RS57711B1 - Novi oksintomodulin derivativi i farmaceutiske kompozicije za tretman gojaznosti, koje ga sadrže - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novi peptid koji pokazuje odlične aktivnosti na glukagonu sličan peptid-1 receptor i glukagon receptor veće od nativnog oksintomodulin, i kompozicije za prevenciju ili lečenje gojaznosti koji sadrže peptid kao aktivni sastojak.

Stanje tehnike

[0002] Nedavni ekonomski rast i promene u načinu života dovode do promena navika u ishrani. Glavni uzroci porasta stopa prekomerne težine i gojaznosti kod savremenog čoveka su potrošnja visoko-kalorične hrane, kao što je brza hrana i nedostatak vežbanja. Svetska zdravstvena organizacija (SZO) procenjuje da je više od 1 milijarde ljudi širom sveta gojazno, a najmanje 300 miliona od njih su klinički gojazni. Naročito, svake godine u Evropi umre 250.000 ljudi, a više od 2.5 miliona ljudi u svetu svake godine umre zbog prekomerne težine (World Health Organization, Global Strategy on Diet, Physical Activity and Health, 2004).

[0003] Prekomerna težina i gojaznost povećavaju krvni pritisak i nivoe holesterola što izaziva pojavu ili pogoršanje različitih bolesti kao što su kardiovaskularne bolesti, dijabetes i artritis, a takođe su glavni uzročnici porasta stope incidencije arterioskleroze, hipertenzije, hiperlipidemije ili kardiovaskularne bolesti kod dece ili adolescenata, kao i kod odraslih.

[0004] Gojaznost je ozbiljno stanje koje izaziva različite bolesti širom sveta. Smatra se da se prevazilazi pojedinačnim naporima, a sa druge strane se veruje da gojazni pacijenti nemaju samokontrolu. Međutim, lečenje gojaznosti je teško, pošto je gojaznost kompleksan poremećaj koji uključuje regulaciju apetita i metabolizam. Za lečenje gojaznosti, abnormalne akcije udružene sa regulisanjem apetita i metabolizma energije treba lečiti zajedno, uz napore gojaznih pacijenata. Učinjeni su mnogi pokušaji da se razviju lekovi koji su sposobni za lečenje abnormalnih akcija. Kao rezultat tih napora, razvijeni su lekovi kao što je rimonabant (Sanofi-Aventis), Sibultramin (Abbott), Contrave (Takeda) i Orlistat (Roche), ali oni pokazuju nedostatke usled ozbiljnih neželjenih efekata ili veoma slabih efekata protiv gojaznosti. Na primer, bilo je prijavljeno da Rimonabant (Sanofi-Aventis) pokazuje sporedni efekat poremećaja centralnog nervnog sistema, Sibutramine (Abbott) i Contrave (Takeda) pokazuju kardiovaskularne neželjene efekte, i Orlistat (Roche) pokazuje samo 4 kg mršavljenja nakon godinu dana uzimanja. Nažalost, ne postoje terapeutski agensi protiv gojaznosti koji se mogu bezbedno prepisati gojaznim pacijentima.

[0005] Urađene su mnoge studije da se razviju terapeutska sredstva protiv gojaznosti koja nemaju probleme konvencionalnih lekova protiv gojaznosti. Nedavno su veliku pažnju privukli derivati glukagona. Glukagon proizvodi pankreas kada nivo glukoze u krvi padne kao posledica drugih lekova ili bolesti, hormona ili enzimskih nedostataka. Glukagon stimuliše razbijanje glikogena u jetri, i olakšava oslobađanje glukoze da se podigne nivo glukoze u krvi u normalnim granicama. Osim efekta povećanja nivoa glukoze u krvi, glukagon potiskuje apetit i aktivira hormon-senzitivne lipaze (HSL) adipocita da olakšaju lipolizu čime je pokazao efekte protiv gojaznosti. Jedan od derivata glukagona, glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) je u razvoju kao terapeutski agens za hiperglikemiju kod bolesnika sa dijabetesom i funkcioniše tako da stimuliše sintezu i sekreciju insulina, za inhibiranje sekrecije glukagona, usporavanje pražnjenja želuca, za povećanje glukoze i za inhibiciju unosa hrane. Eksendin-4 je izolovan iz otrova guštera koji deli oko 50% homologije amino kiseline sa GLP-1, a takođe je prijavljeno da aktivira receptor GLP 1, čime ublažava hiperglikemiju kod bolesnika sa dijabetesom. Međutim, prijavljeno je da lekovi protiv gojaznosti uključujući GLP-1 ispoljavaju sporedne efekte kao što su povraćanje i mučnina.

