RS56986B1 - Humanizovana antitela na beta amiloid - Google Patents

Humanizovana antitela na beta amiloid

Info

Publication number
RS56986B1
RS56986B1 RS20180266A RSP20180266A RS56986B1 RS 56986 B1 RS56986 B1 RS 56986B1 RS 20180266 A RS20180266 A RS 20180266A RS P20180266 A RSP20180266 A RS P20180266A RS 56986 B1 RS56986 B1 RS 56986B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
antibody
seq
fragment
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20180266A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrea Pfeifer
Bosch Maria Pihlgren
Andreas Muhs
Ryan Watts
Original Assignee
Ac Immune Sa
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49474825&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS56986(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ac Immune Sa, Genentech Inc filed Critical Ac Immune Sa
Priority claimed from EP11192705.9A external-priority patent/EP2468770B1/en
Publication of RS56986B1 publication Critical patent/RS56986B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na antitela i kompozicije za dijagnozu i tretiranje amiloidoze, grupu poremećaja i abnormalnosti vezanih za amiloidni protein, kao što je Alchajmerova bolest.
[0002] Amiloidoza nije samo jedno oboljenje, već pre raznovrsna grupa progresivnih oboljenjskih procesa i koje karakterišu ekstracelularni depoziti u tkivima voskastog proteina nalik skrobu, nazvanog amiloid, koji se akumulira u jednom ili više organa ili telesnih sistema. Kako se amiloidni depoziti nakupljaju, počinju da ometaju normalno fukcionisanje jednog ili više organa ili telesnih sistema. Postoji najmanje 15 različitih tipova amiloidoze. Glavni oblici su primarna amiloidoza bez poznatog prethodnika, sekundarna amiloidoza koja nastaje posle nekih drugih stanja, i nasledna amiloidoza.
[0003] Do sekundarne amiloidoze dolazi tokom hroničnih infekcija ili inflamatornih oboljenja, kao što su tuberkuloza, bakterijska infekcija nazvana Mediteranska groznica, infekcije kostiju (osteomijelitis), reumatoidni artritis, zapaljenje tankog creva (granulomatozni ileitis), Hodžkinova bolest i guba.
[0004] Depoziti amiloida uključuju amiloid P (pentagonalni) komponentu (AP), glikoprotein srodan normalnom amiloidu seruma P (SAP), i sulfatisane glikozaminoglikane (GAG), složene ugljene hidrate vezivnog tkiva. Fibrili amiloidnog proteina koji čine oko 90% amiloidnog materijala, sadrže jedan od nekoliko različitih tipova proteina. Ovi proteini su u stanju da se upakuju u tzv. "beta-naborane" ploče fibrila, jedinstvena konfiguracija proteina koja ima vezna mesta za Kongo crveno, što dovodi do jedinstvene osobine bojenja amiloidnog proteina.
[0005] Mnoge bolesti starenja zasnovane su ili su vezane za proteine nalik amiloidu i odlikuju se delom izgradnjom ekstracelularnih depozita amiloida ili njemu sličnog materijala koji doprinose patogenezi, kao i napredovanju bolesti. Ove bolesti uključuju, ali se ne ograničavaju njima, neurološke poremećaje kao što su Alchajmerova bolest (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije. Druga oboljenja zasnovana na, ili vezana za proteine slične amiloidu, su progresivna supranuklearna paraliza, multiple skleroza; Krojcfeld Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), dijabetes tip 2; senilna amiloidoza srca, endokrini tumori, i druge, uključujući degeneraciju makule.
[0006] Iako patogeneza ovih oboljenja može biti različita, njihovi karakteristični depoziti često sadrže zajedničke molekulske konstituente. U značajnom stepenu to se može pripisati lokalnoj aktivaciji proinflamatornih puteva, što dovodi do istovremenog taloženja aktiviranih dopunskih komponenti, akutnih faznih reaktanata, imunskih modulatora i drugih medijatora inflamacije (McGeer et al., 1994).
[0007] Alchajmerova bolest (AD) je neurološki poremećaj, za koji se prvenstveno smatra da je izazvan plakovima amiloida, nagomilavanjem nenormalnih depozita proteina u mozgu. Najčešći tip amiloida nađen u mozgu pogođenih pojedinaca sastoji se uglavnom od Aβ fibrila. Naučni dokaz pokazuje da povećanje stvaranja i akumulacija beta-amiloidnog proteina u plakovima dovodi do smrti nervnih ćelija, što doprinosi razvoju i progresiji AD. Gubitak nervnih ćelija u strateškim delovima mozga, sa svoje strane, dovodi do smanjenja neurotransmitera i slabljenja pamćenja. Proteini koji su glavni odgovorni za formiranje plakova uključuju amiloidni prekursorski protein (APP) i dva presenilina (presenilin I i presenilin II). Sekvencijalno razlaganje amiloidnog prekursorskog proteina (APP), koji se konstitutivno eksprimira i kataboliše u većini ćelija enzimima β i γ sekretazom, dovodi do oslobađanja od 39 do 43 Aβ peptida aminokiseline. Degradacija APP-ova verovatno povećava njihovu sklonost da agregiraju u plakove. Naročito Aβ (1-42) fragment ima veliku sklonost ka stvaranju agregata zbog dva vrlo hidrofobna aminokiselinska ostatka iz C-kraja. Prema tome, za Aβ (1-42) fragment veruje se da uglavnom učestvuje i da je odgovoran za otpočinjanje formiranja neuritskih plakova kod AD i da, prema tome, ima visok patološki potencijal. Stoga postoji potreba za agensima koji bi sprečili formiranje amiloidnih plakova i difuziju postojećih plakova u AD.
[0008] Simptomi AD manifestuju se sporo i prvi simptom može biti samo blaga zaboravnost. U ovom stupnju pojedinci mogu da zaborave nedavne događaje, aktivnosti, imena poznatih im ljudi ili stvari i mogu da izgube sposobnost rešavanja jednostavnih matematičkih problema. Kako bolest napreduje, simptomi se sve lakše primećuju i postaju dovoljno ozbiljni da nateraju ljude sa AD ili članove njihovih porodica da potraže medicinsku pomoć. Simptomi srednjeg stadijuma AD uključuju zaboravljanje načina obavljanja jednostavnih zadataka, kao što je češljanje, a pojavljuju se i problemi u govoru, razumevanju, čitanju ili pisanju. Pacijenti u kasnijem stadijumu AD mogu da postanu anksiozni ili agresivni, mogu da odlutaju od kuće i, najzad, zahtevaju potpunu negu.
[0009] Sada je jedini način da se dijagnostikuje AD identifikovanje plakova i klupčića u tkivu mozga prilikom autopsije posle smrti pojedinaca. Prema tome, dok je osoba još živa, doktori mogu da daju samo dijagnozu „moguća“ ili „verovatna“ AD. Korišćenjem postojećih metoda lekari mogu da dijagnostikuju AD tačno do 90 procenata vremena primenom nekoliko pristupa da bi dijagnostikovali AD kao „verovatnu“. Lekari postavljaju pitanja o opštem zdravlju osobe, prethodnim medicinskim problemima i o istoriji svih tegoba koje osoba ima pri izvođenju dnevnih aktivnosti. Bihejvioralni testovi pamćenja, rešavanja problema, pažnje, brojanja i jezika pružaju informacije o kognitivnoj degeneraciji, a medicinski testovi, kao što su ispitivanja krvi, urina, ili spinalne tečnosti i skeniranja mozga mogu da pruže dodatne informacije.
[0010] Postupanje sa AD sastoji se u tretmanu sa i bez lekova. Tretmani čiji je cilj bio da promene tok bolesti (odlože ili preokrenu njeno napredovanje) dosad su uglavnom bili neuspešni. Pokazano je da lekovi koji obnavljaju deficit (defekt), ili loše funkcionisanje hemijskih posrednika nervnih ćelija (neurotransmiteri), naročito inhibitori holinesteraze (ChEI-e), kao što su takrin i rivastigmin, popravljaju simptome. ChBI-e ometaju enzimsku degradaciju neurotransmitera i time povećavaju količinu hemijskih posrednika koji mogu da prenesu nervne signale do mozga.
[0011] Kod nekih ljudi u ranom ili srednjem stadijumu bolesti, lekovi takrin (COGNEX®, Morris Plains, NJ), donepezil (ARICEPT®, Tokyo, JP), rivastigmin (EXELON®, East Hanover, NJ), ili galantamin (REMINYL®, New Brunswick, NJ) mogu da pomognu u sprečavanju pogoršavanja nekih simptoma u ograničenom vremenu. Drugi lek, memantin (NAMENDA®, New York, NY), odobren je za lečenje umerenih do ozbiljnih AD. Postoje i lekovi namenjeni psihijatrijskim manifestacijama AD. Takođe, neki lekovi mogu da pomognu u kontroli bihejvioralnih simptoma AD, kao što su nesanica, uznemirenost, lutanje, anksioznost i depresija. Tretiranje ovih simptoma često čini da se pacijenti osećaju bolje, što njihovim negovateljima olakšava brigu o njima. Nažalost, uprkos značajnom napredovanju tretmana koji pokazuju da je ova klasa agenasa zaista bolja nego placebo, bolest nastavlja da napreduje i prosečan efekat na mentalno funkcionisanje vrlo je skroman. Mnogi lekovi koji se koriste za tretiranje AD, kao što su, na primer, ChEI, takođe imaju bočne efekte koji uključuju gastrointestinalnu disfunkciju, toksičnost za jetru i gubitak težine.
[0012] Druga bolest koja se zasniva na, ili je povezana sa nagomilavanjem i depozitom proteina sličnog amiloidu, jeste degeneracija makule.
[0013] Degeneracija makule je uobičajena bolest oka koja dovodi do propadanja makule koja je centralni deo retine (tkivo u zadnjoj strani oka, debljine papira, gde ćelije osetljive na svetlost šalju vizuelne signale mozgu). Oštar, jasan, 'direktan vid' obrađuje se makulom. Oštećenje makule dovodi do razvoja slepih mrlja i zamagljenog ili iskrivljenog vida. Starosna degeneracija makule (AMD) je glavni razlog oštećenja vida u Sjedinjenim državama i kod ljudi iznad 65 godina je vodeći razlog legalnog slepila kod belaca. Oko 1,8 miliona Amerikanaca starosti 40 godina i starijih imaju uznapredovalu AMD, a drugih 7,3 miliona ljudi imaju intermedijarnu AMD uz znatan rizik gubljenja vida. Vlada procenjuje da će oko 2020 godine biti oko 2,9 miliona ljudi sa uznapredovalom AMD. Žrtve AMD se često se iznenade i frustriraju kad shvate koliko se malo zna o uzrocima i lečenju ovog stanja koje vodi slepilu.
[0014] Postoje dva oblika degeneracije makule: suva degeneracija makule i vlažna degeneracija makule. Suv oblik, u kome ćelije makule sporo počinju da pucaju, dijagnostikuje se u 85 procenata slučajeva degeneracije makule. Suva AMD obično napada oba oka, mada jedno oko može da oslepi, dok drugo oko ostaje nepromenjeno. Druze, žuti depoziti pod retinom, obično su rani znaci suve AMD. Rizik razvića poodmakle faze suve AMD ili vlažne AMD raste sa brojem ili veličinom druza. Moguće je da suva AMD napreduje i izazove gubitak vida, a da ne pređe u vlažan oblik bolesti; međutim, moguće je takođe da početni stupanj suvog oblika AMD naglo pređe u vlažan oblik.
Vlažan oblik, mada obuhvata samo 15 posto slučajeva, u 90 posto slučajeva dovodi do slepila i smatra se poodmaklom AMD (ne postoji rani ili intermedijarni stupanj vlažne AMD). Vlažnoj AMD uvek prethodi suv oblik oboljenja. Kako se suv oblik pogoršava, kod nekih ljudi počinju da se formiraju abnormalni krvni sudovi iza makule. Ovi sudovi su vrlo krhki i iz njih može da procuri tečnost i krv (otuda „vlažna“ degeneracija makule), što dovodi do brzog oštećenja makule.
[0015] Suv oblik AMD u početku će dovoditi do slabo zamagljenog vida. Centar vida naročito može tada da postane zamagljen, a taj region se proširuje kako bolest napreduje. Ako je pogođeno samo jedno oko ne moraju se primetiti nikakvi simptomi. Kod vlažne AMD, prave linije mogu izgledati kao talasaste, si do gubitka centralnog vida može doći brzo.
[0016] Dijagnoza degeneracije makule tipično obuhvata ispitivanje proširenog oka, test oštrine vida i posmatranje očnog dna postupkom koji se naziva fundoskopija da bi se pomoglo dijagnostikovanje AMD, a ako se sumnja na vlažnu AMD može se takođe izvršiti fluorescentna angiografija. Ako suva AMD uđe u poodmakle stadijume, za sada nema tretmana koji bi sprečio gubitak vida. Međutim, specifična visoka doza formule antioksidansa i cinka može da odloži ili spreči intermedijarnu AMD od prelaska u poodmakli stadijum. Macugen® (injekcije natrijum pegaptaniba), laserska fotokoagulacija i fotodinamička terapija mogu da kontrolišu rast abnormalnih krvnih sudova i krvarenje u makuli, što je od pomoći nekim osobama sa vlažnom AMD; međutim, već izgubljeni vid ovim tehnikama neće biti povraćen. Ako je vid već izgubljen, postoje pomagala za slabovide koja mogu da poboljšaju kvalitet života.
[0017] Jedan od prvih znakova starosne degeneracije makule (AMD) jeste akumulacija ekstracelularnih depozita poznatih kao druze, između bazalne lamine pigmentisanog epitelijuma retine (RPE) i Bruhove membrane (BM). Nedavna ispitivanja koja su obavili Anderson et al. potvrdila su da druza sadrže beta amiloid. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256).
[0018] U toku je istraživanje koje proučava faktore okoline, genetske i dijetetske, koji mogu da doprinesu AMD. Ispituju se takođe i nove strategije lečenja, koje uključuju transplantaciju ćelija retine, lekove koji će sprečiti ili usporiti napredovanje bolesti, radijacionu terapiju, gensku terapiju, ubacivanje kompjuterskog čipa u retinu koji može da pomogne u stimulisanju vida i agensi koji će sprečiti porast novih krvnih sudova pod makulom.
[0019] Važan faktor koji treba razmatrati kod razvoja novih lekova je lakoća primene kod ciljnih pacijenata. Oralno unošenje leka, -specifično tableta, kapsula i mekih gelova, obuhvata 70% svih oblika doza uzetih od strane pacijenata zbog pogodnosti. Oni koji razvijaju lekove slažu se u tome da pacijenti više vole oralnu primenu nego da se podvrgavaju injekcijama ili nekim drugim, invazivnijim oblicima primene leka. Takođe su poželjne i formulacije koje daju kratke intervale za doziranje (tj., jednom dnevno ili produženo oslobađanje). Lakoća primene antibiotika u oblicima za oralno doziranje dovelo je do povećanja saglasnosti pacijenta tokom tretmana.
[0020] Ono što je potrebno jesu efikasni metodi i kompozicije za sprečavanje ili namenjeni komplikacijama vezanim za amiloidozu, grupe bolesti i poremećaja vezanih za stvaranje amiloidnih plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i staračku amiloidozu, uključujući, ali i ne ograničavajući se na, neurološke poremećaje kao što su Alchajmerova bolest (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (Holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i sve druge bolesti zasnovane na, ili vezane za amiloid-slične proteine, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza; Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tip 2; senilna amiloidoza srca, endokrini tumori, i druge, uključujući degeneraciju makule. Ono što je naročito potrebno jesu agensi koji mogu da neutrališu fiziološke manifestacije bolesti kao što je fomiranje plakova vezanih sa agregacijom vlakana amiloida ili peptida sličnih amiloidu.
[0021] Saopšteno je da anti-amiloidna antitela izazvana inokulacijom sa Aβ1-42pomešanog sa Freundovim kompletnim ili nekompletnim ađuvansom smanjuju opterećenje amiloidom kod transgenih miševa za humanu Alchajmerovu bolest (Schenk et al., 1999). Intraperitonealna inokulacija tetrapalmitoilovanog Aβ1-16rekonstituisanog u lipozomima u NORBA transgenim miševima izazvala je antiamiloidna antitela značajnog titra, za koje je objavljeno da rastvaraju amiloidna vlakna i plakove in vitro i in vivo. (Nicolau et al., 2002).
[0022] WO 01/62801 A2 opisuje anti-β-amiloid humanizovano antitelo 266 antitela i sugeriše da su antitela koja vezuju β-amiloid između položaja 13 i 28 (npr, 266 i 4G8) u stanju da izdvoje rastvorljive oblike β-amiloida iz njihovih vezanih cirkulišućih oblika u krvi, a da se ne vezuju sa velikim aflnitetom za agregirani β-amiloid.
[0023] WO 03/070760 A2 opisuje molekul antitela koji prepoznaje konformacioni epitop na β-A4 peptidu, koji je definisan aminokileinskim sekvencama AEFRHDSGY i VHHQKLVFFAEDVG.
[0024] WO 2006/066171 A1 otkriva anti-13-amiloid antitelo (15C11) koje se vezuje za centralni region β- amiloida (tj., amino kiseline 19-22) i vezuje oligomerne vrste β-amiloida, ali se izgleda ne vezuje za monomere β-amiloida.
[0025] Bard et al., (2000) su prvi sugerisali mogući mehanizam kojim dolazi do rastvaranja amiloidnih plakova i vlakana, i zaključili su da antitela opsonizuju plakove, koji zatim bivaju uništeni od strane makrofaga mikroglija. De Mattos et al., (2001) su ukazali da neko mAb usmereno na centralni domen βamiloida može da se veže za amiloid u plazmi i da ga potpuno izdvoji. Oni su uvrdili da prisustvo ovih mAb u krvotoku pomera ravnotežu Aβ između mozga i plazme, favorizujući periferni kliring i katabolizam umesto taloženja u mozgu.
[0026] Produžena terapija čoveka antitelima glodara može da dovede do antiglobulinskog odgovora koji se uočava posle oko 8-12 dana od primene i dostiže pik za oko 20-30 dana. Ako se konstatuje takav antiglobulinski odgovor, tretman se mora prekinuti najdalje za oko 10 dana, a ponovni kasniji tretman je obično onemogućen zato što dovodi do brzog nastajanja sekundarnog antiglobulinskog odovora. Iako antitela glodara dele u znatnoj meri konzervisane sekvence sa humanim antitelima, postoji dosta razlika u sekvenci antitela glodara i čoveka, dovoljnih da antitela glodara budu imunogena za ljude.
[0027] Ovaj problem se može prevazići dobijanjem antitela direktno u Ijudima ili stvaranjem „humanizovanih“ antitela (poznatih i kao "preoblikovana“ antitela). Humanizovana antitela imaju aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona koja sadrži glodarske CDR razasute u humane ili slične okvirne sekvence. Pošto je specifičnost humanizovanih antitela dobijena glodarskim CDR, njihovi ostaci se mogu koristiti uglavnom nepromenjeni, sa dozvoljenim samo minornim modifikacijama koje ne utiču značajno na afinitet i specifičnost antitela u odnosu na njegov ciljani antigen. Ostaci okvirnih delova mogu se izvesti iz bilo kog primata ili, naročito, iz bilo kog humanog varijabilnog regiona ili mogu biti njihova kombinacija, a nastali projektovan varijabilni region smatrao bi se preoblikovanim.
[0028] Da bi se maksimizovala verovatnoća da će i u preoblikovanom antitelu ostati afinitet važno je napraviti pravi izbor okvirnog regiona. Poznato je da okvirne sekvence održavaju CDR-ove u njihovim tačnim prostornim orijentacijama za interakciju sa antigenom i da okvirni ostaci mogu ponekad čak i da učestvuju u vezivanju antigena. Da bi se održao afinitet antitela za njegov antigen najpovoljnije je odabrati humane okvirne sekvence koje su najsličnije okvirnim sekvencama glodara. I tada može biti neophodno da se zameni jedna ili više amino kiselina u okvirnoj sekvenci čoveka odgovarajućom amino kiselinom okvirnog dela glodara da bi se izbegli gubici afiniteta. Zamena se može pospešiti kompjuterskim modelovanjem.
[0029] Ovaj pronalazak daje nova antitela i kompozicije koje sadrže visoko specifična i visoko efikasna antitela, naime, humanizovana antitela uključujući i njihove fragmente, koja imaju sposobnost da speciflčno prepoznaju i da se vezuju za epitope iz opsega β-amiloidnih antigena, koja se mogu ponuditi antitelu u vidu monomera, dimera, trimera, itd, u polimernom obliku, u obliku agregata, vlakana, filamenata ili u kondenzovanom obliku plakova. Antitela nastala na osnovu ovog pronalaska naročito su korisna za tretiranje amiloidoza, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje amiloidnih plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, uključujući, ali se ne ograničavajući na, neurološke poremećaje kao što su Alchajmerova bolest (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (Holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i sve druge bolesti zasnovane na ili vezane za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multiple skleroza; Krojcfeld-Jakobova bolest, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom holandskog tipa, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tip 2; senilna amiloidoza srca, endokrini tumori, i druge, uključujući degeneraciju makule, da nabrojimo samo neke.
[0030] Začuđujuće, antitela prema ovom pronalasku vezuju se za β-amiloid u različitim oblicima βamiloida, uključujući rastvorljive monomere, oligomere i fibrile, sa visokim afinitetom, i inhibiraju agregaciju monomera u oligomere/fibrile i indukuju dezagregaciju oligomera/fibrila.
[0031] Ovaj pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo ili njegov fragment, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov fragment obuhvata:
(A) (i) varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15, pri čemu HCVR obuhvata komplementarnost teškog lanca koji određuje region 1 (CDR1) kao što je dato u SEQ ID NO: 1, teški lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 2 i teški lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 3, i (ii) varijabilni region lakog lanca (LCVR) comprising akoji obuhvata laki lanac CDR1 kao što je dato u SEQ ID NO: 4, laki lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 5, RVSNRFS ili KVSSRFS i laki lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 6, ili
(B) (i) HCVR koji obuhvata teški lanac CDR1 kao što je dato u SEQ ID NO: 1, teški lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 2 i teški lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 3, i (ii) LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12, pri čemu LCVR obuhvata laki lanac CDR1 kao što je dato u SEQ ID NO: 4, laki lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 5, RVSNRFS ili KVSSRFS i laki lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 6,
pri čemu se pomenuto antitelo ili njegov fragment specifično vezuje za β-amiloid protein.
[0032] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment kao što je definisano u 1(A) gore, obuhvata LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12.
[0033] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment kao što je definisano u 1(B) gore, obuhvata HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.
[0034] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment obuhvata:
i) HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15; ili
ii) LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12; ili
iii) HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15 i LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12.
[0035] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment obuhvata:
i) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 16; ili
ii) laki lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 13; ili
iii) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 16 i laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 13.
[0036] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment je IgG4 izotipa.
[0037] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment može da inhibira agregaciju β-amiloid monomera do visokomolekularnih polimernih fibrila i dezagregaciju prethodno formiranih polimernih fibrila ili filamenata.
[0038] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment vezuje se za Aβ vlakno, fibril ili filament sa afinitetom vezivanja koji je najmanje 10 puta, najmanje 15 puta, najmanje 20 puta, ili najmanje 25 puta, viši od afiniteta vezivanja pomenutog antitela ili njegovog fragmenta za neki Aβ monomer.
[0039] U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment ima:
(a) amino kiselinu u Kabat položaju 47 okvirnih regiona varijabilnog regiona teškog lanca je amino kiselina Leu; i/ili
(b) amino kiselina u Kabat položaju 94 u okvirnim regionima varijabilnog regiona teškog lanca je amino kiselina Ser; i/ili
(c) amino kiselina u Kabat položaju 87 u okvirnim regionima varijabilnog regiona lakog lanca je amino kiselina Tyr, Phe, Leu, VaI, Ile, ili Ala.
[0040] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji obuhavat nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment.
[0041] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku.
[0042] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju koja obuhvata ekspresioni vektor prema ovom pronalasku.
[0043] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment, a koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, i/ili ekscipijens.
[0044] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje mešavinu koja obuhvata humanizovano antitelo prema ovom
1
pronalasku ili njegov fragment, a koja dalje obuhvata biološki aktivnu supstancu, farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, i/ili ekscipijens.
