RS56941B1 - Postupak za povećanje imunoreaktivnosti - Google Patents

Description

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke za modulaciju imunološkog odgovora üelija.

[0002] Aktivna imunizacija je prvo omoguüila široko rasprostranjenu kontrolu najugroženijih infektivnih bolesti, a u nekim sluþajevima þak i postigla njihovo iskorenjivanje širom sveta koristeüi jeftin i visoko efikasni mehanizam odbrane. Stoga su nastojali i nastojaüe da se razviju pristupci za profilaktiþke i terapeutske vakcinacije protiv razliþitih indikacija. Meÿutim, efikasna vakcinacija zahteva indukciju imunološkog odgovora koji rezultira zaštitnim imunitetom. Nedostatak imunogenosti imunizirajuüeg antigena, meÿutim, dovodi do odsustva željenog efekta. Vrlo zanimljive i specifiþne formulacije antigena veü su razvijene za profilaksu i leþenje malarije, HIV-a, gripa ili tumora, a to su samo nekoliko istaknutih primera. Meÿutim, ove terapije nisu bile uspešne, na primer, zbog nedostatka imunogenosti imunizirajuüeg antigena. Štaviše, þak i široko korišüene vakcine suoþene su sa problemima nedostatka imunogenosti, kao što je vakcina protiv hepatitisa B, koja zapravo gradi titar zaštitnih imunoloških odgovora samo za oko 80% tretiranih. Glavni razlog nedostatka reaktivnosti imunog sistema je u tome što ovi antigeni nisu prepoznati kao "inostrani". Kod sisara, pre svega T üelije odluþuju da li üe struktura predstavljena antigenskim prezentujuüim üelijama (APCs) biti prepoznata kao endogena ili strana. Za indukovanje imunog odgovora, u suštini su potrebna dva odvojena i nezavisna signala. Ovaj mehanizam je dizajniran da spreþi prekoraþenje imunološkog sistema. Prvi zahtev je da T-üelijski receptor prepoznaje i antigen koji je predstavio APC. Ako to nije sluþaj, nema nikakve dalje reakcije. Pored toga, da bi se indukovao imuni odgovor, interakcija CD28 receptora na površini T-üelija sa B7, koja je izražena na APC-u samo ako klasifikuje antigensku strukturu kao opasnu, je imperativ u sluþaju vakcinacije sa antigenskom vakcinacijom koja ima samo marginalnu imunogenost, gde istovremena stimulacija putem interakcije izmeÿu B7 i CD28 neüe uspeti, što kasnije ne dovodi do imunološkog odgovora, veü na pojavu tolerancije na nivou T-üelija. Meÿutim, pokazano je da se potreba za istovremenom stimulacijom može zaobiüi iskljuþivanjem enzima E3-ubihitin ligaze Cbl-b. Ovaj enzim predstavlja kljuþnu taþku u kontroli imunoreaktivnosti (Chiang et al., J Clin Invest (2007) 117(4): 1033-1034, doi: 10.1172/JCI29472). U odsustvu Cbl-b, primenjene supstance koje su jedva imunogene mogu dovesti do indukcije snažnog imunološkog odgovora. Osim toga, Cbl-b deficijentni miševi (homozigotni gen knock-out) su održivi i njihov imunološki sistem je u stanju da efikasno prepoznaje autologne tumore i, s druge strane, stvara litinski imuno odgovor prvenstveno zahvaljujuüi CD8+ T-üelijama (Loeser et al., JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699). Meÿutim, potpuna eliminacija enzima, koja je opisana, takoÿe dovodi do poveüane autoimunosti nakon imunizacije sa superantigenima. Loeser at al. su stoga bili u moguünosti da pokažu da je Cbl-b kao negativni regulator u velikoj meri odgovoran za "imunoreaktivnost" T-üelija.

[0003] siRNK tehnologija za ublažavanje specifiþne ekspresije gena takoÿe je opisana za Cbl-b sa nižom efikasnosti. US 2007/0087988 se odnosi na postupak za regulaciju HPK1, ekspresija koja se može poveüati poveüanjem Cbl-b ekspresije i obrnuto (npr. putem Cbl-b siRNK inhibicije).

[0004] US 2007/0054355 opisuje Cbl-b peptide i Cbl-b povezane proteine, naroþito POSH, i njihovu upotrebu za leþenje Cbl-b-povezanih bolesti.

[0005] WO 2004/078130 A2 se odnosi na kompozicije za leþenje bolesti povezanih sa POSH, kao što su virusne bolesti, rak ili neurološki poremeüaji. POSH može biti dostupan zajedno sa nizom proteina povezanih sa POSH-om, ukljuþujuüi Cbl-b.

[0006] US 2006/0292119 A1 se odnosi na metode za poveüanje imunološkog odgovora imunih üelija inhibiranjem negativnih imunoloških regulatora u üeliji. Takvi negativni imunološki regulatori su izabrani od proteina koji su povezani sa molekularnom stabilnošüu, npr. putem ubihitinacije, deubihitinacije i sumoilacije, kao i faktori transkripcije koji indukuju ekspresiju NFkB inhibitora ili supresori transkripcije NkB ciljanih gena.

[0007] US 2007/0015768 A1 otkriva jedinjenja za inhibiranje ubihitin ligaza, ponekad siRNK za suzbijanje Cbl-b ekspresije.

[0008] Plautz G et al. (Urol.54 (4) (1999): 617-623) opisuje ex vivo metod za aktivaciju CD4 i CD8 T-limfocita kod izolovanih pacijenata, pri þemu imune üelije tretiraju sa IL-2/stafilokoknim enterotoksinom A (SEA), a zatim ponovo injektiraju u pacijenta.

[0009] Meÿutim, još uvek nije opisana primena Cbl-b medijatora pogodnih za kliniþke primene. Stoga je predmet ovog pronalaska da obezbedi praktiþan metod za moduliranje imunoreaktivnosti.

[0010] Ovaj pronalazak se prema tome odnosi na in vitro ili ex vivo postupak poboljšanja imunoreaktivnosti üelija imunog sistema, koji obuhvata prolaznu redukciju ili inhibiranje ekspresije Cbl-b pomoüu kratke DNK i/ili RNK sekvence komplementarne na deo ciljane Cbl-b-mRNK sekvence, pri þemu su üelije kontaktirane sa antigenom pre ili posle sakupljanja i gde je poveüana imunoreaktivnost üelija protiv antigena i gde su üelije antigen predstavljajuüe üelije, PBMC (Mononuklearne üelije periferne krvi), T-limfociti, B-limfociti, monociti, makrofage, NK üelije i/ili NKT üelije.

[0011] Cbl-b gen i njegovi genski proizvodi su detaljno opisani u stanju tehnike (UniGene Id.

Hs.3144 und Hs.381921). Cbl-b sekvence su npr. objavljene u bazi GenBank Datebank pod Acc.

Br. NM_008279 i NP_009112. Anti-Cbl-b antitela, siRNKs i antisenzitivni inhibitori su komercijalno dostupni. Odreÿene siRNKs su pogodne za redukciju ili inhibiciju Cbl-b ekspresije, a time i Cbl-b funkcije su otkrivene, na primer, u US 2007/0054355 sa mešanim nukleotidima RNK/DNK i dužinom od oko 20 baza.

