RS57242B1 - [1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazini za upotrebu u tretmanu proliferativnih bolesti - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na određena supstituisana jedinjenja triazolopiridazina (TPDZ) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, koje poseduju anti-kancerogenu aktivnost i prema tome su korisne u postupcima tretmana ljudskog ili životinjskog tela. Pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju pomenutih TPDZ jedinjenja, farmaceutskih sastava koje sadrže pomenuta jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli. Obelodanjene su metode lečenja kancera kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0002] Pronalazak se takođe odnosi na TPDZ jedinjenja koja su inhibitori jednog ili vise proteina koji sadrže bromodomene, a posebno BET porodicu bromodomen-sadržećih proteina.

[0003] Proteini koji sadrže bromodomene su uključeni u različite bolesti i od značajnog su interesa kao terapeutske mete. Bromodomen je visoko konzervisani strukturni deo koji prepoznaje ostatke acetiliranog lizina i nalazi se u velikim multidomenskim proteinima koji su povezani sa hromatin-remodelovanom kontrolom transkripcije, aktivnošću metil ili acetil transransa ili helikazama. BET familiju proteina koji sadrže bromodomen čine četiri člana (BRD2, BRD3, BRD4 i BRDt), koji prikazuju zajedničku arhitektoniku domena N-terminalnih tandem bromodomena sposobnih za vezivanje za ostacima acetiliranih lizina u histonima i transkripcionim faktorima. BRD4 igra važnu ulogu u regulaciji transkripcije gena, što potvrđuje njegova povezanost sa pozitivnim faktorom elongacije transkripcije b (pTEFb) (Jang i dr. Mol. Cell, 2005, 19, 523-534), generalnim transkripcijskim kofaktorom Mediator (Chiang, F1000 Biol. Rep, 2009, 1, 98), genetski specifičnim proinflamatornim faktorom NFkB (Huang i dr., Mol. Cell Biol.2009, 29, 1375-1387) i transkripcijskim regulatorima kodiranih sa virusom ( You i dr. Cell, 2004, 117, 349-360). Uočeno je da BRD4 ima asimetrično opterećenje na ekstra velikim ojačivačima koji su povezani sa malim podskupom gena koji često predstavljaju onkogene i linearno-specifične transkripcijske programe u određenom celularnom kontekstu (Loven i dr. Cell, 2013, 153, 320- 334). Slično tome, BRD2 i BRD3 su prijavljeni kao regulatori transkripcije koji se vezuju za regione hiper-acetiliranih hromatina gena koji promovišu rast (LeRoy i dr., Mol., 2008, 30, 51-60). Takođe je prijavljeno da BRD4 ili BRD3 mogu da se spoje sa NUT (nuklearni protein u testisu) koji formiraju nove onkogene, BRD4-NUT ili BRD3-NUT, u veoma malignim oblicima epitelne neoplazije (French i dr. Cancer Research, 2003, 63, 304-307 i French i dr. Journal Clinical Oncology, 2004, 22, 4135-4139). Podaci sugerišu da BRD-NUT fuzioni proteini doprinose karcinogenezi (French i dr.2008, Oncogene, 27, 2237-2242). Takođe je utvrđeno da se BRD4 gen menja u vidu amplifikacije gena kod seroznih karcinoma jajnika i drugih karcinoma u skupu podataka u Atlasu genoma kancera (Cancer Genome Atlas, TCGA). Prijavljeno je da su svi članovi porodice BET-a imali neku funkciju koja kontroliše ili izvršava aspekte ćelijskog ciklusa i pokazalo se da ostanu u kompleksu sa hromozomima tokom deobe ćelije, što ukazuje na ulogu u održavanju epigenetske memorije. Nije iznenađujuće da su članovi porodice BET nedavno ustanovljeni kao važni za održavanje mnogih tipova tumora, na primer, akutnu mijeloidnu i mešovitu linijsku leukemiju (AML), multipli mijelom (MM), limfom, glioblastom i neuroblastom. BRD4 inhibicija snažno suprimira Myc, ER, BC12 i druge onkogene koji se često menjaju u kanceru. Veruje se da modulacija ovih ključnih gena doprinosi antitumorskom fenotipu BET inhibicije.

[0004] Dodatno, pokazano je da Bet inhibitori imaju antiinflamatorna svojstva (Nicodeme i dr. Nature, 2010, 468, 1119-1123) i da reaktiviraju latetnu HIV transkripciju u ćelijskoj liniji latentnih modela (Banerjee i dr. J Leukoc Biol, 2012, 92, 1147-1154).

[0005] Nedavno je prijavljeno nekoliko jedinjenja kao inhibitora bromodomena, na primer derivati benzodiazepina kao što su oni obelodanjeni u WO2011/054553. Triazolopiridazini za upotrebu u lečenju kancera obelodanjeni su, na primer, u WO 2010/092371 i u WO 2010/131022. Međutim, ostaje potreba za razvojem novih i snažnih inhibitora bromodomena koji se mogu koristiti za lečenje bolesti i indikacija u kojima su implicirani proteini koji sadrže bromodomen.

[0006] Pronađeno je da jedinjenja pronalaska poseduju aktivnost kao inhibitori proteina koji sadrže bromodomen, kao što je BET porodica bromodomena, na primer BRD4, BRD2, BRD3 i BRDt, i njihovih tandem domena, na primer BRD4(1) i BRD4(2).

[0007] Prema jednom od aspekata pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so

i ---- označava tačku vezivanja;

R<2>je C1-C4alkil; i

n je 2 ili 3.

[0008] U drugom aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) kao što je prethodno definisano.

[0009] U daljem aspektu pronalaska R<2>je metil.

[0010] U dodatnom aspektu pronalaska R<1>je grupa.

R<2>je C1-C4alkil; i

n je 2.

[0011] U jednom aspektu pronalaska, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje izabrano od:

4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on;

1-(4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)etil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanon;

4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)propil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on; i

1-(4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)propil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanon.

[0012] U drugom aspektu pronalaska, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje Formule (IA):

Jedinjenje Formule (IA) se od sad pa na dalje naziva kao Jedinjenje A.

[0013] U drugom aspektu, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje Formule (IB):

[0014] Prema daljim aspektima pronalaska, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje Formule (IC):

[0015] Prema daljim aspektima pronalaska, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje Formule

[0016] Dodatni aspekt obezbeđuje bilo koji od aspekata definisanih ovde (na primer aspekt prema zahtevu 1) pod uslovom da se jedan ili više specifičnih Primera (na primer jedan, dva ili tri specifična Primera) biraju iz grupe koju čine Primeri 1, 2, 3 i 4, pojedinačno je odbačena.

[0017] Neka od jedinjenja Formule (I) mogu biti kristalna i mogu imati više od jednog kristalnog oblika. Treba razumeti da pronalazak obuhvata bilo koji kristalni ili amorfni oblik, ili njihove smeše, koje u obliku poseduju svojstva korisna u BET inhibitornoj aktivnosti i, kao što su BRD2, BRD3, BRD4 i BRDt inhibitorna aktivnost. Dobro je poznato kako odrediti efikasnost kristalnog ili amorfnog oblika pomoću standardnih testova opisanih u daljem tekstu.

[0018] Opšte je poznato da se kristalni materijali mogu analizirati korišćenjem konvencionalnih tehnika, kao što su, na primer, analiza difrakcije praha rentenskim zracima (u daljem tekstu XRPD) i kalorimetrijom diferencijalnog skeniranja (u daljem tekstu DSC).

[0019] Kao primer, jedinjenje Primera 1 pokazuje kristalinitet i identifikovan je jedan kristalni oblik, Oblik A.

[0020] Shodno tome, dalji aspekat pronalaska je Oblik A jedinjenja A (Primer 1).

[0021] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 20,9 °, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0022] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 16.7°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0023] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 20.9° i 16.7°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0024] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 20.9, 16.7, 20.2, 21.2, 27.4, 18.0, 16.8, 23.6, 15.1 i 15.5°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0025] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak suštinski isti kao XRPD pokazan u Slici A, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0026] Prema daljim aspektima pronalaska, obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 20.9° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0027] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 16.7° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0028] ] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 20.9° i 16.7° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0029] Prema pronalasku obezbeđen je kristalni oblik, Oblik A jedinjenja A koje ima obrazac rendgenske difrakcije čestica sa specifičnom vrhom 2-teta = 20.9, 16.7, 20.2, 21.2, 27.4, 18.0, 16.8, 23.6, 15.1 i 15.5° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0030] Kada se kaže da se pronalazak odnosi na kristalni oblik Jedinjenja A, Oblik A, stepen kristaliniteta je pogodno veći od oko 60%, pogodnije veće od oko 80%, poželjno veće od oko 90% i poželjnije više od oko 95%. Najpoželjnije je stepen kristalnosti veći od oko 98%.

[0031] Neke od jedinjenja Formule (I) mogu da formiraju ko-kristale sa specifičnim kobivšim molekulima. Treba podrazumevati da predmetni pronalazak obuhvata sve takve kokristale koji poseduju svojstva korisna u BET inhibitornoj aktivnosti, kao što su BRD2, BRD3, BRD4 i BRDt inhibitorna aktivnost. Dobro je poznato kako odrediti efikasnost takvih ko-kristala standardnim testovima opisanim u daljem tekstu.

[0032] Shodno tome, pronalazak obezbeđuje ko-kristal jedinjenja Formule (I) i ko-bivšeg molekula.

[0033] Shodno tome, pri daljem aspektu pronalaska je obezbeđen ko-kristal Jedinjenja A i ko-bivši molekul 6-hidroksi-2-naftojske kiseline.

[0034] Za izbegavanje sumnje, termin "ko-kristal" odnosi se na multikomponentni sistem u kojem postoji molekul ili molekuli domaćina API (aktivni farmaceutski sastojak) i gost molekul ili molekuli (ili ko-bivši) u istoj kristalnoj rešetci. U ko-kristalu, molekuli API i molekul gosta (ili ko-bivšeg) postoje kao čvrste supstance na sobnoj temperaturi kada su samo u čistom obliku (kako bi se razlikovao ko-kristal iz solvata ili hidrata). U ko-kristalu API i ko-bivši molekuli komuniciraju pomoću vezivanja vodonika i eventualno drugih nekovalentnih interakcija.

[0035] U pripremi ko-kristala Jedinjenja A sa 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom, gde je Jedinjenje A API, može se postići niz API: ko-bivših molarnih odnosa/stehiometrija, na primer ukupnog API: ko-bivši molarni odnos od 1: 1, iako se ovo može malo razlikovati, zavisno od, na primer, merenja karakterizacije. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje kokristal Jedinjenja A i ko-bivšeg molekula 6-hidroksi-2-naftojske kiseline sa molskim odnosom Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline u opsegu 1: 0,8 do 1: 1.2. U jednom aspektu pronalaska obezbeđeno je ko-kristalno Jedinjenje A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1).

[0036] U daljem aspektu pronalaska ko-kristal Jedinjenja A sa 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom je kristalna forma, Oblika A.

[0037] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal.

[0038] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 19.4°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0039] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 12.5°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0040] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta = 19.4° i 12.5°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0041] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa specifičnim vrhovima na oko 2-teta = 19.4, 12.5, 12.8, 18.1, 24.2,, 23.4, 14.0, 18.6, 17.0, i 17.9°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0042] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon suštinski isti kao XRPD šablon pokazan u Slici 1, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0043] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 19.4° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0044] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 12.5° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0045] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta = 19.4° i 12.5° pri čemu pomenute vrednosti mogu biti plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0046] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika A, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta = 19.4, 12.5, 12.8, 18.1, 24.2, 23.4, 14.0, 18.6, 17.0 i 17.9° pri čemu pomenute vrednosti mogu biti plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0047] U daljem aspektu pronalaska ko-kristal Jedinjenja A sa 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom je u kristalnoj formi, Oblik B. Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblik B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojska kiselina (1:1) ko-kristal.

[0048] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 15.2° mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0049] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 6.1°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

1

[0050] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta =15.2 i 6.1° mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0051] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta =15.2, 6.1, 16.8, 12.2, 26.1, 28.4, 18.3,3.1 i 20.7°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0052] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon suštinski isti kao šablon difrakcije praha rentgenskim zracima pokazanim u Slici K, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0053] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na 2-teta = 15.2° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0054] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa najmanje jednim specifičnim vrhom na 2-teta = 6.1° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0055] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristala koji ima XRPD šablon sa najmanje dva specifična vrha na 2-teta = 15.2° i 6.1° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0056] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika B, Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristal koji ima XRPD šablon sa specifičnim vrhovima na 2-teta = 15.2,6.1, 16.8, 12.2,26.1,28.4, 18.3,3.1 i 20.7° pri čemu pomenute vrednosti mogu biti plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0057] U daljem aspektu pronalaska je ko-kristal Jedinjenja A sa 6-hirdoksi-2-naftojskom kiselinom kristalna forma, Oblika C.

[0058] Prema pronalasku obezbeđena je kristalna forma, Oblika C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-nafrojske kiseline (1:1) ko-kristal.

[0059] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 8.2 ° mereno upotrebom CuKα zračenja.

[0060] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik B, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 24.8°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0061] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta = 8.2 i 24.8° mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0062] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik B, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa specifičnim vrhovima na oko 2-teta =8.2, 24.8, 18.9, 29.0, 14.8, 15.5 i 16.3°, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0063] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak substitucijalno isti kao difrakcija praha rentgenskim zracima prikazanim u Slici M.

[0064] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 8.2° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0065] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje jednim specifičnim vrhom na oko 2-teta = 24.8° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0066] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta = 8.2 i 24.8° plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0067] Prema pronalasku obezbeđen je kristalna forma, Oblik C, Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala koji ima XRPD uzorak sa najmanje dva specifična vrha na oko 2-teta = 8.2, 24.8, 18.9, 29.0, 14.8, 15.5 i 16.3° pri čemu pomenute vrednosti mogu biti plus ili minus 0.2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.

[0068] Kada se navodi da se pronalazak odnosi na kristalni oblik jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala stepen kristaliteta je pogodno veći od oko 60%, pogodnije više od oko 80 %, poželjno veće od oko 90% i poželjnije veće od oko 95%. Najpoželjniji je stepen kristaliteta veći od oko 98%.

[0069] Biće shvaćeno da se 2-teta vrednosti uzorka difrakcije praha rentgenskim znacima mogu blago varirati od jedne mašine do druge ili od jednog uzorka do drugog, pa se navedene vrednosti ne mogu tumačiti kao apsolutne.

