RS56402B1 - Obogaćivanje i identifikacija fetalnih ćelija u majčinoj krvi i ligandi za takvu upotrebu - Google Patents

Obogaćivanje i identifikacija fetalnih ćelija u majčinoj krvi i ligandi za takvu upotrebu

Info

Publication number
RS56402B1
RS56402B1 RS20170977A RSP20170977A RS56402B1 RS 56402 B1 RS56402 B1 RS 56402B1 RS 20170977 A RS20170977 A RS 20170977A RS P20170977 A RSP20170977 A RS P20170977A RS 56402 B1 RS56402 B1 RS 56402B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
sample
ligand
fetal
cell marker
Prior art date
Application number
RS20170977A
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas Eckelt
Britta Christensen
Steen Kølvraa
Marie Brinch
Ripudaman Singh
Lotte Hatt
Original Assignee
Arcedi Biotech Aps
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arcedi Biotech Aps filed Critical Arcedi Biotech Aps
Publication of RS56402B1 publication Critical patent/RS56402B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Osnova pronalaska
[0001] Ispitivanje fetalnih ćelija za ranu detekciju fetalnih bolesti i genetskih abnormalnosti se sprovodi kod mnogih trudnoća, posebno kada je starost majke visoka (35 godina ili više) ili kada je poznato da u porodici postoje genetske bolesti. Fetalne ćelije mogu da se dobiju amniocentezom, uzimanjem amnionske tečnosti iz amnionske šupljine u amnionskoj kesi ili biopsijom horiona, kada se biopsije uzimaju iz placente, takozvanim invazivnim uzorkovanjem.
[0002] Prenatalni skrining na aneuploidiju uključuje ili tradicionalno ispitivanje hromozoma ili DNK probe specifične za hromozom za ispitivanje odstupanja u broju hromozoma kod kojih se ovo odstupanje najčešće javlja, posebno hromozoma 13, 18, 21, X i Y u fetusu.
[0003] Zbog invazivnosti prethodno opisanih postupaka i opasnosti od pobačaja, bilo bi pogodno izvesti fetalnu dijagnostiku neinvazivnim postupkom, kao na primer upotrebom uzorka majčine krvi.
[0004] Tokom trudnoće različiti tipovi ćelija fetalnog porekla prolaze kroz placentu i cirkulišu u majčinoj perifernoj krvi. Izvodljivost korišćenja fetalnih ćelija u majčinoj cirkulaciji u dijagnostičke svrhe ometala je činjenica da su fetalne ćelije prisutne u majčinoj krvi u veoma ograničenom broju, prijavljeni brojevi iznose od jedne fetalne ćelije na 10<5>-10<8>majčinih ćelija koje imaju jedro, ili 1-10 fetalnih ćelija po ml majčine krvi. Osim toga, većina fetalnih ćelija ne može da se razlikuje od majčinih ćelija samo na osnovu morfologije, stoga su ispitivani alternativni postupci za identifikaciju fetalnih ćelija.
[0005] US2007/0015171 opisuje neinvazivni postupak za izdvajanje i detekciju fetalne DNK. Postupak obogaćuje uzorak majčinske krvi korišćenjem antitela koja se specifično vezuju za majčine ćelije i/ili antitela koja se specifično vezuju za fetalne ćelije. Pronalazači predlažu upotrebu nekoliko posebno pomenutih antitela: HLe-1 je antitelo koje prepoznaje antigen prisutan na zrelim humanim leukocitima i na veoma nezrelim prekursorima eritrocita, ali ne i na zrelim eritrocitima sa jedrom. Stoga, predloženo je da ovo antitelo može da se koristi za prepoznavanje majčinih leukocita, ali ne i fetalnih eritrocita sa jedrom. Antimonocitno antitelo (M3) i anti-limfocitno antitelo (L4) su takođe predloženi za uklanjanje majčinih ćelija iz uzorka. Najzad, autori predlažu korišćenje monoklonskog antitela, koje prepoznaje receptor za transferin (TfR) na fetalnim ćelijama. DNK iz izdvojenih fetalnih ćelija se zatim čini dostupnim za detekciju i dijagnostiku.
[0006] WO2008/132753 opisuje postupak za identifikaciju trofoblasta detekcijom u ćelijama iz biološkog uzorka ekspresije trofoblastnog markera izabranog iz grupe koja se sastoji od aneksina IV, citokeratina-7, citokeratina 8 i citokeratina-19. Trofoblast se odnosi na epitelijalnu ćeliju koja potiče iz placente embriona ili fetusa sisara; trofopblast se obično nalazi u kontaktu sa zidom materice. Pomenuta su tri tipa trofoblasta, citotrofoblast vila, sinciciotrofoblast i trofoblast izvan vila. Bitno je da su pronalazači koristili monoklonska antitela protiv Vimentina da procene stepen kontaminacije fibroblastima trofoblasta izolovanih iz placenti u prvom tromesečju trudnoće. Stoga, trofoblasti koje su izdvojili ovi pronalazači ne sadrže Vimentin.
[0007] Gussin et al., 2004, pretpostavili su da fetalne ćelije u majčinoj krvi koje ne odgovaraju na hematopoezne uslove kultivisanja predstavljaju endotelijalne ćelije. Oni su ispitivali da li endotelijalne progenitorske ćelije fetalnog porekla mogu da budu izabrane iz majčine krvi na osnovu svoje ekspresije CD133 ili CD105 i umnožavane u kulturi. Autori su zaključili da CD133+ i CD105+ ćelije izolovane iz majčine krvi mogu da se umnožavaju in vitro pod uslovima istim kao i za endotelijalne ćelije. Izgleda da ove ćelije potiču od majke, pre nego od fetusa.
[0008] WO 2010/078872 opisuje obogaćivanje fetalnih ćelija iz majčine krvi dovođenjem u kontakt ćelijske suspenzije sa CD105 mikroperlama.
[0009] Kye-Hwan Na et al., "Isolation and Characterisation of Trophoblast Stem Cells-like Cells Derived from Human Term Placenta", Dev. Reprod. vol.14(3), p.155-162, (2010) opisuje da trofoblastne ćelije slične stem-ćelijama ispitivane pomoću RT-PCR i FACS metoda eksprimiraju i CD105 i CK7. Stoga, ostaje potreba za poboljšanim postupcima izdvajanja fetalnih ćelija iz uzoraka majčine krvi kako bi se olakšala prenatalna detekcija i dijagnostika.
Sažetak pronalaska
[0010] Predmetni pronalazak se zasniva na identifikaciji antigena koji mogu da se koriste za identifikaciju i/ili obogaćivanja fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi. Pronalazak se naročito zasniva na iznenađujućem otkriću da fetalne ćelije u uzorku majčine krvi pokazuju i endotelijalna i epitelijalna svojstva. Korišćenjem ove promene pronalazači obezbeđuju novi postupak za obogaćivanje i identifikaciju fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi i takođe opisuju nove antigene za ovu svrhu.
[0011] U poželjnom prvom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kao što je definisano patentnim zahtevima, uzorak majčine krvi se dovodi u kontakt sa endotelijalnim ćelijskim markerom i ćelije sa endotelijalnim fenotipom se tako obogaćuju odabirom ćelija specifičnih za pomenuti endotelijalni ćelijski marker. Ovakav postupak za identifikaciju fetalne ćelije u uzorku majčine krvi obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker ili sa ligandom koji se vezuje za endotelijalni ćelijski marker i
c. obogaćivanja ćelija specifičnih za pomenuti endotelijalni ćelijski marker.
d. Dovođenja u kontakt ćelija odabranih u koraku b) koje ispoljavaju endotelijalni fenotip sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili sa ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker.
e. Detekcije ćelija sa endotelijalnim fenotipom koje se takođe vezuju za epitelijalni ćelijski marker u koraku c).
f. Izborno, dijagnostikovanja i/ili prognoziranja genetskog sadržaja ćelija detektovanih u koraku d)
pri čemu koraci b-e mogu da se izvedu bilo kojim redosledom.
Kratak opis slika
Slika 1. Muška fetalna ćelija identifikovana pomoću X i Y specifičnih proba. Strelica pokazuje fetalnu ćeliju.
Slika 2. Učestalost fetalnih ćelija po ml majčine krvi.
Slika 3. Fetalna ćelija koja ispoljava bojenje na pan-citokeratin. Strelica pokazuje fetalnu ćeliju.
Slika 4. Fetalna ćelija koja ispoljava bojenje na citokeratin 7. Strelica pokazuje fetalnu ćeliju.
Slika 5. Fetalna ćelija koja ispoljava bojenje na vimentin. Strelica pokazuje fetalnu ćeliju.
Slika 6. Fetalna ćelija obojena citokeratinom (zeleno) i FISH probama za hromozom 21 (crveno) i X hromozom (plavo). Strelica pokazuje tri kopije hromozoma 21 u fetalnoj ćeliji. Majčine ćelije u pozadini sadrže svaka po dve kopije hromozoma 21
Opis pronalaska
[0013] Predmetni pronalazak se zasniva na identifikaciji antigena koji mogu da se koriste za identifikaciju i/ili obogaćivanje fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi. Pronalazak se naročito zasniva na iznenađujućem otkriću da fetalne ćelije u uzorku majčine krvi pokazuju i endotelijalna i epitelijalna svojstva. Predmetni pronalazak prvi put opisuje da fetalne ćelije prisutne u uzorku majčine krvi podležu jedinstvenoj promeni kojoj ni jedna normalna majčina ćelija u krvi ne podleže. Već od ranog stadijuma blastocista, ćelije embriona diferenciraju u tri germinativna sloja, nazvana endoderm, mezoderm i ektoderm. Mezoderm predstavlja ćelije mekog tkiva kao što su mišići, masno tkivo i krvni sudovi. Ektoderm i endoderm predstavljaju epitelijalne ćelije koje pokrivaju spoljašnje i unutrašnje površine. Mezodermalne i ektodermalne ćelije imaju izražene razlike u načinu eksprimiranja markera. Epitelijalno-mezenhimalna promena (EMT) je proces kojim epitelijalne ćelije gube svoja epitelijalna svojstva i stiču mezenhimu-sličan fenotip. EMT je opisana u ranoj embriogenezi kada je migracija i prolazna dediferencijacija embrionskih epitelijalnih ćelija potrebna za obrazovanje npr. neuralne cevi.
EMT je takođe opisana u vezi sa kancerom gde nekoliko onkogenih puteva indukuje EMT. EMT je prethodnih godina naročito izučavana u vezi sa metastatskim procesom.
[0014] Predmetni pronalazak se odnosi na saznanje činjenice do koga su došli pronalazači, da fetalne ćelije prisutne u majčinoj krvi podležu EMT, i korišćenjem ovog svojstva, predmetni pronalazak obezbeđuje novi postupak za izdvajanje i identifikaciju fetalnih ćelija prisutnih u uzorku majčine krvi. Upotrebom mezodermalnog markera (tj. endotelijalnog markera) kao markera za pozitivnu selekciju, fetalne ćelije prisutne u veoma malom broju u uzorku majčine krvi se obogaćuju zajedno sa nekim majčinim ćelijama. Pozitivna identifikacija fetalnih ćelija se zatim radi dovođenjem u kontakt preostalih ćelija sa epitelijalnim markerom koristeći na taj način fenomen EMT. Nijedna od normalnih majčinih ćelija prisutnih u uzorku krvi ne eksprimira ni jedan epitelijalni marker.
Korišćenjem ove promene pronalazači obezbeđuju nov postupak za obogaćivanje i identifikaciju fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi i takođe opisuju nove antigene za ovu svrhu.
[0015] Stoga postupci pronalaska obuhvataju izolaciju ćelija koje eksprimiraju endotelijalne ćelijske markere praćenu detekcijom ćelija, koje dodatno eksprimiraju epitelijalne ćelijske markere.
[0016] Identifikovani antigeni mogu da se koriste za identifikaciju fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi detekcijom ili kvantifikovanjem iRNK ili proteina (antigena) kodiranog pomoću iRNK. Kada se termin detekcija ovde koristi, on obuhvata i detekciju i kvantifikaciju. Međutim, u dva odvojena primera izvođenja termin detekcija obuhvata ili detekciju ili kvantifikaciju. Uopšteno, stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati kada detekcija obuhvata i kvantifikaciju, tj. kada je bitno kvantifikovati nivoe iRNK ili nivoe proteina kodiranog pomoću iRNK. To može, npr. da bude neophodno za detekciju date iRNK koja se eksprimira na niskom nivou u majčinim ćelijama (ali nije odsutna) i gde se ista iRNK eksprimira na, npr.
3 tri puta višem nivou u fetalnim ćelijama.
[0017] Kada se termin obogaćivanje ovde koristi, on obuhvata izdvajanje jedne ili više ćelija od bilo kojih drugih ćelija prisutnih u uzorku. U jednom primeru izvođenja obogaćena ćelija(e) nije izdvojena iz uzorka već se bilo kakva dijagnostika izvodi na ćeliji(ama) dok su još prisutne u uzorku. Uzorak može da se nalazi na mikroskopskoj pločici i dijagnostika može da se radi korišćenjem mikroskopije i ćelije se u ovom primeru izvođenja pre detektuju nego izdvajaju.
[0018] Još jedno otkriće predmetnih pronalazača je da korak fiksacije ćelija majčinog uzorka značajno pomaže identifikaciji i obogaćivanju fetalnih ćelija iz uzorka. Korak fiksacije može da se sprovede zajedno sa ovde opisanim postupcima obogaćivanja i/ili identifikacije fetalnih ćelija ili zajedno sa postupcima obogaćivanja i/ili identifikacije fetalnih ćelija opisanim u stanju tehnike (npr. US2007/0015171 opisanom u odeljku osnove pronalaska).
