RS57083B1 - Mezenhimske matične ćelije dobijene iz koštane srži kao izvor progenitora neuralnih ćelija - Google Patents

Mezenhimske matične ćelije dobijene iz koštane srži kao izvor progenitora neuralnih ćelija

Info

Publication number
RS57083B1
RS57083B1 RS20180406A RSP20180406A RS57083B1 RS 57083 B1 RS57083 B1 RS 57083B1 RS 20180406 A RS20180406 A RS 20180406A RS P20180406 A RSP20180406 A RS P20180406A RS 57083 B1 RS57083 B1 RS 57083B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
mscs
neural precursor
precursor cells
msc
Prior art date
Application number
RS20180406A
Other languages
English (en)
Inventor
Saud A Sadiq
Violane K Harris
Original Assignee
Multiple Sclerosis Res Center Of New York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Multiple Sclerosis Res Center Of New York filed Critical Multiple Sclerosis Res Center Of New York
Publication of RS57083B1 publication Critical patent/RS57083B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis pronalaska
Polje pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu mezenhimskih matičnih ćelija izvedenih iz koštane srži kao izvora progenitora neuralnih ćelija za upotrebu u terapiji multiple skleroze autolognim matičnim ćelijama.
Pozadina pronalaska
Multipla skleroza (MS) je hronična autoimuna bolest centralnog nervnog sistema (CNS) ljudi koja pogađa 600.000 Amerikanaca i 2,5 miliona ljudi širom sveta. Dijagnoza MS se najčešće uspostavlja između 20 i 50 godina starosti, a na listi uzroka neuroloških invaliditeta kod mladih odraslih osoba, ona je druga, odmah iza trauma. Bolest se obično javlja u starosnom dobu od 20 do 40 godina, a postoje dva glavna oblika bolesti. Relapsno-remitentna MS (RR-MS) je najčešći oblik (85%-90%) a pogađa žene oko dva puta češće nego muškarce. Većina pacijenata koja pati od RR-MS kasnije razvije drugi glavni oblik bolesti, poznat pod imenom sekundarna progresivna MS (SP-MS). Kod oko 10% - 15% pacijenata bolest stalno napreduje, nakon što se prvi put pojavi, bez perioda remisije; ovaj oblik naziva se primarna progresivna MS (PP-MS). (Sospedra, et al., Annu Rev Immunol 23, 683 [2005]). MS je veoma heterogena bolest; svaki pacijent pokazuje različitu kliničku prezentaciju i različit odgovor na tretman.
Iako je tačan uzrok MS nepoznat, u patološkom smislu dolazi do uništenja mijelinskog omotača oko aksona u mozgu i kičmenoj moždini, izazvanog zapaljenjem, koje dovodi do smanjene provodljivosti nerava. Klinički, gubitak mijelina dovodi do različitih neuroloških simptoma i, kod određenih pacijenata, do ozbiljnog invaliditeta. Kod većine pacijenata sa relapsno-remitentnim oblikom bolesti, demijeliniziju izazvanu zapaljenjem spontano saniraju oligodendrociti, ćelije u mozgu koje proizvode i održavaju mijelin. Akutno zapaljenje i hronična demijelinizacija konačno dovode do uništavanja oligodendrocita i gubitka aksona.
Sekundarna progresivna faza MS odlikuje se neurodegeneracijom i funkcionalnim pogoršanjem stanja koje je otporno na tretman.
Trenutno dostupne opcije za tretman MS su imunomodulatorne i imunosupresivne terapije koje su najdelotvornije u toku relapsno-remitentne faze MS u kojoj posreduje zapaljenje. Ove terapije su samo delimično delotvorne u usporavanju progresivne faze MS, koja može da bude u značajnoj meri neurodegenerativna. Postoji hitna potreba za terapijama koje bi mogle da zaustave ili preokrenu napredovanje MS kroz strategije koje podrazumevaju saniranje i regeneraciju neuralnih ćelija.
Terapije matičnim ćelijama deluju veoma obećavajuće, kada je reč o regenerativnoj medicini. Matične ćelije imaju potencijal da se razviju u mnogo različitih vrsta ćelija unutar organizma. Matične ćelije mogu, u teoriji, neograničeno da se dele kako bi dopunile one ćelije kojima je potrebno saniranje. Postoje različite vrste matičnih ćelija sa različitim rasponima mogućih puteva razvoja. Embrionske matične ćelije imaju veliki potencijal u regenerativnoj medicini; međutim, one imaju nekoliko nedostataka, uključujući i moguće odbacivanje transplanta i moguć nastanak teratoma ukoliko se ćelije ne diferenciraju pravilno pre presađivanja. Matične ćelije odraslih, kao što su neuralne matične ćelije (NSC) i prekursorske ćelije oligodendrocita (OPC) imaju nešto ograničeniji razvojni potencijal od embrionskih ćelija i generalno se diferenciraju duž svojih izvornih linija. Iako adultne neuralne matične ćelije takođe predstavljaju mogući tretman neurodegenerativnih poremećaja koja obećava, one imaju određene nedostatke, uključujući teškoće pri izolovanju, ograničen kapacitet za širenje i imunološko odbacivanje transplantiranih, donorskih ćelija.
Mezenhimske matične ćelije dobijene iz koštane srži (MSC, Mesenchymal Stem Cells) su još jedna vrsta matičnih ćelija odraslih koje se diferenciraju u nehematopojetična tkiva, uključujući osteoblaste, adipocite, hondrocite i mioblaste (Ferrari, et. al., Science 279:1528-1530 [1998]; Pittenger, et.al., Science 287:143-147 [1999]; Prockop, et. al., Science 276:71-74 [1997]). Upotreba matičnih ćelija dobijenih iz koštane srži donosi brojne terapeutske prednosti. Koštana srž je lako dostupan i autologni izvor matičnih ćelija kojim se eliminiše rizik od odbacivanja. Kako mezenhimske matične ćelije imaju ogromnu sposobnost širenja ex vivo, moguće je razmnožiti malu populaciju ćelija na broj koji je dovoljan za kliničku primenu.
MSC imaju nekoliko izvanrednih in vitro odlika koje ih čine veoma privlačnim kandidatima za neurodegenerativne i imunološke poremećaje.
MSC pokazuju plastičnost diferencijacije, što znači da mogu da se diferenciraju niz ćelijske linije različite od njihovog histološkog porekla (Jiang, et. al., Nature 418: 41-49 [2002]; Woodbury, et.al., J. Neurosci Res 69: 908-917 [2002]). MSC su u stanju da formiraju ćelije neuronskog i glijalnog fenotipa in vitro (Black et al., Blood Cells Mol Dis 27: 632-636 [2001]; Deng et.al., Biochem Biophys Res Commun 282: 148-152 [2001]; Hermann, et. al., J. Cell Sci 117:4411-4422 [2004]; SanchezRamos, et. al., Exp. Neurol 164: 247-256 [2000]; Suzuki, et. al., Biochem Biophys Res Commun 322: 918-922 [2004]; Woobury , et. al., J Neurosci Res 61: 364-370 [2000]). MSC koje su inkubirane u prisustvu faktora rasta - baznog faktora rasta fibroblasta (bFGF) i epidermalnog faktora rasta (EGF) pokazuju morfologiju neuralnih matičnih ćelija sa povećanom ekspresijom markera neuralnih matičnih ćelija (Hermann et al., J Cell Sci 117: 4411-4422 [2004]). Ove studije otvaraju pitanje da li bi MSC mogle da zamene ćelije u oštećenim delovima mozga i kičmene moždine.
MSC imaju imunoregulatornu funkciju. Pokazano je da MSC mogu da suprimiraju aktivaciju i proliferaciju T, B, NK i dendritskih ćelija (Uccelli et al., Expert Opin Biol Ther 6: 17-22 [2006]). Ova protivzapaljenska svojstva MSC ukazuju na moguću kliničku primenu kod bolesti u kojima posreduje imuni sistem.
MSC mogu da pospeše genezu neurona i oligodendrocita iz neuralnih matičnih ćelija (Bai et al., Neurochem Res 32: 353-362 [2007]; Rivera, et. al. Stem Cell 24: 2209-2219 [2006]). Ove nedavne studije pokazuju da MSC luče tropne faktore koji utiču na potomstvo neuralnih matičnih ćelije, što može da ima kliničke implikacije za unapređenje oporavka nakon širokog spektra ozleda CNS-a.
Rezultati koji govore da MSC mogu da daju ćelije nalik neuralnim matičnim ćelijama, koje eksprimiraju ćelijske markere neuralnih matičnih ćelija (Hermann et al., J Cell Sci 117: 4411-4422 [2004]) ukazuju da bi neuralne prekursorske ćelije izvedene iz MSC mogle da budu moćniji izvor terapeutskih upotreba za CNS. MSC koje su gajene u kulturi, u podlozi specifičnoj za neuralne matične ćelije (podloga bez seruma koja sadrži po 20 ng/ml EGF i bFGF) pokazale su neurosferičnu morfologiju i povećanje genskih markera za neuralne matične ćelije (nestin), glijalnih gena (GFAP, MBP) i neuronskih gena (Map2, neurofilament, tirzon hidroksilaza, voltažno-zavisni K+ kanali) (Hermann et al., J Cell Sci 117: 4411-4422 [2004]; Hermann, et. al., J Neurosci Res 83: 1502-1514 [2006]; Mareschi, et. al., Exp Hematol 34: 1563-1572 [2006]). Kada se porede različiti uslovi gajenja u kulturi za konverziju MSC u neuralne prekursorske ćelije, u jednoj studiji je pronađeno da MSC gajene u kulturi u podlozi za održavanje progenitora neuralnih ćelija (Neural Progenitor Maintenance Media (NPMM, Lonza)) dobijaju morfološke karakteristike, neuralne markere i elektrofiziološka svojstva koja ukazuju na neuralnu diferencijaciju (Mareschi et al., Exp Hematol 34: 1563-1572 [2006]).
Upotreba mezenhimskih matičnih ćelija kod neuroloških bolesti
Nekoliko kliničkih studija analiziralo je bezbednost i terapeutsku delotvornost MSC. Više stotina pacijenata primilo je infuziju alogenih MSC sa HLA poklapanjem u kontekstu transplantacije hematopojetskih matičnih ćelija zbog maligniteta ili urođenih metaboličkih bolesti (Lazarus, et. al., Biol Blood Marrow Transplant 11: 389-398 [2005]; Le Blanc, et. al., Biol Blood Marrow Transplant 11: 321-334 [2005]). Bolesti graft protiv domaćina (GvHD) u uznapredovalom stadijumu je preokrenuta nakon infuzije MSC dobijenih od donora (Le Blanc et. al., Lancet 363: 1439-1441 [2004]). U ovim studijama, infuzija od približno 1-2 miliona ćelija/kg MSC dobro se podnosi, bez ikakvih sporednih dejstava. Stoga početni podaci dobijeni iz kliničkih studija ukazuju da terapije zasnovane na MSC deluju veoma obećavajuće kao modulatori imunog sistema; dodatne studije faza I i II, u kojima se proučavaju uloge MSC u tretmanu GvHD su u toku (Giordano, et. al., J Cell Physiol 211: 27-35 [2007]). Dalje, kliničke studije koje ispituju MSC kod osteogenesis imperfecta (Horwitz, et. al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 8932-8937 [2002]; Le Blanc, et. al., Transplantation 79: 1607-1614 [2005]), infarkta miokarda (Chen, et. al., Am J Cardiol 94: 92-95 [2004]; Katritsis et. al., Catherter Cardiovas Interv 65: 321-329 [2005]) i šloga (Bang, et. al., Ann Neurol 57: 874-882 [2005]) pokazale su da je ovakav tretman bezbedan i efikasan i kod ovih bolesti.
