RS56489B1

RS56489B1 - Terapeutski agens za bolest baziran na inhibitornom efektu faktora inhibicije migracije makrofaga

Info

Publication number: RS56489B1
Application number: RS20171061A
Authority: RS
Inventors: Keiichi Tanaka; Kimiko Morimoto
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2014-07-17
Publication date: 2018-01-31
Also published as: PL3078372T3; DK2929880T3; EP3078372B1; SMT201700080T1; US20160228406A1; CN105407887A; EP2929880B1; US20160228404A1; RS55394B1; LT2929880T; CY1119496T1; WO2015008827A1; SI2929880T1; TWI603965B; EP2929880A4; NO3078372T3; IL243550A0; EP2929880A1; SMT201700080B; ES2642440T3

Description

Oblast tehnike

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak upotrebe derivata benzopirana koji inhibitorno deluje na faktor inhibicije migracije (u daljem tekstu označen kao MIF) ili njegovu so za terapeutsko lečenje bolesti nervnog sistema kao što je neuropatska bol. Dalje, odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži derivat benzopiran ili njegovu so za terapeutsko lečenje bolesti nervnog sistema.

Stanje tehnike

Neuropatska bol (u daljem tekstu označen kao NB) je vrsta bolesti hroničnog bola izazvanih poremećajima perifernog i/ili centralnog nervnog sistema i funkcionalan poremećaj nastao kao posledica karcinoma ili fizičke povrede. Ova bol je izgubio svoj prvobitni značaj upozoravanja na poremećaj tkiva, ali ne predstavlja ništa više od bola. Kvalitet života (KŽ, engl.QOL) pacijenta je značajno smanjen usled ovakvog bola.

Simptom NB je, pored stalnog spontanog bola, uglavnom alodinija (doživljaj bola na draži koje normalno ne izazivaju bol) kod koje se stimulacija dodirom manifestuje kao kao drastična bol. Ovakva vrsta bola je izuzetno otporna na nesteroidne anti-inflamatorne lekove (u daljem tekstu označeni kao NSAID) kao što je ibuprofen i takođe otporna na morfin, koji je narkotički analgetik (Nepatentni dokument 1).

Patološka fiziologija i uzrok NB još uvek nisu u potpunosti objašnjeni, ali kao rezultat nedavnih fundamentalnih istraživanja potvrđeno je sledeće: (1) NB je indukovana oštećenjem perifernog i/ili centralnog nerva.

(2) Različiti citokini i hemokini se oslobađaju iz oštećenih nervnih ćelija. (3) Oslobođeni citokini i slični izazivaju značajnu aktivaciju mikroglija poznatih kao imunokompetentne ćelije za centralni nervni sistem.

NB je tretirana u cilju ublažavanja bola, povećanja funkcionalnog kapaciteta pacijenta i poboljšanja njegove/njene aktivnosti. Za ove potrebe, na primer, administriran je antidepresant, narkotički analgetik i slični, izvedeni su tretmani blokade nerava i akupunktura i moksa terapija (moksibustija).

Međutim, nije još uvek poznata uspešna terapeutska metoda bazirana na razvoju mehanizma NB a postoji potreba za takvom terapeutskom metodom za NB.

MIF je citokin odabran od aktiviranih limfocita i poseduje različite biološke aktivnosti. Poznato je da ispoljava aktivnosti na primer, za imunski sistem, endokrini sistem i proliferaciju i diferencijaciju ćelija. Naime, MIF ima snačajnu ulogu u sistemskom inflamatornom i imunskom odgovoru i faktor je povezan sa odloženom reakcijom hipersenzitivnosti za inhibiciju nasumične migracije makrofaga. Pored toga, MIF poseduje aktivnost dopahrom tautomeraze (Nepatentni dokument 3).

Sa druge strane, poznato je da MIF ima homologiju sa glutation S-transferazom, da bi pokazao detoksifikaciju, treba da bude sekretovan iz adenohipofize u vreme endotoksičnog šoka, da bude indukovan niskim nivoom glukokortikoida i da suzbije svoj imunosupresivni efekat (Nepatentni dokument 4). Drugim rečima, MIF inhibira aktivnost glukokortikoida, antagonizuje anti-inflamatorni efekat endogenih ili terapeutski administriranog glukokortikoida i deluje takođe kao uzrok ili kao otežavajući faktor inflamatorne bolesti i inflamatornog stanja.

Pored toga, MIF je neophodan za aktivaciju T ćelija, eksprimiran je u različitim ćelijama i intentzivno je eksprimiran naročito u nervnom sistemu.

U odnosu između MIF i bolesti, na primer, inhibitor MIF olakšava simptom alodinije na životinjskom modelu za NB. Sa druge strane, mišji model pokazuje reakciju osetljivosti na nadražaj dodatno pogoršan stresom koji se može postići davanjem injekcije rekombinantnog MIF normalnom mišu (Nepatentni dokument 5). Pored toga, na životinjskom modelu za NB, posebno na modelu alodinije indukovan ligacijom išijatičnog nerva, MIF je u velikoj meri eksprimovan u ipsilateralnom zadnjem rogu kičmene moždine i aktivirani su signalni molekuli na strani nizvodno od MIF (Nepatentni dokument 6). Dalje, kod MIF knockout miševa, eliminisana je alodinija indukovana ligacijom išijatičnog nerva (Nepatentni dokumenti 5 i 6). Tako se smatra da je MIF be neophodan za ispoljavanje simptoma NB.