Fiksacija ćelija uzorka majčine krvi
[0019] U jednom primeru izvođenja pronalaska otkriće da fiksacija ćelija uzorka majčine krvi značajno povećava stabilnost fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi, dok istovremeno dozvoljava obogaćivanje i identifikaciju fetalnih ćelija npr. kao što je prethodno dodatno opisano. U jednom primeru izvođenja postupak fiksacije može da se izvede na neobogaćenom uzorku krvi odmah nakon uzorkovanja (tj. koraka a postupka opisanog u prvom primeru izvođenja), rezultujući u fiksaciji ćelijskih komponenata u uzorku majčine krvi. U isto vreme fiksacija je tako blaga da majčini eritrociti mogu selektivno da liziraju u narednom koraku liziranja. U jednom primeru izvođenja, fiksacija može da se izvede u bilo kom pogodnom trenutku između koraka a-d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. U jednom primeru izvođenja fiksacija se izvodi nakon koraka a postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. U drugom primeru izvođenja fiksacija se izvodi nakon koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. U još jednom primeru izvođenja fiksacija se izvodi nakon koraka c postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. U još jednom primeru izvođenja fiksacija se izvodi nakon koraka d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja.
[0020] Stoga, jedan primer izvođenja pronalaska je postupak koji obuhvata korake
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa rastvorom za fiksaciju
[0021] Poželjno, uzorak majčine krvi se dovodi u kontakt sa rastvorom za fiksaciju odmah nakon dobijanja uzorka. Termin odmah, kada se koristi u ovom kontekstu, znači da uzorak nije podvrgnut bilo kakvim drugim manipulacijama pre dovođenja u kontakt sa rastvorom za fiksaciju. Poželjno, uzorak se dovodi u kontakt sa rastvorom za fiksaciju ne kasnije od 24 časa nakon dobijanja uzorka. Poželjnije, uzorak se dovodi u kontakt sa rastvorom za fiksaciju ne kasnije od 12 časova, kao što je 8 časova, 4 časa, 2 časa, 1 čas, 30 minuta, 15 minuta nakon dobijanja uzorka. Najpoželjnije, uzorak se dovodi u kontakt sa rastvorom za fiksaciju ne kasnije od 1 časa nakon dobijanja uzorka.
U još jednom poželjnom primeru izvođenja, rastvor za fiksaciju se dodaje celoj krvi i poželjno pre izbornog koraka sedimentacije kao što je npr. sedimentacija pod uticajem gravitacije ili sedimentacija centrifugiranjem.
Fiksacija se poželjno sprovodi između 1 i 60 minuta. Poželjnije, fiksacija se sprovodi između 5 i 30 minuta, i najpoželjnije, fiksacija se sprovodi između 5 i 15 minuta, kao što je 10 minuta.
[0022] Rastvor za fiksaciju poželjno sadrži između 2.5% i 7,5 % paraformaldehida, poželjnije između 3% i 6%, i najpoželjnije između 4% i 5%.
Pored paraformaldehida, rastvor za fiksaciju poželjno sadrži so u koncentraciji između 0,05 M i 0,3 M. Poželjnije, koncentracija je između 0,1 i 0,2 M i najpoželjnije, koncentracija je između 0,125 i 0,175 M. So je poželjno LiCl, KCl, NaCl ili PBS, pri čemu je PBS najpoželjniji.
[0023] Kada se koriste prethodno pomenute koncentracije rastvora za fiksaciju, poželjno je dodati između 0,2 i 10 zapremina rastvora za fiksaciju uzorku majčine krvi za fiksaciju, poželjnije, dodaje se između 0,5 i 5 zapremina, i najpoželjnije, dodaje se između 1 i 3 zapremine. Obično se dodaje 2/3 zapremine. U još jednom primeru izvođenja, poželjno je dodati između 1/3 i 3/3 zapremine rastvora za fiksaciju, npr.2/3 zapremine.
[0024] Stručnjaku u ovoj oblasti će biti jasno da različite koncentracije rastvora za fiksaciju i odnos razblaženja mogu da se prilagode tako da se dobiju željene finalne koncentracije nakon dodavanja rastvora za fiksaciju uzorku majčine krvi. Poželjno, finalna koncentracija paraformaldehida je između 2 i 6%, poželjnije između 3 i 5% i najpoželjnije između 3,5% i 4,5%. Tipična finalna koncentracija je 4%.
[0025] Poželjno, korak fiksacije je praćen korakom liziranja koji obuhvata:
c. Dovođenje u kontakt fiksiranog uzorka iz koraka a sa puferom za liziranje
[0026] Pufer za liziranje tipično sadrži nejonski deterdžent, poželjno Triton X-100. Poželjne koncentracije deterdženta su između 0,01% (tež./tež.) i 0,5%, poželjnije između 0,05%-0,3%, i najpoželjnije 0,1%.
[0027] U poželjnom primeru izvođenja, korak liziranja se izvodi odmah nakon koraka fiksacije. Tako se i fiksacija i liziranje izvode nakon koraka a i pre koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. Tj. rastvor za liziranje se dodaje neposredno u uzorak, npr. nakon fiksacije tokom 10 minuta. Liziranje se obično sprovodi u periodu od 15 minuta do 120 minuta, poželjnije 30 do 60 minuta i najpoželjnije 40 do 45 minuta.
[0028] Kao što je prethodno rečeno, korak liziranja iznenađujuće omogućava selektivno liziranje majčinih eritrocita.
[0029] Drugi primer izvođenja pronalaska je upotreba pufera za liziranje za selektivno liziranje majčinih eritrocita u uzorku majčine krvi ili njegovoj frakciji, kao što je ovde prethodno opisano. U poželjnom primeru izvođenja, pufer za liziranje je za upotrebu u postupku prema predmetnom pronalasku i pufer za liziranje može da se doda uzorku majčine krvi ili njegovoj frakciji nakon koraka a postupka opisanog u prvom primeru izvođenja.
Dovođenje u kontakt uzorka majčine krvi sa ligandom ili probom
[0030] Opisan je postupak za odabiranje fetalne ćelije u uzorku majčine krvi, pomenuti postupak obuhvata korake
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker ili
ii. ligandom usmerenim prema endotelijalnom ćelijskom markeru
c. Odabira ćelija koje se vezuju za hibridizacionu probu ili ligand iz prethodnog koraka i na taj način obogaćivanja uzorka ćelijama koje se vezuju za hibridizacionu probu ili ligand iz prethodnog koraka
d. Dovođenja u kontakt (obogaćenog) uzorka iz koraka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili
ii. ligandom usmerenim prema epitelijalnom ćelijskom markeru.
[0031] Poželjno, postupak dalje sadrži korak identifikaciju fetalnih ćelija u uzorku. Kao što će biti jasno, identifikacija poželjno sadrži detekciju prisustva liganda usmerenog na epitelijalni ćelijski marker na ili u fetalnoj ćeliji ili detekciju prisustva hibridizacione probe koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker na ili u fetalnoj ćeliji. Uzorak majčine krvi se poželjno dovodi u kontakt sa ligandom ili hibridizacionom probom koja se vezuje za endotelijalni ćelijski marker ili gen koji kodira pomenuti marker i ćelije sa endotelijalnim fenotipom se na taj način obogaćuju odabiranjem ćelija koje su specifične za pomenuti endotelijalni ćelijski marker. Takav postupak obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker ili ligandom usmerenim na endotelijalni ćelijski marker i
c. odabiranja ćelija specifičnih za pomenuti endotelijalni ćelijski marker obogaćujući na taj način uzorak ćelijama sa endotelijalnim fenotipom
d. Dovođenja u kontakt ćelija odabranih u koraku c) koje pokazuju endotelijalni fenotip sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker
e. Detekcije ćelija sa endotelijalnim fenotipom koje takođe vezuju epitelijalni ćelijski marker iz koraka d).
f. Izborno, dijagnostikovanja i/ili prognoziranja genetskog sadržaja ćelija detektovanih u e)
pri čemu koraci b-e mogu da se izvode bilo kojim redosledom.
[0032] Stručnjak u oblasti će znati da u jednom primeru izvođenja prethodno opisani koraci b, c, d, e i f mogu da se izvedu bilo kojim redom, poželjno prethodno opisanim redom, ili po redu b, d, c, e i f, poželjnije prethodno opisanim redosledom. Stoga, u jednom primeru izvođenja uzorak se dovodi u kontakt sa hibridizacionom probom ili ligandom usmerenim na endotelijalni ćelijski marker, što je praćeno dovođenjem u kontakt istog uzorka sa hibridizacionom probom ili ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker pre izvođenja koraka odabiranja. Endotelijalni ćelijski marker je izabran iz grupe koja se sastoji od CD105, CD146 ili CD141, Vimentin, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 ili CDH3. Endotelijalni marker predmetnog pronalaska je marker koji se prvenstveno eksprimira u ili na endotelijalnim ćelijama. Pomenuti endotelijalni marker nije posebno eksprimiran u ili na bilo kojom drugom tipu ćelija. Najpoželjniji je CD105 (SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 2). Epitelijalni ćelijski marker je izabran iz grupe koja se sastoji od CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 ili CK19. Epitelijalni marker predmetnog pronalaska je marker koji se prvenstveno eksprimira u ili na epitelijalnim ćelijama. Pomenuti epitelijalni marker nije posebno eksprimiran u ili na bilo kojom drugom tipu ćelija.
[0033] U poželjnom primeru izvođenja, postupak dalje sadrži dovođenje u kontakt uzorka sa antitelom M30 (ili drugim ligandom usmerenim na apoptotski CK18). U poželjnom primeru izvođenja epitelijalni marker je izabran iz grupe koja se sastoji od: CK4, CK5, CK6A, CK6B, CK7, CK8, CK10, CK13 i CK18. Najpoželjniji je CK18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO 13).
[0034] Antigeni za upotrebu u predmetnom pronalasku i geni koji ih kodiraju su identifikovani u tabeli 1.
Tabela 1:
[0035] Antigeni za upotrebu u koraku b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja i geni koji ih kodiraju su poželjno odabrani iz tabele 2. Prema tome, endotelijalni ćelijski marker iz koraka b) postupka prema prvom primeru izvođenja pronalaska opisanom u Sažetku pronalaska je poželjno odabran od markera koje kodiraju geni iz tabele 2:
Tabela 2:
[0036] Antigeni za upotrebu u koraku d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja i geni koji ih kodiraju su poželjno odabrani iz tabele 3. Prema tome, endotelijalni ćelijski marker iz koraka d) postupka prema prvom primeru izvođenja pronalaska opisanom u Sažetku pronalaska je poželjno odabran od markera koje kodiraju geni iz tabele 3:
Tabela 3:
[0037] Treba napomenuti da hibridizaciona proba iz koraka b i d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja (videti Sažetak pronalaska) može da bude komplementarna ili kodirajućem lancu ili nekodirajućem lancu gena. Poželjno, proba je komplementarna kodirajućem lancu (lancu koji ne služi kao matrica). U povezanom primeru izvođenja, proba je usmerena na iRNK. Ako je proba usmerena na iRNK, može da bude usmerena na spojeve nastale splajsovanjem, što znači, da su sekvence razdvojene u DNK.
[0038] Termin "njena frakcija" se koristi da označi da uzorak majčine krvi može da se dovodi u kontakt neposredno sa ligandom ili hibridizacionom probom ili da uzorak majčine krvi može da se prethodno obradi tako da sadrži samo frakciju originalnog uzorka majčine krvi kada se dovodi u kontakt sa ligandom ili hibridizacionom probom. Uzorak majčine krvi može npr. da se podvrgne koncentrovanju svojih ćelija, koraku koagulacije ili koraku obogaćivanja pre nego što se dovede u kontakt sa ligandom ili hibridizacionom probom.
[0039] U poželjnom primeru izvođenja, postupak obuhvata
a. Obezbeđivanje uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenje u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira humani vimentin i/ili
ii. ligandom usmerenim prema humanom vimentinu.
[0040] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, postupak obuhvata
a. Obezbeđivanje uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenje u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira humani citokeratin 7 i/ili
ii. ligandom usmerenim prema humanom citokeratinu 7.
[0041] U poželjnijem primeru izvođenja, postupak obuhvata
a. obezbeđivanje uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. dovođenje u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 nukleotida komplementarnih genu koji kodira CD105 i/ili
ii. ligandom usmerenim prema CD105 (SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2) i
c. dovođenje u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira citokeratin 7 (SEQ ID NO: 7) i/ili
ii. ligandom usmerenim prema humanom citokeratinu 7 nakon što je uzorak majčine krvi bio doveden u kontakt sa endotelijalnim markerom, u poželjnom primeru izvođenja CD105.
[0042] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, postupak obuhvata
a. Obezbeđivanje uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenje u kontakt uzorka sa
i. unakrsno-reaktivnom hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genima iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju humani citokeratin 1-6, 8, 10 i 13-19 i/ili
ii. unakrsno-reaktivnim ligandom usmerenim prema humanim citokeratinima 1-6, 8, 10 i 13-19.
[0043] U ovom primeru izvođenja, ligand može da se veže za multiple citokeratine, tj. citokeratine 1-6, 8, 10 i 13-19. Ova unakrsna reaktivnost može da se postigne usmeravanjem liganda na konzervativne (identične) regione citokeratina. Slično, unakrsno-reaktivne hibridizacione probe mogu da budu dizajnirane usmeravanjem probe prema konzervativnim (identičnim) regionima gena koji kodiraju pomenute citokeratine.
[0044] U poželjnom primeru izvođenja, postupak obuhvata:
a. Obezbeđivanje uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenje u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 nukleotida komplementarnih genu koji kodira CD105 i/ili
ii. ligandom usmerenim prema CD105 i
c. Dovođenje u kontakt uzorka sa
i. unakrsno-reaktivnom hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genima u grupi koja se sastoji od gena koji kodiraju humani citokeratin 1-6, 8, 10 i 13-19 i/ili
ii. unakrsno-reaktivnim ligandom usmerenim prema humanim citokeratinima 1-6, 8, 10 i 13-19.
[0045] U još jednom primeru izvođenja, koristi se smeša hibridizacionih proba ili liganda (jedna za svaki antigen ili gen) kao alternativa unakrsno reaktivnoj hibridizacionoj probi ili unakrsno reaktivnom ligandu.
