RS57267B1 - Postupak za proizvodnju vezikula spoljašnje membrane gram-negativne bakterije bez upotrebe deterdženta - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblasti medicinske mikrobiologije i vakcina. Naročito, pronalazak se odnosi na postupak za pripremu bez upotrebe deterdženta vezikula spoljašnje membrane (OMV) Gram-negativnih bakterija za upotrebu u vakcinama, na OMV koje mogu da se dobiju navedenim postupkom, i na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži takve OMV. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu OMV prema ovom pronalasku kao leka, naročito za upotrebu u postupku za izazivanje imunskog odgovora.

Osnova pronalaska

[0002] Neisseria meningitidis je humani patogen koji izaziva akutni meningitis i septikemiju, sa stopom smrtnosti oko 15% [Girard et al, 2006]. Meningitis serogrupe B predstavlja 30-40% slučajeva meningitisa u Severnoj Americi [Sharip et al, 2006; Kaplan et al, 2006] i do 80% u nekim zemljama Evrope [Trotter et al, 2007; Gray et al, 2006], pa ipak vakcina širokog spektra zaštite još uvek nije dostupna. Efikasne vakcine protiv drugih serogrupa koje su razvijene, zasnivaju se na polisaharidu kapsule konjugovanom sa proteinskim nosačem [Snape et al, 2008]. Ovaj pristup nije bio izvodljiv za serogrupu B, zbog slabe imunogenosti [Morley et al, 2001] i zabrinutosti zbog vakcinacijom-indukovane autoimunosti [Finne et al, 1983]. Do danas, vakcine koje se zasnivaju na vezikulama spoljašnje membrane (OMV) su jedine vakcine koje su uspešno kontrolisale epidemije serogrupe B sa primerima u Norveškoj, Kubi i Novom Zelandu [Bjune et al, 1991; Thornton et al, 2006; Martin et al, 1998; Sierra et al, Fredriksen et al, 1991].

[0003] OMV se oslobađaju sa spoljašnje membrane Gram-negativnih bakterija i sastoje se od dvostrukog sloja fosfolipida (PL) koji sadrži proteine, lipopolisaharid (LPS) i periplazmatske sastojke spoljašnje membrane [Deatherage et al, 2009]. PorA protein je identifikovan kao glavni zaštitni antigen u OMV, ali je on visoko varijabilan među cirkulišućim sojevima serogrupe B, što usložnjava razvoj vakcine [Saukkonen et al, 1989; Martin et al, 2006]. Iz tog razloga je Rijks Instituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM), tj. Nacionalni institut za javno zdravlje i životnu sredinu (Bilthoven, Holandija), razvio OMV vakcinu koja se zasniva na genetski modifikovanim sojevima N. meningitidis koji eksprimiraju višestruke podtipove PorA. Ova multivalentna OMV vakcina je na početku napravljena sa 2 trovalentna soja PorA, koji eksprimiraju ukupno 6 podtipova PorA [van der Ley et al, 1995; Claassen et al, 1996] i pružila je funkcionalnu imunogenost u fazi II kliničkih ispitivanja. Da bi se osigurala pokrivenost sojeva serogrupe B koji globalno cirkulišu, dodat je treći trovalentni soj [van den Dobbelsteen et al, 2007].

[0004] OMV vakcine se tradicionalno pripremaju ekstrakcijom sa deterdžentom (dOMV postupak prečišćavanja) da bi se uklonio LPS i povećalo oslobađanje vezikula. LPS iz N. meningitidis je visoko toksičan, ali rezidualne količine (pribl.1%) su potrebne da održe strukturu vezikule i pomognu imunski odgovor protiv PorA [Arigita et al, 2005; Arigita et al, 2003; Steeghs et al, 2004]. Sa uravnoteženim koncentracijama deterdženta, dOMV postupak prečišćavanja obezbeđuje ove zahteve, međutim postoje krupni nedostaci. Zajedno sa LPS, deterdžent uklanja PL kao i lipoproteine koji doprinose imunogenosti, kao što je protein koji se vezuje za faktor H [Koeberling et al, 2009; Koeberling et al, 2008]. Rezultujući imunski odgovor je usmeren protiv specifičnog podtipa PorA, bez izazivanja unakrsne zaštite [Morley et al, 2001; van der Voort et al, 1996]. pored toga, selektivno uklanjanje LPS i PL menja nativnu strukturu vezikule i pospešuje agregaciju [Holst et al, 2009; Cametti et al, 2008]. Obrada deterdžentom je neophodna za smanjivanje toksičnosti LPS, ali ima štetna sporedna dejstva koja komplikuju razvoj vakcine.

[0005] Postupak za prečišćavanje OMV bez deterdženta zadržava sav LPS, rezultujući ne samo u očuvanoj nativnoj strukturi vezikule, već i u vakcinama koje su inherentno toksične kada se koriste za parenteralnu imunizaciju [Holst et al, 2009]. Opisana su dva postupka za prečišćavanje bez deterdženta. Postupak sa nativnim OMV (nOMV) [Zollinger et al 1979; US 6,558,677] obuhvata slične korake kao dOMV, ali sa korakom ekstrakcije bez deterdženta, a postupak sa OMV u supernatantu (sOMV) [Post et al, 2005; Devoe et al, 1973; Hoekstra et al, 1976] koristi ultrafiltraciju ili ultracentrifugiranje za prečišćavanje spontano oslobođenih OMV iz supernatanta kulture, bez ekstrakcije. nOMV vakcine su proizvele ohrabrujuće rezultate kod životinja i ljudi, ali je visok sadržaj LPS ograničio primenljivost vakcine na intranazalnu primenu [Guthrie et al, 2004; Katial et al, 2002; Saunders et al, 1999; Drabick et al, 1999]. Predklinički podaci o sOMV vakcinama su ograničeni na pojedinačnu studiju na miševima, prikazujući unakrsnu zaštitu od panela sojeva serogrupe B koja nije nađena sa dOMV, međutim potencijalne razlike u toksičnosti i stabilnosti nisu razmatrane [Ferrari et al, 2006]. Postupak sOMV nameće dodatni izazov, budući da proizvodi prinose OMV koji su previše niski za razvoj izvodljivog postupka [Post et al, 2005; Devoe et al, 1973].

[0006] Otkriće lpxL1 mutantnih sojeva na institutu RIVM Bilthoven [van der Ley et al, 2001] obezbedilo je rešenje za problem toksičnosti LPS. Delecija lpxL1 oslabljuje toksičnost LPS, uz očuvanje adjuvantne aktivnosti potrebne za imunski odgovor [Koeberling et al, 2008; van der Ley et al, 2001; Fisseha et al, 2005; van de Waterbeemd et al, 2010].

[0007] Međutim, za klinička ispitivanja ili proizvodnju nOMV/sOMV prema DPP potreban je robustan postupak za proizvodnju koji omogućava povećanje obima proizvodnje, u kome visok prinos zahteva korak ekstrakcije upotrebom EDTA, ali do danas izaziva neželjena dejstva kao što je liza bakterija [Prachayasittikul et al, 2010]. Oslobađanje DNK izazvano lizom je problem za proizvodnju velikog obima, budući da postupci za njeno uklanjanje, kao što je ultracentrifugiranje, imaju ograničen kapacitet.

[0008] Prema tome, budući da se kod postupaka koji su do danas dostupni za pripremu sOMV i nOMV ili javlja problem niskog prinosa i/ili niske čistoće i/ili ograničenosti na laboratorijsku proizvodnju, postoji potreba za poboljšanim postupcima za pripremu bakterijskih OMV, naročito za postupcima industrijskog obima.

Opis pronalaska

[0009] Iznenađujuće, sada je pokazano da OMV mogu da se pripreme bez deterdženta, sa visokim prinosom i visokom čistoćom u postupku koji može da se izvede u bilo kom obimu. Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Prema tome, u prvom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu bez deterdženta bakterijskih vezikula spoljašnje membrane (OMV) za upotrebu u vakcinama, pomenuti postupak obuhvata korake:

a) kultivacije populacije Gram-negativne bakterije do stacionarne faze rasta;

b) u vremenskom trenutku najmanje 1 čas nakon početka stacionarne faze rasta, inkubacije bakterija dobijenih u a), u medijumu koji je podešen na, ili ima pH vrednost višu od pH 8.0 i koncentraciju metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, između oko 1 i 100 mM, za ekstrakciju OMV; i,

c) ponovnog dobijanja OMV koje su ekstrahovane u b), pri čemu ponovno dobijanje sadrži bar uklanjanje bakterija iz OMV.

[0010] Poželjno, vremenski trenutak nakon početka stacionarne faze od oko 1 časa predstavlja vremenski trenutak između 1 i 9 časova, poželjnije između 1 i 8 časova, 1 i 7 časova, 1 i 6 časova, 2 i 5 časova, 2 i 4 časa, 2 i 3.5 časova ili 2.5 i 3.5 časova.

[0011] Poželjno, u bilo kom od postupaka prema pronalasku, OMV se sterilišu, poželjno sterilizacijom filtriranjem, poželjno korišćenjem filtera sa porama manjim od oko 0.3 mikrometra. Poželjno, sterilizacija se izvodi tokom koraka c); gubitak prinosa je značajno smanjen zahvaljujući izvođenju koraka b) prema pronalasku. Sterilizacija filtriranjem, takođe označena i kao sterilna filtracija, ovde se definiše kao filtracija jedinjenja od interesa kroz filter, poželjno sa porama između oko 0.5 i 0.2 mikrometra, tako da filtrat koji sadrži jedinjenje od interesa, ne sadrži nikakav mikroorganizam, ili da je količina mikroorganizma u filtratu snižena do prihvatljivo niskog nivoa.