[0012] Da bi se izbegao rizik od prekomerne reakcije imunog sistema koji dovodi do indukcije npr. autoimunska reaktivnost, inhibicija/deaktivacija Cbl-b funkcije u T-üelijama može se desiti samo u strogo odreÿenom vremenskom periodu. Stoga je neophodno da se za terapeutski adjuvansni pristup vakcinacija kontroliše na ograniþen naþin samo u ograniþenom vremenskom periodu kako bi se podržalo uspostavljanje imunološkog odgovora na imunološki antigen, ali da se spreþi autoimunska bolest blagovremenim obnavljanjem imunološkog "normalnog stanja". Prema tome, prema predmetnom pronalasku, samo odreÿeni izbor izolovanih üelija imunog sistema je tretiran in vitro ili ex vivo i potom vraüeno pacijentu. Jedan pristup za efikasnost in vitro ili ex vivo Cbl-b slabljenja je stoga preduslov za poveüanje imunoreaktivnosti.

[0013] Prema pronalasku, funkcija Cbl-b je smanjena ili inhibirana redukcijom ili inhibicijom ekspresije Cbl-b. Redukcija ili inhibicija termina se odnosi na smanjenje funkcije (ili ekspresije) Cblb u poreÿenju sa nepromenjenom prirodnom funkcijom sve do potpune inhibicije funkcije. Poželjno je da se funkcija (i/ili ekspresija) smanji za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%.

[0014] Redukcija ili inhibicija funkcije Cbl-b je prelazna. Drugim reþima, funkcija je redukovana samo privremeno kao što je prethodno naznaþeno i naknadno se može oporaviti, na primer, putem konzumiranja ili degradacije inhibitora, npr. Cbl-b siRNK, ili sa neogenezom ili ne-Cbl-b poremeüenim üelijama (in vivo). Prelazna redukcija u Cbl-b u imunskim üelijama takoÿe se može postiüi ponavljanjem, npr. sve dok se ne postigne terapeutski uspeh.

[0015] Poželjno, izraz Cbl-b je redukovan ili inhibiran korišüenjem Cbl-b antisensne RNK ili siRNK. U tu svrhu koriste se kratke DNK i / ili RNK sekvence koje su komplementarne sa jednim od dela ciljane Cbl-bmRNK sekvence, tako da se hibridizuju sa njima i inaktiviraju. Dužina ovih sekvenci je poželjno najmanje 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 ili 200 baza za kompletiranje ciljane sekvence, poželjno do 2502, 2000, 1500, 1000, 500 ili 300 baza. Poželjno se koriste sekvence SEQ ID brojeva 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i/ili 8.

[0016] 2þigledno je da funkcija Cbl-b može biti redukovana ili inhibirana razliþitim drugim poznatim komponentama, kao što su upotreba antagonista Cbl-b, inhibitora, naroþito aptamera ili intramera. Svi antagonisti ili inhibitori koji suzbijaju funkciju Cbl-b mogu se koristiti za poboljšanje imuno reaktivnosti üelija. U još jednom izvoÿenju ovog rešenja, antagonisti ili inhibitori se poželjno koriste za pripremu farmaceutskog agensa in vitro, ex vivo, ili þak in vivo za poboljšanje imuno reaktivnosti üelija imunog sistema. Ovo dozvoljava leþenje bolesti sa potisnutim ili neefikasnim imunološkim sistemom, prvenstveno rakom, kao i poveüanje imunološkog odgovora na (vakcinacija) antigene koji se mogu kontaktirati sa üelijama imunog sistema in vivo ili ex vivo.

[0017] Predmetni pronalazak se takoÿe odnosi na postupak za smanjivanja imunoreaktivnosti üelija imunog sistema koji sadrži redukciju ili inhibiciju c-Cbl funkcije üelija, þime se smanjuje imunoreaktivnost üelija na antigen, poželjno prelaznom redukcijom ili inhibicijom, prvenstveno korišüenjem c-Cbl antisense RNK ili siRNK. Da bi se poveüala imunoreaktivnost, apsolutno nije neophodno oslabiti c-Cbl pridružen zajedno sa Cbl-b. Umesto toga, kao što je prikazano u primerima, slabljenje c-Cbl obnavlja efekte izazvane inhibicijom Cbl-b. Zbog toga Cbl-b i c-Cbl imaju antagonistiþke funkcije. C-Cbl takoÿe ispunjava dosad nepoznatu funkciju u finoj regulaciji reaktivnosti T-üelije, s tim što njegovo slabljenje dovodi do poveüane imunološke tolerancije. Zbog toga je redukcija ili inhibicija funkcije c-Cbl pogodna za imunosupresiju i stoga dozvoljava njegovu primenu npr. kod upala ili alergija. Obzirom da stepen i pravac slabljenja zavise od doze redukcije ili inhibicije Cbl-b i/ili c-Cbl (analogno Cbl-b kao što je ovde opisano), oba faktora mogu biti redukovana u svojoj funkciji u kombinaciji. Da bi se poveüala imunoreaktivnost, redukcija Cbl-b u odnosu na redukciju c-Cbl i obrnuto prevazilazi redukciju. C-Cbl antisense ili siRNK može imati iste linije sekvence kao što je gore opisano za Cbl-b. Poželjno, sekvence SEQ ID Nos: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 i/ili 16 se koriste.

[0018] U konkretnim izvoÿenjima pronalaska, üelije koje su preuzele antigen i poželjno predstavljaju antigenski fragment ili bolje, prepoznaju antigenski fragment u kontekstu HLA i na taj naþin su aktivirane, su naroþito korišüene.

[0019] U poželjnim rešenjima, üelije koje se koriste prema pronalasku su üelije koje predstavljaju antigen, PBMCs (Mononuklearne üelije periferne krvi), T-limfocite, B-limfocite, monocite, makrofage i/ili dendritske üelije, naroþito T-limfocite, CD8+ T-limfocite, CD4+ T- limfocite, naroþito Th1, Th2, Th17, Tregs (regulatori T-üelija) ili CTL (citotoksiþne T-üelije), NK üelije ili NKT üelije. Isto tako, takoÿe je moguüe uopšteno koristiti CD3/CD19 negativne limfocite. NK üelije su posebno poželjna grupa. Poželjno je da antigen preuzme üelije i oni poželjno predstavljaju antigenski fragment. Posebno su poželjni PBMC i T üelije u kombinaciji za leþenje kako bi se proizvela posebno jaka antigen-specifiþna reakcija. U drugim rešenjima, posebno za opšte poboljšanje imunoreaktivnosti (npr., za leþenje imunskog deficita) razliþite T-üelije same su dovoljne da postignu široki efekat. Prema pronalasku poveüana imunoreaktivnost je poželjno posredovana ovim üelijama, posebno CD8 ili CD4 üelijama, kao i NK i/ili NKT üelijama.