[0046] U jednom takvom primeru izvođenja, postupak obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 nukleotida komplementarnih genu koji kodira CD105 i/ili
ii. ligandom usmerenim prema CD105 i
c. Dovođenja u kontakt uzorka sa
i. Smešom hibridizacionih proba, koja sadrži hibridizacione probe koje sadrže najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genima u grupi koja se sastoji od gena koji kodiraju humane citokeratine 1-6, 8, 10 i 13-19, hibridizacionu probu koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira humani citokeratin 7 i hibridizacionu probu koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira humani vimentin i/ili
ii. Smešom liganda koja sadrži unakrsno reaktivni ligand usmeren na humane citokeratine 1-6, 8, 10 i 13-19, ligand usmeren prema humanom citokeratinu 7 i ligand usmeren prema humanom vimentinu.
[0047] U poželjnom primeru izvođenja ćelije koje reaguju i sa endotelijalnim (tj. CD105) i epitelijalnim markerom (tj. citokeratin 7) se zatim identifikuju i odabiraju za dalja ispitivanja.
[0048] U poželjnom primeru izvođenja korak b poželjno koristi hibridizacionu probu kao što je ovde opisano u nastavku, i korak d koristi ligand kao što je ovde opisano u nastavku.
Odabir iz pune krvi
[0049] U jednom primeru izvođenja, uzorak majčine krvi iz koraka a postupka opisanog u prvom primeru izvođenja je puna krv, tj. krv nije bila podvrgnuta nikakvim frakcionisanju pre dovođenja u kontakt sa ligandom usmerenim na endotelijalni ćelijski marker ili hibridizacionom probom usmerenom prema genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker.
Fiksacija i selektivno liziranje
[0050] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, ćelije u uzorku majčine krvi se fiksiraju kao što je opisano u jednom primeru izvođenja pronalaska. Broj majčinih ćelija znatno prevazilazi broj fetalnih ćelija prisutan u uzorku majčine krvi, tako da može da bude korisno uključiti korak obogaćivanja kojim se majčine ćelije uklanjaju iz uzorka koji se ispituje.
Korak obogaćivanja može da se izvede u bilo kom pogodnom trenutku tokom postupka, najpogodnije kao korak nakon koraka a postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. Kako se ne bi uklonilo nimalo fetalnih ćelija, poželjno je da korak obogaćivanja ne pravi razliku između različitih fetalnih tipova ćelija sa jedrom. Veliku frakciju majčinih ćelija u uzorku krvi sačinjavaju eritrociti. Poznato je nekoliko postupaka za uklanjanje eritrocita, i najpogodniji je liziranje eritrocita, koje može da se postigne liziranjem posredovanim sa NH4Cl. Stoga, u poželjnom primeru izvođenja, majčini eritrociti se selektivno liziraju odmah nakon fiksacije. Prema tome, postupak za identifikaciju fetalne ćelije u uzorku majčine krvi obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Obogaćivanja fetalnih ćelija podvrgavanjem pomenutog uzorka majčine krvi liziranju eritrocita
c. Fiksacije preostalih ćelija,
d. Dovođenja u kontakt uzorka sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker ili ligandom koji se vezuje za endotelijalni ćelijski marker i
e. obogaćivanja ćelija specifičnih za pomenuti endotelijalni ćelijski marker
f. Dovođenja u kontakt ćelija odabranih u koraku b) koje pokazuju endotelijalni fenotip sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker
g. Detekcije ćelija sa endotelijalnim fenotipom koje takođe vezuju epitelijalni ćelijski marker iz koraka c)
h. Izborno, dijagnostike i/ili prognoziranja genetskog sadržaja ćelija detektovanih u koraku d)
pri čemu koraci b-e mogu da se izvedu bilo kojim redom, poželjno gore navedenim redom.
Permabilizacija
[0051] U još jednom primeru izvođenja, ćelije u uzorku majčine krvi se podvrgavaju koraku permeabilizacije pre dovođenja u kontakt sa ligandima ili hibridizacionim probama kao što je prethodno opisano. Tj. korak permeabilizacije se izvodi pre koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. Ovaj korak poželjno sadrži dovođenje uzorka u kontakt sa metanolom, acetonom ili saponinom. Poželjno, sredstvo za permeabilizaciju je metanol. U skladu sa tim, postupak za identifikaciju fetalne ćelije u uzorku majčine krvi obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Permeabilizacije ćelija pomenutog uzorka majčine krvi,
c. Dovođenja u kontakt uzorka sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker ili ligandom koji se vezuje za endotelijalni ćelijski marker i
d. obogaćivanja ćelija specifičnih za pomenuti endotelijalni ćelijski marker
e. Dovođenja u kontakt ćelija odabranih u b) koje pokazuju endotelijalni fenotip sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker
f. Detekcije ćelija sa endotelijalnim fenotipom koje takođe vezuju epitelijalni ćelijski marker iz koraka c)
g. Izborno, dijagnostike i/ili prognoziranja genetskog sadržaja ćelija detektovanih u koraku d)
pri čemu koraci b-e mogu da se izvedu bilo kojim redosledom.
Pozitivni odabir
[0052] Poželjno, obogaćivanje zavisno od antigena obuhvata dovođenje u kontakt uzorka majčine krvi sa antitelima usmerenim prema CD105 kao što je opisano u odeljku sa primerima i u jednom primeru izvođenja pronalaska. Tj. u jednom primeru izvođenja, korak b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja je korak zavisan od antigena.
[0053] U poželjnom primeru izvođenja, uzorak majčine krvi se fiksira, lizira i obogaćuje korišćenjem antitela usmerenih prema CD105 pre dovođenja u kontakt sa ligandima ili hibridizacionim probama usmerenim na epitelijalne ćelije (tj. koraka d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja).
Efikasnost
[0054] Poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska čini identifikaciju fetalne ćelije komercijalno izvodljivom, jer dramatično smanjuje broj pojedinačnih ćelija koje moraju da budu ispitane zbog identifikacije fetalnih ćelija. Predmetni pronalazak smanjuje broj ćelija u uzorku 10 do 20 puta, tako da one mogu da se ispituju korišćenjem automatskog skeniranja oko 20 do 30 predmetnih stakala. Tj. pronalazak ne obezbeđuje samo antigene specifične za fetalnu ćeliju za upotrebu u identifikaciji fetalne ćelije. On takođe obezbeđuje postupak za obogaćivanje koji dramatično smanjuje broj ćelija koje moraju da budu ispitane za identifikaciju fetalnih ćelija. Postupci omogućavaju doslednu identifikaciju 0,1 do 1,1 fetalnih ćelija/ml uzorka majčine krvi i uz ispitivanje samo 20 do 30 predmetnih stakala / 10<6>- 10<7>ćelija ukupno.
[0055] Površina predmetnog stakla koja je pokrivena ćelijama je tipično 15 mm x 15 mm što dodatno naglašava efikasnost metode.
Hibridizacione probe
[0056] Hibridizacione probe koraka b i d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska u odeljku "Sažetak pronalaska" se uopšteno koriste u stanju tehnike i tipično su DNK ili RNK, poželjno DNK. U poželjnim primerima izvođenja, probe su modifikovane nukleotidima koji nisu prirodni koji poboljšavaju afinitet vezivanja i/ili specifičnost vezivanja. Poželjni primeri takvih neprirodnih nukleotida su LNA (zaključane nukleinske kiseline), TINA (upredene interkalirajuće nukleinske kiseline), PNA (peptidne nukleinske kiseline), INA (interkalirajuće nukleinske kiseline), morfolino i 2'O-supstituisani monomeri RNK kao što su 2'O-metil monomeri RNK i 2'O-(2-metoksietil) RNK.
[0057] Dužina proba može da bude bilo koja pogodna dužina, kao što je u opsegu od 10 do 200 nukleotida, poželjno između 10 i 30 nukleotida, poželjnije 15-25 nukleotida i poželjno, proba je u potpunosti komplementarna genu koji kodira humani citokeratin 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13) i 19, CD105 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2) i/ili humani vimentin dužinom probe.
[0058] U jednom primeru izvođenja proba je najmanje 85% komplementarna genu koji kodira bilo koji od proteina opisanih u tabeli 1-3, poželjno u tabeli 2, kao što je najmanje 90% komplementarna, na primer najmanje 95% komplementarna dužinom probe. Proba može da bude komplementarna DNK ili iRNK koja kodira pomenuti protein.
U jednom primeru izvođenja proba je najmanje 85% komplementarna genu koji kodira humani citokeratin 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13) i 19, CD105 (SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO: 2) i/ili humani vimentin, kao što je najmanje 90% komplementarna, na primer najmanje 95% komplementarna dužinom probe. Proba može da bude komplementarna DNK ili iRNK koja kodira pomenuti protein.
U jednom poželjnom primeru izvođenja proba je potpuno komplementarna genu koji kodira CD105 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2) dužinom probe. U drugom poželjnom primeru izvođenja proba je potpuno komplementarna genu koji kodira CK18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO 13) dužinom probe. U jednom primeru izvođenja hibridizacione probe za upotrebu u koraku b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska u odeljku "Sažetak pronalaska" mogu da budu odabrane od hibridizacionih proba koje hibridizuju sa nukleotidom koji kodira protein odabran iz grupe koja se sastoji od: CD 105, Vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, i VEGF-3. Najpoželjniji je CD105 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2).
[0059] U jednom primeru izvođenja hibridizacione probe za upotrebu u koraku d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja mogu da budu odabrane od hibridizacionih proba koje hibridizuju sa nukleotidom koji kodira protein odabran iz grupe koja se sastoji od: CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 i CK19. Najpoželjniji je CK18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13).
Reporter boje
[0060] Hibridizacione probe i ligandi koji se koriste u skladu sa pronalaskom, u koraku b i d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska opisanog u "Sažetku pronalaska", mogu da sadrže ili poželjno da budu vezane za reporter boju (koja se ovde takođe naziva obeleživač). Pomenute hibridizacione probe ili ligand su poželjno kovalentno vezane za reporter boju. Reporter boja je poželjno fluorescentna reporter boja. Poželjno, reporter boja je izabrana iz grupe koja se sastoji od boja FAM™, TET™, JOE™, VIC™, SYBR® zeleno, 6 FAM, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, fluorescein, Cy3, Cy5, Cy5.5, teksas crveno, rodamin, rodamin zeleno, rodamin crveno, 6-karboksirodamin 6G, Alexa Fluor, Oregon zeleno 488, Oregon zeleno 500 i Oregon zeleno 514.
[0061] U jednom primeru izvođenja, hibridizacione probe takođe sadrže boju za prigušivanje. U poželjnom primeru izvođenja, boja za prigušivanje je izabrana iz grupe koja se sastoji od boja TAMRA™, Black Hole Quencher™, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, DDQ I, DDQ II i Eclipse Dark Quencher.
[0062] Upotreba reporter boje i boje za prigušivanje je poželjna jer omogućava različite vrste kvantifikacija pored identifikacije.
[0063] Tipično, reporter boja i boja za prigušivanje su smeštene blizu jedna drugoj u hibridizacionoj probi, omogućavajući da fluorescencija koju emituje reporter boja, a koja je pobuđena svetlošću ili laserom bude prigušena bojom za prigušivanje. Kada se oligonukleotid veže za komplementarnu matricu, reporter boja i boja za prigušivanje su odvojene jedna od druge tako da prigušivač više ne prigušuje signal sa reportera, tj. hibridizacija može da se detektuje.
[0064] Prema tome, u jednom primeru izvođenja, hibridizaciona proba je sposobna da obrazuje strukturu drška-petlja, u kojoj su prigušivač i reporter boja dovedeni u blizinu u strukturi drške. U jednom primeru izvođenja, oligonukleotid je takozvani molekularni svetionik. Prigušivač i reporter više nisu u blizini, kada se molekularni svetionik veže za matricu sparivanjem baza. U tom slučaju, signal sa reporter boje izazvan laserom više nije prigušen.
[0065] Umesto korišćenja reporter boje i boje za prigušivanje, može da se koristi takozvani FRET (fluorescentno rezonantni prenos energije) par koji sadrži donorski fluorofor i akceptorski fluorofor. Kada se donorski fluorofor pobudi spoljašnjim izvorom svetla, on emituje svetlost talasne dužine koja pobuđuje akceptorski fluorofor, koji zauzvrat emituje svetlost različitih talasnih dužina, koja može da se detektuje i meri.
[0066] Energija se prenosi sa donora na akceptor ako su donorski fluorofor i akceptorski fluorofor veoma blizu.
[0067] Poželjni FRET parovi uključuju BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, FAM-ROX, FAM-Cy5, FAM-Hex, FAM-TAMRA i Cy3-Cy5.
[0068] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska hibridizacione probe i ligandi koji se koriste u koraku b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja su poželjno vezani za reporter boju, pomenuta reporter boja je drugačija od reporter boje vezane za hibridizacione probe i ligande koji se koriste u koraku d istog postupka.
Ligandi
[0069] Ligand, kako se koristi u postupku pronalaska, u koraku b i d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja, poželjno je antitelo, peptid ili aptamer. Ligand, kako se koristi u postupku pronalaska, vezuje se prvenstveno za ćeliju(e) od interesa, poželjno sa većim afinitetom nego kada se vezuje za druge ćelije. Tako, poželjno, ligand se prvenstveno vezuje za pomenuti endotelijalni ćelijski marker ili pomenuti epitelijalni ćelijski marker.
[0070] Ligand može da bude aptamer. Aptameri su ligandi na bazi nukleinske kiseline visokog afiniteta koji se vezuju za antigene kao što su proteini. Oni se obično identifikuju korišćenjem in vitro evolutivnih tehnika kao što je SELEX (sistemska evolucija liganda eksponencijalnim obogaćivanjem). U tehnici SELEX, koriste se ponovljeni ciklusi odabira i amplifikacije nukleinskih kiselina iz početne biblioteke za identifikaciju visoko-afinitetnih aptamera. Kako je početna biblioteka veoma velika (npr. 10<14>različitih sekvenci), i sekvence mogu da mutiraju tokom ponavljanja ciklusa, identifikacija visoko-afinitetnih aptamera može sada da se uradi na rutinskoj bazi i takvi postupci su poznati stručnjaku u oblasti. Poželjni aptameri su dužine manje od 50 nukleotida.
