RS57413B1

RS57413B1 - Antitela za ligande bradikinin b1 receptora

Info

Publication number: RS57413B1
Application number: RS20180704A
Authority: RS
Inventors: Dorothea KOMINOS; Jie Zhang; Alla Pritsker; Matthew Davison; Nicolas Baurin; Govindan Subramanian; Xin Chen; Han Li
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2018-09-28
Also published as: JP2024038036A; EP3246339A1; JP2021166538A; BR112014024282A2; AU2018203081A1; HRP20180928T1; CN113773385B; CL2017003039A1; CL2014002590A1; US20180222967A1; WO2013148296A1; JP7411609B2; KR20200121370A; IL234830B; HK1206754A1; CY1121466T1; KR102166083B1; AU2013240242A1; JP6779012B2; US9376494B2

Description

Opis

Pozadina

[0001] Bradikinin B1 receptor je impliciran u patogenezi upalnih oboljenja i hroničnog bola. Modulacijom upale tkiva i bubrežne fibroze, B1 receptor je takođe povezan sa patogenezom akutne povrede bubrega, kao i hroničnim bolestima bubrega koji su glavni uzroci poslednje faze renalne insuficijencije.

Kod ljudi, glavni agonisti bradikinin B1 receptora su kinini. Kinini su bioaktivni peptidi proizvedeni od proteolitičkog cepanja proteina kininogena. Glavni kininski agonisti bradikinin B1 receptora su dekapeptid Kalidin, i nonapeptid des-Arg10-Kalidin (formiran proteolitskim cepanjem c-terminalnog argininskog oblika Kalidina). Prema tome, agensi koji mogu inhibirati vezivanje Kalidina i des-Arg10-Kalidin za bradikinin B1 receptor imaju potencijal da leče ili spreče patologije posredovane bradikinin B1 receptorom.

[0002] Shodno tome, u oblasti postoji potreba za novim agensima koji inhibiraju vezivanje Kalidina i des-Arg10-Kalidina za bradikinin B1 receptor za primenu u lečenju patoloških bolesti posredovanih bradikinin B1 receptorom.

[0003] Bedi i dr. (Biochimica et Biophysica Acta, vol.842, no.1, 1985, strane 90-99) opisuju monoklonska antitela koja se vezuju za bradikinin.

[0004] Hilgenfeldt i dr. (Analytical Biochemistry, vol.228, no.1, 1995, strane 35-41) opisuju antiserum specifičan za Kalidin.

[0005] Carretero i dr. (Biochemical Pharmacology, vol.25, no.20, 1976, strane 2265-2270) opisuju anti-kalidin antiserum.

[0006] Geppetti i dr. (Regulatory Peptides, vol.33, no. 3, 1991, strane 321-329) opisuju analgetički efekatkalidina na ljudsku nazalnu mukoznu.

SAŽETAK

[0007] Pronalazak se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

i) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 3 (HCDR3) teškog lanca, aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 2 (HCDR2) teškog lanca, i aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 1 (HCDR1) teškog lanca, izabrane iz grupe koju čine:

a)

SEQ ID NO: 7 [X1YX2X3DX4HAMX5Y], gde

X1je Y, F ili H,

X2je R, D, A, V, L, I, M, F, Y ili W,

X3je Y, F, W ili H,

X4je D, E ili Y, i,

X5je D ili E;

SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], gde

X1je D, R, A, V, L, I, M, F, Y ili W, i

X2je Y, D, E, N, ili Q; i

SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], gde X1je N, W ili Y; respektivno,

b)

SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], gde X1je W ili F,

X2je N ili nije aminokiselina;

X3je Y ili S,

X4je D ili P, i

X5je F ili Y;

SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], gde

X1je I, ili V,

X2je T, ili S, i

X3je G, ili D; i

SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], gde X1je L, ili M; respektivno,

c)

SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 14; i

SEQ ID NO: 15;

respektivno,

d)

SEQ ID NO: 32;

SEQ ID NO: 33; i

SEQ ID NO: 34;

respektivno,

e)

SEQ ID NO: 40;

SEQ ID NO: 41; i

SEQ ID NO: 42;

respektivno,

f)

SEQ ID NO: 47;

SEQ ID NO: 48;

SEQ ID NO: 49;

respektivno,

i

g)

SEQ ID NO: 55;

SEQ ID NO: 56;

SEQ ID NO: 57;

respektivno; i

ii) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 3 (LCDR3) lakog lanca, aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 2 (LCDR2) lakog lanca, i aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 1 (LCDR1) lakog lanca, izabrane iz grupe koju čine:

h)

SEQ ID NO: 10 [QQ X1X2S X3P X4T], gde

X1je Y, F ili H,

X2je Y, F, H ili W,

X3je Y, F, T ili H, i,

X4je W, Y, F, H ili L:

SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], gde X1je E, D, Q ili N; i

SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], gde

X1je W, H, Y ili F, i

X2je H ili Y;

respektivno,

i)

SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], gde

X1je Q ili N,

X2je Y, F, D ili H,

X3je Y, F, H ili W,

X4je Y, F, T ili H, i

X5je W, Y, F, H ili L;

SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], gde

X1je W ili G, i

X2je E, D, Q ili N; i

SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], gde

X1je W, H, Y ili F,

X2je S ili G,

X3je N ili D,

X4je K ili R,

X5je H ili Y;

respektivno,

j)

SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], gde X1je L ili M;

SEQ ID NO: 36; i

SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], gde X1 je K ili E;

respektivno,

k)

SEQ ID NO: 16;

SEQ ID NO: 17; i

SEQ ID NO: 18;

respektivno,

l)

SEQ ID NO: 35;

SEQ ID NO: 36; i

SEQ ID NO: 37;

respektivno,

m)

SEQ ID NO: 43;

SEQ ID NO: 17; i

SEQ ID NO: 44;

respektivno,

n)

SEQ ID NO: 50;

SEQ ID NO: 51; i

SEQ ID NO: 52;

respektivno,

i

o)

SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 59; i

SEQ ID NO: 60;

respektivno.

[0008] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena patentnog zahteva 1 obuhvataju

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 13, 14, i 15, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87, i H108, prema Kabatu; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 16, 17, i 18, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 i L104, prema Kabatu.

[0009] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena patentnog zahteva 1 obuhvataju aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca i lakog lanca date u SEQ ID NO: 24 i 30, respektivno.

[0010] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je u farmaceutskom sastavu sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0011] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena patentnog zahteva 1 obuhvataju:

aminokiselinsku sekvencu varijabilne regije domena teškog lanca, i aminokiselinsku sekvencu varijabilne regije domena lakog lanca sa barem 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NOs: 19 i 26, respektivno,

b) SEQ ID NOs: 20 i 27, respektivno,

c) SEQ ID NOs: 21 i 28, respektivno,

d) SEQ ID NOs: 22 i 28, respektivno,

e) SEQ ID NOs: 23 i 29, respektivno,

f) SEQ ID NOs: 24 i 30, respektivno,

g) SEQ ID NOs: 25 i 31, respektivno,

h) SEQ ID NOs: 38 i 39, respektivno,

i) SEQ ID NOs: 45 i 46, respektivno,

j) SEQ ID NOs: 53 i 54, respektivno,

k) SEQ ID NOs: 61 i 62, respektivno.

[0012] U otelotvorenju, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena patentnog zahteva 1 obuhvataju:

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu, i aminokiselinsku sekvencu varijabilne regije domena lakog lanca izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NOs: 19 i 26, respektivno,

b) SEQ ID NOs: 20 i 27, respektivno,

c) SEQ ID NOs: 21 i 28, respektivno,

d) SEQ ID NOs: 22 i 28, respektivno,

e) SEQ ID NOs: 23 i 29, respektivno,

f) SEQ ID NOs: 24 i 30, respektivno,

g) SEQ ID NOs: 25 i 31, respektivno,

h) SEQ ID NOs: 38 i 39, respektivno,

i) SEQ ID NOs: 45 i 46, respektivno,

j) SEQ ID NOs: 53 i 54, respektivno,

k) SEQ ID NOs: 61 i 62, respektivno.

[0013] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata konsenzus aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 7, 8, i 9, respektivno; i b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 10, 11, i 12, respektivno.

[0014] U otelotvorenju, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 13, 14, i 15, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 16, 17, i 18, respektivno.

[0015] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 32, 33, i 34, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 35, 36, i 37, respektivno.

[0016] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 40, 41 i 42, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 43, 17, i 44, respektivno.

[0017] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 47, 48, i 49, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 50, 51, i 52, respektivno.

[0018] U otelotvorenju pronalaska, izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 55, 56, i 57, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 58, 59, i 60, respektivno.

[0019] Predmetna prijava dalje objavljuje nukleinske kiseline koje kodiraju anti-Kalidin i des-Arg10-Kalidin antitela, rekombinantne vektore eksprimiranja i ćelije domaćine za pravljenje takvih antitela, ili njihovih fragmenata. Takođe su objavljeni postupci korišćenja antitela, ili njihovih fragmenata, iz objave za detektovanje Kalidin i des-Arg10-Kalidin ili za modulisanje Kalidin i des-Arg10-Kalidin aktivnosti, bilo in vitro ili in vivo. Predmetna prijava takođe objavljuje postupke pravljenja antitela koje se specifično vezuje za des-Arg9-Bradikinin i des-Arg10-Kalidinu sličan peptid.

[0020] Prema tome, u jednom aspektu predmetna objava pruža izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se:

a) specifično vezuje za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin;

b) specifično vezuje za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin uz KD manji od 1x10<-10>M;

c) specifično vezuje za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin uz Koffmanji od 1x10<4>s<-1>; ili d) specifično vezuje za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin i inhibira vezivanje za bradikinin B1 receptor.

[0021] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena se vezuju za N-terminalni Lizin ostatak Kalidina ili des-Arg10-Kalidina.

[0022] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena inhibiraju vezivanje Kalidina ili des-Arg10-Kalidina za bradikinin-1 receptor.

[0023] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena se vezuju specifično za mišji Kalidinu sličan peptid (KLP).

[0024] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu HCDR3 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 7 [X1Y X2X3D X4HAM X5Y], gde

X1je Y, F ili H,

X2je R, D, A, V, L, I, M, F, Y ili W,

X3je Y, F, W ili H,

X4je D, E ili Y, i,

X5je D ili E;

b) SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], gde

X1je W ili F,

X2je N ili nije aminokiselina;

X3je Y ili S,

X4je D ili P, i

X5je F ili Y;

c) SEQ ID NO: 13;

d) SEQ ID NO: 32;

e) SEQ ID NO: 40;

f) SEQ ID NO: 47; i

g) SEQ ID NO: 55.

[0025] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu HCDR2 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], gde

X1je D, R, A, V, L, I, M, F, Y ili W, i

X2je Y, D, E, N, ili Q;

b) SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], gde

X1je I, ili V,

X2je T, ili S, i

X3je G, ili D;

c) SEQ ID NO: 14

d) SEQ ID NO: 33;

e) SEQ ID NO: 41;

f) SEQ ID NO: 48; i

g) SEQ ID NO: 56.

[0026] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu HCDR1 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], gde X1je N, W ili Y;

b) SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], gde X1je L, ili M;

c) SEQ ID NO: 15;

d) SEQ ID NO: 34;

e) SEQ ID NO: 42;

f) SEQ ID NO: 49; i

g) SEQ ID NO: 57.

[0027] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu LCDR3 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 10 [QQ X1X2S X3P X4T], gde

X1je Y, F ili H,

X2je Y, F, H ili W,

X3je Y, F, T ili H, i,

X4je W, Y, F, H ili L:

b) SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], gde

X1je Q ili N,

X2je Y, F, D ili H,

X3je Y, F, H ili W,

X4je Y, F, T ili H, i

X5je W, Y, F, H ili L;

c) SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], gde X1je L ili M;

d) SEQ ID NO: 16;

e) SEQ ID NO: 35;

f) SEQ ID NO: 43;

g) SEQ ID NO: 50; i

h) SEQ ID NO: 58.

[0028] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu LCDR2 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], gde X1je E, D, Q ili N;

b) SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], gde

X1je W ili G, i

X2je E, D, Q ili N;

c) SEQ ID NO: 17;

d) SEQ ID NO: 36;

e) SEQ ID NO: 51; i

f) SEQ ID NO: 59.

[0029] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu LCDR1 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], gde

X1je W, H, Y ili F, i

X2je H ili Y;

b) SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], gde

X1je W, H, Y ili F,

X2je S ili G,

X3je N ili D,

X4je K ili R,

X5je H ili Y.

c) SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], gde X1je K ili E;

b) SEQ ID NO: 18;

c) SEQ ID NO: 37;

d) SEQ ID NO: 44;

e) SEQ ID NO: 52; i

f) SEQ ID NO: 60.

[0030] U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu LCDR3 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 10 [QQ X1X2S X3P X4T], gde

X1je Y, F ili H,

X2je Y, F, H ili W,

X3je Y, F, T ili H, i,

X4je W, Y, F, H ili L:

b) SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], gde

X1je Q ili N,

X2je Y, F, D ili H,

X3je Y, F, H ili W,

X4je Y, F, T ili H, i

X5je W, Y, F, H ili L;

c) SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], gde X1je L ili M;

d) SEQ ID NO: 16;

e) SEQ ID NO: 35;

f) SEQ ID NO: 43;

g) SEQ ID NO: 50; i

h) SEQ ID NO: 58.

[0031] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu LCDR2 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], gde X1je E, D, Q ili N;

b) SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], gde

X1je W ili G, i

X2je E, D, Q ili N;

c) SEQ ID NO: 17;

d) SEQ ID NO: 36;

e) SEQ ID NO: 51; i

f) SEQ ID NO: 59.

[0032] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu LCDR1 izabranu iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], gde

X1je W, H, Y ili F, i

X2je H ili Y;

b) SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], gde

X1je W, H, Y ili F,

X2je S ili G,

X3je N ili D,

X4je K ili R,

X5je H ili Y.

c) SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], gde X1je K ili E;

b) SEQ ID NO: 18;

c) SEQ ID NO: 37;

d) SEQ ID NO: 44;

e) SEQ ID NO: 52; i

f) SEQ ID NO: 60.

[0033] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs 13, 14, i 15, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87, i H108 prema Kabatu.

[0034] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs 16, 17, i 18, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 i L104, prema Kabatu.

[0035] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu varijabilne regije teškog lanca sa barem 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 24, 25, 38, 45, 53, i 61.

[0036] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca sa barem 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54, i 62.

[0037] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilnu regiju lakog lanca aminokiselinska sekvenca sa barem 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54, i 62.

[0038] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabrane iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 24, 25, 38, 45, 53, i 61.

[0039] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54, i 62.

[0040] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54, i 62.

[0041] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinske sekvence varijabilne regije teškog lanca i lakog lanca date u SEQ ID NO: 19 i 26, SEQ ID NO: 20 i 27, SEQ ID NO: 21 i 28; SEQ ID NO: 22 i 28; SEQ ID NO: 23 i 29; SEQ ID NO: 24 i 30; SEQ ID NO: 25 i 31; SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 45 i 46, SEQ ID NO: 53 i 54, ili SEQ ID NO: 61 i 62, respektivno.

[0042] U drugom aspektu, objava pruža antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koji se specifično vezuju za Kalidin i des-Arg10-Kalidin, gde se antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, nadmeću za vezivanje za Kalidin i des-Arg10-Kalidin gde antitelo obuhvata aminokiselinske sekvence varijabilne regije teškog lanca i lakog lanca date u SEQ ID NO: 19 i 26, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 45 i 46, SEQ ID NO: 53 i 54, ili SEQ ID NO: 61 i 62, respektivno.

[0043] U drugom aspektu, objava pruža izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se nadmeću za vezivanje za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin gde je antitelo iz bilo kod od prethodnih patentnih zahteva, i ne vezuje se za bradikinin ili desArg9-Bradikinin.

[0044] U drugom aspektu, objava pruža izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za konformacijski epitop kalidina (KD) ili desArg10 -Kalidina (DAKD) koji usvaja Pro4 kink konformaciju koja obuhvata tip II uskog obrtanja na Prolinu 4 od KD ili DAKD). U jednom otelotvorenju, Pro 4 kink konformacija od KD ili DAKD dalje obuhvata aminokiselinska ponavljanja sigmoidnog oblika koja su poravnata sa hidrofobnim bočnim lancima aminokiselina u režimu prostornog slaganja. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju (a) specifično se vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin; b) specifično se vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin uz KD manji od 1x10<-10>M; c) specifično se vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin uz Koffmanji od 1x10<4>s<-1>; ili d) specifično se vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin i inhibiraju vezivanje za bradikinin B1 receptor.

[0045] U drugom aspektu, antitelo ili fragment za vezivanje antigena su konjugovani za dijagnostički ili terapeutski agens.

[0046] U drugom aspektu, objava pruža izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu antitela, ili njegov fragment za vezivanje antigena, iz objave.

[0047] U drugom aspektu, objava pruža rekombinantni vektor eksprimiranja koji obuhvata nukleinsku kiselinu iz objave.

[0048] U drugom aspektu, objava pruža ćeliju domaćina koja obuhvata rekombinantni vektor eksprimiranja iz objave.

[0049] U drugom aspektu, objava pruža postupak proizvodnje antitela koje se vezuje specifično za Kalidin i des-Arg10-Kalidin, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina iz objave pod uslovima tako da se antitelo koje se vezuje specifično za Kalidin i des-Arg10-Kalidin proizvodi od strane ćelije domaćina.

[0050] U drugom aspektu, objava pruža farmaceutski sastav koji obuhvata antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, iz objave i jedan ili više farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0051] U drugom aspektu, objava pruža postupak za tretman bolesti ili poremećaja povezanih sa kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom, gde postupak obuhvata primenu pacijentu kom je to potrebno farmaceutskog sastava iz objave.

[0052] U jednom otelotvorenju, bolest ili poremećaj je hronični bol.

[0053] U drugom aspektu, objava pruža postupak stvaranja antitela koje se specifično vezuje za des-Arg9- Bradikinin i des-Arg10-Kalidinu sličan peptid koji obuhvata: imunizovanje životinje sa imunogenom koji obuhvata peptid, gde se peptid sastoji od aminokiselinske sekvence date u SEQ ID No.11, i gde je peptidov amino terminal arginina indirektno spojen za nosač deo kroz veznik deo, tako da se antitelo koje se specifično vezuje za des-Arg9-Bradikinin, des-Arg10-Kalidin i des-Arg10-Kalidinu sličan peptid, proizvodi od strane imunog sistema životinje.

[0054] U drugom otelotvorenju, postupak dalje obuhvataju izolovanje iz životinje, antitela, nukleinske kiseline koja kodira antitelo, ili imune ćelije koja eksprimira antitelo.

[0055] U jednom otelotvorenju, nosač deo je protein. U drugom otelotvorenju, protein je Keyhole limpet hemocijanin (KLH). U drugom otelotvorenju, gde veznik deo obuhvata [Gly-Gly-Gly]n, gde je n barem 1.

KRATAK OPIS SKICA

[0056]

Slika 1 prikazuje rezultate ELISA testova koji pokazuju vezivanje EE1 antitela na kinin peptide.

Slika 2 prikazuje rezultate merenja kalorimetrije diferencijalnog skeniranja F151 antitela.

Slika 3 prikazuje poravnanja aminokiselinske sekvence varijabilnih regija mišjeg i humanizovanog F151 antitela. Svi identični ostaci su navedeni u poravnanju, dok se homologni ostaci identifikuju znakom „+“ i ne-homologni ostaci ostaju prazni.

Slika 4 prikazuje mapu gustine elektrona na mestu vezivanja antigena F151 antitela/kalidin kompleksa.

Slika 5 prikazuje mapu gustine elektrona na mestu vezivanja antigena F151 antitela/des-Arg10-kalidin kompleksa.

Slika 6 prikazuje traka i štap predstavljanje Fv podjedinice F151 vezanog za Kalidin.

Slika 7 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regija lakog lanca primernih mišjih anti-kalidin antitela objave. Ostaci aminokiselina koji međusobno deluju sa kalidinom označeni su zvezdicom.

Slika 8 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regija teškog lanca primernih mišjih anti-kalidin antitela objave. Ostaci aminokiselina koji međusobno deluju sa kalidinom označeni su zvezdicom.

Slika 9 prikazuje rezultate in vivo eksperimenata koji određuju efekat EE1 antitela na akutni upalni bol izazvan formalinom.

Slika 10 prikazuje rezultate in vivo eksperimente koji određuju efekat EE1 antitela na CFA-indukovanu mehaničku preosetljivost.

Slika 11 prikazuje rezultate in vivo eksperimente koji određuju efekat EE1 antitela na toplotnu preosetljivost koju izaziva CFA.

Slika 12 prikazuje rezultate in vivo eksperimenti koji određuju efekat EE1 antitela na CCI-indukovanu mehaničku preosetljivost.

