RS57708B1 - Antigen vezujući proteini specifični za p komponentu amiloida seruma - Google Patents

Antigen vezujući proteini specifični za p komponentu amiloida seruma

Info

Publication number
RS57708B1
RS57708B1 RS20181162A RSP20181162A RS57708B1 RS 57708 B1 RS57708 B1 RS 57708B1 RS 20181162 A RS20181162 A RS 20181162A RS P20181162 A RSP20181162 A RS P20181162A RS 57708 B1 RS57708 B1 RS 57708B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sap
seq
antibody
human
antigen
Prior art date
Application number
RS20181162A
Other languages
English (en)
Inventor
Tejinder Kaur Bhinder
Susannah Karen Ford
Volker Germaschewski
Alan Peter Lewis
Mark Brian Pepys
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43881068&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57708(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of RS57708B1 publication Critical patent/RS57708B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antigen-vezujuće proteine, kao što su antitela, koji se vezuju za komponentu P amiloida seruma (SAP), polinukleotide koji kodiraju takve antigenvezujuće proteine, farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenute antigen-vezujuće proteine i postupke proizvodnje. Ovaj opis se takođe odnosi na upotrebu takvih antigen-vezujućih proteina u tretmanu ili profilaksi bolesti povezanih sa nagomilavanjem amiloida uključujući sistemsku amiloidozu, lokalnu amiloidozu, Alzheimer-ovu bolest, i dijabetes tipa 2.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Amiloidoza je teška i obično fatalna bolest izazvana ekstraćelijskom akumulacijom abnormalnih nerastvorljivih proteinskih vlakana poznatih kao amiloidna vlakna u tkivima. Oni predstavljaju derivate više od 20 različitih proteina u različitim oblicima bolesti, ali sva amiloidna vlakna imaju zajedničku unakrsnu-β strukturu jezgra i svi se stvaraju pogrešnim pakovanjem normalno rastvorljivih prekursorskih proteina (Pepys, M.B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241). Normalni nefibrilni plazma protein, komponenta P amiloida seruma (SAP), takođe je uvek prisutna u amiloidnim naslagama usled njenog izuzetno specifičnog kalcijum zavisnog vezivanja za sve tipove amiloidnih vlakana (Pepys et al. (1979) Clin. Exp. Immunol., 38:284-293; Pepys et al. (1997) Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., 4: 274-295).
[0003] Humani SAP je konstitutivni protein u plazmi, u koncentraciji oko 20-40 mg/l (Nelson et al. (1991) Clin. Chim. Acta, 200:191-200) i sa ukupno oko 50-100 mg SAP u kombinovanim plazma i ekstravaskularnim odeljcima i kod normalnih individua i kod pacijenata sa bolestima koje nisu amiloidoza (Hawkins et al. (1990) J.Clin.- Invest., 86: 1862-1869). Kod pacijenata sa amiloidozom, SAP je takođe specifično koncentrisan u amiloidnim naslagama i kod individua sa ekstenzivnom sistemskom amiloidozom može biti i 20,000 mg SAP u amioloidu (Pepys et al. (1994) PNAS, 91: 5602-5606), reverzibilno vezano sa vlaknima i u ravnoteži sa pulom SAP u tečnoj fazi. Normalna fiziološka funkcija cirkulišućeg SAP je nedovoljno poznata, ali eksperimenti na životinjama i in vitro studije sugerišu ulogu u odbrani domaćina (Noursadeghi et al. (2000) PNAS, 97: 14584-14589)). SAP je takođe konstituent matriksa normalnog tkiva povezan sa elastičnim vlaknima i glomerularnom bazalnom membranom iako tu njegova funkcija nije poznata.
[0004] Kod amiloidoze, ekstracelularne amiloidne naslage izazivaju bolest progresivnom akumulacijom dok ne oštete strukturu i time i funkciju bilo kog tkiva gde se nalaze (Pepys, M.B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241). Veoma se retko javlja bilo kakav inflamatorni ili odgovor na ’strano telo’ na naslage amiloida, bilo uočeno lokalno u tkivima ili sugerisano sistemskim markerima inflamacije. Sistemska amiloidoza može zahvatiti bilo koji organ, obično je fatalna i izaziva ∼1 od hiljadu smrti u razvijenim zemljama. Lokalizovani amiloid, ograničen na pojedinačnoj anatomskoj lokaciji ili tipu tkiva, takođe može biti veoma ozbiljan, na primer cerebralna amiloidna angiopatija je važan uzrok hemoragičnog šoka. Klinički vidovi amiloidoze su ekstremno različiti i retko se dijagnoza može uspostaviti pre nego što je prisutna značajna oštećenost organa. Preko 20 različitih proteina amiloidnih vlakana odgovorno je za različite oblike amiloidoze, ali tretmani koji značajno smanjuju veliku količinu respektivnog prekursora proteina amiloidnog vlakna zaustavljaju akumulaciju amiloida i naslage se mogu smanjiti. Nažalost efikasne mere nisu uvek raspoložive i, kada postoje, toksične su ili rizične i sporog delovanja (Pepys, M.B (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241). Stoga postoji medicinska potreba za terapijom koja bezbedno promoviše uklanjanje uspostavljenih naslaga amiloida. Dodatno, postoje druga stanja kod kojih su amiloidne nasage uvek prisutne, najvažnije Alzheimer-ova bolest (AD) i dijabetes melitus tipa 2, kod kojih doprinos amiloidnih naslaga patogenezi bolesti, specifično gubitak kognitivnih funkcija i funkcije pankreasnih ostrvaca, respektivno, nije poznat (Pepys, M.B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241). Međutim, može se pokazati da su amiloidne naslage na bilo kom drugom mestu u telu patogene i veoma je verovatno da su cerebralne naslage kod AD i amiloidne naslage u ostrvcima kod dijabetesa tipa 2 takođe štetne. Kako će tretman koji uklanja amiloidne naslage kod sistemske amiloidoze biti sigurno terapeutski (Pepys, M.B. (2006) Annu. Rev. Med., 57:223-241), uklanjanje amiloidnih naslaga kod AD i dijabetesa tipa 2 će takođe biti klinički korisno.
[0005] Vezivanje SAP stabilizuje amiloidna vlakna, štiti ih od proteolize in vitro (Tennent et al., (1995) PNAS,92: 4299-4303), može poboljšati amiloidnu fibrogenezu in vitro (Myers et al., (2006), Biochemistry, 45: 2311-2321) i doprinosi patogenezi sistemske amiloidoze in vivo (Botto et al., (1997) Nature Med., 3: 855-859). Zajedno sa njenim univerzalnim prisustvom u svim amiloidnim naslagama, ove osobine SAP čine je atraktivnom terapeutskim ciljnim mestom.
[0006] Evropska patentna prijava EP 0915088 opisuje jedinjenja derivate D-prolina koja su kompetitivni inhibitori vezivanja SAP sa amiloidnim vlaknima, kao i postupke za njihovu proizvodnju. Poželjno jedinjenje opisano u EP 0915088 je (R)-1-[6-[(R)-2-karboksi-pirolidin-1-il]-6-okso-heksanoil] pirolidin-2-karboksilna kiselina (CPHPC).
[0007] Međunarodna patentna prijava WO 03/051836 opisuje prolekove za jedinjenja derivate D-prolina.
[0008] Međunarodna patentna prijava WO 2004/099173 opisuje derivate glicerol cikličnog piruvata koji su kompetitivni inhibitori vezivanja SAP sa amiloidnim vlaknima.
[0009] Međunarodna patentna prijava WO 04/059318 opisuje postupke za koje se tvrdi da poboljšavaju formiranje fibocita koji obuhvataju obezbeđivanje kompozicija koje vezuju SAP. Takve kompozicije uključuju anti-SAP antitela i CPHPC. WO 04/059318 ne opisuje tretman bolesti povezane sa amiloidnim naslagama. Dodatno, mnogo je kliničkih i in vivo dokaza da ni SAP ni njegova deplecija nemaju nikakav efekat na fibrozu kod ljudi (Tennent et al., (2007) Arthritis Rheum., 56: 2013-2017; Pepys, M.B., Tennent, G.A. and Denton, C.P. (2007) Reply to Letter from Pilling, D., Buckley, C.D., Salmon, M. and Gomer, R.G., Serum amyloid P and fibrosis in systemic sclerosis:comment on the article by Tennent et al. Arthritis Rheum., 56:4229-4230).
[0010] Bis-D-prolin jedinjenje, CPHPC, opisano u prethodno navedenim patentima, vezuje se sa visokim afinitetom za humani SAP i namena mu je kao leka za uklanjanje SAP iz amiloidnih naslaga in vivo čime se olakšava njihovo uklanjanje. Vezivanje CPHPC sa SAP inicira brzo uklanjanje kompleksa od strane jetre, depletira skoro sav cirkulišući SAP dok god se lek primenjuje, i uklanja puno ali ne sav SAP vezan za amiloid (Pepys et al., (2002) Nature,417: 254-259). U inicijalnim kliničkim studijama (Gillmore et al., (2010) Brit. J. Haematol., doi:10.1111/j.1365-2141.2009.08036.x), izgleda da je primena CPHPC zaustavila akumulaciju amiloida, ali nije dovela do regresije amiloida i kako CPHPC ne uklanja kompletno sav SAP iz amiloidnih naslaga, potreban je drugi pristup.
[0011] Međunarodna patentna prijava WO 2009/000926 opisuje upotrebu jedinjenja koja depletiraju SAP iz cirkulacije, kao što su derivati D-prolina, naročito CPHPC, u kombinaciji sa antitelom specifičnim za SAP za tretman ili profilaksu amiloidoze.
[0012] Povezana Međunarodna patentna prijava PCT/EP2008/011135 (WO 2009/15592) tiče se različitih mišjih monoklonskih antitela koja se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjima koja depletiraju SAP iz cirkulacije, kao što su derivati D-prolina, naročito CPHPC, za tretman ili profilaksu amiloidoze.
[0013] Shodno tome, u tehnici postoji potreba za antitelima, naročito humanizovanim ili humanim antitelima, koja specifično ciljaju SAP i obezbeđuju poboljšanu terapeutsku efikasnost kod pacijenata, naročito humanih pacijenata, kod bolesti povezanih sa amiloidnim naslagama da bi se sačuvala funkcija organa i produžio život.
REZIME PRONALASKA
[0014] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i u kompeticiji je za vezivanje sa SAP sa referentnim antitelom koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca prema SEQ ID NO:7 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca prema SEQ ID NO:9.
[0015] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se vezuje za SAP i sadrži CDRH3 naveden u SEQ ID NO: 3 ili funkcionalnu varijantu CDRH3.
[0016] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP, pri čemu je antigen-vezujući protein himerno ili humanizovano antitelo koje sadrži odgovarajući CDRH3 sekvence varijabilnog domena prema SEQ ID NO:7, ili funkcionalnu varijantu CDRH3.
[0017] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP, i sadrži vezujuću jedinicu H3 koja sadrži Kabat ostatke 95-101 prema SEQ ID NO:7 ili funkcionalnu varijantu vezujuće jedinice H3.
[0018] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i sadrži varijabilni region teškog lanca izabran od SEQ ID NO:27-31; i/ili varijabilni region lakog lanca izabran od SEQ ID NO:34-36; ili varijantu varijabilnog regiona teškog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca sa 75% ili većom identičnošću sekvence.
[0019] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i sadrži teški lanac prema SEQ ID NO:62; i/ili laki lanac prema SEQ ID NO:64; ili varijantu teškog lanca ili lakog lanca sa 75% ili većom identičnosti sekvence.
[0020] Predmetni pronalazak daje ćelije domaćine sposobne da proizvode antigen-vezujuće proteine prema pronalasku.
[0021] Predmetna specifikacija opisuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antigenvezujući protein kao što je ovde obezbeđen. Predmetna specifikacija opisuje postupke za prevenciju i/ili lečenje subjekta podložnog ili pogođenog bolešću povezanom sa amiloidnim naslagama, pri čemu taj postupak sadrži korak primene profilaktički ili terapeutski efikasne količine antigen-vezujućeg proteina na navedenog subjekta. Obezbeđena je upotreba antigenvezujućeg proteina kao što je ovde definisana za prevenciju i/ili lečenje subjekta podložnog ili pogođenog bolešću povezanom sa amiloidnim naslagama. Takođe je opisana upotreba antigen-vezujućeg proteina kao što je ovde opisana za proizvodnju leka za prevenciju i/ili lečenje subjekta podložnog ili pogođenog bolešću povezanom sa amiloidnim naslagama.
KRATAK OPIS SLIKA
[0022]
Slika 1 prikazuje krive vezivanja sa mišjim antitelima SAP-E i SAP-K u 1 µg/mL koncentraciji za oblaganje humanog SAP.
Slika 2 prikazuje krive vezivanja sa mišjim antitelima SAP-E i SAP-K u 5 µg/mL koncentraciji za oblaganje humanog SAP.
Slika 3 prikazuje krive vezivanja za himerna antitela cSAP-E i cSAP-K. Profil krivih za himerna antitela isti je kao kod ekvivalentnih hibridoma.
Slika 4 prikazuje krive vezivanja za SAP-K H0L0, SAP-K H1L0, SAP-K H2L0 i SAP-K H3L0 u poređenju sa SAP-K himerom i SAP-E H1L1 u poređenju sa SAP-E himerom. Irelavantno humano IgG1 kapa antitelo je takođe testirano kao negativna kontrola.
Slika 5 prikazuje prečišćena SAP-K i SAP-E mišja monoklonska antitela u kompetitivnoj ELISA sa SAP-E himerom.
Slika 6 prikazuje prečišćena SAP-K i SAP-E mišja monoklonska antitela u kompetitivnoj ELISA sa SAP-K himerom.
Slika 7 prikazuje imunoradiometrijski test za vezivanje monoklonskih mišjih antitela SAP-E i SAP-K za humani SAP zarobljen od strane imobilisanog ovčijeg poliklonskog anti-humanog SAP antitela.
Slika 8 prikazuje mapiranje epitopa za monoklonsko anti-humano SAP antitelo SAP-E.
Slika 9 prikazuje lokaciju epitopa na humanom SAP prepoznatu od strane SAP-K (A, naznačeno crnom) i SAPE (B, prikazano belo).
Slika 10 prikazuje C3 aktivaciju sa humanizovanim monoklonskim anti-humanim SAP antitelima u kompletnom humanom serumu.
Slika 11 prikazuje C3 aktivaciju sa niskom dozom humanizovanih monoklonskih antihumanih SAP antitela u kompletnom humanom serumu.
Slika 12 prikazuje C3 aktivaciju sa humanizovanim monoklonskim anti-humanim SAP antitelima u kompletnom mišjem serumu sa dodatkom čistog humanog SAP.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0023] Ova specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se vezuje za serum amiloid P komponentu (SAP), na primer humani SAP, kao njegov specifični antigen (tj. SAP vezujući protein). U terapeutskim primenama pronalaska, antigen-vezujući protein može da bude antitelo, na primer monoklonsko antitelo. Antigen-vezujući protein prema pronalasku nije mišje antitelo. U primeru izvođenja, antigen-vezujući protein prema pronalasku je himerni, humanizovani ili humani antigen-vezujući protein.
[0024] "P komponenta amiloida seruma" ili "SAP" odnosi se na homopentamerni plazma glikoprotein pentraksin porodice. Svaki molekul je sastavljen od 5 identičnih protomera, svaki sa spljoštenim „β-jelly roll fold“ i jednim alfa heliksom, nekovalentno vezanim u diskoliki prsten sa cikličnom pentamernom simetrijom (Hutchinson et ai., (2000) Mol. Med., 6:482-493); Pepys et al., (2002) Nature, 417: 254-259). Termin "SAP" kao što je ovde korišćen takođe uključuje individualne podjedinice kodirane humanim genom APCS (hromozom: 1; lokacija: 1q21-q23) ili homologim genima u drugim organizmima, na primer humana SAP polipeptid podjedinica sa sekvencom kao što je dato u SEQ ID NO:43 kao i nativni pentamerni oblik SAP, i bilo koji fragmenti i varijante SAP koje zadržavaju biološku aktivnost vezivanja za amiloidna vlakna in vivo.
[0025] SAP-vezujući protein kao što je ovde opisan se može vezati za bilo koju ili bilo koju kombinaciju prethodno opisanih različitih obika SAP. U specifičnom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein pronalaska vezuje humani SAP. SAP-vezujući protein koji je ovde opisan može se vezati za SAP kada je SAP vezan za amiloidna vlakna bilo kog tipa i na bilo kojoj ekstracelularnoj lokaciji unutar tela. Antigen-vezujući protein koji je ovde opisan se takođe može vezati za nativni nevezani SAP.
[0026] Esencijalni aspekt korišćenja SAP-vezujućih proteina kao što su ovde opisani u terapeutskim postupcima je da koncentracija SAP u cirkulaciji mora biti smanjena najmanje 90% ispod svoje normalne vrednosti pre primene SAP-vezujućeg proteina. Specifično, ovo se može postići jedinjenjima koja smanjuju količinu cirkulišućeg SAP i, naročito, jedinjenjima koja rezultuju u depleciji cirkulišućeg SAP, ovde definisana kao "SAP depletirajuća jedinjenja". Takva jedinjenja su lignadi vezani sa SAP i kompetitivni su inhibitori vezivanja SAP za amiloidna vlakna, kao što su derivati D-prolina i derivati glicerol cikličnog piruvata.
Derivati D-prolina su opisani u EP 0915088, koja je ovde uključena u celini na osnovu reference, i termin "derivati D-prolina" uključuje prolekove, kao što su oni opisani u WO 03/051836, koji je takođe ovde uključen u celini na osnovu reference. D-prolini sledeće formule su predviđeni:
gde
R je
i grupa
R<1>je vodonik ili halogen; i
X je -(CH2)n-; -CH(R2)(CH2)n-; -CH2O(CH2)n-; -CH2NH-; -C(R2)=CH-; -CH2CH(OH)-; ilitiazol-2,5-diil; -O-;
Y je -S-S-; -(CH2)n-; -O-; -NH-; -N(R2)-; -CH=CH-; -NHC(O)NH-;-N(R2)C(O)N(R2)-; -N[CH2C6H3(OCH3)2]-; -N(CH2C6H5)-;-N(CH2C6H5)C(O)N(CH2C6H5)-; -N(alkoksialkil)-; N(cikloalkil-metil)-; 2,6-piridil; 2,5-furanil; 2,5-tienil; 1,2-cikloheksil; 1,3-cikloheksil; 1,4-cikloheksil; 1,2-naftil;1,4-naftil; 1,5-naftil; 1,6-naftil; ili 1,2-fenilen, 1,3-fenilen i 1,4-fenilen, gde su fenilen grupe izborno supstituisane sa 1-4 supstituenta, izabrana od halogena, nižeg alkila, nižeg alkoksi, hidroksil, karboksi, -COO-niži alkil, nitrilo, 5-tetrazol, (2-karboksilna kiselina pirolidin-1-il)-2-okso-etoksi, N-hidroksikarbamimiodil, 5-okso[1,2,4oksadiazolil, 2-okso [1,2,3,5] oksatiadiazolil, 5-tiokso[1,2,4]oksadiazolil i 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oksadiazolil;
X’ je -(CH2)n-; -(CH2)nCH(R2)-; -(CH2)nOCH2-; -NHCH2-;-CH=C(R2)-; CH(OH)CH2; ilitiazol-2,5-diil; -O-;
R<2>je niži alkil, niži alkoksi ili benzil,
n je 0-3 i gde
alkil ili niži alkil je C1-6alkil; alkoksi ili niži alkoksi je C1-6alkoksi; cikloalkil je C3-6cikloalkil; halogen je F, Cl ili Br; i mesto gde se u formuli pojavljuje tačkasta linija je ili prosta ili dvoguba veza;
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so ili mono- ili diestar.
[0027] D-prolini iz prethodne formule I-A mogu se zapisati kao Ligand - linker - Ligand, gde X-Y-X’ grupa formalnog I-A obrazuje linker. Linker (X-Y-X’) može biti dužine od 4 do 20 linearnih atoma ugljenika, uključujući od 4-15 linearnih atoma ugljenika, 5-10 linearnih atoma ugljenika, i 6-8 linearnih atoma ugljenika. Linker može biti linearni ili granati lanac, ili izborno može formirati jednu ili više struktura prstena, uz uslov da je u linkeru prisutno najmanje 4 linearna ili negranata atoma ugljenika. Najmanje jedan od linearnih ili negranatih C atoma može se izborno supstituisati sa najmanje jednim heteroatomom izabranim od N, O, ili S, pogodno O ili S, pogodno O.
[0028] Stoga, "izborno supstituisani linker" može imati jednu ili više supstitucija koje dovode do grananja i/ili jednu ili više supstitucija ugljenikovih atoma linearnog ili negranatog lanca ugljenikovih atoma linkera, npr. linker može biti etar ili supstituisani etar.
[0029] (R)-1-[6-[(R)-2-Karboksi-pirolidin-1-il]-6-okso-heksanoil]pirolidin-2-karboksilna kiselina (CPHPC) je specifični D-prolin predviđen pronalaskom. U specifičnom primeru izvođenja, CPHPC se primenjuje na humanog pacijenta.
[0030] Derivati glicerol cikličnog piruvata opisani su u WO 2004/099173.
[0031] Termin "antigen-vezujući protein" kao što je ovde korišćen označava antitela, fragmente antitela I ostale konstrukte proteina, kao što su domeni, koji su sposobni da se vezuju za SAP.
[0032] Termin "antitelo" je ovde korišćen u najširem smislu da bi se odnosio na molekule sa domenima sličnim imunoglobulinu i uključuju monoklonska, rekombinantna, poliklonska, himerna, humanizovana, bispecifična heterokonjugovana antitela; pojedinačni varijabilni domen, domen antitelo, antigen vezujući fragmenti, imunološki efikasni fragmenti, jednolančani Fv, diatela, Tandabs™, itd. (za rezime alternativnih formata "antitela" videti Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No.9, 1126-1136).
[0033] Izraz "jedan varijabilni domen" označava varijabilni domen antigen-vezujućeg proteina (na primer, VH, VHH, VL) koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od različitog varjabilnog regiona ili domena.
[0034] "Domen antitelo" ili "dAb" može se smatrati istim kao "jedan varijabilni domen" koji je sposoban da se veže za antigen. Jedan varijabilni domen može biti varijabilni domen humanog antitela, ali takođe obuhvata varijabilne domene jednog antitela iz drugih vrsta kao što su VHH dAb glodara (na primer, kao što je otkriveno u WO 00/29004), ajkule “nurse shark” i kamelida. VHH kamelida su polipeptidi jednog varijabilnog domena imunoglobulina koji su poreklom od vrsta uključujući kamilu, lamu, alpaku, jednogrbu kamilu, i gvanako, koji proizvode antitela sa teškim lancem koja prirodno nemaju lake lance. Takvi VHH domeni mogu biti humanizovani prema standardnim tehnikama dostupnim u stanju tehnike, i takvi domeni se smatraju "domen antitelima". Kao što je ovde korišćen VH obuhvata VHH domene kamelide.
[0035] Kao što je ovde korišćen termin "domen" označava savijenu strukturu proteina koji ima tercijarnu strukturu nezavisno od ostatka proteina. Generalno, domeni su odgovorni za odvojene funkcionalne osobine proteina, i u mnogim slučajevima mogu se dodati, ukloniti ili prebaciti do drugih proteina bez gubitka funkcije ostatka proteina i/ili domena. "Jedan varijabilni domen" je savijeni polipeptidni domen koji sadrži sekvence karakteristične za varijabilne domene antitela. On prema tome obuhvata kompletne varijabilne domene antitela i modifikovane varijabilne domene, na primer, u kojima su jedna ili više petlji zamenjene sekvencama koje nisu karakteristične za varijabilne domene antitela, ili varijabilne domene antitela koji su skraćeni ili sadrže N- ili C-terminalne produžetke, kao i savijene fragmente varijabilnih domena koji zadržavaju najmanje vezujuću aktivnost i specifičnost domena pne dužine. Domen može da se veže za antigen ili epitop nezavisno od različitog varijabilnog regiona ili domena.
[0036] Antigen-vezujući fragment može biti obezbeđen pomoću uređenja jednog ili više CDR regiona na proteinskoj osnovi koja nije antitelo kao što je domen. Domen može biti domen antitelo ili može biti domen koji je derivat osnove izabrane iz grupe koja se sastoji od CTLA-4, lipokalina, SpA i Affi-tela, avimera, GroEl, transferina, GroES i fibronektina/adnektina, koji je podvrgnut konstrukciji proteina u cilju dobijanja vezivanja za antigen, kao što je SAP, osim prirodnog liganda.
[0037] Antigen-vezujući fragment ili imunološki efikasan fragment može da sadrže parcijalne varijabilne sekvence teškog ili lakog lanca. Fragmenti su najmanje 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina u dužinu. Alternativno fragmenti su najmanje 15, najmanje 20, najmanje 50, najmanje 75, ili najmanje 100 aminokiselina u dužinu.
[0038] Termin "specifično vezuje" kao što je korišćen u ovoj specifikaciji u odnosu na antigen-vezujuće proteine označava da se antigen-vezujući protein vezuje sa SAP bez ili sa beznačajnim vezivanjem za bilo koje druge proteine, ukjljučujući blisko srodne molekule kao što su C-reaktivni protein (CRP) koji, kod ljudi, deli 55% striktnih ostataka za homologiju sekvence ostataka aminokiselina i ima suštinski isto pakovanje proteina.
1
[0039] Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) interakcije antigen-vezujući protein-SAP može biti 1 mM ili manja, 100 nM ili manja, 10 nM ili manja, 2 nM ili manja ili 1 nM ili manja. Alternativno KD može biti između 5 i 10 nM; ili između 1 i 2 nM. KD može biti između 1 pM i 500 pM; ili između 500 pM i 1 nM.
[0040] Afinitet vezivanja može se meriti sa BIAcore™, na primer sa hvatanjem antigena sa SAP vezanim za karboksmetildekstran čip preko vezivanja primarnog amina i hvatanja antitela na ovu površinu. Alternativno, afinitet vezivanja se može meriti BIAcore™ vezivanjem anti-SAP antitela sa humanim SAP uhvaćenim sa O-fosfoetanolaminom imobilisanim na CM5 čipu. BIAcore™ postupci opisani u Primeru 8 mogu se koristiti za merenje afiniteta vezivanja.
