RS57449B1 - Kombinovana terapija sa hijaluronidazom i taksanom koji ciljno deluje na tumor - Google Patents

Kombinovana terapija sa hijaluronidazom i taksanom koji ciljno deluje na tumor

Info

Publication number
RS57449B1
RS57449B1 RS20180852A RSP20180852A RS57449B1 RS 57449 B1 RS57449 B1 RS 57449B1 RS 20180852 A RS20180852 A RS 20180852A RS P20180852 A RSP20180852 A RS P20180852A RS 57449 B1 RS57449 B1 RS 57449B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tumor
hyaluronan
composition
hyaluronidase
seq
Prior art date
Application number
RS20180852A
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel C Maneval
Michael H Shepard
Curtis B Thompson
Original Assignee
Halozyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Halozyme Inc filed Critical Halozyme Inc
Publication of RS57449B1 publication Critical patent/RS57449B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] U ovom tekstu obezbeđena je kombinovana terapija koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i taksan koji ciljno deluje na tumor, i izborno dodatno hemioterapijsko sredstvo kao što je nukleozidni analog. Kombinovana terapija može da se koristi u postupcima za lečenje kancera, i naročito kanceroznih solidnih tumora.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Antihijaluronanska sredstva, kao enzimi koji razgrađuju hijaluronan, npr., PH20, koriste se u postupcima za lečenje bolesti ili stanja udruženih sa hijaluronanom, uključujući kancere i naročito kancere ili tumore udružene sa hijaluronanom. Hijaluronan (hijaluronska kiselina; HA) je glikozaminoglikan koji se javlja prvenstveno u vezivnim tkivima, koži, hrskavici, i u sinovijalnoj tečnosti sisara. U vezivnom tkivu, hidratišuća voda povezana sa hijaluronanom stvara hidratisanu matricu između tkiva. HA je nađen u ekstracelularnom matriksu mnogih ćelija, posebno u mekim vezivnim tkivima. Izvesne bolesti su udružene sa ekspresijom i/ili proizvodnjom hijaluronana, uključujući solidne tumore. Antihijaluronanska sredstva su sredstva koja modulišu sintezu ili degradaciju HA, čime menjaju nivoe HA u tkivu ili ćeliji. Konkretno, hijaluronidaze su enzimi koji degradiraju hijaluronan. Zahvaljujući katalizovanju razgradnje HA, hijaluronidaze mogu da se koriste za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa nakupljanjem HA ili drugih glikozaminoglikana, uključujući kancere i tumore. Za lečenje kancera, i naročito kanceroznih solidnih tumora, postoji potreba za poboljšanim ili alternativnim terapijskim tretmanima.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0003] Ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju kompozicija za upotrebu u lečenju kancera pankreasa, pri čemu kombinacija sadrži: prvu kompoziciju koja sadrži hijaluronidazu konjugovanu sa polimerom; i drugu kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor, pri čemu taksan koji ciljno deluje na tumor sadrži nab-paklitaksel ili nab-docetaksel.
[0004] Pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju, koja sadrži hijaluronidazu konjugovanu sa polimerom za upotrebu u lečenje kancera pankreasa, u kojoj se hijaluronidaza koristi sa taksanom koji ciljno deluje na tumor i primenjuje se kod subjekta istovremeno, gotovo istovremeno, odvojeno ili uzastopno sa taksanom koji ciljno deluje na tumor; i taksan koji ciljno deluje na tumor sadrži nab-paklitaksel ili nab-docetaksel.
[0005] Ovde su obezbeđene kombinacije koje sadrže kompoziciju koja sadrži antihijaluronansko sredstvo i kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor. Takođe su ovde obezbeđene kombinacije koje sadrže kompoziciju koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor i kompoziciju koja sadrži nukleozidni analog. Bilo koje od ovde obezbeđenih kombinacija mogu dalje da sadrže kompoziciju koja sadrži kortikosteroid. Ovde su obezbeđene kombinacije ili kompozicije za upotrebu u lečenje kancera pankreasa u kojima se primenjuju kompozicija koja sadrži antihijaluronansko sredstvo i kompozicija koja sadrži formulaciju taksana koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, postupci dalje uključuju primenu kompozicije koja sadrži nukleozidni analog. U nekim primerima, postupci dalje uključuju primenu kortikosteroida. U drugim primerima, postupci dalje uključuju primenu tretmana protiv kancera. U takvim kombinacijama i postupcima, sredstva su obezbeđena u terapijski efikasnim količinama kao što je ovde opisano.
[0006] Ovde su takođe opisane medicinske upotrebe kombinovane terapije. Na primer, ovde su opisane upotrebe antihijaluronanskog sredstva i taksana koji ciljno deluje na tumor za lečenje kancera pankreasa, pri čemu su antihijaluronansko sredstvo i taksan koji ciljno deluje na tumor formulisani odvojeno ili zajedno. Takođe su ovde obezbeđene upotrebe antihijaluronanskog sredstva za lečenje kancera pankreasa, pri čemu navedeno lečenje uključuje istovremenu, odvojenu ili uzastopnu primenu kod subjekta, taksana koji ciljno deluje na tumor. Ovde su obezbeđene i kompozicije koje sadrže antihijaluronansko sredstvo za upotrebu u lečenju kancera pankreasa, pri čemu navedeno lečenje obuhvata istovremenu, odvojenu ili uzastopnu primenu kod subjekta, taksana koji ciljno deluje na tumor. U primerima medicinske upotrebe koji su ovde dati, lečenje može da uključuje i primenu kod subjekta nukleozidnog analoga istovremeno, odvojeno ili uzastopno sa antihijaluronanskim sredstvom ili taksanom koji ciljno deluje na tumor. U drugim ili dodatnim primerima, lečenje može da uključuju primenu kortikosteroida istovremeno, odvojeno ili uzastopno sa antihijaluronanskim sredstvom.
[0007] U ovde obezbeđenim kombinacijama, kompozicijama i upotrebama, antihijaluronansko sredstvo je enzim koji razgrađuje hijaluronan ili sredstvo koje inhibira sintezu hijaluronana. U nekim primerima, antihijaluronansko sredstvo je enzim koji razgrađuje hijaluronan koji predstavlja hijaluronidazu. U drugim primerima, antihijaluronansko sredstvo je enzim koji razgrađuje hijaluronan koji je konjugovan sa polimerom. U nekim primerima, antihijaluronansko sredstvo je sredstvo koje inhibira sintezu hijaluronana koje je odabrano od sens ili antisens molekula nukleinske kiseline protiv HA sintaze ili je lek u vidu malog molekula. U nekim primerima, antihijaluronansko sredstvo je lek u vidu malog molekula odabran od 4-metilumbeliferona (MU) ili njegovog derivata, ili leflunomida ili njegovog derivata. U drugim primerima, antihijaluronansko sredstvo je lek u vidu malog molekula koji je derivat 4- metilumbeliferona (MU) odabran od 6,7-dihidroksi-4-metil kumarina ili 5,7-dihidroksi-4-metil kumarina.
[0008] Ovde su obezbeđene kombinacije koje sadrže kompoziciju koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom i kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor. Ovde su obezbeđene i kombinacije koje sadrže kompoziciju koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor i kompoziciju koja sadrži nukleozidni analog. Bilo koja od ovde obezbeđenih kombinacija može dalje da sadrži kompoziciju koja sadrži kortikosteroid. Ovde su obezbeđene kombinacije ili kompozicije za upotrebu u lečenje kancera pankreasa pri čemu se primenjuju kompozicija koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan koji je konjugovanu sa polimerom i kompozicija koja sadrži formulaciju taksana koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, postupci dalje uključuju primenu kompozicije koje sadrže nukleozidni analog. U nekim primerima, postupci dalje uključuju primenu kortikosteroida. U drugim primerima, postupci dalje uključuju primenu tretmana protiv kancera.
[0009] Ovde su obezbeđene kombinacije, i upotrebe, koje sadrže kompoziciju koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan, u kojoj je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom; i kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima kombinacije, kompozicije su formulisane za neposrednu primenu, koncentracija enzima koji razgrađuje hijaluronan je dovoljna da razgradi hijaluronan povezan sa tumorom, i koncentracija taksana koji ciljno deluje na tumor je dovoljna da se postigne dostava u tumor. U nekim primerima, koncentracija formulacije taksana koji ciljno deluje na tumor je dovoljna da smanji nivoe proteina nukleozid deaminaze ili aktivnost proteina unutar tumora u poređenju sa nivoima ili aktivnošću nukleozid deaminaze u odsustvu formulacije taksana u tumoru. U nekim primerima kombinacija, enzim koji razgrađuje hijaluronan i taksan koji ciljno deluje na tumor su obezbeđeni kao koformulacija. U drugim primerima kombinacija, enzim koji razgrađuje hijaluronan i taksan koji ciljno deluje na tumor su obezbeđeni odvojeno.
[0010] U bilo kom od primera, obezbeđene kombinacije dalje sadrže kompoziciju koja sadrži nukleozidni analog. U određenim primerima, kompozicija je formulisana za neposrednu primenu i koncentracija nukleozidnog analoga je dovoljna za postizanje dostave u tumor. U nekim primerima kombinacije, nukleozidni analog je obezbeđen odvojeno od enzima koji razgrađuje hijaluronan i taksana koji ciljno deluje na tumor. U drugim primerima kombinacije, nukleozidni analog je obezbeđen kao koformulacija sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan ili je obezbeđen kao koformulacija sa taksanom koji ciljno deluje na tumor. U sledećim primerima kombinacije, nukleozidni analog je obezbeđen kao koformulacija sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan i taksanom koji ciljno deluje na tumor.
[0011] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, kompozicije koje sadrže enzim koji razgrađuje hijaluronan, kompozicije koje sadrže taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili kompozicije koje sadrže nukleozidni analog su formulisane za višedoznu primenu. U drugim primerima ovde obezbeđenih kombinacija, kompozicije koje sadrže enzim koji razgrađuje hijaluronan, kompozicije koje sadrže taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili kompozicije koje sadrže nukleozidni analog su formulisane za jednodoznu primenu.
[0012] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, kompozicija enzima koji razgrađuje hijaluronan sadrži, ili je formulisana tako da sadrži između ili oko između 0.5 µg do 50 mg, 100 µg do 1 mg, 1 mg do 20 mg, 100 µg do 5 mg, 0.5 µg do 1450 µg, 1 µg do 1000 µg, 5 µg do 1250 µg, 10 µg do 750 µg, 50 µg do 500 µg, 0.5 µg do 500 µg, 500 µg do 1450 µg enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom. U drugim primerima kombinacija koje su ovde obezbeđene, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom ima specifičnu aktivnost od najmanje ili oko 20000 U/mg, 25000 U/mg, 30000 U/mg, 31000 U/mg, 32000 U/mg, 33000 U/mg, 34 000 U/mg, 35000 U/mg, 36 000 U/mg, 37000 U/mg, 38 000 U/mg, 39000 U/mg, 40 000 U/mg, 45 000 U/mg, 50 000 U/mg, 55 000 U/mg, 60 000 U/mg ili više. U sledećim primerima kombinacija koje su ovde obezbeđene, kompozicija enzima koji razgrađuje hijaluronan sadrži između ili oko između 150 jedinica (U) do 60000 U, 300 U do 30000 U, 500 U do 25000 U, 500 U do 10000 U, 150 U do 15000 U, 150 U do 5000 U, 500 U do 1000 U, 5000 U do 45000 U, 10000 U do 50000 U, ili 20 000 U do 60000 U enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom. Zapremina kompozicije koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan može da bude između, ili može da bude oko između 0.5 mL do 100 mL, 0.5 mL do 50 mL, 0.5 mL do 10 mL, 1 mL do 40 mL, 1 mL do 20 mL, 1 mL do 10 mL, ili 3 mL do 10 mL. U nekim primerima kombinacija koje su ovde obezbeđene, kompozicija koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan sadrži histidin i/ili NaCl. U drugim primerima, kompozicija koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan ima pH koji je između ili oko između 6.0 do 7.4
[0013] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, enzim koji razgrađuje hijaluronan je hijaluronidaza. Na primer, hijaluronidaza može da bude PH20 ili njen skraćeni oblik kome nedostaje C-terminalno mesto za vezivanje glikozilfosfatidilinozitola (GPI) ili deo mesta za vezivanje GPI. U nekim primerima, hijaluronidaza je PH20 koja je humana ili nehumana PH20. U konkretnom primeru, enzim koji razgrađuje hijaluronan je skraćeni PH20 i skraćeni PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1, ili sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži najmanje aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost. U nekim primerima, hijaluronidaza je PH20 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži najmanje aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
[0014] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je skraćena na C-terminalnom kraju posle aminokiseline na položaju 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:1, ili predstavlja njenu varijantu koja ispoljava najmanje 85% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja je skraćena na C-terminalnom kraju posle aminokiseline na položaju 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost. Na primer, PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja je skraćena na C-terminalnom kraju posle aminokiseline na položaju 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
[0015] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, taksan koji ciljno deluje na tumor je paklitaksel ili docetaksel. Taksan koji ciljno deluje na tumor može da bude vezan neposredno ili posredno za fragment koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, taksan koji ciljno deluje na tumor je formulisan kao vehikulum za dostavu odabran između micele, nanočestice, mikrosfere, lipozoma ili hidrogela. Vehikulum za dostavu može da bude vezan neposredno ili posredno za fragment koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, fragment koji ciljno deluje na tumor je odabran između makromolekula, proteina, peptida, monoklonskog antitela ili lipida masne kiseline. U drugim primerima, fragment koji ciljno deluje na tumor je monoklonsko antitelo odabrano od cetuksimaba ili trastuzumaba. U drugim primerima, fragment koji ciljno deluje na tumor je albumin. U skladu sa predmetnim patentnim zahtevima, taksan koji ciljno deluje na tumor je paklitaksel vezan za albumin ili docetaksel vezan za albumin.
[0016] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, kompozicija taksana koji ciljno deluje na tumor sadrži, ili je formulisana tako da sadrži između ili oko između 10 mg do 1000 mg, na primer 20 mg do 500 mg, 10 mg do 250 mg, 75 mg do 400 mg, 100 mg do 200 mg, 150 mg do 400 mg, 200 mg do 800 mg, 50 mg do 200 mg ili 50 mg do 150 mg taksana koji ciljno deluje na tumor. U drugim primerima, zapremina kompozicije koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor je između ili oko između 0.5 mL do 100 mL, 1 mL do 500 mL, 0.5 mL do 50 mL, 0.5 mL do 10 mL, 1 mL do 40 mL, 1 mL do 20 mL, 1 mL do 10 mL, ili 3 mL do 10 mL
[0017] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, nukleozidni analog je analog purina ili pirimidina ili njihovi derivati. U nekim primerima, nukleozidni analog je odabran između fluoropirimidin 5-fluorouracila, 5-fluoro-2’-deoksicitidina, citarabina, gemcitabina, troksacitabina, decitabina, azacitidina, pseudoizocitidina, zebularina, ancitabina, fazarabina, 6-azacitidina, kapecitabina, N4oktadecil-citarabina, citarabina elaidinske kiseline, fludarabina, kladribina, klofarabina, nelarabina, forodesina i pentostatina, ili njihovih derivata. U jednom primeru, nukleozidni analog je supstrat za nukleozid deaminazu koja je adenozin deaminaza ili citidin deaminaza. U nekim primerima, nukleozidni analog je odabran između fludarabina, citarabina, gemcitabina, decitabina i azacitidina ili njihovih derivata.
[0018] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, kompozicija nukleozidnog analoga sadrži ili je formulisane tako da sadrži 100 mg do 5000 mg, 500 mg do 5000 mg, 500 mg do 2500 mg, 1000 mg do 2500 mg, 1500 mg do 2500 mg ili 2000 mg do 5000 mg nukleozidnog analoga. U drugim primerima, zapremina kompozicije koje sadrže nukleozidni analog je između ili oko između 0.5 mL do 1000 mL, na primer 0.5 mL do 100 mL, 0.5 mL do 10 mL, 1 mL do 500 mL, 1 mL do 10 mL.
[0019] Bilo koja od kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane može dalje da sadrži kompoziciju koja sadrži kortikosteroid. U nekim primerima, kortikosteroid je glukokortikoid koji je odabran između kortizona, deksametazona, hidrokortizona, metilprednizolona, prednizolona i prednizona. U nekim primerima, kompozicija kortikosteroida sadrži, ili je formulisana tako da sadrži između ili oko 0.1 do 20 mg, 0.1 do 15 mg, 0.1 do 10 mg, 0.1 do 5 mg, 0.2 do 20 mg, 0.2 do 15 mg, 0.2 do 10 mg, 0.2 do 5 mg, 0.4 do 20 mg, 0.4 do 15 mg, 0.4 do 10 mg, 0.4 do 5 mg, 0.4 do 4 mg, 1 do 20 mg, 1 do 15 mg ili 1 do 10 mg kortikosteroida.
[0020] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, kompozicija/kompozicije je/su formulisana/formulisane za oralnu, intravensku (IV), subkutanu, intramuskularnu, intratumoralnu, intradermalnu, topikalnu, transdermalnu, rektalnu, intratekalnu ili subepidermalnu primenu. Na primer, kompozicija/kompozicije je/su formulisana/formulisane za intravensku primenu ili subkutanu primenu.
[0021] U bilo kom od primera kombinacija, postupaka i upotreba koje su ovde opisane, polimer je polialkilen glikol, dekstran, pululan ili celuloza. U jednom primeru, polimer je polialkilen glikol koji je odabran između polietilen glikola (PEG) ili metoksipoiletilen glikola (mPEG). U konkretnom primeru, polimer je PEG, i PEG je granati ili linearni PEG. U nekim primerima, polimer je proizveden reakcijom sa metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil butanoatom (mPEG-SBA) (5 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil butanoatom (mPEGSBA) (20 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil butanoatom (mPEG-SBA) (30 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil α-metilbutanoatom (mPEG-SMB) (20 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil α-metilbutanoatom (mPEG-SMB) (30 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-butiraldehidom (mPEG-butiraldehidom) (30 kDa), metoksipoli(etilen glikol)-sukcinimidil propionatom (mPEG-SPA) (20 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil propionatom (mPEG-SPA) (30 kDa); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (10 kDa granati); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (20 kDa granati); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (40 kDa granati); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (60 kDa granati); biotin-poli(etilen glikol)-N-hidroksisukcinimid estrom (biotin-PEG-NHS) (5 kDa biotinilisani); poli(etilen glikol)-pnitrofhenil karbonatom (PEG-p-nitrofenilkarbonat) (30 kDa); ili poli(etilen glikol)-priopionaldehid (PEG-propionaldehid) (30 kDa). U konkretnim primerima, polimer je PEG koji ima molekulsku težinu od 30 ili oko 30 kilodaltona.
[0022] Bilo koja od kombinacija koje su ovde obezbeđene može da bude upakovana kao kit i da opciono uključuje uputstvo za upotrebu.
[0023] Ovde su obezbeđene i kombinacije ili kompozicije za upotrebu u lečenje kancera pankreasa u kojima se primenjuje kompozicija koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan, gde je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom i primenjuje se kompozicija koja sadrži formulaciju taksana koji ciljno deluje na tumor. U bilo kom od primera postupka, primenjuje se i kompozicija koja sadrži nukleozidni analog.
[0024] U bilo kom od primera ovde opisanih postupaka ili upotrebe, kancer je tumor. U jednom primeru, tumor je solidni tumor. U bilo kom od primera postupka ili upotreba u ovom tekstu, tumor ima povišenu ćelijsku i/ili stromalnu ekspresiju hijaluronana, u poređenju sa nekancerskim tkivom istog tipa tkiva, ili u poređenju sa nemetastatskim tumorom istog tipa tumora. U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, kancer je odabran između kancera pankreasa, kancera jajnika, kancera pluća, kancera kolona, kancera prostate, cervikalnog kancera, kancera glave i vrata i kancera dojke. U skladu sa predmetnim patentnim zahtevima, kancer je kancer pankreasa.
[0025] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, enzim koji razgrađuje hijaluronan je hijaluronidaza. Na primer, hijaluronidaza je PH20 ili njen skraćeni oblik kome nedostaje mesto za vezivanje C-terminalnog glikozilfosfatidilinozitola (GPI) ili deo mesta za vezivanje GPI. U konkretnom primeru, hijaluronidaza je PH20 koja je humana ili nehumana PH20. U određenom primeru, enzim koji razgrađuje hijaluronan je skraćena PH20 i skraćena PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1, ili sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži najmanje aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost. U nekim primerima, PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži najmanje aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost. U drugim primerima, PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je skraćena na C-terminalnom kraju posle aminokiseline na položaju 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:1, ili predstavlja njenu varijantu koja ispoljava najmanje 85% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja je skraćena na C-terminalnom kraju posle aminokiseline na položaju 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost. U drugim primerima, PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja je skraćena na C-terminalnom kraju posle aminokiseline na položaju 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
[0026] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, polimer je polialkilen glikol, dekstran, pululan ili celuloza. U jednom primeru, polimer je polialkilen glikol koji je odabran između polietilen glikola (PEG) ili metoksipoiletilen glikola (mPEG). U konkretnom primeru, polimer je PEG, i PEG je granati ili linearni PEG. U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde obezbeđene, polimer je proizveden reakcijom sa metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil butanoatom (mPEG-SBA) (5 kDa); metoksipoli(etilen glikol)-sukcinimidil butanoatom (mPEGSBA) (20 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil butanoatom (mPEG-SBA) (30 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil α-metilbutanoatom (mPEG-SMB) (20 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil α-metilbutanoatom (mPEG-SMB) (30 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)butiraldehidom (mPEG-butiraldehidom) (30 kDa), metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil propionatom (mPEG-SPA) (20 kDa); metoksi-poli(etilen glikol)-sukcinimidil propionatom (mPEG-SPA) (30 kDa); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (10 kDa granati); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (20 kDa granati); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (40 kDa granati); (metoksi-poli(etilen glikol))2-N-hidroksisukcinimid estrom (mPEG2-NHS) (60 kDa granati); biotin-poli(etilen glikol)-N- hidroksisukcinimid estrom (biotin-PEG-NHS) (5 kDa biotinilisani); poli(etilen glikol)-p-nitrofenil karbonatom (PEG-p-nitrofenilkarbonat) (30 kDa); ili poli(etilen glikol)-priopionaldehid (PEG-propionaldehid) (30 kDa). U konkretnim primerima, polimer je PEG koji ima molekulsku težinu od 30 ili oko 30 kilodaltona.
[0027] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, enzim koji razgrađuje hijaluronan se primenjuje u, ili je formulisan za primenu u doznom opsegu količina od između ili oko između 0.01 µg/kg do 25 mg/kg (subjekta), 0.5 µg/kg do 25 mg/kg, 0.5 µg/kg do 10 mg/kg, 0.02 mg/kg do 1.5 mg/kg, 0.01 µg/kg do 15 µg/kg, 0.05 µg/kg do 10 µg/kg, 0.75 µg/kg do 7.5 µg/kg ili 1.0 µg/kg do 3.0 µg/kg (subjekta). U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde obezbeđene, enzim koji razgrađuje hijaluronan se primenjuje u, ili je formulisan za primenu u doznom opsegu količina od između ili oko između 1 jedinice/kg do 800000 jedinica/kg (subjekta), na primer 10 do 800 000 jedinica/kg, 10 do 750 000 jedinica/kg, 10 do 700 000 jedinica/kg, 10 do 650 000 jedinica/kg, 10 do 600000 jedinica/kg, 10 do 550000 jedinica/kg, 10 do 500000 jedinica/kg, 10 do 450 000 jedinica/kg, 10 do 400000 jedinica/kg, 10 do 350000 jedinica/kg, 10 do 320 000 jedinica/kg, 10 do 300 000 jedinica/kg, 10 do 280 000 jedinica/kg, 10 do 260 000 jedinica/kg, 10 do 240000 jedinica/kg, 10 do 220000 jedinica/kg, 10 do 200000 jedinica/kg, 10 do 180 000 jedinica/kg, 10 do 160000 jedinica/kg, 10 do 140000 jedinica/kg, 10 do 120 000 jedinica/kg, 10 do 100 000 jedinica/kg, 10 do 80 000 jedinica/kg, 10 do 70 000 jedinica/kg, 10 do 60000 jedinica/kg, 10 do 50000 jedinica/kg, 10 do 40000 jedinica/kg, 10 do 30 000 jedinica/kg, 10 do 20 000 jedinica/kg, 10 do 15 000 jedinica/kg, 10 do 12 800 jedinica/kg, 10 do 10000 jedinica/kg, 10 do 9000 jedinica/kg, 10 do 8000 jedinica/kg, 10 do 7 000 jedinica/kg, 10 do 6000 jedinica/kg, 10 do 5000 jedinica/kg, 10 do 4000 jedinica/kg, 10 do 3 000 jedinica/kg, 10 do 2 000 jedinica/kg, 10 do 1 000 jedinica/kg, 10 do 900 jedinica/kg, 10 do 800 jedinica/kg, 10 do 700 jedinica/kg, 10 do 500 jedinica/kg, 10 do 400 jedinica/kg, 10 do 300 jedinica/kg, 10 do 200 jedinica/kg, 10 do 100 jedinica/kg, 16 do 600 000 jedinica/kg, 16 do 500 000 jedinica/kg, 16 do 400 000 jedinica/kg, 16 do 350 000 jedinica/kg, 16 do 320000 jedinica/kg, 16 do 160000 jedinica/kg, 16 do 80000 jedinica/kg, 16 do 40000 jedinica/kg, 16 do 20000 jedinica/kg, 16 do 16 000 jedinica/kg, 16 do 12800 jedinica/kg, 16 do 10000 jedinica/kg, 16 do 5000 jedinica/kg, 16 do 4000 jedinica/kg, 16 do 3 000 jedinica/kg, 16 do 2000 jedinica/kg, 16 do 1000 jedinica/kg, 16 do 900 jedinica/kg, 16 do 800 jedinica/kg, 16 do 700 jedinica/kg, 16 do 500 jedinica/kg, 16 do 400 jedinica/kg, 16 do 300 jedinica/kg, 16 do 200 jedinica/kg, 16 do 100 jedinica/kg, 160 do 12800 jedinica/kg, 160 do 8000 jedinica/kg, 160 do 6000 jedinica/kg, 160 do 4 000 jedinica/kg, 160 do 2000 jedinica/kg, 160 do 1000 jedinica/kg, 160 do 500 jedinica/kg, 500 do 5000 jedinica/kg, 1000 do 100000 jedinica/kg ili 1000 do 10000 jedinica/kg (subjekta).
[0028] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, taksan koji ciljno deluje na tumor je paklitaksel ili docetaksel. Taksan koji ciljno deluje na tumor može da bude povezan neposredno ili posredno za fragment koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, taksan koji ciljno deluje na tumor je formulisan kao vehikulum za dostavu odabran između micele, nanočestice, mikrosfere, lipozoma ili hidrogela. Vehikulum za dostavu može da bude vezan neposredno ili posredno za fragment koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, fragment koji ciljno deluje na tumor je odabran između makromolekula, proteina, peptida, monoklonskog antitela ili lipida masne kiseline. U drugim primerima, fragment koji ciljno deluje na tumor je monoklonsko antitelo odabrano od cetuksimaba ili trastuzumaba. U skladu sa predmetnim patentnim zahtevima, fragment koji ciljno deluje na tumor je albumin. Taksan koji ciljno deluje na tumor je paklitaksel vezan za albumin ili docetaksel vezan za albumin. U bilo kom od primera postupaka ili upotreba obezbeđenih u ovom tekstu taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuje se u, ili je formulisan za primenu u doznom opsegu koji se nalazi između ili oko između 1 mg/m<2>do 1000 mg/m<2>(telesne površine subjekta), 10 mg/m<2>do 500 mg/m<2>, 50 mg/m<2>do 400 mg/m<2>, ili 25 mg/m<2>do 300 mg/m2.
[0029] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, nukleozidni analog je analog purina ili pirimidina ili njihovi derivati. U bilo kom od primera, nukleozidni analog je odabran između fluoropirimidin 5-fluorouracila, 5-fluoro-2’-deoksicitidina, citarabina, gemcitabina, troksacitabina, decitabina, azacitidina, pseudoizocitidina, zebularina, ancitabina, fazarabina, 6-azacitidina, kapecitabina, N4-oktadecil-citarabina, citarabina elaidinske kiseline, fludarabina, kladribina, klofarabina, nelarabina, forodesina i pentostatina, ili njihovih derivata. U određenom primeru, nukleozidni analog je supstrat za nukleozid deaminazu koja je adenozin deaminaza ili citidin deaminaza. U primerima, nukleozidni analog je odabran između fludarabina, citarabina, gemcitabina, decitabina i azacitidina ili njihovih derivata. U drugim primerima, nukleozidni analog je gemcitabin, ili njegov derivat. U bilo kom od primera postupaka ili upotreba obezbeđenih u ovom tekstu, nukleozidni analog se primenjuje u, ili je formulisan za primenu u doznom opsegu koji se nalazi između ili između oko 100 mg/m<2>do 2500 mg/m<2>, 500 mg/m<2>do 2000 mg/m<2>, 750 mg/m<2>do 1500 mg/m2 , 1000 mg/m2 do 1500 mg/m2 , ili 500 mg/m2 do 1500 mg/m2. U drugim primerima postupaka ili upotreba obezbeđenih u ovom tekstu, nukleozidni analog se primenjuje u, ili je formulisan za primenu u količini koja je najmanje, ili najmanje oko 200 mg/m<2>ili 500 mg/m2 , ali koja je manja od 1000 mg/m2 ili 1250 mg/m2.
[0030] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, kompozicija/kompozicije se primenjuje/primenjuju ili je/su formulisana/formulisane za oralnu, intravensku (IV), subkutanu, intramuskularnu, intratumoralnu, intradermalnu, topikalnu, transdermalnu, rektalnu, intratekalnu ili subepidermalnu primenu. U određenom primeru, kompozicija/kompozicije se primenjuje/primenjuju intravenski ili subkutano. U bilo kom od postupaka ili upotreba ovde, enzim koji razgrađuje hijaluronan se primenjuje ili se koristi pre, istovremeno ili gotovo istovremeno, uzastopno ili naizmenično sa taksanom koji ciljno deluje na tumor.
[0031] U primerima postupaka koji su ovde opisani, enzim koji razgrađuje hijaluronan se primenjuje pre primene taksana koji ciljno deluje na tumor. U jednom primeru, enzim koji razgrađuje hijaluronan primenjuje se najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova pre primene taksana koji ciljno deluje na tumor. U drugom primeru postupaka obezbeđenih u ovom tekstu, enzim koji razgrađuje hijaluronan i taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuju se istovremeno ili gotovo istovremeno.
[0032] U bilo kom od primera postupaka koji su ovde opisani, učestalost primene enzima koji razgrađuje hijaluronan je dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom na svakih 14 dana, jednom na svakih 21 dan ili jednom svakog meseca. U drugim primerima, učestalost primene taksana koji ciljno deluje na tumor je dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom na svakih 14 dana, jednom na svakih 21 dan ili jednom svakog meseca. U bilo kom od primera postupaka ili upotreba obezbeđenih u ovom tekstu, enzim koji razgrađuje hijaluronan i/ili taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuje se, ili je formulisan za primenu pre, istovremeno ili gotovo istovremeno, uzastopno, ili naizmenično sa nukleozidnim analogom.
[0033] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, enzim koji razgrađuje hijaluronan i taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuju se tokom unapred određenog broja nedelja u ciklusu primene. U jednom primeru, unapred određeni broj nedelja može da bude najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje ili najmanje četiri nedelje. U nekim primerima, enzim koji razgrađuje hijaluronan primenjuje se najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova pre primene nukleozidnog analoga. U nekim primerima, taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuje se najmanje ili najmanje oko ili oko ili 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa ili 24 časa pre primene nukleozidnog analoga. U određenom primeru, taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuje se istovremeno ili gotovo istovremeno sa nukleozidnim analogom. U obezbeđenim postupcima, učestalost primene nukleozidnog analoga može da bude dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom na svakih 14 dana, jednom na svakih 21 dan ili jednom svakog meseca. U nekim primerima, nukleozidni analog se primenjuje tokom unapred određenog broja nedelja u ciklusu primene. Na primer, unapred određeni broj nedelja može da bude najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje ili najmanje četiri nedelje. U drugom primeru postupaka koji su ovde obezbeđeni, nakon unapred određenog broja nedelja primene nukleozidnog analoga, primena se prekida tokom prvog unapred određenog perioda vremena, i zatim nastavlja tokom najmanje jedne nedelje.
[0034] U konkretnim primerima postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, enzim koji razgrađuje hijaluronan i taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuju se pre primene nukleozidnog analoga; primenjuju se istovremeno ili gotovo istovremeno; i primenjuju se sa učestalošću primene dva puta nedeljno ili jednom nedeljno tokom unapred određenog broja nedelja. U nekim primerima, unapred određeni broj nedelja je četiri nedelje. U takvim primerima, nukleozidni analog se primenjuje najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova posle primene enzima koji razgrađuje hijaluronan i taksana koji ciljno deluje na tumor.
[0035] U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, nukleozidni analog se primenjuje jednom nedeljno tokom unapred određenog broja nedelja. U jednom primeru, unapred određeni broj nedelja je tri nedelje. U takvim primerima, primena može da bude prekinuta tokom najmanje jedne nedelje.
[0036] U bilo kom od postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, ciklus primene i/ili prekid primene može da bude ponavljan mnogo puta. U nekim primerima, učestalost primene u prvom ciklusu primene je ista ili drugačija od učestalosti primene u sledećim ciklusima primene. Na primer, učestalost primene je dva puta nedeljno u prvom ciklusu primene i jednom nedeljno za sledeće cikluse primene.
[0037] Bilo koji postupci ili upotrebe koji su ovde opisani mogu dalje da uključuju korak primene kortikosteroida ili tretman koji uključuje primenu kortikosteroida. U bilo kom od takvih primera, kortikosteroid je glukokortikoid koji može da bude odabran između kortizona, deksametazona, hidrokortizona, metilprednizolona, prednizolona i prednizona. U nekim primerima postupka, kortikosteroid se primenjuje pre, istovremeno sa, naizmenično sa ili nakon primene enzima koji razgrađuje hijaluronan. U jednom primeru, kortikosteroid se zajedno primenjuje sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan. U drugom primeru, kortikosteroid se primenjuje najmanje ili oko najmanje 1 čas pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan. U drugom primeru obezbeđenih postupaka, kortikosteroid se primenjuje najmanje 8 časova do 12 časova posle primene enzima koji razgrađuje hijaluronan. U nekim primerima, količina kortikosteroida koja se primenjuje, ili koja je formulisana za primenu je između ili oko 0.1 do 20 mg, 0.1 do 15 mg, 0.1 do 10 mg, 0.1 do 5 mg, 0.2 do 20 mg, 0.2 do 15 mg, 0.2 do 10 mg, 0.2 do 5 mg, 0.4 do 20 mg, 0.4 do 15 mg, 0.4 do 10 mg, 0.4 do 5 mg, 0.4 do 4 mg, 1 do 20 mg, 1 do 15 mg ili 1 do 10 mg. Kortikosteroid može da se primenjuje oralno.
[0038] Bilo koji od postupaka ili upotreba koje su ovde opisane mogu dalje da uključuju primenu tretmana protiv kancera. U nekim primerima, tretman protiv kancera je odabran između hirurške intervencije, zračenja, hemioterapijskog sredstva, biološkog sredstva, polipeptida, antitela, peptida, malog molekula, vektora za gensku terapiju, virusa i DNK. Bilo koja od kombinacija i kompozicija obezbeđenih u ovom tekstu može da se koristi za lečenje subjekta koji je čovek.
[0039] Ovde su obezbeđene i kombinacije kompozicija za upotrebu u lečenje kancera pankreasa. Bilo koja od kombinacija kompozicija obezbeđenih u ovom tekstu može da se koristi za lečenje kancera. U nekim primerima kancer je tumor. Na primer, kancer je solidni tumor. U nekim primerima, tumor ima povišenu ćelijsku i/ili stromalnu ekspresiju hijaluronana, u poređenju sa nekancerskim tkivom istog tipa tkiva, ili u poređenju sa nemetastatskim tumorom istog tipa tumora. U bilo kom od primera postupaka ili upotreba koje su ovde opisane, kancer je odabran između kancera pankreasa, kancera jajnika, kancera pluća, kancera kolona, kancera prostate, cervikalnog kancera, kancera glave i vrata i kancera dojke. U skladu sa predmetnim patentnim zahtevima, kancer je kancer pankreasa. Ovde je takođe opisana upotreba kombinacije koja sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom i kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor za povećanje intratumorske aktivnosti nukleozidnog analoga.
KRATAK OPIS SLIKA
[0040]
Slika 1 prikazuje dejstvo PEGPH20 (P) i/ili nab-paklitaksela (NAB, N) na rast tumora u mišjem ksenograftskom modelu tumora BxPC-3 PDA.
Slika 2 prikazuje dejstva primene različitih doza gemcitabina (GEM) na rast tumora u mišjem ksenograftskom modelu tumora BxPC-3 PDA.
Slika 3 prikazuje dejstvo PEGPH20 (P), gemcitabina (GEM, G) i/ili nab-paklitaksela (NAB, N) na rast tumora u mišjem ksenograftskom modelu tumora BxPC-3 PDA. Slika 4 prikazuje medijanu vremena preživljavanja miševa tretiranih sa PEGPH20 (P), gemcitabinom (GEM, G) i/ili nab-paklitakselom (NAB, N) u mišjem ksenograftskom modelu tumora BxPC-3 PDA.
Slika 5 prikazuje nivoe CA19-9 (slika 5A) i CEA markera (slika 5B) iz seruma miševa tretiranih sa PEGPH20 (P), gemcitabinom (GEM, G) i/ili nab-paklitakselom (NAB, N) u mišjem ksenograftskom modelu tumora BxPC-3 PDA.
Slika 6 prikazuje inhibiciju rasta tumora pomoću PEGPH20 i paklitaksela konjugovanog sa albuminom (Ab-pac) u ksenograftskom modelu. Slika 6A prikazuje inhibiciju rasta tumora kod miševa tretiranih vehikulumom, paklitakselom konjugovanim sa albuminom (Ab-pac), PEGPH20, ili Ab-pac i PEGPH20 u tumorskom modelu MDA-MB-468/HAS3. Slika 6B prikazuje inhibiciju rasta tumora kod miševa tretiranih vehikulumom, paklitakselom konjugovanim sa albuminom (Abpac) pri dozi od 1mg/kg, Ab-pac pri dozi od 3 mg/kg, Ab-pac pri dozi od 1 mg/kg i PEGPH20, ili Ab-pac pri dozi od 10 mg/kg u tumorskom modelu MDA-MB-468/HAS3.
DETALJAN OPIS
Kratak pregled
[0041]
A. Definicije
B. Kombinovana terapija antihijaluronanskim sredstvom
1. Solidni tumori i terapije koje ciljno deluju na tumore
a. Taksan koji ciljno deluje na tumor
b. Antihijaluronansko sredstvo
2. Kombinovana terapija antihijaluronanskim sredstvom i taksanom koji ciljno deluje na tumor
C. Sredstva za kombinovanu terapiju
1. Antihijaluronanska sredstva
a. Sredstva koja inhibiraju sintezu hijaluronana
b. Enzim koji razgrađuje hijaluronan i enzim konjugovan sa polimerom koji razgrađuje hijaluronan
i. Hijaluronidaze
(a) Hijaluronidaza PH20 sisarskog tipa
(b) Bakterijska hijaluronidaza
(c) Hijaluronidaze iz pijavica, drugih parazita i ljuskara
ii. Drugi enzimi koji razgrađuju hijaluronan
iii. Rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan
(a) Rastvorljiva humana PH20
(b) rHuPH20
iv. Glikozilacija enzima koji razgrađuju hijaluronan
v. Modifikovani (konjugovani sa polimerom) enzimi koji razgrađuju hijaluronan
PEG-ilovani rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan
2. Taksani i njihove formulacije
a. Taksani
b. Taksani usmereni na tumor ili stromu
Taksani vezani za albumin
3. Dodatno hemioterapijsko sredstvo (npr. nukleozidni analog)
Primeri nukleozidnih analoga
i. Gemcitabin
ii. Citarabin
ii. Decitabin
iv. Azacitidin
D. Postupci za proizvodnju nukleinska kiselina i kodiranih polipeptida enzima koji razgrađuju hijaluronan
1. Vektori i ćelije
2. Ekspresija
a. Prokariotske ćelije
b. Ćelije kvasca
c. Insekatske ćelije
d. Sisarske ćelije
e. Biljke
3. Tehnike za prečišćavanje
4. PEG-ilacija polipeptida enzima koji razgrađuje hijaluronan
E. Farmaceutske kompozicije i formulacije
1. Formulacije
a. Injektabilne formulacije, rastvori i emulzije
b. Liofilizovani prahovi
c. Topikalna primena
d. Kompozicije za druge puteve primene
2. Količine formulacija
3. Pakovanje i proizvodni artikli
F. Postupci za procenu aktivnosti, bioraspoloživosti i farmakokinetike
1. In Vitro testovi
a. Hijaluronidazna aktivnost enzima koji razgrađuje hijaluronan
b. Aktivnost taksana
c. Antikancerska aktivnost
2. In Vivo životinjski modeli
3. Farmakokinetika i tolerabilnost
G. Postupci i upotrebe kombinovane terapije
1. Kanceri
Izbor subjekata za tretman
2. Doziranje i primena
3. Dozni režim: učestalost i ciklus primene
4. Dodatna kombinovana terapija
a. Kortikosteroid
b. Anti-kancerska sredstva i drugi tretmani
H. Primeri
A. DEFINICIJE
[0042] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što to uobičajeno podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj pronalazak/pronalasci pripadaju. U slučaju da postoji više definicija pojmova u ovom tekstu, one navedene u ovom odeljku prevladavaju. Kada postoji referenca za URL ili neki drugi takav identifikator ili adresu, jasno je da takvi identifikatori mogu da se promene, i određene informacije na internetu mogu da se pojave i nestanu, ali ekvivalentne informacije mogu biti pronađene pretraživanjem interneta. Upućivanje na to dokazuje dostupnost i raširenost takvih informacija u javnosti.
[0043] Kako se ovde koristi, "kombinovana terapija" odnosi se na lečenje u kome su subjektu data dva ili više terapijskih sredstava, na primer najmanje dva ili najmanje tri terapijska sredstva, za lečenje jedne bolesti. U svrhu ovog teksta, kombinovana terapija uključuje terapiju enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom i taksanom koji ciljno deluje na tumor i izborno dodatno antikancersko sredstvo ili hemioterapijsko sredstvo kao što je nukleozidni analog.
[0044] Kako se ovde koristi, taksan se odnosi na familiju antimitotičkih ili antimikrotubularnih sredstava koja inhibiraju ćelijski rast zaustavljanjem mitoze i ćelijske deobe zbog interferencije sa polimerizacijom mikrotubula. Taksani uključuju prirodno proizvedene diterpene koje proizvode biljke roda Taxus (tisa). Taksani uključuju i taksane koji se sintetički proizvode koji ispoljavaju antimitotičku ili antimikrotubularnu aktivnost. Tipično, taksani dele zajedničku strukturu jezgra koja sadrži četiri prstena (šestočlane A i C prstenove, osmočlani B prsten i četvoročlani D prsten). Primeri taksana su paklitaksel, taksan ili njihov derivat ili analog.
[0045] Kako se ovde koristi, antimitotička aktivnost odnosi se na inhibiciju, smanjenje ili sprečavanje mitoze. Zbog takve aktivnosti, ćelijski rast je inhibiran, smanjen ili sprečen. Na primer, sredstvo ispoljava antimitotičku aktivnost ako je ćelijski rast inhibiran za najmanje ili oko najmanje ili 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više u poređenju sa ćelijskim rastom u odsustvu sredstva.
[0046] Kako se ovde koristi, antimikrotubularna aktivnost se odnosi na aktivnost bilo kog sredstva koje interferira sa mikrotubulama, na primer snižavanjem, redukovanjem ili sprečavanjem polimerizacije mikrotubula. Stoga, antimikrotubularna aktivnost može da se odnosi na bilo koju aktivnost koja stabilizuje mikrotubule, koje su prirodno nestabilne i koje podležu dinamičkom procesu depolimerizacije (skraćivanja) i polimerizacije (izduživanja). Na primer, antimikrotubularna aktivnost se postiže sredstvima, kao što su taksani, koja interaguju sa krajevima mikrotubula, čime se zamrzava ili sprečava rasklapanje ili sklapanje. Testovi za procenu polimerizacije mikrotubula su poznati u ovoj oblasti, i primeri testova su ovde opisani. Antimikrotubularna aktivnost postoji ako sredstvo inhibira polimerizaciju mikrotubula za najmanje ili oko najmanje ili 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više u poređenju sa polimerizacijom u odsustvu sredstva.
[0047] Kako se ovde koristi, "taksan koji ciljno deluje na tumor" odnosi se na taksan koji je vezan, neposredno ili posredno, za fragment molekula i koji ispoljava povećanu specifičnost prema jednom ili više molekula na površini tumora u poređenju sa taksanom koji nije vezan za fragment za ciljno delovanje na tumor. Na primer, fragment može da bude makromolekul, peptid, protein, antitelo (npr. monoklonsko antitelo) ili lipid koji interaguje ili se vezuje (npr. specifično vezuje) sa molekulom prisutnim na površini tumora kao što je šećer, lipid, glikozaminoglikan ili protein prisutan na površini tumora. Uopšteno, molekul koji je prisutan na površini tumora prisutan je na nivou ili do stepena koji je aberantan ili različit od onog kod netumorskog tkiva ili normalnih tkiva ili ćelija.
[0048] Kako se ovde koristi, izraz "dovoljno za postizanje dostave unutar tumora" označava da taksan ispoljava povišeno ili veće ciljno delovanje na tumorsku ćeliju nego na netumorsku ćeliju, i na taj način ispoljava povišenu ili veću intracelularnu lokalizaciju u njemu. Testovi za procenu dostave u tumor mogu da uključuju in vitro ili in vivo testove, kao što je test vezivanja ili testovi za subcelularnu lokalizaciju pri čemu se nivo vezanog ili intracelularni nivo ili količina leka, kao što je taksan, poredi između normalnih ćelija i tumorskih ćelija. Takvi testovi uključuju, ali nisu ograničeni na imunotestove, uključujući radioimunotestove ili ELISA testove (npr. ELISA testovi bazirani na lizatu i infracrvena ELISA; videti takođe Svojanovsky et al. (1999) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 20:549-555); biotest na bazi tubulina (videti npr. Suye et al. (1997) Anal. Chem., 69:3633-3635); histohemiju ili imunohistohemiju (Hong et al. (2007) Mol. Cancer. Ther., 6: 3239); HPLC; testove zasnovane na fluorescenciji, uključujući protočnu citometriju i druge postupke (videti npr. Sheikh et al. (2001) Biosensors & Bioelectronics, 16:647-652), i druge slične testove poznate stručnjaku u oblasti. Antitela na taksan za upotrebu u takvim postupcima su dostupna (videti npr. Grothaus et al. (1995) J Nat. Prod., 58:1003-14; Leu et al. (1993) Cancer Res., 53:1388-1391; kataloški br. ab26953, Abcam). Biosenzor tehnologija takođe može da se koristi (videti npr. Braunhut et al. (2005) Assay and Drug Dev. Tech., 3: 77-88). Testovi mogu da uključuju i indirektne testove, u kojima se ocenjuje aktivnost taksana na ćelijski mehanizam, uključujući dejstva na apoptozu tumorskih ćelija i tumorski rast, uključujući veličinu ili zapreminu tumora.
[0049] Kako se ovde koristi, antihijaluronansko sredstvo odnosi se na bilo koje sredstvo koje moduliše sintezu ili razgradnju hijaluronana (HA), menjajući tako nivoe hijaluronana u tkivu ili ćeliji. U svrhu ovog teksta, antihijaluronanska sredstva redukuju nivoe hijaluronana u tkivu ili ćeliji u poređenju sa nivoima u odsustvu sredstva. Takva sredstva uključuju jedinjenja koja modulišu ekspresiju genetskog materijala koji kodira HA sintazu (HAS) i druge enzime ili receptore uključene u metabolizam hijaluronana, ili koja modulišu proteine koji sintetišu ili razgrađuju hijaluronan uključujući funkciju ili aktivnost HAS. Sredstva uključuju male molekule, nukleinske kiseline, peptide, proteine ili druga jedinjenja. Na primer, antihijaluronanska sredstva uključuju, ali nisu ograničena na antisens ili sens molekule, antitela, enzime, male molekule inhibitore i analoge supstrata za HAS.
[0050] Kako se ovde koristi, "konjugat" se odnosi na polipeptid vezan neposredno ili posredno za jedan ili više drugih polipeptida ili hemijskih fragmenata. Takvi konjugati uključuju fuzione proteine, proizvedene putem hemijske konjugacije i proizvedene bilo kojim drugim postupcima. Na primer, konjugat se odnosi na enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza ili rastvorljivi PH20 polipeptid, vezan neposredno ili posredno za jedan ili više drugih polipeptida ili hemijskih fragmenata, pri čemu je najmanje jedan rastvorljiv PH20 polipeptid vezan, neposredno ili posredno za drugi polipeptid ili hemijski fragment sve dok konjugat zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
[0051] Kako se ovde koristi, "enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom" odnosi se na enzim koji razgrađuje hijaluronan koji je vezan neposredno ili posredno za polimer. Veza može da bude bilo koja vrsta veze, uključujući, ali bez ograničenja, jonske i kovalentne veze, i bilo koje druge dovoljno stabilne interakcije. Pozivanje na enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom znači da konjugat ispoljava hijaluronidaznu aktivnost. Tipično, polimer-konjugat ispoljava najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više hijaluronidazne aktivnosti u poređenju sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan koji nije konjugovan sa polimerom.
[0052] Kako se ovde koristi, enzim koji razgrađuje hijaluronan odnosi se na enzim koji katalizuje sečenje polimera hijaluronana (takođe označenog kao hijaluronska kiselina ili HA) na fragmente manje molekulske težine. Primeri enzima koji razgrađuju hijaluronan su hijaluronidaze, i posebno hondroitinaze i lijaze koje imaju sposobnost da depolimerizuju hijaluronan. Primeri hondroitinaza koje su enzimi koji razgrađuju hijaluronan uključuju, ali nisu ograničeni na hondroitin ABC lijazu (takođe poznatu kao hondroitinaza ABC), hondroitin AC lijazu (takođe poznatu kao hondroitin sulfat lijaza ili hondroitin sulfat eliminaza) i hondroitin C lijazu. Hondroitin ABC lijaza sadrži dva enzima, hondroitinsulfat-ABC endolijazu (EC 4.2.2.20) i hondroitin-sulfat-ABC egzolijazu (EC 4.2.2.21). Primeri hondroitinsulfat-ABC endolijaza i hondroitin-sulfat-ABC egzolijaza uključuju, ali nisu ograničeni na one iz Proteus vulgaris i Flavobacterium heparinum (Proteus vulgaris hondroitin-sulfat-ABC endolijaza je prikazana u SEQ ID NO:98; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol.41(1):39-46). Primeri hondroitinaza AC enzima iz bakterija uključuju, ali nisu ograničeni na one iz Flavobacterium heparinum, navedene u SEQ ID NO:99, Victivallis vadensis, navedene u SEQ ID NO: 100, i Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444). Primeri hondroitinaza C enzima iz bakterija uključuju, ali nisu ograničeni na one iz Streptococcus i Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem.262:127-133).
[0053] Kako se ovde koristi, hijaluronidaza se odnosi na klasu enzima koji razgrađuju hijaluronan. Hijaluronidaze uključuju bakterijske hijaluronidaze (EC 4.2.2.1 ili EC 4.2.99.1), hijaluronidaze iz pijavica, drugih parazita, i ljuskara (EC 3.2.1.36), i hijaluronidaze (EC 3.2.1.35) sisarskog tipa. Hijaluronidaze uključuju bilo koju od hijaluronidaza nehumanog porekla uključujući, ali bez ograničenja, mišju, pseću, mačiju, zečju, ptičiju, goveđu, ovčiju, svinjsku, konjsku, riblju, žablju, bakterijsku, i bilo koju iz pijavica, drugih parazita i ljuskara. Primeri nehumanih hijaluronidaza uključuju, hijaluronidaze krava (SEQ ID NOS:10, 11, 64 i BH55 (SAD pat. br.5,747,027 i 5,827,721)), žute ose (SEQ ID NOS:12 i 13), pčele medarice (SEQ ID NO:14), beloglavog stršljena (SEQ ID NO:15), papirne ose (SEQ ID NO:16), miša (SEQ ID NOS:17-19, 32), svinje (SEQ ID NOS:20-21), pacova (SEQ ID NOS:22-24, 31), zeca (SEQ ID NO:25), ovce (SEQ ID NOS:26, 27, 63 i 65), šimpanze (SEQ ID NO:101), rezus majmuna (SEQ ID NO:102), orangutana (SEQ ID NO:28), cinomolgus majmuna (SEQ ID NO:29), zamorca (SEQ ID NO:30), enzim hijaluronidazu iz Arthrobacter sp. (soj FB24) (SEQ ID NO:67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO:68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO:69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO:71); serotip Ia (SEQ ID NO:72); i serotip III (SEQ ID NO:73)), Staphylococcus aureus (soj COL (SEQ ID NO:74); soj MRSA252 (SEQ ID NOS:75 i 76); soj MSSA476 (SEQ ID NO:77); soj NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); soj goveđi RF122 (SEQ ID NOS:79 i 80); i soj USA300 (SEQ ID NO:81)), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO:82); soj ATCC BAA-255 / R6 (SEQ ID NO:83); i serotip 2, soj D39 / NCTC 7466 (SEQ ID NO:84)), Streptococcus pyogenes (serotip M1 (SEQ ID NO:85); serotip M2, soj MGAS10270 (SEQ ID NO:86); serotip M4, soj MGAS10750 (SEQ ID NO:87); serotip M6 (SEQ ID NO:88); serotip M12, soj MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 i 90); serotip M12, soj MGAS9429 (SEQ ID NO:91); i serotip M28 (SEQ ID NO:92)); Streptococcus suis (SEQ ID NOS:93-95); Vibrio fischeri (soj ATCC 700601/ ES114 (SEQ ID NO:96)), i Streptomyces hyaluronolyticus, koja je specifična za hijaluronsku kiselinu i ne seče hondroitin ili hondroitin sulfat (Ohya, T. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Hijaluronidaze uključuju i one koje su humanog porekla. Primeri humanih hijaluronidaza uključuju HYAL1 (SEQ ID NO:36), HYAL2 (SEQ ID NO:37), HYAL3 (SEQ ID NO:38), HYAL4 (SEQ ID NO:39), i PH20 (SEQ ID NO:1). Takođe su uključene među hijaluronidaze i rastvorljive hijaluronidaze, uključujući, ovčiju i goveđu PH20, rastvorljivu humanu PH20 i rastvorljivu rHuPH20. Primeri komercijalno dostupnih goveđih ili ovčijih rastvorljivih hijaluronidaza uključuju Vitrase® (ovčija hijaluronidaza), Amphadase® (goveđa hijaluronidaza) i Hydase™ (goveđa hijaluronidaza).
[0054] Kako se ovde koristi, "prečišćena goveđa hijaluronidaza testisa" odnosi se na goveđu hijaluronidazu prečišćenu iz ekstrakata goveđih testisa (videti SAD patente br. 2,488,564, 2,488,565, 2,806,815, 2,808,362, 2,676,139, 2,795,529, 5,747,027 i 5,827,721). Primeri komercijalno dostupnih prečišćenih goveđih hijaluronidaza testisa uključuju Amphadase® i Hydase™, i goveđe hijaluronidaze, uključujući, ali bez ograničenja, one koje su dostupne kod Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Raybiotech, Inc., i Calzyme. Uključene su i rekombinantno proizvedene goveđe hijaluronidaze, kao što su, ali bez ograničenja, one napravljene ekspresijom molekula nukleinske kiseline navedene u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 190-192.
[0055] Kako se ovde koristi, "prečišćena ovčija hijaluronidaza testisa" se odnosi na ovčiju hijaluronidazu prečišćenu iz ekstrakata ovčijih testisa (videti SAD patente br. 2,488,564, 2,488,565 i 2,806,815 i međunarodnu PCT objavu br. WO1005/118799). Primeri komercijalno dostupnih prečišćenih ovčijih hijaluronidaza testisa uključuju Vitrase®, i ovčije hijaluronidaze, uključujući, ali bez ograničenja, one koje su dostupne kod Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com i Raybiotech, Inc. Uključene su i rekombinantno proizvedene ovčije hijaluronidaze, kao što su, ali bez ograničenja, one napravljene ekspresijom molekula nukleinske kiseline navedene u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS:66 i 193-194.
[0056] Kako se ovde koristi, "PH20" se odnosi na vrstu hijaluronidaze koja se javlja u spermi i koja je aktivna u neutralnoj sredini. PH-20 se javlja na površini sperme, i u akrozomu koji potiče iz lizozoma, gde je vezan za unutrašnju membranu akrozoma. PH20 uključuje PH20 bilo kog porekla uključujući, ali bez ograničenja, humano poreklo, poreklo od šimpanze, cinomolgus majmuna, rezus majmuna, mišje, goveđe, ovčije, zamorca, zeca i pacova. Primeri PH20 polipeptida uključuju one od čoveka (SEQ ID NO:1), šimpanze (SEQ ID NO:101), rezus majmuna (SEQ ID NO:102), cinomolgus majmuna (SEQ ID NO:29), krave (npr., SEQ ID NOS:11 i 64), miša (SEQ ID NO:32), pacova (SEQ ID NO:31), zeca (SEQ ID NO:25), ovce (SEQ ID NOS:27, 63 i 65) i zamorca (SEQ ID NO:30).
[0057] Ukazivanje na enzime koji razgrađuju hijaluronan obuhvata polipeptidne prekursore enzima koji razgrađuje hijaluronan i polipeptide zrelog enzima koji razgrađuje hijaluronan (kao što su oni kod kojih je odstranjena signalna sekvenca), njihove skraćene oblike koji imaju aktivnost, i obuhvata alelske varijante i varijante vrsta, varijante kodirane varijantama nastalim različitom obradom transkripta, i druge varijante, uključujući polipeptide koji imaju najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa polipeptidnim prekursorima navedenim u SEQ ID NOS: 1 i 10-48, 63-65, 67-102, ili njihovim zrelim oblikom. Na primer, ukazivanje na enzim koji razgrađuje hijaluronan takođe obuhvata varijante polipeptidnih prekursora humanog PH20 navedene u SEQ ID NOS:50-51. Enzimi koji razgrađuju hijaluronan takođe obuhvataju one koji sadrže hemijske ili posttranslacione modifikacije i one koji ne sadrže hemijske ili posttranslacione modifikacije. Takve modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na PEG-ilaciju, albuminaciju, glikozilaciju, farnezilaciju, karboksilaciju, hidroksilaciju, fosforilaciju i druge modifikacije polipeptida koje su poznate iz odgovarajuće oblasti. Skraćena PH20 hijaluronidaza je bilo koji njen C-terminalno skraćeni oblik, posebno oblici koji su skraćeni i aktivni u neutralnoj sredini kada su N-glikozilovani.
[0058] Kako se ovde koristi, "rastvorljiva PH20" odnosi se na bilo koji oblik PH20 koji je rastvorljiv pod fiziološkim uslovima. Rastvorljiva PH20 može da bude identifikovana, na primer, po svojoj raspodeli u vodenoj fazi Triton® X-114 rastvora na 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). PH20 koje su vezane za membranu, kao što su PH20 koje su vezane za lipide, uključujući GPI-usidrenu PH20, raspodeliće se u fazu bogatu deterdžentom, ali će se raspodeliti u fazu siromašnu deterdžentom ili vodenu fazu posle tretmana fosfolipazom-C. Među rastvorljive PH20 su uključene PH20 koje su usidrene za membranu, u kojima su jedan ili više regiona povezanih sa usidravanjem PH20 za membranu odstranjeni ili modifikovani, pri čemu rastvorljivi oblik zadržava hijaluronidaznu aktivnost. Rastvorljive PH20 obuhvataju rekombinantne rastvorljive PH20 i one koje su sadržane ili su prečišćene iz prirodnih izvora, kao što su, na primer, ekstrakti ovčijih ili goveđih testisa. Primer takvih rastvorljivih PH20 je rastvorljiva humana PH20.
[0059] Kako se ovde koristi, rastvorljiva humana PH20 ili sHuPH20 uključuje PH20 polipeptide kojima nedostaje ceo ili deo sekvence glikozilfosfatidilinozitol (GPI) sidra na C-terminalnom kraju, tako da su nakon ekspresije polipeptidi rastvorljivi pod fiziološkim uslovima. Rastvorljivost može da bude procenjena bilo kojim pogodnim postupkom u kome se pokazuje rastvorljivost pod fiziološkim uslovima. Primer takvih postupaka je Triton® X-114 test, koji procenjuje raspodelu u vodenoj fazi i koji je opisan u prethodnom tekstu i u primerima. Dodatno, polipeptid rastvorljive humane PH20 je, ako se proizvodi u CHO ćelijama, kao što su CHO-S ćelije, polipeptid koji se eksprimira i sekretuje u medijum ćelijske kulture. Polipeptidi rastvorljive humane PH20, međutim, nisu ograničeni na one proizvedene u CHO ćelijama, već mogu da budu proizvedeni u bilo kojim ćelijama ili bilo kojim postupkom, uključujući rekombinantnu ekspresiju i sintezu polipeptida. Ukazivanje na sekreciju iz CHO ćelija je definiciono. Stoga, ako polipeptid može da bude eksprimiran i sekretovan u CHO ćelijama i ako je rastvorljiv, tj. raspodeljuje se u vodenoj fazi pri ekstrakciji sa Triton® X-114, to je rastvorljivi PH20 polipeptid bilo da je proizveden na taj način ili ne. Prekursorski polipeptidi za sHuPH20 polipeptide mogu da uključuju signalnu sekvencu, kao što je heterologa ili neheterologa (tj. nativna) signalna sekvenca. Primeri prekursora su oni koji uključuju signalnu sekvencu, kao što je nativna signalna sekvenca od 35 aminokiselina na aminokiselinskim položajima 1-35 (videti, npr., aminokiseline 1-35 sekvence SEQ ID NO:1).
[0060] Kako se ovde koristi, "produžena rastvorljiva PH20" ili "esPH20" uključuje polipeptide rastvorljive PH20 koji sadrže ostatke sve do signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra i jedan ili više susednih ostataka iz signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra tako da je esPH20 rastvorljiva pod fiziološkim uslovima. Rastvorljivost pod fiziološkim uslovima može da bude određena bilo kojim postupkom poznatim stručnjaku u oblasti. Na primer, može da bude procenjena Triton® X-114 testom koji je opisan u prethodnom tekstu i u primerima. Dodatno, kao što je prethodno diskutovano, rastvorljiva PH20 je, ako se proizvodi u CHO ćelijama, kao što su CHO-S ćelije, polipeptid koji se eksprimira i sekretuje u medijum ćelijske kulture. Polipeptidi rastvorljive humane PH20, međutim, nisu ograničeni na one proizvedene u CHO ćelijama, već mogu da budu proizvedeni u bilo kojim ćelijama ili bilo kojim postupkom, uključujući rekombinantnu ekspresiju i sintezu polipeptida. Ukazivanje na sekreciju iz CHO ćelija je definiciono. Stoga, ako polipeptid može da bude eksprimiran i sekretovan u CHO ćelijama i ako je rastvorljiv, tj. raspodeljuje se u vodenoj fazi pri ekstrakciji sa Triton® X-114, to je rastvorljivi PH20 polipeptid bilo da je proizveden na taj način ili ne. Polipeptidi humane rastvorljive esPH20 uključuju, pored ostataka 36-490, jednu ili više susednih aminokiselina posle položaja aminokiselinskog ostatka 491 iz SEQ ID NO:1, inkluzivno, tako da je rezultujući polipeptid rastvorljiv. Primeri polipeptida rastvorljive humane esPH20 su oni koji imaju aminokiselinske ostatke koji odgovaraju aminokiselinama 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 i 36-497 sekvence SEQ ID NO:1. Primeri navedenog su oni sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od SEQ ID NOS:151-154 i 185-187. Takođe su uključene i alelne varijante i druge varijante, kao što je bilo koja sa 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa odgovarajućim polipeptidima sekvence SEQ ID NOS:151-154 i 185-187 koja zadržava aktivnost u neutralnoj sredini i koja je rastvorljiva. Ukazivanje na identičnost sekvence odnosi se na varijante sa supstitucijama aminokiselina.
[0061] Kako se ovde koristi, ukazivanje na "esPH20" uključuje prekursor polipeptida esPH20 i zrele esPH20 polipeptide (kao što su oni u kojima je signalna sekvenca uklonjena), njihove skraćene oblike koji imaju enzimsku aktivnost (zadržavajući najmanje 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili više od aktivnosti oblika cele dužine) i koji su rastvorljivi, i uključuju alelne varijante i varijante različitih vrsta, varijante kodirane varijantama obrade transkripta, i drugim varijante, uključujući polipeptide koji imaju najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa prekursorskim polipeptidima navedenim u SEQ ID NOS:1 i 3, ili njihove zrele oblike.
[0062] Kako se ovde koristi, ukazivanje na "esPH20" uključuje i one koje sadrže hemijske ili posttranslacione modifikacije i one koje ne sadrže hemijske ili posttranslacione modifikacije. Takve modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na PEG-ilaciju, albuminaciju, glikozilaciju, farnezilaciju, karboksilaciju, hidroksilaciju, fosforilaciju, i druge modifikacije polipeptida poznate u stanju tehnike.
[0063] Kako se ovde koristi, "rastvorljiva rekombinantna humana PH20 (rHuPH20)" se odnosi na kompoziciju koja sadrži rastvorljive oblike humane PH20 kao rekombinantno eksprimirane i sekretovane u ćelijama ovarijuma kineskog hrčka (CHO). Rastvorljiva rHuPH20 je kodirana molekulom nukleinske kiseline koji sadrži signalnu sekvencu i naveden je u SEQ ID NO:49. Nukleinska kiselina koja kodira rastvorljivu rHuPH20 se eksprimira u CHO ćelijama koje sekretuju zreli polipeptid. Pošto se proizvodi u medijumu za kultivaciju, na C-terminusu postoji heterogenost, tako da proizvod sadrži smešu vrsta koja može da obuhvata jednu ili više od SEQ ID NO.4 do SEQ ID NO.9 sa različitom zastupljenošću.
[0064] Slično, kod drugih oblika PH20, kao što su esPH20, rekombinantno eksprimirani polipeptidi i njihove kompozicije mogu da uključuju mnoštvo vrsta čiji C-terminus ispoljava heterogenost. Na primer, kompozicije rekombinantno eksprimirane esPH20 proizvedene ekspresijom polipeptida sekvence SEQ ID NO:151, koja kodira esPH20 koji ima aminokiseline 36-497, mogu da uključuju oblike sa manje aminokiselina, kao što je 36-496 ili 36-495.
[0065] Kako se ovde koristi, "N-vezani fragment" se odnosi na asparaginski (N) aminokiselinski ostatak polipeptida koji je sposoban da bude glikozilovan putem posttranslacine modifikacije polipeptida. Primeri N-vezanih fragmenata humane PH20 uključuju aminokiseline N82, N166, N235, N254, N368 i N393 humane PH20 navedene u SEQ ID NO:1.
