RS57797B1 - Kristal derivata azol benzena kao inhibotor ksantin oksidaze - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Polje pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na kristal novog derivata azol benzena koristan kao terapeutsko sredstvo ili profilaktičko sredstvo za bolesti koje se dovode u vezu sa ksantin oksidazom kao što su giht, hiperurikemija, sindrom lize tumora, kalkuloze urotrakta, hipertenzija, dislipidemija, dijabetes, kardiovaskularne bolesti kao što su arterioskleroza ili otkazivanje srca, bubrežne bolesti kao što je dijabetska nefropatija, respiratorne bolesti kao što je hronična opstruktivna bolest pluća, zapaljenske bolesti creva ili autoimune bolesti.

Pozadina pronalaska

Ksantin oksidaza je enzim koji katalizuje konverziju hipoksantina u ksantin i dalje u urinsku kiselinu u metabolizmu nukleinskih kiselina.

Inhibitor ksantin oksidaze inhibira sintezu urinske kiseline smanjujući koncentraciju urinske kiseline u krvi u smislu aktivnosti ksantin oksidaze. Drugim rečima, inhibitor ksantin oksidaze je delotvoran kao terapeutsko sredstvo za hiperurikemiju i različite bolesti izazvane hiperurikemijom. S druge strane, postoji gihtozni artritis i gihtozni tofus koji se nazivaju giht, kao kliničko stanje izazvano gomilanjem kristala urata nakon produžene hiperurikemije. Uz to, hiperurikemija se smatra važnom kao faktor u bolestima koje se dovode u vezu sa načinom života, odnosno sa gojaznošću, hipertenzijom, dislipidemijom i dijabetesom ili metaboličkim sindromima, a nedavno je pojašnjeno da je hiperurikemija faktor rizika za oštećenje bubrega, kalkuloze urotrakta i kardiovaskularne bolesti u skladu sa epidemiološkim ispitivanjima koje je sprovela Komisija japanskog društva za giht i metabolizam nukleinskih kiselina i objavila u svojim smernicama (The Guideline Revising Committee of Japanese Society of Gout and Nucleic Acid Metabolism, urednici, Guideline for the management of hyperuricemia and gout, drugo izdanje, Medical Review (2010)). Dalje, očekuje se da će inhibitor ksantin oksidaze biti koristan u tretmanu bolesti koje se dovode u vezu sa aktivnim kiseoničnim vrstama, putem inhibitorne aktivnosti prema nastanku aktivnih kiseoničnih vrsta, na primer, za tretman kardiovaskularnih bolesti kroz aktivnost usmerenu ka unapređenju vaskularne funkcije (Circulation.2006; 114: 2508-2516).

Alopurinol i febuksostat se klinički koriste kao terapeutska sredstva za hiperurikemiju, ali je prijavljeno da alopurinol ima neželjena dejstva kao što su Stivens-Džonson sindrom, toksična epidermalna nekroliza, poremećaji jetre i disfunkcija bubrega (Nippon Rinsho, 2003; 61, dodatak 1: 197- 201).

Kao jedinjenje koje ima inhibitornu aktivnost prema ksantin oksidazi objavljen je, na primer, derivat 2-geniltiazola (PTL 1 do 3).

S druge strane, u nepatentnim dokumentima 4 i 5 objavljeni su derivati ditiazol karboksilne kiseline sa benzenskim prstenom u centru. Dalje, u PTL 6 i 7 objavljen je derivat bifenil tiazol karboksilne kiseline.

Spisak citirane literature

Patentna literatura:

[PTL 1] Međunarodna publikacija br.92/09279

[PTL 2] Japanski otvoreni patent br.2002-105067

[PTL 3] Međunarodna publikacija br.96/31211

[PTL 4] Međunarodna publikacija br.2011/139886

[PTL 5] Međunarodna publikacija br.2011/101867

[PTL 6] Međunarodna publikacija br.2010/018458

[PTL 7] Međunarodna publikacija br.2010/128163

Kratak opis pronalaska

Tehnički problem

Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi kristal novog jedinjenja korisnog kao terapeutsko sredstvo ili kao profilaktičko sredstvo za bolesti koje se dovode u vezu sa ksantin oksidazom kao što su giht, hiperurikemija, sindrom lize tumora, kalkuloze urotrakta, hipertenzija, dislipidemija, dijabetes, kardiovaskularne bolesti kao što su arterioskleroza ili otkazivanje srca, bubrežne bolesti kao što je dijabetska nefropatija, respiratorne bolesti kao što je hronična opstruktivna bolest pluća, zapaljenske bolesti creva ili autoimune bolesti.

Rešenje problema

Kao rezultat posvećenog ispitivanja usmerenih ka ostvarenju prethodno navedenog cilja, pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina (u daljem tekstu označena i kao jedinjenje (I)) može da se kristališe i da postoji kao najmanje jedna vrsta kristalnog polimorfa.

Drugim rečima, predmetni pronalazak je sledeći.

[1] Kristal 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline;

[2] Kristal u skladu sa [1], gde navedeni kristal ima kristalnu formu A;

[3] Kristal u skladu sa [2], gde navedeni kristal ima karakteristične maksimume uglova 2 Θ = 7,2°, 11,3°, 15,9°, 17,9°, 20,8°, 22,3°, 23,1°, 23,8°, 24,3° i 28,6° u spektru difrakcije X zraka;

[4] Kristal u skladu sa [2], gde navedeni spektar difrakcije X zraka ima profil prikazan na slici 1;

[5] Kristal u skladu sa [2], gde je njegov egzotermni maksimum u termogravimetrijskoj/diferencijalnoj termičkoj analizi na 232°C;

[6] Farmaceutski preparat koji sadrži kristal u skladu sa bilo kojom od tačaka [1] do [5] i farmaceutski prihvatljv nosilac;

[7] Inhibitor ksantin oksidaze koji sadrži kristal u skladu sa bilo kojom od tačaka [1] do [5] kao aktivni sastojak; i

[8] Terapeutsko ili profilaktičko sredstvo za upotrebu kod jedne ili većeg broja bolesti odabranih iz grupe se sastoji od gihta, hiperurikemije, sindroma lize tumora, kalkuloza urotrakta, hipertenzije, dislipidemije, dijabetesa, kardiovaskularnih bolesti, bubrežnih bolesti, respiratornih bolesti, zapaljenskih bolesti creva i autoimunih bolesti, a koje sadrži kristal u skladu sa bilo kojom od tačaka [1] do [5] kao aktivni sastojak.

