RS55394B1 - Terapeutsko sredstvo protiv bolesti bazirano na inhibitornom efektu faktora inhibicije migracije makrofaga - Google Patents

Description

Oblast tehnike

Predmetni pronalazak se odnosi na derivat benzopirana kao što je đefinisano u patentnom zahtevu 1, koji ima faktor inhibicije migracije mikrofaga (u daljem tekstu označen kao MIF) inhibitornu aktivnost za upotrebu u lečenju relapsno-remitentne ili sekundarne progresivne multiple skleroze u vreme recidiva.

Stanje tehnike

Multipla skleroza {u daljem tekstu MS) je bolest koja ima fokus generisan u centralnom nervnom sistemu, kao što je mozak ili kičmena moždina i izaziva razne neurološke simptome (poput vizuelnog poremećaja, diskinezije, hipestezije, dizestezije, bola, disekvilibrijuma, drhtavice, dizurije, seksualne disfunkcije, umora i emocionalnog poremećaja). MS je podeljena u zavisnosti od progresivnog režima stanja pacijenta, u "relapsno-remitentni tip" gde se recidiv i povlačenje ponavljaju i "hronični progresivni tip" gde je simptom postepeno pogoršan. Hronični progresivni tip je dalje podeljen na "sekundarni progresivni tip", gde relapsno-remitentna MS naknadno pokazuje hroničnu progresiju i "primarni progresivni tip", gde se očigledno ne dogodi recidiv, ali je simptom postepeno pogoršan od inicijalne etape na početku.

Uzrok MS još nije razjašnjen. Postoji izveštaj o uzroku MS, gde se T ćelije ili makrofage infiltriraju u nervna tkiva i napadnu pacijentov sopstveni mijelin, pokrivajući akson nervnih ćelija mozga ili kičmene moždine i, kao rezultat, inflamacija je izazvana u mijelinu i stoga je demijelinizacija izazvana, što dovodi do MS (Nepatentni dokument 2).

Terapeutski postupak za MS je podeljen u tri kategorije, odnosno, inhibiciju inflamacije u akutnom periodu, inhibiciju relapsa ili progresije i, olakšanje simptoma.

U lečenju u jednom akutnom periodu, glukokortikoid {steroid antiinflamatorni lek) se koristi za inhibiciju upale mesta gde je oštećen mijelin. MS je bolest od koje se teško potpuno oporavi jer recidiv i povlačenje u više navrata nastaju. Razni imunološki tretmani, zasnovani na pato-genetskom mehanizmu MS su proučavani (Nepatentni dokument 2), a pretpostavlja se da su interferon p i imunosupresivna sredstva efikasni. Međutim, nije uspostavljen dovoljno efikasan i bezbedan terapeutski postupak. Posebno, poželjan je odličan terapeutski postupak za MS, u vreme relapsa.

MIF je citokin izlučen iz aktiviranih limfocita i ima razne biološke aktivnosti. Poznato je da ispoljava aktivnosti za, na primer, imuni sistem, endokrini sistem i, proliferaciju i diferencijaciju ćelija. Posebno, MIF igra značajnu ulogu u sistemskoj inflamaciji i imunom odgovoru i, faktor je koji se odnosi takođe na zakasnelu reakciju preosetljivosti za inhibiciju nasurnične migracije makrofaga. Osim toga. MIF ima aktivnost dopahromne tautomeraze (Nepatentni dokument 3).

S druge strane, MIF je poznat da ima homologiju sa glutation S-transferazom, da pokazaje detoksikaciju, da se izlučuje iz adenohipofize u trenutku endotoksičnog šoka, da je indukovan niskim nivoom glukokortikoida i, da se suprotstavlja svom imunosupresivnom efektu (Nepatentni dokument 4) Drugim recima, MIF inhibira aktivnost glukokortikoida, antagonizuje antiinflamatorno dejstvo endogenog ili terapeutski ordiniranog glukokortikoida, a deluje i kao uzrok ili otežavajući činilac inflamatorne bolesti i inflamatornog stanja.

Osim toga, MIF je neophodan za aktivaciju T ćelija, izražen je u raznim ćelijama, a snažno je izražen naročito u nervnom sistemu.

U odnosu između MIF i bolesti, na primer, inhibitor MIF ublažava simptom alodinije na životinjskom modelu za NP. S druge strane, model miša pokazuje da stimulans osetljiva reakcija, pogoršana stresom, može biti proizvedena ubrizgavanjem rekombinantnog MIF normalnom mišu (Nepatentni dokument 5). Osim toga, u životinjskom modelu za NP, specifično u modelu za alodinije indukovan ligacijom išijatičkog nerva, MIF je visoko eksprimiran u ipsilateralnom leđnom rogu kičmene moždine i, aktiviraju se signalni molekuli na nizvodnoj strani od MIF (Nepatentni dokument 6). Nadalje, u izbacivanju MIF kod miša, alodinija izazvana ligacijom išijatičkog nerva je eliminisana (Nepatentni dokumenti 5 i 6). U skladu sa tim, MIF je, pretpostavlja se, neophodan za ekspresiju simptoma NP.