[0066] Kako se ovde koristi, "N-glikozilovani polipeptid" se odnosi na PH20 polipeptid ili njegov skraćeni oblik koji sadrži oligosaharidnu vezu od najmanje tri N-vezana aminokiselinska ostataka, na primer, N-vezane fragmente koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima N235, N368 i N393 sekvence SEQ ID NO:1. N-glikozilovani polipeptid može da uključuje polipeptid u kome su tri, četiri, pet, pa i svi N-vezani fragmenti vezani za oligosaharid. N-vezani oligosaharidi mogu da uključuju oligomanozu, kompleksne, hibridne ili sulfatirane oligosaharide, ili druge oligosaharide i monosaharide.
[0067] Kako se ovde koristi, "N-delimično glikozilovani polipeptid" odnosi se na polipeptid koji minimalno sadrži N-acetilglukozamin glikan vezan za najmanje tri N-vezana fragmenta. Delimično glikozilovani polipeptid može da uključuje različite oblike glikana, uključujući monosaharide, oligosaharide, i granate oblike šećera, uključujući one obrazovane obradom polipeptida sa EndoH, EndoF1, EndoF2 i/ili EndoF3.
[0068] Kako se ovde koristi, "deglikozilovani PH20 polipeptid" odnosi se na PH20 polipeptid u kome je glikozilovano manje mesta glikozilacije nego što je to moguće. Deglikozilacija može da se postigne, na primer, uklanjanjem glikozilacije, njenim sprečavanjem, ili modifikovanjem polipeptida tako da se ukloni mesto glikozilacije. Određena N-glikozilaciona mesta nisu neophodna za aktivnost, dok druga jesu.
[0069] Kako se ovde koristi, "polimer" se odnosi na bilo koji prirodni ili sintetski fragment velike molekulske težine koji je napravljen od ponavljajućih jedinica. Polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na fragmente polietilen glikola, dekstran, celulozu i sijalinsku kiselinu. Ovi i drugi primeri polimera su ovde opisani, i mnogi su poznati u stanju tehnike. U svrhu ovog teksta, polimer može da bude konjugovanu sa, tj. stabilno vezan neposredno ili posredno preko linkera, za polipeptid. Takvi konjugati polimera, tipično produžavaju serumski poluživot, i uključuju, ali bez ograničenja sijalinske fragmente, PEG-ilacione fragmente, dekstran, i šećer i druge fragmente, kao što je glikozilacija. Na primer, hijaluronidaze, kao što su rastvorljive PH20 ili rHuPH20, mogu da budu konjugovane sa polimerom.
[0070] Kako se ovde koristi, "PEG-ilovan" se odnosi na kovalentno ili drugo stabilno vezivanje polimernih molekula, kao što je polietilen glikol (PEG-ilacioni fragment PEG) za proteine, uključujući enzime koji razgrađuju hijaluronan, kao što su hijaluronidaze, obično da bi se povećao polu-život enzima koji razgrađuje hijaluronan.
[0071] Kako se ovde koristi, anti-kancersko sredstvo ili hemioterapijsko sredstvo se odnosi na sredstvo koje je sposobno da ubije ćelije koje se brzo dele, kao što su kancerske ćelije. Stručnjak u oblasti je upoznat sa anti-kancerskim sredstvima, uključujući hemioterapijska sredstva. Primeri sredstava su ovde opisani.
[0072] Kako se ovde koristi, nukleozidni analog se odnosi na sredstvo koje zamenjuje ili imitira jedan od gradivnih blokova nukleinskih kiselina, kao što je purinski ili pirimidinski nukleozid, tokom replikacije DNK. Postupak može da zaustavi rast tumora, budući da dodatni nukleozidi ne mogu da se vežu. Primer nukleozidnog analoga je gemcitabin, koji predstavlja analog deoksicitidina i nakon metaboličke aktivacije, obrazuje trifosfat koji imitira ili zamenjuje nukleozid citidin pri ugradnji u DNK i kompetitivno inhibira sintezu DNK.
[0073] Kako se ovde koristi, nukleozid deaminaza se odnosi na enzim koji vrši deaminaciju nukleozida. Na primer, citidin deaminaza (CDA) obavlja deaminaciju citidina i deoksicitidina u uridin odnosno deoksiuridin. Adenozin deaminaza (ADA) obavlja deaminaciju adenozina, pretvarajući ga u srodni nukleozid inozin supstitucijom amino grupe za hidroksilnu grupu.
[0074] Kako se ovde koristi, supstrat nukleozid deaminaze je molekul na kome može da bude obavljena deaminacija u neaktivni metabolit, a time i inaktivacija, u prisustvu nukleozid deaminaze. Testovi za procenu deaminacije su poznati stručnjaku u oblasti, i uključuju, ali nisu ograničeni na tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC) ili masenu spektrometriju za metabolite i metabolite koji su podlegli deaminaciji, testove deaminacije kao što je test deaminaze baziran na UDG koji koristi uracil-DNK glikozilazu u višku (videti npr. Morgan et al. (2004) J. Biol. Chem., 279:52353-52360) ili procenu citotoksičnosti u ćelijama za koje je poznato da eksprimiraju nukleozid deaminazu.
[0075] Kako se ovde koristi, izraz "dovoljno da redukuje nivoe proteina ili aktivnost proteina nukleozid deaminaze" odnosi se na količinu taksana koja je potrebna za inhibiranje aktivnosti nukleozid deaminaze. Na primer, inhibicija može da bude procenjena ispitivanjem deaminacione aktivnosti deaminaze (npr. citidin deaminaze) upotrebom testova za deaminaciju kao što je prethodno opisano. Inhibicija takođe može da bude procenjena ispitivanjem intracelularnih nivoa proteina deaminaze. Testovi za procenu subcelularnih proteina su dobro poznati stručnjaku u oblasti i uključuju na primer, ELISA test na bazi ćelija, protočnu citometriju ili postupke za detekciju proteina kao što je Western blot. Uopšteno, takvi testovi mogu da se izvode na ćelijskim lizatima ili permeabilizovanim ćelijama. Na primer, western blot za citidin deaminazu može da bude izveden rastvaranjem ukupnih ćelijskih lizata, razdvajanjem proteina, i imunoblotingom za deaminazu upotrebom antitela protiv CDA (npr. kat. br. ab82346, Abcam), a nakon toga inkubacijom sa sekundarnim antitelom obeleženim peroksidazom rena, i detekcijom. Uopšteno, količina je dovoljna da redukuje nivoe proteina ili aktivnost proteina nukleozid deaminaze, ako je nivo ili aktivnost proteina redukovana najmanje, ili najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više.
[0076] Kako se ovde koristi, prolek je jedinjenje koje ispoljava farmakološku aktivnost posle biotransformacije. Na primer, nukleozidni analozi kao što je gemcitabin su prolekovi, pri čemu se aktivnost javlja kao rezultat intracelularnog pretvaranja u dva aktivna metabolita, gemcitabin difosfat i gemcitabin trifosfat pomoću deoksicitidin kinaze. Trifosfat (diflurorodeoksicitidin trifosfat) je u kompeticiji sa endogenim deoksinukleozid trifosfatima za ugrađivanje u DNK.
[0077] Kako se ovde koristi, derivat se odnosi na oblik leka koji je podlegao izmeni ili modifikaciji referentnog leka ili sredstva, ali još uvek zadržava aktivnost (npr. ispoljava povećanu ili sniženu aktivnost) u poređenju sa referentnim lekom ili sredstvom. Tipično oblik derivata jedinjenja znači da je bočni lanac jedinjenja modifikovan ili izmenjen.
[0078] Kako se ovde koristi, analog leka ili sredstva je lek ili sredstvo koje je srodno referentnom leku, ali čija hemijske i biološke aktivnosti mogu da budu drugačije. Tipično, analozi ispoljavaju slične aktivnosti sa referentnim lekom ili sredstvom, ali aktivnost može da bude povećana ili smanjena, ili drugačije poboljšana. Tipično, analogni oblik jedinjenja ili leka označava da je osnovno jezgro njegove strukture modifikovano ili izmenjeno u poređenju sa referentnim lekom.
[0079] Kako se ovde koristi, "aktivnost" se odnosi na funkcionalnu aktivnost ili aktivnosti polipeptida ili njegovog dela povezane sa (kompletnim) proteinom cele dužine. Na primer, aktivni fragmenti polipeptida mogu da ispoljavaju aktivnost proteina cele dužine. Funkcionalne aktivnosti obuhvataju, ali nisu ograničene na biološku aktivnost, katalitičku ili enzimsku aktivnost, antigenost (sposobnost da se vezuje ili stupa u kompeticiju sa polipeptidom za vezivanje za anti-polipeptidno antitelo), imunogenost, sposobnost da se obrazuju multimeri i sposobnost za specifično vezivanje za receptor ili ligand polipeptida.
[0080] Kako se ovde koristi, "hijaluronidazna aktivnost" se odnosi na svojstvo enzimskog katalizovanja isecanja hijaluronske kiseline. Prema farmakopeji SAD (USP) XXII test za hijaluronidazu određuje hijaluronidaznu aktivnost indirektno, merenjem količine supstrata hijaluronske kiseline ili hijaluronana (HA) veće molekulske težine, koji ostane pošto se dopusti da enzim reaguje sa HA tokom 30 min na 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). U testu za određivanje relativne aktivnosti se može upotrebiti referentni standardni rastvor, u jedinicama bilo koje hijaluronidaze. In vitro testovi za određivanje hijaluronidazne aktivnosti hijaluronidaza, kao što je PH20, uključujući rastvorljive PH20 i esPH20, su poznati iz odgovarajuće oblasti i ovde su opisani. Primeri testova obuhvataju test mikroturbiditeta kojim se indirektno meri isecanje hijaluronske kiseline hijaluronidazom detekcijom nerastvorljivog taloga, koji se formira kada se neisečena hijaluronska kiselina veže za serumski albumin i test biotinilisane hijaluronske kiseline koji meri isecanje hijaluronske kiseline indirektno detekcijom preostale biotinilisane hijaluronske kiseline nekovalentno vezane za bunarčiće mikrotitar ploče sa konjugatom streptavidin-peroksidaza rena i hromogenim supstratom. Mogu se upotrebiti referentni standardi, na primer, za generisanje standardne krive za određivanje aktivnosti u jedinicama hijaluronidaze koja se testira.
[0081] Kako se ovde koristi, specifična aktivnost se odnosi na jedinice aktivnosti po mg proteina. Miligrami hijaluronidaze su definisani apsorpcijom rastvora na 280 nm pod pretpostavkom da je molarni ekstinkcioni koeficijent približno 1.7, u jedinicama M<-1>cm<-1>.
[0082] Kako se ovde koristi, izraz "aktivno u neutralnoj sredini" se odnosi na svojstvo polipeptida PH20 da enzimski katalizuje sečenje hijaluronske kiseline na neutralnom pH (npr. na ili oko pH 7.0).
[0083] Kako se ovde koristi, "signalna sekvenca za vezivanje GPI-sidra" je C-terminalna aminokiselinska sekvenca koja usmerava dodavanje unapred formiranog GPI-sidra na polipeptid u lumenu ER. Signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra su prisutne u prekursorskim polipeptidima GPI-usidrenih polipeptida, kao što su GPI-usidreni PH20 polipeptidi. C-terminalna signalna sekvenca za vezivanje GPI-sidra obično sadrži prvenstveno hidrofobni region od 8-20 aminokiselina, kome prethodi region hidrofilne spojnice od 8-12 aminokiselina, odmah nishodno od ω-mesta, ili mesta vezivanja GPI-sidra. Signalna sekvenca za vezivanje GPI-sidra može da bude identifikovana korišćenjem postupaka dobro poznatih u stanju tehnike. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, in silico postupke i algoritme (videti, npr. Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392), uključujući one koji su lako dostupni na bioinformatičkim veb sajtovima, kao što je ExPASy Proteomics tools sajt (npr., the World Wide Web site expasy.ch/tools/).
[0084] Kako se ovde koristi, "nukleinske kiseline" obuhvataju DNK, RNK i njihove analoge, uključujući i peptidne nukleinske kiseline (PNK) i njihove smeše. Nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane. Kada se ukazuje na probe ili prajmere, koji su opciono obeleženi, na primer detektabilnim markerom, kao što je fluorescentni ili radioaktivni, u obzir dolaze jednolančani molekuli. Takvi molekuli obično imaju takvu dužinu da je njihov cilj statistički jedinstven ili je u malom broju kopija (obično manje od 5, generalno manje od 3) za biblioteku za probe ili prajmiranje. Generalno proba ili prajmer sadrži najmanje 14, 16 ili 30 susednih nukleotidnih sekvenci komplementarnih sa ili identičnih genu od interesa. Probe i prajmeri mogu biti dugi 10, 20, 30, 50, 100 ili više nukleinskih kiselina.
[0085] Kako se ovde koristi, peptid se odnosi na polipeptid čija dužina je veća od, ili jednaka 2 aminokiseline i čija dužina je manja od, ili jednaka 40 aminokiselina.
[0086] Kako se ovde koristi, aminokiseline koje se pojavljuju u različitim aminokiselinskim sekvencama koje su ovde realizovane, identifikuju se njihovim poznatim, troslovnim ili jednoslovnim skraćenicama (tabela 1). Nukleotidi koji se pojavljuju u različitim fragmentima nukleinskih kiselina se označavaju standardnim jednoslovnim oznakama koje se rutinski primenjuju u odgovarajućoj oblasti.
[0087] Kako se ovde koristi, "aminokiselina" je organsko jedinjenje koje sadrži amino grupu i karboksilno-kiselinsku grupu. Polipeptid sadrži dve ili više aminokiselina. Za ove svrhe, aminokiseline obuhvataju dvadeset prirodnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline i analoge aminokiselina (tj. aminokiseline kod kojih α-ugljenik ima bočni lanac).
[0088] Kako se ovde koristi, "aminokiselinski ostatak" se odnosi na aminokiselinu koja je formirana posle hemijske digestije (hidrolize) polipeptida na njenim peptidnim vezama. Za aminokiselinske ostatke koji su ovde opisani se pretpostavlja da su u "L" izomernom obliku. Ostaci u "D" izomernom obliku, koji su tako označeni, mogu biti supstituisani za bilo koji L-aminokiselinski ostatak sve dok je željeno funkcionalno svojstvo polipeptida očuvano. NH2se odnosi na slobodnu amino grupu koja je prisutna na amino terminusu polipeptida. COOH se odnosi na slobodnu karboksi grupu koja je prisutna na karboksilnom terminusu polipeptida. U skladu sa standardnom nomenklaturom polipeptida opisanom u J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), i usvojenom 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, skraćenice za aminokiselinske ostatke su prikazane u tabeli 1:
Tabela 1 - Tabela korelacije
[0089] Sve sekvence aminokiselinskih ostataka koje su ovde predstavljene formulama imaju orijentaciju sleva na desno u uobičajenom smeru od amino-terminusa ka karboksil-terminusu. Pored toga, izraz "aminokiselinski ostatak" je definisan tako da obuhvata aminokiseline navedene u tabeli korespodencije (tabela 1), i modifikovane i neuobičajene aminokiseline, kao što su one koji su navedene u 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822. Pored toga, trebalo bi naglasiti da crtica na početku ili kraju sekvence aminokiselinskog ostatka ukazuje na peptidnu vezu sa sledećom sekvencom od jednog ili više aminokiselinskih ostataka, sa amino-terminalnom grupom, kao što je NH2ili sa karboksilnom terminalnom grupom, kao što je COOH.
[0090] Kako se ovde koristi, "prirodne α-aminokiseline" su ostaci onih 20 α-aminokiselina koje se nalaze u prirodi koje su ugrađene u protein specifičnim prepoznavanjem molekula opterećene tRNK sa svojim srodnim iRNK kodonom kod ljudi. Aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi tako uključuju, na primer, aminokiseline ili analoge aminokiselina drugačije od 20 aminokiselina koje se javljaju u prirodi i uključuju, ali nisu ograničene na D-stereoizomere aminokiselina. Primeri neprirodnih aminokiselina su ovde opisani i poznati stručnjacima u odgovarajućoj oblasti.
[0091] Kako se ovde koristi, DNK konstrukt je jedno- ili dvolančani, linearni ili cirkularni DNK molekul koji sadrži segmente DNK koji su sjedinjeni i međusobno postavljeni na način koji se ne može naći u prirodi. DNK konstrukti postoje kao rezultat humane manipulacije, i obuhvataju klonove i druge kopije manipulisanih molekula.
[0092] Kako se ovde koristi, DNK segment je deo većeg DNK molekula koji ima specifikovana svojstva. Na primer, DNK segment koji kodira specifikovani polipeptid je deo dužeg DNK molekula, kao što je plazmid ili fragment plazmida, koji kada se očitava u smeru od 5’ do 3’, kodira aminokiselinsku sekvencu specifikovanog polipeptida.
[0093] Kako se ovde koristi, izraz polinukleotid znači jedno- ili dvolančani polimer od dezoksiribonukleotidnih ili ribonukleotidnih baza koji se očitava od 5’ prema 3’ kraju. Polinukleotidi obuhvataju RNK i DNK, i mogu biti izolovani iz prirodnih izvora, sintetizovani in vitro, ili pripremljeni od kombinacije prirodnih i sintetičkih molekula. Dužina polinukleotidnog molekula je ovde data u smislu nukleotida (skraćeno "nt") ili parova baza (skraćeno "bp"). Izraz nukleotidi se upotrebljava za jedno- i dvolančane molekule tamo gde to kontekst dozvoljava. Kada se ovaj izraz primeni na dvolančane molekule, onda se on upotrebljava da označi njihovu celu dužinu i podrazumeva se da je ekvivalentan izrazu parovi baza. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se dva lanca dvolančanog polinukleotida mogu neznatno razlikovati po dužini i da njihovi krajevi mogu biti naizmenično raspoređeni; shodno tome, svi nukleotidi u okviru dvolančanog polinukleotidnog molekula ne moraju biti upareni. Neupareni krajevi generalno neće po dužini prelaziti 20 nukleotida.
[0094] Kako se ovde koristi, "sličnost" između dva proteina ili nukleinske kiseline se odnosi na srodnost između aminokiselinske sekvence proteina ili nukleotidne sekvence nukleinskih kiselina. Sličnost može biti bazirana na stepenu identičnosti i/ili homologije sekvenci ostataka i ostataka koji su u njima sadržani. Metodi za ocenjivanje stepena sličnosti između proteina ili nukleinskih kiselina su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Na primer, prema jednom metodu ocenjivanja sličnosti sekvenci, dve aminokiselinske ili nukleotidne sekvence se poravnaju na način koji daje maksimalni nivo identičnosti između sekvenci. "Identičnost" se odnosi na meru u kojoj su aminokiselinske ili nukleotidne sekvence invarijantne. Poravnanje aminokiselinskih sekvenci, i do izvesne mere nukleotidnih sekvenci, takođe može uzeti u obzir konzervativne razlike i/ili česte supstitucije u aminokiselinama (ili nukleotidima). Konzervativne razlike su one za koje su sačuvana fiziko-hemijska svojstva uključenih ostataka. Poravnanje može biti globalno (poravnanje upoređivanih sekvenci po celoj dužini sekvenci i uključuje sve ostatke) ili lokalno (poravnanje dela sekvenci koje uključuje samo najsličniji region ili regione).
[0095] "Identičnost" kao takva ima značenje prihvaćeno u odgovarajućoj oblasti i može se izračunati korišćenjem objavljenih tehnika. (vidi, npr.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., i Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Pošto postoji više metoda za merenje identičnosti između dva polinukleotida ili polipeptida, izraz "identičnost" je dobro poznat prosečnim stručnjacima (Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
[0096] Kako se ovde koristi, homologi (u vezi sa nukleinskom kiselinom i/ili aminokiselinskim sekvencama) znači oko više od, ili jednako 25% homologije sekvence, obično više od, ili jednako 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95% homologije sekvence; može se specifikovati tačan procenat ako je potrebno. Za ovdašnje svrhe se izrazi "homologija" i "identičnost" često koriste jedan umesto drugog, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Generalno, za određivanje procenta homologije ili identičnosti, sekvence se poravnavaju tako da se dobije podudaranje najvišeg reda (vidi, npr.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., i Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Homologijom sekvenci se određuje broj konzerviranih aminokiselina programima sa standardnim algoritmima za poravnanje, i mogu se primeniti unapred određeni kazneni poeni za praznine koje odredi svaki dobavljač. U suštini homologi molekuli nukleinske kiseline će obično hibridizovati pod uslovima umerene strogosti ili pod uslovima visoke strogosti celom dužinom nukleinske kiseline koja je od interesa. Takođe se razmatraju molekuli nukleinske kiseline koji sadrže degenerisane kodone umesto kodona u hibridizujućem molekulu nukleinske kiseline.
[0097] Da li bilo koja dva molekula imaju nukleotidne sekvence ili aminokiselinske sekvence koje su najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% "identične" ili "homologe" može se odrediti korišćenjem poznatih kompjuterskih algoritama, kao što je "FASTA" program, uz korišćenje, na primer, unapred određenih parametara kao u Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (drugi programi obuhvataju GCG programski paket (Devereux, J., et al., Nucleid Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S.F., et al., J Mol Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, i Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Na primer, da bi se odredila identičnost može se upotrebiti BLAST funkcija u bazi podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Drugi komercijalni ili javno dostupni programi obuhvataju, DNAStar "MegAlign" program (Madison, WI) i the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" program (Madison WI). Procenat homologije ili identičnosti molekula proteina i/ili nukleinskih kiselina može se odrediti, na primer, upoređivanjem informacija o sekvenci korišćenjem GAP kompjuterskog programa (npr. Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, revidirali Smith i Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Ukratko, GAP program definiše sličnost kao broj poravnatih simbola (tj. nukleotida ili aminokiselina) koji su slični, podeljen ukupnim brojem simbola u kraćoj od dve sekvence. Unapred određeni parametri za GAP program mogu obuhvatati: (1) jediničnu matricu poređenja (koja sadrži vrednost 1 za identičnosti i 0 za neidentičnosti) i težinsku matricu poređenja autora Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res.
14:6745, koje su opisali Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, str. 353-358 (1979); (2) kaznu od 3,0 za svaku prazninu i dodatnu kaznu od 0,10 za svaki simbol u svakoj praznini; i (3) bez kazne za krajnje praznine.
[0098] Zbog toga, kada se ovde koristi, izraz "identičnost" ili "homologija" predstavlja poređenje između ispitivanog i referentnog polipeptida ili polinukleotida. Kada se ovde koristi, onda se izraz najmanje "90% identičan sa" odnosi na procenat identičnosti od 90 do 99,99 u odnosu na referentnu nukleinsku kiselinu ili aminokiselinsku sekvencu polipeptida. Identičnost na nivou od 90% ili više je indikacija činjenice da se, primera radi, porede ispitivani i referentni polipeptid dužine od 100 aminokiselina. Ne više od 10% (tj.10 od 100) aminokiselina u ispitivanom polipeptidu se razlikuje od onih u referentnom polipeptidu. Slična poređenja se mogu napraviti između ispitivanih i referentnih polinukleotida. Takve razlike mogu predstavljati tačkaste mutacije koje su slučajno raspoređene po celoj dužini polipeptida ili mogu biti grupisane na jednoj ili više lokacija različite dužine do maksimalne dozvoljene, npr. razlike 10/100 između aminokiselina (identičnost od približno 90%). Razlike su definisane kao supstitucije, insercije ili delecije nukleinskih kiselina ili aminokiselina. Na nivou homologije ili identičnosti iznad oko 85-90%, rezultat bi trebalo da bude nezavisan od programa i datih parametara za praznine; takvi visoki nivoi identičnosti se mogu lako oceniti, često ručnim poravnanjem, bez oslanjanja na softver.
[0099] Kako se ovde koristi, poravnata sekvenca se odnosi na primenu homologije (sličnosti i/ili identičnosti) za poravnanje odgovarajućih pozicija u sekvenci nukleotida ili aminokiselina. Obično su poravnate dve ili više sekvenci koje su srodne za 50% ili više identičnosti. Poravnati skup sekvenci se odnosi na 2 ili više sekvenci koje su poravnate na odgovarajućim pozicijama i mogu obuhvatati poravnavanje sekvenci izvedenih od RNK, kao što su EST i druge cDNK, poravnatih sa genomskom DNK sekvencom.
[0100] Kako se ovde koristi, "prajmer" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji može da deluje kao tačka inicijacije sinteze DNK usmerene šablonom pod odgovarajućim uslovima (npr. u prisustvu četiri različita nukleozidna trifosfata i sredstva za polimerizaciju, kao što je DNK polimeraza, RNK polimeraza ili reverzna transkriptaza) u odgovarajućem puferu i na podesnoj temperaturi. Smatra se da izvesni molekuli nukleinske kiseline mogu služiti i kao "proba", i kao "prajmer." Međutim, prajmer ima 3’ hidroksilnu grupu za ekstenziju. Prajmer se može koristiti u mnoštvu metoda uključujući, na primer, lančanu reakciju polimeraze (PCR), reverzne-transkriptaze (RT)-PCR, RNK PCR, LCR, multipleksnu PCR, tzv. „panhandle“ PCR, hvatajuću PCR, ekspresionu PCR, 3’ i 5’ RACE, in situ PCR, ligacijom posredovanu PCR i druge protokole amplifikacije.
[0101] Kako se ovde koristi, "par prajmera" se odnosi na set prajmera koji sadrži 5’ (uzvodni) prajmer koji se hibridizuje sa 5’ krajem sekvence koja treba da se amplifikuje (npr. pomoću PCR) i 3’ (nizvodni) prajmer koji hibridizuje sa komplementom 3’ kraja sekvence koja treba da se amplifikuje.
[0102] Kako se ovde koristi, "specifično hibridizije" se odnosi na hibridizaciju, komplementarnim sparivanjem baza, molekula nukleinske kiseline (npr. oligonukleotida) sa ciljnim molekulom nukleinske kiseline. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti su upoznati sa in vitro i in vivo parametrima koji utiču na specifičnu hibridizaciju, kao što su dužina i kompozicija specifičnog molekula. Parametri koji su posebno relevantni za in vitro hibridizaciju dalje obuhvataju temperature hibridizacije i ispiranja, kompoziciju pufera i koncentraciju soli. Primeri uslova za ispiranje radi odstranjivanja nespecifično vezanih molekula nukleinske kiseline pod visoko strogim uslovima su 0,1 x SSPE, 0,1% SDS, 65°C, a uslova srednje strogosti su 0,2 x SSPE, 0,1 % SDS, 50°C. Ekvivalentni visoko strogi uslovi su poznati iz odgovarajuće oblasti. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može lako da podesi ove parametre da bi ostvario specifičnu hibridizaciju molekula nukleinske kiseline sa ciljnim molekulom nukleinske kiseline koji je podesan za specifičnu primenu. Komplementarnost, kada se radi o dve nukleotidne sekvence, znači da su te dve sekvence nukleotida sposobne za hibridizaciju, obično sa manje od 25%, 15% ili 5% pogrešnog sparivanja između naspramnih nukleotida. Ako je potrebno, biće specifikovan procenat komplementarnosti. Obično se biraju dva molekula tako da hibridizuju pod visoko strogim uslovima.
[0103] Kako se ovde koristi, u suštini identičan za proizvod znači da je dovoljno sličan, tako da je svojstvo od interesa dovoljno nepromenjeno, što znači da se u suštini identičan proizvod može upotrebiti umesto samog proizvoda.
[0104] Kako se ovde koristi, takođe se podrazumeva da izrazi "u suštini identični" ili "slični" variraju u skladu sa kontekstom, što stručnjaci iz odgovarajuće oblasti podrazumevaju.
[0105] Kako se ovde koristi, alelska varijanta ili alelska varijacija se odnosi na bilo koja dva ili više alternativnih oblika gena koji zauzimaju isti hromozomski lokus. Alelska varijacija se prirodno pojavljuje usled mutacije i može rezultovati fenotipskim polimorfizmom u okviru populacije. Mutacije gena mogu biti tihe (bez promene kodiranog polipeptida) ili mogu kodirati polipeptide koji imaju izmenjenu aminokiselinsku sekvencu. Izraz "alelska varijanta" se ovde takođe upotrebljava za označavanje proteina kodiranog alelskom varijantom gena. Obično referentni oblik gena kodira divlji tip i/ili predominantni oblik polipeptida iz populacije ili samo jedan referentni član te vrste. Obično alelske varijante, koje obuhvataju varijante između vrsta, imaju najmanje 80%, 90% ili veću aminokiselinsku identičnost sa divljim tipom i/ili predominantnim oblikom kod iste vrste; stepen identičnosti zavisi od gena i od toga da li je to poređenje između vrsta ili unutar vrste. Generalno, alelske varijante unutar vrste imaju najmanje oko 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti ili više sa divljim tipom i/ili predominantnim oblikom, uključujući 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sa divljim tipom i/ili predominantnim oblikom polipeptida. Ovde se ukazivanje na alelsku varijantu generalno odnosi na varijacije u proteinima između članova iste vrste.
[0106] Kako se ovde koristi, "alel", koji se ovde upotrebljava naizmenično sa "alelskom varijantom", se odnosi na alternativne oblike gena ili njegovih delova. Aleli zauzimaju isti lokus ili poziciju na homologim hromozomima. Kada subjekt ima dva identična alela gena, onda se kaže da je subjekt homozigotan za taj gen ili alel. Kada subjekt ima dva različita alela gena, onda se kaže da je subjekt heterozigotan za taj gen. Aleli specifičnog gena se mogu međusobno razlikovati po samo jednom ili po nekoliko nukleotida, i mogu sadržati modifikacije kao što su supstitucije, delecije i insercije nukleotida. Alel gena takođe može biti oblik gena koji sadrži mutaciju.
[0107] Kako se ovde koristi, varijante vrsta se odnose na varijante u polipeptidima između različitih vrsta, uključujući različite sisarske vrste, kao što su miš i čovek. Kao primer za PH20, primer varijante vrsta ovde obezbeđen je PH20 primata, kao što je, ali bez ograničenja, PH20 čoveka, šimpanze, makaka i cinomolgus majmuna. Uopšteno, varijante vrsta imaju 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili više identičnosti sekvence. Odgovarajući ostaci između i unutar varijanti vrsta mogu da budu određeni poređenjem i poravnanjem sekvenci da bi se maksimalno povećao broj podudarnih nukleotida ili ostataka, na primer, tako da identičnost između sekvenci bude jednaka ili veća od 95%, jednaka ili veća od 96%, jednaka ili veća od 97%, jednaka ili veća od 98%, ili jednaka ili veća od 99%. Položaju od interesa se zatim daje broj dodeljen u referentnom molekulu nukleinske kiseline. Poravnanje može da bude postignuto ručno ili vizuelno, naročito, tamo gde je identičnost sekvenci veća od 80%.
[0108] Kako se ovde koristi, humani protein je onaj koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline, kao što je DNK, prisutnim u genomu čoveka, uključujući sve alelske varijante i njihove konzervativne varijacije. Varijanta ili modifikacija proteina je humani protein ako je modifikacija zasnovana na sekvenci humanog proteina koja je divljeg tipa ili dobro poznata.
[0109] Kako se ovde koristi, varijanta nastalim različitom obradom transkripta se odnosi varijantu koja je proizvedena različitom obradom primarnog transkripta genomske DNK koja rezultuje sa više od jednog tipa iRNK.
[0110] Kako se ovde koristi, modifikacija se odnosi na modifikaciju aminokiselinske sekvence polipeptida ili sekvence nukleotida u molekulu nukleinske kiseline i uključuje delecije, insercije, i zamene (npr. supstitucije) aminokiselina odnosno nukleotida. Primeri modifikacija su aminokiselinske supstitucije. Polipeptid sa supstituisanom aminokiselinom može da ispoljava 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili više identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ne sadrži aminokiselinske supstitucije. Aminokiselinske supstitucije mogu da budu konzervativne ili nekonzervativne. Uopšteno, bilo kakva modifikacija polipeptida zadržava aktivnost polipeptida. Postupci modifikacije polipeptida predstavljaju rutinu za stručnjake u odgovarajućoj oblasti, na primer upotrebom metodologije rekombinantne DNK.
[0111] Kako se ovde koristi, pogodne konzervativne supstitucije aminokiselina su poznate stručnjacima u odgovarajućoj oblasti i mogu da budu uvedene uglavnom bez menjanja biološke aktivnosti rezultujućeg molekula. Stručnjaci u odgovarajućoj oblasti prepoznaju da, uopšteno, pojedinačne aminokiselinske supstitucije u neesencijalnim oblastima polipeptida ne menjaju suštinski biološku aktivnost (videti, npr., Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224). Takve supstitucije mogu da budu uvedene u skladu sa onim koje su navedene u tabeli 2 kao što sledi:
Tabela 2
Druge supstitucije su takođe dozvoljene i mogu da budu određene empirijski ili u skladu sa poznatim konzervativnim supstitucijama.
[0112] Kako se ovde koristi, izraz promotor označava deo gena koji sadrži DNK sekvence koje obezbeđuju vezivanje RNK polimeraze i započinjanja transkripcije. Promotorske sekvence se uobičajeno, ali ne uvek, nalaze u 5’ nekodirajućoj oblasti gena.
[0113] Kako se ovde koristi, izolovani ili prečišćeni polipeptid ili protein ili njegov biološki aktivni deo u suštini je slobodan, odnosno ne sadrži ćelijski materijal ili druge kontaminirajuće proteine iz ćelije ili tkiva iz koga je protein dobijen, ili je slobodan, odnosno u suštini ne sadrži hemijske prekursore ili druge hemikalije kada se hemijski sintetiše. Smatra se da su preparati u suštini slobodni ako ne sadrže nečistoće koje su lako detektabilne standardnim analitičkim metodama, kao što su tankoslojna hromatografija (TLC), gel elektroforeza i tečna hromatografija visokih performansi (HPLC), koje primenjuju stručnjaci iz odgovarajuće oblasti da bi odredili takvu čistoću, ili su dovoljno čisti tako da dalje prečišćavanje ne bi detektabilno izmenilo fizička i hemijska svojstva supstance, kao što su enzimska i biološka aktivnost. Metode za prečišćavanje jedinjenja za proizvodnju u suštini čistih hemijskih jedinjenja su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Međutim, u suštini čisto hemijsko jedinjenje, može biti smeša stereoizomera. U takvim slučajevima, dalje prečišćavanje bi moglo povećati specifičnu aktivnost jedinjenja.
[0114] Prema tome, pozivanje na suštinski prečišćeni polipeptid, kao što je suštinski prečišćena rastvorljiva PH20, odnosi se na preparate proteina koji su suštinski bez ćelijskog materijala koji uključuju preparate proteina u kojima je protein odvojen od ćelijskih komponenata ćelija iz kojih je izolovan ili rekombinantno proizveden. U jednom primeru izvođenja, izraz u suštini slobodan od ćelijskog materijala obuhvata preparate enzimskih proteina koji imaju manje od oko 30% (suve težine) neenzimskih proteina (koji se ovde takođe naziva kontaminirajući protein), generalno manje od oko 20% neenzimskih proteina ili 10% neenzimskih proteina ili manje od oko 5% neenzimskih proteina. Kada se enzimski protein proizvede rekombinantno, on je u suštini takođe slobodan od medijuma za kultivaciju, tj. medijum za kultivaciju predstavlja manje od oko ili 20%, 10% ili 5% zapremine preparata enzimskog proteina.
[0115] Kako se ovde koristi, izraz u suštini slobodan od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija obuhvata preparate enzimskih proteina u kojima je protein izolovan od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. Izraz obuhvata preparate enzimskih proteina koji imaju manje od oko 30% (suve težine), 20%, 10%, 5% ili manje hemijskih prekursora ili neenzimskih hemikalija ili komponenata.
[0116] Kako se ovde koristi, sintetički, na primer, u vezi sintetičkog molekula nukleinske kiseline ili sintetičkog gena ili sintetičkog peptida, se odnosi na molekul nukleinske kiseline ili molekul polipeptida koji je proizveden rekombinantnim metodama i/ili metodama hemijske sinteze.
[0117] Kako se ovde koristi, rekombinantna proizvodnja ili proizvodnja primenom rekombinantnih DNK metoda, označava primenu dobro poznatih metoda molekularne biologije za ekspresiju proteina koji su kodirani kloniranom DNK.
[0118] Kako se ovde koristi, vektor (ili plazmid) se odnosi na pojedinačne elemente koji se primenjuju za uvođenje heterologe nukleinske kiseline u ćelije, bilo radi njihove ekspresije ili replikacije. Vektori obično ostaju epizomalni, ali mogu biti pripremljeni tako da izazovu integraciju gena ili njegovog dela u hromozom genoma. Takođe su razmotreni vektori koji su veštački hromozomi, kao što su veštački hromozomi kvasca i sisarski veštački hromozomi. Selekcija i primena takvih vehikuluma je dobro poznata stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.
[0119] Kako se ovde koristi, ekspresioni vektor obuhvata vektore koji mogu da eksprimiraju DNK koja je operativno vezana za regulatorne sekvence, kao što su promotorski regioni, koji mogu da izvrše ekspresiju takvih DNK fragmenata. Takvi dodatni segmenti mogu da obuhvate promotorske i terminatorske sekvence, i opciono mogu da obuhvataju jedno ili više mesta početka replikacije, jedan ili više selektabilnih markera, pojačavač, poliadenilacioni signal. Ekspresioni vektori generalno potiču od plazmidne ili virusne DNK, ili mogu sadržati elemente obe. Shodno tome, ekspresioni vektor se odnosi na rekombinantni DNK ili RNK konstrukt, kao što je plazmid, fag, rekombinantni virus ili drugi vektor koji, posle uvođenja u odgovarajuću ćeliju domaćina, rezultuje ekspresijom klonirane DNK. Odgovarajući ekspresioni vektori su dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju one koji se mogu replikovati u eukariotskim ćelijama i/ili prokariotskim ćelijama i one koji ostaju epizomalni ili one koji se mogu integrisati u genom ćelije domaćina.
[0120] Kako se ovde koristi, vektor takođe obuhvata "virusne vektore" ili "viralne vektore". Viralni vektori su virusi dobijeni genetičkim inženjeringom koji su operativno povezani sa egzogenim genima radi transfera (kao nosači ili transporteri) egzogenih gena u ćelije.
[0121] Kako se ovde koristi, "operabilno" ili "operativno povezan", kada se odnosi na DNK segmente znači da su segmenti raspoređeni tako da funkcionišu u skladu sa njihovim željenim svrhama, npr. tako da transkripcija počinje nizvodno od promotora i uzvodno od bilo kojih transkribovanih sekvenci. Promotor je obično domen za koji se vezuje transkripciona mašinerija da bi počela sa transkripcijom i nastavila duž kodirajućeg segmenta do terminatora.
[0122] Kako se ovde koristi izraz "procenjivanje" treba da obuhvati kvantitativno i kvalitativno određivanje u smislu dobijanja apsolutne vrednosti za aktivnost proteina, kao što je enzim, ili njegovog domena, prisutnog u uzorku, a takođe i dobijanje indeksa, odnosa, procenta, vizuelne ili druge vrednosti koja je indikativna za nivo aktivnosti. Procenjivanje može biti direktno ili indirektno. Na primer, naravno da same hemijske vrste koje su zapravo detektovane ne moraju biti proizvod enzimskog isecanja, već mogu biti, na primer, njihov derivat ili neke druge supstance. Na primer, detekcija proizvoda isecanja može da bude pomoću detektabilnog fragmenta kao što je fluorescentni fragment.
[0123] Kako se ovde koristi, biološka aktivnost se odnosi na in vivo aktivnosti jedinjenja ili fiziološke reakcije koje nastaju posle in vivo primene jedinjenja, kompozicije ili druge smeše. Shodno tome, biološka aktivnost obuhvata terapijska dejstva i farmaceutsku aktivnost takvih jedinjenja, kompozicija i smeša. Biološke aktivnosti se mogu posmatrati u in vitro sistemima, pripremljenim za testiranje ili primenu takvih aktivnosti. Shodno tome, u svrhu ovog teksta biološku aktivnost enzima hijaluronidaze predstavlja degradacija hijaluronske kiseline ovim enzimom.
[0124] Kako se ovde koristi ekvivalent, kada se odnosi na dve sekvence nukleinskih kiselina, znači da te dve sekvence o kojima se radi kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu ili ekvivalentne proteine. Kada se ekvivalent koristi za ukazivanje na dva proteina ili peptida, to znači da dva proteina ili peptida imaju u suštini isti aminokiselinsku sekvencu samo sa aminokiselinskim supstitucijama koje u suštini ne menjaju aktivnost ili funkciju proteina ili peptida. Kada se ekvivalent odnosi na svojstvo, onda to svojstvo ne mora da bude prisutno u istoj meri (npr. dva peptida mogu ispoljavati različite brzine istog tipa enzimske aktivnosti), ali su aktivnosti obično u suštini iste.
[0125] Kako se ovde koristi, "moduliše" i "modulacija" ili "menja" se odnosi na promenu aktivnosti molekula, kao što je protein. Primeri aktivnosti obuhvataju, ali nisu ograničeni na biološke aktivnosti, kao što je transdukcija signala. Modulacija može obuhvatati povećanje aktivnosti (tj. regulaciju naviše ili agonistička aktivnost), smanjenje aktivnosti (tj. regulaciju naniže ili inhibicija) ili bilo koju drugu promenu aktivnosti (kao što su promena periodičnosti, učestalosti, trajanja, kinetike ili drugog parametra). Modulacija može biti zavisna od konteksta i obično se modulacija poredi sa naznačenim stanjem, na primer, proteinom divljeg tipa, proteinom u konstitutivnom stanju ili proteinom eksprimiranim u navedenom tipu ćelija ili stanja.
[0126] Kako se ovde koristi, direktna primena se odnosi na kompoziciju koja se primenjuje bez razblaživanja.
[0127] Kako se ovde koristi, jednodozna formulacija se odnosi na formulaciju koja se koristi samo jednom. Tipično, jednodozna formulacija je za direktnu primenu.
[0128] Kako se ovde koristi, višedozna formulacija odnosi se na formulaciju za upotrebu u ponovljenim primenama.
[0129] Kako se ovde koristi, kompozicija se odnosi na bilo koju smešu. To može biti rastvor, suspenzija, tečnost, prah, pasta, vodena smeša, nevodena smeša, ili bilo koja njihova kombinacija.
[0130] Kako se ovde koristi, kombinacija se odnosi na bilo kakvu vezu između dve ili više stvari. Kombinaciju mogu predstavljati dve ili više posebnih stvari, kao što su dve kompozicije ili dve kolekcije, njihova smeša, kao što je jedna smeša dve ili više stvari, ili bilo koja njihova varijacija. Elementi kombinacije su generalno funkcionalno povezani ili srodni.
[0131] Kako se ovde koristi, "bolest ili poremećaj" se odnosi na patološko stanje u organizmu koje rezultuje iz nekog uzroka stanja uključujući, ali se ne ograničavajući na infekcije, stečena stanja, genetska stanja i karakteriše se simptomima koji se mogu identifikovati. Bolesti i poremećaji koji su ovde od interesa su bolesti i poremećaji udruženi sa hijaluronanom.
[0132] Kako se ovde koristi, "intravenska primena" se odnosi na dostavu terapeutika neposredno u venu.
[0133] Kako se ovde koristi, "kancer udružen sa hijaluronanom" ili "hijaluronanom bogati kanceri" uključuju kancere u kojima su nivoi hijaluronana povišeni kao uzrok, posledica, ili drugačije zapaženi kod bolesti ili stanja. Kanceri ili tumori povezani sa hijaluronanom su povezani sa povišenim nivoima hijaluronana u tkivu ili ćeliji, povećanim pritiskom intersticijalnog fluida, smanjenim vaskularnim volumenom, i/ili povećanim sadržajem vode u tkivu. Takvi kanceri uključuju, na primer, tumore, uključujući solidne tumore kao što su kanceri u kasnom stadijumu, metastatski kanceri, nediferencirani kanceri, kancer jajnika, in situ karcinom (ISC), karcinom skvamoznih ćelija (SCC), kancer prostate, kancer pankreasa, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer dojke, kancer kolona i drugi kanceri.
[0134] Kako se ovde koristi, izraz povišeni nivoi hijaluronana se odnosi na količine hijaluronana u određenom tkivu, telesnoj tečnosti ili ćeliji, u zavisnosti od bolesti ili stanja, kao posledica ili drugačije zapažen kod bolesti. Na primer, kao posledica prisustva hijaluronanom bogatog tumora, nivoi hijaluronana (HA) mogu da budu povišeni u telesnim tečnostima, kao što je krv, urin, pljuvačka i serum, i/ili u tumorskom tkivu ili ćeliji. Nivo može da bude upoređen sa standardom ili drugom pogodnom kontrolom, kao što je uporedivi uzorak od subjekta koji nema bolest povezanu sa HA.
[0135] Kako se ovde koristi, "lečenje" subjekta sa bolešću ili stanjem znači da su simptomi kod subjekta delimično ili potpuno ublaženi ili da su ostali statični posle tretmana. Prema tome, tretman obuhvata profilaksu, terapiju i/ili lečenje. Profilaksa se odnosi na prevenciju potencijalne bolesti i/ili na prevenciju pogoršanja simptoma ili progresije bolesti.
[0136] Kako se ovde koristi, farmaceutski efikasno sredstvo, obuhvata bilo koje terapijsko sredstvo ili biološki aktivno sredstvo, uključujući, ali se ne ograničavajući, na primer, na hemioterapeutike, anestetike, vazokonstriktore, disperzante, uobičajene terapeutske lekove, uključujući lekove sa malim molekulima i terapeutske proteine.
[0137] Kako se ovde koristi, tretman znači bilo koji način pomoću koga se simptomi stanja, poremećaja ili bolesti ili druge indikacije ublažavaju ili korisno menjaju na neki drugi način.
[0138] Kako se ovde koristi, terapijsko dejstvo znači dejstvo koje nastaje usled tretmana subjekta koje menja, a obično poboljšava ili ublažava simptome bolesti ili stanja ili koje leči bolest ili stanje. Terapijski efikasna količina se odnosi na količinu kompozicije, molekula ili jedinjenja koja rezultuje terapijskim dejstvom nakon davanja subjektu.
[0139] Kako se ovde koristi, izraz "subjekt" odnosi na životinju, uključujući sisara, kao što je ljudsko biće.
[0140] Kako se ovde koristi, pacijent se odnosi na humanog subjekta koji ispoljava simptome bolesti ili poremećaja.
[0141] Kako se ovde koristi, približno isto znači u okviru količine koju bi stručnjak u ovoj oblasti smatrao istom ili u okviru prihvatljivih granica greške. Na primer, tipično, za farmaceutske kompozicije, u okviru najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5% ili 10% se smatra približno istim. Takva količina može da varira u zavisnosti od tolerancije za varijaciju u konkretnoj kompoziciji kod subjekata.
[0142] Kako se ovde koristi, dozni režim se odnosi na primenjenu količinu sredstva, na primer, kompozicije koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, na primer rastvorljivu hijaluronidazu ili drugo sredstvo, i na učestalost primene. Dozni režim zavisi od bolesti ili stanja koje treba da se leči, i zbog toga može da varira.
[0143] Kako se ovde koristi, učestalost primene se odnosi na vreme između uzastopnih primena tretmana. Na primer, učestalost može da predstavlja dane, nedelje ili mesece. Na primer, učestalost može da bude više od jednom nedeljno, na primer, dvaput nedeljno, triput nedeljno, četiri puta nedeljno, pet puta nedeljno, šest puta nedeljno ili dnevno. Učestalost takođe može da bude na jednu, dve, tri ili četiri nedelje. Konkretna učestalost zavisi od konkretne bolesti ili stanja koje se leči. Uopšteno, učestalost je više od jednom nedeljno, i uopšteno je dvaput nedeljno.
[0144] Kako se ovde koristi, "ciklus primene" se odnosi na ponovljeni raspored doznog režima primene enzima i/ili drugog sredstva koji se ponavlja tokom uzastopnih primena. Na primer, primer ciklusa primene je ciklus od 28 dana sa primenom dvaput nedeljno tokom tri nedelje, praćen jednom nedeljom prekida davanja doze.
[0145] Kako se ovde koristi, kada se poziva na dozu zasnovanu na mg/kg subjekta, smatra se da prosečni humani subjekat ima masu od oko 70 kg-75 kg, kao što je 70 kg i telesnu površinu (BSA) od 1.73.
[0146] Kako se ovde koristi, ublažavanje simptoma specifične bolesti ili poremećaja tretmanom, kao što je davanjem farmaceutske kompozicije ili drugog terapeutika, odnosi se na ublažavanje, bilo permanentno ili privremeno, trajno ili prolazno, simptoma ili, neželjenih efekata stanja, kao što je, na primer, smanjenje neželjenih efekata povezanih sa, ili do kojih dolazi nakon primene antihijaluronanskog sredstva, kao što je PEG-ilovana hijaluronidaza.
[0147] Kako se ovde koristi, prevencija ili profilaksa se odnosi na smanjenje rizika od razvoja bolesti ili stanja.
[0148] Kako se ovde koristi, "terapijski efikasna količina" ili " terapijski efikasna doza" se odnosi na količinu sredstva, jedinjenja, materijala ili kompozicije koja sadrži jedinjenje koja je bar dovoljna za ostvarivanje terapijskog dejstva. Shodno tome, to je količina koja je potrebna za sprečavanje, lečenje, ublažavanje, usporavanje ili delimično usporavanje simptoma bolesti ili poremećaja.
[0149] Kako se ovde koristi, jedinični dozni oblik se odnosi na fizički odvojene jedinice koje su podesne za humane i životinjske subjekte i koje su zapakovane pojedinačno, kao što je poznato iz odgovarajuće oblasti.
[0150] Kako se ovde koristi, jednodozna formulacija se odnosi na formulaciju koja predstavlja jednu dozu.
[0151] Kako se ovde koristi, formulacija za direktnu primenu označava da kompozicija ne zahteva dalje razblaživanje za primenu.
[0152] Kako se ovde koristi, "proizvodni artikal" je proizvod koji se pravi i prodaje. Kada se koristi u prijavi, ovaj izraz treba da obuhvati antihijaluronanska sredstva, na primer enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, i drugo sredstvo kompozicije sadržano u pakovanju predmeta. Na primer, drugo sredstvo je kortikosteroid, taksan koji ciljno deluje na tumor ili hemioterapijsko sredstvo.
[0153] Kako se ovde koristi, fluid se odnosi na bilo koju kompoziciju koja može da teče. Shodno tome, fluidi obuhvataju kompozicije koje su u polučvrstom stanju, paste, rastvore, vodene smeše, gelove, losione, kreme i druge takve kompozicije.
[0154] Kako se ovde koristi, kombinacija, kao što je kombinacija kompozicija obezbeđena u ovom tekstu, odnosi se na udruživanje elemenata kombinacije.
[0155] Kako se ovde koristi kit se odnosi na kombinaciju komponenata, kao što je kombinacija kompozicija u ovom tekstu, i drugog predmeta u svrhu, uključujući, ali bez ograničenja, rekonstitucije, aktivacije, instrumenata/uređaja za dostavu, primene, dijagnoze i procenjivanja biološke aktivnosti ili svojstva. Kitovi izborno obuhvataju uputstva za upotrebu.
[0156] Kako se ovde koristi, ćelijski ekstrakt ili lizat se odnosi na preparat ili frakciju koja je napravljena od liziranih ili razorenih ćelija.
[0157] Kako se ovde koristi, životinja obuhvata bilo koju životinju, kao što su, ali bez ograničavanja na primate uključujući ljude, gorile i majmune; glodare, kao što su miševi i pacovi; živinu, kao što su pilići; preživare, kao što su koze, krave, jeleni, ovce; svinje i druge životinje. Nehumane životinje isključuju ljude kao razmatranu životinju. Ovde obezbeđene hijaluronidaze su iz bilo kog izvora, životinjskog, biljnog, prokariotskog i gljivičnog. Većina hijaluronidaza je životinjskog porekla, uključujući sisarsko poreklo. Uopšteno, hijaluronidaze su humanog porekla.
[0158] Kako se ovde koristi, anti-kancerski tretmani obuhvataju primenu lekova i drugih sredstava za lečenje kancera, kao i protokole lečenja, kao što je hirurška intervencija i zračenje. Anti-kancerski tretmani obuhvataju primenu antikancerskog sredstva.
[0159] Kako se ovde koristi, antikancersko sredstvo se odnosi na bilo koja sredstva, ili jedinjenja, korišćena u antikancerskom tretmanu. Ona uključuju bilo koja sredstva, koja korišćena sama ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, mogu da ublaže, redukuju, poboljšaju, spreče, ili fiksiraju ili održavaju u stanju remisije kliničke simptome, ili dijagnostičke markere povezane sa tumorima i kancerom, i koja mogu da se koriste u kombinacijama i kompozicijama koje su ovde obezbeđene. Primeri antikancerskih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što su PEG-ilovani enzimi koji razgrađuju hijaluronan obezbeđeni u ovom tekstu korišćeni pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim antikancerskim sredstvima, kao što su hemioterapeutici, polipeptidi, antitela, peptidi, mali molekuli ili vektori, virusi ili DNK za gensku terapiju.
[0160] Kako se ovde koristi, kontrola se odnosi na uzorak koji je u suštini identičan ispitivanom uzorku, osim po tome što nije tretiran sa ispitivanim parametrom, ili, ako je to uzorak plazme, onda on može biti od normalnog dobrovoljca koji nema stanje od interesa. Kontrola takođe može biti interna kontrola.
[0161] Kako se ovde koristi, oblici u jednini uključuju množinu osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Shodno tome, na primer, ukazivanje na jedinjenje koje obuhvata ili sadrži "ekstracelularni domen" uključuje jedinjenja sa jednim ili mnoštvom ekstracelularnih domena.
[0162] Kako se ovde koristi, opsezi i količine mogu biti izraženi sa "oko" specifične vrednosti ili opsega. Oko takođe obuhvata i tačnu količinu. Shodno tome, "oko 5 baza" znači "oko 5 baza", a takođe i "5 baza".
[0163] Kako se ovde koristi, "izborni" ili "izborno" znači da se događaj opisan u nastavku ili okolnost događa ili se ne događa, i da opis obuhvata slučajeve gde se pomenuti događaj ili okolnost događa i slučajeve gde se ne događa. Na primer, opciono supstituisana grupa znači da je grupa nesupstituisana ili da je supstituisana.
[0164] Kako se ovde koriste, skraćenice za bilo koje zaštitne grupe, aminokiseline i druga jedinjenja su, osim ako nije drugačije navedeno, u skladu sa njihovom uobičajenom upotrebom, priznatim skraćenicama, ili IUPAC-IUB Komisijom za biohemijsku nomenklaturu (videti, (1972) Biochem.11:1726).
B. KOMBINOVANA TERAPIJA ANTIHIJALURONANSKIM SREDSTVOM
[0165] Ovde su obezbeđene kombinovane terapije antihijaluronanskim sredstvom, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je albuminvezani paklitaksel, za upotrebu u tretmanu kancera. Na primer, ovde su obezbeđene kombinovane terapije enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom, na primer hijaluronidazom, kao što je PEGPH20, i taksanom koji ciljno deluje na tumor, kao što je albumin-vezani paklitaksel, za upotrebu u tretmanu kancera. Naročito, kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena koristi se u tretmanu bilo kojih kancera koji se odlikuju solidnim tumorima u koje se ne može prodreti zbog stromalnog sloja. Primeri takvih kancera uključuju kancerozne solidne tumore, kao što je, ali bez ograničenja, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer prostate, kancer želuca, kancer kolona, kancer jajnika, kancer glave i vrata i drugi. Kombinovana terapija može dalje da uključuje dodatni citotoksični hemioterapijski lek, na primer bilo koji čija aktivnost je povećana (npr. zbog povećane dostave i/ili produženog polu-života) pomoću jednog ili oba antihijaluronanska sredstva, na primer, enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom, i/ili taksanom koji ciljno deluje na tumor. Na primer, dodatno hemioterapijsko sredstvo može da bude nukleozidni analog, kao što je gemcitabin ili njegov derivat, koji ispoljava neposredne antitumorske aktivnosti.
1. Solidni tumori i terapije koje ciljno deluju na tumor
[0166] Solidni tumori su načinjeni od kancerskih ćelija i ćelija strome (npr. fibroblasta i inflamatornih ćelija) koje su okružene ekstracelularnim matriksom i vaskularnom mrežom. Ćelije strome, komponente ekstracelularnog matriksa i/ili vaskulatura su uglavnom abnormalne u poređenju sa onim prisutnim u normalnim tkivima. Na primer, mnogi solidni tumori imaju povećan broj fibroblasta u poređenju sa normalnim tkivima. Takođe, vaskulatura u solidnim tumorima može da ispoljava razgranatu ili uvijenu strukturu u poređenju sa normalnom vaskulaturom, i da ispoljava strukturne aberacije koje se odlikuju proširenim sudovima, smanjenjem endotelne podloge i/ili komprimovanim sudovima. Najzad, tumor i stromalne ćelije proizvode i sklapaju složenu mrežu komponenti ekstracelularnog matriksa, kao što su kolageni, proteoglikani, glikozaminoglikani (npr. hijaluronan) i drugi molekuli koji obrazuju gustu masu i mogu da doprinesu visokom intersticijalnom pritisku tumora. Visoki intersticijalni pritisak fluida veći od intravaskularnog pritiska u završnim arteriolama i kapilarima može da ometa perfuziju fluida i rastvorenih supstanci u intersticijum. Tako, visoki intersticijalni pritisak može da spreči preuzimanje terapeutika u tumorska tkiva, i takođe može da utiče na svojstva rasta tumorskih ćelija podržavajući proliferaciju tumorske ćelije.
[0167] Da bi terapija tumora bila efikasna, lekovi moraju efikasno da napuste tumorske krvne sudove i prodru u tumorska tkiva da bi dospeli do kancerskih ćelija. Visoki intersticijalni pritisak fluida, kao i gust sastav i organizacija ekstracelularnog matriksa i povezanih ćelija utiče na prodiranje leka. Rezultat je to da stromalna barijera često sprečava prodiranje antitumorskih lekova u tumore, što čini mnoge uobičajene tretmane protiv kancera neefikasnim.
[0168] Na primer, kancer pankreasa je među onima u koje je najteže prodiranje od svih kancera u vidu solidnog tumora. Kao rezultat, kanceri pankreasa, uključujući pankreatični duktalni adenokarcinom, odlikuju se urođenom rezistencijom na uobičajene hemioterapeutike tako da je stopa preživljavanja petogodišnjeg perioda manja od 5%. Standardna terapija za kancer pankreasa je tretman gemcitabinom. Gemcitabin ima ograničena dejstva na povećanje preživljavanja pacijenta. Na primer, samo četvrtina pacijenata lečenih monoterapijom gemcitabina ispoljava kliničku korist sa medijanom preživljavanja od malo iznad 5 meseci, što je samo jedan mesec duže nego kod tretmana sa hemioterapijskim sredstvom fluorouracilom (5-FU) (Burris et al. (1997) J Clin Oncol, 15:2403-2413). U slučaju adjuvantne terapije pri čemu je tretman takođe praćen hirurškom operacijom kancera pankreasa ili drugom nehemioterapijskom adjuvantnom terapijom, gemcitabin je povećao preživljavanje za dva meseca u poređenju sa pacijentima koji su imali samo hiruršku operaciju (Neuhaus et al. (2008) J. Clin. Oncol.26: May 20 suppl; abst.).
[0169] Nedavno, razvijene su terapije koje uključuju terapijsko sredstvo koje može da prodre kroz stromalni sloj i udruženu vaskulaturu. Terapeutici koji mogu da smanje stromu, naprave otvore u njoj, ili drugačije prodru kroz stromu, smatraju se obećavajućim terapeuticima za mnoge kancere koji se odlikuju neprobojnim stromalnim slojem. Takva sredstva uključuju, na primer, taksane konjugovane sa albuminom (Von Hoff et al. (2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-54; Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269), ježoliki inhibitor (Olive et al. (2009) Science, 324:1457-61) i hijaluronidazu konjugovanu sa polimerom (Provenzano et al. (2012) Cancer Cell, 21:418-429). Svaki od ovih tretmana je takođe povezan sa povećanom dostavom hemioterapijskih sredstava koja ne deluju ciljno na stromu, rezultujući u pojačanim antitumorskim dejstvima i u udvostručavanju vremena preživljavanja u poređenju sa monoterapijom hemioterapijskim sredstvom (npr. gemcitabinom).
a. Taksan koji ciljno deluje na tumor
[0170] Taksani, kao što je paklitaksel (npr. Taxol®) i docetaksel (npr. Taxotere®) su snažna hemioterapijska sredstva za upotrebu u tretmanu različitih tipova tumora. Taksani deluju kao inhibitori mitoze vezujući se za mikrotubule sa visokim afinitetom, interferirajući na taj način sa ćelijskom deobom. Kao rezultat, taksani sprečavaju rast i metastaziranje tumorske ćelije, i mogu da izazovu ćelijsku smrt. Terapijska upotreba taksana je ograničena zbog problema sa rastvorljivošću i udružene toksičnosti, dugotrajne sistemske raspoloživosti i nedospevanja do strome tumora.
[0171] Da bi se prevazišli problemi povezani sa terapijskom upotrebom taksana, razvijena je formulacija leka u vidu nanočestica usmerenih na gp60 receptor sačinjenih od albuminvezanih čestičnih oblika taksana. Ovo uključuje, na primer, nanočestični albumin-vezani (nab)-paklitaksel (ABI-007, npr. Abraxane®) i nanočestični albumin-vezani docetaksel (ABI-008). Gp60 je albuminski receptor na vaskularnom endotelijumu. Preuzimanje posredovano albuminskim receptorom preko gp60 rezultuje povezivanjem sa intracelularnim kaveolinom-1 što vodi invaginaciji ćelijske membrane i obrazovanju transcitotičkih vezikula (označenih kao kaveole) koje sadrže vezane konstituente plazme iz ekstracelularnog prostora, transcitoze i ekstravaskularnog taloženja sadržaja kaveola. Pored toga, albumin se takođe vezuje za SPARC (sekretorni kiseli protein bogat cisteinom), koji predstavlja glikoprotein ekstracelularnog matriksa koji je prekomerno eksprimiran i povezan sa lošom prognozom u različitim kancerima. Ovime se postiže zaobilaženje stromalnih barijera za dostavu leka, i postiže se viša koncentracija leka unutar tumora. Nab-paklitaksel može da dostigne više intratumorske koncentracije i povećanu bioraspoloživost u poređenju sa uobičajenim paklitakselom na bazi rastvarača (Foote (2007) Biotechnology Annual Review, 13:345).
[0172] Budući da taksan koji ciljno deluje na tumore, kao što su albumin-konjugovani taksani, može da prodre i smanji ili uruši stromu, ova sredstva mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim hemioterapijskim sredstvima koja nemaju ciljno delovanje na stromu u cilju poboljšanja dostave tih drugih sredstava do tumora. Mehanizam poboljšanja dostave pripisuje se narušavanju građe strome i indukciji reaktivne angiogeneze koja vodi povećanoj perfuziji i dostavi hemioterapijskog sredstva (videti, npr., Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269). Na primer, ispitivanja su pokazala da nab-paklitaksel, albuminkonjugovani taksan, u kombinaciju sa gemcitabinom povećava gotovo 2.8 puta količinu gemcitabina u tumoru u poređenju sa lečenjem samim gemcitabinom (Von Hoff et al. (2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-4554). Rezultati su takođe pokazali da kombinovana terapija udvostručuje vreme preživljavanja pacijenata sa kancerom pankreasa (Von Hoff et al. (2011)).
[0173] Povećanje intratumorskih količina gemcitabina u kombinaciji sa terapijom nabpaklitakselom je nedavno pripisano nezavisnom mehanizmu povezanom sa redukcijom citidin deaminaze (Cda) kod grupa lečenih nab-paklitakselom (Frese et al. (2012) Cancer Discovery 2:260-269). Cda je sveprisutno eksprimiran u ćelijama, i može da inaktivira gemcitabin deaminacijom u njegov metabolit difluorodeoksiuridin (dFdU). Tretman nabpaklitakselom povećava reaktivne kiseonične vrste (ROS), što vodi degradaciji Cda bez ikakve izmene nivoa iRNK. Stoga, kotretman sa nab-paklitakselom rezultuje u redukciji deaminacije gemcitabina, i time stabilizuje gemcitabin dovodeći do povećanja intratumorskih nivoa gemcitabina.
b. Antihijaluronansko sredstvo
[0174] Antihijaluronanska sredstva snižavaju nivoe hijaluronske kiseline (HA; takođe ovde označena kao hijaluronan) interferirajući sa njenom sintezom ili povećavajući njenu razgradnju. Na primer, enzimi koji razgrađuju hijaluronan, kao što su enzimi hijaluronidaze, su enzimi koji interferiraju sa, i razgrađuju hijaluronsku kiselinu. Hijaluronan je glavni sastojak ekstracelularnog matriksa solidnih tumora. HA je linearni glikozaminoglikan velike molekulske težine koji sadrži ponavljajuće disaharidne jedinice, β-1,3 N-acetil-D-glukozamin-vezan β-1,4 za D-glukuronsku kiselinu. HA se prirodno javlja u telu i sekretuje se na izuzetno visokim nivoima u nekim kancerskim ćelijama, uključujući ćelije kancera pankreasa. Lokalne nepravilnosti metabolizma HA su prijavljene u mnogim malignitetima solidnih tumora, gde su povišeni nivoi HA često u korelaciji sa lošom prognozom u tumorima kao što je karcinom dojke, želuca, kolorektalni karcinom, karcinom jajnika, prostate i pluća.
[0175] HA je uključen u povećano preuzimanje vode i pritisak intersticijalnog fluida (IFP) u bolesnim tkivima, kao što su tumori, što dovodi do komprimirane vaskulature tumora. Na primer, na mestima inflamacije ili u tumorskom fokusu, javlja se brzo nakupljanje hijaluronana, drugih sastojaka matriksa i vode. Zbog ovog brzog nakupljanja, obolelo mesto ne može da postigne ravnotežu sa okruženjem i stoga ima viši pritisak intersticijalnog fluida od normalnih tkiva. Kao što je gore razmatrano, IFP većine solidnih tumora i drugih obolelih tkiva povezan sa nakupljanjem HA je povišen, delujući kao barijera za efikasnu dostavu leka (Heldin et al. (2004) Nat Rev Cancer 4(10):806-813). Nakupljanje HA takođe snižava kontaktnu inhibiciju između i unutar tumorskih ćelija (videti, npr., Itano et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.99:3609-3614).
[0176] Antihijaluronanska sredstva koja inhibiraju sintezu HA ili razgrađuju hijaluronan, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, npr., hijaluronidaze (npr. PH20), mogu da redukuju hijaluronan tako da tkivo splašnjava, krvni sudovi se šire, i više krvi može da protiče kroz to tkivo. Ovo rezultuje u smanjenju pritiska intersticijalnog fluida u tkivu i povezanom povećanju vaskularne perfuzije. Na primer, pokazano je da hijaluronidaza uklanja HA iz tumora dovodeći do redukcije zapremine tumora, redukcije intratumorskog intersticijalnog pritiska, usporavanja proliferacije tumorskih ćelija, i poboljšane efikasnosti koadministriranih hemioterapijskih lekova i bioloških sredstava omogućavanjem povećanog prodiranja u tumor (videti npr. SAD objavljenu prijavu br. 20100003238 i međunarodnu objavljenu PCT prijavu br. WO 2009/128917).