[0045] U nekim primerima izvođenja, mešavina obuhvata:
(i) biološki aktivnu supstancu koja je jedinjenje korišćeno u tretmanu amiloidoza, ili
(ii) najmanje jedno od sledećih jedinjenja: jedinjenje anti-oksidativnog stresa; anti-apoptotično jedinjenje; helator metala; Inhibitor DNK popravke kao što su pirenzepin i metaboliti; 3-amino-1-propansulfonska kiselina (3 APS); 1,3-propandisulfonat (1,3PDS); aktivator α-sekretaze; inhibitor Aβ-sekretaze; inhibitor γ-sekretaze; tau protein; neurotransmiter; raskidač aβ-lista; atraktant za ćelijskih komponenata amiloid beta kliringa/osiromašenja; inhibitor N-terminalnog skraćenog amiloid beta, kao što je piroglutamatni amiloid beta 3-42; anti-inflamatorni molekul; inhibitor holinesteraze (ChEI) kao što je takrin, rivastigmin, donepezil, i/ili galantamin; Ml agonist; ili drugi lek kao što je amiloid- ili tau-modifikujući lek ili hranljivi suplement.
[0046] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano antitelo ili njegov fragment kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-9, kompoziciju kao što je definisana u patentnom zahtevu 13, ili mešavinu kao što je definisana u patentnom zahtevu 14 ili 15 za upotrebu u postupku tretiranja ili ublažavanja efekata amiloidoza kod životinja, kao što su sisari ili čovek.
[0047] U nekim primerima izvođenja, amiloidoza je sekundarna amiloidoza, starosno povezana amiloidoza, neurološki poremećaj, Alchajmerova bolest (AD), Demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (Holandski tip), kompleks Guam-Parkinsonove demencije, progresivna supranuklearna paraliza, multiple skleroza, Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija povezana sa HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), dijabetes tip 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori, ili makularna degeneracija.
[0048] U nekim primerima izvođenja, amiloidoza je Alchajmerova bolest.
[0049] U nekim primerima izvođenja, tretman životinja prema ovom pronalasku dovodi do
i) povećanja kapaciteta kognitivne memorije; i/ili
ii) zadržavanja kapaciteta kognitivne memorije; i/ili
iii) potpune restauracije kapaciteta kognitivne memorije.
[0050] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak dijagnoze neke amiloidozae kod pacijenta, koji obuhvata:
i) dovođenje u kontakt uzorka, dela tela, ili oblasti tela koja sadrži amiloid protein sa humanizovanim antitelom prema ovom pronalasku ili njegovim fragmentom pod uslovima koji omogućavaju vezivanje pomenutog antitela ili njegovog fragmenta za amiloid protein; i ii) detekciju antitela ili njegovog fragmenta vezanog za protein,
pri čemu prisustvo ili odsustvo antitela ili njegovog fragmenta vezanog za amiloid protein pokazuje prisustvo ili odsustvo amiloid proteina u pomenutom uzorku, delu tela, ili oblasti tela.
[0051] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za određivanje opsega opterećenja amiloidogenskim plakom u uzorku tkiva ili uzorku telesne tečnosti, koji obuhvata:
i) ispitivanje uzorka tkiva ili uzorka telesne tečnosti na prisustvo amiloid proteina sa humanizovanim antitelom prema ovom pronalasku ili njegovim fragmentom;
ii) određivanje količine antitela ili njegovog fragmenta vezanog za amiloid protein; i iii) izračunavanje opterećenja plakom u uzorku tkiva ili uzorku telesne tečnosti.
[0052] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje komplet za detekciju i dijagnozu oboljenja i stanja povezanih sa amiloidom, koji obuhvata humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment, pri čemu pomenuti komplet obuhvata kontejner sa jednim ili više antitela prema ovom pronalasku ili njihovih fragmenata i uputstva za upotrebu pomenutih antitela ili njihovih fragmenata.
[0053] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment, kompoziciju prema ovom pronalasku, ili mešavinu prema ovom pronalasku, za upotrebu u postupku prevencije degeneracije neurona usled izlaganja β-amiloid oligomerima.
[0054] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment, kompoziciju prema ovom pronalasku, ili mešavini prema ovom pronalasku, za upotrebu u postupku zaštite neurona od degradacije izazvane β-amiloidom.
[0055] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za pripremanje humanizovanog antitela prema ovom pronalasku ili njegovog fragmenta, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ćelije prema ovom pronalasku, i prečišćavanje antitela ili njegovog fragmenta.
REZIME PRONALASKA
[0056] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment, koji prepoznaje i vezuje se bar za jedno određeno vezno mesto, naročito za najmanje dva određena vezna mesta i, najbolje za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde navedeno jedno, navedena najmanje dva i navedena najmanje tri vezna mesta sadrže najmanje jedan ili dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela.
[0057] Naročito se humanizovano antitelo ili njegov fragment, prema ovom pronalasku, vezuje za najmanje dva, posebno najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu kada najmanje dva od tri određena vezna mesta sadrže najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela i najmanje jedno od tri određena vezna mesta sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak.
[0058] Najmanje dva određena vezna mesta koja sadrže najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela locirana su blisko jedan drugom na antigenu i razdvojeni su i/ili okruženi najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u mnogo manjoj meri u poređenju sa pomenuta najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka, što formira konformaciono diskontinuiran epitop.
[0059] Najmanje tri određena vezna mesta koja sadrže najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka, i najmanje jedan aminokiselinski ostatak, respektivno, koje uglavnom učestvuju u vezivanju antitela nalaze se na epitopu blizu jedan drugom, razdvojeni i/ili okruženi najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u mnogo manjoj meri u poređenju sa aminokiselinskim ostacima koji dominantno učestvuju u vezivanju antitela što formira konformaciono diskontinuiran epitop.
[0060] Posebno je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje jedno određeno vezno mesto, posebno za najmanje dva određena vezna mesta, još određenije za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako pomenuto najmanje jedno ili pomenuta najmanje dva određena vezna mesta sadrže najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, gde najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka predstavljaju prvo vezno mesto jesu -Phe-Pheuključena unutar sledeće osnovne sekvence (SEQ ID NO: 9):
Xaa3- Phe - Phe - Xaa4- Xaa5– Xaa6, gde je
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe, i Ile;
Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile;
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp,
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, i gde navedeni aminokiselinski ostaci Xaa3, Xaa4, Xaa5i Хаа6ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u
1
znatno manjoj meri u poređenju sa -Phe-Phe- veznim mestom.
[0061] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde
Xaa3je Val ili Leu, ali naročito Val;
Xaa4je Ala ili Val, ali naročito Ala;
Xaa5je Glu ili Asp, ali naročito Glu;
Xaa6je Glu ili Asp, ali naročito Asp.
[0062] Posebno je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje jedno ođređeno vezno mesto, posebno za najmanje dva određena vezna mesta, još određenije za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde pomenuta određena vezna mesta sadrže najmanje jedan, odnosno najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka, respektivno, koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, gde su najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji predstavljaju prvo vezno mesto -Phe-Phe- i najmanje jedan aminokiselinski ostatak je -His- smešten unutar sledeće osnovne sekvence:
- Xaa1- His - Xaa3- Xaa4- Xaa5- Xaa6- Phe - Phe - Xaa7-Xaa8- Xaa9-, gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg
Хаа3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln
Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile;
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe, i Ile Xaa7je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, i Ile, Xaa8je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp,
Xaa9je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, i gde aminokiselinski ostaci Xaa1, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8i Xaa9, ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u značajnoj manjoj meri u poređenju sa veznim mestom -His- i -Phe-Phe-, respektivno.
[0063] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde
Xaa3je Gln ili Asn, ali naročito Gln;
Xaa4je Lys
Xaa5je Leu
Xaa6je Val ili Leu, ali naročito Val;
Xaa7je Ala ili Val, ali naročito Ala;
Xaa8je Glu ili Asp, ali naročito Glu; i
Xaa9je Asp ili Glu, ali naročito Asp.
[0064] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje jedno određeno vezno mesto, posebno za najmanje dva određena vezna mesta, još više za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako pomenuto najmanje jedno ili pomenuta najmanje dva određena vezna mesta sadrže najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, gde najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka predstavljaju drugo vezno mesto su -Lys-Leusmeštena unutar sledeće osnovne sekvence (SEQ ID NO: 10):
Xaa1- Xaa2- Lys - Leu - Xaa3gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg;
Хаа2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln;
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile; i gde pomenuti aminokiselinski ostaci Xaa2, Xaa3, ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u manjoj, do značajno manjoj meri u poređenju sa -Lys-Leu- veznim mestom.
[0065] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje jedno određeno vezno mesto, posebno za najmanje dva određena vezna mesta, još određenije za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako pomenuto određeno vezno mesto sadrži najmanje jedan ili najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka, respektivno, koja uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, gde najmanje jedna i najmanje dve uzastopne aminokiseline koje su razdvojene najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u značajno manjoj meri u poređenju sa aminokiselinskim ostacima koji dominiraju u vezivanju antitela, jesu -His- i -Lys-Leu-, respektivno, smešteni unutar sledeće osnovne sekvence:
His - Xaa2- Lys - Leu - Xaa3- Xaa4- Xaa5-Xaa6- - Xaa7- Xaa8- gde
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln;
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile; Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile;
Хаа7je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp,
Хаа8je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp
i gde pomenuti aminokiselinski ostaci Xaa2, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8, ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u manjoj, do značajno manjoj meri u poređenju sa –His- i -Lys-Leu- veznim mestom, respektivno.
1
[0066] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment u kome
Xaa2je Gln ili Asn, ali naročito Gln;
Xaa3je Val ili Leu, ali naročito Val;
Xaa4je Phe
Xaa5je Phe
Xaa6je Ala ili Val, ali naročito Ala;
Xaa7je Glu ili Asp, ali naročito Glu; i
Xaa8je Asp ili Glu, ali naročito Asp.
[0067] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje dva određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako od pomenuta najmanje dva vezna mesta sadrži najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koja uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, pri čemu su najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka razdvojena najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u značajno manjoj meri u poređenju sa pomenutim uzastopnim aminokiselinskim ostacima koji su -Phe-Phe- i -Lys-Leu-, respektivno, koji predstavljaju prvo i drugo vezno mesto smešteno unutar sledeće osnovne sekvence:
Xaa1- Xaa2- Lys - Leu - Xaa3- Phe - Phe - Xaa4- Xaa5- Xaa6, gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg;
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln;
Хаа3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ilе; Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile;
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp,
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp i gde pomenuti aminokiselinski ostaci Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5i Xaa6ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u manjoj, do značajno manjoj meri u poređenju sa -Lys-Leu- i -Phe-Phe- veznim mestom, respektivno.
[0068] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje jedno određeno vezno mesto, posebno za najmanje dva određena vezna mesta, još određenije za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde pomenuta određena vezna mesta sadrže najmanje jedan ili najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka, respektivno, koja uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, gde su najmanje jedan i najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka razdvojena najmanje jednim aminokiselinskim
1
ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u značajno manjoj meri u poređenju sa aminokiselinskim ostacima koji dominiraju u vezivanju antitela, i gde su pomenuti aminokiselinski ostaci -His- i -Phe-Phe- i -Lys-Leu-, respektivno, smešteni unutar sledeće osnovne sekvence:
His - Xaa2- Lys - Leu - Xaa3- Phe - Phe - Xaa4- Xaa5- Xaa6, gde
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln;
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile; Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile;
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp,
Хаа6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, i gde pomenuti aminokiselinski ostaci Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u manjoj, do značajno manjoj meri u poređenju sa -His-, -Lys-Leu- i -Phe-Phe- veznim mestom, respektivno.
[0069] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde
Xaa2je Gln ili Asn, ali naročito Gln;
Xaa3je Val ili Leu, ali naročito Val;
Xaa4je Ala ili Val, ali naročito Ala;
Xaa5je Glu ili Asp, ali naročito Glu; i
Xaa6je Asp ili Glu, ali naročito Asp.
[0070] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje dva određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako od pomenuta najmanje dva određena vezna mesta sadrži najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, i gde su najmanje dve uzastopne aminokiseline razdvojene najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u značajno manjoj meri u poređenju sa pomenutim uzastopnim aminokiselinskim ostacima koji su -Phe-Phe- i -Lys-Leu-, respektivno, koji predstavljaju prvo i drugo vezno mesto smešteno unutar sledeće osnovne sekvence:
Xaa1- Xaa2- Lys - Leu - Xaa3- Phe - Phe - Xaa4- Xaa5- Xaa6, gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg;
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln;
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Val, Ala, Leu, Met, Phe, norleucin i Ile Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu i Ile;
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp,
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, i gde pomenuti
1
aminokiselinski ostaci Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u manjoj, do značajno manjoj meri u poređenju sa -Lys-Leu- i -Phe- Phe- veznim mestom, respektivno.
[0071] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde
Xaa1je His ili Arg, ali naročito His;
Xaa2je Gln ili Asn, ali naročito Gln;
Xaa3je Val ili Leu, ali naročito Val;
Xaa4je Ala ili Val, ali naročito Ala;
Xaa5je Glu ili Asp, ali naročito Glu; i
Xaa6je Asp ili Glu, ali naročito Asp.
[0072] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje dva određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako od pomenuta najmanje dva određena vezna mesta sadrži najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, a to su - Phe - Phe - Ala - Glu -, naročito - Phe - Phe - Ala -, ali još određenije - Phe - Phe - i - Lys - Leu -, respektivno, i gde pomenuta najmanje dva određena vezna mesta imaju aminokiselinsku sekvencu -Val - Phe - Phe - Ala - Glu - Asp -prikazanu u SEQ ID NO: 7 i aminokiselinsku sekvencu His - Gln - Lys - Leu - Val - prikazanu u SEQ ID NO: 8, respektivno.
[0073] Takođe je opisano himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje jedno određeno vezno mesto, posebno za najmanje dva određena vezna mesta, još određenije za najmanje tri određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde pomenuto najmanje jedno ili pomenuta najmanje dva određena vezna mesta sadrže najmanje jedan i najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka, respektivno, koji uglavnom učestvuju u vezivanju antitela koja su - Phe - Phe - i - Lys - Leu - i -His-, respektivno, gde su pomenuta određena vezna mesta smeštena unutar aminokiselinske sekvence -Val - Phe - Phe - Ala - Glu-, i aminokiselinske sekvence -His - Gln - Lys - Leu - Val -, respektivno.
[0074] U jednom drugom aspektu, himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment obuhvata mesto prepoznavanja i vezivanja za antigen, koje prepoznaje i koje se vezuje za najmanje dva određena vezna mesta na β-amiloid proteinu, gde svako od dva pomenuta određena vezna mesta sadrži najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka unutar aminokiselinske sekvence date u SEQ ID NO: 7 i 8, respektivno, gde pomenuti uzastopni aminokiselinski ostaci, naročito -Phe- Phe-
1
i -Lys- Leu-, uglavnom učestvuju u vezivanju β-amiloid proteina.
[0075] Takođe je opisano antitelo ili njegov fragment, koje se vezuje za 4 određena vezna mesta na βamiloid proteinu, gde ta 4 određena vezna mesta uključuju 2 vezna mesta od kojih svako sadrži jedan aminokiselinski ostatak i 2 vezna mesta od kojih svako sadrži dva uzastopna aminokiselinska ostatka, koji ostaci uglavnom učestvuju u vezivanju antitela, gde su pomenuta 4 određena vezna mesta locirana vrlo blisko jedno drugom na β-amiloid proteinu, i gde su pomenuta 4 određena vezna mesta razdvojena najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom koji ne učestvuje u vezivanju antitela ili učestvuje u vezivanju ali u značajno manjoj meri nego pomenuti aminokiselinski ostatak, a pomenuta dva uzastopna aminokiselinska ostatka 4 određena vezna mesta tako formiraju konformaciono diskontinuirani epitop.
[0076] Određeno, prvi od dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji dominira u vezivanju antitela jeste -Lys-Leu-, a drugi od najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka jeste -Phe-Phe-, prvi od pojedmačnih aminokiselinskih ostataka je -His-, a drugi od pojedinačnih aminokiselinskih ostataka je -Asp- smešten unutar sledeće osnovne sekvence:
- Xaa1- His - Xaa2- Lys - Leu -Xaa3- Phe - Phe - Хаa4- Xaa5- Asp. - Xaa6gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg, ali naročito His;
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln, ali naročito Gln ; Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile, naročito Val;
Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile, naročito Ala;
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, naročito Glu;
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile, naročito Val; i gde pomenuti aminokiselinski ostaci Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u vezivanju, ali u značajno manjoj meri u poređenju sa -His-,-Asp-, -Lys-Leu, i -Phe-Phe- veznom mestu.
[0077] Takođe je opisano antitelo ili njegov fragment, koje se vezuje za 4 određena vezna mesta na βamiloid proteinu, gde svako od ta 4 određena vezna mesta uključuje po 2 vezna mesta uključujući jedan aminokiselinski ostatak i 2 vezna mesta od kojih svako sadrži dva uzastopna aminokiselinska ostatka, gde prvi od dva uzastopna aminokiselinska ostatka koji dominira u vezivanju antitela jeste -Lys- Leu-, a drugi od najmanje dva uzastopna aminokiselinska ostatka jeste -Phe-Phe-, prvi od pojedinačnih aminokiselinskih ostataka je -His-, a drugi od pojedinačnih aminokiselinskih ostataka je -Asp- smešteni unutar sledeće osnovne sekvence:
1
-Xaa1- His - Xaa2- Lys - Leu -Xaa3- Phe - Phe - Xaa4-Xaa5-Asp. - Xaa6gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, Lys i Arg, ali naročito His;
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln, ali naročito Gln ;
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile, naročito Val;
Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile, naročito Ala; Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, naročito Glu;
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala, Val, Leu, norleucin, Met, Phe i Ile, naročito Val; i gde aminokiselinski ostaci Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u vezivanju, ali u značajno manjoj meri u poređenju sa -His-,-Asp-, -Lys-Leu, i -Phe-Phe- veznom mestu.
[0078] U specifičnom aspektu, mesta prepoznavanja i vezivanja, kako su ovde definisana, formiraju konformaciono diskontinuirani epitop, lokalizovan u regionu β-amiloid proteina između aminokiselinskog ostatka 12 do 24, naročito između ostataka 14 do 23, još specifičnije između aminokiselinskih ostataka 14 i 20, gde svako od najmanje dva određena mesta prepoznavanja i vezivanja sadrži najmanje 2 aminokiselinska ostatka i locirano je na položajima 16 i 17, i na položajima 19 i 20, respektivno, i gde je najmanje jedno određeno mesto prepoznavanja i vezivanja koje ima najmanje 1 aminokiselinski ostatak locirano na položaju 14 i ti ostaci uglavnom učestvuju u vezivanju β-amiloid proteina i gde se pomenuta određena mesta prepoznavanja i vezivanja bar sa jedne strane graniče sa aminokiselinskim ostacima, uglavnom ostacima 21 i 22, i razdvojena su jednim aminokiselinskim ostatkom lociranim na položajima 15 i 18, a ti aminokiselinski ostaci ne učestvuju neposredno u vezivanju antigena ili, najmanje, učestvuju u bitno manjoj meri.
[0079] U jednom drugom aspektu, pomenuta najmanje tri određena mesta prepoznavanja i vezivanja graniče se sa obe strane aminokiselinskim ostacima, naročito ostacima 12 i 13, i ostacima 21 i 22 i razdvojeni su aminokiselinskim ostatkom lociranim na položaju 15 i 18, i ti aminokiselinski ostaci ne učestvuju neposredno u vezivanju antigena ili, najmanje, učestvuju u bitno manjoj meri.
[0080] U specifičnom aspektu, pomenuti uzastopni aminokiselinski ostaci, naročito -Lys-Leu- na položaju 16 i 17 i -Phe- Phe- na položaju 19 i 20, koji uglavnom učestvuju u vezivanju β-amiloid proteina, smešteni su unutar sledeće osnovne sekvence:
2
[0081] U jednom drugom specifičnom aspektu, pomenuti aminokiselinski ostaci, naročito -Lys-Leu- na položaju 16 i 17 i -Phe- Phe- na položaju 19 i 20, i -His- na položaju 14, koji uglavnom učestvuju u vezivanju β-amiloid proteina, smešteni su u okviru sledeće osnovne sekvence:
[0082] U jednom drugom aspektu, opisano je humanizovano antitelo ili njegov fragment koje u varijabilnom regionu lakog lanca i teškog lanca, respektivno, sadrži najmanje jedan CDR ne-humanog porekla, posebno dva CDR ne-humanog porekla, još određenije tri CDR ne-humanog porekla, smeštena u jedan ili više okvirnih regiona izvedenih iz čoveka ili primata i, opciono, konstantan region izveden iz nekog izvora antitela čoveka ili primata, koje humanizovano antitelo ili njegov fragment je u stanju da specifično prepozna i da se veže za β-amiloid protein, posebno za monomerni peptid β-amiloida, određenije za polimerni peptid β-amiloida i još određenije za vlakna, fibrile ili filamente β-amiloida izolovane ili kao deo plakova β-amiloida na epitopu koji sadrži sledeću aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11):
Xaa1- Xaa2- Lys - Leu - Xaa3- Phe - Phe- Xaa4- Xaa5- Xaa6, gde
Xaa1je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine His, Asn, Gln, ali naročito His;
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln, ali naročito Gln; i
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Val, Leu i Ile, ali naročito Val;
Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala i Val, ali naročito Ala;
Хаа5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, ali naročito Glu;
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, ali naročito Asp.
[0083] U jednom drugom aspektu opisano je humanizovano antitelo ili njegov fragment koje u varijabilnom regionu lakog lanca i teškog lanca, respektivno, sadrži najmanje jedan CDR ne-humanog porekla, posebno dva CDR ne-humanog porekla, još određenije tri CDR ne-humanog porekla, smeštena u jedan ili više okvirnih regiona izvedenih iz čoveka ili primata i, opciono, konstantan region izveden iz nekog izvora antitela čoveka ili primata, koje humanizovano antitelo ili njegov fragment je u stanju da specifično prepozna i da se veže za β-amiloid protein, posebno za monomerni peptid β-amiloida, određenije za polimerni peptid β-amiloida i još određenije za vlakna, fibrile ili filamente β-amiloida izolovane ili kao deo plakova β-amiloida na epitopu koji obuhvata sledeću aminokiselinsku sekvencu:
His - Xaa2- Lys - Leu - Xaa3- Phe - Phe- Xaa4Xaa5- Xaa6, gde
Xaa2je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Asn i Gln, ali naročito Gln; i
Xaa3je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Val, Leu i Ile, ali naročito Val;
Xaa4je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Ala i Val, ali naročito Ala;
Xaa5je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, ali naročito Glu;
Xaa6je aminokiselinski ostatak odabran od grupe koju čine Glu i Asp, ali naročito Glu; i gde pomenuti aminokiselinski ostaci Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6ne učestvuju u vezivanju antitela ili učestvuju u manjoj meri nego -His- i -Lys-Leu- i -Phe-Phe- vezno mesto.
[0084] U jednom specifičnom aspektu, CDR ne-humanog porekla dobijen je od donorskog antitela, naročito od mišjeg donorskog antitela dobijenog na fragment antigena koji ne sadrži pomenuto vezno mesto. Ta promena regiona epitopa možda je, bar delimično, izazvana upotrebom supramolekulskog antigenog konstrukta koji sadrži neki antigeni peptid koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci β-amiloid peptida, naročito β-amiloid peptida Aβ1-16, modifikovan hidrofilnom grupom kao što je, na primer, polietilen glikol (PEG), gde je data hidrofilna grupa kovalentno vezana za svaki od krajeva antigenog peptida preko bar jedne, posebno preko jedne ili dve amino kiseline, kao što su, na primer, lizin, glutaminska kiselina i cistein ili bilo koja pogodna amino kiselina ili analog amino kiseline koji može da služi kao spojnica za spajanje hidrofilne grupe za peptidni fragment, kao što će kasnije biti pokazano u procesu imunizacije. Kada se kao hidrofilna grupa koristi PEG slobodni krajevi PEG su kovalentno vezani za fosfatidiletanolamin ili bilo koje drugo jedinjenje pogodno da služi kao element ukotvljavanja, na primer, da ubaci antigeni konstrukt u dvostruki sloj lipozoma, kako je ovde opisano.
