RS57793B1 - Postupak ekspandovanja odraslih matičnih ćelija iz cele krvi - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

Oblici ovde opisanih realizacija odnose se na postupak za ekspandovanje odraslih matičnih ćelija iz cele krvi, posebno, ali ne samo periferne krvi, odraslih sisara, i na odgovarajuću primenu na polju medicine, posebno humane ili veterinarske medicine, za terapijsko tretiranje lezija, kako spoljašnjih tako i unutrašnjih, lezija tetiva, ligamenata, i hrskavice, preloma kostiju, i takođe terapijski i/ili prevetivni tretman hroničnih i/ili akutinih inflamatornih patologija, neuroloških i neurovegetativnih patologija, kardijačnih patologija, patologija tumora, autoimunih patologija, oftalmoloških patologija, i patologija genetskog porekla.

Ovde i dalje u opisu, a kao što je poznato u literaturi, reć „ekpandovanje“ označava proces povećanja broja ćelija bilo deljenjem ćelija ili, kao u ovde opisanom specifičnom slučaju č ija se zaštita ovde traži, „dediferencijacijom“ ili „deprogramiranjem”, to jest, procesom kojim su neke ć elije prisutne u krvi ponovo transformisane u matične ćelije posle pogodnog tretmana in vitro, kako će ovde biti kasnije prikazano.

STANJE TEHNIKE

Poslednjih godina upotreba matičnih ćelija u terapiji postigla je opšti konzensus, ali dobijeni terapijski rezultati su daleko ispod oćekivanja, osim za matićne ćelije dobijene iz krvi.

Zapravo, mnoge poznate metode za dobijanje matičnih ćelija pokazale su se kao dugotrajne, teške i skupe, sa relativnim rezultatima i ponekad sporednim efektima.

Postoje embrionske matične ćelije i odrasle matične ćelije, prve izvedene od 8-dnevnih blastocisti, dok se odrasle matične ćelije mogu dobiti uglavnom iz kostne srži, masnog i mišićnog tkiva, iz periferne krvi i iz pupčane vrpce, itd.

Definicija matičnih ćelija sa stalno razvija. Za sve ove ćelije, kako za embrionske (ES) tako i za odrasle, kako za hematopoetske (HSC) tako i za mezenhimalne (MSC) (Kuwana M. et al., 2003), identifikovani su razni genetski markeri, od kojih su neki zajednički za mnoge tipove ćelija (Condomines M. et al., 2006; Kang W. J. et al., 2006; Zhao Y. et al., 2003; Rabinovitch M. et al., 1976).

Da bi se identifikovale pluripotentne matične ćelije (PSCs), embrionske i odrasle, razmatrana je ekspresija nekih intracelularnih transkripcionih faktora (Sox2,Oct3/4 i Nanog).

U početku, istraživanje je bilo usmereno ka matičnim ćelijama embrionskog porekla, pošto su one pluripotentne, i takođe se mogu okarakerisati i može se odrediti njihova količina (kvalifikovati i kvantifikovati), stoga pogodne za ekperimentalno ispitivanje; međutim, etička pitanja i iznad svega kontraindikacije usled stvaranja tumora, učinili su da su morale da budu ostavljene po strani. Prema tome, u današnje vreme, poželjne su odrasle matične ćelije. Odrasle matične ćelije drugog pojedinca (alogene) vrlo često izazivaju ozbiljne probleme odbacivanja, zato što nisu prepoznate kao “lične”. To naročito utiče na matične ćelije iz pupčane vrpce, koje se skoro isključivo upotrebljavaju kao alogene matične ćelije.

Pluripotenne matične ćelije uvedene upotrebom procesa koji preko virusa prenosi pluripotentne faktore od embrionskih matičnih ćelija do odraslih matičnih ćelija su ćelije koje nisu pogodne za tretiranje usled kontraindikacija sličnih onima koje su postojale sa embrionskim matičnim ćelijama, i zbog ekstremno visokih troškova.

Kod čoveka, za sada, prihvaćena je upotreba matičnih ćelija dobijenih iz periferne krvi procesom nazvanim „afereza“ ili „leukafereza“. Matične ćelije su ekstrahovane iz krvi, sakupljene, i zatim inokulisane u pacijente koji pate od nekih leukemijskih patologija, neposredno posle hemoterapije ili radioterapije. Matične ćelije su hematopoetske, i one tako mogu da reaguju isključivo sa patologijama krvi.

U aferezi, koja traje od 6 do 8 sati, krv je uzeta iz vene u ruci, vratu ili grudima, i provedena kroz mašinu koja uklanja matične ćelije. Krv, tako prečišćena, vraća se u pacijenta, dok se sakupljene ćelije čuvaju zamrzavanjem u tečnom azotu (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006). Ova tehnika ne samo što je bolna, već je takođe i izuzetno stresna za pacijenta. To obezbeđuje in vivo inokulaciju faktora rasta kako bi se stimulisalo oslobađanje matičnih ćelija iz kostne srži u krv, i ne omogućava stvarno razlikovanje i/ili prećišćavanje matičnih ćelija u cirkulaciji.

Ove ćelije su dozvoljene, u današnje vreme, u skladu sa zakonom, isključivo u terapijama za tretiranje patologija krvi.

Matične ćelije koje su danas uvedene u promet za tretiranje različitih patologija su odrasle matične ćelije, uglavnom mazenhimalne, dobijene iz kostne srži i masti. Međutim, one imaju neka ograničenja:

• one zahtevaju invazivne metode za njihovo skupljanje, bušenje kosti za matićne ćelije kostne srži ili operaciju za matične ćelije iz masti;

• one mogu da reaguju samo sa nekim tkivima zbog njihove mezenhimalne derivacije;

• kad su gajene kako bi se dobio odgovarajući broj za terapiju, one počinju da se diferenciraju u druge tipove ćelija, pokazujući uvek različite membranske receptore i one stoga ne mogu da budu okarkterisane i ne može da se odredi njihova količina, što je neophodna karakteristika za humana ispitivanja,

Drugi poznati postupak opisali su Zhao Y. et al., u članku „A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells“ i u WO-A-2004/043990. Ovo je postupak za dobijanje matičnih ć elija izvedenih iz monocita, koja uključuje faze izdvajanja monocita iz periferne krvi, njihovo dovođenje u kontakt sa mitogenom komponentom i zatim gajenje monocita iz periferne krvi u uslovima pogodnim za njihovo umnožavanje.

Ovaj postupak, koja u početku zahteva fazu izdvajanja monocita i zatim fazu ekspandovanja u medijmu kulture, traje vrlo dugo, oko 15 - 20 dana, da bi se dobilo značajan broj matičnih ćelija, i ne omogućava dobijanje pluripotentnih matičnih ćelija.