[0020] Za transfekciju üelija, posebno T-üelija ili NK üelija, sa Cbl-b inhibitorom, kao što je CblsiRNK ili izduženi Cbl-b konstrukt, poželjno se koristi elektroporacija. Za tu svrhu bilo koji medijum koji dovodi do transfekcije, odn., do inhibicije Cbl-b, može biti pogodan. Takav medijum je na primer Optimem (Gibco, #31985-047).

[0021] Pored toga, üelije takoÿe mogu biti leþene, odn., stimulisane sa imuno stimulirajuüom supstancom, npr. imuno stimulišuüi citokin ili ligand drugih imuno stimulirajuüih receptora (kao što su TLR, toll kao receptori) ili antitela na površinske molekule, poželjno CD3 i/ili CD28, tretiraju se ili stimulišu da promovišu imuni odgovor üelija.

[0022] Isto tako, inhibicija Cbl-b se može koristiti kao deo vakcinacije koja je podržana sa dendritiþkim üelijama, poželjno anti-tumorska vakcinacija.

[0023] Alternativno i/ili dodatno, moguüa je in vitro kultivacija üelija inhibiranih Cbl-b üelija sa dendritiþkim üelijama iz pacijenata, koje su poželjno optereüene tumorskim (üelijskim) antigenom, kao i upotreba ko-kulture u svrhe pronalaska.

[0024] "Vakcinacija", kako se ovde koristi, ne treba shvatiti u apsolutnom smislu - tj., davanje imunogena koji rezultira apsolutnom zaštitom od imunološkog sistema - veü kao imunološka primena radi poboljšanja zaštite od strane imunološkog sistema i/ili da aktivira imuni sistem, posebno njihove üelije protiv antigena vakcine.

[0025] U jednom posebnom aspektu predmetnog pronalaska, kratka DNK i/ili RNK koja se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži sekvencu komplementarnu na deo ciljane-Cbl-b-mRNK sekvence za upotrebu u terapiji sadrži izolaciju üelija imunog sistema pacijenta, üelije antigena predstavljenih üelija, PBMC (mononuklearne üelije periferne krvi), T-limfociti, B-limfociti, monociti, makrofage, NK üelije i/ili NKT üelija; in vitro ili ex vivo poveüanje imunoreaktivnosti üelija korišüenjem kratke DNK i/ili RNK sekvence komplementarne na deo ciljane-Cbl-b-mRNK sekvence, i reimplantaciju üelija u pacijenta, gde kroz prolazne redukcije ili inhibicije Cbl-b funkcije üelija poboljšava imunoreaktivnost. Dalje, pronalazak se odnosi na izolovane üelije imunog sistema pacijenta, transfektovane sa kratkom DNK i/ili RNK sekvencom komplementarno kratkotrajno na deo ciljane-Cbl-b-mRNK sekvence, pri þemu su üelije koje predstavljaju antigen, PBMC (mononuklearne üelije periferne krvi), T-limfociti, B-limfociti, monociti, makrofage, NK üelije i/ili NKT üelije; i gde su üelije kontaktirane sa antigenom pre ili nakon sakupljanja, za primenu

koja sadrži reimplantaciju üelija kod pacijenta, pri þemu je imunoreaktivnost poveüana u terapiji prolazne redukcije ili inhibicije funkcije Cbl-b üelija.

[0026] Realizacija poveüavanja u imunoreaktivnosti, poželjno za ograniþeni vremenski period, istovremeno sa vakcinacijom, davanjem antigena, se može ostvariti redukcijom Cbl-b ekspresije u malom delu cirkulišuüih T-üelija. PBMC (mononuklearne üelije periferne krvi) se mogu dobiti iz cele krvi i/ili krvnih üelija iz koštane srži i iz samog tkiva tumora (TILS) pacijenta, koji je idealno bio imuniziran nekoliko dana ranije, na primer, 5 dana, i tretiran in vitro ili ex vivo sa oslabljenom serijom siRNK specifiþnog Cbl-b. Ovaj postupak je veoma brz. U idealnom sluþaju, ovaj üelijski preparat može ponovo biti primenjen na pacijenta samo nekoliko minuta nakon uklanjanja.

Opciono, üelije mogu biti poveüane ili proširene za odreÿene üelije prikladnim ex vivostimulacionim protokolima pre nego što su üelije reimplantovane. In vitro aktivirane T üelije, koje predstavljaju samo mali procenat pacijenta T-üelijske populacije, susreüu antigenske predstavljene üelije u limfnim þvorovima dok cirkulišu u organizmu primaoca, gde su ove antigenske predstavljene üelije uzele antigene usled imunizacije koja se veü desila i migrirala tamo. Pošto T-üelije tretirane in vivo ne zahtevaju istovremenu stimulaciju signala, one se razmnožavaju odmah nakon prepoznavanja imunizacionog agensa i luþe citokin, koji doprinose sistemski da indukuju imuni odgovor na oba üelijski i humoralni nivo. Ovim pristupom, þak i slabi imunogenski antigeni üe dovesti do uspostavljanja dugotrajne zaštite. Sliþno tome, odbacivanje autolognih tumora može se pokrenuti kod pacijenata sa kancerom na ovaj naþin. Cbl-b antagonist ovde poveüava imunoreaktivnost, gde je ovo korišüeno ili u sluþaju iskljuþive i/ili prateüe hemoterapije/terapije zraþenjem u kombinaciji sa pasivnim imunizacijama, kao što su tumor-antigenska specifiþna antitela.

[0027] Ova metoda je stoga pogodna za leþenje kongenitalnog ili steþenog imunološkog nedostatka, posebno AIDS-a, multiple mieloma, hroniþne limfocitne leukemije, imunosupresije izazvane lekovima ili kancera, opciono sa odabirom antigena specifiþnih za bolesti. Posebno je poželjno leþenje kancera koji obuhvata þvrste tumore.

[0028] Da bi se poveüale šanse za uspeh terapije, leþenje kancera se poželjno odvija u kombinaciji sa drugom antitumorskom terapijom, posebno hemoterapijom, radioterapijom, primenom terapijske biologije ili dendritiþne üelije podržane vakcinacijom (tumor). Inhibicija Cbl-b se može koristiti kao deo dendritiþne üelije podržane vakcinacijom, poželjno anti-tumorskom vakcinacijom. Alternativno i/ili dodatno, moguüa je in vitro kultivacija Cbl-b inhibiranih üelija sa dendritiþkim üelijama dobijene iz pacijenta, koje su poželjno optereüene tumorskim (üelijskim) antigenima, kao i upotreba kokulture za svrhe pronalaska.

[0029] In vitro ili ex vivo poveüanje imunoreaktivnosti može se izvesti u terapeutskom postupku kao što je gore opisano, pri þemu se izloženost üelija antigenu može izvesti pre nego što se üelije uklone ili naknadno.

[0030] Hronološka sekvenca koja prikazuje imunizacione antigene, njegovo uzimanja üelijama koje predstavljaju antigen i dalja migracija ovih üelija u lokalne limfne þvorove, gde su ingestirane supstance predstavljene kako bi aktivirale T-üelije, je takoÿe važno u terapijskoj implementaciji. Prema tome, poželjno je da pacijent bude inokuliran antigenom, poželjno þak i pre izolacije üelija, poželjnije najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 dana i/ili najviše 20, 16, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 nedelja pre izolacije üelija. Takoÿe je moguüe naknadno vakcinisati ili tretirati üelije in vitro ili ex vivo sa antigenom.