[0177] Nedostatak upotrebe hijaluronidaze, kao što je PH20 enzim, za sistemsko lečenje predstavljaju problemi povezani sa kratkim polu-životom enzima. Na primer, nemodifikovana hijaluronidaza obično ima kratak polu-život enzimske aktivnosti u krvi u minutima, uopšteno manje od 5 minuta. Ovo znači da takvi enzimi uopšteno nisu pogodni za upotrebu u intravenskim primenama, i drugim primenama, gde je trajanje njihovog delovanja kratko. Ovo je zbog toga što se, nakon degradacije, HA supstrat zamenjuje sa polu-životom od približno 5 časova. Nasuprot tome, postupci koji povećavaju dostavu i/ili produžavaju povezanost hijaluronidaze sa hijalurounanom udruženim sa ćelijama (npr. pericelularni hijaluronan udružen sa tumorom) omogućavaju lečenje tumora bogatih u HA. Takvi postupci mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na konjugaciju enzima sa polimerom, upotrebu enzima koji je aglikozilovan ili koji je modifikovan tako da ima redukovanu glikozialciju, kontinuiranom infuzijom enzima i/ili lokalizovanom dostavom enzima. Na primer, polimerna modifikacija hijaluronidaze, kao što je PEG-ilacija, povećava polu-život enzima do približno 48 do 72 časova i omogućava sistemsko lečenje tumora bogatih u HA (videti npr. SAD objavljenu prijavu br. 20100003238 i međunarodnu objavljenu PCT prijavu br. WO 2009/128917). Povećan polu-život u odnosu na nemodifikovanu hijaluronidazu omogućava kontinuirano uklanjanje HA, i time redukuje ili snižava stepen regeneracije HA u obolelim tkivima, kao što je tumor. Tako, održavanje nivoa enzima u plazmi konjugacijom sa polimerom može da ukloni HA, kao što je tumorska HA, i deluje nasuprot ponovne sinteze HA.
[0178] Pored toga, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerima, kao što je hijaluronidaza konjugovana sa polimerom ili PH20, na primer PEGPH20, može da stanji stromu koja okružuje kancerske ćelije razgradnjom HA. Takva sredstva mogu da se koriste u terapiji pojedinačnim sredstvom za lečenje tumora ili u kombinovanoj terapiji za poboljšanje dostave hemioterapijskih sredstava koja ne deluju ciljno na stromu kao što je gemcitabin. Rezultati iz kliničkih ispitivanja pacijenata sa kancerom pankreasa takođe pokazuju da PEGPH20 tretman u kombinaciji sa gemcitabinom rezultuje u gotovo udvostručavanju preživljavanja u poređenju sa lečenjem samim gemcitabinom (Provenzano et al. (2012) Cancer Cell, 21:418-429).
2. Kombinovana terapija antihijaluronanskog sredstva i taksana koji ciljno deluje na tumor
[0179] Ovde je nađeno da kombinovane terapije koje sadrže najmanje dve različite terapije usmerene na stromu ili tumor ispoljavaju efikasnost koja je veća od pojedinačne efikasnosti sredstva usmerenog na stromu. Na primer, ovde je nađeno da kombinovana terapija sa taksanom koji ciljno deluje na tumor i antihijaluronanskim sredstvom, naročito antihijaluronanskim sredstvom sposobnim da dopre do pericelularne HA na tumoru tokom vremena dovoljnog za sniženje nivoa HA, ispoljava povećanu efikasnost u poređenju sa pojedinačnim tretmanom bilo kog sredstvo koje se koristi samostalno. Na primer, kombinovana terapija taksanom koji ciljno deluje na tumor i hijaluronidazom konjugovanom sa polimerom rezultuje u povećanju efikasnosti većem od 25% u poređenju sa tretmanom pojedinačnim sredstvom. U narednoj kombinaciji sa hemioterapijskim lekom koji ne deluje ciljno na stromu gemcitabinom, medijana preživljavanja kod kancera datog kao primer povećana je za 79% u mišjem modelu kancera pankreasa u poređenju sa lečenjem samo sa gemcitabinom i povećana je za više od 30% u poređenju sa postojećim terapijama koje sadrže samo jedno sredstvo usmereno na stromu. Ovo povećanje efikasnosti može da bude preneto na suštinsko povećanje preživljavanja pacijenata sa kancerom pankreasa i drugim kancerima koji se odlikuju stromom u koju ne može da se prodre, u poređenju sa postojećim tretmanima.
[0180] Stoga, ovde su obezbeđeni postupci koji koriste kombinovanu terapiju koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan ili enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom (npr. hijaluronidaza ili PH20), i taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je albumin vezani-taksan, za lečenje kanceroznih stromalnih solidnih tumora. Na primer, kombinovana terapija može da se koristi za lečenje kancera pankreasa, kancera dojke, kancera prostate, kancera želuca, kancera kolona, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera jajnika i drugih. Kompozicije koje sadrže antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom (npr. hijaluronidaza ili PH20), i taksan koji ciljno deluje na tumor (npr. albumin vezani-taksan) mogu da budu obezbeđene odvojeno u kombinaciji, ili obezbeđene u jednoj kompoziciji. Ako su obezbeđena i primenjuju se odvojeno, sredstva mogu da budu primenjena istovremeno ili gotovo istovremeno, uzastopno ili naizmenično bilo kojim redom. Na primer, antihijaluronanska sredstva, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom (npr. hijaluronidaza ili PH20) i taksan koji ciljno deluje na tumor (npr. albuminvezani taksan) mogu da budu primenjena odvojeno, pri čemu se primenjuju gotovo istovremeno ili su njihove primene razdvojene časovima ili danima. Mesto injektovanja može da bude isto ili različito. Ako je različito, mesto injektovanja može da bude blizu mesta injektovanja prvog primenjenog sredstva.
[0181] Kombinacija sredstava koja ciljno deluju na tumor može da se koristi zajedno za lečenje kanceroznih stromalnih solidnih tumora, ili može da se koristi u daljem kombinovanju sa drugim hemioterapijskim sredstvima ili tretmanima. U konkretnim primerima, kombinacija antihijaluronanskih sredstava, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom (npr. hijaluronidaza ili PH20), i taksan koji ciljno deluje na tumor (npr. albumin vezani-taksan) koristi se u dodatnoj kombinaciji sa hemioterapijskim sredstvom. Drugo sredstvo može da bude sredstvo koje je usmereno ili koje nije usmereno na stromu. Tipično, drugo sredstvo je citotoksično sredstvo koje nema ciljno delovanje na stromu koje ispoljava neposrednu antitumorsku aktivnost. Na primer, dopunsko hemioterapijsko sredstvo može da bude citotoksično sredstvo kao što je platina (cisplatin ili karboplatin), paklitaksel, gemcitabin, docetaksel, vinorelbin, irinotekan i pemetreksed. Tipično, dopunsko hemioterapijsko sredstvo je nukleozidni analog, kao što je gemcitabin. Dopunski tretman ili sredstvo može da bude primenjeno odvojeno ili zajedno sa antihijaluronanskim sredstvom, kao što je kombinovana terapija enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom (npr. hijaluronidaza), i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor (npr. albumin vezani-taksan). Dopunsko sredstvo može da bude primenjeno odvojeno u kombinaciji ili obezbeđeno u jednoj kompoziciji. Ako je obezbeđeno i primenjuje se odvojeno, dopunsko sredstvo može da se primenjuje istovremeno ili gotovo istovremeno, uzastopno ili naizmenično bilo kojim redom sa kombinovanom terapijom antihijaluronanskog sredstva i/ili albumin-vezanog taksana. Tipično, u cilju postizanja poboljšane dostave dodatnog sredstva, dodatno sredstvo se primenjuje posle primene kombinovane terapije antihijaluronanskog sredstva i/ili albumin-vezanog taksana. Zbog poboljšane dostave i poluživota dodatnog hemioterapijskog sredstva, doziranje dopunskog sredstva za primenu može da bude redukovano i/ili učestalost primene može da bude redukovana u poređenju postojećim doznim režimima. Rezultat je to da kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena može da rezultuje smanjenim sporednim dejstvima ko-administriranog dodatnog terapeutika (npr. nukleozidnog analoga kao što je gemcitabin) u poređenju sa njegovom pojedinačnom primenom ili njegovom primenom sa bilo kojim od antihijaluronanskog sredstva, npr., enzima koji razgrađuje hijaluronan, ili taksana koji ciljno deluje na tumor pojedinačno.
[0182] Naredni odeljci opisuju primere antihijaluronanskih sredstava, uključujući enzime koji razgrađuju hijaluronan konjugovane sa polimerom, taksan koji ciljno deluje na tumore i druge primere neograničavajućih hemioterapijskih sredstava za upotrebu u kombinovanoj terapiji koja je ovde obezbeđena. Primeri doznih režima i postupaka za lečenje kancera u vidu stromalnih solidnih tumora takođe su opisani.
C. Sredstva kombinovane terapije
[0183] Ovde su obezbeđene kombinovane terapije antihijaluronanskih sredstava, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronane, i taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je albuminvezani paklitaksel, za upotrebu u lečenju kancera. Naročito, ovde su obezbeđene kombinovane terapije enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom, na primer hijaluronidaze, kao što je PEGPH20, i taksana koji ciljno deluje na tumor, kao što je albumin-vezani paklitaksel, za upotrebu u lečenju kancera. Posebno, kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena koristi se u lečenju bilo kojih kancera koji se odlikuju solidnim tumorima u koje se ne može prodreti zbog HA u ekstracelularnom matriksu. Primeri takvih kancera uključuju kancere u vidu solidnog tumora, kao što je ali bez ograničenja, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer prostate, kancer želuca, kancer kolona, kancer jajnika, kancer glave i vrata i drugi. Kombinovana terapija može dalje da uključuje dopunski citotoksični hemioterapijski lek, na primer bilo koji čija aktivnost je povećana (npr. zbog povećane dostave i/ili povećanog polu-života) pomoću jednog ili oba antihijaluronanska sredstva, uključujući enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i/ili taksan koji ciljno deluje na tumor. Na primer, dopunsko hemioterapijsko sredstvo može da bude nukleozidni analog, kao što je gemcitabin ili njegov derivat, koji ispoljava neposredne antitumorske aktivnosti.
1. Antihijaluronanska sredstva
[0184] Kombinovana terapija, uključujući njene kombinacije i postupke i upotrebu, koja je ovde obezbeđena sadrži antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom. Antihijaluronansko sredstvo je ono koje može da se primenjuje tako da dosegne svoj cilj, i naročito da dosegne tumorsku ćeliju koja sadrži povišeni pericelularni HA. Na primer, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, može da se primenjuje kontinuiranom infuzijom ili da se injektuje lokalno, može da bude modifikovano sa polimerom, ili je aglikozilovano ili je modifikovano tako da je aglikozilovano ili ima sniženu glikozilaciju. U jednom primeru, obezbeđene kompozicije i kombinacije sadrže enzim koji razgrađuje hijaluronan, naročito hijaluronidazu, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza (npr. PH20 ili skraćena PH20), koja je modifikovana konjugacijom sa jednim ili više polimerinih molekula (polimera), tipično da bi se povećao polu-život enzima koji razgrađuje hijaluronan, na primer, da bi se podstakla produžena/neprekidna dejstva tretmana kod subjekta.
[0185] Hijaluronan je sastojak ekstracelularnog matriksa i glavni konstituent intersticijalne barijere. Katalizovanjem hidrolize hijaluronana, enzimi koji razgrađuju hijaluronan snižavaju viskoznost hijaluronana, povećavajući tako propustljivost tkiva i povećavajući brzinu apsorpcije fluida koji se primenjuju parenteralno. Kao takva, antihijaluronanska sredstva, uključujući enzime koji razgrađuju hijaluronan, kao što su hijaluronidaze, korišćena su, na primer, kao sredstva za širenje ili dispergovanje zajedno sa drugim sredstvima, lekovima i proteinima za poboljšanje njihovog rasprostiranja i dostave.
[0186] Antihijaluronanska sredstva redukuju nivoe hijaluronske kiseline (HA; takođe ovde označena kao hijaluronan) putem interferencije sa njenom sintezom ili povećanja njene razgradnje. Na primer, enzimi koji razgrađuju hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, interferiraju sa i razgrađuju hijaluronsku kiselinu (HA). Tretman sredstvima koja razgrađuju ili inhibiraju sintezu hijaluronana, kao što su enzimi koji razgrađuju hijaluronan, redukuje hijaluronan tako da tkivo splašnjava, krvni sudovi se šire, i više krvi protiče kroz to tkivo. Primeri takvih antihijaluronanskih sredstava su sredstva koja inhibiraju sintezu hijaluronana ili razgrađuju hijaluronan.
a. Sredstva koja inhibiraju sintezu hijaluronana
[0187] Antihijaluronanska sredstva uključuju sredstva koja inhibiraju sintezu hijaluronana, kao što su sredstva koja inhibiraju, redukuju ili nishodno regulišu ekspresiju HA sintaze, inhibitori sinteze HA i inhibitori tirozin kinaze.
[0188] HA može da bude sintetisana pomoću tri enzima koja su proizvodi tri odgovarajuća sisarska gena identifikovana kao HA sintaza, označena kao has-1, has-2 i has-3. Različiti tipovi ćelija eksprimiraju različite HAS enzime i ekspresija HAS iRNK je u korelaciji sa biosintezom HA. Poznato je da utišavanje HAS gena u tumorskim ćelijama inhibira rast tumora i metastaze. Antihijaluronansko sredstvo uključuje bilo koje sredstvo koje inhibira, redukuje ili nishodno reguliše ekspresiju ili nivo HA sintaze. Takva sredstva su poznata stručnjaku u oblasti ili mogu da bude identifikovana.
[0189] Na primer, nishodna regulacija HAS može da bude postignuta obezbeđivanjem oligonukleotida koji specifično hibridizuju ili na drugi način međusobno reaguju sa jednim ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju HAS. Na primer, antihijaluronanska sredstva koja inhibiraju sintezu hijaluronana uključuju antisens ili sens molekule protiv has gena. Takva antisens ili sens inhibicija se tipično zasniva na hibridizaciji zasnovanoj na vezivanju vodonika oligonukleotidnih lanaca ili segmenata tako da je najmanje jedan lanac ili segment isečen, razgrađen ili drugačije učinjen neoperativnim. U drugim primerima, mogu da se koriste posttranskripciono utišavanje gena (PTGS), RNKi, ribozimi i DNKzimi. Takve konstrukte može da stvori stručnjak u odgovarajućoj oblasti na osnovu sekvence HAS1 (navedene u SEQ ID NO:195), HAS2 (navedene u SEQ ID NO:196) ili HAS3 (navedene u SEQ ID NO:197 ili 198). U struci je jasno da sekvenca antisens ili sens jedinjenja ne mora da bude 100% komplementarna sa onom kod svoje ciljne nukleinske kiseline da bi mogla specifično da hibridizuje. Osim toga, oligonukleotid može da hibridizuje preko jednog ili više segmenata tako da umetnuti ili susedni segmenti nisu uključeni u hibridizacioni događaj (npr. struktura petlje ili struktura ukosnice). Uopšteno, antisens ili sens jedinjenja imaju najmanje 70% komplementarnosti sekvence sa ciljnim regionom u okviru ciljne nukleinske kiseline, na primer, 75% do 100% komplementarnosti, kao što je 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%. Primeri sens ili antisens molekula su poznati u struci (videti npr. Chao et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:27513-27522; Simpson et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am. J Path., 161:849; Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res., 65:6139; i objavljenu SAD patentnu prijavu br. US20070286856).
[0190] Drugi primeri antihijaluronanskog sredstva koje je inhibitor sinteze HA je 4-metilumbeliferon (4-MU; 7-hidroksi-4-metilkumarin) ili njegov derivat. 4-MU deluje putem smanjenja pula prekursora UDP-GlcUA koji je potreban za sintezu HA. Na primer, u sisarskim ćelijama, HA se sintetiše pomoću HAS koji koristi UDP-glukuronku kiselinu (UGA) i UDP-N-acetil-D-glukozaminske prekursore.4-MU interferira sa procesom kojim se stvara UGA, iscrpljujući tako intracelularni pul UGA i rezultujući u inhibiciji sinteze HA. Za 4-MU je poznato da ima antitumorsku aktivnost (videti npr. Lokeshwar et al. (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170; Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459). Oralna primena 4-MU pri 600 mg/kg/d) redukuje metastaze za 64% u modelu B16 melanoma (Yoshihara et al. (2005) FEBS Lett., 579:2722-6). Struktura 4-MU je prikazana u nastavku. Takođe, derivati 4-MU ispoljavaju antikancersku aktivnost, naročito 6,7-dihidrozi-4-metil kumarin i 5,7-dihidroksi-4-metil kumarin (videti npr. Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459).
4-Metilumbeliferon (4-MU; C10H8O3)
[0191]
[0192] Dodatni primeri antihijaluronanskih sredstava su inhibitori tirozin kinaze, kao što je leflunomid (Arava), genistein ili erbstatin. Leflunomid je takođe inhibitor sinteze pirimidina. Leflunomid je poznati lek za lečenje reumatoidnog artritisa (RA), i takođe je efikasan u lečenju odbacivanja alografta kao i ksenografta. Za HA je poznato da neposredno ili posredno doprinosi RA (videti npr. Stuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376-7382). Inhibitori tirozin kinaze inhibiraju gensku ekspresiju HAS1 (Stuhlmeier 2005).
b. Enzimi koji razgrađuju hijaluronan i enzimi koji razgrađuju hijaluronan konjugovani sa polimerima
[0193] Antihijaluronanska sredstva uključuju enzime koji razgrađuju hijaluronan. Enzimi koji razgrađuju hijaluronan, kao što je hijaluronidaze, pripadaju porodici enzima koji razgrađuju hijaluronan, koji je suštinski sastojak ekstracelularnog matriksa i glavni konstituent intersticijalne barijere. Enzimi koji razgrađuju hijaluronan deluju na razgradnju hijaluronana tako što seku hijaluronanske polimere, koji su sačinjeni od ponavljajućih disaharidnih jedinica, D-glukuronske kiseline (GlcA) i N-acetil-D-glukozamina (GlcNAc), koji su povezani putem naizmeničnih β-1→4 i β-1→3 glikozidnih veza. Hijaluronanski lanci mogu da dostignu oko 25 000 disaharidnih ponovaka ili više u dužinu i veličina polimera hijaluronana može da varira od oko 5 000 do 20 000 000 Da in vivo. Katalizovanjem hidrolize hijaluronana, glavnog konstituenta intersticijalne barijere, enzimi koji razgrađuju hijaluronan snižavaju viskoznost hijaluronana, povećavajući tako tkivnu propustljivost.
[0194] Prema tome, enzimi koji razgrađuju hijaluronan za obezbeđene kombinacije, upotrebe i postupke uključuju bilo koji enzim koji ima sposobnost da katalizuje sečenje hijaluronanskog disaharidnog lanca ili polimera. U nekim primerima enzim koji razgrađuje hijaluronan seče β-1→4 glikozidnu vezu u hijaluronanskom lancu ili polimeru. U drugim primerima, enzim koji razgrađuje hijaluronan katalizuje sečenje β-1→3 glikozidne veze u hijaluronanskom lancu ili polimeru.
[0195] Enzimi koji razgrađuju hijaluronan uključuje hijaluronidaze, kao i druge enzime kao što su hondrotinaze i lijaze koje imaju sposobnost da seku hijaluronan. Dalje, enzimi koji razgrađuju hijaluronan takođe uključuju njihove rastvorljive oblike koji mogu da budu eksprimirani i sekretovani iz ćelija. Kao što je u nastavku opisano, enzimi koji razgrađuju hijaluronan postoje u oblicima koji su vezani za membranu ili rastvorljivim oblicima koji se sekretuju iz ćelija. U svrhu ovog teksta, rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan su obezbeđeni za upotrebu u kombinacijama, postupcima i upotrebama koje su ovde date. Tako, kada enzimi koji razgrađuju hijaluronan uključuju glikozilfosfatidilinozitolsko (GPI) sidro i/ili su drugačije usidreni na membrani ili nerastvorljivi, takvi enzimi koji razgrađuju hijaluronan mogu da budu obezbeđeni u rastvorljivom obliku skraćivanjem ili delecijom GPI sidra da bi se dobio enzim koji je sekretovan i rastvorljiv. Na taj način, enzimi koji razgrađuju hijaluronan uključuju skraćene varijante, npr. skraćene da bi se uklonilo celo ili deo GPI sidra. Primeri takvih rastvorljivih hijaluronidaza su rastvorljivi PH20 hijaluronidi, kao što su bilo koji navedeni u (SAD patentu br. 7,767,429; SAD objavama br. US20040268425 ili US20100143457.
[0196] Enzimi koji razgrađuju hijaluronan koji su ovde obezbeđeni takođe uključuju varijante bilo kog enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je bilo koja hijaluronidaza ili rastvorljiva hijaluronidaza, na primer PH20, koje su poznate stručnjaku u oblasti ili koje su ovde opisane. Na primer, enzimi koji razgrađuju hijaluronan mogu da sadrže jednu ili više varijacija u svojoj primarnoj sekvenci, kao što su aminokiselinske supstitucije, adicije i/ili delecije. Varijanta enzima koji razgrađuje hijaluronan uopšteno ispoljava najmanje ili oko 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence u poređenju sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan koji ne sadrži varijaciju. Bilo koja varijacija može da bude uključena u enzim koji razgrađuje hijaluronan u svrhu ovog teksta pod uslovom da enzim zadržava hijaluronidaznu aktivnost, kao što je najmanje ili oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više od aktivnosti enzima koji razgrađuje hijaluronan koji ne sadrži varijaciju (mereno in vitro i/ili in vivo testovima dobro poznatim u ovoj oblasti i ovde opisanim). Na primer, primeri enzima koji razgrađuju hijaluronan, uključujući one koji mogu da budu konjugovani sa polimerom, su bilo koji navedeni u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 2, 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189 i 199-210, ili bilo koji, koji ispoljava najmanje ili oko 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NOS: 2, 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189 i 199-210.
[0197] Različiti oblici enzima koji razgrađuju hijaluronan, uključujući hijaluronidaze su pripremljeni i odobreni za terapijsku upotrebu kod subjekata, uključujući ljude. Na primer, preparati hijaluronidaza životinjskog porekla uključuju Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), prečišćenu ovčiju hijaluronidazu testisa, Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), goveđu hijaluronidazu testisa i Hydase™ (Prima Pharm Inc.), goveđu hijaluronidazu testisa. Hylenex® (Halozyme Therapeutics) je humana rekombinantna hijaluronidaza proizvedena u genetski modifikovanim ćelijama kineskog hrčka (CHO) koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira rastvorljive oblike PH20, označene kao rHuPH20 (videti npr., SAD objavu br. US20040268425; SAD patent br. 7,767,429). Podrazumeva se da bilo koji preparat hijaluronidaze može da se koristi u kombinacijama, postupcima i upotrebama koje su ovde obezbeđene, videti, npr., SAD patente br. 2,488,564, 2,488,565, 2,676,139, 2,795,529, 2,806,815, 2,808,362, 5,747,027 i 5,827,721 i međunarodnu PCT objavu br. WO2005/118799; SAD objavu br. US20040268425; SAD patent br. 7,767,429; ili bilo koja ovde obezbeđena.
[0198] Neograničavajući opis primera enzima koji razgrađuju hijaluronan, kao što su enzimi hijaluronidaze ili rastvorljivi enzimi hijaluronidaze, na primer PH20, za upotrebu u kombinacijama i postupcima koji ovde su obezbeđene, dat je u nastavku. Uopšteno, takvi enzimi koji razgrađuju hijaluronan uključuju one koji su konjugovani sa polimerom.
i. Hijaluronidaze
[0199] Hijaluronidaze su članovi velike familije enzima koji razgrađuju hijaluronan. Postoje tri opšte klase hijaluronidaza: hijaluronidaze sisarskog tipa, bakterijske hijaluronidaze i hijaluronidaze iz pijavica, drugih parazita i ljuskara. Poznate su i druge hijaluronidaze, na primer hijaluronidaza žute ose (SEQ ID NOS:12 i 13), pčele medarice (SEQ ID NO:14), beloglavog stršljena (SEQ ID NO:15) i papirne ose (SEQ ID NO:16). Bilo koji od takvih enzima može da se koristi u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde obezbeđeni.
(a) Hijaluronidaze sisarskog tipa
[0200] Hijaluronidaze sisarskog tipa (EC 3.2.1.35) su endo-β-N-acetil-heksozaminidaze koje hidrolizuju β1→4 glikozidnu vezu hijaluronana na oligosaharide različiti dužina kao što su tetrasaharidu i heksasaharidi. Ovi enzimi imaju i hidrolitičku i transglikozidaznu aktivnost, i mogu da razgrađuju hijaluronan i hondroitin sulfate (CS), uopšteno C4-S i C6-S. Hijaluronidaze ovog tipa uključuju, ali nisu ograničene na one iz krava (goveđe) (SEQ ID NOS:10, 11, 64, 203 i 204 i molekuli nukleinske kiseline navedeni u SEQ ID NOS:190-192), ovaca (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 i 65, molekuli nukleinske kiseline navedeni u SEQ ID NOS:66 i 193-194), svinje (SEQ ID NOS:20-21), miša (SEQ ID NOS:17-19, 32, 205), pacova (SEQ ID NOS:22-24, 31, 206), zeca (SEQ ID NO:25, 207), orangutana (SEQ ID NO:28), cinomolgus majmuna (SEQ ID NO:29, 202), zamorca (SEQ ID NO:30, 208), šimpanze (SEQ ID NO:101, 199, 200), rezus majmuna (SEQ ID NO:102, 201), lisice (SEQ ID NO: 209 i 210) i humane hijaluronidaze (SEQ ID NOS:1-2, 36-39). Gore navedene hijaluronidaze uključuju PH20 hijaluronidaze. Takođe, BH55 hijaluronidaza pripada ovom tipu kao što je opisano u SAD pat. br. 5,747,027 i 5,827,721. Primeri hijaluronidaza u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde obezbeđeni su rastvorljive hijaluronidaze.
[0201] Sisarske hijaluronidaze mogu dalje da se podele na one koje su aktivne u neutralnoj sredini, prvenstveno nađene u ekstraktima testisa, i aktivne u kiseloj sredini, prvenstveno nađene u organima kao što je jetra. Primeri hijaluronidaza koje su aktivne u neutralnoj sredini uključuju PH20, uključujući ali bez ograničenja, PH20 poreklom od različitih vrsta kao što je ovčija (SEQ ID NOS:27, 63 i 65), goveđa (SEQ ID NO:11 i 64) i humana (SEQ ID NO:1). Humana PH20 (takođe poznata kao SPAM1 ili površinski protein sperme PH20), je uopšteno povezana sa plazma membranom preko glikozilfosfatidil inozitol (GPI) sidra. U prirodi je uključena u adheziju sperma-jajna ćelija i pomaže prodiranje sperme kroz sloj ćelija kumulusa putem digestije hijaluronske kiseline.
[0202] Pored humanog PH20 (takođe nazvanog SPAM1), pet hijaluronidazi-sličnih gena je identifikovano u humanom genomu, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 i HYALP1. HYALP1 je pseudogen, a za HYAL3 (SEQ ID NO:38) nije pokazano da poseduje enzimsku aktivnost bilo kom poznatom supstratu. HYAL4 (prekursorski polipeptid naveden u SEQ ID NO:39) je hondroitinaza i ispoljava malo aktivnosti prema hijaluronanu. HYAL1 (prekursorski polipeptid naveden u SEQ ID NO:36) je prototip enzima aktivnog u kiseloj sredini i PH20 (prekursorski polipeptid naveden u SEQ ID NO:1) je prototip enzima aktivnog u neutralnoj sredini. Hijaluronidazama aktivnim u kiseloj sredini, kao što su HYAL1 i HYAL2 (prekursorski polipeptid naveden u SEQ ID NO:37) uopšteno nedostaje katalitička aktivnost na neutralnom pH (tj. pH 7). Na primer, HYAL1 ima malo katalitičke aktivnosti in vitro iznad pH 4.5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 je enzim aktivan u kiseloj sredini sa veoma niskom specifičnom aktivnošću in vitro. Hijaluronidazislični enzimi takođe može da budu okarakterisani kao oni koji su uopšteno vezani za plazma membranu preko glikozilfosfatidil inozitol (GPI) sidra kao što je humani HYAL2 i humani PH20 (Danilkovitch-Miagkova et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-4585), i oni koji su uopšteno rastvorljivi kao što je humani HYAL1 (Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-15).
[0203] PH20, kao druge sisarske hijaluronidaze, predstavlja endo-β-N-acetilheksozaminidazu koja hidrolizuje β1→4 glikozidnu vezu hijaluronske kiseline na različite dužine oligosaharida kao što su tetrasaharidi i heksasaharidi. Ona ima i hidrolitičku i transglikozidaznu aktivnost i može da razgradi hijaluronsku kiselinu i hondroitin sulfate, kao što su C4-S i C6-S. PH20 je prirodno uključena u adheziju sperma-jajna ćelija i pomaže prodiranje sperme kroz sloj ćelija kumulusa putem digestije hijaluronske kiseline. PH20 je smeštena na površini sperme, i u akrozomu koji potiče od lizozoma, gde je vezana za unutrašnju akrozomalnu membranu. PH20 plazma membrane ima hijaluronidaznu aktivnost samo na neutralnom pH, dok PH20 unutrašnje akrozomalne membrane ispoljava aktivnost i na neutralnom i na kiselom pH. Pored toga što predstavlja hijaluronidazu, izgleda da je PH20 takođe receptor za ćelijski prenos signala indukovan sa HA i receptor za zona pellucida koja okružuje oocit.
[0204] Primeri PH20 proteina, uključujući prekursorske i zrele oblike, uključuju, ali nisu ograničeni na PH20 polipeptide čoveka (prekursorski polipeptid naveden u SEQ ID NO:1, zreli polipeptid naveden u SEQ ID NO: 2), šimpanze (SEQ ID NO:101, 199, 200), rezus majmuna (SEQ ID NO:102, 201) goveđe (SEQ ID NOS: 11 i 64, 203, 204), zečje (SEQ ID NO: 25, 207), ovčije PH20 (SEQ ID NOS: 27, 63 i 65), cinomolgus majmuna (SEQ ID NO: 29, 202), zamorca (SEQ ID NO: 30, 208), pacova (SEQ ID NO: 31, 206), miša (SEQ ID NO: 32, 205) i lisice (SEQ ID NO: 209 i 210).
[0205] Goveđa PH20 je prekursorski polipeptid od 553 aminokiseline (SEQ ID NO:11). Poravnanje goveđe PH20 sa humanom PH20 pokazuje samo slabu homologiju, sa višestrukim prazninama koje postoje od aminokiseline 470 do odgovarajućeg karboksi kraja zbog odsustva GPI sidra u goveđem polipeptidu (videti npr., Frost (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440). Zapravo, jasna GPI sidra nisu predviđena u mnogim drugim PH20 onih vrsta koje nisu humane. Tako, PH20 polipeptidi ovčijeg i goveđeg porekla prirodno postoje u rastvorljivim oblicima. Iako je goveđa PH20 veoma slabo vezana za plazma membranu, ona nije usidrena preko sidra osetljivog na fosfolipazu (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod.
65(2):628-636). Ovo jedinstveno svojstvo goveđe hijaluronidaze omogućilo je upotrebu rastvorljivog enzima hijaluronidaze goveđih testisa kao ekstrakta za kliničku upotrebu (Wydase®, Hyalase®).
[0206] Transkript iRNK humane PH20 se normalno translatira da bi se dobio prekursorski polipeptid od 509 aminokiselina (SEQ ID NO:1) koji sadrži signalnu sekvencu dugu 35 aminokiselina na N-terminusu (položaji aminokiselinskih ostataka 1-35) i signalnu sekvencu od 19 aminokiselina za vezivanje glikozilfosfatidilinozitolskog (GPI) sidra na C-terminusu (položaji aminokiselinskih ostataka 491-509). Zreli PH20 je, prema tome, polipeptid od 474 aminokiseline navedene u SEQ ID NO:2. Nakon transporta prekursorskog polipeptida do ER i uklanjanja signalnog peptida, C-terminalni signalni peptid za vezivanje GPI se seče da bi se olakšalo kovalentno vezivanje GPI sidra za novoobrazovanu C-terminalnu aminokiselinu na aminokiselinom položaju koji odgovara položaju 490 prekursorskog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:1. Na taj način, proizvodi se GPI-usidreni zreli polipeptid od 474 aminokiseline sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:2.
[0207] Humana PH20 ispoljava hijaluronidaznu aktivnost na neutralnom i kiselom pH. U jednom aspektu, humana PH20 je prototip hijaluronidaze aktivne u neutralnoj sredini koja je uopšteno učvršćena za plazma membranu preko GPI sidra. U drugom aspektu, PH20 se eksprimira na unutrašnjoj akrozomalnoj membrani gde ima hijaluronidaznu aktivnost na neutralnom i kiselom pH. izgleda da PH20 sadrži dva katalitička mesta u različitim regionima polipeptida: region peptida 1 i region peptida 3 (Cherr et al., (2001) Matrix Biology 20:515-525). Dokazi ukazuju na to da je region peptida 1 u PH20, koji odgovara aminokiselinskim položajima 107-137 zrelog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:2 i položajima 142-172 prekursorskog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:1, potreban za enzimsku aktivnost na neutralnom pH. Aminokiseline na položajima 111 i 113 (u odnosu na zreli PH20 polipeptid naveden u SEQ ID NO:2) u okviru ovog regiona su izgleda značajne za aktivnost, budući da mutageneza aminokiselinskom zamenom rezultuje u PH20 polipeptidima sa 3% hijaluronidazne aktivnosti odnosno sa nedetektabilnom hijaluronidaznom aktivnošću, u poređenju sa PH20 divljeg tipa (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
[0208] Region peptida 3, koji odgovara aminokiselinskim položajima 242-262 zrelog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:2, i položajima 277-297 prekursorskog polipeptida navedenog u SEQ ID NO: 1, izgleda da je važan za enzimsku aktivnost na kiselom pH. U okviru ovog regiona, aminokiseline na položajima 249 i 252 zrelog PH20 polipeptida izgleda da su od suštinske važnosti za aktivnost, i mutageneza bilo koje od njih rezultuje u polipeptidu suštinski bez aktivnosti (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem.247:810-814).
[0209] Pored katalitičkih mesta, PH20 takođe sadrži hijaluronan-vezujuće mesto. Eksperimentalni dokazi ukazuju na to da je ovo mesto smešteno u regionu peptida 2, koje odgovara aminokiselinskim položajima 205-235 prekursorskog polipeptida navedenog u SEQ ID NO: 1 i položajima 170-200 zrelog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:2. Ovaj region je visoko konzervativan među hijaluronidazama i sličan vezujućem motivu ukosnice. Mutacija argininskog ostatka na položaju 176 (u odnosu na zreli PH20 polipeptid naveden u SEQ ID NO:2) u glicin rezultuje u polipeptidu sa samo oko 1% hijaluronidazne aktivnosti polipeptida divljeg tipa (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem.247:810-814).
[0210] Postoji sedam potencijalnih mesta glikozilacije, uključujući N- i O-vezana glikozilaciona mesta, u humanoj PH20 na N82, N166, N235, N254, N368, N393 i S490 polipeptida prikazanog u SEQ ID NO: 1. Budući da aminokiseline 36 do 464 u SEQ ID NO:1 izgleda sadrže minimalno aktivan hijaluronidazni domen humane PH20, glikozilaciono mesto na S490 nije neophodno za ispravnu hijaluronidaznu aktivnost. U humanoj PH20 postoji šest disulfidnih veza. Dve disulfidne veze između cisteinskih ostataka C60 i C351 i između C224 i C238 polipeptida prikazanog u SEQ ID NO: 1 (odgovara ostacima C25 i C316, odnosno C189 i C203 zrelog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:2). Sledeće četiri disulfidne veze se obrazuju između cisteinskih ostataka C376 i C387; između C381 i C435; između C437 i C443; i između C458 i C464 polipeptida prikazanog u SEQ ID NO: 1 (odgovara ostacima C341 i C352; između C346 i C400; između C402 i C408; i između C423 i C429 zrelog polipeptida navedenog u SEQ ID NO:2, redom).
(b) Bakterijske hijaluronidaze
[0211] Bakterijske hijaluronidaze (EC 4.2.2.1 ili EC 4.2.99.1) razgrađuju hijaluronan i, u različitom stepenu, hondroitin sulfate i dermatan sulfate. Hijaluronan lijaze izolovane iz bakterija razlikuju se od hijaluronidaza (iz drugih izvora, npr., hijaluronoglukozaminidaza, EC 3.2.1.35) po svom načinu delovanja. One su endo-β-N-acetilheksozaminidaze koje katalizuju reakciju eliminacije, pre nego hidrolize, β1→4-glikozidne veze između ostataka N-acetil-beta-D-glukozamina i D-glukuronske kiseline u hijaluronanu, dajući 3-(4-deoksi-β-D-gluk-4-enuronozil)-N-acetil-D-glukozamin tetra- i heksasaharidne, i disaharidne krajnje proizvode. Reakcija rezultuje u obrazovanju oligosaharida sa nezasićenim ostacima heksuronske kiseline na njihovim neredukujućim krajevima.
[0212] Primeri hijaluronidaze iz bakterija za upotrebu u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su obezbeđeni uključuju, ali nisu ograničeni na enzime koji razgrađuju hijaluronan u mikroorganizmima, uključujući sojeve rodova Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides i Streptomyces. Konkretni primeri takvih sojeva i enzima uključuju, ali nisu ograničeni na Arthrobacter sp. (soj FB24) (SEQ ID NO:67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO:68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO:69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO:71); serotip Ia (SEQ ID NO:72); i serotip III (SEQ ID NO:73)), Staphylococcus aureus (soj COL (SEQ ID NO:74); soj MRSA252 (SEQ ID NOS:75 i 76); soj MSSA476 (SEQ ID NO:77); soj NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); soj goveđi RF122 (SEQ ID NOS:79 i 80); i soj USA300 (SEQ ID NO:81)), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO:82); soj ATCC BAA-255 / R6 (SEQ ID NO:83); i serotip 2, soj D39 / NCTC 7466 (SEQ ID NO:84)), Streptococcus pyogenes (serotip M1 (SEQ ID NO:85); serotip M2, soj MGAS10270 (SEQ ID NO:86); serotip M4, soj MGAS10750 (SEQ ID NO:87); serotip M6 (SEQ ID NO:88); serotip M12, soj MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 i 90); serotip M12, soj MGAS9429 (SEQ ID NO:91); i serotip M28 (SEQ ID NO:92)); Streptococcus suis (SEQ ID NOS:93-95); Vibrio fischeri (soj ATCC 700601/ ES114 (SEQ ID NO:96)), i enzim hijaluronidazu iz Streptomyces hyaluronolyticus, koji je specifičan za hijaluronsku kiselinu i ne seče hondroitin ili hondroitin sulfat (Ohya, T. i Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607).
(c) Hijaluronidaze iz pijavica, drugih parazita i ljuskara
[0213] Hijaluronidaze iz pijavica, drugih parazita i ljuskara (EC 3.2.1.36) su endo-βglukuronidaze koje stvaraju tetra- i heksasaharidne krajnje proizvode. Ovi enzimi katalizuju hidrolizu 1→3-veza između ostataka β-D-glukuronata i N-acetil-D-glukozamina u hijaluronatu. Primeri hijaluronidaze iz pijavica uključuju, ali nisu ograničeni na hijaluronidazu iz Hirudinidae (npr., Hirudo medicinalis), Erpobdellidae (npr., Nephelopsis obscura i Erpobdella punctata,), Glossiphoniidae (npr., Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata, Placobdella ornata i Theromyzon sp.) i Haemopidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.
124(3):319-26). Primeri hijaluronidaza iz bakterija koje imaju isti mehanizam dejstva kao hijaluronidaza pijavice su one iz cijanobakterija, Synechococcus sp. (soj RCC307, SEQ ID NO:97).
ii. Drugi enzimi koji razgrađuju hijaluronan
[0214] Pored familije hijaluronidaza, drugi enzimi koji razgrađuju hijaluronan mogu da se koriste u obezbeđenim kompozicijama, kombinacijama i postupcima. Na primer, enzimi, uključujući naročito hondroitinaze i lijaze, koji imaju sposobnost da seku hijaluronan mogu da se koriste. Primeri hondroitinaza koje mogu da razgrađuju hijaluronan uključuju, ali nisu ograničeni na hondroitin ABC lijazu (takođe poznatu kao hondroitinaza ABC), hondroitin AC lijazu (takođe poznatu kao hondroitin sulfat lijaza ili hondroitin sulfat eliminaza) i hondroitin C lijazu. Postupci za proizvodnju i prečišćavanje takvih enzima za upotrebu u obezbeđenim kompozicijama, kombinacijama i postupcima poznati su u stanju tehnike (npr., SAD patent br. 6,054,569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem.160(30):1849-1857).
[0215] Hondroitin ABC lijaza sadrži dva enzima, hondroitin-sulfat-ABC endolijazu (EC 4.2.2.20) i hondroitin-sulfat-ABC egzolijazu (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol Chem.
272(14):9123-30), koji razgrađuju različite glikozaminoglikane tipa hondroitin-sulfata i dermatan-sulfata. Hondroitin sulfat, hondroitin-sulfat proteoglikan i dermatan sulfat su poželjni supstrati za hondroitin-sulfat-ABC endolijazu, ali enzim takođe može da deluje na hijaluronan po nižoj stopi. Hondroitin-sulfat-ABC endolijaza razgrađuje različite glikozaminoglikane hondroitin-sulfatnog i dermatan-sulfatnog tipa, proizvodeći smešu Δ4-nezasićenih oligosaharida različitih veličina koji se na kraju razgrađuju do Δ4- nezasićenih tetra- i disaharida. Hondroitin-sulfat-ABC egzolijaza ima istu supstratsku specifičnost ali uklanja disaharidne ostatke sa neredukujućih krajeva polimernih hondroitin sulfata i njihovih oligosaharidnih fragmenata proizvedenih pomoću hondroitin-sulfat-ABC endolijaze (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). Primeri hondroitin-sulfat-ABC endolijaza i hondroitin-sulfat-ABC egzolijaza uključuju, ali nisu ograničeni na one iz Proteus vulgaris i Flavobacterium heparinum (hondroitin-sulfat-ABC endolijaza iz Proteus vulgaris je prikazana u SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol.41(1):39-46).
[0216] Hondroitin AC lijaza (EC 4.2.2.5) je aktivna na hondroitin sulfatima A i C, hondroitinu i hijaluronskoj kiselini, ali nije aktivna na dermatan sulfatu (hondroitin sulfat B). Primeri enzima hondroitinaza AC iz bakterija uključuju, ali nisu ograničeni na one iz Flavobacterium heparinum i Victivallis vadensis, navedene u SEQ ID NOS:99 odnosno 100, i Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
[0217] Hondroitinaza C seče hondroitin sulfat C proizvodeći tetrasaharid i nezasićeni 6-sulfatisani disaharid (delta Di-6S). Ona takođe seče hijaluronsku kiselinu proizvodeći nezasićeni nesulfatisani disaharid (delta Di-OS). Primeri enzima hondroitinaza C iz bakterija uključuju, ali nisu ograničeni na one iz Streptococcus i Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
iii. Rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan
[0218] Ovde su obezbeđeni u kompozicijama, kombinacijama, upotrebama i postupcima rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan, uključujući rastvorljive hijaluronidaze. Rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan uključuju bilo koje enzime koji razgrađuju hijaluronan koji se sekretuju iz ćelija (npr. CHO ćelija) nakon ekspresije i postoje u rastvorljivom obliku. Takvi enzimi uključuju, ali nisu ograničeni na rastvorljive hijaluronidaze, uključujući nehumane rastvorljive hijaluronidaze, uključujući nehumane životinjske rastvorljive hijaluronidaze, bakterijske rastvorljive hijaluronidaze i humane hijaluronidaze, Hyal1, goveđu PH20 i ovčiju PH20, njihove alelne varijante i druge njihove varijante. Na primer, u rastvorljive enzime koji razgrađuju hijaluronan uključeni su bilo koji enzimi koji razgrađuju hijaluronan koji su modifikovani tako da budu rastvorljivi. Na primer, enzimi koji razgrađuju hijaluronan koji sadrže GPI sidro mogu da budu učinjeni rastvorljivim skraćivanjem i uklanjanjem celog ili dela GPI sidra. U jednom primeru, humana hijaluronidaza PH20, koja je normalno usidrena za membranu preko GPI sidra, može da bude učinjena rastvorljivom skraćivanjem i uklanjanjem celog ili dela GPI sidra na C-terminusu.
[0219] Rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan takođe uključuju hijaluronidaze koje su aktivne u neutralnoj sredini i u kiseloj sredini. U zavisnosti od faktora kao što je, ali bez ograničenja, željeni nivo aktivnosti enzima nakon primene i/ili mesta primene, hijaluronidaze aktivne u neutralnoj sredini i u kiseloj sredini mogu da budu odabrane. U određenom primeru, enzim koji razgrađuje hijaluronan za upotrebu u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde dati je rastvorljiva hijaluronidaza koja je aktivna u neutralnoj sredini.
[0220] Primeri hijaluronidaze uključuju rastvorljivi oblik PH20 iz bilo koje vrste, kao što je rastvorljivi oblik PH20 bilo koje od sekvenci SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65, 101-102 i 199-210. Takvi rastvorljivi oblici uključuju njihove skraćene oblike kojima nedostaje ceo ili deo C-terminalnog GPI sidra, sve dok je hijaluronidaza rastvorljiva (sekretovana nakon ekspresije) i zadržava hijaluronidaznu aktivnost. Takvi oblici su takođe tipično zreli oblici kojima, kada su eksprimirani u ćeliji, nedostaje signalni peptid. U rastvorljive hijaluronidaze takođe su uključeni rastvorljivi oblici varijanti bilo koje od PH20 bilo koje vrste navedene u SEQ ID NOS:1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65,101-102 i 199-210, ili njihovi skraćeni oblici, koji ispoljavaju hijaluronidaznu aktivnost. Varijante uključuju polipeptide koji imaju 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65, 101-102 i 199-210, njihovim zrelim (npr. bez signalne sekvence) ili skraćenim oblicima. Aminokiselinske varijante uključuju konzervativne i nekonzervativne mutacije. Podrazumeva se da su ostaci koji su važni ili na drugi način neoprodni za aktivnost hijaluronidaze, kao što su bilo koji gore opisani ili oni koji su poznati stručnjaku u oblasti, uopšteno invarijantni i ne mogu da se menjaju. Oni uključuju, na primer, ostatke aktivnih mesta. Tako, na primer, aminokiselinski ostaci 111, 113 i 176 (koji odgovaraju ostacima u zrelom PH20 polipeptidu navedenom u SEQ ID NO:2) humanog PH20 polipeptida, ili njegovog rastvorljivog oblika, uopšteno invarijantni i nisu izmenjeni. Drugi ostaci koji obezbeđuju glikozilaciju i obrazovanje disulfidnih veza potrebnih za pravilno sklapanje takođe mogu da budu invarijantni.
[0221] U nekim slučajevima, rastvorljivi enzim koji razgrađuje hijaluronan je normalno GPI-usidren (kao što je, na primer, humana PH20) i učinjen je rastvorljivim skraćivanjem na C-terminusu. Takvo skraćivanje može da ukloni celu signalnu sekvencu za vezivanje za GPI sidro, ili može da ukloni samo deo signalne sekvence za vezivanje za GPI sidro. Rezultujući polipeptid je, međutim, rastvorljiv. U slučajevima kada rastvorljivi enzim koji razgrađuje hijaluronan zadržava deo signalne sekvence za vezivanje za GPI sidro, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više aminokiselinskih ostataka u signalnoj sekvenci za vezivanje GPI-sidra može da bude zadržano, pod uslovom da je polipeptid rastvorljiv. Polipeptidi koja sadrže jednu ili više aminokiselina GPI sidra nazivaju se produženi rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan. Stručnjak u odgovarajućoj oblasti može da odredi da li je polipeptid GPI-usidren korišćenjem postupaka dobro poznatih u stanju tehnike. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na korišćenje poznatih algoritama za predviđanje prisustva i lokacije signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra i ω-mesta, i izvođenje ispitivanja rastvorljivosti pre i posle digestije sa fosfatidilinozitol-specifičnom fosfolipazom C (PI-PLC) ili D (PI-PLD).
[0222] Produženi rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan mogu da budu proizvedeni skraćivanjem na C-terminalnom kraju bilo kog prirodnog GPI-usidrenog enzima koji razgrađuje hijaluronan tako da rezultujući polipeptid bude rastvorljiv i sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra (videti, npr., SAD objavljenu pat. prijavu br. US20100143457). Primeri produženih rastvorljivih enzima koji razgrađuju hijaluronan koji su C-terminalno skraćeni ali su zadržali deo signalne sekvence za vezivanje GPI sidra uključuju, ali nisu ograničeni na produžene rastvorljive PH20 (esPH20) polipeptide poreklom od primata, kao što su, na primer, esPH20 polipeptidi čoveka i šimpanze. Na primer, esPH20 polipeptidi mogu da budu napravljeni C-terminalnim skraćivanjem bilo kog od zrelih ili prekursorskih polipeptida navedenih u sekvencama SEQ ID NOS:1, 2, 50, 51 ili 101, ili drugih njihovih varijanti, uključujući njihov aktivni fragment, pri čemu je rezultujući polipeptid rastvorljiv i zadržava jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra. Varijante uključuju polipeptide koji imaju 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NOS: 1, 2, 50, 51 ili 101 koja zadržava hijaluronidaznu aktivnost. Polipeptidi esPH20 koji su ovde obezbeđenu mogu da budu C-terminalno skraćeni za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselina u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa, kao što je polipeptid sa sekvencom navedenom u sekvencama SEQ ID NOS: 1, 2, 50, 51 ili 101, pod uslovom da je rezultujući esPH20 polipeptid rastvorljiv i da zadržava 1 ili više aminokiselinskih ostataka iz signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra.
[0223] Tipično, za upotrebu u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde dati, koristi se rastvorljivi humani enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljivi humani PH20. Iako enzimi koji razgrađuju hijaluronan, kao što je PH20, drugih životinja mogu da budu korišćeni, takvi preparati su potencijalno imunogeni, budući da predstavljaju životinjske proteine. Na primer, značajan udeo pacijenata ispoljavaju prethodnu senzitizaciju sekundarnu prema ingestiranoj hrani, i budući da su to životinjski proteini, svi pacijenti imaju rizik od naknadne sensitizacije. Prema tome, nehumani preparati mogu da ne budu pogodni za hroničnu upotrebu. Ukoliko su poželjni nehumani preparati, ovde je razmatrano da takvi polipeptidi mogu da budu pripremljeni tako da imaju smanjenu imunogenost. Takve modifikacije su na nivou veštine u struci i mogu da uključuju, na primer, uklanjanje i/ili zamenu jednog ili više antigenih epitopa na molekulu.
[0224] Enzimi koji razgrađuju hijaluronan, uključujući hijaluronidaze (npr., PH20), koji su ovde korišćeni u postupcima mogu da budu rekombinantno proizvedeni ili mogu da budu prečišćeni ili delimično prečišćeni iz prirodnih izvora, kao što je, na primer, iz ekstrakta testisa. Postupci za proizvodnju rekombinantnih proteina, uključujući rekombinantne enzime koji razgrađuju hijaluronan, obezbeđeni su na drugom mestu u ovom tekstu i dobro su poznati u struci.
(a) Rastvorljiva humana PH20
[0225] Primer rastvorljive hijaluronidaze je rastvorljiva humana PH20. Rastvorljivi oblici rekombinantne humane PH20 su proizvedeni i mogu da se koriste u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde opisani. Proizvodnja takvih rastvorljivih oblika PH20 opisana je u SAD objavljenoj patentnoj prijavi br. US20040268425; US20050260186, US20060104968, US20100143457 i međunarodnoj PCT objavi br. WO2009111066. Na primer, rastvorljivi PH20 polipeptidi, uključuju C-terminalno skraćene varijante polipeptida koje uključuju aminokiselinsku sekvencu u SEQ ID NO:1 ili 2, ili imaju najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ili 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom uključenom u SEQ ID NO:1 ili 2, zadržavaju hijaluronidaznu aktivnost i rastvorljivi su. Među ove polipeptide uključeni su rastvorljivi PH20 polipeptidi kojima u potpunosti nedostaje ceo ili deo signalne sekvence za vezivanje GPI-sidra.
[0226] Takođe su uključeni produženi rastvorljivi PH20 (esPH20) polipeptidi koji sadrže najmanje jednu aminokiselinu GPI sidra. Tako, umesto da imaju GPI sidro kovalentno vezano za C-terminus proteina u ER i da su usidreni na ekstracelularnu laminu plazma membrane, ovu polipeptidi se sekretuju i rastvorljivi su. C-terminalno skraćeni PH20 polipeptidi mogu da budu C-terminalno skraćeni za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više aminokiselina u poređenju sa celom dužinom polipeptida divljeg tipa, kao što je cela dužina polipeptida divljeg tipa sa sekvencom navedenom u SEQ ID NOS:1 ili 2, ili njihove alelske varijante, ili varijante vrsta, ili druge varijante.
[0227] Na primer, rastvorljivi oblici uključuju, ali nisu ograničeni na C-terminalno skraćene polipeptide humane PH20 navedene u SEQ ID NO:1 koji imaju C-terminalne aminokiselinske ostatke 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 i 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ili 500 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:1, ili polipeptidi koji ispoljavaju najmanje 85% identičnosti sa njima. Rastvorljivi oblici humane PH20 uopšteno uključuju one koji sadrže aminokiseline 36-464 navedene u SEQ ID NO:1. Na primer, kada su eksprimirani u sisarskim ćelijama, N-terminalna signalna sekvenca od 35 aminokiselina se iseca tokom obrade, i zreli oblik proteina se sekretuje. Prema tome, zreli rastvorljivi polipeptidi sadrže aminokiseline 36 do 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 i 483 sekvence SEQ ID NO:1. Tabela 3 obezbeđuje neograničavajuće primere C-terminalno skraćenih PH20 polipeptida, uključujući C-terminalno skraćene rastvorljive PH20 polipeptide. U tabeli 3 u nastavku, u kojoj je data dužina (u aminokiselinama) prekursora i zrelih polipeptida, i identifikator sekvence (SEQ ID NO), prikazani su primeri aminokiselinskih sekvenci prekursorskih i zrelih polipeptida C-terminalno skraćenih PH20 proteina. PH20 polipeptid divljeg tipa je takođe uključen u tabelu 3 radi poređenja. Konkretno, primeri rastvorljive hijaluronidaze su rastvorljivi humani PH20 polipeptidi dužine 442, 443, 444, 445, 446 ili 447 aminokiselina, kao što je navedeno u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 4-9, ili njihove alelske varijante, ili varijante vrsta, ili druge varijante.
[0228] Na primer, rastvorljivi oblici PH20 uključuju, na primer, polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189, ili aminokiselinsku sekvencu koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u bolo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
[0229] Uopšteno rastvorljivi oblici PH20 se proizvode upotrebom sistema za ekspresiju proteina koji olakšavaju ispravnu N-glikozilaciju da bi se osiguralo da polipeptid zadržava aktivnost, budući da je glikozilacija važna za katalitičku aktivnost i stabilnost hijaluronidaze. Takve ćelije uključuju, na primer ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO) (npr. DG44 CHO ćelije).
(b) rHuPH20
[0230] Rekombinantni rastvorljivi oblici humane PH20 su stvoreni i mogu da se koriste u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde obezbeđeni. Dobijanje takvih rastvorljivih oblika rekombinantne humane PH20 je opisano, na primer, u SAD objavljenim patentnim prijavama br. US20040268425; US 20050260186; US20060104968; US20100143457; i međunarodnoj PCT prijavi br. WO2009111066. Primeri takvih polipeptida su oni dobijeni ekspresijom molekula nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiseline 1-482 (navedene u SEQ ID NO:3). Primer takvog molekula nukleinske kiseline prikazan je u SEQ ID NO:49. Posttranslaciona obrada uklanja signalnu sekvencu od 35 aminokiselina, ostavljajući 447 aminokiselina dugu rastvorljivu rekombinantnu humanu PH20 (SEQ ID NO:4). Budući da je proizveden u medijumu kulture, na njegovom C-terminalnom kraju se javlja heterogenost, tako da proizvod, označen kao rHuPH20, uključuje smešu vrsta koje mogu da uključuju bilo koju jednu ili više od sekvenci SEQ ID NOS.4-9 sa različitom zastupljenošću. Tipično, rHuPH20 se proizvodi u ćelijama koje olakšavaju ispravnu N-glikozilaciju da bi se očuvala aktivnost, kao što su CHO ćelije (npr. DG44 CHO ćelije).
iv. Glikozilacija enzima koji razgrađuju hijaluronan
[0231] Glikozilacija, uključujući N- i O-vezanu glikozilaciju, nekih enzima koji razgrađuju hijaluronan, uključujući hijaluronidaze, može da bude važna za njihovu katalitičku aktivnost i stabilnost. Dok izmena tipa glikana koji modifikuje glikoprotein može da ima dramatične efekte na antigenost, strukturno uvijanje, rastvorljivost i stabilnost proteina, smatra se da većina enzima ne zahteva glikozilaciju za optimalnu enzimsku aktivnost. Za neke hijaluronidaze, uklanjanje N-vezane glikozilacije može da rezultuje u gotovo potpunoj inaktivaciji hijaluronidazne aktivnosti. Prema tome, za takve hijaluronidaze, prisustvo N-vezanih glikana je kritično za stvaranje aktivnog enzima.
[0232] N-vezani oligosaharidi pripadaju nekoliko glavnih tipova (oligomanoza, kompleksni, hibridni, sulfatni), od kojih svi imaju (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-jezgra povezana preko amidnog azota u Asn ostacima koji pripadaju -Asn-Xaa-Thr/Ser-sekvencama (gde Xaa nije Pro). Glikozilacija na -Asn-Xaa-Cys-mestu je prijavljena kod koagulacionog proteina C. U nekim slučajevima, enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, može da sadrži i N-glikozidne i O-glikozidne veze. Na primer, PH20 ima O-vezane oligosaharide kao i N-vezane oligosaharide. Postoji šest potencijalnih N-vezanih glikozilacionih mesta na N82, N166, N235, N254, N368, N393 humane PH20 prikazane u SEQ ID NO: 1. Aminokiselinski ostataci N82, N166 i N254 su zauzeti glikanima kompleksnog tipa, dok su aminokiselinski ostataci N368 i N393 zauzeti glikanima tipa sa visokim sadržajem manoze. Aminokiselinski ostatak N235 je približno 80% zauzet glikanima tipa sa visokim sadržajem manoze i 20% glikanima kompleksnog tipa. Kao što je gore napomenuto, O-vezana glikozilacija na S490 nije neophodna za hijaluronidaznu aktivnost.
[0233] U nekim primerima, enzimi koji razgrađuju hijaluronan za upotrebu u obezbeđenim kompozicijama, kombinacijama i/ili postupcima su glikozilovani na jednom ili svim glikozilacionim mestima. Na primer, za humanu PH20, ili njen rastvorljivi oblik, 2, 3, 4, 5, ili 6 od N-glikozilacionih mesta koja odgovaraju aminokiselinama N82, N166, N235, N254, N368, i N393 of SEQ ID NO: 1 su glikozilovana. U nekim primerima enzimi koji razgrađuju hijaluronan su glikozilovani na jednom ili više nativnih glikozilacionih mesta. U drugim primerima, enzimi koji razgrađuju hijaluronan su modifikovani na jednom ili više glikozilacionih mesta koja nisu nativna, da bi se omogućila glikozilacija polipeptida na jednom ili više dodatnih mesta. U takvim primeri, vezivanje dodatnih fragmenata šećera može da poboljša farmakokinetička svojstva molekula, kao što je poboljšani polu-život i/ili poboljšana aktivnost.
[0234] U drugim primerima, enzimi koji razgrađuju hijaluronan za upotrebu u kompozicijama, kombinacijama i/ili postupcima koji su ovde obezbeđeni su delimično deglikozilovani (ili N-delimično glikozilovani polipeptidi). Na primer, delimično deglikozilovani rastvorljivi PH20 polipeptidi koji zadržavaju svu ili deo hijaluronidazne aktivnosti potpuno glikozilovane hijaluronidaze mogu da se koriste u kompozicijama, kombinacijama i/ili postupcima koji su ovde obezbeđeni. Primeri delimično deglikozilovanih hijalurodinaza uključuju rastvorljive oblike delimično deglikozilovanih PH20 polipeptida bilo koje vrste, kao što je bilo koja navedena u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101-102 i 199-210, ili njihove alelske varijante, ili varijante vrsta, ili druge varijante. Takve varijante su poznate stručnjaku u oblasti, i uključuju polipeptide koji imaju 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101-102 i 199-210, ili njihovim skraćenim oblicima. Delimično deglikozilovane hijaluronidaze koje su ovde obezbeđene takođe uključuju hibridne, fuzione i himerne delimično deglikozilovane hijaluronidaze, i konjugate delimično deglikozilovane hijaluronidaze.
[0235] Glikozidaze, ili glikozid hidrolaze, su enzimi koji katalizuju hidrolizu glikozidne veze čime nastaju dva manja šećera. Glavni tipovi N-glikana kod kičmenjaka uključuju glikane sa visokim sadržajem manoze, hibridne glikane i kompleksne glikane. Postoji nekoliko glikozidaza koje rezultuju samo u delimičnoj deglikozilaciji proteina, uključujući: EndoF1, koja seče glikane sa visokim sadržajem manoze i hibridne glikane; EndoF2, koja seče glikane biantenarnog kompleksnog tipa; EndoF3, koja seče biantenarne i granatije kompleksne glikane; i EndoH, koja seče glikane sa visokim sadržajem manoze i hibridne glikane. Obrada enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza, kao što je rastvorljiva PH20, jednom ili svim ovim glikozidazama može da rezultuje u samo delimičnoj deglikozilaciji i, stoga, očuvanju hijaluronidazne aktivnosti.
[0236] Delimično deglikozilovani enzimi koji razgrađuju hijaluronan, kao što su delimično deglikozilovane rastvorljive hijaluronidaze, mogu da budu proizvedeni digestijom sa jednom ili više glikozidaza, uopšteno glikozidazom koja ne uklanja sve N-glikane, već samo delimično deglikoziluje protein. Na primer, obrada PH20 (npr. rekombinantne PH20 označene kao rHuPH20) jednom ili svim gore navedenim glikozidazama (npr. EndoF1, EndoF2 i/ili EndoF3) rezultuje u delimičnoj deglikozilaciji. Ovi delimično deglikozilovani PH20 polipeptidi mogu da ispoljavaju hijaluronidaznu enzimsku aktivnost koja se može uporediti sa potpuno glikozilovanim polipeptidima. Nasuprot tome, obrada PH20 sa PNGaseF, glikozidazom koja iseca sve N-glikane, rezultuje u potpunom uklanjanju svih N-glikana i stoga čini PH20 enzimski neaktivnom. Tako, iako sva N-vezana glikozilaciona mesta (kao što su, na primer, ona na aminokiselinama N82, N166, N235, N254, N368, i N393 humane PH20, prikazane u SEQ ID NO: 1) mogu da budu glikozilovana, tretman sa jednom ili više glikozidaza može da učini stepen glikozilacije nižim u poređenju sa hijaluronidazom koja nije digestirana sa jednom ili više glikozidaza.
[0237] Delimično deglikozilovani enzimi koji razgrađuju hijaluronan, uključujući delimično deglikozilovane rastvorljive PH20 polipeptide, mogu da imaju 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80% nivoa glikozilacije potpuno glikozilovanog polipeptida. U jednom primeru, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 od N-glikozilacionih mesta koja odgovaraju aminokiselinama N82, N166, N235, N254, N368, i N393 u SEQ ID NO:1 su delimično deglikozilovana, tako da više ne sadrže glikane tipa sa visokim sadržajem manoze ili kompleksnog tipa, već pre sadrže najmanje N-acetilglukozaminski fragment. U nekim primerima, 1, 2 ili 3 od N-glikozilacionih mesta koja odgovaraju aminokiselinama N82, N166 i N254 u SEQ ID NO:1 su deglikozilovana, odnosno, ne sadrže šećerni fragment. U drugim primerima, 3, 4, 5, ili 6 od N-glikozilacionih mesta koja odgovaraju aminokiselinama N82, N166, N235, N254, N368, i N393 u SEQ ID NO:1 su glikozilovana. Glikozilovani aminokiselinski ostataci minimalno sadrže N-acetilglukozaminski fragment. Tipično, delimično degliklozilovani enzimi koji razgrađuju hijaluronan, uključujući delimično deglikozilovane rastvorljive PH20 polipeptide, ispoljavaju hijaluronidaznu aktivnost koja predstavlja 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% ili više od hijaluronidazne aktivnosti koju ispoljava potpuno glikozilovani polipeptid.
v. Modifikovani (konjugovani sa polimerom) enzimi koji razgrađuju hijaluronan
[0238] Kovalentno ili drugo stabilno vezivanje (konjugacija) polimernih molekula, kao što je polietilen glikol (PEG-ilacioni fragment (PEG)), za enzime koji razgrađuju hijaluronan, kao što su hijaluronidaze, donosi korisna svojstva rezultujućoj kompoziciji enzim koji razgrađuje hijaluronan-polimer. Takva svojstva uključuju poboljšanu biokompatibilnost, produžavanje polu-života proteina (i enzimske aktivnosti) u krvi, ćelijama i/ili u drugim tkivima u subjektu, efektivnu zaštitu proteina od proteaza i hidrolize, poboljšanu biološku raspodelu, poboljšanu farmakokinetiku i/ili farmakodinamiku, i povećanu rastvorljivost u vodi.
[0239] Primeri polimera koji mogu da budu konjugovani enzimom koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, uključuju prirodne i sintetske homopolimere, kao što su polioli (tj. poli-OH), poliamini (tj. poli-NH2) i polikarboksilne kiseline (tj. poli-COOH), i dalje heteropolimere tj. polimere koji sadrže jednu ili više različitih kuplujućih grupa npr. hidroksilnu grupu i aminske grupe. Primeri pogodnih polimernih molekula uključuju polimerne molekule odabrane između polialkilen oksida (PAO), kao što su polialkilen glikoli (PAG), uključujući polietilen glikole (PEG), metoksipolietilen glikole (mPEG) i polipropilen glycole, PEG-glicidil etre (Epox-PEG), PEG-oksikarbonilimidazol (CDI-PEG) granate polietilen glikole (PEG), polivinil alkohol (PVA), poli(etilenimin) (PEI), linearne poliamidoamine, poliakrilamid (PAAm), polidimetilakrilamid (PDAAm), polivinil alkhol (PVA), polikarboksilate, polivinilpirolidon (PVP), poli-D,L-aminokiseline, anhidrid polietilen-ko-maleinske kiseline, anhidrid polistiren-ko-maleinske kiseline, dekstrane uključujući karboksimetil-hitosan, dekstrin, dekstrane, heparin, homologi albumin, celuloze, uključujući metilcelulozu, karboksimetilcelulozu, etilcelulozu, hidroksietilcelulozu karboksietilcelulozu i hidroksipropilcelulozu, hidrolizate hitosana, skrobove kao što su hidroksietil-skrobovi i hidroksipropil-skrobovi, glikogen, agaroze i njihovi derivati, guar gume, pululan, inulin, ksantan guma, karagenan, pektin, hidrolizati alginske kiseline i biopolimeri.
[0240] Obično su polimeri polialkilen oksidi (PAO), kao što su polietilen oksidi, kao što je PEG, obično mPEG, koji u poređenju sa polisaharidima kao što su dekstran i pululan, imaju malo reaktivnih grupa koje mogu da se umrežavaju. Obično su polimeri netoksični polimerni molekuli kao što su (m)polietilen glikol (mPEG), koji mogu da se kovalentno konjuguju sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza (npr. sa grupama za vezivanje na površini proteina) korišćenjem relativno jednostavne hemije.
[0241] Objavljeno je da pegilovanje terapeutika povećava otpornost na proteolizu, povećava poluživot u plazmi i da smanjuje antigenost i imunogenost. Primeri metodologija PEG-ilacije su poznati u stanju tehnike (videti na primer, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994; Lu i Felix, Peptide Res., 6:140-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46:253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154:3088-95, 1995; videti takođe, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev.