Opet u okviru dobijanja matičnih ćelija od monocita, poznati su dokumenti WO-A-2005/046570, WO-A-2007/131200 i WO-A-03/083092. Međutim, pošto moraju da izvedu preliminarno prečišćavanje krvi kako bi se izdvojila samo jedna frakcija ćelija, to jest, monocita, i zatim ekspandovanje da bi se dobile željene matične ćelije, metode opisane u ovima dokumentima, takođe, zahtevaju vrlo dugo vreme, opet oko reda veličine 15 - 40 dana, da bi se dobila prihvatljiva količina matičnih ćelija.

Dokument WO-A-2008/034370 na ime ovog podnosioca je, takođe, poznat, i odnosi se na metod ekspandovanja odraslih matičnih ćelija iz krvi, upotrebom makrofagnih faktora stimulacije kolinija (MCSF). Ovaj poznat postupak obezbeđuje rast odraslih matičnih ćelija pošto je krv uzeta in vitro tretmanom sa MCSF, u koncentraciji između 8 nM i 15 nM, i potom prečišćena, poželjno frakcionisanjem na Ficoll gradijentu. Postupak, takođe, može da obezbedi rast matičnih ćelija iz periferne krvi prečišćene in vitro tretmanom sa MCSF u koncentraciji između 35 nM i 55 nM.

Efikasnost postupka je potvrđena prisustvom i prepoznavanjem markera matičnih ćelija CD90, CD90/34, CD34 i CD 117, i činjenicom da matične ćelije nisu izgubile svoje „lične” faktore prepoznavanja posle podele ili ekspandovanja. Matične ćelije nisu dovele do sporednih efekata kao što je odbacivanje, infekcija ili razvoj teratoma kad su bile date pacijentu, i bile su sposobne da se diferenciraju „in vivo" i ponašaju kao pluripotentne matične ćelije.

Autori su primetili da tako porasle ćelije, deljenjem ili ekspandovanjem, kad su injektirane lokalno ili intravenozno, stiču „in vivo" (a ne „in vitro" kao u poznatim metodama stanja tehnike pogodnim faktorima rasta i/ili hemijskim stimulansom (Gulati R. et al., 2003; Katz R. L. et al., 2002; Okazaki T. et al, 2005)), sve morfološke i hemijske karakteristike makrofaga, limfocita, epitelijuma, endotelijuma, neuronalnih i hepatocitnih ćelija, u zavisnosti od potreba i patologija tretiranih živih organizama. Postupak je manje invazivan nego druge metode koje su ranije upotrebljene za sakupljanje matičnih ćelija, bezbolna je (za razliku od afereze) i ekonomična.

Najzad, mogućnost lakog dobijanja ovih ćelija, koje je zatim moguće čuvati tokom dugog vremena, na primer, smrznute i tečnom azotu, čini ćelije dobijene korišćenjem ove poznate metode pogodnim za autologe kaleme (transplantate) i tretiranje mnogih patologija (lezija raličitih tipova, metaboličkih bolesti, neuroloških patologija, akutnih i hroničnih inflamatornih patologija).

Dokument WO-A-2009/115522 je takođe poznat, na ime ovog podnosioca, i odnosi se na pribor za sakupljanje krvi, poželjno periferne krvi, za dobijanje pluripotentnih matičnih ćelija, uključujući posudu, koja može da drži uzetu krv, koja sadrži antikoagulant i MCSF supstancu. Ovaj pribor se može koristiti u okviru metode opisane u WO-A-2008/034370.

Međutim, podnosilac je našao da razne faze rada i rukovanja kojima su matične ćelije izložene u izvođenju procesa opisanog u WO-A-2008/034370, kao š to je uklanjanje crvenih čestica, prečišćavanje matičnih ćelija od drugih komponenata krvi, dobijanje veće količine pluripotentnih matičnih ćelija u poređenju sa hematopoetskim i mezenhimalnim matičnim ćelija, gajenje, diferencijacija u druge tipove ćelija, može da dovede do stresa tako dobijene odrasle matične ćelije, ostavljajući ih živim ali manje efikasnim i sa smanjenim potencijalnim kapacitetom za energiju i informaciju.

Na polju veterine postoje razne tehnike i aparature za dobijanje matičnih ćelija, posebno za koncentrisanje matičnih ćelija iz masti i kostne srži i za dobijanje fakotra rasta.

Međutim, prva prepreka za matične ćelije je da ih je teško sakupiti, kao što smo naveli, da bi se dobile od kostne srži kost se mora bušiti ili se mora prodrti u kičmu, i da bi se dobile iz masti potrebna je prava hirurška operacija, sa šavovima.

Postoji, takođe, i logistička kompleksnost: otpremanje uzorka i dobijanje matičnih ćelija, održavajući ih živim i stabilnim.

Druge prepreke mogu biti broj potrebnih manuelnih operacija, vreme dobijanja i cena za sve do sada korišćene odrasle matične ćelije.

Ove teškoće, zajedno sa lošim kliničkim rezultatima, učinile su da su matične ćelije skoro potpuno iščezle iz kliničke vetrinarske prakse, i samo nekoliko veterinara je nastavilo da ih koristi, pre svega u eksperimentalne svrhe.

Priprema ćelija opisana u WO-A-2008/034370 i objavljena u raznim naučnim publikacijama može da okarakteriše dobijene matične ćelije i odredi njihovu količinu, potvrđujući njihove pluripotentne karakteristike. Ona je, takođe, mnogo lakša nego do sada korišćene tehnike, kako zbog toga š to je sakupljanje uzoraka jednostavno – nekoliko mililitara krvi – već takođe i zato što ćelije ne moraju da se gaje.

Međutim, ovaj sistem se, takođe, može poboljšati, kako bi se matične ćelije upotrebile u humanoj klniičkoj praksi, prevazišle prepreke povezane sa dopremanjem uzoraka do laboratorije, zatim deprogramiraju sa MCSF i vrate u strukture gde se izvodi terapijski tretman. Drugo ograničenje može bit potpuno prečišćavanje matičnih ćelija dobijenih iz krvi korišćenjem metode opisane u WO-A-2008/034370 koja omogućava veću bezbednost za moguću alogenu inokulaciju (bezbednost koja još treba da se dokaže). U stvari, prečišćavanje i procesi koji su upotrebljeni da se uklone crvene čestice i prolaz ćelija kroz sorter (kvalifikacija) izazivaju značajan stres kod dobijenih matičnih ćelija, što dovodi do toga da one gube deo svog kapaciteta lečenja. Prema tome, postoji jaka potreba da se do minimuma smanji rukovanje krvlju kako bi se dobile efikasne matične ćelije i tako dobiju bolji rezultati.

Drugo ograničenje svih terapija sa matičnim ćelijama koje su dobijene korišćenjem poznatih postupaka, uključujući WO-A-2008/034370, je to što one zahtevaju specijalizovane laboratorije.

Takođe je poznat dokument WO-A-2008/036374, koji opisuje metode i sastave za transplantate matičnih ćelija kod pacijenata koji pretodno nisu bili imunosupresivni.