S druge strane, kod pacijenta sa MS. koncentracija MIF u cerebrospinalnoj tečnosti je značajno povećana u vreme recidiva kada se uporedi sa vremenom remisije {Nepatentni dokument 7). Pored toga, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (u daljem tekstu EAE) miša, to jest, životinjski model za MS, može sprečiti recidiv od strane izbacivanja MIF gena (Nepatentni dokument 8), Očigledno je, iz ovih činjenica, da MIF igra izuzetno značajnu ulogu u formiranju NP i MS,

EAE, odnosno životinjski model za MS, uključuje model za reprodukciju početka akutnog perioda (monofaznog) i model za reprodukciju hroničnog relapsno/remitentnog stanja i, uopšte, pacovi se koristeuprvom, a miševi se koriste u kasnijem, za konstruisanje modela.

Objavljeno je, na primer, da ciklofosfamid imunosupresivnog agensa inhibira početak akutnog EAE kod pacova, ati je neefikasan za tip recidiva ili hronični progresivni tip EAE kod miševa (Nepatentni dokument 9).

Takođe je objavljeno da je anti-a4 ekvivalent integrin antitela na MS terapeutskom agensu kod pacova ili miša, natalizumab, odložio početak i smanjio jačinu bolesti u odnosu na akutni EAE kod pacova i, inhibirao EAE početak kod miševa ordiniranjem za sprečavanje EAE, ali simptomi su pogoršani terapeutskim ordiniranjem (Nepatentni dokumenti 10 i 11)

Derivat benzopirana ispoljava dejstvo protiv artritisa (Patentni dokument 1), inhibitorni efekatza proizvodnju inflamatornih citokina, poput interleukina-1(3 i interleukina-6 i imunomodulatorno dejstvo (Nepatentni dokumenti 12. 13 i 14), a poznato je da je koristan za lečenje reumatoidnog artritisa i drugih vrsta artritisa i autoimunih bolesti (Patentni dokument 2) Pored toga, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid je poznat kao efikasan za akutni EAE kod pacova (Nepatentni dokument 15 i Patentni dokument 2).

Međutim, nije poznato uopšte da se derivat benzopirana vezuje za MIF, da inhibira svoje biološke aktivnosti, kao što je pomenuto gore.

Pored toga, delotvornost derivata benzopirana za NP kao što je gore pomenuto nije poznata uopšte, a njihova efektivnost za relapsno-remitentnu ili sekundarnu progresivnu MS u vreme relapsa, takođe nije uopšte poznata.

Dokumenti stanja tehnike

Patentni dokument

Patentni dokument 1: JP 02-049778 A

Patentni dokument 2: Pamflet Međunarodnog broja WO 94/23714 Nepatentni dokument

Nepatentni dokument 2: N. Engl. J. Med.. 2000, vol. 343, pp. 938-952

Nepatentni dokument 3: Nat. Rev. Drug Discov., 2006. vol 5, pp. 399-410 Nepatentni dokument 4: Molecular Medicine, 1996, vol. 2, pp. 143-149 Nepatentni dokument 5: Exp. Neurol., 2012, vol. 236, pp. 351-362

Nepatentni dokument 6: Anesthesiologv, 2011, vol 114, pp. 643-659

Nepatentni dokument 7: J. Neurol. Sci,, 2000, vol. 179, pp 127-131 Nepatentni dokumente: J. Immunol., 2005, vol. 175, pp. 5611-5614

Nepatentni dokument 9: Clin. Exp. Immunol., 2009, vol. 159, pp. 159-168

Nepatentni dokument 10: J. Pharmacol Exp. Ther., 2003, vol. 305, pp. 1150-62 Nepatentni dokument 11: J. Clin. Invest., 2001, vol. 107, pp. 995-1006

Nepatentni dokument 12: Chem. Pharm. Buli., 2000, vol. 48, pp. 131-139 Nepatentni dokument 13: J. Pharamcobiodvn , 1992, vol. 15, pp. 649-655 Nepatentni dokument 14: Int. J. Immunotherapv, 1993, vol, 9, pp. 69-78 Nepatentni dokument 15: J. Neuroimmunol., 1998, vol. 89, pp. 35-42

Suština pronalaska

Tehnički problem

Medicinski proizvod koristan za recidiv MS je poželjan.

Rešenje problema

Pod ovim okolnostima, pronalazači ovog pronalaska su utvrdili da se derivat benzopirana kao što je definisano u zahtevu lili njegove soli, vezuje za MIF, ispoljava MIF inhibitorni efekat i stoga je koristan za terapeutsko ili preventivno lečenje bolesti za koje je inhibicija MIF delotvorna, što je rezultiralo u postizanju ovog pronalaska.

N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1 -benzopiran-3-il]formamid je poželjni derivat jedinjenja [Formule 1]

gde R<1>predstavlja opciono supstituisanu C^g alkil grupu; jedan od R<2>i R<3>predstavlja atom vodonika; a drugi od R<2>i R<3>predstavlja atom vodonika, opciono supstituisanu amino grupu, opciono supstituisanu acilamino grupu, opciono supstituisanu karbamoil grupu ili opciono supstituisanu aril grupu.

Povoljni efekti pronalaska

Gore pomenuti derivat benzopirana potpada pod opštu formulu [1] i ispoljava MIF inhibitorni efekat i koristan je za terapeutsko ili preventivno lečenje boiesti za koje je inhibicija MIF efikasna, poput reiapsno-remitentne i sekundarne progresivne MS u vreme recidiva.