[0006] Kao alternativa za GLP-1, dakle, mnogo pažnje je usmerena na oksintomodulin, peptid izveden iz glukagon prekursora, pre-glukagon koji se vezuje za receptore dva peptida, GLP-1 i glukagona. Oksintomodulin predstavlja snažnu terapiju protiv gojaznosti, pošto kao i GLP-1, sprečava unos hrane, promoviše sitost, a ima lipolitičku aktivnost poput glukagona.

[0007] Na osnovu dualne funkcije oksintomodulin peptida, on je aktivno proučavan kao lek za lečenje gojaznosti. Na primer, Korean Patent No. 925017 opisuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje oksintomodulin kao aktivni sastojak za lečenje gojaznih osoba, koji se administrira oralno, parenteralno, mukozno, rektalno, subkutano ili transdermalnim putem. Međutim, prijavljeno je da ovaj lek protiv gojaznosti, uključujući oksintomodulin ima kratak in vivo polu-život i slabu terapeutsku efikasnost, iako se primenjuje u visokoj dozi tri puta dnevno. Tako, su učinjeni mnogi napori da mu se poboljša poluživot in vivo ili terapeutsko dejstvo oksintomodulina na gojaznost njegovom modifikacijom.

[0008] Na primer, dvostruki agonist oksintomodulin (Merck) je dobijen supstitucijom L-serina sa D-serinom na poziciji 2 oksintomodulina zbog povećanja otpornosti na dipeptidil peptidaze-IV (DPP-IV) i povezivanjem holesterol grupe na C-terminal da mu se istovremeno poveća poluživot u krvi. ZP2929 (Zeland) je dobijen supstitucijom L-serina sa D-serinom na poziciji 2 za poboljšanje otpornosti na DPP-IV, supstitucijom arginina alaninom na poziciji 17 za poboljšanje otpornosti na proteaze, supstitucijom metionina lizinom na poziciji 27 da se poveća oksidaciona stabilnost, i supstitucijom glutamina sa asparaginskom kiselinom i alaninom na pozicijama 20 i 24 i asparagina sa serinom na položaju 28 da se poboljša stabilnost od deamidacije. Međutim, iako je poluživot dvojnog agoniste oksintomodulina (Merck) usavršen da pokaže poluživot koji je 8-12 minuta duži nego kod nativnog oksintomodulina, on i dalje ima veoma kratak in vivo polu-život od 1.7 časova i njegova doza administracije je i visoka kao što je nekoliko mg/kg. Nažalost, oksintomodulin ili njihovi derivati imaju nedostatke svakodnevne administracije visoke doze zbog kratkog poluživota i niske efikasnosti.

Opis pronalaska

Tehnički problem

[0009] Prema tome, pronalazači predstavljenog pronalaska su razvili derivativ oksintomodulina koji je pripremljen modifikacijom aminokiselinske sekvence nativnog oksintomodulina u cilju poboljšanja terapeutskih efekata na gojaznost i smanjenja doze administracije. Kao rezultat toga, otkrili su da derivativ oksintomodulina pokazuje više odličnih dejstava na receptor glukagona i GLP-1 receptor nego nativni oksintomodulin, čime je pronalazak kompletiran.

Rešenje problema

[0010] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi novi peptid koji pokazuje odlične terapeutske efekte na gojaznost.

[0011] Sledeći cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi kompoziciju za prevenciju ili lečenje gojaznosti, koja sadrži peptid.

[0012] Još jedan cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi postupak za sprečavanje ili lečenje gojaznosti primenom peptida ili kompozicije na subjektu.

[0013] Još jedan cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi upotrebu peptida u pripremi lekova za prevenciju ili lečenje gojaznosti.