Derivat benzopirana ispoljava antiartritičan efekat (Patent Dokument 1), na stvaranje inflamatornih citokina, kao što su interleukin-1β i interleukin-6, i imunomodulatornu efekat (Nepatentna dokumenta 12, 13 i 14 i poznat jekao koristan u lečenju reumatoidnog artritisa i drugih artritisa i autoimunskih bolesti (Patentni Dokument 2). WO2007/042035 opisuje upotrebu N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida za umanjenje ili eliminaciju crvenila.

Nije, međutim, poznato da se svi derivati benzopirana vezuju za MIF i tako inhibiraju njihove biološe aktivnosti, kao što je prethodno opisano.

Efikasnost derivata benzopirana za NB kao što je prethodno opisano uopšte nije poznata.

Dokumenti iz stanja tehnike

Patentni dokumenti

Patentni dokument 1: JP 02-049778 A

Patentni dokument 2: Pamphlet of International Publication No. WO 94/23714

Nepatentni dokumenti

Nepatentni dokument 1: Lancet, 1999, vol.353, pp.1959-1964 Nepatentni dokument 3: Nat. Rev. Drug Discov., 2006, vol.5, pp.399-410 Nepatentni dokument 4: Molecular Medicine, 1996, vol.2, pp.143-149 Nepatentni dokument 5: Exp. Neurol., 2012, vol.236, pp.351-362 Nepatentni dokument 6: Anesthesiology, 2011, vol.114, pp.643-659 Nepatentni dokument 12: Chem. Pharm. Bull., 2000, vol. 48, pp. 131-139 Nepatentni dokument 13: J. Pharamcobiodyn., 1992, vol.15, pp.649-655 Nepatentni dokument 14: Int. J. Immunotherapy, 1993, vol.9, pp.69-78 Opis pronalaska

Tehnički problem

Tražen je medicinski proizvod koristan za terapeutsko lečenje NB i farmaceutska kompozicija za inhibiciju MIF, koji je faktor značajan kao uzrok ove bolesti. Posebno, poželjna je farmaceutska kompozicija korisna za terapeutski ili preventivni tretman neuropatskog bola.

Rešenje problema

Pod ovim okolnostima, pronalazači predmetnog pronalaska su pronašli da se derivati benzopirana predstavljeni opštom formulom [1] ili njihove soli, vezuju za MIF, ispolajvajući inhbitorni efekat na MIF i tako su korisni u terapeutskom lečenju NP za koji je efikasna inhibicija MIF, što je dovelo do realizavije predmetnog pronalaska:

gde R<1>predstavlja po izboru supstituisanu C1-6alkil grupu; jedan od R<2>i R<3>je atom vodonika; a drugi od R<2>i R<3>je atom vodonika, po izboru supstituisana amino grupa, po izboru supstitusana acilamino grupa, po izboru supstituisana karbamoil grupa ili po izboru substitutisana aril grupa.

Povoljni efekti pronalaska

Derivat benzopirana dat opštom formulom [1] ili njegova so ispoljava efekat inhibicije na MIF i koristan je u terapeutskom lečenju bolesti kod kojih je efikasna inhibicija MIF, kao što je NB.

Opis realizacija

Predmetni pronalzak će biti detaljno opisam u daljem tekstu.

Ovde korišćeni izrazi imaju sledeća značenja osim ako je drugačije naznačeno.

Atom halogena označava atom fluora, atom hlora, atom broma ili atom joda.

C1-6alkil grupa odnosi se na linearnu ili razgranatu C1-6alkil grupu kao što je metil grupa, etil grupa, propil grupa, izopropil grupa, butil grupa, sekbutil grupa, izobutil grupa, terc-butil grupa, pentil grupa, izopentil grupa i heksil grupa.

C1-6alkoksi grupa označava linearnu ili razgranatu C1-6alkiloksi grupu kao što je metoksi grupa, etoksi grupa, propoksi grupa, izopropoksi grupa, butoksi grupa, izobutoksi grupa, sek-butoksi grupa, terc-butoksi grupa, pentiloksi grupa i heksiloksi grupa.

C2-12alkanoil grupa označava linearnu ili razgranatu C2-12alkanoil grupu poput acetil grupe, propionil grupe, valeril grupe, izovaleril grupe i pivaloil grupe.

Aroil grupa označava benzoil grupu ili naftoil grupu.

Heterociklična karbonil grupa označava nikotinoil grupu, tenoil grupu, pirolizinokarbonil grupu ili furoil grupu.

(α-substituisana) aminoacetil grupa označava (α-supstituisanu) aminoacetil grupu koja je izvedena iz amino kiseline (kao što je glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, cistein, metionin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, asparagin, glutamin, arginin, lizin, histidin, hidroksilizin, fenilalanin, tirozin, triptofan, prolin i hidroskiprolin) i koji imaju zaštićen N-kraj.

Acil grupa označava formil grupu, sukcinil grupu, glutaril grupu, maleoil grupu, ftaloil grupu, C2-12alkanoil grupu, aroil grupu, heterocikličnu karbonil grupu ili (α-supstituisanu) aminoacetil grupu.

Acilamino grupa označava amino grupu supatituisanu acil grupom. Aril grupa onačava fenil grupu, naftil grupu, indanil grupu, indenil grupu, tetrahidronaftil grupu ili slične.

C1-6alkil grupa u R<1>može se supstituisati jednim ili više atoma halogena.

