RS57167B1 - Ekstrakti sene i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima 1-17. Predmetni pronalazak se odnosi na ekstrakte Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia osiromašene senozidima kao sredstva za zaštitu mukoznih membrana, gastroprotektivna i/ili dermoprotektivna sredstva, postupke za njihovu pripremu i kompozicije koje sadrže takve ekstrakte.

STANJE TEHNIKE

[0002] Sena (Cassia acutifolia ili Cassia angustifolia) je biljka čije lišće ili čije mahune (meškovi) se uobičajeno koriste kao laksativi.

[0003] Laksativno dejstvo sene je znatno iritativno laksativno dejstvo, zbog prisustva, u mahunama i lišću, antrahinona poznatih kao senozidi.

[0004] Glavni aktivni sastojci u lišću su senozidi A i B (i senozidi A1, C, D, G), oko 2,5% njih se ispoljava kao sadržaj senozida B (C42H38O20; Mr863 prema evropskoj farmakopeji), i u mahuni, često označenoj i kao mešak, pomenute komponente se u oko 4% ispoljavaju kao sadržaj senozida B.

[0005] Dejstvo senozida potiče od njihove konverzije, u debelom crevu, u aktivni metabolit (rein antron) koji deluje na pokretljivost debelog creva (stimuliše peristaltičke kontrakcije i inhibira lokalne kontrakcije) s posledičnim ubrzanjem prolaska kroz kolon i smanjenjem apsorpcije tečnosti i delovanjem na sekretorna dejstva (stimulacija mukozne sekrecije i aktivne hloridne sekrecije) sa povećanjem sekrecije tečnosti.

[0006] Standardni postupak za titraciju senozida u lišću i mahunama sene opisan je u evropskoj farmakopeji 7.0, u poglavljima nazvanim Sennae folium (stranice 1236 i 1237, European Pharmacopoeia 7.0 izd.2011, 01/2008:0206 korigovana 6.0). U predmetnom opisu, naznaka ukupnih senozida prisutnih u ekstraktima, označenih kao „SFM ukupni senozidi izraženi kao senozid B“ je ona dobijena gore navedenim postupkom, tj. predstavlja senozide određene pomoću spektrofotometrijskog postupka u skladu sa onim kako je opisano u prethodno citiranoj evropskoj farmakopeji.

[0007] Različiti oblici kvantitativnog određivanja će biti različito naznačeni.

[0008] Prema tome, upotreba lišća i/ili mahuna sene kao laksativa, i njihovih ekstrakata kao laksativa je poznata u stanju tehnike, a i iritantno dejstvo takvog proizvoda na crevo je poznato, pri čemu su oba povezana sa prisustvom senozida u lišću, kao i u mahunama biljke sena.

REZIME PRONALASKA

[0009] Predmetni pronalazak se odnosi na ekstrakt sene suštinski osiromašen poznatim farmakološki aktivnim sastojcima predstavljenim ukupnim senozidima, od kojih ostaje samo trag, i izborno osiromašen i smolama, i na postupak za dobijanje takvih ekstrakata. Ekstrakt prema pronalasku može da se koristi u svrhu koja je sasvim drugačija od one u koju se ekstrakt sene koristi u stanju tehnike, tj. kao zaštitno sredstvo za mukozne membrane ili za kožu. Takva upotreba može da se ostvari zahvaljujući zaštitnim aktivnostima preostalih sastojaka, kojima je ekstrakt obogaćen za 15-25% u odnosu na polazni proizvod zahvaljujući uklanjanju ukupnih senozida iz njega. Ekstrakt prema pronalasku stoga obezbeđuje novi izvor materijala biljnog porekla koristan za zaštitu mukoznih membrana i kože, pri čemu su farmakološka dejstva koja se mogu pripisati sastojcima poznatim kao aktivni principi suštinski smanjena ili otklonjena.

[0010] Pomenuto stanje je posebno poželjno kada materijali prirodnog ili biljnog porekla treba da se koriste za delovanja uglavnom mehaničkog tipa (tj., ne za farmakološka delovanja koja imaju, npr., neposredno dejstvo na aktivaciju receptorskih puteva, imunskih puteva ili metaboličkih postupaka). Upotreba supstanci sa uglavnom mehaničkim dejstvom, kao što su na primer supstance koje imaju ulogu barijere ili mukoadhezivno dejstvo, poželjna je, npr., kao pomoć farmakološkoj terapiji. Smanjivanjem prisustva supstanci sa farmakološkim aktivnostima u materijalu prirodnog ili biljnog porekla, kao u predmetnom pronalasku, dobijen je materijal sa uglavnom mehaničkim dejstvom, koji može da se koristi u kombinaciji sa lekovima, čime se smanjuju moguće neželjene interakcije sa lekovima i, u isto vreme, koristi tipična osobina supstanci biljnog porekla, da imaju veliki broj komponenata koje mogu da pružaju zaštitno dejstvo, osim onih farmakološki aktivnih koje se najčešće koriste.

[0011] Upotreba biljnih ekstrakata ili prirodnih složenih supstanci osiromašenih farmakološki aktivnim principima podrazumeva dvostruku prednost obezbeđivanja materijala koji ima uglavnom mehaničko zaštitno dejstvo (zaštita mukozne membrane ili zaštita kože) i omogućavanja konkretne i korisne upotrebe materijala koji se obično odbacuju u procesima ekstrakcije biljnih ili prirodnih aktivnih principa.

[0012] Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na ekstrakt sene osiromašen ukupnim senozidima, gde navedeni ukupni senozidi imaju koncentraciju u težinskom procentu od najmanje ≤ 0.5%; njegovu upotrebu kao zaštitnog sredstva delimično oštećene kože ili mukoznih membrana; kompozicije koje sadrže takav ekstrakt; njihovu upotrebu u zaštiti kože ili mukoznih membrana i postupke za pripremu takvog ekstrakta i takve kompozicije.

[0013] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu ekstrakta sene kao što je gore definisano, koji obuhvata sledeće korake:

a. pripremanje hidroalkoholnog ekstrakta lišća i/ili mahuna (meškova) sene, pri čemu je navedeni hidroalkoholni ekstrakt pripremljen podvrgavanjem lišća i/ili mahuna Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia, izborno usitnjenih, postupku dva ili više koraka ekstrakcije u etanolu opadajuće koncentracije

b. dobijanje iz ekstrakta pripremljenog u a. koncentrovanog vodenog ekstrakta i smolastog ekstrakta bez senozida

c. koncentrovanje navedenog alkoholnog ekstrakta odlivanjem i/ili centrifugiranjem i/ili filtracijom, sakupljanjem supernatanta ili filtrata

d. navedeni supernatant ili filtrat iz c. podvrgava se jednom ili više koraka ultrafiltracije pri čemu se sakuplja permeat i navedeni permeat sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤ 50.5% i pri čemu se navedeni jedan ili više koraka ultrafiltracije izvodi na polupropustljivoj membrani sa graničnom vrednošću od 500-15000 daltona i/ili

gde se navedeni filtrat ili supernatant dobijen u koraku c. ili navedeni permeat dobijen posle ultrafiltracije podvrgava jednom ili više koraka propuštanja kroz visoko poroznu adsorbujuću smolu i eluat se sakuplja, pri čemu navedeni eluat dobijen na takav način sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤0.5.

DETALJAN OPIS SLIKA

[0014]

Slika 1 prikazuje blok dijagram primera izvođenja postupka prema pronalasku.

Slika 2a prikazuje blok dijagram koraka d i slika 2b prikazuje blok dijagram koraka d’. Slika 3 prikazuje grafik mukoadhezije na nagnutoj ravni (test je opisan u nastavku) u kome je ispitivana supstanca 50° etanol na panelu A (rastvarač ekstrakta), natrijum alginat na panelu B, ekstrakt prema pronalasku na panelu C, voda na panelu D (rastvarač za natrijum alginat).

[0015] Kvadrati označavaju rezultate dobijene na nagnutoj ravni sa mucinom i ispitivanim uzorkom, dok rombovi označavaju rezultate dobijene sa kontrolom (slepa proba) u kojoj se ispitivani uzorak ispituje na nagnutoj ravni bez mucina.

[0016] Slika 3A prikazuje da se za 50% etanol, koji nije mukoadhezivna supstanca, merenja klizanja na nagnutoj ravni sa i bez mucina praktično preklapaju.

[0017] Kvadrati označavaju rezultate dobijene na nagnutoj ravni sa mucinom i 50% etanolom, dok rombovi označavaju rezultate dobijene za kontrolu (slepu probu) u kojoj se ispitivani uzorak ispituje na nagnutoj ravni bez mucina.

[0018] Slika 3B prikazuje grafik mukoadhezije na nagnutoj ravni (test je opisan u nastavku) gde je ispitivana supstanca natrijum alginat, supstanca sa poznatim mukoadhezivnim svojstvima.

[0019] Kvadrati označavaju rezultate dobijene na nagnutoj ravni sa mucinom i natrijum alginatom, dok rombovi označavaju rezultate dobijene za kontrolu (slepu probu) u kojoj se natrijum alginat ispituje na nagnutoj ravni bez mucina.

[0020] U slučaju uzorka koji se sastoji od natrijum alginata; prisutna je značajna razlika u ponašanju u prisustvu i u odsustvu mucina.

[0021] Slika 3C prikazuje grafik mukoadhezije na nagnutoj ravni (test je opisan u nastavku) gde je ispitivana supstanca ekstrakt sene osiromašen smolama i senozidima (koji dakle može da se dobije u tački d. ili d’ prema postupku) u skladu sa predmetnim opisom u cilju potvrđivanja njegovih mukoadhezivnih svojstava.

[0022] Kvadrati označavaju rezultate dobijene na nagnutoj ravni sa mucinom i ekstraktom sene u skladu sa predmetnim opisom, dok rombovi označavaju rezultate dobijene za kontrolu (slepu probu) u kojoj se ekstrakt sene u skladu sa predmetnim opisom ispituje na nagnutoj ravni bez mucina.

[0023] Slika 3D prikazuje grafik mukoadhezije na nagnutoj ravni (test je opisan u nastavku) gde je ispitivana supstanca voda.

[0024] Kvadrati označavaju rezultate dobijene na nagnutoj ravni sa mucinom i vodom dok rombovi označavaju rezultate dobijene za kontrolu (slepu probu) u kojoj se voda ispituje na nagnutoj ravni bez mucina.

[0025] Slika pokazuje da se za vodu, supstancu koja nije mukoadhezivna, merenja klizanja na nagnutoj ravni sa i bez mucina praktično preklapaju.

