RS57067B1 - Peptidi derivati ezrina i njihove farmaceutske kompozicije - Google Patents

Peptidi derivati ezrina i njihove farmaceutske kompozicije

Info

Publication number
RS57067B1
RS57067B1 RS20180392A RSP20180392A RS57067B1 RS 57067 B1 RS57067 B1 RS 57067B1 RS 20180392 A RS20180392 A RS 20180392A RS P20180392 A RSP20180392 A RS P20180392A RS 57067 B1 RS57067 B1 RS 57067B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
pharmaceutical composition
peptides
amino acid
sequence
Prior art date
Application number
RS20180392A
Other languages
English (en)
Inventor
Rupert Holms
Ravshan Ataullakhanov
Rustam Ataullakhanov
Khachik Sayadyan
Original Assignee
Nearmedic International Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nearmedic International Ltd filed Critical Nearmedic International Ltd
Publication of RS57067B1 publication Critical patent/RS57067B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4735—Villin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast medicine, specifično, oblast hemijske i farmaceutske industrije i tiče se peptida derivata ezrina, naročito, peptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) X1EKKRRETVERE X2X3, naznačeno time da svaki X predstavlja nepolarni aminokiselinski ostatak i naznačeno time da je aminokiselinski ostatak dužine 14 do 25 ostataka. Upotreba peptida je kao imunostimulatornih sredstava, i specifičnije, za upotrebu u tretiranju i prevenciji antivirusnih, antibakterijskih i antifungalnih infekcija, i tretmana bolesti GI trakta, naročito ulcerativnih poremećaja GI trakta. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže peptide. Dodatno, pronalazak se odnosi na postupke lečenja infekcije i ulcerativnih bolesti GI trakta koji sadrži primenu peptida na pacijente kojima je to potrebno.
[0002] Ezrin protein, takođe poznat kao citovilin ili vilin-2, je protein kod ljudi kodiran od strane EZR gena. Peptidi izvedeni iz ezrin proteina, koji imaju biološku aktivnost, su dobro poznati. Najbliži analog peptidu prema pronalasku je farmaceutski tetradekapeptid NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu_COOH, koji sadrži 14 aminokiselinskih ostataka, koji je poznat kao HEP-1 peptid ili humani ezrin peptid jedan (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE) i koji je razvijen za tretman HIV-infekcije [R.D.Holms, AIDS prophylactics. PCT/GB95/001285, 02.06.95, WO 95/33768] i, dodatno, za tretman širokog opsega bakterijskih, gljivičnih, i virusnih infekcija.
[0003] Liofilizovani farmaceutski proizvod GEPON® (trgovinski autorizacioni broj: P N000015/01-010911), koji sadrži oko 96% HEP-1 peptida, široko je korišćen u medicinske svrhe u Ruskoj federaciji (Kladova, O.V., Kharlamova, F.S., Shcherbakova, A.A., Legkova, T.P, Feldfix, L.I., Znamenskaya, A.A., Ovchinnikova, G.S., Uchaikin, V.F. The first experience of Hepon intranasal application in children with respiratory infections. // Pediatrics, 2002, No. 2, pp. 86-88), (Polyakova T.O., Magomedov, M.M., Artemyev, M.E., Surikov, E.V., Palchun, V.T. A new approach in the treatment of chronic diseases of the pharynx // Attending Doctor, 2002, No. 4, pp. 64-65), (Novokshonov, A.A., Uchaikin, V.F., Sokolova, N.V., Tikhonova, O.N., Portnykh, O.Yu. Biocenosis protecting therapy of intestinal infections in children. // Russian Medical Journal, special supplement "diseases of the Digestive System ", 2004, volume 6, No. 1), (Parfenov, A.I. The activator of the local immunity Hepon in the complex treatment of dysbiotic disorders of the intestine. // Experimental and Clinical Gastroenterology, 2003, Nº3, pp. 66-69),. (Tishchenko, A.L. A new approach in the treatment of recurrent urogenital candidiasis. //Attending Doctor, 2002, No. 3, pp. 46-47), (Telunts, A. V. Treatment of candidiasis in infants. // Questions of Gynecology, Obstetrics, and Perinatology, 2004, vol. 3, No. 4, pp. 89-90), (Ataullakhanov, R.I., Holms, R.D., Katlinsky, A.V., Pichugin A.V., Papuashvili, M.N., Shishkova, N.M. Treatment with Hepon immunomodulator increases the efficacy of the immune control of opportunistic infections in HIV-infected patients. // Allergy, Asthma, and Clinical Immunology, 2002, No. 10, pp. 3-11), (Cherednichenko, T.V., Uchaikin, V.F., Chaplygina, G.V., Kurbanova, G.M. A new efficient treatment of viral hepatitis.// Attending Doctor, 2003, No. 3, pp. 82-83), (Gorbarets, I.P., Voronkova, N.V., Lopatina, T.V., Ivanovskaya, V.N., Braginsky, D.M., Blokhina, N.P., Malyshev, N.A. The combined use of Hepon drug product and recombinant interferon-alpha in the patients with chronic hepatitis C increases the efficiency of antiviral treatment and reduces side effects of the therapy.// Hepatology, 2003, No. 4, pp.23-28), (Lazebnik, L.B., Zvenigorodskaya, L.A., Firsakova, V.Yu., Pichugin, A.V., Ataullakhanov, R.I. The application of Hepon immunomodulator in the treatment of erosive ulcerous lesions of gastroduodenal zone.// Experimental and Clinical Gastroenterology, 2003, No. 3, pp. 17-20), (Malakhova, N.S., Pichugin, A.V., Khalif, I.L., Ataullakhanov, R.I. The application of Hepon immunomodulator for the treatment of nonspecific ulcerative colitis.// Farmateka, 2005, No. 6 [101], pp. 105-108), Dudchenko, M.A., Lysenko, B.F., Chelishvili, A.L., Katlinsky, A.V., Ataullakhanov, R.R. Complex treatment of trophic ulcers.// Attending Doctor 2002, No.10, pp. 72-75), (Bardychev, M.S. Treatment of local radiation injuries with the activator of local immunity.// Russian Medical Journal, 2003, volume 11, No. 11 (183), pp. 646-647), Salamov G., R.Holms, W. Bessler, R. Ataullakhanov. Treatment of hepatitis C virus infection with human ezrin peptide one (HEP1) in HIV infected patients.// Arzneimittel-Forschung (Drug Research) 2007; 57(7): 497-504].
[0004] HEP-1 ima biološku antivirusnu aktivnost protiv hepatitisa C i može se koristiti za tretman pacijenata sa hepatitisom C [R.D.Holms, R.I.Ataullakhanov. HCV combination therapy. PCT/GB2004/000330, 27.01.2004, WO 2004067024 A2].
[0005] HEP-1 ima antiulcersku biološku aktivnost i može se koristiti u tretmanu ulcerskih bolesti gastrointestinalnog trakta [R.D.Holms, R.I.Ataullakhanov. The use of peptides in antiulcer therapy. PCT/GB2006/004390, 23.11.2006, WO/2007/060440].
[0006] Pronalazači predmetnog pronalaska razvili su novi peptid koji je pripremljen sintetički i koji ima imunostimulatornu aktivnost. Kao što su pokazali biološki testovi, peptid kao što je opisan prema pronalasku i njegove farmaceutske kompozicije ima visoku imunostimulatornu aktivnost, koja prevazilazi aktivnost HEP-1 peptida, koji je glavna komponenta GEPON® proizvoda leka.
[0007] U prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) X1EKKRRETVEREX2X3, naznačeno time da X1, X2i X3predstavljaju nepolarni aminokiselinski ostatak (SEQ ID No: 5) i gde je aminokiselinska sekvenca dužine 14 do 25 ostataka.
[0008] Nepolarni aminokiselinski ostaci mogu biti nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od glicina, alanina, valina, leucina, metionina, izoleucina, prolina, fenilalanina i triptofana, i/ili njihove kombinacije.
[0009] U nekim primerima izvođenja, X1, X2i/ili X3mogu se nezavisno izabrati od nepolarnih aminokiselina koje imaju male R grupe, naročito glicina, alanina i/ili valina, i/ili njihove kombinacije. Stoga, u nekim primerima izvođenja pronalaska, svaki od X1, X2i X3su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od glicina, alanina i valina.
[0010] U nekim primerima izvođenja, svi od X1, X2i/ili X3mogu biti ista aminokiselina. U poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedan od X1, X2i/ili X3je glicin. U poželjnijem primeru izvođenja, najmanje 2 od X1, X2i/ili X3su glicini. U najpoželjnijem primeru izvođenja, svaki od X1, X2i/ili X3je glicin. U jednom primeru izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) X1EKKRRETVERE X2X3, naznačeno time da je svaki X1, X2i X3nepolaran, i dodatno naznačeno time da najmanje jedan, ili najmanje dva, od X1, X2i/ili X3su glicin. U poželjnom primeru izvođenja, peptid ima sekvencu GEKKRRETVEREGG.