[0070] Poznato je da se može dobiti obrazac difrakcije praha rentgenskim zracima koji ima jednu ili više grešaka u merenju u zavisnosti od uslova merenja (kao što je upotrebljena oprema ili mašina). Konkretno, opšte je poznato da intenziteti u obrazu difrakcije praha rentgenskim zracima mogu varirati u zavisnosti od uslova merenja. Stoga bi trebalo da se shvati da Jedinjenje A, Oblika A iz ovog pronalaska nije ograničeno na kristale koji pružaju obrasce difrakcije praha rentgenskim zracima koji su identični sa šemom difrakcije praha rentgenskim zracima prikazanoj na Slici A, i bilo koji kristali koji pružaju obrasce difrakcije praha rentgenskim zracima suštinski isti kao oni prikazani na Slici A spadaju u opseg pronalaska. Slično tome, Biće shvaćeno da ko-kristalni Oblik A Jedinjenja A : 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) prema pronalasku nije ograničen na kristale koji obezbeđuju obrasce difrakcije praha rentgenskim zracima identične sa obrascem difrakcije praha rendgenskim zracima prikazanim na Slikama C ili I, i bilo koji kristali koji daju obrasce difrakcije praha rentgenskim zracima suštinski su isti kao oni prikazani na Slikama C ili I, i spadaju u opseg pronalaska. Slično tome, Biće shvaćeno da ko-kristalni Oblici B i C Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ovog pronalaska nisu ograničeni na kristale koji pružaju obrasce difrakcije praha rentgenskim zracima identične obrascu difrakcije praha rentgenskim zracima prikazan na Slikama K i M respektivno, a bilo koji kristali koji daju obrasce difrakcije praha rentgenskim zracima suštinski su isti kao oni prikazani na Slikama K i M spadaju u opseg

1

pronalaska. Lice kvalifikovano u tehnologiji difrakcije praha rentgenskim zracima može da proceni suštinski identitet obrasca difrakcije praha rentgenskim zracima.

[0071] Stručnjak iz oblasti difrakcije praha rentgenskim zracima će shvatiti da na relativan intenzitet vrhova mogu uticati, na primer, zrna iznad 30 mikrona u veličini i nejednakih odnosa, što može uticati na analizu uzoraka. Iskusna osoba će takođe shvatiti da na položaj refleksija može uticati tačna visina na kojoj uzorak sedi u difraktometru i nulta kalibracija difraktometra. Planarnost površine uzorka takođe može imati mali efekat. Stoga prikazani podaci difrakcije nisu uzeti kao apsolutne vrednosti. (Jenkins, R & Snyder, R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons 1996; Bunn, C.W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-Ray Diffraction Procedures).

[0072] Generalno, greška merenja difrakcionog ugla kod difraktograma praha rentgenskim zracima je približno plus ili minus 0,2 ° 2-teta, a takav stepen greške pri merenju treba uzeti u obzir kada se uzme u obzir obrazac difrakcije praha rentgenskim zracima u Slikama A, C, I, K i M i prilikom čitanja Tabela A do E (vidi Primer 1). Štaviše, treba shvatiti da intenzitet može da varira u zavisnosti od uslova eksperimenta i pripreme uzorka (poželjna orijentacija).

[0073] Jedinjenja Formule (I) uključuju jedan ili više hiralnih centara. U meri u kojoj struktura ili hemijsko ime u ovoj specifikaciji ne ukazuju na hiralnost, struktura ili ime treba da obuhvati bilo koji pojedinačni stereoizomer (tj. svaki pojedinačni hiralni izomer) koji odgovara toj strukturi ili imenu, kao i svaku mešavinu stereoizomera (npr. racemat). U struci je opšte poznato kako se takvi optički aktivni oblici mogu pripremiti. Na primer, jedan stereoizomer može se dobiti izolovanjem od smeša izomera (npr. racemata) koristeći, na primer, hiralno hromatografsko odvajanje. U drugim izvođenjima, jedan stereoizomer se dobija direktnom sintezom iz, na primer, hiralnog početnog materijala.

[0074] Određeni enantiomer ili diastereoizomer jedinjenja opisani u tekstu može biti aktivniji nego drugi enantiomeri ili diastereoizomeri istog jedinjenja.

[0075] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, koja je jedinstveni enantiomer u višku enantiomera (% ee) od 95%, ≥ 98% ili ≥ 99%. Poželjno jedinstveni enantiomer je prisutan u višku enantiomera od ≥ 99%.

[0076] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, koja je jedinstveni enantiomer u višku enantiomera (% ee) u opsegu 95 do 100%.

[0077] U skladu sa daljim aspektom pronalaska, obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje Formule (I) koje je jedinstveni enantiomer u višku enantiomera (% ee) od 95%, ≥ 98% ili ≥ 99 % ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Poželjno, jedinstveni enantiomer je prisutan u višku enantiomera od ≥ 99%.

[0078] U skladu sa daljim aspektom pronalaska, obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje Formule (I) koje je jedinstveni enantiomer u višku enantiomera (% ee) u okviru 95 do 100%, ili njegova farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem.

[0079] Cilj pronalaska je da obuhvati sve izotope atoma koji se javljaju u sadašnjim jedinjenjima. Shvata se da izotopi obuhvataju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različiti maseni broj. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum i izotope ugljenika uključuju<13>C i<14>C.

[0080] Termin "farmaceutski prihvatljiv" se koristi da specifikuje da je predmet (na primer, so, oblik doze, rastvarač ili nosač) pogodan za upotrebu kod pacijenata. Lista primera farmaceutski prihvatljivih soli može se naći u Priručniku farmaceutskih soli:

Properties, Selection and Use, P. H. Stahl and C. G. Wermuth, editors, Weinheim/Zürich:Wiley-VCH/VHCA, 2002. Pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I) je, na primer, so adicione kiseline. So adicione kiseline jedinjenja Formule (I) se može formirati dovođenjem jedinjenja u kontakt sa odgovarajućom neorganskom ili organskom kiselinom pod uslovima poznatim stručnoj osobi. Na primer, so adicione kiseline može biti formirana pomoću neorganske kiseline odabrane iz grupe koju čine hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina i fosforna kiselina. So adicione kiseline takođe može biti formirana korišćenjem organske kiseline izabrane iz grupe koju čine

1

trifluorosirćetna kiselina, limunska kiselina, maleinska kiselina, oksalna kiselina, sirćetna kiselina, mravlja kiselina, benzojska kiselina, fumarna kiselina, sukcinska kiselina, vinska kiselina, mlečna kiselina , piruvična kiselina, metansulfonska kiselina, benzensulfonska kiselina i para-toluensulfonska kiselina.

[0081] Biće shvaćeno da jedinjenja Formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu postojati u solvatnim i nesolvatnim oblicima. Na primer, solvantni oblik može biti hidrirani oblik. Treba razumeti da predmetni pronalazak obuhvata sve takve solvatne i nesolvate oblike.

[0082] Jedinjenja Formule (I) mogu se primeniti u obliku proleka, koji je jedinjenje koje je razloženo u ljudskom ili životinjskom telu kako bi se oslobodilo jedinjenje prema pronalasku. Takvi, farmaceutski prihvatljivi, prolekovi jedinjenja Formule (I) takođe formiraju aspekt ovog prikazivanja. Različiti oblici prolekova su poznati u tehnici. Na primer, pogledati:

1. a) Design of Pro-drugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985);

2. b) A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Pro-drugs", by H. Bundgaard p.

113-191 (1991);

3. c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992);

4. d) H. Bundgaard, i dr., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); and 5. e) N. Kakeya, i dr., Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984).

[0083] Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za dobijanje jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Pogodan postupak ilustrovan je sledećim reprezentativnim postupkom u kojem, ukoliko nije drugačije naznačeno, R<1>R<2>i n imaju značenja koja su prethodno definisana. Potrebni početni materijali se mogu dobiti standardnim postupcima organske hemije. Priprema takvih polaznih materijala opisana je zajedno sa sledećim reprezentativnim varijantama procesa i u pratećim primerima.

Alternativno, neophodni polazni materijali se mogu dobiti analognim procedurama onima koji su ilustrovani i koji su u okviru uobičajene veštine organskog hemičara.

[0084] Jedinjenja Formule (I) pogodno se izvode reakcijom kuplovanja, na primer, reakcijom jedinjenja Formule (II) sa jedinjenjem Formule (IIIa) ili Formule (IIIb) u prisustvu trialkil fosfina, kao što je trialkil tributilfosfin i diazenskog reagensa kao što je (E)-diazen-

1

1,2-diilbis (piperidin-1-ilmetanon, u pogodnom rastvaraču, kao što je dihlorometan, i prikladnu temperaturu, kao što je 5 °C.

[0085] Jedinjenja Formule (II) se mogu izvesti, na primer, reakcijom jedinjenja Formule (IV) sa 4- (piperidin-4-il) fenolom u prisustvu baze, kao što su N, N-diizopropiletilamin, u pogodnom rastvaraču, kao što je etanol, i odgovarajuću temperaturu, kao što je 55 °C.

[0086] Jedinjenja Formule (IV) se mogu izvesti, na primer, reakcijom 3-hloro-6-hidrazinilpiridazina sa tetrametoksialkanom, kao što je tetrametoksimetan, na pogodnoj temperaturi kao što je 90 °C.

[0087] Jedinjenja Formule (IIIa) mogu se izvesti reakcijom 1,3-dimetilpiperazin-2-jedan hidrohlorida sa 2-bromoetanolom sa bazom, kao što je kalijum karbonat, u rastvaraču, kao što je 2-metil-tetrahidrofuran, na odgovarajućoj temperaturi, kao što je 100 °C.

1

[0088] Jedinjenja Formule (IIIb) mogu se izvesti reakcijom 1- (3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanona (jedinjenje V) sa 2-bromopropan-1-olom sa bazom, kao što je kalijum karbonat, u rastvaraču, kao što je 2-metil-tetrahidrofuran, na prikladnoj temperaturi, kao što je 80 °C.

[0089] 1- (3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon može se izvesti reakcijom N-acetil-N- (2-(trifluorometil) fenil) acetamida sa 2,6-dimetilpiperazinom u rastvaraču, kao što je etanol, u odgovarajuća temperatura, kao što je temperatura okoline.

[0090] N-acetil-N- (2-(trifluorometil) fenil) acetamid se može napraviti reakcijom acetil hlorida sa 2- (trifluorometil) anilinom i piridinom u pogodnom rastvaraču kao što je toluen na pogodnoj temperaturi, kao što je 50 °C.

[0091] 4- (piperidin-4-il) fenol se može napraviti, na primer, prema sledećoj reakcionoj šemi (Šema 1)

Šema 1

[0092] U šemi (1) mogu se koristiti sledeći uslovi reakcije: -

1

korak (a): baza, kao što je litijum bis (trimetilsilil) amid i sredstvo za sulfonilovanje, kao što je 1,1,1-trifluoro-N-fenil-N- (trifluorometilsulfonil) metansulfonamid, u prisustvu rastvarača kao THF, na pogodnoj temperaturi, kao što je između -78 do 0 °C;

korak (b): 4-hidroksifenilboronska kiselina u prisustvu paladijum II katalizatora, kao što je 1,1'-bis (difenilfosfino) ferocendikloropaladijum (II), abaza, kao što je natrijum karbonat i rastvarač, kao što je dioksan-voda, na pogodnoj temperaturi, kao što je 80 °C; i

korak (c): vodonik u prisustvu katalizatora za hidrogenaciju, kao što je 5% paladijum na ugljeniku, u rastvaraču, kao što je metanol.

[0093] Jedinjenja Formule (I) takođe mogu biti izvedena, na primer, reakcijom jedinjenja Formule (VIa) ili jedinjenja Formule (VIb) sa jedinjenjem Formule (IV), kako je gore opisano, u prisustvu baze, kao što je trietilamin, u pogodnom rastvaraču, kao što je dimetil formamid, i na pogodnoj temperaturi, kao što je 56 °C.

[0094] Jedinjenja Formule (VIa) se mogu dobiti reakcijom jedinjenja Formule (VIIa) sa kiselinom, kao što je vodonik-hlorid, u prisustvu pogodnog rastvarača, kao što je dioksan, i odgovarajuća temperaturu kao što je 20 °C.

1

[0095] Jedinjenja Formule (VIIa) mogu se izvesti reakcijom jedinjenja Formule (VIIIa) sa 1,3-dimetilpiperazin-2-on u prisustvu baze, kao što je N, N-diizopropiletilamin, u prisustvu katalizatora, kao kao kalijum jodid i rastvarač, kao što je dimetilacetamid, i odgovarajuću temperaturu, kao što je 120°C.

[0096] Jedinjenja formule (VIIa) se mogu dobiti reakcijom terc-butil 4- (4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilata sa 1-bromo-3-hloroalkanom i bazom, kao što je kalijum karbonat i rastvarač, kao što je dihlorometan , i na prikladnoj temperaturi, kao što je 80°C.

[0097] Terc-butil 4- (4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilat se može dobiti reagovanjem 4-(piperidin-4-il) fenola (napravljenog kao što je prethodno opisano) sa di-terc-butil dikarbonatom u pogodnom rastvaraču, kao dihlorometan i na odgovarajućoj temperaturi, kao što je 0°C.

[0098] Jedinjenja Formule (VIb) mogu se izvesti reakcijom jedinjenja Formule (VIIb) u prisustvu odgovarajućeg rastvarača, kao što je metanol, i pogodnog katalizatora, kao što je 10% paladijum na ugljeniku, pod atmosferom vodonika.

2

[0099] Jedinjenja Formule (VIIb) mogu se izvesti reakcijom jedinjenja Formule (VIIIb) sa 1-(3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanonom, napravljenim kao što je gore opisano, u prisustvu pogodne baze, kao što su N, N-diizopropiletilamin, u prisustvu katalizatora, kao što je kalijum jodid, i rastvarač, kao što je dimetilacetamid, i na pogodnoj temperaturi, kao što je 120°C.

[0100] Jedinjenja Formule (VIIIb) se mogu dobiti reakcijom benzil 4- (4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilata sa 1-bromo-3-hloroalkanom i bazom, kao što je kalijum karbonat i rastvarač, kao što je dihlorometan, i na odgovarajućoj temperaturi, kao što je 80°C.

[0101] Benzil 4- (4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilat se može dobiti reakcijom 4-(piperidin-4-il) fenola (napravljenog kako je ranije opisano) sa benzilhloroformatom i DIPEA u pogodnom rastvaraču, kao što je dihlorometan, i pogodnoj temperaturi.

[0102] Kao što je gore navedeno, jedan aspekt pronalaska je ko-kristal iz jedinjenja A sa 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom.

[0103] Ko-kristal se može pripremiti mešanjem jedinjenja A u pogodnom rastvaraču sa 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom u pogodnom rastvaraču. Prema tome, u skladu sa drugim aspektom pronalaska, obezbeđen je postupak za pripremu ko-kristala Jedinjenja A sa 6hidroksi-2-naftojskom kiselinom, postupak koji obuhvata korak mešanja rastvora Jedinjenja A koji je u pogodnom rastvaraču sa 6-hidroksi-2-naftojoj kiselinom koja je u pogodnom rastvaraču. Pogodni rastvarači bi uključivali rastvarače koji solubilišu obe komponente i ne formiraju solvate sa Jedinjenjem A ili 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom. Prema još jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je ko-kristal 6: hidroksi-2-naftojske kiseline Jedinjenja A koji se može dobiti koracima

1. i) mešanjem rastvora Jedinjenja A u pogodnom rastvaraču sa 6-hidroksi-2-naftojskom kiselinom u pogodnom rastvaraču; i

2. ii) sušenjem dobijene mešavine iz koraka (i) da bi se dobila čvrsta materija.

[0104] U jednom aspektu pronalaska pogodni rastvarač je metanol.

[0105] Pronađeno je da Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ima brojne pogodne osobine u poređenju sa oblikom slobodne baze Jedinjenja A. Konkretno, utvrđeno je da je značajno manje hidroskopan od Jedinjenja A slobodne baze. Takođe je utvrđeno da je ko-kristal stabilniji od slobodne baze Jedinjenja A kada je izložen opsegu temperatura i vlažnosti.