Amino grupa ili karbamoil grupa u R<2>i R<3>može da bude supstituisana jednom ili više C1-6alkil grupa.

Acilamino grupa u R<2>i R<3>može da bude supstitusana jednim ili više atoma halogena.

Aril grupa u R<2>i R<3>može da bude supstituisana jedno ili više grupa odabranih od atoma halogena, amino grupe, hidroksilne grupe, C1-6alkil grupe koja može d abude supstituisana jednim ili više atoma halogena i C1-6alkoksi grupa koja može da bude supstituisana jednim ili više atoma halogena.

Poželjni primeri derivata benzopirana datih opštom formulom [1] predmetnog pronalaska obuhvata jedinjenja opisana u daljem tekstu.

Prednost se daje jedinjenju u kojem je R<1>po izboru supstituisan C1-

6alkil grupom; jedan od R<2>i R<3>je atom vodonika; i jedan od R<2>i R<3>je po izboru supstituisan acilamino grupa.

Posebno, prednost se daje i: N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamidu, N-(3-amino-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamidu, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]acetamidu, N-(4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamidu, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-2-karboksamidu, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-2-il]acetamidu, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-karboksamidu, N-[7-[(etilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamidu, i N-(4-okso-6-fenoksi-2-fenil-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamidu i N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamidu.

Derivat benzopirana opšte formule [1] upotrebljen u ovom pronalasku dobijen je kombinovanjem javno priznatih postupaka i može se dobiti, na primer, postupkom opisanim u Patentnom dokumentu 1.

Primeri soliderivata benzopirana opšte formule [1] uključuju soli sa alkalnim metalom kao što je natrijum ili kalijum; soli sa zemnoalkalnim metalom kao što su kalcijum i magnezijum; amonijum so; i so sa organskom bazamom koja sadrži azot kao što je trimetilamin, trietilamin, tributilamin, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dietilamin, dicikloheksilamin, prokain, dibenzilamin, N-benzil-β-fenetilamin, 1-efenamin i N,N'-dibenziletilendiamin.

Od prethodno navedenih soli, prednost se daje farmakološki prihvatljivim solima.

MIF ima visoku homologiju sa bakterijskom tautomerazom, i katalizuje reakciju dopahromne tautomeraze (Molecular Medicine, 1996, vol.2, pp. 143-149). Tako, biološka aktivnost MIF može se odrediti primenom reakcije tautomeraze sa dopahromom kao supstratom.

Derivat benzopirana opšte formule [1] ili njegova so deluje tako da inhibira aktivnost MIF tautomeraze (odnosno, MIF inhibitorni efekat), i lek koji sadrži derivat benzopirana opšte formule [1] ili njegovu so koristan je za terapeutski ili preventivni tretman bolesti za koje je efikasna inhibicija MIF.

Primeri bolesti za koje je efikasna inhibicija MIF uključuje NB. Primeri NB uključuju fibromialgiju, postherpetični bol, dijabetična neuropatija, bol nakon povrede kičme, postapoplektični bol, hronični bol, kompleksni regionalni bolni sindrom, bol u leđima za koji nisu dovoljno efikasni NSAID, išijalgija, karlični bol, trigeminalna neuralgija, osteoartritisni bol za koji nisu dovoljno efikasni NSAID lekovi, sindrom deaferencijacijskog bola, bol usled mizoitisa, bol usled fasciitisa i bol usled seronegativnog artritisa. Primeri sindroma deaferencijacijskog bola uključuju talamusni bol, bol usled MS-a, bol nakon avulzione povrede, bol fantomskog uda i sindrom postoperativnog bola. Primeri bola usled seronegativnog artitisa uključuju bol usled poremećaja aksijalnih zglobova, bol usled ankilznog spondilitisa, bol usled poremećaja sakroiliačnog zgloba i bol usled seronegativnog spondilitisa.

Primeri oboljenja kojima se daje prednost su fibromialgija, posterpetični bol, dijabetična neuropatija, bol u leđima za koju nisu dovoljno efikasni NSAID lekovi, osteoartritisni bol za koji nisu dovoljno efikasni NSAID lekovi, bol usled miozitisa, bol usled fasciitisa i bol usled seronegativnog artritisa, i još bolje primeri uključuju: posterpetični bol, dijabetičku neuropatiju, bol u leđima za koji nisu dovoljno efikasni NSAID lekovi, osteoartritisni bol za koji nisu dovoljno efikasni NSAID lekovi, bol usled miozitisa, bol usled fasciitisa i bol usled seronegativnog artritisa.

Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se formulisati u farmaceutske formulacije kao oralni preparati (uključujući tablete, kapsule, prah, granule, fine granule, pilule, suspenzije, emulzije, tečnosti i sirupe), injecije i kapi za oči mešanjem sa različitim farmaceutskim aditivimakao što je ekscipijens, vezivna sredstvi, dezintegrant, inhbitor dezintegracije, agensi protiv stvaranja grudvica, lubrikant, nosač, rastvarač, ekspander, agens za podešavanje toničnosti, sredstvo za regulisanje rastvaranja, emulgator, agens za suspendovanje, agens za zgušnjavanje, sredstvo za oblaganje, agens za povećanje apsorpcije sredstvo za poboljšanje želiranja, sredstvo za ubrzavanje koagulacije, stabilizator na svetlost, konzervans, desikator, stabilizator emulzije, stabilizator suspenzije, stabilizator disperzije, inhbitor bojenja, apsrober kiseonika, agens za maskiranje ukusa, agens za maskiranje mirisa, boje, agens za penušanje, agens protiv penušanja, emolijens, antistatički agens, razblaživač, pH pufer i regulator pH.