U nedavnoj kliničkoj studiji u Italiji (Mazzini, et. al., Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 4: 158-161 [2003]; Mazzini, et. al., Neurol Res 28: 523-526 [2006]; Mazzini, et.al., Neurol Sci [2007]), autologne MSC izvedene iz koštane srži presađene su direktno u kičmenu moždinu devet pacijenata sa amiotrofnom lateralnom sklerozom (ALS), degenerativnom bolešću motornih neurona. Intraspinalna transplantacija prosečnog broja od 32 miliona autolognih MSC bila je bezbedna i pacijenti koji pate od ALS su je dobro podneli; period kontrole bio je 4 godine. Manji neželjeni događaji bili su bolne refleksije u međurebarnom prostoru i senzorna dizestezija nogu, koji su nestali nakon 6 nedelja. Kod 5 pacijenata koji su primili transplantaciju autolognih MSC, došlo je do značajnog usporavanja linearnog opadanja na skali za funkcionalno ocenjivanje ALS (Mazzini, et. al., Neurol Res 28: 523-526 [2006]). Imajući u vidu progresivnu prirodu ove bolesti, ovakvi rezultati ukazuju na kliničke dobrobiti transplantacije MSC i zahtevaju dalja ispitivanja. Ohrabrujući klinički rezultati transplantacije autolognih MSC kod ALS i bezbednosti i podnošljivosti koje su uočene tokom perioda praćenja (kontrole) od 4 godine ukazuju da bi se mogao primeniti sličan pristup lečenju drugih neurodegenerativnih poremećaja, kao što je MS.
Upotreba mezenhimskih ćelija kod MS
Na osnovu pretkliničkih podataka koji pokazuju perifernu imunosupresiju kod EAE, trenutno se sprovodi istraživanje faze VIIA na Univerzitetu Kembridž u Kembridžu, Engleska. Ova studija usmerena je ka ispitivanju bezbednosti intravenske primene autolognih MSC kod pacijenata sa multiplom sklerozom. U studiju je uključeno 20 pacijenata, a doza je 2 miliona ćelija/kg (http://clinicaltrials.gov/ctlshow/NCT00395200,jsessionid=F5A5DF2968El 567A594549 F1CCE4B7EF?order=14).
U nedavnoj pilot studiji koja je sprovedena u Iranu, humane autologne MSC ubrizgane su intratekalno kod deset pacijenata koji pate od primarne progresivne i sekundarne progresivne MS (Mohyeddin, et. al., Iran J lmmunol 4: 50-572007]). Istraživači su ubrizgavali 8,73 miliona ćelija u proseku. Najveća doza bila je 13,2 miliona ćelija, dok je najniža bila 2,5 miliona ćelija. Pacijenti su praćeni tokom perioda od devetnaest meseci nakon tretmana, u proseku, sa mesečnim kontrolnim pregledima i MRI pregledom 12 meseci nakon intratekalne injekcije autolognih MSC. Kod pacijenata je praćena promena u EDSS oceni, promena broja i dimenzija lezija na MRI i subjektivno poboljšanje. Istraživači su pronašli da je intratekalna transplantacija autolognih MSC bezbedna i da se dobro podnosi, sa sporednim dejstvima koja su u vezi sa procedurom intratekalne injekcije (npr. glavobolja). Dva pacijenta su dobila jatrogeni meningitis i oba pacijenta su uspešno lečena antibioticima. Takođe su uočili da je terapija povezana sa određenim poboljšanjem. Kod jednog pacijenta, EDSS ocena se smanjila. Kod četiri pacijenta, došlo je do poboljšanja u svakodnevnom funkcionisanju, bez promene EDSS ocene. Kod pet pacijenta došlo je do povećanja EDSS ocene i svih pet pacijenata prijavilo je subjektino poboljšanje u roku od tri meseca nakon tretmana. Istraživači su zaključili da je intratekalna injekcija autolognih MSC bezbednan tretman za MS pacijente, koji obećava.
Do sada nije prijavljena upotreba neuralnih prekursora izvedenih iz MSC kod ljudi.
Kratak opis pronalaska
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za in vitro diferencijaciju neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih ćelija, kao što je definisano u priloženim nezavisnim patentnim zahtevima. Dalje su obezbeđeni postupci za tretman i(li) smanjenje stepena multiple skleroze kod ljudi, primenom neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija kod pacijenata koji pate od multiple skleroze.
Neuralne prekursorske ćelije dobijene iz mezenhimskih matičnih ćelija prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju gajenjem mezenhimskih matičnih ćelija u bazalnoj podlozi za neuralne progenitore, zasejavanjem ćelija i njihovim gajenjem sa baznim faktorom rasta fibroblasta (bFGF). Neuralne prekursorske ćelije se potom obeležavaju, na primer pomoću tehnika fluorescentne imunohemije, za potrebe identifikacije. Neuralne prekursorske ćelije obuhvataju oligodendroglijalne i(li) neuronalne ćelije.
Primena autolognih neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija kod pacijenta može da podrazumeva sledeće korake: pripremu autolognog seruma za rast dobijenog od pacijenta; uzimanje matičnih ćelija izvedenih iz koštane srži pacijenta koji će se tretirati ovim postupkom; izolovanje i razmnožavanje mezenhimskih matičnih ćelija izvedenih iz koštane srži u serumu za rast; gajenje u kulturi i izolovanje neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija od mezenhimskih matičnih ćelija; te intratekalnu primenu navedenih neuralnih prekursorskih ćelija izvedenih iz mezenhimskih matičnih ćelija kod navedenog pacijenta. Neuralne prekursorske ćelije dobijene iz mezenhimskih matičnih ćelija prema predmetnom pronalasku pokazuju povećane količine markera nestina, neurofilamenata i GFAP (glijalnog fibrilarnog kiselog proteina) i smanjenje količine markera vimentina.
Navedene, kao i druge odlike predmetnog pronalaska, uključujući i različite nove detalje konstrukcije i kombinovanja delova, biće detaljnije opisani u daljem tekstu uz pozivanje na priložene slike, a zatim istaknute u patentnim zahtevima. Podrazumeva se da su konkretni uređaji i postupci koji predstavljaju rešenja prema predmetnom pronalasku prikazani isključivo kao ilustracije i da ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska. Principi i karakteristike predmetnog pronalaska mogu da se primene na različita i brojna rešenja, bez udaljavanja od obima zaštite predmetnog pronalaska.
Kratak opis slika
Ova i druge karakteristike, rešenja i prednosti aparata i postupaka prema predmetnom pronalasku biće jasnije u kontekstu opisa koji sledi, priloženih patentnih zahteva i priloženih slika, na kojima:
Slika 1: Povećana ekspresija neuronalnih i oligodendroglijalnih markera u neuronalnim prekursorskim ćelijama izvedenim iz MSC (MSC-NP) i MSC nakon diferencijacije in vitro. Ekspresija 133-tubulina ( β3-tubulina, prim. prev.) (neuronalnog markera) i 04 (ranog markera oligodendroglijalne diferencijacije) značajno je povećana kod MSC-NP u poređenju sa MSC koje se gaje u bFGF tokom 3 nedelje.
Slika 2: Povećana ekspresija neuronalnih i oligodendroglijalnih markera u neuralnim prekursorskim ćelijama izvedenim iz MSC nakon diferencijacije in vitro. Neuronalni markeri (β3-tubulin i MAP-2) i oligodendroglijalni markeri (O1 i GalC) se povećavaju nakon tronedeljne diferencijacije u bFGF. Ekspresija nestina, koji je marker neuralnih progenitora, smanjena je kod približno 50% MSC-NP ćelija nakon diferencijacije.
Slika 3 grafički ilustruje da neuralne prekursorske ćelije izvedene iz MSC pokazuju protivzapaljenske odlike slične onima kod MSC, putem inhibicije PHA-stimulisane proliferacije T ćelija u zajedničkoj kulturi.
Slika 4: Neuralne prekursorske ćelije izvedene iz MSC (MSC-NP) gube svoju sposobnost da se diferenciraju u mezenhimske ćelijske linije. MSC-NP pokazuju smanjenu sposobnost da se diferenciraju u adopocite pozitivne za uljano-crvenu O (A) ili osteocite koji sadrže kalcijum (B) u poređenju sa MSC.
Slika 5 grafički prikazuje smanjenu kliničku ocenu nakon intravenske (A) ili intracerebroventrikularne (B) primene neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC miša u trenutku pojave EAE (10. dan) kod miševa.
Slika 6: Povećana ekspresija nestina kod neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC . (A) Vretenasta morfologija humanih MSC izolovanih iz koštane srži i gajenih u MSCGM (podloga za gajenje mezenhimskih matičnih ćelija) (10% serum), vizuelizovana svetlosnom mikroskopijom. (B) Sferna morfologija neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC. Neuralne prekursorske ćelije dobijene su iz MSC nakon gajenja u kulturi NPMM u toku 15 dana. (C) Približno 30% humanih MSC eksprimiraju protein nestin. (D) >90% neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC eksprimira protein nestin. Ekspresija proteina nestina određena je standardnom imunofluorescencijom. Ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu i označene nestinskim antitelom (Chemicon), nakon čega je usledila reakcija sa anti-zečjim sekundarnim antitelom konjugovanim za Alexa-594 (Molecular Probes). Polja A-C posmatrana su pod 100x uvećanjem a polje D pod uvećanjem od 200x.
Slika 7: Neuralne prekursorske ćelije (MSC-NP) pokazuju povećanu ekspresiju proteina nestina, GFAP i neurofilamenta-M, a smanjenu ekspresiju vimentina i αSM aktina u poređenju sa MSC.
Slika 8 grafički ilustruje povećanu ekspresiju proteina u neuralnim prekursorskim ćelijama dobijenim iz MSC za nestin, GFAP i neurofilament-M, a smanjenu ekspresiju vimentina i αSM aktina u poređenju sa MSC.
Detaljan opis pronalaska
Kod pacijenata koji pate od multiple skleroze obično dolazi do progresivnog neurološkog propadanja, usled produženih autoimunih napada, neuspeha endogenog mehanizma za remijelinizaciju da popravi oštećenja i aksonalnog gubitka. Upotreba neuralnih prekursorskih ćelija dobijnih iz MSC usmerena je ka preokretanju toka neurodegeneracije do koje dolazi kod multiple skleroze, kroz popravke oštećenja i regeneraciju oštećenih ćelija. Pretkliničke studije na životinjama su pokazale da terapije zasnovane na MSC donose značajne dobrobiti u modelima ozlede CNS-a i demijelinizujuće bolesti. Podaci kliničkih studija ukazuju da je primena MSC bezbedna i da se dobro podnosi; međutim, neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC nisu korišćene u kliničkim studijama. Uz to, kliničke studije sa pacijentima koji pate od MS i ALS ukazuju da bi MSC mogle da donesu određenu terapeutsku dobrobit. Predmetni pronalazak je, tako, usmeren na određivanje bezbednosti, podnošljivosti, doziranja i efikasnosti intratekalnih injekcija autolognih neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC kod pacijenata sa MS. Ovaj tretman mogao bi da preokrene tok neurodegeneracije u demijelinišućim plakama kod pacijenata sa MS. Injekcije neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC takođe bi mogle da dovedu do smanjenja zapaljenskog odgovora koji se dovodi u vezu sa napadima MS. Autologne neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC mogle bi da služe kao delotvoran obrazac za neuroregeneraciju sa minimalnim neželjenim sporednim dejstvima.