Povoljni Efekti Pronalaska

[0014] Za razliku od nativnog oksintomodulina, novi peptid prema predmetnom pronalasku smanjuje unos hrane, potiskuje pražnjenje želuca i olakšava lipolizu bez sporednih efekata, a takođe pokazuje odlične efekte aktiviranja receptora. Prema tome, on može biti u širokoj upotrebi u lečenju gojaznosti uz bezbednost i efikasnost.

Kratak opis crteža

[0015] Sl. 1 je grafik koji pokazuje promene u unosu hrane u zavisnosti od doze administracije oksintomodulina ili derivata oksintomodulina.

Najbolji način za izvođenje pronalaska

[0016] Za postizanje navedenih ciljeva, predmetni pronalazak obezbeđuje novi peptid koji uključuje amino kiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinske sekvence SEK ID NO: 24, 25 ili 26.

[0017] Amino kiselinama koje su ovde pomenute su dodeljene skraćenice prema nomenklaturnom pravilu IUPAC-IUB kako sledi:

Alanin A Arginin R

Asparagin N Aspartanska kiselina D

Cistein C Glutaminska kiselina E

Glutamin Q Glicin G

Histidin H Izoleucin I

Leucin L Lizin K

Metionin M Fenilalanin F

Prolin P Serin S

Treonin T Triptofan W

Tirozin Y Valin V

[0018] Peptidi koji uključuju ove aminokiseline i atipične peptidne sekvence mogu biti sintetisani i nabavljeni kod komercijalnih snabdevača, na primer, American Peptide Company ili Bachem (USA) ili Anigen (Koreja).

[0019] Oksintomodulin ima aktivnosti dva peptida, GLP-1 i glukagona. GLP-1 smanjuje nivo glukoze u krvi, smanjuje unos hrane i potiskuje pražnjenja želuca, a glukagon povećava nivo glukoze u krvi, olakšava lipolizu i smanjuje telesnu težinu povećanjem energetskih metabolizama. Različiti biološki efekti dva peptida mogu izazvati neželjene efekte kao što je povećanje nivoa glukoze u krvi ukoliko glukagon pokazuje dominantniji uticaj od GLP-1, ili izaziva mučninu i povraćanje ukoliko GLP-1 pokazuje dominantniji uticaj od glukagona. Prema tome, derivati oksintomodulina iz predmetnog pronalaska nemaju za cilj samo da povećaju ove aktivnosti, na primer, aminokiseline na položaju 1 i 11. oksintomodulina koje suzbijaju aktivnost glukagona, mogu biti modifikovane za uravnotežavanje koeficijenata aktivnosti glukagona i GLP 1.

[0020] Predstavljeni pronalazak i izvedena in vitro eksperimentima pokazuju da je peptid iz ovog pronalaska pokazuje odlične aktivnosti na GLP-1 receptora i receptora glukagona, u poređenju sa oksintomodulinom. S toga se predlaže da peptid iz ovog pronalaska aktivira GLP-1 receptor i receptor glukagona, da pokaže više odličnih terapijskih efekata na gojaznost nego konvencionalni oksintomodulin. Pored toga, ispitani su njegovi inhibitorni efekti na in vivo unošenja hrane i on je pokazao više odličnih inhibitorno efekata na unos hrane nego konvencionalni oksintomodulin (Sl.1).

[0021] Očigledno je onima koji su verzirani u stanje tehnike da kada se oksintomodulin derivati iz predmetnog pronalaska modifikuju korišćenjem uobičajenih tehnika, uključujući modifikaciju polimerima kao što je PEG i šećera lanac ili fuziju sa albuminom, transferinom, masnim kiselinama i imunoglobulinom u cilju poboljšanja terapeutskih efekata derivata oksintomodulina, oni će pokazati superiorne terapeutske efekte nativnog oksintomodulina. Prema tome, modifikovani derivati oksintomodulina su takođe obuhvaćeni obimom predmetnog pronalaska.

[0022] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira peptid.