[0011] U predmetnom opisu, kodovi od jednog slova su korišćeni za označavanje različitih aminokiselina. Korišćenjem kodova od tri slova i jednog slova aminokiseline mogu takođe biti označene kao što sledi: glicin (G ili Gly), alanin (A ili Ala), valina (V ili Val), leucin (L ili Leu), izoleucin (I ili Ile), prolin (P ili Pro), fenilalanin (F ili Phe), tirozin (Y ili Tyr), triptofan (W ili Trp), lizin (K ili Lys), arginin (R ili Arg), histidin (H ili His), asparaginska kiselina (D ili Asp), glutaminska kiselina (E ili Glu), asparagin (N ili Asn), glutamin (Q ili Gln), cistein (C ili Cys), metionin (M ili Met), serin (S ili Ser) i treonin (T ili Thr). Gde ostatak može biti asparaginska kiselina ili asparagin, mogu se koristiti simboli Asx ili B. Gde ostatak može biti glutaminska kiselina ili glutamin, mogu se koristiti simboli Glx ili Z. Reference na asparaginsku kiselinu uključuju aspartat, i glutaminsku kiselinu uključuju glutamat, ukoliko kontekst ne nalaže drugačije.
[0012] Termin peptid može uključivati kompozicije koje sadrže ovde opisane aminokiselinske sekvence. Na primer, peptidi se mogu modifikovati (na primer na C ili N terminusima) da bi se zaštitili od degradacije ili da bi se povećala njihova biodostupnost i/ili biokompatibilnost, kako se smatra pogodnim ili neophodnim od strane stručnjaka. Napominje se da u odnosu na "peptid prema pronalasku" jednako se primenjuje aminokiselinska sekvenca specifikovana u opštim formulama.
[0013] Peptid prema pronalasku je dužine 14 do 25 aminokiselinskih ostataka uz uslov da aminokiselinska sekvenca sadrži opštu formulu (I) X1EKKRRETVEREX2X3, naznačeno time da svaki X predstavlja nepolarni aminokiselinski ostatak, kao što je ovde opisano.
[0014] U nekim primerima izvođenja, peptid je dužine 14 do 25 ostataka, na primer dužine 14 do 20 ostataka, ili dužine 14 do 18 ostataka i sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) (ili njene dodatno definisane primere izvođenja). U nekim primerima izvođenja, peptid je dužine 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 ostataka i sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) (ili njene dodatno definisane primere izvođenja). U dodatnim primerima izvođenja, peptid je dužine 14 do 25 ostataka, na primer dužine 14 do 20 ostataka, ili dužine 14 do 18 ostataka i sadrži sekvencu prema SEQ ID No: 1 (GEKKRRETVEREGG). U nekim primerima izvođenja, peptid je dužine 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 ostataka i sadrži sekvencu prema SEQ ID No: 1 (GEKKRRETVEREGG). U jednom primeru izvođenja, peptid je dužine između 14 i 18 ostataka i sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) X1EKKRRETVERE X2X3, gde svaki od X1, X2i X3su nepolarni, i dodatno naznačeno time da najmanje dva od X1, X2i X3su glicin. U poželjnim primerima izvođenja, peptid prema pronalasku je najmanje dužine 14 aminokiselina i sadrži SEQ ID No: 1 (GEKKRRETVEREGG).
[0015] Poželjno, peptid prema pronalasku je dužine 14 aminokiselina. U najpoželjnijem primeru izvođenja pronalaska, peptid ima sekvencu NH2_Gly-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Gly-Gly_COOH (sekvenca ID No.1: GEKKRRETVEREGG) (ovde označena kao HP-V2).
[0016] Cilj predmetnog pronalaska je proširenje opsega peptidnih jedinjenja sa poboljšanom imunostimulatornom aktivnošću. Dodatno, cilj predmetnog pronalaska je priprema farmaceutske kompozicije sa najvećom imunostimulatornom aktivnošću i sa širokim opsegom dejstva na osnovu peptida za koji je tražena zaštita i poznatih Ezrin peptida. Generalno, peptidi prema pronalasku imaju viši imunostimulatorni profil i/ili višu antivirusnu aktivnost u poređenju sa peptidima koji sadrže ili koji se sastoje od SEQ ID No: 2. Imunostimulacija i antivirusna aktivnost može se meriti bilo kojim postupkom poznatim stručnjaku. Na primer, imunološka aktivnost peptida može se proceniti prema efektu na sintezu citokin iRNK u J-96 ćelijama (na primer: IFN-α, IL-1β i IL-6). Antivirusna aktivnost se može meriti prema citotoksičnom efektu na virus encefalomiokarditisa (ECM) i/ili prema IC50za peptid u inhibiciji replikacije EMC virusa. Drugi postupci će biti očigledni stručnjaku.
[0017] Željeni cilj se može postići sa predloženim novim peptidom koji sadrži sekvencu formule (I), i njene derivate kao što je ovde razmatrano, i specifičnije sekvencu prema SEQ ID No. 1: GEKKRRETVEREGG. Ovi peptidi prema pronalasku su pripremljeni sintetički i imaju visoku imunostimulatornu aktivnost. Pretraga sekvenci peptida u bazi podataka http://research.bioinformatics.udel.edu/peptidmatch/index.jsp i pretraga sekvenci proteina u bazi podataka http://www.uniprot.org/blast/ potvrdila je novost peptida (HP-V2), koji sadrži 14 aminokiselinskih ostataka (sekvenca ID No.1: GEKKRRETVEREGG).
[0018] Kao što su pokazali biološki testovi, peptid prema pronalasku i njegove farmaceutske kompozicije imaju visoku imunostimulatornu aktivnost, koja prevazilazi aktivnost HEP-1 peptida, koji je glavna komponenta GEPON® proizvoda leka.
[0019] Poznati ezrin peptid HEP-1 (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE), i dva manja peptida: HP1-5 peptid formule NH2Thr-Glu-Lys-Lys-Arg COOH (sekvenca ID No. 3: TEKKR) ovde definisana kao HP1-5, i HP6-14 peptid formule NH2_Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu COOH (sekvenca ID No. 4: RETVEREKE) ovde definisan kao HP6-14, korišćeni su za pripremu farmaceutskih kompozicija sa peptidom prema pronalasku. Poslednje pomenuta dva peptida su proizvodi cepanja HEP1 peptida (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE) i imaju sekvence, koje su identične onima opisanim prethodno [R.D.Holms. Regulatory/unfolding peptidi of ezrin. PCT/GB00/03566, 15.09.2000, WO 01/025275]. HP1-5 peptid i HP6-14 peptid su dva satelit peptida, koji su pronađeni kao nečistoće u GEPON® proizvodu leka.
[0020] U nekim primerima izvođenja, peptid prema pronalasku se može kombinovati sa HEP-1 (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE), ili sa HP1-5 peptidom formule NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg COOH (sekvenca ID No.3: TEKKR) ovde definisana kao HP1-5, ili sa HP6-14 peptidom formule NH2Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu COOH (sekvenca ID No. 4: RETVEREKE) ovde definisana kao HP6-14.
[0021] Peptidi prema pronalasku i kombinacije peptida kao što je ovde opisano mogu biti korisni u medicini, na primer za upotrebu u tretmanu i prevenciji virusnih, bakterijskih i gljivičnih infekcija, kao i za tretman ulceroznih bolesti mukoznih membrana i mekih tkiva.
[0022] U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je peptid prema pronalasku (kao što je peptid opšte formule (I), naročito peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1), za upotrebu u medicini. Naročite medicinske upotrebe uključuju tretman ili prevenciju infekcije. Infekcija može biti virusna, bakterijska ili gljivična infekcija. Dodatni primeri izvođenja pronalaska uključuju tretman ili prevenciju ulceracije mukozne membrane creva, kao što su ulceri želudca, debelog creva, duodenuma ili tankog creva, i tretman ili prevenciju inflamatornih bolesti creva, uključujući bolesti i/ili poremećaje povezane sa ulcerima želudca, debelog creva, duodenuma ili tankog creva, sindrom iritabilnog creva (IBS). Peptidi prema pronalasku su takođe obezbeđeni za upotrebu u tretmanu ili prevenciji ulcerativnog kolitisa i Crohn-ove bolesti. U poželjnim primerima izvođenja, peptidi prema pronalasku su obezbeđeni za upotrebu u tretmanu ili prevenciji inflamacije donjih delova creva i/ili ulceracije.
[0023] Takođe je obezbeđen peptid prema pronalasku (kao što je peptid opšte formule (I), naročito peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1), za upotrebu u stimulisanju imunog odgovora kod subjekta. U nekim primerima izvođenja pronalaska, peptidi se mogu koristiti za stimulisanje endogene proizvodnje interferona kod subjekta. Peptidi se takođe mogu koristiti za stimulisanje aktivacije MAPK/ERK signalnih puteva.