Podaci dobijeni in vitro ukazuju da je pred-diferencijacija MSC u neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC neophodna za diferencijaciju u zreliji neuronski ili glijalni fenotip. Iako je objavljena i pojava diferencijacije MSC direktno u ćelije nalik neuronalnim (Deng, et. al., Biochem Biophys Res Commun 282: 148-152 [2001]; Sanchez-Ramos, et. al., Exp Neurol 164: 247-256 [2000]; Woodbury, et. al., J Neurosci Res 61:364-370 [2000]), verovatno je da je ove promene potrebno pripisati ćelijskoj toksičnosti (Bertani, et. al., J Cell Sci 118: 3925-3936 [2005]; Neuhuber, et. al., JNeurosci Res 77: 192-204 [2004]). Konverzija MSC u neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC dovodi do značajno povećane ekspresije nestina (videti, npr. sliku 7) koja je neophodna za dalju diferencijaciju u neurone i astrocite (Wislet-Gendebien, et. al., J Cell Sci 116: 3295-3302).
Pronalazači predmetnog pronalaska pokazali su da su neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC, ali ne i same MSC, u stanju da se diferenciraju, in vitro, u oligodendroglijalne (O4+) ili neuronalne (β3-Tubulin+) ćelijske tipove (slike 1 i 2). Uz to, pronalazači predmetnog pronalaska su generisali podatke koji ukazuju da neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC zadržavaju protiv-zapaljenska svojstva MSC ćelija (slika 3) ali gube plastičnost diferencijacije koja ih odlikuje (tj. diferencijaciju u osteoblaste ili adipocite) (slika 4).
Ovi nalazi ukazuju da je veća verovatnoća da će neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC odgovoriti na signale za diferencijaciju poreklom iz CNS, te da dodatno mogu da suprimiraju imuni odgovor i da oštećenim ćelijama pruže tropnu podršku. Uopšteno gledano, ovi podaci podržavaju obrazloženje za upotrebu neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC za ćelijsku terapiju multiple skleroze u ovom protokolu.
Primarni cilj predmetnog pronalaska bio je da se utvrdi bezbednost i efikasnost upotrebe ćelijske terapije za MS na bazi autolognih neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija. Ovaj cilj je postignut primenom intratekalnih injekcija izolovanih i razmnoženih autolognih neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC. Još jedan cilj je da se utvrdi podnošljivost režima doziranja za intratekalne primene autolognih neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija, u toku različitih vremenskih perioda.
Ispitivanja u životinjskim modelima neuroloških bolesti
Veliki broj studija pokazao je da je transplantacija MSC kod pretkliničkih životinjskih modela bolesti CNS bezbedna i delotvorna. Studije u kojima je ispitivana povreda kičmene moždine kod pacova in vivo, pokazale su da se presađene MSC delotvorno usmeravaju ka ozleđenom tkivu kičmene moždine i pružaju podršku rastu aksona, čime promovišu značajan klinički oporavak (Chopp, et. al., Neuroreport 11: 3001-3005 [2000]; Hofstetter, et. al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 2199-2204 [2002]; Ohta, et. al., Exp Neurol 187: 226-278 [2004]; Satake, et. al., Spine 29: 1971-1979 [2004]; Zurita, Neuroreport 15: 1105-1108 [2004]; Zurita, Neurosci Lett 402: 51-56). U modelu ishemijske ozlede mozga kod pacova, presađene MSC su migrirale do mesta ozlede mozga i poboljšale neurološki ishod (Chen et. al., Am J Cardiol 94: 92-95 [2004]; Lu, et. al., J Neurosurg 97: 935-940 [2002]; Lu, et. al., J Neurotrauma 18: 813-819 [2001]; Lu, et. al., Neuroreport 12: 559-563 [2001]). Presađivanje MSC u više različitih drugih modela neurodegenerativnih bolesti takođe je pokazalo delotvorno preživljavanje, migraciju i pospešivanje neuronalnog umrežavanja (Bae, et. al., Stem Cells 25: 1308-1316 [2007]; Hellmann, et. al., Neurosci Lett 395: 124-128 [2006]), pokazujući neuroprotektivna i neuroregenerativna svojstva MSC u modelima kod glodara. Dalje, MSC su bile sposobne za funkcionalnu remijelinizaciju kada su presađene u demijelinizovanu kičmenu moždinu (Akiyama, et. al., JNeurosci 22: 6623-6630 [2002]). U modelima kod primata različitih od ljudi, pretklinička evaluacija presađivanja MSC u CNS rezus majmuna pokazala
1
je usađivanje ćelija, preživljavanje, usmeravanje ka mestu ozlede i neurološke dobrobiti bez toksičnosti (Deng, et. al., Cytotherapy 8: 210-214 [2006]; Isakova, et. al., Mol Ther 13: 1173-1184 [2006]), što ukazuje da terapije zasnovane na MSC predstavljaju bezbedan terapeutski pristup poremećajima CNS-a.
Nešto su šturiji pretklinički podaci za neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC u CNS-u. U nedavnoj studiji, 100.000 MSC ili neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC intratekalno je presađeno u cisterna magna u mišjem modelu ALS (Habisch, et. al., J Neural Transm (u štampi) [2007]). Primarni parametar ishoda bio je dejstvo na vreme preživljavanja, dok su sekundarni parametri ishoda obuhvatali poboljšanje motorne funkcije i subarahnoidalnu i intraparenhimalnu distribuciju ćelija. Intratekalno presađivanje MSC ili neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC nije imalo nikakvo dejstvo na vreme preživljavanja kod ALS miševa u poređenju sa miševima koji nisu tretirani, verovatno zbog izostanka ćelijske migracije u kičmenu moždinu. Ono što je interesantno jeste da je došlo do značajnog povećanja u pretsimptomatskim motornim performansama kod miševa koji su primali MSC ili neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC. Došlo je do široke distribucije svih transplanitranih ćelija unutar subarahnoidalnog prostora, kao i značajne intraparenhimalne migracije. Ova studija je pokazala da se neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC podnose isto kao i MSC i da pokazuju slične odlike u pogledu preživljavanja i migracije unutar CNS-a.
Studije u životinjskim modelima MS
Primena MSC takođe je testirana kod miševa sa eksperimentalnim autoimunim encefalomijelitisom (EAE), eksperimentalnim modelom za multiplu sklerozu kod ljudi. Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE), koji se naziva još i eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, predstavlja životinjski model za multiplu sklerozu. Životinjski modeli bolesti ljudi su bolesti vrsta različitih od čoveka (često su u pitanju glodari) koje veoma liče na odgovarajuće bolesti kod ljudi i koje mogu da se proučavaju sa ciljem boljeg razumevanja i lečenja odgovarajućih bolesti kod ljudi. EAE nije multipla skleroza, niti je reč o pojedinačnoj bolesti kod pojedinačne vrste, već njegovi različiti oblici liče na različite oblike i stadijume MS, u velikoj meri i na veliki broj različitih načina.
EAE je akutna, ili hronična - relapsna, stečena, zapaljenska i demijelinišuća autoimuna bolest CNS-a. Životinjama se ubrizgavaju celi ili delovi različitih proteina koji čine mijelin, izolatorski sloj koji okružuje nervne ćelije (neurone). Ovi proteini dovode do autoimunog odgovora kod životinja - drugim rečima, imuni sistem životinje razvija odgovor na sopstveni mijelin kao posledica izlaganja injekciji. Kod životinja se razvija bolest koja pokazuje patološke i kliničke sličnosti sa MS kod ljudi.
EAE je indukovan kod većeg broja različitih životinjskih vrsta, uključujući miševe, pacove, zamorce, zečeve, makaki majmune, rezus majmune i marmosete. Zbog različitih razloga, uključujući i broj imunoloških alata, dostupnost, životni vek i plodnost životinja, kao i sličnosti indukovanih bolesti sa MS, najčešće korišćene vrste su miševi i pacovi.
Životinje se pare u srodstvu kako bi se pouzdano prenosila podložnost EAE kod ovih životinja. Kao i kod MS kod ljudi, neće svi miševi i pacovi imati prirodnu sklonost da razviju EAE. Dalje, različite rase će razviti različite oblike EAE, od kojih su neki dobri modeli za različite oblike MS kod ljudi. Različiti oblici EAE takođe se koriste za različite stadijume MS.
Itravenska injekcija MSC kod miševa sa EAE dovela je do smanjenjog broja zapaljenskih infiltrata, manjeg broja demijelinisanih lezija i poboljšanja neurološke funkcije (Zappia, et. al., Blood 106: 1755-1761 [2005]; Zhang, et. al., Exp Neurol 195: 16-26 [2005]). Iako je pronađeno da su neke od periferno ubrizganih ćelija lokalizovane u parenhimu (Zhang, et. al., Exp Neurol 195: 16-26 [2005]), kod većine MSC došlo je do asocijacije sa limfoidnim organima, gde one delotvorno modulišu patogeni imuni odgovor (Zappia, et. al., Blood 106: 1755-1761 [2005]; Gerdoni, et. al., Ann Neurol 61: 219-227 [2007]).
Pronalazači predmetnog pronalaska su pokazali da injekcija neuroloških prekursora dobijenih iz MSC miševa u trenutku razvoja EAE kod miševa dovodi do sličnog smanjenja ocene EАЕ, kao i u studijama koje su prethodno opisane. Milion ćelija je ubrizgano bilo intravenski ili intracerebroventrikularno, a miševi su praćeni u periodu od 3-4 meseca. Kao što je prikazano na slici 5A, došlo je do smanjenja ukunog nivoa invaliditeta kod miševa kojima su intravenski ubrizgane neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC u poređenju sa miševima koji su primili fiziološki rastvor. Kada su ćelije ubrizgane direktno u CNS (slika 5B), došlo je do značajnog odlaganja pojave EAE i do smanjenja ukupnog invaliditeta.
Osnov za intratekalni put primene
Pretklinički životinjski modeli su primenjeni kako bi se ispitala bezbednost i podnošljivost MSC primenjenih različitim putem. Pronađeno je da je intravenska primena korisna kod perifernih bolesti kod kojih posreduje imuni sistem, kao što su EAE i bolest graft protiv domaćina (GvHD) (Zappia, et. al., Blood 106: 1755-1761 [2005]; Bartholomew, et. al., Exp Hematol 30: 42-48 [2002]). MSC koje se ubrizgaju intravenski uklone se iz krvotoka nakon 1 čas (Koc, et. al., J Clin Oncol 18: 307-316 [2000]), pri čemu većina ćelija ostaje zarobljena u plućima. Procenjeno je da manje od 1% intravenski primenjenih MSC dođu do CNS-a (Corti, et. al., Brain 127: 2518-2532 [2004]), zbog čega je intravenski put primene potpuno nepogodan za bolesti CNS-a usled činjenice da bi bio potroban ogroman broj ćelija.