[0023] Izraz "homologija", kako se ovde koriste za polinukleotid, pokazuje sličnost sekvence između sekvenci amino kiselina divljeg tipa ili nukleotidne sekvence divljeg tipa, i uključuje sekvencu gena koja je 75% ili više, poželjno 85% ili više, još poželjnije 90% ili više i još poželjnije 95% ili više identična sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira peptid. Evaluacija homologije može da se izvede golim okom ili korišćenjem komercijalno dostupnih programa. Korišćenjem komercijalno dostupnog računarskog programa, homologija između dve ili više sekvenci može biti izražena u procentima (%), a homologija (%) između susednih sekvenci može biti procenjena. Polinukleotid koji kodira peptid se ubacuje u vektor i eksprimira tako da se dobije velika količina peptida.

[0024] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za prevenciju ili lečenje gojaznosti a koji sadrži peptid.

[0025] Kako se ovde koristi, termin "prevencija" označava sve akcije pomoću kojih se pojava gojaznosti zadržava ili usporava primenom peptida ili kompozicije, i termin "tretman” (lečenje) podrazumeva sve radnje pomoću kojih su simptomi gojaznosti okrenuti na bolje ili su povoljno modifikovani uz pomoć administracije peptida ili kompozicije.

[0026] Kako se ovde koristi, termin "administracija" označava uvođenje unapred određene supstance u pacijenta pomoću određenog pogodnog postupka. Kompozicija prema predstavljenom pronalasku se može administrirati bilo kojim uobičajenim putem, sve dok je u stanju da dospe u željena tkiva, na primer, ali ne ograničavajući se na, intraperitonealnu, intravensku, intramuskularnu, subkutanu, intradermalnu, oralnu, topikalnu, intranazalnu, intrapulmonalnu ili intrarektalnu administraciju. Međutim, pošto se peptidi nakon oralnog ordiniranja vare, aktivni sastojci kompozicije za oralnu primenu treba da budu obloženi ili formulisani za zaštitu od degradacije u želucu.

[0027] Kako se ovde koristi, termin "gojaznost" podrazumeva akumulaciju viška masnog tkiva u telu, a indeks telesne mase (telesna težina (kg) podeljenu sa kvadratom visine (m)) iznad 25 treba smatrati za gojaznost. Gojaznost je najčešće uzrokovana energetskim disbalansom, kada količina dijetetskog unosa premašuje količinu utrošene energije tokom dužeg vremenskog perioda. Gojaznost je metabolička bolest koja utiče na celo telo i povećava rizik od dijabetesa, hiperlipidemije, seksualne disfunkcije, artritisa i kardiovaskularne bolesti, a u nekim slučajevima, je povezana sa incidencijom karcinoma.

[0028] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može dalje da sadrži i farmaceutski prihvatljiv nosač, inertni punilac ili diluent. Kako je ovde korišćen, termin "farmaceutski prihvatljiv" znači da je kompozicija dovoljna za postizanje terapeutskih efekata bez štetnih sporednih efekata i lako može biti određena u zavisnosti od vrste bolesti, starosti pacijenta, telesne težine, zdravstvenog stanja, pola i osetljivosti na lek, puta administracije, načina administracije, učestalosti administracije, trajanja lečenja, lekova koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa kompozicijom iz ovog pronalaska, i drugih faktora poznatih u medicini.

[0029] Farmaceutska kompozicija, uključujući derivative iz predmetnog pronalaska može dodatno da uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Za oralnu primenu, nosač može uključivati, ali ne ograničavajući se na, vezivno sredstvo, lubrikant, sredstvo za dezintegraciju, ekscipijens, rastvarač, agens za dispergovanje, stabilizator, sredstvo za suspendovanje, kolorant i aromant. Za injektibilne preparate, nosač može da sadrži pufer, konzervans, analgetik, rastvarač, izotonični agens i stabilizator. Kod preparata za topikalnu primenu, nosač može da sadrži bazu, ekscipijens, lubrikant i konzervans.

[0030] Kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti formulisane u različitim doznim oblicima u kombinaciji sa pomenutim farmaceutski prihvatljivim nosačima. Na primer, za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može biti formulisana u obliku tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa ili wafera. Za injektibilne preparate, farmaceutska kompozicija može biti formulisana u ampuli kao pojedinačom doznom obliku ili višedoznog kontejnera. Farmaceutska kompozicija takođe može biti formulisana u obliku rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula i preparata sa produženim delovanjem.