[0085] Naročito, CDR ne-humanog porekla je dobjen iz mišjeg donorskog antitela, koje ispoljava karakteristične osobine ACI-01-Ab7C2 (zvanog takođe i "mC2" u ovoj prijavi), deponovanog 01. decembra 2005. kod "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, shodno odredbama Budimpeštanskog ugovora, pod pristupnim brojem DSM ACC2750).
[0086] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, CDR ne-humanog porekla dobija se iz mišjeg donorskog antitela ACl-01-Ab7C2 (zvanog takođe i "mC2" u ovoj prijavi) deponovanog 01. decembra 2005. kod "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, under the provisions of the Budapest Treaty under accession no DSM ACC2750).
[0087] Takođe, upotreba lipida A, kao dela protokola imunizacije, može da doprinese promeni regiona epitopa.
[0088] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment koji u okvirnim regionima izvedenim od čoveka ili primata sadrži integrisan najmanje jedan peptid aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 2, koja predstavlja CDR2, i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), i SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0089] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, u kome pomenuto humanizovano antitelo ima integrisan u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje jedan peptid aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe sekvenci koje sadrže SEQ ID NO: 2, koja predstavlja CDR2, i SEQ ID NO: 3, koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR). Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, u kome pomenuto humanizovano antitelo ima integrisan u okvirne regione lakog lanca, izvedene od čoveka ili primata, peptid aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, koja predstavlja CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0090] Takođe je opisan varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima integrisan u okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, najmanje jedan peptid aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, koja predstavlja CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0091] Takođe je opisan varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima integrisan u okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, najmanje jedan peptid aminokiselinske sekvence odabrane od grupe sekvenci koju čine sekvence SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0092] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment koji obuhvata okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, u koja su integrisana najmanje dva peptida,koji peptidi su različiti i pokazuju aminokiselinsku sekvencu odabranu od grupe sekvenci koju čine sekvence SEQ ID NO:1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), gde isti CDR ne može biti zastupljen dva puta u tom antitelu. Naročito, ako su najmanje dva prisutna CDR oba CDR-ovi varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), najmanje jedan od pomenutih CDR mora biti CDR1 predstavljen sa SEQ ID NO: 4.
[0093] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment koji ima integrisan u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2
2
koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), ali naročito humanizovano antitelo ili njegov fragment gde isti CDR ne može biti zastupljen dva puta u tom antitelu.
[0094] Takođe je opisan varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima integrisana u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0095] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, koji ima integrisana u okvirne regione lakog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0096] Takođe je opisan varijabilni region lakog lanca (LCVR), koji ima integrisana u okvirne regione lakog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), gde isti CDR ne može da bude zastupljen dva puta u tom antitelu i, naročito, najmanje jedan od pomenutih CDR mora biti CDR1 predstavljen sa SEQ ID NO: 4.
[0097] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, koji ima integrisane u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, peptide sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), naročito po navedenom redosledu.
[0098] Takođe je opisan varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima integrisane u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, peptide sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR), naročito po navedenom redosledu.
[0099] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment koji ima integrisane u okvirne regione lakog lanca, izvedene od čoveka ili primata, peptide sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), naročito po navedenom redosledu.
[0100] Takođe je opisan varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima integrisane u okvirne regione lakog lanca, izvedene od čoveka ili primata, peptide sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), naročito po navedenom redosledu.
[0101] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje ima integrisane u okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, najmanje tri peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), ali naročito humanizovano antitelo ili njegov fragment gde isti CDR ne može da bude zastupljen dva puta u tom antitelu.
[0102] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje antitelo ima integrisane u okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, najmanje četiri peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO:3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), ali naročito humanizovano antitelo ili njegov fragment gde isti CDR ne može da bude zastupljen dva puta u tom antitelu.
[0103] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje ima integrisana u okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, najmanje pet peptida sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od grupe sekvenci koju čine SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO:3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), ali naročito humanizovano antitelo ili njegov fragment gde isti CDR ne može da bude zastupljen dva puta u tom antitelu.
[0104] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, koje ima integrisane u okvirne regione, izvedene od čoveka ili primata, peptide sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1, SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0105] Takođe je opisano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR), ili njegov fragment, gde
2
pomenuto humanizovano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment ima integrisan u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje jedan peptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0106] Takođe je opisano humanizovano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment, gde pomenuto humanizovano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment ima integrisan u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje jedan peptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0107] Takođe je opisano humanizovano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment, gde antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment imaju integrisana u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čovcka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1 i SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0108] Takođe je opisano humanizovano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment, koje antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment ima integrisana u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0109] Takođe je opisano humanizovano antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment, koje antitelo, varijabilni region teškog lanca (HCVR) ili njegov fragment ima integrisana u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 i SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0110] Takođe je opisano humanizovano antitelo, varijabilni region lakog lanca (LCVR) ili njegov fragment, koje antitelo, varijabilni region lakog lanca (LCVR) ili njegov fragment ima integrisana u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1 i SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0111] Takođe je opisano humanizovano antitelo, varijabilni region lakog lanca (LCVR) ili njegov
2
fragment, koje antitelo, varijabilni region lakog lanca (LCVR) ili njegov fragment ima integrisana u okvirne regione teškog lanca, izvedene od čoveka ili primata, najmanje dva peptida sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1 i SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0112] Takođe je opisano humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde i varijabilni region teškog lanca (HCVR) i varijabilni region lakog lanca (LCVR) mišjeg C2 antitela doprinose barem jedan od svojih CDR regiona u najmanje dva CDR regiona humanizovanog antitela. Rezultujuće humanizovano antitelo ili njegov fragment zbog toga mogu da sadrže
- najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 4 koja predstavlja CDR1 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1 koja predstavlja CDR1 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2 koja predstavlja CDR2 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:2 koja predstavlja CDR2 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:1 koja predstavlja CDR1 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 5 koja predstavlja CDR2 (LCVR); - najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 3 koja predstavlja CDR3 (HCVR) u kombinaciji sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 6 koja predstavlja CDR3 (LCVR).
[0113] Humanizovano antitelo prema ovom pronalasku može da sadrži konstantan region lakog lanca i/ili teškog lanca poreklom od čoveka ili primata.
[0114] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde je najmanje jedna, naročito najmanje jedna ali ne više od 5, naročito najmanje jedna ali ne više od 4, još određenije najmanje jedna ali ne više od 3, ali najodređenije najmanje jedna ali ne više od 2, od amino kiselina reprezentativnih za CDR regione lakog lanca i/ili teškog lanca kako su date u SEQ
2
ID NO: 1 - 6 izmenjena konzervativnom supstitucijom, tako da antitelo zadržava svoju punu funkcionalnost.
[0115] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde je u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR), CDR2, kako je dat u SEQ ID NO: 5, Lys u Kabatovom položaju 50 zamenjen aminokiselinskim ostatkom odabranim iz grupe koju čine Arg, Gln i Glu, naročito Arg.
[0116] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na varijabilni region lakog lanca (LCVR) gde je u CDR2, kako je dat u SEQ ID NO: 5, Lys na Kabatovom položaju 50 zamenjen aminokiselinskim ostatkom odabranim iz grupe koju čine Arg, Gln i Glu, naročito Arg.
U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde je u CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR), kako je dat u SEQ ID NO: 5, Ser na Kabatovom položaju 53 zamenjen aminokiselinskim ostatkom odabranim iz grupe koju čine Asn ili Thr, ali naročito Asn.
[0117] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na varijabilni region lakog lanca (LCVR) gde je u CDR2, kako je dat u SEQ ID NO: 5, Ser na Kabatovom položaju 53 zamenjen aminokiselinskim ostatkom odabranim iz grupe koju čine Asn ili Thr, ali naročito Asn.
[0118] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment, u kojem varijabilni region teškog lanca (HCVR) ima aminokiselinsku sekvencu 90%, posebno 95%, još određenije 98% identičnu sekvenci datoj u sekvencama SEQ ID NO: 15 i 16, respektivno.
[0119] U još jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment gde varijabilni region lakog lanca (LCVR) ima aminokiselinsku sekvencu 90%, posebno 95%, još određenije 98% identičnu sekvenci datoj u sekvencama SEQ ID NO: 12 i 13, respektivno.
U još jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment gde najmanje dva, ali naročito tri od CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) imaju aminokiselinsku sekvencu 90%, posebno 95%, još određenije 98% identičnu odgovarajućem CDR regionu kako je dat u SEQ ID NO: 1 - 3.
[0120] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment, gde najmanje dva, ali naročito tri od CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) imaju aminokiselinsku sekvencu 90%, posebno 95%, još određenije 98% identičnu odgovarajućem CDR regionu kako je dat u SEQ ID NO: 4 - 6.
2
[0121] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku, a kako je prethodno opisano, gde varijabilni region teškog lanca (HCVR) ima aminokiselinsku sekvencu 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu sekvenci datoj u SEQ ID NO: 15 i 16, respektivno.
[0122] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku, a kako je prethodno opisano, gde varijabilni region lakog lanca (LCVR) ima aminokiselinsku sekvencu 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu sekvenci datoj u SEQ ID NO: 12 i 13, respektivno.
[0123] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku, a kako je prethodno opisano, gde najmanje jedan, posebno najmanje dva, ali naročito tri od CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) imaju aminokiselinsku sekvencu 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu odgovarajućem CDR regionu kako je dat u SEQ ID NO: 1 - 3.
[0124] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku, a kako je prethodno opisano, gde najmanje jedan, posebno najmanje dva, ali naročito tri od CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) imaju aminokiselinsku sekvencu 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu odgovarajućem CDR regionu kako je dat u SEQ ID NO: 4 - 6.
[0125] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku, a kako je prethodno opisano, gde se najmanje jedna od aminokiselina reprezentativnih za akceptorske okvirne sekvence dobijene iz humanih VHi VKsekvenci embrionalne linije čoveka, respektivno menja supstitucijom u amino kiselinu iz odgovarajućeg regiona mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2 ili njenom konzervativnom supstitucijom.
[0126] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na varijabilni region teškog lanca i na humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz embrionalne linije VHčoveka, KABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Leu, norleucin, Ile, Val, Met, Ala i Phe, naročito Leu i Ile, ali naročito Leu, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15.
[0127] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na varijabilni region teškog lanca i na humanizovano antitelo koji
2
sadrže taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Arg na Kabatovom položaju 94 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz humane embrionalne linije VH, KABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Ser i Thr, ali naročito Ser kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15.
[0128] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i humanizovano antitelo koji sadrže taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz embrionalne linije VHčoveka, KABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Leu, norleucin, Ile, Val, Met, Ala i Phe, naročito Leu i Ile, ali je specijalno Leu i Arg na Kabatovom položaju 94 zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Ser i Thr, ali naročito Ser kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15.
[0129] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na varijabilni region lakog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region lakog lanca, respektivno, gde je Gln na Kabatovom položaju 45 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VK, KABAT-ove podgrupe VKII varijabilnog regiona lakog lanca zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Lys, Arg, Gln i Asn, naročito Lys i Arg, ali naročito Lys.
[0130] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na varijabilni region lakog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region lakog lanca, respektivno, gde je Tyr na Kabatovom položaju 87 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VKKABAT-ove podgrupe VKII varijabilnog regiona lakog lanca zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Phe, Leu, Val, Ile i Ala, naročito Leu i Phe, ali naročito Phe.
[0131] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na varijabilni region lakog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region lakog lanca, respektivno, gde je Lys na Kabatovom položaju 50 u CDR2 regionu dobijenom iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, zamenjen sa Arg.
[0132] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region lakog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region lakog lanca, respektivno, gde je Asn na Kabatovom položaju 53 u CDR2 regionu dobijenom iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, zamenjen sa Ser.
[0133] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Leu, norleucin, Ile, Val, Met, Ala i Phe, naročito Leu i Ile, ali naročito Leu, a Arg na Kabatovom položaju 94 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Ser i Thr, ali naročito Ser, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15, a Tyr na Kabatovom položaju 87 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VKKABAT-ove podgrupe VKII varijabilnog regiona lakog lanca zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Phe, Leu, Val, Ile i Ala, naročito Leu i Phe, a naročito Phe.
[0134] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15, zamenjen sa Leu.
[0135] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Arg na Kabatovom položaju 94 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca zamenjen sa Ser, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15.
[0136] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci, dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjen sa Leu i Ile, ali su naročito Leu i Arg na Kabatovom položaju 94 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjeni sa Ser, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15.
[0137] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region lakog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Tyr na Kabatovom položaju 87 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VKKABAT-ove podgrupe VKII varijabilnog regiona lakog lanca zamenjen sa Phe.
[0138] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i
1
humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca zamenjen sa Leu i Ile, ali posebno su Leu i Arg na Kabatovom položaju 94 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjeni sa Ser kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15, a Tyr je na Kabatovom položaju 87 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VKKABAT-ove podgrupe VKII varijabilnog regiona lakog lanca zamenjen sa Phe.
[0139] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci, dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Leu, norleucin, Ile, Val, Met, Ala i Phe, naročito Leu i Ilе, ali su posebno Leu i Arg na Kabatovom položaju 94 zamenjeni amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Ser i Thr, ali naročito Ser, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15, a gde je Lys na Kabatovom položaju 50 u CDR2 regionu dobijenom iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito mišjeg antitela ACl-01-Ab7C2, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Arg, Gln, His i Asn, ali naročito Arg.
[0140] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na varijabilni region teškog lanca i humanizovano antitelo koje sadrži taj varijabilni region teškog lanca, respektivno, gde je Trp na Kabatovom položaju 47 u akceptorskoj okvirnoj sekvenci, dobijenoj iz sekvenci embrionalne linije čoveka VHKABAT-ove podgrupe VHIII varijabilnog regiona teškog lanca, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Leu, norleucin, Ile, Val, Met, Ala i Phe, naročito Leu i Ile, ali naročito Leu, a Arg je na Kabatovom položaju 94 zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Ser i Thr, ali naročito Ser, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 i gde je Asn na Kabatovom položaju 53 u CDR2 regionu dobijenom iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2, zamenjen amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Ala, Val, Leu, Ser i Ile, ali naročito Ser. Opisan je varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 12. U još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 12.
[0141] Opisan je varijabilni region lakog lanca uključujući signalne sekvence, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13.
[0142] U drugom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano
2
antitelo koje sadrži ceo varijabilni region lakog lanca, uključujući signalne sekvence, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13.
[0143] U još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 12 i konstantni region lakog lanca SEQ ID NO: 14.
[0144] U još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano antitelo koje sadrži potpuni varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 13 i konstantni region lakog lanca SEQ ID NO: 14. Takođe je opisan varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 15.
[0145] U još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 15. Opisan je i varijabilni region teškog lanca koji uključuje signalne sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 16.
[0146] U još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je humanizovano antitelo koje sadrži ceo varijabilni region teškog lanca, ukljčujući signalne sekvence, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 16.
U još jednom primeru izvođenja obezbeđeno je humanizovano antitelo koje obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 15 i konstantni region teškog lanca SEQ ID NO: 17.
U još jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je humanizovano antitelo koje obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 16 i konstantni region teškog lanca SEQ ID NO: 17.
U jednom primeru izvođenja humanizovano antitelo prema ovom pronalasku i kako je ovde opisano, posle koinkubacije sa Aβ monomernim peptidom, koji ima najmanje 30, posebno najmanje 35, određenije najmanje 38, i još određenije najmanje 40 aminokiselnskih ostataka i/ili jednim polimernim rastvorljivim amiloid peptidom, Aβ, koji sadrži više pomenutih Aβ monomernih jedinica, ali naročito sa Aβ1-42monomernim i/ili Aβ polimernim rastvorljivim amiloid peptidom koji sadrži više pomenutih Aβ1-
42monomernih jedinica, posebno u odnosu molarne koncentracije antitela prema Aβ1-42od do 1:1000, naročito do 1:500, određenije do 1:300, čak još određenije do 1:200, ali naročito u odnosu molarne koncentracije od između 1:10 i 1:100, inhibira agregaciju Aβ monomera u visokomolekulske polimerne fibrile.
[0147] Posebno, koinkubacija antitela prema ovom pronalasku sa amiloid monomernim i/ili polimernim rastvorljivim amiloid peptidima izvodi se tokom 24 sata do 60 sati, naročito tokom 30 sati do 50 sati, posebno, tokom 48 sati, ali naročito tokom 24 sata, na temperaturi između 28°C i 40°C, naročito između 32°C i 38°C, određenije na 37°C.
[0148] U jednom specifičnom aspektu, koinkubacija sa amiloid monomernim i/ili polimernim rastvorljivim amiloid peptidima izvodi se tokom 24 sata na temperaturi od 37°C.
[0149] Posebno, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku uključujući sve njegove funkcionalne delove vezuje se za Aβ1-42monomerni peptid i/ili Aβ polimerni solubni amiloid peptid koji sadrži više pomenutih Aβ1-42monomernih jedinica i posle koinkubacije sa Aβ1-42monomernim peptidom i/ili Aβ polimernim rastvorljivim amiloid peptidom koji obuhvata više pomenutih Aβ1-42monomernih jedinica inhibira agregaciju Aβ monomera i/ili polimera u visokomolekulske fibrile.
[0150] U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku, uključujući sve njegove funkcionalne delove, inhibira agregaciju Aβ monomera i/ili Aβ rastvorljivih polimera koji sadrže više pomenutih Aβ monomernih jedinica, u visokomolekulske polimerne fibrile najmanje 50%, posebno najmanje 60%, posebno najmanje 65%, još određenije najmanje 75%, čak još određenije najmanje 80%, ali naročito najmanje 85%-90%, ili više, u poređenju sa odgovarajućim amiloid peptidnim monomerima inkubiranih u puferu (kontrola) u odnosu molarne koncentracije antitela prema Aβ1-42 od do 1:1000, naročito u odnosu molarne koncentracije između 1:10 i 1:100, ali naročito u odnosu molarne koncentracije 1:10.
[0151] U jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku uključujući sve njegove funkcionalne delove inhibira agregaciju Aβ monomera i/ili Aβ rastvorljivih polimera koji sadrže više pomenutih Aβ monomernih jedinica, u visokomolekulske polimerne fibrile najmanje 30% pri odnosu molarne koncentracije antitela prema Aβ1-42 od 1:100.
[0152] U drugom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku uključujući sve njegove funkcionalne delove inhibira agregaciju Aβ monomera i/ili Aβ rastvorljivih polimera koji sadrže više pomenutih Aβ monomernih jedinica, u visokomolekulske polimerne fibrile najmanje 80% pri odnosu molarne koncentracije antitela prema Aβ1-42 od 1:10.
[0153] Vezivanje antitela prema ovom pronalasku i kao što je ovde opisano, za amiloidogene monomerne i/ili polimerne peptide, ali naročito za amiloidni oblik (1-42) dovodi do inhibicije agregacije monomernih i/ili polimernih amiloidogenih peptida u visokomolekulske fibrile ili filamente. Inhibiranjem agregacije amiloidogenih monomernih i/ili polimernih peptida, antitela ovog pronalaska su u stanju da spreče ili uspore formiranje amiloidnih plakova, naročito amiloidnog oblika (1-42), za koji se zna da postaje nerastvoran promenom sekundarne konformacije i da je glavni deo amiloidnih plakova u mozgu obolelih životinja ili ljudi.
4
[0154] Potencijal inhibicije agregacije antitela prema ovom pronalasku može se odrediti bilo kojim odgovarajućim metodom poznatim u struci, naročito prvo ultracentrifugiranjem u gradijentima gustina, a zatim SDS-PAGE sedimentacionom analizom na već formiranim gradijentima i/ili tioflavin T (Th-T) fluorescentnim testom.
[0155] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na humanizovano antitelo kako je ovde opisano uključujući sve njegove funkcionalne delove, koje je antitelo, posle koinkubacije, naročito pri odnosu molarne koncentracije između 1:5 i 1:1000, naročito između 1:10 i 1:500, još određenije pri odnosu 1:10 do 1:300, čak još određenije pri odnosu 1:10 i 1:100, sa već formiranim visokomolekulskim polimernim amiloidnim fibrilima ili filamentima formiranim agregacijom Aβ monomernih peptida koji imaju najmanje 30, naročito bar 35, određenije najmanje 38, čak još određenije najmanje 40 aminokiselinskih ostataka i, ali naročito Aβ1-42monomernih peptida, u stanju da dezagregira formirane polimerne fibrile ili filamente najmanje 20%, naročito najmanje 30%, određenije najmanje 35%, čak još određenije 40%, ali naročito 50% ili više.
[0156] U jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, inhibicija agregacije i potencijal dezagregacije antitela, respektivno, određen je ultracentrifugiranjem u gradijentima gustina, a zatim SDS-PAGE sedimentacionom analizom na već formiranim gradijentima.
[0157] U drugom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, inhibicija agregacije i potencijal dezagregacije antitela, respektivno, određen je tioflavin T (Th-T) fluorescentnim testom.
[0158] U drugom specifičnom primeru izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku je koinkubirano sa već formiranim visokomolekulskim polimernim amiloidnim fibrilima ili filamentima tokom 12 sati do 36 sati naročito tokom 18 sati do 30 sati, određenije 24 sata na temperaturi između 28°C i 40°C, naročito između 32°C i 38°C, određenije na 37°C.
[0159] Određenije, koinkubacija sa već formiranim visokomolekulskim polimernim amiloidnim fibrilima ili filamentima vršena je tokom 24 sata na temperaturi 37°C.
[0160] U specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku uključujući sve njegove funkcionalne delove u stanju je da dezagregira prethodno formirane polimerne fibrile ili filamente najmanje 24% pri odnosu molarne koncentracije antitela prema Aβ1-42 od 1:100.
[0161] U još jednom specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku uključujući sve njegove funkcionalne delove u stanju je da dezagregira prethodno formirane polimerne fibrile ili filamente najmanje 32% pri odnosu molarne koncentracije antitela prema Aβ1-42 od 1:10.
[0162] Dezagregacijom amiloidogenih polimernih fibrila ili filamenata antitela prema ovom pronalasku su u stanju da spreče ili uspore formiranje amiloidnih plakova što dovodi do ublažavanja simptoma vezanih za oboljenje i odlaganje ili preokret u njegovom napredovanju.
[0163] Prema tome, još jedan primer izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi humanizovano antitelo uključujući sve njegove funkcionalne delove kako je ovde već opisano, koje antitelo je u stanju da smanji ukupnu količinu Aβ u mozgu životinje, naročito sisara, ali naročito čoveka koji pati od te bolesti ili stanja koje dovodi do povećane koncentracije Aβ u mozgu.
[0164] U još jednom primeri uzvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo prema ovom pronalasku i kako je ovde već opisano, koje antitelo je biefektivno po tome što ispoljava i osobinu inhibicije agregacije, kao i osobinu dezagregacije, naročito spojenu sa visokim stepenom konformacione osetljivosti.
[0165] Naročito, ovaj pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde već opisano, koje antitelo je, posle koinkubacije sa amiloid monomernim i/ili polimernim rastvorljivim amiloid peptidima, naročito sa β-amiloid monomernim peptidima kao što su, na primer, Aβ monomerni peptidi 1-39; 1-40, 1-41 ili 1-42, i/ili polimerni rastvorljivi β-amiloid peptid koji sadrži više pomenutih Aβ monomernih jedinica, ali naročito sa Aβ1-42monomernim i/ili Aβ polimernim rastvorljivim amiloid peptidom koji sadrži više pomenutih Aβ1-42monomernih jedinica, inhibira agregaciju Aβ monomera u visokomolekulske polimerne fibrile ili filamente i, uz to, posle koinkubacije sa već formiranim visokomolekulskim polimernim amiloidnim fibrilima ili filamentima nagrađenim agregiranjem amiloid monomernih peptida, naročito β-amiloid monomernih peptida, kao što su, na primer, Aβ monomerni peptidi 1-39; 1-40, 1-41 ili 1-42, ali naročito Aβ1-42monomerni peptidi, u stanju da dezagregira već formirane polimerne fibrile ili filamente.