Prethodno opisane različite formulacije, formulisane se prema uobičajenim postupcima.

Oralna čvrsta formulacija kao što su: tableta, prah i granule mogu se formulisati uobičajenim postupcima korišćenjem farmaceutskih aditiva, kao na primer, ekscipijensa kao što je laktoza, saharoza, natrijum hlorid, glukoza, skrob, kalcijum karbonat, kaolin, kristalna celuloza, anhidrovnai dvobazni kalcijum fosfat, delimično preželatinizovan skrob, kukuruzni skrob i alginska kiselina; vezivno sredstvo kao što je običan sirup, rastvor glukoze, rastvor skroba, rastvor želatina, polivinil alkohol, polivinil etar, polivinil pirolidon, karboksimetil celuloza, šelak, metil celuloza, etil celuloza, natrijum alginat, akacija, hidroksipropil metil celuloza i hidroksipropil celuloza; sredstvo za dezintegraciju kao što je suvi skrob, alginska kiselina, sprašeni agar, skrob, umrežen polivinil pirolidon, umržena karboksimetil celuloza natrijum, karboksimetil celulose kalijum i skrobni natrijum glikolat; inhbitor dezinegracije kao što je stearil alkohol, stearinska kiselina, kakao puter, i hidrogenizovano ulje; agens protiv zgrudvavanja kao što je aluminijum silicat, kalcijum hidrogen fosfat, magnezijum oksid, talk i anhidrid salicilne kiseline; lubrikant kao što je karnauba vosak, laka anhidrovena silicilna kiselina, aluminijum silikat, magnezijum silikat, hidrogenizovano ulje, derivat hidrogenizovanog biljnog ulja, susamovo ulje, beli pčelinji vosak, titanijum oksid, osušeni aluminijum hidroksid gel, stearinska kiselina, kalcijum stearat, magnezijum stearat, talk, kalcijum hidrogen fosfat, natrijum lauril sulfat i polietilen glikol; pojačavač apsropcije kao što su kvartenarna amonijum so, natrijum lauril sulfat, urea i enzim; i nosač kao što je skrob, laktoza, kaolin, bentonit, anhidrid silicijumove kiseline, hidratisan silicijum dioksid, magnezijum aluminometasilicat i koloidna silicilna kiselina.

Tableta se može obilkovati, po potrebi, u uobičajenu obloženu tabletu, kao šot je tableta obložena šećerom, tableta obližena želatinom, obložene tablete rastvorne u želucu, gastrorezistentne obložene tablete i film obložene tablete rastvorne u vodi.

Kapsula je pripremljena punjenjem tvrde želatinske kapsule, meke kapsule i slične bilo kojim od prethodno navedenih farmaceutskih aditiva.

Alternativno, farmaceutski aditiv kao što je rastvarač, ekspander, agens za podešavanje toničnosti, agens za poboljšavanje rastvaranja, emulgator, agens za suspendovanje i zgušnjivač može se upotrebiti za pripremu prema uobičajenom postupku za dobijanje vodene ili uljane suspenzije, rastvora, sirupa i napitka.

Injekcija se može pripremiti prema uobičajenim farmaceutskim postupcima upotrebom farmaceutskih aditiva, na primer, razblaživač (diluent) kao što je voda, etil alkohol, makrogol, propilen glikol, limunska kiselina, sirćetna kiselina, fosforna kiselina, mlečna kiselina, natrijum laktat, sumpotna kiselina i natrijum hidroksid; pH pufer i agens za podešavanje pH kao što je natrijum citrat, natrijum acetat i natrijum fosfat; stabilizator emulzije, stabilizator suspenzije i stabilizator disperzije kao što je natrijum pirosulfit, etilendiamintetrasirćetna kiselina, tioglikolna kiselina i tiomlečna kiselina; agens za korekciju toničnosti kao što su: so, glukoza, manitol and glicerin; agens za poboljšanje rastvorljivosti kao što su natrijum karboksimetil celuloza, propilen glikol, natrijum benzoat, benzil benzoat, uretan, etanolamin i glicerin; emolijens kao što su kalcijum glukonat, hlorobutanol, glukoza i benzil alkohol; i lokalni anestetik.

Kapi za oči mogu se pripremiti prema uobičajenim postupcima približnim mešanjem konzervansa kao što je hlorobutanol, natrijum dehidroacetat, benzalkonijum hlorid, cetilpiridinijum hlorid, fenetil alkohol, metil paraoksibenzoat i benzetonijum hlorid; pH pufer i agens za podešavanje pH kao što su boraks, borna kiselina i kalijum dihidrogenfosfat; agens za zgušnjavanje, kao što su metil celuloza, hidroksietil celuloza, karboksimetil celuloza, hidroksipropil metil celuloza, polivinil alkohol, karboksimetil celuloza natrijum i hondroitin sulfat; agens za poboljšanje rastvorljivosti kao što je polisorbat 80 i polioksietileno ricinusovo ulje 60; stabilizator emulzije, stabilizator suspenzije i stabilizator disperzije kao što su natrijum EDTA i natrijum hidrogen sulfit; i agens za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid i glicerin.

Način primene formulacije nije posebno ograničen i određuje se prema obliku formulacije, starosti, polu i drugim parametrima pacijenta i prema obliku simptoma kod pacijenta.