[0031] Pored toga, moguüe je koristiti üelije koje predstavljaju antigen, poželjno koji potiþu od samog pacijenta i mogu se kontaktirati sa odgovarajuüim antigenom, a zatim zajedno ili kratko pre ili nakon primene Cbl-b inhibirane imune üelije, poželjno T-üelije, da bi se poveüala specifiþna imunoreaktivnost.

[0032] Poželjno, üelije su specifiþne za odreÿeni antigen, ili su üelije koje sadrže odreÿeni antigen odabrane za specifiþnost ili prisustvo antigena, þime se poveüava imunoreaktivnost izabranih üelija. Izborom odreÿenog antigena i/ili üelija sa specifiþnošüu za poboljšanje imuniteta, za ovu svrhu, može se ciljati imunološki odgovor na odreÿenu metu kod pacijenta. Takva meta bi prvenstveno bila tumor (izborom najmanje jednog ili više tumorskih antigena) ili patogen.

[0033] Moguüe je da, uporedo sa odvajanjem üelija u istoj sterilnoj cevi za jednokratnu upotrebu, odgovarajuüa siRNK je veü uvedena u transfekcionu smešu. Prema tome, u drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na poželjno sterilnu posudu, kao što je cev za jednokratnu upotrebu, koja sadrži inhibitor Cbl-b, posebno za poveüanje imunoreaktivnosti üelija imunog sistema na antigen.

[0034] Takoÿe, predmetni pronalazak predlaže kit koji sadrži posudu, posebno jednokratnu cev za držanje üelija imunog sistema, kao i inhibitora Cbl-b, kao što je siRNK, naroþito za poveüanje imuno reaktivnosti üelija imunog sistema protiv antigena postupkom prema pronalasku.

[0035] Posuda i/ili kit takoÿe mogu dodatno da sadrže imunostimulativnu supstancu, poželjno citokin(e) ili ligande drugih receptora (npr. TLR) ili antitela na površinske molekule, poželjno CD3 i/ili CD28, kako bi dodatno poboljšali stimulaciju. Sliþno tome, kit ili posuda može takoÿe da sadrži stabilizujuüe komponente, medijum ili pufere (za stabilizaciju üelija), rastvore transfekcije ili nukleofekcije, poželjno üelijski medijum kao što su RPMI ili Optimem.

[0036] Predmetni pronalazak je ilustrovan sledeüim slikama i primerima bez ograniþavanja.

[0037] Na slikama:

Fig. 1 prikazuje šematski dijagram aktivacije T-üelija pomoüu istovremene stimulacije (a), ili u sluþaju slabljenja ekspresije Cbl-b, jednom stimulacijom T-üelijskog receptora (c), koji obiþno ne dovodi do aktivacije (b);

Fig. 2 prikazuje Western Blot analizu Cbl-b ekspresije. CD8+ üelije su izolovane iz humane PBMC, transfektirane sa Cbl-b-siRNK, održavane u kulturi i uporeÿene sa kontrolnom grupom bez, stimulacije, posle anti-CD3 ili posle anti-CD3 i anti-CD28 stimulacije. Fin je korišüen kao kontrola optereüenja;

Fig. 3 prikazuje IFN-gama sekreciju humanih CD8+ üelija 2 dana nakon siRNK tretmana.

Koncentracija IFN-gama izmerena je u supernatantima od CD8+ T-üelija bez stimulacije (srednje) (levo) i nakon CD3-specifiþne (srednje) ili posle CD3- i CD28-specifiþne istovremene stimulacije (desno). U svakom sluþaju, 2 dana stara populacija üelija transfektovana pomoüu nespecifiþne siRNK (1. pravougaonik), Cbl-b specifiþne siRNK (2. pravougaonik), c-Cbl-specifiþne siRNK (3. pravougaonik) i Cbl-b-specifiþne i c-Cbl-specifiþne siRNK (4. pravougaonik) je uporeÿena;

Fig. 4 prikazuje IL2 sekreciju humanih CD8+ üelija 20 dana nakon siRNK tretmana. Koncentracija IL2 je izmerena u supernatantima CD8+ T-üelija bez stimulacije (srednje) (levo) i nakon CD3-specifiþne (srednje) ili posle CD3- i CD28-specifiþne istovremene stimulacije (desno). U svakom sluþaju, 2 dana stara populacija üelija transfektovana pomoüu nespecifiþne siRNK (1. pravougaonik), Cbl-b specifiþne siRNK (2. pravougaonik), c-Cbl-specifiþne siRNK (3. pravougaonik) i Cbl-b-specifiþne i c-Cbl-specifiþne siRNK (4. pravougaonik) je uporeÿena; i Fig. 5 prikazuje hronološku sekvencu in vitro Cbl-b oslabljene serije za poveüanje imunoreaktivnosti.

Fig.6 prikazuje siRNK uzimanje sa humanim T üelijama, izolovanih iz PBMCs (A), i siRNK uzimanje sa CD8-üelijama osiromašenih PBMCs (B)

Fig. 7 prikazuje ekspresiju Cbl-b mRNK nakon RNKi (A) i dobijenu koliþinu Cbl-b proteina nakon RNKi u Western Blotu (B)

Fig. 8 prikazuje IFN-gama, TNF-alfa, IL-2 dobijanje nakon Cbl-b inhibicije

Fig. 9 prikazuje IFN-gama dobijanje posle Cbl-b inhibicije kao vremenski profil

Fig. 10 prikazuje poveüanje reaktivnosti T-üelija kao što je mereno pomoüu CD107a CD69 (A), CD107a, CD3, CD40L, ICAM (B) marker ekspresije.

Fig. 11 A: prikazuje rast tumora kod miševa nakon terapije, sa/bez supresije Cbl-b u terapijskim CD8 üelijama; B: smrtnost miševa sa EG7ova tumorima nakon leþenja.