[0166] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde već opisano, koje antitelo je u stanju da indukuje prelaz iz konformacije β-naboranih ploča u α-spiralu i/ili konformaciju nasumičnog namotaja, ali naročito nasumično ispresavijanu konformaciju, čak određenije u nasumično ispresavijanu konformaciju na datom mestu u molekulu, naročito u okruženju Tyr 10 i Val 12 Aβ proteina, što dovodi do povećanja nasumično ispresavijane konformacije na račun konformacije β-naboranih ploča i poboljšane rastvorljivosti već formiranih visokomolekulskih polimernih amiloidnih fibrila ili filamenata. Posebno, smanjenje konformacije β- naboranih ploča dostiže najmanje 30%, naročito najmanje 35%, i još neobičnije do najmanje 40% i više u poređenju sa već formiranim amiloidnim polimernim fibrilima ili filamentima inkubiranim u puferu (kontrola).
[0167] Potencijal antitela za indukovanje prelaza sekundarne strukture određen je 13C NMR spektroskopijom čvrstog stanja, ali, naročito, merenjem integralnih intenziteta konformacija Tyr 10 i Val 12 Cβ u Aβ1-42peptidu. Obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment, kako je ovde već opisano, koje sadrži najmanje jedan laki lanac ili njegov fragment ili najmanje jedan teški lanac ili njegov fragment, gde se pomenuto antitelo, ili fragment, vezuje za Aβ monomer sa visokim afinitetom vezivanja, sa KDu opsegu između najmanje od oko 1 x 10<-7>M do najmanje oko 1 x 10<-12>M, naročito najmanje oko 1 x 10<-8>M do najmanje oko 1 x 10<-11>M, određenije, od najmanje oko 1 x 10<-9>M do najmanje oko 1 x 10<-10>M, čak još određenije od najmanje oko 1 x 10<-8>M do najmanje oko 2 x 10<-8>M ali, prevashodno, ne pokazuju nikakvu značajnu unakrsnu reaktivnost sa prekursorskim proteinom amiloida (APP). Obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment, kako je ovde već opisano, koji sadrže najmanje jedan laki lanac ili njegov fragment ili najmanje jedan teški lanac ili njegov fragment, gde se pomenuto antitelo, ili fragment, vezuju za, Aβ vlakno, fibril ili filament sa visokim afinitetom vezivanja, sa KDu opsegu između od najmanje oko 1 x 10<-7>M do najmanje oko 1 x 10<-12>M, naročito od najmanje oko 1 x 10<-8>M do najmanje oko 1 x 10<-11>M, određenije od najmanje oko 1 x 10<-9>M do najmanje oko 1 x 10<-10>M, čak još određenije od najmanje oko 2 x 10<-9>M do najmanje oko 5 x 10<-9>M, ali, prevashodno, ne pokazuju nikakvu značajnu unakrsnu reaktivnost sa prekursorskim proteinom amiloida (APP).
[0168] U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo prema ovom pronalasku i kako je ovde već opisano ili njegov fragment ispoljavaju afinitet vezivanja za Aβ vlakno, fibril ili filament koji je najmanje 2 puta, naročito najmanje 4 puta, naročito najmanje 10 puta, naročito najmanje 15 puta, posebno najmanje 20 puta, ali naročito najmanje 25 puta više od afiniteta vezivanja za Aβ monomer.
[0169] U još jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde opisano, suštinski se vezuje za agregiran Aβ, uključujući Aβ plakove, u mozgu sisara, naročito čoveka ali, prevashodno, ne pokazuju nikakvu značajnu unakrsnu reaktivnost sa prekursorskim proteinom amiloida (APP). U drugom aspektu ovog pronalaska, humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde opisano, suštinski se vezuje za rastvorljiv polimeran amiloid, naročito amiloid β (Aβ), uključujući Aβ monomere, u mozgu sisara, naročito čoveka, ali, prevashodno, ne pokazuju nikakvu značajnu unakrsnu reaktivnost sa prekursorskim proteinom amiloida (APP).
[0170] Dalje je obezbeđeno humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde već opisano, koje antitelo značajno smanjuje opterećenje Aβ plakovima u mozgu sisara, naročito čoveka. Ovo se može postići ili vezivanjem antitela za plak, ili pomeranjem ravnoteže između amiloida, naročito amiloida β (Aβ), od njegovog nerastvorljivog i agregiranog stanja prema njegovom rastvorljivom obliku disagregiranjem vlakana u rastvorljive poli- i monomerne oblike izazivanjem promena konformacije i vezivanjem i stabilizovanjem dezagregiranih i rastvorenih oblika amiloida, naročito amilod β (Aβ) oblika, u tkivu i/ili telesnim tečnostima, naročito u mozgu. Stoga se pomoću aktivnosti antitela prema ovom pronalasku favorizuje periferni kliring i katabolizam više nego taloženje u tkivu i/ili telesnim tečnostima, naročito u mozgu. Blagotvoran efekat antitela prema ovom pronalasku može se tako dobiti bez vezivanja antitela za plak.
[0171] Stabilizacionom aktivnošću, antitelo prema ovom pronalasku je u stanju da neutrališe toksične efekte polimernog i manje agregiranog rastvorljivog amiloid proteina, naročito amiloid β (Aβ) proteina, u tkivu i/ili telesnim tečnostima. U jednom specifičnom aspektu, antitelo prema ovom pronalasku može tako da postigne svoje blagotvorne efekte, a da ne mora da se veže za agregirani beta amiloid u mozgu. Obezbeđeno je humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde već opisano, koje sadrži najmanje jedan laki lanac ili njegov fragment ili najmanje jedan teški lanac ili njegov fragment u koja su ugradena jedan, naročito dva i još određenije tri CDR regiona dobijena od donorskog mišjeg antitela, naročito iz mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2 (nazvanog "mC2" i hC2 za humanizovana C2 antitela u ovoj prijavi) deponovanog 01. decembra 2005. kod "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, pod pristupnim brojem DSM ACC2750, gde pomenuto antitelo ili njegov fragment ima afinitet za Aβ antigen koji je najmanje 5 puta, naročito najmanje 8 puta, određenije najmanje 10 puta, ali naročito najmanje 15 puta veći nego afinitet mišjeg donorskog antitela.
[0172] Antitelo ovog pronalaska može biti, u jednom primeru izvođenja, celo antitelo (npr., sa dva laka lanca celokupne dužine i dva teška lanca celokupne dužine) bilo kog izotipa i podtipa (npr., IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1 i IgA2); ali naročito antitelo lgG4 izotipa; alternativno, u jednom drugom primeru izvođenja, može da bude antigen-vezujući fragment (npr., Fab, F(ab')2i Fv) celog antitela.
[0173] Stoga se ovaj pronalazak takođe odnosi i na fragmente antitela opisane ovde. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, fragment se bira od grupe koju čine Fab fragment, Fab' fragment, F(ab)2fragment, i Fvfragment, uključujući proizvode ekspresione biblioteke Fab imunoglobulina i fragmenata koji se vezuju za epitop bilo kog dosad spomenutog antitela.
[0174] U jednom drugom primeru izvođenja, antitelo ovog pronalaska ili antigen-vezujući fragment konjuguje se sa polietilen glikolom. U jednom drugom primeru izvođenja, konstantan region antitela ovog pronalaska se modifikuje tako što smanjuje, u odnosu na nemodifikovano antitelo, najmanje jednu biološku efektorsku funkciju koja se ostvaruje preko konstantnog regiona. U još jednom drugom primeru izvođenja, antitelo ovog pronalaska ili antigen-vezujući fragment sadrži Fc region izmenjene efektorske funkcije.
[0175] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na nukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kako je ovde dosad opisano.
[0176] Naročito, ovaj pronalazak odnosi se na nukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira kontinuirani niz molekula amino kiselina kako je dat u SEQ ID NO: 2 i 3, respektivno, ili komplementarnu sekvencu koja predstavlja regione koji određuju komplementarnost (CDR) 2 i 3 varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0177] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na nukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira kontinuirani niz molekula amino kiselina kako je dat u SEQ ID NO: 4, ili komplementarnu sekvencu koja predstavlja regione koji određuju komplementarnost (CDR) 1 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0178] U drugom aspektu obezbeđen je nukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu kako je data u SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19, ili komplementarnu sekvencu, koja kodira aminokiselinsku sekvencu CDR 2 i CDR 3, respektivno, varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR).
[0179] U drugom aspektu obezbeđen je nukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu kako je data u SEQ ID NO: 20, ili komplementarnu sekvencu, koja kodira aminokiselinsku sekvencu CDR 1 varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR).
[0180] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, nukleotidni molekul prema ovom pronalasku obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 21, ili komplementarnu sekvencu, koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca.
[0181] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, nukleotidni molekul prema ovom pronalasku obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 22, ili komplementarnu sekvencu, koja kodira potpun varijabilni region lakog lanca, uključujući signalne sekvence.
[0182] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, nukleotidni molekul prema ovom pronalasku obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 22 i konstantan region lakog lanca SEQ ID NO: 23.
[0183] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, nukleotidni molekul prema ovom pronalasku obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 24 koja kodira varijabilni region teškog lanca.
[0184] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, nukleotidni molekul prema ovom pronalasku obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 25 koja kodira potpun varijabilni region teškog lanca uključujući signalne sekvence.
[0185] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska dat je nukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 25 i konstantan region teškog lanca SEQ ID NO: 26. Ovaj pronalazak uključuje takođe i komplementarni lanac datog nukleotidnog molekula.
[0186] Ovde je uključena i nukleotidna sekvenca koja hibridizuje sa jednom od gore opisanih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitelo ovog pronalaska, naročito sa njenim komplementarnim lancem, bilo da je izolovan, bilo da je deo većeg nukleotidnog molekula.
[0187] Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje, pri uobičajenim uslovima hibridizacije, naročito u strogim uslovima hibridizacije, bilo sa kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 18-26 i 29 - 32, naročito sa njihovim komplementarnim lancima.
[0188] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska dat je ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku. U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska data je ćelija koja sadrži ekspresioni vektor sa nulkleinskom kiselinom prema ovom pronalasku. U jednom drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo prema ovom pronalasku, ali naročito himerno antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i kao što je ovde već navedeno, uključujući svako funkcionalno ekvivalentno antitelo ili bilo koji njegov derivat ili funkcionalne delove u terapeutski efektivnim količinama, naročito kompoziciju koja predstavlja farmaceutsku kompoziciju i koja opciono sadrži i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, pomenuta kompozicija obuhvata antitelo u terapeutski efikasnoj količini.
[0189] Ovim pronalaskom je dalje obuhvaćena mešavina koja sadrži humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku uključujući njihov bilo koji funkcionalni deo u terapeutski efikasnoj količini i opciono, još neku biološki aktivnu supstancu i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač
4
i/ili neki ekscipijens.
[0190] Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na mešavinu u kojoj je dalja biološki aktivna supstanca jedinjenje koje se koristi za lečenje amiloidoza, grupu bolesti i poremećaja vezanih za amiloid ili njemu sličan protein, kao što je Aβ protein uključen u Alchajmerovu bolest.
[0191] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, druga biološki aktivna supstanca ili jedinjenje može takođe da bude terapeutski agens koji se može koristiti u tretiranju amiloidoza izazvanih amiloidom β ili se može koristiti u lečenju drugih neuroloških poremećaja.
[0192] Druga biološki aktivna supstanca ili jedinjenje može da ispolji svoj biološki efekat preko istog ili sličnog mehanizma kao i antitelo ovog pronalaska ili preko nekog nepovezanog mehanizma delovanja ili višestrukim srodnim i/ili nesrodnim mehanizmima delovanja.
[0193] Generalno, drugo biološki aktivno jedinjenje može da uključuje poboljšivač transmisije neutrona, psihoterapijske lekove, inhibitore holin esteraze, blokatore kalcijumovih kanala, biogene amine, benzodijazepinske trankvilizatore, sintezu acetilholina, skladištenje ili oslobađanje poboljšivača, agoniste acetilholinskog postsinaptičkog receptora, inhibitore monoamin oksidaza -A ili -B, agoniste receptora N-metil-D-aspartat glutamata, nesteroidne antiinflamatorske lekove, antioksidante i antagoniste serotonergičnog receptora.
[0194] Specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na mešavinu koja sadrži najmanje jedno jedinjenje odabrano od grupe koju čine jedinjenja efikasna protiv oksidativnog stresa, antiapoptotična jedinjenja, helatori metala, inhibitori popravke DNK, kao što je pirenzepin i metaboliti, 3-amino-1-propansulfonska kiselina (3APS), 1,3-propandisulfonat (1,3PDS), aktivatori α-sekretaze, inhibitori β- i y-sekretaze, tau proteini, neurotransmiter, razbijači β-naboranih ploča, atraktanti kliringa/uklanjanja beta amiloida ćelijskih komponenti, inhibitori beta amiloida skraćenog sa N-kraja, uključujući piroglutaminovan beta amiloid 3- 42, anti-inflamatorni molekuli, ili inhibitori holinesteraze (ChEIs) kao što su takrin, rivastigmin, donepezil, i/ili galantamin, agonisti M1 i drugi lekovi, uključujući sve lekove koji modifikuju amiloid ili tau i nutritivne dodatke, kao i nutritivne dodatke, zajedno sa nekim antitelom prema ovom pronalasku i, opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač, i/ili razblaživač i/ili neki ekscipijens.
[0195] Pronalazak se, dalje, odnosi na mešavinu u kojoj je jedinjenje inhibitor holinesteraze, (ChEIs), naročito na mešavinu u kojoj je jedinjenje neko jedinjenje odabrano iz grupe koju čine takrin, rivastigmin, donepezil, galantamin, nijacin i memantin.
[0196] U drugom primeru izvođenja, mešavina prema ovom pronalasku može da sadrži nijacin ili memantin zajedno sa nekim antitelom prema ovom pronalasku i, opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač, i/ili razblaživač i/ili neki ekscipijens.
[0197] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđene su mešavine koje sadrže „atipične antipsihotike“, kao što su, na primer, klozapin, ciprasidon, risperidon, aripiprazol ili olanzapin za tretiranje pozitivnih i negativnih psihotičnih simptoma, uključujući halucinacije, deluzije, poremećaje u mišljenju (koji se manifestuju vidnom inkoherencijom, iskliznućima, tangencijalnošću), i bizarno ili neorganizovano ponašanje, kao što su anhedonija, zaravnjeni afekt, apatija i socijalno povlačenje, zajedno sa nekim antitelom, naročito monoklonskim antitelom prema ovom pronalasku, ali naročito himernim antitelom ili njegovim fragmentom, ili humanizovanim antitelom ili njegovim fragmentom, prema ovom pronalasku i kao što je ovde već navedeno i, opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač, i/ili razblaživač i/ili neki ekscipijens.
[0198] U specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, kompozicije i mešavine prema ovom pronalasku obuhvataju antitelo i biološki aktivnu supstancu, respektivno, u terapeutski efektivnoj količini.
[0199] Druga jedinjenja koja se mogu pogodno koristiti u mešavinama, u kombinaciji sa antitelom prema ovom pronalasku opisana su u WO 2004/058258 (vidi naročito str.16 i 17), uključujući mete terapeutskih lekova (str.36-39), alkansulfonske kiseline i alkanolsumporne kiseline (str.39-51), inhibitore holinesteraze (str.51-56), antagonist receptora NMDA (str.56-58), estrogene (str.58-59), nesteroidne antiinflamatorne lekove (str.60-61), antioksidante (str.61-62), receptore aktivirane peroksizomnim proliferatorima (PPAR), agoniste (str.63-67), agense koji snižavaju holesterol (str.68-75); inhibitore amiloida (str.75-77), inhibitore formiranja amiloida (str.77-78), helatore metala (str.78-79), antipsihotike i antidepresante (str.80-82), nutritivne dodatke (str.83-89) i jedinjenja koja povećavaju raspoloživost biološki aktivnih supstanci u mozgu (videti str.89-93) i prolekove (str.93 i 94).
[0200] U drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na mešavinu koja sadrži antitelo, naročito monoklonsko antitelo, prema ovom pronalasku, ali naročito himerno antitelo ili njegov fragment, ili humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku i, kao što je ovde već navedeno, i/ili biološki aktivnu supstancu u terapeutski efektivnoj količini.
[0201] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta prema ovom pronalasku i, kao što je ovde već navedeno, i/ili njegovog funkcionalnog dela i/ili na farmaceutsku kompoziciju ili mešavinu koja sadrži redeno antitelo, za dobijanje medikamenta za ublažavanje efekata amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, kao što su bolesti, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, neurološki poremećaji kao što su Alchajmerova bolest, (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (holandski tip); kompleks Guam dcmencije s parkinsonizmom; kao i druga oboljenja zasnovana na, ili vezana za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza; Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tipa 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori i druge, uključujući degeneraciju makule.
[0202] Takođe, ovim pronalaskom obuhvaćen je metod za pripremanje humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta prema ovom pronalasku, i/ili njegovog funkcionalnog dela, i/ili farmaceutskog sastava, ili mešavine koja sadrži pomenuto antitelo i/ili njegov funkcionalni deo, naročito u terapeutski efektivnoj količini za korišćenje u metodu za sprečavanje, lečenje ili ublažavanje efekata amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, kao što su bolesti, uključujući, ali se ne ogranićavajući njima, neurološki poremećaji kao što su Alchajmerova bolest, (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i druga oboljenja zasnovana na, ili vezana za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza; Krojcfeld- Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tipa 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori i druge, uključujući degeneraciju makule, koji sadrži formulisanje humanizovanog antitela, ili njegovog fragmenta, prema ovom pronalasku u farmaceutski prihvatljivom obliku.
[0203] Dalje je ovim pronalaskom obuhvaćeno humanizovano antitelo i/ili njegov funkcionalan deo ili kompozicija ili mešavina koja obuhvata takvo antitelo i/ili njegov funkcionalni deo za upotrebu u metodu za sprečavanje, lečenje ili ublažavanje efekata amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, kao što su bolesti, uključujući, ali se ne ogranićavajući njima, neurološki poremećaji kao što su Alchajmerova bolest, (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i druga oboljenja zasnovana na, ili vezana za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza; Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tipa 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori i druge, uključujući degeneraciju makule, što obuhvata davanje tog antitela u terapeutski efikasnoj količini životinji ili čoveku pogođenom takvim oboljenjem.
4
[0204] Takođe, cilj ovog pronalaska je lečenje amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, ncurološke poremećaje kao što su Alchajmerova bolest, (AD), naročito oboljenje ili stanje koje karakteriše gubitak kapaciteta kognitivne memorije, davanjem životinji, posebno sisaru ili čoveku, humanizovanog antitela, posebno farmaceutskog sastava prema ovom pronalasku i kao što je ovde već opisano.
[0205] U specifičnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na zadržavanje ili povećanje kapaciteta kognitivne memorije, ali naročito za obnavljanje kapaciteta kognitivne memorije životinje, posebno sisara ili čoveka koji pati od gubitka pamćenja, koji se sastoji u davanju životinji, posebno sisaru ili čoveku, humanizovanog antitela, naročito farmaceutskog sastava prema ovom pronalasku. Dalji cilj ovog pronalaska je da se obezbedi terapeutska kompozicija i lečenje amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, neurološke poremećaje kao što su Alchajmerova bolest, (AD), naročito oboljenje ili stanje koje karakteriše gubitak kapaciteta kognitivne memorije, koristeći neko antitelo prema ovom pronalasku i kao što je ovde već opisano.
[0206] Naročito, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu humanizovanog antitela prema ovom pronalasku u metodi za lečenje neke životinje, naročito sisara ili čoveka, koji pate od stanja vezanog za amiloid, koje karakteriše gubitak kapaciteta kognitivne memorije, koji metod dovodi do zadržavanja kapaciteta kognitivne memorije.
[0207] Ovaj pronalazak dalje se odnosi na metod dijagnostikovanja oboljenja vezanog za amiloid ili stanje pacijenta, koji se sastoji u detektovanju imunospecifičnog vezivanja nekog antitela ili njegovog aktivnog fragmenta za epitop amiloidnog proteina u uzorku ili in situ, što uključuje sledeće stupnjeve (a) dovođenje u kontakt uzorka ili specifičnog dela tela ili površine tela za koje se sumnja da sadrži amiloidni protein sa humanizovanim antitelom ili njegovim fragmentom prema ovom pronalasku i/ili njegovim funkcionalnim delom, a koje se antitelo vezuje za epitop amiloidnog proteina;
(b) omogućavanje antitelu i/ili njegovom funkcionalnom delu da se veže za amiloidni protein i formira imunološki kompleks;
(c) detektovanje formiranja imunološkog kompleksa i
(d) korelisanje prisustva ili odsustva imunološkog kompleksa sa prisustvom ili odsustvom amiloidnog proteina u uzorku ili specifičnom delu tela ili površine.
[0208] Pronalazak se takođe odnosi na metod određivanja veličine opterećenja amiloidogenim plakovima u tkivu i/ili telesnim tečnostima, što obuhvata
(a) testiranje tkiva i/ili uzorka telesne tečnosti na prisustvo amiloidnog proteina humanizovanim antitelom ili njegovim fragmentom prema ovom pronalasku i/ili njegovog funkcionalnog dela;
(b) ođređivanje količine antitela vezanog za taj protein; i
(c) izračunavanje opterećenja plakovima u tkivu ili uzorku telesne tečnosti.
[0209] Naročito je formiranje imunološkog kompleksa u stupnju b određeno tako da prisustvo ili odsustvo imunološkog kompleksa koreliše sa prisustvom ili odsustvom amiloid proteina.
[0210] U drugom primeru izvođenja ovog pronalaska dat je komplet za detekciju i dijagnostikovanje bolesti i stanja vezanih za amiloid, koji sadrži humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku, i/ili njegovog funkcionalnog dela.
[0211] Posebno, ovaj pronalazak odnosi se na komplet za ispitivanje detekcije i dijagnozu bolesti i stanja povezanih sa amiloidom, koji obuhvata pakovanje sa jednim ili dva antitela prema ovom pronalasku, i/ili njegov funkcionalni deo, i uputstva za korišćenje antitela za vezivanje za amiloidni protein da bi formirao imunološki kompleks i detektovanje formiranja imunološkog kompleksa tako da prisustvo ili odsustvo imunološkog kompleksa korelira sa prisustvom ili odsustvom amiloidnog proteina.
[0212] U drugom aspektu, prikazano je ovde antitelo koje sadrži varijabilni region naveden u SEQ ID NO: 27, ili njegova varijanta. U jednom aspektu, ćelijska linija koja eksprimira to antitelo.
[0213] U drugom aspektu, prikazan je ovde gen za antitelo, koji sadrži varijabilni region naveden u SEQ ID NO: 29, ili njegova varijanta. U jednom aspektu, ćelijska linija koja eksprimira to antitelo.
[0214] U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na metod za dezagregaciju formiranih betaamiloidnih vlakana, koji obuhvata interreagovanje nekog hC2 antitela sa prethodno formiranim betaamiloidnim vlaknima.
[0215] U drugom aspektu, humanizovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku štite neurone od degradacije izazvane Abeta.
[0216] U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na prevenciju degradacije neurona izazvane Abeta koji obuhvata tretiranje neurona efikasnom količinom humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta, prema ovom pronalasku.
4
[0217] U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na upotreba humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta prema ovom pronalasku ovde za dobijanje lekova za sprečavanje degeneracije neurona posle izlaganja Abeta oligomeru.
KRATAK OPIS SLIKA I SEKVENCI
[0218]
FIG.1 (Primer 2): Ekspresiona kaseta varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg himernog antitela FIG.2 (Primer 2): Ekspresiona kaseta varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg himernog antitela FIG.3 (Primer 5.2): Poređenje varijabilnog regiona teškog lanca sa najbližom sekvencom mišje embrionalne linije
FIG.4 (Primer 8): Aktivnost prečišćenih humanizovanih C2 antitela
FIG.5 (Primer 9): Vezivna aktivnost antitela proizvedenih prolaznom ekspresijom C2 modifikovanih CDR12 konstrukata povezanih sa C2 himernim teškim lancem u poređenju sa himernim antitelom C2ChVHAF/ChVK, dobijenim prolaznom transfekcijom i prečišćenim antitelom.