[0031] Sa druge strane, primeri nosača, ekscipijensa i diluenta pogodnog za farmaceutske formulacije uključuju laktozu, dekstrozu, saharozu, sorbitol, manitol, ksilitol, eritritol, maltitol, skrob, akacija gumu, alginat, želatin, kalcijum fosfat, kalcijum silikat, celulozu, metilcelulozu, mikrokristalnu celulozu, polivinilpirolidon, vodu, metilhidroksibenzoat, propilhidroksibenzoat, talk, magnezijum stearat i mineralna ulja. Pored toga, farmaceutske formulacije mogu dalje uključivati punioce, agense protiv zgrušavanja, lubrikante, humektante, arome i antiseptike.

[0032] Dalje, farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska može da bude bilo koji preparat odabran iz grupe koju čine tablete, pilule, praškovi, granule, kapsule, suspenzije, tečnosti za unutrasnju upotrebu, emulzije, sirupi, sterilni vodeni rastvori, nevodeni rastvarači, liofilizirane formulacije i supozitorije.

[0033] Pored toga, kompozicija može biti formulisana u pojedinačnom doznom obliku pogodnom za telo pacijenta, a poželjno je formulisana u oblik preparata koristan za peptidne lekove prema tipičnom postupku u farmaceutskoj oblasti tako da se administrira oralnim ili parenteralnim putem kao što je kroz kožu, intravenski, intramuskularno, intraarterijski, intramedularno, intramedularno, intraventrikularno, pulmonalno, transdermalno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno, intrakolonski, topikalno, sublingvalno, vaginalno ili rektalnom administracijom, ali ne ograničavajući se na navedeno.

[0034] Peptid se može mešati sa različitim farmaceutski prihvatljivim nosačima, kao što je fiziološki rastvor ili organski rastvarači. U cilju povećanja stabilnosti ili absorptivnosti, mogu se koristiti ugljeni hidrati kao što su glukoza, saharoza ili dekstrani, antioksidansi kao što je askorbinska kiselina ili glutation, helirajući agensi, proteini niske molekulske težine ili drugi stabilizatori.

[0035] Doza administracije i učestalost farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska se određuje prema vrsti aktivnog sastojka, zajedno sa različitim faktorima kao što su bolest koja se tretira, način davanja, starost pacijenta, pol i telesna težina i ozbiljnost bolesti.

[0036] Ukupna efektivna doza kompozicije iz ovog pronalaska se može administrirati pacijentu u jednoj dozi, ili se može davati duže vremena u višestrukim dozama prema frakcionisanom protokolu lečenja. U farmaceutskoj kompoziciji iz predmetnog pronalaska, sadržaj aktivnog sastojka može varirati u zavisnosti od težine bolesti. Poželjno, ukupna dnevna doza peptida iz predmetnog pronalaska može biti oko 0.0001 ! g do 500 mg po 1 kg telesne težine pacijenta. Međutim, efikasna doza peptida se određuje na osnovu razmatranja različitih faktora, uključujući starost pacijenta, telesnu težinu, zdravstveno stanje, pol, težinu bolesti, način ishrane i brzinu sekrecije, pored puta administracije i učestalosti tretmana farmaceutske kompozicije. S obzirom na navedeno, oni koji su verzirani u stanju tehnike mogu lako odrediti efikasnu dozu pogodnu za određenu upotrebu farmaceutske kompozicije prema predstavljenom pronalasku. Farmaceutska kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom nije naročito ograničena formulacijom i načinom i režimom administracije, pod uslovom da pokazuje efekte predstavljenog pronalaska.

[0037] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska pokazuje odlično in-vivo trajanje efikasnosti i titra, čime značajno smanjuje broj i učestalost njene administracije.