Doza aktivnog sastojka predmetne formulacije je odgovarajuće odabrana u skladu sa upotrebom, godinama i polom pacijenta, oblika bolesti i drugih stanja i generalno, može se adminstrirati u dozi od 0.1 do 500 mg, poželjno od 10 do 200 mg na dan, odjednom ili u više podeljenih doza tokom dana kod odraslog pacijenta.

Primeri

Dalje, Predmetni pronalazak će biti opisan sa pozivom na test primere i treba naglasiti da predmetni pronalazak nije ograničen na ove primere.

Skraćenice koje su korišćene u odgovarajućim test primerima imaju sledeća značenja.

MES: 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina

DMF: N,N-dimetilformamid

EDC: 1-etil-3 -(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid EDTA: etilendiamintetrasirćetna kiselina

NHS: N-hidroksisukcinimid

TBST: Tween 20-koji sadrži rastvor tris-pufera

Sledeća jedinjenja su korišćena kao test supstance.

[Tabela 1]

Test Primer 1 (Potvrda vezivanja Jedinjenja A i MIF)

Kao test supstanca, korišćeno je Jedinjenje A, (N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid).

(1) Priprema ćelijskog lizata

Ćelije THP-1 su kultivisane oko 6 sati u PRMI 1640 medijumu koji sadrži 1% fetalni goveđi serum i 50 µmol/L 2-merkaptoetanola. Zatim je u kulturu dodat lipopolisaharid (E. coli 0127:B8, Sigma Aldrich) u krajnjoj koncentraciji od 1 µg/mL i ćelije su gajene tokom 30 minuta. Ćelije su sakupljene i isprane fosfatnim puferskim rastvorom soli i pomećane sa oko 2-strukom zapreminom pufera za ćelijsku lizu (20 mmol/L Tris, 150 mmol/L natrijum hlorid, 1 mmol/L magnezijum hlorid, 0.1%NP-40, 1 mmol/L ditiotreitol, 0.1 % Triton X-100, pH 7.4). Dobijena smeša je stavljena na led uz povremeno mešanje u trajanju od oko 30 minuta i centrifugirana (20000 × g, 4°C, 8 minuta). Odvojen i dobijen supernatant je upotrebljen kao ćelijski lizat. Koncentracija proteina ćeljskog lizata merena je pomoću reagensa BCA kompleta za određivanje koncetracije proteina (Thermo Fisher Scientific K.K.) prema uputstvu.

(2) Sinteza 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorida

U rastvor 500 mg N-(3-amino-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamida u 5.0 mL DMF, dodato je 293 mg 4-(tercbutoksikarbonilamino)buterne kiseline i 304 mg f EDC pa je zatim reakciona mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h i 30 minuta. U ovako dobijenu reakcionu smešu dodato je 111 mg EDC, nakon čeka je smeša mešana na sobnoj temperaturi 3 sata i 30 minuta. U dobijenu reakcionu smešu, dodati su etil acetat i 10% vodeni rastvor limunske kiseline i nastala smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta i čvrsti ostatak je profiltriran. U ovako dobijen čvrsti ostatak, dodati su DMF, etil acetat i 10% vodeni rastvor limunske kiseline, nakon čega je smeša mešana na sobnoj temperaturi, 1 sat. Zatim, profiltriran je čvrsti ostatak pri čemu je dobijeno 397 mg terc-butil [4-[[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]amino]-4-oksobutil]karbamata u obliku svetlo žutog čvrstog ostatka. 300 mg ovako dobijenog terc-butil [4-[[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]amino]-4-oksobutil]karbamata je suspendovano u 3.0 mL metilen hlorida, dodato je 0.60 mL trifluorsirćetne kiseline uz hlađenje u ledu, pa je dobijena smeša zatim mešana na sobnoj temperaturi 40 minuta i rastvarač je predestilovan pod sniženim pritiskom. U ovako dobijen ostatak, dodato je 3 mL etil acetata i 0.25 mL 4 mol/L rastvora hlorovodonik/etil acetata i rastvarač je predestilovan pod sniženim pritiskom. U ovako dobijen ostatak, dodat je 5.0 mL etil acetata i 0.50 mL 4 mol/L rastvora hlorovodnik/etil acetata nakon čega je smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Zatim, čvrsti ostatak je profiltriran pri čemu je dobijeno 232 mg 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorida kao svetlo žuta čvrsta suptanca.

(3) Priprema kuglica

Imobilizacija 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorida na Dynabeads M-270 sa karboksilnim grupama kao površinskim grupama (Life Technologies Corporation) je izvedena opštim metodama.

Ukratko, posle NHS esterifikacije COOH terminalnih grupa na oko 30 mg kuglica (Dynabeads M-270 Carboksilic Acid, Life Technologies Corporation), dodato je 0.010 mL DMF, 0.90 mL 0.01 mol/L rastvora 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorid/DMF i 0.090 mL 1 mol/L rastvora N,N-diizopropiletilamin/DMF i dobijena smaša je mućkana na sobnoj temperaturi, 70 minuta. Kuglice su isprane dva puta sa 0.5 mL DMF i zatim je dodato 0.94 mL DMF i 0.060 mL 2-aminoetanola, nakon čega je smeša mućkana na sobnoj temperaturi, 2 sata. Kuglice su isprane dva puta sa po 0.5 mL DMF i zatim četiri puta sa po 1 mL 0.05 mol/L fosfatnim puferom (pH 6) i tako su dobijene kuglice za koje je vezano Jedinjenje A preko linkera (u daljem tekstu označno kao kuglice sa jedinjenjem). Pored toga, kuglice dobijene sličnom reakcijom bez dodatka 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3 -il]butanamid hidrohlorida su korišćene kao kontrolne kuglice. Svaki tip kuglica je suspendovan u 1 mL 0.05 mol/L fosfatnom puferu (pH 6) za čuvenje u frižideru do upotrebe. Neposredno pre upotrebe, deo kuglica je odvojen i ispran tri puta puferom za ćelijsku lizu.