Patološka odlika multiple skleroze su multifokalne demijelinizirajuće lezije u mozgu. Lezije različitog stepena demijelinizacije/remijelinizacije uočavaju se u celokupnom mozgu i kičmenoj moždini, iako je primećeno da periventrikularne lezije pokazuju niži stepen remijelinizacije od dubokih lezija bele mase (Patrikios, et. al., Brain 129: 3165-317260 [2006]). Većina fizičkih invaliditeta kod MS izazvana je lezijama u kičmenoj moždini, tako da bi matične ćelije mogle da se dopreme direktno do lezija u kičmenoj moždini intraspinalnim injekcijama. Međutim, takva procedura bi zahtevala neurohiruršku intervenciju i donela neopravdan rizik po pacijente. Dalje, obično postoji više mesta demijelinizacije koja dopriose invaliditetu, usled čega je teško dopremiti ćelije u sve lezije. Uz to, direktne injekcije u tkivo CNS bile bi opasne i preterano agresivne za bolest koja nije smrtonosna.
Optimalni put primene i dopremanja trebalo bi da zaseje neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC u mozgu i kičmenoj moždini putem venske, arterijske ili cirkulacije spinalne tečnosti. Intravensko dopremanje matičnih ćelija je najmanje invazivan put dopremanja a pokazano je da je, za MSC, bezbedan i da se lako toleriše. Međutim, IV injekcije neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC ne garantuju da će pogodan broj matičnih ćelija prodreti u mozak i kičmenu moždinu. Stoga smo odabrali intratekalni put dopremanja, koji je minimalno invazivan i doveo bi do zasejavanja matičnih ćelija unutar CNS putem cirkulacije cerebrospinalne tečnosti, čime se obezbeđuje potencijalni pristup lezijama kičmene moždine i periventrikularnim lezijama u mozgu. Prtkliničke studije koje su pokazale sposobnost MSC da migriraju prema oblastima koje se nalaze cefaladno u odnosu na mesto injekcije (Bakshi, et. al., J Neurotrama 23: 55-65 [2006]; Lepore, et. al., Brain Res 1045: 206-216 [2005]), ukazuju da je intratekalna primena putem lumbalne punkcije delotvoran način da se matične ćelije dopreme do mesta ozlede CNS-a. Ubrizgavanje lekova ili ćelija u cerebrospinalnu tečnost (CST) omogućava ovim sredstvima da zaobiđu organe van CNS i da brzo uđu u mozak. Iako se, uopšteno posmatrano, CST kreće od rostralnog ka kaudalnom smeru, postoji određeni retrogradni tok CST (Johnson, et. al., Pharm Res 22: 1011-1037 [2005]). Nekoliko efikasnih tretmana se primenjuje intratekalno. Na primer, intratekalni baklofen (ITB) se koristi za tretman grčeva kod pokretnih pacijenata koji pate od MS. U studiji koju su sproveli pronalazači predmetnog pronalaska, trideset šest pacijenata sa izraženim grčevima tretirano je kontinualnom infuzijom ITB. Pacijenti su praćeni u periodu od 1 do 13 godina. Kod svih tridesetšest pacijenata došlo je do značajnog gubitka spastičnosti, ocenjivanog na Ašvortovoj skali (Sadiq, et. al., J Neurol 253: 563-569 [2006]).
1
U modelima CNS bolesti, MSC su ubrizgavane intracerebroventrikularno (Ohta, et. al., Exp Neurol 187: 266-278 [2004]; Arnhold, et. al., Eur J Cell Biol 85: 551-565 [2006]; Chen, et. al., J Neurol Sci 189: 49-57 [2001]) i, u nekim slučajevima, direktno u patološka tkiva CNS (Chopp, et. al., Neuroreport 11: 3001-3005 [2000]; Hofstetter, et. el., Proc Natl Acad Sci USA 99: 2199-2204 [2002]). Iako su se ovi načini dopremanja pokazali delotvornim u životinjskim modelima, kod ljudi bi to predstavljalo veoma invazivnu i potencijalno opasnu proceduru. MSC koje se ubrizgavaju intratekalno u lumbalni region pacova, nakon cervikalne povrede kičmene moždine, migrirale su i nakupljale se u oblasti povređenog tkiva (Bakshi, et. al., Neurotrauma 23:55-65 [2006]), čime je potvrđena validnost ovakvog pristupa. Zbog rostralne migracije MSC, izvodi se pretpostavka da su MSC osetljive na hemotaktičke signale i specifične molekule adhezije (Bakshi, Et. al., J Neurotrauma 23: 55-56 [2006]; Lapore, et. al., Brain Res 1045: 206-216 [2005]). Prevedeno na ljude, intratekalno dopremanje matičnih ćelija minimalno invazivnom lumbalnom punkcijom može da ima značajan terapeutski potencijal.
Kod ljudi, prvo pitanje koje se postavlja je pitanje bezbednosti i podnošljivosti. Najbezbedniji put za dopremanje ćelija bio bi intravenski ili intratekalni put. Na osnovu pretkliničkih modela koji su prethodno opisani, ćelije se primenjuju kod pacijenata - ljudi lumbalnom punkcijom.
U ispitivanju kod ljudi koje treba upravo da počne, biće upotrebljene sledeće procedure i koraci kako bi se pokazala efikasnost primene autolognih neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija kod ljudi za tretman i(li) smanjenje stepena MS.
Uzimanje seruma
Matične ćelije dobijene iz koštane srži su izolovane i razmnožene u autolognom serumu iz istog pacijenta koji učestvuje u istraživanju. Rast matičnih ćelija u autolognom serumu sprečava uvođenje potencijalno štetnih životinjskih proizvoda prisutnih u fetalnom goveđem serumu (Stute, et al. Exp Hematol 32: 1212-1225 [2004]). Serum od svakog pacijenta u ispitivanju uzet je pre procedure aspiracije koštane srži, tokom posete pri ulasku u ispitivanje. Medicinski radnik uzima približno 200 ml periferne krvi od svakog od pacijenata u epruvete koje su prethodno obeležene identifikatorom jedinstvenim za svakog pacijenta. Pacijentima se daje tečnost da piju i uzimaju se vitalni parametri pre nego što se pacijenti pošalju kući. Krv se odmah prebacuje u laboratoriju za gajenje ćelija u kulturi. Krv se potom centrifugira, a serum se sakuplja i spaja, korišćenjem aseptične tehnike u biološkoj bezbednosnoj komori (kapeli). Serum se potom filtrira kroz filter od 20 µm a potom čuva u alikvotima u posebno određenom zamrzivaču na -80<o>C koji se stalno prati, pomoću sistema za praćenje zamrzivača sa telefonskim alarmom. Svaka epruveta sa serumom se obeležava identifikatorom koji je jedinstven za datog pacijenta i datumom. Grupe seruma od svakog pacijenta takođe se pakuju u sopstvene kutije koje se obeležavaju jedinstvenim identifikatorom tog pacijenta. Materijali koji bi mogli da kontaminiraju ili na drugi način nepovoljno utiču na proizvode za ćelijsku terapiju neće se čuvati u tom namenskom zamrzivaču. Serum se koristi za podržavanje rasta autolognih mezenhimskih matičnih ćelija.
Uzimanje koštane srži
U cilju dobijanja aspirata koštane srži iz posteriorne ilijačne kreste sprovodi se aspiracija koštane srži pod sterilnim uslovima, nakon injekcije lokalne anestezije. Prati se standardna procedura za aspiraciju koštane srži pomoću kompleta za koštanu srž za odrasle, sa heparinizovanim špricem. Kod pacijenate sa invaliditetom koji ne mogu da se prebace na sto bez Hojerovog lifta, pristup ilijačnoj kresti je otežan. Kod ovih pacijenata, aspirat koštane srži dobija se iz manubrijuma grudne kosti, na nivou drugog međurebarnog prostora. Procedura se izvodi u invalidskim kolicima. Pacijenti čiji stepen invaliditeta ih sprečava da se postave u položaj koji hematologu omogućava pristup njihovoj ilijačnoj kresti takođe se podvrgavaju aspiraciji iz grudne kosti. Prati se standardna procedura za aspiraciju koštane srži pomoću kompleta za koštanu srž za odrasle, sa heparinizovanim špricem. Od svakog pacijenta aspirira se približno 10 cc koštane srži.
Reagensi za gajenje ćelija u kulturi
Jedan od glavnih razloga za zabrinutost u literaturi, kada je reč o reagensima za gajenje ćelija u kulturi za terapije koje se zasnivaju na matičnim ćelijama je upotreba fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Mannello, et. al., Stem Cells 25: 1603-1609 [2007]), zbog toga što antigeni iz goveđeg seruma ostaju vezani sa ćelijama, što dovodi do imunološke reakcije. Pronalazači predmetnog pronalaska su eliminisali rizike koji se dovode u vezu sa FBS upotrebom autologog seruma. Ipak, u nekoliko kliničkih studija, ubrizgavane su MSC koje su razmnožavane u podlozi kojoj je dodavan FBS, bez ikakvih značajnih sporednih dejstava koja se dovode u vezu sa FBS (Lazarus et. al., Biol Blood Marrow Transplant 11: 389-398 [2005]; Le Blanc, et. al., Lancet 363: 1439-1441 [2004]; Horwitz, et.al., Proc Natl Acad Sci USA 99:8932-8937 [2002]; Bang, et. al., Ann Neurol 57: 874-882 [2005]; Mazzini, et al., Neurol Sci [2007]; Mohyeddin, et. al., Iran J Immunol 4: 50-57 [2007]; Karussis, et. al., J Neurol Sci [2007]). Jedna nedavna studija pokazala je da su pacijenti kojima su presađene alogene MSC razvili klinički beznačajna anti-FBS antitela i da nisu razvili antitela specifična za MSC (Sundin et. al., Haematologica
1
[2007]). U svim kliničkim studijama sa MSC do danas, MSC su razmnožavane u podlozi sa FBS i L-Glut, tretirane tripsinom, resuspendovane bilo u fiziološkom rastvoru ili u cerebrospinalnoj tečnosti i dopremane intravenski (Lazarus et al., Biol Blood Marrow Transplant 11: 389-398 [2005]; Le Blanc, et. al., Lancet 363: 1439-1441 [2004]; Horwitz, et. al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 8932-8937 [2002]; Bang, et. al., Ann Neurol 57: 874-882 [2005]), intraspinalno (Mazzini, et. al., J Neuro Sci [2007]), ili intratekalno (Mohyeddin, et. al., Iran J Immunol 4: 50-57 [2007]; Karussis, et. al., J Neurol Sci [2007]), bez značajnih sporednih dejstava koja bi se dovela u vezu sa infuzijom. Slično ovim ispitivanjima, finalni ćelijski proizvod prema predmetnom pronalasku se dobro ispira i resuspenduje u fiziološkom rastvoru kliničke čistoće pre ubrizgavanja kod ljudi, kako bi se sprečila infuzija reagenasa za gajenje ćelijske kulture. Opšti opis svih reagenasa koji se koriste za gajenje ćelija u kulturi u ovom protokolu naveden je u tekstu koji sledi.