Biološke analize-[0106] Sledeći testovi korišćeni su za merenje efekata jedinjenja iz ovog pronalaska.

BROMOscan ™ test (bivši Discoverx)

[0107] Sposobnost jedinjenja da se vezuju za protein bromodomena testirali su Discoverx koristeći sopstveni test takmičenja usmerenog na ligand vezujuće mesto. Isporučena jedinjenja su anonimna.

[0108] Analiza BROMOscan zasnovana je na principu da test jedinjenja koja vezuju bromodomen protein sprečavaju vezivanje za imobilizovan ligand, čime se smanjuje količina proteina zarobljenog na čvrstoj podlozi. Nasuprot tome, test molekuli koji ne vezuju bromodomen ne utiču na količinu proteina zarobljenih na čvrstoj podlozi. Skrining "hitovi" se identifikuju merenjem količine bromodomena zarobljenih u testu protiv kontrolnih uzoraka korišćenjem kvantitativnog, preciznog i ultra osetljivog qPCR metoda koji otkriva pridruženu DNK oznaku. Na sličan način, konstante disocijacije (Kds) za interakcije test-jedinjenjabromodomena izračunavaju se merenjem količine bromodomenovog proteina zarobljenog na čvrstom nosaču kao funkcija koncentracije test jedinjenja.

Analiza alfa-ekrana

[0109] Sposobnost jedinjenja da se vezuju za protein bromodomena testiraju se u testu AlphaScreen®. Analiza se zasniva na interakciji između proteina bromodomena označenog histidinom, koji se može vezati za granate donora nikl-helata i biotinilovani acetil lizin peptid koji odgovara histon aminokiselinskoj sekvenci, koja se može vezati za prihvaćene streptavidin-konjugovane akceptorske perlice. Interakcija proteina i peptida se može detektovati emisijom svetlosti na 520-620 nm. U prisustvu jedinjenja koja se vezuju za BRD4 primećuje se niži signal pošto se protein-peptidna interakcija smanjuje.

1. Analiza je izvedena na sledeći način: - korišćena je spojnica pločica BioOne (cat no.

784075). Jedinjenja su pripremljena korišćenjem Labcyte Echo Acoustic Dispensera sa jedinjenjima u konačnom volumenu od 40 nl po bunardu normalizovano do 0,5% (v/v) DMSO u uslovima konačnog testa. Jedinjenja su testirana u formatu odgovora koncentracije od 12 tačaka.

2. 4 µl proteina BRD4 (6His-TEV-BRD4, aminokiselinski ostaci 42-169, odgovara BD1 domenu) (konačna koncentracija koncentracije = 50 nM) po luku je dodata pomoću Beckman Coulter BioRAPTR® mikrofluidne radne stanice za leteće reagense disperzore.

3. Inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi.

4. Dodato 4 µl acetil lizin peptida (H4K5,8,12,16(Ac)4-biotin:(NH2-) YSGRG(K-Ac)GG(K-Ac)GLG(K-Ac)GGA(K-Ac)RHR(K-Biotin)(-COOH)) (finalna koncentracija analize = 50 nM) po bunaru koristeći Beckman Coulter BioRAPTR® leteći reagens mikrofluidni dispenzer radnu stanicu.

5. Inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi.

6. Dodato 4 µl Nickel & Streptavidin-vrste prethodno pomešanog rastvora (vrste obezbeđene o strane Perkin Elmera) po bunaru koristeći kao ranije BioRaptr (finalna koncentracija analize = 4µg/ml). Nakon adicije drži se na mračnom mestu.

7. Inkubirano 60 minuta na sobnoj temperaturi držeći analizirani ploče u mraku.

8. Ploče su zatim pročitane korišćenjem čitača ploča Perkin Elmer Envision, laserska ekscitacija na 680nm i detektovana emisija na 520-620nm.

9. Podaci su analizirani korišćenjem Genedata softvera i IC50vrednosti izračunate.

2

Antiproliferativni test

[0110] Antiproliferativni efekat jedinjenja je procenjen testom AlamarBlue u ćelijama MM1.S ćelije koje su prvobitno izvedene od pacijenta sa multiplim mijelomom.

Ovaj test zasnovan je na Resazurinu, ne-fluorescentnoj indikatorskoj boji koja se pretvara u sjajni crveno-fluorescentni resorufin putem redukcionih reakcija metabolički aktivnih ćelija. Količina proizvedene fluorescencije proporcionalna je broju živih ćelija. MM.1S ćelije se kultivišu u medijumu RPMI-1640 (Gibco®) plus 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1mM L-glutamina. 12-24 sati pre doziranja jedinjenja, 90 µL suspenzije ćelija (18.750 ćelija) je zasađeno u mikrotitarske ploče 96 (crno, ravno dno). Na dan složenog doziranja, jedinjenja su serijski razblažena 1: 3 u 100% DMSO korišćenjem kolona 2-10 mikrotitarske ploče 96. Kolona 11 spojene serijske ploče sadrže samo DMSO. Svi bunari su zatim dalje razblažene 1:30 u medijima.10 µL jedinjenja ili samo DMSO u medijumu je dodato u kolone ćelija 2-11 u tri kopije. Pored toga, 1 ploča je dodala 10 µL medija i razvila se pomoću alamar plave boje. Ploče razvijene na dan dodavanja jedinjenja su nazvane Dan 0. Dozirane tablice su kultivisane 3 dana pod normalnim uslovima (RPMI-1640 plus 10% FBS i 1mML-glutamin). Nakon 3 dana kulture, dozirane ploče razvijaju se koristeći ili MTS ili alamar plavo. Za svaku koncentraciju jedinjenja,% neto rasta izračunava se prema

(3. dan dobivao dobro prosječan dan 0)/(Prosečan dan 3 DMSO kontrola - Prosečan dan 0). GI50, koncentracija koja izaziva 50% inhibicije rasta svakog jedinjenja izračunata je korišćenjem% neto rasta, kao što je definisao Nacionalni institut za rak (NCI).

Analiza monitoringa cMyc protein modulacije

[0111] Multipli mijelom MM1 S ćelije su kultisane RPMI-1640 medijumu koji sadrži 10% FBS i 1% L-glutamina u standardizovanim uslovima u navlaženom inkubatoru (37°C i 5% CO2). Uticaj cMyc proteinske modulacije indukovane inhibitorima bromodomena je procenjen je bojenjem i kvantifikovanjem nivoa cMyc proteina nakon složenog tretmana korišćenjem protočnog citomera analize, izvedenog u pločastom formatu u 96-kanala po bunaru. Ćelije su treitrane serijski razblaženim jedinjenjima 16 časova pre fiksacije sa 2% paraformaldehidom (finalna koncentracija) 10 minuta na 37°C. Nakon što su permeabilizovane ledeno hladnim 90% metanolom na 4°C 30min, ćelije su oprane, blokirane puferom (0.5% FBS u fosfat-pufer rastvoru (PBS) pufer) 10 minuta na sobnoj temperaturi, i bojene cMyc antitelima 1 sat (Cell Signaling Technology®5605, 1:200 rastvor). Ćelije su oprane i bojene inkubacijom sa Alexa-488 konjugovanim anti-Rabbit IgG (Cell Signaling Technology®#4412, 1:1000 rastvor) na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon bojenja, ćelije su opet oprane i fiksirane 2% paraformaldehidom u PBS i spremne su za analizu BD FACSCalibur™ citometrom protoka. Geometrijska sredina fluorescencije je izračunata uz pomoć FlowJo (TreeStar Inc), maksimalni inhibitorni signal je određen kontrolom tretmana jedinjenja na visokoj dozi preko svake ploče, a minimalni inhibitorni signal je određen DMSO tretmanom. IC50 je izračunat podešavanjem doza-odgovor tačaka podataka koje su normalizovane nasuprot maksimalnih i minimalnih signala kao procenat inhibicije koristeći standardni ne linearni 4-Parameter-Logistic regresivni model.

[0112] Iako farmakološke osobine jedinjenja Formule (I) variraju u strukturnim promenama kao što je očekivano, uopšte, aktivnost koja poseduju jedinjenja Formule (I) može se pokazati u sledećim koncentracijama ili dozama u jednom ili više gore navedenih ispitivanja .

[0113] Podaci koji slede su generisani za primere (podaci prikazani ispod mogu biti rezultat pojedinačnog eksperimenta ili mogu biti prosek multiplih ponovljenih eksperimenata):

Tabela X

Broj ponavljanja u zagradama

Tabela Y

2

Broj ponavljanja u zagradama

Ksenograft modeli

[0114] Jedinjenje A takođe je istraženo u modelu ksenografta kao što je opisano u nastavku.

[0115] Ženski miš CB17 SCID star 6 do 8 nedelja je dobijen od Charles River laboratorija (Wilmington, MA) i držan pod specifičnim-bezpatogenskim uslovima u AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) – akreditovanoj ustanovi. Obogaćena hrana i autoklavirana voda su obezbeđeni ad libitum.

[0116] MV-4-11 ćelije (American Tissue Culture Consortium) su resuspendovane u 0.1 ml medijuma bez seruma i Matrigel-u (Becton Dickinson) u razmeri 1:1. Ćelije (10<7>/miš) su injektovane subkutano u desni bok miševa. Tumorima je dozvoljeno da rastu dok ne dostignu prosečnu zapreminu od 200mm<3>za efikasnost, a zatim su miševi randomizovani u grupe od 8. Jedinjenje A je rastvoreno u 0.5% HPMC/0.1% Tween80 za doziranje. Za efikasnost, bilo jedno vozilo ili Jedinjenje A je primenjeno PO jednom dnevno (qd) 21 dan na 10 mg/kg (mpk). Telesna težina i zapremina tumora su mereni dva puta nedeljno tokom 21 dana.

Rezultati su prikazani na Slici E i pokazuju efekat Jedinjenja A na volumen tumora.

[0117] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđen je farmaceutski preparat, koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kako je ovde definisano, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Prema još jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži ko-kristal Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojsku kiselinu, kako je ovde definisano, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem.

[0118] Sastave prema pronalasku mogu biti u obliku pogodnom za oralnu upotrebu (na primer kao tablete, pastile, tvrde ili meke kapsule, vodene ili uljane suspenzije, emulzije, disperzivni prah ili granule, sirupi ili eliksiri), za topikalnu upotrebu (na primer kao što su

2

kreme, masti, gelovi ili vodeni ili uljni rastvori ili suspenzije), za primenu inhalacijom (na primer kao fino odvojeni prah ili tečni aerosol) za administraciju insuflacijom (na primer kao fino podeljeni prah) ili za parenteralnu (na primer kao sterilni vodeni ili uljani rastvor za intravenozno, subkutano, intramuskularno ili intramuskularno doziranje ili kao supozitorije za rektalno doziranje). U jednom aspektu pronalaska, farmaceutska sastava prema pronalasku je sastava pogodna za oralnu upotrebu.

[0119] Sastave pronalaska mogu se dobiti konvencionalnim postupcima koristeći konvencionalne farmaceutske ekscipijente, dobro poznate u nauci. Prema tome, sastave namenjene za oralnu upotrebu mogu sadržati, na primer, jedno ili više sredstava za bojenje, zaslađivanje, ukus i/ili konzervansa.

[0120] Za dalje informacije o formulaciji upućujemo čitaoca na poglavlje 25.1 u Volumen 5 Sveobuhvatne medicinske hemije (Corwin Hansch; Chairman of editorial Board), Pergamon Štampa 1990.

[0121] Jedinjenje Formule (I) ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline obično se primenjuje na toplokrvnu životinju u jediničnoj dozi u opsegu od 5 do 5000mg/m<2>telesne površine životinja tj. otprilike 0,1 do 100 mg/kg, a ovo normalno obezbeđuje terapeutski efikasnu dozu. Oblik jedinične doze, kao što je tableta ili kapsula, obično sadrži 0.5 mg do 250 mg, kao i 1 do 250 mg aktivnog sastojka. Dnevna doza će se nužno razlikovati u zavisnosti od tretiranog domaćina ili pacijenta, specifičnog načina primene i težine bolesti koja se leči. Shodno tome, lekar koji leči određenu životinju ili pacijenta može odrediti optimalnu dozu. Jedinjenja ili ko-kristali ovog pronalaska su potencijalno od vrednosti kao antiproliferativni agensi i/ili agensi za ubijanje ćelija u zadržavanju i/ili lečenju hematoloških kancera (takođe nazvani kao tečni kancer) i čvrstog tumorskog oboljenja. Naročito se očekuje da se jedinjenja ili ko-kristali iz pronalaska mogu koristiti u prevenciji ili lečenju onih tumora koji su povezani sa amplifikacijom jedne ili više BET familija proteina koji sadrže bromodomen, odgovarajuću BRD4 amplifikaciju ili su zavisni od ključnih onkogena koji mogu biti regulisani jednim ili više BET familijom proteina koji sadrže bromodomen, pogodno BRD4, na primer, jajnika, akutne mijeloidne i mešovite linearne leukemije (AML), multiplog mijeloma (MM), difuznog velikog B-ćelijskog limfoma ( DLBCL), karcinoma prostate rezistentnog na kastraciju (CRPC), krupnoćelijskoh karcinoma pluća (NSCLC), kancera malih ćelija pluća (SCLC), karcinoma dojke, glioblastoma i neuroblastoma.

2

[0122] Izraz "terapija" je nameren da ima svoje normalno značenje bavljenja oboljenjem kako bi u potpunosti ili delimično olakšao jedan, neki ili sve njegove simptome, ili da ispravi ili nadoknađuje osnovnu patologiju. Termin "terapija" takođe obuhvata "profilaksu", osim ako ne postoje konkretni indikatori za suprotno. Termine "terapeutski" i "terapijski" treba tumačiti na odgovarajući način.

[0123] Izraz "profilaksa" je nameren da ima svoje normalno značenje i uključuje primarnu profilaksu, da spreči razvoj bolesti. I sekundarnu profilaksu, pri čemu je bolest već razvijena, a pacijent je privremeno ili trajno zaštićen od egzacerbacije ili pogoršanja bolesti ili razvoja novih simptoma povezanih sa bolestima.

[0124] Termin "tretman" se koristi sinonimno sa "terapijom". Slično tome, termin "lečiti" se može smatrati "primenom terapije" gde je "terapija" definisana ovde.

[0125] Termin "efektivna količina" odnosi se na količinu jedinjenja Formule (I) ili kokristala kako je opisano u bilo kom od ovakvih rešenja ovde, što je efektivno za potencijalno pružanje terapije kod subjekta. U slučaju karcinoma, efektivna količina može prouzrokovati bilo kakvu promenu koja se može posmatrati ili meriti kod subjekta kao što je opisano u definiciji "terapija", "tretman" i "profilaksa". Na primer, efektivna količina može potencijalno smanjiti broj ćelija raka ili tumorskih ćelija; potencijalno smanjuje ukupnu veličinu tumora; potencijalno inhibira ili zaustavlja infiltraciju tumorskih ćelija u periferne organe, uključujući, na primer, meka tkiva i kost; potencijalno inhibira i zaustavlja metastazu tumora; potencijalno inhibira i zaustavlja rast tumora; potencijalno može u određenoj meri olakšati jedan ili više simptoma povezanih sa rakom; potencijalno smanjuje morbiditet i mortalitet; potencijalno poboljšava kvalitet života; ili kombinacija takvih efekata. Efikasna količina može biti količina koja je dovoljna da smanji simptome bolesti, koja odgovara na inhibiciju jednog ili više proteina koji sadrže bromodomen. Za terapiju rakom, efikasnost in-vivo može se, na primer, meriti procenom trajanja preživljavanja, vremena do progresije bolesti (TTP), brzine odgovora (RR), trajanja odgovora i/ili kvaliteta života.