(4) Reakcija između ćelijskog ekstrakta i kuglica

0.1 mL ćelijskog lizata (2 mg/mL proteina) i oko 0.9 mg kuglica sa jedinejnjem ili kontrolnih kuglica je mešano preko noći na 4°C. Supernatanti su odvojeni od kuglica pomoću magneta i sakupljeni su kao propuštene frakcije. Osim toga, kuglice su isprane puferom za ćelijsku lizu i zatim su reagovale sa 40 µL pufera za ćelijsku lizu koji sadrži 0.5 mmol/L Jedinjenja A na 4°C tokom 8 sati uz snažno mešanje. Supernatanti su odvojeni od kuglica pomoću magneta i sakljupeni kao eluat- Jedinjenja A. Dalje kuglice su blago isprane puferom za ćelijsku lizu, pomešane sa 15 µL puferom SDS-PAGE za uzorak (2ME+) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.),koji je 4 puta razblažen i zagrevane na oko 95°C tokom 5 minuta. Dalje, supernatanti su odvojeni od kuglica pomoću magneta i sakupljeni kao toplo-eluirana frakcija.

(5) Detekcija MIF Vestern blotom (Western blotting)

Vestern blot je izveden prema opštem postupku.

Oba dela propuštenih frakcija i deo eluata- Jedinjenja A dobijene kao što je prethodno opisano u (4) pomešane su sa puferom za uzorak SDS-PAGE (2ME+) i zagrevane. Ovi toplotno-tretirani uzorci i toplotno-eluirane frakcije su podvrgnute elektroforezi na SDS-PAGE gelu (SuperSep Ace 15%, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pri 30 do 50 mA u trajanju od 80 minuta u zatim elektroforezom prebačeni na PVDF membrane (Hybond-P, GE Healthcare Japan Corporation) pri 100 mA u trajanju od oko 60 minuta.

Membrana sa prebačenim proteinima je uronjena u i rastvor TBST (10 mmol/L Tris, 100 mmol/L natrijum hlorid, 0.1% Tween-20, pH 7.5) koji sadrži 5% obrano mleko na sobnoj temperaturi tokom 1 sata i blago mućkana. Zatim je membrana uronjena u rastvor TBST koji sadrži 1/50000 zapremine anti-MIF antitela (Abcam Plc.) i 5% obrano mleko i ostavljena da reaguje preko noći na 4°C uz blago mešanje. Nakon kratkog ispiranja membrane tri puta rastvrorom TBST, dobijena membrana je uronjena u rastvor TBST koji sadrži 1/5000 zapremine HRP-modifikovano anti-kozje IgG antitelo (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i 5% obrano mleko i ostavljena da reaguje na sobnoj temperaturi tokom 1 sata uz blago mešanje. Nakon kratkog ispiranja membrane tri puta rastvorom TBST, detektovan je MIF pomoću reagensa ECL Prime (GE Healthcare Japan Corporation) prema priloženom uputstvu.

Sl. 1 prikazuje fotografiju membrane na kojoj su hemiluminescencijom detektovani vezujući reaktanti MIF i antitelo.

Frakcije podvrgnute elektroforezi u odgovarajućim trakama gela su: Traka 1: Propuštena frakcija kuglica sa jedinjenjem;

Traka 2: Frakcija eluat-Jedinjenja A kuglica sa jedinjenjem;

Traka 3: Toplotno-eluirana frakcija kulgica sa jedinjenjem;

Traka 4: Rekombinantni MIF (Abcam Plc.);

Traka 5: Propuštena frakcija kontrolnih kuglica;

Traka 6: Frakcija eluat-Jedinjenja A kontronih kuglica;

Traka 7: Toplotno-eluirana frakcija kontrolnih kuglica.

Frakcija eluat-Jedinjenja A kuglica sa jedinjenjem sadrži proteine koji imaju kapacitet vezivanja za kuglice sa jedinjenjem i oslobađaju se od kuglica sa jedinjenjem u prisustvu viška Jedinjenja A. Pokazalo se da je traka detektovana u frakciji eluat-Jedinjenja A (tj. traka 2) , MIF zato što je vezana za anti-MIF antitelo i nalazi na položaju kojem odgovara ista molekulska težina kao za rekombinantni MIF.

Drugim rečima, otkriveno je da MIF ima kapacitet vezivanja za kuglice sa jedinjenjem.

S druge strane, frakcija eluat-Jedinjenja A kontrolnih kuglica i toplotnoeluirana frakcija kontrolnih kuglica sadrži proteine koji imaju kapacitet vezivanja za kontrolne kuglice. Budući da MIF nije detektovan u ovim frakcijama (odnosno, trakama 6 i 7), pokazano je da MIF nema kapaciet vezivanja za kontrolne kuglice.

Prema tome, dokazano je da se MIF specifično veže za Jedinjenje A.