[0041] Konstanta disocijacije (kd) može biti 1x10<-3>s<-1>ili manja, 1x10<-4>s<-1>ili manja, ili 1x10<-5>s<-1>ili manja. kd može biti između 1x10<-5>s<-1>i 1x10<-4>s<-1>; ili između 1x10<-4>s<-1>i 1x10<-3>s<-1>. Mala kd može rezultovati u sporoj disocijaciji kompleksa antigen-vezujući protein-ligand i poboljšanom uklanjanju kompleksa SAP vezanog za amiloid.
[0042] Stručnjacima će biti jasno da je namera da termin "izveden" definiše ne samo izvor u smislu da je fizički ishodan za materijal, već da takođe definiše materijal koji je strukturno identičan materijalu, ali koji ne potiče iz referentnog izvora. Stoga "ostaci koji se nalaze u donor antitelu" ne moraju obavezno biti prečišćeni iz donorskog antitela.
[0043] Pod "izolovanim" podrazumeva se da je molekul, kao što je antigen vezujući protein, uklonjen iz okoline u kojoj se može naći u prirodi. Na primer, molekul može biti prečišćen iz supstanci sa kojima bi u prirodi normalno postojao. Na primer, masa molekula u uzorku može biti 95% ukupne mase.
[0044] "Himerno antitelo" se odnosi na tip injženjeringom dobijenog antitela koje sadrži varijabilni region koji se javlja u prirodi (laki lanac i teški lanac) izveden iz donorskog antitela zajedno sa konstantnim regionima lakog i teškog lanca izvedenim iz akceptorskog antitela.
[0045] "Humanizovano antitelo" se odnosi na tip inženjeringom dobijenog antitela čiji su CDRs izvedeni iz ne-humanog donorskog imunoglobulina, a ostali imunoglobulin-izvedeni delovi molekula su izvedeni iz jednog ili više humanih immunoglobulina. Dodatno, okvirni ostaci mogu se izmeniti da sačuvaju afinitet vezivanja (videti, npr., Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al. Bio/Technology, 9:421 (1991)). Pogodno humano akceptorsko antitelo može se izabrati iz konvencionalne baze podataka, npr., KABAT® database, Los Alamosdatabase, i Swiss Protein database, putem homologije sa nukelotidnim i aminokiselinskim sekvencama donor antitela. Humano antitelo koje karakateriše homologija sa okvirnim regionima donor antitela (na aminokiselinskoj osnovi) može biti pogodno da obezbedi konstantni region teškog lanca i/ili varijabilni okvirni region teškog lanca za inserciju donorskih CDRs. Pogodno akceptorsko antitelo sposobno da donira konstantni region lakog lanca ili varijabilne okvirne regione može se izabrati na sličan način. Treba zapaziti da nije neophodno da teški i laki lanci akceptorskog antitela potiču od istog akceptorskog antitela. Prethodna tehnika opisuje nekoliko načina za proizvodnju takvih humanizovanih antitela –videti na primer EP-A-0239400 i EP-A-054951.
[0046] Termin "donor antitelo" odnosi se na antitelo koje daje aminokiselinske sekvence svojih varijabilnih regiona, CDRs, ili druge funkcionalne fragmente ili njihove analoge prvom imunoglobulinskom partneru. Donor stoga obezbeđuje izmenjeni region koji kodira imunoglobulin i rezultujuće eksprimirano izmenjeno antitelo sa specifičnošću za antigen i neutrališućom aktivnošću karkaterističnom za donorsko antitelo.
[0047] Termin "akceptorsko antitelo" odnosi se na antitelo koje je heterologno donorskom antitelu, koje daje sve (ili bilo koji deo) aminokiselinskih sekvenci koje kodiraju njegove okvirne regione teškog i/ili lakog lanca i/ili njegove konstantne regione teškog i/ili lakog lanca prvom imunoglobulinskom partneru. Humano antitelo može biti akceptorsko antitelo.
[0048] Termin "humano antitelo" odnosi se na antitelo izvedeno iz sekvenci gena humanog imunoglobulina. Ova potpuno humana antitela obezbeđuju alternativu re-inženjeringom dobijenim, ili de-imunizovanim, glodarskim monoklonskim antitelima (npr. humanizovanim antitelima) kao izvor nisko imunogenih terapeutskih antitela i normalno su stvorena korišćenjem ili fagnog prikaza ili platformi transgenog miša. U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska je humano antitelo.
[0049] Termini "VH" i "VL" su ovde korišćeni za označavanje varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca respektivno prema antigen vezujućem proteinu.
[0050] "CDRs" su definisani kao aminokiselinske sekvence regiona koji određuje komplementarnost antigen vezujućeg proteina. Ovo su hipervarijabilni regioni teških i lakih lanaca imunoglobulina. Postoje po tri CDRs (ili CDR regiona) teškog lanca i lakog lanca u varijabilnom delu imunoglobulina. Stoga, "CDRs" kao što je ovde korišćeno odnose se na sva tri CDRs teškog lanca, sva tri CDRs lakog lanca, sve CDRs teškog i lakog lanca, ili na najmanje dva CDRs.
[0051] U specifikaciji, aminokiselinski ostaci u sekvencama varijabilnog domena i sekvence antitela pune dužine numerisani su prema Kabat konvenciji numerisanja. Slično tome, termini "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" korišćeni u Primerima prate Kabat konvenciju numerisanja. Za dodatne informacije, videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).
[0052] Međutim, iako koristimo Kabat konvenciju numerisanja za aminokiselinske ostatke u sekvencama varijabilnog domena i sekvence antitela pune dužine u ovoj specifikaciji, stručnjacima će biti očigledno da postoje alternativne konvencije numerisanja za aminokiselinske ostatke u sekvencama varijabilnog domena i sekvencama antitela pune dužine. Postoje takođe alternativne konvencije numerisanja za CDR sekvence, na primer one date u Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883. Struktura i pakovanje proteina antitela može značiti da se drugi ostaci smatraju delom CDR sekvence što bi bilo jasno stručnjaku iz date oblasti tehnike.
[0053] Druge konvencije numerisanja za CDR sekvence dostupne stručnjaku uključuju "AbM" (University of Bath) i "contact" (University College London) postupke. Može se odrediti minimalni preklapajući region korišćenjem najmanje dva od Kabat, Chothia, AbM i „contact“ postupka da bi obezbedila "minimalna vezujuća jedinica". Minimalni vezujući deo može biti pod-deo CDR.
[0054] Tabela 1 u daljem tekstu predstavlja jednu definiciju korišćenjem svake konvencije numerisanja za svaki CDR ili vezujuću jedinicu. Šema Kabat numerisanja je korišćena u Tabeli 1 da bi se numerisala aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena. Treba zapaziti da neke od definicija CDR mogu varirati u zavisnosti od pojedinačne publikacije koja se koristi.
Tabela 1
1
[0055] Kao što je ovde korišćen, termin "antigen vezujuće mesto" odnosi se na mesto na antigen vezujućem proteinu koje je sposobno da se specifično vezuje za antigen. Ovo može biti pojedinačni domen (na primer, epitop-vezujući domen), ili jednolančani Fv (ScFv) domeni ili mogu biti parni VH/VL domeni kao što se može naći na standardnom antitelu.
[0056] Termin "epitop" kao što je ovde korišćen odnosi se na deo antigena koji stvara kontakt sa određenim vezujućim domenom antigen vezujućeg proteina. Epitop može biti linearan, i sadrži suštinski lineranu aminokiselinsku sekvencu iz antigena. Alternativno, epitop može biti konformacioni ili diskontinuirani. Na primer, konformacioni epitop sadrži aminokiselinske ostatke koji zahtevaju element strukturnog ograničenja. U slučaju konformacionog epitopa, iako ostaci mogu biti iz različitih regiona peptidnog lanca, oni mogu biti veoma blizu u trodimenzionalnoj strukturi antigena. U slučaju multimernih antigena, kao što je SAP, konformacioni epitop može uključivati ostatke iz različitih peptidnih lanaca koji mogu biti blizu u trodimenzionalnoj strukturi antigena. Takvi strukturno susedni ostaci se mogu odrediti preko programa za kompjutersko modelovanje ili preko trodimenzionalnih struktura dobijenih preko postupaka poznatih u tehnici, kao što je rendgenska kristalografija.
[0057] Diskontinuirani epitop sadrži aminokiselinske ostatke koji su razdvojeni drugim sekvencama, tj. nisu u kontinuiranoj sekvenci u primarnoj sekvenci antigena. U kontekstu tercijerne i kvaternarne strukture antigena, ostaci diskontinuiranog epitopa su međusobno dovoljno blizu da bi ih vezao antigen vezujući protein.
[0058] U primeru izvođenja, antigen-vezujući protein pronalaska se vezuje za epitop unutar ostataka 140-158 humanog SAP.
[0059] Za nukleotidne i aminokiselinske sekvence, termin "identično" ili "identičnost sekvence" označava stepen identičnosti između dve sekvence nukleinske kiseline ili aminokiseline kada su optimalno poravnate i upoređene sa odgovarajućim insercijma ili delecijama.
[0060] Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija zajedničkih za sekvence (tj., % identičnosti = broju identičnih pozicija/ukupan broj pozicija pomnožen sa 100), uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koje se moraju uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u nastavku.
[0061] Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može se odrediti korišćenjem GAP programa u GCG softverskom paketu, korišćenjem NWSgapdna.CMP matrice i “gap weight” od 40, 50, 60, 70, ili 80 i “length weight” 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Procenat identičnosti između dve nukeotidne ili aminokiselinske sekvence može se takođe odrediti algoritmom od E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) koji je uključen u ALIGNprogram (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 “weight residue table”, “gap length penalty” od 12 i “gap penalty” od 4. Dodatno, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritma koji je uključen u GAP program u GCG softverskom paketu, korišćenjem ili Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice, i “gap weight” od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i “length weight” od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0062] Putem primera, polinukleotidna sekvenca može biti identična referentnoj polinukleotidnoj sekvenci kao što je ovde opisana (videti na primer SEQ ID NO:8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65-73), odnosno 100% je identična, ili može uključivati do određene celobrojne vrednosti izmene nukleotida u poređenju sa referentnom sekvencom, kao što je najmanje 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična. Takve izmene su izabrane od najmanje jedne delecije nukleotida, supstitucije, uključujući tranziciju i transverziju, ili inserciju, i gde se pomenute izmene mogu biti na 5’ ili 3’ terminalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između ovih terminalnih pozicija, ubačene bilo individualno između nukleotida u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Broj nukleotidnih izmena je određen množenjem ukupnog broja nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci kao što je ovde opisano (videti na primer SEQ ID NO:8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65-73), sa procentom respektivnog procenta identičnosti (podeljenim sa 100) i oduzimanjem tog proizvoda od pomenutog ukupnog broja nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci kao što je ovde opisano (videti na primer SEQ ID NO:8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65-73), ili:
gde nnje broj nukleotidnih izmena, xnje ukupan broj nukleotida u referentnoj polinukleotidnoj sekvenci kao što je ovde opisano (videti na primer SEQ ID NO:8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65-73), i y je 0.50 za 50%, 0.60 za 60%, 0.70 za 70%, 0.75 za 75%, 0.80 za 80%, 0.85 za 85%, 0.90 za 90%, 0.95 za 95%, 0.98 za 98%,0.99 za 99% ili 1.00 za 100%, • je simbol za množenje, i gde je bilo koji proizvod xni y koji nije ceo broj zaokružen je do najbližeg celog broja pre nego što se oduzme od xn.
[0063] Slično tome, polipeptidna sekvenca može biti identična sa polipeptidnom referentnom sekvencom kao što je ovde opisano (videti na primer SEQ ID NO:1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74), odnosno da je 100% identična, ili može uključivati do određene
1
celobrojne vrednosti izmene aminokiselina u poređenju sa referentnom sekvencom, tako da je % identičnosti manji od 100%, kao što je najmanje 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična. Takve izmene su izabrane od najmanje jedne delecije aminokiseline, supstitucije, uključujući konzervativnu i nekonzervativnu supstituciju, ili inserciju, i gde se pomenute izmene mogu desiti na amino ili karboksi terminalnim pozicijama referentne polinukleotidne sekvence sekvence ili bilo gde između ovih terminalnih pozicija, ubačene bilo individualno između aminokiselina u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Broj aminokiselinskih izmena za dati % identičnosti je određen množenjem ukupnog broja aminokiselina u polipeptidnoj sekvenci kodiranoj polipeptidnom referentnom sekvencom kao što je ovde opisano (videti na primer SEQID NO:1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74) sa procentom respektivnog procenta identičnosti (podeljenog sa 100) i zatim oduzimanjem tog proizvoda od pomenutog ukupnog broja aminokiselina u polipeptidnoj referentnoj sekvenci kao što je ovde opisano (videti na primer SEQ ID NO:1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74), ili:
gde naje broj aminokiselinskih izmena, xaje ukupan broj aminokiselina u referentnoj polipeptidnoj sekvenci kao što je ovde opisana (videti na primer SEQ ID NO:1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74), i y je, 0.50 za 50%, 0.60 za 60%, 0.70 za 70%, 0.75 za 75%, 0.80 za 80%, 0.85 za 85%, 0.90 za 90%, 0.95 za 95%, 0.98za 98%, 0.99 za 99%, ili 1.00 za 100%, • je simbol za množenje, i gde je bilo koji proizvod xai y koji nije ceo broj zaokružen je do najbližeg celog broja pre nego što se oduzme od xa.
[0064] % identičnosti se može odrediti u celoj dužini sekvence.
[0065] Svaki od termina "peptid", "polipeptid" i "protein" odnosi se na molekul koji sadrži dva ili više aminokiselinskih ostataka. Peptid može biti monomeran ili polimeran.
[0066] Dobro je poznato u tehnici da se određene aminokiselinske supstitucije smatraju "konzervativnim". Aminokiseline su podeljene u grupe na osnovu zajedničkih osobina bočnog lanca i supstitucije unutar grupa koje zadržavaju sav ili suštinski sav afinitet vezivanja antigen-vezujućeg proteina smatraju se konzervativnim supstitucijama, videti Tabelu 2 u daljem tekstu:
Tabela 2
1
[0067] Antigen-vezujući protein može biti u kompeticiji za vezivanje sa SAP sa referentnim antitelom koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 7, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 9. Alternativno, antigen-vezujući protein može biti u kompeticiji za vezivanje za SAP sa referentnim antitelom koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 17, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 19.
[0068] Kompeticija između antigen-vezujućeg proteina i referentnog antitela može se odrediti kompetitivnom ELISA, FMAT ili BIAcore. Kompetitivni antigen-vezujući protein može se vezati za isti epitop, preklapajući epitop, ili epitop u blizini epitopa za koji se vezuje referentno antitelo.
[0069] Predmetni pronalazak takođe daje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i sadrži CDRH3 prema SEQ ID NO:3 ili njegovu CDR varijantu. Antigen-vezujući protein može dalje da sadrži jedan ili više CDR regiona, ili sve CDR regione, u bilo kojoj kombinaciji, izabrane od: CDRH1 (SEQ ID NO:1), CDRH2 (SEQ ID NO:2), CDRL1 (SEQ ID NO:4), CDRL2 (SEQ ID NO:5) i CDRL3 (SEQ ID NO:6); ili njihovu varijantu.
[0070] Na primer, antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH3 (SEQ ID NO:3) i CDRH1 (SEQ ID NO:1), ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH3 (SEQ ID NO:3) i CDRH2 (SEQ ID NO:2), ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH1 (SEQ ID NO:1) i CDRH2 (SEQ ID NO:2), i CDRH3 (SEQ ID NO:3), ili njihove varijante.
[0071] Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRL1 (SEQ ID NO:4) i CDRL2 (SEQ ID NO:5), ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRL2 (SEQ ID NO:5) i CDRL3 (SEQ ID NO:6), ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRL1 (SEQ ID NO:4), CDRL2 (SEQ ID NO:5) i CDRL3 (SEQ ID NO:6), ili njihove varijante.
1
[0072] Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH3 (SEQ ID NO:3) i CDRL3 (SEQ ID NO:6), ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH3 (SEQ ID NO:3), CDRH2 (SEQ ID NO:2) i CDRL3 (SEQ ID NO:6), ili njihove varijante. Antigenvezujući protein može da sadrži CDRH3 (SEQ ID NO:3), CDRH2 (SEQ ID NO:2), CDRL2 (SEQ ID NO:5) i CDRL3 (SEQ ID NO:6), ili njihove varijante.
[0073] Antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH1 (SEQ ID NO:1), CDRH2 (SEQ ID NO:2), CDRH3 (SEQ ID NO:3), CDRL1 (SEQ ID NO:4), CDRL2 (SEQ ID NO:5) i CDRL3 (SEQ ID NO:6), ili njihove varijante.
[0074] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i sadrži CDRH3 prema SEQ ID NO:13 ili njihovu CDR varijantu. Antigen-vezujući protein može dalje da sadrži jedan ili više CDR regiona ili sve CDR regione, u bilo kojoj kombinaciji, izabrane od: CDRH1 (SEQ ID NO:11), CDRH2 (SEQ ID NO:12), CDRL1 (SEQ ID NO:14), CDRL2 (SEQ ID NO:15), i CDRL3 (SEQ ID NO:16); ili njihovu varijantu.
[0075] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP, pri čemu je antigen-vezujući protein himerno ili humanizovano antitelo koje sadrži odgovarajući CDRH3 sekvence varijabilnog domena prema SEQ ID NO:7, ili varijantu CDRH3.
[0076] Himerni ili humanizovani antigen-vezujući protein može dodatno da sadrži jedan ili više, ili sve od odgovarajućih CDR regiona izabrane od sekvence varijabilnog domena prema SEQ ID NO:7 ili SEQ ID NO:9, ili njegovu CDR varijantu.
[0077] Na primer, antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH3 i odgovarajući CDRH1, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH3 i odgovarajući CDRH2, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH1, odgovarajući CDRH2 i odgovarajući CDRH3; ili njihove varijante.
[0078] Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRL1 i odgovarajući CDRL2, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRL2 i odgovarajući CDRL3, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRL1, odgovarajući CDRL2 i odgovarajući CDRL3, ili njihove varijante.
[0079] Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH3 i odgovarajući CDRL3, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH3, odgovarajući CDRH2 i odgovarajući CDRL3, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH3, odgovarajući CDRH2, odgovarajući CDRL2 i odgovarajući CDRL3, ili njihove varijante.
1
[0080] Antigen-vezujući protein može da sadrži odgovarajući CDRH1, odgovarajući CDRH2, odgovarajući CDRH3, odgovarajući CDRL1, odgovarajući CDRL2 i odgovarajući CDRL3, ili njihove varijante.
[0081] Odgovarajući CDR regioni mogu biti definisani u vezi sa Kabat (1987), Chothia (1989), AbM ili postupcima kontakta, ili kombinacijom ovih postupaka. Jedna definicija svakog od postupaka može se naći u Tabeli 1 i može se primeniti na referentni varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:7 i referentni varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:9 da bi se odredio odgovarajući CDR.
[0082] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP, pri čemu je antigen-vezujući protein himerno ili humanizovano antitelo koje sadrži odgovarajući CDRH3 sekvence varijabilnog domena prema SEQ ID NO:17, ili varijantu CDRH3.
[0083] Himerni ili humanizovani antigen-vezujući protein može dalje da sadrži jedan ili više, ili sve od odgovarajućih CDR regiona izabranih od sekvence varijabilnog domena prema SEQ ID NO:17 ili SEQ ID NO:19, ili njihovu CDR varijantu.
[0084] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP, i sadrži vezujuću jedinicu H3 koja sadrži Kabat ostatke 95-101 prema SEQ ID NO:7, ili varijantu H3. Antigen-vezujući protein može dalje da sadrži jednu ili više ili sve vezujuće jedinice izabrane od: H1 koja sadrži Kabat ostatke 31-32 prema SEQ ID NO:7, H2 koja sadrži Kabat ostatke 52-56 prema SEQ ID NO:7, L1 koja sadrži Kabat ostatke 30-34 prema SEQ ID NO:9, L2 koja sadrži Kabat ostatke 50-55 prema SEQ ID NO:9 i L3 koja sadrži Kabat ostatke 89-96 prema SEQ ID NO:9; ili varijantu vezujuće jedinice.
[0085] Na primer, antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu H3 i vezujuću jedinicu H1, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu H3 i vezujuću jedinicu H2, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu H1, vezujuću jedinicu H2 i vezujuću jedinicu H3; ili njihove varijante.
[0086] Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu L1 i vezujuću jedinicu L2, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu L2 i vezujuću jedinicu L3, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu L1, vezujuću jedinicu L2 i vezujuću jedinicu L3; ili njihove varijante.
[0087] Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu H3 i vezujuću jedinicu L3, ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu H3, vezujuću jedinicu H2 i vezujuću jedinicu L3; ili njihove varijante. Antigen-vezujući protein može da
1
sadrži vezujuću jedinicu H3, vezujuću jedinicu H2, vezujuću jedinicu L2 i vezujuću jedinicu L3; ili njihove varijante.
[0088] Antigen-vezujući protein može da sadrži vezujuću jedinicu H1, vezujuću jedinicu H2, vezujuću jedinicu H3, vezujuću jedinicu L1, vezujuću jedinicu L2 i vezujuću jedinicu L3; ili njihove varijante.
[0089] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP, i sadrži vezujuću jedinicu H3 koja sadrži Kabat ostatke 95-101 prema SEQ ID NO:17, ili varijantu H3. Antigen-vezujući protein može dalje da sadrži jednu ili više ili sve vezujuće jedinice izabrane od: H1 koja sadrži Kabat ostatke 31-32 prema SEQ ID NO:17, H2 koja sadrži Kabat ostatke 52-56 prema SEQ ID NO:17, L1 koja sadrži Kabat ostatke 30-34 prema SEQ ID NO:19, L2 koja sadrži Kabat ostatke 50-55 prema SEQ ID NO:19 i L3 koja sadrži Kabat ostatke 89-96 prema SEQ ID NO:19; ili varijantu vezujuće jedinice.
[0090] CDR varijanta ili varijanta vezujuće jedinice obuhvata aminokiselinsku sekvencu modifikovanu sa najmanje jednom aminokiselinom, pri čemu navedena modifikacija može biti hemijska ili parcijalna promena aminokiselinske sekvence (na primer za ne više od 10 aminokiselina), pri čemu ta modifikacija dozvoljava da varijanta zadrži biološke karakteristike nemodifikovane sekvence. Na primer, varijanta je funkcionalna varijanta koja se specifično vezuje za SAP i aktivira klirens kompleksa SAP vezanih za amiloid iz tkiva. Parcijalna promena CDR aminokiselinske sekvence može biti putem delecije ili supstitucije jedne do nekoliko aminokiselina, ili dodavanjem ili insercijom jedne do nekoliko aminokiselina, ili njihovom kombinacijom (na primer za ne više od 10 aminokiselina). CDR varijanta ili varijanta vezujuće jedinice može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija, u bilo kojoj kombinaciji, u aminokiselinskoj sekvenci. CDR varijanta ili varijanta vezujuće jedinice može da sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije, insercije ili delecije, u bilo kojoj kombinaciji, u aminokiselinskoj sekvenci. Supstitucije u aminokiselinskim ostacima mogu biti konzervativne supstitucije, na primer, supstitucija jedne hidrofobne aminokiseline za alternativnu hidrofobnu aminokiselinu. Na primer leucin može biti supstituisan sa valinom ili izoleucinom.
[0091] Jedan ili više od CDR regiona, odgovarajućih CDR regiona, varijanti CDR regiona ili vezujućih jedinica koji su ovde opisani mogu biti prisutni u kontekstu humanog okvira, na primer kao humanizovani ili himerni varijabilni domen. Potpuno humana antitela koja sadrže jedan ili više CDR regiona, odgovarajućih CDR regiona, varijanti CDR regiona ili vezujućih jedinica koji su ovde opisani takođe su razmatrana i unutar su obima prema pronalasku.
2
[0092] CDR regioni L1, L2, L3, H1 i H2 teže da strukturno ispolje jedan od konačnog broja glavnih konformacija lanca. Određena kanonijska strukturna klasa CDR je definisana dužinom CDR i pakovanjem petlje, određenim ostacima lociranim na ključnim položajima u CDR regionima i okvirnim regionima (strukturno određujući ostaci ili SDR). Martin i Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815) su generisali automatski postupak za definisanje "ključni ostatak" kanonijskih obrazaca. Klaster analiza je korišćena za definisanje kanonijskih klasa za setove CDR regiona, i kanonijski obrasci su zatim identifikovani analizom sakrivenih hidrofobnosti, ostataka koji se vezuju za vodonik i konzervativnih glicina i prolina. CDR regioni sekvenci antitela mogu biti dodeljeni kanonijskim klasama upoređivanjem sekvenci sa obrascima ključnih ostataka i ocenjivanjem svakog obrasca upotrebom identiteta ili slličnih matrica.
[0093] Primeri kanonijskih CDR unutar obima pronalaska su dati u daljem tekstu. Korišćena aminokiselinska numeracija je Kabat.
[0094] Kanonijski primeri za CDRH1 kao što su navedeni u SEQ ID NO:1, njihova varijanta, CDRH1 prema SEQ ID NO:7 ili odgovarajući CDR su: Tyr 32 je supsituisan za Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu ili Asp; Asn 33 je supstituisan za Tyr, Ala, Trp, Gly, Thr, Leu ili Val; Met 34 je supstituisan za Ile, Val ili Trp; i/ili His 35 je supstituisan za Glu, Asn, Gln, Ser, Tyr ili Thr.
[0095] Kanonijski primeri za CDRH2 kao što su navedeni u SEQ ID NO:2, njihova varijanta, CDRH2 prema SEQ ID NO:7 ili odgovarajući CDR su: Tyr 50 je supsituisan za Arg, Glu, Trp, Gly, Gln, Val, Leu, Asn, Lys ili Ala; Ile51 je supsituisan za Leu, Val, Thr, Ser ili Asn; Tyr 52 je supsituisan za Asp, Leu, Asn ili Ser; Gly 53 je supsituisan za Ala, Tyr, Ser, Lys, Thr ili Asn; Asp 54 je supsituisan za Asn, Ser, Thr, Lys ili Gly; Asn 56 je supsituisan za Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Val, Ser ili Ala; i/ili Asn 58 je supsituisan za Lys, Thr, Ser, Asp, Arg, Gly, Phe ili Tyr.