[0026] Može da se primeti kako ekstrakt ima ponašanje slično natrijum alginatu; uočljiva razlika u ponašanju javlja se u odsustvu mucina, rezultujući time mukoadhezivnim svojstvima.

KRATAK REČNIK

[0027]

NMWCO=Nominalna granična vrednost molekulske težine

FILTRAT: ekstrakt koji je prošao kroz polupropustljivu membranu za ultrafiltraciju ili kroz panel filtera

PERMEAT: ekstrakt koji je prošao kroz membranu za ultrafiltraciju.

RETENTAT: ekstrakt koji nije prošao kroz membranu za ultrafiltraciju ili materijal adsorbovan na smoli

ELUAT: materijal koji nije adsorbovan na smolu nakon prolazaka kroz nju tokom adsorpcije.

ULTRAFILTRACIJA: tehnika filtracije na polupropustljivoj membrani koja se odlikuje porama veličine od 100000 daltona (oko 0.1 µm) do 500 daltona (oko 0.005 µm)

Pod "NE VIŠE OD", u odnosu na količine aktivnih principa u ekstraktu, u predmetnom opisu podrazumeva se ≤.

[0028] Pod „ukupni senozidi“, u predmetnom pronalasku, podrazumevaju se ukupni SFM senozidi, izraženi kao senozid B prema referenci u opisu stanja tehnike (evropska farmakopeja 7.0 izd.2011).

[0029] U svrhu predmetnog pronalaska, prikazani težinski procenti odnose se na osušene ekstrakte i stoga su težinski procenti suvih ekstrakata.

[0030] U svrhu predmetnog pronalaska, pojam „sena“ koristi se da označi Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0031] Kao što je prethodno naznačeno, u predmetnom opisu je obezbeđen ekstrakt sene osiromašen ukupnim SFM senozidima izraženim kao senozid B, gde navedeni ukupni senozidi imaju koncentraciju u težinskom procentu od oko ≤ 0.5%. Primenom postupka ekstrakcije prema pronalasku, opisanog u nastavku teksta, i separacionih tehnika na polupropustljivoj membrani ili na smoli, bilo je moguće dobiti smolasti ekstrakt sene bez senozida i ekstrakt sene osiromašen smolama i ukupnim senozidima, i istovremeno iznenađujuće obogaćen preostale supstancama. Oba ekstrakta su pokazala zaštitno dejstvo na kožu i na mukozne membrane, što je očigledno iz testa mukoadhezije i testa za svojstva barijere prikazanih u eksperimentalnom odeljku u nastavku teksta.

[0032] Oba ekstrakta su korisna kao što je opisano u predmetnom pronalasku i mogu takođe da se pomešaju tako da se dobije ekstrakt sene koji sadrži smole i osiromašen je ukupnim senozidima.

[0033] U poređenju sa suvim ekstraktima sene i sa lišćem i/ili mahunama sene kao takvim, koji sadrže količine ukupnih senozida od najmanje oko 4.6% po težini, ekstrakt bez smola, kao i ekstrakt osiromašen smolama rekonstituisan sa smolastim ekstraktom koji ne sadrži senozide prema predmetnom pronalasku, imaju samo tragove takvih aktivnih principa, budući da sadrže količinu ukupnih senozida od najmanje ≤ 0.5% po težini.

[0034] Očigledno, takvi procenti su, u praksi, tragovi ukupnih senozida koji ne mogu da budu odgovorni za mukoadhezivne osobine i osobine barijere koje pokazuje ekstrakt pronalaska, i koji ne mogu da izazovu farmakološka dejstva za koja se sena ili ekstrakti sene uobičajeno koriste.

[0035] Budući da je u jednom primeru izvođenja ekstrakt paralelno takođe osiromašen smolama, a poslednje su i skoro potpuno eliminisane u celokupnom postupku ekstrakcije kao što je gore opisano, mukoadhezivno dejstvo i dejstvo barijere, primećeno kod ekstrakta osiromašenog smolama prema pronalasku, takođe se ne može pripisati smolama.

[0036] Ekstrakt prema pronalasku može prema tome da bude

a. smolasti ekstrakt dobijen u koraku b. postupka,

b. ekstrakt osiromašen smolama i senozidima, dobijen u koraku d. postupka

c. smeša gore opisanih ekstrakata a. i b. u bilo kom željenom odnosu, npr.50% i 50% ili u drugim odnosima, na primer nastala mešanjem ukupnih količina oba ekstrakta dobijena iz istog polaznog materijala.

[0037] Svaki od takvih ekstrakata je stoga koristan zbog svojih svojstava mukoadhezije i dejstva barijere u svim onim slučajevima u kojima je zaštita kože ili mukoznih membrana potrebna ili poželjna; to mogu da budu slučajevi u kojima lek koji deluje agresivno na mukozne membrane ili kožu mora da se primeni, prema tome u cilju sprečavanja oštećenja zbog leka, ili u onim slučajevima u kojima je zaštita čak i delimično oštećene kože ili mukozne membrane povoljna ili poželjna, tako da se omogući njihovo bolje i brže zaceljivanje, njihovom odbranom od daljih napada, ili u onim slučajevima u kojima pojedinac ima hronični poremećaj u kome su koža ili mukozne membrane pretrpele iritacije ili izmene, stoga dejstvo barijere može da spreči ili ograniči oštećenja na koži ili mukoznoj membrani.

[0038] Pri definisanju zaštitnog dejstva mukozne membrane, u predmetnom opisu podrazumeva se da takve mukozne membrane mogu da budu oralna sluzokoža, sluzokoža želuca, sluzokoža creva, sluzokoža nosa, sluzokoža materice, rektalna sluzokoža.

[0039] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremu ekstrakta kao što je gore opisano, navedeni postupak obuhvata sledeće korake:

a. pripremanje hidroalkoholnog ekstrakta lišća i/ili mahuna (meškova) sene gde je navedeni hidroalkoholni ekstrakt pripremljen podvrgavanjem lišća i/ili mahuna Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia, izborno usitnjenih, postupku dva ili više koraka ekstrakcije u etanolu opadajuće koncentracije

b. dobijanje iz ekstrakta pripremljenog u a. koncentrovanog vodenog ekstrakta i smolastog ekstrakta bez senozida

c. koncentrovanje navedenog alkoholnog ekstrakta odlivanjem i/ili centrifugiranjem i/ili filtracijom, sakupljanjem supernatanta ili filtrata

d. navedeni supernatant ili filtrat u c. se podvrgava jednom ili više koraka ultrafiltracije pri čemu se permeat sakuplja i navedeni permeat sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤50.5%, i pri čemu se navedeni jedan ili više koraka ultrafiltracije izvodi na polupropustljivoj membrani sa graničnom vrednošću od oko 500-15000 daltona, i/ili

navedeni filtrat ili supernatant dobijen u koraku c. ili navedeni permeat dobijen posle ultrafiltracije, podvrgava se jednom ili više koraka propuštanja kroz adsorbujuću smolu visoke poroznosti i sakuplja se eluat,

gde navedeni eluat koji je dobijen na taj način sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤0.5.

[0040] Ekstrakt dobijen u koraku d. prema gore opisanom postupku imaće koncentraciju ukupnih senozida u težinskom procentu ≤0.5%.

[0041] Smolasti ekstrakt dobijen u koraku b. prema gore opisanom postupku će biti bez senozida, koji ostaju u vodenom ekstraktu koji se uvek dobija u b.

[0042] Kao što je već pomenuto, cilj pronalaska su oba ekstrakta, kao i njihova mešavina.

[0043] Postupak koji je ovde opisan može da se izvede polazeći od lišća i/ili mahuna (meškova, ili plodova) sene.

[0044] Alkoholni ekstrakti sene mogu da budu obrađeni prema postupku prikazanom u koraku b.

[0045] Suvi ekstrakt sene može da bude obrađen prema postupku prikazanom u koraku a.

[0046] Prema pronalasku, gore opisani postupak može da se sprovede izvođenjem u tački a. najmanje dva, najmanje tri, ili najmanje četiri koraka sa opadajućim koncentracijama etanola, gde se opadajuće koncentracije etanola nalaze u opsegu od oko 96% etanola do oko 0% etanola.

[0047] Na primer, korak a. postupka može da se sprovede izvođenjem koraka u približno 85% etanolu, koraka u približno 50% etanolu, i koraka u približno 20% etanolu.

[0048] Ili, korak a. postupka može da se sprovede izvođenjem koraka u približno 85% etanolu, koraka u približno 50% etanolu, koraka u približno 20% etanolu i koraka u približno 5% etanolu.

[0049] Ekstrakti dobijeni kao što je gore opisano se spajaju da obrazuju hidroalkoholni ekstrakt. Oni mogu da budu spojeni, na primer, u međusobno jednakim odnosima, kao 50:50 u slučaju dva koraka postupka u etanolu, ili kao 33.3:33.3:33.3 u slučaju tri koraka postupka u etanolu ili 25:25:25:25 u slučaju četiri koraka postupka u etanolu. Očigledno, ekstrakti dobijeni izvođenjem različitih gore opisanih koraka postupka u etanolu mogu da budu spojeni u različitim odnosima, prema opštem znanju tehničara u ovoj oblasti.

[0050] Kao što je gore već naznačeno, hidroalkoholni ekstrakt dobijen u koraku a. biće korišćen za pripremu koncentrovanog vodenog ekstrakta u koraku b.

[0051] Navedeni koncentrovani vodeni ekstrakt može da se pripremi koncentrovanjem hidroalkoholnog ekstrakta dobijenog u a. isparavanjem alkohola, i on se zatim odliva i/ili centrifugira i/ili filtrira i koncentrovana vodena faza se sakuplja (na primer, u slučaju odlivanja i/ili centrifugiranja) vodeni supernatant se sakuplja, dok se u slučaju filtracije sakuplja filtrat. Alternativno, isparavanje alkohola može da se izvede posle faze centrifugiranja i/ili odlivanja i/ili filtracije.

[0052] Odlivanje može da se izvodi, npr., 1 do 72 časa, i može da bude praćeno ili zamenjeno sa jednim ili više centrifugiranja do oko 3000-4000 (npr., oko 3500) obr/min tokom perioda obuhvaćenog između 1 i 10 minuta, npr. oko 5 minuta. Za filtraciju mogu da se koriste, panelni filteri sa graničnom vrednošću od 10 do 50 mikrometara. Supernatant dobijen posle ovog/ovih koraka se zatim sakuplja i podvrgava, u slučaju da to nije već urađeno ranije, isparavanju alkohola standardnim tehnikama, kao, npr., upotrebom sistema destilacije sa tankim filmom, ili sistema koncentrovanja serije prema standardnim protokolima koje uobičajeno koriste tehničari u ovoj oblasti.