Slika 13 prikazuje rezultate in vivo eksperimenti koji određuju efekat EE1 antitela na CCI-indukovanu toplotnu preosetljivost.

Slika 14 prikazuje šematske mape VL i VH konstrukata eksprimiranja za generisanje humanizovane F151 varijante HC3a/LC3a sa restrikcionim DNK endonukleaznim mestima predstavljenim kao dedukovane sekvence (podebljano i podvučeno). Panel A prikazuje laki lanac, dok panel B prikazuje težak lanac.

Slika 15 prikazuje poravnanje amino kiselinskih sekvenci teškog lanca F151 (A) i lakog lanca (B) sa najbližim aminokiselinskim sekvencama ćelijske germ linije. Slika 16 prikazuje poravnanje F151 teškog lanca (A) i lakog lanca (B) sa lokusom teškog lanca (1-08 i 1-18) i lokusom lakog lanca (V IV-B3) od VH1 pod-porodice. CDR regije i Vernier regije su označene podebljano, dok su humanizujuće mutacije podvučene.

Slika 17 prikazuje (A) sekundarnu i (B) tercijarnu strukturu glavnog lanca komformacije polipeptidne kičme kalidina (KD) kao vezanu za F151 antitelo koje obuhvata tipa II uskog obrtanja na Prolinu 4 (C).

DETALJAN OPIS

[0057] Predmetna objava pruža antitela koja se specifično vezuju za Kalidin i des-Arg10-Kalidin i sprečavaju vezivanje za bradikinin B1 receptor. Takva antitela su naročito korisna za lečenje bolesti pi poremećaja povezanih sa Kalidinom i des-Arg10-Kalidinom (npr., bol). Objava takođe pruža farmaceutske sastave, kao i nukleinske kiseline koje kodiraju anti-Kalidin i des-Arg10-Kalidin antitela, rekombinantni vektori eksprimiranja i ćelije domaćina za stvaranje takvih antitela, ili njihove fragmente. Postupci korišćenja antitela objave za detektovanje Kalidina i des-Arg10-Kalidin ili za modulisanje Kalidinske i des-Arg10-Kalidinske aktivnost, bilo in vitro ili in vivo, takođe su obuhvaćeni objavom.

I. Definicije

[0058] Kako bi se predmetna objava mogla lakše shvatiti, određeni pojmovi su najpre definisani.

[0059] Kad se ovde koristi, izraz „Kalidin“ se odnosi na peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence KRPPGFSPFR (SEQ ID NO.1).

[0060] Kad se ovde koristi, izraz „des-Arg10-Kalidin“ odnosi se na peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence KRPPGFSPF (SEQ ID NO.2).

[0061] Kad se ovde koristi, izraz „mišji Kalidin“ ili „Kalidin sličan peptidu“ odnosi se na peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence RRPPGFSPFR (SEQ ID NO.3)

[0062] Kad se ovde koristi, izraz „miš des-Arg10-Kalidin“ ili „des-Arg10Kalidinski peptid“ odnosi se na peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence RRPPGFSPF (SEQ ID NO.4).

[0063] Kad se ovde koristi, izraz „Bradikinin“ se odnosi na peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence RPPGFSPFR (SEQ ID NO.5).

[0064] Kad se ovde koristi, izraz „des-Arg9-Bradikinin“ odnosi se na peptid koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence RPPGFSPF (SEQ ID NO.6).

[0065] Kad se ovde koristi, izraz „antitelo“ se odnosi na molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr., IgM). Svaki težak lanac sadrži varijabilnu regiju teškog lanca (skraćeno VHili VH) i konstantnu regiju teškog lanca (CHili CH).

Konstantna regija teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilnu regiju lakog lanca (skraćeno VL) i konstantnu regiju lakog lanca (CLili CL). Konstantna regija lakog lanca sadrži jedan domen (CL1). VHi VLregije se dalje mogu podeliti u regije hipervariabilnosti, označene regijama koji određuju komplementarnost (CDR), koje se provlače sa regijama koje su više konzervirane, označene kao okvirne regije (FR). Svaki VHi VLsastoji se od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0066] Kad se ovde koristi, izraz „antigen-vezujući fragment“ antitela uključuje bilo koji prirodno prisutan, koji se može dobiti enzimski, sintetički ili genetski konstruisani polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen kako bi se formirao kompleks. Antigenvezujući fragmenti antitela mogu se izvesti, na primer, iz punih molekula antitela koristeći bilo koje odgovarajuće standardne tehnike kao što su proteolitička varijabilnost ili tehnike rekombinantnog genetičkog inženjeringa koji uključuju manipulaciju i eksprimiranje DNK koji kodira varijabilne i opciono konstantne domene antitela. Neograničavajući primeri delova koji vezuju antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) monovalentne Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervariabilnu regiju antitela (npr. izolovana regija za određivanje komplementarnosti (CDR)). Ostali veštački dizajnirani molekuli, kao što su diatelo, triatelo, tetratelo i miniberi, takođe su obuhvaćeni izrazom „antigen-vezujući fragment“.

[0067] Kad se ovde koristi, izraz „CDR“ ili „regija za određivanje

komplementarnosti“ označava nepovezana antigenska mesta za kombinovanje koja se nalaze u varijabilnoj regiji polipeptida teškog i lakog lanca. Ove određene regije su opisani od strane Kabat i dr., J. Biol. Chem.252, 6609-6616 (1977) and Kabat i dr., Sequences of protein of immunological interest. (1991), i od strane Chothia i dr., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987) i od strane MacCallum i dr., J. Mol. Biol.262:732-745 (1996) gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka, jednih u poređenju sa drugima. Ostaci aminokiselina koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci su predstavljeni za poređenje. U jednom otelotvorenju objave, izraz „CDR“ je CDR kao što je definisano od strane Kabata, na osnovu poređenja sekvenci.

[0068] Kad se ovde koristi, izraz „okviri (FR) aminokiselinskih ostataka“ odnosi se na one aminokiseline u okvirnoj regiji Ig lanca. Izraz „okvirna regija“ ili „FR regija“ kako se ovde koristi, uključuje ostatke aminokiselina koji su deo varijabilne regije, ali nisu deo CDR-a (npr., koristeći Kabat definiciju CDR-a). Dakle, okvir varijabilne regije dugačak je između 100-120 amino kiselina, ali uključuje samo one aminokiseline van CDR-a.

[0069] Kad se ovde koristi, izraz „specifično se vezuje za“ odnosi se na sposobnost antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena da se veže na antigen sa Kd od najmanje oko 1 x 10<∼6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, 1 x 10<-12>M, ili više. Izraz obuhvata i odnosi se na sposobnost antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena da se vežu za antigen sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od njegovog afiniteta za nespecifični antigen. Treba, međutim, shvatiti da je antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigen, sposobno za specifično vezivanje za dva ili više antigena koji su povezani u sekvenci (npr. Kalidin ili des-Arg10-Kalidin i mišji Kalidin ili des- Arg10-Kalidin).

[0070] Kad se ovde koristi, izraz „antigen“ se odnosi na mesto vezivanja ili epitop koji je prepoznao antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena.

[0071] Kad se ovde koristi, izraz „vektor“ je namenjen da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban za transport druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan. Jedna vrsta vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvostruko vezanu DNK petlju u koju se mogu ligirati dodatni segmenti DNK. Druga vrsta vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu ligirati sa virusnim genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni sisarski vektori). Drugi vektori (npr., neepizomalni sisarski vektori) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i tako se repliciraju zajedno sa genomom domaćinom. Pored toga, određeni vektori su sposobni da usmeravaju eksprimiranje gena na koje su operativno povezani. Takvi vektori ovde se nazivaju „rekombinantni vektori eksprimiranja“ (ili jednostavno, „vektori eksprimiranja“). Generalno, vektori eksprimiranja od koristi u tehnikama rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. Izrazi „plazmid“ i „vektor“ međusobno su zamenjivi.

Međutim, cilj objave je da uključi i druge oblike vektora eksprimiranja, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa defektom, adenovirusi i adeno-pridruženi virusi), koji služe ekvivalentne funkcije.

[0072] Kad se ovde koristi, izraz „ćelija domaćin“ je namenjen da se odnosi na ćeliju u koju je uveden rekombinantni vektor eksprimiranja. Treba shvatiti da se ovaj izraz odnosi ne samo na određenu ćeliju pacijenta, već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se u narednim generacijama mogu pojaviti određene modifikacije zbog mutacije ili uticaja na životnu sredinu, takva potomstva možda nisu identična sa roditeljskom ćelijom, ali su i dalje obuhvaćena pojmom „ćelija domaćin“ kad se ovde koristi.

[0073] Kad se ovde koristi, izraz „lečenje“, „lečiti“ i „tretman“ odnose se na terapeutske ili preventivne mere opisane ovde. Postupci „lečenja“ uključuju primenu pacijentu, antitela ili fragmenta za vezivanje antigena predmetne objave, na primer, pacijentu koji ima bolest ili poremećaj povezan sa Kalidinom ili sa des-Arg10-Kalidinom (npr. upalna bolest) ili predisponiran da ima takvu bolest ili poremećaj, kako bi se sprečila, izlečila, odložila, smanjila ozbiljnost ili poboljšao jedan ili više simptoma bolesti ili poremećaja ili ponavljajuće bolesti ili poremećaja, ili kako bi se produžilo preživljavanje pacijenta koje nije bilo očekivano u odsustvu takvog tretmana.

[0074] Kad se ovde koristi, izraz „bolest ili poremećaj povezana sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom“ uključuje stanja bolesti i/ili simptome koji su povezani sa bolestima, gde su pronađeni izmenjeni nivoi ili aktivnost Kalidina ili des-Arg10-Kalidina. Primer bolesti ili poremećaja povezanih sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom uključuju, ali nisu ograničeni na, bol i fibrozu.

[0075] Kad se ovde koristi, izraz „efikasna količina“ odnosi se na tu količinu antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen koji vezuje Kalidin ili des-Arg10-Kalidin, koja je dovoljna da utiče na tretman, prognozu ili dijagnozu bolesti ili poremećaja povezanih sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom, kako je ovde opisano, kada se daju pacijentu.

Terapeutski efikasna količina će se razlikovati u zavisnosti od pacijenta i stanja oboljenja koji se tretira, težine i starosti pacijenta, ozbiljnosti bolesnog stanja, načina primene i slično, koji se lako mogu odrediti od strane stručnjaka u oblasti. Doze za primenu mogu da variraju od, na primer, oko 1 ng do oko 10,000 mg, oko 1 ug do oko 5000 mg, oko 1 mg do oko 1,000 mg, oko 10 mg do oko 100 mg, antitela ili fragmenta za vezivanje antigena prema objavi. Režimi doziranja mogu se prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan terapijski odgovor. Efikasna količina je takođe ona u kojoj se minimizuju ili premašuju bilo kakvi eventualni toksični ili štetni efekti (tj. neželjeni efekti) antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena.

[0076] Kad se ovde koristi, izraz „pacijent“ uključuje svaku ljudsku ili ne-ljudsku životinju.

[0077] Kad se ovde koristi, izraz „epitop“ se odnosi na antigensku determinantu koja interakuje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnoj regiji molekula antitela poznatoj kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela mogu se vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi od prostorno susednih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji se proizvodi susednim aminokiselinskim ostacima u polipeptidnom lancu.

[0078] Ovde se navodi da, kad se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblik jednine uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.

II. Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela

[0079] U jednom aspektu objava pruža antitela ili njihove fragmente za vezivanje antigena, koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin. Primeri VH, VL i CDR aminokiselinskih sekvenci antitela objave dati su u Tabeli 1.

Tabela 1. VH, VL i CDR aminokiselinske sekvence primernih anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela.

[0080] U određenim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju jednu ili više aminokiselinsku sekvencu CDR regije izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 5152, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, i 70.

[0081] U drugim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija izabrane iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 7, 8, i 9;

b) SEQ ID NO: 13, 14, i 15;

c) SEQ ID NO: 32, 33, i 34;

d) SEQ ID NO: 40, 41, i 42;

e) SEQ ID NO: 47, 48, i 49;

f) SEQ ID NO: 55, 56, i 57; i

g) SEQ ID NO: 63, 64, i 65, respektivno.

[0082] U drugim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija izabrane iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 10, 11, i 12;

b) SEQ ID NO: 16, 17, i 18;

c) SEQ ID NO: 35, 36, i 37;

d) SEQ ID NO: 43, 17, i 44;

e) SEQ ID NO: 50, 51, i 52;

f) SEQ ID NO: 58, 59, i 60;

g) SEQ ID NO: 66, 67, i 68; i

h) SEQ ID NO: 69, 25, i 70, respektivno.

[0083] U drugim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2, HCDR1, LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija izabrane iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, i 12;

b) SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, i 18;

c) SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 i 37;

d) SEQ ID NO: 40, 41, 42, 43, 17, i 44;

e) SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, i 52; i

f) SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, i 60, respektivno.

[0084] U drugom otelotvorenju, objava pruža humanizovana antitela, ili njihov fragment za vezivanje antigena, koji obuhvata jednu ili više CDR regiju (ili njenu konzervativno modifikovanu varijantu) iz ovde objavljenog mišjeg antitela. Bilo koji postupak humanizacije može da se primeni za generisanje humanizovanih antitela iz objave. Odgovarajući postupci su objavljeni ovde i specifično dati u Primeru 4.

[0085] U jednom određenom otelotvorenju, humanizovan antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u 13, 14, i 15, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87, i H108; i/ili

varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u 16, 17, i 18, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 i L104 (prema Kabat konvenciji numerisanja).

[0086] U drugim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju VH regiju aminokiselinskih sekvenci datih u SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 24, 25, 38, 45, 53, i/ili 61.

[0087] U drugim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju VL regiju aminokiselinskih sekvenci datih u SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54, i/ili 62.

[0088] U drugim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju VH i VL regije aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 19 i 26, SEQ ID NO: 20 i 27, SEQ ID NO: 21 i 28; SEQ ID NO: 22 i 28; SEQ ID NO: 23 i 29; SEQ ID NO: 24 i 30; SEQ ID NO: 25 i 31; SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 45 i 46, SEQ ID NO: 53 i 54, ili SEQ ID NO: 61 i 62, respektivno.

[0089] U određenim otelotvorenjima, antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, obuhvataju jednu ili više aminokiselinsku sekvencu CDR regije izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 5152, 55, 56, 57, 58, 59 i 60, gde jedna ili više aminokiselinska sekvenca CDR regija obuhvataju barem jenu ili više konzervativnu aminokiselinsku supstituciju.

[0090] Predmetna objava obuhvata i „konzervativne aminokiselinske supstitucije“ u CDR aminokiselinskim sekvencama (npr., SEQ ID NOs:, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 5152, 55, 56, 57, 58, 59 i 60) antitela objave, tj., modifikacije aminokiselinske sekvence koje ne ukidaju vezivanje antitela na antigen, npr. Kalidin ili des-Arg10-Kalidin. Konzervativne aminokiselinske supstitucije uključuju supstituciju aminokiseline u jednoj klasi aminokiseline iste klase, gde je klasa definisana zajedničkim fizičkim i aminokiselinskim svojstvima bočnog lanca i visokim frekvencijama zamene u homolognim proteinima koji se pronalaze u prirodi, kako je to utvrđeno, na primer, standardnom Daihof matricom razmene frekvencije ili BLOSUM matricom. Kategorizovano je šest opštih klasa aminokiselinskih bočnih lanaca i obuhvataju: Klasu I (Cys); Klasu II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Klasu III (Asn, Asp, Gln, Glu); Klasu IV (His, Arg, Lys); Klasu V (Ile, Leu, Val, Met); i Klasu VI (Phe, Tyr, Trp). Na primer, supstitucija Asp za drugi ostatak klase III, kao što su Asn, Gln ili Glu, je konzervativna supstitucija. Prema tome, predviđeni ne-esencijelnu aminokiselinski ostatak u anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitelu poželjno je zamenjen sa drugim amino kiselinskim ostacima iz iste klase. Postupci identifikacije konzervativnih aminokiselinska supstitucija koje ne eliminišu vezivanje antigena su dobro poznate u oblasti (pogledati, na primer, Brummell i dr., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi i dr. Protein Eng.12(10):879-884 (1999); i Burks i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).

[0091] U drugom otelotvorenju, predmetna objava pruža anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela, ili njihov fragment za vezivanje antigena, koji sadrže aminokiselinsku sekvencu VH i/ili VL regije sa oko 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom VH regije koja je navedena u SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 24, 25, 38, 45, 53 ili 61 ili aminokiselinskom sekvencom VL regije koja je navedena u SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54 ili 62, respektivno.

[0092] U još jednom otelotvorenju, predmetna objava pruža anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela koja se vezuju za isti epitop i/ili se unakrsno se nadmeću sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena koji sadrži aminokiselinske sekvence VH i VL regija koje su navedene u SEQ ID NO: 19 i 25, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 45 i 46, SEQ ID NO: 53 i 54 ili SEQ ID NO: 61 i 62, respektivno. Takva antitela mogu se identifikovati korišćenjem rutinskih testova nadmetanja vezivanja uključujući, na primer, testove nadmetanja zasnovane na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR).

[0093] U određenim aspektima, antitela objave vezuju konformacioni epitop kalidina (KD) ili desArg10 -kalidina (DAKD) koji usvaja „Pro4 kink“ konformaciju. Kao što je prikazano na Slici 17, obeležje proformacije „Pro 4 kink“ je tip II uskog obrtanja u glavnom lancu polipeptidne kičme KD ili DAKD na Prolinu 4. Kao što je poznato stručnjacima u oblasti, konformacija tipa II uskog obrtanja sastoji se od tri ostataka (X1-X2-X3) gde karbonil ostatak X1 formira vodonične veze sa amidom N ostatka X3, koji je tipično glicin (pogledati Richardson JS. “The anatomy and taxonomy of protein structure." Adv Protein Chem.1981 ;34:167-339, koji je ovde uključen referencom). Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, konformacija tipa II uskog obrtanja se formira Pro3-Pro4-Gly5 motivom od KD ili DADK. U konkretnijim otelotvorenjima, konformacija „Pro 4 kink“ se dalje definiše svim ili suštinski svim preostalim aminokiselinama od KD (1-2 i 6-9) ili DAKD prihvatanje ponavljanja sigmoidnog oblika koji poravnava hidrofobne bočne lance u režimu prostornog slaganja. III. Modifikovana Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela

[0094] U određenim otelotvorenjima, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela objave mogu sadržati jednu ili više modifikacija. Modifikovani oblici anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu se izvesti pomoću bilo kojih tehnika poznatih u struci.

i) Smanjenje imunogenosti

[0095] U određenim aspektima, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela, ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena, objave su modifikovana kako bi se smanjila njihova imunogenost korišćenjem tehnika poznatih u struci. Na primer, antitela ili njihovi fragmenti mogu biti himerizovana, humanizovana i/ili deimunizovana.

[0096] U jednom aspektu, antitelo objave ili njegov fragment za vezivanje antigena mogu biti himerni. Himerno antitelo je antitelo u kom različiti delovi antitela potiču iz različitih životinjskih vrsta, kao što su antitela koja imaju varijabilnu regiju izvedenu iz mišjeg monoklonskog antitela i konstantne regije ljudskog imunoglobulina. Postupci za proizvodnju himernih antitela ili njihovih fragmenata su poznati u struci. Pogledati, na primer, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i dr., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies i dr., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); U.S. Pat. Nos.5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397, koji su ovde u potpunosti obuhvaćeni referencom. Tehnike razvijene za proizvodnju „himernih antitela“ (Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci.81:851-855 (1984); Neuberger i dr., Nature 312:604-608 (1984); Takeda i dr., Nature 314:452-454 (1985)) mogu se koristiti za sintezu navedenih molekula. Na primer, genetska sekvenca koja kodira vezivnu specifičnost molekula mišjeg anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela može biti spojena zajedno sa sekvencom iz molekula ljudskog antitela odgovarajuće biološke aktivnosti. Kad se ovde koristi, himerno antitelo je molekul u kom različiti delovi potiču iz različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilnu regiju izvedenu iz mišjeg monoklonskog antitela i konstantnu regiju ljudskog imunoglobulina, na primer, humanizovana antitela.

[0097] U drugom otelotvorenju, antitelo objave ili njegov fragment za vezivanje antigena, je humanizovano. Humanizovana antitela imaju specifičnost vezivanja koja obuhvata jednu ili više regija za određivanje komplementarnosti (CDRs) od ne-ljudskog antitela i okvirnu regiju od molekula ljudskih antitela. Često će ostaci okvira u ljudskim okvirnim regija biti supstituisani sa odgovarajućim ostatkom iz antitela donora CDR-a kako bi se promenilo, poželjno poboljšalo vezivanje antigena. Ove okvirne supstitucije se identifikuju postupcima poznatim u struci, npr. modeliranjem interakcija CDR-a i ostataka okvira za identifikaciju ostataka okvira važnih za vezivanje antigena i poređenje sekvence kako bi se identifikovali neobični ostaci okvira na određenim pozicijama. (pogledati, npr., Queen i dr., U.S. Pat. No.