Bazalna podloga: Bazalna podloga koja se koristi za ekspanziju (razmnožavanje) MSC (MSCBM) proizvodi se u objektu Lonza koji ispunjava sve zahteve za GMP (dobru proizvođačku praksu) iz relevantnih propisa. U MSCBM se dodaje Gluta-MAX (Invitrogen) koji je stabilna dipeptidna zamena za L-glutamin, esencijalnu aminokiselinu neophodnu za optimalan rast ćelija. Kako ćelije metabolišu Gluta-MAX, ne očekuje se nikakva toksičnost u vezi sa infuzijom. I stvarno, podloge koje se koriste za rast MSC za primenu infuzijom kod ljudi često se suplementiraju L-glutaminom bez ikakvih očiglednih sporednih dejstava (Lazarus et al., Biol Blood Marrow Transplant 11: 389-398 [2005]; Le Blanc, et. al., Lancet 363: 1439-1441 [2004]; Horwitz, et.al., Proc Natl Acad Sci USA 99:8932-8937 [2002]; Bang, et. al., Ann Neurol 57: 874-882 [2005]; Mazzini, et al., Neurol Sci [2007]; Mohyeddin, et. al., Iran J Immunol 4: 50-57 [2007]; Karussis, et. al., J Neurol Sci [2007]). MSCBM se dalje dodaje 10% autolognog seruma. Bazalna podloga koja se koristi za dobijanje neuralnih prekursorskih ćelija izvedenih iz MSC (NPNM) takođe se proizvodi u objektu koji ispunjava sve zahteve za GMP navedene u odgovarajućim propisima, u objektu Lonza. NPMM se sastoji od bazalne podloge (NPBM) sa tri dodatka (suplementa): 1) rekombinantni humani epidermalni faktor rasta (rhEGF), 2) rekombinantni humani osnovni faktor rasta fibroblasta (rhbFGF) i 3) faktor preživljavanja neuroloških ćelija (NSF-1). EGF i bFGF se koriste, oba, u konačnoj koncentraciji od 20 ng/ml. Štok rastvori EGF i bFGF se prave u fiziološkom rastvoru koji sadrži 0,1% goveđeg serum albumina (BSA) kao proteinski nosilac, a potom se razblažuju do koncentracije od 0,00002% BSA. Mehanistički, EGF i bFGF se vezuju za receptore na površini ćelije, nakon čega se kompleks receptor-ligand uvodi u ćeliju i unutar nje razgrađuje. Kako bi se osiguralno potpuno uklanjanje faktora rasta pre ubrizgavanja neuralnih prekursorskih ćelija
1
dobijenih iz MSC, ćelije se dobro isperu tri puta fiziološkim rastvorom. Koncentracije EGF i bFGF su ispitane pomoću ELISA u toku svakog koraka ispiranja i nije pronađeno da je zaostala bilo kakva značajna količina faktora rasta u konačnom ćelijskom proizvodu. NSF-1 je registrovana formulacija koja se koristi kao podrška za rast neuralnih progenitorskih ćelija. Prema informacijama dobijenim od proizvođača Lonza, jedna komponenta NSF-1 je goveđeg porekla. Lonza navodi da su svi njihovi proizvodi dobijeni iz govedine sa poreklom odobrenim od strane USDA, čime se na najmanju moguću meru smanjuje moguće prenošenje priona ili virusa. Štok rastvor NSF-1 se dalje razblažuje 50 puta do radne koncentracije u bazalnoj podlozi.
Tripisin: MSC se svaki put propuste kroz TrypLE (Invitrogen), mikrobiološki proizvedenu alternativu za životinjski tripisin. Tripsin je serin proteaza koja se nalazi u digestivnom traktu, a koja se koristi za hidrolizu vanćelijskih proteina neophodnih za pričvršćivanje ćelija za plastične posude. Tripsin se prečišćava iz svinjskog pankeasa, dok se TrypLE proizvodi u kontrolisanom procesu fermentacije u kome nema nikakvih komponenti koje su dobijene iz humanih ili animalnih tkiva. Produženo izlaganje tripsinu (ili TrypLE) dovodi do toksičnosti po ćelije, pa se pazi da se izlaganje ćelija TripLE svede na najmanju moguću meru, tako što se on dodaje veoma kratko a potom u potpunosti ispira. Nema nikakvog razloga da se smatra da će TrypLE serin proteaza ostati vezana za ćelije, jer bi to dovelo do toksičnosti po ćelije.
Antibiotici: U podlogu se dodaje antibiotički-antimikotički rastvor (Sigma), koji sadrži penicilin, streptmicin i amfoteracin B u toku prvobitnog gajenja u kulturi mononuklearne ćelijske frakcije iz koštane srži. Antibiotski-antimikotički rastvor se potom izostavlja iz podloge u toku prvog prebacivanja ćelija, kao i tokom svakog naknadnog prebacivanja ćelija.
Izolovanje MSC iz koštane srži
Uzorak sterilne koštane srži pacijenta koji učestvuje u ispitivanju se postavi u prethodno obeleženu kesu i odmah prebaci sa klinike u laboratoriju za gajenje matičnih ćelija u kulturi. Svi procesi rukovanja koštanom srži i matičnim ćelijama koje se iz nje dobiju sprovode se u namenskoj laboratoriji za obradu matičnih ćelija u aseptičnim uslovima u kapeli 2. nivoa biološke bezbednosti sa laminarnim protokom vazduha. Istraživač prebacuje uzorak koštane srži u sterilnu konusnu epruvetu od 50 ml. Mononuklearne ćelije iz uzorka koštane srži izoluju se centrifugiranjem u gradijentu gustine. 10 ml uzorka koštane srži razblaži se sa 20 ml sterilnog Henkovog izbalansiranog rastvora soli (Hank's Balanced Salt Solution, Sigma)), a zatim se presloji preko 15 ml FicollPaque PREMIUM, bez endotoksina (GE Healthcare, Life
1
Sciences) u zasebnoj sterilnoj konusnoj epruveti, te se centrifugira na 400 x g 40 minuta. Sloj mononuklearnih ćelija se odvoji, prebaci u novu konusnu epruvetu od 50 ml i ispere dva puta centrifugiranjem na 100 x g po 10 minuta u Henkovom sterilnom izbalansiranom rastvoru soli. U tom trenutku, izvodi se test vijabilnosti sa triptan plavim i ćelije se prebrojavaju. Ćelije se prebacuju u sterilnu bocu za gajenje u kulturi (T-boca od 75 cm<2>sa poklopcem sa ventilacijom) u podlozi koja se sastoji od 15ml MSCBM (Lonza), stabilnog L-glutamina (GlutaMAX, Invitrogen) i 10% prethodno sakupljenog autolognog seruma pacijenta, te se inkubiraju na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2i ovlaživanjem vazduha. Antibiotički-antimikotički rastvor (Sigma) koji sadrži penicilin, streptomicin i amfoteracin B se dodaje u podlogu do prvog prebacivanja ćelija ("prolaza"), a zatim se izostavlja iz podloge tokom svih narednih prolaza. Svi preparati za podloge se pripremaju zajedno i cede kroz filter od 0,2 µm pre dodavanja u ćelije. Svi preparati za podloge se označavaju odgovarajućim jedinstvenim identifikatorom pacijenta kako bi se sprečila unakrsna kontaminacija reagenasa.
Razmnožavanje (ekspanzija) MSC i krioprezervacija
Podloga za gajenje u kulturi se menja na svaka 3-4 dana, kako bi se uklonile nevezane (hematopojetične) ćelije. Kada početna kultura stigne do 80% konfluentnog rasta, ćelije se odvajaju od površine enzimskom disocijacijom pomoću TrypLE (tripsin bez komponenata životinjskog porekla, Invitrogen), ispiraju u PBS-u kako bi se uklonio tripsin i ponovo zasejavaju u T-bocu od 150 cm<2>sa poklopcem za ventilaciju, sa 25 ml podloge, i obeležavaju kao "prolaz br.1". Kada MSC iz "prolaza br.1" dostignu 80-90% konfluentnog rasta, ćelije se ponovo tretiraju tripsinom (TrypLE), prebroje, pa se 300.000 ćelija preseje u novu T-bocu od 150 cm<2>(gustina ćelija od 2000 ćelija/cm<2>) i obeleže kao "prolaz br.2". Ćelije iz "prolaza br.
1" koje preostanu (oko 3-9 miliona ćelija) se krioprezerviraju u podlozi za zamrzavanje koja sadrži 10% autolognog seruma i 10% DMSO. Ćelije se centrifugiraju (100 x g, 5 minuta) pa se ćelijski talog resuspenduje u podlozi za zamrzavanje u koncentraciji od 1 milion ćelija po ml. 1 milion ćelija (ili 1 ml) se prebaci u kriokivete od 2 ml, koje su obeležene jedinstvenim identifikatorom odgovarajućeg pacijenta. Kriokivete se prebace u namenski kontejner za zamrzavanje u izopropanolu preko noći na -80<o>C, a potom čuvaju u tečnom azotu. Količine tečnog azota se elektronski prate kako bi se osiguralo da se uzorci čuvaju na odgovarajućoj temperaturi. Kada MSC iz "prolaza br.2" dostignu 80-90% konfluentnog rasta, 300.000 ćelija se preseje u novu T-bocu od 150 cm<2>(gustina ćelija od 2000 ćelija/cm<2>) i obeleže kao "prolaz br. 3" a preostale ćelije se krioprezerviraju. Ćelije iz prolaza br. 3 se gaje do 80-90% konfluentnog rasta i koriste za karakterizaciju i kontrolu kvaliteta MSC. 500.000 ćelija iz
1
prolaza br.3 takođe se odvoji za analizu ekspresije gena (videti odeljak "Ispitivanje kvaliteta ćelija" ispod). Sve MSC koje se koriste za dalje razmnožavanje, selekciju neuroloških prekursora i autologne injekcije se dobijaju iz krioprezerviranih zaliha iz prolaza br. 1 ili prolaza br.2.
Karakterizacija i kontrola kvaliteta
Kulture MSC se sastoje od heterogene populacije ćelija, čak i kada se generišu kao kolonije izvedene iz pojedinačne ćelije (Prockop, et al., Proc Natl Acad Sci USA 100 Suppl 1:11917-11923 [2003]). Dalje, ne postoje adekvatni markeri koji bi bili specifični za MSC. U skladu sa navodima Međunarodnog udruženja za ćelijsku terapiju (International Society for Cellular Therapy (Dominici et. al., Cytotherapy 8: 315-317 [2006])), minimalni kriterijumi kojima se definiše humana MSC obuhvataju: 1) prijanjanje za plastiku, 2) vretenastu morfologiju, 3) ekspresiju površinskih antigena (CD105+/CD73+/CD90+) i izostanak ekspresije hematopojetskih markera (CD45-/CD34-/CD14- /CD79-) i MHC (HLA-I-/HLA-DR-), i 4) in vitro diferencijacija u adipocite, osteoblaste i hondroblaste. MSC dobijene iz koštane srži se ocenjuju po ovim kriterijumima, za svakog pacijenta. Za svaku grupu kriterijuma, MSC pacijenta se porede sa zdravim kontrolnim MSC iz istog prolaza (kupljenim od Lonza). Prijanjanje za plastiku i morfologija se ocenjuju i dokumentuju pomoću Olympus IX71 invertnog svetlosnog mikroskopa na koji je povezan digitalni foto-aparat. Ekspresija površinskih antigena se ocenjuje fluorescentnom imunocitohemijom, konkretnije protočnom citometrijom (BD FACS Aria) koja koristi FITC (fluorescein izotiocijanat)-obeležena antitela na CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, CD14, CD79, HLAI i HLA-DR (sve nabavljeno od BD). Limfociti iz periferne krvi se koriste kao pozitivna kontrola za hematopojetske markere a Lonza MSC se koriste kao pozitivna kontrola za MSC. Uključena je i kontrola za izotip. In vitro diferencijacija MSC u adipocite, osteoblaste i hondroblaste se sprovodi pomoću podloge i postupka koje obezbeđuje Lonza, te se poredi sa Lonza MSC i sa nediferenciranim kontrolama. Adipogena diferencijacija se kvalitativno ocenjuje bojenjem sa uljanom crvenom O. Očekuje se da broj ćelija pozitivnih na bojenje uljanom crvenom O bude 30-100%. Nakon osteogene diferencijacije, kvantitativno se određuju naslage kalcijuma pomoću testa StanbioTotal Calcium LiquiColor (Stanbio Labs). Očekivani opseg sadržaja kalcijuma u konfluentnoj ploči sa 6 polja je 10.000-50.000 ng/µl. Hondrogena diferencijacija se kvalitativno ocenjuje imunološkim bojenjem isečaka hondrogenih peleta u parafinu na kolagen tipa II, što ukazuje na uspešnu diferencijaciju u hondroblaste. MSC pacijenta moraju da ispune
1
sve prethodno navedene kriterijume pre nego što se razmnože u MSC za ubrizgavanje za dalji tok studije.
