RS56852B1

RS56852B1 - Terapija na osnovu proteina i dijagnoza patologije u kojoj posreduje tau u alchajmerovoj bolesti

Info

Publication number: RS56852B1
Application number: RS20180054A
Authority: RS
Inventors: Michal Noväk; Eva Kontsekovä; Branislav Kovácech; Norbert Zilka
Original assignee: Axon Neuroscience Se
Priority date: 2011-09-19
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2018-04-30
Also published as: RU2014115481A; SMT201800109T1; JP6360869B2; SG10201912964PA; TR201800669T4; US9518101B2; KR102130439B1; IL274440B; JP6253583B2; BR112014006376A2; US11098106B2; SG10201703771WA; JP2017042172A; KR20210099167A; CN115417916B; IL287794A; JP6950981B2; IL259775B; CL2015001314A1; HRP20180083T1

Description

Opis

OBLAST

[0001] Ovde su opisani metodi na osnovu proteina (npr., antitela, peptidi) i sredstva za intervenisanje u proizvodnji i klirensu određenih formi tau koje su uključene u izazivanje i/ili razvoj patoloških tau-tau agregata u Alchajmerovoj bolesti, kao i metodi za dobijanje antitela na tau, koja su korisna u dijagnostikovanju i lečenju Alchajmerove bolesti. Ovaj opis se dalje odnosi na metode i sredstva za dijagnostikovanje Alchajmerove bolesti, uključujući metode za određivanje stepena i procenjivanje napretka lečenja.

STANJE TEHNIKE

[0002] Alchajmerova bolest (AD) je progresivan neurodegenerativan poremećaj koji uništava više strukture mozga, kao što su one uključene u memoriju i kogniciju. Ova bolest dovodi do deficita u kognitivnoj funkciji i propadanja memorije, učenja, jezika i sposobnosti da se vrše voljni i svrsishodni pokreti. AD prati i ponašajna, emocionalna, interpersonalna i socijalna deterioracija. Ovi kognitivni i bihejvioralni deficiti čine život teškim (Burns et al., 2002). Pacijenti u poodmaklom stadijumu AD su često nesposobni da govore, razumeju jezik i da se bazično brinu o sebi, u krajnjem ishodu zahtevajući negu sve vreme i superviziju i često zavise od članova porodice i ustanova za negu. AD je vodeći uzrok senilne demencije i predviđen je porast u prevalenciji, jer udeo starih osoba u populaciji raste. Predviđen je porast ukupnog broja osoba sa AD bar tri puta negde između 2000. i 2050., čineći AD svetskim zdravstvenim problemom (Sloane et al., 2002). Kliničko bavljenje/upravljanje Alchajmerovom bolešću ostaje u velikoj meri suportivno. Odnosno, pacijentima se pružaju tretmani usmereni na prevenciju, kontrolu ili olakšavanje komplikacija i bočnih efekata AD i za poboljšanje njihovog komfora i kvaliteta života. Još uvek postoji neodgovorena potreba za tretmanima koji su direktno usmereni na procese bolesti i koji imaju efekte modifikovanja bolesti.

[0003] AD je histološki okarakterisan prisustvom vanneuronskih plakova i unutarćelijske i vanćelijske neurofibrilarne klubadi u mozgu. Plakovi se pretežno sastoje od β amiloida (Aβ), dok klubad sadrže patološke forme tau, kao što su patološki tau konformeri i njihovi agregati. Veza između plakova i klubadi i procesa bolesti ostaje nejasna, mada studije sugerišu vezu između amiloida i tau patogeneze (Hardy et al., 1998; Oddo et al., 2004; Rapoport et al., 2002; Roberson, et al., 2007; Shipton et al., 2011). Centralna uloga Aβ u AD patologiji je prvo bila predložena u hipotezi nazvanoj "Aβ kaskada", gde posle Aβ deponovanja sledi tau fosforilacija i stvaranje klubadi, a zatim umiranje neurona (Hardy i Allsop, 1991; Hardy i Selkoe, 2002; za pregled, videti Walsh i Selkoe, 2004; videti i Seabrook et al.2007). U skladu s tim, prvi terapijski pristupi AD su bili fokusirani prvenstveno na ciljanje Aβ. Međutim, postoji dokumentovan nedostatak korelacije između stepena moždane Aβ patologije u AD pacijentima i kliničkog napredovanja bolesti (Braak i Braak, 1991). Pored toga, kod asimptomatskih osoba se pokazalo u autopsiji ekstenzivno, često difuzno, taloženje amiloida (Braak i Braak, 1991) i, bar u ranoj fazi AD, gubitak neurona i taloženje amiloida se javljaju u različitim regionima mozga (Carter i Lippa, 2001). Prema tome, ciljanje samo Aβ ne može biti dovoljno da promeni tok bolesti u bilo kom ili u svim pacijentima. Ipak, najnaprednije terapije koje ciljaju bolest koje su u kliničkim ispitivanjima na AD pacijentima ostaju one usmerene na proizvodnju i klirens Aβ. Ove terapije uključuju pasivne imunoterapije, npr., BAPINEUZUMAB, SOLANEUZUMAB i PONEZUMAB, kao i mali molekul inhibitora gama-sekretaze SEMAGACESTAT (za pregled, videti Citron et al., 2010).

[0004] Prepoznata uloga tau u AD patologiji je pokazana u brojnim studijama. Na primer, Braak je pokazao da je najbliži korelat neurodegeneraciji u AD prisustvo tau klubadi, a ne amiloidnih plaka (Braak i Braak, 1991). U jednoj drugoj studiji, izgledalo je da Aβ neurotoksičnost u gajenim neuronima zavisi od tau (Rapoport et al., 2002). Nedavno, smanjenje endogenog tau je sprečilo ponašajne deficite u transgenim miševima koji su eksprimirali humani protein prekursor amiloida, bez menjanja njihovog visokog nivoa Aβ (Roberson et al., 2007). Smanjenje tau je zaštitilo i transgene i netransgene miševe od ekscitotoksičnosti. Id. Santacruz et al. su demonstrirali da je smanjenje količine tau obnovilo memorjsku funkciju u modelu tauopatije (Santacruz et al., 2005). Dakle, terapije usmerene na smanjenje tau mogu da predstavljaju efektivnu strategiju za tretiranje AD i drugih oboljenja vezanih za tau.

[0005] Tau pripada familiji intrinsično poremećenih proteina, koje odlikuje odsustvo krute trodimenzione strukture u njihovom fiziološkom okruženju (Zilka et al., 2008) Međutim, skraćenje i hiperfosforilacija tau mogu da izazovu patološke transformacije od intrinsično poremećenog stanja do mnogih rastvorljivih i nerastvorljivih duplo poremećenih struktura, uključujući sparene helične filamente (PHF) i druge agregate (Wischik et al., 1988a; Wischik et al., 1988b; Novak et al., 1993; Skrabana et al., 2006; Zilka et al., 2008; Kovacech et al., 2010). Ove strukturne promene dovode do toksičnog porasta funkcije, do gubitka fiziološke funkcije nativnog proteina, ili oba (Zilka et al., 2008; Kovacech et al., 2010).

[0006] Fiziološka funkcija tau je posredovanje u udruživanju tubulinskih monomera u mikrotubule koje konstituišu neuronsku mikrotubularnu mrežu (Buee et al., 2000). Tau se vezuje za mikrotubule preko ponovljenih regiona lociranih u C-terminalnom delu proteina. Id. Ovi ponovljeni domeni (R1-R4), nisu identični među sobom, nego sadrže visoko konzervisane 31-32 aminokiseline (Taniguchi et al., 2005b). U mozgu čoveka, postoji šest jedinstvenih izoformi tau, koje se razlikuju među sobom po prisustvu, odnosno odsustvu određenih aminokiselina u N-terminalnom delu tau, u kombinaciji sa tri (R1, R3, i R4) ili četiri (R1-R4) ponovljena domena, na C-kraju proteina. Videti i Sl. 1, koja pokazuje šest humanih izoformi (2N4R, 1 N4R, 2N3R, 0N4R, 1 N3R i 0N3R). Predloženo je da je najpotentniji deo tau u indukciji polimerizacije mikrotubula 274-KVQIINKK-281 region (SEQ ID NO: 113), koji se preklapa sa R1-R2. Id. Pored toga, izgleda da na patološke i fiziološke funkcije tau utiče specifična strukturna konformacija i intrinsično poremećena struktura, koju usvoje izoforme celog proteina i njihovi fragmenti. Na primer, Kontsekova et al. su opisali konformacioni region (koji obuhvata ostatke 297-IKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSL-325 (SEQ ID NO: 114)) unutar određenih skraćenih tau molekula koji ima značajnu vezu sa funkcijom onih skraćenih tau molekula u sastavu mikrotubula (WO 2004/007547).

[0007] Pored njihove fiziološke uloge, veruje se da tau ponovci učestvuju u formiranju patoloških tau agregata i drugih struktura. Prema tome, postoji potreba za terapijskim i dijagnostičkim pristupima koji su usmereni na tau i koji su sposobni da diskriminišu fiziološke i patološke aktivnosti u kojima posreduju ponovci. Na primer, jezgro patoloških sparenih heličnih filamenata (PHF) otporno na pronazu se sastoji od mikrotubularnih regiona vezivanja od tau izoformi sa 3 i 4 ponovka (Jakes et al., 1991; Wischik, et al. 1988a; Wischik, et al. 1988b). Dalje, Novak et al. su pokazali da je jezgro PHF otporno na pronazu, koje je dugo 93-95 aminokiselina, ograničeno na tri tandemska ponovka (Novak et al., 1993). Von Bergen et al. su odredili minimalan motiv tau peptid interakcije (306-VQIVYK-311; SEQ ID NO: 115), kao i drugo mesto na tau (275-VQIINK-280) (SEQ ID NO: 116), koji formiraju beta ravan i opisani su kao potencijalno odgovorni za iniciranje formiranja PHF, patoloških tau agregata (Von Bergen et al., 2000; EP 1214598; WO 2001/18546). Videti Sl. 2 za funkcionalnu mapu tau. Sledstveno tome, sadašnje strategije su usmerene na pravljenje lekova protiv agregiranja a koji ne remete unutarćelijsku ulogu tau u stabilizaciji mikrotubula.

[0008] Štaviše, smatra se da je pod fiziološkim okolnostima tau unutarćelijski citoplazmatski protein, unutarćelijski tau se može osloboditi u vanćelijski prostor i doprineti neurodegeneraciji (Gómez-Ramos et al., 2006). Zaista, gubitak neurona je povezan sa topografskom distribucijom neurofibrilarne klubadi (napravljene od tau proteina) u mozgovima pacijenata sa AD (West et al., 1994; Gomez-Isla et al., 1996, 1997). Dalje, nivoi ukupnog tau i fosforilisanog tau su povećani u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) pacijenata sa AD (Hampel et al., 2010) i vanćelijski tau je opisan kao "sablasna klubad" u mozgu (Frost i Diamond, 2009), ukazujući na to da je unutarćelijski tau oslobođen u vanćelijski prostor. Pored toga, vanćelijski agregati tau mogu da uđu u ćelije i stimulišu fibrilizaciju unutarćelijskog tau, rasejavajući dalje tau monomer za proizvodnju patoloških tau agregata (Frost et al., 2009). Takve studije su naglasile da vanćelijski, nerastvorljiv tau može da deluje kao prenosivi agens za širenje tau patologije kroz ceo mozak na način kao prioni (Frost et al., 2009; Frost i Diamond, 2009). Klirens vanćelijske klubadi tau može da smanji vanćelijsku i unutarćelijsku patologiju vezanu za tau. Videti, npr., Asuni et al., 2007. Prema tome, postoji potreba za tretmanima koji su sposobni da smanje vanćelijski tau, bilo sprečavanjem njegovog stvaranja, bilo podsticanjem njegovog klirensa, ili oba, kao i za tretmanima koji smanjuju unutarćelijski "bolestan" (vezan za bolest) tau.

[0009] Sve u svemu, iako izgleda da tau igra patološku ulogu u kliničkoj manifestaciji AD, razvoj lekova koji rade protiv tau je bio spor, delimično zbog važnosti tau u fiziološkoj dinamici mikrotubula i zbog njegove kompleksne biologije (Dickey i Petrucelli, 2006). Međutim, povećano razumevanje molekulskih mehanizama koji leže u osnovi patoloških transformacija tau je otvorilo mogućnost specifičnog ciljanja patoloških modifikacija tau u terapijske svrhe. Kao rezultat, pojavio se veliki broj terapijskih pristupa koji direktno ili indirektno target ciljaju tau kaskadu (za pregledne članke, videti, npr. Dickey and Petrucelli, 2006; Schneider and Mandelkow, 2008; Zilka et al., 2008), uključujući jedinjenja koja sprečavaju ili obrću smer tau agregiranja (Wischik et al., 1996; Necula et al. 2005; Pickhardt et al., 2005; Taniguchi et al., 2005a; Larbig et al., 2007), lekove tipa malih molekula koji inhibiraju tau kinaze ili aktiviraju tau fosfataze (Iqbal and Grundke-lqbal, 2004; Noble et al., 2005; Iqbal and Grundke-Iqbal, 2007), lekove koji stabilišu mikrotubule (Zhang et al., 2005), lekove koji olakšavaju proteolitičku degradaciju pogrešno savijenih tau proteina (Dickey et al., 2005, Dickey et al. 2006; Dickey i Petrucelli, 2006), i imunosupresivne lekove (Zilka et al., 2008), kao i imunoterapijske strategije koje uključuju aktivnu i pasivnu imunizaciju (Schneider and Mandelkow et al., 2008; Zilka et al., 2008: Tabira, T. Immunization Therapy for Alzheimer disease: A Comprehensive Review of Active Immunization Strategies. Tohoku J. Exp. Med., 220: 95-106 (2010)).

[0010] Uopštenije, nova monoklonska antitela (mAb) ulaze u kliničke studije u stepenu od preko 40 godišnje od 2007. Na kraju 2010., bar 25 mAb-ova i pet Fc fuzionih proteina je bilo u fazi 2/3 ili fazi 3 kliničkih studija u SAD (Reichert, 2011). Ova tendencija demonstrira da je pasivna imunoterapija rastući pristup u lečenju humanih poremećaja, uključujući AD. Videti, npr., Citron et al., 2010. U stvari, iako se tretmani AD suočavaju sa preprekom prolaženja kroz krvno-moždanu barijeru (BBB), rastući broj predkliničkih i kliničkih studija nalazi da terapije posredovane antitelima mogu da očiste mozak od AD agregata i predlažu više mehanizama akcije, kao što su (i) uvođenje antitela u mozak putem promenjene permeabilnosti BBB u AD, ili propuštanja BBB; (ii) rad antitela kao "perifernih odvoda" za rastvorljive vrste amiloida koje prave plakove; (iii) ulaz ćelija koje sekretuju antitelo sa perifeije u mozak, isporučujući antitela lokalno i (iv) transport IgG unutar i među ćelijama. Videti, npr., Citron et al., 2010 i Asuni et al., 2007, za pregled. U skladu s tim, terapijska antitela koja gađaju bolesne oblike tau predstavljaju perspektivan pristup za lečenje i/ili dijagnostikovanje AD i drugih tauopatija (WO 2004/007547, US2008/0050383).

[0011] Jedan od imunoterapijskih pristupa usmerenih na tau patologiju se zasniva na pojmu da antitela na tau mogu da spreče agregiranje tau, uklone tau agregate, ili oba. Iako su studije opisale antitela koja se vezuju za sekvence tau i neka od tih antitela navodno interferiraju sa agregiranjem i klirensom tau (Asuni et al., 2007), još nije prijavljeno nijedno monoklonsko antitelo na tau koje je podvrgnuto in vivo predkliničkom ili kliničkom ispitivanju u AD. Zaista, predviđeno je da mAb ima tri vezivna mesta u okviru mišjeg tau domena za vezivanje mikrotubula (naime, na R3, R4 i možda R1), ali ono nije blokiralo vezivanje mikrotubula. (Dingus et al., 1991). Dingus nije opisao ulogu ovog antitela u agregiranju tau i prema tome, nema razloga da se veruje da će Dingus blokirati agregiranje tau. U drugim radovima, napravljeni su mAb-ovi su koji razlikuju tau izoforme, ali opet, nema sugestija da će oni imati bilo kakav efekat na agregiranje tau (DeSilva et al., 2003; Ueno et al., 2007). Taniguchi et al. su demonstrirali da određeni mAb-ovi na R1 ili R2, inhibiraju agregiranje tau u PHF in vitro, dok podstiču udruživanja tubulina koja indukuje tau (Taniguchi et al., 2005b). Taniguchi-jeva antitela RTA-1 i RTA-2 su se specifično vezivala za R1 i R2, respektivno. Nijedno antitelo se nije vezalo za više od jednog tau ponovka i navodno nijedno nije testirano na in vivo efekte bilo na agregiranje, bilo na klirens tau. Uprkos postojanju bar tri antitela na amiloid u kliničkim ispitivanjima terapije AD na osnovu pasivne imunizacije (tj., one u kojoj se pacijentu administriraju antitela), još nema izveštaja kliničkog testiranja pasivne imunoterapije za AD na bazi tau.

[0012] Pristup aktivne imunizacije (tj., onaj u kom telo samog pacijenta generiše imunitet na određenu metu) se pokazao efektivan u uklanjanju Aβ depozita i u oporavljanju neuropatoloških lezija u nekoliko studija AD sa APP-transgenim mišem (videti, npr. Schenk et al., 1999; Janus et al., 2000; Morgan et al., 2000; Sigurdsson et al., 2001). Nedavno je aktivna imunoterapija sa fosforilisanim tau epitopom (Tau 379-408 [P-Ser 396, 404]) smanjila nivo agregiranog tau u mozgu i usporila napredak ponašajnog fenotipa u mišjim modelima patologije na bazi klubadi tau (Asuni et al., 2007; Boutajangout et al. 2010; US2008/0050383; US/2010/00316564). Tretirane životinje su proizvodile antitela na tau, koja su detektovana u mozgu i kolokalizovana sa antitelima koja prepoznaju patološki tau (Asuni et al., 2007). Ovaj imunoterapijski pristup je suštinski efektivniji u ranim fazama funkcionalnih poremećaja u životinjama (5 meseci) nego u kasnijim fazama (8 meseci), sugerišući da klirens u ranim fazama patološkog tau može biti od terapijske koristi (Asuni et al., 2007; Zilka et al., 2008). Zaista, postoji svest o tome da nije sav tau podložan ili možda čak pogodan za razbijanje i klirens. Neki su sugerisali da bi razbijanje agregata tau moglo da poveća količinu toksičnih intermedijarnih vrsta, dok su drugi sugerisali da detektabilni agregati tau nisu nužno toksični i da čak mogu da igraju protektivnu ulogu (Lee et al., 2005). Prema tome, iako su se imunoterapijski pristupi gađanju tau pokazali kao predklinički obećavajući, još uvek postoji potreba za terapijama koje specifično ciljaju rane, aberantne forme tau, čija eliminacija dovodi do poboljšane, trajne koristi. Ipak, još uvek postoji i potreba da se identifikuju one vrste tau koje su pogodne mete za imunoterapiju.

[0013] U tom cilju, još jedna stvar koja treba da se uzme u obzir u razvijanju mAb na tau je identifikacija i karakterizacija različitih strukturnih formi tau (fiziološke, u ranoj bolesti, u poodmakloj bolesti) i faze tau patologije koje se ciljaju. Oddo et al. su uočili da dok je Aβ imunoterapija uklonila Aβ plakove i ranu tau patologiju u modelu AD transgenog miša, zreli agregati tau su ostali intaktni (Oddo et al., 2004). Slično, genetsko (ne imunoterapijsko) smanjenje ekspresije tau u P301L tau modelu tauopatije je poboljšalo memoriju, čak iako je neurofibrilarna klubad nastavila da se akumulira (Santacruz et al., 2005).

[0014] Uprkos njenoj prevalenciji, AD ostaje najveća neispunjena medicinska potreba u neurologiji (Citron, 2010). Najzastupljeniji medicinski pristup je obezbeđivanje simptomatske terapije, koja nije efikasna čak i posle nekoliko godina lečenja. Novi terapijski pristupi i strategije za AD zahtevaju da se ide dalje od lečenja simptoma, da bi se sprečilo kognitivno opadanje i da bi se suprotstavilo fundamentalnim patološkim procesima bolesti. Konkretno, postoji potreba za razvijanjem molekula koji, bilo sami, bilo u kombinaciji sa drugim lekovima usmerenim na AD, interferiraju u bar nekoj od najranijih faza bolesti. Takvi molekuli bi obezbedili nove, preimućstvene opcije u ranoj dijagnostici (što bi samo po sebi popravilo ishode lečenja), prevenciji i lečenju AD.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

[0015] Predmet pronalaska je definisan patentnim zahtevima.

[0016] U jednom izvođenju, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo, gde se to antitelo vezuje za jedan ili više tau epitopa i sposobno je za dva ili više od sledećih:

a) ispoljavanje većeg afiniteta za patološki tau nego za fiziološki tau;

b) inhibiranje agregacija tau i

c) posredovanje u preuzimanju i razgradnji patološkog tau proteina koji vrše mikroglije; i gde svaki tau epitop sadrži region za podsticanje agregiranja tau.

[0017] U jednom izvođenju, ovo izolovano antitelo je takvo da je svaki od jednog ili više epitopa nezavisno odabran od epitopa u okviru:

i. pozicija 267-273 ili ostataka KHQPGGG (SEQ ID NO: 98), u odnosu na tau441;

ii. pozicija 298-304 ili ostataka KHVPGGG (SEQ ID NO: 99), u odnosu na tau441iii. pozicija 329-335 ili ostataka HHKPGGG (SEQ ID NO: 100), u odnosu na tau441i iv. pozicija 361-367 ili ostataka THVPGGG (SEQ ID NO: 101), u odnosu na tau441.

[0018] U određenim izvođenjima, izolovano antitelo, koje ima osobine opisane u rešenjima u prethodnim pasusima, sposobno je da se veže za jednu ili više formi patološkog tau odabranu od pogrešno uređenih tau, duplo poremećenih tau, tau nerastvorljivih u sarkozilu, neurofibrilarne klubadi, neuropilnih niti i neuritskih plakova iz biopsije mozga humanog pacijenta sa Alchajmerovom bolešću, iz uzorka mozga životinjskog modela Alchajmerove bolesti, ili iz oba. U određenim izvođenjima, izolovano antitelo je takvo da je bar jedan od epitopa koji ono prepoznaje konformacioni epitop.

[0019] U jednom izvođenju, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo, gde se to antitelo vezuje za jedan ili više tau epitopa i sposobno je za dva ili više od sledećih:

a) ispoljavanje većeg afiniteta za patološki tau nego za fiziološki tau;

b) inhibiranje agregacija tau i

[0020] U jednom izvođenju, ovo izolovano antitelo je takvo da je svaki od jednog ili više epitopa nezavisno odabran od epitopa u okviru:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441;

ii. pozicija 299-304 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441iii. pozicija 330-335 ili ostataka HKPGGG (SEQ ID NO: 224), u odnosu na tau441i iv. pozicija 362-367 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441.

[0021] U jednom izvođenju, ovo izolovano antitelo je takvo da je svaki od jednog ili više epitopa koje ono vezuje nezavisno odabran od epitopa u okviru:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441;

ii. pozicija 299-304 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441iii. pozicija 330-335 ili ostataka HKPGGG (SEQ ID NO: 224), u odnosu na tau441i iv. pozicija 362-367 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441; i antitelo sadrži:

a) varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži:

i. QSLLNSRTRKNY (SEQ ID NO: 117) ili SEQ ID NO: 247 za CDR1; ii. WAS (SEQ ID NO: 118) ili SEQ ID NO: 253 za CDR2 i

iii. KQSFYLRT (SEQ ID NO: 119) ili bilo koju od SEQ ID NO: 255, 257, 258, 259 i 260 za CDR3 i

b) varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži:

iv. GYIFTDYVIS (SEQ ID NO: 120), SEQ ID NO: 261, ili SEQ ID NO: 262 za CDR1;

v. IFPRSGST (SEQ ID NO: 121), SEQ ID NO: 264, ili SEQ ID NO: 265 za CDR2 i

vi. ARDYYGTSFAMDY (SEQ ID NO: 122), SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, ili SEQ ID NO: 269 za CDR3.

[0022] Ovde je obezbeđeno izolovano antitelo, gde se navedeno antitelo vezuje za jedan ili više epitopa na tau na konformaciono specifičan način, gde:

a) je svaki od jednog ili više epitopa nezavisno odabran od epitopa u okviru:

i. pozicija 267-273 ili ostataka KHQPGGG (SEQ ID NO: 98), u odnosu na tau441; ii. pozicija 298-304 ili ostataka KHVPGGG (SEQ ID NO: 99), u odnosu na tau441iii. pozicija 329-335 ili ostataka HHKPGGG (SEQ ID NO: 100), u odnosu na tau441i iv. pozicija 361-367 ili ostataka THVPGGG (SEQ ID NO: 101), u odnosu na tau441; b) nula, jedan, dva, ili tri od epitopa su linearni epitopi i

c) jedan, dva, tri ili četiri od epitopa su konformacioni epitopi.

[0023] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo, gde se navedeno antitelo vezuje za jedan ili više epitopa na tau na konformaciono specifičan način, gde:

a) je svaki od jednog ili više epitopa nezavisno odabran od epitopa u okviru:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441; ii. pozicija 299-304 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441iii. pozicija 330-335 ili ostataka HKPGGG (SEQ ID NO: 224), u odnosu na tau441i iv. pozicija 362-367 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441. b) nula, jedan, dva, ili tri od epitopa su linearni epitopi i

c) jedan, dva, tri ili četiri od epitopa su konformacioni epitopi.

[0024] U jednom izvođenju, ovo antitelo je DC8E8, gde je DC8E8 antitelo koje je proizveo hibridom deponovan kod American Type Culture Collection patentnim depozitom br. PTA-11994.

[0025] U određenim izvođenjima, izolovano antitelo se vezuje za jedan ili više istih epitopa na tau kao oni za koje se vezuje DC8E8. U jednom izvođenju, izolovano antitelo je u kompeticiji sa monoklonskim antitelom DC8E8 za vezivanje tau.

[0026] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovano antitelo koje sadrži u domenu za vezivanje epitopa jednu ili više sekvenci regiona koji određuje komplementarnost (CDR) odabranu od:

i. QSLLNSRTRKNY (SEQ ID NO: 117)

ii. WAS (SEQ ID NO: 118)

iii. KQSFYLRT (SEQ ID NO: 119)

iv. GYIFTDYVIS (SEQ ID NO: 120)

v. IFPRSGST (SEQ ID NO: 121) i

vi. ARDYYGTSFAMDY (SEQ ID NO: 122).

[0027] Pronalazak takođe obezbeđuje da bilo koje od antitela opisanih u bilo kom izvođenju opisanom u prethodnim paragrafima može da bude takvo da izolovano antitelo sadrži:

a) varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži:

i. QSLLNSRTRKNY (SEQ ID NO: 117) za CDR1;

ii. WAS (SEQ ID NO: 118) za CDR2, i

iii. KQSFYLRT (SEQ ID NO: 119) za CDR3, i

b) varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži:

iv. GYIFTDYVIS (SEQ ID NO: 120) za CDR1

v. IFPRSGST (SEQ ID NO: 121) za CDR2, i

vi. ARDYYGTSFAMDY (SEQ ID NO: 122) za CDR3.

[0028] Pronalazak takođe obezbeđuje da bilo koje od antitela opisanih u prethodnim izvođenjima može da bude takvo da izolovano antitelo sadrži:

a) jednu ili više sekvenci CDR-ova lakog lanca iz monoklonskog antitela DC8E8 ili jednu ili više sekvenci koja ima bar 80%, 90%, ili 95% identičnosti, posle optimalnog poravnjavanja, sa jednom od ovih CDR-ova lakog lanca, i

b) jednu ili više sekvenci CDR-ova teškog lanca iz monoklonskog antitela DC8E8 ili jednu ili više sekvenci koja ima bar 80%, 90%, ili 95% identičnosti, posle optimalnog poravnjavanja, sa jednom od ovih CDR-ova teškog lanca

i gde:

i. CDR-ovi lakog lanca sadrže sekvencu odabranu od QSLLNSRTRKNY (SEQ ID NO: 117), WAS (SEQ ID NO: 118) i KQSFYLRT (SEQ ID NO: 119), i

ii. CDR-ovi teškog lanca sadrže sekvencu odabranu od GYIFTDYVIS (SEQ ID NO: 120), IFPRSGST (SEQ ID NO: 121), i ARDYYGTSFAMDY (SEQ ID NO: 122).

[0029] Bilo koje od antitela opisanih u prethodnim izvođenjima može da se sastoji od ili da sadrži Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv fragment, bilo koji drugi fragment koji vezuje antigen; ili deo antitela koji vezuje antigen; koji ima jednu ili više sledećih imunoloških karakteristika vezivanja:

1. antitelo vezuje jedan ili više tau epitopa na konformaciono specifičan način, gde:

a) je svaki od jednog ili više tau epitopa nezavisno odabran od epitopa u okviru:

i. pozicija 267-273 ili ostataka KHQPGGG (SEQ ID NO: 98), u odnosu na tau441; ii. pozicija 298-304 ili ostataka KHVPGGG (SEQ ID NO: 99), u odnosu na tau441iii. pozicija 329-335 ili ostataka HHKPGGG (SEQ ID NO: 100), u odnosu na tau441, i iv. pozicija 361-367 ili ostataka THVPGGG (SEQ ID NO: 101), u odnosu na tau441;

b) nula, jedan, dva, ili tri od epitopa su linearni epitopi, i

c) jedan, dva, tri ili četiri od epitopa su konformacioni epitopi;

2. antitelo vezuje dva ili više tau epitopa i sposobno je da ispoljava veći afinitet za patološki tau nego za fiziološki tau, gde su dva tau epitopa odabrana od epitopa u okviru:

v. pozicija 267-273 ili ostataka KHQPGGG (SEQ ID NO: 98), u odnosu na tau441; vi. pozicija 298-304 ili ostataka KHVPGGG (SEQ ID NO: 99), u odnosu na tau441vii. pozicija 329-335 ili ostataka HHKPGGG (SEQ ID NO: 100), u odnosu na tau441, i viii. pozicija 361-367 ili ostataka THVPGGG (SEQ ID NO: 101), u odnosu na tau441.

[0030] Bilo koje od antitela opisan u prethodnim oblicima može da se sastoji od ili da sadrži Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv fragment, bilo koji drugi fragment koji vezuje antigen; ili deo antitela koji vezuje antigen; koji ima jednu ili više sledećih imunoloških karakteristika vezivanja:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441; ii. pozicija 299-304 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441iii. pozicija 330-335 ili ostataka HKPGGG (SEQ ID NO: 224), u odnosu na tau441, i iv. pozicija 362-367 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441.

b) nula, jedan, dva, ili tri od epitopa su linearni epitopi i

c) jedan, dva, tri ili četiri od epitopa su konformacioni epitopi;

[0031] Takođe su opisana izolovana antitela koja se kompetitivno vezuju za tau u odnosu na bilo koje od izolovanih antitela opisanih u prethodnim oblicima. U jednom izvođenju, izolovano antitelo se kompetitivno vezuje za tau kad se testira njegovo vezivanje za tau u odnosu na izolovan DC8E8.

[0032] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži lak lanac koji sadrži SEQ ID NO.: 141. U nekim oblicima, antitelo sadrži lak lanac koji sadrži SEQ ID NO.: 138. U nekim oblicima, antitelo sadrži lak lanac koji sadrži SEQ ID NO.: 141 i lak lanac koji sadrži SEQ ID NO.: 138.

[0033] Pronalazak obezbeđuje da antitela obezbeđena ovim pronalaskom mogu da budu odabrana iz grupe:

a) monoklonsko antitelo;

b) poliklonsko antitelo;

c) rekombinantno antitelo;

d) himerno antitelo;

e) humanizovano antitelo;

f) humano antitelo i

g) fragment koji vezuje antigen ili deo koji vezuje antigen bilo kog od (a) do (f).

[0034] Bilo koje od izolovanih antitela obezbeđenih ovde može biti podignuto u sisaru. U određenim oblicima, izolovano antitelo je proizvela rekombinantna životinja ili rekombinantna ćelija domaćin.

[0035] Pronalazak obezbeđuje da bilo koja od izolovanih antitela obezbeđenih ovde su takva da se mogu detektabilno obeležiti jednim ili sa više obeleživača. U određenim oblicima, bar jedan obeleživač je odabran od enzima, radioizotopa, fluorofore, markera za nuklearnu magnetnu rezonancu i teškog metala.

[0036] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži bar jedan lek (kombinacioni agens) zakačen za molekul antitela.

[0037] Takođe su obezbeđene izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bar jedan CDR, ili bar domen za vezivanje ili varijabilni region imunoglobulinskog lanca bilo kog od antitela na tau opisanog u prethodnim oblicima. Takođe su obezbeđeni izolovani vektori koji sadrže bilo koju od tih nukleinskih kiselina. Takođe je obezbeđena izolovana ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više od ovih izolovanih nukleinskih kiselina i vektora.

1

[0038] Takođe je obezbeđena izolovana ćelijska linija koja eksprimira bilo koje od antitela na tau opisano u prethodnim oblicima. U jednom izvođenju, izolovana ćelijska linija je hibridom. U jednom izvođenju, izolovana ćelijska linija je hibridom iz koje se pravi monoklonsko antitelo DC8E8 i koja ćelijska linija je deponovana u American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, 13. Jula, 2011., sa ATCC depozitnom oznakom PTA-11994.

[0039] Takođe je obezbeđena upotreba bilo kog od antitela na tau, nukleinskih kiselina i ćelija obezbeđenih ovde, kao lek ili u proizvodnji leka za dijagnostiku, prevenciju, ili lečenje Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije.

[0040] U nekim izvođenjima, antitela se sadrže u farmaceutskom sastavu, koji još sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač. U jednom izvođenju, farmaceutski sastav sadrži kombinaciju antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač, gde kombinacija sadrži bar dva različita antitela, i gde je svako od antitela nezavisno odabrano od antitela opisanih u prethodnim oblicima. U jednom izvođenju, bar jedno od antitela je DC8E8, ili humana verzija DC8E8, ili humanizovana verzija DC8E8.

[0041] U nekim izvođenjima, antitela se sadrže u sastavu, koji još sadrži razblaživač i/ili nosač. Sastav može biti farmaceutski sastav, dijagnostički sastav, ili bilo koji drugi sastav. U nekim oblicima, sastav još može da sadrži bar jedno jedinjenje ili agens odabran od detektabilnih obeleživača, hemocijanina iz prilepka, tetanus toksoida ili toksoida izvedenog iz neke druge patogene bakterije, serumskih albumina, goveđeg serumskog albumina, imunoglobulinskog molekula ili njegovog fragmenta, tiroglobulina, ovoglobulina, univerzalnog T-ćelijskog epitopa, citokina, hemokina, interleukina 1-alfa (IL-1α), IL-1β, IL-2, IL-10, interferona -gama (IFN-γ), granulocitnog makrofagnog faktora stimulacije kolonije (GM-CSF), makrofagnog inflamatornog proteina 1 alfa (MIP1α), MIP1β i RANTES (regulisan po aktivaciji, eksprimiran i sekretovan u normalnoj T-ćeliji; CCL5).

[0042] Takođe je obezbeđen proizvod (npr., komplet) za farmaceutsku ili dijagnostičku upotrebu, koji sadrži materijal za ambalažu i kontejner koji sadrži rastvor liofilizovanog oblika jednog ili više antitela na tau obezbeđenih ovde. U određenim oblicima, kontejner je deo naprave ili sistema za isporuku antitela subjektu.

[0043] Takođe je obezbeđena medicinska naprava koja sadrži antitelo na tau kao što je ovde obezbeđeno (videti gore), gde je naprava pogodna za kontakt ili davanje antitela na bar jedan način odabran od parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenskog, intrartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrahrskavičnog, intrakavitarnog, intracelijačnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intratekalnog, intrakoličkog, intracervikalnog, intragastričkog, intrahepatičkog, intramiokardijalnog, intraostealnog, intrapelvičkog, intraperikardijalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonalnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterusnog, intravezikalnog, intralezijskog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog načina.

[0044] U jednom izvođenju, ovde je obezbeđen metod lečenja ili sprečavanja napredovanja Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije u subjektu, gde metod obuhvata administriranje navedenom subjektu efektivne količine bar jednog od antitela na tau obezbeđenog ovde. U nekim oblicima, metod je sposoban da smanji motoričko oštećenje, popravi motoričku funkciju, smanji kognitivno oštećenje, popravi kognitivnu funkciju, ili njihovu kombinaciju.

[0045] U određenim oblicima, ovde je obezbeđen metod poboljšanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodnu tauopatiju u subjektu, gde metod obuhvata administraciju navedenom subjektu efektivne količine bar jednog od antitela na tau obezbeđenog ovde.

[0046] A u još jednom drugom izvođenju, ovde je obezbeđen metod dijagnostikovanja ili skrininga subjekta na prisustvo Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije u subjektu, ili za određivanje subjektovog rizika za razvoj Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije, gde metod obuhvata:

a) kontaktiranje subjekta, ili ćelije, tkiva, organa, tečnosti, ili bilo kog drugog uzorka subjekta, sa efektivnom količinom bar jednog od antitela na tau kao što je ovde obezbeđeno i

b) određivanje prisustva kompleksa koji sadrži patološki tau i antitelo, gde je prisustvo kompleksa dijagnostičko za Alchajmerovu bolest ili srodnu tauopatiju vezanu za prisustvo patološkog tau.

[0047] U jednom srodnom obliku, ovde je obezbeđen metod praćenja subjekta za prisustvo, progresiju, regresiju, ili stabilizaciju Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije u subjektu, ili za određivanje faze Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije u subjektu, gde metod obuhvata:

a) kontaktiranje subjekta, ili ćelije, tkiva, organa, tečnosti, ili bilo kog drugog uzorka subjekta, sa efektivnom količinom bar jednog od antitela na tau obezbeđenog ovde i b) određivanje prisustva i/ili karakteristika kompleksa koji sadrži patološki tau i antitelo, gde je prisustvo kompleksa dijagnostičko za Alchajmerovu bolest ili srodnu tauopatiju vezanu za prisustvo patološkog tau.

[0048] U nekim izvođenjima, antitelo se daje intravenski, intramuskularno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno, intracerebroventrikularno, intratekalno, ili kao aerosol.

[0049] U nekim izvođenjima metoda lečenja ili sprečavanja napretka Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije u subjektu i metoda poboljšanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodnu tauopatiju u subjektu, efektivna količina svakog antitela je bar 1 mg/kg telesne težine subjekta po dozi. U nekim izvođenjima, efektivna količina svakog antitela je bar 10 mg/kg telesne težine subjekta po dozi. U nekim izvođenjima, bar jedno od antitela se daje u višestrukim dozama tokom perioda od bar šest meseci. U nekim izvođenjima, antitelo se daje periferno humanom subjektu da bi ispoljilo svoje korisne efekte. U nekim izvođenjima se antitelo, kad se da periferno humanom subjektu, veže za rastvorljiv tau, tau nerastvorljiv u sarkozilu, ili za oba. U nekim izvođenjima, antitelo se, kad se da periferno humanom subjektu, veže za tau, gde je tau u jednom ili više patoloških oblika odabran od pogrešno uređenog tau, duplo poremećenog tau, tau nerastvorljivog u sarkozilu, neurofibrilarne klubadi, neuropilnih niti i neuritskih plakova iz biopsije mozga humanog pacijenta sa Alchajmerovom bolešću, iz uzorka mozga životinjskog modela Alchajmerove bolesti. U nekim izvođenjima, antitelo, kad se da periferno humanom subjektu, ispolji jedan ili više blagotvornih efekata na subjekta koji su posredovani efektorskom funkcijom. U nekim izvođenjima, antitelo se isporučuje periferiji injektiranjem/implantiranjem u subjektov mozak ćelije koja eksprimira antitelo. U nekim izvođenjima, ćelija koja eksprimira antitelo je ćelija hibridom. U nekim izvođenjima, ćelija hibridom je hibridom koji eksprimira DC8E8.

[0050] U određenim srodnim oblicima, ovo otkriće obezbeđuje izolovan peptid, gde:

a) je izolovan peptid fragment tau koji je dug najmanje 6 aminokiselina, najmanje 7 aminokiselina, najmanje 9 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 12 aminokiselina, ili 30 aminokiselina i

b) izolovan peptid sadrži terapijski tau epitop.

[0051] U nekim srodnim oblicima, terapijski epitop sadrži terapijski epitop odabran od onih u okviru:

i. pozicija 267-273 ili ostataka KHQPGGG (SEQ ID NO: 98), u odnosu na tau441;

ii. pozicija 298-304 ili ostataka KHVPGGG (SEQ ID NO: 99), u odnosu na tau441iii. pozicija 329-335 ili ostataka HHKPGGG (SEQ ID NO: 100), u odnosu na tau441,i iv. pozicija 361-367 ili ostataka THVPGGG (SEQ ID NO: 101), u odnosu na tau441.

[0052] U određenim srodnim oblicima, ovo otkriće obezbeđuje izolovan peptid, gde:

b) izolovan peptid sadrži terapijski tau epitop.

[0053] U nekim srodnim oblicima, terapijski epitop sadrži terapijski epitop odabran od onih u okviru:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441;

ii. pozicija 299-304 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441iii. pozicija 330-335 ili ostataka HKPGGG (SEQ ID NO: 224), u odnosu na tau441, i iv. pozicija 362-367 ili ostataka HVPGGG (SEQ ID NO: 154), u odnosu na tau441.

[0054] U nekim srodnim oblicima, terapijski epitop je odabran od:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441;

[0055] U nekim drugim izvođenjima, izolovan peptid je sekvenca odabrana od SEQ ID NOs: 1-4, SEQ ID NO: 9-101, i SEQ ID NOs: 108-112, NIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 200), NIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 201), IKHVPGGGS (SEQ ID NO: 202), KHVPGGGSV (SEQ ID NO: 203), HVPGGGSVQ (SEQ ID NO: 204), VPGGGSVQ (SEQ ID NO: 205), GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250), SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNKKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 159), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161), i DNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 171).

[0056] U nekim drugim izvođenjima, izolovan peptid je sekvenca odabrana od SEQ ID NO: 270 (TENLKHQPGGGK); SEQ ID NO: 271 (KHQPGGG), SEQ ID NO: 272 (HQPGGG);

1

SEQ ID NO: 275 (ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS), SEQ ID NO: 276 (KHVPGGG), SEQ ID NO: 277 (HVPGGG), SEQ ID NO: 280 (DNIKHVPGGGSVQIVYKPV), SEQ ID NO: 281 (HHKPGGG), SEQ ID NO: 282 (HKPGGG), i SEQ ID NO: 283 (THVPGGG).

[0057] U nekim drugim izvođenjima, izolovan peptid je sekvenca odabrana od SEQ ID NO: 270 (TENLKHQPGGGK); SEQ ID NO: 271 (KHQPGGG), SEQ ID NO: 272 (HQPGGG); SEQ ID NO: 275 (ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS), SEQ ID NO: 276 (KHVPGGG), SEQ ID NO: 277 (HVPGGG), SEQ ID NO: 280 (DNIKHVPGGGSVQIVYKPV), SEQ ID NO: 281 (HHKPGGG), SEQ ID NO: 282 (HKPGGG), i SEQ ID NO: 283 (THVPGGG), a terapijski epitop je odabran od:

i. pozicija 268-273 ili ostataka HQPGGG (SEQ ID NO: 223), u odnosu na tau441;

[0058] U nekim drugim izvođenjima, izolovan peptid je sekvenca odabrana od SEQ ID NO: 272 (HQPGGG) i SEQ ID NO: 277 (HVPGGG).

[0059] U određenim izvođenjima, izolovani peptid je aktivan u bar jednom testu, odabranom od testova koji mere sposobnost peptida:

a) da kompetiraju sa tau za vezivanje za monoklonsko antitelo DC8E8;

b) da redukuju nivo tau nerastvorljivog u sarkozilu, in vivo;

c) da podstiču klirens tau iz mozga, in vivo;

d) da redukuju nivo jednog biohemijskog markera AD, in vivo;

e) da redukuju količinu neurofibrilarne klubadi (NFT), in vivo;

f) da poboljšaju bar jedan neurobihejvioralni parametar, in vivo;

g) da povoljno modifikuju tok AD u subjektu;

h) da redukuju nivo tau u mozgu, u cerebrospinalnoj tečnosti, ili u oba i/ili

i) da služe kao imunogen u pravljenju antitela sposobnog da kompetira sa monoklonskim DC8E8 u vezivanju za tau.

[0060] Ovaj izum se odnosi i na jedinjenja koja sadrže bilo koji od izolovanih peptida obezbeđenih ovde i grupu. U određenim izvođenjima, grupa je N-terminal, C-terminal, ili je vezana za internu aminokiselinu peptida i gde je grupa odabran od jednog ili više cisteinskih ostataka, fosfo grupe, hemocijanina iz prilepka, tetanus toksoida ili toksoid izvedenog iz neke druge patogene bakterije, serumskih albumina, goveđeg serumskog albumina, imunoglobulinskog molekula ili njegovog fragmenta, tiroglobulina, ovoglobulina, univerzalnog T-ćelijskog epitopa, citokina, hemokina, interleukina 1-alfa (IL-1α), IL-1β, IL-2, IL-10, interferona - gama (IFN-γ), granulocitnog makrofagnog faktora stimulacije kolonije (GM-CSF), makrofagnog inflamatornog proteina 1 alfa (MIP1α), MIP1β, i RANTES (regulisan po aktivaciji, eksprimiran i sekretovan u normalnoj T-ćeliji).

[0061] Obezbeđeni su i farmaceutski sastavi koji sadrže jedan ili više izolovanih peptida i/ili jedinjenja obezbeđena ovim pronalaskom i farmaceutski prihvatljiv nosač, i/ili razblaživač, i/ili adjuvant. U nekim izvođenjima, farmaceutski sastav je prilagođen da obezbedi doziranje peptida ili jedinjenja između 1 ng i 10 mg. U određenim izvođenjima, farmaceutski sastav je prilagođen da obezbedi doziranje peptida ili jedinjenjaveće od 10 mikrograma.

[0062] Pronalazak se odnosi i na proizvod (npr., komplet) za farmaceutsku ili dijagnostičku upotrebu, koji sadrži materijal za ambalažu i kontejner koji sadrži rastvor ili liofilizovan oblik peptida i/ili jedinjenja obezbeđenih ovde. U nekim izvođenjima, kontejner je deo naprave ili sistema za isporuku peptida ili jedinjenja subjektu.

[0063] Obezbeđene su medicinske naprave koje sadrže peptid, jedinjenje, i/ili sastav sa peptidom/jedinjenjem kao što je obezbeđen gore, gde je naprava pogodna za dovođenje u kontakt ili administraciju antitela na bar jedan način odabran od parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenskog, intrartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrahrskavičnog, intrakavitarnog, intracelijačnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intratekalnog, intrakoličkog, intracervikalnog, intragastričnog, intrahepatičkog, intramiokardijalnog, intraostealnog, intrapelvičkog, intraperikardijalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonalnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterusnog, intravezikalnog, intralezijskog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog.

[0064] U srodnim oblicima, predmetni pronalazak obezbeđuje metod lečenja ili sprečavanja napredovanja Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija u subjektu, metod obuhvata administraciju navedenom subjektu efektivne količine bar jednog peptida i/ili bar jednog jedinjenja kao što je ovde obezbeđeno. U nekim izvođenjima, metod je sposoban da smanji motoričko oštećenje, popravi motoričku funkciju, smanji kognitivno oštećenje, popravi kognitivnu funkciju, ili njihovu kombinaciju.

[0065] U srodnim oblicima, pronalazak obezbeđuje metod poboljšanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije u subjektu, gde metod obuhvata administraciju navedenom subjektu efektivne količine bar jednog peptida i/ili bar jednog jedinjenja kao što je ovde obezbeđeno.

[0066] U nekim od ovih metoda lečenja, sprečavanja, ili poboljšavanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodnu tauopatiju u subjektu, metod obuhvata administraciju humanom pacijentu peptida i/ili jedinjenja kao što je obezbeđeno gore, i/ili adjuvanta koji povećava imuni odgovor, gde metod deluje na imuni odgovor koji sadrži antitela na patološki tau, čime leči, sprečava napredovanje ili poboljšava bar jedan od simptoma vezanih za AD kod humanog pacijenta.

[0067] Obezbeđen je metod proizvodnje antitela koje je sposobno da bude u kompeticiji sa DC8E8 za vezivanje tau, gde metod obuhvata imunizovanje subjekta bar jednim od peptida i/ili bar jednim jedinjenjem kao što je ovde obezbeđeno. U nekim izvođenjima, bar jedan peptid je peptid odabran od bilo koje od SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 9-101 i SEQ ID NO: 108-112, NIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 201), IKHVPGGGS (SEQ ID NO: 202), KHVPGGGSV (SEQ ID NO: 203), HVPGGGSVQ (SEQ ID NO: 204), VPGGGSVQ (SEQ ID NO: 205), GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250), SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNKKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 159), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161) i DNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 171). U jednom izvođenju, peptid je odabran od SEQ ID NO: 1-4. U jednom drugom izvođenju, peptid je SEQ ID NO. 108. U jednom izvođenju, peptid je GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250). U određenim izvođenjima, peptid je

1

SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251). U određenim izvođenjima peptid je odabran od SEQ ID NO: 270 (TENLKHQPGGGK); SEQ ID NO: 271 (KHQPGGG), SEQ ID NO: 272 (HQPGGG); SEQ ID NO: 275 (ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS), SEQ ID NO: 276 (KHVPGGG), SEQ ID NO: 277 (HVPGGG), SEQ ID NO: 280 (DNIKHVPGGGSVQIVYKPV), SEQ ID NO: 281 (HHKPGGG), SEQ ID NO: 282 (HKPGGG), i SEQ ID NO: 283 (THVPGGG). U nekim drugim izvođenjima, peptid je odabran od SEQ ID NO: 272 (HQPGGG) i SEQ ID NO: 277 (HVPGGG).

[0068] Obezbeđen je i metod izolovanja DC8E8, ili izolovanja antitela koje je sposobno da uđe u kompeticiju sa DC8E8 za vezivanje tau, gde metod obuhvata dovođenje u kontakt DC8E8 ili antitela sa peptidom i/ili sa jedinjenjem kao što je ovde obezbeđeno.

[0069] U srodnim oblicima, obezbeđen je metod dijagnostikovanja ili skrininga subjekta na prisustvo Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija u subjektu, ili za određivanje subjektovog rizika za razvoj Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija, gde metod obuhvata:

a) kontaktiranje subjekta, ili ćelije, tkiva, organa, tečnosti, ili bilo kog drugog uzorka subjekta, sa efektivnom količinom bar jednog antitela obezbeđenog pronalaskom i b) određivanje prisustva kompleksa koji sadrži patološki tau i antitelo, gde je prisustvo kompleksa dijagnostičko za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije vezane za prisustvo patološkog tau.

[0070] U određenim izvođenjima, obezbeđen je metod praćenja subjekta za prisustvo, progresiju, regresiju, ili stabilizaciju Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija, ili za određivanje faze Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija u subjektu, gde metod obuhvata:

a) kontaktiranje subjekta (npr., administraciju), ili ćelije, tkiva, organa, tečnosti, ili bilo kog drugog uzorka subjekta, sa efektivnom količinom bar jednog antitela kao što je obezbeđeno bar jednim izvođenjem pronalaska i

b) određivanje prisustva i/ili karakteristika kompleksa koji sadrži patološki tau i antitelo, gde je prisustvo kompleksa dijagnostičko za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije vezane za prisustvo patološkog tau.

[0071] U nekim izvođenjima metoda praćenja subjekta za prisustvo, progresiju, regresiju, ili stabilizaciju Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija, ili za određivanje faze Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija u subjektu, antitelo, peptid, i/ili jedinjenje se administrira intravenski, intramuskularno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno, intracerebroventrikularno, intratekalno, ili kao aerosol. U nekim izvođenjima, efektivna količina svakog peptida i/ili jedinjenja je bar 1 µg po dozi, bar 10 µg po dozi, bar 100 µg po dozi. U nekim izvođenjima, efektivna količina svakog peptida i/ili jedinjenja je bar 10 µg po dozi u prisustvu adjuvanta i bar 100 µg po dozi u odsustvu adjuvanta. U nekim izvođenjima, bar jedan peptid ili jedinjenje se administrira u višestrukim dozama tokom perioda od bar šest meseci.

[0072] Prema jednom srodnom obliku, obezbeđen je metod lečenja ili sprečavanja napredovanja Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija u subjektu, gde metod obuhvata administraciju navedenom subjektu efektivne količine bar jednog antitela iz pronalaska, i/ili bar jednog peptida, i/ili bar jednog jedinjenja kao što je ovde obezbeđeno, u kombinaciji sa bar jednim kombinacionim agensom odabranim od inhibitora acetilholinesteraze, antagonista N-metil-D-aspartatnog (NMDA) receptora, helirajućih agenasa prelaznih metala, faktora

1

rasta, hormona, nesteroidnih antiinflammatornih lekova (NSAID), antioksidanata, sredstava za snižavanje lipida, selektivnih inhibitora fosfodiesteraze, inhibitora agregiranja tau, inhibitora protein kinaza, inhibitora proteina toplotnig šoka, antiamiloida pasivne i aktivne imunizacije, inhibitora amiloidnog agregiranja i inhibitora sekretaze. U nekim izvođenjima, metod je sposoban da smanji motoričko oštećenje, popravi motoričku funkciju, smanji kognitivno oštećenje, popravi kognitivnu funkciju, ili njihovu kombinaciju.

[0073] U jednom srodnom obliku, obezbeđen je metod poboljšavanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije u subjektu, gde metod obuhvata administraciju navedenom subjektu efektivne količine bar jednog antitela iz pronalaska, bar jednog peptida i/ili bar jednog jedinjenja kao što je ovde obezbeđeno, u kombinaciji sa bar jednim kombinacionim agensom odabranim od inhibitora acetilholinesteraze, antagonista NMDA receptora, helirajućih agenasa prelaznih metala, faktora rasta, hormona, nesteroidnih antiinflammatornih lekova (NSAID), antioksidanata, sredstava za snižavanje lipida, selektivnih inhibitora fosfodiesteraze, inhibitora agregiranja tau, inhibitora protein kinaza, inhibitora proteina toplotnog šoka, pasivne i aktivne imunizacije na amiloide, inhibitora amiloidnog agregiranja i inhibitora sekretaze.

[0074] U nekim izvođenjima metoda lečenja, sprečavanja ili poboljšavanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije u subjektu, metod obuhvata davanje humanom pacijentu efektivne količine bar jednog antitela iz pronalaska, bar jednog peptida i/ili bar jednog jedinjenja kao što je ovde obezbeđeno, i/ili adjuvanta koji povećava imuni odgovor; u kombinaciji sa bar jednim kombinacionim agensom odabranim od inhibitora acetilholinesteraze, antagonista NMDA receptora, helirajućih agenasa prelaznih metala, faktora rasta, hormona, nesteroidnih antiinflammatornih lekova (NSAID), antioksidanata, sredstava za snižavanje lipida, selektivnih inhibitora fosfodiesteraze, inhibitora agregiranja tau, inhibitora protein kinaza, inhibitora proteina toplotnog šoka, pasivne i aktivne imunizacije na amiloide, inhibitora amiloidnog agregiranja i inhibitora sekretaze; gde metod deluje na imuni odgovor koji sadrži antitela na patološki tau, čime leči, sprečava napredovanje ili poboljšava bar jedan od simptoma vezanih za AD kod humanog pacijenta.

[0075] U nekim izvođenjima metoda lečenja, sprečavanja ili poboljšavanja bar jednog od simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije u subjektu, kombinacioni agens se daje pred, simultano ili posle davanja antitela iz pronalaska, peptida i/ili jedinjenja kao što je ovde obezbeđeno.

[0076] U jednom srodnom obliku, pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač i

a) antitelo iz pronalaska; i/ili

b) peptid kao što je ovde obezbeđen i/ili

c) jedinjenje kao što je ovde obezbeđeno;

U kombinaciji sa bar jednim kombinacionim agensom odabranim od inhibitora acetilholinesteraze, antagonista NMDA receptora, helirajućih agenasa prelaznih metala, faktora rasta, hormona, nesteroidnih antiinflammatornih lekova (NSAID), antioksidanata, sredstava za snižavanje lipida, selektivnih inhibitora fosfodiesteraze, inhibitora agregiranja tau, inhibitora protein kinaza, inhibitora proteina toplotnig šoka, pasivne i aktivne imunizacije na amiloide, inhibitora amiloidnog agregiranja i inhibitora sekretaze. U nekim izvođenjima,

1

antitelo je DC8E8. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži bar jedan CDR iz DC8E8. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži bar jedan varijabilan lanac (lak ili težak) iz DC8E8. U određenim izvođenjima, humanizovana ili humana verzija DC8E8 se može koristiti. U nekim izvođenjima, bar jedan peptid je odabran od bilo koje od SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 9-101, i SEQ ID NOs: 108-112, NIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 201), IKHVPGGGS (SEQ ID NO: 202), KHVPGGGSV (SEQ ID NO: 203), HVPGGGSVQ (SEQ ID NO: 204), VPGGGSVQ (SEQ ID NO: 205), GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250), SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNKKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 159), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161), i DNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 171). U jednom izvođenju, peptid je odabran od SEQ ID NO: 1-4. U jednom drugom izvođenju, peptid je SEQ ID NO. 108. U jednom izvođenju, peptid je GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250). U određenim izvođenjima, peptid je SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251). U određenim izvođenjima peptid je odabran od SEQ ID NO: 270 (TENLKHQPGGGK); SEQ ID NO: 271 (KHQPGGG), SEQ ID NO: 272 (HQPGGG); SEQ ID NO: 275 (ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS), SEQ ID NO: 276 (KHVPGGG), SEQ ID NO: 277 (HVPGGG), SEQ ID NO: 280 (DNIKHVPGGGSVQIVYKPV), SEQ ID NO: 281 (HHKPGGG), SEQ ID NO: 282 (HKPGGG), i SEQ ID NO: 283 (THVPGGG). U nekim drugim izvođenjima, peptid je odabran od SEQ ID NO: 272 (HQPGGG) i SEQ ID NO: 277 (HVPGGG).

[0077] Dodatni predmeti i prednosti rešenja pronalaska će biti delimično predstavljeni u opisu koji sledi, a delimično će biti očigledni iz opisa, ili se mogu naučiti praktikovanjem izvođenja. Predmeti i prednosti rešenjaa će biti realizovani i postignuti pomoću elemenata i kombinacija naročito istaknutih u priloženim zahtevima.

[0078] Podrazumeva se da su i prethodni opšti opis i sledeći detaljan opis samo primeri i objašnjenja, a nisu ograničenja rešenja pronalaska, za koji je zaštita tražena.

[0079] Prateći crteži, koji su ugrađeni u i čine deo ovog opisa, prikazuju nekoliko rešenja i zajedno sa opisom, služe da objasne principe ovih rešenja. Publikacije diskutovane ovde su date samo zbog njihovog objavljivanja pre datuma podnošenja ove prijave. Ovde ništa ne treba tumačiti kao prihvatanje da predmetni pronalazak nema pravo da prethodi takvoj objavi na osnovu ranijeg pronalaska. Dalje, navedeni datumi objavljivanja mogu biti drukčiji od stvarnih datuma objavljivanja, za koje može da bude potrebno da se nezavisno potvrde.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0080]

Slika 1: Šematski prikaz šest izoformi humanog tau.

Slika 2: Šematska funkcionalna mapa humanog tau (2N4R). Slika 2 prikazuje "VQIINK" i "VQIVYK" kao SEQ ID NOS 116 i 115, respektivno.

Slika 3: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona DC8E8 i njihovo poređenje sa najbližim embrionalnim mišjim sekvencama. Slika prikazuje nukleotidnu (SEQ ID NO: 165) (A) i aminokiselinsku (SEQ ID NOS 141 (za varijabilni region lakog lanca), odnosno 117-119 sekvencu (za svaki od CDR, prema IMGT) po redosledu pojavljivanja); (B) sekvence varijabilnog regiona (VL) DC8E8 (poravnanje predstavlja SEQ ID NOS 166, odnosno 168, po redosledu pojavljivanja); i (C) poravnanje

1

varijabilnog lakog lanca V-gena DC8E8 sa najbližom mišjom embrionalnom sekvencom IGKV8-21*01 (poravnanje predstavlja SEQ ID NOS 166 odnosno 167, po redosledu pojavljivanja; posle čega dolazi poravnanje VL J-gena DC8E8 (SEQ ID NO: 168) sa najbližim mišjim J genom, IGKJ1*01 (SEQ ID NO: 169). Slika prikazuje nukleotidnu (SEQ ID NO: 170) (na D) i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca DC8E8 i sekvence njegova tri CRD (SEQ ID NOS 171, odnosno 120-122, po redosledu pojavljivanja). Na (F) su prikazana sledeća poravnanja za DC8E8: prvo, varijabilni V-gen teškog lanca (VH) DC8E8 (SEQ ID NO 172) sa najbližom mišjom embrionalnom sekvencom IGHV1-81*01 (SEQ ID NO 172); drugo, varijabilni D-gen teškog lanca (VH) DC8E8 (SEQ ID NO 174) sa najbližom mišjom embrionalnom sekvencom IGHD2-14*01 (SEQ ID NO 175); i, na kraju, varijabilni J-gen teškog lanca (VH) DC8E8 (SEQ ID NO 176) sa najbližom mišjom embrionalnom sekvencom IGHJ4*01 (SEQ ID NO 177). Prikazane su i sekvence konstantnog regiona kapa lakog lanca DC8E8 (SEQ ID NO: 178) (G) i sekvenca konstantnog regiona teškog lanca (SEQ ID NO: 179) (H). Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) su podvučeni u proteinskim sekvencama (B) i (E) i identifikovani su prema IMGT sistemu numeracije.

Slika 4: Poravnanje varijabilnih sekvenci lakog lanca (VL) DC8E8 (SEQ ID NOS 166 (V-gene) odnosno 168 (J-gene), sa najbližim humanim embrionalnim VL genom (SEQ ID NOS 180-181, respektivno, po redosledu pojavljivanja).

Slika 5: Poravnanje varijabilnih sekvenci teškog lanca (VH) DC8E8 (SEQ ID NOS 172,174, i 176, za V, D, i J gene, respektivno) sa najbližim humanim embrionalnim VH genom (SEQ ID NOS 182-183 odnosno 185, po redosledu pojavljivanja).

Slika 6: Mapiraje epitopa DC8E8 pomoću delecionih mutanata tau upotrebom ELISA. (A) Šematski prikaz tau proteina korišćenih za mapiranje epitopa DC8E8 i (B) njihove aminokiselinske sekvence (SEQ ID NOS 186-197, 102, 104, odnosno 198-199, po redosledu pojavljivanja). (C) Čitanja ELISA. DC8E8 prepoznaje sledeće tau proteine: Δ358-441, Δ421-441, Δ134-168, Δ1-220, Δ1-126, 2N4R, 2N3R, Δ(1-296;392-441) i Δ(1-150;392-441)/4R. DC8E8 ne prepoznaje sledeće tau proteine: Δ222-427, Δ306-400, Δ228-441, Δ300-312, Δ257-400, Δ137-441, Δ283-441.

Slika 7: (A) i (B) Šematski prikaz sintetičkih peptida (SEQ ID NOS 206, 207, 208, 2, 210, 211, 212, 3, 214, 215, 4, 217, 26, 219, 36, 221, 222, 109, odnosno 88, po redosledu pojavljivanja) za mapiranje epitopa i, respektivno, njihove sekvence. (C) Mapiranje epitopa DC8E8 sintetičkim peptidima pomoću ELISA. (D) Šematski prikaz epitopa u okviru tau koje je DC8E8 u stanju da veže. DC8E8 je u stanju da se veže bilo za koji od četiri zasebna vezivna regiona, od kojih je svaki zaseban epitop, nazvan epitopom 1 do 4. Četiri epitopa su zasebno locirana unutar 1. (epitop #1), 2. (epitop #2), 3. (epitop #3), i 4. (epitop #4) ponovljenog domena proteina tau. Kao što je pokazano svaki od epitopa DC8E8 nalazi se u po jednoj od sledećih aminokiselinskih sekvenci: 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (u okviru 1. ponovljenog domena tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (u okviru 2. ponovljenog domena tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (u okviru 3. ponovljenog domena tau proteina), odnosno 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (u okviru 4. ponovljenog domena tau proteina).