[0053] Rezultat ovog isparavanja je koncentrovani vodeni ekstrakt koji se, u koraku c. postupka, podvrgava odlivanju i/ili filtrira.

[0054] Talog dobijen nakon ovih koraka je smolasti ekstrakt koji ne sadrži senozide, i on je takođe cilj ovog pronalaska.

[0055] Stoga, cilj pronalaska je takođe postupak koji obuhvata samo korake a. i b., u kojima se zadržava smolasti ekstrakt dobijen sedimentacijom ili taloženjem, tj. postupak za pripremu ekstrakta sene koji ne sadrži senozide, obuhvata sledeće korake:

a. pripremanje hidroalkoholnog ekstrakta lišća i/ili mahuna (meškova) sene

b. dobijanje iz ekstrakta pripremljenog u a. vodenog ekstrakta i smolastog ekstrakta koji ne sadrži senozide, navedeni smolasti ekstrakt se sakuplja.

[0056] U ovom slučaju, naravno, nije neophodno koncentrovati vodeni ekstrakt.

1

[0057] U postupku koji obuhvata korake a-d, koncentrovani vodeni ekstrakt (koji se može označiti i kao koncentrovani vodeni rastvor) može da bude podvrgnut odlivanju tokom perioda sadržanog između 1 i 72 časa, i supernatant se zatim izdvaja, čime se dobija prečišćeni rastvor. Odlivanje može da bude praćeno ili zamenjeno sa jednim ili više centrifugiranja na oko 3000-4000 (npr., oko 3500) obr/min tokom perioda između 1 i 10 minuta, npr. oko 5 minuta.

[0058] Alternativno, koncentrovani vodeni ekstrakt se filtrira, čime se dobija prečišćeni rastvor. Filtracija može da se izvede, npr., na panelnom filteru sa graničnom vrednošću od 10 do 50 mikrometara, kao, npr. sa graničnom vrednošću od 15-20 mikrometara, ili sa graničnom vrednošću od 25 mikrometara, ili čak i više.

[0059] U sledećem primeru izvođenja koncentrovani vodeni ekstrakt može da bude odliven kao što je gore opisano i dobijeni supernatant može zatim da bude filtriran kao što je gore opisano.

[0060] Supernatant ili filtrat dobijen kao što je gore opisano se izdvaja i podvrgava koraku d. osiromašivanja u sadržaju ukupnih senozida.

[0061] Osim toga, postupak obuhvata korak d. obrade supernatanta ili filtrata dobijenog u gore opisanom koraku c. pre sakupljanja željenog ekstrakta.

[0062] Ovaj korak (d) može da se izvede ultrafiltracijom supernatanta ili filtrata dobijenog u c. i/ili propuštanjem supernatanta ili filtrata dobijenog u c. ili permeata dobijenog posle ultrafiltracije kroz adsorpcionu smolu visoke poroznosti.

[0063] U prvom slučaju, supernatant ili filtrat dobijen u c. podvrgava se jednom ili više koraka ultrafiltracije i permeat se izdvaja, pri čemu navedeni permeat sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤0.5%.

[0064] U ovom sledećem koraku, vodeni ekstrakt (rezultat filtracije ili supernatant iz odlivanja u c.) podvrgava se jednom ili više koraka na polupropustljivim membranama sa graničnom vrednošću molekulske težine (NMCWO) od 500 do 50000 daltona, npr. od 500, 1 000, 2 500, 5 000, 10 000, 20 000, 50 000 daltona. Tako dobijen permeatni ekstrakt je suštinski bez ukupnih senozida smole i supstanci terpenoidne strukture, dok je obogaćen supstancama koje imaju zaštitno dejstvo i može da se koristi kao takav, ili da se podvrgne postupku liofilizacije da bi se dobio liofilizovani ekstrakt koristan za formulacije koje imaju terapijsku upotrebu za unutrašnju i/ili spoljašnju upotrebu.

[0065] Prema pronalasku, stoga, navedeni jedan ili više korak ultrafiltracije može da se izvede na membranama koje imaju graničnu vrednost od oko 500-50000 daltona, npr. oko 10 000 daltona, 5000 daltona i 2500 daltona (korigovano).

[0066] Predmetni pronalazak se prema tome takođe odnosi na postupak za pripremu ekstrakta sene obuhvata sledeće korake:

a. pripremanje hidroalkoholnog ekstrakta lišća i/ili mahuna (meškova) sene b. dobijanje iz ekstrakta pripremljenog u a. koncentrovanog vodenog ekstrakta i smolastog ekstrakta bez senozida

c. odlivanje i/ili filtriranje navedenog vodenog ekstrakta sakupljanjem supernatanta ili filtrata

d. podvrgavanje supernatanta ili filtrata dobijenog u c. jednom ili više koraka ultrafiltracije i izdvajanje (sakupljanje) završnog permeata,

gde navedeni permeat sadrži ukupne senozide u koncentraciji po težini ne većoj od 0.5% (≤0.5%).

[0067] Kao što je već pomenuto, izborno ekstrakt dobijen u b. i ekstrakt dobijen u d. mogu da se pomešaju.

[0068] Prema sledećem primeru izvođenja, postupak prema pronalasku može da sadrži, alternativno ili dodatno koraku d. kao što je gore opisano, korak d’. u kome se filtrat ili supernatant dobijen u c. ili permeat dobijen posle ultrafiltracije podvrgava jednom ili više koraka propuštanja kroz visoko poroznu adsorbujuću smolu i eluat, koji se sastoji od supstanci koje nisu adsorbovane na smolu se sakuplja, pri čemu tako dobijen navedeni eluat sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤0.5%.

[0069] Predmetni pronalazak se stoga takođe odnosi na postupak za pripremu ekstrakta sene koji obuhvata sledeće korake:

a. pripremanje hidroalkoholnog ekstrakta lišća i/ili mahuna (meškova) sene b. dobijanje iz ekstrakta pripremljenog u a. koncentrovanog vodenog ekstrakta i smolastog ekstrakta bez senozida

c. odlivanje i/ili filtriranje navedenog vodenog ekstrakta sakupljanjem supernatanta ili filtrata

d’. filtrat ili supernatant dobijen u c., ili permeat dobijen iz jednog ili više koraka ultrafiltracije kao što je gore opisano, dodatno se podvrgavaju jednom ili više koraka (pasaža) kroz visoko poroznu adsorbujuću smolu,

pri čemu tako dobijen navedeni eluat sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤0.5.

[0070] Kao što je već pomenuto, izborno ekstrakt dobijen u b. i ekstrakt dobijen u d. mogu da se pomešaju.

[0071] Prema predmetnom pronalasku, korak u d’ može da se izvede na koloni ili sa smolama sposobnim da adsorbuju aromatične ili visoko apolarne supstance i da dozvole eluiranje nearomatičnih polarnih supstanci. Materijal adsorbovan na smoli, po želji, može da bude desorbovan pogodnim rastvaračem, kao npr. etanolom ili hidroalkoholnim rastvaračima, za druge upotrebe.

[0072] Pogodne hromatografske smole mogu da budu, npr., visoko porozne adsorpcione smole od stiren-divinil benzen kopolimera, kao, npr., amberlit XAD-2, serdolit PAD-II, ADS TQ 318.

[0073] Naročito, smola će biti smola sposobna da adsorbuje aromatične i/ili apolarne supstance, kao, npr., hidrofobna adsorbujuća smola; smola koja se sastoji od mikrosfera prečnika 0.2 mm - 0.8 mm, sa koeficijentom uniformnosti ≤ 1.5 dobijena polimerizacijom stirena i DVB bez aktivnih grupa, koja se odlikuje veoma poroznom fizičkom strukturom i koja ima parametar koji se odnosi na zapreminu pore jednak oko 1.3 ml/g, omogućavajući adsorpciju i selektivno eluiranje organskih supstanci, poželjno aromatične prirode. Prema tome, propuštanje kroz smole koje imaju svojstva adsorbovanja takvog tipa kao što je gore opisano omogućavaju dobijanja frakcije (ekstrakt prema pronalasku) osiromašene u ukupnim senozidima (≤0.5%).

[0074] Ekstrakt dobijen gore naznačenim postupcima sadržaće samo tragove i drugih supstanci terpenoidne strukture prisutnih u polaznom proizvodu, pored ukupnih senozida.

1

[0075] Ekstrakt koji može da se dobije prema pronalasku sadrži ukupne senozide u koncentraciji po težini ne većoj od 0.5% (≤0.5%, pri čemu se ovaj proizvod odnosi na suvi proizvod).

[0076] Ekstrakti prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste kao takvi ili mogu da budu obrađeni, npr. podvrgavanjem sušenju liofilizacijom.

[0077] Ekstrakt dobijen u d ili d’ ima svojstva kao, npr., ona prikazana u tabeli 1, u kojoj je upoređen sa polaznim proizvodom, ultrafiltracionim permeatom ili eluatom sa smole dobijenim u d i d’, redom.

Tabela 1

[0078] Postupak prema predmetnom pronalasku, u kome redosled koraka kao što je gore opisano omogućava prema tome dobijanje ekstrakta sene osiromašenog ukupnim senozidima i iznenađujuće bogatog supstancama koje imaju zaštitno delovanje. Gore opisani postupak a. do d. takođe uklanja smole putem korišćenih reagenasa i koraka, kao što je očigledno tehničaru u ovoj oblasti.

[0079] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, ekstrakt prema pronalasku će takođe biti suštinski bez smola koje će biti nađene u smolastom ekstraktu dobijenom u b. i u frakcijama odbačenim u c. i d. ili d’.

[0080] Međutim, smolasti ekstrakt bez senozida se sakuplja i može da se koristi kao takav ili ponovo spojen sa ekstraktom dobijenim u d. ili d’.

[0081] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži ekstrakt u bilo kom od gore opisanih primera izvođenja korisnu za zaštitu kože ili mukoznih membrana.

[0082] Navedena zaštita, naravno, uzimajući u obzir i ekstrakt po sebi, i kompoziciju, može da bude preventivna zaštita ili zaštita delimično oštećene kože ili mukoznih membrana.

[0083] Na primer, kompozicija ili ekstrakt može, putem svog dejstva barijere, da olakša popravku oštećene kože uključujući obnavljanje zdrave i elastične kože.

[0084] Oštećenja kože prema predmetnom pronalasku su, npr. oštećenja koja mogu da uključuju i tkivo koje leži ispod kože i kod kojih nisu prisutne otvorene rane.