[0024] U nekim primerima izvođenja pronalaska, peptid prema pronalasku se može kombinovati sa HEP-1 (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE), ili sa HP1-5 peptidom formule NH2Thr-Glu-Lys-Lys-Arg COOH (sekvenca ID No. 3: TEKKR) ovde definisana kao HP1-5, ili sa HP6-14 peptidom formulae NH2Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu COOH (sekvenca ID No. 4: RETVEREKE) ovde definisana kao HP6-14. Na primer, peptid opšte formule (I), naročito peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1, može se kombinovati sa jednom ili više od SEQ ID No: 2, 3 ili 4. Takve kombinacije su korisne u medicinskim aspektima pronalaska, uključujući tretman ili prevenciju infekcije. Infekcija može biti virusna, bakterijska ili gljivična infekcija. Kombinacije peptida su takođe korisne u tretmanu ili prevenciji ulceracije mukoznih membrana creva kao što su ulceri želudca, debelog creva, duodenuma ili tankog creva, i tretman ili prevenciju inflamatornih bolesti creva, uključujući bolesti i/ili poremećaje povezane sa ulcerima želudca, debelog creva, duodenuma ili tankog creva, i sindromom iritabilnog creva (IBS). Peptidi prema pronalasku su takođe obezbeđeni za upotrebu u tretmanu ili prevenciji ulcerativnog kolitisa i Crohn-ove bolesti. U poželjnim primerima izvođenja, kombinacije peptida prema pronalsku su obezbeđene za upotrebu u tretmanu ili prevenciji inflamacije donjeg dela creva i/ili ulceraciji.
[0025] Primeri izvođenja pronalaska dodatno obuhvataju postupke za tretiranje ili prevenciju infekcija, ulcera želudca, debelog creva, duodenuma ili tankog creva, bolesti i/ili poremećaja povezanih sa ulcerima želudca, debelog creva, duodenuma ili tankog creva, i sindromom iritabilnog creva (IBS), ulcerativnim kolitisom i Crohn-ovom bolešću koji sadrže primenu peptida prema pronalasku (kao što je peptid opšte formule (I), naročito peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No: 1) na pacijenta kome je to potrebno. Infekcija može biti virusna, bakterijska ili gljivična infekcija. Peptidi prema pronalasku su primenjeni u terapeutski efikasnoj količini i mogu biti primenjeni sa jednim ili više drugih farmaceutski aktivnih jedinjenja. Naročito, peptidi prema pronalasku mogu se primeniti u kombinaciji sa jednim ili više peptida prema SEQ ID No: 2, 3 i/ili 4.
[0026] Stoga takođe je obezbeđena kombinacija peptida prema pronalasku (kao što je peptid opšte formule (I), naročito peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1) i peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 2, 3, ili 4, za upotrebu u medicini. Takve medicinske upotrebe uključuju tretiranje ili prevenciju infekcija (kao što su virusne, bakterijske ili gljivične infekcije), ulceracije mukoznih membrana creva (kao što su ulceri želudca, ulceri debelog creva, duodenalni ulceri i ulceri tankog creva), ili inflamatorna bolest creva ili bolest ili poremećaj povezan sa inflamatornom bolešću creva (kao što je IBS, ulcerativni kolitis ili Crohn-ova bolest). U poželjnim primerima izvođenja, peptidi prema pronalasku su obezbeđeni za upotrebu u tretmanu ili prevenciji inflamacije donjeg dela creva i/ili ulceracije. Takve medicinske upotrebe takođe uključuju stimulisanje imunog odgovora kod subjekta.
[0027] U poželjnim primerima izvođenja, kada su peptidi prema pronalasku korišćeni u kombinaciji sa HEP-1, HP1-5 ili HP6-14, dodatni peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID No: 2, 3, ili 4.
[0028] Takođe je obezbeđen postupak stimulisanja imunog odgovora kod subjekta, koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine peptida prema pronalasku (kao što je peptid opšte formule (I), naročito peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1) na pacijenta kome je to potrebno.
[0029] U trećem aspektu pronlaska, obezbeđene je farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid prema pronalsku i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punioc. U nekim primerima izvođenja pronalaska, farmaceutska kompozicija može sadržati dodatno farmaceutski aktivno jedinjenje. Naročito, farmaceutska kompozicija može doodatno sadržati HEP-1 (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE), HP1-5 (sekvenca ID No. 3: TEKKR), ili HP6-14 (sekvenca ID No.4: RETVEREKE).
[0030] Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid od dužine između 14 i 18 ostataka, gde peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom X1EKKRRETVERE X2X3, gde svaki od X1, X2i X3su nepolarni, i dodatno gde najmanje dva od X1, X2i X3su glicin, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punilac.
[0031] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu sadržati druge farmaceutski aktivne supstance, kao što su anti-virusne, anti-bakterijske, anti-fungalne, analgetičke i/ili anti-inflamatorne supstance. Farmaceutska kompozicija može se formulisati korišćenjem bilo kog pogodnog ađuvansa i/ili fiziološki prihvatljivih razblaživača.
[0032] Punioci, nosači, konzervansi, i stabilizatori, koji se obično koriste od strane stručnjaka u tehnologiji dopremanja leka, mogu se koristiti kao prihvatljiv nosač ili punioc za pripremu obezbeđenih farmaceutskih kompozicija. Za injekcije, pretežno se koriste destilovana voda ili fiziološki rastvor.
[0033] Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za primenu bilo kojim odgovarajućim putem, na primer oralno (uključujući bukalno ili sublingvalno), rektalno, nazalno, topikalno (uključujući bukalno, sublingvalno ili transdermalno), vaginalno ili parenteralno (uključujući potkožno, intramuskularno, intravenski ili intradermalno). Takve kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u farmaceutskoj tehnici, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem (nosačima) ili ekscipijensima pod sterilnim uslovima. U naročitim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska koja sadrži peptide prema pronalasku je u obliku tablete za oralnu primenu, kao što je glukozna tableta. U nekim primerima izvođenja, tableta se može rastvoriti.
[0034] Farmaceutske kompozicije prilagođene za oralnu primenu mogu biti u obliku zasebnih jedinica kao što su kapsule ili tablete; kao praškovi ili granule; kao rastvori, sirupi ili suspenzije (u vodenim ili ne-vodenim tečnostima; ili kao jestive pene ili kremovi; ili kao emulzije). U poželjnim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska koja sadrži peptide prema pronalasku je u obliku tablete za oralnu primenu, kao što je glukozna tableta. U nekim primerima izvođenja, tableta je rastvorljiva.
[0035] U nekim primerima izvođenja pronalaska, peptidi su obezbeđeni u obliku liofilizovanog praška ili granula.
[0036] Pogodni ekscipijensi za tablete ili tvrde želatinske kapsule uključuju laktozu, kukuruzni skrob ili njihove derivate, stearinsku kiselinu ili njihove soli. Pogodni ekscipijensi za upotrebu sa mekim želatinskim kapsulama uključuju na primer biljna ulja, voskove, masti, polučvrste supstance, ili tečne poliole itd.
[0037] Za pripremu rastvora i sirupa, ekscipijensi koji se mogu koristiti uključuju na primer vodu, poliole i šećere. Za pripremu suspenzija mogu se koristiti ulja (npr. biljna ulja) da bi se obezbedila ulje-u-vodi ili voda u ulju suspenzija.
[0038] Farmaceutske kompozicije prilagođene za transdermalnu primenu mogu biti u obliku zasebnih flastera namenjenih da ostanu u bliskom kontaktu sa epidermisom primaoca u produženom vremenskom periodu. Na primer, aktivni sastojak se može dopremiti iz flastera jontoforezom kao što je generalno opisano u Pharmaceutical Research, 3 (6), strana 318 (1986).
[0039] Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu primenu mogu se formulisati kao masti, kreme, suspenzije, losioni, praškovi, rastvori, paste, gelovi, sprejevi, aerosoli ili ulja. Za infekcije oka ili drugih spoljnih tkiva, na primer usta i kože, kompozicije su pogodno primenjene kao topikalna mast ili krema. Kada je formulisan u masti, aktivni sastojak se može upotrebiti ili sa parafinskom ili masnom bazom koja je mešljiva sa vodom. Alternativno, aktivni sastojak može se formulisati u krem sa ulje-u-vodi bazom krema ili voda-u-ulju bazi. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu primenu na oko uključuju kapi za oči gde je aktivni sastojak rastvoren ili suspendovan u pogodnom nosaču, naročito vodenom rastvaraču. Farmaceutske kompozicije prilagođene za topikalnu primenu u ustima uključuju lozenge, pastile i vodice za ispiranje usta.
[0040] Farmaceutske kompozicije prilagođene za rektalnu primenu mogu biti u obliku supozitorija ili klistira.
[0041] Farmaceutske kompozicije prilagođene za nazalnu primenu gde je nosač čvrsta supstanca uključuju grubi prašak sa veličinom čestica na primer u opsegu od 20 do 500 mikrona. Pogodne kompozicije gde je nosač tečan, za primenu kao nazalni sprej ili kao kapi za nos, uključuju vodene ili uljane rastvore aktivnog sastojka.
[0042] Farmaceutske kompozicije prilagođene za primenu inhalacijom uključuju prah finih čestica ili oblačiće koji se mogu stvoriti različitim tipovima aerosola pod pritiskom sa merenom dozom, nebulizatorima ili insuflatorima.
[0043] Farmaceutske kompozicije prilagođene za vaginalnu primenu mogu biti u obliku formulacija pesarije, tampona, krema, gelova, pasta, pena ili spreja.