Slika 8: (A) Poravnanje humane tau aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 225) sa tau proteinskom sekvencom druge vrste (SEQ ID NOS 226-245, respektivno, po redosledu pojavljivanja). Za poravnanje je korišćena cela dužina humanog tau proteina, a prikazane su samo aminokiseline 265-368 humanog tau iz poravnanja. Regioni koji obuhvataju četiri odvojena epitopa DC8E8 humanog tau i poravnane sekvence uokvirene su i ispisane u bold. (B) Kompeticiona ELISA koja pokazuje da je šest tau peptida (SEQ ID NOS 201-205 i 200, respektivno, po redosledu pojavljivanja) sposobno da konkuriše tauΔ(1-150;392-441)/4R (SEQ ID NO: 199) za vezivanje za antitelo DC8E8 (C) Kompeticiona

1

ELISA koja pokazuje da se sedam tau peptida (SEQ ID NOS 144, 146, 149, 151, 159, 161, i 171) nadmeću sa tauΔ(1-150;392-441)/4R za vezivanje za antitelo

DC8E8, sposobni da prepoznaju najmanje jedan od epitopa tau koji učestvuju u tau-tau agregiranju.

Slika 9: (A). Površinska plazmonska rezonanca (SPR, Surface plasmon resonance) za karakterisanje vezivanja DC8E8 za tauΔ(1-150;392-441)/4R i 2N4R. (B). Površinska plazmonska rezonanca (SPR) za karakterisanje vezivanja DC8E8 za tauΔ(1-150;392-441)/3R i 2N3R.

Slika 10: (A). Brzine asocijacije i disocijacije vezivanja DC8E8 za tauΔ(1-150;392-441)/4R i za tau 2N4R, određene pomoću SPR. (B). Brzine asocijacije i disocijacije vezivanja DC8E8 za tauΔ(1-150;392-441)/3R i za tau 2N3R, određene pomoću SPR. Koncentracije korišćene u merenjima naznačene su na graficima, isprekidane linije su umetnute pomoću kompjuterskog programa BIA softvera za evaluaciju 4.1 (Biacore AB) na osnovu izmerenih podataka za izračunavanje kinetičkih parametara.

Slika 11: Monoklonsko antitelo DC8E8 je u stanju da napravi razliku između pretkliničkog AD, početnog kliničkog AD i potpuno razvijenog konačnanog stadijuma AD. DC8E8 pokazuje bojenje ranih stadijuma (tau monomeri, dimeri) patološkog tau u pretkliničkom AD čoveka – Braakov Stadijum I. (A). Antitelo prepoznaje stadijum patoloških tau oligomera (strelice) i stadijum patoloških tau polimera (klubad) (vrh strelice) (B). U potpuno razvijenoj Alchajmerovoj bolesti ((konačnani stadijum – Braakov Stadijum VI), DC8E8 prepoznaje uglavnom patološke tau polimere u obliku neurofibrilarne klubadi (vrhovi strelica), neuritski plakovi (u krugu) i neuritska vlakna (unutar pentagona) (C). Crta označava: 100µm. Monoklonsko antitelo DC8E8 prepoznaje sve razvojne stadijume formiranja klubadi u Alchajmerovoj bolesti. (D). DC8E8 prepoznaje rane razvojne stadijume formiranja klubadi - monomerne, dimerne i rane oligomerne stadijume (D1) i kasne oligomerne, pred-klubad stadijum (D2), kao i kasne razvojne stadijume patoloških tau polimera - intracelularnu (D3) i ekstracelularnu neurofibrilarnu klubad (D4). Vrh strelice ukazuje na male oligomerne tau agregate u piramidalnim neuronima hipokampusa (D1). Crta označava: 10 µm

Slika 12: (A) Monoklonsko antitelo DC8E8 prepoznaje neurofibrilarnu degeneraciju kod transgenih pacova SHR72. DC8E8 prepoznaje tau oligomerni stadijum (strelice) i stadijum klubadi (vrh strelice) neurodegeneracije tau. Štaviše, antitelo reaguje sa pogrešno savijenim tau koji se nalazi u vlaknima aksona (unutar pravougaonika). (B) U mozgovima kontrolnih pacova iste starosti antitelo ne daje bojenje u neuronima. Crta označava: 20µm. DC8E8 takođe prepoznaje sve razvojne stadijume formiranja klubadi u mozgu transgenog pacova (SHR 72) kao i u Alchajmerovoj bolesti čoveka. DC8E8 prepoznaje rane razvojne stadijume formiranja klubadi - monomerne, dimerne i rane oligomerne stadijume (C) kasni oligomerni pred-klubad stadijum (D), kao i kasne razvojne stadijume patoloških tau polimera - unutarćelijsku (E) i vanćelijsku neurofibrilarnu klubad (bez jezgra) (F). Vrh strelice u (C) ukazuje na male oligomerne agregate tau unutar neurona (A). Crta označava: 10 µm

Slika 13: (A) Bojenje neurofibrilarne klubadi pomoću DC8E8 u korteksu SHR24 transgenih pacova koji eksprimiraju tauΔ(1-150;392-441)/3R. (B) DC8E8 prepoznaje neurofibrilarnu klubad u moždanom stablu transgenih pacova SHR72, koji eksprimiraju tauΔ(1-150;392-441)/4R. Kontrast u presecima tkiva postizan je pomoću metil zelenog. Strelica – neurofibrilarna klubad. Crta označava: 50µm

Slika 14: Monoklonsko antitelo DC8E8 prepoznaje i rastvorljiv (A) i nerastvorljiv tau protein (B) u uzorcima mozga izolovanim iz modela transgenih pacova SHR24 (izokorteks) i pacijenata sa Alchajmerovom bolešću (tkivo alokorteksa koje uključuje hipokampus, entorinalni i temporalni korteks). Vrh strelice – humani skraćeni tau, strelica

2

- endogeni tau pacova. Za frakcije rastvorljivog tau nanošeno je po 15 µg proteina po ležištu. Za frakcije nerastvorljivog tau talozi su rastvarani u 1x natrijum dodecil sulfatnom (SDS) puferu za nanošenje uzorka u 1/50 zapremine 1S; na ležišta su nanošene iste zapremine kao i kod rastvorljivih frakcija. Monoklonsko antitelo DC8E8 prepoznaje i rastvorljive i nerastvorljive tau proteine u uzorcima mozga izolovanim iz pacijenata sa Alchajmerovom bolešću (tkivo alokorteksa uključujući hipokampus, entorinalni i temporalni korteks) (C) i iz modela transgenih pacova SHR72 (moždano stablo) (D). Strelica - fiziološki tau proteini čoveka (A) i endogeni tau pacova (B), vrh strelice – skraćeni tau (tauΔ(1-150;392-441)/4R) eksprimiran kao transgen u neuronima SHR72 pacova (D). Za frakcije rastvorljivog tau nanošeno je po 15 µg proteina po ležištu. Za frakcije nerastvorljivog tau talozi su rastvarani u 1x natrijum dodecil sulfatnom (SDS) puferu za nanošenje uzorka u 1/50 zapremine 1S; na ležišta su nanošene iste zapremine kao i kod rastvorljivih frakcija.

Slika 15: DC8E8 inhibira patološke tau-tau interakcije u testu za tau fibrilizaciju zasnovanom na fluorescenciji. TauΔ(1-150;392-441)/4R (Sl. 15A) ili tauΔ(1-296;392-441)/4R (Sl. 15B) indukovani su heparinom da pretrpe konformacionu promenu i stvore fibrile što se meri fluorescencijom tioflavina T; mAbs DC8E8, Rab50, and DC11 testirani su na sposobnost da spreče patološke konformacione promene.

Slika 16: Analiza inhibitornog potencijala DC8E8 da spreči da skraćeni protein tauΔ(1-296;392-441)/4R formira tau dimere, trimere, i oligomere pomoću imunoblotinga upotrebom HRP-konjugovanog mAb DC25.

Slika 17: Unos i razgradnja TauΔ(1-150;392-441)/4R u mikroglijskim ćelijama BV2. Mišjim BV2 ćelijama dodaje se TauΔ(1-150;392-441)/4R ili sam (1µM) ili u kompleksu sa monoklonskim antitelom DC8E8 (1µM tauΔ(1-150;392-441)/4R 1µM DC8E8). Posle inkubiranja tokom različitih vremenskih perioda (2, 4, 6 i 12 sati), BV2 ćelije se isperu kiselinom, ćelijski proteini ekstrahuju i nivoi tau koji je bio unutar ćelija analizira pomoću Western blota pan-tau antitelom DC25. TauΔ(1-150;392-441)/4R bio je imunološki obeležen u lizatima ćelija (intracelularni tau) (A) i u medijumu za kultivisasnje ćelija (ekstracelularni tau) (B). Antitelo DC8E8 se učinividljivim pomoću antitela na mišji protein konjugovanog sa HRP. Na ležište je nanošeno po 20µg proteina. Slika 18: Stabilnost (rok trajanja) DC8E8 na 37°C, testiran je pomoću ELISA. Antitelo prepoznaje tauΔ(1-150;392-441)/4R i posle nekoliko meseci lagerovanja (1, 2, 3 i 4 meseca). Stubići predstavljaju serijska razblaženja antitela kako je naznačeno. Merenja su vršena u triplikatu

Slika 19: DC8E8 prepoznaje i cilja pogrešno savijene (bolesne) tau u humanim tkivima mozga sa Alchajmerovom bolešću. (A) Western blot analiza sa pan-tau DC25 antitelom:

1) Biohemijska ekstrakcija patološkog tau iz humanih tkiva mozga sa Alchajmerovom bolešću (Greenberg and Davies, 1989);

2) kontrolno antitelo (Rab50) ne prepoznaje tau;

3) DC8E8 prepoznaje i cilja pogrešno savijene (bolesne) tau u humanim tkivima mozga sa Alchajmerovom bolešću, i

(B) Ponceau (Ponso) S bojenje: 2),3) Kontrola količine antitela (Rab50 i DC8E8) korišćena u eksperimentu.

Slika 20: DC8E8 prepoznaje i cilja pogrešno savijene (bolesne) tau u tkivima mozga sa Alchajmerovom bolešću u SHR72 pacovskom modelu. (A) Western blot analiza sa pantau DC25 antitelom:

4) Biohemijska ekstrakcija patološkog tau iz tkiva mozga sa Alchajmerovom bolešću (Greenberg and Davies, 1989);

5) kontrolno antitelo (Rab50) ne prepoznaje tau;

6) DC8E8 prepoznaje i cilja pogrešno savijene (bolesne) tau u humanim tkivima mozga sa Alchajmerovom bolešću i

(B) Ponceau S bojenje: 2),3) kontrola količine antitela (Rab50 i DC8E8) korišćena u eksperimentu.

Slika 21: In vivo, DC8E8 cilja patološke forme tau u mozgu transgenih pacova (SHR72) i transportuje patološki tau iz mozga u perifernu krv. (A) Koncentracija DC8E8 antitela u serumu DC8E8 tretiranih životinja je dostigla 466, 200 i 273 µg/ml, respektivno. (B) Viđen je in vivo transport DC8E8-tau kompleksa iz mozga u perifernu krv. Patološki tau je dostigao prosečnu koncentraciju od 350 µg/ml seruma. Aktivan transport tau pomoću DC8E8 eliminiše patološke tau proteine iz mozga. S druge strane, nisu detektovani tau proteini u serumima životinja tretiranih kontrolnim antitelom (Rab50) koje prepoznaje virus besnila (Macikova et al., 1992). Koncentracija tau u serumima tretiranih životinja je određena koristeći Innotest hTAU ELISA (Innogenetics, Belgija). Grafik pokazuje srednje vrednosti sa standardnim greškama srednjih vrednosti (SEM). Svaki od 8 stubića za pacove A-C ukazuje na različita uzastopna razblaženja seruma (od 100 puta do 12800 puta, s leva na desno).

Slika 22: DC8E8 monoklonsko antitelo uklanja patološki tau iz mozga transgenih pacova (SHR72). (A) Intracerebralna primena DC8E8 (levi panel) uklanja (strelice) patološki tau iz neurona u poređenju sa životinjama tretiranim kontrolnim antitelom (desni panel). (B) Kvantifikacija patološkog tau u neuronima životinja tretiranih pomoću kontrolnog antitela i DC8E8 pokazuje radikalno smanjenje količine patološkog tau kod životinja tretiranih pomoću DC8E8 (p<0,0001).

Slika 23: Rekombinantan scFv fragment (scDC8E8v) monoklonskog antitela DC8E8, eksprimiran u bakterijama, prepoznaje patološki duplo poremećen tauΔ(1-150;392-441)/4R. (A) Bojenje Coomassie brilijantnim plavim sirovih lizata kontrolnih BL21 bakterija i bakterija koje imaju plazmid koji eksprimira scDC8E8v, razdvojenih pomoću 10% SDS-PAGE:: staza 1, sirovi lizat kontrolnih BL21 bakterija; staza 2, sirovi lizat BL21 bakterija koje eksprimiraju scDC8E8v i staza M, proteinski marker molekulske težine (Page Ruller Prestained Protein Ladder #SM0672, Fermentas. (B) nitrocelulozna membrana koja sadrži tau proteine, obojena pomoću Ponceau S: staza 1, tauΔ(1-150;392-441)/4R, 500 ng; staza 2, tauΔ(1-150;392-441)/4R, 250 ng; staza 3, taut(1-150;392-441)/4R, 125 ng; staza 4 tauΔ228-441, 50 ng i staza M, proteinski marker molekulske težine. (C) Western blot/nitrocelulozna membrana koja sadrži tau proteine, kao u B), detektovana pomoću lizata bakterija koje eksprimiraju scDC8E8v. (D) Western blot/ nitrocelulozna membrana koja sadrži tau proteine, kao u B), razvijena pomoću negativne kontrole bakterijskog lizata.

Slika 24: Rekombinantan scFv fragment monoklonskog antitela DC8E8 (scDC8E8v) ispoljava osobine vezivanja tau slične onima DC8E8 antitela - selektivno prepoznaje tauΔ(1-150;392-441)/4R. (A) Određivanje pomoću SPR kinetičkog affiniteta vezivanja scDC8E8v za AD tauΔ(1-150;392-441)/4R. (B) Određivanje pomoću SPR kinetičkog affiniteta vezivanja scDC8E8v za tau 2N4R. (C) Konstante brzina (kONi kOFF) i konstanta ravnoteže asocijacije za vezivanje scDC8E8v.

Slika 25: Identifikacija ostataka u mestu kombinovanja scDC8E8v koji utiču na scDC8E8v/DC8E8 prepoznavanje duplo poremećenog tau. (A) Bojenje Coomassie brilijantnim plavim poliakrilamidnih gelova posle razdvajanja proteina iz grubog lizata BL21 bakterija koje imaju plazmid koji eksprimira scDC8E8v (wt) i njegove mutantne forme. Svaka numerisana staza odgovara broju odgovarajućeg klona (npr. staza 2 odgovara 2-VL-R33A). Eksprimirani jednolančani proteini su označeni zvezdicom. Kontrolne bakterijske kulture ne eksprimiraju jednolančane proteine. (B) Nitrocelulozna membrana koja sadrži tau proteine, obojena pomoću Ponceau S: staza 1, tauΔ(1-150;392-441)/4R, 500 ng; staza 2, tauΔ(1-150;392-441)/4R, 250 ng; staza 3, tauΔ(1-150;392-441)/4R, 125 ng. (C) Western Blot na nitroceluloznim membranama koje sadrže tau proteine, kao u B), detektovana pomoću lizata iz bakterija koje eksprimiraju bilo scDC8E8v (wt gel), bilo jednu od njegovih mutantnih formi (blotovi od 1-VL-N31A do 22-VH-G102A).

Slika 26: (A) Šematski prikaz tau 2N4R (SEQ ID NO: 102) sa četiri DC8E8 epitopa prikazani u šrafiranim boksovima u okviru uvećane regije između ostataka 261 i 373 (SEQ ID NO. 246): SEQ ID NOs 98-101, respektivno. (1) Šematski prikaz peptidnih imunogena izvedenih iz tau koji se preklapaju, a koji sadrže bar jedan od četiri regiona tau koje prepoznaje DC8E8 antitelo, za upotrebu kao aktivne vakcine ili za prečišćavanje DC8E8 antitela i slično; (2) opšte mogućnosti za druge modifikovane i kreirane peptide i jedinjenja, sa grupama po želji. (B) Sažetak imunoblot analize nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72, koji eksprimiraju tauΔ(1-150;392-441)/4R) tretiranih peptidima SEQ ID NO 1-8 i 108. Imunoblot analiza je izvedena sa različitim mAb, da bi se odredilo smanjenje nerastvorljivog tau iz sledećih epitopa relevantnih za AD: mAb DC25 (tau 347-353), mAb DC217 (tau pThr217), mAb DC209 (tau pThr 231), mAb AT8 (tau pSer202/pThr205) i mAb AT270 (tau pThr181). (C) Denzitometrijska imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla pacova tretiranih pomoću tau 251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280 (SEQ ID NO: 1) kombinovanog sa adjuvantom i iz kontrolnih pacova tretiranih samo adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti. Slika 27: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) koji su model za AD, tretiranih pomoću tau 251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280 (SEQ ID NO: 1). Deset dana posle 5. doze imunogena, transgeni pacovi su korišćeni za testiranje ponašanja. Dijagrami predstavljaju srednje vrednosti±SEM. Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale.

Slika 28: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 1 je dovela do 49%-nog smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 29: Kvantitativna imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285 (SEQ ID NO: 2) sa adjuvantom ili kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 30: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285 (SEQ ID NO: 2). Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale. Slika 31: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 2 je dovela do 60%-nog smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 32: Kvantitativna imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285 (SEQ ID NO: 2) sa adjuvantom ili

2

kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 33: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 2/fosfo je dovela do 77%-nog smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 34: Kvantitativna imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288 (SEQ ID NO: 3) sa adjuvantom ili kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 35: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 259- KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288 (SEQ ID NO: 3). Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale. Slika 36: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 3 je dovela do 58%-nog smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 37: Kvantitativna imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 275-VQIINKKLDL SNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 4) ili kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 38. Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 4 je pokazala umereno poboljšanje u neurobihejvioralnim parametrima. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5 cm). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale. Podaci su prikazani sa standardnom greškom srednje vrednosti..

Slika 39: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 4 je dovela do 66%-nog smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 40: Imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) imunizovanih pomoću tau 201-GSPGTPGSRSRTPSLPTPPT REPKKVAVVR-230/ koji nosi fosforilisan treonin na poziciji 217 (SEQ ID NO: 5) sa adjuvantom ili kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 41: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 201- GSPGTPGSRSRTPSLPTPPT REPKKVAVVR-230/ koji nosi fosforilisan treonin na poziciji 217 (SEQ ID NO: 5). Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale.

Slika 42: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 5 nije pokazala nikakav efekat na količinu neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 43: Imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) imunizovanih pomoću tau 379-RENAKAKTDHGAEIVYKSPVV SGDTSPRHL-408 koji nosi fosforilisan serin na pozicijama 396 i 404 (SEQ ID NO: 6) i adjuvanta ili kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 44: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau SEQ ID NO: 6 fosforilisan at Ser396/Ser404.). Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale.

Slika 45: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 6 nije pokazala nikakvo smanjenje količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 46: Imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) imunizovanih pomoću tau 181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210 koji nosi fosforilisan serinski ostatak na poziciji 202 i treoninski ostatak na 205 (SEQ ID NO: 7) sa adjuvantom ili kontrolnih pacova tretiranih samo adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 47: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210 koji nosi fosforilisan serinski ostatak na poziciji 202 i treoninski ostatak na 205 (SEQ ID NO: 7). Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale. Slika 48: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 7 nije pokazala nikakav efekat na količinu neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 49: Imunoblot analiza nerastvorljivog tau dobijenog iz moždanog stabla transgenih pacova (SHR72) imunizovanih pomoću tau 300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317 (SEQ ID NO: 8) sa adjuvantom ili kontrolnih pacova tretiranih samim adjuvantom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 50: Neurobihejvioralna evaluacija transgenih pacova (SHR72) tretiranih pomoću tau 300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317 (SEQ ID NO: 8). Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa. (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale.

Slika 51: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 8 nije pokazala nikakvo smanjenje količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 52: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom (SEQ ID NO: 108) je statistički značajno smanjila nerastvorljiv patološki tau (p< 0,001). Patološki nerastvorljiv tau je ekstrahovan iz mozgova transgenih pacova SHR72 imunizovanih tau peptidom i analiziran imunoblotom. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 53: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom (SEQ ID NO: 108) je statistički značajno poboljšala neurobihejvioralne parametre (p<0,05). (A) Test hodanja po gredi (greda od 3,5). (B) Broj skliznuća zadnjih udova (greda od 3,5). (C) Neuroscale. Podaci su prikazani sa standardnom greškom srednje vrednosti..

Slika 54: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom (SEQ ID NO: 108) je dovela do 60%-nog smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Antitelo AT8 je korišćeno za evaluaciju NFT u tkivima mozga transgenih pacova SHR72.

Slika 55: ELISA seruma dobijenih iz transgenih pacova imunizovanih (SHR72) pomoću peptida tau 275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 4) pokazuje razliku u vezivanju seruma za humani patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R i humani fiziološki tau 2N4R.

Slika 56: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je indukovala formiranje antitela koja se preferencijalno vezuju za patološki tau protein. Geometrijska sredina titara antitela merena ELISA-om pokazuje da antitela izazvana vakcinacijom tau peptidom SEQ ID NO: 108 ispoljavaju najvišu aktivnost vezivanja za

2

imunogen (SEQ ID NO: 108 peptid) i za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R. Fiziološki tau (tau2N4R), koji je korišćen kao kontrola, je bio slabije preopznat.

Slika 57: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je preferencijalno indukovala formiranje IgG izotipova antitela specifičnih za patološki tau. Prikazan je izotipski profil antitela indukovan tau peptidom SEQ ID NO: 108. Serumi pojedinačnih pacova su razblaženi 1:800 i aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R je analizirana ELISA-om.

Slika 58: Određivanje pomoću SPR afiniteta vezivanja antiseruma, dobijenih iz pacova SHR72 imunizovanih peptidom tau 275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 4), za humani tauΔ(1-150;392-441)/4R i humani tau 2N4R.

Slika 59: Imunohistohemijsko bojenje mozga humanog pacijenta sa AD pomoću pacovskih antitela dobijenih imunizacijom transgenih pacova (SHR72) pomoću tau 275-VQIINKKLDL SNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 4). (A) Antiserumi su prepoznali neurofibrilarne lezije u mozgu sa Alchajmerovom bolešću, u hipokampusu. (B) Veće uvećanje pokazuje neurofibrilarnu klubad. Crta označava: 100 µm (A), 10 µm (B).

Slika 60: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je indukovala prepoznavanje patoloških tau proteina od strane antitela u presecima iz humanih tkiva mozga sa Alchajmerovom bolešću. Reprezentativno imuno-bojenje pacovskih seruma br.3 (A), 5 (B), 6 (C), 7 (D), i 8 (E) pokazuje da sva testirana antitela iz pacovskih seruma prepoznaju neurofibrilarnu klubad u pre-α sloju entorinalnog korteksa pacijenta sa Alchajmerovom bolešću. Objedinjeni serumi iz pacova imunizovanih samim adjuvantom su korišćeni kao negativna kontrola (F). Korišćeni su serijski preseci iz humanih moždanih tkiva iz entorinalnog korteksa. Crta označava: 50 µm.

Slika 61: Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je indukovala prepoznavanje patoloških tau proteina u humanim mozgovima sa Alchajmerovom bolešću, kao i u mozgovima transgenih pacova SHR72, od strane specifičnih antitela. Patološki tau je ekstrahovan iz humanih i pacovskih moždanih tkiva i analiziran pomoću imunoblota sa objedinjenim serumima transgenih pacova SHR72 imunizovanih pomoću peptida SEQ ID NO: 108. Antitela iz seruma su prepoznala monomeran (staza br.1, 2 i br. 3) i oligomeran (staza br. 2 i br. 3) patološki tau, uključujući patološki tau A68, karakterističan za AD.

Slika 62: Imunizacija miševa tau peptidom SEQ ID NO: 109 je indukovala antitela sa statistički značajno većom aktivnošću vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (p=0,0115). Grafik predstavlja statističku evaluaciju ELISA rezultata za pojedinačne serume razblažene 1:800. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 63: Imunizacija miševa tau peptidom SEQ ID NO: 110 je indukovala antitela koja ispoljavaju statistički značajno veću aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (p=0,0029). Grafik predstavlja statističku evaluaciju ELISA rezultata za pojedinačne serume razblažene 1:800. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 64: Imunizacija miševa tau peptidom SEQ ID NO: 111 je indukovala antitela koja ispoljavaju statistički značajno veću aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (p=0,0007). Grafik predstavlja statističku evaluaciju ELISA rezultata za pojedinačne serume razblažene 1:800. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 65: Imunizacija miševa tau peptidom SEQ ID NO: 112 je indukovala antitela koja ispoljavaju statistički značajno veću aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (p<0,001). Grafik predstavlja statističku evaluaciju

2

ELISA rezultata za pojedinačne serume razblažene 1:800. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 66: Kreirani terapijski epitopi GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251) su kompetirali sa patološkim tauΔ(1-150;392-441)4R za vezivanje za antitelo DC8E8.

Slika 67: Kreirani terapijski epitopi GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251) su indukovali proizvodnju antitela koja statistički značajno diskriminišu patološki tauΔ(1-150;392-441)4R od fiziološkog tau 2N4R, kao što je testirano ELISA-om. Serumi (u razblaženju 1:3200) iz miševa imunizovanih jednim od peptida 250 i 251 su testirani ELISA-om na antitela specifična za tau proteine: patološki tauΔ(1-150;392-441)4R i fiziološki tau 2N4R.

Slika 68: Imunizacija kreiranim terapijskim epitopima GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251) je indukovala najrobustniju proizvodnju antitela IgG1 izotipa.

Slika 69: Kvantitativna SPR (Surface Plasmon Resonance, površinska plazmonska rezonanca) merenja pokazuju da antitela, koja su indukovali kreirani terapijski epitop 1 (GWSIHSPGGGSC, SEQ ID NO: 250) (Slika 69A) i kreirani terapijski epitop 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) (Slika 69B), statistički značajno (p<0,001 i p<0,01, respektivno) diskriminišu patološki tauΔ(1-150;392-441)/4R od fiziološkog 2N4R tau.

Slika 70: Imunohistohemijsko bojenje humanih moždanih tkiva sa AD pomoću seruma napravljenih protiv kreiranog terapijskog epitopa 1 (GWSIHSPGGGSC, SEQ ID NO: 250) i kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251). (A) Antiserumi protiv kreiranog terapijskog epitopa 1 su prepoznali neurofibrilarnu patologiju u mozgu AD pacijenta. (C) Veliko uvećanje neurofibrilarne klubadi i neuropilnih niti (strelice). (B) Antiserumi protiv kreiranog terapijskog epitopa 2 su prepoznali neurofibrilarnu patologiju u mozgu AD pacijenta. (D) Veliko uvećanje obojene neurofibrilarne klubadi i neuropilnih niti (strelice). Antiserumi protiv kreiranog terapijskog epitopa 1 i kreiranog terapijskog epitopa 2 nisu prepoznali normalan tau u kontrolnom humanom mozgu (E, F). Crta označava: 50µm (A, B, E, F), 20 µm (C, D). (G) Serum napravljen protiv kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) prepoznaje neurofibrilarne lezije u transgenim pacovima SHR72. (H) U kontrolnim pacovskim mozgovima uparenim po starosti, antitelo ne ispoljava intraneuronsko bojenje. Serum prepoznaje oligomerni (I), kao i unutarćelijski (J) stadijum pre klubadi. Crta označava: 20µm (A, B), 10 µm (C, D).

Slika 71: Antitela koja su indukovali kreirani terapijski epitop 1 (GWSIHSPGGGSC, SEQ ID NO: 250) i kreirani terapijski epitop 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) su prepoznala rastvorljiv i nerastvorljiv u sarkozilu patološki tau izolovan iz humanih moždanih tkiva sa Alchajmerovom bolešću.

Slika 72: Antitela koja su indukovali kreirani terapijski epitop 1 (GWSIHSPGGGSC, SEQ ID NO: 250) i kreirani terapijski epitop 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) su prepoznala rastvorljiv (staza 1, 3, 5) i nerastvorljiv (staza 2, 4, 6) patološki tau izolovan iz mozgova pacovskih modela (SHR72) Alchajmerove bolesti.

Slika 73: Imunoterapija pomoću kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) je pokazala značajno poboljšanje u neurobihejvioralnim parametrima (Neuroscale) tretiranih SHR72 pacova. (A) Test hodanja po gredi. (B) Broj skliznuća zadnjih udova (p<0,05). (C) Neuroscale. Pacovi tretirani kreiranim terapijskim epitopom 2 (SEQ ID NO: 251) su pokazali: a) smanjena kašnjenja u prelasku za 27% u testu hodanja po gredi, b) smanjen broj skliznuća zadnjih udova za 44% (p<0,05) i c) smanjen broj bodova na Neuroscale za 26% u odnosu na transgene kontrolne pacove koji su primili

2

sam adjuvant. Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa.

Slika 74: Imunoterapija pomoću kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) je pokazala statistički značajno smanjenje patološkog tau u mozgovima imunizovanih transgenih SHR72 pacova sa Alchajmerom. Imunoterapija je statistički značajno (p<0,05) smanjila količinu patološkog nerastvorljivog tau u imunizovanim životinjama u poređenju sa kontrolnim transgenim pacovima koji su primili sam adjuvant. Smanjenje patološkog nerastvorljivog tau je primećeno na svim analiziranim tau epitopima (p<0,05).

Slika 75: (A) Šematski prikaz sintetičkih peptida korišćenih za dalju evaluaciju minimalnog epitopa DC8E8 (terapijska glavna jedinica) i određivanje imunogene moći i (B) njihove aminokiselinske sekvence.

Slika 76: Određivanje minimalnog epitopa DC8E8 (terapijska glavna jedinica) korišćenjem sintetičkih peptida pomoću kompetitivne ELISA-e. Deset tau peptida (SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281, 282 i 283), koji sadrže bar 6 aminokiselina iz DC8E8 sekvence za prepoznavanje, je sposobno da uđe u kompeticiju sa patološkim tauΔ(1-150;392- 441)/4R za vezivanje antitela DC8E8. Tau peptidi koji sadrže samo 5 aminokiselina iz DC8E8 sekvence za prepoznavanje (SEQ ID NO: 273, 274, 278 i 279) ne mogu da se takmiče sa tauΔ(1-150;392-441)/4R (SEQ ID NO: 199) za vezivanje antitela DC8E8.

Slika 77: Indukcija antitela specifičnog za tau posle imunizacije C57BL miševa tau peptidima. (A) 12-merni, 7-merni i 6-merni peptidi (SEQ ID NO: 270, 271 i 272, respektivno) su imunogeni. Antitela koja je indukovala imunizacija ispoljavaju statistički značajno veću aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (p<0,0079; p<0,0052; p<0,0079, respektivno). 5-merni peptidi SEQ ID NO: 273 i 274 nisu imunogeni. (B) 42-merni, 19-merni, 7-merni i 6-merni peptidi (SEQ ID NO: 275, 280, 276 i 277, respektivno) su imunogeni. Antitela koja su indukovali ovi peptidi su statistički značajno (p<0,0079, p<0,0159, p<0,0079 i p<0,0379, respektivno) diskriminisali patološki tauΔ(1-150;392-441)/4R od fiziološkog tau 2N4R.

5-merni peptidi SEQ ID NO: 278 i 279 nisu imunogeni. (C) 7-merni peptidi (SEQ ID NO: 281 i 283) su imunogeni. Antiserumi protiv ovih peptida su statistički značajno (p<0,0379, i p<0,0286, respektivno) diskriminisali patološki tauΔ(1-150;392-441)/4R od fiziološkog tau 2N4R. Nivoi antitela na patološki tau i fiziološki tau koja je indukovao 6-merni peptid SEQ ID NO: 282 su bili vrlo niski. Grafici predstavljaju statističku evaluaciju rezultata ELISA-e za pojedinačne serume razblažene 1:800. Srednje vrednosti su prikazane sa standardnom greškom srednje vrednosti.

Slika 78: Geometrijska sredina titara antitela specifičnih za tau posle imunizacije C57BL miševa tau peptidima. Vakcinacija C57BL miševa tau peptidom SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283 indukovala je formiranje antitela specifičnih za tau. Geometrijska sredina titara antitela merenih ELISA-om pokazuje da antitela izazvana vakcinacijom tau peptidima SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283 ispoljavaju višu aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392- 441)/4R nego za fiziološki tau (tau2N4R). Niži titri antitela specifičnih za tau su detektovani posle imunizacije miševa tau peptidima SEQ ID NO: 273, 274, 278, 279 i 282.

Slike 79A i 79B: pokazan je izotipski profil antitela koja su indukovali tau peptidi. Imunizacija C57/BL miševa tau peptidima koji nose minimalan DC8E8 epitop je preferencijalno indukovala formiranje IgG1 i IgG2b izotipova antitela specifičnih za patološki tau. Objedinjeni serumi iz pojedinačnih miševa su razblaženi 1:800 i aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R je analizirana ELISA-om.

2

Slika 80: Kvantitativna evaluacija kapaciteta vezivanja antitela, koja su bila indukovana u miševima C75BL imunizovanim tau peptidima, za tauΔ(1-150;392-441)/4R i 2N4R. Merenja površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) su pokazala da antitela na tau peptide SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283 statistički značajno (**... p<0,001 i *... p<0,01) diskriminišu patološki tauΔ(1-150;392-441)/4R od fiziološkog 2N4R tau. KA - ravnotežna konstanta asocijacije (vezivanja).

Slika 81: Antitela indukovana u miševa imunizovanim tau peptidima prepoznaju patološke forme u Western blotu. Vakcinacija C57BL miševa tau peptidima SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283 indukovala je specifična antitela, koja prepoznaju patološke tau proteine izolovane iz humanih moždanih tkiva sa Alchajmerovom bolešću kao i iz moždanog stabla transgenih pacova SHR72. Antiserumi posle imunizacije miševa peptidima SEQ ID NO: 273, 274, 278, 279 i 282 nisu prepoznali patološke forme tau.

Slikas 82A-C: Neurofibrilarna klubad koju su prepoznala antitela indukovana tau peptidom u humanim moždanim tkivima sa AD. Vakcinacija C57BL miševa tau peptidima SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283 indukovala je antitela koja prepoznaju neurofibrilarne lezije u hipokampusu mozga sa Alchajmerovom bolešću. Serumi iz miševa imunizovanih pomoću samog adjuvanta su korišćena kao negativna kontrola. Korišćeni su preseci moždanog tkiva iz hipokampusa CA1. Crta označava: 100 µm.

Slika 83: Rezime imunohistohemijskog bojenja (i odgovarajućih relativnih intenziteta) moždanih tkiva iz humanog pacijenta sa AD pomoću seruma antitela dobijenih iz C57BL miševa imunizovanih tau peptidima SEQ ID NO: 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282 i 283.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0081] Termin "antitelo" se odnosi na imunoglobulin, bilo da je dobijen genetičkim inženjeringom, bilo da je prirodan, ili proizveden potpuno ili delimično sintetički ili rekombinantno. Svi njegovi derivati, delovi i fragmenti koji zadržavaju osobine vezivanja antigena i bar jednu od karakterističnih osobina opisanih ovde su takođe uključeni u termin. Termin takođe obuhvata svaki protein koji ima domen za vezivanje koji je homologan ili uveliko homologan sa imunoglobulinskim domenom za vezivanje. Ovi proteini mogu biti izvedeni iz prirodnih izvora, ili proizvedeni potpuno ili delimično sintetički ili rekombinantno. Antitelo može biti monoklonsko ili poliklonsko. Antitelo može biti član bilo koje imunoglobulinske klase, uključujući bilo koju od humanih klasa: IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE. Derivati IgG klase su u nekim oblicima poželjni.

[0082] Termini "izolovano antitelo" i "izolovan peptid" se odnose na protein ili peptid proizveden iz cDNK-, rekombinantne RNK-, ili bilo kog drugog sintetičkog porekla, ili neka njihova kombinacija; kao i na proteine i peptide koji, zahvaljujući svom poreklu, ili izboru derivacije, ili (1) nisu vezani za proteine nađene u prirodi, (2) su slobodni od drugih proteina iz istog izvora, npr. slobodni od mišjih proteina, (3) su eksprimirani u ćeliji iz različite vrste, ili (4) se ne javljaju u prirodi.

[0083] Antitela opisana ovde uključuju, dodatno, takva antitela koja imaju "modifikacije konzervativne sekvence", modifikacije nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci koje ne pogađaju ili ne menjaju gorepomenute osobine antitela. Modifikacije se mogu uvesti standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što je dirigovana mutageneza i mutageneza dirigovana PCR-om. Supstitucije konzervativnih aminokiselina uključuju one u kojima je

2

aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. U struci su definisane familije aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance. Ove familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), sa kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), bočnim lancima sa beta-grananjem (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, predviđen nebitan aminokiselinski ostatak u antitelu na tau može, na primer, biti zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste familije bočnih lanaca.

[0084] "Fragmenti antitela" i "delovi antitela" sadrže deo celog antitela, generalno, bar deo/domen za vezivanje antigena ili njegov varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju dijatela, jednolančane molekule antitela, imunotoksine i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela. Pored toga, fragmenti antitela sadrže jednolančane polipeptide koji imaju karakteristike VH lanca koji vezuje patološki tau, naime, sposobni su da se udruže sa VL lancem ili VL lanca koji vezuje patološki tau, naime, sposobni su da se udruže sa VH lancem da formiraju funkcionalni džep koji vezuje antigen i time obezbede osobinu vezivanja za patološki tau. Termini takođe obuhvataju fragmente koji sami nisu sposobni da obavljaju efektorske funkcije (npr., ADCC/CDC), ali obavljaju ovu funkciju posle kombinovanja sa odgovarajućim konstantnim domenom(-ima) antitela.

[0085] Termin "himerno antitelo" se odnosi na monoklonsko antitelo koje sadrži varijabilni region, tj., vezujući region iz jednog izvora ili vrste i bar deo konstantnog regiona izveden iz nekog drugog izvora ili vrste, obično dobijeno tehnikama rekombinantne DNK. Himerna antitela koja sadrže mišji varijabilni region i humani konstantni region su naročito poželjna. Takva mišja/humana himerna antitela su proizvod eksprimiranin imunoglobulinskih gena koji sadrže segmente DNK koji kodiraju mišje varijabilne regione imunoglobulina i segmente DNK koji kodiraju humane konstantne regione imunoglobulina. Ostale forme "himernog antitela" obuhvaćene ovde su one u kojima je klasa ili podklasa modifikovana ili promenjena od one originalnog antitela. Takva "himerna" antitela se nazivaju i "antitela promenjene klase". Metodi za proizvodnju himernih antitela uključuju konvencionalne tehnike rekombinantne DNK i transfekcije genima sada poznate u struci. Videti, npr., Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; U.S. Pat. Nos.5,202,238 i 5,204,244.

[0086] Termin "humanizovano antitelo" se odnosi na antitela u kojima su okvirni regioni (FR) i/ili regioni koji određuju komplementarnost (CDR) modifikovani tako da sadrže CDR imunoglobulina drukčije specifičnosti od one roditeljskog imunoglobulina. U jednom izvođenju, mišji CDR je nakalemljen u okvirni region humanog antitela da bi se dobilo "humanizovano antitelo". Videti, npr., Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Naročito poželjni CDR-ovi odgovaraju onima koji predstavljaju sekvence koje prepoznaju antigene i epitop na tau, ovde opisane kao "terapijski epitopi".

[0087] Termin "humano antitelo", kao što se ovde koristi, treba da uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humane embrionske imunoglobulinske sekvence. Konstantni regioni antitela mogu biti, na primer, konstantni regioni humanog IgG1 tipa. Takvi regioni mogu biti alotipski i opisani su u, npr., Johnson, G. and Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 i tamo navedene baze podataka i preferencijalno su korisne za neka rešenja, dok god su zadržane osobine indukovanja ADCC i, na primer, CDC, opisane ovde.

[0088] Termin "rekombinantno humano antitelo", kao što se ovde koristi, treba da uključuje sva humana antitela koja su dobijena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela izolovana iz ćelije domaćina, kao što je NSO ili CHO ćelija ili iz životinje (npr. miša, kao što je XENOMOUSE, genetički modifikovan miš koji proizvodi antitela koja imaju aminokiselinu sekvencu humanog antitela, npr., aminokiselinsku sekvencu humanog okvirnog regiona (FR) i humanog konstantnog regiona) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene ili antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humane embrionske imunoglobulinske sekvence u preuređenoj formi. Rekombinantna humana antitela su bila podvrgnuta in vivo somatskoj hipermutaciji. Prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, mada izvedene iz i vezane za humane embrionske VH i VL sekvence, ne mogu prirodno da postoje unutar embrionskog repertoara humanog antitela in vivo.

[0089] Termin "effektorske funkcije" uključuje, ali nije ograničen na, C1 q vezivanje; citotoksičnost (CDC) zavisnu od komplementa; vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC) zavisnu od antitela; fagocitozu i nishodnu regulaciju receptora na površini ćelije (npr. B ćelijski receptor; BCR).

[0090] Termin "epitop" se ovde koristi da označi mesta vezivanja koja prepoznaje vezujući protein ili antitelo. Epitopi mogu biti bilo koji molekuli ili njihove grupacije, uključujući, ali bez ograničenja, aminokiseline, aminokiselinske bočne lance, šećere i lipide, i mogu da imaju specifičnu trodimenzionu strukturu ili konformaciju. Prema tome, epitop može da sadrži bilo koji deo molekula tau peptida/proteina koji uključuje primarnu, sekundarnu, tercijarnu ili kvaternarnu strukturu, jer su ti termini uopšteno poznati u struci. "Linearan epitop" je sačinjen od kontinualne sekvence aminokiselinskih ostataka. Linearan epitop je onaj koji je prisutan na fiziološkom tau (npr., prisutan je u tau 2N/4R). "Konformacioni epitop" je epitop za koji se antitelo ili vezujući protein vezuje na konformaciono specifičan način. U slučaju epitopa zasnovanih na proteinima, vezivanje može da zavisi od sekundarne, tercijarne ili kvaternarne strukture proteina koji nosi epitop. Drugim rečima, antitelo se vezuje na strukturno specifičan način, tercijarno strukturan specifičan način, ili kvaternarno strukturan specifičan način. Konformacioni epitop je onaj koji je prisutan u patološkom tau (npr., prisutan u tauΔ(1-150;392-441)/4R)).

[0091] Termin "terapijski epitop" se odnosi na regione unutar tau koji su ovde identifikovani i nađeni da podstiču agregiranje tau, kad su u određenim konformacijama (prepoznatim od strane DC8E8 antitela). Antitela (i drugi vezujući proteini), koja se vezuju za jedan ili više od ovih regiona, inhibiraju rane i kasne stadijume agregiranja tau, uključujući konverziju monomera tau u dimer i konverziju u više oblike agregata; tj., antitela inhibiraju konverziju iz fiziološkog tau u patološki tau. Ovi regioni unutar tau mogu biti uključeni u podsticanje tau fibrilizacije u sparene helične filamente (PHF), podsticanjem formiranja beta ravni u okviru susednih regiona u tau. Terapijski epitopi su sadržani unutar 267-KHQPGGG-273 (unutar prvog ponovljenog domena tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (unutar 3. ponovljenog domena tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (unutar 4<.>ponovljenog domena tau proteina). U nekim izvođenjima, svaki od terapijskih epitopa je sadržan unutar 268-HQPGGG-273 (unutar 1. ponovljenog

1

domena tau proteina), 299-HVPGGG-304 (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 330-HKPGGG-335 (unutar 3. ponovljenog domena tau proteina) i 362-HVPGGG-367, respektivno.

[0092] Termin "ispoljava veći afinitet za patološki tau nego za fiziološki tau" se odnosi na veći stepen interakcije između antitela i bar jedne forme patološkog tau nego između antitela i bar jedne forme fiziološkog tau. Interakcija se može meriti, npr., pomoću ELISA-e ili površinske plazmonske rezonance (SPR), kao što je opisano u PRIMERIMA niže.

[0093] Termini "specifično vezuje", "vezuje specifično" i "specifičan za" su međusobno zamenjivi i znače da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (ili neki drugi vezujući protein) formira kompleks sa antigenom ili epitopom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može biti okarakterisano konstantom disocijacije od oko 1×10<-6>M ili manjom, na primer, manjom od oko 100 nM i najviše, na primer, manjom od 10 nM. Metodi za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju su poznati u struci i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Tipično, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je molekul koji vezuje antigen ili epitop sa takvom konstantom disocijacije od bar oko 1×10<-6>M ili manjom, ali ne vezuje druge molekule sa takvom konstantom disocijacije.

[0094] "Preferencijalno vezuje" se odnosi na vezivanje sa većim afinitetom za patološki tau nego za fiziološki tau, na primer, vezivanje sa većim afinitetom za tauΔ(1-150;392-441)/4R nego za 2N4R.

[0095] "Univerzalni T-ćelijski epitop" je sekvenca odabrana iz grupe: Influenza Hemagglutinin HA307-319 (PKYVKQNTLKLAT) (SEQ ID NO: 123); PADRE (AKXVAAWTLKAAA) (SEQ ID NO: 124); Malaria CS: T3 epitop (EKKIAKMEKASSVFNV) (SEQ ID NO: 125); površinski antigen hepatitisa B: HBsA919_28 (FFLLTRILTI) (SEQ ID NO: 126); protein toplotnog šoka 65: hsp65153_171 (DQSIGDLIAEAMDKVGNEG) (SEQ ID NO: 127); bacil Calmette-Guerin (QVHFQPLPPAVVKL) (SEQ ID NO: 128); tetanus toksoid: T1830-844 (QYIKANSKFIGITEL) (SEQ ID NO: 129); tetanus toksoid: T1947-967 (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) (SEQ ID NO: 130); i HIV gp120 T1 (KQIINMWQEVGKAMYA) (SEQ ID NO: 131).

[0096] Termin "intrinsično poremećen tau" se odnosi na normalnu/fiziološku formu tau proteina, kojoj nedostaje bilo kakva definisana 3D struktura. On postoji u zdravom mozgu (Kovacech et al., 2010).

[0097] "Duplo poremećen tau" se odnosi na forme tau koje se konformaciono razlikuju od normalnog/fiziološkog intrinsično poremećenog tau i nemaju čvrstu/definisanu 3D strukturu. Duplo poremećen skraćen tau je u stanju da indukuje neurofibrilarnu degeneraciju in vivo. On ne postoji u zdravom mozgu (Kovacech et al., 2010). "Pogrešno uređen tau" se odnosi na strukturisanu patološku formu tau udruženu u polimere PHF, koja formira NFT. Pogrešno uređen tau ne postoji u zdravom mozgu (Kovacech et al., 2010).

[0098] "SHR24" se odnosi na transgenu pacovsku liniju koja eksprimira tau tipa IIB (151-391/R3). Transgeni pacovi su razvili progresivnu neurofibrilarnu degeneraciju zavisnu od starosti u kortikalnim oblastima mozga. Neurofibrilarna klubad (NFT) u SHR24 pacovima zadovoljavaju nekoliko ključnih histoloških kriterijuma korišćenih za identifikaciju

2

neurofibrilarne degeneracije u Alchajmerovoj bolesti čoveka uključujući argirofiliju, Kongo crveno dvostruko prelamanje i reaktivnost na tioflavin S. Ovi kriterijumi se mogu koristiti za analizu neurofibrilarne degeneracije u subjektima koji primaju neka od rešenja pream pronalasku. Neurofibrilarna klubad je takođe identifikovana pomoću antitela korišćenih za detekciju patološkog tau u humanom mozgu, uključujući DC11, prepoznajući abnormalnu tau konformaciju i antitela koja su specifična za hiperfosforilisane forme tau proteina. Štaviše, neurofibrilarna degeneracija je okarakterisana ekstenzivnim formiranjem kompleksa tau proteina nerastvorljivih u sarkozilu, koji se sastoje od pacovskih endogenih i skraćenih tau vrsta (Filipcik et al., 2010).

[0099] "SHR72" se odnosi na transgene pacove koji eksprimiraju humani skraćeni tauΔ(1-150;392-441)/4R u skladu sa međunarodnom patentnom prijavom PCT WO 2004/007547), u nekoliko regiona mozga i kičmenoj moždini. Generisanje ove pacovske linije je opisana u Zilka et al., 2006, a tau patologija je opisana u Koson et al., 2008.

[0100] "Tau tipa IA" se odnosi na N- i C- terminalno duplo skraćene tau proteine koji imaju bar prvih 236 N-terminalnih aminokiselina i bar poslednjih 45 C- terminalnih aminokiselina iz tau43 koji sadrži 4 ponovka skraćene. Ovi molekuli su detektabilni u moždanom tkivu sa Alchajmerovom bolešću, a nisu detektabilni u normalnom zdravom moždanom tkivu (WO2004/007547 A2).

[0101] "Tau tipa IB" se odnosi na N- i C- terminalno duplo skraćene tau proteine koji imaju bar prvih 236 N-terminalnih aminokiselina i bar poslednjih 45 C- terminalnih aminokiselina iz tau44 koji sadrži 3 ponovka skraćene. Ovi molekuli su detektabilni u moždanom tkivu sa Alchajmerovom bolešću, a nisu detektabilni u normalnom zdravom moždanom tkivu (WO2004/007547 A2).

[0102] "Tau tipa IIA" se odnosi na N- i C- terminalno duplo skraćene tau proteine koji imaju bar prvih 68 N- terminalnih aminokiselina i bar poslednjih 40 C- terminalnih aminokiselina iz tau43 koji sadrži 4 ponovka skraćene. Ovi molekuli su detektabilni u moždanom tkivu sa Alchajmerovom bolešću, a nisu detektabilni u normalnom zdravom moždanom tkivu (WO2004/007547 A2).

[0103] "Tau tipa IIB" se odnosi na N- i C- terminalno duplo skraćene tau proteine koji imaju bar prvih 68 N- terminalnih aminokiselina i bar poslednjih 20 C- terminalnih aminokiselina iz tau44 koji sadrži 3 ponovka skraćene. Ovi molekuli su detektabilni u moždanom tkivu sa Alchajmerovom bolešću, a nisu detektabilni u normalnom zdravom moždanom tkivu (WO2004/007547 A2).

[0104] Kao što se ovde koriste, termini "tretman", "tretiranje" i slično, odnose se na postizanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktičan u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja oboljenja ili njegovog simptoma i/ili može biti terapijski, u smislu delimičnog ili potpunog leka za oboljenje i/ili negativan afekat koji se može pripisati bolesti. "Tretman", kao što se ovde koristi, pokriva i svaki tretman AD ili srodnih tauopatija u sisaru, naročito u čoveku, i uključuje: (a) sprečavanje da se bolest pojavi u subjektu koji može biti predisponiran ka toj bolesti ili u riziku od dobijanja bolesti, ali mu još nije dijagnostikovana kao da je ima; (b) inhibiranja bolesti, tj., zaustavljanja njenog razvoja i (c) olakšavanja bolesti, tj., uzrokovanja regresije bolesti. Poželjni oblici "tretmana" su još diskutovani niže. U nekim izvođenjima, "tretiranje" se odnosi na davanje terapijskog agensa pacijentu za kog se sumnja da pati ili već pati od AD ili neke druge tauopatije. Može se odnositi i na redukovanje, eliminisanje ili bar delimično zaustavljanje, kao i na ispoljavanje bilo kakvog blagotvornog efekta na jedan ili više simptoma bolesti i/ili asociranog sa bolešću i/ili njenim komplikacijama.

[0105] "Prevencija" se odnosi na davanje pacijentu podložnom, ili na drugi način u riziku od, određene bolesti. Svako u opštoj populaciji je u riziku od AD. Neke osobe imaju povećan, genetski rizik od AD. Prevencija može da eliminiše ili smanji rizik ili da odloži početak bolesti. Odlaganje početka ili napredovanja se može meriti na osnovu standardnih vremena napredovanja bolesti u sličnim populacijama ili pojedincima.

[0106] "Tauopatija" se odnosi na bolest vezanu za formiranje patoloških tau.

[0107] "Fiziološki tau" se odnosi na bilo koju od 6 izoformi normalnog humanog tau, naime:

2N4R (SEQ ID NO: 102)

1N4R (SEQ ID NO: 103)

2N3R (SEQ ID NO: 104)

0N4R (SEQ ID NO: 105)

1N3R (SEQ ID NO: 106)

0N3R (SEQ ID NO: 107)

Izuzeti iz ove definicije su oni koji nose bilo koju od fosforilacija vezanih za Alchajmerovu bolest i ostale tauopatije.

[0108] "Patološki tau" uključuje patološke konformere i strukture tau i obuhvata sve od sledećih: tau tipa IA, IB, IIA, i IIB, pogrešno uređen, duplo poremećen tau (monomer, dimer, trimer, oligomer), duplo poremećen rastvorljiv tau, tau nerastvorljiv u sarkozilu, vanćelijske tau depozite, agregate tau, sparene helične filamente, neurofibrilarnu patologiju, uključujući neurofibrilarne lezije, klubad, niti, fibrile, aksonske sferiode, visoko fosforilisane forme skraćenog tau i tau cele dužine, ili bilo koju drugu formu tau povezanu sa AD ili nekom drugom tauopatijom.

[0109] "Vezan" se odnosi na spoj grupe sa peptidom, antitelom ili jedinjenjem. Grupa može biti kuplovana ili u kompleksu, ili kovalentno ili nekovalentno spojena. Grupa može biti hemijski unakrsno vezana ili eksprimirana ili sintetisana kao fuzija sa peptidom ili antitelom.

[0110] "Grupa" se odnosi na bilo koje jedinjenje, organsko, peptid, protein, nukleinsku kiselinu, nosač, adjuvant, koje je sposobno da se spoji sa peptidom, antitelom ili vezujućim proteinom, ali da sam nije zahtevani peptid, antitelo ili vezujući protein.

[0111] "Imunogen" se odnosi na nešto što može da podigne imuni odgovor. Imuni odgovor može biti posredovan antitelom ili ćelijomili pomoću oba.

[0112] "Adjuvant" se odnosi na supstancu koja je sposobna da poveća, amplifikuje ili moduliše imuni odgovor na pridružen peptid.

[0113] "Druga terapija" se odnosi na dodatne terapije koje pacijenti podvrgnuti lečenju mogu da dobijaju.

4

[0114] "Klirens" se odnosi na smanjenje nivoa ili detekcije patološkog tau i/ili strukture patološkog tau. Klirens ne mora da bude potpun nestanak patološkog tau, tj., može da bude delimičan nestanak.

[0115] Termin "podsticanje" obuhvata indukovanje, poboljšanje ili povećanje.

[0116] "Moždano tkivo" se odnosi na bilo koje neuronsko tkivo, npr., iz mozga, moždanog stabla i kičmene moždine.

[0117] Termin "specifično vezivanje" i "visok afinitet", respektivno, se odnosi na vezivanje antitela za predodređen antigen, tj. tau epitop definisan gore. Tipično, antitelo se vezuje sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-6>M ili manjom i vezuje se za predodređen antigen sa KD koja je bar dvaput manja od njegove KD vezivanja za nespecifičan antigen (npr., BSA, kazein, ili bilo koji drugi specifikovan polipeptid) koji nije predodređen antigen. Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i " antitelo specifično za antigen" se ovde koriste u istom značenju sa terminom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen". Kao što se ovde koristi, "visoko specifično" vezivanje znači da je relativna KDvezivanja antitela za duplo poremećen tau bar 4 puta manja od KDvezivanja tog antitela za druge ligande ili za normalan tau pune dužine.

[0118] Termin "prokariotski" treba da uključuje sve bakterije koje se mogu transformisati ili transfektovati pomoću DNK ili RNK molekula za ekspresiju antitela iz pronalaska ili jednog ili više odgovarajućih imunoglobulinskih lanaca. Prokariotski domaćini mogu da uključuju gram-negativne, kao i gram-pozitivne bakterije kao što su, na primer, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis. Termin "eukariotski" treba da uključuje kvasac, višu biljku, insekta i, na primer, sisarske ćelije, najviše, na primer, HEK 293, NSO i CHO ćelije.

[0119] Termin "hemijski derivat" opisuje molekul koji sadrži dodatne hemijske grupe koje nisu normalno deo osnovnog molekula. Takve grupe mogu da poboljšaju rastvorljivost, poluživot, apsorpciju, itd. osnovnog molekula. Alternativno, grupe mogu da umanje neželjene bočne efekte osnovnog molekula ili da smanje toksičnost osnovnog molekula.

[0120] Termini "nukleinska kiselina", "nukleinska sekvenca", "sekvenca nukleinske kiseline", "polinukleotid" "oligonukleotid", "polinukleotidna sekvenca" i "nukleotidna sekvenca" se koriste u istom značenju u ovom pronalasku i odnose se na preciznu sekvencu nukleotida, modifikovanu ili ne, definišući fragment ili region nukleinske kiseline, koji sadrži ili ne sadrži neprirodne nukleotide i koja je ili dvolančana DNK, a jednolančana DNK ili proizvodi transkripcije navedenih DNK.

[0121] Termin "izolovan polinukleotid" ili "izolovana nukleinska kiselina", kao što se ovde koristi, će označavati polinukleotid čije je poreklo genomsko, cDNK ili sintetičko ili neka njihova kombinacija, koja, zahvaljujući svom poreklu, ili (1) nije povezana sa celim ili sa delom polinukleotida u kom se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) je operativno vezana za polinukleotid za koji nije vezana u prirodi, ili (3) se ne javlja u prirodi kao deo veće sekvence.

Antitela za dijagnostiku, pasivnu imunizaciju, isporuku leka i terapiju AD

[0122] Ovde su opisana nova izolovana antitela, specifična za jedan ili više tau epitopa koje prikazuju patološke forme tau. Ovi epitopi su locirani unutar regiona tau kojima je prvi put dodeljena uloga u patološkom agregiranju tau, naime, unutar: 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (tj., epitop #1 je lociran unutar 267-KHQPGGG-273, koji pada unutar prvog ponovljenog domena tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (epitop #2, unutar drugog ponovljenog domena tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (epitop #3, unutar trećeg ponovljenog domena tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (epitop #4, unutar četvrtog ponovljenog domena tau proteina). Ova antitela su sposobna da prepoznaju pogrešno uređen i duplo poremećen tau u humanim mozgovima sa AD, kao i u transgenim pacovskim modelima AD i srodnih tauopatija, eksprimirajući humani duplo poremećen skraćeni tauΔ(1-150;392-441)/3R ili tauΔ(1-150;392-441)/4R. Izolovana antitela su sposobna i da interferiraju sa jednom ili nekoliko od mnogih aktivnosti u kojima posreduje tau doprinoseći patologiji AD, uključujući: (i) prelaz bilo iz pogrešno uređenog, bilo iz fiziološkog tau u duplo poremećen tau; (ii) formiranje monomera, dimera, trimera "patološkog tau" i drugih multimera tau; (iii) formiranje nerastvorljivih agregata tau i (iv) podsticanje klirensa vanćelijskog tau.

[0123] Opisani pronalazak se zasniva delom na otkriću da su antitela, koja se specifično vezuju za jedan od četiri prethodno neidentifikovana funkcionalna regiona tau, odabrana od 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (unutar 1. ponovljenog domena tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (unutar 3. ponovljenog domena tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (unutar 4<.>ponovljenog domena tau proteina), sposobna da inhibiraju formiranje patoloških agregata tau i da detektuju razne patološke forme tau, od kojih se neke formiraju u najranijoj fazi bolesti (npr., patološki monomeri). Hibridomi proizvedeni protiv humanog duplo poremećenog tau II (151-391/4R), koji se u ovoj aplikaciji naziva i tauΔ(1-150;392-441)/4R, su pretraženi na proizvodnju monoklonskih antitela specifičnih za humane PHF i imunohistohemijski (IHC) i enzimskim imunoesejem (ELISA). Dobijeni skup je uključio mišje monoklonsko antitelo (mAb) DC8E8, koje je IgG1 podklase. Mapiranje epitopa DC8E8 je otkrilo da ono vezuje četiri neidentifikovana funkcionalna epitopa na humanom tau. Štaviše, dalja funkcionalna analiza DC8E8 je otkrila da svaki epitop predstavlja zaseban funkcionalni region unutar tau. Ovi regioni, koji se sada mogu opisati kao nove mete za dijagnostikovanje i terapiju AD i, prema tome, se nazivaju "terapijski epitopi", su sadržani unutar 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (unutar 1. ponovljenog domena tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (unutar 3. ponovljenog domena tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (unutar 4. ponovljenog domena tau proteina). U nekim izvođenjima, jedan ili više od terapijskih epitopa se sadrži unutar 268-HQPGGG-273 (SEQ ID NO: 223) (unutar 1. ponovljenog domena tau proteina), 299-HVPGGG-304 (SEQ ID NO: 154) (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 330-HKPGGG-335 (SEQ ID NO: 224) (unutar 3. ponovljenog domena tau proteina) i 362-HVPGGG-367 (SEQ ID NO: 154) (unutar 4. ponovljenog domena tau proteina). U nekim izvođenjima, bar jedan od terapijskih epitopa se sadrži unutar 299-HVPGGG-304 (SEQ ID NO: 154) (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina). U nekim izvođenjima, jedan ili više od terapijskih epitopa je 299-HVPGGG-304 (SEQ ID NO: 154).

[0124] Zaista, DC8E8 je sposobno da diskriminiše patološke od normalnih tau proteina, sugerišući da je bar jedan od ova četiri epitopa konformacioni. Drugim rečima, DC8E8 je otkrio da bar jedan od regiona obuhvaćenih svakim od četiri terapijska epitopa pokazuje konformaciju u patološkom tau koja je drukčija od oblika u intrinsično poremećenom tau (normalnom tau). DC8E8 je sposobno da oseti ili detektuje tu promenu time što se ono vezuje za patološki tau sa većim afinitetom nego za fiziološki tau. Štaviše, vezivanje DC8E8 za tau je u stanju da inhibira tau-tau interakcije koje dovode do formiranja patoloških agregata tau, što se meri sposobnošću DC8E8 da inhibira formiranje nerastvorljivih agregata tau in vitro. Na primer, vezivanje DC8E8 za normalan tau je u stanju da spreči jednu ili više promena konformacija/oblika, diskutovanu gore, za regione koji obuhvataju terapijske epitope.

[0125] Pored toga, vezivanje DC8E8 za normalan tau na jednom ili više ovih regiona ili terapijskih epitopa ometa određene druge konformacijske promene na drugom mestu u molekulu, koje su potrebne za pravljenje patološkog tau. Ne vezujući se ni za jedan specifičan mehanizam, smatra se da jedan ili više ovih epitopa/regiona unutar tau koje prepoznaje DC8E8, funkcioniše unutar tau kao podstrekač agregiranja tau. Na primer, struktura/oblik/konformacija jednog ili više ovih epitopa utiče na strukturu susednih regiona, tako da popravljanje njenog oblika unutar tau molekula vezivanjem DC8E8 za nju interferira sa sposobnošću (npr., 274-281) ili tendencijom da formira beta ravni susednog regiona, gde je formiranje beta ravni potrebno za agregiranje tau-tau. Prema tome, smatra se da je vezivanje DC8E8 za jedan od ova četiri regiona unutar normalnog tau u stanju da spreči jednu od najranijih patoloških promena u tau identifikovanih do danas: promenu koja je potrebna da podstakne, ili koja sama podstiče ili omogućava formiranje beta ravni unutar tau. Štaviše, smatra se i da je vezivanje DC8E8 za jedan od ova četiri regiona unutar duplo poremećenog/patološkog tau, tj., pošto se već jedan ili više od ta četiri promenio u patološku konformaciju, još uvek u stanju da inhibira patološko agregiranje tau, bar zato što još uvek inhibira formiranje beta ravni, blokira fizičku interakciju tau-tau ili oba.

[0126] Prema tome, koristeći DC8E8 kao alatku za identifikovanje novih meta ili funkcionalnih regiona unutar tau, četiri mesta vezivanja na tau specifična za DC8E8 su dobila ulogu u Alchajmerovoj bolesti. Ovo je urađeno kroz prepoznavanje da je jedno ili više ovih mesta na tau uključeno u formiranje patoloških monomera i multimera tau, bar zbog toga što je vezivanje DC8E8 za jedan ili više njih u stanju da inhibira ove procese. Štaviše, antitela (npr., DC8E8) koja se vezuju za jedan ili više ovih terapijskih epitopa, su sposobna da podstaknu klirens patološkog tau iz vanćelijskog okruženja, bar zato što su sposobna da posreduju u preuzimanju i degradaciji patološkog tau od strane mikroglija, in vitro; smanjenju vanćelijskog i unutarćelijskog tau u mozgu, in vivo ili oba. Drugim rečima, ova antitela imaju kapacitet da pomognu da se smanji šteta koju takve patološke forme tau izazovu u mozgu.