Opis realizacija

Ovaj pronalazak će biti opisan detaljno u daljem tekstu

Izrazi koji su ovde korišćeni imaju sledeća značenja, osim ako nije drugačije naznačeno.

Atom halogena označava atom fluora, atom hlora, atom broma ili atom joda.

Ci-6alkil grupa označava linearnu ili razgranatu C5.6alkil grupu kao što je metil grupa, etil grupa, propil grupa, izopropil grupa, butil grupa, sec-butil grupa, izobutil grupa, ferc-butil grupa, pentil grupa, izopentil grupa i heksil grupa.

C,.6alkoksi grupa označava linearnu ili razgranatu Ci-6alkiloksi grupu kao što je metoksi grupa, etoksi grupa, propoksi grupa, izopropoksi grupa, butoksi grupa, izobutoksi grupa, sec-butoksi grupa, ferc-butoksi grupa, pentiloksi grupa i heksiloksi grupa.

C2-12alkanoil grupa označava linearnu ili razgranatu C2-12alkanoil grupu kao što je acetil grupa, propionil grupa, valeril grupa, izovaleril grupa i pivaloil grupa.

Aroil grupa označava benzoil grupu ili naftoil grupu.

Heterociklična karbonilna grupa označava nikotinoil grupu tenoil grupu, pirolizinokarbonilnu grupu ili furoil grupu.

(a-supstituisana) aminoacetil grupa označava (a-supstituisanu) aminoacetil grupu koja je izvedena iz aminokiseline (kao što je glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, cistein, metionin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, asparagin, glutamin, arginin, lizin, histidin, hidroksilizin, fenilalanin, tirozin, triptofan, prolin i hidroksiprolin) i koja može imati zaštićeni N-terminal.

Acil grupa označava formil grupu, sukcinil grupu, glutaril grupu, maleoil grupu, ftaloil grupu, C2-12alkanoil grupu, aroil grupu, heterocikličnu karbonitnu grupu ili (a-supstituisanu) aminoacetil grupu.

Acilamino grupa označava amino grupu supstituisanu sa acil grupom

Aril grupa označava fenil grupu, naftil grupu, indanil grupu, indenii grupu, tetrahidronaftil grupu ili slično.

Ci.6alkil grupa ili R<1>može biti supstituisana sa jednim ili više atoma halogena.

Amino grupa ili karbamoil grupa R<2>i R<3>može biti supstituisana sa jednom ili više d-e alkil grupa.

Acilamino grupa R<2>i R<3>može biti supstituisana sa jednim ili više atoma halogena.

Aril grupa R<2>i R<3>može biti supstituisana sa jednim ili više grupa odabranih od atoma halogena, amino grupe, hidroksilne grupe, Cve alkil grupe koja može biti supstituisana sa jednim ili više atoma halogena i C,.6alkoksi grupe koja može biti supstituisana sa jednim ili više atoma halogena.

Konkretno, poželjan je N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid.

Derivat benzopirana opšte formule [1] korišćen u predmetnom pronalasku je proizveden kombinujući javno priznate postupke i može se proizvesti, na primer, postupkom opisanim u Patentnom dokumentu 1

Primeri soli derivata benzopirana uključuju so sa alkalnim metalom kao što je natrijum ili kalijum; so sa zemnoalkalnim metalom kao što su kalcijum i magnezijum; amonijumovu so; i so sa organskom bazom koja sadrži azot kao što su trimetilamin, trietilamin, tributilamin, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dietilamin, dicikloheksilamin, prokain, dibenzilamin, N-benzil-p-fenetilamin, 1-efenamin i N,N'-dibenziletilendiamin.

Među pomenutim solima, poželjne su farmakološki prihvatljive soli.

MIF ima visoku homologiju sa bakterijskom tautomerazom i, katalizuje reakciju dopahromne tautomeraze (Molecular Medicine, 1996, vol. 2, pp, 143-149) Stoga, biološka aktivnost MIF može biti procenjena upotrebom reakcije tautomeraze sa dopahrom kao supstratom.

Derivat benzopirana opšte formule [1] ili njegove soli predmetnog pronalaska ima dejstvo da inhibira aktivnost MIF tautomeraze (naime, MIF inhibitorni efekat), a lek koji sadrži derivat benzopirana opšte formule [1] ili njegove soli je koristan za terapeutsko ili preventivno lečenje bolesti za koje je inhibicija MIF efikasna.

Primeri bolesti za koje je inhibicija MIF efikasna, uključuju relapsno-remitentnu i sekundarnu progresivnu MS u vreme relapsa.

Relapsno-remitentna MS ima svojstvo da je poboljšana tokom nekoliko nedelja ili više meseci, nakon što neurološki simptom koji se akutno javlja dostigne fastigium, a zatim pogoršana da reprodukuje ili oteža neurološki simptom. Period remisije prati recidiv Recidiv se dogodio svakih nekoliko meseci ili godina i ponavlja se spora ili postepena remisija

Sekundarna progresivna MS ima karakteristiku da se stanje remisije pacijenta, koji ima inicijalno razvijenu relapsno-remitentnu MS, postepeno pogoršava dok se recidiv i remisija ponavljaju.