[0071] Visoko-afinitetni peptidi mogu da se naprave korišćenjem prikaza na fagima. Kod prikazivanja na fagima, biblioteka faga koji prikazuju peptide se selektuje protiv ciljnog jedinjenja i zatim amplifikuje evolutivnim postupkom sličnim tehnici SELEX. Postoje različiti sistemi prikazivanja na fagima i veličina peptida može da se odabere tako da odgovara konkretnim potrebama. U jednom primeru izvođenja, peptidi koji se koriste u postupku pronalaska imaju veličinu manju od 50 aminokiselina.
[0072] Često je biblioteka prikazana na nosaču, npr. na nosaču antitela. Na taj način, prikaz na fagima može da se koristi za identifikaciju visoko-afinitetnih antitela. Druge in vitro evolutivne tehnike za stvaranje antitela uključuju prikazivanje na iRNK, prikazivanje na ribozomima i prikazivanje na kovalentno vezanoj DNK.
[0073] Ligand može takođe da bude antitelo. Antitelo koje se koristi u pronalasku je polipeptid ili protein sposoban da prepozna i da se veže za antigen koji sadrži najmanje jedno antigen-vezujuće mesto. Pomenuto antigen-vezujuće mesto poželjno sadrži najmanje jedan CDR. Antitelo može da bude prirodno antitelo, fragment prirodnog antitela ili sintetičko antitelo.
Termin "prirodno antitelo" se odnosi na heterotetramerne glikoproteine koji su sposobni da prepoznaju i da se vežu za antigen, i koji sadrže dva istovetna teška (H) lanca i dva istovetna laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region (ovde se koristi skraćenica VH) teškog lanca i konstantni region (ovde se koristi skraćenica CH) teškog lanca. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region (ovde se koristi skraćenica VL) lakog lanca i konstantni region (ovde se koristi skraćenica CL) lakog lanca. VH i VL regioni mogu dalje da se podele u hipervarijabilne regione, nazvane regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), rasute između regiona koji su konzervativniji, i koji se nazivaju okvirnim regionima (FR). Antitela mogu da sadrže nekoliko istovetnih heterotetramera.
Antitela mogu takođe da se proizvedu korišćenjem imunizacije pogodnih životinja kao što su miševi, pacov, koza, zec, konj itd.
[0074] Antitela koja se koriste u predmetnom pronalasku mogu da budu monoklonska ili poliklonska. Postupci za proizvodnju obe vrste antitela su dobro poznati stručnjaku u oblasti. Kao dodatak in vitro evolutivnim postupcima koji su prethodno prikazani, monoklonska antitela se obično pripremaju korišćenjem tehnologije hibridoma.
[0075] U poželjnom primeru izvođenja ligand je antitelo ili aptamer koji prepoznaje i vezuje se za antigen odabran iz grupe koja se sastoji od:
CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18, CK19, CD105, Vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11, CDH3.
[0076] U poželjnom primeru izvođenja ligand za upotrebu u koraku b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska u odeljku "Sažetak pronalaska" je izabran iz grupe koja se sastoji od: CD 105, Vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, i VEGF-3. Najpoželjniji je CD105 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2). Ligand za upotrebu u koraku d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska u odeljku "Sažetak pronalaska " je izabran iz grupe koja se sastoji od: CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 i CK19. Najpoželjniji je CK18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13).
Specifičnost liganda
[0077] Poželjno, ligandi za upotrebu u koraku b i d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja se specifično vezuju za fetalne ćelije. Kada se govori o specifičnosti, ono što se podrazumeva jeste da ligandi imaju veći afinitet vezivanja za fetalne ćelije nego za majčine ćelije. Afinitet vezivanja može da se izrazi u terminima konstante disocijacije (kd), a specifičnost kao odnos između vrednosti kd datog liganda za majčine ćelije i vrednosti kd istog liganda za fetalne ćelije. Tj. ligand može da ima vrednost kd od 10<-5>M za majčine ćelije i 10<-9>M za fetalne ćelije. U ovom slučaju, specifičnost bi bila 10.000. Međutim, budući da ni fetalne ćelije ni majčine ćelije nisu neophodno homogena populacija, specifičnost može takođe da se iskaže u terminima umnoška obogaćenja koje može da se postigne sa datim ligandom (kao što je opisano u nastavku teksta). U poželjnom primeru izvođenja, ligandi se proizvode postupkom prema predmetnom pronalasku opisanom u nastavku teksta. Tj. specifičnost liganda je optimizovana.
[0078] Poželjno, postupak dalje obuhvata korak identifikacije fetalnih ćelija u uzorku i/ili korak obogaćivanja fetalnih ćelija u uzorku. U poželjnom primeru izvođenja, korak obogaćivanja se izvodi pre koraka identifikacije. Nakon obogaćivanja i/ili identifikacije, obično se izvodi korak detekcije i korak prognoziranja i/ili dijagnostikovanja.
Identifikacija
[0079] Kada postupak obuhvata korak identifikacije, jedan primer izvođenja obuhvata detekciju prisustva liganda ili hibridizacione probe na ili u fetalnim ćelijama (korak e postupka opisanog u prvom primeru izvođenja).
[0080] Detekcija može da bude omogućena obeležavanjem liganda ili hibridizacione probe fluorescentnim bojama ili drugim bojama pogodnim za detekciju. Tako, postupak može npr. da bude fluorescentna in-situ hibridizacija (FISH). Proba može da sadrži prigušivač kao i fluorofor ili FRET par kao što je prethodno opisano, koji omogućavaju detekciju hibridizacionih proba vezanih za njihove ciljne sekvence. Alternativno ili dodatno, probe koje se vezuju za svoje ciljeve se razdvajaju od nevezanih proba u jednom ili više koraka pranja.
[0081] Identifikacija može takođe da se uradi korišćenjem imuno-bojenja upotrebom liganda kao što je antitelo.
[0082] Identifikacija može da se uradi korišćenjem višebojne FISH tehnike ili višebojnog imuno-bojenja. Tj. različite hibridizacione probe sa različitim fluorescentnim obeleživačima mogu da se koriste istovremeno, ili dva (ili više) različita antitela sa različitim fluorescentnim obeleživačima mogu da se koriste istovremeno. Svi oni mogu da budu specifični za fetalne ćelije, ili jedno može da bude specifično za fetalne ćelije, a drugo može da bude specifično za majčine ćelije.
[0083] U jednom primeru izvođenja identifikovana fetalna ćelija može da se podvrgne metodi laserske mikrodisekcije (LCM).
Obogaćivanje
[0084] U poželjnom primeru izvođenja, korak obogaćivanja zavisan od liganda ili od hibridizacione probe izvodi se nakon što je majčin uzorak bio doveden u kontakt sa ligandom ili hibridizacionom probom tj. koraka c postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska u "Sažetku pronalaska". U jednom primeru izvođenja, obogaćivanje može takođe da se izvede nakon koraka d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. Za obogaćivanje, ligand je poželjniji od hibridizacione probe.
[0085] Ligand koji se koristi u koraku c postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska je poželjno vezan za molekul metala, kao što su magnetne perle.
[0086] Kada je reč o obogaćivanju, podrazumeva se da je odnos fetalnih ćelija prema majčinim ćelijama u uzorku povećan. Umnožak obogaćivanja je poželjno više od 1000 puta, čak poželjnije više od 10.000 puta i najpoželjnije više od 100.000 puta.
[0087] U drugom primeru izvođenja, umnožak obogaćivanja je izabran iz grupe koja se sastoji od više od 10 puta, više od 100 puta, više od 1000 puta, više od 10.000 puta, više od 100.000 puta i više od 1.000.000 puta. Osnova obogaćivanja su identifikovane iRNK prvenstveno eksprimirane u fetalnim ćelijama i proteini koje kodiraju iRNK.
[0088] Kao što će biti jasno stručnjaku u oblasti, moguće je izvesti dodatne korake obogaćivanja zavisne od antigena, zasnovane na ligandima (ili antigenima), poznate u stanju tehnike. Primeri takvih antigena poznatih u stanju tehnike su: CD34, Tra, Oct1, Crypto1, SSEA1, CD29, CD33, CD146 i CD166.
[0089] Kao što je prethodno opisano u vezi sa npr. CD105, korak obogaćivanja može takođe da se izvede pre dovođenja u kontakt majčinog uzorka sa ligandom ili hibridizacionom probom, tj. pre koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja.
Razvrstavanje zasnovano na protoku
[0090] U poželjnom primeru izvođenja, obogaćivanje se sprovodi korišćenjem fluorescentno-aktiviranog razvrstavanja ćelija (FACS). Prema tome, ligand se fluorescentno obeležava što omogućava primenu FACS metode. FACS metoda i pogodni obeleživači su dobro poznati stručnjaku u oblasti i u prethodnom tekstu su dati primeri za njih.
[0091] Kao alternativa FACS metodi, može da se koristi razvrstavanje ćelija pomoću mikrofluidnog uređaja.
Imobilizacija
[0092] U drugom poželjnom primeru izvođenja, obogaćivanje se sprovodi korišćenjem imobilizacije liganda. Ligandi za upotrebu u koraku b i/ili d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja pronalaska u "Sažetku pronalaska" mogu npr. da budu imobilisani na perlama kao što su magnetne perle, sefarozne perle, agarozne perle itd. Kada se ligandi i ćelije koje su vezane za njih imobilizuju, ćelije koje nisu vezane mogu da se operu sa perli. Takav postupak pranja može da se izvede u masi ili na koloni. Nakon obogaćivanja (frakcionisanja), vezane ćelije mogu da se eluiraju korišćenjem visokih ili niskih koncentracija soli, linkera koji mogu da se seku, niskog ili visokog pH, denaturišućih sredstava itd. Poželjnije, vezane ćelije se eluiraju korišćenjem kompetitivne elucije rastvorljivim antigenima ili sekundarnim ligandima koji se vezuju za ligande specifične za fetalnu ćeliju, npr. antitela usmerena prema pričvršćenom delu liganda koji je korišćen za imobilizaciju.
[0093] Poželjan postupak za obogaćivanje je MACS (imuno-magnetsko razvrstavanje ćelija), u kome se ligandi imobilišu na magnetnim perlama. Tj. ćelije vezane za ligande mogu da se razdvoje od nevezanih izborom čestica korišćenjem magnetizma.
[0094] U poželjnom primeru izvođenja obogaćivanje u koraku b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja se izvodi upotrebom CD105 imobilisanih na magnetnim perlama.
Negativan odabir korišćenjem antigena
[0095] Ligandi koji se specifično vezuju za majčine ćelije mogu takođe, u jednom primeru izvođenja, da se koriste za obogaćivanje. Tako, u poželjnom primeru izvođenja, postupak dalje obuhvata korak dovođenja u kontakt uzorka sa ligandom specifičnim za majčinu ćeliju usmerenim na majčin antigen. Ovaj korak može da se izvede u bilo kom pogodnom trenutku, kao što je pre koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. Nakon dovođenje u kontakt uzorka sa ligandom specifičnim za majčinu ćeliju, obogaćivanje može npr. da se uradi korišćenjem FACS, MACS, mikrofluidnih ili imobilizacionih metoda kao što je prethodno opisano.
[0096] Poželjno, ligand je izabran iz grupe koja se sastoji od liganda koji se vezuju za antigene koje kodiraju iRNK koje se prvenstveno eksprimiraju u ćelijama majčine krvi, ali ne i u fetalnim ćelijama kao što su identifikovali predmetni pronalazači.
[0097] Kao što će biti jasno stručnjaku u ovoj oblasti, moguće je koristiti dodatne korake obogaćivanja zavisne od antigena (negativna selekcija), zasnovane na ligandima (ili antigenima) poznate u stanju tehnike. Tako, u jednom primeru izvođenja, izvodi se dodatni korak obogaćivanja zavisan od antigena, pri čemu je ligand izabran iz grupe koja se sastoji od liganda koji se vezuju za antigene specifične za majčine ćelije poznate u stanju tehnike kao CD45, HLA-A, HLA-B ili antitela odabrana iz grupe koja se sastoji od HLe-1, M3 i L4.
[0098] Poželjan marker za određeni tip ćelija, za negativni odabir je CD45 takođe poznat kao opšti leukocitni antigen. CD45 je transmembranski protein koji eksprimiraju sve diferencirane hematopoezne ćelije osim eritrocita i plazma ćelija. CD45 protein postoji u različitim oblicima koji su svi proizvedeni iz jednog kompleksnog gena koji daje osam različitih zrelih iRNK i rezultuje u osam različitih proteinskih proizvoda. On je eksprimiran na svim leukocitima, ali ne i na drugim ćelijama, i zbog toga funkcioniše kao marker za sve leukocute, uključujući razne i različite vrste leukocita (ili belih krvnih ćelija) kao što su neutrofili, eozinofili, bazofili, limfociti (B i T ćelije), monociti i makrofagi.
[0099] Zahvaljujući ekspresiji CD45 na velikoj većini ćelija sa jedrom prisutnih u majčinoj krvi, poželjan je negativan odabir korišćenjem CD45 markera. Nakon smanjenja zastupljenosti ćelija pozitivnih na CD45, ćelije koje su negativne na CD45 u uzorku se sakupljaju. Takvo smanjenje zastupljenosti i sakupljanje može da se izvede bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u stanju tehnike.
[0100] U jednom primeru izvođenja ćelije prisutne u uzorku majčine krvi ili njegovom fragmentu se dodatno obeležavaju korišćenjem CD45 markera u bilo kom pogodnom trenutku i na taj način identifikuju majčine ćelije prisutne u uzorku. Ćelije u uzorku koje su negativne na CD45 mogu zatim da se sakupe. Takvo dodatno obeležavanje i sakupljanje može da se izvede bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u stanju tehnike.