[0038] Osim toga, farmaceutska kompozicija se može administrirati sama ili u kombinaciji ili istovremeno sa drugim farmaceutskim formulacijama koje pokazuju profilaktičko ili terapeutsko delovanje na gojaznost. Farmaceutske formulacije koje pokazuju profilaktičke ili terapeutske efekte na gojaznost nisu posebno ograničene, i mogu uključivati agonist GLP-1 receptora, agonist receptora leptina, inhibitor DPP-IV, antagonist Y5 receptora, antagonist receptora za hormon koncentrovanja melanina (MCH), agonist Y2/3 receptora, agonist MC3/4 receptora, inhibitor lipaze želuca/pankreasa, 5HT2c agonist, agonist β3A, agonist Amilin receptora, antagonist Grelina i/ili antagonist Grelin receptora.

[0039] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za prevenciju ili lečenje gojaznosti, koji sadrži korak administriranja subjektu, peptida ili farmaceutske kompozicije koja ga sadrži.

[0040] U predstavljenom pronalasku, termin "subjekat" je neko za koga postoji sumnja da je gojazan, što podrazumeva sisara uključujući čoveka, miša, ili domaće životinje koja je gojazna ili postoji takva mogućnost. Međutim, svaki subjekat koji se tretira peptidom ili farmaceutskom kompozicijom iz ovog pronalaska je uključen bez ograničenja. Farmaceutska kompozicija uključujući peptid iz ovog pronalaska se primenjuje na subjekta pod sumnjom za gojaznost, tako da se subjekt efikasno tretira. Gojaznost je kako je gore opisano.

[0041] Terapeutski metod predmetnog pronalaska može da uključi korak administracije kompozicije uključujući peptid u farmaceutski efikasnoj količini. Ukupna dnevna doza se određuje putem odgovarajućeg medicinskog rasuđivanja od strane lekara, i primenjuje jednom ili više puta. U pogledu predmeta ovog pronalaska, specifični terapeutski efikasan nivo doze za bilo kog određenog pacijenta može varirati u zavisnosti od različitih faktora koji su poznati u medicinskoj tehnici, uključujući vrstu i stepen odgovora koji treba postići, konkretne kompozicije prema tome da li se sa njima koriste i drugi agensi ili ne, starosti pacijenta, telesnu težinu, zdravstveno stanje, pol i ishranu, vreme i put administracije, brzinu sekrecije kompozicije, trajanje terapije, upotrebu drugih lekova u kombinaciji ili istovremeno sa kompozicijom iz pronalaska, i slične faktore dobro poznate u medicini.

[0042] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu peptida ili farmaceutske kompozicije koja ih sadrži, za dobijanje lekova za prevenciju ili lečenje gojaznosti.

Modaliteti pronalaska

[0043] U daljnjem tekstu, ovaj pronalazak će biti detaljnije opisan uz pozivanje na sledeće Primere. Međutim, ovi primeri su dati samo radi ilustracije, i ovaj pronalazak ne treba da bude ograničen ovim primerima.

Primer 1. Proizvodnja in vitro aktiviranih ćelijskih linija

Primer 1-1: Produkcija ćelijske linije koja pokazuje cAMP odgovor na GLP-1

[0044] PCR je obavljena korišćenjem regiona koji odgovara ORF (Open Reading Frame) u cDNK (OriGene Technologies, Inc. USA) gena humanog GLP-1 receptora kao šablona, i sledećih forvardnih i reverznih prajmera uključujući svako od HindIII i EcoRI restrikcionih mesta tako da se dobije produkt PCR.

[0045]

Forvardni prajmer: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3 '(SEK ID BR.47)

Reverzni prajmer: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3' (SEK ID BR.48)

[0046] Produkt PCR je kloniran u poznati vektor za ekspresiju u animalnm ćelijama x0GC/dhfr za pripremz rekombinantnog vektora x0GC/GLP1R.

[0047] CHO DG44 ćelijska linija kultivisana u DMEM/F12 (10% FBS) medijumu je transfektovana rekombinantnim vektorom x0GC/GLP1R korišćenjem Lipofektamina (Invitrogen, USA) i gajena u medijumu za selekciju koji je sadržao 1 mg/mL G418 i 10 nM metotraksata. Monoklonske ćelijske linije su izdvojene metodom graničnog razblaženja, a od njih je konačno izdvojena ćelijska linija koja, na način zavistan od koncentracije, pokazuje odličan cAMP odgovor na GLP-1.