Primeri simptoma relapsno-remitentne MS i sekundarne progresivne MS u vreme recidiva uključuju smanjenu viziju, motornu oduzetost, senzorni poremećaj, višestruku viziju, dizuriju i dizartriju

Jedinjenje predmetnog pronalaska može se formirati u farmaceutske formulacije kao što su oralni preparati (uključujući tablete, kapsule, praškove, granule, fine granule, pilule, suspenzije, emulzije, rastvore i sirupe), injekcije i kapi za oči mešanjem sa različitim farmaceutskih aditivima kao što su ekscipijens, vezivno sredstvo, sredstvo za raspadanje, inhibitor raspadanja, sredstvo protiv kejkovanja, lubrikans, nosač, rastvarao, ekspander. sredstvo za podešavanje toničnosti, sredstvo za rastvaranje, emulgator, sredstvo za suspendovanje, sredstvo za ugušćivanje, sredstvo za oblaganje, pojačivač apsorpcije, pojačivač za želiranje, sredstvo za ubrzavanje koagulacije, sredstvo za zaštitu od svetlosti, konzervans, sredstvo za sušenje, stabilizator emulzija, stabilizator suspenzija, stabilizator disperzija, inhibitor bojenja, apsorber kiseonika. antioksidans, sredstvo za maskiranje ukusa, sredstvo za maskiranje mirisa, sredstvo za bojenje, sredstvo za stvaranje pene, sredstvo protiv stvaranja pene, sredstvo za ublažavanje, antistatičko sredstvo, sredstvo za razblaživanje, sredstvo za puferovanje i sredstvo za podešavanje pH vrednosti.

Gore opisane razne formulacije su formulisane uobičajenim postupcima

Oralne čvrste formulacije kao što su tablete, praškovi i granule mogu biti formulisani uobičajenim postupcima koristeći farmaceutske aditive, na primer, ekscipijens poput laktoze, saharoze, natrijum hlorida, glukoze, škroba, kalcijum karbonata, kaolina, kristalne celuloze, bezvodnog dibaznog kalcijum fosfata, delimićno preželatiniziranog škroba, kukuruznog škroba i alginske kiseline; vezivno sredstvo poput jednostavnog sirupa, rastvora glukoze, rastvora škroba, rastvora želatina, polivinil alkohola, polivinil etra, polivinil pirolidona, karboksimetil celuloze, šelaka, metil celuloze, etil celuloze, natrijum alginata, akacije, hidroksipropilmetil celuloze i hidroksipropil celuloze; sredstvo za raspadanje poput suvog škroba, alginske kiseline, praškastog agara, škroba, umreženog polivinil pirolidona, umrežene natrijum karboksimetil celuloze, kalijum karboksimetil celuloze i natrijum-skrob glikolata; inhibitor raspadanja poput stearil alkohola, stearinske kiseline, kakao butera i hidrogenizovanog ulja; sredstvo protiv kejkovanja poput aluminijum silikata, kalcijum hidrogen fosfata, magnezijum oksida, talka i anhidrida silicijuma; lubrikans poput karnauba voska, lake anhidrovane silicijumove kiseline, aluminijum silikata, magnezijum silikata, hidrogenizovanog ulja, derivata hidrogenizovanog biljnog ulja, susamovog ulja. belog pčelinjeg voska, titanijum oksida, osušenog aluminijum hidroksid gela, stearinske kiseline, kalcijum stearata, magnezijum stearata, talka, kalcijum hidrogen fosfata, natrijum lauril sulfata i polietilen glikola; pojačivač apsorpcije poput kvaternerne amonijumove soli, natrijum lauril sulfata, uree i enzima; i nosač poput škroba, laktoze, kaolina, bentonita, anhidrida silicijuma, hidratisanog silicijum dioksida, magnezijum aluminometasilikata i koloidne silicijumove kiseline.

Tablete mogu biti formirane, ako je neophodno, u opšte obložene tablete, poput šećerom obložene tablete, želatinom obložene tablete, obložene tablete rastvorljive u želucu, enterične obložene tablete i filmom obložene tablete rastvorljive u vodi.

Kapsule su pripremljene punjenjem tvrde želatinske kapsule, meke kapsule i slično sa bilo kojim od prethodno navedenih raznih farmaceutskih aditiva

Alternativno, farmaceutski aditiv poput rastvarača. ekspandera, sredstva za podešavanje toničnosti, sredstva za rastvaranje, emulgatora, sredstva za suspendovanje, sredstva za ugušćivanje može se koristiti za izradu uobičajenim postupcima za dobijanje vodene ili uljane suspenzije, rastvora, sirupa i eliksira.

Injekcije se mogu pripremiti uobičajenim postupcima koristeći farmaceutske aditive, na primer, rastvarač poput vode, etil alkohola, makrogola, propilen glikola, limunske kiseline, sirćetne kiseline, fosforne kiseline, mlečne kiseline, natrijum laktata, sumporne kiseline i natrijum hidroksida; sredstvo za puferovanje i sredstvo za podešavanje pH vrednosti poput natrijum citrata, natrijum acetata i natrijum fosfata; stabilizator emulzija, stabilizator suspenzija i stabilizator disperzija poput natrijum pirosulfita, etilendiamintetrasirćetne kiseline, tioglikolne kiseline i tiomlečne kiseline; sredstvo za podešavanje toničnosti poput obične soli, glukoze, manitola i giicerina; sredstvo za rastvaranje poput natrijum-karboksimetil ceiuloze, propilen glikola, natrijum benzoata, benzil benzoata, uretana, etanolamina i giicerina; sredstvo za ublažavanje poput kalcijum glukonata, hlorobutanola, glukoze i benzil alkohola; i lokalni anestetik.