5,585,089; Riechmann i dr., Nature 332:323 (1988), koji su ovde u potpunosti obuhvaćeni referencom.) Antitela se mogu humanizovati korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci uključujući, na primer, CDR-graftovanje (EP 239,400; PCT objavi WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), furniranjem ili izranjanjem (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka i dr., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. i dr., PNAS 91:969-973 (1994)), i premeštanje lanaca (U.S. Pat. No.5,565,332).

[0098] U konkretnom otelotvorenju se primenjuje postupak humanizacije koji se zasniva na uticaju molekularne fleksibilnosti antitela tokom i pri imunološkom prepoznavanju (pogledati WO2009/032661, koji je ovde u potpunosti obuhvaćen referencom). Fleksibilnost proteina je vezana za molekularno kretanje molekula proteina. Fleksibilnost proteina je sposobnost čitavog proteina, dela proteina ili jedinstvenog amino kiselinskog ostatka da usvoje ansambl konformacija koji se značajno razlikuju jedne od drugih. Informacije o fleksibilnosti proteina se mogu dobiti izvođenjem eksperimenata proteinske rendgenske kristalografije (pogledati, na primer, Kundu i dr.2002, Biophys J 83:723-732.) eksperimenata nuklearne magnetne rezonance (pogledati, na primer, Freedberg i dr., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923) ili pokretanjem simulacija molekularne dinamike (MD). MD simulacija proteina se vrši na računaru i omogućava određivanje kretanja svih atoma proteina u određenom vremenskom periodu izračunavanjem fizičkih interakcija atoma jednih sa drugima. Izlaz MD simulacije je trajektorija proučavanog proteina u vremenskom periodu simulacije. Trajektorija je ansambl proteinskih konformacija, takođe se nazva snimak, koji se periodično uzorkuju tokom perioda simulacije, npr. svake 1 pikosekunde (ps). Analizom ansambla snimaka može se kvantifikovati fleksibilnost proteinskih amino kiselinskih ostataka. Dakle, fleksibilan ostatak je onaj koji usvaja ansambl različitih konformacija u kontekstu polipeptida u kom se nalazi ostatak. MD postupci su poznate u oblasti, pogledati, na primer, Brooks i dr. „Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics“ (Wiley, New York, 1988). Nekoliko softvera omogućava MD simulacije, kao što su Amber (pogledati Case i dr. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688), Charmm (pogledati Brooks i dr. (1983) J Comp Chem 4:187-217; i MacKerell i dr. (1998) i „The Encyclopedia of Computational Chemistry“ vol.

1:271-177, Schleyer i dr., eds. Chichester: John Wiley & Sons) ili Impact (pogledati Rizzo i dr. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900.)

[0099] Većina kompleksa proteina dele relativno veliku i planiranu površinu i pokazalo se da fleksibilnost partnera za vezivanje uzrokuje njihovu plastičnost, omogućavajući im da se prilagode jedni drugima (Structure (2000) 8, R137-R142). Kao takvi, pokazano je da primeri „indukovanog uklapanja“ imaju dominantnu ulogu u protein-protein interfejsima. Pored toga, postoji stalno rastući broj podataka koji pokazuju da proteini zapravo vezuju ligande različitih oblika i sastava (Protein Science (2002) 11:184-187) i da se čini da je konformaciona raznolikost suštinska komponenta sposobnosti prepoznavanja različitih partnera (Science (2003) 299, 1362-1367). Fleksibilni ostaci uključeni su u vezivanje protein-protein partnera (Structure (2006) 14, 683-693).

[0100] Fleksibilni ostaci mogu usvojiti različite konformacije koje obezbeđuju ansambl područja interakcije koji će verovatno biti prepoznati od strane memorijskih B ćelija i izazvati imunogeni odgovor. Prema tome, antitelo može biti humanizovano modifikovanjem velikog broja ostataka iz okvira, tako da ansambl konformacija i područja prepoznavanja, prikazani od strane modifikovanih antitela, podsećaju što je više moguće na one koje usvaja ljudsko antitelo. To se može postići modifikacijom ograničenog broja ostataka: (1) izgradnjom modela homologije roditeljskog mAb i pokretanjem MD simulacije; (2) analizirajući fleksibilne ostatke i identifikovanjem najfleksibilnijih ostataka molekula neljudskog antitela, kao i identifikovanjem ostataka ili motiva koji mogu biti izvor heterogenosti ili reakcije degradacije; (3) identifikovanjem ljudskog antitela koje prikazuje najsličniji ansambl oblasti prepoznavanja kao roditeljsko antitelo; (4) utvrđivanjem fleksibilnih ostataka koji treba mutirati, gde su ostaci ili motivi koji mogu biti izvor heterogenosti i degradacije takođe mutirani; i (5) proveravanjem prisustva poznatih T ćelijskih ili B ćelijskih epitopa. Fleksibilni ostaci se mogu naći pomoću izračunavanja MD, kao što je ovde predočeno korišćenjem implicitnog modela rastvarača, koji uzrokuje interakciju vodenog rastvarača sa atomima proteina u vremenskom periodu simulacije.

[0101] Jednom kada se identifikuje skup fleksibilnih ostataka u varijabilnim lakim i teškim lancima, identifikuju se set okvira varijabilne regije teškog i lakog lanca koji blisko podseća na antitelo od interesa. To se može učiniti, na primer, korišćenjem BLAST pretrage na setu fleksibilnih ostataka u odnosu na bazu podataka sekvenci germ linije ljudskog antitela.

Takođe se može uraditi upoređivanjem dinamike roditeljskog monoklonskog antitela sa dinamikom biblioteke kanoničkih struktura germ linija. Ostaci CDR-a i susedni ostaci isključeni su iz pretrage kako bi se obezbedio visok afinitet za antigen. Tada se zamenjuju fleksibilni ostaci.

[0102] Kada nekoliko ljudskih ostataka pokazuje slične homologije, selekciju vodi i priroda ostataka koji mogu da utiču na ponašanje rastvora humanizovanog antitela. Na primer, polarni ostaci će biti poželjni u izloženim fleksibilnim petljama pre hidrofobnih ostataka. Ostaci koji su potencijalni izvor nestabilnosti i heterogenosti takođe su mutirani čak i ako se nalaze u CDR-u. To će obuhvatiti izložene metionine, jer formiranje sulfofida može biti rezultat radikala kiseonika, proteolitičkog cepanja kiselih labilnih veza kao što su one kd Asp-Pro dipeptida (Drug Dev Res (2004) 61:137-154), mesta deamidacije koja se pronađu sa izloženim ostatkom asparagina praćena malom aminokiselino, kao što su Gly, Ser, Ala, H je, Asn ili Cys (J Chromatog (2006) 837:35-43) i mesta N-glikozilacije, kao što je mesto Asn-X-Ser/Thr. Tipično, izloženi metionini će biti zamenjeni sa Leu, izloženi asparagini će biti zamenjeni glutaminom ili aspartatom, ili će se naredni ostaci menjati. Za mesto glikozilacije (Asn-X-Ser/Thr), ili Asn ili Ser/Thr ostatak će biti promenjen.

[0103] Rezultujuća sekvenca kompozitnog antitela proverava se za prisustvo poznatih B ćelijskih ili linearnih T-ćelijskih epitopa. Pretraživanje se vrši, na primer, sa javno dostupnom bazom podataka imunih epitopa (Immune Epitope Data Base - IEDB) (PLos Biol (2005) 3(3)e91). Ako se poznati epitop nalazi unutar kompozitne sekvence, drugi niz ljudskih sekvenci se preuzima i supstituiše. Stoga, za razliku od postupka rekonstrukcije iz U.S. Pat. No. 5,639,641, ia B-ćelijski posredovani i T-ćelijski posredovani imunogeni odgovori se obrađuju postupkom. Ovaj postupak takođe izbegava problem gubitka aktivnosti koji se ponekad primećuje kod CDR graftovanja (U.S. Pat. No.5,530,101). Osim toga, problemi stabilnosti i rastvorljivosti se takođe uzimaju u obzir u procesu inženjeringa i selekcije, što dovodi do antitela koje je optimizovano za nisku imunogenost, visok afinitet antigena i poboljšana biofizička svojstva.

[0104] U nekim otelotvorenjima, deimunizacija se može koristiti za smanjenje imunogenosti i antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena. Kad se ovde koristi, izraz „deimunizacija“ uključuje promenu antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena za modifikovanje T ćelijskih epitopa (pogledati, na primer, WO9852976A1, WO0034317A2). Na primer, VH i VL sekvence iz početnog antitela mogu se analizirati i „mapa“ ljudskog T-ćelijskog epitopa može se generisati iz svake V regije koji prikazuje lokaciju epitopa u odnosu na regije koji određuju komplementarnost (CDR) i druge ključne ostatke u okviru sekvence. Pojedinačni T ćelijski epitopi iz T ćelijske mape epitopa se analiziraju kako bi se identifikovale alternativne supstitucije amino kiselina sa niskim rizikom od promene aktivnosti konačnog antitela. Dizajniran je niz alternativnih VH i VL sekvenci koje sadrže kombinacije aminokiselinskih supstitucija i ove sekvence se kasnije inkorporiraju u niz Kalidin ili des-Arg10-Kalidin-specifičnih antitela ili njihovih fragmenata za upotrebu u dijagnostičkim i postupcima objave koji su ovde prikazani, koji se zatim testiraju za funkciju. Tipično, generiše se i testira između 12 i 24 varijanti antitela. Kompletni geni teškog i lakog lanca, koja sadrže modifikovane V i ljudske C regije se zatim kloniraju u vektore eksprimiranja i naredni plazmidi su uvedeni u ćelijske linije za proizvodnju celog antitela. Antitela se onda upoređuju u odgovarajućim biohemijskim i biološkim testovima, i optimalna varijanta je identifikovana.

ii) Efektorske funkcije i modifikacije Fc

[0105] Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela objave mogu sadržati konstantnu regiju antitela (npr. IgG konstantnu regiju npr. ljudsku IgG konstantnu regiju, npr. ljudsku IgG1 ili IgG4 konstantnu regiju) koja posreduje jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa za konstantnu regiju antitela može aktivirati sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi ćelijskih patogena.

Aktivacija komplementa takođe stimuliše upalni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunu preosetljivost. Dalje, antitela se vezuju za receptore na različitim ćelijama preko Fc regije, sa Fc receptorskim vezujućim mestom na Fc vezujućoj regiji antitela za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji nekoliko Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptori), IgE (epsilon receptori), IgA (alfa receptori) i IgM (mu receptori). Vezivanje antitela na Fc receptore na ćelijskim površinama pokreće niz važnih i raznovrsnih bioloških odgovora uključujući okruživanje i uništavanje čestica obloženih antitelima, čišćenje imunih kompleksa, lizu ciljanih ćelija obloženih antitelima od strane ćelija ubica (nazvano ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, ili ADCC), oslobađanje upalnih medijatora, placentni transfer i kontrola proizvodnje imunoglobulina. U poželjnim otelotvorenjima, antitela objave ili njihovi fragmenti se vezuju za Fc-gama receptor. U alternativnim otelotvorenjima, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu sadržati konstantnu regiju koja je lišena jedne ili više efektorskih funkcija (npr., ADCC aktivnost) i/ili nije u mogućnosti da vezuje Fc receptor.

[0106] Određena otelotvorenja objave uključuju anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela u kojima je najmanje jedna aminokiselina u jednom ili više domena konstantne regiju izbrisana ili na drugi način izmenjena kako bi se obezbedile željene biohemijske karakteristike kao što su smanjene ili poboljšane efektorske funkcije, sposobnost nekovalentnog dimerizovanja, povećana sposobnost lokalizacije na mestu tumora, smanjivanje poluživota u serumu ili povećanje poluživota u serumu u poređenju sa celim, neizmenjenim antitelom približno iste imunogenosti. Na primer, određena antitela ili njihovi fragmenti za upotrebu u postupcima dijagnostike i postupaka koji su ovde opisani su antitela koja se antitela kojima je obrisan domena, obuhvataju polipeptidni lanac sličan imignoglobulinskom teškom lancu, ali kom nedostaje barem deo jednog ili više domena teškog lanca. Na primer, u određenim antitelima, jedan ceo domen konstantne regiju modifikovanog antitela biće izbrisan, na primer, celi ili deo CH2 domena će biti izbrisan.

[0107] U nekim drugim otelotvorenjima, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela sadrže konstantne regije izvedene iz različitih izotipa antitela (npr., konstantne regije od dva ili više ljudskih IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4). U drugim otelotvorenjima, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela obuhvataju himerni zglob (tj. zglob koji sadrži delove zgloba izvedene iz domena zglob različitih izotipa antitela, npr. domen gornjeg zgloba od IgG4 molekula i IgG1 domen srednjeg zgloba). U jednom otelotvorenju, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela obuhvataju Fc regiju ili njen deo od ljudskog IgG4 molekula i Ser228Pro mutacije (EU numeracija) u jezgru zglobnog dela molekula.

[0108] Kod određenih anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela, Fc deo može biti mutiran kako bi povećao ili smanjio efektorsku funkciju koristeći tehnike poznate u struci. Na primer, brisanje ili inaktivacija (preko tačaka mutacija ili drugim putem) domena konstantne regije može smanjiti vezivanje Fc receptora koji cirkulišu modifikovano antitelo, čime se povećava lokalizacija tumora. U drugim slučajevima može biti da su modifikacije konstantne regije konzistentne sa predmetnom objavom umerenog vezivanja komplementa, i na taj način se smanjuje poluživot u serumu i nespecifična asocijacija konjugovanog citotoksina. Ipak, druge modifikacije konstantnu regiju mogu se koristiti za modifikaciju disulfidnih veza ili oligosaharidnih ostataka koji omogućavaju poboljšanu lokalizaciju zbog povećane specifičnosti antigena ili fleksibilnosti. Dobijeni fiziološki profil, bioraspoloživost i drugi biohemijski efekti modifikacija, kao što je lokalizacija tumora, biodistribucija i poluživot u serumu, lako se mogu meriti i kvantifikovati koristeći dobro poznate imunološke tehnike bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0109] U određenim otelotvorenjima, Fc domen koji se koristi u antitelu objave je Fc varijanta. Kad se ovde koristi, izraz „Fc varijanta“ se odnosi na Fc domen koji ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na Fc domen divljeg tipa iz kog je izveden navedeni Fc domen. Na primer, kada je Fc domen izveden iz ljudskog IgG1 antitela, Fc varijanta navedenog ljudskog IgG1 Fc domena sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na navedeni Fc domen.

[0110] Aminokiselinska supstitucija varijante Fc može biti locirana na bilo kom položaju (tj. bilo kom aminokiselinskom položaju EU konvencije) unutar Fc domena. U jednom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na aminokiselinskom položaju koja se nalazi u domenu zgloba ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na aminokiselinskom položaju koja se nalazi u CH2 domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na aminokiselinskom položaju koja se nalazi u CH3 domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na aminokiselinskom položaju koja se nalazi u CH4 domenu ili njegovom delu.

[0111] Antitela objave mogu primeniti bilo koju Fc varijantu koja je u struci poznata da daje poboljšanje (npr. redukciju ili poboljšanje) u efektorskoj funkciji i/ili vezivanju FcR. Ove varijante Fc mogu uključivati, na primer, bilo koju od aminokiselinskih supstitucija objavljenih u međunarodnim PCT objavama WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2 ili U.S. Pat. Nos.5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; i 7,083,784, od kojih je svaki uključen ovde referencom. U jednom primeru otelotvorenja, antitelo objave može sadržati Fc varijantu koja sadrži aminokiselinsku supstituciju na EU položaju 268 (npr., H268D ili H268E). U još jednom primernom otelotvorenju, antitelo objave može sadržati aminokiselinsku supstituciju na EU položaju 239 (npr., S239D ili S239E) i/ili EU položaju 332 (npr., I332D ili I332Q).

[0112] U određenim aspektima, antitelo objave može sadržati Fc varijantu koja sadrži aminokiselinsku supstituciju koja menja antigen-nezavisne efektorske funkcije antitela, posebno poluživot cirkulacije antitela. Takva antitela pokazuju ili povećanje ili smanjenje vezivanja za FcRn u poređenju sa antitelima koja nemaju ove supstitucije, dakle, imaju povećan ili smanjen poluživot u serumu, respektivno. Za Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcRn je predviđeno da imaju duži poluživot u seruma i takvi molekuli imaju korisne primene u postupcima lečenja sisara u kojima je poželjan dugačak poluživot primene antitela, npr., za lečenje hroničnog oboljenja ili poremećaja. Nasuprot tome, očekuje se da Fc varijante sa smanjenim FcRn vezivnim afinitetom imaju kraći poluživot, i takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za davanje sisaru kod koga skraćeno vreme cirkulacije može biti povoljno, npr. za in vivo dijagnostičko snimanje ili u situacijama kada početno antitelo ima neželjene toksične efekte kada su prisutni u cirkulaciji duže vreme. Za varijante Fc sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn takođe je manje verovatno da prelaze placentu i stoga su korisne i pri lečenju bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, druge primene u kojima se može tražiti smanjen afinitet vezivanja FcRn uključuju one primene u kojima je poželjna lokalizacija mozga, bubrega i/ili jetre. U jednom primeru otelotvorenja, izmenjena antitela objave pokazuju smanjeni transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U još jednom otelotvorenju, izmenjena antitela objave pokazuju smanjen transport preko krvno-moždane barijere (BBB) iz mozga u vaskularni prostor. U jednom otelotvorenju, antitelo sa izmenjenim vezivanjem FcRn sadrži Fc domen koji ima jednu ili više aminokiselinska supstitucija unutar „FcRn vezujuće petlje“ Fc domena. FcRn vezujuća petlja se sastoji od amino kiselinskih ostataka 280-299 (prema EU numeraciji). Primerne aminokiselinske supstitucije koje su promenile aktivnost vezivanja FcRn su objavljene u međunarodnim PCT objavi br. WO05/047327 koji je ovde uključen referencom. U određenim primerima otelotvorenja, antitela ili njihovi fragmenti obuhvataju Fc domen koji ima jednu ili više sledećih supstitucija: V284E, H285E, N286D, K290E i S304D (EU numeracija).

[0113] U drugim otelotvorenjima antitela za upotrebu u dijagnostičkim i postupcima obrade opisanim ovde imaju konstantnu regiju, npr. konstantnu regiju teškog lanca IgG1 ili IgG4, koja se menja da smanji ili eliminiše glikozilaciju. Na primer, antitelo objave može takođe sadržati Fc varijantu koja sadrži aminokiselinsku supstituciju koja menja glikozilaciju antitela. Na primer, pomenuta Fc varijanta može imati smanjenu glikozilaciju (npr., N- ili O-vezanu glikozilaciju). U primernim otelotvorenjima, Fc varijanta sadrži smanjenu glikozilaciju N-povezanog glikana koji se normalno nalazi na aminokiselinskom položaju 297 (EU numeracija). U još jednom otelotvorenju, antitelo ima aminokiselinsku supstituciju u blizini ili u okviru glikozilacionog motiva, na primer, N-vezanog glikozilacionog motiva koji sadrži aminokiselinsku sekvencu NXT ili NXS. U konkretnom otelotvorenju, antitelo sadrži Fc varijantu sa aminokiselinskom supstitucijom na aminokiselinskom položaju 228 ili 299 (EU numeracija). U specifičnim otelotvorenjima, antitelo sadrži konstantnu regiju IgG1 ili IgG4 koja sadrži S228P i T299A mutaciju (EU numeracija).

[0114] Primerne aminokiselinske supstitucije koje donose redukovanu ili izmenjenu glikozilaciju su objavljene u međunarodnim PCT objavi br. WO05/018572, koji je ovde uključen referencom. U poželjnim otelotvorenjima, antitela objave ili njihovi fragmenti su modifikovani kako bi se eliminisala glikozilacija. Takva antitela ili njihovi fragmenti mogu se nazvati „agli (agly)“ antitela, ili njihovi fragmenti, (npr. „agli“ antitela). Iako nije vezano teorijom, veruje se da „agli“ antitela ili njihovi fragmenti mogu imati poboljšani profil sigurnosti i stabilnosti in vivo. Primerna agli antitela ili njihovi fragmenti obuhvataju aglikozilovanu Fc regiju IgG4 antitela koja je lišena funkcije Fc-efektora, čime se eliminiše potencijal za toksičnost posredovanu sa Fc prema normalnim vitalnim organima koji eksprimiraju Kalidin ili des-Arg10-Kalidin. U još nekim otelotvorenjima, antitela objave ili njihovi fragmenti sadrže izmenjeni glikan. Na primer, antitelo može imati smanjeni broj fukoznih ostataka na N-glikanu u Asn297 od Fc regije, tj. afukosilisano je. U još jednom otelotvorenju, antitelo može imati izmenjeni broj ostataka sijalične kiseline na N-glikanu u Asn297 od Fc regije.

iii) Kovalentno vezivanje

[0115] Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu se modifikovati, npr., pomoću kovalentnog vezivanja molekula za antitelo, tako da kovalentna veza ne sprečava antitelo da se specifično vezuje za svoj srodni epitop. Na primer, ali ne ograničavajući se, antitela objave ili njihovi fragmenti mogu se modifikovati glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem na ćelijski ligand ili neki drugi protein itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se obaviti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju itd. Dodatno, derivat može sadržati jednu ili više od neklasičnih amino kiselina.