[0085] Pod oštećenjima kože koja ne uključuju prisustvo otvorenih rana, prema predmetnom opisu, podrazumevaju se ona oštećenja kod kojih su površinski sloj kože, i slojevi koji se nalaze ispod njega, iako nisu povređeni, posebno krhki, iritirani i oštećeni.

[0086] Neograničavajuće primere ovog tipa oštećenja predstavljaju opekotine prvog stepena, lezije prvog stepena povezane sa dekubitisom, lezije nastale usled pritiska, osip kod novonastalog ožiljnog tkiva, rane ili opekotine, iritacije, eritemi.

[0087] Kompozicija ili ekstrakt prema pronalasku može zatim da se koristi za lečenje ili prevenciju oštećenja kože koja ne uključuju prisustvo otvorenih rana, ili u prevenciji ili usporavanju pogoršavanja istih.

[0088] Kompozicije prema pronalasku mogu pogodno da sadrže dodatne sastojke, npr. biljnog porekla, koji imaju, npr. emolijentna, digestivna, prokinetička, holagogna, karminativna, prebiotička, opuštajuća svojstva, svojstva ekscipijensa, svojstva konzerviranja, svojstva kvašenja.

[0089] Kada se kompozicija ili ekstrakt prema pronalasku koriste za zaštitu kože, njihova primena će biti topikalna. Primeri izvođenja kompozicija za topikalnu su prikazani u dole navedenom opisu.

[0090] Kompozicija prema pronalasku može da bude napravljena, npr., kao emulzija ulje-uvodi, emulzija voda-u-ulju, emulzija ulje-u-gelu ili gel-u-ulju, višestruke emulzije, sprejevi i anhidrovane formulacije (melem, gel, pasta, krema, mast), i sadržaće jedan ili više ekscipijenasa pogodnih za pravljenje željenog krajnjeg oblika.

[0091] Takvi ekscipijensi mogu da budu, npr., sredstva za emulgovanje (cetearil alkohol, cetearil glukozid, hidrogenizovano ricinusovo ulje) reološki aditivi, antioksidansi (kao, npr., vitamini, tokoferoli ili drugi antioksidansi poznati u ovoj oblasti).

1

[0092] Sredstvo za emulgovanje može da bude surfaktant, koji snižavanjem međufaznog napona smanjuje slobodnu energiju sistema; alternativno, mogu da se koriste i supstance koje nisu surfaktanti, kao što je guma arabika, želatin, hidrofilni koloidi ili fino razdeljeni prahovi (npr., talk). U jednom primeru izvođenja, ekscipijens može da bude prisutan u ukupnoj koncentraciji po težini sadržanoj između 3 i 8%, takva koncentracija je naravno indikativna, uzimajući u obzir da bilo kako da tehničar u ovoj oblasti bude znao kako da prilagodi koncentraciju neophodnih ekscipijenasa prema primeru izvođenja, to neće uključivati inventivnu aktivnost.

[0093] Osim toga, kompozicija može da sadrži sredstva za davanje mirisa i/ili boje koja joj daju prijatan miris, kao, npr., jedno ili više esencijalnih ulja kao, npr., esencijalno ulje lavande, esencijalno ulje čajevca, limun, mentu, pomorandžu, i/ili sredstva za davanje boje koja omogućavaju, npr., da se lako prepoznaju oblasti primene kompozicije, pri čemu je bojenje npr., privremeno, tako da ne ometa druge kasnije primene kompozicije.

[0094] U jednom primeru izvođenja, navedena sredstva za davanje mirisa i/ili boje su sadržana u ukupnoj koncentraciji po težini od 0.001 do 3%.

[0095] Pod „ukupnom koncentracijom po težini“ podrazumeva se težinska koncentracija u kompoziciji zbira različitih ekscipijenasa, ili težinska koncentracija u kompoziciji zbira različitih sredstva za davanje mirisa i/ili boje prisutnih u kompoziciji.

[0096] Kada je u pitanju upotreba kompozicije u zaštiti kože, pronalazak se odnosi i na medicinske uređaje kao npr. lekovite flastere, lekovite gaze, lekovite zavoje, lekovite ubruse, lekovite uloške, lekovite pelene, tj. flastere, gaze, zavoje, ubruse, uloške ili pelene koji sadrže, ili su bar delimično prekriveni ili bar delimično prožeti opisanim kompozicijom prema pronalasku u najprikladnijoj formi.

[0097] Gaze mogu da budu načinjene kao masne gaze, kao i zavoji i flasteri, upotrebom kompozicije napravljene u obliku, npr., masti, paste ili kreme. Ubrusi mogu da budu prožeti kompozicijom u obliku uljane emulzije sa vodom ili gelom, i pelene ili apsorbujući ulošci mogu da budu napravljeni ubacivanjem kompozicije u relevantne slojeve poznate u struci za ubacivanje zaštitnih ili anti-iritantnih kompozicija.

[0098] Takvi proizvodi, kao, npr., dečije pelene, apsorbujući ulošci (uobičajeno nazvani „sanitarni ulošci“) za žene i ulošci za inkontinenciju za odrasle, uobičajeno se koriste, npr., u oblastima koje se tiču dece, žena i starijih osoba, i tehničar u ovoj oblasti će znati gde da

1

ubaci kompoziciju koja je ovde opisana i koji primer izvođenja će biti najpogodniji, bez potrebe za određenim obučavanjem i samo na osnovu konvencionalnih tehnika u ovoj oblasti.

[0099] Takvi uređaji će biti primenljivi na deo koji treba da se leči i/ili zaštiti u preventivne svrhe.

[0100] Kao što je prethodno navedeno, kompozicija prema pronalasku može da bude kompozicija za topikalnu primenu koja može da bude ostvarena u obliku emulzije ulje-uvodi, emulzije voda-u-ulju, višestrukih emulzija, sprejeva, i anhidrovanih formulacija (melem, mast, gel, pasta, krema, sprej), u skladu sa tehnikama koje se uobičajeno koriste u ovoj oblasti. Formulacija koja je ovde označena kao „sprej“ može da bude anhidrovana formulacija ili čak formulacija u emulziji, u obliku sa atomizerom koji omogućava i samoprimenu na oblastima koje su nedostupne (kao, npr., leđa), što je korisno u svim onim slučajevima u kojima se formulacija koristi, npr., za ublažavanje osipa izazvanih suncem, eritema, ili iritacija kože različitih vrsta.

[0101] Prema drugom primeru izvođenja, ekstrakt ili kompozicija prema pronalasku mogu da se koriste, zahvaljujući svojim mukoadhezivnim dejstvima i dejstvima barijere, za zaštitu mukoznih membrana.

[0102] I u ovom slučaju, navedena zaštita može da bude preventivna zaštita, npr. u svim onim slučajevima koji predviđaju primenu lekova koji imaju sporedno dejstvo agresivnog delovanja na mukozne membrane, ili kod onih pacijenata koji ispoljavaju stanja ponovljenih iritacija iste. U drugim slučajevima, zaštita može umesto toga da bude zaštita u svrhe lečenja, ili u svrhe izbegavanja pogoršanja stanja iritiranih ili delimično oštećenih mukoznih membrana.

[0103] U ovim slučajevima, primena ekstrakta ili kompozicije može da bude topikalna za sve one mukozne membrane kod kojih je topikalna primena moguća (npr., oralna, rektalna, vaginalna, sluzokoža nosa) ili oralna u slučajevima u kojima su navedene membrane, npr., intestinalne ili želudačne mukozne membrane.

[0104] Kompozicije za zaštitu mukoznih membrana mogu dakle da budu načinjene u obliku kapsule, tablete, lozenge, granule, praha, sirupa, eliksira, tvrdog želatina, mekog želatina, suspenzije, emulzije, rastvora, supozitorije, kreme, gela, spreja, masti, pomade, paste, emulzije ulje-u-vodi, emulzije voda-u-ulju, emulzije ulje-u-gelu, emulzije gel-u-ulju.

1

[0105] U slučaju formulacija za topikalnu primenu, mogu se pratiti gore navedene indikacije vezane za kompozicije za zaštitu kože, ili mogu da se naprave sirupi, tečnosti za ispiranje, sprejevi, npr., za zaštitu mukoznih membrana usta, grla, nosa.

[0106] Za primenu na rektalnu sluzokožu mogu da se koriste supozitorije ili klizme ili mikroklizme, sa ekscipijensima koji su poznati tehničaru u ovoj oblasti za pravljenje takvih kompozicija.

[0107] Kao što je već pomenuto, kompozicija prema pronalasku može da bude u obliku kapsule, tablete, lozenge, tvrdog želatina, mekog želatina, granule, praha, sirupa, eliksira, suspenzije, emulzije. Za oralnu primenu, kompozicija može da bude napravljena u obliku dnevnih jediničnih doza ili frakcija dnevnih jediničnih doza (npr. 2, 3, 4, 5, 6, ili više pojedinačnih doza kapsula, tableta, lozengi, granula ili praha, ili želatina može da se uzme tokom dana, u skladu sa procenom nadležnog lekara), i može da sadrži uobičajene ekscipijense uključujući, npr., vezivna sredstva, kao guma arabika, želatin, sorbitol, guma tragakant, i/ili polivinilpirolidon; punioce, kao laktoza, šećer, kukuruzni skrob, pirinčani skrob, kalcijum fosfat, sorbitol i/ili glicin; sredstva za podmazivanje kod tabletiranja, kao magnezijum stearat, talk, polietilenglikol i/ili silicijum dioksid; sredstva za raspadanje, kao skrob krompira; i sredstva za vlaženje kao natrijum laurilsulfat. Tablete mogu da budu obložene prema postupcima koji su dobro poznati u standardnoj farmaceutskoj praksi.

[0108] Kompozicija može takođe da bude napravljena u tečnom ili polutečnom obliku, kao suspenzija, emulzija, rastvor za oralnu primenu i može izborno da sadrži prirodna sredstva za davanje arome koja joj daju prijatan ukus.

[0109] Kompozicija u obliku praha ili granula može da bude unapred odmerena u pogodne kontejnere i spremna za upotrebu, bilo za gutanje kompozicije kao takve, ili za resuspendovanje u odgovarajućoj tečnosti kao što je voda, čaj, itd. I u ovom slučaju, kompozicija može da sadrži prirodna sredstva za davanje arome koja joj daju prijatan ukus.

[0110] Očigledno, svi gore navedeni ekscipijensi mogu da se koriste u obliku farmaceutski prihvatljive čistoće.