[0126] Prema predmetnom pronalasku, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili jedinjenje Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u terapiji.

2

[0127] Prema daljim aspektima pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili jedinjenje Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za proizvodnju leka.

[0128] Prema predmetnom pronalasku, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili jedinjenje Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu kod toplokrvnih životinja kao što je čovek kao lek.

[0129] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili jedinjenje Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za proizvodnju antiproliferativnog ili efekta ubijanja ćelija kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0130] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđena je upotreba jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili jedinjenja Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji leka za upotrebu u produkciji antiproliferativnog ili efekta ubijanja ćelija kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0131] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđena je upotreba jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili jedinjenja Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za proizvodnju antiproliferativnog ili efekta ubijanja ćelija kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0132] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je metod produkcije antiproliferativnog ili efekta ubijanja ćelija kod toplokrvnih životinja, kao što je čovek, u potrebi takvog tretmana koji kompenzuje upotrebu kod pomenutih životinja u efektivnoj količini jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja A: kokristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano.

2

[0133] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili jedinjenje Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu kancera kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0134] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđena je upotreba jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili jedinjenja Formule (I): ko-bivši ko-kristal, pogodno Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji medikamenata za upotrebu u prevenciji ili tretmanu kancera kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0135] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za prevenciju ili lečenje kancera kod toplokrvne životinje, kao što je čovek, kojoj je potreban takav tretman koji obuhvata davanje pomenutoj životinji efikasne količine jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala, ili Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftoične kiseline, kao što je prethodno definisano.

[0136] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđeno je jedinjenje Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenje A: 6-hidroksi-2naftojska kiselina kokristal, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu hematoloških kancera (odnosno tečnih kancera) i čvrstih kancera kod toplokrvnih životinja kao što je čovek.

[0137] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je korišćenje jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji medikamenta za upotrebu u prevenciji ili lečenju hematoloških i čvrstih karcinoma kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0138] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za prevenciju ili lečenje hematoloških i čvrstih karcinoma kod toplokrvne životinje, kao što je čovek, koja zahteva takav tretman koji obuhvata davanje efikasne količine jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, ovoj životinji, kao što je prethodno definisano.

[0139] Jedan aspekt pronalaska obezbeđuje Jedinjenja Formule (I) koja potencijalno inhibiraju jedan ili više proteina koji sadrže bromodomen, tj. BET familiju proteina koji sadrže bromodomen, a kao što su BRD2, BRD3, BRD4 i BRDt i, na odgovarajući način, BRD4. Takva jedinjenja mogu biti korisna za lečenje proliferativnog poremećaja kao što je rak kod pacijenta kod kojih je proliferativni poremećaj, poremećaj posredovan proteinom koji sadrži bromodomen. „Poremećaj proteina posredstvom bromodomena“ podrazumeva svaku bolest ili drugo štetno stanje u kojem je poznato da jedan ili više proteina koji sadrže bromodomen igraju ulogu.

[0140] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal sa Jedinjenjem A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciju ili lečenju BET zavisnog karcinoma kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0141] Pod BET zavisnim karcinomom podrazumevamo bilo koji karcinom i kome jedan ili više proteina koji sadrže brododomen iz BET porodice, kao što su BRD2, BRD3, BRD4, i BRDt igraju ulogu.

[0142] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili lečenju BRD4 zavisnog raka kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0143] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je korišćenje jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji medikamenta za upotrebu u prevenciji ili lečenju BET zavisnog karcinoma kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0144] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je korišćenje jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji medikamenta za upotrebu u prevenciji ili lečenju BDR4 zavisnog karcinoma kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

1

[0145] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za prevenciju ili tretman BET zavisnog karcinoma u toplokrvnoj životinji, kao što je čovek, koji zahteva takav tretman koji obuhvata davanje ovoj životinji efektivne količine jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano.

[0146] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za prevenciju ili tretman BRD4 zavisnog kancera kod toplokrvne životinje, kao što je čovek, koja zahteva davanje takvog tretmana koji obuhvata efikasnu količinu jedinjenja Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili ko-kristal Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano.

[0147] Prema daljem aspektu pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u obezbeđivanju inhibitornog efekata na jednu ili više BET familiju proteina koji sadrže bromodomen.

[0148] U skladu sa daljim aspektom pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u obezbeđivanju inhibitornog dejstva na BRD4.

[0149] U skladu sa daljim aspektom pronalaska, obezbeđena je upotreba jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji medikamenta za upotrebu u obezbeđivanju inhibitog dejstva na jednu ili više BET familija proteina koji sadrže bromodomen.

[0150] U skladu sa daljim aspektom pronalaska, obezbeđena je upotreba jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano, u proizvodnji medikamenta koji se koriste u obezbeđivanju inhibitornog dejstva na BRD4.

2

[0151] Prema daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za obezbeđivanje inhibitornog dejstva na jednu ili više BET familija proteina koji sadrže bromodomen koji obuhvata davanje navedenoj životinji efektivne količine jedinjenja Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano.

[0152] U skladu sa daljim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za obezbeđivanje inhibitornog efekta na BRD4 koji obuhvata davanje efikasne količine jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili Jedinjenja A: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline pomenutoj životinji, kao što je prethodno definisano.

[0153] Ko-kristal Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline može biti u obliku A, B ili C, kako je ovde definisano i odgovarajuće je u obliku A.

[0154] Terapija protiv karcinoma koja je ovde opisana može se primeniti kao jedina terapija ili može uključiti, pored jedinjenja pronalaska, konvencionalnu hirurgiju ili radioterapiju ili hemoterapiju ili imunoterapiju. Takva hemoterapija može se primenjivati istovremeno, simultano, sekvencijalno ili odvojeno za tretman sa jedinjenjem pronalaska.

[0155] Kada se koristi kombinovana terapija, količina jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili ko-kristala Jedinjenja A: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline opisana u ovoj specifikaciji i količina drugog farmaceutski aktivnog sredstva(sredstava) su, u kombinaciji, zajednički efikasni za lečenje ciljanog poremećaja kod životinja pacijenata. U tom kontekstu, kombinovane količine su u "terapeutski efikasnoj količini" ako su, u kombinaciji, dovoljne da snize simptome bolesti koja odgovara inhibiciji jednog ili više proteina koji sadrže bromodomen. Tipično, takve količine može da odredi naučnik, na primer, počevši od opsega doze opisanog u ovoj specifikaciji za jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili Jedinjenje A: ko-kristal 6-hidroksi-2 -naftojske kiseline kao što je ovde definisano i odobreni ili na drugi način objavljeni dozni opseg(zi) drugih farmaceutski aktivnog(ih) jedinjenja.

[0156] U daljem aspektu pronalaska obezbeđen je farmaceutski proizvod koji sadrži jedinjenje Formule (I) i dodatnu anti-tumorsku supstancu, za zajednički tretman kancera.

[0157] U takvom aspektu pronalaska obezbeđen je farmaceutski proizvod koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao što je prethodno definisano, i dodatni anti-tumorski agens za zajednički tretman kancera.

[0158] U takvim aspektima farmaceutski proizvod sadrži jedinjenje Formule (I) i ko-bivši u obliku ko-kristala.

[0159] U daljem aspektu pronalaska obezbeđen je farmaceutski proizvod koji sadrži Jedinjenje A: ko-kristal hidroksi-2-naftojske kiseline, kao što je prethodno definisano i dodatnu anti-tumorsku supstancu, za zajednički tretman kancera.

[0160] Takav udruženi tretman može uključivati jedan ili više sledećih anti-tumorskog agenasa:-(i) antiproliferativne/antineoplastične lekove i njihove kombinacije, kao što se koriste u medicinskoj onkologiji, kao što su sredstva za alkilovanje (na primer cis-platin, oksaliplatin, karboplatin, ciklofosfamid, azotni senf, melfalan, hlorambucil, busulfan, temozolamid i nitrosoureas); antimetaboliti (na primer gemcitabin i antifolati kao što su fluoropirimidi kao što su 5-fluorouracil, pemetreksel i tafur, raltitreksed, metotreksat, citozin arabinozid i hidroksiurea); antitumorski antibiotici (na primer antracikline kao što su adriamicin, bleomicin, doksorubicin, daunomicin, epirubicin, idarubicin, mitomicin-C, daktinomicin i mithramicin); i inhibitori topoizomeraze (na primer epipodofilotoksini poput etopozida i tenipozida, amsacrina, topotekana i kamptotecina i irinotekana); inhibitori mehanizama popravke DNK kao što je CHK kinaza; DNK zavisni inhibitori protein kinaze; inhibitori poli (ADP-riboze) polimeraze (PARP inhibitori, uključujući olaparib); i Hsp90 inhibitore kao što su tanespimicin i retaspimicin;

(ii) jedinjenja koja inhibiraju progresiju kroz ćelijski ciklus kao što su antimitotički agensi (na primer, alkaloidi vinca kao što su vinkristin, vinblastin, vindezin i vinorelbin, epotiloni kao što su iksabepilon i patupilon, taksoidi kao taksol, taksoter i docetaksel, inhibitori polo-kinaze i inhibitori kinezinski motorni proteini kao što su inhibitori proteina Eg5); inhibitori aurora kinaze (na primer AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 i AX39459); ciklin zavisni inhibitori kinaze, kao što su CDK2 i/ili CDK4 inhibitori; i inhibitori centromerne proteinske funkcije kao što su inhibitori CENP-E;

4

(iii) citostatici koji menjaju hormon zavisni rast kao što su antioestrogeni (na primer tamoksifen, fulvestrant, toremifen, raloksifen, droloksifen i jodoksifen), antiandrogeni (na primer bikalutamid, flutamid, nilutamid i ciproteron acetat), LHRH antagonisti ili LHRH agonisti npr. goserelin, leuprorelin i buserelin), progestogeni (na primer megestrol acetat), inhibitori aromataze (na primjer kao anastrozol, letrozol, vorazol i eksemestan); inhibitori 5a-reduktaze kao što su finasterid i inhibitori CYP17A1 kao što je abiraterone;

(iv) anti-invazivni agensi, na primer inhibitori porodice c-Src kinaze kao AZD0530 (sarakatinib); dasatinib (BMS-354825), J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661) i bosutinib (SKI-606) i inhibitori metaloproteinaze kao što su marimastat, inhibitori receptorske funkcije urokinaze plazminogena aktivatora ili antitela na heparanazu; inhibitori FAK-a ili kinaze fokalne adhezije; inhibitori malih molekula MET receptor-kinaze (na primer, volitinib/AZD6904); antitela na MET receptorsku kinazu ili faktor rasta hepatocita za MET ligand (na primer onartuzumab);

(v) inhibitori funkcije faktora rasta: na primer, takvi inhibitori uključuju antitela faktora rasta i antitela receptora faktora rasta (na primer anti-erbB2 antitelo trastuzumab [Herceptin ™], anti-EGFR antitelo panitumumab, anti-erbB 1 antitelo cetuksimab [Erbituk, C225] i bilo koji faktor rasta ili antitela receptora faktora rasta (koji je obelodanio Stern i dr. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol.54, pp11-29); takvi inhibitori takođe uključuju inhibitore tirozin-kinaze, na primer inhibitore familije epidermalnog faktora rasta (na primer inhibitori tirozin-kinaze EGFR-a kao što su gefitinib (ZD1839), erlotinib (OSI-774) i CI 1033, erbB2 tirozin kinaze inhibitori kao što je lapatinib; mešani erbB 1/2 inhibitori kao što je afatanib i nepovratni inhibitori EGFR i Her2 kao što je HKI-272, ireverzibilni inhibitori EGFR kao što su AZD9291, inhibitori porodice faktora rasta hepatocita i njihovi receptori, inhibitori faktora rasta insulina uključujući inhibitore kinaze malih molekula i antitela usmerena na faktore rasta koji su slični insulinu i receptori faktora rasta kao insulin, inhibitori porodičnog faktora rasta faktora rasta i njihovi receptori kao što su imatinib i/ili nilotinib (AMN107), inhibitori c-kit, AnLK inhibitori Flt3 kinaze, inhibitori c-abl kinaze i inhibitori CSF-1R ili TRK-kinaze;

(vi) inhibitorima transakcionih kinaza kao FGFR (na primer AZD4547), PIM (na primer AZD1208), MEK (na primer Selumetinib (AZD6244), AKT (npr. AZD5363), inhibitori TOR kinaza (uključujući TORC1 i TORC2, na primjer AZD2014) , i inhibitori PI3 kinaze, uključujući izoforme kao što su PI3K-α, PI3K-β ili PI3K-δ (na primer AZD8186), inhibitori serin/treonin kinaza kao što su Ras ili Raf kinaze (na primer sorafenib ili vemurafenib); inhibitori PDK, SGK, PI4K ili PIP5K, JAK, STAT (uključujući STAT3, inhibitor koji je AZD9150) i IRAK4; ATR inhibitori (npr. AZD6738) ili ATM inhibitori; BTK inhibitori kao što su ibrutinib, SIK inhibitori kao što je fostatatinib i inhibitori zavisnosti od ciklin-zavisnih kinaza, inhibitori farnesil transferaze kao što su tipifarnib (R115777) lonafarnib (SCH66336) i inhibitori Vee-li kinaze (na primer AZD1775 kao što je opisano u WO2007/126128);

(vii) antiangiogeni agensi kao što su oni koji inhibiraju efekte faktora rasta vaskularnog endotela, na primer anti-vaskularno endotelno ćelijsko antitelo bevacizumab (Avastin ™) i na primer inhibitor tirozin kinaze receptora VEGF receptora kao što je vandetanib (ZD6474), sorafenib, vatalanib (PTK787), sunitinib (SU11248), akitinib (AG-013736), pazopanib (GV 786034) i cediranib (AZD2171), jedinjenja kao što su ona obelodanjena u WO97/22596, WO97/30035, WO97/32856 i WO98/13354 i jedinjenja koja rade pomoću drugih mehanizama (na primer linomid, inhibitori integrin αvβ3 funkcije i angiostatin); (viii) agensi koji su vaskularno štetni kao što je Kombretastatin A4 i jedinjenja obelodanjena u WO99/02166, WO00/4052 WO00/41669, WO01/92224, WO02/04434 i WO02/08213;

(ix) antisensne terapije, na primer one koje su usmerene na gore pomenute mete, kao što je ISIS 2503, ani-ras antisensna;

(x) pristupi genskoj terapiji, uključujući na primer pristupe da se zamene aberantni geni, kao što su aberantni p53 ili aberantni BRCA1 ili BRCA2, GDEPT (genski-usmerena terapija na enzim pro-lek) pristupi kao što su oni koji koriste citozin deaminazu, timidin kinazu ili bakterijski nitrorevodazni enzim i pristupe za povećavanje tolerancije pacijenta na hemoterapiju ili radioterapiju, kao što je genska terapija rezistentnosti na više lekova; (xi) imunoterapijski pristupi, uključujući na primer ex-vivo i in-vivo pristupe za povećanje imunogenosti tumorskih ćelija pacijenata, kao što su transfekcija sa citokinima, kao što je interleukin 2, interleukin 4 ili faktor stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga; pristupi za smanjenje anergije T-ćelije ili regulatorne T-ćelijske funkcije; pristupi koji poboljšavaju T-ćelijske odgovore na tumore, kao što su blokada antitela na CTLA4 (na primer ipilimumab i tremelimumab), B7H1, PD-1 (na primer BMS-936558 ili MEDI-4736) i agonistička antitela na CD137; pristupi koristeći transfektovane imune ćelije kao što su dendritične ćelije transfektovane sa citokinom; pristupi korišćenjem linija tumorskih ćelija transfektovanih citokina, pristupa upotrebi antitela antigena povezanih sa tumorom i antitela koja osiromašuju tipove ćelija ćelija (npr. nekonjugovana anti-CD20 antitela kao što su Rituksimab, antitela sa anti-CD20 antitela Bexxar i Zevalin i antiCD54 antitela Campath); R-CHOP režim hemoterapije (Rituksimab zajedno sa ciklofosfamidom, doksorubicin hidrohloridom, vinkristin sulfatom i prednizonom); pristupi za upotrebu anti-idiotipskih antitela; pristupi koji poboljšavaju funkciju Natural Killer ćelije; i pristupi koji koriste konjugate antitela-toksina (npr. anti-CD33 antitelo Mylotarg); imunotoksini kao što je moketumumab pasudotoks; agonisti toll-like receptora 7 ili toll-like receptora 9;

(xii) inhibitori degradacije proteinima posredovanih proteasomom, uključujući, ali bez ograničenja, inhibitore proteasoma kao što su Velcade ™ (Bortezomib) ili karfilzomib, inhibitori lipaze ubiquiti, inhibitori ubiquitin proteaza, inhibitori proteina Neddylation i inhibitori simulacije proteina; i

(xiii) ostali standardni agensi za negu kao što su ciklofosfamid, prednison, lenalidomid ili thalidomid.