[0127] U skladu s tim, ovde su opisana antitela koja se specifično vezuju za jedan ili više terapijskih epitopa na tau, gde je svaki od terapijskih epitopa odvojeno lociran unutar aminokiselinskih ostataka 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (epitop #1, unutar 1. ponovljenog domena tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (epitop #2, unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (epitop #3, unutar 3. ponovljenog domena tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (epitop #4, unutar 4. ponovljenog domena tau proteina). U nekim izvođenjima, terapijski epitopi #1 do 4 su sadržani unutar 268-HQPGGG-273 (SEQ ID NO: 223) (unutar 1. ponovljenog domena tau proteina), 299-HVPGGG-304 (SEQ ID NO: 154) (unutar 2. ponovljenog domena tau proteina), 330-HKPGGG-335 (SEQ ID NO: 224) (unutar 3. ponovljenog domena tau proteina), i 362-HVPGGG-367 (SEQ ID NO: 154) (unutar 4. ponovljenog domena tau proteina). Antitela mogu biti monoklonska ili poliklonska. Uključeni su i delovi antitela za vezivanje antigena, fragmenti antitela, varijante antitela, inženjerisani proteini i polimerne "skele". Ovi uključuju svaki molekul koji sadrži protein ili peptid i koji sadrži bar deo imunoglobulinskog molekula, kao što je, ali bez ograničenja, bar jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog ili lakog lanca ili njegov deo za vezivanje liganda, varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca, konstantni region teškog lanca ili lakog lanca, okvirni region, ili bilo koji njihov deo.

[0128] Kao neograničavajući primer, pogodno antitelo, njegov deo, fragment, ili varijanta, kao što je ovde obezbeđeno, može da se veže za bar jedan od opisanih terapijskih epitopa. Termin "antitelo" uključuje i fragmente digestije antitela, specifikovane delove antitela i njegove varijante, uključujući jednolančana antitela i njihove fragmente. Funkcionalni fragmenti uključuju fragmente za vezivanje antigena koji se vezuju za jedan ili više terapijskih epitopa. Na primer, fragmenti antitela sposobni da se vežu za terapijski epitop, uključuju, ali nisu ograničeni na fragmente Fab (npr., pomoću digestije papainom), Fab' (npr., by pepsin digestion i partial smanjenje) i F(ab')2(npr., pomoću digestije pepsinom), facb (npr., pomoću digestije plazminom), pFc' (npr., pomoću digestije pepsinom ili plazminom), Fd (npr., pomoću digestije, delimične redukcije i reagregacije pepsinom), Fv ili scFv (npr., tehnikama molekularne biologije). Videti i William E. Paul (ed.) Fundamental Immunology, 6th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, NY, N.Y. (2008). Određeni fragmenti se mogu proizvoditi enzimskim razlaganjem, sintetičkim ili rekombinantnim tehnikama, kao što je rutinski poznato u struci, ili kao što je ovde obezbeđeno. Antitela se mogu proizvoditi i u vidu raznih skraćenih formi, korišćenjem gena antitela u koje je uveden jedan ili više stop kodona uzvodno od prirodnog stop mesta. Na primer, kombinacija gena koji kodira deo teškog lanca F(ab')2može da se dizajnira da uključi DNK sekvencu koja kodira CH1 domen i/ili zglobni region teškog lanca. Različiti delovi antitela se mogu spojiti hemijski konvencionalnim tehnikama, ili se mogu dobiti kao kontinuirani protein korišćenjem rutinskih tehnika genetičkog inženjerstva.

[0129] Zna se da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer je sastavljen od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan "lak" (oko 25-kDa) i jedan "težak" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina, prvenstveno odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksil-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su klasifikovani kao kapa i lambda lak lanac. Teški lanci su klasifikovani kao mi, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgA, i IgE, respektivno. Unutar lakog i teškog lanca, varijabilni i konstantni regioni su spojeni "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, gde težak lanac uključuje i "D" region od oko 10 više aminokiselina. Videti uopšteno, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog od para lak/težak lanac formiraju mesto vezivanja antitela. Prema tome, intaktno antitelo ima dva mesta vezivanja. Osim u bifunkcionalnim ili bispecifičnim antitelima, ova dva mesta vezivanja su ista. Svi lanci ispoljavaju istu opštu strukturu sa relativno konzervisanim okvirnim regionima (FR) spojenim pomoću tri hiper varijabilna regiona, koji se zovu i regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi. CDR-ovi iz dva lanca svakog para su poravnati prema okvirnim regionima, što omogućava vezivanje za specifičan epitop. Od N-kraja do C- kraja, i lak i težak lanac sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama IMGT. Alternativne definicije su takođe poznate stručnjaku uobičajenog nivoa. Videti, npr. Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

[0130] U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima bar oko 80%, bar oko 85%, bar oko 90%, bar oko 95%, bar oko 98% ili bar oko 99% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 141, 143, 152 i 153. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NO: 141, 143, 152 i 153 po samo jednoj, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset aminokiselina. Stručnjaci uobičajenog nivoa mogu da odrede koje aminokiseline u varijabilnom regionu lakog lanca mogu da se izmene. Na primer, poređenjem aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lakih lanaca antitela iste specifičnosti, stručnjaci mogu da odrede koje aminokiseline mogu da se izmene bez menjanja specifičnosti. Videti PRIMERE za poređenje CDR aminokiselinskih sekvenci lakog lanca antitela DC8E8 iz primera. Pored toga, da li je specifičnost promenjena može se odrediti pomoću testa za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u bilo kojoj od SEQ ID NO: 141, 143, 152 i 153.

[0131] U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima bar oko 80%, bar oko 85%, bar oko 90%, bar oko 95%, bar oko 98% ili bar oko 99% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 138, 140, 147 i 148. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži težak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od bilo koje od SEQ ID NO: 138, 140, 147 i 148 po samo jednoj, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset aminokiselina. Stručnjaci uobičajenog nivoa mogu da odrede koje aminokiseline u varijabilnom regionu teškog lanca mogu da se izmene. Na primer, poređenjem aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca antitela iste specifičnosti, stručnjaci mogu da odrede koje aminokiseline mogu da se izmene bez menjanja specifičnosti. Videti, npr., FIG. 3E i 25B za poređenje CDR aminokiselinskih sekvenci teškog lanca antitela DC8E8 iz primera. Pored toga, da li je specifičnost promenjena može se odrediti pomoću testa za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u bilo kojoj od SEQ ID NO: 138, 140, 147 i 148.

[0132] U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 141 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 138. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 141 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 140. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 141 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 147. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 141 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 148. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 143 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 138. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 143 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 140. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 143 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 147. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 143 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 148. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 152 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 138. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 152 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 140. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 152 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 147. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 152 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 148. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 153 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 138. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 153 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 140. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 153 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 147. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 153 i težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je data u SEQ ID NO: 148.

[0133] U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži bar jedan, bar dva, ili tri CDR odabrana od SEQ ID NO. 117-119. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži bar jedan, bar dva, ili tri CDR odabrana od SEQ ID NO. 120-122. Obezbeđeni su i oblici u kojima je neki od ovih šest CDR-ova izmenjen kao što je opisano u PRIMERU 14. U nekim izvođenjima, bar jedan od izmenjenih CDR-ova u lakom lancu je odabran od SEQ ID NO: 247 za CDR1, SEQ ID NO: 253 za CDR2 i bilo koja od SEQ ID NO: 255, 257, 258, 259 i 260 za CDR3. U nekim izvođenjima, bar jedan od izmenjenih CDR u teškom lancu je odabran od SEQ ID NO: 261 ili SEQ ID NO: 262 za CDR1, SEQ ID NO: 264, ili SEQ ID NO: 265 za CDR2 i SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 ili SEQ ID NO: 269 za CDR3.

[0134] Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para težak/lak lanac i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela se mogu praviti nizom metoda, uključujući fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Proizvodnja bispecifičnih antitela može biti relativno naporan proces u poređenju sa proizvodnjom konvencionalnih antitela, a prinosi i stepen čistoće su uopšteno niži za bispecifična antitela. Bispecifična antitela ne postoje u vidu fragmenata koji imaju jedno mesto vezivanja (npr., Fab, Fab', i Fv).

[0135] Pronalazak se ne odnosi na antitela u prirodnom obliku, tj., ona nisu uzeta iz svog prirodnog okruženja, nego su izolovana i dobijena prečišćavanjem iz prirodnih izvora, ili su dobijena genetičkom rekombinacijom ili hemijskom sintezom i, prema tome, ona mogu da nose neprirodne aminokiseline. Prema tome, kao što se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Videti Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub i D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline, Nle, Nva, Cha, Orn, Hie, Chg, Hch, ili Har) od dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su .alfa.-, .alfa.-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide opisane ovde. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju (tj., nisu ograničeni na): 4-

4

hidroksiprolin, gama.-karboksiglutamat, epsilon.-N,N,N-trimetillizin, .epsilon.-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, .sigma.-N-metilarginin i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U notaciji za polipeptide koja se ovde koristi, smer ulevo je amino terminalni smer, a smer udesno je karboksi-terminalni smer, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

[0136] Slično, ova prijava se ne odnosi na nukleotidne sekvence u njihovom prirodnom hromozomskom okruženju, tj., u prirodnom stanju. Sekvence iz ovog pronalaska su izolovane i prečišćene, tj., one su uzorkovane direktno ili indirektno, na primer kopiranjem, njihovo okruženje je bar delimično modifikovano. Izolovane nukleinske kiseline, dobijene rekombinantnom genetikom, pomoću, na primer, ćelija domaćina, ili dobijene hemijskom sintezom su takođe obezbeđene.

[0137] U vezi sa ovom prijavom, "procenat identičnosti" između dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina označava procenat identičnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u dve sekvence koje se porede, dobijen posle optimalnog poravnanja, gde je ovaj procenat čisto statistički, a razlike između dve sekvence su raspodeljene nasumično duž njihove dužine. Poređenje dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se tradicionalno vrši poređenjem sekvenci pošto su one optimalno poravnate, gde se navedeno poređenje može sprovoditi po segmentima ili korišćenjem "prozora za poravnanje". Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može vršiti, pored ručnog poređenja, pomoću algoritma za lokalnu homologiju Smith-a i Waterman-a (1981) [Ad. App. Math. 2:482], pomoću algoritma za lokalnu homologiju Neddleman-a i Wunsch-a (1970) [J. Mol. Biol.

48:443], pomoću metoda traženja sličnosti Pearson-a i Lipman-a (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ili pomoću kompjuterskih softvera koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ili softvera za poređenje BLAST NR ili BLAST P).

[0138] Procenat identičnosti dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina je određeno poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u kojem sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline za poređenje može da ima adicije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima je aminokiselina, nukleotid ili ostatak identičan u dve sekvence, na primer, u dve potpune sekvence, deljenjem broja identičnih pozicija ukupnim brojem pozicija u prozoru za poravnanje i množenjem rezultata sa 100, da bi se dobio procenat identičnosti dve sekvence.

[0139] Na primer, program BLAST, "BLAST 2 sequence" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250) dostupni na sajtu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, se mogu koristiti sa parametrima po obrascu (default) (naročito za parametre "open gap penalty" (kazna za jaz čija se dužina unese): 5 i "extension gap penalty" (kazna za produženi jaz): 2; gde je odabrana matrica, na primer, "BLOSUM 62" matrica predložena u programu); procenat identičnosti dve sekvence za poređenje koje direktno izračunava program.

[0140] Za aminokiselinsku sekvencu koja ispoljava bar 80%, na primer, 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, poželjni primeri uključuju one koji sadrže referentnu sekvencu, određene modifikacije, naročito deleciju, adiciju ili supstituciju bar jedne aminokiseline, skraćivanje ili produžavanje. U slučaju supstitucije jedne ili više konsekutivnih ili nekonsekutivnih aminokiselina, poželjne su supstitucije u kojima su supstituisane aminokiseline zamenjene "ekvivalentnim" aminokiselinama. Ovde, izraz "ekvivalentne aminokiseline" označava svaku aminokiselinu za koju je verovatno da će biti supstituisana jednom od strukturnih aminokiselina, ali bez modifikovanja bioloških aktivnosti odgovarajućih antitela i specifičnih primera definisanih niže.?!

[0141] Ekvivalentne aminokiseline se mogu određivati bilo po njihovoj strukturnoj homologiji sa aminokiselinama koje su supstituisale, bilo na osnovu rezultata komparativnih testova biološke aktivnosti raznih antitela koja će verovatno biti generisana. Kao neograničavajući primer, tabela niže sumira moguće supstitucije koje će se verovatno uraditi, a koje ne dovode do značajnih modifikacija biološke aktivnosti odgovarajućeg modifikovanog antitela; inverzne supstitucije su prirodno moguće u istim uslovima.

[0142] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje proizvodi mišja hibridomska ćelijska linija deponovana u American Type Culture Collection, (ATCC, 10801 University Blvd, Manassas, VA, USA) 13. jula, 2011., sa ATCC depozitnom oznakom PTA-11994 (izdatom 29. jula, 2011.), kao što je opisano u Primerima 1-2. Druga pogodna antitela se mogu proizvesti pomoću ćelijske linije, mešane ćelijske linije, imortalizovanih ćelija ili klonske populacije imortalizovanih ćelija, kao što je poznato u struci. Videti, npr., Ausubel et al. (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. (1987-2001)); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) i Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (kolektivno, "Sambrook"); Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); Colligan, et al. (Eds.), Current Protocols in Immunology, (John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1994-2001)); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)).

[0143] U jednom pristupu proizvodnji antitela, napravi se hibridom fuzionisanjem pogodne besmrtne ćelijske linije (npr., ćelijske linije mijeloma) sa jednom od niza ćelija koje proizvode antitelo. Pogodne besmrtne ćelijske linije uključuju, ali nisu ograničene na, Sp2/0, Sp2/0-AG14, P3/NS1/Ag4-1, NSO, P3X63Ag8.653, MCP-11, S-194, heteromijelome, njihove fuzione proizvode, ili bilo koje ćelije ili fuzione ćelije izvedene iz njih, ili bilo koju drugu pogodnu ćelijsku liniju kao što su poznate u struci, i/ili komercijalno dostupne za ovu svrhu (npr., ATCC). Pogodne ćelije koje proizvode antitelo uključuju, ali nisu ograničene na, izolovane ili klonirane ćelije slezine, periferne krvi, limfe, krajnika, ili neke druge ćelije koje sadrže imune ili B ćelije koje eksprimiraju konstantne ili varijabilne ili okvirne ili CDR sekvence teškog ili lakog lanca, bilo kao endogene, bilo kao heterologne nukleinske kiseline, kao što su rekombinantne ili endogene, kao što su rekombinantne, ili endogene, iz virusa, bakterija, algi, prokariota, amfibije, insekata, reptila, riba, sisara, glodara, konja, goveda, koze, ovce, primata, eukariote, genomske DNK, cDNK, rDNK, mitohondrijske DNK ili RNK, hloroplastne DNK ili RNK, hnRNK, iRNK, tRNK, jednolančane, dvolančane ili trolančane, hibridizovane i slično ili bilo koju kombinaciju istih. Videti, npr., Ausubel, supra i Colligan, Immunology, supra, 2. poglavlje.

[0144] Drugi pristupi za proizvodnju antitela raznih oblika opisanih gore uključuju, ali nisu ograničeni na, metode koji odabiraju rekombinantna antitela iz biblioteka peptida ili proteina, uključujući one komercijalno dostupne od Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, Del.; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Calif.; Ixsys; Applied Molecular Evolution i slično; metode koji počivaju na imunizaciji transgenih životinja koje su sposobne da proizvode selektabilne skupove humanih antitela (uopšteno, ovi miševi sadrže bar jedan transgen koji sadrži DNK iz bar jednog humanog imunoglobulinskog lokusa koji je funkcionalno preuređen, ili koji može da se podvrgne funkcionalnom preuređenju; endogeni imunoglobulinski lokusi u takvim miševima se mogu prekinuti ili deletirati da bi se eliminisao kapacitet životinje da proizvodi antitela koja kodiraju endogeni geni); metode selekcije uključujući ekspoziciju na ribozomima (ribosome display), tehnologije za proizvodnju antitela iz pojedinačnih ćelija (npr., metod odabranog antitela iz limfocita ("SLAM")) i selekcije B-ćelija; subtraktivnu imunizaciju uz korišćenje tretmana ciklofosamidom; kao i bilo koje druge metode rutinske u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one opisane u US Published Application No.2005/0142609).

[0145] U nekim izvođenjima, antitela su optimizovana antitela cele dužine, himerna ili humanizovana, koja se mogu proizvoditi bilo kojom jednom ili kombinacijom poznatih tehnika, kao što je izlistano i dato u primerima u, na primer, poglavljima 3, 4, i 5 knjige "Business Insights, Preclinical Development of Monoclonal Antibodies and Related Biologicals-Emerging technologies and new therapeutic candidates", od James-a Shirvill-a, 2010., kao što su: kalemljenje CDR (CDR grafting), kao što je UBC SLAM tehnologija, PDL SMART tehnologija, Arana Therapeutics plc's Superhumanization, kombinovanje različitih

4

okvira (framework patching), tehnike za pravljenje složenih humanih antitela, BioAtla LLC's ATLAb platforma, "humanering", strategije vođene linijom mutacija (MLG), strategije dezimunizacije, strategije "humanacije", humani inženjering (npr., XOMA's HE tehnologija), FcX, Biolex Therapeutics Inc (Pittsboro, NC, SAD) LEX system, Potelligent pristupi (npr, BioWa), Complegent tehnologija, BestMAb, ImmunoBody, EB66, Synageva Expression Platforms, Xencor Inc. XmAb, Sugar Engineered Antibodies (npr, Seattle Genetics Inc (Bothell, WA, US)), "Wox" (oksidovan triptofan) antitela (npr., InNexus Biotechnology Inc (Vancouver, BC, Kanada)) i slično. U nekim izvođenjima, antitela su potpuno humana monoklonska antitela i mogu se proizvoditi jednom ili kombinacijom tehnoloških platformi, kao što je izlistano i dato u primerima u, na primer, poglavlju 4 knjige "Business Insights, Preclinical Development of Monoclonal Antibodies and Related Biologicals-Emerging technologies and new therapeutic candidates", od James-a Shirvill-a, 2010., i uključujući, ali bez ograničenja na: ispoljavanje na fazima (npr., PDL, Dyax Corp; Cambridge, MA, SAD); Skrining antitela na bazi molekula (MBAS, od Molecule Based Antibody Screening) (npr., Affitech A/S, opisano u, npr., EP0547201 i US 6,730,483); platforme selekcije antitela na bazi ćelije (CBAS, od cell based antibody selection); Biblioteke humanih kombinovanih antitela (HuCAL, od Human Combinatorial Antibody Libraries; npr., MorphoSys AG); MAbstract platforme (npr., Crucell NV), uključujući one sa PER.C6 ćelijskom linijom; Adimab platforme; XenoMouse; UltiMAb platforme; SEBVI platforme; VelocImune platforme, platforme Otvorena monoklonska tehnologija (Open Monoclonal Technology), Xenerex platforme; platforme Kloniranje humanog odgovora (Cloning the Human Response npr., IQ Therapeutics) i "Antitela trenutnog imuniteta" ("Instant Immunity Antibodies"); Viventia platforme (npr., Fusogenics, UnLock, ImmunoMine); platforme "Prirodna humana antitela" ("Natural Human Antibodies", npr., OncoMab, Patrys, Acceptys); MablgX (npr., Kenta Biotech); platforme Reverzne translacione medicine (Reverse Translational Medicine, npr., NeuImune Therapeutics); I-STAR (npr., Theraclone Sciences); Cellpot (npr., Trellis Bioscience); iBioLaunch (npr., iBio Inc.) i slično.

[0146] U nekim izvođenjima, antitela su modifikovana njihovim spajanjem sa agensima koji nisu antitela, korišćenjem jedne ili više tehnoloških platformi i metoda kao što je opisano u poglavlju 5 knjige "Business Insights, Preclinical Development of Monoclonal Antibodies and Related Biologicals-Emerging technologies and new therapeutic candidates", od James-a Shirvill-a, 2010., uključujući: konjugat antitelo lek (antibody drug conjugate npr., ADC, Seattle Genetics); korisna nosivost ciljanog antitela (targeted antibody payload, TAP; Immunogen Inc); Protela (Probodies npr., CytomX Therapeutics); ogrtanje antitela (antibody cloaking, npr., BioTransformations); ciljana fotodinamička terapija (targeted photodynamic therapy, npr., PhotoBiotics; AlbudAb (npr., GSK); hyFc (npr., Genexine); zamke za ligand (ligand traps, npr., BioLogix); CovX-Body (npr., CovX); dinamičko unakrsno vezivanje (Dynamic CrossLinking, npr., InNexus Biotehnology); LEC tehnologija (LEC Technology, npr., Pivotal BioSciences, Morphotek) i slično.

[0147] U nekim izvođenjima, antitelo ili njegove kodirajuće cDNK mogu dalje da budu modifikovane. Prema tome, u još jednom izvođenju, metodi proizvodnje antitela raznih izvođenja pronalaska su obezbeđeni, gde metodi sadrže bilo koji od koraka proizvodnje himernih antitela, humanizovanih antitela, ili analoga bilo kog od ovih. U nekim izvođenjima, proizvodnja himernih antitela je kao što je opisana u međunarodnoj prijavi WO89/09622 . Metodi za proizvodnju humanizovanih antitela su opisani u, npr., US Patent No.6,548,640 ili Canadian Patent No.1340879 (kalemljenje CDR).

[0148] Pored toga, antitelo ili njegove kodirajuće cDNK mogu dalje da budu modifikovane. Prema tome, u još jednom izvođenju, metodi koji sadrže bilo koji od koraka proizvodnje jednolančanog antitela, Fab-fragmenta, bispecifičnog antitela, fuzionog antitela, obeleženog antitela ili analoga bilo kog od ovih su takođe obezbeđeni. Kao što je diskutovano gore, antitelo opisano ovde može da postoji u raznim oblicima pored kompletnih antitela; uključujući, na primer, Fv, Fab i F(ab)2, kao i pojedinačne lance. Videti npr. međunarodnu prijavu WO88/09344. Pored toga, dijatela i molekuli koji se vezuju za domene slične V su dobro poznati stručnjaku; videti, npr. U.S. Pat. No.7,166,697.

[0149] U nekim izvođenjima, antitela (npr., DC8E8) su modifikovana ili služe kao osnova za pravljenje vezujućih molekula sa jednom ili više osobina vezivanja antigena, opisanih za antitelo DC8E8. Ovi vezujući proteini mogu da se prave korišćenjem jedne ili više tehnika izlistanih i datih u primerima u, na primer, poglavlju 6 knjige "Business Insights, Preclinical Development of Monoclonal Antibodies and Related Biologicals-Emerging technologies and new therapeutic candidates", od James-a Shirvill-a, 2010., uključujući: Fab, TetraMABs (npr., Galileo Oncologics); scFv; Immuna (npr., ESBA Tech AG); [scFv]2, uključujući vezujuće molekule koji vezuju bilo koja dva od četiri terapijska epitopa DC8E8; BiTE (Affitech, Micromet AG); Avibodies (npr., Avipep Pty); TandAb (npr., Affimed Therapeutics); Flexibody (npr., Affimed); V-NAR (npr., AdAlta); Nanobody (Ablynx NV); Domenska antitela (Domain Antibodies, npr, Diversys Ltd. GSK, US Patent No. 6,248,516 i EP0368684); Heteropolimer (npr., Elusys Therapeutics Inc.); Unibody (npr., GenMab A/S); Antitela sa razmenjenim domenima (Domain Exchanged Antibodies, npr., Calmune Corporation, Science. 2003 Jun 27;300(5628):2065-71); Mali modularni imunofarmaceutski preparati (Small Modular ImunoPharmaceuticals, SMIP) i SCORPION molekuli (npr., Trubion Pharmaceuticals); Imunoglobulini sa dvojnim varijabilnim domenom, (Dual Variable Domain Immunoglobulin, DVD-Ig, Abbott Laboratories) i slično.

[0150] Antitela iz ovog pronalaska ili njihovi odgovarajući imunoglobulinski lanci mogu biti dalje modifikovani upotrebom konvencionalnih tehnika poznatih u struci, na primer, upotrebom aminokiselinskih delecija, insercija, supstitucija, adicija, i/ili rekombinacija i/ili bilo kojih drugih modifikacija poznatih u struci, bilo saminh, bilo u kombinaciji. Videti, npr., PRIMERE obezbeđene dalje niže. Metodi za uvođenje takvih modifikacija u sekvencu DNK koja leži u osnovi aminokiselinske sekvence imunoglobulinskog lanca su poznati stručnjaku. Videti, npr., Sambrook (supra) i Ausubel (Supra). Modifikacije antitela uključuju hemijske i/ili enzimske derivatizacije na jednoj ili više konstitucionih aminokiselina, uključujući modifikacije bočnih lanaca, modifikacije okosnice, i modifikacije N- i C-kraja, uključujući acetilaciju, hidroksilaciju, metilaciju, amidaciju i dodavanje ili uklanjanje ugljenih hidrata ili lipidne grupe, kofaktora i slično. Isto tako, ova prijava obuhvata proizvodnju himernih proteina koji sadrže opisano antitelo ili neke njegove fragmente na amino terminusu fuzionisane sa heterolognim molekulom kao što je imunostimulatorni ligand na karboksilnom kraju. Videti, npr., međunarodnu prijavu WO00/30680 za odgovarajuće tehničke detalje.

[0151] U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na metod za proizvodnju antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta ili imunoglobulinskih lanaca, gde metod obuhvata

(a) gajenje ćelije kao što je opisano gore i

(b) izolovanje navedenog antitela ili vezujućeg fragmenta iz pronalaska iz kulture.

U nekim izvođenjima, izolovanje obuhvata dovođenje u dodir uzorka koji sadrži antitelo sa jednim od peptida obezbeđenih ovde, za koji se antitelo vezuje.

4

[0152] Transformisani domaćini mogu biti rasti u fermentorima i gajeni prema tehnikama poznatim u struci da bi se postigao optimalan rast ćelija. Jednom kad su eksprimirana cela antitela, njihovi dimeri, pojedinačni laki i teški lanci, ili ostale forme imunoglobulina obezbeđene ovde, mogu da budu prečišćene prema standardnim procedurama u struci, uključujući taloženje amonijum sulfatom, afinitivne kolone, hromatografiju na koloni, elektroforezu na gelu i slično; videti, Scopes, "Prečišćavanje proteina" "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Antitelo ili njegovi odgovarajući imunoglobulinski lanci se mogu zatim izolovati iz medijuma za rašćenje, ćelijskih lizata, ili frakcija ćelijske membrane. Izolovanje i prečišćavanje, npr., rekombinantno eksprimiranih antitela ili imunoglobulinskih lanaca obezbeđeno ovde može se vršiti bilo kojim konvencionalnim sredstvima kao što su, na primer, razdvajanje preparativnom hromatografijom i imunološke separacije, kao i metode koje uključuju upotrebu monoklonskih ili poliklonskih antitela na konstantan region antitela.

[0153] Suštinski čisti imunoglobulini od bar oko 90 do 95% homogenosti su poželjni, a 98 do 99% ili više homogenosti su najpoželjniji za farmaceutske upotrebe. Jednom kad su prečišćena, delimično ili do željene homogenosti, antitela se mogu koristiti terapijski (uključujući ekstrakorporalno) ili u razvijanju i izvođenju procedura testiranja.

[0154] Antitela kuplovana sa drugim grupama u svrhe kao što su usmeravanje leka i primene u imidžingu su takođe obezbeđena. Takvo kuplovanje se može sprovoditi hemijski posle ekspresije antitela do mesta vezivanja ili proizvod kuplovanja može biti inženjerisan u antitelo na nivou DNK. DNK se zatim eksprimiraju u pogodnom sistemu domaćina i eksprimirani proteini se skupljaju i renaturišu, ako je potrebno.

[0155] Metod za proizvodnju ćelija sposobnih da eksprimiraju antitelo iz pronalaska ili njegove odgovarajuće imunoglobulinske lance, koji obuhvata ćelje genetički inženjerisane sa polinukleotidom ili sa vektorom iz pronalaska, je takođe obezbeđen. Ćelije koje se mogu dobiti ovim metodom se mogu koristiti, na primer, za testiranje interakcija navedenog antitela sa svojim antigenom.

[0156] Pronalazak obezbeđuje i ćelijske linije koje proizvode antitela i rekombinantne ćelije, kao izvor antitela obezbeđenih ovim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na dijagnostičke eseje i komplete koji sadrže antitela obezbeđena pronalaskom i na terapijske metode zasnovane na njima.

[0157] Metodi za proizvodnju antitela koja su sposobna da uđu u kompeticiju sa DC8E8 i koja su sposobna i da inhibiraju patološke tau-tau interakcije, su takođe obezbeđeni. Ta antitela mogu biti skrinovana za njihovu sposobnost da budu dovoljno kompetitivna sa DC8E8 za vezivanje za tau i vezivanje za jedan, dva, tri ili sva četiri "terapijska epitopa" identifikovana ovde.

[0158] Ova prijava se takođe odnosi na polinukleotide koji kodiraju jedan ili više od agenasa na bazi antitela obezbeđene ovde. U određenim slučajevima, nukleotid, na primer, kodira bar domen za vezivanje ili varijabilni region imunoglobulinskog lanca antitela opisan gore. Tipično, navedeni varijabilni region, kodiran od strane polinukleotida, sadrži bar jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) VH i/ili VL varijabilnog regiona navedenog antitela. Stručnjak zna da svaki varijabilni domen (težak lanac VH i lak lanac VL) antitela sadrži tri hipervarijabilna regiona, ponekad zvani regioni koji određuju komplementarnost ili "CDR", oivičena sa četiri relativno konzervisana okvirna regiona ili "FR" i odnosi se na

4

aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Prema Kabatovom sistemu numeracije, hipervarijabilni regioni ili CDR-ovi humanog IgG podtipa antitela sadrže aminokiselinske ostatke od ostataka 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) ci 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca kao što su opisali Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) i/ili one ostatke iz hipervarijabilne petlje, tj. ostatke 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca kao što su opisali Chothia et al., J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. U jedinstvenom sistemu numeracije IMGT, konzervisane aminokiseline uvek imaju istu poziciju, na primer, cistein 23 (1st-CYS), triptofan 41 (CONSERVED-TRP), hidrofobna aminokiselina 89, cistein 104 (2nd-CYS), fenilalanin ili triptofan 118 (J-PHE ili J-TRP). Videti, npr., Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. i Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003). Jedinstvena numeracija IMGT obezbeđuje standardizovanu delimitaciju okvirnih regiona (FR1-IMGT: pozicije 1 do 26, FR2-IMGT: 39 do 55, FR3-IMGT: 66 do 104 i FR4-IMGT: 118 do 128) i regiona koji određuju komplementarnost: CDR1-IMGT: 27 do 38, CDR2-IMGT: 56 do 65 i CDR3-IMGT: 105 do 117. Jedinstvena numeracija IMGT se koristi u 2D grafičkim reprezentacijama, označenih kao IMGT Colliers de Perles. Videti, npr., Ruiz, M. i Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. i Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007). Koristi se i za predstavljanje 3D struktura. Videti, npr., IMGT/3D structure - DB Kaas, Q., Ruiz, M. i Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004). Okvirni ili FR ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu hipervarijabilni regioni ni koji ga okružuju.

[0159] Obezbeđena je i izolovana nukleinska kiselina okarakterisana time što je odabrana među sledećim nukleinskim kiselinama (uključujući i svaki izrođeni genetički kod):

a) nukleinska kiselina, DNK ili RNK, koja kodira antitelo prema pronalasku;

b) nukleinska kiselina komplementarna nukleinskoj kiselini kao što je definisana u a); c) nukleinska kiselina od bar 18 nukleotida sposobna da hibridizuje pod jako strogim uslovima sa bar jednim od CDR odabranim od SEQ ID NO. 117-122 i SEQ ID NO. 247, 253, 255, 257-259, 122, 261, 262, 264, 265-267 i 269 i

d) nukleinska kiselina od bar 18 nukleotida sposobna da hibridizuje pod jako strogim uslovima sa bar lakim lancem sekvence nukleinske kiseline SEQ ID 165 i/ili teškim lancem sekvence nukleinske kiseline SEQ ID No.170, ili sekvence sa bar 80%, na primer, 85%, 90%, 95% i 98% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 165 i/ili SEQ ID 170, na primer, sa bar jednim od njihovih CDR prema numeraciji IMGT.

[0160] Nukleinske sekvence koje ispoljavaju procenat identičnosti od bar 80%, na primer, 85%, 90%, 95% i 98%, posle optimalnog poravnanja sa poželjnom sekvencom, podrazumeva nukleinske sekvence koje ispoljavaju u odnosu na referentnu nukleinsku sekvencu određene modifikacije kao što su, konkretno, delecija, skraćivanje, produžavanje, himerna fuzija i/ili supstitucija, naročito tačkasta. U nekim izvođenjima, ovo su sekvence koje kodiraju iste aminokiselinske sekvence kao referentna sekvenca, a to je vezano za izrođenost genetičkog koda, ili sekvence komplementarnosti koje će verovatno hibridizovati specifično sa referentnim sekvencama, na primer, pod jako strogim uslovima, naročito onima definisanim niže.

4

[0161] Hibridizacija pod jako strogim uslovima znači da su uslovi vezani za temperaturu i jonsku jačinu tako odabrani da omogućavaju održavanje hibridizacije između dva fragmenta komplementarne DNK. Na čisto ilustrativnoj osnovi, jako strogi uslovi koraka hibridizacije u cilju definisanja polinukleotidnih fragmenata opisanog gore su korisni, kao što sledi.

[0162] DNK-DNK ili DNK-RNK hibridizacija je sprovedena u dva koraka: (1) predhibridizacija na 42°C, tri sata u fosfatnom puferu (20 mM, pH 7,5) koji sadrži 5X SSC (1X SSC odgovara rastvoru 0,15 M NaCl 0,015 M natrijum citrata), 50% formamid, 7% natrijum dodecil sulfat (SDS), 10X Denhardt-ov rastvor, 5% dekstran sulfat i 1% DNK iz sperme lososa; (2) primarna hibridizacija 20 sati na temperaturi koja zavisi od dužine probe (tj.: 42°C za probu >100 nukleotida u dužini), zatim dva pranja po 20 minuta na 20°C u 2X SSC 2% SDS, jedno pranje od 20 minuta na 20°C u 0,1 X SSC 0,1 % SDS. Poslednje pranje se vrši u 0,1 X SSC 0,1% SDS 30 minuta na 60°C za probu >100 nukleotida u dužini. Jako strogi uslovi hibridizacije opisani gore za polinukleotid definisane veličine mogu da se adaptiraju od strane stručnjaka za duže ili kraće oligonukleotide, u skladu sa procedurama opisanim u Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).

[0163] Afinitet ili aviditet antitela za antigen se može odrediti eksperimentalno korišćenjem pogodnog metoda; videti, na primer, Pope ME, Soste MV, Eyford BA, Anderson NL, Pearson TW. (2009) J Immunol Methods. 341(1-2):86-96. i metoda opisanih ovde. Mereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako se meri u različitim uslovima, npr., koncentracija soli, pH. Prema tome, merenja afiniteta i ostalih parametara vezivanja antigena, npr., KD, IC50, se, na primer, rade sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena i sa standardizovanim puferom.

[0164] Varijabilni domen antitela koji ima gore opisan varijabilni domen se može koristiti za konstruisanje drugih polipeptida ili antitela željene specifičnosti i biološke funkcije. Prema tome, polipeptidi i antitela koja sadrže bar jedan CDR od gore opisanih varijabilnih domena i koji preimućstveno imaju suštinski iste ili slične osobine vezivanja kao antitelo opisano u dodatim primerima su takođe ovde opisani. Stručnjak će razumeti da korišćenjem varijabilnih domena ili CDR-ova opisanih ovde mogu da se konstruišu antitela u skladu sa metodima poznatim u struci, npr., kao što je opisano u Evropskim patentnim prijavama EP 0451 216 A1 i EP 0 549 581 A1. Pored toga, stručnjak zna da afinitet vezivanja može da se poveća aminokiselinskim supstitucijama unutar CDR-ova ili unutar hipervarijabilnih petlji (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196 (1987), 901-917) koje se delimično preklapaju sa CDR-ovima, kao što je definisao Kabat. Prema tome, antitela u kojima jedan ili više od pomenutih CDR-ova sadrži jednu ili više, na primer, ne više od dve aminokiselinske supstitucije, su takođe ovde opisana. U nekim izvođenjima, antitelo iz pronalaska sadrži u jednom ili oba svoja imunoglobulinska lanca dva ili sva tri CDR varijabilnih regiona, kao što je dato na SLIKAMA 3B i 3E. U nekim izvođenjima, antitelo iz pronalaska sadrži u jednom ili oba svoja imunoglobulinska lanca dva ili sva tri CDR kao što je dato na SLICI 25B.

[0165] Polinukleotidi ili nukleinske kiseline koje kodiraju gore opisana antitela mogu biti, npr., DNK, cDNK, RNK ili sintetički proizvedena DNK ili RNK ili rekombinantno proizveden molekul himerne nukleinske kiseline koji sadrži bilo koji od ovih polinukleotida bilo sam, bilo u kombinaciji. U nekim izvođenjima, polinukleotid je deo vektora. Takvi vektori mogu da sadrže još gena, kao što su marker geni koji omogućavaju selekciju navedenog vektora u pogodnoj ćeliji domaćinu i u pogodnim uslovima.

4

[0166] U nekim izvođenjima, polinukleotid je operativno spojen sa jednoim ili više sekvenci za kontrolu ekspresije, omogućavajući ekspresiju prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. Ekspresija navedenog polinukleotida obuhvata transkripciju polinukleotida u iRNK koja se može prevesti. Regulatorni elementi koji osiguravaju ekspresiju u eukariotskim ćelijama, na primer, sisarskim ćelijama, su poznati stručnjaku. Oni obično sadrže regulatorne sekvence koje obezbeđuju započinjanje transkripcije i opciono poli-A signale koji obezbeđuju završavanje transkripcije i stabilizaciju transkripta. Dodatni regulatorni elementi mogu da uključuju transkripcione, kao i translacione enhansere (pojačivače) i/ili prirodno asocirane ili heterologne promotorske regione.

[0167] U ovom pogledu, stručnjak će razumeti da polinukleotidi koji kodiraju bar varijabilni domen lakog i/ili teškog lanca mogu da kodiraju varijabilne domene oba imunoglobulinska lanca ili samo jednog. Isto tako, navedeni polinukleotidi mogu biti pod kontrolom istog promotora ili mogu biti odvojeno kontrolisani za ekspresiju. Mogući regulatorni elementi koji dozvoljavaju ekspresiju u prokariotskim ćelijama domaćinima sadrže, npr., PL, lac, trp ili tac promotor u E. coli, a primeri regulatornih elemenata koji dozvoljavaju ekspresiju u eukariotskim ćelijama domaćinima su AOX1 ili GAL1 promotor u kvascu ili CMV-, SV40-, RSV-promotor, CMV-enhanser, SV40-enhanser ili globinski intron u sisarskim i ćelijama drugih životinja.

[0168] Pored elemenata koji su odgovorni za započinjanje transkripcije, takvi regulatorni elementi mogu da sadrže i signale za završavanje transkripcije, kao što je SV40-poli-A mesto ili tk-poli-A mesto, nizvodno od polinukleotida. Pored toga, u zavisnosti od korišćenog ekspresionog sistema, čeone sekvence sposobne da usmere polipeptid u ćelijski odeljak ili da ga sekretuju u medijum se mogu dodati kodirajućoj sekvenci polinukleotida i poznate su u struci. Čeone sekvence su sastavljene u odgovarajućoj fazi sa sekvencama za translaciju, inicijaciju i terminaciju, i opciono, čeona sekvenca sposobna da usmeri sekreciju novosintetisanog proteina, ili njegov deo, u periplazmatski prostor ili vanćelijski medijum. U nekim izvođenjima, heterologna sekvenca može da kodira fuzioni protein koji uključuje C- ili N-terminalni identifikacioni peptid koji daje željene osobine, npr., stabilizaciju ili uprošćeno prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proizovda. U ovom kontekstu, pogodni ekspresioni vektori su poznati u struci, i uključuju, bez ograničenja, Okayama-Berg cDNK ekspresioni vektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNK1, pcDNK3 (Invitrogen) i pSPORT1 (GIBCO BRL).

[0169] U nekim izvođenjima, sekvence za kontrolu ekspresije mogu biti eukariotski promotorski sistemi u vektorima, sposobni da transformišu ili transfektuju eukariotske ćelije domaćine, ali se mogu koristiti i kontrolne sekvence za prokariotske domaćine. Jednom kad je vektor ugrađen u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava u uslovima pogodnim za visok nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci, i, po želji, može da usledi sakupljanje i prečišćavanje imunoglobulinskih lakih lanaca, teških lanaca, dimera lakih/teških lanaca ili intaktnih antitela, vezujućih fragmenata ili drugih imunoglobulinskih formi. Videti, npr., Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).

[0170] Pored toga, obezbeđeni su vektori, naročito plazmidi, kozmidi, virusi i bakteriofazi koji se konvencionalno koriste u genetičkom inženjerstvu, koji sadrže polinukleotid koji kodira varijabilni domen imunoglobulinskog lanca antitela iz pronalaska; opciono u kombinaciji sa polinukleotidom iz pronalaska koji kodira varijabilni domen drugog imunoglobulinskog lanca antitela iz pronalaska. U nekim izvođenjima, navedeni vektor je

4

ekspresioni vektor i/ili vektor za transfer gena ili usmeravajući vektor. Ekpresioni vektori izvedeni iz virusa kao što su retrovirusi, virus vakcinije, adeno-asocirani virus, herpes virusi, ili goveđi papiloma virus, se mogu koristiti za dostavu polinukleotida ili vektora iz pronalaska u ciljanu ćelijsku populaciju. Svi metodi poznati stručnjacima se mogu koristiti za konstruisanje rekombinantnih virusnih vektora. Videti, na primer, tehnike opisane u Sambrook-u (supra) i Ausubel-u (supra). Alternativno, polinukleotidi i vektori obezbeđeni ovom prijavom se mogu rekonstituisati u lipozome za dostavu ciljnim ćelijama. Vektori koji sadrže polinukleotide obezbeđene ovom prijavom (npr., sekvence koje kodiraju teške i/ili lake varijabilne domene imunoglobulinskih lanaca i sekvence za kontrolu ekspresije) se mogu preneti u ćeliju domaćina poznatim metodima, koji variraju u zavisnosti od tipa ćelije domaćina. Na primer, kalcijum hloridna transfekcija se obično koristi za prokariotske ćelije, dok se kalcijum fosfatni tretman ili elektroporacija može koristiti za druge ćelije domaćine.

[0171] Predmetni pronalazak se, pored toga, odnosi na ćelije domaćine transformisane pomoću polinukleotida ili vektora obezbeđenog pronalaskom. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska ćelija. Polinukleotid ili vektor koji je prisutan u ćeliji domaćinu može biti bilo ugrađen u genom ćelije domaćina, bilo može biti održavan vanhromozomski. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija, kao što je iz bakterije, insekta, gljivice, biljke, životinje ili humana ćelija. Poželjne gljivične ćelije su, na primer, one iz roda Saccharomyces, naročito one iz vrste S. cerevisiae. U zavisnosti od domaćina upotrebljenog u proceduri rekombinantne proizvodnje, antitela ili imunoglobulinski lanci kodirani od strane polinukleotida iz ove prijave mogu biti glikozilovani ili mogu biti neglikozilovani. Određena antitela obezbeđena prijavom ili odgovarajući imunoglobulinski lanci, mogu da uključuju i inicijalni metioninski aminokiselinski ostatak. Polinukleotid iz pronalaska se može koristiti za transformisanje ili transfektovanje domaćina primenom bilo koje tehnike obično poznate stručnjaku uobičajenog nivoa. Pored toga, metodi za dobijanje fuzionisanih, operativno vezanih gena i njihovo eksprimiranje u, npr., sisarskim ćelijama i bakterijama su dobro poznati u struci. Videti, npr., Sambrook. Genetički konstrukti i metodi opisani tamo se mogu koristiti za ekspresiju antitela obezbeđenih prijavom ili njihovih odgovarajućih imunoglobulinskih lanaca, u eukariotskim ili prokariotskim domaćinima. U opštem slučaju, ekspresioni vektori koji sadrže promotorske sekvence koje olakšavaju efikasnu transkripciju insertovanog polinukleotida se koriste u vezi sa domaćinom. Ekpresioni vektor tipično sadrži start replikacije (origin of replication),, promotor i terminator, kao i specifične gene koji su sposobni da obezbede fenotipsku selekciju transformisanih ćelija. Pogodne ćelije za DNK sekvence i ćelije domaćini za ekspresiju i sekreciju imunoglobulina se mogu dobiti iz niza izvora, kao što je American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", peto izdanje (1985), Manassas, VA, U.S.A., i druge dostupne verzije). Pored toga, transgene životinje, na primer sisari, koji sadrže navedene ćelije iz pronalaska se mogu koristiti za proizvodnju antitela na velikoj skali.

[0172] Dodatno, ovaj opis obuhvata male peptide, uključujući one koji sadrže vezujući molekul kakav je opisan gore, na primer, koji sadrže CDR3 region varijabilnog regiona bilo kog od pomenutih antitela, naročito CDR3 teškog lanca, pošto je često uočavano da je, za određena antitela, težak lanac CDR3 (HCDR3) region koji ima veći stepen varijabilnosti i predominantno učešće u interakciji antigen-antitelo. Takvi peptidi se mogu sintetisati ili proizvoditi rekombinantnim sredstvima da bi se proizveo agens za vezivanje, koristan prema ovoj prijavi. Takvi metodi su poznati stručnjaku uobičajenog nivoa. Peptidi se mogu sintetisati, na primer, pomoću automatizovanih aparata za sintezu peptida, koji su komercijalno dostupni. Peptidi mogu biti proizvedeni i rekombinantnim tehnikama, ugradnjom DNK koja eksprimira peptid u ekspresioni vektor i transformisanjem ćelija pomoću ekspresionog vektora da prave peptid.

[0173] Gore opisani fuzioni proteini mogu dalje da sadrže razgradljivu spojnicu (linker) ili mesto sečenja za proteinaze, koji se mogu nazivati margine ili spejser grupe. Ove spejser grupe, sa svoje strane, mogu biti bilo nerastvorljive, bilo rastvorljive (Diener et al., Science 231 (1986), 148) i mogu biti odabrane da omoguće otpuštanje leka iz antitela u ciljno mesto. Primeri terapijskih agenasa koji se mogu kuplovati sa antitelima iz ovog pronalaska za imunoterapiju su lekovi, radioizotopi, lektini i toksini. Lekovi koji se mogu konjugovati sa antitelima i antigenima iz ovog pronalaska uključuju jedinjenja koja se klasično nazivaju lekovi, kao što je mitomicin C, daunorubicin i vinblastin. Kad se koriste radioizotopski konjugovana antitela ili antigeni iz pronalaska za, npr., imunoterapiju, određeni izotopi mogu biti poželjniji od drugih, u zavisnosti od takvih faktora kao što je distribucija leukocita, kao i izotipska stabilnost i emisija. U zavisnosti od autoimunog odgovora, neki emiteri mogu biti poželjniji od drugih. U opštem slučaju, radioizotopi koji emituju alfa i beta čestice su poželjni u imunoterapiji. U određenim poželjnim slučajevima, radioizotopi su alfa emiteri kratkog dometa, visoke energije, kao što je<212>Bi. Primeri radioizotopa koji se mogu vezati za antitela ili antigene iz pronalaska u terapijske svrhe su<125>I,<131>I,<90>Y,<67>Cu,<212>Bi,<212>At,<211>Pb,<47>Sc,<109>Pd i<188>Re. U određenim slučajevima, radioaktivni obeleživač je<64>Cu. Ostali terapijski agensi koji se mogu kuplovati sa antitelom ili antigenom, kao i ex vivo i in vivo terapijski protokoli, su poznati, ili ih može saznati stručnjak uobičajenog nivoa. Gde god je to pogodno, stručnjak može da upotrebi polinukleotid koji kodira (i kao izvor za) bilo koje od gore opisanih antitela, antigena, ili odgovarajućih vektora, umesto samog proteinskog materijala.

[0174] Upotreba vezujućeg molekula ili antitela, kao što su ovde obezbeđeni, za dobijanje sastava za upotrebu in vivo za suprimiranje formiranja, ili za smanjvanje nivoa na neki drugi način, duplo poremećenih i/ili pogrešno uređenih tau u subjektu; ili za vantelesnu ekstrakciju jedinjenja patološkog tau ili njihovih prekursora iz telesnih tečnosti, je takođe ovde obezbeđena. Ovi metodi se mogu koristiti za poboljšanje kognicije ili usporavanje ili popravljanje kognitivnog pada vezanog za bolesti. Antitelo obezbeđeno pronalaskom, ili njegovi hemijski derivati, može se administrirati direktno u krv ili CSF i ukloniti u sledećem koraku hvatanjem po afinitetu iz krvi ili CSF, pri čemu se pogrešno uređen i duplo poremećen tau uklanja zajedno sa prethodno pomenutim vezujućim molekulom. Stoga, metod lečenja ili sprečavanja početka ili napretka Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija u subjektu je takođe obezbeđen, gde navedeni metod obuhvata uklanjanje krvi ili CSF iz tela subjekta, kontrolisanje krvi i CSF i vraćanje subjektu tako dobijene krvi, odnosno CSF.

[0175] Molekuli i čestice sa antitelom iz pronalaska, peptid, ili vezujući molekul/protein kao što su ovde opisani, imaju i dijagnostičku korisnost. Pronalazak obezbeđuje antitela koja prepoznaju i razlikuju različite forme tau proteina koji su prisutni u različitim stadijumima Alchajmerove bolesti. Ova antitela su sposobna da detektuju tau (i njegove različite konformacione promene) i in vitro i in vivo. Antitela mogu da razlikuju fiziološki i patološki tau u mnoštvu testova, uključujući biohemijski, imunoprecipitaciju, ELISA, Western blot i imunohistohemijske testove (npr., svež, fiksiran, zamrznut, zaliven parafinom), kao i in vivo imidžing korišćenjem, npr., radioaktivno obeleženog DC8E8 (uključujući fragmente DC8E8 kao što je jedan lanac DC8E8), koji razlikuje fiziološki od patološkog tau (videti PRIMERE). Ona su sposobna da to rade i u čvrstim i u tečnim (npr., krv, plazma, CSF, homogenati) životinjskim (npr., glodari, ljudi) uzorcima i biopsijama. Neki od ovih testova detekcije su opisani u PRIMERIMA niže. Drugi rutinski metodi za detektovanje proteina su poznati stručnjacima i, prema tome, mogu se rutinski adaptirati za antitela iz pronalaska, kao i peptidi,

1

i molekuli koji vezuju tau, obezbeđeni ovde. Antitela iz ovog pronalaska se mogu obeležavati (npr., fluorescentno radioaktivno, enzimski, nuklearno magnetno, teškim metalom) i koristiti za detektovanje specifičnih meta in vivo ili in vitro uključujući testove nalik na imunohistohemijske in vitro (videti, npr., PRIMERE opisane niže). Takođe, in vivo, ona bi mogla da se koriste na način sličan imidžing tehnikama nuklearne medicine za detektovanje tkiva, ćelija, ili drugog materijala koji ima duplo poremećen tau i njegove depozite. Ciljanje unutarćelijskih i vanćelijskih duplo poremećenih tau i neurofibrilarnih lezija dijagnostičkim imidžing probama detektabilnim pomoću MRI ili PET bi obezbedilo biološki marker za definitivnije premortem dijagnostikovanje AD, kao i sredstvo za praćenje efikasnosti terapije koja cilja tau protein. Prema tome, antitela opisana ovde se mogu koristiti za dobijanje sastava, i u metodima, za detekciju tau i/ili ciljanje dijagnostičkim agensom patološkog tau i neurofibrilarnih lezija mozga za AD dijagnostikovanje. Ovi sastavi i metodi se mogu koristiti kao deo protokola tretmana AD i srodnih tauopatija.

[0176] Antitela pogodna za upotrebu u imunoesejima u kojima se ona mogu koristiti u tečnoj fazi ili vezana za čvrst nosač su takođe obezbeđena. Primeri imunoeseja koji mogu da koriste navedena antitela su kompetitivni i nekompetitivni imunoeseji bilo u direktnom, bilo u indirektnom formatu. Primeri takvih imunoeseja su radioimunoesej (RIA), sendvič (imunometrijski esej), protočna citometrija i Western blot esej. Antitela mogu biti vezana za jedan od mnogo različitih nosača i korišćena za izolovanje ćelija koje su za njih specifično vezane. Primeri poznatih nosača uključuju staklo, polistiren, polivinil hlorid, polipropilen, polietilen, polikarbonat, dekstran, najlon, amiloze, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamide, agaroze i magnetit. Nosač može biti ili rastvorljiv ili nerastvorljiv. Ima mnogo različitih obeleživača i metoda za obeležavanje poznatih stručnjaku uobičajenog nivoa.

[0177] Primeri tipova obeleživača koji se mogu koristiti uključuju enzime, radioizotope i radionuklide, koloidne metale, fluorescentna jedinjenja, hemiluminiscentna jedinjenja, biotinil grupe, prethodno određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., sparene sekvence leucinskog rajsferšlusa, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, markeri vezani za epitop) i hemi/elektrohemi/bioluminiscentna jedinjenja. Enzimi uključuju peroksidazu (npr, HRP), luciferazu, alkalnu fosfatazu, α-D-galaktozidazu, oksidazu glukoze, amilazu glukoze, karbonatnu anhidrazu, acetil-holinesterazu, lizozim, malat dehidrogenazu ili glukoza-6 fosfat dehidrogenazu. Alternativno, obeleživač je biotin, digoksigenin, ili 5-bromo-dezoksiuridin. Fluorescentni obeleživači mogu da se kombinuju i sa antitelima iz pronalaska i proteinima za vezivanje tau obezbeđenim ovde, uključujući rodamin, lantanid fosfore, fluorescein i njegove derivate, fluorohrom, rodamin i njegove derivate, zeleni fluorescentni protein (GFP), crveni fluorescentni protein (RFP) i druge, dansil, umbeliferon. U takvim konjugatima, antitela/vezujući proteini mogu da se dobijaju metodima poznatim stručnjaku. Oni se zatim mogu vezati sa enzimima ili fluorescentnim obeleživačima direktno; preko spejser grupe ili spojnice kao što je polialdehid, glutaraldehid, etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA) ili dietilentriaminpentaacetatna kiselina (DPTA); ili u prisustvu drugih agenasa za vezivanje kao što su oni rutinski poznati u struci. Konjugati koji nose fluoresceinske obeleživače se mogu dobiti, na primer, reakcijom sa izotiocijanatom. U određenim situacijama, obeleživač ili marker može takođe biti terapijski.

[0178] Drugi konjugati mogu da uključuju hemiluminiscentne obeleživače kao što je luminol i dioksetan, bioluminiscentne obeleživače kao što je luciferaza i luciferin, ili radioaktivne obeleživače kao što su jod<123>, jod<125>, jod<126>, jod<133,131>, brom<77>, tehnicijum<99m>, indijum<111>, indijum<113m>, galijum<67>, galijum<68>, rutenijum<95>, rutenijum<97>, rutenijum<103>, rutenijum<105>, živa<107>, živa<203>, renijum<99m>, renijum<101>, renijum<105>, skandijum<47>, telurijum<121m>, telurijum<122m>,

2

telurijum<125m>, tulijum<165>, tulijum<167>, tulijum<168>, fluor<18>, itrijum<199>i jod<131>. Postojeći metodi poznati stručnjaku za obeležavanje antitela pomoću radioizotipa, bilo direktno, bilo preko helirajućeg agensa kao što je EDTA ili DTPA pomenut gore, mogu se koristiti kao dijagnostički radioaktivni izotopi. Videti, npr, obeležavanje [I<125>]Na hloramin-T tehnikom [Hunter W.M. i Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495]; obeležavanje tehnicijumom<99m>kao što je opisano u Crockford et al. (US patent 4,424,200) i vezivanje preko DTPA kao što je opisao Hnatowich (US patent 4,479,930).

[0179] Antitela iz pronalaska i ostali molekuli koji vezuju tau se mogu koristiti u metodu za dijagnostikovanje poremećaja u pojedincu dobijanjem uzorka telesne tečnosti od pojedinca, koji može biti uzorak krvi, uzorak limfe ili bilo koji drugi uzorak telesne tečnosti i dovođenjem u kontakt uzorka telesne tečnosti sa antitelom ovog pronalaska u uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa antitelo-antigen. Prisustvo i/ili količina takvih kompleksa se zatim odredi metodima poznatim u struci, gde nivo značajno viši od onog formiranog u kontrolnom uzorku ukazuje na prisustvo bolesti u testiranom pojedincu. Prema tome, predmetni pronalazak se odnosi na in vitro imunoesej koji sadrži antitelo iz pronalaska.

[0180] Pored toga, ova prijava se odnosi na in vivo imidžing tehnike koje koriste bilo koji od molekula koji vezuju tau opisan ovde. Na primer, medicinska imidžing tehnika Pozitron emisiona tomografija (PET) koja proizvodi trodimenzionalnu sliku delova tela se zasniva na detekciji radijacije iz emisije pozitrona. Tipično, biomolekul je radioaktivno obeležen, npr. on ima ugrađen radioaktivan izotop. Po administraciji obeleženog biomolekula subjektu, tipično injekcijom u cirkulaciju krvi, radioaktivno obeležen biomolekul postaje koncentrovan u tkivima od interesa. Subjekt se zatim postavi u imidžing skener, koji detektuje emisiju pozitrona. U jednom izvođenju, obeležen, na primer,<64>Cu obeležen vezujući molekul kao što je antitelo je administriran subjektu i detekcija vezujućeg molekula i, prema tome, duplo poremećenog ili pogrešno uređenog tau se vrši postavljanjem subjekta u imidžing skener i detektovanjem emisije pozitrona, koja, kad je ima, ukazuje na neurološki poremećaj. Ova prijava, prema tome, obuhvata metod za PET imidžing, koji sadrži korak administriranja<64>Cu-obeleženog ili ekvivalentno obeleženog vezujućeg molekula opisanog ovde subjektu.

[0181] Ovde je takođe obezbeđen proizvod, kao što su farmaceutska i dijagnostička pakovanja ili kompleti koji sadrže jedan ili više kontejnera napunjenih jednim ili sa više gore opisanih sastojaka, tj. vezujući molekul, antitelo ili njegov vezujući fragment, polinukleotid, vektor ili ćelija. Povezana sa takvim kontejnerom može biti objava u formi koju je propisala državna agencija a koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koja objava odražava odobrenje od agencije proizvodnje, upotrebe ili prodaje za humanu administraciju. Pored toga ili alternativno, komplet sadrži reagense i/ili instrukcije za upotrebu u odgovarajućim dijagnostičkim esejima. Sastav ili komplet iz ovog pronalaska je pogodan za dijagnostikovanje, prevenciju i tretman Alchajmerove bolesti i srodnih tauopatija.

[0182] Biološka aktivnost antitela obezbeđenih pronalaskom sugeriše da ona imaju dovoljan afinitet da ih učini kandidatima za lokalizaciju leka/isporuku leka ćelijama ili tkivima. Ciljanje i vezivanje za depozite duplo poremećenog tau bi moglo da bude korisno za isporuku terapijski ili dijagnostički aktivnih agenasa i gensku terapiju/iporuku gena. Prema tome, antitela opisana ovde se mogu koristiti za dobijanje sastava, i u metodima, za detekciju i/ili ciljanje terapijskim ili dijagnostičkim agensima u patološki tau i neurofibrilarne lezije mozga. Ovi sastavi i metodi se mogu koristiti kao deo protokola tretmana za AD i srodnih tauopatija. Obezbeđeni su sastavi koji sadrže jedno ili više od ranije pominjanih jedinjenja, uključujući vezujuće molekule, antitela, vezujuće fragmente, njihove hemijske derivate; polinukleotide, vektore i ćelije. Određeni sastavi mogu još da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača. Određeni hemijski derivati sadrže hemijske grupe koje nisu normalno deo osnovnog molekula ili ćelija (npr, antitela, vezujućeg molekula, polinukleotida, vektora i ćelija), ali su spojene sa njima rutinskim metodima. Takve grupe mogu da funkcionišu da, na primer, poprave rastvorljivost, poluživot, vizualizaciju, detektabilnost, i/ili apsorpciju, osnovnog molekula ili ćelije. Alternativno, grupe mogu da ublaže neželjene bočne efekte osnovnog molekula ili da smanje toksičnost osnovnog molekula.

[0183] Obezbeđeni su sastavi koji sadrže jedno ili više ranije pomenutih jedinjenja, uključujući vezujuće molekule, antitela, vezujuće fragmente; njihove hemijske derivate; polinukleotide, vektore i ćelije. Određeni sastavi mogu još da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača. Određeni hemijski derivati obuhvataju hemijske grupe koje nisu normalno deo osnovnog molekula ili ćelije (npr, antitela, vezujućeg molekula, polinucleotida, vektora i ćelija), ali su vezani za njih rutinskim metodima. Takve grupe mogu da funkcionišu da, na primer, poprave rastvorljivost, poluživot, vizualizaciju, detektabilnost, i/ili apsorpciju, osnovnog molekula ili ćelije. Alternativno, grupe mogu da umanje neželjene bočne efekte osnovnog molekula ili da smanje toksičnost osnovnog molekula.

[0184] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske sastave koji sadrže kombinacije antitela iz pronalaska sa drugim agensima, kao što su sa interleukinima ili interferonima, u zavisnosti od namenjene upotrebe farmaceutskog sastava. Na primer, za upotrebu u tretmanu Alchajmerove bolesti, dodatni agens može biti odabran iz grupe koja se sastoji od malih organskih molekula, antitela na tau, antitela na beta-amlioid i njihovih kombinacija. Ostali agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore acetilholinesteraze, antagoniste NMDA receptora, helirajuća sredstva prelaznih metala, faktore rasta, hormone, nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID), antioksidante, agense za smanjenje lipida, selektivne inhibitore fosfodiesteraze, inhibitore agregiranja tau, inhibitore protein kinaza, inhibitore proteina toplotnog šoka, reagense antiamiloidne pasivne i aktivne imunizacije, inhibitore amiloidnog agregiranja i inhibitore sekretaze. Iz toga, u jednom izvođenju, vezujući molekul, antitelo ili vezujući fragment iz ovog pronalaska ili od vezujućeg molekula koji ima suštinski iste specifičnosti vezivanja kao bilo koji od njih, polinukleotid, vektor ili ćelija iz ovog pronalaska se mogu koristiti za dobijanje farmaceutskog ili dijagnostičkog sastava za lečenje ili sprečavanje napredovanja Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija; za poboljšanje simptoma vezanih za Alchajmerovu bolest ili srodne tauopatije; za dijagnostikovanje ili skrining subjekta na prisustvo Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija, za određivanje subjektovog rizika za razvoj Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija.

Peptidi za dijagnostiku, aktivnu imunizaciju i terapiju AD

[0185] Predmetni pronalazak se delimično zasniva na otkriću da su određeni fragmenti tau aktivni u indukovanju imunog odgovora na patološki tau kad se injektiraju u pacovske modele AD i očekivalo bi se da urade isto u ljudima. Nađeno je da su ovi imunogeni fragmenti tau, koji sadrže jedan ili više regiona tau identifikovanih gore, preko DC8E8, kao promoteri ili bar učesnici u razvoju i napredovanju AD, sposobni da (i) promovišu klirens vanćelijskih depozita tau unutar AD mozgova (pacovskih modela); (ii) indukuju proizvodnju protektivnih antitela na AD u životinjskom modelu i/ili (iii) usporavaju napredovanje AD u subjektuma koji ih primaju, što se meri jednim ili pomoću više biohemijskih i neuroloških eseja, u

4

životinjskom modelu. Oni mogu i da direktno fizički interferiraju sa sposobnošću tau da formira interakcije patoloških tau-tau duž ovih regiona.

[0186] Imunogeni ili imunogeni peptidi izvedeni iz novoidentifikovanih regiona tau proteina koji su važni za formiranje jezgra PHF i promovišu formiranje PHF in vitro su ovde opisani. Strategijsko ciljanje ovih regiona ("terapijski epitopi") može da dovede do uspešnog tretmana AD i srodnih tauopatija. Imunogeni mogu da se skrinuju na terapijsku efikasnost u životinjskom modelu, kao što su transgeni pacovski modeli opisani niže.

[0187] U jednom izvođenju, tau peptidi, na primer, obuhvataju jednu od sledećih aminokiselinskih sekvenci, unutar koje se odvojeno sadrži svaki od četiri terapijska epitopa: a) SEQ ID NO:98 tau 267-KHQPGGG-273, b) SEQ ID NO:99 tau 298-KHVPGGG-304, c) SEQ ID NO: 100 tau 329-HHKPGGG-335, i d) SEQ ID NO: 101 tau 361-THVPGGG-367 (numerisana prema najdužoj humanoj izoformi tau 2N4R, dugoj 441 ostatak, videti SEQ ID NO: 102). U jednom drugom izvođenju, tau peptidi sadrže bar jedan terapijski epitop, gde je terapijski epitop odabran od SEQ ID NO: 223 tau 268-HQPGGG-273, SEQ ID NO: 154 tau 299-HVPGGG-304, SEQ ID NO: 224 tau 330-HKPGGG-335 i SEQ ID NO: 154 tau 362-HVPGGG-367.