Kapi za oči se mogu pripremiti uobičajenim postupcima odgovarajućim mešanjem sa konzervansom poput hlorobutanola, natrijum dehidroacetata, benzalkonijum hlorida, cetilpiridinijum hlorida, fenetil alkohola, metil parahidroksibenzoata i benzetonijum hlorida, sredstvom za puferovanje i sredstvom za podešavanje pH vrednosti poput boraksa, borne kiseline, kalijum dihidrogenfosfata; sredstvom za ugušćivanje poput metil celuloze, hidroksietil celuloze, karboksimetil celuloze, hidroksipropilmetil celuloze, polivinil alkohola, natrijum-karboksimetil celuloze i hondroitin sulfata; sredstvom za rastvaranje poput polisorbata 80 i polioksietilen poboljšanog ricinusovog ulja 60; stabilizatorom emulzija, stabilizatorom suspenzija i stabilizatorom disperzija poput natrijum edetata i natrijum hidrogensulfita; i sredstvom za podešavanje toničnosti poput natrijum hlorida, kalijum hlorida i giicerina.

Ordinirajući postupak formulacija nije posebno ograničen i na odgovarajući način je utvrđen u skladu sa oblikom formulacije, godinama, polom i drugim uslovima pacijenta i, stepenom simptoma pacijenta.

Doza aktivnog sastojka predmetne formulacije je na odgovarajući način odabrana u skladu sa upotrebom, godinama i polom pacijenta, oblikom bolesti i drugim uslovima i, obično, može se ordinirati u dozi od 0,1 do 500 mg, poželjno 10 do 200 mg na dan, jednom ili podeljena nekoliko puta dnevno za odrasle.

Primeri

Dalje, predmetni pronalazak biće opisan u odnosu na test primere i, konstatovano je da predmetni pronalazak nije ograničen na ove primere.

Skraćenice korišćene u odgovarajućim test primerima imaju sledeća značenja.

MES: 2-(N-morfolin)etansulfonska kiselina

DMF: N,N-dimetilformamid

EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid

EDTA: etilendiamintetrasirćetna kiselina

NHS: N-hidroksisukcinimid

PLP: Proteolipidni protein

TBST: fiziološki rastvor puferovan Tris-om koji sadrži Tween 20

Sledeća jedinjenja su korišćena kao test supstance.

Test primer 1 (Potvrda vezivanja jedinjenja A i MIF)

Kao test supstanca, korišćeno je jedinjenje A (N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid).

(1) Priprema ćelijskog iizata

THP-1 ćelije su kultivisane oko 6 sati u PRMI 1640 medijumu koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma i 50 umol/l 2-merkaptoetanola. Zatim je, lipopolisaharid (E. coli 0127:B8, Sigma Aldrich) dodat na ploču za kulturu u krajnjoj koncentraciji od 1ug/ml i ćelije su kultivisane oko 30 minuta. Ćelije su sakupljene i isprane sa fosfatnim puferom i pomešane sa oko 2-strukom zapreminom ćelijskog pufera za lizu (20mmol/l Tris, 150 mmol/l natrijum hlorid, 1 mmol/l magnezijum hlorid, 0,1% NP-40, 1 mmol/l ditiotreitol, 0,1% Triton X-100. pH 7,4). Dobijena smeša je postavljena na led uz povremeno mešanje oko 30 minuta i centrifugirana (20000 g, 4 °C, 8 minuta). Odvojeni i dobijeni supernatant je korišćen kao ćelijski lizat. Koncentracija proteina ćelijskog Iizata je izmerena sa BCA proteinskim test reagensom (Thermo Fisher Scientific K.K.), u skladu sa njegovim uputstvom.

(2) Sinteza 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1 -benzopiran-3-iljbutanamid hidrohlorida

Rastvoru od 500 mg N-(3-amino-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il)metansulfonamida u 5,0 ml DMF, dodato je 293 mg 4-(terc-butoksikarbonilamino)butirne kiseline i 304 mg EDC, praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi 1 sat i 30 minuta. U tako dobijenu reakctonu smešu, dodato je 111 mg EDC, praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi 3 sata i 30 minuta. Etil acetat i 10% vodeni rastvor limunske kiseline su dodati u dobijenu reakcionu smešu, dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 30 minuta, a čvrsti ostatak je filtriran. U tako dobijeni čvrsti ostatak su dodati DMF, etil acetat i 10% vodeni rastvor limunske kiseline, praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi 1 sat Zatim, čvrsti ostatak je filtriran do dobijanja 397 mg terc-butil [4-[[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]amino]-4-oksobutii]karbamata u obliku bledo žute čvrste supstance. 300 mg tako dobijenog terc-butil [4-[[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]amino]-4-oksobutil]karbamata suspendovano je u 3,0 ml metilen hlorida, ovome je dodato 0,60 ml trifluorosirćetne kiseline uz hlađenje ledom, dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 40 minuta, a zatim je rastvarač izdestilisan pod sniženim pritiskom. U tako dobijeni ostatak su dodati 3 ml etil acetata i 0,25 ml 4 mol/l hlorovodonik/etil acetatnog rastvora, a rastvarač je izdestilisan pod sniženim pritiskom. U tako dobijeni ostatak su dodati 5,0 ml etil acetata i 0,50 ml 4 mol/l hlorovodonik/etil acetatnog rastvora, praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi 2 sata. Zatim, čvrsti ostatak je filtriran do dobijanja 232 mg 4-amino-N-[7-[(metiisulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorida kao biedo žute čvrste supstance.