[0161] Prema ovom aspektu pronalaska, obezbeđena je kombinacija pogodna za upotrebu u lečenju kancera koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i dodatni anti-tumorski agens, posebno bilo koji od anti- tumorskih agenasa navedenih u (i)-(xiii) iznad.

[0162] Prema ovom aspektu pronalaska, takođe je obezbeđena kombinacija pogodna za upotrebu u lečenju kancera koja sadrži ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline Jedinjenja A i dodatnog anti-tumorskog sredstva, naročito nekog od anti-tumorskih agenasa navedenih u (i)-(xiii) iznad.

[0163] U daljem aspektu pronalaska obezbeđeno je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u kombinaciji sa dodatnim anti-tumorskim agensom, posebno antitumorskim agensom odabranim od jednog od navedenog u (i )-(xiii) iznad.

[0164] U daljem aspektu pronalaska obezbeđeno je Jedinjenje A: 6-hidroksi-2-naftoični kokristal u kombinaciji sa dodatnim anti-tumorskim agensom, posebno anti-tumorskim agensom odabranim iz jednog navedenog u ( i)-(xiii) iznad.

[0165] U skladu sa drugim aspektom pronalaska, obezbeđen je kit koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili Jedinjenje A: 6-hidroksi-2-naftoični ko-kristal u kombinaciji sa anti-tumorskim agensom. U određenim izvođenjima, komplet dodatno sadrži uputstva za upotrebu navedenog (ih) jedinjenja ili ko-kristala.

[0166] U skladu sa drugim aspektom pronalaska, obezbeđen je kit koji sadrži:

a) jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili Jedinjenje A: 6-hidroksi-2-naftoični ko-kristal u obliku prve jedinice doziranja;

b) dodatni anti-tumorski agens u obliku druge dozne jedinice; i

c) kontejnera za držanje pomenutih prvih i drugih doznih oblika.

[0167] Pronalazak će biti ilustrovan sledećim primerima u kojima, uopšteno:

(i) temperature se daju u stepenima Celzijusa (°C); osim ako nije drugačije navedeno, operacije su sprovedene na sobnoj temperaturi ili temperaturi okoline, odnosno na temperaturi od 18 do 25°C;

(ii) organski rastvori se suše preko bezvodnog magnezijum sulfata ili bezvodnog natrijum sulfata; isparavanje rastvarača je izvedeno pomoću rotacionog isparivača pod sniženim pritiskom (od 600 do 4000 paskala, 4,5 do 30 mmHg) sa temperaturom kupke do 60°C;

(iii) hromatografija podrazumeva fleš hromatografiju na silika gelu; tankoslojna hromatografija (TLC) izvedena na pločama s silika gelom;

(iv) generalno, tok reakcija je praćen TLC i/ili analitički LC-MS, a vremenima reakcije su data samo za ilustraciju;

(v) finalni proizvodi su imali zadovoljavajuće spektre protonske nuklearne magnetne rezonance (NMR) i/ili masene spektralne podatke;

(vi) prinosi su dati samo za ilustraciju i nisu nužno oni koji se mogu dobiti uz pomoć marljivog razvijanja procesa; pripreme su ponovljene ako je bilo potrebno više materijala;

(vii) kada su dati, NMR podaci su u obliku vrednosti delta za glavne dijagnostičke protone, dato u delovima na milion (ppm) u odnosu na tetrametilsilane (TMS) kao interni standard, određen na 300, 400 ili 500 MHz koristeći perdeuterio dimetil sulfoksid (DMSO - d6) kao solvent, osim ako nije drugačije naznačeno; korišćene su sledeće skraćenice: s, singlet; d, dublet; t, triplet; q, kvartet; m, multiplet; bs, broad singlet; dd, dvostruki duplet; td, trostruki dublet; qd, kvartet duplet;

(viii) Za magnetni ugao unakrsne polarizacije ugljenika (<13>C) spinovana NMR analiza čvrstih materija izvedena u Primeru 1, spektri ko-kristala, slobodne baze Jedinjenja A i ko-bivši zabeleženi su na Bruker Avance NMR spektrometru koji radi na<1>H frekvenciji od 400 MHz. Uzorci su okrenuli magični ugao na frekvenciji od 9 kHz a kontaktni puls od 2 ms korišćen je da omogući prenos magnetizacije od protona do ugljenika. Odlaganje od reciklaže od 5 s korišćeno je da se dozvoli opuštanje spinske rešetke;

(ix) Za azotski (<15>N) unakrsni polarizacijski magični ugao spinovana NMR analiza čvrstih materija izvedena u Primeru 1, spektri ko-kristala su zabeleženi na Bruker Avance NMR spektrometru koji radi na frekvenciji<1>H od 400 MHz. Uzorci su okrenuli magični ugao na frekvenciji od 5kHz i kontaktni impuls od 200ms i 2ms korišćen je da bi se omogućilo prenos magnetizacije sa protona na ugljenik.

Odlaganje od reciklaže od 5 s korišćeno je da omogući spuštanje relaksacije rešetke; (x) hemijski simboli imaju svoja uobičajena značenja, korišćene su SI jedince i simboli;

(xi) Podaci o masenom spektru (MS) i LC-MS su generisani na LC-MS sistemu gde HPLC komponenta uglavnom sadrži Agilent 1100, Waters Alliance HT (2790 i 2795) opremu ili pumpu HP1100 i Diode Array sa CTC autosamplerom i radi se na Phenomenek Gemini C185 µm, kolonu 50 k 2 mm (ili slično) uz eluiranje ili sa kiselim eluentom (na primer, koristeći gradijent između 0-95% vode/acetonitrila sa 5% 1% mravlje kiseline u 50: 50 vode: acetonitril (v/v) smeša) ili bazni eluent (na primer, koristeći gradijent između 0-95% vode/acetonitrila sa 5% od 0,1% 880 amonijaka u smeši acetonitrila); i MS komponenta obuhvata generalno skeniranje masenog spektrometra Waters ZQ u odgovarajućem opsegu masa. Generišu se hromatogrami za elektrosprej (ESI) pozitivne i negativne bazne vršne intenzitete i UV ukupnu apsorpcionu hromatografiju od 220-300 nm i daju se vrednosti za m/z; generalno, samo joni koji ukazuju na masu roditelja su prijavljeni i osim ako nije drugačije naznačeno, navedena vrednost je (M+H) za režim pozitivnog jona i (M-H)- za režim negativnog jona;

(xii) osim ako nije navedeno drugačije jedinjenja koja sadrže asimetrično supstituisan ugljenik nisu rešena;

(xiii) preparativna tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) izvedena je na Gilsonovom instrumentu koristeći sledeće uslove: -Kolona: C18 obrnuto-fazni silika, na primer Waters 'Xbridge', 5 µm silicijum dioksid, 19 x 100 mm ili 30 x 100 mm, koristeći smanjujuće polarne mešavine rastvarača kao eluent (smanjujući odnos rastvarača A do rastvarača B); rastvarač A: voda sa 1% amonijum hidroksida; rastvarač B: acetonitril; protok: 28 ml/min ili 61 ml/min; gradijent: prilagođen svakom sastavu - uglavnom 7-10 min dužine; talasna dužina: 254 nm;

(xiv) Hromatografija jake kationske razmene (SCKS) je obavljena na prethodno zapakovanim kertridžima (na primer, kertridži zasnovani na ISOLUTE SCX-2 na osnovi propil sulfonske kiseline koju je isporučio International Sorbent Technology), koristeći osnovni eluent (na primer, 1M amonijak u metanolu);

(xv) naredne abrevacije su ovde korišćene, gde je potrebno:-ADDP

1,1' -(azodikarbonil)dipiperidin

DCM

dihlorometan

DIPEA

N,N-diizopropiletilamin

DMA

N,N-dimetil acetamid

DMF

N,N-dimetilformamid

DME

Dimetoksietan

DMSO

dimetilsulfoksid

Et2O

dietileter

EtOAc

etil acetat

EtOH

etanol

HPLC

tečna hromatografija visokih frekvenci

MeOH

metanol

MgSO4

magnezijum sulfat

4

MTBE

metil terc-butil eter

NMR

nuklearna magnetna rezonanca

SCX

razmena visokog opreza

TFA

trifluoroacetna kiselina

THF

tetrahidrofuran;

(xvii) Za XRPD analizu iz Primera 1, uzorak je montiran na silikonsku podlogu i analiziran pomoću PANalytical CubiX PRO difraktometra. Uzorci su mereni u geometriji refleksije u konfiguraciji θ-2θ u opsegu skeniranja od 2 ° do 40 ° 2θ sa nominalnom ekspozicijom od 25 sekundi po porastu od 0.02°. Uzorak se okreće na 30 obrtaja u minuti (radi poboljšanja statistike prebrojavanja) i osvetljen je sa rendgenskim zracima generisanim od bakarne duge fokusne cevi koja radi na 45kV i 40mA sa talasnom dužinom od 1.5418 Å. Osobe kvalifikovane u tehnologiji rentgenske difrakcije praha će razumeti da relativan intenzitet vrhova može biti pod uticajem, na primer, zrna iznad 30 mikrona u veličini i nejednakih odnosa koji mogu uticati na analizu uzoraka. Iskusna osoba će takođe shvatiti da na položaj refleksa može uticati precizna visina na kojoj uzorak sedi u difraktometru i nulta kalibraciju difraktometra. Plodnost površine uzorka takođe može imati mali efekat. Stoga prikazani podaci difrakcije nisu uzeti kao apsolutne vrednosti.

(xviii) Diferencijalna kalorimetrija skeniranja: Analitički instrument: TA instrumenti Q1000 DSC.

Tipično manje od 5 mg materijala sadržanih u standardnom aluminijumskom panlu sa poklopcem zagrejano je u temperaturnom opsegu od 25°C do 300°C pri stalnom zagrevanju od 10°C u minuti. Korišćen je gas za čišćenje pomoću azota - brzina protoka 50ml u minuti.

Primer 1: Priprema (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksiletil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on Oblik A

[0168]

[0169] Tributilfosfin (102 mL, 414.92 mmol) je dodat u porciju do suspenzije 4- (1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4- il) fenol (67.5 g, 207.46 mmol) u dobro degaziranom, bezvodnom DCM (1.7 L) na 5 °C pod azotom. Smeša je ohlađena na 0 °C i dodato porcijsko (E)-diazen-1,2-diilbis (piperidin-1-il metanon) (105 g, 414.92 mmol). Zatim je u kapima dodato rastvor (R)-4-(2-hidroksietil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on (46.4 g, 269.70 mmol) u DCM (200 mL). Reakciona smeša je mešana 30 minuta i filtrirana. Providni rastvor je razblažen dodatnim DCM (1 L) i zatim zakiseljen sa 2M HCl (400 mL) i vodom (400 mL). Kombinovani vodeni rastvor je ispran DCM (3 x 1 L), a zatim EtOAc (1 L).

Vodeni rastvor je zatim bazifikovan sa čvrstim Na2CO3do pH∼10 i ekstrahovan sa DCM (3 x 1,5 L). Kombinovani organski rastvor je ispran vodom (500 mL) i zasićenim slanim rastvorom (500 mL), zatim sušen preko MgSO4i uparen do suvog da se dobije sirovi materijal. Ovo je prečišćeno pomoću fleš silikatne hromatografije, eluiranjem sa EtOH: EtOAc: heptan: NH3(aq)1,8: 4: 4: 0,2. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su isparene do suvog da se dobije žuta pena. Ovo je dalje prečišćeno preparativnom HPLC (Chiralpak AS kolona, 20mm silicijum dioksid, prečnik 100 mm, dužine 250 mm), heptan/EtOH 50/50 na 400 ml/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su uparene do suvog i dobijena čvrsta supstanca je mešana kao suspenzija u dietil etru (300 mL) tokom 18 sati, filtrirana i osušena da bi se dobilo (R)-4-(2-(4-(1-( 3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on (69 g, 69,4 %) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.22 (3H, d), 1.62 (2H, qd), 1.82 (2H, d), 2.6 - 2.79 (3H, m), 2.79 (3H, s), 2.85 - 3.09 (4H, m), 3.13 (1H, q), 3.2 - 3.26 (2H, m), 4.03 (2H, t), 4.17 (3H, s), 4.28 (2H, d), 6.85 (2H, d), 7.15 (2H, d), 7.29 (1H, d), 7.85 (1H, d). m/z ES+ [M+H]+ 480

[0170] 4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenol je korišćen kao polazni materijal i pripremljen kao što je dalje objašnjeno:-Priprema benzil 4-(trifluorometilsulfoniloksil-5,6-dihidropiridin-1(2H)-karboksilata

[0171]

[0172] Rastvoru benzil 4-oksopiperidin-1-karboksilata (88.57 g, 379.70 mmol) u THF (300 mL) dodato je kap po kap u litijum bis (trimetilsilil) amid (1M u THF) (418 mL, 417.67 mmol) na -78°C, tokom perioda od 1 sata pod azotom. Dobijena smeša je mešana na -78°C tokom 90 minuta, a zatim je dodan rastvor 1,1,1-trifluoro-N-fenil-N- (trifluorometilsulfonil) metansulfonamida (142 g, 398,68 mmol) u THF (600 mL) u kapima tokom perioda od 1 sata. Dobijena smeša je mešana na -78°C tokom 30 minuta, zatim je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana 16 sati. Reakciona smeša je ugašena sa 2M vodenim rastvorom natrijum hidroksida (450 mL). Slojevi su odvojeni i organski sloj je ispran 2M vodenim rastvorom natrijum hidroksida (360 mL). Rastvarač je uparen, zatim je ostatak ponovo rastvoren u Et2O (1500 mL) i rastvor ispran vodom (500 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i uparen, dajući benzil 4- (trifluorometilsulfoniloksi)-5,6-dihidropiridin-1 (2H)-karboksilat (124 g, 81%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 2.43 (2H, m), 3.62 (2H, m), 4.06 (2H, m), 5.10 (2H, s), 6.02 (1H, m), 7.34 (5H, m).