[0096] Kanonijski primeri za CDRH3 kao što su navedeni u SEQ ID NO:3, njihova varijanta, CDRH3 prema SEQ ID NO:7 ili odgovarajući CDR su: Ser 102 je supsituisan za Tyr, His, Val, Ile, Asp ili Gly.
[0097] Kanonijski primeri za CDRL1 kao što su navedeni u SEQ ID NO:4, njihova varijanta, CDRL1 prema SEQ ID NO:9 ili odgovarajući CDR su: Asn 28 je supsituisan za Ser, Asp, Thr ili Glu; Ile 29 je supsituisan za Val; Tyr 30 je supstituisan za Asp, Leu, Val, Ile, Ser, Asn, Phe, His, Gly ili Thr; Ser 31 je supsituisan za Asn, Thr, Lys ili Gly; Tyr 32 je supstituisan za Phe, Asn, Ala, His, Ser ili Arg; Leu 33 je supsituisan za Met, Val, Ile ili Phe; i/ili Ala 34 je supstituisan za Gly, Asn, Ser, His, Val ili Phe.
[0098] Kanonijski primeri za CDRL2 kao što su navedeni u SEQ ID NO:5, njihova varijanta, CDRL1 prema SEQ ID NO:9 ili odgovarajući CDR su: Ala 51 je supsituisan za Thr, Gly ili Val.
[0099] Kanonijski primeri za CDRL3 kao što su navedeni u SEQ ID NO:6, njihova varijanta, CDRL1 prema SEQ ID NO:9 ili odgovarajući CDR su: Gln 89 je supsituisan za Ser, Gly, Phe ili Leu; His 90 je supsituisan za Gln ili Asn; His 91 je supsituisan za Asn, Phe, Gly, Ser, Arg, Asp, Thr, Tyr ili Val; Tyr 92 je supsituisan za Asn, Trp, Thr, Ser, Arg, Gln, His, Ala ili Asp; Gly 93 je supsituisan za Glu, Asn, His, Thr, Ser, Arg ili Ala; Ala 94 je supsituisan za Asp, Tyr, Thr, Val, Leu, His, Asn, Ile, Trp, Pro ili Ser; i/ili Leu 96 je supsituisan za Pro, Tyr, Arg, Ile, Trp ili Phe.
[0100] Kanonijski primeri za CDRH1 kao što su navedeni u SEQ ID NO:11, njihova varijanta, CDRH1 prema SEQ ID NO:17 ili odgovarajući CDR su: Tyr 32 je supsituisan za Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu ili Asp; Trp 33 je supstituisan za Tyr, Ala, Gly, Thr, Leu ili Val; Met 34 je supsituisan za Ile, Val ili Trp; i/ili His 35 je supsituisan za Glu, Asn, Gln, Ser, Tyr ili Thr.
[0101] Kanonijski primeri za CDRH2 kao što su navedeni u SEQ ID NO:12, njihova varijanta, CDRH1 prema SEQ ID NO:17 ili odgovarajući CDR su: Met 50 je supsituisan za Arg, Glu, Trp, Tyr, Gly, Gln, Val, Leu, Asn, Lys ili Ala; Ile51 je supstituisan za Leu, Val, Thr, Ser ili Asn; His 52 je supsituisan za Asp, Leu, Asn, Ser ili Tyr; Asn 53 je supstituisan za Ala, Gly, Tyr, Ser, Lys ili Thr; Ser 54 je supsituisan za Asn, Thr, Lys, Asp ili Gly; Asn 56 je supsituisan za Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Val, Ser ili Ala; i/ili Asn 58 je supsituisan za Lys, Thr, Ser, Asp, Arg, Gly, Phe ili Tyr.
[0102] Kanonijski primeri za CDRH3 kao što su navedeni u SEQ ID NO:13, njihova varijanta, CDRH1 prema SEQ ID NO:17 ili odgovarajući CDR su: Val 102 je supsituisan za Tyr, His, Ile, Ser, Asp ili Gly.
[0103] Kanonijski primeri za CDRL1 kao što su navedeni u SEQ ID NO:14, njihova varijanta, CDRL1 prema SEQ ID NO:19 ili odgovarajući CDR su: Asn 28 je supsituisan za Ser, Asp, Thr ili Glu; Val 29 je supsituisan za Ile; Asn 30 je supstituisan za Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Ser, Phe, His, Gly ili Thr; Ser 31 je supsituisan za Asn, Thr, Lys ili Gly; Asn 32 je supstituisan za Phe, Tyr, Ala, His, Ser ili Arg; Val 33 je supsituisan za Met, Leu, Ile ili Phe; Ala 34 je supsituisan za Gly, Asn, Ser, His, Val ili Phe.
[0104] Kanonijski primeri za CDRL2 kao što su navedeni u SEQ ID NO:15, njihova varijanta, CDRL1 prema SEQ ID NO:19 ili odgovarajući CDR su: Ala 51 je supsituisan za Thr, Gly ili Val.
[0105] Kanonijski primeri za CDRL3 kao što su navedeni u SEQ ID NO:16, njihova varijanta, CDRL1 prema SEQ ID NO:19 ili odgovarajući CDR su: Gln 89 je supsituisan za Ser, Gly, Phe ili Leu; Gln 90 je supsituisan za Asn ili His; Cys 91 je supsituisan za Asn, Phe, Gly, Ser, Arg, Asp, His, Thr, Tyr ili Val; Asn 92 je supsituisan za Tyr, Trp, Thr, Ser, Arg, Gln, His, Ala ili Asp; Asn 93 je supsituisan za Glu, Gly, His, Thr, Ser, Arg ili Ala; Tyr 94 je supsituisan za Asp, Thr, Val, Leu, His, Asn, Ile, Trp, Pro ili Ser; i/ili Phe 96 je supsituisan za Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile ili Trp.
[0106] Mogu postojati višestruke varijante CDR kanonijskih položaja po CDR, po odgovarajućem CDR, po vezujućoj jedinici, po varijabilnom regionu teškog ili lakog lanca, po teškom ili lakom lancu i po antigen-vezujućem proteinu, i prema tome bilo koja kombinacija supstitucije može biti prisutna u antigen-vezujućem proteinu prema pronalasku, uz uslov da je kanonijska struktura CDR održavana tako da je antigen-vezujući protein sposoban da specifično vezuje SAP.
[0107] kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, određena kanonijska strukturna klasa CDR je definisana dužinom CDR i pakovanjem petlje, određenim ostacima lociranim na ključnim položajima u CDR regionima i okvirnim regionima.
[0108] Na taj način pored CDR regiona navedenih u SEQ ID NO: 1-6 ili 11-16, CDR regioni prema SEQ ID NO:7, 9, 17 ili 19, odgovarajući CDR regioni, vezujuće jedinice ili njihove varijante, kanonijski okvirni ostaci antigen-vezujućeg proteina prema pronalasku mogu da obuhvataju (upotrebom Kabat numeracije): težak lanac: Val, Ile ili Gly na položaju 2; Leu ili Val na položaju 4; Leu, Ile, Met ili Val na položaju 20; Cys na položaju 22; Thr, Ala, Val, Gly ili Ser na položaju 24; Gly na položaju 26; Ile, Phe, Leu ili Ser na položaju 29; Trp na položaju 36; Trp ili Tyr na položaju 47; Ile, Met, Val ili Leu na položaju 48; Ile, Leu, Phe, Met ili Val na položaju 69; Val, Ala ili Leu na položaju 71; Ala, Leu, Val, Tyr ili Phe na položaju 78; Leu ili Met na položaju 80; Tyr ili Phe na položaju 90; Cys na položaju 92; i/ili Arg, Lys, Gly, Ser, His ili Asn na položaju 94. Laki lanac: Ile, Leu ili Val na položaju 2; Val, Gln, Leu ili Glu na položaju 3; Met ili Leu na položaju 4; Cys na položaju 23; Trp na položaju 35; Tyr, Leu ili Phe na položaju 36; Leu, Arg ili Val na položaju 46; Tyr, His, Phe ili Lys na položaju 49; Tyr ili Phe na položaju 71; Cys na položaju 88; i/ili Phe na položaju 98.
[0109] U posebnom primeru izvođenja, okvir teškog lanca sadrži sledeće ostatke: Val na položaju 2, Leu na položaju 4, Val na položaju 20, Cys na položaju 22, Ala na položaju 24, Gly na položaju 26, Phe na položaju 29, Trp na položaju 36, Trp na položaju 47, Met na položaju 48, Ile na položaju 69, Ala na položaju 71, Ala na položaju 78, Met na položaju 80, Tyr na položaju 90, Cys na položaju 92 i Arg na položaju 94; i okvir lakog lanca sadrži
2
sledeće ostatke: Ile na položaju 2, Gln na položaju 3, Met na položaju 4, Cys na položaju 23, Trp na položaju 35, Tyr na položaju 36, Leu na položaju 46, His na položaju 49, Phe na položaju 71, Cys na položaju 88 i Phe na položaju 98.
[0110] Bilo koji, bilo koja kombinacija ili svi okvirni položaji opisani u prethodnom tekstu mogu biti prisutni u antigen-vezujućem proteinu kao što je ovde opisano. Mogu postojati višestruki varijantni okvirni kanonijski položaji po varijabilnom regionu teškog ili lakog lanca, po teškom ili lakom lancu, i po antigen-vezujućem proteinu, i prema tome bilo koja kombinacija može biti prisutna u antigen-vezujućem proteinu prema pronalasku, uz uslov da je zadržana kanonijska struktura okvira.
[0111] Humanizovani varijabilni domen teškog lanca može da sadrži CDR regione navedene u SEQ ID NO:1-3; varijante CDR regiona; odgovarajuće CDR regione u SEQ ID NO:7; vezujuće jedinice; ili njihove varijante, unutar okvira akceptorskog antitela koji ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti u okvirnim regionima sa sekvencom humanog akceptorskog varijabilnog domena u SEQ ID NO:25. Humanizovani varijabilni domen lakog lanca može da sadrži CDR regione navedene u SEQ ID NO:4-6; varijante CDR regiona; odgovarajuće CDR regione u SEQ ID NO:9; vezujuće jedinice; ili njihove varijante, unutar okvira akceptorskog antitela koji ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti u okvirnim regionima sa sekvencom humanog akceptorskog varijabilnog domena u SEQ ID NO:32.
[0112] Varijabilni domen humanizovanog teškog lanca može da sadrži CDR regione navedene u SEQ ID NO:11-13; varijante CDR regiona; odgovarajuće CDR regione u SEQ ID NO:17; vezujuće jedinice; ili njihove varijante, unutar okvira akceptorskog antitela koji ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti u okvirnim regionima sa sekvencom humanog akceptorskog varijabilnog domena u SEQ ID NO:25. Varijabilni domen humanizovanog lakog lanca može da sadrži CDR regione navedene u SEQ ID NO:14-16; varijante CDR regiona; odgovarajuće CDR regione u SEQ ID NO:19; vezujuće jedinice; ili njihove varijante, unutar okvira akceptorskog antitela koji ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti u okvirnim regionima sa sekvencom humanog akceptorskog varijabilnog domena u SEQ ID NO:32.
[0113] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i sadrži varijabilni region teškog lanca izabran od bilo kog od SEQ ID NO:27-31. Antigen-vezujući protein može da sadrži varijabilni region lakog lanca izabran od bilo kog od SEQ ID NO:34-36. Bilo koji od varijabilnih regiona teškog lanca mogu biti kombinovani sa bilo kojim od varijabilnih regiona lakog lanca.
[0114] Antigen-vezujući protein može da sadrži bilo koju od sledećih kombinacija varijabilnog regiona teškog lanaca i lakog lanca: H0L0 (SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:34), H0L1 (SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:35), H0L2 (SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:36), H1L0 (SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:34), H1L1 (SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:35), H1L2 (SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:36), H2L0 (SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:34), H2L1 (SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:35), H2L2 (SEQ ID NO:29 i SEQ ID NO:36), H3L0 (SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:34), H3L1 (SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:35), H3L2 (SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:36), H4L0 (SEQ ID NO:31 i SEQ ID NO:34), H4L1 (SEQ ID NO:31 i SEQ ID NO:35), ili H4L2 (SEQ ID NO:31 i SEQ ID NO:36).
[0115] Predmetna specifikacija opisuje antigen-vezujući protein koji se specifično vezuje za SAP i sadrži varijabilni region teškog lanca izabran od bilo kog od SEQ ID NO:37-40. Antigen-vezujući protein može da sadrži varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 ili SEQ ID NO:74. Bilo koji od varijabilnih regiona teškog lanca može biti kombinovan sa bilo kojim od varijabilnih regiona lakog lanca.
[0116] Antigen-vezujući protein može da sadrži bilo koju od sledećih kombinacija varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca: H0L0 (SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:41), H0L1 (SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:42), H1L0 (SEQ ID NO:38 i SEQ ID NO:41), H1L1 (SEQ ID NO:38 i SEQ ID NO:42), H2L0 (SEQ ID NO:39 i SEQ ID NO:41), H2L1 (SEQ ID NO:39 i SEQ ID NO:42), H3L0 (SEQ ID NO:40 i SEQ ID NO:41), ili H3L1 (SEQ ID NO:40 i SEQ ID NO:42).
[0117] L0 (SEQ ID NO:41) može biti supstituisan sa L091 A (SEQ ID NO:74).
[0118] Varijabilni region teškog lanca antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:28. Varijabilni region lakog lanca antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:35.
[0119] Varijabilni region teškog lanca antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:40. Varijabilni region lakog lanca antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:41. Varijabilni region lakog lanca
2
antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:74.
[0120] Varijabilni region teškog lanca antitela može biti varijanta bilo koje od SEQ ID NO:27-31 koja sadrži 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija. Varijabilni region lakog lanca antitela može biti varijanta bilo koje od SEQ ID NO:34-36 koja sadrži 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija.
[0121] Varijabilni region teškog lanca antitela može biti varijanta bilo koje od SEQ ID NO:37-40 koja sadrži 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija. Varijabilni region lakog lanca antitela može biti varijanta prema SEQ ID NO:41, 42 ili 74 koja sadrži 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija.
[0122] Na primer, kanonijski CDR regioni i supstitucije kanonijskih okvirnih ostataka opisane u prethodnom tekstu mogu takođe biti prisutni u varijanti varijabilnih regiona teškog ili lakog lanca kao varijante sekvenci koje su najmanje 75% identične ili koje sadrže do 30 aminokiselinskih supstitucija.
[0123] Bilo koji varijabilni regioni teškog lanca mogu biti kombinovani sa pogodnim humanim konstantnim regionom. Bilo koji od varijabilnih regiona lakog lanca mogu biti kombinovani sa pogodnim konstantnim regionom.
[0124] Antigen-vezujući protein prema pronalasku može da sadrži težak lanac prema SEQ ID NO:62 i/ili varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO:64.
[0125] Težak lanac antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:62. Laki lanac antitela može da ima 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100% identičnosti sa SEQ ID NO:64.
[0126] Težak lanac antitela može biti varijanta bilo koje od SEQ ID NO:62 koja sadrži 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija. Laki lanac antitela može biti varijanta bilo koje od SEQ ID NO:64 koja sadrži 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija.
[0127] Diskoliki SAP molekul ima dva lica. Pojedinačni alfa heliks prisutan na svakoj od 5 protomera smešten je na A licu. Džep za vezivanje liganda zavisno od kalcijuma svakog promotora nalazi se na B licu i i ovo lice je stoga zaklonjeno kada je SAP vezan za amiloidna vlakna. Da bi antigen-vezujući proteini ovog pronalaska imali terapeutsku upotrebu, epitop
2
prepoznat od strane ovde opisanog antigen-vezujućeg proteina je poželjno dostupan u SAP kada je SAP vezan za amiloidne naslage i stoga je smešten na A licu ili na ivicama SAP molekula. Antigen-vezujući protein tada može prepoznati i vezati se za amiloid vezani SAP, što dovodi do aktivacije komplementa koja inicira efikasni makrofag zavisni mehanizam uklanjanja u telu. Shodno tome, u primeru izvođenja pronalaska antigen-vezujući protein vezuje humani SAP koji je vezan za amiloidna vlakna in vivo. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, antigen-vezujući protein se vezuje za A lice humanog SAP.
[0128] Antigen-vezujući protein može biti poreklom od pacova, miša, zeca, kamile (ili srodne vrste kamelida), ili primata (npr. makaki, majmuna Starog sveta, čovekolikih majmuna ili čoveka). U posebnom primeru izvođenja antigen-vezujući protein je poreklom od miša. U sledećem primeru izvođenja antigen-vezujući protein je poreklom od čoveka. Antigenvezujući protein može biti humanizovano ili himerno antitelo. Antigen-vezujući protein može biti humano antitelo. Antigen-vezujući protein nije mišje antitelo.
[0129] Antigen-vezujući protein može da sadrži konstantni region, koji može biti bilo kog izotipa ili podklase. Konstantni region može biti IgG izotipa, na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njihove varijante. Konstantni region antigen-vezujućeg proteina može biti IgGl. Antigen-vezujući protein koji je ovde opisan sadrži konstantni region koji je funkcionalan u aktivaciji komplementa npr. humani IgG1, IgG2 ili IgG3.
[0130] Antigen-vezujući protein koji je ovde opisan sadrži konstantni region koji je funkicionalan u vezivanju makrofaga npr. humani IgG1 ili IgG3.
[0131] Antigen-vezujući protein koji je ovde opisan sadrži konstantni region koji je funkicionalan kako u aktivaciji komplementa tako i u vezivanju makrofaga npr. humani IgG1 ili IgG3.
[0132] Antigen-vezujući protein može da sadrži jednu ili više modifikacija izabranih od mutiranog konstantnog domena tako da antitelo ima promenjene efektorne funkcije/ADCC i/ili aktivaciju komplementa. Primeri pogodnih modifikacija su opisani u Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604, Lazar et al. PNAS (2006) 103: 4005-4010 i US6737056, WO2004063351 i WO2004029207.
[0133] Antigen-vezujući protein može da sadrži konstantni domen sa promenjenim glikozilacionim profilom tako da antigen-vezujući protein ima promenjene efektorne funkcije/ADCC i/ili aktivaciju komplementa. Primeri pogodnih metodologija za proizvodnju antigen-vezujućeg proteina sa promenjenim profilom glikozilacije opisani su u WO2003/011878, WO2006/014679 i EP1229125.
2
[0134] Antigen-vezujući proteini kao što su opisani ovde su izabrani koji nemaju ostatke unutar regiona koji su odgovorni za vezivanje antigena, npr. CDR regiona, koji su podložni deamidaciji. Antigen-vezujući proteini kao što su ovde opisani su izabrani koji nemaju ostatke unutar regiona odgovorne za aktivaciju komplementa koji su podložni demidaciji.
[0135] Predmetna specifikacija opisuje molekul nukleinske kiseline koji kodira antigenvezujući protein kao što je ovde opisan. Molekul nukleinske kiseline može da sadrži sekvence koje kodiraju obe, varijabilnu ili sekvencu pune dužine teškog lanca; i varijabilnu ili sekvencu pune dužine lakog lanca. Alternativno, molekul nukleinske kiseline koji kodira antigenvezujući protein koji je ovde opisan može da sadrži sekvence koje kodiraju varijabilnu ili sekvencu pune dužine teškog lanca; ili varijabilnu ili sekvencu pune dužine lakog lanca.
[0136] Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca može da sadrži bilo koju od SEQ ID NO:51 ili 53-57. Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region lakog lanca može da sadrži bilo koju od SEQ ID NO:52 or 58-60.
[0137] Molekul nukleinske kiseline koji kodira težak lanac može da sadrži SEQ ID NO:61. Molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac može da sadrži SEQ ID NO:63.
[0138] Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca može da sadrži bilo koju od SEQ ID NO:65 ili 67-70. Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region lakog lanca može da sadrži bilo koju od SEQ ID NO:66 ili 71-73.
[0139] Molekul nukleinske kiseline može takođe da sadrži jednu ili više nukleotidnih supstitucija koje ne menjaju aminokiselinsku sekvencu kodiranog teškog i/ili lakog lanca.
[0140] Predmetna specifikacija opisuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline kao što je ovde opisan. Predmetni pronalazak daje rekombinantnu ćeliju domaćina, koja sadrži ekspresioni vektor kao što je ovde opisan.
[0141] Ovde opisani antigen-vezujući protein može se stvoriti u pogodnoj ćeliji domaćinu. Postupak za proizvodnju antigen-vezujućeg proteina kao što je ovde opisan može sadržati korak kultivacije ćelije domaćina kao što je ovde opisan i rekuperaciju antigen-vezujućeg proteina. Rekombinantna transformisana, transficirana ili transdukovana ćelija domaćin može sadržati najmanje jednu ekspresionu kasetu, gde pomenuta ekspresiona kaseta sadrži polinukletid koji kodira teški lanac antigen-vezujućeg proteina opisanog ovde i dodatno sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac antigen-vezujućeg proteina koji je ovde opisan. Alternativno, rekombinantna transformisana, transficirana, ili transdukovana ćelija domaćin može sadržati najmanje jednu ekspresionu kasetu, gde pomenuta prva ekspresiona kaseta sadrži polinukletid koji kodira teški lanac antigen vezujućeg proteina opisanog ovde i dodatno sadrži drugu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac antitela koje je ovde
2
opisan. Stabilno transformisana ćelija domaćin može sadržati vektor koji sadrži jednu ili više ekspresionih kaseta koje kodiraju teški lanac i/ili laki lanac antigen-vezujućeg proteina koji je ovde opisan. Na primer takve ćelije domaćini mogu sadržati prvi vektor koji kodira laki lanac i drugi vektor koji kodira teški lanac.
[0142] Ćelija domaćin može biti eukariotska, na primer sisarska. Primeri takvih ćelijskih linija uključuju CHO ili NS0. Ćelija domaćin se može kultivisati u medijumu kulture, na primer medijumu kulture bez seruma. Antigen-vezujući protein se može izlučiti od strane ćelija domaćina u medijum kulture. Antigen-vezujući protein se može prečistiti do najmanje 95% ili više (npr. 98% ili više) u odnosu na pomenuti medijum kulture koji sadrži antigenvezujući protein.
[0143] Može se obezbediti farmaceutska kompozicija koja sadrži antigen-vezujući protein i farmaceutski prihvatljiv nosač. Može se obezbediti komplet koj sadrži farmaceutsku kompoziciju zajedno sa uputstvima za upotrebu. Kao pogodnost, komplet može sadržati reagense u predefinisanim količinama sa uputstvima za upotrebu.
Strukture antitela
Intaktna antitela
[0144] Laki lanci antitela iz većine vrsta kičmenjaka mogu se svrstati u jedan od dva tipa nazvani Kapa i Lambda na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog regiona. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog regiona teških lanaca, humana antitela se mogu svrstati u pet različitih klasa, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. IgG i IgA dalje podeljenih u potklase, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4; i IgA1 i IgA2. Postoje varijante za vrste pri čemu miš i pacov imaju najmanje IgG2a, IgG2b.
[0145] Konzervativniji delovi varijabilnog regiona nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen intaktnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FR povezana sa tri CDRs. CDRs u svakom lancu su zajedno blisko postavljeni preko FR regiona i sa CDRs iz drugog lanca doprinose formiranju antigen vezujućeg mesta antitela.
[0146] Konstantni regioni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali imaju različite efektorske funkcije kao što je učestvovanje u ćelijski-posredovanoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), fagocitozi preko vezivanja za Fcγ receptor, stopa polu-života/klirensa preko neonatalnog Fc receptora (FcRn) i aktivacija komplementa preko C1q komponente, što vodi hemotaktičkim, opsonizujućim i, potencijalno u slučaju vijabilnog ćelijskog ciljnog antigena,
2
citolitičkim aktivnostima komplementa. Humana antitela IgG1 klase su najpotentnija u aktiviranju sistema komplementa i stoga su poželjni izotip za terapeutsku primenu antitela ovog pronalaska.
[0147] Objavljeno je da humani IgG2 konstantni region suštinski nema sposobnost da aktivira komplement preko klasičnog puta ili da posreduje u antitelo-zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti. Objavljeno je da humani IgG4 konstantni region suštinski nema sposobnost da aktivira komplement preko klasičnog puta ili da samo slabo posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela. Antitela koja suštinski nemaju ove efektorske funkcije mogu se označiti kao ’ne-litička’ antitela.
Humana antitela
[0148] Humana antitela mogu biti proizvedena pomoću određenog broja postupaka poznatih stručnjaku iz date oblasti tehnike. Humana antitela mogu biti pripremljena pomoću postupka hibridoma upotrebom humanih mijeloma ili mišjih-humanih heteromijeloma ćelijskih linija videti Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001, i Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Alternativni postupci obuhvataju upotrebu fagnih biblioteka ili transgenih miševa od kojih oba mogu da koriste repertoare humanog varijabilnog regiona (videti Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23).
[0149] Nekoliko sojeva transgenih miševa su sada dostupni u kojima su njihovi mišji imunoglobulinski lokusi zamenjeni genskim segmentima humanog imunoglobulina (videti Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851; Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156). Nakon izlaganja antigenu takvi miševi su sposobni da proizvode repertoar humanih antitela od kojih mogu biti izabrana antitela od interesa.
[0150] Tehnologija fagnog prikaza može biti korišćena za proizvodnju humanih antigenvezujućih proteina (i njihovih fragmenata), videti McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 i Griffiths et al. (1994) EMBO 13: 3245-3260.
[0151] Tehnika afinitetnog sazrevanja (Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783) može biti korišćena za poboljšanje vezujućeg afiniteta pri čemu je afinitet primarnog humanog antitela poboljšan sekvencijalnom zamenom varijabilnih regiona teškog (H) i lakog (L) lanca sa prirodnim varijantama i izbor na osnovu poboljšanih vezujućih afiniteta. Varijante ove tehnike kao što je "imprintovanje epitopa" su sada takođe dostupne, videti na primer WO 93/06213; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res.21: 2265-2266.