HLA
[0101] Humani leukocitni antigeni, koji predstavljaju deo humanog glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) odgovoran za antigen-prezentujuće proteine na površini ćelije i mnoge druge gene.
[0102] Postoje dve klase humanih leukocitnih antigena, klasa I antigena (A, B i C) i klasa II antigena (DR, DP i DQ) koje imaju različite funkcije. Obe klase uključuju veliki broj varijabilnih alela. HLA geni koje ne eksprimiraju fetalne ćelije mogu da se koriste za smanjenje zastupljenosti majčinih ćelija u uzorku. Tj. uzorak majčine krvi ili njegova frakcija prisutan u koraku a postupka opisanog u prvom primeru izvođenja može da se podvrgne antigenima usmerenim prema HLA genima.
Drugi postupci za obogaćivanje
[0103] Dodatni postupci za obogaćivanje koji ne koriste antigen specifične ligande mogu takođe da se koriste.
[0104] Poželjan dodatni postupak za obogaćivanje je liziranje eritrocita kao što je liziranje posredovano sa NH4Cl, koje omogućava selektivno liziranje eritrocita ostavljajući ćelije sa jedrom nedirnute. Ovaj postupak je poznat stručnjaku u ovoj oblasti. U poželjnom primeru izvođenja liziranje eritrocita se izvodi pre koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja. Za liziranje posredovano sa NH4Cl poželjno se koristi koncentracija od 0.1-0.2 mM NH4Cl, kao što je 0.14-0.18 mM NH4Cl, poželjnije 0.15-0.17 mM NH4Cl.
[0105] Za obogaćivanje takođe mogu da se kriste postupci za fiksaciju i selektivno liziranje koji su ovde opisani u prethodnom tekstu.
[0106] Uzorak može takođe da se podvrgne početnom razdvajanju na osnovu veličine ili gustine, kao što je centrifugiranje u gradijentu gustine Ficoll-Hypaque. Ovo rezultuje u nastanku sloja supernatanta, koji sadrži trombocite; sloja ćelija sa jednim jedrom; i aglutiniranog taloga koji sadrži eritrocite bez jedra i granulocite. Sloj ćelija sa jednim jedrom se odvaja od drugih slojeva da bi se proizveo majčin uzorak obogaćen fetalnim ćelijama.
[0107] Za obogaćivanje takođe mogu da se koriste fizička svojstva ćelija, kao što je, ali ne isključivo, naelektrisanje.
Sedimentacija
[0108] Ćelije prisutne u uzorku krvi mogu da budu obogaćene sedimentacijom, pri čemu se većini ćelija prisutnih u uzorku omogućava da se stalože. Uzorak krvi može pre sedimentacije da se razblaži u odgovarajućem rastvoru, kao što je 0.15 M NaCl. Sedimentacija može da se nastavi dok ne dođe do potpune sedimentacije, kao što je tokom najmanje 5 časova, ili poželjno preko noći.
[0109] Poželjno uzorak se ostavlja da se staloži na temperaturi nižoj od sobne temperature, kao što je temperatura niža od 15°C, kao što je niža od 10°C ili 8°C ili 6°C, poželjno na temperaturi od 2-8°C ili oko 4°C.
[0110] Manja populacija ćelija niske gustine se neće staložiti i može da se izdvoji blagom prethodnom fiksacijom kao što je opisano, na primer u 0.5% paraformaldehidu, praćenom centrifugiranjem.
Kombinovanje liganda i postupci za obogaćivanje
[0111] Jasno je da se različiti ligandi i postupci za obogaćivanje mogu kombinovati. Tako, 1, 2, 3 ili više liganda specifičnih za fetalnu ćeliju usmerenih na ćelije sa endotelijalnim fenotipom (tj. endotelijalnih ćelijskih markera) može da se koristi u isto vreme ili uzastopno. Isto tako, ponovljena obogaćivanja korišćenjem redom liganda specifičnih za fetalnu ćeliju i liganda specifičnih za majčinu ćeliju mogu da se koriste.
Uzorak
[0112] Poželjno je dobiti toliko veliki uzorak majčine krvi koliko je moguće, u cilju povećanja ukupnog broja fetalnih ćelija. Prema tome, veličina uzorka majčine krvi koraka a u postupku opisanom u prvom primeru izvođenja je poželjno u opsegu od 0.5 do 50 ml, na primer u opsegu od 1 do 40 ml, kao što je od 5 do 35 ml ili od 10 do 30 ml.
[0113] Obezbeđeni uzorak majčine krvi poželjno je dobijen od trudne žene u gestacionom periodu između 5 -24 ili 6 -20 nedelja, poželjnije između 7-16, ili 8-12 nedelja.
Razblaživanje - koncentrovanje
[0114] Takođe, prema pronalasku, uzorak može da se razblaži ili koncentruje u bilo kom trenutku tokom postupka. Uzorak može da se razblaži najmanje 1.5 puta, kao što je dvaput, poželjnije najmanje tri puta, kao što je pet puta, dodavanjem izotoničnih pufera, kao što su fiziološki rastvori, fosfatno puferisani fiziološki rastvori, PBS, i/ili pogodni medijumi za rast, kao što su osnovni medijumi, i medijumi za rast tkiva. Korak postupka može da uključuje razblaživanje uzorka dodavanjem različitih komponenata određenih za specifični korak postupka.
[0115] Za izvođenje postupka, zbog izvodljivosti različitih koraka postupka, može da bude pogodno koncentrovati uzorak npr. da bi se smanjila zapremina bez uklanjanja bilo kojih ćelija. Zapremina uzorka može da se smanji do manje od 80%, kao 70, ili 60 ili 50% početne zapremine uzorka, ili čak poželjno do manje od 40%, kao što je 25% početne zapremine uzorka. Korak koncentrovanja može da bude centrifugiranje. Postupak može, prema pronalasku, da obuhvata jedan ili više koraka koncentrovanja. Centrifugiranje je poželjan postupak za koncentrovanje ćelija. U cilju izbegavanja oštećenja ćelija, poželjno je blago centrifugiranje, kao što je centrifugiranje na 300 g tokom 10 minuta.
Detekcija i dijagnoza
[0116] Poželjno, postupak pronalaska može da se koristi za prenatalnu detekciju i prognoziranje i/ili dijagnozu (tj. korak e i f postupka opisanog u prvom primeru izvođenja). Tako, identifikovana ćelija može da se podvrgne detekciji i prognoziranju i/ili dijagnozi, ili uzorak majčine krvi obogaćen fetalnim ćelijama može da se podvrgne detekciji i prognoziranju i/ili postavljanju dijagnoze.
[0117] U jednom primeru izvođenja, fetalni proteini su učinjeni dostupnim za detekciju npr. pomoću imunoblotinga, sekvenciranja proteina ili masene spektrometrije.
U drugom poželjnom primeru izvođenja, detekcija i/ili dijagnoza obuhvata korak u kome se fetalna DNK ili RNK čini dostupnom za detekciju.
Poželjni postupci za detekciju koraka e postupka opisanog u prvom primeru izvođenja su FISH (fluorescentna in situ hibridizacija), northern blotting, southern blotting, sekvenciranje DNK/RNK, ispitivanja na mikročipu i amplifikacija. Takvi postupci mogu da se koriste za detekciju prisustva specifičnih sekvenci koje ukazuju na određeno stanje, npr. prenatalnu bolest ili predispoziciju za određenu bolest. Postupci mogu takođe da se koriste za detekciju hromozomske aneuploidije kao što je trizomija 13, trizomija 18 ili trizomija 21. Postupci za detekciju mogu takođe da se koriste za određivanje pola fetusa detekcijom sekvenci specifičnih za Y hromozom.
[0118] U alternativnom primeru izvođenja, broj fetalnih ćelija u uzorku se poredi sa standardnim brojem. Povećani brojevi fetalnih ćelija u uzorku mogu da ukažu na to da je trudnoća rizična. Broj fetalnih ćelija u uzorku (kao i u kontrolnom uzorku) može da se proceni korišćenjem npr. FACS metode.
Identifikacija specifičnih liganda
[0119] Opisan je postupak za identifikaciju liganda specifičnog za fetalnu ćeliju koji obuhvata korake:
a) Obezbeđivanja biblioteke kandidata za ligande specifične za fetalnu ćeliju
b) Obezbeđivanja pula majčinih ćelija
c) Dovođenja u kontakt biblioteke iz koraka a sa majčinim ćelijama iz koraka b
d) Odabira liganda koji se ne vezuju za majčine ćelije da bi se napravila biblioteka osiromašena za ligande koji se vezuju za majčine ćelije. Poželjno, postupak dalje obuhvata korake
e) Dovođenja u kontakt biblioteke iz koraka a ili biblioteke iz koraka d sa fetalnom ćelijom
f) Odabira liganda koji se vezuju za fetalnu ćeliju da bi se napravila biblioteka obogaćena ligandima koji se vezuju za fetalne ćelije, ali ne i za majčine ćelije.
[0120] Treba razumeti da je jedna ćelija dovoljna za izbor liganda koraka f, ali da očigledno može da se koristi više fetalnih ćelija. Opisano je da su identifikovani specifični ligandi odabrani tako da je osigurano da su ligandi usmereni prema epitelijalnim ćelijama placentalnog porekla. Koraci b-f mogu da se izvedu pomoću koraka:
g) Obezbeđivanja uzorka majčine krvi
h) Dovođenja u kontakt biblioteke sa uzorkom majčine krvi
i) Odabira liganda koji se vezuju za fetalne ćelije uklanjanjem pojedinačnih fetalnih ćelija, koje su bile identifikovane tako što je FISH metodom dokazan Y hromozom i/ili koje su identifikovane postupkom prema petom aspektu pronalaska, i sakupljanjem liganda samo iz ovih ćelija.
[0121] Uzorak majčine krvi može da bude obogaćen fetalnim ćelijama. Poželjno, postupak dalje obuhvata:
j) umnožavanje/amplifikaciju odabranih liganda kao što je pripremanjem amplifikovane biblioteke za dodatne selekcije protiv fetalnih ćelija i/ ili protiv majčinih ćelija.
[0122] Jasno je da višestruki ciklusi selekcije i amplifikacije mogu da se sprovedu za identifikaciju najboljih liganda. Opisano je da se postupak za identifikaciju liganda specifičnog za fetalnu ćeliju izvodi kao što je opisano u primeru 1 u WO2010/078872. Biblioteka kandidata za ligand specifičan za fetalnu ćeliju može da bude biblioteka antitela ili peptida prikazanih na fagima (prikaz na fagima), iRNK (prikaz na ribozomima ili prikaz na iRNK) ili na DNK (prikaz na kovalentno vezanoj DNK ili selekcija plazmida prema afinitetu). Biblioteka može takođe da bude biblioteka oligonukleotida DNK ili RNK za identifikaciju aptamera.
[0123] Termin "kandidati" se koristi da ukaže da se jedinjenja biblioteke ne vezuju nužno za fetalne ćelije. Ona treba da se ispitaju na vezivanje za identifikaciju liganda specifičnih za fetalnu ćeliju.
[0124] U jednom aspektu, biblioteka kandidata za ligand specifičan za fetalnu ćeliju je potpuno nasumična biblioteka. U tom slučaju, biblioteka može prvo da bude ponovljeno selektovana protiv fetalnih ćelija i amplifikovana, pre nego što se izvede protiv-selekcija (negativna selekcija) protiv majčinih ćelija.
[0125] U drugom aspektu, biblioteka kandidata za ligand specifičan za fetalnu ćeliju se zasniva na poznatim ligandima fetalnih ćelija. Takva biblioteka može npr. da se napravi prikazivanjem antitela koje se vezuje za fetalne ćelije na fagu i mutagenezom gena koji kodira antitelo da bi se napravila biblioteka. U tom slučaju, mutageneza može da poboljša specifičnost uz zadržavanje ili čak poboljšanje afiniteta za fetalne ćelije.
[0126] U jednom aspektu, ligand se vezuje za antigen koji kodira gen odabran iz grupe koja se sastoji od humanog citokeratina 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 i 19, humanog citokeratina 7 i humanog vimentina. Stoga se afinitet i/ili specifičnost liganda optimizuje korišćenjem prethodno opisanog postupka.
Ligandi i hibridizacione probe specifični za fetalnu ćeliju
[0127] U jednom primeru izvođenja pronalaska, ligand i hibridizacione probe sa endotelijalnom specifičnošću koraka b postupka opisanog u prvom primeru izvođenja predmetnog pronalaska mogu da budu izabrane iz grupe koja se sastoji od:
i. liganda usmerenog na antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD105, Vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGF-3 i
ii. hibridizacione probe usmerene na nukleinsku kiselinu koja sadrži najmanje 10 nukleotida gena izabranog iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju CD105, Vimentin, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3.
[0128] U pronalasku, ligand i hibridizacione probe sa epitelijalnom specifičnošću koraka d postupka opisanog u prvom primeru izvođenja predmetnog pronalaska mogu da budu izabrane iz grupe koja se sastoji od:
i. liganda usmerenog na antigen izabran iz grupe koja se sastoji od humanog CK1 CK1,
CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17,
CK18 i CK19 i
ii. hibridizacione probe usmerene na nukleinsku kiselinu koja sadrži najmanje 10 nukleotida gena izabranog iz grupe koja se sastoji od gena koji kodiraju CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 i CK19.
[0129] U jednom primeru izvođenja ligand i hibridizaciona proba specifična za fetalnu ćeliju je izabrana iz grupe koja se sastoji od: CD105 i CK18.
[0130] U jednom primeru izvođenja, ligand ili hibridizaciona proba se odlikuju time što omogućavaju 90%-tno ispravno odabiranje ćelija u ispitivanom uzorku koji sadrži 99,9% majčinih ćelija i 0,1% fetalnih ćelija. Tj. kada je reč o 90%-tno ispravnoj identifikaciji, to znači da pri izvođenju odabira sa ispitivanim uzorkom i sa ligandom, 90 fetalnih ćelija će biti sakupljeno na svakih 10 majčinih ćelija i slično za bolju/lošiju ispravnost odabiranja.