Priprema benzil 4-(4-hidroksifenil)-5,6-dihidropiridin-1(2H)-karboksilata

[0173]

[0174] Na benzil 4-(trifluorometilsulfoniloksi -5, 6-dihidropiridin-1(2H)-karboksilat (123.1 g, 303.26 mmol) i 4-hidroksifenilboronska kiselina (46.0 g, 333.59 mmol) dodat je natrijum karbonat (96 g, 909.79 mmol) u smeši dioksana (1000 mL) i vode (250 mL). Dobijena smeša je isprana u atmosferi azota 10 minuta, a doda se 1,1'-bis(difenilfosfino)feroendikloropaladijum (II) (5,49 g, 7,58 mmol) i reakciona smeša je zagrevana na 80°C tokom 1 časa. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (2 L) i isprana vodom (2 L). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa DCM (1 L), zatim su kombinovane

4

organske materije isprane zasićenim slanim rastvorom (500 mL), osušene preko MgSO4, filtrirane i uparene da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijentom elucije 10 do 30% EtOAc u izoheksanu. Frakcije koje sadrže željeni proizvod su uparene do suvog, zatim izdrobljen sa izoheksanom, filtrirane i osušene, dajući benzil 4-(4-hidroksifenil)-5, 6-dihidropiridin-l(2H)-karboksilat (62.3 g, 66.4%) kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 2.44 (2H, m), 3.61 (2H, m), 4.05 (2H, m), 5.12 (2H, s), 5.99 (1H, m), 6.73 (2H, d), 7.26 (2H, d), 7.32 - 7.40 (5H, m), 9.45 (1H, s). mlz: ES+ [M+H]+ 310.

Priprema 4-(piperidin-4-il)fenola

[0175]

[0176] Benzil 4-(4-hidroksifenil)-5, 6-dihidropiridin-l (2H)-karboksilat (37.7 g, 121.86 mmol) i 5% paladijum na ugljeniku (7.6 g, 3.57 mmol) u MeOH (380 mL) su mešani pod atmosferom vodonika na 5 bara i 25°C tokom 2 sata. Katalizator je uklonjen filtracijom, ispran sa MeOH i rastvarači su upareni. Sirovi materijal je izdrobljen sa Et2O (200 mL), zatim željeni proizvod prikupljen filtriranjem i osušen pod vakuumom, dajući 4-(piperidin-4-il) fenol (20.36 g, 94%) kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.46 (2H, m), 1.65 (2H, m), 2.45 (1H, m), 2.58 (2H, m), 3.02 (2H, m), 6.68 (2H, d), 7.00 (2H, d), 9.15 (1H, s). mlz: ES+ [M+H]+ 178

Priprema 4-(piperidin-4-il)fenol hidrobromida

[0177]

[0178] Vodonik bromid (48% u vodi) (0.283 mL, 2.48 mmol) je dodat u kapima u suspenziju 4-(piperidin-4-il) fenola (0.4 g, 2.26 mmol) u THF (23 mL). Nastala suspenzija je mešana 30 minuta. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana sa THF (20 mL) i osušena pod vakuumom, dajući 4-(piperidin-4-il) fenol hidrobromid (0.580 g, 100%) kao beli prah.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.74 (2H, qd), 1.86 (2H, d), 2.71 (1H, tt), 2.96 (2H, td), 3.33 (2H, d), 6.68 - 6.73 (2H, m), 6.97 - 7.02 (2H, m), 8.48 (2H, br s), 9.18 (1H, br s).

Priprema 6-hloro-3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazina

[0179]

[0180] 3-hloro-6-hidrazinilpiridazin (18 g, 124,51 mmol) je suspendovan u DME (330 mL) i tretiran tetrametoksimetanom (26,5 mL, 199,22 mmol) i dobijena smeša je mešana na 90°C tokom 3 sata. DME je uparen i ostatak je rastvoren u 5% MeOH/DCM; i zatim filtrira kroz silikonski utikač. Filtrat je uparen do suvog, a zatim je uzet u MTBE (200 mL) i osušen 1 sat. Čvrsta supstanca je filtrirana i osušena pod vakuumom da bi se dobio 6-hloro-3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin (19,78 g, 86%) kao krem prah.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 4.25 (3H, s), 7.30 (1H, d), 8.22 (1H, d). mlz: ES+ [M+H]+ 185

Priprema 4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenola [0181]

[0182] 6-hloro-3-metoksi-[l, 2,4]triazolo [4,3-b]piridazin (19,73 g, 106,91 mmol) je dodat u 4- (piperidin-4-il) fenol hidrobromid (18,4 g, 71,28 mmol) u EtOH (200 mL). U ovu smešu dodato je DIPEA (62,2 mL, 356,38 mmol) i reakcija je mešana na 55°C tokom 18 sati.

Reakciona smeša je zatim ohlađena do sobne temperature i sipana u snažno mešanu vodu (1600 mL); meša se snažno 2 sata. Čvrsti talog je filtriran i ispran sekvencijalno sa H2O (200 mL) i Et2O (200 mL). Dobijena čvrsta supstanca se osuši pod vakuumom da se dobije 4- (1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenol (15,30 g , 66,0%) kao

4

bledo braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.59 (2H, qd), 1.81 (2H, d), 2.67 (1H, ddt), 2.9 - 3.02 (2H, m), 4.17 (3H, s), 4.23 - 4.31 (2H, m), 6.63 - 6.71 (2H, m), 7.02 (2H, dd), 7.29 (1H, d), 7.84 (1H, d), 9.14 (1H, s). m/z ES+ [M+H]+ 326

[0183] (R)-4-(2-hidroksietil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on je korišćen kao početni materijal i pripremljen je kako je dalje objašnjeno:-

Priprema (R)-4-(2-hidroksietil)-1,3-dimethilpiperazin-2-on

[0184]

[0185] 2-bromoetanola (108 mL, 1518,54 mmol) je dodat u smešu (R)-1,3-dimetilpiperazin-2-on hidrohlorida (50 g, 303,71 mmol) i kalijum karbonata (126 g, 911,12 mmol) u 2-metiltetrahidrofuran (500 mL). Smeša je mešana na 100°C tokom 16 sati. Smeša je filtrirana i uparena do suvog da se dobije sirovi proizvod. Ovo se prečišćava fleš hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 1 do 5% MeOH u DCM i čiste frakcije se kombinuju i uparavaju do suvog da se dobije (R)-4-(2-hidroksietil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on (36,0 g, 68,8%) kao gusto žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.19 (3H, d), 2.42 (1H, dt), 2.59 (2H, tt), 2.79 (3H, s), 2.93 - 3.1 (2H, m), 3.17 - 3.25 (2H, m), 3.47 (2H, q), 4.41 (1H, t).

[0186] Konačni proizvod, (R)-4 (2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on, analiziran je XRPD i DSC i utvrđeno je da je kristalan. XRPD uzorka materijala dala je difrakcioni obrazac kao što je prikazano na slici A. (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4, 3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on Oblik A se karakteriše najmanje jednim vrhom sa vrednošću 2θ od 20,9° ili 16,7°, izmereno korišćenjem CuKα zračenja. Deset najistaknutijih vrhova XRPD prikazano je u Tabeli A.

Tabela A : Deset najistaknutijih XRPD vrhova za (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il )fenoksi)etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on Oblik A

4

Pri čemu su 2-teta vrednosti /- 0.2°.

[0187] Analiza diferencijalnog skeniranja kalorimetrije (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidina -4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on Oblik A pokazuje toplotnu endotermu sa početkom od 106,4°C i vrhom na 111,2°C. Trag DSC je prikazan na Slici B.

Primer 1.1: Dobijanje (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala, Oblika A.

[0188] Približno 3g (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4- fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on Oblika A se dodaje u bočicu sa okruglim dnom koja sadrži 10 mL metanola. Odvojeni rastvor koji sadrži 1 molarni ekvivalent (1.18 g) 6-hidroksi-2-naftojske kiseline u 5 mL metanola zatim je u kapima dodavan u bocu sa okruglim dnom i reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Materijal je filtriran sledećeg dana i ispran sa metanolom (5 mL). Obnovljena čvrsta supstanca je sušena na vazduhu i zatim prebačena u vakuumsku pećnicu gde je dalje osušena preko noći na 50°C. (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) )-1,3-

4

dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristal je dobijen kao bela čvrsta supstanca. Ovaj oblik je utvrđen XRPD-om da je kristalan.

[0189] Ovaj materijal je analiziran od strane XRPD i DSC. XRPD uzorka materijala dala je difrakcioni obrazac kao što je prikazano na Slici C. (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4, 3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojska kiselina (1: 1) karakteriše se najmanje jednim vrhom sa vrednošću 2θ od 19,5° ili 12,5°, mereno korišćenjem CuKα zračenja. Deset najistaknutijih vrhova XRPD prikazano je u Tabeli B.

Tabela B - Deset najistaknutijih XRPD vrhova za (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi)etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristala Oblika A

pri čemu su 2-teta vrednosti /- 0.2°.

Analiza diferencijalnog skeniranja kalorimetrije (DSC) (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidina -4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristalnog oblika A pokazuje toplotnu endotermu sa početkom od 186,3°C i vrhom na 188,3°C. Trag DSC je prikazan na Slici D.

4

[0190] Ko-kristali se mogu definisati u smislu ΔpKa, tj. (pKa (baza)- pKa (kiselina)). Ako je ΔpKa <1, API: kompleks molekula koformera klasifikovan je kao ko-kristal. (Regulatory Classification of Pharmaceutical Co-Crystals, US FDA Guidance, April 2013). PKa za osnovni centar na piperazinonu u Jedinjenju A određen je da iznosi 4,8, a pKa za ko-bivši molekul 6-hidroksi-2-naftojske kiseline 4,3, što daje ΔpKa <1 i stoga je u skladu sa formiranjem ko-kristala.

[0191]<13>C unakrsna polarizacija magnetnog magičnog ugla koji se spinuje čvrstoće NMR analiza je izvedena na finalnom proizvodu iz primera 1.1, (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4 , 3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on i 6-hidroksi-2-naftojska kiselina. Spektri su prikazani na Slici F. Donji spektri na Slici F (tj. Proizvoda iz Primera 1.1) nije bio suma spektara (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi -[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on (srednji spektri) bivši (top spektar). U gornjim spektrima došlo je do vrha na oko 172 ppm, pripisanom potpuno protonisanoj karboksilnoj kiselini u ko-bivšem. (Ako karboksilna kiselina u kobivšem nije protonirana, tada bi se očekivao maksimum na 177 ppm, a ne na 172 ppm). U srednjim spektrima je došlo do vrha pri oko 169 ppm pripisanoj karbonilu u (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3- b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on. U spektrima za proizvod iz Primera 1.1, u karbonilskom regionu su bila 3 pika koja nisu u skladu sa vrhovima u gornjem ili srednjem spektru. Štaviše, u ovom spektru nije bilo vrhunca na 177 ppm. Takav vrh bi se očekivao da bude prisutan ako suverena karboksilna kiselina nije protonirana i indikativno je da je proton premešten između ko-bivše i slobodne baze i formirane soli. Odsustvo ovog vrha je u skladu sa formiranjem kokristala.

[0192]<15>N unakrsna polarizacija magičnog ugla spinovanja čvrstog stanja NMR analiza je izvedena na finalnom proizvodu iz Primera 1.1. Spektri su zabeleženi u kontaktnim vremenima od 2 ms i 200 ms i prikazani su na Slici G. Spektar zabeležen sa dužim vremenom kontaktiranja bio je u skladu sa najmanje 8 različitih azotnih okruženja u ko-kristalu, dok u kraćem vremenu kontakta nisu primećeni pikovi. To je bilo u skladu ni sa jednim atomom azota koji pokazuje snažnu dipolarnu vezu sa protonom, kao što bi bio slučaj ako je proton u potpunosti prebačen između konformera i baze kako bi se posmatralo za so.

4

[0193] Stehiometrija (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4- fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: ko-kristal 6-hidroksi-2-naftojske kiseline je određena protonomskim NMR. Materijal je izazvao NMR spektar kao što je prikazano na Slici H. Stoihometrija je određena integracijom rezonance koja je nastala zbog (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on, na primer korišćenjem rezonance pri 6,85 ppm (2H) i upoređivanjem sa rezonancom usled 6-hidroksi-2-naftojske kiseline, na primer korišćenjem rezonance na 8,46 (1H) i određivanjem odnosa između vrhova, omogućavajući broj protona koji dovode do rezonantnog signala. Stoihometrija (molski odnos) je određena kao 1: 1.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 1.22 (3H, d), 1.62 (2H, qd), 1.82 (2H, d), 2.63 - 2.79 (3H, m), 2.81 (3H, s), 2.85 - 3.09 (4H, m), 3.13 (1H, q), 3.20 - 3.28 (2H, m), 4.03 (2H, t), 4.17 (3H, s), 4.28 (2H, d), 6.85 (2H, d), 7.12 - 7.21 (4H, m), 7.29 (1H, d), 7.75 (1H, d), 7.83 - 7.89 (2H, m), 7.96 (1H, d), 8.47 (1H, s), 10.15 (1H, bs), 12.81 (1H, bs)

[0194] Stoga su,<1>H NMR,<13>C i<15>N čvrsto stanje NMR i ΔpKa, na koje se misli u prethodnom tekstu, bili konzistentni sa formiranjem Jedinjenja A:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1:1) ko-kristala.

Primer 1.2. Pripremanje (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on:6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika A

[0195] 4-(1-(3-metoksi-[l, 2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenol (0,818 kg, 2,34 mol) je pomešan sa ADDP (1,19 kg, 4,67 mol) i DCM (9,8L, 150 mol) i mešan na oko 10°C. Tributil fosfin (0.98 kg, 47.6 mol) je dodavan porciono u reakcionu smešu tokom 30 minuta i zatim je mešano 30 minuta. Zatim je u kapima dodat rastvor (R)-4-(2-hidroksietil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on (0,503kg, 2,80 mol) u DCM (1,64L, 25,6mol) i reakciona smeša je mešana 24 sati.

[0196] Reakciona smeša je zatim filtrirana pranjem pomoću DCM da bi se uklonio nusproizvod ADDR. Filtrat je mešan vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline i odbačen je donji organski sloj. Vodeni sloj je dalje ispran DCM i donji organski sloj je odbačen.

Vodeni rastvor je zatim bazifikovan sa Na2CO3do pH 9-10 i ekstrahovan sa DCM. DCM sloj je dodatno ispran vodom i uparen i azeotropiran sa metanolom kako bi se uklonio ostatak vode kako bi se priuštio sirov materijal. Sirovi materijal je rastvoren u metanolu (7.5L, 190 mol) i zagrejan na 60°C u sudu 1.6-hidroksinaftalen-2-karboksilna kiselina (0.360kg, 1.87ml) je rastvorena u metanolu (3.8L, 94mol) u sudu 2.10% rastvora iz posude 2 je zatim dodato u posudu 1 u kapima tokom 10 minuta. Temperatura posude 1 održavana je na približno 60°C.