(3) Priprema perli

Imobilizacija 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorida na Dvnabeads M-270 Carboxylic Acid (Life Technologies Corporation) je izvedena opštim postupkom.

Ukratko, nakon NHS esterifikacije COOH završetaka približno 30 mg perli (Dvnabeads M-270 Carboxylic Acid, Life Technologies Corporation), 0,010 ml DMF, 0,90 ml 0,01 mol/l 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-iljbutanamid hidrohlorid/DMF rastvora i 0,090 ml 1 mol/l N,N-diizopropiletilamin/DMF rastvora su dodati i dobijeni rastvor je tresen na sobnoj temperaturi 70 minuta Perle su isprane sa 0,5 ml DMF dva puta, a zatim su dodati 094 ml DMF i 0,060 ml 2-aminoetanola, praćeno mućkanjem na sobnoj temperaturi 2 sata. Perle su isprane sa 0,5 ml DMF dva puta, a zatim su isprane sa 1 ml 0,05 mol/l fosfatnim puferom (pH 6) četiri puta i na taj način, dobijene su perle za koje je jedinjenje A vezano preko povezivača (u daljem tekstu kao jedinjenje perli). Osim toga, korišćene su perle dobijene primenom slične reakcije, bez dodavanja 4-amino-N-[7-[(metilsutfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamid hidrohlorida, kao kontrolne perle. Svaki tip ovih perli je suspendovan u 1 ml 0,05 mol/l fosfatnom puferu (pH 6) da bi se čuvao u frižideru do upotrebe. Neposredno pre upotrebe, deo perli je odvojen i ispran sa puferom za lizu ćelija tri puta.

(4) Reakcija između ćelijskog ekstrakta i perli

0,1 ml ćelijskog Iizata (2 mg/ml proteina) i približno 0,9 mg jedinjenja perli ili kontrolnih perli su dobro izmešani preko noći na 4 °C. Supernatanti su odvojeni od perli pomoću magneta i prikupljeni su kao protočna frakcija Osim toga, perle su isprane sa puferom za lizu ćelija, a zatim su reagovale sa 40 ul pufera za lizu ćelija koji sadrži 0.5 mmol/l jedinjenja A na 4 °C. oko 8 sati uz intenzivno mešanje Supernatanti su odvojeni od perli pomoću magneta i prikupljeni su kao jedinjenje A-eluat. Štaviše, perle su lagano isprane sa puferom za lizu ćelija, mešane su sa 15 ul SDS-PAGE pufera za uzorke (2ME+) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), koji je razblažen do 4 puta i, zagrejani su na oko 95 "C 5 minuta. Nakon toga, supernatanti odvojeni od perli pomoću magneta prikupljeni su kao zagrejana-eluirana frakcija.

(5) Detekcija MIF po vVestern blotting

VVestern blottingje izveden opštim postupkom.

Oba dela protočne frakcije i deo jedinjenja A-eluata, dobijeni kako je gore opisano u (4) su pomešani, respektivno sa SDS-PAGE puferom za uzorke (2ME+) i zagrejani su Ovi uzorci termički obrađeni i zagrejana-eluirana frakcija su izloženi elektroforezi na SDS-PAGE gelu (SuperSep Ace 15%. Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) na 30 do 50 rnA u trajanju od oko 80 minuta, a zatim su elektroforetski prebačeni na PVDF membranu (Hybond-P, GE Healthcare Japan Corporation) na 100 mA tokom približno 60 minuta Proteinska-prebačena membrana je uronjena i blago protresena u TBST rastvoru (10 mmol/l Tris, 100 mmol/l natrijum hlorid, 0,1 % Tween-20, pH 7,5) koji sadrži 5 % obranog mleka na sobnoj temperaturi, oko 1 sat. Nakon toga, membrana je uronjena u TBST rastvor koji sadrži 1/50000 zapremine anti-MIF antitela (Abcam Plc.) i 5 % obranog mleka i reaguje preko noći na 4 °C, uz blago mešanje. Nakon laganog ispiranja membrane sa TBST rastvorom tri puta, rezultujuća membrana je potopljena u TBST rastvor koji sadrži 1/5000 zapremine HRP-modifikovanog anti-kozjeg IgG antitela (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i 5 % obranog mleka i reaguje na sobnoj temperaturi u toku 1 sata , uz blago mešanje. Nakon laganog ispiranja membrane sa TBST rastvorom tri puta, detektovan je MIF pomoću ECL Prime reagensa (GE Healthcare Japan Corporation), u skladu sa njegovim uputstvom.