Poželjan postupak za odabir je MACS. Poželjniji je ligand koji obezbeđuje 95%-tno ispravan odabir, 98%-tno ispravan odabir ili čak poželjnije 99%-tno ispravan ćelijski odabir. Kako uzorak majčine krvi ima veoma malu količinu fetalnih ćelija, čak je poželjnije da ligand omogućava 99,9%-tno, 99,99%-tno ili 99,999%-tno ispravan ćelijski odabir iz ispitivanog uzorka, kao što je prethodno opisano. Poželjno, ligandi su aptameri, peptidi ili antitela. Najpoželjnija su antitela.
[0131] Ligandi se poželjno identifikuju korišćenjem postupka koji je ovde prethodno opisan ili je opisan u WO2010/078872, tako da imaju poboljšanu specifičnost. Opisano je da se ligandi ili hibridizacione probe, identifikovane korišćenjem postupka koji je prethodno opisan ovde, ili u WO2010/078872, koriste za obogaćivanje uzorka majčine krvi fetalnim ćelijama, ili za identifikaciju fetalnih ćelija u uzorku majčine krvi. Poželjno, ligandi ili hibridizacione probe se upotrebljavaju kao što je ovde prethodno opisano. Opisano je da se ligandi ili hibridizacione probe koriste za identifikaciju dodatnih liganda specifičnih za fetalnu ćeliju. Ligandi i/ili hibridizacione probe se koriste u postupku koji je prethodno opisan ovde ili u WO2010/078872. Opisana je fetalna ćelija identifikovana postupkom koji je ovde prethodno opisan. Pomenuta ćelija se odlikuje ekspresijom markera odabranog iz grupe humanih citokeratina 1, 2, 3, 4 (SEQ ID NO: 3), 5 (SEQ ID NO: 4), 6A (SEQ ID NO: 5), 6B (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 7), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 9), 13 (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13) i 19, humanog vimentina i CD105 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2) i može da se razlikuje od drugih ćelija po ekspresiji CD105 ili vimentina i/ili ko-ekspresiji CD105 ili vimentina i citokeratina. Poželjno, fetalna ćelija je bila izdvojena ili identifikovana npr. kao što je opisano u drugim aspektima ovog pronalaska, i nije prisutna u ljudskom telu. Opisana je upotreba fetalne ćelije identifikovane postupkom koji je ovde prethodno opisan za detekciju i dijagnozu, kao što je prethodno opisano, ili za proizvodnju dodatnih liganda specifičnih za fetalnu ćeliju, npr. kao što je opisano u odeljku "Identifikacija specifičnih liganda".
Prenatalno određivanje pola
[0132] Izdvojena fetalna ćelija može dalje da se koristi za određivanje pola fetusa, bilo korišćenjem specifičnih proba za muški pol, ili uključivanjem antigen-vezujućih jedinjenja identifikovanih postupkom koji je ovde opisan za detekciju fetalnih ćelija, praćenim pogodnim postupcima za određivanje pola poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.
Prenatalna dijagnoza hromozomske abnormalnosti
[0133] Paralelno sa određivanjem pola, opisani su postupci za određivanje hromozomskih abnormalnosti, putem detekcije fetalnih ćelija zasnovane na antigenima ili vezujućem jedinjenju koje prepoznaje pomenute antigene fetalne ćelije, izdvojene ili identifikovane na osnovu predmetnog pronalaska. Takvi postupci određivanja hromozomskih abnormalnosti odnose se na detekciju abnormalnosti kao što je aneuploidija, translokacija, nebalansirana translokacija, rearanžman, subtelomerni rearanžman, nebalansirani hromozomski rearanžman, nebalansirani subtelomerni rearanžman, delecija, inverzije, nebalansirane inverzije, duplikacija i nestabilnost i/ili skraćivanje telomere. Hromozomska abnormalnost može dalje da bude zamena jednog nukleotida, mikro-delecija, mikro-insercija, kratke delecije, kratka insercija, multi-nukleotidne izmene, metilacija DNK i/ili gubitak genetičkog utiskivanja (LOI). U poželjnom primeru izvođenja hromozomska aneuploidija je potpuna i/ili delimična trizomija. Na primer, trizomija 21, trizomija 18, trizomija 13, trizomija 16 i/ili XXX i druge abnormalnosti polnih hromozoma. Alternativno aneuploidija je potpuna i/ili delimična monozomija, kao monozomija X, monozomija 21, monozomija 22, monozomija 16 i/ili monozomija 15.
[0134] Tehnike hibridizacije DNK mogu da se koriste za određivanje pola ili određivanje hromozomskih abnormalnosti. Tehnike poznate u ovoj oblasti uključuju postupke kao što je fluorescentna in situ hibridizacija (FISH), in situ obeležavanje prajmerom (PRINS), kvantitativna FISH (Q-FISH) i metod višebojnih traka (MCB). Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) koristi molekularne probe obeležene kao što je prethodno opisano npr. fluorescencijom. Koristi se proba koja odgovara genu ili DNK sekvenci, i ona pod mikroskopom ispoljava signal na specifičnom lokusu u jedru. Tehnika FISH može da se primeni na interfazne ćelije i može da potvrdi prisustvo euploidije ili aneuploidije hromozoma X, Y, 13, 15, 18, 21. Metoda FISH je korisna za identifikaciju abnormalnog broja hromozoma kao što su trizomije i monozomije i može, kada su probe za specifične regione hromozoma dostupne, da se koristi za određivanje prisustva delecija, translokacija, ili duplikacija.
[0135] Kao alternativa prethodno pomenutim hibridizacionim tehnikama, PCR metode mogu da se koriste za određivanje hromozomskih abnormalnosti. Ovo bi zahtevalo početno izdvajanje nekoliko fetalnih ćelija. PCR metode prema pronalasku uključuju pogodan postupak poznat u stanju tehnike, koji ima sposobnost da detektuje abnormalnosti kao trizomije itd., kao što je prethodno opisano. PCR metode mogu dalje da se koriste za određivanje malih abnormalnosti, kao što su male delecije mutacije u specifičnim genima. Kvantitativna fluorescentna PCR (QF-PCR) je primer takvih postupaka pogodnih za detekciju na primer trizomije 13, 18, 21, triploidija, dvostrukih trizomija, kao i X i Y aneuploidija (V. Cirigliano, 2004). Dizajnom pogodnih prajmera za manje, ali ne manje ozbiljne hromozomske abnormalnosti, PCR metode mogu da se koriste za određivanje bolesti kao što je, na primer cistična fibroza koju često izaziva delecija 3 bp u genu za cističnu fibrozu što vodi nastanku proteina kome nedostaje ključna aminokiselina fenilalanin.
[0136] Fetalne ćelije, kao što je prethodno opisano mogu da budu stem ćelije. Stem ćelije se javljaju u različitim varijetetima, u zavisnosti od toga kada i gde su proizvedene tokom razvoja i koliko su raznovrsne. Detektovane fetalne stem ćelije mogu da budu bilo kog tipa, kao što su embrionske, ili somatske, da budu pluripotentne ili multipotentne.
Upotreba stem ćelija
[0137] Primenom ovde opisane tehnologije, fetalne stem ćelije mogu da se izdvoje iz uzoraka majčine krvi upotrebom vezujućeg jedinjenja, antitela ili fragmenta antitela koji prepoznaje pomenuti fetalni ćelijski antigen prema pronalasku. Stem ćelije mogu da proizvedu veći broj stem ćelija, i one mogu da se koriste za stvaranje specijalizovanih tipova ćelija kao što su nervne, krvne, ili ćelije jetre. U zavisnosti od tipova izdvojenih stem ćelija, ćelije mogu da imaju različite primene u razvoju ćelija specifičnih ćelijskih tipova ili tkiva. Pluripotentne stem ćelije mogu da daju bilo koji tip ćelija, dok multipotentne stem ćelije mogu da daju ograničeniji broj tipova ćelija. Na primer, stem ćelije koje obrazuju krv (hematopoezne) mogu da budu u stanju da obrazuju sve tipove krvnih ćelija, dok su mezenhimske stem ćelije u stanju da obrazuju mezenhimske ćelije.
[0138] Stem ćelije, naročito pluripotentne stem ćelije, mogu da se koriste za lečenje različitih bolesti. Pluripotentne stem ćelije su uobičajeno embrionske stem ćelije, koje su iz etičkih razloga ograničeno raspoložive. Mogućnost korišćenja stem ćelija izdvojenih iz uzorka majčine krvi predstavlja privlačnu alternativu. Pluripotentne stem ćelije mogu da se koriste za lečenje mnoštva bolesti za koje uobičajene metode ne pružaju odgovarajuće lečenje.
Reference
[0139] Gussin HA, Sharma AK, Elias S. »Culture of endothelial cells isolated from maternal blood using anti-CD105 and CD133.« Prenat Diagn, 2004 : Mar;24(3):189-93.
Primeri
PRIMER 1
Priprema uzoraka krvi.
[0140] Uzorci periferne krvi od 24 ml su dobijeni od trudnih žena u gestacionom periodu od 11 do 14 nedelja. Uzorci krvi su uzeti pre invazivne procedure i nakon informisanog pristanka. Svi uzorci krvi su sakupljeni u epruvete obrađene heparinom i obrađeni odmah nakon što su sakupljeni.
[0141] Osim krvi sa heparinom, 5 ml krvi je sipano u epruvete obrađene sa EDTA. Ova krv je korišćena za ispitivanje pola fetusa. Pol fetusa je određivan pomoću metode PCR u realnom vremenu, u slobodnoj fetalnoj DNK korišćenjem gena specifičnih za y-hromozom. Samo uzorci krvi iz trudnoća sa fetusom muškog pola su dalje obrađivani.
Fiksacija
[0142] Za svaki uzorak, 3 ml pune krvi je podjednako raspodeljeno u prethodno obložene epruvete za centrifugiranje zapremine 50 ml (8 epruveta po uzorku) korišćenjem prethodno obloženih pipeta (pufer za oblaganje je bio 2% BSA u PBS bez Ca<2+>i Mag<2+>). U svaku epruvetu je dodato dva ml 10% formaldehida u PBS korišćenjem prethodno obloženih pipeta. Nakon pažljivog mešanja, krv je fiksirana 10 minuta na sobnoj temperaturi.
Selektivno liziranje
[0143] Nakon fiksacije, 30 ml 0,12% Triton X-100 u PBS (bez Ca2+ i Mg2+) dodato je u svaku epruvetu. Epruvete su 3 puta prevrnute, i crvene krvne ćelije su lizirane 45 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon lize, 15 ml hladnog (4°C) 2% BSA u PBS (bez Ca2+ i Mg2+) dodato je u svaku epruvetu. Nakon mešanja prevrtanjem epruveta dva puta, ćelije koje nisu lizirale su staložene centrifugiranjem na 500 g tokom 15 minuta na 4°C. Nakon uklanjanja supernatanta, ćelije su resuspendovane u 10 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+) ohlađenog na 4°C, i čuvane preko noći na 4°C.
Permeabilizacija
[0144] Uzorci su permeabilizovani dodatkom 10 ml hladnog (-20°C) metanola nakon čega su inkubirani na 4°C u toku 10 minuta. Nakon centrifugiranja na 500 g tokom 10 minuta, ćelijski talozi su sakupljeni u 2 epruvete korišćenjem prethodno obloženih pipeta. Prazne epruvete su isprane sa 1 ml hladnog pufera MASC (PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA). Sakupljene ćelije su zatim prenete u dve prethodno obložene epruvete od 15 ml i centrifugirane na 500 g tokom 10 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, ćelije u svakoj epruveti su resuspendovane u 500 µl MACS pufera.
Pozitivan odabir korišćenjem CD105 mikroperli i MACS.
[0145] U 500 µl ćelijske suspenzije dodato je 130 µl CD105 mikroperli (Miltenyi) i ćelijska suspenzija je inkubirana 60 minuta na 4°C. Ćelije su zatim oprane dodatkom 6 ml hladnog MACS pufera nakon čega su centrifugirane 10 minuta na 500 g. Supernatant je uklonjen i ćelije su resuspendovane u 2 ml hladnog MACS pufera.
[0146] Ćelijska suspenzija obeležena sa CD105 je naneta na prethodno opranu LD kolonu (Miltenyi) već smeštenu na magnet i složenu na vrh prethodno oprane MS kolone (Miltenyi). Kada su ćelije prošle kroz LD kolonu, ona je dva puta oprana sa 2 ml hladnog MACS pufera. MS kolona je oprana sa 1 ml hladnog MACS pufera. LD kolona je zatim uklonjena sa magneta, smeštena na prethodno obloženu epruvetu od 15 ml, i ćelije su eluirane primenom 2 puta po 5 ml hladnog MACS pufera. Prvih 5 ml pufera je prošlo kroz kolonu bez upotrebe klipa. Drugih 5 ml pufera je potisnuto kroz kolonu upotrebom klipa. MS kolona je tada uklonjena sa magneta i smeštena na epruvetu za prikupljanje. Ćelije su eluirane na isti način kao kod LD kolone korišćenjem 2 puta po 1 ml hladnog MACS pufera umesto 2 puta po 5 ml pufera. Epruveta za prikupljanje je centrifugirana na 500 g tokom 10 minuta. Supernatant je odbačen i ćelijski talog je resuspendovan u hladnom MACS puferu. Ćelijska suspenzija je zatim naneta na predmetna stakla obložena poli-lizinom, i predmetna stakla su osušena na vazduhu (preko noći) pre daljeg ispitivanja.
Identifikacija muških fetalnih ćelija pomoću FISH metode specifične za X- i Y-hromozom i automatskog skeniranja.