[0197] Jedinjenje A: 6-hidroksi-2-naftojska kiselina (1: 1) ko-kristal semenskog materijala (1.2 g, 0.0018 mol), koji se može napraviti kako je opisano u Primeru 1.1, dodat je u posudu 1, a temperatura zadržana na 60°C oko 1 sat. Preostali sadržaj posude 2 zatim je dodan u posudu 1 u kapima tokom približno 16 sati. Rezultujuća suspenzija je ohlađena do sobne temperature tokom 5 sati, a zatim filtrirana i isprana sa metanolom. Obnovljena čvrsta supstanca se osuši u vakuumskoj pećnici na 50°C da se dobije (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristal (prinos 56,45%).

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) ä ppm 1.43 (d, J=7.00 Hz, 3 H) 1.54 - 1.69 (m, 2 H) 1.80 (d, J=11.36 Hz, 2 H) 2.74 (tt, J=12.06, 3.41 Hz, 1 H) 2.84 (s, 3 H) 2.91 - 3.03 (m, 2 H) 3.25 -3.63 (m, 6 H) 3.83 (d, J=6.88 Hz, 1 H) 4.10 - 4.34 (m, 7 H) 6.89 (d ,J=8.69 Hz, 2 H) 7.09 -7.22 (m, 4 H) 7.28 (d, J=10.34 Hz, 1 H) 7.72 (d, J=8.72 Hz, 1 H) 7.79 - 7.88 (m, 2 H) 7.92 (d, J=8.88 Hz, 1 H) 8.44 (d, J=0.63 Hz, 1 H) 10.12 (br. S., 1H). m/z (ES+), [M+H]+ = 480.

Oblik je određen kao kristalni pomoći XRPD.

Priprema 4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenola [0198] 3-hloro-6-hidrazinilpiridazin (0.753kg) pomešan je sa tetrametoksimetanom (8.231 mol, 1.22 kg) u metanolu (5.7L) i mešan. Dobijena smeša je zatim zagrejana i mešana na 55°C tokom 2 sata. Nakon hlađenja do 45°C, dodat je 4- (piperidin-4-il) fenol hidrobromid (pripremljen kako je gore opisano) (1.000kg, 3.874 mol). DIPEA (2.03L, 11.6mol) je zatim u kapima dodavana tokom perioda od oko 10 minuta i reakcija je dalje mešana. Dodat je metanol (5.1L, 126 mol) i reakciona smeša je mešana najmanje 48 sati na približno 45°C. Smeša je filtrirana i filtrat je ispran sa metanolom i vodom. Izolovana čvrsta supstanca se osuši u vakuumskoj pećnici na približno 50°C, dajući 4- (1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4 -il) fenol (65% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.59 (2H, qd), 1.81 (2H, d), 2.67 (1H, ddt), 2.9 - 3.02 (2H, m), 4.17 (3H, s), 4.23 - 4.31 (2H, m), 6.63 - 6.71 (2H, m), 7.02 (2H, dd), 7.29 (1H, d), 7.84 (1H, d), 9.14 (1H, s). mlz ES+ [M+H]+ 326

1

[0199] (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) )-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojska kiselina (1: 1) ko-kristal je analiziran pomoću XRPD i DSC. XRPD uzorka materijala dala je obrazac difrakcije prikazan na Slici 1. (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3 -b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) najmanje jednim vrhom sa vrednosti 2θ od 19,4° ili 12,5°, mereno korišćenjem CuKα zračenja. Deset najistaknutijih vrhova XRPD prikazano je u Tabeli C.

Tabela C - Deset najistaknutijih XRPD vrhova za (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika A

pri čemu su 2-teta vrednosti /- 0.2°.

Analiza kalorimetrije diferencijalnog skeniranja (DSC) (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidina -4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristalnog Oblika A pokazuje toplotnu endotermu sa početkom od 184,9°C i vrhom na 187,9°C (Slika J).

Tako je DSC analiza pokazala da je (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4- il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: ko-kristal 6-hidroksi-

2

2-naftojske kiseline (1: 1) Oblik A je čvrsta supstanca koja se topi sa pojavom topljenja u rasponu od 163 -186°C i vrhom u opsegu od 169-188°C.

Primer 1.1A-Materijal napravljen u ponovljenoj pripremi rute opisane u Primeru 1.1, rezultirao je u daljem obliku, Obliku B. Ovaj oblik je utvrđen da je kristalan pomoću XRPD.

[0200] XRPD uzorka materijala dao je difrakcioni obrazac kao što je prikazano na Slici K. (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4, 3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojska kiselina (1: 1) ko-kristal Oblika B odlikuje se najmanje jednim vrhom na 2θ vrednosti od 15.2 ° ili 6.1 °, mereno korišćenjem CuKα zračenja. Devet najistaknutijih vrhova XRPD prikazani su u Tabeli D.

Tabela D - Devet najistaknutijih XRPD vrhova za (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika B

pri čemu su 2-teta vrednosti /- 0.2°.

Analiza kalorimetrije diferencijalnog skeniranja (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidina -4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika B pokazuje toplotnu endotermu sa početkom od 169,3°C i vrhom na 172,7°C. Trag DSC je prikazan na Slici L<.>

Primer 1.3: Priprema (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4- il) fenoksiletil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: ko-kristala 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1), oblik C.

[0201] Uzorak (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4 -il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika A analiziran je vrućim stadijumom XRPD koristeći Bruker D8 napredni difraktometar. Uzorak je zagrejan na 210°C sa difraktogramima prikupljenim na svaka 3°C.

[0202] Uzorak je zatim ohlađen na 25°C na 10 C/min, a nakon otvaranja faze uzorka na kraju eksperimentalnog materijala primećen je sublimiran i sakupljen na nožnom snopu difraktometra kao beli prašak. Ovaj beli prah je sakupljen i analiziran i pokazao se kao različit kristalni oblik, Oblik C. Ovaj oblik je utvrđen da je kristalan pomoću XRPD.

[0203] XRPD uzorka materijala dao je difrakcioni obrazac kao što je prikazano na Slici M. (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4, 3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika C koji se karakteriše najmanje jednim vrhom sa vrednošću 2θ od 8,2° ili 24,8°, mereno korišćenjem CuKα zračenja. Sedam najistaknutijih vrhova XRPD prikazani su u Tabeli E.

Tabela E - Sedam najistaknutijih XRPD vrhova za (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) ko-kristala Oblika C

4

pri čemu su 2-teta vrednosti /- 0.2°.

Analiza kalorimetrije diferencijalnog skeniranja (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidina -4-il) fenoksi) etil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on: ko-kristala 6-hidroksi-2-naftojske kiseline (1: 1) Oblika C pokazuje toplotnu endotermu sa početkom od 156,8°C i vrhom na 160.5°C. Trag DSC je prikazan na Slici N.

Primer 2: Priprema 1 -((3S, 5R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il )piperidin-4-il)fenoksiletil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanona

[0204]

[0205] DIPEA (1.455 mL, 8.36 mmol) doda se u 1 - ((3S, 5R)-3,5-dimetil-4- (2-(4-(piperidin-4-il) fenoksi) etil) piperazin-1-il ) etanon (1.502 g, 4.18 mmol) i 6-hloro-3-metoksi-[l, 2,4]triazolo [4,3-b]piridazina (dobijenog kao što je opisano u Primeru 1, priprema počenih materijala)(1.003g, 5,43 mmol) u DMF (15 mL). Dobijeni rastvor je mešan na 80°C tokom 18 sati i uparen do suva. Sirovi proizvod je prečišćen jonskom hromatografijom razmene pomoću SCX kolone. Željeni proizvod je eluiran iz kolone pomoću 1M NH3/MeOH i uparen do suvog da se dobije smeđa guma. Ovo je dalje prečišćeno pomoću fleš silikatne hromatografije, gradijent elucije od 0 do 10% 7M NH3/MeOH u EtOAc. Čiste frakcije su isparene do suvog da se dobije 1-((3S, SR)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin- 6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon (0,991 g, 46,7%) kao kremasta pena.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 100 °C) 1.06 - 1.1 (6H, m), 1.69 (2H, qd), 1.91 (2H, d), 1.97 (3H, s), 2.56 - 2.68 (4H, m), 2.78 (1H, tt), 2.99 (2H, t), 3.06 (2H, td), 3.84 (2H, br s), 4.00 (2H, t), 4.21 (3H, s), 4.27 (2H, d), 6.83 - 6.88 (2H, m), 7.14 - 7.19 (3H, m), 7.74 (1H, d). m/z: ES+ [M+H]+ 508

[0206] 1-((3S,SR)-3,5-dimetil-4-(2-(4-(piperidin-4-il)fenoksi)etil)piperazin-1-il)etanon korišćen kao početni materijal je pripremljen kao što sledi:

Priprema benzil 4-(4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilata

[0207]

[0208] Benzil hloroformat (5.97 mL, 41.84 mmol) je dodat u 4-(piperidin-4-il) fenol hidrobromid (dobijen kao što je opisano u Primeru 1, pripremanje polaznih materijala) (9 g, 34.86 mmol) i DIPEA (14.57 mL, 83.67 mmol) u DCM (150 mL). Nastala suspenzija je mešana 2 sata. Reakciona smeša se ispere sekvencijalno vodom (2 x 100 mL) i 1 M vodenom limunskom kiselinom (100 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i uparen da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijentom elucije od 0 do 5% MeOH u DCM. Čiste frakcije su isparene do suvog da se dobije benzil 4-(4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilat (7.89 g, 72.7%) kao bezbojna guma koja se očvršćava stojeći.1HNMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.43 (2H, qd), 1.71 (2H, d), 2.57 (1H, tt), 2.79 - 2.93 (2H, m), 4.11 (2H, d), 5.08 (2H, s), 6.64 - 6.69 (2H, m), 6.98 - 7.02 (2H, m), 7.28 - 7.33 (1H, m), 7.34 - 7.4 (4H, m), 9.10 (1H, s). m/z: ES+ [M+H]+ 312

Priprema benzil 4-(4-(2-hloroetoksi)fenil)piperidin-1-karboksilata

[0209]

[0210] U benzil 4-(4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilat (5,322 g, 17,09 mmol) i kalijum karbonat (4,72 g, 34,18 mmol) u MeCN (80 mL) dodat je 1-bromo-2-hloroetan (2,134 mL, 25,64 mmol). Dobijena smeša je mešana na 85°C tokom 18 sati. Reakcija je bila nepotpuna i dodat je kalijum karbonat (4.72 g, 34.18 mmol) i 1-bromo-2-hloroetan (2.134 mL, 25.64 mmol) i smeša je mešana na 85°C u toku dodatnih 48 sati. Reakcija je pokazala određeni napredak do ~50% završetka. Reakcija je bila nepotpuna, pa je temperatura povećana na 95°C i reakciona smeša je mešana još 24 sata. Reakciona smeša je uparena do suvog i ponovo rastvorena u EtOAc (200 mL) i isprana sekvencijalno vodom (2 x 100 mL) i zasićenim rastvorom soli (100 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i uparen da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijentom elucije od 0 do 5% MeOH u DCM. Čiste frakcije su isparene do suvog da se dobije benzil 4-(4-(2-hloroetoksi) fenil)piperidin-1-karboksilat (3,30 g, 51,7%) kao bledo žuta guma. 1H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.47 (2H, qd), 1.73 (2H, d), 2.64 (1H, tt), 2.81 - 2.95 (2H, m), 3.90 (2H, dd), 4.12 (2H, d), 4.20 (2H, dd), 5.08 (2H, s), 6.85 - 6.9 (2H, m), 7.12 - 7.17 (2H, m), 7.28 - 7.34 (1H, m), 7.34 - 7.4 (4H, m). m/z: ES+ [M+H]+ 374

Priprema benzil 4-(4-(2-((2S,6R)-4-acetil-2,6-dimetilpiperazin-1-il)etoksi)fenil)piperidin-1-karboksilata

[0211]

[0212] DIPEA (3,05 mL, 17,49 mmol) je dodat benzil 4-(4-(2-hloroetoksi) fenil)piperidin-1-karboksilatu (2,18 g, 5,83 mmol), 1-((3S, 5R) dimetilpiperazin-1-il) etanon (1.366 g, 8.75 mmol) i kalijum jodidu (0.968 g, 5.83 mmol) u DMA (25 mL). Dobijena smeša je mešana na 125°C tokom 18 sati. Reakciona smeša je uparena do suvog i ponovo rastvorena u EtOAc (250 mL) i isprana sekvencijalno vodom (200 mL) i zasićenim rastvorom soli (200 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i uparen da bi se dobio sirovi proizvod. Ovo je prečišćeno fleš silićkom hromatografijom, gradijentom elucije od 0 do 4% 7M NH3/MeOH u DCM. Čiste frakcije su isparene do suvog da bi se dobio benzil 4-(4-(2-((2S, 6R)-4-acetil-2,6-dimetilpiperazin-1-il) etoksi) fenil)piperidin-1-karboksilat (2.180 g , 76%) kao smeđa guma.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 100 °C) 1.06 - 1.1 (6H, m), 1.51 (2H, qd), 1.76 - 1.83 (2H, m), 1.97 (3H, s), 2.57 - 2.72 (5H, m), 2.93 (2H, td), 2.99 (2H, t), 3.85 (2H, br s), 4.00 (2H, t), 4.14 (2H, d), 5.12 (2H, s), 6.83 - 6.87 (2H, m), 7.1 - 7.15 (2H, m), 7.27 - 7.33 (1H, m), 7.34 - 7.38 (4H, m). m/z: ES+ [M+H]+ 494

Priprema 1-((3S,SR)-3,5-dimetil-4-(2-(4-(piperidin-4-il)fenoksi)etil) piperazin-1-il)etanona

[0213]

[0214] Benzil 4-(4-(2-((2S, 6R)-4-acetil-2,6-dimetilpiperazin-1-il) etoksi) fenil)piperidin-1-karboksilat (2.18 g, 4.42 mmol) i 10% paladijum na ugljeniku (0,470 g, 0,44 mmol) u MeOH (45 ml) su mešani u atmosferi vodonika 5 sati. Smeša je zatim filtrirana i isparena do suvog da se dobije 1–((3S, SR)-3,5-dimetil-4- (2-(4-(piperidin-4-il) fenoksi) etil) piperazin-1-il ) etanon (1.502 g, 95%) kao bledo žuta guma.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 100 °C) 1.07 - 1.1 (6H, m), 1.48 (2H, qd), 1.70 (2H, d), 1.97 (3H, s), 2.5 - 2.66 (7H, m), 2.99 (2H, t), 3.01 - 3.07 (2H, m), 3.85 (2H, br s), 4.00 (2H, t), 6.82 - 6.86 (2H, m), 7.09 - 7.13 (2H, m). m/z: ES+ [M+H]+ 360

[0215] 1-((3S,5R)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanon korišćen kao početni materijal je pripremljen kao što je dalje opisano:-

Priprema N-acetil-N-(2-(trifluorometil)fenil)acetamida

[0216]

[0217] Acetil hlorid (132 mL, 1861.91 mmol) je dodat u kapima tokom 30 minuta do 2-(trifluorometil) anilina (100 g, 620.64 mmol) i piridina (200 mL, 2482.55 mmol) u toluenu (500 mL) ohlađen do 0°C. Reakcija je zagrevana na 50°C i mešana 20 sati. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature i isprana dva puta sa 1M vodenom limunskom kiselinom (250 mL). Sirova smeša proizvoda je zatim isparena do polovine zapremine i tretirana heptanom (500 mL). Dobijena suspenzija je mešana na 5°C tokom 4 sata, a zatim se precipitat prikuplja filtracijom, ispran heptanom (500 mL) i osušen pod vakuumom. Ovo je dalo N-acetil-N- (2-(trifluorometil) fenil) acetamid (93 g, 59.1%) kao svetlo smeđu čvrstu supstancu.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 2.18 (6H, s), 7.58 - 7.93 (4H, m). m/z: ES+ [M+H]+ 246

Priprema 1-((3R,SS)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanona

[0218]

[0219] N-acetil-N-(2-(trifluorometil) fenil) acetamid (13.28 g, 52.54 mmol) je dodat u 2R, 6S-2,6-dimetilpiperazin (5 g, 43.79 mmol) u EtOH (75 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 24 sata. Ovo je zatim upareno do suvog, ponovo rastvoreno u DCM (25 mL) i isprano sa 2 M vodenom HCl (25 mL). Vodeni rastvor je zatim bazifikovan na pH 14 sa koncentrovanim vodenim NaOH i ekstrahovan sa DCM (2 x 25 mL). Kombinovane organske materije su isparene do suvog da se dobije žuta tečnost. Ovo je prečišćeno pomoću fleš silikatne hromatografije, gradijent elucije od 0 do 10% 7M NH3/MeOH u DCM. Čiste frakcije su isparene do suvog da se dobije 1-((3S, SR)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon (4,00 g, 66,7%) kao bledo tanko ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 100 °C) 0.98 (6H, d), 1.78 (1H, br s), 1.96 (3H, s), 2.26 (2H, br s), 2.58 - 2.68 (2H, m), 3.94 (2H, br s).