Korisni efekti predmetnog pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje kristale derivata azol benzena koji su korisni kao terapeutsko ili profilaktičko sredstvo za bolesti koje se dovode u vezu sa ksantin oksidazom, kao što su giht, hiperurikemija, sindrom lize tumora, kalkuloze urotrakta, hipertenzija, dislipidemija, dijabetes, kardiovaskularne bolesti kao što su arterioskleroza ili otkazivanje srca, bubrežne bolesti kao što je dijabetska nefropatija, respiratorne bolesti kao što je hronična opstruktivna bolest pluća, zapaljenske bolesti creva ili autoimune bolesti. Ovi kristali mogu da se koriste kao aktivni farmaceutski sastojci za dobijanje farmaceutskog sredstva.

Kratak opis crteža

Slika 1 je spektar difrakcije X zraka kristalne forme A.

Opis rešenja

"Ksantin oksidaza" se koristi i u širem smislu, da je to enzim koji katalizuje reakciju oksidacije iz hipoksantina u ksantin i dalje u urinsku kiselinu, i u užem smislu, da je to ksantin oksidoreduktaza oksidaznog tipa koja je jedan od enzima koji katalizuje navedenu reakciju. U predmetnoj prijavi, osim ako je drugačije naznačeno, "ksantin oksidaza" je kolektivni naziv za enzim koji katalizuje reakciju oksidacije hipoksantina u ksantin i dalje u urinsku kiselinu. Među ksantin oksidoreduktazama koje su odgovorne za ovu reakciju, prisutna su dva tipa oksidoreduktaza, oksidazni i dehidrogenazni tip, i oba tipa su obuhvaćena izrazom "ksantin oksidaza" prema predmetnom pronalasku. Osim ukoliko je drugačije naznačeno, izraz "ksantan oksidaza" ima značenje kao što je prethodno definisano i u izrazima "inhibitorna aktivnost prema ksantin oksidazi", "inhibitor ksantin oksidaze" itd.

Kristali prema predmetnom pronalasku se karakterišu spektrima difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka i(li) termogravimetrijskom/diferencijalnom termičkom analizom (TG/DTA) i slično. Spektri difrakcije X zraka (XRD spektri) ovih kristala pokazuju karakteristične obrasce, a svaki kristal ima specifične vrednosti za ugao difrakcije 2 Θ. Uz to, svaki od ovih kristala pokazuje sopstveno karakteristično termičko ponašanje pri termogravimetrijskoj/diferencijalnoj termičkoj analizi (TG/DTA).

Kristalna forma A prema predmetnom pronalasku ima karakteristične maksimume uglova 2 Θ= 7,2°, 11,3°, 15,9°, 17,9°, 20,8°, 22,3°, 23,1°, 23,8°, 24,3° i 28,6° u spektru difrakcije X zraka. Uz to, kristalna forma A prema predmetnom pronalasku ima obrazac u svom spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka prikazan na slici 1 i ima egzotermni maksimm na 232°C pri termogravimetrijskoj/diferencijalnoj termičkoj analizi (TG/DTA). Kristalna forma A je anhidrovani kristal.

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "karakteristični maksimumi" označava maksimume koji se dominantno uočavaju na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka za svaki kristalni polimorf, kao i jedinstvene maksimume. Kristali prema predmetnom pronalasku identifikovani pomoću uglova difrakcije takođe obuhvataju i neke dodatne maksimume osim onih koji su prethodno opisani kao karakteristični maksimumi.

Položaj i relativni intenzitet difrakcionog ugla 2 Θ na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka može neznatno da varira u zavisnosti od mernih uslova, te stoga, čak iako postoji neznatna razlika u uglovima 2 Θ, identitet kristalne forme treba prepoznati pravilnim referenciranjem obrasca celokupnog spektra. Kristali u okviru opsega takvih grešaka takođe su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska. Greške u 2 Θ mogu, na primer, da budu u opsegu od ±0,5<o>C ili ±0,2<o>C. Drugim rečima, kristali koji se identifikuju prethodno opisanim uglovima difrakcije obuhvataju one sa opsegom greške od ±0,5<o>C ili ±0,2<o>C.

U termogravimetrijskoj/diferencijalnoj termičkoj analizi (TG/DTA), "egzotermni maksimum" i "endotermni maksimum" se definišu kao temperature početne tačke maksimuma i označavaju egzotermnu i endotermnu početnu temperaturu koje se određuju ekstrapolacijom. "Egzotermni maksimum" i "endotermni maksimum" na TG/DTA mogu neznatno da variraju u zavisnosti od mernih uslova. Na primer, smatra se da se greška kreće u opsegu od ±5<o>C ili ±2<o>C. Drugim rečima, kristali koji se identifikuju prethodno opisanim maksimumima obuhvataju one čiji su maksimumi u opsegu greške od ±5<o>C ili ±2<o>C.

Dalje, i za spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka i za TG/DTA, razlika između izmerenih vrednosti za referentni materijal kristala, na primer, za svaki kristal koji je dobijen postupkom opisanim u primerima predmetnog pronalaska i numeričkih vrednosti navedenih u predmetnoj prijavi može se prihvatiti kao greška u merenju. Dakle, kristali koji imaju iste uglove difrakcije i egzotermne i endotermne maksimume u okviru opsega grešaka, izračunatih pomoću takvih postupaka, obuhvaćeni su kao kristali prema predmetnom pronalasku.

Kristalni oblik 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline može da se sintetiše, na primer, pomoću postupaka sinteze koji su navedeni u daljem tekstu.