Takođe su poznate sledeće naučne publikacije:

• Spaas J. H., Gambacurta A., Polettini M., Broeckx S. et al., „Purification and expansion of stem cells from equine peripheral blood, with clinical applications", vol. 80, no. 2, strane 129-135 preuzeto sa Interneta: URL:http://hdl.handle.net/1854/LU-1215157;

• G. E. Garber et al., „The use of ozone-treated blood in the therapy of HIV infection and immune disease: a pilot study of safety and efficacy" AIDS, 1 January 1991, strane 981-984, preuzeto sa Interneta: URL:http://graphics.tx.ovid.com/ovftpdfs/FPDDNCFBHADJCP00/fs047/ovft/liv e/gv039/00002030/00002030-199108000-00009.pdf;

• Larini et al., „Effects of ozone on isolated peripheral blood mononuclear cells", Toxicology in vitro, Elsevier Science, GB, vol. 19, no. 1, 1 February 2005, stane 55-61.

Prema tome, postoji potreba za usavršavanjem metode za ekspandovanje odraslih matičnih ćelija iz cele krvi koja može da prevaziđe bar jedan od nedostataka stanja tehnike.

Podnosioci su osmislili, testirali i uoblilčili predmetni pronalazak kako bi prevazišli nedostatke stanja tehnike i postigli ovaj i druge ciljeve i pogodnosti.

Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde i u daljem tekstu imaju isto značenje koje se obično podrazumeva za prosečnog stručnjaka u oblasti tehnike kojoj predmetni pronalazak pripada. Čak ako se u praksi i ispitivanjima predmetnog pronalaska mogu koristiti metode i materijali sličini ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, metode i materijali su u daljem tekstu opisani kao primer. U slučaju konflikta, predmenta prijava će imati prednost uključujući njene defiinicije. Materijali, metode i primeri imaju isključivo svrhu prikazivanja i ne treba da se smatraju kao ograničenja.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

Predmetni pronalazak je izložen i okarakterisan u nezavisnim patentnim zahtevima, dok zavisni zahtevi opisuju druge karakteristike pronalaska ili varijante glavne inovacione ideje.

U skladu sa navedenim ciljevima, postupak za ekspandovanje odraslih matičnih ćelija iz krvi, koji prevazilazi ograničenja stanja tehnike i uklanja njene nedostatke, obezbeđuje:

• rast i deprogramiranje odraslih matičnih ćelija krvi uzetog uzorka krvi, korišćenjem in vitro tretmana uzorka krvi pomoću makrofagnog faktora stimulacije kolonija (MCSF);

• ozonizaciju uzorka krvi.

Predmetni pronalazak tako omogućava dobijanje pluripotentnih odraslih matičnih ćelija iz uzorka krvi.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, postupakobezbeđuje da se ozonizacija uzorka krvi izvede pre MCSF tretmana. Posebno, tretman sa MCSF može biti načinjen na već ozonizovanom uzorku krvi.

U skladu sa drugim mogućim oblicima realizacije, postupak obezbeđuje da se ozonizacija uzorka krvi izvede tokom MCSF tretmana. Posebno, tretman sa MCSF može biti načinjen na uzorku krvi tokom ozonizacije.

U skladu sa drugim mogućim oblicima realizacije, postupak obezbeđuje da se ozonizacija uzorka krvi izvede posle MCSF tretmana. Posebno, tretman sa MCSF može biti načinjen na uzorku krvi.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje da ozonizacija snabdeva uzorak krvi smešom O2- O3.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje stehiometrijski odnos krvi prema O2- O3smeši od 1:1.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupakobezbeđuje količinu O2- O3smeše u uzorku krvi veću od ili jednaku oko 1 mic.g/l.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje da količina O2- O3smeše u uzorku krvi može biti izabrana u intervalu od oko 1 mic.g/ml do oko 42 mic.g/ml.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje da se uzorku krvi doda antikoagulant.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje upotrebu pribora za sakupljanje krvi koji uključuje najmanje posudu koja može da sadrži najmanje uzetu krv i koja sadrži najmanje MCSF supstancu.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje da količina uzorka krvi sakupljenog i tretiranog iznosi između 0,2 ml i 100 ml, posebno između 0,5 ml i 50 ml, posebnije između 1 ml i 25 ml, još posebnije između 2 ml i 10 ml, posebnije između 2 ml i 8 ml, posebnije između 3 ml i 8 ml, posebnije između 3 ml i 5 ml.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje da je koncentracija MCSF u intervalu od oko 1 nM do oko 55 nM.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, koji mogu biti kombinovani sa svim oblicima ovde opisane realizacije, postupak obezbeđuje vreme rasta i deprogramiranja sa in vitro tretmanom sa MCSF između 4 sata i 96 sati.

Osim toga, drugi oblici ovde opisane realizacije odnose se na metodu za ekspandvanje odraslih matičnih ćelija iz krvi, koja se sastoji isključivo od:

• rasta i deprogramiranja odraslih matičnih čelija krvi uzetog uzorka krvi, korišćenjem in vitro tretmana uzorka krvi sa MCSF.

Ovde opisani oblici realizacije, takođe, se odnose na uzorak krvi koji sadrži odrasle matične ćelije koje se mogu dobiti pomoću postupka u skladu sa ovim opisom.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, obezbeđen je uzorak krvi za upotrebu u terapijskom tretmanu i/ili u prevenciji patologija.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, obezbeđen je uzorak krvi za upotrebu u terapijskom tretmanu uključujući terapiju lezija, kako spoljšnjih, tako i unutrašnjih, lezija tetiva, ligamenata i hrskavice, prelome kostiju, terapiju i/ili prevenciju hroničnih i/ili akutnih inflamatornih patologija, neuroloških i neurodegenerativnih patologija, kardijačnih patologija, patologija tumora, autoimunih patologija, oftalmoloških patologija i genetskih patologija.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, obezbeđen je uzorak krvi za upotrebu u tretmanu koji obezbeđuje intravenoznu, intrarterijsku ili lokalnu primenu (na primer, supkutanu, intramuskularnu ili intra-tkivnu) uzorka krvi koji je tretiran sa MCSF i ozonizovan.

U skladu sa mogućim oblicima realizacije, obezbeđen je uzorak krvi za upotrebu u tretmanu koji obezbeđuje intravenoznu, intrarterijsku ili lokalnu primenu (na primer, supkutanu, intramuskularnu ili intra-tkivnu) uzorka krvi koji je tretiran sa MCSF i sistemsku ozonizaciju pacijenta.

Ovde opisani oblici realizacije, takođe, se odnose na pribor koji uključuje najmanje posudu, koja sadrži uzorak krvi koji sadrži odrasle matične ćelije koje se mogu dobiti metodom prema ovom opisu.