Primeri:

Primer 1: Sekvence

[0038] Sledeüe siRNK sekvence su korišüene za inhibiranje Cbl-b, samostalno ili u kombinaciji:

1. Sense Sekuenca:

G.A.A.C.A.U.C.A.C.A.G.G.A.C.U.A.U.G.A.U.U (SEQ ID Nr.1) Antisense Sekvenca:

5’-P.U.C.A.U.A.G.U.C.C.U.G.U.G.A.U.G.U.U.C.U.U (SEQ ID Nr.2)

2. Sense Sekvenca:

G.U.A.C.U.G.G.U.C.C.G.U.U.A.G.C.A.A.A.U.U (SEQ ID Nr.3) Antisense Sekvenca:

5’-P.U.U.U.G.C.U.A.A.C.G.G.A.C.C.A.G.U.A.C.U.U (SEQ ID Nr.4)

3. Sense Sekvenca:

G.G.U.C.G.A.A.U.U.U.U.G.G.G.U.A.U.U.A.U.U (SEQ ID Nr.5) Antisense Sekvenca:

5’-P.U.A.A.U.A.C.C.C.A.A.A.A.U.U.C.G.A.C.C.U.U (SEQ ID Nr.6)

4. Sense Sekvenca

U.A.U.C.A.G.C.A.U.U.U.A.C.G.A.C.U.U.A.U.U (SEQ ID Nr.7) Antisense Sekvenca

5’-P.U.A.A.G.U.C.G.U.A.A.A.U.G.C.U.G.A.U.A.U.U (SEQ ID Nr.8)

[0039] Sledeüe siRNK sekvence su korišüene za inhibiranje Cbl-b, samostalno ili u kombinaciji:

1. Sense Sekvenca

A.A.U.C.A.A.C.U.C.U.G.A.A.C.G.G.A.A.A.U.U (SEQ ID Nr.9) Antisense Sekvenca

5’-P.U.U.U.C.C.G.U.U.C.A.G.A.G.U.U.G.A.U.U.U.U (SEQ ID Nr.10)

2. Sense Sekvenca

G.A.C.A.A.U.C.C.C.U.C.A.C.A.A.U.A.A.A.U.U (SEQ ID Nr.11) Antisense Sekvenca

5’-P.U.U.U.A.U.U.G.U.G.A.G.G.G.A.U.U.G.U.C.U.U (SEQ ID Nr.12)

3. Sense Sekvenca

U.A.G.C.C.C.A.C.C.U.U.A.U.A.U.C.U.U.A.U.U (SEQ ID Nr.13) Antisense Sekvenca

5’-P.U.A.A.G.A.U.A.U.A.A.G.G.U.G.G.G.C.U.A.U.U (SEQ ID Nr.14)

4. Sense Sekvenca

G.G.A.G.A.C.A.C.A.U.U.U.C.G.G.A.U.U.A.U.U (SEQ ID Nr.15) Antisense Sekvenca

5’-P.U.A.A.U.C.C.G.A.A.A.U.G.U.G.U.C.U.C.C.U.U (SEQ ID Nr.16)

Primer 2: Prelazno smanjenje ekspresije Cbl-b

[0040] U ovom primeru üe biti pokazano da se na imunoreaktivnost T-üelija može uticati ex vivo.

[0041] Pomoüu CPT epruveta (Vacutainer), celokupna krv je uzeta od donora i PBMC-a su odvojeni centrifugiranjem. U drugom koraku, iz ovog preparata, CD8+ üelije su koncentrovane. One su transfektovane pomoüu Cbl-b specifiþne siRNK korišüenjem aparata za transfekciju Amaxa (detaljni protokol u primeru 3) i dalje kultivisane. Kao kontrola, identiþna serija sa nespecifiþnom siRNK je transfektovana koristeüi identiþni protokol. Posle sumnje na potencijalno preklapanje funkcije Cbl-b i c-Cbl, dve dodatne serije su tretirane korišüenjem c-Cbl specifiþne siRNK i kombinacijom siRNK specifiþne c-Cbl i Cbl-b. Sve serije su kultivisane 2 dana. Ta þinjenica da transfekcija vodi do željenog slabljenja Cbl-b ekspresija je pokazana naknadnom Western Blot analizom. Kako bi se indukovala Cbl-b ekspresija, kultura je stimulisana sa CD3 a druga serija sa CD3 i CD28 specifiþnim antitelima. U svim eksperimentima, Cbl-b ekspresija u transfektovanom preparatu je prisiljena na ispod 5% intenziteta kontrolne transfekcije, što se vidi na FIG.2. Pošto je stabilnost siRNK i poslediþna efikasnost suzbijanja ekspresije ograniþenog trajanja i ne prenosi se na druge üelije, odabrana serija je prolaznog slabljenja Cbl-b ekspresije, koja je strogo povezana za prisutni CBL-b siRNK.

Primer 3: Protokol transfekcije

Nukleofekcija sa siRNKs u humanim T-üelijama

[0042] Nukleofekcija se izvodi zajedno sa drugim zaposlenim u laboratoriji. Jedna osoba izvodi pipetiranje siRNK oligosa, a drugi zaposleni prenosi uzorke u hranljivi medijum. Ovo znaþajno ubrzava proceduru.

1. Napraviti medijum za üeliju RPMI (+pen/strep., L-glut, 10% FCS).

2. Pipetitirati hranljivi medijum u najmanje dve 50 ml Falcon cevi/konstruktore (jedan za sakupljanje nukleofektnih üelija, a jedan za medijum za pranje üelije), uzorak od 1 ml/l nukleofekcije u svakoj cevi. Staviti cevi na 37°C.

3. Oznaþiti Eppendorf cevi za svaki uzorak nukleofekcije.

4. Centrifugirati nukleofektne üelije (410 g) tokom 7 min i ukloniti supernatant. Dodati Optimem (Gibco, #31985-047),

5. tako da gustina üelije bude 40 x 10<6>/ml. Pipetirati 100 ml (= 4 x 10<6>üelije) u svaku Eppendor cev.

6. Dodati 1,5 - 2,5 µM siRNK-oligo u Eppendorfnu cev koja sadrži üelije neposredno pre nukleofekcije. Izmešati pipetiranjem i prebaciti rastvor u üeliju (spreþiti stvaranje mehuriüa vazduha). Tapnuti kivetu o stol kako bi se uklonili mehuriüi.

7. Zatvorititi poklopac i postavititi kivetu u aparat za transfekciju Amaxa (elektroporator). (Program U-14, a ne V-24 kao najbolja opcija koristeüi nukleofektorski rastvor Optimem). Pritisnuti dugme x i ukloniti kivetu nakon signala OK. (Pritisnuti taster x ponovo pre sledeüe elektroporacije).

8. Odmah dodati 500 µl RPMI (37 °C) u kivetu nukleofekcije i pažljivo pomešati pipetiranjem pipetom Pasteuer. Prebaciti üelije u sakupljajuüu Falcon cev. Kivetu jednom oprati sa 500 µl zagrejanog RPMI i prebaciti ostatak üelija u sakupljajuüu Faþcon cev.

9. Ponoviti korake 5-7 sa svakim uzorkom.

10. Postaviti Falcon cevi u inkubator sve dok svi uzorci nisu nukleofektovani.

11. Pipetirati 4 ml suspenzije üelije u ploþu sa 6 bunarþLüa (= 2 uzorka) i postaviti ploþe u inkubator.

12. Sakupiti üelije sledeüeg dana, brojati ih i zapoþeti kultivaciju 24 sata nakon nukleofekcije koja je izvedena kao što je gore opisano. Uzeti alikvot üelija za izolaciju RNK da bi se proverilo da li je ciljani gen regulisan u trenutku aktivacije. Uzorci proteina uzimaju se na osnovu kinetike ekspresije proteina.

Primer 4: Efikasnost nukleofekcije

[0043] CD8+ je izolovan iz ljudske periferne krvi kao što je prethodno opisano. Negativno selektovanje je izvedeno korišüenjem kuglica.