Sinteza jedinjenja (A-2)

(gde Y<1>i Y<2>predstavljaju odlazeće grupe). Primeri odlazećih grupa predstavljenih oznakama Y<1>i Y<2>obuhvataju halogeni atom, metansulfoniloksi grupu, p-toluensulfoniloksi grupu, trifluormetansulfoniloksi grupu i slične. Ova reakcija predstavlja postupak za sintezu jedinjenja (A-2) u reakciji neopentil alkohola sa odlazećom grupom Y<2>u jedinjenju (A-1) u prisustvu baze. Primeri baza obuhvataju neorganske soli kao što su natrijum hidrid, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, litijum hidroksid, natrijum karbonat, kalijum karbonat, cezijum karbonat, alkokside metala kao što su natrijum etoksid, natrijum metoksid i kalijum-tbutoksid, i organske amine kao što su trietilamin, piridin, 4-aminopiridin, N-etil-N,N-diizopropilamin (DIPEA) i 1,8-diazabiciklo[5.4.0]-7-undecen (DBU). Reakcija se odvija između baze u ekivalentnoj količini ili neznatnom višku u odnosu na jedinjenje (A-1) i neopentil alkohola u ekvivalentnoj količini ili neznatnom višku u odnosu na jedinjenje (A-1) u rastvaraču koji je inertan za tu reakciju, u opsegu temperature između 0<o>C i 140<o>C, nakon čega sledi dodavanje jedinjenja (A-1) u datu smešu, pa se reakcija ostavlja da se odvija, uopšteno posmatrano, od 0,5 do 16 časova. Poželjno je da se ova reakcija izvodi u atmosferi inertnog gasa kao što je azot. Rastvarači ovde obuhvataju, iako nisu posebno ograničeni na, na primer, aromatične ugljovodonike kao što su benzen, toluen i ksilen; etre kao što su dietil etar, tetrahidrofuran (THF), 1,4-dioksan, 1,2-dimetoksietan i 1,2-dietoksietan; halogenovane ugljovodonike kao što su dihlormetan, 1,2-dihloretan i hloroform; N,N-dimetilformamid (DMF); N-metilpirolidon; dimetil sulfoksid (DMSO); vodu; ili mešovite rastvarače ovih rastvarača.

Sinteza jedinjenja (A-4)

(Gde R predstalja alkil grupu koja ima 1 do 6 ugljenikovih atoma). Ova reakcija predstavlja postupak za sintezu jedinjenja (A-4) reakcijom kuplovanja jedinjenja (A-2) i (A-3). Primeri odlazeće grupe predstavljene oznakom Y<1>obuhvataju halogeni atom, metansulfoniloksi grupu, p-toluensulfoniloksi grupu, trifluormetansulfoniloksi grupu. Reakcija se izvodi omogućavanjem da jedinjenja (A-2) i (A-3) reaguju uz upotrebu ekvivalentne količine, ili blagog viška, jednog jedinjenja u odnosu na drugo jedinjenje u rastvaraču koji je za reakciju inertan, u prisustvu baze i katalizatora - prelaznog metala, uz dodavanje liganda, karboksilne kiseline i monovalentne ili dvovalentne bakarne soli kada je potrebno, u opsegu temperatura od sobne temperature do temperature refluksa, uopšteno posmatrano od 0,5 časova do 2 dana. Poželjno je da se ova reakcija izvodi u atmosferi inertnog gasa kao što je azot. Rastvarači ovde obuhvataju, iako nisu posebno ograničeni na, na primer, aromatične ugljovodonike kao što su benzen, toluen i ksilen; etre kao što su dietil etar, tetrahidrofuran (THF), 1,4-dioksan, 1,2-dimetoksietan i 1,2-dietoksietan; halogenovane ugljovodonike kao što su dihlormetan, 1,2-dihloretan i hloroform; alkohole kao što su metanol, etanol, 2-propanol i butanol; N,N-dimetilformamid (DMF); N-metilpirolidon; dimetil sulfoksid (DMSO); vodu; i mešovite rastvarače ovih rastvarača. Primeri baza obuhvataju litijum hidrid, natrijum hidrid, kalijum hidrid, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, natrijum karbonat, kalijum karbonat, cezijum karbonat, kalijum fluorid, cezijum fluorid, trikalijum fosfat, natrijum acetat i kalijum acetat; metalnu so alkoksida koja ima 1 do 6 ugljenikovih atoma (litijumova so, natrijumova so, kalijumova so ili magnezijumova so); metalnu so alkil anjona koji ima 1 do 6 ugljenikovih atoma (litijumova so, natrijumova so, kalijumova so i magnezijumova so); tetra (alkil koji ima 1 do 4 ugljenikova atoma) amonijum so (fluorid, hlorid i bromid); diizopropiletilamin; tributilamin; N-metilmorfolin; diazabicikloundecen; diazabiciklooktan; i imidazol.

Primeri katalizatora od prelaznog metala obuhvataju bakar, paladijum, kobalt, gvožđe, rodijum, rutenijum i iridijum. Primeri liganada obuhvataju tri(t-butil)fosfin, tri(cikloheksil)fosfin, t-butildicikloheksilfosfin, di(t-butil)cikloheksilfosfin i di(tbutil)metilfosfin. Primeri monovalentnih i dvovalentnih bakarnih soli obuhvataju bakar (I) hlorid, bakar (I) bromid, bakar (I) jodid, bakar (I) acetat, bakar (II) fluorid, bakar (II) hlorid, bakar (II) bromid, bakar (II) jodid, bakar (II) acetat, hidrate takvih jedinjenja i njihove smeše. Primeri karboksilnih kiselina obuhvataju mravlju kiselinu, sirćetnu kiselinu, propionsku kiselinu, N-buternu kiselinu, izobutrenu kiselinu, pentansku kiselinu, izopentansku kiselinu, pivalinsku kiselinu i trifluorsirćetnu kiselinu.

Sinteza jedinjenja (A-5)

(Gde R predstalja alkil grupu koja ima 1 do 6 ugljenikovih atoma). Ova reakcija predstavlja postupak za sintezu jedinjenja (A-5) redukcijom nitro grupe jedinjenja (A-4). Reakcija se izvodi tako što se omogući da jedinjenje (A-4) reaguje u atmosferi gasovitog vodonika i rastvaraču koji je inertan za reakciju, u prisustvu katalizatora od prelaznog metala u opsegu temperature od sobne temperature do temperature refluktovanja, uopšteno govoreći, od 0,5 časova do 2 dana. Rastvarači ovde obuhvataju, iako nisu posebno ograničeni na, na primer, aromatične ugljovodonike kao što su benzen, toluen i ksilen; etre kao što su dietil etar, tetrahidrofuran (THF), 1,4-dioksan, 1,2-dimetoksietan i 1,2-dietoksietan; halogenovane ugljovodonike kao što su dihlormetan, 1,2-dihloretan i hloroform; alkohole kao što su metanol, etanol, 2-propanol i butanol; N,N-dimetilformamid (DMF); N-metilpirolidon; dimetil sulfoksid (DMSO); vodu; etilacetat; i mešovite rastvarače ovih rastvarača. Poželjni primeri katalizatora od prelaznog metala obuhvataju paladijum na ugljeniku, paladijum hidroksid, paladijum crno, platinu na ugljeniku, Ranijev nikl i druge.