[0188] Ova prijava obezbeđuje imunogene duge 30 aminokiselina, kao što je bilo koja od SEQ ID NO prikazana u Tabeli 1. Svaki od imunogena uključen u Tabelu 1 je izolovan fragment tau koji sadrži jedan od terapijskih epitopa, lociran unutar SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 100, i SEQ ID NO: 101.

Tabela 1: 30-merni peptidi tau od kojih svaki nosi po jedan terapijski epitop

[0189] U nekim izvođenjima, imunogeni peptid je odabran od SEQ ID NO: 1 tau 251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280; SEQ ID NO: 2 tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285; SEQ ID NO: 3 tau 259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINK KLDLSNVQ-288 i SEQ ID NO: 4 tau 275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304.

[0190] Ova prijava takođe obezbeđuje kraće i duže imunogene peptide za upotrebu kao što je ovde opisano koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 98 267-KHQPGGG-273, ili aminokiseline SEQ ID NO: 99 298-KHVPGGG-304, ili aminokiseline SEQ ID NO: 100 329-HHKPGGG-335, ili aminokiseline SEQ ID NO: 101361-THVPGGG-367 koje mogu biti izvedene iz bilo koje od šest izoformi humanog tau proteina. U jednom izvođenju, imunogeni peptid sadrži bar jedan terapijski epitop, gde je terapijski epitop odabran od SEQ ID NO: 223 tau 268-HQPGGG-273, SEQ ID NO: 154 tau 299-HVPGGG-304, SEQ ID NO: 224 tau 330-HKPGGG-335, i SEQ ID NO: 154 tau 362-HVPGGG-367. U jednom izvođenju, imunogeni peptid sadrži sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 109 Tau 314-DLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSE-342; SEQ ID NO: 110 Tau 352-SKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFREN-380; SEQ ID NO: 111 Tau 325-LGNIHHKPGGGQ-336; SEQ ID NO: 112 Tau 357-LDNITHVPGGGN-368; SEQ ID NO: 108 Tau 294-305 KDNIKHVPGGGS. U nekim izvođenjima, bar jedan imunogeni peptid je odabran od bilo koje od SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 9-101, i SEQ ID NO: 108-112, NIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 200), NIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 201), IKHVPGGGS (SEQ ID NO: 202), KHVPGGGSV (SEQ ID NO: 203), HVPGGGSVQ (SEQ ID NO: 204), VPGGGSVQ (SEQ ID NO: 205), GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250), i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNKKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 159), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161), i DNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 171).

[0191] Aminokiselinske sekvence koje odgovaraju humanim tau izoformamasu date u SEQ ID NO: 102-107

[0192] SEQ ID NO: 102 (2N4R):

[0193] SEQ ID NO: 103 (1N4R):

[0194] SEQ ID NO: 104 (2N3R):

[0195] SEQ ID NO: 105 (0N4R):

[0196] SEQ ID NO: 106 (1N3R):

[0197] SEQ ID NO: 107 (0N3R):

[0198] Upotreba vakcina na bazi peptida za podizanje imunog odgovora u bolestima za koje konvencionalne vakcine još nisu dostupne je atraktivna (Brown, 1994; BenYedidia, et al., 1997). Međutim, u mnogim slučajevima mali peptidi su slabi imunogeni zato što se ponašaju kao hapteni kojima nedostaju neophodni epitopi Th-ćelija i/ili koji su uhvaćeni sa malom efikasnošću od strane ćelija koje prezentuju antigen (APC). U jednom izvođenju, imunogeni epitopi mogu biti duži polipeptidi koji uključuju protektivan epitop tau peptida, ili analogon zajedno sa drugim aminokiselinama.

[0199] Neki od agenasa opisanih ovde za indukovanje imunog odgovora sadrže odgovarajući epitop za indukovanje imunog odgovora na patološki tau i depozite tau ali su suviše mali da bi bili imunogeni. U tom slučaju, imunogeni peptid može da se veže za pogodan nosač da pomogne u podizanju imunog odgovora. U određenim izvođenjima, pogodni nosači uključuju serumske albumine, hemocijanin iz prilepka, imunoglobulinske molekule, tiroglobulin, ovalbumin, tetanus toksoid, ili toksoid iz druge patogene bakterije, kao što je difterija, E. coli, kolera, ili H. pylori, ili epitopi Th-ćelija toksina. Ostali nosači za stimulisanje ili pojačavanje imunog odgovora uključuju citokine kao što su IL-1, IL-1α i β peptidi, IL-2, γINF, IL-10, GM-CSF i hemokine, kao što su M1P1 α i β i RANTES. Imunogeni agensi mogu takođe biti spojeni sa peptidima koji povećavaju transport kroz tkiva, kao što je opisan u O'Mahony, WO 97/17613 i WO 97/17614.

[0200] Imunogeni agensi mogu biti spojeni sa nosačima hemijskim unakrsnim vezama. Tehnike za spajanje imunogena sa nosačem uključuju formiranje disulfidnih veza pomoću N-sukcinimidil-3-(2-piridil-tio) propionata (SPDP) i sukcinimidil 4-(Nmaleimidometil)cikloheksan-1-karboksilata (SMCC) (ako peptidu nedostaje sulfhidril grupa, to može biti obezbeđeno dodatkom cisteinskog ostatka). Ovi reagensi grade disulfidnu vezu među sobom i cistein iz peptida ostaje na jednom proteinu i amidna veza preko .epsilon.-amino na lizinu, ili druge slobodne amino grupe u drugim aminokiselinama. Niz takvih agenasa koji formiraju disulfid/amid su opisani u Immun. Rev. 62, 185 (1982). Drugi bifunkcionalni agensi za kuplovanje formiraju tioetar rađe nego disulfidnu vezu. Mnogi od ovih agenasa koji formiraju tioetar su komercijalno dostupni i uključuju reaktivne estre 6-maleimidokapronske kiseline, 2-bromoacetatne kiseline i 2-jodoacetatne kiseline, 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilne kiseline. Karboksilne grupe mogu da budu aktivirane kombinovanjem mogu da budu prisutni u fuzionom proteinu.

[0201] Imunogeni peptidi se mogu eksprimirati kao fuzioni proteini sa nosačima. Imunogeni peptid može biti povezan za nosač amino krajem, karboksilnim krajem, ili bilo sa kojim mestom na peptidu (interno). U nekim izvođenjima, u fuzionom proteinu mogu da budu prisutni mnogostruki ponovci imunogenog peptida.

[0202] Na primer, takođe su obezbeđeni imunogeni koji uključuju fuzione proteine koji sadrže tau peptid koji nosi protektivan B ćelijski epitop vezan za promiskuitetan neprirodan Pan DR T-ćelijski epitop koji indukuje B-ćelijski odgovor na protektivan epitop. U jednoj alternativi, obezbeđeni su imunogeni, koji mogu da budu dizajnirani kao polimeri (Jackson et al., 1997), višestruki antigen peptid sistemi (MAP) (Tam i Recent, 1996), imunostimulatorni kompleksi (ISCOM) (Barr, I. G. i Mitchell, 1996) i moguće drugi razgranati amfoterni polipeptidi (Wilkinson et al., 1998), ili himerni peptidi proizvedeni kolinearizacijom epitopa (Marussig et al., 1997).

[0203] U određenim izvođenjima, terapijski peptidi mogu da se primenjuju sami ili u kombinaciji, vezani ili ne za farmaceutski prihvatljiv nosač uključujući KLH, tetanus toksoid, protein koji vezuje albumin, goveđi serumski albumin, dendrimer (MAP; Biol. Chem. 358: 581) kao i adjuvant, ili njihove kombinacije, opisane npr. u O'Hagan et al. (2003) (naročito endogena imunopotencirajuća jedinjenja i sisteme za razlivanje opisane tamo) i u Wilson-Welderer et al. (2009) (naročito one date u tabelama 2 i 3 navedenog dokumenta) ili njihove smese.

[0204] U određenim izvođenjima, imunogeni agens, kao što je ovde opisan, može biti vezan ili spojen sa pogodnim nosačem hemijskim unakrsnim vezama da poveća imuni odgovor na patološki tau, uključujući depozite tau. U određenim izvođenjima, vezan ili spojen farmaceutski prihvatljiv nosač je hemocijanin iz prilepka (KLH), tetanus toksoid, goveđi serumski albumin (BSA), imunoglobulinski (Ig) molekul, tiroglobulin, ili ovoglobulin. Ostali nosači za stimulisanje imunog odgovora uključuju citokine (kao što su IL-1, IL-2, IL-10 IFNγ, GM-CSF) i hemokine (kao što su M1P1α i β).

[0205] Tau peptidi ili njihovi analozi se mogu sintetisati sintezom peptida čvrste faze ili rekombinantnom ekspresijom, ili se mogu dobiti iz prirodnih izvora. Automatski aparati za sintezu peptida peptida su komercijalno dostupni od brojnih snabdevača, kao što je Applied Biosystems, EZBiolab, ili Antagene. Sistemi za rekombinantnu ekspresiju mogu da uključuju bakterije, kao što je E. coli, kvasac, ćelije insekata, ili sisarske ćelije. Procedure za manipulaciju DNK i dobijanje DNK konstrukata za rekombinantnu ekspresiju su opisani u Sambrook et al. (1989), metodi za proizvodnju rekombinantnih proteina su opisani detaljno u Current Protocols in Protein Science (poglavlje 5 "Production of Recombinant Proteins",

1

UNITS 5.1-5.24, DOI: 10.1002/0471140864, takođe dostupno online na sajtu onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/0471140864/toc).

[0206] Imunogeni agensi opisani ovde mogu da budu eksprimirani pomoću virusa ili bakterije kao vektora ili nosača. Nukleinska kiselina koja kodira imunogeni peptid je ugrađena u genom ili epizom virusa ili bakterije. Konačno, imunogeni peptidi mogu da budu eksprimirani kao sekretovani protein ili kao fuzioni protein sa proteinom spoljne površine virusa ili može biti prikazan kao transmembranski protein bakterije. Virusi ili bakterije koji se koriste u takvim metodima su uopšteno nepatogeni ili ublaženi. Pogodni virusi uključuju adenoviruse, HSV, venecuelanski konjski virus encefalitisa i druge alfa viruse, virus vezikularnog stomatitisa i druge rabdo viruse, vakciniju i živinske boginje. Pogodne bakterije uključuju Salmonella-u i Shigella-u. Alternativno, fuzija imunogenog peptida sa HBsAg HBV-a je pogodna.

[0207] Još jedan aspekt ove prijave se odnosi na terapijski agens ili imunogen, koji može da bude i analog raznih peptida opisanih u različitim oblicima pronalaska (npr., SEQ ID No: 1-4; 9-97) ili njihovim fragmentima.

[0208] Ova prijava je takođe zasnovana na otkriću novih peptida, označenih u ovoj aplikaciji kao kreirani terapijski epitopi. Uprkos tome što imaju primarnu sekvencu drukčiju od one tau i tau fragmenata, ova prijava predstavlja kreirane terapijske epitope koji su sposobni da imaju oblik (npr., intrinsično poremećenu strukturu, tercijarnu strukturu, konformaciju) koja imitira onu jednog ili više "terapijskih epitopa" tau opisanih gore. Imitiranjem jednog ili više ovih regiona, ovi kreirani terapijski epitopi mogu da budu korisni za pravljenje antitela na njih, kao što su antitela koja su u kompeticiji sa DC8E8. Ovi peptidi su sposobni da budu u kompeticiji sa tau ili tau fragmentima za vezivanje DC8E8 antitela, opisanim gore.

[0209] Takođe su uključeni imunogeni kreirani terapijski epitopi sposobni da indukuju imuni odgovor na patološki tau kad se injektiraju u pacovske modele AD i za koje bi se očekivalo da to isto urade kod ljudi. Pored toga, opisana su i mišja antitela/antiserumi, proizvedeni kao odgovor na imunizaciju pomoću jednog ili više kreiranih terapijskih epitopa i sposobna da (i) prepoznaju jedan ili više epitopa koji su ili imitiraju ona DC8E8; (ii) diskriminišu patološki tau od normalnog tau; i/ili (iii) prepoznaju neurofibrilarne lezije u humanom mozgu sa AD i/ili u transgenim pacovskim modelima AD.

[0210] Sastavi za prevenciju, tretman i/ili dijagnostikovanje Alchajmerove bolesti su takođe obezbeđeni, gde sastav sadrži (i) sredstvo za tretiranje Alchajmerove bolesti u subjektu inhibiranjem agregiranja tau i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač. Sastavi za prevenciju, tretman i/ili dijagnostikovanje Alchajmerove bolesti su takođe obezbeđeni, gde sastav sadrži (i) sredstvo za tretiranje Alchajmerove bolesti u subjektu vezivanjem za jedan ili više "terapijskih epitopa" u patološkom tau i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživače. Sastavi za prevenciju, tretman i/ili dijagnostikovanje Alchajmerove bolesti su takođe obezbeđeni, gde sastav sadrži (i) sredstvo za smanjivanje agregiranja tau vezivanjem za jedan ili više "terapijskih epitopa" u patološkom tau i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživače.

Formulacije

[0211] Agensi iz pronalaska se mogu davati kao farmaceutske formulacije koje sadrže terapijski agens (npr., antitelo ili peptid, kao što je opisan gore) i jednu ili više drugih

2

farmaceutski prihvatljivih komponenata. Videti Remington, Pharmaceutical Science (15. izdanje, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, pomade, gelove, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovoska (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smese koje sadrže karbovosak. Svaka od prethodnih smesa može da bude odgovarajuća u tretmanima i terapijama u skladu sa ovim pronalaskom, uz uslov da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerabilna sa putem administracije. Videti i Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman W N "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J. Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i citate tamo, za dodatne informacije vezane za formulacije, ekscipijente i nosače poznate farmaceutskim hemičarima.

[0212] Širok spektar farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata je poznat u struci i nema potrebe detaljno ih diskutovati ovde. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti su opširno opisan u nizu publikacija, uključujući, na primer, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20. izdanje, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7.sup.th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; i Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3 ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

[0213] Izabrana formulacija zavisi od planiranog načina administracije i terapijske primene. Formulacije mogu da uključuju farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače ili razblaživače, koji su definisani kao nosači koji se obično koriste za formulisanje farmaceutskih sastava za davanje životinjama ili ljudima. Razblaživač se bira tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, fiziološki fosfatno puferisan slani rastvor, Ringerovi rastvori, rastvor dekstroze i Hankov rastvor. Farmaceutski sastav ili formulacija mogu da uključe i druge nosače, adjuvante, ili netoksične, neterapijske, neimunogene stabilizatore i slično. Međutim, neki reagensi pogodni za davanje životinjama, kao što je kompletan Freund-ov adjuvant, nisu tipično uključeni u sastave za humanu upotrebu.

[0214] Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su poznati u struci i uključuju fosfatno puferisane slane rastvore, vodu, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, razne tipove agenasa za kvašenje, sterilne rastvore, itd. Sastavi koji sadrže takve nosače mogu biti formulisani poznatim konvencionalnim metodima. Više nosača je opisano dalje niže.

Adjuvanti

[0215] Terapijski agensi, imunogeni, opisani ovde se mogu davati u kombinaciji sa adjuvantima, tj., supstancama koje same ne izazivaju adaptivne imune odgovore, nego amplifikuju ili modulišu odgovor na prateći antigen. Niz adjuvanata se može koristiti u kombinaciji sa terapijskim peptidima i antitelima u ovom pronalasku, da bi se podigao imuni odgovor. Poželjni adjuvanti povećavaju intrinsičan odgovor na imunogen ne izazivajući konformacione promene u imunogenu koje bi uticale na kvalitativnu form odgovora.

[0216] U određenim izvođenjima, adjuvant je aluminijumova so kao što je aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat i aluminijum sulfat (Hunter, 2002). Takvi adjuvanti se mogu koristiti sa ili bez drugih specifičnih imunostimulišućih agenasa, kao što je 3 de-O-acilaovan monofosforil lipid A (MPL) ili 3-DMP, polimerne ili monomerne aminokiseline, kao što je poliglutaminska kiselina ili polilizin. Takvi adjuvanti se mogu koristiti sa ili bez drugih specifičnih imunostimulišućih agenasa, kao što su muramil peptidi (npr., N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'dipalmitoil-sn--glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin (MTP-PE), N-acetilglukozaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-izoglu-L-Aladipalmitoksi propilamid (DTP-DPP) teramid™), ili neke druge komponente bakterijskog ćelijskog zida. Ostali adjuvanti su emulzije ulje-u-vodi i uključuju (a) MF59 (WO 90/14837 do Van Nest et al.), koja sadrži 5% skvalen, 0,5% Tween 80 i 0,5% Span 85 (koji opciono sadrži različite količine MTP-PE) formulisane u submikronske čestice korišćenjem mikrofluidizera kao što je Model 110Y microfuidizer (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, koja sadrži 10% skvalen, 0,4% Tween 80, 5% poloksamerom blokiran polimer L121 i thr-MDP, bilo mikrofluidizovan u submikronsku emulziju, bilo mešan na vorteksu da bi se napravila emulzija većih čestica i (c) Ribi.TM. adjuvantni sistem (RAS), (Ribi InunoChem, Hamilton, Mont.) koji sadrži 2% skvalen, 0,2% Tween 80 i jednu ili više komponenata bakterijskog ćelijskog zida iz grupe koja se sastoji od monofosforilipida A (MPL), trehaloza dimikolat (TDM) i skelet ćelijskog zida (CWS), na primer MPL+CWS (Detox.TM.). U nekim izvođenjima, adjuvant je saponin, kao što je Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) ili čestice generisane iz njega kao što su ISCOM-i (imunostimulišući kompleksi) i ISCOMATRIX. Ostali adjuvanti uključuju kompletan Freund-ov adjuvant (CFA) i nekompletan Freund-ov adjuvant (IFA), citokine, kao što su interleukini (IL-1, IL-2, i IL-12), faktor koji stimuliše formiranje kolonije makrofaga (M-CSF) i faktor nekroze tumora (TNF).

[0217] Alternativno, tau peptidi i njihovi imunogeni analozi se mogu kuplovati sa adjuvantom. Na primer, lipopeptidna verzija tau peptida "A" se može dobiti kuplovanjem palmitinske kiseline ili drugih lipida direktno sa N-krajem "A" kao što je opisano za vakcinaciju antigenom hepatitisa B (Livingston, J. immunol. 159, 1383-1392 (1997)). Međutim, takvo kuplovanje ne bi trebalo suštinski da promeni konformaciju tau peptida "A" tako da ona utiče na imuni odgovor na njega.

[0218] Adjuvant se može davati sa imunogenom u jednom sastavu, ili se može davati pre, paralelno sa ili posle davanja imunogena. Imunogen i adjuvant se mogu pakovati i isporučivati u istoj bočici ili se mogu pakovati u odvojenim separate vočicama i pomešati pre upotrebe. Imunogen i adjuvant se tipično pakuju sa obeleživačem, koji ukazuje na namenjenu terapijsku primenu. Ako se imunogen i adjuvant pakuju odvojeno, pakovanje tipično uključuje uputstvo za mešanje pre upotrebe. Izbor adjuvanta i/ili nosača zavisi od stabilnosti imunogene formulacije koja sadrži adjuvant, načina davanja, rasporeda doziranja, efikasnosti adjuvanta vrstu koja se vakciniše, i, kod ljudi, farmaceutski prihvatljiv adjuvant je onaj koji je odobren ili se može odobriti za davanje ljudima od strane by relevantnih regulatornih tela. Na primer, kompletan Freund-ov adjuvant nije pogodan za davanje ljudima. Međutim, aluminijumova so, MPL ili nekompletan Freund-ov adjuvant (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32: 173-186 (1998) sam ili, opciono, u kombinaciji sa bilo kojom aluminijumovom solju, QS21 i MPL i sve njihove kombinacije su pogodne za davanje ljudima.

4

[0219] Farmaceutski sastavi mogu da uključe i velike, slowly metabolized makromolekule koji sporo metabolišu, kao što su proteini, polisaharidi kao hitosan, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimeri (npr., sefaroza funkcionalizovana lateksom, agaroza, celuloza i slično), polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina i lipidni agregati (npr., kapi ulja ili lipozomi). Dodatno, ovi nosači mogu da funkcionišu kao imunostimulatorni agensi (tj., adjuvanti).

Kombinacije

[0220] Sastavi i metodi tretmana koji kombinuju antitela i peptide opisane ovde sa drugim tretmanima za AD i srodne tauopatije su ovde obezbeđeni. Na primer, trenutno, terapijske strategije vezane za tau se uglavnom fokusiraju na lekove koji inhibiraju tau kinaze ili aktiviraju fosfataze (Iqbal i Grundke-Iqbal, 2004, 2005, 2007; Noble et al. 2005), lekove koji stabilišu mikrotubule (Zhang et al. 2005), lekove koji facilitiraju proteolitičku degradaciju pogrešno savijenih tau proteina (Dickey et al. 2005; Dickey i Petrucelli, 2006; Dickey et al.

2006), jedinjenja koja sprečavaju ili menjaju smer agregiranja tau (Wischik et al. 1996; Pickhardt et al. 2005; Taniguchi et al.2005; Necula et al. 2005; Larbig et al. 2007) ili klirens posredovan vakcinom od agregiranog tau (Asuni et al.2007). Prema tome, višestruko ciljanje (npr., ciljanje i tau i beta-amiloida) može suštinski da poveća efikasnost tretmana.

[0221] U slučaju Alchajmerove bolesti i srodnih tauopatija, u kojima se patološki rastvorljiv tau i nerastvorljiv tau (tau depoziti) javljaju u mozgu, agensi opisani ovde se mogu davati i u konjunkciji sa drugim agensima koji povećavaju prolaz agenasa kroz krvno-moždanu barijeru.

Metodi administracije

[0222] Agensi za indukovanje imunog odgovora (pasivno ili aktivno), za smanjenje nivoa tau, ili za bilo koje druge metode sprečavanja, lečenja ili dijagnostikovanja (in vivo) opisane ovde, se mogu davati parenteralnim, topičkim, intradermalnim, intravenoznim, oralnim, subkutanim, intraperitonealnim, intranazalnim ili intramuskularnim sredstvima za profilaktički i/ili terapijski tretman. Tipičan put davanja je subkutani, mada i ostali mogu biti jednako efektivni. Jedan drugi tipičan put je intramuskularna injekcija. Ovaj tip injekcije se najtipičnije vrši u mišiće ruku ili nogu. Intravenozne injekcije kao i intraperitonealne injekcije, intraarterijske, intrakranijalne, ili intradermalne injekcije su takođe efektivne u generisanju imunog odgovora. U nekim metodima, agensi se injektiraju direktno u određeno tkivo gde su se akumulirali depoziti.

[0223] Aerosolne formulacije kao što su formulacije spreja za nos uključuju prečišćen vodeni ili druge rastvore aktivnog agensa sa agensima za konzerviranje i izotoničnim agensima. Takve formulacije su, na primer, podešene na pH i izotonično stanje kompatibilno sa nazalnim mukoznim membranama. Formulacije za rektalnu ili vaginalnu administraciju mogu biti predstavljene kao supozitorije sa pogodnim nosačem.

[0224] Za parenteralnu administraciju, terapijski peptidi opisani ovde se mogu administrirati kao injektabilne doze rastvora ili suspenzije supstance u fiziološki prihvatljivom razblaživaču sa farmaceutskim nosačem koji može biti sterilna tečnost kao što je voda, ulje, slani rastvor, glicerol ili etanol. Dodatno, pomoćna supstanca, kao što je sredstvo za kvašenje ili emulzifikovanje, surfaktanti, puferske supstance i slično, mogu biti prisutne u sastavima. Ostale komponente farmaceutskih sastava su one naftnog, životinjskog, povrćnog ili sintetičkog porekla. Ulje od kikirikija, sojino ulje i mineralno ulje su sve primeri korisnih materijala. U opštem slučaju, glikoli, kao što je propilen glikol ili polietilen glikol, su poželjni tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Agensi opisani ovde takođe mogu biti administrirani u vidu injekcije-depoa ili implantiranog preparata koji može biti formulisan na takav način da dozvoli trajno oslobađanje aktivnog sastojka. Primeran sastav sadrži monoklonsko antitelo u 5 mg/mL, formulisan u vodenom puferu koji se sastoji od 50 mM L-histidina, 150 mM NaCl, podešen na pH 6,0 pomoću HCl.

[0225] Preparati za parenteralnu administraciju uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i injektabilni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući slani rastvor i puferisane medijume. Parenteralni nosači uključuju natrijum hloridni rastvor, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, laktatni Ringer-ov rastvor, ili neisparljiva ulja. Intravenozni nosači uključuju tečne i hranljive dopune, dopune elektrolita (kao što su onizasnovani na Ringerovoj dekstrozi) i slično. Mogu da budu prisutni i konzervansi i drugi aditivi na primer, antimikrobna sredstva, antioksidansi, helirajuća sredstva, inertni gasovi i slično.

[0226] Tipično, sastavi se prave kao injektabilni, ili kao tečni rastvori ili suspenzije; čvrste forme pogodne za rastvaranje, ili suspendovanje, u tečnom nosaču pred injektiranje se takođe mogu praviti. Preparat može biti emulzifikovan ili enkapsuliran u lipozomima ili mikro česticama kao što je polilaktid, poliglikolid, ili kopolimer za pojačani adjuvantni efekat, kao što je diskutovano gore (videti Langer, Science 249, 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Agensi opisani ovde mogu biti davani u vidu depoinjekcije ili implantiranog preparata koji može biti formulisan na takav način da dozvoli stalno ili pulsatilno oslobađanje aktivnog sastojka.

[0227] Dodatne formulacije pogodne za druge načine davanja uključuju oralne, intranazalne i pulmonalne formulacije, supozitorije i transdermalne aplikacije.

[0228] Za supozitorije, veziva i nosači uključuju, na primer, polialkilen glikole ili trigliceride; takve supozitorije se mogu formirati iz smesa koje sadrže aktivan sastojak u opsegu od 0,5% do 10%, na primer, 1%-2%. Oralne formulacije uključuju ekscipijente, kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza i magnezijum karbonat farmaceutske čistoće. Ovi sastavi imaju forme rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa produženim oslobađanjem ili prahova i sadrže 10%-95% aktivnog sastojka, na primer 25%-70%.

[0229] Topičke aplikacije mogu da dovedu do transdermalne ili intradermalne isporuke. Topičko davanje može biti olakšano koadministriranjem agensa sa kolera toksinom ili njegovim detoksifikovanim derivatima ili podjedinicama ili drugim sličnim bakterijskim toksinima (Videti Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Koadministriranje može biti postignuto korišćenjem komponenti kao smese ili kao zakačenih molekula dobijenih hemijskim unakrsnim vezivanjem ili ekspresijom kao fuzioni protein.

[0230] Alternativno, transdermalna isporuka se može postići korišćenjem flastera ili korišćenjem transferozoma (Paul et al., Eur. J. imunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)). Subkutana administracija predmetnog antitela, peptida, ili jedinjenja, se postiže pomoću standardnih metoda i uređaja, npr., igle i šprica, port sistema isporuke subkutane injekcije i slično. Intramuskularna administracija se postiže standardnim sredstvima, npr., iglom i špricem, sistemom za kontinualnu isporuku, itd. U nekim izvođenjima, predmetno antitelo, peptid, i/ili jedinjenje, se isporučuje sistemom za kontinualnu isporuku. Termin "sistem za kontinualnu isporuku" se ovde koristi u istom značenju kao "kontrolisan sistem isporuke" i obuhvata medicinske uređaje za kontinualnu (npr., kontrolisanu) isporuku (npr., pumpe) u kombinaciji sa kateterima, sredstvima za injekcije i slično, čega je širok spektar poznat u struci. Mehaničke ili elektromehaničke infuzione pumpe mogu da budu pogodne i za upotrebu kao što je ovde opisano. Primeri takvih uređaja uključuju one opisane u, na primer, U.S. Pat. Nos. 4,692,147; 4,360,019; 4,487,603; 4,360,019; 4,725,852; 5,820,589; 5,643,207; 6,198,966 i slično. U opštem slučaju, ovi metodi isporuke leka se mogu postići korišćenjem bilo kog od niza pumpnih sistema koji se mogu puniti. Pumpe obezbeđuju konzistentno, kontrolisano oslobađanje tokom vremena.

[0231] Agensi se mogu davati i sada već standardnom procedurom bušenja male rupe u lobanji da bi se dao lek. U jenom poželjnom aspektu, vezujući molekul, pogotovo antitelo ili lek na bazi antitela iz ovog pronalaska, može da prođe kroz krvno-moždanu barijeru, što omogućava intravensku ili oralnu administraciju.

[0232] U farmaceutskim oblicima doze, agensi (antitela, peptidi, jedinjenja opisana ovde) mogu da budu administrirani u vidu svojih farmaceutski prihvatljivih soli, ili mogu biti korišćeni sami, ili u odgovarajućim asocijacijama, kao i u kombinaciji, sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima. Metodi i ekscipijenti opisani ovde su samo primeri i ni na koji način nisu ograničavajući. Predmetno antitelo, peptid, ili jedinjenje, se može formulisati u preparate za injektiranje njegovim rastvaranjem, suspendovanjem ili emulzifikacijom u vodenom ili nevodenom rastvaraču, kao što je biljno ili neko drugo slično ulje, sintetički gliceridi alifatičnih kiselina, estri viših alifatičnih kiselina ili propilen glikol i, po želji, sa konvencionalnim aditivima kao što su sredstva koja pomažu rastvaranje, izotonična sredstva, suspendujuća sredstva, emulzifikujuća sredstva, stabilizatori i konzervansi. Jedinične forme doza za injektiranje ili intravenoznu administraciju mogu da sadrže aktivan agens u sastavu kao rastvor u sterilnoj vodi, normalnom slanom rastvoru ili nekom drugom farmaceutski prihvatljivom nosaču. Termin "jedinična forma doze" ili "doza", kao što se ovde koristi, se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne za jedinične doze za humane i životinjske subjekte, gde svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu predmetnog antitela, izračunatu da bude dovoljna da proizvede željeni efekat udružena sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Specifikacije za ove jedinične forme doze zavise od konkretnog jedinjenja koje se koristi i efekta koji treba postići i farmakodinamike vezane za svako jedinjenje u domaćinu.

[0233] Imuni odgovori na patološke tau proteine i tau depozite mogu biti indukovani i administracijom nukleinskih kiselina koje kodiraju terapijske tau peptide. Takve nukleinske kiseline mogu biti DNK ili RNK. Segment nukleinske kiseline koji kodira imunogen je spojen sa regulatornim elementima, kao što je promotor i enhanser koji dozvoljavaju ekspresiju takvog DNK segmenta u ciljnim ćelijama pacijenta. Obično, promotorski i enhanserski elementi iz imunoglobulinskih gena (lak ili težak lanac) ili CMV glavni intermedijarni rani promotor i enhanser su pogodni za usmeravanje ekspresije u ćelijama krvi, koje su željena meta za indukciju imunog odgovora. Spojeni regulatorni elementi i kodirajuće sekvence se često kloniraju u vektor.

[0234] Brojni sistemi virusnih vektora su dostupni uključujući retrovirusne sisteme (videti, npr., Lawrie et al., Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993)); adenovirusne vektore (Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993)); adeno-asocirane virusne vektore (Zhou et al., J. Exp.

Med. 179: 1867 (1994)), virusne vektore iz porodice boginja, uključujući virus vakciniju i viruse ptičjih boginja, virusne vektore iz roda alfa virusa, kao što su oni izvedeni iz Sindbis i Semliki šumskih virusa (Dubensky et al., J. Virol 70:508-519 (1996)), venecuelanski virus konjskog encefalitisa (videti U.S. Pat. No.5,643,576 do Johnston et al.) i rabdoviruse, kao što je virus vezikularnog stomatitisa (videti WO 96/34625 do Rose ) i papiloma virusi (Ohe, et al., Human Gene Therapy 6:325-333 (1995); WO 94/12629 do Woo et al. i Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res.24:2630-2622 (1996)).

[0235] DNK koja kodira imunogen, ili vektor koji sadrži isto, može da se pakuje u lipozome. Pogodni lipidi i srodni analozi su opisani u U.S. Pat. Nos. 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 i 5,283,185. Vektori i DNK koji kodiraju imunogen mogu da budu i adsorbovani na ili spojeni sa određenim nosačima, gde primeri uključuju polimetil metakrilat polimere i polilaktide i poli(laktid-ko-glikolide), videti, npr., McGee et al., J. Micro Encap. (1996).

[0236] Vektori za gensku terapiju ili gola DNK može da bude isporučena in vivo administracijom pojedinačnom pacijentu, tipično sistemskom administracijom (npr., intravenski, intraperitonealnom, nazalnom, gastričkom, intradermalnom, intramuskularnom, subdermalnom ili intrakranijalnom infuzijom) ili topičkom primenom (videti npr., U.S. Pat. No. 5,399,346). DNK se može davati i korišćenjem genskog topa (videti U.S. Pat. No.

6,436,709). U ovoj aplikaciji, DNK koja kodira imunogen se staloži na površinu mikroskopskih metalnih perli. Mikroprojektili se ubrzavaju pomoću udarnog talasa ili širenjem helijuma i prodiru u tkiva do dubine od nekoliko slojeva ćelija (pregled u Haynes et al., 1996). Na primer, pogodni su Accel™ Gene Delivery Device proizveden od Agacetus, Inc. (Middleton, WI) ili Helios Gene Gun proizveden u Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Za terapijske svrhe, DNK se može isporučivati elektroporacijom (npr. kao što je opisano u Trollet et al., 2008, uključujući reference tamo). Alternativno, gola DNK može da prođe kroz kožu u krvotok jednostavno nakapavanjem DNK na kožu uz hemijsku ili mehaničku iritaciju (videti WO 95/05853) ili tetovažu (npr. kao što je opisano u van den Berg et al., 2009).

[0237] U jednoj varijanti, DNK ili vektori koji kodiraju imunogene mogu biti isporučeni ćelijama ex vivo, kao što su ćelije eksplantirane iz pojedinačnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati kostne srži, biopsije tkiva) ili univerzalne donorske hematopoietske matične ćelije, pa ponovo implantirane u pacijenta, na primer, posle verifikacije ekspresije imunogena i obično posle selekcije ćelija koje su inkorporisale vektor.

[0238] Još jedan obećavajući, mada potencijalno rizičniji, pristup za tretman ljudi je bio da se transfektuju dentritske ćelije (DC, kroz durektnu isporuku DNK ili korišćenjem virusnih strategija) da bi one same proizvodile antigen (Xing et al., 2005), time obezbeđujući kontinualno snabdevanje intaktim antigenom predstavljenim kroz MHC I.

Subjekti podložni tretmanu

[0239] Subjekti podložni tretmanu uključuju pojedince u riziku od Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija ali koji ne pokazuju simptome, kao i pacijenti koji već pokazuju simptome. U slučaju Alchajmerove bolesti, praktično je svako u riziku od dobijanja Alchajmerove bolesti ako on ili ona živi dovoljno dugo. Prema tome, ovi tretmani ili terapije se čak mogu davati profilaktički opštoj populaciji bez procene rizika za pacijenta. Vakcine predstavljenje u ovom patentu mogu biti naročito korisne za pojedince koji znaju da nose genetski rizik od Alchajmerove bolesti. Takvi pojedinci uključuju one koji imaju rođake koji su patili od ove bolesti i one čiji rizik je određen prisustvom genetskih ili biohemijskih markera. Genetski markeri rizika ranog početka familijarne Alchajmerove bolesti uključuju mutacije u APP genu, presenilin genima PS1 i PS2 i markerima za kasni početak Alchajmerove bolesti u ApoE4 genu (nedavno objavljen pregled Bertram i Tanzi, 2008). Dodatni faktori rizika uključuju porodičnu istoriju AD, hiperholesterolemiju ili aterosklerozu. Pojedinci koji trenutno pate od Alchajmerove bolesti mogu biti prepoznati po karakterističnoj demenciji, kao i prisustvu faktora rizika opisanih gore. Pored toga, niz dijagnostičkih testova je dostupan za identifikovanje pojedinaca koji imaju AD. Ovi uključuju merenje nivoa ukupnog tau, fosfotau i amiloida β (1-42) u CSF. Povišen nivo tau i/ili fosfo-tau i smanjen nivo amiloida β (1-42) ukazuje na prisustvo AD. Pojedinci koji pate od Alchajmerove bolesti mogu biti dijagnostikovani pomoću MMSE, ADRDA ili drugih kriterijuma.

[0240] U asimptomatičnim pacijentima, tretman može da počne u bilo kom dobu (npr., 10, 20, 30). Međutim, možda nije neophodno da se počne tretman dok pacijent ne dostigne 40, 50, 60 ili 70 godina. Tretman može da iziskuje višestruke doze tokom nekog vremenskog perioda. Tretman može da bude praćen testiranjem antitela, ili aktiviranih T-ćelijskih ili B-ćelijskih odgovora na terapijski agens (npr., tau peptid) tokom vremena. Ako odgovor pada, treba dati buster dozu. U slučaju potencijalnih pacijenata sa Down-ovim sindromom, koji su pod većim rizikom za AD ili srodne tauopatije, tretman može da počne prenatalno, administriranjem terapijskog agensa u majku, ili ubrzo posle rođenja.

[0241] U nekim izvođenjima, DC8E8 (ili himerno, humanizovano, humano, ili neki drugi njegov derivat/deo/fragment) je antitelo ili pasivna vakcina namenjena za upotrebu kod ostarelih imunosenescentnih pacijenata sa Alchajmerovom bolešću (AD) koji pokazuju značajno smanjenje nivoa kostimulatornih molekula CD28 na T-ćelijama. Smanjenje kostimulatornog molekula CD28 je indikativno za narušen imuni odgovor (Saurwein-Teissl et al., 2002). CD8<+>CD28<->T ćelijski klonovi, koji su često CD45RA<+>(imunofenotip: CD8<+>CD28<->CD45RA<+>), proizvode veliku količinu proinflamatornog citokina IFN-γ i marginalnih količina IL-5. Ovi klonovi se akumuliraju tokom normalnog starenja i indukuju neravnotežu u proizvodnji Th1i Th2citokina. Prema tome, akumulacija CD8<+>CD28-CD45RA<+>T ćelijskih klonova zajedno sa opadajućom populacijom naivnih B ćelija (Siegrist i Aspinall, 2009) najviše doprinose opadanju imunih funkcija, što pogađa oko jednu trećinu starije populacije (Weng et al., 2009, Saurwein-Teissl et al., 2002).

[0242] U skladu s tim, pasivna imunoterapija (npr., pomoću DC8E8 (ili himernog, humanizovanog, humanog, ili nekog drugog njegovog derivata/dela/fragmenta) obezbeđuje sredstvo da se zaobiđe propadajući imuni sistem velike populacije AD pacijenata i da se ciljaju patološki tau proteini koji izazivaju neurofibrilarnu degeneraciju.

[0243] U nekim izvođenjima, jedan od terapijskih epitopa tau (ili peptid koji sadrži jedan od terapijskih epitopa tau opisan ovde) se koristi kao aktivna vakcina, namenjena za upotrebu u ostarelim, imunokompetentnim pacijentima sa Alchajmerovom bolešću. Imunofenotip imunokompetentnih pacijenata je CD8<+>CD28<+>CD45RA<+>. Prema tome, nivoi kostimulatornog molekula CD28 na CD8<+>T ćelijama će biti određen i korišćen kao selekcioni marker pacijenata za aktivnu vakcinaciju.

[0244] Pored toga, pred tretman, CSF i krv uzeti iz pacijenata će biti testirani za antitela na Borrelia, Treponema, Chlamydia, Herpes virus i druge patogene mozga, da bi se isključili pojedinci sa hroničnim infektivnim i inflamatornim poremećajima CNS, koji mogu da imitiraju ili pojačaju simptome AD (Balin et al., 2008; Itzhaki i Wozniak, 2008; Miklossy, 2008; Andreasen, 2010). CNS infekcije često kompromituju funkciju krvno-moždane barijere (BBB), naročito infekcije endotelnih ćelija mozga hlamidijom, koje mogu da dovedu do povećanog influksa monocita u moždanom parenhimu i tako da utiču na lokalni imuni odgovor (Balin et al., 2008). Takođe je pokazano da stariji subjekti sa višim nivoima IgG na citomegalovirus (CMV) pate od bržeg kognitivnog pada (Itzhaki i Wozniak, 2008). Prema tome, da bi se sprečili nepoželjni efekti posle imunizacije jednim od agenasa opisanih ovde (npr. nekontrolisana imuna reakcija na normalan tau), pacijenti sa Alchajmerovom bolešću sa infekcijama CNS ili oni koji su pozitivni na testu za antitela na gorepomenute patogene, će biti tretirani visoko selektivnom vakcinom.

[0245] Pred tretman, CSF i krv uzeti iz pacijenata mogu da se testiraju na antitela na Borrelia, Treponema, Chlamydia, Herpes virus i druge patogene mozga da bi se isključili pojedinci sa hroničnim infektivnim i inflamatornim poremećajima CNS, koji mogu da imitiraju ili pojačaju simptome AD (Balin et al., 2008; Itzhaki i Wozniak, 2008; Miklossy, 2008; Andreasen, 2010). da bi se sprečili mogući nepoželjni efekti koje podstiču razne hronične infekcije, ova grupa pacijenata će biti tretirana selektivnijim antitelom ili vakcinom koja sadrži terapijski epitop. U nekim primerima, aktivna vakcina je kreirani epitop (npr., videti PRIMERE), koji indukuje proizvodnju strogo selektivnih antitela koja ciljaju terapijski epitop na patološkim tau proteinima. U nekim izvođenjima, vakcina ne sadrži nijednu aminokiselinsku sekvencu koju ima normalan/fiziološki tau protein.

Režimi tretmana

[0246] U profilaktičkim aplikacijama, farmaceutski sastavi ili lekovi se administriraju pacijentu koji je podložan, ili na drugi način pod rizikom od konkretne bolesti, u količini dovoljnoj da eliminiše ili smanji rizik ili odloži početak bolesti. U terapijskim aplikacijama, sastavi ili lekovi se daju pacijentu za koga se sumnja, ili koji već pati od takve bolesti, u količini dovoljnoj da izleči, ili bar delimično zaustavi simptome bolesti i njene komplikacije. Količina adekvatna da se ovo postigne, je definisana kao terapijski ili farmaceutski efektivna doza. I u profilaktičkom i u terapijskom režimu, agensi se obično daju u nekoliko doza dok se ne postigne dovoljan imuni odgovor. Tipično, imuni odgovor se prati i doze se ponovo daju ako imuni odgovor počne da se smanjuje.

[0247] Efektivne doze sastava iz ovog pronalaska, za tretman gore opisanih stanja, variraju u zavisnosti od mnogo faktora, uključujući sredstva administracije, mesto koje se cilja, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, drugi lekovi koje prima i da li je tretman profilaktički ili terapijski. Obično, pacijent je čovek. Doze tretmana treba da se istitruju da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost. U skladu s tim, tretman antitelom ili proteinom koji vezuje tau će tipično zahtevati višestruke doze tokom nekog vremenskog perioda. Za pasivnu imunizaciju antitelom, doza se kreće u opsegu od oko 0,0001 do 100 mg/kg, a češće od 0,01 do 5 mg/kg telesne težine domaćina. U nekim aplikacijama, količina antitela ili proteina koji vezuje tau se može davati u dozi od bar 0,1 mg/kg telesne težine, u dozi od bar 0,5 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, ili any kombinacija of dosages između 0,1 i 10 mg/kg telesne težine. U nekim metodima, antitelo ili protein koji vezuje tau može da se daje u mnogostrukim dozama (istim ili različitim) tokom perioda od bar 1 mesec, bar 3 meseca ili bar 6 meseci. Ukupan broj doza tokom bilo kog perioda tretmana može biti, na primer, između 4 i 6, mada se i drugi brojevi mogu koristiti, u zavisnosti od faktora diskutovanih gore. Tretman može da se prati bilo kojim metodima opisanim još niže.

[0248] Količina imunogena zavisi od toga da li se adjuvant takođe administrira, sa višim dozama potrebnim u odsustvu adjuvanta. Količina imunogena za davanje nekad varira od 1 µg - 500 µg po pacijentu i više, obično od 5-500 µg po injekciji za humanu administraciju. Povremeno se koristi visoka doza od 1-2 mg po injekciji. Tipično oko 10, 20, 50 ili 100 µg se koristi za svaku humanu injekciju. Tajming injekcija može značajno da varira od jednom dnevno, do jednom godišnje, do jednom u dekadi. Bilo kog dana kad je data doza imunogena, doza je veća od 1 µg/pacijentu i obično veća od 10 µg/pacijent ako se daje i adjuvant i veća od 10 µg/pacijentu i obično veća od 100 µg/pacijent u odsustvu adjuvanta. Tipičan režim se sastoji od imunizacije, praćene buster injekcijama u intervalima od 6 nedeljno. Jedan drugi režim se sastoji od imunizacije, praćene buster injekcijama posle 1, 2 i 12 meseci. Još jedan režim zahteva injekciju na svaka dva meseca života. Alternativno, buster injekcije mogu biti na nepravilnoj osnovi kao što je indikovano praćenjem imunog odgovora. U nekim izvođenjima, aktivna vakcina će biti formulisana sa pogodnim nosačem, preferencijalno KLH i aluminijum hidroksidom kao adjuvantom. Preferencijalno, 100 µg peptid /doza/pacijent (ali i 1 µg, 10 µg 100 µg i 1 mg će biti primenjeno u predkliničkoj fazi i 10 µg 100 µg 200 µg u fazi I studije toksičnosti) će biti primenjeno jednom u 4 nedelje, 5 doza ukupno.

[0249] Doze nukleinskih kiselina koje kodiraju imunogene leže u opsegu od oko 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 µg do 10 mg, ili 30-300 µg DNK po pacijentu. Doze za infektivne virusne vektore variraju od 10-10<9>, ili više, viriona po dozi. Tretman može da se prati testiranjem antitela, ili aktiviranjem T-ćelijskih ili B-ćelijskih odgovora na terapijski agens tokom vremena. Ako odgovor padne, buster doza se može indikovati.

[0250] Konačno, režim doze će odrediti nadležni lekar i klinički faktori. Kao što je poznato u medicinskoj struci, doze za bilo kog jednog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući pacijentovu veličinu, površinu tela, starost, konkretno jedinjenje koje se daje, pol, vreme i put administracije, opšte zdravlje i druge lekove koji mu se daju paralelno. Tipična doza može da bude, na primer, u opsegu od 0,001 do 1000 mg; međutim, predviđene su i doze ispod i iznad ovog primernog opsega, naročito kad se uzmu u obzir ranije pomenuti faktori. Uopšteno, režim kao regularna administracija farmaceutskog sastava bi trebalo da bude u opsegu od 1 mg do 10 mg jedinica na dan. Ako je režim kontinualna infuzija, trebalo bi takođe da bude u opsegu od 1 mg do 10 mg po kilogramu telesne težine u minutu, respektivno. Progres može da se prati periodičnim procenjivanjem.

[0251] Pored toga, koadministracija ili sekvencijalna administracija drugih agenasa može da bude poželjna. U nekim izvođenjima, terapijski efektivna doza ili količina se odnosi na onu količinu aktivnog sastojka dovoljnu da poboljša simptome ili stanje. Terapijska efikasnost i toksičnost takvih jedinjenja se može odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., ED50 (doza terapijski efektivna u 50% populacije) i LD50 (doza letalna za 50% populacije). Odnos između terapijskih i toksičnih efekata doze je terapijski indeks i on može da bude izražen kao odnos, LD50/ED50. U nekim izvođenjima, terapijski agens u sastavu je prisutan u količini dovoljnoj da obnovi normalno ponašanje i/ili kognitivne osobine u slučaju Alchajmerove bolesti i srodnih tauopatija.

[0252] Može se osloniti na različite mere za evaluaciju efektivnosti tretmana bilo kojim agensom opisanim ovde. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjene nivoe jedne ili više patoloških formi tau (npr., unutar mozga), povećan klirens patološkog tau iz mozga i/ili CSF; poboljšane mere kognitivnih performansi, kao što su kognitivne funkcije (testirane, na primer, pomoću Ocenjivanja kliničke demencije – CDR, Skale za procenu Alchajmerove

1

bolesti - Kognitivna podskala - ADAS-Cog, Mini ispitivanja mentalnog stanja - MMSE); testove poboljšanih motoričkih funkcija (npr., Test jačine stiska, Timed Up & Go (TUG) test, TUG manual, Test pričanja uz hodanje, Unifikovana skala za ocenjivanje Parkinsonove bolesti - UPDRS); testove poboljšanog izvođenja osnovnih aktivnosti dnevnog življenja (ADL) (npr, higijena, oblačenje, kontinencija, jedenje, spremanje obroka, telefoniranje, izlazak, finansije i korespondencija; testovi procene nesposobnosti u demenciji) i smanjenu jačinu/stepenovanje jačine stiska oštećenog u AD, lokomociju i apraksiju (koje imaju direktne korelacije sa životinjskim modelima i testovima opisanim niže, u PRIMERIMA), pad memorije, afaziju, agnoziju, dezorijentaciju u vremenu i prostoru i depresiju.

[0253] U cilju procene efektivnosti tretmana, nivoi i distribucija tau (unutar mozga, i u telesnim fluidima) se mogu testirati bilo kojim od metoda opisanih ovde, i/ili bilo kojim drugim metodima dostupnim za detekciju tau. Na primer, nivoi tau bi mogli da budu mereni in vivo (pozitronskom emisionom tomografijom) korišćenjem novih imidžing radioaktivnih obeleživača 18F-THK523, koji se selektivno vezuju za tau i tau patologiju in vitro, ex vivo (preseci tkiva) i in vivo (transgeni miševi) (Fodero-Tavoletti et al., 2011, Brain). Tau bi mogao da bude identifikovan u cerebrospinalnoj tečnosti i u krvi isto tako, pomoću ELISA kompleta koji prepoznaju bilo ukupan tau, bilo fosfo-tau.

[0254] Zaista, neurobihejvioralno pogoršanje u transgenim pacovima ima paralele sa motoričkim smetnjama kod pacijenata sa Alchajmerovom bolešću, što ima implikacije za klinička ispitivanja i protokole tretmana bilo kojim od terapijskih agenasa obezbeđenih ovde (uključujući, ali bez ograničenja na, agense za aktivnu vakcinaciju. U ljudima, Alchajmerova bolest je klinički okarakterisana progresivnim memorije i kognitivnim padom, bihejvioralnim promenama i psihološkim simptomima (poremećaji raspoloženja, emocija, apetita, ciklusa budno stanje / spavanje, konfuzija, agitacija i depresija) i poremećena motorička funkcija (apraksija, mioklonus, smetnje u hodu, smanjena jačina mišića, ekstrapiramidalne karakteristike kao što je bradikinezija, krutost i tremor u mirovanju) (Goldman et al., 1999; Boyle et al., 2009). Mnoge studije su objavile da su motorički znaci često uočljivi u Alchajmerovoj bolesti (AD) i postaju sve upadljiviji kako bolest napreduje (Goldman et al., 1999; Wilson et al., 2003; Louis et al., 2004; Pettersson et al., 2005; Scarmeas et al., 2004; Scarmeas et al., 2005; Waite et al., 2005; Alfaro-Acha et al., 2006; Wang et al., 2006; Buchman et al., 2007a; Boyle et al., 2009). Naročito, motorički znaci mogu da prethode kognitivnim smetnjama i da predvide kognitivni i funkcionalni pad, institucionalizaciju i mortalitet u Alchajmerovoj bolesti (Morris et al., 1989; Soininen et al., 1992; Kraemer et al., 1994; Chui et al., 1994; Scarmeas et al., 2004; Scarmeas et al., 2005). Pokazano je da smanjena jačina mišića prethodi razvoju kognitivnih smetnji (Buchman et al., 2007b; Boyle et al., 2009).

[0255] Razvoj motoričkih znaka u AD je povezan sa neuronskom degeneracijom i gubitkom neurona u moždanom stablu (Zarow et al. 2003; Burns et al. 2005; Grudzien et al. 2007; Simic et al., 2009; Wai et al., 2009; Braak i DelTredici, 2011). Štaviše, nekoliko studija je sugerisalo da neurofibrilarna degeneracija polazi iz moždanog stabla i prethodi kortikalnoj neurodegeneraciji (Hertz, 1989; Simic et al., 2009; Braak i DelTredici, 2011).

[0256] Ovi nalazi pokazuju da motoričke smetnje predstavljaju ključno obeležje AD patogeneze. Štaviše, funkcionalno oštećenje nekih motoričkih domena mogu da prethode demenciji i da predvide kognitivni pad. Aktivna imunoterapija peptidima (uključujući terapijske epitope) opisana ovde može da popravi motoričko oštećenje kod transgenih pacova koji eksprimiraju humani patološki tau. Prema tome, direktno ciljanje patologije moždanog

2

stabla aktivnom imunoterapijom može da spreči, uspori ili odloži motorička, kao i kognitivna oštećenja kod humanih pacijenata sa AD. Prema tome, testiranje motoričkih funkcija može biti uključeno u bateriju testova koji se mogu koristiti za procenu kliničke efikasnosti agenasa (npr., agensi za klirens tau, aktivne i pasivne vakcine) opisanih ovde.

[0257] Takođe, stručnjak uobičajenog nivoa je svestan dobro utvrđenih korelacija između nivoa i distribucije patološkog tau (npr., NFT u korteksu/hipokampusu) i napretka bolesti. Gustina patološkog tau (NFT patologija) je korelisana sa kognitivnim deficitom i jačinom Alchajmerove bolesti (Braak i Braak, 1991; Bierer et al., 1995; Berg et al., 1998; Duyckaerts et al., 1998; Giannakopoulos et al., 1998, 2003). Patološki tau (npr., NFTs, neuropilne niti) u entorinalnom korteksu i hipokampusu su inverzno povezane sa longitudinalnim promenama u memoriji (Reitz et al., 2009). Slično, u moždanom stablu, patološki tau (NFT) se javlja u dorsalnom rafe nukleusu u vrlo ranom stadijumu; druga rafe jezgra su pogođena kasnije. Ove lezije objašnjavaju serotoninergički deficit nađen u AD (Duykaerts et al., 2009). Ekstrapiramidalni simptomi su korelisani sa tau patologijom u substantia nigra (Liu et al., 1997). U skladu s tim, tretirajući agens koji može da pogodi jedan ili više ovih AD distribucionih obrazaca će verovatno imati blagotvoran efekat u AD.

PRIMERI

PRIMER 1: DOBIJANJE REKOMBINANTNIH HUMANIH TAU PROTEINA

[0258] Humani tau pune dužine (2N4R, 2N3R) i delecioni mutanti tau: rekombinantni tau proteini (Slike 1 i 6) su napravljeni iz klona T40 (Goedert,1989), koji je subkloniran u ekspresioni plazmid pET-17b (Novagen) i eksprimiran u bakteriji. Svaki delecioni mutant tau je potvrđen sekvenciranjem DNK. Svi delecioni mutanti tau i tau peptidi su numerisani prema najdužoj humanoj tau izoformi 2N4R, koja ima 441 aminokiselinu u dužinu i prema tome se zove i tau441(D'Souza, 2005). Delecioni mutanti tau i peptidi izvedeni iz izoforme 2N3R su označeni sa "3R" da se naznači da nedostaje drugi ponovak za vezivanje mikrotubule (aminokiseline 275-305 2N4R). Proizvodnja tau proteina uključuje sledeće korake: a) ekspresija tau u bakteriji; b) tau prečišćavanje jonoizmenjivačkom hromatografijom; c) prečišćavanje tau filtracijom na gelu; d) koncentracija i skladištenje izolovanog tau i e) imunoafinitetno prečišćavanje (ovo je izuzetak usvojen samo za tauΔ(1-150;392-441)/4R, koji je korišćen u eksperimentima sa mikroglijalnim preuzimanjem, videti Primer 10, Slika 17).

[0259] a) Bakterijska ekspresija humanog tau cele dužine (bilo 2N4R, bilo 2N3R) i delecioni mutanti rekombinantnog tau: humani tau (gore) ekspresioni plazmidi su transformisani u Escherichia coli (E. coli), proizvodni soj BL21(DE3). Bakterijske ćelije koje sadrže odgovarajući ekspresioni plazmid su gajene i indukovane kao što je opisano u "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" by Sambrook i Russell (2001). Jedna jedina kolonija BL21(DE3) bakterija, transformisanih pET-17b plazmidom koji je vodio ekspresiju tau proteina ili njegovog fragmenta, je gajena na 37°C u 500 ml Luria broth medijumu sa 100 µg/ml ampicilina na 300 rpm i indukovana dodatkom izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) do konačne koncentracije od 0,4 mM. Posle dodatne inkubacije od 3 sata na 37°C, bakterije su sakupljene centrifugiranjem na 3,000 x g 15 min na 4°C.

[0260] b) Prečišćavanja katjonoizmenjivačkom hromatografijom baznih i neutralnih tau proteina (izoforme tau cele dužine, tauΔ358-441, tauΔ306-400, tauΔ421-441, tauΔ300-312, tauΔ134-168, tauΔ1-220, tauΔ1-126, tauΔ(1-150; 392-441)/4R, tauΔ(1-150; 392-441)/3R i tauΔ(1-296;392-441)/4R) su urađena u suštini kao što je ranije opisano (Krajciova et al., 2008). Posle ekspresije, staložene bakterije su ponovo suspendovane u 10 ml pufera za lizu (50 mM 1,4-piperazindietansulfonska kiselina (PIPES) pH 6,9, 50 mM natrijum hlorid (NaCl), 1 mM etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), 5 mM ditiotreitol (DTT), 0,1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), 5% (v/v) glicerol), brzo zamrznuti u tečnom azotu i ostavljeni na -80°C do upotrebe za prečišćavanje tau proteina. Za prečišćavanje tau proteina, zamrznute suspenzije bakterija su brzo odmrznute i stavljene na led. Zidovi bakterijskih ćelija su razbijeni sonikacijom na ledu korišćenjem Sonopuls HD 2200, tip TT-13 (Bandelin, Nemačka) nameštenog na 50% radnog ciklusa, 50 W izlazne snage, 6 puta za 30 s sa pauzama od po 30 s. Lizati su izbistreni centrifugiranjem (21,000xg 15 min na 4°C) i supernatanti su profiltrirani kroz membranski filter od 0,45 µm. Prečišćavanje rekombinantnih tau proteina na velikoj skali je rađeno na 6°C pomoću radne stanice ÄKTA-FPLC (Amersham Biosciences, Sweden). Profiltrirani lizati su stavljeni na 5-ml HiTr ap SP HP kolonu (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) pri brzini protoka od 3 ml/min, uravnoteženi puferom za lizu i obilno oprani pomoću 60 ml pufera za lizu dok osnovna linija na 280 nm nije postala stabilna. Vezani tau proteini su eluirani gradijentom (0-30% unutar 15 ml) pufera B (pufer za lizu obogaćen sa 1 M NaCl). Pojedinačne frakcije od po 1 ml su sakupljene i analizirane elektroforezom na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE). Da bi se uklonile nukleinske kiseline, koje se prečišćavaju zajedno sa pozitivno naelektrisanim tau proteinima, frakcije koje sadrže tau protein su objedinjene i prečišćene drugim korakom katjonoizmenjivačke hromatografije, na 5-ml HiTrap SP HP koloni (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) sa manje strmim gradijentom pufera B (0-30% u 45 ml).

[0261] c) Prečišćavanje anjonoizmenjivačkom hromatografijom kiselih tau proteina (tauΔ222-427, tauΔ228-441, tauΔ257-400, tauΔ137-441, tauΔ283-441) je rađeno kao što je ranije opisano (Csokova et. al 2004). Posle ekspresije, staložene bakterije su ponovo suspendovane u 10 ml histidinskog pufera za lizu (20mM histidin, pH 6,0, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 0,1 mM PMSF i 5% (v/v) glicerol). Zidovi bakterijskih ćelija su razbijeni sonikacijom na ledu korišćenjem Sonopuls HD 2200, tip TT-13 (Bandelin, Nemačka), nameštenog na 50% radnog ciklusa, 50 W izlazne snage, 6 puta za 30 s sa pauzama od po 30 s. Lizati su izbistreni centrifugiranjem (21,000xg 15 min na 4°C). Bakterijski lizati su precipitirani pomoću 1% streptomicin sulfata (Medexport, Russia), inkubirani na ledu 5 min, izbistreni centrifugiranjem (21,000xg 15 min na 4°C), i profiltrirani kroz membranski filter od 0,45 µm. Profiltrirani lizati precipitirani streptomicinom su stavljeni su stavljeni na 5ml HiTrap QSepharose HP column (Amersham Biosciences, Sweden) pri brzini protoka od 3 ml/min i obilno oprani pomoću 30-50ml histidinskog pufera za lizu dok osnovna linija A280 nije postala stabilna. Tau proteini su eluirani gradijentom soli u dva koraka (0,05-0,5M NaCl u 40ml, a zatim 0,5-1M NaCl u 20 ml) u histidinskom puferu za lizu.

[0262] d) U konačnom gel-filtracionom koraku prečišćavanja (isti za sve tau proteine), objedinjene frakcije tau proteina, dobijene jonoizmenjivačkom hromatografijom, su injektirane na gel-filtracionu kolonu (HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade kolona, GE Healthcare) pri 3 ml/min u PIPES-u ili u histidinskom puferu za lizu za bazne/neutralne ili kisele tau proteine, respektivno, obogaćenom sa 100 mM NaCl. Eluirani tau proteini su objedinjeni.

[0263] e) Za koncentraciju tau proteina posle gel-filtracionog prečišćavanja, objedinjene frakcije su razblažene sa 1,5 zapreminom 2,5% glicerola i ponovo stavljene na HiTrap SP HP kolonu (bazni i neutralni tau proteini) ili na HiTrap Q HP kolonu (kiseli tau proteini). Koncentrisan rekombinantan tau protein je zatim eluiran sa kolone diskontinuiranim

4

gradijentom 1 M NaCl. Konačno, pufer je promenjen u fosfatno-puferisan slani rastvor (PBS, 8,09 mM dinatrijum fosfat (Na2HPO4), 1,47 mM kalijum dihidrogen fosfat (KH2PO4), 136,89 mM NaCl, 2,7 mM kalijum hlorid (KCl)) zasićen argonom, pomoću 5 ml HiTrap Desalting kolone (GE Healthcare). Kvantifikacija proteina u prečišćenim uzorcima je urađena korišćenjem kompleta za kvantifikaciju sa bicinhoninskom kiselinom (BCA) (Pierce, USA), sa albuminom iz goveđeg seruma (BSA) kao standardom. Tau proteini su alikvotirani u radne alikvote, brzo smrznuti u tečnom azotu i ostavljeni na -70°C.

[0264] f) Da bi se uklonili mogući bakterijski kontaminanti iz rekombinantnog tauΔ(1-150;392-441)/4R korišćenog za merenja preuzimanja (uptake) tau od mikroglija (Primer 10, Slika 17), rekombinantan tau protein je prečišćen modifikovanim metodom na sledeći način. Posle prvog koraka katjonoizmenjivačke hromatografije, frakcije koje sadrže tau su objedinjene i 1/20 zapremine ledenog 5% polietilenimina je dodata uz mešanje. Mešanje je nastavljeno još 30 min, na ledu. Uzorak je centrifugiran na 20,000xg 15 min na 4°C. Supernatant je sakupljen i injektiran na HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade kolonu (GE Healthcare) pri 3 ml/min u PIPES puferu za lizu obogaćenom sa 100 mM NaCl, ali bez DTT ili bilo kog drugog redukujućeg sredstva. Posle filtracije na gelu, frakcije sa tau proteinom su objedinjene i stavljene na imunoafinitetnu kolonu (pri brzini protoka od 0,5 ml/min) koja sadrži antitelo DC25 (epitop 347-353 od 2N4R tau, Axon Neuroscience, Beč, Austrija) imobilisan na CNBr-aktiviranoj sefarozi. Kolona je prethodno uravnotežena u 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 (TBS-Tween). Posle vezivanja, kolona je oprana sa 5 zapremina kolone TBS-Tween-a i vezani tau proteini su eluirani pomoću 0,1 M glicina, pH 2,7. Sakupljene frakcije su neutralisane dodavanjem 1/30 zapremine 1 M Tris-HCl pH 8,8 i objedinjene. Na kraju, pufer je zamenjen PBS-om (zasićenim argonom), korišćenjem HiTrap Desalting kolone, 5 ml (GE Healthcare). Kvantifikacija proteina u prečišćenim uzorcima je urađena korišćenjem kompleta za kvantifikaciju sa bicinhoninskom kiselinom (BCA) (Pierce, USA), sa BSA kao standardom. Protein je alikvotiran u radne alikvote, brzo smrznut u tečnom azotu i ostavljen na -70°C.

