RS56510B1 - Molekuli antitela koji vezuju trombin i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela koji inhibiraju trombin.

Koagulacija krvi je ključni proces u sprečavanju krvarenja iz oštećenih krvnih sudova (hemostaza). Međutim, krvni ugrušak koji ometa protok krvi kroz neki krvni sud (tromboza) ili se od njega odvoji i zatim zaustavi u nekom drugom krvnom sudu u telu (tromboembolija) može da predstavlja značajnu pretnju po zdravlje.

Dostupno je više antikoagulantnih terapija kojima se može tretirati patološka koagulacija krvi. Zajednički nedostatak ovih terapija je povećan rizik od krvarenja (Mackman (2008) Nature 451(7181): 914-918). Mnogi antikoagulansi pokazuju uzak terapeutski opseg između doze koja sprečava trombozu i doze koja dovodi do krvarenja. Ovaj opseg je često dodatno ograničen varijacijama u odgovoru pojedinačnih pacijenata.

Predmetni pronalazak se odnosi na neočekivano otkriće da molekuli antitela koji prepoznaju epitop exosite 1 na trombinu selektivno inhibiraju trombin bez pospešivanja krvarenja. Takvi molekuli antitela mogu da budu korisni u tretmanu i prevenciji tromboze, embolije i drugih stanja u kojima je trombin posrednik.

Jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje izolovani molekul antitela koji se specifično vezuje za mesto označeno kao exosite 1 na trombinu, gde navedeno antitelo sadrži VH domen koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br.3, 4 i 5, redom, i VL domen koji sadrži LCDR2 i LCDR3 sa sekvencama iz Sekv. sa ID br.8 i 9, redom, i LCDR1 sa sekvencom iz Sekv. sa ID br.7 ili LCDR1 koji ima sekvencu iz Sekv. sa ID br. 7 u kojoj je mesto glikozilacije izbačeno mutacijom, tako što je uvedena supstitucija aminokiselinskog ostatka koji odgovara S30 u Sekv. sa ID br.6.

Izolovani molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da inhibiraju trombin in vivo bez pospešivanja ili značajnog pospešivanja krvarenja, tj. molekuli antitela ne inhibiraju, ili ne inhibiraju značajno, normalne fiziološke reakcije na vaskularne povrede (tj. hemostazu). Na primer, molekuli antitela mogu da ne inhibiraju hemostazu, ili da je minimalno inhibiraju (tj. inhibiraju na beznačajnom nivou, koji ne utiče na dobrobit pacijenta niti zahteva dalju intervenciju). Molekuli antitela mogu da ne povećavaju krvarenje, ili da ga povećavaju minimalno.

Exosite 1 (takođe poznat kao „spoljašnje mesto (eng. exosite) za vezivanje anjona 1” i kao „spoljašnje mesto prepoznavanja fibrinogena”) je detaljno okarakterisano sekundarno mesto vezivanja na molekulu trombina (videti, npr. James A. Huntington, 2008, Structural Insights into the Life History of Thrombin, u Recent Advances in Thrombosis and Hemostasis 2008, urednici; K. Tanaka & E.W.Davie, Springer Japan KK, Tokio, str. 80-106). Exosite 1 mesto nastaje u zrelom trombinu, ali još nije formirano u protrombinu (videti, npr. Anderson et al (2000) JBC 277516428-16434).

Exosite 1 učestvuje u prepoznavanju supstrata trombina, kao što je fibrinogen, ali je udaljeno od katalitički aktivnog mesta. Različiti faktori vezivanja trombina vezuju se za mesto exosite 1, uključujući antikoagulans dodekapeptid hirugen (Naski et al, 1990, JBC 26513484-13489), faktor V, faktor VIII, trombomodulin (kofaktor za aktivaciju proteina C i TAFI), fibrinogen, PAR1 i fibrin (kofaktor za aktivaciju faktora XIII). Wu et al (1994 JBC 269: 3725-3730) opisuje epitop antitela specifičnog za spoljašnje mesto vezivanja na trombinu, za koji je pronađeno da inhibira zgrušavanje fibrinogena i aktivnost trombina u vezivanju trombomodulina, a koje antitelo je izolovano iz pacijenta sa rekurentnom arterijskom trombozom. ARNAUDE ET AL: "An autoantibody directed against human thrombin anionbinding exosite in a patient with arterial thrombosis: Effects on platelets, endothelial cells, and protein C activation", BLOOD 19940915 SAD, tom 84, br.6, 15.9. 1994. (1994-09-15), strane 1843-1850 opisuje autoantitelo usmereno ka spoljašnjem mestu za vezivanje anjona na humanom trombinu kod pacijenta koji pati od arterijske tromboze, gde navedeno antitelo inibira sve interakcije trombina koje zahtevaju sekundarno mesto vezivanja, a da pritom ne ometa katalitičko mesto (apstrakt). Opisano je antitelo protiv spoljašnjeg mesta vezivanja anjona na humanom trombinu, izolovano iz pacijenata, gde navedeno antitelo specifično inhibira slepljivanje trombocita indukovano trombinom. Epitop koji prepoznaje navedeno antitelo podrazumeva His66, Arg 68, Arg 70, Pro23, Glu24, Glu25 ostatke B lanca trombina. Navedeno antitelo odlaže sva prokoagulantna dejstva trombina, kao što je nastanak fibrina i agregiranje (slepljivanje) krvnih pločica, ali i nastanak PGI2 u endotelijalnim ćelijama. Ovo antitelo takođe inhibira aktivaciju proteina trombinom u prisustvu trombomodulina.

CHANG A C ET AL: "The reaction of thrombin with platelet-derived nexin requires a secondary recognition sitein addition to the catalytic site", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMICPRESS INC. ORLANDO, FL, SAD, tom 177, br. 3, 28. 6. 1991. (1991-06-28), strane 1198-1204 opisuje monoklonsko antitelo EST-6 koje blokira reakcije trombina koje podrazumevaju spoljašnje mesto za vezivanje anjona. Antitelo inhibira dejstvo trombina na fibrinogen, ali ne inhibira amidolitičku aktivnost. Antitelo reaguje sa ostacima Arg67-Arg77a b-lanca trombina.

QUINGYU WU ET AL: "ACTIVATION-INDUCED EXPOSURE OF THE

THROMBIN ANION-BINDING EXOSITE. ÖINTERACTIONS OF RECOMBINANT MUTANT PROTHROMBINS WITH THROMBOMODULIN AND ATHROMBIN EXOSITE-SPECIFIC ANTIBODY", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, SAD, tom 269, br.4, 4.2. 1994. (1994-02-04), strane 3725-3730 opisuje autoantitelo dobijeno iz pacijenta sa rekurentnom arterijskom trombozom, koje inhibira aktivnosti trombina u zgrušavanju fibrinogena i vezivanju trombomodulina, što ukazuje da bi navedeno telo moglo da prepoznaje epitop na spoljašnjem mestu vezivanja trombina. Navedeno antitelo inhibira interakciju trombina sa fibrinogenom i trombomodulinom, ali ne inhibira amidolitičku aktivnost trombina.

Anti-exosite 1 antitelo prema predmetnom pronalasku se vezuje za exosite 1 zrelog humanog trombina. Sekvenca humanog preprotrombina data je kao Sekv. sa ID br.1. Humani protrombin ima sekvencu ostataka 44 do 622 iz Sekv. sa ID br. 1. Zreli humani trombin ima sekvencu ostataka 314-363 (laki lanac) i ostataka 364 do 622 (teški lanac).

U nekim rešenjima, anti-exosite 1 antitelo takođe može da se vezuje za exosite 1 zrelog trombina drugih vrsta. Sekvence trombina drugih vrsta poznate su u struci i dostupne su preko javnih baza podataka kao što je Genbank. Odgovarajući ostaci u sekvencama trombina iz drugih vrsta mogu lako da se identifikuju pomoću alata za poređenje sekvenci.

Šema za označavanje ostataka trombina koja je ovde korišćena je uobičajena u struci i zasniva se na obrascu himotripsina (Bode W et al, EMBO J. 1989 Nov; 8(11):3467-75). Trombin ima petlje za inserciju, u odnosu na himotripsin, koje su označene uzastopnim malim slovima.

Spoljašnje mesto za vezivanje exosite 1 zrelog humanog trombina podvučeno je na Sekv. sa ID br. 1 i može da obuhvata sledeće ostatke: M32, F34, R35, K36, S36a, P37, Q38, E39, L40, L65, R67, S72, R73, T74, R75, Y76, R77a, N78, E80, K81, I82, S83,M84, K109, K110, K149e, G150, Q151, S153 i V154. U nekim rešenjima, drugi ostaci trombina koji se nalaze blizu (tj. u okviru 0,5 nm ili u okviru 1 nm) bilo kog od ovih ostataka takođe se mogu smatrati delom mesta exosite 1. Anti-exosite 1 antitelo može da se vezuje za epitop koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više od 20 ostataka mesta exosite 1. Poželjno je da se anti-exosite 1 antitelo vezuje za epitop koji se sastoji isključivo od ostataka koji ulaze u strukturu mesta exosite 1.