Test Primer 2 (potvrda inhibicije aktivnost MIF)

Jedinjenja A do I su korišćena kao test supstance.

Inhibitorni efekat test supstanci na tautomerazne aktivnosti MIF određena je prema postupku koji su opisali Healy et al. (Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 2011, vol.20, pp.1516-1523).

U ovom postupku, tautomerna reakcija iz metil estra L-3,4-dihidroksifenilalanina (metil estar L -dopahrom, obojen) u metil estar 5,6-hidroksiindol-2-karboksilne kiseline (bezbojan) meren je kao promena u apsorbance na 475 nm.

Kao izvor enzima, korišćen je rekombinantni MIF koji proizvodi Abcam Plc. ili MIF dobijen i prečišćen prema postupku koji su opisali Lubetsky et al. (The Journal of Biological Chemistry, 2002, vol.277, pp.24976-24982).

Postupak prečišaćvanja je opisan u daljem tekstu.

Vektor pET15b (Merck) u koji je umetnuta genska sekvenca PIF cele dužine je transfekotvan soj E. coli BL21 Star (DE3) (Life Technologies Corporation). Soj E. coli je gajen sve dok medijum za gajenje pokazuje apsorbancu (na 600 nm) od 0.5 do 0.8, dodat je izopropil-β-tiogalaktopiranzid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) do krajnje koncentracije od 0.1 mmol/L, i indukovana je ekpresija proteina tokom 4 sata. Soj E. coli resuspendovan je u puferu (pH 7.5) koji sadrži 20 mmol/L Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mmol/L natrijum hlorida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 1 mmol/L ditiotreitola (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), i zatim je dobijena smeša podvrgnuta ultrasoničnoj lizi i centrifugirana na 15000 rpm tokom 10 minuta. Ovako dobijen supernatant je profiltriran koristeći filter od 0.20 µm izatim propušten kroz HiTrap Q HP i HiTrap SP HP kolone (GE Healthcare Japan Corporation), kako bise razdvojile propuštene frakcije svaka od po 5 mL. Svki od 10 µL razdvojenih frakcija podvrgnuto je elektroforezi korišćenjem 5 do 20% poliakrilamidnog gela (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), i svi proteini su obojeni reagensom Kumasi brijlijantno plavo (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Na osnovu ovako dobijenih rezultata, frakcije koje sadrže veliku količinu MIF i koje sadrže najmanju količinu drugih proteina su odabrane za prečišćavanje MIF. Koncentracija MIF proteina merena je pomoću BCA kompleta za određivanje koncetracije proteina (Thermo Fisher Scientific K. K.).

Inhibitorni efekat svake od test supstanci na tautomeranu aktivnost MIF merena je kako sledi u daljem tekstu.

U pufer (pH 6.2) koji sadrži 50 mmol/L Bis-Tris (Dojindo Laboratories) i 1 mmol/L EDTA (Dojindo Laboratories), dodat je MIF u konačnoj koncentraciji od 10 do 50 nmol/L i svaka od supstanci u krajnjoj koncentraciji od 30 µmol/L ili 0.5% dimetil sulfoksida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) kao kontrola i reakcija je izvedena na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta pri čemu je dobijen reakcioni rastvor 1.

Sa druge strane, u pufer koji ima sastav isti kao onaj korišćen za dobijane reakcionog rastvora 1, dodato je 1/20 zapremine 12 mmol/L metil estra L-3,4-dihidroksifenilalanina (Sigma Aldrich) i 1/20 zapremine 24 mmol/L natrijum periodata (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pri čemu je dobijen reakcioni rastvor 2.

Dalje, reakcioni rastvor 1 i reakcioni rastvor 2 su pomešani i odmah je merena privremena promena apsorbanca dobijene smeše na 475 nm.

Dobijena je razlika u apsorbenci između 1 minuta nakon početka merenja i na oko 5 minuta posle merenja. Pretpostavljajući da je promena apsorbance kontrole 100%, izračunata je brzina inhibicije reakcije tautomeraze u prisustvu svake od test supstanci.

Rezultati su prikazani u Tabeli 2. U Tabeli 2, brzina inhibicije reakcije tautomeraze prikazana je kako sledi. "-" ; manje od 50%, "+" ; 50% ili more i više od 75%, "++" ; 75% ili više.

[Tabela 2]

Sve testirane supstance inhibirale su tautomeraznu aktivnost MIF. Prethodno opisani rezultati otkrivaju da jedinjenje opšte formule [1] ili njegova so pokazuju inhibitorni efekat na MIF i korisna su kao inhibitor MIF.

Test Primer 3 (efekat jedinjenja A na hroničnu konstrikciju povređenog nerva na modelu pacova )

Ovaj test izveden je prema postupku koji su opisali Bennett et al. (Pain, 1988, vol.33, pp.87-107).

Jedinjenje A je upotrebljeno kao test supstanca i kao referenta supstanca upotrebljen je celekoksib, jedan od NSAID. Jedinjenje A administrirano je u dozi od 30 mg/kg (grupa Jedinjenja A ). Celekoksib je administriran u dozi od 30 mg/kg (grupa celekoksiba). U kontrolnoj grupi, administriran je 0.5% vodeni rastvor metil celuloze koji je korišćen kao nosač.