[0012] Pojam „bez deterdženta“ je ovde poželjno definisan tako da se nikakav deterdžent ne dodaje i/ili koristi tokom koraka ekstrakcije u bilo kom od postupaka prema pronalasku; poželjnije, deterdžent se ne dodaje i/ili koristi uopšte tokom bilo kog od postupaka prema pronalasku. Ako se deterdžent koristi, npr. kao pomoćno sredstvo u postupku u obliku sredstva protiv stvaranja pene, kao što su sredstva protiv stvaranja pene proizvođača Sigma-Aldrich (kat. br. A6426, A5633, A5757, A8011 ili A5758), ili molekuli sa sličnom funkcijom drugih proizvođača, tokom kultivacije populacije, ovo se smatra obuhvaćenim obimom postupka prema pronalasku. Takođe je moguće da su u korišćenom rastvoru u okviru postupka prema predmetnom pronalasku, mali tragovi deterdženta inherentno prisutni, npr. tragovi deterdženta u složenom medijumu za kultivaciju; takvo inherentno prisustvo takođe se smatra obuhvaćenim obimom postupka prema pronalasku.

[0013] Deterdžent je ovde poželjno definisan kao sredstvo, poželjno reagens, koji ima kapacitet surfaktanta i, kada dođe u dodir sa bakterijom, ima kapacitet da ekstrahuje protein iz bakterije. Deterdžent može da bude anjonski, katjonski, nejonski (da ima neto naelektrisanje nula, takođe poznat kao cviterjonski) ili etiloksilat. Poželjno, sredstvo protiv stvaranja pene, tj. sredstvo koje smanjuje i ometa obrazovanje pene u tečnostima industrijskog postupka kao što su sredstva protiv stvaranja pene proizvođača Sigma-Aldrich (kat. br. A6426, A5633, A5757, A8011 ili A5758) ne spada pod definiciju deterdženta. Kultivacija populacije Gram-negativnih bakterija u bilo kom od postupaka prema pronalasku može da se izvede prema bilo kom metodu poznatom stručnjaku u ovoj oblasti. Poželjni medijum za kulturu je hemijski definisani medijum, poželjno kao što je opisano kod Baart et al., 2007. Temperatura može da varira na bilo kojoj temperaturi od oko 30 do oko 40°C. Vrednost pH može da varira na bilo kom pH kao što je pH od oko 5.5 do 8.5. Poželjni uslovi gajenja obuhvataju gajenje na oko 35°C na pH 7.2 sa aeracijom. Kultivacija može da se izvede u nekoliko koraka, uključujući, ali bez ograničenja predkulturu ili kulturu za zasejavanje i glavnu kulturu. Kultivacija može da se izvede u bilo kom obimu, uključujući, ali bez ograničenja, kultivaciju u boci za mućkanje, kultivaciju malog ili velikog obima (uključujući kontinuiranu, diskontinuiranu, diskontinuiranu sa dodavanjem hranljive podloge, ili kultivaciju u čvrstom stanju) u laboratorijskim ili industrijskim fermentorima. Poželjno, zapremina kulture je najmanje oko 10 L, poželjnije najmanje oko 20 L, 40 L, 60 L 80 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 800 L, 1500 L, 5000 L, 10000 L, 20000 L ili 40000 L.

[0014] Populacija bakterija je ovde definisana kao bar dve bakterije, poželjno istog roda i vrste.

[0015] Poželjno, OMV se pripremaju od Gram-negativne bakterije koja ima genetsku modifikaciju koja dovodi do toga da bakterija proizvodi LPS koji je modifikovan tako da ima sniženu toksičnost. Poželjno, Gram-negativna bakterija ima LPS sa sniženom toksičnošću, pri čemu je LPS (ili njegov fragment Lipid A (LA)) modifikovan tako da ima sniženu toksičnost. LPS koji je modifikovan tako da ima sniženu toksičnost se ovde smatra kao LPS koji je modifikovan tako da ima manju toksičnost nego što je toksičnost odgovarajućeg divljeg tipa LPS. Poželjno, modifikovani LPS ima manje od oko 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, ili 0.2% toksičnosti odgovarajućeg divljeg tipa LPS. Toksičnosti divljeg tipa i različitih modifikovanih LPS sa sniženom toksičnošću mogu da se odrede bilo kojim pogodnim testom poznatim u ovoj oblasti. Poželjni test za određivanje toksičnosti, tj. biološke aktivnosti LPS je WEHI test za indukciju TNF-alfa u MM6 ćelijskoj liniji makrofaga [Espevik and Niessen, 1986, J.Immunol.Methods 95: 99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int.J.Cancer 41: 456-461].

[0016] Međutim, dok je poželjno da LPS iz Gram-negativne bakterije (ili njegov fragment LA) ima sniženu toksičnost, dalje je poželjno da LPS zadrži bar deo imunostimulatorne aktivnosti, tj. adjuvantnu aktivnost. Prema tome, LPS sa sniženom toksičnošću iz Gram-negativne bakterije za upotrebu u pronalasku poželjno ima najmanje oko 10, 20, 40, 80, 90 ili 100% imunostimulatorne aktivnosti odgovarajućeg divljeg tipa LPS, pri čemu se imunostimulatorna aktivnost određuje merenjem proizvodnje bar jednog citokina ili ekspresije bar jednog kostimulatornog molekula pri ko-kultivaciji dendritičnih ćelija (DC) sa Gram-negativnim bakterijama koje proizvode LPS sa sniženom toksičnošću kao što je opisano u primeru 3 u WO 2005/107798. Citokin proizveden od strane DC je poželjno odabran od IL12, IL10, TNF-α, IL6 i IL-1β, a kostimulatorni molekul koji eksprimiraju DC je poželjno odabran od CD40 i CD86.

[0017] Gram-negativni LPS koji imaju sniženu toksičnost fragmenta Lipid A, ali su zadržali (deo) adjuvantne aktivnosti, mogu npr. da budu dobijeni iz genetski modifikovanih Gramnegativnih patogena, kao što je prikazano u WO02/09746. Genetski modifikovani Gramnegativni patogeni koji proizvode LPS sa sniženom toksičnošću fragmenta Lipid A koji su zadržali (deo) adjuvantne aktivnosti uključuju npr. Gram-negativne bakterije koje imaju jednu ili više genetskih modifikacija koje smanjuju ili isključuju ekspresiju jednog ili više gena odabranih od lpxL1 i lpxL2 gena ili njihovih homologa (ranije poznatih kao htrB i msbB; videti npr. WO00/26384; US 5,997,881) i lpxK gena koji kodira lipid A 4’-kinazu ili njegovog homologa (videti takođe nastavak teksta); i genetske modifikacije koje utiču na ekspresiju jednog ili više heterologih gena lpxE i pagL. Poželjne genetske modifikacije su modifikacije koje snižavaju ili isključuju ekspresiju jednog ili više gena odabranih od gena lpxL1 i lpxL2 ili njihovih homologa. Poželjni LPS sa sniženom toksičnošću fragmenta Lipid A, koji je zadržao (deo) adjuvantne aktivnosti je LPS opisan u WO00/26384 i to je LPS sa lipidom A koji ima smanjen broj sekundarnih acil lanaca po molekulu LPS u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim LPS molekulom i koji ima bar jedan sekundarni acil lanac vezan za primarni acil lanac na redukujućem kraju glukozamin disaharida; poželjno navedeni lipid A ima isti broj primarnih acil lanaca kao nemodifikovani LPS molekul i/ili navedeni lipid A ima sekundarni acil lanac na primarnom acil lancu na položaju 2 glukozamina na redukujućem kraju glukozamin disaharida i/ili navedeni LPS predstavlja LPS u kome je sekundarni acil lanac lauroil lanac i/ili navedeni lipid A ima fosfoetanolamin vezan za fosfatnu grupu na redukujućem kraju i/ili navedeni lipid A ima molekulsku strukturu:

[0018] Stacionarna faza rasta je ovde definisana kao faza u kulturi u kojoj je brzina rasta usporena kao rezultat iscrpljivanja hranljivih sastojaka i/ili nakupljanja toksičnih proizvoda. Ova faza se npr. dostiže kako bakterije počinju da iscrpljuju izvore specifičnih hranljivih sastojaka koji su prethodno bili dostupni. Stacionarna faza rasta je poželjno period u kulturi u kome je brzina rasta bakterija bliska ili jednaka brzini umiranja bakterija. Poželjno, brzina rasta bakterija je smanjena na ispod 0.1. Poželjnije, brzina rasta bakterija se promenila od između oko 0.3 - 0.5 do ispod 0.1, čak poželjnije od oko 0.40 ± 0.10 čas<-1>(eksponencijalni rast) do 0.00 ± 0.10 čas<-1>(stacionarni rast). Početak stacionarne faze rasta može da odredi stručnjak u ovoj oblasti bilo kojim raspoloživim sredstvima, uključujući, ali bez ograničenja, praćenje bakterijskog rasta sa podesnim merenjem optičke gustine ili merenjima suve težine, ili merenjem iscrpljivanja hranljivih sastojaka kao što su izvori ugljenika, kao glukoza, izvori azota kao što su aminokiseline ili amonijum, ili praćenjem potrošnje kiseonika ili proizvodnje CO2.