Na primer, anti-exosite 1 antitelo može da se vezuje za epitop koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili svih 16 ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od M32, F34, S36a, P37, Q38, E39, L40, L65, R67, R73, T74, R75, Y76, R77a, I82 i Q151 humanog trombina, ili odgovarajućih ostataka trombina drugih vrsta. U nekim poželjnim rešenjima, epitop može da sadrži ostatke trombina Q38, R73, T74, Y76 i R77a i, opciono, jedan ili veći broj dodatnih ostataka.

Molekuli anti-exosite 1 antitela koji su opisani u predmetnoj prijavi specifični su za spoljašnje mesto vezivanja exosite 1 na trombinu i vezuju se za taj epitop sa visokim afinitetom u odnosu na druge epitope, na primer, epitope sisarskih proteina osim zrelog trombina. Na primer, molekul anti-exosite 1 antitela može da pokaže afinitet vezivanja za exosite 1 trombina koji je najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta ili najmanje 2000 puta veći nego za druge epitope.

Poželjno je da molekul antitela koji je ovde opisan, a koji je specifičan za exosite 1, može da se vezuje za zreli trombin ali da ne pokazuje vezivanje, ili da ne pokazuje značajno vezivanje, za protrombin.

Bez ograničavanja bilo kakvom teorijom, anti-exosite 1 antitela možda ne mogu da dođu do trombina u centru hemostatičkog ugruška, te zbog toga ne mogu da utiču na hemostazu prekidanjem normalne funkcije trombina na mestima povrede krvnih sudova. Međutim, budući da se anti-exosite 1 antitela i dalje vezuju za trombin na površini ugruška i u spoljašnjem omotaču ugruška, sprečava se tromboza, odnosno nehemostatičko proširenje ugruška.

Molekul anti-exosite 1 antitela može da ima konstantu disocijacije za exosite 1 manju od 50 nM, manju od 40 nM, manju od 30 nM, manju od 20 nM, manju od 10 nM ili manju od 1 nM. Na primer, molekul antitela može da ima afinitet za exosite 1 od 0,1 do 50 nM, npr.0,5 do 10 nM. Pogodan molekul anti-exosite 1 antitela može, na primer, da ima afinitet za spoljašnje mesto vezivanja exosite 1 trombina od oko 1 nM.

Kinetika vezivanja i afinitet (izražen kao ravnotežna konstanta disocijacije, Kd) molekula anti-exosite 1 antitela može da se odredi pomoću standardnih tehnika, kao što je površinska plazmonska rezonanca, npr. pomoću BIAcoreanalysis.

Molekul anti-exosite 1 antitela opisan u predmetnoj prijavi može da bude imunoglobulin ili njegov fragment, i može da bude prirodan ili delimično ili u potpunosti sintetisan, na primer, rekombinantni molekul.

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da obuhvataju bilo koje polipeptide ili proteine koji sadrže mesto vezivanja antigena na antitelu, uključujući Fab, Fab2, Fab3, dijatela, trijatela, tetratela, minitela i antitela sa pojedinačnim domenom, uključujući nanotela, kao i cela antitela bilo kog izotipa ili potklase. Molekuli antitela i postupci za njihovo dobijanje i uporebu opisani su, na primer, u Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 (2005).

U nekim poželjim rešenjima, molekul anti-exosite 1 antitela može da bude celo antitelo. Na primer, molekul anti-exosite 1 antitela može da bude IgG, IgA, IgE ili IgM ili bilo koja potklasa izotipa, a posebno IgG1 i IgG4. Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da budu monoklonska antitela. U drugim poželjim rešenjima, molekul anti-exosite 1 antitela može da bude fragment antitela.

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da budu himerna, humanizovana ili humana antitela.

Molekuli anti-exosite 1 antitela opisani u predmetnoj prijavi mogu da budu izolovani, u smislu da ne sadrže zagađujuće supstance, kao što su antitela koja mogu da se vezuju za druge polipeptide i(li) komponente seruma. Za neke namene poželjna su monoklonska antitela, iako takođe mogu da se koriste i poliklonska antitela.

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da se dobiju primenom tehnika koje su standardne u struci. Postupci za dobijanje antitela obuhvataju imunizaciju sisara (npr. miša, pacova, zeca, konja, koze, ovce ili majmuna) proteinom ili fragmentom proteina. Antitela mogu da se dobiju iz imunizovanih životinja primenom širokog spektra tehnika koje su u struci poznate, te da se ispitaju na vezivanje, poželjno je primenom vezivanja antitela za željeni antigen. Na primer, mogu da se koriste tehnike Vestern blota ili imunoprecipitacije (Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82). Izolovanje antitela i(li) ćelija koje proizvode antitela iz životinja može da podrazumeva korak žrtvovanja životinje.

Kao alternativa ili dopunska tehnika imunizaciji sisara peptidom, antitelo specifično za neki protein može da se dobije iz rekombinantno dobijene biblioteke eksprimiranih varijabilnih domena imunoglobulina, npr. upotrebom lambda bakteriofaga ili filamentoznog bakteriofaga koji na svojoj površini iskazuju funkcionalne domene za vezivanje imunoglobulina, videti, npr. WO92/01047. Ovakva biblioteka može da bude naivna, tj. sačinjena iz sekvenci dobijenih iz organizama koji nisu imunizovani bilo kakvim proteinima (ili fragmentima) od interesa, ili može da bude sačinjena od sekvenci dobijenih iz organizama koji jesu bili izloženi antigenu od interesa.

Drugi molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da se identifikuju pregledom (skriningom) seruma pacijenta na antitela koja se vezuju za exosite 1.

U nekim rešenjima, molekuli anti-trombinskih antitela mogu da se dobiju na bilo koji uobičajen način, na primer, postupkom koji je prethodno opisan, a zatim da se izvrši skrining na diferencijalno vezivanje za zreli trombin u odnosu na trombin sa mutiranim exosite 1 mestom, gama trombin (gde je mesto exosite 1 defektno zbog autolize na mestima R75 i R77a), ili u odnosu na protrombin. Odgovarajući postupci skrininga poznati su u struci.

Antitelo koje pokazuje povećano vezivanje za zreli trombin, u odnosu na netrombinske proteine, trombin sa mutiranim exosite 1 mestom, gama trombin ili protrombin, na primer, antitelo koje se vezuje za zreli trombin ali se ne vezuje za trombin sa mutacijom mesta exosite 1, gama trombin ili protrombin, može se označiti kao molekul anti-exosite 1 antitela.

Nakon dobijanja i(li) izolovanja, može da se ispita biološka aktivnost molekula antiexosite 1 antitela. Na primer, može da se odredi sposobnost molekula antitela da inhibira vezivanje trombinskog supstrata, kofaktora ili inhibitora i(li) hidrolizu od strane trombina, i(li) može da se odredi sposobnost molekula antitela da inhibira trombozu bez pospešivanja krvarenja.

Pogodni molekuli antitela mogu da se testiraju na datu aktivnost pomoću testa fibrinogenskog zgrušavanja ili trombinskog vremena. Pogodni testovi dobro su poznati u struci.

Dejstvo molekula antitela na koagulaciju i krvarenje može da se odredi pomoću standardnih tehnika. Na primer, efekat molekula antitela na trombozu može da se odredi u životinjskom modelu, kao što je model miša, sa krvnim ugrušcima u krvnim sudovima indukovanim ferihloridom. Dejstva na hemostazu mogu takođe da se odrede pomoću životinjskog modela, na primer, merenjem krvarenja iz repa kod miša.

Molekuli antitela obično sadrže antigen-vezujući domen koji sadrži varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) i varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL), iako su mogući i antigen-vezujući domeni koji sadrže samo varijabilni domen teškog lanca (VH) (npr. antitela kamelida ili ajkula).

Svaki od VH i VL domena obično sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji su odgovorni za vezivanje antigena, a koji su međusobno razdvojeni okvirnim regionima.

U nekim rešenjima, vezivanje za exosite 1 može da se odigra u potpunosti, ili u značajnoj meri, preko VHCDR3 molekula anti-exosite 1 antitela.