FIG.6 (Primer 11): Rezultati imunohistohemijskog vezivnog testa sa himernim antitelom AF i humanizovanim antitelom H4K1.
FIG.7 (Primer 12): Funkcionalnost mC2 na amiloidnim vlaknima
FIG.8 (Primer 12): Afinitet vezivanja C2 u ELISA testu.
FIG.9 (Primer 14): Konformaciono specifično vezivanje mC2 za različite klase amiloidnog proteina. Pripremanje peleta dato u legendi ove slike odnosi se na vlakna Aβ1-42, dobijanje supernatanta odnosi se na monomere amiloida.
FIG.10: Humanizovane C2 VK sekvence upoređene sa mišjom sekvencom i akceptorskim sekvencama čoveka DPK15 i JK1
FIG.11: Humanizovane C2 VH sekvence upoređene sa mišjom sekvencom i akceptorskim sekvencama čoveka DP54 i JH6
FIG.12: Potpune DNK i proteinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca C2 humanizovanog antitela, C2HuVKl
FIG.13: Potpune DNK i proteinske sekvence konstantnog regiona lakog lanca (humana C Kapa) humanizovanog C2 antitela.
FIG.14: Potpune DNK i proteinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca (humani IgG4 ser228-pro) humanizovanog C2 antitela
FIG.15A-C (Primer 15): Rezultati eksperimenata mapiranja epitopa
FIG.16 (Primer 13): Rezultati eksperimenata sa probama agregiranja
FIG.17 (Primer 13): Rezultati eksperimenata sa probama dezagregiranja
FIG.18: (Primer 16): Rezultati eksperimenata sa zaštitom neurona humanizovanim antitelom C2.
4
SEQ ID NO: 1 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVH AF 4 humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca (CDR1)
SEQ ID NO: 2 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVH AF 4 humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca (CDR2)
SEQ ID NO: 3 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVH AF 4 humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca (CDR3)
SEQ ID NO: 4 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVK 1 humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca (CDR1) SEQ ID NO: 5 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVK 1 humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca (CDR2)
SEQ ID NO: 6 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVK 1 humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca (CDR3)
SEQ ID NO: 7 Aminokiselinska sekvenca Aβ regiona 2 epitopa
SEQ ID NO: 8 Aminokiselinska sekvenca Aβ regiona 1 epitopa
SEQ ID NO: 9 Aminokiselinska sekvenca Aβ modifikovanog regiona 2 epitopa
SEQ ID NO: 10 Aminokiselinska sekvenca Aβ modifikovanog regiona 1 epitopa
SEQ ID NO: 11 Aminokiselinska sekvenca modifikovanog celog regiona epitopa
SEQ ID NO: 12 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVK 1 humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca
SEQ ID NO: 13 Aminokiselinska sekvenca C2 humanizovanog lakog lanca
SEQ ID NO: 14 Aminokiselinska sekvenca konstantnog regiona humanizovanog C2 lakog lanca SEQ ID NO: 15 Aminokiselinska sekvenca C2 HuVH AF 4 humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca
SEQ ID NO: 16 Aminokiselinska sekvenca C2 humanizovanog teškog lanca
SEQ ID NO: 17: Aminokiselinska sekvenca modifikovanog C regiona IG GAMA-4 lanca
SEQ ID NO: 18: Nukleotidna sekvenca CDR2 iz C2 HuVH AF 4 humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca
SEQ ID NO: 19: Nukleotidna sekvenca CDR3 iz C2 HuVH AF 4 humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca
SEQ ID NO: 20: Nukleotidna sekvenca CDR1 iz C2 HuVK 1 humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca
SEQ ID NO: 21: Nukleotidna sekvenca C2 HuVK 1 humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 22: Nukleotidna sekvenca C2 humanizovanog lakog lanca
SEQ ID NO: 23: Nukleotidna sekvenca C2 humanizovanog konstantnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 24: Nukleotidna sekvenca C2 HuVH AF 4 humanizovanog konstantnog regiona teškog lanca
SEQ ID NO: 25: Nukleotidna sekvenca C2 humanizovanog teškog lanca
4
SEQ ID NO: 26: Nukleotidna sekvenca C2 humanizovanog konstantnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 27: Aminokiselinska sekvenca C2 varijabilnog regiona lakog lanca miša
SEQ ID NO: 28: Aminokiselinska sekvenca C2 varijabilnog regiona teškog lanca miša
SEQ ID NO: 29: Nukleotidna sekvenca C2 varijabilnog regiona lakog lanca miša
SEQ ID NO: 30: Nukleotidna sekvenca C2 lakog lanca miša
SEQ ID NO: 31: Nukleotidna sekvenca C2 varijabilnog regiona teškog lanca miša
SEQ ID NO: 32: Nukleotidna sekvenca C2 lakog lanca miša
DEFINICIJE
[0219] Termini "polipeptid", "peptid", i "protein", kako se ovde koriste, međusobno su razmenljivi i označavaju biološki molekul sastavljen od amino kiselina povezanih peptidnom vezom.
[0220] Izraz "bolesti i poremećaji izazvani ili povezani sa amiloidom ili amiloidu sličnim proteinima " uključuju, ali se ne ograničavaju njima, bolesti i poremećaje izazvane prisustvom ili aktivnošću amiloid proteina u stanju monomera, fibrila, ili polimera, ili bilo u kojoj kombinaciji ta tri stanja. Te bolesti i poremećaji uključuju, ali se ne ograničavaju njima, amiloidozu, endokrine tumore, i degeneraciju makule.
[0221] Termin "amiloidoza" odnosi se na grupu bolesti i poremećaja vezanih za formiranje amiloidnih plakova, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, sekundarnu amiloidozu i staračku amiloidozu, kao što su bolesti, uključujući, ali i ne ograničavajući se njima, neurološki poremećaji kao što je Alchajmerova bolest (AD), uključujući bolesti ili stanja koja se karakterišu gubitkom kapaciteta kognitivne memorije, kao što je, na primer, blago kognitivno oštećenje (MCI), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (Holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i druge bolesti zasnovane na, ili vezane za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza, Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tip 2; senilna amiloidoza srca, različite bolesti oka, kao što je degeneracija makule, optička neuropatija vezana za druze, i katarakta nastala taloženjem beta-amiloida.
[0222] Termini "detektovanje" ili "detektovan" kako se ovde koriste, znače korišćenje poznatih tehnika za detekciju bioloških molekula, kao što su imunohemijski ili histološki metodi i odnose se na kvalitativno ili kvantitativno određivanje prisustva ili koncentracije ispitivanog biomolekula.
[0223] "Polimerni rastvorljivi amiloid" odnosi se na više agregiranih monomera amiloidnih peptida ili peptida sličnih amiloidu ili modifikovane ili nepotpune amiloidne peptide ili druge derivate amiloidnih
4
peptida koji formiraju oligomerne ili polimerne strukture koje su rastvorljive u telu sisara ili čoveka, određenije u mozgu, ali naročito na višestruko agregirane monomere β amiloida (Aβ) ili modifikovane ili nepotpune β amiloidne (Aβ) peptide ili njihove derivate koji su rastvorljivi u telu sisara ili čoveka, određenije u mozgu.
[0224] "Amiloid β, Aβ ili β-amiloid" je termin priznat u struci i odnosi se na amiloid β proteine i peptide, prekursor amiloid β proteina (APP), kao i njegove modifikacije, fragmente i bilo koje funkcionalne ekvivalente. Naročito, pod amiloid β, kako se ovde koristi, podrazumeva se bilo koji fragment dobijen proteolitičkim razlaganjem APP, ali naročito oni fragmenti koji učestvuju, ili su povezani sa amiloidnim patologijama uključujući, ali se ne ograničavajući njima, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41, Aβ1-42i Aβ1-43.
[0225] Struktura i sekvenca amiloidnih β peptida, kao što je spomenuto, dobro su poznati dobrim stručnjacima i metodi za dobijanje pomenutih peptida ili njihovo ekstrahovanje iz mozga i drugih tkiva opisani su na primer, u Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm129, 885-890 (1984). Šta više, β amiloidni peptidi su komercijalno na raspolaganju u različitim oblicima.
[0226] Pod "izolovanim" podrazumeva se biološki molekul oslobođen bar od nekih komponenti sa kojima se prirodno nalazi.
[0227] Termini "antitelo" ili "antitela", kako se ovde koriste, su termini priznati u struci i podrazumeva se da se odnose na molekule ili aktivne fragmente molekula koji se vezuju za poznate antigene, naročito za imunoglobulinske molekule i za imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj., molekule koji sadrže vezno mesto koje specifično vezuje neki antigen. Imunoglobulin je protein koji sadrži jedan ili više polipeptida koje uglavnom kodiraju geni za konstantne regione kapa i lambda, alfa, gama, delta, epsilon i mi imunoglobulina, kao i mnošvo gena za varijabilne regione imunoglobulina. Laki lanci se klasifikuju kao kapa ili lambda. Teški lanci se klasifikuju kao gama, mi, alfa, delta, ili epsilon, koji sa svoje strane definišu klase imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, respektivno. Poznate su i subklase teških lanaca. Na primer, IgG teški lanci čoveka mogu pripadati nekoj od subklasa IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
Imunoglobulini prema ovom pronalasku mogu biti bilo koje klase (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA i IgY) ili subklase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) imunoglobulinskih molekula.
[0228] Kako se ovde koristi, "specifično se vezuje", kada se poziva na neko antitelo, znači da se antitelo vezuje za svoj ciljni antigen većim afinitetom nego što se vezuje za strukturno različit antigen(e).
[0229] Zna se da, tipično, strukturnu jedinicu imunoglobulina čini tetramer. Svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, od kojih svaki par ima jedan „lak“ (oko 25 kD) i jedan „težak“
4
lanac (oko 50-70 kD). N-kraj svakog lanca definiše varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino kiselina koje su najviše odgovorne za prepoznavanje antigena. Termini varijabilan lak lanac (VL) i varijabilan težak lanac (VH) odnosi se na ove lake, odnosno teške lance.
[0230] Antitela postoje kao intaktna antitela pune dužine ili kao niz dobro okarakterisanih fragmenata dobijenih digestijom različitim peptidazama ili hemikalijama. Tako, na primer, pepsin digerira neko antitelo ispod disulfidnih veza u zglobnom regionu i stvara F(ab')2, dimer Fab koji je, u stvari, lak lanac spojen za VH-CH1disulfidnom vezom. F(ab')2se može redukovati pod blagim uslovima da se raskinu disulfidne veze u zglobnom regionu, čime se F(ab')2dimer prevodi u Fab’ monomer. Monomer Fab' je uglavnom Fab fragment sa delom zglobnog regiona (videti, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), za detaljniji opis fragmenata antitela). Dok se različiti fragmenti antitela definišu kao proizvodi digestije intaktnog antitela, vešt stručnjak zna da se bilo koja vrsta fragmenata antitela može sintetisati de novo bilo hemijskim putem, bilo korišćenjem metodologije rekombinantne DNK. Stoga termin antitelo, kako se ovde koristi, uključuje i fragmente antitela dobijene ili modifikacijom celih antitela, ili sintetisanjem de novo, ili antitela i fragmente dobijene korišćenjem metodologije rekombinantne DNK.
[0231] U okviru ovog pronalaska namera je da "antitela" uključe monoklonska antitela, poliklonska antitela, himerna, jednolančana, bispecifična, simijanizovana, humana i humanizovana antitela, kao i njihove fragmente. Primeri aktivnih fragmenata molekula koji se vezuju za poznate antigene uključuju razdvojene lake i teške lance, fragmente Fab, Fab/c, Fv, Fab', i F(ab')2, uključujući proizvode ekspresione biblioteke Fab imunoglobulina i fragmente bilo kog spomenutog antitela ili fragmenta, koji vezuju epitop.
[0232] Ovi aktivni fragmenti mogu se dobiti iz nekog antitela ovog pronalaska brojnim tehnikama. Na primer, monoklonska antitela mogu se iseći nekim enzimom, kao što je pepsin, i podvrgnuti HPLC gel filtraciji. Odgovarajuća frakcija koja sadrži Fab fragmente može se zatim sakupiti i koncentrovati filtracijom na membrani i slično. Za dalji opis opštih tehnika za izolovanje aktivnih fragmenata antitela vidi, na primer, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med.23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.
[0233] Rekombinantno dobijena antitela mogu biti konvencionalna antitela, pune dužine, aktivni fragmenti antitela poznata iz proteolitičkih digestija, jedinstveni aktivni fragmenti antitela, kao što su Fv ili jednolančani Fv (scFv), antitela sa deletiranim domenima, i slično. Jedno Fv antitelo je veličine oko 50 Kd i sadrži varijabilne regione lakog i teškog lanca. Jednolančani polipeptid Fv ("scFv") je kovalentno povezan VH::VL heterodimer, koji može biti eksprimovan sa nukleinske kiseline, uključujući sekvence koje kodiraju VH i VL, ili direktno povezane ili povezane peptidom koji kodira spojnica. Videti Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883. Postoji čitav niz struktura koje prevode prirodno agregirane, ali hemijski odvojene lake i teške polipeptidne lance od V regiona antitela u scFv molekul, koji će se upakovati u trodimenzionalnu strukturu, uglavnom sličnu strukturi mesta koje vezuje antigen. Videti, npr., U.S. Patent Nos.5,091,513, 5,132,405 i 4,956,778.
[0234] Mesto kombinovanja odnosi se na deo nekog antitela koje učestvuje u vezivanju antigena. Vezno mesto za antigen formira se od N-terminalnih aminokiselinskih ostataka varijabilnih ("V") regiona teških ("H") i lakih ("L") lanaca. Varijabilni regioni antitela imaju tri jako divergentna niza koja se nazivaju "hipervarijabilni regioni" ili "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR), koji su umetnuti između konzervisanijih bočnih sekvenci, poznatih kao „okvirni regioni" (FR). U molekulu antitela tri hipervarijabilna dela lakog lanca, (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) su međusobno raspoređeni tako u trodimenzionalnom prostoru da formiraju površinu, ili džep, koja vezuje antigen. Prema tome, mesto kombinovanja antitela predstavlja amino kiseline koje čine CDR-ove nekog antitela i sve amino kiseline okvirnog regiona koje formiraju vezno mesto u džepu.
[0235] Identitet aminokiselinskih ostataka u određenom antitelu koji formiraju mesto kombinovanja može se odrediti primenom metoda dobro poznatih u struci. Na primer, CDR-ovi antitela mogu se identifikovati kao hipervarijabilni regioni kako su prvobitno predložili Kabat i dr. (videti, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G i Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu). Položaji CDR-ova mogu se identifikovati kao strukture u vidu petlje, kakve su prvobitno opisali Chothia i drugi, (videti Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989), i Tramontano et al., J. Mol. Biol.215, 175 (1990)). Drugi metodi uključuju "AbM definiciju" koja predstavlja kompromis između Kabata i Chothia i izvedena je korišćenjem progama za modelovanje antitela Oxford Molecular's AbM antibody modeling software (sada Accelrys)) ili "kontaktnu definiciju" CDR-ova koju su predložili Macallum et al., ("Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J Mol Biol.1996 Oct 11;262(5):732-45). Sledeća tabela identifikuje CDR-ove na osnovu različitih poznatih definicija.
1
Opšte smernice pomoću kojih se mogu identifikovati CDR-ovi u nekom antitelu samo na osnovu sekvence su sledeće:
LCDR1:
Start - približno ostatak 24.
Ostatak pre je uvek Cys.
Ostatak posle je uvek Trp. Tipično, posle TRP dolazi TYR-GLN, ali mogu takođe biti i LEU- GLN, PHE-GLN ili TYR-LEU.
Dužina je 10 do 17 ostataka.
LCDR2:
Start -16 ostataka posle kraja L1.
Sekvenca ispred je uglavom ILE-TYR, ali mogu takođe biti i VAL-TYR, ILE-LYS ili ILE-PHE. Dužina je uglavnom 7 ostataka.
LCDR3:
Start - uglavnom 33 ostatka posle kraja L2.
Ostatak ispred je Cys.
Sekvenca posle je PHE-GLY-X-GLY.
Dužina je 7 do 11 ostataka.
HCDR1:
Start - približno na ostatku 26 (četlri ostatka posle CYS) [Chothia / AbM definicija] Kabatova definicija počinje 5 ostataka kasnije.
Sekvenca ispred je CYS-X-X-X.
Ostatak posle je TRP, posle čega tipično dolazi VAL, ali mogu takođe biti i ILE ili ALA.
Dužina je 10 do 12 ostataka po AbM definiciji, dok definicija Chothia isključuje poslednja 4 ostatka. HCDR2:
Start -15 ostataka posle kraja Kabat /AbM definicija CDR-H1.
2
Sekvenca ispred je tipično LEU-GLU-TRP-ILE-GLY, ali su moguće i brojne varijacije.
Sekvenca posle je LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA
Dužina je 16 do 19 ostataka po Kabatovoj definiciji (AbM definicija daje kraj 7 ostataka ranije).
HCDR3:
Start-33 ostatka posle kraja CDR-H2 (dva ostatka posle CYS).
Sekvenca ispred je CYS-X-X (tipično CYS-ALA-ARG).
Sekvenca posle je TRP-GLY-X-GLY.
Dužina je 3 do 25 ostataka.
[0236] Identitet aminokiselinskih ostataka u određenom antitelu koji su van CDR-ova, ali ipak predstavljaju deo mesta kombinovanja time što im je bočni lanac deo uređivanja mesta kombinovanja, (tj., raspoloživ je za vezivanje preko mesta kombinovanja), može se odrediti metodima dobro poznatim u struci, kao što su molekulsko modelovanje i kristalografija X-zracima. Videti, npr., Riechmann et al., (1988) Nature, 332:;323-327.
[0237] Himerna antitela su ona u kojima su jedan ili više regiona antitela iz jedne vrste životinja, a jedan ili više regiona antitela su iz druge vrste životinja. Preferencijalno himerno antitelo je ono koje sadrži regione iz imunoglobulina primata. Podrazumeva se da himerna antitela za kliničku primenu za ljude imaju varijabilne regione neke životinje, npr., glodara, a konstantne regione čoveka. Nasuprot tome, humanizovano antitelo koristi CDR-ove iz ne-humanih antitela sa većinom, ili celim okvirnim regionima i svim konstantnim regionima imunoglobulina čoveka. Za himerno antitelo čoveka podrazumeva se da ima varijabilne regione glodara. Tipično himerno antitelo čoveka ima konstantne regione teškog lanca čoveka i konstantne regione lakog lanca čoveka sa varijabilnim regionima i teškog i lakog lanca glodara. U himernom antitelu mogu da budu neke promene nativne aminokiselinske sekvence humanih konstantnih regiona i nativnih sekvenci varijbilnih regiona glodara. Himerna i humanizovana antitela mogu se dobiti metodima dobro poznatim u struci uključujući pristupe CDR kalemljenja (videti npr., U.S. Patent Nos.5,843,708; 6,180,370; 5,693,762; 5,585,089; 5,530,101), strategije mešanja lanaca (videti npr., U.S. Patent No.5,565,332; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1998) 95:8910-8915), strategije molekulskiog modelovanja (U.S. Patent No.5,639,641), i slično.
[0238] "Humanizovano antitelo" kako se ovde koristi, u slučaju dvolančanog antitela je ono u kome je bar jedan lanac humanizovan. Lanac humanizovanog antitela ima varijabilni region u kome su jedan ili više okvirnih regiona poreklom od čoveka. Humanizovano jednolančano antitelo je ono u kome taj lanac ima varijabilni region u kome su jedan ili više okvirnih regiona poreklom od čoveka. Ne-humani delovi varijabilnog regiona lanca humanizovanog antitela, ili njegovog fragmenta, dobijeni su iz drugih izvora, a ne čoveka, naročito iz ne-humanog antitela, obično poreklom od glodara. Ne-humani udeo u humanizovanom antitelu obično je u vidu najmanje jednog CDR regiona, umetnutog u okvirne sekvence dobijene od jednog (ili više) imunoglobulina čoveka. Pored toga, ostaci koji podržavaju okvirni region mogu biti izmenjeni da bi se očuvao afinitet vezivanja.
[0239] Humanizovano antitelo može da sadrži i konstantne regione (npr., najmanje jedan konstantan region, ili njegov deo u slučaju lakog lanca, i preferencijalno tri konstantna regiona u slučaju teškog lanca). Konstantni regioni humanizovanog antitela, ako ih ima, uglavnom su od čoveka.
[0240] Metodi za dobijanje "humanizovanih antitela" dobro su poznati u struci (videti npr., Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).
[0241] "Humanizovano antitelo" može se takođe dobiti novim pristupom genetičkog inženjerstva koje omogućava proizvodnju polildonskih antitela, afinitivno zrelih i nalik ljudskim, u većim životinjama, kao što su, na primer, zečevi i miševi. Videti npr U.S. Pat No.6,632,976.
Termin konstantan region (CR) kako se ovde koristi, odnosi se na konstantne regione imunoglobulina. Geni za konstantne regione kodiraju deo molekula antitela koji mu daje efektorske funkcije. Za himerna antitela čoveka i humanizovana antitela, najčešće se ne-humani (npr., mišji) konstantni regioni supstituišu konstantnim regionima čoveka. Konstantni regioni izloženih himernih ili humanizovanih antitela najčešce se izvode od imunoglobulina čoveka. Konstantan region teškog lanca može se odabrati od bilo kog od pet izotipova: alfa, delta, epsilon, gama ili mi. Dalje, teški lanci različitih subklasa (kao što su, IgG subklase teških lanaca) odgovorni su za različite efektorske funkcije, tako da se, biranjem željenog konstantnog regiona teškog lanca, mogu dobiti antitela željene efektorske funkcije. Konstantni regioni koji se mogu upotrebiti u okviru ovog pronalaska su gama 1 (IgG1), naročito Fc region gama 1 (IgG1) izotip, gama 3 (IgG3) i naročito gama 4 (IgG4). Konstantan region lakog lanca može biti kapa ili lambda tip, poželjno kapa tip. U jednom primeru izvođenja, konstantan region lakog lanca je kapa konstantan lanac čoveka (Heiter et al. (1980) Cell 22:197-207), a konstantan težak lanac je IgG4 konstantan lanac čoveka.
[0242] Termin "monoklonsko antitelo" je takođe poznato u struci i odnosi se na antitelo koje je proizvod klonirane samo jedne ćelije koja proizvodi antitela. Monoklonska antitela se najčešće dobijaju fuzionisanjem normalno kratkoživeće B-ćelije koja proizvodi antitela, sa nekom ćelijom koja brzo raste, kao što je ćelija kancera (koja se ponekad naziva „besmrtna“ ćelija). Novonastala hibridna ćelija, ili hibridom, se umnožava brzo, stvarajući klon koji proizvodi antitelo.
[0243] Za svrhe ovog pronalaska, treba podrazumevati da "monoklonsko antitelo" obuhvata antitela koja proizvodi maternalni klon koji još nije postigao svoju punu monoklonalnost.
4
[0244] Podrazumeva se da se "funkcionalno ekvivalentno antitelo" odnosi na antitelo koje bitno deli najmanje jednu glavnu funkcionalnu osobinu sa gore navedenim antitelom i, kako je ovde opisano, obuhvata: specifičnost vezivanja za β-amiloid protein, naročito za Aβ1-42protein, i, specifičnije za 16-21 region epitopa Aβ1-42proteina, imunoreaktivnost in vitro, inhibiciju agregiranja Aβ1-42monomera u visokomolekulske polimerne fibrile i/ili dezagregaciju prethodno formiranih Aβ1-42polimernih fibrila, i/ili osobinu raskidanja β-naboranih ploča i olakšavanje efekata amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje amiloidnih plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, bolesti kao što su, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, neurološki poremećaji kao što su Alchajmerova bolest, (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i druga oboljenja zasnovana na, ili vezana za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza; Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), dijabetes tipa 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori i druge, i uključujući degeneraciju makule, kada se daju profilaktički ili terapeutski. Antitela mogu biti bilo koje klase, kao što su IgG, IgM ili IgA, itd., ili bilo koje subklase kao što su IgG1, IgG2a, itd i drugih gore spomenutih subklasa ili poznatih u struci, ali naročito IgG4 klase. Dalje, antitela se mogu proizvesti bilo kojim metodom, kao što je eksponiranje na fazima, ili proizvesti bilo u kom organizmu ili ćelijskoj liniji, uključujući bakterije, insekte, sisare ili druge tipove ćelija ili ćelijskih linija koje proizvode antitela željenih karakteristika, kao što su humanizovana antitela. Antitela se takođe mogu formirati i kombinovanjem Fab dela i nekog Fc regiona iz različitih vrsta.