1

Ovi i drugi aspekti, karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska bolje će se razumeti sa osvrtom na sledeće opise, crteže i priložene patentne zahteve. Crteži, koji su uključeni i č ine deo ovog opisa, prikazuju neke oblike realizacije predmetnog pronalaska, i zajedno sa opisom imaju namenu da opšu principe pronalaska.

Razni aspekti i karakteristike opisane u ovom opisu mogu se primeniti pojedinačno kad je to moguće. Ovi pojedinačni aspekti, na primer aspekti i karakteristike koji su opisani u priloženim zavisnim zahtevima, mogu biti predmet izdvojenih primena.

Podrazumeva se da bilo koji aspekt li karakteristika za koje je otkriveno, tokom procesa izrade patenta, da su već poznati, neće biti zaštićeni i biće predmet odbacivanja.

DETALJAN OPIS NEKIH OBLIKA REALIZACIJA

Sada ćemo detaljno razmotriti različite oblike realizacija predmetnog pronalaska. Svaki primer je dat ilustrovanjem pronalaska i ne treba ga tumačiti kao ograničenje. Na primer, karakteristike koje su prikazane ili opisane, jer su deo jednog oblika realizacije, mogu se usvojiti ili zajedno sa drugim oblicima realizacije daju još jedan oblik realizacije. Razume se da će predmetni pronalazak uključiti sve takve modifikacije i varijante.

Pre opisivanja ovih oblika realizacija, takođe, moramo pojasniti da sadašnji opis nije ograničen u njegovoj primeni, na detalje konstrukcije i raspoređivanja komponenti kao što je opisano u opisu koji sledi korištenjem priloženih crteža. Ovaj opis može da obezbedi druge oblike realizacija i može se dobiti ili izvršiti na različite druge načine. Takođe, moramo razjasniti da su frazeologija i terminologija upotrebljene ovde samo u svrhu opisa i ne mogu se smatrati ograničavajućim.

Pojmovi kao što su „oko“, „uopšteno/generalno“, „suštinski“ i slično treba shvatiti njihovom funkcijom modifikacije termina ili vrednosti koja nije apsolutna, ali nisu navedeni u stanju tehnike. Takvi uslovi će se definisati posebnim okolnostima i uslovima koji su namenjeni da se modifikuju u skladu sa zajedničkim prihvatanjem takvih uslova u određenoj oblasti. Oni će uzeti u obzir barem stepen eksperimentalne greške koja se očekuje, tehničku grešku i instrumentalnu grešku za datu tehniku koja je usvojena za merenje vrednost. Osim ako nije drugačije naznačeno, u sadašnjem opisu se smatra da oblici jednine kao što su „a" (engl.), „an" (engl.) i „jedan" uključuju oblike množine, osim ako kontekst ne navodi drugačije.

Svi intervali koji su ovde dati obuhvataju ekstreme, uključujući i one koji daju interval „između“ dve vrednosti, osim ako nije drugačije naznačeno.

Sadašnji opis, takođe, uključuje intervale koji potiču od povezivanja ili preklapanja opisanih dva ili više intervala, osim ako nije drugačije naznačeno.

Sadašnji opis takođe uključuje intervale koje mogu proisteći iz kombinacije dve ili više vrednosti uzete u različitim tačkama, osim ako nije drugačije naznačeno.

Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste i imaju isto značenje koje kao i obično razume prosečan stručnjak u oblasti tehnike, kojoj pripada predmetni pronalazak.

Čak i ako metode i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu se koristiti u praksi i u testovima prema predmetnom pronalasku, postupci i materijali su opisani u daljem tekstu, kao primer. U slučaju sukoba, predmetna prijava će prevladati, uključujući i u njoj date definicije. Materijali, metode i primeri imaju čisto ilustrativnu svrhu i ne smeju se razumeti restriktivno.

Oblici realizacija koje su ovde opisane, odnose se na postupak za ekspandovanje odraslih matičnih ćelija iz krvi, što obezbeđuje:

• rast i deprogramiranje odraslih matičnih ćelija iz uzoraka krvi uzetih od pacijenta, koristeći in vitro tretman uzorka krvi sa MCSF;

• Ozonizaciju uzorka krvi.

Konkretno, krv može biti cela krv, a naročito periferna cela krv.

Prema tome, predmetni pronalazak dozvoljava da se dobiju pluripotentne matične ćelije odraslih iz uzetog uzorka krvi.

U stvari, kao što je opisano u WO-A-2008/034370 i WO-A-2009/115522, dobijene matične ćelije imaju markere matičnih ćelija CD90, CD90 / 34, CD34 i CD117, takođe, eksprimiraju neke intra-ćelijske transkripcione faktore koji su snažno povezani sa pluripotentnim karakteristikama (Sox2, Oct3/4 i Nanog) i ne izgube svoje faktore prepoznavanja „samog sebe" posle deobe ili ekspanzije/širenja. Matične ćelije ne uzrokuju sporedne efekte kao što su odbacivanje, infekcija, razvoj teratoma nakon davanja pacijentu, one su u stanju da se međusobno razlikuju „in vivo" i stoga se ponašaju kao pluripotentne matične ćelije.

Izraz „rast i deprogramiranje odraslih krvnih matičnih ćelija uzorka krvi uzetog od pacijenta, uz in vitro tretiranje uzorka krvi sa MCSF“ znači da se uzorak krvi koji je uzet od pacijenta i sadrži određenu količinu odraslih matičnih ćelija, tretira in vitro sa MCSF kako bi se postigao rast odraslih matičnih ćelija koje su izvorno prisutne u uzorku krvi, pomoću deprogramiranja ćelija bele linije krvi.

Pored toga, naglašavamo da izraz „ozonizacija" ovde znači tretiranje uzorka krvi ozonom, odnosno dodavanje, isporuku, primenu ili mešanje ozona ili smeše kiseonika i ozona, na/u uzorak krvi.

Ozon (simbol O3) je alotropni oblik kiseonika, sa triatomskim molekulom i molekulskom težinom od 48. U normalnim uslovima, ozon se pojavljuje kao plavi gas, uz oštar miris i ima jako je oksidaciono sredstvo. Ozon može delovati kao dezinfekciono sredstvo, deodorans, baktericid, sterilizator ili oksidans u brojnim organskim sintezama.

Prema mogućim oblicima realizacija, ozonizacija uzorka krvi može biti izvedena pre tretmana sa MCSF.

Prema mogućim oblicima realizacija, ozonizacija uzorka krvi može se izvršiti istovremeno sa tretmanom sa MCSF.

Prema mogućim oblicima realizacija, ozonizacija uzorka krvi može biti izvedena nakon MCSF tretmana.

Prema mogućim oblicima realizacija, obezbeđen je dodatak antikoagulansa u uzorak krvi. Heparin, EDTA ili natrijum citrat su primeri mogućih antikoagulanasa.