Molekul anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku može da sadrži VH domen koji sadrži HCDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br. 5 ili sekvencu iz Sekv. sa ID br. 5 sa 1 ili više, na primer, 2, 3, 4 ili 5 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. Navedene supstitucije mogu da budu konzervativne supstitucije. HCDR3 može da sadrži aminokiselinske ostatke u položajima 4 do 9 Sekv. sa ID br.5 (SEFEPF), ili, što je poželjnije, aminokiselinske ostatke u položajima 2 i 4 do 10 iz Sekv. sa ID br. 5 (D i SEFEPFS) sa supstitucijama, delecijama ili insercijama u jednom ili većem broju položaja u Sekv. sa ID br.5. HCDR3 može da bude jedini region na molekulu antitela koji interaguje sa exosite 1 epitopom trombina, ili suštinski jedini region. HCDR3 stoga može da određuje specifičnost i(li) afinitet molekula antitela za region exosite 1 na trombinu.

VH domen molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku može dodatno da sadrži HCDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.4 ili sekvencu iz Sekv. sa ID br.4 sa 1 ili više, na primer, 2, 3, 4 ili 5 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. HCDR2 može da sadrži aminokiselinske ostatke u položajima 3 do 7 Sekv. sa ID br.

4 (DPQDG), ili, što je poželjnije, aminokiselinske ostatke u položajima 2 i 4 do 7 iz Sekv. sa ID br.4 (L i PQDG) iz Sekv. sa ID br.4, sa supstitucijama, delecijama ili insercijama u jednom ili većem broju položaja u Sekv. sa ID br.4.

VH domen molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku može dodatno da sadrži HCDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.3 ili sekvencu iz Sekv. sa ID br.3 sa 1 ili više, na primer, 2, 3, 4 ili 5 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. Navedeni HCDR1 može da sadrži aminokiselinski ostatak T u položaju 5 Sekv. sa ID br.3 sa supstitucijama, delecijama ili insercijama u jednom ili većem broju položaja u Sekv. sa ID br.3.

Molekul antitela sadrži VH domen koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br. 3, 4 i 5, redom. Molekul antitela može da sadrži VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.2 ili sekvencu iz Sekv. sa ID br.2 sa 1 ili više, na primer, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija u Sekv. sa ID br.2.

Molekul anti-exosite 1 antitela dalje sadrži VL domen, na primer, VL domen koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br.7, 8 i 9, redom. VL domen prema predmetnom pronalasku može da sadrži sekvence iz Sekv. sa ID br.7, 8 i 9, redom, sa, nezavisno jedna od druge, 1 ili više, na primer, 2, 3, 4, 5 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. Navedene supstitucije mogu da budu konzervativne supstitucije. Na primer, molekul antitela može da sadrži VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.6 ili sekvencu iz Sekv. sa ID br.6 sa 1 ili više, na primer, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija u Sekv. sa ID br.6.

U nekim rešenjima, VL domen može da sadrži Tyr49.

Molekul anti-exosite 1 antitela može, na primer, da sadrži jednu ili veći broj aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija koje unapređuju jedno ili veći broj svojstava datog antitela, na primer, afinitet, funkcionalni poluživot, brzine vezivanja i otpuštanja.

Tehnike koje su potrebne kako bi se uvele supstitucije, delecije ili insercije u aminiokiselinskim sekvencama CDR regiona, u VH ili VL domene antitela ili generalno u antitela, generalno su dostupne u struci. Mogu da se proizvedu varijante sekvenci sa supstitucijama, delecijama ili insercijama za koje može, ali ne mora da se predvidi da mogu da imaju minimalni ili pozitivan efekat na aktivnost, te se mogu testirati na sposobnost za vezivanje exosite 1 mesta na trombinu i(li) za bilo koje drugo poželjno svojstvo.

U nekim rešenjima, molekul anti-exosite 1 antitela može da sadrži VH domen koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br.3, 4 i 5, redom i VL domen koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br.7, 8 i 9, redom.

Na primer, VH i VL domeni mogu da imaju aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.

2 i Sekv. sa ID br.6, redom, ili mogu da imaju aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.2 i Sekv. sa ID br.6 koje sadrže, nezavisno jedna od druge, 1 ili više, na primer, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. Navedene supstitucije mogu da budu konzervativne supstitucije.

U nekim rešenjima, antitelo može da sadrži jednu ili više supstitucija, delecija ili insercija kojima se uklanja mesto glikozilacije. Na primer, mesto glikozilacije u VL domenu Sekv. sa ID br.6 može da se izbaci mutacijom, tako što se uvede supstitucija bilo u N28 ili u S30.

Molekul anti-exosite 1 antitela može da bude u bilo kom formatu, kao što je prethodno opisano. U nekim poželjnim rešenjima, molekul anti-exosite 1 antitela može da bude celo antitelo, na primer IgG, kao što su IgG1 ili IgG4, IgA, IgE ili IgM.

Molekul anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku može da bude onaj molekul koji pokazuje kompeticiju za vezivanje za mesto exosite 1 sa molekulom antitela koji je prethodno opisan, na primer, molekulom antitela koji

(i) vezuje exosite 1 mesto na trombinu i

(ii) sadrži VH domen iz Sekv. sa ID br.2 i(li) VL domen iz Sekv. sa ID br.6, HCDR3 iz Sekv. Sa ID br.5; HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 ili LCDR3 iz Sekv. sa ID br.3, 4, 7, 8 ili 9, redom; VH domen koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz Sekv. sa ID br.3, 4 i 5, redom; i(li) VH domen koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz Sekv. sa ID br. 3, 4 i 5, redom i VL domen koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz Sekv. sa ID br. 7, 8 i 9, redom.

Kompeticija između molekula antitela lako može da se utvrdi in vitro testom, na primer, pomoću ELISA testova ili dodavanjem posebnog molekula-reportera na jedan molekul antitela koji može da se detektuje u prisustvu jednog ili većeg broja drugih neobeleženih molekula antitela, kako bi se omogućila identifikacija molekula antitela koji vezuju isti ili preklopljeni epitop. Takvi postupci su dobro poznati stručnjacima sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti. Stoga, dalje rešenje prema predmetnom pronalasku obezbeđuje molekul antitela koji sadrži antigen-vezujuće mesto koje kompetira sa molekulom antitela, na primer, molekulom antitela koji sadrži VH i(li) VL domen, CDR npr. HCDR3 ili komplete CDR domena matičnog antitela koje je prethodno opisano, za vezivanje za exosite 1 mesto na trombinu. Pogodan molekul antitela može da sadrži antigen-vezujuće mesto koje kompetira sa antigen-vezujućim mestom antitela za vezivanje za exosite 1 mesto, gde je antigen-vezujuće mesto sačinjeno od VH domena i VL domena, i gde VH domen i VL domen sadrže HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence iz Sekv. sa ID br.3, 4 i 5, redom i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence iz Sekv. sa ID br.7, 8 i 9, redom, na primer VH i VL domene iz Sekv. sa ID br.2 i 6.

Molekul anti-exosite 1 antitela opisan u predmetnoj prijavi može da inhibira vezivanje faktora koji vezuju trombin, uključujući faktore koji se vezuju za exosite 1. Na primer, molekul antitela može kompetitivno ili nekompetitivno da inhibira vezivanje jednog ili više molekula izabranih iz grupe koja se sastoji od fV, fVIII, trombomodulina, fibrinogena ili fibrina, PAR1 i(li) hirugena i analoga hirugena, za trombin.

Molekul anti-exosite 1 antitela opisan u predmetnoj prijavi može da inhibira jednu ili veći broj aktivnosti trombina. Na primer, molekul anti-exosite 1 antitela može da inhibira hidrolizu jednog ili većeg broja supstrata trombina, kao što su fibrinogen, receptor krvnih pločica PAR-1 i faktor koagulacije FVIII. Na primer, vezivanje molekula antitela za trombin može da dovede do najmanje petostrukog, najmanje desetostrukog ili najmanje petnaestostrukog smanjenja hidrolize fibrinogena, PAR-1, faktora koagulacije FVIII i(li) drugih supstrata trombina, kao što su faktor V, faktor XIII u prisustvu fibrina i protein C i(li) TAFI u prisustvu trombomodulina. U nekim rešenjima, vezivanje molekula anti-exosite 1 anitela za trombin može da dovede do toga da se ne može detektovati hidroliza trombinskog supstrata od strane trombina.

Tehnike za merenje aktivnosti trombina, na primer merenjem hidrolize supstrata trombina in vitro standardne su u struci i opisane su u predmetnoj prijavi.

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu dalje da budu modifikovani hemijskim modifikacijama, na primer PEGilovanjem, ili ugradnjom u lipozome, kako bi se poboljšala njihova farmaceutska svojstva, na primer, povećanjem poluživota in vivo.

Efekat molekula anti-exosite 1 antitela na koagulaciju i krvarenje može da se odredi pomoću standardnih tehnika. Na primer, može da se odredi efekat antitela na model tromboze. Pogodni modeli obuhvataju indukciju stvaranja ugruška pomoću ferihlorida u krvnim sudovima u mišjem modelu, nakon čega sledi merenje krvarenja iz repa kako bi se ispitala normalna hemostaza. Drugi pogodni modeli za trombozu dobro su poznati u struci (videti, na primer, Westrick et al., ATVB (2007) 27:2079-2093).