[0044] Farmaceutske kompozicije prilagođene za parenteralnu primenu uključuju vodene i ne-vodene sterilne rastvore za injekcije koji mogu sadržati anti-oksidante, pufere, bakteriostate i rastvorljive supstance koje čine formulaciju u značajnom stepenu izotoničnom sa krvi nameravanog primaoca; i vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje mogu uključivati sredstva za suspenziju i agense za zgušnjavanje. Ekscipijensi koje se mogu
1
koristiti za injektabilne rastvore uključuju vodu, alkohole, poliole, glicerin i biljna ulja, na primer. Kompozicije mogu biti u obliku spremnika sa pojedinačnom ili višestrukom dozom, na primer zapečaćenim ampulama i vijalicama, i mogu biti uskladištene u stanju osušenog zamrzavanjem (liofilizovanom) zahtevajući samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Ex tempore rastvori i suspenzje za injekciju mogu se pripremiti od sterilnih praškova, granula i tableta.
[0045] Farmaceutske kompozicije mogu sadržati konzervans, sredstva za povećanje rastvorljivosti, stabilizaciona sredstva, sredstva za vlaženje, emulzifikatore, zaslađivače, boje, mirisna sredstva, soli (supstance prema predmetnom pronalasku mogu same po sebi biti obezbeđene u obliku farmaceutski prihvatljive soli), puferi, sredstva za oblaganje ili antioksidanti. One takođe mogu sadržati terapeutski aktivna sredstva kao dodatak supstancama predmetnog pronalaska.
[0046] Doze farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku mogu varirati unutar širokih granica, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se tretira, starosti i stanja individue koja se tretira, itd. i na kraju će lekar odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti.
[0047] Takve kompozicije mogu se formulisati za humanu ili veterinarsku medicinu. Predmetna prijava podjednako važi za ljude kao i za životinje, osim ukoliko kontekst jasno drugačije ne nalaže.
[0048] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju u obliku tablete za oralnu primenu, naročito glukoznu tabletu, koja sadrži peptid dužine između 14 i 18 ostataka, gde peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu X1EKKRRETVERE X2X3, naznačeno time da svaki X1, X2i X3su nepolarni, i dodatno naznačeno time da su najmanje dva od X1, X2i X3glicin, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punilac. U poželjnijem primeru izvođenja, peptid ima sekvencu GEKKRRETVEREGG.
[0049] Pronalazak se proširuje na postupke za proizvodnju pogodnih farmaceutskih kompozicija, kao i na upotrebu peptida prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za korišćenje u medicini, za korišćenje u bilo kojoj upotrebi naznačenoj ovde.
[0050] U dodatnom aspektu pronalaska, obezbeđena je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku, naročito peptid opšte formule I, kao što je peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1 ili SEQ ID No: 5.
[0051] Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK or RNK kao što je iRNK dobijena kloniranjem ili proizvedena hemijskom sintezom. DNK može biti jednolančana ili dvolančana. Jednolančana DNK može biti kodirajući sens lanac, ili može biti ne-kodirajući ili anti-sens lanac.
[0052] U dodatnom aspektu pronalaska obezbeđen je vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku. U sledećem aspektu pronalaska obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži vektor prema predmetnom pronalasku. Postupci proizvodnje ili dobijanja takvih nukleinskih kiselina, vektora i ćelija domaćina su takođe uključeni u predmetni pronalazak i poznati su u tehnici.
[0053] Peptid prema predmetnom pronalasku može se sintetisati hemijom za sintezu peptida, na primer peptid prema pronalasku može se sintetisati sintezom tečne faze (Combinatorial Chemistry: A Practical Approach, ed. Hicham Fenniri, Oxford University Press (2000)) korišćenjem standardne procedure ili sintezom čvrste faze, na primer "Fmoc" ili "Bmoc" sinteza, (Fmoc Solid Phase Peptid Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach S.), ed.s W. Chan &, Peter White, Oxford University Press (2000)). Kada je upotrebljena sinteza čvrste faze, onda se koriti čvrsta faza, kao što je polistirenska smola ili poliamidna smola, ili PEG hibridna polistirenska smola, ili smola na bazi PEG. Različite zaštitne grupe su korišćene tokom sinteze, na primer, N-terminalne zaštitne grupe, t-Boc ili FMOC zaštitne grupe. Dodatno, benziloksikarbonil (Z) grupe ili aliloksikarbonil (Alloc) zaštitne grupe, ili foto uklonjive (litografske) zaštitne grupe, ili se može upotrebiti tehnika zaštitne bočne grupe. Peptidni proizvodi su prečišćeni HPLC razdvajanjem ili bilo kojim drugim postupkom prečišćavanja. Struktura peptida je potvrđena podacima iz analize aminokiselina, masene spektrometrije, i tečne hromatografije visokih performansi.
[0054] U nekim slučajevima, fragmenti se mogu sintetisati korišćenjem postupaka u čvrstom stanju i zatim zajedno kuplovani u rastvoru. Peptidi se mogu sintetisati sa strane karbonil grupe ka strani amino grupe aminokiselinskog lanca u ovom postupku, iako se u ćelijama peptidi sinetetišu u suprotnom smeru. U takvim postupcima, amino-zaštićena aminokiselina vezana je za supstratnu kuglicu (tj. kuglicu sa smolom), formirajući kovalentnu vezu između karbonil grupe i smole. Amino grupa je zatim deprotektovana i reagovana sa karbonil grupom sledeće amino-zaštićene aminokiseline. Ciklus se ponavlja koliko je potrebno često da bi se formirao željeni peptidni lanac. Sintetisani peptid je zatim isečen sa kuglice na kraju procedure. Zaštitne grupe za amino grupe koje se najčešće koriste u ovoj sintezi peptida su 9-fluorenilmetiloksikarbonil grupa ("Fmoc") i t-butiloksikarbonil ("Boc"). Fmoc grupa je uklonjena sa amino terminusa sa bazom dok je Boc grupa uklonjena sa kiselinom.
[0055] HEP-1 peptid, HP1-5 peptid, i HP6-14 peptid, korišćeni u predmetnom pronalasku za pripremu farmaceutskih kompozicija, pripremljeni su postupkom sinteze tečne faze licenciranog proizvođača "Immapharma", LLC (Moskva).
[0056] U dodatnom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za stvaranje peptida prema pronalasku, naročito peptida prema opštoj formuli 1, kao što su peptidi koji sadrže aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No: 1 ili SEQ ID No: 5. Postupak može sadržati sintetisanje peptida sintezom tečne faze ili sintezom čvrste faze.
[0057] U jednom primeru izvođenja pronalska, obezbeđen je peptid dužine 14 aminokiselina, gde je aminokiselinska sekvenca GEKKRRETVEREGG. Peptid je koristan u medicini, naročito u tretiranju zapaljenja donjeg dela creva i/ili ulceraciji. Peptid može biti obezbeđen u obliku tablete za oralnu primenu, naročito glukozne tablete.
[0058] Poželjne osobine za drugi i naredne aspekte pronalaska su kao za prvi aspekt mutatis mutandis.
[0059] Predmetni pronalazak će sada biti opisan u odnosu na sledeće Primere koji su prisutni samo kao referenca i ne treba ih smatrati ograničavajućim u odnosu na pronalazak. U primerima, načinjena je referenca na određen broj slika u kojima:
Slika 1. Tečna hromatografija visoke performanse HEP-1 peptida. Luna C18 (2) kolona, 4.6 x 250 mm, 5.0 mm čestice. Pokretna faza: A - voda, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program 5-25% ACN 20 min. Stopa protoka: 1 ml/min. X-osa: vreme, Y-osa: UV apsorpcija (mV, gornja linija, sa pikovima), pritisak (donja, horizontalna linija).
Slika 2. Tečna hromatografija visoke performanse smeše HEP-1 peptida i HP 1-5 peptida. Luna C18 (2) kolona, 4.6 x 250 mm, 5.0 mm čestice. Pokretna faza: A - voda, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program 5-25% ACN 20 min. Stopa protoka: 1 ml/min. X-osa: vreme, Y-osa: UV apsorpcija (mV, gornja linija, sa pikovima), pritisak (donja, horizontalna linija). Slika 3. Tečna hromatografija visoke performanse smeše HEP-1 peptida i HP 6-14 peptida. Luna C18 (2) kolona, 4.6 x 250 mm, 5.0 mm čestice. Pokretna faza: A - voda, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program 5-25% ACN for 20 min. Stopa protoka: 1 ml/min. X-osa: vreme, Y-osa: UV apsorpcija (mV, gornja linija, sa pikovima), pritisak (donja, horizontalna linija).
Slika 4. Tečna hromatografija visoke performanse smeše HEP-1 peptida i HP-V2 peptida. Luna C18 (2) kolona, 4.6 x 250 mm, 5.0 mm čestice. Pokretna faza: A - voda, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program 5-25% ACN 20 min. Stopa protoka: 1 ml/min. X-osa: vreme, Y-osa: UV apsorpcija (mV, gornja linija, sa pikovima), pritisak (donja, horizontalna linija). Slika 5. Tečna hromatografija visoke performanse smeše HP-V2 peptida. Luna C18 (2) kolona, 4.6 x 250 mm, 5.0 mm čestice. Pokretna faza: A - voda, 5% ACN, 0,1% TFA; B -0,1% TFA; program 5-25% ACN 20 min. Stopa protoka: 1 ml/min. X-osa: vreme, Y-osa: UV apsorpcija (mV, gornja linija, sa pikovima), pritisak (donja, horizontalna linija).