55(10):1261-77 i Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). PEG-ilacija takođe može da se koristi za dostavu molekula nukleinske kiseline in vivo. Na primer, PEG-ilacija adenovirusa može da poveća stabilnost i genski transfer (videti, npr., Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9):1444-51).
[0242] Podesni polimerni molekuli za vezivanje za enzime koji razgrađuju hijaluronan, uključujući hijaluronidaze obuhvataju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG) i PEG derivate, kao što su metoksi-polietilen glikoli (mPEG), PEG-glicidil etri (Epox-PEG), PEG-oksikarbonilimidazol (CDI-PEG), razgranati PEGs, i polietilen oksid (PEO) (vidi npr. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review (2002) 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, (2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221; i Tsubery, (2004) J Biol. Chem 279(37):38118-24). Polimerni molekul može imati molekulsku težinu koja se obično nalazi u opsegu od oko 3 kDa do oko 60 kDa. U nekim primerima izvođenja polimerni molekul koji je konjugovan sa proteinom, kao što je hijaluronidaza, na primer PH20, ima molekulsku težinu imeđu, ili oko između 5 i 60 kDa, kao što je najmanje, ili oko najmanje ili 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više od 60 kDa.
PEG-ilovani rastvorljivi enzimi koji razgrađuju hijaluronan
[0243] Enzim koji razgrađuje hijaluronan koji se koristi u kombinacijama i postupcima koji su ovde dati može da bude PEG-ilovani enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je PEG-ilovani rastvorljivi enzim koji razgrađuje hijaluronan. U jednom primeru, to je PEG-ilovana rastvorljiva hijaluronidaza, npr. PEG-ilovana PH20. Različite metode modifikacije polipeptida kovalentnim vezivanjem (konjugacijom) PEG ili PEG derivata (tj. "PEG-ilacija") su poznate iz odgovarajuće oblasti (videti npr., U.S. 2006/0104968; U.S. 5,672,662; U.S.
6,737,505; i U.S. 2004/0235734). Tehnike za PEG-ilaciju obuhvataju, ali nisu ograničene na specijalizovane linkere i hemikalije za kuplovanje (videti npr., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), vezivanje višestrukih PEG radikala za samo jedno mesto konjugacije (kao što je primenom razgranatih PEG; videti npr., Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), mesto-specifičnu PEG-ilaciju i/ili mono-PEG-ilaciju (videti npr., Chapman et al., Nature Biotech.17:780-783, 1999), i mesto-specifičnu enzimsku PEG-ilaciju (videti npr., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Postupci i tehnike koji su opisani u odgovarajućoj oblasti mogu proizvesti proteine koji imaju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 PEG ili PEG derivata koji su vezani za samo jedan molekul proteina (videti npr., U.S.2006/0104968).
[0244] U stanju tehnike su opisani brojni reagensi za PEG-ilaciju. Takvi reagensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na N-hidroksisukcinimidil (NHS) aktivirani PEG, sukcinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroksisukcinimid, mPEG sukcinimidil alfa-metilbutanoat, mPEG sukcinimidil propionat, mPEG sukcinimidil butanoat, mPEG sukcinimidil estar karboksimetil 3-hidroksibutanoinske kiseline, homobifunkcionalni PEG-sukcinimidil propionat, homobifunkcionalni PEG propionaldehid, homobifunkcionalni PEG butiraldehid, PEG maleimid, PEG hidrazide, p-nitrofenil-karbonat PEG, mPEG-benzotriazol karbonat, propionaldehid PEG, mPEG butiraldehid, razgranati mPEG2 butiraldehid, mPEG acetil, mPEG piperidon, mPEG metilketon, mPEG "bezlinkerski" maleimid, mPEG vinil sulfon, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioestar, mPEG ortopiridil disulfid, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfon PEG-NHS, akrilat PEG-NHS, fluorescein PEG-NHS, i biotin PEG-NHS (videti npr., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polimers 12:197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S.
6,495,659; U.S.6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S.4,179,337; U.S.5,122,614; U.S. 5,324, 844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S. 5,766,581; U.S. 5,795, 569; U.S.
5,808,096; U.S.5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S.5,985,263; U.S.5,990, 237; U.S.6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S.
6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; U.S. 6,858,736; U.S.
2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S.
2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S.
2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO0500360; U.S. 2005/0114037; U.S.2005/0171328; U.S.2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; i WO 0187925).
2. Taksani i njihove formulacije
[0245] Kombinovana terapija, uključujući kompozicije, kombinacije i postupke i njihovu upotrebu, koja je ovde obezbeđena sadrži taksan. Taksani su uopšteno slabo rastvorljivi, u vodi što ograničava njihovu terapijsku upotrebu. U kompozicijama i kombinacijama koje su ovde obezbeđene, taksani su obezbeđeni kao formulacije koje ispoljavaju rastvorljivost u vodi. U konkretnim primerima koji su ovde obezbeđeni, taksani su obezbeđenu kao formulacije koje ciljno deluju i/ili prodiru u stromu ili ćelije tumora. Primer takve formulacije taksana je taksan vezan za albumin.
a. Taksani
[0246] Taksani su diterpeni koji se proizvode iz biljaka roda Taxus (tisa). Taksani su antimitotska sredstva koja se vezuju za tubulin i deluju tako što stabilizuju polimerizaciju mikrotubula, remeteći tako normalnu ravnotežu uključenu u sklapanje i rasklapanje mikrotubula i zaustavljajući funkcionisanje mikrotubula. Dok taksani pospešuju obrazovanje mikrotubula, oni sprečavaju depolimerizaciju tubulina koji obrazuje mikrotubule mitotičkog vretena. Mikrotubule imaju suštinski značaj za deobu ćelija i ćelije izložene taksanima se zaustavljaju u premitotičkoj G2 fazi i ne uspevaju da se podele. Ovi lekovi prema tome interferiraju sa procesom ćelijske deobe budući da su ćelije tretirane ovim lekovima zadržane u mitozi. Ovo na kraju može da rezultuje u ćelijskoj smrti zbog neuspele mitoze.
[0247] Taksani takođe stvaraju reaktivne kiseonične vrste (ROS), uključujući nakupljanje O2i H2O2u tretiranim ćelijama. Nakupljanje ROS je povezano sa neposrednom citotoksičnom aktivnošću taksana, uključujući paklitaksel, kao i za „efekat posmatrača“ na susedne ćelije (videti npr. Alexandre et al. (2007) Cancer Res., 67:3512).
[0248] Taksani za upotrebu u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde obezbeđeni uključuju bilo koje diterpensko jedinjenje koje inhibira depolimerizaciju tubulina.
Naročito, takvi taksani takođe uključuju bilo koje od onih koji rezultuju u nakupljanju ROS u tretiranim ćelijama. Taksani uključuju one koji predstavljaju prečišćene oblike prirodno proizvedenog diterpena ili one koji su veštački sintetisani. Taksani uključuju one koji su nekristalni i/ili amorfni. Taksani takođe mogu da uključuju anhidrovane oblike taksana.
[0249] Paklitaksel (taksol) je diterpenoid koji se javlja u prirodi. Njegovo hemijsko ime je 5β,20-epoksi-1,2α,4,7β,10β,13α-heksahidroksitaks-11-en-9-on 4,10-diacetat 2-benzoat. Taksol je nađen u kori stabla pacifičke tise, Taxus brevifolia, kao i u T. baccata i T. cuspidata. Prvo je izolovana iz kore drveta pacifičke tise, Taxus brevifolia (Wani et al. (1971) J. Am. Chem. Soc., 93:2325).
A. Struktura jezgra paklitaksela sadrži četiri prstena (šestočlani A i C prstenovi, osmočlani B prsten i četvoročlani D prsten). Struktura paklitaksela je prikazana ispod, sa prikazanim brojevima prema uobičajenom sistemu za numerisanje ove klase lekova.
[0250] Paklitaksel može da bude pripremljen polu-sintetskim postupcima iz prekursorskih hemikalija nazvanih bakatini, koji potiču iz iglica i grančica drveta evropske ili himalajske tise. Na primer, paklitaksel može da bude može da se pripremi iz bakatina dodavanjem zaštitnih grupa na hidroksilne grupe bakatina koje će postati hidroksilne grupe paklitaksela, pretvaranjem prekursorskog bakatina u paklitaksel, i zatim uklanjanjem zaštitnih grupa sa hidroksilnih grupa da bi se dobio paklitaksel. Pored toga, paklitaksel je nedavno sintetisan iz jednostavnih prekursora. (Videti, npr., međunarodnu PCT objavu br. WO93/10076, WO93/16059; SAD pat. br. 5,200,534 SAD pat. br. 5,015,744; SAD pat. br. 4,960,790; Nicolaou (1993) Nature 364: 464-466; Nicolaou, K. C. et al. (1994) Nature, 367:630-634; i Holton et al. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116: 1597-1600).
[0251] Docetaksel (taksoter) je drugi primer taksana za upotrebu u kombinacijama i kompozicijama koji je ovde obezbeđen. Docetaksel ima hemijsko ime 1,7β,10β-trihidroksi-9-okso-5β,20-epoksitaks-11-en-2α,4,13α-triil 4-acetat 2-benzoat 13-{(2R,3S)-3-[(tercbutoksikarbonil)amino]-2-hidroksi-3-fenilpropanoat i ima strukturu prikazanu u nastavku sa prikazanim brojevima prema uobičajenom sistemu za numerisanje ove klase lekova.
[0252] Docetaksel je polu-sintetski, taksan druge generacije izveden iz jedinjenja nađenog u evropskoj tisi Taxus baccata. Docetaksel je esterifikovani proizvod 10-deacetil bakatina III, koji se ekstrahuje iz drveta evropske tise. Razlikuje se od paklitaksela na dva položaja u svojoj hemijskoj strukturi: nedostaje mu acetat estar, a na fenilpropionatnom bočnom lancu postoji terc-butil karbamatni estar umesto benzil amida u paklitakselu. Docetaksel, analog paklitaksela, proizvodi se polu-sintetski iz 10-deacetil bakatina III, necitotoksičnog prekursora ekstrahovanog iz iglica Taxus baccata i esterifikovanog sa hemijski sintetisanim bočnim lancem (Cortes and Pazdur, 1995, J. Clin. Oncol.13(10):2643-55).
[0253] Taksani za upotrebu u kompozicijama, kombinacijama i postupcima koji su ovde obezbeđeni uključuju analoge, derivate i oblike prolekova paklitaksela ili docetaksela. Takvi derivati taksana uključuju one koji ispoljavaju poboljšanu rastvorljivost u vodi u poređenju sa paklitakselom ili docetakselom. Na primer, derivati, analozi i prolekovi taksana uključuju u kojima su položaji u prstenu modifikovani ili derivatizovani, i naročito u kojima su položaji 2’ i 7 ili 10 derivatizovani pogodnim grupama (videti npr. Fu et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:1-13).
[0254] Na primer, derivati, analozi ili prolekovi taksana uključuju, ali bez ograničenja, taksole rastvorljive u vodi koji imaju različite supstituisane acil grupe na 2’-O-položaju (videti npr. SAD patent br. 4,942,184); taksole rastvorljive u vodi, u kojima je 2’ i/ili 7’ hidroksi grupa derivatizovana odabranom aminokiselinom ili jedinjenjem aminokiselinskim mimetikom (videti npr. SAD patent br.4,960,790); sulfonovani 2’-akriloil, sulfonovani 2’-O-acil taksol i supstituisani 2’-benzoil i 2’7-dibenzoil taksol (videti npr. SAD patente br. 5, 352,805 i 5,411,984); 2’i/ili 7-O-estar i 2’- i/ili 7-O-karbonatne derivate taksola (videti npr. SAD patent br. 5,817,840); taksanske derivate obrazovane konjugacijom sa polimerima kao što je polietilen glikol, poli(L-glutaminksa kiselina), poli(L-asparaginska kiselina) (videti npr. SAD patent br.5,977,163); oblike proleka taksana koji imaju fosfonooksi grupu na C-7, C-10 i/ili 2’-položaju bočnog lanca taksana (videti npr. WO9414787); soli 2’-sukcinilpaklitaksela i 2’glutarilpaklitaksela (Deutch et al. (1989) J. Med. Chem., 32:788-792); 2’ i 7-aminokiselinske derivate paklitaksela i njihove soli (Matthew et al. (1992) J. Med. Chem., 35:145-151); sulfonatne derivate (Zhao et al. (1991) J. Nat. Prod., 54:1607-1611); 7-fosfatne analoge paklitaksela (Vyas et al. (1993) Bioorg. Med. Chem., Lett., 3:1357-1360); 2’i 7-polietilen glikol estre paklitaksela (Greenwald et al. (1995) J. Org. Chem., 60:331-336; Greenwald et al. (1996) J. Med. Chem., 39:424-431); 2’ i 7-fosfonoksifenil-propionat paklitaksel (Ueda et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:1761-1766); 2’ i 7-metilpiridinijum acetatne analoge paklitaksela (Nicolaou et al. (1994) Angew Chemie, 106:1672-1675); Paloma et al. (1994) Chem. Biol., 1:107-112); prolek paklitaksela sa jabučnom kiselinom na 2’ položaju (Damen et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:427-432); sulfonatne soli taksana i naročito taksola (SAD patent br.5,059,699); derivate u kojima je dodat acil lanac za poboljšanje rastvorljivosti taksana u lipidima (videti npr. SAD patent br.
6,482,850); trihidratne oblike docetaksela koji ispoljavaju veću stabilnost od anhidrovanog proizvoda (videti npr. SAD patent br. 6,022,985 i 6,838,569); C-10 derivate taksana, uključujući one koji sadrže karbamatni fragment na položaju C-10 (SAD patent br.
8,138,361); hidrofobne derivate taksana (SAD patentna objava br. US20090263483); i hidrazid koji sadrži karboksilatne derivate taksana (videti npr. SAD patent br.8,133,888).
b. Taksani koji ciljno deluju na tumor ili stromu
[0255] Jedinjenja taksana obezbeđena u kompozicijama i kombinacijama u ovom tekstu se uopšteno pripremaju tako da ciljno deluju na tumor ili stromu koja okružuje tumor. Taksan u kompozicijama i kombinacijama koje su ovde obezbeđene, takođe je obezbeđen u vidu solubilizovanih ili nanodispergovanih formulacija koje ispoljavaju poboljšanu rastvorljivost.
[0256] Prirodno ili polu-sintetski proizvedeni paklitaksel (taksol) ima nedostatke kao što su niska rastvorljivost u vodi i nespecifično ciljno delovanje ili lokalizacija. Na primer, taksani, uključujući paklitaksel i docetaksel, su veoma slabo rastvorljivi u vodi (manje od 10 µg/mL), i kao rezultat, ne mogu da budu praktično formulisani sa vodenim medijumom za intravensku primenu. Da bi se rešili problemi rastvorljivosti u vodi, aktuelne formulacije paklitaksela su formulisane za intravensku primenu kod pacijenata sa kancerom u rastvoru sa polioksietilovanim ricinusovim uljem (Polyoxyl 35 ili Cremophor®) kao primarnim rastvaračem/surfaktantom, sa visokim koncentracijama etanola koji se koristi kao korastvarač. Slično paklitakselu, docetaksel je veoma slabo rastvorljiv u vodi. Trenutno, rastvaračem/surfaktant koji se koristi za rastvaranje docetaksela je polisorbat 80 (Tween 80) (Bissery et al.1991 Cancer Res.51(18):4845-52; Tomiak et al.1992). Etanol, Cremophor i/ili Tween u postojećim formulacijama su povezani sa pojavom reakcija preosetljivosti, koje mogu da uključuju ozbiljni kožni osip, urtikarije, crvenilo, dispneju, tahikardiju i drugo.
[0257] Dalje, povećanjem specifičnosti za kancersko tkivo, molekuli taksana ispoljavaju manju toksičnost zbog smanjenih sistemskih delovanja ili izlaganja. Tipično, taksan koji ciljno deluje na tumor je taksan, njegov derivat, analog ili prolek koji je konjugovan ili vezan neposredno ili posredno preko linkera za fragment za prepoznavanje tumora. Fragment za prepoznavanje tumora može da bude monoklonsko antitelo, protein, peptid, lipid ili makromolekulski kompleks koji prepoznaje tumor-specifični marker ili fragment koji se diferencijalno eksprimira na kancerskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama. Kancerske ćelije prekomerno eksprimiraju mnoge tumor-specifične markere ili receptore koji mogu da budu mesto ciljnog delovanja za dostavu taksana.
[0258] Taksan koji ciljno deluje na tumor može da bude obezbeđen kao micele, nanočestice, mikrosfere, lipozomi ili hidrogel formulacije. Takve formulacije mogu da se koriste kako bi se inkapsulirali aktivni sastojci kao što su taksani koji mogu da ispoljavaju nisku rastvorljivost u vodenom medijumu. Takve formulacije su dobro poznate stručnjaku u oblasti. U nekim primerima, vehikulum za dostavu je obložen ili konjugovan sa fragmentom koji ciljno deluje na tumor, kao što je makromolekulski kompleks, monoklonsko antitelo, protein, peptid ili lipid. Stoga, u nekim primerima, platforma za dostavu leka inkapsulira taksan, i sama prikazuje ligand koji ciljno deluje, ili druge polimerne prevlake na svojoj površini, za postizanje ciljnog delovanja na tumor.
[0259] Primeri taksana koji ciljno deluje na tumore i njihove formulacije, sadrže fragment koji ciljno deluje na tumor koji predstavlja makromolekul kao poli-L-glutamat (PGA-TXL, Xyotax; Li et al. (1998) Cancer Res., 58:2404-2409); monoklonsko antitelo specifično protiv tumor markera, kao što su receptori p140 TrkA ili p75 (Guillemard and Saragovi (2001) Cancer Res., 61:694) ili antitelo protiv receptora epidermalnog faktora rasta (tj. anti-EGFR monoklonsko antitelo, kao što je cetuksimab; Safavy et al. (2003) Bioconjug., 14:302-10; Ojima et al. (2002) J. Med. Chem., 45:5620-3), anti-HER2 (Herceptin, trastuzumab, Cirstoiu-Hapca et al. (2010) J. Control Release, 144:324-31); polinezasićena masna kiselina kao što je dokozaheksaenoinska kiselina (DHA; Bradley et al. (2001) Clin. Cancer Research, 7:3229-38), linoleinska kiselina ili linolna kiselina (Kuznetsova et al. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:974-7); peptid kao što je 7 aminokiselina dug sintetski peptid označen kao BBN[7-13] koji se vezuje za bombezin/gastrin-oslobađajući peptid (BBN/GRP) na površini ćelije (Safavy et al. (1999) J. Med. Chem., 42:4919-4924), 19 aminokiselina dug peptid angiopep-2 usmeren na LRP-1 (Wen et al. (2011) Molecular Cancer Therapeutics, 10 (dodatak 11):Apstrakt B49), oktapeptid koji se seče pomoću matriksne metaloproteaze 2 (MMP2; Yamada et al. (2010) Cancer Biology and Therapy, 9:192-203), RGD peptid (videti npr. Zhao et al. (2009) J. Drug Target, 17:10-8); proteini koji ciljno deluju na tumor-specifične receptore kao što su receptori za vitamine, uključujući biotin (vitamin H ili B-7, folat ili folna kiselina, vitamin B12 ili riboflavin (videti npr. Chen et al. (2010) Biconjug. Chem., 21:979-987, Li et al. (2011) International Journal of Nanomedicine, 6:1167-1184); hijaluronska kiselina (HA) (Auzenne et al. (2007) Neoplasia, 9:479-486); transferin (Sahoo et al. (2004) Int. J. Cancer, 112:335-40); i albumin.
Taksan vezan za albumin
[0260] Primer rastvorljivog kompleksa polimer-lek je albumin-konjugovani taksan. Albumin je prirodni nosač endogenih hidrofobnih molekula, kao što su vitaminu ili hormonu. Pored toga što ima ulogu nosača, albumin takođe olakšava endotelijalnu transcitozu konstituenata plazme vezanih za protein vezivanjem za gp60 na površini endotelijalnih ćelija, što utiče na transcitozu posredovanu kaveolama. Albumin takođe može da se veže za sekretorni kiseli protein bogat cisteinom (SPARC, poznat i kao osteonektin), koji je prisutan na mnogim tumorskim ćelijama. Stoga, albumin podstiče nakupljanje lekova vezanih za albumin u tumorskim ćelijama.
[0261] Albumin uključuje humani serum albumin (HSA) kao i nehumani albumin kao što je goveđi serum albumin (BSA). HSA je visoko rastvorljiv globularni protein od Mr65K i sadrži 585 aminokiselina (SEQ ID NO:211). HSA je najzastupljeniji protein u plazmi i obezbeđuje 70-80% koloidnog osmotskog pritiska humane plazme. Aminokiselinska sekvenca HSA sadrži ukupno 17 disulfidnih mostova, jednu slobodnu tiolnu grupu (Cys 34), i jedan triptofan (Trp 214).
[0262] Humani serum albumin (HSA) ima višestruka hidrofobna vezujuća mesta (ukupno osam za masne kiseline, endogeni ligand HSA) i pokazano je da se vezuje za raznovrsni niz farmaceutskih sredstava, posebno za neutralna i negativno naelektrisana hidrofobna jedinjenja (Goodman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed., McGraw-Hill New York (1996)). Predložena su dva visokoafinitetna vezujuća mesta u subdomenima IIA i IIIA u HSA, koja predstavljaju veoma izdužene hidrofobne džepove sa naelektrisanim ostacima lizina i arginina blizu površine koji funkcionišu kao mesta vezivanja za polarne ligande (videti, npr., Fehske et al., Biochem. Pharmcol., 30, 687-92 (1981), Vorum, Dan. Med. Bull., 46, 379-99 (1999), Kragh-Hansen, Dan. Med. Bull., 37:57-84 (1990), Curry et al., Nat. Struct. Biol., 5, 827-35 (1998), Sugio et al., Protein. Eng., 12, 439-46 (1999), He et al., Nature, 358, 209-15 (1992), i Carter et al., Adv. Protein. Chem., 45, 153-203 (1994)). Pokazano je da se paklitaksel i docetaksel vezuju za HSA (videti, npr., Paal et al., Eur. J. Biochem., 268(7), 2187-91 (2001), Purcell et al., Biochim. Biophys. Acta, 1478(1), 61-8 (2000), Altmayer et al., Arzneimittelforschung, 45, 1053-6 (1995), Garrido et al., Rev. Esp. Anestestiol. Reanim., 41, 308-12 (1994); i Urien et al., Invyvest. New Drugs, 14(2), 147-51 (1996)).
[0263] Težinski odnos albumina prema taksanu u kompoziciji je oko ili manje od 20:1 ili manje, kao što je 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 ili manje, i uopšteno predstavlja najmanje, ili približno najmanje, ili predstavlja 9:1. Rezultujući proizvod može da bude napravljen bez rastvarača i/ili surfaktanta. Taksan je obložen albuminom. Nanočestice taksan/albumin uopšteno imaju prosečni prečnik ne veći od 200 nm, i uopšteno 100 nm do 200 nm, kao što je prosečni prečnik od 130 nm.
[0264] Na primer, taksani vezani za albumine uključuju albumin-vezani (nab-)paklitaksel (npr. Abraxane, American Bioscience, Inc. (Santa Monica, CA); takođe opisan u SAD pat. br.
5,439,686 i 6,749,868) ili albumin-vezani-docetaksel (npr. opisan u, na primer, objavi SAD pat. prijave br. 20080161382, 20070117744 i 20070082838). Humani albumin deluje kao površinski-aktivni polimer koji obezbeđuje stabilizaciju naelektrisanja i prostornu stabilizaciju nanočestica paklitaksela da bi se sprečila agregacija. Stabilizacija se postiže zbog činjenice da se albumin adsorbuje na površini nanočestica paklitaksela, stvarajući tako sloj koji funkcioniše kao površinski-aktivni polimer sprečavajući agregaciju nanočestica paklitaksela. Interakcija između paklitaksela i humanog albumina je slaba i obe supstance slobodno disociraju nakon rekonstitucije. Na taj način, kada se rekonstituiše i injektuje u krvotok, koncentracija paklitaksela brzo opada i veruje se da čestice albumina disociraju na pojedinačne molekule albumina i zatim cirkulišu sa paklitakselom koji je i dalje vezan. Naročito, albumin-vezani paklitaksel (npr. nab-paklitaksel ili abraksan) može da se koristi kao koloidna suspenzija izvedena iz liofilizovane formulacije paklitaksela i humanog serum albumina razblažene u fiziološkom rastvoru (0.9% NaCl). Rezultujući kompleks čestica leka je stabilizovan pri prosečnoj veličini od 130 nm. Nanočestice koje sadrže druge taksane, kao što je bilo koji od opisanih u prethodnom tekstu, takođe mogu da budu napravljene i korišćene, i mogu da imaju ista svojstva kao što je gore opisano.
3. Dodatno hemioterapijsko sredstvo (npr. nukleozidni analog)
[0265] Izborno, dodatno hemioterapijsko sredstvo čija aktivnost je poboljšana ili povećana zajedničkom primenom sa jednim ili oba od enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom i/ili formulacije taksana, može da bude uključeno u kombinovanu terapiju koja je ovde obezbeđena. Na primer, jedan ili više nukleozidnih analoga, naročito anti-metabolita, može da bude uključen u kombinovanu terapiju koja je ovde obezbeđena. Nakon što uđu u ćeliju, nukleozidni analozi se sukcesivno fosforilišu do nukleozid 5’-mono-fosfata, di-fosfata i tri-fosfata. Na primer, uopšteno, nukleozidni analozi se prevode u aktivno jedinjenje fosforilacijom nukleozida u njegov trifosfat (npr. pomoću difosfat kinaza), koje tada može da kompetira sa fiziološkim nukleozidom (npr. dCTP) kao supstratom za ugradnju u DNK. Stoga, nukleozidni analozi oponašaju fiziološke nukleozide. Jednom kada se ugradi, analog je neefikasan supstrat, čime se zaustavlja replikacija i/ili izaziva zaustavljanje lanca. Videti Sampath et al. (2003), Oncogene, 22:9063-9074 za pregled nukleozidnih analoga. Budući da nukleozidni analozi zahtevaju prevođenje u aktivni oblik, oni su uopšteno prolekovi koji moraju da budu fosforilisani u aktivni oblik.
[0266] Nukleozidni analozi za upotrebu u kompozicijama i kombinacijama u ovom tekstu uključuju purinske i pirimidinske nukleozidne analoge, kao i njihove derivate i prolekove. Pirimidinski nukleozidni analozi uključuju, ali nisu ograničeni na fluoropirimidin 5-fluorouracil (5-FU; fluorouracil), 5-fluoro-2’-deoksicitidin (FCdR), arabinozilcitozin (araC; takođe nazvan citozin arabinozid ili citarabin), gemcitabin (2’-deoksi-2’,2’-difluorocitidin), troksacitabin (beta-L-dioksolan citidin, BCH-4556), decitabin (5-aza-2’-deoksicitidin), Azacitidin (4-amino-1-β-D-ribofuranozil-1,3,5-triazin-2(1H)-on), pseudoizocitidin (psi ICR), 5-aza-2’-deoksi-2’,2’-difluorocitidin; 5-aza-2’-deoksi-2’-fluorocitidin; 1-β-D-ribofuranozil-2(1H)-pirimidinon (zebularin); 2’,3’-dideoksi-5-fluoro-3’-tiacitidin (emtriva); 2’-ciklocitidin (ancitabin); 1-β-D-arabinofuranozil-5-azacitozin (fazarabin ili ara-AC); 6-azacitidin (6-aza-CR); 5,6-dihidro-5-azacitidin (dH-aza-CR); N4-pentiloksikarbonil-5’-deoksi-5-fluorocitidin (kapecitabin); N4-oktadecil-citarabin; i citarabin elaidinske kiseline, i njihove derivate i prolekove. Purinski nukleozidni analozi uključuju, na primer, fludarabin, kladribin, klofarabin, nelarabin, forodezin, pentostatin i tezacitabin, i derivate i prolekove.
[0267] Drugi oblici prolekova nukleozidnih analoga su poznati ili mogu da budu napravljeni. Na primer, drugi oblici prolekova uključuju one koji su modifikovani da bi se izmenila svojstva preuzimanja u ćelije i/ili otpornost na deaktivaciju deaminazom (diskutovano u nastavku teksta). Na primer, takvi oblici prolekova mogu da omoguće poboljšanu oralnu apsorpciju i/ili povećano ili specifično tkivno ciljno delovanje (Li et al. (2008) Journal Pharm. Science, 97:1109-1134).
[0268] Antitumorska aktivnost nekih nukleozidnih analoga je ograničena niskim nivoima citotoksičnosti koje mogu da postignu. Ovo je uglavnom zbog inaktivacije enzimima do koje može doći u mnogim tkivima. Na primer, metabolička inaktivacija nekih nukleozidnih analoga može da bude izazvana deaminacijom. Deaminacija može da bude katalizovana nukleotid-specifičnom deaminazom, kao što je adenozin deaminaza ili citidin deaminaza (cdA). Tako, neki lekovi protiv kancera se metabolišu enzimima koji su prirodno prisutni u organizmu, kao što su adenozin deaminaza (ADA, EC 3.5.4.4) i citidin deaminaza (CDA, takođe označena kao citozin nukleozid deaminaza, citidin aminohidrolaza, ili EC 3.5.4.5). Ovi enzimi funkcionišu tako što obavljaju deaminaciju prirodnog aminopurinskih odnosno aminopirimidinskih nukleozida kod čoveka i drugih organizama. Ovi enzimi takođe pretvaraju aktivne lekove protiv kancera na bazi nukleozida u neaktivne metabolite. Na primer, CDA je komponenta pirimidinskog puta nukleotidnog spasavanja. On pretvara citidin i deoksicitidin u uridin odnosno deoksiuridin hidrolitičkom deaminacijom (Cacciamani et al. (1991) Arch. Biochem. Biophys. 290:285-292; Wentworth and Wolfenden (1978) Methods Enzymol. 57:401-407; Wisdom and Orsi (1967) Biochem. J. 104:7P). On takođe obavlja deaminaciju brojnih sintetskih citozinskih analoga koji su klinički korisni lekovi, kao što je ara-C i drugi, kao što je diskutovano u nastavku (Eliopoulos et al. (1998) Cancer Chemother. Pharmacol. 42:373-378; Kees et al. (1989) Cancer Res. 49:3015-3019; Antiviral Chem. Chemother. (1990) 1:255-262). Na primer, polu-život gemcitabina u plazmi je približno 10 minuta, zbog brze deaminacije endogenim enzimom deoksicitidin deaminazom u odgovarajući uracilski derivat (dFdU) (P. G. Johnston et al., Cancer Chromatography and Biological Response Modifiers, Annual 16, 1996, Chap.1, ed. Pinedo H. M. et al.).
[0269] Na primer, purinski nukleozidni lek arabinoziladenin (fludarabin, ara-A) se deaminuje pomoću ADA; rezultujuće jedinjenje, sa parentalnom amino grupom zamenjenom hidroksilnom, je neaktivno kao antitumorsko sredstvo u poređenju sa parentalnim jedinjenjem. Slično, lek arabinozilcitozin (takođe nazvan citarabin Ara-C (ili AraC); 4-amino-1-(β-D-arabinofuranozil)-2(1H)-pirimidinon; citozin arabinozid; ili 1-(β-D-arabinofuranozil)citozin) se metabolički razgrađuje pomoću CDA u neaktivni arabinoziluracil. Gemcitabin, decitabin, azacitidin i drugi se takođe slično inaktivišu. Deaminacija nukleozidnih analoga, kao što su citozinski nukleozidi i njihovi analozi (npr. citarabin i gemcitabin), sprečava nakupljanje njihovih toksičnih intracelularnih trifosfatnih derivata koji deluju kao aktivni metaboliti.
[0270] Pretvaranje citozinskih jedinjenja u uridinske derivate obično donosi gubitak terapijske aktivnosti ili dodavanje sporednih efekata. Takođe je pokazano da kanceri koji steknu otpornost na lekove na bazi citozinskog analoga često prekomerno eksprimiraju CDA (Leuk. Res.1990, 14, 751-754). Ćelije leukemije i solidni tumori koji eksprimiraju visok nivo CDA mogu da ispolje otpornost na citozinske antimetabolite i tako ograniče antineoplastičnu aktivnost takvih terapeutika (Biochem. Pharmacol. 1993, 45:1857-1861). Otpornost na nukleozidne analoge može da zahteva povećanje doza, kontinuirane infuzije ili ponovljene primene. Ovo može da vodi ozbiljnim neželjenim efektima, posebno povezanim sa mijelosupresijom i imunosupresijom.
[0271] Reaktivne kiseonične vrste (ROS) su povezane sa inaktivacijom enzima, uključujući nukleozid deaminaze. Poznato je da taksani indukuju intratumorske ROS, i tako mogu da inaktivišu aktivnost nukleozid deaminaza (videti npr. Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269).
[0272] Stoga, u svrhu ovog teksta, primeri nukleozidnih analoga za upotrebu u kombinacijama i kompozicijama obezbeđenim u ovom tekstu su oni koji predstavljaju supstrate za deaminazu, i koji su time inaktivirani. Na primer, deaminaza može da bude citidin deaminaza ili adenozin deaminaza. Intratumorski nivo i aktivnost takvih analoga može da bude znatno povećana u kombinovanoj terapiji sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom i formulacijom taksana. Primeri takvih nukleozidnih analoga uključuju, ali nisu ograničeni na fludarabin, citarabin, gemcitabin, decitabin i azacitidin ili njihove derivate. U konkretnim primerima, nukleozidni analog je onaj koji može da leči solidne tumore, kao što je kancer bešike, dojke, pluća, jajnika, pankreasa i drugi kanceri.
[0273] Bilo koji od ovde obezbeđenih nukleozidnih analoga mogu da budu formulisani kao lipozomi, mikročestice, nanočestice, ili kao konjugati polimera. Na primer, formulacije mogu da budu prripremljene da bi se kontrolisala dostava i/ili povećali polu-životi primenjenih lekova. Na primer, primeri lipozomalnih formulacija su poznati (videti npr. SAD patente br.
5,736,155 i 8,022,279).
Primeri nukleozidnih analoga
i) Gemcitabin
[0274] Gemcitabin (2’,2’-difluorodeoksicitidin, dFdC) je bifluorisani analog deoksicitidina i prema tome predstavlja nukleozidni analog ili antimetabolit. Nakon ulaska u ćelije, intracelularnom fosforilacijom pomoću nukleozid monofosfat i difosfat kinaza od njega nastaju 5’-difosfatni (dFdCDP) odnosno 5’-trifosfatni (dFdCTP) derivati. Gemcitabin trifosfat deluje kao lažna baza, koja kompetira sa dCTP za ugradnju u DNK. Ako se ugradi u DNK, samo još jedan nukleotid može da bude ugrađen pre nego što se izduživanje lanca DNK zaustavi. DNK polimeraza epsilon tada ne može da ukloni gemcitabinski nukleotid i popravi rastuće nizove DNK (prikriveni završetak lanca).
[0275] Gemcitabin se na tržištu nalazi kao Gemzar®, koji predstavlja formulaciju u vidu liofilizovanog praha. Gemzar®, gemcitabin za injekcije, USP, sadrži gemcitabin HCl koji predstavlja 2’-deoksi-2’,2’-difluorocitidin monohidrohlorid (β-izomer). Gemzar® se dostavlja kao intravenska formulacija koja sadrži ili 200 mg ili 1 g gemcitabina HCl (u vidu slobodne baze) formulisanog sa manitolom (200 mg odnosno 1 g) i natrijum acetatom (12.5 mg odnosno 62.5 mg) kao sterilni liofilizovani prašak. pH formulacije može da bude podešen dodavanjem hlorovodonične kiseline i/ili natrijum hidroksida. Gemzar®, postupak za njegovo pravljenje i postupci za upotrebu su opisani u SAD pat. br.5,464,826 i SAD pat. br.
4,808,614. Gemzar® je trenutno odobren za lečenje kancera pankreasa, kancera dojke i nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) i u toku je njegova procena za kancer jajnika. Pored toga, Gemzar® može da se koristi u lečenju HCV kao i kao modulator funkcionisanja imunskog sistema (videti SAD pat. br 6,555,518). Gemzar® može da se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od približno 1000 do 1250 mg/m<2>tokom 30 minuta, jednom nedeljno do 7 nedelja, a zatim nedeljom odmora od tretmana.
[0276] Sintetski derivati gemcitabina, uključujući nekoliko oblika proleka su poznati (videti na primer, Ishitsuka et al, međunarodna objava br. WO03/043631; Alexander et al. (2003) J. Med. Chem., 46: 4205-4208; SAD pat. br. 6,303,569; Guo et al. (2001) Cancer Chemother. Pharmacol.,48:169-176; međunarodna objava br. WO01/21135; Di Stefano et al. (1999) Biochem. Pharmacol., 57: 793-799; Guo et al. (1999) J. Org. Chem., 64: 8319-8322; međunarodna objava br. WO99/33483; međunarodna objava br. WO98/32762; međunarodna objava br. WO98/00173; SAD pat. br.5,606,048; SAD pat. br.5,594,124; evropska patentna prijava br. EP712860; SAD pat. br. 5,521,294; SAD pat. br. 5,426,183; SAD pat. br.
5,401,838; evropski patent br. EP0376518; evropska patentna prijava br. EP577303; evropska patentna prijava br. EP576230; Chou et al. (1992) Synthesis, 565-570; Richardson et al. (1992) Nucleic Acid Res., 20: 1763-1768; Baker et al. (1991) J. Med. Chem., 34: 1879-1884; međunarodna objava br. WO91/15498; evropska patentna prijava br. EP329348; evropska patentna prijava br. EP272891).
[0277] Primeri poboljšanih prolekova uključuju, ali nisu ograničeni na gemcitabin elaidat (takođe označen kao 2’-deoksi-2’,2’-difluorocitidin-5’-il estar 9(E)-oktadecenoinske kiseline; 2’-deoksi-2’,2’-difluoro-5’-O-[9(E)-oktadecenoil]citidin; CP-4126; ili CAS regist. br.
210829-30-4); so meglumina gemcitabin estra azelainske kiseline (takođe označen kao 1-[5-O-(9-karboksinonanoil)-β-D-arabinofuranozil]citozin meglumin so); druge soli gemcitabin estra azelainske kiseline; i 1-[4-(2-propilpentanamido)-2-okso-1H-pirimidin-1-il]-2-deoksi-2,2-difluoro-β-D-ribofuranoza (takođe označena kao LY-2334737). Na primer, CP-4126 je derivat gemcitabina u vidu lipofilnog estra nezasićene masne kiseline. Zahvaljujući svojoj lipofilnosti, on ispoljava povećano preuzimanje i nakupljanje u ćelijama, čime dolazi do povećanog pretvaranja u aktivne metabolite.
[0278] U poređenju sa drugim nukleozidnim analozima, gemcitabin i njegovi derivati ili prolekovi, ispoljavaju veću antitumorsku aktivnost, posebno prema solidnim tumorima. Antitumorska aktivnost gemcitabina je pokazana protiv kancera pankreasa, sitnoćelijskog i nesitnoćelijskog kancera pluća, i kancera bešike.
[0279] Kao relativno hidrofilno jedinjenje, gemcitabin ima ograničenu sposobnost prolaska kroz plazma membrane putem pasivne difuzije. Prema tome, neophodne su povećane doze ili infuzije. Primena gemcitabina je povezana sa nekim neželjenim dejstvima. Primenjene doze ili duže vreme infuzije u cilju održavanja citotoksičnih nivoa mogu da budu povezane sa mijelotoksičnošću, i drugim neželjenim dejstvima kao što je povišeni nivo enzima transaminaze jetre, mučnina i povraćanje i osip kože.
ii) Citarabin
[0280] Citarabin je nukleozidni analog koji je prvobitno izolovan iz sunđera Cryptotethya crypta. Citarabin se fosforiliše u ara-CTP, koji može da kompetira sa dCTP. Ara-CTP takođe može da bude ugrađen u DNK i interferira sa polimerizacijom lanca i popravkom DNK. Citarabin može da bude inaktivisan citidin deaminazom.
[0281] Citarabin je prvenstveno korišćen u hematološkim kancerima. Sintetski derivati citarabina su razvijeni i pokazano je da ispoljavaju efikasnost protiv solidnih tumora. Oni uključuju, na primer, gemcitabin (videti gore u tekstu). Na primer, poznati su estarski derivati citarabina. Primer takvog derivata je CP-4055, koji predstavlja estar citarabina 5’elaidinske kiseline (videti npr. Breistol et al. (1999) Cancer Res., 59:2944).
[0282] Zbog problema u održavanju dovoljnih nivoa citotoksičnih dejstava, primenjene doze ili duža vremena infuzije mogu da izazovu neželjena dejstva kao što je mijelosupresija i druga specifična oštećenja tkiva.
iii) Decitabin
[0283] Decitabin (5-aza-2’-deoksicitidin, 5-aza-CdR) je pirimidinski nukleozidni analog citidina. Decitabin je prvobitno pripremljen ciklizacijom peracilglikozil izocijanata (Pliml and Sorm (1964) Collect. Czech. Chem. Commun. 29:2576-2577). Mogu se razlikovati dva izomerna oblika decitabina. β-anomer je aktivni oblik. Decitabin je aktivni sastojak u komercijalnom proizvodu DACOGEN™, u obliku sterilnog liofilizovanog praha za injekcije.
[0284] Unutar ćelije, decitabin se prvo prevodi u svoj aktivni oblik, fosforilisani 5-azadeoksicitidin, pomoću deoksicitidin kinaze koja se prvenstveno sintetiše tokom S faze ćelijskog ciklusa. Afinitet decitabina za katalitičko mesto deoksicitidin kinaze sličan je prirodnom supstratu, deoksicitidinu (Momparler et al. (1985) Pharmacol Ther 30:287-299). Posle prevođenja u trifosfatni oblik pomoću deoksicitidin kinaze, decitabin se ugrađuje u replicirajuću DNK brzinom sličnom onoj kod prirodnog supstrata, dCTP (Bouchard and Momparler (1983) Mol. Pharmacol. 24:109-114).
[0285] Jedna od funkcija decitabina je njegova sposobnost da specifično i snažno inhibira metilaciju DNK. Metilacija citozina u 5-metilcitozin događa se na nivou DNK. Ugradnja decitabina u lanac DNK ima hipometilaciono dejstvo. Svaka klasa diferenciranih ćelija ima svoj posebni obrazac metilacije. Nakon udvajanja hromozoma, u cilju očuvanja ovog obrasca metilacije, 5-metilcitozin parentalnog niza ima ulogu da upravlja metilacijom na komplementarnom novom lancu DNK. Zamena ugljenika na 5 položaju citozina za azot interferira sa ovim normalnim procesom metilacije DNK. Zamena 5-metilcitozina sa decitabinom na specifičnom mestu metilacije dovodi do nepovratne inaktivacije DNK metiltransferaze, verovatno zbog obrazovanja kovalentne veze između enzima i decitabina (Juttermann et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11797-11801). Specifičnom inhibicijom DNK metiltransferaze, enzima neophodnog za metilaciju, može da se spreči aberantna metilacija tumor supresorskih gena.
[0286] Postupci za pripremu decitabina, i posebno β-anomera, su poznati u struci (videti npr. SAD patent br. 3,350,388; SAD patent br. 3,817,980; SAD patent br. 4,209,613; objavljenu SAD prijavu br. US20120046457; objavu međunarodne prijave br. WO2008/101448; Winkley et al. (1970) J Org Chem, 35:491-495; Piskala et al. (1978) Nucleic Acids Research, 1:s109-s114; Ben-Hattar et al. (1986) J Org Chem, 51:3211-3213.) Decitabin može da bude formulisan standardnim postupcima poznatim u struci. Formulacije mogu da budu tečne ili liofilizovane formulacije. Na primer, decitabin se uobičajeno dostavlja kao sterilni liofilizovani prašak za injekcije, zajedno sa puferskom soli, kao što je kalijum dihidrogen fosfat, i pH modifikatorom, kao što je natrijum hidroksid. Na primer, decitabin isporučuje SuperGen, Inc., kao liofilizovani prašak pakovan u staklene bočice od 20 mL, koje sadrže 50 mg decitabina, monobazni kalijum dihidrogen fosfat, i natriju hidroksid. Kada se rekonstituiše sa 10 mL sterilne vode za injekciju, svaki mL sadrži 5 mg decitabina, 6.8 mg KH2PO4, i približno 1.1 mg NaOH. pH dobijenog rastvora je 6.5-7.5. Rekonstituisani rastvor može dalje da se razblažuje do koncentracije od 1.0 ili 0.1 mg/mL u hladnim infuzionim fluidima, tj., 0.9% natrijum hloridu; ili 5% dekstrozi; ili 5% glukozi; ili Ringerov laktatni rastvor. Neotvorene bočice se tipično skladište u frižideru (2-8° C.; 36-46° F.), u originalnom pakovanju. Tečne formulacije su takođe poznate (videti npr. SAD patent br.6,982,253).
[0287] Decitabin ispoljava kratak polu-život in vivo zbog deaminacije decitabina u 5-aza-2’-deoksiuridin, što je katalizovano citidin deaminazom (Chabot et al. (1983) Biochemical Pharmacology 22:1327-1328). Procenjena Kmdecitabina iznosi 250 µM za enzim koji je prečišćen iz jetre čoveka u poređenju sa Kmod 12 µM za prirodni supstrat, deoksicitidin. Brzina deaminacije deoksicitidina pomoću citidin deaminaze pri jednakim koncentracijama bila je oko 6 puta veća nego kod decitabina. Zbog kratkog polu-života, decitabin se najuobičajenije primenjuje kod pacijenata injekcijom, kao što je bolus I.V. injekcija, kontinuiranom I.V. infuzijom, ili I.V. infuzijom.
[0288] Dužina trajanja I.V. infuzije može da bude ograničena razgradnjom decitabina u vodenim rastvorima. Postoje derivati decitabina koji su stabilniji u vodenim rastvorima (videti npr. SAD patent br.7,250,416).
iv) Azacitidin
[0289] 5-Azacitidin (oznaka Nacionalnog servisnog centra NSC-102816; CAS registarski broj 320-67-2), takođe poznat kao azacitidin, AZA, ili 4-amino-1-β-D-ribofuranozil-1,3,5-triazin-2(1H)-on, je analog decitabina (videti npr. Hanna et al. (1998) Collect. Czech. Chem. Commun., 63:222-230). Trenutno se nalazi na tržištu kao lek VIDAZA®. Azacitidin je nukleozidni analog, konkretnije analog citidina. On je antagonist njegovog prirodnog nukleozida. Na primer, jedina strukturna razlika između azacitozina i citozina je prisustvo atoma azota na položaju 5 citozinskog prstena u azacitozinu u poređenju sa ugljenikom na ovom položaju u citozinu.
[0290] Postupci za pripremu azacitidina, i naročito postupci u kojima se izbegava korišćenje vode, su poznati u struci (SAD pat. br. 3,350,388; SAD pat. br. 8,058,424; Winkley and Robins (1970) J. Org. Chem., 35:491; Piskala and Sorm (1978) Nucl. Acid. Chem., 1:435; i Vorbrueggen et al. (1981) Chemische Berichte, 114:1234-1255.
[0291] Azacitidin je supstrat za citidin deaminazu (videti npr. Voytek et al. (1977) Cancer Res., 37:1956-61). U cilju ispoljavanja citotoksičnih dejstava in vivo, potrebne su visoke koncentracije ili kontinuirane infuzije. Neželjena dejstva uključuju smanjeni broj belih i crvenih krvnih ćelija i trombocita, mučninu, povraćanje, zamor, dijareju, između ostalog.
D. POSTUPCI ZA PROIZVODNJU NUKLEINSKIH KISELINA I KODIRANIH POLIPEPTIDA ENZIMA KOJI RAZGRAĐUJU HIJALURONAN
[0292] Polipeptidi enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza, koji su ovde navedeni, mogu da se dobiju postupcima koji su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti za prečišćavanje proteina i ekspresiju rekombinantnih proteina. Može se primeniti bilo koji metod koji je poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti za identifikaciju nukleinskih kiselina koje kodiraju željene gene. Bilo koji metod koji je raspoloživ iz stanja tehnike se može primeniti za dobijanje cDNK cele dužine (tj. one koja obuhvata ceo kodirajući region) ili klona genomske DNK koja kodira hijaluronidazu, kao što je iz ćelije ili tkiva kao izvora. Modifikovane rastvorljive hijaluronidaze ili varijanta rastvorljivih hijaluronidaza, mogu da se dobiju inženjeringom iz polipeptida divljeg tipa, na primer, mesto-specifičnom mutagenezom.
[0293] Polipeptidi se mogu klonirati ili izolovati korišćenjem bilo kog od raspoloživih metoda poznatih iz odgovarajuće oblasti za kloniranje i izolovanje molekula nukleinske kiseline. Takvi metodi obuhvataju PCR amplifikaciju nukleinskih kiselina i pretraživanje, odn. skrining biblioteka, uključujući hibridizacioni skrining nukleinskih kiselina i skrining baziran na aktivnosti.
[0294] Metodi za amplifikaciju nukleinskih kiselina se mogu primeniti za izolovanje molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju željeni polipeptid, uključujući na primer, metod reakcije polimeraznog lanca (PCR). Materijal koji sadrži nukleinsku kiselinu se može upotrebiti kao polazni materijal iz koga se može izolovati molekul nukleinske kiseline koji kodira željeni polipeptid. Na primer, DNK i iRNK preparati, ćelijski ekstrakti, ekstrakti tkiva, uzorci fluida (npr. krv, serum, pljuvačka), uzorci od zdravih i/ili bolesnih subjekata se mogu upotrebiti u metodima amplifikacije. Biblioteke nukleinskih kiselina se takođe mogu upotrebiti kao izvor polaznog materijala. Mogu da se konstruišu prajmeri za amplifikaciju željenog polipeptida. Na primer, prajmeri mogu biti konstruisani na osnovu izražavanja sekvence od koje se generiše željeni polipeptid. Prajmeri mogu biti konstruisani na osnovu reverzne translacije polipeptidne aminokiselinske sekvence. Mogu se sekvencirati molekuli nukleinske kiseline koji su generisani amplifikacijom i zatim potvrditi da oni kodiraju željeni polipeptid.
[0295] Dodatne nukleotidne sekvence se mogu povezati sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid, uključujući vezne sekvence koje sadrže restrikciona mesta endonukleaze za svrhe kloniranja sintetičkog gena u vektor, na primer, vektor za ekspresiju proteina ili vektor konstruisan za amplifikaciju DNK sekvence koja kodira protein jezgra. Dalje, dodatne nukleotidne sekvence koje specifikuju funkcionalne DNK elemente mogu biti operativno povezane sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. Primeri takvih sekvenci obuhvataju, ali nisu ograničeni na promotorske sekvence namenjene za olakšavanje intracelularne ekspresije proteina, i sekrecione sekvence, na primer, heterologe signalne sekvence, konstruisane za olakšavanje sekrecije proteina. Takve sekvence su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Sekvence dodatnih nukleotidnih ostataka, kao što su sekvence baza koje specifikuju regione za vezivanje proteina takođe mogu biti povezane sa molekulima nukleinske kiseline koji kodiraju enzime. Takvi regioni obuhvataju, ali nisu ograničeni na sekvence ostataka koji olakšavaju ili kodiraju proteine koji olakšavaju apsorpciju enzima u specifičnim ciljnim ćelijama ili na neki drugi način menjaju farmakokinetiku proizvoda sintetičkog gena. Na primer, enzimi mogu biti vezani za PEG fragmente.
[0296] Pored toga, mogu biti dodati tagovi ili drugi radikali, na primer, da bi pomogli detekciju ili afinitetno prečišćavanje polipeptida. Na primer, dodatne sekvence nukleotidnih ostataka, kao što su sekvence baza koje specifikuju epitopski tag ili drugi detektabilni marker takođe mogu biti vezane za molekule nukleinske kiseline koji kodiraju enzim. Primeri takvih sekvenci obuhvataju sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju His tag (npr. 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO:54) ili Flag Tag (DYKDDDDK; SEQ ID NO:55).
[0297] Identifikovane i izolovane nukleinske kiseline se mogu onda insertovati u odgovarajući vektor za kloniranje. Može se upotrebiti veliki broj sistema vektor-domaćin koji su poznati iz odgovarajuće oblasti. Mogući vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni na plazmide ili modifikovane viruse, ali sistem vektora mora biti kompatibilan sa upotrebljenom ćelijom domaćinom. Takvi vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni na bakteriofage, kao što su lambda derivati, ili plazmide, kao što su pCMV4, pBR322 ili pUC derivati plazmida ili Bluescript vektor (Stratagene, La Jolla, CA). Drugi ekspresioni vektori obuhvataju HZ24 ekspresioni vektor koji je ovde dat kao primer. Insercija u vektor za kloniranje može se, na primer, ostvariti ligacijom DNK fragmenta u vektor za kloniranje koji ima komplementarne kohezivne terminuse. Insercija se može ostvariti korišćenjem TOPO vektora za kloniranje (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ako upotrebljena komplementarna restrikciona mesta za fragmentiranje DNK nisu prisutna u vektoru za kloniranje, onda se krajevi DNK molekula mogu enzimski modifikovati. Alternativno tome, bilo koje željeno mesto se može proizvesti ligacijom nukleotidnih sekvenci (linkera) na DNK terminuse; ovi ligatirani linkeri mogu sadržati specifične hemijski sintetizovane oligonukleotide koji kodiraju sekvencu za restrikcionu sekvencu za prepoznavanje endonukleaze. U alternativnom metodu, pokidani vektor i gen proteina mogu biti modifikovani homopolimernim dodavanjem nastavaka. Rekombinantni molekuli mogu se uvesti u ćelije domaćine, na primer, putem transformacije, transfekcije, infekcije, elektroporacije i sonoporacije, tako da se generiše mnogo kopija sekvence gena.
[0298] U specifičnim primerima izvođenja, transformacija ćelija domaćina sa molekulima rekombinantne DNK koji sadrže izolovani gen proteina, cDNK, ili sintetizovanu DNK sekvencu omogućava generisanje višestrukih kopija gena. Shodno tome, gen se može dobiti u velikim količinama kultivisanjem transformanata, izolovanjem rekombinantnih DNK molekula iz transformanata i, ako je potrebno, izdvajanjem insertovanog gena iz izolovane rekombinantne DNK.
1. Vektori i ćelije
[0299] Za rekombinantnu ekspresiju jednog ili više željenih proteina, kao što je bilo koji od ovde opisanih peptida enzima koji razgrađuje hijaluronan, nukleinska kiselina koja sadrži celu ili deo nukleotidne sekvence koja kodira protein se može insertovati u odgovarajući ekspresioni vektor, tj. vektor koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju insertovane sekvence za kodiranje proteina. Neophodni transkripcioni i translacioni signali takođe mogu biti obezbeđeni sa prirodnim promotorom za gene enzima, i/ili njihove oivičavajuće regione.
[0300] Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira enzim. Takođe su realizovane ćelije koji sadrže vektore. Ćelije obuhvataju eukariotske i prokariotske ćelije, a vektori su bilo koji od onih koji su ovde podesni za upotrebu.
[0301] Obezbeđene su prokariotske i eukariotske ćelije, uključujući endotelijalne ćelije, koje sadrže vektore. Takve ćelije obuhvataju bakterijske ćelije, ćelije kvasca, gljivične ćelije, Archea, biljne ćelije, insektne ćelije i životinjske ćelije. Ćelije se upotrebljavaju za proizvodnju njihovih proteina kultivacijom gore navedenih ćelija pod uslovima pod kojima ćelije eksprimiraju kodirani protein i zatim izdvajanjem eksprimiranog proteina. Za ovdašnje svrhe, na primer, enzim može biti sekretovan u medijum.
[0302] Obezbeđeni su vektori koji sadrže sekvencu nukleotida koja kodira polipeptid enzima koji razgrađuje hijaluronan, u nekim primerima rastvorljivi polipeptid hijaluronidaze kuplovan sa prirodnom ili heterologom signalnom sekvencom, kao i sa svojim višestrukim kopijama. Vektori mogu biti selekcionisani za ekspresiju proteina enzima u ćeliji ili tako da se protein enzima izražava kao sekretorni protein.
[0303] Za ekspresiju sekvence koja kodira protein se može primeniti mnoštvo sistema domaćin-vektor. Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na sisarske ćelijske sisteme inficirane virusom (npr. vakcinija virus, adenovirus i drugi virusi); insektne ćelijske sisteme inficirane virusom (npr. bakulovirus); mikroorganizme, kao što su kvasci koji sadrže kvaščeve vektore; ili bakterije transformisane bakteriofagom, DNK, plazmidnu DNK, ili kozmidnu DNK. Ekspresija elemenata vektora može varirati po svojoj jačini i specifičnosti. U zavisnosti od upotrebljenog sistema domaćin-vektor, može se upotrebiti bilo koji od više podesnih transkripcionih i translacionih elemenata.
[0304] Može se upotrebiti bilo koji metod koji je poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti za inserciju DNK fragmenata u vektor da bi se konstruisali ekspresioni vektori koji sadrže himerni gen koji sadrži odgovarajuće transkripcione/translacione kontrolne signale i sekvence koje kodiraju protein. Ovi metodi mogu obuhvatati in vitro rekombinantne DNK i sintetičke tehnike i in vivo rekombinante (genetska rekombinacija). Ekspresija sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein, ili njeni domeni, derivati, fragmenti ili homolozi se može regulisati sekvencom druge nukleinske kiseline, tako da geni ili njihovi fragmenti budu izraženi u domaćinu koji je transformisan sa rekombinantnim DNK molekulom, odnosno molekulima. Na primer, ekspresija proteina se može kontrolisati bilo kojim promotorom/pojačavačem koji je poznat iz odgovarajuće oblasti. U specifičnom primeru izvođenja, promotor nije prirodni za gene za željeni protein. Promotori koji se mogu upotrebiti obuhvataju, ali nisu ograničeni na SV40 rani promotor (Bernoist i Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), promotor sadržan u 3’ dugom terminalnom ponavljanju virusa Rusovog sarkoma (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), promotor herpes timidin kinaze (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), regulatornu sekvencu metalotionein gena (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); prokariotske ekspresione vektore, kao što je promotor β-laktamaze (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) ili tac promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); vidi takođe "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": u Scientific American 242:79-94 (1980)); biljni ekspresioni vektori koji sadrže promotor nopalin sintetaze (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1983)) ili 35S RNK promotor iz mozaičnog virusa karfiola (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), i promotor fotosintetičkog enzima ribuloze bisfosfat karboksilaze (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); promotorske elemente iz kvasca i drugih gljiva, kao što je Gal4 promotor, promotor alkohol dehidrogenaze, promotor fosfoglicerol kinaze, promotor alkalne fosfataze, i sledeće životinjske transkripcione kontrolne regione koji ispoljavaju specifičnost za tkivo i koji su upotrebljeni u transgenim životinjama: kontrolni region gena elastaze I koji je aktivan u pankreasnim grozdastim ćelijama (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); kontrolni region insulinskog gena koji je aktivan u pankreasnim beta ćelijama (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), kontrolni region imunoglobulinskog gena koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol.7:1436-1444 (1987)), kontrolni region mišijeg sisarskog virus tumora koji je aktivan u ćelijama testisa, dojke, limfoidnim ćelijama i ćelijama mlečnih žlezda (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), kontrolni region albuminskog gena koji je aktivan u jetri (Pinckert et al., Genes and Devel.1:268-276 (1987)), kontrolni region alfa-fetoproteinskog gena koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), kontrolni region alfa-1 antitripsinskog gena koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987)), kontrolni region beta globinskog gena koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), kontrolni region mijelinskog bazalnog proteinskog gena koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama mozga (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), kontrolni region gena miozinskog lakog lanca- 2 koji je aktivan u skeletnim mišićima (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), i kontrolni region gena gonadotrofnog oslobađajućeg hormona koji je aktivan u gonadotrofima hipotalamusa (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).
[0305] U specifičnom primeru izvođenja, koristi se vektor koji sadrži promotor koji je operativno povezan sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju željeni protein, ili njihov domen, fragment, derivat ili homolog, jedno ili više porekla replikacije, i opciono, jedan ili više selektabilnih markera (npr. gen rezistencije na antibiotike). Primeri plazmidnih vektora za transformaciju E.coli ćelija, obuhvataju, na primer, pQE ekspresione vektore (mogu se nabaviti od firme Qiagen, Valencia, CA; vidi takođe literaturu koju je objavio Qiagen opisujući sistem). pQE vektori imaju promotor T5 faga (koga prepoznaje RNK polimeraza E. coli) i dvostruki lac operatorski modul represije za obezbeđivanje precizno regulisane ekspresije rekombinantnih proteina visokog nivoa u E. coli, sintetičko ribozomsko mesto vezivanja (RBS II) za efikasnu translaciju, 6XHis tag kodirajuću sekvencu, t0i T1 transkripcijske terminatore, ColE1 poreklo replikacije i gen beta-laktamaze za prenošenje rezistencije na ampicilin. pQE vektori omogućavaju postavljanje 6xHis taga bilo na N- ili C-terminus rekombinantnog proteina. Takvi plazmidi obuhvataju pQE 32, pQE 30, i pQE 31 koji obezbeđuju višestruka mesta kloniranja za sva tri okvira za čitanje i obezbeđuju ekspresiju N-terminalno 6xHis-tagovanih proteina. Drugi primeri plazmidnih vektora za transformaciju ćelija E. coli obuhvataju, na primer, pET vektore ekspresije (vidi, US patent 4,952,496; mogu se nabaviti od firme Novagen, Madison, WI; vidi, takođe literaturu objavljenu od strane firme Novagen u kojoj se opisuju). Takvi plazmidi obuhvataju pET 11a, koji sadrži T71ac promotor, T7 terminator, induktibilni E. coli lac operator, i lac represorski gen; pET 12a-c, koji sadrži T7 promotor, T7 terminator, i E. coli ompT signal sekrecije; i pET 15b i pET19b (Novagen, Madison, WI), koji sadrži His-Tag™ lider sekvencu za primenu u prečišćavanju His kolonom i mesto sečenja trombina koje dozvoljava sečenje T7-lac promotorskog regiona i T7 terminatora posle prečišćavanja preko kolone.
[0306] Primer vektora za ekspresiju u sisarskim ćelijama je HZ24 ekspresioni vektor. HZ24 ekspresioni vektor potiče od skeleta pCI vektora (Promega). On sadrži DNK koja kodira gen rezistencije na beta-laktamazu (AmpR), F1 poreklo replikacije, srednje rani pojačavački/promotorski region citomegalovirusa (CMV), i SV40 kasni poliadenilacioni signal (SV40). Ekspresioni vektor takođe ima interno mesto ulaska ribozoma (IRES) iz ECMV virusa (Clontech) i gen mišije dihidrofolat reduktaze (DHFR).
2. Ekspresija
[0307] Polipeptidi enzima koji razgrađuje hijaluronan, uključujući polipeptide rastvorljive hijaluronidaze, mogu se proizvesti bilo kojim metodom koji je poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti uključujući in vivo i in vitro metode. Željeni proteini mogu biti izraženi u bilo kom organizmu koji je podesan za proizvodnju željenih količina i oblika proteina, kao što su na primer, oni koji su potrebni za primenu i tretiranje. Domaćini ekspresije obuhvataju prokariotske i eukariotske organizme kao što su E. coli, kvasac, biljke, insektne ćelije, sisarske ćelije, uključujući humane ćelijske linije i transgene životinje. Domaćini ekspresije se mogu razlikovati po svojim nivoima proizvodnje proteina, kao i po tipovima posttranslacionih modifikacija koje su prisutne na izraženim proteinima. Izbor ekspresionog domaćina može biti baziran na ovim i drugim faktorima, kao što su regulatorna i bezbednosna razmatranja, troškovi proizvodnje, te potreba i metoda prečišćavanja.
[0308] Mnogi ekspresioni vektori su dostupni i poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i mogu se primeniti za ekspresiju proteina. Na izbor ekspresionih vektora može da utiče izbor sistema domaćina ekspresije. Generalno, ekspresioni vektori mogu da obuhvataju transkripcione promotore i opciono pojačavače, translacione signale, kao i transkripcione i translacione terminacione signale. Ekspresioni vektori koji se upotrebljavaju za stabilnu transformaciju obično imaju selektabilni marker koji omogućava selekciju i održavanje transformisanih ćelija. U nekim slučajevima se može primeniti poreklo replikacije za amplifikaciju više kopija vektora.
[0309] Polipeptidi enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što su polipeptidi rastvorljive hijaluronidaze, takođe mogu da se koriste ili eksprimiraju kao fuzioni proteini. Na primer, može se generisati enzim fuzije da bi se enzimu dala dodatna funkcionalnost. Primeri enzimskih fuzionih proteina obuhvataju, ali nisu ograničeni na fuzione signalne sekvence, tag kao što je onaj za lokalizaciju, npr. his6tag ili myc tag, ili tag za prečišćavanje, kao što je, na primer, GST fuzija, i sekvencu za usmeravanje izlučivanja proteina i/ili asocijaciju membrane.
a. Prokariotske ćelije
[0310] Prokarioti, a naročito E. coli, obezbeđuju sistem za proizvodnju velikih količina proteina. Transformacija E.coli je jednostavna i brza tehnika koja je dobro poznata stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Vektori ekspresije za E.coli mogu sadržati induktibilne promotore, a takvi promotori su korisni za indukovanje visokih nivoa ekspresije proteina i za izražavanje proteina koji ispoljavaju izvesnu toksičnost za ćelije domaćine. Primeri induktibilnih promotora obuhvataju lac promotor, trp promotor, hibridni tac promotor, T7 i SP6 RNK promotore i temperaturski regulisan λPL promotor.