U nekim oblicima realizacija, postupak prema sadašnjem opisu može da obezbedi za upotrebu komplet za sakupljanje krvi, za proizvodnju pluripotentnih matičnih ćelija prema gore opisanom postupku, uključujući najmanje jedan kontejner, poput epruvete, koji može da sadrži uzet uzorak krvi, a koji sadrži MCSF supstancu i eventualno, ako je to predviđeno, navedeni antikoagulans.

1

Sa kompletom ovog tipa, moguće je sakupljati celu krv, poželjno perifernu krv, kako bi brzo počelo sa rastom i proizvodnjom matičnih ćelija, koristeći gore opisani postupak prema sadašnjem opisu, a samim tim i učiniti proizvodnju mnogo bržom.

Ovde opisani oblici realizacija mogu da obezbede da količina uzorka krvi koja je sakupljena i tretirana prema ovde opisanom postupku, odnosno rasta i deprogramiranja sa MCSF i ozonizacijom uzorka krvi, je samo nekoliko mililitara, na primer, obuhvata od 0,2 ml do 100 ml, posebno između 0,5 i 50 ml, posebno između 1 ml i 25 ml, još bolje između 2 ml i 10 ml, posebno između 2 ml i 8 ml, posebno između 3 ml i 8 ml, još bolje između 3 ml i 5 ml.

Druge varijante mogu da obezbede da količina uzorka krvi koja je sakupljena i podvrgnuta rastu i deprogramiranju sa MCSF je nekoliko stotina mililitara, na primer, od 100 do 1000 ml, posebno od 200 ml do 600 ml, a posebno od 400 ml do 600 ml, na primer 500 ml. Uzorak krvi se može ubrizgati u cirkulaciju pacijentu (intravenozno ili intra-arterijalno), koji se kasnije može podvrgnuti sistemskom tretmanu ozonizacije.

Neki oblici realizacija, koje se mogu kombinovati sa svim oblicima realizacija koje su ovde opisane, mogu da obezbede prethodno opisan metod koji može koristiti bilo koji tip kontejnera u koji se može uvesti cela krv i ozon, sa bilo kojim tipom mogućeg antikoagulansa i sa bilo kojom koncentracijom MCSF, na primer, u intervalu od oko 1 nM do oko 55 nM. Primeri pod-intervala mogu biti od 2 nM do 50 nM ili od 5 nM do 45 nM. Ostali primeri podintervala mogu biti od 2 nM do 20 nM ili od 8 nM do 15 nM ili od 8 do 10 nM ili od 10 nM do 12 nM ili od 12 nM do 35 nM ili od 15 nM do 30 nM ili od 20 nM do 25 nM ili od 35 nM do 55 nM ili od 40 nM do 50 nM ili kombinacija svih ovih intervala ili podintervala, uključujući i sve cele brojeve ili frakcije prisutne u intervalima ili podintervali pominju i ovde nisu eksplicitno navedeni.

Pojedini oblici realizacija, koji se mogu kombinovati sa svim oblicima ovde opisane realizacije, mogu da obezbede da ozonizacija isporučuje uzorak krvi sa smešomO2<- O>3<.>

U mogućim primenama, podnosilac prijave je utvrdio da odnos krvi i smeše O2- O3poželjno može da bude stehiometrijski odnos 1: 1.

U mogućim primenama, količina smeše O2- O3u uzorku krvi može biti veća ili jednaka oko 1 mic.g/l, posebno odabrana u intervalu od oko 1 mic.g/ml do oko 42 mic.g/ml, konkretnije od oko 5 mic.g/ml do oko 30 mic.g / ml, još posebno od oko 10 mic.g / ml do oko 20 mic.g / ml.

Neki oblici realizacija koji su ovde opisani, obezbeđuju da, nakon što je napustila krv u ovim uslovima, poželjno na sobnoj temperaturi, nakon određenog vremena, poželjno između 4 sata i 96 sati, a posebno između 4 sata i 72 sata, posebno između 4 sata i 48 sati, dobijena cela krv sa komponentom matičnih ćelija dobijenih deprogramiranjem se može potpuno ponovo sistemski inokulirati (intravenozno ili intra-arterijalno) ili lokalno u ili blizu obolelog tkiva.

U mogućim primenama, vreme rasta i deprogramiranja korišćenjem in vitro tretmana sa MCSF može da obuhvati između 12 sati i 96 časova, naročito između 12 sati i 72 časa, posebno između 12 sati i 36 sati.

U mogućim implemenatacijama, vreme rasta i deprogramiranja u in vitro tretmanima sa MCSF može da obuhvati između 24 sata i 96 sati, posebno između 24 sata i 72 časa, posebno između 24 sata i 36 sati.

U mogućim implementacijama, vreme rasta i deprogramiranja korišćenjem u in vitro tretmanima sa MCSF može da obuhvati između 48 sati i 96 sati, posebno između 48 sati i 72 časa, posebno između 48 sati i 60 sati.

Podnosilac je pretpostavio da ozonizacija uzorka krvi koja je podvrgnuta rastu i deprogramiranju koristeći in vitro tretman sa MCSF stimuliše proces ekspanzije i deprogramiranja odraslih matičnih ćelija, tako da nakon nekoliko sati postoji značajan broj korisnih odraslih matičnih ćelija.

Podnosilac je utvrdio da trajanje in vitro tretmana sa MCSF koji se obuhvata od oko 4 do 96 sati može dovesti do stabilizacije rasta matičnih ćelija, uz identifikaciju markera matičnih ćelija CD90, CD90/34, CD34 i CD117. Veruje se da je to optimalno stanje.

Podnosilac, takođe, je utvrdio da sa koncentracijama MCSF od oko 1 nM do oko 55 nM ćelije održavaju fenotip pluripotentnih odraslih matičnih ćelija. Primećeno je da kod upotrebe MCSF u koncentracijama većim od 55 nM (na primer 70nM), već nakon 24 sata ćelije više ne održavaju fenotip pluripotentnih odraslih matičnih ćelija.

1

Oblici realizacija opisanog postupka mogu da obezbede ne samo navedeni kontejner sa MCSF-om i gde se dešava ekspanzija matičnih ćelija odraslih, već i upotrebu drugog kontejnera koji sadrži matične ć elije dobijene kao š to je gore opisano, na primer, u slučaju intravenozne ili intra-arterijalne upotrebe i eventualno trećeg kontejnera različitih veličina, za lokalnu upotrebu. Matične ćelije koje se proizvode i čuvaju u pomenutim kontejnerima mogu se odmah koristiti ili se mogu očuvati, na primer u tečnom azotu, a kasnije koristiti, po potrebi.

Ozonizacija prema sadašnjem opisu može se izvesti na uzorcima krvi koji sadrže matične ćelije pre, tokom ili nakon ekspanzije i deprogramiranja sa MCSF, a koje se nalaze u bilo kojem od pomenutih kontejnera.