[0245] Termin "hibridizovati", kako se ovde koristi, odnosi se na uobičajene uslove hibridizacije, najčešće uslove hibridizacije u kojima se kao rastvor koristi 5xSSPE, 1% SDS, 1xDenhardtov rastvor i/ili temperature hibridizacije su između 35°C i 70°C, najbolje 65°C. Posle hibridizacije, pranje se najčešće vrši prvo sa 2xSSC, 1% SDS, a zatim sa 0,2xSSC na temperaturama između 35°C i 70°C, najbolje na 65°C (što se tiče definicija SSPE, SSC i Denhardtovog rastvora videti Sambrook et al, loc. cit.). Naročito se preferiraju strogi uslovi hibridizacije, kao što su, na primer, opisani gore u Sambrook et al. Naročito se strogi uslovi hibridizacije primenjuju, na primer, ako su se hibridizacija i pranje odvijali na 65°C, kao što je navedeno. Nestrogi uslovi hibridizacije, na primer, hibridizacija i pranje na 45°C se rede primenjuju, a na 35°C još ređe.
[0246] "Homologija" između dve sekvence određuje se na osnovu identičnosti između dve sekvence. Ako se dve sekvence koje treba međusobno uporediti razlikuju u dužini, identičnost sekvenci se, po pravilu, odnosi na procenat nukleotida u kraćoj sekvenci koji su identični nukleotidima u dužoj sekvenci. Identičnost sekvenci može se odrediti uobičajeno, korišćenjem kompjuterskih programa kao što je Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit koristi algoritam lokalne homologije, Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, da bi se našao segment sa najvećom identičnošću dveju sekvenci. Kada se koristi Bestfit ili neki drugi program za upoređivanje sekvenci da bi se odredilo da li je, na primer, određena sekvenca 95% identična sa nekom referentnom sekvencom ovog pronalaska, parametri se, po pravilu, podešavaju tako da se procenat identičnosti izračunava po celoj dužini referentne sekvence i da se dozvoljavaju prekidi u homologiji do 5% ukupnog broja nukleotida u referentnoj sekvenci. Kada se koristi Bestfit, takozvani opcioni parametri se najčešće ostavljaju na njihovim zadatim ("default") vrednostima. Odstupanja koja se javljaju u upoređivanju date sekvence i gore opisanih sekvenci ovog pronalaska mogu biti prouzrokovane, na primer, adicijom, delecijom, supstitucijom, insercijom ili rekombinacijom. Takvo poređenje sekvenci može se preferencijalno takođe izvesti i programom "fasta20u66" (verzija 2.0u66, Septembar 1998, William R. Pearson i the University of Virginia; videti i W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, appended examples i http://workbench.sdsc.edu/). Za ovu svrhu mogu se koristiti "default" parametri.
[0247] Antitelo prema ovom pronalasku može biti imunoglobulin ili antitelo za koje se podrazumeva da svako od njih ima identična mesta vezivanja (ako je multivalentno) ili, alternativno, može da bude "bispecifično" ili "bifunkcionalno antitelo".
[0248] "Bispecifično" ili "bifunkcionalno antitelo"je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para težak/lak lanac i dva različita vezna mesta. Bispecifična antitela mogu se dobiti čitavim nizom metoda, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp, Immunol.79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol, 148,1547-1553 (1992).
[0249] Termin "fragment" odnosi se na deo ili delove nekog antitela ili lanca antitela koji sadrže manje aminokiselinskih ostataka nego intaktno ili potpuno antitelo ili lanac antitela. Fragmenti se mogu dobiti hemijskim putem ili tretiranjem enzimima nekog intaktnog ili potpunog antitela ili lanca antitela.
Fragmenti se takođe mogu dobiti na rekombinantan način. Egzemplarni fragmenti uključuju Fab, Fab', F(ab')2, Fabc i/ili Fv fragmente. Termin "fragment koji vezuje antigen" odnosi se na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji vezuje antigen ili kompetira sa intaktnim antitelom (tj., sa intaktnim antitelom od koga su izvedeni) za vezivanje antigena (tj., specifično vezivanje).
[0250] Vezivni fragmenti se proizvode tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim raskidanjem imunoglobulina. Vezivni fragmenti uključuju Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, jednostruke lance i jednolančana antitela.
[0251] "Fragment" se takođe odnosi na peptid ili polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu od najmanje 5 susedna aminokiselinska ostatka, najmanje 10 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 15 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 20 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 25 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 40 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 50 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 60 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 70 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 80 aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 90 aminokiselinskih ostatka, najmanje susednih 100 aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 125 aminokiselinskih ostataka, najmanje 150 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 175 aminokiselinskih ostataka, najmanje susednih 200 aminokiselinskih ostataka, ili najmanje susednih 250 aminokiselinskih ostataka aminokiselinske sekvence drugog polipeptida. U specifičnom primeru izvođenja, fragment polipeptida zadržava najmanje jednu funkciju polipeptida.
[0252] Termin "antigen" odnosi se na celinu ili njen fragment koja se može vezati za antigen. Imunogen se odnosi na antigen koji može da podstakne imunski odgovor u nekom organizmu, naročito životinje, specifičnije sisara, uključujući čoveka. Termin antigen obuhvata regione, poznate kao antigenske determinante ili epitopi, koji se odnose na deo antigena (koji se kontaktiraju ili koji igraju značajnu ulogu u podržavanju kontakta koji je u antigenu odgovoran za antigenost ili antigenske determinante.
[0253] Kako se ovde koristi, termin "rastvorljiv" znači delimično ili potpuno rastvoren u vodenom rastvoru.
[0254] Takođe, kako se ovde koristi, termin "imunogeni" se odnosi na supstance koje podstiču stvaranje antitela, T-ćelija i drugih reaktivnih imunskih ćelija usmerenih protiv antigena datog imunogena.
[0255] Do imunskog odgovora dolazi kada neka pojedinac proizvodi dovoljno antitela, T-čelija i drugih reaktivnih imunskih ćelija usmerenih protiv datih imunogenih sastava ovog pronalaska da bi se umerio ili ublažio poremećaj koji treba lečiti.
[0256] Termin imunogenost, kako se ovde koristi, odnosi se na meru sposobnosti antigena da podstakne imunski odgovor (humoralni ili ćelijski) kada se da nekom recipijentu. Ovaj pronalazak se bavi pristupima koji smanjuju imunogenost datih himernih ili humanizovanih antitela čoveka.
[0257] Humanizovano antitelo smanjene imunogenosti odnosi se na humanizovano antitelo koje ispoljava smanjenu imunogenost u poređenju sa ishodnim antitelom, npr., mišjim antitelom.
[0258] Humanizovano antitelo koje u velikoj meri zadržava vezivne osobine ishodnog antitela odnosi se na humanizovano antitelo koje zadržava sposobnost da se specifično vezuje za antigen koji prepoznaje ishodno antitelo upotrebljeno da se dobije takvo humanizovano antitelo. Preferencijalno, humanizovano antitelo će ispoljavati isti, ili uglavnom isti afinitet za vezivanje antigena i aviditet kao i ishodno antitelo. Idealno, afinitet tog antitela neće biti manji od 10% afiniteta ishodnog antitela, još bolje, ne manji od oko 30%, i, najbolje, afinitet neće biti manji od 50% ishodnog antitela. Metodi za proveru afiniteta za vezivanje za antigen su dobro poznati u struci i uključuju polu-maksimalne vezivne testove , kompeticione testove i Skačardovu analizu. U ovoj prijavi opisani su pogodni testovi za vezivanje antigena.
[0259] „Povratna mutacija“ je mutacjja uvedena u nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovano antitelo, mutacija daje amino kiselinu koja odgovara amino kiselini u ishodnom antitelu (npr., donorskom antitelu, na primer, mišjem antitelu). Neke okvirne amino kiseline ishodnog antitela mogu se zađržati tokom humanizovanja antitela ovog pronalaska da bi se vezivne osobine ishodnog antitela zadržale u velikoj meri, a u isto vreme minimizovala moguća imunogenost nastalog antitela. U jednom oblliku ovog pronalaska, ishodno antitelo je poreklom od miša. Na primer, povratna mutacija menja amino kiselinu okvirnog regiona čoveka u amino kiselinu okvirnog regiona miša. Primeri okvirnih amino kiselina koje mogu povratno da mutiraju uključujući, ali se ne ograničavajući njima, jesu kanonske amino kiseline, amino kiseline važne za pakovanje, neuobičajene amino kiseline ishodnog antitela koje su blizu vezivnog mesta, amino kiseline u "Vernier zoni" (koja formira platformu na koju se postavljaju CDR) (Foote & Winter, 1992, J. Mol. Biol.224, 487-499), i one koje su blizu CDR H3.
[0260] Kako se ovde koristi, „konzervativna promena“ odnosi se na promene koje su u osnovi konformaciono ili antigeno neutralne, izazivajući minimalne promene tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili izazivajući minimalne promene antigenskih determinanti mutiranih polipeptida u poređenju sa nativnim proteinom. Kada se odnose na antitela ili fragmente antitela prema ovom pronalasku, konzervativna promena znači supstituciju amino kiseline koja ne onesposobljuje antitelo da se veže za dati receptor. Svaki stručnjak će biti u stanju da predvidi koje amino kiseline se mogu supstituisati a da se očuva visoka verovatnoća konformacione i antigenske neutralnosti. Takva uputstva su data u, na primer, Berzofsky, (1985) Science 229:932-940 i Bowie et al. (1990) Science 247:1306-1310. Faktori koje treba uzeti u obzir koji utiču na verovatnoću održavanja konformacione i antigenske neutralnosti uključuju, ali se ne ograničavaju njima: (a) supstitucija hidrofobnih amino kiselina je malo verovatno da će uticati na antigenost zato što je verovatnije da su hidrofobni ostaci smešteni u unutrašnjosti proteina (b) supstitucija fizikohemijski sličnih amino kiselina je manje verovatno da će uticati na konformaciju zato što supstituisana amino kiselina strukturno imitira nativnu amino kiselinu i (c) promena evoluciono konzervisanih sekvenci verovatno negativno utiče na konformaciju, pošto ta konzervativnost sugeriše da te aminokiselinske sekvence mogu imati funkcionalan značaj. Svaki stručnjak će moći da odredi promene konformacije proteina koristeći dobro poznate testove, kao što su, ali ne ograničavajući se time, metod fiksacije mikrokomplementa (Wasserman et al. (1961) J. Immunol.
87:290-295; Levine et al. (1967) Meth. Enzymol.11:928-936) i putem ispitivanja vezivanja monoklonskih antitela koja zavise od konformacije (Lewis et al. (1983) Biochem.22:948-954).
[0261] Dalje, termin "terapeutski efikasna količina " odnosi se na količinu antitela koja je, kada se da čoveku ili životinji, dovoljna da proizvede terapeutski efekt u datoj osobi ili životinji. Stručnjaci mogu lako da odrede efikasnu količinu korišćenjem rutinskih procedura.
[0262] Kako se ovde koriste, termini „tretirati“, „sprečavati“, „sprečavanje“ i „prevencija“ odnose se na sprečavanje recidiva ili nastajanja jednog ili više simptoma poremećaja kod nekog subjekta usled davanja profilaktičkog ili terapeutskog agensa.
Konstruisanje humanizovanih antitela
[0263] Ovaj pronalazak obezbeđuje nove upotrebe i kompozicije koji sadrže visokospecifična i visokoefikasna antitela koja imaju sposobnost da specifično prepoznaju i da se vežu za specifične epitope iz opsega β-amiloidnih antigena. Antitela dobijena po uputstvima ovog pronalaska naročito su korisna u tretiranju amiloidoze, grupe bolesti i poremećaja vezanih za formiranje amiloidnih plakova, uključujući sekundarnu amiloidozu i starosnu amiloidozu, bolesti kao što su, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, neurološki poremećaji, kao što su Alchajmerova bolest, (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (holandski tip); kompleks Guam-Parkinsonove demencije; kao i druga oboljenja zasnovana na, ili vezana za proteine slične amiloidu, kao što su progresivna supranuklearna paraliza, multipla skleroza; Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija vezana za HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), dijabetes tipa 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori i druge, uključujući degeneraciju makule, da navedemo samo neke.
[0264] Potpuno humanizovan ili preoblikovan varijabilni region prema ovom pronalasku može se kreirati unutar obima ovog pronalaska prvo projektovanjem aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona koja sadrži CDR-ove izvedene iz mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2 (zvanog takođe i "mC2" u ovoj prijavi i deponovanog 01. decembra 2005. kod "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) u Braunsehweigu, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, shodno odredbi Budimpeštanskog ugovora, pod pristupnim brojem DSM ACC2750) umetnute u okvirne sekvence izvedene iz sekvenci čoveka. Ne-humani CDR-ovi, naročito izvedeni iz glodarskih, koji se mogu dobiti iz antitela prema ovom pronalasku pružaju željenu specifičnost. Shodno tome, ove ostatke treba uključiti u projektovani preoblikovan varijabilni region uglavnom nepromenjene. Stoga bi sve modifikacije trebalo da budu svedene na minimum i dobro kontrolisane u pogledu promena specifičnosti i afiniteta antitela. S druge strane, ostaci u okvirnim sekvencama, u teoriji, mogu se izvesti iz bilo kog varijabilnog regiona čoveka.
[0265] Da bi se kreiralo preoblikovano antitelo koje ispoljava prihvatljv, ili čak poboljšan afinitet, treba tako izabrati humane okvirne sekvence da budu u istoj meri pogodne i za kreiranje preoblikovanog varijabilnog regiona i za zadržavanje afiniteta antitela.
[0266] Da bi se postigao taj cilj, razvijena je najpogodnija strategija, Kako je poznato da okvirne sekvence služe da održe CDR-ove u njihovoj pravilnoj prostornoj orijentaciji za interakciju sa antigenom, i da ostaci u okvirnom regionu mogu nekad da udestvuju i u vezivanju antigena, ova strategija teži da minimizuje promene koje bi mogle negativno da utiču na trodimenzionalnu strukturu antitela time što se za humane okvirne sekvence koje se koriste za preoblikovanje antitela, uzima varijabilni region čoveka koji ima najveću homologiju ili je sličan ne-humanom varijabilnom regionu, naročito varijabilnom regionu izvedenom iz glodarskog. To takođe maksimizuje verovatnoću da će se u preoblikovanom antitelu zadžati afinitet.
[0267] Na svom najprostijem nivou, najpogodnija ("best fit") strategija uključuje poređenje donorskog V-regiona glodara sa svim poznatim aminokiselinskim sekvencama V-regiona čoveka i bira najhomologniju da bi se dobili akceptorski okvirni regioni za upotrebu u humanizovanju. U stvarnosti, postoji još nekoliko drugih faktora koje bi takođe trebalo razmotriti koji mogu da utiču na konačan izbor akceptorskih okvirnih regiona. Predviđanja molekulskog modelovanja mogu se u ovom smislu koristiti pre ikakvog eksperimentalnog rada u pokušaju da se maksimizuje afinitet nastalog preoblikovanog antitela. Uglavnom, cilj modelovanja je predviđanje koje ključne ostatke (ako ih ima) najhomolognijeg okvirnog dela čoveka treba ostaviti kao u glodara da bi se dobio najbolji afinitet u preoblikovanom antitelu.
[0268] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska CDR-ovi se mogu dobiti iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito iz mišjeg monoklonskog antitela ACI-01-Ab7C2 (nazvanog "mC2" u ovoj prijavi), opisanog u prijavi koja je u toku ispitivanja, EP 05027092.5 zavedenoj 12.12.2005.
[0269] Hibridoma ćelije FP-12H3-C2, koje proizvode mišje monoklonsko antitelo ACl-01-Ab7C2 (nazvano "mC2" i hC2 za humanizovana C2 antitela, u ovoj prijavi) deponovane su 01. decembra 2005. u prijavi koja je u toku ispitivanja br. EP05027092.5 kod "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. (DSMZ) u Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, shodno odredbi Budimpeštanskog ugovora, i pod pristupnim brojem DSM ACC2750.
[0270] Može se dobiti mišje antitelo na supramolekulski antigeni konstrukt koji sadrži antigeni peptid čija aminokiselinska sekvenca odgovara aminokiselinskoj sekvenci β-amiloid peptida, naročito β-amiloid peptidu Aβ1-15, Aβ1-16i Aβ1-16(Δ14), modifikovanoj hidrofobnom grupom kao što je, na primer, palmitinska kiselina, ili hidrofilnom grupom kao što je, na primer, polietilen glikol (PEG), ili njihovom kombinacijom, gde je hidrofobna, odnosno hidrofilna grupa kovalentno vezana za kraj svakog od lanaca antigenog peptida preko najmanje jedne, bolje jedne ili dve amino kiseline kao što su, na primer, lizin, glutaminska kiselina i cistein ili bilo koja druga amino kiselina ili aminokiselinski analogon koji su u stanju da služe za povezivanje u kuplovanju hidrofobne i hidrofilne grupe za peptidni fragment. Kada se kao hidrofilna grupa koristi PEG, njegov slobodan kraj je kovalentno vezan za fosfatidiletanolamin ili bilo koje drugo jedinjenje pogodno da služi kao kotva, na primer, da umetne antigeni konstrukt u dvostruki sloj lipozoma.
[0271] Posebno, može se dobiti mišje antitelo na supramolekulski antigeni konstrukt koji sadrži antigeni peptid koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci β-amiloid peptida Aβ1-16modifikovanoj hidrofilnom grupom kao što je, na primer, hidrofilna grupa polietilen glikola (PEG) koja je kovalentno vezana za kraj svakog od lanaca antigenog peptida preko najmanje jedne, bolje jedne ili dve amino kiseline kao što su, na primer, lizin, glutaminska kiselina i cistein ili bilo koja druga amino kiselina ili aminokiselinski analogon koji su u stanju da služe za povezivanje u kuplovanju hidrofobne i hidrofilne grupe za peptidni fragment. Kada se kao hidrofilna grupa koristi PEG, slobodan kraj PEG je kovalentno vezan za fosfatidiletanolamin ili bilo koje drugo jedinjenje pogodno da služi kao kotva, na primer, da umetne antigeni konstrukt u dvostruki sloj lipozoma.
[0272] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđeno je himerno antitelo ili njegov fragment ili humanizovano antitelo ili njegov fragment koji u varijabilnom regionu sadrži najmanje jedan CDR ne-humanog porekla, umetnut u jedan ili više okvirnih regiona izvedenih iz primata ili čoveka i koji je kombinovan sa konstantnim regionom izvedenim iz antitela dobijenog od primata ili čoveka, gde su himerno antitelo ili njegov fragment, ili humanizovano antitelo ili njegov fragment, u stanju da specifično prepoznaju i da se vežu za β-amiloid monomerni peptid.
[0273] CDR-ovi sadrže ostatke koji se, najverovatnije, vezuju za antigen i koji se moraju zadržati u preoblikovanom antitelu. CDR-ove definiše sekvenca po Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. CDR-ovi spadaju u kanonske klase (Chothia et al, 1989 Nature, 342, 877-883), gde ključni ostaci određuju u velikoj meri strukturnu konformaciju CDR petlje.
1
Ovi ostaci se skoro uvek zadžavaju u preoblikovanom antitelu.
[0274] U procesu dobijanja humanizovanog antitela prema ovom pronalasku, aminokiselinske sekvence C2 varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (VHi VK) upoređuju se sa sekvencama VHi VKglodarskog antitela u NCBI i Kabatovim bazama podataka.
[0275] Najbolje podudaranje gena embrionalne linije miša sa C2 VKje sa bbl, Locus MMU231201, (Schable et al, 1999). Poređenje pokazuje da se dve amino kiseline razlikuju od sekvence ove embrionalne linije i da se obe nalaze unutar CDRL1. Mogu se naći i zrela mišja antitela slične, ali ne i identične sekvence. Nekoliko njih ima identičan CDRL2 i identičan CDRL3, ali izgleda da je CDRL1 iz C2 unikatan. Poređenje VKsekvenci embrionalne linije čoveka pokazuje da se geni iz VKII podgrupe čoveka najviše podudaraju sa C2 VK(Cox et al, 1994). C2 VKse tako može pripisati sekvenca Kabatove podgrupe MuVKII.
[0276] Može se odabrati DPK15, zajedno sa J regionom HuJK1 čoveka, da za humanizovana VKdaju akceptorske okvirne sekvence.
[0277] Definisani su ostaci na površini između varijabilnih delova lakog i teškog lanca (Chothia et al, 1985 J. Mol. Biol., 186, 651-663). One se obično zadržavaju u preoblikovanom antitelu. Phe na položaju 87 C2 VKmiša je neuobičajen za tu površinu, dok je Tyr uobičajeniji u podgrupi VKII, što ukazuje da ova okvirna amino kiselina može da bude važna za aktivnost antitela. Tyr 87 je prisutan u embrionalnoj liniji čoveka i humanizovanom C2VK.
[0278] Humanizovane VKsekvence se stoga mogu projektovati tako da se C2HuVK1 sastoji od C2 VKCDR-ova miša, sa okvirnim regionima iz DPK 15 i humanog JK1. U specificnom obliku ovog pronalaska, u okvirnom regionu čoveka, mogu se ostaci na položajima 45 ili 87 supstituisati mišjim ostacima. U CDR2 regionu, koji se može dobiti iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito mišjeg antitela ACI-01- Ab7C2, aminokiselinske supstitucije se mogu vršiti na Kabatovim položajima 50 i/ili 53. Ostatak 45 može da učestvuje u podržavanju konformacije CDR-ova. Ostatak 87 nalazi se u interfazi između VHi VKdomena. Stoga ove amino kiseline mogu biti kritične za održavanje vezivanja antitela.
[0279] Najbolje podudaranje gena embrionalne linije miša sa C2 VHAF je VH7183, Locus AF120466, (Langdon et al, 2000). Poređenje sa sekvencama VHembrionalne linije čoveka pokazuje da se geni iz podgrupe VHIII najbolje podudaraju sa C2 VH. C2 VHAF može se pripisati Kabatovoj podgrupi MuVHIIID. Može se odabrati sekvenca DP54, zajedno sa J regionom čoveka, HuJH6, koja će dati akceptorske okvirne sekvence za humanizovane VH.
2
Poređenje pokazuje da ima devet aminokiselinskih razlika između sekvence C2 VH i akceptorske sekvence embrionalne linije čoveka DP54 i JH6, koje su uglavnom locirane unutar CDRH2. Nađena su zrela mišja antitela identičnih ili sličnih (razlika u jednoj amino kiselini) CDRH1 ili sličnog CDRH2 (razlika u jednoj amino kiselini), ali nijedna sa sva tri CDR identična C2 VHAF. CDRH3 antitela C2 je neuobičajeno kratak i sastoji se samo od tri aminokiselinska ostatka. Međutim, u bazama podataka nadena su i druga antitela sa CDRH3 ove dužine. Ostatak 47 u C2 VHje Leu, a ne Trp koji je uobičajeniji, a ostatak 94 je Ser, a ne normalan Arg, što ukazuje da ovi ostaci okvirnog regiona mogu biti od značaja za aktivnost antitela.
[0280] Mogu se projektovati različite sekvence humanizovanog VH. C2HuVH1 sastoji se od C2 VHAF CDR-ova sa okvirnim sekvencama iz DP54 i HuJH6. U jednom specifičnom obliku ovog pronalaska, mišji aminokiselinski ostatak može zameniti ostatke u okvirnom regionu čoveka ostatke na položajima 47 ili 94 ili na oba. Ostatak 47 u okvirnom regionu 2 pravi kontakte i sa CDR-ovim i sa VKdomenom. Moguće je da ostatak 94 učestvuje u podržavanju konformacije CDR-ova. Stoga ovi ostaci mogu biti kritični za održavanje vezivanja antitela.