Primer 1-2: Dobijanje ćelijske linije koja pokazuje cAMP odgovor na glukagon

[0048] PCR je obavljena korišćenjem regiona koji odgovara ORF u cDNK (OriGene Technologies, Inc. USA) gena humanog receptora za glukagon kao šablona, i sledećih forvardnih i reverznih prajmera uključujući svako od EcoRI i Xhol restrikcionih mesta tako da se dobije PCR produkt.

[0049]

Forvardni prajmer: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(SEK ID BR.49)

Reverzni prajmer: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3' (SEK ID BR.50)

[0050] Produkt PCR je kloniran u poznati vektor za ekspresiju u animalnim ćelijama x0GC/dhfr za pripremu rekombinantnog vektora x0GC/GCGR.

[0051] CHO DG44 ćelijska linija gajena u DMEM/F12 (10% FBS) medijumu je transfektovana rekombinantnim vektorom k0GC/GCGR korišćenjem Lipofektamina i gajena u medijumu za selekciju koji sadrži 1 mg/mL G418 i 10 nM metotraksata. Monoklonske ćelijske linije su izdvojene metodom graničnog razblaženja, a od njih je konačno izdvojena ćelijska linija koja, na način zavisan od koncentracije, pokazuje odličan cAMP odgovor na glukagon.

Primer 2. Test in vitro aktivnosti derivata oksintomodulina

Primer 2-1: Sinteza derivata oksintomodulina

[0052] U cilju određivanja aktivnosti derivata oksintomodulina in vitro, sintetisani su oksintomodulin derivati koji imaju sledeće amino kiselinske sekvence (Tabela 1).

Tabela 1

[Tabela 1]

[0054] U Tabeli 1, amino kiseline boldirane i podvučene predstavljaju formaciju prstena, a aminokiseline označene sa X predstavljaju nenativnu amino kiselinu, alfa-metil-glutaminsku kiselinu. Pored toga, CA predstavlja 4-imidazoacetil a DA predstavlja dezamino-histidil.

Primer 2-2: Test in vitro aktivnosti derivata oksintomodulina

[0055] U cilju određivanja efikasnosti protiv gojaznosti derivata oksintomodulina sintetisanih u Primeru 2-1, merena je aktivnost ćelija in vitro, korišćenjem ćelijskih linija pripremljenih u Primerima 1-1 i 1-2.

[0056] Ćelijske linije su one pripremljene transfekcijom CHO (jajnik kineskog hrčka) za eksprimiranje gena humanog GLP-1 receptora i gena receptora glukagona, respektivno. Tako, oni su pogodni za merenje aktivnosti GLP-1 i glukagona. Prema tome, aktivnost svakog derivata oksintomodulina je merena korišćenjem svake transformisane ćelijske linije.

[0057] Konkretno, svaka ćelijska linija je sub-kultivisana dva ili tri puta nedeljno i alikvotirana u velove ploča sa 96 velova sa gustinom od 1 x 10<5>, nakon čega je usledila kultivacija od 24 sata.

[0058] Kultivisane ćelije su oprane KRB puferom i suspendovane u 40 ml KRB pufera koji sadrži 1 mM IBMX, i ostavljene na sobnoj temperaturi 5 minuta. Oksintomodulin (SEK ID NO. 1) i derivati oksintomodulina (predstavljeni SEK ID NO. 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27-30 i 31) su razblaženi od 1000 nM do 0.02 nM petostrukim serijskim razblaženjem, ćelijama je dodato po 40 mL i kultivisane su 1 sat na 37 °C u CO2inkubatoru. Zatim je dodato 20 mL pufera za lizu ćelija, i ćelijski lizati su naneti na cAMP assay kit (Molecular Device, SAD) za merenje cAMP koncentracija. Na osnovu njih su izračunate EC50vrednosti, i međusobno poređene. EC50vrednosti su prikazane u sledećoj Tabeli 2.