[0311] Proteini, kao što je bilo koji od onih koji su ovde obezbeđeni, mogu da se eksprimiraju u citoplazmatičnom okruženju E. coli. Citoplazma je redukujuće okruženje i za neke molekule, ovo može rezultovati formiranjem nerastvorljivih inkluzionih tela. Redukujući agensi, kao što su ditiotreitol i β-merkaptoetanol i denaturanti, kao što su guanidin-HCl i urea, mogu se upotrebiti za resolubilizaciju proteina. Alternativni pristup je ekspresija proteina u periplazmatičnom prostoru bakterija koji obezbeđuje oksidaciono okruženje i šaperoninu slične i disulfidne izomeraze i može dovesti do proizvodnje rastvorljivog proteina. Obično je liderska sekvenca fuzionisana sa proteinom koji treba da bude izražen, što usmerava protein na periplazmu. Lider se onda odstranjuje signalnim peptidazama unutar periplazme. Primeri lider sekvenci usmerenih na periplazmu obuhvataju pelB lider iz pektat lijaza gena i lider poreklom od gena alkalne fosfataze. U nekim slučajevima, periplazmatična ekspresija dozvoljava curenje izraženog proteina u medijum za kultivaciju. Izlučivanje proteina dozvoljava brzo i jednostavno prečišćavanje iz supernatanta kulture. Proteini koji nisu izlučeni se mogu dobiti iz periplazme osmotskom lizom. Slično citoplazmatičnoj ekspresiji, u nekim slučajevima proteini mogu postati nerastvorljivi, pa se mogu upotrebiti denaturanti i redukujući agensi za olakšanje rastvaranja i ponovnog savijanja. Temperature indukcije i rasta takođe mogu uticati na nivoe ekspresije i rastvorljivost, a obično se upotrebljavaju temperature između 25°C i 37°C. Bakterije obično proizvode aglikozilovane proteine. Shodno tome, ako proteini zahtevaju glikozilaciju radi funkcije, onda se glikozilacija može dodati in vitro posle prečišćavanja iz ćelija domaćina.
b. Ćelije kvasca
[0312] Kvasci kao što su Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis i Pichia pastoris su dobro poznati kvasci domaćini ekspresije koji se mogu upotrebiti za proizvodnju proteina, kao što je bilo koji od ovde opisanih. Kvasci se mogu transformisati epizomalnim replikacionim vektorima ili stabilnom hromozomskom integracijom putem homologe rekombinacije. Za regulaciju ekspresije gena se obično upotrebljavaju induktibilni promotori. Primeri takvih promotora obuhvataju GAL1, GAL7 i GAL5 i metalotioneinske promotore, kao što su CUP1, AOX1 ili druge Pichia ili drugi kvaščev promotor. Vektori ekspresije često obuhvataju selektabilni marker, kao što su LEU2, TRP1, HIS3 i URA3, za selekciju i održavanje transformisane DNK. Proteini izraženi u kvascu su često rastvorljivi. Ko-ekspresija sa šaperoninima, kao što su Bip i proteinska disulfidna izomeraza, može poboljšati nivoe ekspresije i rastvorljivost. Pored toga, proteini izraženi u kvascu se mogu usmeriti radi izlučivanja korišćenjem sekrecionih signalnih peptidnih fuzija, kao što je uparivanje kvasca tipa alfa-faktor sekrecionog signala iz Saccharomyces cerevisae i fuzije sa proteinima površine ćelije kvasca, kao što su Aga2p upareni receptor adhezije ili Arxula adeninivorans glukoamilaze. Mesto odvajanja proteaze, kao što je za Kex-2 proteazu, se može genetski modifikovati tako da se odstrane fuzionisane sekvence iz izraženih polipeptida kada oni izađu iz procesa izlučivanja. Kvasac takođe može biti sposoban za glikozilaciju na Asn-X-Ser/Thr motivima.
c. Insekatske ćelije
[0313] Ćelije insekata, a naročito za korišćenje ekspresije bakulovirusa, su korisne za izražavanje polipeptida kao što su polipeptidi hijaluronidaze. Insektne ćelije izražavaju visoke nivoe proteina i sposobne su za većinu post-translacionih modifikacija koje koriste više eukariote. Bakulovirus ima restriktivni opseg domaćina, koji poboljšava stabilnost i smanjuje regulatorne probleme u vezi eukariotske ekspresije. Tipični ekspresioni vektori koriste promotor za visoki nivo ekspresije, kao što je polihedrinski promotor bakulovirusa. Uobičajeni bakulovirusni sistemi obuhvataju bakuloviruse, kao što su Autographa californica nuklearni polihedrozni virus (AcNPV), i Bombyx mori nuklearni polihedrozni virus (BmNPV) i insektnu ćelijsku liniju, kao što je Sf9 poreklom od Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) i Danaus plexippus (DpN1). Za visoki nivo ekspresije, nukleotidna sekvenca molekula koja treba da bude eksprimirana fuzioniše se neposredno nishodno od kodona inicijacije polihedrina virusa. Sisarski sekretorni signali se pouzdano prerađuju u insektnim ćelijama i mogu se upotrebiti za izlučivanje izraženog proteina u medijum za kultivaciju. Pored toga, ćelijske linije Pseudaletia unipuncta (A7S) i Danaus plexippus (DpN1) proizvode proteine sa šemama glikozilacije koje su slične sisarskim ćelijskim sistemima.
[0314] Alternativni sistem ekspresije u insektnim ćelijama je upotreba stabilno transformisanih ćelija. Za ekspresiju se mogu upotrebiti ćelijske linije, kao što su Schneider 2 (S2) i Kc ćelije (Drosophila melanogaster) i C7 ćelije (Aedes albopictus). Drosophila metalotioneinski promotor se može upotrebiti za indukovanje visokih nivoa ekspresije u prisustvu indukcije teškim metalom sa kadmijumom ili bakrom. Vektori ekspresije se obično održavaju primenom selektabilnih markera, kao što su neomicin i higromicin.
d. Sisarske ćelije
[0315] Sisarski sistemi za ekspresiju se mogu upotrebiti za ekspresiju proteina uključujući polipeptide enzima koji raugrađuje hijaluronana, kao što su polipeptidi rastvorljive hijaluronidaze. Ekspresioni konstrukti mogu biti preneti u sisarske ćelije virusnom infekcijom, kao što je adenovirusnim, ili direktnim DNK transferom, kao što je lipozomima, kalcijum fosfatom, DEAE-dekstranom, i fizičkim sredstvima, kao što su elektroporacija i mikroinjekcija. Vektori ekspresije za sisarske ćelije obično obuhvataju terminalno mesto mRNK, TATA kutiju, sekvencu za inicijaciju translacije (Kozakova konsenzusna sekvenca) i poliadenilacione elemente. takođe mogu biti dodati IRES elementi da bi se omogućila bicistronična ekspresija sa drugim genom, kao što je selektabilni marker. Takvi vektori često sadrže transkripcione promotore-pojačavače za visoki nivo ekspresije, na primer SV40 promotor-pojačavač, humani citomegalovirusni (CMV) promotor i dugo terminalno ponavljanje Rusovog sarkoma virusa (RSV). Ovi promotori-pojačavači su aktivni u mnogim tipovima ćelija. Promotorski i pojačavački regioni tipa tkiva i ćelija se takođe mogu upotrebiti za ekspresiju. Primeri promotorskih/pojačavačkih regiona obuhvataju, ali nisu ograničeni na one iz gena, kao što su elastaza I, insulin, imunoglobulin, mišji sisarski tumorski virus, albumin, alfa fetoprotein, alfa 1 antitripsin, beta globin, mijelinski bazalni protein, miozinski laki lanac 2, i kontrola gena za gonadotropni oslobađajući hormon. Za izbor i održavanje ćelija sa ekspresionim konstruktom se mogu upotrebiti selektabilni markeri. Primeri selektabilnih markerskih gena obuhvataju, ali nisu ograničeni na higromicin B fosfotransferazu, adenozin deaminazu, ksantin-gvanin fosforibozil transferazu, aminoglikozid fosfotransferazu, dihidrofolat reduktazu (DHFR) i timidin kinazu. Na primer, ekspresija se može izvršiti u prisustvu metotreksata da bi se izabrale samo one ćelije koje izražavaju DHFR gen. Fuzija sa signalnim molekulima na površini ćelija, kao što su TCR-ζ i FcεRI-γ može usmeriti ekspresiju proteina u aktivnom stanju na površini ćelija.
[0316] Za sisarsku ekspresiju su na raspolaganju mnoge ćelijske linije uključujući mišije, pacovske, humane, majmunske, pileće i hrčkove ćelije. Primeri ćelijskih linija obuhvataju, ali nisu ograničeni na CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, mišije NS0 (neizlučujuće) i druge mijeloma ćelijske linije, hibridoma i heterohibridoma ćelijske linije, limfocite, fibroblaste, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, i HKB ćelije. Takođe su raspoložive ćelijske linije koje su prilagođene za medijume bez seruma, što olakšava prečišćavanje izlučenih proteina iz medijuma za kultivaciju ćelija. Primeri obuhvataju CHO-S ćelije (Invitrogen, Carlsbad, CA, kat. br. 11619-012) i EBNA-1 ćelijsku liniju bez seruma (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-342.). Takođe su raspoložive ćelijske linije koje su prilagođene za kultivaciju u specijalnim medijumima optimizovanim za maksimalnu ekspresiju. Na primer, DG44 CHO ćelije su prilagođene za kultivaciju u suspendovanoj kulturi u hemijski definisanom medijumu bez životinjskih proizvoda.
e. Biljke
[0317] Za izražavanje proteina kao što su bilo koji od onih koji su ovde opisani se mogu upotrebiti transgene biljne ćelije i biljke. Ekspresioni konstrukti se obično prenose u biljke korišćenjem direktnog DNK transfera, kao što su bombardovanjem mikroprojektilima i transferom u protoplaste posredovanim sa PEG, i transformacijom posredovanom agrobakterijama. Vektori ekspresije mogu sadržati promotorske i pojačavačke sekvence, transkripcione terminacione elemente i translacione kontrolne elemente. Vektori ekspresije i tehnike transformacije se obično podeljene između domaćina dikotila, kao što su Arabidopsis i duvan, i domaćina monokotila, kao što su kukuruz i pirinač. Primeri biljnih promotora koji se upotrebljavaju za ekspresiju obuhvataju promotor mozaičnog virusa karfiola, promotor nopalin sintetaze, riboza bisfosfat karboksilazni promotor i ubikvitin, kao i UBQ3 promotore. Selektabilni markeri kao što su higromicin, fosfomanoza izomeraza i neomicin fosfotransferaza se često upotrebljavaju za olakšavanje izbora i održavanje transformisanih ćelija. Transformisane biljne ćelije se mogu održavati u kulturi kao ćelije, agregati (callus tkivo) ili regenerisani u celim biljkama. Transgene biljne ćelije takođe mogu obuhvatati alge koje su genetski modifikovane tako da proizvode hijaluronidazne polipeptide. Pošto biljke imaju drugačije procese glikozilacije od sisarskih ćelija, ovo može uticati na izbor proteina proizvedenog u ovim domaćinima.
3. Tehnike prečišćavanja
[0318] Metod prečišćavanja polipeptida, uključujući polipeptide enzima koji razgrađuje hijaluronan (npr. rastvorljive polipeptide hijaluronidaze) ili druge proteine, iz ćelija domaćina će zavisiti od izabranih ćelija domaćina i sistema ekspresije. Kod izlučenih molekula, proteini se generalno prečišćavaju iz medijuma za kultivaciju posle odstranjivanja ćelija. Kod intracelularne ekspresije, ćelije se mogu lizirati, a zatim proteini prečistiti iz ekstrakta. Kada se transgeni organizmi, kao što su transgene biljke i životinje upotrebljavaju za ekspresiju, onda se tkiva ili organi mogu upotrebiti kao polazni materijal za pripremu liziranog ekstrakta ćelija. Pored toga, proizvodnja u transgenim životinjama može obuhvatati proizvodnju polipeptida u mleku ili jajima, koji se mogu sakupiti, i ako je neophodno, proteini se mogu ekstrahovati i dalje prečistiti upotrebom standardnih metoda u odgovarajućoj oblasti.
[0319] Proteini, kao što su rastvorljivi polipeptidi hijaluronidaze, mogu se prečistiti upotrebom standardnih tehnika prečišćavanja proteina koje su poznate iz odgovarajuće oblasti uključujući, ali bez ograničavanja na SDS-PAGE, frakcionisanje po veličini i ekskluzionu hromatografiju po veličini, amonijum sulfatno taloženje i jonoizmenjivačku hromatografiju, kao što je anjonska jonoizmenjivačka hromatografija. Za poboljšanje efikasnosti i čistoće preparata takođe se mogu upotrebiti afinitetne tehnike prečišćavanja. Na primer, antitela, receptori i drugi molekuli koji vezuju enzime hijaluronidaze se mogu upotrebiti u afinitetnom prečišćavanju. Takođe mogu biti genetskim inženjeringom pripremljeni konstrukti za ekspresiju da bi se proteinu dodao afinitetni tag, kao što su myc epitop, GST fuzija ili His6i afinitet prečišćen sa myc antitelom, glutationskom smolom i Nismolom, respektivno. Čistoća se može oceniti bilo kojim metodom poznatim iz odgovarajuće oblasti uključujući gel elektroforezu, bojenje i spektrofotometrijske tehnike. Kompozicije prečišćene rHuPH20, kao što su ovde obezbeđene, tipično imaju specifičnu aktivnost od najmanje 70 000 do 100 000 jedinica/mg, na primer, oko 120 000 jedinica/mg. Specifična aktivnost može da varira po modifikaciji, kao što je modifikacija sa polimerom.
4. PEG-ilacija polipeptida enzima koji razgrađuje hijaluronan
[0320] Polietilen glikol (PEG) se široko koristi u biomaterijalima, biotehnologiji i medicini, prvenstveno zbog toga što je PEG biokompatibilan, netoksičan, polimer rastvorljiv u vodi koji je tipično neimunogen (Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). U oblasti dostave lekova, derivati PEG se široko koriste u kovalentnom vezivanju (tj., "PEG-ilaciji") za proteine da bi se smanjila imunogenost, proteoliza i klirens bubrega i poboljšala rastvorljivost (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). Slično, PEG je vezivan za, relativno hidrofobne lekove male molekulske težine da bi se poboljšala rastvorljivost, smanjila toksičnost i izmenila biološka raspodela. Tipično, PEG-ilovani lekovi se injektuju kao rastvori.
[0321] Srodnu primenu predstavlja sinteza unakrsno povezanih degradabilnih mreža PEG ili formulacija za upotrebu u dostavi leka budući da mnogo istovetne hemije korišćene u dizajniranju degradabilnih, rastvorljivih nosača lekova može takođe da se koristi u dizajniranju degradabilnih gelova (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993). Takođe je poznato da intermakromolekulski kompleksi mogu da se obrazuju mešanjem rastvora dva komplementarna polimera. Takvi kompleksi se uopšteno stabilizuju elektrostatičkim interakcijama (polianjon-polikatjon) i/ili vodoničnim vezama (polikiselinapolibaza) između polimera koji su uključeni, i/ili hidrofobnim interakcijama između polimera u vodenom okruženju (Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). Na primer, mešanje rastvora poliakrilne kiseline (PAAc) i polietilen oksida (PEO) pod odgovarajućim uslovima rezultuje u obrazovanju kompleksa zasnovanih većinom na vodoničnim vezama. Disocijacija ovih kompleksa pod fiziološkim uslovima korišćena je za dostavu slobodnih lekova (tj., ne-PEG-ilovanih). Pored toga, kompleksi komplementarnih polimera su obrazovani i iz homopolimera i iz kopolimera.
[0322] U stanju tehnike su opisani brojni reagensi za PEG-ilaciju. Takvi reagensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na N-hidroksisukcinimidil (NHS) aktivirani PEG, sukcinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroksisukcinimid, mPEG sukcinimidil alfa-metilbutanoat, mPEG sukcinimidil propionat, mPEG sukcinimidil butanoat, mPEG sukcinimidil estar karboksimetil 3-hidroksibutanojeve kiseline, homobifunkcionalni PEG-sukcinimidil propionat, homobifunkcionalni PEG propionaldehid, homobifunkcionalni PEG butiraldehid, PEG maleimid, PEG hidrazide, p-nitrofenil-karbonat PEG, mPEG-benzotriazol karbonat, propionaldehid PEG, mPEG butiraldehid, razgranati mPEG2butiraldehid, mPEG acetil, mPEG piperidon, mPEG metilketon, mPEG "bezlinkerski" maleimid, mPEG vinil sulfon, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioestar, mPEG ortopiridil disulfid, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfon PEG-NHS, akrilat PEG-NHS, fluorescein PEG-NHS, i biotin PEG-NHS (vidi npr. Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6,495,659; U.S. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,324, 844; U.S.
5,446,090; U.S.5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S.5,766,581; U.S.5,795, 569; U.S.5,808,096; U.S. 5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990, 237; U.S. 6,113,906; U.S.
6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S.6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S. 6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; U.S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S.
2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S.
2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S.
2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO0500360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; i WO 0187925).
[0323] U jednom primeru, polietilen glikol ima molekulsku težinu u opsegu od oko 3 kD do oko 50 kD, i tipično od oko 5 kD do oko 30 kD. Kovalentno vezivanje PEG za lek (poznato kao "PEG-ilacija") može da bude postignuto poznatim tehnikama hemijske sinteze. Na primer, PEG-ilacija proteina može da se postigne reakcijom NHS-aktiviranog PEG sa proteinom pod pogodnim reakcionim uslovima.
[0324] Dok su brojne reakcije PEG-ilacije opisane, one koje su najšire primenljive doprinose usmerenosti, koriste blage reakcione uslove, i ne zahtevaju intenzivnu nishodnu obradu za uklanjanje toksičnih katalizatora ili sporednih proizvoda. Na primer, monometoksi PEG (mPEG) ima samo jednu reaktivnu terminalnu hidroksil grupu, tako da njegova upotreba ograničava donekle heterogenost nastale mešavine proizvoda PEG-proteina. Aktivacija hidroksil grupe na kraju polimera suprotnom od terminalne metoksi grupe je uglavnom neophodna za postizanje efikasne PEG-ilacije proteina, sa ciljem da se derivatizovani PEG učini podložnijim napadu nukleofila. Nukleofil za napad je obično epsilon-amino grupa lizil ostatka, ali i drugi amini takođe mogu da reaguju (npr. N-terminalni alfa-amin ili prstenasti amini histidina) ukoliko su lokalni uslovi pogodni. Usmerenije vezivanje je moguće kod proteina koji sadrže jedan lizin ili cistein. PEG-maleimid može da bude usmeren na ovaj drugi ostatak za tiol-specifičnu modifikaciju. Alternativno, PEG hidrazid može da reaguje sa perjodatom oksidovanim enzimom koji razgrađuje hijaluronan i da bude redukovan u prisustvu NaCNBH3. Specifičnije, PEG-ilovani CMP šećeri mogu da reaguju sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan u prisustvu odgovarajućih glikozil-transferaza. Jedna tehnika je tehnika "PEG-ilacije" u kojoj su brojni polimerni molekuli kuplovani sa polipeptidom o kome se radi. Kada se korist ova tehnika, imunski sistem ima poteškoće u prepoznavanju epitopa na površini polipeptida odgovorne za obrazovanje antitela, smanjujući tako imunski odgovor. Za polipeptide uvedene direktno u cirkulatorni sistem ljudskog tela, da bi postigli konkretno fiziološko dejstvo (tj. farmaceutsko), tipičan potencijalni imunski odgovor jr odgovor IgG i/ili IgM, dok polipeptidi koji se inhaliraju kroz respiratorni sistem (tj. industrijski polipeptid) potencijalno mogu da izazovu IgE odgovor (tj. alergijski odgovor). Jedna od teorija koje objašnjavaju smanjeni imunski odgovor je da polimerni molekul(i) štite epitop(e) na površini polipeptida odgovornog za imunski odgovor koji vodi do obrazovanja antitela. Druga teorija, ili bar delimični faktor je ta da što je teži konjugat, dobija se redukovaniji imunski odgovor.
[0325] Obično, da bi se napravili PEG-ilovani enzimi koji razgrađuju hijaluronan koji su ovde obezbeđeni, uključujući PEG-ilovane hijaluronidaze, PEG fragmenti se konjuguju, putem kovalentnog vezivanja za polipeptide. Tehnike za PEG-ilaciju obuhvataju, ali nisu ograničene na specijalizovane linkere i hemikalije za kuplovanje (videti npr., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), vezivanje višestrukih PEG fragmenata za samo jedno mesto konjugacije (kao što je primenom razgranatih PEG; videti npr., Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), mesto-specifičnu PEG-ilaciju i/ili monoPEG-ilaciju (videti npr., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), i mesto-usmerenu enzimsku PEG-ilaciju (videti npr., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Postupci i tehnike opisane u stanju tehnike mogu da proizvedu proteine koji imaju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 PEG ili derivata PEG spojenih sa jednim molekulom proteina (videti npr., U.S. 2006/0104968).
[0326] Kao ilustrativni primeri PEG-ilacije u ilustrativnom postupku za pravljenje PEG-ilovanih enzima koji razgrađuju hijaluronan, kao što su PEG-ilovane hijaluronidaze, svaki od aldehida, sukcinimida i karbonata PEG se primenjuje da bi se konjugovali PEG fragmenti, tipično sukcinimidil PEG, u rHuPH20. Na primer, rHuPH20 je konjugovan sa sukcinimidil monoPEG (mPEG) reagensima datim kao primer, uključujući mPEG-sukcinimidil propionate (mPEGSPA), mPEG-sukcinimidil butanoate (mPEG-SBA), i (za vezivanje "razgranatih" PEG) mPEG2-N-hidroksilsukcinimid. Ovi PEG-ilovani sukcinimidil estri sadrže ugljenične osnove različitih dužina između PEG grupe i aktiviranog unakrsnog linkera, i ili pojedinačnu ili razgranatu PEG grupu. Ove razlike mogu da se koriste, na primer, za dobijanje različitih reakcionih kinetika i za potencijalno ograničavanje mesta dostupnih za vezivanje PEG za rHuPH20 tokom postupka konjugacije.
[0327] Sukcinimidil PEG (kao gore) koji sadrže bilo linearne ili granate PEG mogu da budu konjugovani sa rHuPH20. PEG mogu da se koriste za ponovljivo dobijanje rHuPH20 koje sadrže molekule koji imaju, u proseku, između oko tri do šest ili tri do šest PEG molekula po hijaluronidazi. Takve kompozicije PEG-ilovane rHuPH20 mogu lako da se prečiste da bi se dobile kompozicije koje imaju specifičnu aktivnost od približno 25 000 ili 30 000 jedinica/mg proteina hijaluronidazne aktivnosti, i koje su bez ne-PEG-ilovane rHuPH20 (manje od 5% ne-PEG-ilovane).
[0328] Korišćenjem različitih PEG reagenasa, mogu da se pripreme primeri verzija enzima koji razgrađuju hijaluronan, naročito rastvorljive human rekombinante hijaluronidaze (npr. rHuPH20), na primer, upotrebom mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD), i razgranate verzije zasnovane na mPEG2-NHS (40 kD) i mPEG2-NHS (60 kD). PEG-ilovane verzije rHuPH20 su napravljene korišćenjem NHS hemije, kao i karbonata, i aldehida, korišćenjem svakog od sledećih reagenasa: mPEG2-NHS-40K razgranati, mPEG-NHS-10K razgranati, mPEG-NHS-20K razgranati, mPEG2-NHS-60K razgranati; mPEG-SBA-5K, mPEG-SBA-20K, mPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldehid; mPEG-SPA-20K, mPEG-SPA-30K; i PEG-NHS-5K-biotin. PEG-ilovane hijaluronidaze su takođe pripremljene korišćenjem PEG reagenasa dostupnih kod Dowpharma, odeljka Dow Chemical Corporation; uključujući hijaluronidaze PEG-ilovane upotrebom PEG p-nitrofenil-karbonata (30 kDa) proizvođača Dowpharma i PEG propionaldehida (30 kDa).
[0329] U jednom primeru, PEG-ilacija uključuje konjugaciju mPEG-SBA, na primer, mPEG-SBA-30K (molekulske težine od oko 30 kDa) ili drugih sukcinimidil estara derivata PEG buterne kiseline, sa rastvorljivom hijaluronidazom. Sukcinimidil estri derivata PEG buterne kiseline, kao što je mPEG-SBA-30K se lako kupluju sa amino grupama proteina. Na primer, kovalentna konjugacija m-PEG-SBA-30K i rHuPH20 (koja je veličine približno 60 KDa) obezbeđuje stabilne amidne veze između rHuPH20 i mPEG, kao što je prikazano na šemi 1, ispod.
Šema 1
PEG-ilovana rHuPH20
[0330] Tipično, mPEG-SBA-30K ili drugi PEG se dodaje enzimu koji razgrađuje hijaluronan, u nekim slučajevima hijaluronidazi, pri molarnom odnosu PEG:polipeptid od 10:1 u pogodnom puferu, npr.130 mM NaCl /10 mM HEPES na pH 6.8 ili 70 mM fosfatnom puferu, pH 7, nakon čega sledi sterilizacija, npr. sterilna filtracija, i kontinuirana konjugacija, na primer, uz mešanje, preko noći na 4°C u hladnoj sobi. U jednom primeru, konjugovani PEG- enzim koji razgrađuje hijaluronan se koncentruje i obavlja se izmena pufera.
[0331] Drugi postupci kuplovanja sukcinimidil estara derivata PEG buterne kiseline, kao što je mPEG-SBA-30K su poznati u stanju tehnike (videti npr., U.S. 5,672,662; U.S.6,737,505; i U.S. 2004/0235734). Na primer, polipeptid, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan (npr. hijaluronidaza), može da bude kuplovan sa derivatom PEG aktiviranim sa NHS reakcijom u boratnom puferu (0.1 M, pH 8.0) tokom jednog časa na 4°C. Rezultujući PEG-ilovani protein može da bude prečišćen ultrafiltracijom. Alternativno, PEG-ilacija goveđe alkalne fosfataze može da bude postignuta mešanjem fosfataze sa mPEG-SBA u puferu koji sadrži 0.2 M natrijum fosfat i 0.5 M NaCl (pH 7.5) na 4°C, 30 minuta. Neizreagovali PEG može da bude uklonjen ultrafiltracijom. U drugom metodu polipeptid reaguje sa mPEG-SBA u dejonizovanoj vodi kojoj je dodat trietilamin da bi se pH podigao do 7.2-9. Rezultujuća smeša se meša na sobnoj temperaturi nekoliko časova do potpune PEG-ilacije.
[0332] Postupci za PEG-ilaciju polipeptidida koji razgrađuju hijaluronan, uključujući, na primer, hijaluronidaze životinjskog porekla i bakterijske enzime koji razgrađuju hijaluronan, poznati su stručnjaku u oblasti. Videti, na primer, evropski patent br. EP 0400472, koji opisuje PEG-ilaciju hijaluorindaze goveđih testisa i hondroitin ABC lijaze. Takođe, SAD objava br. 2006014968 opisuje PEG-ilaciju humane hijaluronidaze koja potiče od humane PH20. Na primer, PEG-ilovani enzim koji razgrađuje hijaluronan uopšteno sadrži najmanje 3 PEG fragmenta po molekulu. Na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan može da ima molarni odnos PEG prema proteinu između 5:1 i 9:1, na primer, 7:1.
E. Farmaceutske kompozicije i formulacije
[0333] Ovde su obezbeđene kompozicije ili kombinacije antihijaluronanskog sredstva i formulacije taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, ovde su obezbeđene kompozicije ili kombinacije enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom i formulacije taksana koji ciljno deluje na tumor. Formulacija taksana može da bude ko-formulisana ili koadministrirana sa kompozicijama koje sadrže antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan. Na primer, takve kombinacije i kompozicije mogu da se koriste u lečenju kancera, uključujući solidne tumore, kao što je ovde opisano. U nekim primerima, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, može da bude obezbeđeno kao kombinacija odvojenih kompozicija koje se primenjuju odvojeno. U drugim primerima, antihijaluronansko sredstvo, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan, i taksan su obezbeđeni u istoj kompoziciji i mogu da se primenjuju zajedno. Kompozicije ili kombinacija kompozicija mogu da budu formulisane za parenteralnu dostavu (tj. za sistemsku dostavu). Na primer, kompozicije ili kombinacija kompozicija su formulisane za subkutanu dostavu ili za intravensku dostavu.
[0334] Ovde su takođe obezbeđene kombinacije i kompozicije koje sadrže treće sredstvo koje predstavlja dodatno hemioterapijsko sredstvo za lečenje kancera, kao što je nukleozidni analog ili drugi antimetabolit (npr. gemcitabin ili derivat ili drugi nukleozidni analog). Primeri takvih sredstava su opisani iznad i na drugom mestu u ovom tekstu. Dodatno hemioterapijsko sredstvo, na primer nukleozidni analog, može da bude ko-formulisano ili koadministrirano sa kompozicijama koje sadrže antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i/ili kompozicije koje sadrže taksan koji ciljno deluje na tumor. Na primer, dodatno hemioterapijsko sredstvo, na primer nukleozidni analog, može da bude obezbeđeno kao kompozicija koja je odvojena od kombinacija ili kompozicija antihijaluronanskog sredstva, npr., enzima koji razgrađuje hijaluronan, i taksana. U drugim primerima, nukleozidni analog je ko-formulisan sa jednim ili oba od antihijaluronanskog sredstva, na primer, enzima koji razgrađuje hijaluronan, i taksana. Na primer, nukleozidni analog je ko-formulisan sa antihijaluronanskim sredstvom, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, a taksan koji ciljno deluje na tumor je obezbeđen kao posebna kompozicija. U drugom primeru, nukleozidni analog je ko-formulisan sa taksanom koji ciljno deluje na tumor, a antihijaluronansko sredstvo, na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan, je obezbeđen kao posebna kompozicija. Kao sledeći primer, nukleozidni analog, antihijaluronansko sredstvo i taksan koji ciljno deluje na tumor su ko-formulisani zajedno u istoj kompoziciji. Kompozicije ili kombinacija kompozicija mogu da budu formulisane za parenteralnu dostavu (tj. for sistemsku dostavu). Na primer, kompozicije ili kombinacija kompozicija su formulisane za subkutanu dostavu ili za intravensku dostavu.
[0335] Kompozicije mogu da budu formulisane za jednodoznu primenu ili za višedoznu primenu. Sredstva mogu da budu formulisana za neposrednu primenu. Kompozicije mogu da budu obezbeđene kao tečna ili liofilizovana formulacija.
[0336] Jedinjenja mogu da budu formulisana u pogodne farmaceutske preparate kao što su rastvori, suspenzije, tablete, disperzibilne tablete, pilule, kapsule, prahovi, formulacije sa produženim oslobađanjem ili eliksiri, za oralnu primenu, kao i preparati transdermalnih flastera i inhaleri suvog praha. Tipično, jedinjenja su formulisana u farmaceutsku kompozicije korišćenjem tehnika i postupaka koji su dobro poznati u ovoj oblasti (videti npr., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126). Uopšteno, način formulacije zavisi od putqa primene. Kompozicije mogu da budu ko-formulisane ili obezbeđene kao posebne kompozicije.
[0337] Uopšteno, kompozicije su formulisane u liofilizovanom ili tečnom obliku. Kada su kompozicije obezbeđene u liofilizovanom obliku, one mogu da budu rekonstituisane neposredno pre upotrebe odgovarajućim puferom, na primer, sterilnim fiziološkim rastvorom. Kompozicije mogu da budu obezbeđene zajedno ili odvojeno. U svrhu ovog teksta, takve kompozicije tipično su obezbeđene odvojeno. Antihijaluronansko sredstvo, na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza, taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili dodatno hemioterapijsko sredstvo mogu da budu upakovani kao odvojene kompozicije za primenu zajedno, uzastopno ili naizmenično. Kombinacije mogu da budu pakovane kao kit.
[0338] Kompozicije mogu da budu formulisane za primenu bilo kojim putem poznatim stručnjacima u odgovarajućoj oblasti uključujući intramuskularnu, intravensku, intradermalnu, intralezionalnu, intraperitonealnu injekciju, subkutanu, intratumoralnu, epiduralnu, nazalnu, oralnu, vaginalnu, rektalnu, topikalnu, lokalnu, otičku, inhalacionu, bukalnu (npr., sublingvalnu) i transdermalnu primenu ili bilo koji put. Drugi oblici primene su takođe obuhvaćeni. Primena može da bude lokalna, topikalna ili sistemska u zavisnosti od mesta tretmana. Lokalna primena na površinu kojoj je tretman potreban može da bude postignuta, na primer, ali bez ograničenja, lokalnom infuzijom tokom operacije, topikalnom primenom, npr., u kombinaciji sa previjanjem rane nakon operacije, injekcijom, pomoću katetera, pomoću supozitorije, ili pomoću implanta. Kompozicije takođe mogu da budu primenjene sa drugim biološki aktivnim sredstvima, bilo uzastopno, naizmenično ili u istoj kompoziciji. Primena takođe može da uključuje sisteme za kontrolisano oslobađanje uključujući formulacije za kontrolisano oslobađanje i uređaje za kontrolisano oslobađanje, kao što je primena pomoću pumpe.
[0339] Najpogodniji put u svakom datom slučaju zavisi od različitih faktora, kao što je priroda bolesti, napredovanje bolesti, ozbiljnost bolesti i konkretna kompozicija koja se koristi. U svrhu ovog teksta, poželjno je da se antihijaluronansko sredstvo, tipično enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza, taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili dodatno hemioterapijsko sredstvo primenjuju tako da farmaceutski dostupna količina ili nivo postoji u plazmi. Na primer, kompozicije se primenjuju sistemski, na primer, putem intravenske primene. Subkutani postupci takođe mogu da budu upotrebljeni, mada povećana vremena apsorpcije mogu da budu neophodna da se osigura ekvivalentna bioraspoloživost u poređenju sa intravenskim postupcima. Sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, taksan koji ciljno deluje na tumor, i/ili dodatno hemioterapijsko sredstvo (npr. nukleozidni analog) mogu da budu primenjena različitim putevima primene. Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane u doznim oblicima pogodnim za svaki put primene.
[0340] Metodi primene mogu da budu korišćeni da bi se smanjilo izlaganje enzima koji razgrađuju hijaluronan, npr. rastvorljivih hijaluronidaza, i drugih molekula, procesima razgradnje kao što je proteolitička razgradnja i imunološka intervencija putem antigenih i imunogenih odgovora. Primeri takvih postupaka uključuju lokalnu primenu na mestu tretmana ili kontinuiranu infuziju antihijaluronskog sredstva.
1. Formulacije
[0341] Farmaceutski prihvatljive kompozicije se pripremaju s obzirom na odobrenja regulatorne agencije ili druge agencije, u skladu sa uopšteno priznatom farmakopejom za upotrebu kod životinja i kod ljudi. Kompozicije mogu da imaju oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, prahova, i formulacija sa produženim oslobađanjem.
Kompozicija može da bude formulisana kao supozitorija, sa uobičajenim vezivnim sredstvima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može da uključuje standardne nosače kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat farmaceutske čistoće, i druga takva sredstva. Formulacija treba da odgovara obliku primene.
[0342] Farmaceutske kompozicije mogu sadržati nosače, kao što su razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili vehikulum sa kojima se enzim ili aktivator primenjuje. Primeri podesnih farmaceutskih nosača su opisani kod E. W. Martin u "Remington’s Pharmaceutical Sciences". Takve kompozicije će sadržati terapeutski efektivnu količinu jedinjenja, generalno u prečišćenom obliku, zajedno sa podesnom količinom nosača, tako da se dobije oblik za adekvatnu primenu na pacijentu. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ona koja potiču od petroleja, životinja, biljaka ili sintetička, kao što su ulje od kikirikija, ulje od soje, mineralno ulje i susamovo ulje. Voda je tipični nosač kada se farmaceutska kompozicija daje intravenski. Slani rastvori i vodeni dekstrozni i glicerolski rastvori se takođe mogu upotrebiti kao tečni nosači, a naročito za injektabilne rastvore. Kompozicije mogu sadržati zajedno sa aktivnim sastojkom: razblaživač, kao što su laktoza, saharoza, dikalcijum fosfat, ili karboksimetilceluloza; lubrikant, kao što su magnezijum stearat, kalcijum stearat i talk; i vezivo, kao što su skrob, prirodne gume, kao što su guma akacija, želatin, glukoza, melase, polivinilpirolidin, celuloze i njihovi derivati, povidon, krospovidoni i druga takva veziva koja su poznata stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Podesni farmaceutski ekscipijensi obuhvataju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, surutku u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu i etanol. Kompozicija, ako je poželjno, takođe može sadržati male količine agenasa za vlaženje ili emulgovanje, ili pH puferske agense, na primer, acetat, natrijum citrat, derivate ciklodekstrina, sorbitan monolaurat, trietanolamin natrijum acetat, trietanolamin oleat, i druga takva sredstva.
[0343] U jednom primeru, farmaceutski preparat može da bude u tečnom obliku, na primer, rastvori, sirupi ili suspenzije. Takvi tečni preparati mogu da budu pripremljeni na uobičajene načine sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što su sredstva za suspendovanje (npr., sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); sredstva za emulgovanje (npr., lecitin ili akacija); nevodeni vehikulumi (npr., bademovo ulje, uljani estri, ili frakcionisana biljna ulja); i konzervansi (npr., metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). U drugom primeru, farmaceutski preparati mogu da budu prisutni u liofilizovanom obliku za rekonstituciju sa vodom ili drugim pogodnim vehikulumom pre upotrebe.
[0344] Farmaceutski i terapijski aktivna jedinjenja i njihovi derivati su obično formulisani i daju se u pojedinačnim doznim oblicima ili višestrukim doznim oblicima. Svaka pojedinačna doza sadrži unapred određenu količinu terapeutski aktivnog jedinjenja koja je dovoljna da proizvede željeni terapeutski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem, nosačem ili razređivačem. Pojedinačni dozni oblici obuhvataju, ali bez ograničenja,tablete, kapsule, pilule, prahove, granule, sterilne parenteralne rastvore ili suspenzije, i oralne rastvore ili suspenzije i emulzije ulje-voda koje sadrže pogodne količine jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih derivata. Pojedinačni dozni oblici mogu da se nalaze u ampulama i špricevima i pojedinačno zapakovanim tabletama ili kapsulama. Pojedinačni dozni oblici mogu se davati u delovima ili više njih zajedno. Višestruki dozni oblik je mnoštvo identičnih doznih jedinica koje su zapakovane u samo jednom kontejneru da bi bile davane u odvojenom doznom obliku. Primeri višestrukih doznih oblika obuhvataju bočice, boce sa tabletama ili kapsule ili boce od pinte ili galona. Zato višestruki dozni oblik u stvari predstavlja mnoštvo pojedinačnih doza koje nisu razdvojene u pakovanju. Generalno se mogu pripremiti dozni oblici ili kompozicije koje sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0.005% do 100% uravnoteženo napravljene sa netoksičnim nosačem.
[0345] Farmaceutska kompozicija može da bude formulisana u doznim oblicima pogodnim za svaki put primene.
a. Injektabilni oblici, rastvori i emulzije
[0346] U ovom tekstu razmatra se parenteralna primena, koja se uopšteno odlikuju injektovanjem, subkutano, intramuskularno, intratumoralno, intravenski ili intradermalno. Injektabilni oblici mogu da budu pripremljeni kao uobičajeni oblici, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije, čvrsti oblici pogodni za rastvaranje ili suspendovanje u tečnosti pre injektovanja, ili kao emulzije. Pogodni ekscipijensi su, na primer, voda, fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol ili etanol. Pored toga, po želji, farmaceutske kompozicije za primenu mogu takođe da sadrže aktivator u obliku rastvarača kao što su pH puferska sredstva, soli metalnih jona, ili drugi takvi puferi. Farmaceutske kompozicije takođe mogu da sadrže druge manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su sredstva za kvašenje ili emulgovanje, pH puferska sredstva, stabilizatori, sredstva za poboljšavanje rastvorljivosti, i druga takva sredstva, kao što su na primer, natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleate i ciklodekstrini.
Implantacija sistema za sporo oslobađanje ili produženo oslobađanje, kojima se održava konstantni nivo doziranja (videti, npr., SAD pat. br. 3,710,795) takođe se razmatraju u ovom tekstu. Procenat aktivnog jedinjenja sadržanog u takvim parenteralnim kompozicijama u velikoj meri zavisi od njihove specifične prirode nature, kao i aktivnosti jedinjenja i potreba subjekta.
[0347] Na primer, standardna stabilizovana formulacija enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza konjugovana sa polimerom koja je ovde obezbeđena, formulisana je sa jednim ili više od sledećeg: EDTA, NaCl, CaCl2, histidin, laktoza, albumin, Pluronic® F68, TWEEN® i/ili drugim deterdžentom ili drugim sličnim sredstvima. Na primer, kompozicije koje su ovde obezbeđene mogu da sadrže jedan ili više pH pufera (kao što je, na primer, histidin, fosfat, ili drugi puferi), ili kiseli pufer (kao što je acetat, citrat, piruvat, Gly-HCl, sukcinat, laktat, maleat ili drugi puferi), modifikator toničnosti (kao što je, na primer, aminokiselina, polialkohol, NaCl, trehaloza, druge soli i/ili šećeri), stabilizator, helirajuće sredstvo, kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina, etilendiaminetetraacetat ili kalcijum EDTA, apsorber kiseonika, kao što je metionin, askorbinska kiselina/askorbat, limunske kiselina/citrat, ili albumin, i/ili konzervans, kao što je konzervans koji sadrži aromatični prsten (npr. fenol ili krezol). Primeri stabilizatora koji su korisni za kompozicije koje sadrže enzim koji razgrađuje hijaluronan uključuju deterdžente, kao što su polisorbati i proteine kao što je humani serum albumin. Primeri koncentracija serum albumina koji su korisni u ovde datim kompozicijama uključuju 0.1 mg/mL do 1 mg/mL, kao što je najmanje ili najmanje oko, ili oko, ili 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL ili 1 mg/mL, ali mogu da budu veće ili manje. Polisorbati takođe mogu da budu prisutni u kompozicijama u, na primer, koncentracijama od, ili oko između 0.001% do 0.1%, kao što je najmanje oko, ili najmanje, ili oko, ili 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 00.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% ili 0.1%. Metal-helirajuće sredstvo, kao što je kalcijum EDTA (CaEDTA), takođe može da bude prisutno, kao što je na primer, u koncentracijama od između približno 0.02 mM do 20 mM, kao što je najmanje oko, ili najmanje, ili oko, ili 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM ili više. Vrednost pH i osmolarnost kompozicije može da podesi stručnjak u odgovarajućoj oblasti da bi optimizovao uslove za željenu aktivnost i stabilnost kompozicije. U nekim primerima, kompozicije koje su ovde obezbeđene imaju osmolarnost od između 100 mOsm/kg do 500 mOsm/kg, kao što je najmanje, ili najmanje oko, ili jednako, ili oko 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 ili više mOsm/kg, i pH od između, ili između oko 6 do 8, kao što je 6 do 7.4, na primer jednako ili oko 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 ili 8.
[0348] Uopšteno, NaCl je obezbeđen u formulacijama koje sadrže enzim koji razgrađuje hijaluronan koje su ovde date, na primer, u količini koja iznosi ili iznosi oko 100 mM do 150 mM ili više. Na primer, primeri formulacija mogu da sadrže ili oko 10 mM histidina i/ili jednako ili oko 130 mM NaCl. Druge formulacije mogu da sadrže pored toga ili alternativno laktozu, na primer, u količini jednakoj, ili oko 13 mg/ml. Dodatno, antibakterijsko ili antifungalno sredstvo, uključujući, ali bez ograničenja tiomersal, može da bude prisutno u formulaciji. Formulacije mogu dalje da sadrže Albumin, Pluronic® F68, TWEEN® i/ili drugi deterdžent. Formulacije su obezbeđene na pH koji iznosi ili iznosi oko 6.0 do 7.4, kao što je 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 ili 7.4, uopšteno koji je ili je oko pH 6.5. Koncentrovane formulacije modifikovane rastvorljive hijaluronidaze za upotrebu u ovom tekstu se uopšteno razblažuju u fiziološkom rastvoru ili drugom puferisanom rastvoru soli pre primene da bi se održala odgovarajuća koncentracija soli.
[0349] Injektabilni preparati su prilagođeni za lokalnu i sistemsku primenu. Za ovdašnje svrhe, lokalna primena je poželjna za direktnu primenu u pogođenom intersticijumu. Preparati za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne rastvore koji su spremni za injekciju, sterilne suve rastvorljive proizvode, kao što su liofilizovani praškovi, spremni da budu sjedinjeni sa rastvaračem neposredno pre upotrebe, uključujući hipodermijske tablete, sterilne suspenzije spremne za injekciju, sterilne suve nerastvorljive proizvode spremne za sjedinjavanje sa vehikulumom pre upotrebe i sterilne emulzije. Rastvori mogu biti bilo vodeni, ili nevodeni. Ako se vrši intravenska primena, onda podesni nosači obuhvataju fiziološki rastvor ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS), kao i rastvore koji sadrže agense za zgušnjavanje i rastvaranje, kao što su glukoza, polietilen glikol, i polipropilen glikol i njihove smeše.
[0350] Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se primenjuju u parenteralnim preparatima obuhvataju vodene vehikulume, nevodene vehikulume, antimikrobna sredstva, sredstva za podešavanje izotoničnosti, pufere, antioksidanse, lokalne anestetike, sredstva za suspendovanje i dispergovanje, emulgujuća sredstva, sekvestirajuća ili helatirajuća sredstva i druge farmakološki prihvatljive supstance. Primeri vodenih vehikuluma obuhvataju natrijum hlorid za injekcije, Ringerov rastvor za injekcije, izotonični dekstrozni rastvor za injekcije, sterilnu vodu za injekcije, dekstrozni i laktatni Ringerov rastvor za injekcije. Nevodeni parenteralni vehikulumi obuhvataju fiksna ulja biljnog porekla, kukuruzno ulje, ulje od semena pamuka, susamovo ulje i ulje od kikirikija. Parenteralnim preparatima zapakovanim u kontejnere za višestruke doze mogu biti dodata antimikrobna sredstva u bakteriostatskim ili fungistatskim koncentracijama, koja obuhvataju fenole ili krezole, jedinjenja žive, benzil alkohol, hlorobutanol, metil i propil estre p-hidroksibenzojeve kiseline, timerosal, benzalkonijum hlorid i benzetonijum hlorid. Sredstva za podešavanje izotoničnosti obuhvataju natrijum hlorid i dekstrozu. Puferi obuhvataju fosfat i citrat. Antioksidansi obuhvataju natrijum bisulfat. Lokalni anestetici obuhvataju prokain hidrohlorid. Sredstva za suspendovanje i dispergovanje obuhvataju natrijum karboksimetilcelulozu, hidroksipropil metilcelulozu i polivinilpirolidon. Sredstva za emulgovanje obuhvataju Polisorbat 80 (TWEEN 80). Sekvestrirajuća ili helatirajuća sredstva za metalne jone obuhvataju EDTA. Farmaceutski nosači takođe obuhvataju etil alkohol, polietilen glikol i propilen glikol za vodomešljive nosače i natrijum hidroksid, hlorovodoničnu kiselinu, limunsku kiselinu ili mlečnu kiselinu za podešavanje pH.
[0351] Ako se primenjuju intravenski, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS), i rastvore koji sadrže sredstva za zgušnjavanje i solubilizaciju, kao što je glukoza, polietilen glikol, i polipropilen glikol i njihove smeše.
[0352] Koncentracija farmaceutski aktivnog jedinjenja se podešava tako da injekcija obezbeđuje efikasnu količinu za dobijanje željenog farmakološkog dejstva. Precizna doza zavisi od starosti, težine i stanja pacijenta ili životinje kao što je poznato u struci. Parenteralni preparati u vidu jedinične doze pakuju se u ampulu, bočicu ili špric sa iglom. Zapremina tečnog rastvora ili rekonstituisanog praškastog preparata, koja sadrži farmaceutski aktivno jedinjenje, zavisi od bolesti koja treba da se leči i konkretnog proizvodnog artikla koji je odabran za pakovanje. Svi preparati za parenteralnu primenu moraju da budu sterilni, kao što je poznato i kako se praktikuje u struci.
b. Liofilizovani prahovi
[0353] Ovde su od interesa liofilizovani praškovi, koji se mogu rekonstituisati za primenu kao rastvori, emulzije i druge smeše. Oni mogu takođe da budu rekonstituisani i formulisani kao čvrste materije ili gelovi. Liofilizovani prahovi mogu da budu pripremljeni iz bilo kog od gore opisanih rastvora.
[0354] Sterilni liofilizovani prašak se priprema rastvaranjem jedinjenja antihijaluronanskog sredstva koje predstavlja enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza i /ili drugog sredstva u puferskom rastvoru. Puferski rastvor može sadržati ekscipijens koji poboljšava stabilnost ili drugu farmakološku komponentu praška ili rekonstituisanog rastvora, pripremljenog od praška. Sledstvena sterilna filtracija rastvora, praćena liofilizacijom pod standardnim uslovima, koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, daje željenu formulaciju. Ukratko, liofilizovani prašak se priprema rastvaranjem ekscipijensa, kao što je dekstroza, sorbitol, fruktoza, kukuruzni sirup, ksilitol, glicerin, glukoza, saharoza ili drugo podesno sredstvo, u podesnom puferu, kao što je citrat, natrijum ili kalijum fosfat ili drugi takav pufer poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Onda se rezultujućoj smeši dodaje izabrani enzim i meša se sve dok se ne rastvori. Rezultujuća smeša se sterilno filtrira ili se tretira radi odstranjivanja čestica i obezbeđivanja sterilnosti, pa se raspodeljuje u bočice radi liofilizacije. Svaka bočica će sadržati pojedinačnu dozu (1 mg – 1 g, uopšteno 1-100 mg, kao 1-5 mg) ili višestruke doze jedinjenja. Liofilizovani prašak se može čuvati pod odgovarajućim uslovima, kao što je na oko 4°C do sobne temperature.
[0355] Rekonstitucijom ovog liofilizovanog praška sa puferskim rastvorom se dobija formulacija za upotrebu u parenteralnoj primeni. Precizna količina zavisi od indikacije koja se tretira i odabranog jedinjenja. takva količina može da se odredi empirijski.
c. Topikalna primena
[0356] Topikalne smeše se pripremaju kao što je opisano za lokalnu i sistemsku primenu. Rezultujuća smeša može da bude rastvor, suspenzija, emulzije ili slično, i formulisana je u vidu krema, gelova, masti, emulzija, rastvora, eliksira, losiona, suspenzija, tinktura, pasta, pena, aerosola, oblika za irigaciju, sprejeva, supozitorija, bandaža, dermalnih flastera ili bilo koje druge formulacije pogodne za topikalnu primenu.
[0357] Jedinjenja ili njihovi farmaceutski prihvatljivi derivati mogu da budu formulisana u vidu aerosola za topikalnu primenu, kao što je inhalacijom (videti, npr., SAD pat. br.
4,044,126, 4,414,209, i 4,364,923, koji opisuju aerosolove za dostava steroida korisnog za lečenje inflamatornih bolesti, naročito astme). Ove formulacije za primenu na respiratorni trakt mogu da budu u obliku aerosola ili rastvora za nebulizer, ili kao mikrofini prašak za udisanje, odvojeno, ili u kombinaciji sa inertnim nosačem kao što je laktoza. u tom slučaju, čestice formulacije će tipično imati prečnik manji od 50 mikrona, poželjno manji od 10 mikrona.
[0358] Jedinjenja mogu da budu formulisana za lokalnu ili topikalnu primenu, kao što je za topikalnu primenu na kožu i mukozne membrane, kao što je u oko, u obliku gelova, krema, i losiona i za primenu u oko ili za intracisternalno ili intraspinalno davanje. Topikalna primena se razmatra za transdermalnu dostavu i takođe za primenu u oči ili na mukozu, ili za inhalacione terapije. Nazalni rastvori aktivnog jedinjenja odvojeno ili u kombinaciji sa drugim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima takođe mogu da budu primenjeni.
[0359] Formulacije pogodne za transdermalnu primenu su obezbeđene. One mogu da budu obezbeđene u bilo kom pogodnom obliku, kao što su pojedinačni flasteri prilagođeni da ostanu u bliskom kontaktu sa epidermisom primaoca tokom produženog perioda vremena. Takvi flasteri sadrže aktivno jedinjenje u po izboru puferisanom vodenom rastvoru koncentracije od, na primer, 0.1 do 0.2 M, u odnosu na aktivno jedinjenje. Formulacije pogodne za transdermalnu primenu takođe mogu da budu dostavljene jontoforezom (videti, npr., Pharmaceutical Research 3(6), 318 (1986)) i tipično imaju oblik po izboru puferisanog vodenog rastvora aktivnog jedinjenja.
d. Kompozicije za druge puteve primene
[0360] U zavisnosti od stanja koje se leči, ovde se takođe razmatraju drugi putevi primene, kao što je topikalna primena, transdermalni flasteri, oralna i rektalna primena. Na primer, farmaceutski dozni oblici za rektalnu primenu su rektalne supozitorije, kapsule i tablete za sistemsko delovanje. Rektalne supozitorije uključuju čvrsta tela za ubacivanje u rektum koja se tope ili omekšavaju na telesnoj temperaturi oslobađajući jedno ili više farmakološki ili terapijski aktivnih sastojaka. Farmaceutski prihvatljive supstance koje se koriste u rektalnim supozitorijama su baze ili vehikulumi i sredstva za podizanje tačke topljenja. Primeri baza uključuju kakao buter (ulje iz teobroma), glicerin-želatin, karbovaks (polioksietilen glikol) i odgovarajuće smeše mono-, di-i triglicerida masnih kiselina. Kombinacije različitih baza mogu da se koriste. Sredstva za podizanje tačke topljena supozitorija uključuju spermacet i vosak. Rektalne supozitorije mogu da se pripreme metodom komprimovanja ili livenja. Tipična težina rektalne supozitorije je oko 2 do 3 grama. Tablete i kapsule za rektalnu primenu proizvode se upotrebom iste farmaceutski prihvatljive supstance i istim postupcima kao formulacije za oralnu primenu.
[0361] Formulacije pogodne za rektalnu primenu mogu da budu obezbeđene supozitorije u jediničnoj dozi. One mogu da budu pripremljene mešanjem aktivnog jedinjenja sa jednim ili više uobičajeni čvrstih nosača, na primer, kakao buterom, i zatim oblikovanjem nastale smeše.
[0362] Za oralnu primenu, farmaceutske kompozicije mogu da imaju oblik, na primer, tableta ili kapsula pripremljenih na uobičajene načine sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su vezivna sredstva (npr., pred-želatinizovani kukuruzni skrob, polivinil pirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); puniocima (npr., laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); lubrikansima (npr., magnezijum stearat, talk ili silika); sredstvima za raspadanje (npr., skrob krompira ili natrijum-skrob glikolat); ili sredstvima za kvašenje (npr., natrijum lauril sulfat). Tablete mogu da budu obložene postupcima koji su dobro poznati u struci.
[0363] Formulacije pogodne za bukalnu (sublingvalnu) primenu uključuju, na primer, lozenge koje sadrže aktivno jedinjenje u aromatizovanoj bazi, obično saharozi i akaciji ili tragakantu; i pastile koje sadrže jedinjenje u inertnoj bazi kao što je želatin i glicerin ili saharoza i akacija.
[0364] Farmaceutske kompozicije takođe mogu da budu primenjuje pomoću formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem i/ili uređaja za dostavu (videti, npr., u SAD pat. br. 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,660; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,556; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 i 5,733,566).
[0365] Različiti sistemi za dostavu su poznati i mogu da se koriste za primenu odabranih kompozicija, kao što je, ali bez ograničenja, inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju jedinjenje, endocitoza posredovana receptorom, i dostava molekula nukleinske kiseline koji kodiraju rastvorljivu hijaluronidazu, ili drugo sredstvo kao što su retrovirusni sistemi za dostavu.
[0366] Dakle, u određenim primerima izvođenja, lipozomi i/ili nanočestice takođe mogu da budu uključeni u primenu kompozicija koje su ovde date. Lipozomi se obrazuju od fosfolipida koji su dispergovani u vodenom medijumu i spontano obrazuju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (takođe označene kao multilamelarne vezikule (MLV)). MLV uopšteno imaju prečnike od 25 nm do 4 µm. Sonikacija MLV rezultuje u obrazovanju malih jednolamelarnih vezikula (SUV) sa prečnicima u opsegu od 200 do 500 angstroma koje sadrže vodeni rastvor u jezgru.
[0367] Fosfolipidi mogu da obrazuju različite strukture drugačije od lipozoma kada se disperguju u vodi, u zavisnosti od molarnog odnosa lipida prema vodi. Pri niskim odnosima, obrazuju se lipozomi. Fizička svojstva lipozoma zavise od pH, jonske snage i prisustva divalentnih katjona. Lipozomi mogu da ispolje slabu propustljivost za jonske i polarne supstance, ali na povišenim temperaturama podležu faznom prelazu koji značajno menja njihovu propustljivost. Fazni prelaz uključuje promenu od gusto pakovane, uređene strukture, poznate kao gel stanje, do labavo pakovane, manje uređene strukture, poznate kao fluidno stanje. Ovo se odvija na karakterističnoj temperaturi faznog prelaza i rezultuje u povećanju propustljivosti za jone, šećere i lekove.
[0368] Lipozomi interaguju sa ćelijama različitim mehanizmima: endocitozom od strane fagocitnih ćelija retikuloendotelijalnog sistema kao što su makrofagi i neutrofili; adsorpcijom za površinu ćelije, bilo nespecifičnim slabim hidrofobnim ili elektrostatičkim silama, ili specifičnim interakcijama sa komponentama ćelijske površine; fuzijom sa plazma membranom ćelija insercijom lipidnog dvosloja lipozoma u plazma membranu, sa spontanim oslobađanjem lipozomalnih sadržaja u citoplazmu; i prenošenjem lipozomalnih lipida do ćelijske mebrane ili subcelularnih membrana, ili obrnuto, bez asocijacije sadržaja lipozoma. Variranje formulacije lipozoma može da se promeni mehanizam koji je operativan, mada više od jednog može da funkcioniše u isto vreme. Nanokapsule mogu uopšteno da obuhvate jedinjenja na stabilan i ponovljiv način. Da bi se izbegla neželjena dejstva zbog intracelularnog polimernog opterećenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0.1 µm) treba da budu dizajnirane korišćenjem polimera koji mogu da se razgrađuju in vivo. Biorazgradive polialkil-cijanoakrilatne nanočestice koje odgovaraju zahtevima ovde se razmatraju za upotrebu, i takve čestice mogu lako da se naprave.
2. Količine formulacija
[0369] Kompozicije mogu da budu formulisane za jednodoznu ili višedoznu primenu. Sredstva mogu da budu formulisana za neposrednu primenu.
[0370] U kompozicijama ili kombinacijama kompozicija koje su ovde obezbeđene, u kojima je antihijaluronansko sredstvo enzim koji razgrađuje hijaluronan kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom je formulisan u količini za neposrednu primenu u opsegu između ili oko između 0.5 µg do 50 mg, kao što je 100 µg do 1 mg, 1 mg do 20 mg, 100 µg do 5 mg, 0.5 µg do 1450 µg, 1 µg do 1000 µg, 5 µg do 1250 µg, 10 µg do 750 µg, 50 µg do 500 µg, 0.5 µg do 500 µg ili 500 µg do 1450 µg. Na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom je formulisan u količini za neposrednu primenu u opsegu između ili oko između 15 jedinica (U) ili 150 jedinica (U) do 60000 jedinica po dozi, 300 U do 30 0000 U, 500 U do 25000 U, 500 U do 10000 U, 150 U do 15 000 U, 150 U do 5000 U, 500 U do 1000 U, 5000 U do 45 000 U, 10000 U do 50 000 U ili 20 000 U do 60000 U, na primer najmanje ili oko najmanje ili oko ili 15 U, 50 U, 100 U, 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1000 U; 1250 U; 1500 U; 2000 U; 3000 U; 4000 U; 5000 U; 6 000 U; 7000 U; 8000 U; 9000 U; 10 000 U; 20000 U; 30000 U; 40000 U; ili 50000 U. Enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom može da bude obezbeđen kao stok rastvor jednak ili oko 50 U/mL do 15,000 U/mL, kao što je 10 U/mL do 500 U/mL, 1000 U/mL do 15000 U/mL, 100 U/mL do 5000 U/mL, 500 U/mL do 5000 U/mL ili 100 U/mL do 400 U/mL, na primer najmanje ili najmanje oko ili oko ili 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 1000 U/mL, 2000 jedinica/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 6000 U/mL, 7000 U/mL, 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10000 U/mL, 11000 U/mL, 12 000 U/mL, ili 12 800 U/mL. Zapremina kompozicije može da bude 0.5 mL do 1000 mL, kao što je 0.5 mL do 100 mL, 0.5 mL do 10 mL, 1 mL do 500 mL, 1 mL do 10 mL, kao što je najmanje, ili oko najmanje, ili oko, ili 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL ili više. Kompozicija je uopšteno formulisana tako da se enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom ne primenjuje u zapreminama većim od oko 50 mL, i tipično se primenjuje u zapremini od 5-30 mL, uopšteno u zapremini koja nije veća od oko 10 mL. Za veće zapremine, vreme trajanja infuzije može da bude prilagođeno tako da olakša dostavu veće zapremine. Na primer, vreme infuzije može da bude najmanje 1 minut, 5 minuta, 10 minuta, 20 minuta, 30 minuta, 40 minuta, 50 minuta, 1 čas ili više.
[0371] U kompozicijama ili kombinacijama kompozicija koje su ovde obezbeđene, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin, na primer albumin-vezani paklitaksel, formulisan je u količinama za neposrednu primenu taksana u opsegu između ili oko između 10 mg do 1000 mg, kao što je 20 mg do 500 mg, 10 mg do 250 mg, 75 mg do 400 mg, 100 mg do 200 mg, 150 mg do 400 mg, 200 mg do 800 mg, 50 mg do 200 mg ili 50 mg do 150 mg. Kompozicija može da bude obezbeđena kao liofilizovani oblik za kasniju rekonstituciju ili kao tečna formulacija. Na primer, rekonstitucija tečne formulacije može da bude sa vodom ili 0.9% natrijum hloridom ili drugim fiziološkim rastvorom. Kada se rekonstituiše ili obezbeđuje kao tečna formulacija, kompozicija može da bude obezbeđena tako da sadrži taksan u formulaciji taksana koji ciljno deluje na tumor kao stok rastvor između, ili oko između 0.01 mg/mL do 100 mg/mL, kao što je 1 mg/mL do 50 mg/ml, 2.5 mg/mL do 25 mg/mL, 5 mg/mL do 15 mg/mL ili 10 mg/mL do 100 mg/mL, na primer najmanje ili oko najmanje 5 mg/mL. Zapremina kompozicije može da bude 0.5 mL do 1000 mL, kao što je 0.5 mL do 100 mL, 0.5 mL do 10 mL, 1 mL do 500 mL, 1 mL do 10 mL, kao što je najmanje, ili oko najmanje, ili oko, ili 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL ili više. Celokupni sadržaj bočice može da bude izvučen za primenu, ili može da bude podeljen na mnoštvo doza za višestruku primenu. Za veće zapremine, vreme trajanja infuzije može da bude prilagođeno tako da olakša dostavu veće zapremine. Na primer, vreme infuzije može da bude najmanje 1 minute, 5 minuta, 10 minuta, 20 minuta, 30 minuta, 40 minuta, 50 minuta, 1 čas ili više. Jasno je da formulacije taksana mogu da sadrže druge komponente, uključujući nosače, polimere, lipide i druge ekscipijense. Doze koje su gore obezbeđene su u odnosu na komponentu taksana, koji predstavlja aktivni sastojak.
[0372] Na primer, Abraxane®, albumin-vezani paklitaksel, je formulisan kao formulacija paklitaksela bez rastvarača, u kojoj se paklitaksel nalazi u kompleksu samo sa albuminom da bi obrazovao stabilne čestice veličine jednake, ili oko 130 nm. Svaka bočica od 50 mL leka Abraxane® sadrži 100 mg paklitaksela i približno 900 mg humanog albumina u vidu sterilnog liofilizata. Svaka bočica je predviđena da bude rekonstituisana sa 20 mL 0.9% natrijum hlorida za injekcije, USP, da bi se dobila suspenzija koja sadrži 5 mg/mL paklitaksela. Rekonstituisana suspenzija abraksana se daje infuzijom pri preporučenoj dozi od 260 mg/m2 intravenski, tokom 30 minuta.
[0373] U kompozicijama ili kombinacijama kompozicija koje su ovde obezbeđene, nukleozidni analog, kao što je gemcitabin ili njegov derivat, formulisan je u količini za neposrednu primenu u opsegu između, ili oko između 100 mg do 5000 mg, kao što je 500 mg do 5000 mg, 500 mg do 2500 mg, 1000 mg do 2500 mg, 2000 mg do 5000 mg ili 1500 mg do 2500 mg, uopšteno najmanje, ili oko najmanje, ili oko 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg ili 1000 mg. Kompozicija može da bude obezbeđena u liofilizovanom obliku za kasniju rekonstituciju ili kao tečna formulacija. Na primer, rekonstitucija tečne formulacije može da bude sa vodom ili 0.9% natrijum hloridom ili drugim fiziološkim rastvorom. Kada se rekonstituiše ili obezbeđuje kao tečna formulacija, kompozicija može da bude obezbeđena kao stok rastvora koji sadrži nukleozidni analog između, ili oko između 1 mg/mL do 500 mg/mL, kao što je 5 mg/mL do 100 mg/ml, 10 mg/mL do 50 mg/mL, 25 mg/mL do 200 mg/mL ili 20 mg/mL do 100 mg/mL, na primer najmanje ili oko najmanje 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL ili 40 mg/mL, i uopšteno ne više od 40 mg/mL kako bi se nepotpuno rastvaranje svelo na namanju meru. Zapremina kompozicije može da bude 0.5 mL do 1000 mL, kao što je 0.5 mL do 100 mL, 0.5 mL do 10 mL, 1 mL do 500 mL, 1 mL do 10 mL, kao što je najmanje, ili oko najmanje, ili oko, ili 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL ili više. Celokupni sadržaj bočice može da bude izvučen za primenu, ili može da bude podeljen na mnoštvo doza za višestruku primenu. Za veće zapremine, vreme trajanja infuzije može da bude prilagođeno tako da olakša dostavu veće zapremine. Na primer, vreme infuzije može da bude najmanje 1 minut, 5 minuta, 10 minuta, 20 minuta, 30 minuta, 40 minuta, 50 minuta, 1 čas ili više. Nakon izvlačenja količine leka za primenu, formulacija može da bude dalje razblažena, ako je poželjno, na primer razblažena u vodi, slanom rastvoru (npr.0.9%) ili drugim fiziološkim rastvorima. Jasno je da formulacije nukleozidnog analoga (npr. gemcitabina ili derivata) mogu da sadrže druge komponente, uključujući nosače, polimere, lipide i druge ekscipijense. Doze koje su gore obezbeđene su u odnosu na komponentu nukleozidnog analoga, koji predstavlja aktivni sastojak.
[0374] Na primer, Gemzar®, gemictabin za injekciju, obezbeđen je kao liofilizovana formulacija koja sadrži 200 mg ili 1000 mg aktivnog sredstva po bočici. Predviđeno je da svaka bočica bude rekonstituisana sa 5 mL odnosno 25 mL, 0.9% natrijum hlorida za injekcije, USP, da bi se dobila suspenzija koja sadrži 40 mg/mL gemcitabina (uzimajući u obzir zapreminu liofilizovanog praška, rekonstituisana koncentracija može da bude oko ili jednaka 38 mg/mL). Pre primene, odgovarajuća količina leka može da bude dalje razblažena sa 0.9% natrijum hloridom ili drugim fiziološkim rastvorom.
3. Pakovanje i proizvodni artikli
[0375] Takođe su obezbeđeni proizvodni artikli koji sadrži pakovne materijale, bilo koju farmaceutsku kompoziciju ili kombinaciju koja je ovde obezbeđena, i etiketu koja ukazuje na to da su kompozicije i kombinacije za upotrebu u lečenju kancera, kao što su kancerozni stromalni tumori ili kancerozin solidni tumori. Primeri proizvodnih artikala su kontejneri koji sadrže jednu komoru i kontejneri sa dve komore.
[0376] Kontejneri uključuju, ali nisu ograničeni na epruvete, boce i špriceve. Kontejneri mogu dodatno da uključuju iglu za subkutanu primenu.
[0377] U jednom primeru, proizvodni artikal sadrži farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i taksan koji ciljno deluje na tumor i ne sadrži dodatno sredstvo ili tretman. U drugom primeru, proizvodni artikal sadrži farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, taksan koji ciljno deluje na tumor, i dodatno hemioterapijsko sredstvo (npr. nukleozidni analog). U ovom primeru, sredstva mogu da budu obezbeđena zajedno ili odvojeno, za pakovanje kao proizvodni artikli.
[0378] Proizvodni artikli koji su ovde opisani sadrže ambalažne materijale. Ambalažni materijali za primenu u pakovanju farmaceutskih proizvoda su dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Vidi, na primer, SAD patent br. 5,323,907, 5,052,558 i 5,033,352. Primeri farmaceutskih ambalažnih materijala obuhvataju, ali nisu ograničeni na blister pakovanja, boce, epruvete, inhalatore, pumpe, kese, bočice, kontejnere, špriceve, boce i bilo koji materijal za pakovanje koji je podesan za izabranu formulaciju i ciljni način primene i tretmana.