[0265] Prečišćeno antitelo DC25 (Axon Neuroscience, Beč, Austrija) korišćeno za DC25 afinitetnu kolonu (supra) je pripremljeno na sledeći način. Supernatant DC25 hibridomske kulture bez seruma je podešen na pH 7,5 dodatkom 0,2 zapremine PBS, prethodno izbistren centrifugiranjem na 20,000 x gza 10 minuta na 4 °C i supernatant je profiltriran kroz filter od 0,2 µm. Prethodno izbistren supernatant DC25 hibridomske kulture je nanet na PBS-uravnoteženu HiTrap Protein G HP kolonu (5 ml, GE Healthcare) pri 1 ml/min. Kad je nanošenje završeno, kolona je oprana sa 4 zapremine kolone PBS i vezano antitelo je eluirano pomoću 100 mM glicina pH 2,7. Eluirane frakcije su neutralisane pomoću 1 M Tris-HCl pH 9, objedinjene i pufer je zamenjen PBS-om korišćenjem HiTrap Desalting kolone (5 ml, GE Healthcare). Prečišćeno antitelo DC25 je ostavljeno u malim alikvotima na -70°C.

PRIMER 2: DOBIJANJE HIBRIDOMSKIH ĆELIJSKIH LINIJA KOJE PROIZVODE MONOKLONSKA ANTITELA NA HUMANI TAUΔ(1-150;392-441)/4R, SKRINING MONOKLONSKIH ANTITELA ELISA-om i INICIJALNA KARAKTERIZACIJA MONOKLONSKIH ANTITELA DC8E8

[0266] Šest nedelja stari Balb/c miševi su primovani subkutano sa 50 µg rekombinantnog tauΔ(1-150;392-441)/4R (dobijenog kao što je opisano u Primeru 1) u kompletnom Freundovom adjuvantu (SIGMA) i pojačan pet puta u intervalima od pet nedelja sa 50 µg istog antigena u nekompletnom Freund-ovom adjuvantu. Tri dana pre fuzije, miševima je intravenski injektirano 50 µg istog antigena u PBS. Ćelije slezine iz imunizovanih miševa su fuzionisane sa NS/0 ćelijama mijeloma prema metodu Kontsekove et al. (1988). Splenociti (10<8>) su pomešani sa 2x10<7>NS/0 ćelija mijeloma (odnos 5:1) i fuzionisane 1 minut u 1 ml 50% polietilen glikola (PEG) 1550 (Serva) u Dulbecco modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) bez seruma obogaćenom sa 10% dimetil sulfoksida. Fuzionisane ćelije su ponovo suspendovane u DMEM koji sadrži 20% konjskog seruma, L-glutamin (2 mM), hipoksantin (0,1 mM), aminopterin (0,04 mM), timidin (0,016 mM) i gentamicin (40 U/ml), u gustini od 2,5 x10<5>ćelija slezine po ležištu na ploči od 96 ležišta. Ćelije su inkubirane 10 dana na 37°C i rastući hibridomi su pretraživani za proizvodnju anti-tauΔ(1-150;392-441)/4R-specifičnih monoklonskih antitela enzimskim imunosorbentnim esejem (ELISA).

[0267] ELISA je korišćena za detekciju monoklonskih antitela u supernatantima kulture hibridoma usmerenih protiv tauΔ(1-150;392-441)/4R (duplo poremećene forme tau). Mikrotitarske ploče su prevlačene preko noći sa tauΔ(1-150;392-441)/4R (5 µg/ml, 50 µl/ležište) na 37°C u PBS. Posle blokiranja 1% nemasnim suvim mlekom da bi se smanjilo nespecifično vezivanje, ploče su oprane pomoću PBS-0,05% Tween 20 i inkubirane sa 50 µl/ležište supernatanta kulture hibridoma 1 sat na 37°C. Vezana monoklonska antitela su detektovana ovčjim anti-mišjim imunoglobulinom (Ig) konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP, DAKO). Reakcija je razvijena pomoću rastvora ortofenilendiamina kao supstrata za peroksidazu i zaustavljena pomoću 50 µl 2 M H2SO4. Apsorbanca na 492 nm je merena korišćenjem Multiscan MCC/340 ELISA čitača (Labsystems). Čitanja sa vrednošću apsorbance bar dvaput većom od vrednosti negativnih kontrola (PBS) su smatrana pozitivnim. Pozitivne kulture hibridoma su dalje testirane imunohistohemijski (prema metodu od Zilka et al., 2003) i subklonirane u mekom agaru prema proceduri opisanoj u Kontsekova et al. (1991).

[0268] Monoklonsko antitelo DC8E8 (proizvedeno u mišjoj hibridomskoj ćelijskoj liniji deponovano u American Type Culture Collection 13. jula, 2011., sa ATCC depozitnom oznakom PTA-11994) je identifikovano među ovako proizvedenim pozitivnim hibridomskim kulturama i selektovano. DC8E8 je dalje okarakterisano kao što je opisano niže. Izotip antitela je određen kao mišji IgG1 pomoću ELISA korišćenjem kompleta za mišju Ig izotipizaciju (ISO-2, SIGMA).

PRIMER 3: SEKVENCIRANJE VARIJABILNIH REGIONA DC8E8 i NJIHOVA HUMANIZACIJA KALEMLJENJEM CDR

[0269] a) Određivanje nukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca DC8E8 (Slika 3). Nukleotidna sekvenca varijabilnih regiona DC8E8 (Slika 3A i 3D) je određena DNK sekvenciranjem cDNK sintetisane korišćenjem ukupne RNK ekstrahovane iz mišje ćelijske linije hibridoma PTA-11994 (ATCC), koja eksprimira monoklonsko antitelo DC8E8. Cela RNK je ekstrahovana korišćenjem TRIZOL® Reagent-a (Invitrogen, USA). Sinteza cDNK prvog lanca je izvršena korišćenjem kompleta "High capacity cDNA reverse transcription" prema protokolu proizvođača (Applied Biosystems, USA). Sastav reagenasa za master miks za 2x reverznu transkripciju je bio sledeći (količine na 20 µL reakcije): 2 µL 10x RT pufera; 0,8 µL 25x dNTP Mix (100 mM); 2 µl 10x RT nasumičnih prajmera (50 µM); 1 µL MultiScribe™ reverzne transkriptaze (50 U/µL); 4,2 µL H2O bez nukleaze. Za reverznu transkripciju, 10 µL master miksa za 2x reverznu transkripciju je pomešano sa uzorkom RNK (2 µg/10 µL) i cDNK je sintetisana pod sledećim uslovima: 10 min na 25°C, 120 min na 37°C, 5 min na 85°C i konačno hlađenje do 4°C. Amplifikacija gena koji kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca je urađena lančanom reakcijom polimeraze (PCR) korišćenjem Phusion® High-Fidelity DNK polimeraze (Finnzymes, Finland). Prajmeri za kodirajući lanac (8E8L-sens 5'-ACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCC-3' (SEQ ID NO: 132) i 8E8H-sens 5'-CTCCTCCAATTGCAGCAGTCTGG-3'(SEQ ID NO: 133)) su dizajnirani prema proteinskoj sekvenci sa N-krajeva lakog (DIVMSQSPSS) (SEQ ID NO: 134) i teškog (QVQLQQSGPE) (SEQ ID NO: 135) lanca DC8E8. N-terminalne proteinske sekvence su određene pomoću Edmanove degradacije (lak lanac) i MALDI in-source raspada (težak lanac). Korišćenjem ove informacije, najsličniji proteini sa lakim i teškim lancem su identifikovani u Genebank, zajedno sa njihovim odgovarajućim nukleotidnim sekvencama. Najverovatnija nukleotidna sekvenca mišjih V-gena (lak i težak) je zatim identifikovana u bazi podataka IMGT/LIGM-DB (www.imgt.org). Ovi geni su upotrebljeni za dizajn prajmera (napravljene su korekcije korišćenjem N-terminalne proteinske sekvence DC8E8). Reverzni prajmeri za lak i težak lanac (Kapa-antisens 5'-GGAATTCGTTGAAGCTCTTGACAATGGGTG-3' (SEQ ID NO: 136) i G1-antisens 5'-GGAATTCACATATGCAAGGCTTACAACCAC-3 (SEQ ID NO: 137)) su izvedeni iz kapa i konstantnih regiona IgG1 lanaca, respektivno.

[0270] Proizvodi PCR su sekvencirani i dobijene sekvence DNK varijabilnih regiona lakog i teškog lanca DC8E8 su prikazane na Slikama 3A i 3D, respektivno. Poravnanje DC8E8 sa najbližim mišjim embrionskim lakim lancem IGKV8-21*01 i teškim lancem IGHV1-81*01 je prikazano na Slikama 3C i 3F, respektivno. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) su podvučeni u proteinskim sekvencama lakog i teškog lanca DC8E8 (Slike 3B i 3E, respektivno). CDR-ovi i okvirni regioni (FR) su identifikovani prema sistemu za numeraciju imunoGeneTics (IMGT) (videti, npr., Lefranc M.P. The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The Immunologist 7, 132-136, 1999 (1999)).

[0271] b) Humanizacija DC8E8. Da bi se identifikovao humani imunoglobulin koji je pogodan kandidat za proizvodnju humanizovanog DC8E8 putem kalemljenja mišjih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) DC8E8, humani embrionski gen sa najvećom sekvencnom identičnošću sa DC8E8 je određen pomoću ClustalX2 poravnanja po parovima nukleotidne sekvence DC8E8 u odnosu na odabrani skup humanih imunoglobulinskih gena ekstrahovanih iz IMGT/LIGM-DB flat file release 201112-6 (www.imgt.org). IgKv4-1*01 je identifikovan kao najbliži humani embrionski gen za lak lanac DC8E8 (Slika 4) i IgHV1-69*10 je identifikovan kao najbliži embrionski gen za težak lanac DC8E8 (Slika 5). Sledeći pristup (Metod 1 i Metod 2) je dizajniran i može se koristiti za dobijanje jedne ili više humanizovanih verzija antitela DC8E8. Posle ekspresije u odgovarajućem sistemu za ekspresiju antitela (npr., sisarski ekspresioni vektori korišćeni za ekspresiju antitela in vitro (npr., HEK293 ćelije) ili in vivo (transgene životinje)), dobijena humanizovana, rekombinantna antitela, mogu biti testirana na aktivnost (npr., biohemijsko i terapijsko dejstvo) prema bilo kom od metoda korišćenih za karakterizaciju aktivnosti DC8E8.

[0272] Metod 1: Kalemljenje CDR i mutacije u okvirnom regionu (FR), ako je neophodno (CDR-ovi su u boldu, podvučeni, FR mutacije su u boldu):

[0273] Metod 2: Mišji (Slika 3) i humani (Slike 4 i 5) embrionski imunoglobulini sa najvećom sekvencnom identičnošću sa DC8E8 su nađeni i poravnati sa proteinskom sekvencom DC8E8. CDR regioni su identifikovani sledeći IMGT sistem numeracije. Najverovatniji ostaci za kontaktiranje antigena unutar mesta kombinovanja DC8E8 su identifikovani na osnovu rada MacCallum-a et al, J. Mol. Biol.1996.

[0274] Različiti aminokiselinski kandidati za mutaciju u humanizovanoj verziji DC8E8 su identifikovani na osnovu sledećih kombinovanih kriterijuma:

i. njihovo prisustvo u CDR i verovatnoća kontakta sa antigenom

ii. njihovo prisustvo u Vernier-ovoj zoni

iii. da li ili ne su bili mutirani u mišjem embrionu

[0275] Dva nivoa kandidata za mutacije su identifikovana prema gornjim kriterijumima:

ostaci X- tipa (bold):

- ostaci koji nisu isti u DC8E8 i najbližoj mišjoj embrionskoj liniji, neslične aminokiseline

- ostaci u CDR i kontaktirajućem antigenu. CDR-ovi su malim slovima bold u italiku u sekvenci DC8E8 niže.

ostaci Y- tipa (bold, podvučeno):

[0276]

- ostaci identični u DC8E8 i najbližoj mišjoj embrionskoj liniji, ali različiti u najbližem humanoj embrionskoj liniji i locirani u Vernier-ovoj zoni (neslične aminokiseline)

- ostaci koji nisu isti u DC8E8 i najbližoj mišjoj embrionskoj liniji (slične/konzervisane aminokiseline)

[0277] Dve humanizovane sekvence za svaki lanac su identifikovane sa mutacijama predviđenim da utiču na aktivnost DC8E8:

SEQ ID No.147, 152: samo ostaci X tipa će biti mutirani

SEQ ID No.148, 153: ostaci i X i Y tipa će biti mutirani

PRIMER 4: MAPIRANJE EPITOPA DC8E8 POMOĆU DELECIONIH MUTANATA REKOMBINANTNOG TAU i PEPTIDE IZVEDENE IZ TAU

[0278] Delecioni mutanti humanog tau proteina 2N4R, kao i peptidi izvedeni iz tau (Antagene, Inc. (Sunnyvale, CA) i EZBiolab, (USA)) su korišćeni za mapiranje epitopa DC8E8 pomoću ELISA (Slike 6, 7, i 8). Rekombinantne humane izoforme tau (2N4R; 2N3R) i delecioni mutanti tau (Slike 6A, 6B) su dobijenni kao što je opisano u Primeru 1. Peptidi (Slika 7A, 7B) su sintetisani pomoću EZBiolabs (USA) sa čistoćom većom od 85%.

[0279] Mikrotitarske ploče su prevlačene preko noći na 37°C bilo rekombinantnim tau proteinima, bilo tau peptidima (5 µg/ml u PBS, 50 µl/ležište). Posle blokiranja 1% nemasnim suvim mlekom da bi se smanjilo nespecifično vezivanje, ploče su oprane pomoću PBS-0,05% Tween 20 i inkubirane sa 50 µl/ležište supernatanta kulture hibridoma DC8E8, 1 sat na 37°C. Vezano monoklonsko antitelo je detektovano ovčjim anti-mišjim imunoglobulinom (Ig) konjugovanim sa peroksidazom rena (DAKO). Reakcija je razvijena pomoću rastvora ortofenilendiamina kao supstrata za peroksidazu i zaustavljena pomoću 50 µl 2 M H2SO4. Apsorbanca na 492 nm je merena korišćenjem Multiscan MCC/340 ELISA čitača (Labsystems). Čitanja sa vrednošću apsorbance bar dvaput većom od vrednosti negativnih kontrola (PBS) su smatrana pozitivnim.

[0280] DC8E8 je prepoznalo sledeće humane tau proteine: Δ358-441, Δ421-441, Δ134-168, Δ1-220, Δ1-126, Δ(1-296;392-441)/4R i Δ(1-150;392-441)/4R, ali nije uspelo da prepozna tau proteine sa delecijama Δ222-427, Δ306-400, Δ228-441, Δ300-312, Δ257-400, Δ137-441 i Δ283-441 (Slike 6B, 6C). DC8E8 je prepoznalo izoforme fiziološkog tau 2N4R i 2N3R u manjoj meri nego što je prepoznalo patološki/duplo poremećen tauΔ(1-296;392-441)/4R, tauΔ(1-150;392-441)/4R i delecione mutante tau (Δ358-441, Δ421-441, Δ134-168, Δ1-220, Δ1-126) tau 2N4R (Slika 6C). Detaljnije mapiranje epitopa, korišćenjem tau peptida, je otkrilo da DC8E8 nije prepoznalo tau peptide 240-270, 270-300 i 301-330 (Slika 7A, 7B, 7C). Zajedno, ovi nalazi sugerišu da DC8E8 ima četiri mesta vezivanja ili epitopa na humanom tau, od kojih je svako locirano u regionu ponovljenog domena za vezivanje mikrotubula tau proteina i od kojih je svaki epitop odvojeno lociran unutar jedne od sledećih sekvenci tau: 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (1. ponovljeni domen tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (2. ponovljeni domen tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (3. ponovljeni domen tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (4. ponovljeni domen tau proteina) (Slika 7D). Štaviše, zato što se DC8E8 vezuje za skraćene forme tau bolje nego za celu dužinu tau sa 3 ponovka i tau sa 4 ponovka, ovi rezultati takođe sugerišu da se DC8E8 vezuje bolje za bolesne forme tau nego za fiziološki tau (tau39 (2N3R) i tau40 (2N4R)). Takođe, zato što se smatra da tau menja konformaciju iz fiziološkog tau (intrinsično poremećen) u bolestan tau (duplo poremećen i pogrešno uređen, Kovacech et al., 2010), ovi rezultati sugerišu da jedno ili više mesta vezivanja za DC8E8 (DC8E8 epitopi) ima različitu konformaciju u fiziološkom tau od one u bolesnom tau, i da je DC8E8 sposobno da detektuje tu konformacijsku promenu.

[0281] Zato što su ovi ponovljeni domeni tau konzervisani u vrstama (Slika 8A), DC8E8 će verovatno reagovati sa tau proteinima iz tako različitih vrsta kao što su pacov, miš, krava, šimpanza, žaba i drugi. Poravnanje tau proteina različitih životinjskih vrsta je urađeno pomoću softvera ClustalW2 (dostupan, na primer, na www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Humani tau je predstavljen najdužom izoformom tau koja je eksprimirana u neuronima humanog mozga (2N4R, 441 aminokiselina). Tau proteini drugih vrsta su odabrani iz javnih

2

baza podataka. Sekvence unutar kojih je lociran svaki od četiri epitopa koje prepoznaje antitelo DC8E8 su uokvirene boksom.

[0282] Dodatne tačkaste mutacije i delecije su urađene na određenim peptidima (8-meri, 9-meri i 10-meri) da bi se dalje definisali epitopi DC8E8, što je procenjeno sposobnošću svakog peptida da uđe u kompeticiju sa tauΔ(1-150:392-441/4R) za vezivanje DC8E8. Peptidi su sintetisani pomoću EZBiolabs (USA) sa čistoćom većom od 85%. Kompeticiona ELISA je vršena prema sledećem standardnom protokolu. ELISA ploče (IWAKI jako vezujuća ploča, #3801-096, Bertoni GmbH, Austrija) su oblagane preko noći na 4°C sa 100 µl/ležište rekombinantim prečišćenim tauΔ(1-150;392-441/4R) u PBS koncentracije 5 µg/ml. IWAKI jako vezujuće ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20 (0,05% v/v) i blokirane PBS/Tweenom 202 h na 25°C. Svaki od peptida je zasebno rastvoren u PBS u konačnoj koncentraciji od 5 mM. Serijska razblaženja (dvostruka) peptida u PBS/Tween 20 su dobijena u polipropilenskim pločama sa ležištima kupastog dna (Greiner, #651201) (opseg koncentracija 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM i 2,5 µM). Dodato je po 100 µl svakog razblaženja po ležištu. Prečišćeno monoklonsko antitelo DC8E8 (prečišćavanje je urađeno kao što je opisano niže, u Primeru 5) je razblaženo do koncentracije od 2 µg/ml u PBS/Tween 20 i po 100 µl ovog razblaženog antitela je pomešano sa svakim serijskim razblaženjem peptida, što je dalo smese od po 200 µl sa po 100 ng antitela/100µl, od kojih svaka sadrži odgovarajući testirani peptid u koncentraciji od 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM i 1,25 µM. Smese antitelo/peptid su inkubirane 1 sat na 25°C na rotirajućoj platformi, nameštenoj na 250 rpm. Po sto mikrolitara (100 µl) smese antitelo/peptid je prebačeno sa polipropilenske ploče u IWAKI jako vezujuće ploče obložene sa tauΔ(1-150;392-441/4R) i blokirane PBS/Tween 20-om i inkubirane 1 sat na 25°C na rotirajućoj platformi, nameštenoj na 250 rpm. Ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20. Uzorci (u pločama) su inkubirani 1 sat na 25°C na rotirajućoj platformi (nameštenoj na 250 rpm) sa 100 µl poliklonskih kozjih anti-mišjih imunoglobulina/ HRP (Dako, #P0447) razblaženih 1:4000 u PBS/Tween 20. Ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om. Uzorci/ploče su zatim inkubirane sa 100 µl 1,5 mg/2ml rastvora o-PDA (o-fenilenediamin, SIGMA, P1526) u 0,1 M Na-acetatu, pH 6,0 (Roth, #6779) obogaćenom sa 1,5 µl/2ml 30% H2O2(SIGMA, H-0904) 10 minuta na 25°C, u mraku. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 2 M H2SO4(Merck, 1.00731.1000). Stepen reakcije je praćen čitanjem apsorbance uzoraka/ploča na 490 nm (npr. pomoću Victor Multilabel Counter (Wallac).

[0283] Slika 8B prikazuje rezultate kompeticione ELISA izvedene sa sledećih šest peptida: NIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 200), NIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 201), IKHVPGGGS (SEQ ID NO: 202), KHVPGGGSV (SEQ ID NO: 203), HVPGGGSVQ (SEQ ID NO: 204) i VPGGGSVQ (SEQ ID NO: 205). Peptidi KHVPGGGSV (SEQ ID NO: 203) i HVPGGGSVQ (SEQ ID NO: 204), koji obuhvataju tau terapijski epitop #2, su bili u kompeticiji sa bar jednim od originalnih terapijskih epitopa prisutnih na tauΔ(1-150;392-441/4R). Uklanjanje podvučenog histidina sa epitop SEQ ID NO: 204 dovela je do gubitka kompetitivnosti (videti peptid VPGGGSVQ, SEQ ID NO: 205). Tačkasta mutacija koja menja histidin u alanin (na odgovarajućoj tau poziciji 299, u "epitopu #2") dovela je do gubitka kompetitivnosti (peptid NIKAVPGGGS, SEQ ID NO: 200). Peptidi koji sadrže 2 ili 3 aminokiseline pre "histidina 299" (prema N terminusu) takođe su u kompeticiji sa originalnim epitopom (peptidi IKHVPGGGS (SEQ ID NO: 202) i NIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 201), respektivno). Ovi rezultati sugerišu da je minimalan epitop DC8E8, koji upada u drugi ponovak tau (epitop #2), unutar 6-merne sekvence, naime HVPGGG (SEQ ID NO: 154).

[0284] Prethodno pominjani eksperimenti sa mapiranjem sugerišu prisustvo aminokiselinske sekvence PGGG unutar jednog ili više epitopa antitela DC8E8. Pored toga, ova aminokiselinska sekvenca je prisutna u sva četiri epitopa na tau proteinu koja vezuje DC8E8 (videti SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101). Da bi se odredili ostaci u N-terminalnom regionu DC8E8 epitopa, eksperimenti sa skeniranjem alanina su urađeni na tau peptidu 295-DNIKHVPGGGS-305, koji sadrži DC8E8 epitop (unutar 298-KHVPGGG-304, SEQ ID NO: 99) koji upada unutar 2. ponovljenog domena tau.

[0285] Kapacitet vezivanja mutantnih peptida za DC8E8 je procenjen sposobnošću svakog peptida da uđu u kompeticiju sa tauΔ(1-150;392-441/4R) za vezivanje DC8E8. Sedam peptida je sintetisano pomoću EZBiolabs (USA) sa čistoćom većom od 85%: ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNKKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 159), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161) i peptid sa originalnom sekvencom DNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 171). Kompeticiona ELISA je izvedena prema sledećem standardnom protokolu. ELISA ploče (IWAKI jako vezujuća ploča, #3801-096, Bertoni GmbH, Austrija) su oblagane preko noći na 4°C sa 100 µl/ležište 5 µg/ml rekombinantnog prečišćenog tauΔ(1-150;392-441/4R) u PBS. IWAKI jako vezujuće ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20 (0,05% v/v) i blokirane PBS/Tween-om 202 sata na 25°C. Svaki od peptida je zasebno rastvoren u PBS u konačnoj koncentraciji od 5 mM. Serijska razblaženja (dvostruka) peptida u PBS/Tween 20 su dobijena u polipropilenskim pločama sa ležištima kupastog dna (Greiner, #651201) (opseg koncentracija 320 µM, 160 µM, 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, i 2,5 µM). Dodato je po 100 µl svakog razblaženja po ležištu. Prečišćeno monoklonsko antitelo DC8E8 (prečišćavanje je urađeno kao što je opisano niže, u Primeru 5) je razblaženo do koncentracije od 2 µg/ml u PBS/Tween 20 i po 100 µl ovog razblaženog antitela je pomešano sa svakim serijskim razblaženjem peptida, što je dalo smese od po 200 µl sa po 100 ng antitela/100µl, od kojih svaka sadrži odgovarajući testirani peptid u koncentraciji od 160 µM, 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM i 1,25 µM. Smese antitelo/peptid su inkubirane 1 sat na 25°C na rotirajućoj platformi, nameštenoj na 250 rpm. Po sto mikrolitara (100 µl) smese antitelo/peptid je prebačeno sa polipropilenske ploče u IWAKI jako vezujuće ploče obložene sa tauΔ(1-150;392-441/4R) i blokirane PBS/Tween 20-om i inkubirane 1 sat na 25°C na rotirajućoj platformi, nameštenoj na 250 rpm. Ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20. Uzorci (u pločama) su inkubirani 1 sat na 25°C na rotirajućoj platformi (nameštenoj na 250 rpm) sa 100 µl poliklonskih kozjih anti-mišjih imunoglobulina/ HRP (Dako, #P0447) razblaženih 1:4000 u PBS/Tween 20. Ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om. Uzorci/ploče su zatim inkubirane sa 100 µl 1,5 mg/2ml rastvora o-PDA (o-fenilenediamin, SIGMA, P1526) u 0,1 M Na-acetatu, pH 6,0 (Roth, #6779) obogaćenom sa 1,5 µl/2ml 30% H2O2(SIGMA, H-0904) 10 minuta na 25°C, u mraku. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 2 M H2SO4(Merck, 1.00731.1000). Stepen reakcije je praćen čitanjem apsorbance uzoraka/ploča na 490 nm (npr. pomoću Victor Multilabel Counter (Wallac).

[0286] Slika 8C prikazuje rezultate competition ELISA izvedene sa sledećih sedam peptida: ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNKKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKAVPGGGS (SEQ ID NO: 159), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161) i DNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 171). Tačkasta mutacija koja menja histidin u alanin (na odgovarajućoj tau poziciji 299, u "epitopu #2") dovela je do potpunog gubitka kompetitivnosti sa tauΔ(1-150;392-441/4R) za vezivanje za DC8E8 (peptid DNIKAVPGGGS, SEQ ID NO: 159). Mutacije koje su promenile aminokiseline D, N, I, K i V u alanin nisu ukinule

4

kompetitivnost odgovarajućih mutantnih peptida (peptidi ANIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 144), DAIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 146), DNAKHVPGGGS (SEQ ID NO: 149), DNIAHVPGGGS (SEQ ID NO: 151), DNIKHAPGGGS (SEQ ID NO: 161). Ovi rezultati sugerišu da je minimalan epitop DC8E8, koji upada u drugi tau ponovak (epitop #2), unutar 6-merne sekvence, naime HVPGGG (SEQ ID NO: 154) i da se DC8E8 vezuje za HXPGGG (SEQ ID NO: 164).

PRIMER 5: DC8E8 PREPOZNAJE DUPLO POREMEĆENE TAUΔ(1-150;151-391)/4R, ŠTO JE PROCENJENO POVRŠINSKOM PLAZMONSKOM REZONANCOM

[0287] Površinska plazmonska rezonanca (SPR) se može koristiti za detekciju vezivanja proteina i za određivanje termodinamičkih parametara proteinskih kompleksa (npr., kompleksa antitelo-antigen) direktnim praćenjem dešavanja vezivanja u realnom vremenu. Ova tehnologija se rutinski koristi za karakterizaciju i dijagnostičkih i terapijskih antitela (Videti, npr., Karlsson i Larsson, Affinity Measurement Using Surface Plasmon Resonance, in Methods in Molecular Biology, Vol. 248: Antibody Engineering: Methods and Protocols. Edited by: B. K. C. Lo © Humana Press Inc., Totowa, NJ, (2008)).

[0288] Za SPR eksperimente, monoklonska antitelo (mAb) DC8E8 je prečišćeno iz hibridomskog supernatanta bez seruma na Protein G afinitetnoj koloni, kao što sledi. Hibridomski supernatant je podešen na pH 7,5, rastvor je prethodno izbistren centrifugiranjem, profiltriran kroz membranski filter od 0,45 µm i stavljen na Protein G Sepharose kolonu od 5 ml. DC8E8 mAb je eluirano sa kolone pomoću 0,1 M glicin-HCl, pH 2,7. Eluirane frakcije su odmah neutralisane sa 1M Tris-HCl pH 9,0. Objedinjene frakcije su dijalizovane prema PBS, koncentrisane ultrafiltracijom i ostavljene na -70 °C. Koncentracija antitela je određena merenjem apsorbance na 280 nm, korišćenjem formule c(mg/ml) = A280nm/1,43.

[0289] Instrument BIACORE3000 sa senzorskim čipom CM5 (Biacore AB, Uppsala) je korišćen za SPR testove. Reagensi za kuplovanje amina (EDC, NHS, etanolamin pH 8,5), deterdžent P20 i 10 mM natrijum acetat na pH 5,0 su dobijeni od Biacore AB. Ovi eksperimenti su urađeni na 25°C u PBS na pH 7,4 sa 0,005% P20 (PBS-P) kao radnim puferom. Tipično, 5,000 RU (responsivnih jedinica) poliklonskog anti-mišjeg antitela (No. Z 0420; DakoCytomation, Glostrup, Danska) je kuplovano na pH 5,0 preko primarnih amina simultano u dve protočne ćelije, od kojih je jedna služila kao referentno merenje.

[0290] U svakom ciklusu analize, prečišćen DC8E8 je uhvaćen u analitičku protočnu ćeliju da bi dostigao nivo imobilizacije od 230-250 RU. Za određivanja KA, kao i za određivanje konstanti kinetičkih brzina (kONi KOFF), dvostruka serijska razblaženja bilo tau proteina (u odnosu na koji je testiran afinitet DC8E8), bilo PBS-P kao kontrole, su injektirana pri brzini protoka od 50 µl/min preko senzorskog čipa. Podaci o kinetičkom vezivanju su duplo referencirani prema Myszka, 1999 i fitovani pomoću BIA softvera za evaluaciju 4.1 (Biacore AB) na dvofazni reakcioni model. Konstante kinetičkih brzina su globalno procenjene, maksimalni odgovori su fitovani lokalno i glavnina odgovora je nameštena na nulu.

[0291] Da bi se kvantifikovao afinitet DC8E8 za svaki od testiranih tau proteina, ravnotežne konstante vezivanja (KA) su određivane za vezivanje DC8E8 za izoforme tau proteina sa četiri ponovka 2N4R, izoforme tau proteina sa tri ponovka 2N3R, kao i za duplo poremećen tauΔ(1-150;392-441)/4R i duplo poremećen tauΔ(1-150;392-441)/3R. Svi tau proteini korišćeni za SPR su dobijeni prema Primeru 1. Afinitet DC8E8 je bio najveći za tau sa četiri ponovka tauΔ(1-150;392-441)/4R, zatim za tau izoformu pune dužine sa četiri ponovka 2N4R, zatim za tau sa tri ponovka tauΔ(1-150;392-441)/3R i na kraju za tau izoformu pune dužine sa tri ponovka 2N3R (Slika 9A, B). Ovi rezultati su potvrdili: (1) specifičnost DC8E8 za duplo poremećenu formu tau i (2) selektivnost DC8E8 za duplo poremećen tau (tj., bolest ili patološki tau) u odnosu na tau cele dužine (tj., normalan ili fiziološki tau).

[0292] Praćenje događaja vezivanja u realnom vremenu korišćenjem SPR je omogućilo merenje kinetičkih brzina asocijacije (kON) i disocijacije (kOFF) između DC8E8 i nekoliko tau proteina. Kinetika vezivanja DC8E8 je otkrila izmenjenu konformaciju za duplo poremećen tauΔ(1-150;392-441)/4R i tauΔ(1-150;392-441)/3R, u poređenju sa fiziološkim 2N4R tau, što je indikovano lakše dostupnim DC8E8 epitopima u duplo poremećenim tau proteinima. Ovo se odražava u bržem vezivanju i većim kON za duplo poremećene tau proteine u poređenju sa odgovarajućim tau cele dužine. Štaviše, prisustvo jednog više mesta vezivanja za DC8E8 na vrsti tau proteina sa četiri ponovka je dovelo do 10 puta sporije disocijacije 4R tau vrste iz kompleksa sa DC8E8 i odgovarajuće 10 puta niže kOFF (Slika 10A, B; isprekidane linije su interpolisane iz merenih podataka računanjem kinetičkih parametara pomoću kompjuterskog programa BIAEvaluation v4.1).

PRIMER 6: DC8E8 PREPOZNAJE SVE RAZVOJNE STADIJUME NEUROFIBRILARNE DEGENERACIJE U HUMANOM MOZGU SA ALCHAJMEROVOM BOLEŠĆU

[0293] Humano moždano tkivo (na parafinskim blokovima) je dobijeno iz Holandske banke mozga. Blokovi su isečeni na mikrotomu. Parafinski preseci (8 µm) hipokampalno entorinog korteksa iz mozga sa Alchajmerovom bolešću (Braak-ov stadijum VI) i nedementih kontrola (Braak-ov stadijum I i III) su tretirani hladnom (+4°C) 99% mravljom kiselinom 1 min na sobnoj temperaturi (25°C). Preseci tkiva su inkubirani u rastvoru za blokiranje (5% BSA, 0,3 % Triton X-100 in 50 nM Tris-HCl), a zatim preko noći sa prečišćenim primarnim antitelom DC8E8 (7,8 mg/ml; dobijeno kao što je opisano u Primeru 5), koje je razblaženo 1:2000 u rastvoru za blokiranje. Zatim su preseci inkubirani sa biotinilovanim sekundarnim antitelom (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) na sobnoj temperaturi jedan sat, a zatim reagovali sa kompleksom avidin-biotin peroksidaza 60 minuta (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories), oba na sobnoj temperaturi (25°C). Imunoreakcija je vizualizovana pomoću kompleta sa supstratom peroksidaze (Vector VIP, Vector laboratories, Ca, USA) i kontrastno obojena metil zelenim (Vector Laboratories). Preseci su ispitani pod mikroskopom Olympus BX71.

[0294] Monoklonsko antitelo DC8E8 je pravilo razliku između predkliničkog AD, klinički početnog AD i potpuno razvijenog konačnog stadijuma AD. Imunohistohemijska studija je pokazala da DC8E8 je detektovala rane stadijume (tau monomeri, dimeri) patološkog tau u humanom predkliničkom AD – Braak-ov stadijum I. (Slika 11A). Mozak sadrži samo ograničen broj neurofibrilarne klubadi (NFT) u entorinalnom korteksu i nimalo NFT u hipokampusu (Braak-ov stadijum I). U klinički početnom AD mozgu, gde je nađeno samo nekoliko NFT u hipokampusu (Braak-ov stadijum III), mAb DC8E8 je prepoznao i stadijum patoloških tau oligomera (strelice) i stadijum patoloških tau polimera (klubad) (Slika11B). U mozgu sa potpuno razvijenom Alchajmerovom bolešću, gde je prisutna obimna neurofibrilarna degeneracija, DC8E8 prepoznaje uglavnom patološke tau polimere u vidu neurofibrilarne klubadi, neuritskih plakova i neuritskih niti (Slika11C). Prema tome, mAb DC8E8 prepoznaje sve razvojne stadijume neurofibrilarnih lezija u humanom moždanom tkivu sa Alchajmerovom bolešću, uključujući monomeran, dimeran, rano oligomeran stadijum (Slika 11D1) i kasno oligomeran pred-klubad stadijum (Slika11D2), kao i kasne razvojne stadijume patoloških tau polimera - unutarćelijsku (Slika11D3) i vanćelijsku neurofibrilarnu klubad (Slika11D4). Ova reaktivnost mAb DC8E8 je, prema tome, korisna i za dijagnostičke i za terapijske primene ovog antitela.

PRIMER 7: DC8E8 PREPOZNAJE SVE RAZVOJNE STADIJUME NEUROFIBRILARNE DEGENERACIJE U MOZGU TRANSGENIH PACOVA SHR72, ŠTO SE VIDI U HUMANOJ ALCHAJMEROVOJ BOLESTI

[0295] SHR24 transgena pacovska linija: ova linija eksprimira tauΔ(1-150;392-441)/3R, protein opisan u međunarodnoj patentnoj prijavi PCT WO 2004/007547. Pravljenje i karakterizacija ove transgene linije je opisano u Filipcik et al., 2010. Ovi transgeni pacovi ratvijaju progresivnu neurofibrilarnu degeneraciju zavisnu od starosti u oblastima kortikalnog mozga. Neurofibrilarna klubad (NFT) zadovoljava nekoliko ključnih histoloških kriterijuma koji se koriste za identifikovanje neurofibrilarne degeneracije u humanoj Alchajmerovoj bolesti, uključujući argirofiliju, Kongo crveno dvostruko prelamanje i reaktivnost na tioflavin S. Neurofibrilarna klubad je takođe identifikovana antitelima korišćenim za detekciju patoloških tau u humanom mozgu, uključujući DC11, koje prepoznaje tau konformaciju u bolesti (Vechterova et al. 2003; Kovacech et al. 2010) i antitelima koja su specifična za hiperfosforilisane forme tau proteina. Štaviše, neurofibrilarna degeneracija je okarakterisana ekstenzivnim formiranjem kompleksa tau proteina nerastvorljivog u sarkozilu koji se sastoje od pacovskih endogenih i transgenih skraćenih tau vrsta (Filipcik et al., 2010). Najistaknutija histopatološka karakteristika ovih transgenih pacova je obimna neurofibrilarna patologija – neurofibrilarna klubad u korteksu. Medijana vremena preživljavanja transgenih pacova je 222,5 dana (SD = 43,56), a najduži period preživljavanja dostiže 475 dana (Filipcik et al., 2010).

[0296] The SHR72 transgena pacovska linija: Ovi transgeni pacovi eksprimiraju humani skraćeni tauΔ(1-150;392-441)/4R prema Međunarodnoj patentnoj prijavi PCT WO 2004/007547) u nekoliko regiona mozga i kičmenoj moždini. Generisanje ove pacovske linije je opisano u Zilka et al., 2006, a tau patologija je opisana u Koson et al., 2008. Najistaknutija histopatološka karakteristika ovih transgenih pacova je obimna neurofibrilarna patologija, npr., neurofibrilarna klubad. Pojava NFT zadovoljava nekoliko histoloških kriterijuma koji se koriste za identifikovanje neurofibrilarne degeneracije u humanom AD, uključujući argirofiliju, Kongo crveno dvostruko prelamanje i reaktivnost na tioflavin S. NFT su takođe identifikovani antitelima korišćenim za detekciju patoloških tau u humanom mozgu, uključujući DC11, koje prepoznaje abnormalnu tau konformaciju (videti US Patent No.

7,446,180) i antitelima koja su specifična za hiperfosforilisane forme tau proteina. Štaviše, neurofibrilarna degeneracija je okarakterisana ekstenzivnim formiranjem kompleksa tau proteina nerastvorljivog u sarkozilu koji se sastoje od pacovskih endogenih i transgenih skraćenih tau vrsta. U heterozigotnoj liniji ovog modela, najobimnija neurofibrilarna patologija je viđena u moždanom stablu i kičmenoj moždini (Zilka et al., 2006). Transgeni nivoi ekspresije, opterećenje NFT i trajanje života pacova su prethodno određeni. Medijana vremena preživljavanja transgenih pacova (linija SHR72) je 222,5 dana (SD=24,48) (Koson et al., 2008).

[0297] Transgene pacovske linije SHR24 (eksprimiraju tauΔ(1-150;392-441)/3R) i SHR72 (eksprimiraju tauΔ(1-150;392-441)/4R) razvijaju obimnu neurofibrilarnu degeneraciju u mozgu i kičmenoj moždini. Transgena pacovska linija SHR24 prikazuje tešku neurodegeneraciju u izokorteksu, moždanom stablu i kičmenoj moždini, dok SHR72 transgeni pacovi razvijaju NFT uglavnom u moždanom stablu i kičmenoj moždini, ali ne u korteksu. Napredovanje senzorimotorniih i neuroloških oštećenja je slično među ovim transgenim linijama; međutim, SHR72 transgeni pacovi imaju kraći život.

[0298] U transgenim pacovskim studijama prikazanim u ovoj prijavi, korišćeni su hemizigotni transgeni pacovi (SHR24 i SHR72). Svi pacovi su čuvani u standardnim laboratorijskim uslovima sa slobodnim pristupom vodi i hrani i čuvani su u diurnalnim uslovima osvetljenja (ciklusi sveto/tama od 12 sati, gde svetlost počinje u 7:00). Učinjeni su napori da se minimizuje broj korišćenih pacova i da se ograniči njihova nelagodnost, bol i patnja.

[0299] Imunohistohemija pacovskog moždanog tkiva sa DC8E8: transgenim pacovima (7 meseci starim) je transkardijalno urađena perfuzija PBS-om 1 min u dubokoj anesteziji, a zatim perfuzija sa 100 ml 4% paraformaldehida (pH 7,4). Posle perfuzije, glava im je odsečena i mozak brzo uklonjen. Mozak je sagitalno isečen na dve hemisfere iste veličine pomoću skalpel nožića za jednokratnu upotrebu. Moždana tkiva su zatim fiksirana u 4% paraformaldehidu, uronjena u parafin i isečena na preseke na mikrotomu. Imunohistohemija i histopatologija su urađeni na presecima tkiva od 8 µm uronjenim u parafin. Preseci tkiva su prethodno tretirani 20 min rastvorom koji demaskira antigen (Vector laboratories, CA, USA) i 1 min hladnom (+4°C) 90% mravljom kiselinom (Applichem, Germany), na sobnoj temperaturi (25°C). Posle blokiranja, preseci su inkubirani preko noći prečišćenim monoklonskim antitelom DC8E8 (7,8 mg/ml) koje je bilo razblaženo 1:2000 rastvorom za blokiranje (5% goveđi serum albumin, 0,3 % Triton X 100 u 50 nM Tris-HCl). Posle pranja, preseci su inkubirani sa biotinilovanim sekundarnim antitelom (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) na sobnoj temperaturi jedan sat, a zatim su reagovali sa kompleksom avidin-biotin peroksidaza 60 minuta (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories), oba na sobnoj temperaturi (25°C). Imunoreakcija je vizualizovana pomoću kompleta sa supstratom peroksidaze (Vector VIP, Vector laboratories, Ca, USA) i preseci su kontrastno obojeni metil zelenim (Vector Laboratories). Preseci su ispitani pod mikroskopom Olympus BX71.

[0300] U transgenom pacovskom mozgu (SHR72), mAb DC8E8 prepoznaje stadijum bolesti oligomera patološkog tau (strelice) i stadijum bolesti polimera patološkog tau (klubad) (Slika 12A). Štaviše, DC8E8 je reagovao sa pogrešno savijenim tau koji je lociran u aksonskim vlaknima. U pacovskim mozgovima kontrola sparenih po starosti, antitelo nije bojilo neuronske some ni aksonske procese (Slika 12B).

[0301] Kao u humanom mozgu sa Alchajmerovom bolešću (videti supra), mAb DC8E8 prepoznaje sve razvojne stadijume neurofibrilarnih lezija u mozgu SHR72 transgenih pacova, uključujući monomerni, dimerni i rano-oligomerni stadijum bolesti (Slika 12C) i kasnooligomerni pred-klubad stadijum tau (Slika 12D), kao i kasne razvojne stadijume patoloških tau polimera - unutarćelijska (Slika 12E) i vanćelijska neurofibrilarna klubad (Slika 12F).

[0302] DC8E8 takođe prepoznaje neurofibrilarnu klubad u mozgu transgenih pacova koji eksprimiraju tauΔ(1-150;392-441)/3R) (SHR24, Slika 13A; SHR72, Slika 13B).

PRIMER 8: DC8E8 PREPOZNAJE I RASTVORLJIV DUPLO POREMEĆEN TAU I NERASTVORLJIV TAU U HUMANOJ ALCHAJMEROVOJ BOLESTI I U MOZGOVIMA TAU TRANSGENIH PACOVA

[0303] Kompleksi rastvorljivog tau i nerastvorljivog tau su izolovani ili iz humanih AD mozgova ili iz pacovskih mozgova transgenih za bolestan tau (SHR24 i SHR72 linije opisane u Primeru 7), korišćenjem sarkozilnog metoda (Greenberg i Davies, 1990). Za ekstrakciju proteina, zamrznuta humana AD moždana tkiva (alokorteks, uzorci Braak-ovog stadijuma V i VI dobijeni iz Holandske banke mozga) i tkiva iz transgenih SHR24 pacova (izokorteks, 10, 12 i 14 meseci starih) i iz transgenih SHR72 pacova (moždano stablo, 7,5 meseci starih) su homogenizovana u 10 zapremina hladnog ekstrakcionog pufera (10 mM Tris pH 7,4, 0,8 M NaCl, 1 mM EGTA i 10% saharoza). Homogenati su centrifugirani 20 min na 20,000xg i 50 µl supernatanta je korišćeno za analizu rastvorljivog tau.

[0304] Da bi se dobio tau nerastvorljiv u sarkozilu, preostali supernatanti su obogaćeni N-lauroilsarkozinom (SIGMA) do konačne koncentracije od 1% i inkubirani 1 h na sobnoj temperaturi, uz mućkanje. Posle 1h centrifugiranja na 100,000xg, dobijeni supernatanti su odbačeni, a talozi sadrže frakciju sa tau nerastvorljivim u sarkozilu.

[0305] Frakcije rastvorljivog tau i tau nerastvorljivog u sarkozilu su analizirane imunoblotingom. Frakcije rastvorljivog tau su razblažene jednakom zapreminom 2x SDS-pufera za nanošenje uzorka (sa β-merkaptoetanolom) (Laemmli, 1970) i naneto je 15 µg proteina po ležištu. Za frakcije tau nerastvorljivog u sarkozilu, peleti su rastvoreni u 1x SDS-puferu za nanošenje uzorka, u 1/50 zapremine rastvorljive frakcije korišćene za dobijanje frakcije nerastvorljivog tau. Zatim, jednake zapremine frakcija rastvorljivog tau i tau nerastvorljivog u sarkozilu su korišćene za imunoblot analizu, koje odgovaraju 15 µg ukupnog proteina u rastvorljivoj frakciji (videti Filipcik et al. 2010). Uzorci su grejani na 95°C 5 min, stavljeni na poliakrilamidne gelove sa 5-20% gradijentom SDS i elektroforezirani u Tris-glicin-SDS puferskom sistemu 40 minuta na 25 mA. Proteini su prebačeni na poliviniliden fluoridnu (PVDF) membranu (1 h na 150 mA u 10 mM CAPS, pH 12). Posle prenosa, membrane su blokirane u 5% nemasnom suvom mleku u fosfatom puferisanom slanom rastvoru (PBS; 136,89 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,09 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4) 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirane 1 h sa supernatantom kulture DC8E8 hibridoma, razblaženim 1:1 TBST-mlekom (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 5% nemasno suvo mleko), a onda tri puta oprane velikim zapreminama PBS. Membrane su inkubirane (1 h na sobnoj temperaturi) sa HRP-konjugovanim kozjim antimišjim Ig (DAKO, Danska), razblaženim 1:4000 PBS-om, kao sekundarnim antitelom. Posle ove inkubacije je sledilo pranje (tri outa) 0,2% Igepal-om CA-630 (SIGMA) u PBS. Blotovi su razvijeni sa supstratom SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A) i proteinski signali su detektovani pomoću LAS3000 imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan). Intenziteti hemiluminiscentnog signala su kvantifikovani pomoću softvera AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Germany).

[0306] DC8E8 prepoznaje i rastvorljiv humani tauΔ(1-150;392-441)/3R i fiziološke pacovske tau izoforme u SHR24 transgenim pacovima (Slika 14A). Štaviše, DC8E8 prepoznaje tauΔ(1-150;392-441)/3R i patološke pacovske tau proteine u frakcijama sa tau nerastvorljivim u sarkozilu iz SHR24 pacovskih mozgova (Slika 14B). Važno je da DC8E8 jako prepoznaje patološke humane tau proteine u frakciji sa tau nerastvorljivim u sarkozilu u humanim mozgovima sa AD (Braak-ov stadijum V i VI, Slika 14B i 14C). DC8E8 prepozne i rastvorljiv human tauΔ(1-150;392-441)/4R i (fiziološki) pacovski tau izoforme cele dužine u SHR72 transgenim pacovima (Slika 14D). Značajno, DC8E8 specifično prepoznaje patološki tauΔ(1-150;392-441)/4R i patološke forme pacovskog tau u frakcijama sa tau nerastvorljivim u sarkozilu iz SHR72 pacovskih mozgova (Slika 14D).

PRIMER 9: DC8E8 INHIBIRA INTERAKCIJE PATOLOŠKOG TAU

[0307] Test tau fibrilizacije. Test in vitro tau fibrilizacije je korišćen za određivanje da li DC8E8 ima inhibitoran efekat na interakcije patološkog tau. Test se zasniva na intrinsičnoj osobini tau proteina, naime, na njihovoj sposobnosti da podlegnu konformacijskoj promeni po interakciji sa polianjonima, kao što je sulfatisan glikozaminoglikan heparin. Ova izmenjena konformacija jednog tau molekula dalje vodi do njegovih patoloških interakcija sa drugim tau molekulom, stabilizacije tau-tau kompleksa kroz formiranje unakrsnih struktura β ravni u regionima vezivanja mikrotubula interagujućih tau molekula, i, na kraju, formiranja sparenih spiralizovanih filamenata kao u Alchajmerovoj bolesti (PHF) (Skrabana et al., 2006). Formiranje struktura bogatih beta ravnima se može detektovati fluorescentnim bojama, kao tioflavin T.

[0308] Test za merenje efekta DC8E8 na interakcije patološkog tau je postavljen u PBS (profiltriran kroz 0,2 µm filter) koji sadrži: 20 µM (konačna koncentracija) bilo kog od testiranih rekombinantnih tau proteina (tauΔ(1-150; 392-441)/4R ili tauΔ(1-296;392-441)/4R), prečišćenih kao što je opisano u Primeru 1; 5 µM heparin (natrijumova so heparina iz svinjske crevne mukoze, ≥150 IU/mg, suva baza, od SIGMA) i 12,5 µM (konačna koncentracija) tioflavin T. Svaka reakcija (80 µl konačna zapremina) je inkubirana 20 h na 37°C u zapečaćenoj crnoj čvrstoj polistirenskoj ploči (384 ležišta, Greiner BioOne). Fluorescencija tioflavina T je merena pomoću čitača fluorescencije (Fluoroskan Ascent FL (Labsystems)), sa talasnom dužinom ekscitacije od 450 nm, emisijom na 510 nm i vremenom merenja od 200 ms. Za određivanje inhibitornog dejstva mAb DC8E8 na interakcije patološkog tau, prečišćen DC8E8 (Primer 5) je dodat u reakcionu smesu konačne koncentracije 20 µM, pred inkubaciju na 37°C. Dva antitela su korišćena kao kontrole: DC51 (koje prepoznaje protein omotača virusa besnila; Macikova et al., 1992) i DC11 (koje prepoznaje određene skraćene konformacijski izmenjene forme tau, US Patent No.

7,446,180).

[0309] Količina konformacijski izmenjenog i fibrilizovanog tau je merena preko fluorescencije tioflavina T u odsustvu ("Ctrl") i u prisustvu ("DC8E8") DC8E8 (Slike 15A i 15B). mAb DC8E8, dodat u konačnoj koncentraciji 20 µM, je sprečio patološke konformacijske promene i fibrilizaciju i duplo poremećenih tau proteina, smanjujući količinu fibrilizovanih patoloških formi tau do manje od 5% i 16% za tauΔ(1-150;392-441)/4R i tauΔ(1-296;392-441)/4R, respektivno. Ovo inhibitorno dejstvo DC8E8 je statistički značajno kad se analizira neparametrijskim t-testom ("DC8E8", p<0,001 i p p<0,01 na Slikama 15A i 15B, respektivno). Irelevantno antitelo, Rab50 (Macikova et al., 1992), koje se ne vezuje za tau, nije sprečilo konformacijske promene tau, što je dovelo do neizmenjene fluorescencije tioflavina T ("Rab50"). Antitelo DC11, koje prepoznaje određene patološki izmenjene konformacije tau (Vechterova et al., 2003 i US Patent No. 7,446,180), je dalje podstaklo formiranje fibrilizovanog tau; ovaj efekat može da odražava stabilizaciju patološke konformacije tau potrebnu za abnormalne tau-tau interakcije i formiranje fibrila pomoću DC11.

[0310] DC8E8 je takođe inhibiralo formiranje tau dimera, trimera i oligomera duplo poremećenog tauΔ(1-296;392-441/4R) (Slika 16). Rekombinantan tau Δ(1-296;392-441)/4R je inkubiran 1, 4 i 20 h bilo u prisustvu, bilo u odsustvu DC8E8, kao što je opisano gore za test fibrilizacije. U naznačenim vremenskim tačkama, reakcija je zaustavljena dodavanjem SDS-pufera za nanošenje uzorka. Za analizu proteina, 10 µl svake reakcije fibrilizacije je stavljeno na poliakrilamidne gelove sa 5-20% gradijentom SDS i elektroforezirano u Trisglicin-SDS puferskom sistemu 40 minuta na 25 mA. Posle prenosa proteina na PVDF membrane (1 h na 150 mA u 10 mM CAPS, pH 12), membrane su blokirane u 5% nemasnom suvom mleku u PBS 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirane 1 h sa DC25 konjugovanim sa HRP (Skrabana et al. (2006) razblažen 1:1000 u PBS, a onda tri puta oprane velikim zapreminama PBS. Blotovi su razvijeni sa supstratom SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A) i hemiluminiscentni signali su detektovani pomoću LAS3000 imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan). Intenziteti hemiluminiscentnog signala su kvantifikovani pomoću softvera AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Germany).

[0311] Ovi rezultati otkrivaju da je jedno ili više od četiri mesta vezivanja koja DC8E8 prepoznaje/vezuje u humanom tau uključeno u konformacijske promene monomera tau, fibrilizacije tau i u formiranju agregata tau (dimeri, trimeri i ostali oligomeri). Drugim rečima, jedan ili više od četiri regiona tau obuhvaćenih ostacima 267-KHQPGGG-273 (SEQ ID NO: 98) (1. ponovljeni domen tau proteina), 298-KHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 99) (2. ponovljeni domen tau proteina), 329-HHKPGGG-335 (SEQ ID NO: 100) (3. ponovljeni domen tau proteina) i 361-THVPGGG-367 (SEQ ID NO: 101) (4<.>ponovljeni domen tau proteina) podstiče i/ili je uključen u fibrilizaciju tau i formiranje agregata tau (dimeri, trimeri i ostali oligomeri).

PRIMER 10: DC8E8 POSREDUJE U PREUZIMANJU I DEGRADACIJI DUPLO POREMEĆEN TAU

[0312] Mišje BV2 mikroglijalne ćelije su tretirane u pločama sa 6 ležišta različite vremenske periode ili samim 1 µM rekombinantnim tauΔ(1-150;392-441)/4R, ili smesom/kompleksom tauΔ(1-150;392-441)/4R i DC8E8. Medijum je sakupljen i ćelije su oprane prvo PBS-om, a zatim 1 min blago kiselim rastvorom za pranje (0,5 M NaCl, 0,.2 M sirćetna kiselina, pH 3). Oprane ćelije su zatim lizirane u TTL puferu (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Triton X-100, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, Roche – inhibitor proteaze kompletan) i brzo zamrznute u tečnom azotu. Dobijeni ćelijski ekstrakti su analizirani na 12% SDS-PAGE gelu i Western blotom kao što je ranije opisano (Koson et al., 2008). Ukratko, proteini su prebačeni na nitrocelulozne membrane (Millipore, Billerica, MA, USA) i obojeni pomoću Ponceau S da bi se potvrdio uniforman prenos proteina, a zatim su membrane ispitane pomoću supernatanta kulture DC25 hibridoma koji prepoznaje tau ostatke 347-353, i naziva se pan-tau antitelo (Axon Neuroscience, Beč, Austrija). Western bloting sa antitelom na GADPH (1:1000, Abcam) je korišćen kao kontrola nanošenja proteina. Iza inkubacije sa primarnim antitelom DC25 su sledila pranja i inkubacija sa poliklonskim kozjim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom, koje je konjugovano sa HRP (1:3000; Dako, Glostrup, Danska). Blotovi su razvijeni sa supstratom SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A) i hemiluminiscentni signali su detektovani pomoću LAS3000 imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan).

[0313] TauΔ(1-150;392-441)/4R je dodat kulturi mišjih BV2 ćelija u koncentraciji od 1 µM ili sam ili sa 1 µM mAb DC8E8, kao što je opisano u prethodnom paragrafu. Posle inkubacije od 2, 4, 6 i 12 sata, ćelijski proteini su ekstrahovani i nivoi internalizovanog tau su analizirani pomoću Western blota. Pan-tau antitelo DC25 je pokazalo prisustvo duplo poremećenog tau u mikroglijalnim ćelijama. Western blot profil je otkrio da je degradacija duplo poremećenog tau bila brža u prisustvu DC8E8 (Slika 17A).

1

[0314] Samo DC8E8 antitelo je takođe nađeno u BV2 ćelijama. Slika 17A. Štaviše, DC8E8 je smanjio količinu rastvorljivog duplo poremećenog tau u medijumu za ćelije, što može da odražava aktivaciju vanćelijske proteolitičke mašinerije (Slika 17B).

PRIMER 11: DC8E8 JE STABILAN NA 37°C

[0315] DC8E8 (prečišćen kao što je opisano u Primeru 5) je razblažen do koncentracije od 2 mg/ml u PBS i alikvoti (100 µl) su inkubirani na 37°C. U različitim 1-mesečnim intervalima, alikvoti su zamrznuti na -20°C. Alikvot DC8E8 (2mg/ml), čuvan na -20°C tokom trajanja celog eksperimenta, je korišćen kao "kontrola". Posle 4 meseca (kad su svi uzorci sakupljeni), analiza aktivnosti DC8E8 (vezivanje za rekombinantan tauΔ(1-150;392-441)/4R kao čvrstu fazu), a time i rok trajanja i stabilnost na 37°C, je urađena ELISA-om, kao što je opisano u Primeru 2. Svaki alikvot DC8E8 je razblažen 2000 puta (tj., 2000 x ili 1:2000), 4000 x, 8000 x,16000 x, 32000 x, 64000 x,128000 x, 256000 x i 512000 x. DC8E8 je bio aktivan (što je mereno njegovom sposobnošću da veže tauΔ(1-150;392-441)/4R) i, prema tome, stabilan čak i posle 4 meseca inkubacije na 37°C, u poređenju sa "kontrolom" (Slika 18).

PRIMER 12: DC8E8 JE SPOSOBAN ZA VEZIVANJE i IMUNOPRECIPITIRANJE I RASTVORLJIVOG i NERASTVORLJIVOG TAU IZ HUMANOG MOZGA SA AD I IZ MOZGA SHR72 PACOVA, U NATIVNIM USLOVIMA SLIČNIM EX VIVO

[0316] Pogrešno savijeni tau proteini nerastvorljivi u sarkozilu su biohemijski izolovani ili iz humanih mozgova sa AD ili iz tau transgenih pacovskih mozgova (linija SHR72, opisana u Primeru 7) korišćenjem sarkozilnog metoda (Greenberg i Davies, 1990). Za ekstrakciju proteina, nefiksiran zamrznut humani mozak sa AD (transentorinalni korteks, Braak-ov stadijum V, dobijen iz Holandske banke mozga) i tkiva iz transgenih SHR24 pacova (izokorteks, 7,5 meseci starih životinja) su homogenizovana u 10 zapremina ledenog ekstrakcionog pufera [10 mM Tris pH 7,4, 0,8 M NaCl, 1 mM EGTA, i 10% saharoza (obogaćenog sa 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4i koktelom od inhibitora proteaze Complete® bez EDTA (od Roche-a)]. Homogenati su centrifugirani 20 min na 20,000xg da bi se uklonio membranski materijal. Da bi se dobile frakcije tau nerastvorljivog u sarkozilu, supernatanti su obogaćeni N-lauroilsarkozinom (SIGMA) do konačne koncentracije od 1% i inkubirani 1 h na sobnoj temperaturi, uz mućkanje. Posle 1h centrifugiranja na 100,000xg, dobijeni supernatanti su odbačeni i peleti su oprani jednom u 3 ml fosfatom puferisanog slanog rastvora (PBS, 8,09 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, 136,89 mM NaCl, 2,7 mM (KCl)). Peleti, koji predstavljaju frakciju moždanih proteina obogaćenu oligomernim i polimernim pogrešno savijenim tau vrstama (tj. bolest tau proteina), su ponovo suspendovani u 1 ml PBS (obogaćenog sa 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4i koktelom od inhibitora proteaze Complete® bez EDTA (Roche)) sonikacijom 2 minuta na ledu pomoću Bandelin Sonopuls HD2200/UW2200 opremljenom MS72 probom, na 20% radnog ciklusa sa izlazom podešenim na 20% (Bandelin Electronic, Nemačka).

[0317] Dobijene suspenzije (i iz humanog mozga sa AD i iz mozga pacovskog AD modela), obogaćene bolesnim tau proteinima, su podeljene na dve porcije od po 500 µl i svaka porcija je dobila po 25 µg jednog od dva prečišćena antitela: ili DC8E8 ili kontrolno antitelo Rab50 (koje prepoznaje protein omotača virusa besnila; Macikova et al., 1992). Suspenzije su inkubirane sa antitelima sa vertikalnom rotacijom od 2 sata na 6°C. Da bi se izolovali formirani kompleksi antitelo-bolestan tau, dodato je po 50 µl 50% suspenzije kuglica Protein G Mag Sepharose (GE Healthcare) uravnotežene u PBS, u svaku reakciju suspenzije, koje su dalje inkubirane 1 sat na 6°C. Kuglice sa vezanim kompleksima antitelo-tau su pokupljene i

2

oprane tri puta PBS-om (obogaćenim sa 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0,02% IGEPAL CA-630 (SIGMA) i koktelom od inhibitora proteaze Complete® bez EDTA (Roche)). Vezani kompleksi antitela su eluirani sa kuglica pomoću tri odvojene 5-minutne inkubacije u 100 µl 200 mM mravlje kiseline na pH 2,7. Eluati od po 100 µl su objedinjeni, liofilizovani, proteini su rastvoreni u SDS puferu za nanošenje uzorka (Laemmli, 1970), razdvojeni na 12% SDS-PAGE gelovima, prebačeni na nitrocelulozne membrane i tau proteini su detektovani inkubacijom sa pan-tau antitelom DC25 (epitop 347-353 sa 2N4R tau, Axon Neuroscience, Beč, Austrija), konjugovani sa HRP kao gore (Kementec, Danska). Posle inkubacije (1 h na sobnoj temperaturi) je usledilo pranje (tri puta) 0,2% Igepal-om CA-630 (SIGMA) u PBS. Blotovi su razvijeni pomoću SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate sistema (Pierce, U.S.A) i signali su detektovani pomoću LAS3000 imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan).

[0318] DC8E8 prepoznaje, cilja i vezuje sve forme bolesnih tau proteina: oligomerne i polimerne pogrešno savijene tau vrste prisutne u mozgu pacijenta sa Alchajmerovom bolešću (Slika 19A). Staza 1 na Slici 19A prikazuje biohemijski ekstrahovane patološke vrste tau iz humanog mozga sa AD. Staza 3 prikazuje tau vrste prepoznate, vezane i izolovane imunoprecipitacijom sa DC8E8. Obrazac DC8E8-vezanih/imunoprecipitiranih bolesnih tau vrsta je isti kao biohemijski ekstrahovanih tau proteina. Ovi rezultati pokazuju efikasno ex vivo prepoznavanje od strane DC8E8 patoloških tau vrsta u humanom mozgu, tj., u ekstraktima gde su proteini u kao in vivo, nemodifikovanoj formi, pokazujući da DC8E8 ima korisne terapijske osobine, jer je u stanju da cilja bolesne vrste tau in vivo. Kontrolno antitelo Rab50 (staza 2) ne prepoznaje nijedan od tau proteina prisutan u ekstraktu mozga, potvrđujući da je vezivanje DC8E8 za tau proteine specifično.

[0319] Slika 19B pokazuje količinu kontrolnog antitela (Rab50) i DC8E8 (trake 2 i 3, respektivno) korišćenu za imunoprečišćavanje tau proteina. Pozicije teškog i lakog lanca DC8E8 su takođe označene na traci 3 na Slici 19A. Prisustvo veće količine lanaca antitela deformiše obrazac bolesnog tau.