1
Slika 6. MALDI TOF/TOF spektar smeše HEP-1 peptida i HP-V2 peptida.
PRIMERI
[0060] Postupak tečne hromatografije visoke performanse korišćen je za preciznu procenu koncentracije svake komponente tokom pripreme farmaceutskih kompozicija. Rezultati studije su pokazali da je bilo nemoguće razlikovati HP-V2 peptid, sa sličnim brojem aminokiselina sa HEP-1 peptidom, u uslovima tečne hromatografije visoke performanse (HPLC), i ova činjenica ne omogućava procenu kvantitativnog sadržaja kompozicija na osnovu HP-V2 i HEP-1 (Primer 4; Sl.1, Sl.4, Sl. 5). Sa druge strane kvantitativni sastav HP-V2 peptida za koji je tražena zaštita i satelitskih peptida HP1-5 i HP6-14 može se lako izračunati na osnovu hromatogrtama kao posledica njihovog dobrog razdvajanja (Primeri 2, 3; Sl. 2, Sl.3).
[0061] Međutim MALDI TOF masena spektrometrija jasno detektuje svaki peptid u smeši dva peptida, koji sadrže 14 aminokiselinskih ostataka, naročito, u smeši HP-V2 peptida (sekvenca ID No. 1: GEKKRRETVEREGG), koja je definisana kao HP-V2, i HEP-1 peptid (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE), koja je definisana kao HEP-1 (Primer 5; Sl.6).
Primer 1. Priprema HP-V2 peptida.
[0062] Sinteza HP-V2 peptida je izvedena postupkom čvrste faze korišćenjem alkoksibenzil polimera. Kuplovanja su izvedena upotrebom postupka zasnovanog na korišćenju ili: 1) tetrafluoroborata O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluroniuma (TBTU); ili 2) 1-hidroksibenzotriazola (HOBT) i N,N’- diizopropilkarbodiimida (DIPC). Sekvencijalno vezivanje Fmoc-zaštićenih aminokiselinskih ostataka izvedeno je pojedinačno, osim u slučajevima kada su nereagovane amino grupe pronađene na rastućem peptidil-polimeru nakon rekacije kuplovanja. Kontrola sadržaja nereagovanih amino grupa u peptidil-polimeru održavana je preko ninhidrin testa. Trifluorosirćetna kiselina sa dodatkom tioanizola, fenola, etanditiola, triizopropilsilana, i vode korišćena je za razdvajanje peptida i polimernog nosača i za finalno deblokiranje. Struktura i homogenost željenog proizvoda potvrđena je podacima iz aminokiselinske analize, masene spektrometrije, i tečne hromatografije visoke performanse.
[0063] Predložene su sledeće farmaceutske kompozicije na osnovu obezbeđenog HP-V2 peptida (sekvenca ID No. 1: GEKKRRETVEREGG), kao i na osnovu njegovih smeša sa sledećim peptidima:
HEP-1 (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE);
HP1-5 (sekvenca ID No.3: TEKKR);
HP6-14 (sekvenca ID No.4: RETVEREKE).
Farmaceutske kompozicije:
[0064] Farmaceutska kompozicija, koja sadrži efikasnu količinu peptida prema sekvenci ID No. 1: GEKKRRETVEREGG, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punioc – drugi.
[0065] Farmaceutska kompozicija, koja sadrži efikasnu količinu peptida prema sekvenci ID No. 1: GEKKRRETVEREGG, peptid prema sekvenci ID No. 2: TEKKRRETVEREKE, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punioc – drugi.
[0066] Farmaceutska kompozicija, koja sadrži efikasnu količinu peptida prema sekvenci ID No. 1: GEKKRRETVEREGG, peptid prema sekvenci ID No. 3: TEKKR, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punioc – drugi.
[0067] Farmaceutska kompozicija, koja sadrži efikasnu količinu peptida prema sekvenci ID No. 1: GEKKRRETVEREGG, peptid prema sekvenci ID No. 4: RETVEREKE, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punioc.
[0068] Specifične smeše, koje sadrže HP-V2 peptide i HEP-1, HP1-5, HP6-14, koji su upotrebljeni za pripremu farmaceutskih kompozicija, obezbeđeni su u Primeru 6.
[0069] HP-V2 peptid ili njegove smeše sa prethodno pomenutim peptidima u količini od 0.01 mg do 1000 mg je rastvoren u zapremini od 1 ml do 10 ml sterilne vode. Dozni oblici mogu biti pripremljeni na osnovu pripremljenog rastvora i mogu biti korišćeni oralno, analno, ili vaginalno, ili intranazalno kao kapi, ili kao sprej za inhalaciju.
[0070] HP-V2 peptid ili kombinacija peptida u količini od 0.01 mg do 1000 mg stavljena je u tabletu ili kapsulu, supozitoriju, ili gel, ili formulaciju masti u kombinaciji sa odgovarajućim puniocima, nosačima, konzervansima, i stabilizatorima, koji su obično korišćeni od strane stručnjaka u tehnologiji dopremanja leka.
[0071] HP-V2 peptid ili kombinacija peptida u prethodno pomenutim farmaceutskim kompozicijama može se upotrebiti za pripremu doznih oblika, koji se mogu koristiti oralno, analno, ili vaginalno, ili koji mogu biti lokalno primenjeni. Sterilni rastvor, koji sadrži 0.01 mg do 1000 mg HP-V2 peptida ili kombinacije peptida, rastvoren u zapremini od 1 ml do 10 ml vode za injekciju ili bilo kom fiziološkom rastvoru, primenjen je kao injekcija potkožnim, intramuskularnim ili intravenskim putem.
1
Primer 2. Razdvajanje HEP-1 i HP 1-5 peptida sa HPLC.
[0072] Tečna hromatografija visoke performanse (HPLC) je korišćena za razdvajanje peptida na osnovu njihovih retencionih vremena. Stok rastvori HEP-1 i HP 1-5 peptida pripremljeni su njihovom solubilizacijom u dejonizovanoj vodi sa koncentracijom od 1-2 mg/ml nakon čega je izvedena filtraciona sterilizacija preko Millipore filtera sa veličinom pore od 0.2 μm. Kompozicija, koja sadrži 80% HEP-1 peptida i 20% HP 1-5 peptida, pripremljena je mešanjem odgovarajućih stok rastvora u odgovarajućim zapreminama.
[0073] HPLC je izvedena na Luna C18 (2) koloni, 4.6 x 250 mm po veličini, napunjena sa 5 μm čestice. Pokretna faza je pripremljena programom mešanja faza A i B, pri čemu je A sadržala vodu, 5% acetonitril (ACN), 0.1% TFA, i B je sadržala 0.1% TFA. Programirani gradijent 5 do 25% acetonitrila (ACN) formiran je tokom 20 minuta. Zapremina uzorka je bila 20 μl; stopa protoka je bila 1 ml/min. Pikovi su zabeleženi automatski sa njihovom UV-apsorpcijom na različitim retencionim vremenima.
[0074] Sl. 1 ilustruje HPLC pik HEP-1 peptida sa njegovim tipičnim retencionim vremenom između 9 i 1-minuta. Sl. 2 ilustruje jasno razdvajanje dva pika, HEP-1 (RT= 9.822 min) i HP1-5 (RT= 3.666 min), sa HPLC.
Primer 3. Razdvajanje HEP-1 i HP6-14 peptida sa HPLC.
[0075] Stok rastvori HEP-1 i HP6-14 peptidi i njihove smeše su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 2. Analiza peptida i njihovih smeša sa HPLC izvedena je na Luna C18 (2) koloni, 4.6 x 250 mm po veličini, napunjena sa 5 μm česticama kao što je opisano u Primeru 1.
[0076] U korišćenim HPLC uslovima, smeša HEP-1 i HP6-14 peptida bila je jasno razdvojena na 2 pika (Sl. 3), od kojih je jedan imao retenciono vreme, koje je bilo tipično za HP6-14 peptid (RT=9.495 min), i drugi je imao retenciono vreme, koje je bilo tipično za HEP-1 peptid (RT= 9.894 min).
Primer 4. Analiza smeše HEP-1 i HP-V2 peptida sa HPLC.
[0077] Stok rastvori HEP-1 i HP-V2 peptida, kao i njihove smeše pripremljene su kao što je opisano u Primeru 2. HPLC analiza peptida i smeša je izvedena na Luna C18 (2) koloni, 4.6 x 250 mm po veličini, napunjena sa 5 μm česticama kao što je opisano u Primeru 2.
1
[0078] U korišćenim HPLC uslovima, smeša HEP-1 i HP-V2 peptida je eluirana sa kolone kao jedan pik (Sl. 4) sa retencionim vremenom koje je bilo tipično za HEP-1 peptid. HPLC-analiza rastvora samog HP-V2 peptida pokazala je (Sl. 5) da je retenciono vreme ovog peptida, zaista, bilo isto kao retenciono vreme HEP-1 peptida. To znači da je nemoguće razlikovati HP-V2 i HEP-1 peptide u ovim HPLC uslovima.
Primer 5. Masena spektrometrija smeše HEP-1 i HP-V2 peptida.