Himerna i humanizovana antitela
[0152] Himerna antitela se tipično proizvode korišćenjem postupaka rekombinantne DNK. DNK koja kodira antitela (npr. cDNK) je izolovana i sekvencirana korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju H i L lance antitela. Ćelija hibridoma služe kao tipični izvor takve DNK. Po izolovanju, DNK se stavlja u ekspresione vektore koji su zatim transficirani u ćelije domaćine kao što je E. coli, COS ćelije, CHO ćelije ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein da bi se dobila sinteza antitela. DNK može biti modifikovana supstitucijom kodirajuće sekvence za humane L i H lance sa odgovarajućim ne-humanim (npr. mišjim) H i L konstantnim regionima, videti na primer Morrison (1984) PNAS 81: 6851.
[0153] Veliko smanjenje imunogenosti može se postići graftovanjem samo CDRs ne-humanih (npr. mišjih) antitela ("donorska" antitela) u humani okvirni region ("akceptorski okvirni region") i konstantnih regiona da bi se stvorila humanizovana antitela (videti Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536). Međutim, CDR grafting per se ne mora rezultirati kompletnim zadržavanjem antigen-vezujućih karakteristika i često se događa da se neki ostaci okvirnog regiona (ponekad označeni kao "povratne mutacije") donorska antitela moraju očuvati u humanizovanom molekulu ukoliko treba povratiti značajni antigen vezujući afinitet (videti Queen et al. (1989)PNAS 86: 10,029-10,033: Co et al. (1991) Nature 351: 501-502). U ovom slučaju, humani varijabilni regioni koji pokazuju najveću homologiju sekvence sa ne-humanim donorskim antitelom su izabrani iz baze podataka da bi se obezbedio humani okvirni region (FR). Izbor humanih FRs može se izvršiti ili iz humanih konsenzus ili individualnih humanih antitela. Po potrebi, ključni ostaci iz donorskih antitela mogu se supstituisati u humani akceptorski okvirni region da bi se očuvale konformacije CDR. Može se koristiti kompjutersko modelovanje antitela da bi se pomoglo u identifikaciji takvih strukturno važnih ostataka, videti WO 99/48523.
[0154] Alternativno, humanizacija se može postići "veneering" procesom. Statistička analiza jedinstvenih humanih i mišjih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina otkrila je da su tačni obrasci izloženih ostataka različiti kod humanih i mišjih antitela, i većina individualnih površinskih pozicija ima snažnu preferencu za mali broj različitih ostataka
1
(videti Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498; i Pedersen et al. (1994) J. Mol.Biol.
235: 959-973). Stoga je moguće smanjiti imunogenost ne-humanog Fv zamenom izloženih ostataka u njihovom okvirnom regionu koji se razlikuju od onih koji se obično nalaze u humanim antitelima. Kako se antigenost proteina može dovesti u korelaciju sa površinskom dostupnošću, zamena površinskih ostataka može biti dovoljna da učini mišji varijabilni region "nevidljivim" za humani imuni sistem (videti takođe Mark et al. (1994) u Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134). Ova procedura humanizacije je označena kao "veneering" jer je izmenjena samo površina antitela, pri čemu okolni ostaci ostaju nepromenjeni. Dodatni alternativni pristupi uključuju one date u WO04/006955 i proceduru Humaneering™ (Kalobios) koje koriste bakterijske ekspresione sisteme i proizvode antitela koja su data u sekvenci sa humanom klicinom linijom (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California).
[0155] Bispecifičan antigen-vezujući protein je antigen-vezujući protein koji ima vezujuće specifičnosti za najmanje dva različita epitopa. Postupci za pripremu takvih antigen-vezujućih proteina su poznati u stanju tehnike. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antigen-vezujućih proteina je zasnovana na ko-ekspresiji dva para H lanca-L lanca imunoglobulina, gde dva H lanca imaju različite vezujuće specifičnosti, videti Millstein et al. (1983) Nature 305: 537-539; WO 93/08829; i Traunecker et al. (1991) EMBO 10: 3655-3659. Zbog slučajnog sortiranja H i L lanaca, proizvedena je potencijalna smeša deset različitih struktura antitela od kojih samo jedno ima željenu vezujuću specifičnost. Alternativni pristup obuhvata fuzionisanje varijabilnih domena sa željenim vezujućim specifičnostima sa konstantnim regionom teškog lanca koji sadrži najmanje deo zglobnog regiona, CH2 i CH3 regione. CH1 region koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca može biti prisutan u najmanje jednoj od fuzija. DNK koja kodira ove fuzije, i ako je poželjno L lanac su inserirani u posebne ekspresione vektore i zatim su kotransficirani u pogodan organizam domaćina. Ipak je moguće inserirati kodirajuće sekvence za dva ili sva tri lanca u jedan ekspresioni vektor. U jednom pristupu, bispecifično antitelo je sastavljeno od H lanca sa prvom vezujućom specifičnošću u jednoj grani i par H-L lanaca, obezbeđujući drugu vezujuću specifičnost u drugoj grani, videti WO 94/04690. Takođe videti Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210.
Antigen-vezujući fragmenti
2
[0156] Fragmenti koji nemaju konstantni region nemaju sposobnost za aktivaciju komplementa putem klasičnog puta ili za posredovanje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela. Tradicionalno takvi fragmenti su proizvedeni pomoću proteolitičke digestije intaktnih antitela pomoću npr. digestije papainom (videti na primer, WO 94/29348), ali mogu biti proizvedeni direktno od rekombinantno transformisanih ćelija domaćina. Za proizvodnju ScFv, videti Bird et al. (1988) Science 242: 423-426. Pored toga, antigen-vezujući fragmenti mogu biti proizvedeni upotrebom različitih tehnika konstrukcije kao što su opisane u daljem tekstu.
[0157] Fv fragmenti izgleda da imaju nižu energiju interakcije njihova dva lanca od Fab fragmenata. Da bi se stabilizovala veza VH i VL domena, oni su vezani sa peptidima (Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883), disulfidnim mostovima (Glockshuber et al. (1990) Biochemistry 29: 1362-1367) i mutacijama "ključ u bravu" (Zhu et al. (1997) Protein Sci., 6: 781-788). ScFv fragmenti mogu biti proizvedeni pomoću postupaka dobro poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike, videti Whitlow et al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105 i Huston et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217. ScFv može biti proizveden u bakterijskim ćelijama kao što je E. coli ili u eukariotskim ćelijama. Jedan nedostatak ScFv je monovalentnost proizvoda, koji isključuje povećani aviditet zbog polivalentnog vezivanja, i njihov kratak polu-život. Pokušaji za prevazilaženje ovih problema obuhvataju bivalentni (ScFv’)2proizveden od ScFv koji sadrži dodatni C-terminalni cistein pomoću hemijskog kuplovanja (Adams et al. (1993) Can. Res 53: 4026-4034; i McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8: 301-314) ili pomoću spontane dimerizacije ScFv, specifične za mesto, koji sadrži nespareni C-terminalni cisteinski ostatak (videti Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biophys 26: 187-204). Alternativno, ScFv može biti prinuđen da formira multimere skraćivanjem peptidnog linkera do 3 do 12 ostataka da bi se formirala"diatela", videti Holliger et al. (1993) PNAS 90: 6444-6448. Redukcija linkera može dalje da rezultuje u ScFv trimerima ("triatela", videti Kortt et al. (1997) Protein Eng 10: 423-433) i tetramerima ("tetratela", videti Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168). Konstrukcija bivalentnih ScFv molekula takođe može biti postignuta pomoću genetičke fuzije sa protein dimerizujućim motivima tako da se formiraju "miniantitela" (videti Pack et al. (1992) Biochemistry 31: 1579-1584) i "minitela" (videti Hu et al. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061). ScFv-Sc-Fv tandemi ((ScFV)2) mogu takođe biti proizvedeni vezivanjem dve ScFv jedinice pomoću trećeg peptidnog linkera, videti Kurucz et al. (1995) J. Immol. 154: 4576-4582. Bispecifična diatela mogu biti proizvedena preko ne-kovalentnog vezivanja dva jednolančana fuziona proizvoda koji se sastoje od VH domena iz jednog antitela vezana preko kratkog linkera za VL domen drugog antitela, videti Kipriyanov et al. (1998) Int. J. Can 77: 763-772. Stabilnost takvih bispecifičnih diatela može biti pojačana uvođenjem disulfidnih mostova ili mutacija "ključ u bravu" kao što su opisani u prethodnom tekstu ili putem formiranja jednolančanih diatela (ScDb) gde su dva hibridna ScFv fragmenta vezana preko peptidnog linkera videti Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods 226:179-188. Tetravalentni bispecifični molekuli su dostupni pomoću npr. fuzionisanja ScFv fragmenta za CH3 domen molekula IgG ili za Fab fragment preko zglobnog regiona, videti Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163. Alternativno, tetravalentni bispecifični molekuli su stvoreni fuzijom bispecifičnih jednolančanih diatela (videti Alt et al. (1999) FEBS Lett 454: 90-94. Manji tetravalentni bispecifični molekuli takođe mogu biti formirani pomoću dimerizacije ScFv-ScFv tandema sa linkerom koji sadrži motiv spirala-petlja-spirala (DiBi miniantitela, videti Muller et al. (1998) FEBS Lett 432: 45-49) ili jednolančanog molekula koji sadrži četiri varijabilna domena antitela (VH i VL) u orijentaciji koja sprečava intramolekularno sparivanje (tandem diatelo, videti Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol.293: 41-56). Bispecifični F(ab’)2fragmenti mogu biti stvoreni pomoću hemijskog kuplovanja Fab’ fragmenata ili pomoću heterodimerizacije preko leucinskih zatvarača (videti Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225; i Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553). Takođe su dostupni izolovani VH i VL domeni (Domantis plc), videti US 6,248,516; US 6,291,158; i US 6,172,197.
Heterokonjugatna antitela
[0158] Heterokonjugatna antitela su sastavljena od dva kovalentno spojena antitela formirana upotrebom bilo kojih pogodnih unakrsno-vezujućih molekula. Videti, na primer, US 4,676,980.
Ostale modifikacije
[0159] Antigen-vezujući proteini prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže ostale modifikacije za pojačanje ili promenu njihovih efektornih funkcija. Veruje se da interakcija između Fc regiona antitela i različitih Fc receptora (FcγR) posreduje u efektornim funkcijama antitela koje obuhvataju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fiksaciju komplementa, fagocitozu i polu-život/klirens antitela. Različite modifikacije Fc regiona antitela mogu biti izvedene u zavisnosti od željene osobine. Na primer, specifične mutacije u
4
Fc regionu za prevođenje inače litičkog antitela u ne-litičko detaljno su opisane u EP 0629240 i EP 0307434 ili je moguće ugraditi spašavajući epitop koji se vezuje za receptor u antitelo za povećanje polu-života u serumu videti US 5,739,277. Humani Fcγ receptori obuhvataju FcγR (I), FcyRlla, FcyRllb, FcyRllla i neonatalni FcRn. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604 su pokazali da je zajednička grupa IgG1 ostataka uključena u vezivanje svih FcyRs, dok FcγRII i FcγRIII koriste posebna mesta izvan ove zajedničke grupe. Jedna grupa IgG1 ostataka smanjila je vezivanje za sve FcyRs kada je promenjena u alanin: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 i Pro-239. Svi su u IgG CH2 domenu i grupisani blizu zglobnog spoja CH1 i CH2. Dok FcγRI koristi samo zajedničku grupu IgG1 ostataka za vezivanje, FcγRII i FcγRIII interaguju sa posebnim ostacima pored zajedničke grupe. Promena nekih ostataka smanjila je vezivanje samo za FcγRII (npr. Arg-292) ili FcγRIII (npr. Glu-293). Neke varijante su pokazale poboljšano vezivanje za FcγRII ili FcγRIII, ali nisu uticale na vezivanje za drugi receptor (npr. Ser-267Ala poboljšao je vezivanje za FcγRII, ali vezivanje za FcγRIII nije bilo pogođeno). Ostale varijante ispoljile su poboljšano vezivanje za FcγRII ili FcγRIII sa redukcijom u vezivanju za drugi receptor (npr. Ser-298Ala poboljšao je vezivanje za FcγRIII i smanjio vezivanje za FcγRII). Za FcyRllla, najbolje vezujuće IgG1 varijante imale su kombinovane supstitucije alanina na Ser-298, Glu-333 i Lys-334. Veruje se da je neonatalni FcRn receptor uključen u klirens antitela i transcitozu u tkivima (videti Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57; i Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766). Humani IgG1 ostaci određeni tako da interaguju direktno sa humanim FcRn obuhvataju Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 i His435. Supstitucije na bilo kom od položaja opisanih u ovom delu mogu da omoguće povećani polu-život u serumu i/ili promenjene efektorne osobine antitela.
[0160] Ostale modifikacije obuhvataju glikozilacione varijante antitela. Poznato je da glikozilacija antitela na konzervativnim položajima u njihovim konstantnim regionima ima izražen efekat na funkciju antitela, naročito efektorno funkcionisanje kao što su ona opisana u prethodnom tekstu, videti na primer, Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318. Razmatrane su glikozilacione varijante antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata u koje je jedna ili više ugljenohidratnih grupa dodata, supstituisana, deletirana ili modifikovana. Uvođenje asparagin-X-serin ili asparagin-X-treonin motiva stvara potencijalno mesto za enzimatsko vezivanje ugljenohidratnih grupa i može prema tome biti korišćeno za manipulaciju glikozilacije antitela. U Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876 terminalna sialiacija TNFR-IgG imunoadhezina je povećana preko postupka regalaktozilacije i/ili resialilacije upotrebom beta-1,4-galaktoziltransferaze i/ili alfa, 2,3 sialiltransferaze.
Veruje se da povećanje terminalne sialilacije povećava polu-život imunoglobulina. Antitela, zajedno sa većinom glikoproteina, su tipično proizvedena kao smeša glikoformi. Ova smeša je naročito vidljiva kada su antitela proizvedena u eukariotskim, naročito sisarskim ćelijama. Različiti postupci su razvijeni za proizvodnju definisanih glikoformi, videti Zhang et al. (2004) Science 303: 371: Sears et al. (2001) Science 291: 2344; Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727. Antitela (na primer IgG izotipa, npr. IgG1) kao što su ovde opisana mogu da sadrže definisani broj (npr.7 ili manje, na primer 5 ili manje, kao što je dva ili jednu) glikoformi.
[0161] Antitela mogu biti spojena sa ne-proteinskim polimerom kao što je polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol ili polioksialkilen. Konjugacija proteina za PEG je ustanovljena tehnika za povećanje polu-života proteina, kao i redukcija antigenosti i imunogenosti proteina. Upotreba PEGilacije sa različitim molekulskim težinama i stilovima (linearna ili granata) ispitivana je sa intaktnim antitelima kao i Fab’ fragmentima, videti Koumenis et al. (2000) Int. J. Pharmaceut.198: 83-95.
Postupci za proizvodnju
[0162] Antigen vezujući proteini mogu se proizvesti u transgenim organizmima kao što su koze (videti Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157), kokoške (videti Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55, miševi (videti Pollock et al.) ili biljkama (videti Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol.11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med.4: 601-606; Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol.42: 583-590).
[0163] Antigen vezujući proteini se takođe mogu proizvesti hemijskom sintezom. Međutim, antigen vezujući proteini se tipično proizvode korišćenjem tehnologije kultivisanja rekombinantnih ćelija koja je dobro poznata stručnjacima. Polinukleotid koji kodira antigen vezujući protein je izolovan i ubačen u replicirajući vektor kao što je plazmid za dalje kloniranje (amplifikaciju) ili ekspresiju. Jedan ekspresioni sistem je sistem glutamat sintetaze (kao što prodaje Lonza Biologics), naročito gde je ćelija domaćin CHO ili NS0. Polinukleotid koji kodira antigen vezujući protein se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. oligonukleotidnih proba). Vektori koji se mogu koristiti uključuju plazmid, virus, fag, transpozone, minihromozome, od kojih se tipično koriste plazmidi. Generalno takvi vektori dalje uključuju signalnu sekvencu, oridžin replikacije, jedan ili više marker gena, pojačivački element, promotor i sekvence za završetak transkripcije operativno vezane sa polinukleotidom antigen vezujućeg proteina da bi se olakšala ekspresija. Polinukleotid koji kodira lake i teške lance može biti ubačen u zasebne vektore i introdukovan (na primer, transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom ili transdukcijom) u istu ćeliju domaćina istovremeno ili sekvencijalno ili, ukoliko je poželjno, i teški i laki lanac može se ubaciti u isti vektor pre pomenute introdukcije.
[0164] Može se koristiti optimizacija kodona sa namerom da je ukupni nivo proteina proizvedenog od strane ćelije domaćina veći kada je transficiran sa kodon optimizovanim genom u poređenju sa nivoom kada je transficiran sa sekvencom. Nekoliko postupaka je objavljeno (Nakamura et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215; WO98/34640;WO97/11086). Usled redundantnosti genetskog koda, polinukleotidi alternativni onima koji su opisani ovde (naročito oni kodon optimizovani za ekspresiju u datoj ćeliji domaćinu) mogu takođe kodirati ovde opisane antigen vezujuće proteine. Upotreba kodona antigen vezujućeg proteina ovog proteina stoga se može modifikovati da bi se prilagodila sklonost ćelije domaćina prema kodonu u smislu povećanja prinosa transkripta i/ili proizvoda (npr. Hoekema et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24). Izbor kodona može biti zasnovan na pogodnoj kompatibilnosti sa ćelijom domaćinom korišćenom za ekspresiju.
Signalne sekvence
[0165] Antigen vezujući proteini se mogu proizvesti kao fuzioni proteini sa heterolognom signalnom sekvencom koja ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina. Signalna sekvenca bi trebalo da bude prepoznata i obrađena od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćine, signalna sekvenca može biti na primer alkalna fosfataza, penicilinaza, ili toplotno stabilni enterotoksin II lideri. Za sekreciju kvasca signalne sekvence mogu biti na primer lider invertaze kvasca, α faktor lider ili kisela fosfataza lideri videti npr. WO90/13646. U sistemima sisarskih ćelija, mogu biti pogodni virusni sekretorni lideri kao što je herpes simplex gD signal i nativna imunoglobulinska signalna sekvenca. Tipično je signalna sekvenca vezana u okviru čitanja sa DNK koja kodira antigen vezujući protein. Može se koristiti mišja signalna sekvenca kao što je ona prikazana na SEQ ID NO: 79.
Oridžin replikacije
[0166] Oridžin replikacije je dobro poznat u tehnici pri čemu je pBR322 pogodan za većinu gram-negativnih bakterija, 2m plazmid za većinu kvasaca i različiti virusni oridžini kao što je SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV za većinu sisarskih ćelija. Generalno komponenta oridžina replikacije nije potrebna za sisarske ekspresione vektore, ali se može koristiti SV40 jer sadrži rani promotor.
Marker za selekciju
[0167] Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) prenose rezistenciju na antibiotike ili druge toksine npr. ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin ili (b) nadomešćuju auksotrofne deficijencije ili dobavljaju nutrijente koji nisu dostupni u kompleksu medijuma ili (c) su kombinacija oba. Šema selekcije može uključivati sprečavanje rasta ćelije domaćina. Ćelije, koje su uspešno transformisane sa genima koji kodiraju antigen vezujući protein, preživljavaju usled npr. rezistencije na lek prenesene ko-dopremljenim selekcionim markerom. Jedan primer je DHFR selekcioni marker gde su transformanti kultivisani u prisustvu metotreksata. Ćelije mogu biti kultivisane u prisustvu rastućih količina metotreksata da bi se amplifikovao broj kopija egzogenog gena od interesa. CHO ćelije su naročito korisna ćelijska linija za DHFR selekciju. Dodatni primer je ekspresioni sistem glutamat sintetaze (Lonza Biologics). Primer selekcionog gena za upotrebu u kvascima je trp1 gen, videti Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 38.
Promotori
[0168] Pogodni promotori za ekspresiju antigen vezujućih proteina su operabilno vezani sa DNK/polinukleotidom koji kodira antigen vezujući protein. Promotori za prokariotske ćelije domaćine uključuju phoA promotor, beta-laktamaza i laktoza promotor sisteme, alkalnu fosfatazu, triptofan i hibridne promotore kao što je Tac. Promotori pogodni za ekspresiju kod ćelija kvasca uključuju 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime npr. enolazu, gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenazu, heksokinazu, piruvat dekarboksilazu, fosfofruktokinazu, glukoza 6 fosfat izomerazu, 3-fosfoglicerat mutazu i glukokinazu. Inducibilni promotori kvasca uključuju alkohol dehidrogenazu 2, izocitohorm C, kiselu fosfatazu, metalotionein i enzime odgovorne za metabolizam azota ili korišćenje maltoze/galaktoze.
[0169] Promotori za ekspresiju u sistemima sisarskih ćelija uključuju virusne promotore kao što su polioma, virus boginja živine i adenovirusi (npr. adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičiji sarkoma virus, citomegalovirus (naročito neposredni rani genski promotor), retrovirus, hepatitis B virus, aktin, rous sarcoma virus (RSV) promotor i rani ili kasni Simian virus 40. Naravno izbor promotora je zasnovan na pogodnoj kompatibilnosti sa ćelijom domaćinom korišćenom za ekspresiju. Prvi plazmid može sadržati RSV i/ili SV40 i/ili CMV promotor, DNK koja kodira varijabilni region lakog lanca (VL), κC region zajedno sa selekcionim markerima za rezistenciju na neomicin i ampicilin i drugi plazmid koji sadrži RSV ili SV40 promotor, DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca (VH), DNK koja kodira γ1 konstantni region, markere za rezistenciju na DHFR i ampicilin.
Pojačivački element
[0170] Gde je pogodno, npr. za ekspresiju u višim eukariotima, može se koristiti pojačivački element operabilno vezan sa promotorskim elementom u vektoru. Pojačivačke sekvence sisara uključuju pojačivačke elemente iz globina, elastaze, albumina, fetoproteina i insulina. Alternativno, može se koristiti pojačivački element iz virusa eukariotske ćelije kao što je SV40 pojačivač (na bp100-270), citomegalovirus rani promotor pojačivač, polioma pojačivač, bakulovirusni pojačivač ili mišji IgG2a lokus (videti WO04/009823). Pojačivač može biti smešten na vektoru na mestu ushodno od promotora. Alternativno, pojačivač se može nalaziti na drugom mestu, na primer u regionu koji se ne prevodi ili nishodno od poliadenilacionog signala. Izbor i pozicioniranje pojačivača može se zasnivati na pogodnoj kompatibilnosti sa ćelijom domaćinom korišćenom za ekspresiju.
Poliadenilacija/terminacija
[0171] U eukariotskim sistemima, poliadenilacioni signali su operativno povezani sa DNK/polinukleotidom koji kodira antigen vezujući protein. Takvi signali su tipično postavljeni 3’ od otvorenog okvira čitanja. U sisarskim sistemima, neograničavajući primeri uključuju signale izvedene iz hormona rasta, elongacionog faktora-1 alfa i virusnih (npr. SV40) gena ili retrovirusnih dugačkih terminalnih ponovaka. U sistemima kvasca neograničavajući primeri poliadenilacionih/terminacionih signala uključuju one izvedene iz gena fosfoglicerat kinaze (PGK) i alkohol dehidrogenaze 1 (ADH). U prokariotskim sistemima, poliadenilacioni signali tipično nisu potrebni i umesto toga je uobičajeno da se upotrebe kraće i definisanije terminacione sekvence. Izbor poliadenilacionih/terminacionih sekvenci može se zasnivati na pogodnoj kompatibilnosti ćelije domaćina koji se koristi za ekspresiju.
Drugi postupci/elementi za poboljšani prinos
[0172] Kao dodatak prethodnom, druge karakteristike koje se mogu upotrebiti da se poboljša prinos uključuju remodelovanje elemenata hromatina, introne i modifikaciju kodona specifičnu za ćeliju domaćina.
Ćelije domaćini
[0173] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antigen vezujuće proteine su prokariotske, ćelije kvasca ili ćelije viših eukariota. Pogodne prokariotske ćelije uključuju eubakterije tj. enterobacteriaceae kao što je Escherichia npr. E. coli (na primer ATCC 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella npr. Salmonella typhimurium, Serratia npr. Serratia marcescans i Shigella kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (videti DD 266710), Pseudomonas kao što je P. aeruginosa i Streptomyces. Od ćelija domaćina kvasca takođe su predviđeni Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (npr. ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), yarrowia (EP402,226), Pichia pastoris (EP 183 070, videti takođe Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192), Candida, Trichodermareesia (EP 244 234), Penicillin, Tolypocladium i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.
[0174] Ćelije domaćini viših eukariota uključuju sisarske ćelije kao što su COS-1 (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCCCRL 1651), linija 293 humanog embrionalnog bubrega, ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK) (ATCC CRL. 1632), BHK570 (ATCCNO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), ćelije ovarijuma kineskog hrčka CHO (npr. CHO-K1, ATCC NO: CCL 61,DHFR-CHO ćelijska linija kao što je DG44 (videti Urlaub et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556), naročito one CHO ćelijske linije prilagođene za kulturu sa suspenzijom, mišje Sertolijeve ćelije, ćelije bubrega majmuna, ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC CRL-1587), HELA ćelije, ćelije bubrega psa (ATCC CCL 34), humane ćelije pluća (ATCC CCL 75), Hep G2 i mijeloma ili limfoma ćelije npr. NS0 (videti SAD 5,807,715), Sp2/0, Y0.
[0175] Takve ćelije domaćini mogu takođe biti dalje podvrgnute inženjeringom ili prilagođene da se modifikuje kvalitet, funkcija i/ili prinos antigen vezujućeg proteina. Neograničavajući primeri uključuju ekspresiju specifičnih modifikujućih (npr. glikozilacija) enzima i šaperona za pakovanje proteina.