[0320] DC8E8 takođe prepoznaje i cilja sve forme pogrešno savijenih (bolesnih) tau u mozgu SHR72 pacovskog modela Alchajmerove bolesti. Slika 20A, staza 1 pokazuje biohemijski ekstrahovane bolesne tau vrste iz mozga transgenih pacova. Inkubacija DC8E8 antitela sa ekstraktom mozga transgenog pacova je dozvolila imunoprečišćavanje bolesnih tau vrsta prisutnih u mozgu (Slika 20A, staza 3). prečišćene tau vrste pomoću DC8E8 su pokazale obrazac identičan onom biohemijski izolovanih tau proteina (Slika 20A, staza 1), što potvrđuje da DC8E8 prepoznaje i vezuje sve patološke tau vrste prisutne u transgenom pacovskom mozgu. Mala deformacija obrasca vezivanja tau proteina je izazvana prisustvom teškog i lakog lanca antitela DC8E8 (obeleženih na Slici 20A, staza 3). Kontrolno antitelo Rab50 (Slika 20A, staza 2) nije vezalo nijedan od tau proteina.

[0321] Slika 20B pokazuje količinu kontrolnog antitela (Rab50) i DC8E8 (staze 2 i 3, respektivno) korišćenu za imunoprečišćavanje tau proteina iz ekstrakta mozga pacova transgenog modela Alchajmerove bolesti. Pozicije teškog i lakog lanca DC8E8 su takođe označene na traci 3 na Slici 20A. Prisustvo veće količine lanaca antitela je blago deformisalo obrazac bolesnog tau.

PRIMER 13: DC8E8 MONOKLONSKO ANTITELO UKLANJA PATOLOŠKI TAU IZ MOZGA TRANSGENIH PACOVA SHR72

[0322] Hibridomske ćelije koje proizvode ili DC8E8 ili Rab50 (antitelo kao negativna kontrola, prepoznaje virus besnila) su gajene u DMEM koji sadrži 10% NHS i 1% glutamin. Ćelije su brojane u Bürker-oj komori za brojanje. Ćelijske suspenzije koje sadrže 500000 ćelija po mililitru su vrćene na 100xg za 5 min i peleti su ponovo suspendovani u 1ml PBS. Ćelijske suspenzije su vrćene opet na 100xg za 5 min i peleti su ponovo suspendovani u 5 µl PBS.

[0323] Transgeni pacovi SHR72 (6 meseci stari) su korišćeni za ove eksperimente (3 pacova po grupi). Bar jedan sat pre operacije, imunosupresivan lek - Sandimmun (15mg/kg) - je je primenjen na pacovima subkutano. Transgeni pacovi su anestezirani smesom Tiletamine-Zolazepam (100mg/ml)/ Xylazine (20mg/ml) u odnosu 3:5, injektiranom intraperitonealno. Doziranje anestetika je bilo sledeće: Zoletil (30 mg/kg) i Xylariem (10 mg/kg). Glave anesteziranih pacova su pričvršćene u stereotaksičkom aparatu (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) postavljanjem fiksirajučih kraka u ušne kanale svake životinje. Rupe su probušene na glavi svake životinje, korišćenjem hirurške bušilice, prema odabranim stereotaksičkim koordinatama (lateralno 5 mm; anteriorno-posteriorno 4 mm; dorsoventralno -5 mm, u odnosu na teme). Suspenzije hibridomskih ćelija, koje proizvode ili DC8E8 (10<5>ćelija) ili Rab50 (10<5>ćelija), su bilateralno injektirane u fimbrije hipokampusa pacovskih mozgova. Brzo posle operacije, Ketonal (5mg/kg) je administriran intramuskularno. Sandimmun (15mg/kg) je primenjen subkutano tokom 8 dana posle zahvata. Enroksil (20mg/kg/24h) je davan u pijaćoj vodi 10 dana.

[0324] Dve nedelje posle hirurške procedure, pacovi su anestezirani smesom Zoletila (30 mg/kg) i Xylariem-a (10 mg/kg). Posle 2-5 minuta, pacovi su podignuti na postolje za disekciju i njihova abdominalna šupljina je otvorena. Pre perfuzije, krv je sakupljena za analizu nivoa tau i antitela u krvnom serumu. Igla za perfuziju je stavljena u levu srčanu komoru i pacovi su perfuzionisani PBS-om 2 minuta uz pomoć peristaltičke pumpe (Tip pp1-05, Zalimp, brzina - 10x, stepen 7 - 22 ml/1 min perfuzione tečnosti). Svaki pacov je dekapitiran, lobanja mu je otvorena peanom i mozak je (sa delom kičmene moždine) pažljivo izvađen. Mozgovi su isečeni sagitalno na dva dela; desna strana je fiksirana u 4% PFA (4°C) preko noći. Leva strana je isečena i moždano stablo i dve kortikalne oblasti su brzo zamrznute u tečnom azotu.

[0325] Količina antitela DC8E8 u serumu tretiranih životinja je određivana pomoću ELISA, kao što je opisano niže u Primeru 19 korišćenjem tauΔ(1-150; 392-441)4R kao čvrste faze. Serum svake životinje (A, B, C) je serijski razblažen od 100 x do 12800 x (Slika 21A). Koncentracija DC8E8 antitela u serumu je određena pomoću prečišćenog DC8E8 kao standarda. DC8E8 dostiže koncentracije od 466, 200 i 273 ng/ml u tretiranim životinjama (A, B, C iz grupe tretirane DC8E8, respektivno).

[0326] Koncentracija tau u serumu svake tretirane životinje je takođe određena. To je urađeno pomoću kompleta Innotest hTAU ELISA kit (Innogenetics, Belgija), prema protokolu proizvođača. Tretman pomoću DC8E8 je izazvao transport kompleksa antitelo-tau u krv, gde je tau dostigao prosečnu koncentraciju od 350 pg/ml. Ovaj efekat DC8E8 pomaže da se patološki tau proteini eliminišu iz mozga. S druge strane, tau proteini nisu detektovani u serumima životinja tretiranih kontrolnim antitelom (Rab50), koje prepoznaje protein omotača virusa besnila (Macikova et al., 1992). Grafik prikazuje srednje vrednosti sa standardnim greškama srednjih vrednosti (SEM) (Slika 21B).

4

[0327] Fiksirana moždana tkiva su uronjena u parafin i isečena na mikrotomu. Imunohistohemija je urađena na presecima od 8 µm uronjenim u parafin. Preseci tkiva su prethodno tretirani 20 min ključalim rastvorom koji demaskira antigen (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) i 1 min 85% mravljom kiselinom (Applichem, Darmstadt, Germany). Posle blokiranja, preseci tkiva su inkubirani sa mAb DC8E8 preko noći, a zatim prani i inkubirani (1 sat, na sobnoj temperaturi) sa biotinilovanim sekundarnim antitelom (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) 60 minuta na sobnoj temperaturi. Imunoreakcija je vizualizovana pomoću kompleta sa supstratom peroksidaze (Vector VIP, Vector laboratories, Burlingame, CA, USA). Superioran maslinasti kompleks je korišćen za kvantifikaciju intraneuronskog signala DC8E8. Ukupan signal je kvantifikovan u pojedinačnim motornim neuronima, bar 15 neurona po preseku. Analiza slike je rađena pomoću softvera AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Germany). Brojanje je urađeno na presecima svih tretiranih životinja, a zatim je statistički procenjeno korišćenjem neparametrijskog Mann-Whitney testa.

[0328] Kvantifikacija (Slika 22B) količine patološkog tau u superiornom maslinastom kompleksu preseka iz životinja tretiranih Mock-om (Slika 22A, desni panel) i tretiranih DC8E8 (Slika 22A, levi panel) je pokazala smanjenje količine patološkog tau u testiranoj oblasti mozga u sve tri životinje tretirane DC8E8 u poređenju sa životinjama tretiranim Mockom (p<0,0001) (Slike 22A i 22B).

PRIMER 14: MAPIRANJE OSTATAKA UNUTAR MESTA KOMBINOVANJA DC8E8 KOJE UTIČE NA PREPOZNAVANJE TERAPIJSKIH EPITOPA TAU OD STRANE DC8E8

[0329]

a) Kloniranje jednog jedinog lanca DC8E8 antitela i mutageneza mesta kombinovanja antitela. Funkcionalna jednolančana verzija (scDC8E8v) DC8E8 mAb cele dužine je dobijena da bi pomogla u mapiranju aminokiselinskih ostataka mAb DC8E8 suštinskih za prepoznavanje tau proteina. To je urađeno korišćenjem cDNK lakih i teških lanaca DC8E8 dobijenih kao što je opisano u Primeru 3.

Varijabilni regioni DC8E8 su dalje umnoženi pomoću PCR korišćenjem prajmera za kloniranje koji nose restrikciona mesta za NcoI (čeoni prajmer: 5'-ATATTACCATGGACATTGTGATGTCACAG-3' (SEQ ID NO: 155)) i XhoI (reverzni prajmer: 5'-ATATTATTCTCGAGGGAGACGGTGACTGAGGT-3' (SEQ ID NO: 156)) restrikcioni enzimis i oligonukleotidne linker sekvence (VH-LINK-F: 5'-GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCCATGCAGGTCCAATTGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 157); VL-LINK-R: 5'-GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCCGTTTG ATGTCCAGCTTGGTGCC-3' (SEQ ID NO: 158)), koji su korišćeni za spajanje varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (linker sekvenca je dizajnirana prema Krebber et al.1997). Posle digestije izolovanih PCR produkata (pomoću Ncol i Xhol enzima) i prečišćavanja elektroforezom na agaroznom gelu, fragmenti su klonirani u pET22b plazmid digestiran pomoću NcoI i Xhol, uz upotrebu T4-DNA-Ligase (Fermentas, Germany). Bakterijski soj DH5α je korišćen za umnožavanje dobijenog plazmida i tačna pozicija insercije u odabranim klonovima je proverena analizom restrikcionim enzimima. Tačnost sekvence dobijenog jednolančanog konstrukta DC8E8 (scDC8E8v) je proverena sekvenciranjem DNK pomoću 3130 Genetic Analyzer-a (Applied Biosystems, USA).

b) Identifikacija, mutagenezom alaninskim skeniranjem, ostataka u mestu kombinovanja DC8E8 koje utiče na prepoznavanje patološkog tau od strane DC8E8. Za identifikaciju ostataka koji utiču na vezivanje DC8E8 za tau, mutageneza Ala skeniranjem je urađena na odabranim mestima (bold i podvučeni, videti niže) scDC8E8v. Aminokiseline odabrane za Ala supstituciju su identifikovane na osnovu rada MacCallum-a et al (J. Mol. Biol.1996). Mutageneza scDC8E8v je urađena metodom produžavanja preklopljenih delova uz korišćenje mutantnih oligonukleotida u PCR standardnim procedurama opisanim u "Molecular Cloning: A Laboratory manual" by Sambrook i Russell (2001).

[0330] Mutantni pojedinačni lanci su izlistani niže, u odnosu na svaku originalnu sekvencu DC8E8. Mutirani ostaci su boldirani i podvučeni. Nazivi mutantnih pojedinačnih lanaca se sastoje od broja konstrukta, akronima za varijabilni težak ili lak lanac (VH ili VL), koda od jednog slova originalne aminokiseline u DC8E8, a zatim njene pozicije u sekvenci lakog i teškog lanca SEQ ID Nos.141 i No.138, respektivno, a zatim A za supstituišući alanin. Na primer, mutant 1-VL-N31A odgovara jednolančanom mutantu broj 1, gde je varijabilni lak lanac mutiran na poziciji 31 (u odnosu na DC8E8), zamenjvanjem asparagina 31 (N31) alaninom (A)):

[0331] Varijabilni region lakog lanca DC8E8 (CDR su podvučeni): [SEQ ID No.141]:

Mutacije u CDR1 [SEQ ID No. 117] (mutirani ostaci su u boldu i podvučeni): QSLL N S R TRKN Y (SEQ ID NO: 117) (originalna DC8E8 sekvenca CDR1)

1-VL-N31A [SEQ ID NO.247]

2-VL-R33A [SEQ ID NO.248]

3-VL-Y38A [SEQ ID NO.249]

Mutacija u okvirnom regionu FR2 koji prethodi CDR2: LAWYQQKPGQSPKLLI Y (SEQ ID NO: 160) (originalna DC8E8 sekvenca okvirnog regiona FR2)

4-VL-Y55A [SEQ ID NO.252]

Mutacija u CDR2 [SEQ ID No. 118]: W AS (SEQ ID NO: 118) (originalna DC8E8 sekvenca CDR2)

5-VL-W56A [SEQ ID NO.253]

Mutacije u CDR3 [SEQ ID No. 119]: KQSFYLR T (SEQ ID NO: 119) (originalna DC8E8 sekvenca CDR3)

6-VL-K95A [SEQ ID NO.254]

7-VL-Q96A [SEQ ID NO.255]

8-VL-S97A [SEQ ID NO.256]

9-VL-F98A [SEQ ID NO.257]

10-VL-Y99A [SEQ ID NO.258]

11-VL-L100A [SEQ ID NO.259]

12-VL-R101A[SEQ ID NO.260]

Varijabilni region teškog lanca DC8E8 (CDR su podvučeni): [SEQ ID No.138]:

Mutacije u CDR1 [SEQ ID No.120] (mutirani ostaci su u boldu i podvučeni):

GYIFTD YV IS (SEQ ID NO: 120) (originalna DC8E8 sekvenca CDR1)

14-VH-Y32A [SEQ ID NO.261]

15-VH-V33A [SEQ ID NO.262]

Mutacija u okvirnom regionu FR2 koji prethodi CDR2: WVKQRTGQGLEWIG E (SEQ ID NO: 162) (originalna DC8E8 sekvenca okvirnog regiona FR2)

16-VH-E50A [SEQ ID NO.263]

Mutacije u CDR2 [SEQ ID No. 121]: I F PRSG S T (SEQ ID NO: 121) (originalna DC8E8 sekvenca CDR2)

17-VH-F52A [SEQ ID NO.264]

18-VH-S57A [SEQ ID NO.265]

Mutacije u CDR3 [SEQ ID No. 122]: AR DYYG TSFAMDY (SEQ ID NO: 122) (originalna DC8E8 sekvenca CDR3)

19-VH-D99A [SEQ ID NO.266]

20-VH-Y100A [SEQ ID NO.267]

21-VH-Y101A [SEQ ID NO.268]

22-VH-G102A [SEQ ID NO.269]

[0332] Analitička i preparativna ekspresija varijanti rekombinantnog antitela DC8E8: pET22b-scDC8E8v DNK konstrukti prirodnog antitela i njegovi mutanti (svi su obeleženi sa His) su transformisani u E. coli ćelije iz proizvodnog soja BL21(DE3). Dobijeni klonovi su prvo provereni za proizvodnju rekombinantnog scDC8E8v. Pojedinačne kolonije dobijene posle transformacije su inokulisane sa po 2 ml LB medijuma obogaćenog sa 100 µg/ml ampicilina i gajene su na 37°C 5 sati uz konstantno mućkanje (Sambrook i Russell 2001). Alikvoti od po 100 µl iz svake kulture su uzeti, mešani sa 2/3 zapremine 100% glicerola i ostavljene zamrznute na -80°C za kasniju upotrebu. Ekspresija rekombinantnog proteina je indukovana dodatkom izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) u konačnu koncentraciju od 1 mM i inkubacija je nastavljena dodatna 3 sata. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem u stonoj centrifugi na 4°C 1 min na 10000xg, supernatant je odbačen, ćelijski pelet je ponovo suspendovan u 1x SDS puferu za uzorke (Laemmli 1970) i ključao je 5 minuta. Uzorci su centrifugirani 5 minuta na 10000xg i supernatanti (bakterijski lizati) analizirani elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE). Razdvojeni proteini su vizualizovani bojenjem Coomassie brilijantnim plavim R250 (SIGMA).

[0333] Za preparativnu ekspresiju svakog scDC8E8v antitela (nativnog i mutantnog), bakterijske ćelije koje sadrže odgovarajuće ekspresione plazmide su kultivisane i indukovane kao što je opisano u "Molecular Cloning: A Laboratory manual" by Sambrook i Russell (2001). Transformisane ćelije su gajene na 37°C u 100-500 ml LB medijuma sa 100 µg/ml ampicilina na 230 rpm. Kad je apsorbanca kulture na 600 nm dostigla 0,8-1,0, IPTG je dodat do konačne koncentracije od 1 mM da se indukuje ekspresija scDC8E8v. Posle dalje inkubacije na 37°C još 3 sata, ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 3000g 15 min na 4°C.

Staložene ćelije su ponovo suspendovane u 10 ml pufera za lizu (50 mM PIPES pH 6,9, 50 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) i sonikovane na ledu 6 puta po 30 s sa pauzama od 30 s korišćenjem vrha TT-13 (50% radnog ciklusa, 50 W izlazna snaga, Sonopuls HD 2200, Bandelin, Germany). Lizat je izbistren centrifugiranjem (21000xg 15 min na 4°C). Lizati su profiltrirani kroz membranski filter od 0,45 µm i čuvani na -80°C do upotrebe. Za ispitivanje uspešne indukcije i nivoa ekspresije, 1 ml indukovane kulture je sakupljen, ćelije sakupljene centrifugiranjem kao gore, ponovo suspendovane u 100 µl 1x SDS pufera za uzorak, ključale 5 minuta na 95°C, a zatim analizirane pomoću SDS-PAGE (Slika 23A). Citoplazmatski lizat je korišćen za vezivanje/detekciju tau proteina (western blot analizom) i za SPR određivanje afiniteta rekombinantih antitela prema tau, što su oba mere aktivnosti nativnih i mutantnih scDC8E8v antitela.

PRIMER 15: REKOMBINANTAN FRAGMENT scFV MONOKLONSKOG ANTITELA DC8E8 (scDC8E8v) PREPOZNAJE PATOLOŠKI TAU (TAUΔ(1-150;392-441)/4R)

[0334] Za određivanje osobina vezivanja scDC8E8v za patološke forme tau, proteinski lizat iz bakterija koje eksprimiraju scDC8E8v je razblažen 16 puta TBS-T puferom (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i korišćen je za prekrivanje nitrocelulozne membrane koja sadrži 500, 250 i 125 ng rekombinantnog skraćenog tau proteina (tauΔ(1-150;392-441)/4R) i rekombinantnog C-terminalno skraćenog tau proteina (tauΔ228-441) (bojenje proteina pomoću Ponceau S, Slika 23B). Vezani scDC8E8v je detektovan imunoblotingom pomoću anti-6xhisTag (SEQ ID NO: 163) antitela (No. A00174; GenScript, Piscataway, NJ, USA) i vizualizovan pomoću anti-zečjeg antitela konjugovanog sa HRP (DAKO Cytomation, Danska) (Slika 23C). Blotovi su razvijeni pomoću SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A) i detektovani pomoću LAS3000 imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan).

[0335] Western blot analiza je pokazala da rekombinantno jednolančano antitelo (scDC8E8v) detektuje skraćeni tau [tauΔ(1-150;392-441)/4R]. vezivanje je specifično, pošto scDC8E8v ne prepoznaje kontrolni skraćeni tau protein tauΔ228-441, koji ne sadrži nijedan od četiri terapijska epitopa koje prepoznaje intakctno DC8E8 (Slika 23C, staza 4). Testiranje nitrocelulozne membrane koja sadrži tau proteine (kao što je pokazano na Slici 23B) pomoću lizata iz kontrolnih bakterija koje ne eksprimiraju scDC8E8v nije proizvelo nikakav signal (Slika 23D).

PRIMER 16: REKOMBINANTAN FRAGMENT scFV MONOKLONSKOG ANTITELA DC8E8 (scDC8E8v) ISPOLJAVA OSOBINE VEZIVANJA TAU SLIČNE ONIMA ANTITELA DC8E8 - SELEKCTIVNO PREPOZNAJE PATOLOŠKI TAU (TAUΔ(1-150;392-441)/4R) I ZNAČAJNO GA DISKRIMINIŠE OD FIZIOLOŠKOG, NATIVNOG TAU (TAU2N4R).

[0336] Za kvantifikovanje osobina vezivanja tau rekombinantnog jednolančanog antitela scDC8E8v, urađena su određivanja kinetičkog afiniteta pomoću SPR (Biacore 3000, Biacore, Sweden) da bi se izmerilo vezivanje scDC8E8v za patološki skraćeni tau (tauΔ(1-150;392-441)/4R) (Slika 24A) i za normalnu humanu izoformu tau sa četiri ponovka 2N4R (Slika 24B). U tom cilju, 11000 RU zečjeg poliklonskog antitela na His marker (No. A00174; GenScript, Piscataway, NJ, USA) je imobilisano na senzornom čipu CM5. Svi eksperimenti su rađeni na 25 °C u PBS pH 7,4 sa 0,005% P20 (PBS-P) kao radnim puferom. Rekombinantni scDC8E8v obeležen sa His je uhvaćen u analitičku protočnu ćeliju da bi dostigao nivo imobilizacije od 60 RU i poznate koncentracije svakog tau proteina ili PBS-P kontrolnog uzorka, su injektirane pri brzini protoka od 100 µl/min preko senzorskog čipa. Podaci o kinetičkom vezivanju su duplo referencirani i fitovani pomoću BIA softvera za evaluaciju 4.1 (Biacore AB) na 1:1 model interakcije. Konstante kinetičkih brzina su globalno procenjene, maksimalni odgovori su fitovani lokalno i glavnina odgovora je nameštena na nulu.

[0337] Kinetička merenja su pokazala veće konstante brzine asocijacije i niže konstante brzine disocijacije scDC8E8v prema patološkom AD tauΔ(1-150;392-441)/4R nego prema normalnom tau 2N4R (Slika 24C). Sledstveno, afinitet scDC8E8v prema skraćenom AD tau je veći (veća vrednost ravnotežne konstante asocijacije KA) nego prema izoformi tau cele dužine 2N4R. Ova merenja su potvrdila da jednolančana verzija antitela DC8E8 (scDC8E8v) pokazuje preferencu vezivanja za konformacijski izmenjene, patološke tau proteine, kao što je roditeljsko antitelo DC8E8 cele dužine. Rekombinantan scDC8E8v je, prema tome, pogodan za identifikaciju aminokiselinskih ostataka unutar mesta kombinovanja antitela DC8E8 odgovornih za njegove osobine vezivanja.

PRIMER 17: IDENTIFIKACIJA OSTATAKA U MESTU KOMBINOVANJA scDC8E8v KOJI UTIČU NA PREPOZNAVANJE PATOLOŠKIH TAU EPITOPA OD STRANE sCDC8E8v/DC8E8'S

[0338] Nekoliko aminokiselinskih ostataka koji utiču na interakciju DC8E8-antigen je određeno mutagenezom skeniranjem alaninom ostataka na mestu kombinovanja scDC8E8v. Ostaci koji potencijalno kontaktiraju antigen u lakim i teškim lancima su identifikovani na osnovu rada MacCallum-a et al (J. Mol. Biol. 1996) i mutirani u alanin, kao što je opisano u Primeru 14. Mutantne verzije scDC8E8v su zatim eksprimirane u BL21 E. coli soju (Slika 25A, jednolančani proteini su naznačeni zvezdicama). Osobine vezivanja mutiranog scDC8E8v su analizirane pomoću western blota (Slika 25B-C). Slika 25B pokazuje PonceauS bojenje nitroceluloznih membrana koje sadrže različite količine skraćenog tauΔ(1-150;392-441)/4R proteina. Identičnel membrane su korišćene za detekciju skraćenog tau pomoću različitih mutantnih jednolančanih antitela (Slika 25C).

[0339] Na osnovu ovih rezultata, aminokiselinski ostaci u varijabilnom regionu DC8E8 su klasifikovani u tri glavne kategorije, na sledeći način:

[0340] Kategorija 1: Ostaci navedeni u ovoj kategoriji (boldirani) najviše doprinose vezivanju scDC8E8v za patološki skraćeni AD tau (tauΔ(1-150;392-441)/4R). Mutacija bilo kog od ovih ostataka u alanin najviše sprečava prepoznavanje DC8E8 epitopa na tau proteinu.

Kategorija 1 ostaci u lakom lancu DC8E8:

[0341]

Asparagin na poziciji 31 u CDRL1 [SEQ ID No.117]

Tirozin na poziciji 38 u CDRL1 [SEQ ID No.117]

Serin na poziciji 97 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Kategorija 1 ostaci u teškom lancu DC8E8:

[0342]

Glutaminska kiselina na poziciji 50 u FRH2 koja prethodi CDRH2 [SEQ ID No.121] Tirozin na poziciji 101 u CDRH3 [SEQ ID No.122]

[0343] Kategorija 2: Ostaci navedeni u ovoj kategoriji doprinose vezivanju scDC8E8v za patološki tau (tauΔ(1-150:392-441)/4R). Mutacija bilo kog od ovih ostataka u alanin smanjuje reaktivnost scDC8E8v prema skraćenom AD tau (tauΔ(1-150;392-441)/4R), ali ga sprečava u manjoj meri nego mutacije ostataka u Kategoriji 1:

Kategorija 2 ostaci u lakom lancu DC8E8:

[0344]

Tirozin na poziciji 55 u okvirnom regionu FRL2 koji prethodi CDRL2 [SEQ ID No.118] Lizin na poziciji 95 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Kategorija 2 ostaci u teškom lancu DC8E8:

[0345]

Serin na poziciji 57 u CDRH2 [SEQ ID No.121]

Tirozin na poziciji 100 u CDRH3 [SEQ ID No.122]

Glicin na poziciji 102 u CDRH3 [SEQ ID No.122]

[0346] Kategorija 3: Ostaci navedeni u ovoj kategoriji najmanje doprinose vezivanju scDC8E8v za patološki AD tau (tauΔ(1-150;392-441)/4R). Mutacija ovih ostataka u alanin ne menja reaktivnost scDC8E8v prema skraćenom tau (tauΔ(1-150;392-441)/4R):

Kategorija 3 ostaci u lakom lancu DC8E8:

[0347]

Arginin na poziciji 33 u CDRL1 [SEQ ID No.117]

Triptofan na poziciji 56 u CDRL2 [SEQ ID No.118]

Glutamin na poziciji 96 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Fenilalanin na poziciji 98 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Tirozin na poziciji 99 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Leucin na poziciji 100 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Arginin na poziciji 101 u CDRL3 [SEQ ID No.119]

Kategorija 3 ostaci u teškom lancu DC8E8:

[0348]

Tirozin na poziciji 32 u CDRH1 [SEQ ID No.120]

Valin na poziciji 33 u CDRH1 [SEQ ID No.121]

Fenilalanin na poziciji 52 u CDRH2 [SEQ ID No.121]

Asparaginska kiselina u poziciji 99 in CDRH3 [SEQ ID No.122]

1

PRIMER 18: AKTIVNA VAKCINACIJA TERAPIJSKIM EPITOPIMA TAU: DOBIJANJE IMUNOGENA ZA VAKCINE NA OSNOVU JEDNOG OD EPITOPA NA TAU KOJI VEZUJE DC8E8 I ADMINISTRACIJA VAKCINE

[0349] a. Peptidi: Peptidni imunogeni koji se sastoje od sintetičkih fragmenata humanog tau proteina 2N4R su sintetisani u Antagene, Inc. (Sunnyvale, CA) i EZBiolab, USA, sa čistoćom većom od 95%. Svaka peptidna sekvenca je dizajnirana da obuhvati jednu od sekvenci za koje se veruje da je uključena u i/ili da podstiče fibrilizaciju/agregaciju tau (novi ciljni "terapijski epitopi") i koji epitopi su identifikovani gore kao mesta vezivanja za DC8E8 i pomoću testova opisani u Primerima 1-11. Videti Sliku 26A. Ove četiri sekvence se ovde nazivaju i "terapijski epitopi" (videti niže). Ovi epitopi predstavljaju motive tau-tau interakcije (agregacioni epitopi), koje su važne za tau fibrilizaciju/PHF spojeve. Prema tome, ciljanje ovih strateških terapijskih epitopa može da dovede do uspešnog tretmana AD i srodnih tauopatija. Pored toga, upotreba takve specifične terapije protiv tau bi se pokazalo bezbednije nego široko ciljane terapije koje počivaju na nasumično odabranim tau epitopima, zato što se mislilo da ciljanje nekih tau epitopa provocira autoimuni odgovor i potencijalno otežava bolest (Furlan et al., 2003; Gruden et al., 2004).

[0350] U skladu s tim, da bi se dalje odredio terapijski potencijal imunoterapije zasnovane na tau, nekoliko skupova tau peptida je naznačeno za upotrebu u svojstvu imunogena. Svi ostaci se odnose na one cele dužine tau 2N4R, koja ima 441 aminokiselinski ostatak. Prvi skup imunogena je napravljen od SEQ ID NO: 1 tau 251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280; SEQ ID NO: 2 tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285; SEQ ID NO: 3 tau 259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288; SEQ ID NO: 4 tau 275-VQIINKKLDL SNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304; SEQ ID NO: 5 tau 201-GSPGTPGSRS RTPSLPTPPTREPKKVAVVR-230; SEQ ID NO: 6 tau 379-RENAKAKTDHGAEI VYKSPVVSGDTSPRHL-408; SEQ ID NO: 7 tau 181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210; SEQ ID NO: 8 tau 300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317 i SEQ ID NO: 108 tau 294-KDNIKHVPGGGS-305. Neke od ovih sekvenci nose fosforilisane epitope prethodno nađene u AD tau patologiji. Prema tome, tau peptid SEQ ID NO: 5 sadrži fosforilisan treonin na poziciji 217, tau peptid SEQ ID NO: 6 sadrži fosforilisan serin na poziciji 396 i 404 i tau peptid SEQ ID NO: 7 sadrži fosforilisan serin na poziciji 202 i treonin na poziciji 205. Tau peptid SEQ ID NO: 2 je sintetisan u nefosforilisanoj i fosforilisanoj formi. Fosforilisana forma sadrži fosforilisan serinski ostatak na poziciji 262.

[0351] Unutar ovog skupa, jedan podskup imunogena (tau peptidi SEQ ID NO: 1-4 i 108) obuhvata jedan od terapijskih epitopa predstavljen ili sekvencom SEQ ID NO: 98, (tau 267-KHQPGGG-273) ili SEQ ID NO: 99 (tau 298-KHVPGGG-304). Jedan drugi podskup tau peptida (SEQ ID NOs:5-7) obuhvata fosforilisana mesta, nađena u Alchajmerovoj bolesti i drugim tauopatijama. Tau peptid SEQ ID NO: 8 ne nosi nijedan od pomenutih epitopa i korišćen je kao kontrola. (Slika 26)

[0352] Drugi skup peptida je napravljen od SEQ ID NO: 9 do 97, koje predstavljaju preklapajuće sekvence koje pokrivaju ostatke 244-390 humanog tau 2N4R. Svaki od ovih peptida sadrži jednu od sekvenci terapijskih epitopa tau u različitom okruženju na bazi tau. Drugim rečima, u svakom podskupu, svaki od epitopa #1 do #4 je okružen različitim tau ostacima i na svom N- i C-terminusu. (Slika 26).

1 1

[0353] b. Konjugacija za upotrebu kao vakcina: Tau peptidi SEQ ID NO: 2, 4, 7 i 108 su konjugovani sa hemocijaninom iz prilepka (KLH) preko cisteinske veze.

[0354] U tom cilju, tau peptidi SEQ ID NO: 2, 4, 7 i 108 su sintetisani kao cisteinovani peptidi sa dodatnim N-terminalno lociranim cisteinskim ostatkom, sa ciljem da se dobije orijentisano vezivanje peptida za površinu KLH proteina. Peptidi su kuplovani sa KLH nosačem preko bifunkcionalnog kros-linkera N-[γ-maleimidobutiriloksi]sukcinimid estar (GMBS). Da bi se dobila reakcija konjugacije, 20 mg KLH (Calbiochem) je rastvoreno u puferu za konjugaciju (PBS sa 0,9 M NaCl, 10 mM EDTA) do koncentracije od 10 mg/ml nežnim mešanjem 10 minuta. Za dobijanje KLH aktiviranog maleimidom, 2 mg aktivnog bifunkcionalnog kros-linkera GMBS je rastvoreno u 50 µl anhidrovanog dimetilformamida i mešano sa 2 ml KLH rastvora 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je neizreagovan GMBS uklonjen na HiTrap Desalting koloni za odsoljavannje od 5 ml (GE Healthcare), uravnoteženoj u puferu za konjugaciju. Konjugacija je sprovedena u odnosu 1:1 peptid prema KLH aktiviran maleimidom (w/w, 20 mg peptida) 2 h na sobnoj temperaturi (25°C). Dobijeni konjugati su dijalizovani prema PBS 100 puta u višku, sa četiri promene pufera za dijalizu da bi se odstranio nekonjugovan peptid. Posle dijalize, konjugati su centrifugirani 15 min na 21000xg na 2°C. Završetak konjugacije je potvrđen odsustvom slobodnog peptida u puferu za dijalizu, što je mereno pomoću LC-MS/MS. Konjugati su alikvotirani i ostavljeni na -20°C do upotrebe.

[0355] c. Dobijanje vakcine: Da bi se dobile doze za imunizaciju sa Aluminijum/Alum adjuvantom AdjuPhos (Brenntag Biosector, Danska), po 200 µg svakog odgovarajućeg konjugata tau peptida (rastvorenog u 150 µl PBS) je emulzifikovano u odnosu 1:1 (zaprem.) sa AdjuPhos adjuvantom, u konačnoj zapremini doze od 300 µl. Svaka suspenzija/emulzija je inkubirana uz rotaciju na 4°C preko noći da bi se omogućilo peptidu da se adsorbuje na česticama aluminijum fosfata.

[0356] Da bi se dobile doze za imunizaciju sa kompletnim Freund-ovim adjuvantom, po 200 µg svakog odgovarajućeg konjugata tau peptida (rastvorenog u 150 µl PBS) je emulzifikovano u odnosu 1:1 (zaprem.) sa kompletnim Freund-ovim adjuvantom, u konačnoj zapremini doze od 300 µl. Za kasnije buster doze, imunogen je dobijen slično, ali je emulzifikovan sa nekompletnim Freund-ovim adjuvantom.

[0357] d. Administracija vakcine: Dobijene doze vakcine su injektirane u transgene pacove koji nose humani skraćeni tau transgen (SHR72 linija opisana gore u Primeru 7, koja eksprimira tauΔ(1-150;392-441)/4R (Zilka et al., 2006). Pacovi su dobili prvu subkutanu injekciju od 200 µg imunogena u konačnoj zapremini od 300 µl u dobu od 2 meseca, a zatim drugu injekciju tri nedelje kasnije i posle toga na mesečnom nivou. Kontrolni transgeni pacovi su dobili adjuvant pomešan sa PBS, 1:1. Procena efikasnosti imunoterapije je opisana u Primeru 19.

[0358] Izolovanje i prečišćavanje fetalnog pacovskog tau, za upotrebu kao interni standard u kvantitativnoj analizi nerastvorljivog tau u pacovima koji su tretirani vakcinom: prečišćavanje fetalnog pacovskog tau je rađeno u suštini kao što je opisano u Ivanovova et al., 2008, korišćenjem 1% perhlorne kiseline. Moždano tkivo dobijeno iz 1-7 dana starih mladunaca pacova je homogenizovano u ledenoj 1% perhlornoj kiselini (1,5 g tkiva u 5 ml perhlorne kiseline, PCA) i ostavljeno da stoji na ledu 20 min. Homogenat je centrifugiran na 15000xg 20 min i bistar supernatant je koncentrovan i simultano, pufer je promenjen puferom za pranje (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) pomoću uređaja Amicon Ultra

1 2

Centrifugal Filter (Millipore). Profiltrirani PCA ekstrakti, koji sadrže oko 10 mg ukupnih proteina, su stavljeni pri brzini protoka od 0,2 ml/min na Poly-Prep kolonu C10/10 (GE Healthcare) pakovanu sa sefarozome koja nosi imobilisan pan-tau mAb DC25 (videti gore). Nevezani proteini su sprani pomoću 10-15 ml pufera za pranje dok apsorbanca eluiranih frakcija (na 280 nm) nije postala stabilna. Fetal tau, vezan za mAb DC25, je eluiran 0,1 M glicinom, pH 2,6. Eluirane frakcije od po 0,5 ml su odmah neutralisane pomoću 50 µl 1 M Tris-HCl, pH 9 i testirane pomoću SDS-PAGE. Frakcije koje sadrže fetal tau su koncentrovane pomoću uređaja Amicon Ultra Centrifugal Filter (Millipore) uz simultanu promenu pufera u PBS. Fetalni tau prečišćen afinitetnom hromatografijom je precipitiran prema Chen et al., (2005) dodatkom četiri zapremine ledenog acetona koji sadrži 10% trihlorsirćetne kiseline. Smesa je inkubirana na -20°C 2 sata i centrifugirana na 15000xg 20 min na 2°C. Supernatant je odbačen i precipitat je ponovo suspendovan u 1 ml ledenog acetona, ostavljen da stoji na ledu 20 min i opet centrifugiran kao gore. Dobijeni talog je osušen na sobnoj temperaturi i rastvoren u zapremini PBS jednakoj onoj zapremini pre precipitacije.

PRIMER 19: OPŠTI METODI EVALUIRANJA VAKCINA SA TAU PEPTIDOM U TRANSGENIM PACOVSKIM MODELIMA ALCHAJMEROVE BOLESTI

[0359] Aktivne vakcine su procenjene sledećim pristupima: (a) biohemijski, evaluacijom efekta njihove administracije na nivoe fosforilisanih formi nerastvorljivog tau korišćenjem imunoblot analize uzoraka pacovskog mozga sa monoklonskim antitelima specifičnim za fosforilaciju AT270, DC209, DC217 i AT8, i ukupne količine nerastvorljivog tau korišćenjem pan-tau monoklonskog antitela DC25; (b) neurobihejvioralni, evaluacijom pomoću NeuroScale; (c) imunohistohemijski, uključujući NFT kvantifikaciju i (d) analizom indukovanog odgovora antitela. Pasivne vakcine mogu biti evaluirane i predklinički jednim od ili pomoću više ovih pristupa, između ostalog.

[0360] (a). Biohemijska analiza: Frakcije nerastvorljivog tau su dobijene pomoću sarkozilnog metoda (Greenberg i Davies, 1990), iz moždanog stabla transgenih (SHR72) pacova imunizovanih pomoću testiranih peptida, kao i iz lažno tretiranih SHR72 pacova (injektirani samo adjuvantom (kontrola)), kao što je opisano u Primeru 8. Uzorci tau nerastvorljivog u sarkozilu su analizirani imunoblotingom pomoću različitih monoklonskih antitela, kao što je opisano niže. Rezultati ove analize za imunogene peptide SEQ ID NO 1-8 i 108 su sumirani na Slici 26B. Pokazano je da nivoi nerastvorljivog tau korelišu sa napredovanjem tau patologije u SHR72 transgenim pacovima. Koson et al., 2008.

[0361] Imunoblot analiza: Uzorci frakcija tau nerastvorljivog u sarkozilu su rastvorene u 1x natrijum dodecil sulfatnom (SDS) puferu za nanošenje uzorka (Laemmli, 1970) u 1/50 zapremine rastvorljive frakcije (videti Filipcik et al. 2010) i grejani na 95°C 5 min. 6 µl svakog su zatim stavljeni na 5-20% gradijent SDS poliakrilamidne gelove i elektroforezirani u Tris-glicin-SDS puferskom sistemu 40 minuta na 25 mA. Proteini su prebačeni na PVDF membrane (1 h na 150 mA u 10 mM CAPS, pH 12). Posle transfera, membrane su blokirane u 5% nemasnom suvom mleku u PBS 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirani 1 h sa primarnim (tau-specifičnim) monoklonskim antitelima (videti niže za detaljnije opise svakog antitela), zatim su tri puta oprane velikom zapreminom PBS. Posle pranja, kozji anti-mišji Ig (DAKO, Danska) konjugovan sa HRP, razblažen 1:4000 PBS-om was je korišćen kao sekundarno antitelo. Posle inkubacije (1 h na sobnoj temperaturi) je sledilo pranje (tri puta) 0,2% Igepal-om u PBS. Blotovi su razvijeni pomoću SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A) i signal je detektovan pomoću LAS3000

1

imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan). Intenziteti signala su kvantifikovani pomoću softvera AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Nemačka). Fetalni tau (0,6 µg/staza) je korišćen kao interni standard za kvantifikacionu analizu.

[0362] Monoklonska antitela AT8 i AT270 su kupljena od Innogenetics (Belgija) i oba su korišćena za imunoblot analizu. AT8 je korišćen i za imunohistohemiju. AT8 prepoznaje fosforilisan serin 202 i treonin 205 lociran u domenu tau bogatom prolinom, koji najviše doprinosi afinitetu tau vezivanja mikrotubula. AT270 prepoznaje fosforilisan treonin 181 lociran takođe u domenu bogatom prolinom. Oba antitela vezuju rastvorljiv i nerastvorljiv tau. Monoklonska antitela specifična za fosforilaciju DC209 (prepoznaje pT231), DC217 (prepoznaje pT217) korišćena u ovoj studiji su dobijena od Axon Neuroscience, GmbH (Beč, Austrija). Pan-tau antitelo DC25 (Axon Neuroscience, GmbH) prepoznaje epitop u četvrtom ponovku za vezivanje mikrotubula na C-kraju tau proteina (347-353) u svim formama rastvorljivog i nerastvorljivog tau. DC25 antitelo prepoznaje tau proteine nezavisno od njihovog nivoa fosforilacije.

[0363] (b). Neurobihejvioralna evaluacija: Neurobihejvioralni odgovori pacova su procenjeni 10 dana posle poslednje doze vakcine pomoću NeuroScale, što je baterija bihejvioralnih testova originalno dizajnirana za transgene pacove koji eksprimiraju humani skraćeni tau protein (Korenova et al., 2009). NeuroScale se sastoji od senzorimotornih (test hodanja po gredi), neuromišićnih (test hvatanja i vuče, engl. prehensile traction test) i neuroloških zadataka (postavljanje, ispravljanje, postura, sluh, trzanje i refleks istezanja zadnjih udova), obogaćenih osnovnim opservacionim procenama.

[0364] Opšta opservacija uključena u procenu funkcija posture i udova; neurološko ispitivanje uključeno u bazični refleksni odgovor, sve na skali od jednog stepena (normalan odgovor 0; zakasneo ili nekompletan odgovor 1 poen). Procena refleksa istezanja zadnjih udova se daje na skali od 3 stepena (normalan odgovor 0-1; deficit 2-3 poena).

[0365] Za test hodanja po gredi, korišćene su tri vrste segmenata preko kojih prelaze (3x3 cm, 4x2 cm, i obla greda, prečnika 3,5 cm). Maksimalan broj poena je 10 (5 poena za latenciju 5 poena za skliznuće zadnje noge na jednom kraju grede). Niži skor dobijen na testu hodanja po gredi, veća sposobnost senzorimotorne koordinacije testirane životinje. Zbir poena koji je moguće postići je 30.

[0366] Za test hvatanja i vuče, pacovu je dozvoljeno da dohvati, prednjim šapama, horizontalnu čeličnu žicu (prečnika 3 mm) koja visi 76 cm iznad tapacirane površine. Kašnjenje u padanju sa žice je mereno. Maksimalan broj poena je 5, koji odražava ozbiljno oštećenje neuromišićne funkcionalnosti i slabosti mišića. Što je duže kašnjenje u padanju, dobija se niži skor na zadatku, koji odražava snagu mišića prednjih udova i gipkost testirane životinje.

[0367] NeuroScale skor je računat iz skorova dobijenih na pojedinačnim testovima. Maksimalan ukupan skor od 49 poena je moguć kad se saberu doprinos opservacione procene, neurološkog ispitivanja, tri serije testa hodanja po gredi i test hvatanja i vuče. Što je ozbiljnije neurobihejvioralno oštećenje, viši je skor na NeuroScale.

[0368] (c). Imunohistohemija: Za skupljanje uzoraka mozgova, pacovi su perfuzionisani transkardijalno PBS-om 2 minuta u dubokoj anesteziji. Posle perfuzije, pacovski mozgovi su uklonjeni i isečeni sagitalno na dve hemisfere iste veličine. Moždano stablo i cerebelum desne

1 4

hemisfere su uzeti za biohemijske analize. Leva hemisfera je fiksirana pomoću 4% paraformaldehida preko noći na 4°C, a zatim je tretirana 25% saharozom 48 sati da bi se obezbedila kriozaštita. Materijal je zatim zamrznut u hladnom 2-metilbutanu (-42°C) 30 s i isečen na kriomikrotomu. Sagitalni preseci (40 µm) su stavljeni u kriostat na -18°C. Slobodno plutajući preseci su korišćeni za imunohistohemijske studije.

[0369] Imunohistohemijsko bojenje je rađeno na zamrznutim presecima mozga tretiranih i kontrolnih pacova. Koson et al., 2008, su pokazali da broj NFT u mozgu SHR72 transgenih pacova korelira sa vremenom smrti životinje (tj., više NFT, životinja je umrla ranije). Da bi se analizirale neurofibrilarne promene u pacovskim mozgovima, pripremljeni su sagitalni preseci mozga. Slobodno plutajući preseci tkiva su tretirani hladnom (+4°C) 80% mravljom kiselinom 30 s na sobnoj temperaturi (25°C). Preseci mozga su inkubirani 20 minuta na sobnoj temperaturi u PBS sa 0,3% Triton X-100 i 1% H2O2, a zatim 30 minuta inkubacije u rastvoru za blokiranje (PBS sa 0,3% Triton X-100, 1% konjski serum), a zatim preko noći inkubacija na 4°C, ili sa prečišćenim antitelom AT8 (0,2 µg/ml u puferu za blokiranje) ili sa supernantantom hibridomske kulture DC217 (1:100 u puferu za blokiranje). Oba antitela su pokazala slične obrasce imunobojenja u moždanom stablu transgenih pacova. Posle pranja, preseci su imunobojeni standardnim metodom avidin biotin peroksidaza (ABC Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Reakcioni produkt je vizualizovan pomoću avidin-biotin sistema i Vector VIP kao hromogen (Vector Laboratories). Preseci su zatim ispitani pod mikroskopom Olympus BX 51.

[0370] (d). Odgovor antitela: Transgeni pacovi su iskrvavili pre početka studije (tj., pred prvu injekciju) i dve nedelje posle poslednje injekcije. Odgovor antitela na dat imunogen/vakcinu je određen pomoću ELISA uz upotrebu serijski razblaženih uzoraka plazme. Peptidni imunogeni, rekombinantan tau protein tauΔ(1-150;392-441)/4R i rekombinantna izoforma tau cele dužine 2N4R, su odvojeno prevučeni na ploče sa 96 ležišta (IWAKI, Japan) u koncentraciji od 10 µg/ml u PBS preko noći na 37°C. Posle blokiranja pomoću 1% nemasnog suvog mleka u PBS, ploče su oprane PBS-0,05% Tween-om 20 i inkubirane sa 50 µl/ležište serijskim razblaženjima plazme (1:200-1:128000 u puferu za blokiranje) 1 hr na 37°C. Posle inkubacije i pranja, sekundarno antitelo konjugovano peroksidazom (zečji anti-pacovski Ig, DAKO, Danska) je razblaženo 1:1000 i stavljeno u ležišta (50 µl/ležište) 1 hr na 37°C. Reakcija je razvijena pomoću o-fenilendiamina u rastvoru supstrata peroksidaze (0,1 M fosfatni pufer) i zaustavljena pomoću 50 µl 2M H2SO4. Apsorbanca na 492 nm je merena pomoću Multiscan MCC/340 ELISA čitača (Labsystems). Čitanja apsorbance od bar dva puta veće vrednosti od negativnih kontrola su smatrane pozitivnim.

[0371] Merenja afiniteta su vršena pomoću SPR, kao što je opisano gore u Primeru 5. Ukratko, eksperimenti su vršeni na 25°C u fosfatom puferisanom slanom rastvoru pH 7,4 sa 0,005% P20 (PBS-P) kao radnimpuferom. 3000 RU (responsivnih jedinica) poliklonskog antimišjeg antitela (No. Z 0420; DakoCytomation, Glostrup, Danska) je kuplovano u koncentraciji od 5 µg/ml (dobijeno 40 puta razblaženjem 200 µg/ml 0,5xPBS matičnog rastvora u 10 mM natrijum acetatnom puferu pH 4,5) preko primarnih amina, simultano u dve protočne ćelije, od kojih je jedna korišćena u merenju kao referentna. U svakom ciklusu analize, 1000 puta razblaženi serumi su hvatani u analitičku protočnu ćeliju da bi dostigao nivo imobilizacije od ∼ 850 RU, što se približavalo zasićenju. Za određivanja KA, kao i za određivanje konstanti kinetičkih brzina, 100 nM rastvori imunogenih tau peptida ili tau proteina su injektirani pri brzini protoka od 100 µl/min preko senzorskog čipa. PBS-P injekcija je korišćena za oduzimanje pozadinskog signala u proceduri duplog referenciranja (Myszka J Mol Rec 1999). Podaci o kinetičkom vezivanju su fitovani pomoću BIA softvera

1

za evaluaciju 4.1 (Biacore AB) na 1:1 model reakcije. Konstante kinetičkih brzina su globalno procenjene, maksimalni odgovori su fitovani lokalno i ukupni odgovor je namešten na nulu.

PRIMER 20: TAU PEPTIDNE VAKCINE KOJE SADRŽE BAR JEDNU OD ČETIRI SEKVENCE TERAPIJSKIH EPITOPA SU BLAGOTVORNE KOD TRANSGENIH PACOVA KOJI MODELUJU HUMANU ALCHAJMEROVU BOLEST

[0372] a. SEQ ID NO: 1 tau 251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280. Transgeni pacovi (SHR72) su imunizovani tau peptidom SEQ ID NO: 1 formulisanim sa adjuvantom Adju-phos.

[0373] Konverzija tau iz rastvorljivog do patoloških formi nerastvorljivih u sarkozilu se vidi kao važan korak u razvoju tau patologije i izgleda da zavisi od nekoliko faktora, kao što je koncentracija tau, skraćivanje tau i nivo fosforilacije tau (Alonso et al. 2001; Koson et al.

2008; Kovacech i Novak 2010). Rezultati imunoblot kvantitativne analize nerastvorljivog tau u frakcijama mozga nerastvorljivim u sarkozilu sakupljenim iz grupe pacova imunizovanih tau peptidom SEQ ID NO: 1 i iz kontrolne grupe su prikazani na Slici 26C. Vakcinacija je smanjila količinu nerastvorljivog tau u pacovima imunizovanim pomoću tau251-280 (SEQ ID NO.1) u poređenju sa kontrolnim pacovima, koji su primili sam adjuvant (Slika 26C). Ovo smanjenje je primećeno i za ukupne nivoe nerastvorljivog tau (što je procenjeno pomoću DC25 pan-tau antitela, koje prepoznaje ostatke 347-353) kao i za sve druge testirane AD-relevantne tau epitope (surogat markeri AD) opisane na Slikama 26B i 26C i za koje se zna da su prisutni u frakcijama nerastvorljivim u sarkozilu. Zaista, imunizacija tau peptidom SEQ ID NO: 1 je indukovala statistički značajno (p<0,001) smanjenje nerastvorljivog tau, koje je primećeno na nivou ukupnog nerastvorljivog tau (71%) pomoću pan-tau monoklonskog antitela DC25 (Slika 26B,C). Analiza sa DC217 (pThr217), AT270 (pThr181), je otkrila trend prema smanjenju nivoa fosforilacije na Thr217 (42%) i pThr181 (58%) nerastvorljivog tau u imunizovanim pacovima u odnosu na kontrolne pacove. Slabiji efekat tretmana (11%) je nađen za fosfoepitop pThr231 nerastvorljivog tau proteina (Slika 26B). Ovi rezultati sugerišu da je vakcina aktivirala mehanizam odgovoran za inhibiciju agregiranja tau i/ili mehanizam uključen u smanjenje nivoa tau proteina sklonih tau-tau interakcijama.

[0374] Pacovi tretirani tau peptidnim imunogenom SEQ ID NO: 1 su pokazali statistički značajna smanjena kašnjenja u prelasku iz testa hodanja po gredi (* p = 0,.045) u odnosu na kontrolne pacove (Slika 27A). Slično, broj skliznuća zadnjih nogu je smanjen u vakcinisanoj grupi u odnosu na kontrole; međutim, ova razlika je marginalno statistički značajna (p = 0,059, Slika 27B). Skor na NeuroScale (opisan u Primeru 19, gore) je izračunat iz vrednosti dobijenih u testovima hodanja po gredi, testovima hvatanja i vuče i neurološkim ispitivanjima (osnovni refleksi, refleks istezanja zadnjih udova). Imunizacija je poboljšala skor na NeuroScale pacova tretiranih peptidom SEQ ID NO: 1 u odnosu na kontrolnu grupu, ali ovo poboljšanje nije statistički značajno (p = 0,065, Slika 27C). Ukupan skor na NeuroScale je potvrdio neurobihejvioralno poboljšanje tretiranih pacova u odnosu na netretirane pacove. Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa.

[0375] Neurobihejvioralni parametri korelišu sa nivoima nerastvorljivog tau u moždanom stablu. Tretirani pacovi sa niskim nivoima nerastvorljivog tau su pokazali manje kašnjenje u prelasku i skliznuća zadnjih udova u odnosu na kontrole. Ovi nalazi ukazuju na to da smanjenje visoko nerastvorljivih, pogrešno savijenih tau dovodi do funkcionalnih poboljšanja kod imunizovanih pacova, što bi moglo da ima terapijsku vrednost. Imunoterapija tau peptidom SEQ ID NO: 1 je dovela do poboljšanja u neurobihejvioralnim parametrima

1

tretiranih pacova. Ovaj efekat je pratio smanjenje nivoa nerastvorljivog tau u mozgovima imunizovanih pacova. Ovi nalazi ukazuju na to da spuštanje nivoa nerastvorljivog tau ima terapijsku korist.

[0376] Efikasnost imunoterapije tau peptidom SEQ ID NO: 1 je dalje testirana na imunohistohemijskom nivou (Slika 28). Neurofibrilarna klubad (NFT) je analizirana pomoću antitela na tau AT8, DC217, koja prepoznaju fosforilisane epitope na patološkom tau, u moždanim stablima tretiranih i kontrolnih, lažno tretiranih transgenih pacova SHR 72, koji su primili samo adjuvant/PBS. Broj NFT je određen pomoću semikvantitativnog metoda. Dodeljena su tri kvantitativna nivoa: 1) nijedan ili samo nekoliko neurofibrilarne klubadi (do 3 u moždanom stablu); 2) umeren (mnogo NFT, uglavnom u retikularnoj formaciji moždanog stabla) i 3) težak (mnogo NFT u svim oblastima moždanog stabla). "Ekstenzivan" znači umeren do težak stadijum neurofibrilarne neurodegeneracije. Imunohistohemijska analiza je pokazala 50% smanjenje količine neurofibrilarne klubadi u grupi transgenih životinja tretiranoj vakcinom.

[0377] Smanjenje nivoa nerastvorljivog tau mereno biohemijski korelira sa rezultatima imunohistohemijske analize. Podaci iz imunizacije sa SEQ ID NO: 1 pokazuju tretmanski kapacitet ovog peptida, koji sadrži DC8E8 epitop br.1.

[0378] b. SEQ ID NO: 2 tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK KLDLS-285. Transgeni pacovi (SHR72) su imunizovani tau peptidom SEQ ID NO: 2 konjugovanim sa nosačem KLH (kao što je opisano gore).

[0379] Imunoblot analiza je otkrila da je vakcina smanjila količinu nerastvorljivog tau u imunizovanim pacovima u odnosu na kontrolne pacove koji su primili sam adjuvant. Slika 29 pokazuje smanjenje u svim praćenim epitopima prisutnim u nerastvorljivom/agregiranom tau. Kvantitativna analiza imunoreaktivnosti pan-tau DC25 je otkrila 41 % smanjenje nerastvorljivog tau (statistički značajno, p<0,001) u imunizovanim pacovima u odnosu na kontrolne pacove koji su primili sam adjuvant (Slika 26B). Takođe, imunoreaktivnost drugih antitela koja prepoznaju fosforilisane AD-specifične epitope na nerastvorljivom tau je smanjena (Slika 26B i Slika 29). Dodatno, tretman je imao uticaj na nivo drugog tau fosfoepitopa, koji je napravljen iz dva fosfoostatka Ser202/Thr205 i koji je poznat kao marker AD patologije. Vakcina je indukovala 80% smanjenje ovog epitopa u imunizovanim transgenim pacovima, u poređenju sa netretiranim životinjama. Slično, nivoi fosforilisanih tau epitopa Thr217, Thr231 i Thr181 su smanjeni za 72% (p<0,001), 64% i 74% (p<0,01), respektivno. Ovi rezultati sugerišu da je vakcina indukovala mehanizam odgovoran za inhibiciju agregiranja tau i/ili mehanizam koji smanjuje tau vrste sklone patološkim tau-tau interakcijama.

[0380] Pacovi su podvrgnuti bihejvioralnim analizama i Slika 30 pokazuje rezultate dobijene u testu hodanja po gredi (Slika 30A), testu skliznuća zadnjih udova (Slika 30B) i analizom Neuroscale (Slika 30C, * p = 0,05). Vidi se pozitivan trend u kašnjenju u prelasku u hodanju po gredi (p = 0,096) u grupi pacova tretiranih tau peptidom SEQ ID NO: 2. Imunizacija je smanjila broj skliznuća zadnjih udova u testu bočnog kretanja po gredi; međutim, razlika nije statistički značajna (p = 0,25) u poređenju sa kontrolnom grupom. Testovi motornih oštećenja zajedno sa testom hvatanja i vuče i neurološkim ispitivanjem je sumirano u skor na Neuroscale. Slika 30 pokazuje statistički značajno poboljšanje u skoru Neuroscale pacova tretiranih tau peptidom SEQ ID NO: 2 u odnosu na kontrolnu grupu (* p = 0,036). U opštem slučaju, imunizacija tau peptidom SEQ ID NO: 2 je popravila ukupne motoričke radnje.

1

Poboljšanje na neurobihejvioralnom nivou je korelisalo sa smanjenjem količine nerastvorljivog tau (AD šablonski tau) u imunizovanim životinjama u odnosu na kontrole. Ovi nalazi indikuju da sniženje nivoa nerastvorljivog tau može imati terapijsku korist.

[0381] Efikasnost imunoterapije tau peptidom SEQ ID NO: 2 je dalje testirano na imunohistohemijskom nivou (Slika 31). U tu svrhu, korišćena su dva različita antitela na tau (AT8, DC217), koja prepoznaju i fosforilisan rastvorljiv i nerastvorljiv tau. Neurofibrilarna patologija u ovim pacovima (SHR72) je lokalizovana uglavnom u moždanom stablu i kičmenoj moždini i delimično u cerebelumu (podaci nisu prikazani). Broj NFT je određen primenom semikvantitativnog metoda. Dodeljena su tri kvantitativna nivoa: 1) nijedan ili samo nekoliko neurofibrilarne klubadi (do 3 u moždanom stablu); 2) umeren (mnogo NFT, uglavnom u retikularnoj formaciji moždanog stabla) i 3) težak (mnogo NFT u svim oblastima moždanog stabla). "Ekstenzivan" znači umeren do težak stadijum neurofibrilarne neurodegeneracije. Imunoterapija peptidom SEQ ID NO: 2 je smanjila broj transgenih pacova sa ekstenzivnim NFT u moždanom stablu skoro za 60% (Slika 31).

[0382] Ovi rezultati demonstriraju da vakcinacija tau peptidom SEQ ID NO: 2 pokazuje nekoliko željenih ishoda vakcine: 1) smanjenje nerastvorljivog tau u mozgovima imunizovanih transgenih pacova na biohemijskom nivou; 2) umanjenje senzorimotornih deficita u imunizovanim transgenim pacovima na bihejvioralnom nivou i 3) smanjenje u broju neurofibrilarnih lezija na imunohistohemijskom nivou.

[0383] SEQ ID NO: 2 tau 256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285 sa fosforilisanim Ser262. SEQ ID NO: 2 koji sadrži fosforilisan serin na poziciji 262 je konjugovan sa KLH.

[0384] Imunoblot frakcija pacovskog moždanog tau nerastvorljivog u sarkozilu sa antitelom DC25 je otkrio da je vakcina statistički značajno smanjila ukupnu količinu nerastvorljivog tau za 46% (p<0,01) u imunizovanim životinjama u odnosu na kontrolne transgene pacove koji su primili sam adjuvant (Slika 32 i Slika 26B, merenja na bazi DC25 (podaci "347-353"). Isto tako, kvanitifikacija signala DC209 (pThr231), DC217 (pThr217), AT8 (pSer202, pThr205) i AT270 (pT181) je pokazala niže nivoe nerastvorljivog fosforilisanog tau u imunizovanoj grupi životinja u odnosu na kontrole (Slika 26B). Međutim, smanjenje nivoa fosforilisanog nerastvorljivog tau na pThr217 (p<0,001; 73%), pThr231 (84%), pSer202/pThr205 (82%) i pThr181 (p<0,01; 82%) je izraženije nego smanjenje viđeno u ukupnom nerastvorljivom tau. Ove promene u nivoima fosfoepitopa uključene u kaskadu pogrešnog savijanja AD tau su koristan indikator efekta tretmana. Smanjenje AD-relevantnih tau epitopa pokazuje da je vakcina aktivirala mehanizam odgovoran za inhibiciju agregiranja tau i/ili mehanizam koji smanjuje nivoe tau sklonog patološkim interakcijama sa endogenim tau.

[0385] Imunohistohemijski profil (Slika 33) pokazuje da imunoterapija fosfopeptidom SEQ ID NO: 2 dovodi do smanjenja broja transgenih pacova sa ekstenzivnim NFT u moždanom stablu. Smanjenje od 78% u broju transgenih pacova sa ekstenzivnim NFT je uočeno u imunizovanoj grupi u odnosu na kontrolnu neimunizovanu grupu. Imunizacija je zaustavila razvoj moždane tau patologije u imunizovanim životinjama. Sličan efekat je dobijen na biohemijskom nivou, sa smanjenjem nerastvorljivog tau na analiziranim AD-relevantnim epitopima (Slika 26B i 32).

[0386] Ovi rezultati demonstriraju da je vakcinacija tau fosfopeptidom SEQ ID NO: 2/pSer262 podstakla: 1) smanjenje nerastvorljivog tau u mozgovima imunizovanih transgenih

1

pacova na biohemijskom nivou i 2) pozitivan efekat tretmana na broj neurofibrilarnih lezija na imunohistohemijskom nivou.

[0387] d. SEQ ID NO: 3 tau 259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288. Transgeni pacovi (SHR72 linija) su imunizovani tau peptidom SEQ ID NO: 3 formulisanom sa alum adjuvantom (AdjuPhos).

[0388] Slika 34 demonstrira da imunoterapija smanjuje nerastvorljiv tau u imunizovanim pacovima u odnosu na kontrolne pacove koji su primili sam adjuvant. Smanjenje nivoa nerastvorljivog tau je detektovano za sve analizirane tau epitope (tj, za antitelo 347-353/DC25, antitelo pT217/DC217, antitelo pT231/DC209, antitelo pS202/pT205/AT8 i antitelo pT181/AT270). Nivo ukupnog nerastvorljivog tau se smanjio za 40%, što je otkriveno imunodetekcijom sa pan-tau antitelom DC25. Slično, vakcina je indukovala 30% smanjenje tau proteina fosforilisanog na pT217, kao što je prikazano na Slici 26B i Slici 34. Tretman je imao veći efekat na nivoe nerastvorljivih tau formi fosforilisanih na Thr231 (63%), Thr181 (74%) i Ser202/Thr205 (61 %) u imunizovanim pacovima u odnosu na neimunizovane pacove (Slika 26B i Slika 34). Ovi nalazi pokazuju da smanjenje nerastvorljivog tau može da dovede do dodatnih promena nivoa tau proteina koji dovode do patologija i, prema tome, može da ima terapijski značaj. Smanjenje AD-relevantnih tau epitopa pokazuje da je vakcina aktivirala mehanizam odgovoran za inhibiciju agregiranja tau i/ili mehanizam koji smanjuje nivoe tau sklonog patološkim interakcijama sa endogenim tau.

[0389] Slika 35A-C pokazuje rezultate dobijene neurobihejvioralnom evaluacijom. U grupi pacova tretiranih peptidom SEQ ID NO: 3, vidi se pozitivan trend u kašnjenju u prelasku u hodanju po gredi; međutim, bez statistički značajne razlike između peptidom tretiranih i netretiranih/kontrolnih pacova (Slika 35A; p = 0,21). Slično, tretman je doveo do smanjenja broja skliznuća zadnjih udova u grupi imunizovanih pacova u odnosu na netretirane pacove, ali ovaj efekat nije statistički značajan (Slika 35B, p = 0,15). Ukupan skor na Neuroscale je potvrdio neurobihejvioralno poboljšanje kod pacova tretiranih tau peptidom SEQ ID NO: 3 u odnosu na netretirane pacove (p=0,11 u oba slučaja). Međutim, razlika u skoru na Neuroscale nije statistički značajna (p = 0,19). Imunoterapija tau peptidom SEQ ID NO: 3 je dovela do bolje senzorimotorne koordinacije tretiranih pacova u odnosu na kontrolne pacove u testu hodanja po gredi, kao i u testu skliznuća zadnjih udova; ovi rezultati su potvrđeni skorom na Neuroscale.