[0116] Antitela objave ili njihovi fragmenti mogu dalje biti rekombinantno spojeni sa heterolognim polipeptidom na N- ili C-terminu ili hemijski konjugovani (uključujući kovalentne i ne-kovalentne konjugacije) na polipeptide ili druge sastave. Na primer, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela mogu biti rekombinantno spojena ili konjugovana sa molekulima korisnim kao oznake u testovima detekcije i efektorskim molekulima kao što su heterologni polipeptidi, lekovi, radionuklidi ili toksini. Pogledati, na primer, PCT objavi WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Pat. No.5,314,995; i EP 396,387.

[0117] Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela mogu biti spojeni sa heterolognim polipeptidima radi povećanja poluživota in vivo ili za upotrebu u imunoanalizama korišćenjem postupaka poznatih u struci. Na primer, u jednom otelotvorenju, PEG može biti konjugovan sa anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitelom objave kako bi povećao njihov poluživot in vivo. Leong, S. R., i dr., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); ili Weir i dr., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002).

[0118] Pored toga, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu biti fuzionisana sa marker sekvencama, kao što je peptid, kako bi se olakšalo njihovo pročišćavanje ili detekcija. U poželjnim varijantama, marker aminokiselinska sekvenca je heksa-histidin peptid, kao što je obeležje koje je dato u pQE vektoru (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), između ostalog, mnoga od njih su komercijalno dostupni. Kao što je opisano u Gentz i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), na primer, heksahistidin pruža pogodno pročišćavanje fuzionog proteina. Ostala obeležja peptida koja su korisna za pročišćavanje uključuju, ali nisu ograničena na, obeležje „HA“, koje odgovara epitopu izvedenom iz proteina hemaglutinina gripa (Wilson i dr., Cell 37:767 (1984)) i „flag“ obeležje.

[0119] Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu se koristiti u nekonjugovanom obliku ili mogu biti konjugovana sa najmanje jednim od različitih molekula, npr. radi poboljšanja terapeutskih svojstava molekula, kako bi se olakšala detektacija cilja, ili za snimanje ili terapiju pacijenta. Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu biti obeležena ili konjugovani bilo pre ili nakon pročišćavanja, kada se vrši pročišćavanje. Konkretno, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela iz objave mogu biti konjugovana na terapeutske agense, prolekove, peptide, proteine, enzime, viruse, lipide, modifikatore biološkog odgovora, farmaceutske agensi ili PEG.

[0120] Predmetna objava dalje obuhvata anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela objave konjugovanih sa dijagnostičkim ili terapeutskim agensom. Antitela protiv Kalidina ili des-Arg10-Kalidina mogu se koristiti dijagnostički, na primer, da prate razvoj ili progresiju poremećaja imunih ćelija (npr. CLL) kao deo postupka kliničkog ispitivanja, na primer, za određivanje efikasnosti datog tretman i/ili preventivnog režima. Detekcija može biti olakšana spajanjem anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela u detektabilnu supstancu. Primeri detektabilnih supstanci uključuju različite enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminiscenčne materijale, radioaktivne materijale, metale koji emituju pozitrone koristeći različite pozitronske emisione tomografije i neradioaktivne paramagnetne metalne jone. Pogledati, na primer, U.S. Pat. No.4,741,900 za metalne jone koji se mogu konjugovati sa antitelima za upotrebu kao dijagnostici prema predmetnoj objavi. Primeri pogodnih enzima uključuju perokidazu rena, alkalne fosfataze, pgalaktozidaze ili acetilholinesteraze; primeri odgovarajućih kompleksa proteinske grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri odgovarajućih fluoroscentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocianat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uključuje luminol; primeri bioluminiscentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i aekuorin; i primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju 125I, 131I, 111In ili 99Tc.

[0121] Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela za upotrebu u postupcima dijagnostike i lečenja koji su ovde opisani mogu se konjugovati sa citotoksinama (kao što su radioizotopi, citotoksični lekovi ili toksini) terapeutski agensi, citostatici, biološki toksini, prolekovi, peptidi, proteini , enzimi, virusi, lipidi, modifikatori biološkog odgovora, farmaceutski agensi, imunološki aktivni ligandi (npr. limfokini ili druga antitela gde se nastali molekul vezuje za neoplastične ćelije i efektorske ćelije kao što je T ćelija) ili PEG.

[0122] U još jednom otelotvorenju, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitelo za upotrebu u dijagnostičkim i postupcima objave koji su ovde prikazani mogu se konjugovati sa molekulom koji smanjuje rast tumora ćelija. U drugim otelotvorenjima, opisani sastav može sadržati antitela ili njihove fragmente, spojene sa lekovima ili prolekovima. Još neke druge realizacije predmetne objave sadrže upotrebu antitela ili njihovih fragmenata konjugovanih na specifične biotoksine ili njihove citotoksične fragmente kao što su ricin, gelonin, Pseudomonas ekotoksin ili difterijski toksin. Odabir koja će se konjugovana ili nekonjugovana antitela koristiti zavisiće od vrste i stadijuma raka, upotrebe dodatnog tretmana (npr., hemoterapije ili spoljašnjeg zračenja) i stanja pacijenta. Biće poželjno da stručnjaci u ovoj oblasti lako mogu napraviti ovakav izbor s obzirom na navode ovde.

[0123] Razumeće se da se u prethodnim studijama uspešno koriste anti-tumorska antitela obeležena sa izotopima kako bi se uništile tumorske ćelije na životinjskim modelima, i u nekim slučajevima i kod ljudi. Primeri radioizotopa uključuju: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re u 188Re. Radionuklidi deluju tako što proizvode jonizujuće zračenje koje uzrokuje višestruke prekide u nuklearnoj DNK, što dovodi do smrti ćelije. Izotopi koji se koriste za proizvodnju terapeutskih konjugata obično proizvode visoko energetske alfa- ili beta čestice koji imaju kratku dužinu puta. Takvi radionuklidi ubijaju ćelije koje su u neposrednoj blizini, na primer neoplastične ćelije kojima je konjugat priključen ili je ušao u njih. Oni imaju malo ili nimalo efekta na ne-lokalizovane ćelije. Radionuklidi su u suštini ne-imunogeni.

IV. Eksprimiranje anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela ili njihovih fragmenata za vezivanje antigena

[0124] Nakon manipulacije izolovanim genetskim materijalom kako bi se obezbedila anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela objave kao što je navedeno prethodno, geni su tipično umetnuti u vektor eksprimiranja za uvođenje u ćelije domaćina koje se mogu koristiti za proizvodnju željene količine tvrdih antitela ili njihovih fragmenata.

[0125] Izraz „vektor“ ili „vektor eksprimiranja“ kada se ovde koristi u svrhe specifikacije i patentnih zahteva, označava vektore koji se koriste u skladu sa predmetnom objavom kao agens za uvođenje i eksprimiranje željenog gena u ćeliji. Kao što je poznati stručnjacima, takvi vektori mogu se lako izabrati iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, virusa i retrovirusa. Generalno, vektori koji su kompatibilni sa predmetnom objavom će sadržati selekcioni marker, odgovarajuća mesta za ograničavanje kako bi se olakšalo kloniranje željenog gena i sposobnost ulaza i/ili replikacije u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama.

[0126] Za svrhe ovog objave mogu se koristiti brojni sistemi vektora eksprimiranja. Na primer, jedna klasa vektora koristi DNK elemente koji su izvedeni iz životinjskih virusa kao što su goveđi papiloma virus, virus polioma, adenovirus, virus vakcinije, bakulovirus, retrovirusi (RSV, MMTV ili MOMLV) ili SV40 virus. Drugi uključuju upotrebu policistronskih sistema sa unutrašnjim mestima vezivanja ribozoma. Pored toga, ćelije koje su integrisale DNK u svoje hromozome mogu se odabrati uvođenjem jednog ili više markera koji omogućavaju selekciju transfektovanih ćelija domaćin. Marker može obezbediti prototrofiju aukotrofnom domaćinu, otpornost na biocid (npr. antibiotike) ili otpornost na teške metale kao što je bakar. Selektivni markerski gen može biti direktno povezan sa DNK sekvencama koje treba da se eksprimiraju, ili se unose u istu ćeliju pomoću kotransformacije. Dodatni elementi mogu biti potrebni za optimalnu sintezu mRNK. Ovi elementi mogu uključivati signalne sekvence, signale vezivanja, kao i promotere transkripcije, pojačivače i signale zaključivanja. U posebno poželjnim otelotvorenjima geni klonirane varijabilne regije ubacuju se sintetički u vektor eksprimiranja zajedno sa sintetičkim genom konstantne regije teškog i lakog lanca (poželjno ljudski), kao što je gore opisano.

[0127] U drugim poželjnim otelotvorenjima, anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela objave ili njihovi fragmenti mogu se eksprimirati upotrebom polikistronskih konstrukta. U takvim sistemima eksprimrianja, višestruki proizvodi gena koji su od interesa, kao što su teški i laki lanci antitela mogu se proizvoditi iz jednog polikistronskog konstrukta. Ovi sistemi poželjno koriste unutrašnje mesto za unos ribozoma (IRES) da bi obezbedili relativno visoke nivoe polipeptida objave u eukariotskim ćelijama domaćina. Kompatibilne IRES sekvence su obelodanjene u U.S. Pat. No.6,193,980, koji je ovde uključen referencom.

Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da se takvi sistemi eksprimiranja mogu koristiti za efikasno proizvodnju čitavog spektra polipeptida koji su objavljeni u predmetnoj prijavi.

[0128] Uglavnom, kada se pripremi vektor ili DNK sekvenca koja kodira antitelo ili njegov fragment, vektor eksprimiranja se može uneti u odgovarajuću ćeliju domaćina. To znači da se ćelije domaćina mogu transformisati. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, transfekciju (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuziju protoplasta, precipitaciju kalcijum fosfata, fuziju ćelija sa obmotanom DNK, mikroinženjering i infekciju sa netaknutim virusom. Pogledati, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp.470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Najpoželjnije je uvođenje plazmida u domaćina je putem elektroporacije.

Transformisane ćelije se uzgajaju pod uslovima koji su pogodni za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca, i analizirane su za sintezu proteina teških i lakih lanaca. Primerne tehnike analize uključuju imunosorbent analizu vezanu sa enzimima (ELISA), radioimunotest (RIA) ili analizu ćelijskog sortera aktiviranog fluorescencijom (FACS), imunohistohemiju i slično.

[0129] Kad se ovde koristi, izraz „transformacija“ će se koristiti u širem smislu kako bi se odnosio na uvođenje DNK u ćeliju domaćina primaoca koji menja genotip i stoga rezultuje promenom ćelije primaoca.

[0130] U sličnom smislu, „ćelije domaćini“ odnosi se na ćelije koje su transformisane pomoću vektora konstruiranih pomoću tehnike rekombinantne DNK i kodiraju najmanje jedan heterologni gena. U opisima procesa za izolaciju polipeptida iz rekombinantnih domaćina, izrazi „ćelija“ i „ćelijska kultura“ koriste se zamenljivo kako bi označili izvor antitela, osim ako nije jasno naznačeno drugačije. Drugim rečima, oporavak polipeptida iz „ćelija“ može značiti ili iz usporenih celih ćelija, ili iz ćelijske kulture koja sadrži i medijum i suspendovanu ćeliju.

[0131] U jednom otelotvorenju, linija ćelija domaćin korišćena za eksprimiranje antitela je sisarskog porekla; stručnjaci u oblasti mogu odrediti određene ćelijske linije domaćina koje su najpogodnije za eksprimiranje željenog genskog proizvoda. Primerne ćelijske linije domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, DG44 i DUXB11 (linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (karcinoma ljudske materice), CVI (linija bubrega majmuna), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), R1610 (fibroblast kineskog hrčka), BALBC/3T3 (mišji fibroblast), HAK (linija bubrega hrčka), SP2/O (mišji mielom), BFA-1c1BPT (goveđe endotelne ćelije), RAJI (ljudski limfocit), 293 (ljudski bubreg). U jednom otelotvorenju, ćelijska linija pruža izmenjenu glikozilaciju, npr. afukosilaciju, antitela koje je iz nje eksprimirano (npr. PER.C6.RTM. (Crucell) ili FUT8-knockout CHO ćelijske linije (Potelligent.RTM. Cells) (Biowa, Princeton, N.J.)). U jednom otelotvorenju mogu se koristiti NS0 ćelije. CHO ćelije su posebno poželjne. Linije ćelija domaćin su obično dostupne od strane komercijalnih pružaoca usluga, od American Tissue Culture Collection ili iz objavljene literature.

[0132] In vitro proizvodnja dozvoljava povećanje količine željenih polipeptida. Tehnike za kultivaciju ćelija sisara u uslovima tkivne kulture su poznate u oblasti i uključuju homogenu kulturu suspenzije, npr. u vazdušnom reaktoru ili u reaktoru sa stalnim mešanjem, ili imobilisanu ili uvezanu ćelijsku kulturu, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, agaroznim mikrogranulama ili keramičkim kertridžima. Ako je neophodno i/ili poželjno, rastvori polipeptida mogu biti pročišćeni pomoću uobičajenih postupka hromatografije, na primer filtracija gelom, jonizujuća hromatografija, hromatografija preko DEAE-celuloze i/ili (imuno-) afinitetna hromatografija.

[0133] Geni koji kodiraju anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela ili njihove fragmente objave mogu se takođe biti eksprimirane ne-sisarske ćelije kao što su bakterije ili kvasac ili biljne ćelije. U tom smislu biće prihvaćeno da se različiti jednoćelijski ne-sisarski mikroorganizmi, kao što su bakterije, takođe mogu transformisati; tj. mogu se gajiti u kulturi ili fermentaciji. Bakterije, koje su podložne transformaciji, uključuju članove enterobakterija, kao što su sojevi Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što je Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, i Haemophilus influenzae. Dalje će se uvažiti da, kada se eksprimiraju u bakterijama, polipeptidi mogu postati deo inkluzionih tela. Polipeptidi moraju biti izolovani, pročišćeni i zatim sastavljeni u funkcionalne molekule.

[0134] Pored prokariota, mogu se koristiti i eukariotski mikrobi. Saccharomyces cerevisiae, ili uobičajeni pekarski kvasac, najčešće se koristi među eukariotskim mikroorganizmima, iako su mnogi drugi sojevi takođe dostupni. Za eksprimiranje u Saccharomyces, obično se koristi plazmid YRp7, na primer (Stinchcomb i dr., Nature, 282:39 (1979); Kingsman i dr., Gene, 7:141 (1979); Tschemper i dr., Gene, 10:157 (1980)). Ovaj plazmid već sadrži TRP1 gen koji daje selekcioni marker za mutantni soj kvasaca koji nema sposobnost da raste u triptofanu, na primer ATCC No.44076 or PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). Prisustvo trpl lezije kao karakteristika genoma ćelije domaćina kvasca potom pruža efektivno okruženje za detektovanje transformacije rastom u odsustvu triptofana.

V. Farmaceutske formulacije i postupci primene anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela.

[0135] U drugom aspektu, objava pruža farmaceutske sastave koje sadrže anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitelo, ili njegov fragment.

[0136] Postupci pripreme i davanja antitela objave ili njihovih fragmenata pacijentu dobro su poznati, ili se lako određuju od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Način primene antitela objave ili njegovih fragmenata može biti oralni, parenteralni, inhalacijom ili topikalno. Izraz parenteralno kad se ovde koristi uključuje intravenoznu, intraarterijalnu, intraperitonealnu, intramuskularnu, potkožnu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Uobičajeni su intravenski, intraarterijalni, potkožni i intramuskularni oblici parenteralne primene. Iako su svi ovi oblici primene jasno razmatrani kao da su u okviru objave, oblik za primenu bio bi rastvor za injekciju, posebno za intravenoznu ili intraarterijalnu injekciju ili kapanje. Obično, pogodan farmaceutski sastav za injekciju može sadržati pufer (npr. acetat, fosfat ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbat), opciono agens za stabilizaciju (npr. ljudski albumin) itd.

Međutim, u drugim postupcima kompatibilnim sa ovim tekstom, polipeptidi se mogu dostaviti direktno na mesto neželjene ćelijske populacije čime se povećava izloženost obolelog tkiva terapijskom agensu.

[0137] Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i injekcijski organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvora, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i pufer. U predmetnoj objavi, farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, 0,01-0,1 M i poželjno 0,05 M fosfatni pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Drugi uobičajeni parenteralni nosači uključuju rastvore natrijum-fosfata, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, laktatizovanog Ringera ili fiksna ulja. Intravenski nosači uključuju obnavljače tečnosti i hranljivih materija, obnavljače elektrolita, poput onih zasnovanih na Ringerovoj dekstrozi i slično. Konzervansi i drugi aditivi mogu takođe biti prisutni, na primer, antimikrobi, antioksidanti, agensi za keliranje, inertni gasovi i slično. Konkretnije, farmaceutski sastavi pogodne za injektibilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (gde je voda rastvarač) ili disperzije i sterilni prah za neposredno pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. U takvim slučajevima, sastav mora biti sterilan i trebalo bi da bude tečan u meri u kojoj omogućava lako korišćenje sa špricem. Trebalo bi da bude stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja, i poželjno će biti očuvan od kontaminacije mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosilac može biti rastvarač ili agens za disperziju koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilenglikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom prevlake kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem površinski aktivnih materija. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal i slično. U mnogim slučajevima biće poželjnije uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol, sorbitol ili natrijum-hlorid u kompoziciji. Produžena apsorpcija injektibilnih sastava može se dobiti tako što se u sastav uključi agens koji odlaže apsorpciju, na primer aluminijum-monostearat i želatin.

[0138] U svakom slučaju, sterilni injekcioni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja (npr. samog antitela ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima) u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih ovde, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilan nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektibilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem, što daje prah aktivnog sastojka plus dodatni željeni sastojak iz ranije sterilnog filtriranog rastvora. Preparati za injekcije se obrađuju, pune u ambalažu kao što su ampule, vreće, bočice, špricevi ili epruvete, i zapečaćeni su u aseptičkim uslovima prema postupcima poznatim u ovoj oblasti. Dalje, preparati mogu biti upakovani i prodati u obliku kompleta kao što su oni opisani u U.S. Publication No.

2002/0102208 koji je ovde inkorporiran referencom. Ovakvi predmeti proizvodnje će poželjno imati etikete ili umetke za pakovanje koji ukazuju na to da su pridruženi preparati korisni za lečenje pacijenta koji pati od autoimunih ili neoplastičnih poremećaja.

[0139] Efikasne doze stabilizovanih antitela ili njihovih fragmenata predmetne objave za tretiranje gore opisanih stanja variraju zavisno od mnogih različitih faktora, uključujući načine primene, ciljano mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju, i da li je terapija profilaktička ili terapeutska. Obično je pacijent čovek, ali se takođe mogu tretirati i ne-ljudski sisari, uključujući transgene sisare. Doze za lečenje mogu se titrirati korišćenjem rutinskih postupka poznatih stručnjacima kako bi se optimizovali bezbednost i efikasnost.

[0140] Za pasivnu imunizaciju sa antitelom objave, doziranje može da varira, npr. od oko 0,0001 do 100 mg/kg, a obično 0,01 do 5 mg/kg (npr.0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, itd.) telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg, poželjno najmanje 1 mg/kg. Intermedijentne doze u gornjem opsegu takođe imaju za cilj da budu u okviru objave.

[0141] Subjektima se takve doze mogu primenjivati dnevno, svakog drugog dana, nedeljno ili prema bilo kom drugom rasporedu određenom empirijskom analizom. Primerno lečenje podrazumeva primenu u višestrukim dozama tokom dužeg perioda, na primer, od najmanje šest meseci. Dodatni primeri režima lečenja podrazumevaju primenu jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom na svaka 3 do 6 meseci. Primeri rasporeda doziranja uključuju 1-10 mg/kg ili 15 mg/kg svakog dana, 30 mg/kg svakog drugog dana, ili 60 mg/kg nedeljno. U nekim postupcima, istovremeno se daju dva ili više monoklonska antitela sa različitim vezivnim specifičnostima, i u tom slučaju doziranje svakog antitela koje se primenjuje može biti u navedenom opsegu.