Postupci kultivisanja ćelija
4
[0176] Ćelije domaći transformisane sa vektorima koji kodiraju antigen vezujuće proteine mogu se kultivisati bilo kojim postupkom poznatim stručnjacima. Ćelije domaćini mogu biti kultivisane u spiner bocama, roler bocama ili sistemima od šupljih vlakana, ali za masovnu proizvodnju ti reaktori sa rezervoarom koji se meša naročito se koriste za kulture u suspenziji. Mešani rezervoari mogu se prilagoditi za aeraciju korišćenjem npr. prskalica, pregrada ili rotora niskog napona. Za barbotažne kolone i pneumatske reaktore može se koristiti direktna aeracija sa mehurićima vazduha ili kiseonika. Gde su ćelije domaćini kultivisani u medijumu kulture bez seruma, medijumu je dodat zaštitni agens za ćelije kao što je pluronic F-68 da bi se sprečilo oštećenje ćelija kao rezultat aeracionog procesa. U zavisnosti od karakteristika ćelije domaćina, kao supstrati za rast mogu se koristiti ili mikronosači za ćelijske linije koje se pričvršćuju ili se ćelije mogu prilagoditi kulturi u suspenziji (što je tipično). Kultivisanje ćelija domaćina, naročito beskičmenjačkih ćelija domaćina može koristiti različite operativne modove kao što su “fed-batch”, “repeated batch” obrada (videti Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), “extended batch” proces ili perfuziona kultura. Iako se rekombinantno transformisane sisarske ćelije mogu kultivisati u medijumu koji sadrži serum kao što je fetalni teleći serum (FCS), takve ćelije domaćini se mogu kultivisati u sintetičkim medijumima bez seruma kao što je opisano u Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163, ili komercijalno dostupnom medijumu kao što je ProCHO-CDM ili UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), sa dodavanjem, gde je neophodno, energetskog izvora kao što je glukoza i sintetički faktori rasta kao što je rekombinantni insulin. Kultivisanje ćelija domaćina bez seruma može zahtevati da su te ćelije adaptirane da rastu u uslovima bez seruma. Jedan pristup adaptaciji je kultivisanje takvih ćelija domaćina u medijumu koji sadrži serum i ponovljeno zamenjivati 80% medijuma kulture sa medijumom bez seruma tako da ćelije domaćini nauče da se adaptiraju na uslove bez seruma (videti npr. Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds,619-623, Kluwer Academic publishers).
[0177] Antigen vezujući proteini izlučeni u medijum mogu se rekuperovati i prečistiti korišćenjem različitih tehnika da bi se obezbedio stepen čistoće pogodan za nameravanu upotrebu. Na primer korišćenje antigen vezujućih proteina za tretman humanih pacijenata tipično zahteva najmanje 95% čistoću, tipičnije 98% ili 99% ili veću čistoću (u poređenju sa sirovim medijumom kulture). Ćeliski debris iz medijuma kulture se tipično uklanja korišćenjem centrifugiranja praćenog sa korakom razbistravanja supernatanta korišćenjem npr. mikrofiltracije, ultrafiltracije i/ili dubinske filtracije. Dostupno je mnoštvo drugih tehnika kao što je dijaliza i elektroforeza na gelu i hromatografske tehnike kao što je hidroksiapatitna (HA), afinitetna hromatografija (izborno uključuje sistem za obeležavanje afiniteta kao što je polihistidin) i/ili hromatografija sa hidrofobnom interakcijom (HIC, videti US 5, 429,746). Antitela, nakon različitih koraka razbistravanja, mogu se uhvatiti korišćenjem Protein A ili G afinitetne hromatografije. Dodatni hromatografski koraci mogu slediti kao što je jonoizmenjivačka i/ili HA hromatografija, anjonska ili katjonska izmena, hromatografija na osnovu veličine čestica i precipitacija amonijum sulfatom. Mogu se takođe upotrebiti različiti koraci uklanjanja virusa (npr. nanofiltracija korišćenjem npr. DV-20 filtera). Nakon ovih različitih koraka, obezbeđen je prečišćeni (na primer monoklonski) preparat koji sadrži najmanje 75 mg/ml ili više, ili 100 mg/ml ili više, antigen vezujućeg proteina. Takvi preparati su suštinski bez agregatnih oblika antigen vezujućih proteina.
[0178] Mogu se koristiti bakterijski sistemi za ekspresiju antigen vezujućih fragmenata. Takvi fragmenti se mogu lokalizovati intracelularno, unutar periplazme ili se mogu izlučiti ekstracelularno. Nerastvorljivi proteini mogu se ekstrahovati i ponovo spakovati da bi dali aktivne proteine prema postupcima koji su poznati stručnjacima, videti Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol.72: 13-20; i Cupit et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277.
[0179] Deamidacija je hemijska reakcija u kojoj se uklanja amidna funkcionalna grupa. U biohemiji, reakcija je važna u degradaciji proteina jer oštećuje bočne lance aminokiselina asparagina i glutamina koji sadrže amid. Asparagin se konvertuje u smešu izoaspartata i aspartata. Deamidacija glutaminskih ostataka dešava se sa mnogo nižom stopom. Veruje se da su reakcije deamidacije jedan od faktora koji može ograničiti korisno vreme života proteina, one su takođe jedna od najčešćih post-translacionih modifikacija koje se dešavaju tokom proizvodnje terapeutskih proteina. Na primer, smanjenje ili gubitak in vitro ili in vivo biološke aktivnosti je objavljen za rekombinantnu humanu DNKzu i rekombinantni rastvorljivi CD4, dok izgleda da drugi rekombinantni proteini nisu pogođeni.
Farmaceutske kompozicije
[0180] Prečišćeni preparati ovde opisanog antigen-vezujućeg proteina mogu se uključiti u farmaceutske kompozicije za upotrebu u tretmanu ovde opisanih bolesti, poremećaja i stanja kod ljudi. Termini, bolesti, poremećaji i stanja korišćeni su naizmenično. Farmaceutska kompozicija se može koristiti u tretmanu bilo kojih bolesti gde su prisutne amiloidne naslage u tkivu i gde doprinose strukturnom i funkcionalnom oštećenju što dovodi do kliničke bolesti. SAP je uvek prisutan u svim amiloidnim naslagama in vivo i farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu ovde opisanog antigen-vezujućeg proteina može se koristiti u tretmanu bolesti koje reaguju na uklanjanje amiloidnih naslaga iz tkiva.
[0181] Farmaceutski preparat može sadržati antigen-vezujući protein u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Antitelo se može primeniti zasebno, ili kao deo farmaceutske kompozicije.
[0182] Tipično takve kompozicije sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač kao što je poznat i označen u prihvatljivoj farmaceutskoj praksi, videti npr. Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co. Primeri takvih nosača uključuju sterilizovane nosače kao što je slani rastvor, Ringer-ov rastvor ili rastvor dekstroze, izborno puferovan sa pogodnim puferima do pH u opsegu od 5 do 8.
[0183] Farmaceutske kompozicije se mogu primeniti injekcijom ili neprekidnom infuzijom (npr. intravenskom, intraperitonealnom, intradermalnom, potkožnom, intramuskularnom ili intraportalnom). Takve kompozicije su suštinski oslobođene od vidljivih čestica. Farmaceutske kompozicije se takođe mogu primeniti oralno, specifično one koje sadrže CPHPC.
[0184] Farmaceutske kompozicije mogu sadržati između 1mg do 10g antigen-vezujućeg proteina, na primer između 5 mg i 1 g antigen-vezujućeg proteina. Alternativno, kompozicija može sadržati između 5 mg i 500 mg, na primer između 5 mg i 50 mg.
[0185] Postupci za primenu takvih farmaceutskih kompozicija dobro su poznate stručnjacima. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati između 1 mg do 10 g antigen-vezujućeg proteina u jediničnom doznom obliku, izborno zajedno sa uputstvima za upotrebu. Farmaceutske kompozicije mogu biti liofilizovane (osušene zamrzavanjem) za rekonstituciju pre primene prema postupcima dobro poznatim ili očiglednim stručnjacima. Gde antitela imaju IgG1 izotip, helator bakra, kao što je citrat (npr. natrijum citrat) ili EDTA ili histidin, može se dodati farmaceutskoj kompoziciji da bi se smanjio stepen bakar-posredovane degradacije antitela ovog izotipa, videti EP0612251. Farmceutske kompozcije takođe mogu sadržati sredstvo za povećanje rastvorljivosti kao što je baza arginin, deterdžent/anti-agregacioni agens kao što je polysorbate 80, i inertni gas kao što je azot da se zameni kiseonik u gornjem delu bočice.
[0186] Efikasne doze i režimi tretmana za primenu antigen-vezujućeg proteina su generalno određeni empirijski i mogu zavisiti od faktora kao što su starost, težina, i zdravstveno stanje pacijenta i bolesti ili poremećaja koji se tretira. Takvi faktori su unutar delokruga nadležnog lekara. Smernice za izbor odgovarajućih doza mogu se naći u npr. Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York.
4
[0187] Doza antigen-vezujućeg proteina primenjenog na subjekta je generalno između 1 mg/kg do 150 mg/kg, između 0.1mg/kg i 100 mg/kg, između 0.5 mg/kg i 50 mg/kg, između 1 i 25 mg/kg ili između 1 i 10 mg/kg telesne težine subjekta. Na primer, doza može biti 10 mg/kg, 30 mg/kg, ili 60 mg/kg. Antigen-vezujući protein može se primeniti parenteralno, na primer potkožno, intravenski ili intramuskularno.
[0188] SAP-depeltirajuće jedinjenje može se primeniti u dozi od između 0.1 mg/kg i 2 mg/kg, u zavisnosti od njegove aktivnosti. SAP-depletirajuće jedinjenje može se primeniti kao fiksna doza, nezavisna od odnosa doze i telesne težine subjekta. SAP-depletirajuće jedinjenje može se primeniti u jednoj ili više zasebnih, istovremenih ili sekvencijalnih parenteralnih doza od 100 mg ili manje, od 50 mg ili manje, 25 mg ili manje, ili 10 mg ili manje.
[0189] Ukoliko je poželjno, efikasna dnevna doza terapeutske kompozicije može se primeniti kao dve, tri, četiri, pet šest ili više pod-doza zasebno primenjenih u odgovarajućim intervalima tokom dana, izborno, u obliku jedinične doze.
[0190] Antitelo se može primeniti u pojedinačnoj velikoj dozi ili u manjim ponovljenim dozama.
[0191] Primena doze može biti spora neprekidna infuzija tokom perioda od 2 do 24 časa, kao što je od 2 do 12 časova, ili od 2 do 6 časova. Ovo može rezultovati u smanjenju toksičnih sporednih efekata.
[0192] Primena doze može se ponoviti jednom ili više puta po potrebi, na primer, tri puta na dan, jednom svakog dana, jednom svaka 2 dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca, jednom svakih 6 meseci, ili jednom svakih 12 meseci. Antigen-vezujući proteini se mogu primenjivati terapijom održavanja, na primer jednom nedeljnou periodu od 6 meseci ili više. Antigen-vezujući proteini se mogu primenjivati intermitentnom terapijom, na primer u periodu od 3 do 6 meseci i zatim bez doziranja 3 do 6 meseci, praćeno sa ponovnom primenom antigen-vezujućih proteina 3 do 6 meseci, i tako nadalje u ciklusu.
[0193] Na primer, doza se može primeniti potkožno, jednom svakih 14 ili 28 dana u obliku višestrukih pod-doza svakog dana primene.
[0194] Antigen-vezujući protein može biti primenjenivan na subjekta na takav način da terapija cilja određeno mesto. Na primer, antigen-vezujući protein se može injektirati lokalno u zaokruženu lokalnu amiloidnu masu u tkivima, ili primenjeno infuzijom u krvotok do amiloidotičnog organa.
[0195] Antigen vezujući protein mora se koristiti u kombinaciji sa jednim ili više terapeutski aktivnih agenasa, specifično SAP depletirajućih jedinjenja, za tretman ovde opisanih bolesti.
Efikasna deplecija SAP iz cirkulacije mora biti postignuta pre primene SAP vezujućeg proteina da bi poslednje pomenuti bio primenjen i bezbedno i efikasno.
[0196] SAP depletirajuće jedinjenje je primenjeno prvo tako da je uklonjen skoro sav cirkulišući SAP. Kako ovo ostavlja značajne količine SAP povezane sa amiloidnim naslagama u tkivima sekvencijalna primena anti-SAP antigen vezujućeg proteina omogućava lokalizaciju i specifično vezivanje za amiloidne naslage da bi se stimulisalo njihovo brzo i ekstenzivno smanjenje. Pogodno, anti-SAP antigen vezujući protein može se primeniti 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 ili 25 ili više dana nakon početka tretmana sa SAP depletirajućim jedinjenjem.
[0197] Sekvencijalna primena može uključiti dva ili više sekvencijalnih tretmana sa SAP depletirajućim jedinjenjem praćenim sa dva ili više sekvencijalnih tretmana sa anti-SAP antigen vezujućim proteinom.
[0198] Sekvencijalna primena može uključivati tretman sa SAP depletirajućim jedinjenjem praćenu sa jednim sekvencijalnim tretmanom sa anti-SAP antigen vezujućim proteinom, koji je zatim ponovljen jedan ili više puta.
[0199] Sekvencijalna/kasnija doza može biti količina koja je veća od inicijalne/prethodne doze ili manja od inicijalne/prethodne doze.
[0200] Primena inicijalne doze SAP-depletirajućeg jedinjenja proteina može biti praćena sa primenom jedne ili više sekvencijalnih (npr. kasnijih) doza SAP depletirajućeg jedinjenja i/ili anti-SAP antigen-vezujućeg proteina, i gde pomenuta jedna ili više sekvencijalnih doza može biti u količini koja je približno ista ili manja od inicijalne doze.
[0201] Nakon inicijalne deplecije cirkulišućeg SAP, primena dodatnih doza SAP depletirajućeg jedinjenja i prve doze anti-SAP antigen-vezujućeg proteina može biti praćena primenom jedne ili više sekvencijalnih (npr. kasnijih) doza, i pri čemu je najmanje jedna od kasnijih doza u količini koja je veća od inicijalne doze.
[0202] Shodno tome, primena može koristiti unapred određeni ili rutinski raspored primene, što rezultuje u unapred određenom vremenskom periodu između primene doza. Raspored može obuhvatiti vremenske periode koji su identični ili koji se razlikuju po dužini, sve dok je raspored unapred određen. Bilo koja određena kombinacija biće pokrivena rasporedom sve dok je određena pre vremena kada odgovarajući raspored uključuje primenu na određeni dan.
[0203] Farmaceutska kompozicija može sadržati komplet delova antigen-vezujućeg proteina zajedno sa drugim medikamentima, izborno sa uputstvima za upotrebu. Zbog pogodnosti, komplet može sadržati reagense u unapred određenim količinama sa uputstvom za upotrebu.
4
[0204] Termini "pojedinac", "subjekt" i "pacijent" su ovde korišćeni naizmenično. Subjekat može biti primat (npr. marmozet ili majmun). Subjekat je tipično čovek.
[0205] Tretman može biti terapeutski, profilaktički ili preventivni. Subjekat će biti onaj kome je to potrebno. Oni kojima je potreban tretman mogu uključivati pojedince koji već boluju od određene medicinske bolesti kao dodatak onima koji mogu razviti bolest u budućnosti.
[0206] Stoga, SAP depletirajuće jedinjenje praćeno sa SAP antigen-vezujućim proteinom opisanim ovde može se koristiti za profilaktički ili preventivni tretman. U ovom slučaju, ovde opisani sekvencijalni tretmani primenjeni su na pojedinca da bi se sprečio ili odložio početak jednog ili više aspekata ili simptoma bolesti. Subjekat može biti asimptomatski ili može imati genetičku predispoziciju za bolest, jer je poznato da su amiloidne naslage prisutne u tkivu i da se akumuliraju određeni vremenski period pre nego što izazovu dovoljno oštećenje koje proizvodi kliničke simptome. Takve subkliničke amiloidne naslage mogu se detektovati histološkim pregledima biopsije tkiva ili neinvazivnim procedurama vizuelizacije, uključujući radioaktivno obeleženu SAP scintigrafiju, ehokardiografiju i srčanu magnetnu rezonancu. Nakon što se prvo depletira cirkulišući SAP, profilaktički efikasna količina antitela se primenjuje na takvog pojedinca. Profilaktički efikasna količina je količina koja sprečava ili odlaže početak jednog ili više aspekata ili simptoma ovde opisane bolesti.
[0207] Ovde opisani antigen-vezujući protein može se takođe koristiti u postupcima terapije. Termin "terapija" obuhvata ublažavanje, smanjenje, ili prevenciju najmanje jednog aspekta ili simptoma bolesti. Na primer, ovde opisani antigen-vezujući protein može se koristiti da ublaži ili smanji jedan ili više aspekata ili simptoma ovde opisane bolesti.
[0208] Ovde opisani antigen-vezujući protein je korišćen u efikasnoj količini za terapeutski, profilaktički ili preventivni tretman. Terapeutski efikasna količina ovde opisanog antigenvezujućeg proteina je količina efikasna da ublaži ili smanji jedan ili više aspekata ili simptoma bolesti. Ovde opisani antigen-vezujući protein može takođe biti korišćen za tretiranje, prevenciju, ili izlečenje ovde opisane bolesti.
[0209] Ovde opisani antigen-vezujući protein može imati generalno povoljan efekat na zdravlje subjekta, na primer može povećati očekivanu dužinu života subjekta.
[0210] Ovde opisani antigen-vezujući protein ne mora da dovede do potpunog izlečenja, ili iskoreni svaki simptom ili manifestaciju bolesti da bi činilo vijabilni terapeutski tretman. Kao što je prepoznato kao važno, lekovi primenjeni kao terapeutski agensi mogu smanjiti težinu stanja bolesti, ali ne moraju ukloniti svaku manifestaciju bolesti da bi se smatrali korisnim terapeutskim agensima. Slično tome, profilaktički primenjen tretman ne mora da bude potpuno efikasan u sprečavanju početka bolesti da bi činio vijabilni profilaktički agens. Samo
4
smanjivanje uticaja bolesti (na primer, smanjenjem broja ili težine njenih simptoma, ili povećavanjem efikasnosti drugog tretmana, ili proizvodnjom drugog korisnog efekta), ili smanjenja verovatnoće da će se bolest pojaviti (na primer odlaganjem početka bolesti) ili pogoršati kod subjekta, je dovoljno.
[0211] Ovde opisani antigen-vezujući protein može se koristiti u tretmanu ili prevenciji bolesti povezane sa amiloidnim naslagama tj. amiloidozom.
[0212] "Amiloidoza" je bilo koja bolest koju karakteriše ekstracelularna akumulacija amiloida u različitim organima i tkivima tela.
[0213] Termin "amiloid" se odnosi na ekstracelularne naslage u tkivima nerastvorljivih proteinskih vlakana sastavljenih od vlakana sa karakterističnom ultrastrukturnom morfologijom, unakrsne-β ploče strukture jezgra i patognomoničnom osobinom histohemijskog bojenja u vidu vezivanja Congo crvene boje iz alkalnog alkoholnog rastvora i zatim daje crveno-zeleni dihroizam kada se gleda pod mikroskopom u jakom unakrsno polarizovanom svetlu. Poznato je da oko 25 različitih nesrodnih proteina formiraju amiloidna vlakna koja se deponuju u humanim tkivima i dele ove tipične karakteristike. Amiloidne naslage u moždanoj supstanci, cerebralni amiloid, nešto se razlikuju od amiloidnih naslaga na drugim mestima u telu po tome što su uvek fokalne i mikroskopske veličine, i uobičajeno se označavaju kao amiloidne plake.
[0214] Amiloidoza, odnosno bolest direktno izazvana deponovanjem amiloida u tkivima, obuhvata i lokalnu amiloidozu, u kojoj su naslage ograničene na jedan anatomski region i/ili jedno tkivo ili sistem organa, i sistemsku amiloidozu u kojoj se naslage mogu javiti u bilo kom organu ili tkivu u telu, uključujući krvne sudove i vezivna tkiva. Uzrok amiloidoze može biti ili stečen ili nasledan. Stečena amiloidoza javlja se kao komplikacija prethodnog medicinskog stanja, koje samo po sebi može biti stečeno ili nasledno. Tako je reaktivna sistemska amiloidoza, poznata kao amiloid A protein (AA) tipa komplikacija hroničnih aktivnih inflamatornih bolesti kao što su reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, Crohn-ova bolest, hronične infekcije i hronična sepsa, i od naslednih porodičnih sindroma groznice kao što su porodična Mediteranska groznica, Muckle-Wells sindrom i CINCA sindrom. Amiloidoza povezana sa dijalizom izazvana je akumulacijom β2-mikroglobulina kao rezultat poslednjeg stadijuma otkazivanja bubrega. Amiloidoza monoklonskog lakog lanca imunoglobulina (AL) je komplikacija multipnog mijeloma ili inače benigne monoklonske gamopatije (monoklonska gamopatija nepoznatog značaja, MGUS). Stečena amiloidoza transtiretin tipa može se pojaviti bez bilo koje prethodne bolesti i samo je komplikacija povezana sa starošću. Nasledna amiloidoza je izazvana mutacijama u genima za različite
4
proteine koji kodiraju ekspresiju varijanti proteina koji imaju povećanu sklonost ka formiranju amiloidnih vlakana, i uključuje bolesti izazvane transtiretinom, apolipoproteinom Al, gelsolinom, lizozimom, cistatinom C i amiloidnim β-proteinom. Obimni opisi svih različitih oblika amiloidoze i uključenih proteina dostupni su u knjigama i naučnoj literaturi (Pepys, M.B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241; Pepys and Hawkins (2003) Amyloidosis. Oxford Textbook of Medicine, 4th Ed., Vol.2, Oxford University Press, Oxford, pp.162-173; Pepys andHawkins (2001) Amyloidosis. Samter’s Immunologic Diseases, Sixth Ed., Vol. 1, Lippincott Williams & Williams, Philadelphia, pp.401-412).
[0215] Lokalne amiloidne naslage, ograničene na jedan organ ili tkivo, mogu biti klinički tihe ili mogu izazvati ozbiljna oštećena tkiva i bolest. Na primer, cerebralna amiloidna angiopatija u kojoj su vaskularne amiloidne naslage sastavljene od Aβ proteina, je obično sporadično dobijeno stanje koje se javlja iz nepoznatih razloga u odsustvu druge patologije, i glavni je uzrok cerebralne hemoragije i šloga. Postoji nekoliko veoma važnih i čestih bolesti, naročito Alzheimer-ova bolest (AD) i dijabetes tipa 2, kod kojih su amiloidne naslage uvek prisutne, ali kod kojih još nisu poznati precizni mehanizmi koji izazivaju ove respektivne bolesti. Ipak, lokalna naslaga amiloida u mozgu i cerebralnim krvnim sudovima kod Alzheimer-ove bolesti, i u pankreasnim ostrvcima kod dijabetesa će veoma verovatno izazvati patologiju i bolest. Shodno tome, ovaj pronalazak uključuje tretman i Alzheimer-ove bolesti i dijabetesa tipa 2, ustvari bilo kog stanja povezanog sa bilo kojim stanjem povezanim sa prisustvom amiloidnih naslaga u tkivima, sa antigen vezujućim proteinima kao što su ovde opisani.
[0216] Mnogi oblici prenosive spongiformne encefalopatije (prionske bolesti) povezani su sa amiloidnim naslagama u mozgu, i stoga se ovaj pronalazak odnosi na sva ova stanja, uključujući varijante Creutzfeldt-Jakob-ove bolesti kod ljudi, Creutzfeldt-Jakob-ovu bolest, kuru i različite druge oblike humane prionske bolesti, i takođe na goveđu spongiformnu encefalopatiju, hroničnu bolest mršavljenja košuta i losova, i prenosivu encefalopatiju kod kanadske kune.
Dijagnostički postupci za upotrebu
[0217] Ovde opisani antigen-vezujući proteini mogu se koristiti za detekciju SAP u biološkom uzorku in vitro ili in vivo u dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-SAP antigenvezujući proteini se mogu koristiti za detekciju SAP u serumu ili vezanog sa amiloidom npr. amiloidnog plaka. Amiloid se može prvo ukloniti (na primer biopsijom) iz tela čoveka ili
4
životinje. Mogu se upotrebiti konvencionalni imunotestovi, uključujući ELISA, Western blot, imunohistohemiju, ili imunoprecipitaciju.
[0218] Antigen-vezujući proteini mogu biti obezbeđeni u dijagnostičkom kompletu koji sadrži jedan ili više antigen-vezujućih proteina, detektabilni obeleživač, i uputstva za upotrebu za komplet. Kao pogodnost, komplet može sadržati reagense u prethodno određenim količinama sa uputstvima za upotrebu.
PRIMERI
Primer 1- Sekvenciranje varijabilnih regiona hibridoma: SAP-E and SAP-K
[0219] SAP-E i SAP-K potiču iz dve grupe anti-SAP monoklona, pri čemu je svaka grupa posebno testirana u odnosu na njeno vezivanje za humani SAP in vitro. SAP-E i SAP-K pokazali su najsnažnije vezivanje za SAP, unutar njihovih grupa, i međusobno su upoređeni u različitim testovima.
[0220] Prva grupa antitela sadržala je antitela iz 7 hibridoma stvorenih u pojedinačnoj konvencionalnoj imunizaciji sa prečišćenim humanim SAP (SEQ ID NO:43 prikazano u nastavku) (detalji postupka za prečišćavanje humanog SAP dati su u Hawkins et al. (1991) Clin. Exp. Immunol. 84, 308-316) i fuzioni protokoli su označeni kao SAP-A do SAPG. Dva od ovih antitela, SAP-E i SAP-B, su IgG2a izotipa dok su svi drugi IgG1 izotipa (videti Primer 13, Tabela 11).
[0221] Druga grupa antitela sadržala je 6 različitih IgG2a monoklona (SAP-H do SAP-M) izvedena standardnim tehnikama iz imunizacije sa prečišćenim humanim SAP (SEQ ID NO:43 prikazana u nastavku) (Hawkins et al. (1991) Clin.Exp. Immunol. 84, 308-316) i konvencionalne fuzije da bi se stvorili hibridomi koji su klonirani sa rutinskim postupcima.
Zrela aminokiselinska sekvenca SAP od Homo sapiens (SEQ ID NO:43)
[0222] U svrhu poređenja, SAP sekvenca miša, koja ima 69.4% identičnosti sa humanim SAP, data je u nastavku.