[0390] Štaviše, imunohistohemijski profil je otkrio da imunoterapija fosfopeptidom SEQ ID NO: 3 dovodi do 58% smanjenja NFT u moždanom stablu vakcinom tretiranih životinja (Slika 36). Ovi rezultati pokazuju da je imunizacija pomoću SEQ ID NO: 3, koja sadrži DC8E8 epitop br.1, značajno smanjila patološki polimeran tau koji formira NFT. Pored toga, ovaj pozitivan efekat tretmana je pokazan i na biohemijskom nivou, predstavljen statistički značajnim smanjenjem nerastvorljivog patološkog tau.

[0391] e. SEQ ID NO: 4 tau 275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304. Tau peptid SEQ ID NO: 4 je konjugovan sa KLH i korišćen je za imunizaciju alum adjuvantom (AdjuPhos).

[0392] Slika 37 i Slika 26B pokazuju da imunoterapija SEQ ID NO: 4 dovodi do smanjenja u količini nerastvorljivog tau u imunizovanim pacovima, u odnosu na kontrolne pacove koji su primili sam adjuvant. Podaci pokazuju da je smanjenje nivoa nerastvorljivog tau detektovano kod svih analiziranih tau epitopa. Ukupni nivoi nerastvorljivog tau su se smanjili za 63%, što

1

je otkriveno pomoću imunoreaktivnosti pan-tau antitela DC25. Slično, vakcina je indukovala smanjenja tau proteina fosforilisanog na pThr217 (92%), Thr231 (95%), Thr181 (87%) i Ser202/Thr205 (95%), što je pokazano na Slici 26B. Ranije je pokazano da nivo nerastvorljivog tau korelira sa napredovanjem tau patologije (Zilka et al., 2006). Ovi rezultati pokazuju da imunoterapija usmerena na terapijski tau epitop, sadržan unutar SEQ ID NO: 99, može da smanji nivoe nerastvorljivog tau i usporava napredovanje tau patologije.

[0393] Složeno motoričko oštećenje je mereno skupom standardnih testova motorike kombinovanih sa neurološkim ispitivanjem u složenom skoru - Neuroscale. Transgeni pacovi SHR72 od 6,5 meseci, tretirani tau peptidom SEQ ID NO: 4, su podvrgnuti bihejvioralnim testovima sa ciljem da se odredi efekat ove imunoterapije. Pacovi tretirani tau peptidnim imunogenom SEQ ID NO: 4 su pokazali smanjene latencije u prelasku u testu hodanja po gredi, u odnosu na transgene pacovi koji su primili sam adjuvant (kontrole) (Slika 38A). Slično, pozitivni rezultati u broju skliznuća zadnjih udova su viđeni u vakcinisanoj grupi u poređenju sa transgenim kontrolama tretmana (Slika 38B). Ukupan skor na Neuroscale je izračunat iz podataka dobijenih u testu hodanja po gredi, testu hvatanja i vuče i neurološkim ispitivanjima (osnovni refleksi, ekstenzioni refleks istezanja zadnjih nogu). Imunizacija je popravila skor na Neuroscale pacova tretiranih peptidom SEQ ID NO: 4, u odnosu na kontrolnu tretiranu grupu (Slika 38C). Ukupan skor na Neuroscale je potvrdio neurobihejvioralno poboljšanje tretiranih transgenih pacova u odnosu na netretirane transgene pacove.

[0394] Efikasnost imunoterapije tau peptidom SEQ ID NO: 4 je dalje testirana na imunohistohemijskom nivou (Slika 39). Neurofibrilarna klubad (NFT) su analizirani pomoću antitela na tau AT8 i DC217, koja prepoznaju fosforilisane epitope na patološkom tau, u moždanim stablima vakcinom tretiranih i adjuvantom tretiranih (kontrolnih) SHR72 pacova. Moždano tkivo iz životinja koje su primile samo adjuvant je sadržalo AT8- i DC217-pozitivne NFT u svim oblastima moždanog stabla, a uglavnom u retikularnoj formaciji moždanog stabla. Imunohistohemijskai analiza je pokazala 66% smanjenje neurofibrilarne patologije u vakcinom tretiranim transgenim pacovima SHR72 (Slika 39).

[0395] Promene nivoa nerastvorljivog tau u moždanom stablu transgene pacovske linije SHR72 su osetljiv indikator efekta tretmana. Ukupni nivoi nerastvorljivog tau, kao i fosforilisanog tau (patološki monomeri, dimeri, oligomeri i polimeri), su se efektivno smanjili u moždanom stablu tretmanom tau peptidom SEQ ID NO: 4 (63-95% smanjenje; Slika 26B). Smanjenje nivoa nerastvorljivog tau mereno biohemijski korelira sa rezultatima dobijenim u imunohistohemijskoj analizi. Ova analiza je pokazala više od 60% smanjenja neurofibrilarne patologije u moždanom stablu vakcinisanih transgenih pacova (Slika 38). Podaci iz imunizacije pomoću SEQ ID NO: 4 pokazuju tretmanski kapacitet ovog peptida, koji sadrži DC8E8 epitop br.2.

[0396] f. SEQ ID NO: 5 tau 201-GSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVR-230 koji nosi fosforilisan treonin na poziciji 217. Tau peptid SEQ ID NO: 5, fosforilisan na poziciji treonina 217, je dat transgenim pacovima SHR72 pomoću alum adjuvanta (AdjuPhos).

[0397] Imunoblot analiza je pokazala da imunizacija fosfopeptidom SEQ ID NO: 5 nije uticala na ukupnu količinu nerastvorljivog tau (detektovanog DC25 antitelom) u odnosu na kontrolne Tg pacove koji su primili sam adjuvant (Slika 40 i Slika 26B). Međutim, analiza sa antitelima DC209 i AT270 je otkrila smanjenje od oko 30% u nivoima fosfo-tau pThr231 i pThr181 u nerastvorljivim frakcijama tau (Slika 26B). S druge strane, tretman je indukovao

11

umereno povećanje nerastvorljivog tau fosforilisanog na treoninu 217 (11% povećanje) i tau koji nosi fosfo mesta Ser202/ Thr205 (31% povećanje) u odnosu na kontrolne transgene pacove. Ovaj nalaz sugeriše nejednoznačan ili neutralan efekat vakcine za imunizaciju fosfopeptidom SEQ ID NO: 5 na procenjene markere relevantne za AD, gde ovaj peptid ne obuhvata nijedno agregiranje tau epitopa #1 doh #4, identifikovanih gore (Primeri 1 do 11) kao terapijski epitopi.

[0398] Neurobihejvioralne analize pacova tretiranih fosforilisanim tau peptidom SEQ ID NO: 5 su pokazle da nema značajnog poboljšanja u neurobihejvioralnim funkcijama tretiranih grupa u testu hodanja po gredi (Slika 41A, p=0,19) ili u broju skliznuća zadnjih udova u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 41B). Ukupan skor na Neuroscale (Slika 41C) je potvrdio da nema neurobihejvioralnog poboljšanja tretiranih pacova u odnosu na lažno imunizovane pacove (p=0,28).

[0399] Imunohistohemijski, imunoterapija tau fosfopeptidom SEQ ID NO: 5 nije redukovala broj transgenih pacova (SHR72) sa ekstenzivnim NFT u moždanom stablu u odnosu na kontrolne transgene pacove (Slika 42).

[0400] Ovi rezultati pokazuju da vakcinacija tau peptidom SEQ ID NO: 5 pT217, kom nedostaju svi terapijski epitopi (SEQ NO: 98-101), ne dovodi do statistički značajnog poboljšanja neurobihejvioralne funkcije i pokazuje smanjenje od samo približno 11 % u broju neurofibrilarnih lezija na imunohistohemijskom nivou. Nije nađen nikakav efekat na biohemijskom nivou što se tiče smanjenja nerastvorljivog tau, što je procenjeno antitelom DC25.

[0401] g. SEQ ID NO: 6 tau 379-RENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHL-408 koji nosi fosforilisan serin na poziciji 396 i 404. Tau peptid fosforilisan na poziciji 396 i 404 je dat pacovima SHR72 pomoću alum adjuvanta (AdjuPhos). SEQ ID NO: 6/ pS396/pS404 nema nijedan terapijski epitop predstavljen SEQ NO: 98-101, ali sadrži fosfoepitop kog ima jako mnogo u tau proteinima u mozgu sa AD (Greenberg et al. 1992; Otvos et al.1994).

[0402] Za razliku od smanjenja količine tau nerastvorljivog u sarkozilu koje je viđeno sa peptidima SEQ ID NO.1-4, imunizacija fosforilisanim peptidom SEQ ID NO.6 je dovela do povećanja količine nerastvorljivog tau u imunizovanovanim pacovima u odnosu na kontrolne pacove koji su primili sam adjuvant. Imunoblot analiza je otkrila trend ka ukupnom povećanju nivoa nerastvorljivog fosfo-tau (Slika 43 i Slika 26B). Imunizacija je dovela do povećanja ukupnog nivoa u frakciji nerastvorljivog tau, što je otkrilo pan-tau mAb DC25. Povećanje je viđeno i na tau epitopima pT217 (33% povećanje), Thr231 (44% povećanje) i Thr181 (7% povećanje). Međutim, AD-relevantan epitop pS202/pT205 je izuzetak (Slika 26B). Nivo tau proteina koji nosi ovaj fosfoepitop se smanjio za 19% u odnosu na kontrolne pacove. Povećani nivoi mnogih patološki nerastvorljivih tau proteina relevantnih za bolest ukazuju na neželjen negativan efeka ove vakcine na pacove.

[0403] Procenjen je neurobihejvioralni odgovor pacova tretiranih tau peptidom SEQ ID NO: 6/ pS396/pS404 i kontrola (Slike 44A, B i C). Imunoterapija nije pokazala statistički značajne razlike između tretiranih i kontrolnih pacova u latenciji prelaska u hodanju po gredi (p = 0,82) ili u broju skliznuća zadnjih udova (p = 0,75). Ovi rezultati su potvrđeni skorom na Neuroscale (p = 0,96), u kom nisu viđene statistički značajne razlike u ukupnim neurobihejvioralnim performansama između imunizovanih i kontrolnih pacova. Prema tome, tretman peptidom SEQ ID NO: 6/pS396/pS404 nije imao statistički značajan uticaj na latenciju prelaska, broj skliznuća zadnjih udova testa hodanja po gredi, ni na ukupne motoričke performanse testiranih pacova.

[0404] Slika 45 pokazuje procenat transgenih pacova sa ekstenzivnom tau patologijom, što je procenjeno imunohistohemijaom pomoću AT8. Imunoterapija tau peptidom SEQ ID NO: 6/ pS396/pS404 je povećala količinu klubadi za 9% u odnosu na kontrolnu grupu. Prema tome, negativan efekt SEQ ID NO: 6/ pS396/pS404 na imunohistohemijskom nivou je potvrđen na biohemijskom i neurobihejvioralnom nivou.

[0405] Ovi rezultati demonstriraju da vakcinacija tau fosfopeptidom SEQ ID NO: 6/ pS396/pS404, koji nema nijedan od terapijskih tau epitopa opisan u SEQ ID NO: 98-101, pokazuje: 1) nulti terapijski efekat na nerastvorljiv tau u mozgovima imunizovanih pacova; 2) nikakav efekt na bihejvioralnom nivou i 3) nikakvo smanjenje, nego pre 9% povećanje količine klubadi. Prema tome, ovaj fosfoepitop, koji je prijavljen kao specifičan za AD (Greenberg et al.1992; Otvos et al.1994) nije indukovao terapijski efekat.

[0406] h. SEQ ID NO: 7 tau 181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210 koji nosi fosforilisan serinski ostatak na poziciji 202 i fosforilisan treoninski ostatak na poziciji 205. Dobijeni tau peptid SEQ ID NO: 7/ pS202/pT205, nema nijedan od terapijskih epitopa predstavljenih u SEQ ID NO: 98-101. Ovaj fosfopeptid je konjugovan sa KLH i dat transgenim pacovima (linije SHR72) u Freund-ovom adjuvantu.

[0407] Kvantitativna analiza imunoreaktivnosti tau u moždanom stablu pomoću imunoblota nije pokazala nikakav terapijski efekat. (Slika 46). Ukupni nivoi tau (DC25 epitop, 6% povećanje) i tau proteina fosforilisanih na tau epitopima relevantnim za bolest pT217 (3% povećanje), Thr231 (11% povećanje) i Thr181 (7% povećanje), su malo povećani u imunizovanim pacovima u odnosu na kontrole (Slika 46 i 26B). Imunizacija je indukovala veće povećanje nerastvorljivog tau proteina fosforilisanog na Ser202/Thr205 (41% povećanje).

[0408] Imunoterapija fosforilisanim peptidom SEQ ID NO: 7 nije značajno uticala na senzorimotornu funkciju pacova (Slika 47). Imunizovani pacovi su pokazali očigledno poboljšanje u neurobihejvioralnim parametrima u odnosu na kontrole. Međutim, grupe nisu statistički različite, jer nije viđena statistički značajna razlika između tretiranih pacova i kontrola u latenciji prelaska kod hodanja po gredi (p = 0,47, Slika 47A), kao ni u broju skliznuća zadnjih udova (p = 0,54, Slika 47B) i skoru na NeuroScale (p = 0,3, Slika 47C).

[0409] Peptid SEQ ID NO: 7 nosi fosforilisan tau epitop koji ne sadrži nijedan od DC8E8 epitopa. Ispitivanje moždanih stabala tretiranih SHR72 pacova je otkrilo da imunoterapija tau peptidom SEQ ID NO: 7 nije bila u stanju da smanji količinu neurofibrilarne klubadi (Slika 48). Moždano tkivo iz vakcinisanih i kontrolnih životinja je sadržalo skoro identične brojeve AT8 i DC217- pozitivnih NFT u svim oblastima moždanog stabla, uglavnom u retikularnoj formaciji. Vakcina koja sadrži SEQ ID NO: 7, nema DC8E8 epitopa, nije pokazala nikakav povoljan efekat u tretiranim životinjama.

[0410] Ovi rezultati demonstriraju da vakcinacija tau fosfopeptidom SEQ ID NO: 7/ pS202/pT205 ne proizvodi: 1) promene nivoa nerastvorljivog tau u mozgovima imunizovanih pacova na biohemijskom nivou i 2) nikakav efekat na bihejvioralnom nivou. Ovaj fosfopeptid obezbeđuje dodatni dokaz da fosfo mesta predstavljena pS202/pThr205 nisu dovoljna da podignu imunu reakciju koja eliminiše patološke tau proteine i/ili pozitivno utiče na neurobihejvioralni status pacova. Nasuprot njima, terapijski tau epitopi (SEQ ID NO:98-101) postižu ovaj efekat.

[0411] i. SEQ ID NO: 8 tau 300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317. Imunoterapija kraćim tau peptidom, koji je korišćen kao kontrola jer ne nosi kompletan tau 6-mer unutar kog bi mogao da se smesti jedan od četiri "terapijska epitopa" tau, niti fosforilisan epitop, je sprovedena da bi se odredila njegova sposobnost da utiče na nivoe patološkog nerastvorljivog tau i neurofibrilarnih depozita u mozgu. Nivo ukupnog nerastvorljivog tau detektovanog pomoću pan-tau mAb DC25 je značajno povećan (82%) u imunizovanim pacovima u odnosu na kontrole koje su primile sam adjuvant (Slika 49 i Slika 26B). Slično, imunoterapija je indukovala povećanje nivoa nerastvorljivog tau fosforilisanog na T231 (60%) i manje povećanje nerastvorljivog tau fosforilisanog na poziciji T181 (10%). Kvantitativna analiza pomoću različitog skupa antitela, DC217 (pT217) i AT8 (pS202/pT205) nije otkrila nikakav efekat na ove epitope u nerastvorljivom tau (Slika 26B).

[0412] Životinje su podvrgnute bihejvioralnoj analizi (Slikas 50A, B, C). Pacovi tretirani peptidom SEQ ID NO: 8 nisu pokazali statistički značajnu razliku u latenciji prelaska u testu hodanja po gredi (p = 0,6) u odnosu na kontrole. Razlika u broju skliznuća zadnjih udova takođe nije statistički značajna (p = 0,49) u odnosu na kontrole. Slično, nije bilo statistički značajne razlike u skoru na NeuroScale (p = 0,9). Prema tome, davanje peptida SEQ ID NO: 8 nije statistički značajno uticalo na motoričke performanse pacovai.

[0413] Ovi rezultati demonstriraju da vakcinacija tau peptidom SEQ ID NO: 8, koji nema sve terapijske epitope (unutar SEQ ID NO:98-101), ne proizvodi: 1) nikakve promene u nerastvorljivom tau u mozgovima imunizovanih pacova na biohemijskom nivou i 2) nikakav efekat na neurobihejvioralnom nivou.

[0414] Efekat peptidne vakcine na količinu NFT u moždanom stablu tretiranih i lažno tretiranih kontrolnih životinja (primili samo adjuvant) je procenjen imunohistohemijom. Rezultati su pokazali da imunoterapija tau peptidom SEQ ID NO: 8 nije smanjila količinu neurofibrilarne klubadi (Slika 51). Tretirane i lažno tretirane kontrolne životinje su razvile skoro identičan broj neurodegenerativnih promena u svim oblastima moždanog stabla, uglavnom u retikularnoj formaciji moždanog stabla što je otkriveno bojenjem pomoću AT8 i DC217.

[0415] Vakcinacija pomoću SEQ ID NO: 8, koja ne obuhvata nijedan kompletan terapijski epitop (SEQ ID NO: 98-101), nije pokazala nikakav blagotvoran efekat u tretiranim životinjama. Prema tome, rezultati imunizacija peptidima SEQ ID NO: 5-8 pokazuju da je prisustvo bar jednog kompletnog terapijskog epitopa (lociranog unutar SEQ ID NO: 98-101) potrebno za željeni pozitivan efekat vakcine - smanjenje tau patologije i poboljšanje u bar jednom neurobihejvioralnom parametru.

[0416] j. SEQ ID NO: 108 tau 294-KDNIKHVPGGGS-305. SHR72 pacovi su imunizovani tau peptidom SEQ ID NO: 108 konjugovanim sa nosačem KLH, formulisanom sa alum adjuvantom i datom u dozi od 100 µg po životinji.

[0417] Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je statistički značajno smanjila nerastvorljiv patološki tau (p< 0,001). Pošto je patologija Alchajmerove bolesti u SHR 72 izazvana patološki nerastvorljivim tau formama (predstavljene pomoću monomera, dimera, oligomera i polimera patološkog tau), uticaj tretmana 12-mernom

11

pasivnom vakcinom SEQ ID NO: 108 na nivoe nerastvorljivog tau je analiziran. Moždana stabla transgenih životinja imunizovanih pomoću odgovarajućeg imunogena i kontrolne grupe imunizovane samim adjuvantom su korišćena za ekstrakciju patološkog tau nerastvorljivog u sarkozilu (kao što je opisano gore). Rezultati kvantitativne imunoblot analize iz grupe transgenih pacova imunizovanih tau peptidom SEQ ID NO: 108 i kontrolne grupe su prikazani na Slikama 52 i 26B. Vakcinacija je statistički značajno smanjila patološki nerastvorljiv tau u imunizovanim životinjama u odnosu na kontrolne transgene pacove koji su primili sam adjuvant (Slika 52). Ovo smanjenje je uočeno u svim analiziranim tau epitopima relevantnim za AD. Imunizacija tau peptidom SEQ ID NO: 108 je indukovala značajno smanjenje nerastvorljivog patološkog tau (p< 0,001; 70%), što je otkriveno merenjima pomoću pan-tau monoklonskog antitela DC25 (Slika 52). Štaviše, analiza pomoću fosfozavisnih mAb DC217 (pThr217) i AT8 (pSer202/pThr205) je otkrila značajno smanjenje nivoa patoloških tau vrsta fosforilisanih na Thr217 (p< 0,001; 96%) i na Ser202/pThr205 (p< 0,05; 98%) u nerastvorljivom tau imunizovanih pacova u odnosu na kontrole (Slika 52). Statistički značajno smanjenje je viđeno i u nivoima nerastvorljivog patološkog tau koji nosi pThr231 (p< 0,05; 97%) i pThr181 (p< 0,05; 94%). Ovi rezultati pokazuju da vakcinom indukovan imuni odgovor dovodi do statistički značajnog smanjenja ranih formi patološkog tau (predstavljenog monomerima, dimerima, oligomerima) i kasnih formi patoloških tau polimera (predstavljenih pomoću PHF).

[0418] Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je statistički značajno poboljšala neurobihejvioralne parametre (p<0,05). Motorička oštećenja su merena skupom standardnim motoričkih testova kombinovanih sa neurološkim ispitivanjem u složen skor na Neuroscale. U dobu od 6,5 meseci, transgeni pacovi SHR72 tretirani tau peptidom SEQ ID NO: 108 su podvrgnuti bihejvioralnim testovima sa ciljem da se odredi efekat imunoterapije. Pacovi tretirani tau peptidnim imunogenom SEQ ID NO: 108 su pokazali značajno smanjene latencije prelaska u testu hodanja po gredi (*p = 0,04) u odnosu na transgene pacove koji su primili sam adjuvant (kontrole) (Slika 53). Slično, pozitivni trend u broju skliznuća zadnjih udova je uočen u vakcinisanoj grupi u poređenju sa transgenim kontrolama tretmana, gde je ova razlika značajna (*p = 0,045, Slika 53). Ukupan skor na Neuroscale je izračunat iz podataka dobijenih u testu hodanja po gredi, testu hvatanja i vuče i neurološkim ispitivanjima (osnovni refleksi, refleks istezanja zadnjih nogu). Imunizacija je značajno popravila skor na Neuroscale pacova tretiranih peptidom SEQ ID NO: 108 u odnosu na kontrolnu tretiranu grupu (*p = 0,047) (Slika 53C). Ukupan skor na Neuroscale je potvrdio neurobihejvioralno poboljšanje tretiranih transgenih pacova u odnosu na netretirane transgene pacove. Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa.

[0419] Neurobihejvioralni parametri su korelisali sa nivoima nerastvorljivog patološkog tau u moždanom stablu tretiranih transgenih životinja. Životinje tretirane vakcinom-peptidom SEQ ID NO: 108 su ispoljile nizak nivo nerastvorljivog patološkog tau, što je povezano sa nižom latencijom prelaska i nižim brojem skliznuća zadnjih udova u poređenju sa kontrolnim tretiranim životinjama. Ovi nalazi pokazuju da smanjenje nerastvorljivog patološkog tau dovodi do statistički značajnih poboljšanja neurobihejvioralnih deficita u grupi transgenih životinja imunizovanih 12-mernim peptidom (SEQ ID NO: 108) u vidu vakcine, pokazujući njihovu terapijsku vrednost.

[0420] Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je dovela do 60% smanjenja količine neurofibrilarne klubadi (NFT). Imunohistohemijska analiza neurofibrilarne tau patologije (neurofibrilarna klubad, NFT) u moždanom stablu je pokazala smanjenje NFT postignuto kod vakcinom tretiranih SHR72 pacova (Slika 54). Broj imunizovanih transgenih pacova sa ekstenzivnim NFT u moždanom stablu u odnosu na adjuvantom tretirane životinje je smanjeno za više od 60%. Imunizacija je smanjila tau patologiju (patološke tau polimere, PHF) u mozgu transgenih životinja imunizovanih pomoću SEQ ID NO: 108 peptidne vakcine.

[0421] Rezultati pokazuju da je imunoterapija tau peptidom SEQ ID NO: 108 efikasno smanjila tau patologiju u SHR72 pacovima. Vakcinacija je dovela do statistički značajnog smanjenja nivoa nerastvorljivog patološkog tau u mozgovima imunizovanih životinja kao i do smanjenja količine neurofibrilarne klubadi.

[0422] (PHF). Smanjenje količine patoloških tau proteina je dovelo do statistički značajnog poboljšanja neurobihejvioralnih parametara tretiranih transgenih pacova. Prema tome, davanje tau peptida SEQ ID NO: 108 ima kapacitet za tretman AD.

PRIMER 21: IMUNOTERAPIJA AD TERAPIJSKIM PEPTIDIMA JE IMUNOGENA I INDUKUJE PROIZVODNJU ANTITELA SPECIFIČNA ZA BOLESTAN TAU U TRANSGENIM PACOVIMA

[0423] a. Posle pet doza tau peptidne vakcine, sprovedena je analiza peptidne imunogeničnosti tretiranih pacova. Serumi iz imunizovanih pacova su korišćeni za određivanje titra antitela. Serumi iz pacova imunizovanih samim adjuvantom su korišćeni kao kontrola. Titri specifičnih antitela na tau su određeni pomoću ELISA, kao što je opisano u Primeru 19. Serijska razblaženja svakog seruma su testirana na AD tauΔ(1-150; 392-441)/4R i rekombinantan tau cele dužine 2N4R, prethodno nanesena na ploče sa mikrotitarskim ležištima. Testirani imunogeni su indukovali proizvodnju specifičnih antitela na tau.

[0424] Na primer, specifična antitela na tau su napravljena posle imunizacije pomoću 275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 4). Antitelaa indukovana tau peptidom SEQ ID NO: 4 su ispoljila približno 3 puta veću aktivnost vezivanja za duplo poremećen tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za tau 2N4R (Slika 55; 1:3200 razblaženje). Ovi rezultati dalje sugerišu da ova vakcina indukuje antitela koja poseduju terapijski potencijal da prepoznaju i eliminišu/neutrališu patološke tau proteine u Alchajmerovoj bolesti.

[0425] Takođe, vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je indukovala formiranje antitela koja se preferencijalno vezuju za patološki tau protein u odnosu na fiziološki tau. Posle pet doza vakcina, urađena je analiza imunogeničnosti u svakom od vakcinisanih pacova. Životinje su krvarile dve nedelje posle poslednje buster doze i sakupljeni serumi su korišćeni za određivanje geometrijske sredine titra antitela (GMT). Titri specifičnog antitela na tau su određeni pomoću ELISA, kao što je opisano u Primeru 19. Serijska razblaženja (1: 100 do 1:51200) svakog seruma su testirana na patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R i fiziološki tau 2N4R, korišćen kao čvrsta faza. Titri su definisani kao recipročne vrednosti razblaženja seruma koji daje polovinu maksimuma optičke gustine (apsorbance). Da bi se izračunala geometrijska sredina titara antitela, čitanjima titra manjim od 100 je dodeljena vrednost 10. Kao što je pokazano na Slici 56, titar antitela na patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R (GMT 12800) je tri puta viši nego onaj cele dužine tau 2N4R (GMT 4200). Titri antitela su takođe mereni u odnosu na nekonjugovan peptid SEQ ID NO: 108 korišćenjem metodologije opisane u Primeru 19. Slika 56 pokazuje da su najviši titri antitela generisani u odnosu na tau peptid SEQ ID NO: 108 (GMT 20800). Nisu uočeni nikakvi odgovori antitela u transgenim pacovima imunizovanim samo pomoću adjuvanta (GMT 10; podaci nisu prikazani). Vakcinacija peptidom SEQ ID NO: 108, koji nosi DC8E8 epitop br. 2 (unutar

11

SEQ ID NO: 99) je indukovala antitela koja preferencijalno prepoznaju patološki tau protein, na taj način diskriminišući patološki tauΔ(1-150;392-441/4R) od fiziološkog tau 2N4R. Štaviše, rezultati su pokazali da je SEQ ID NO: 108 imunogena i, prema tome, poseduje terapijski potencijal da eliminiše patološke tau proteine u Alchajmerovoj bolesti.

[0426] Štaviše, vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je preferencijalno indukovala formiranje IgG izotipova antitela specifičnih za patološki tau. Da bi se odredili specifični izotipovi antitela proizvedeni kao odgovor na peptid SEQ ID NO: 108, serumi iz pacova imunizovane i kontrolne grupe su serijski razblaženi od 1:100 do 1:12800 i testirani u duplikatu pomoću ELISA (kao što je opisano u Primeru 19) na patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R. Da bi se detektovali pacovski IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c i IgM izotipovi, potklasa specifičnih anti-pacovskih sekundarnih antitela konjugovanih sa HRP je razblažena 1:5000 u PBS (Pierce, anti IgG1- PA1-84708, anti IgG2a - PA1-84709, anti IgG2b - PA1-84710, anti-IgG2c-PA1-84711 i anti-IgM - PA1-84712). Slika 57 pokazuje rezultate za reprezentativno 1:800 razblaženje. Podaci demonstriraju da je peptid SEQ ID NO: 108 konjugovan sa KLH indukovao širok spektar izotipova antitela na tau. Vakcina je generisala visoke nivoe izotipova antitela (IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG2c), za koje se smatra da su antitela visokog afiniteta. Nasuprot tome, izotipski profil je pokazao vrlo niske nivoe IgM antitela. Za ove se smatra da imaju nizak afinitet prema antigenu. Prisustvo visokih titara IgG antitela sa preferencijalnim afinitetom prema patološkom tau ukazuje da je imuni odgovor indukovan vakcinom usmeren protiv vrsta patološkog tau. Kontrolni serumi dobijeni iz lažno imunizovanih pacova (koji su primili sam adjuvant) su bili negativni.

[0427] Ovi podaci su dalje korišćeni za određivanje polarizacije (Th1/Th2 fenotip) imunog odgovora. Nivoi IgG1 i IgG2a izotipa indukovani imunizacijom indirektno sugerišu doprinose imunom odgovoru Th1 citokina prema Th2 citokinima. U opštem slučaju, proizvodnja IgG1 antitela je indukovana Th2 citokinima, a proizvodnja IgG2a antitela je indukovana Th1 citokinima. Prema tome, odnos IgG1 i IgG2a izotipa je izračunat deljenjem OD vrednosti za IgG1 OD vrednostima za IgG2a. Ovi podaci sugerišu (odnos = 0,625) da je imuni odgovor malo pomeren ka Th1 fenotipu.

[0428] b. Praćenje u realnom vremenu događaja vezivanja pomoću površinske plazmonske rezonance je omogućilo merenje kinetičke brzine asocijacije (kON) i disocijacije (kOFF) antitela iz objedinjenih seruma pacova imunizovanih tau peptidom 275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304 (SEQ ID NO: 4). Analiza je pokazala razliku u prepoznavanju tauΔ(1-150;392-441)/4R i fiziološke tau izoforme 2N4R (Slika 58). Antitela indukovana imunizacijom su ispoljila preferencijalan afinitet za tauΔ(1-150;392-441)/4R, veziujući ovaj tau protein sa tri puta većim afinitetom za skraćeni AD tau u odnosu na njihov afinitet za odgovarajuću izoformu cele dužine 2N4R. Određeno je da je ova razlika u vezivanju delimično zbog približno pet puta veće brzine kONza tauΔ(1-150;392-441)/4R (podaci nisu prikazani).

[0429] c. Da se dalje odredi specifičnost antitela indukovanih u pacovima imunizovanim pomoću terapijskih tau peptida, antiserumi se mogu koristiti za imunohistohemijsko bojenje zamrznutih preseka hipokampusa iz humanog mozga sa AD. Na primer, antitela indukovana posle imunizacije pomoću SEQ ID NO: 4 su procenjena ovim testom. Hipokampus iz humanog mozga sa AD je fiksiran pomoću 4% paraformaldehida na 4°C 2 dana, a zatim je a tretiran 25% saharozom 72 sata da bi se obezbedila kriozaštita. Materijal je zatim zamrznut u hladnom 2-metilbutanu (-42°C) 30 sekundi i isečen na kriomikrotomu. Kružni preseci (40 µm) su isečeni u kriostatu na -18°C. Slobodno plutajući preseci su korišćeni za

11

imunohistohemijski studije. Slobodno plutajući preseci tkiva su tretirani hladnom (+4°C) 99% mravljom kiselinom 1 min. na sobnoj temperaturi (25°C). Preseci mozga su inkubirani 20 minuta na sobnoj temperaturi u 0,01 M PBS, pH 7,4, sa 0,3% Triton X-100 i 1% H2O2, a zatim 30 minuta u rastvoru za blokiranje (0,01 M PBS, sa 0,3% Triton X-100, 1% konjski serum), a zatim preko noći sa serumima iz transgenih pacova imunizovanih pomoću vakcine koja sadrži peptid SEQ ID NO: 4 (razblažen 1:1000) na 4°C. Posle pranja, preseci su imuno bojeni standardnim metodom avidin biotin peroksidaza (ABC Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Reacioni proizvod je vizualizovan pomoću avidin-biotin i Vector VIP kao hromogen (Vector Laboratories). Preseci su onda ispitani pod mikroskopom Olympus BX 51. Imunohistohemijsko bojenje je pokazalo da antitela indukovana imunizacijom peptidom SEQ ID NO: 4 specifično prepoznaju patološke tau strukture, tj. neurofibrilarne lezije u hipokampusu mozga sa Alchajmerovom bolešću (Slike 59A, B). Serumi iz kontrolnih pacova, koji su primili sam adjuvant, su korišćeni kao negativna kontrola i oni nisu prepoznali nikakvu neuronsku patologiju (podaci nisu prikazani).

[0430] Vakcinacija transgenih pacova SHR72 tau peptidom SEQ ID NO: 108 je indukovala antitela koja prepoznaju patološke tau proteine u presecima iz humanih moždanih tkiva sa Alchajmerovom bolešću. Za dalje određivanje specifičnosti antitela indukovanih u pacovima imunizovanim terapijskim tau peptidom SEQ ID NO: 108, njihovi serumi su korišćeni za imunohistohemijsko bojenje entorinalnog korteksa korišćenjem zamrznutih preseka humanog mozga sa AD (Braak-ov stadijum VI). Slobodno plutajući preseci tkiva su inkubirani sa serumima (razblaženi 1:1000) iz imunizovanih transgenih pacova na 4°C. Pojedinačni serumi iz životinja vakcinisanih sa SEQ ID NO: 108 su korišćeni zasebno, dok su serumi iz životinja vakcinisanih samo adjuvantom objedinjeni. Posle imunobojenja standardnim metodom avidin biotin peroksidaza (ABC Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA), preseci su ispitani pod mikroskopom Olympus BX51. Imunohistohemijsko bojenje je pokazalo da su antitela indukovana imunizacijom peptidom SEQ ID NO: 108 specifično prepoznala patološke tau strukture, tj. neurofibrilarne lezije u entorinalnom korteksu mozga sa Alchajmerovom bolešću. Slika 60 (A-E) pokazuje reprezentativno imunobojenje pomoću pacovskih seruma sakupljenih iz pet vakcinisanih transgenih pacova SHR72. Serumi životinja vakcinisanih pomoću SEQ ID NO: 108 su dekorisali neurofibrilarnu patologiju vrlo intenzivno, potvrđujući da antitela efikasno ciljaju patološke tau proteine. Serumi iz kontrolnih pacova, koji su primili sam adjuvant, su korišćeni kao negativne kontrole. Oni nisu prepoznali nikakvu neurofibrilarnu patologiju (Slika 60F).

[0431] Antitela koja indukuje SEQ ID NO: 108 vakcina prepoznaju patološke tau proteine ekstrahovane iz mozgova SHR72 i iz humanih mozgova sa AD. Specifičnost seruma iz pacova imunizovanih tau peptidom SEQ ID NO: 108 je dalje ispitana na patološkim formama rastvorljivog i nerastvorljivog patološkog tau imunoblot metodom (kao što je opisano u Primeru 19). Moždana stabla SHR72 pacova u kasnom stadijumu patologije su korišćena za ekstrakciju rastvorljivih i nerastvorljivih patoloških tau proteina. Temporalni korteks humanog mozga sa AD (Braak-ov stadijum VI; dobijen od Holandske banke mozga, Holandija) je korišćen za ekstrakciju humanog patološkog AD tau. Rastvorljivi i nerastvorljivi patološki tau proteini su dobijeni istim metod kao što je opisano u Primeru 8. Za rastvorljive tau frakcije, 15 µg ukupnih proteina je naneseno po traci. Za nerastvorljive tau frakcije, talog je rastvoren u 1x natrijum dodecil sulfatnom (SDS) puferu za nanošenje uzorka (Laemmli, 1970) u 1/50 zapremine rastvorljive frakcije korišćene za dobijanje nerastvorljive tau frakcije i jednaka zapremina je naneta na SDS-PAGE. Objedinjeni serumi iz imunizovanih životinja su razblaženi 1:1000 u PBS i korišćeni kao primarno antitelo. Inkubacija sa primarim antitelom je praćena poliklonskim zečjim anti-pacovskim imunoglobulinima konjugovanim sa

11

peroksidazom rena (1:3000; Dako, Glostrup, Danska). Western blot signal je digitalizovan pomoću LAS3000 CCD imidžing sistema (Fujifilm, Japan). Rezultati ove imunoblot analize su pokazani na Slici 61.

[0432] Rezultati (Slika 61) pokazuju da antitela generisana na peptid koji nosi DC8E8 epitop 2 (SEQ ID NO: 99) prepoznaju patološke tau proteine ekstrahovane iz SHR72 i iz tkiva mozgova sa AD. Indukovana antitela su prepoznala monomerne forme patološkog tau (staza br.1, 2 i br.3) kao i oligomerne forme patološkog tau (staza br.2 i br.3) uključujući A68 tau triplet karakterističan za AD. Ovi nalazi imaju ključan impakt na imunoterapiju koja koristi pacovski model Alchajmerove bolesti. Antitela visokog afiniteta generisana vakcinom ciljaju sve forme patoloških tau proteina. Ona ciljaju monomerne forme patoloških tau proteina i, prema tome, sprečavaju interakcije (oligomerizaciju) patološkog tau dovodeći do smanjenja nivoa nerastvorljivog tau u vakcinisanim pacovima i posledično, do poboljšanja neurobihejvioralnih parametara. Generisana antitela se takođe vezuju za oligomerne forme patološkog tau i ciljaju ih za degradaciju, npr. pomoću mikroglija, kao što je opisano u Primeru 10 za mAb DC8E8.

PRIMER 22: IMUNOTERAPIJA AD TERAPIJSKIM PEPTIDIMA INDUKUJE PROIZVODNJU ANTITELA SPECIFIČNIH ZA BOLESTAN TAU U MIŠEVIMA

[0433] Peptidi SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110 (SEQ ID NO: 88 odgovara SEQ ID NO: 110 plus dodatni N-kraj Cys za konjugaciju), SEQ ID NO: 111, i SEQ ID NO: 112, koji nose jedan od terapijskih epitopa u okviru ili SEQ ID NO: 100 ili 101, su indukovali proizvodnju antitela u imunizovanim miševima. Dobijena antitela pokazuju statistički značajno veću aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R.

SEQ ID NO: 109 Tau 314-DLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSE-342

SEQ ID NO: 110 Tau 352-SKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFREN-381

SEQ ID NO: 111 Tau 325-LGNIHHKPGGGQ-336

SEQ ID NO: 112 Tau 357-LDNITHVPGGGN-368

SEQ ID NO: 100 Tau 329-HHKPGGG-335

SEQ ID NO: 101 Tau 361-THVPGGG-367

[0434] Zaista, sa ciljem da se dalje odredi imunogeni potencijal peptida koji nose jedan ili više terapijskih DC8E8 epitopa (npr., unutar 7-mera: SEQ ID NO: 100 i SEQ ID NO: 101), dizajnirani su peptidi dugi 12 i 30 aminokiselina (SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112) koji nose jedan od DC8E8 terapijskih epitopa. Tau peptidi SEQ ID NO: 109 (30 aminokiselina) i SEQ ID NO: 111 (12 aminokiselina) u sebi sadrže terapijski epitop u SEQ ID NO: 100. Tau peptidi SEQ ID NO: 110 (30 aminokiselina) i SEQ ID NO: 112 (12 aminokiselina) u sebi sadrže terapijski epitop u SEQ ID NO: 101. Peptidi su konjugovani sa KLH preko njihovog N-terminalnog Cys ostatka kao što je opisano u Primerima 18-19. Vakcine za imunizacije su dobijene sa peptid-KLH konjugatima, koji sadrže po 100 µg konjugovanog peptida, u 100 µl PBS i emulzifikovani su 1:1 (zapreminski) pomoću Freund-ovog adjuvanta u konačnoj zapremini doze od 200 µl. Pet Balb/c miševa je korišćeno po grupi za tretman. Prva imunizacija je urađena upotrebom peptid-konjugata u PBS formulisanog sa Freund-ovim kompletnim adjuvantom. Dve sledeće imunizacije, u dvonedeljnim intervalima, su izvedene upotrebom peptid-konjugata u PBS formulisanog sa Freund-ovim nekompletnim adjuvantom. Kao kontrola, korišćena je vakcina koja sadrži samo adjuvant. Serumi su sakupljeni 10 dana posle poslednje imunizacije i odgovor antitela je meren pomoću ELISA kao što je opisano u Primeru 19. Serumi iz pojedinačnih miševa su

11

serijski razblaženi od 1:100 do 1:12800 i testirani u duplikatu. Da bi se odredila specifičnost seruma, patološki tauΔ(1-150;392-441/4R) i fiziološki tau 2N4R su korišćeni kao čvrsta faza. Slike 62 do 65 pokazuju rezime rezultata za serume pri razblaženju 1:800. Rezultati ELISA-e su statistički evaluirani pomoću Mann-Whitney neparametrijskog testa.

[0435] Svi testirani peptidi su generisali tau-specifična antitela u imunizovanim miševima. Antitela indukovana vakcinacijama tau peptidima SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112 su ispoljila statistički značajno veću aktivnost vezivanja za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (Slika 62-65). Štaviše, skraćivanje peptida od 30 aminokiselina (SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110) do 12 aminokiselina (SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112) je dovelo do značajno veće proizvodnje specifičnih antitela, koja preferencijalno prepoznaju patološki tau (SEQ ID NO: 109, p=0,0115; SEQ ID NO: 110, p=0,0029; SEQ ID NO: 111, p=0,0007; SEQ ID NO: 112, p<0,001). Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da su peptidi SEQ ID NO: 109 i SEQ ID NO: 111 (koji nose terapijski epitop unutar SEQ ID NO: 100) i peptidi SEQ ID NO: 110 i SEQ ID NO: 112 (koji nose terapijski epitop unutar SEQ ID NO: 101) imunogeni i da poseduju terapijsko dejstvo ciljanja patoloških tau proteina prisutnih u mozgovima pacijenata koji pate od Alchajmerove bolesti.

PRIMER 23: IDENTIFIKACIJA KREIRANIH PEPTIDA (KREIRANIH TERAPIJSKIH EPITOPA) SPOSOBNIH DA BUDU U KOMPETICIJI SA PATOLOŠKIM TAU ZA VEZIVANJE ZA BAR JEDAN DC8E8 EPITOP.

[0436] Dva dodatna peptida (11-meri) su dizajnirana na osnovu konzervisanih aminokiselinskih ostataka između epitopa #1 (unutar KHQPGGG, SEQ ID NO: 98), #2 (unutar KHVPGGG, SEQ ID NO: 99), #3 (unutar HHKPGGG, SEQ ID NO: 100) i #4 (unutar THVPGGG, SEQ ID NO: 101). U njihovom dizajnu, pet ostataka koji doprinose vezivanju DC8E8 za ove epitope je ostavljeno fiksirano: histidin, prolin i tri glicinska ostatka u sekvenci HxPGGG (SEQ ID NO: 164). Peptidi su sintetisani od EZBiolabs (USA) sa čistoćom višom od 85%. Dva kreirana terapijska epitopa su GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251).

[0437] Ovi peptidi su analizirani za njihovu sposobnost da budu u kompeticiji sa patološkim tau pomoću kompeticione ELISA. ELISA ploče (IWAKI jako vezujuća ploča, #3801-096, Bertoni GmbH, Austrija) su obložene sa po 100 µl/ležište 5 µg/ml rekombinantnog prečišćenog tauΔ(1-150:392-441)4R u PBS preko noći na 4°C. Obložene ELISA ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20 (fosfatom-puferisan slani rastvor obogaćen sa 0,05% v/v Tween 20) i blokirane pomoću PBS/Tween 20 2 h na 25°C. Svaki od peptida je zasebno rastvoren u PBS u konačnoj koncentraciji od 5 mM. Napravljena su serijska dvostruka razblaženja peptida u PBS/Tween 20 u polipropilenskim pločama (Greiner, #651201) (opseg koncentracije 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM i 2,5 µM). Po 100 µl svakog razblaženja peptida je pomešano sa po 100 µl 2 µg/ml prečišćenog DC8E8 monoklonskog antitela (prečišćavanje je urađeno kao što je opisano u Primeru 5). Dobijenih 200 µl smese je zatim sadržalo 1 µg/ml DC8E8 antitela i 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM i 1,25 µM peptida. tauΔ(1-150;392-441)4R je uključen kao pozitivna kontrola. Smese antitelo/peptid su inkubirane 1 hr na 25°C na rotirajućoj platformi podešenoj na 250 rpm. Sto mikrolitara smesa antitelo/peptid je zatim prebačeno na pripremljene ELISA ploče i inkubirano 1 hr na 25°C na rotirajućoj platformi podešenoj na 250 rpm. ELISA ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20. ELISA ploče su zatim inkubirane sa 100 µl poliklonskih kozjih anti-mišjih imunoglobulina / HRP (Dako, #P0447) razblaženog 1:4000 u PBS/Tween 20 i inkubirano 1

11

hr na 25°C na rotirajućoj platformi podešenoj na 250 rpm. ELISA ploče su oprane 4 puta PBS/Tween-om 20. ELISA ploče su zatim inkubirane sa 100 µl 1,5mg/2ml o-PDA (ofenilenediamin, SIGMA, P1526) u 0,1 M Na-acetatu pH=6,0 (Roth, #6779) obogaćenom sa 1,5µl/2ml 30% H2O2(SIGMA, H-0904) 10 minuta na 25°C u mraku. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 2M H2SO4(Merck, 1.00731.1000). Razvijen signal je meren čitanjem na 490 nm (npr. pomoću Victor Multilabel Counter (Wallac)).

[0438] Dva kreirana peptida, naime, GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), su oba u stanju da budu u kompeticiji sa tauA(1-150;392-44)4R za vezivanje za DC8E8 (Slika 66). Peptid GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250), nazvan kreirani terapijski epitop 1, pokazuje najsličniji afinitet prema DC8E8 sa tauΔ(1-150;392-441)4R. Afinitet peptida SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), nazvanog kreirani terapijski epitop 2, za DC8E8 je više nego za jedan red veličine veći od afiniteta bolesnog tau (tauΔ(1-150;392-441)4R prema ovom antitelu.

PRIMER 24: IN VIVO TESTIRANJE IMUNOGENIČNOSTI I SPECIFIČNOSTI IMUNOG ODGOVORA KREIRANIH TERAPIJSKIH EPITOPA 1 i 2.

[0439] Kreirani terapijski epitop 1 (GWSIHSPGGGSC, SEQ ID NO: 250) i kreirani terapijski epitop 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) su konjugovani sa KLH preko njihovih C-terminalnih Cys ostataka (kao što je opisano u Primeru 18) i korišćeni za imunizaciju Balb/c miševa. Tri miša su korišćena za svaki kreirani terapijski epitop. Imunizacije su rađene na sledeći način. Vakcine za imunizacije su pripremljene sa kreiranim terapijskim epitop-KLH konjugatima, koji sadrže po 100 µg konjugovanog peptida 100 µl PBS i emulzifikovane 1:1 (vol/vol) pomoću Freund-ovog adjuvanta u konačnoj zapremini doze od 200 µl. Prva imunizacija je rađena sa konjugatom kreirani terapijski epitop-KLH u PBS formulisanim sa Freund-ovim kompletnim adjuvantom. Četiri sledeće imunizacije, u četvoronedeljnim intervalima, su izvedene upotrebom konjugata kreirani terapijski epitop-KLH u PBS formulisanim sa Freund-ovim nekompletnim adjuvantom. Za kontrolu imunizacije, korišćen je PBS umesto konjugata kreiranog terapijskog epitopa. Serumi su dobijeni 14 dana posle poslednje imunizacije.

[0440] 1. Antitela razlikuju patološki tau. Za određivanje specifičnosti seruma, dva tau proteina su korišćena: rekombinantan patološki tauΔ(1-150;392-441)4R i fiziološki tau 2N4R. Serumi iz svakog miša su serijski razblaženi od 1:100 do 1:12800 i testirani u triplikatu. Titri antitela su određeni pomoću poliklonskih kozjih anti-mišjih imunoglobulina/ HRP (Dako, #P0447) razblaženih 1:4000. Slika 67 pokazuje reprezentativne rezultate za razblaženje 1:3200.

[0441] Oba kreirana terapijska epitopa su generisala visok imuni odgovor u imunizovanim miševima. Pored toga, oba testirana kreirana terapijska epitopa su indukovala antitela koja prepoznaju patološki tauΔ(1-150:392-441)4R sa većim afinitetom nego fiziološki Tau 2N4R (Slika 67). Ova diskriminacija je statistički značajnan za serume iz svih imunizovanih životinja. Sve u svemu, i u kombinaciji sa rezultatima dobijenim sa aktivnošću uočenom sa DC8E8, ovi rezultati pokazuju da su oba kreirana terapijska epitopa 1 i 2 imunogena i indukuju odgovor antitela sa terapijskim potencijalom da ciljaju patološke tau proteine u mozgovima pacijenata sa Alchajmerovom bolešću.

[0442] 2. Izotip antitela: Da bi se odredili specifični izotipovi antitela proizvedenih u odgovor na ove kreirane terapijske epitope 1 i 2, serumi iz miševa iz iste grupe su objedinjeni, serijski

12

razblaženi od 1:100 do 1:12800 i testirani u triplikatu pomoću ELISA za izotip antitela. Da bi se detektovali mišji izotipovi IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3, korišćena je potklasa specifičnih anti-pacovskih sekundarnih antitela konjugovanih sa HRP (antitela kupljena od Lifespan Biosciences, anti IgG1 - #LS-C59107, anti IgG2a - # LS-C59112, anti IgG2b - #LS-C59117, anti-IgG3 - #LS-C59125 i anti-IgM - #LS-C55875). Antiserumi dobijeni iz kontrolnih miševa su negativni. Slika 68 pokazuje reprezentativne rezultate za razblaženje 1:800. Podaci dobijeni sa objedinjenim serumima su demonstrirali da je imunizacija sa oba testirana kreirana terapijska epitopa indukovala širok spektar izotipova antitela na tau i da je izotipski profil vrlo sličan u svim testovima. Oba kreirana terapijska epitopa su generisala uglavnom IgG1 antitela u poređenju sa IgG2a, IgG2b i IgG3 odgovorima. (Slika 68).

[0443] 3. Kreirani terapijski epitopi indukuju odgovor antitela statistički visoko značajno diskriminišući patološki od fiziološkog tau. Analiza afiniteta antitela generisanih na kreirane terapijske epitope je urađena površinskom plazmonskom rezonancom na BIACORE3000 korišćenjem CM5 senzorskog čipa (Biacore AB, Uppsala) kao što je opisano u Primerima 5 i 19. U svakom ciklusu analize, mišji antiserum protiv ili GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250), kreiranog terapijskog epitopa 1 (razblaženog 100 puta) ili SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), kreiranog terapijskog epitopa 2 (razblaženog 100 puta), (objedinjeni antiserumi iz 3 miša), je uhvaćen u analitičku protočnu ćeliju da bi dostigao nivo imobilizacije od ∼ 950 RU, što se približavalo zasićenju. Kao referenca, irelevantno antitelo Rab50 (Macikova et al., 1992), koje ne vezuje tau, je uhvaćeno u referentnu protočnu ćeliju. Za određivanja KA, kao i za određivanje konstanti kinetičkih brzina kONi KOFF, 100 nM rastvori ili patološkog tauΔ(1-150:392-441)4R ili fiziološkog Tau 2N4R, su injektirani pri brzini protoka od 100 µl/min preko senzorskog čipa.

[0444] Antitela indukovana vakcinacijom pomoću kreiranih terapijskih epitopa 1 i 2 su diskriminisala patološki tauΔ(1-150:392-441)4R od fiziološkog Tau 2N4R (Slika 69A i 69B). Afinitet antitela prisutnih u antiserumu na kreirani terapijski epitop 1 (GWSIHSPGGGSC, SEQ ID NO: 250) je meren površinskom plazmonskom rezonancom; ispoljila su skoro 50 puta veći afinitet za patološki tau nego za fiziološki tau, što je statistički visoko značajno (p<0,001). Afinitet antitela prisutnih u antiserumu na kreirani terapijski epitop 2 (SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251) measured površinskom plazmonskom rezonancom, ispoljila su skoro 15 puta veći afinitet za patološki tau nego za fiziološki tau, što je statistički visoko značajno (p<0,01).

[0445] 4. Kreirani terapijski epitopi indukuju odgovor antitela koja prepoznaju patološke tau vrste u humanom mozgu sa AD. Da bi se odredila specifičnost antitela generisanih u miševima imunizovanim pomoću kreiranih terapijskih epitopa, urađeno je imunohistohemijsko bojenje na zamrznutim presecima humanog mozga sa AD.

[0446] Uzorci humanog moždanog tkiva sa AD (entorinalni korteks, AD Braak VI, obezbeđen od Holandske banke mozga) su fiksirani pomoću 4% paraformaldehida u PBS na 2 dana na 4 °C, a zatim kriozaštićeni (25% saharoza), zamrznuti u hladnom 2-metilbutanu (-42°C) i isečeni na kriotomu. Slobodno plutajući preseci tkiva (40 µm) su tretirani hladnom (4°C) 99% mravljom kiselinom 1 min na sobnoj temperaturi (25°C). Preseci su imunoobojeni standardnim metodom avidin biotin peroksidaza (ABC Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Mišji antiserumi na kreirani terapijski epitop 1 (SEQ ID: 250) i kreirani terapijski epitop 2 (SEQ ID NO: 251), svaki objedinjen iz po 3 imunizovana miša, su razblaženi 1:2000 u rastvoru za blokiranje (5% goveđi serum albumin, 0,3 % Triton X-100 u PBS). Preseci su ispitani pod mikroskopom Olympus BX 51.

[0447] Imunohistohemijsko bojenje je pokazalo da su mišji imunoserumi, generisani na oba kreirana terapijska epitopa GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) i SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251), specifično prepoznali patološke tau strukture, tj. neurofibrilarnu klubad i neuropilne niti, u entorinalnom korteksu mozga sa Alchajmerovom bolešću (Slika 70A-D). Antiserumi protiv kreiranog terapijskog epitopa 1 i kreiranog terapijskog epitopa 2 nisu prepoznali normalan tau u kontrolnom humanom mozgu. (Slika 70E, F).

[0448] 5. Kreirani terapijski epitop 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) indukuje odgovor antitela koji prepoznaje patološke tau vrste u mozgovima transgenih pacovskih modela Alchajmerove bolesti. Da bi se odredila specifičnost antitela generisanih u miševima imunizovanim pomoću kreiranih terapijskih epitopa, urađeno je imunohistohemijsko bojenje na presecima mozga transgenih pacova SHR72 u parafinu.

[0449] Transgeni pacovi soja SHR72 (7 meseci stari) su perfuzionisani transkardijalno PBS-om 1 minut u dubokoj anesteziji, a zatim sa 100 ml 4% paraformaldehida (pH 7,4). Posle perfuzije, glava je odsečena i mozak je brzo uklonjen. Mozak je isečen sagitalno na dve hemisfere iste veličine skalpel nožićem za jednokratnu upotrebu. Moždana tkiva su zatim fiksirana u 4% paraformaldehidu, uronjena u parafin i isečena na preseke na mikrotomu. Imunohistohemija i histopatologija su urađene na presecima tkiva od 8 µm uronjenim u parafin. Preseci tkiva su prethodno tretirani 20 min rastvorom koji demaskira antigen (Vector laboratories, CA, USA) i 1 min hladnom (+4°C) 90% mravljom kiselinom (Applichem, Nemačka), na sobnoj temperaturi (25°C). Posle blokiranja, preseci su inkubirani preko noći sa serumom generisanim protiv kreiraniog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) koji je razblažen 1:1000 u rastvoru za blokiranje (5% goveđi serum albumin, 0,3 % Triton X 100 u 50 nM Tris-HCl). Posle pranja, preseci su inkubirani sa biotinilovanim sekundarnim antitelom (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) na sobnoj temperaturi jedan sat, a zatim su reagovali sa kompleksom avidin-biotin peroksidaza 60 minuta (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories), na sobnoj temperaturi (25°C). Imunoreakcija je vizualizovana pomoću kompleta sa supstratom peroksidaze (Vector VIP, Vector laboratories, Ca, USA). Preseci su ispitani pod mikroskopom Olympus BX71.

[0450] U transgenom pacovskom mozgu (SHR72), serum koji je generisan protiv kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) je prepoznao neurofibrilarnu klubad (Slika 70G). U mozgovima kontrolnih pacova sparenih po starosti antitelo nije bojilo neuronske ćelije (Slika 70H).

[0451] Serum koji je generisan protiv kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251) je prepoznao oligomerni stadijum tau pre klubadi (Slika 70I), kao i unutarćelijsku neurofibrilarnu klubad (Slika 70J).

[0452] 6. Antitela indukovana kreiranim terapijskim epitopima 1 i 2 prepoznaju rastvorljiv i nerastvorljiv patološki tau u humanom mozgu sa AD: patološki tau rastvorljiv i nerastvorljiv u sarkozilu je izolovan iz humanog temporalnog korteksa sa Alchajmerovom bolešću (dobijen od od Holandske banke mozga) i analiziran pomoću imunoblotinga, kao što je opisano u Primeru 8.

[0453] Membrana koja sadrži frakcije rastvorljivog i nerastvorljivog patološkog tau proteina je inkubirana ili sa supernatantom DC8E8 hibridoma razblaženim 1:1 sa 5% nemasnim suvim mlekom u PBST ili sa objedinjenim mišjim antiserumima generisanim protiv kreiranog terapijskog epitopa 1 (SEQ ID NO: 250, GWSIHSPGGGSC) ili sa objedinjenim mišjim antiserumima generisanim protiv kreiranog terapijskog epitopa 2 (SVFQHLPGGGSC, SEQ ID NO: 251), gde su oba objedinjen antiseruma razblažena 1:100 u 5 % nemasnom suvom mleku u PBST. Membrane su oprane, a zatim inkubirane sa peroksidaza-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG (DAKO, Danska) razblaženim 1:4000. Blotovi su razvijeni pomoću SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, U.S.A) i detektovani pomoću LAS3000 imidžing sistema (FUJI Photo Film Co., Japan). Intenziteti signala su kvantifikovani pomoću softvera AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Nemačka).

[0454] Rezultati ove imunoblot analize su prikazani na Slici 71. Ovi rezultati pokazuju da antitela generisana na oba kreirana terapijska epitopa 1 (tj., GWSIHSPGGGSC) (SEQ ID NO: 250) i 2 (tj. SVFQHLPGGGSC) (SEQ ID NO: 251) prepoznaju iste patološke tau proteine kao DC8E8. Svi GWSIHSPGGGSC (SEQ ID NO: 250) antiserumi, SVFQHLPGGGSC (SEQ ID NO: 251) antiserumi i DC8E8 antitelo su specifično prepoznali patološke tau proteine prisutne u rastvorljivim i nerastvorljivim u sarkozilu tau frakcijama izolovanim iz moždanih tkiva sa AD (Slika 71).

[0455] 7. Antitela indukovana kreiranim terapijskim epitopima 1 i 2 prepoznaju rastvorljiv i nerastvorljiv patološki tau u mozgovima tau transgenih pacova. Patološki tau rastvorljiv i nerastvorljiv u sarkozilu je izolovan iz tau transgenih pacovskih mozgova (SHR72 linija opisana u Primeru 7) kao što je opisano u Primeru 8.

[0456] Rezultati imunoblot analize (opisani u Primeru 8) su prikazani na Slici 72. Ovi rezultati pokazuju da antitela indukovana kreiranim terapijskim epitopima 1 (tj., GWSIHSPGGGSC) (SEQ ID NO: 250) i 2 (tj. SVFQHLPGGGSC) (SEQ ID NO: 251) prepoznaju iste patološke tau proteine kao DC8E8 (Slika 72). Ciljanje monomerih i oligomerih patoloških tau proteina sprečava stvaranje patoloških agregata tau što dovodi do smanjene tau patologije vodeći ka terapijskom efektu i lečenju AD kod ljudi.

PRIMER 25: IN VIVO EFIKASNOST KREIRANIH TERAPIJSKIH EPITOPA U TRANSGENIM PACOVIMA KOJI MODELUJU AD

[0457] Imunoterapija kreiranim terapijskim epitopima je pokazala poboljšanje u neurobihejvioralnim parametrima tretiranih pacova. Kreirani terapijski epitop 2 (SEQ ID NO: 251) je odabran za imunoterapiju transgenih pacova SHR 72. Pacovi su imunizovani subkutano dozama vakcine koja sadrži kreirani terapijski epitop 2 (SEQ ID NO: 251) konjugovan sa KLH kombinovanim sa Adju-phos adjuvantom. Vakcine su dobijene kao što je opisano u Primeru 18. Jedna doza sadrži 100 µg konjugovanog kreiranog terapijskog epitopa 2. Složeno motoričko oštećenje je mereno skupom standardnih motoričkih testova kombinovanih sa neurološkim ispitivanjem u složen skor - Neuroscale. U dobu od 6,5 meseci, transgeni pacovi SHR72 tretirani vakcinom koja sadrži kreirani terapijski epitop 2 (SEQ ID NO: 251) su podvrgnuti bihejvioralnim testovima sa ciljem da se odredi efekat imunoterapije.

[0458] Pacovi tretirani kreiranim terapijskim epitopom 2 (SEQ ID NO: 251) su pokazali smanjene latencije prelaska u testu hodanja po gredi za 27% u odnosu na transgene kontrolne pacove koji su primili sam adjuvant (Slika 73A). Broj skliznuća zadnjih udova je statistički značajno smanjen (p<0,05) za 44% u vakcinisanoj grupi u poređenju sa transgenim kontrolama (Slika 73B). Skor na Neuroscale je izračunat iz vrednosti dobijenih u testu hodanja po gredi, testu hvatanja i vuče i neurološkim ispitivanjima (osnovni refleksi,

12

ekstenzioni refleks istezanja zadnjih nogu). Imunizacija je značajno popravila skor na Neuroscale pacova tretiranih peptidom SEQ ID NO: 251 by 26% u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 73C). Ukupan Neuroscale skor je potvrdio neurobihejvioralno poboljšanje tretiranih transgenih pacova u odnosu na netretirane transgene pacove. Svi statistički podaci su dobijeni primenom neparametrijskog Mann-Whitney U-testa.

[0459] Imunoterapija kreiranim terapijskim epitopom 2 je pokazala statistički značajno smanjenje (p<0,05) patološkog tau u mozgovima tretiranih transgenih pacova sa Alchajmerom. Da bi se potvrdio efekat imunizacije kreiranim terapijskim epitopom 2 (SEQ ID NO: 251) na nivoe nerastvorljivog patološkog tau, koristili smo imunoblot analizu uzoraka pacovskog mozga. Moždano tkivo (moždano stablo) transgenih životinja imunizovanih kreiranim terapijskim epitopom 2 (SEQ ID NO: 251) i kontrolne grupe transgenih životinja imunizovane pomoću samog adjuvanta je korišćeno za dobijanje frakcije tau nerastvorljivog u sarkozilu kao što je opisano u Primeru 8. Imunoblot analiza je rađena kao što je opisano u Primeru 19. Statistička analiza je rađena T-testom. Monoklonska antitela AT8, DC209, DC217 zavisna od fosforilacije i pan-tau monoklonsko antitelo DC25 su korišćeni u studiji.

[0460] Rezultati imunoblot kvantitativne analize nivoa nerastvorljivog tau iz grupe transgenih pacova imunizovanih kreiranim terapijskim epitopom 2 (SEQ ID NO: 251) i kontrolne grupe su prikazani na Slici 74. Imunoterapija je statistički značajno smanjila količinu nerastvorljivog tau u imunizovanim životinjama u odnosu na kontrolne transgene pacove koji su primili sam adjuvant Smanjenje nerastvorljivog tau je uočeno u svim analiziranim tau epitopima. Smanjenja na 347-353 epitopu i fosfo-tau epitopima su statistički značajna (P<0,05). Uočena smanjenja su sledeća: na 347-353 tau epitop za 46% (P<0,05), na pT217 tau epitopu za 57 % (P<0,05), na p231-tau epitopu za 55 % (P<0,05), na pS202/pT205 tau epitopu za 47 % (P<0,05).