Sinteza jedinjenja (A-6): alkil estar 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline

(gde R i R<1>nezavisno predstavljaju alkil grupu koja ima 1 do 6 ugljenikovih atoma). Postupak sinteze je postupak za sintezu tetrazolovog prstena u reakciji jedinjenja (A-5) sa ortoformatom i azidnim jedinjenjem. Reakcija se izvodi tako što se omogući da jedinjenje (A-5), ortoformat i azidno jedinjenje, uz upotrebu ekvivalentne količine ili viška jednog od jedinjenja, reaguju u rastvaraču koji je inertan za reakciju, u prisustvu kiseline u opsegu temperature od sobne temperature do temperature refluktovanja, uopšteno govoreći, od 0,5 časova do 2 dana. Poželjno je da se ova reakcija izvodi u atmosferi inertnog gasa kao što je azot. Primeri ortoformata obuhvataju trimetil ortoformat i trietil ortoformat. Uz to, primeri azidnog jedinjenja obuhvataju natrijum azid i trimetil sililazid. Primeri kiseline koja se koristi obuhvataju organske kiseline kao što su mravlja kiselina i sirćetna kiselina, neorganske kiseline kao što su hlorovodonična kiselina i sumporna kiselina i Luisove kiseline kao što su indijum triflat, iterbijum triflat, cink triflat i trihlorindijum. Rastvarač koji se koristi u ovoj reakciji obuhvata, iako nije posebno ograničen na, na primer, benzen, toluen, dihlormetan, dihloretan, hloroform, ugljen tetrahlorid, dietiletar, tetrahidrofuran (THF), 1,4-dioksan, 1,2-dimetoksietan, 1,2-dietoksietan, N,N-dimetilformamid (DMF), N-metilpirolidon, dimetil sulfoksid (DMSO) i smeše ovakvih rastvarača; uz to, kao rastvarač se može koristiti i kiselina, kao što je sirćetna kiselina.

Sinteza kristalne forme A jedinjenja (I): 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina

(Gde R predstalja alkil grupu koja ima 1 do 6 ugljenikovih atoma). Kristalna forma A jedinjenja (I) može da se dobije postupkom koji podrazumeva korak suspenzije jedinjenja (A-7) u rastvaraču i hidrolize suspenzije dodatkom vodenog rastvora baze, te korak neutralizacije proizvoda reakcije. Uz to, postupak može dalje da podrazumeva korak dodavanja vode u neutralisani proizvod i dalji korak mešanja reakcionog rastvora. Rastvarač za suspenziju jedinjenja (A-7) obuhvata, na primer, aromatične ugljovodonike kao što su benzen, toluen i ksilen; etre kao što su dietil etar, tetrahidrofuran (THF), 1,4-dioksan, 1,2-dimetoksietan i 1,2-dietoksietan; halogenovane ugljovodonike kao što su dihlormetan, 1,2-dihloretan i hloroform; alkohole kao što su metanol, etanol, 2-propanol i butanol; N,N-dimetilformamid (DMF); N-metilpirolidon; dimetil sulfoksid (DMSO); vodu; i mešovite rastvarače ovih rastvarača. Poželjno je da rastvarač bude etar, alkohol, voda ili mešoviti rastvarač sačinjen od ovih rastvarača.

Poželjno je da u jedinjenju (A-7) R bude alkil grupa koji ima 1 do 6 ugljenikovih atoma a još poželjnije je da to bude etil grupa. Ovde, izraz alkil grupa označava linearnu ili račvastu alifatičnu zasićenu ugljovodoničnu grupu. Konkretni primeri alkil grupa koje imaju

1

1 do 6 ugljenikovih atoma obuhvataju metil grupu, etil grupu, propil grupu, izopropil grupu, butil grupu, izobutil grupu, terc-butil grupu, pentil grupu, izopentil grupu i heksil grupu.

Reakcija hidrolize jedinjenja (A-7) u jedinjenje (I) odvija se suspendovanjem jedinjenja (A-7) u rastvaraču (na primer, u količini koja odgovara petnaestostrukoj količini jedinjenja (A-7)) a potom dovođenjem u dodir jedinjenja (A-7) sa bazom u ekivalentnoj količini ili neznatnom višku u odnosu na jedinjenje (A-7) i puštanjem da se reakcija odvija. Primeri poželjnih baza obuhvataju natrijum hidroksid, kalijum hidrid i litijum hidroksid. Reakcija se odvija u opsegu temperatura između 0<o>C i 100<o>C, a poželjno je da to bude u opsegu između 20<o>C i 30<o>C. Nakon reakcije hidrolize, reakcioni proizvod se neutrališe u reakciji baze sa kiselinom u ekivalentnoj količini ili neznatnom višku u odnosu na bazu. Primer poželjne kiseline obuhvaa hlorovodoničnu kiselinu. Reakcija neutralizacije se odvija u opsegu temperatura između 0<o>C i 100<o>C, a poželjno je da to bude u opsegu između 0<o>C i 30<o>C.

Nakon toga se u neutralisani reakcioni proizvod doda voda (na primer, u količini koja je petostruka količina jedinjenja (A-7)), pa se smeša meša jedan čas, nakon čega se talog odvoji filtracijom i osuši kako bi se dobili kristali. Iako količina rastvarača, količina dodate vode, uslovi mešanja i vreme do razdvajanja ceđenjem nisu posebno ograničeni, kako ovi uslovi mogu da imaju uticaja na prinos kristala, hemijsku čistoću, prečnik čestica i distribuciju veličine čestica, poželjno je da se ovi uslovi kombinuju i podešavaju u skladu sa namenom. Za filtraciju, kao uobičajeni postupak mogu da se koriste, na primer, prirodna filtracija, filtracija pod pritiskom, filtracija pod vakuumom ili razdvajanje centrifugiranjem. Za sušenje, kao uobičajeni postupak mogu da se koriste, na primer, prirodno sušenje, sušenje pod vakuumom, sušenje zagrevanjem i sušenje zagrevanjem pod vakuumom. Međuproizvod reakcije može da se prečisti uobičajenim postupcima kao što su prekristalizacija, ponovno taloženje i različiti hromatografski postupci u toku procesa sinteze.