Razmnožavanje MSC iz krioprezerviranih zaliha
Približno mesec dana pre ubrizgavanja matičnih ćelija, 1 kiveta (1 milion ćelija) MSC iz prolaska br.1 ili prolaska br.2 odgovarajućeg pacijenta koji učestvuje u ispitivanju uzme se iz skladišta u kome se čuva u tečnom azotu, brzo otopi, centrifugira kako bi se uklonio DMSO i odmah zaseje u T-bocu od 150 cm<2>koja sadrži kompletnu podlogu (MSCBM kojoj je dodat Gluta-MAX i 10% autolognog seruma). Kada ćelije stignu do 80% konfluentnosti, tretiraju se isto kao što je prethodno opisano za prolaze, u novu T-bocu od 150 cm<2>pri gustini od 2000 ćelija/cm<2>. Ćelije se gaje kroz još 3-5 prolaza i razmnožavaju, kako bi se dobilo i do 50 miliona ćelija.
Selekcija neuralnih prekursorskih ćelija iz mezenhimskih matičnih ćelija Neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC se selekcionišu tako što se razmnožene MSC odvajaju od podloge pomoću TrypLE, kao što je prethodno opisano. 500.000 MSC se odvaja za analizu genske ekspresije (videti odeljak o ispitivanju kvaliteta ispod).50.000 ćelija se presejava u T-bocu od 25 cm<2>za naknadnu kariotipsku analizu (videti odeljak o ispitivanju kvaliteta ispod). Preostale ćelije se sakupe, centrifugiraju i ponovo suspenduju u NPMM podlozi proizvođača Lonza (bazalna podloga za neuralne progenitore, neuralni faktor preživljavanja 1 (NSF-1), 20 ng/ml EGF, i 20 ng/ml bFGF). Ćelije se zasejavaju u gustini od 4-6 x 10<4>ćelija/cm<2>u T-boci od 75 cm<2>sa niskim prijanjanjem (BD Falcon) u 15 ml NPMM. Podloga za gajenje kulture se menja na svaka 2-3 dana, centrifugiranjem plutajućih grupa neuralnih prekursorskih ćelija i ponovnim suspendovanjem u NPMM. Neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC se gaje u kulturi 10-15 dana. Dva dana pre davanja injekcije, 500,000 neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC se odvoji za analizu ekspresije gena.
Ispitivanje kvaliteta ćelija
Analiza ekspresije gena: Usled prirodne kompleksnosti svojstvene biološkim sistemima, u poređenju sa farmaceutskim proizvodima, doći će do određene prirodne varijabilnosti svakog ćelijskog proizvoda. Uz to, heterogena priroda MSC navodi na pretpostavku da će doći i do određene varijabilnosti u intenzitetu ekspresije gena između različitih pacijenata. Imajući te napomene u vidu, analiza ekspresije gena MSC i neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSCsvakog pacijenta sprovodi se sa ciljem da se dobije
2
kvantitativna ocena statusa diferencijacije ćelija kao odraza čistoće i snage svakog ćelijskog proizvoda. Uzorci od po 500.000 MSC (dobijenih nakon što je ekspanzija završena) i 500.000 neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC (dobijenih dva dana pre dana ubrizgavanja) čuvaju se u preparatu RNA Protect (QIAGEN) na -20<o>C. Svaka serija razmnoženih i diferenciranih MSC i neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC poredi se sa 500.000 MSC dobijenih u prolazu br. 3 u trenutku krioprezervacije. Jedan ili dva dana pre dana ubrizgavanja, RNK se estrahuje pomoću kompleta za ekstrakciju RNK RNA Easy Kit (QIAGEN). Kao obrazac za sintezu cDNK koristi se 1 µg RNK (Superscript III, Invitrogen).2 µl cDNK obrasca se koristi kao obrazac za kvantitativni PCR u stvarnom vremenu uz SyBr zelenu detekciju (Roche) i sa prethodno validiranim prajmerima specifičnim za date gene u aparatu Roche Lightcycler 2.0. Pozitivna kontrola (cDNK ljudskog mozga) se uključuje u svaku analizu, koja služi i kao kalibracija između različitih serija. Negativna kontrola (bez DNK obrasca) takođe se koristi svaki put. Uključuje se i negativna kontrola bez reverzne transkriptaze, kako bi se ocenila kontaminacija genomske DNK. U uzorcima se određuje koncentracija RNK za nestin (marker za neuralne prekursorske ćelije), neurofilament (neuronalni marker), GFAP (glijalni fibrilarni kiseli protein, marker glijalnih i neuralnih prekursorskih ćelija) i vimentin (marker za MSC). Kao referentni gen koristi se RPLP (60S kiselog ribozomnog proteina P0). Za svaki uzorak određuje se odnos gen:RPLP i poredi sa odnosom gen:RPLP iz uzorka za kalibraciju, kako bi se odredio relativni intenzitet ekspresije svakog gena. Uz to, promene u ekspresiji gena za svaki par MSC i neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC određuje se kao umnožak uvećanja ili smanjenja relativnog intenziteta ekspresije gena. Pronalazači su prethodno utvrdili relativne odnose za svaki od prethodno navedenih gena u MSC i neuralnim prekursorskim ćelijama dobijenim iz MSC iz uzoraka 3 pacijenta i 1 kontrolom iz zdrave osobe (Lonza). Povećanje nestina kod neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC kreće se od 2-4 puta, povećanje neurofilamenta se kreće u posegu od 5-15 puta, povećanje GFAP se kreće od 7-10 puta a smanjenje vimentina se kreće u opsegu od 0.4 do 0.7 puta. Ove kvantitativne promene u koncentracijama RNK su u korelaciji sa ekspresijom proteina iz ovih markera (slika 8). Za svakog pacijenta, i pre svake injekcije, parovi MSC i neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC se analiziraju, kako bi se utvrdile ove promene u intenzitetu ekspresije gena. Neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC koje ne pokazuju promene u ekspresiji gena u očekivanom opsegu se odbacuju i ne ubrizgavaju. U tom slučaju, ekspanzija MSC i indukcija neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC se ponavlja, počev od nekog drugog krioprezerviranog uzorka. Ukoliko neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC ne prođu ispitivanje kvaliteta i po drugi put, taj pacijent se isključuje iz studije.
Ispitivanje steriliteta: 1-2 dana pre ubrizgavanja autolognih matičnih ćelija, podloga kondicionirana gajenjem ćelija testira se pomoću PCR na tragove kontaminacije. PCR test sa visokom osetljivošću detektuje kontaminaciju kulture ćelija mikoplazmama i eubakterijama. Komplet za detekciju mikoplazmi VenorGeM Mycoplasma Detection Kit nabavljen je od Sigma, a komplet za detekciju eubakterija OnarEUB Eubacteria Detection Kit od Minerva Biolabs. Svaki PCR test izvodi obučeni molekularni biolog u MSRCNY. Ispitivanje kvaliteta putem PCR obuhvata i pozitivnu i negativnu kontrolu, u skladu sa uputstvima proizvođača. Bilo koji uzorak za koji se potvrdi da je pozitivan na kontaminaciju se odbacuje i ne koristi se za ubrizgavanje, a uzrok kontaminacije se ispituje. Mogući izvori kontaminacije obuhvataju reagense za gajenje ćelija u kulturi, inkubator sa CO2, kontaminaciju unutar kapele sa laminarnim tokom vazduha i nepravilnu tehniku izvođenja operacija. Svi reagensi za koje se sumnja da bi mogli biti izvor kontaminacije se odbacuju, a oprema se čisti. Obavezno se potvrđuje da su svi uzorci neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC negativni na kontaminaciju, pomoću PCR testa pre ubrizgavanja u bilo kog od pacijenata koji učestvuju u ispitivanju. U isto vreme u koje se izvodi i PCR analiza, uzorci svake od kondicioniranih podloga šalju se kod spoljnog dobavljača (Clongen Laboratories LLC) na testiranje sterilnosti postupkom gajenja u kulturi. U slučaju da se uoči pozitivan rezultat, izvor infekcije se metodično ispituje. Uz to, pacijent se ponovo pregleda da bi se utvrdilo prisustvo eventualne infekcije. Kod pacijenta se radi CBC sa diferencijalnom formulom. Ukoliko pacijent ne pokazuje znake infekcije, neće se izvoditi lumbalna punkcija zbog rizika koji se dovode u vezu sa tom procedurom.
Analiza kariotipa: Uzorak MSC koje se gaje u T-boci od 25 cm<2>(presejanih nakon što je ekspanzija završena) podvrgava se kariotipskoj analizi kako bi se ispitale eventualne hromozomske aberacije do kojih može da dođe tokom ekspanzije ex vivo. Pokazano je da je učestalost hromozomskih aberacija tokom ekspanzije mezenhimskih matičnih ćelija ex vivo veoma mala, te da se dešava samo kod ćelija iz kasnijih prolazaka (Rubio et al., Cancer Res 65: 3035-3039 [2005]). Mezenhimske matične ćelije koje se koriste u ovom protokolu su sve ćelije iz ranih prolazaka, sa ukupnim vremenom gajenja u kulturi ex vivo od 1 do 2 meseca, što je i te kako u okviru vremenskog perioda u kojem je moguće bezbedno upravljati ovim ćelijama (Rubio et al., Cancer Res 65: 3035-3039 [2005]). Rezultati kariotipske analize dobijaju se pre ubrizgavanja neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC. Ukoliko se utvrdi da postoji bilo kakva kariotipska aberacija u razmnoženim MSC, odgovarajuće neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC se odbacuju i ne koriste za injekcije.
Eksperimentalni deo
Ekspresija proteina nestina iz neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC Ekspresija proteina nestina određivana je standardnom imunofluorescencijom. Ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu i označene nestinskim antitelom (Chemicon), nakon čega je usledila reakcija sa anti-zečjim sekundarnim antitelom konjugovanim za Alexa-594 (Molecular Probes). Slika 6 prikazuje povećanu ekspresiju nestina u neuralnim prekursorskim ćelijama dobijenim iz MSC. Neuralne prekursorske ćelije u ploči B izvedene su iz MSC nakon gajenja u kulturi u podlozi za održavanje neuralnih progenitorskih ćelija (NPMM). Ploče A-C na slici 6 su posmatrane pri uveličanju do 100x a ploča D je posmatrana pri uveličanju od 200 x.