[0281] Različiti HCVR i LCVR regioni mogu se projektovati tako da sadrže ne-humane CDR-ove koji se dobijaju iz donorskog antitela, na primer, mišjeg antitela, umetnute u nativne ili modifikovane okvirne regione izvedene iz čoveka ili primata. Kod modifikacija se naročito radi o zameni jednog ili više aminokiselinskih ostataka u okvirnom regionu ne-humanim ostacima, naročito mišjim aminokiselinskim ostacima, koji se često nalaze na ovom položaju u odgovarajućim podgrupama, ili ostacima koji imaju slične osobine onima koji se češće nalaze na ovom položaju u odgovarajućim podgrupama.
[0282] Modifikacija okvirnog regiona, okvirne sekvence služe da održe CDR-ove u njihovoj tačnoj prostornoj orijentaciji za interakciju sa antigenom, a okvirni ostaci mogu ponekad da učestvuju i u vezivanju antigena. U jednom od oblika ovog pronalaska preduzete su mere da se dalje prilagode odabrane humane okvirne sekvence da se učine najsličnijim sekvencama okvirnih regiona glodara da bi se maksimizovala verovatnoća da će se u preoblikovanom antitelu zadržati isti afinitet.
[0283] Shodno tome, neki aminokiselinski ostatak u okvirnom regionu čoveka može se supstituisati mišjim. Posebno, mišjim ostatkom se može supstituisati u okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca čoveka (HCVR) na položajima 47 ili 94 ili oba, i u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca čoveka (LCVR) na položajima 45 i/ili 87. U CDR2 regionu, koji se može dobiti iz mišjeg monoklonskog antitela, naročito mišjeg antitela ACI-01-Ab7C2, aminokiselinska supstitucija može se izvršiti na Kabatovim položajima 50 i/ili 53.
[0284] Ostaci nađeni na gore navedenim položajima u okvirnom regionu čoveka mogu se zameniti mišjim ostacima koji se obično nalaze na tim položajima u odgovarajućim podgrupama. Naročito, Trp na Kabatovom položaju 47 u okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 može se zameniti Leu, ili nekim aminokiselinskim ostatkom sličnih osobina, čija supstitucija daje promene koje su uglavnom konformaciono i antigenski neutralne, dovodeći do minimalnih promena tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili dovodeći do minimalnih promena antigenskih determinanti. Naročito, Trp na Kabatovom položaju 47 u okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 može se dalje zameniti amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine norleucin, Ile, Val, Met, Ala i Phe, naročito Ile. Mogu se razmatrati i alternativne konzervativne supstitucije koje su konformaciono i antigenski neutralne.
Arg na Kabatovom položaju 94 u okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 može se zameniti amino kiselinom Ser ili nekim aminokiselinskim ostatkom sličnih osobina, čija supstitucija daje promene koje su uglavnom konformaciono i antigenski neutralne, dovodeći do minimalnih promena tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili dovodeći do minimalnih promena antigenskih determinanti. Posebno, Arg na Kabatovom položaju 94 u okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 može se alternativno zameniti Thr.
[0285] U drugoj alternativni, u humanizovanom antitelu mogu se zameniti oba osatatka.
Gln na Kabatovom položaju 45 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, može se zameniti amino kiselinom Lys ili nekim aminokiselinskim ostatkom sličnih osobina, čija supstitucija daje promene koje su uglavnom konformaciono i antigenski neutralne, dovodeći do minimalnih promena tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili dovodeći do minimalnih promena antigenskih determinanti. Posebno, Gln na Kabatovom položaju 45 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, može se dalje zameniti amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Arg, Gln i Asn, naročito Arg.
[0286] Leu na Kabatovom položaju 50 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12 može se zameniti amino kiselinom Lys ili nekim aminokiselinskim ostatkom sličnih osobina, čija supstitucija daje promene koje su uglavnom konformaciono i antigenski neutralne, dovodeći do minimalnih promena tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili dovodeći do minimalnih promena antigenskih determinanti. Posebno, Leu na Kabatovom položaju 50 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, može se zameniti amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Arg, Gln i Asn, naročito Arg.
4
[0287] Asn na Kabatovom položaju 53 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12 može se zameniti amino kiselinama His i Gln ili nekim aminokiselinskim ostatkom sličnih osobina, čija supstitucija daje promene koje su uglavnom konformaciono i antigenski neutralne, dovodeći do minimalnih promena tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili dovodeći do minimalnih promena antigenskih determinanti. Posebno, Asn na Kabatovom položaju 53 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, može se zameniti amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Gln, His, Lys i Arg.
[0288] Thr na Kabatovom položaju 87 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, može se zameniti amino kiselinom Phe ili nekim aminokiselinskim ostatkom sličnih osobina, čija supstitucija daje promene koje su uglavnom konformaciono i antigenski neutralne, dovodeći do minimalnih promena tercijarne strukture mutiranih polipeptida ili dovodeći do minimalnih promena antigenskih determinanti. Posebno, Tyr na Kabatovom položaju 87 u okvirnom regionu varijabilnog regiona lakog lanca izvedenog od čoveka ili primata, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12, može se zameniti amino kiselinom odabranom iz grupe koju čine Leu, Val, Ile i Ala, naročito Leu.
[0289] Tako dobijeni varijabilni regioni koji sadrže najmanje jedan CDR ne-humanog porekla umetnut u jedan ili više okvirnih regiona izvedenih od čoveka ili primata može se zatim kombinovati sa konstantnim regionom izvedenim iz antitela dobijenog od čoveka ili primata, naročito sa IgG4, odnosno κ konstantnim regionima čoveka. Konstantan region IgG4 može se modiftkovati, na primer, menjanjem serina na položaju 228 u zglobnom regionu u prolin (HuIgG4 Ser-Pro). Ova mutacija stabilizuje međulančanu disulfidnu vezu i sprečava fomiranje polumolekula do čega može doći u nativnim IgG4 čoveka. Konstantan region IgG4 može se dalje modifikovati delecijom terminalnog Lys na položaju 439, kao što je pokazano u SEQ ID NO: 16.
[0290] Modifikovani varijabilni regioni mogu se konstruisati metodom poznatim u struci, kao što je, na primer, preklopljena PCR rekombinacija. Ekspresione kasete za himerno antitelo, C2 ChVHAF i C2 СhVK, mogu se koristiti kao matrice za mutagenezu okvirnih regiona u željene sekvence. Sintetišu se setovi mutagenih osnovinih parova koji okružuju regione koje treba promeniti. Dobijene ekspresione kasete za humanizovane VHi VKmogu se klonirati u odgovarajućim vektorima za kloniranje, poznatim u struci, kao što je, na primer, pUC19. Pošto se potvrdi da je cela sekvenca DNK tačna za svaki VHi VK, modifikovani geni V-regiona teškog i lakog lanca mogu se iseći iz vektora za kloniranje kao ekspresione kasete. One se zatim mogu preneti u odgovarajuće ekspresione vektore, kao što su pSVgpt i pSVhyg koji uključuju IgG4 Ser-Pro ili κ konstantne regione čoveka, respektivno.
EKSPRESIONI VEKTORI
[0291] Expresioni vektor pSVgpt zasnovan je na pSV2gpt (Mulligan i Berg, 1980) i uključuje gen za rezistenciju na ampicilin za selekciju bakterijskih ćelija, gpt gen za selekciju ćelija sisara, poboljšivački region imunoglobulinskog teškog lanca miša, genomsku sekvencu koja kodira gen za konstantan region i sekvence SV40 poli A. Da bi se eksprimovao, varijabilni region teškog lanca umetnut je kao HindIII do BamHI fragment.
[0292] Expresioni vektor pSVhyg obuhvata gen za rezistenciju na ampicilinin za selekciju bakterijskih ćelija, hyg gen za selekciju ćelija sisara, stimulatorski region imunoglobulinskog teškog lanca miša, genomsku sekvencu koja kodira gen za konstantan region kapa i uključuje i stimulator kapa i sekvence SV40 poli A. Da bi se eksprimovao, varijabilni region lakog lanca umetnut je kao HindIII do BamHI fragment.
[0293] Zatim se dokazuje da je sekvenca DNK za humanizovane VHi VKu ekspresionim vektorima tačna.
[0294] Za proizvodnju antitela, ekspresioni vektori sa humanizovanim teškim i lakim lancem mogu se uvesti u odgovarajuće proizvodne ćelijske linije poznate u struci kao što su, na primer, NS0 ćelije.
Uvođenje ekspresionih vektora može se postići kotransfekcijom putem elektroporacije ili bilo kojom drugom pogodnom transformacionom tehnologijom dostupnom u struci. Ćelijske linije koje proizvode antitela mogu se zatim selektovati i umnožiti, a humanizovana antitela prečistiti. Prečišćena antitela se mogu zatim analizirati standardnim tehnikama, kao što je SDS-PAGE.
ANTITELO SA POBOLJŠANIM AFINITETOM, SPECIFIĆNOŠĆU, STABILNOŠĆU
[0295] Sekvenca CDRL2 ("KVSNRFS") mišjeg C2 antitela može se malo modifikovati, bez negativnih efekata na aktivnost antitela. Konzervativne supstitucije mogu se dobiti razmenom R za K na položaju 50 i S za N na položaju 53. Dve alternativne sekvence CDRL2 su, prema tome, "RVSNRFS" i "KVSSRFS". One su ugrađene u mišju VKsekvencu, bez drugih promena, kao C2 VK-R i C2 VK-S, respekivno.
[0296] Kako je ovde opisano, afinitet, specifičnost i stabilnost nekog antitela prema ovom pronalasku ili njegovog fragmenta može se modifikovati promenom njegovog načina ili profila glikozilacije, što poboljšava njegove terapeutske vrednosti.
[0297] Da bi se postigla promena profila glikozilacije, ćelije-domaćini se mogu inženjerisati tako da mogu da eksprimiraju preferencijalan opseg aktivnosti glikozil tansferaze koja modifikuje glikoprotein, što povećava kompleks N-povezanih polisaharida koji nose račvasti GIcNAc. Dalje, mogu se dobiti modifikovani glikooblici glikoproteina, na primer antitela, uključujući cele molekule antitela, fragmente antitela, ili fuzione proteine koji uključuju region ekvivalentan Fc regionu nekog imunoglobulina, koji ima veću ćelijsku citotoksičnost posredovanu Fc-om.
[0298] Metodi za dobijanje antitela sa modifikovanim profilom glikozilacije poznati su dobrim stručnjacima i opisani su, na primer, u EP1071700, US2005272128, Ferrara et al (2006) J Biol Chem 281(8), 5032-5036); Ferrara et al (2006) Biotechnology and Bioengineering 93(5), 851-861.
FARMACEUTSKO DOBIJANJE I PRIMENA
[0299] Antitela prema ovom pronalasku, a određenije monoklonsko antitelo prema ovom pronalasku, mogu se dobiti korišćenjem poznatih tehnika u fiziološki prihvatljivoj formulaciji i mogu da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijens. Na primer, da bi se formulisao terapeutski sastav, antitelo prema ovom pronalasku i kako je ovde prethodno opisano određenije monoklonsko antitelo uključujući bilo koji njegove funkcionalne delove kombinuje se sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i/ili ekscipijensom. Pogodni farmaceutski nosači, razblaživači i/ili ekscipijensi dobro su poznati u struci i uključuju, na primer, sone rastvore puferovane fosfatima, vodu, emulzije kao što su emulzije ulje/voda, različite tipove ovlaživača, sterilne rastvore itd.
[0300] Formulacija farmaceutskog sastava prema ovom pronalasku može se postići standardnom metodologijom poznatoj stručnjacima.
[0301] Kompozicije ovog pronalaska, u pogodnoj, farmaceutski eftkasnoj dozi, mogu se dati nekom subjektu u vidu čvrste supstance, tečne ili aerosola. Primeri čvrstih sastava uključuju pilule, masti, i jedinične doze koje se mogu implantirati. Pilule se mogu davati oralno. Terapeutske masti se mogu primeniti topično. Jedinične doze koje se mogu implantirati mogu se dati lokalno, na primer, na mestu tumora, ili se mogu implantirati tako da sistematski otpuštaju terapeutski sastav, na primer, subkutano. Primeri tečnih sastava uključuju formulacije adaptirane za intramuskulamo, subkutano, intravensko, intraarterijsko injektiranje i formulacije za topičku i intraokularnu primenu. Primeri aerosolnih formulacija uključuju formulacije za inhaliranje u primeni za pluća.
[0302] Kompozicije se mogu davati standardnim načinima primene. Uopšteno, kompozicija se može davati topički, oralno, rektalno, nazalno, intradermalno, intraperitonealno ili parenteralno (na primer, intravenski, subkutano, ili intramuskulamo). Pored toga, kompozicije mogu biti ugrađene u matrice sa sporim otpuštanjem, kao što su biodegradabilni polimeri, polimeri koji se ugrađuju blizu željenog mesta primene, na primer, na mestu tumora. Metod uključuje davanje jedne doze, ponovljeno davanje doze u određenim vremenskim intervalima, i neprekidno davanje tokom određenog vremena.
[0303] Matriks sa neprekidnim otpuštanjem, kako se ovde koristi, je matriks napravljen od materijala, obično polimera koji se mogu razgraditi enzimima, ili hidrolizom bazom ili kiselinom, ili rastvaranjem. Jednom kad se ubaci u telo, na matriks deluju enzimi i telesne tečnosti. Poželjno je da se matriks sa neprekidnim davanjem odabere od biokompatibilnih materijala, kao što su lipozomi, polilaktidi (polilaktidna kiselina), poliglikolidi (polimer glikolne kiseline), polilaktid koglikolidi (kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline), polianhidridi, poli(orto)estri, polipeptidi, hijaluronska kiselina, kolagen, hondroitin sulfat, karboksilne kiseline, masne kiseline, fosfolipidi, polisaharidi, nukleinske kiseline, poliamino kiseline, amino kiseline, kao što su, fenilalanin, tirozin, izoleucin, polinukleotidi, polivinil propilen, polivinil pirolidon i silikon. Najpoželjniji biodegradabilni matriks je ili od polilaktida, poliglikolida, ili polilaktid koglikolida (kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline).
[0304] Dobro je poznato stručnjacima u relevantnoj oblasti da će doza u farmaceutskom sastavu zavisiti od različitih faktora kao što su, na primer, stanje koje treba tretirati, određena kompozicija koji se primenjuje, i drugi klinički faktori, kao što su težina, veličina, polipeptid i opšte stanje zdravlja pacijenta, veličina površine tela, specifično jedinjenje ili kompozicija koja se daje, drugi lekovi koji se daju istovremeno, i način davanja.
[0305] Data kompozicija se može primeniti u kombinaciji sa drugim kompozicijema koje sadrže biološki aktivnu supstancu ili jedinjenje, naročito najmanje jedno jedinjenje odabrano iz grupe koju čine jedinjenja protiv oksidativnog stresa, antiapoptotička jedinjenja, helatori metala, inhibitori popravke DNK, kao što je pirenzepin i metaboliti, 3-amino-1-propansulfonska kiselina (3APS), 1,3-propandisulfonat (1,3PDS), aktivatori α-sekretaze, inhibitori, β- i γ- sekretaze, tau proteini, neurotransmiteri, razbijači β-naboranih ploča, atraktanti za kliring /uklanjanje beta amiloida ćelijskih komponenti, inhibitori amiloida beta skraćenog sa N-kraja, uključujući piroglutaminovan beta amiloid 3-42, anti-inflamatorni molekuli, "atipični antipsihotici” kao što su, na primer, klozapin, ziprasidon, risperidon, aripiprazol ili olanzapin ili inhibitori holinesteraze (ChEIs) kao što su takrin, rivastigmin, donepezil, i/ili galantamin, M1 agonisti i drugi lekovi, uključujući sve lekove koji modifikuju amiloid ili tau i nutritivne dodatke kao što su, na primer, vitamin B12, cistein, prekursor acetilholina, lecitin, holin, Ginkgo biloba, acietil-L-karnitin, idebenon, propentofilin, ili derivati ksantina, zajedno sa nekim antitelom prema ovom pronalsku i, opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač i/ili neki ekscipijens i postupke za lečenje oboljenja.
[0306] Proteinska farmaceutski aktivna supstancija može biti prisutna u količinama između 1 ng i 10 mg po dozi. Uopšteno, režim davanja bi trebalo da bude u opsegu između 0,1 µg i 10 mg antitela ovog pronalaska, naročito u opsegu od 1,0 µg do 1,0 mg, i određenije u opsegu između 1,0 µg i 100 µg, gde su svi pojedinačni brojevi koji spadaju u ove opsege, takođe deo ovog pronalaska. Ako se primena obavlja kontinuiranom infuzijom, doza koja više odgovara može biti u opsegu izraeđu 0,01 µg i 10 mg jedinica po kilogramu telesne težine na sat, gde su svi pojedinačni brojevi koji spadaju u ove opsege, takođe deo ovog pronalaska.
[0307] Primena će biti uglavnom parenteralna, npr., intravenozna. Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene i nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Nevodeni rastvarači uključuju, ali se ne ograničavaju njima, propilen glikol, polietilen glikol, biljno ulje, kao što je maslinovo ulje, i organske estre koji se mogu injektirati, kao što je etil oleat. Vodeni rastvarači se mogu odabrati iz grupe koju čine voda, alkohol/vodeni rastvori, emulzije ili suspenzije, uključujući sone rastvore i puferovane medijume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hiorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringer sa laktatom, ili fiksirana ulja. Intravenozni nosači uključuju tečne i nutritivne dopune, dopune elektrolita (kao što su oni koji su bazirani nа Ringerovom rastvoru sa dekstrozom) i drugi. Mogu biti prisutni i konzervansi, kao što su, na primer, antimikrobijski agensi, antioksidanti, helirajući agensi, inertni gasovi itd.
[0308] Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži proteinske nosače kao što su, na primer, albumin seruma ili imunoglobulin, naročito poreklom od čoveka. I drugi biološki aktivni agensi mogu biti prisutni u farmaceutskom sastavu ovog pronalaska, zavisno od nameravane primene.
[0309] Kada je cilj vezivanja lociran u mozgu, neki oblici ovog pronalaska daju antitelo ili neki njegov aktivan fragment koje prolazi krvno-moždanu barijeru. Neka neurodegenerativna oboljenja vezana su za porast permeabilnosti krvno moždane barijere, tako da antitelo ili njegov aktivan fragment može lako da se unese u mozak. Kada krvno-moždana barijera ostaje intaktna, poznato je nekoliko pristupa za transportovanje molekula kroz nju, uključujući, ali se ne ograničavajući njima, fizičke metode, metode zasnovane na lipidima, i metode zasnovane na receptorima i kanalima.
[0310] Fizički metodi transportovanja antitela ili njegovog aktivnog fragmenta kroz krvno-moždanu barijeru, uključuju, ali se ne ograničavaju njima, zaobilaženje krvno-moždane barijere u potpunosti, ili stvaranjem otvora u krvno-moždanoj barijeri. Metodi zaobilaženja uključuju, ali se ne ograničavaju njima, direktno injektiranje u mozak (videti npr., Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) i ugrađivanje sredstva za isporuku u mozak (videti npr., Gill et al., Nature Med.9: 589-595 (2003); i Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Metodi stvaranja otvora u barijeri uključuju, ali se ne ograničavaju njima, ultrazvuk (videti npr., U.S. Patent Publication No.2002/0038086), osmotski pritisak (npr., davanjem hipertoničnog manitola (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilizaciju, npr., bradikininom ili permeabilizatorom A-7 (videti npr., U.S. Patent Nos.5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, i 5,686,416), i transfekciju neurona koji premošćavaju krvno-moždanu barijeru, vektorima koji sadrže gene koji kodiraju dato antitelo ili antigen-vezujući fragment, (videti npr., U.S. Patent Publication No.
2003/0083299).
[0311] Metodi za transportovanje antitela ili njegovog aktivnog fragmenta kroz krvno-moždanu barijeru, zasnovani na lipidima, uključuju, ali se ne ograničavaju njima, inkapsuliranje antitela ili njegovog aktivnog fragmenta u lipozome koji su kuplovani sa fragmentima koji vezuju antitela i koji se vezuju za receptore na vaskularnom endotelijumu krvno-moždane barijere (videti npr., U.S. Patent Application Publication No.20020025313), i oblaganjem antitela ili njegovog aktivnog fragmenta česticama lipoproteina male gustine (videti npr., U.S. Patent Application Publication No.20040204354) ili apolipoprotein E (videti npr., U.S. Patent Application Publication No.20040131692).
[0312] Metodi za transportovanje antitela ili njegovog aktivnog fragmenta kroz krvno-moždanu barijeru, zasnovani na receptorima i kanalima, uključuju, ali se ne ograničavaju njima, korišćenje glukokortikoidnih blokatora da bi se povećala propustljivost krvno-moždane barijere (vidi npr., U.S. Patent Application Publication Nos.2002/0065259, 2003/0162695, i 2005/0124533); aktiviranje kalijumovih kanala (vidi npr., U.S. Patent Application Publication No.2005/0089473), inhibiranje ABC transportera lekova (vidi npr., U.S. Patent Application Publication No.2003/0073713); oblaganje antitela transferinom i modulisanje aktivnosti jednog ili više receptora transferina (videti npr., U.S. Patent Application Publication No, 2003/0129186), i prevođenje antitela u katjone (vidi, npr., U.S. Patent No.
5,004,697).
DETEKCIJA/DIJAGNOZA
[0313] U jednom drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak daje metode i komplete za detekciju i dijagnozu bolesti ili stanja vezanih za amiloid. Ovi metodi uključuju poznate imunološke metode koje se obično koriste za detektovanje ili kvantifikovanje supstancija u biološkim uzorcima ili u in situ stanju.
[0314] Dijagnoza kod nekog pacijenta oboljenja ili stanja vezanog za amiloid može se postići detektovanjem imunospecifičnog vezivanja monoklonskog antitela ili nekog njegovog aktivnog fragmenta za neki epitop amiloid proteina u uzorku ili in situ, što obuhvata dovođenje u kontakt uzorka ili specifičnog dela tela ili neke telesne površine za koje se sumnja da sadrže amiloid protein sa antitelom koje vezuje neki epitop amiloid proteina, omogućujući antitelu da se veže za amiloid protein i formira imunološki kompleks, detektovanje formiranja imunološkog kompleksa i korelisanje prisustva ili odsustva imunološkog kompleksa sa prisustvom ili odsustvom amiloid proteina u uzorku ili specifičnom delu tela ili površine.
[0315] Biološki uzorci koji se mogu koristiti za dijagnozu nekog oboljenja ili stanja vezanog za amiloid jesu, na primer, tečnosti kao serum, plazma, saliva, gastrički sekreti, mukus, cerebrospinalna tečnost, limfa i slično, ili uzorci tkiva ili ćelija dobijenih iz organizma, kao što su tkiva nervna, mozga, srca ili vaskularna. Za određivanje prisustva ili odsustva proteina amiloida u uzorku može se koristiti neki imunološki test poznat stručnjacima (videti Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988555-612), kao na primer, metodi indirektne detekcije koji koriste sekundarne reagense za detekciju, ELISA test, testovi imunoprecipitacije i aglutinacije. Detaljan opis ovih testova je, na primer, dat u WO96/13590 do Maertens i Stuyver, Zrein et al. (1998) i WO96/29605.
[0316] Za in situ dijagnozu, antitelo ili bilo koji njegov aktivan i funkcionalan deo može se dati oganizmu kod koga treba izvršiti dijagnozu metodima poznatim u struci , kao što su , na primer, intravensko, intranazalno, intraperitonealno, intracerebralno, intraarterijsko injektiranje, tako da može da dođe do specifičnog vezivanja između antitela ovog pronalaska i regiona epitopa na amiloid proteinu. Kompleks antitelo/antigen može se detektovati pomoću markera pridodatog antitelu ili njegovom funkcionalnom fragmentu.