Iako kristali prema predmetnom pronalasku mogu da se identifikuju pomoću karakterističnog spektra difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka ili termogravimetrijske/diferencijalne termičke analize (TG/DTA), kada su prisutne druge kristalne forme, ne označava se u kojim razmerama su takve druge forme inkorporirane. Ukoliko se dobija samo određeni kristalni oblik, može da se prihvati inkroporacija drugih kristalnih oblika do onog stepena koji se ne mogu detektovati ovim postupcima merenja. Uz to, kada se kao aktivni farmaceutki sastojak za farmaceutsko sredstvo koristi specifični kristalni oblik, to ne znači da je prisustvo drugih oblika kristala neprihvatljivo.

Kristali prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste kao farmaceutski aktivni sastojak. Uz to, kada su prisutne druge kristalne forme, mogu da se koriste ne samo jedan oblik kristala, već dva ili veći broj kristalnih oblika. Prema predmetnom pronalasku, lakoća rukovanja tokom proizvodnje, reproducibilnost rezultata, stabilnost i stabilnost pri skladištenju pokazuju bolje vrednosti ukoliko se dobiju kristali 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline u poređenju sa oblicima koji nisu kristalni.

Farmaceutski preparat može da se dobije upotrebom kristala prema predmetnom pronalasku i farmaceutski prihvatljvog nosioca.

Preparat koji sadrži kristale prema predmetnom pronalasku dobija se upotrebom aditiva koji su u uobičajenoj upotrebi za formulaciju preparata. Primeri aditiva za čvrsti preparat obuhvataju ekscipijense, kao što su laktoza, saharoza, glukoza, kukuruzni skrob, beli krompirov skrob, kristalna celuloza, silicijum dioksid, sintetski aluminijum silikat, magnezijum aluminometasilikat i kalcijum hidrogen fosfat; vezivna sredstva kao što su kristalna celuloza, karboksimetil celuloza, hidroksipropil celuloza, karboksimetil celuloza natrijum i polivinil pirolidon; sredstva za dezintegrisanje kao što su skrob, karboksimetil celuloza natrijum, karboksimetil celuloza kalcijum, kroskarmeloza natrijum i natrijum karboksi metil skrob; lubrikanse kao što su talk i stearinska kiselina; sredstva za oblaganje kao što su hidroksimetilpropilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza ftalat i etilceluloza; i boje; aditivi za polučvrste preparate obuhvataju baze kao što su beli parafin; a aditivi za tečne preparate obuhvataju rastvarač kao što je etanol; sredstvo za poboljšavanje rastvorljivosti kao što je etanol; konzervans kao što je parahidroksibenzoat; sredstvo za podešavanje toničnosti kao što je glukoza; pufer kao što je limunska kiselina; antioksidans kao što je L-askorinska kiselina; sredstvo za heliranje kao što je EDTA; i sredstvo za suspendovanje i sredstvo za emulgovanje kao što je polisorbat 80.

Kristali prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u bilo kom doznom obliku, kao što su čvrsti preparat, polučvrsti preparat i tečni preparat, i mogu da se koriste u preparatu za bilo koji put primene, kao što su preparati za oralnu primenu i preparati za parenteralnu primenu (kao što su preparati za injekcije, preparati za perkutanu primenu, preparati za oftalmičku primenu, supozitorije, transnazalni preparati i preparati za inhalaciju).

Farmaceutski preparat koji sadrži kristale prema predmetnom pronalasku kao aktivno jedinjenje može da se koristi kao inhibitor ksantin oksidaze ili kao terapeutsko sredstvo i kao profilaktičko sredstvo za bolesti koje se dovode u vezu sa ksantin oksidazom kao što su giht, hiperurikemija, sindrom lize tumora, kalkuloze urotrakta, hipertenzija, dislipidemija, dijabetes, kardiovaskularne bolesti kao što su arterioskleroza ili otkazivanje srca, bubrežne bolesti kao što je dijabetska nefropatija, respiratorne bolesti kao što je hronična opstruktivna bolest pluća, zapaljenske bolesti creva ili autoimune bolesti. Ovde izraz "profilaktički" označava sprečavanje pojave ili razvoja bolesti kod pacijenta koji ne pati od date bolesti ili je još uvek nije razvio, a izraz "terapeutski" podrazumeva lečenje, smanjivanje ili olakšavanje bolesti ili simptoma kod pacijenta koji već pati od date bolesti ili kod kojeg se data bolest već razvila.

Primeri

Postupak merenja

Difrakcija X zraka sa sprašenog uzorka kristala prema predmetnom pronalasku merena je pod sledećim uslovima.

Aparat: D8 DISCOVER sa GADDS CS proizvođača Bruker AXS

Izvor zračenja: Cu K α, talasna dužina: 1,541838 (10<-10>m), 40 kV-40 mA,

Incident ravni grafitni monohromator, kolimator prečnika 300 µm,

dvodimenzionalni PSPC detektor, skenira 3 do 40°

Termogravimetrijska/diferencijalna termička analiza (TG/DTA) kristala prema predmetnom pronalasku merena je pod sledećim uslovima.

Aparat: TG8120 proizvođača Rigaku

Brzina porasta temperature: 10°C/min,

Atmosfera: azot

Posuda za uzrak: aluminijumska;

Referentna supstanca: aluminijum oksid,

Uzorkovanje 1,0 s;

Temperaturni opseg merenja: 25 do 300°C

Kada je reč o jedinjenjima za koje je meren<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6 ili CDCl3), navedeni su hemijsko pomeranje (δ: ppm) i konstanta kuplovanja (J: Hz).

Aparat: JMTC-400/54/SS proizvođača JEOL

Skraćenice imaju sledeće značenje: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, brs = široki singlet, m = multiplet

1

Referentni primer 1

Dobijanje etil 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata

(1) Smeša dobijena suspendovanjem 1,06 g neopentil alkohola u 40,0 ml toluena ohlađena je do 0<o>C u atmosferi azota, te je dodato 1,35 g t-butoksinatrijuma, pa je dobijena smeša mešana na 0°C 30 minuta. Nakon toga, nakon što je dodato 2,20 g 4-brom-1-fluor-2-nitrobenzena u ovu smešu na 0<o>C, dobijena reakciona smeša je ugrejana do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi 2 časa. Nakon dodatka vode u rastvor reakcione smeše, izvršena je ekstrakcija pomoću etilacetata. Organski sloj je ispran vodenim rastvorom soli, nakon čega je osušen i koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo 3,12 g 4-brom-1-(2,2-dimetilpropoksi)-2-nitrobenzena.