Rezultat (Amaxa poreÿenje):

[0044]

ýistoüa populacije: 97% CD8 (FACS)

Eksperiment sa Optimem-om

[0045] Na taj naþin je znaþajno smanjena ekspresija Cbl-b koja je otkrivena u proteinskoj hemiji.

Primer 5: Prelazno poveüanje reaktivnosti T-üelija - merenje IFN-gama

[0046] Tako je pokazano da se Cbl-b ekspresija u humanim CD8 üelijama može suprimisati sa najmanje 95% efikasnosti. Kao dodatna posledica, sada se pokazuje da se reaktivnost populacije T-üelija može takoÿe poveüati. Kako bi se osiguralo da je željeni efekat iskljuþivo Cbl-b specifiþan i i ne mogu se izbeüi u sluþaju slabljenja Cbl-b ekspresije sa c-Cbl, u drugom aspektu, c-Cbl je takoÿe oslabljen, a u treüoj seriji c-Cbl i Cbl-b su oslabljeni. Sve ove CD8+ üelijske kulture su kultivisane na dva dana i stimulisane sa CD3 i takoÿe sa CD3 i CD28 i uporeÿeni sa nestimulisanom grupom. Obiþno, T-üelije zahtevaju ovu istovremenu stimulaciju CD3 i CD28 kako bi se umnožile, što se može lako detektovati pomoüu distribucije inflamatornih citokina u supernatantima kultura. Da bi se otkrila ova aktivacija T-üelija, titri IFN-gama su mereni u supernatantima. Grafiþko predstavljanje uticaja slabljenja na ekspresiju sa siRNK tretmanom na reaktivnost T-üelije je prikazano na Fig.3. Dva dana posle transfekcije, sve CD8+ üelijske kulture su transfektovane sa Cbl-b i/ili c-Cbl specifiþnom siRNK, stimulisane kao što je opisano, i uporeÿene sa kontrolnom grupom koja je transficirana sa nespecifiþnom siRNK. Nestimulisane üelije nisu pokazale IFN-gama ekspresiju. Nakon ekskluzivne CD3 stimulacije, sve kulture pokazuju poveüanu reaktivnost, tako da najmanje 500 pg/ml IFN-gama se može detektovati u supernatantima. Signali za c-Cbl specifiþnu siRNK i ne-specifiþno transfektirane üelije su veoma sliþni (niski). Samo üelije transfektovane sa Cbl-b-specifiþnom siRNK pokazuju znaþajno veüu reaktivnost, koja je povezana sa IFN-gama titrom od oko 3 ng/ml. Meÿutim, reaktivnost üelijskog preparata istovremeno transfektovan sa c-Cbl i Cbl-b-specifiþnom siRNK je bila manja nego posle tretmana sa Cbl-b-specifiþnom siRNK, dostižuüi samo 1.2 ng/ml. Kao što se i oþekivalo, u svim sluþajevima, istovremena stimulacija, specifiþna za CD3 i CD28, dala je znaþajno veüe signale od stimulacije samo specifiþne CD3. Kontrolni preparat koji je tretirana sa nespecifiþnom siRNK daje IFN-gama titar u koliþini od 1.2 ng/ml, dok kultura tretirana sa Cbl-b specifiþnom siRNK imao IFN-gama koncentraciju od 3.8 ng/ml. Bilo je važno da Cbl-b i c-Cbl specifiþna istovremeno oslabljena kultura ima titar u iznosu od 1.7 ng/ml, koji je znatno niži nego onaj u Cbl-b oslabljenoj grupi.

Takoÿe je neoþekivano da üelijska populacija, koja je tretirana sa c-Cbl-specifiþnom siRNK ima znatno manju reaktivnost i samo 500 pg/ml IFN-gama je izmereno u supernatantu. Ova koncentracija je znatno niža nego kod nespecifiþno tretirane istovremeno stimulisane kontrolne grupe i uporediva je sa vrednostima kontrolne grupe stimulisane samo sa anti-CD3. Stoga, suvišnost Cbl-b i c-Cbl u humanim CD8 T-üelijama je iskljuþena eksperimentalno nasuprot mišjem sistemu i terapijski pristup preko Cbl-b (i njegovi gornji regulatori), ali ne i preko Cbl-b/c-Cbl kombinacija, je koristan za poveüanje imunoreaktivnosti. Inhibicija c-Cbl, meÿutim, omoguüava imunosupresiju za druge aplikacije, kao što je leþenje zapaljenja ili alergija.

[0047] Ovaj istovetni terapeutski pristup, koji je osmišljen ili kao monoterapija ili kombinovana sa vakcinacijom, takoÿe može prepoznati diseminirane tumorske üelije na periferiji i da se na njih održava izgradnjom imunološkog odgovora. Kada se koristi odmah nakon što je dijagnostikovan rak, diseminacija primarnog tumora je takoÿe ovim spreþena.

Primer 6: Prelazni porast T üelijske reaktivnosti - merenje IL2

[0048] Veoma sliþan rezultat je dobijen merenjem IL-2 koncentracija u istim supernatantima, što se može videti sa Fig.4. Bez stimulisanja nije bilo merljivog odgovora, dok je anti-CD3 specifiþan tretman doveo do definitno merljivog signala u svim grupama. Tako je > 200 pg/ml izmereno u Cblb oslabljenoj grupi. Koncentracija IL2 u Cbl-b i c-Cbl oslabljenoj populaciji ponovo je znatno niža i iznosila je <100 pg/ml. Anti-CD3 i anti-CD28 specifiþne istovremene stimulacije zauzvrat su dale veüe signale. IL2 koncentracija od > 800 pg/ml je izmerena u svim grupama, bez obzira na siRNK tretman. Kontrolna grupa je dala vrlo sliþne titre za Cbl-b oslabljene titre od 1.3 i 1.4 ng/ml, respektivno. Zanimljivo, koncentracije IL-2 su znaþajno niže posle c-Cbl specifiþnog slabljenja i iznosile su samo 800 pg/ml, bez obzira da li je samo c-Cbl korišüen ili c-Cbl je korišüen zajedno sa Cbl-b u ovom pristupu.

Primer 7: Prelazni porast imunoreaktivnosti

[0049] Usled in vitro ili ex vivo leþenja, reaktivnost T-üelije se efikasno poveüava, tako da je moguüe pokrenuti proliferaciju T-üelija stimulisanjem samo T-üelijskog receptora. Ovo je suštinski preduslov za opisani terapeutski pristup. Zbog upotrebe RNKi tehnologije, ovo slabljenje je prolazno.

[0050] Ova primenljivost ovih modifikovanih üelija služi za poveüanje imunogenosti vakcina i generalno poveüanje reaktivnosti imunog sistema. Pet dana posle osnovne imunizacije, kompletna krv üe biti uzeta od pacijenta u CPT epruvete. Posle približno oko 20 minuta, PBMC su izolovane centrifugiranjem. Preparati üelija su transfektovani sa Cbl-b specifiþnom siRNK i odmah se vraüaju pacijentu. Na dan 10, celokupna krv je ponovo uzeta i od nje ekstrakovan serum. Titri proinflamatornih citokina su izmereni u ovom serumu i poreÿeni sa kontrolnom grupom. Priroda indukovanog imuno odgovora je takoÿe analizirana u pogledu üelijske orjentacije Th1-kontrolnog imuno odgovora (poveüani IFN-gama, IL-2 i IL-12 titar) ili humoralne tendencije u Th2-usmerenom imuno odgovoru (poveüani IL4, IL5 i IL10 titar). Ukoliko je potrebno, dodatne imunizacije sa ili bez PBMC tretmana, su izvedene u intervalu od 14 dana (Fig.5).