[0019] Poželjno, početak stacionarne faze rasta definiše se utvrđivanjem najmanje jednog parametra od maksimalne brzine potrošnje kiseonika i maksimalne brzine proizvodnje CO2. Poželjno je prema tome, da se najmanje jedno od maksimalne brzine potrošnje kiseonika i maksimalne brzine proizvodnje CO2prate kontinuirano najmanje tokom koraka kultivacije.

[0020] Početak stacionarne faze može da bude indukovan pasivno, kao što je slučaj u diskontinuiranoj kulturi kada hranljivi sastojak postane iscrpljen. Početak stacionarne faze može da bude indukovan aktivno, kao u slučaju iscrpljivanja hranljivog sastojka iz medijuma za dopunu u diskontinuiranoj kulturi sa dodavanjem hranljive podloge, promenom pH, ili zaustavljanjem ili smanjivanjem snabdevanja hranljivim medijumom ili kiseonikom. Posle početka stacionarne faze, bakterije se poželjno održavaju pod istim uslovima kulture koji su bili prisutni na početku stacionarne faze, kao što je temperatura, koncentracija kiseonika, mešanje, pH itd. Poželjno, nakon vremenskog trenutka najmanje 1 čas posle početka stacionarne faze rasta kao što je ovde prethodno naznačeno, bakterije ili kultura koja sadrži bakterije hladi se do temperature ispod oko 20°C, poželjnije ispod oko 15°C, 10°C, 8°C, 6°C, poželjnije 5°C, 4°C, 3°C, 2°C, ili ispod oko 1°C. Kada se ohlade, bakterije ili kultura koja sadrži bakterije mogu da se čuvaju na temperaturi ispod 20°C kao što je gore definisano. Bakterije mogu da se čuvaju na ispod -20°C, poželjnije na ispod -80°C, -135°C ili ispod -150°C; međutim, poželjno je da se bakterije ili kultura koja sadrži bakterije ne hlade do temperature koja bi izazvala zamrzavanje (dela) kulture ili bakterija, kao što su npr. temperature ispod 0°C, budući da bi to moglo da izazove lizu bakterija.

[0021] Posle vremenskog trenutka najmanje 1 čas posle početka stacionarne faze rasta kao što je ovde prethodno definisano, dobijene bakterije se inkubiraju u medijumu koji sadrži metalhelirajuće sredstvo, poželjno EDTA, za ekstrakciju OMV. Metal-helirajuće sredstvo može da bude bilo koje metal-helirajuće sredstvo poznato stručnjaku u ovoj oblasti. Poželjno, metalhelirajuće sredstvo je jedno ili najmanje jedno odabrano iz grupe koja se sastoji od poliamino karboksilnih kiselina npr. nitrilotrisirćetne kiseline (NTA), dietilen triamin pentasirćetne kiseline (DTPA), etilen glikol tetrasirćetne kiseline (EGTA), 1,2-bis(o-aminofenoksi) etan-N,N,N’,N’-tetrasirćetne kiseline (BAPTA), etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA). Poželjno, metalhelirajuće sredstvo je EDTA. Inkubacija može da se izvodi u bilo kom obimu. Pronalazak obuhvata inkubiranje bakterija iz nekoliko različitih kultura u jednom medijumu koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, za ekstrakciju OMV. Poželjno, zapremina kulture je najmanje oko 10L, poželjnije najmanje oko 20 L, 40 L, 60 L 80 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 800 L, 1500 L, 5000 L, 10 000 L, 20 000 L ili 40 000 L. Bakterije mogu da budu u kontaktu sa medijumom koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, na bilo koji način poznat stručnjaku u ovoj oblasti. Bakterije mogu, npr. da budu izdvojene iz medijuma kulture centrifugiranjem i da zatim budu dovedene u kontakt sa medijumom koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, npr. resuspendovanjem u medijumu koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA. Poželjno, medijum kulture se postepeno zamenjuje medijumom koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA. Poželjno, dobijene bakterije u kulturi se prvo koncentruju mikrofiltracijom. Poželjno, zapremina kulture se smanjuje 2 puta, poželjnije 3 puta, poželjnije 4 puta, poželjnije 5 puta, poželjnije 6 puta, poželjnije 7 puta, poželjnije 9 puta, poželjnije 10 puta. Koncentrovana bakterijska suspenzija se zatim podvrgava dijafiltraciji. Poželjno, medijum kulture se postepeno zamenjuje puferom koji ima odgovarajuću pH vrednost za ekstrakciju. Dijafiltracija je ovde definisana kao mikrofiltracija sa konstantnom zapreminom, u kojoj se medijum koji sadrži jedinjenje od interesa zamenjuje putem kontinuirane dijalize drugim medijumom, tako da je jedinjenje od interesa nakon dijafiltracije prisutno u drugom medijumu. Na taj način, medijum kulture se tako postepeno zamenjuje drugim pogodnim medijumom, poželjno 100 mM Tris-HCl pH 8.6. Koncentrovanje i dijafiltracija mogu da se sprovedu istovremeno ili uzastopno. Kada se izvode istovremeno, drugi medijum je medijum koji ima odgovarajući pH za ekstrakciju i koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, ili puferski medijum sa odgovarajućim pH kome se odgovarajuća količina metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA dodaje direktno nakon dijafiltracije; poželjno, drugi medijum sadrži pufersko sredstvo kao što je Tris-HCl, u koncentraciji od između oko 10 mM do 250 mM, sa pH višim od oko pH 7.5, poželjno kao što je definisano ispod, kome je dodato između oko 1 mM do 100 mM metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA. Dijafiltracija se poželjno izvodi dok se prvi medijum u potpunosti ne zameni drugim medijumom; ovaj postupak može da traje najmanje 1 čas do 4 časa, ili više. Dijafiltracija može da se izvede korišćenjem bilo koje pogodne membrane poznate stručnjaku u ovoj oblasti. Poželjno, koriste se elementi od šupljih vlakana sa veličinom pora od 0.2 mikrometra.

[0022] Medijum koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, može da bude bilo koji medijum pogodan za ekstrakciju OMV. Poželjno, medijum ne sadrži deterdžent. Poželjno, medijum koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, dodatno sadrži pufersko sredstvo ili smešu puferskih sredstava; primeri puferskih sredstava su, ali nisu ograničeni na Tris i fosfat. Poželjni medijum je 100 mM Tris-HCl; pH 8.6 sa 10 mM EDTA.

[0023] Poželjno, medijum koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, ima koncentraciju metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA između oko 1 i 100 mM. Poželjno, koncentracija je između oko 1 i 50 mM, poželjnije između oko 1 i 25 mM, 2 i 25 mM, 3 i 25 mM, 4 i 25 mM, 5 i 25 mM, ili 5 i 20 mM, i najpoželjnije između oko 5 i 15 mM kao što je oko 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15 mM. Poželjno, metal-helirajuće sredstvo je kao što je definisano ranije u tekstu, poželjnije, metal-helirajuće sredstvo je EDTA. Poželjno, medijum ima poželjnu vrednost koncentracije metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, nakon što se bakterije koncentruju sa medijumom. Koncentracija metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, u medijumu može da bude podešena. Podešavanje može da se izvede tokom bilo kog vremena dovođenja u kontakt bakterija sa medijumom ili tokom inkubacije bakterija u medijumu, i može da se izvede više od jedanput i može da se izvodi kontinuirano i/ili automatski. Stručnjak u ovoj oblasti zna kako da prilagodi koncentraciju metal-helirajućeg sredstva u medijumu, npr. merenjem koncentracije metal-helirajućeg sredstva i dodavanjem odgovarajuće količine metalhelirajućeg sredstva, ili u vidu čvrste supstance ili u vidu rastvora. Kada je metal-helirajuće sredstvo EDTA, EDTA može da bude u bilo kom obliku, npr. kao kiselina ili kao jedna od EDTA soli poznatih stručnjaku u ovoj oblasti, ili kao smeša nekoliko oblika EDTA.

[0024] Poželjno, medijum koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA, ima pH viši od oko pH 7.5. Poželjno, pH medijuma koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA viši je od oko pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.9, pH 9.0, pH 9.1, pH 9.2, pH 9.3, pH 9.4 ili pH 9.5. Poželjnije, pH medijuma je između oko pH 7.5 i pH 9.5, poželjnije između oko pH 8.0 i pH 9.0, poželjnije između oko pH 8.2 i pH 8.8, poželjnije između oko pH 8.4 i pH 8.7. Najpoželjnije, pH medijuma koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA je oko pH 8.6. Poželjno, pH je na poželjnoj vrednosti nakon što su bakterije dovedene u kontakt sa medijumom koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA. Vrednost pH medijuma koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA može da bude podešena. Podešavanje može da se izvede tokom bilo kog vremena dovođenja u kontakt bakterija sa medijumom ili tokom inkubacije bakterija u medijumu, i može da se izvede više od jedanput i može da se izvodi kontinuirano i/ili automatski. Stručnjak u ovoj oblasti zna kako da podesi pH medijuma, npr. merenjem pH i dodavanjem pogodne kiseline ili baze u medijum koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA.

[0025] Poželjni medijum za ekstrakciju OMV je medijum sa pH višim od oko pH 7.5 i u kome je koncentracija metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, između oko 5 i 15 mM; poželjnije, pH je oko pH 8.6 i koncentracija metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, je između oko 5 i 15 mM; poželjno, medijum sadrži Tris-HCl, npr.100 mM kao pufersko sredstvo.