[0111] U jednom primeru izvođenja, kompozicija kao što je ovde opisano, u bilo kom od gore navedenih primera izvođenja, može da bude u obliku farmaceutske kompozicije, tj. da sadrži sastojke farmaceutske čistoće, ili može da bude uključena u hranu posebne namene (medicinsku hranu) ili u medicinski uređaj.

1

[0112] Kompozicija prema predmetnom opisu može da bude napravljena u obliku farmaceutske kompozicije ili medicinskog uređaja prema bilo kojoj od klasa opisanih u direktivi 93/42/EEC za medicinske uređaje (koji takođe sadrže supstance a ne samo „uređaje“ u mehaničkom smislu izraza), ili u obliku medicinske hrane, dodatka ishrani, ili u bilo kom obliku u skladu sa regulatornim odredbama države u kojoj će navedena kompozicija biti proizvedena.

[0113] Medicinska hrana takođe može da sadrži kao sastojke druge komponente koje obuhvataju, npr., kombinacije vitamina, mineralne soli i druge supstance namenjene dodatku ishrani.

[0114] Ekstrakt ili kompozicija prema pronalasku je prema tome korisna zbog svojih svojstava mukoadhezije i dejstva barijere u svim onim slučajevima u kojima je potrebna ili poželjna zaštita kože ili mukoznih membrana; to mogu da budu slučajevi u kojima mora da se primeni lek koji deluje agresivno na mukozne membrane ili kožu, u cilju prevencije ili ograničavanja oštećujućeg dejstva leka, ili u onim slučajevima u kojima je potrebna ili poželjna zaštita delimično oštećene kože ili mukoznih membrana tako da se omogući njeno bolje i brže zaceljivanje, braneći je od dodatnih agresivnih uticaja, ili u onim slučajevima u kojima pojedinac ima hronični poremećaj u kome su koža ili mukozne membrane pretrpele iritacije ili promene, stoga dejstvo barijere može da spreči ili ograniči oštećenja na koži ili mukoznoj membrani.

[0115] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju pojave ili pogoršanja oštećenja kože koja ne uključuju prisustvo otvorenih rana, pri čemu takav postupak obuhvata jednu ili više primena kompozicije prema pronalasku ili medicinskog uređaja koji je sadrži, jednom ili više puta dnevno na delu koji se razmatra.

[0116] Primena kompozicije, na primer, može da se ponavlja kad god je potrebno (npr. pri svakoj promeni uloška kod prevencije osipa povezanog sa inkontinencijom) ili jednom, dva puta, tri puta, četiri ili više puta dnevno, uopšteno.

[0117] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu kompozicije prema bilo kom od gore opisanih primera izvođenja, u kojoj je ekstrakt sene osiromašen ukupnim senozidima, pri čemu navedeni ukupni senozidi imaju koncentraciju u težinskom procentu ≤0.5%, pomešan sa najmanje jednim od ekscipijensa i/ili supstance prirodnog i/ili biljnog porekla koja ima emolijentna, digestivna, prokinetička, holagogna, karminativna, prebiotička,

1

opuštajuća svojstva, svojstva ekscipijensa, svojstva konzerviranja, svojstva kvašenja, kao što je gore opisano.

[0118] Među njima, npr., može da se koristi jedan ili više od: ekstrakta korena lincure, ekstrakta lišća biljke boldo, ekstrakta ploda sikavice, ekstrakta lista artičoke, ekstrakta korena maslačka, ekstrakta ploda anisa, ekstrakta lista ruzmarina, ekstrakta lista mente, ekstrakta lista marjorana, ekstrakta ploda kumina, ekstrakta ploda korijandera, ekstrakta korena đumbira, ekstrakta ploda komorača, ekstrakta ploda kima, uglja, inulina, gela iz lista aloje.

[0119] Cilj predmetnog pronalaska je takođe postupak za upotrebu u zaštitnom (preventivnom ili kurativnom) lečenju kože ili mukoznih membrana koji obezbeđuje primenu ekstrakta ili kompozicije prema predmetnom pronalasku kod pacijenta kome je to potrebno. Takva primena može takođe da bude istovremena sa primenom drugih lekova.

[0120] Odsustvo farmakološki aktivnih principa sene u ekstraktu ili u kompoziciji čini takve proizvode posebno pogodnim za primenu istovremeno sa drugim lekovima, budući da je sporedno dejstvo interakcija između ekstrakta ili kompozicije prema pronalasku i leka, koji se primenjuje zajedno sa njom, ili istovremeno sa njom, malo verovatno.

[0121] Neograničavajući primer postupka lečenja i/ili prevencije kože ili mukoznih membrana, može da obuhvata primenu, podeljenu na pojedinačne doze ili višestruke doze, opisane za smešu ili kompoziciju prema predmetnom opisu, tokom perioda vremena između jedne i šest nedelja, npr. između tri i šest nedelja ili čak tokom perioda vremena dužeg od šest nedelja, u skladu sa procenom nadležnog lekara.

[0122] Ovakva primena može da prethodi davanju leka čak i tokom dužeg perioda, tako da se optimizuje zdravstveno stanje kože ili mukozne membrane koja treba da se leči.

[0123] Nadležni lekar će znati kako da uspostavi najpogodnije doziranje i vreme primene, takođe i na osnovu zdravstvenog stanja, težine, pola i godina pacijenta.

[0124] Jednu od suštinskih razlika između strukture kože i mukozne membrane predstavlja odsustvo, u mukoznoj membrani, selektivne barijere kao što je kornealni sloj. Kontakt oralnih mukoznih membrana sa štetnim ili iritantnim supstancama prisutnim u okruženju (zagađivači, patogeni mikroorganizmi, itd.) može stoga da dovede do značajnog prodiranja navedenih supstanci i unutar mukoznih membrana i u povezane vazdušne puteve (bronhije, pluća, itd.) izazivajući zapaljenske i/ili alergijske patologije.

2

[0125] Zaštitno dejstvo ekstrakta prema predmetnom pronalasku procenjeno je testovima za mukoadheziju i testovima za dejstvo barijere.

[0126] Prvi ima za cilj procenu mukoadhezivnosti ispitivanog proizvoda kako bi se utvrdilo da li takav proizvod ima sposobnost da adherira na mukozne membrane i posledično ispolji zaštitno delovanje.

[0127] Na primer, dostupna su dva jednostavna modela za procenu mukoadhezivnosti proizvoda od interesa. Prvi, npr., procenjuje sposobnost mukoadhezije uzorka merenjem njegove sposobnosti da se veže za mucin izložen na nagnutoj ravni, omogućavajući uklanjanje klizanjem uzorka koji nema mukoadhezivnu sposobnost. Drugi omogućava procenu mukoadhezivne sposobnosti uzorka inhibicijom veze lektin/glikoprotein koja se ispoljava na ćelijskoj membrani ćelija koje potiču iz mukozne membrane.

[0128] Za procenu dejstva barijere dostupan je in vitro model koji omogućava procenu ometanja uzorka da prođe kroz LPS, odgovornog, u modelu, za oslobađanje medijatora kao što je interleukin 6 (IL-6), što se mereni polukvantitativno pomoću testa ELISA.

Procena procenta inhibicije veze lektin/glikoprotein

[0129] U prvom modelu, mukoadhezivnost je određena procenom procenta inhibicije vezivanja lektin/glikoprotein. U ovom modelu, na primer, mogu da se koriste bukalne ili vaginalne mukozne ćelije. Ćelije su na početku tretirane biotinilizovanim lektinom (Con-A), koji ima visok afinitet za glukozidne i manozidne ostatke prisutne u glikoproteinima membrane. Mesta na glikoproteinima mukoznih membrana će stoga biti zauzeta biotinilizovanim lektinom. Prisustvo biotina (vitamin H) u lektinu neophodno je za sledeću fazu. Ćelije koje su već tretirane biotinilizovanim lektinom se opterećuju streptavidin peroksidazom, što stvara mogućnost obrazovanja kompleksa protein/glukoza/lektin/biotin/streptavidin peroksidaza. U ovom trenutku, ćelije se ispiraju i kompleks protein/glukoza/lektin/biotin/streptavidin peroksidaza se kvantitativno određuje, zahvaljujući prisustvu peroksidaze, pomoću reakcije oksidacije orto-fenilendiamina.

[0130] Kompleks protein/glukoza/lektin/biotin/streptavidin peroksidaza katalizuje reakciju polimerizacije:

[0131] Intenzitet žuto/narandžaste obojenosti rastvora (izmeren korišćenjem spektrofotometra sa λ=450 nm) proporcionalan je količini veza glikoprotein/lektin i stoga količini dostupnih mesta (glikoproteina) za mukoadheziju. Vrednost apsorbance koja je tako određena predstavlja „kontrolu“.

[0132] U testu za mukoadheziju koji je prikazan u daljem tekstu, mukozne ćelije se tretiraju tokom oko 15 minuta na 30°C ispitivanim proizvodom pre tretmana sa lektinom. U prisustvu mukoadhezivnih proizvoda, navedeni proizvodi će inhibirati vezivanje lektina, smanjujući proporcionalno svojoj sposobnosti mukoadhezije, jačinu signala u uzorku u poređenju sa kontrolom kao što je gore opisano.

[0133] Procenat mukoadhezije proizvoda (%MA) može da se odredi kao

%MA = (1 – aps uzorka / aps kontrole) x 100

Procena procenta adhezije pomoću nagnute ravni sa mucinom.

[0134] Merenja se izvode pomoću opreme koja obuhvata ravan nagnutu pod 45°, termostatiranu na 37°C; ispod navedene ravni postavljena je mikro-vaga, koja sprovodi merenje u pravilnim 1-s intervalima i štampa zabeležena merenja na papiru. Izvedena merenja se zatim prepisuju i ponovo obrađuju u tabeli programa Excel.

[0135] Nagnuta ravan deluje kao podloga za biološki supstrat, koji se sastoji od filma mucina postavljenog nanošenjem, na ravan od pleksiglasa koja se drži u horizontalnom položaju, zapremine jednake 3 ml suspenzije gastričnog mucina svinje u koncentraciji od 8% (tež./tež.) u fosfatnom puferu, pH 6.4.

[0136] Disperzija se zatim suši na temperaturi od 44°C tako da se dobije film poznate površine jednake 33.6 cm<2>.

[0137] Precizno izmerena količina ekstrakta prema pronalasku se rastvara u rastvaraču. Ekstrakt se zatim nanosi na mernu ravan multikanalnom pipetom pri konstantnom vremenu i brzini tokom 6 sekundi.