4
Zreli protein SAP od Mus musculus (SEQ ID NO:44)
[0223] Ukupna RNK je ekstrahovana iz taloga hibridoma ćelija od približno 10<6>ćelija korišćenjem RNeasy kompleta od Qiagen (#74106). AccessQuick RT-PCR System (A1702) korišćen je za stvaranje cDNK varijabilnih teških i lakih regiona korišćenjem degenerisanih prajmera specifičnih za lider sekvence mišjeg gena imunoglobulina i mišjih IgG2a/K konstantnih regiona. Prečišćeni RT-PCR fragmenti su klonirani korišćenjem TA kompleta za kloniranje od Invitrogena (K2000-01). Konsenzusna sekvenca je dobijena za svaki hibridom poravnanjem sekvence, i poravnanjem sa poznatim varijabilnim sekvencama imunoglobulina navedenim u KABAT (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). Konsenzusne sekvence za SAP-E i SAP-K prikazane su u nastavku.
SAP-E sekvence
[0224]
CDRH1 SAP-E (SEQ ID NO:1)
TYNMH
CDRH2 SAP-E (SEQ ID NO:2)
YIYPGDGNANYNQQFKG
CDRH3 SAP-E (SEQ ID NO:3)
GDFDYDGGYYFDS
CDRL1 SAP-E (SEQ ID NO:4)
RASENIYSYLA
CDRL2 SAP-E (SEQ ID NO:5)
NAKTLAE
CDRL3 SAP-E (SEQ ID NO:6)
QHHYGAPLT
Aminokiselinaska sekvenca VHSAP-E (SEQ ID NO:7) sa podvučenim CDRs
1
2
Primer 2: Konstruisanje himernih antitela
[0226] Himerna antitela, koja sadrže roditeljske mišje varijabilne domene graftovane na divlji tip humanih IgG1/κ konstantnih regiona konstruisana su PCR kloniranjem za SAP-E i SAP-K. Na osnovu konsenzusne sekvence, prajmeri za amplifikaciju mišjih varijabilnih domena su dizajnirani, uključujući restrikciona mesta neophodna da olakšaju kloniranje u sisarske ekspresione vektore. Preko uvođenja restrikcionog mesta u FR4 (okvirni region 4 (V-region sekvenca nakon CDR3 i pre prvog konstantnog domena)) aminokiselinska sekvenca VHu SAP-E izmenjena je iz TTLTVSS kao što je prikazano u SEQ ID NO:7 u TLVTVSS i aminokiselinska sekvenca VHu SAP-K je izmenjena iz TTVTVSS kao što je prikazano u SEQ ID NO:17 u TLVTVSS. U SAP-K varijabilnom lakom lancu interno EcoRI mesto je prisutno u CDRL1 i dizajnirani su prajmeri za mutagenezu da bi se uklonilo ovo neželjeno interno EcoRI izmenom jednog baznog para – ovo nije izmenilo aminokiselinsku sekvencu.
[0227] Proteinske sekvence pune dužine teškog i lakog lanca SAP-E himernog antitela (cSAP-E) date su u SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22 respektivno. Proteinske sekvence pune dužine teškog i lakog lanca SAP-K himernog antitela (cSAP-K) date su u SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:24 respektivno.
Nukleotidna sekvenca himernog VHSAP-E (SEQ ID NO:45)
Nukleotidna sekvenca himernog VLSAP-E (SEQ ID NO:46)
4
Aminokiselinska sekvenca himernog VLSAP-K (SEQ ID NO:24)
Primer 3: Strategija humanizacije
[0228] Humanizovana antitela stvorena su procesom graftinga CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 iz mišjeg antitela na pogodnu humanu okvirnu sekvencu.
Strategija humanizacije SAP-E
Humanizacija teškog lanca SAP-E
[0229] Za sekvencu mišjeg varijabilnog teškog lanca SAP-E izabran je akceptorski okvir humane klicine linije (IGHV1-69, SEQ ID NO:25) koja je imala 60% identičnosti (uključujući CDRs) sa sekvencom varijabilnog dela teškog lanca mišjeg SAP-E (SEQ ID NO:7) zajedno sa JH1 minigenom (Kabat: AEYFQHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:26)). Prvih šest ostataka JH1 minigena potpadaju pod CDR3 region i zamenjeni su sa dolazećim CDR iz donor antitela.
[0230] Stvoreno je pet humanizovanih varijanti na osnovu poređenja sekvence i mogućeg uticaja na funkciju antitela. Konstrukt H0 bio je linearni graft mišjeg CDRs (korišćenjem Kabat definicije) u prethodno izabrani humani akceptorski okvir. Konstrukt H1 imao je dodatne povratne mutacije na ostacima 27 i 30. Konstrukti H2 i H3 su zasnovani na H1 sa dodatnim povratnim mutacijama na ostacima 2 (H2), i 48 i 67 (H3). Konstrukt H4 je zasnovan na H3 sa dodatnim povratnim mutacijama na ostacima 69, 73 i 91. Videti Tabelu 3.
[0231] Sekvence humanizovanih varijabilnih teških domena iz H0, H1, H2, H3 i H4 dati su u nastavku (SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO:31 respektivno).
Tabela 3: Rezime generisanih VH varijanti humanizovanog SAP-E
Humanizacija lakog lanca SAP-E
[0232] Za sekvencu varijabilnog lakog lanca mišjeg SAP-E izabran je akceptorski okvir humane klicine linije (IGKV1-39, SEQ ID NO:32) koja je imala 68% identičnosti (uključujući CDRs) sa sekvencom varijabilnog lakog lanca mišjeg SAP-E (SEQ ID No:9) zajedno sa minigenom J-regiona kapa 2 (Kabat: YTFGQGTKLEIK, SEQ ID NO:33)) na osnovu sličnosti sekvence. Prva dva ostatka JK-2 minigena potpadaju pod CDR3 region i zamenjeni su sa dolazećim CDR iz donorskog antitela.
[0233] Tri humanizovane varijante su stvorene na osnovu poređenja sekvence i mogućeg uticaja na funkciju antitela. Konstrukt L0 bio je linearni gaft mišjeg CDRs (korišćenjem Kabat definicije) u prethodno izabrani humani akceptorski okvir. Konstrukt L1 ima povratnu mutaciju na ostatku 49 i konstruktu L2 ima povratne mutacije na pozicijama 48 i 49. Videti Tabelu 4.
[0234] Sekvence humanizovanih varijabilnih lakih domena L0, L1 i L2 su dati u nastavku (SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35 i SEQ ID NO:36 respektivno).
T l 4 R zim n ri nih L ri n i h m niz n AP-E
Strategija SAP-K humanizacije
Humanizacija SAP-K teškog lanca
[0235] Za sekvencu mišjeg SAP-K varijabilnog teškog lanca izabran je akceptorski okvir humane klicine linije (IGHV1-69, SEQ ID NO:25) koji je imao 65% identičnosti (uključujući CDRs) sa sekvencom varijabilnog teškog lanca mišjeg SAP-K (SEQ ID NO:17) zajedno sa JH1 minigenom (Kabat: AEYFQHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:26)). Prvih šest ostatka JH1 minigena potpada pod CDR3 region i zamenjeni su sa dolazećim CDR iz donorskog antitela.
[0236] Četiri humanizovane varijante stvorene su na osnovu poređenja sekvenci i mogućeg uticaja na funkciju antitela. Konstrukt H0 bio je linearni graft mišjih CDRs (korišćenjem Kabat definicije) u prethodno izabrani humani akceptorski okvir. Konstrukt H1 ima dodatne povratne-mutacije na ostacima 27 i 30. Konstrukt H2 je zasnovan na H1 sa dodatnim povratnim-mutacijama na ostacima 48 i 67. Konstrukt H3 je zasnovan na H2 sa dodatnim povratnim-mutacijama na ostacima 69 i 71. Videti Tabelu 5.
[0237] Sekvence humanizovanih varijabilnih teških regiona H0, H1, H2 i H3 date su u nastavku (SEQ IDNO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 i SEQ ID NO:40 respektivno).
T l R zim n ri nih H ri n i h m niz n AP-K
Humanizacija lakog lanca SAP-K
[0238] Za sekvencu varijabilnog lakog lanca mišjeg SAP-K izabran je akceptorski okvir humane klicine linije (IGKV1-39, SEQ ID NO:32) koja je imala 63% identičnosti (uključujući CDRs) sa sekvencom mišjeg SAP-K varijabilnog lakog lanca (SEQ ID NO:19) zajedno sa J-regionom kapa 2 minigena (Kabat: YTFGQGTKLEIK, SEQ ID NO:33) na osnovu sličnosti sekvence. Prva dva ostatka JK-2 minigena potpadaju pod CDR3 region i zamenjeni su sa dolazećim CDR iz donorskog antitela.
[0239] Dve humanizovane varijante su stvorene na osnovu poređenja sekvence i mogućeg uticaja na funkciju antitela. Konstrukt L0 bio je linearni graft mišjih CDRs (koiršćenjem Kabat definicije) u prethodno izabrani humani akceptorski okvir. Konstrukt L1 imao je povratnu mutaciju na ostatku 46.
[0240] Sekvence humanizovanih varijabilnih lakih domena L0 i L1 date su u nastavku (SEQ ID NO:41 i SEQ ID NO:42 respektivno).
T l R zim n ri nih L ri n i h m niz n AP-K
Konstruisanje vektora humanizovanih antitela
[0241] DNK sekvence humanizovanog varijabilnog regiona su optimizovane. DNK fragmenti koji kodiraju humanizovane varijabilne teške i varijabilne lake regione konstruisani su de novo korišćenjem PCR-zasnovane strategije i preklapajućih nukleotida. PCR proizvod je kloniran u sisarske ekspresione vektore koji sadrže humani gama 1 konstantni region i humani kapa konstantni region respektivno. Ovo je Fc region divljeg tipa.
Akceptorska nukleotidna sekvenca klicine linije varijabilnog teškog lanca humanog IGHV1-69 (SEQ ID NO:49)
Akceptorska aminokiselinska sekvenca klicine linije varijabilnog teškog lanca humanog IGHV1-69 (SEQ ID NO:25)
Akceptorska nukleotidna sekvenca klicine linije varijabilnog teškog lanca humanog IGHV1-39 (SEQ ID NO:50)
Akceptorska aminokiselinska sekvenca klicine linije varijabilnog teškog lanca humanog IGKV1-39 (SEQ ID NO:32)
JH1 minigen (SEQ ID NO:26)
AEYFQHWGQGTLVTVSS
Jκ2 minigen (SEQ ID NO:33)
YTFGQGTKLEIK
Ne-kodon optimizovana nukleotidna sekvenca varijante H0 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:51)
1
Ne-kodon optimizovana nukleotidna sekvenca varijante L0 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:52)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H0 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:53)
Aminokiselinska sekvenca varijante H0 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:27)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H1 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:54)
2
Aminokiselinska sekvenca varijante H1 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:28)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H2 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:55)
Aminokiselinska sekvenca varijante H2 VH humanizovanog SAP-E SEQ ID NO:29
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H3 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:56)
Aminokiselinska sekvenca varijante H3 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:30)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H4 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:57)
Aminokiselinska sekvenca varijante H4 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:31)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante L0 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:58)
4
Aminokiselinska sekvenca varijante L0 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E SEQ ID NO:34
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante L1 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:59)
Aminokiselinska sekvenca varijante L1 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:35)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante L2 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:60)
Aminokiselinska sekvenca varijante L2 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:36)
(Kodon optimizovana) cela zrela nukleotidna sekvenca H1 teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:61)
Cela zrela aminokiselinska sekvenca H1 teškog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:62)
(Kodon optimizovana) cela zrela nukleotidna sekvenca L1 lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:63)
Cela zrela aminokiselinska sekvenca L1 lakog lanca humanizovanog SAP-E (SEQ ID NO:64)
Ne-kodon optimizovana nukleotidna sekvenca varijante H0 regona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:65)
Ne-kodon optimizovana nukleotidna sekvenca varijante L0 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:66)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H0 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ IS NO:67)
Aminokiselinska sekvenca varijante H0 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:37)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H1 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K SAP (SEQ ID NO:68)
Aminokiselinska sekvenca varijante H1 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:38)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H2 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:69)
Aminokiselinska sekvenca varijante H2 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:39)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante H3 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:70)
Aminokiselinska sekvenca varijante H3 regiona V teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:40)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante L0 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:71)
Aminokiselinska sekvenca varijante L0 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:41)
(kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante L1 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:72)
Aminokiselinska sekvenca varijante L1 regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:42)
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca H3 teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:75)
1
Aminokiselinska sekvenca H3 teškog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:76)
2
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca L0 lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:77)
Aminokiselinska sekvenca L0 lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:78)
Signalna sekvenca za imunoglobulinske lance (SEQ ID: 79)
MGWSCIILFLVATATGVHS
Primer 4: - Ekspresija antitela
Ekspresija rekombinantnog antitela
[0242] Ekspresioni plazmidi koji kodiraju teške i lake lance respektivno himernih ili humanizovanih antitela prolazno su ko-transficirani u HEK2936E ćelije lipidnom transfekcijom korišćenjem Fectin 293. Ćelije su uzgajane u Freestyle expression media 293 sa 10% pluronic F68 i 50mg/ml geneticina, 37 stepeni C, 5% CO272 - 120 časova, supernatant je sakupljen centrifugiranjem. U nekim slučajevima materijal supernatanta je korišćen kao test u analizama vezivanja. U drugim slučajevima, materijal supernatanta je sterilizovan filtriranjem i antitelo je rekuperovano afinitetnom hromatografijom korišćenjem Protein A MAbSelect SuRE kolone praćeno dijalizom u PBS.
Ekspresija antitela hibridoma
[0243] Ćelije hibridoma su uzgajane u šejker bocama u Ex620 medijumu sa dodatkom 4mM glutamaksa i 10% FCS sa niskim sadržajem IgG. Ćelije su pasažirane i odvojene od seruma do dobrog rasta u medijumu bez seruma. Ćelije su zatim korišćene za zasejavanje 10L “wavebag”. Ćelije su uzgajane u “wavebag” na 22 ljuljanja/min, 37 stepeni C, 5% CO2@ 0.1L/min dok vijabilnost nije pala na 30%. Kondicionirani medijum je sakupljen sterilnom filtracijom. Antitelo je rekuperovano afinitetnom hromatografijom korišćenjem rekombinantnog Proteina A praćeno sa dijalizom u PBS.
Primeri 5-7: Uporedni podaci između hibridoma i/ili himernih mAbs i/ili humanizovanih Mabs
Primer 5: Poređenje SAP-K i SAP-E hibridoma u ELISA sa vezivanjem humanog SAP
[0244] 1 µg/mL ili 5 µg/mL humanog SAP je direktno imobilisano na ELISA ploči i blokirano sa 1%BSA/TBSplus 0.05% TWEEN20. Anti-SAP antitela iz prečišćenog materijala su titrovana duž ploče. Vezano antitelo je detektovano tretmanom sa zečjim-anti-mišjim IgG antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) (Dako, P0260). ELISA je razvijena korišćenjem O-fenilendiamin dihidrohlorid (OPD) peroksidaza supstrata (Sigma, P9187).
[0245] Slika 1 prikazuje krive vezivanja za mišja antitela SAP-E i SAP-K na 1 µg/mL koncentraciji za oblaganje humanog SAP.
[0246] Slika 2 prikazuje krive vezivanja za mišja antitela SAP-E i SAP-K na 5 µg/mL koncentraciji za oblaganje humanog SAP.
[0247] Na 5 µg/mL koncentraciji za oblaganje, SAP-K i SAP-E pokazali su slično vezivanje za imobilisani humani SAP, dok je na 1 µg/mL oblaganju sa niskom gustinom SAP-K prikazao veće vezivanje od SAP-E. Sve naknadne ELISAs vezivanja humanog SAP korišćenjem ovog formata koristile su nižu gustinu 1 µg/mL koncentracije za oblaganje da bi se napravila razlika između vezujućih karakteristika dva antitela.
4
Primer 6: Poređenje SAP-K i SAP-E himernih/humanizovanih mAbs u ELISA sa vezivanjem humanog SAP
[0248] 1µg/mL humanog SAP je direktno imobilisano na ELISA ploči i blokirano sa 1%BSA/TBS plus 0.05%TWEEN20. Anti-SAP antitela iz test supernatanata ili prečišćenog materijala titrovana su duž ploče. Vezano antitelo je detektovano tretmanom sa kozjim antihumanim kapa laki lanac – peroksidaza konjugatom (Sigma, A7164).ELISA je razvijena korišćenjem O-fenilendiamin dihidrohlorid (OPD) peroksidaza supstratom (Sigma, P9187).
[0249] Slika 3 prikazuje krive vezivanja za himerna antitela cSAP-E i cSAP-K. Profil krivih za himerna antitela je isti kao onaj ekvivalentnih hibridoma.
[0250] Slika 4 prikazuje krive vezivanja za SAP-K H0L0, SAP-K H1L0, SAP-K H2L0 i SAP-K H3L0 u poređenju sa SAP-K himerom i SAP-E H1L1 u poređenju sa SAP-E himerom. Irelevantno humano IgG1 kapa antitelo je takođe testirano kao negativna kontrola. Podaci pokazuju da je humanizacija SAP-K antitela rezultovala u gubitku vezujuće aktivnosti humanog SAP od oko 2-puta u poređenju sa roditeljskom SAP-K himerom, dok je humanizovano SAP-E antitelo zadržalo vezujuću aktivnost u poređenju sa roditeljskom SAP-E himerom.
Primer 7 Kompetitivna ELISA
[0251] ELISA ploče su obložene sa humanim SAP na ili 1µg/mL (za kompeticiju sa SAP-K himerom) ili 5µg/mL (za kompeticiju sa SAP-E himerom) i blokirane sa 1% BSA/PBS. Konstantna koncentracija himernog anti-SAPmAb je pomešana sa serijski razblaženim (1:1) količinama mišjih anti-SAP mAbs. Ploče su isprane i količina himernog antitela vezanog za imobilisani humani SAP je detektovana korišćenjem kozjeg anti-humanog kapa lakog lanca – peroksidaza konjugata (Sigma, A7164). ELISA je razvijena korišćenjem O-fenilendiamin dihidrohlorid (OPD) peroksidaza supstrata (Sigma, P9187).
[0252] Slika 5 prikazuje prečišćena SAP-K i SAP-E mišja monoklonska antitela u kompetitivnoj ELISA sa SAP-E himerom.
[0253] Slika 6 prikazuje prečišćena SAP-K i SAP-E mišja monoklonska antitela u kompetitivnoj ELISA sa SAP-K himerom.
[0254] Na obe slike 5 i 6 nije uočena komepticija između SAP-E i SAP-K antitela što pokazuje da se antitela vezuju za različite epitope na humanom SAP molekulu.
Primer 8: Određivanje kinetike vezivanja
Biacore analiza vezivanja varijanti humanizovanog anti-SAP antitela za prečišćeni humani i prečišćeni SAP makaki majmuna.
[0255] Humani i makaki SAP su imobilisani na Biacore C1 čipu kuplovanjem sa primarnim aminom u skladu sa uputstvom proizvođača. Humanizovano anti-SAP antitelo sadržano u supernatantima kulture i prečišćena himerna antitela na 512nM pasažirane su preko površina i humanog i makaki SAP i dobijeni su senzorgrami vezivanja. Sva izvođenja su dvostruko referencirana sa injekcijom pufera za prečišćeni uzorak ili medijum za uzorke supernatanta preko površina humanog i makaki SAP. Analiza je izvedena na 25°C korišćenjem HBS-EP pufera. Regeneracija površine urađena je u prisustvu 3M MgCl2i nije uticala na sposobnost antitela da se ponovo vežu za humani SAP u naknadnom ciklusu. Podaci su analizirani korišćenjem 1 prema 1 modela disocijacije u Biacore T100 softveru za procenu.
[0256] Podaci generisani u Tabelama 6a i 6b prikazuju konstante disocijacije (kd) supernatanata humanizovanog SAP-E i SAP-K antitela respektivno. Vrednosti su zasnovane na pojedinačnoj krivoj i korišćene u svrhu rangiranja između različitih konstrukata za vezivanje za humani SAP. Humanizovana SAP-E antitela pokazala su bolje konstante disocijacije od humanizovanih SAPK antitela za vezivanje humanog SAP. Određenih broj varijanti SAP-K humanizovanih antitela pokazalo je vezivanje za SAP makaki majmuna (N.B. SAP-K himera vezani SAP makaki majmuna), dok nijedno od varijanti humanizovanih SAP-E antitela nije vezivalo SAP makaki majmuna (N.B. SAP-E himera takođe nije vezivalo SAP makaki majmuna). Varijante humanizovanog SAP-E antitela koje su sadržale ili linearni graft humanizovanog teškog lanca (H0) ili linerani graft humanizovanog lakog lanca (L0) ili kombinaciju oba pokazale su najslabije konstante disocijacije. SAP-E humanizovani L1 laki lanac bio je najbolja varijanta lakog lanca i kombinacija L1 sa varijantom H1 teškog lanca dala je humanizovano antitelo sa prihvatljivom stopom disocijacije uz održavanje broja povratnih mutacija na minimumu. Rangiranje konstante disocijacije varijanti humanizovanog SAP-K pokazalo je da je L0 linearni graft najbolja varijanta humanizovanog lakog lanca i da je H0 linearni graft najslabija varijanta humanizovanog teškog lanca.
Tabela 6a
Tabela 6b
Biacore analiza vezivanja anti-SAP antitela sa prečišćenim humanim SAP direktno imobilisanim na podlozi čvrste faze
[0257] Humani SAP je imobilisan na Biacore CM3 čipu kuplovanjem sa primarnim aminom u skladu sa uputstvima proizvođača. Anti SAP antitela su pasažirana preko ove površine na 512, 128, 32, 8, 2, 0.5 nM i dobijeni su senzorgrami vezivanja. Sva izvođenja su dvostruko referencirana sa injekcijom pufera preko površine humanog SAP. Analiza je izvedena na 25°C korišćenjem HBS-EP pufera. Regeneracija površine urađena je omogućavanjem da pufer teče preko površine nekoliko minuta i nije uticala na sposobnost humanog SAP da ponovo vežu antitela u naknadnom ciklusu. Podaci su analizirani iz 128 - 0.5nM izvođenja korišćenjem modela bivalentnog analita inherentnog za Biacore T100 softver za procenu.
[0258] Podaci generisani i sakupljeni u tabeli 7 namenjeni su poređenju između konstrukata i pokazuju da SAP-K antitela imaju bolju stopu asocijacije u ovom testu dok SAP-E antitela pokazuju bolje stope disocijacije. Dodatno, humanizacija nije izmenila kinetiku vezivanja SAP-E antitela, dok je za SAP-K gubitak u stopi asocijacije i disocijacije uočen nakon humanizacije.
Tabela 7
Biacore analiza vezivanja anti-SAP antitela za prečišćeni humani SAP zarobljen ili imobilisan O-fosfoetanolaminom
[0259] O-fosfoetanolamin je imobilisan na Biacore CM5 čipu kuplovanjem sa primarnim aminom u skladu sa uputstvima proizvođača. Humani SAP je zatim zarobljen na površini u prisustvu kalcijum hlorida, da bi se replicirao Biacore sistem in vitro, tačna orijentacija SAP molekula vezanih za amiloidna vlakna in vivo. Anti SAP antitela su zatim pasažirana preko ove površine na 256, 64, 16, 4, 1 nM i dobijeni su senzorgrami vezivanja. Analiza je izvedena na 25°C korišćenjem 4% BSA, 10mM Tris, 140mM NaCl, 2mM CaCl2, 0.05% surfaktant P20, 0.02%NaN3, pH 8.0 kao tekući pufer. Regeneracija je postignuta korišćenjem dva pulsa Tris-EDTA (10mM Tris, 140mM NaCl, 10mM EDTA, pH 8.0) koja su uklonila vezani humani SAP, ali nisu značajno uticali na naknadno vezivanje SAP za imobilisani fosfoetanolamin. Generisani podaci su dvostruko referencirani sa injekcijom pufera preko površine humanog SAP i analizirani korišćenjem modela bivalentnog analita u Biacore T100 softveru za procenu.
[0260] Generisani podaci, kao što je prikazano u Tabeli 8, namenjeni su samo za poređenje između konstrukata. Oni ne čine precizne kinetičke vrednosti, usled mogućih modifikacija vezivanja preko efekta aviditeta inherentnom u formatu testa. Verovatnije je da je aviditet uticao na stope disocijacije antitela, što dovodi do nižih izračunatih KD vrednosti. Dodatno, za sva SAP-E antitela, dobijena stopa disocijacije (kd) je izvan granice opsega merenja Biacore. Ipak, rezultati ukazuju na čvrsto vezivanje anti-SAP antitela sa humanim SAP imobilisanim interakcijom SAP sa ligandom čvrste faze, kao što je to kod amiloidnih naslaga in vivo, što je terapeutski cilj ovog pronalaska.
Tabela 8
Primer 9: Skeniranje aminokiselina na poziciji 91 L0 humanizovanog lakog lanca SAP-K
[0261] Korišćena je usmerena saturaciona mutageneza da bi se generisao panel varijanti gde je cisteinski ostatak na poziciji 91 (Kabat numerisanje) potencijalno supstituisan sa svih drugih 19 aminokiselina u pojedinačnoj reakciji korišćenjem prajmera za mutagenezu koji kodira NNK na ovoj poziciji (gde je N kod za adenozin ili citidin ili guanozin ili timidin i K je kod za guanizin ili timidin). Iz Biacore rangiranja konstante disocijacije izvedenog na supernatantu antitela za generisane varijante, četiri su izabrane za pojačanje u HEK2936E ćelijama i prečišćavanje. Biacore analiza kinetike korišćenjem O-fosfoetanolamin postupka kao što je detaljno dato u Primeru 7 pokazala je da je varijanta sa alaninom na poziciji 91 (SEQ ID NO:43) imao poboljšan afinitet u poređenju sa divljim tipom; KD vrednosti od 0.436 nM i 36.8 nM izmerene su respektivno. N.B. sve varijante su testirane u istom eksperimentu koji je korišćen da se dobiju rezultati prikazani u tabeli 7.
[0262] Druge varijante, na primer glicin, serin i valin poboljšali su vezivanje u odnosu na H3L0, ali u manjoj meri od alanina. Dodatno, činjenica da su ove četiri varijante imale bolje karakteristike vezivanja od L0 takođe je uočena u ELISA eksperimentu vezivanja i Biacore rangiranju konstante disocijacije kada su laki lanci upareni sa H1.