[0379] Izbor pakovanja zavisi od sredstava, i od toga da li će takve kompozicije biti pakovane zajedno ili odvojeno. Uopšteno, pakovanje ne reaguje sa kompozicijama koje sadrži. U drugim primerima, neke od komponenti mogu da budu pakovane kao smeša. U drugim primerima, sve komponente su pakovane odvojeno. Taki, na primer, komponente mogu da budu pakovane kao posebne kompozicije koje, nakon mešanja neposredno pre primene, mogu da budu direktno primenjene zajedno. Alternativno, komponente mogu da budu pakovane kao pojedinačne kompozicije za odvojenu primenu.
[0380] Komponente mogu da budu pakovane u kontejneru. Komponente se odvojeno pakuju u istom kontejneru. Uopšteno, primeri takvih kontejnera uključuju one koji imaju zatvoreni, definisani prostor koji sadrži enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i zasebno zatvoreni, definisani prostor koji sadrži druge komponente ili komponentu, tako da su susedne oblasti razdvojene membranom koja se lako uklanja koja, po uklanjanju, dozvoljava mešanje komponenti, ili koja omogućava da se komponente odvojeno primene. Razmatra se bilo koji kontejner ili drugi proizvodni artikal, sve dok su sredstva razdvojena od drugih komponenata pre primene. Za pogodne primere izvođenja videti npr., kontejnere opisane u SAD pat. br.3,539,794 i 5,171,081.
[0381] Odabrane kompozicije uključujući proizvodne artikle napravljene od njih, takođe mogu da budu obezbeđene kao kitovi. Kitovi mogu da uključuju farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana i element za primenu obezbeđen kao proizvodni artikal. Kit može, po izboru, da uključuje uputstvo za primenu uključujući doziranje, dozne režime i uputstvo za načine primene. Kitovi mogu takođe da uključuju farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana i element za dijagnostiku.
F. POSTUPCI ZA PROCENU AKTIVNOSTI, BIORASPOLOŽIVOSTI I FARMAKOKINETIKE
[0382] Moguće je proceniti svojstva i aktivnost sredstava sadržanih u kompozicijama koje su date u ovom tekstu. Svojstva i aktivnosti mogu da budu povezane sa biološkom aktivnošću i/ili tumorogenom aktivnošću. Testovi mogu da budu izvedeni in vitro ili in vivo. Takvi testovi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na merenje količina hijaluronana u tkivu ili tumorskim biopsijama ili rastvorljivog hijaluronana u plazmi, merenja katabolita hijaluronana u krvi ili urinu, merenja hijaluronidazne aktivnosti u plazmi, ili merenja pritiska intersticijalnog fluida, vaskularnog volumena ili sadržaja u vodi u tumorima. Testovi mogu da se koriste za procenu delovanja sredstava, uključujući dejstva doze i puta primene.
1. In Vitro testovi
a. Hijaluronidazna aktivnost enzima koji razgrađuje hijaluronan
[0383] Aktivnost enzima koji razgrađuje hijaluronan se može oceniti korišćenjem metoda koji su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti. Na primer, USP XXII test za hijaluronidazu određuje aktivnost indirektno, merenjem količine nedegradirane hijaluronske kiseline ili hijaluronana, (HA) supstrata koji ostane posle dopuštanja da enzim reaguje sa HA tokom 30 min na 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Rastvor referentnog standarda hijaluronidaze (USP) ili nacionalne formulacije (NF) standarda hijaluronidaze mogu se upotrebiti u testu za određivanje aktivnosti, u jedinicama, bilo koje hijaluronidaze. U jednom primeru, aktivnost se meri korišćenjem testa mikroturbiditeta. On je baziran na formiranju nerastvorljivog taloga kada se hijaluronska kiselina vezuje za serumski albumin. Aktivnost se meri inkubacijom hijaluronidaze sa natrijum hijaluronatom (hijaluronskom kiselinom) tokom zadatog vremenskog perioda (npr. 10 minuta), a zatim taloženjem nerazgrađenog natrijum hijaluronata uz dodatak zakišeljenog serumskog albumina. Mutnoća rezultujućeg uzorka se meri na 640 nm posle dodatnog perioda razvijanja. Smanjenje mutnoće koje nastaje usled hijaluronidazne aktivnosti na natrijum hijaluronatnom supstratu je mera hijaluronidazne enzimske aktivnosti. U sledećem primeru hijaluronidazna aktivnost se meri korišćenjem mikrotitarskog testa u kome se meri rezidualna biotinilovana hijaluronska kiselina posle inkubacije sa hijaluronidazom (vidi npr. Frost i Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, SAD pat obj. br. 20050260186). Slobodne karboksilne grupe na glukuronsko-kiselinskim ostacima hijaluronske kiseline su biotinilovane, pa je supstrat biotinilovane hijaluronske kiseline kovalentno kuplovan na mikrotitarskoj ploči. Posle inkubacije sa hijaluronidazom detektuje se supstrat rezidualne biotinilovane hijaluronske kiseline korišćenjem avidinperoksidazne reakcije i poredi se sa onim koji je dobijen posle reakcije sa hijaluronidaznim standardima poznate aktivnosti. Takođe su poznati i drugi testovi za merenje hijaluronidazne aktivnosti iz odgovarajuće oblasti i oni se mogu upotrebiti u ovdašnjim metodima (vidi npr. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
[0384] Takođe se može proceniti sposobnost enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je modifikovana rastvorljiva hijaluronidaza (npr PEG-ilovana rHuPH20) da deluje kao agens za širenje ili difuziju. Na primer, tripan plava boja se može injektirati subkutano ili intradermalno, sa ili bez enzima koji razgrađuje hijaluronan u latelarnu kožu na svakoj strani golih miševa. Onda se meri obojena površina, kao što je sa mikrošestarom, da bi se odredila sposobnost enzima koji razgrađuje hijaluronan da deluje kao agens za širenje (videti npr, objavljeni SAD patent br.20060104968). Efekat zajedničkog davanja enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, sa drugim sredstvom, kao što je hemioterapeutik na farmakokinetička i farmakodinamička svojstva tog sredstva takođe se može oceniti in vivo korišćenjem životinjskog modela i/ili humanih subjekata, kao što je definisanjem kliničkog ispitivanja, kao što je gore razmatrano i pokazano dole u primeru 1. Funkcionalna aktivnost enzima koji razgrađuje hijaluronan koji nije hijaluronidaza se može uporediti sa hijalurnidazom korišćenjem bilo kog od ovih testova. Ovo se može uraditi određivanjem šta je funkcionalno ekvivalentna količina enzima koji razgrađuje hijaluronan. Na primer, sposobnost enzima koji razgrađuje hijaluronan da deluje kao agens za širenje ili difuziju može se oceniti njegovim injektiranjem (npr. subkutano ili intradermalno) u latelarnu kožu miša sa tripan plavom, kao i količine koja je potrebna za ostvarivanje iste količine difuzije, na primer, 100 jedinica referentnog standarda hijaluronidaze. Potrebna količina enzima koji razgrađuje hijaluronan je zato funkcionalno ekvivalentna sa 100 U hijalurnidaze. Hidraulična provodljivost (K), na primer u tumoru, pre i posle tretmana sa modifikovanim enzimom koji razgrađuje hijaluronan, kao što je modifikovana hijaluronidaza, takođe može da bude merena da bi se ocenila aktivnost preparata modifikovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan.
[0385] Sposobnost modifikovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je modifikovana hijaluronidaza, uključujući PEG-ilovanu hijaluronidazu, da utiče na bilo koji ili više markera povezanih sa bolestima i poremećajima udruženim sa hijaluronanom koji su ovde opisani, ili bilo koje druge udružene markere ili fenotipove, može da bude procenjena korišćenjem bilo kog ili više testova koji su gore opisani. Na primer, sposobnost modifikovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je modifikovana hijaluronidaza, da redukuje nivoe ili sadržaj hijaluronana, obrazovanje ili veličinu haloa, pritisak intersticijalnog fluida, sadržaj vode i/ili vaskularni volumen može da bude procenjena upotrebom bilo kog ili više testova koji su gore navedeni in vitro, ex vivo i/ili in vivo. U jednom primeru, modifikovana hijaluronidaza može da bude primenjena kod subjekta sa tumorom ili na odgovarajući životinjski model i dejstvo na nivoe hijaluronana, obrazovanje ili veličinu haloa, pritisak intersticijalnog fluida, sadržaj vode i/ili vaskularni volumen može da bude procenjeno i upoređeno sa subjektima ili životinjskim modelima kod koji nije primenjena modifikovana hijaluronidaza. U nekim primerima, modifikovana hijaluronidaza može da se primenjuje sa drugim sredstvom, kao što je hemioterapijsko sredstvo.
[0386] Drugi različiti testovi za ocenu hijaluronidazne aktivnosti, uključujući dejstva na sintezu ili razgradnju HA, su poznati stručnjaku u oblasti, uključujući, ali bez ograničenja bilo koje koji su ovde opisani ili poznati u stanju tehnike, na primer, in vitro testove koji mere razgradnju hijaluronana (videti npr., Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269), bojenje tkiva ili drugih uzoraka na HA kao što je upotrebom proteina koji se vezuje za HA ili drugih anti-HA reagenasa (videti npr., Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:2189321899), test sa isključivanjem čestica (Nishida et al. 1999; Morohashi et al. (2006) Biochem Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459); merenje ili ocena ekspresije HAS iRNK za has gen (Nishida et al.1999).
b. Aktivnost taksana
[0387] Standardni fiziološki, farmakološki i biohemijski postupci su dostupni za ispitivanje jedinjenja kako bi se identifikovala ona koja poseduju željenu biološku aktivnost za inhibiciju povezivanja tubulina. In vitro i in vivo testovi mogu da se koriste za ocenu biološke aktivnosti, kao što je citotoksičnost i polimerizacija tubulina (videti npr., Hidaka et al. (2012) Biosci. Biotechnol. Biochem., 76:349-352).
[0388] Na primer, jedinjenja taksana koja su ovde obezbeđena mogu da budu ispitana u testu stabilizacije mikrotubula (Barron et al., (2003) Anal. Biochem., 315:49-56). Povezivanje tubulina ili njegova inhibicija mogu da se prate u testu polimerizacije tubulina u vidu apsorbancije ili fluorescencije. Na primer, može da se koristi test polimerizacije tubulina zasnovan na optičkoj gustini, budući da je koncentracija polimera mikrotubula proporcionalna stepenu svetlosti koju mikrotubule rasipaju. Primer takvog testa je HTS test polimerizacije tubulina (kataloški br. BK004P ili BK006P; Cytoskeleton, Denver, CO). Može da se koristi i test koji se zasniva na fluorescenciji, u kome je polimerizacija praćena pojačanjem fluroescencije zahvaljujući ugradnji fluorescentnog reportera u mikrotubule (kataloški br. BK011P, Cytoskeleton, Denver). U takvim testovima, tubulin može da se inkubira sa jedinjenjem taksana, kao što je paklitaksel, vinblastin ili doceletaksel, i može da se meri polimerizacija tokom vremena. Na primer, u testu fluroescencije, polimerizacija može da se meri praćenjem promena u fluorescenciji pri pobuđivanju na 360 nm i emisiji na 420 nm. Povezivanje tubulina može takođe da se prati rasipanjem svetlosti, što je aproksimirano očiglednom apsorpcijom na 350 nm. Za sprečavanje agregacije, u testu se obično koristi goveđi serum albumin (BSA). Takođe, da bi se povećao odnos signala prema šumu, izostavlja se glicerol, koji je pojačivač polimerizacije tubulina. Kao kontrola može da se koristi vinblastin, lek koji destabilizuje mikrotubule, koji stabilizuje tubulin i ne utiče na depolimerizaciju.
c. Antikancerska aktivnost
[0389] Antikancerska aktivnost jedinjenja i sredstava koja su ovde opisana, uključujući enzim koji razgrađuje hijaluronan, taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili drugo hemioterapijsko sredstvo (npr. nukleozidni analog) i njihove formulacije, može da bude ispitana in vitro, na primer, inkubacijom kulture kancerskih ćelija sa derivatom, i zatim ocenom inhibicije rasta ćelija u kulturi. Pogodne ćelije za takvo ispitivanje uključuju ćelije mišje leukemije P388, ćelije melanoma B16 i ćelije kancera pluća Lewis, kao i humane ćelije kancera mlečne žlezde MCF7, kancera jajnika OVCAR-3, kancera pluća A549, MX-1 (ćelije humanog tumora mlečne žlezde), HT29 (ćelijska linija kancera kolona), HepG2 (ćelijska linija kancera jetre), i HCT116 (ćelijska linija kancera kolona).
2. In Vivo životinjski modeli
[0390] Životinjski modeli mogu da se koriste za ocenu dejstava kompozicija ili kombinacija koje su ovde obezbeđene na nivoe ili sadržaj hijaluronana, pritisak intersticijalnog fluida, sadržaj vode, vaskularni volumen, i na veličinu, zapreminu ili rast tumora. Pored toga, životinjski modeli mogu da se koriste za ocenu farmakokinetike ili tolerabilnosti kompozicija ili kombinacija.
[0391] Životinjski modeli mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na miševe, pacove, zečeve, pse, zamorce i nehumane primate, kao što su cinomolgus majmuni ili rezus makake. Životinjski modeli uključuju genetičke modele, kao i ksenograftske modele. Na primer, ksenograftski modeli uključuju one u kojima, pre ispitivanja sredstva, tumori mogu da budu uspostavljeni u pogodnim životinjama za test, npr., golim miševima. U nekim primerima, imunodeficijentnim miševima, kao što su goli miševi ili SCID miševi, transplantira se tumorska ćelijska linija, na primer iz kancera udruženog sa hijaluronanom, da bi se uspostavio životinjski model tog kancera. Primeri ćelijskih linija, uključujući one iz kancera udruženih sa hijaluronanom, uključuju, ali nisu ograničeni na ćelije karcinoma prostate PC3, ćelije adenokarcinoma pankreasa BxPC-3, ćelije karcinoma dojke MDA-MB-231, ćelije tumora dojke MCF-7, ćelije tumora dojke BT474, tumorske ćelije prostate Tramp C2 i ćelije kancera prostate Mat-LyLu, i druge ćelijske linije koje su ovde opisane a koje su povezane sa hijaluronanom, npr. sadrže povišene nivoe hijaluronana. Primer životinjskog tumorskog modela kancera pankreasa uključuje stvaranje tumora kod životinja upotrebom ćelija adenokarcinoma pankreasa BxPC-3 (videti npr. Von Hoff et al. (2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-54).
[0392] Takođe mogu da se koriste genetički modeli u kojima su životinje učinjene deficijentnim u jednom ili više gena što rezultuje u stvaranju ili obrazovanju tumora. Takvi mišji modeli dobijeni genetskim inženjeringom (GEMM) mogu da rekapituliraju molekularne i kliničke karakteristike bolesti. Na primer, primer genetičkog modela kancera pankreasa uključuje ekspresiju specifičnu za pankreas endogenih mutanata alela Kras i Trp53, koja rezultuje u mutantnim miševima koji ispoljavaju deficijentni fenotip (označen kao KPC miševi; LSL-Kras<G12D>, LSL-Trp53<R172H>, Pdx-1-Cre). KPC miševi razvijaju primarne tumore pankreasa koji ispoljavaju svojstva sliča bolesti čoveka, uključujući otpornost na nukleozidni analog gemcitabin (videti npr. Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269).
[0393] Kompozicije ili kombinacije koje su ovde obezbeđene mogu da se primenjuju na miševe za ocenu dejstava na bolest. Na primer, mogu da se procene ili mere nivoi hijaluronana. U drugom primeru, mogu da budu procenjena dejstva na rast tumora ili inhibiciju tumorskih ćelija. Na primer, mogu da se odrede vrednosti ED50, to jest, količina sredstva/sredstava neophodna za postizanje 50% inhibicije rasta tumora kod životinje. Takođe mogu da budu određene stope preživljavanja.
3. Farmakokinetika i tolerabilnost
[0394] Ispitivanja farmakokinetike i tolerabilnosti mogu da budu sprovedena upotrebom životinjskih modela ili mogu da budu sprovedena tokom kliničkih ispitivanja na pacijentima da bi se ocenilo dejstvo kombinacije i kompozicija koje su ovde obezbeđene. Životinjski modeli obuhvataju, ali nisu ograničeni na miševe, pacove, zečeve, pse, zamorčiće i nehumane primatske modele, kao što su cinomolgus majmuni ili rezus makaki. U nekim slučajevima, farmakokinetičke i studije tolerabilnosti su izvedene korišćenjem zdravih životinja. U drugim primerima, studije su bile izvedene korišćenjem životinjskih modela bolesti za koje se razmatra terapija upotrebom kombinacije ili kompozicije prema ovom tekstu, kao što su životinjski modeli kancera.
[0395] Farmakokinetička svojstva kombinacija ili kompozicija koje su ovde obezbeđene mogu da budu procenjena merenjem parametara kao što su maksimalna (vršna) koncentracija hemioterapijskog sredstva (Cmax), vršno vreme (tj. kada se javlja maksimalna koncentracija hemioterapijskog sredstva; Tmax), minimalna koncentracija hemioterapijskog sredstva (tj. minimalna koncentracija između doza hemioterapijskog sredstva; Cmin), polu-život eliminacije (T1/2) i površina ispod krive (tj. površina ispod krive generisane ucrtavanjem vremena prema koncentraciji; AUC), nakon primene. U slučajevima kada se hemioterapijsko sredstvo primenjuje subkutano, apsolutna bioraspoloživost sredstva se određuje poređenjem površine ispod krive hemioterapijskog sredstva nakon subkutane dostave (AUCsc) sa AUC hemioterapijskog sredstva nakon intravenske dostave (AUCiv). Apsolutna bioraspoloživost (F), može da se izračuna upotrebom formule: F = ([AUC]scx dozasc) / ([AUC]ivx dozaiv). Koncentracija hemioterapijskog sredstva u plazmi nakon subkutane primene može da se meri korišćenjem bilo kog postupka poznatog u stanju tehnike koji je pogodan za ocenu koncentracija hemioterapijskog sredstva u uzorcima krvi.
[0396] Opseg doza i različite učestanosti doziranja mogu se primenjivati u farmakokinetičkim studijama radi ocenjivanja efekta povećanja ili smanjenja koncentracija ko-administriranog sredstva (npr. nukleozidnog analoga). Farmakokinetička svojstva subkutano primenjenog hemioterapeutika, kao što je bioraspoloživost, takođe mogu da budu procenjena sa ili bez ko-administracije enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, psima, kao što je bigl, može da se administrira hemioterapeutik (npr. nukleozidni analog kao što je gemcitabin) u kombinaciji sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom i/ili taksanom koji ciljno deluje na tumor, ili sam, korišćenjem jednog ili više puteva primene. Takva ispitivanja mogu da se sprovedu za ocenu dejstva ko-administracije sa antihijaluronanskim sredstvom, kao što je hijaluronidaza, na farmakokinetička svojstva, kao što je bioraspoloživost, hemioterapijskih sredstava.
[0397] Iz odgovarajuće oblasti su takođe poznate i mogu se ovde upotrebiti studije za ocenjivanje bezbednosti i tolerabilnost. Posle primene kombininacije i kompozicija prema ovom tekstu, može se pratiti razvoj bilo kakvih neželjenih reakcija. Neželjene reakcije mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na reakcije na mestu injekcije, kao što su edem ili oticanje, glavobolja, groznica, zamor, jeza, crvenilo, vrtoglavica, urtikarija, šištanje ili stezanje u grudima, nauzeja, povraćanje, ukočenost, bol u leđima, bol u grudima, mišićni grčevi, napadi ili konvulzije, promene krvnog pritiska i anafilaktičke ili ozbiljne hipersenzibilne reakcije. U studijama bezbednosti i tolerabilnosti se obično daje niz različitih doza i sa različitom učestanosti doziranja radi ocenjivanja efekta povećanih ili smanjenih koncentracija hemioterapijskog sredstva i/ili antihijaluronanskog sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i/ili taksan koji ciljno deluje na tumor u dozi.
G. POSTUPCI I UPOTREBE KOMBINOVANE TERAPIJE
[0398] Kombinacije i kompozicije, koje su ovde obezbeđene, mogu da se koriste u postupcima terapije za lečenje kancera, i naročito za lečenje kanceroznih solidnih tumora. U postupcima, kombinovana terapija antihijaluronanskim sredstvom, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom (npr. hijaluronidaza, kao što je PH20, na primer PEGPH20) i formulacijom taksana (npr. formulacijom taksana vezanih za albumin) primenjuje se kod subjekta koji ima solidni tumor. U nekim primerima, takođe može da se primenjuje dodatno sredstvo koje predstavlja nukleozidni analog, i naročito sredstvo u vidu nukleozidnog analoga koje se koristi za lečenje solidnih tumora i/ili koje je podložno inhibiciji deaminacijom (npr. gemcitabin ili njegov derivat). Kako je ovde nađeno, količina nukleozidnog analoga unutar tumora, i na taj način njegovih citotoksičnih dejstava, u kombinovanom režimu sa enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom i formulacijom taksana daleko prevazilazi dejstva u slučaju kada se nukleozidni analog primenjuje sa samo jednim od sredstava (tj. enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom ili formulacijom taksana). Na primer, dejstva mogu da budu sinergistička. Stepen i nivo aktivnosti nukleozidnog analoga unutar tumora primećen u kombinovanoj terapiji koja je ovde obezbeđena dostiže rezultate koji do sada nisu bili postignuti postojećim terapijama, uključujući povećanu efikasnost i stopu preživljavanja koja prevazilazi postojeće režime lečenja.
1. Kanceri
[0399] Kombinovana terapija antihijaluronanskim sredstvom, npr. enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom, formulacijom taksana i/ili nukleozidnim analogom može da se koristi za lečenje kanceroznih ćelija, neoplazmi, tumora i metastaza. Kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena ispoljava antitumorsku efikasnost i rezultuje u usporavanju ili redukciji tumorskog rasta, smanjenju zapremine tumora i u nekim slučajevima eliminacijom ili eradikacijom tumora. Kombinovana terapija rezultuje u povećanom preživljavanju subjekata u poređenju sa subjektima koji su lečeni iszim sredstvima kao pojedinačnom ili kombinovanom terapijom sa dva sredstva. Za kancere kao kancer pankreasa koji se teško leče, kombinovana terapija obezbeđuje značajne koristi u poređenju sa postojećim postupcima.
[0400] Na primer, kombinovana terapija može da se koristi za lečenje solidnog tumora, kao što je kancer pluća i bronha, dojke, kolona i rektuma, bubrega, želuca, ezofagusa, jetre i intrahepatičnog žučnog kanala, mokraćne bešike, mozga i drugih delova nervnog sistema, glave i vrata, usne duplje i farinksa, grlića, tela materice, tiroidee, jajnika, testa, prostate, maligni melanom, holangiokarcinom, timom, nemelanomski kanceri kože, kao i hematoloških tumora i/ili maligniteta, kao što su dečija leukemija i limfomi, multipli mijelom, Hodgkin-ova bolest, limfomi koji potiču od limfoca i kože, akutna i hronična leukemija kao što je akutna limfoblastna, akutna mijelocitna ili hronična mijelocitna leukemija, neoplazma plazma ćelija, limfoidna neoplazma i kanceri povezani sa SID-om. Tipično, kombinovana terapija se koristi za lečenje solidnih tumora, na primer, kancera u vidu stromalnog solidnog tumora. Primeri tumora uključuju, na primer, tumore pankreasa, tumore jajnika, tumore pluća, tumore kolona, tumore prostate, tumore grlića i tumore dojke.
[0401] Naročito, kanceri mogu da budu kanceri bogati hijaluronanom koji su pogodni za ciljno delovanje antihijaluronanskog sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan. Identifikovano je nekoliko kancera bogatih hijaluronanom. Tumori bogati hijaluronanom uključuju, ali nisu ograničeni na tumore prostate, dojke, kolona, jajnika, želuca, glave i vrata i druge tumore i kancere. U nekim slučajevima, nivoi hijaluronana su u korelaciji sa lošom prognozom, na primer, sniženom stopom preživljavanja i/ili stopom preživljavanja bez recidiva, metastazama, angiogenezom, invazijom kancerskih ćelija u druga tkiva/područja, i drugim indikatorima loše prognoze. Takva korelacija je zapažena, na primer, u tumorima bogatim hijaluronanom uključujući kancer jajnika, SCC, ISC, kancer prostate, kancer pluća, uključujući nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer dojke, kancer kolona i kancer pankreasa (videti, na primer, Anttila et al., (2000) Cancer Research, 60:150-155; Karvinen et al., (2003) British Journal of Dermatology, 148:86-94; Lipponen et al., (2001) Eur. Journal of Cancer, 849-856; Pirinen et al., (2001)Int. J. Cancer: 95: 12-17; Auvinen et al., (2000) American Journal of Pathology, 156(2):529-536; Ropponen et al., (1998) Cancer Research, 58: 342-347). Prema tome, kanceri bogati hijaluronanom mogu da budu lečeni primenom antihijaluronanskog sredstva, kao što je hijaluronidaza, za lečenje jednog ili više simptoma kancera.
[0402] U primerima lečenja kancera bogatih hijaluronanom, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, može da deluje terapijski samostalno i/ili može da poboljša aktivnost drugog ko-administriranog sredstva ili kombinovane terapije. Na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronane, kao što je hijaluronidaza, ima neposredna antikarcinogena dejstva kada se injektuje u tumore. Hijaluronidaza sprečava rast tumora transplantiranih u miševe (De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660) i inhibira obrazovanje tumora nakon izlaganja karcinogenima (Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer 23:105-109) Hijaluronidaza je efikasna kao samostalno terapijsko sredstvo u lečenju kancera mozga (glioma) (videti, međunarodnu pat. obj. br. WO198802261).
[0403] Antihijaluronanska sredstva, kao što su enzimi koji razgrađuju hijaluronan, uključujući hijaluronidaze, mogu takođe da se koriste za povećanje dostave hemioterapijskih sredstava u tumore. Enzim koji razgrađuje hijaluronan može da se primenjuje u kombinaciji sa, na primer, istovremeno ili pre, jednim ili više drugih hemioterapijski ili drugih antikancerskih sredstava ili tretmana (npr. lečenje formulacijom taksana i/ili lečenje nukleozidnim analogom). U nekim slučajevima, enzimi mogu da povećaju osetljivost tumora koji su otporni na uobičajenu hemioterapiju. Na primer, enzimi koji razgrađuju hijaluronan, uključujući hijaluronidaze, kao što je rHuPH20, mogu da se primenjuju kod pacijenta u količini efikasnoj u povećanju difuzije oko mesta na kome se nalazi tumor (npr., da bi se olakšala cirkulacija i/ili povećala koncentracija hemioterapijskih sredstava u i oko mesta gde se nalazi tumor), inhibiciji pokretljivosti tumorskih ćelija, na primer degradacijom hijaluronske kiseline, i/ili u snižavanju praga apoptoze tumorskih ćelija. Ovo može da dovede tumorsku ćeliju/ćelije u stanje anoikisa, što čini tumorsku ćeliju podložnijom delovanju hemioterapijskih sredstava. Primena enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, može da indukuje responsivnost tumora pankresa, želuca, kolona, janika, i dojke koji su ranije bili otporni na hemioterapiju (Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390). Enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, tipično poboljšava prodiranje hemioterapijskih ili drugih antikancerskih sredstava u solidne tumore, lečeći bolest na taj način.
Izbor subjekata za lečenje
[0404] Postupci uključuju korake za izbor subjekata za lečenje koji imaju tumor ili kancer udružen sa hijaluronanom. Takvi postupci uključuju postupke za detekciju markera bolesti udružene sa hijaluronanom, koji uključuju bilo koju indikaciju da subjekt ima bolest udruženu sa hijaluronanom, da će subjekt verovatno odgovoriti na lečenje antihijaluronanskim sredstvom, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i/ili da uzorak uzet od subjekta, kao što je tkivo, ćelija ili fluid, sadrži povišenu ekspresiju hijaluronana. Primeri testova za detekciju markera su opisani u nastavku, i uključuju testove za merenje nivoa HA i/ili relativnih nivoa HA u uzorku uzetom od subjekta, testovi za analizu dejstava enzima koji razgrađuju hijaluronane na uzorku uzetom od subjekta, i testovi za merenje pokazatelja koji su obično povezani sa određenim bolestima/stanjima udruženim sa hijaluronanom, kao što je niska ekspresija ili aktivnost hijaluronidaze, visok pritisak intersticijalnog fluida, vaskularni volumen i sadržaj vode. Uopšteno, može da se koristi bilo koji poznati test za detekciju proteina ili nukleinskih kiselina u uzorcima uzetim od subjekata, ili za ocenu dejstava tretmana na ćelije/tkiva in vitro.
[0405] Subjekti odabrani za tretman u postupcima koji su ovde obezbeđeni uključuju subjekte koji imaju povišene, aberantne ili akumulirane nivoe hijaluronana u poređenju sa subjektima koji nemaju bolest ili stanje, ili u poređenju sa normalnim tkivima ili uzorcima koji nemaju povišenu, aberantnu ili akumuliranu ekspresiju HA. Bilo koji uzorak ili tkivo uzeto od subjekta može da bude ispitano i upoređeno sa normalnim uzorkom ili tkivom. Nivoi hijaluronana mogu da se mere iz bilo kog izvora, na primer iz tkiva (npr. biopsijom), tumora, ćelija, ili iz krvi, seruma, urina ili drugih telesnih fluida. Na primer, kao što je opisano na drugom mestu u tekstu, profili taloženja HA u solidnim tumorima su uopšteno kategorizovani kao pericelularni ili stromalni. Zapaženo je da su povišeni nivoi HA u plazmi najizraženiji kod pacijenata sa Vilmsovim tumorom, mezoteliomom i metastazama na jetri. Prema tome, u zavisnosti od bolesti ili stanja, nivoi hijaluronana mogu da se mere u različitim uzorcima. Izbor uzorka se nalazi u okviru kompetentnosti stručnjaka u odgovarajućoj oblasti.
[0406] Test koji se koristi za merenje nivoa supstrata hijaluronidaze zavisi od bolesti ili stanja i može da bude odabran na osnovu konkretne bolesti ili stanja. Stručnjaku u ovoj oblasti su poznati postupci za detekciju hijaluronana, koji uključuju, ali nisu ograničeni na imunohistohemijske postupke ili ELISA metod.
[0407] U jednom primeru, korak detekcije markera izvodi se pre lečenja subjekta, na primer, da bi se odredilo da li subjekt ima stanje ili bolest udruženu sa hijaluronanom koja će biti podložna lečenju enzimom koji razgrađuje hijaluronan. U ovom primeru, ako je marker detektovan (npr. ako je utvrđeno da ćelija, tkivo ili fluid pacijenta sadrži povišenu ekspresiju hijaluronana ili je responsivan na enzim koji razgrađuje hijaluronan), izvodi se korak tretmana, u kome se enzim koji razgrađuje hijaluronan primenjuje kod subjekta. U jednom primeru, kada marker nije detektovan (npr. ako je određeno da ćelija, tkivo ili fluid pacijenta sadrži normalnu ili ekspresiju hijaluronana koja nije povišena ili nije responsivan na enzim koji razgrađuje hijaluronan), može da bude odabrana druga varijanta lečenja.
[0408] U drugom primeru, korak detekcije markera izvodi se posle lečenja subjekta, ili tokom trajanja lečenja subjekta, (npr. tretman antihijaluronanskim sredstvom, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan (npr. rastvorljiva modifikovana hijaluronidaza) (sa ili bez koadministriranog sredstva)), na primer, da bi se odredilo da li tretman antihijaluronanskim sredstvom ima dejstvo na lečenje bolesti ili stanja. U jednom takvom primeru, ako marker nije detektovan ili je detektovan u količini ili relativnom nivou koji je smanjen u poređenju sa količinom/nivoom pre lečenja, ili u poređenju drugim uzorkom, tretman se nastavlja, izvodi se još jedna etapa tretmana, ili se započinje drugi tretman, kao što je kombinovana terapija. U drugom takvom primeru, ukoliko je detektovan isti nivo markera kao pre lečenja ili isti nivo markera kao u drugom uzorku, može da bude odabrana druga varijanta lečenja.
[0409] Testovi za detekciju markera bolesti i stanja udruženog sa hijaluronanom uključuju testove za merenje količine (npr. relativne količine) hijaluronana i/ili ekspresije hijaluronidaze u tkivu, ćeliji i/ili telesnom fluidu subjekta, na primer, u tumoru. U takve testove su uključeni oni koji mogu da detektuju ekspresiju HA, ekspresiju hijaluronan sintaze 1 (HAS1), ekspresiju hijaluronan sintaze 2 (HAS2), ekspresiju hijaluronan sintaze 3 (HAS3), prisustvo HALO (pericelularnih matriksnih regiona bogatih proteoglikanima, uključujući hijaluronan), i prisustvo enzima koji razgrađuju hijaluronane, kao što su hijaluronidaze, na primer, u uzorcima uzetim od subjekta.
[0410] Testovi za detekciju nivoa proteina i nukleinskih kiselina su dobro poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste u ovde opisanim postupcima za merenje hijaluronana, ekspresije hijaluronan sintaze ili drugih proteina i/ili nukleinskih kiselina. Takvi testovi uključuju, ali nisu ograničeni na ELISA, SDS-PAGE, Western Blot, PCR, RT-PCR, imunohistohemiju, histologiju i protočnu citometriju. Na primer, uzorak uzet od subjekta, kao što je uzorak tkiva (npr. biopsija tumora uzeta od pacijenta ili životinjskog modela, stromalni uzorak), fluid (npr. krv, urin, plazma, saliva ili drugi uzorak), ćelija ili ćelijski uzorak, ili ekstrakt, ili drugi uzorak, može da bude obojen anti-HA antitelima ili proteinima koji vezuju HA, na primer, korišćenjem histološkog bojenja, kao što je imunohistohemija (IHC) fiksiranih ili zamrznutih isečaka tkiva, da bi se odredilo prisustvo i stepen hijaluronana u tkivu ili uzorku, ili imunofluorescentno ćelijsko bojenje, „pull-down“ testovi i protočna citometrija. U drugom primeru, uzorak, npr. biopsija, može da bude ispitan pomoću RT-PCR da bi se ocenila količina iRNK HA.
[0411] Poznati postupci za detekciju ekspresije hijaluronana u kanceru uključuju, ali nisu ograničeni na test sličan ELISA-testu opisan kod Lokeshwar et al., (1997) Cancer Res. 57: 773-777, za merenje nivoa HA u urinu ili ekstraktima tkiva bešike subjekata koji imaju kancer bešike. Za izvođenje testa, urin ili ekstrakti se nanose na mikroploče (nanosi se i HA pupčane vrpce koja se koristi kao standard), nakon čega se inkubiraju (npr.16 časova, sobna temperatura) sa obeleženim (npr. biotinilisanim) HA-vezujućim proteinom, kao što su oni koji su ovde opisani, peru i HA-vezujući protein vezan za bunarčiće se kvantitativno određuje upotrebom supstrata sredstva za avidin-biotin detekciju. Takvi postupci su dobro poznati u stanju tehnike. U jednom primeru, urin subjekta sa kancerom bešike udruženim sa HA sadržao je nivoe HA koji su povišeni 2-9 puta u poređenju sa urinom/ekstraktima koji potiču od normalnih pacijenata (zdravih subjekata ili subjekata sa drugim gastrourinarnim bolestima ili stanjima); tako da bi marker bio detektovan ako su nivoi HA u urinu povišeni u poređenju sa normalnim subjektima, npr. povišeni 2-9 puta, ili oko 2-9 puta, npr. povišeni 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 puta, ili povišeni oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 puta, u poređenju sa normalnim subjektom.
[0412] U sledećem primeru, ekspresija i proizvodnja hijaluronana u tumorskim ćelijama in vitro može da bude procenjena korišćenjem bilo kog od gore opisanih postupaka. Slično, proizvodnja i/ili ekspresija hijaluronan sintaze (npr. HAS1, HAS2 ili HAS3) u ćelijama in vitro, ex vivo ili in vivo takođe može da bude ispitana pomoću metoda, na primer, ELISA, SDS-PAGE, Western Blot, PCR, RT-PCR, imunohistohemije, histologije ili protočne citometrije.
[0413] U drugom primeru, određuje se količina hijaluronidazne aktivnosti u uzorku uzetom od subjekta, npr. u krvi ili plazmi, na primer testom turbiditeta.
[0414] U drugom primeru, izoluje se ćelija ili drugo tkivo pacijenta, npr. tumorska ćelija, i koristi u ispitivanju da bi se odredilo da li je ćelija ili tkivo responsivno na lečenje enzimom koji razgrađuje hijaluronan in vitro, na primer, upotrebom klonogenog testa ili bilo kog drugog testa za merenje rasta, proliferacije i/ili preživljavanja ćelija ili tkiva, kao što su tumorske ćelije, kao odgovor na lečenje. Na primer, kancerske ćelije subjekta mogu da se zaseju na površinu, kao što je ekstracelularni matriks ili smeša proteina, kao što je smeša koja se prodaje pod zaštićenim imenom Matrigel® (BD Biosciences). U ovom primeru, marker udružen sa hijaluronanom je osetljivost ćelija ili tkiva na primenu enzima koji razgrađuje hijaluronan. U ovom primeru, ako je bilo koje svojstvo, kao što je proliferacija, rast ili preživljavanje ćelija, inhibirano ili zaustavljeno dodatkom enzima koji razgrađuje hijaluronan, time je određeno da subjekt može da bude podložan lečenju kompozicijama koje sadrže enzim koji razgrađuje hijaluronan.
[0415] Pored testova za određivanje nivoa ekspresije hijaluronana, drugi testovi mogu da se koriste za izbor subjekta za tretman, i/ili za procenu efikasnosti i/ili trajanja tretmana. Pritisak intersticijalnog fluida (IFP) može da se meri upotrebom odgovarajuće probe ili instrumenta.
Na primer, kateter sa transducerom na vrhu može da se koristi za merenje IFP u kancerskim tkivima ili drugim tkivima od interesa. Kateter prolazi kroz unutrašnji otvor hirurške igle, koja se zatim postavlja u centar tumora. Igla se povlači, dok kateter ostaje na položaju. IFP (mmHg) može da se meri korišćenjem odgovarajućeg uređaja za prikupljanje podataka (Ozerdem et al. (2005) Microvasc. Res. 70:116-120). Drugi postupci za merenje IFP uključuju metod fitilja u igli (Fadnes et al. (1977) Microvasc. Res.14:27-36).
[0416] Vaskularni volumen može da bude izmeren korišćenjem, na primer, ultrazvučnog snimanja. Ovaj postupak uključuje hiperehogene mikromehuriće da bi se dobile jake refleksije ultrazvučnih talasa koje se detektuju. Mikromehurići se, kada se injektuju, na primer intravenski, subjektu ili životinjskom modelu, kreću kroz vaskularni prostor zahvaljujući svojoj veličini. Testovi za procenu sadržaja vode u tkivu, kao što je sadržaj vode u tumorskom tkivu takođe su poznati u stanju tehnike. Na primer, uzorci iz tumora mogu da budu sakupljeni, osušeni, izmereni i naglo smrznuti pre liofilizacije. Težina vode se zatim prikazuje kao odnos težine vlažnog tkiva prema suvom (tj. liofilizovanom).
[0417] Sposobnost tumorske ćelije da obrazuje pericelularni matriks (haloe) in vitro može da bude procenjena upotrebom testa sa isključivanjem čestica. Male čestice (crvene krvne ćelije fiksirane formalinom) mogu da se dodaju kulturama tumorskih ćelija niske gustine u prisustvu, na primer, agrekana, koji predstavlja veliki agregirajući hondroitin sulfat proteoglikan. Nakon što se čestice stalože, kulture mogu da se posmatraju pod uveličanjem od 400x da bi se odredilo da li su tumorske ćelije obrazovale haloe. Ovo se može videti kao oblasti oko ćelija iz kojih su čestice isključene.
[0418] Za bilo koje postupke detekcije, marker (npr. ekspresija HA, responsivnost na enzim koji razgrađuje hijaluronan, ekspresija HA sintaze ili hijaluronidazna aktivnost) se tipično upoređuje sa kontrolnim uzorkom, tako da detekcija markera obično uključuje određivanje da je očitavanje povišeno ili sniženo u poređenju sa kontrolnim uzorkom.
[0419] Na primer, kontrolni uzorak može da bude drugo tkivo, ćelija ili telesni fluid, kao što je normalno tkivo, ćelija ili telesni fluid, na primer, tkivo, ćelija ili telesni fluid koji je analogan uzorku koji se ispituje, izolovan iz drugog subjekta, kao što je subjekt koji je normalan (tj. nema bolest ili stanje, ili nema vrstu bolesti ili stanja koju ima ispitivani subjekt), na primer, subjekt nema bolest ili stanje udruženo sa hijaluronanom, ili analogno tkivo iz drugog subjekta koji ima sličnu bolest ili stanje, ali čija bolest nije toliko ozbiljna i/ili nije udružena sa hijaluronanom ili eksprimira relativno manje hijaluronana i prema tome je udružena sa hijaluronanom u manjem stepenu. Na primer, kada se ćelija, tkivo ili fluid ispituje iz subjekta koji ima kancer, može da se upoređuje sa tkivom, ćelijom ili fluidom iz subjekta koji ima manje ozbiljan kancer, kao što je kancer u ranom stadijumu, diferencirani ili drugi tip kancera. U drugom primeru, kontrolni uzorak je fluid, tkivo, ekstrakt (npr. ekstrakt ćelije ili jedra), preparat nukleinske kiseline ili peptida, ćelijska linija, biopsija, standard ili drugi uzorak, sa poznatom količinom ili relativnom količinom HA, kao što je uzorak, na primer tumorska ćelijska linija, za koju je poznato da eksprimira relativno niske nivoe HA, kao što su primeri tumorskih ćelijskih linija koje su ovde opisane, koje eksprimiraju niske nivoe HA, na primer, ćelijska linija HCT 116, ćelijska linija HT29, ćelijska linija NCI H460, ćelijska linija DU145, ćelijska linija Capan-1, i tumori iz tumorskih modela stvorenih upotrebom takvih ćelijskih linija.
[0420] Jasno je da određena promena, npr. povećanje ili smanjenje HA, zavisi od korišćenog testa. Na primer, u ELISA testu, umnožak povećanja ili smanjenja apsorbance na određenoj talasnoj dužini ili u količini proteina (npr. određeno korišćenjem standardne krive) može da bude izražen u odnosu na kontrolu. U PCR testu, kao što je RT-PCR, može da bude upoređen sa nivoima ekspresije kontrole (npr. izražen kao umnožak promene) korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima u odgovarajućoj oblasti, na primer korišćenjem standarda.
[0421] Na primer, kada se ispituje količina hijaluronana u uzorku uzetom od subjekta, detekcija markera može da bude pokazatelj da je količina HA u uzorku (npr. kanceroznoj ćeliji, tkivu ili fluidu) subjekta povišena u poređenju sa kontrolnim uzorkom, kao što je kontrolni uzorak opisan u prethodnom paragrafu. U jednom primeru, kancer je određen kao kancer bogat hijaluronanom ako je količina HA u tkivu, ćeliji ili fluidu povišena za ili oko 0.5 puta, 1 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 11 puta, 12 puta, 13 puta, 14 puta, 15 puta, 20 puta, ili više, u poređenju sa kontrolnim uzorkom, koji može da bude, na primer, ali bez ograničenja, fluid, tkivo, ekstrakt (npr. ekstrakt ćelije ili jedra), preparat nukleinske kiseline ili peptida, ćelijska linija, biopsija, standard ili drugi uzorak, sa poznatom količinom ili relativnom količinom HA, kao što je uzorak, na primer tumorska ćelijska linija, za koju je poznato da eksprimira relativno niske nivoe HA, kao što su primeri tumorskih ćelijskih linija koje su ovde opisane koje eksprimiraju niske nivoe HA, na primer, ćelijska linija HCT 116, ćelijska linija HT29, ćelijska linija NCI H460, ćelijska linija DU145, ćelijska linija Capan-1, i tumori iz tumorskih modela stvorenih upotrebom takvih ćelijskih linija.
[0422] Pored toga, u takvim postupcima, nivo hijaluronana povezanog sa ćelijom može da bude ocenjen kao nizak, umeren ili visok. Na primer, ekspresija HA se smatra visokom ili umerenom ako 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili više od površine tumora pokazuje perzistentni HA signal. Tipično, ovde se razmatra lečenje subjekata koji imaju najmanje umeren do visok HA.
2. Doziranje i primena
[0423] Kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena koja sadrži antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i taksan koji ciljno deluje na tumor, i opciono u dodatnoj kombinaciji sa nukleozidnim analogom, primenjuje se u količini dovoljnoj da ispolji terapijski korisno dejstvo. Tipično, aktivna sredstva se primenjuje u količini koja ne rezultuje u neželjenim sporednim dejstvima na pacijenta koji se leči, ili koja svodi na najmanju meru ili smanjuje zapažena sporedna dejstva u poređenju sa dozama i količinama neophodnim za pojedinačni tretman sa jednim od gore navedenih sredstava. Na primer, kao što je opisano na drugom mestu u ovom tekstu, ovde je nađeno da kombinovana terapija enzimom koji razgrađuje hijaluronan konjugovanim sa polimerom i taksanom koji ciljno deluje na tumor rezultuje u povećanoj intratumorskoj dostavi i povećanom intratumorskom polu-životu ko-administriranog nukleozidnog analoga, npr. gemcitabina. Prema tome, količina nukleozidnog analoga (npr. gemcitabina) koja može da bude primena u kombinovanoj terapiji koja je ovde obezbeđena, u poređenju sa količinama nukleozidnog analoga koje se primenjuju upotrebom postupaka prema prethodnom stanju tehnike (npr. monoterapija gemcitabinom ili dvostruka terapija zajedno sa jednim drugim sredstvom) se smanjuje, uz postizanje suštinski iste ili poboljšane terapijske efikasnosti. Smanjenjem doze koja se primenjuje, sporedna dejstva povezana sa primenom nukleozidnog analoga (npr. gemcitabina), kao što je imunosupresija ili mijelosupresija, se redukuju, svode na nakmanju meru ili izbegavaju.
[0424] Na nivou znanja stručnjaka u odgovarajućoj oblasti je da odredi precizne količine aktivnih sredstava, uključujući antihijaluronansko sredstvo, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, taksan koji ciljno deluje na tumor, i izborno nukleozidni analog, koje treba da se primene se kod subjekta. Na primer, takva sredstva i upotrebe za lečenje bolesti i stanja, kao što su kanceri i solidni tumori, su dobro poznate u struci. Prema tome, doziranje takvih sredstva u kompoziciji ili kombinovanoj terapiji može da bude odabrano na osnovu standardnih doznih režima za to sredstvo pri datom putu primene.
[0425] Jasno je da je precizno doziranje i trajanje tretmana u funkciji tkiva ili tumora koji se leči i može da se odredi empirijski korišćenjem poznatih protokola isitivanja ili ekstrapolacijom podataka in vivo ili in vitro testova i/ili može da bude određeno iz poznatih doznih režima za konkretno sredstvo. Treba napomenuti da vrednosti koncentracija i doza mogu takođe da variraju sa godinama osobe koja se leči, težinom osobe, putem primene i/ili stepenom ili ozbiljnošću bolesti i drugim faktorima, čije je razmatranje na nivou kompetentnosti kvalifikovanog lekara. Uopšteno, dozni režimi se odabiraju tako da se ograniči toksičnost. Treba zapaziti da će nadležni lekar znati kako da i kada da završi, prekine ili prilagodi terapiju na nižu dozu zbog toksičnosti, ili disfunkcije kosne srži, jetre ili bubrega ili drugog tkiva. Nasuprot tome, nadležni lekar će takođe znati kako i kada da podesi tretman na više nivoe ako klinički odgovor nije odgovarajući (sprečavajući toksična neželjena dejstva). Dalje treba razumeti da za bilo koji konkretan subjekt, specifični dozni režimi treba da budu prilagođeni tokom vremena individualnim potrebama i prema profesionalnoj proceni osobe koja primenjuje ili nadgleda primenu formulacija, i da su opsezi koncentracija koji su ovde prikazani samo primeri i nisu namenjeni da ograniče obim predmetnog pronalaska.
[0426] Na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, kao što je hijaluronidaza, na primer PH20 (npr. PEGPH20), primenjuje se u terapijski efikasnoj količini za razgradnju ili sečenje hijaluronana povezanog sa tumorom. Količina enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je rastvorljiva hijaluronidaza, za primenu u lečenju bolesti ili stanja, na primer kancera ili solidnog tumora kao što je tumor bogat u HA, može da bude određena standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, in vitro testovi i životinjski modeli mogu da budu korišćeni da pomognu u identifikaciji optimalnih doznih opsega. Precizno doziranje, koje može da se odredi empirijski, može da zavisi od konkretnog enzima, puta primene, tipa bolesti koja treba da se leči i ozbiljnosti bolesti. Primer doznog opsega iznosi, ili je oko 50 jedinica do 50 000 000 jedinica enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom, ili funkcionalno ekvivalentna količina drugog enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom. Ovde je jasno da je jedinica aktivnosti normalizovana prema standardnoj aktivnosti, na primer, aktivnost izmerena u testu mikroturbiditeta za ispitivanje hijaluronidazne aktivnosti.
[0427] Prema tome, na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je hijaluronidaza, na primer PH20, konjugovan sa polimerom, na primer, PEG, može da se primenjuje u količini od, ili oko 10 do 50 000 000 jedinica, 10 do 40000 000 jedinica, 10 do 36000 000 jedinica, 10 do 12000 000 jedinica, 10 do 1200 000 jedinica, 10 do 1000 000 jedinica, 10 do 500 000 jedinica, 100 do 100 000 jedinica, 500 do 50 000 jedinica, 1000 do 10 000 jedinica, 5000 do 7500 jedinica, 5000 jedinica do 50 000 jedinica, ili 1 000 do 10 000 jedinica. Uopšteno, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom primenjuje se kod subjekta u količini koja je između ili oko između 0.01 µg/kg do 25 mg/kg, kao što je 0.0005 mg/kg (0.5 µg/kg) do 25 mg/kg, 0.5 µg/kg do 10 mg/kg, 0.02 mg/kg do 1.5 mg/kg, 0.01 µg/kg do 15 µg/kg, 0.05 µg/kg do 10 µg/kg, 0.75 µg/kg do 7.5 µg/kg ili 1.0 µg/kg do 3.0 µg/kg. Enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom može da se primenjuje, na primer, u dozi od najmanje ili oko najmanje 0.0005 mg/kg (subjekta), 0.0006 mg/kg, 0.0007 mg/kg, 0.0008 mg/kg, 0.0009 mg/kg, 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, ili više, primenjuje se kod prosečnog odraslog humanog subjekta, tipično težine oko 70 kg do 75 kg.
[0428] Enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, kao što je PEG-ilovana hijaluronidaza (npr. PEGPH20), koja je ovde obezbeđena može da se primenjuje u količini od između, ili oko između 1 jedinice/kg do 800 000 jedinica/kg, kao što je 10 do 800 000 jedinica/kg, 10 do 750000 jedinica/kg, 10 do 700000 jedinica/kg, 10 do 650000 jedinica/kg, 10 do 600 000 jedinica/kg, 10 do 550000 jedinica/kg, 10 do 500000 jedinica/kg, 10 do 450 000 jedinica/kg, 10 do 400 000 jedinica/kg, 10 do 350 000 jedinica/kg, 10 do 320 000 jedinica/kg, 10 do 300000 jedinica/kg, 10 do 280000 jedinica/kg, 10 do 260000 jedinica/kg, 10 do 240 000 jedinica/kg, 10 do 220000 jedinica/kg, 10 do 200000 jedinica/kg, 10 do 180 000 jedinica/kg, 10 do 160 000 jedinica/kg, 10 do 140 000 jedinica/kg, 10 do 120 000 jedinica/kg, 10 do 100000 jedinica/kg, 10 do 80000 jedinica/kg, 10 do 70000 jedinica/kg, 10 do 60000 jedinica/kg, 10 do 50000 jedinica/kg, 10 do 40 000 jedinica/kg, 10 do 30000 jedinica/kg, 10 do 20000 jedinica/kg, 10 do 15000 jedinica/kg, 10 do 12800 jedinica/kg, 10 do 10 000 jedinica/kg, 10 do 9 000 jedinica/kg, 10 do 8 000 jedinica/kg, 10 do 7 000 jedinica/kg, 10 do 6000 jedinica/kg, 10 do 5000 jedinica/kg, 10 do 4000 jedinica/kg, 10 do 3 000 jedinica/kg, 10 do 2000 jedinica/kg, 10 do 1000 jedinica/kg, 10 do 900 jedinica/kg, 10 do 800 jedinica/kg, 10 do 700 jedinica/kg, 10 do 500 jedinica/kg, 10 do 400 jedinica/kg, 10 do 300 jedinica/kg, 10 do 200 jedinica/kg, 10 do 100 jedinica/kg, 16 do 600000 jedinica/kg, 16 do 500 000 jedinica/kg, 16 do 400000 jedinica/kg, 16 do 350000 jedinica/kg, 16 do 320 000 jedinica/kg, 16 do 160 000 jedinica/kg, 16 do 80 000 jedinica/kg, 16 do 40 000 jedinica/kg, 16 do 20000 jedinica/kg, 16 do 16000 jedinica/kg, 16 do 12800 jedinica/kg, 16 do 10 000 jedinica/kg, 16 do 5 000 jedinica/kg, 16 do 4 000 jedinica/kg, 16 do 3 000 jedinica/kg, 16 do 2 000 jedinica/kg, 16 do 1 000 jedinica/kg, 16 do 900 jedinica/kg, 16 do 800 jedinica/kg, 16 do 700 jedinica/kg, 16 do 500 jedinica/kg, 16 do 400 jedinica/kg, 16 do 300 jedinica/kg, 16 do 200 jedinica/kg, 16 do 100 jedinica/kg, 160 do 12800 jedinica/kg, 160 do 8 000 jedinica/kg, 160 do 6 000 jedinica/kg, 160 do 4 000 jedinica/kg, 160 do 2 000 jedinica/kg, 160 do 1000 jedinica/kg, 160 do 500 jedinica/kg, 500 do 5000 jedinica/kg, 1000 do 100000 jedinica/kg ili 1000 do 10000 jedinica/kg, mase subjekta kod koga se primenjuje. U nekim primerima, enzim koji razgrađuje hijaluronan, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, kao što je PEG-ilovana hijaluronidaza (npr. PEGPH20) može da se primenjuje u količini od, ili oko 1 jedinice/kg do 1000 jedinica/kg, 1 jedinice/kg do 500 jedinica/kg ili 10 jedinica/kg do 50 jedinica/kg.
[0429] Uopšteno, kada specifična aktivnost PEG-ilovane hijaluronidaze iznosi, ili je oko 10 000 U/mg do 80000 U/mg, kao što je 20000 U/mg do 60 000 U/mg ili 18000 U/mg do 45 000 U/mg, uopšteno se primenjuje količina od, ili oko 1 jedinice/kg (U/kg), 2 U/kg, 3 U/kg, 4 U/kg, 5 U/kg, 6 U/kg, 7 U/kg, 8 U/kg, 8 U/kg 10 U/kg, 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1000 U/kg, 2000 U/kg, 3000 U/kg, 4000 U/kg, 5000 U/kg, 6000 U/kg, 7000 U/kg, 8000 U/kg, 9 000 U/kg, 10 000 U/kg, 12 800 U/kg, 20 000 U/kg, 32 000 U/kg, 40 000 U/kg, 50 000 U/kg, 60 000 U/kg, 70000 U/kg, 80000 U/kg, 90000 U/kg, 100 000 U/kg, 120 000 U/kg, 140 000 U/kg, 160000 U/kg, 180000 U/kg, 200000 U/kg, 220000 U/kg, 240000 U/kg, 260 000 U/kg, 280000 U/kg, 300000 U/kg, 320000 U/kg, 350000 U/kg, 400000 U/kg, 450000 U/kg, 500 000 U/kg, 550 000 U/kg, 600000 U/kg, 650 000 U/kg, 700 000 U/kg, 750000 U/kg, 800000 U/kg ili više, po masi subjekta. Na primer, primenjuje se 60000 U; 70000 U; 80 000 U; 90000 U; 100000 U; 200000 U; 300000 U; 400000 U; 500 000 U; 600000 U; 700 000 U; 800000 U; 900000 U; 1000 000 U; 1500 000 U; 2000 000 U; 2500 000 U; 3 000 000 U; 3500 000 U; 4000 000 U, ili više.
[0430] U primerima koji su ovde dati, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel), primenjuje se u terapijski efikasnoj količini dovoljnoj da se postigne intratumorska dostava. U nekim primerima, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel) primenjuje se u terapijski efikasnoj količini za redukovanje nivoa proteina intratumoralne deaminaze (npr. citidin deaminaze) u odnosu na na otsustvo tretmana, kao što je redukovanje ili smanjenje nivoa za najmanje, ili oko najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više. U konkretnim primerima, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezani za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel) primenjuje se u terapijski efikasnoj količini za povećanje intratumorskog nivoa ko-admininstriranog nukleozidnog analoga (npr. gemcitabin ili derivat) u odnosu na odsustvo tretmana. Na primer, intratumorski gemcitabin se povećava za najmanje, ili oko najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više. Količina taksana koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel) za primenu u tretmanu bolesti ili stanja, na primer kancera ili solidnog tumora kao što je tumor bogat u HA, može da bude određena standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, in vitro testovi i životinjski modeli mogu da budu uključeni da pomognu u identifikovanju optimalnih doznih opsega. Precizno doziranje, koje može da bude određeno empirijski, može da zavisi od konkretnog taksana, konkretne formulacije (npr. formulacije nanočestica ili lipozoma), puta primene, tipa bolesti koja treba da se leči i ozbiljnosti bolesti.
[0431] Tipično, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel) primenjuje se kod subjekta u odnosu na površinu tela (BSA; m<2>) subjekta između, ili oko između 1 mg/m<2>do 1000 mg/m<2>, kao što je između ili oko između 10 mg/m2 do 500 mg/m2 , 50 mg/m2 do 400 mg/m2 , 25 mg/m2 do 300 mg/m2 , i uopšteno najmanje ili oko najmanje ili oko ili 20 mg/m2 , 30 mg/m2 , 40 mg/m2 , 50 mg/m2 , 60 mg/m2 , 70 mg/m2 , 80 mg/m2 , 90 mg/m2 , 100 mg/m2 , 150 mg/m2 , 200 mg/m2 , 250 mg/m2 , 300 mg/m2. U nekim slučajevima, niže doze taksana koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel), mogu da budu primenjene kod subjekata u poređenju sa postojećim formulacijama ili doznim režimima. Na primer, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel), primenjuje se kod subjekta u količini koja je najmanje ili oko najmanje 50 mg/m<2>ili 100 mg/m2 , ali koja je manja od 260 mg/m2 , 200 mg/m2 ili 150 mg/m2. U drugim primerima, doza koja se primenjuje po primeni ista je kao postojeće doze i dozni režimi, ali je raspored doziranja redukovan tako da se niža količina nukleozidnog analoga primenjuje po ciklusu primene. U drugim slučajevima, više doze taksana koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel), mogu da budu primenjene kod subjekata u poređenju sa postojećim formulacijama ili doznim režimima. Na primer, taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je taksan vezan za albumin (npr. albumin-vezani paklitaksel), primenjuje se kod subjekta u količini koja je najmanje, ili oko najmanje 300 mg/m2 , kao što je između, ili oko između 300 mg/m<2>do 1000 mg/m<2>. Na nivou znanja stručnjaka u odgovarajućoj oblasti je da pretvori ili odredi odgovarajuće doze u mg/kg na osnovu visine i težine subjekta. Na primer, BSA se određuje pomoću formule (visina (cm) x težina (kg)/3600)<1/2>. BSA prosečne odrasle osobe je 1.73 m<2>.
[0432] U primerima koji su ovde dati, kombinovana terapija opciono sadrži dodatnu primenu nukleozidnog analoga (npr. gemcitabina ili derivata ili drugog analoga). Gemictabin se primenjuje u terapijski efikasnoj količini dovoljnoj za postizanje intratumorske dostave. U konkretnim primerima, nukleozidni analog (npr. gemciatabin ili derivat ili drugi analog) se ovde ko-administrira u kombinovanoj terapiji u količini za postizanje intratumorskog nivoa koji je najmanje 1.5 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta ili više povećan u poređenju sa intratumorskim nivoom kada se primenjuje sam. Količina nukleozidnog analoga (npr. gemcitabin, njegov derivat ili drugi analog koji je ovde opisan) koja treba da se primeni u tretmanu bolesti ili stanja, na primer kancera ili solidnog tumora kao što je tumor bogat u HA, može da se odredi standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, in vitro testovi i životinjski modeli mogu da budu uključeni da pomognu u identifikovanju optimalnih doznih opsega. Precizno doziranje, koje može da bude određeno empirijski, može da zavisi od konkretnog doznog analoga, konkretne formulacije, puta primene, tipa bolesti koja treba da se leči i ozbiljnosti bolesti.
[0433] Tipično, nukleozidni analog (npr. gemcitabin ili njegov derivat ili drugi analog) primenjuje se kod subjekta u odnosu na telesnu površinu (BSA; m<2>) subjekta od između, ili oko između 100 mg/m<2>do 2500 mg/m<2>, kao što je između, ili oko između 500 mg/m<2>do 2000 mg/m2 , 750 mg/m2 do 1500 mg/m2 , 1000 mg/m2 do 1500 mg/m2 , ili 500 mg/m2 do 1500 mg/m2 , i uopšteno najmanje ili oko najmanje ili oko ili 500 mg/m<2>, 600 mg/m<2>, 700 mg/m<2>, 800 mg/m2 , 900 mg/m2 , 1000 mg/m2 , 1250 mg/m2 , 1500 mg/m2 , 1750 mg/m2 , 2000 mg/m2 ili više. U nekim slučajevima, niže doze nukleozidnog analoga (npr. gemcitabina ili njegovog derivata ili drugog taksana), mogu da budu primenjene kod subjekata u poređenju sa postojećim formulacijama ili doznim režimima. Na primer, nukleozidni analog (npr.
gemcitabin ili njegov derivat ili drugi taksan), primenjuje se kod subjekta u količini koja je najmanje, ili oko najmanje 200 mg/m2 ili 500 mg/m2 , ali koja je manja od 1000 mg/m2 ili 1250 mg/m2. U drugim slučajevima, doza koja se primenjuje po primeni ista je kao postojeće doze i dozni režimi, ali je raspored doziranja redukovan tako da se niža količina nukleozidnog analoga primenjuje po ciklusu primene. Na nivou znanja stručnjaka u odgovarajućoj oblasti je da pretvori ili odredi odgovarajuće doze u mg/kg.
[0434] Sredstva koja su ovde obezbeđena mogu da se primenjuju intravenski, subkutano, intratumoralno, intradermalno, oralno ili drugim putevima primene. Konkretan put može da se razlikuje među sredstvima koja se primenjuju ili može da bude isti. Na primer, jedno ili više, ili sva sredstva, mogu da budu primenjena subkutano. U konkretnim primerima, ovde se razmatra da enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom može da bude primenjen subkutano. U takvim primerima, enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom primenjuje se u režimu doziranja koji omogućava 1-8 časova, kao što je 1-2 časa, apsorpcije za postizanje bioraspoloživi enzima u krvotoku, u cilju rezultovanja u sličnoj tumorskoj aktivnosti kao kod trenutnog intravenskog doznog režima. U primerima koji su ovde dati, taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili nukleozidni analog takođe može da se primenjuje subkutano. Određena subkutana formulacija ili ko-formulacija jednog ili više sredstava obezbeđena je tako da postigne dovoljnu bioraspoloživost sredstva i da svede na najmanju meru reakcije na mestu injektovanja.
[0435] U drugom primeru, jedan ili više, ili sva sredstva, mogu se primenjuju intravenski. U takvom primeru, jedan ili više, ili sva, od sredstava mogu da se primenjuju pritiskom ili infuzijom. Vreme primene pritiska ili infuzije može da bude 1 minut do 60 minuta, i uopšteno oko 10 minuta do 40 minuta i ne više od 60 minuta. Sredstva mogu da se primenjuju istovremenom infuzijom ili uzastopnom infuzijom. U jednom primeru, dva od sredstava ili sva tri od primenjenih sredstava u kombinovanoj terapiji koja je ovde obezbeđen, primenjuju se istovremenom infuzijom. U takvom primeru, sredstva koja se primenjuju obezbeđena su u istoj kompoziciji za infuziju zajedno u istoj vreći. U drugim slučajevima, sredstva koja se primenjuju obezbeđena su u posebnim kompozicijama, ali se kombinuju u jednu vreću kao jedan infuzat neposredno pre infuzije. U sledećem primeru, sredstva koja se primenjuju daju se infuzijom istovremeno ili gotovo istovremeno ili se daju uzastopnom infuzijom, i nalaze se u posebnim vrećama za posebne infuzije.
3. Dozni režim: učestalost i ciklus primene
[0436] Antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, može da bude primenjeno pre, istovremeno ili gotovo istovremeno, uzastopno ili naizmenično sa taksanom koji ciljno deluje na tumor. Na primer, antihijaluronansko sredstvo, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i taksan koji ciljno deluje na tumor mogu da budu ko-admininstrirani zajedno ili odvojeno. Ako se primenjuju odvojeno, sredstva mogu da budu primenjena neposredno odvojeno jedno od drugog, na primer primenjena u okviru 30 sekundi do 15 minuta jedno od drugog, kao što je manje od 15 minuta, 14 minuta, 12 minuta, 10 minuta, 5 minuta, 2 minuta, 1 minut ili 30 sekundi odvojeno jedno od drugog. U drugim slučajevima, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, i taksan koji ciljno deluje na tumor primenjuju se uzastopno i/ili naizmenično. U takvim primerima, antihijaluronansko sredstvo, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan, može da bude prvo primenjeno, ili taksan koji ciljno deluje na tumor može da bude prvo primenjen. Uopšteno, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, primenjuje se pre taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, antihijaluronansko sredstvo, ili enzim koji razgrađuje hijaluronan, primenjuje se najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova pre primene taksana koji ciljno deluje na tumor.
[0437] U primerima kombinovane terapije u ovom tekstu, nukleozidni analog može da bude primenjen pre, istovremeno ili gotovo istovremeno, uzastopno ili naizmenično sa antihijaluronanskim sredstvom (npr. enzimom koji razgrađuje hijaluronan) i/ili taksanom koji ciljno deluje na tumor. Nukleozidni analog može da bude ko-admininstriran zajedno ili odvojeno sa jednim ili oba od antihijaluronanskog sredstva (npr. enzima koji razgrađuje hijaluronan) i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor. Ako se primenjuje odvojeno, nukleozidni analog može da bude primenjen neposredno pre ili posle primene antihijaluronanskog sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i/ili taksan koji ciljno deluje na tumor, kao što je primena u okviru 30 sekundi do 15 minuta jednog od drugog, kao što je manje od 15 minuta, 14 minuta, 12 minuta, 10 minuta, 5 minuta, 2 minuta, 1 minut ili 30 sekundi odvojeno od antihijaluronanskog sredstva (npr. enzim koji razgrađuje hijaluronan) i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor. Uopšteno, nukleozidni analog se primenjuje posle antihijaluronanskog sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan.
U nekim slučajevima, nukleozidni analog se primenjuje posle antihijaluronanskog sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, nukleozidni analog se primenjuje najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova posle primene antihijaluronanskog sredstva (npr. enzim koji razgrađuje hijaluronan) i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor.