(2) Dodavanjem 3,04 g kalijum bikarbonata, 63 mg paladijum (II) hlorida i 297 mg bakar (I) bromida u 4,18 g 4-brom-1-(2,2-dimetilpropoksi)-2-nitrobenzena, te suspendovanjem ove smeše u 45 ml toluena, pripremljena je suspenzija. Nakon toga, reakciona smeša pripremljena dodavanjem 2,97 g etil 4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata, 133 µl izobuterne kiseline i 333 µl di-t-butilcikloheksilfosfina u prethodnu suspeniju zagrevana je na 120<o>C 14 časova u atmosferi azota. Reakciona smeša je proceđena kroz celit kako bi se uklonile nerastvorne supstance, u filtrat je dodata voda, pa je izvršena ekstrakcija etilacetatom. Organski sloj je ispran vodenim rastvorom soli a potom osušen i koncentrovan pod sniženim pritiskom nakon čega je prečišćen uobičajenim postupcima, kako bi se dobilo 5,13 g etil 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3- nitrofenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata.

<1>H-NMR (400Mz,CDCl3) δ: 1,08 (9H, s), 1,39 (3H, t, J = 6,8Hz), 2,77 (3H, s), 3,79 (2H, s), 4,36 (2H, q, J = 6,8Hz), 7,12 (1H, d, J = 8,8Hz), 8,10 (1H, dd, J = 2,0, 8,8Hz), 8,45 (1H, d, J = 2,0Hz)

(3) Reakciona smeša pripremljena je suspendovanjem 5,13 g etil 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3- nitrofenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata u 50 ml etanola, te dodatkom 500 mg paladijuma na uglju (10% u mas. %) u datu suspenziju, pa je mešana na 50°C 20 časova u atmosferi vodonika. Reakciona smeša je proceđena a filtrat koncentrovan pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo 4,66 g etil 2-[3-amino-4-(2,2-dimetilpropoksi)fenil)-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata.

(4) Reakciona smeša pripremljena suspendovanjem 2,58 g etil 2-[3-amino-4-(2,2-dimetilpropoksi)fenil)-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata u 30 ml sirćetne kiseline, te dodatkom 962 mg natrijum azida i 2,19 g trietil ortoformata, mešana je na 70°C 2 časa u atmosferi azota. Nakon hlađenja reakcione smeše do sobne temperature, dodato je 20 ml, nakon čega je usledilo prečišćavanje uobičajenim postupkom kako bi se dobilo 2,78 g etil 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata.

<1>H-NMR (400Mz, CDCl3) δ: 1,00 (9H, s), 1,39 (3H, t, J = 6,8Hz), 2,78 (3H, s), 3,82 (2H, s), 4,36 (2H, q, J = 6,8Hz), 7,18 (1H, d, J = 8,8Hz), 8,08 (1H, dd, J = 2,4, 8,8Hz), 8,42 (1H, d, J = 2,4Hz), 9,19 (1H, s).

Primer 1

Dobijanje kristalne forme A 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline

Reakciona smeša pripremljena rastvaranjem 2,58 g etil 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata u 30,0 ml mešovitog rastvarača tetrahidrofuran/metanol = 1:1 a zatim dodatkom 6,50 ml 2M vodenog rastvora natrijum hidroksida mešana je na temperaturama između 20°C i 30<o>C 3 časa. Dok je reakciona smeša mešana na temperaturama između 20°C i 30<o>C, polako joj je dodato 6,50 ml 2M hlorovodonične kiseline a zatim, isto polako, i 17,0 ml vode. Reakciona smeša je mešana na temperaturama između 20°C i 30<o>C jedan čas, a kristali su dobijeni filtracijom. Ovako dobijeni kristali su isprani sa 7,0 ml mešovitog rastvora metanol/voda = 1:1 i 7,0 ml vode. Kristali su osušeni pod vakuumom na 50<o>C kako bi se dobilo 2,25 g kristala 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline. XRD dobijenih kristala prikazan je na slici 1. Maksimumi su uočeni pri difrakcionim uglovima od 2 Θ = 7,2°, 11,3°, 15,9°, 17,9°, 20,8°, 22,3°, 23,1°, 23,8°, 24,3° i 28,6°. Uz to, egzotermni maksimum na termogravimetrijskoj/diferencijalnoj termičkoj analizi (TG/DTA) uočen je na 232°C.

<1>H-NMR (400Mz,DMSO-d6) δ: 0,83 (9H, s), 2,66 (3H, s), 3,83 (2H, s), 7,47 (1H, d, J = 8,8Hz), 8,18 (1H, dd, J = 2,4, 8,8Hz), 8,27 (1H, d, J = 2,0Hz), 9,78 (1H, s), 13,40 (1H, s).

Referentni primer 2

Dobijanje 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline

Reakciona smeša dobijena rastvaranjem 307 mg etil 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilata u 8,0 ml mešovitog rastvora tetrahidrofuran/metanol = 1:1, a zatim dodavanjem 1,0 ml 2M vodenog rastvora natrijum hidroksida, mešana je na sobnoj temperaturi 3 časa. Nakon što je u reakcionu smešu dodat 1,0

1

ml 2M hlorovodonične kiseline, dodato je i 6 ml vode, nakon čega je usledilo prečišćavanje uobičajenim postupkom kako bi se dobilo 244 mg 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline.<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 0,83 (9H, s), 2,66 (3H, s), 3,83 (2H, s), 7,47 (1H, d, J = 8,8Hz), 8,18 (1H, dd, J = 2,4, 8,8Hz), 8,27 (1H, d, J = 2,0Hz), 9,78 (1H, s), 13,40 (1H, s)

Referentni primer 3

Merenje inhibitorne aktivnosti prema ksantin oksidazi

(1) Priprema jedinjenja za ispitivanje

Nakon rastvaranja 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline u DMSO-u (proizvođača Sigma Corporation), tako da se dobije koncentracija od 20 mM, rastvor je korišćen podešavanjem koncentracije na željenu vrednost za konkretnu namenu pre upotrebe.