(Kodon optimizovana) nukleotidna sekvenca varijante L0 91A regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:73)
Aminokiselinska sekvenca varijante L0 91A regiona V lakog lanca humanizovanog SAP-K (SEQ ID NO:74)
Primer 10: Zavisnost uklanjanja amiloida sa anti-SAP antitelom od komplementa.
[0263] Uloga komplementa u uklanjanju amiloida sa anti-SAP antitelom ispitivana je poređenjem efikasnosti tretmana između miševa sa deficijencijom komplementa i normalnih, životinja sa komplementom. Ciljana delecija gena za C1q blokovsku aktivaciju klasičnog puta komplementa, koji je iniciran vezivanjem C1q sa kompleksom antitelo antigen, ali C3 aktivacija, ključni funkcionalni korak odgovoran za hemotaksiju i opsonizaciju, glavne biološke funkcije komplementa, može se i dalje nastaviti preko alternativnog i lektinskog puta kao i preko direktnog C3 cepanja sa ne-komplement serin proteinazama. Ciljana delecija gena za C3 kompletno ukida ove funkcije.
Indukcija AA amiloidoze
[0264] AA amiloidoza je indukovana i potvrđena u dve grupe komplement deficijentnih miševa: C3 nokaut (n=14) i C1q nokaut (n=12), i u 15 miševa divljeg tipa. Svi miševi su bili čiste linije C57BL/6. Svaki miš je primio jednu dozu amiloid pojačivačkog faktora, ekstrakt amiloidnog tkiva koje sadrži amiloidne fibrile (Baltz et al, (1986) PlenumPress, New York, pp. 115-121), intravenskom injekcijom praćenom 4 dana kasnije sa 10 dnevnih potkožnih injekcija 10% w/v kazeinom u rastvoru u 0.1M NaHCO3primenjenih tokom 12-dnevnog perioda (Botto et al, (1997) Nature Med., 3:855-859). Kazein izaziva perzistentnu akutnu inflamaciju i produženo povećanje proizvodnje serum amiloid A proteina (SAA) u AA amiloidnim naslagama kod svih životinja. Sedam dana nakon poslednje injekcije kazeina, Kl je uveden u pijaću vodu svih miševa i 3 dana kasnije svaki miš je primio intravensku injekciju standardne doze<125>I-obeleženih humanih SAP (Hawkins et al, (1990) J. Clin. Invest., 86: 1862-1869 i Hawkins et al, (1988) J. Exp. Med.,167: 903-913). Svi miševi su podvrgnuti brojanju u celom telu 24h i 48h nakon injekcije trejsera da bi se odredila retencija radioaktivnosti, precizni indeks amiloidnog opterećenja u celom telu. Deset dana nakon injekcije<125>I-SAP trejsera, svi miševi su ’napunjeni’ sa humanim SAP jednom intraperitonealnom injekcijom od 10 mg po mišu izolovanog čistog humanog SAP. Humani SAP injektiran u amiloidične miševe lokalizuje se u amiloidnim naslagama i ostaje tu sa poluživotom od oko 3-4 dana dok se bilo koji humani SAP koji nije vezan za amiloid ne ukloni iz cirkulacije sa polu-životom od oko 3-4 časa (Hawkinset al, (1988) J. Exp. Mend, 167: 903-913 i Pepys et al, (2002) Nature, 417: 254-259).
[0265] Imunohistohemijsko bojenje sa anti-humanim SAP antitelom u slezini amiloidičnog miša nakon injekcije izolovanog čistog humanog SAP pokazuje da postoji snažno pozitivno bojenje svih amiloidnih naslaga u njihovim tipičnim marginalnim zonama distribucije. Ovaj vezani humani SAP je ciljno mesto terapeutskog anti-SAP antitela prema ovom pronalasku.
Anti-SAP tretman
[0266] Tri dana nakon injekcije humanog SAP, kada se humani SAP više nije mogao detektovati u cirkulaciji, svi miševi osim dva u svakoj od komplement nokaut grupa primili su jednu intraperitonealnu injekciju sa 1 ml cele IgG frakcije (serija br. 2866) monospecifičnog ovčijeg anti-humanog SAP antiseruma sa 50 mg/ml u rastvoru u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS), sa 7 mg/ml stvarnog anti-SAP antitela. Antiserum je proizveden sa The BindingSite Ltd, Birmingham, UK, korišćenjem humanog SAP (rigorozno prečišćenog do 100% u University College London Centre for Amyloidosis and Acute Phase Proteins) i zaštićenih imunizacionih procedura. Sve životinje su zatim ubijene 15 dana nakon anti-SAP primene za histološku procenu opterećenja amiloidom sa alkalnim alkoholnim Congo crvenim bojenjem (Puchtler, H., Sweat, F. and Levine, M. (1962) On the binding of Congo red by amyloid. J. Histochem. Cytochem., 10: 355-364). Congo crveni preseci slezine i jetre svih životinja su nezavisno ispitivani od strane jednog ili više eksperata posmatrača, slepih u
1
odnosu na tretman koji je svaki miš primio, i bodovani u odnosu na količinu prisutnog amiloida kao što je prethodno objavljeno (Botto et al, (1997) Nature Med., 3 : 855-859). Skor od 1-5 predstavljaju približno log baze 10 rangirajuće skale od 1, što odgovara jednoj ili dve male mrlje amiloida u nekoliko preseka odgovarajućeg organa, do 5, što odgovara bogato raširenim naslagama koje sadrže oko 10,000 više amiloida od ocene 1 (Botto et al,(1997) Nature Med., 3: 855-859). Skorovi različitih posmatrača uvek su bili saglasni iako su neki posmatrači koristili srednje skorove celobrojne vrednosti 5. Aritmetička sredina skorova svih posmatrača za svaki organ u svakoj životinji korišćena je za statističku analizu.
Rezultati
[0267] Kao izraziti kontrast efikasnom uklanjanju amiloidnih naslaga u divljem tipu miševa sa normalnim komplementom, još uvek je postojalo mnogo amiloida u obe grupe komplement deficijentnih životinja iako sa tendencijom fragmentisanijeg izgleda nego u dve kontrolne komplement deficijentne grupe svakog tipa. Medijana, opseg amiloidnih skorova slezine i jetre bili su: divlji tip, 1.17, 0.0-1.5, n=15; C3 nokaut, 1.92, 1.17-4.33, n=12; C1q nokaut, 1.25, 1.17-3.5, n=10 (Kruskal-Wallis neparametrijska ANOVA, P<0.001). Razlike između kontrola divljeg tipa i obe komplement deficijentne grupe bile su značajne, P<0.001 za C3 nokaut i P=0.036 (sa Bonferroni korekcijom za višestruka poređenja) za C1q nokaut, ali razlika između C3 i C1q nokautnije bila značajna, P=0.314 (Mann-Whitney U testovi).
Diskusija
[0268] Kod miševa kojima nedostaje ili C1q ili C3, anti-SAP tretman nije uklonio amiloidne naslage tako efikasno kao kod miševa divljeg tipa sa komplementom. Terapeutska efikasnost anti-SAP je stoga u veoma značajnom stepenu zavisna od komplemeta i nije posredovana samo sa vezivanjem IgG antitela koje bi, u teoriji, moglo angažovati fagocitne ćelije preko njihovih Fc(γ) receptora. Ipak fragmenisaniji izgled perzistentnih amiloidnih naslaga kod komplement deficijentnih miševa sugerisalo je najmanje neki efekat samog antitela. Takođe trend većeg klirensa kod C1q deficijentnih u poređenju sa C3 deficijentnim životinjama sugerisalo je da je C3 aktivacija kritična i da se može javiti nešto aktivacije komplementa u odsustvu C1q.
Primer 11: Uslovi za intaktno IgG anti-SAP antitelo
2
[0269] Aktivacija komplementa sa IgG antitelom zahteva ceo intaktni molekul, uključujući Fc region, i odvija se preko klasičnog puta iniciranog vezivanjem C1q. Međutim, u nekim sistemima antitelo-antigen, aktivacija komplementa preko alternativnog puta može biti posredovana sa F(ab)2fragmentom. Da bi se potvrdila zavisnost uklanjanja amiloida sa anti-SAP antitelom od komplementa i da bi se istražili potencijalni uslovi za Fc region antitela, efekat je testiran sa F(ab)2anti-SAP antitelom koje je proizvedeno sa cepanjem pepsinom na pH 4.0 iz IgG frakcije ovčijeg poliklonskog anti-humanog SAP antiseruma (serija 2866) i prečišćeno standardnim postupcima.
Indukcija i tretman AA amiloidoze
[0270] AA amiloidoza je indukovana i potvrđena kod divljeg tipa C57BL/6 miševa kao što je detaljno opisano u prethodnom Primeru 10. Nakon punjenja amiloidnih naslaga sa humanim SAP što je takođe detaljno opisano u Primeru 10, grupe miševa su tretirane sa celom IgG frakcijom ovčijeg poliklonskog anti-humanog SAP antiseruma, samo sa nosačem puferom ili sa F(ab)2fragmentom IgG frakcije. Doza injektiranog anti-SAP antitela bila je 7.28 mg po mišu koji prima F(ab)2i 7 mg (50mg od ukupnog IgG kao uobičajeno) po mišu koji prima ceo IgG. Svi miševi su ubijeni 14 dana kasnije za procenu amiloidnog opterećenja sa Congo crveno bojenjem.
Rezultati
[0271] Uklanjanje amiloidnih naslaga bilo je skoro potpuno kod miševa koji su primali IgG anti-SAP antitelo u poređenju sa masivnim amiloidnim naslagama kod kontrolnih miševa koji su primili samo nosač. Miševi koji su primili F(ab)2imali su manje amiloida od netretiranih kontrola, ali još uvek značajno više od miševa tretiranih sa celim IgG anti-SAP antitelom (Tabela 9).
Tabela 9. Smanjena efikasnost F(ab)2 anti-SAP u poređenju sa intaktnim IgG antitelom u klirensu amiloidnih nasla a.
Diskusija
[0272] Molarna doza F(ab)2anti-SAP antitela korišćenog u ovoj studiji bila je za oko trećinu veća nego ona IgG antitela, usled manje molekulske težine F(ab)2fragmenta u poređenju sa celim IgG. Za optimalni efekat na uklanjanje amiloida Fc je neophodan. Ovo nije zbog direktne uključenosti ćelijskog prepoznavanja od strane Fc(γ) receptora jer je celi IgG bio čak manje efikasan kod komplement deficijentnih miševa nego što je bio F(ab)2kod miševa sa normalnim komplementom. Verovatno je da je primenjena visoka doza F(ab)2bila sposobna da aktivira nešto komplementa preko alternativnog puta.
Primer 12: Potreba za makrofagima
[0273] Histološke i histohemijeke studije opisane u SAD 2009/0191196 pokazuju da su ćelije koje infiltriraju, okružuju i fagocitiraju amiloidne naslage kod miševa tretiranih sa anti-SAP antitelom makrofagi. Da bi se potvrdilo da su makrofagi zaista odgovorni za uklanjanje amiloida, efekat tretmana sa frakcijom celog IgG ovčijeg poliklonskog anti-humanog SAP antiseruma (serija 2866) testiran je kod miševa kod kojih je inhibirana sva aktivnost makrofaga primenom lipozomalnog klodronata. Reagensi, eksperimentalni protokol i efekti lipozomalnog klodronata na funkciju makrofaga su dobro ustanovljeni i ekstenzivno dokumentovani (Van Rooijen et al,(2002) J. Liposome Research. Vol.12. Pp, 81-94).
Indukcija i tretman AA amiloidoze
[0274] Nakon indukcije i potvrde AA amiloidoze kod miševa divljeg tipa, korišćenjem protokola detaljno datog u prethodnom Primeru 10, sve životinje su primile jednu intraperitonealnu dozu od 10 mg izolovanog čistog humanog SAP da bi se njihove naslage
4
napunile sa humanim SAP. Test grupa je zatim primila 0.3 ml lipozomalnog klodronata intraperitonealno odmah i na dane 2, 7 i 14 nakon toga. Jedna kontrolna grupa i test grupa primile su jednu intraperitonealnu dozu od 50 mg IgG frakcije ovčijeg anti-humanog SAP antiseruma na dan 3 nakon injekcije humanog SAP. Druga kontrolna grupa nije primila anti-SAP niti drugi dodatni tretman. Svi miševi su ubijeni za procenu opterećenja amiloidom sa Congo crveno bojenjem 14 dana nakon primene anti-SAP na test i antitelo kontrolne grupe.
Rezultati
[0275] Tretman sa anti-SAP proizveo je skoro potpuno uklanjanje amiloidnih naslaga u poređenju sa grupom koja nije primila antitelo. Nasuprot tome, kod miševa koji su primili lipozomalni klodronat u režimu za koji se zna da potpuno onemogućava funkciju makrofaga, nije bilo uklanjanja amiloidnih naslaga (Tabela 10).
Tabela 10. Deplecija makrofaga inhibira uklanjanje amiloidnih naslaga pomoću anti-SAP antitela.
Diskusija
[0276] Rezltati u ovom naročitom eksperimentu potvrdili su da je funkcija makrofaga neophodna za uklanjanje naslaga amiloida sa anti-humanim SAP antitelom.
Primer 13: Efikasnost mišjeg monoklonskog anti-humanog SAP antitela, SAP-E, u uklanjanju mišjih sistemskih AA amiloidnih naslaga.
[0277] Kapacitet različitih monoklonskih antitela da posreduju u uklanjanju mišjih AA amiloidnih naslaga koje sadrže humani SAP je tražen u poređenju sa standardnim ovčijim poliklonskim anti-humanim SAP antitelom kao pozitivnom kontrolom.
Indukcija AA amiloidoze i tretman
[0278] SAP nokaut C57BL/6 miševi transgeni za humani SAP stvoreni su ukrštanjem životinja čiste linije C57BL/6 u kojima je mišji SAP gen deletiran (Botto et al, (1997) Nature Med., 3: 855-859) sa C57BL/6 miševima koji nose humani SAP transgen (Yamamura et al, (1993) Mol. Reprod. Dev., 36: 248-250 i Gillmore et al, (2004) Immunology,112: 255-264). Ovi miševi stoga nemaju mišji SAP ali eksprimiraju humani SAP u koncentracijama značajno većim od onih uočenih kod čoveka. Sistemska AA amiloidoza je indukovana kod nokaut transgenih miševa sa humanim SAP kao što je opisano u Primeru 10, i 9 dana nakon finalne injekcije kazeina u miševe, prisustvo i stepen amiloidnih naslaga je potvrđen kao što je uobičajeno sa brojanjem amiloida u celom telu nakon injekcije doze trejsera od<125>I-obeleženog humanog SAP. Svi miševi su imali značajne i uporedive količine amiloida, i smešteni su u blisko uparene grupe da prime različite trretmane. Nedelju dana nakon injekcije trejsera, svaki miš je primio jednu dozu od 5mg CPHPC intraperitonealnom injekcijom, da bi se depletirao njihov cirkulišući humani SAP, praćen 5h kasnije istim načinom primene ili standardne ovčije poliklonske anti-humane SAP IgG frakcije (serija 2866, 1 ml na 50 mg/ml ukupnog proteina koji sadrži 7 mg/ml anti-humanog SAP antitela) ili 5 mg jednog od devet različitih izolovanih čistih monoklonskih anti-humanih SAP antitela (Tabela 11). Svi miševi su ubijeni 21 dan nakon injekcije antitela i opterećenje amiloidom je određeno Congo crvenom histologijom njihovih slezina.
Tabela 11. Prisustvo amiloida u slezini miševa sa sistemskom AA amiloidozom posle tretmana sa CPHPC i različitim anti-humanim SAP antitelima.
[0279] Među testiranim monoklonskim antitelima, samo je SAP-E doveo do uklanjanja amiloidnih naslaga, ali je njegov efekat bio isti kao i visoko reproducibilna i dramatična aktivnost ovčijeg poliklonskog antitela. Važno je naglasiti da je SAP-E iz mišjeg IgG2a izotipa za koji je poznato da aktivira mišji komplement, dok su svi drugi mnonoklonovi izuzev SAPB bili IgG1 izotipa koji ne aktivira komplement. Iako je SAP-B mišji IgG2a izotip, njegovo vezivanje za SAP in vitro bilo je uočljivo manje nego ono kod SAP-E i očigledno nije bilo dovoljno in vivo da bi bilo efikasno.
Diskusija
[0280] Ovi rezultati pokazuju da dovoljno avidno, komplement aktivirajuće, IgG2a mišje monoklonsko anti-humano SAP antitelo posreduje u uklanjanju amiloida in vivo sa istom efikasnošću kao ovčije poliklonsko anti-humano SAP antitelo.
Primer 14: Uporedna karkaterizacija monoklonskih mišjih anti-humanih SAP antitela, SAP-K i SAP-E, in vitro.
[0281] SAP-K je izabran od 6 različitih, koji se vezuju sa najvećim aviditetom, mišjih IgG2a monoklona, izvedenih standardnim tehnikama iz imunizacija sa prečišćenim humanim SAP i konvencionalne fuzije da bi se dobili hibridomi koji su klonirani rutinskim postupcima. Od ovih IgG2a antitela, SAP-K su pokazivali najveće vezivanje sa imobilisanim humanim SAP. Ovo je bio slučaj nezavisno od toga da li je humani SAP bio direktno imobilisan na plastičnoj površini nespecifičnom adhezijom ili kovalentnim vezivanjem, ili sa kalcijum specifičnim vezivanjem SAP sa imobilisanim ligandima, bilo amiloidnim vlaknima ili ligandima malog molekula, fosfoetanolamina. SAP-K se takođe dobro vezivao za direktno imobilisani SAP u prisustvu ili odsutvu kalcijuma, i ukoliko je SAP bio prethodno u kompleksu sa CPHPC i zatim kovalentno ’fiksiran’ u dekamernom SAP-CPHPC kompleksu (Pepys, M.B. et al (2002) Targeted pharmacological depletion of serum amyloid P component for treatment of human amyloidosis. Nature, 417: 254-259; Kolstoe, S.E. et al (2009) Molecular dissection of Alzheimer’s disease neuropathology by depletion of serum amyloid P component. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 106: 7619-7623). SAP-E se takođe dobro vezivao sa humanim SAP i svim ovim različitim konfiguracijama. Međutim dva antitela se značajno razlikuju po tome što se mnogi više SAP-K nego SAP-E vezuje kada je humani SAP samo retko prisutan, na primer kada su ploče izložene samo 1 mg/ml humanog SAP za oblaganje, dok kada je bilo mnogo više imobilisanog SAP, na primer kada je rastvor za oblaganje sadržao 100 mg/ml SAP, bilo je više vezivanja SAP-E nego SAP-K. Ova razlika sugeriše da se SAP-E optimalno vezuje kada je više od jednog SAP molekula grupisano dok se SAP-K avidno vezuje sa pojedinačnim izolovanim SAP molekulima. Ovaj mehanizam je podržan nalazom da kada je humani SAP bio imobilisan zarobljavanjem na pločama obloćenim sa poliklonskim ovčijim anti-humanim SAP (serija 2866), koji obezbeđuje parove SAP molekula koji se čvrsto drže u dve ruke svakog molekula ovčijeg IgG antitela, SAP-E se vazivao bolje od SAP-K na svim nivoima humanog SAP inputa (Slika 7).
[0282] Slika 7 prikazuje imunoradiometrijski test za vezivanje monoklonskih mišjih antitela za humani SAP zarobljen sa imobilisanim ovčijim poliklonskim anti-humanim SAP antitelom. Ponuđeno je značajno više SAP-E od SAP-K vezano na svim koncentracijama humanog SAP. Svaka tačka je srednja vrednost 3 ponavljanja.
[0283] Veoma je važno da su se i SAP-E i SAP-K vezivali očigledno jednako dobro za nativni humani SAP, prikazano sa sličnom imunnoprecipitacijom oba antitela u dvostrukoj imunodifuziji na agaroznom gelu protiv oba izolovana čista humana SAP i celog humanog seruma. Slično vezivanje ova dva mišja monoklonska antitela odražava se u sličnim parametrima merenim Biacore instrumentom (BIAcoreX, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) korišćenjem humanih SAP kovalentno imobilisanih na čipu (Tabela 12).
Tabela 12. Afinitet monoklonskih antitela za humani SAP određen pomoću Biacore
[0284] Nasuprot tome, iako su se oba antitela vezala za nativni humani SAP u western blot-u nakon elektroforeze na agaroznom gelu u fiziološkim puferima, samo se SAP-E vezao za humani SAP u western blot-u iz redukovanog SDS-PAGE. SAP-E stoga prepoznaje denaturisani humani SAP, dok SAP-K prepoznaje samo nativni humani SAP i mora se vezivati za konformacioni epitop.
[0285] CNBr digestija humanog SAP rezultuje u cepanju između 159M i 160W što rezultuje u novom peptidu gde je pozicija 159 pretvorena iz metionina u homoserin lakton (označen 150-158-homoserin lakton). U western blot-u iz SDS-PAGE, SAP-E se vezivao za N-terminalni 1-158-homoserin lakton polipeptid oslobođen CNBr cepanjem SAP na ostatku Met159, ali je slabo reagovao sa 1-140 fragmentom oslobođenim sa himotripsin digestijom u odsustvu kalcijuma (Slika 8). Epitop prepoznat sa SAP-E mora stoga biti u regionu 140-158 koji očigledno sadrži nešto sekundarne strukture otporne na denaturaciju jer SAP-E vezivanje nije potentno inhibirano sa peptidima 136-147, 138-149, 140-151 i 112-119 u rastvoru. Ovo je u skladu sa kinetičkom stabilnošću i otpornošću na denaturaciju SAP (Manning, M. and Colón, W. (2004) Biochemistry, 43: 11248-11254).
[0286] Slika 8 prikazuje mapiranje epitopa za monoklonsko anti-humano SAP antitelo, SAP-E. A, kompletna aminokiselinska sekvenca humanog SAP koja pokazuje tačke u kojima je isečeno sa CNBr u 70% TFA (ostatak 159M) i sa himotripsinom, bez redukcije/karbamidometilacije, u amonijum bikarbonatu u odsustvu kalcijuma, (ostaci 140Y i 144F). B, SDS-PAGE analiza SAP isečenog sa CNBr. Levo polje: Coomassie plavo bojenje; traka 1, netretirana kontrola SAP; traka 2, SAP nakon CNBr cepanja, koja pokazuje rezidualne neodvojene intaktne protomere u tragovima i očekivane fragmente na približno 20kD (ostaci 1-158-homoserin-lakton) i 5kD (160-204) respektivno. Ovo je tačno potvrđeno masenom spektrometrijom. Desno polje: Western blot sa SAP-5 koji prikazuje intenzivno bojenje intaktnog netretiranog SAP u trakama 1 (100 ng napunjeno) i 2 (10 ng), i takođe rezidualni intaktni SAP i veći ostatak 1-158-homoserin-lakton fragmenta u CNBr isečenom SAP u trakama 3 (600 ng), 4 (130 ng) i 5 (64 ng). Traka 6 je sadržala izolovani čisti humani CRP sa kojim uopšte nije reagovao SAP-5. C, SDS-PAGE analiza SAP digestovanog sa himotripsinom. Levo polje: Coomassie plavo bojenje; traka 1, netretirana kontrola SAP; traka 2, SAP nakon digestije himotripsinom, koja pokazuje očekivane glavne fragmente koji odgovaraju ostacima 1-140 i 145-204. Oni su tačno potvrđeni sa masenom spektrometrijom. Desno polje: Western blot sa SAP-E koji pokazuje intenzivno bojenje inatktnog netretiranog SAP u trakama 1 (500 ng napunjeno) i 2 (100 ng), i takođe rezidualni intaktni SAP u trakama 3 i 4 koje su sadržavale SAP digestovan himotripsinom pri različitim punjenjima. Veoma slabo vezivanje SAP-E sa ostatkom 1-140 fragmenta uočeno je samo u traci 3 koja je najviše napunjenja. Trake 5 (500 ng) i 6 (100 ng) sadržale su izolovani čisti humani CRP sa kojim SAP-E nije uopšte reagovao. D, Poređenje sekvence između humanog SAP (h) i mišjeg SAP (m) za ostatke 136-147. Gornje polje, razlike označene iznad sa ostacima prikazanim crno u mišjoj sekvenci. Donje polje, pozicija ove produžene petlje sa 140Y na njenom vrhu prikazana belom u 3D strukturi subjedinice humanog SAP. Različiti ostaci u mišjoj sekvenci su prikazani crnom. Sive sfere predstavljaju atome kalcijuma vezane u ligand vezujućem džepu.
[0287] Konformacioni epitop prepoznat od SAP-K identifikovan sa CLIPS® tehnologijom mapiranja epitopa (PepscanPresto BV) kao izložena periferna petlja, ostaci 121-131, na obodu diskolikog pentamernog nativnog SAP molekula.
[0288] Slika 9 prikazuje lokaciju epitopa na humanom SAP prepoznatom sa SAP-K (A, naglašeno crnim, kao što je određeno CLIPS® tehnologijom) i SAP-E (B, prikazano belim, 140-158 kao što je određeno rezultatima vezivanja sa proizvodom CNBr cepanja SAP i fragment oslobođen sa digestijom sa himotripsinom u odusutvu kalcijuma).
Primer 15: Efikasnost SAP-K mišjeg monoklonskog anti-humanog SAP antitela u uklanjanju amiloidnih naslaga in vivo u mišjem modelu AA amiloidoze.
[0289] Potencija SAP-K upoređena je sa aktivnošću standardnog ovčijeg poliklonskog antitela u uklanjanju ustanovljenih sistemskih AA amiloidnih naslaga kod miša.
Indukcija AA amiloidoze i tretman
[0290] AA amiloidoza je indukovana i potvrđena kod divljeg tipa C57BL/6 miševa kao što je detaljno dato u prethodnom Primeru 10. Nakon punjenja amiloidnih naslaga sa humanim SAP takođe detaljno datim u Primeru 10, grupe miševa su tretirane sa 50 mg po mišu ukupnog IgG kao frakcije celog IgG (serija 2866) ovčijeg poliklonskog anti-humanog SAP antiseruma što je obezbedilo dozu od 7 mg stvarnog anti-SAP antitela, izolovanim prečišćenim SAP-K na dozi od 5 mg po mišu, izolovanim prečišćenim SAPK u dozi od 1 mg po mišu, i, kao negativna kontrola, izolovanim prečišćenim mišjim monooklonskim IgG2a antitelom specifičnim za nesrodni humani antigen i nereaktivno sa ili humanim SAP ili bilo kojim mišjim antigenom. Svi miševi su ubijeni 17 dana kasnije za procenu opterećenja amiloidom sa Congo crvenim bojenjem.
