ES2665928T3 - Procedimiento para aumentar la inmunorreactividad - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro o ex vivo para el aumento de la inmunoreactividad de las células del sistema inmune, que comprende la reducción o inhibición transiente de la expresión de Cbl-b mediante empleo de una secuencia corta de DNA y/o RNA complementaria a una parte de la secuencia de mRNA de Cbl-b objetivo, poniéndose en contacto las células con un antígeno antes o después de la extracción, y aumentándose la inmunoreactividad de las células frente al antígeno, y comprendiendo las células células que presentan antígeno, PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, células NK y/o células NKT.

Description

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3. Secuencia sentido:

G.G.U.C.G.A.A.U.U.U.U.G.G.G.U.A.U.U.A.U.U (SEQ ID No. 5)

Secuencia antisentido: 5’-P.U.A.A.U.A.C.C.C.A.A.A.A.U.U.C.G.A.C.C.U.U. (SEQ ID No. 6)

4. Secuencia sentido:

U.A.U.C.A.G.C.A.U.U.U.A.C.G.A.C.U.U.A.U.U (SEQ ID No. 7) Secuencia antisentido:

5’-P.U.A.A.G.U.C.G.U.A.A.A.U.G.C.U.G.A.U.A.U.U (SEQ ID No. 8) Las siguientes secuencias de siRNA se utilizaron para la inhibición de Cbl-b, por separado o en combinación:

1. Secuencia sentido:

A.A.U.C.A.A.C.U.C.U.G.A.A.C.G.G.A.A.A.U.U (SEQ ID No. 9)

Secuencia antisentido: 5’-P.U.U.U.C.C.G.U.U.C.A.G.A.G.U.U.G.A.U.U.U.U (SEQ ID No. 10)

2. Secuencia sentido:

G.A.C.A.A.U.C.C.C.U.C.A.C.A.A.U.A.A.A.U.U (SEQ ID No. 11)

Secuencia antisentido: 5’-P.U.U.U.A.U.U.G.U.G.A.G.G.G.A.U.U.G.U.C.U.U (SEQ ID No. 12)

3. Secuencia sentido:

U.A.G.C.C.C.A.C.C.U.U.A.U.A.U.C.U.U.A.U.U (SEQ ID No. 13)

Secuencia antisentido: 5’-P.U.A.A.G.A.U.A.U.A.A.G.G.U.G.G.G.C.U.A.U.U (SEQ ID No. 14)

4. Secuencia sentido:

G.G.A.G.A.C.A.C.A.U.U.U.C.G.G.A.U.U.A.U.U (SEQ ID No. 15)

Secuencia antisentido:

5’-P.U.A.A.U.C.C.G.A.A.A.U.G.U.G.U.C.U.C.C.U.U (SEQ ID No. 16)

Ejemplo 2: Reducción transiente en la expresión de Cbl-b

En este ejemplo se muestra que la inmunorreactividad de las células T pudo ser influenciada ex vivo.

Se extrajo sangre completa de un donante por medio de tubos CPT (Vacutainer), y se separaron las PBMCs de ésta por centrifugación. En otra etapa se concentraron células CD8+ a partir de esta preparación. Éstas se transfectaron por medio de un siRNA específico de Cbl-b utilizando un aparato de transfección Amaxa (protocolo detallado en el Ejemplo 3) y se cultivaron adicionalmente. Como control se transfectó la carga idéntica con un siRNA inespecífico utilizando el protocolo idéntico. Puesto que se supone una superposición potencial de Cbl-b y c-Cb1, dos de otros lotes se trataron mediante siRNA específico de c-Cb1 y una combinación de siRNA específico de c-Cb1 y específico de Cbl-b. Todas las cargas se cultivaron durante dos días. El hecho de que la transfección condujera a 35 la atenuación deseada de la expresión de Cbl-b se demostró mediante el análisis Western Blot subsecuente. Para inducir la expresión de Cbl-b, los cultivos se estimularon con CD3 y en otra carga con anticuerpos específicos de CD3 y específicos de CD28. En todos los experimentos, la expresión de Cbl-b en la preparación transfectada se redujo a menos de 5% de la intensidad de una transfección de control, como se muestra en la Fig. 2. Puesto que la estabilidad del siRNA, y consecuentemente una supresión eficiente de la expresión es de una duración limitada y no

40 es transmitida a otras células, la carga seleccionada es una atenuación transiente de la expresión Cbl-b, que se relaciona estrictamente con la presencia del siRNA de Cbl-b.

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Experimento con Optimem:

Nucleofección en

Programa Células después en Viabilidad después de 3,5h negativo a azul de tripano (%) Viabilidad después de 24h negativo a azul de tripano (%) Eficiencia siGlOpos en FACS (%)

Disolución nucleofectora

V-24 hTC 99 92 96

Optimem

V-24 RMPI 92 67 96

Optimem

U-14 RMPI 95 92 96

Así se detectó una expresión de Cbl-b claramente reducida en la química de proteína.