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da budu sadržani u farmaceutskim preparatima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima.

Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens može da bude jedinjenje ili kombinacija jedinjenja koja ulaze u sastav farmaceutskog preparata a koja ne dovode do sekundarnih reakcija, te koja omogućavaju, na primer, olakšavanje primene molekula anti-exosite 1 antitela, produžavanje njegovog poluživota i(li) unapređenje njegove efikasnosti u organizmu, ili povećanje njegove rastvorljivosti. Ovi farmaceutski prihvatljivi nosioci su dobro poznati i stručnjak u ovoj oblasti ih lako može prilagoditi potrebama, u skladu sa putem primene molekula anti-exosite 1 antitela.

U nekim rešenjima, molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da budu obezbeđeni u liofilizovanom obliku, za ponovno rastvaranje pre primene. Na primer, liofilizovani molekuli antitela mogu da se rastvore u sterilnoj vodi i pomešaju sa vodenim rastvorom soli pre primene kod pacijenta.

Molekuli anti-exosite 1 antitela obično će se primenjivati u obliku farmaceutskog preparata, koji može da sadrži najmanje još jednu komponentu, uz molekul antitela. Tako farmaceutski preparati mogu da sadrže, uz molekul anti-exosite 1 antitela, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosilac, pufer, stabilizator ili bilo koji drugi materijal koji je dobro poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Takvi materijali bi trebalo da budu netoksični i ne bi trebalo da utiču na efikasnost molekula anti-exosite 1 antitela. Tačna priroda nosioca ili drugih materijala zavisiće od puta primene, koji može da bude bolus, infuzija, injekcija ili bilo koji drugi odgovarajući put primene, kao što će biti detaljnije opisano u tekstu koji sledi.

Za parenteralnu, na primer, potkožnu ili intravensku primenu, npr. injekcijom, farmaceutski preparat koji sadrži molekul anti-exosite 1 antitela može da bude u obliku vodenog rastvora prihvatljivog za parenteralnu primenu koji ne sadrži pirogene i ima odgovarajuću pH vrednost, izotoničnost i stabilnost. Osobe sa odgovarajućim znanjem u ovoj oblasti sasvim su u stanju da pripreme odgovarajuće rastvore primenom, na primer, izotoničnih nosilaca kao što su rastvor za injekcije na baz natrijum hlorida, Ringerov rastvor za injekcije, Ringerov rastvor za injekcije sa dodatkom laktata. Konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidansi i(li) drugi aditivi mogu da se koriste prema potrebi, uključujući pufere kao što su fosfatni, citratni i drugi puferi na bazi organskih soli; antioksidanse, kao što su askorbinska kiselina i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što su metil ili propilparaben; katehol, rezorcinol; cikloheksanol; 3’-pentanol i m-krezol); niskomolekulske polipeptide; proteine, kao što su serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatore, kao što je EDTA; šećere, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjone za izgradnju soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i(li) nejonske surfaktante, kao što su TWEEN<TM>, PLURONICS<TM>ili polietilen glikol (PEG).

Farmaceutski preparat koji sadrži molekul anti-exosite 1 antitela može da se primeni sam, ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo istovremeno ili jedan za drugim, u zavisnosti od stanja koje se leči.

Molekul anti-exosite 1 antitela opisan u predmetnoj prijavi može da se koristi u postupku za tretman ljudskog ili životinjskog organizma, uključujući i profilaktički i preventivni tretman (npr. tretman pre pojave stanja kod neke jedinke, kako bi se smanjio rizik da se kod date jedinke to stanje razvije, odložio njegov razvoj ili smanjio njegov intenzitet kad se jednom razvije). Postupak tretmana može da podrazumeva primenu molekula anti-exosite 1 antitela kod pacijenta kome je takav tretman potreban.

Primena obično podrazumeva „terapeutski delotvornu količinu”, koja je dovoljna da kod pacijenta pokaže blagotvorno dejstvo. Takvo blagotvorno dejstvo može da bude najmanje poboljšanje najmanje jednog simptoma. Količina koja se zapravo primenjuje, intenzitet i trajanje primene zavisiće od prirode i stepena stanja koje se tretira, a konkretno od toga koji sisar se tretira, kliničkog stanja pojedinačnog pacijenta, uzroka poremećaja, mesta dopremanja preparata, postupka primene, rasporeda primene i drugih faktora koji su poznati stručnjacima u oblasti medicine. Propisivanje tretmana, npr. odluke o dozi itd. spadaju u nadležnost lekara opšte prakse i drugih lekara i mogu da zavise od intenziteta simptoma i(li) progresije bolesti koja se leči. Odgovarajuće doze molekula antitela dobro su poznate u struci (Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K. D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Specifične doze mogu da budu naznačene u predmetnoj prijavi ili se mogu primeniti one navedene u publikaciji Physician’s Desk Reference (2003) kao prikladne za vrstu leka koja se primenjuje. Terapeutski delotvorna ili odgovarajuća doza molekula antitela može da se odredi poređenjem njegove in vitro aktivnosti sa njegovom in vivo aktivnošću u životinjskom modelu. Postupci za ekstrapolaciju delotvornih doza kod miševa i drugih životinja za ispitivanje na doze pogodne za ljude su poznati. Precizna doza zavisiće od većeg broja faktora, uključujući to da li se antitelo koristi za prevenciju ili lečenje, od vrste i lokacije zone koja se tretira, precizne prirode antitela (npr.

celo antitelo, fragment) i prirode bilo kakvog obeleživača ili drugog molekula vezanog za antitelo.

Tipična doza antitela kretaće se u opsegu od 100 μg do 1 g za sistemske primene, a od 1 μg do 1 mg za topijske primene. Moguće je primeniti početnu veću dozu, nakon čega sledi primena jedne ili većeg broja manjih doza. Antitelo će obično biti celo antitelo, npr. izotip IgG1 ili IgG4. Ovo je doza za pojedinačan tretman odraslog pacijenta, koja može proporcionalno da se prilagodi za decu i odojčad, a može i da se prilagodi za druge formate antitela u odnosu na njihovu molekulsku masu. Tretmani mogu da se ponavljaju na dnevnoj bazi, dva puta nedeljno, nedeljno ili jednom mesečno, sve to u skladu sa odlukom ordinirajućeg lekara. Raspored tretmana za pojedinačnog pacijenta može da zavisi od farmakokinetičkih i farmakodinamičkih svojstava preparata antitela, puta primene i prirode stanja koje se tretira.

Tretman može da bude periodičan, a period između primene može da bude oko dve nedelje ili duže, npr. oko tri nedelje ili duže, oko četiri nedelje ili duže, oko jednom mesečno ili duže, oko pet nedelja ili duže ili oko šest nedelja ili duže. Na primer, tretman može da se primenjuje na svake dve do četiri nedelje, ili svake četiri do osam nedelja. Tretman može da se primeni pre i(li) nakon hirurške intervencije, i(li) može da se primeni direktno na anatomskom mestu hirurškog tretmana ili invazivne procedure. Pogodne formulacije i putevi primene opisani su gore.

U nekim rešenjima, molekuli anti-exosite 1 antitela opisani u predmetnoj prijavi mogu da se primene kao potkožne injekcije. Potkožne injekcije mogu da se primenjuju pomoću autoinjektora, na primer za dugotrajne profilaktičke tretmane i tretmane lečenja.

U nekim poželjnim rešenjima, terapeutsko dejstvo molekula anti-exosite 1 antitela može da traje nekoliko poluživota, u zavisnosti od doze. Na primer, terapeutsko dejstvo pojedinačne doze molekula anti-exosite 1 antitela može da traje kod nekog pojedinca 1 mesec ili duže, 2 meseca ili duže, 3 meseca ili duže, 4 meseca ili duže, 5 meseci ili duže ili 6 meseci ili duže. Molekuli anti-exosite 1 antitela opisani u predmetnoj prijavi inhibiraju trombin i mogu da budu korisni u tretmanu stanja u kojima posreduje trombin.

Hemostaza je normalni koagulacioni odgovor, tj. sprečavanje krvarenja, na primer iz oštećenog krvnog suda. Hemostaza zaustavlja krvarenje iz krvnih sudova u organizmu.

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da nemaju nikakvo dejstvo, ili suštinski nikakvo dejstvo na hemostazu, tj. da ne promovišu krvarenje.

Rešenja prema predmetnom pronalasku obezbeđuju: molekul anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u postupku tretmana ljudskog ili životinjskog organizma; molekul anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u postupku tretmana poremećaja u kome posreduje trombin; upotrebu molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku u izradi leka za tretman stanja u kome posreduje trombin; i postupak tretmana stanja u kojem posreduje trombin koji podrazumeva primenu molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku kod pacijenta kome je to potrebno.