[0079] Stok rastvori HEP-1 i HP-V2 peptida, kao i njihove smeše, pripremljene su kao što je opisano u Primeru 2. MALDI TOF spekri su preuređeni na Bruker Ultraflex TOF/TOF masenom spektrometru korišćenjem 2,5-dihidroksibenzojeve kiseline kao matrice.
[0080] Maseni spektar smeše HEP-1 i HP-V2 peptida (Slika 6) jasno otkriva oba peptida sa njihovim molekulskim jonima 1818.0726 (MW) za HEP-1 i 1630.9385 (MW) za HP-V2.
Uvod za Primere 6 - 8.
[0081] Sledeći primeri Primers 6-8 pokazuju biološku aktivnost svih korišćenih peptida i njihovih smeša. Ovi peptidi indukuju proizvodnju interferona i štite različite tipove humanih ćelija od smrti izazvane infekcijom virusom citopatskog encefalomiokarditisa u dozi od 100 TCID50/ml u ćelijskim kulturama in vitro.
[0082] Peptid (HP-V2) (sekvenca ID No. 1: GEKKRRETVEREGG), koji sadrži 14 aminokiselinskih ostataka, i njegove kompozicije sa HEP-1 peptidom (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE), ili sa HP1-5 peptidom (sekvenca ID No. 3: TEKKR), ili sa HP6-14 peptidom (sekvenca ID No.4: RETVEREKE) studirani su u odnosu na njihovu sposobnost da indukuju antivirusni odgovor sa proizvodnjom interferona tipa I u kulturama različitih ćelija. Koristili smo konvencionalnu metodologiju testiranja antivirusne (interferon-indukujuće) aktivnosti jedinjenja u kulturi in vitro, koja je u širokoj upotrebi u skrininigu imunostimulatornih, antivirusnih lekova, i induktora interferona.
[0083] U ovoj metodologiji in vitro, prethodno smo tretirali različite tipove ćelija sa studiranim peptidima, i zatim su ćelije inficirane sa dozom od 100 LD50 virusa encefalomiokarditisa. 24 časa nakon infekcije procenjen je citopatski efekat virusa da bi se procenila zaštitna aktivnost testiranog jedinjenja ukoliko poslednje ima sposobnost da dovede ćelije u stanje, rezistentno na virus, koje je smrtonosno za ćelije.
1
[0084] Kao što je dobro poznato, u velikoj većini slučajeva takva zaštitna aktivnost je iskazana po indukciji interferona (termin «interferon» označava jedinjenje, koje je proizvedeno od strane ćelije i koje sprečava replikaciju virusa). Bilo je moguće proceniti antivirusnu (interferon-indukujuću) aktivnost ovih jedinjenja korišćenjem različitih koncentracija pomenutih peptida i njihovih kompozicija in vitro.
[0085] Što je niža koncentracija koja štiti 50% ćelija od smrti usled infekcija na dozi od 100 LD50 virusa encefalomiokarditisa, viša je antivirusna (interferon-indukujuća) aktivnost teestiranog jedinjenja.
[0086] Peptid (HP-V2) (sekvenca ID No. 1: GEKKRRETVEREGG), koji sadrži 14 aminokiselinskih ostataka, i njegove kombinacije sa HEP-1 peptidom (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE), ili sa HP1-5 peptidom (sekvenca ID No. 3: TEKKR), ili sa HP6-14 peptidom (sekvenca ID No. 4: RETVEREKE) testirani su u odnosu na imunostimulatornu (antivirusnu, interferon-indukujuću) aktivnost.
Primer 6. Studija (interferon-indukujuće) aktivnosti peptida u kulturi ćelijske linije humanog hepatoma.
[0087] PLC/PRF/5 (Alexander) ćelijska linija humanog hepatoma dobijena je od Research Institute of Virology nazvanom po Ivanovskiy (Moskva). Kompletni medijum za kulturu ćelija bio je pripremljen na osnovu MEM Eagle medijuma sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), L-glutamina (300 mg/ml), i penicilina (100 U/ml).
[0088] Testirani su sledeći peptidi:
HEP-1 (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE);
HP1-5 (sekvenca ID No.3: TEKKR);
HP6-14 (sekvenca ID No.4: RETVEREKE);
HP-V2 (sekvenca ID No.1: GEKKRRETVEREGG);
Smeše peptida:
[0089] MXHP1-5+HEP-1 – smeša 90% HEP-1 peptida (sekvenca ID No. 2: TEKKRRETVEREKE) i 10% HP1-5 peptida (sekvenca ID No. 3: TEKKR); MXHP6-14+ HEP-1 – smeša 90% HEP-1 peptida (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE) i 10% HP6-14 peptida (sekvenca ID No. 4: RETVEREKE); MXHP-V2+HP1-5 –smeša 90% HP-V2
1
peptida (sekvenca ID No.1: GEKKRRETVEREGG) i 10% HP1-5 peptida (sekvenca ID No.
3: TEKKR); MXHP-V2+HP6-14 – smeša 90% HP-V2 peptida (sekvenca ID No. 1: GEKKRRETVEREGG) i 10% HP6-14 peptida (sekvenca ID No.4: RETVEREKE). MXHP-V2+HEP-1 –smeša 95% HP-V2 peptida (sekvenca ID No. 1: GEKKRRETVEREGG) i 5% HEP-1 peptida (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE).
[0090] Peptidi su rastvoreni u destilovanoj vodi, i zatim sterilisani propuštanjem kroz filtere sa veličinom pore 0.2 µm da bi se dobili stok rastvori od 1-2 mg/ml. Na dan 0, ćelije su zasejane u bunarčiće ploče sa 96 bunarčića u kompletnom medijumu kulture sa gustinom ćelija od 200 hiljada ćelija u 1 ml. Na dan 1, pripremljena su serijska razblaženja svakog testiranog uzorka (24 serijska razblaženja u inkrementima od 2) u tripletima u bunarčićima ploče sa 96 bunarčića. Na dan 3, sve kulture su inficirane sa dozom od 100 TCID50/ml virusa encefalomiokarditisa soj "Columbia SK-Col-SK". Konačno, na dan 4, citopatski efekat virusa je procenjen korišćenjem Leitz invertnog mikroskopa u prisustvu različitih koncentracija testiranog peptida ili u kulturama be z peptida (kontrola).
[0091] Antivirusni efekat proizvoda leka procenjen je na osnovu njegove minimalne koncentracije koja štiti 50% ćelija od smrti izazvane virusom encefalomiokarditisa sa dozom od 100 TCID50/ml. Titar interferona (U/ml) izračunat je kao vrednost, obrnuto proporcionalna maksimalnom razblaženju proizvoda leka, koji je zaštitio 50% ćelija od smrti izazvane virusom encefalomiokarditisa sa dozom od 100 TCID50/ml.
[0092] Dobijeni podaci su predstavljeni u Tabeli 1. Evidentno je da svi testirani peptidi i njihove kombinacije sprečavaju replikaciju virusa encefalomiokarditisa u ćelijama humanog hepatoma. Peptidi su zaštitili ćelije hepatoma od citopatskog efekta virusa indukcijom proizvodnje interferona. Efikasnost peptida i njihovih kompozicija bila je različita. Najviši nivo antivirusne (interferon-indukujuće) aktivnosti registrovan je sa HP-V2 peptidom i njegovom kompozicijom sa HP1-5 peptidom.
Tabela 1. Antivirusna (interferon-indukujuća) aktivnost peptida u kulturi PLC/PRF/5 (Alexander) ćelijske linije humanog hepatoma.
1
Primer 7. Studija antivirusne (interferon-indukujuće) aktivnosti peptida u kulturi ćelijske linije humanog cervikalnog karcinoma.
[0093] HELA ćelijska linija humanog cervikalnog karcinoma dobijena je od Research Institute of Virology nazvanog po Ivanovskiy (Moskva). Kompletan medijum za ćelijsku kulturu, peptidi i njihove kompozicije, kao i postupak procene za njihovo antivirusnu (interferon-indukujuću) aktivnost bili su isti kao što je opisano u Primeru 5.
[0094] Dobijeni podaci su predstavljeni u Tabeli 2. Evidentno je da su svi testirani peptidi i kompozicije sprečile razvoj infekcije sa virusom encefalomiokarditisa kod ćelija humanog cervikalnog karcinoma. Peptidi su zaštitili ćelije cervikalnog karcinoma od citopatskog efekta virusa indukcijom proizvodnje interferona. Peptidi i njihove kompozicije su imali različitu aktivnost. Maksimalna antivirusna (interferon-indukujuća) aktivnost detektovana je pri korišćenju HP1-5 peptida (sekvenca ID No.3: TEKKR) i HP 6-14 peptida (sekvenca ID No.
4: RETVEREKE), kao i njihovih kombinacija sa HP-V2 peptidom.
Tabela 2. Antivirusna (interferon-indukujuća) aktivnost peptida u kulturi HELA ćelijske linije humanog cervikalnog karcinoma.
2
Primer 8. Studija antivirusne (interferon-indukovane) aktivnosti peptida u kulturi humane epitelne Girardi srčane ćelijske linije.