[0438] U jednom primeru u ovom tekstu, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, primenjuje se odvojeno od drugog sredstva i primenjuje se neposredno pre ili posle taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, enzim koji razgrađuje hijaluronan primenjuje se manje od 15 minuta, 14 minuta, 12 minuta, 10 minuta, 5 minuta, 2 minuta, 1 minut ili 30 sekundi pre ili posle taksana koji ciljno deluje na tumor. U takvim primerima, nukleozidni analog se primenjuje posle antihijaluronanskog sredstva (npr. enzima koji razgrađuje hijaluronan) i taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, nukleozidni analog se primenjuje najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova posle primene enzima koji razgrađuje hijaluronan i taksana koji ciljno deluje na tumor.
[0439] U drugom primeru, antihijaluronansko sredstvo, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, primenjuje se pre taksana koji ciljno deluje na tumor, koji se primenjuje pre nukleozidnog analoga. Na primer, antihijaluronansko sredstvo (npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan) se primenjuje najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova pre primene taksana koji ciljno deluje na tumor. U takvom primeru, nukleozidni analog se primenjuje najmanje ili najmanje oko ili oko ili 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 6 časova, 8 časova, 12 časova, 16 časova, 18 časova, 20 časova, 22 časa, 24 časa, 30 časova, 36 časova, 40 časova ili 48 časova posle primene taksana koji ciljno deluje na tumor.
[0440] Učestalost i podešavanje vremena primene, i dozne količine, mogu da budu primenjene periodično tokom ciklusa primene da bi se održalo kontinuirano i/ili dugotrajno dejstvo aktivnih sredstava tokom željenog perioda vremena. Kombinacije ili kompozicije mogu da se primenjuju na čas, dnevno, nedeljno, mesečno, godišnje ili jednom. Dužina trajanja ciklusa primene može da bude empirijski određena, i zavisi od bolesti koja treba da se leči, ozbiljnosti bolesti, konkretnog pacijenta, i drugih razmatranja u okviru nivoa stručnosti nadležnog lekara. Dužina trajanja lečenja kombinovanom terapijom koja je ovde obezbeđena može da bude jednu nedelju, dve nedelje, jedan mesec, nekoliko meseci, jednu godinu, nekoliko godina ili više. Doze mogu da budu podeljene na mnoštvo ciklusa primene tokom trajanja tretmana. Na primer, modifikovani enzim hijaluronidaza može da bude primenjen dvaput nedeljno tokom perioda od godinu dana ili više. Ako simptomi bolesti opstaju u odsustvu prekinutog tretmana, tretman može da bude nastavljen tokom dodatnog perioda vremena. Tokom trajanja tretmana, mogu da se prate znaci bolesti i/ili toksičnosti ili sporednih dejstava povezanih sa tretmanom.
[0441] Pored toga, ciklus primene mogu da budu prilagođeni tako da se dodaju periodi diskontinuiranog tretmana kako bi se obezbedio period odmora od izlaganja sredstvima. Dužina trajanja prekida tretmana može da bude tokom unapred određenog vremena, ili može da se odredi empirijski u zavisnosti od toga kako pacijent odgovara ili u zavisnosti od primećenih sporednih dejstava. Na primer, tretman može da bude prekinut tokom jedne nedelje, dve nedelje, jednog meseca ili nekoliko meseci. Uopšteno, period prekida tretmana je ugrađen u ciklus doznog režima za pacijenta.
[0442] Na primer, primer doznog režima je tretmanski ciklus ili ciklus primene od 28 dana. Sredstvo, kao što je antihijaluronansko sredstvo, npr., enzim koji razgrađuje hijaluronan konjugovan sa polimerom, taksan koji ciljno deluje na tumor i/ili nukleozidni analog, mogu da se primenjuju jednom nedeljno ili dva puta nedeljno. Na primer, sredstvo može da se primenjuje tokom prve 3 nedelje, jednom nedeljno ili dvaput nedeljno, praćeno jednom nedeljom bez doziranja. Prema tome, na primer, pacijent može da primi dozu sredstva dvaput nedeljno na dane 1, 4, 8, 11, 15 i 18 (ili dane 0, 3, 6, 9, 12 i 15), nakon čega sledi jedna nedelja prekida tretmana, tokom trajanja 28-dnevnog ciklusa. U drugom primeru, pacijentu može da se daje doza sredstva jednom nedeljno na dane 1, 8 i 16, nakon čega sledi jedna nedelja prekida tretmana, tokom trajanja 28-dnevnog ciklusa. U drugom primeru, sredstvo može da se primenjuje čitavih 28 dana jednom nedeljno ili dvaput nedeljno. Prema tome, na primer, kod pacijenta može da se primenjuje doza sredstva dvaput nedeljno na dane 1, 4, 8, 11, 15, 18, 21 i 24 (ili dane 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21 ili 25) tokom čitavog ciklusa od 28 dana. U drugim primerima, kod pacijenta može da se primenjuje doza sredstva jednom nedeljno na dane 1, 8, 16 ili 24 tokom čitavog ciklusa od 28 dana. Podrazumeva se da je gornji opis dat samo u ilustrativnu svrhu i da mogu da se primene varijacije prethodno navedenog. Dalje, slični ciklusi primene mogu da budu korišćeni za sva sredstva koja se primenjuju, ili svako sredstvo koje se primenjuje može da se koristi prema svom doznom režimu u kombinovanoj terapiji koja je ovde obezbeđena.
[0443] Određivanje preciznog ciklusa primene i rasporeda doziranja nalazi se u oblasti kompetentnosti stručnjaka u odgovarajućoj oblasti. Kao što je gore istaknuto, ciklus primene može da traje tokom bilo kog željenog perioda vremena. Stoga, 28-dnevni ciklus primene može da se ponavlja tokom bilo kog perioda vremena. U okviru kompetentnosti nadležnog lekara je da usvoji ciklus primene i dozni režim koji odgovara potrebama pacijenta u zavisnosti od ličnih pitanja specifičnih za pacijenta i bolest koja treba da se leči.
[0444] Uopšteno, podešavanje vremena primene nukleozidnog analoga, na primer gemcitabina ili derivata, tipično je u funkciji ciklusa primene antihijaluronanskog sredstva, npr., enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom, i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor. Na primer, nukleozidni analog može da bude primenjen posle prve primene antihijaluronanskog sredstva, kao što je enzim koji razgrađuje hijaluronan, i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor u ciklusu primene, i/ili posle bilo koje ili više uzastopnih primena u ciklusu. U drugim primerima, nukleozidni analog se primenjuje posle svake uzastopne primene antihijaluronanskog sredstva (npr. enzim koji razgrađuje hijaluronan) i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor u ciklusu, posle svake druge uzastopne primene enzima koji razgrađuje hijaluronan i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor u ciklusu, ili se primenjuje jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, ili jednom mesečno tokom ciklusa primene antihijaluronanskog sredstva, npr. enzima koji razgrađuje hijaluronan, i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor. U nekim primerima, nukleozidni analog se primenjuje samo jednom po ciklusu primene antihijaluronanskog sredstva, npr. enzima koji razgrađuje hijaluronan, i/ili taksana koji ciljno deluje na tumor. U dodatnom primeru, nukleozidni analog se primenjuje naizmenično između ciklusa primene. Na primer, nukleozidni analog se ne primenjuje tokom prvog ciklusa primene, ali se primenjuje tokom drugog ciklusa, nakon čega se preskače treći ciklus i primenjuje se ponovo tokom četvrtog ciklusa, itd., ili bilo koja varijacija navedenog.
[0445] U konkretnim primerima kombinovane terapije u ovom tekstu, postupci uključuju primenu antihijaluronanskog sredstva i taksana koji ciljno deluje na tumor istovremeno ili gotovo istovremeno, na primer zajedno. Antihijaluronansko sredstvo i taksan koji ciljno deluje na tumor mogu da se primenjuju pri učestalosti primene od dvaput nedeljno ili jednom nedeljno tokom unapred određenog broja nedelja. Naročito, antihijaluronansko sredstvo se primenjuje dvaput nedeljno i taksan koji ciljno deluje na tumor se primenjuje jednom nedeljno. Izborno, nukleozidni analog takođe može da bude primenjen u kombinovanoj terapiji. Na primer, nukleozidni analog se primenjuje jednom nedeljno tokom unapred određenog broja nedelja, i tipično nukleozidni analog se primenjuje jednu nedelju posle primene antihijaluronanskog sredstva i taksana koji ciljno deluje na tumor. Postupak takođe može da uključuje primenu kortikosteroida pre, istovremeno sa, naizmenično sa ili nakon primene antihijaluronanskog sredstva. Ciklus primene može da bude tokom perioda vremena, i u okviru je kompetentnosti nadležnog lekara ili kliničara. Tipično, unapred određeni broj nedelja je 3 nedelje ili 4 nedelje, ali može da bude duži. Ciklus primene može da se ponavlja više puta u zavisnosti od statusa bolesti i odgovora subjekta.
4. Dodatne kombinacije tretmana
[0446] Kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena može da se koristi sama ili u dodatnoj kombinaciji sa drugim terapijama ili tretmanima. Kombinacije ili kompozicije koje su ovde obezbeđene mogu da budu dodatno ko-formulisane ili ko-administrirane zajedno sa, pre, naizmenično sa, ili nakon, drugih terapijskih ili farmakoloških sredstava ili tretmana, kao što su procedure. Na primer, takva sredstva uključuju, ali nisu ograničena na druga biološka sredstva, antikancerska sredstva, jedinjenja malog molekula, sredstva za raspršivanje, anestetike, vazokonstriktore i hiruršku operaciju, i njihove kombinacije. Takva sredstva takođe mogu da uključuju jedno ili više sredstava za poboljšanje, redukciju ili sprečavanje sporednih dejstava. U nekim slučajevima, kombinovana terapija može da se koristi u kombinaciji sa jednim ili više tretmana protiv kancera koji uklanjaju primarni tumor ili koji obavljaju imunosupresiju subjekta pre lečenja. Na primer, dodatna hemioterapija ili zračna terapija može da se koristi pored kombinovane terapije koja je ovde obezbeđena. Takva dodatna terapija može da ima dejstvo slabljenja imunskog sistema subjekata. U drugim primerima, hirurško uklanjanje i/ili terapija koja slabi imunski sistem mogu da ne budu neophodni. Primeri drugih postupaka koji mogu da budu kombinovani u ovom dokumentu uključuju primenu jedinjenje koje snižava stopu proliferacije tumorskih ili neoplastičnih ćelija bez slabljenja imunskog sistema (npr., primenom tumor-supresorskih jedinjenja ili primenom jedinjenja specifičnih za tumorsku ćeliju) ili primenom jedinjenja koje inhibira angiogenezu.
[0447] Preparat drugog sredstva ili sredstava ili tretman ili tretmani mogu da budu primenjeni odjednom, ili mogu da budu podeljeni na neki broj manjih doza za primenu u vremenskim intervalima. Odabrani preparati sredstva/tretmani mogu da budu primenjeni u jednoj ili više doza tokom trajanja tretmana, na primer tokom nekoliko časova, dana, nedelja, ili meseci. U nekim slučajevima, korisna je kontinuirana primena. Jasno je da precizno doziranje i tok primene zavisi od indikacije i tolerabilnosti pacijenta. Uopšteno, dozni režimi za druga sredstva/tretmane u ovom tekstu poznati su stručnjaku u oblasti.
a. Kortikosteroidi
[0448] Kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena može da se koristi sama ili u dodatnoj kombinaciji sa jednim ili više kortikosteroida. Kortikosteroid se primenjuje u količini koja je terapijski efikasna u poboljšanju ili redukovanju jednog ili više neželjenih dejstava primene enzima koji razgrađuju hijaluronan konjugovanog sa polimerom ili drugog sredstva, naročito, neželjenih muskuloskeletnih dejstava. Terapijski efikasna količina je doza dovoljna da poboljša, spreči, eliminiše ili redukuje jedan ili više simptoma ili neželjenih dejstava. Indikatori poboljšanja ili uspešnog pretretmana uključuju utvrđivanje nemogućnosti utvrđivanja relevantnog rezultata na skali CTCAE ili promene u rangiranju ili ozbiljnosti na skali CTCAE.
[0449] Kortikosteroidi su klasa steroidnih hormona koja se proizvodi u adrenalnom korteksu. Kortikosteroidi su uključeni u širok opseg fizioloških sistema kao što odgovor na stres, imunski odgovor i regulacija inflamacije, metabolizam ugljenih hidrata, katabolizam proteina, nivoi elektrolita u krvi, i ponašanje. Oni uključuju glukokortikoide, koji su antiinflamatorna sredstva sa velikim brojem drugih funkcija i mineralokortikoide, koji kontrolišu ravnotežu soli i vode prvenstveno putem dejstva na bubrege.
[0450] Glukokortikoidi su klasa steroidnih hormona, npr., kortikosteroida, koja se vezuje za glukokortikoidni receptor. Glukokortikoidi ostvaruju svoja dejstva vezivawnjem za glukokortikoid receptor. Među ostalim aktivnostima, aktivirani glukokortikoidni kompleki zauzvrat ushodono regulišu ekspresiju antiinflamatornih proteina u nukleusu i suzbijaju ekspresiju proinflamatornih proteina u citosolu sprečavanjem translokacije drugih transkripcionih faktora iz citosola u nukleus.
[0451] Uopšteno, bilo koji kortikosteroid, npr., glukokortikoid, može da se koristi u postupcima ili kombinacijama koje su ovde obezbeđene. Glukokortikoidi uključuju sintetske i nesintetske glukokortikoide. Primeri glukokortikoida uključuju, ali nisu ograničeni na: alklometazone, algestone, beklometazone (npr. beklometazon dipropionat), betametazone (npr. betametazon 17-valerat, betametazon natrijum acetat, betametazon natrijum fosfat, betametazon valerat), budesonide, klobetasole (npr. klobetasol propionat), klobetasone, klokortolone (npr. klokortolon pivalat), kloprednole, kortikosterone, kortizone i hidrokortizone (npr. hidrokortizon acetat), kortivazole, deflazakorte, desonide, dezoksimetazone, deksametazone (npr. deksametazon 21-fosfat, deksametazon acetat, deksametazon natrijum fosfat), diflorazone (npr. diflorazon diacetat), diflukortolone, difluprednate, enoksolone, fluazakorte, flukloronide, fludrokortizone (npr., fludrokortizon acetat), flumetazone (npr. flumetazon pivalat), flunizolide, fluocinolone (npr. fluocinolon acetonid), fluocinonide, fluokortine, fluokortolone, fluorometolone (npr. fluorometolon acetat), fluperolone (npr., fluperolon acetat), fluprednidene, fluprednizolone, flurandrenolide, flutikazone (npr. flutikazon propionat), formokortale, halcinonide, halobetazole, halometazone, halopredone, hidrokortamate, hidrokortizone (npr. hidrokortizon 21-butirat, hidrokortizon aceponat, hidrokortizon acetat, hidrokortizon buteprat, hidrokortizon butirat, hidrokortizon cipionat, hidrokortizon hemisukcinat, hidrokortizon probutat, hidrokortizon natrijum fosfat, hidrokortizon natrijum sukcinat, hidrokortizon valerat), loteprednol etabonat, mazipredone, medrizone, meprednizone, metilprednizolone (metilprednizolon aceponat, metilprednizolon acetat, metilprednizolon hemisukcinat, metilprednizolon natrijum sukcinat), mometazone (npr., mometazon furoat), parametazone (npr., parametazon acetat), prednikarbate, prednizolone (npr. prednizolon 25-dietilaminoacetat, prednizolon natrijum fosfat, prednizolon 21-hemisukcinat, prednizolon acetat; prednizolon farnezilat, prednizolon hemisukcinat, prednizolon-21 (beta-D-glukuronid), prednizolon metasulfobenzoat, prednizolon steaglat, prednizolon tebutat, prednizolon tetrahidroftalat), prednizone, prednivale, prednilidene, rimeksolone, tiksokortole, triamcinolone (npr. triamcinolon acetonid, triamcinolon benetonid, triamcinolon heksacetonid, triamcinolon acetonid 21-palmitat, triamcinolon diacetat). Ovi glukokortikoidi i njihove soli su detaljno diskutovane, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (16th ed.1980).
[0452] U nekim primerima, glukokortikoid je odabran između kortizona, deksametazona, hidrokortizona, metilprednizolona, prednizolona i prednizona. U određenom primeru, glukokortikoid je deksametazon.
[0453] Kortikosteroid je obezbeđen u terapijski efikasnoj dozi. Terapijski efikasna koncentracija može da se odredi empirijski ispitivanjem u poznatim in vitro ili in vivo (npr. životinjski model) sistemima. Na primer, količina odabranog kortikosteroida koja treba da se primeni da bi se ublažila neželjena dejstva može da bude određena standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, životinjski modeli mogu da se koriste kako bi se olakšalo identifikovanje optimalnih doznih opsega. Precizno doziranje, koje može da bude određeno empirijski, može da zavisi od konkretnog terapijskog preparata, režima i rasporeda doziranja, puta primene i ozbiljnosti bolesti.
[0454] Koncentracija odabranog terapijskog sredstva u kompoziciji zavisi od brzina apsorpcije, inaktivacije i ekskrecije, fizikohemijskih svojstava, rasporeda doziranja, i količine koja se primenjuje, kao i od drugih faktora poznatih stručnjacima u odgovarajućoj oblasti. Na primer, jasno je da precizno doziranje i trajanje tretmana zavisi od bolesti ili stanja, tkiva koje se leči, pacijenta ili subjekta i antihijaluronanskog sredstva, uključujući količinu i dozni režim. Doza kortikosteroida takođe može da varira u zavisnosti od starosti i zdravlja pacijenta, doziranja enzima koji razgrađuje hijaluronan konjugovanog sa polimerom (npr. doziranja PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan), aktivnosti kortikosteroida, i puta primene. Na primer, treba zapaziti da ćr koncentracije i dozne vrednosti varirati sa terapijskom dozom i doznim režimom enzima koji razgrađuje hijaluronan. dodatno, kortikosteroid može da se primenjuje dnevno, nedeljno, ili mesečno ili tokom dužih perioda vremena u cilju postizanja željenih rezultata. Konkretna zapremina doze može da varira i zavisi od doznog režima, učestalosti primene i željene brzine primene. Treba zapaziti da koncentracije i vrednosti doziranja mogu takođe variraju sa starošću pojedinca koji se leči.
[0455] Precizno doziranje i trajanje tretmana može da se odredi empirijski korišćenjem poznatih protokola ispitivanja ili ekstrapolacijom podataka dobijenih ispitivanjem in vivo ili in vitro. Dalje se podrazumeva da za bilo kod konkretnog subjekta, specifični dozni režimi treba da se prilagode tokom vremena prema individualnim potrebama i profesionalnom mišljenju osobe koja obavlja primenu ili nadgleda primenu formulacija, i da opsezi koncentracija koji su ovde dati predstavljaju samo primere i nisu namenjeni da ograničavaju obim pronalaska. Uopšteno, dozni režimi se biraju tako da se ograniči toksičnost, i ovde su odabrani tako da ublaže neželjena sporedna dejstva. Treba napomenuti da će nadležni lekar znati kako i kada da završi, prekine ili prilagodi terapiju na niže doze zbog toksičnosti, ili disfunkcije kosne srži, jetre ili bubrega ili drugih tkiva. Nasuprot tome, nadležni lekar će takođe znati kako i kada da prilagodi tretman na više nivoe ako klinički odgovor nije odgovarajući (sprečavajući toksična neželjena dejstva). Primena terapijskog sredstva ne treba da pređe maksimalne dozne nivoe uspostavljene od strane uprave za hranu i lekove SAD ili objavljene u lekarskom priručniku.
[0456] Uopšteno, doza kortikosteroida koji se primenjuje zavisi od specifičnog kortikosteroida, budući da postoje razlike u aktivnosti između različitih kortikosteroida (videti tabelu 4 ispod). Kortikosteroid, ili glukokortikoid, na primer deksametazon, može da bude dat oralno (tablete, tečnost ili tečni koncentrat) PO, intravenski (IV) ili intramuskularno. Kortikosteroid se tipično primenjuje kao bolus, ali može da se primenjuje tokom perioda vremena, sve dok je doza efikasna u poboljšanju jednog ili više sporednih dejstava povezanih sa primenom antihijaluronanskog sredstva, na primer, PEG-ilovane hijaluronidaze.
[0457] Kortikosteroid može da bude primenjen u bilo kojoj količini koja je efikasna u ublažavanju jednog ili više sporednih dejstava povezanih sa primenom enzima koji razgrađuje hijaluronan. Prema tome, kortikosteroid, npr., glukokortikoid, može da bude primenjen, na primer, u količini jednakoj između, ili oko 0.1 i 100 mg, po dozi, 0.1 do 80 mg, 0.1 do 60 mg, 0.1 do 40 mg, 0.1 do 30 mg, 0.1 do 20 mg, 0.1 do 15 mg, 0.1 do 10 mg, 0.1 do 5 mg, 0.2 do 40 mg, 0.2 do 30 mg, 0.2 do 20 mg, 0.2 do 15 mg, 0.2 do 10 mg, 0.2 do 5 mg, 0.4 do 40 mg, 0.4 do 30 mg, 0.4 do 20 mg, 0.4 do 15 mg, 0.4 do 10 mg, 0.4 do 5 mg, 0.4 do 4 mg, 1 do 20 mg, 1 do 15 mg ili 1 do 10 mg, kod odraslog humanog subjekta od 70 kg. Tipično, kortikosteroid, kao što je glukokortikoid primenjuje se u količini između ili oko 0.4 i 20 mg, na primer, jednakoj, ili oko 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.75 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg ili 20 mg po dozi, kod prosečnog odraslog humanog subjekta.
[0458] Kortikosteroid može da budu primenjen, na primer, u dozi jednakoj ili oko 0.001 mg/kg (subjekta), 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.50 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.60 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.70 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.80 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.90 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1 mg/kg, 1.05 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.15 mg/kg, 1.20 mg/kg, 1.25 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.35 mg/kg ili 1.4 mg/kg, kod prosečnog odraslog humanog subjekta, tipično težine oko 70 kg do 75 kg.
[0459] Primenjena doze može da varira sve dok primena kortikosteroida ublažava jedno ili više neželjenih sporednih dejstava povezanih sa primenom enzima koji razgrađuje hijaluronan. U jednom primeru, doza glukokortikoida, na primer, deksametazona, primenjuje se u uzastopno nižim dozama po ciklusu tretmana. Stoga, u takvim režimima tretmana, doza kortikosteroida se smanjuje. Na primer, deksametazon se primenjuje pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, pri početnoj dozi od 4 mg, i nakon svake uzastopne primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, doza deksametazona se snižava, tako da je doza 3 mg za sledeću primenu enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze, zatim 2 mg po primeni antihijaluronanskog sredstva, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze, i zatim 1 mg po primeni antihijaluronanskog sredstva, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze. Bilo koja doza se razmatra sve dok je doza kortikosteroida efikasna u redukovanju jednog ili više sporednih dejstava povezanih sa primenom enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze.
[0460] Vreme primene može da varira sve dok primena kortikosteroida ublažava jedno ili više neželjenih sporednih dejstava povezanih sa primenom enzima koji razgrađuje hijaluronan, kao što je PEG-ilovana hijaluronidaza. Kortikosteroid može da bude primenjen uzastopno, naizmenično, u isto vreme ili u istoj kompoziciji kao enzim koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovani enzim koji razgrađuje hijaluronan. Na primer, kortikosteroid može da bude primenjen pre, tokom, istovremeno sa, ili posle primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze. U drugom primeru, kortikosteroid i enzim koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovana hijaluronidaza se primenjuju naizmenično. Uopšteno, kortikosteroid se primenjuje pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze. Na primer, kortikosteroid, npr., glukokortikoid, kao što je deksametazon, može da bude primenjen na ili oko 0.5 minuta, 1 minut, 2 minuta, 3 minuta, 4 minuta, 5 minuta, 6 minuta, 7 minuta, 8 minuta, 9 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta, 25 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 5 časova, 6 časova, 7 časova, 8 časova, 9 časova, 10 časova, 11 časova, 12 časova, 18 časova, 24 časova, 36 časova ili više pre primene antihijaluronanskog sredstva, na primer a PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan.
[0461] U nekim primerima, kortikosteroid se primenjuje u isto vreme sa primenom enzima koji razgrađuje hijaluronan, na primer PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan. U ovom primeru, kortikosteroid može da bude primenjen zajedno sa, ili odvojeno od, enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze. Tipično, kortikosteroid se primenjuje odvojeno od enzima koji razgrađuje hijaluronan, na primer PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan. U drugim primerima, kortikosteroid se primenjuje na ili oko 0.5 minuta, 1 minut, 2 minuta, 3 minuta, 4 minuta, 5 minuta, 6 minuta, 7 minuta, 8 minuta, 9 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta, 25 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 5 časova, 6 časova, 7 časova, 8 časova, 9 časova, 10 časova, 11 časova, 12 časova, 18 časova, 24 časa, 36 časova ili više posle primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, na primer PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan.
[0462] U jednom primeru, kortikosteroid se primenjuje pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, na primer PEG-ilovane hijaluronidaze. Na primer, kortikosteroid, npr., glukokortikoid, na primer, deksametazon, primenjuje se 1 čas pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze. U drugom primeru, kortikosteroid se primenjuje 5 minuta pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan. U drugom primeru, kortikosteroid se primenjuje i pre i posle primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovane hijaluronidaze. U ovom primeru, kortikosteroid, kao što je deksametazon, primenjuje se jedan do pet minuta neposredno pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan i osam časova posle primene antihijaluronanskog sredstva, npr. PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan. U drugom primeru, kortikosteroid, kao što je deksametazon, primenjuje se jedan čas pre primene enzima koji razgrađuje hijaluronan, npr. PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan i osam do dvanaest časova posle primene antihijaluronanskog sredstva, npr. PEG-ilovanog enzima koji razgrađuje hijaluronan.
[0463] Bilo koji dozni režim se razmatra sve dok vreme doziranja kortikosteroida ublažava jedno ili više sporednih dejstava povezanih sa primenom enzima koji razgrađuje hijaluronan, na primer PEG-ilovane hijaluronidaze. Pored toga, doza ili dozni režim kortikosteroida je onaj koji ne interferira ili ne redukuje terapijsko dejstvo enzima koji razgrađuje hijaluronan ili drugog sredstva u kompozicijama i kombinacijama koje su ovde obezbeđene, uključujući pri lečenju kancera ili solidnog tumora.
b. Antikancerska sredstva i drugi tretmani
[0464] Kombinovana terapija koja je ovde obezbeđena može da se koristi sama ili u dodatnoj kombinaciji sa drugim antikancerskim sredstvima. Antikancersko sredstvo/sredstva ili tretman(i) mogu da budu hirurški, zračni, lekovi, hemioterapeutici, polipeptidi, antitela, peptidi, mali molekuli ili vektori, virusi ili DNK za gensku terapiju.
[0465] Primeri antikancerskih sredstava koja mogu da budu primenjena posle, zajedno sa, ili pre primene kombinovane terepije koja je ovde data, uključuju, ali nisu ograničeni na acivicine; avicin; aklarubicine; akodazole; akronine; adozelesine; aldesleukine; alemtuzumabe; alitretinoine (9-cis-retinoinska kiselina); alopurinole; altretamine; alvocidibe; ambazone; ambomicine; ametantrone; amifostine; aminoglutetimide; amsakrine; anastrozole; anaksirone; ancitabine; antramicine; apazikvone; argimesne; arsenik triokside; asparaginaze; asperline; atrimustine; azacitidine; azetepe; azotomicine; banoksantrone; batabuline; batimastate; živu BCG vakcinu; benaksibine; bendamustine; benzodepe; beksarotene; bevacizumab; bikalutamide; bietaserpine; birikodare; bisantrene; bisnafid dimezilate; bizelesine; bleomicine; bortezomibe; brekvinare; bropirimine; budotitane; busulfane; kaktinomicine; kalusterone; kanertinibe; kapecitabine; karacemide; karbetimere; karboplatine; karbokvone; karmofure; karmustine sa polifeprozanima; karmustine; karubicine; karzelesine; cedefingole; celekoksibe; cemadotine; hlorambucile; cioteronele; cirolemicine; cisplatine; kladribine; klanfenure; klofarabine; krisnatole; ciklofosfamide; lipozomalne citarabine; citarabine; dakarbazine; daktinomicine; darbepoetin alfe; lipozomalne daunorubicine; daunorubicine/daunomicine; daunorubicine; decitabine; denileukin diftitokse; deksniguldipine; deksonaplatine; deksrazoksane; dezaguanine; diazikvone; dibrospidijume; dienogeste; dinaline; disermolide; docetaksele; dofekvidare; doksifluridine; lipozomalne doksorubicine; doksorubicin HCL; lipozomalni doksorubicin HCL za injekciju; doksorubicine; droloksifene; dromostanolon propionate; duazomicine; ekomustine; edatreksate; edotekarine; eflornitine; elakridare; elinafide; Eliotove B rastvore; elsamitrucine; emitefure; enloplatine; enpromate; enzastaurine; epipropidine; epirubicine; epoetin alfe; eptaloproste; erbulozole; ezorubicine; estramustine; etanidazole; etoglucide; etopozid fosfate; etopozide VP-16; etopozide; etoprine; egzemestane; egzisulinde; fadrozole; fazarabine; fenretinide; filgrastime; floksuridine; fludarabine; fluorouracile; 5-fluorouracile; fluoksimesterone; flurocitabine; foskvidone; fostriecine; fostriecine; fotretamine; fulvestrante; galarubicine; galocitabine; gemcitabine; gemtuzumabe/ozogamicine; gerokvinole; gimatekane; gimeracile; gloksazone; glufosfamide; goserelin acetate; hidroksiuree; ibritumomabe/ tiuksetane; idarubicine; ifosfamide; ilmofosine; ilomastate; imatinib mezilate; imeksone; improsulfane; indisulame; inprokvone; interferone alfa-2a; interferone alfa-2b; interferone alfa; interferone beta; interferone gama; interferone; interleukine-2 i druge interleukine (uključujući rekombinantne interleukine); intoplicine; jobenguane [131-1]; iproplatine; irinotekane; irsogladine; iksabepilone; ketotreksate; L-alanozine; lanreotide; lapatinibe; ledoksantrone; letrozole; leukovorine; leuprolide; leuproreline (leuprorelide); levamisole; leksakalcitole; liarozole; lobaplatine; lometreksole; lomustine/CCNU; lomustine; lonafarnibe; lozoksantrone; lurtotekane; mafosfamide; manosulfane; marimastate; masoprokole; majtanzine; mehloretamine; mehloretamine/azotne mustarde; megestrol acetate; megestrole; melengestrole; melfalane; melfalane L-PAM; menogarile; mepitiostane; merkaptopurine; 6-merkaptopurin; mesne; metezinde; metotreksate; metokssalene; metomidate; metoprine; meturedepe; miboplatine; miproksifene; mizonidazole; mitindomide; mitokarcine; mitokromine; mitoflaksone; mitogiline; mitoguazone; mitomalcine; mitomicine C; mitomicine; mitonafide; mitokvidone; mitospere; mitotane; mitoksantrone; mitozolomide; mivobuline; mizoribine; mofarotene; mopidamole; mubritinibe; mikofenolne kiseline; nandrolon fenpropionate; nedaplatine; nelzarabine; nemorubicine; nitrakrine; nokodazole; nofetumomabe; nogalamicine; nolatreksede; nortopiksantrone; oktreotide; oprelvekine; ormaplatine; ortataksele; oteracile; oksaliplatine; oksisurane; oksofenarsine; paklitaksele; pamidronate; patubilone; pegademaze; pegaspargaze; pegfilgrastime; peldezine; peliomicine; pelitreksole; pemetreksede; pentamustine; pentostatine; peplomicine; perfosfamide; perifosine; pikoplatine; pinafide; pipobromane; piposulfane; pirfenidone; piroksantrone; piksantrone; plevitreksede; plikamicid mitramicine; plikamicine; plomestane; plomestane; natrijum porfimere; porfimere; porfiromicine; prednimustine; prokarbazine; propamidine; prospidijume; pumitepe; puromicine; pirazofurine; kvinakrine; ranimustine; rasburikaze; riboprine; ritrosulfane; rituksimabe; rogletimide; rokvinimekse; rufokromomicine; sabarubicine; safingole; sargramostime; satraplatine; sebriplatine; semustine; simtrazene; sizofirane; sobuzoksane; sorafenibe; sparfosate; sparfozne kiseline; sparzomicine; spirogermanijume; spiromustine; spiroplatine; spiroplatine; skvalamine; streptonigrine; streptovarikine; streptozocine; sufosfamide; sulofenure; sunitinib malat; 6-tioguanin (6-TG); tacedinaline; talkove; talizomicine; talimustine; tamoksifene; tarikvidare; tauromustine; tekogalane; tegafure; teloksantrone; temoporfine; temozolomide; tenipozide/VM-26; tenipozide; teroksirone; testolaktone; tiamiprine; tioguanine; tiotepe; tiamiprine; tiazofurine; tilomizole; tilorone; timkodare; timonacike; tirapazamine; topiksantrone; topotekane; toremifene; tozitumomabe; trabektedine (ekteinascidin 743); trastuzumabe; trestolone; tretinoine/ATRA; triciribine; trilostane; trimetreksate; triplatin tetranitrate; triptoreline; trofosfamide; tubulozole; ubenimekse; uramustine; uredepe; valrubicine; valspodare; vapreotide; verteporfine; vinblastine; vinkristine; vindezine; vinepidine; vinflunine; vinformide; vinglicinate; vinleucinole; vinleurozine; vinorelbine; vinrozidine; vintriptole; vinzolidine; vorozole; ksantomicine A (guamecikline); zeniplatine; zilaskorbe [2-H]; zinostatine; zoledronat; zorubicine; i zosukvidare, na primer:
aldesleukine (npr. PROLEUKIN®); alemtuzumabe (npr. CAMPATH®); alitretinoine (npr. PANRETIN®); alopurinole (npr. ZYLOPRIM®); altretamine (npr. HEXALEN®); amifostine (npr. ETHYOL®); anastrozole (npr. ARIMIDEX®); arsenik triokside (npr. TRISENOX®); asparaginaze (npr. ELSPAR®); žive BCG vakcine (npr. TICE® BCG); beksarotene (npr. TARGRETIN®); bevacizumab (AVASTIN®); bleomicine (npr. BLENOXANE®); busulfane za intravensku primenu (npr. BUSULFEX®); busulfane za peroralnu primenu (npr. MYLERAN®); kalusterone (npr. METHOSARB®); kapecitabine (npr. XELODA®); karboplatine (npr. PARAPLATIN®); karmustine (npr. BCNU®, BiCNU®); karmustine sa polifeprozanima (npr. GLIADEL® Wafer); celekoksibe (npr. CELEBREX®); hlorambucile (npr. LEUKERAN®); cisplatine (npr. PLATINOL®); kladribine (npr. LEUSTATIN®, 2-CdA®); ciklofosfamide (npr. CYTOXAN®, NEOSAR®); citarabine (npr. CYTOSAR-U®); lipozomalne citarabine (npr. DepoCyt®); dakarbazine (npr. DTIC-Dome): daktinomicine (npr. COSMEGEN®); darbepoetine alfa (npr. ARANESP®); lipozomalne daunorubicine (e. g. DANUOXOME®); daunorubicine/daunomicine (npr. CERUBIDINE®); denileukin diftitokse (npr. ONTAK®); deksrazoksane (npr. ZINECARD®); docetaksele (npr. TAXOTERE®); doksorubicine (npr. ADRIAMYCIN®, RUBEX®); lipozomalne doksorubicine, uključujući lipozomalni doksorubicin HCL za injekcije (npr. DOXIL®); dromostanolon propionate (npr. DROMOSTANOLONE® i MASTERONE® za injekciju); Eliotove B rastvore (npr. Elliott’s B Solution®); epirubicine (npr. ELLENCE®); epoetine alfa (npr. EPOGEN®); estramustine (npr. EMCYT®); etopozid fosfat (npr. ETOPOPHOS®); etopozid VP-16 (npr. VEPESID®); egzemestan (npr. AROMASIN®); filgrastime (npr. NEUPOGEN®); floksuridine (npr. FUDR®); fludarabine (npr. FLUDARA®); fluorouracile uklj. 5-FU (npr. ADRUCIL®); fulvestrante (npr. FASLODEX®); gemcitabine (npr. GEMZAR®); gemtuzumabe/ozogamicine (npr. MYLOTARG®); goserelin acetate (npr. ZOLADEX®); hidroksiuree (npr. HYDREA®); ibritumomabe/tiuksetane (npr. ZEVALIN®); idarubicine (npr. IDAMYCIN®); ifosfamide (npr. IFEX®); imatinib mezilate (npr. GLEEVEC®); interferone alfa-2a (npr. ROFERON-A®); interferone alfa-2b (npr. INTRON A®); irinotekane (npr. CAMPTOSAR®); letrozole (npr. FEMARA®); leukovorine (npr. WELLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); levamizole (npr. ERGAMISOL®); lomustine/CCNU (npr. CeeBU®); mehloretamine/azotne iperite (npr. MUSTARGEN®); megestrol acetate (npr. MEGACE®); melfalane/L-PAM (npr. ALKERAN®); merkaptopurin, uključujući 6-merkaptopurine (6-MP; npr. PURINETHOL®); mesne (npr. MESNEX®); metotreksate; metoksalene (npr. UVADEX®); mitomicine C (npr. MUTAMYCIN®, MITOZYTREX®); mitotane (npr. LYSODREN®); mitoksantrone (npr. NOVANTRONE®); nandrolon fenpropionate (npr. DURABOLIN-50®); nofetumomabe (npr. VERLUMA®); oprelvekine (npr. NEUMEGA®); oksaliplatine (npr. ELOXATIN®); paklitaksele (npr. PAXENE®, TAXOL®); pamidronate (npr. AREDIA®); pegademaze (npr. ADAGEN®); pegaspargaze (npr. ONCASPAR®); pegfilgrastime (npr. NEULASTA®); pentostatine (npr. NIPENT®); pipobromane (npr. VERCYTE®); plikamicin/mitramicine (npr. MITHRACIN®); natrijum porfimere (npr. PHOTOFRIN®); prokarbazine (npr. MATULANE®); kvinakrine (npr. ATABRINE®); rasburikaze (npr. ELITEK®); rituksimabe (npr. RITUXAN®); sargramostime (npr. PROKINE®); streptozocine (npr. ZANOSAR®); sunitinib malate (npr. SUTENT®); talkove (npr. SCLEROSOL®); tamoksifene (npr. NOLVADEX®); temozolomide (npr. TEMODAR®); tenipozide/VM-26 (npr. VUMON®); testolaktone (npr. TESLAC®); tioguanine uključujući, 6-tioguanin (6-TG); tiotepe (npr. THIOPLEX®); topotekane (npr. HYCAMTIN®); toremifene (npr. FARESTON®); tozitumomabe (npr. BEXXAR®); trastuzumabe (npr. HERCEPTIN®); tretinoine/ATRA (npr. VESANOID®); uramustine; valrubicine (npr. VALSTAR®); vinblastine (npr. VELBAN®); vinkristine (npr. ONCOVIN®); vinorelbine (npr. NAVELBINE®); i zoledronate (npr. ZOMETA®).
H. PRIMERI
[0466] Sledeći primeri su uključeni samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da ograničavaju obim pronalaska.
Primer 1
Antitumorsko dejstvo kombinovanog lečenja sa PEGPH20 i nab-paklitakselom u ksenograftskom modelu humanog tumora pankreasa
[0467] Antitumorska dejstva PEGPH20 u kombinaciji sa nanočesticama albumin-vezanog (nab)-paklitaksela procenjivana su na ksenograftskom modelu humanog tumora pankreasa.
[0468] Tumorske ćelije iz ćelijske linije BxPC3 kancera pankreasa (Američka kolekcija kultura tkiva (ATCC) CRL1687) gajene su do približno 80% konfluentnosti, tripsinizirane, sakupljene, oprane jednom u HBSS (Hankov balansirani rastvor soli, Mediatech Inc.). Pre inokulacije ćelije su oprane dvaput sterilnim HBSS, izbrojane upotrebom automatskog uređaja za brojanje Nexcelom Cellometer (Nexcelom Bioscience; Lawrence, MA) koji određuje koncentraciju i vijabilnost ćelija putem isključivanja sa bojom tripan plavom i razblažene sa HBSS do koncentracije od 1 x 10<8>ćelija/mL na ledu pre inokulacije u životinje. Mužjaci golih miševa (bestimusni NCr nu/nu miševi, Taconic Laboratories, Inc.) starosti približno 6 nedelja, inokulisani su intramuskularno (IM) sa 0.05 mL ćelijske suspenzije, peritibijalno, u levu zadnju nogu (u blizini tibijalnog periosteuma). Tumori u životinjama su procenjenivani dva puta nedeljno i ostavljeni da rastu do srednje zapremine tumora od približno 350 - 400 mm<3>. Trenutne zapremine tumora su određene upotrebom VisualSonics Vevo 770 ultrazvuka visoke rezolucije (VisulaSonics Inc.; Toronto, Ontario, Canada).
[0469] Životinje koje su nosile tumore grupisane su u 8 tretmanskih grupa od 8 životinja po grupi i tretirane intravenski sa: 1) vehikulumom (API pufer; 2) PEGPH20 (4.5 mg/kg); 3) nab-paklitakselom (3 mg/kg; niska doza); 4) nab-paklitakselom (10 mg/kg; umerena doza); 5) nab-paklitakselom (30 mg/kg; visoka doza); 6) PEGPH20 (4.5 mg/kg) nabpaklitakselom (3 mg/kg); 7) PEGPH20 (4.5 mg/kg) nab-paklitakselom (10 mg/kg); ili 8) PEGPH20 (4.5 mg/kg) nab-paklitakselom (30 mg/kg). PEGPH20 i nab-paklitaksel su primenjivani odvojeno. Prvo je primenjivana PEGPH20, a odmah zatim nab-paklitaksel.
Doziranje i učestalost tretmana bilo je na svaka 3 dana, ukupno 6 injekcija počevši od dana 0 sa zapreminom doze od 0.1 mL/25 g miša, ili 4.0 mL/kg (tj. na dane 0, 3, 6, 9, 12, 15).
[0470] Zapremine tumora za sve miševe merene su snimanjem korišćenjem ultrazvučnog sistema VisualSonics 2 puta nedeljno. Zapremina tumora je izračunata upotrebom softverskog programa za snimanje u 3D-modu (VisualSonics ® Vevo 770®, v 3.0.0). Procenat inhibicije rasta tumora (% TGI) izračunat je prema sledećoj jednačini:
[1-(Tn-T0)/(Cn-C0)] x 100%
U gornjoj jednačini, Tnje prosečna zapremina tumora u tretmanskoj grupi odgovarajućeg dana "n" u označenoj vremenskoj tački nakon tretmana; T0je prosečna zapremina tumora u tretmanskoj grupi na dan 0 pre tretmana; Cnje prosečna zapremina tumora u kontrolnoj grupi odgovarajućeg dana "n" u označenoj vremenskoj tački nakon tretmana sa vehikulumom; i C0je prosečna zapremina tumora u kontrolnoj grupi na dan 0 pre tretmana.
[0471] Rezultati su prikazani na slici 1. Rezultati pokazuju da je nab-paklitaksel u visokim i umerenim dozama inhibirao rast tumora, i ovo dejstvo je bilo pojačano u prisustvu PEGPH20. Na primer, u poslednjoj vremenskoj tački u kojoj je zapremina tumora merena, umerene do visoke doze nab-paklitaksela (10 mg/kg i 30 mg/kg) inhibirale su rast tumora za 62% (p<0.01) odnosno 74% (p<0.01), u poređenju sa kontrolom vehikuluma. U prisustvu PEGPH20, inhibicija rasta tumora za tretmanske grupe od 10 mg/kg nab-paklitaksela povećana je do 72% (p<0.01) i za tretmanske grupe od 30 mg/kg nab-paklitaksela povećana je do 91% (p<0.01). To predstavlja povećanje efikasnosti posredovano sa PEGPH20 od 19% za umerenu dozu nab-paklitaksela, i 26% za visoku dozu nab-paklitaksela. Suštinska inhibicija rasta tumora nije zapažena u grupama tretiranim sa 4.5 mg/mg PEGPH20, ili u grupama tretiranim niskom dozom nab-paklitaksela od 3 mg/kg u prisustvu ili odsustvu PEGPH20.
Primer 2
Antitumorsko dejstvo kombinovanog lečenja sa PEGPH20, nab-paklitakselom i gemcitabinom u ksenograftskom modelu humanog tumora pankreasa
A. Inhibicija rasta tumora
[0472] Ksenograftski model humanog tumora pankreasa opisan u primeru 1 korišćen je za ocenu antitumorska dejstva kombinovane terapije PEGPH20 i nab-paklitaksela u dodatnoj kombinaciji sa tretmanom gemcitabinom. Pre sprovođenja ispitivanja, put primene i nivo doze za gemcitabin je zasnovano odabran. Da bi se to postiglo miševi koji nose tumor su tretirani različitim dozama gemcitabina (60 mg/kg, 120 mg/kg, 180 mg/kg i 240 mg/kg) jednom nedeljno tokom 21 dana (dan 0, 7, 14 i 21) i zapremina tumora je praćena kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani na slici 2. Rezultati pokazuju da je gemcitabin inhibirao rast tumora pri svim ispitivanim dozama u poređenju sa samim vehikulumom. Suboptimalna doza od 180 mg/kg je odabrana za upotrebu u sledećim ispitivanjima kombinovane hemioterapije sa PEGPH20. Suboptimalne doze oba, i gemcitabina i nab-paklitaksela su odabrane za ocenu potencijalne koristi od kombinovanja tri antikancerska sredstva: PEGPH20, gemcitabina i nab-paklitaksela.
[0473] Miševi koji nose tumor su grupisani u 8 tretmanskih grupa od 12 životinja po grupi i tretirane sa: 1) vehikulumom (API pufer); 2) PEGPH20 (4.5 mg/kg); 3) nab-paklitakselom (10 mg/kg); 4) gemcitabinom (180 mg/kg); 5) PEGPH20 (4.5 mg/kg) nab-paklitakselom (10 mg/kg); 6) PEGPH20 (4.5 mg/kg) gemcitabinom (180 mg/kg); 7) nab-paklitakselom (10 mg/kg) gemcitabinom (180 mg/kg); ili 8) PEGPH20 (4.5 mg/kg) nab-paklitakselom (10 mg/kg) gemcitabinom (180 mg/kg). PEGPH20 i nab-paklitaksel su primenjeni intravenski i doziranje i učestalost tretmana bila je 2 puta nedeljno (2x/ned.) za četvoronedeljni ciklus doziranja. Gemcitabin je primenjivan intraperitonealno 24 časa posle PEGPH20 i/ili nab-paklitaksela svakih 7 dana tokom tronedeljnog ciklusa doziranja. U zavisnosti od ispitivane grupe, raspored doziranja za primenu sredstava u četvoronedeljnom ciklusu je prikazan u tabeli 5.
[0474] Zapremina tumora i inhibicija rasta tumora je određena kao što je opisano u primeru 1. Rezultati su prikazani na slici 3. Rezultati pokazuju da su gemcitabin pojedinačno, PEGPH20 pojedinačno i PEGPH20 gemcitabin ispoljili izvesnu antitumorsku aktivnost, ali da je antitumorsko dejstvo bilo mnogo veće u terapijama koje sadrže nab-paklitaksel sa najvećim antitumorskim dejstvom ispoljenim kod životinje tretiranih sa PEGPH20, nab-paklitakselom i gemcitabinom. Tabela 6 prikazuje rezultate kao procenat inhibicije rasta u odnosu na vehikulum određeno iz merenja zapremine tumora na dan 26. Rezultati pokazuju da je lečenje životinja sa PEGPH20 kao dodatkom tretmanu sa nab-paklitakselom i gemcitabinom rezultovalo u 81% inhibicije rasta tumora u odnosu na vehikulum, dok je tretman sa nabpaklitakselom i gemcitabinom bez PEGPH20 rezultovao u inhibiciji rasta tumora od samo 66%. Prema tome, rezultati pokazuju da je dodavanje PEGPH20 kombinovanoj terapiji nabpaklitakselom i gemcitabinom rezultovalo u povećanju efikasnosti od 23%.
B. Medijana vremena preživljavanja
[0475] Nakon prvog četvoronedeljnog ciklusa doziranja kao što je navedeno u delu A, ciklus doziranja je ponovljen dva puta i vreme do krajnje tačke preživljavanja je praćeno tokom vremena. Ukratko, u svakom ciklusu doziranja, životinje su tretirane vehikulumom ili PEGPH20 (4.5 mg/mL) sa ili bez nab-paklitaksela (10 mg/kg) primenjenog intravenski dvaput nedeljno tokom četiri nedelje. U svakom ciklusu, kod grupa koje primaju gemcitabin primenjen je gemcitabin (180 mg/kg) 24 časa posle PEGPH20 i/ili nabpaklitaksel svakih 7 dana tokom tri nedelje ciklusa doziranja. Vreme do krajnje tačke preživljavanja, indirektni pokazatelj preživljavanja životinja, definisan je kao (a) vreme do zapremine tumora veće od 2000 mm3, (b) vreme do gubitka telesne težine većeg od 20%, ili (c) vreme do iznurenosti ili smrti životinje.
[0476] Rezultati su navedeni na slici 4 i u tabeli 7. Rezultati pokazuju da je medijana vremena preživljavanja do krajnje tačke za životinje tretirane samo sa gemcitabinom bila 38 dana, za životinje tretirane sa nab-paklitakselom i gemcitabinom 52 dana, i za životinje tretirane sa PEGPH20, nab-paklitakselom i gemcitabinom 68 dana. Prema tome, rezultati pokazuju da je dodavanje PEGPH20 tretmanu sa nab-paklitakselom i gemcitabinom povećalo medijanu vremena preživljavanja u poređenju sa bilo kojim drugim tretmanom sa povećanjem efikasnosti od 31% u poređenju sa lečenjem nab-paklitakselom i gemcitabinom bez PEGPH20 i povećanu efikasnost od 79% u poređenju sa lečenjem samo gemcitabinom.
C. Merenje biomarkera tumora
[0477] Da bi se izmerio terapijski odgovor mereni su biomarkeri karbohidratni antigen 19-9 (CA19-9) i karcinoembrionski antigen (CEA) povezani sa kancerom pankreasa. Životinje su tretirane kao što je opisano u delu A. Serum je sakupljen od pratećih životinja (n≤3) iz svake grupe na dan 0, 6, 13 i 20 prvog ciklusa doziranja. Humani CA19-9 je meren upotrebom CA 19-9 ELISA kita (kataloški br. CA199T, Calbiotech, Spring Valley, CA), a CEA tumor antigen je meren upotrebom CEA ELISA kita (kataloški br. CE062T, Calbiotech, Spring Valley, CA).
[0478] Rezultati su navedeni na slici 5. Rezultati pokazuju da je tretman sa PEGPH20 rezultovao u redukciji izmerenih markera u svim tretmanskim grupama. Na primer, na dan 20, detektovani nivo CA19-9 markera bi je sličan u svim grupama tretiranim sa PEGPH20 u opsegu od približno 40-60 U/mL. Nasuprot tome, nivo CA19-9 markera kod životinja tretiranih nab-pakilitakselom ili nab-paklitakselom gemcitabinom bio je približno dvostruk u odnosu na životinje tretirane i sa PEGPH20, i iznosio je približno 110 U/mL. Životinje tretirane samo gemcitabinom ispoljile su nivoe CA19-9 koji su bili približno slični onima kod kontrole vehikuluma. Stoga, rezultati pokazuju da su životinje tretirane sa PEGPH20+ nabpaklitakselom imale redukovane nivoe CA19-9 u poređenju sa životinjama tretiranim samo sa nab-paklitakselom; životinje tretirane sa PEGPH20 gemcitabinom imale su redukovane nivoe CA19-9 u poređenju sa životinjama tretiranim samo sa gemcitabinom; i životinje tretirane sa PEGPH20 nab-paklitakselom gemcitabinom imale su redukovane nivoe CA19-9 u poređenju sa životinjama tretiranim samo sa nab-paklitakselom gemcitabinom. Kod životinja tretiranih sa PEGPH20 nab-paklitakselom gemcitabinom, CA19-9 je bio redukovan 49% u poređenju sa životinjama tretiranim sa nab-paklitakselom gemcitabinom u odsustvu PEGPH20.
[0479] Rezultati su bili slični kada je meren CEA marker. Korišćenjem ovog markera, rezultati pokazuju da nivoi CEA nisu suštinski promenjeni na dan 20 kod životinja tretiranih samo nab-paklitakselom u poređenju sa kontrolom vehikuluma, budući da je u ovim grupama izmereno približno 20 do 25 ng/mL CEA. Kod životinja tretiranih gemcitabinom ili nabpaklitakselom gemcitabinom postojala je izvesna redukcija u izmerenom CEA markeru na dan 20 do približno 15 ng/mL. U prisustvu PEGPH20, nivo markera koji je izmeren bio je značajno redukovan u poređenju sa tretmanskim grupama bez PEGPH20. Na primer, kod životinja tretiranih samo sa PEGPH20, izmereni CEA na dan 20 bio je približno 7-8 ng/mL. Kod životinja tretiranih sa PEGPH20 gemcitabinom, PEGPH20+nab-paklitakselom, ili PEGPH20+nab-paklitakselom+gemcitabinom, nivoi CEA na dan 20 bili su suviše niski da bi se kvantitativno odredili pomoću testa ELISA.
Primer 3
Ćelijske linije koje eksprimiraju rHuPH20
A. Stvaranje inicijalne ćelijske linije koja eksprimira rastvorljivu rHuPH20
[0480] Ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije) su transficirane HZ24 plazmidom (naveden u SEQ ID NO:52). HZ24 plazmidni vektor za ekspresiju rastvorljivog rHuPH20 sadržao je pCI vektorski skelet (Promega), DNK koja kodira aminokiseline 1-482 humane PH20 hijaluronidaze (SEQ ID NO:49), unutrašnje ribozomalno ulazno mesto (IRES) iz ECMV virusa (Clontech), i mišiji gen dihidrofolat reduktaze (DHFR). pCI vektorski skelet takođe sadrži DNK koja kodira gen rezistencije na beta-laktamazu (AmpR), f1 mesto početka replikacije, citomegalovirusni neposredno-rani pojačavač/promotorski region (CMV), himerni intron, i SV40 kasni poliadenilacioni signal (SV40). DNK koja kodira konstrukt rastvorljive rHuPH20 sadrži NheI mesto i Kozakovu konsezusnu sekvencu pre DNK koja kodira metionin na aminokiselinskoj poziciji 1 prirodne signalne sekvence humanog PH20 od 35 aminokiselina, i stop kodon koji sledi posle DNK koja kodira tirozin koji odgovara aminokiselinskoj poziciji 482 humane PH20 hijaluronidaze navedene u SEQ ID NO:1), praćen BamHI restrikcionim mestom. Konstrukt pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24), zato rezultuje jednom vrstom iRNK koju pokreće CMV promotor, koja kodira aminokiseline 1-482 humanog PH20 (navedena u SEQ ID NO:3) i aminokiseline 1-186 mišije dihidrofolat reduktaze (navedena u SEQ ID NO:53), razdvojene unutrašnjim ribozomalnim ulaznim mestom (IRES).
[0481] Netransficirane CHO ćelije koje su rasle u GIBCO modifikovanom CD-CHO medijumu za DHFR(-) ćelije, kome je bilo dodato 4 mM glutamina i 18 ml/L Pluronic F68/L (Gibco), zasejane su u koncentraciji od 0.5 x 106 ćelija/ml u balonu za mućkanje u preparatu za transfekciju. Ćelije su rasle na 37° C u 5% CO2u inkubatoru sa ovlaživanjem vazduha uz mućkanje na 120 rpm. Pre transfekcije je bila testirana vijabilnost eksponencijalno rastućih netransficiranih CHO ćelija.
[0482] Šezdeset miliona vijabilnih ćelija netransficirane CHO ćelijske kulture je bilo peletirano i resuspendovano do gustine od 2 × 107 ćelija u 0.7 mL 2x transfekcionog pufera (2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM dekstroze). Svakom alikvotu resuspendovanih ćelija bilo je dodato 0.09 mL (250 μg) linearnog HZ24 plazmida (linearizovan je digestijom preko noći sa Cla I (New England Biolabs), pa su rastvori ćelija/DNK bili preneti u kivete za elektroporaciju sa žljebom od 0.4 cm BTX (Gentronics) na sobnoj temperaturi. Negativna kontrola elektroporacije bila je izvedena bez plazmidne DNK pomešane sa ćelijama. Smeše ćelije/plazmid su bile elektroporirane sa kondenzatorskim pražnjenjem od 330 V i 960 μF ili od 350 V i 960 μF.
[0483] Ćelije su bile uklonjene iz kiveta posle elektroporacije, pa su prenete u 5 mL modifikovanog CD-CHO medijuma za DHFR(-) ćelije, obogaćenog sa 4 mM glutamina i 18 ml/L Pluronic F68/L (Gibco), i ostavljene da rastu u bunarčiću ploče za kultivisanje tkiva sa 6 bunarčića bez selekcije tokom 2 dana na 37° C u 5% CO2u inkubatoru sa ovlaživanjem vazduha.
[0484] Dva dana posle elektroporacije, 0,5 mL medijuma za kultivaciju tkiva je bilo odstranjeno iz svakog bunarčića i testirano na prisustvo hijaluronidazne aktivnosti, korišćenjem mikroturbidimetrijskog testa koji je opisan u primeru 6. Ćelije koje eksprimiraju najviše nivoe hijaluronidazne aktivnosti su sakupljene iz bunarčića za kultivaciju tkiva, zatim su izbrojane i razređene od 1×10<4>do 2×10<4>vijabilnih ćelija po mL. Alikvot od 0,1 mL suspenzije ćelija je bio prenet u svaki bunarčić od pet bunarčića ploča sa 96 bunarčića za kultivisanje tkiva sa okruglim dnom. Sto mikrolitara CD-CHO medijuma (GIBCO), koji je sadržao 4 mM GlutaMAX™-1 suplementa (GIBCO™, Invitrogen Corporation) i bez hipoksantinskih i timidinskih suplemenata, bilo je dodato u bunarčiće koji su sadržali ćelije (finalna zapremina 0.2 mL).
[0485] Bilo je identifikovano deset klonova iz 5 ploča koji su rasli bez metotreksata. Šest od ovih HZ24 klonova je bilo umnoženo u kulturi i preneto u balone za mućkanje u vidu suspenzija pojedinačnih ćelija. Klonovi 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 i 4D10 su bili zasejani u ploče sa 96 bunarčića za kultivaciju tkiva sa okruglim dnom korišćenjem dvodimenzionalne strategije beskonačnog razređivanja u kome su ćelije bile razređivane 1:2 niz ploču i 1:3 poprečno duž ploče, polazeći od 5000 ćelija na gornjem levom bunarčiću. Razređeni klonovi su gajeni na podlozi od 500 netransficiranih DG44 CHO ćelija po bunarčiću, da bi se dobili neophodni faktori rasta za početne dane u kulturi. Bilo je napravljeno deset ploča po jednom subklonu, i to 5 ploča koje su sadržale 50 nM metotreksata i 5 ploča bez metotreksata.
[0486] Klon 3D3 je proizveo 24 vizuelna subklona (13 iz tretmana bez metotreksata i 11 iz tretmana sa 50 nM metotreksata. Značajna hijaluronidazna aktivnost je bila izmerena u supernatantima 8 od 24 subklona (>50 jedinica/mL), i ovih 8 subklonova je bilo umnoženo u bocama za kultivaciju tkiva T-25. Izolovani klonovi iz protokola sa tretmanom metotreksatom bili su umnoženi u prisustvu 50 nM metotreksata. Klon 3D35M je bio dalje umnožen u 500 nM metotreksata u balonima za mućkanje da bi se dobili klonovi koji proizvode više od 1.000 jedinica/ml hijaluronidazne aktivnosti (klon 3D35M; ili Gen1 3D35M). Nakon toga, pripremljena je glavna ćelijska banka (MCB) 3D35M ćelija.
B. Stvaranje druge generacije ćelijske linije koja eksprimira rastvorljivu rHuPH20
[0487] Ćelijska linija 3D35M Gen1 opisana u primeru 3A je prilagođena višim nivoima metotreksata da bi se proizvela generacija 2 (Gen2) klonova. 3D35M ćelije su zasejane iz uspostavljenih kultura koje sadrže metotreksat u CD CHO medijum koji sadrži 4 mM GlutaMAX-1™ i 1.0 µM metotreksata. Ćelije su prilagođene višem nivou metotreksata gajenjem i pasažiranjem 9 puta tokom perioda od 46 dana na 37°C, 7% CO2, u inkubatoru sa ovlaživačem. Umnožena populacija ćelija je klonirana putem graničnog razblaženja u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčića koje sadrže medijum sa 2.0 µM metotreksata. Posle približno 4 nedelje, klonovi su identifikovani i klon 3E10B je odabran za umnožavanje. Ćelije 3E10B su gajene u CD CHO medijumu koji sadrži 4 mM GlutaMAX-1™ i 2.0 µM metotreksata tokom 20 pasažiranja. Napravljena je glavna ćelijska banka (MCB) 3E10B ćelijske linije i zamrznuta i korišćena za nastavak ispitivanja.
[0488] Umnožavanje ćelijske linije nastavljeno je gajenjem 3E10B ćelija u CD CHO medijumu koji sadrži 4 mM GlutaMAX1™ i 4.0 µM metotreksata. Posle 12. pasaže, ćelije su zamrznute u bočicama kao istraživačka ćelijska banka (RCB). Jedna bočica RCB je odmrznuta i sadržaj je gajen u medijumu koji sadrži 8.0 µM metotreksata. Posle 5 dana, koncentracija metotreksata u medijumu je povećana do 16.0 µM, zatim 20.0 µM, 18 dana kasnije. Ćelije iz 8. pasaže u medijumu koji sadrži 20.0 µM metotreksata su klonirane putem graničnog razblaženja u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčića koje sadrže medijum CD CHO sa 4 mM GlutaMAX-1™ i 20.0 µM metotreksata. Klonovi su identifikovani 5-6 nedelja kasnije i klon 2B2 je odabran za umnožavanje u medijumu koji sadrži 20.0 µM metotreksata. Nakon 11. pasaže, ćelije 2B2 su zamrznute u bočicama kao istraživačka ćelijska banka (RCB).
[0489] Rezultujuće 2B2 ćelije su DG44 CHO ćelije deficijentne u dihidrofolat reduktazi (dhfr-) koje eksprimiraju rastvorljivu rekombinantnu humanu PH20 (rHuPH20). Rastvorljiva PH20 je prisutna u 2B2 ćelijama u broju kopija od približno 206 kopija/ćeliji. Southern blot analiza genomske DNK 2B2 ćelija digestovane enzimima Spe I-, Xba I- i BamH I/Hind III, upotrebom probe specifične za rHuPH20, otkrila je sledeći restrikcioni profil digestije: jedna glavna hibridizujuća traka od ∼7.7 kb i četiri manje hibridizujuće trake (∼13.9, ∼6.6, ∼5.7 i ∼4.6 kb) u DNK digestovanoj sa Spe I; jedna glavna hibridizujuća traka ∼5.0 kb i dve manje hibridizujuće trake (∼13.9 i ∼6.5 kb) u DNK digestovanoj sa Xba I; i jedna jedinstvena hibridizujuća traka ∼1.4 kb zapažena upotrebom 2B2 DNK digestovane sa BamH I/Hind III.
Analiza sekvence transkripta iRNK ukazala je na to da je izvedena cDNK (SEQ ID NO:56) identična referentnoj sekvenci (SEQ ID NO:49) osim razlike u jednom baznom paru na poziciji 1131, za koju je zapaženo da predstavlja timidin (T) umesto očekivanog citozina (C). Ovo je tiha mutacija, bez uticaja na aminokiselinsku sekvencu.
Primer 4
Proizvodnja i prečišćavanje rHuPH20
A. Proizvodnja rastvorljive rHuPH20 u Gen2 u bioreaktoru za ćelijske kulture od 300 L
[0490] Bočica ćelija HZ24-2B2 (primer 3B) je odmrznuta i ćelije su gajene prenošenjem iz balona za mućkanje do rotirajućih boca od 36L u CD-CHO medijum (Invitrogen, Carlsbad, CA) obogaćen sa 20 μM metotreksata i GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Ukratko, bočica sa ćelijama je bila odmrznuta na 37°C u vodenom kupatilu, dodat je medijum i ćelije su centrifugirane. Ćelije su bile resuspendovane u balonu za mućkanje od 125 mL sa 20 mL svežeg medijuma, i smeštene na 37°C, u inkubator sa 7% CO2. Ćelije su bile gajene u 40 mL medijuma u balonu za mućkanje od 125 mL. Kada je gustina ćelija postala veća od 1.5 x 10<6>ćelija/mL, kultura je preneta u rotirajuću bocu od 125 mL sa zapreminom kulture od 100 mL. Boca je inkubirana na 37°C, sa 7% CO2. Kada je gustina ćelija postala veća od 1.5 x 106 ćelija/mL, kultura je preneta u rotirajuću bocu od 250 mL sa zapreminom kulture od 200 mL, pa je boca inkubirana na 37°C, sa 7% CO2. Kada je gustina ćelija postala veća od 1.5 x 106 ćelija/mL, kultura je bila preneta u rotirajuću bocu od 1 L sa zapreminom kulture od 800 mL, pa je inkubirana na 37°C, sa 7% CO2. Kada je gustina ćelija postala veća od 1.5 x 106 ćelija/mL, kultura je bila preneta u rotirajuću bocu od 6 L sa zapreminom kulture od 5000 mL, pa je inkubirana na 37°C, sa 7% CO2. Kada je gustina ćelija postala veća od 1.5 x 10<6>ćelija/mL, kultura je preneta u rotirajuću bocu od 36 L sa zapreminom kulture od 32 L, koja je inkubirana na 37°C, sa 7% CO2.
[0491] Reaktor od 400 L je sterilisan, pa je dodato 230 mL CD-CHO medijuma. Pre upotrebe, provereno je da li je reaktor kontaminiran. Približno 30 L ćelija je bilo preneto iz rotirajućih boca od 36L u bioreaktor (Braun) od 400 L sa gustinom inokulacije od 4.0 × 10<5>vijabilnih ćelija po ml i ukupnom zapreminom od 260 L. Parametri su bili: temperatura podešena na 37°C; brzina propelera 40-55 RPM; pritisak u sudu: 3 psi; barbotiranje vazduha 0.5- 1.5 L/min.; prestrujavanje vazduha: 3 L/ min. Iz reaktora su uzorci uzimani svakodnevno za brojanje ćelija, verifikaciju pH, analizu medijuma, produkciju i retenciju proteina. Takođe, tokom rada su bile dodate hranljive materije. Posle 120 h (dan 5), bilo je dodato 10.4 L hranljivog medijuma br. 1 (4× CD-CHO 33 g/L glukoze 160 mL/L Glutamax-1™ 83 mL/L Yeastolate 33 mg/L rHuInsulina). Posle 168 sati (dan 7), bilo je dodato 10.8 L hranljivog medijuma br. 2 (2× CD-CHO 33 g/L glukoze 80 mL/L Glutamax-1™ 167 mL/L Yeastolate 0,92 g/L natrijum butirata), i temperatura kulture je bila promenjena na 36.5°C. Posle 216 sati (dan 9), bilo je dodato 10.8 L hranljivog medijuma br.3 (1× CD-CHO 50 g/L glukoze 50 mL/L Glutamax-1™ 250 mL/L Yeastolate 1.80 g/L natrijum butirata), i temperatura kulture je bila promenjena na 36° C. Posle 264 sati (dan 11) bilo je dodato 10.8 L hranljivog medijuma br. 4 (1× CD-CHO 33 g/L glukoze 33 mL/L Glutamax-1™ 250 mL/L Yeastolate 0.92 g/L natrijum butirata), i temperatura kulture je bila promenjena na 35.5° C. Bilo je uočeno da je dodavanje hranljivog medijuma dramatično povećalo proizvodnju rastvorljivog rHuPH20 u finalnim fazama proizvodnje. Reaktor je bio ispražnjen posle 14 ili 15 dana ili kada je vijabilnost ćelija pala ispod 40%. Postupak je rezultovao finalnom produktivnošću od 17 000 jedinica po ml sa maksimalnom gustinom ćelija od 12 miliona ćelija/mL. Pri sakupljanju kulture uzeti su uzorci za mikoplazmu, biološko opterećenje, endotoksin i viruse in vitro i in vivo, transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM) i enzimsku aktivnost.