[0026] Posle inkubacije bakterija u medijumu koji sadrži metal-helirajuće sredstvo, poželjno EDTA za ekstrakciju OMV, OMV se ponovo dobijaju bar uklanjanjem bakterija iz OMV. Uklanjanje bakterija iz OMV može da se izvede bilo kojim načinima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti. Primeri postupaka za uklanjanje su, ali bez ograničenja: filtracija pri veličini pora od 0.5-0.2 µm, centrifugiranje, ili bilo kojim drugi postupak za (spontanu) sedimentaciju bakterija. Poželjni metod za uklanjanje bakterija iz OMV je diskontinuirano ili kontinuirano centrifugiranje, u zavisnosti od obima procesa, npr. diskontinuirano centrifugiranje za zapremine do oko 100 L i kontinuirano centrifugiranje za zapremine iznad oko 100 L.

[0027] Nakon ponovnog dobijanja ili istovremeno sa ponovnim dobijanjem, preparat OMV može da bude prečišćen. Prečišćavanje može da obuhvata bilo koje metode poznate stručnjaku u ovoj oblasti. Poželjno se primenjuje najmanje jedan metod iz sledeće grupe: ultrafiltracija kao što je ovde prethodno opisano i/ili dijafiltracija za izmenu medijuma, npr. za uklanjanje metalhelirajućeg sredstva iz ekstrakcionog medijuma i/ili koncentrovanje preparata OMV; degradacija nukleinskih kiselina kao što su dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) i ribonukleinska kiselina (RNA), koja može da se izvede enzimski, korišćenjem jedne ili više pogodnih nukleaza, poželjno upotrebom Benzonase® (Merck, Holandija); klarifikacija filtracijom, poželjno upotrebom filtera sa veličinom pora od između oko 0.5 µM i 1.0 µM; gel-filtracija (kao što je ekskluziona hromatografija; materijal za kolonu Sepharose 6 Fast Flow; OMV se ponovo dobijaju iz praznog volumena kolone); sterilna filtracija kao što je opisano ranije u tekstu. Poželjno, primenjuje se bar sterilna filtracija. Poželjno, primenjuje se više od jednog metoda prečišćavanja. Poželjno, primenjuju se uzastopno sledeći metodi: ultrafiltracija (npr. granična vrednost od 100 ili 300 kDa), dijafiltracija (npr. granična vrednost od 100 ili 300 kDa), enzimska degradacija nukleinskih kiselina, klarifikacija, gel filtracija i sterilna filtracija, mada nije neophodno izvođenje ovim redom. Poželjni postupak prema pronalasku ne uključuje ultracentrifugiranje.

[0028] Degradacija nukleinskih kiselina korišćenjem benzonaze poželjno se izvodi u puferu pH vrednosti 8.4 /- 0.4, koji sadrži između oko 0.1 i 10 U benzonaze/ml i između oko 1 i 10 mM Mg2+ , na 4°C do 37°C tokom 1 do 20 časova.

[0029] Poželjno, u bilo kom od postupaka prema pronalasku, populacija Gram-negativnih bakterija sadrži vrste rodova Neisseria, Bordetella, Haemophilus, Actinobacillus ili Pasteurella; poželjnije vrste rodova Neisseria ili Bordetella; čak poželjnije, populacija Gram-negativnih bakterija sadrži Neisseria lactamica, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis, ili Pasteurella multocida; čak poželjnije Neisseria meningitidis, poželjno serogrupu B Neisseria meningitidis ili Bordetella pertussis.

[0030] Poželjno, populacija Gram-negativnih bakterija sadrži Gram-negativnu bakteriju koja ima jednu ili više mutacija za smanjenje ili isključivanje ekspresije genskog proizvoda. Poželjno, proizvod gena je odabran iz grupe koja se sastoji od cps, ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, exbB, exbD, frpB, galE, htrB, msbB, lpbB, lpxK, lpxL1, nmb0033, opA, opC, rmpM, phoP, pilC, pmrE, pmrF, porA, porB, siaA, siaB, siaC, said, synA, synB, sync, tbpA i tbpB, ili njihovih homologa; mnoge od ovih mutacija su prikazane u WO02/09746. Poželjno, proizvod gena je odabran iz grupe koja se sastoji od cps, genskih proizvoda biosinteze lipida A uključujući lpxL1, rmpM, porA, porB i opA. Poželjno, Gram-negativna bakterija ima najmanje mutacije za smanjenje ili isključivanje ekspresije lpxL1, poželjno kao što je opisano u WO00/26384. Poželjno, Gramnegativna bakterija ima najmanje mutacije za smanjenje ili isključivanje ekspresije i lpxL1 i rmpM. Poželjno, lpxL1 ima najmanje oko 30% identičnosti sekvence, poželjnije najmanje oko 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1. Najpoželjnije, lpxL1 je identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1.

[0031] Poželjno, rpmM ima najmanje oko 30% identičnosti sekvence, poželjnije najmanje oko 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2. Najpoželjnije, rpmM je identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2.

[0032] Poželjno, Gram-negativna bakterija je soj Neisseria meningitidis koji predstavlja kopiju ili derivat Neisseria meningitidis serogrupe B izolat H44/76 [Holten et al, 1979; van den Dobbelsteen et al, 2007].

[0033] Jasno je da su kopije i/ili derivati bilo kog soja prema pronalasku obuhvaćeni pronalaskom. Pojam „kopija“ se odnosi na biološki materijal koji predstavlja suštinski neizmenjenu kopiju materijala, kao što je materijal proizveden rastom mikroorganizama, npr. rastom bakterija u medijumu kulture. Pojam „derivat“ odnosi se na materijal stvoren iz biološkog materijala i koji je suštinski modifikovan tako da ima nova svojstva, na primer izazvana naslednim promenama u genetskom materijalu. Ove promene mogu ili da se dogode spontano ili da budu rezultat primenjenih hemijskih i/ili fizičkih sredstava (npr. mutagenih agenasa) i/ili pomoću tehnika rekombinantne DNK kao što je poznato u stanju tehnike. Kada se upućuje na soj „izveden“ iz drugog soja, podrazumeva se da su i „kopija“ tog soja, kao i „derivati“ soja obuhvaćeni, sve dok izvedeni soj može da se koristi za izazivanje imunskog odgovora protiv Gram-negativne bakterije korišćene u postupku prema pronalasku, kao što je npr. Neisseria meningitidis.

[0034] Procenat identičnosti se ovde poželjno određuje izračunavanjem odnosa broja identičnih nukleotida/aminokiselina u sekvenci podeljenog dužinom ukupnih nukleotida/aminokiselina minus dužine bilo kakvih praznina. Poravnavanje višestrukih DNK sekvenci ovde je izvedeno korišćenjem bilo kog pogodnog programskog paketa za poravnanje sekvenci dostupnog stručnjaku u ovoj oblasti. Najmanja dužina relevantne aminokiselinske sekvence koja pokazuje 30% ili veći stepen identičnosti treba poželjno da bude oko 40 aminokiselina, poželjnije oko 50, 70, 100, 150, 170, 200, 210, 220, 230, 240 ili više aminokiselina, i u slučaju lpxL1 poželjnije oko 50, 70, 100, 150, 170, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 295 ili više aminokiselina. Poželjno, identičnost sekvence se izračunava duž cele sekvence SEQ ID NO: 1 ili 2.

[0035] Ovde će biti podrazumevano da ekspresija obuhvata bilo koji korak uključen u proizvodnju polipeptida uključujući, ali bez ograničenja, transkripciju, post-transkripcionu obradu, translaciju, post-translacionu obradu i izlučivanje.

[0036] Za smanjenje ili isključivanje ekspresije genskog proizvoda kao što je definisano ranije u tekstu, stručnjaku u ovoj oblasti je dostupno mnoštvo poznatih alata. Za stručnjaka u ovoj oblasti izbor odgovarajuće strategije za uvođenje pogodne modifikacije u polinukleotid u cilju smanjenja ili isključivanja ekspresije funkcionalnog genskog proizvoda predstavlja rutinsku praksu. Na primer, postupci za in vitro mutagenezu opisani su kod Sambrook et al. (Molecular cloning, A laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989). Odgovarajući postupci su takođe komercijalno dostupni u obliku kitova (npr., QuickChange kit za mesto-usmerenu mutagenezu proizvođača Stratagene, La Jolla, USA). Delecija polinukleotida može, na primer, da se postigne pomoću tehnologije zamene gena koja je dobro poznata stručnjaku u ovoj oblasti.

[0037] Poželjno, populacija Gram-negativnih bakterija obuhvata više vrsta Gram-negativnih bakterija tako da se višestruki serotipovi antigena eksprimiraju i konačno dospevaju u preparat OMV. Poželjnije, vrsta Gram-negativnih bakterija eksprimira višestruke serotipove antigena. Kada populacija bakterija sadrži Neisseria meningitidis, populacija poželjno sadrži Neisseria meningitidis koja eksprimira višestruke serotipove porA antigena; poželjnije, populacija bakterija sadrži više vrsta Neisseria meningitidis, gde svaka vrsta eksprimira višestruke serotipove porA antigena. Poželjno, populacija Gram-negativnih bakterija sadrži tri trovalentna PorA soja Neisseria meningitidis, koji eksprimiraju ukupno 9 podtipova PorA [van der Ley et al, 1995; Claassen et al, 1996; van den Dobbelsteen et al, 2007].