Primer 3 : Priprema (R)-4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)propil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on

[0220]

[0221] U 6-hloro-3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin (dobijen kao što je opisano u Primeru 1, priprema početnih materijala) (350 mg, 1.90 mmol) doda se trietilamin (0,396 mL, 2,84 mmol) i (R)-1,3-dimetil-4-(3-(4-(piperidin-4-il) fenoksi) propil) piperazin-2-on (655 mg, 1,90 mmol) u DMF (10 mL) i smeša je zagrevana do 56°C tokom 5 sati. Sirovi proizvodni rastvor je prečišćen jonizacionom hromatografijom koristeći SCX kolonu. Željeni proizvod je eluiran iz kolone pomoću 7M NH3/MeOH i uparen do suvog da se dobije smeđa guma. Ovo je dalje prečišćeno fleš silika hromatografijom, gradijentom elucije od 0 do 10% MeOH u DCM. Čiste frakcije su isparene do suvog da bi se dobilo (R)-4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin -4-il) fenoksi) propil)-1,3-dimetilpiperazin-2-on (140 mg, 14.96%) kao braon pena.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C); 1.20 (3H, d), 1.64 (2H, m), 1.86 (4H, m), 2.45 (2H, m), 2.72 (2H, m), 2.82 (3H, s), 3.00 (4H, m), 3.25 (2H, m), 3.98 (2H, tr), 4.19 (3H, s), 4.30 (2H, m), 6.87 (2H, dd), 7.17 (2H, dd), 7.30 (1H, d), 7.86 (1H, d). m/z ES+ [M+H]+ = 494

[0222] (R)-1,3-dimetil-4-(3-(4-(piperidin-4-il)fenoksi)propil)piperazin-2-on korišćen kao početni materijal je pripremljen kako je dalje opisano:-Priprema terc-butil 4-(4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilata

[0223]

[0224] Sporo dodat je trietilamin (23.76 mL, 170.44 mmol) u 4- (piperidin-4-il) fenol hidrobromid (dobijen kao što je opisano u Primeru 1, pripremanje polaznih materijala) (40 g, 154.95 mmol) u DCM (190 mL) na 0°C. Dobijena smeša je mešana 20 minuta, a zatim dodat di-terc-butil dikarbonat (35.5 g, 162.69 mmol). Ledeno kupatilo je uklonjeno i reakcija je mešana na temperaturi okoline tokom 2 sata. Reakciona smeša se ispere sekvencijalno vodom (2 x 200 mL) i zasićenim rastvorom soli (200 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i uparen da bi se dobio sirovi proizvod. Čvrsta supstanca je podignuta u MTBE (150 mL) ujednačena i osušena 2 sata. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana sa heptanom (200 mL) i osušena pod vakuumom da se dobije terc-butil 4- (4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilat (36.0 g, 84%) kao kremasto beli tvrdi proizvod.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 27 °C) 1.40 (9H, s), 1.44 (2H, d), 1.68 (2H, d), 2.49 - 2.59 (1H, m), 2.76 (2H, s), 4.03 (2H, d), 6.63 - 6.7 (2H, m), 6.96 - 7.04 (2H, m), 9.13 (1H, s). m/z [ES-] M-= 276

Priprema terc-butil 4-(4-(3-hloropropoksi)fenil)piperidin-1-carboksilat

[0225]

[0226] U mešani rastvor terc-butil 4- (4-hidroksifenil)piperidin-1-karboksilata (9.99 g, 36.02 mmol) u MeCN (200 mL) dodat je 1-bromo-3-hloropropan (14.27 mL, 144.07 mmol) i kalijum karbonat (19.91 g, 144.07 mmol). Reakcija je mešana na 80 °C tokom 16 sati.

Reakciona smeša je razblažena vodom (125 mL) i ekstrahovana sa DCM (200 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i uparen, dajući terc-butil 4-(4-(3-hloropropoksi) fenil)piperidin-1-karboksilat (12.75 g, 100%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3, 30 °C) 1.48 (9H, s), 1.54 - 1.65 (2H, m), 1.79 (2H, d), 2.20 (2H, d), 2.59 (1H, tt), 2.78 (2H, t), 3.56 (2H, t), 4.02 - 4.13 (2H, m), 4.23 (2H, d), 6.8 - 6.87 (2H, d), 7.03 - 7.17 (2H, d).

Priprema (R)-terc-butil 4-(4-(3-(2,4-dimetil-3-oksopiperazin-1-il)propoksi) fenil)piperidin-1-karboksilata

[0227]

[0228] DIPEA (28,2 mL, 162,13 mmol) je dodat u suspenziju (R)-1,3-dimetilpiperazin-2-on hidrohlorida (7.12 g, 43.23 mmol), terc-butil 4- (4-(3-hloropropoksi) fenil)piperidin-1-karboksilat (12.75 g, 36.03 mmol) i kalijum jodid (5.98 g, 36.03 mmol) u DMA (100 mL). Rastvor je zagrevan do 120°C tokom 24 sata. Reakciona smeša je razblažena vodom (200 mL) i ekstrahovana sa DCM (200 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i

1

uparen da bi se dobio sirovi proizvod. Ovo je prečišćeno pomoću fleš silikatne hromatografije, eluiranjem sa 10% MeOH u EtOAc. Čiste frakcije su isparene do suvog da bi se dobilo (R)-tert-butil 4-(4-(3-(2,4-dimetil-3-oksopiperazin-1-il) propoksi) fenil)piperidin-1-karboksilat (15,50 g , 97%) kao smeđe ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.19 - 1.22 (3H, d), 1.42 (9H, s), 1.71 (2H, d), 1.8 - 1.9 (2H, m), 1.96 (2H, s), 2.37 - 2.49 (1H, m), 2.60 (1H, ddt), 2.80 (5H, d), 2.93 - 3.05 (4H, m), 3.2 - 3.28 (2H, m), 4.05 (2H, dd), 6.8 - 6.9 (2H, m), 7.12 (2H, dd). m/z ES+ [M+H]+ = 446

Priprema 1(R)-1,3-dimetil-4-(3-(4-(piperidin-4-il)fenoksi)propil)piperazin-2-one [0229]

[0230] U suspenziju (R)-terc-butil 4-(4-(3-(2,4-dimetil-3-oksopiperazin-1-il) propoksi) fenil)piperidin-1-karboksilata (15.5 g, 34.78 mmol) u dioksanu (20 mL), doda se 4,0 M vodoniklorid u dioksanu (34,8 mL, 139,14 mmol) ). Rastvor je mešan na 20°C tokom 2 sata. Reakciona smeša je uparena da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću jonske hromatografije razmene, koristeći SCX kolonu. Željeni proizvod je eluiran iz kolone pomoću 7M NH3/MeOH i čiste frakcije su isparene do suvog da bi se dobilo (R)-1,3-dimetil-4-(3-(4-(piperidin-4-il) fenoksi) propil ) piperazin-2-on (10,50 g, 87%) kao smeđe ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 1.21 (3H, d), 1.73 - 1.93 (6H, m), 2.4 - 2.46 (1H, m), 2.68 - 2.78 (2H, m), 2.80 (3H, s), 2.92 - 3.04 (4H, m), 3.18 (1H, d), 3.22 - 3.27 (2H, m), 3.35 (2H, s), 3.98 (2H, t), 6.89 (2H, d), 7.13 (2H, d), 8.79 (1H, bs). m/z ES+ [M+H]+ = 346

Primer 4 : Priprema 1-((3R,SS)-4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il)fenoksi)propil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanona

[0231]

2

[0232] 4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenolu (dobijen kao što je opisano u Primeru 1, pripremanje polaznih materijala) (0.95 g, 2.92 mmol) dodat je u kapima tributilfosfin (1.441 mL, 5.84 mmol)), 1-((3R, 5S)-4-(3-hidroksipropil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanon (0.751 g, 3.50 mmol) i (E)-diazen-1,2-diilbis (piperidin-1-ilmetanon) (1.473 g, 5.84 mmol) u degasiranoj DCM (20 mL) pod azotom. Dobijena smeša je mešana tokom 90 minuta i zatim filtrirana. Sirovi proizvodni rastvor je prečišćen jonizacionom hromatografijom koristeći SCX kolonu. Željeni proizvod je eluiran iz kolone pomoću 1M NH3/MeOH i uparen do suvog da se dobije bledo smeđa guma. Ovo je dalje prečišćeno pomoću fleš silikatne hromatografije, gradijent elucije od 0 do 10% 7M NH3/MeOH u EtOAc. Čiste frakcije su isparene do suvog da se dobije 1-((3R, 5S)-4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin- 6-il)piperidin-4-il) fenoksi) propil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon (0,868 g, 57,0%) kao bela pena.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 100 °C) 1.04 (6H, d), 1.69 (2H, qd), 1.76 - 1.84 (2H, m), 1.88 - 1.94 (2H, m), 1.96 (3H, s), 2.51 - 2.55 (2H, m), 2.56 - 2.7 (2H, m), 2.74 - 2.82 (3H, m), 3.06 (2H, td), 3.81 (2H, br s), 3.98 (2H, t), 4.21 (3H, s), 4.27 (2H, d), 6.83 - 6.87 (2H, m), 7.13 - 7.18 (3H, m), 7.74 (1H, d). m/z: ES+ [M+H]+ 522

[0233] 1-((3R,SS)-4-(3-hidroksipropil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanon je korišćen kao početni materijal i pripremljen kako je dalje opisano:-

Priprema 1-((3R,SS)-4-(3-hidroksipropil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)etanona

[0234]

[0235] 3-bromopropan-1-ol (6.41 mL, 70.84 mmol) je dodat u 1-((3R, 5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon (dobijen kao što je opisano u Primeru 2, priprema početnih materijala)(6.51 g, 41.67 mmol) i kalijum karbonata (14.40 g, 104.18 mmol) u 2-metil tetrahidrofuranu (40 mL). Dobijena smeša je mešana na 80°C tokom 18 sati, zatim je filtrirana i uparena do suva. Sirovi proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijentom elucije od 0 do 6% 7M NH3/MeOH u DCM. Čiste frakcije su isparene do suvog da se dobije 1-((3R, 5S)-4-(3-hidroksipropil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon (0,749 g, 8,39%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 30 °C) 0.96 - 1.03 (6H, m), 1.39 - 1.5 (2H, m), 1.96 (3H, s), 2.19 - 2.28 (1H, m), 2.28 - 2.36 (1H, m), 2.39 - 2.47 (1H, m), 2.67 -2.77 (3H, m), 3.36 (2H, t), 3.60 (1H, dt), 4.12 (1H, dt), 4.36 (1H, br s).

4

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so

   ili grupa

   i ---- pokazuje mesta vezivanja; R<2>je C1-C4alkil; i n je 2 ili 3.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>grupa

   gde --- pokazuje mesta vezivanja; R<2>je C1-C4alkil; i n je 2 ili 3.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>grupa

   gde --- pokazuje mesta vezivanja; R<2>je C1-C4alkil; i n je 2 ili 3.
4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<1>grupa

   gde --- pokazuje mesta vezivanja; R<2>je C1-C4alkil; i n je 2.
5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je jedinjenje izabrano od 4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil) 3-dimetilpiperazin-2-on; 1-(4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon; 4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) propil) 3-dimetilpiperazin-2-on; i 1-(4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) propil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon.
6. 6. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je jedinjenje izabrano od: (R)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) )-1,3-dimetilpiperazin-2-on (u daljem tekstu: Jedinjenje A); 1-((3S, SR)-4-(2-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) etil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon; (R)-4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) )-1,3-dimetilpiperazin-2-on; i 1-((3R, 5S)-4-(3-(4-(1-(3-metoksi-[1,2,4]triazolo [4,3-b]piridazin-6-il)piperidin-4-il) fenoksi) propil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il) etanon.
7. 7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so od Formule
8. 8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7 Formule (IA)
9. 9. Jedinjenje prema patentnim zahtevima 7 i 8 u kristalnom obliku koji ima XRPD uzorak sa najmanje dva specifična pika na 2-teta = 20,9° i 16,7°, plus ili minus 0,2° 2-teta, mereno korišćenjem CuKα zračenja.
10. 10. Ko-kristal jedinjenja Formule (IA) prema patentnom zahtevu 7, i ko-raniji molekul 6-hidroksi-2-maftojske kiseline.
11. 11. Ko-kristal jedinjenja Formule (IA) prema zahtevu 7 i 6-hidroksi-2-naftojske kiseline koji se mogu dobiti koracima i) mešanje rastvora jedinjenja Formule (IA) u pogodnom rastvaraču sa ko-kristalom 6-hidroksi-2-naftojske kiseline u pogodnom rastvaraču; i ii) sušenje dobijene smeše iz koraka (i) da se dobije čvrsta supstanca.
12. 12. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal prema patentnim zahtevima 10 i 11, za upotrebu kao lek.
13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal prema patentnim zahtevima 10 i 11, za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera kod toplokrvne životinje kao što je čovek .
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili ko-kristal prema patentnim zahtevima 10 i 11 za upotrebu u lečenju karcinoma jajnika, akutne mijeloidne i mešovite leukemije linearnosti (AML), multiplog mijeloma (MM), difuznog velikog B-ćelijskog limfoma (DLBCL), kastrorezistentnog karcinoma prostate (CRPC), krupnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinoma malih celija pluća (SCLC), raka dojke, glioblastoma i neuroblastoma kod toplokrvne životinje kao što je čovek.
15. 15. Farmaceutski sastava koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili ko-kristal prema patentnim zahtevima 10 i 11 i farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač.