RS56886B1 - Antigeni pseudomonasa i kombinacije antigena - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antigene koji potiču iz P.aerugonisa i njihovu upotrebu u imunizaciji.

[0002] Pseudomonas aeruginosa, oportunistički patogen gram-negativna bakterija koji je nalazi u spoljašnoj sredini uključujudi rezervoare sa vodom i zemljište, je jedan od vodedih nokozomijalnih patogena svuda u svetu. Ova gram-negativna bakterija je dobro poznata kao vodedi uzrok morbiditeta i smrtnosti kod pacijenata sa cističnom fibrozom (CF), sa 80% odraslih CF pacijenata koji nose P. aeruginosa u svojim pludima [1], i skoro je postala ozloglašena kada je klasifikovana u ’superbakterije’ od strane medija. Poslednje potiče njegove usled unutrašnje otpornosti ovog oportunističkog patogena koju ima protiv antibiotika [2], i njegove istaknutosti kao uzroka nokozomijalnih infekcija (tj. postoji procenjeno 10000 slučajeva svake godine u UK bolnicama) [3].

[0003] Uprkos značajnim prednostima u antimikrobnoj terapji, efikasno lečenje i kontrola P. aeruginosa infekcija postaje stalan problem, primarno zbog prirodne otpornosti organizma i njegove značajne sposobnosti da stekne otpornost na višestuka antimikrobna sredstva pomodu različitih mehanizama.

[0004] Vakcija protiv P. aeruginosa se dugo traži, ali do sada nije dostupna. Nekoliko kandidata za vakcine je procenjivano kod eksperimentalnih životinja i ljudi, koji obuhvataju poddelijkse frakcije komponente kapsule, prečišdene i rekombinantne proteine.

[0005] Jedinstvene karakteristike domadina i patogena su zakomplikovale razvijanje vakcine. Referenca 4 beleži da je prilaz vakcini zasnovanoj na rekombinantnom proteinu zasnovan na na pojedinačnom fuzionom proteinu dobijenom fuzijom dva fragmenta dva proteina koji potiču iz spoljnih membrana, naime OprF i OprI. Ova vakcina je u tokudim kliničkim ispitivanjima [5], a drugi detalji su opisani u ref. 6. Ref. 51 i Sawa et al., 1999 (Nature Medicine, 5, 392) opisuju kompoziciju vakcine koja sadrži antigen Pseudomonas aeruginosa i izaziva zaštitni imuni odgovor. Prema tome, postoji potreba za daljim identifikovanjem i poboljšavanjem antigena za upotrebu kao pojedinačnih antigena ili u kombinaciji u vakcinama P. aeruginosa, i naročito za vakcine koje su korisne naspram višestrukih patologija P. aeruginosa, koje obuhvataju npr. citičnu fibrozu. Sveukupno, i dalje postoji potreba za dobijanjem efikasne vakcine protiv P. aeruginosa.

OPIS PRONALASKA

[0006] Pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 (PA5340) antigen i opciono jedan ili više antigena izabranih iz liste : PSE44-4 (PA3526) antigen; PSE10-1 (PA1178) antigen; PSE21-5 (PA5112) antigen; PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE52-1 (PA4765) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE11-3 (PA1248) antigen; PSE41-5 (PA2407) antigen; PSE47A-2 (PA4082); PSE5-1 (PA0595); PSE13-2 (PA1954); PSE17-1 (PA3692); PSE18-2 (PA4370); PSE20-1 (PA4735); PSE23-1 (PA3647); PSE24-1 (PA0126); PSE25-1 (PA0189); PSE26-1 (PA0274); PSE28-2 (PA0537); PSE31-2 (PA0737); PSE33-2 (PA1086); PSE42-1 (PA2793); PSE45-2 (PA3535); PSE50-1 (PA4578); PSE51-4 (PA4667); PSE19-1 (PA4710); PSE34-1 (PA1106); PSE36-3 (PA1324); PSE38-1 (PA1777).

[0007] Pronalazak takođe obezbeđuje framaceutski kompoziciju koja se sastoji od:

(a) polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 80% ili više identična sa SEQ ID NO: 10 koji može izazvati antitelo koje prepoznaje SEQ ID NO: 10; ili

(b) polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; i

opciono dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 80% ili više identična sa jednom od SEQ ID NOs: 1-9, 11-35 ili SEQ ID NOs: 36-65.

[0008] Pronalazači su identifikovali različite polipetide P. aeruginosa koji su korisni za imunizaciju, ili sami ili u kombinaciji. Ovi polipeptidi mogu biti kombinovani sa saharidima P. aeruginosa ili drugim polipeptidima P. aeruginosa ili antigenima koji potiču iz ostalih patogena (tj. S. aureus, E. coli, itd.). Antigeni su korisni u vakcinama P. aeruginosa ali mogu takođe biti kao komponente u vakcinama za imuniziranje protiv višestrukih patogena.

[0009] Pronalazači su identifikovali ukupno sledede polipetide:

PSE54 (PA5340) antigen; PSE44-4 (PA3526) antigen; PSE10-1 (PA1178) antigen; PSE21-5 (PA5112) antigen; PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE52-1 (PA4765) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE11-3 (PA1248) antigen; PSE41-5 (PA2407) antigen; PSE47A-2 (PA4082); PSE5-1 (PA0595); PSE13-2 (PA1954); PSE17-1 (PA3692); PSE18-2 (PA4370); PSE20-1 (PA4735); PSE23-1 (PA3647); PSE24-1 (PA0126); PSE25-1 (PA0189); PSE26-1 (PA0274); PSE28-2 (PA0537); PSE31-2 (PA0737); PSE33-2 (PA1086); PSE42-1 (PA2793); PSE45-2 (PA3535); PSE50-1 (PA4578); PSE51-4 (PA4667); PSE19-1 (PA4710); PSE34-1 (PA1106); PSE36-3 (PA1324); PSE38-1 (PA1777).

[0010] U ukupnom setu izabranih antigena može se razlikovati ’prva grupa antigena’ koja je opisana kao grupa antigena za koji nisu bili učinjeni pokušaji njihovih testiranja kao antigena vakcina. "Prva grupa antigena" sadrži 25 od 30 izabranih antigena.

[0011] Naročito "prva grupa antigena" sadrži sledede antigene: PSE54 (PA5340) antigen; PSE44-4 (PA3526) antigen; PSE21-5 (PA5112) antigen; PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE41-5 (PA2407) antigen; PSE47A-2 (PA4082) antigen; PSE5-1 (PA0595) antigen; PSE13-2 (PA1954) antigen; PSE17-1 (PA3692) antigen; PSE18-2 (PA4370) antigen; PSE20-1 (PA4735) antigen; PSE23-1 (PA3647) antigen; PSE24-1 (PA0126) antigen; PSE25-1 (PA0189) antigen; PSE26-1 (PA0274) antigen; PSE28-2 (PA0537) antigen; PSE31-2 (PA0737) antigen; PSE33-2 (PA1086) antigen; PSE42-1 (PA2793) antigen; PSE45-2 (PA3535) antigen; PSE50-1 (PA4578) antigen; PSE51-4 (PA4667) antigen; PSE34-1 (PA1106) antigen; i PSE36-3 antigen (PA1324).

[0012] Ovaj pronalazak obezbeđuje imunogene kompozicije koje sadrže jedan ili više (tj.1, 2, 3, 4, 5 ili više) antigena izabranih iz prve grupe antigena.

[0013] U okviru prve grupe antigena, poželjno su antigeni izabrani iz liste PSE54 (PA5340) antigena, PSE21-5 (PA5112) antigena; PSE27-1 (PA0328) antigena; PSE41-5 (PA2407) antigena; PSE44-4 (PA3526) antigena; PSE47A-2 (PA4082) antigena; i/ili PSE53-1 (PA5047) antigena.

[0014] U okviru ’prve grupe antigena’, antigeni su poželjno izabrani iz podseta 5 polipeptida, i naročito su korisni u izazivanju zaštinog imunog odgovora in vivo ukoliko su korišdeni kao pojedinačni antigeni ili u kombinaciji sa: PSE54 (PA5340) antigenom; PSE44-4 (PA3526) antigenom; PSE21-5 (PA5112) antigenom; PSE53-1 (PA5047) antigenom; PSE42-1 (PA2793).

[0015] U okviru prve grupe antigena, svi navedeni antigeni mogu biti izabrani kao pojedinačni antigeni za upotrebu protiv P. aeruginosa, uz uslov da PSE27-1 (PA0328) antigen može biti korisno izostavljen sa liste (’prva grupa antigena’).

[0016] "Druga grupa antigena" je definisana kao grupa identifikovanih antigena koji su ved bili predloženi kao mogudi imunogeni antigeni samostalne vakcine, ali nikad nisu razmatrani u kombinaciji sa bar dva (tj. 2, 3, 4, 5, 6 ili više) antigena u in vivo eksperimentima. Podset " druga grupa antigena" je definisan kao grupa "dodatnih antigenih polipeptida" i sadrži one antigene polipeptide koju su ved intenzivno testirani kao antigeni vakcina in vivo.

[0017] Druga grupa antigena obuhvata slededu listu antigena: PSE10-1 (PA1178) antigen; PSE11-3 (PA1248) antigen; PSE52-1 (PA4765) antigen; PSE19-1 (PA4710) antigen; i PSE38-1 (PA1777) antigen.

[0018] Podset druge grupe antigena je definisan kao grupa "dodatnih antigenih polipeptida " koja sadrži slededu listu antigena: PilA (PA4524), OprF-OprI, FliC (PA1092), FliD (PA1094) i/ili egzoprotein A (PA1148). Prema tome, "druga grupa antigena" sadrži ukupno 10 polipeptida.

[0019] Prema tome pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju antigena, pomenuta kombinacija sadrži dva ili više (tj.2, 3, 4, 5, 6 ili više) antigena izabranih iz grupe koju čine: PSE54 (PA5340) antigen; PSE44-4 (PA3526) antigen; a PSE10-1 (PA1178) antigen; a PSE21-5 (PA5112) antigen; a PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE52-1 (PA4765) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE11-3 (PA1248) antigen; a PSE41 (PA2407) antigen; PSE47A-2 (PA4082); PSE5-1 (PA0595); PSE13-2 (PA1954); PSE17-1 (PA3692); PSE18-2 (PA4370); PSE20-1 (PA4735); PSE23-1 (PA3647); PSE24-1 (PA0126); PSE25-1 (PA0189); PSE26-1 (PA0274); PSE28-2 (PA0537); PSE31-2 (PA0737); PSE33-2 (PA1086); PSE42-1 (PA2793); PSE45-2 (PA3535); PSE50-1 (PA4578); PSE51-4 (PA4667); PSE19-1 (PA4710); PSE34-1 (PA1106); PSE36-3 (PA1324); PSE38-1 (PA1777).

[0020] U okviri prve grupe antigena, antigeni su poželjno izabrani iz podseta 7 od 30 polipeptida, naime: PSE54 (PA5340), PSE47A-2 (PA4082), PSE41-5 (PA2407), PSE53-1 (PA5047), PSE21-5 (PA5112), PSE27-1 (PA0328) ili PSE44-4 (PA3526) antigena i podseta "druge grupe antigena", naime: PSE52-1 (PA4765), PSE10-1 (PA1178), PSE11-3 (PA1248) i OprF-OprI koji je izabran iz podseta ’druge grupe antigena’ definisanog kao grupe "dodatnih antigenih polipeptida". Prema tome pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju antigena, pomenuta kombinacija sadrži dva ili više (tj.2, 3, 4, 5, 6 ili više) antigena izabrana iz grupe koju čine ovih jedanaest antigena.

[0021] U okviru 11 antigena izabranih iz prve, druge grupe i grupe dodatnih antigenih polipeptida su 55 mogudih parova antigenih kombinacija.

[0022] U okviru ’druge grupe antigena’, koja obuhvata podset od 5 polipeptida koji se ovde nazivaju ’dodatni antigeni polipeptidi", ima ukupno 10 polipeptida. Pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju antigena, pomenuta kombinacija sadrži smešu dva ili više (tj. 2, 3, 4, 5, 6 ili više) antigena izabranih između bilo kog od poželjnih iz "prve grupe antigena" sa bilo kojim iz "druge grupe antigena" ili grupe "dodatnih antigenih polipeptida".

[0023] Pronalazak obezbeđuje imunogene kompozicije koje sadrže kombinaciju antigena, pomenuta kombinacija sadrži smešu dva ili više (tj. 2, 3, 4, 5, 6 ili više) antigena izabranih između bilo kog antigena iz prve grupe antigena i druge grupe antigena.

[0024] U okviru 30 antigena smeše prve grupe antigena i druge grupe antigena ima 435 moguda prara različitih antigena. Svi takvi parovi su ovde opisani i deo su ovog pronalaska. Prema tome opis obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži par antigena, u kome pomenuti par je jedan od 435 parova.

[0025] U okviru 35 antigena smeše prve grupe antigena i druge grupe antigena postoji 595 moguda para različitih antigena. Svi takvi parovi su ovde opisani i deo su pronalaska. Prema tome, opis obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži par antigena, gde pomenuti par je jedan od pomenutih 595 parova.

[0026] U jednom izvođenju, kompozicija obuhvata bar jedan antigen (tj. 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više) izabranih iz prve grupe antigena i bar jednog (tj. 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više) izabranog iz grupe drugog antigena. Antigeni iz prve grupe antigena mogu biti izabrani iz poželjnom podseta PSE54 (PA5340), PSE47A-2 (PA4082), PSE41-5 (PA2407), PSE53-1 (PA5047), PSE21-5 (PA5112), ili PSE44-4 (PA3526) antigena, i antigeni iz druge grupe antigena mogu biti izabrani između PSE52-1 (PA4765), PSE10-1 (PA1178) ili između bilo kog antigenog polipetida podseta druge grupe antigena, poželjno fuzionog OprF-OprI.

[0027] Opis takođe obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja obuhvata kombinaciju koja obuhvata antigene, pomenuta kombinacija sadrži dva ili više (tj. 2, 3, 4 ili 5) antigena izabranih iz grupe koju čine: (1) PSE54 antigen; (2) PSE10-1 antigen; (3) PSE44-4 antigen; (4) PSE52-1 antigen; (5) PSE53-1 antigen; (6) PSE21-5 antigen; (7) PSE27-1 antigen; (8) PSE47A-2 antigen; i/ili (9) OprF-OprI antigen.

[0028] U poželjnih 9 antigena izabranih iz prve grupe antigena, druge grupe antigena i/ili grupe dodatnih antigena postoji 36 mogudih parova različitih antigena. Svi takvi parovi su ovde opisani i deo su ovog opisa. Prema tome opis obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži par antigena, gde pomenuti par je jedan od pomenutih 36 parova.

[0029] Kompozicija može takođe da uključuje adjuvant npr. aluminijum hidroksidni adjuvant.

[0030] Pogodne kombinacije su one u kojima jedna ili više antigena deluju sinergistički. Prema tome, njihovim kombinovanim davanjem postiže se zaštita naspram bolesti P. aeruginosa, koja prevazilazi onu očekivanu samo sabiranjem njihovih pojedinačnih efekata zaštite.

[0031] Specifične kombinacije od interesa obuhvataju, ali bez ograničenja:

(1) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen, PSE27 antigen

(2) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen i OprF-OprI antigen

(3) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen, PSE27 antigen i/ili OprF-OprI antigen

(4) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen i/ili PSE44 antigen

(5) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen i/ili PSE21-5 antigen

(6) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen i/ili PSE52-1 antigen

(7) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE47A-2 antigen i/ili PSE53-1 antigen

(8) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen i/ili PSE10-1 antigen

(9) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 i PSE53-1 antigen

(10) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE47A-2 i PSE52-1 antigen

(11) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE54 antigen i/ili PSE44-4 antigen i/ili PSE47A-2 antigen

(12) Imunogenu kompoziciju koja sadrži PSE47A-2 antigen, PSE53-1 antigen, ili PSE54 antigen i/ili PSE27 antigen.

(13) Imunogenu kompoziciju koja sadrži (a) PSE47A-2 antigen kombinovan sa PSE53-1 antigenom, ili (b) PSE54 antigen kombinovan sa PSE21-5 antigenom.

(14) Imunogenu kompozicijukoja sadrži PSE47A-2 antigen i/ili PSE52 antigen.

[0032] U nekim izvođenjima, bilo koja od ovih imunogenih i zaštitnih kompozicija može sadržati dodate antigene pseudomonasa, i ovi drugi antigeni mogu biti polipeptidi i/ili sahardidi. Na primer, korisno oni mogu obuhvatati jedan ili više antigena Pseudomonasa koji spadaju u "drugu grupu antigena" koja obuhvata grupu "dodatni antigenih polipeptida", koja obuhvata fuzioni polipeptid OprF-OprI na sinergistički način.

[0033] Imunogena kompozicija može takođe obuhvatati adjuvant.

Grupa ostalih polipeptidnih antigena

[0034] Pored antigena iz različitih grupa antigena prema pronalasku, imunogene kompozicije mogu sadržati jedan ili više slededih antigena P. aeruginosa (ili antigena koji sadrže njihove imunogene fragmente da bi se pospešila efikasnost imunog odgovora napram P. aeruginosa izazvana kompozicijom:

• OprF-OprI [4]

• PA4525, poznat takođe kao PilA

• PA1092, poznat takođe kao FliC

• PA1094, poznat takođe kao FliD

• PA1148, egzoprotein A ili egzotoksin A

[0035] Grupa "dodatnih antigenih polipeptida" je definisana kao podruga druge grupe antigena. Ova grupa poznatih antigena može biti korisna pri korišdenu u kombinaciji sa 1, 2 ili više drugih korisnih antigena prve grupe antigena ili druge grupe antigena.

Kombinacija sa drugim antigenima koji potiču iz P. aeruginosa

[0036] Pojedinačni antigeni identifikovani u grupama antigena prema pronalasku mogu biti korišdeni u kombinaciji sa drugim antigenima iz P.aeruginosa. U nekim izvođenjima drugi antigeni P. aeruginosa mogu biti u obliku konjugata saharida sa proteinom nosačem. Prema tome pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju:

(1) jednog ili više antigena izabranih između antigena prve, druge ili dodatne grupe (kako su gore definisane); i/ili njihove kombinacije ili smeše i

(2) jedan ili više konjugata sahardinog dela, i proteina nosača.

[0037] Konjugat korišden u komponenti (2) ove kombinacije obuhvata saharidni deo i protein nosač.

[0038] U izvođenjima pronalaska, kompozicija dalje obuhvata 5-heksozni Psl polisaharid P. aeruginosa, koji može biti prisutan kao slobodni polisaharid i/ili konjugovani sa proteinom nosačem. Opciono, jedan ili više adjuvanata flagelina i/ili fuzionih proteina prema pronalasku deluju kao protein nosač i imaju za njega konjugovan Psl polisaharid. Na primer, monomeri i/ili dimeri polisaharida P. aeruginosa mogu biti konjugovani za jedan ili više adjuvanta flagelina i/ili fuzionih proteina. Videti referencu 7.

[0039] Konjugat korišden u komponenti (2) kombinacije obuhvata sahardini deo i deo nosača. Saharidni deo je od egzopolisahardia P. aeruginosa. Saharid može biti polisahardi koji ima veličinu koja proističe u toku prečišdavanja iz bakterije ili može biti oligosahardi koji je dobijen fragmentacijom takvog polisaharida.

[0040] Pronalazak takođe obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju:

(1) jednog ili više antigena odgabranih između antigena prve, druge ili dodane grupe;

(2) jednog ili više konjugata P. aeruginosa egzopolisahardia i proteina nosača.

[0041] Deo nosača u ovim konjugatima de uglavnom biti ptoein, ali uglavnom nije jedan od antigena (1).

[0042] Tipično proteini nosači su bakterijski toksini, kao što su toksini difterije ili tetanusa, ili toksoidi ili mutanti ili njihovi fragmenti. Koristan je mutant CRM197 toksina difterije [8]. Drugi pogodni proteini nosači obuhvataju spoljašnji membranski proteinski kompleks N.meningitidis [9], sintetičke peptide [10], proteine toplotnog šoka [11], protein velikog kašlja [12], citokine [13], limfokine [13], faktore rasta [13], veštački proteini koji sadrže višestruke humane epitope CD4<+>T delija iz različitih antigena iz patogena [14] kao što sus N19 [15], protein D iz H.influenzae 16, pneumolizin [17] ili njegovi netoksični derivati [18], pneumokokni površinski protein PspA [19], proteini za preuzimanje gvožđa [20], toksin A ili B iz C.difficile [21], rekombinantni P.aeruginosa egzoprotein A (rEPA) [22], itd. U nekim izvođenjima protein nosač je protein P. aeruginosa, kao antigen izabran iz prve, druge ili dodatne grupe antigena.

[0043] Gde kompozicija obuhvata više od jednog konjugata, svaki konjugat može koristiti isti protein nosač ili različiti protein nosač.

[0044] Konjugati mogu imat višak nosača (w/w) ili višak saharida (w/w). U nekim izvođenjima, konjugat može obuhvatati u suštini jednake mase svakog.

[0045] Molekul nosač može biti kovalento konjugovan za nosač direktno ili preko vezujude grupe. Direktne veze za protein se mogu postidi na primer, pomodu reduktivne aminacije između saharida i nosača, kako je opisano u, na primer referencama 23 i 24. Saharid može prvo biti potrebne da se akivira npr.. oksidacijom. Veze preko vezujude grupe mogu biti napravljene pomodu bilo kog poznatog postupaka, na primer, postupaka opisanih u referencama 25 i 26. Poželjni tip veze je vezujuda grupa adipinske kiseline, koja može biti obrzovana kuplovanjem slobodnih -NH2grupa (npr. unetih glukan aminacijom) sa adipinskom kiselinom (pomodu, na primer, diimidne aktivacije), i zatim kuplovanja proteina sa dobijenim intermedijerom saharid-adipinska kiselina [27]. Još jedan poželjan tip veze je karbonilni linker, koji može biti obrazovan reakcijom sa slobodnom hidroksilnom grupom sahardida CDI [28] praden reakcijom sa proteinom da bi se obrazovala karbamatna veza. Ostale vezujude grupe obuhvataju β-propionamido [29], nitrofenil-etilamin [30], haloacil halide [31], glikozidne veze [32], 6-aminokapronsku kiselinu [33], ADH [34], C4do C12radikale [35], itd. Karbodiimidna kondenzacija može takođe biti korišdena [36].

[0046] Pojedinačni antigeni identifikovani u grupama antigena prema pronalasku mogu biti korišdeni kao proteini nosači za egzopolisaharide, da bi se obrazovao kovalenti konjugat. Prema tome pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži konjugat (1) antigena izabranog iz prve, druge i dodatnih grupa antigena i (2) P. aeruginosa egzopolisaharida. Ovi konjugati mogu biti kombinovani sa bilo kojim ovde opisanim antigenima.

Kombinacije sa drugim patogenima koji potiču iz antigena (koji nisu iz pseudomonasa)

[0047] Pojedinačni antigeni identifikovani u grupama antigena porema pronalasku mogu biti korišdeni takođe u kombinaciji sa drugim antigenima koji potiču iz patogena, tj. antigenima koji nisu iz pseudomonasa, i naročito sa antigenima iz bakterija koji su u vezi sa nozokomijalnim infekcijama. Prema tome. pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju:

(1) jednog ili više antigena izabranih iz prve, druge i dodatne grupe antigena (kako su gore definisane); i

(2) jednog ili više antigena izabranog iz grupe patogena koju čine: S. aureus (uključujudi jedan ili više konjugata (i) a S.aureus egzopolisaharida; i/ili jednog ili više proteina antigena iz S.aureus); Burkholderia cenocepacia (npr. O antigen lipopolisaharida), Clostridium difficile; Candida albicans; i/ili ekstraintestinalna patogena Escherichia coli.