[0142] Antitela objave ili njihovi fragmente mogu se primenjivati u više navrata. Intervali između pojedinačnih doziranja mogu biti, npr., dnevno, nedeljno, mesečno ili godišnje.

Intervali takođe mogu biti nepravilni, kao što je prikazano merenjem nivoa nivoa polipeptida ili ciljnog molekula kod pacijenta. U nekim postupcima doziranje se prilagođava kako bi se postigla određena plazma antitela ili koncentracija toksina, npr. 1-1000 ug/ml ili 25-300 ug/ml. Alternativno, antitela ili njihovi fragmenti mogu se primenjivati kao formulacija sa produženim oslobađanjem, i u tom slučaju je neophodna manje česta primena. Doziranje i učestalost variraju zavisno od poluživota antitela u pacijentu. Generalno, humanizovana antitela pokazuju najduži poluživot, praćena himernim antitelima i ne-ljudskim antitelima. U jednom aspektu, antitela objave ili njihovi fragmenti mogu se davati u nekonjugovanom obliku. U još jednom otelotvorenju, antitela objave mogu se davati više puta u konjugovanom obliku. U još jednom otelotvorenju, antitela objave ili njihovi fragmenti mogu se davati u nekonjugovanom obliku, zatim u konjugovanom obliku ili obrnuto.

[0143] Doziranje i učestalost primene mogu se razlikovati u zavisnosti od toga da li je terapija profilaktička ili terapijska. U profilaktičkim upotrebama, sastavi koje sadrže prisutna antitela ili njihov koktel se daju pacijentu koji nije još u bolesnom stanju da bi poboljšao otpor pacijenta. Takva količina je definisana kao „profilaktički efikasna doza". U ovoj upotrebi, precizne količine opet zavise od zdravstvenog stanja pacijenta i opšteg imuniteta, ali uopšte se kreću od 0,1 do 25 mg po dozi, posebno od 0,5 do 2,5 mg po dozi. Relativno niska doza se primenjuje u relativno niskim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju lečenje do kraja svog života.

[0144] U terapeutskim upotrebama relativno visoka doza (npr. od oko 1 do 400 mg/kg antitela po dozi, gde se doze od 5 do 25 mg češće koriste za radioimunokonjugate, a veće doze za konjugovane molekule citotoksina) u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna sve dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, i poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može primeniti profilaktički režim.

[0145] U jednom aspektu, pacijent se može tretirati molekulom nukleinske kiseline koji kodira polipeptid objave (npr., u vektoru). Doze za nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide se kreću od oko 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 ug do 10 mg ili 30-300 ug DNK po pacijentu. Doze za zarazne virusne vektore variraju od 10-100, ili više, viriona po dozi.

[0146] Terapeutski agensi se mogu davati parenteralnim, topikalnim, intravenoznim, oralnim, potkožnim, intraarterijalnim, intrakranijalnim, intraperitonealnim, intranazalnim ili intramuskularnim putevima za profilaktički i/ili terapijski tretman. Intramuskularna injekcija ili intravenozna infuzija su poželjni za primenu antitela objave. U nekim postupcima, terapeutska antitela ili njihovi fragmenti se direktno ubrizgavaju u kranijum. U nekim postupcima, antitela ili njihovi fragmenti se primenjuju kao sastav ili uređaj sa produženim oslobađanjem, kao što je Medipad™ uređaj.

[0147] Agensi objave mogu se opciono primenjivati u kombinaciji sa drugim agensima koji su efikasni u lečenju poremećaja ili stanja za koje je potrebno lečenje (npr., profilaktički ili terapijski). Poželjni dodatni agensi su oni koji su priznati u struci i koji se standardno primenjuju za određeni poremećaj.

[0148] Efikasne doze jednokratnog tretmana (tj. terapeutski efikasne količine) 90Yobeleženih antitela objave u rasponu su od oko 5 i oko 75 mCi, poželjnije od oko 10 i oko 40 mCi. Efikasne ablativne doze jednokratnog tretmana, koji nije za srž, 131I-obeleženih antitela u rasponu su od oko 5 do oko 70 mCi, poželjnije od oko 5 i oko 40 mCi. Efikasne ablativne doze jednokratnog tretmana (tj., mogu zahtevati autolognu transplantaciju koštane srži) 131I-označenih antitela u rasponu su od oko 30 do oko 600 mCi, poželjnije od oko 50 i manje od oko 500 mCi. U kombinaciji sa himernim modifikovanim antitelima, zahvaljujući dužem cirkulacionom poluživotu vis-a-vis mišjeg antitela, efikasne ablativne doze jednokratnog tretmana, koji nije za srž, jod-131-obeleženih himernih antitela u rasponu su od oko 5 i oko 40 mCi, poželjnije manje od oko 30 mCi. Kriterijumi za snimanje, npr.111In obeležje, obično su manji od oko 5 mCi.

[0149] Iako je dobilo steklo kliničko iskustvo sa 131I i .90Y, druga radioobeležja su poznata u struci i koriste se u slične svrhe. I dalje se koriste drugi radioizotopi za snimanje. Na primer, dodatni radioizotopi koji su kompatibilni sa obimom trenutne objave uključuju, ali nisu ograničeni na, 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211A 213Bi. S tim u vezi, alfa, gama i beta emiteri su kompatibilni u okviru predmetne objave. Dalje, s obzirom na predmetnu objavu, pretpostavlja se da će stručnjak u oblasti lako odrediti koji su radionuklidi kompatibilni sa odabranim tokom tretmana bez nepotrebnog eksperimentisanja. U tom cilju, dodatni radionuklidi koji su već korišćeni u kliničkoj dijagnozi uključuju 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, kao i 111In. Antitela su takođe obeležena različitim radionuklidima za potencijalnu upotrebu u ciljanoj imunoterapiji (Peirersz i dr. Immunol. Cell Biol.65: 111-125 (1987)). Ovi radionuklidi uključuju 188Re i 186Re, kao i 199Au i 67Cu u manjoj meri. U.S. Pat. No. 5,460,785 daje dodatne podatke u vezi sa takvim radioaktivnim izotopima i ovde je uključen referencom.

[0150] Kao što je prethodno razmatrano, antitela objave ili njihovi fragmenti mogu se davati u farmaceutski efikasnoj količini za in vivo tretman poremećaja sisara. U tom smislu, biće prihvaćeno da će objavljena antitela ili njihovi fragmenti biti formulisani tako da olakšaju primenu i da unapređuju stabilnost aktivnog agensa. Poželjno, farmaceutski sastavi u skladu sa ovim predmetnom objavom obuhvataju farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilni nosač kao što su fiziološki rastvor, netoksični puferi, konzervansi i slično. Za potrebe predmetne prijave, farmaceutski efikasna količina antitela objave, konjugovana ili nekonjugovana sa terapijskim agensom, smatra se količinom koja je dovoljna da postigne efektivno vezivanje za cilj i da postigne pogodnost, npr. da poboljša simptome bolesti ili poremećaja ili da detektuje supstancu ili ćeliju. U slučaju tumorskih ćelija, polipeptid će poželjno biti u interakciji sa odabranim imunoreaktivnim antigenom na neoplastičnim ili imunoreaktivnim ćelijama i obezbediti povećanje smrti tih ćelija. Naravno, farmaceutski sastavi predmetne objave mogu se primenjivati u jednoj ili više doza kako bi se obezbedila farmaceutski efikasna količina polipeptida.

[0151] U skladu sa obimom predmetne objave, antitela objave mogu se davati čoveku ili drugoj životinji u skladu sa gore pomenutim postupcima lečenja u količini koja je dovoljna da proizvede terapeutski ili profilaktički efekat. Polipeptidi objave mogu se primenjivati na takvog čoveka ili drugu životinju u konvencionalnom doznom obliku, pripremljenim kombinovanjem antitela objave sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem u skladu sa poznatim tehnikama. Stručnjaku će biti poznato da oblik i karakter farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača diktiraju količina aktivnog sastojka sa kojim se kombinuje, način primene i druge dobro poznate varijable. Stručnjaci u ovoj oblasti će dodatno ceniti da koktel koji sadrži jednu ili više vrsta polipeptida prema ovom prikazanom postupku može biti posebno efikasan.

VI. Postupci lečenja bolesti ili poremećaja povezanih sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom

[0152] Anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitela objave ili njihovi fragmenti su korisni za antagonizaciju aktivnosti Kalidina ili des-Arg10-Kalidina. Shodno tome, u drugom aspektu, objava pruža postupke za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom davanjem pacijentu, kom je to potrebno, farmaceutskog preparata koji sadrži jedno ili više anti-Kalidin ili des-Arg10-Kalidin antitelo objave ili njegov fragmenta za vezivanje antigena.

[0153] Bolesti ili poremećaj povezanih sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom podložni tretiranju uključuju, ali nisu ograničene na, patofiziološka stanja kao što su upala, trauma, opekotine, šok, alergija, akutni ili hronični bol i fibroza, na primer, bubrežna fibroza. U izvesnim primernim otelotvorenjima, antitela objave se mogu koristiti za lečenje bubrežne fibroze i povezanih akutnih povrede bubrega, kao i hroničnih bolesti bubrega koje su glavni uzroci endoskopske renalne insuficijencije.

[0154] Stručnjak u oblasti bi mogao, rutinskim eksperimentisanjem, da utvrdi koja efikasna, netoksična količina antitela (ili dodatni terapeutski agensi) bi bila za svrhe lečenja bolesti ili poremećaja povezanih sa Kalidinom ili des-Arg10-Kalidinom. Na primer, terapeutski aktivna količina polipeptida može se razlikovati u zavisnosti od faktora kao što je stadijum bolesti (npr. faza I u odnosu na fazu IV), starost, pol, medicinske komplikacije (npr. imunosupresivna stanja ili bolesti) i težina pacijenta, i sposobnost antitela da izazove željeni odgovor u pacijentu. Režim doziranja se može prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan terapijski odgovor. Na primer, nekoliko podeljenih doza može se primenjivati dnevno, ili doza može biti proporcionalno smanjena, kao što je pokazano potrebama terapeutske situacije. Međutim, generalno, očekuje se da efektivna doza bude u opsegu od oko 0,05 do 100 miligrama po kilogramu telesne težine dnevno, a poželjnije od oko 0,5 do 10, miligrama po kilogramu telesne težine dnevno.

VII. Primeri

[0155] Ova objava dalje sadrži sledeće primere koji se ne treba da se tumače kao ograničavajući.

[0156] Osim toga, u skladu sa predmetnom objavom može se koristiti uobičajene tehnike molekularne biologije, mikrobiologije i rekombinantne DNK u okviru struke. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledati, na primer., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (ovde "Sambrook i dr., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed.1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel i dr. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Primer 1:Proizvodnja hibridoma: Imunizacija miševa sa Kalidin peptidom konjugovanim sa KLH i stvaranje antitela protiv ljudskih BKR1liganda

[0157] Cilj je bio razviti unakrsno reaktivna antitela protiv Kalidina (KD, SEQ ID NO: 1) i des-arg-Kalidina (DAKD, SEQ ID NO: 2) koja bi inhibirala one ligande koji se vezuju za ljudski BKR1. Generalno, imunizacija miševa sa KLH konjugovanim KD pomoću dodatnih cisteina na C- ili N- terminusu peptida korišćena je za dobijanje splenocita miša za fuziju sa ćelijskim linijama mijeloma miša kao fuzionog partnera za proizvodnju hibridoma.

[0158] Ukratko, protokol imunizacije bio je sledeći: BALB/c miševi (8-20 nedelja naivne ženke) su imunizovani intraperitonealno sa mešavinom jednakih količina KLH-KD i KD-KLH u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) kao antigen ukupno 100 ug po mišu pomešano u odnosu 1:1 Sigma Adjuvant System (Sigma cat# 6322) u ukupnoj zapremini od 200 μl po mišu (dan 0). Na dan 21, miševi su pojačani mešavinom ravnomernih količina KLH-KD i KD-KLH u PBS kao antigen ukupno 50 ug po mišu pomešano u odnosu 1:1 Sigma Adjuvant System (Sigma cat# 6322) u ukupnoj zapremini 200 μl po mišu. Na dan 30, uzorci krvi su sakupljeni za KD specifičnu evaluaciju titara antitela. Na dan 51, miševi su pojačani za fuziju sa mešavinom ravnomernih količina KLH-KD i KD-KLH u PBS-u kao antigen ukupno 50 ug po mišu pomešano u odnosu 1:1 Sigma Adjuvant System (Sigma cat# 6322) u ukupnoj zapremini od 200 μl po mišu. Na dan 55 miševi su žrtvovani u CO2 komori, krv je sakupljena kroz srčanu punkciju i slezina je sakupljena za proizvodnju hibridoma.

[0159] Hibridomi su napravljeni spajanjem ćelija mijeloma miševa koji su deficijentni za adenozin fosforiboziltransferazu (APRT) sa ćelijama slezine miševa imunizovanih sa specifičnim antigenom. Sistem selekcije koji koristi HAT (hipoksantin, azaserin i timidin) eliminiše sve osim fuzionih ćelija koje su APRT+. Uspešni hibridomi takođe moraju zadržati teški lanac imunoglobulina (Igh), jedan od lokusa lakog lanca imunoglobulina i izlučeno funkcionalno antitelo.

[0160] Agens za proizvodnju hibridoma (IMDM) napravljen je kombinovanjem sledećeg: 500 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (HyClone SH30259.01), 50 ml fetalnog goveđeg seruma (HyClone SH30070.03), 5 ml L-glutamina (Gibco Invitrogen cat# 25030), 5 ml ne-esencijalnih aminokiselina (Gibco Invitrogen cat# 11140050), 5 ml natrijum piruvata (Gibco Invitrogen cat# 11360070), 5 ml 0,1% penicilin-streptomicina (Gibco Invitrogen cat# 15140148). Medijum je filtriran pre upotrebe. Ekspanzioni medijum je napravljen kombinovanjem sledećeg: 1000 ml seruma bez medijuma (Gibco Hibridoma SFM # 12045), 100 ml 10% HyClone SuperLow IgG Defined FBS # SH30898.03 i 10 ml penicilin/streptomicina. Agens za zamrzavanje je 45 ml FBS inaktiviran toplotom (HyClone SH30070.03) i 5 ml DMSO, filter sterilizovan. Ostali materijali uključuju sledeće: HAT (50x) je dobijen od Sigma-Aldrich (# HO262); Hybridoma Fusion i Cloning Supplement (50X) (Roche Diagnostics 11363 735 001); Trypan Blue Stain 0,4% (Invitrogen cat# 15250-061 ili T10282); PEG 1500 u 75 mM Hepes 50% w/v (Roche cat# 783641 (10783641001). Svi reagensi osim HAT i Hybridoma Fusion i Cloning Supplement su korišćeni na 37°C.

Tabela 2. Peptidni reagensi koji se koriste u imunizaciji i skriningu

[0161] Ukratko, tri ili četiri dana pre fuzije, miševi su pojačani antigenom od interesa bilo intraperitonealno ili intravenozno. Na dan fuzije, miš je žrtvovan u CO2komori, krv je sakupljena srčanom punkcijom, i slezina je izvađena i stavljena u 10 ml IMDM bez seruma u Petrijevoj posudi. Mijelom ćelija fuzionih partnera: FO (ATCC ref CRL-1646)/X63 Ag8.653 (ATCC ref CRL1580) su uzgajane u log fazi, i zatim se rastavljaju jedan dan pre fuzije (1:2 i 1:5) i sakupljaju se u 20 ml cevi za centrifugu, obrću i resuspenduju pelete u 10 ml IMDM. Pelete se ispiraju dva puta u IMDM medijumu bez seruma. Sve centrifuge se izvode na 1570 obrtaja u minuti tokom 5 minuta. Konačna resuspenzija bila je u 10 ml IMDM bez seruma. Vezivno tkivo je izvađeno od slezine. Slezina je injektirana sa 1 ml IMDM bez seruma unapred zagrejanog na 37°C pomoću 1 ml šprica i igle sa 25 otvora. Splenociti su stisnuti iz fibroelastičnog premaza pomoću šiljaka i oprani dva puta u 10 ml IMDM bez seruma (uključujući početno obrtanje) i resuspendovani su u 10 ml IMDM bez seruma. Ćelije su prebrojane u Countess Automated Cell Counter.

[0162] Ćelije fuzioni partneri i splenociti su kombinovani u jednoj epruveti od 50ml u odnosu od 1:2 do 1:10 (po broju ćelija) i obrtane se na 970 obrtaja u minuti tokom 10 min (sporo centrifugiranje) kako bi se formirale labave pelete. Nakon „sporog“ obrtanja, supernatant je oprezno izvučen kako se ne bi ometale pelete, ali kako bi se minimizovala količina tečnosti preko ćelija kako ne bi se razblažio PEG 1500. Poslednji preostali medijum je rezervisan i dodat nazad nakon što je PEG dodat (u nastavku). Unapred zagrejani PEG 1500 (37°C, ukupno 1 ml) dodat je kap po kap ćelijskom peletu tokom perioda od 1 minuta, i ćelije su mešane nakon dodavanja svake kapi PEG. Peleti su inkubirani sa PEG još 1 minut, nakon čega je dodato 10 ml IMDM medijuma bez seruma u trajanju od 1 minuta, tako da se prvi 1 ml od 10 dodaje tokom 30 sekundi. Ćelije su sporo obrtane na 970 obrtaja u minuti tokom 10 min, i supernatant je dekantovan. U (2) 100ml korita, dodato je sledeće: 70ml IMDM sa 10% FBS, 2ml HATand 2ml Hybridoma i Fusion Cloning Supplement. Ćelije su resuspendovane u 10 ml IMDM sa 10% FBS i podeljene na (2) 50 ml epruvete (5 ml ćelije/epruveta) i 25 ml IMDM sa 10% FBS. Dobijeni 30ml je prebačen u korita koja sadrže 70ml HBSS/HAT/ cloning supplement i 200ul ćelija/komorica je pipetirano u (10) 96-komorične ploče. Fuzija je bila spremna za skrining pomoću ELISA (50ul) oko 10 do 14 dana kasnije, ili kada je medijum u komoricama žut. Nakon primarnog skrininga, odabrani su pozitivni klonovi, numerisani i premešteni u 24-komoričnu ploču u 500 ul IMDM po komorici sa 10% FBSHI. Supernatanti hibridoma su prikazani pomoću ELISA na streptavidinu obloženom sa N- i C-terminalni biotinilovanim peptidima (pogledati u nastavku).

Primer 2: Karakterizacija i odabir hibridoma koji eksprimiraju antitela protiv ljudskih BKR1 liganda

[0163] Supernatanti hibridoma su skrinigovani pomoću ELISA na streptavidin pločama obloženim N- i C-terminalni biotinilovanim peptidima (pogledati, na primer, one navedene u Tabeli 2), i potom kinetika vezivanja antitela određena za potvrđene pozitivne klonove hibridoma.

[0164] Sposobnost antitela u supernatantima hibridoma da se vezuju za BKR1 ligand peptid evaluirana je pomoću ELISA testa. DAKD-biotin ili KD-biotin peptidi su obloženi na 96-komoričnog SA ploči u fosfatom puferisanom slanom rastvoru (PBS) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi na 5 ug/ml, a nespecifična mesta vezivanja blokirana je sa 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) u PBS puferu. Ova ploča je korišćena za izvođenje primarnog i sekundarnog skrininga supernatanta sirovih hibridoma. Supernatanti hibridoma su dodati na ploče za vezivanje za obložene KD ili DAKD peptide. Posle 1 sata inkubacije, ploča je isprana i vezana antitela su detektovana pomoću peroksidaza ren (HRP) konjugovanih sekundarnih antitela (HRP-kozji antimišji IgG (H+L): Jackson ImmunoResearch Labs # 115-035-166) i razvijene koristeći 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS) supstrat (Roche diagnostics # 11204 521 001). Podaci su analizirani pomoću programa Excel. Antitela koja pokazuju pozitivne signale (2 puta veće od 1:10000 serumskog razblaženja ELISA signala) su izabrana i ponovo prikazana u duplikatu radi potvrde.

Potvrđeni pozitivni klinovi hibridoma su odabrani i podvrgnuti rangiranju stope disocijacije od strane Biacore.