Inhibicija trombina pomoću anti-exosite 1 antitela, opisana u predmetnoj prijavi, može da donese kliničku dobrobit u tretmanu bilo kog stanja u kojem posreduje trombin. Stanje u kojem posreduje trombin može da obuhvata poremećaje koji se dovode u vezu sa nastankom ili aktivnošću trombina.

Trombin igra ključnu ulogu u hemostazi, koagulaciji i trombozi. Stanja u kojem posreduje trombin obuhvataju trombotska stanja, kao što su tromboza i embolija.

Tromboza je koagulacija koja je preterana u odnosu na potrebe hemostaze (tj. preterana koagulacija) ili koagulacija koja nije potrebna za hemostazu (tj. ekstra-hemostatska ili nehemostatska koagulacija).

Tromboza je zgrušavanje krvi unutar lumena krvnih sudova. Odlikuje se nastankom krvnog ugruška (tromba), većeg nego što zahtevaju potrebe hemostaze, ili izvan potreba hemostaze. Krvni ugrušak može da ometa protok krvi kroz dati krvni sud, što dovodi do medicinskih komplikacija. Krvni ugrušak može da se odvoji od mesta na kome je nastao, dovodeći do embolije na nekom drugom mestu sistema za cirkulaciju. U arterijskom sistemu, tromboza je obično rezultat pucanja arterosklerotičnog plaka.

U nekim rešenjima, tromboza može da nastane nakon početnog fiziološkog hemostatskog odgovora, na primer, nakon oštećenja endotelnih ćelija krvnog suda. U drugim rešenjima, tromboza može da se javi u odsustvu bilo kakvog fiziološkog hemostatskog odgovora.

Tromboza može da se javi kod pojedinaca sa urođenom sklonošću ka trombozi (tj. trombofilijom) ili kod „normalnih” pojedinaca bez urođene predispozicije za trombozu, na primer, kao odgovor na stimulus spolja.

Tromboza i embolija mogu da nastanu u bilo kojoj veni, arteriji ili drugom krvnom sudu unutrar sistema za cirkulaciju i mogu da podrazumevaju mikrovaskularnu trombozu.

Tromboza i embolija mogu da se dovedu u vezu sa hirurškom intervencijom (bilo tokom same operacije ili nakon toga), ili sa uvođenjem stranih tela, kao što su koronarni stentovi, u organizam pacijenta.

Na primer, anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku mogu da budu korisna kod hirurških i drugih procedura u kojima se krv izlaže veštačkim površinama, kao što su operacije na otvorenom srcu ili dijaliza.

Trombotska stanja mogu da obuhvataju trombofiliju, trombotski šlog i okluziju koronarnih arterija.

Pacijenti kod kojih se može primeniti tretman prema predmetnom pronalasku obuhvataju pacijente sa stanjima u kojima je tromboza simptom ili sporedno dejstvo tretmana, ili stanjima koja donose povećani rizik od tromboze, ili kod pacijenata sa prirodnom predispozicijom ili povećanim rizikom od tromboze u odnosu na opštu populaciju. Na primer, molekul anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku takođe može da bude koristan u tretmanu ili prevenciji venske tromboze kod pacijenata koji pate od kancera, kao i u tretmanu ili prevenciji bolničke tromboze koja je odgovorna za 50% slučajeva venske tromboembolije.

Molekuli anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku mogu da pokazuju terapeutsko ili drugo blagotvorno dejstvo na stanja u kojima posreduje trombin, kao što su trombotska stanja, bez da značajno inhibiraju ili ometaju hemostazu. Na primer, rizik od krvarenja kod pacijenata tretiranih molekulima anti-exosite 1 antitela možda neće biti povećan, ili značajno povećan, u odnosu na netretirane pojedince.

Pojedinci tretirani uobičajenim antikoagulansima, kao što su prirodni i sintetski heparini, varfarin, direktni inhibitori serin proteaze (npr. argatroban, dabigatran, apiksaban i rivaroksaban), hirudin i njegovi derivati (npr. lepirudin i bivalirudin) i anti-trombocitnim lekovima (npr. klopidogrel, tiklopidin i abciksimab) dovode do krvarenja. Rizik od krvarenja kod pacijenata tretiranih molekulima anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku može da bude manji u odnosu na pacijente tretirane uobičajenim antikoagulansima.

Stanja u kojem posreduje trombin obuhvataju netrombotska stanja koja se dovode u vezu sa aktivnošću trombina, uključujući zapaljenje, infekcije, rast i metastaze tumora, odbacivanje organa i demenciju (vaskularnu i nevaskularnu, tj. Alchajmerovu bolest) (Licari et al J Vet Emerg Crit Care (San Antonio).2009 Feb;19(1):11-22; Tsopanoglou et al Eur Cytokine Netw.

2009 Dec 1; 20(4):171-9).

Molekuli anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku takođe mogu da budu korisni u in vitro testovima, na primer, u analizi i karakterizaciji koagulacije, na primer u uzorku dobijenom od pacijenta.

Molekuli anti-exosite 1 antitela mogu da budu korisni u merenju nastanka trombina. Testovi za nastanak trombina tehnički su problematični zbog toga što konverzija fibrinogena u fibrin dovodi do zamućenja, što sprečava upotrebu jednostavnog hromogenog indikatora završetka reakcije.

Dodatkom molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku u uzorak krvi sprečava se ili se inhibira nastanak fibrina, te samim tim i zamućenje, što omogućava merenje nastanka trombina pomoću hromogenog supstrata, bez potrebe za korakom odstranjivanja fibrina.

Na primer, postupak merenja nastanka trombina može da podrazumeva dovođenje uzorka krvi u dodir sa ahromogenim supstratom trombina u prisustvu molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku i merenje hromogenog signala supstrata; gde hromogeni signal ukazuje na nastanak trombina u uzorku.

Hromogeni signal može da se meri direktno, bez uklanjanja fibrina iz uzorka.

Pogodni supstrati dobro su poznati u struci i obuhvataju S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa), β-Ala-Gly-Arg-p-nitroanilid diacetat (Prasa, D. et al. (1997) Thromb. Haemost. 78, 1215; Sigma Aldrich Inc) i Tos-Gly-Pro-ArgpNa.AcOH (Biophen CS-01(81); Aniara Inc OH, SAD).

Molekuli anti-exosite 1 antitela takođe mogu da budu korisni u inhibiciji ili prevenciji koagulacije krvi kao što je prethodno opisano, u sistemima za cirkulisanje krvi izvan organizma, kao što su hemodijaliza i oksigenacija na vantelesnoj membrani.

Na primer, postupak inhibicije ili sprečavanja koagulacije krvi in vitro ili ex vivo može da podrazumeva uvođenje molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku u uzorak krvi. Uzorak krvi može da se uvede u sistem za vantelesnu cirkulaciju pre, istovremeno ili nakon uvođenja anti-exosite 1 antitela i da se, što je opciono, podvrne tretmanu kao što su hemodijaliza ili oksigenacija. U nekim rešenjima, tretirana krv može zatim da se da pacijentu. Druga rešenja obezbeđuju molekul anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u postupku inhibicije ili sprečavanja koagulacije krvi u uzorku krvi ex vivo i upotrebu molekula anti-exosite 1 antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji leka za upotrebu u postupku inhibicije ili sprečavanja koagulacije krvi u uzorku krvi ex vivo.

Druga rešenja prema predmetnom pronalasku odnose se na dobijanje molekula antitela koji se vezuju za epitop trombina exosite 1 i koja mogu biti korisna, na primer, u tretmanu patološke koagulacije krvi ili tromboze.

Postupak za dobijanje antigen-vezujućeg domena antitela za exosite 1 epitop na trombinu može da podrazumeva:

● obezbeđenje, pomoću adicije, delecije, supstutucije ili insercije jedne ili većeg broja aminokiselina u aminokiselinsku sekvencu matičnog VH domena koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3, gde HCDR1, HCDR2 i HCDR3 imaju aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br. 3, 4 i 5, redom, VH domena koji je varijanta aminokiselinske sekvence matičnog VH domena i;

● opciono, kombinovanje tako dobijenih VH domena sa jednim ili većim brojem VL domena kako bi se dobila jedna ili veći broj VH/VL kombinacija; i

● ispitivanje navedenog VH domena, koji je varijanta aminokiselinske sekvence matičnog VH domena za VH/VL kombinaciju ili kombinacije, kako bi se identifikovao antigen-vezujući domen za epitop exosite 1 na trombinu.

VH domen koji je varijanta aminokiselinske sekvence matičnog VH domena može da ima HCDR3 sekvencu iz Sekv. sa ID br. 5 ili varijantu sa adicijom, delecijom, supstitucijom ili insercijom jedne, dve, tri ili više aminokiselina.