Prema mogućim oblicima realizacija, krv koja je upravo uzeta od pacijenta može se ubaciti odmah u epruvetu sa antikoagulansom i MCSF. Antikoagulans može da zaustavi početak koagulacije, dok istovremena prisutnost MCSF-a može omogućiti brzi početak procesa ekspanzije i garantovati da se minimizira početak lečenja pacijenta. Pored toga, uzorak se podvrgava ozonizaciji prema predmetnom opisu.

Prema drugim mogućim oblicima realizacija, antikoagulans se može dodati u uzorak krvi uzet od pacijenta kako bi se zaustavila koagulacija krvi koja je podvrgnuta procesu konzervacije koja ne menja njegovu sposobnost proizvodnje matičnih ćelija. Kada je potrebno, uzorak krv je uzet sa mesta gde je sačuvan i podvrgnut je proceduri ekspanzije matičnih ćelija kao što je gore opisano, odnosno brzim dodavanjem MCSF supstance, pri čemu se dobijaju neophodne količine matičnih ćelija. Pored toga, u ovom slučaju je uzorak podvrgut ozonizaciji prema sadašnjem opisu.

Postupak prema sadašnjem opisu omogućava prevazilaženje nedostataka stanja tehnike i podrazumeva brojne prednosti.

Na primer, predmetni pronalazak omogućava pripremu i manipulaciju celom krvlju, izuzetno pojednostavljujući terapiju, čime se elimiše bilo kakva potreba za ćelijskim tretmanom u laboratoriji. Zapravo, predmetni pronalazak isključuje neophodnost ili mogućnost izrade tretmana, na primer, za uklanjanje crvenih korpuskula ili za prečišćavanje matičnih ćelija u odnosu na sve ostale komponente krvi kako bi se dobila veća količina pluripotentnih matičnih ćelija u poređenju sa druge dve komponente matičnih ćelija, hematopoetske i mezenhimalne, ili za gajenje ili diferenciranje u druge

1

vrste ćelija. Ovi dodatni tretmani mogu normalno stresirati dobijene matične ćelije, ostavljajući ih živim, ali sa smanjenim informacionim i energetskim potencijalom. Naprotiv, predmetni pronalazak eliminiše potrebu za svim daljim radom i rukovanjem uzorkom krvi, tako da odrasle matične ćelije prisutne u celoj krvi bolje održavaju svoje osobine jer nisu pod stresom i zato što u krvi mogu imati koristi od prisustva drugih elemenata koji pomažu u regenerativnom procesu.

Podnosilac je utvrdio da neizlečive patologije kao što je degeneracija miokarda koji su već tretirani matičnim ćelijama dobijenim od krvi kroz deprogramiranje sa dobrim rezultatima kao što je opisano u WO-A-2008/034370 imaju definitivno pozitivniji razvoj sa deprogramiranim matičnim ćelijama u celoj krvi, bez dodatnih operacija i rukovanja kako je prethodno opisano, na taj način koristeći metodu koja, takođe, može da se sastoji isključivo od rasta i deprogramiranja sa MCSF, bez dodatnih radnih koraka uključujući prečišćavanje, naknadnu ekspanziju ili koja može da uključi rast i deprogramiranje MCSF-om i ozonizaciju.

Priprema matičnih ćelija prema opisanom postupku eliminiše potrebu za složenom laboratorijskom pripremom, omogućavajući bilo kojoj bolnici, klinici ili doktoru da priprema matične ćelije koristeći jednostavnu epruvetu sa poželjno minimalnom količinom MCSF-a. Drugim rečima, upotrebom jedne epruvete u koju se stavlja nekoliko ml uzorka krvi sa MCSF-om, moguće je lečiti i poboljšati čak i ozbiljne patologije kao što su, na primer, posledice srčanog udara ili Parkinsonove bolesti. Prema tome, ovi rezultati podržavaju činjenicu da, prema mogućim oblicima realizacije, postupak za ekspanziju odraslih matičnih ćelija iz krvi može, takođe, da se sastoji isključivo od rasta i deprogramiranja odraslih krvnih matičnih ćelija iz uzorka krvi, koristeći in vitro tretman uzorak krvi sa MCSF-om.

Dalje, u nekim oblicima realizacije, dodavanje ili doprinos ozona uzorku krvi, koji proističe iz ozonizacije uzorka krvi, može imati katalizirajuće dejstvo na deprogramiranje odraslih matičnih ćelija i na kvalitet dobijenih matičnih ćelija i njihovu informaciju i energetski sadržaj, tako da pozitivno utiče na regeneraciju ćelija oštećenih tkiva, a takođe daje dodatno uverenje da je proizvod sterilan. U stvari, kao što smo rekli, ozon može da ima funkciju dezinfekcionog sredstva ili baktericida.

EKSPERIMENTALNI SLUČAJEVI

Podnosilac je osmislio ideju tretiranja MCSF-om i ozonizacijom, odnosno dodavanje ozona ili smeše kiseonika i ozona u ekspanziju i „deprogramiranje“ sa MCSF, nakon par

1

in vivo eksperimenata koji dokazuju katalizirajuće dejstvo ozona u terapiji obavljenioj sa deprogramiranim matičnim ćelijama dobijenim iz koraka rasta prema sadašnjem opisu.

SISTEMSKA OZONIZACIJA

Konj star 15 godina povučen je iz takimičenja zbog hronične proksimalne lezije prednje desne površine flektorske tetive, što je učinilo da on hramlje tokom 18 meseci (videti sliku1). On je lečen spaljivanjem" 6 meseci ranije, što je bila uobičajena praksa godinama unazad (vodeti sliku 2); ovo nije dalo bilo kakve pozitivne terapijske efekte i zaista je izazvalo cicatricijalnu sklerozu. Konj je bio u lošem opštem stanju i spaljivanje je izazvalo proksimalnu leziju (videti sliku 3) u osetljivoj oblasti koju je teško lečiti kod starijih konja. Spaljivanje je izazvalo ožiljak kod koga č ak i lokalna injekcija ekspandovanih matičnih ć elija dobijenih deprogramiranjem sa MCSF tri puta svakih 6 nedelja nije dala nikakvo poboljšanje, to jest čak ni najmanje poboljšanje nije načinjeno ni u ultrazvuku ili u hromosti. Posle 5 meseci takvih injekcija ekspandovanih matičnih ćelija, konj je mogao da radi ali su lezije počele da se pogoršavaju (videti slike 4 i 5)..

Prema tome, u ovom slučaju skleroze tetiva usled spaljivanja, lokalna i sistemska inokulacija deprogramiranih matičnih ćelija iz krvi dobijenih ekspandovanjem sa MCSF, nije dala poboljšanje posle tri inokulacije načinjene sa naznačenom učestalošču.