SI. 1 prikazuje fotografiju membrane na kojoj su vezujući reaktanti MIF i antitelo detektovani pomoću hemiluminiscencije.

Elektroforetske frakcije u odgovarajućim trakama gela bile su stedeće:

Traka 1: protočna frakcija jedinjenja perli

Traka 2: jedinjenje A-eluat jedinjenja perli

Traka 3: zagrejana-eluirana frakcija jedinjenja perli

Traka 4: rekombinantni MIF (Abcam Plc.)

Traka 5. protočna frakcija kontrolnih perli

Traka 6: jedinjenje A-eluat kontrolnih perli

Traka 7: zagrejana-eluirana frakcija kontrolnih perli

Jedinjenje A-eluat jedinjenja perli sadrži proteine koji imaju kapacitet vezivanja za jedinjenje perli i oslobođeno je iz jedinjenja perli u prisustvu prekomerne količine jedinjenja A. Krivina detektovana u jedinjenju A-eluat (tj., Traka 2) dokazano je da je MIF zato što je vezana za anti-MIF antitelo i bila je u poziciji koja odgovara istoj molekulskoj težini kao kod rekombinantnog MIF.

Drugim rečima, otkriveno je da MIF ima kapacitete vezivanja za jedinjenje perli.

Sa druge strane, oba jedinjenje A-eluat kontrolnih perli i zagrejana-eluirana frakcija kontrolnih perli sadrže proteine koji imaju kapacitet vezivanja za kontrolne perle. S obzirom da MIF nije detektovan u ovim frakcijama (naime, Trake 6 i 7), pokazano je da MIF nema kapacitet vezivanja za kontrolne perle.

Shodno tome, dokazano je da se MIF specifično vezuje za jedinjenja A.

Test Primer 2 (Potvrda inhibicije MIF aktivnosti)

Jedinjenja A do I su korišćena kao test supstance.

Inhibitorni efekat test supstanci protiv tautomerazne aktivnosti MIF je procenjen pozivajući se na postupak Healy i sar (Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 2011, vol. 20, pp. 1516-1523).

U ovom postupku, tautomerazna reakcija od L-3,4-dihidroksifenitalanin metil estra (L-dopahrom metil estar, obojen) do metil estra 5,6-hidroksiindol-2-karboksilne kiseline (bez boje) merena je kao promena apsorpcije na 475 nm.

Kao izvor enzima, korišćen je rekombinantni MIF proizveden od Abcam Plc. ili MIF proizveden i prečišćen pozivajući se na postupak Lubetsky i sar, (The Journal of Biological Chemistry, 2002, vol. 277, pp. 24976-24982) Postupak prečišćavanja za MIF je opisan u nastavku.

pET15b vektor (Merck), u koji je ubačena genska sekvenca MIF pune dužine transfektovan je E. coli BL21 Star (DE3) sojem (Life Technologies Corporation). E. coli je kultivisana dok se medijum za kultivisanje izlagao apsorbanciji (na 600 nm) od 0,5 do 0,8 izopropil-p-tiogalaktopiranozida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) je dodato do konačne koncentracije od 0,1 mmol/l, a ekspresija proteina je indukovana 4 sata E coli su ponovo suspendovane u puferu (pH 7,5) koji sadrži 20 mmol/l Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mmol/l natrijum hlorida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 1 mmol/l ditiotreitola (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i dobijeni rastvor je podvrgnut ultrazvučnoj lizi i centrifugiranju na 15000 o/min, 10 minuta. Ovako dobijeni supernatant je filtriran koristeći 0,20 um filtera i dozvoljeno je da prođe kroz HiTrap Q HP i HiTrap SP HP kolone (GE Healthcare Japan Corporation), tako da se odvoje protočne frakcije, svaka od 5ml. Svaka od 10 ul razdvojenih frakcija je podvrgnuta elektroforezi koristeći 5 do 20 % poliakrilamidnog geta (VVako Pure Chemical Industries, Ltd.) i svi proteini su bojeni sa Coomassie brilliant blue reagensom (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Na osnovu tako dobijenih rezultata, frakcija koja sadrži veliku količinu MIF i koja sadrži najmanju količinu drugih proteina, odabrana je kao prečišćeni MIF. Koncentracija MIF proteina je merena korišćenjem BCA proteinskog test reagensa (Thermo Fisher Scientific

K. K.).

Inhibitorni efekat svake test supstance protiv MIF tautomerazne aktivnosti je meren kao što sledi.

Konačna koncentracija od 10 do 50 nmol/l MIF i konačna koncentracija od 30 umol/l svake test supstance ili 0,5 % dimetil sulfoksida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) kao kontrole, dodate su u pufer (pH 6,2) koji sadrži 50 mmol/l Bis-Tris (Dojindo Laboratories) i 1 mmol/L EDTA (Dojindo Laboratories) i reakcija je izvedena na sobnoj temperaturi u toku 15 minuta dajući reakcioni rastvor 1.