VH domen koji je varijanta aminokiselinske sekvence matičnog VH domena može da ima HCDR1 i HDR2 sekvence iz Sekv. sa ID br. 3 i 4, redom, ili varijante ovih sekvenci sa adicijom, delecijom, supstitucijom ili insercijom jedne, dve, tri ili više aminokiselina.

Postupak za dobijanje molekula antitela koje se specifično vezuje za epitop exosite 1 na trombinu može da podrazumeva:

● obezbeđenje početne nukleinske kiseline koja kodira VH domen ili početnog repertoara nukleinskih kiselina koje kodiraju VH domen, gde VH domen ili VL domeni predstavljaju bilo HCDR1, HCDR2 i(li) HCDR3 koje treba supstituisati, ili im nedostaje region za kodiranje HCDR1, HCDR2 i(li) HCDR3;

● kombinovanje početne nukleinske kiseline ili početnog repertoara sa nukleinskom kiselinom ili nukleinskim kiselinama donora koje kodiraju, ili koje su nastale mutacijom aminokiselinske sekvence iz HCDR1, HCDR2 i(li) HCDR3, a koje imaju aminokiselinske sekvence Sekv. sa ID br. 3, 4 i 5, redom, tako da se donorska nukleinska kiselina ili donorske nukleinske kiseline ubacuju insercijom u regione CDR1, CDR2 i(li) CDR3 u početnoj nukleinskoj kiselini, kao bi se dobio repertoar nukleinskih kiselina koje kodiraju VH domene;

● ekspresiju navedenih nukleinskih kiselina iz dobijenog repertoara kako bi se dobili VH domeni;

● opciono kombinovanje navedenih dobijenih VH domena sa jednim ili većim brojem VL domena;

● odabir molekula antitela koji se vezuju za exosite 1 na trombinu, a gde navedeni molekuli antitela sadrže dobijeni VH domen i opciono VL domen; i

● izolovanje navedenog molekula antitela ili nukleinske kiseline koja ga kodira.

Pogodne tehnike za sazrevanje i optimizaciju molekula antitela dobro su poznate u struci. Antigen-vezujući domeni antitela i molekuli antitela za epitop exosite 1 trombina mogu da se ispitaju kao što je prethodno opisano. Na primer, može da se odredi sposobnost vezivanja za trombin i(li) inhibicije hidrolize trombinskih supstrata.

Dejstvo molekula antitela na koagulaciju i krvarenje može da se odredi standardnim tehnikama. Na primer, može da se primeni model tromboze kod miša koji podrazumeva indukciju formiranja ugruška pomoću ferihlorida u krvnom sudu, kao što su femoralna vena ili karotidna arterija, nakon čega sledi određivanje vremena krvarenja iz repa kako bi se ispitala normalna hemostaza.

Različita dalja rešenja predmetnog pronalaska biće očigledna stručnjacima u ovoj oblasti u svetlu navoda iznesenih u predmetnoj prijavi.

Svi dokumenti koji su navedeni u ovom opisu inkorporirani su u potpunosti po referenci. Osim ukoliko je drugačije naznačeno, ostaci antitela označavaju se brojevima u skladu sa Kabatovom šemom za numeraciju.

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, izraz „i(li)” treba da se tumači kao specifično navođenje svake od dve navedene odlike ili komponente, u prisustvu ili odsustvu one druge. Na primer, „A i(li) B” treba tumačiti kao specifično navođenje svakog od (i) A, (ii) B i (iii) A i B, kao da je svaka od ovih opcija pojedinačno navedena u predmetnoj prijavi.

Osim ukoliko kontekst drugačije ne ukazuje, opisi i definicije odlika navedenih u prethodnom tekstu nisu ograničeni ni na jedno konkretno rešenje prema predmetnom pronalasku i podjednako se primenjuju na sva rešenja koja su opisana. Dakle, sve odlike koje su prethodno navedene, objavljene su u svim svojim kombinacijama i permutacijama.

Određena rešenja prema predmetnom pronalasku će sada biti ilustrovana, kao primer, i uz pozivanje na slike i tabele koje su opisane u tekstu koji sledi.

Slika 1 prikazuje vezivanje i eluciju IgA na koloni punjenoj sefarozom za koju je vezan humani trombin. Slika 1A prikazuje profil elucije za IgA (uski maksimum) sa trombinsefarozne kolone pomoću pH gradijenta (neutralan do niskog, što se vidi sa uzlazne krive). Slika 1B prikazuje nativni plavi gel koji prikazuje ukupno naneseni IgA, frakciju koja je prošla kroz kolonu sa humanim trombinom bez vezivanja i frakciju koja je eluirana (eluat) na niskom pH.

Slika 2 prikazuje gel sa neredukcione SDS-PAGE elektroforeze koji ukazuje da IgA vezuje trombin, ali ne i protrombin. U ovom testu sa vezivanjem za podlogu, lektin agaroza se koristi da se veže za IgA u prisustvu trombina ili prorombina. Supernatanti se potom propuštaju kroz SDS gel elektroforezu. U koloni 1 su standardi za molekulske veličine; u koloni 2 vidi se izostanak trombina iz supernatanta; u koloni 3 vidi se da taj izostanak zavisi od prisustva IgA; kolone 3 i 4 prikazuju da sadržaj protrombina nije smanjen, te da se on stoga ne vezuje za IgA.

Na slici 3 prikazana je relativna brzina hidrolize S2238 od strane trombina u prisustvu ili odsustvu IgA (tj. pojedinačna kriva apsorpcije na 405 u zavisnosti od vremena za hidrolizu S2238). Ovo ukazuje da se IgA ne vezuje za aktivno mesto trombina.

Slika 4 prikazuje rezultate studija vezivanja koji ukazuju da IgA kompetira sa fluorescentno obeleženim dodekapeptidom hirugenom za vezivanje za trombin.

Slika 5 prikazuje dejstvo IgA na hidrolizu S2238 trombinom. Analiza omogućava da se Kd za interakciju IgA-trombin proceni na 12 nM.

Slika 6 prikazuje SDS-PAGE gel celog IgA i Fab fragmenata pod redukujućim i neredukujućim (oks) uslovima. Pokazano je da neredukovani IgA ima molekulsku masu između 100 i 200 kDa a neredukovani Fab ima molekulsku masu od oko 50 kDa.

Na slici 7 prikazana je kristalna struktura trombin-Fab kompleksa koja prikazuje interakciju između spoljašnjeg mesta vezivanja exosite 1 na trombinu i HCDR3 na Fab fragmentu.

Na slici 8 prikazan je detalj kristalne strukture koji prikazuje interakciju između specifičnih ostataka spoljašnjeg mesta vezivanja exosite 1 na trombinu i HCDR3 na Fab fragmentu.

Slika 9 prikazuje slike dobijene fluorescetnom mikroskopijom za formiranje krvnog ugruška izazvanog FeCl3povredom femoralne vene, kod C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan FITC-obeleženi fibrinogen, pri čemu su uzorci uzimani u vremenskom periodu od 2 do 30 minuta nakon toga. Kod kontrole nosiocem, primenjeno je 100 ul PBS-a.

Slika 10 prikazuje slike dobijene fluorescetnom mikroskopijom za formiranje krvnog ugruška izazvanog FeCl3povredom femoralne vene, kod C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan FITC-obeleženi fibrinogen i 40 nM (konačna koncentracija u krvi miša, ekvivalentna dozi od približno 0,6 mg/kg) anti-exosite 1 IgA (100 μl u PBS-u).

Slika 11 prikazuje slike dobijene fluorescetnom mikroskopijom za formiranje krvnog ugruška izazvanog FeCl3povredom femoralne vene, kod C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan FITC-obeleženi fibrinogen i 80 nM (konačna koncentracija u krvi miša, ekvivalentna dozi od približno 1,2 mg/kg) anti-exosite 1 IgA (100 μl u PBS-u), kao i regija izvan zone povrede za potrebe poređenja.

Slika 12 prikazuje slike dobijene fluorescetnom mikroskopijom za formiranje krvnog ugruška izazvanog FeCl3povredom femoralne vene, kod C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan FITC-obeleženi fibrinogen i 200 nM (konačna koncentracija u krvi miša, ekvivalentna dozi od približno 3 mg/kg) anti-exosite 1 IgA (100 μl u PBS-u), kao i regija izvan zone povrede za potrebe poređenja.

Slika 13 prikazuje slike dobijene fluorescetnom mikroskopijom za formiranje krvnog ugruška izazvanog FeCl3povredom femoralne vene, kod C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan FITC-obeleženi fibrinogen i 400 nM (konačna koncentracija u krvi miša, ekvivalentna dozi od približno 6 mg/kg) anti-exosite 1 IgA (100 μl u PBS-u).