(2) Postupak merenja

Ocenjivanje inhibitorne aktivnosti 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline prema ksantin oksidazi sprovedeno je u skladu sa postupkom opisanim u referenci (Method Enzymatic Analysis, 1, 521-522, 1974), uz određene delimične izmene. Ovo određivanje izvedeno je merenjem ksantin oksidoreduktazne aktivnosti oksidaznog tipa. Konkretno, rastvor ksantina (prozvođača Sigma Co.) pripremljen je u koncentraciji od 10 mM uz primenu 20 mM rastvora natrijum hidroksida, a potom mešan sa 100 mM fosfatnog pufera kako bi se koncentracija podesila na 30 µm. Po 75 µl rastvora dodato je u svako polje ploče sa 26 polja. Ispitivano jedinjenje razblaženo je DMSO-om 100 puta do konačne koncentracije, te je dodato u svako polje u količini od 1,5 µl po polju. Nakon što su uzorci u poljima izmućkani, merena je apsorbancija na 290 nm pomoću čitača za mikroploče SPECTRA MAX Plus 384 (proizvođača Molecular Devices LLC). Nakon toga, pripremljen je rastvor ksantin oksidaze oksidaznog tipa (iz fermentisanog mlečnog proizvoda proizvođača Calbiochem Novabiochem Corp.) u koncentraciji od 30,6 mU/ml pomoću 100 mM fosfatnog pufera; zatim je taj rastvor dodat u svako polje, u količini od 73,5 µl po polju. Odmah nakon mešanja, merena je promena apsorbance na 290 nm u toku 5 minuta. Enzimska aktivnost rastvora DMSO bez ispitivanog jedinjenja korišćena je kao 100% kontrola, dok je stopa inhibicije ispitivanog jedinjenja računata. Koncentracija pedesetoprocentne inhibicije ispitivanog jedinjenja za aktivnost

1

ksantin oksidoreduktaze oksidaznog tipa izračunata je fitovanjem u krivu odgovora u zavisnosti od doze.

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je pokazala inhibitornu aktivnost prema ksantin oksidazi od 1,0 nM ≤ IC50 <5,0 nM.

Referentni primer 4

Hipourikemijski efekat (normalni pacovi)

Hipourikemijski efekat potvrđen je za 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilnu kiselinu. Mužjacima Sprague-Dawley pacova starim 8 do 9 nedelja (Japan Charles River Co.), na silu su data ispitivana jedinjenja suspendovana u 0,5% rastvoru metilceluloze gavažom pomoću igle za hranjenje. Nakon što je krv uzeta iz cefalične vene 2 časa nakon primene, razdvojena je plazma. Koncentracija urinske kiseline u uzorku krvi merena je urikaznim postupkom pomoću apsorpcionog spektrometra kao i pomoću kompleta za određivanje urinske kiseline (L type Wako UA F: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Procenat hipourikemijskog efekta određivan je pomoću sledećeg izraza:

Procenat hipourikemijskog efekta (%) = (koncentracija urinske kiseline kod kontrolne životinje – koncentracija urinske kiseline kod životinje kojoj je dato ispitivano jedinjenje) x 100 / koncentracija urinske kiseline kod kontrolne životinje

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je pokazala hipourikemijski efekat od 50% ili više u obe doze, i pri 10 mg/kg i 1 mg/kg.

Iz prethodnih rezultata, pokazano je da 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina ima moćno hipourikemijsko dejstvo.

1

Primer 5

Produženi hipourikemijski efekat (normalni pacovi)

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je primenjivana kod mužjaka Sprague-Dawley pacova na isti način kao u referentnom primeru 4. Nakon što je krv uzeta iz cefalične vene 24 časova nakon primene, razdvojena je plazma. Koncentracija urinske kiseline u uzorku krvi merena je urikaznim postupkom pomoću apsorpcionog spektrometra kao i pomoću kompleta za određivanje urinske kiseline (L type Wako UA F: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Procenat hipourikemijskog efekta određivan je pomoću sledećeg izraza:

Procenat hipourikemijskog efekta (%) = (koncentracija urinske kiseline kod kontrolne životinje – koncentracija urinske kiseline kod životinje kojoj je dato ispitivano jedinjenje) x 100 / koncentracija urinske kiseline kod kontrolne životinje

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je pokazala hipourikemijski efekat od 50% ili više u dozi od 10 mg/kg i 40% ili više u dozi od 3 mg/kg, 24 časa nakon primene.

Iz prethodnih rezultata, pokazano je da 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina ima produženo hipourikemijsko dejstvo u toku dužeg vremenskog perioda.

Referentni primer 6

Hipourikemijski efekat (Hiperuremijski biglovi)

Hipourikemijski efekat 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline potvrđen je kod pasa rase bigl koji pate od hiperurikemije izazvane oksonskom kiselinom. Ispitivano jedinjenje suspendovano u 0,5% rastvoru metilceluloze dato je psu rase bigl (Kitayama labes) oralnom gavažom. Pre, i 4 sata nakon primene jedinjenja, potkožno je dat kalijum oksonat (50 mg/kg). Nakon što je krv uzeta iz cefalične vene 8 časova nakon primene, razdvojena je plazma. Koncentracija urinske kiseline u uzorku plazme merena je pomoću LC-MS/MS postupka a procenat hipourikemijskog efekta određivan je pomoću sledećeg izraza:

1

Procenat hipourikemijskog efekta (%) = (koncentracija urinske kiseline kod kontrolne životinje – koncentracija urinske kiseline kod životinje kojoj je dato ispitivano jedinjenje) x 100 / koncentracija urinske kiseline kod kontrolne životinje

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je pokazala hipourikemijski efekat od 80% ili više u dozi od 10 mg/kg 8 časova nakon primene.

Iz prethodnih rezultata, pokazano je da jedinjenja prema predmetnom pronalasku imaju snažan hipourikemijski efekat kod psa rase bigl.

Referentni primer 7

Produženo inhibitorno dejstvo na ksantin oksidazu u tkivu i plazmi

Za potrebe predmetnog pronalaska, u izrazu "ksantin oksidaza", u ovom primeru, pravi se razlika između aktivnosti katalize oksidativne reakcije koju pokazuje ksantin oksidoreduktaza oksidaznog tipa pojedinačno, i koju pokazuju i oksidazni tip i dehidrogenazni tip ksantin oksidoreduktaze. Ova prva se naziva "XO aktivnost" a druga "XOR aktivnost". U izrazima "XO aktivnost u tkivu", "XO aktivnost u plazmi", "XOR aktivnost u tkivu", "inhibicija aktivnosti XOR u tkivu", i sličnim, izrazi "XO aktivnost" i "XOR aktivnost" imaju ista značenja kao što je prethodno opisano. Tkivo obuhvata jetru, bubrege i krvne sudove. Uz to, procenat inhibicije aktivnosti XO i procenat inhibicije XO aktivnosti u istom uzorku smatraju se sličnim, u skladu sa rezultatima koji slede.