[0492] Kultura je pumpana peristaltičkom pumpom kroz module četiri Millistak filtraciona sistema (Millipore) paralelno, od kojih je svaki sadržao sloj dijatomejske zemlje gradirane na 4-8 μm i sloj dijatomejske zemlje gradiran na 1.4-1.1 μm, praćen celuloznom membranom, zatim kroz drugi pojedinačni Millistak filtracioni sistem (Millipore) koji je sadržao sloj dijatomejske zemlje gradiran na 0.4-0.11 μm i sloj dijatomejske zemlje gradiran na <0.1 μm, praćen celuloznom membranom, i onda kroz finalni filter od 0.22 μm u sterilnu fleksibilnu kesu za jednokratnu upotrebu sa kapacitetom od 350 L. Sakupljenom fluidu ćelijske kulture dodato je 10 mM EDTA i 10 mM Tris do pH od 7,5. Kultura je bila koncentrovana 10× pomoću uređaja za tangencijalnu filtraciju (TFF) korišćenjem četiri Sartoslice TFF polietar sulfonska (PES) filtera sa graničnom vrednošću molekulske težine (MWCO) od 30 kDa (Sartorius), zatim je pufer 10x zamenjen sa 10 mM Tris, 20mM Na2SO4, pH 7.5 i fluid propušten kroz finalni filter od 0.22 μm u sterilnu kesu za čuvanje od 50 L.
[0493] U koncentrovanom, dijafiltriranom proizvodu urađena je inaktivacija virusa. Pre inaktivacije virusa, bio je pripremljen rastvor od 10% Triton X-100, 3% tri-(n-butil)-fosfata (TNBP). Koncentrovani, dijafiltrirani proizvod je bio izložen delovanju 1% Triton X-100, 0.3% TNBP tokom 1 časa u staklenom reakcionom sudu od 36 L neposredno pre prečišćavanja na Q koloni.
B. Prečišćavanje rastvorljive rHuPH20 iz Gen2
[0494] Pripremljena je Q sefarozna (Pharmacia) jonoizmenjivačka kolona (9 L smole, H= 29 cm, D= 20 cm). Uzorci ispirka su sakupljeni za određivanje pH, provodljivosti i endotoksina (LAL test). Kolona je izbalansirana sa 5 zapremina kolone sa 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5. Posle inaktivacije virusa, koncentrovani, dijafiltrovani proizvod (primer 4A) je nanet na Q kolonu pri protoku od 100 cm/h. Kolona je bila isprana sa 5 zapremina kolone 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 i 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Protein je bio eluiran sa 10 mM HEPES, 400 mM NaCl, pH 7.0 kroz finalni filter od 0.22 μm u sterilnu kesu. Uzorak eluata je ispitan kako bi se odredilo biološko opterećenje, koncentracija proteina i hijaluronidazna aktivnost. Očitavanja apsorbance A280izvršeno je na početku i na kraju izmene.
[0495] Nakon toga, izvedena je hidrofobna hromatografija na fenil-sefarozi (Pharmacia). Pripremljena je fenil-sefarozna (PS) kolona (19-21 L smole, H=29 cm, D= 30 cm). Ispirak je sakupljen i uzorkovan za pH, provodljivost i endotoksin (LAL test). Kolona je izbalansirana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Proteinski eluat sa Q sefarozne kolone je obogaćen stok rastvorima 2M amonijum sulfata, 1 M kalijum fosfata i 1 M CaCl2da bi se dobile finalne koncentracije od 5 mM, 0.5 M odnosno 0.1 mM. Protein je nanet na PS kolonu pri protoku od 100 cm/hr i sakupljena je tečnost koja je prošla kroz kolonu. Kolona je oprana sa 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i 0.1 mM CaCl2pH 7.0 pri 100 cm/čas i ispirak je dodat sakupljenoj tečnosti koja je prošla kroz kolonu. Kombinovana sa ispirkom kolone, tečnost koja je prošla kroz kolonu je propuštena kroz finalni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Tečnost koja je prošla kroz kolonu je uzorkovana za biološko opterećenje, koncentraciju proteina i enzimsku aktivnost.
[0496] Aminofenil boronatna kolona (ProMedics) je pripremljena. Ispirak je sakupljen i uzeti su uzorci za određivanje pH, provodljivosti i endotoksina (LAL test). Kolona je izbalansirana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata. Tečnost koja je prošla kroz PS i sadržala prečišćeni protein naneta je na aminofenil boronatnu kolonu pri protoku od 100 cm/h. Kolona je bila isprana sa 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0. Kolona je isprana sa 20 mM bicina, 0.5 M amonijum sulfata, pH 9.0. Kolona je isprana sa 20 mM bicina, 100 mM natrijum hlorida, pH 9.0. Protein je eluiran sa 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9 i propušten je kroz sterilni filter u sterilnu kesu. Eluirani uzorak je ispitan kako bi se odredilo biološko opterećenje, koncentracija proteina i enzimska aktivnost.
[0497] Pripremljena je hidroksiapatitna (HAP) kolona (Biorad). Ispirak je sakupljen i ispitan je pH, provodljivost i endotoksin (LAL test) u njemu. Kolona je izbalansirana sa 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Protein prečišćen na aminofenil boronatu obogaćen je do finalnih koncentracija od 5 mM kalijum fosfata i 0.1 mM CaCl2, pa je nanet na HAP kolonu pri protoku od 100 cm/h. Kolona je isprana sa 5 mM kalijum fosfata, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2. Kolona je zatim isprana sa 10 mM kalijum fosfata, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2. Protein je eluiran sa 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0 i onda propušten kroz sterilni filter od 0,22 μm u sterilnu kesu. Eluirani uzorak je ispitan kako bi se odredilo biološko opterećenje, koncentracija proteina i enzimska aktivnost.
[0498] Protein prečišćen na HAP je zatim propušten kroz filter za odstranjivanje virusa. Sterilisani Viosart filter (Sartorius) je prvo pripremljen ispiranjem sa 2 L 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0. Pre upotrebe, filtrirani pufer je uzorkovan pH i provodljivost. Protein prečišćen na HAP je pumpan pomoću peristaltičke pumpe kroz filter za odstranjivanje virusa od 20 nM. Isfiltrirani protein u 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0 je propušten kroz finalni filter od 0,22 μm u sterilnu kesu. U uzorku koji je bio isfiltriran da bi se odstranili virusi određena je koncentracija proteina, enzimska aktivnost, i ispitan sadržaj oligosaharida, monosaharida i sijalinske kiseline. Uzorak je takođe bio ispitan na prisustvo nečistoća povezanih sa postupkom.
Primer 5
Priprema PEG-ilovane rHuPH20
[0499] U ovom primeru, rHuPH20 je PEG-ilovana reakcijom enzima sa linearnim N-hidroksisukcinimidil estrom metoksi poli(etilen glikol) butanske kiseline (mPEG-SBA-30K).
A. Priprema mPEG-SBA-30K
[0500] U cilju dobijanja PEGPH20, rHuPH20 (koja ima veličinu od približno 60 KDa) je kovalentno konjugovana sa linearnim N-hidroksisukcinimidil estrom metoksi poli(etilen glikol) butanske kiseline (mPEG-SBA-30K), koji ima približnu molekulsku težinu od 30 kDa. Struktura mPEG-SBA je prikazana ispod, pri čemu je n ≈ 681.
[0501] Postupci korišćeni za pripremu mPEG-SBA-30K koji su bili upotrebljeni za PEG-ilaciju rHuPH20 su opisani, na primer, u SAD patentu br. 5,672,662. Ukratko, mPEG-SBA-30K je napravljena prema sledećoj proceduri:
Rastvor etil malonata (2 ekvivalenta) rastvorenog u dioksanu je ukapan u natrijum hidrid (2 ekvivalenta) i toluen pod atmosferom azota. mPEG metan sulfonat (1 ekvivalent, MT 30 kDa, Shearwater) je rastvoren u toluenu, pa je dodat gornjoj smeši. Rezultujuća smeša je refluksovana približno 18 časova. Reakciona smeša je koncentrovana na polovinu polazne zapremine, ekstrahovana 10% vodenim rastvorom NaCl, i ekstrahovana 1% vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline, pa su vodeni ekstrakti sjedinjeni. Sakupljeni vodeni slojevi su ekstrahovani dihlorometanom (3 puta), a organski sloj je osušen sa magnezijum sulfatom, a zatim je isfiltriran i uparen do suvog. Rezultujući ostatak je rastvoren u 1N natrijum hidroksidu koji je sadržao natrijum hlorid, pa je smeša mešana 1 čas. pH smeše je podešen na približno 3 dodavanjem 6N hlorovodonične kiseline. Smeša je ekstrahovana dihlorometanom (2 puta).
[0502] Organski sloj je osušen preko magnezijum sulfata, filtriran, koncentrovan je i izliven u hladni dietil etar. Talog je sakupljen filtracijom, pa je osušen pod vakuumom. Rezultujuće jedinjenje je rastvoreno u dioksanu, a zatim je refluksovano 8 časova i zatim koncentrovano do suvog. Rezultujući ostatak je rastvoren u vodi i ekstrahovan dihlorometanom (2 puta), osušen preko magnezijum sulfata, i rastvor je koncentrovan rotacionim uparivačem i zatim je izliven u hladni dietil etar. Talog je sakupljen filtracijom i osušen pod vakuumom. Rezultujuće jedinjenje (1 ekvivalent) je rastvoreno u dihlorometanu, pa mu je dodat N-hidroksisukcinimid (2.1 ekvivalent). Rastvor je ohlađen do 0 °C, a zatim je ukapan rastvor dicikloheksilkarbodiimida (2.1 ekvivalent) u dihlorometanu. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi približno 18 časova. Reakciona smeša je isfiltrirana, koncentrovana i staložena je u dietil etru. Talog je sakupljen filtracijom i osušen pod vakuumom da bi se dobio prah mPEGSBA-30K koji je zatim zamrznut na ≤ -15°C.
B. Konjugacija mPEG-SBA-30K sa rHuPH20
[0503] Da bi se napravila PEGPH20, mPEG-SBA-30K je kuplovan sa amino grupom, odnosno grupama rHuPH20 kovalentnom konjugacijom, čime su nastale stabilne amidne veze između rHuPH20 i mPEG, kao što je prikazano ispod, pri čemu je n ≈ 681.
[0504] Pre konjugacije, prečišćeni protein rHuPH20 u ukupnoj zapremini napravljen u primeru 4B koncentrovan je do 10 mg/mL, upotrebom polietarsulfonskih (PES) kaseta za tangencijalnu filtraciju (TFF) (Sartorius) od 10 kDa, filtracione površine od 0.2 m<2>, i pufer je izmenjen na 70 mM kalijum fosfat na pH 7.2. Koncentrovani protein je skladišten na 2-8°C do upotrebe.
[0505] Za konjugaciju rHuPH20, mPEG-SBA-30K (Nektar) je odmrznut na sobnoj temperaturi u mraku tokom ne više od 2 časa. U zavisnosti od veličine serije, sterilni štapić za mešanje od 3 inča je stavljen u Erlenmajer bocu od 1 ili 3 litra i dodat je protein rHuPH20 sa promenjenim puferom. Pet grama suvog praha mPEG-SBA-30K na gram rHuPH20 (molarni odnos mPEG-SBA-30K: rHuPH20 iznosi 10:1) je dodato u bocu pod vakuumskim digestorom i smeša je mešana 10 minuta ili dok se mPEG-SBA-30K ne rastvori u potpunosti. Brzina mešanja je podešena tako da se mućkanje odvija bez stvaranja pene.
[0506] Rastvor je zatim filtriran u laminarnoj komori klase 100 pumpanjem rastvora, pomoću peristaltičke pumpe, kroz polistirensku, celulozno-acetatnu filter kapsulu (Corning 50 mL Tubetop filter) od 0.22 µm u novu Erlenmajer bocu od 1 ili 3 litra koja sadrži sterilni štapić za mešanje od 3 inča. Zapremina reakcione smeše PEGPH20 je određena prema masi (gustina od 1 g/mL) i filteru od 0.22 µm koji je korišćen za filtraciju ispitana je celovitost nakon upotrebe.
[0507] Smeša je zatim stavljena ploču mešalice na 2-8°C i mešana 20±1 čas u mraku. Brzina mešanja je ponovo podešena tako da se mućkanje odvija bez stvaranja pene. Cela Erlenmajer boca je umotana u foliju da bi se rastvor zaštitio od svetla. Nakon mešanja, reakcija je ugašena dodavanjem 1M glicina do finalne koncentracije od 25 mM. Iz boce su uzeti uzorci za ispitivanje pH i provodljivosti. Za prečišćavanje na Q sefarozi, pH i provodljivost su zatim podešeni dodavanjem rastvoru 5 mM Tris Base (5.65 L/L) i 5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH 8.0 (13.35 L/L).
[0508] Jonoizmenjivačka kolona sa QFF sefarozom (GE Healthcare) (visina = 21.5-24.0 cm, prečnik = 20 cm) je pripremljena uravnotežavanjem sa 5 zapremina kolone (36 L) 5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH 8.0. Konjugovani proizvod je nanet na QFF kolonu pri protoku od 95 cm/čas. Kolona je zatim oprana sa 11 L ekvilibracionog pufera (5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH 8.0) pri protoku od 95 cm/čas nakon čega je oprana sa 25 L ekvilibracionog pufera pri protoku od 268 cm/čas. Proteinski proizvod je zatim eluiran sa 5mM Tris, 130 mM NaCl, pH 8.0 pri protoku od 268 cm/čas. Rezultujuća prečišćena PEGPH20 je koncentrovana do 3.5 mg/mL, korišćenjem polietarsulfonskih (PES) kaseta za tangencijalnu filtraciju od 30 kDa (Sartorius) filtracione površine od 0.2 m<2>, i izmenom pufera na 10 mM histidin, 130 mM NaCl na pH 6.5. U dobijenom materijalu ispitana je enzimska aktivnost kao što je opisano u primeru 6 u nastavku. Materijal PEG-ilovane rHuPH20 u koncentraciji od 3.5 mg/mL (finalna enzimska aktivnost 140000 U/mL) je napunjen, u zapreminama po 3 mL, u staklene bočice od 5 mL sa silikoniziranim gumenim zapušačem od bromobutila i aluminijumskom zapečaćenom kapicom, i zamrznut (zamrznut preko noći u zamrzivaču na -80°C, a zatim stavljen u zamrzivač na -20°C za duže skladištenje). PEG-ilovana rHuHP20 je sadržala približno 4.5 molova PEG po molu rHuPH20.
Primer 6
Određivanje hijaluronidazne aktivnosti rastvorljive rHuPH20
[0509] Hijaluronidazna aktivnost rastvorljive rHuPH20 u uzorcima kao što su ćelijske kulture, plazma, frakcije posle prečišćavanja i prečišćeni rastvori određivana je korišćenjem turbidimetrijskog testa, koji se zasniva na obrazovanju nerastvorljivog taloga kada se hijaluronska kiselina veže za serum albumin, ili testa sa biotinilisanom hijaluronskom kiselinom u prisustvu supstrata, koji meri količinu enzimski aktivne rHuPH20 ili PEGPH20 digestijom supstrata biotinilisane hijaluronske kiseline (bHA) koja je nekovalentno vezana za plastične mikrotitracione ploče.
A. Mikroturbidimetrijski test
[0510] Hijaluronidazna aktivnost rastvorljive rHuPH20 određena je inkubacijom rastvorljive rHuPH20 sa natrijum hijaluronatom (hijaluronska kiselina) tokom zadatog perioda vremena (10 minuta), a zatim taloženjem nerazgrađenog natrijum hijaluronata uz dodatak zakišeljenog serumskog albumina. Turbiditet rezultujućeg uzorka meren je na 640 nm posle perioda razvijanja od 30 minuta. Smanjenje turbiditeta koje nastaje usled enzimske aktivnosti na supstratu natrijum hijaluronata je mera hijaluronidazne aktivnosti rastvorljive rHuPH20. Metod je izveden korišćenjem kalibracione krive koja je generisana sa razređenjima radnog referentnog standarda za rastvorljivu rHuPH20, a merenja aktivnosti uzoraka su vršena u odnosu na ovu kalibracionu krivu.
[0511] Razređenja uzorka su pripremljena u rastvoru za razređivanje enzima. Rastvor za razređivanje enzima je pripremljen rastvaranjem 33.0 ± 0,05 mg hidrolizovanog želatina u 25.0 mL 50 mM PIPES reakcionog pufera (140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) i 25.0 mL sterilne vode za injekcije (SWFI), i razređivanjem 0.2 mL 25% buminatnog rastvora u smeši, a zatim vrtloženjem tokom 30 sekundi. Rastvor je pripreman u okviru 2 časa pre upotrebe i čuvan je na ledu sve do upotrebe. Uzorci su bili razređeni na procenjenih 1-2 U/mL. Generalno, maksimalno razređenje po koraku nije prelazilo 1:100, a početna veličina uzorka za prvo razređivanje nije bila manja od 20 μL. Minimalne zapremine uzorka potrebne za izvođenje testa su bile kao što sledi: procesni uzorci, FPLC frakcije: 80 μL; supernatanti kultura tkiva: 1 mL; koncentrovani materijal 80 μL; prečišćeni materijal ili materijal u finalnom koraku: 80 μL. Razređenja su napravljena u triplikatu u ploči sa 96 bunarčića sa malim vezivanjem proteina i 30 μL svakog razređivanja je preneto u Optilux ploče sa crnim/providnim dnom (BD BioSciences).
[0512] Razređenja poznate rastvorljive rHuPH20 u koncentraciji od 2.5 U/mL su pripremljena u rastvoru za razređivanje enzima da bi se generisala standardna kriva i dodata su u Optilux ploču u triplikatu. Razređenja su obuhvatala 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL, i 2.5 U/mL. Bunarčići koji su služili kao "slepa proba za reagens" koji su sadržali 60 μL rastvora za razređivanje enzima bili su uključeni na ploči kao negativna kontrola. Ploča je onda pokrivena i zagrevana na grejnom bloku tokom 5 minuta na 37°C. Poklopac je zatim uklonjen, pa je ploča bila protresana 10 sekundi. Posle protresanja, ploča je vraćena na grejni blok, pa je u uređaj MULTIDROP 384 Liquid Handling Device dodat vreli rastvor 0.25mg/mL natrijum hijaluronata (pripremljen rastvaranjem 100 mg natrijum hijaluronata (LifeCore Biomedical) u 20.0 mL SWFI. Ovo je bilo mešano blagim okretanjem i/ili ljuljanjem na 2-8°C tokom 2-4 časa, ili do potpunog rastvaranja). Reakciona ploča je preneta u MULTIDROP 384, pa je reakcija inicirana pritiskanjem dugmeta za startovanje da bi se u svaku ćeliju raspodelilo po 30 μL natrijum hijaluronata. Ploča je zatim uklonjena iz MULTIDROP 384 i protresana 10 sekundi pre nego što je preneta do grejnog bloka sa zamenjenim poklopcem ploče. Ploča je bila inkubirana 10 minuta na 37°C.
[0513] MULTIDROP 384 je pripremljen za zaustavljanje reakcije stavljanjem u njega radnog rastvora seruma i promenom podešene zapremine na 240 μL (25 mL stok rastvora seruma [1 zapremina konjskog seruma (Sigma) je razređena sa 9 zapremina 500 mM acetatnog puferskog rastvora, pa je pH bio podešen na 3.1 sa hlorovodoničnom kiselinom] u 75 mL 500 mM acetatnog puferskog rastvora). Ploča je bila uklonjena iz grejnog bloka, stavljena na MULTIDROP 384, i 240 μL radnog rastvora seruma je raspodeljeno u bunarčiće. Ploča je uklonjena i protresana na čitaču ploča 10 sekundi. Posle još 15 minuta, izmeren je turbiditet uzoraka na 640 nm i hijaluronidazna aktivnost (u U/mL) svakog uzorka je određena putem poređenja sa standardnom krivom.
[0514] Specifična aktivnost (jedinica/mg) je izračunata deljenjem hijaluronidazne aktivnosti (U/ml) sa koncentracijom proteina (mg/mL).
B. Test sa biotinilisanim hijaluronanom
[0515] Test sa biotinilisanom hijaluronskom kiselinom meri količinu enzimski aktivne rHuPH20 ili PEGPH20 u biološkim uzorcima digestijom supstrata biotinilisane hijaluronske kiseline (bHA) velike molekulske dužine (∼ 1.2 megadaltona) koja je nekovalentno vezana za plastične mikrotitarske ploče sa više bunarčića. rHuPH20 ili PEGPH20 u standardima i uzorcima su ostavljene da se inkubiraju u ploči obloženoj sa b-HA na 37°C. Posle niza pranja, preostala neisečena/vezana b-HA se tretira konjugatom streptavidin-peroksidaza rena (SA-HRP). Reakcija između imobilizovanog SA-HRP i hromogenog supstrata, 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), proizvodi plavo obojeni rastvor. Posle zaustavljanja reakcije kiselinom, obrazovanje rastvorljivog žutog proizvoda reakcije se određuje očitavanjem apsorbance na 450 nm korišćenjem spektrofotometra za mikrotitar ploče. Smanjenje apsorbance na 450 nm nastalo enzimskom aktivnošću nad supstratom biotinilisanom hijaluronskom kiselinom (b-HA) predstavlja meru hijaluronidazne aktivnosti rastvorljive rHuPH20. Postupak se izvodi upotrebom kalibracione krive konstruisane prema razblaženjima referentnog standarda rastvorljive rHuPH20 ili PEGPH20, i merenja aktivnosti uzorka su urađena u odnosu na ovu kalibracionu krivu.
[0516] Razblaženja uzorka i kalibrator su pripremljeni u razblaživaču za test. Razblaživač za test je pripremljen dodavanjem 1% zapr./zapr. sakupljene plazme (iz odgovarajućih vrsta) u 0.1% (tež./zapr.) BSA u HEPES, pH 7.4. Ovaj rastvor je pripreman dnevno i skladišten na 2-8°C. U zavisnosti od vrste kao i od očekivanog nivoa hijaluronidaze, pripremano je jedno ili višestruka razblaženja da bi se osiguralo da najmanje jedno razblaženje uzorka bude u opsegu kalibracione krive. Da bi se odabralo razblaženje, odnosno razblaženja ispitivanog uzorka, korišćene su poznate informacije o primenjenoj dozi hijaluronidaze, putu primene, približnoj zapremini plazme date vrste i vremenskoj tački za procenu nivoa hijaluronidazne aktivnosti. Svako razblaženje uzorka je promešano čim je napravljeno kratkim pulsnim vrtloženjem i nastavci pipete su menjani između svakog razblaženja. Uopšteno, razblaženja su počinjala sa polaznih 50 ili 100 puta, praćena dodatnim serijskim razblaženjima. Kalibraciona kriva sa sedam tačaka za rHuPH20 ili PEGPH20 (u zavisnosti od primenjenog tretmana) pripremljena je u opsegu koncentracija od 0.004 do 3.0 U/mL za rHuPH20 i od 0.037 do 27 U/mL za PEGPH20. Sto mikrolitara (100 µL) svakog razblaženja ispitivanog uzorka i tačke kalibracione krive su nanete u triplikatu u bunarčiće mikrotitar ploče sa 96 bunarčića (Immulon 4HBX, Thermo) koja je prethodno obložena sa 100 mL po bunarčiću b-HA u koncentraciji od 0.1 mg/mL i blokirana sa 250 µL 1.0% (tež./zapr.) goveđeg serum albumina u PBS. Ploča/ploče su pokrivene adhezivnim poklopcem za ploče i inkubirane na 37°C približno 90 minuta. Na kraju inkubacionog perioda, adhezivni poklopac je uklonjen sa ploče, uzorci su aspirirani i ploča je oprana pet (5) puta sa 300 µL po bunarčiću puferom za pranje (10 mM fosfatni pufer, 2.7 mM kalijum hlorid, 137 mM natrijum hlorid, pH 7.4, sa 0.05% (zapr./zapr.) Tween 20, PBST) korišćenjem uređaja za automatsko pranje ploča (BioTek ELx405 Select CW, program ’4HBX1’). Sto mikrolitara radnog rastvora streptavidin-HRP konjugata [streptavidin-HRP konjugat (1:5 000 zapr./zapr.) u 20 mM Tris-HCl, 137 mM natrijum hlorida, 0.025% (zapr./zapr.) Tween 20, 0.1% (tež./zapr.) goveđi serum albumin] je dodato po bunarčiću. Ploča je čvrsto zatvorena i ostavljena da se inkubira na sobnoj temperaturi približno 60 minuta bez protresanja i zaštićena od svetla. Na kraju inkubacionog perioda, adhezivni poklopac je uklonjen sa ploče, uzorci su aspirirani i ploča je oprana pet (5) puta sa 300 µL po bunarčiću puferom za pranje kao što je gore opisano. U svaki bunarčić je dodat rastvor TMB (na sobnoj temperaturi) i ploča je ostavljena da se inkubira zaštićena od svetla približno pet (5) minuta na sobnoj temperaturi. TMB rastvor za zaustavljanje reakcije (KPL, kataloški br.50-85-06) je zatim dodat u količini od 100 µL po bunarčiću. Apsorbanca svakog bunarčića na 450 nm je određena upotrebom spektrofotometra za mikrotitar ploče. Kalibraciona kriva za svaku ploču modelovana je pomoću aproksimacije 4-parametarske logističke krive. Hijaluronidazna aktivnost za svaku nepoznatu je izračunata interpolacijom iz kalibracione krive, korigovana za faktor razblaženja uzorka, i prikazana u U/mL.
Primer 7
Dejstvo lečenja sa PEGPH20 u modelu tumora sa visokim nivoom peritumoralnog hijaluronana (HA)
[0517] Za procenu dejstva PEGPH20 na visoke nivoe peritumoralnog HA, stvorena je tumorska ćelijska linija BXPC3-Has3 da bi se uspostavio mišji model ksenograftskog HA<high>tumora. BxPC3 ćelije (ATCC kat. br. CRL-1687) su kultivisane pod standardnim uslovima kultivacije korišćenjem kompletnog medijuma RPMI. Za ekspresiju transkripta cDNK humane hijaluronan sintaze 3 (navedene u SEQ ID NO: 212) napravljen je lentivirusni sistem. Stvoreni lentivirusni vektor koji eksprimira hHAS3 cDNK označen je kao pLV-EF1ahHAS3-IRES-Hyg i prikazan je u SEQ ID NO:213. Stabilna ćelijska linija BX-PC3-Has3 je stvorena virusnom infekcijom sa pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg, praćena selekcijom sa higromicinom. U svim eksperimentima su korišćene ćelije koje su inficirane u svrhu prekomerne ekspresije hHAS3.
[0518] Za potvrdu nivoa HA, intenzitet boje u isečcima tumora meren je pomoću programa Aperio spectrum. Tumor je ocenjen kao HAHigh pri jakom bojenju HA preko 25% isečka tumora; kao HAModerate pri jakom bojenju HA između 10 i 25% isečka tumora; kao HA<Low>pri jakom bojenju HA ispod 10% isečka tumora.
[0519] Za stvaranje tumora visokog pritiska, NCr (nu/nu) miševi starosti 5 do 6 nedelja i težine između 20-25 g su inokulisani ćelijama BxPC-3-Has3 (5 x 10<6>/50 µL) u blizini periosteuma desne tibije. Dužina (L) i širina (W) mase solidnog tumora su merene kaliperom i zapremina tumora (TV) je izračunata kao: (L x W<2>)/2. Kada je zapremina tumora dostigla približno 1500 do 2000 mm<3>u prečniku, miševi su podeljeni u dve tretmanske grupe: (1) BxPC3 HAhigh , kontrola vehikuluma ili (2) BxPC3 HAhigh , PEGPH20.
[0520] Životinjama je dat ili vehikulum (10 mM histidin, pH 6.5, 130 mM NaCl) ili PEGPH20 (4.5 mg/kg) na 0 časova i ponovo na 42 časa. Sa prvim tretmanom sa PEGPH20 ili kontrolom vehikuluma (na 48 časova pre žrtvovanja, tj. na t=0 časova), životinje su takođe tretirane sa 240 mg/kg gemcitabina, intraperitonealno, i 10 mg/kg paklitaksela (Abraxane®), intravenski. Dva časa pre žrtvovanja (46 časova), životinje su tretirane intraperitonealno sa HYPOXYPROBE™ (pimonidazol hidrohlorid; Chemicon International, Temecula, CA) u koncentraciji od 60 mg/kg i takođe sa 0.5 mL BrdU. Pet minuta pre žrtvovanja (48 časova), životinje su tretirane intravenski sa 75 µL 0.6 mg/mL fluorescentnog karbocijanina rastvorenog u 75% DMSO 1,1’-dioktadecil-3,3,3’,3’-tetrametilindokarbocijanin perhlorata (DiI).
[0521] Životinje su žrtvovane na 48 časova. Celi tumori su sakupljeni, tkiva ohlađena do -20°C na aluminijumskim blokovima, pokrivena medijumom za oblaganje OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA) i skladištena na -80°C do pravljenja isečaka. Krioisečci tumora su isečeni na 10 µm i obrađeni za imunohistohemiju ili mikroskopski snimljeni. Procenjeno je delovanje na vaskularnu perfuziju i hipoksiju tumora.
A. Vaskularna perfuzija
[0522] Neobojeni, sveži krioisečci su skenirani sistemom za fluorescentno mikroskopsko snimanje (sistema konfokalne vizuelizacije BD CARV II Confocal Imager, Sparks, MD; kamere Quentem 512sc (Photometrics, Tucson, AZ); sistema praćenog pomeranja po x-y osi MIV2000, i sistema MetaMorph System, Sunnyvale, CA). Za određivanje perfuzije tumora celi isečci tumora su skenirani pri uveličanju od 10x za fluorescentni signal karbocijanina (DiI) (ekscitacija 562 nm/ emisija 624 nm). Snimci su analizirani korišćenjem Image-Pro Analyzer 7.0 (Media Cybermetrics, Bethesda, MD). Određena je površina celog tumora i površina koja se pozitivno boji. Vaskularna perfuzija u svakom tumoru je izračunata kao procenat (signal) dela koji se pozitivno boji od celog isečka tumora.
[0523] Rezultati su navedeni u tabeli 8. Rezultati pokazuju da perfuzija bojom posredovana lečenjem sa PEG-PH20 u BxPC3-HAS3 tumorima, sa značajnim povećanjem perfuzije krvnih sudova u tumorima miševa tretiranih sa PEGPH20 nasuprot tumorima koji su tretirani kontrolom. Kao što je prikazano u tabeli 8, životinje tretirane sa PEGPH20 pokazale su povećanje vaskularne perfuzije sa srednjom površinom od 7.24 ± 1.78, što predstavlja povećanje od 116.9% u odnosu na kontrolne životinje.
B. Hipoksija
[0524] Hipoksični regioni isečaka tumora iz tretiranih životinja su upoređeni vizuelizacijom pimonidazol hidrohlorida (HYPOXYPROBE™). Konkretno, nakon žrtvovanja, krioisečci koji su blokirani kozjim serumom za nespecifično bojenje, ispitani su tokom 1 časa na sobnoj temperaturi dodatkom razblaženja 1:50 anti-pimonidazol antitela (Hypoxyprobe™-1 Mab-1, mišji IgG1; Chemicon International, Temecula, CA) za detekciju adukata pimonidazola ili razblaženja 1:100 anti-CD31 antitela (pacov, BD Pharmingen, San Diego, CA) za detekciju endotelijalnih ćelija. Posle pranja u cilju uklanjanja primarnog reagensa, kao sekundarni reagens korišćeno je ili FITC kozje anti-mišje sekundarno antitelo (za vizuelizaciju Hypoxyprobe™-1 Mab-1, razblaženje 1:100; Vector Labs Burlingame, CA, USA), ili Texas Red kozje anti-pacovsko sekundarno antitelo (za vizuelizaciju CD31 endotelijalnih ćelija; razblaženje 1:100; Vector Labs Burlingame, CA, USA) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Isečci su snimljeni upotrebom sistema vizuelizacije Image-Pro Analyzer 7.0 (Media Cybermetrics, Bethesda, MD). Za vizuelizaciju CD31, talasna dužina ekscitacije bila je 562 nm, a talasna dužina emisije 624 nm. Za vizuelizaciju pimonidazol hidrohlorida (HYPOXYPROBE™), talasna dužina ekscitacije bila je 490 nm, a talasna dužina emisije 520 nm.
[0525] Rezultati su navedeni u tabeli 9. Rezultati pokazuju da PEGPH20, koja posreduje u uklanjanju HA, rezultuje u rezultuje u smanjenoj hipoksiji u BxPC3-Has3 tumorima. Kontrolne životinje su imale srednji procenat oblasti hipoksije u odnosu na celu površinu isečka tumora od 3.98 ± 2.70%. Životinje tretirane sa PEGPH20 su imale smanjenu oblast hipoksije u tumorima sa srednjom površinom od 0.86 ± 1.07, što predstavlja smanjenje od 78% u odnosu na kontrolne životinje.
Primer 8
Dejstvo kombinovanog lečenja sa PEGPH20 i nab-paklitakselom na modelu tumora kancera dojke negativnog po tri markera, sa visokim nivoom peritumoralnog hijaluronana (HA)
[0526] Stvorena je MDA-MB-468 trostruko negativna ćelijska linija kancera dojke (TNBC) koja prekomerno eksprimira transkript cDNK hHAS3A (SEQ ID NO: 212) i na taj način je uspostavljen model HAhigh TNBC. MDA-MB-468 ćelije (ATCC kat. br. HTB-132), kultivisane pod standardnim uslovima kultivacije upotrebom kompletnog RPMI medijuma, inficirane su sa lentivirusnim vektorom pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg (SEQ ID NO:213) koji eksprimira cDNK hHAS3, koji je gore opisan, nakon čega je urađena selekcija higromicinom da bi nastala stabilna ćelijska linija MDA-MB-468/HAS3 koja eksprimira hHAS3.
[0527] Ćelije MDA-MB-468/HAS3, suspendovane u RPMI su injektovane u gole miševe. Zapremina tumora je merena kao što je gore opisano. Na dan 17, kada su tumori dostigli zapreminu od približno 300 mm<3>, životinje su podeljene u 6 tretmanskih grupa, kojima je dato 1) vehikulum; 2) 1 mg/kg nab-paklitaksela; 3) 3 mg/kg nab-paklitaksela; 4) 10 mg/kg nab-paklitaksela; 5) 4.5 mg/kg PEGPH20; ili 6) 1 mg/kg nab-paklitaksela i 4.5 mg/kg PEG20 intravenski. Zapremine tumora su merene svakih 3 do 4 dana tokom 45 dana.
[0528] Rezultati su navedeni na slici 6. Životinje u tretmanskoj grupi 1, koje su primale samo vehikulum, ispoljile su progresivan rast tumora tokom trajanja ispitivanja. Poslednjeg dana ispitivanja (dan 62), prosečna veličina tumora bila je nešto veća od dvostruke zapremine. Tumori životinja u tretmanskim grupama 2 i 3, koji su primali nab-paklitaksel u dozi od 1 ili 3 mg/kg ispoljili su početno smanjenje (približno 30%) zapremine tumora u danima 17-27 posle implantacije ćelija (0-10 dana posle tretmana), ali nakon toga se rast tumora nastavio sa smanjenom brzinom u poređenju sa kontrolnim životinjama koje su primale vehikulum. Poslednjeg dana ispitivanja, prosečna zapremina tumora bila je odmah ispod dvostruke polazne zapremine.
[0529] Obrazac rasta tumora primećen kod životinja koje su tretirane sa PEGPH20 (grupa 5) bio je sličan onome kod grupa 2 i 3, ali je prosečna veličina tumora za grupu 5 bila neznatno manja od one kod grupa 2 i 3 poslednjeg dana. Prosečna veličina tumora kod životinja u grupi 4, koje su primile 10 mg/kg nab-paklitaksela, pratila je isti trend kao kod grupa 2, 3, i 5 prvih 10 dana posle tretmana ( dani 17-27 ispitivanja), ali je zadržala smanjenu zapreminu dodatnih 11 dana, a zatim se progresivno smanjena tokom ostatka ispitivanja dodatnih 30%, da bi dostigla prosečnu zapreminu tumora na kraju ispitivanja koja je iznosila jednu trećinu prosečne početne zapremine tumora.
[0530] Kombinacija 1 mg/kg nab-paklitaksela i PEGPH20 (grupa 6) rezultovala je u suštinskom smanjenju prosečne zapremine tumora. Ovi rezultati pokazuju da postoje sinergistička dejstva pri lečenju kombinacijom nab-paklitaksela i PEGPH20, što rezultuje u značajnom poboljšanju efikasnosti inhibicije rasta tumora u poređenju sa pojedinačnim tretmanima sa istom dozom. Kombinovana terapija rezultuje u sličnom smanjenju zapremine tumora kao ona zapažena kod životinja koje primaju 10 puta veću dozu nab-paklitaksela kao pojedinačnu terapiju (10 mg/kg nab-paklitaksela (grupa 5)), koja je takođe dovela do toga da prosečna konačna zapremina tumoru iznosi približno jednu trećinu prosečne početne zapremine tumora.
[0531] Budući da će modifikacije biti očigledne stručnjacima u odgovarajućoj oblasti, predviđeno je da ovaj pronalazak bude ograničen samo obimom priloženih patentnih zahteva.
LISTA SEKVENCI
[0532]

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Kombinacija kompozicija za upotrebu u lečenju kancera pankreasa, naznačena time što kombinacija sadrži:
prvu kompoziciju koja sadrži hijaluronidazu konjugovanu sa polimerom; i
drugu kompoziciju koja sadrži taksan koji ciljno deluje na tumor, pri čemu taksan koji ciljno deluje na tumor sadrži nab-paklitaksel ili nab-docetaksel.
2. Kompozicija, koja sadrži hijaluronidazu konjugovanu sa polimerom za upotrebu u lečenju kancera pankreasa, naznačena time što:
hijaluronidaza se koristi sa taksanom koji ciljno deluje na tumor i primenjuje se kod subjekta istovremeno, gotovo istovremeno, odvojeno ili uzastopno sa taksanom koji ciljno deluje na tumor; i
taksan koji ciljno deluje na tumor sadrži nab-paklitaksel ili nab-docetaksel.
3. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što je taksan koji ciljno deluje na tumor nab-paklitaksel.
4. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time što:
kompozicija/kompozicije je/su formulisana/formulisane za direktnu primenu; koncentracija hijaluronidaze je dovoljna za razgrađivanje hijaluronana povezanog sa tumorom; i
koncentracija taksana koji ciljno deluje na tumor je dovoljna za postizanje dostave taksana unutar tumora.
5. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koja dodatno sadrži kompoziciju koja sadrži nukleozidni analog koji je hemioterapijsko sredstvo.
6. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što je nukleozidni analog odabran između purinskog ili pirimidinskog nukleozidnog analoga, ili njihovog proleka, koji je hemioterapijsko sredstvo.
7. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što: kompozicija/kompozicije je/su formulisana/formulisane za direktnu primenu; i koncentracija nukleozidnog analoga je dovoljna za postizanje dostave unutar tumora.
8. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5-7, naznačena time što:
nukleozidni analog ili njegov prolek je obezbeđen odvojeno od hijaluronidaze i taksana koji ciljno deluje na tumor; ili
nukleozidni analog ili njegov prolek predstavlja koformulaciju sa hijaluronidazom; ili nukleozidni analog ili njegov prolek predstavlja koformulaciju sa taksanom koji ciljno deluje na tumor; ili
nukleozidni analog ili njegov prolek predstavlja koformulaciju sa hijaluronidazom i taksanom, koji ciljno deluje na tumor.
9. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačena time što je/su kompozicija/kompozicije formulisana/formulisane za jednodoznu ili višedoznu primenu.
10. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačena time što hijaluronidazna kompozicija sadrži između 50 jedinica hijaluronidazne aktivnosti (U)/ml i 15 000 U/mL, 10 U/mL i 500 U/mL, 1000 U/mL i 15 000 U/mL, 100 U/mL i 5000 U/mL, 500 U/mL i 5000 U/mL ili 100 U/mL i 400 U/ml.
11. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačena time što je hijaluronidaza PH20 ili njen skraćeni oblik kome nedostaje C-terminalno mesto vezivanja glikozilfosfatidilinozitola (GPI) ili deo mesta vezivanja GPI.
12. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačena time što:
hijaluronidaza je skraćena PH20;
hijaluronidaza je aktivna u neutralnoj sredini i rastvorljiva; i
skraćena PH20 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1, ili sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži najmanje aminokiseline 36-464 sekvence SEQ ID NO:1 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
13. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačena time što je hijaluronidaza PH20 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 4-9, 47, 48, 150-170 i 183-189, ili aminokiselinsku sekvencu koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOS: 4-9, 47, 48, 150-170 i 183-189 i zadržava hijaluronidaznu aktivnost.
14. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, naznačena time što kompozicija taksana koji ciljno deluje na tumor sadrži koncentraciju taksana koji ciljno deluje na tumor koja iznosi između 0.01 mg taksana/mL i 100 mg/mL, kao što je 1 mg/mL i 50 mg/ml, 2.5 mg/mL i 25 mg/mL, 5 mg/mL i 15 mg/mL ili 10 mg/mL i 100 mg/mL.
15. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5-14, naznačena time što je nukleozidni analog odabran između fluoropirimidin 5-fluorouracila, 5-fluoro-2’-deoksicitidina, citarabina, gemcitabina, troksacitabina, decitabina, azacitidina, pseudoizocitidina, zebularina, ancitabina, fazarabina, 6-azacitidina, kapecitabina, N4-oktadecil-citarabina, citarabina elaidinske kiseline, fludarabina, kladribina, klofarabina, nelarabina, forodesina i pentostatina, ili njihovih derivata.
16. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5-14, naznačena time što je nukleozidni analog gemcitabin.
17. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5-15, naznačena time što je nukleozidni analog supstrat za nukleozid deaminazu, i nukleozid deaminaza je adenozin deaminaza ili citidin deaminaza.
18. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5-17, naznačena time što kompozicija nukleozidnog analoga sadrži koncentraciju nukleozidnog analoga koja iznosi između 1 mg nukleozidnog analoga/ml i 500 mg/ml, 5 mg/mL i 100 mg/ml, 10 mg/mL i 50 mg/mL, 25 mg/mL i 200 mg/mL ili 20 mg/mL i 100 mg/mL.
19. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-18, koja dodatno sadrži kompoziciju koja sadrži glukokortikoid.
20. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19, naznačena time što je polimer polialkilen glikol, dekstran, pululan ili celuloza.
21. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačena time što je polialkilen glikol odabran između polietilen glikola (PEG) i metoksipolietilen glikola (mPEG).
22. Kombinacija ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-21 koja je upakovana kao kit i opciono uključuje uputstvo za upotrebu.
23. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što su hijaluronidaza i taksan koji ciljno deluje na tumor koformulisani za primenu u jednoj kompoziciji.
RS20180852A 2012-04-04 2013-03-15 Kombinovana terapija sa hijaluronidazom i taksanom koji ciljno deluje na tumor RS57449B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261686429P 2012-04-04 2012-04-04
US201261714719P 2012-10-16 2012-10-16
EP13715069.4A EP2833905B1 (en) 2012-04-04 2013-03-15 Combination therapy with hyaluronidase and a tumor-targeted taxane
PCT/US2013/032684 WO2013151774A1 (en) 2012-04-04 2013-03-15 Combination therapy with an anti - hyaluronan agent and a tumor - targeted taxane

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57449B1 true RS57449B1 (sr) 2018-09-28

Family

ID=48050937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180852A RS57449B1 (sr) 2012-04-04 2013-03-15 Kombinovana terapija sa hijaluronidazom i taksanom koji ciljno deluje na tumor

Country Status (27)

Country Link
US (3) US9913822B2 (sr)
EP (1) EP2833905B1 (sr)
JP (4) JP6042527B2 (sr)
KR (2) KR101809858B1 (sr)
CN (2) CN108686203A (sr)
AU (1) AU2013243873B2 (sr)
BR (1) BR112014024848A2 (sr)
CA (3) CA2869460C (sr)
CY (1) CY1120523T1 (sr)
DK (1) DK2833905T3 (sr)
EA (1) EA031986B1 (sr)
ES (1) ES2673093T3 (sr)
HR (1) HRP20181187T1 (sr)
HU (1) HUE038744T2 (sr)
IL (2) IL234703B (sr)
LT (1) LT2833905T (sr)
MX (2) MX360092B (sr)
NZ (1) NZ700073A (sr)
PL (1) PL2833905T3 (sr)
PT (1) PT2833905T (sr)
RS (1) RS57449B1 (sr)
SG (1) SG11201406340QA (sr)
SI (1) SI2833905T1 (sr)
SM (1) SMT201800366T1 (sr)
TR (1) TR201809231T4 (sr)
WO (1) WO2013151774A1 (sr)
ZA (1) ZA201406969B (sr)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004060403A2 (en) 2003-01-06 2004-07-22 Angiochem Inc. Aprotinin and anglos as carriers across the blood-brain barrier
NZ542873A (en) 2003-03-05 2008-07-31 Halozyme Inc Soluble, neutral-active hyaluronidase activity glycoprotein (sHASEGP) that is produced with high yield in a mammalian expression system by introducing nucleic acids that lack a narrow region encoding amino acids in the carboxy terminus of the human PH20 cDNA
WO2015081096A2 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor-targeted nanoparticles for enhanced transcytosis mediated drug delivery
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
KR20130116386A (ko) 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
CA2740316A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Angiochem Inc. Conjugates of glp-1 agonists and uses thereof
WO2010043049A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Angiochem Inc. Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
CA2745524C (en) 2008-12-05 2020-06-09 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
EA022752B1 (ru) * 2008-12-09 2016-02-29 Галозим, Инк. Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование
US8853353B2 (en) 2008-12-17 2014-10-07 Angiochem, Inc. Membrane type-1 matrix metalloprotein inhibitors and uses thereof
MX2011011023A (es) 2009-04-20 2012-01-20 Angiochem Inc Tratamiento de cancer de ovarios usando un agente anti-cancer conjugado con un analogo de angiopep-2.
RU2012103240A (ru) 2009-07-02 2013-08-10 Ангиокем Инк. Мультимерные пептидные конъюгаты и их применение
HUE028832T2 (en) 2009-09-17 2017-01-30 Baxalta Inc Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, as well as a process for its preparation
WO2012012300A2 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
WO2013102144A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptede variants, formulations and uses thereof
CN108686203A (zh) 2012-04-04 2018-10-23 哈洛齐梅公司 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
JP2016530265A (ja) * 2013-08-12 2016-09-29 ベナロヤ リサーチ インスティテュート アット バージニア メイソン 免疫調節のための４−メチルウンベリフェロン処置
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
WO2015166986A1 (ja) 2014-04-30 2015-11-05 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物及びその製造方法
US10117886B2 (en) 2014-05-30 2018-11-06 Hao Cheng Hyaluronidase and a low density second PEG layer on the surface of therapeutic-encapsulated nanoparticles to enhance nanoparticle diffusion and circulation
PT3186281T (pt) 2014-08-28 2019-07-10 Halozyme Inc Terapia de combinação com uma enzima de degradação de hialuronano e um inibidor de pontos de verificação imunológica
CN104237500B (zh) * 2014-09-30 2016-09-28 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种透明质酸固相包被方法
CN107406506A (zh) 2014-12-04 2017-11-28 詹森生物科技公司 用于治疗急性髓系白血病的抗cd38抗体
US10947282B2 (en) 2015-01-19 2021-03-16 The Texas A & M University System Functionalized protein-based materials and their uses
EA201792546A1 (ru) 2015-05-20 2018-04-30 Янссен Байотек, Инк. Антитела к cd38 для лечения амилоидоза легких цепей и прочих cd38-положительных гематологических злокачественных опухолей
EP3307326B9 (en) 2015-06-15 2021-02-24 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis
IL256242B2 (en) 2015-06-22 2024-09-01 Janssen Biotech Inc Combination therapies for heme malignancies with anti-cd38 antibodies and survivin inhibitors
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
DK3372232T3 (da) * 2015-11-02 2021-06-07 Fujifilm Corp Tumorterapeutisk middel omfattende gemcitabinliposomsammensætning og kit
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
CA3004152C (en) 2015-11-03 2024-04-16 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-cd38 antibodies and their uses
EP3187190A1 (en) * 2015-12-31 2017-07-05 Erytech Pharma Method of treating a mammal, including human, against cancer using methionine and asparagine depletion
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
WO2017195792A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 国立大学法人熊本大学 新規なｐｅｇ修飾酵素及びそれを用いた抗がん剤デリバリー
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
IL265044B2 (en) * 2016-08-31 2025-02-01 Fujifilm Corp An antitumor preparation containing the substances nab-paclitaxel and 1-(2-deoxy-2-fluoro-4-thio-D-beta-arabinofurnosyl)cytosine, a kit containing these substances and their uses
MA50514A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Biotech Inc Méthodes de traitement du myélome multiple à haut risque
JP7450888B2 (ja) * 2017-12-20 2024-03-18 タルガジェニックス，インコーポレイテッド がんにおける免疫療法との併用タキソイドナノエマルジョン
EP3765035A4 (en) * 2018-03-16 2021-10-27 DFB Soria, LLC TOPICAL THERAPY FOR THE TREATMENT OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA (CIN) AND COLD CANCER USING TAXANE NANOPARTICLES
AU2019271132B2 (en) * 2018-05-15 2026-02-05 Translate Bio, Inc. Subcutaneous delivery of messenger RNA
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
ES2984147T3 (es) 2018-06-20 2024-10-29 Fujifilm Corp Medicamento combinado que comprende una composición liposómica de gemcitabina encapsulada y bloqueo de punto de control inmunitario
CN110960506A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 中山大学 用于治疗由线粒体功能失调引起的疾病的纳米制剂
US12491263B2 (en) 2019-05-13 2025-12-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Polymer-based implant for retinal therapy and methods of making and using the same
CN110302395B (zh) * 2019-07-18 2023-02-17 暨南大学 一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用
RU2706341C1 (ru) * 2019-07-24 2019-11-18 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАДИОЛОГИИ И ХИРУРГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ИМЕНИ АКАДЕМИКА А.М. ГРАНОВА" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ / ФГБУ "РНЦРХТ им. ак. А.М. Гранова" Минздрава России Способ лечения неоперабельной аденокарциномы головки поджелудочной железы
IL299205A (en) * 2020-07-17 2023-02-01 Geron Corp Subcutaneous telomerase inhibitor preparations and methods of using them
US12178852B2 (en) 2020-09-30 2024-12-31 Willow Laboratories, Inc. Insulin formulations and uses in infusion devices
CN112245580A (zh) * 2020-10-26 2021-01-22 深圳先进技术研究院 一种靶向载氧纳米酶制剂及其制备方法
CN116726186A (zh) * 2022-03-11 2023-09-12 四川省医学科学院·四川省人民医院 药物递送系统及其在制备抗黑色素瘤药物中的应用
EP4637716A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Halozyme, Inc. Hyaluronidase enzyme formulations for high volume administration
WO2024177927A1 (en) * 2023-02-20 2024-08-29 Lindy Biosciences, Inc. Hyaluronidase particles, compositions comprising the same and methods of making and using the same
WO2025166213A1 (en) * 2024-02-01 2025-08-07 Fulgent Pharma Llc Treatment of head and neck cancer with pharmaceutical composition comprising nanoparticles containing taxane
WO2025174913A1 (en) * 2024-02-12 2025-08-21 Prolynx Llc Locoregional therapies using slow-release conjugates
CN118931881A (zh) * 2024-09-26 2024-11-12 山东福瑞达医药集团有限公司 一种蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶、酵母工程菌及构建方法与应用

Family Cites Families (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2488564A (en) 1947-06-03 1949-11-22 Orthe Pharmaecutlcal Corp Preparation of hyaluronidase
US2488565A (en) 1947-06-04 1949-11-22 Ortho Pharma Corp Preparation of hyaluronidase
US2676139A (en) 1950-09-01 1954-04-20 American Home Prod Hyaluronidase
US2808362A (en) 1952-05-02 1957-10-01 Armour & Co Preparation of hyaluronidase
US2795529A (en) 1954-06-17 1957-06-11 American Home Prod Stabilized hyaluronidase solution containing calcium chloride
US2806815A (en) 1955-04-12 1957-09-17 Ortho Pharma Corp Stabilized hyaluronidase
GB1050899A (sr) 1963-12-22
US3539794A (en) 1967-09-12 1970-11-10 American Cyanamid Co Self-contained chemiluminescent lighting device
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
DE2012888C3 (de) 1970-03-14 1981-04-02 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Verfahren zur Herstellung von 5-Azapyrimidinnucleosiden
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
DE2757365A1 (de) 1977-12-20 1979-06-21 Schering Ag Neues verfahren zur herstellung von nucleosiden
US4526988A (en) 1983-03-10 1985-07-02 Eli Lilly And Company Difluoro antivirals and intermediate therefor
GB8322007D0 (en) 1983-08-16 1983-09-21 Wellcome Found Pharmaceutical delivery system
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5736155A (en) 1984-08-08 1998-04-07 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
EP0184365B1 (en) 1984-12-04 1993-08-04 Eli Lilly And Company Improvements in the treatment of tumors in mammals
WO1988002261A1 (fr) 1986-09-30 1988-04-07 Biochemie Gesellschaft M.B.H. Utilisation de hyaluronidase
PT86377B (pt) 1986-12-24 1990-11-20 Lilly Co Eli Processo para a preparacao de conjugados de imunoglobulinas com um difluoronucleosideo acilado
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
EP0329348B1 (en) 1988-02-16 1995-07-12 Eli Lilly And Company 2',3'-Dideoxy-2',2'-difluoronucleosides
US4942184A (en) 1988-03-07 1990-07-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Water soluble, antineoplastic derivatives of taxol
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
CA2004695C (en) 1988-12-12 1999-08-10 Rosanne Bonjouklian Phospholipid nucleosides
US4960790A (en) 1989-03-09 1990-10-02 University Of Kansas Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5015744A (en) 1989-11-14 1991-05-14 Florida State University Method for preparation of taxol using an oxazinone
WO1991015498A2 (en) 1990-04-04 1991-10-17 Nycomed Imaging As Nucleoside derivatives
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5059699A (en) 1990-08-28 1991-10-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Water soluble derivatives of taxol
WO1993010076A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 The University Of Mississippi Synthesis and optical resolution of the taxol side chain and related compounds
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
FR2687150B1 (fr) 1992-02-07 1995-04-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de derives du taxane.
US5200534A (en) 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
US5171081A (en) 1992-05-29 1992-12-15 Pita Joe W Chemiluminescent reactive vessel
US5606048A (en) 1992-06-22 1997-02-25 Eli Lilly And Company Stereoselective glycosylation process for preparing 2'-Deoxy-2', 2'-difluoronucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides
US5426183A (en) 1992-06-22 1995-06-20 Eli Lilly And Company Catalytic stereoselective glycosylation process for preparing 2'-deoxy-2',2'-difluoronucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides
US5401838A (en) 1992-06-22 1995-03-28 Eli Lilly And Company Stereoselective fusion glycosylation process for preparing 2'-deoxy-2',2'-difluoronucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides
YU43193A (sh) 1992-06-22 1997-01-08 Eli Lilly And Company 2'-deoksi-2',2'-difluoro(4-supstituisani)pirimidinski nukleozidi antivirusnog i antikancerogenog dejstva i međuproizvodi
UA41261C2 (uk) 1992-06-22 2001-09-17 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб одержання збагачених бета-аномером нуклеозидів
US5594124A (en) 1992-06-22 1997-01-14 Eli Lilly And Company Stereoselective glycosylation process for preparing 2'-Deoxy-2',2'-difluoropyrimidine nucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoropyrimidine nucleosides and intermediates thereof
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
WO1994005282A1 (en) 1992-09-04 1994-03-17 The Scripps Research Institute Water soluble taxol derivatives
US5411984A (en) 1992-10-16 1995-05-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Water soluble analogs and prodrugs of taxol
CZ292993B6 (cs) 1992-12-23 2004-01-14 Bristol-Myers Squibb Company Způsob přípravy taxanu nesoucího oxazolinový postranní řetězec a taxan tímto způsobem připravený
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US6749868B1 (en) 1993-02-22 2004-06-15 American Bioscience, Inc. Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US5439686A (en) 1993-02-22 1995-08-08 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for in vivo delivery of substantially water insoluble pharmacologically active agents and compositions useful therefor
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
GEP20002180B (en) 1994-03-31 2000-07-25 Amgen Inc Composition and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation
US5795569A (en) 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
FR2722191B1 (fr) 1994-07-08 1996-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation du trihydrate du (2r,3s)-3-tertbutoxycarbonylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate de 4-acetoxy2alpha-benzoyloxy-5beta,20epoxy-1,7beta,10beta trihydroxy-9-oxo-tax-11-en-13alpha-yle
US6093563A (en) 1994-07-08 2000-07-25 Ibex Technologies R And D, Inc. Chondroitin lyase enzymes
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5521294A (en) 1995-01-18 1996-05-28 Eli Lilly And Company 2,2-difluoro-3-carbamoyl ribose sulfonate compounds and process for the preparation of beta nucleosides
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6107332A (en) 1995-09-12 2000-08-22 The Liposome Company, Inc. Hydrolysis-promoting hydrophobic taxane derivatives
CN1304058C (zh) 1996-03-12 2007-03-14 Pg－Txl有限公司 水溶性紫杉醇产品
PT909184E (pt) 1996-07-03 2004-02-27 Upjohn Co Libertacao de farmaco para um alvo utilizando derivados de sulfonamida
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6103525A (en) 1996-10-17 2000-08-15 The Regents Of The University Of California Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that bind to human plasma hyaluronidase
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
CA2278056C (en) 1997-01-24 2006-12-12 Norsk Hydro Asa Gemcitabine derivatives
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
PT1023050E (pt) 1997-06-27 2013-12-04 Abraxis Bioscience Llc Novas formulações de agentes farmacológicos, métodos para a sua preparação e métodos para a sua utilização
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
JP4078032B2 (ja) 1998-03-12 2008-04-23 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 近位の反応性基を持つポリ（エチレングリコール）誘導体
TW466112B (en) 1998-04-14 2001-12-01 Lilly Co Eli Novel use of 2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine for immunosuppressive therapy and pharmaceutical composition comprising the same
CN1314992A (zh) 1998-07-03 2001-09-26 奈勒斯菲尔德控制有限公司 流体测量的方法和装置
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
AU773420B2 (en) 1998-12-11 2004-05-27 Medarex, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
MXPA01008699A (es) 1999-02-24 2002-06-21 Uab Research Foundation Derivados de taxano para terapia de cancer dirigida. .
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
US6376470B1 (en) 1999-09-23 2002-04-23 Enzon, Inc. Polymer conjugates of ara-C and ara-C derivatives
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1446438A2 (en) 2001-11-07 2004-08-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
EP1492523A2 (en) 2001-11-23 2005-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for identification of tumor targeting enzymes
US6982253B2 (en) 2002-06-05 2006-01-03 Supergen, Inc. Liquid formulation of decitabine and use of the same
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
CA2509365C (en) 2002-12-09 2012-08-07 American Bioscience, Inc. Compositions and methods of delivery of pharmacological agents
CA2508948A1 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
US6838569B2 (en) 2002-12-16 2005-01-04 Dabur India Limited Process for preparation of paclitaxel trihydrate and docetaxel trihydrate
BRPI0407882B1 (pt) 2003-02-26 2021-07-27 Nektar Therapeutics Composição compreendendo conjugados de polímero-porção de fator viii e seu método de fabricação
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
NZ542873A (en) 2003-03-05 2008-07-31 Halozyme Inc Soluble, neutral-active hyaluronidase activity glycoprotein (sHASEGP) that is produced with high yield in a mammalian expression system by introducing nucleic acids that lack a narrow region encoding amino acids in the carboxy terminus of the human PH20 cDNA
US20090123367A1 (en) 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7038038B2 (en) 2003-03-17 2006-05-02 Pharmion Corporation Synthesis of 5-azacytidine
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
EP2644206B1 (en) 2003-05-23 2019-04-03 Nektar Therapeutics PEG derivatives containing two PEG chains
CA2541438C (en) 2003-10-10 2013-11-26 Meditech Research Limited The modulation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
WO2005118799A1 (en) 2004-04-15 2005-12-15 Ista Pharmaceuticals, Inc. Ovine hyaluronidase
EP2407169A1 (en) 2004-04-22 2012-01-18 Celator Pharmaceuticals, Inc. Combination formulations of anthracycline agents and cytidine analogs
AU2006249235B2 (en) 2004-05-14 2010-11-11 Abraxis Bioscience, Llc Sparc and methods of use thereof
US7112687B2 (en) 2004-07-15 2006-09-26 Indena, S.P.A. Methods for obtaining paclitaxel from taxus plants
KR20070114753A (ko) 2005-02-18 2007-12-04 아브락시스 바이오사이언스 인크. 치료제의 조합 및 투여 방식, 및 조합 요법
US7250416B2 (en) 2005-03-11 2007-07-31 Supergen, Inc. Azacytosine analogs and derivatives
JP2006265117A (ja) 2005-03-22 2006-10-05 Noribumi Sawamukai Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害を目的として使用するレフルノミド
JP2006298892A (ja) 2005-04-18 2006-11-02 Glyco Japan Co Ltd 抗癌剤
LT3311805T (lt) 2005-08-31 2020-04-27 Abraxis Bioscience, Llc Kompozicijos, apimančios silpnai vandenyje tirpius farmacinius agentus ir priešmikrobinius agentus
EP3527202A1 (en) 2005-08-31 2019-08-21 Abraxis BioScience, LLC Compositions and methods for preparation of poorly water soluble drugs with increased stability
US8138361B2 (en) 2005-12-28 2012-03-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania C-10 carbamates of taxanes
US20100112077A1 (en) 2006-11-06 2010-05-06 Abraxis Bioscience, Llc Nanoparticles of paclitaxel and albumin in combination with bevacizumab against cancer
CZ2007136A3 (cs) 2007-02-20 2008-08-27 Ústav organické chemie a biochemie AV CR, v.v.i. Zpusob výroby 1-(2-deoxy-alfa-D-erythro-pentofuranosyl)-5-azacytosinu
ES2389828T3 (es) 2007-04-13 2012-11-02 Abraxis Bioscience, Inc. Composiciones que comprenden polipéptidos SPARC
CA2716925A1 (en) 2008-02-21 2010-07-15 Sun Pharma Advanced Research Company Ltd. Novel hydrazide containing taxane conjugates
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
SI4269578T1 (sl) 2008-03-06 2024-07-31 Halozyme, Inc. Sestava topne hialuronidaze
MX2010011165A (es) 2008-04-10 2011-02-22 Abraxis Bioscience Llc Composiciones de derivados de taxano hidrofobos y sus usos.
KR20130116386A (ko) 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
TW201014602A (en) 2008-07-08 2010-04-16 Abbott Lab Prostaglandin E2 binding proteins and uses thereof
EA022752B1 (ru) 2008-12-09 2016-02-29 Галозим, Инк. Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование
EP2424845A4 (en) 2009-04-27 2014-03-05 Reddys Lab Ltd Dr PREPARATION OF DECITABIN
WO2010138918A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Hyaluronidase as an adjuvant for increasing the injection volume and dispersion of large diameter synthetic membrane vesicles containing a therapeutic agent
WO2011057034A2 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Catenae: serosal cancer stem cells
TWI502004B (zh) * 2009-11-09 2015-10-01 Dow Corning 群集官能性聚有機矽氧烷之製法及其使用方法
MX2012011155A (es) 2010-03-29 2012-12-05 Abraxis Bioscience Llc Metodos para mejorar suministros de farmacos y efectividad de agentes terapeuticos.
US9221882B2 (en) 2010-05-21 2015-12-29 Technische Universitat Munchen Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses
MX347225B (es) * 2010-06-04 2017-04-19 Abraxis Bioscience Llc * Metodos de tratamiento contra el cancer pancreatico.
WO2012012300A2 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
WO2013102144A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptede variants, formulations and uses thereof
CN108686203A (zh) 2012-04-04 2018-10-23 哈洛齐梅公司 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods

Also Published As

Publication number Publication date
IL234703A0 (en) 2014-11-30
PL2833905T3 (pl) 2019-01-31
MX2014011965A (es) 2015-04-08
US10137104B2 (en) 2018-11-27
IL234703B (en) 2019-12-31
IL259977B (en) 2019-09-26
CY1120523T1 (el) 2019-07-10
IL259977A (en) 2018-12-02
CA2986512C (en) 2022-05-17
EA201401096A1 (ru) 2015-09-30
SG11201406340QA (en) 2014-11-27
KR101809858B1 (ko) 2017-12-15
TR201809231T4 (tr) 2018-07-23
WO2013151774A1 (en) 2013-10-10
EA031986B1 (ru) 2019-03-29
JP6422920B2 (ja) 2018-11-14
CA2986512A1 (en) 2013-10-10
JP2015514109A (ja) 2015-05-18
HRP20181187T1 (hr) 2018-09-21
CN108686203A (zh) 2018-10-23
US20190083449A1 (en) 2019-03-21
CA2869460C (en) 2018-05-15
ZA201406969B (en) 2020-01-29
JP2016188250A (ja) 2016-11-04
EP2833905B1 (en) 2018-05-02
MX360092B (es) 2018-10-19
US9913822B2 (en) 2018-03-13
JP2018138613A (ja) 2018-09-06
HUE038744T2 (hu) 2018-11-28
JP2019199479A (ja) 2019-11-21
JP6042527B2 (ja) 2016-12-14
DK2833905T3 (en) 2018-07-30
PT2833905T (pt) 2018-08-06
NZ700073A (en) 2016-08-26
HK1203844A1 (en) 2015-11-06
CA3152081A1 (en) 2013-10-10
LT2833905T (lt) 2018-07-10
AU2013243873B2 (en) 2016-08-25
BR112014024848A2 (pt) 2017-07-11
CA2869460A1 (en) 2013-10-10
ES2673093T3 (es) 2018-06-19
KR20150002752A (ko) 2015-01-07
US20170290796A1 (en) 2017-10-12
KR20160033249A (ko) 2016-03-25
SMT201800366T1 (it) 2018-09-13
SI2833905T1 (en) 2018-08-31
MX2022013713A (es) 2022-12-13
US20130302400A1 (en) 2013-11-14
EP2833905A1 (en) 2015-02-11
CN104411324A (zh) 2015-03-11
AU2013243873A1 (en) 2014-10-09
KR101626703B1 (ko) 2016-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10137104B2 (en) Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and therapeutic agent
JP6262700B2 (ja) 修飾されたヒアルロニダーゼおよびヒアルロナン関連疾患および状態の治療における使用
JP6113262B2 (ja) 抗ヒアルロナン剤の投与に関連する有害副作用の処置
RS58728B1 (sr) Produženi rastvorljivi ph20 polipeptidi i njihove upotrebe
US20190351031A1 (en) Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
TW201534726A (zh) 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
HK1203844B (en) Combination therapy with hyaluronidase and a tumor - targeted taxane