Petnaest dana posle treće inokulacije, sistemsko tretiranje je izvedeno ozonom autotransfuzijom sa pola litra krvi obogaćene sa 120 cc O2<- O>3<, 10 mic.g/ml.>

[0108] Iznenađujuće, podnosioci su u eksperimentu našli, da uvođenjem ozona sistemski, to jest preko transfuzije krvi autologom krvi obogaćenom ozonom radi oksigenacije pacijentove krvi, za samo petnaest dana bilo je moguće opaziti katalitički efekat ozona pošto je ultrazvuk pokazao da su lezije uklonjene i konj nije više hramao (videti sliku 6). Patološko tkivo, koje je prethodno bilo snabdeveno inokulacijom matičnih ćelija dobijenih iz krvi ekspandovanjem sa MCSF koje su aktivirale matične ćelije člana povređene površine tetive fleksora, izlečeno je katalitičkim efektom ozona na proces regeneracije.

Tri meseca posle terapije ozonom, ehokardiografska analiza je jasno pokazala da je lezija izlečena (videti slike 7 i 8).

1

Kao dokaz stvarnog izlečenja, konj je nateran da radi tokom 15 dana i poslat na takmičenje, sa pozitivnim i dugotrajnim efektima. Poboljšanje koje je ultrazvuk pokazao je bilo stvarno, pošto je konj nastavio redovno, sa prosekom od 6 takmičenja mesečno, svoju takmičarsku karijeru sa skokovima do metar šezdeset, do starosti od 18 godina. Ustvari, konj je nastavio da se takmiči još tri godine baz ikakvih pogoršanja, učestvujući u takmičenjima sa preskakanjem prepona sa 16 (videti sliku.

9), sa 17 (videti sliku 10), i do 18 godina starosti (videti sliku 11).

Katalitičko dejstvo ozona na odrasle matične ćelije dobijene iz krvi ekspandovanjem i deprogramiranjem sa MCSF detektovano je in vivo prethodno opisanim ekspreimentima.

Posle ovog slučaja, terapija ozonom je uključena kao katalitičko sredstvo kod mnogih pacijenata tretiranih matičnim ćelijama dobijenim iz krvi, ekspandovanim i deprogramiranim sa MCSF.

In vivo delovanje na matične ćelije dobijene iz krvi omogućio je hipotezu istog katalitičkog dejstva, takođe, in vitro, to jest, u krvi u epruveti za test, pre, posle i tokom tretiranja sa MCSF.

IN VITRO OZONIZACIJA

Prateći dobijene rezultate, podnosioci su, takođe, osmislili novu i inovativnu ideju uvođenja ozona direktno u posudu koja sadrži krv i MCSF, tako da katališe proces deprogramiranja i da veći potencijal energije-informacija matičnim ćelijama dobijenih rastom i deprogramiranjem sa MCSF.

Podnosioci su delovanje ozona na krv ispitivali kako in vitro tako i in vivo (videti prethodni tekst).

Kad se u mehurićma propušta kroz krv, smeša O2<- O>3<reaguje za nekoliko sekundi>sa masnim kiselinama fosfolipidnog sloja ćelijske membranei.

Kao rezultat ove reakcije ozona O3sa dvostrukom vezom nezasićenih masnih kiselina, fosfolidni lanci su razbijeni i prodiru u eritrocite u obliku peroksida, utičući na reakcije u eritrocitima, ali ne prolazeći iza ćelijske membrane. Ali, usled velike citotoksične snage peroksida, eritrociti reaguju odmah, aktivirajući mehanizam

1

detoksikacije kroz glutationski sistem. Glutation tako utrošen je restruktuiran kroz bajpas glikolize, to jest, putem pentoza fosfata.

Stoga je hemoglobin (Hb) zaštićen od oksidacije u meta-hemoglobin, čuvajući funkciju HbO2, omogućavajući transmisiju kiselonika O2.

Specijalna uloga koju ima 2,3-disfosfoglicerat (2,3-DPG) takođe se mora razmatrati, imajući u vidu funkciju eritrocita.2,3-DPG je prisutan u eritrocitima i njegova funkcija je da modulira afinitet hemoglobina prema kiseoniku. Sa ozonom, posebno, efekat oslobađanja kiseonika se odvija eritrocitima na perifernim delovima.

[0120] Drugo interesantno dejstvo je imunostimulacioni efekat ozona izazvan uvođenjem interferona. Među imunokompetentnim ćelijama, T4 limfociti ili helper ćelije imaju klučnu ulogu zato što, aktvirane makrofagama, one proizvode specifične supstance, interleukine, faktore rasta, itd., koje deluju kao međućelijski mesendžeri i olakšavaju komunikaciju među ćelijama.

Posle aktivacije interleukinima, makrofage proizvode faktor nekroze tumora (TNF) koji služi kao standard za merenje aktivnosti imunokompetentnih ćelija.

Prema tome, ozon deluje direktno na ćelije bele linije i indirektno preko reakcije izvedene na eritrocitima, imajući ulogu katalizatora za funkcije ćelijskih linija krvi i stoga, takođe, za proces deprogramiranja aktvirian sa MCSF, na ćelije bele linije.

Što se tiče odnosa krvi prema smeši O2<- O, podnosioci su našli da je ova vrednost>poželjno stehiometrijski odnos 1:1.

Osim toga, podnosioci su našli da količina smeše O2- O3u krvi može biti veća od ili jednaka oko 1 mic.g/l, posebno izabrana u intervalu od oko 1 mic.g/ml do oko 42 mic.g/ml, poželjnije posebno od oko 5 mic.g/ml do oko 30 mic.g/ml, još poželjnije posebno od oko 10 mic.g/ml do oko 20 mic.g/ml. Jedan primer može da obezbedi količinu smeše O2- O3od oko 12 mic.g/ml. Drugi primer može da obezbedi količinu smeše O2- O3od oko 15 mic.g/ml. Još jedan primer može da obezbedi količinu smeše O2- O3od oko 18 mic.g/ml.

2

PRIMER TERAPIJSKOG TRETMANA DEGENERATIVNE PATOLOGIJE MIOKARDIJUMA

Podnosioci su izveli eksperiment da pokažu kliničku efikasnost matičnih ćelija dobijenih iz deprogramirane i ozonizovane cele krvi primenjenih kod degenerativnih patologija miokardijuma.

Crteži. 12 i 13 su dve tabele koje sadrže značajne parametre kontraktilnih funkcija radi poređenja terapijskih rezultata patologija sa kardijačnom insuficijencijom jednog psa upotrebom matičnih ćelija dobijenih kao što je opisano u WO-A-2008/034370 i za 3 psa upotrebom matičnih ćelija dobijenih metodom u skladu sa ovim opisom, to jest, rastom i deprogramiranjem sa MCSF i ozonizacijom (ozonizovana cela krv). Upoređivanjem parametara poboljšanje se može jasno videti u povećanju kapaciteta kontrakcije upotrebom metode koja je ovde opisana u poređenju sa WO-A-2008/034370, i posebno u činjenici da ovo poboljšanje nastaje već za kratko vreme (kontrola na 45 dana).