Inhibitorno dejstvo na XO aktivnost u tkivu, XOR aktivnost u tkivu i XO aktivnost u plazmi potvrđeno je za 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilnu kiselinu. Mužjacima Sprague-Dawley pacova starim 7 do 9 nedelja (Japan Charles River Co.), na silu su data ispitivana jedinjenja suspendovana u 0,5% rastvoru metilceluloze gavažom pomoću igle za hranjenje. Uzorci krvi uzeti su iz abdominalne vene, a tkivo je uzorkovano 24 ili 27 časova nakon primene jedinjenja. Uzorak plazme pripremljen je centrifugiranjem.

XO aktivnost u tkivu, XOR aktivnost u tkivu i XO aktivnost u plazmi mereni su testom na bazi pterina, koji koristi reakciju u kojoj se pterin oksiduje pod dejstvom svake od vrsta ksantin oksidoreduktaza, dajući fluorescentni izoksantopterin. Ukratko, smrznuta tkiva su homogenizovana u kalijum fosfatnom puferu, pH 7,4, koji sadrži 1 mM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) i inhibitore proteaze, kako bi se pripremile sledeće

1

koncentracije tkiva (jetra: 25 mg/ml, bubreg: 25 mg/ml, krvni sud: 30 mg/ml). Potom su homogenati centrifugirani na 12,000 rpm 15 min na 4<o>C. Kada je merena XO aktivnost, supernatant tkiva i plazma su inkubirani zajedno sa 50 µM rastvorom pterina na 37<o>C. Kada je merena XOR aktivnost, supernatant homogenata inkubiran je zajedno sa 50 µM rastvorom pterina i 50 µM rastvorom metilen plavog na 37<o>C. Kao kontrola, ksantin oksidaza oksidaznog tipa (iz fermentisanog mlečnog proizvoda proizvođača Calbiochem Novabiochem Corp.) takođe je inkubirana, na isti način, sa rastvorom pterina. XO aktivnost i XOR aktivnost uzoraka utvrđivane su iz intenziteta fluorescencije, normalizovanog pomoću intenziteta fluorescencije kontrole i iz koncentracije proteina.

Procenat inhibicije XO aktivnosti i inhibicije XOR aktivnosti određeni su pomoću sledećeg izraza:

Procenat inhibicije XO ili XOR aktivnosti (%) = (XO ili XOR aktivnost kod kontrolne životinje – XO ili XOR aktivnost kod životinje kojoj je dato ispitivano jedinjenje) x 100 / XO ili XOR aktivnost kod kontrolne životinje

XO aktivnosti u jetri i bubrezima i XO aktivnost u plazmi 27 časova nakon primene jedinjenja prikazane su u tabeli koja sledi.

Tabela 1

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je inhibirala 80% ili više XO aktivnosti 27 časova nakon primene leka, u poređenju sa kontrolnom životinjom, pri dozi od 10 mg/kg, u jetri.

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 70% ili više XO aktivnosti 27 časova nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 10 mg/kg, u bubregu.

2

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 40 % ili više XO aktivnosti 27 časova nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 10 mg/kg u plazmi.

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 80 % ili više XOR aktivnosti 27 časova nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 1 mg/kg, u jetri.

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 60 % ili više XOR aktivnosti 27 časova nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 1 mg/kg, u bubregu.

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 25% ili više XOR aktivnosti 27 časova nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 1 mg/kg u plazmi.

Uz to, XOR aktivnost u krvnim sudovima 24 časa nakon primene jedinjenja prikazana je u tabeli koja sledi:

Tabela 2

2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina je inhibirala 80% ili više XOR aktivnosti 24 časa nakon primene leka, u poređenju sa kontrolnom životinjom, pri dozi od 10 mg/kg, u jetri.

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 50% ili više XOR aktivnosti 24 časa nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 10 mg/kg, u krvnom sudu.

Dalje, predmetno jedinjenje inhibiralo je 80 % ili više XOR aktivnosti 24 časa nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 1 mg/kg, u jetri.

Predmetno jedinjenje inhibiralo je 30% ili više XOR aktivnosti 24 časa nakon primene leka u poređenju sa kontrolnom životinjom u dozi od 1 mg/kg, u krvnom sudu.

Iz prethodnih rezultata, pokazano je da jedinjenja prema predmetnom pronalasku imaju produžen inhibitorni efekat na XO aktivnost ili XOR aktivnost.

Industrijska primenljivost

Kristali 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline prema predmetnom pronalasku koriste se kao farmaceutsko sredstvo. Dalje, ovi kristali mogu da se koriste kao aktivni farmaceutski sastojci za dobijanje farmaceutskog sredstva.

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Kristal 2-[4-(2,2-dimetilpropoksi)-3-(1H-1,2,3,4-tetrazol-1-il)fenil]-4-metil-1,3-tiazol-5-karboksilne kiseline.

2. Kristal prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedeni kristal ima kristalnu formu A.

3. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što navedeni kristal ima karakteristične maksimume difrakcionih uglova 2 Θ = 7,2°, 11,3°, 15,9°, 17,9°, 20,8°, 22,3°, 23,1°, 23,8°, 24,3° i 28,6° u svom spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

4. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što njegov spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka ima profil prikazan na slici 1.

5. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je njegov egzotermni maksimum u termogravimetrijskoj/diferencijalnoj termičkoj analizi na 232°C.

6. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži kristal iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljv nosilac.

7. Kristal prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, ili farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u terapiji ili profilaksi.

8. Kristal prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, ili farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koja se dovodi u vezu sa ksantin oksidazom.

9. Kristal ili farmaceutski preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeni time što je navedena bolest koja se dovodi u vezu sa ksantin oksidazom odabrana iz grupe koja se sastoji od gihta, hiperurikemije, sindroma lize tumora, kalkuloza

2

urotrakta, hipertenzije, dislipidemije, dijabetesa, kardiovaskularnih bolesti, bubrežnih bolesti, respiratornih bolesti, zapaljenskih bolesti creva i autoimunih bolesti.