[0038] Gram-negativna bakterija, koja je poželjno soja Neisseria meningitidis koja predstavlja kopiju ili derivat Neisseria meningitidis serogrupe B izolata H44/76, može da eksprimira antigen koji je strani za navedenu Gram-negativnu bakteriju. OMV pripremljene prema pronalasku pripremljene iz navedene Gram-negativne bakterije će sadržati navedeni strani antigen. Na taj način, OMV prema pronalasku mogu da se koriste kao nosač sa adjuvantnom aktivnošću i mogu pogodno da se koriste za lečenje bolesti ili stanja udruženih sa navedenim stranim antigenom. Antigen koji je strani za Gram-negativnu bakteriju može da bude bilo koji antigen i može da bude jedan ili najmanje jedan odabran iz grupe koja se sastoji od NadA proteina, heparinvezujućeg proteina, površinskog antigena Q-groznice, Chlamydia antigena, pertaktina, toksina pertusisa, antigena od 92 kDa, fim2, fim3, dermonekrotičkog toksina, faktor H-vezujućeg proteina, polisaharida iz Neisseria meningitis serogrupe A, C, W135 ili Y, površinskog antigena Chlamydia, toksoida difterije, oslabljenog ili inaktivisanog polio virusa, toksoida tetanusa, polisaharida Haemophilus influenzae b ili auto-antigena povezanih sa bolestima u koje može da bude uključen autoimunski odgovor kao što ja npr. Alchajmerova bolest i tumorskih antigena.

[0039] Strani antigen može da bude eksprimiran na bilo koji način poznat stručnjaku u ovoj oblasti; poželjno strani antigen je usmeren na OMV. Poželjno, strani antigen ili njegov deo je fuzionisan sa ili sadržan u porA Neisseria meningitidis serogrupe B ili njegovom delu.

[0040] U okviru obima pronalaska, moguće je kultivisati ili drugačije obezbediti nekoliko vrsta Gram-negativnih bakterija, od kojih svaka eksprimira pojedinačni ili višestruki antigeni serotip i ekstrahovati OMV istovremeno iz jedne ili više spojenih populacija navedenih bakterija. Takođe je u okviru obima predmetnog pronalaska ekstrahovanje OMV zasebno iz populacija bakterija, i zatim poželjno spajanje preparata OMV. Takođe je u okviru obima pronalaska kultivacija različitih vrsta Gram-negativnih bakterija zajedno u jednoj, mešanoj populaciji, ili odvojeno u pojedinačnim populacijama, ili čak u kombinaciji pojedinačnih i mešanih populacija.

[0041] Preparat OMV dobijen bilo kojim od postupaka u skladu sa predmetnim pronalaskom može pogodno da se skladišti za buduću upotrebu, ili u liofilizovanom obliku ili u rastvoru, ili zamrznut u rastvoru. U bilo kom od postupaka u skladu sa predmetnim pronalaskom, jedno ili više jedinjenja mogu da se dodaju preparatu OMV kao što je (koloidni) stabilizator, kao što je saharoza, u cilju sprečavanja agregacije i/ili konzervans kao što je tiomersal u cilju sprečavanja rasta mikroorganizama.

[0042] Preparat OMV dobijen bilo kojim od postupaka u skladu sa predmetnim pronalaskom može pogodno da se koristi za pripremu leka, poželjno leka za lečenje meningitisa, poželjno navedeni lek je vakcina protiv infekcije bakterijom Neisseria meningitidis. Prema tome, bilo koji od postupaka u skladu sa predmetnim pronalaskom, može dodatno da obuhvata korak kombinovanja OMV sa farmaceutski prihvaćenim ekscipijensom, kao što je nosač, adjuvans, sredstvo za stabilizaciju, osmotsko sredstvo, pufersko sredstvo i/ili sredstvo za raspršivanje. Dodatno, u bilo kom od postupaka prema predmetnom pronalasku, OMV mogu da se kombinuju sa drugim sredstvom za pripremu mešane vakcine, poželjno sa antigenima koji sadrže proteine spoljašnje membrane iz Neisseria meningitidis serogrupe B, ili iz drugih gram-negativnih patogena, uključujući, ali bez ograničenja NadA protein, heparin-vezujući protein, površinski antigen Q-groznice, pertaktin, toksin pertusisa, antigen od 92k Da, fim2, fim3, dermonekrotički toksin, faktor H-vezujući protein, polisaharide iz Neisseria meningitis serogrupe A, C, W135 ili Y poželjno konjugovane sa pogodnim farmaceutski prihvaćenim proteinskim nosačem, površinski antigen Chlamydia, toksoid difterije, oslabljeni ili inaktivisani polio virus, toksoid tetanusa, polisaharid Haemophilus influenzae b, poželjno konjugovan sa pogodnim farmaceutski prihvaćenim proteinskim nosačem.

[0043] Vakcinacija se primenjuje za profilaktičku zaštitu od patogena ili za lečenje bolesti nakon infekcije patogenom.

[0044] Adjuvansi su ovde definisani tako da uključuju bilo koju supstancu ili jedinjenje koje, kada se koristi u kombinaciji sa antigenom, za imunizaciju subjekta, poželjno sisara, poželjno čoveka, stimuliše imunski sistem, na taj način povećavajući, poboljšavajući ili olakšavajući imunski odgovor protiv antigena, poželjno bez stvaranja specifičnog imunskog odgovora na sam adjuvans. Poželjni adjuvansi poboljšavaju imunski odgovor na dati antigen za najmanje faktor 1.5, 2, 2.5, 5, 10 ili 20, u poređenju sa imunskim odgovorom razvijenim na antigen pod istim uslovima, ali u odsustvu adjuvansa. Testovi za određivanje statistički prosečnog poboljšanja imunskog odgovora na dati antigen proizvedenog od strane adjuvansa u grupi životinja ili ljudi, u odnosu na odgovarajuću kontrolnu grupu, dostupni su u stanju tehnike. Adjuvans je poželjno sposoban da poboljša imunski odgovor na najmanje dva različita antigena.

[0045] Farmaceutski nosač može da bude bilo koja kompatibilna, netoksična supstanca pogodna za dostavljanje aktivnih sastojaka subjektu. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača za intranazalnu dostavu su voda, puferisani fiziološki rastvori, glicerin, polisorbat 20, kremofor EL, i vodena smeša kaprilnog/kapričnog glicerida, i mogu da budu puferisani da bi obezbedili pH neutralno okruženje. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača za parenteralnu dostavu su sterilni puferisani 0.9% NaCl ili 5% glukoza izborno obogaćena 20% albuminom. Preparati za parenteralnu primenu moraju da budu sterilni. Parenteralni put primene aktivnih sastojaka je u skladu sa poznatim metodima, npr. injekcijom ili infuzijom subkutanim, intravenskim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intraarterijalnim ili intralezionalnim putevima.

Kompozicije prema pronalasku se poželjno primenjuju putem bolus injekcije. Za oralnu primenu, aktivni sastojak može da bude primenjen u tečnim doznim oblicima, kao što su eliksiri, sirupi i suspenzije. Tečni dozni oblici za oralnu primenu mogu da sadrže sredstva za bojenje i davanje arome kako bi ih pacijent bolje prihvatio. Postupci za pripremu parenteralno, oralno ili intranazalno primenjivih kompozicija su dobro poznati u struci i opisani u više detalja u različitim izvorima, uključujući, na primer, Remington’s Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980).

[0046] U drugom aspektu, predmetni opis obezbeđuje OMV koje mogu da se dobiju bilo kojim od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska. Poželjno, navedene OMV su neposredno dobijeni proizvod bilo kog od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska.

[0047] Preparat OMV koji može da se dobije bilo kojim od postupaka prema predmetnom pronalasku može pogodno da se upotrebi za pripremu leka, poželjno leka za lečenje meningitisa, poželjno navedeni lek je vakcina protiv infekcije bakterijom Neisseria meningitidis. Poželjno, navedeni preparat OMV je neposredno dobijeni proizvod bilo kog od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži OMV koje mogu da se dobiju bilo kojim od postupaka prema predmetnom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, kao što je nosač, adjuvans, sredstvo za stabilizovanje, osmotsko sredstvo, pufersko sredstvo i/ili sredstvo za raspršivanje, kao što je opisano u prethodnom tekstu. Poželjno, navedene OMV su neposredno dobijeni proizvod bilo kog od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska. Budući da predmetni pronalazak obezbeđuje OMV koje sadrže adjuvantnu aktivnost same po sebi, poželjna farmaceutska kompozicija ne sadrži dodatni adjuvans sem OMV koje sadrže adjuvantnu aktivnost.

[0048] Farmaceutska kompozicija može da se koristi kao vakcina. Vakcina može da se upotrebi za imunizaciju (razvijanje imunskog odgovora) ili vakcinaciju subjekta, poželjno sisara, poželjno čoveka. U farmaceutskoj kompoziciji, OMV mogu da se kombinuju sa drugim antigenom za pripremu mešane vakcine, tj. u kombinaciji sa vakcinama protiv Neisseria meningitidis serogrupe A, C, W135, Y, pneumokokne bolesti, difterije, velikog kašlja, polio virusa, RSV, ili tetanusa.

[0049] Predmetni opis dalje obezbeđuje OMV koje mogu da se dobiju bilo kojim od postupaka prema predmetnom pronalasku za upotrebu kao lek, poželjno u lečenju meningitisa. Poželjno, navedeni lek je vakcina protiv infekcije bakterijom Neisseria meningitidis. Poželjno, navedene OMV su neposredno dobijeni proizvod bilo kog od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska.