[0138] Multikanalna pipeta se kalibriše tako da izmeri rastvor (ili disperziju) nanet preko radne ravni. Ukupna količina se meri u svakom testu (težina navedene zapremine se meri pre testa i zavisi od gustine ispitivanog uzorka).

[0139] Uzorak, koji će pasti na mikro-vagu na kraju ciklusa, nanosi se na gornji deo nagnute ravni, koja sadrži film mucina, i pušta da klizi niz nju. Količina uzorka koji je pao meri se beleženjem promene težine u funkciji vremena. Ovakav test traje 40 sekundi, mada obično posle 20 sekundi nema promena težine.

[0140] Merenja u odsustvu mucinskog filma na nagnutoj ravni se takođe izvode (merenja označena kao slepa proba) sa istim količinama uzorka i pod istim uslovima testa.

[0141] Prema tome, moguće je proceniti intrinzička svojstva klizanja uzorka, bez obzira na njegovu sposobnost da interaguje sa biološkim supstratom.

[0142] Izračunava se adherirani %: definisan kao količina uzorka koji je ostao da prijanja za mucinski film ili za nagnutu ravan (bez mucina, slepa proba) na kraju merenja, normalizovana u odnosu na količinu koja je naneta na nagnutu ravan.

[0143] Osim toga, određuje se procentualna razlika između količine uzorka koji prijanja na ravan sa mucinom i količine uzorka koji prijanja na ravan bez mucina. Obračun se izvodi u skladu sa sledećom jednačinom:

% razlike = (% adheriranog mucina - % adherirane slepe probe) / adherirani % slepe probe

u kojoj

• % adheriranog mucina = procenat uzorka koji je ostao adheriran na mucinski film na kraju merenja

• % adherirane slepe probe = procenat uzorka na nagnutoj ravni na kraju merenja slepe probe.

Test dejstva barijere

[0144] Test dejstva barijere je in vitro test biološkog tipa koji se koristi za procenu sposobnosti gotovih proizvoda i/ili sirovih materijala da štite, putem obrazovanja tankog „izolacionog“ sloja, mukozne membrane i kožu od kontakta sa zagađivačima životne sredine (prašina, poleni, mikroorganizmi, itd.).

2

[0145] Test je razvijen tako da in vitro simulira dejstvo koje ispoljavaju proizvodi koji se primenjuju na kožu i/ili mukozne membrane u cilju stvaranja zaštitnog filma protiv agresivnih dejstava iz spoljašnje sredine.

[0146] Model koristi princip da ćelije koje su podvrgnute kontaktu sa inflamatornim sredstvom proizvode i izlučuju pro-inflamatorne medijatore (citokine) u vanćelijsko okruženje u količini povezanoj sa stepenom izazvanog zapaljenja; u određenom opsegu, postoji direktna srazmera između koncentracije i vremena izlaganja inflamatornom sredstvu i količina oslobođenih citokina.

[0147] Prihvaćeni eksperimentalni model obezbeđuje dve komore koje su fizički odvojene polupropustljivom membranom (pore od 0.4 µm). Ćelije se zasejavaju u donju komoru, dok gornja komora sadrži inflamatorno sredstvo; na polupropustljivu membranu koja razdvaja komore nanosi se tanak film ispitivanog uzorka da istakne, ako je prisutno, dejstvo barijere na slobodan prolazak inflamatornog sredstva.

[0148] Polupropustljiva membrana omogućava prolazak inflamatornog sredstva u donju komoru i predstavlja podlogu na koju se ispitivani uzorak nanosi. U zavisnosti od „izolacione“ sposobnosti uzorka, doći će do smanjenja migracije LPS iz gornje komore u donju (time i do manje stimulacije ćelija za proizvodnju citokina).

PRIMERI

Primer 1

Priprema ekstrakta

[0149] Lišće i/ili mahune (meškovi) sene su usitnjeni i podvrgnuti četiri koraka ekstrakcije u etanolu pri opadajućim koncentracijama; izvođenjem koraka u 85% etanolu, koraka u 50% etanolu, koraka u 20% etanolu, koraka u 5% etanolu.

[0150] Alkoholni ekstrakti, dobijeni kao što je opisano, spojeni su u odnosu 25:25:25:25 i podvrgnuti centrifugiranju tokom 1-5 minuta pri rotacionoj brzini jednakoj 3500 obr/min; supernatant je izdvojen, i koncentrovan isparavanjem etanola upotrebom sistema za destilaciju sa tankim filmom prema standardnom protokolu, uz obezbeđivanje napajanja ekstraktom koji se koncentruje pri brzini od oko 500 l/h; u radu je rezidualni vakuum podešen na 0.6-0.8 bara, a temperatura fluida koji zagreva zidove za isparavanje bila je 140°C, čime je dobijen, nakon uklanjanja etanola, koncentrovani vodeni ekstrakt.

[0151] Talog, ili smolasti ekstrakt, je sakupljen i pokazano je da ne sadrži senozide.

[0152] Tako dobijeni vodeni ekstrakt je filtriran na panelnom filteru sa graničnom vrednošću od 25 mikrometara.

[0153] Tako dobijen filtrat, koji sadrži ukupne senozide u koncentraciji po težini ne većoj od 5% podvrgnut je koraku ultrafiltracije na membrani sa graničnom vrednošću od 10 000 daltona i/ili 5000 daltona i/ili 2500 daltona prema standardnim metodologijama.

[0154] Tako dobijeni krajnji permeat sadržao je ukupne senozide u koncentraciji po težini ne većoj od 0.5%.

[0155] Koncentrovani vodeni ekstrakt, nakon taloženja i izdvajanja supernatanta ili nakon filtracije i izdvajanja permeata, podvrgnut je, alternativno ili dodatno gore opisanom postupku ultrafiltracije, obradi sa visoko poroznom adsorpcionom smolom; konkretno je korišćena smola od stiren-DVB kopolimera tipa ADS TQ 318. Očigledno, bilo koja adsorbujuća smola sa sličnim svojstvima bi mogla da se koristi u realizaciji predmetnog pronalaska.

[0156] U ovom slučaju standardni postupak dobijanja ekstrakta obradom na smoli zahteva uvođenje koncentrovanog vodenog ekstrakta u hromatografsku kolonu koja sadrži adsorpcionu smolu. Fluid za napajanje mora da ima suspendovane čvrste supstance indikativno sadržane između 0.2 i 10° Bix, Brzina napajanja se nalazi između 1 i 4 BV/čas, i poželjno 2BV/čas. Odgovarajući vodeni eluat se sakuplja i podvrgava sušenju liofilizacijom, ili desikaciji. Supstance adsorbovane na smoli se eluiraju upotrebom 96% etil alkohola, ili metanola ili acetona, ili vodenih smeša ovde navedenih rastvarača, poželjno 96% etil alkohola. U ovom drugom slučaju, alkoholni eluat podvrgava se desikaciji ili liofilizaciji (nakon dodavanja, u ovom drugom slučaju, vode u odnosu 1:1 zapr./zapr. sa alkoholnim eluatom i isparavanja etanola), upotrebljiv u druge svrhe.

[0157] Preostali senozidi se zadržavaju na smoli i eluat se sakuplja. Ovim postupkom, dobija se ekstrakt koji sadrži ukupne senozide u koncentraciji ne većoj od 0.5% (titar se odnosi na proizvod koji je osušen, npr. liofilizacijom) i, kada se oba koraka d. (ultrafiltracija i adsorpcija na smoli) izvode, koncentracija senozida se dalje snižava.

[0158] Sledeći primeri prikazuju podatke za ekstrakt osiromašen smolama i senozidima i za smolasti ekstrakt osiromašen senozidima prema pronalasku.

2

Primer 2

Procena mukoadhezivne sposobnosti ekstrakta prema pronalasku određivanjem procenta inhibicije veze lektin/glikoprotein

[0159] Usna duplja 8-10 davalaca muškog i ženskog pola (uzrast: 20-35 godina), koji nisu prethodno uzimali hranu bar 60 minuta, nežno je zagrebana drvenom špatulom i ćelije su uronjene u 0.05 M TBS (fiziološki rastvor puferisan TRIS-om) pH 7,6. Nakon brojanja sa 0.5% Tripan plavo, ćelije su razblažene sa 0.9% NaCl do dobijanja finalne koncentracije od 480 000 ćelija za svaki uzorak koji će se koristiti u ispitivanju. Ćelije su čuvane na temperaturi od 4°C. Ćelijske suspenzije su zatim centrifugirane na 2000 obr/min tokom 5 minuta i inkubirane sa 5 ml rastvora koji sadrži 0.5% ekstrakta prema pronalasku. Za kontrolu, ćelijske suspenzije su umesto toga inkubirane sa 5 ml 0.9% NaCl. Inkubacija je izvedena tokom 15 minuta na temperaturi od 30°C, uz pažljivo mešanje. Nakon 3 pranja sa TBS, bukalne ćelije su inkubirane sa 5 ml 10 mg L-1 Kon-A na 30°C tokom 30 minuta, oprane 3 puta sa TBS i zatim inkubirane na 30°C tokom 60 minuta sa 5 ml 5 mg L-1 streptavidin peroksidaze. Posle 3 pranja sa TBS, 240000 ćelija po uzorku je dodato u 2.5 ml o-fenilendiamina (o-pd) u 0.05M fosfat citratu i H2O2i reakcija je zaustavljena posle 5 minuta sa 1 M H2SO4.

[0160] Zatim, vrednosti apsorbance za pojedinačna određivanja su očitane pomoću spektrofotometra (eksperiment je izveden u triplikatu). Budući da kompozicija ima obojenost koja može da interferira sa preciznim određivanjem vrednosti apsorbance zabeležene na kraju protokola, za očitavanje uzoraka, kao slepa proba korišćeni su (0.9%) rastvor NaCl (za kontrolu) ili rastvor proizvoda pogodno razblažen 0.9% rastvorom NaCl. Pojedinačni uzorci su ispitivani 3 puta i prikazani rezultati predstavljaju prosečnu vrednost ±SEM za sve urađene testove.

2

[0161] Dobijeni rezultati pokazuju da ispitivani ekstrakt ima visoku mukoadhezivnu sposobnost u odnosu na mukozne membrane usne duplje. U svetlu dobijenih rezultata, moguće je tvrditi da kompozicija, koja je pokazala da poseduje visoku, rezistentnu mukoadhezivnost, može da ima značajnu zaštitnu ulogu prema mukoznim ćelijama.