Rezultati
[0291] Miševi tretirani sa 5 mg SAP-K pokazali su isto izvanredno uklanjanje amiloidnih naslaga u slezini i jetri kao što je uočeno sa 7 mg dozom ovčijeg poliklonskog antitela. Samo su tri mrlje amiloida ostale u slezinama tretiranih miševa i nijedna nije detektovana u mnogim jetrama, što je izrazito različito u odnosu na ekstenzivne amiloidne naslage u slezinama i jetrama svih životinja koje su primile irelevantno kontrolno mišje IgG2a antitelo (Tabela 13). Na nižim dozama od 1 mg, 0.5 mg i 0.1 mg (podaci nisu prikazani za 0.5 mg i 0.1 mg) SAP-K po mišu, nije bilo nikakvog značajnog efekta.
Tabela 13. Efekat monoklonskog mišjeg IgG2a anti-humanog SAP antitela SAP-K na visceralne amiloidne naslage kod miševa – sa sistemskom AA amiloidozom.
Amiloid skor
– medijana,
opseg
Grupa (tretman, veličina grupe) Slezina Jetra 1 (negativni kontrolni mišji IgG2a, n=8) 4.08, 1.5-4.50 2.42, 2.0-2.67 2 (7 mg ovčjeg poliklonskog IgG anti-humanog 1.17, 1.0-1.5 1.0, 0.67-1.17 SAP antitela, n=5)
3 (1 mg monoklonskog mišjeg IgG2a anti- 3.5, 2.83-4.5 1.83, 1.0-2.83 humanog SAP antitela, SAP-K, n=10)
4 (5 mg monoklonskog mišjeg IgG2a anti- 1.25, 1.0-2.0 1.0, 1.0-1.33 humanog SAP antitela, SAP-K, n=10)
Kruskal-Wallis test: slezina, P<0.001; jetraP,0.001
Mann-Whitney testovi*: 1 napsram 2, slezina, P=0.002; jetra, P=0.002; 1 naspram 3, slezina, P=0.173; jetra, P=0.083; 1 naspram 4, slezina, P<0.001; jetra, P<0.001; 2 naspram 3, slezina, P=0.0.001; jetra, P=0.019; 2 naspram 4, slezina, P=0.513; jetra, P=0.768; 3 naspram 4, slezina, P<0.001; jetra, P=0.004. *Zahvaljujući višestrukim poređenjima, P vrednost od 0.01 ili manje je potrebna za značajnost.
Diskusija
[0292] Ovi rezultati pokazuju efikasnost monoklonskog anti-humanog SAP antitela u uklanjanju amiloidnih naslaga in vivo, aktivaciji komplementa mišjeg IgG2a izotipa, koje specifično prepoznaje konformacioni epitop. Monoklonska anti-humana SAP antitela za upotrebu prema ovom pronalasku mogu se usmeriti ili ka predominantno sekvencama epitopa, kao što je antitelo SAP-E, ili ka potpuno konformacionim epitopima, kao što je SAP-K.
Primer 16: Poređenje efikasnosti SAP-E i SAP-K u uklanjanju sistemskih AA amiloidnih naslaga kod miševa i procena konecentracija anti-SAP antitela u plazmi.
Indukcija AA amiloidoze i tretman
[0293] AA amiloidoza je indukovana i potvrđena kod divljeg tipa C57BL/6 miševa kao što je detaljno dato u prethodnom Primeru 10. Nakon punjenja amiloidnih naslaga sa humanim SAP
1
takođe detaljno datim u Primeru 10, grupe miševa su tretirane sa 3 mg i 1 mg po mišu dva različita antitela. Kontrolna grupa, u kojoj je takođe indukovan amiloid, primila je samo PBS umesto antitela i dvema sledećim grupama data je poznata efikasna doza od 5 mg/mišu svakog antitela. Svim miševima je uzimana krv za test cirkulišućeg anti-SAP antitela na dane 1, 5 i 15 nakon doziranja sa antitelom i svi su ubijeni na dan 21 za procenu amiloidnog opterećenja sa Congo crvenim bojenjem. Svi serumi su testirani u odnosu na anti-SAP aktivnost korišćenjem robusnog imunoradiometrijskog testa standardizovanog sa prečišćenim SAP-E i SAP-K respektivno, koji su u poznatim koncentracijama dodati u normalni mišji serum.
Rezultati
[0294] Amiloidno opterećenje je bodovano od strane četiri nezavisna eksperta posmatrača svih slepih u odnosu na identitet svakog ispitivanog tkiva. Skorovi svih posmatrača bili su kao i obično visoko saglasni i za statističku analizu ukupni skorovi svih posmatrača i za slezinu i za jetru za svakog miša su sabrani. Oba antitela bila su efikasna, kao što je prethodno pokazano, i postojao je jasan efekat zavistan od doze, ali je SAP-E bio očigledno potentniji od SAP-K na nižim dozama.
Tabela 14. Poređenje potencije između SAP-E i SAP-K u uklanjanju visceralnih AA amiloidnih nasla a
[0295] Aktivnosti koncentracija cirkulišućeg anti-SAP antitela bile su snažno i konzistentno zavisne od doze nakon jedne doze primenjene na sve životinje, osim jedne ekstremne jedinke u svakoj od grupa sa nižom dozom. Nakon doze od 1 mg po mišu, ništa iznad osnovne
2
vrednosti nije se generalno moglo detektovati čak ni na dan 1 kod većine miševa. Nasuprot tome, nakon 5 mg doze puno antitela je i dalje bilo prisutno na dan 15, i nakon 3 mg većina miševa je imala cirkulišuće antitelo na dan 5 ali nekoliko nakon 15 dana (Tabela 15). Nije bilo značajne razlike između obrazaca za SAP-E i SAP-K.
Tabela 15. Koncentracija anti-SAP antitela u serumu posle pojedinačnih intra eritonealnih doza.
Diskusija
[0296] U direktnom poređenju postoje konzistentni dokazi da je SAP-E bio malo, ali značajno potentniji od SAP-K. Nakon primene 1 mg po mišu nije se mogla detektovati aktivnost cirkulišućeg anti-SAP antitela dan kasnije, pri čemu su svi očigledno bili lokalizovani u humanom SAP unutar amiloidnih naslaga. Nakon 3 mg doze puno anti-SAP bilo je prisutno u cirkulaciji na dan 1 i bilo je dalje prisutno na dan 5. Nakon 5 mg po mišu bila je i dalje značajna koncentracija anti-SAP u krvi nakon 15 dana. Ove opservacije sugerišu da ponovljene male doze anti-SAP antitela mogu biti dovoljne da iniciraju uklanjanje amiloida.
Primer 17: Poređenje efikasnosti niske doze SAP-E i SAP-K u uklanjanju sistemskih AA amiloidnih naslaga kod miševa.
Indukcija AA amiloidoze i tretman
[0297] AA amiloidoza je indukovana i potvrđena kod divljeg tipa C57BL/6 miševa kao što je detaljno dato u prethodnom Primeru 10. Nakon punjenja amiloidnih naslaga sa humanim SAP kao što je takođe detaljno dato u Primeru 10, grupe miševa (n=10 svaka) tretirane su sa pojedinačnim dozama od ili 0.5 mg i 1 mg po mišu dva različita antitela, ili 6 ponovljenih doza od 0.15 mg, datih u intervalima od 3 ili 4 dana. Kontrolna grupa (n=9), u kojoj je takođe indukovan amiloid, primila je samo PBS umesto antitela i dvema dodatnim grupama (n=3 svaka) data je poznata efikasna doza od 5 mg/mišu svakog antitela. Svi su ubijeni na dan 29 za procenu opterećenja amiloidom sa Congo crvenim bojenjem.
Rezultati
[0298] Niske doze, uključujući ponovljene veoma niske doze, pokazale su značajnu efikasnost u smanjenju opterećenja amiloidom, naročito u jetri. SAP-E bio je ponovo očigledno potentniji od SAP-K.
Tabela 16. Poređenje potencije između niskih doza SAP-E i SAP-K u uklanjanju visceralnih AA amiloidnih naslaga
Amiloidni skor, (medijana, opseg)
Grupa Slezina Jetra C, negativna kontrola, samo PBS 4.5, 4.0-4.75 3.25, 2.0-4.0
E1, SAP-E 1 mg 1.25, 1.0-4.25 1.0, 0.5-1.25 E0.5, SAP-E 0.5 mg 4.75, 1.0-5.0 1.0, 0.5-3.5
Erep, SAP-E 6x 0.15 mg 3.5, 2.0-4.5 0.5, 0.0-3.25
K1, SAP-K 1 mg 4.13, 1.0-5.0 1.0, 0.0-4.0 K0.5, SAP-K 0.5 mg 4.25, 1.75-4.5 1.13, 0.0-2.75 Krep, SAP-K 6x 0.15 mg 4.38,1.5-4.75 1.0, 0.0-2.25 Kruskal-Wallis test: slezina, P<0.001; jetra, P=0.001
Mann-Whitney testovi*: E1 naspram C: slezina, P<0.001; jetra P<0.001; E0.5 naspram C: slezina, P=0.604; jetra P=0.004; Erep naspram C: slezina, P0.002; jetra, P<0.001; K1 naspram C: slezina, P=0.065; jetra, P=0.001; K0.5 naspram C: slezina, P=0.022; jetra,P=0.001; Krep naspram C: slezina, P=0.079; jetra, P<0.001; E1 naspram E0.5: slezina, P=0.005; jetra P=0.143; E1 naspram Erep: slezina,P=0.043; jetra, P=0.280; E0.5 naspram Erep: slezina, P=0.019; jetra, P=0.043; K1 naspram K0.5: bez značajnih razlika; K1 naspram Krep: bez značajnih razlika; K0.5 naspram Krep: bez značajnih razlika; E1 naspram K1: slezina, P=0.015; jetra, P=0.353; E0.5 naspram K0.5: bez značajnih razlika; Erep naspram Krep: bez značajnih razlika. *Zahvaljujući višestrukim poređenjima, P vrednost od 0.01 ili manje je potrebno za značajnost.
Diskusija
[0299] Značajno veća potencija SAP-E od SAP-K izgleda da može biti reproducibilna. Efikasnost čak veoma malih doza kad se primenjuju ponovljeno i sugerisanje većih efekata na amiloidne naslage u jetri nego u slezini su od interesa i potencijalnog kliničkog značaja.
4
Primer 18: Aktivacija komplementa sa humanizovanim monoklonskim anti-humanim SAP antitelima in vitro.
[0300] Aktivacija komplementa je esencijalna za efikasnost uklanjanja amiloida sa antihumanim SAP antitelima prema ovom pronalasku. Kapacitet humanizovanih monoklonskih antitela, SAP-E H1L1 i SAP-K H3L0, da aktiviraju C3 u serumu čoveka i miša poređena je in vitro dodavanjem različitih količina izolovanih čistih antitela ili celom humanom serumu ili humanom serumu koji sadrži SAP koncentraciju od 30 mg/l, ili celom mišjem serumu u koji je dodat izolovanim čistim humanim SAP u ovoj istoj koncentraciji. U oba slučaja serum je bio svež i sa komplementom i eksperimentalni uslovi su bili optimalni za aktivaciju komplementa sa test puferom za fiksaciju komplementa (CFT) kao razblaživačem.
[0301] Sledeće smeše su napravljene (Tabela 17):
Tabela 17
Epruveta Serum Monoklonsko anti-SAP Krajnje koncentracije br. antitelo (µg/ml)
Anti-SAP Humani SAP M1 Mišji humani SAP SAP-E H1L1 15 30
M2 Mišji humani SAP SAP-E H1L1 30 30
M3 Mišji humani SAP SAP-E H1L1 60 30
M4 Mišji humani SAP SAP-E H1L1 120 30
M5 Mišji humani SAP SAP-K H3L0 15 30
M6 Mišji humani SAP SAP-K H3L0 30 30
M7 Mišji humani SAP SAP-K H3L0 60 30
M8 Mišji humani SAP SAP-K H3L0 120 30
M9 Mišji humani SAP Nijedno 0 30
H1 Humani SAP-E H1L1 15 30
H2 Humani SAP-E H1L1 30 30
H3 Humani SAP-E H1L1 60 30
H4 Humani SAP-E H1L1 120 30
H5 Humani SAP-K H3L0 15 30
H6 Humani SAP-K H3L0 30 30
H7 Humani SAP-K H3L0 60 30
H8 Humani SAP-K H3L0 120 30
H9 Humani Nijedno 0 30
[0302] Sve epruvete su inkubirane na 37°C 2 časa da se omogući aktivacija komplementa. Kako se spora spontana aktivacija uvek odigrava u serumu, dve dodatne kontrole su obezbeđene, replike M9 i H9, označene kao M10 i H10, koje nisu inkubirane, ali su zamrznute na -80°C neposredno nakon mešanja i zatim odmrznute neposredno pre testiranja C3 cepanja. Poređenje između M/H9 i M/H10 omogućuje razlikovanje između spontanog C3 cepanja i bilo koje dodatne aktivacije proizvedene sa anti-SAP antitelom, kao i bilo koji efekat dodavanja samog humanog SAP serumu miša.
[0303] C3 cepanje u humanom serumu testirano je sa dvodimenzionalnom elektroimunoforezom korišćenjem monospecifičnog antitela protiv humanog C3. Ovaj postupak je nisko osetljiv za cepanje mišjeg C3 usled različitih elektroforetskih pokretljivosti mišji C3 je teže pouzdano razlikovati nego što je to slučaj sa humanim C3. Cepanje mišjeg C3 je stoga testirano elektroforezom na agaroznom gelu praćenom imunoblotovanjem sa monospecifičnim antimišjim C3 antitelom.
Rezultati
[0304] Oba humanizovana antitela su efikasno aktivirala humani komplement, što je dokazano velikom doznom zavisnošću cepanja C3, stvarajući smanjenje veličine imunoprecipitacionog pika sporije pokretljivog nativnog C3 i povećanje veličine pika bržeg isečenog C3c (Slika 10).
[0305] Slika 10 prikazuje C3 aktivaciju sa humanizovanim monoklonskim anti-humanim SAP antitelima u celom humanom serumu.
[0306] U testu koji uključuje kontrolu za osnovni nivo C3 cepanja u uzorku H10, jasno je da čak i najniža doza i anti-SAP antitela proizvodi više C3 cepanja nego što je to uočeno u kontroli bez antitela sa sponatnim cepanjem (Slika 11).
[0307] Slika 11 prikazuje C3 aktivaciju sa niskom dozom humanizovanog monoklonskog anti-humanih SAP antitela u celom humanom serumu.
[0308] Veoma slični rezultati dobijeni su za cepanje mišjeg C3 u celom mišjem serumu sa dodatkom humanog SAP. Oba antitela pokazala su dozno zavisno cepanje nativnog mišjeg C3 što vodi do smanjenog intenziteta sporije pokretljive trake nativnog C3 i povećanog intenziteta brže pokretljivog aktiviranog oblika. Takođe čak i najniža doza svakog antitela dovela je do više C3 cepanja nego što je uočeno u kontroli bez antitela sa spontanom aktivacijom (Slika 12).
[0309] Slika 12 prikazuje C3 aktivaciju sa humanizovanim anti-humanim SAP antitelima u celom mišjem serumu sa dodatkom čistog humanog SAP.
Diskusija
[0310] Oba humanizovana monoklonska anti-humana SAP antitela efikasno aktiviraju komplement u prisustvu humanog SAP i stoga su pogodni kandidati za upotrebu u tretmanu sistemske amiloidoze, i bilo koje druge bolesti izazvane ekstracelularnim amiloidnim naslagama u tkivima, prema ovom pronalasku.
KONKORDANCA SEKVENCI
1
11
12
1
14
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14

Claims (9)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantna transformisana, transficirana ili transducirana ćelija domaćin koja sadrži prvi vektor koji kodira laki lanac i drugi vektor koji kodira težak lanac antitela, pri čemu antitelo ima varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca prema SEQ ID NO: 28 i pri čemu antitelo sadrži konstantni domen humanog IgG1 ili IgG3.
2. Ćelija domaćin kao što je definisana u patentnom zahtevu 1, naznačena time što prvi vektor kodira laki lanac prema SEQ ID NO: 64 i drugi vektor kodira težak lanac prema SEQ ID NO:62.
3. Ćelija domaćin kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačena time što prvi vektor sadrži molekul nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 59.
4. Ćelija domaćin kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što drugi vektor sadrži molekul nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 54.
5. Ćelija domaćin kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačena time što prvi vektor sadrži molekul nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 63.
6. Ćelija domaćin kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2 ili 5, naznačena time što drugi vektor sadrži molekul nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 61.
7. Ćelija domaćin kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 naznačena time što ćelija domaćin je eukariotska.
8. Ćelija domaćin kao što je definisana u patentnom zahtevu 7 naznačena time što ćelija domaćin je CHO ćelija.
9. Postupak za proizvodnju antitela kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, naznačen time što postupak sadrži korak kultivacije ćelije domaćina definisane u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 i izolacije antitela.
RS20181162A 2010-03-03 2011-03-01 Antigen vezujući proteini specifični za p komponentu amiloida seruma RS57708B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30995710P 2010-03-03 2010-03-03
EP15178026.9A EP3025729B1 (en) 2010-03-03 2011-03-01 Antigen binding proteins specific for serum amyloid p component

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57708B1 true RS57708B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=43881068

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181162A RS57708B1 (sr) 2010-03-03 2011-03-01 Antigen vezujući proteini specifični za p komponentu amiloida seruma
RS20160741A RS55133B1 (sr) 2010-03-03 2011-03-01 Antigen vezujući proteini specifični za p komponentu amiloida seruma

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160741A RS55133B1 (sr) 2010-03-03 2011-03-01 Antigen vezujući proteini specifični za p komponentu amiloida seruma

Country Status (39)

Country Link
EP (2) EP3025729B1 (sr)
JP (2) JP5922592B2 (sr)
KR (1) KR101817265B1 (sr)
CN (1) CN102858371B (sr)
AR (1) AR080432A1 (sr)
AU (1) AU2011223048C1 (sr)
BR (1) BR112012021926A2 (sr)
CA (1) CA2789557A1 (sr)
CL (1) CL2012002418A1 (sr)
CO (1) CO6602134A2 (sr)
CR (1) CR20120491A (sr)
CY (2) CY1118046T1 (sr)
DK (2) DK2542261T3 (sr)
DO (1) DOP2012000232A (sr)
EA (1) EA026375B1 (sr)
ES (2) ES2699078T3 (sr)
HR (2) HRP20161096T1 (sr)
HU (1) HUE028960T2 (sr)
IL (2) IL221418A (sr)
JO (1) JO3188B1 (sr)
LT (2) LT2542261T (sr)
MA (1) MA34135B1 (sr)
ME (1) ME02491B (sr)
MX (1) MX340350B (sr)
MY (1) MY159255A (sr)
NZ (1) NZ601763A (sr)
PE (1) PE20130040A1 (sr)
PH (1) PH12012501743A1 (sr)
PL (2) PL3025729T3 (sr)
PT (2) PT3025729T (sr)
RS (2) RS57708B1 (sr)
SG (2) SG183316A1 (sr)
SI (2) SI2542261T1 (sr)
SM (2) SMT201800633T1 (sr)
TW (1) TWI558409B (sr)
UA (1) UA108227C2 (sr)
UY (1) UY33258A (sr)
WO (1) WO2011107480A1 (sr)
ZA (1) ZA201206529B (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2506876B1 (en) 2009-12-02 2016-10-12 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
EA031025B1 (ru) * 2012-12-21 2018-11-30 Сиэтл Дженетикс, Инк. Антитела против ntb-a и связанные с ними композиции и способы
CN103239713A (zh) * 2013-05-28 2013-08-14 东南大学 一种糖尿病肾病微炎症小鼠模型的建立方法
US9737505B2 (en) * 2014-04-29 2017-08-22 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Prodrug of 1,1′-(1,6-dioxo-1,6-hexanediyl)bis-D-proline
GB201407506D0 (en) 2014-04-29 2014-06-11 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compound
WO2017027325A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
WO2019185502A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Antibodies comprising methionine sulfoxide at the ch2-ch3 interface
CN116925216B (zh) * 2022-04-11 2024-09-24 东莞市朋志生物科技有限公司 抗血清淀粉样蛋白a抗体、检测血清淀粉样蛋白a的试剂和试剂盒

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
GB9122820D0 (en) 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
ATE183513T1 (de) 1993-06-03 1999-09-15 Therapeutic Antibodies Inc Herstellung von antikörperfragmenten
GB9317120D0 (en) * 1993-08-17 1993-09-29 Royal Postgrad Med School Human serum amyloid p component
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0969862B1 (en) 1997-02-07 2006-10-18 Merck & Co., Inc. Synthetic hiv gag genes
SI0915088T1 (en) 1997-10-31 2002-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag D-proline derivatives
GB9806530D0 (en) 1998-03-26 1998-05-27 Glaxo Group Ltd Inflammatory mediator
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
RU2321630C2 (ru) 2001-08-03 2008-04-10 Гликарт Биотекнолоджи АГ Гликозилированные антитела (варианты), обладающие повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
US6903129B2 (en) 2001-12-14 2005-06-07 Hoffman-La Roche Inc. D-proline prodrugs
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
ATE422943T1 (de) 2002-12-23 2009-03-15 William Marsh Rice Univeristy Verfahren und verbindungen zur verstärkung der fybrozyten-bildung
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
CA2525302A1 (en) 2003-05-12 2004-11-18 David Bundle Multivalent inhibitors of serum amyloid p component
AU2005269759A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
WO2009155962A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Pentraxin Therapeutics Limited Use
GB0712503D0 (en) 2007-06-27 2007-08-08 Therapeutics Pentraxin Ltd Use

Also Published As

Publication number Publication date
ES2699078T3 (es) 2019-02-07
BR112012021926A2 (pt) 2020-08-25
ES2593454T3 (es) 2016-12-09
EA026375B1 (ru) 2017-04-28
PE20130040A1 (es) 2013-02-09
CO6602134A2 (es) 2013-01-18
AU2011223048C1 (en) 2018-06-21
HUE028960T2 (en) 2017-01-30
SMT201800633T1 (it) 2019-01-11
HK1223292A1 (en) 2017-07-28
PL2542261T3 (pl) 2016-12-30
JP6236478B2 (ja) 2017-11-22
CA2789557A1 (en) 2011-09-09
SI2542261T1 (sl) 2016-11-30
SI3025729T1 (sl) 2018-11-30
DK2542261T3 (en) 2016-09-19
CY1120803T1 (el) 2019-12-11
JP5922592B2 (ja) 2016-05-24
DOP2012000232A (es) 2013-01-15
SMT201600337B (it) 2016-11-10
AU2011223048A1 (en) 2012-10-04
PT3025729T (pt) 2018-11-30
TW201143789A (en) 2011-12-16
ME02491B (me) 2017-02-20
MY159255A (en) 2016-12-30
CN102858371B (zh) 2017-03-01
EP3025729B1 (en) 2018-09-12
NZ601763A (en) 2014-08-29
HRP20181666T1 (hr) 2018-12-14
EA201290671A1 (ru) 2013-05-30
HK1173959A1 (zh) 2013-05-31
EP2542261A1 (en) 2013-01-09
AR080432A1 (es) 2012-04-11
AU2011223048B2 (en) 2013-12-19
MA34135B1 (fr) 2013-04-03
SG10201500382SA (en) 2015-03-30
TWI558409B (zh) 2016-11-21
DK3025729T3 (en) 2018-11-26
JP2016154535A (ja) 2016-09-01
LT3025729T (lt) 2018-12-10
IL251031A0 (en) 2017-04-30
EP2542261B1 (en) 2016-07-06
IL221418A (en) 2017-03-30
UY33258A (es) 2011-09-30
RS55133B1 (sr) 2016-12-30
CN102858371A (zh) 2013-01-02
LT2542261T (lt) 2016-09-26
HRP20161096T1 (hr) 2016-11-04
IL221418A0 (en) 2012-10-31
KR101817265B1 (ko) 2018-01-10
SG183316A1 (en) 2012-09-27
PH12012501743A1 (en) 2012-11-12
WO2011107480A1 (en) 2011-09-09
MX2012010129A (es) 2012-09-12
ZA201206529B (en) 2018-12-19
JO3188B1 (ar) 2018-03-08
EP3025729A1 (en) 2016-06-01
PT2542261T (pt) 2016-09-27
PL3025729T3 (pl) 2019-02-28
CL2012002418A1 (es) 2013-03-08
UA108227C2 (xx) 2015-04-10
JP2013521252A (ja) 2013-06-10
CR20120491A (es) 2013-02-20
KR20130027483A (ko) 2013-03-15
IL251031A (en) 2017-11-30
MX340350B (es) 2016-07-06
CY1118046T1 (el) 2017-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6993992B2 (ja) 抗ｐｄ－１抗体、その産生方法及びその使用方法
AU2017266298B2 (en) Anti PD-1 and anti-LAG3 antibodies for cancer treatment
JP6236478B2 (ja) 血清アミロイドｐ成分に特異的な抗原結合タンパク質
US20110200585A1 (en) Cd127 binding proteins
AU2018219595B2 (en) Anti human annexin A1 antibody
CA2700481A1 (en) Antigen binding proteins
CN116113642A (zh) 多特异性抗体、包含其的组合物、及其载体和用途
CA3177888A1 (en) Anti-hemojuvelin (hjv) antibodies for treating anemia of chronic disease
TWI836069B (zh) 抗-sema3a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途
TW202342515A (zh) 抗c3抗體及其抗原結合片段及其用於治療眼疾病之用途
US10221234B2 (en) Antigen binding proteins
CA3140071A1 (en) Anti-angpt2 antibodies
HK1223292B (en) Antigen binding proteins specific for serum amyloid p component
HK1173959B (en) Antigen binding proteins specific for serum amyloid p component