Pod anestezijom Somnopentila (proizvođač Kyoritsu Seiyaku Corporation, oko 52 mg/kg, intraperitonealna administracija), izvedena je operacija konstrikcije nerva na levim išijatičnim nervima na mužjacima Sprague-Dawley miševa (starosti 7 nedelja). Ukratko, levi femoralni region kod svakog od pacova je seciran, išijatični nerv je odvojen od okolnog tkiva, i nerve je labavo konstriktovan 4-0 svilenim koncem (proizvođač Eticon Inc., hirurška svila) tako da ima četiri sužena dela na četiri položaja u intervalima od oko 1 mm. Odgovarajući sloj mišića i kože su zašiveni i operisani region je dezinfikovan. Nosač, test supstanca ili referentna supstanca oralno su administrirani jednom na dan kontinulano tokom 14 dana od 16-og dana posle operacije.

Od početka administracije, određen je osećaj bola (mehanička alodinija) stopala leve zadnje šape prema Fon Frajevom testu. Ukratko, filamenti Fon Fraja različite fleksibilnosti (Semmes-Weinstein Von Frey Anesthesiometer (proizvođač Danmic Global, LCC)) su vertikalno pritisnuti na jastučiće leve zadnje šape počevši od najelastičnije i kao vrednost praga bola određena je elastična sila filamenta za koje pacov pokazuje refleks povlačenja šape.

Procena osećaja bola izražena je kao prosečna vrednost vrednosti praga bola. Rezultati su prikazani u Tabeli 3.

[Tabela 3]

Vrednosti praga bola u grupi jedinjenja A povećana je na 13.5 g, 14 dana posle početka administratcije (30-og dana posle operacije), te prema tome jedinjenjenje A je inhibiralo simptom mehaničke alodinije u odnosu na kontrolnu grupu.

S druge strane, administracija celekoksiba (30 mg/kg), NSAID, nije suzbila simptom mehaničke alodinije.

Prethodno opisani rezultati otkrili su da jedinjenje A suzbija simptom mehaničke alodinije prema mehanizmu koji se razlikuje od mehanizma dejstva NSAID.

Kratk opis crteža

[Sl. 1] Sl.1 je fotografija membrane na kojoj su hemiluminscencijom detektovani reaktanti nastali vezivanjem MIF i antitela.

Industrijska primenljivost

Derivat benzopirana prikazan opštom formulom [1] ili njegova so vezuje se za MIF, čime MIF ispoljava inhibitorni efekat i koristan je za lečenje neuropatskog bola.

Claims

Patentni zahtevi 1. Derivat benzopirana za upotrebu u lečenju neuropatskog bola, naznačen time, što je predstavljen opštom formulom ili njegova so,

u kojoj R<1>predstavlja po izboru supstituisanu C1-6alkil grupu; jedan od R<2>i R<3>predstavlja atom vodonika; a drugi od R<2>i R<3>je atom vodonika, po izboru supstituisana amino grupa, po izboru supstituisana acilamino grupa, po izboru supstituisana karbamoil grupa ili po izboru supstituisana aril grupa.
2. Derivat benzopirana za upotrebu prema ahtevu 1, naznačen time, što jedan od R<2>i R<3>je atom vodonika; i drugi od R<2>i R<3>je po izboru supstituisana acilamino grupa.
3. Derivat benzopirana za uptorebu prema zahtevu 1, naznačen time, što je N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid, N-(3-amino-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamid, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]acetamid, N-(4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamid, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-2-karboksamid, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-2-il]acetamid, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-karboksamid, N-[7-[(etilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid ili N-(4-okso-6-fenoksi-2-fenil-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamid.
4. Derivat benzopirana za upotrebu prema zahtevu 1, naznačen time, što je to N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid.
5. Agens za lečenje za upotrebu u tretiranju neuropatskog bola, pri čemu agen za lečenje sadži derivat benzopirana dat opštom formulom, ili njegovu so

gde R<1>predstavlja po izboru supstituisanu C1-6alkil grupu; jedan od R<2>i R<3>je atom voconika; i drugi od R<2>i R<3>je atom vodonika, po izboru supstituisana amino grupa, po izboru supstituiana acilamino grupa, po izboru supstituisana karbamoil grupa ili po izboru supstituisana aril grupa.
6. Agens za lečenje za upotrebu prema zahtevu 5, naznačen time što jedan od R<2>i R<3>je atom vodonika; a drugi od R<2>i R<3>je po izboru supstituisana acilamino grupa.
7. Agens za lečenje za upotrebu prema zahtevu 5, naznačen time, što derivat benzopirana je N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid, N-(3-amino-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamid, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]acetamid, N-(4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamid, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-2-karboksamid, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-2-il]acetamid, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-karboksamid, N-[7-[(etilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid ili N-(4-okso-6-fenoksi-2-fenil-4H-1-benzopiran-7il)metansulfonamid.
8. Agens za lečenjeza upotrebu prema zahtevu 5, naznačen time, što derivat benzopirana je N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid.
9. Agens za lečenje za upotrebu prema jednom od zahteva 5 do 8, gde neuropatski bol je fibromialgija, posterpetični bol, dijabetčna neuropatija, bol nakon povrede kičme, postapoplektični bol, hronični bol, kompleksni regionalni bolni sindrom, bol u leđima za koji nisu dovoljno efikasni NSAID, išijalgija, karlični bol, trigeminalna neuralgija, osteoartritisni bol za koji nisu dovoljno efikasni NSAID lekovi, sindrom deaferencijacijskog bola, bol usled mizoitisa, bol usled fasciitisa i bol usled seronegativnog artritisa