Sa druge strane, 1/20 zapremine 12 mmol/l L-3,4-dihidroksifenilalanin metil estar (Sigma Aldrich) i 1/20 zapremine 24 mmol/l natrijum perjodata (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dodate su u pufer koji ima istu kompoziciju kao onaj korišćen za dobijanje reakcionog rastvora 1, dajući reakcioni rastvor 2.

Sledeći, reakcioni rastvor 1 i reakcioni rastvor 2 su pomešani i privremena pramena apsorbancije na 475 nm dobijene smeše je odmah izmerena.

Razlike u apsorbanciji su dobijene između oko 1 minut nakon početka merenja i nakon približno 5 minuta. Pod pretpostavkom daje pramena apsorbancije kontrole 100 %, izračunata je stopa inhibicije tautomerazne reakcije u prisustvu svake test supstance.

Rezultati su prikazani u Tabeli 2. U Tabeli 2, stopa inhibicije tautomerazne reakcije je prikazana kao što sledi.manje od 50%, "+"; 50% ili više, a manje od 75%,"++"; 75% ili više.

Sve test supstance su inhibirale tautomeraznu aktivnost MIF.

Gore opisani rezultati otkrivaju da jedinjenje opšte formule [1] ili njegove soli pokazuju MIF inhibitorni efekat i korisno je kao MIF inhibitor.

Test Primer 4 (Uticaj na hronični recidiv EAE modela miša)

Jedinjenje A je odabrano kao test supstanca, a salazosulfapiridin (u daljem tekstu SASP) je odabran kao uporedni kontrolni agens Jedinjenja A je ordinirano u dozi od 30 mg/kg (Jedinjenje A grupe). SASP je ordiniran u dozi od 300 mg/kg (SASP grupa). U kontrolnoj grupi i normalnoj grupi (grupa bez indukcije tretmana), ordinirano je 0,5% vodenog rastvora metil celuloze, korišćenog kao nosač tečnosti za ordiniranje

Hronični recidiv EAE je indukovan u SJL/J ženku miša imunizacijom sa delimičnim PLP peptidom. Ukratko, emulzija je pripremljena mešanjem ekvivalentnih zapremina slanog fosfatnog pufera koji sadži 1 mg/ml peptida koji odgovara 139-151 ostataka PLP i Freund's nekompletnog adjuvansa koji sadrži 4 mg/ml ubijenih M. Tuberculosis H37Ra. Emulzija je intradermalno ubrizgana (50 ug PLP po mišu) u četiri mesta na leđima za imunizaciju i, dodatno, na dan imunizacije i nakon dva dana, toksin pertusis je intraperitonealno ubrizgan u svakom iznosu po 150 ng po mišu. ukupno dva puta. Nosač, test supstanca ili referentna jedinica, neprekidno je oralno ordiniran 44 dana, jednom dnevno od dana imunizacije.

U predmetnom eksperimentu, paraliza je razvijena da dostigne vrhunac 14-og do 16-og dana nakon imunizacije, a simptom je vraćen jednom, ali i recidiv da dostigne vrhunac 38-dana.

Simptom je procenjen u skladu sa izveštajem VVeaver i sar (FASEB Journal, 2005, vol. 19, p. 1668). Ukratko, paraliza sva četiri ekstremiteta i repa je procenjena bodovanjem u 4 reda rezultatima od 0 do 3 i u 3 reda rezultatima od 0 do 2, respektivno, a zbir rezultata je određen kao EAE rezultat (maksimalni rezultat 14).

Stopa incidencije (broj miševa koji su razvili bolest/broj korišćenih miševa) i prosečni EAE rezultat svake grupe su mereni u periodu inicijalnog nastanka (15-og dana nakon imunizacije) i u periodu recidiva (38-og dana nakon imunizacije). Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

U Jedinjenju A grupe, stopa incidencije je bila niska u oba, periodu inicijalnog nastanka i periodu recidiva, a EAE rezultat je bio očigledno nizak, takođe.

Sa druge strane, u SASP grupi, ni stopa incidencije ni EAE rezultat nisu bili sniženi.

Gore opisani rezultati otkrivaju da Jedinjenje A suzbija pojavu paralize hroničnog recidiva EAE. Efekat jedinjenja A je očigledno različit od onog od SASP, iako su oba ova leka kategorizovana u imunomodulatoru.

Gore opisani rezultati otkrivaju da je jedinjenje opšte formule [1] ili njegove soli, korisno kao MIF inhibitor, a takođe je korisno za terapeutsko ili preventivno lečenje bolesti za koje je inhibicija M1F efikasna, poput NP i perioda recidiva relapsno-remitentne i sekundarne progresivne MS.

Kratak opis slike

[SI. 1] SI. 1 je fotografija membrane na kojoj su reaktanti, dobijeni vezivanjem između MIF i antitela, detektovani hemiluminescencijom

Industrijska primenljivost

Benzopiranski derivat, kao što je definisano u zahtevu 1 ili njegove soli, vezuje se za MIF, ispoljava MIF inhibitorni efekat i koristan je u lečenju relapsno-remitentne ili sekundarne progresivne multiple skleroze u vreme recidiva.

Claims (1)

1. Agens za lečenje, za upotrebu u lečenju relapsno-remitentne ili sekundarne progresivne multiple skleroze u vreme recidiva, koji sadrži N-[7-[{metilsulfonil)amino]-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-3-il]formamid ili njegove soli