[0461] Ovi rezultati pokazuju da je vakcina indukovala antitela specifična za patološki tau što je dovelo do smanjenja patološkog tau. Smanjenje nivoa patološkog tau u mozgu tretiranih pacovskih modela Alchajmerove bolesti je korelisalo sa neurobihejvioralnim parametrima. Tretirane životinje sa niskim nivoima nerastvorljivog tau su pokazale kraće kašnjenje u prelasku i statistički značajno smanjen broj skliznuća zadnjih udova (p<0,05) u poređenju sa kontrolnim životinjama. Ovi nalazi pokazuju da imunizacija kreiranim terapijskim epitopom dovodi do smanjenja nerastvorljivog patološkog tau i do neurobihejvioralnog poboljšanje kod tretiranih životinja, što naglašava terapijski potencijal vakcine za lečenje Alchajmerove bolesti i srodnih tauopatija kod ljudi.

PRIMER 26: DALJA KARAKTERIZACIJA DC8E8 MINIMALNIH EPITOPA (ZA TERAPIJSKE GLAVNE JEDINICE)

[0462] Za dalju karakterizaciju DC8E8 minimalnih epitopa, dizajniran je panel tau peptida različitih dužina (42-mer, 19-mer, 12-meri, 7-meri, 6-meri i 5-meri), izvedenih iz ponovljenih regiona za vezivanje mikrotubula (MTBR1, MTBR2, MTBR3, MTBR4) humanog tau proteina 2N4R (Sl.75A, B). Peptidi su sintetisani od EZBiolabs (USA) sa čistoćom većom od 95%. Svi peptidi su analizirani na sposobnost da kompetiraju sa patološki tauΔ(1-150:392-441)/4R za vezivanje DC8E8 pomoću kompeticione ELISA. ELISA ploče (Sarstedt, #821581001) su obložene sa 50 µl/ležište 5 µg/ml rekombinantog prečišćenog tauΔ(1-150;392-441)/4R) u PBS preko noći na 37°C. Obložene ploče su oprane 5 puta PBS/Tweenom 20 (0,05% v/v) i blokirane pomoću PBS/Tween 20 (0,05% v/v) 1 h na 25°C. Svaki od peptida je zasebno rastvoren u PBS u konačnoj koncentraciji od 1 mM. Serijska razblaženja (2,5x) peptida u PBS/Tween 20 su napravljena u polipropilenskim mikrotitarskim pločama sa konusnim dnom ležišta (Greiner, #651201), unutar opsega koncentracije od 200 µM; 80 µM; 32 µM; 12,8 µM; 5,12 µM; 2,048 µM; 0,8192 µM; 0,32768 µM). Validaciono monoklonsko antitelo DC8E8 je razblaženo do koncentracije od 0,6 µg/ml u PBS i 60 µl ovog razblaženog antitela je dodato u svako ležište u sa serijskim razblaženjem peptida, što je dalo 120 µl/ležište smese. Smese antitelo/peptid su inkubirane 1 hr na 25°C na rotirajućoj platformi podešenoj na 230 rpm. Smese antitelo/peptid (50 µl/ležište) su prebačene sa polipropilenske ploče na ELISA ploče (u duplikatu) obložene sa tauΔ(1-150:392-441)/4R i blokirane pomoću PBS/Tween 20 i inkubirani 1 hr na 25°C. Ploče su oprane 5 puta PBS/Tween-om 20 i inkubirane sa 50 µl/ležište poliklonskim kozjim anti-mišjim imunoglobulinima/HRP (Dako, #P0447) razblaženim 1:1000 u PBS/Tween 20 1 hr na 25°C. Posle pranja, ploče su zatim inkubirane sa 50 µl/ležište 1 mg/2 ml o-PDA (o-fenilenediamin, Sigma, P1526) u 0,1 M Naacetatu pH=6,0 (Roth, #6779) obogaćenim sa 1,5 µl/2 ml 30% H2O2(Sigma, H-0904) 20 minuta na 25°C u mraku. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl/ležište 2M H2SO4(Merck, 1.00731.1000) ploče su čitane na 492 nm (npr. Powerwave HT, Bio-Tek).

[0463] Slika 76 pokazuje rezultate kompeticije ELISA izvedene sa sledećim peptidima: TENLKHQPGGGK (SEQ ID NO: 270), KHQPGGG (SEQ ID NO: 271), HQPGGG (SEQ ID NO: 272), HQPGG (SEQ ID NO: 273), QPGGG (SEQ ID NO: 274), ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 275), KHVPGGG (SEQ ID NO: 276), HVPGGG (SEQ ID NO: 277), HVPGG (SEQ ID NO: 278), VPGGG (SEQ ID NO: 279), DNIKHVPGGGSVQIVYKPV (SEQ ID NO: 280), HHKPGGG (SEQ ID NO: 281), HKPGGG (SEQ ID NO: 282) i THVPGGG (SEQ ID NO: 283). Svi analizirani peptidi koji obuhvataju tau terapijske epitope su kompetirali sa patološkim tauΔ(1-150;392-441/4R). Kao što je pokazano na Slici 76, čak su i 6-merni peptidi (SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 277 i SEQ ID NO: 282) bili u stanju da kompetiraju sa tau Δ(1-150;392-441)/4R za vezivanje DC8E8. Međutim, uklanjanje bilo histidina (5-merni peptidi SEQ ID NO: 274, 279), bilo poslednjeg glicina (5-merni peptidi SEQ ID NO: 273, 278), je dovelo do gubitka kompeticije sa tauΔ(1-150;392-441/4R) za vezivanje DC8E8 (5-merni peptidi su izvedeni iz SEQ ID NO: 272 i SEQ ID NO: 277, uklonjene aminokiseline His i Gly su podvučene, videti gore). Ovi rezultati sugerišu da 5-merni peptidi nisu generisali terapijske 3D strukture koje prepoznaje DC8E8 na patološkom tau. S druge strane, peptidi koji sadrže šest aminokiselinskih ostataka grade terapijsku 3D strukturu odgovornu za biološku aktivnost merenu kompetitivnom ELISA i formiraju minimalne epitope (terapijske glavne jedinice) DC8E8. U njihovom dizajnu, pet aminokiselinskih ostataka, koji su konservisani, je važno za prepoznavanje DC8E8 (histidin, prolin i tri glicina u sekvenci HxPGGG).

[0464] Zaključak: Podaci sugerišu da se minimalan DC8E8 epitop na humanom tau sastoji od 6 aminokiselina, koje sadrže ostatke HQPGGG (locirane unutar MTBR1), HVPGGG (unutar MTBR2), HKPGGG (unutar MTBR3) i HVPGGG (unutar MTBR4). Prema tome, mesto vezivanja DC8E8 (=epitop) je prisutno četiri puta u 2N4R tau i tri puta u 2N3R tau. Ovo sugeriše da su potrebne aminokiseline unutar 6-merne sekvence histidin i sva tri glicina.

PRIMER 27: ODREĐIVANJE IMUNOGENIČNOSTI PEPTIDA KOJI NOSE DC8E8 MINIMALNE EPITOPE

[0465] a) Peptidi koji nose DC8E8 minimalne epitope su imunogeni: Sa ciljem da se odredi imunogeni potencijal pojedinačnih tau peptida, peptidi su konjugovani sa KLH preko njihovih N-terminalnih Cys ostataka.

12

[0466] U ovom cilju, tau peptidi su sintetisani kao cisteinovani peptidi sa dodatnim N-terminalno lociranim cisteinskim ostatkom sa ciljem da se dobije orijentisano vezivanje peptida na površini KLH proteina. Peptidi su kuplovani sa KLH nosačem preko bifunkcionalnih kros-linkera N-[γ-maleimidobutiriloksi]sukcinimid estra (GMBS). Da bi se dobila reakcija konjugacije, 20 mg KLH (Calbiochem) je rastvoreno u puferu za konjugaciju (PBS sa 0,9 M NaCl, 10 mM EDTA) do koncentracije od 10 mg/ml nežnim mešanjem 10 minuta. Za dobijanje KLH aktiviranog maleimidom, 2 mg aktivnog bifunkcionalnog kroslinkera GMBS je rastvoreno u 50 µl anhidrovanog dimetilformamida i mešano sa 2 ml KLH rastvora 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je neizreagovan GMBS uklonjen na HiTrap Desalting koloni za odsoljavanje od 5 ml (GE Healthcare), uravnoteženoj u puferu za konjugaciju. Konjugacija je sprovedena u odnosu 1:1 peptid prema KLH aktiviran maleimidom (w/w, 20 mg peptida) 2 h na sobnoj temperaturi (25°C). Dobijeni konjugati su dijalizovani prema PBS 100 puta u višku, sa četiri promene pufera za dijalizu da bi se odstranio nekonjugovan peptid. Posle dijalize, konjugati su centrifugirani 15 min na 21000xg na 2°C. Konjugati su alikvotirani i ostavljeni na -20°C do upotrebe.

[0467] Vakcine za imunizaciju su napravljene sa konjugatima peptid-KLH, koji sadrže 100 µg konjugovanog peptida, u 100 µl PBS i emulzifikovani su 1:1 (zapreminski) pomoću Freund-ovog adjuvanta u konačnoj zapremini doze od 200 µl. Pet C57/BL miševa je korišćeno po grupi za tretman. Prva imunizacija je rađena pomoću peptidnog konjugata u PBS formulisanog sa Freund-ovim kompletnim adjuvantom. Dve sledeće imunizacije, u jednondeljnim intervalima, su izvedene upotrebom peptidnog konjugata u PBS formulisanog sa Freund-ovim nekompletnim adjuvantom. Životinje su krvarile nedelju dana posle poslednje buster doze i sakupljeni serumi su korišćeni za određivanje titra antitela. Titri specifičnog antitela na tau su određeni pomoću ELISA, kao što je opisano u Primeru 19. Serijska razblaženja (1:100 do 1:102400) svakog seruma su testirana na patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R i fiziološki tau 2N4R, korišćen kao čvrsta faza. Slika 77A-C pokazuje rezime rezultata za serume u razblaženju 1:800. Rezultati ELISA su statistički evaluirani primenom Mann-Whitney neparametrijskog testa. Titri su definisani kao recipročna razblaženja seruma koji daje polovinu maksimumalnog OD i sumirani na Slici 78.

[0468] Imunizacija miševa tau peptidima TENLKHQPGGGK (SEQ ID NO: 270), KHQPGGG (SEQ ID NO: 271), ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSN VQSKCGS KDNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 275), KHVPGGG (SEQ ID NO: 276), HVPGGG (SEQ ID NO: 277), DNIKHVPGGGSVQIVYKPV (SEQ ID NO: 280), HHKPGGG (SEQ ID NO: 281) i THVPGGG (SEQ ID NO: 283) je indukovala visoke nivoe tau specifičnih antitela u imunizovanim miševima. Pored toga, indukovana antitela su ispoljila veći afinitet za patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R nego za fiziološki tau 2N4R (Fig. 77A-C). Ova diskriminacija je statistički značajna za serume iz svih imunizovanih životinja (SEQ ID NO: 270, p<0,0079; SEQ ID NO: 271, p<0,0052; SEQ ID NO: 275, p<0,0079; SEQ ID NO: 276, p<0,0079; SEQ ID NO: 277, p<0,0379; SEQ ID NO: 280, p<0,0159; SEQ ID NO: 281, p<0,0379 i SEQ ID NO: 283, p<0,0286). Uopšteno, geometrijska sredina titara antitela na patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R je tri do pet puta veća nego onih za fiziološki tau 2N4R (Sl. 78). Kao što je pokazano nA Slici 78, najviše titre antitela na patološki tau su indukovali tau peptidi SEQ ID NO: 275 (GMT 51200), SEQ ID NO: 280 (GMT 51200), SEQ ID NO: 270 (GMT 22286) i SEQ ID NO: 276 (GMT 22286). 5-merni peptidi (SEQ ID NO: 273, 274, 278, 279), koji izgleda da nemaju terapijsku 3D strukturu, nisu bili u stanju da indukuju tau specifična antitela u imunizovanim životinjama. Sve u svemu, ovi rezultati su pokazali da peptidi (SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283) koji nose minimalne terapijske epitope (terapijske glavne jedinice) su imunogeni i indukuju antitela sa terapijski potencijalom da

12

ciljaju patološke tau proteine u mozgovima pacijenata sa Alchajmerovom bolešću. Ranije pomenuti eksperimenti sa mapiranjem epitopa su pokazali da peptid SEQ ID NO: 282 gradi terapijsku 3D strukturu (npr., bar delimično imitira minimalan DC8E8 epitop), ipak, on nije indukovao specifičan odgovor antitela u imunizovanim miševima (GMT za patološki tau je bio 174, Sl.78).

[0469] b) Izotipski profil: Vakcinacija C57/BL miševa tau peptidima SEQ ID NOS: 270, 271, 275, 276, 277, 280, 281 i 283 preferencijalno je indukovala formiranje IgG1 i IgG2b izotipova antitela specifičnih za patološki tau. Da bi se odredili specifični izotipovi antitela proizvedenih kao odgovor na peptide, serumi iz miševa su objedinjeni i razblaženi od 1:100 do 1:12800 i testirani u duplikatu pomoću ELISA (kao što je opisano u Primeru 19) na patološki tauΔ(1-150; 392-441)/4R. Za detekciju mišjih IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3 i IgM izotipova, potklasa specifičnih anti-mišjih konjugovanih sa HRP sekundarnih antitela je razblažena 1:5000 u PBS (antitela kupljena od Lifespan Biosciences). Slika 79 pokazuje rezultate za reprezentativno razblaženje 1:800. Podaci sugerišu da su peptidi konjugovani sa KLH indukovali širok spektar izotipova antitela na tau. U opštem slučaju, vakcinacija peptidima je generisala najviši nivo izotipova antitela (IgG1, IgG2b), za koja se smatra da su antitela visokog afiniteta. Prisustvo visokih titara IgG1 i IgG2b antitela sa preferencijalnim afinitetom za patološki tau ukazuju na to da je imuni odgovor indukovan vakcinom usmeren na vrste patološkog tau. Kontrolni serumi dobijeni iz lažno imunizovanih miševa (koji su primili sam adjuvant) su negativni (podaci nisu prikazani).

[0470] c) Peptidi koji nose terapijske epitope indukuju antitela koja diskriminišu patološki od fiziološkog tau: Praćenje u realnom vremenu događaja vezivanja pomoću površinske plazmonske rezonance je omogućilo merenje kinetičke brzine asocijacije (kON) i disocijacije (kOFF) antitela iz objedinjenih seruma C57/BL imunizovanih pojedinačnim tau peptidima TENLKHQPGGGK (SEQ ID NO: 270), KHQPGGG (SEQ ID NO: 271), HQPGGG (SEQ ID NO: 272), HQPGG (SEQ ID NO: 273), QPGGG (SEQ ID NO: 274), ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS (SEQ ID NO: 275), KHVPGGG (SEQ ID NO: 276), HVPGGG (SEQ ID NO: 277), HVPGG (SEQ ID NO: 278), VPGGG (SEQ ID NO: 279), DNIKHVPGGGSVQIVYKPV (SEQ ID NO: 280), HHKPGGG (SEQ ID NO: 281), HKPGGG (SEQ ID NO: 282) i THVPGGG (SEQ ID NO: 283). Analiza je urađena površinskom plazmonskom rezonancom na BIACORE3000 pomoću CM5 senzorskog čipa (Biacore AB, Uppsala) kao što je opisano u Primerima 5 i 19. Analiza je pokazala da su antitela indukovana imunizacijom peptidima sposobna da diskriminišu prepoznavanje tauΔ(1-150;392-441)/4R i fiziološke tau izoforme 2N4R (Slika 80). Antitela indukovana imunizacijom peptidima SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283, koji nose minimalne terapijske epitope, su ispoljila preferencijalni afinitet za tauΔ(1-150;392-441)/4R, u odnosu na afinitet za odgovarajući fiziološki tau 2N4R. Ova diskriminacija je statistički značajna za serume iz peptida: SEQ ID NO: 270 (p=0,0392), SEQ ID NO: 271 (p= 0,0363), SEQ ID NO: 272 (p= 0,0022), SEQ ID NO: 276 (p= 0,0013), SEQ ID NO: 277 (p= 0,0023), SEQ ID NO: 280 (p= 0,0104), SEQ ID NO: 281 (p=0,0123) i SEQ ID NO: 283 (p=0,0011). Dobijeni rezultati su u skladu sa prethodnim eksperimentima za imunogeničnost, što je sumirano na Slici 77A-C i Slici 78.

[0471] d) Peptidom indukovana antitela prepoznaju patološke forme of tau pomoću western blota: Antitela indukovana imunizacijom miševa C57/BL pojedinačnim tau peptidima su ispitana na patološke forme tau pomoću imunoblot metoda (kao što je opisano u Primeru 19). Moždana stabla SHR72 pacova u kasnom stadijumu neurofibrilarne patologije su korišćena za ekstrakciju nerastvorljivih patoloških tau proteina. Temporalni korteks humanog mozga sa

12

AD (Braak-ov stadijum VI; dobijen od Holandske banke mozga, Holandija) je korišćen za ekstrakciju humanih patoloških AD tau. Ekstrahovani tau proteini su dobijeni prema sarkozilnom metodu (Greenberg i Davies 1990). Objedinjeni serumi iz imunizovanih životinja su razblaženi 1:1000 u PBS i korišćeni kao primarno antitelo. Inkubacija sa primarnim antitelom je praćena poliklonskim zečjim anti-pacovskim imunoglobulinima konjugovanim sa peroksidazom rena (1:3000; Dako, Glostrup, Danska). Antitela konjugovana sa peroksidazom rena su zatim vizualizovana hemiluminiscencijom pomoću SuperSignal West Pico Chemiluminescence Substrate (Thermo Scientific, Belgija). signal je digitalizovan pomoću LAS3000 CCD imidžing sistema (Fujifilm, Japan). Sumirani rezultati su dati na Slici 81. Antitela podignuta vakcinacijom peptidima koji verovatno grade terapijsku 3D strukturu DC8E8 epitopa (SEQ ID NO: 270, 271, 272, 275, 276, 277, 280, 281 i 283) su prepoznala sve patološki forme tau proteina ekstrahovane iz SHR72 i iz moždanih tkiva sa AD, uključujući A68 tau triplet karakterističan za AD. Ipak, peptid SEQ ID NO: 282 izgleda da pravi terapijsku 3D strukturu (kompetira sa tau Δ(1-150;392-441)/4R za vezivanje DC8E8), nije indukovao odgovor specifičnih antitela u ovim imunizovanim miševima, prema tome, reaktivnost je bila negativna. Slično, 5-merni peptidi koji nisu sposobni da indukuju tau odgovor specifičnih antitela su negativni u ovoj analizi.

[0472] e) Peptidom indukovana antitela prepoznaju patološke tau proteine u presecima iz human moždanih tkiva sa Alchajmerovom bolešću: Tau-specifična antitela podignuta vakcinacijom miševa C57/BL pojedinačnim peptidima su testirana na humanom moždanom tkivu (parafinski blokovi) dobijenom od Holandske banke mozga. Blokovi su sečeni na mikrotomu. Parafinski preseci (8 µm) CA1 sektora hipokampusa iz mozga sa Alchajmerovom bolešću (Braak-ov stadijum V) su tretirani hladnom (+4°C) 99% mravljom kiselinom 1 min na sobnoj temperaturi (25°C). Preseci tkiva su inkubirani u rastvoru za blokiranje (5% BSA, 0,3 % Triton X-100 in 50 nM Tris-HCl), a zatim preko noći sa serumom razblaženim 1:1000 u rastvoru za blokiranje. Zatim su preseci inkubirani sa biotinilovanim sekundarnim antitelom (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) na sobnoj temperaturi jedan sat, a zatim su reagovali sa kompleksom avidin-biotin peroksidaza još jedan sat (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories), oba na 25°C. Imunoreakcija je vizualizovana pomoću kompleta sa supstratom peroksidaze (Vector VIP, Vector laboratories, Ca, USA). Preseci su ispitani pod mikroskopom Olympus BX71. Imunohistohemijsko bojenje (Fig.82A-C, Fig. 83) sugeriše da su antitela indukovana imunizacijom peptidima SEQ ID NO: 270, 271, 275, 276, 280, 281 i 283 specifično prepoznala strukture patološkog tau, tj. Neurofibrilarna klubad u hipokampusu moždanog tkiva sa Alchajmerovom bolešću. Serumi životinja vakcinisanih prethodno pomenutim peptidima su dekorisali neurofibrilarnu patologiju intenzivno, potvrđujući da antitela ciljaju patološke tau proteine. Antitela indukovana vakcinacijom peptidima SEQ ID NO: 272 i 277 pokazuju slabiji intenzitet bojenja struktura patološkog tau u moždanim tkivima. Peptidi koji indukuju niži nivo tau-specifičnog odgovora antitela ili nisu indukovali tau-specifičan odgovor antitela (SEQ ID NO: 273, 274, 278, 279 i 282) su negativni u ovoj analizi. Serumi iz miševa, koji su primili sam adjuvant, su korišćeni kao negativne kontrole. Oni nisu prepoznali neurofibrilarne patologije (Slika 82C).

[0473] Alfaro-Acha et al. Handgrip Strength and Cognitive Decline in Older Mexican Americans. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. (2006); 61(8): 859-865.

[0474] Alonso A, Zaidi T, Novak M, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. 2001. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci USA 98: 6923-6928.

12

[0475] Al-Lazikani, B., Lesk, A.M., and Chothia, C. (1997). Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. Journal of molecular biology 273, 927-948.

[0476] Andreasen N, Blennow K, Zetterberg H. 2010. Neuroinflammation Screening in Immunotherapy Trials against Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2010:638379.

[0477] Asuni AA, Boutajangout A, Quartermain D, Sigurdsson EM. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. J Neurosci 27:9115-9129 (2007).

[0478] Balin BJ, Little CS, Hammond CJ, Appelt DM, Whittum-Hudsond JA, Gerard HC, Hudson AP. 2008. Chlamydophila Pneumoniae and the Etiology of Late-Onset Alzheimer's disease. J Alzheimer's Dis 13:371-380.

[0479] Berg, L., et al. Clinicopathologic Studies in Cognitively Healthy Aging and Alzheimer disease. ARCH NEUROL/VOL 55, MAR 1998.

[0480] Bertram L, Tanzi RE. Thirty years of Alzheimer's disease genetics: the implications of systematic meta-analyses. Nat Rev Neurosci 9:768-778 (2008).

[0481] Bierer, L.M., et al. Neocortical Neurofibrillary Tangles Correlate With Dementia Severity in Alzheimer's disease. Arch Neuro/Vol.52, Jan 1995.

[0482] Boyle, P., et al. Association of Muscle Strength With the Risk of Alzheimer disease and the Rate of Cognitive Decline in Community-Dwelling Older Persons. (REPRINTED) ARCH NEUROL/VOL 66 (NO.11), NOV 2009.

[0483] Braak H, Braak E (1999) Temporal sequence of Alzheimer's disease-related pathology. In: Neurodegenerative and age-related changes in structure and function of the cerebral cortex, vol.14 (Peters, A. and Morrison, J. H., eds), pp 475-512 New York: Kluwer Academic/Plenum Publications.

[0484] Braak, H., et al. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239 - 259 (1991).

[0485] Braak, H., et al. The pathological process underlying Alzheimer's disease in individuals under thirty. Acta Neuropathol (2011) 121:171-181.

[0486] Buchman, A., et al., Frailty is Associated With Incident Alzheimer's disease and Cognitive Decline in the Elderly. Psychosomatic Medicine 69:483-489 (2007).

[0487] Buchman, A., et al., Grip Strength and the Risk of Incident Alzheimer's disease. Neuroepidemiology;29:66-73 (2007)

[0488] Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P.R. (2000). Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Research. Brain Research Reviews. 33, 95-130.

[0489] Burns, A., Zaudig, M. 2002. Mild cognitive impairment in older people. Lancet.

360(9349),1963-5.

12

[0490] Burns, J.M., et al. The pathology of the substantia nigra in Alzheimer disease with extrapyramidal signs. Neurology 2005;64;1397.

[0491] Carter J, Lippa CF. Beta-amyloid, neuronal death and Alzheimer's disease. Curr Mol Med 1:733-737 (2001).

[0492] Cevc G, Gebauer D, Stieber J, Schätzlein A, Blume G (1998) Ultraflexible vesicles, Transfersomes, have an extremely low pore penetration.

[0493] Chui, H.C., et al. Extrapyramidal Signs and Psychiatric Symptoms Predict Faster Cognitive Decline in Alzheimer's disease. Arch Neurol/Vol 51, July 1994.

[0494] Citron, M. (2010). Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nature Rev Drug Discovery 9, 387-398.

[0495] Clavaguera, F., Bolmont, T., Crowther, R.A., Abramowski, D., Probst, A., Fraser, G., Stalder, A.K., Beibel, M., Staufenbiel, M., Jucker, M., Goedert, M., Tolnay, M. (2009). Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol 11 (7), 909-13.

[0496] Csokova N, Skrabana R, Liebig HD, Mederlyova A, Kontsek P, Novak M. Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases. Protein Expr Purif 35:366-372 (2004).

[0497] Current Protocols in Protein Science 2001 May;Chapter 5

[0498] Dickey CA, Ash P, Klosak N, Lee WC, Petrucelli L, Hutton M, Eckman CB (Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression. Mol Neurodegener 1:6.2006).

[0499] Dickey CA, Eriksen J, Kamal A, Burrows F, Kasibhatla S, Eckman CB, Hutton M, Petrucelli L (Development of a high throughput drug screening assay for the detection of changes in tau levels -- proof of concept with HSP90 inhibitors. Curr Alzheimer Res 2:231-238.2005).

[0500] Dickey CA, Petrucelli L. Current strategies for the treatment of Alzheimer's disease and other tauopathies. Expert Opin Ther Targets 10:665-676 (2006).

[0501] Dodart JC, Bales KR, Gannon KS, Greene SJ, DeMattos RB, Mathis C, DeLong CA, Wu S, Wu X, Holtzman DM, Paul SM (Immunization reverses memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer's disease model. Nat Neurosci 5:452-457 (2002).

[0502] Duyckaerts, C., et al. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol (2009) 118:5-36.

[0503] Duyckaerts, C., et al. Diagnosis and Staging of Alzheimer disease. Neurobiology of Aging, Vol.18, No. S4, pp. S33-S42 (1997)

1

[0504] Duyckaerts, C., et al. The progression of the lesions in Alzheimer disease: insights from a prospective clinicopathological study. J. Neural Transm (1998) [Suppl] 53:119-126.

[0505] D'Souza, I., and Schellenberg, G.D. (2005). Regulation of tau isoform expression and dementia. Biochimica et biophysica acta 1739, 104-115.

[0506] Ferri CP, Prince M, Brayne C, Brodaty H, Fratiglioni L, Ganguli M, Hall K, Hasegawa K, Hendrie H, Huang Y, Jorm A, Mathers C, Menezes PR, Rimmer E, Scazufca M (Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study. Lancet 366:2112-2117(2005).

[0507] Filipcik P, Zilka N, Bugos O, Kucerak J, Koson P, Novak P, Novak M. (2010) First transgenic rat model developing progressive cortical neurofibrillary tangles. Neurobiol Aging.

2010 Dec 31. [Epub ahead of print]

[0508] Fodero-Tavoietti, M.T., et al. F-THK523: a novel in vivo tau imaging ligand for Alzheimer's disease. Brain 134; 1089-1100 (2011)

[0509] Frenkel D, Dewachter I, Van Leuven F, Solomon B (Reduction of beta-amyloid plaques in brain of transgenic mouse model of Alzheimer's disease by EFRH-phage immunization. Vaccine 21:1060-1065 (2003).

[0510] Frost, B., Diamond, M.I. (2009). The expanding realm of prion phenomena in neurodegenerative disease. Prion 3(2):74-7.

[0511] Frost, B., Jacks, R.L., Diamond, M.I. (2009). Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem 284(19),12845-52

[0512] Furlan R, Brambilla E, Sanvito F, Roccatagliata L, Olivieri S, Bergami A, Pluchino S, Uccelli A, Comi G, Martino G (Vaccination with amyloid-beta peptide induces autoimmune encephalomyelitis in C57/BL6 mice. Brain 126:285-291 (2003).

[0513] Gelinas DS, DaSilva K, Fenili D, St George-Hyslop P, McLaurin J (Immunotherapy for Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl 2:14657-14662 (2004).

[0514] Giannakopoulos, P., et al. Pathologic Correlates of Apraxia in Alzheimer disease. ARCH NEUROL/VOL 55, MAY 1998.

[0515] Giannakopoulos, P., Herrmann, F.R., Bussiere, T., Bouras, C., Kövari, E., Perl, D.P., Morrison, J.H., Gold, G., Hof, P.R. (2003). Tangle and neuron.

[0516] Glenn GM, Rao M, Matyas GR, Alving CR. (1998). Skin immunization made possible by cholera toxin. Nature 391:851.

[0517] Goedert, M., Spillantini, M.G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R.A. (1989a). Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron.3, 519-526.

[0518] Goedert, M., Spillantini, M.G., Potier, M.C., Ulrich, J., Crowther, R.A. (1989b.) Cloning and sequencing of the cDNA encoding an isoform of microtubule-associated protein

1 1

tau containing four tandem repeats: differential expression of tau protein mRNAs in human brain. EMBO J.8,393-399.

[0519] Goldman, W.P., et al., Motor dysfunction in mildly demented AD individuals without extrapyramidal signs. Neurology (1999);53;956.

[0520] Gomez-Isla T, Hollister R, West H, Mui S, Growdon JH, Petersen RC, Parisi JE, Hyman BT. Neuronal loss correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease. Ann Neurol 41:17-24 (1997).

[0521] Gomez-Isla, T., Price, J.L., McKeel Jr, D.W., Morris, J.C., Growdon, J.H., Hyman, B.T. (1996). Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer's disease. J Neurosci 16(14),4491-500.

[0522] Gómez-Ramos, A., Díaz-Hernández, M., Cuadros, R., Hernández, F., and Avila, J. (2006). Extracellular tau is toxic to neuronal cells. FEBS Lett 580(20), 4842-50.

[0523] Gómez-Ramos, A., Díaz-Hernández, M., Rubio, A., Díaz-Hernández, J.I., Miras-Portugal, M.T., Avila, J. (2009). Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. Eur Neuropsychopharmacol 19(10):708-17.

[0524] Gómez-Ramos, A., Díaz-Hernández, M., Rubio, A., Miras-Portugal, M.T., Avila, J. (2008). Extracellular tau promotes intracellular calcium increase through M1 and M3 muscarinic receptors in neuronal cells. Mol Cell Neurosci 37(4), 673-81.

[0525] Goode, B.L., Chau, M., Denis, P.E., Feinstein, S.C. 2000. Structural and functional differences between 3-repeat and 4-repeat tau isoforms. Implications.

[0526] Goode, B.L., Feinstein, S.C. (1994). Identification of a novel microtubule binding and assembly domain in the developmentally regulated inter-repeat region of tau. J Cell Biol.124, 769-782.

[0527] Greenberg SG, Davies P. A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis. Proc Natl Acad Sci USA 87:5827-5831 (1990).

[0528] Greenberg SG, Davies P, Schein JD, Binder LI. (1992). Hydrofluoric acid-treated tau PHF proteins display the same biochemical properties as normal tau. The Journal of Biological Chemistry 267: 564-569.

[0529] Gruden MA, Davudova TB, Malisauskas M, Zamotin VV, Sewell RD, Voskresenskaya NI, Kostanyan IA, Sherstnev VV, Morozova-Roche LA. Autoimmune responses to amyloid structures of Abeta(25-35) peptide and human lysozyme in the serum of patients with progressive Alzheimer's disease. Dement Geriatr Cogn Disord 18:165-171 (2004).

[0530] Grudzien, A., et al. Locus coeruleus neurofibrillary degeneration in aging, mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging 28 (2007) 327-335.

1 2

[0531] Grundke-Iqbal I, Iqbal K, Tung YC, Quinlan M, Wisniewski HM, Binder LI. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A 83:4913-4917 (1986).

[0532] Hampel, H., Blennow, K., Shaw, L.M., Hoessler, Y.C., Zetterberg, H., Trojanowski, J.Q. (2010). Total and phosphorylated tau protein as biological markers of Alzheimer's disease. Exp Gerontol 45(1), 30-40.

[0533] Hardy J, Allsop D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends Pharmacol Sci 12:383-388 (1991).

[0534] Hardy J, Duff K, Hardy KG, Perez-Tur J, Hutton M. Genetic dissection of Alzheimer's disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau. Nat Neurosci 1:355-358 (1998).

[0535] Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297:353-356 (2002).

[0536] Haynes JR, McCabe DE, Swain WF, Widera G, Fuller JT. Particle-mediated nucleic acid immunization. J Biotechnol 44:37-42.1996).

[0537] Hertz, L. Is Alzheimer's disease an anterograde degeneration, originating in the brainstem, and disrupting metabolic and functional interactions between neurons and glial cells? Brain Research Reviews, 14 (1989) 335-353.

[0538] Hunter RL. Overview of vaccine adjuvants: present and future. Vaccine 2002;20 Suppl. 3:S7-12.

[0539] Iqbal K, Grundke-Iqbal I. Developing pharmacological therapies for Alzheimer disease. Cell Mol Life Sci 64:2234-2244 (2007).

[0540] Iqbal K, Grundke-Iqbal I. Inhibition of neurofibrillary degeneration: a promising approach to Alzheimer's disease and other tauopathies. Curr Drug Targets 5:495-502 (2004).

[0541] Ivanovova N, Handzusova M, Hanes J, Kontsekova E, Novak M. High-yield purification of fetal tau preserving its structure and phosphorylation pattern. J Immunol Methods 339:17-22 (2008).

[0542] Itzhaki RF, Wozniak MA.2008. Herpes Simplex Virus Type 1 in Alzheimer's disease: The Enemy Within. J Alzheimers Dis.13:393-405.

[0543] Jacobsen JS, Reinhart P, Pangalos MN. Current concepts in therapeutic strategies targeting cognitive decline and disease modification in Alzheimer's disease. NeuroRx 2:612-626 (2005).

[0544] Jakes, R., Novak, M., Davison, M., Wischik, C.M. (1991). Identification of 3- and 4-repeat tau isoforms within the PHF in Alzheimer's disease. EMBO J 10, 2725-2729.

1

[0545] Jansen FK, Blythman HE, Carrière D, Casellas P, Gros O, Gros P, Laurent JC, Paolucci F, Pau B, Poncelet P, Richer G, Vidal H, Voisin GA. (1982). Immunotoxins: hybrid molecules combining high specificity and potent cytotoxicity. Immun. Rev.62, 185-216

[0546] Janus C, Pearson J, McLaurin J, Mathews PM, Jiang Y, Schmidt SD, Chishti MA, Horne P, Heslin D, French J, Mount HT, Nixon RA, Mercken M, Bergeron C, Fraser PE, St George-Hyslop P, Westaway D (A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408:979-982.2000).

[0547] Jensen FC, Savary JR, Diveley JP, Chang JC (1998). Adjuvant activity of incomplete Freund's adjuvant,Advanced Drug Delivery Reviews, 32:173-186.

[0548] Krebber A, Bornhauser S, Burmester J, Honegger A, Willuda J, Bosshard HR, Plückthun A. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods.

1997 Feb 14;201(1): 35-55

[0549] Kawasaki G (1991). International Patent Application Publication No. WO91/05058.

[0550] Kontsekova, E. (2002) International Patent Application Publication No. WO/2004/007547.

[0551] Korenova M, Zilka N, Stozicka Z, Bugos O, Vanicky I, Novak M (NeuroScale, the battery of behavioural tests with novel scoring system for phenotyping of transgenic rat model of tauopathy. J Neurosci Methods 177:108-114.2009).

[0552] Kosik, K.S., Kowall, N.W., McKee, A. (1989a). Along the way to a neurofibrillary tangle: a look at the structure of tau. Ann Med.21,109-112.

[0553] Koson P, Zilka N, Kovac A, Kovacech B, Korenova M, Filipcik P, Novak M. Truncated tau expression levels determine life span of a rat model of tauopathy without causing neuronal loss or correlating with terminal neurofibrillary tangle load. Eur J Neurosci 28:239-246 (2008).

[0554] Kovac, A., Zilkova, M., Deli, M.A., Zilka, N., Novak, M. (2009). Human truncated tau is using a different mechanism from amyloid-beta to damage the blood-brain barrier. J Alzheimers Dis 18(4), 897-906.

[0555] Kovacech B, Novak M. (2010). Tau truncation is a productive posttranslational modification of neurofibrillary degeneration in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res 7: in press.

[0556] Kovacech B, Skrabana R, Novak M. (2010). Transition of tau protein from disordered to misordered in Alzheimer's disease. Neurodegener Dis 7: 24-27.

[0557] Kraemer, H.C., et al. 'How Far' vs 'How Fast' in Alzheimer's disease. Arch Neurol/Vol 51, Mar (1994).

1 4

[0558] Krajciova, G., Skrabana, R., Filipcik, P., and Novak, M. (2008). Preserving free thiols of intrinsically disordered tau protein without the use of a reducing agent. Anal Biochem 383, 343-345.

[0559] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685 (1970).

[0560] Langer R, Cleland JL, Hanes J. (1997). New advances in microsphere-based singledose vaccines. Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119.

[0561] Langer R. New methods of drug delivery. (1990) Science 249:1527-33.

[0562] Larbig G, Pickhardt M, Lloyd DG, Schmidt B, Mandelkow E. Screening for inhibitors of tau protein aggregation into Alzheimer paired helical filaments: a ligand based approach results in successful scaffold hopping. Curr Alzheimer Res 4:315-323(2007).

[0563] Lee HG, Perry G, Moreira PI, Garrett MR, Liu Q, Zhu X, Takeda A, Nunomura A, Smith MA Tau phosphorylation in Alzheimer's disease: pathogen or protector? Trends Mol Med 11:164-169 (2005).

[0564] Liu, Y., et al. Pathological Correlates of Extrapyramidal Signs in Alzheimer's disease. Ann Neurol (1997);41:368 -374.

[0565] Livingston, B.D., Crimi, C., Grey, H., Ishioka, G., Chisari, F.V., Fikes, J., Grey, H., Chesnut, R.W., and Sette, A. The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection. J. Immunol. 159:1383-1392 (1997).

[0566] Louis, E.D., et al. Parkinsonian Signs in Older People in a Community-Based Study. (REPRINTED) ARCH NEUROL/VOL 61, (AUG 2004).

[0567] MacCallum RM, Martin AC, Thornton JM. Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography. J Mol Biol. (1996) Oct 11;262(5):732-45.

[0568] Macikova I., Dedek L., Kontsekova E., Kontsek P., Ciampor F, Novak M., Vrzal V. (1992) Common and different antigenic properties of the rabies virus glycoprotein between strains SAD-Vnukovo and Pitman-Moore. Acta virol.36, 541-55.

[0569] März W, Scharnagl H, Kirça M, Bohl J, Gross W, Ohm TG. 1996. Apolipoprotein E polymorphism is associated with both senile plaque load and Alzheimer-type neurofibrillary tangle formation. Ann N Y Acad Sci.777:276-80.

[0570] Matsuo ES, Shin RW, Billingsley ML, Van deVoorde A, O'Connor M, Trojanowski JQ, Lee VM Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at).

[0571] Miklossy J. 2008. Chronic Inflammation and Amyloidogenesis in Alzheimer's disease - Role of Spirochetes. J Alzheimer's Dis 13:381-391381

[0572] Moe, J.G., Chatterjee, I., Davidowitz, E.J., Arancio, O. (2009). Modulation of synaptic function by extracellular tau enriched in oligomers. Alzheimer Dem 5 (4), P499

1

[0573] Morgan D, Diamond DM, Gottschall PE, Ugen KE, Dickey C, Hardy J, Duff K, Jantzen P, DiCarlo G, Wilcock D, Connor K, Hatcher J, Hope C, Gordon M, Arendash GW. A beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer's disease. Nature 408:982-985 (2000).

[0574] Morgan D.2011. Immunotherapy for Alzheimer's disease. J Intern Med. 269(1):54-63.

[0575] Morris, J.C., et al. Clinical and Pathological Aspects of Parkinsonism in Alzheimer's disease. Arch Neurol-Vol 46 (June 1989).

[0576] Mouri A, Noda Y, Hara H, Mizoguchi H, Tabira T, Nabeshima T. Oral vaccination with a viral vector containing Abeta cDNA attenuates age-related Abeta accumulation and memory deficits without causing inflammation in a mouse Alzheimer model. FASEB J 21:2135-2148 (2007).

[0577] Myszka, D.G. (1999) Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit.12, 279-84.

[0578] Necula M, Chirita CN, Kuret J Cyanine dye N744 inhibits tau fibrillization by blocking filament extension: implications for the treatment of tauopathic neurodegenerative diseases. Biochemistry 44:10227-10237 (2005).

[0579] Nicolau C, Greferath R, Balaban TS, Lazarte JE, Hopkins RJ A liposome-based therapeutic vaccine against beta -amyloid plaques on the pancreas of transgenic NORBA mice. Proc Natl Acad Sci U S A 99:2332-2337 (2002).

[0580] Noble W, Planel E, Zehr C, Olm V, Meyerson J, Suleman F, Gaynor K, Wang L, LaFrancois J, Feinstein B, Burns M, Krishnamurthy P, Wen Y, Bhat R, Lewis J, Dickson D, Duff K (Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102:6990-6995 (2005).

[0581] Novak, M., Kabat, J., Wischik, C.M. (1993). Molecular characterization of the minimal protease resistant tau unit of the Alzheimer's disease paired helical filament. EMBO J 12, 365-70.

[0582] Oddo S, Billings L, Kesslak JP, Cribbs DH, LaFerla FM. Abeta immunotherapy leads to clearance of early, but not late, hyperphosphorylated tau aggregates via the proteasome. Neuron 43:321-332 (2004).

[0583] Oddo S, Caccamo A, Shepherd JD, Murphy MP, Golde TE, Kayed R, Metherate R, Mattson MP, Akbari Y, LaFerla FM. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron 39:409-421 (2003).

[0584] O'Hagan DT, Valiante NM (Recent advances in the discovery and delivery of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov 2:727-735 (2003).

[0585] O'Mahony, DJ. (1995) International Patent Application Publication No. WO9717613

1

[0586] Otvos L, Jr., Feiner L, Lang E, Szendrei GI, Goedert M, Lee VM. (1994). Monoclonal antibody PHF-1 recognizes tau protein phosphorylated at serine residues 396 and 404. Journal of neuroscience research 39: 669-673.

[0587] Paul A, Cevc G, Bachhawat BK. (1995). Transdermal immunization with large proteins by means of ultradeformable drug carriers. Eur J Immunol. Dec;25(12):3521-4.

[0588] Pettersson, A.F., et al. Motor Function in Subjects with Mild Cognitive Impairment and Early Alzheimer's disease. Dement Geriatr Cogn Disord (2005);19:299-304.

[0589] Pickhardt M, von Bergen M, Gazova Z, Hascher A, Biernat J, Mandelkow EM, Mandelkow E Screening for inhibitors of tau polymerization. Curr Alzheimer Res 2:219-226 (2005).

[0590] Price JL, Morris JC Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease. Ann Neurol 45:358-368 (1999).

[0591] Rapoport M, Dawson HN, Binder LI, Vitek MP, Ferreira A Tau is essential to beta -amyloid-induced neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 99:6364-6369 (2002).

[0592] Reichert, J.M. (2011). Antibody-based therapeutics to watch in 2011. mAbs 3(1),76-99.

[0593] Reitz, C., et al. Memory performance is related to amyloid and tau pathology in the hippocampus. (Mar 2009); J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2009;80;715-721; originally published online.

[0594] Roberson ED, Scearce-Levie K, Palop JJ, Yan F, Cheng IH, Wu T, Gerstein H, Yu GQ, Mucke L Reducing endogenous tau ameliorates amyloid beta-induced deficits in an Alzheimer's disease mouse model. Science 316:750-754 (2007).

[0595] Sambrook J, Russell D (2001) Moleclular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0596] Santacruz K, Lewis J, Spires T, Paulson J, Kotilinek L, Ingelsson M, Guimaraes A, DeTure M, Ramsden M, McGowan E, Forster C, Yue M, Orne J, Janus C, Mariash A, Kuskowski M, Hyman B, Hutton M, Ashe KH Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science 309:476-481 (2005).

[0597] Saurwein-Teissl M, Lung TL, Marx F, Gschösser C, Asch E, Blasko I, Parson W, Bock G, Schönitzer D, Trannoy E, Grubeck-Loebenstein B. 2002. Lack of antibody production following immunization in old age: association with CD8(+)CD28(-) T cell clonal expansions and an imbalance in the production of Th1 and Th2 cytokines. J Immunol.

168(11):5893-9.

[0598] Scarmeas, N., et al. Motor signs during the course of Alzheimer disease. Neurology. (2004); 63(6): 975-982.

[0599] Scarmeas, N., et al. Motor signs predict poor outcomes in Alzheimer disease. Neurology. (2005); 64(10): 1696-1703. doi:10.1212/01.WNL.0000162054.15428.E9.

1

[0600] Schenk D, Barbour R, Dunn W, Gordon G, Grajeda H, Guido T, Hu K, Huang J, Johnson-Wood K, Khan K, Kholodenko D, Lee M, Liao Z, Lieberburg I, Motter R, Mutter L, Soriano F, Shopp G, Vasquez N, Vandevert C, Walker S, Wogulis M, Yednock T, Games D, Seubert P Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400:173-177 (1999).

[0601] Schenk D, Hagen M, Seubert P Current progress in beta-amyloid immunotherapy. Curr Opin Immunol 16:599-606 (2004).

[0602] Schneider, A., Mandelkow, E., (2008). Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics 5(3), 443-57.

[0603] Seabrook GR, Ray WJ, Shearman M, Hutton M Beyond amyloid: the next generation of Alzheimer's disease therapeutics. Mol Interv 7:261-270 (2007).

[0604] Selkoe DJ Alzheimer's disease: a central role for amyloid. J Neuropathol Exp Neurol 53:438-447 (1994).

[0605] Shipton OA, Leitz JR, Dworzak J, Acton CE, Tunbridge EM, Denk F, Dawson HN, Vitek MP, Wade-Martins R, Paulsen O, Vargas-Caballero M (Tau Protein Is Required for Amyloid {beta}-Induced Impairment of Hippocampal Long-Term Potentiation. J Neurosci 31:1688-1692 (2011).

[0606] Siegrist CA, Aspinall R. (2009). B-cell responses to vaccination at the extremes of age. Nat Rev Immunol. 9(3):185-94

[0607] Sigurdsson EM, Knudsen E, Asuni A, Fitzer-Attas C, Sage D, Quartermain D, Goni F, Frangione B, Wisniewski T (An attenuated immune response is sufficient to enhance cognition in an Alzheimer's disease mouse model immunized with amyloid-beta derivatives. J Neurosci 24:6277-6282 (2004).

[0608] Sigurdsson EM, Scholtzova H, Mehta PD, Frangione B, Wisniewski T Immunization with a nontoxic/nonfibrillar amyloid-beta homologous peptide reduces Alzheimer's diseaseassociated pathology in transgenic mice. Am J Pathol 159:439-447 (2001).

[0609] Simic, G., et al. Annotation - Does Alzheimer's disease begin in the brainstem? Neuropathol Appl Neurobiol. 2009 December; 35(6): 532-554. doi:10.1111/j.1365-2990.2009.01038.x.

[0610] Skrabana, R., Sevcik, I., Novak, M. (2006). Intrinsically disordered proteins in the neurodegenerative processes: formation of tau protein paired helical filaments and their analysis. Cell Mol Neurobiol 26, 1085-1097.

[0611] Skrabana, R., M. Skrabanova-Khuebachova, et al. (2006). "Alzheimer's-diseaseassociated conformation of intrinsically disordered tau protein studied by intrinsically disordered protein liquid-phase competitive enzyme-linked immunosorbent assay." Anal Biochem 359(2): 230-7.

1

[0612] Sloane PD, Zimmerman S, Suchindran C, Reed P, Wang L, Boustani M, Sudha S The public health impact of Alzheimer's disease, 2000-2050: potential implication of treatment advances. Annu Rev Public Health 23:213-231 (2002).

[0613] Soininen, H., et al. Extrapyramidal signs in Alzheimer's disease: a 3-year follow-up study. J Neural Transm [P-D Sect] (1992) 4:107-119.

[0614] Steinhilb ML, Dias-Santagata D, Fulga TA, Felch DL, Feany MB (Tau phosphorylation sites work in concert to promote neurotoxicity in vivo. Mol Biol Cell 18:5060-5068 (2007a).

[0615] Steinhilb ML, Dias-Santagata D, Mulkearns EE, Shulman JM, Biernat J, Mandelkow EM, Feany MB. S/P and T/P phosphorylation is critical for tau neurotoxicity in Drosophila. J Neurosci Res 85:1271-1278 (2007b).

[0616] Taniguchi S, Suzuki N, Masuda M, Hisanaga S, Iwatsubo T, Goedert M, Hasegawa M. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem 280:7614-7623 (2005a).

[0617] Taniguchi T, Sumida M, Hiraoka S, Tomoo K, Kakehi T, Minoura K, Sugiyama S, Inaka K, Ishida T, Saito N, Tanaka C (Effects of different anti-tau antibodies on tau fibrillogenesis: RTA-1 and RTA-2 counteract tau aggregation. FEBS Lett 579:1399-1404 (2005b).

[0618] Trollet C, Scherman D, Bigey P Delivery of DNA into muscle for treating systemic diseases: advantages and challenges. Methods Mol Biol 423:199-214 (2008).

[0619] van den Berg JH, Nujien B, Beijnen JH, Vincent A, van Tinteren H, Kluge J, Woerdeman LA, Hennink WE, Storm G, Schumacher TN, Haanen JB. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum Gene Ther 20:181-189 (2009).

[0620] Van Nest G., Ott G., Barchweld G. (1990) Prijava patenta objavljena pod br. WO9014837

[0621] Vechterova L, Kontsekova E, Zilka N, Ferencik M, Ravid R, Novak M. (2003). DC11: a novel monoclonal antibody revealing Alzheimer's disease-specific tau epitope. Neuroreport 14: 87-91.

[0622] Wai, M., et al. Co-localization of hyperphosphorylated tau and caspases in the brainstem of Alzheimer's disease patients. Biogerontology (2009) 10:457-469.

[0623] Waite, L.M., et al. Gait slowing as a predictor of incident dementia: 6-year longitudinal data from the Sydney Older Persons Study. Journal of the Neurological Sciences 229- 230 (2005) 89-93

[0624] Walsh DM, Selkoe DJ. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease. Neuron 44:181-193 (2004).

1

[0625] Wang, Li, et al. Performance-Based Physical Function and Future Dementia in Older People. (REPRINTED) ARCH INTERN MED/VOL 166 (MAY 22, 2006).

[0626] Weiner HL, Lemere CA, Maron R, Spooner ET, Grenfell TJ, Mori C, Issazadeh S, Hancock WW, Selkoe DJ (Nasal administration of amyloid-beta peptide decreases cerebral amyloid burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Ann Neurol 48:567-579 (2000).

[0627] Weng NP, Akbar AN, Goronzy J. 2009. CD28(-) T cells: their role in the ageassociated decline of immune function. Trends Immunol. 30(7):306-12.

[0628] West, M.J., Coleman, P.D., Flood, D.G., Troncoso, J.C. (1994). Differences in the pattern of hippocampal neuronal loss in normal ageing and Alzheimer's disease. Lancet 344,769-72.

[0629] Wilson, R.S., et al. Parkinsonian-like Signs and Risk of Incident Alzheimer disease in Older Persons. (REPRINTED) ARCH NEUROL/VOL 60 (APR 2003).

[0630] Wilson-Welder JH, Torres MP, Kipper MJ, Mallapragada SK, Wannemuehler MJ, Narasimhan B. Vaccine adjuvants: current challenges and future approaches. J Pharm Sci 98:1278-1316 (2009).

[0631] Wischik CM, Edwards PC, Lai RY, Roth M, Harrington CR (Selective inhibition of Alzheimer disease-like tau aggregation by phenothiazines. Proc Natl Acad Sci U S A 93:11213-11218 (1996).

[0632] Wischik, C.M., Novak, M., Edwards, P.C., Klug, A., Tichelaar, W., Crowther, R.A. (1988a). Structural characterization of the core of the paired helical filament of Alzheimer disease, Proc Natl Acad Sci USA 85,4884-8.

[0633] Wischik, C.M., Novak, M.. Thogersen, H.C., Edwards, P.C., Runswick, M.J., Jakes, R., Walker, J.E., Milstein, C., Roth, M., Klug, A. (1988b). Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer disease, Proc Natl Acad Sci USA 85, 4506-10.

[0634] Xing Z, Santosuosso M, McCormick S, Yang TC, Millar J, Hitt M, Wan Y, Bramson J, Vordermeier HM. Recent advances in the development of adenovirus- and poxvirusvectored tuberculosis vaccines. Curr Gene Ther 5:485-492 (2005).

[0635] Zarow, C., et al. Neuronal Loss Is Greater in the Locus Coeruleus Than Nucleus Basalis and Substantia Nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. (REPRINTED) ARCH NEUROL/VOL 60, MAR 2003.

[0636] Zhang B, Maiti A, Shively S, Lakhani F, McDonald-Jones G, Bruce J, Lee EB, Xie SX, Joyce S, Li C, Toleikis PM, Lee VM, Trojanowski JQ. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proc Natl Acad Sci U S A 102:227-231 (2005).

[0637] Zhang J, Wu X, Qin C, Qi J, Ma S, Zhang H, Kong Q, Chen D, Ba D, He W (A novel recombinant adeno-associated virus vaccine reduces behavioural impairment and betaamyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis 14:365-379 (2003).

14

[0638] Zielinski C, Scheiner O, Jensen-Jarolim E, Breiteneder H, Pehamberger H. (2003). Prijava patenta objavljena pod br. WO03/020750

[0639] Zilka N, Vechterová L, Kontseková E, Novák M. (2003) A rapid immunohistochemical primary screening assay for hybridomas. J Immunol Methods. 272(1-2):49-53.

[0640] Zilka N, Filipcik P, Koson P, Fialova L, Skrabana R, Zilkova M, Rolkova G, Kontsekova E, Novak M. Truncated tau from sporadic Alzheimer's disease suffices to drive neurofibrillary degeneration in vivo. FEBS Lett 580:3582-3588 (2006).

[0641] Zilka, N., et al. Chaperone-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies. Journal of Alzheimer's disease 15 (2008) 169-179.

[0642] Zilkova, M., Koson, P., Zilka, N. 2006. The hunt for dying neurons: insight into the neuronal loss in Alzheimer's disease. Bratisl Lek Listy 107(9-10), 366-73.

[0643] Wischik CM, Edwards PC, Lai RY, Roth M, Harrington CR (Selective inhibition of Alzheimer disease-like tau aggregation by phenothiazines. Proc Natl Acad Sci U S A 93:11213-11218 (1996).

[0644] Wischik, C.M., Novak, M., Edwards, P.C., Klug, A., Tichelaar, W., Crowther, R.A. (1988a). Structural characterization of the core of the paired helical filament of Alzheimer disease, Proc Natl Acad Sci USA 85,4884-8.

[0645] Wischik, C.M., Novak, M.. Thogersen, H.C., Edwards, P.C., Runswick, M.J., Jakes, R., Walker, J.E., Milstein, C., Roth, M., Klug, A. (1988b). Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer disease, Proc Natl Acad Sci USA 85, 4506-10.

[0646] Xing Z, Santosuosso M, McCormick S, Yang TC, Millar J, Hitt M, Wan Y, Bramson J, Vordermeier HM. Recent advances in the development of adenovirus- and poxvirusvectored tuberculosis vaccines. Curr Gene Ther 5:485-492 (2005).

[0647] Zarow, C., et al. Neuronal Loss Is Greater in the Locus Coeruleus Than Nucleus Basalis and Substantia Nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. (REPRINTED) ARCH NEUROL/VOL 60, MAR 2003.

[0648] Zhang B, Maiti A, Shively S, Lakhani F, McDonald-Jones G, Bruce J, Lee EB, Xie SX, Joyce S, Li C, Toleikis PM, Lee VM, Trojanowski JQ. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proc Natl Acad Sci U S A 102:227-231 (2005).

[0649] Zhang J, Wu X, Qin C, Qi J, Ma S, Zhang H, Kong Q, Chen D, Ba D, He W (A novel recombinant adeno-associated virus vaccine reduces behavioural impairment and betaamyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis 14:365-379 (2003).

[0650] Zielinski C, Scheiner O, Jensen-Jarolim E, Breiteneder H, Pehamberger H. (2003). Prijava patenta objavljena pod br. WO03/020750

[0651] Zilka N, Vechterová L, Kontseková E, Novák M. (2003) A rapid immunohistochemical primary screening assay for hybridomas. J Immunol Methods. 272(1-2):49-53.

[0652] Zilka N, Filipcik P, Koson P, Fialova L, Skrabana R, Zilkova M, Rolkova G, Kontsekova E, Novak M. Truncated tau from sporadic Alzheimer's disease).

[0653] Zilka, N., et al. Chaperone-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies. Journal of Alzheimer's disease 15 (2008) 169-179.

[0654] Zilkova, M., Koson, P., Zilka, N. 2006. The hunt for dying neurons: insight into the neuronal loss in Alzheimer's disease. Bratisl Lek Listy 107(9-10), 366-73.

LISTING SEKVENCI

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

�

11

��

1

14

�

1

�

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

�

2

�

21

22

2

21

22

2

24

2

24

2

21

22

2

24

2

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za jedan ili više tau epitopa, gde navedeno izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži:

i. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 117 i SEQ ID NO: 248 za lak lanac CDR1; ii. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 253 za lak lanac CDR2; iii. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259 i SEQ ID NO: 260 za lak lanac CDR3 i

iv. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 261 i SEQ ID NO: 262 za težak lanac CDR1;

v. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 264 i SEQ ID NO: 265 za težak lanac CDR2 i

vi. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 i SEQ ID NO: 269 za težak lanac CDR3.

2. Izolovano antitelo prema zahtevu 1, gde je njegov navedeni fragment koji vezuje antigen Fab, Fab', F(ab')2, Facb, pFc', Fd, Fv ili scFv fragment.

3. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, gde navedeno antitelo sadrži:

a) varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži:

i. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 117, i SEQ ID NO: 248 za CDR1 ; ii. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 253 za CDR2; iii. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259 i SEQ ID NO: 260 za CDR3 i

b) varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži:

i. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 261 i SEQ ID NO: 262 za CDRI ;

ii. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 264 i SEQ ID NO: 265 za CDR2 i

iii. sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 i SEQ ID NO: 269 za CDR3.

4. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži:

a) varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži:

i. sekvencu SEQ ID NO: 117 za CDR1;

ii. sekvencu SEQ ID NO: 118 za CDR2;

iii. sekvencu SEQ ID NO: 119 za CDR3 i

b) varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži:

2

iv. sekvencu SEQ ID NO: 120 za CDR1

v. sekvencu SEQ ID NO: 121 za CDR2 i

vi. sekvencu SEQ ID NO: 122 za CDR3.

5. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde navedeno antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141 i varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.

6. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde je navedeno antitelo odabrano od:

a) monoklonskog antitela;

b) rekombinantnog antitela;

c) himernog antitela;

d) humanizovanog antitela i

e) fragmenta koji vezuje antigen ili dela koji vezuje antigen bilo kog od (a) do (d).

7. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je navedeno antitelo monoklonsko antitelo DC8E8, gde je DC8E8 antitelo proizvedeno od strane hibridoma deponovanog kod American Type Culture Collection patentnim depozitom br. PTA-11994.

8. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedeno antitelo humanizovana verzija DC8E8, gde je DC8E8 antitelo proizvedeno od strane hibridoma deponovanog kod American Type Culture Collection patentnim depozitom br. PTA-11994.

9. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedeno antitelo detektabilno obeleženo pomoću jednog ili više obeleživača.

10. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je ono spojeno sa agensom koji nije antitelo.

11. Izolovano antitelo prema zahtevu 10, gde je navedeno antitelo, spojeno sa agensom koji nije antitelo, konjugat antitela i leka (ADC).

12. Izolovana nukleinska kiselina ili izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

13. Izolovani vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili izolovane nukleinske kiseline iz zahteva 12.

14. Izolovana ćelija domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili izolovane nukleinske kiseline iz zahteva 12 i/ili vektor iz zahteva 13.

15. Izolovana ćelijska linija prema zahtevu 14 koja eksprimira izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

16. Izolovana ćelijska linija iz zahteva 15, gde je navedena ćelijska linija hibridom deponovan kod American Type Culture Collection patentnim depozitom br. PTA-11994.

17. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11, izolovana nukleinska kiselina prema zahtevu 12 ili izolovana ćelija domaćin prema zahtevu 14, za njihovu upotrebu kao lek.

18. Izolovano antitelo prema zahtevu 17, za upotrebu u sprečavanju ili lečenju Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija.

19. Sastav koji sadrži bar jedno antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

20. Sastav iz zahteva 19, koji još sadrži bar jedno jedinjenje ili agens odabran od detektabilnih obeleživača, hemocijanina iz prilepka, tetanus toksoida ili toksoida izvedenog iz neke druge patogene bakterije, serumskih albumina, goveđeg serumskog albumina, imunoglobulinskog molekula ili njegovog fragmenta, tiroglobulina, ovoglobulina, univerzalnog T ćelijskog epitopa, citokina, hemokina, IL-1 a, IL- , IL-2, IL-10, IFN-Y, GM-CSF, MIP1 a, MIP1 β i RANTES.

21. Sastav koji sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za njegovu upotrebu kao lek za sprečavanje ili lečenje Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija.

22. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač.

23. Proizvod za farmaceutsku ili dijagnostičku upotrebu, koji sadrži materijal za pakovanje i kontejner koji sadrži rastvor ili liofilizovanu formu antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

24. Proizvod prema zahtevu 23, gde je kontejner deo uređaja ili sistema za dostavu antitela subjektu.

25. Medicinski uređaj koji sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde je uređaj pogodan za kontaktiranje ili administriranje antitela na bar jedan od načina odabran od parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenskog, intrartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrahrskavičnog, intrakavitarnog, intracelijačnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intratekalnog, intrakoličkog, intracervikalnog, intragastričkog, intrahepatičkog, intramiokardijalnog, intraostealnog, intrapelvičkog, intraperikardijalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičkog, intrapulmonalnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterusnog, intravezikalnog, intralezijskog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog.

26. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za njegovu upotrebu u sprečavanju ili lečenju Alchajmerove bolesti ili srodnih tauopatija.

27. Izolovano antitelo za upotrebu prema zahtevu 26, gde se navedeno antitelo administrira intravenski, intramuskularno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno, intracerebroventrikularno, intratekalno, ili kao aerosol.

2

28. Izolovano antitelo za upotrebu prema zahtevu 26 ili 27, gde se navedeno antitelo administrira periferno humanom subjektu.

29. Izolovano antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 26 do 28, gde je količina navedenog administriranog antitela najmanje 1 mg/kg telesne težine subjekta, po dozi.

30. Izolovano antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 26 do 29, gde je količina navedenog administriranog antitela najmanje 10 mg/kg telesne težine subjekta, po dozi.

31. Izolovano antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 26 do 30, gde je navedeno antitelo administrirano u više doza, jednakih ili različitih, tokom perioda od bar tri meseca, poželjno bar šest meseci.

32. Izolovano antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 26 do 31, gde je navedeno izolovano antitelo administrirano u kombinaciji sa bar jednim kombinatornim agensom odabranim od: inhibitora acetilholinesteraze, antagonista NMDA receptora, helirajućih agenasa prelaznih metala, faktora rasta, hormona, nesteroidnih antiinflammatornih lekova (NSAID), antioksidanata, sredstava za snižavanje lipida, selektivnih inhibitora fosfodiesteraze, inhibitora agregiranja tau, inhibitora protein kinaza, inhibitora proteina toplotnog šoka, reagenasa antiamiloidne pasivne i aktivne imunizacije, inhibitora amiloidnog agregiranja i inhibitora sekretaze.

33. Metod in vitro dijagnostikovanja ili skrininga subjekta na prisustvo Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije, ili za određivanje subjektovog rizika za razvoj Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije, gde metod obuhvata:

a) kontaktiranje ćelije, tkiva, organa, fluida, ili bilo kog drugog uzorka subjekta, sa efektivnom količinom bar jednog antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9, i b) određivanje prisustva kompleksa koji sadrži patološki tau i antitelo, gde je prisustvo kompleksa indikativno na prisustvo Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije povezane sa prisustvom patološkog tau.

34. Metod prema zahtevu 33, gde se određivanje prisustva kompleksa koji sadrži patološki tau i antitelo vrši u testu odabranom od: kompetitivnog i nekompetitivnog imunoeseja, imunoprecipitacije, ELISA-e, western blota i imunohistohemijskog eseja.

35. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za upotrebu u metodu za dijagnostikovanje ili skrining subjekta na prisustvo Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije, ili za određivanje subjektovog rizika za razvoj Alchajmerove bolesti ili srodne tauopatije, in vivo imidžingom.

2