[0165] Za kinetiku vezivanja antitela, korišćeni instrumenti bili su BIACORE 2000 ili BIACORE 3000 (GE Healthcare), dizajnirani za analizu biomolekularne interakcije (BIA) u realnom vremenu. Senzorski čip koji je korišćen bio je SA čip (GE Healthcare) sa streptavidinom koji je kovalentno imobilisan na karboksimetiliranoj dekstranskoj matrici. Svaki senzorski čip ima četiri paralelne ćelije protoka (Fc). Svi biotinilovani BKR1 ili BKR2 ligand peptidi su imobilisani u jednu od ćelija protoka 2 do 4 (Fc2 do Fc4) u SA čipu za vezivanje skrininga stope disocijacije i selektivnog skrininga. Ćelija protoka 1 (Fc1) je rezervisana i imobilisana sa slučajnim peptidom (biotiniliran na jednom terminusu) sa jednakom ili bliskom dužinom peptida u poređenju sa test ligand peptidima kao negativnom kontrolom. U skrining testovima supernatantia ćelijske kulture klonova hibridoma odabrani primarnim skriningom transientno eksprimiranih humanizovanih varijanti injektirani su preko imobilizovanih peptida. Medijum ćelijske kulture hibridoma takođe je injektiran preko površine čipa kao prazan za uspostavljanje osnovne linije. Nakon oduzimanja signala Fc1 i praznih puferskih prelaza, stopa disociacije antitela od supernatanta za svaki peptid analizirana je i rangirana pomoću BIAevaluation softvera. Samo klonovi antitela koji su pokazali superiornu (kd <10 -41/s) stopu disocijacije vezivanja su izabrani za subkloniranje i dalje karakterizaciju. U kinetičkoj analizi, odgovarajući biotin-peptidi identifikovani u skriningu za ispitivanje antitela imobilisani su u Fc2 do Fc4, dok se Fc1 sa slučajnim peptidom koristi kao referentna ćelija. Svako pročišćeno antitelo izabrano iz skrininga napravljeno je u seriji dvostrukih razblaženja u aktivnom puferu (1 x HBS-EP pufer, GE Healthcare) između 0,1 i 10 nM. Stopu disociacije vezivanja, stopa disociacije i ukupan afinitet izračunati su u BIAevaluation. Kinetika vezivanja antitela za svako antitelo je svaki put potvrđena u tri testa pomoću Biacore.

[0166] Ukupno 8 miševa je imunizovano sa mešanim KLH-KD/KD-KLH i KLH-DAKD/DAKD-KLH, a slezine su spojene koristeći gore navedene protokole. Nakon primarnog skrininga od oko 7680 hibridoma klonova u ELISA sa DAKD-biotinom i KD-biotinom, samo 76 klonova su potvrđeni kao pozitivni i izabrani za stopu disociacije vezivanja u Biacore 3000/2000 preko imobilisanih DAKD-biotina i KD-biotina na Streptavidin (SA) čipovima. Među njima, 8 hibridoma klonova sa stopom disocijacije <= od 10<-4>su subklonirani, sekvencirani, pročišćeni i dalje karakterisani (pogledati Tabelu 3).

Na osnovu rezultata iz Tabele 3, pet klonova sa jedinstvenim sekvencama su izabrani za kinetička ispitivanja. Ova antitela su bila visoko selektivna za DAKD-biotin, KD-biotin, DAKLP-biotin i KLP-biotin vezivanje (pogledati Tabelu 4). Ona se ne vezuju za druge kinin peptide ili peptidone biotinilovane na N-terminusu.

Tabela 4. Sažetak kinetike izabranih kandidata za anti-DAKD/KD antitelo

[0167] Dodatna imunizacija je izvršena za niz imunogena (pogledati spisak peptida, Tabela 2) za generisanje antitela koja blokiraju glodarske BKR1 ligande, DABK i DAKD, kao i antitela sa drugim specifičnostima vezivanja protiv drugog člana kinin porodice peptida. Tabela 5 navodi teške i lake sekvence generisanih antitela.

PRIMER 3: Generisanje surogatnog antitela za ispitivanja na miševima

[0168] Za surogatna antitela koja se koriste u ispitivanjima na miševima potrebno je da mogu da vežu i neutrališu glodalske BKR1 ligande, DABK i DAKLP (mišji ekvivalent DAKD-a). U cilju generisanja potrebnog surogatnog antitela, miševi su prvo imunizovani sa DABK i/ili DAKD sa KLH direktno konjugovanim na N-terminale peptida. Biotin-DABK/biotin-DAKD (biotinilacija direktno na N-terminus peptida) pozitivnih hibridoma klonova iz ELISA skrininga izabrani su za skaliranje i pročišćavanje. Antitela navedena u Porodici 7 (pogledati Tabelu 12) koja su pokazala visok afinitet vezivanja za biotin-DABK, biotin-DAKLP i biotin-DAKD su odabrana na osnovu Biacore testa direktnog vezivanja (Tabela 10).

Međutim, antitela ove Porodice 7 nisu pokazala nikakvo vezivanje za matične, nemodifikovane DABK i DAKD peptide u kompetitivnom ELISA, i nedostaje im neutralizujuća funkcionalnost u testu influksa kalcijuma sa Functional Drug Screening System (FDSS) (Hamamatsu Photonics K.K., Japan). Štaviše, biotin-DABK i biotin-DAKD su potpuno izgubili bioaktivnost u FDSS testu u poređenju sa prirodnim, neizmenjenim DABK i DAKD peptidima (podaci nisu prikazani).

[0169] Pretpostavljeno je da direktna N-terminusna konjugacija KLH-a i biotina sprečava prirodnu konformaciju DABK-a i DAKD-a da se formira. U cilju obnove prirodne konformacije u KLH- i biotin- konjugovanim peptidima, veznici su projektovani i dodati N-terminusu DABK-a i/ili DAKD-a sa namerom da „ublaže“ efekat konjugacije KLH/biotina na konformaciju peptida. Poli-glicinski veznici najpre testirani zbog svojih jednostavnih, nepolarnih i neutralnih osobina zasnovanih na rezultatima modeliranja. Rezultati FDSS analize pokazali su da je veznik gly-gly-gly (3G) najbolji po svojoj sposobnosti da obnovi bioaktivnost KLH i biotin konjugovanih DABK i DAKD peptida (podaci nisu prikazani). Zbog toga je KLH-3G-DABK odabran da imunizuje miševe. I biotin-3G-DABK i biotin-3G-KD su korišćeni u analizama zasnovanim na vezivanju (ELISA i Biacore). Nekoliko DABK/DAKD specifičnih antitela (Porodica 3, pogledati Tabelu 13) identifikovani su u ovom novom krugu izbora hibridoma surogatnih antitela. EE1 je izabrano kao vodeće surogatno antitelo zasnovano na svom superiornom vezivnom afinitetu i neutralizaciji prema prirodnom DABK/DAKD-u i nedostatku unakrsne reaktivnosti na druge peptide (pogledati Tabele 6-12).

[0170] Antitela sa različitim specifičnostima su generisana kada se koriste različiti imunogeni navedeni u Tabeli 13. Antitela Porodice 4 su specifična za BKR2 receptorske ligande, BK i KD. Antitela Porodice 5 se specifično vezuju za C terminus BK i DABK. Antitela Porodice 6 vezuju BK, DABK i DAKD, ali se ne vezuju za KD.

[0171] Procenjeni su dodatni veznici za vezivanje za surogatna EE1 antitela zbog svoje sposobnosti da se uklope u DABK/DAKD vezujući džep u EE1, uključujući duže poliglicinske veznike, poli-alaninske veznike i prethodno postojeće veznike kao što je veznik polietilenglikola (PEG2) i aminoheksanonska kiselina (Ahx) veznik (6-karbonski inertni veznik). Svi veznik peptidi su sintetisani od strane Abgent (San Diego, CA). Svi testirani biotinilovani peptidi sa veznicima (biotin-veznik-DABK/DAKD) dobro se vezuju za EE1, što ukazuje na to da bilo koji inertni N-terminalni veznici pomažu DABK i DAKD peptidima da zadrže svoju prirodnu bioaktivnu konformaciju kada su konjugovani sa biotinom i drugim molekulima. Nasuprot tome, nije bilo vezivanja za EE1, ili je bilo slabog vezivanja, kod biotin-DABK i biotin-DAKD, peptida koji imaju direktnu konjugaciju N-terminalnog biotina (pogledati Sliku 1).

[0172] Vezujuća kinetika generisanih antitela se sumira u Tabelama 5-11. Zatim su sva proizvedena antitela sortirana u porodice i njihove vezivne specifičnosti su sumirane u tabeli 12. Tabela 13 daje sekvence teškog i lakog lanca antitela koja su smeštena u Porodicu 1 i Porodicu 2 na osnovu svojih vezivnih specifičnosti (pogledati Tabelu 12).

Tabela 6. Sažetak kinetike antitela za b-3G-DABK i b-3G-DAKD peptide

Tabela 7. Sažetak kinetike antitela za b-3G-DAKLP i b-3G-BK peptide

Tabela 8. Sažetak kinetike antitela za b-3G-KLP i b-3G-KD peptide

Tabela 9. Sažetak kinetike antitela za DABK-b i DAKLP-b peptide

Tabela 10. Sažetak kinetike antitela za BK-b i b-BK peptide

Tabela 11. Sažetak kinetike antitela za b-DABK i b-DAKD peptide

Tabela 12. Sažetak kinetike antitela za b-DAKLP i b-KD peptide

Tabela 13. Sažetak generisanja anti-kinin peptid antitela

Primer 4: Karakterizacija trošenja des-arg-kinin liganda koristeći mobilizaciju kalcijuma

[0173] Funkcionalna analiza korišćena je za dalje karakterisanje sedam porodica generisanih antitela. Signalizacija Bradikinin B1 receptora je Gq spojena, pa se aktivacija receptora može nadgledati korišćenjem Gq aktivacije IP3 i nizvodne mobilizacije kalcijuma. HEK mBKR1 (rekombinantni mišji bradikinin B1 receptor) ili MRC5 (endogena eksprimirani bradikinin B2 receptori; (ATCC CCL-171)) su korišćeni za merenje mobilizacije kalcijuma.

[0174] Ukratko, mišji Bdkrb1 gen (dole prikazana sekvenca) je pojačan iz cDNA mišjih pluća (Biochain, Cat# C1334152) primenom PCR prajmera 804_cGWY_F: 5'-AAAAGCAGGCTTAGGAGCGGCCGCCATGGCGTCCCAGGCCTCGCTG-3' (SEQ ID NO: 107) i 804_cGWY_R: 5'-CAAGAAAGCTGGGTCGGATCCTTATAAAGTTCCCAGAACCCTGGTC-3' (SEQ ID NO: 108) i Pfu polimeraze (Agilent Technologies, Cat# 600264) i kloniran je u pDONR201 koristeći enzimsku mešavinu BP klonaze (Invitrogen, Cat# 11789-020). Paralelno, vektor eksprimiranja pEAK8 (EDGE Biosystems) je modifikovan ubacivanjem N-terminalnog HA obeležja (GCATACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT, GenBank SEQ ID NO:109 CY100443) u pEAK8 linearizovan sa EcoRI i HindIII (vektor pEAK8-nHA) i naknadnim ubacivanjem Gateway kasete B (Invitrogen, Cat# 11828-029) u pEAK8_nHA razblažen sa EcoRI i NotI i direktno završena sa Klenov polimerazom (NEB, cat# M0210S) što rezultuje vektorom pEAK8_nHA_DEST. Naredni mišji Bdkrb1 je subkloniran u pEAK8_nHA_DEST koristeći LR klonazu (Invitrogen, Cat# 11791-100).293-PSC ćelije su tada transfektovane sa pEAK8-Bdkrb1 plazmidom pomoću Fugene 6 reagensa transfekcije. Ćelije su stavljene pod antibiotičku (puromicin) selekciju 24 sata posle transfekcije, a selekcija je održavana kako bi se stvorila stabilna ćelijska linija. Prisustvo Bdkrb1 gena u rezultujućim stabilnim ćelijskim linijama potvrđeno je korišćenjem RT-PCR u realnom vremenu i elektroforezom agaroza gela. Eksprimiranje Bradikinin B1 receptora na površini ćelija izvršeno je korišćenjem antitela protiv N-terminal-HA obeležja (Covance, Cat# MMS-101P) na Bradikinin B1R na FACS instrumentu. Funkcionalna aktivnost bradikinin B1 receptora pokazana je u testu mobilizacije kalcijuma sa selektivnim agonistima.

Bdkrb1 gen subkloniran u ćelije:

[0175] HEK mBKR1 ili MRC5 ćelije su pokrivene u 384-komoričnim pločama sa čistim dnom u rastućem medijumu i dozvoljeno im je da se vezuju preko noći. Zatim je uklonjen medijum rasta, ćelije su isprane u puferu za testiranje (HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecid), i zatim su opterećene bojom sa 0,5 uM Fluo-4AM, ćelijska permeabilna boja za detektovanje kalcijuma, sa 0,04% Pluronske kiseline tokom 1 sata 37C. AM estar se cepa, i kalcijumska boja se zadržava u citoplazmi. Nakon 1 sata, ćelije su isprane kako bi se uklonio višak boje, i 20 ul rezidualnog pufera je ostalo na ćelijama. Tretmani su dodati kao 2x rastvori na Functional Drug Screening System from Hamamatsu (FDSS), i mobilizacija kalcijuma je kinetički praćena najmanje 4 minuta. Aktivacija B1R ili B2R receptora dovodi do Galfa q posredovane aktivacije fosfolipaze C i IP3 posredovane mobilizacije kalcijuma.

Boja Fluo-4 helatira oslobođeni kalcijum, i primećuje se robusna promena fluorescencije. Rezultati su dati kao maksimalne relativne fluorescentne jedinice za normalizaciju zbog razlika između gustine ćelija ili opterećenja boje preko ploče.

[0176] Potentnost liganda je određena svakog dana tako što su napravljene krive odgovora koncentracije liganda i izabrana je približna koncentracija liganda EC70-80 za inkubaciju antitela. Koncentracija EC80 izabrana je zato što se nalazi na linearnom opsegu krive detekcije i postoji veliki prozor kako bi se primetilo smanjenje sa antagonistima ili antitelima koja oštećuju ligand. Krivi odgovora na dozu antitela dozvoljeno je da vezuje EC80 koncentraciju liganda, i obim trošenja liganda se prati korišćenjem promene fluorescencije. Rezultati su normalizovani na pufer i EC80 ligand odgovor, i izračunat je EC50 za trošenje liganda. Rezultati su zatim dati kao molarni odnos koji odgovara koncentraciji antitela koja smanjuje 50% od odgovora liganda (tj. EC50 antitela) podeljeno korišćenjem koncentracije liganda. Teoretski maksimum bi trebalo da bude 0,5, jer jedna jedinica antitela treba da bude u stanju da osiromaši 2 jedinice liganda, ali u praksi smo videli niže vrednosti, ali one mogu biti odraz neosetljivosti postupka detekcije koncentracija niskog liganda, pre nego stohiometrijsko ograničenje za antitelo. Rezultati ovih eksperimenata su navedeni u Tabelama 14-16.

[0177] Sva antitela Porodice 1 i Porodice 2 (pogledati Tabelu 13) pokazala su superiornu vezujuću kinetiku od strane Biacore (Tabela 3) i aktivnost neutralizacije koja se meri pomoću mobilizacije kalcijuma protiv DAKD i KD peptida (Tabele 14 i 15). Antitela su dalje analizirana zbog svoje termičke stabilnosti i pogodnosti sekvence za humanizaciju. F151 je dalje korišćen za humanizaciju jer je bio termički stabilan, i u CDR regijama nije bilo problematičnih ostataka, i bile su unakrsno reaktivne za mišje i ligande KLP i DAKLP.

Tabela 14: Karakterizacija des-arg-kinin ligand trošenja korišćenje mobilizacije kalcijuma u HEK mBKR1 ćelijama

Tabela 15: Karakterizacija kinin ligand trošenja korišćenje mobilizacije kalcijuma u MRC5 ćelijama fibroblasta fetalnih pluća

Primer 5: Inženjering F151: humanizacija, stabilizacija i mutacija neželjenih motiva sekvenci

1. HUMANIZACIJA

[0178] Korišćen protokol humanizacije je opisan u PCT/US08/74381 (US20110027266), koji je ovde u celosti uključen referencom. Varijabilne lake (VL) i varijabilne teške (VH) sekvence mišjeg F151 korišćene su za izgradnju modela homologije anti-DAKD/KD F151 LC i HC u molekularnom operativnom okruženju (MOE, v.2009.10, Chemical Computing Group). Korišćeni su sledeći šabloni: okvir lakog lanca - 1SBS (93% identičnosti u okvirnim regijama), okvir teškog lanca - 2VXT (84% identičnosti u okvirnim regijama), L1 - 1LVE (93% identičnosti), L2 - 1EEU 100% identičnosti), L3 - 2R56 (93% identičnosti), H1 - 1NJ9 (95% identičnosti), H2 - 2VXU (76% identičnosti) i H3 - 1HIL (49% identičnosti). Šabloni su bili dostupni kod RCSB Protein Data Bank na vebsajtu rcsb.org, kojim upravljaju Rutgers and the University of California San Diego (Berman, H.M; Westbrook J.; Feng. Z.; Gilliland, G.; Bhat, T.N.; Weissig, H.; Shindyalov, I.N.; Bourne, P.E. The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242.). Model homologije je naknadno bio minimizovan korišćenjem standardnih procedura primenjenih u MOE. Simulacija molekularne dinamike (MD) minimizovanog 3D homologijskog modela mipjeg F151 je kasnije izvedena, sa ograničenjima za kičmu proteinu na 500 K temperaturi tokom 1,1 nanosekundi (ns) u generalizovanom Bornovom implicitnom rastvaraču. Deset različitih konformacija je izvučeno iz ovog prvog MD ponavljanja na svakih 100 pikosekundi (ps) tokom poslednje 1 ns. Ove raznovrsne konformacije su zatim sve podnesene na MD simulaciju, bez ograničenja za kičmu proteina i na 300 K temperaturi, tokom 2,3 ns. Za svaku od 10 MD operacija, poslednjih 2.000 snimaka, po jedna svake ps, sa MD trajektorije, tada su korišćeni za izračunavanje, za svaku mišju F151 aminokiselinu, korena njenog srednjeg kvadratnog odstupanja (rmsd) u poređenju sa referentnim položajem medoida. Upoređivanjem prosečnog rmsd na 10 odvojenih MD poteza datih aminokiselina do ukupnog proseka rmsd svih mišjih F151 aminokiselina, odlučuje se da li je aminokiselina dovoljno fleksibilna, kao što je primećeno tokom MD, da se smatra da će verovatno interakovati sa T-ćelijskim receptorima i biti odgovorna za aktiviranje imunološkog odgovora. 62 aminokiseline su identifikovane kao fleksibilne u mišjem F151 antitelu, isključujući CDR i njegovu neposrednu 5 Å blizinu.

[0179] Kretanje 28 najfleksibilnijih mišjih F151 aminokiselina, tokom 20 ns (10 X 2 ns), zatim je upoređeno sa kretanjem odgovarajućih fleksibilnih aminokiselina od 49 ljudska germlinija modela homologije, gde je svaki provučen kroz 10 x 2 ns simulacije MD.49 ljudskih germlinija modela je izgrađeno sistematskim kombinovanjem 7 najčešćih ljudskih germlinija lakih lanaca (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) i 7 najčešćih ljudskih germlinija teških lanaca (vh1a, vh1b, vh2, vh3 , vh4, vh5, vh6). vk1-vh1b ljudskog germlinija antitelo pokazalo je 0,804D sličnosti svojih fleksibilnih aminokiselina u poređenju sa fleksibilnim aminokiselinama mišjeg F151 antitela; vk1-vh1b germlinija antitelo je stoga korišćeno za humanizaciju F151 antitela fokusirajući se na fleksibilne aminokiseline. Za paru aminokiselinskih veza između mišjeg F151 vk1-vh1b aminokiselina, 2 sekvence su poravnate na osnovu optimalne 3D superpozicije alfa ugljenika od 2 odgovarajuća modela homologije (pogledati Sliku 15 za poravnanje F151 LC i F151 HC sa vk1 i vh1b, respektivno).

2. STABILIZACIJA

[0180] Dva pristupa su korišćena za poboljšanje stabilnosti antitela.

a) PRISTUP ZNANJEM

[0181] Predložene su aminokiseline lakog i teškog lanca sa niskom učestalošću pojavljivanja u odnosu na svoje kanoničke sekvence, isključujući CDR-e, koje se mutiraju u najčešće pronađene aminokiseline (ΔΔGth > 0,5 kcal/mol; E. Monsellier, H. Bedouelle. J. Mol. Biol.

362, 2006, p.580-593). Ova prva lista konsenzus mutacija za laki lanac (LC) i teški lanac (HC) bila je ograničena na aminokiseline pronađene u najbližoj ljudskoj germinaliniji (vk1-vh1b). Predložene promene u neposrednoj blizini CDR-a (5 Angstroma „Vernijer“ zona, J.