[0095] Kultura humane epitelne Girardi srčane ćelijske linije dobijena je od Research Institute of Virology nazvanog po Ivanovskiy (Moskva). Kompletan medijum za ćelijsku kulturu, peptidi i njihove kompozicije, kao i postupak procene za njihovu antivirusnu (interferonindukujuću) aktivnost bili su isti kao što je opisano u Primeru 5.
[0096] Dobijeni rezultati su predstavljeni u Tabeli 3. Iz predstavljenih podataka je evidentno da su svi testirani peptidi i kompozicije sprečili razvoj infekcije sa virusom encefalomiokarditisa u ćelijama humane epitelne srčane Girardi ćelijske linije. Testirani peptidi i njihove kompozicije bili su visoko efikasni u indukciji proizvodnje interferona i u zaštiti epitelne srčane Girardi ćelijske linije od citopatskog efekta virusa. Maksimalna antivirusna (interferon-indukujuća) aktivnost je detektovana pri upotrebi HEP-1 peptida (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE) sa HP1-5 peptid (sekvenca ID No.3: TEKKR) i HP6-14 peptid (sekvenca ID No.4: RETVEREKE) kombinacijama, kao i kombinaciji HP-V2 peptida (sekvenca ID No.1: GEKKRRETVEREGG) sa HP1-5 peptidom (sekvenca ID No.3: TEKKR) i sa HEP1 peptidom (sekvenca ID No.2: TEKKRRETVEREKE).
Tabela 3 Antivirusna (interferon-indukujuća) aktivnost peptida u kulturi humane epitelne Girardi srčane ćelijske linije
[0097] Kao što pokazuju obezbeđeni primeri sa opisom bioloških testova i tabele, predloženi novi HP-V2 peptid poseduje visoku imunostimulatornu aktivnost, koja je ista (Tabela 3) ili koja je 4 puta viša (Tabela 1) u poređenju sa aktivnošću poznatog HEP-1 peptida. Dodatno, farmaceutske kompozcije sa najvišom imunostimulatornom aktivnošću i sa širokim opsegom aktivnosti (Tabele 1-3), koje su nekoliko puta veće od onih poznatih za HEP-1 peptid i njegove kompozicije, dobijene su sa HP-V2 peptidom za koji je tražena zaštita i poznatim Ezrin peptidima.
Primer 9: Studija za pokazivanje uticaja peptida na molekularni mehanizam u obnavljanja tkiva i ćelijskoj proliferaciji
[0098] Sledeća studija obezbeđuje dokaz da je peptid prema pronalasku (HP-V2) uključen u molekularni mehanizam obnavljanja tkiva i ćelijske proliferacije. Poznato je da jedinjenja koja utiču na molekularni mehanizam ćelijske proliferacije, na primer regulacija TGFβ ekspresije je povezana sa obnavljanjem creva (Monteleone et al,, "Mongersen, an Oral SMAD7 Antisense Oligonucleotide, and Crohn’s Disease", New England Journal of Medicine, 372:1104-1113). Dodatno, Akita et al., "Basic Fibroblast Growth Factor in Scarless Wound Healing", Adv. Wound Care, 2013, 2(2):44-49 razmatraju korist od i ulogu baznog faktora rasta fibroblasta (bFGF) u zarastanju rana bez ožiljka u kliničkoj primeni i osnovnom mehanizmu. bFGF je glikoprotein koji se široko koristi u tretiranju rana i ulcera. bFGF se lako primenjuje na bilo koji tip rane i vodi do boljeg ishoda u odnosu na boju, teksturu i čvrstinu. Chen et al., "NGF Accelerates Cutaneous Wound Healing by Promoting the Migration of Dermal Fibroblasts via the PI3K/Akt-Rac1-JNK and ERK Pathways", BioMed Research International, Volume 2014, Article ID 547187) pokazali su da je NGF značajno ubrzao zarastanje ekcizionih rana kože kod pacova i migracija fibroblasta indukovana sa NGF može doprineti procesu zarastanja. Ovo je takođe pokazalo da je aktivacija svih od PI3K/Akt, Rac1, JNK, i ERK bila uključena u regulaciju NGF-indukovane migracije fibroblasta. Dodatno, Raffetto et al., "Mitogen-activated protein kinase pathway regulates cell proliferation in venous ulcer fibroblasts", Vasc. Endovascular Surg., 2006, 40(1):59-66 pokazali su da je MAPK ERK put važan za ćelijsku proliferaciju kod fibroblasta ulcera vena.
[0099] Stoga, peptidi prema pronalasku su korisni u prevenciji i tretmanu inflamacije donjeg dela creva i ulceraciji.
[0100] Pokazano je da peptid GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1) indukuje aktivaciju fibroblasta koji su glavni tip ćelija odgovoran za regeneraciju tkiva, kao i za zarastanje rana i ulcera. Ovaj primer pokazuje direktan aktivacioni uticaj peptida GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1) na fibroblaste miša, otkrivajući učešće brze aktivacije unutar ćelija na nivou MAPK-ERK signalnog puta.
[0101] Peptid GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1) je dobijen kao što je opisano u Primeru 1, BALB/c fibroblasti miša su kupljeni od American Type Culture Collection i propagirani u kompletnom medijumu koji se sastojao od DMEM sa visokim sadržajem glukoze sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma, 1 mM natrijum piruvata, 1:50 MEM neesencijalnih aminokiselina, 2 mM L-glutamina, 10 µg/ml gentamicina i 50 µM β-merkaptoetanola. Ćelije su uzgajane u šoljama za kulturu od 10 cm na 5% CO2i 37 C. Pasažiranje ćelija je urađeno na 50-60% konfluence. Za odvajanje ćelija, korišćen je 0.05% tripsin/EDTA sa sledećim centrifugiranjem (470 x g, 15 min) u 10-strukoj zapremini medijuma za ispiranje koji sadrži 10% FCS da bi se ugasio tripsin. Supernatant je odbačen i ćelijski pelet je suspendovan u 10 ml kompletnog medijuma za kulturu, zatim su ćelije izbrojane korišćenjem hemocitometra pre nego što su ćelije korišćene za eksperimente.
[0102] Fibroblasti su kultivisani u pločama sa 8 bunarčića, ispitivani peptid ili citokin TGF-β1 (pozitivna kontrola) rastvor, ili ekvivalentna zapremina medijuma kulture (negativna kontrola) dodati su u respektivne triplikate kultura. Ćelije su inkubirane u prisustvu peptida
2
GEKKRRETVEREGG SEQ ID No: 1 (10 µg/ml) ili TGF-β1, ili bez bilo kog efektorskog jedinjenja tokom 1 ili 6 časova na 5% CO2i 37°C. U naznačenim vremenskim tačkama, ćelije su sakupljene, dva puta isprane sa PBS i lizirane korišćenjem pufera za ekstrakciju ćelija u prisustvu inhibitora proteaze tokom 30 min na 4°C. Ekstrakti su razbistreni centrifugiranjem (14,000 x g, 10 min, 4°C). Koncentracija proteina merena je korišćenjem reagensa za analizu proteina (Pierce, 23225). Odgovarajuća razblaženja ekstrakata (10 µg proteina po stazi) su zatim frakcionisana u 8% SDS-PAGE i zatim preneta na PVDF-membranu (Amersham) za imuno bloting. Ciljani proteini su detektovani korišćenjem antitela specifičnih za fosfop44/42 MAPK (Cell Signaling, 4370) i GAPDH (Abcam ab8245). Proteinske trake su vizuelizovane i zatim je izmeren njihov intenzitet korišćenjem ImageJ programa. Podaci su izraženi kao vrednost (piksela po traci) ERK1, ERK2 ili fosfo-ERK1 i fosfo-ERK2 normalizovana u odnosu na vrednost respektivnih GAPDH traka. Srednje vrednosti SD su izračunate korišćenjem podataka 3 nezavisna izvođenja.
[0103] Rezultati naših eksperimenata pokazuju da oba peptid GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1) i pozitivna kontrola TGF-β1 indukuju rapidnu aktivaciju MAPK/ERK signalnog puta u fibroblastima. 1 čas nakon inokulacije ovih efektorskih jedinjenja koncentracija fosforilovanog ERK1 (44kD) i ERK2 (42 kD) povećana je približno 3-5-puta. Stoga, 1 čas nakon aktivacije fibroblasta sa GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1) peptidom (10 µg/ml) ili TGF-β1 (5 ng/ml), fosfo-ERK1 normalizovane vrednosti su bile 0.4+0.02 (p< 0.01) i 0.5+0.02 (p< 0.01), respektivno, u poređenju sa 0.1+0.002 kod negativne kontrole, i fosfo-ERK2 vrednosti su bile 1.3+0.05 (p< 0.01) i 1.9+0.1 (p< 0.01) u poređenju sa 0,4+0.01 kod negativne kontrole. Kasnije, 6 časova nakon aktivacije, vrednosti fosfo-ERK1 kod fibroblasta aktiviranih sa peptidom GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1) ili TGF-β1 bile su 0.1+0.006 (p> 0.1) i 0.3 0.02 (p< 0.05), respektivno, uz 0.1+0.01 u kulturama sa negativnom kontrolom. Fosfo-ERK2 vrednosti na 6 časova vremenskoj tački bile su 0.1 0.01 (p> 0.1), 0.35+0.02 (p< 0.01) i 0.1+0.007 kod peptida, TGF-β1 i neaktiviranim kulturama, respektivno.