Slika 14 prikazuje slike dobijene fluorescetnom mikroskopijom za formiranje krvnog ugruška izazvanog FeCl3povredom femoralne vene, kod C57BL/6 miševa tretiranih pomoću FITC-obeleženog fibrinogena i 4 μM (konačna koncentracija u krvi miša, ekvivalentna dozi od približno 60 mg/kg) anti-exosite 1 IgA (100 μl u PBS-u).

Slika 15 prikazuje kvantitativno određivanje odnosa odgovora na dozu anti-exosite 1 IgA sa fluorescentnih snimaka prikazanih na slikama 9 do 13.

Slika 16 prikazuje vreme krvarenja iz repne vene kod kontrolnih C57BL/6 miševa i kod miševa tretiranih rastućim koncentracijama anti-exosite 1 IgA. Druga prosečna vrednost ne uključuje vrednosti sa ekstremnim odstupanjem.

Slika 17 prikazuje rezultate testova skraćivanja repa na C57BL/6 miševima divljeg tipa (WT) (n=5) nakon injekcije bilo IgA ili PBS-a u repnu venu.15 minuta nakon injekcije, repovi su skraćeni na prečniku od 3 mm te je praćen gubitak krvi u toku 10 minuta.

Na slikama 18A do 18D prikazani su rezultati modela okluzije karotidne arterije izazvane ferihloriom kod mužjaka WT C57BL/6 miševa starih 9 nedelja, kojima je ubrizgan, kao što je prethodno opisano, 400nM anti-trombin IgA (konačna koncentracija u krvi, ekvivalentna dozi od približno 6 mg/kg ili PBS, 15 minuta pre izazova pomoću 5% FeCl3u toku 2 minuta. Slika 18A prikazuje rezultate za tipične miševe kojima je ubrizgan PBS (okluzija u roku od 20 minuta) a slike 18B, 18C i 18D prikazuju primere rezultata za miševe tretirane pomoću 400nM anti-trombin IgA (bez okluzije).

Na slici 19 prikazana su trombinska vremena (tj. zgrušavanje sakupljene plazme) sa rastućim koncentracijama IgG i IgA prema predmetnom pronalasku, nakon dodatka 20nM humanog trombina.

Na slici 20 prikazano je vezivanje sintetskog IgG za imobilizovani trombin (na instrumentu ForteBio Octet Red).

Na slici 21 prikazan je tipičan Octet trag za vezivanje 24nM S195A trombina za imobilizovani IgG koji se vidi tokom uključene faze, nakon čega sledi faza isključenja. Crna linija predstavlja fitovanu krivu.

Slika 22 prikazuje Octet trag za 500 nM protrombin gde je vrh napunjen imobilizovanim IgG. Isti uslovi korišćeni su za ovaj eksperiment, kao i za eksperiment sa trombinom na slici 21. Nema dokaza o vezivanju, čak ni pri ovako visokoj koncentraciji.

Eksperimentalni podaci

1. Izolovanje i karakterizacija antitela

Skrining koagulacije izvršen je na uzorku krvne plazme dobijenom od pacijenta. Testovi koagulacije izvršeni su na pacijentu koji je, nakon povrede glave, pretrpeo subduralni hematom. Hematom je spontano nestao bez intervencije. Ne postoji prethodna istorija krvarenja i u poslednje 4 godine od te povrede, nije bilo daljih epizoda krvarenja. Rezultati su prikazani u tabeli 1.

Protrombinsko vreme (PT), aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (APTT) i trombinsko vreme (TT) su bila duža kod pacijenta u poređenju sa kontrolom, ali je reptilazno vreme bilo normalno.

Trombinsko vreme nije korigovano heparinazom, što ukazuje da tretman heparinom ili kontaminacija heparinom nisu odgovorni za ovakve rezultate. Koncentracija fibrinogena kod pacijenta bila je normalna, prema ELISA testu i testu reptilaze. Klausov test dao je veštački nizak nivo fibrinogena usled prisustva inhibitora trombina. Pronađeno je da su produžena PT i APTT vremena zgrušavanja krvi, nakon testa mešanja u kome je korišćen odnos od 50:50 sa plazmom normalnih pojedinaca u pulu. Ovim je pokazano prisustvo inhibitora u uzorku dobijenom od pacijenta.

Pronađeno je da je u plazmi pacijenta visok titar IgA. Pronađeno je da se ovaj IgA molekul vezuje za kolonu sa humanim trombinom (slika 1). Lektin-agaroza koja vezuje IgA povukla je trombin u prisustvu, ali ne i u odsustvu datog IgA. Navedena lektin-agaroza nije povukla protrombin u prisustvu datog IgA, što ukazuje da se IgA specifično vezuje za trombin, ali ne i za protrombin (slika 2).

Zatim je ispitivano mesto vezivanja IgA za trombinski molekul.

Nešto veća brzina hidrolize S2238 trombinom zabeležena je u prisustvu IgA, što ukazuje da IgA ne blokira aktivno mesto trombina (slika 3).

Vezivanje fluorescentno obeleženog hurigena za trombin inhibirano je u prisustvu 700 nM IgA, što ukazuje da se epitop za antitelo preklapa sa mestom vezivanja hirugena na trombinu, odnosno, sa spoljašnjim mestom vezivanja exosite 1 na trombinu (slika 4).

Testirano je dejstvo datog IgA na hidrolizu nekih od trombinskih prokoagulantnih supstrata. Rezultati su prikazani u tabeli 2. Ovi rezultati pokazuju da IgA molekul izolovan iz uzorka dobijenog od pacijenta inhibira više prokoagulantnih aktivnosti trombina.

Inhibicija trombina antitrombinom (AT) u prisustvu navedenog IgA samo je neznatno izmenjena, kako u prisustvu, tako i u odsustvu heparina (tabela 3).

Konstanta disocijacije (Kd) IgA za trombin prvo je procenjena na osnovu brzine hidrolize S2238 na približno 12nM (slika 5). Određeno je da je Kd za vezivanje IgA za S195A trombin (koji je deaktiviran mutacijom katalitičkog serina) 2 nM pomoću ForteBio Octet Red instrumenta (tabela 4).

Prečišćeni IgA je hidrolizovan papainom (slika 6), nakon čega je izolovan Fab fragment i kombinovan sa humanim PPACK-trombinom (PPACK je kovalentni inhibitor aktivnog mesta). Kompleks humani PPACK-trombin-FAB je kristalisan i korišćen za strukturnu analizu. Statistika strukturne analize koja je dobijena je sledeća: rezolucija je 1.9Å; Rfactor = 19,43%; Rfree = 23,42%; jedan kompleks u asimetričnoj jedinici; Ramahandran: favorizovan = 97,0%, ekstremnih vrednosti =0%. Kristalna struktura otkrila je blisko vezivanje HCDR3 sa IgA Fab i mesta exosite 1 na trombinu (slika 7).

Konkretnije, ostaci M32, F34, Q38, E39, L40, L65, R67, R73, T74, R75, Y76, R77a i I82 mesta exosite 1 svi direktno interaguju sa HCDR3 petljom na IgA Fab (slika 8).

PISA analiza površine dodira antitela i trombina pokazala je da je ukupna uronjena površina u kompleksu 1075 Å<2>. Ostaci koji dolaze u dodir, a koji se nalaze na teškom lancu IgA su (Kabatova numeracija): 30, 51, 52a, 53-55, 96, 98, 99, 100, 100a, 100b, 100c, 100d). Ovo su sve ostaci u CDR regionima: CDRH1 - GYTLTEAAIH; CDRH2 -GLDPQDGETVYAQQFKG; CDRH3 - GDFSEFEPFSMDYFHF (podvučeni ostaci su u dodiru). Pronađeno je da je najbitniji region CDRH3, jer on obezbeđuje 85% uronjene površine na antitelu. Laki lanac ostvaruje jedan marginalni kontakt preko Tyr49, neposredno pre CDRL2 (sa Ser36a u trombinu). Neki pojedinačni doprinosi uronjenoj površini su: Glu9954Å<2>, Phe100 134,8 Å<2>, Glu100a 80,6 Å<2>, Phe100c 141,7 Å<2>.

Pronađeno je da su ostaci koji ostvaruju kontakt u trombinu (himotripsinska numeracija): 32, 34, 36a-40, 65, 67, 73-76,77a, 82 i 151. Najvažniji pojedinačni doprinosi uronjenoj površini su: Gln3886,4 Å<2>, Arg7344,5 Å<2>,Thr7460,1 Å<2>, Tyr7678,4 Å<2>, Arg77a 86,9 Å<2>.

Pacijent nije pokazivao povećano ili abnormalno krvarenje, uprkos koncentraciji ovog IgA u njegovoj cirkulaciji od 3 g/l, što ukazuje da ovo antitelo inhibira trombin a pritom ne deluje na normalnu hemostazu.