[0050] Predmetni opis dalje obezbeđuje upotrebu OMV koje mogu da se dobiju bilo kojim od postupaka prema predmetnom pronalasku za pripremu leka, poželjno za lečenje meningitisa. Poželjno, navedeni lek je vakcina protiv infekcije bakterijom Neisseria meningitidis. Poželjno, navedene OMV su neposredno dobijeni proizvod bilo kog od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska.

[0051] Predmetni opis dalje obezbeđuje postupak za stvaranje imunskog odgovora kod subjekta, poželjno protiv Neisseria meningitidis, koji obuhvata primenu kod navedenog subjekta OMV koje mogu da se dobiju bilo kojim od postupaka prema predmetnom pronalasku ili primenu kod navedenog subjekta farmaceutske kompozicije prema pronalasku, poželjno vakcine protiv infekcije sa Neisseria meningitidis. Poželjno, navedene OMV su neposredno dobijeni proizvod bilo kog od postupaka prema prvom aspektu predmetnog pronalaska.

[0052] Predmetni opis dalje obezbeđuje upotrebu OMV prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku za stvaranje imunskog odgovora kod subjekta, poželjno protiv Neisseria meningitidis, koji obuhvata primenu kod navedenog subjekta OMV prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku.

[0053] U ovom dokumentu i njegovim patentnim zahtevima, glagol „sadržati“ i njegovi oblici se koristi u svom neograničavajućem smislu da označi da su stavke koje ga slede uključene, ali stavke koje nisu specifično navedene nisu isključene. Dodatno, pozivanje na element u jednini ne isključuje mogućnost da je više od jednog elementa prisutno, osim ako kontekst izričito ne zahteva da bude jedan i samo jedan od elemenata. Jednina stoga obično znači „najmanje jedan“. Reč „oko“ ili „približno“ kada se koristi zajedno sa brojčanom vrednošću (npr. oko 10) poželjno označava da vrednost može da bude data vrednost (od 10) plus ili minus 0.1% od vrednosti.

[0054] Informacije o sekvenci kao što su ovde date ne bi trebalo tako usko tumačiti da zahtevaju uključivanje pogrešno identifikovanih baza. Stručnjak u oblasti je u stanju da identifikuje takve pogrešno identifikovane baze i zna kako da ispravi takve greške. U slučaju grešaka u sekvenci, polipeptidna sekvenca koja može da se dobije ekspresijom gena prisutnog u Neisseria meningitidis serogrupe B izolat H44/76 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira za polipeptid treba da prevlada.

[0055] Predmetni pronalazak je dodatno opisan sledećim primerom koji ne treba smatrati ograničavajućim za obim pronalaska.

[0056] Osim ako nije drugačije naznačeno, u praktičnom izvođenju pronalaska će se koristiti standardni konvencionalni metodi molekularne biologije, virusologije, mikrobiologije ili biohemije. Takve tehnike su opisane kod Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; i Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.).

Opis slika

[0057]

Slika 1. Tipičan sadržaj PorA trovalentnog zbirnog proizvoda OMV iz tri različita trovalentna RL NonaMen soja, koji zajedno eksprimiraju istih 9 podtipova PorA kao HP NonaMen sojevi [van den Dobbelsteen et al, 2007], ali sa dodatnim delecijama u rmpM i lpxL1 genima. Prikazani su trovalentni zbirni proizvodi OMV iz sojeva RL16215, RL10124 i RL1416, redom, koji sadrže PorA od približno 41 kDa. Tipičan sadržaj PorA u RL NonaMen trovalentnom zbirnom proizvodu OMV je između 60-80% od ukupnog sadržaja proteina.

Slika 2. Funkcionalna imunogenost vakcina RL NonaMen kod zečeva pri 2 različite doze (7.5 i 15 µg/PorA), sa i bez adjuvansa AlPO4. Serumi pre imunizacije su uzeti na dan D=0, a serumi posle imunizacije su uzeti posle tri imunizacije. Sve tri vakcine su dale značajno veće baktericidne titrove na dan D=43 nego na dan D=0, ali nikakva značajna dejstva vezana za dozu ili adjuvans nisu zapažena. Ovo ukazuje na to da RL od 7.5 µg/PorA sadrži dovoljno antigena i da nema potrebe da se upotrebljavaju adjuvansi kada se vakcina pravi ovde opisanim postupkom.

Sekvence

[0058]

Tabela 1. Sekvence kao što je navedeno u Listi sekvenci

Primeri

Primer 1: Proizvodnja sa mogućnošću povećanja obima devetovalentne OMV vakcine protiv Neisseria meningitidis serotipa B poboljšanog prinosa i čistoće

[0059] Primer koji je prikazan u nastavku teksta izveden je sa proizvodnom kulturom od 40 L, ali ima potpunu mogućnost povećanja obima na najmanje 800 L.

[0060] Tri različita soja Neisseria meningitidis serogrupe B, koja potiču od soja H44/76 [Fredriksen et al 1991] sa dodatnim delecijama u genima cps, porB, rmpM i lpxL1 [Van de Waterbeemd et al 2010] i od kojih svaki eksprimira 3 jedinstvena podtipa PorA [Van den Dobbelsteen et al 2007], naime:

P1.7,16 / P1.5-1,2-2 / P1.19,15-1 za soj RL16.2.15;

P1.5-2,10 / P 12-1,13 / P1.7-2,4 za soj RL10.12.4 i

P1.22,14 / P1.7-1,1 / P1.18-1,3,6 za soj RL14.1.6,

skladištena su na -135°C kao serije glavnog izvora semena. Serije glavnog izvora semena su odmrznute i umnožene u bocama za mućkanje sa 150 mL hemijski definisanog medijuma [Baart et al 2007], podeljene u alikvote tokom eksponencijalnog rasta i skladištene na -135°C posle dodavanja glicerola da bi se dobio radni izvor semena.

[0061] Boce za mućkanje za primarnu predkulturu sa hemijski definisanim medijumom za rast (Baart et al., 2007) su inokulisane zamrznutim radnim izvorom semena da bi se obezbedila identična polazna tačka za svaku proizvodnu seriju. Tokom eksponencijalnog rasta cela primarna predkultura je korišćena za inokulaciju sekundarne predkulture, gajene u 3 L hemijski definisanog medijuma za rast [Baart et al., 2007] u bioreaktoru. Tokom rasta sekundarne predkulture, temperatura je kontrolisana na 35°C i koncentracija rastvorenog kiseonika je kontrolisana na 30% sa različitom brzinom mešanja i dodavanjem čistog kiseonika u vazdušni tok slobodnog prostora iznad tečnosti. Tokom eksponencijalnog rasta, 1L biomase iz sekundarne predkulture prenet je u 40 L hemijski definisanog medijuma za rast (Baart et al., 2007). Proizvodna kultura je gajena u bioreaktoru sa kontrolisanom temperaturom na 35°C, pH kontrolisanom na 7.2 sa fosfornom kiselinom, i sredstvom protiv stvaranja pene. Koncentracija rastvorenog kiseonika je kontrolisana na 30% pomoću kombinacije promenljive brzine mešanja i promenljivog protoka vazduha iz raspršivača.

[0062] Nastupanje stacionarne faze rasta je određeno periodičnim merenjem OD. Celokupna proizvodna kultura od 40 L je zatim sakupljena prebacivanjem u tank sa mešalicom nakon 3 časa stacionarnog rasta, da bi se osigurala optimalna ravnoteža između prinosa OMV i oslobađanja DNK izazvanog lizom bakterija. Sakupljena proizvodna kultura je prvo ohlađena do 20°C i zapremina je zatim smanjena sa 40 L na 6 L, upotrebom mikrofiltracije sa jedinicama sa šupljim vlaknima (veličine pora 0.2 µm). Koncentrovani proizvod je podvrgnut dijafiltraciji sa 2 zapremine (12 L) 100 mM Tris-HCl pufera na pH 8.6 da bi se pH biomase podesio na pH 8.4±0.4. Dodat je koncentrovani 100 mM rastvor EDTA do finalne koncentracije od 10 mM da bi se započela ekstrakcija OMV što je praćeno inkubacijom od 30 minuta na 20°C u tanku sa mešanjem na 100 obr/min. Biomasa je razdvojena od ekstrakta OMV paralelnim diskontinuiranim centrifugiranjem pri polu-visokim brzinama (6 kontejnera od 1 L; 30 minuta; 4°C; 20 000 x g); supernatant je zadržan. Diskontinuirano centrifugiranje može da se zameni kontinuiranim, po želji, za proizvodnju industrijskog obima. Supernatanti su spojeni i bilo kakvi rezidualni patogeni ili druge čestice su uklonjene dubokom filtracijom kroz jedinicu sa veličinom pora koja se smanjuje sa polaznih 0.5 µm do finalne veličine pora od 0.2 µm.