Primene u ekspresiji gena u neuralnim prekursorskim ćelijama dobijenim iz MSC Kultura MSC je razmnožena u podlozi za rast mezenhimskih matičnih ćelija (MSCGM) u 4 prolaza. MSC-NP su selekcionisane od MSC gajenjem 15 dana u kulturi u NPMM. Ćelije su zasejane na slajdove sa po 8 polja obložene sa PDL/Lamininom, te je 18 časova kasnije ispitivana ekspresija proteina standardnom fluorescencijom. Ćelije su obeležene antitelima na nestin (1:2000), GFAP (1:500), neurofilament-M (NF-M, 1:1000), vimentin (1:5000), alfa izoformu olfaktina iz glatkih mišića (aktin αSM, 1:1000), svi nabavljeni od Chemicon. Sekundarna tela protiv mišjih IgG ili zečjih IgG konjugovana za Alexa-594 nabavljena su od Molecular Probes. U test je uključeno i samo sekundarno antitelo, kao kontrola. Obeležene ćelije postavljene su na mikroskopske preparate sa DAPI i posmatrane kroz Olympus BX60 fluorescentni mikroskop pod uvećanjem 200 x. Povećana ekspresija proteina nestina, GFAP-a i neurofilamenta-M, i smanjena ekspresija vimentina i αSM aktina u neuralnim prekursorskim ćelijama dobijenim iz MSC u poređenju sa MSC prikazana je na slikama 7 i 8. Diferencijacija neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC in vitro
MSC-NP su diferencirane u neuronalne i oligodendroglijalne ćelijske tipove in vitro. MSC-NP su selekcionisane od MSC gajenjem 15 dana u kulturi u NPMM. Ćelije su zasejane na slajdove sa po 8 polja obložene matrigelom i gajene u kulturi ili samo u osnovnoj podlozi (kontrola) ili u podlozi koja sadrži 100 ng/ml bFGF, u toku 21 dan. Ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu i imuno-obeležene primarnim antitelima na β-tubulin klase III, protein asociran sa mikrotubilama-2 (MAP-2, 1:100), oligodendrocitni marker 04 (1:200),
2
oligodendrocitni marker O1(1:1000), galaktocerebrozid (GalC, 1:50) i nestin (1:1000), svi nabavljeni od Chemicon. Fluorescentno konjugovana sekundarna antitela na mišje IgG ili IgM (Alexa594) ili zečji IgG (Alexa-488) nabavljena su od Molecular Probes. Obeležene ćelije postavljene su na mikroskopske preparate sa DAPI i posmatrane kroz Olympus BX60 fluorescentni mikroskop pod uvećanjem 200 x. Slike 1 i 2 ilustruju povećanu ekspresiju neuronalnih i oligodendroglijalnih markera u neurološkim prekursorima izvedenim iz MSC (MSC-NP) i MSC nakon diferencijacije in vitro.
Protivzapaljenske odlike neuralnih prekurskorskih ćelija dobijenih iz MSC Alogene T ćelije iz periferne krvi obeležene sa CFSE stimulisane su pomoću PHA (fitohemoaglutinin) 4 dana. T ćelije su gajene u kulturi same, ili u udruženoj kulturi sa humanim MSC iz donora 1 ili neuralnim prekursorskim ćelijama dobijenim iz MSC od donora 1 ili donora 2. Proliferacija T ćelija merena je pomoću FACS analize na osnovu smanjenja CFSE fluorescencije CD3+ ćelija. Protivzapaljenske odlike neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC ilustrovane su na slici 3.
Gubitak kapaciteta za diferencijaciju neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC Za potrebe adipogene indukcije, MSC ili MSC-NP su gajene u kulturi ili u MSCGM (kontrola) ili u podlozi za indukciju adipocita koja sadrži insulin, deksametazon, indometacin i IBMX tokom 3 nedelje. Ćelije su fiksirane a lipidne vakuole su obojene uljanom crvenom O. Za potrebe osteogene indukcije, MSC ili MSC-NP su gajene u kulturi, bilo u MSCGM (kontrola) ili u podlozi za indukciju osteocita koja sadrži deksametazon, askorbinsku kiselinu i P-glicerofosfat tokom 3 nedelje. Ukupna akumulacija kalcijuma određivana je pomoću kompleta Calcium (CPC) Liquicolor Kit (Stanbio Laboratory). Gubitak kapaciteta za diferencijaciju u mezodermalne ćelijske linije kod neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC prikazan je na slici 4.
Priprema autolognih matičnih ćelija za injekcije
Pre davanja injekcije, neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC se sakupe i odvoje centrifugiranjem. Agregati ćelija se razbiju u suspenziju pojedinačnih ćelija inkubiranjem sa TrypLE 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se isperu tri puta u sterilnom fiziološkom rastvoru čistoće koja odgovara za parenteralnu primenu, sa 0,9% natrijum hlorida, USP, kako bi se uklonili svi tragovi podloge i faktora rasta. Ukupno 10 miliona ćelija se resuspenduje u 0,2 ml sterilnog fiziološkog rastvora čistoće koja odgovara za parenteralnu primenu, sa 0,9% natrijum hlorida, USP, prenese u malu sterilnu epruvetu i postavi u obeleženi, sterilni kontejner za transport do IMSMP.10 miliona ćelija je relativno niska doza ćelija, a izračunata je pomoću prosečnih vrednosti za studije kod životinja i kod ljudi.
Injekcija autolognih matičnih ćelija
Pacijenti su primili intratekalne injekcije izolovanih i razmnoženih matičnih ćelija pod sterilnim uslovima, uz poštovanje standardne procedure. Korišćen je sterilisani LP nosač. Uspostavljeno je sterilno polje, a kao lokalni anestetik korišćen je 0,1% lidokain. Primarni istraživač je aspirirao 6 ml CST u nivou L3-L4 pomoću igle promera 25. Standardni komplet za LP ima iglu promera 20; međutim, u ovoj studiji korišćena je igla promera 25 kako bi se smanjila incidencija glavobolja koje se dovode u vezu sa uzorkovanjem spinalne tečnosti. Ukoliko je pristup u nivou L3-L4 ograničen, kao alternativno mesto se koristi L2-L3 nivo. U 3 ml CST se dodaju matične ćelije, nakon čega se smeša CST i matičnih ćelija ubrizgava intratekalno, nakon čega se ubrizga i dodatnih 3 ml CST. Ova procedura traje približno 30 minuta. Odmah nakon ove procedure, pacijentu se da infuzija 80 mg Tobromicina i 500 mg Vankomicina (McKesson Corporations). Ova infuzija traje približno 4 sata. Vankomicin je lek izbora za S. epidermis, koji bi bio kontaminant sa kože u toku procedure lumbalne punkcije. On je takođe i lek koji se koristi za lečenje S. pneumoniae otpornog na penicilin. Vankomicin je takođe indikovan kod empirijske upotrebe kod meningitisa, do identifikacije uzročnika. Tobromicin je u sinergiji sa Vankomicinom i takođe je tretman izbora za infekcije pseudomonasom. Takođe, Vankomicin i Tobramicin su indikovani u empirijskoj upotrebi za tretman meningitisa kod svih neurohirurških procedura u najvećem broju ustanova (The Manual of Medical Therapeutics, 30th Edition). Injekcije se daju na svaka tri meseca, a pacijenti prolaze kroz tri runde tretmana. Faza tretmana u ovoj studiji traje 9 meseci a pacijenti se prate 12 meseci nakon trećeg (poslednjeg) tretmana. Ovo je dovoljno vremena da se ćelije integrišu i da se pokažu bilo kakvi eventualni problemi sa bezbednošću i podnošljivošću.
Doziranje kod ljudi
Injekcije autolognih matičnih ćelija daju se u intervalima na po 3 meseca, u toku devet meseci. Pri svakom tretmanu ubrizga se 10 miliona neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz MSC. Ova doza je izračunata na osnovu pretkliničkih podataka o bezbednosti gde je 2,5 x 10<6>(Black, et. al., Blood Cells Mol Dis 27: 632-636) MSC ćelija iz koštane srži presađeno u CNS zdravih rezus majmuna bez ikakvih neželjenih dejstava u periodu evaluacije od 6 meseci (Isakova, et. al., Mol Ther 13: 1173-1184 [2006]). Izračunato je da je HED
2
(http.//www.fda.gov/cber/gdlns/dose.htm) 1,5x10<5>(Woodbury, et. al., J Neurosci Res 69: 908-917) ćelija/kg ili približno 10 miliona ćelija po pacijentu. Ova doza je bila bezbedna i dobro podnošljiva u kliničkoj studiji MS sprovedenoj u Iranu (Mohyeddin, et. al., Iran J Immunol 4: 50-57 [2007]). Pacijenti su primili intratekalne injekcije od 2,5 miliona do 13 miliona MSC. Doza od 10 miliona ćelija takođe se smatra niskom dozom u poređenju sa intraspinalnim dopremanjem MSC u studiji ALS (gde se kretala u opsegu od 7 do 150 miliona ćelija)(Mazzini et al., Neurol Res 28: 523-526 [2006]). Iz pretkliničkih studija je zaključeno da je niska doza ćelija koja se ubrizgava više puta delotvornija od pojedinačnih injekcija visokih doza (Bakshi, et. al., J Neurotrama 23: 55-65 [2006]; Lapore, et. al., Brain Res 1045: 206-216 [2005]), što je u skladu sa dizajnom naše studije. Odmah nakon infuzije ćelija, pacijenti će takođe dobiti infuziju od 80 mg Tobromicina i 500 mg Vankomicina. Ovi lekovi dobijeni su od McKesson Corporation.
Ćelije se proizvode uskladu sa svim propisima kojima se reguliše dobra proizvođačka praksa. Ćelije se krioprezerviraju u podlozi koja sadrži 10% autolognog seruma i 10% DMSO u kriobočicama od 2 ml. Kriobočice se obeleže jedinstvenim identifikatorom svakog pacijenta i čuvaju u tečnom azotu, pri čemu se svaka grupa seruma čuva u odvojenoj kutiji koja je takođe obeležena. Mesto čuvanja svakog od uzoraka uneto je u bazu podataka, a rezervna kopija baze podataka postoji u odštampanoj verziji. Količine tečnog azota se elektronski prate kako bi se obezbedilo da se uzorci čuvaju na odgovarajućoj temperaturi. Sve mezenhimske ćelije koje se koriste za dalje korake ekspanzije, selekcije neuralnih prekursorskih ćelija i injekcije autolognih ćeliija dobijaju se iz kriokonzerviranih zaliha. Nema dokaza da ćelije koje se čuvaju u tečnom azotu bez manipulacija gube bilo njihovu vijabilnost određenu in vitro, bilo njihovu biološku aktivnost. Stoga nije neophodno dodeliti nikakav rok trajanja MSC koje se trajno čuvaju u tečnom azotu. Približno 1 mesec pre injekcije matičnih ćelija, mezenhimske matične ćelije datog pacijenta koji učestvuje u ispitivanju se izvade iz tečnog azota i razmnože u bazalnoj podlozi za mezenhimske matične ćelije koja sadrži autologni serum, kao što je prethodno opsiano. Ćelije se presejavaju u 3-5 prolaza, u bocama za gajenje ćelija u kulturi, tako da se razmnože do 50 miliona ćelija. MSC se potom gaje u kulturi u podlozi za održavanje neuralnih progenitora 10-15 dana kako bi se dobile neuralne prekursorske ćelije dobijene iz MSC.
Iako je pokazano i opisano ono što se smatra poželjnim rešenjem prema predmetnom pronalsku, podrazumeva se da bi se mogle uneti različite modifikacije i izmene forme i detalja u dalja rešenja, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Stoga je namera da predmetni pronalazak ne bude ograničen na konkretna rešenja koja su opisana i ilustrovana,
2
već ga je potrebno tumačiti kao da podrazumeva sve modifikacije koje mogu da potpadnu pod obim zaštite predmetnog pronalaska.