[0147] Pre hibridizacije, predmetna stakla su isprana u PBS 5 minuta i dehidrirana u 60%-tnom, 80%-tnom i 99,9%-tnom etanolu, po 3 minuta u svakom. Hromozom-specifična CEP X proba za ponovak DXZ1 u DNK alfa satelita obeležena bojom spectrum green i CEP Y proba za DYZ1 za satelit III obeležena bojom spectrum orange (Abbott Molecular) su korišćene za ovo ispitivanje. Hibridizacione smeše koje sadrže obe probe su pripremljene mešanjem 1 dela X-probe, 1 dela Y-probe, 1 dela destilovane vode i 7 delova hibridizacionog pufera. Dodato je petnaest µl hibridizacione smeše i pokriveno sa pokrovnim staklom veličine 24 x 24 mm. Pokrovna stakla su pričvršćena gumenim cementom, i DNK je denaturisana na vrućoj ploči na 83,5°C tokom 7 minuta i hibridizovana preko noći u vlažnoj atmosferi na 42°C. Hibridizovana predmetna stakla su oprana 2 minuta na 73°C u 0,4 x SSC sa 0,3% Tween 20 i 1 minut na sobnoj temperaturi u 2xSSC sa 0,1% Tween 20. Predmetna stakla su zatim stavljena u medijum Vectashield sa DAPI.
[0148] Ćelije koje sadrže crveni FISH signal smešten u jedru obojenom sa DAPI su identifikovane automatskim skeniranjem korišćenjem dva različita tipa skenera. To su MDS (verzija 5.8.0) sistem za skeniranje predmetnog stakla koji je originalno razvio Applied Imaging, i MetaCyte sistem za skeniranje koji je razvio Metasystems. Sa MDS sistemom za skeniranje, predmetna stakla su skenirana pod uveličanjem od 20X korišćenjem funkcije za skeniranje 5. Sa MetaCyte, predmetna stakla su skenirana pod uveličanjem od 10x korišćenjem klasifikatora koji je razvijen i optimizovan u laboratoriji za detekciju pravih FISH signala boje Spectrum Orange. Nakon skeniranja, ćelije identifikovane skenerom su automatski predstavljene za vizuelni pregled. Ćelije koje su davale jedan zeleni X signal i jedan narandžasti Y-signal značajno veči od X-signala su klasifikovane kao muške fetalne ćelije.
Bojenje muških fetalnih ćelija antitelom.
[0149] Fetalne ćelije su bojene sledećim antitelima korišćenim pojedinačno. Pan Citokeratin (proizvod br. C2562, Sigma-Aldrich). Citokeratin 7 (proizvod br. M7018, DAKO Cytomation) i Vimentin (proizvod br. V2258, Sigma-Aldrich). Anti-pan citokeratin antitelo prepoznaje humani citokeratin 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 i 19. Anti-citokeratin 7 antitelo prepoznaje humani citokeratin 7 i anti-vimentin antitelo prepoznaje epitop humanog vimentina koji se ne detektuje u humanim limfoidnim ćelijama. Sva tri antitela su mišja monoklonska antitela izotipa IgG1, IgG2 (citokeratini) ili IgM (vimentin).
[0150] Nakon sušenja na vazduhu, predmetna stakla su rehidratisana u 4xSSC tokom 10 minuta, zatim preinkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 100 µl pufera za blokiranje koji se sastoji od 4xSSC koji sadrži 10% normalnog kozjeg seruma, 1% BSA i 0,5% reagensa za blokiranje (Roche) ili 100 µl pojačivača prikaza Imaging Enhancer (Molecular Probes). Predmetna stakla su zatim inkubirana 60 minuta na sobnoj temperaturi sa 100 µl primarnog antitela razblaženog 1:50 u puferu za blokiranje. Nakon inkubacije antitela, predmetna stakla su oprana 3 puta po 5 minuta u 4xSSC. Za detekciju, predmetna stakla su inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 100 µl zečjeg anti-mišjeg IgG (citokeratini) ili IgM (vimentin) konjugovanog sa AlexaFluor-488, (Molecular Probes), razblaženog 1:200 u puferu za blokiranje, oprana 3 puta po 5 minuta u 4xSSC i zatim inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 100 µl kozjeg anti-zečjeg Ig konjugovanog sa AlexaFluor-488, (Molecular Probes), razblaženog 1:200 u puferu za blokiranje. Nakon pranja dva puta po 5 minuta u 4xSSC i jednom tokom 5 minuta u 2xSSC, predmetna stakla su stavljena u medijum Vectashield sa DAPI (Vector Laboratories).
Bojenje antitelom na Vimentin nakon bojenja Pan-Citokeratinom.
[0151] Pokrovna stakla su uklonjena pranjem u 4xSSC u toku 10 minuta. Predmetna stakla su zatim isprana u 4xSSC 5 minuta i inkubirana 30 minuta sa 100 µl pufera za blokiranje ili pojačivača prikaza Imaging Enhancer, kao što je prethodno opisano. Predmetna stakla su zatim inkubirana 60 minuta na sobnoj temperaturi sa 100 µl anti-vimentin antitela razblaženog 1:50 u puferu za blokiranje. Nakon inkubacije antitela, predmetna stakla su oprana 3 puta po 5 minuta u 4xSSC. Za detekciju, predmetna stakla su inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 100 µl zečjeg anti-mišjeg IgM konjugovanog sa AlexaFluor-555, razblaženog 1:200 u puferu za blokiranje. Nakon pranja 2 puta po 5 minuta u 4xSSC i jednom tokom 5 minuta u 2xSSC, predmetna stakla su stavljena u medijum Vectashield sa DAPI.
[0152] Predmetna stakla obojena antitelom su smeštena u skenirajući mikroskop i fetalne ćelije su automatski predstavljene za vizuelni pregled na pozitivno ili negativno bojenje.
Eksperimentalni rezultati primera 1.
[0153] Fetalno poreklo ćelija obogaćenih magnetnim razvrstavanjem ćelija (MACS) sa CD105 protokolom je ispitano na 32 uzorka krvi trudnih žena koje nose muške fetuse. FISH je izveden sa probama specifičnim za X- i Y-hromozome, i ćelije koje ispoljavaju jedan X i jedan Y signal značajno jači od X signala su smatrane fetalnim ćelijama (Slika 1). Između 0,1 i 1,1 fetalnih ćelija po ml krvi je detektovano u uzorcima majčine krvi (Slika 2).97% uzoraka je bilo pozitivno na fetalne ćelije. U jednom uzorku krvi fetalne ćelije nisu detektovane.
[0154] Dvadeset jedna muška fetalna ćelija je okarakterisana bojenjem anti-citokeratin 7, anti-pan citokeratin i anti-vimentin antitelima korišćenjem prethodno opisanog protokola. Tri od 21 fetalne ćelije se pozitivno obojilo anti-citokeratin 7 antitelom, 10 od 14 citokeratin 7 negativnih ćelija se pozitivno obojilo anti-pan citokeratin antitelom, dok su se 3 od 4 fetalne ćelije negativne na bojenje citokeratinom obojile pozitivno anti-vimentin antitelom. Osim toga, 4 od 4 ćelije pozitivne na pan-citokeratin takođe je pokazalo pozitivno bojenje antivimentin antitelom. Ovi rezultati pokazuju, da magnetno razvrstavanje ćelija (MACS) zasnovano na CD105 uzoraka majčine krvi otkriva novi tip fetalne ćelije u majčinoj krvi koji eksprimira citokeratine i/ili vimentin, čime se ovaj tip ćelija razlikuje od fetalnih trofoblasta.
Primer 2
ODABIR IZ PUNE KRVI I BOJENJE UNUTAR KOLONE
Uzorkovanje krvi
[0155] Uzorci periferne krvi od 30 ml su dobijeni od trudnih žena u gestacionom periodu od 11 do 14 nedelja. Uzorci krvi su uzeti pre invazivne procedure i nakon informisanog pristanka. Svi uzorci krvi su sakupljeni ili u epruvete obrađene heparinom ili u epruvete obrađene sa EDTA i obrađeni unutar 4 časa nakon što su sakupljeni.
[0156] Osim krvi sa heparinom, 5 ml krvi je sipano u epruvete obrađene sa EDTA. Ova krv je korišćena za ispitivanje pola fetusa. Pol fetusa je određivan pomoću metode PCR u realnom vremenu, u slobodnoj fetalnoj DNK korišćenjem gena specifičnih za y-hromozom.
Priprema uzoraka krvi - CD105 odabir
[0157] Na jedan ml krvi dodato je 20 - 50 µl mikroperli (Miltenyi) sa CD105, i nakon mešanja, uzorak je inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, uzorak krvi je raspoređen u jednakim zapreminama u 6 prethodno obloženih epruveta od 50 ml (pufer za oblaganje je bio 2% BSA u PBS bez Ca2+ i Mg2+) i 20 ml MACS-pufera je dodato u svaku epruvetu pre centrifugiranja na 445 g tokom 12 minuta na 4°C. Supernatanti su uklonjeni i MACS-pufer je dodat do finalne zapremine od 7,5 ml. Nakon pažljivog mešanja korišćenjem prethodno obložene pipete, puna krv obeležena sa CD105 je naneta na 2 prethodno oprane kolone za punu krv u alikvotima od 3 ml krvi. Kada je krv prošla kroz kolone, kolone su oprane dva puta sa 4 ml MACS-pufera, uklonjene sa magneta i postavljene na prethodno obloženu epruvetu od 15 ml, i ćelije su eluirane sa kolona uz upotrebu klipa korišćenjem 5 ml pufera za eluiranje kolone za punu krv (Miltenyi). Nakon centrifugiranja na 445 g tokom 12 minuta na 4°C supernatant je odbačen i ćelijski talog je resuspendovan u 500 µl PBS korišćenjem prethodno obloženog nastavka za pipetu.
Fiksacija i permeabilizacija
[0158] Ćelije su fiksirane 20 minuta nakon dodavanja 500 µl fiksatora inside fix (Miltenyi) Nakon fiksacije, dodato je 10 ml MACS-pufera i epruvete su centrifugirane na 500 g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatant je zatim odbačen i ćelijski talog je resuspendovan u 500 µl MACS-pufera. Ćelije su permeabilizovane sa 500 µl ledeno hladnog MeOH i inkubirane 10 minuta na 4°C. Ćelije su zatim nanete na prethodno opranu MS kolonu (Miltenyi) koja je već smeštena na magnet. Nakon što je ćelijska suspenzija u potpunosti ušla u kolonu, ćelije su oprane primenom 500 µl MACS-pufera na kolonu.
Bojenje ćelija unutar MS kolona.
[0159] Fetalne ćelije su obojene koktelom sledećih antitela. Pan-Citokeratin (proizvod br. C2562, Sigma-Aldrich). Citokeratin 7 (proizvod br. M7018, DAKO Cytomation) i Citokeratin 8/18 (proizvod 18.0213, Invitrogen). Anti-pan citokeratin antitelo prepoznaje humani citokeratin 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 i 19. Anti-citokeratin 7 antitelo prepoznaje humani citokeratin 7, i anti-citokeratin 8/18 prepoznaje citokeratin 8/18. Sva tri antitela su mišja monoklonska antitela izotipa IgG1, IgG2.
[0160] Pre bojenja antitelom, kolone su pre-inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi nakon primene 500 µl pojačivača prikaza Imaging Enhancer (Molecular Probes), a zatim oprane jednom primenom 500 µl MACS-pufera. Kolone su zatim inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi nakon primene 200 µl koktela citokeratina razblaženog 1:50 u puferu za blokiranje koji se sastoji od 4xSSC koji sadrži 10% normalnog kozjeg seruma, 1% BSA i 0,5% reagensa za blokiranje (Roche). Nakon inkubacije antitela, kolone su oprane 3 puta sa 500 µl MACS-pufera. Za detekciju, kolone su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 200 µl F(ab)2 fragmenata kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa AlexaFluor-488, (Invitrogen), razblaženih 1:50 u puferu za blokiranje, oprane 3 puta sa 500 µl MACS-pufera i zatim inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 200 µl F(ab)2 fragmenata zečjeg antikozjeg IgG konjugovanog sa AlexaFluor-488, (Invitrogen), razblaženih 1:50 u puferu za blokiranje. Nakon inkubacije, kolone su zatim oprane jednom sa 500 µl MACS-pufera i dva puta sa 500 µl PBS bez Ca2+ i Mg2+. Kolone su zatim premeštene sa magneta na epruvetu od 15 ml i ćelije su izdvojene primenom 500 µl MACS-pufera dva puta, uz korišćenje klipa pri drugoj primeni MACS-pufera. Nakon što su ćelije staložene centrifugiranjem na 500 g tokom 10 minuta na 4°C, ćelijski talog je resuspendovan u PBS bez Ca2+ i Mg2+, ćelije nanete premazom na predmetna stakla i predmetna stakla su preko noći osušena na vazduhu u mraku i zatim stavljena u medijum Vectashield sa DAPI (Vector Laboratories).
Ispitivanje predmetnih stakala obojenih citokeratinom
Identifikacija ćelija obojenih citokeratinom
[0161] Fetalne ćelije obojene koktelom anti-citokeratin antitela identifikovane su automatskim skeniranjem korišćenjem sistema za skeniranje MetaCyte koji je razvio Metasystems. Predmetna stakla su skenirana pod uveličanjem od 10x korišćenjem klasifikatora koji je razvijen i optimizovan u laboratoriji za detekciju ćelija obojenih citokeratinom. Nakon skeniranja, ćelije identifikovane pomoću skenera su automatski predstavljene za vizuelni pregled.
Identifikacija/verifikacija (muških) fetalnih ćelija pomoću FISH metode
[0162] U slučaju trudnoća sa muškim fetusom, specifičnost bojenja antitela je potvrđena pomoću XY FISH. Pre hibridizacije, pokrovna stakla su uklonjena i predmetna stakla su isprana u PBS 5 minuta i zatim dehidrirana u 60%-tnom, 80%-tnom i 99,9%-tnom etanolu, po 3 minuta u svakom. Hromozom-specifična CEP X proba za ponovak DXZ1 u DNK alfa satelita obeležena bojom spectrum aqua i CEP Y proba za DYZ1 za satelit III obeležena bojom spectrum orange (Abbott Molecular) su korišćene za ovo ispitivanje. Hibridizacione smeše koje sadrže obe probe su pripremljene mešanjem 1 dela X-probe, 1 dela Y-probe, 1 dela destilovane vode i 7 delova hibridizacionog pufera. Dodato je petnaest µl hibridizacione smeše i pokriveno sa pokrovnim staklom veličine 24 x 24 mm. Pokrovna stakla su pričvršćena gumenim cementom, i DNK je denaturisana na vrućoj ploči na 83,5°C tokom 7 minuta i hibridizovana preko noći u vlažnoj atmosferi na 42°C. Hibridizovana predmetna stakla su oprana 2 minuta na 73°C u 0,4 x SSC sa 0,3% Tween 20 i 1 minut na sobnoj temperaturi u 2xSSC sa 0,1% Tween 20. Predmetna stakla su zatim stavljena u medijum Vectashield sa DAPI.