Tabela 2

[0059]

[Tabela 2]

[0060] Kao što je prikazano u tabeli 2, oksintomodulin derivati pokazuju odlične in vitro aktivnosti i različite odnose aktivnosti za receptor GLP-1 i receptor glukagona u poređenju sa nativnim oksintomodulinom SEK ID BR. 1.

[0061] Poznato je da oksintomodulin aktivira kako GLP-1 receptor i receptor glukagona da suzbije apetit, olakša lipolizu, i promoviše sitost, te tako pokazuju i na taj način dejstvo protiv gojaznosti. Derivati oksintomodulin prema predmetnom pronalasku pokazuju veću in vitro aktivnost na receptor GLP-1 i receptor glukagona nego oksintomodulin divljeg tipa, i stoga se može koristiti kao terapeutsko sredstvo protiv gojaznosti sa većom efikasnošću nego poznati oksintomodulin.

Primer 3. Test na in vivo aktivnosti oksintomodulin derivata

[0062] U cilju određivanja in vivo terapeutske aktivnosti oksintomodulin derivata, promene unosa hrane pomoću administracije oksintomodulin derivata su ispitane na ob/ob miševima pomo

u nativnog oksintomodulina kao kontrole.

[0063] Konkretno, gojazni dijabetični ob/ob miševi, koji se obično koriste za testiranje efikasnosti terapeutskih agensa za gojaznost i dijabetes, izgladnjivani su tokom 16 sati, i administrirani sa 1 ili 10 mg/kg oksintomodulina ili 0.02, 0.1, 1 ili 10 mg/kg derivata oksintomodulina sa sekvencom SEK ID NO. 2. Zatim, je ispitivan unos hrane tokom 2 časa (Sl.1). Sl 1 je grafikon koji pokazuje promene unosa hrane u odnosu na dozu administracije oksintomodulina ili derivata oksintomodulina. Kao što je prikazano na Sl.1, administracija 1 mg/kg derivata oksintomodulina je pokazala mnogo ja

e inhibitorno dejstvo na unos hrane nego administracija 10 mg/kg oksintomodulina.

[0064] Sveukupno, derivati oksintomodulina iz ovog pronalaska imaju mnogo jače delovanje protiv gojaznosti nego divlji tip oksintomodulina, iako se administriraju u nižoj dozi, što ukazuje na poboljšanje problema divljeg tipa oksintomodulina koji pokazuje slabije delovanje protiv gojaznosti, a treba ga primenjivati u visokoj dozi tri puta dnevno.

Claims (11)

Patentni Zahtevi

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od sekvenci SEK ID BR: 24, 25 ili 26.

2. Peptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu aminokiselinska sekvenca sadrži SEK ID BR: 24.

3. Peptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu aminokiseline u položajima 12 i 16, ili 16 i 20, formiraju prsten.

4. Peptid prema patentnom zahtevu 3, pri čemu aminokiselinska sekvenca sadrži SEK ID BR: 25.

5. Peptid prema patentnom zahtevu 3, pri čemu aminokiselinska sekvenca sadrži SEK ID BR: 26.

6. Peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pre čemu peptid ima dejstvo protiv gojaznosti.

7. Farmaceutska kompozicija za prevenciju ili tretman gojaznosti, koja kao aktivni sastojak sadrži peptid prema bilo kojem od patnetnih zahteva od 1 do 6.

8. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7, dalje sadržavajući farmaceutski prihvatljiv nosač.

9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7 ili 8, pri čemu se kompozicija primenjuje sama ili u kombinaciji, ili koincidentno, sa drugim farmaceutskim formulacijama koje pokazuju profilaktičko ili terapeutsko dejstvo na gojaznost.

10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što farmaceutska formulacija koja pokazuje profilaktičko ili terapeutsko dejstvo na gojaznost predstavlja agonist GLP-1 receptora, agonist leptin receptora, DPP-IV inhibitor, antagonist I5 receptora, antagonist receptora hormona koncentrovanja melanina (MCH), agonist I2/3 receptora, agonist MC3/4 receptora, inhibitor lipaze želuca/pankreasa, agonist 5HT2c, agonist β3A receptora, agonist Amilin receptora, antagonist Grelina ili antagonist Grelin receptora.

11. Peptid prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, ili kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 7 do 10, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu gojaznosti.