2

Claims (9)

Patentni zahtevi
1. Postupak za in vitro diferencijaciju neuralnih prekursorskih ćelija iz mezenhimskih matičnih ćelija dobijenih iz koštane srži, naznačen time što podrazumeva:
(a) razmnožavanje izolovanih mezenhimskih matičnih ćelija dobijenih iz koštane srži uzetih od pacijenta, u bazalnoj podlozi koja sadrži autologni serum za rast dobijen iz datog pacijenta;
(b) gajenje u kulturi i izolovanje neuralnih prekursorskih ćelija dobijenih iz mezenhimskih matičnih ćelija; i
(c) sprovođenje analize ekspresije gena kako bi se identifikovale neuralne prekursorske ćelije dobijene iz mezenhimskih matičnih ćelija koje pokazuju 2 - 4 puta uvećanu količinu nestina, 5 - 15 puta uvećanu količinu neurofilamenta, 7 - 10 puta uvećanu količinu GFAF (glijalnog fibrilarnog kiselog proteina) i 0,4 - 0,7 puta umanjenu količinu vimentina.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što korak (b) podrazumeva gajenje u kulturi navedenih mezenhimskih matičnih ćelija dobijenih u koraku (a) u bazalnoj podlozi za neuralne progenitorske ćelije (NPBM) kojoj je dodat neuralni faktor preživljavanja 1 (NSF-1), 20 ng/ml epidermalnog faktora rasta (EGF) i 20 ng/ml osnovnog faktora rasta fibroblasta (bFGF) kako bi se generisale navedene neuralne prekursorske ćelije.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je navedeni EGF rekombinantni humani EGF (rhEGF) i navedeni bFGF je rekombinantni humani bFGF (rhbFGF).
4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se navedene mezenhimske matične ćelije u koraku (a) i navedene neuralne prekursorske ćelije u koraku (b) gaje u kulturi u bocama za gajenje ćelija u kulturi sa niskim prijanjanjem.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 4, naznačen time što se navedene neuralne prekursorske ćelije izoluju sakupljanjem grupa plutajućih neuralnih
2
prekursorskih ćelija, poželjno je da to bude centrifugiranjem, te ponovnom suspenzijom sakupljenih ćelija u navedenoj NPBM podlozi za gajenje u kulturi sa suplementima.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što se navedeno sakupljanje plutajućih neuralnih prekursorskih ćelija i ponovno suspendovanje u NPBM podlozi za gajenje u kulturi sprovode na svaka 2 - 3 dana.
7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se neuralne prekursorske ćelije dobijene iz matičnih ćelija gaje u kulturi u koraku (b) 10 -15 dana.
8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedena analiza genske ekspresije podrazumeva analizu koncentracija RNK za nestin, neurofilament, glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) i vimentin, u uzorku neralnih prekursorskih ćelija i uzorku mezenhimskih matičnih ćelija.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedeni pacijent ima multiplu sklerozu.
RS20180406A 2006-11-03 2007-11-02 Mezenhimske matične ćelije dobijene iz koštane srži kao izvor progenitora neuralnih ćelija RS57083B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85651506P 2006-11-03 2006-11-03
EP07867349.8A EP2086332B1 (en) 2006-11-03 2007-11-02 Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as a source of neural progenitors
PCT/US2007/023184 WO2008057443A2 (en) 2006-11-03 2007-11-02 Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as a source of neural progenitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57083B1 true RS57083B1 (sr) 2018-06-29

Family

ID=39365076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180406A RS57083B1 (sr) 2006-11-03 2007-11-02 Mezenhimske matične ćelije dobijene iz koštane srži kao izvor progenitora neuralnih ćelija

Country Status (15)

Country Link
US (5) US8642331B2 (sr)
EP (2) EP3031326A3 (sr)
CA (1) CA2668200C (sr)
CY (1) CY1120115T1 (sr)
DK (1) DK2086332T3 (sr)
ES (1) ES2663875T3 (sr)
HR (1) HRP20180533T1 (sr)
HU (1) HUE036745T2 (sr)
LT (1) LT2086332T (sr)
MX (1) MX2009004776A (sr)
PL (1) PL2086332T3 (sr)
PT (1) PT2086332T (sr)
RS (1) RS57083B1 (sr)
SI (1) SI2086332T1 (sr)
WO (1) WO2008057443A2 (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2086332T3 (en) 2006-11-03 2018-04-16 Multiple Sclerosis Res Center Of New York Bone marrow derived mesenchymal stem cells as a source of neural progenitors
US9301975B2 (en) * 2009-05-01 2016-04-05 Biocardia, Inc. Method of preparing autologous cells and method of use for therapy
US20120020931A1 (en) 2010-06-02 2012-01-26 Rutgers, The State University Of New Jersey Therapeutic encapsulated embryonic stem cells and mesenchymal stromal cells
CA2844109C (en) 2010-08-18 2018-11-06 Theresa Deisher Compositions and methods to inhibit stem cell binding to active germinal centers in lymphatic tissues
EP4663241A3 (en) 2010-10-08 2026-03-25 Mesoblast International Sàrl Enhanced msc preparations
WO2012070964A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Модифицированные олигопептиды с противораковыми свойствами и способ их получения
EP3058063B1 (en) 2013-10-14 2018-06-06 Hadasit Medical Research Services and Development Ltd. Method of obtaining terminally differentiated neuronal lineages
WO2015143074A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 University Of Southern California Brain cancer immunotherapy
WO2016168993A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Innolife Co., Ltd. Methods of tissue repair and regeneration
JP2018517743A (ja) 2015-06-15 2018-07-05 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 多系統萎縮症を治療するための自家間葉系幹細胞の使用
US20180369287A1 (en) 2015-10-08 2018-12-27 Neurona Therapeutics Inc. Neural precursor cell populations and uses thereof
WO2018002930A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Stem Cell Medicine Ltd. Treatment of inflammatory bowel disease with long acting glatiramer and adipose-derived stem cells
CA3062123A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Stem Cell Medicine Ltd. Treatment of multiple sclerosis with adipose-derived stem cells
WO2018211486A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Stem Cell Medicine Ltd. Treatment of multiple sclerosis with long acting glatiramer and adipose-derived stem cells
AU2018372631B2 (en) 2017-11-22 2025-06-05 Mesoblast International Sarl Cellular compositions and methods of treatment I
EP4004191A4 (en) 2019-07-26 2022-10-12 Brexogen Inc. Precursor cells of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells and method for preparing the same
WO2021020666A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Brexogen Inc. Precursor cells of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells and method for preparing the same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7037719B1 (en) 1999-02-12 2006-05-02 Stemcells California, Inc. Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations
US8017112B2 (en) * 1999-05-14 2011-09-13 Henry Ford Health System Transplantation of bone marrow stromal cells for treatment of neurodegenerative diseases
US20040208858A1 (en) * 2000-04-12 2004-10-21 Gihan Tennekoon Therapeutic uses for mesenchymal stromal cells
US20040259254A1 (en) * 2001-10-30 2004-12-23 Osamu Honmou Method for inducing differentiation mesodermal stem cells, es cells or immortalized cells into nervous system cells
EP1893747B1 (en) * 2005-06-16 2014-09-03 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Isolated cells and populations comprising same for the treatment of cns diseases
DK2086332T3 (en) 2006-11-03 2018-04-16 Multiple Sclerosis Res Center Of New York Bone marrow derived mesenchymal stem cells as a source of neural progenitors

Also Published As

Publication number Publication date
SI2086332T1 (en) 2018-06-29
HRP20180533T1 (hr) 2018-05-18
US20140308745A1 (en) 2014-10-16
US8642331B2 (en) 2014-02-04
CA2668200A1 (en) 2008-05-15
EP2086332A2 (en) 2009-08-12
CA2668200C (en) 2017-04-18
EP3031326A3 (en) 2016-09-14
PT2086332T (pt) 2018-04-04
US9328329B2 (en) 2016-05-03
US20100166712A1 (en) 2010-07-01
ES2663875T3 (es) 2018-04-17
MX2009004776A (es) 2009-07-14
US9657268B2 (en) 2017-05-23
US20110236357A1 (en) 2011-09-29
US20150064145A1 (en) 2015-03-05
EP2086332B1 (en) 2018-01-10
HUE036745T2 (hu) 2018-07-30
EP3031326A2 (en) 2016-06-15
PL2086332T3 (pl) 2018-07-31
WO2008057443A3 (en) 2008-11-20
WO2008057443A2 (en) 2008-05-15
US20150118198A1 (en) 2015-04-30
WO2008057443A9 (en) 2008-07-17
DK2086332T3 (en) 2018-04-16
CY1120115T1 (el) 2018-12-12
EP2086332A4 (en) 2010-08-11
LT2086332T (lt) 2018-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2086332B1 (en) Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as a source of neural progenitors
Chang et al. Neurogenic differentiation of dental pulp stem cells to neuron-like cells in dopaminergic and motor neuronal inductive media
AU2009314797B2 (en) Composition comprising mesenchymal stem cells or culture solution of mesenchymal stem cells for the prevention or treatment of neural diseases
Hao et al. Fetal human hematopoietic stem cells can differentiate sequentially into neural stem cells and then astrocytes in vitro
CN101801396B (zh) 治疗神经变性的方法和组合物
US20130078222A1 (en) Intervertebral Disc Nucleus Pulposus Stem Cell/Progenitor Cell, The Cultivation Method And Intended Use Thereof
KR20040039382A (ko) 골격근 간질 유래 다분화능 줄기세포
US20100021434A1 (en) Isolated Oligodendrocyte-Like Cells and Populations Comprising Same for the Treatment of CNS Diseases
EP3513797B1 (en) Method of treating the effects of stroke
Jung et al. Characterization of neurogenic potential of dental pulp stem cells cultured in xeno/serum‐free condition: in vitro and in vivo assessment
Ahlfors et al. Examining the fundamental biology of a novel population of directly reprogrammed human neural precursor cells
US9771555B2 (en) Canine amniotic membrane-derived multipotent stem cells
Nizzardo et al. iPSC-derived LewisX+ CXCR4+ β1-integrin+ neural stem cells improve the amyotrophic lateral sclerosis phenotype by preserving motor neurons and muscle innervation in human and rodent models
Cristofanilli et al. Cerebrospinal fluid derived from progressive multiple sclerosis patients promotes neuronal and oligodendroglial differentiation of human neural precursor cells in vitro
Barruet et al. Modeling the ACVR1 R206H mutation in human skeletal muscle stem cells
Yang et al. Phenotypic and functional characterizations of mesenchymal stem/stromal cells isolated from human cranial bone marrow
JP6243675B2 (ja) オルファクトリースフィア細胞の生成・単離方法及び製造方法並びに該オルファクトリースフィア細胞を用いた脱随疾患治療剤及び末梢神経軸索再生増強剤の製造方法
Sypecka et al. Mesenchymal cells of umbilical cord and umbilical cord blood as a source of human oligodendrocyte progenitors
Kang et al. The potential of mouse skin-derived precursors to differentiate into mesenchymal and neural lineages and their application to osteogenic induction in vivo
Kadivar et al. Multilineage differentiation activity by the human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells
Case et al. In vitro clonal analysis of murine pluripotent stem cells isolated from skeletal muscle and adipose stromal cells
RU2396345C1 (ru) Способ получения популяции стромальных клеток жировой ткани, индуцированных к нейральной дифференцировке
JP3928881B2 (ja) 単球由来多能性細胞ｍｏｍｃ
Awaya et al. Selective Development of Myogenic Mesenchymal Cells from Human Embryonic and Induced
HK40010333B (en) Method of treating the effects of stroke