Ispitivanje trizomije 21
[0163] U slučaju visokorizičnih trudnoća (1:50 ili više), fetalne ćelije obojene citokeratinom su ispitivane na prisustvo ili odsustvo trizomije 21 (Daunov sindrom) korišćenjem probe LSI 21 specifične za hromozom 21 obeležene bojom spectrum orange (Abbott Molecular). Proba CEP X obeležena bojom spectrum aqua je korišćena zajedno sa probom LSI 21 kao interna kontrola. Hibridizacione smeše koje sadrže obe probe su pripremljene mešanjem 1 dela X-probe, 1 dela LSI 21 probe, 1 dela destilovane vode i 7 delova hibridizacionog pufera.
[0164] Pre FISH, pokrovna stakla su uklonjena pranjem predmetnog stakla 10 minuta u 2% paraformaldehidu (PFA) u PBS. Predmetna stakla su zatim naknadno fiksirana inkubacijom tokom 10 minuta u 4% PFA, oprana u PBS 2 minuta i dehidrirana u 60%-tnom, 80%-tnom i 99,9%-tnom EtOH, po 3 minuta u svakom. Nakon sušenja na vazduhu predmetna stakla su pre-denaturisana hibridizacionom smešom koja ne sadrži probe na sledeći način. Dodato je 18 µl hibridizacione smeše i pokriveno pokrovnim staklom veličine 24 x 24 mm. Predmetna stakla su zatim smeštena na vruću ploču na 90°C tokom 10 minuta. Pokrovna stakla su uklonjena, predmetna stakla su oprana u PBS tokom 5 minuta i ledeno hladnom 99,9%-tnom EtOH tokom 10 minuta. Nakon sušenja na vazduhu, dodato je 18 µl hibridizacione smeše koja sadrži LSI 21 probu i CEP X probu i pokriveno pokrovnim staklom veličine 24 x 24 mm. Pokrovno staklo je pričvršćeno gumenim cementom, i molekuli DNK su denaturisani na vrućoj ploči na 90° C tokom 10 minuta i hibridizovani preko noći u vlažnoj atmosferi na 42°C. Hibridizovana predmetna stakla su oprana 2 minuta na 73°C u 0,4 x SSC sa 0,3% Tween 20 i 1 minut na sobnoj temperaturi u 2xSSC sa 0,1% Tween 20. Predmetna stakla su zatim stavljena u medijum Vectashield sa DAPI. Digitalizacija FISH signala hromozoma 21 u obojenim fetalnim ćelijama obavljena je pomoću preklapanja originalne datoteke sa rezultatima skeniranja. Slika 6 prikazuje slučaj neinvazivne prenatalne dijagnoze trizomije 21 (Daunov sindrom).
LISTA SEKVENCI

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Postupak za izdvajanje fetalne ćelije u uzorku majčine krvi, pomenuti postupak obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker, ili sa ligandom usmerenim na endotelijalni ćelijski marker, gde je endotelijalni ćelijski marker izabran iz grupe koja se sastoji od CD105, CD146, CD141, Vimentina, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 ili CDH3 i
c. odabiranja ćelija specifičnih za pomenuti endotelijalni ćelijski marker čime se uzorak obogaćuje ćelijama sa endotelijalnim fenotipom
d. Dovođenja u kontakt ćelija odabranih u koraku c) koje pokazuju endotelijalni fenotip sa hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili sa ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker, gde je epitelijalni ćelijski marker izabran iz grupe koja se sastoji od CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 ili CK19,
e. Detekcije ćelija sa endotelijalnim fenotipom koje se takođe vezuju za epitelijalni ćelijski marker koraka d).
f. Izborno, dijagnostikovanja i/ili prognoziranja genetskog sadržaja ćelija detektovanih u koraku e)
pri čemu koraci b-e mogu da se izvedu bilo kojim redosledom.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se ciljno mesto za endotelijalni marker nalazi na površini ćelije koja treba da se identifikuje.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se ciljno mesto za epitelijalni marker nalazi unutar ćelije koja treba da se identifikuje.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji obuhvata korake:
a. Obezbeđivanja uzorka majčine krvi ili njegove frakcije
b. Dovođenja u kontakt uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira endotelijalni ćelijski marker ili
ii. ligandom usmerenim na endotelijalni ćelijski marker
c. Odabiranja ćelija koje se vezuju za hibridizacionu probu ili ligand iz prethodnog koraka i, na taj način, obogaćivanja uzorka ćelijama koje se vezuju za hibridizacionu probu ili ligand prethodnog koraka
d. Dovođenja u kontakt obogaćenog uzorka sa
i. hibridizacionom probom koja sadrži najmanje 10 uzastopnih nukleotida komplementarnih genu koji kodira epitelijalni ćelijski marker ili
ii. ligandom usmerenim na epitelijalni ćelijski marker.
5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, koji dodatno obuhvata korak identifikacije fetalnih ćelija uzorka.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 4 i 5, naznačen time što identifikacija obuhvata detekciju prisustva liganda usmerenog na epitelijalni ćelijski marker ili hibridizacione probe usmerene na epitelijalni ćelijski marker, na ili u fetalnoj ćeliji.
7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je uzorak majčine krvi puna krv.
8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se ćelije u uzorku podvrgavaju koraku fiksacije nakon koraka odabiranja/obogaćivanja.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se ćelije u uzorku permeabilizuju nakon koraka fiksacije i pre dovođenja u kontakt sa ligandom ili hibridizacionom probom usmerenom na epitelijalni ćelijski marker.
10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je endotelijalni ćelijski marker izabran iz grupe koja se sastoji od: CD105, CD146 ili CD141.
11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što endotelijalni ćelijski marker predstavlja CD105.
12. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je epitelijalni ćelijski marker izabran iz grupe koja se sastoji od: CK8, CK18, CK19 ili CK7.
13. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka sa M30 antitelom.
RS20170977A 2010-11-09 2011-11-09 Obogaćivanje i identifikacija fetalnih ćelija u majčinoj krvi i ligandi za takvu upotrebu RS56402B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201001018 2010-11-09
EP11785308.5A EP2638176B1 (en) 2010-11-09 2011-11-09 Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
PCT/DK2011/050423 WO2012062325A1 (en) 2010-11-09 2011-11-09 Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56402B1 true RS56402B1 (sr) 2018-01-31

Family

ID=45001595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170977A RS56402B1 (sr) 2010-11-09 2011-11-09 Obogaćivanje i identifikacija fetalnih ćelija u majčinoj krvi i ligandi za takvu upotrebu

Country Status (22)

Country Link
US (1) US9429520B2 (sr)
EP (1) EP2638176B1 (sr)
JP (2) JP6068354B2 (sr)
KR (2) KR102057931B1 (sr)
CN (1) CN103261439B (sr)
CA (1) CA2817390C (sr)
CY (1) CY1119526T1 (sr)
DK (1) DK2638176T3 (sr)
EA (1) EA027314B1 (sr)
ES (1) ES2642313T3 (sr)
HR (1) HRP20171468T1 (sr)
HU (1) HUE034937T2 (sr)
IL (1) IL226188A (sr)
LT (1) LT2638176T (sr)
PL (1) PL2638176T3 (sr)
PT (1) PT2638176T (sr)
RS (1) RS56402B1 (sr)
SG (2) SG10201509230VA (sr)
SI (1) SI2638176T1 (sr)
SM (1) SMT201700509T1 (sr)
WO (1) WO2012062325A1 (sr)
ZA (1) ZA201303148B (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2642313T3 (es) * 2010-11-09 2017-11-16 Arcedi Biotech Aps Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso
WO2014067528A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 Arcedi Biotech Aps Improved enrichment and detection of rare blood cells
AU2015215008B2 (en) * 2014-02-05 2019-11-28 Fujirebio Diagnostics Ab Composition and method for detecting malignant neoplastic disease
CN106537144A (zh) * 2014-08-05 2017-03-22 富士胶片株式会社 有核红血球的分选方法
EP3247789A4 (en) * 2015-01-23 2018-09-12 Unimed Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Microfluidics based fetal cell detection and isolation for non-invasive prenatal testing
CN104977284B (zh) * 2015-07-03 2018-05-29 石莹 一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法
CN107475358A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 益善生物技术股份有限公司 结直肠癌组织溯源ctc分型鉴定试剂盒
CN107475354A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 益善生物技术股份有限公司 前列腺癌组织溯源ctc分型鉴定试剂盒
CN107475353A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 益善生物技术股份有限公司 肺癌组织溯源ctc分型鉴定试剂盒
US20180299442A1 (en) * 2017-04-14 2018-10-18 Jennifer C. Chow Enrichment and identification of fetal material
CN111122520A (zh) * 2018-10-31 2020-05-08 四川大学华西第二医院 一种胚胎植入检测试剂盒及其应用和使用方法
WO2020158824A1 (ja) * 2019-01-30 2020-08-06 大日本印刷株式会社 小腸上皮細胞を含む細胞構造物、その製造のための方法、及び、それを保持する基材
SG11202113242QA (en) 2019-06-07 2021-12-30 Arcedi Biotech Aps Isolation of fetal cells using facs
AU2020315211A1 (en) * 2019-07-15 2022-02-10 A. Menarini Biomarkers Singapore Pte. Ltd. Compositions and methods for isolating, detecting, and analyzing fetal cells
MX2022015727A (es) 2020-06-10 2023-03-23 Univ Texas Metodo para determinar riesgo de parto prematuro.
WO2022165084A1 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Biofluidica, Inc. High efficiency capture of fetal cells from maternal samples
WO2023104773A1 (en) * 2021-12-06 2023-06-15 Arcedi Biotech Aps Isolation and diagnostics of fetal cells
CN115109780B (zh) * 2022-06-22 2024-07-05 湖南大学 一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641628A (en) 1989-11-13 1997-06-24 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
BR9306867A (pt) 1992-07-17 1998-12-08 Aprogenex Inc Enriquecimento e identificação de células fetais do sangue materno para a hibridização in situ
US5629147A (en) 1992-07-17 1997-05-13 Aprogenex, Inc. Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
US5714325A (en) * 1993-09-24 1998-02-03 New England Medical Center Hospitals Prenatal diagnosis by isolation of fetal granulocytes from maternal blood
GB0009179D0 (en) 2000-04-13 2000-05-31 Imp College Innovations Ltd Non-invasive prenatal diagnosis
WO2001088100A1 (en) * 2000-05-16 2001-11-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel method of inducing the differentiation of embryonic stem cells into ectodermal cells and use thereof
AU2002306768A1 (en) * 2001-03-20 2002-10-03 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Expression profiles and methods of use
ES2564312T3 (es) * 2007-05-01 2016-03-21 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Métodos y kits para detectar células fetales en la sangre materna
CA2752838A1 (en) 2008-02-18 2009-08-27 Genetic Technologies Limited Cell processing and/or enrichment methods
EP2634268A3 (en) * 2009-01-07 2013-12-25 QuantiBact A/S Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
EP2389455A4 (en) 2009-01-26 2012-12-05 Verinata Health Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING A FETAL CELL
US20120115167A1 (en) * 2009-04-22 2012-05-10 Clinical Genomics Pty. Ltd. Method and apparatus for isolating a target bioentity from a biological sample
ES2642313T3 (es) * 2010-11-09 2017-11-16 Arcedi Biotech Aps Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso

Also Published As

Publication number Publication date
SI2638176T1 (en) 2018-01-31
KR20180037308A (ko) 2018-04-11
JP2017060525A (ja) 2017-03-30
CA2817390C (en) 2021-02-09
CA2817390A1 (en) 2012-05-18
CN103261439A (zh) 2013-08-21
ES2642313T3 (es) 2017-11-16
EA027314B1 (ru) 2017-07-31
ZA201303148B (en) 2014-01-29
JP2014503193A (ja) 2014-02-13
JP6310540B2 (ja) 2018-04-11
SG190175A1 (en) 2013-06-28
KR102057931B1 (ko) 2019-12-20
US20130331284A1 (en) 2013-12-12
PT2638176T (pt) 2017-10-17
PL2638176T3 (pl) 2018-01-31
EP2638176B1 (en) 2017-08-23
CY1119526T1 (el) 2018-03-07
WO2012062325A1 (en) 2012-05-18
JP6068354B2 (ja) 2017-01-25
SMT201700509T1 (it) 2017-11-15
CN103261439B (zh) 2015-04-15
EP2638176A1 (en) 2013-09-18
IL226188A0 (en) 2013-07-31
KR20130102612A (ko) 2013-09-17
DK2638176T3 (da) 2017-11-20
EA201390638A8 (ru) 2014-01-30
LT2638176T (lt) 2017-11-27
IL226188A (en) 2017-08-31
HRP20171468T1 (hr) 2017-12-15
EA201390638A1 (ru) 2013-09-30
SG10201509230VA (en) 2015-12-30
HUE034937T2 (en) 2018-03-28
US9429520B2 (en) 2016-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9429520B2 (en) Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
DK2385992T3 (en) Enriching and identifying fetal cells in maternal blood and ligand for such use
US20220235420A1 (en) Compositions and methods for isolating, detecting, and analyzing fetal cells
EP2287619B1 (en) Detection of foetal cells from maternal blood
HK1186755A (en) Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
HK1186755B (en) Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
EP4445135A1 (en) Isolation and diagnostics of fetal cells
HK40007341A (en) Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
HK40007341B (en) Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
HK1208883B (en) Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use
WO2014067528A1 (en) Improved enrichment and detection of rare blood cells