[0104] Prethodna studija pokazala je da aktivnost HP-V2 podseća na aktivnost TGF β (pozitivna kontrola), i stoga potencijal za upotrebu u prevenciji i tretmanu inflamacije i ulceracije donjeg dela creva.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opšte formule (I) X1EKKRRETVEREX2X3(SEQ ID No:5)
naznačeno time da svaki od X1, X2i X3predstavlja nepolarni aminokiselinski ostatak i naznačeno time da je aminokiselinska sekvenca dužine 14 do 25 ostataka.
2. Peptid kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je nepolarna aminokiselina nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, alanina, valina, leucina, metionina, izoleucina, prolina, fenilalanina, triptofana, i/ili njihovih kombinacija.
3. Peptid kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time da X1, X2i X3je glicin.
4. Peptid kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time da je aminokiselinska sekvenca GEKKRRETVEREGG (SEQ ID No: 1).
5. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži efikasnu količinu peptida kao što je tražena zaštita prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili punioc.
6. Farmaceutska kompozicija kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 5, koja dodatno sadrži efikasnu količinu peptida prema SEQ ID No.2 (TEKKRRETVEREKE).
7. Farmaceutska kompozicija kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 5, koja dodatno sadrži efikasnu količinu peptida prema SEQ ID No.3 (TEKKR).
8. Farmaceutska kompozicija kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 5, koja dodatno sadrži efikasnu količinu peptida prema SEQ ID No.4 (RETVEREKE).
9. Peptid kao što je tražena zaštita prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, za upotrebu u stimulisanju imunog odgovora kod subjekta.
2
10. Peptid kao što je tražena zaštita prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, za upotrebu u tretmanu ili prevenciji virusne, bakterijske ili gljivične infekcije.
11. Peptid kao što je tražena zaštita prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, za upotrebu u tretmanu ili prevenciji ulceracije mukoznih membrana creva.
12. Peptid ili farmaceutska kompozicija za upotrebu kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time da je ulceracija mukozne membrane creva ulcer želudca, ulcer debelog creva, ulcer duodenuma, ili ulcer tankog creva.
13. Peptid kao što je tražena zaštita prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, za upotrebu u tretmanu ili prevenciji inflamatorne bolesti creva ili bolesti ili poremećaja povezanog sa inflamatornom bolešću creva.
14. Peptid ili farmaceutska kompozicija za upotrebu kao što je tražena zaštita prema patentnom zahtevu 13, gde je bolest ili poremećaj povezan sa inflamatornom bolešću creva izabran iz grupe koja se sastoji od sindroma iritabilnog creva (IBS), ulcerativnog kolitisa i Crohn-ove bolesti.
RS20180392A 2015-06-01 2016-06-01 Peptidi derivati ezrina i njihove farmaceutske kompozicije RS57067B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015120667 2015-06-01
EP16728271.4A EP3191504B1 (en) 2015-06-01 2016-06-01 Ezrin-derived peptides and pharmaceutical compositions thereof
PCT/EP2016/062336 WO2016193285A1 (en) 2015-06-01 2016-06-01 Ezrin-derived peptides and pharmaceutical compositions thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57067B1 true RS57067B1 (sr) 2018-06-29

Family

ID=56117690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180392A RS57067B1 (sr) 2015-06-01 2016-06-01 Peptidi derivati ezrina i njihove farmaceutske kompozicije

Country Status (26)

Country Link
US (1) US9682140B2 (sr)
EP (1) EP3191504B1 (sr)
JP (1) JP6721419B2 (sr)
KR (1) KR101842978B1 (sr)
CN (1) CN106188267B (sr)
AU (1) AU2016203656B2 (sr)
CA (1) CA2931875C (sr)
CY (1) CY1120501T1 (sr)
DK (1) DK3191504T3 (sr)
ES (1) ES2660894T3 (sr)
GB (1) GB2546439B (sr)
HR (1) HRP20180560T1 (sr)
HU (1) HUE038737T2 (sr)
LT (1) LT3191504T (sr)
MA (1) MA39421A (sr)
MD (1) MD3191504T2 (sr)
ME (1) ME03033B (sr)
MX (1) MX377333B (sr)
PL (1) PL3191504T3 (sr)
PT (1) PT3191504T (sr)
RS (1) RS57067B1 (sr)
SG (1) SG10201604401UA (sr)
SI (1) SI3191504T1 (sr)
SM (1) SMT201800190T1 (sr)
WO (1) WO2016193285A1 (sr)
ZA (1) ZA201603723B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11174288B2 (en) 2016-12-06 2021-11-16 Northeastern University Heparin-binding cationic peptide self-assembling peptide amphiphiles useful against drug-resistant bacteria
CN106596977B (zh) * 2017-02-08 2018-06-08 南京医科大学第一附属医院 ezrin在制备哮喘诊断试剂中的应用
WO2021198346A2 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Dr. Nesselhut Besitzgesellschaft Mbh Ezrin peptide 1 for use in a method of treating covid-19
CA3173136A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 Thomas Nesselhut Ezrin peptide 1 for use in a method of treating covid-19
EP4313108A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Pantapharm AG Ezrin peptide 1 for use in a method of treating post covid-19

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2290293A (en) 1994-06-08 1995-12-20 Rupert Donald Holms Preparation which inhibits the autoimmune response in HIV, or SLE, patients
GB2354241A (en) * 1999-09-17 2001-03-21 Rupert Donald Holms Regulatory/unfolding peptides of ezrin
GB0301879D0 (en) 2003-01-27 2003-02-26 Regent Res Llp HCV combination therapy
WO2007060440A2 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Regent Research L.L.P. The use of peptides in anti-ulcer therapy

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201604401UA (en) 2017-01-27
KR20160141673A (ko) 2016-12-09
GB2546439B (en) 2020-08-26
CA2931875A1 (en) 2016-12-01
KR101842978B1 (ko) 2018-03-29
HRP20180560T1 (hr) 2018-05-04
CN106188267A (zh) 2016-12-07
DK3191504T3 (en) 2018-04-30
CN106188267B (zh) 2020-11-06
ME03033B (me) 2018-10-20
SI3191504T1 (en) 2018-04-30
PL3191504T3 (pl) 2018-08-31
EP3191504B1 (en) 2018-01-17
LT3191504T (lt) 2018-04-10
WO2016193285A1 (en) 2016-12-08
BR102016012501A2 (pt) 2020-04-28
NZ720748A (en) 2023-09-29
ES2660894T3 (es) 2018-03-26
JP2017025055A (ja) 2017-02-02
JP6721419B2 (ja) 2020-07-15
GB2546439A (en) 2017-07-19
AU2016203656A1 (en) 2016-12-15
MD3191504T2 (ro) 2018-04-30
SMT201800190T1 (it) 2018-05-02
US20160346383A1 (en) 2016-12-01
PT3191504T (pt) 2018-04-16
ZA201603723B (en) 2019-03-27
HUE038737T2 (hu) 2018-11-28
MX2016007122A (es) 2017-01-25
AU2016203656B2 (en) 2020-02-06
MA39421A (fr) 2017-07-19
EP3191504A1 (en) 2017-07-19
CA2931875C (en) 2022-06-21
GB201705990D0 (en) 2017-05-31
US9682140B2 (en) 2017-06-20
CY1120501T1 (el) 2019-07-10
MX377333B (es) 2025-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2931875C (en) Ezrin-derived peptides and pharmaceutical compositions thereof
CN108348568B (zh) 抗炎肽及其用途
CN112020367B (zh) 用于治疗急性呼吸道传染病的抗病毒免疫调节剂
CN104736552B (zh) 用于预防或治疗心血管疾病的、包含对血管紧张素‑i转换酶表现出抑制活性的肽作为活性成分的药物组合物
NO326298B1 (no) Anvendelse av R&#39;-Glu-Trp-R&#39;&#39; dipeptider i fremstilling av medikamenter
CN114269769B (zh) 新型肽化合物或其药学上可接受的盐
WO2005046569A2 (en) Pharmaceutical compositions for the treatment of sars
WO2000001730A1 (en) Peptides based on the sequence of human lactoferrin and their use
ES2404669T3 (es) Péptidos bioactivos cortos para modulación celular e inmunológica
RU2694906C2 (ru) Пептиды производные эзрина и фармацевтические композиции на их основе
EP2205270A1 (en) Peptides based on the sequence of human lactoferrin and their use
US20250059232A1 (en) Pentapeptide and use thereof
BR102016012501B1 (pt) Peptídeo, composição farmacêutica, uso do peptídeo e uso da composição farmacêutica
NZ720748B2 (en) Ezrin-derived peptides and pharmaceutical compositions thereof
KR102544102B1 (ko) 상처 치료 및 항염증 활성을 가지는 펩타이드 및 이의 용도
US7750114B2 (en) Peptides having a high cysteine content
SUSZKO-PAWŁOWSKA et al. Ovocystatin tetramer–effect on humoral immune response in SRBC-immunized mice and cytotoxic activity
CN100366633C (zh) 棕点湍蛙抗病毒多肽及其在制药中的应用
HK40068628A (en) Novel peptide compound or pharmaceutically acceptable salt thereof