Mol. Biol.224, 1992, p.487-499) su uklonjene iz razmatranja. Ovo je dovelo do 5 stabilišućih mutacija u LC (pogledati Tabelu 19) i 4 stabilišuće mutacije u HC (pogledati Tabelu 20). Ostali kriterijumi su uzeti u obzir kako bi se razmotrile ove mutacije za potencijalno stabilisanje anti-DAKD/KD F151 antitela. Ovi kriterijumi bili su povoljna promena hidropatije na površini ili predviđena stabilizacija mutanta na osnovu molekularne mehanike. Takođe, dodatne stabilišuće mutacije koje su se pokazale kao uspešne u literaturi (E. Monsellier & H. Bedouelle, J. Mol. Biol., 362, 2006, p.580-593; B.J. Steipe et al. J. Mol. Biol, 1994, 240, 188-192) su razmatrane (pogledati Tabelu 16-22). Jedna od ovih promena je inkorporirana kao stabilišuća mutacija (D89E) u sekvencama HC2a, HC2b i HC2c ispod. Još jedna predložena promena (Q62E) je ugrađena u varijantu HC2b.

b) 3D i MD-ZASNOVANI PRISTUPI

[0182] O 3D i MD pristupima je prethodno izveštavano (Seco J, Luque FJ, Barril X., J Med Chem. 2009 Apr 23;52(8):2363-71; Malin Jonsson et al., J. Phys. Chem. B 2003, 107, 5511-5518). Hidrofobne regije antitela eksplicitno su identifikovane analizom simulacije molekularne dinamike Faba u binarnom rastvaraču (20% izopropanol u vodi, 20 ns simulacije proizvodnje). Lizinske mutacije su zatim uvedene u blizini ovih regija kao pokušaj da se spreči agregacija. Obavljena je dodatna analiza koristeći hidrofobnu površinsku mapu u okviru Schrodingerovog maestro softvera (v.8.5.207). Koristeći kombinaciju ove dve tehnike predložene su 2 Lys mutacije, 1 u teškom lancu i 1 u lakom lancu.

3. HUMANIZACIJA GRAFTOVANJEM

[0183] Prethodno je objavljena humanizacija pomoću tehnika graftovanja (Peter T. Jones, Paul H. Dear, Jefferson Foote, Michael S. Neuberger & Greg Winter Nature, 1986, 321, 522-525). Proces humanizacije koji je korišćen započeo je identifikovanjem najbližih ljudskih germlinija do anti-DAKD/KD lakog i teškog lanca. Ovo se obavlja izvršavanjem pretrage BLAST-a u odnosu na sve ljudske germlinije koje su sistematično popisane (sve moguće kombinacije V & J domena za kappa i lambda lance, V, D i J domene za teške lance).

[0184] Sledeće najbliže ljudske germlinije identifikovane su sa 83% i 62% identičnosti sekvence sa anti-DAKD/KD F151 lakim lancima (LC) i teškim lancima (HC), respektivno (pogledati Sliku 16). Korišćenjem unutrašnje VBASE germlinije, otkriveno je da je laki lanac blizu V IV-B3 (~83% identičnosti) lokusa i da je teški lanac blizu 1-08 i 1-18 (~62% identičnosti) lokusa VH1 podporodice . CDR regije (kao što ih definiše MOE), i Vernijer regije (kao što ih definišu Foote & Winter, J. Mol. Biol., 1992, 224, 487-499) su označene podebljanim slovima. Humanizacione mutacije u podvučenom dobijene su poređenjem parova 2 poravnate sekvence, isključujući ostatke CDR i Vernijer zone kao što je prethodno definisano. U drugoj varijanti humanizacije, u poređenju su isključene samo CDR.

4. MUTACIJA NEŽELJENIH MOTIVA SEKVENCI

[0185] Razmatrani su sledeći motivi sekvenci: Asp-Pro (kisela labilna veza), Asn-X-Ser/Thr (glikozilacija, X = bilo koja aminokiselina osim Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (sukcinimid/izo-asp formiranje u fleksibilnim regijama), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (izložena mesta deamidacije) i Met (oksidacija u izloženim područjima). Između ostalih kriterijuma, VL i VH domeni mišjeg F151 izabrani su od drugih mišjeg antitela jer mišji F151 nije imao izložene neželjene sekvence motiva, ali su uvedeni u neke humanizovane varijante.

[0186] LC3a, LC3b, HC3a i HC3b imaju potencijalno problematične sukcinimidne lokacije koje su identifikovane. Ove lokacije nisu bile modifikovane u predloženim nizovima, jer su uključeni ostaci potencijalno uključeni u mrežu H-veza (vizuelni pregled modela homologije). Ove pozicije su takođe pronađene u brojnim drugim strukturama antitela. Pored toga, i kod HC3a i HC3b, stroga humanizacija pomoću graftovanja uključuje zamenu Ser115 za Met. Ovaj metionin je izložen. Supstitucija Leucina na ovom položaju predložena je kao humanizujuća mutacija, jer je to uobičajeni ostatak među mnogim sekvencama germlinija čvorova.

[0187] Dobijene humanizovane sekvence su rastavljene za sličnost sekvence prema bazi podataka International Epitope Database (IEDB) (pronađena na internetu na na imuneepitope.com; immuneepitope.com; verzoja iz juna 2009; Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. The immune epitope database 2.0. Nucleic Acids Res.2010 Jan;38(Database issue):D854-62. Epub 2009 Nov 11) kako bi se osiguralo da nijedna od sekvenci ne sadrži poznate ljudske epitope B ili T-ćelija (identučnost sekvence od 70% koristi se kao prekid u rezultatima dobijenim pretraživanjem BLAST-a i uzimaja u obzir samo rezultate od ljudskih vrsta).

5. ORIGINALNE SEKVENCE MIŠJIH F151 VARIJABILNIH DOMENA

[0188] CDR su istaknute podebljano, dok su Vernijer regije (kao što su definisali Foote & Winter, J. Mol. Biol., 1992, 224, 487-499) podvučene.

Indeks germinalnosti = 83% sa Z46615_1_V_X67858_1_J [V IV-B3]

Teški lanac (SEQ ID NO:19) :

Indeks germinalnosti = 62% sa Z12316_1_VX97051_4_D_X97051_5_J [VH1-18]

6. KONSTRUISANE SEKVENCE

a) Pozadina

[0189] Predloženo je 5 verzija lakog lanca (LC1, LC2a, LC2b, LC3a i LC3b) i 5 verzija teškog lanca (HC1, HC2a, HC2b, HC3a i HC3b).

[0190] LC1 sadrži 5 humanizujućih mutacija identifikovanih korišćenjem 4D protokola humanizacije. LC2a je uveo još 5 stabilišućih mutacija. LC2b je dodao 1 mutaciju lizina kako bi sprečio agregaciju. LC3a sadrži 15 mutacija izvedenih iz graftovanja do najbliže ljudske germlinija sekvence i zadržava ostatke mišjih CDR i Vernijer zone. LC3b sadrži 16 mutacija izvedenih iz CDR-graftovanja sa još jednom humanizujućom mutacijom.

[0191] HC1 ima 6 humanizujućih mutacija identifikovanih internim protokolom. HC2a je uveo 5 dodatnih stabilišućih mutacija, dok HC2b sadrži 6 dodatnih stabilišućih mutacija u poređenju sa HC1. HC2c sadrži 1 Lys mutaciju, pored stabilišućih mutacija HC2a, kako bi se sprečilo agregiranje. HC3a sadrži 19 mutacija izvedenih iz graftovanja do najbliže ljudske germlinija sekvence i zadržava ostatke mišjih CDR i Vernijer zone. HC3b sadrži 25 mutacija izvedenih iz CDR graftovanja.

[0192] 6 Kombinacije su ukupno predložene (sažeto u Tabeli 16):

• LC1 k HC1 (mutacije koje se bave samo humanizacijom)

• LC2a k HC2a (mutacije koje se bave humanizacijom i stabilizacijom)

• LC2a k HC2b (mutacije koje se bave humanizacijom i stabilizacijom)

LC2b k HC2c (mutacije koje se bave humanizacijom, stabilizacijom i „anti-agregacijom“) LC3a k HC3a (mutacije koje uglavnom obrađuju humanizaciju graftovanjem Vernijer) LC3b k HC3b (mutacije koje se bave humanizacijom pomoću graftovanja)

Tabela 17: Mutacije 5 LC varijanti anti-DAKD/KD F151 antitela

a) Konstruisane sekvence lakog lanca:

[0193] Nisu pronađene potencijalno problematični T-ćelijski ili B-ćelijski epitopi u predloženim varijantama.

LC1 (SEQ ID NO:27), humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane:

LC2a (SEQ ID NO:28), humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane, stabilišuće mutacije su u kurzivu (T na položaju 5, S na položaju 12, I na položaju 21, S na položaju 69, T na položaju 91 su prikazani u nastavku):

LC2b (SEQ ID NO:29) humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane, stabilišuće mutacije su u kurzivu (T na položaju 5, S na položaju 12, I na položaju 21, S na položaju 69, T na položaju 91 prikazani u nastavku) i antiagregaciona mutacija je K na položaju 89:

LC3a (SEQ ID NO:30), graftovane mutacije su podvučene i CDR i Vernijer zone su podebljane:

LC3b (SEQ ID NO:31), graftovane mutacije su podvučene i CDR i Vernijer zone su podebljane:

[0194] Obratiti pažnju da je L na položaju 52 Vernijer ostatak koji je mutiran do ljudskog. c) Konstruisane sekvence teškog lanca

[0195]

HC1 (SEQ ID NO:20), humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane:

HC2a (SEQ ID NO:21), humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane, stabilišuće mutacije su u kurzivu (Q na položaju 1, A na položaju 9, G na položaju 44, Y na položaju 80 i E na položaju 90 su prikazani u nastavku):

HC2b (SEQ ID NO:22), humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane, stabilišuće mutacije su u kurzivu (Q na položaju 1, A na položaju 9, G na položaju 44, E na položaju 62, Y na položaju 80 i E na položaju 90 su prikazani u nastavku):

Ljudski epitopi nisu identifikovani za sekvencu HC2b u IEDB bazi podataka.

HC2c (SEQ ID NO:23), humanizujuće mutacije su podvučene, CDR i Vernijer zone su podebljane, stabilišuće mutacije su u kurzivu (Q na položaju 1, A na položaju 9, G na položaju 44, Y na položaju 80 i E na položaju 90 prikazani u nastavku) i antiagregaciona mutacija je K na položaju 86:

HC3a (SEQ ID NO:24), graftovane mutacije su podvučene i CDR i Vernijer zone su podebljane:

LC3b (SEQ ID NO:25), graftovane mutacije su podvučene i CDR i Vernijer zone su podebljane:

[0196] Obratiti pažnju da su naredni Vernijer ostaci mutirani do ljudskog: V na položaju 2, M na položaju 48, V na položaju 68, M na položaju 70 i T na položaju 74.

[0197] Ljudski epitopi nisu identifikovani za sekvencu HC3b u IEDB bazi podataka.

Tabela 19: Stabilišuće promene predložene u lakom lancu

Tabela 20: Stabilišuće promene predložene u teškom lancu

Tabela 21: Procenjene kombinacije stabilišućih mutacija

Tabela 22: Potencijal stabilišuće Mutacije

Primer 6: Karakterizacija varijanti humanizacije

[0198] Na osnovu siliko modela prikazanog u Tabeli 16, varijabilna regija lakog lanca (VL) i teškog lanca (VH) DNK humanizovanog F151 je bila kodon optimizovana za eksprimiranje HEK293 i gena koji je sintetisan od strane GeneArt (podružnica Life Technologies).

Sintetisani DNK fragmenti su klonirani u konstantnu regiju lakog lanca (CL) koja kodira vektore, pFF0362 (A. ljudski kapa LC vektor) na ApaLI/BsiWI mestima i konstantnim regijama teškog lanca (CH1, CH2 i CH3) koje kodiraju vektore, pFF0363 (B. ljudski IgG1 HC vektor) na ApaLI/Apal mestima, respektivno. Rezultujući plazmidi pFF0460 koji sadrže punu sekvencu LC i pFF0466 koji sadrže punu dužinu HC humanizovanih varijanti F151 su ko-transfektovani i transientno eksprimirani u FreeStyle™ 293 sistemu eksprimiranja (Invitrogen/Life Technologies, kataloški broj K9000-01).

[0199] Šest humanizovanih varijanti prikazanih u Tabeli 16 su karakterisane različitim parametrima kao što su vezivna kinetika (gore razmatrano), kao i hemijska i fizička svojstva kao što je termostabilnost koja se rutinski koristi u struci.

[0200] Karakterizacija je izvršena u dva nivoa. Nivo I obuhvata diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC) prikazanu u Tabeli 24 i Slici 2. Ukratko, za DCS eksperimente, antitela su dijalizirana u poređenju sa fosfatnog puferisanim slanim rastvorom. Koncentracije antitela su merene UV absorbancijom. Antitela su razređena na 1 mg/mL koristeći PBS. Skenirana su pomoću instrumenta Calorimetry Sciences Corporation N-DSC II koristeći 0,3268 ml kapilarnu ćeliju sa PBS u referentnoj ćeliji. Brzina skeniranja je 2°C/min, i uzorci su skenirani od 20°C do 100°C.

[0201] Sve varijante, izuzev HC3b/LC3b, pokazale su sličan afinitet vezivanja za roditeljsko antitelo. Varijanta HC3a/LC3a je izabrana u odnosu na druge varijante zasnovane na drugim fiziohemijskim osobinama kao što su podaci SEC, stabilnost i nedostatak agregacije (pogledati Tablete 23-25).

Tabela 23. Upoređivanje kinetike humanizovanih F151 varijanti

Tabela 25. Nivo 2 poređenja varijanti humanizacije

[0202] Za poravnavanje lakog i teškog lanca roditeljskog F151 do humanizovane varijante F151 (HC3a/LC3a), pogledati Sliku 3.

Primer 7: Kristalna struktura humanizovanog antitela F151 u odnosu na BRK1 ligand kalidin i des-Arg10-kalidin

[0203] Kristalne strukture humanizovanog F151 (HC3a/LC3a) Faba vezane za kalidin ili des-Arg10-kalidin su određene, i analizirane su molekulske interakcije.

[0204] Kalidin prah je nabavljen od Phoenix Pharmaceuticals (kataloški br.009-37). Za generisanje Fab proteina, DNK regija VH teškog lanca (HC) iz humanizovanog F151 HC3a je klonirana u 6XHis obeležen CH1 vektor pFF0366. Plazmid lakog lanca (LC) koji je ovde korišćen bio je isti kao kod prvobitnog F151 LC3a korišćenog za humanizaciju F151 (pogledati Primer 5). Dva plazmida su ko-transfekovana u slobodne HEK293 ćelije za Fab eksprimiranje. Fab protein je pročišćen korišćenjem kobalt-smole, puferom je razmenjen do 50 mM MES pH6,0, 50mM NaCl pre nego što je koncentrisan do oko 9 mg/mL. Pročišćeni F151 Fab protein je pomešan sa kalidinom u molarnom odnosu od 1:2 i spremljen je za kristalizaciju. Skrining kristalizacije je obavljen sa širokim spektrom uslova. Najbolji kristal je primećen pod uslovima B10, B12 i G10 Hampton Research skrining kompleta PEG/ION HT. Kristali su krio-zaštićeni sa 20% glicerola u puferu i zamrznuti za prikupljanje podataka difrakcijom. Podaci o rendgenskoj difrakciji za oba kompleksa prikupljeni su na Canadian Light Izvorna, beamline CMCF-08ID. Rmerge za F151-KD kompleks je 8,9% i I/s (l) = 20,2, dok su oni za F151 -DAKD 7,7% i 18,5, respektivno. Struktura F151-KD je rastvorena molekularnom zamenom u Phaseru koristeći Fab koordinate iz PDB unosa 3QOS, tretirajući VL-VHi CL-CH1 domene kao nezavisne jedinice. Struktura je rafinirana u autoBusteru sa rezolucijom 2,07 Å u prostorjnoj grupi P212121do Rfaktora od 0,205 i Rfree od 0,228.

Struktura F151-DAKD je rastvorena korišćenjem koordinata F151-KD. Struktura je rafinirana u autoBusteru sa rezolucijom 1,86 Å u prostornoj grupi P212121 do Rfaktora od 0,232 i Rfree od 0,238.

[0205] Mape gustine elektrona prikazane na Slikama 4 i 5 prikazuju vezivanje kalidina (KD) i Des-Arg<10>-kalidina (DAKD) za F151 Fab i nedvosmisleno određuju položaje svake aminokiseline. Za kalidin, gustina elektrona za ekstremni C-terminalni ostatak Arg<10>nije prisutna. Ovo je u saglasnosti sa zapažanjem da se DAKD, koji je nedostajući arginin ostatak C-terminala (prikazan u Tabeli 27 u nastavku), jednako dobro se vezuje za F151 kao KD. IC50 vrednosti F151 u neutralizaciji FDSS ćelijskog testa prema KD i DAKD su 0,12 nM i 0,09 nM, respektivno. U oba slučaja gustina elektrona je slabija prema C-terminusima peptida. Pošto Phe<9>u KD ima nešto bolju elektronsku gustinu od one u DAKD, moguće je da prisustvo dodatnog arginina na C-terminusu KD stabilizuje C-terminus ovog peptida kada se vezuje za F151, iako ovaj arginin nije dovoljno stabilan da bi bio primećen rendgenom. Pošto su dve strukture u suštini identične (rms između KD i DAKD je 0,139 za C atome i 0,328 za sve atome), sve sledeće diskusije se zasnivaju na strukturi F151-KD.

Tabela 27. Izabrani spisak kinin peptida

[0206] KD je vezan za N-terminus koji je zakopan u interfejsu između Fv podjedinica lakog i teškog lanca, kao što je prikazano na Slici 6. Interfejs između lakih i teškog lanca upakovan je sa aromatičnim aminokiselinama, uključujući Tyr-L42, Tyr-L93 , Tyr-L100, Trp_L102, Phe-L104 i Tyr-H35, Trp-H47, Tyr-H50, Tyr-H99, Trp-H110, koje se stabilišu međusobno kroz složene i hidrofobne interakcije. Ostaci iz svake od CDR lakog i teškog lanca doprinose vezivanju. Ostaci duž lakog i teškog lanca koji su uključeni u interakcije sa KD mapirani na CDR prikazani su na Slikama 7 i 8. CDR H3 teškog lanca je najduža petlja i najčešće se koristi u interakcijama sa KD, formirajući bočnu zaštitu za KD. Petlja je stabilizovana uglavnom kroz interakcije sa druga dva CDR, H1 i H2 teškog lanca, posebno slani most između Asp-H101 i Arg-H52 (stabilizujući H1 i H3), aren-H interakcija između Tyr-H102 i Tyr-H54 (stabilizovanje H2 i H3), H-veza između Asp-H108 i Tyr-H35 i H-veze između His-H105 i Tyr-L55 (stabilizovanje H3 i L2).

Poredeći KD ostatke koji interakuju među proizvedenim antitelima, može se videti da postoji sličnost među antitelima, i neke su više povezana sa upotrebom određenih aminokiselina za KD-interakciju od drugih. Na primer, u lakom lancu F151, C63 i I22 koriste više sličnih aminokiselina u svojim CDR kako bi vezali KD, dok su B21 i I54 više slični. U teškom lancu, F151 i C63 su bili iznenađujuće jedinstveni jedan od drugog i od B21, I22 i I54.

Izgleda da ova poslednja tri čine grupu sličnosti. C63 je naročito interesantan u svom teškom lancu, po tome što je dužina petlje u H2 i H3 više različita od svih ostalih. Uzimajući u obzir Fab kao celinu, B21 i I54 su bili najbliže povezani.

[0207] U kristalnoj strukturi smo otkrili da je KD uključen u sistematsku vodoničnu vezu i hidrofobne interakcije sa Fab. N-terminus KD-a je zakopan u Fabu i ima intenzivnije interakcije, dok je C-terminus u suštini izložen rastvaraču. Osim prva 4 ostatka (Lys-Arg-Pro-Pro), ostali ostaci KD-a postepeno se proširuju u rastvarač. Amidinijum grupa Lys1 bočnog lanca je usidrena od strane Glu-L61 (L: laki lanac) putem slanih mostova, dok amino terminalna amino grupa Lys 1 formira slani most sa Asp-H108 (H: teški lanac). Amidinijum grupa Lys1 bočnog lanca takođe visi preko aromatičnog prstena Tyr-L55, uključenog u interakcije katjona. Takve intenzivne interakcije koje su uključene u Lys1 čvrsto povezuju amino terminus KD u Fab. Ovo takođe uzima u obzir značaj Lys1 u vezivanju KD-a prema F151. Bez njega (tj. bradikinina), ne može se meriti detektabilno vezivanje za hF151 ili F151. Kao Lys1, Arg2 interakuje sa Fabom preko slanog mosta. Gvanidijum grupa Arg2 komunicira sa bočnim lancem Asp-H104. Bočni lanac od Arg2 je takođe H-vezan sa karbonil kiseonikom Arg-H101 glavnog lanca. Takođe, kiseonik Pro8 glavnog lanca je H-vezan za bočni lanac od Arg-H101. Tyr-H102 je na pola puta interkaliran u Phe8 i Pro9, koji uključuju hidrofobne interakcije sa KD. Osim direktne interakcije, vidljive su i brojne H-veze posredovane vodom između KD i Faba. Takođe je interesantno primetiti da se ostaci tirozina najčešće koriste u interakciji u odnosu na druge aminokiseline; 9 od 16 ostataka označenih zvezdicama na Slikama 7 i 8 su tirozini. Svi ostaci u F151 koji okružuju KD izgleda da igraju ulogu u vezivanju liganda, osim Asn-H33, koji je blizu Phe6 bočnog lanca ali je nekompatibilan u polaritetu i nedostatku drugih važnih interakcija. Supstitucija sa aromatičnim/hidrofobnim ostacima, kao što su Trp ili Tyr u interakciji sa Phe8, izgleda kao brz izbor ako se uzme u obzir sazrevanje afiniteta. Ove dve aromatične aminokiseline zapravo se vide kod drugih antitela (Trp u C63 i Tyr u B21, I22, I54). Tabela 28 dole daje detaljnu analizu 16 KD-interaktivnih aminokiselinskih ostataka označenih na Slikama 7 i 8 i postavlja funkcionalne zamene koje mogu biti izvedene u CDR regijama koji ne bi trebalo da narušavaju vezivanje antigena.