Posebno, podnosioci su tretirali 3 psa (1 mužjak danske doge, 1 mužjak njifaundlendera, 1 ženka dobermana) sličnih godina (6-7) pogođenih primarnom dilatiranom miokardiopatijom u stadijumu napredovanja (patologija koja izaziva progresivni gubitak kontraktilnih funkcija, za sada bez mogućnosti regresije upotrebom bilo kakve terapije), sa teškom depresijom kontraktilne funkcije (FS 15-20%). Psi su tretirani ekpandovanim matičnim ćelijama, deprogramiranim sa MCSF, iz ozonizovane cele krvi i date bez bilo kakvog prečišćavanja intravenozno i supkutano u kardijačnu zonu. Snimci ehokardigrafa na slikama 14 i 16 pokazju situaciju dva različita pacijenta (ženka dobermana Šanel i mužjak njifaundlender Leonardo kao na tabeli u crtežu.13) pre tretmana, pri čemu se parametri kontraktilne funkcije mogu videti kao ekstremno negativne vrednosti DsVSx (sistolni prečnik leve ventrikule), FS% i FE%.

Nasuprot ovome, kako se može videti sa snimaka ehokardiografa na slikama 15 i 17 za iste pacijente, posle tretmana podnosioci su našli povećanje u kapacitetu kontrakcije merene linearnom i volumetrijskom procenom (Teicholz & Simpson metoda) parametara kontraktilne funkcije DsVSx (sistolni prečnik leve ventrikule), FS% i FE%. Ovaj efekat je mnogo jače izražen već za kratko vreme (kontrola na 45 dana u odnosu na rezultate dobijene u istom vremenskom periodu kod pacijenata prethodno tretiranih sa tipom prečišćenih matičnih ćelija dobijenih iz krvi kao što je opisano u WO-A-2008/034370).

Takođe, imajući u vidu efekte izazvane miokardijalnom-degenerativnom patologijom na opšte stanje i kliničku ISACHS klasu insuficijencije srca, poboljšanje koje su našli podnosioci je mnogo brže, sa povratkom apetita, značajnim povećanjem težine i znatnim poboljšanjem u fizičkim karakteristikama i otpronosti prema stresu već posle jednog meseca.

Podnosioci su stoga zaključili da postupak ekspandovanja odraslih matičnih ćelija, koja obuhvata rast sa MCSF i ozonizaciju u skladu sa predmetnim pronalaskom, omogućava oporavak kontraktilnosti miokardijuma koji je postao neefikasan usled degeneracije istog: u isto vreme, ovo ne bi imalo mogućnost oporavka sa najsavremenijom terapijom. U stvari, na polju veterine, pokušana su druga rešenja regenerativnom medicinom, ali čak ni okulacija mezenhimalnim matičnim ćelijama različitog porekla (kostna srž, mast) u sam miokardijum nije dala značajne terapijske rezultate.

Preko matičnih ćelija dobijenih iz krvi, koje imaju pluripotentnu komponentu tako da mogu da reaguju sa mišićem i njiegovom inervacijom, rezultati su bili pozitivni, sa postepenim poboljšanjem tokom vremena. Međutim, najiznenađujući efekat je nađen sa primenom odraslih matičnih ćelija iz cele krvi koje su bile ozonizovane i nisu bile prečišćene, intravenozno i supkutano u kardijačnu zonu, što je poboljšalo terapijski rezultat u poređenju sa prečišćenim ćelijama, dobijajući bolji rezultat za mnogo kraće vreme.

Snimci ehokardiograma na slikama 14, 15, 16 i 17 potvrđuju kako su izuzetna dobijena poboljšanja.

Jasno je da se metodi ekspandovanja odraslih matičnih ć elija iz cele krvi kako je prehodno opisano mogu načiniti modifikacije i/ili dodatni delovi, a da se pritom ne odstupa od delokruga i opsega predmetnog pronalaska.

Takođe je jasno da, iako je predmetni pronalazak opisan sa osvrtom na neke specifične primere, prosečni stručnjak ć e sigurno moći da postigne mnoge druge ekvivalentne oblike ekspandovanja odraslih matičnih ćelija iz cele krvi, koje imaju karakteristike utvrđene u patentnim zahtevima i koje stoga sve spadaju u ovde definisani delokrug zaštite.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Postupak za ekspandovanje odraslih matičnih ćelija iz krvi, navedeni postupak obuhvata:

- rast i deprogramiranje odraslih matičnih ćelija uzetog uzorka krvi, upotrebom in vitro tretmana uzorka krvi sa MCSF;

- ozonizaciju uzorka krvi.

2. Postupak prema primeru 1, koji obezbeđuje da je ozonizacija uzorka krvi izvedena pre tretiranja sa MCSF.

3. Postupak prema primeru 1, koji obezbeđuje da je ozonizacija uzorka krvi izvedena tokom tretiranja sa MCSF.

4. Postupak prema primeru 1, koji obezbeđuje da je ozonizacija uzorka krvi izvedena posle tretiranja sa MCSF .

5. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji obezbeđuje da ozonizacija doprema uzorku krvi smešu O2<- O>3<.>

6. Postupak prema zahtevu 5, koji obezbeđuje stehiometrijski 1:1 odnos krvi prema smeši O2- O3.

7. Postupak prema zahtevu 5 ili 6, koji obezbeđuje količinu smeše O2- O3u uzorku krvi veću od ili jednaku oko 1 mic.g/l.

8. Postupak prema zahtevu 7, koji obezbeđuje da je količina smeše O2- O3u uzorku krvi izabrana u intervalu od oko 1 µg/ml do oko 42 µg/ml.

9. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koji obezbeđuje dodavanje antikoagulansa uzorku krvi.

10. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koji obezbeđuje upotrebu pribora za sakupljanje krvi koji uključuje posudu za držanje uzete krvi, koja sadrži najmanje MCSF supstancu.

11. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koi obezbeđuje da količina uzorka krvi sakupljene i izložene rastu i deprogramiranju sa MCSF i ozonizaciji iznosi između 0,2 ml i 100 ml.

2

12. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koji obezbeđuje da količina uzorka krvi sakupljene i izložene rastu i deprogramiranju sa MCSF i ozonizaciji iznosi između 2 ml i 10 ml.

13. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koji obezbeđuje da količina uzorka krvi sakupljene i izložene rastu i deprogramiranju sa MCSF i ozonizaciji iznosi između 3 ml i 5 ml.

14. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koji obezbeđuje da koncentracija MCSF nalazi u intervalu od oko 1 nM do oko 55 nM.

15. Postupak prema bilo kom od prethodih zahteva, koji obezbeđuje vreme rasta i deprogramiranje pomoću in vitro tretmana sa MCSF iznosi između 4 sata i 96 sati.