Ejemplo 5: Incremento transiente en la reactividad de célula T-medición de IFN-gamma

Así se demostró que la expresión de Cbl-b en células CD8+ humanas se puede suprimir con al menos 95% de eficiencia. Como consecuencia ulterior, ahora será demostrado que la reactividad de la población de células T también se puede incrementar. Para asegurar que el efecto deseado sea exclusivamente específico de Cbl-b y no se pueda evitar en el caso de la atenuación de la expresión de Cbl-b mediante c-Cb1, en otra carga se atenuó igualmente c-Cb1, y en una tercera carga también se atenuaron c-Cb1 y Cbl-b. Todos estos cultivos de células CD8+ se cultivaron durante dos días y se estimularon por una parte mediante CD3, y también mediante CD3 y CD28, y se compararon con un grupo no estimulado. Normalmente, las células T requieren esta coestimulación de CD3 y CD28 para proliferar, lo que se puede detectar fácilmente a través de la secreción de citoquinas inflamatorias en los sobrenadantes de los cultivos. Para detectar esta activación de la célula T se midieron títulos de IFN-gamma en los sobrenadantes. Una representación gráfica de la influencia de la atenuación de la expresión mediante el tratamiento siRNA sobre la reactividad de célula T se muestra en la Fig. 3. Dos días después de la transfección, todos los cultivo de célula CD8+, que se transfectaron con siRNA específico de Cbl-b y/o c-Cb1, se estimularon como es descrito y se compararon con un grupo de control que se transfectó con un siRNA no específico. Las células no estimuladas no mostraron una expresión de IFN-gamma en principio. Después de la estimulación de CD3 exclusiva, todos los cultivos mostraban una reactividad elevada, de modo que se pudieron identificar al menos 500 pg/mL de IFN-gamma en los sobrenadantes. En este caso, las señales para siRNA específico de c-Cb1 y células transfectadas inespecíficamente eran muy similares (bajas). Solamente las células transfectadas con siRNA específico de Cbl-b mostraban una reactividad mucho más alta, que iba acompañada de un título de IFN-gamma de aproximadamente 3 ng/mL. La reactividad de la preparación celular cotransfectada mediante siRNA específico de c-Cb1 y Cbl-b, sin embargo, fue menor que después del tratamiento de siRNA específico de Cb-b, alcanzando solamente 1,2 ng/mL. En todos los casos, la coestimulación específica de CD3 y CD28 produjo, como es esperado, señales claramente más altas que la estimulación únicamente específica de CD3. La preparación de control, que se trató con siRNA inespecífico, produjo un título de IFN-gamma en una cantidad de 1,2 ng/mL, mientras que el cultivo tratado con siRNA específico de Cbl-b presentaba una concentración de IFN-gamma de 3,8 ng/mL. Fue notable que el cultivo coatenuado especifico de Cbl-b y c-Cb1 mostraba títulos de 1,7 ng/mL, que fueron así claramente menores que el grupo atenuado en el Cbl-b. También fue inesperado que la población celular, que se trató con siRNA específico de c-Cb1, presentaba una reactividad significativamente menor y solamente se midieron 500 pg/mL de IFN-gamma en el sobrenadante. Esta concentración es significativamente menor que la del grupo de control coestimulado tratado inespecíficamente, y es comparable a los valores del grupo de control estimulado solamente con anti-CD3. Así, en contraste con el sistema murino, una redundancia de Cbl-b y c-Cb1 en células T CD8* humanas se excluye experimentalmente, y un procedimiento terapéutico es razonable solo por la vía de Cbl-b (y sus reguladores de línea de entrada), pero no por la vía de las combinaciones de Cbl-b/c-Cb1, para incrementar la inmunorreactividad. Sin embargo, la inhibición de c-Cb1 permite la inmunosupresión para otras aplicaciones, tales como, por ejemplo, el tratamiento de inflamaciones o alergias.

Este procedimiento terapéutico concomitante, ya sea concebido como monoterapia o combinado con una vacunación, también es capaz de reconocer células tumorales diseminadas en la periferia y combatir las mismas de manera duradera mediante el desarrollo de una respuesta inmune. Inmediatamente tras diagnóstico de un cáncer, de esta manera se impide igualmente una diseminación de un tumor primario.

Ejemplo 6: Incremento transiente en la reactividad de célula T -Medición de IL-2

Un resultado muy similar se obtuvo al medir las concentraciones de IL-2 en los mismos sobrenadantes, como se puede observar de la Fig. 4: Sin la estimulación no hubo respuesta mensurable, mientras que un tratamiento específico anti-CD3 condujo una señal claramente medible en todos los grupos. Así, se midieron >200 pg/ml en el grupo atenuado con Cbl-b. La concentración de IL-2 en la población coatenuada con Cbl-b y c-Cb1 fue nuevamente mucho menor y ascendía a >100 pg/mL. La coestimulación específica de anti-CD3 y anti-CD28 a su vez produjo señales más altas. Se midieron concentraciones de IL-2 de >800 pg/mL en todos los grupos, independientemente

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