2. Efekat IgA na životinjski model tromboze

C57BL/6 miševi su anestezirani. U karotidnu arteriju uveden je kateter (za složene injekcije). U karotidnu arteriju ubrizgan je fibrinogen obeležen FITC (2mg/ml). PBS (kontrola) ili IgA takođe su ubrizgani u karotidnu arteriju. Femoralna vena je otkrivena te je primenjen 10% FeCl3(zasićeni papir za blot, dužine 3 mm) u toku 3 minuta, kako bi se pokrenulo zgrušavanje.

Snimljene su slike sa fluorescentne mikroskopije duž mesta povrede, 0, 5, 10 i 20 minuta nakon povrede ferihloridom, pomoću tehnika fluorescentne mikroskopije.

Ugrušci (naslage fibrina) u femoralnoj veni bili su jasno vidljivi kao osvetljena mesta (slika 9). Uočeno je da najniža doza antitela dovodi do značajne inhibicije stvaranja ugruška, ali, kako je doza rasla, stvaranje ugruška je prestalo (slike 10 do 15).

Takođe su merena vremena krvarenja miševa. Vremena krvarenja ocenjivana su merenjem vremena do prestanka krvarenja nakon isecanja repa. Uprkos prisustvu jednog uzorka sa ekstremnim odstupanjem, pronađeno je da na vreme krvarenja ne utiče tretman antiexosite 1 IgA molekulom (slika 16).

Ovi rezultati pokazuju da je anti-exosite 1 IgA antitelo moćan inhibitor tromboze, ali da nema nikakvo dejstvo na vreme krvarenja.

3. Test sa isecanjem repa

Test sa isecanjem repa izvršen je na mužjacima C57BL/6 miševa divljeg tipa kojima je ubrizgan ili 400 nM IgA (konačna koncentracija u krvi, ekvivalentna dozi od približno 6 mg/kg) ili PBS. Praćen je gubitak krvi u toku 10 minuta nakon što je rep isečen na mestu gde mu je prečnik 3 mm, 15 minuta nakon injekcije. Pronađeno je da tretman anti-exosite 1 IgA antitelom ne utiče na ukupan gubitak krvi (slika 17).

4. Okluzija karotidne arterije nakon povrede ferihloridom

Ispitivanje okluzije karotidne arterije nakon povrede ferihloridom izvedeno je na mužjacima C57BL/6 miševa divljeg tipa starim 9 nedelja. Miševima je ubrizgan 400nM anti-IIa IgA (konačna koncentracija u krvi, ekvivalentna dozi od približno 6 mg/kg) ili PBS, 15 minuta pre povrede 5% FeCl3u toku 2 minuta. Zatim je praćen protok krvi pomoću Dopler aparata i mereno vreme do okluzije. „Krvni ugrušak” se definiše kao stabilan okluzivni tromb, pri kojem se protok krvi usporava na vrednost koja je obično manja od 0,1 ml/min i ostaje na toj vrednosti. Kod kontrolnih miševa, pronađeno je da se krvni ugrušak formira oko 20 minuta nakon izazova (slika 18A). Međutim, većina miševa tretiranih 400nM anti-IIa IgA antitelom nije mogla da formira stabilne krvne ugruške, a njihovi snimci pokazuju da su se krvni ugrušci brzo razložili, da su se razlagali više puta ili da se nikada nisu formirali. Tri reprezentativna snimka prikazana su na slikama 18B do 18D.

5. Anti-exosite 1 IgG

IgA molekul koji je identifikovan kod pacijenta, kao što je prethodno opisano, reformatiran je u IgG pomoću standardnih tehnika.

Vreme koagulacije humane plazme sakupljene u pul od više uzoraka pokazalo je oštar maksimum sa rastućim količinama originalnog IgA, a novi IgG je testiran nakon dodatka humanog trombina do koncentracije od 20 nM (slika 19). I matični IgA i sintetički IgG povećali su vreme do nastanka krvnog ugruška na identičan način zavisan od koncentracije, čime se ukazuje da imaju identičan afinitet za trombin.

Ovo je potvrđeno merenjem vezivanja sintetskog IgG za imobilizovani S195A trombin pomoću ForteBio<TM>Octet Red instrumenta. Trombin je vezan za sondu, nakon čega je praćeno vezivanje antitela (u različitim koncentracijama). Određene su brzine vezivanja i disocijacije. Oba antitela pokazala su slične brzine vezivanja od 3x10<5>M<-1>s<-1>i brzine disocijacije od približno 5x10<-4>s<-1>, sa konstantama disocijacije (Kd) od približno 2 nM. Kd vrednosti od približno 2 nM dobijene su i za IgA i IgG antitela analizom ravnotežnog stanja (steady-state) (tabela 4). Reprezentativna kriva ravnotežnog stanja prikazana je na slici 20. Svojstva IgA antitela su, dakle, reprodukovana na IgG okviru.

Vezivanje protrombina za IgG antitelo ispitano je pomoću Octet sistema na imobilizovanom IgG. Trombin se vezivao za imobilizovani IgG brzinom i sa afinitetom približno jednakim onim koji su dobijeni za imobilizovani trombin (tabela 4); protrombin se nije vezivao za IgG. Slika 1 prikazuje snimak 24 nM trombina koji se vezuje za i disosuje sa imobilizovanog IgG. Slika 22 prikazuje isti eksperiment sa 500 nM protrombinom, gde se ne vide nikakvi dokazi vezivanja.

Sekvence

Aminokiselinska sekvenca humanog protrombina (Sekv. sa ID br. 1; GeneID: 2147; NP_000497.1 GI: 4503635; mesto exosite 1 je podvučeno)

Aminokiselinska senvekca anti-exosite 1 IgA i IgG VH domena, označenog Kabatovom šemom numeracije (CDR regioni su podvučeni): (Sekv. sa ID br.2)

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG HCDR1 (Sekv. sa ID br.3).

GYTLTEAAIH

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG HCDR2 (Sekv. sa ID br.4) GLDPQDGETVYAQQFKG

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG HCDR3 (Sekv. sa ID br.5) GDFSEFEPFSMDYFHF

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG VL domena označena Kabatovom šemom numeracije: (Sekv. sa ID br.6)

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG LCDR1 (Sekv. sa ID br.7) RASQNVSSFLA

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG LCDR2 (Sekv. sa ID br.8) DASSRAT

Aminokiselinska sekvenca anti-exosite 1 IgA i IgG LCDR3 (Sekv. sa ID br.9) QQRRSWPPLT

Tabela 1 - Rezultati skrininga koagulacije

Tabela 2 - Dejstvo anti-exosite 1 IgA antitela na hidrolizu prokoagulantnih supstrata trombinom

Tabela 3 - Dejstvo zasićene koncentracije anti-exosite 1 IgA antitela (Fab) na inhibiciju trombina antitrombinom (AT) u odsustvu i prisustvu 1 nM heparina (Hep)

Tabela 4 - Konstante vezivanja anti-exosite 1 IgA antitela (n=1 pod ovim konkretnim uslovima), IgG antitela (n=3) i FAB dobijenih iz IgG za S195A trombin (aktivno mesto slobodno, rekombinantni trombin) * Kd utvrđena iz analize ravnotežnog stanja odgovora naspram koncentracije # Kd izračunata iz brzina određena pomoću imobilizovanog FAB

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Izolovani molekul antitela koji se specifično vezuje za region exosite 1 na trombinu, naznačen time što navedeni molekul antitela sadrži VH domen koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br.3, 4 i 5, redom, i VL domen koji sadrži LCDR2 i LCDR3 koji imaju sekvence iz Sekv. sa ID br.8 i 9, redom i LCDR1 koji ima sekvencu iz Sekv. sa ID br.7 ili LCDR1 koji ima sekvencu iz Sekv. sa ID br.7 u kojoj je mesto glikozilacije izbačeno mutacijom, tako što je uvedena supstitucija aminokiselinskog ostatka koji odgovara S30 u Sekv. sa ID br.6.

2. Molekul antitela prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što inhibira aktivnost trombina.

3. Molekul antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačen time što navedeni molekul antitela ima VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.2.

4. Molekul antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedeni molekul antitela ima VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br. 6 ili aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.6 u kojoj je mesto glikozilacije izbačeno mutacijom, tako što je uvedena supstitucija na aminokiselinskom ostatku koji odgovara S30.

5. Molekul antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je celo antitelo.

6. Molekul antitela prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što je IgA ili IgG.

7. Molekul antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je monoklonsko antitelo.

8. Molekul antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je fragment antitela.

9. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži molekul antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 8 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

10. Molekul antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za upotrebu u postupku tretmana ljudskog ili životinjskog organizma.

11. Molekul antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za upotrebu u postupku tretmana stanja u kojem posreduje trombin, izabranog iz grupe koja se sastoji od tromboze i embolije.