Tabela 28. Spisak aminokiselinskih ostataka pronađenih oko KD vezujućeg džepa, i njihove uloge u KD vezivanju i potencijalnim funkcionalnim supstitucijama (ostaci lakog lanca u sivim ćelijama i ostaci teškog lanca u neobojenim ćelijama)

[0208] Analiza konformacionog epitopa Kalidina (KD) ili desArg10 -Kalidina (DAKD) otkrila je da usvaja konformaciju „Pro4 kink“. Kao što je prikazano na Slici 17, obeležje konformacije „Pro 4 kink“ je tip II uskog obrtanja polipeptidnog glavnog lanca KD ili DAKD na Prolinz 4 (pogledati Richardson JS. „The anatomy and taxonomy of protein structure.“ Adv Protein Chem. 1981 ;34:167-339, koji je ovde uključen referencom). Konformacija „Pro 4 kink“ može dalje definirati sve ili u suštini sve preostale aminokiseline KD (1-2 i 6-9) ili DAKD koji prihvata ponavljanja sigmoidnog oblika koja poravnavaju hidrofobne bočne lance u režimu prostornog slaganja.

Primer 8: in vivo farmakologija anti-BKR1-ligand antitela u modelima bola

[0209] Primeri predmetne objave ilustruju in vivo efikasnost anti-BKR1 receptor-ligand antitela u različitim predkliničkim modelima akutnog i hroničnog bola prema modifikovanim procedurama opisanim u (a) Saddi GM and Abbott FV., Pain (2000), 89:53-63; (b) Chen et al., Molecular Pain (2010), 2:6-13 and (c) Bennett GJ i Xie YK., Pain (1988), 33:87-107.

Životinje

[0210] Eksperimenti su izvedeni pomoću odraslih muških OF1 miševa (20-30 gr) za studije formalina i odraslih muških C57BI/6J miševa (25-30 gr) za studije CFA i CCI. Miševi su držani u prostoriji kontrolisane temperature u 12-časovnom ciklusu svetlosti. Obezbeđeni su hrana i voda po volji. Za sve eksperimente, miševi su bili aklimatizovani u laboratorijsku prostoriju najmanje 2 sata pre testiranja. Nije izvršena randomizacija za studije. Izvršioci eksperimenta koji sprovode testove ponašanja nisu bili slepi za tretman; međutim oni nisu bili svesni hipoteza studije. Svi postupci su odobreni od strane „Comité d'Expérimentation pour la Protection de l'Animal de Laboratoire“ (Odbor za zaštitu i upotrebu životinja) od sanofiaventis recherche & développement i sprovođeni su u skladu sa francuskim zakonodavstvom (Dekret br.°87-848 - 19 oktobar1987 - i odluka-19 april 1988) koja primenjuje Evropsku direktivu 86/609/EEC.

A. Akutni upalni bol izazvan formalinom

[0211] Test formalina je korišćen za merenje nociceptivnog i upalnog bola. Zapravo, intraplantarna injekcija formalina indukuje inicijalni akutni nociceptivni odgovor u ponašanju (0-12 minuta), a zatim sledi drugi upalno-posredovani odgovor (15-45 minuta), koji se pripisuje ekscitabilnosti kičmene moždine.

[0212] Formaldehid (37%, Sigma) je razblažen u fiziološkom rastvoru (v/v) kako bi se dobila koncentracija formaldehida 2,5% (tj. ≅6,25% koncentracija formalina). Miševi su nežno vezani i 20 μL ovog rastvora je potkožno ubrizgano u dorzalni deo jedne zadnje šape.

Odgovori u ponašanju su zabeleženi odmah nakon injekcije formalina, a zatim u intervalima od 3 minuta tokom 45 minuta kako sledi: (0): normalno nošenje težine injektirane šape; (1): injektirana šapa se blago odmara na podu; (2): podizanje-elevacijeainjektirane šape; (3): lizanje ili grizanje injektirane šape. Veličine grupe su bile 11-12 muških OF1 miševa.

[0213] Rezultati su prikazani u zavisnosti od vremena, a područja ispod krivih (AUC) izračunata su od srednje vrednosti (± SEM) kako za ranu (0-12 min), tako i za kasnu (15-45 min) fazu. Preokret ponašanja nalik bolu izražen je kao promena u AUC u %.

[0214] EE1 antitelo inhibiralo je ponašanje nalik bolu u kasnoj fazi testa formalina kod muških OF1 miševa. EE1 antitelo, kada se primenjuje intravenozno 48 sati pre intraplantarne injekcije formalina, pokazalo je ponašanje nalik bolu zavisno od doze samo u kasnoj fazi sa minimalnom efektivnom dozom (MED) = 2,5 mg/kg, što je prikazano na Slici 9. Zaista, kada se primenjuje na 2,5, 10 i 30 mg/kg, EE1 je obrnuo kasnu fazu za 35±5%, 33±5% i 45±7%, respektivno, kako je prikazano u Tabeli 29.

[0215] Nasuprot tome, F151 slabo inhibira ponašanje u obliku bola u kasnoj fazi formalin testa kada se daje 48 sati pre intraplantarne injekcije formalina. Zaista, kada se primenjuje na 2,5 i 10 mg/kg, F151 je oborio završnu fazu za 15±7% i 21±5%, respektivno, kako je prikazano u Tabeli 29.

Tabela 29. Uticaj EE1 i F151 antitela na ponašanje nalik bolu indukovano formalinom kod muških OF1 miševa

B. CFA (kompletni Freundov adjuvant)-izazvan hronični upalni bol

[0216] Hronična upala indukovana je pod kratkom anestezijom (Izofluran, 3%) pomoću intraplantarne primene 25 μL kompletnog Freundovog adjuvanta (CFA) koji sadrži 1 μg/μL toplotom ubijene Mycobacterium tuberculosis u mineralnom ulju i manuelnom monooleatu (Sigma). Veličine grupe su bile 8 muških C57BI/6 miševa.

[0217] EE1 antitelo je primenjeno intravenozno 22 sata nakon intraplantarne injekcije CFA na 2,5 i 30 mg/kg, i mehanička i toplotna preosetljivost su procenjene na dan 1 (D1), dan 4 (D4) i dan 7 (D7) posle intraplantarneprimene CFA-a.

B1. Mehanička preosetljivost

[0218] Mehanička preosetljivost je procenjena merenjem frekvencije odgovora na povlačenje (FR, u %) nakon 10 primena 0,6 g Von Frej filamenta (Bioseb, France) na plantarnu površinu upaljene šape.

Kako bi se ispitala efikasnost antitela EE1 na ponašanje nalik bolu, izračunali smo preokret mehaničke preosetljivosti (u %) na sledeći način:

Procenat preokreta je izračunat kao (srednji FR-izotip-kontrolaposle doze– FR-Ipsiposle doze) / (srenji FR-izotip-kontrolaposle doze– srednji FR-shamposle doze) za svakog miša.

[0219] Kod D1, D4 i D7 nakon intraplantarne injekcije CFA, značajno povećanje FR na Von Frej filamentu primećeno je u grupi koja je tretirana izotopom 1B7.11, u poređenju sa naivnom grupom, koja pokazuje razvoj mehaničke preosetljivosti. EE1 antitelo, kada se primenjuje intravenozno 22 sata nakon intraplantarnog CFA, uspelo je značajno da smanji ovaj FR u različitim proučavanim trenucima u poređenju sa onom dobijenim u grupi koja je tretirana izotopom 1B7.11. (Slika 10).

[0220] Preokret mehaničke preosetljivosti bio je 41±8% i 22±8% kod D1, 36±9% i 32±9% kod D4 i 27±10% i 50±9% kod D7 za 2,5 mg/kg i 30 mg/kg intravenozne primene EE1 antitela, respektivno (Tabela 30).

Tabela 30. Uticaj EE1 antitela na CFA-indukovanu mehaničku preosetljivost kod muških C57Bl/6 miševa

B2. Termalna preosetljivost

[0221] Za termalnu preosetljivost, procenjena su merenja latencije povlačenja šape (PWL, u sekundama) u odgovoru na radijantnu toplotu pomoću aparata (IITC, Woodland Hills, USA).

[0222] Kako bi se ispitala efikasnost antitela EE1 na bolničko ponašanje, izračunali smo preokret termalne preosetljivosti (u %) na sledeći način:

Procenat preokreta je izračunat kao (PWLposle doze– srednja izotip-kontrolaposle doze) / (srednja izotip-kontrolapre doze– srednja izotip kontrolaposle doze) za svakog miša.

[0223] Termalne preosetljivosti nisu se razlikovale između grupa na početku, pre intraplantarne injekcije CFA (podaci nisu prikazani).

[0224] Kod D1, D4 i D7 nakon intraplantarne injekcije CFA, značajno smanjenje latencije povlačenja šape injektirane šape primećeno je kod 1B7.11-tretirane grupe miševa sa kontrolom izotipa, pokazujući da je CFA indukovao toplotnu preosetljivost (podaci nisu prikazani).

[0225] EE1 antitela, primenjena intravenozno 22 sata nakon intraplantarne injekcije CFA (tj. na Dan 1 posle intraplantarne injekcije CFA) i nisu bila u mogućnosti da povećaju latenciju povlačenja šapa na D1, bez obzira na testiranu dozu (Slika 11). Međutim, EE1 je značajno povećao latenciju povlačenja šapa na D4 i ovaj efekat je prisutan i na D7 (Slika 11).

[0226] Preokret termalne preosetljivosti bio je 41±15%, i 58±21% kod D4 i 46±10% i 52±17% kod D7 za intravenoznu primenu EE1 od 2,5 mg/kg i 30 mg/kg (Tabela 31).

Tabela 31. Uticaj EE1 antitela na CFA-indukovanu mehaničku preosetljivost kod C57B1L6 miševa

C. CCI (hronična konstrikciona povreda) - izazvan bol u obliku neuropatije (Bennetov model)

[0227] CCI model je korišćen kao model povrede perifernih nerava. Ukratko, miševi su anestezirani sa Izofluranom (3%), i desni išijatični nerv bio je izložen na srednjem nivou bedra kroz mali rez. Oko išijatičnog nerva postavljene su tri labave ligature od 6,0 hromičnog creva (Ethicon) na 1 mm razmaka. Hirurški zahvat završen je zatvaranjem mišića i kože. Dan CCI hirurgije je smatran za Dan 0. Grupe su bile 6-10 muških C57BI/6 miševa.

[0228] EE1 antitelo je primenjeno intravenozno na 2,5 i 30 mg/kg tokom operacije posle 11 dana, i mehanička i termalna preosetljivost procenjene su na dan 12 (D12), dan 14 (D14) i dan 18 (D18) posle operacije, što odgovara danu 1 (D1), danu 3 (D3) i danu 7 (D7) posle tretmana.

C1. Mehanička preosetljivost

[0229] Mehanička preosetljivost je procenjena merenjem pragova za povlačenje zadnje šape (kod povređenih [tj. Ipsi] i ne povređenih [tj. kontra] šapa) do povećanog pritiska (u g) stimulusa koristeći Dynamic Plantar Aesthesiometer (Ugo-Basile, Italy); na zadnje šape miševa primenjena je čelična šipka sa povećanjem sile (5 grama za 10 sekundi).

[0230] Kako bi se ispitala efikasnost antitela EE1 na ponašanje nalik bolu, utvrdili smo preokret mehaničke preosetljivosti na sledeći način: procentualni preokret izračunat je kao (Ipsiposle doze– Ipskipre doze) / (Kontrapre doze– Ipsipre doze) za svakog miša.

[0231] Posle operacije, operisani miševi su razvili robusnu senzibilizaciju na mehaničke stimuluse na povređenoj šapi, dok nije bilo efekta na nepovređenu šapu. Na dan 11, mehanička senzibilizacija na povređenoj šapi dostigla je plato (podaci nisu prikazani).

[0232] EE1 antitelo, primenjeno intravenozno na dan 11, pokazalo je malu tendenciju da preokrene CCI indukovanu mehaničku preosetljivost na D12, D14 i D18 sa 15,2±4,9% i 15,2±5,7% na D12, 26,8±5,7% i 25,7±4,5% na D14 i 30,3±7,1% i 20,8±5,9% na D18, pri 2,5 i 30 mg/kg respektivno (Slika 12 i Tabela 32).

Tabela 32. Uticaj EE1 antitela na CCI-indukovanu mehaničku preosetljivost kod muških C57BI/6 miševa

C2. Termalna preosetljivost

[0233] Za toplotnu preosetljivost, procenjena su merenja latencije povlačenja šape (u sekundama) kao odgovor na na radijantnu toplotu pomoću aparata (IITC, Woodland Hills, USA) na injektiranoj zadnjoj šapi.

[0234] Kako bi se ispitala efikasnost antitela EE1 na ponašanje nalik bolu, izračunali smo preokret termalne preosetljivosti (u%) na sledeći način:

Procenat preokreta je izračunat kao (Ipsiposle doze– srednja izotip-kontrolaposle doze) / (srednja naivnaposle doze– srednja izotip-kontrolaposle doze) za svakog miša.

[0235] Nakon operacije, operisani miševi su razvili robusnu senzibilizaciju na termalni stimulus na povređenoj šapi, dok nije bilo efekta na nepovređenu šapu. Na dan 11, termalna senzibilizacija na povređenoj šapi dostigla je plato (podaci nisu prikazani).

[0236] EE1 antitelo, primenjeno intravenozno na dan 11 nije značajno povećalo latenciju povlačenja šape povrijeđene šape na D12, čak i ako je primećen trend. Međutim, od D14, EE1 antitelo značajno je povećalo povlačenje šape (Slika 13).

Preokret termalne preosetljivosti bio je 41±16%, a 56±24% kod D12 i 51±16% i 98±48% kod D14 i 78±19% i 84±22% kod D18, za 2,5 mg/kg i 30 mg/kg intravenozne primene EE1 antitela, respektivno (Tabela 33).

Tabela 33. Uticaj EE1 antitela na CCI indukovanu toplotnu preosetljivost kod muških C57BI/6 miševa Kinetička evaluacija

LISTA SEKVENCI [0237]

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a)

SEQ ID NO: 7 [X1Y X2X3D X4HAM X5Y], gde

X1je Y, F ili H,

X2je R, D, A, V, L, I, M, F, Y ili W,

X3je Y, F, W ili H,

X4je D, E ili Y, i,

X5je D ili E;

SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], gde

X1je D, R, A, V, L, I, M, F, Y ili W, i

X2je Y, D, E, N ili Q; i

SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], gde X1je N, W ili Y;

respektivno,

b)

SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], gde

X1je W ili F,

X2je N ili nije aminokiselina,

X3je Y ili S,

X4je D ili P, i

X5je F ili Y;

SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], gde

X1je I ili V,

X2je T ili S, i

X3je G ili D;

SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], gde X1je L ili M;

respektivno,

SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 14; i

SEQ ID NO: 15;

respektivno,

d)

SEQ ID NO: 32;

SEQ ID NO: 33; i

SEQ ID NO: 34;

respektivno,

e)

SEQ ID NO: 40;

SEQ ID NO: 41; i

SEQ ID NO: 42;

respektivno,

f)

SEQ ID NO: 47;

SEQ ID NO: 48; i

SEQ ID NO: 49;

respektivno,

i

g)

SEQ ID NO: 55;

SEQ ID NO: 56; i

SEQ ID NO: 57;

respektivno, i

ii) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 3 (LCDR3) lakog lanca, aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 2 (LCDR2) lakog lanca, i aminokiselinsku sekvencu regije koja određuje komplementarnost 1 (LCDR1) lakog lanca izabrane iz grupe koju čine:

h)

SEQ ID NO: 10 [QQ X1X2S X3P X4T], gde

X1je Y, F ili H,

X2je Y, F, H ili W,

X3je Y, F, T ili H, i,

X4je W, Y, F, H ili L:

SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], gde X1je E, D, Q ili N; i SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], gde

X1je W, H, Y ili F, i

X2je H ili Y;

respektivno,

i)

SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], gde

X1je Q ili N,

X2je Y, F, D ili H,

X3je Y, F, H ili W,

X4je Y, F, T ili H, i

X5je W, Y, F, H ili L;

SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], gde

X1je W ili G, i

X2je E, D, Q ili N; i

SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], gde X1je W, H, Y ili F,

X2je S ili G,

X3je N ili D,

X4je K ili R,

X5je H ili Y;

respektivno,

j)

SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], gde X1je L ili M;

SEQ ID NO: 36; i

SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], gde X1 je K ili E; respektivno,

k)

SEQ ID NO: 16;

SEQ ID NO: 17; i

SEQ ID NO: 18;

respektivno,

1)

SEQ ID NO: 35;

SEQ ID NO: 36; i

SEQ ID NO: 37;

respektivno,

m)

SEQ ID NO: 43;

SEQ ID NO: 17; i

SEQ ID NO: 44;

respektivno,

n)

SEQ ID NO: 50;

SEQ ID NO: 51; i

SEQ ID NO: 52;

respektivno,

i

o)

SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 59; i

SEQ ID NO: 60;

respektivno.

2. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 13, 14 i 15, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87 i H108, prema Kabatu; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 16, 17 i 18, respektivno, i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na položajima izabranim iz grupe koju čine L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 i L104, prema Kabatu.

3. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena obuhvataju aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca i lakog lanca date u SEQ ID NO: 24 i 30, respektivno.

4. Farmaceutski sastav koji obuhvata antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, patentnog zahteva 1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

5. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) SEQ ID NOs: 19 i 26, respektivno,

b) SEQ ID NOs: 20 i 27, respektivno,

c) SEQ ID NOs: 21 i 28, respektivno,

d) SEQ ID NOs: 22 i 28, respektivno,

e) SEQ ID NOs: 23 i 29, respektivno,

f) SEQ ID NOs: 24 i 30, respektivno,

g) SEQ ID NOs: 25 i 31, respektivno,

h) SEQ ID NOs: 38 i 39, respektivno,

i) SEQ ID NOs: 45 i 46, respektivno,

j) SEQ ID NOs: 53 i 54, respektivno,

k) SEQ ID NOs: 61 i 62, respektivno.

6. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu, i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabrane iz grupe koju čine:

a) SEQ ID NOs: 19 i 26, respektivno,

b) SEQ ID NOs: 20 i 27, respektivno,

c) SEQ ID NOs: 21 i 28, respektivno,

d) SEQ ID NOs: 22 i 28, respektivno,

e) SEQ ID NOs: 23 i 29, respektivno,

f) SEQ ID NOs: 24 i 30, respektivno,

g) SEQ ID NOs: 25 i 31, respektivno,

h) SEQ ID NOs: 38 i 39, respektivno,

i) SEQ ID NOs: 45 i 46, respektivno,

j) SEQ ID NOs: 53 i 54, respektivno,

k) SEQ ID NOs: 61 i 62, respektivno.

7. Farmaceutski sastav koji obuhvata antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, patentnog zahteva 2 i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

8. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata konsenzus aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 7, 8 i 9, respektivno; i b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 10, 11 i 12, respektivno.

9. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 8, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 13, 14 i 15, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 16, 17 i 18, respektivno.

10. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 32, 33 i 34, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 35, 36 i 37, respektivno.

11. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 43, 17 i 44, respektivno.

12. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 47, 48 i 49, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 50, 51 i 52, respektivno.

13. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za Kalidin ili des-Arg10-Kalidin ali ne za Bradikinin ili des-Arg9-Bradikinin patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena obuhvataju:

a) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence HCDR3, HCDR2 i HCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 55, 56 i 57, respektivno; i

b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinske sekvence LCDR3, LCDR2 i LCDR1 regija date u SEQ ID NOs: 58, 59 i 60, respektivno.