Primer 3

Procena mukoadhezivne sposobnosti ekstrakta prema pronalasku na nagnutoj ravni

[0162] Merenja su izvedena pomoću opreme koja se sastojala od ravni nagnute pod 45°, termostatirane na 37°C; ispod navedene ravni postavljena je mikro-vaga, koja je sprovodila merenje u pravilnim 1-s intervalima i štampala zabeležena merenja na papiru. Izvedena merenja su prepisana i ponovo obrađena u tabeli programa Excel.

[0163] Nagnuta ravan deluje kao podloga za biološki supstrat, koji se sastoji od filma mucina. Mucinski film je postavljen nanošenjem, na ravan od pleksiglasa koja se drži u horizontalnom položaju, zapremine jednake 3 ml suspenzije gastričnog mucina svinje u koncentraciji od 8% (tež./tež.) u fosfatnom puferu, pH 6.4.

[0164] Disperzija je osušena na temperaturi od 44°C tako da se dobije film poznate površine jednake 33.6 cm2. Količina, koncentracija i ravan za nanošenje su definisane tokom razvoja postupka.

[0165] Precizno odmerena količina ekstrakta prema pronalasku je rastvorena u rastvaraču (etanol 50°, zatim razblažena 1:2 u medijumu tipa MEM Eagle sa Earle-ovim BSS; koncentracija uzorka: 10 mg/ml ili 1%). Ekstrakt je nanet na mernu ravan multikanalnom pipetom pri konstantnom vremenu i brzini tokom 6 sekundi.

[0166] Multikanalna pipeta je podešena tako da meri 250 mikrolitara rastvora (ili disperzije) preko radne ravni. Ukupna količina izmerena u svakom testu je od oko 1 ml po uzorku (težina navedene zapremine se meri pre testa i zavisi od gustine uzorka koji se ispituje).

[0167] Uzorak, koji bi pao na mikro-vagu, nanet je na gornji deo nagnute ravni, koja sadrži mucinski film, i pušten da klizi niz nju.

[0168] Količina uzorka koji je pao merena je beleženjem variranja težine u funkciji vremena.

[0169] Test je trajao 40 sekundi, međutim, naglašeno je da posle 20 sekundi nije bilo variranja težine.

2

[0170] Merenja u odsustvu mucinskog filma su takođe izvedena (merenja označena kao slepa proba) sa istim količinama uzorka i pod istim uslovima ispitivanja, ali bez mucinskog sloja nanesenog na ravan.

[0171] Na taj način, moguće je oceniti intrinzička svojstva klizanja uzorka, bez obzira na njegovu sposobnost da interaguje sa biološkim supstratom.

[0172] Izračunava se adherirani %: definisan kao količina uzorka koji je ostao adheriran na mucinski film ili na nagnutu ravan (bez mucina, slepa proba) na kraju merenja, normalizovana u odnosu na količinu koja je naneta na nagnutu ravan.

[0173] Osim toga, određuje se procentualna razlika između količine uzorka koji je adheriran na ravan sa mucinom i količine uzorka koji je adheriran na ravan bez mucina. Obračun se izvodi u skladu sa sledećom jednačinom:

% razlike = (% adheriranog mucina - % adherirane slepe probe) / adherirani % slepe probe

u kojoj

• % adheriranog mucina = procenat uzorka koji je ostao adheriran na mucinski film na kraju merenja

• % adherirane slepe probe = procenat uzorka na nagnutoj ravni na kraju merenja slepe probe.

Ispitivani uzorci:

[0174] Merenja su izvedena za sledeće uzorke:

• 50% etanol u vodi: korišćen kao negativna kontrola, tj. kao rastvor bez mukoadhezije • 0.7% natrijum alginat u vodi korišćen kao pozitivna kontrola, tj. kao supstanca sa poznatim mukoadhezivnim svojstvima

• Uzorak sene: liofilizovane frakcije sene, 1% rastvor u 50% etanolu.

Rezultati

[0175] Na graficima prikazanim na slici 3 (paneli A, B, C, D) predstavljeni su, redom, profili klizanja dobijeni sa negativnom kontrolom (50% etanol u vodi), pozitivnom kontrolom (0.7% natrijum alginat), ispitivanim uzorkom (rastvorljiva frakcija sene u 50% etanolu, 1% rastvor) i ispitivanim uzorkom (nerastvorljiva frakcija sene u 50% etanolu, 1% rastvor).

2

[0176] Sa slika je očigledno da je količina mukoadhezivnih supstanci koje su skliznule u prisustvu mucina u svakom trenutku definitivno manja od količine koja je pala kod merenja slepe probe, što ukazuje na to da je došlo do interakcija između formulacije i biološkog supstrata. Navedena razlika postoji i na kraju merenja.

[0177] Slike takođe pokazuju da, uprkos uklanjanju smola (uklonjenih zajedno sa ukupnim senozidima), ekstrakt sene prema predmetnom pronalasku zadržava dobru mukoadhezivnu sposobnost.

[0178] U tabeli u nastavku teksta, prikazani su parametri mukoadhezije, izmereni kao što je opisano u eksperimentalnom odeljku.

[0179] Procenjen je procenat uzorka adheriranog na nagnutu ravan bez mucina i sa mucinom, i izračunata je procentualna razlika između dva uzorka, za ekstrakt dobijen postupkom prema patentnom zahtevu 5, koraci a-d, za natrijum alginat, koji predstavlja supstancu sa poznatim mukoadhezivnim sposobnostima, i za rastvarač.

Tabela 2 A

2

Tabela 2 B

[0180] I u ovom slučaju, rezultati očigledno pokazuju da ekstrakt prema pronalasku ima mukoadhezivna svojstva i svojstva klizanja slična onima koja ima poznata mukoadhezivna supstanca kao što je natrijum alginat.

Primer 4.

Test dejstva barijere

[0181] Za test dejstva barijere, korišćene su dve komore fizički odvojene polupropustljivom membranom (pore od 0.4 µm). Ćelije humanih fibroblasta su zasejane u donju komoru, dok je inflamatorno sredstvo LPS (prečišćeni lipopolisaharid E. Coli) uvedeno u gornju komoru; na polupropustljivu membranu koja razdvaja dve komore nanet je u slojevima tanak film ekstrakta sene, kao što je opisano u predmetnom pronalasku.

[0182] Indukovani inflamatorni odgovor procenjen je putem semi-kvantitativnog doziranja interleukina-6 (IL-6) oslobođenog u medijum kulture donje komore: procena dejstva barijere dobijena je poređenjem sa pozitivnom kontrolom u kojoj su dve komore bile razdvojene istim tipom polupropustljive membrane, ali bez bilo kakve barijere.

[0183] Kao graničnu vrednost iznad koje može da se kaže da supstanca izaziva dejstvo barijere u testu koji je ovde prikazan, pronalazači su, tokom uspostavljanja testa, na osnovu testova izvedenih na supstancama za koje je poznato da imaju dejstvo barijere, identifikovali vrednost jednaku 15% inhibicije u poređenju sa kontrolom.

[0184] Nakon toga, procenjeno je dejstvo barijere ekstrakta kao što je ovde opisano.

[0185] Podaci prikazani u nastavku pokazuju da ekstrakt ima značajno dejstvo barijere.

[0186] Test za procenu je izveden kao što sledi putem postupka razvijenog da simulira in vitro zaštitno delovanje supstanci i formulacija koje, kada se nanesu na kožu i mukozne membrane in vivo, obrazuju „izolacioni“ efekat prema sredstvima životne sredine.

[0187] Model koristi princip prema kome ćelije podvrgnute kontaktu sa inflamatornim sredstvom proizvode i izlučuju pro-inflamatorne medijatore (citokine) u vanćelijsko okruženje u količini koja odgovara stepenu izazvane inflamacije. Što je veća količina inflamatornog sredstva koje dospeva do ćelija, veća je količina oslobođenih citokina.

[0188] Model predviđa sistem od dve komore fizički odvojene polupropustljivom membranom koja omogućava prolazak rastvorljivih supstanci dovoljno malih dimenzija.

[0189] U donjoj komori, koja se sastoji od ploča sa bunarčićima za ćelijske kulture, gaje se ćelije HuDe (br. BS PRC 41), dok je u gornjoj komori, koja se sastoji od umetka za složene ćelijske kulture (trans-bunarčići), smešteno inflamatorno sredstvo.

[0190] Na površini polupropustljive membrane umetka koji razdvaja dve komore, pre uvođenja inflamatornog sredstva u gornju komoru, tanak film ispitivanog uzorka nanosi se u slojevima za procenu bilo kakvog BE nakon slobodnog prolaska inflamatornog sredstva.

[0191] U funkciji izolacionih sposobnosti uzorka, doći će do smanjenja migracije inflamatornog agensa iz gornje komore i, kao posledica toga, manje stimulacije ćelija za proizvodnju citokina. Obim inflamatorne reakcije se procenjuje kroz semi-kvantitativno doziranje citokina oslobođenih u medijum za kulturu donje komore, posebno interleukina 6 (IL-6).

[0192] Kao kontrola, koristi se sličan eksperiment u kome se uzorak ne nanosi na membranu, omogućavajući tako merenje dejstva inflamatornog sredstva bez ikakve barijere osim polupropustljive membrane.

1

[0193] Dalje, koristi se interna kontrola u kojoj se ćelije koje se gaje prethodno obrađuju supstancom prilagođenom da indukuje oslobađanje markera i uzorak se smešta na polupropustljivu membranu u odsustvu navedene supstance, time se vrši jedno ili više merenja količine markera u medijumu kulture navedene interne kontrole. U internoj kontroli, ćelije se prema tome prvo stimulišu indukujućom supstancom, a zatim treba da se odredi da li uzorak koji može da prođe kroz membranu i uđe u ćelije potisnut medijumom koji se nalazi iznad, ima ikakvo dejstvo na smanjenje oslobađanja markera koje nije povezano sa dejstvom barijere. Na primer, kada se inflamatorno sredstvo koristi kao indukujuća supstanca, interna kontrola omogućava da se razume da li je smanjenje koncentracije citokina u medijumu za kulturu posledica dejstva barijere, ili uzorak koji može da prođe u ćelije potisnut putem medijuma koji se nalazi iznad, ima ikakvo dejstvo na smanjenje inflamatornog odgovora nezavisno od dejstva barijere.

[0194] Dejstvo barijere (BE) se izražava kao procenat smanjenja oslobađanja IL-6 i izračunava se pomoću poređenja sa pozitivnom kontrolom u kojoj su dve komore razdvojene istim tipom polupropustljive membrane bez barijere koju stvara uzorak.