Primer 8: Nukleofekcija CD4 T-üelija i CD19 B-üelija

[0051] PBMCs su izolovani kao što je gore opisano i transfektovane pod istim uslovima kao u Primeru 3 (U14). Oligo (siGLO Red) koji se koristi za transfekciju je korišüen u koncentraciji od 2 µM i specifiþno uzimanje je detektovano pomoüu FACS-a, diferencijacija CD4 i CD8 üelija je izvršena istovremenim dvostrukim bojenjem sa CD8-FITC i CD3-APC (Fig.6A).

[0052] PBMCs su pripremljeni kako je gore opisano i njihove CD8 üelije su izolovane. Preostale CD8-negativne üelije su potom transfektovane kako je gore navedeno sa siGLO Red (iako sa oligo koncentracijom od 3.3 µM). Specifiþno uzimanje je detektovano pomoüu FACS istovremenim dvostrukim bojenjem sa CD3-FITC i CD19-APC (Fig.6B). Interesantno je da se u ovom eksperimentu takoÿe primeüuje da se efikasno uzimanje upotrebljenih oligosa takoÿe desilo u delu CD3/CD19-negativni limfociti, koji se sastoje uglavnom od NK üelija.

[0053] Ovaj primer pokazuje da druge imuno üelije mogu biti efikasno transfektovane pod istim uslovima transfekcije kao i CD8 üelije.

Primer 9: Prelazna redukcija Cbl-b ekspresije u humanim CD4 üelijama na mRNK i nivou proteina

[0054] CD4 üelije su izolovane iz PBMC-a smanjenjem CD8 üelija i kultivisane pomoüu PHA / anti-CD3 / 28 stimulacije. Posle 2 nedelje, ove CD4 üelije su transfektovane pomoüu Cbl-b specifiþne siRNK koristeüi protokol transfekcije Amaxa (videti primere 3 i 8). Kao kontrola, identiþni pristup je transfektovan sa nespecifiþnom siRNK koristeüi identiþni protokol. Nakon transfekcije, üelije su bile kultivisane sa IL-2 (5ng / ml) još jedan dan i stimulisane sa anti-CD3/28 antitelom sledeüi dan.

[0055] Cbl-b mRNK ekspresija u transfektovanom preparatu je smanjena za oko 85% u stimulisanoj 24 h CD4 üeliji u poreÿenju sa kontrolnom transfekcijom (Fig.7A). Jako smanjenje Cbl-b mRNK korelirano je sa relativno velikim smanjenjem koliþine Cbl-b proteina, kao što je prikazano u Western Blot (Fig.7 B).

Primer 10: Poveüanje reaktivnosti CD4 T üelija - Merenje citokina sa antitumorskom aktivnošüu

[0056] Jedan od glavnih zadataka CD4 üelija u imuno odgovorima posredovanim T-üelijama je proizvodnja inflamatornih citokina. Citokini IL-2, IFN-Ȗ i TNF-Į su posebno važni u literaturi za antitumorsku aktivnost.

[0057] Izraz ova tri citokina je stoga odreÿen pomoüu ELISA. U toku 24 h nakon anti-CD3/28 stimulacije, ova tri citokina su znaþajno povišena u humanim Cbl-b zaustaljenim CD4 T-üelijama (Fig.8).

Primer 11: Prelazni kurs poveüanja reaktivnosti CD4 T-üelije poveüanjem proizvodnje citokina koji imaju antitumorsku aktivnost

[0058] Da bi se postigla efikasna anti-tumorska aktivnost Cbl-b zaustavljenih T-üelija, važno je da se produži poveüana proizvodnja citokina u vremenskom periodu nakon stimulacije T-üelija.

Meÿutim, ovaj period vremena takoÿe treba ograniþiti u cilju da se minimizira rizik trajnog uspostavljanja neželjene autoimunosti za nemaligna tkiva pacijenta.

[0059] Stoga je proizvodnja IFN-Ȗ takoÿe analizirana u razliþitim vremenskim taþkama pomoüu intracelularnog bojenja u FACS-u. Dijagram na Fig.9 jasno pokazuje da je oznaþeno poveüanje u IFN-Ȗ održavano najmanje 48 sati, ali 6 dana posle stimulacije vraüa se na nivo koji je uporediv sa onim u kontrolnom.

Primer 12: Poveüanje u reaktivnosti T-üelije - Poveüana ekspresija površinskih molekula sa funkcionalnim svojstvima i/ili funkcijom markera stimulacije.

[0060] Odgovarajuüe odreÿivanje proizvodnje citokina kao markera za funkcionalno uspešno zaustavljanje Cbl-b u humanim T-üelijama je tehniþki složenije i stoga se ne može izvesti tako brzo. Zbog toga je izraz FACS odreÿen funkcionalno važnim površinskim markerima.

[0061] CD107a je definisan u literaturi kao površinski marker sekretorne aktivnosti citotoksiþnih T-üelija, i stoga je odreÿen na Cbl-b supresovanim CD8 T-üelijama nakon 24 h anti-CD3/28 stimulacije. T-üelije transfektovane sa Cbl-b siRNK stoga pokazuju znaþajno poveüanu sekretornu aktivnost (Fig.10A).

[0062] S obzirom da molekul CD107a uþestvuje u veskularnom transportu u T-üelijama, on se takoÿe može koristiti kao glavni marker za sekretornu aktivnost CD4 T-üelija. Fig.10B pokazuje da je ekspresija CD107a u Cbl-b siRNK transfektovanim üelijama takoÿe znaþajna u odnosu na inaþe identiþno tretirane kontrolne üelije.

[0063] Dva druga molekula površinske indukovane T-üelije su CD40L i ICAM. Oba molekula su od funkcionalnog znaþaja, CD40L uglavnom za interakciju sa antigen-predstavljavajuüim üelijama i za stimulaciju / proliferaciju B-üelija, ICAM za interakciju sa antigen-predstavljavajuüim üelijama i migracijom iz vaskularnog sistema u (maligno) tkivo. Fig.10B pokazuje da je u Cbl-b siRNK-transficiranim humanim CD4 T üelijama, ekspresija ova dva površinska molekula znaþajno poveüana.

[0064] Jedan od opisanih mehanizama odgovornih za poveüanje reaktivnosti T-üelija je manje izrazito slabljenje CD3 receptora üelijske površine. Fig.10B pokazuje da þak i u Cbl-b siRNK-transficiranim humanim CD4 T üelijama, koliþina CD3 receptora, koja je još uvek na površini üelija, je oþigledno poveüana.