[0317] Imunološki testovi koji se primenjuju u dijagnostici najčešće se oslanjaju na obeležene antigene, antitela ili sekundarna reagensa za detekciju. Ovi proteini ili reagensi mogu se obeležiti jedinjenjima generalno poznatim stručnjacima, uključuju enzime, radioaktivne izotope i fluorescentne, luminescentne i hromogene supstance, uključujući obojene čestice, kao što su koloidno zlato i lateks kuglice. Od navedenog, radioaktivno obeležavanje može se upotrebiti za skoro sve tipove testova i sa najviše varijacija. Enzimski konjugovani markeri su naročito korisni kad mora da se izbegava radioaktivnost ili kad su potrebni brzi rezultati. Fluorohromi, mada za svoju upotrebu zahtevaju skupu opremu, predstavljaju vrlo osetljiv metod detekcije. Antitela korisna za ove testove uključuju monoklonska antitela, poliklonska antitela, i poliklonska antitela prečišćena afinitivnom hromatorafijom. Alternativno, antitela se mogu obeležiti indirektno reakcijom sa obeleženim supstancama koje mogu imati afinitet za imunoglobulin, kao što su protein A ili G ili druga antitela. Antitela se mogu konjugovati sa nekom drugom supstancom i detektovati obeleženom trećom supstancom koja ima afinitet za drugu supstancu koja je konjugovana sa antitelom. Na primer, antitelo se može konjugovati sa biotinom, a antitelo-biotin konjugat detektovati obeleženim avidinom ili streptavidinom. Slično, antitelo se može konjugovati sa haptenom, a antitelo-hapten konjugat detektovati korišćenjem obeleženog antihapten antitela.
[0318] Obični stručnjaci će znati o ovim i drugim pogodnim markerima koji se mogu iskoristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Vezivanje ovih markera za antitela ili njihove fragmente može se postići
1
korišćenjem standardnih tehnika obično poznatim i prosečnim stručnjacima. Tipične tehnike opisali su Kennedy, J. H., et al.,1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), i Schurs, A. H. W. M., et al.1977 (Clin. Chim Acta 81:1-40). Tehnike kuplovanja, spomenute u ovom drugom, su glutaraldehidni metod, perjodatni metod, dimaleimidni metod, i drugi.
[0319] Sadašnji imunološki testovi koriste metod dvostrukih antitela za detektovanje prisustva analita. Antitelo se obeleži indirektno drugim antitelom koje je bilo obeleženo detektibilnim markerom. Drugo antitelo je uglavnom ono koje se vezuje za antitela životinje iz koje je izvedeno monoklonsko antitelo. Drugim rečima, ako je monoklonsko antitelo mišje antitelo, tada je obeleženo, drugo antitelo, anti-mišje antitelo. Da bi se monoklonsko antitelo koristilo u testu koji ćemo opisati, ovaj marker je najčešće kuglica obložena antitelom, najčešće magnetna kuglica. Da bi se polildonsko antitelo koristilo u imunološkom testu koji ćemo opisati, marker je najčešće detektibilni molekul, kao radioaktivna, fluorescentna ili elektrohemiluminiscentna supstancija.
[0320] Alternativni sistem dvostrukih antitela, koji se često naziva sistemi brzog formata zato što su prilagođeni za brza određivanja prisustva nekog analita, mogu se takođe upotrebiti u sklopu ovog pronalaska. Sistem zahteva veliki afinitet između antitela i analita. Prema jednom obliku ovog pronalaska, prisustvo amiloidnog proteina određeno je korišćenjem para antitela, od kojih je svako specifično za amiloid protein. Jedan takav par antitela naziva se ovde „detektorsko antitelo“, a drugi par antitela naziva se ovde „hvatačko antitelo“. Monoklonsko antitelo ovog pronalaska može se uzeti i kao hvatačko antitelo ili kao detektorsko antitelo, zajedno u istoj probi. Jedan oblik ovog pronalaska tako koristi metod dvostrukog sendviča antitela za detektovanje amiloid proteina u uzorku biološke tečnosti. U ovom metodu, analit (amiloid protein) je u sendviču između detektorskog antitela i hvatačkog antitela, gde je hvatačko antitelo ireverzibilno imobilisano na čvrstoj podlozi. Detektorsko antitelo bi imalo detektibilni marker da se identifikuje prisustvo sendviča antitelo-analit, a time i prisustvo analita.
[0321] Primerne supstance čvrste faze uključuju, ali se ne ograničavaju njima, mikrotitarske ploče, polistirenske epruvete, magnetne, plastične ili staklene kuglice i pločice koji su dobro poznati u oblasti radioimuno testova i enzimskih imuno testova. Metodi za kuplovanje antitela za čvrstu fazu takođe su dobro poznati stručnjacima. Od nedavno se kao čvrsta podloga koristi niz poroznih materijala, kao što su najlon, nitroceluloza, celulozo acetat, staklena vlakna i drugi porozni polimeri.
[0322] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na dijagnostički komplet koji sadrži gore definisan sastav, za detektovanje amiloidnog proteina u biološkom uzorku. Štaviše, ovaj pronalazak se odnosi na dijagnostički komplet koji, pored gore definisanog sastava, sadrži i reagens za detekciju, kao što je definisan ranije. Termin „dijagnostički komplet“ odnosi se, uglavnom, na svaki dijagnostički komplet
2
poznat u struci. Specifičnije, ovaj termin odnosi se na dijagnostički komplet kako je opisan u Zrein et al. (1998).
[0323] Još jedan cilj ovog pronalaska je da se obezbede nove imunoprobe i komplete za testiranje za detekciju i dijagnozu oboljenja i stanja vezanih za amiloid, koji sadrže antitela prema ovom pronalasku. Za imunoprobe, antitela se direktno ili indirektno vezuju za odgovarajući reporterski molekul, npr., enzim ili radionuklid. Komplet za testiranje uključuje pakovanje sa jednim ili više antitela prema ovom pronalasku i uputstvima za korišćenje antitela u cilju vezivanja za amiloid protein kako bi formirao imunski kompleks, i detektovanje formiranja imunskog kompleksa, tako da prisustvo ili odsustvo imunskog kompleksa korelira sa prisustvom ili odsustvom amiloid proteina.
PRIMERI
Materijali
[0324] Razvoj i dobijanje mišjeg monoklonskog antitela ACI-01-Ab7C2 (nazvanog "mC2" i hC2 za humanizovano C2 antitelo u ovoj prijavi) opisani su u prijavi koja je u toku ispitivanja EP 05027092.5 podnetoj 12.12.2005.
[0325] Ćelije hibridoma FP-12H3-C2, koje stvaraju mišje antitelo ACI-01-Ab7C2 (nazvano "mC2" i hC2 za humanizovano C2 antitelo u ovoj prijavi) deponovani su 01. decembra 2005. u prijavi koja je u toku ispitivanja, br. EP05027092.5 kod "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) u Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, shodno odredbi Budimpeštanskog ugovora, i pod pristupnim brojem DSM ACC2750.
[0326] Ćelije hibridoma gajene su u Dulbekovom modifikovanom Eagle Medijumu (DMEM) dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom i antibioticima (penicilin/streptomicin). Proveren je izotip dobijenog antitela i nađeno je da je mišji lgG2b/kapa, kao što se očekivalo.
Test
[0327] ELISA test za vezivanje za beta amiloid daje pouzdanu meru potencije C2 antitela. Antitela pozitivne kontrole, mišje FP-12H3-C2 antitelo (Genovac Lot Ho: AK379/01), i standardno Chemicon antitelo 1560 (Lot no: 0508008791).
Izbor konstantnih regiona čoveka
[0328] Kako za kandidata za kliničko antitelo nije poželjno regrutovanje imunskog sistema, odabrani konstantan region za težak lanac bio je IgG4 čoveka, modifikovan da zameni serin, na položaju 228 u zglobnom regionu, u prolin (HuIgG4 Ser-Pro). Ova mutacija stabilizuje međulančanu disulfidnu vezu i sprečava formiranje polumolekula do čega može doći u preparatima nativnog IgG4 čoveka. Antitelu koje se eksprimira u proizvodnim ćelijskim linijama biće takođe uklonjen terminalni lizin. Sekvence konstantnih regiona HuIgG4 Ser-Pro čoveka i Kapa dati su u SEQ ID NO: 17 i 14, respektivno.
Lista sekvenci
[0329]
4
1
�
4
<213> Mus musculus

Claims (24)

Patentni zahtevi
1. Humanizovano antitelo ili njegov fragment, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov fragment obuhvata:
(A) (i) varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15, pri čemu HCVR obuhvata komplementarnost teškog lanca koji određuje region 1 (CDR1) kao što je dato u SEQ ID NO: 1, teški lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 2 i teški lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 3, i (ii) varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji obuhvata laki lanac CDR1 kao što je dato u SEQ ID NO: 4, laki lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 5, RVSNRFS ili KVSSRFS i laki lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 6, ili
(B) (i) HCVR koji obuhvata teški lanac CDR1 kao što je dato u SEQ ID NO: 1, teški lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 2 i teški lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 3, i (ii) LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12, pri čemu LCVR obuhvata laki lanac CDR1 kao što je dato u SEQ ID NO: 4, laki lanac CDR2 kao što je dato u SEQ ID NO: 5, RVSNRFS ili KVSSRFS i laki lanac CDR3 kao što je dato u SEQ ID NO: 6,
gde se pomenuto antitelo ili njegov fragment specifično vezuje za β-amiloid protein.
2. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1(A), pri čemu LCVR ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12.
3. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1(B), pri čemu HCVR ima aminokiselinsku sekvencu koja je 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.
4. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-3, koje obuhvata:
i) HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15; ili
ii) LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12; ili
iii) HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15 i LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12.
5. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-3, koje obuhvata:
2
i) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 16; ili
ii) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 13; ili
iii) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 16 i laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 13.
6. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje antitelo je IgG4 izotipa.
7. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde pomenuto humanizovano antitelo ili njegov fragment može da inhibira agregaciju β-amiloid monomera u visokomolekularne polimerne fibrile i dezagregaciju prethodno formiranih polimernih fibrila ili filamenata.
8. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde se pomenuto antitelo ili njegov fragment vezuje za Aβ vlakno, fibril ili filament sa afinitetom vezivanja koji je najmanje 10 puta, najmanje 15 puta, najmanje 20 puta ili najmanje 25 puta, viši od afiniteta vezivanja pomenutog antitela ili njegovog fragmenta za Aβ monomer.
9. Humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde
(a) amino kiselina u Kabatovom položaju 47 okvirnih regiona varijabilnog regiona teškog lanca je amino kiselina Leu; i/ili
(b) amino kiselina u Kabatovom položaju 94 u okvirnim regionima varijabilnog regiona teškog lanca je amino kiselina Ser; i/ili
(c) amino kiselina u Kabatovom položaju 87 u okvirnim regionima varijabilnog regiona lakog lanca je amino kiselina Tyr, Phe, Leu, VaI, Ile ili Ala.
10. Molekul nukleinske kiseline koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-9.
11. Ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 10.
12. Ćelija koja obuhvata ekspresioni vektor prema zahtevu 11.
13. Kompozicija koja obuhvata humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-9, i koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijens.
14. Mešavina koja obuhvata humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-9, i koja dalje obuhvata biološki aktivnu supstancu, farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijens.
15. Mešavina prema zahtevu 14, koja obuhvata:
(i) biološki aktivnu supstancu koja je jedinjenje korišćeno u tretmanu amiloidoze, ili
(ii) najmanje jedno od sledećih jedinjenja: jedinjenje anti-oksidativnog stresa; anti-apoptotično jedinjenje; helator metala; inhibitor DNK popravke kao što su pirenzepin i metaboliti; 3-amino-1-propansulfonska kiselina (3 APS); 1,3-propandisulfonat (1,3PDS); aktivator α-sekretaze; inhibitor β-sekretaze; inhibitor γ-sekretaze; tau protein; neurotransmiter; raskidač β-lista; atraktant za ćelijskih komponenata amiloid beta kliringa/osiromašenja; inhibitor N-terminalnog skraćenog amiloid beta, kao što su piroglutamatni amiloid beta 3-42; anti-inflamatorni molekul; inhibitor holinesteraze (ChEI) kao što je takrin, rivastigmin, donepezil i/ili galantamin; Ml agonist; ili drugi lek kao što je amiloid- ili tau-modifikujući lek ili hranljivi suplement.
16. Humanizovano antitelo ili njegov fragment kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1-9, kompozicija kao što je definisana u zahtevu 13, ili mešavina kao što je definisana u zahtevu 14 ili 15 za upotrebu u postupku lečenja ublažavanja efekata amiloidoze kod životinje, kao što je sisar ili čovek.
17. Humanizovano antitelo ili njegov fragment, mešavina, ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu je amiloidoza sekundarna amiloidoza, starosno povezana amiloidoza, neurološki poremećaj, Alchajmerova bolest (AD), demencija sa Levijevim telima, Daunov sindrom, nasledna cerebralna hemoragija sa amiloidozom (Holandski tip), kompleks Guam-Parkinsonove demencije, progresivna supranuklearna paraliza, multiple skleroza, Krojcfeld-Jakobova bolest, Parkinsonova bolest, demencija povezana sa HIV, ALS (amiotropna lateralna skleroza), Dijabetes tip 2, senilna amiloidoza srca, endokrini tumori, ili makularna degeneracija.
4
18. Humanizovano antitelo ili njegov fragment, mešavina, ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 17, pri čemu je amiloidoza Alchajmerova bolest.
19. Humanizovano antitelo ili njegov fragment, mešavina, ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu lečenje životinje dovodi do
i) povećanja kapaciteta kognitivne memorije i/ili;
ii) zadržavanja kapacitet kognitivne memorije; i/ili
iii) potpune restauracije kapaciteta kognitivne memorije.
20. Postupak za dijagnozu amiloidoze kod pacijenta, koji obuhvata:
i) dovođenje u kontakt uzorka, dela tela, ili oblasti tela koja sadrži amiloid protein sa humanizovanim antitelom ili njegovim fragmentom prema bilo kom od zahteva 1-9 pod uslovima koji omogućavaju vezivanje pomenutog antitela ili njegovog fragmenta za amiloid protein; i
ii) detekciju antitela ili njegovog fragmenta vezanog za protein,
pri čemu prisustvo ili odsustvo antitela ili njegovog fragmenta vezanog za amiloid protein pokazuje prisustvo ili odsustvo amiloid proteina u pomenutom uzorku, delu tela ili oblasti tela.
21. Postupak za određivanje opsega opterećenja amiloidogenskim plakom u uzorku tkiva ili uzorku telesne tečnosti, koji obuhvata:
i) ispitivanje uzorka tkiva ili uzorka telesne tečnosti na prisustvo amiloid proteina sa humanizovanim antitelom ili njegovim fragmentom prema bilo kom od zahteva 1-9;
ii) određivanje količine antitela ili njegovog fragmenta vezanog za amiloid protein; i
iii) izračunavanje opterećenja plakom u uzorku tkiva ili uzorku telesne tečnosti.
22. Komplet za detekciju ili dijagnozu bolesti i stanja povezanih sa amiloidom, koji obuhvata humanizovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu pomenuti komplet obuhvata kontejner sa jednim ili više antitela ili njegovih fragmenata prema bilo kom od zahteva 1-9 i instrukcije za upotrebu pomenutih antitela ili njihovih fragmenata.
23. Humanizovano antitelo ili njegov fragment kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1-9, kompozicija kao što je definisana u zahtevu 13, ili mešavina kao što je definisana u zahtevu 14 ili 15, za upotrebu u postupku prevencije degeneracije neurona usled izlaganja β-amiloid oligomerima, ili za upotrebu u postupku zaštite neurona od degradacije izazvane β-amiloidom.
24. Postupak za pripremanje humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ćelije prema zahtevu 12, i prečišćavanje antitela ili njegovog fragmenta.
RS20180266A 2006-07-14 2007-07-13 Humanizovana antitela na beta amiloid RS56986B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06014730 2006-07-14
EP06020765 2006-10-02
US94328907P 2007-06-11 2007-06-11
US94349907P 2007-06-12 2007-06-12
EP11192705.9A EP2468770B1 (en) 2006-07-14 2007-07-13 Humanized antibody against amyloid beta.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56986B1 true RS56986B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=49474825

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180266A RS56986B1 (sr) 2006-07-14 2007-07-13 Humanizovana antitela na beta amiloid
RS20130515A RS53160B (sr) 2006-07-14 2007-07-13 Humanizovana antitela na beta amiloid

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20130515A RS53160B (sr) 2006-07-14 2007-07-13 Humanizovana antitela na beta amiloid

Country Status (22)

Country Link
US (2) US20160272699A1 (sr)
EP (1) EP3309172B1 (sr)
KR (6) KR20180043854A (sr)
CN (3) CN106831983B (sr)
BR (1) BRPI0714713B1 (sr)
CR (1) CR20140496A (sr)
CY (1) CY1114604T1 (sr)
DK (2) DK2046833T5 (sr)
ES (2) ES2661562T3 (sr)
HU (1) HUE038438T2 (sr)
IL (1) IL254065B (sr)
LT (1) LT2468770T (sr)
ME (2) ME01758B (sr)
MY (2) MY153248A (sr)
NZ (1) NZ607881A (sr)
PH (1) PH12012501882B1 (sr)
PT (2) PT2468770T (sr)
RS (2) RS56986B1 (sr)
RU (1) RU2668161C2 (sr)
SI (2) SI2468770T1 (sr)
TR (1) TR201802814T4 (sr)
TW (2) TWI608014B (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2598882B1 (en) * 2010-07-30 2017-07-26 AC Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies for use in treating an amyloidosis
WO2016005466A2 (en) * 2014-07-10 2016-01-14 Bioarctic Neuroscience Ab IMPROVED Aß PROTOFIBRIL BINDING ANTIBODIES
CN114796481A (zh) * 2016-06-07 2022-07-29 生物基因国际神经科学有限责任公司 治疗阿尔茨海默病的方法
MX2019005116A (es) * 2016-11-01 2019-11-12 Anaptysbio Inc Anticuerpos dirigidos contra la proteina de inmunoglobulina de linfocitos t y de mucina 3 (tim-3).
WO2018129553A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Tesaro, Inc. Methods of treating cancer with anti-tim-3 antibodies
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPS6412935A (en) 1987-07-02 1989-01-17 Mitsubishi Electric Corp Constant-speed travel device for vehicle
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5843708A (en) 1988-01-05 1998-12-01 Ciba-Geigy Corporation Chimeric antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5112596A (en) 1990-04-23 1992-05-12 Alkermes, Inc. Method for increasing blood-brain barrier permeability by administering a bradykinin agonist of blood-brain barrier permeability
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE191853T1 (de) 1992-07-27 2000-05-15 Us Health Zielgerichte liposome zur blut-hirne schranke
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
JPH10507643A (ja) 1994-10-21 1998-07-28 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型の新規配列、ならびにそれらの予防薬、治療薬および診断薬としての使用
US5756662A (en) 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
CZ295118B6 (cs) * 1996-08-13 2005-05-18 P. N. Gerolymatos S. A. Farmaceutický prostředek
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
MXPA02005576A (es) * 1999-11-29 2002-12-13 Neurochem Inc Vacuna para la prevencion y tratamiento de la enfermedad de alzheimer y otras enfermedades relacionadas con amiloides.
DE1257584T1 (de) * 2000-02-24 2003-05-28 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper, die amyloid beta peptid demarkieren
US6514221B2 (en) 2000-07-27 2003-02-04 Brigham And Women's Hospital, Inc. Blood-brain barrier opening
US20020065259A1 (en) 2000-08-30 2002-05-30 Schatzberg Alan F. Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
US7034036B2 (en) 2000-10-30 2006-04-25 Pain Therapeutics, Inc. Inhibitors of ABC drug transporters at the blood-brain barrier
US20030083299A1 (en) 2000-11-04 2003-05-01 Ferguson Ian A. Non-invasive delivery of polypeptides through the blood-brain barrier
DE10121982B4 (de) 2001-05-05 2008-01-24 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Nanopartikel aus Protein mit gekoppeltem Apolipoprotein E zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke und Verfahren zu ihrer Herstellung
AU2002322720B2 (en) 2001-07-25 2008-11-13 Raptor Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for modulating blood-brain barrier transport
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2504349A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-15 Diagenics International Corporation Monoclonal antibodies specific for beta-amyloid
AR038568A1 (es) * 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20030162695A1 (en) 2002-02-27 2003-08-28 Schatzberg Alan F. Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
JP4995423B2 (ja) 2002-12-03 2012-08-08 ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート 物質を血液−脳関門を渡って輸送するための人工低密度リポタンパク質キャリア
AU2003292936A1 (en) 2002-12-24 2004-07-22 Neurochem (International) Limited Therapeutic formulations for the treatment of beta-amyloid related diseases
ATE468886T1 (de) * 2003-02-10 2010-06-15 Applied Molecular Evolution Abeta-bindende moleküle
JP2007505142A (ja) 2003-09-10 2007-03-08 セダーズ−シナイ メディカル センター 血液脳関門を通過する薬剤のカリウムチャネル媒介性送達
CA2790433A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-26 Northwestern University Anti-addl antibodies and uses thereof
US7811563B2 (en) * 2004-10-25 2010-10-12 Northwestern University Anti-addl antibodies and uses thereof
CA2589017A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Amyloid beta antibodies for use in improving cognition
HRP20140240T4 (hr) * 2005-11-30 2017-02-24 Abbvie Inc. Monoklonalna antitijela protiv amiloidnih beta proteina i njihova upotreba
EP1959996A2 (en) * 2005-12-12 2008-08-27 AC Immune S.A. Monoclonal antibody
CN101058608B (zh) * 2006-04-21 2011-02-23 杜如昱 人类抗Aβ1-32淀粉样蛋白抗体、其纯化方法及用途

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0714713A2 (pt) 2014-10-29
DK2468770T3 (en) 2018-03-12
LT2468770T (lt) 2018-05-25
RU2668161C2 (ru) 2018-09-26
PH12012501882A1 (en) 2014-09-08
IL254065B (en) 2020-07-30
PT2468770T (pt) 2018-03-09
CN106831983B (zh) 2021-11-30
KR20150087435A (ko) 2015-07-29
TWI608014B (zh) 2017-12-11
DK2046833T3 (da) 2013-10-28
MY165105A (en) 2018-02-28
KR20160049045A (ko) 2016-05-04
ME01758B (me) 2014-09-20
SI2046833T1 (sl) 2013-12-31
RS53160B (sr) 2014-06-30
US20220227847A1 (en) 2022-07-21
CN103524617A (zh) 2014-01-22
CY1114604T1 (el) 2016-10-05
BRPI0714713B1 (pt) 2021-11-03
ES2436112T3 (es) 2013-12-27
CN106831983A (zh) 2017-06-13
CN101516911A (zh) 2009-08-26
US20160272699A1 (en) 2016-09-22
TW201527319A (zh) 2015-07-16
KR20190003862A (ko) 2019-01-09
NZ607881A (en) 2014-11-28
PH12012501882B1 (en) 2014-09-08
CR20140496A (es) 2014-12-01
ES2436112T9 (es) 2014-06-04
EP3309172B1 (en) 2021-09-29
EP3309172A1 (en) 2018-04-18
KR20160147066A (ko) 2016-12-21
KR20180043854A (ko) 2018-04-30
TW201815827A (zh) 2018-05-01
TR201802814T4 (tr) 2018-03-21
MY153248A (en) 2015-01-29
IL254065A0 (en) 2017-10-31
CN101516911B (zh) 2016-11-16
DK2046833T5 (en) 2014-03-24
HUE038438T2 (hu) 2018-10-29
RU2013115283A (ru) 2014-10-10
CN103524617B (zh) 2016-12-28
ES2661562T3 (es) 2018-04-02
ME01075B (me) 2012-10-20
SI2468770T1 (en) 2018-05-31
PT2046833E (pt) 2013-11-27
KR20170098978A (ko) 2017-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2468770B1 (en) Humanized antibody against amyloid beta.
CA2690435C (en) Humanized antibodies to amyloid beta
AU2008311365B2 (en) Humanized antibody
US20220227847A1 (en) Humanized antibody
AU2013202799C1 (en) Humanized antibody against amyloid beta
EP3988566A1 (en) Humanized antibody against amyloid beta
US20210317197A1 (en) Humanized antibody
JP2022070853A (ja) アミロイドβに対するヒト化抗体
NO348280B1 (no) Humanisert antistoff
HK1172352B (en) Humanized antibody against amyloid beta
HK1172352A (en) Humanized antibody against amyloid beta
HK1183631A (en) Humanized antibodies to amyloid beta
HK1140433B (en) Humanized antibodies to amyloid beta
HK1140499B (en) Methods and compositions for diagnosis and treatment of amyloidosis
HK1140499A (en) Methods and compositions for diagnosis and treatment of amyloidosis