4.1 PRIPREMA ĆELIJSKE KULTURE:

[0195] Za svaki ispitivani uzorak, ćelije ćelijske linije HuDe zasejane su u bunarčiće ploče za ćelijsku kulturu, jednu za test barijere (BA) i drugu za internu kontrolu pri gustini od 40000 ćelija/ml u MEM medijumu obogaćenom sa 10% goveđeg seruma (FBS); 1 ml ćelijske suspenzije po bunarčiću.

[0196] Ćelije su obrađene UZORKOM (CAM), POZITIVNOM KONTROLOM (C+) (inflamatorno sredstvo bez uzorka), i NEGATIVNOM KONTROLOM (C) (samo medijum) i svaki test je izveden u triplikatu.

[0197] Ploče su inkubirane na 37°C, preko noći (22-24 časa).

4.2 PRIPREMA UMETAKA ZA KOMPLEKSNE ĆELIJSKE KULTURE

[0198] Umeci za kompleksne ćelijske kulture (Becton Dickinson) su smešteni na druge ploče, i na svaki od njih dodata je fiksna količina kolagena od 0.1 ml/ml. Ploče su inkubirane na 37°C, preko noći (22-24 časa).

2

2. DAN

4.3 POTVRDA STANJA I STEPENA ĆELIJSKE KONFLUENTNOSTI

[0199] Kako bi se eksperiment nastavio, potrebna je konfluentnost koja nije niža od 95%.

4.4 SUŠENJE KOLAGENSKOG SLOJA

[0200] Iz dve ploče (BA i IC) sa umecima uklanja se kolagen i umetak ostavlja pod protokom vazduha u laminarnoj komori tokom vremena potrebnog da se osuši u potpunosti (10-15 minuta).

4.5 TEST BARIJERE (BA)

[0201] Koraci opisani u nastavku izvedeni su u ploči za kulturu za BA

Postavljanje sloja uzorka u BA:

[0202] Na polupropustljivu membranu uzorka inokulisano je 100 µl kompozicije na bazi 0.5% alginata i ostavljeno da se staloži 20 minuta dok na umetke C+ i C – ništa nije dodato. Kada je prošlo 20 minuta, višak uzorka je uklonjen i membrane su oprane sa PBS prema procedurama određenim protokolom.

Dodavanje LPS (inflamatorno sredstvo) na umetke za BA

[0203] Kada se sloj uzorka osušio, u prva tri CAM umetka i u tri C+ umetka, 300 µl LPS (membranski lipopolisaharid) je inokulisano u koncentraciji od 1µg/ml dok je u preostala tri C- dodato 300 µl MEM medijuma sa 5% FBS. Umeci su postavljeni u odgovarajuće bunarčiće sa ćelijama i ploče su inkubirane 1 čas na 37°C i pod atmosferom obogaćenom sa 5% CO2preko noći.

[0204] Kada se inkubacija od 1 časa završi, umeci se uklanjaju i odbacuju i ploče se ponovo inkubiraju preko noći (22-24 časa).

4.6 TEST INTERNE KONTROLE (IC):

[0205] Test interne kontrole je izveden istovremeno sa BT

Izlaganje IC ćelija LPS:

[0206] Kada su osušeni, u prvih šest umetaka IC, tri za ispitivani uzorak i tri za C+, inokuliše se 300 µl rastvora LPS dok se u preostala tri C- dodaje 300 µl medijuma.

[0207] Umeci sa LPS i MEM se zatim postavljaju u bunarčiće sa IC ćelijama i svi inkubiraju 1 čas.

Uklanjanje LPS i sušenje IC membrane:

[0208] Kada se inkubacija od 1 časa završi, umeci se uklanjaju iz bunarčića sa ćelijama i prenose u praznu ploču dok se ploča sa ćelijama smešta u inkubator.

[0209] Preostali rastvor LPS se uklanja iz umetaka, oni se podvrgavaju brzom pranju sa ultračistom sterilnom vodom i ostavljaju da se osuše.

Raspoređivanje sloja uzorka u IC:

[0210] Na polupropustljivu membranu tri umetka za uzorak inokuliše se 100 µl kompozicije na bazi 0.5% alginata i ostavlja da se staloži 20 minuta, dok se u umetke C+ i C – ništa ne dodaje. Kada prođe 20 minuta, višak uzorka se uklanja i membrane se peru sa PBS prema procedurama određenim protokolom.

Dodavanje LPS umecima IC

[0211] Kada su umeci sa uzorkom spremni, 300 µl medijuma se dodaje svim umecima (CAM, C+, C-). Umeci se postavljaju u odgovarajuće bunarčiće sa ćelijama i ploče se inkubiraju 1 čas na 37°C.

[0212] Kada je inkubacija od 1 časa završena, umeci se uklanjaju i odbacuju, a ploče se ponovo inkubiraju preko noći (22-24 časa).

3. DAN

4.7 SAKUPLJANJE SUPERNATANTA I ENZIMSKI IMUNOESEJ

[0213] Kada prođe 22-24 časa, supernatanti se sakupljaju iz BA i IC ploča za izvođenje ELISA testa i semi-kvntitativno doziranje IL-6.

4

PROCENA DEJSTVA BARIJERE (BE)

[0214] BE supstance ili jedinjenja izražen je kao % smanjenja oslobađanja IL-6 citokina od strane ćelija izloženih LPS, pri čemu je uzorak ispitivan u odnosu na pozitivnu kontrolu (C+) u kojoj su ćelije bile izložene samo LPS.

BE = % smanjenja otpuštanja IL-6 citokina = 100 - [(pg/µL citokina oslobođenih iz uzorka/pg/µL citokina oslobođenih iz C+) x 100]

Tabela 1, prikazana ispod, pokazuje da ekstrakt sene dobijen prema predmetnom pronalasku stvara barijeru za prolazak LPS.

[0215] Kao što se može videti iz gore navedenih rezultata, ekstrakt osiromašen senozidima i smolama ima odlična mukoadhezivna svojstva i visoko izraženo dejstvo barijere; smolasti ekstrakt osiromašen senozidima, mada ima iznenađujuće redukovana mukoadhezivna svojstva, ima veoma visoko izraženo dejstvo barijere.

[0216] Stoga, očigledno je da su oba ekstrakta pogodna za opisane upotrebe i patentne zahteve, kao i njihove smeše što čini mogućim pojačavanje dejstva barijere uz očuvanje visoko izraženih mukoadhezivnih svojstava.

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Ekstrakt Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia osiromašen ukupnim senozidima, naznačen time što navedeni ukupni senozidi imaju koncentraciju u težinskom procentu ≤0.5%.

2. Ekstrakt prema patentnom zahtevu 1 dodatno osiromašen smolama.

3. Ekstrakt prema patentnom zahtevu 1 ili 2 za upotrebu u lečenju ili zaštiti delimično oštećene kože ili mukoznih membrana.

4. Ekstrakt za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 naznačen time što navedena mukozna membrana predstavlja oralnu sluzokožu, sluzokožu želuca, crevnu sluzokožu, sluzokožu nosa, vaginalnu sluzokožu, sluzokožu materice, rektalnu sluzokožu.

5. Postupak za pripremu ekstrakta Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia koji obuhvata sledeće korake:

a. pripremanje hidroalkoholnog ekstrakta lišća i/ili mahuna Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia pri čemu je navedeni hidroalkoholni ekstrakt pripremljen podvrgavanjem lišća i/ili mahuna Cassia acutifolia i/ili Cassia angustifolia, izborno usitnjenih, postupku dva ili više koraka ekstrakcije u etanolu opadajuće koncentracije b. dobijanje iz ekstrakta pripremljenog u a. prečišćenog alkoholnog ekstrakta i smolastog ekstrakta

c. koncentrovanje navedenog alkoholnog ekstrakta odlivanjem i/ili centrifugiranjem i/ili filtracijom, sakupljanjem supernatanta ili filtrata

d. navedeni supernatant ili filtrat dobijen u c. podvrgava se jednom ili više koraka ultrafiltracije pri čemu se sakuplja permeat i navedeni permeat sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤ 50.5% i pri čemu se navedeni jedan ili više koraka ultrafiltracije sprovodi na polupropustljivoj membrani sa graničnom vrednošću od oko 500-15000 daltona i/ili

navedeni filtrat ili supernatant dobijen u koraku c. ili navedeni permeat dobijen posle ultrafiltracije podvrgava se jednom ili više koraka propuštanja kroz visoko poroznu adsorbujuću smolu i sakuplja se eluat

pri čemu navedeni eluat dobijen na taj način sadrži ukupne senozide u koncentraciji u težinskom procentu ≤0.5.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što se smolasti ekstrakt dobijen u b. i ekstrakt osiromašen senozidima dobijen u d. mešaju.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 5 ili 6, naznačen time što se navedena opadajuća koncentracija etanola u koraku a. nalazi u opsegu od oko 96% etanola do oko 0% etanola.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5-7, naznačen time što navedena dva ili više koraka u a. obuhvataju korak u približno 85% etanolu, korak u približno 50% etanolu, i korak u približno 20% etanolu.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8 koji dodatno obuhvata korak u približno 5% etanolu.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 9, naznačen time što se navedena filtracija u c. sprovodi upotrebom filtera poroznosti od oko 25 mikrometara.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 10, naznačen time što se navedeno propuštanje kroz smolu sprovodi na visoko poroznoj adsorpcionoj smoli od kopolimera stirena i DVB.

12. Kompozicija koja sadrži ekstrakt prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2.

13. Kompozicija prema patentnom zahtevu 12 za upotrebu u lečenju ili zaštiti delimično oštećene kože ili mukoznih membrana.

14. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što navedena mukozna membrana predstavlja oralnu sluzokožu, sluzokožu želuca, crevnu sluzokožu, sluzokožu nosa, vaginalnu sluzokožu, sluzokožu materice, rektalnu sluzokožu.

15. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 14, koja dodatno sadrži supstance prirodnog i/ili biljnog porekla koje imaju emolijentna, digestivna, prokinetička, holagogna, karminativna, prebiotička, opuštajuća svojstva, svojstva ekscipijensa, svojstva konzerviranja, svojstva kvašenja.

16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 15 u obliku kapsule, tablete, lozenge, granule, praha, sirupa, eliksira, tvrdog želatina, mekog želatina, suspenzije, emulzije, rastvora, supozitorije, kreme, gela, spreja, masti, pomade, paste, emulzije ulje-uvodi, emulzije voda-u-ulju, emulzije ulje-u-gelu, emulzije gel-u-ulju.

17. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 16, naznačena time što navedena kompozicija predstavlja farmaceutsku kompoziciju, sadržana je u medicinskom uređaju, ili je sadržana u medicinskoj hrani.