[0065] Zanimljivo je da je poveüana površina ekspresije klasiþnog markera za aktivaciju T-üelija CD69, dok je izraz CD25 ostao nepromenjen. Ovo može biti od posebnog funkcionalnog znaþaja jer iako je CD25 takoÿe definisan kao marker stimulacije, njegova funkcija je naroþito povezana sa prisustvom i opstankom takozvanih T-regulatornih üelija.

[0066] Sve u svemu, Fig.10 stoga pokazuje da su dodatne funkcionalnosti važnih molekula ili molekula koji su korisni kao površinski markeri mogli biti detektovani transfekcijom Cbl-b siRNK u Rþigledno višim koliþinama na površini üelije.

Primer 13: Udruženi prenos Cbl-b deficientnih T-üelija i dendritiþnih üelija je efikasna terapeutska procedura u in vivo tumorskom modelu.

[0067] Kod miševa divljeg tipa, tumor je indukovan subkutanim ubrizgavanjem 0.1 miliona EG7ova üelija. Na dan 5. i 6., CD8 T-üelije i dendritiþne üelije su injektirane i efekat ove usvojene üelijske terapije se prati merenjem rasta tumora. Fig.11A pokazuje da bi rast tumora mogao biti potisnut mnogo više snažnije i za duži vremenski period prenosom Cbl-b deficijentnih T-üelija nego sa T-üelijama divljih vrsta.

[0068] Fig.11B pokazuje da leþenje sa Cbl-b deficijentnim T-üelijama može osigurati dugoroþno preživljavanje znaþajnog dela leþenih miševa do kraja 80-dnevnog posmatranja. Nasuprot tome, leþenje sa T-üelijama divljih vrsta rezultirao je samo marginalnim produženjem života u poreÿenju sa kontrolnim grupama. Prema tome, Fig.11B pokazuje da terapija sa Cbl-b deficijentnim ili inhibiranim T-üelijama ima znaþajnu prednost nad normalnom T-üelijskom terapijom.

LISTA SEKVENCI

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. In vitro ili ex vivo postupak poveüanja imunoreaktivnosti üelija imunog sistema obuhvata prelaznu redukciju ili inhibiciju ekspresije Cbl-b korišüenjem kratke DNK i/ili RNK sekvence komplementarno na deo ciljane Cbl-b-mRNK sekvence, gde su üelije kontaktirane pre ili posle uklanjanja sa antigenom i gde je imunoreaktivnost üelija na antigenu poveüana i gde üelije obuhvataju antigenske predstavljajuüe üelije, PBMCs (Mononuklearne üelije periferne krvi), T limfocite, B limfocite, monocite, makrografe, NK üelije i/ili NKT üelije.

2. Postupak prema zahtevu 1, gde T limfociti obuhvataju CD8+ T limfocite i/ili CD4+ T limfocite.

3. Postupak prema zahtevu 2, gde CD8+ T limfociti obuhvataju regulatorne T üelije (Tregs) i/ili citotksiþne T üelije (CTLs).

4. Postupak prema zahtevu 2 ili 3, gde CD4+ T limfociti obuhvataju Th1, Th2 i/ili TH17.

5. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 4, naznaþen time, što su üelije absorbovale antigen i poželjno predstavljaju fragment antigena.

6. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 5, naznaþen time, što su üelije tretirane sa imunostimulacionom supstancom, poželjno citokinom.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži kratku DNK i/ili RNK sekvencu komplementarno na deo ciljane Cbl-b-mRNK sekvence za primenu u leþenju koja obuhvata izolovanje üelija imunog sistema pacijenta, pri þemu üelije obuhvataju antigenske prezentujuüe üelije, PBMCs (Mononuklearne üelije periferne krvi), T limfocite, B limfocite, monocite, makrofage, NK üelije i/ili NKT üelije; in vitro ili ex vivo poveüanje imunoreaktivnosti üelija korišüenjem kratke DNK i/ili RNK sekvence komplementarno na deo ciljane Cbl-b-mRNK sekvence, poželjno kao što je definisano u jednom od zahteva 1 do 6, i reimplantacija üelija u pacijenta, pri þemu je imunoreaktivnost poveüana prelaznom redukcijom ili inhibicijom Cbl-b funkcije üelija.

8. Izolovane üelije imunog sistema pacijenata, koje su prelazno transfektovane sa kratkom DNK i/ili RNK sekvencom komplementaro na deo ciljane Cbl-b-mRNA sekvence, gde üelije obuhvataju antigenske prezentujuüe üelije, PBMCs (Mononuklearne üelije periferne krvi), T limfocite, B limfocite, monocite, makrofage, NK üelije i/ili NKT üelije; i gde su üelije kontaktirane pre ili posle uklanjanja sa antigenom, za primenu u leþenju ukljuþujuüi reimplantaciju üelija u pacijenta, gde kao rezultat prelazne redukcije ili inhibicije Cbl-b funkcije üelija imunoreaktivnosti je poveüana, poželjno kao što je definisano u jednom od zahteva 1 do 6.

9. Farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 7 ili izolovane üelije za primenu prema zahtevu 8 za leþenje uroÿene ili steþene imunodeficijencije, naroþito AIDS, višestrukog mijeloma, hroniþne limfne leukemije, medicinski izazvane imunosupresije ili kancerogene bolesti, naroþito kancerogenih bolesti koje obrazuju þvrste tumore, naroþito za leþenje kancerogenih bolesti u kombinaciji sa drugom anti-tumornom terapijom, naroþito hemoterapijom, radioterapijom, primenom biološkog preparata ili vakcinacijom zasnovane na dendritiþkim üelijama, naroþito tumourna vakcinacija.

10. Farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema jednom od zahteva 7 do 9, gde T limfociti obuhvataju CD8+ T limfocite i/ili CD4+ T limfocite.

11. Farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema zahtevu 10, gde CD8+ T limfociti obuhvataju regulatorne T üelije (Tregs) i/ili citotoksiþne T üelije (CTLs).

12. Farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema zahtevu 10 ili 11, gde CD4+ T limfociti obuhvataju Th1, Th2 i/ili TH17.

13. Farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema jednom od zahteva 7 do 12, naznaþeno time, što su üelije tretirane sa imunostimulativnom supstancom, naroþito citokinom.

14. Farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema jednom od zahteva 7 do 13, naznaþeno time, što je pacijent inokulisan sa antigenom, poželjno pre izolacija üelija, naroþito poželjno pre najmanje 2 dana i/ili najviše 8 nedelja pre izolacije üelija.

15. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema jednom od zahteva 7 do 14, naznaþen time, što su üelije kontaktirane in vitro ili ex vivo sa antigenom.

16. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 6 i 15 ili farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema jednom od zahteva 7 do 15, naznaþen time, što üelije specifiþne za izvestan antigen ili üelije koje sadrže odreÿen antigen su odabrane u odnosu na specifiþnost ili prisustvo antigena i imunoreaktivnost odabranih üelija je poveüana, pri þemu antigen je poželjno antigen tumora.

17. Postupak prema jednom od zahteva 1 do 6 i 15 ili 16 ili farmaceutska kompozicija ili izolovane üelije za primenu prema jednom od zahteva 7 do 16, naznaþen time, što su üelije proširen pre reimplantacije.