[0063] Ekstrakt OMV bez patogena je ili skladišten na 4°C tokom nekoliko nedelja, ili korišćen neposredno za nishodnu obradu. Zapremina je prvo smanjena 12 puta do 0.5 L korišćenjem ultrafiltracije sa graničnom vrednošću od 100 kDa, a zatim podvrgnuta dijafiltraciji sa 2 zapremine (1 L) 100 mM Tris-HCl pufera pH 8.6 za uklanjanje EDTA. Bilo kakva genomska DNK prisutna u sirovim OMV je digestirana na fragmente manje od 1000 bp upotrebom 1000 U/L (finalna koncentracija) enzima benzonaze (Merck) u prisustvu kofaktora Mg2+ (inkubacija na 21°C tokom 18 časova). Bilo kakvi talozi koji mogu da nastanu tokom obrade enzimom benzonazom uklonjeni su pomoću klarifikacionog filtera (1.2-0.5 µm), pre prečišćavanja sirovih OMV na koloni za gel-filtraciju koja je spakovana sa materijalom Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) za uklanjanje DNK i malih molekula iz OMV i omogućavanje izmene pufera puferom za skladištenje (10 mM Tris-HCl pH 7.4 sa 3% (tež./zapr.) saharoze). Trovalentni zbirni proizvod OMV je zatim sterilisan filtracijom kroz jedinicu sa veličinom pora 0.2 µm i razblažen do 1 mg/mL trovalentnog PorA puferom za skladištenje (10 mM Tris-HCl pH7.4 i 3% (tež./zapr.) saharoze). U ovoj koncentraciji, zbirni proizvod OMV može bezbedno da se skladišti na 4°C najmanje 6 meseci bez gubitka kvaliteta (tabela 2).

[0064] Poboljšanje prinosa dobijeno sakupljanjem proizvodne kulture na 3 časa posle početka stacionarne faze rasta i izvođenje ekstrakcije OMV na pH 8.6 iznosilo je 2.7 puta i moglo je čak da se poveća na 6.3 puta (tabela 3), ako bi sakupljanje bilo odloženo do 9 časova posle početka stacionarnog rasta i uvedene modifikacije postupka za poboljšani kapacitet uklanjanja DNK (tj. korišćenjem 10000 U/L benzonaze). Ukupni prinos gore opisanog postupka bio je 30 ± 4 mg trovalentnog PorA po litru proizvodne kulture (ekvivalent od 1338 humanih doza od 7.5 µg po podtipu PorA). Ovaj prinos PorA dobijen je sa ukupnom efikasnošću nishodnog postupka od 33 ± 7%. Sterilna filtracija je bila uključena u ovaj obračun i naglašeno je da opisani postupak rezultuje u visokoj efikasnosti i ponovljivosti filtracije (92% ± 4%, tabela 4) u poređenju sa referentnim postupkom. Referentni postupci ili koriste konzervans [tiomersalat; Fredriksen et al 1991 i Claasen et al 1996] za sprečavanje gubitka prinosa povezanog sa sterilnom filtracijom, ili uključuju korake postupka sa mehaničkim smicanjem za smanjenje veličine OMV i poboljšanje efikasnosti [RIVM 2007 NonaMen: Van den Dobbelsteen et al 2007 i Zollinger et al Vaccine (2010), 28, 5057-5067]. Osim toga, trovalentni zbirni proizvod OMV od sojeva koji su prethodno pomenuti ima poboljšanu čistoću PorA u poređenju sa OMV iz drugih sojeva i postupaka [Zollinger et al 2010, US6558677 (Slika 5); Fredriksen et al 1991]. Tipični sadržaj trovalentnog PorA bio je 60-80% od ukupnog sadržaja proteina (slika 2). Uprkos visokom sadržaju LPS, zapažena je niska toksičnost. Ovo je omogućeno delecijom lpxL1 koja oslabljuje toksičnost LPS [Van de Waterbeemd et al 2010].

[0065] Trovalentni zbirni proizvod OMV od tri soja koja su prethodno navedena pomešan je proporcionalno da bi se dobio devetovalentni zbirni proizvod OMV i zatim razblažen puferom za skladištenje do finalne koncentracije od 0.135 mg/mL devetovalentnog PorA (7.5 µg po podtipu PorA po dozi; bez adjuvansa) i 0.270 mg/mL devetovalentnog PorA (15 µg po podtipu PorA po dozi; i sa i bez adjuvansa AlPO4). Tri različite vakcine su podeljene u alikvote od 0.5 mL i skladištene na 4°C do parenteralne primene kod zečeva na dan 1, 15 i 29.

[0066] Sve OMV vakcine su dale značajno više baktericidne titrove na dan D=43 nego na dan D=0, ali nisu zapažena značajna dejstva povezana sa dozom ili adjuvansom. Ovo je ukazalo na to da RL 7.5 µg/PorA sadrži dovoljno antigena i da nije potrebno koristiti adjuvanse kada se pravi vakcina postupkom prema predmetnom pronalasku. Pored toga, OMV vakcine su indukovale unakrsnu zaštitu zasnovanu na drugim antigenima osim samog PorA, kao što je pokazano visokim baktericidnim titrovima protiv Δ porA soja HI5 (slika 2).

[0067] Tabela 3: Prinosi OMV i DNK dobijeni sa različitim zadatim vrednostima za vreme sakupljanja kulture (u časovima nakon početka stacionarnog rasta) i pH (pufera za ekstrakciju EDTA). Rezultati su izračunati sa prediktivnim modelima, dobijenim iz ishoda eksperimentalne studije dizajna. U rezultatima br. 1 do br. 3, zadate vrednosti za vreme sakupljanja i pH bile su optimizovane za najniži (br.1) ili najviši (br.2) mogući prinos OMV i za najviši prinos OMV sa ograničenjem prinosa DNK (br.3). Rezultati br.4 do br.8 su dobijeni sa predefinisanim zadatim vrednostima za vreme sakupljanja i fiksnom zadatom vrednošću za pH. Prinos je definisan u mg/L sirovog ekstrakta OMV.

[0068] Tabela 4: Efikasnost sterilne filtracije za tri uzastopne serije zbirnog proizvoda OMV. Zapaženi su minimalni gubici (<10%), uglavnom izazvani „mrtvom zapreminom“ sterilnog filtera.

Lista referenci

[0069]

1. Girard MP, Preziosi MP, Aguado MT, Kieny MP. A review of vaccine research and development: meningococcal disease. Vaccine 2006;24(22):4692-700.

2. Sharip A, Sorvillo F, Redelings MD,Mascola L, Wise M, Nguyen DM. Populationbased analysis of meningococcal disease mortality in the United States: 1990-2002. Pediatr Infect Dis J 2006;25(3):191-4.

3. Kaplan SL, Schutze GE, Leake JA, Barson WJ, Halasa NB, Byington CL, et al. Multicenter surveillance of invasive meningococcal infections in children. Pediatrics 2006;118(4):e979-84.

4. Trotter CL, Chandra M, Cano R, Larrauri A, Ramsay ME, Brehony C, et al. A surveillance network for meningococcal disease in Europe. FEMSMicrobiol Rev 2007;31(1):27-36.

5. Gray SJ, Trotter CL, Ramsay ME, Guiver M, Fox AJ, Borrow R, et al. Epidemiology of meningococcal disease in England and Wales 1993/94 to 2003/04: contribution and experiences of the Meningococcal Reference Unit. J Med Microbiol 2006;55(Pt 7):887-96.

6. Snape MD, Perrett KP, Ford KJ, John TM, Pace D, Yu LM, et al. Immunogenicity of a tetravalent meningococcal glycoconjugate vaccine in infants: a randomized controlled trial. Jama 2008;299(2):173-84.

7. Morley SL, Pollard AJ. Vaccine prevention of meningococcal disease, coming soon? Vaccine 2001;20(5-6):666-87.8. Finne J, Leinonen M, Makela PH. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitis. Implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet 1983;2(8346):355-7.

9. Bjune G, Hoiby EA, Gronnesby JK, Arnesen O, Fredriksen JH, Halstensen A, et al. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet 1991;338(8775):1093-6.

10. Thornton V, Lennon D, Rasanathan K, O’Hallahan J, Oster P, Stewart J, et al. Safety and immunogenicity of New Zealand strain meningococcal serogroup B OMV vaccine in healthy adults: beginning of epidemic control. Vaccine 2006;24(9):1395-400.

11. Martin DR, Walker SJ, Baker MG, Lennon DR. New Zealand epidemic of meningococcal disease identified by a strain with phenotype B:4:P1.4. J Infect Dis 1998;177(2):497-500.

12. Sierra GV, Campa HC, Varcacel NM, Garcia IL, Izquierdo PL, Sotolongo PF, et al. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann 1991;14(2):195-207, discussion 208-10.

13. Fredriksen JH, Rosenqvist E, Wedege E, Bryn K, Bjune G, Froholm LO, et al. Production, characterization an control of MenB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease. NIPH Ann 1991;14(2):67-79, discussion 79-80.

14. Deatherage BL, Lara JC, Bergsbaken T, Rassoulian Barrett SL, Lara S, Cookson BT. Biogenesis of bacterial membrane vesicles. Mol Microbiol 2009;72(6):1395-407.

15. Saukkonen K, Leinonen M, Abdillahi H, Poolman JT. Comparative evaluation of potential components for group B meningococcal vaccine by passive protection in the infant rat and in vitro bactericidal assay. Vaccine 1989;7(4): 325-8.

16. Martin DR, Ruijne N, McCallum L, O’Hallahan J, Oster P. The VR2 epitope on the PorA P1.7-2,4 protein is the major target for the immune response elicited by the strainspecific group B meningococcal vaccine MeNZB. Clin Vaccine Immunol 2006;13(4):486-91.

17. van der Ley P, van der Biezen J, Poolman JT. Construction of Neisseria meningitidis strains carrying multiple chromosomal copies of the porA gene for use in the production of a multivalent outer membrane vesicle vaccine. Vaccine 1995;13(4):401-7.