Prva grupa antigena

PA0328 ili PSE271

[0048] ’PA0328’ antigen je obeležen kao ’spoljnomembranski autotransporter’. U soju PAO1 obeležen je ’hipotetički protein’ i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 i opisan je kao PA0328 u referenci 37. Ova sekvenca je zabeležena u NCBI kao GI: 15595525. Skoro je pokazano da je protein autotransporter relevantan u strategiji zaraznosti usvojenoj za Pseudomonas aeruginosa preko njene arginin specifične aminopeptidazne aktivnosti, kao u referenci 38. Ponekad, se PA0328 ovde naziva ’PSE27-1’ ili ’PSE27’.

[0049] Korisni PA0328 antigeni mogu izazvati antitela (npr. kada se daju ljudima) koji prepoznaju SEQ ID NO: 1 i/ili mogu sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identičan 50% ili više (npr. 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 1; i/ili (b) koja sadrži fragment od bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 1, gde je ’n’ 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PA0328 proteini obuhvatju varijante SEQ ID NO: 1. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 1. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraj i/ili jedna ili dve aminokiseline (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 49, 50 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 1 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 1. Na kraju 40-50 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 1 može korisno biti izostavljeno. Prvih 22 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 1 može korisno biti izostavljeno. Drugi fragmenti izostavljaju jedan ili više proteinskih domena.

[0050] SEQ ID NO: 36 je uglavnom fragment SEQ ID NO: 1 (’PA032822-647’). U ovom fragmentu je izostavljen vodedi peptid na N-terminalnom delu da bi se omogudila ekspresija i prečišdavanje.

PA5112 ili PSE21-5

[0051] ’PSE21-5’ antigen je obeležen kao ’Esteraza ili EstA’ u PAO1 soju. U PAO1 soju PSE21-5 je opisan kao ’PA5112’i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U PAO1 soju njegov identifikator u NCBI je GI: 15600305 Videti ref.37. Ponekad, PA5112 je ovde naziva kao’PSE21-5’ ili ’PSE21’.

[0052] Korisni PSE21-5 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daje ljudima) koje prepoznaje SEQ ID NO: 3 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 3; i/ili (b) sadrži fragment bar ’n’ uzastopnih aminoksielina SEQ ID NO: 3, gde ’n’ je 7 ili viši (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili viši). Ovi PSE21-5 proteini obuhvataju varijante SEQ ID NO: 3. Poželjni fragmenti od (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 3. Drugim poželjnim fragmentma nedostaje jedan ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 3 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 3. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 3 korisno mogu biti izotavljene. Prvih 24 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 3 mogu korisno biti izostavljene. U drugim fragmentima su izostavljeni jedan ili više proteinskih domena. PSE21-5 je prirodni i dugi protein i takođe korišdenje fragmenata je koristno npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0053] SEQ ID NO: 38 je koristan fragment SEQ ID NO: 3 (’PSE21-525-646). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE21-5 i lako je korišden na industrijskohj skali.

PA2407 ili PSE4]-5

[0054] ’PSE41-5’ antigen je obeležen kao ’verovatno adhezioni protein. U PAO1 soju PSE41-5 je nazvan PA2407 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 (GI: 15597603). Videti Ref.37. Ponekad, PA2407 se pozova ovde kao na ’PSE41-5’ ili ’PSE41’. Ponekad, PA2407 se ovde naziva ’PSE41-5’ ili ’PSE41’.

[0055] Korisni ’PSE41-5’ antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 5 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 5; i/ili (b) sadrži fragment od bar’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 5, gde je ’n’ 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi ’PSE41-5’ proteini uključuju varijane SEQ ID NO: 5. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 5. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) iz C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 5 dok se zadržava bar jedan SEQ ID NO: 5. Krajnih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 5 može biti korisno izostavljene. Prvih 37 N-ternminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 5 može korisno biti izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. ’PSE41-5’ je prirodno dug protein i tako da je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju itd.

[0056] SEQ ID NO: 40 je koristan fragment SEQ ID NO: 5 ("PSE41-5’38-317). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen ’PSE41-5’ i lakše je korišden na industrijskoj skali. Takođe je smanjuje sličnost antigena sa humanim proteinima.

PA3526 ili PSE44-4

[0057] PSE44-4 antigen je označen kao ’verovatno spoljašnji prekursor membranskog proteina’. U PAO1 soju PSE44-4 je PA3526 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 (GI: 15598722). Videti Ref 37. Ponekad se PA3526 ovde naziva ’PSE44-4 ili ’PSE44’.

[0058] Korisni PSE44-4 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 6 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 6; i/ili (b) sadrži fragment od bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 6, gde ’n’ je 7 ili vedi (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE44-4 proteini obuhvataju varijante SEQ ID NO: 6. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 6. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) iz N-kraja SEQ ID NO: 6 dok zadržava bar jedan epitope SEQ ID NO: 6. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 6 mogu korisno biti izostavljene. Ostali fragmenti izostavljaju jedan ili više proteinskih domena. PSE44-4 je prirodno dug protein i takođe je upotreba fragmenata korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

1

[0059] SEQ ID NO: 41 je koristan fragment SEQ ID NO: 6 (’PSE544-420-321’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE44-4 i lakše se koristi na industrijskoj skali. On takođe smanjuje sličnost antigena sa humanim proteinima.

PA4082 ili PSE47A-2

[0060] PSE47A-2 antigen je označen kao ’adhezivni protein CupB5’ ili kao "serin proteaza". U PAO1 soju PSE47A-2 se naziva PA4082 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 (GI: 15599277). Videti Ref.37. Ponekad, PA4082 se ovde naziva ’PSE47A’ ili ’PSE47A-2’ (fragment).

[0061] Korisni PSE47A-2 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 7 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 7; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 7, gde ’n’ je 7 ili viši (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili viši). Ovi PSE47A-2 proteini obuhvataju varijante SEQ ID NO: 7. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 7. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 7 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 7. S obzirom da C-krajnji deo proteina odgovara domenu translokatora, koji je potpuno smešten u spoljašnju membranu i prema tome je totalno nedostupan antitelima, pa prema time može biti korisno odbaciti ga. Prema time, krajnjih 435 C-terminalnih aminokiselina iz SEQ ID NO: 7 može biti korisno izostavljeno. Prvih 53 N-terminalnih aminokiselina iz SEQ ID NO: 7 može korisno biti izostavljeno. Drugi fragmenti izostavljaju jedan ili više proteinskih domena. PSE47A-2 je prirodno dug protein i tako da je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd..

[0062] SEQ ID NO: 42 je koristan fragment SEQ ID NO: 7 (’PSE47A-254-583’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE47A-2 i lakše se koristi na industrijskoj skali. On takođe smanjuje sličnost antigena sa humanim proteinima.

PA5047 ili PSE53-1

[0063] PSE53-1 antigen je označen kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE53-1 je PA5047 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 (GI: 15600240). Videti Ref.37. Ponekad, PA5047 se ovde naziva ’PSE53-1 ili ’PSE53’.

[0064] Korisni PSE53-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 9 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 9; i/ili (b) sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 9, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE53-1 proteini uključuju varijante SEQ ID NO: 9. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop SEQ ID NO: 9. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 9 dok se zadražva bar jedan epitop SEQ ID NO: 9. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 9 može biti korisno izostavljeno. Prvih 18 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 9 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima su izostavljeni jedan ili više proteinskih domena. PSE53-1 je prirodno dug protein i prema tome upotreba fragmenta je korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0065] SEQ ID NO: 44 je koristan fragment SEQ ID NO: 9 (’PSE53-119-479’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE53-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali. On takođe smanjuje sličnost antigena sa humanim proteinima.

PA5340 ili PSE54

[0066] PSE54 antigen je označen kao ’verovatni prkursor proteina spoljašnje membrane’ i kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE54 je PA3526 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 (GI: 15598722). Videti Ref.37. Ponekad, PA5340 se ovde naziva ’PSE54’.

[0067] Korisni PSE54 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 10 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 10; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 10, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE54 proteini obuhvataju varijante SEQ ID NO: 10. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 10. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 10 dok se zadržava ba jedan epitop SEQ ID NO: 10. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 10 može biti korisno izostavljeno. Prvih 16 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 10 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE54 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0068] SEQ ID NO: 45 je koristan fragment SEQ ID NO: 10 (’PSE55417-243’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE54 i lakše se koristi na industrijskoj skali. On takođe smanjuje sličnost antigena sa humanim proteinima.

PA0595 ili PSE5-1

[0069] PSE5-1 antigen je označen kao ’ OstA prekursor proteina za toleranciju prema organskim rastvaračima’. U PAO1 soju PSE5-1 je PA0595 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 (GI: 15595792). Videti Ref.37. Ponekad, PA0595 se ovde naziva ’PSE5-1 ili ’PSE5’.

[0070] Korisnil PSE5-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 11 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 11; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 11, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE5-1 proteini uključuju varijante include SEQ ID NO: 11. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 11. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) iz C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) iz N-kraja SEQ ID NO: 11 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 11. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 11 može biti korisno izostavljeno. Prvih 33 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 11 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE5-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0071] SEQ ID NO: 46 je koristan fragment SEQ ID NO: 11 (’PSES-134-924’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE5-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

[0072] PSE13-2 antigen je označen kao ’ hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE13-2 je PA1954 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 (GI: 15597150). Videti Ref.37. Ponekad, PA1954 se ovde naziva ’PSE13-2’ ili ’PSE13’.

[0073] Korisni PSE13-2 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 12 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 12; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 12, gde ’n’ je 7 ili vedi (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE13-2 uključuju varijante SEQ ID NO: 12. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 12. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 12 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 12. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 12 može biti korisno izostavljeno. Prvih 24 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 12 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE13-2 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0074] SEQ ID NO: 47 je koristan fragment SEQ ID NO: 12 (’PSE13-225-340’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE13-2 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA3692 ili PSE17-1

[0075] PSE17-1 antigen je označen kao ’ Lipotoxin F, LptF’. U PAO1 soj PSE17-1 je PA3692 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 (GI: 15598888). Videti Ref.37. Opisan je kao da pripada spoljašnjem membrranskom proteinu i sa njim u vezi peptidoglikanom-vezanim za (lipo) proteine kao što je prikazano u referenci 39. Ponekad, PA3692 se ovde naziva ’PSE17-1’ ili ’PSE17’.

[0076] Korisni PSE17-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 13 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više sa SEQ ID NO: 13; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 13, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ova PSE17-1 uključuje varijante SEQ ID NO: 13. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 13. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 13 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 13. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 13 može biti korisno izostavljeno. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 13 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE17-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

1

[0077] SEQ ID NO: 48 je koristan fragment SEQ ID NO: 13 (’PSE17-120-261’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE17-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA4370 ili PSE18-2

[0078] PSE18-2 antigen je označen kao ’prekursor proteina spoljašnje mebrane metaloproteaze koja cepa insulin’. U PAO1 soj PSE18-2 je PA4370 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 (GI: 15599566). Videti Ref.37. Opisa je da pripada proteinu spoljašnje membrane i naročito spoljašnjem membranskom proteinu metaloproteazi koja cepa insulin (IcmP) kako je prikazano u referenci 40. Ponekad, PA4370 se ovde naziva ’PSE18-2’ ili ’PSE18’.

[0079] Korisni PSE18-2 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 14 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 14; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 14, gde ’n’ je 7 ili viši (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE18-2 uključuju varijante SEQ ID NO: 14. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 14. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) iz C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 14 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 14. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 14 može biti korisno izostavljeno. Prvih 20 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 14 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE18-2 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0080] SEQ ID NO: 49 je koristan fragment SEQ ID NO: 14 (’PSE18-221-446’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE18-2 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA4735 ili PSE20-1

[0081] PSE20-1 antigen je označen kao ’ hipotetični protein’. U PAO1 soju PSE20-1 je PA4735 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 (GI: 15599929). Videti Ref. 37. Ponekad, PA4735 se ovde naziva ’PSE20-1’ ili ’PSE520’.

[0082] Korisni PSE20-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 16 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 16; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 16, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE20-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 16. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 16. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) iz C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 16 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 16. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 16 može biti korisno izostavljeno. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 16 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE20-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0083] SEQ ID NO: 51 je koristan fragment SEQ ID NO: 16 (’PSE20-120-1088’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE20-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA3647 ili PSE23-1

[0084] PSE23-1 antigen je označen kao ’ hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE23-1 je PA3647 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 (GI: 15598843). Videti Ref. 37. Opisana je kao verovatni prekursor proteina spoljašnje membrane ili OmpH gen i opisan je kao kontaminant u toku postupka prečišdavanja OprI kako je prikazano u referenci 41. Ponekad, PA3647 se ovde naziva ’PSE23-1’ ili ’PSE23’.

[0085] Korisni PSE20-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 17 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 17; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 17, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE20-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 17. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 17. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 17 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 17. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 17 može biti korisno izostavljeno. Prvih 22 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 17 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE23-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0086] SEQ ID NO: 52 je koristan fragment SEQ ID NO: 17 (’PSE20-123-168’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE23-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA0126 ili PSE24-1

[0087] PSE24-1 antigen je označen kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soj PSE24-1 je PAO126 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 (GI: 15595324). Videti Ref. 37. Ponekad, PA0126 se ovde naziva ’PSE24-1’ ili ’PSE24’.

[0088] Korisni PSE24-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koji prepoznaje SEQ ID NO: 18 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili više) sa SEQ ID NO: 18; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 18, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ove PSE24-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 18. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 18. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 18 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 18. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 18 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE24-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

1

[0089] SEQ ID NO: 53 je koristan fragment SEQ ID NO: 18 (’PSE24-120-206). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE24-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA0189 ili PSE25-1

[0090] PSE25-1 antigen je označen kao ’mogudi porin’. U PAO1 soju PSE25-1 je PA0189 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 (GI: 15595387). Videti Ref. 37. Ponekad, PA0189 se ovde naziva ’PSE25-1’ ili ’PSE25’.

[0091] Korisni PSE25-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 19 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 19; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 19, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovde PSE25-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 19. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 19. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 19 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 19. Prvih 25 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 19 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE25-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0092] SEQ ID NO: 54 je koristan fragment SEQ ID NO: 19 (’PSE25-126-452’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE25-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA0274 ili PSE26-1

[0093] PSE26-1 antigen je označen kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE26-1 je PA0274 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 (GI: 15595471). Videti Ref. 37. Ponekad, PA0274 se ovde naziva ’PSE26-1’ ili ’PSE26’.

[0094] Korisni PSE26-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 20 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 20; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 20, gde ’n’ is 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ove PSE26-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 20. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 20. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 20 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 20. Prvih 23 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 20 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE26-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0095] SEQ ID NO: 55 je koristan fragment SEQ ID NO: 20 (’PSE26-124-256’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE26-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

1

PA0537 ili PSE28-2

[0096] PSE28-1 antigen je označen kao ’konzervisani hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE28-1 je PA0537 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 (GI: 15595734). Videti Ref. 37. Ponekad, PA0537 se ovde naziva ’PSE28-1’ ili ’PSE28’.

[0097] Korisni PSE28-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 21 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 21; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 21, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE28-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 21. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 21. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 21 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 21. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 21 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE28-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0098] SEQ ID NO: 56 je koristan fragment SEQ ID NO: 21 (’PSE28-1’20-202’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE28-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA0737 ili PSE31-2

[0099] PSE31-2 antigen je označen kao ’konzervisani hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE31-2 je PA0737 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 (GI: 15595934). Videti Ref. 37. Opisan je kao povedano regulisani lipoproteini. Videti ref.42. Ponekad, PA0737 se ovde naziva ’PSE31-2’ ili ’PSE31’.

[0100] Korisni PSE31-2 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 22 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koje je identično 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 22; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 22, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE31-2 uključuju varijante SEQ ID NO: 22. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 22. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 22 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 22. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 22 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE31-2 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0101] SEQ ID NO: 57 je koristan fragment SEQ ID NO: 22 (’PSE31-2’20-151’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE31-2 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

1

PA1086 ili PSE33-2

[0102] PSE33-2 antigen je označen kao ’protein 1 FlgK u vezi sa flagelom’. U PAO1 soju PSE33-2 je PA1086 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 (GI: 15596283). Videti Ref. 37. Ponekad, PA1086 se ovde naziva ’PSE33-2’ ili ’PSE33’.

[0103] Korisni PSE33-2 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 23 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identičana 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 23; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 23, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE33-2 proteini uključuju varijante SEQ ID NO: 23. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 23. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 23 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 23. Prva N-terminalna aminokiselina SEQ ID NO: 23 može biti korisno izostavljena. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE33-2 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0104] SEQ ID NO: 58 je koristan fragment SEQ ID NO: 23, gde smo Met u položaju 1 polipeptida je uklonjen da se omogudi ispravno kloniranje i ekspresija u uobičajeno poznatim ekspresionim sistemima tj. PET vektor sistemu. Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE31-2 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA2793 ili PSE42-1

[0105] PSE42-1 antigen je označen kao ’hipotetični protein’. U PAO1 soju PSE42-1 je PA2793 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 (GI: 15597989). Videti Ref. 37. Ponekad, PA2793 se ovde naziva ’PSE42-1’ ili ’PSE42’.

[0106] PSORT dostupni program je predvideo ovaj protein kao lipoprotein i izvozni signal tipa II (lipoproteina) je predviđen sa LipoP cepanjem posle ostatka 20. Videti Ref.37.

[0107] Korisni PSE42-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 27 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 27; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 27, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE42-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 27. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 27. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 27 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 27. Prvih 20 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 27 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE42-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0108] SEQ ID NO: 62 je koristan fragment SEQ ID NO: 27 (’PSE42-121-344’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE42-1i lakše se koristi na industrijskoj skali.

1

PA3535 ili PSE45-2

[0109] PSE45-2 antigen je označen kao ’mogudi prekursor proteina spoljašnje membrane’. U PAO1 soju PSE45-2 je PA3535 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 (GI: 15598731). Videti Ref.37. Ponekad, PA3535 se ovde naziva ’PSE45-2’ ili ’PSE45’.

[0110] Korisni PSE45-2 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 28 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 28; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 28, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE45-2 uključuju varijante SEQ ID NO: 28. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 28. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 28 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 28. Prvih 30 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 28 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE45-2 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0111] SEQ ID NO: 63 je koristan fragment SEQ ID NO: 28 (’PSE45-231-995’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE45-2 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA4578 ili PSE50-1

[0112] PSE50-1 antigen je označen kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE50-1 je PA4578 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 (GI: 15599774). Videti Ref. 37. Ponekad, PA4578 se ovde naziva ’PSE50-1’ ili ’PSE50’.

[0113] Korisni PSE50-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 29 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identičana 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 29; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 29, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE50-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 29. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 29. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 19, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 29 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 29. Prvi 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 29 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE45-2 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0114] SEQ ID NO: 64 je koristan fragment SEQ ID NO: 29 (’PSE50-120-162’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE50-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

1

PA4667 ili PSE51-4

[0115] PSE51-4 antigen je označen kao ’hipotetičkil protein’. U PAO1 soj PSE51-4 je PA4667 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 (GI: 15599862). Videti Ref. 37. Ponekad, PA4667 se ovde naziva ’PSE51-4’ ili ’PSE51’.

[0116] Korisni PSE51-4 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 30 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 30; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 30, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE51-4 uključuju varijante SEQ ID NO: 30. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 30. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 19, 20, 25, 30 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 30 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 30. Prvih 31 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 30 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE51-4 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0117] SEQ ID NO: 65 je koristan fragment SEQ ID NO: 30 (’PSE51-432-590’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE51-4 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA1106 ili PSE34-1

[0118] PSE34-1 antigen je označen kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE34-1 je PA1106 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 (GI: 15596303). Videti Ref. 37. Ponekad, PA1106 se ovde naziva ’PSE34-1’ ili ’PSE34’.

[0119] Korisni PSE34-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 24 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 24; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 24, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE34-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 24. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 24. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 24 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 24. Prvih 20 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 24 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE34-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0120] SEQ ID NO: 59 je koristan fragment SEQ ID NO: 24 (’PSE34-121-237’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE34-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

2

PA1324 ili PSE36-3

[0121] PSE36-3 antigen je označen kao ’hipotetički protein’. U PAO1 soju PSE36-3 je PA1324 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 (GI: 15596521). Videti Ref. 37. Ponekad, PA1324 se ovde naziva ’PSE36-3’ ili ’PSE36’.

[0122] PA1324 se pretpostavlja da je uključen u vezivanje i transport šedera ili polisaharida koji su u vezi sa matriksom peptidoglikana u toku obrazovanja biofilma [43]

[0123] Korisni PSE36-3 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 25 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 25; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 25, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Oni PSE36-3 uključuju varijante SEQ ID NO: 25. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 25. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 25 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 25. Prvih 19 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 25 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE36-3 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0124] SEQ ID NO: 60 je koristan fragment SEQ ID NO: 25 (’PSE36-3’20-170’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE36-3 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

Druga grupa antigena

PA1178 ili PSE10

[0125] ’PSE10’ antigen je označen kao ’PhoP/Q i nizak Mg2+ induktibilni protein spoljne membrane’. U PAO1 soju PSE10 je nazvan takođe OprH [44] i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U PAO1 soju PSE10 je označen kao PA1178 i njegov NCBI identifikator je GI: 15596375. Videti Ref. 37. Ponekad, PA1178 se ovde naziva ’PSE10-1’ ili ’PSE10’.

[0126] Korisni PSE10 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 2 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 2; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 2, gde ’n’ je 7 ili više (npr. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE10 uključuju varijante SEQ ID NO: 2. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 2. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 2 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 2. Prvih 21 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 2 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. Upotreba fragmenata je korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0127] SEQ ID NO: 37 je koristan fragment SEQ ID NO: 2 (’PSE1022-200’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE10 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA1248 ili PSE11-3

[0128] ’PSE11-3’ antigen je označen kao ’AprF prekursor proteina spoljne membrane sekrecije alkalne proteaze’. U PAO1 soju PSE11-3 je PA1248 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4. U PAO1 soju NCBI identifikator je GI: 15596445. Videti referencu 37 i 45.

[0129] Ponekad, PA1248 se ovde naziva ’PSE11-3’ ili ’PSE11’.

[0130] Korisni PSE11-3 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 4 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 4; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 4, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE11-3 uključuju varijante SEQ ID NO: 4. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 4. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 4 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 4. Prvih 18 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 4 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE11-3 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd. U referenci 45 ovaj antigen je opisan kao poznati virulenti faktor i testiran je kao antigen.

[0131] SEQ ID NO: 39 je koristan fragment SEQ ID NO: 4 (’PSE11-319-481). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE11-3 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA4765 ili PSE52-1

[0132] SE52-1 antigen je označen kao ’ OmlA prekursor spoljnomembranskog lipoproteina’. PAO1 soj PSE52-1 je PA4765 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 (GI: 15599959). Videti Ref. 37. Ponekad, PA4765 se ovde naziva ’PSE52-1’ ili ’PSE552’.

[0133] Opisano je od 1999 da pripada spoljnomembranskoj familiji proteina kao u referenci 46.

[0134] Korisni PSE52-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 8 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 8; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 8, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE52-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 8. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 8. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 8 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 8. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 8 može biti korisno izostavljeno. Prvih 21 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 8 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE52-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0135] SEQ ID NO: 43 je koristan fragment SEQ ID NO: 8 (’PSE52-122-176’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE52-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA4710 ili PSE19-1

[0136] PSE19-1 antigen je označen kao PhuR prekursor spoljnomembranskog receptora preuzimanja hema/hemoglobulina’. U PAO1 soju PSE19-1 je PA4710 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 (GI: 15599904). Videti Ref. 37. Kratki peptidi koji potiču iz pomenutog antigena je predloženo da pokazuju izvesnu imunogenost, međuim ovaj antigen nije testiran kao antigen vakcine u kombinaciji [47]. Ponekad, PA4710 se ovde naziva ’PSE19-1’ ili ’PSE19’.

[0137] Korisni PSE19-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 15 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 15; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 15, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE19-2 uključuju varijante SEQ ID NO: 15. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 15. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 15 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 15. Krajnjih 40 C-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 15 može biti korisno izostavljeno. Prvih 25 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 15 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE19-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0138] SEQ ID NO: 50 je koristan fragment SEQ ID NO: 15 (’PSE19-126-764’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE19-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

PA1777 ili PSE38-1

[0139] PSE38-1 antigen je označen kao ’OprF prekursor glavnog porina i stukturnog spoljnomembranskog porina’. U PAO1 soju PSE38-1 je PA1777 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 (GI: 15596974). Videti Ref. 37 i 48. EP0297291 opisuje prvi put ovaj protein kao korisni antigen. Ponekad, PA1777 se ovde naziva ’PSE38-1’ ili ’PSE38’.

[0140] Korisni PSE38-1 antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 26 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 26; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 26, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PSE38-1 uključuju varijante SEQ ID NO: 26. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 26. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 26 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 26. Prvih 24 N-terminalnih aminokiselina SEQ ID NO: 26 može biti korisno izostavljeno. U drugim fragmentima

2

izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PSE38-1 je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0141] SEQ ID NO: 61 je koristan fragment SEQ ID NO: 26 (’PSE38-125-350’). Ovaj fragment obuhvata najizloženiji domen PSE38-1 i lakše se koristi na industrijskoj skali.

Dodatni antigeni polipeptidi

PA4525 ili PilA

[0142] PilA antigen je označen kao ’fimbrijalnog prekursor PilA tipa 4’. U PAO1 soju PilA je PA4525 i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 (GI: 15599721). Vidi Ref.37. Korisni PilA antigeni mogu izazvati antitelo (npr. kada se daju čoveku) koje prepoznaje SEQ ID NO: 31 i/ili može sadržati aminokiselinsku sekvencu: (a) koja je identična 50% ili više (npr.60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa SEQ ID NO: 31; i/ili (b) koja sadrži fragment sa bar ’n’ uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 31, gde ’n’ je 7 ili više (npr.8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ili više). Ovi PilA uključuju varijante SEQ ID NO: 31. Poželjni fragmenti (b) sadrže epitop iz SEQ ID NO: 31. Drugim poželjnim fragmentima nedostaje jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa C-kraja i/ili jedna ili više aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili više) sa N-kraja SEQ ID NO: 31 dok se zadržava bar jedan epitop SEQ ID NO: 31. U drugim fragmentima izostavljeni su jedan ili više proteinskih domena. PilA je prirodni dug protein i tako je upotreba fragmenta korisna npr. za prečišdavanje, rukovanje, fuziju, ekspresiju, itd.

[0143] Korisni fragment uključuje najizloženiji domen PilA i lakše se koristi na industrijskoj skali. On takođe smanjuje sličnost antigena sa humanim proteinima. Vakcine i imuprimedbarapija koje koriste ovaj antigen su dobijene kao što je prikazano na referenci 49, i referenci 50.

OprF-OprI

[0144] OmpF/I antigen je fuzioni protein koji se sastoji od hibridnog proteina [Met-Ala-(His)6OprF (190-342)-OprI (21-83)], ("(His)6" opisan kao SEQ ID NO: 70), koji je rezultat fuzije zrelog spoljnomembranskog proteina I (OprI) i aminokiselina 190 do 342 OprF iz Pseudomonas aeruginosa eksprimovanog u Escherichia coli i puferu.

[0145] Fuzioni protein je bio opisan u referenci 4 kao SEQ ID NO 006. Za svrhe reference, aminokiselinska sekvence pune dužine ovde opisanog fuzionog proteina je data kao SEQ ID NO: 32. Ovaj antigen može biti korisno upotrebljen kao pozitivna kontrola kao pojedinačni antigen, ili za pokazivanje iznenađujudeg pozitivnog efekata koji povedava efikasnost vakcine u in vivo eksperimentima kada se koriste u kombinaciji sa specifičnim antigenima pseudomonasa.

PA1092 ili FliC (Flagellar protein)

[0146] Flagela i glavni proteini flagele kao FliC (PA1092) ili FliD (PA1094) su obimno karakterisani i korišdeni kao pojedinalni antigeni vakcine u prošlosti kao što je prikazano u referenci 51. Za svrhe reference, ovde je aminokiselinska sekvenca pune dužine FliC data kao SEQ ID NO: 33.

[0147] PA1092 antigen i/ili PA1094 antigen mogu biti korisno kombinovani sa bilo kim iz "prve grupe anitgena " ili "druge grupe antigena".

PA1094 ili FliD (Flagelarni protein)

[0148] Flagelarni i glavni flagelarni proteini kao FliD (PA1094) su detaljno karakterisani i korišdeni kao antigeni vakcine u prošlosti kao što je prikazano u referenci 51. Za svrhe reference, aminokiselinska sekvenca pune dužine FliD je data ovde kao SEQ ID NO: 34.

[0149] PA1094 može biti korisno kombinovan sa bilo kim iz "prve grupe antigena " ili bilo kim iz "druge grupe antigena".

PA1148 ili Egzoprotein A ili Egzotoksin A

[0150] Egzoprotein A poznat takođe kao egzotoksin A je egzoprotein koji je detaljno karakterisan i koji se primarno koristi kao protein nosač u prilazu vakcini polisahardinog konjugata, npr. reference 22. Poznat je kao PA1148 u PAOIPAO1 soju. Videti ref.37.

[0151] PA1148 antigen može biti korisno kombinovan sa bilo kim iz "prve grupe antigena" ili bilo kim iz "druge grupe antigena".

Hibridni polipeptidi

[0152] Antigeni korišdeni u ovom pronalasku mogu biti prisutni u kompoziciji kao pojedinačni odvojeni polipeptidi. Kada je više od jednog antigena korišdeno, ipak, oni ne treba da budu prisutni kao odvojeni polipeptidi. Umesto toga, bar dva (npr. 2, 3, 4, 5, ili više) antigena može biti eksprimovano kao pojedinačni proteinski lanac (’hibrid’ polipeptid). Hibridni polipeptidi nude dve glavne krakteristile: prvu, polipeptid koji može biti nestabilan ili slabo eksprimovan sam, pa je potpomognut dodavanjem pogodnog hibridnog partnera koji prevazilazi problem; drugo, komercijalna proizvodnja je pojednostavljena samo potrebom za jednim korišdenjem eksprimovanja i prečišdavanja u cilju dobijanja dva polipeptida koja su oba korisna kao antigeni. Hibridni polipeptidi mogu sadržati dve ili više polipeptidnih sekvenci iz prve grupe antigena. Hibridni polipeptidi mogu sadržati jedan ili više polipeptidnih sekvenci iz prve grupe antigena i jednog ili više polipeptidnih sekvenci iz druge grupe antigena. Pored toga, hibridni polipeptid može sadražti dve ili više polipeptidnih sekvenci iz liste svakog gore navedenog antigena, ili dve ili više varianti istog antigena u slučajevima u kojima sekvenca ima parcijalnu varjabilnost u soju.

[0153] Korisni su hibridi koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci iz dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, ili deset antigena. Naročito, hibridi koji se sastoje od aminokiselinskih sekvenci od dva, tri, četiri ili pet antigena su poželjni, kao što su sva ili tri antigena.

[0154] Različiti hibridni proteini mogu biti pomešani zajedno u jednoj formulaciji. Hibridi mogu biti kombinovani sa nehibridnim antigenima izabranim iz prve, druge ili trede grupe antigena. U okviru takvih kombinacijama, antigen može biti prisutan u više od jednog polipeptida i/ili kao nehibridni polipeptid. Poželjno je, međutim, da je antigen prisutan ili kao hibrid ili kao nehibrid, ali ne oboje.

[0155] Hibridni polipeptidi mogu takođe biti kombinovani sa konjugatima ili antigenima koji nisu iz P.aeruginosa kako je gore opisano.

[0156] Hibridni polipeptidi mogu biti prikazani sa formulom NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, gde: X je aminokiselinska sekvenca antigena iz P. aeruginosa, kako je gore opisano; L je opciono linker aminokiselinske sekvence; A je opciona N-terminalna aminokiselinska sekvenca; B je opciona C-

2

terminalna aminokiselinska sekvenca; n je ceo broj od 2 ili više (npr.2, 3, 4,5, 6, itd.). Uglavnom n je 2 ili 3.

[0157] Ukoliko -X-deo ima vodedu peptidnu sekvencu u njegovom obliku divljeg tipa, ovo može biti obuhvačeno ili izostavljeno u hibridnom protenu. U nekim izvođenjima, vodedi peptid de biti izbrisan osim sa onog smeštenog u -X- delu na N-kraju hibridnog proteina tj. vodedi peptid X1de biti zadržan, ali vodedi peptidi X2... Xnde biti izostavljen. Ovo je ekvivalent brisanju svih vodedih peptida i korišdenju vodedeg peptida X1kao dela -A-.

[0158] Za svaki n slučaja {-X-L-}, vodeda aminokiselinska sekvenca -L-može biti prisutna ili odsutna. Na primer, kada n=2 hibrid može biti NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, itd. Vezujuda grupa aminokiselinskih sekvenci-L- de tipično biti kratak (npr. 20 ili manje aminokiselina tj.20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Primeri sadrže kratke peptidne sekvence koje olakšavaju kloniranje, vezujudih grupa poli-glicina (tj. koje sadrže Glyngde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više) (SEQ ID NO: 71), i histidinskih obeleživača (tj. Hisngde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više) (SEQ ID NO: 72). Druge pogodne aminokiselinske sekvence vezujudih grupa de biti očigledne osobama iz struke. Koristna vezujuda grupa je GSGGGG (SEQ ID NO: 67) ili GSGSGGGG (SEQ ID NO: 68), sa Gly-Ser dipeptidom koji je obrazovan iz BamHI restrikcionog mesta, tako pomažudi kloniranje i rukovanje, i (Gly)4(SEQ ID NO: 73) tetrapeptid je bio tipična poli-glicin vezujuda grupa. Druge pogodne vezujude grupe, naročito za upotrebu kao kajnjih Lnsu ASGGGS (SEQ ID NO: 69) ili Leu-Glu dipeptid.

[0159] -A- je opciona N-terminalna aminokiselinska sekvenca. Ona de tipično biti kratka (npr. 40 ili manje aminokiselina tj.40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Primeri uključuju vodede sekvence da usmere kretanje proteina, ili kratke peptidne sekvence koje olakšavaju kloniranje ili prečišdavanje (npr. histidinski obeleživači tj. Hisngde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više) (SEQ ID NO: 72). Korisni obeleživač sadrži sekvencu od 6 uzastopnih histidina (SEQ IDNO: 70), koja ima njen početni homoloni ili heterologni polazni metionin i/ili alanin, tj. SEQ ID NO 66. Druge pogodne N-terminalne aminokiselinske sekvence de biti očigledne osobama iz stuke. Ukoliko nedostaje X1njegov N-krajnji metionin, -A- je poželjno oligopeptid (npr. sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselina) koji obezbeđuje N-terminalni metionin npr. Met-Ala-Ser, ili pojedinačni Met ostatak.

[0160] -B-je opciona C-terminalna aminokiselinska sekvenca. Ona de tipično biti kratka (npr. 40 ili manje aminokiselina tj.39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, 1).

Polipeptidi korišdeni sa ovim pronalaskom

[0161] Polipeptidi korišdeni sa pronalaskom mogu imati različite oblike (npr. prirodni, fuzioni, glikozilovani, ne-glikozilovani, sa lipidima, bez lipida, fosforilovani, nefosforilovani, miristilovani, nemiristilovani, monomerni, multimerni, partikulatni, denaturisani, itd.).

[0162] Polipeptidi korišdeni sa pronalaskom mogu biti pripremljeni na različite načine (npr. rekombinantom ekspresijom, prečišdavanjem iz delijske kulture, hemijskom sintezom, izolovanjem iz prirodnih bioloških izvora itd.). Rekombinanto-eksprimovani proteini su poželjni, naročito za hibridne polipeptide.

2

[0163] Korišdeni polipeptidi u pronalasku su poželjno obezbeđeni u prečišdenom ili suštinski čistom obliku tj. suštinski slobodnom od drugih polipeptida (npr. slobodni od polipeptida koji se javljaju u prirodi), naročito od ostalih polipeptida pseudomonasa ili delije domadina, i generalno su bar oko 50% čisti (u odnosu na masu), i uglavnom bar oko 90% čisti tj. manje od oko 50%, i poželjnije manje od oko 10% (npr. 5%) kompozicije je sačinjeno od drugih eksprimovanih polipeptida. Prema tome, antigeni u kompozicijama su odvojeni od celog organizma u kome su molekuli eksprimovani.

[0164] Polipeptidi korišdeni sa pronalskom su poželjno polipeptidi pseudomonasa.

[0165] Izraz "polipeptid" se odnosi na aminokiselinske polimere bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgrant, može sadržati modifikovane aminokiseline, i može biti prekinut sa neaminokiselinama. Izrazi takođe obuhvataju aminokiselinske polimere koji su modifikovani prirodno ili intervencijom; na primer, obrazovanjem disulfidne veze, glikozlilovanjem, sa lipidima, acetilovanjem, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugovanje sa komponentom za obeležavanje. Takođe su obuhvadeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujudi, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), kao i druge modifikacije poznate u ovoj oblasti. Polipeptidi se mogu javiti kao pojedinačni lanci ili vezani lanci.

[0166] Pronalazak obezbeđuje polipeptide koji sadrže sekvencu -P-Q- ili -Q-P-, gde: -P- je aminokiselinska sekvenca kako je gore definsiano i -Q- nije sekvenca koja je gore definisana tj. pronalazak obezbeđuje fuzione proteine. Kada N-terminalni kodon -P-nije ATG, ali ovaj kodon nije prisutan na N-kraju polipeptida, bide preveden kao standardna aminokiselina za taj kodon pre nego Met.

[0167] Kada je ovaj kodon na N-kraju polipeptida, ipak, de biti preveden kao Met. Primeri -Q delova obuhvataju, ali bez ograničenja, histidinske obeleživače (tj. Hisngde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više) (SEQ ID NO: n 72), protein koji veže maltozu, ili glutation-S-transferazu (GST).

[0168] Opis takođe obezbeđuje postupak za dobijanje polipeptida prema pronalasku, koji sadrži korak kultivisanja delije domadina transformisane sa nukleinskom kiselinom prema pronalasku pod uslovima koji izazivaju polipetidnu ekspresiju.

[0169] Mada ekspresija polipeptida prema pronalasku se može odvijati u Pseudomonasu, pronalazak de uglavnom koristiti heterolognog domadina za ekspresiju (rekombinantnu ekspresiju). Heterologni domadin može biti prokariotski (npr. bakterijski) ili eukariotski. Može biti E.coli, a drugi poželjni domadini uključuju Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (npr. M.tuberculosis), kvasac, itd. U poređenju sa divljim tipom P. aeruginosa koji kodira polipeptide prema pronalasku, korisno je promeniti kodone da se optimizuje efikasnost ekspresije u tim domadinima bez uticaja na kodirane aminokiseline.

[0170] Opis obezbeđuje postupak za dobijanje polipeptida prema pronalasku, koji sadrži korak sinteze bar dela polipeptida hemijskim sredstvima.

2

Nukleinske kiseline

[0171] Opis takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide i hibridne polipeptide prema pronalasku.Takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više polipeptida ili hibridnih polipeptida prema pronalasku.

[0172] Opis takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje su identične tim nukleotidnim sekvencama. Identitet između sekvenci je poželjno Smith-Watermanovim algolitrom pretrage homologije kako je gore opisano. Takve nukleinske kiseline uključuju one koji koriste alternativni kodoni da kodiraju iste aminokiseline.

[0173] Opis takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje mogu hibridizovati sa ovim nukleisnkim kiselinama. Hibridizavione reakcije mogu biti izvedene u uslovima različite "tačnosti sparivanja". Uslovi koji povedavaju tačnost sparivanja u reakciji hibridizacije su široko poznati i objavljeni u ovoj oblasti. Primeri relevantih stanja obuhvataju (u cilju povedavanja tačnosti sparivanja): temperature inkubacije 25°C, 37°C, 50°C, 55°C i 68°C; koncentracije pufera 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (gde SSC je 0,15 M NaCl i 15 mM citratnog pufera) i njihovi ekvivalenti koji koriste druge sisteme pufera; koncentracije formaldehida od 0%, 25%, 50%, i 75%; inkubaciona vremena od 5 minuta do 24 sata; 1, 2, ili više koraka ispiranja; vremena inkubacije ispiranja od 1, 2, ili 15 minuta; rastvori za ispiranje 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, ili dejonizovana voda. Hibridizacione tehnike i njihova optimizacija su dobro poznate u ovoj oblasti.

[0174] U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina prema pronalasku hibridizira sa ciljanom pod niskim uslovima tačnosti sparivanja; u drugim izvođenjima hibridizuje pod srednjim uslovima tačnosti sparivanja; u poželjnim izvođenjima, hibridizuje pod uslovima visoke tačnosti sparivanja. Primer parametara hibridizacije pri uslovima niske tačnosti sparivanja je 50°C i 10 x SSC. Primer pramentara hibirizacije pri uslovima srednje tačnosti sparvanja je 55°C i 1 x SSC. Primer parametara hibridizacije pri uslovima visoke tačnosti sparivanja je 68°C i 0,1 x SSC.

[0175] Pronalazak obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže komplementarne sekvence ovim sekvencama (npr. za antisense ili probe, ili za upotrebu kao prajmera).

[0176] Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti korišdene u reakcijama hibridizacije (npr. severni ili južni blotovi, ili u ’microarrays’ analizi nukleinskih kiseline ili ’genskih čipova’) i reakcijama amplifikacije (npr. PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, itd.) i ostalim tehnikama nukleinskih kiselina.

[0177] Nukleinska kiselina prema pronalasku može imati različite oblike (npr. jednolančane, dvolančane, vektore, prajmere, probe, obeleživače itd.). Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti cirkularne ili razgranate, ali de generalno bili linearne. Ukoliko nije drugačije navedeno ili zahtevano, bilo koje izvođenje prema pronalasku koje koristi nukleinsku kiselinu može koristiti i dvolančani oblik i bilo koji od dva komplementarna jednolančana oblika koji čine dvolančani oblik. Primeri i probe su generalno jednolančani, jer su antisens nukleinske kiseline.

[0178] Nukleinske kiseline prema opisu su poželjno obezbeđene u predišdenom ili suštinski prečišdenom obliku tj. suštinski slobodnom obliku od ostalih nukleinskih kiselina (npr. bez nukleinskih kiselina koje se javljaju u prirodi), naročito bez drugih nukleinskih kiselina pseudomonasa ili delije domadina, generalno su bar oko 50% čisti (u odnosu na masu), i uglavnom su bar 90% čisti. Nukleinske kiseline prema pronalasku su poželjno nukleinske kiseline pseudomonasa.

2

[0179] Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti pripremljene na mnogo načina npr. hemijskom sintezom (npr. fosforamiditnom sintezom DNK) u celini ili delom, digestiranjem dužih nukelinskih ksielina pomodu nukleaza (npr. restrikcionih enzima), spajanjem kradih nukleinskih kiselina ili nukleotida (npr. korišdenjem ligaza ili polimeraza), iz genomske ili cDNK biblioteka, itd.

[0180] Nukleinska kiselina prema pronalasku može biti vezana za čvrsti nosač (npr. zrnce, ploče, filter, film, pločicu, nosač za ’microarray ’, smolu, itd.). Nukleinska kiselina prema pronalasku može biti obeležena npr. sa radioaktivnim ili fluorescentnim obeleživačem, ili biotinskim obeleživačem. Ovo je naročito korisno kada se nukleinska kiselina koristi u tehnikama za detekciju npr. kada je nukleinska kiselina prajmer ili kao proba.

[0181] Izraz "nukleinska kiselina" obuhvata generalno polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, koja sadrži deoksiribonukeotide, ribonukleotide, i/ili njihove analoge. Obuhvata DNK, RNK, DNK/RNK hibride. Takođe obuhvata DNK ili RNK analoge, kao što su oni koji sadrže modifikovane osnovne strukture (npr. peptidne nukleinske kiseline (PNAs) ili fosforotioate) ili modifikovane baze. Prema tome pronalazak obuhvata mRNK, tRNK, rRNK, ribozome, DNA, cDNA, rekombinantne nukleinske kiseline, razgranate nukleinske kiseline, plazmide, vektore, probe, prajmere, itd. Kada nukleinska kiselina prema pronalasku ima oblik RNK, može i ne mora imati 5’ kraj.

[0182] Nukleinske kiseline prema opisu mogu biti deo vektora tj. deo konstruktra nukleinske kiseline napravljenog za transdukciju /transfekciju jednog ili više tipova delija. Vektori mogu biti, na primer, "vektori za kloniranje" koji su napravljeni za izolovanje, propagaciju i replikaciju umetnutih nukleotida, "ekspresioni vektori" koji su napravljeni za ekspresiju nukleotidnih sekvenci kod domadina, "virusni vektori" koji su napravljeni da dovedu do proizvodnje rekombinantnih virusa čestica sličnih virusu, ili "vektora za transfer", koji sadrže atribute više od jednog tipa vektora. Poželjni vektori su plazmidi. "Delija domadin" obuhvata pojedinačne delije ili čelije kulture koje mogu biti ili koje su bile recipijenti egzogenih nukleinskih kiselina. Delije domadini obuhvataju potomke pojedinačne delije domadina, i potomak ne mora neophodno biti potpuno identičan (u morfologiji ili u ukupnom DNK komplementu) sa originalnom roditeljskom delijom usled prirodnih, slučajnih ili namernih mutacija i/ili promena. Delije domadina obuhvataju transfektovane delije ili inficirane in vivo ili in vitro sa nukleinskim kiselinama prema pronalasku.

[0183] Kada je nukleinska kiselina DNK, zna se da de"U" u RNK sekvenci de biti zamenjeno sa "T" u DNK. Slično, kada je nukleinska kiselina RNK, zna se da de "T" u DNK sekvenci biti zamenjeno sa "U" u RNK.

[0184] Izraz "komplement" ili "komplementarnost" kada se koristi u vezi sa nukleinskim kiselinama odnosi se na Votson-Krikovo sparivanje baze. Prema tome komplement C je G, komplement G je C, komplement A je T (ili U), i komplement T (ili U) je A. Takođe je mogude da se koriste baze kao što su I (purin inozin) npr. sa komplementima pirimidinima (C or T).

[0185] Nukleinske kiseline prema opisu mogu biti korišdene, na primer: za dobijanje polipeptida; kao hibridizacionih proba za detekciju nukleinske kiseline u biološkim uzorcima; za stvaranje dodatnih kopija nukleinskih kiselina; za stvaranje ribozoma ili antisens oligonukleotida; kao jednolančanih DNK prajmera ili proba; ili kao trostuko obrazovani oligonukleotidi.

2

[0186] Opis obezbeđuje postupak za dobijanje nukleinske kiseline prema pronalasku, gde nukleinska kiselina je sintetizovana delom ili u celini pomodu hemijskih sredstava .

[0187] Opis obezbeđuje vektore koji sadrže nukleotidne sekvence prema pronalasku (npr. vektore za kloniranje ili ekspresiju) i delije domadine transformisane sa takvim vektorima.

[0188] Amplifikacija nukleinskih kiselina prema pronalasku može biti kvantitativna i/ili u realnom vremenu.

[0189] Za izvesna izvođenja prema pronalasku, nukleinske kiseline su poželjno dužine bar 7 nukleotida (npr.8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nukleotida ili duže).

[0190] Za izvesna izvođenja prema pronalaasku, nukleotidne kiseline su poželjno dužine od najviše 500 nukleotida (npr.450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nukleotida ili krade).

[0191] Prajmeri ili probe prema pronalasku, i druge nukleotidne kiseline su korišdeni za hibridizaciju, su poželjno dužine između 10 i 30 nukleotida (npr. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 ili više nukleotida).

Lanci i varijante

[0192] Antigeni su definisani gore u vezi sa postojedom nomenklaturom (npr. "PA0328"), na "PSE52" ili na "PSE pradeno sa prirodnim brojevima, koji ukazuju na broj klona, tj. PSE52-1, itd" ili odgovarajude SEQ ID NOs brojeve.

[0193] Tabela 1 dole udružuje ova tri sistema imenovanja/obeležavanja brojevima na postojedi PAO1 javno dostupno obeležavanje brojevima.

[0194] PAO1 obeležavanje brojevima se odnosi na genom P. aeruginosa soja PAO1 koji je detaljno opisan u smislu genomskih analiza u referenci 37.

[0195] Funkcionalne napomene za svaki antigen su takođe date u bazama podataka.

[0196] Prema tome, primeri aminokiselinske i nukleotidne sekvence za bilo koji od ovih antigena mogu lako biti nađeni u dostupnim bazama podataka sekvenci iz PAO1 soja, ali pronalazak nije ograničen na sekvence iz PAO1 soja. Standardne tehnike pretraživanja i poravnavanja mogu biti korišdene da se identifikuju u bilo kom od ovih (ili drugih) dodatnih genomskih sekvenci homologa bilo koje određene sekvence PAO1 soja. Pored toga, dostupne sekvence iz PAO1 soja mogu biti korišdene da se osmisle prajmeri za pojačavanje homolognih sekvenci iz drugih sojeva. Prema tome, pronalazak nije ograničen na ovaj soj, ali pre obuhvatanja takvih varijanti i homologa iz drugih sojeva P. aeruginosa, kao i varijanti koje nisu prirodne. Generalno, pogodne varijante naročito SEQ ID NO obuhvataju njene varijante alela, njene polimorfne oblike, njene homologe, njene ortologe, njene paraloge, njene mutante, itd.

[0197] Prema tome, na primer, polipeptidi korišdeni sa pronalaskom mogu, poređeni sa SEQ ID NO ovde, obuhvatati jednu ili više (npr. 1,2,3,4,5,6,7,8, 9, itd.) aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne supstitucije (tj. supstitucije jedne aminokiseline sa drugom koja ima sličan bočni lanac). Genetski-kodirane aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: (1) kiselu tj. aspartat, glutamat; (2) baznu tj. lizin, arginin, histidin; (3) nepolarnu tj. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisanu polarnu tj. glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan, i tirozin su ponekad klasifikovani zajedno kao aromatične aminoksieline. Generalno, zamena pojedinačnih aminokiselina u okviru ovih familija nema veliki uticaj na njihovu biološku aktivnost. Polipeptidi mogu takođe obuhvatati brisanje jedne ili više (npr.1, 2, 3,4, 5, 6,7, 8, 9, itd.) pojedinačnih aminokiselina u vezi sa SEQ ID NO sekvencama. Polipeptidi mogu takođe obuhvatati jedno ili (npr. 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, itd.) umetanja (npr. svako 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokisleina) u odnosu na SEQ ID NO sekvence.

[0198] Slično, polipeptid korišden sa pronalaskom može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja:

• je identična (tj.100% identična) sa sekvencom opisanom u listi sekvenci;

• deli sekvencu identičnu (npr. 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili više) sa opisanom sekvencom u listi sekvenci;

• ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 (ili više) pojedinačnih izmena (brisanja, umetanja, zamena), aminokiselina koje mogu biti na odvojenim mestima ili mogu biti uzastopne, kada se porede sa sekvencama (a) ili (b);

• kada su poravnate sa određenom sekvencom iz liste sekvenci pomodu algoritma poravnavanja sparivanjem, svaki pokretni prozor x aminokiselina sa N-kraja do C-kraja (kao taj za poravnavanje koje se proteže do p aminokiselina, gde p>x, postoji p-x+1 takvih prozora) ima bar x·y identičnih poravnatih aminokiselina, gde: x je izabran iz 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y je izabran od 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; i ukoliko x·y nije ceo broj tada je zaokružen do najbližeg celog broja. Poželjni algoritam poravnavanja sparivanjem je Needleman-Wunsch-ov globalni algoritam sprarivanja [52], koji koristi podrazumevajude parametre (npr. sa ’Gap opening penalty’ = 10,0, i sa ’Gap extension penalty ’= 0,5, pomodu matriksa bodovanja EBLOSUM62). Ovaj algoritam je konvencionalno implementiran u ’needle ’ alat u EMBOSS paketu [53].

[0199] Kada su korišdeni polipeptidni hibridi, pojedinačni antigeni u okviru hibrida (tj. individualnih -X-delova) mogu biti iz jednog ili više sojeva. Kada n=2, na primer, X2može biti iz istog soja kao X1ili iz različitog soja. Kada n=3, soj može biti (i) X1=X2=X3(ii) X1=X2≠X3(iii) X1≠X2=X3(iv) X1≠X2≠X3ili (v) X1=X3≠X2, itd.

[0200] U okviru grupe (c), brisanja ili supstitucije mogu biti na N-kraju i/ili C-kraju, ili mogu biti između dva kraja. Prema tome, skradivanje je primer brisanja . Skradivanje može uključivati brisanje do 40 (ili više) aminokiselina na N-kraju i/ili C-kraju. Skradivanja sa N-kraja mogu ukloniti vodede peptide npr. da se olakša rekombinantna ekspresija u heterolognom domadinu. Skradivanja sa C-kraja mogu ukloniti sidro sekvencu npr. da se olakša rekombinantna ekspresija u heterolognom domadinu.

[0201] Generalno, kada antigen sadrži sekvencu koja nije identična sa potpunom P. aeruginosa sekvencom iz liste sekvenci (npr. kada ona sadrrži listu sekvencu <100% identičnu sa njom, ili kada sadrži njen fragmet) poželjno je u svakom pojedinačnom slučaju da antigen može izazvati antitelo koje prepoznaje odgovarajudu kompletnu sekvencu P. aeruginosa.

1

Mutant bakterija

[0202] Prikazani opis, takođe obezbeđuje bakteriju P. aeruginosa u kojoj jedan ili više antigena iz različitih grupa antigene prema pronalasku je nokautirano (engl.’knocked out’) (videti Ref. 46). Tehnike za proizvodnju nokautiranih bakterija su dobro poznate i nokautirani geni iz P. aeruginosa soja su zabeleženi tj. uRef.54. Nokaut mutacija može biti smeštena u kodirajudi region gena ili može ležati u okviru njenih transkripcionih kontrolnih regiona (npr. u okviru njegovog promotera). Nokaut mutacija de smanjiti nivo mRNA kodiranja antigena do <1% od onog proizvedenog sa bakterijom divljeg tipa, poželjno <0,5%, poželjnije <0.1%, i najpoželjnije do 0%.

[0203] Opis takođe obezbeđuje P. aeruginosa u kojoj jedan ili više antigena iz različitih grupa antigena prema pronalasku ima mutaciju koja inhibira njegovu aktivnost. Gen koji kodira antigen de imati mutaciju koja menja kodiranu aminokiselinsku sekvencu. Mutacija može uključuvati brisanja, zamene i/ili umetanja, u koja može biti uključena jedna ili više aminokiselina.

[0204] Opis takođe obezbeđuje bakteriju, kao što je P. aeruginosa bakterija, koja hipereksprimira antigen prema pronalasku.

[0205] Opis takođe obezbeđuje bakteriju, kao što je P. aeruginosa bakterija, koja konsekutivno eksprimira antigen prema pronalasku. Opis takođe obezbeđuje E. coli koja sadrži gen koji kodira antigen prema pronalasku, gde je gen pod kontrolom inducibilnog promotera.

[0206] Mutant bakterija je naročito korisna za dobijanje bakterijskih vezikula spoljašnje membrane koje sadrže P. aeruginosa antigene (npr. antigene prema pronalasku), koji mogu biti korišdeni kao imunogeni [55-57].

Imunogene kompozicije i lekovi

[0207] Imunogene kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne kao vakcine. Vakcine prema pronalasku mogu biti ili profilaktičke (tj. da sprečavaju infekciju) ili terapeutske (tj. da leče infekciju), ali de uglavnom biti profilaktičke.

[0208] Kompozicije mogu prema tome biti farmaceutski prihvatljive. One de uglavnom uključivati komponente pored antigena npr. one de tipično uključivati jedan ili više farmaceutskih nosača i/ili ekscipijenata.

[0209] Kompozicije de generalno biti davane sisarima u vodenom obliku. Pre davanja, međutim, kompozicija može biti u nevodenom obliku. Na primer, mada su neke vakcine proizvedene u vodenom obliku, zatim proceđene i rasproeđene i davane takođe u vodenom obliku, druge vakcine su liofilizovane u toku proizvodnje i rekonstruisane u vodeni oblik kada se upotrebljavaju. Prema tome kompozicija prema pronalasku može biti osušena, tako da je formulacija liofilizovana.

[0210] Kompozicija može obuhvatati konzervanse kao što su tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjno je, međutim, da vakcina bude u suštini bez (tj. manje od 5mg/ml) materijala sa živom npr. beztiomersala. Poželjnije su vakcine koje ne sadrže živu. Vakcine bez konzervansa su naročito poželjne.

[0211] Da bi se povedaval termalna stabilnost, kompozicija može uključivati temperaturno zaštitno sredstvo. Drugi detalji o takvim sredstvima su dole dati.

2

[0212] Da bi se kontrolisala toničnost, poželjno je uključiti fiziološku so, kao što je natrijumova so. Natrijum hlorid (NaCl) je poželjan, koji može biti prisutan između 1 i 20 mg/ml npr. oko 10±2mg/ml NaCl. Druge soli koje mogu biti prisutne obuhvataju kalijum hlorid, kalijum dihidrogen fosfat, dinatrijum fosfat dehidrat, magnezijum hlorid, kalcijum hlorid, itd.

[0213] Kompozicije de generalno imati osmolarnost između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg, poželjno između 240-360 mOsm/kg, i poželjnije de spadati u opseg od 290-310 mOsm/kg.

[0214] Kompozicije mogu sadržati jedan ili više pufera. Tipično puferi obuhvataju: fosfatni pufer; tris pufer; boratni pufer; sukcinatni pufer; histidinski pufer (naročito sa aluminijum hidroksidom kao adjuvantom); ili citratni pufer. Puferi de tipično biti u opsegu 5-20mM.

[0215] pH kompozicije de generalno biti između 5,0 i 8,1, i uobičajenije između 6,0 i 8,0 npr.6,5 i 7,5, ili između 7,0 i 7,8.

[0216] Kompozicija je poželjno sterilna. Kompozicija je poželjno nepirogena npr. sadrži <1 EU (endotoksinska jedinica, standardna mera) po dozi, i poželjno <0,1 EU po dozi. Kompozicija je poželjno bez glutena.

[0217] Kompozicija može uključivati materijal za pojedinačnu imunizaciju, ili može uključivati materijal za višestruku imunizaciju (tj. a ’multidozni’ kit). Poželjno je da je konzervans uključen u višedozne uređaje. Kao alternativa (ili dodatno) uključivanju konzervansa u višedozne kompozicije, kompozicije mogu se nalaziti u sudu koji ima aseptični adapter za uklanjanje materijala.

[0218] Humane vakcine se tipično daju u doznoj zapremini od oko 0,5ml, mada može biti davana deci polovina doze (tj. oko 0,25ml).

[0219] Imunogene kompozicije prema pronalasku mogu takođe sadržati jedan ili više imunoregulacionih sredstava. Poželjno, jedno ili više imunoregulatornih sredstava uključuje jedan ili više adjuvanata. Adjuvanti mogu uključivati TH1 adjuvant i/ili TH2 adjuvant, ili TLR7 agonist dalje dole diskutovane.

[0220] Prema tome pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju:

(1) jednog ili više antigena izabranih iz prve, druge i dodatne grupe antigena (kako je gore definisano); i

(2) adjuvant, kao što je aluminijum hidroksidni adjuvant (na primer, jedan ili više antigena mogu biti adsorbovani za aluminijum hidroksid).

[0221] Na primer, opis obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju sta006 antigena i adjuvanta, kao što je aluminijum hidroksidni adjuvant. Slično, opis obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži kombinaciju sta011 antigena i adjuvanta, kao što je aluminijum hidroksidni adjuvant. Ove kompozicije su idealno puferovane npr. sa histidinskim puferom.

[0222] Adjuvanti koji mogu biti korišdeni u kompozicijama prema pronalasku obuhvataju, ali bez ograničenja:

A. Kompozicije koje sadrže minerale

[0223] Kompozicije koje sadrže minerale pogodne za upotrebu kao adjuvanti u ovom pronalasku obuhvataju mineralne soli, kao što su aluminijumove soli i kalcijumove soli (ili njihove smeše). Kalcijumove soli obuhvataju kalcijum fosfat (npr. "CAP" čestice opisane u ref.58). Aluminijumove soli obuhvataju hidrokside, fosfate, sulfate itd., sa solima koje imaju bilo koji pogodni oblik (npr. gel, kristalini, amorfni, itd.). Adsorpcija na ove soli je poželjna (npr. svi antigeni mogu biti adsorbovani). Kompozicije koje sadrže minerale mogu takođe biti formulisane kao čestce metalnih soli [59].

[0224] Adjuvanti poznati kao aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat mogu biti korišdeni. Pronalazak može koristiti bilo koji od "hidroksidnih" ili "fosfatnih" adjuvanta koji se generalno koriste kao adjuvanti. Adjuvanti poznati kao "aluminijum hidroksid" su uglavnom aluminijum oksihidroksidne soli, koje su uglavnom bar delimičnokristalne. Adjuvanti pozanti kao "aluminijum fosfat" su tipično aluminijum hidroksifosfati, koji često takođe sadrže male količine sulfata (tj. aluminijum hidroksifosfatnih sulfata). One mogu takođe biti dobijene taloženjem, i reakcioni uslovi i koncentracije u toku taloženja utiču na stepen supstitucije fosfata za hidroksil u soli.

[0225] Fibrozna morfologija (npr. koja se vidi u transmisionim elektronskim mikrografima) je tipična za aluminijum hidroksidne adjuvante. pI aluminijum hidroksidnih adjuvanta je tipično oko 11 tj. sami adjuvanti imaju pozitivno naelektrisanje na površini na fiziološkom pH. Adsorptivni kapaciteti između 1,8-2,6 mg proteina po mg Al<+++>na pH 7,4 je zabeleženo za aluminijum hidroksidne adjuvante.

[0226] Adjuvanti aluminijum fosfata generalno imaju PO4/Al molarni odnos između 0,3 i 1,2, poželjno između 0,8 i 1,2, i poželjnije 0,95±0,1. Aluminijum fosfat de generalno biti amorfni, naročito za hidroksifosfatne soli. Tipično adjuvant je amorfni aluminijum hidroksifosfat sa PO4/Al molarnim odnosom između 0,84 i 0,92, obuhvata 0,6mg Al<3+>/ml. Aluminijum fosfat de biti generalno partikulat (npr. morfologija u obliku ploče kako je viđeno elektronskom transmisionom mikrografijom). Tipični prečnici čestica su u opsegu 0,5-20mm (npr. oko 5-10mm) posle bilo koje adsorpcije antigena. Adsorptivni kapaciteti između 0,7-1,5 mg proteina po mg Al<+++>na pH 7,4 su zabaleženi za aluminijum fosfatne adjuvante.

[0227] Tačka nultog naelektrisanja (’point of zero charge’ - PZC) aluminijum fosfata je obrnuto proporcionalna u odnosu sa stepenom supstitucije fosfata za hidroksil, i ovaj stepen supstitucije može varirati od reakcionih uslova i koncentracije reaktanata korišdenih za dobijanje soli taloženjem. PZC je takođe menjan promenom koncentracije slobodnih fosfatnih jonova u rastvoru (više fosfata = više kisela PZC) ili dodavanjem pufera kao što je histidinski pufer (čini PZC baznijim). Aluminijum fosfati korišdeni prema pronalasku de generalno imati PZC između 4,0 i 7,0, poželjnije između 5,0 i 6,5 npr. oko 5,7.

[0228] Suspenzije aluminijumovih soli korišdenih za pripremanje kompozicija prema pronalasku mogu sadržati pufer (npr. fosfatni ili histidinski Tris pufer), ali to nije uvek neophodno. Suspenzije su poželjno sterilne i bez pirogena. Suspenzija može obuhvatati slobodne fosfatne jone u vodi npr. prisutne u koncentraciji između 1,0 i 20 mM, poželjno između 5 i 15 mM, i poželjnije oko 10 mM. Suspenzije mogu takođe sadržati natrijum hlorid.

4

[0229] Pronalazak može koristiti smešu oba i aluminijum hidroksida i alumnijum fosfata. U ovom slučaju bide više aluminijum fosfata nego hidroksida npr. maseni odnos od bar 2:1 npr. ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1, itd.

[0230] Koncentracija Al<+++>u kompoziciji za davanje pacijentima je poželjno manja od 10mg/ml npr. ≤5 mg/ml, ≤4 mg/ml, ≤3 mg/ml, ≤2 mg/ml, ≤1 mg/ml, itd. Poželjan opseg je između 0,3 i 1mg/ml. Maksimum od 0,85mg/dozi je poželjan.

B. Uljane emulzije

[0231] Uljane emulzije za upotrebu kao adjuvati u pronalasku obuhvataju emulzije skvalena i vode, kao što je MF59 [Chapter 10 ref. 63; videti takođe ref. 60] (5% Skvalen, 0,5% Tween 80, i 0,5% Span 85, formulisan u submikronske čestice pomodu mikrofluidizera). Kompletni Freundov adjuvant (CFA) i nekompletni Freundov adjuvant (IFA) mogu takođe biti korišdeni.

[0232] Poznate su različite emulzije ulje u vodi, i one tipično obuhvataju bar jedno ulje i bar jednu površinski aktivnu materiju, sa uljem(ima) ili površinski aktivnom(im) materijom(ma) koj(a)e je(su) biodegradibilne (koje se metabolišu) i biokomatibilne.

[0233] Uljane kapi u emulziji su generalno manje od 5 μm u prečniku, i idealno imaju submikronski prečnik, sa ovim malim česticama koje se postižu sa mikrofluidizerom da bi se obezbedila stabilna emulzija. Kapljice sa veličinom manjom od 220nm su poželjne jer mogu biti podvrgnute sterilizaciji ceđenjem.

[0234] Emulzija može sadržati ulja kao što su ona od životinje (kao što je riba) ili biljni izvor. Izvori biljnih ulja uključuju orašaste prlodove, semena i zrnevlje. Ulje kikirikija, ulje soje, ulje kokosa, i maslinovo ulje, su najpristupačniji, primeri ulja orašastih plodova. Ulje jojobe može biti korišdeno npr. dobijeno iz zrna jojobe. Ulje smena obuhvata ulje šafrana, ulje semena pamuka, ulje suncokreta, ulje semena susama i slično. U grupi zrnevlja, kukuruzno ulje je najdostupnije, ali ulje drugih zrnevlja žitarica kao što je pšenica, ovas, raž, tef, tritikale i slično mogu takođe biti korišdeni. Estri 6-10 ugljenikovih masnih kiselina i glicerola i 1,2-propandiola, koji se ne javljaju u prirodnim uljima semena, mogu biti pripremljeni hidrolizom, odvajanjem i esterifikacijom odgovarajudih materijala polazedi od ulja orašastih polodova i semena. Masti i ulja iz mleka sisara se mogu metabolizirati i prema tome mogu biti korišdeni praktično u pronalasku. Postupci za odvajanje, prečišdavanje, saponifikaciju i druga sredstva neophodna za dobijanje čistih ulja iz životinjskih izvora su dobro poznati u ovoj oblasti. Vedina ribljih ulja koja se metabolišu mogu se potpuno iskoristiti. Na primer, ulje iz jetre bakalara, ulje iz jetre ajkule i ulje kita kao što je spermaceti predstavlja nekoliko ribljih ulja koja mogu biti ovde korišdena. Brojna ulja sa razgranatim lancom su sintetisana biohemijski u izoprenskim jedinicama sa pet ugljenika i generalno sa na njih poziva kao na terpenoide. Ulje jetre ajkule sadrži, razgranate, nezasidene terpenoide poznate kao skvalen, 2,6,10,15,19,23-heksametil -2,6,10,14,18,22-tetrakosaheksaen, koji je naročito ovde poželjan. Skvalen, zasideni analog skvalena, je takođe poželjno ulje. Riblja ulja, uključujudi skvalen i skalan, su lako dostupna iz komercijalnih izvora ili mogu biti dobijena u poznatim postupcima u ovoj oblasti. Skvalan, zasideni analog skvalena je takođe poželjno ulje. Riblja ulja, uključujudi skvalen i skvalan, su lako dostupna iz komercijalnih izvora ili mogu biti dobijena postupcima poznatim u ovoj oblasti. Druga poželjna ulja su tokoferoli (videti dole). Mogu biti korišdene smeše ulja.

[0235] Površinski aktivna sredstva mogu biti klasifikovana sa njihovim ’HLB’ (hidrofilna/lipofilna ravprimedbaža). Poželjne površinski aktivne supstance prema pronalasku imaju HLB od bar 10, poželjno bar 15, i najpoželjnije bar 16. Pronalazak može biti korišden sa površinski aktivnim supstancama koje uključuju, ali bez ograničenja: površinski aktivne supstance polioksietilen sorbitan estara (na koje se uglavnom poziva kao na Tweens), naročito polisorbat 20 i polisorbat 80; kopolimere etilen oksida (EO), propilen oksida (PO), i/ili butilen oksida(BO), koji se prodaju pod trgovačkim nazviom DOWFAX™, kao što je linerani EO/PO blok kopolimeri; oktoksinoli, koji mogu varirati u broju ponavljajudih etoksi (oksi-1,2-etandiil) grupa, sa oktoksinol-9 (Triton X-100, ili toktilfenoksipolietoksietanol) koji su od naročitog značaja; (oktilfenoksi)polietoksietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipidi kao što je fosfatidilholin (lecitin); nonilfenol etoksilati, kao što su Tergitol™ NP serije; polioksietilen masni etri koji potiču iz lauril, cetil, stearil i oleil alkohola (poznatih kao Brij površinski aktivna sredstva), kao što je trietilenglikol monolauril etar (Brij 30); i sorbitanski estri (i uobičajeno korišdeni kao SPANs), kao što su sorbitan trioleat (Span 85) i sorbitan monolaurat. Nejonska površinski aktivna sredstva su poželjna. Poželjna površinski aktivna sredstva koja se uključuju u emulziju su Tween 80 (polioksietilen sorbitan monooleat), Span 85 (sorbitan trioleat), lecitin i Triton X-100.

[0236] Smeše površinski aktivnih supstanci mogu biti korišdene npr. Tween 80/Span 85 smeše. Kombinacija polioksietilen sorbitan estra kao što je polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80) i oktoksinol kao što su t-oktilfenoksipolietoksietanol (Triton X-100) je takođe pogodna. Još jedna korisna konbinacija sadrži lauret 9 plus polioksietilen sorbitan estar i/ili oktoksinol.

[0237] Poželjne količine površinski aktivnih sredstava (% u odnosu na masu) su: polioksietilen sorbitan esteri (kao što su Tween 80) 0,01 do 1%, naročito oko 0,1 %; oktil- ili nonilfenoksi polioksietanola (kao što su Triton X-100, ili drugi deterdženti u Triton seijama) 0,001 do 0,1 %, naročito 0,005 do 0,02%; polioksietilen etri (kao što je lauret 9) 0,1 do 20 %, poželjno 0,1 do 10 % i naročito 0,1 do 1 % ili oko 0,5%.

[0238] Poželjni emulzioni adjuvantri imaju srednju vrednost veličine kapljica <1 μm npr. ≤750nm, ≤500nm, ≤400nm, ≤300nm, ≤250nm, ≤220nm, ≤200nm, ili manju. Ove veličine kapi mogu se konvencionalno postidi sa tehnikama kao što su mikrofluidizacija.

[0239] Specifine emulzije ulje u vodi adjuvanta korisnih za pronalazak uključuju, ali bez ograničenja:

• Submikronsku emulziju skvalena, Tween 80, i Span 85. Kompozicija emulzije u odnosu na zapreminu može biti oko 5% skvalena, oko 0,5% polisorbata 80 i oko 0,5% Span 85. U odnosu na masu, ovi odnosi postaju 4,3% skvalena, 0,5% polisorbata 80 i 0,48% Span 85. Ovaj adjuvant je poznat kao ’MF59’ *61-], kako je opisano u više detalja u poglavlju 10 ref. 63 i poglavlju 12 ref. 64. MF59 emulzija pogodno uključuje citratne jone npr.10mM natrijum citratni pufer.

• Emulzija skvalena, tokoferola, i polisorbata 80 (Tween 80). Emulzija može uključiti rastvor soli puferisan fosfatima. Može takođe uključiti Span 85 (npr. at 1%) i/ili lecitin. Ove emulzije mogu imati od 2 do 10% skvalena, od 2 do 10% tokoferola i od 0,3 do 3% Tween 80, i maseni odnos skvalen:tokoferol je poželjno ≤1 jer to obezbeđuje stabilnije emulzije. Skvalen i Tween 80 mogu biti prisutni u zapreminskom odnosu od oko 5:2 ili u masenom odnosu od oko 11:5. Jedna takva emulzija može biti napravljena rastvaranjem Tween 80 u PBS da bi se dobio 2% rastvor, zatim mešanje 90ml ovog rastvora sa smešom (5g DL-α-tokoferola i 5ml skvalena), zatim mikrofluidizacijom smeše.

Dobijena emulzija može imati submikronske uljane kapi npr. sa prosečnim prečnikom između 100 i 250nm, poželjno oko 180nm. Emulzija može takođe obuhvatati 3-de-O-acilovani monofosforil lipid A (3d-MPL). Još jedna korisna emulzija ovog tipa može sadržati, po dozi za čoveka, 0,5-10 mg skvalena, 0,5-11 mg tokoferola, i 0,1-4 mg polisorbata 80 [65].

• Emulzija svalena, tokoferola, i Triton deterdženta (npr. Triton X-100). Emulzija može takođe uključivati 3d-MPL (videti dole). Zatim emulzija može sadržati fosfatni pufer.

• Emulzija koja sadrži polisorbat (npr. polisorbat 80), Triton deterdžent (npr. Triton X-100) i tokoferol (npr. α-tokoferol sukcinat). Emulzija može obuhvatati ove tri komponente u masenom odnosu od oko 75:11:10 (npr. 750 μg/ml polisorbata 80, 110 μg/ml Triton X-100 i 100 μg/ml αtokoferol sukcinata), i ove koncentracije treba da obuhvataju bilo koji doprinos ovih komponenti iz antigena. Emulzija može takođe sadržati skvalen. Emulzija može takođe sadržati 3d-MPL (videti dole). Vodena faza može sadržati fosfatni pufer.

• Emulzija skvalana, polisorbata 80 i poloksamera 401 ("Pluronic™ L121"). Emulzija može biti formulisana u rastvoru soli puferisanom fosfatima, pH 7,4. Ova emulzija je korisna sredstvo za davanje muramil dipeptida, i bilo je korišdeno sa treonil-MDP u "SAF-1" adjuvantu [66] (0,05-1% Thr-MDP, 5% skvalan, 2,5% Pluronic L121 i 0,2% polisorbat 80). Takođe de biti korišden bez Thr-MDP, kao u "AF" adjuvantu [67] (5% skvalan, 1,25% Pluronic L121 i 0,2% polisorbat 80). Poželjna je mikrofluidizacija.

• Emulzija koja sadrži skvalen, vodeni rastvarač, polioksietilen alkil etar hidrofilino nejonsko površinski aktivno sredstvo (npr. polioksietilen (12) cetostearil etar) i hidrofobno nejonsko površinski aktivno sredstvo (npr. sorbitan estar ili manid estar, kao što su sorbitan monoleat ili ’Span 80’). Emulzija je poželjno termoreverzibilna i/ili ima bar 90% uljanih kapljica (u odnosu na zapreminu) veličine manje od 200 nm [68]. Emulzija može takođe uključiti jedan ili više: alditol; kriozaštitno sredstvo (npr. šeder, kao što je dodecilmaltozid i/ili saharoza); i/ili alkilpoliglikozid. Emulzija može obuhvatati TLR4 agonist [69]. Takve emulzije mogu biti liofilizovane.

• Emulzija skvalena, poloksamera 105 i Abil-Care [70]. Krajnje koncentracije (težinske) ovih komponenti u vakcinama sa adjuvatima su 5% skvalen, 4% poloksamer 105 (pluronski poliol) i 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG16/16 PEG/PPG-16/16 dimetikon; kaprilni/kaprinski triglicerid).

• Emulzija koja ima od 0,5-50% ulja, 0,1-10% fosfolipida, i 0,05-5% nejonskog površinski aktivnog sredstva. Kao što je opisano u referenci 71, poželjne fosfolipidne komponente su fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol, fosfatidilglicerol, fosfatidinska kiselina, sfingomijelin i kardiolipin. Poželjne su submikronske veličine.

• Submikronska emulzija uglja u vodi ulja koje se ne metaboliše (kao što je lako mineralno ulje) i bar jedna površinski aktivna supstanca (kao što su lecitin, Tween 80 ili Span 80). Aditivi mogu biti uključeni, kao što su QuilA saponin, holesterol, saponinlipofilni knjugat (kao što je GPI-0100, opisan u referenci 72, dobijen dodavanjem alifatičnog amina u desacilsaponinu pomodu karboksilne grupe glukuronske kiseline), dimetidioktadecilamonium bromid i/ili N,N-diokta-decil-N,N-bis (2-hidroksietil)propandiamin.

• Emulzija u kojoj saponin (npr. QuilA ili QS21) i sterol (npr. holesterol) su vezani za spiralne micele [73].

• Emulzija koja sadrži mineralno ulje, nejonski lipofilni etoksilovani masni alkohol, i nejonsku hidrofilnu površinski aktivnu supstancu (npr. etoksilatni masni alkohol i/ili polioksietilenpolioksipropilen blok kopolimer) [74].

[0240] U nekim izvođenjima emulzija može biti pomešana sa antigenom ekstremno , u toku davanja, i prema tome adjuvant i antigen mogu biti držani odvojeno u spakovanoj ili raspoređenoj vakcini, spremnoj za krajnje formulisane u vreme upotrebe. U drugim izvođenjima emulzija je pomešana sa antigenom u toku proizvodnje, i prema tome kompozicija je spakovana u tečni oblik sa adjuvantom. Antigen de generalno biti u vodenom obliku, takvom da vakcina je na kraju pripremljena mešanjem dve tečnosti. Zapreminski odnos dve tečnosti za mešenja može varirati (npr. između 5:1 i 1:5) ali je generalno oko 1:1. Kada su koncentracije komponenti date u gornjim opisima specifičnih emulzija, ove koncentracije su tipične za nerazblaženu kompoziciju, i koncentracija posle mešanja sa rastvorom antigena de prema tome opasti.

[0241] Gde kompozicija obuhvata tokoferol, bilo koji od α, β, γ, δ, ε ili ξ tokoferola može biti korišden, ali su poželjni α-tokoferoli. Tokoferol može imati nekoliko oblika npr. različitih soli i/ili izomera. Soli uključuju organske soli, kao što je sukcinat, acetat, nikotinat, itd. D-α-tokoferol i DL-α-tokoferol mogu oba biti korišdena. Tokoferoli su pogodno obuhvadeni vakcinama za upotrebu kod starijih pacijenata (npr. starosti 60 godina ili stariji), jer je vitamin E je zabeležen da ima pozitivan efekat na imuni odgovor u grupi pacijenata [75]. Oni takođe imaju osobine antioksidanta koje mogu pomodi da se stabilizuju emulzije [76]. Poželjni α-tokoferol je DL-α-tokoferol, i poželjna so ovog tokoferola je sukcinat. Sukcinatna so je nađena da reaguje in vivo sa ligandima u vezi sa TNF.

C. Formulacije saponina

[0242] Formulacije saponina mogu takođe biti korišdene kao adjuvanti u pronalasku. Saponini su heterogena grupa glikozida sterola i glikozida triterpenoida koji su nađeni u kori, listovima, stabljikama, korenu i čak cvetovima širokog opsega biljnih vrsta. Saponin iz kore Quillaia saponaria Molina drveta je široko proučavan kao adjuvant. Saponin može takođe biti komercijalno dobijen iz Smilax ornata (sarsaprile), Gypsophilla paniculata (metličastog šušuljaka), i Saponaria officianalis (obične sapunjače). Saponinske formulacije sa adjuvantom obuhvataju prečišdene formulacije kao što su QS21, kao i lipidne formulacije, kao što su ISCOMs. QS21 je na tržištu pod imenom Stimulon™.

[0243] Saponinske kompozicije su prečišdene pomodu HPLC i RP-HPLC. Specifične prečišdene frakcije su identifikovane pomodu ovih tehnika, uključujudi QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B i QH-C. Poželjno, saponin je QS21. Postupak za dobijanje QS21 je opisan u ref. 77. Saponinske formulacije mogu takođe sadržati sterol, kao što je holesterol [78].

[0244] Kombinacije saponina i holesterola mogu biti korišdene da obrazuju jedinstvene čestice koje se nazivaju imunostimulisani kompleksi (ISCOMs) [poglavlja 23 iz ref. 63]. ISCOMs tipično takođe obuhvata fosfolipide kao što su fosfatidiletanolamin ili fosfatidilholin. Bilo koji poznat saponin može biti korišden u ISCOMs. Poželjno, ISCOM obuhvata jedan ili više QuilA, QHA & QHC. ISCOMs su dalje opisani u ref.78-. Opciono, ISCOMS može biti bez dodatnih deterdženata [80].

[0245] Pregled razvoja adjuvanata na bazi saponima može se nadi u ref.81.

E. Bakterijski ili mikrobiološki derivati

[0246] Adjuvanti pogodni za upotrebu u pronalasku obuhvataju bakterijske ili mikrobiološke derivate kao što su netoksični derivati enterobakterijskih lipopolisaharida (LPS), derivata lipida A, imunostimulatorni oligonukleotida i ADP-ribozilujudi tokisni i njihovih detoksifikovanih derivata.

[0247] Nepksični derivati LPS uključuju monofosforil lipid A (MPL) i 3-O-deacilovani MPL (3dMPL).

3dMPL je smeša 3 de-O-acilovanog monofosforil lipida A sa 4, 5 ili 6 acilovanih lanaca. Poželjna "mala čestica" iz 3 De-O-acilovanih monofosforil lipida A je opisana u ref. 82. Takve "male čestice" 3dMPL su dovoljno male da su sterilno proceđene kroz 0,22 μm membranu [82]. Drugi netoksični LPS derivati obuhvataju monofosforil lipidni A mimietik, kao što je aminoalkil glukozaminid fosfatni derivat npr. RC-529 [83].

[0248] Lipidni A derivati obuhvataju derivate lipida A iz Escherichia coli kao što su OM-174. OM-174 je opisan na primer u ref.84 & 85.

[0249] Imunostimulatorni oligonukleotidi pogodni za upotrebu kao adjuvanti u pronalasku uključuju nukleotidne sekvence koje sadrže CpG motiv (dinukleotidna sekvenca koja sadrži nemetilovani citozin koji je povezan sa fosfatnom vezom sa gvanozinom). Dvolančana RNK i oligonukleotidi koji sadrže palindromske ili poli(dG) sekvence su takođe pokazane kao imunostimulatorne.

[0250] CpG’s može uključiti nukleotidne modifikacije /analoge kao što su fosforotioatne modifikacije i mogu biti dvolančane ili jednolančane. Referenca 86 i 87 opisuje mogude analogne supstitucije npr. zamene gvanozina sa 2’-deoksi-7-deazagvanozinom. Efekat adjuvanta CpG oligonukleotida je dalje diskutovan u ref.88.

[0251] CpG sekvenca se može odnositi na TLR9, kao što je motiv GTCGTT ili TTCGTT [89]. CpG sekvenca može biti specifična za izazivanje Th1 imunog odgovora, kao što je CpG-A ODN, ili može biti specifičnija za izazivanje odgovora B delija, kao što je CpG-B ODN. CpG-A i CpG-B ODNs su diskutovani u ref.90-. Poželjno, CpG je CpG-A ODN.

[0252] Poželjno, CpG oligonukleotid je konstruisan tako da je 5’ kraj pristupačan za prepoznavanje receptora. Opciono, dve CpG oligonukleotidne sekvence mogu biti vezane za njihove 3’ krajeve da obrazuju "imunomere". Videti, na primer, ref.92-.

[0253] Korisni CpG adjuvant je CpG7909, takođe poznat ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Drugi je CpG1826. Kao alternativa, ili dodatno, korišdenju CpG sekvenci, TpG sekvence mogu biti korišdene [94], i ovi oligonukleotidi mogu biti slobodni od nemetilovanih CpG motiva. Imunostimulatorni oligonukleotid može biti bogat u pirimidinima. Na primer, mogu sadžati više od jedan uzastopni timidinski nukleotid (npr. TTTT, kako je opisano u ref. 94), i/ili može imati nukleotidnu kompoziciju sa >25% timidina (npr. >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, itd.). Na primer, može sadržati više od jednog uzastopnog citozinskog nukleotida (npr. CCCC, kako je opisano u ref.

94), i/ili može imati nukleotidnu kompoziciju sa >25% citozina (npr. >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, itd.). Ovi nukleotidi mogu biti bez nemetilovnih CpG motiva. Imunostimulatorni oligonukleotidi de tipično sadržati bar 20 nukleotida. Oni mogu sadržati manje od 100 nukleotida.

[0254] Naročito korisni adjuvant smešten oko imunostimulatornih oligonukleotida je poznat kao IC-31™ *95+. Prema tome, adjuvant korišden prema pronalasku može sadržati smešu (i) oligonukleotida (npr. između 15-40 nukleotida) koja obuhvata bar jedan i poželjno višestruke) CpI motive (tj. citozin vezan za inozin da se obrazuje dinukleotid), i (ii) a polikatjonski polimer, kao što je oligopeptid (npr. između 5-20 amino kiselina) uključujudi bar jedan (a poželjno višestruke) Lys-Arg-Lys tripeptidnske sekvence. Oligonukleotid može biti deoksinukleotid koji sadrži 26-mer sekvencu 5’-(IC)31-3’.

[0255] Bakterijski ADP-ribozilujudi toksini i detoksifikovani njihovi derivati mogu biti korišdeni adjuvanti u pronalasku. Poželjno, protein je izveden iz E.coli (E.coli toplotno labilni enterotoksin "LT"), kolere ("CT"), ili velikog kašlja("PT"). Upotreba detoksifikvoanih ADP-ribozilujudih toksina kao mukoznih adjuvanta je opisana u ref.96 i kao parenteralnih adjuvanta u ref.97. Toksin ili toksoid je poželjno u obliku holotoksina, koji sadrži obe podjedinice A i B. Poželjno, podjedinica A sadrži detoksifikujudu mutaciju; poželjno podjedinica nije mutirana. Poželjno, adjuvant je detoksifikovani LT mutant kao što su LT-K63, LT-R72, i LT-G192. Upotreba ADP-ribozilujudih toksina i detoksifikovanih njegovih derivata, naročito LT-K63 i LT-R72, kao adjuvanta se može nadi u ref. 98-101. Korisni CT mutant je ili CT-E29H [102]. Numeričko pozivanje na aminokiselinsku supstituciju je poželjno zasnovano na poravnanjima A i B podjedinica ADPribozilujudih toksina prikazanim u ref.103.

F. Humani imunomodulatori

[0256] Humani imunomodulatori pogodni za upotrebu kao adjuvanti u pronalasku obuhvataju citokine, kao što su interleukini (npr. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [104], itd.), interferone (npr. interferon-γ), faktor stimulacije kolonije makrofaga, i faktora nekroze tumora. Poželjni imunomodulator je IL-12.

G. Bioadhezivi i mukoadhezivi

[0257] Bioadhezivi i mukoadhezivi mogu takođe biti korišdeni kao adjuvanti u pronalasku. Pogodni bioadhezivi obuhvataju esterifikovane hijaluronske mikrosfere [105] ili mukoadhezive kao što su umreženi derivati poli(akriline kiseline), polivinil alkohol, polivinil pirollidon, polisaharidi i karboksimetilceluloza. Hitosan i njegovi derivati mogu takođe biti korišdeni kao adjuvanti u pronalasku [106].

H. Mikročestice

[0258] Mikročestice mogu takođe biti korišdene kao adjuvanti u pronalasku. Mikročestice (tj. čestice ∼100nm do ∼150mm u prečniku, poželjnije ∼200nm do ∼30mm u prečniku, i najpoželjnije ∼500nm do ∼10mm u prečniku) obrazovane od materijala koji je biodegradabilan i netoksičan (npr. poli(αhidroksi kiselina), polihidroksibuterna kiselina, poliortoester, polianhidrid, polikaprolaktone, itd.), sa poli(laktid-ko-glikolid) su poželjni, opciono tretirani da imaju negativno naelektirisanu površinu (npr. sa SDS) ili pozitivno naelektrisanom površinom (npr. sa katjonskim deterdžentom, kao što je CTAB).

I. Lipozomi

[0259] Primeri formulacija lipozoma su pogodni za upotrebu adjuvanti su opisani u ref.107-.

4

J. Formulacije polioksietilen etra i polioksietilen estra

[0260] Adjuvanti pogodni za upotrebu prema pronalasku obuhvataju polioksietilen etre i polioksietilen estre [109]. Takve formulacije dalje obuhvataju polioksietilen sorbitan estarska površinski aktivna sredstva u kombinaciji sa oktoksinolom [110] kao i polioksietilen alkil etrarski ili estaska površinski aktivna sredstva u kombinaciji sa bar jednim dodatnim nejonskim površinski aktivnim sredstvom kao što je oktoksinol [111]. Poželjni polioksietilenski etri su izabrani iz sledede grupe: polioksietilen9-lauril etar (lauret 9), polioksietilen-9-steoril etar, polioksiteilen-8-steoril etar, polioksietilen-4-lauril etar, polioksietilen-35-lauril etar, i polioksietilen-23-lauril etar.

K. Fosfazeni

[0261] Fosfazen, kao što je poli[di(karboksilatofenoksi)fosfazen] ("PCPP") kako je opisano, na primer, u vezi sa 112 i 113, može biti korišden.

L. Muramil peptidi

[0262] Primeri muramil peptida pogodni za upotrebu kao adjuvanti u pronalasku obuhvataju N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin (nor-MDP), i N-acetilmuramil-Lalanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin MTP-PE).

M. Imidazohinolonska jedinjenja.

[0263] Primeri imidazohinolonskih jedinjenje pogodnih za upotrebu adjuvanta u pronalasku obuhvata Imikvimod ("R837") [114], Resikvimod ("R-848") [115], i njihove analoge; i njihove soli (npr. hidrohloridne soli).

N. Susptituisane uree

[0264] Supstituisane uree korisne kao adjuvanti uključuju jedinjenja formule I, II ili III, ili njihove soli:

kao štoi su definisane ovde u referenci 116, kao što su ’ER 803058’, ’ER 803732’, ’ER 804053’, ER 804058’, ’ER 804059’, ’ER 804442’, ’ER 804680’, ’ER 804764’, ER 803022 ili ’ER 804057’ npr.:

O. Dodatni adjuvanti

[0265] Dodatni adjuvanti koji mogu biti korišdeni u pronalasku obuhvataju:

• Aminoalkil glukozaminidinski fosfatni derivat, kao što je RC-529 [117].

• Tiosemikarbazonsko jedinjenje, kao što je ono opisano u referenci 118. Postupci formulisanja, proizvodnje i odabira aktivnih jedinjenja su takođe opisani u vezi sa 118. Tiosemikarbazoni su naročito efikasni u stimulisanju humane periferne krvi mononuklearnih delija za proizvodnju citokina , kao što je TNF-α.

• Jedinjenje triptantrin, kao što je ono opisano u vezi sa referencom 119. Postupci formulisanja, proizvodnje i odabira aktivnih jedinjenja su takođe opisani u vezi sa 119. Tiosemikarbazoni su naročito efikasni u stimulisanju mononuklernih delija humane periferne krvi za proizvodnju citokina, kao što je TNF-α.

• Nukleozidni analog, kao što je: (a) Isatorabin (ANA-245; 7-tia-8-oksogvanozin):

i njegovi prolekovi; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) jedinjenje opisana u referencama 120 d Loksoribin (7-alil-8-oksogvanozin) [122].

• Jedinjenja opisana u referenci 123, uključuju: Acilpiperazinska jedinjenja, Indoledionska jedinjenja, Tetrahidraizohinolinska (THIQ) jedinjenja, Benzociklodionska jedinjenje, Aminoazavinilna jedinjenja, Aminobenzimidazolon hinolinonska (ABIQ) jedinjenja [124], Hidraptalamidna jedinjenja, Benzofenonska jedinjenja, Izoksazolna jedinjenja, Sterolna jedinjenja, hinazilinonska jedinjenja , Pirolna jedinjenja [125], Antrahinonska jedinjenja, hinoksalinska jedinjenja, Triazinska jedinjenja, Pirazalopirimidinska jedinjenja, i Benzazolna jedinjenja [126].

• Jedinjenja koja sadrže lipide vezane za acikličnu strukturu koja sadrži fosfate, kao što je TLR4 antagonist E5564 [127:

• Polioksidonijum polimer [128] ili drugi N-oksidovani polietilen-piperazinski derivat.

• Metil inozin 5’-monofosfat ("MIMP") [129].

• Polihidroksilovano pirolizidinsko jedinjenje [130], kao što je ono koje ima formulu:

gde je R izabran iz grupe koju sadrži vodonik, ravnolančani ili razgranti,nesupstituisan ili supstituisan, zasideni ili nezasiden acil, alkil (npr. cikloalkil), alkenil, alkinil i aril grupe, ili farmaceutski prihvatljiva so ili njegov derivat. Primeri obuhvataju, ali bez ograničenja: kasuarin, kasuarin-6-α-D-glukopiranozu, 3-epi-kasuarin, 7-epi-kasuarin, 3,7-diepi-kasuarin, itd.

• CDld ligand, kao što je α-glikozilceramid [131-] (npr. α-galaktouzilceramid), fitosfingozin-koji sadrži α-glikozilceramid, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galaktopiranozil)-2-(N-heksakosanoilamino)-1,3,4-oktadekanetriol], CRONY-101, 3"-O-sulfo-galaktosilceramid, itd.

• Gama inulin [133] ili njegov derivat, kao što je algamulin.

4

Kombinacije adjuvanata

[0266] Pronalazak takođe sadrži kombinaciju jednog ili više gore navedenih adjuvanta. Na primer, sledede kompozicije adjuvanta mogu biti krišdene u pronalasku: (1) saponin i emulzija ulje u vodi [134]; (2) saponin (npr. QS21) ne-toksični LPS derivat (npr. 3dMPL); (3) saponin (npr. QS21) netoksični LPS derivat (npr. 3dMPL) holesterol; (4) saponin (npr. QS21) 3dMPL IL-12 (opciono sterol); (5) kombinacije 3dMPL sa, na primer, QS21 i/ili emulzijama ulje u vodi [135]; (6) SAF, sadrži 10% skvalana, 0,4% Tween 80™, 5% pluronski-blok polimer L121, i thr-MDP, ili mikrofluidiziran u submikronsku emulziju ili tretiran vorteksom da bi se stovrila emulzija velikih čestica. (7) Ribi™ sistem adjuvanata (RAS), (Ribi Immunochem) koji sadrži 2% skvalena, 0,2% Tween 80, i jednu ili više komponenta bakterijskog zida iz grupe koju čine monofosforilipid A (MPL), trehalozni dimikolat (TDM), i skelet delijskog zida (CWS), poželjno MPL CWS (Detox™); i (8) jedan ili više mineralnih soli (kao što je aluminijumova so) ne-toksični derivat LPS (kao što je 3dMPL).

[0267] Upotreba adjuvanata aluminijum hidroksida i/ili aluminijum fosfata je naročito poželjna, i antigeni su generalno apsorbovani na ove soli. Kalcijum fosfat je još jedan poželjan adjuvant. Druge kombinacije poželjnih adjuvanta obuhvataju kombinacije Th1 i Th2 adjuvanata kao što su CpG & stipsa ili rezikvimod & stipsa. Kombinacija aluminijum fosfata i 3dMPL može biti korišdena.

[0268] Kompozicije prema pronalasku mogu izazvati i delijski posredovan imuni odgovor kao i krvni imuni odgovor. Ovaj imuni odgovor de poželjno biti izazvati dugotrajna (npr. neutrališuda) antitela i delijski posredovanu imunost koja brzo odgovara na izlaganje pseudomonasu.

[0269] Dva tipa T delija, CD4 i CD8 delije, se smatra da su generalno neopohodne da iniciraju i/ili pospeše delijski posredovanu imunost i krvnu imunost. CD8 T delije mogu ispoljiti CD8 ko-receptor i uobičajeno se nazivaju Citotoksični T limfociti (CTLs). CD8 T delije su u stanju da prepoznaju ili reaguju sa antigenima prikazanim na molekulima MHC klase I.

[0270] CD4 T delije mogu biti eksprimovane kao CD4 ko-receptor i uobičajeno se nazivaju kao T pomodne delije. CD4 T delije su u stanju da prepoznaju antigene peptide vezane za molekule MHC klase II. Posle interakcije sa molekulom MHC klase II, CD4 delije mogu lučiti faktore kao što su citokini. Ovi izlučeni citokini mogu aktivirati B delije, citotoksične T delije, makrofage, i ostale delije koje učestvuju u imunom odgovoru. T pomodne delije mogu dalje biti podeljene u dve funkcionalno različita podgrupe: TH1 fenotip i TH2 fenotip koje se razlikuju u njihovoj funkciji citokina i efektora.

[0271] Aktivirane TH1 delije pospešuju delijski imunitet (uključujudi porast proizvodnje antigenspecifičnih CTL) i prema tome su naročito važni u odgovoru na intradelijske infekcije. Aktivirane TH1 delije mogu lučiti jedan ili više IL-2, IFN-γ, i TNF-β. TH1 imuni odgovor može dovesti do lokalnih inflamatronih reakcija aktiviranjem makrofaga, NK (prirodnih ubica) delija, i CD8 citotoksičnih T delija (CTLs). TH1 imuni odgovor može takođe delvoati da povedava imuni odgovor stimulisanjem rasta B i T delija sa IL-12. TH1 stimulisane B delije mogu lučiti IgG2a.

[0272] Aktivirane TH2 delije povedavaju stvaranje antitela i prema tome su od zanačaja u odgovoru na ekstracelularne infekcije. Aktivirane TH2 delije mogu lučiti jedan ili više IL-4, IL-5, IL-6, i IL-10. TH2 imuni odgovor može dovesti do proizvodnje IgG1, IgE, IgA i memorijskih B delija za bududu zaštitu.

[0273] Poboljšani imuni odgovor može obuhvatati jedan ili više poboljšanih TH1 imunih odgovora i TH2 imunog odgovora.

[0274] TH1 imuni odgovor može obuhvatati porast jednog ili više CTLs, porast u jednog ili više citokina u vezi sa TH1 imunim odgovorom (kao što je IL-2, IFN-γ, i TNF-β), porast u aktiviranim makrofagima, porast u NK aktivnosti, ili porast u proizvodnji IgG2a. Poželjno, povedani TH1 imuni odgovor de obuhvatiti porast u proizvodnji IgG2a.

[0275] TH1 imuni odgovor može biti izazvan pomodu TH1 adjuvanta. TH1 adjuvant de generalno izazvati porast u nivoima IgG2a proizvodnje u odnosu na imunizaciju antigena bez adjuvanta. TH1 adjuvanti pogodni za upotrebu mogu obuhvatati na primer formualcije saponina, virozome i čestice slične virusima, netoksične derivate enterobakerijskih lipopolisaharida (LPS), imunostimulatorne oligonukleotide. Imunostimulatorni oligonukleotidi, kao što su oligonukleotidi koji sadrže CpG motiv, su poželjni TH1 adjuvanti za upotrebu u pronalasku.

[0276] TH2 imuni odgovor može uključiti jedan ili više porasta jednog ili više citokina u vezi sa TH2 imunim odgovorom (kao što je IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10), ili porastom u proizvodnji IgGl, IgE, IgA i memorijskim B delijama. Poželjno, poboljšani TH2 imuni odgovor de obuhvatati porast u IgG1 proizvonji.

[0277] TH2 imuni odgovor može biti izazvan pomodu TH2 adjuvanta. TH2 adjuvant de generalno izazvati povedane nivoe proizvodnje IgG1 u odnosu na imunizaciju antigena bez adjuvanta. TH2 adjuvanti pogodni za upotrebu u pronalasku uključuju, na primer, kompozicije koje sadrže minerale, uljane emulzije i ADP-ribozilujude toksine i njihove detoksifikovane derivate. Kompozicije koje sadrže minerale, kao što su aluminijumove soli su poželjni TH2 adjuvanti za upotrebu u pronalasku .

[0278] Poželjno, pronalazak obuhvata kompoziciju koja sadrži TH1 adjuvant i TH2 adjuvant. Poželjno, takva kompozicija izaziva poboljšani TH1 i poboljšani TH2 odgovor,tj., porast u proizvodnji oba, i IgG1 i IgG2a u odnosu na imunizaciju bez adjuvanta. Još poželjnije, kompozicija koja sadrži kombinaciju TH1 i TH2 adjuvanta izaziva poboljšani TH1 i/ili poboljšani TH2 imuni odgovor u odnosu na imunizaciju sa jednim adjuvantom (tj., u odnosu na imunizaciju sa samo TH1 adjuvantom ili imunizaciju sa samo TH2 adjuvantom).

[0279] Imuni odgovor može biti jedan ili oba, TH1 imuni odgovor i TH2 odgovor. Poželjno, imuni odgovor obezbeđuje jedan ili oba poboljšana TH1 odgovor i poboljšani TH2 odgovor.

[0280] Poboljšani imuni odgovor može biti jedan ili više sistemskim i mukoznih imunih odgovora. Poželjno, imuni odgovor obezbeđuje jedan ili više poboljšanih sistemskih i poboljšanih mukoznih

4

imunih odgovora. Poželjno mukozni imuni odgovor je TH2 imuni odgovor. Poželjno, mukozni imuni odgovor obuhvata porast u proizvodnji IgA.

[0281] P. aeruginosa infekcije mogu uticati na različite delove tela i prema tome kompozicije prema pronalasku mogu biti pripremljene u različitim oblicima. Na primer, kompozicije mogu biti pripremljne za injektovanje, ili kao tečni rastvori ili suspenzije. Čvrsti oblici pogodni za rastvor u, ili suspenziju u, tečnim sredstvima pre injektovanja mogu takođe biti pripremljeni (npr. liofilizovana kompozicija ili kompozicija koja je osušena zamrzavanjem i raspršivanjem u obliku spreja). Kompozicija može biti dobijena za lokalno davanje npr. kao mast, krema ili prah. Kompozicija može biti dobijena za oralno davanje npr. kao tableta ili kapsula, ili sprej, ili sirup (opciono aromatizovan). Kompozicija može biti pripremljena za pulmonarno davanje npr. za inhaliranje, u obliku finog praha ili spreja. Kompozicija može biti pripremljena kao supozitorija ili pesar. Kompozicija može biti pripremljena za nazalno, ušno ili okularno davanje npr. kao kapi. Kompozicija može biti u obliku kita, osmišljenog da se kombinovana kompozicija rekonstruiše neposredno pre davanja pacijentu. Takvi kitovi mogu sadržati jedan ili više antigena u tečnom obliku i jedan ili više liofilizovanih antigena.

[0282] Kada kompozicija treba da se pripremi neposteno pre primene (npr. kada je komponenta prisutna u liofilizovanom obliku) i prisutna je kao kit, kit može sadržati dve fiole, ili može sadžati jedan pripremljen napunjen špric i jednu fiolu, pri čemu se sastojci šprica koriste da se reaktivira sadržaj fiole pre injekovanja.

[0283] Imunogene kompozicije koje se koriste kao vakcine sadrže imunološki efikasnu količinu antigena, kao i bilo kojih drugih komponenti, kada je potrebno. Pod ’imunološki efikasnom količinom, misli se da davanje količine pojedincu, ili u jednoj dozi ili kao deo spreja, je efikasana za lečenje i prevenciju. Ova količina varira u zavisnosti od zdravstenog i fizičkog stanja pojedinca koji se leči, godina, taksonomske grupe pojedinca koji se leči (npr. nehumanog primata, primata, itd.), kapaciteta imunog sistema pojedinca da sitetiše antitela, stepena željene zaštite, formulacije vakcine, procene medicinskog stanja doktora koji sprovodi lečenje, i drugih relevantih faktora. Očekuje se da de količina pasti u relativno širok opseg koji može biti određen rutinskim ispitivanjima. Gde je više od jenog antigena obuhvadeno u kompoziciju tada dva antigena jedan u odnosu na drugi mogu biti prisuta u istim ili u različitim dozama.

[0284] Kako je gore pomenuto, kompozicija može uključivati zaštitno temperaturno sredstvo, i ova komponenta može biti naročito korisna u kompozicijama adjuvanta (naročito onim koji sadrže mineralni adjuvant, kao što je aluminijumova so). Kao što je opisano u referenci 136, tečno zaštitno temperaturno sredstvo može biti dodato u vodene kompozicije vakcina da snize njenu tačku mržnjenja npr. da smanje tačku mržnjenja ispod 0°C. Prema tome kompozicija može biti čuvana ispod 0°C, ali iznad njegove tačke mržnjenja, da se inhibira njihovo termalno raspadanje. Zaštitno temperaturno sredstvo takođe dozvoljava mržnjenje kompozicije dok zaštitni adjuvanti mineralnih soli protiv aglomeraciji ili sedimentacije posle mržnjenja i otapanja, mogu takođe zaštititi kompoziciju na povišenim temperaturama npr. iznad 40°C. Polazna vodena vakcina i tečno zaštitno temperaturno sredstvo mogu biti pomešani tako da tečno zaštitno temperaturno sredstvo čini 1-80% zapreminskih krajnje smeše. Pogodna zaštitna temperaturna sredstva treba da su sigurna za davanje, lako mešljiva /rastvorna u vodi, i ne mogu oštetiti druge komponente (npr. antigen i adjuvant) u kompoziciji. Primeri uključuju glicerin, propilen glikol, i/ili polietilen glikol (PEG). Pogodni PEGs mogu imati

4

prosečnu molekulsku masu u opsegu od 200-20000 Da. U poželjnom izvođenju, polietilen glikol može imati prosečnu molekulsku masu od oko 300 Da (’PEG-300’).

[0285] Opis obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži: (i) jedan ili više antigen(a) izabranih između prve, druge, trede ili četvrte grupe antigena; i (ii) zaštitnog temperaturnog sredstva. Ova kompozicija može biti obrazovana mešanjem (i) vodene kompozcije koja sadrži jedan ili više antigena izabranih iz prve, druge, trede ili četvrte grupe antigena, sa (ii) zaštitnim temperaturnim sredstvom. Smeša može biti zatim čuvana npr. ispod 0°C, od 0-20°C, od 20-35°C, od 35-55°C, ili višem. Može biti čuvana u vodnom ili smrznutom obliku. Smeša može biti liofilizovana. Kompozicija može alternativno biti obrazovanja mešanjem (i) suve kompozicije koja sadrži jedan ili više antigena izabranih iz prve, druge, trede ili četvrte grupe antigena, sa (ii) tečnom kompozicijom koja sadrži zaštitno temperaturno sredstvo. Prema tome komponenta (ii) može biti korišdena za rekonstrukciju komponente (i).

Postupci lečenja, i davanja vakcine

[0286] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za podizanje imunog odgovora kod sisara koji obuhvata korak davanja efikasne količine kompozicije prema pronalasku. Imuni odgovor je poželjno zaštitan i poželjno obuhvata antitela i/ili delijski posredovanu imunost. Postupak može podidi pojačani odgovor.

[0287] Pronalazak takođe obezbeđuje bar dva antigena prema pronalasku za kombinovanu upotrebu kao lek npr. za upotrebu u podizanju imunog odgovora kod sisara.

[0288] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu bar dva antigena prema pronalasku u proizvodnji leka za podizanje imunog odgovor kod sisara.

[0289] Podizanjem imunog odgovora kod sisara ovim upotrebama i postupcima, sisari mogu biti zaštitdeni naspram infekcija P. aeruginosa, uključujudi nokozomijalnu infekciju. Određenije, sisar može biti zaštitden naspram infekcija kože, uključujudi one od opekotina, povreda usled traume i očiju pokazanih u referenci 137. upale pluda, meningitisa i neonatalnog meningitisa, osteomijelitisa endokarditisa, pseudomonas folikulitisa, sindroma toksičnog šoka, i/ili septicemije i cistične fibroze.

[0290] Opis takođe obezbeđuje kit koji sadrži prvu komponentu i drugu komponentu gde ni prva komponenta ni druga komponenta nisu kompozicije prema pronalasku kako je gore opsiano, ali gde prva komponenta i druga komponenta mogu biti kombinovane da bi se dobila kompozicija prema pronalasku kako je gore opisano. Kit može dalje obuhvatati tredu komponentu koja sadrži jedno ili više slededih: instrukcije, špric ili druge uređaje za davanje, adjuvant, ili farmaceutske prihvatljve rastvore za formulisanje.

[0291] Opis takođe obezbeđuje uređaj za davanje prethodno napunjen sa imunogenom kompozicijom prema pronalasku.

[0292] Sisar je poželjno čovek. Kada je vakcina za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete (npr. odojče ili dete) ili tinejdžer; kada je vakcina za terapeutski upotrebu, čovek je poželjno tinejdžer ili odrastao čovek. Vakcina namenjena za dete može takođe biti davana odraslima npr. da se proceni sigurnost, doza, imunogenost, itd. Drugi sisari koji mogu biti pogodno imunizirani prema pronalasku su krave, psi, konji i svinje.

4

[0293] Jedan način za proveru efikasnosti terapeutskog tretmana obuhvata pradenje infekcije P. aeruginosa posle davanja kompozicije prema pronalasku. Jedan način provere efikasnosti profilaktičkog tretmana obuhvata pradenje imunih odgovora, sistemski (kao što je pradenje nivoa proizvodnje IgG1 i IgG2a) i/ili mukozno (kao što je pradenje nivoa proizvodnje IgA), naspram antigena u kompozicijama prema pronalasku posle davanja kompozicije. Tipično, antigen-specifični odgovori antitela u serumu su određeni posle imunizacije , ali pre izazivanja , gde su antigen-specifični mukozni odgovori antitela određeni posle imunizacije i posle izazivanja.

[0294] Još jedan način procenivanja imunogenosti kompozicija prema prikazanom pronalasku je da eksprimuje proteine rekombinantno za skrining seruma i mukozne sekrecije pacijenata pomodu imunoblota i/ili ’microarrays’ analiza. Pozitivna reakcija između proteina i uzoraka pacijenata ukazuje da pacijent ima podignut imuni odgovor na protein koji je u pitanju. Ovaj postupak može takođe biti korišden da identifikuje imunodominantne antigene i/ili epitope sa antigenima.

[0295] Efikasnost kompozicija vakcine može takođe biti određena in vivo izazivanjem na životinjskom modelu infekcije P. aeruginosa na, npr., zamorcima ili miševima, sa kompozicijama vakcine. Naročito, jedan koristan životinjski model za ispitivanje bolesti sa infekcijama P. aeruginosa, opisan je detaljno u poglavlju pod nazivom "testiranje efikasnosti" Model letalne infekcije prati broj miševa koji preživljavaju pošto su inficirani intratrahealnim putem sa normalnom-letalnom dozom P. aeruginosa. Različiti antigeni, i različite kombinacije antigena, mogu doprineti različitim aspektima efikasnosti vakcine.

[0296] Kompozicije prema pronalasku de generalno biti davane direktno pacijentu. Direktno davanje može se postidi parenteralnom injekcijom (npr. subkutanozno, intraperitonealno, intravenski, intramuskularno, ili u intersticijalni prostor tkiva), ili mukozno, kao što je rektalno, oralno (npr. tableta, sprej), vaginalno, loklano, transdermalno ili transkutanozno, intranazalno, okularno, ušno, pulmonarno ili drugim mukoznim davanjem.

[0297] Pronalazak može biti korišden da izazove sistemsku i/ili mukoznu imunost, poželjno izazivanjem povedanog sistemskog i/ili mukoznog imuniteta.

[0298] Poželjno pojačani sistemski i/ili mukozni imunitet se refluktuje u povedanom TH1 i/ili TH2 imunom odgovoru. Poželjno, povedani imuni odgovor obuhvata porast u proizvodnji IgG1 i/ili IgG2a i/ili IgA.

[0299] Th17 delije su skoro opisane kao linija pomodnih T delija koje mogu poboljšati antibakterijsku mukoznu zaštitu i mogu potencijalno posredovati u zaštitnom odgovoru izazvanim vakcinom. Videti referecnu 138.

[0300] Doziranje može biti prema rasporedu kao jedna doza ili prema rasporedu kao više doza. Višestruke doze mogu biti korišdene u primarnom rasporedu imunizacije i/ili u rasporedu pojačane imunizacije. U rasporedu višestrukih doza različite doze mogu biti date istim ili različitim putevima npr. prvenstveno parenteralnim i mukoznim pojačavanjem, prvenstveno mukoznim i parenteralnim pojačavanjem itd. Višestruke doze de tipično biti davane u razmaku od bar 1 nedelje (npr. oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 6 nedelja, oko 8 nedelja, oko 10 nedelja, oko 12 nedelja, oko 16 nedelja, itd.).

4

[0301] Vakcine pripremljene prema pronalasku mogu biti korišdene za lečenje i dece i odraslih. Prema tome, humani pacijent može biti star manje od 1 godine, 1-5 godina, 5-15 godina, 15-55 godina, ili bar 55 godina. Poželjni pacijenti za primanje vakcina su stariji (npr. ≥50 godina stari, ≥60 godina stari, i poželjno ≥65 godina), mlađi (npr. ≤5 godina stari), hospitalizovani pacijenti, zdravstveni radnici, oružane službe i vojni personal, trudne žene , hronično bolesni, ili imunodeficijenti pacijenti. Vakcine nisu pogodne isključivo za ove grupe, međutim, mogu biti korišdene generalno u populaciji.

[0302] Vakcine dobijene pronalaskom mogu biti davane pacijentima u suštini u isto vreme kao (npr. u toku istih medicinskih konsultacija ili posete zdravstvenom radniku ili centru za vakcine) druge vakcine npr. u suštini istovremeno kao vakcine gripa, vakcine malih boginja, vakcine zauški, vakcina rubele , MMR vakcina, vakcina varičele, MMRV vakcina, vakcina difterije, vakcina tetanusa, vakcina velikog kašlja, DTP, konjigovana H.influenzae vakcina tipa b, vakcina naktiviranog poliovirusa, vakcina hepatitisa B virus, meningokokna konjugovana vakcina (kao što je tetravalentna A-C-W135-Y vakcina), vakcina respiratornog sincitialnog virusa, itd. Dalje vakcine koje ne sadrže pseudomonas pogodne za zajedničko davanje obuhvataju jedan ili više antigena.

Imunizacija nukleinskim kiselinama

[0303] Ovde opisana imunogena kompozicija obuhvata polipeptidne antigene iz P. aeruginosa. U svim slučajevima, međutim, polipeptidni antigeni mogu biti zamenjeni sa nukleinskim kiselinama (tipično DNK) koje kodiraju te peptide, da bi dali kompozicije, postupke i upotrebe zasnovane na imunizaciji nukelinskim kiselinama. Imunizacija nukleinskim kiselinama je sada razvijena oblast.

[0304] Nukleinska kiselina koja kodira imunogen je eksprimovana in vivo posle davanja pacijentu i eksprimovani imunogen zatim stimuliše imuni sistem. Aktivni sastojak de tipično imati oblik vektora nukleinske kiseline koji sadrži : (i) promoter; (ii) sekvencu koja kodira imunogen, operativno vezanu za promoter; i opciono (iii) selekcioni marker. Poželjni vektori mogu dalje sadržati (iv) mesto početka replikacije; i (v) terminator transkripcije niz lanac i operativno vezan za (ii). Generalno, (i) & (v) de biti eukariotski i (iii) & (iv) de biti prokariotski.

[0305] Poželjni promoteri su virusni promoteri npr. iz citomegalovirusa (CMV). Vektor može takođe obuhvatiti transkripcionu regulatornu sekvencu (npr. poboljšivače) pored promotera i koji reaguju funkcionalno sa promoterom. Poželjni vektori obuhvataju srednji-rani CMV poboljšivač/promoter, i poželjniji vektori takođe obuhvataju CMV intron A. Promoter je operativno vezan za sekvencu niz lanac koja kodira imunogen, tako da je ekspresija sekvence koja kodira imunogen pod kontrolom promoetera.

[0306] Kada je korišden marker, poželjno funkcioniše u mikrobiološkom domadinu (npr. u prokarioti, u bakteriji, u kvascu). Marker je poželjno prokariotski selekcioni marker (npr. transkribovan pod kontrolom prokariotskog promotera). Pogodno, tipični markeri su geni antibiotske rezistence.

[0307] Vektor prema pronalasku je poželjno autozmno replikujudi epizomalni ili ekstrahromozomalni vektor, kao što je plazmid.

[0308] Vektor prema pronalasku poželjno sadrži mesto početka replikacije. Poželjno mesto početka replikacije je aktivno u prokariotama ali ne u eukarotama.

4

[0309] Poželjni vektori obuhvataju prokariotske markere za selekciju vektora, prokariotsko mesto početka replikacije, ali eukariotski promoter za vođenje transkripcije sekvence koja kodira imunogen. Vektori de prema tome (a) biti pojačani i odabrani u prokariotskim domadinima bez polipeptidne ekspresije, ali (b) biti eksprimovani u eukariotskim domadinima bez da su pojačani.Ovaj raspored je idealan za vektore nukleinskih kiselina za imunizaciju.

[0310] Vektor prema pronalasku može sadržati eukariotsku transkripcionu terminator sekvencu niz lanac od kodirajude sekvence. Ovo poboljšava nivoe transkripcije. Kada kodirajuda sekvenca nema svoj, vektor prema pronalasku poželjno sadrži poliadenilacionu sekvencu. Poželjna poliadenailaciona sekvenca je iz goveđeg hormona rasta.

[0311] Vektor prema pronalasku može sadržati višestruka mesta kloniranja

[0312] Pored sekvenci koje kodiraju imunogen i marker, vektor može sadržati drugu eukariotsku kodirajudu sekvencu. Vektor može takođe sadržati IRES uzvodno od pomenute druge sekvence u cilju dozovljavanja translacije drugog eukariotskog polipeptida iz istog transkripta imunogena. Alternativno, sekvenca koja kodira imunogen može biti niz lanac od IRES.

[0313] Vektor prema pronalsku može sadržati nemetilovane CpG motive npr. nemetilovane DNK sekvence koje imaju uobičajeno citozin koji prethodi gvanozinu, okružen sa dva 5’ purina i dva 3’ pirimidina. U njihovim nemetilovanim oblicim ovih DNK motiva je pokazano da su jaki stimulatori nekoliko tipova imunih delija.

[0314] Vektori mogu biti dostavljeni putem ciljanja. Tehnika dostavljanja DNK posredovane receptorom su opisane u oblasti tehnike. Terapeutske kompozicije koje sadrže nukleinsku kiselinu su davane u opsagu od oko 100ng do oko 200mg DNK za lokalno davanje u protokolu genske terapije. Koncentracioni opsezi oko 500 ng do oko 50 mg, oko 1 μg do oko 2 mg, oko 5 μg do oko 500 μg, i oko 20 μg do oko 100 μg DNK mogu takođe biti korišdeni u toku protokola genske terapije. Faktori kao što su postupak delovanja (npr. za nivoe poboljšavanja ili inhibicije kodiranog genskog proizvoda) i efikasnost transformacije i ekspresije su razmatrana i imade uticaja na potrebne doze za krajnju efikasnost. Gde je poželjena veda ekspresija u vedoj oblasti tkiva, vede količine vektora ili iste količine ponovo davane u uzastopnom protokolu davanja, ili nekoliko davanja u delove različitih susednih ili bliskih tkiva može biti porebno da bi se potigao pozitivan terapeutski ishod. U svim slučajevima, rutinsko eksperimentisanje u kliničkim ispitivanjima de odrediti specifične opsege za optimalan terapeutski efekat.

[0315] Vektori mogu biti davani pomodu sredstava za dostavljanje gena. Sredstva za dostavljanje gena mogu biti viralna ili neviralnog porekla (videti generalno referencu 139).

[0316] Vektori na bazi virusa za davanje željene nukleinske kiseline i ekspresiju u željenoj deliji su dobro poznati u ovoj oblasti. Primeri sredstava na bazi virusa obuhvataju, ali bez ograničenja, rekombinantne retroviruse (npr. referenca 140 do ), vektore na bazi alfavirusa (npr. vektori Sindbis virusa, virus šume Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus reke Ros (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) i Venecuelanskog konjskog encefalitisa (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532); takođe biti korišdeni hibridi ili himere ovih virusa mogu), vektori poksivirusa (npr. vakcinija, boginje i difterija živine, boginja kanarinaca, i modifikovana vakcina Ankara, itd.), vektori adenovirusa, i vektori u vezi sa adenovirusom (AAV) (npr. videti ref. 142 do ). Može takođe biti korišdeno davanje DNK vezane za umrtvljen adenovirus [144].

[0317] Nevisrusna sredstva za davanje i postupci koji takođe biti korišdeni, uključujudi ali bez ograničenja samo na njih, polikatijonsku kondenozovanu DNK vezanu ili nevezanu za sam umrtvljen adenovirus [npr.144], DNK vezanu za ligand [145], delije za davanje eukariotskih delija [npr. refs.146 do ] i neutralizaciju nuklearnog naelektrsanja ili fuziju sa delijksim membranama . Takođe može biti korišdena ogoljena DNK. Primeri postupaka uvođenja ogoljene DNKsu opisani u ref. 148. Lipozomi(npr. imunolipozomi) koji mogu biti sredstva za davanje gena su opsana u ref. 149 do . Dodatni prilazi su opisani u referencama 151-152.

[0318] Druga nevirusna davanja pogodna za upotrebu obuhvataju mehaničke sisteme za dostavljanje kao što su oni opisani u ref. 152. Pored toga, kodirajuda sekvenca i proizvod ekspresije kao takav može biti dostavljen kroz naslage materijala fotopolimerizovanog hidrogela ili upotrebu jonizujudeg zračenja (npr. ref. 153). Drugi konvencionlani postupci za davanje gena koji mogu biti korišdeni za davanje kodirajude sekvence obuhvataju, na primer, ručni pištolj za prenos gena [154] ili upotrebu jonizujudeg zračenja za aktiviranje prenetih gena.

[0319] Dostavljanje DNK pomodu PLG {poli(laktid-ko-glikolidnih)} mikročestica je naročito poželjan postupak npr. adsorbovanjem za mikročestice, koje su opcion tretirane da imaju negativno naelektrisanu provršinu (npr. tretirane sa SDS) ili pozitivno naelektirsnu površinu (npr. tretirane sa katjonskim deterdžentom, kao što je CTAB).

Antitela

[0320] Antitela protiv P. aeruginosa antigena mogu biti korišdena kao pasivna imunizacija. Prema tome opis obezbeđuje antitelo koje je specifično za antigen iz prve, druge, trede ili četvrte grupe antigena. Opis takođe obezbeđuje upotrebu takvih antitela u terapiji. Opis takođe obezbeđuje upotrebu takvih antitela u proizvodnji leka. Pronalazak takođe obzebeđuje postupak za lečenje sisara koji sadrži korak davanja efikasne količine antitela prema pronalasku. Kako je ovde opisano za imunogene kompozicije, ovi postupci i upotrebe omogudavaju sisaru da se zaštiti naspram infekcije P. aeruginosa.

[0321] Izraz "antitelo"obuhvata intaktne imunoglobulinske molekule, kao i njihove fragmente koji su u stanju da se vežu za antigen. Oni uključuju hibridne (himerne) molekule antitela; F(ab’)2 i F(ab) fragmente i Fv molekule; nekovalentne heterodimere; pojedinačne lance Fv molekula (sFv); dimerne i trimerne fragmente konstrukta antitela; minitela; molekule humanizovanih antitela; i bilo koje funkcionalne fragmente dobijene iz takvih molekula, kao i antitela dobijena preko nekonvencionalnih postupaka kao što je dispelj faga. Poželjno, antitela su monoklonalna antitela. Postupci za dobijanje monoklonalnih antitela su dobro poznati u ovoj oblasti. Humanizovana ili potpuno humanizovana antitela su poželjna.

Princip

[0322] U izvođenju prikazanog pronalaska de se koristiti, ukoliko nije drugačije navedeno, konvencionalni postupci hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, koji su poznati osobi iz stuke. Takve tehnike su objašnjenje u potpunosti u literaturi.

1

[0323] "GI" numeracija je korišdena. GI broj, ili "GenInfo Identifikator", je serija brojeva koji su konsekventno dodeljeni svakoj zabeleženoj sekvenci obrađenoj pomodu NCBI kada su sekvence dodate u njegovu bazu podataka. GI broj nema sličnosti sa pristupnim brojem zabeležene sekvence. Kada je sekvenca ažurirana (npr. radi korekcije, ili da bi se dodalo još zapažanja ili informacija) tada ona dobija novi GI broj. Prema tome sekvenca koja je u vezi sa datim GI brojem nikad nije promenjena. Pogledati takođe referencu 37.

[0324] Kada se pronalazak tiče "epitopa", ovaj epitop može biti B-delijski epitop i/ili T- delijski epitop. Takvi epitopi mogu biti identifikovani empirijski (npr. korišdenjem PEPSCAN [155] ili sličnim postupcima), ili mogu biti predviđeni (npr. pomodu Jameson-Wolf antigenog indeksa [156], prilazima zasnovanim na matrici [157], MAPITOPE [158], TEPITOPE [159], OptiMer & EpiMer [160], ADEPT [161], Tmestima, hidrofilnosti antigenog indeksa ili postupcima poznatim u ovoj oblasti. Epitopi su deo antigena koji su prepoznati od i vežu se za vezujude mesto antigena antitela ili receptora T-delija, i oni mogu takođe se nazivati "antigene determinante".

[0325] Kada je antigenski "domen" izostavljen, ovo takođe može obuhvatati izostavljanje signalnog peptida, citoplazmatičnog domena, transmembranskog domena, ekstracelularnog domena, itd.

[0326] Izraz "sadrži" obuhvata "sastoji se od" kao i "čine ga" npr. kompozicija "sadrži" X može da se sastoji isključivo od X ili može sadržati nešto dodatno npr. X Y.

[0327] Izraz "oko" u vezi sa numeričkom vrednošdu x je opciono i označava, na primer, x±10%.

[0328] Pozivanje na procenat identičnosti sekvence između dve aminokiselinske sekvence označava da kada je poravnata, taj procenat aminokiselina je isti pri upoređivanju dve sekvence. Ovo poravnavanje i procenat homologije ili identičnosti sekvence može biti određen pomodu softverskih programa poznatih u ovoj oblasti, na primer onima opisanim u odeljcima 7.7.18 iz ref.162. Poželjno poravnanje je određeno pretraživanjem Smith-Waterman homologije pomodu algoritma koji koristi ’affine gap’ pretraživanja sa ’gap open penalty’ od 12 i ’gap extension penalty ’od 2, BLOSUM matrice od 62. Smith-Waterman algoritam pretraživanja homologije je opisan u referenci.163.

NAČINI ZA IZOVĐENJE PRONALASKA

Odabir antigena

[0329] P. aeruginosa proteini su bili odbrani za upotrebu kao komponente vakcine na osnovu kombinacije različitih kriterijuma koji uključuju sledede:

• predviđanje delijske lokalizacije, pomodu koje je dodeljena prednost proteinima predviđenim kao "spoljašnjo membranski", "periplazmatični", ekstracelularni" i "nepoznati". U vezi sa poslednjim definicijom proteina predviđanje je da imaju "nepoznatu" delijsku lokalizaciju koja je često sastavljena iz višestrukih domena, od kojih jedna može biti stvarna izložena površina.

• značajna homologija sa poznatim virulentnim faktorima, kandidatima za vakcine iz drugih vrsta

• nedostatak značajne homologije sa humanim proteinima kodiranim sa sekvenciranim humanim genomom, u cilju ograničavanja verovatnide stvaranja autoimunog odgovora ili vakcinom izazvane autoimunosti.

2

• Nedostatak značajne homologije sa proteinima E. coli, uzimajudi u obzir da proteini imaju odgovarajude delove u mnogo bakterijskih vrsta, ili patogenih ili nepatogenih koji imaju vedu verovatnodu da imaju verovatnodu da imaju funkcije održavanja i prema tome je manje verovatno da su dobri antigeni

• Konzervacija u toku panela od bar 5 od 7 potpuno sekvenciranih genoma P. aeruginosa.

• Korisne aminokiselinske sekvence dužine koja se smatra da je bar 150 aa

• ’Microarray’ podaci. In vitro ekspresija proteina koji potiču iz repertora P. aeruginosa PAO1 su testirani da bi se analizirale promene u ekspresiji gena pod anaerobnim uslovima kao što su ona nađena u mukozi pacijenata sa CF (cističnom fibrozom) poređenih sa anaerobnim uslovima nađenim u okolini. Prioritet je dodeljen proteinima čija ekspresija je održavana i u aerobnim i anarobnim uslovima delijske kulture.

[0330] Protein se može takođe adsorbovati prilično dobro na aluminijum hidroksid (videti takođe dole), koji je koristan za stabilnu u formulaciju za davanje ljudima.

Pokrivenost sojeva

[0331] U cilju procene konzervacije izabranih antigena, različiti klinički izolati P. aeruginosa su korišdeni. P. aeruginosa klinički sojevi su izolovani iz CF pacijenata sa pankreasnom insuficijencijom koji poseduju CF kliniku the Medizinische Hochschule Hannover. P. aeruginosa sojevi iz prvih pozitivnih kultura su označani kao "rani" izolati, dok intermedijarni izolati su sakupljeni 1 do 5 godina posle njih i kasni izolati koji su sakupljeni 7 do 16 godina posle kolonizacije ili pre smrti ili transplantacije pluda. Lista testiranih sojeva je data u slededoj tabeli.

Tabela pokrivenosti sojva

[0332] Simbol ° ukazuje na poslednji soj P. aeruginosa pre smrti ili transplantacije pluda . Geni koji kodiraju PSE54, PSE44-4, PSE10-1, PSE21-5, PSE27-1, PSE52-1, PSE53-1, PSE11, PSE41, PSE47-2, su bili prisutni u svim testiranim sojevima što je potvrđeno sa PCR (lančanom reakcijom polimeraze).

[0333] Prema tome, uzimajudi u obzir efikasnost vakcine u smislu šire zaštite unakrsnih sojeva vakcine zasnovana na bilo kojoj od najboljih kombinacija/koktela kako je testirano u tabeli 2, može biti validno rešenje u cilju produženja pokrivenosti vakcine napsram infekcija koje potiču od pseudomonasa.

Koliniranje i ekspresija rekombinantih proteina P. aeruginosa

[0334] Kloniranje i ekspresija antigena može biti izvedena standardnim postupcima.

[0335] Polipeptidni antigeni iz PA soja PAO1 su PCR-amplifikovani pomodu specifičnih oligonukleotida i PA hromozomske DNK kao šablona. Dobijeni PCR proizvodi su klonirani u pET15b (Novagen) pomodu PIPE postupka [164], koji se sastoje od PCR amplifikacije klonirajudeg vektora (V-PCR) i u PCR amplifikacije inserta (I-PCR). Zatim, 1 μl V-PCR i 1 μl I-PCR su pomešani i transformisani u hemijski kompetente HK100 delije [165]. I-PCR reakcije su podešene da sadrže 1 μM svaki od prednjih i reverznih prajmera, 1x kloniranog Pfu DNK pufera za polimerazne reakciju, 2,5 jedinice Pfu Turbo DNK polimeraze (Stratagene), 200 μM svakog dNTP (Invitrogen) i 50 ng genomskog DNK šablona. Reakcije su izvođenje kao što sledi: inicijalna denaturacija u toku 2 min na 95 °C, zatim 25 ciklusa 95 °C za 30 s, 55 °C za 45 s, i 68 °C za 3 min pradeno sa krajnjim hlađenjem na 4 °C. V-PCR reakcije su bile identične sa I-PCR reakcijama ali koraci na 68 °C su trajali 14 min i2 ng pET15b plazmida je korišdeno kao DNK šablon. Ispravne transformacije su izabrane sa PCR skriningom i sekvenciranjem DNK

4

plazmida vektorskim umetcima. Ispravni plazmid je zatim pripremljen iz izabranih HK100 klonova i korišden je za transformaciju BL21(DE3)T1<r>delija (Sigma) u cilju dozvoljavanja ekspresije proteina.

[0336] Da bi se eksprimovali klonirani proteini, BL21(DE3)T1<r>klonovi koji sadrže pET15b konstrukte su gajeni u LB medijumu koji sadrži 100 μg/ml ampicilina na 37 °C do OD600= 0,5. Ekspresija proteina je zatim indukovana dodavanjem 1 mM IPTG i gajenjem na istoj temperaturi u toku dodatna 3 sata. Konvencionalne ekstrakcije proteina i SDS-Page su izvedeni da bi se proverila ekspresija proteina. Tehnike Zapadnog blota poznate u ovoj oblasti su korišdene da se potvrdi ispravna ekspresija tesiranih antigena P. aeruginosa. Specifični antiserum iz imuniziranih miševa je korišden da se potvrdi ekspresija proteina. Tehnike imunofluorescencije poznate u ovoj oblasti su korišdene da se potvordi lokalizacija površine testiranih antigena P. aeruginosa pomodu antitela anti-delijskog zida kao kolokalizatora i/ili specifičnog anti-antigena seruma dobijenog posle imunizacije miševa.

Formulacije adjuvanata

[0337] Odabrani kandidati proteinskih antigena P. aeruginosa su bili formulisani sa aluminijum hidroksidom ili pojedinačno ili kao kombinacija proteina. Formulacije su optimizovane na pH i osmolarnost.

[0338] Antigeni su formulisani kao kombinacije monovalentih antigena ili viševalentnih antigena u aluminijum hidroksidu. Svaki antigen je korišden pri 10 μg/formulaciji/životinji. Korišden je aluminijum hidroksid pri 2 mg/ml krajnjoj koncentraciji, u 10mM histidinskom puferu (pH 6,5). Natrijum hlorid je korišden da se prilagodi osmolarnost na fiziološke uslove. Formulacije su zatim date intratrahealno u krajnjoj zapremini kompozicije vakcine od 200 μl/životinji.

[0339] Sve monovalentne i kombinovane formulacije, treba da su prilagođene u odnosu na željeni pH i osmolarnost. Formulacije su imale pH u opsegu 6,2-7,3, i osmolarnost u opsegu 248-360 mOsm/kg. Vedina testiranih proteina, u različitim monovalentim i kombinovanim formulacijama, dobro je adsorbovana na aluminijum hidroksidni adjuvant.

[0340] Individualni PSE54, PSE10-1, PSE21-5, PSE27-1, PSE44-4, PSE52-1, PSE53-1 proteini su kompletno adsorbovani i mogu biti desorbovani bez promene njihovog predsorpcinog elektroforeznog profila.

[0341] Svaki antigen u kombinaciji je bi potpuno adsorbovan, bez međuantigenske kompeticije za adjuvant. Antigeni u kombinaciji PSE25+PSE54, PSE27-1+PSE44, PSE38-1+PSE11-3, PSE38-1+PSE11-3, PSE41-5+PSE47A-2, PSE41-5+PSE53-1, PSE47A-2+PSE53-1, PSE47A-2+PSE52-1, su takođe kompletno adsorbovani.

[0342] Sve testirane formulacije su bile stabilne na njihovom pH i osmolarnosti. Svi preostali antigeni su potpuno adosrbovani za adjuvant. Svi antigeni su zadržali svoje desorpcione karakteristike. Nije bilo dokaza o povedanoj degradaciji ili agregaciji antigena posle desorpcije.

Efikasnost testiranja

[0343] Pojedinačni antigeni koji su izlistani u tabeli 2 su testirani na njihovu sposobnost da zaštite napram intra-trahealne (IT) letalne infekcije izazvane sa 5x10<6>cfu planktonskog PAO1 soja. Rezultati su prikazani na slici 1.

[0344] Rekombinanti proteini su korišdeni za imunizaciju miševa za ispitivanja zaštite naspram P. aeruginosa, pomodu referentog soja PAO1. Grupe od 10 miševa (C57BL/6NCrlBR muških 5 nedelja starih, Charles River Laboratories, Italy) su imuniziranedana 0, 21 i 35 sa različitim antigenima i dana 50 izazvane akutnom infekcijom sa homolognim P. aeruginosa PAO1 referentnim sojem. U svakom pojačivaču svaki miš je primio 10 μg ili 20 μg rekombinanog proteina adsorbovanog samo sa stipsom ili sa 10<7>cfu toplotno inaktiviranim PAO1. Da bi se dobili antiserumi miševi svih grupa su krvarili dana -1, dana 34, i dana 49. Kao negativna kontrola 10 miševa po imunizacionom cilusu je bilo injektovano samo sa stipsom, dok kao pozitivna kontrola 10 miševa po imunizacionom ciklusu je pojačano 10<7>cfu toplotno inaktiviranim PAO1 sojem. Dana 50, miševi su inficirani sa 5x10<6>cfu (prva letalna doza) planktonskom P. aeruginosa PAO1 intratrahealnim (IT) putem. Miševi su anestezirani i trahea je direktno vizuelizovana sa trbušnim srednjim rezom, izložena i intubirana sa sterilnom, fleksibilnom 22-g kanilom vezanom za špric od 1 ml. Inokulum plaktonske bakterije od 60 ml je implantiran prekon kanile u pluda. Miševi su posmatrani 120 sati radi preživljavanja u intervalima od dvanaest sati i poređeni sa nevakcinisanim i PAO1 vakcinisanim kontrolnim grupama.

[0345] Antigeni koji su prikazali da su u stanju da daju postepen pomak u krivama preživljavanja u poređenju sa kontrolom su prikazani u tabeli 2, i najbolji rezultati su viđeni sa PSE21-5, PSE47A-2, PSE52-1, PSE53-1 ili PSE54, PSE10, PSE 11-3, PSE 27-1, PSE44-4 i PSE 41-5.

[0346] Dalje, pojedini antigeni su testirani u kombinaciji kako je zabeleženo u tabeli 2.

[0347] Tabela 2 daje ukratko rezultate dobijene sa različitim antigenima kada su korišdeni sami ili u kombinacijama in vivo na životinjskom modelu miša. Podaci o preživljavanju su prikazani u tabli 2. U koloni statističke značajnosti , vrednost p u Mantel-Coksovom testu je izračunata naspram negativne kontrolne grupe. Kriva preživljavanja svakog proteina je poređena sa krivom preživljavanja negativne kontrole istog ciklusa u kome je protein testiran. Preživljavanje je mereno u toku 120 sati u intervalima od dvanaest sati i u poređenju sa nevakcinisanim i PAO1 vakcinisanim kontrolnim grupama. Procenat preživljavanja miševa posle 36 sati je bio dokaz pozitivnih rezultata imunizacije in vivo.

[0348] Između različitih ciklusa uzimajudi u obzir 30 testiranih rekombinantih proteina (Tabela 2), tri proteina (PSE10-1 (PA1178), PSE47A-2 (PA4082), i PSE52-1 (PA4765) imaju takođe visoku statističku značajnost u razlici kriva preživljavanja u odnosu na negativnu kontrolnu grupu (p vrednost u Mantel-Coksovom testu naspram negativne kontrolne grupe 0,0261, 0,0364 i 0,0275 respektivno).

[0349] Na bazi analize kriva preživljavanja sedam dodatnih rekombinantih proteina može se predvideti da rezultati mogu takođe biti značajno potkrepljeni povedavanjem broja životinja testiranih in vivo dalje potvrđujudi preliminarne pozitivne i iznenađujude podatke za PSE11-3 (PA1248), PSE41-5 (PA2407), PSE44-4 (PA3526), PSE53-1 (PA5047), PSE21-5 (PA5112), PSE-54 (PA5340), PSE-27-1 (PA0328).

[0350] Pored toga, kada je poznati antigen, naime OprF-OprI, korišden sam da se imunizira miš na prikazanom životinjskom modelu dobijeno je preživljavanje od 20%, sa statističkom značajnošdu od 0,0446.

[0351] U cilju daljeg poboljšavanja preživljavanja u ovom in vivo modelu, specifične kombinacije su takođe testirane kombinovanjem zajedno proteina koji najviše obedava u cilju daljeg porasta efikasnosti vakcine.

Upoređivanje kombinacija naspram njihovih pojedinačnih polipeptida

[0352] Kombinacije među pozatim koktelima antigena u pojedinačnoj formulaciji su takođe korišdeni za imunizaciju miševa. U kombinacijama je tipično korišden kao adjuvant aluminijum hidroksid (videti poglavlje "Adjuvant Formulation) i davane su 0, 21 i 35 dana. Imunizirani su C57BL/6NCrlBR muški miševi star 5 nedelja, 10 po grupi. Dana 50. miševi su izazavni sa letalnom dozom toplotno inaktivnirane bakterije i preživljavanje koje je sledelo je 120 h. Za poređenje, PBS je korišden kao negativna kontrola i PAO1 je toplotno inaktiviran kao pozitivna kontrola.

[0353] Porast u preživljavanju, u toku pradenja u toku 120 h posle rasporeda imunizacije i drugih infekcija sa letalnom dozom soja Pseudomonas homologous, kada se porede sa negativnom kontrolnom grupom, su iznenađujude pokazali najbolji rezultat kada su sledede kombinacije testirane (Tabela 2): PSE47A-2+PSE53-1, PSE47A-2+PSE53-1, PSE54+PSE44-4 i PSE54+PSE21-5 najviše obedavaju; dok je PSE47A-2+PSE52-1 kominacija manje obedavala.

[0354] Različiti testovi su izvedeni da bi se uporedile različite kombinacije sa njenih sedam pojedinačnih polipeptida (tj. PSE54 ili PSE21-5 ili PSE27-1, PSE44-4, PSE52-1, PSE53-1, PSE47A-2), kao i OprF/I kao dalja pozitivna kontrola ili negativna kontrola bez antigena.

[0355] Miševi su imunizirani sa koktelima dva različita proteina. Osam koktela je imalo statistički različite krive preživljavanja kada se koriste sa negtivnom kontrolnom grupom (uzimajudi uobzir takođe PSE54+OprF-OprI kompoziciju).

[0356] U šestom ciklusu, testirani su različiti kokteli proteina kombinovani sa PSE47A-2: PSE47A-2+PSE52-1 i PSE47A-2+PSE53-1 kojisu pokazivali iznenađujudi statističku razliku u odnosu na negativnu kontrolnu grupu (p vrednost u Mantel-Coksovom testu naspram negativne kontrolne grupe 0,0374 i 0,0373 respektivno).

[0357] Posebno, vakcinacija sa koktelom PSE47A-2+PSE53-1 je dovela iznenađujude do preživljavanja od 30%, održavajudi dobru statističku značajnost.

[0358] U desetom ciklusu, testiranu su različiti kokteli proteina kombinovani sa PSE54. Pet koktela od osam ima značajno različiti krivu morataliteta kada se poredi sa negativnom kontrolnom grupom kako je zabeleženo u tabeli 2. Naročito, vakcinacija je sa koktelima PSE54+PSE44-4 i PSE54+PSE52-1 antigena dala veoma dobru zaštitu životinja dovodedi do 40% i 33% preživljavanja životinja respektivno (p vrednost u Mantel-Coksovom testu naspram negativne kontrolne grupe 0,0076 i 0,0142 respektivno). Kada su ponovo testirani u jedanaestom ciklusu, PSE54+PSE44-4 su potvrdili pozitivan rezultat koji pokazuje porast u preživljavanju životinja od 57%. Drugi kokteli su pokazli bolju efikasnost vakcine kada su korišdeni u kombinaciji gde: PSE54+PSE21-5, PSE54+PSE53-1 i PSE54+PSE10-1 (p vrednost u Mantel-Coksovom testu protiv negativne kontrolne grupe 0,0332, 0,0085 i 0,0025 respektivno).

[0359] Pored toga, ovaj poslednji koktel, PSE54+PSE10-1, ima uporedne rezultate u dva različita ciklusa imunizacije koji potkrepljuju pozitivne i iznenađujude rezultate, koji dovode do istog odnosa preživljavanja životinja (20%) u oba ciklusa.

[0360] Na kraju četiri dodatna koktela različitih proteina (PSE27-1+PSE44-4, PSE53-1+PSE41-5 i PSE53-1+PSE52-1 iPSE54+PSE27-1) mogu biti još značajnija daljim ponavljanjem eksperimenata u drugim eksperimentima koji potvrđuju rastudi broj životinja.

[0361] U cilju da se još poboljša kapacitet zaštite i na kraju efikasnost vakcine izabranih antigena, bila je testirana kombinacija tri proteina. Sedam grupa je testirano održavajudi dva fiksana proteina PSE54+PSE44-4 plus jedan varjabilni protein, dok druge testirane grupe su bile sa PSE47A-2+PSE52-1+PSE53-1, PSE54+PSE52-1+PSE53-1 i PSE54+PSE53-1+PSE 27-1. Neke ove kombinacije nisu dale značajnu zaštitu životinjama kada se porede sa negativnom kontrolnom grupom pošto kada se uzme u obzir npr. PSE54+PSE44-4+PSE47A2 ili PSE54+PSE53-1+PSE 27-1 oni mogu obezbediti značaju zaštitu kroz potvrdne eksperimente, dobijene porastom broja životinja (videti tabelu 2). Prema tome, neke kombinacije tri proteina nisu poboljšale zaštitu nego su je pogoršale u odnosu na dva proteina.

[0362] Međutim, kada se uzme u obzir dalja kombinacija dodavanja koktela antigena takođe je pozitivna kontrola OprF-OprI fuzije uključena u dalje kombinacije.

[0363] Kada je OprF-OprI korišden kao pojedinačni fuzioni proteinski antigen pokazao je 20% preživljavanja sa statističkom značajnošdu od 0,0446, slično sa drugom pojedinačnom imunizacijom sa jednim obedavajudim antigenom, gde kada je korišden u kombinaciji sa PSE54 iznenađujude procenat preživljavanja raste na 50% sa sličnom statističkom značajnošdu. Pored toga, imunizacija sa slededim antigenima u kombinaciji PSE54+PSE27+OprF-OprI pokazala je iznenađujude čak 60% preživljavanja sa uporednom statističkom značajnošdu, dok razmatranje druge kombinacije, naime PSE54+PSE53+OprF-OprI nije pokazalo bilo koji aditivan efekat ili značajnu imunogenost efikasnosti vakcine u odnosu na pojedinačnu imunizaciju antigena, čak u jednoj imunizaciji uz upotrebu smanjene količine svakog antigena (Table 2). Razumo je očekivati da povedanje broja testiranih životinja de takođe ovoj specifinoj kombinaciji obezbediti značajan porast u imunološkoj zaštiti.

TABELA 1: NOMENKLATURA UNAKRSNIH REFERENCI

TABELA 2: SAŽETI PRIKAZ REZULTATA NA ŽIVOTINJSKOM MODELU MIŠA

Statistička

Ags Ciklus ug Ags

značajnost<£>Preživljavanje % PSE5 11 10 0.10 0 (0/5) PSE10 1 10 0.026 0 (0/9) PSE10-1 8 20 0.56 0 (0/10) PSE11-3 2 10 0.47* 14 (1/7)

7 20 0.28* 22 (2/9)

PSE13 4 10 0.55 0 (0/10) PSE17 11 10 0.35 0 (0/8) PSE18-2 1 10 0.73 0 (0/8) PSE19-1 4 10 0.17 0 (0/6) PSE20 11 10 0.91 12.5 (1/8) PSE21-5 2 10 0.08* 0 (0/10) PSE21 11 10 0.19* 50 (5/10) PSE23-1 1 10 0.61 0 (0/9) PSE24-1 1 10 0.19 0 (0/8) PSE25-1 4 10 0.10 0 (0/10)

8 20 0.90 0 (0/10)

PSE26 3 10 0.32 0 (0/9) PSE27-1 2 10 0.91 0 (0/10)

4 10 0.21* 0 (0/10)

7 20 0.80 11 (1/9)

PSE28-2 2 10 0.37 0 (0/10) PSE31-2 2 10 1 0 (0/10)

11 10 0.76 10 (1/10)

PSE33 11 10 0.61 0 (0/9) PSE34 1 10 0.17 0 (0/9) PSE36-3 1 10 1 0 (0/10) PSE38-1 2 10 0.53 22 (2/9) PSE41-5 1 10 0.34* 0 (0/10)

6 20 0.25 0 (0/9)

7 20 0.65* 0 (0/10)

PSE42-1 4 10 0.55 13 (1/8) PSE44-4 2 10 0.08* 0 (0/9)

7 20 0.28* 22 (2/9)

PSE45-2 4 10 0.32 0 (0/8) PSE47-3 4 10 0.06 0 (0/5) PSE47A-2 2 10 0.0364 10 (1/10)

4 10 0.55 0 (0/10)

6 20 0.26 20 (2/10)

1

Statistička

Ags Ciklus ug Ags vanje % značajnost<£>Preživlja

9 20 0.27 20 (2/10)

PSE50 3 10 0.96 0 (0/9) PSE51 3 10 1 0 (0/8) PSE52 3 10 0.0275 0 (0/9) PSE52-1 6 20 0.0208 10 (1/10) PSE53 3 10 0.07* 0 (0/9) PSE53-1 6 20 0.22* 0 (0/8)

7 20 0.25* 22 (2/9)

PSE54 3 10 0.17* 10 (1/10)

8 20 0.88 0 (0/10)

9 20 0.16* 0 (0/8)

14 10 0.19* 60 (6/10)

PSE25+PSE54 8 10+10 0.49 0 (0/10) PSE27-1+PSE44 7 10+10 0.38* 0 (0/10) PSE38-1+PSE11-3 9 10+10 0.004# 0 (0/9) PSE41-5+PSE52-1 6 10+10 0.27 11 (1/9) PSE41-5+PSE47A-2 6 10+10 0.98 0 (0/4) PSE41-5+PSE53-1 7 10+10 0.55* 10 (1/10) PSE47A-2+PSE53-1 6 10+10 0.0373 30 (3/10) PSE47A-2+PSE53-1 9 10+10 0.09 0 (0/10) PSE47A-2+PSE52-1 6 10+10 0.0374 0 (0/7) PSE47A-2+PSE52-1 9 10+10 0.06 0 (0/9) PAE47A-2+PSE21-5 9 10+10 0.28 11 (1/9) PSE47A-2+PSE44-4 9 10+10 0.34 0 (0/9) PSE47A-2+PSE38-1 9 10+10 0.003# 0 (0/10) PSE47A-2+PSE11-3 9 10+10 0.01# 0 (0/10) PSE53-1+PSE52-1 6 10+10 0.20* 0 (0/9) PSE54+PSE10-1 8 10+10 0.0154 20 (2/10)

10 10+10 0.0025 20 (2/10)

PSE54+PSE47A-2 10 10+10 0.55 10 (1/10) PSE54+PSE11-3 10 10+10 0.31 10 (1/10) PSE54+PSE52-1 10 10+10 0.0142 33 (3/9)

11 10+10 0.96 0 (0/3)

PSE54+PSE53-1 10 10+10 0.0085 12.5 (1/8) PSE54+ PSE53 13 10+10 0.61 22 (2/9)

2

Ciklus ug AgsStatističkaPreživljavanje % Ags značajnost<£>

PSE54+PSE21-5 7 10+10 0.332 14 (1/7)

PSE54+PSE21 13 10+10 0.0213 40 (4/10)

14 10+10 0.13* 70

PSE54+PSE27-1 10 10+10 0.20* 22 (2/9)

PSE54+ PSE27 13 10+10 0.16* 10 (1/10)

14 10+10 0.052* 80 (8/10)

PSE54+PSE44-4 10 10+10 0.0076 40 (4/10)

11 10+10 0.14* 57.1 (4/7)

PSE54+OprF-OprI 13 10+10 0.0403 50 (5/10)

PSE10-1+PSE25-1 8 10+10 0.44 0 (0/7)

PSE47A-2+PSE52- 9 10+10+10 0.06 0 (0/8)

1+PSE53-1

PSE54+PSE44- 12 10+10+10 0.69 0 (0/10)

4+PSE10-1

PSE54+PSE44- 12 10+10+10 0.34 0 (0/10)

4+PSE21-5

PSE54+PSE44- 12 10+10+10 0.32 0 (0/10)

4+PSE27

PSE54+PSE44- 12 10+10+10 0.61 0 (0/5)

4+PSE52

PSE54+PSE44- 12 10+10+10 0.25 0 (0/7)

4+PSE53-1

PSE54+PSE44-4+ 12 10+10+10 0.17* 16.6 (1/6)

PSE47A-2

PSE54+PSE44- 12 10+10+10 0.46 0 (0/10)

4+PSE11

PSE54+PSE52- 12 10+10+10 0.68 0 (0/4)

1+PSE53-1

PSE54+PSE27+OprF- 13 10+10+10 0.0021 60 (6/10)

OprI

PSE54+ PSE53+OprF- 13 10+10+10 0.17* 20 (2/10)

OprI

PSE54+PSE53+ PSE27 13 10+10+10 0.08* 20 (2/10)

PSE54+PSE53+ PSE27 13 6.7+6.7+6.7 0.17* 20 (2/10)

OprF-OprI 11 10 0.28 0 (0/8)

12 10 0.43 10 (1/10)

13 10 0.0446 20 (2/10)

Legenda za tabelu 2:

[0364]

# p vrednost u Mantel-Coksovom testu naspram negativne kontrolne grupe: Kriva preživljavanja za svaki protein je poređena sa krivom preživljavanja negativne kontrole u istom ciklusu u kom je protein testiran. Preživljavanje je mereno u toku 120 h u intervalima od dvanaest sati i poređeno sa nevakcinisanim i PAO1 vakcinisanim kontrolnim grupama. Procenat preživljavanja posle 36 sati je bio dokaz pozitivnih rezltata imunizacije in vivo.

* t-test značajnosti sa povedanim brojem životinja: antigen vs negativna kontrola.

<#>t-test značajnosti: antigen vs. negativna kontrola značajan ali miševi imunizirani sa antigenom mrtvi pre negativnih kontrola . Nd: nije sprovedeno

REFERENCE

[0365]

[1] FEMS Microbiol Lett.2009 Nov;300(2):153-64.

[2] J Antimicrob Chemother.2009 Aug;64(2):229-38.

[3] Clin Microbiol Rev.2009 Oct; 22(4):582-610.

[4] EP0717106B1

[5] Mansouri et al., Infect. Immun.1999, 67(3):1461

[6] WO2012/084272.

[7] WO2010107778

[8] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).

[9] EP-A-0372501.

[10] EP-A-0378881.

[11] WO93/17712.

[12] WO98/58668.

[13] WO91/01146.

[14] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[15] Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.

[16] EP-A-0594610.

[17] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[18] Michon et al. (1998) Vaccine.16:1732-41.

[19] WO02/091998.

[20] WO01/72337.

[21] WO00/61761.

[22] WO00/33882

[23] US patent 4,761,283.

[24] US patent 4,356,170.

[25] US patent 4,882,317.

[26] US patent 4,695,624.

[27] Mol. Immunol., 1985, 22, 907-919

[28] Bethell G.S. et al., J. Biol. Chem., 1979, 254, 2572-4

[29] WO00/10599.

[30] Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 165 : 171-288 (1979).

[31] US patent 4,057,685.

[32] US patents 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.

[33] US patent 4,459,286.

[34] US patent 4,965,338.

[35] US patent 4,663,160.

[36] WO2007/000343.

[37] Winsor GL, et al. Nucleic Acids Res.2011 Jan;39(Database issue):D596-600

4

[38] Luckett et al., (2012) Activity. PLoS Pathog 8(8): el002854.

[39] Damron et al., (2009) Microbiology 155, 1028-1038

[40] Choi et al., Proteomics 2011, 11, 3424-3429

[41] Finke et al., (1990) Infection and Imunity, July p.2241-2244

[42] Remans et al., (2010) Microbiology, 156, 2597-2607

[43] Mercier et al., (2009) Protein Science, 18, 606-618

[44] Bell et al., (1989) Journal of bacteriology, 171(6), 3211-3217

[45] Montor et al., Infect. Immun.2009, 77(11):4877.

[46] Ochsner et al., J. Bacteriol.1999, 181(4):1099

[47] WO2009005040

[48] EP0297291B

[49] Doring et al., (2008) Vaccine 26, 1011-1024

[50] Kao et al., Chem Biol Drug Des 2009; 74: 33-42

[51] Campodonico et al., INFECTION AND IMMUNITY, Feb.2010, p.746-755

[52] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48, 443-453.

[53] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277.

[54] Taniyama et al.,_J. Bacteriol.-2012-1447-56

[55] Bauman & Kuehn (2006) Microbes Infect.8:2400-8.

[56] Ellis et al. (2010) Infect Immun.78(9):3822-31.

[57] Tashiro et al. (2012) Environmental Microbiology 14:1349-62.

[58] US patent 6355271.

[59] WO00/23105.

[60] WO90/14837.

[61] WO90/14837.

[62] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[63] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[64] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O’Hagan.

[65] WO2008/043774.

[66] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[67] Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[68] US-2007/014805.

[69] US-2007/0191314.

[70] Suli et al. (2004) Vaccine 22(25-26):3464-9.

[71] WO95/11700.

[72] US patent 6,080,725.

[73] WO2005/097181.

[74] WO2006/113373.

[75] Han et al. (2005) Impact of Vitamin E on Immune Function and Infectious Diseases in the Aged at Nutrition, Immune functions and Health EuroConference, Paris, 9-10 June 2005.

[76] US-6630161.

[77] US 5,057,540.

[78] WO96/33739.

[79] EP-A-0109942.

[80] WO00/07621.

[81] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[82] EP-A-0689454.

[83] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[84] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[85] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.

[86] WO02/26757.

[87] WO99/62923.

[88] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[89] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658.

[90] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[91] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[92] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.

[93] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.

[94] WO01/22972.

[95] Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72.

[96] WO95/17211.

[97] WO98/42375.

[98] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[99] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[100] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.

[101] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.

[102] Tebbey et al. (2000) Vaccine 18:2723-34.

[103] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

[104] WO99/40936.

[105] Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276.

[106] WO99/27960.

[107] US 6,090,406.

[108] US 5,916,588.

[109] WO99/52549.

[110] WO01/21207.

[111] WO01/21152.

[112] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.

[113] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.

[114] US 4,680,338.

[115] WO92/15582.

[116] WO03/011223.

[117] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[118] WO2004/060308.

[119] WO2004/064759.

[120] US 6,924,271.

[121] US2005/0070556.

[122] US patent 5,011,828.

[123] WO2004/87153.

[124] US 6,605,617.

[125] WO2004/018455.

[126] WO03/082272.

[127] Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42.

[128] Dyakonova et al. (2004) Int Immunopharmacol 4(13):1615-23.

[129] Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3(8):1177-86.

[130] WO2004/064715.

[131] De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496

[132] US patent 5,936,076.

[133] Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80.

[134] WO99/11241.

[135] European patent applications 0835318, 0735898 and 0761231.

[136] WO2006/110603.

[137] Molina et al., Bol Asoc Med P R.1991 Apr; 83(4):160-3.

[138] Weihui et al., Am J Respir Crit Care Med Vol 186, Iss.5, pp 420-427, Sep 1, 2012

[139] Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51

[140] WO 90/07936.

[141] WO 94/03622.

[142] WO 94/12649.

[143] WO 93/03769.

[144] Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147

[145] Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985

[146] US patent 5,814,482.

[147] WO 95/07994.

[148] US patent 5,580,859

[149] US patent 5,422,120

[150] WO 95/13796.

[151] Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411

[152] Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:11581

[153] US patent 5,206,152.

[154] US patent 5,149,655.

[155] Geysen et al. (1984) PNAS USA 81:3998-4002.

[156] Jameson, BA et al.1988, CABIOS 4(1):181-186.

[157] Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89.

[158] Bublil et al. (2007) Proteins 68(1):294-304.

[159] De Lalla et al. (1999) J. Immunol.163:1725-29.

[160] Meister et al. (1995) Vaccine 13(6):581-91.

[161] Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7.

[162] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30 [163] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math.2: 482-489.

[164] Klock, H.E., et al. (2008). Proteins 71:982-994

[165] Klock, H. E., et al. (2005) J. Struct. Funct. Genomics 6, 89-94

LISTA SEKVENCI

2

�

1

2

�

1

2

�

1

11

12

�

��

�

1

�

�

�

11

11

11

11

11

11

11

��

12

��

��

12

12

��

�

11

12

1

��

�

1

1

1

�

��

14

��

14

��

��

14

1

11

��

1

��

�

1

�

1

1

�

11

12

�

14

1

1

�

�

�

1

11

��

1

��

1

�

�

�

1

�

11

��

�

14

1

�

1

1

1

1

11

��

�

14

1

�

1

�

1

�

21

22

2

24

�

�

2

2

2

21

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Imunogena kompozicija koja sadrži PSE54 (PA5340) antigen i opciono jedan ili više antigena izabranih iz liste koju čine: PSE44-4 (PA3526) antigen; PSE10-1 (PA1178) antigen; PSE21-5 (PA5112) antigen; PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE52-1 (PA4765) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE11-3 (PA1248) antigen; PSE41-5 (PA2407) antigen; PSE47A-2 (PA4082); PSE5-1 (PA0595); PSE13-2 (PA1954); PSE17-1 (PA3692); PSE18-2 (PA4370); PSE20-1 (PA4735); PSE23-1 (PA3647); PSE24-1 (PA0126); PSE25-1 (PA0189); PSE26-1 (PA0274); PSE28-2 (PA0537); PSE31-2 (PA0737); PSE33-2 (PA1086); PSE42-1 (PA2793); PSE45-2 (PA3535); PSE50-1 (PA4578); PSE51-4 (PA4667); PSE19-1 (PA4710); PSE34-1 (PA1106); PSE36-3 (PA1324); PSE38-1 (PA1777).

2. Kompozicija prema zahtevu 1, koja obuhvata PSE54 (PA5340) antigen u kombinaciji sa bar jednim drugim antigenom izabranim iz liste koju čine: PSE44-4 (PA3526) antigen; PSE10-1 (PA1178) antigen; PSE21-5 (PA5112) antigen; PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE52-1 (PA4765) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE11-3 (PA1248) antigen; PSE41 (PA2407) antigen; PSE47A-2 (PA4082); PSE5-1 (PA0595); PSE13-2 (PA1954); PSE17-1 (PA3692); PSE18-2 (PA4370); PSE20-1 (PA4735); PSE23-1 (PA3647); PSE24-1 (PA0126); PSE25-1 (PA0189); PSE26-1 (PA0274); PSE28-2 (PA0537); PSE31-2 (PA0737); PSE33-2 (PA1086); PSE42-1 (PA2793); PSE45-2 (PA3535); PSE50-1 (PA4578); PSE51-4 (PA4667); PSE19-1 (PA4710); PSE34-1 (PA1106); PSE36-3 (PA1324); PSE38-1 (PA1777).

3. Kompozicija prema zahtevu 2, koja dodatno sadrži jedan ili više antigena izabranih iz liste koju čine: PilA, OprF-OprI, FliC, FliD, ExoA.

4. Kompozicija prema zahtevu 2, koja sadrži bar jedan antigen izabran između: PSE10-1 (PA1178), PSE52-1 (PA4765), PSE53-1 (PA5047) i PSE21-5 (PA5112).

5. Kompozicija prema zahtevu 2, koja sadrži jedan ili više antigena izabranih iz grupe koju čine: PSE10-1 (PA1178) antigen; PSE44-4 (PA3526) antigen; PSE52-1(PA4765) antigen; PSE53-1 (PA5047) antigen; PSE21-5 (PA5112) antigen; PSE27-1 (PA0328) antigen; PSE47A-2 (PA4082) antigen; ili OprF-OprI.

6. Kompozicija prema bilo kom od prethodnom zahtevu, gde jedan ili više pomenutih antigena je adsorbovano na aluminijum hidroksidni adjuvant, i opciono gde kompozicija sadrži histidinski pufer.

7. Kompozicija prema bilo kom od prethodnom zahtevu, što dodatno sadrži: jedan ili više konjugata (i) P. aeruginosa egzopolisaharida i (ii) protein nosač.

8. Imunogena kompozicija koja sadrži kompoziciju prema bilo kom od prethodnih zahteva, i dodatno sadrži jedan ili više:

(A) jedan ili više konjugat (i) S.aureus egzopolisaharida;

(B) jedan ili više proteinskih antigena (i) S.aureus ili

(C) jedan ili više patogenih antigena E. coli

(D) jedan ili više patogenih antigena B. cenocepacia

9. Imunogena kompozicija koja sadrži kompoziciju prema zahtevu 1 i jedan ili više (i) OprF-OprI antigen; (ii) FliC antigen; (iii) FliD antigen; i/ili (iv) PilA antigen.

10. Kompozicija prema bilo kom zahtevu 1, gde je jedan ili više antigena OprF-OprI antigen.

11. Kompozicija prema bilo kom prethodnom zahtevu, koja sadrži adjuvant.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži:

(a) polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima 80% ili više identičnosti sa SEQ ID NO: 10 koji može izazvati antitelo koje prepoznaje SEQ ID NO: 10; ili

(b) polipeptid koji sadrži aminokiselinksu sekvcencu SEQ ID NO:45; i

opciono još sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 80% ili više identična sa bilo kojom sekvencom SEQ ID NOs: 1-9, 11-35 ili SEQ ID NOs: 36-65.

13. Imunogena kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-11, za upotrebu:

(i) u podizanju imunog odgovora protiv infekcija Pseudomonas aeruginosa kod ljudi; ili

(ii) kao profilaktička ili terapeutska vakcina naspram nozokomijalni infekcija izazvanih sa Pseudomonas aeruginosa.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5