18. Claassen I, Meylis J, van der Ley P, Peeters C, Brons H, Robert J, et al. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine 1996;14(10):1001-8.

19. de Kleijn E, van Eijndhoven L, Vermont C, Kuipers B, van Dijken H, Rumke H, et al. Serum bactericidal activity and isotype distribution of antibodies in toddlers and schoolchildren after vaccination with RIVM hexavalent PorA vesicle vaccine. Vaccine 2001;20(3-4):352-8.

20. van den Dobbelsteen GP, van Dijken HH, Pillai S, van Alphen L. Immunogenicity of a combination vaccine containing pneumococcal conjugates and meningococcal PorA OMVs. Vaccine 2007;25(13):2491-6.

21. Arigita C, Luijkx T, Jiskoot W, Poelen M, Hennink WE, Crommelin DJ, et al. Welldefined and potent liposomal meningococcal B vaccines adjuvated with LPS derivatives. Vaccine 2005;23(43):5091-8.

22. Arigita C, Kersten GF, Hazendonk T, Hennink WE, Crommelin DJ, Jiskoot W. Restored functional immunogenicity of purified meningococcal PorA by incorporation into liposomes. Vaccine 2003;21(9-10):950-60.

23. Steeghs L, Tommassen J, Leusen JH, van de Winkel JG, van der Ley P. Teasing apart structural determinants of ’toxicity’ and ’adjuvanticity’: implications for meningococcal vaccine development. J Endotoxin Res 2004;10(2): 113-9.

24. Koeberling O, Giuntini S, Seubert A, Granoff DM. Meningococcal outer membrane vesicle vaccines derived from mutant strains engineered to express factor Hbinding proteins from antigenic variant groups 1 and 2. Clin Vaccine Immunol 2009;16(2):156-62.

25. Koeberling O, Seubert A, Granoff DM. Bactericidal antibody responses elicited by a meningococcal outer membrane vesicle vaccine with overexpressed factor H-binding protein and genetically attenuated endotoxin. J Infect Dis 2008;198(2):262-70.

26. van der Voort ER, van der Ley P, van der Biezen J, George S, Tunnela O, van Dijken H, et al. Specificity of human bactericidal antibodies against PorA P1.7,16 induced with a hexavalent meningococcal outer membrane vesicle vaccine. Infect Immun 1996;64(7):2745-51.

27. Holst J, Martin D, Arnold R, Huergo CC, Oster P, O’Hallahan J, et al. Properties and clinical performance of vaccines containing outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis. Vaccine 2009;27(Suppl.2):B3-12.

28. Cametti C. Polyion-induced aggregation of oppositely charged liposomes and charged colloidal particles: the many facets of complex formation in low density colloidal systems. Chem Phys Lipids 2008;155(2):63-73.

29. Zollinger WD, Mandrell RE, Griffiss JM, Altieri P, Berman S. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J Clin Invest 1979;63(5):836-48.

30. Post DM, Zhang D, Eastvold JS, Teghanemt A, Gibson BW, Weiss JP. Biochemical and functional characterization of membrane blebs purified from Neisseria meningitidis serogroup B. J Biol Chem 2005;280(46):38383-94.

31. Devoe IW, Gilchrist JE. Release of endotoxin in the form of cell wall blebs during in vitro growth of Neisseria meningitidis. J Exp Med 1973;138(5):1156-67.

32. Hoekstra D, van der Laan JW, de Leij L, Witholt B. Release of outer membrane fragments from normally growing Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1976;455(3):889-99.

33. Guthrie T, Wong SY, Liang B, Hyland L, Hou S, Hoiby EA, et al. Local and systemic antibody responses in mice immunized intranasally with native and detergent extracted outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis. Infect Immun 2004;72(5):2528-37.

34. Katial RK, Brandt BL, Moran EE, Marks S, Agnello V, Zollinger WD. Immunogenicity and safety testing of a group B intranasal meningococcal native outer membrane vesicle vaccine. Infect Immun 2002;70(2):702-7.

35. Saunders NB, Shoemaker DR, Brandt BL, Moran EE, Larsen T, Zollinger WD. Immunogenicity of intranasally administered meningococcal native outer membrane vesicles in mice. Infect Immun 1999;67(1):113-9.

36. Drabick JJ, Brandt BL, Moran EE, Saunders NB, Shoemaker DR, Zollinger WD. Safety and immunogenicity testing of an intranasal group B meningococcal native outer membrane vesicle vaccine in healthy volunteers. Vaccine 1999;18(1-2):160-72.

37. Ferrari G, Garaguso I, Adu-Bobie J, Doro F, Taddei AR, Biolchi A, et al. Outer membrane vesicles from group B Neisseria meningitidis delta gna33 mutant: proteomic and immunological comparison with detergent-derived outermembrane vesicles. Proteomics 2006;6(6):1856-66.

38. van der Ley P, Steeghs L, Hamstra HJ, ten Hove J, Zomer B, van Alphen L. Modification of lipid A biosynthesis in Neisseria meningitidis lpxL mutants: influence on lipopolysaccharide structure, toxicity, and adjuvant activity. Infect Immun 2001;69(10):5981-90.

39. Fisseha M, Chen P, Brandt B, Kijek T, Moran E, Zollinger W. Characterization of native outer membrane vesicles from lpxL mutant strains of Neisseria meningitides for use in parenteral vaccination. Infect Immun 2005;73(7):4070-80.

40. Van de Waterbeemd B, Streefland M, van der Ley P, Zomer B, van Dijken H, Martens D, Wijffels R, van der Pol L. Improved OMV vaccine aginst Neisseria meningitidis using gentically engineered strains and dtergent-free purification process. Vaccine 2010; 28: 4810 - 4816.

41. Prachayasittikul, Z et al. EDTA-induced membrane fluidization and destabilization: biophysical studies on artificial lipid membranes. Acta Biochim Biophys Sin 2007; 39(11): 901-913.

42. Holten, E., Serotypes of Neisseria meningitidis isolated from patients in Norway during the first six months of 1978. J Clin Microbiol, 1979.9(2): p.186-188.

43. Baart, G.J., et al., Scale-up for bulk production of vaccine against meningococcal disease. Vaccine, 2007.25(34): p.6399-408.

LISTA SEKVENCI [0070]

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripremu bez deterdženta bakterijskih vezikula spoljašnje membrane (OMV) za upotrebu u vakcinama, navedeni postupak obuhvata korake:

a) kultivacije populacije Gram-negativne bakterije do stacionarne faze rasta;

b) u vremenskom trenutku najmanje 1 čas nakon početka stacionarne faze rasta, inkubacije bakterija dobijenih u a) u medijumu koji je podešen na, ili ima pH vrednost višu od pH 8.0 i koncentraciju metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, između 1 i 100 mM, za ekstrakciju OMV; i,

c) ponovnog dobijanja OMV ekstrahovanih u b), pri čemu ponovno dobijanje obuhvata najmanje uklanjanje bakterija iz OMV.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što Gram-negativna bakterija ima genetsku modifikaciju koja dovodi do toga da bakterija proizvodi LPS sa sniženom toksičnošću, ali taj LPS zadržava najmanje deo svoje adjuvantne aktivnosti; poželjno navedena genetska modifikacija predstavlja modifikaciju koja smanjuje ili isključuje ekspresiju jednog ili više gena odabranih od gena lpxL1 i lpxL2 ili njihovih homologa i gena lpxK ili njegovog homologa i/ili predstavlja modifikaciju koja ima uticaj na ekspresiju jednog ili više lpxE i/ili pagL gena.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je vremenski trenutak nakon početka stacionarne faze rasta u kome se bakterije inkubiraju u medijumu u b) između 1 i 9 časova, poželjno između 2 i 5 časova.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se OMV sterilišu, poželjno sterilizacijom filtriranjem, poželjno upotrebom filtera sa porama manjim od 0.3 mikrometra.

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je koncentracija metal-helirajućeg sredstva, poželjno EDTA, u koraku b) između 5 i 15 mM i/ili naznačen time što je pH između pH 8.0 i pH 9.5, poželjno između pH 8.0 i pH 9.0, poželjnije između pH 8.2 i pH 8.8, poželjnije između pH 8.4 i pH 8.7.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je zapremina kulture u a) i/ili zapremina medijuma u b) najmanje 10 L, poželjnije najmanje 20 L, 40 L, 60 L 80 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 800 L, 1500 L, 5000 L, 10000 L, 20000 L ili 40 000 L.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je Gramnegativna bakterija vrsta roda Neisseria ili Bordetella, poželjno je Neisseria meningitidis ili Bordetella pertussis.

8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što Gram-negativna bakterija ima jednu ili više mutacija za smanjenje ili isključivanje ekspresije genskog proizvoda, poželjno, genskog proizvoda odabranog iz grupe koja se sastoji od cps, genskih proizvoda biosinteze lipida A, uključujući lpxL1, rmpM, porA, porB i opA.

9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što Gram-negativna bakterija eksprimira višestruke podtipove porA, pri čemu poželjno populacija sadrži više od jednog soja Gram-negativne bakterije, i pri čemu svaki soj eksprimira različite podtipove porA.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što Gramnegativna bakterija eksprimira antigen koji je strani za navedenu Gram-negativnu bakteriju.

11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji dodatno sadrži korak kombinovanja OMV sa farmaceutski prihvaćenim ekscipijensom.