RS57824B1 - Retinoid-lipozomi za poboljšanje modulacije hsp47 ekspresije - Google Patents

Retinoid-lipozomi za poboljšanje modulacije hsp47 ekspresije

Info

Publication number
RS57824B1
RS57824B1 RS20181081A RSP20181081A RS57824B1 RS 57824 B1 RS57824 B1 RS 57824B1 RS 20181081 A RS20181081 A RS 20181081A RS P20181081 A RSP20181081 A RS P20181081A RS 57824 B1 RS57824 B1 RS 57824B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
covalently attached
seq
nucleotide
nucleic acid
positions
Prior art date
Application number
RS20181081A
Other languages
English (en)
Inventor
Violetta Akopian
Kenjiro Minomi
Yoshiro Niitsu
Joseph E Payne
Victor Knopov
Richard P Witte
Mohammad Ahmadian
Loren A Perelman
Yasunobu Tanaka
Elena Feinstein
Sharon Avkin-Nachum
Hagar Kalinski
Igor Mett
Wenbin Ying
Yun Lui
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
Publication of RS57824B1 publication Critical patent/RS57824B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/52—Methods for regulating/modulating their activity modulating the physical stability, e.g. GC-content

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis
REFERENCA KOJA UPUĆUJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava se poziva na prioritet US Provizione prijave Br.61/497,447 podnete 15 Juna, 2011 i US Provizione prijave Br.61/494,832 podnete 8 Juna, 2011.
OBLAST TEHNIKE
[0002] Ovde su obezbeđene farmaceutske kombinacije koje obuhvataju retinoid-lipozome za poboljšanje modulacije hsp47 ekspresije od strane siRNK.
POZADINA
[0003] Fibroza jetre može biti izazvana aktiviranim hepatičnim stelatnim ćelijama (HSC), što rezultuje kao više vrsta molekula kolagena i fibronektina koji se deponuje na intresticijalnom tkivu. To vodi ka hepatičnoj cirozi, otkazivanju jetre, i/ili hepatocelularnom karcinomu. Dalje, hronični pankreatitis razvija se kao rezultat fibroze pankreasa istim mehanizmom kao i onaj za fibrozu jetre (Madro, et al., 2004; Med Sci Monit.10:RA166-70; Jaster, 2004, Mol Cancer.6:26). Pored toga, stelatne ćelije prisutne su u poremećajima glasnih žica i grkljana kao što su formiranje ožiljaka na glasnim žicama, mukozalna fibroza glasnih žica, i fibroza grkljana. U cilju sprečavanja ili lečenja fibroze u ovim organima kao i bilo gde drugde u telu, postoji potreba za razvojem nosača leka i kompleta nosača leka.
[0004] Stelatne ćelije predstavljaju jednog od značajnih ciljanih kandidata za za lečenje fibroze (Fallowfield et al., 2004, Expert Opin Ther Targets.8:423-35; Pinzani, et al., 2004, Dig liver Dis.36:231-42). Tokom fibroze, stelatne ćelije se aktiviraju citokinima iz okolnih ćelija radi proizvodnje mnogih faktora koji izazivaju hepatičnu fibrozu. Stelatne ćelije skladište vitamin A, i pripadaju familiji mijofibroblasta.
[0005] Terapeutski postupci za sprečavanje ili lečenje fibroze pokušavaju da kontrolišu metabolizam kolagena, promociju kolagenskog degradacionog sistema, i inhibiciju aktivacije stelatnih ćelija. Međutim, u svim ovim slučajevima, niska specifičnost aktivnosti i/ili niska specifičnost organa, ograničena efikasnost i štetni sporedni efekti, stvaraju probleme.
[0006] Inhibicija sinteze proteina kolagena nije utvrđena kao terapeutski postupak. Potencija molekula koji ciljaju proizvodnju kolagena ograničena je zbog mogućnosti od izazivanja sporednih efekata.
Inhibiranje proizvodnje kolagena direktno obezbeđuje još jedan terapeutski postupak za sprečavanje ili lečenje fibroze. Takav postupak zahteva kontrolisanje jedne ili dve različite vrste kolagena Vrste I do IV. Postupak kojim bi se ovo postiglo može biti putem proteina 47 toplotnog šoka (HSP47), kolagenspecifični molekularni pratilac koji je od suštinskog značaja za intraćelijski transport i sazrevanje molekula koji su potrebni za razne vrste kolagena. Prema tome, ukoliko se funkcija HSP47 može specifično kontrolisati u stelatnim ćelijama, postoji mogućnost inhibiranja hepatične fibroze.
[0007] EP1842557 tiče se nosača leka i kompleta nosača leka za inhibiranje fibroze.
[0008] Sato et al. (Nature Biotechnology; Izdanje 26, Broj 4; April 2008; stranice 431 - 442) odnosi se na ršavanje ciroze jetre upotrebom vitamin A-kuplovanih lipozoma kako bi se dostavila siRNK protiv kolagen-specifičnog šaperona.
REZIME
[0009] Ovaj pronalazak definisan je, između ostalog, sledećim tačkama:
1. Farmaceutska kombinacija koja obuhvata:
(i) dvolančani molekul nukleinske kiseline i nosač leka koji obuhvata mešavinu retinoida i lipida, pri čemu taj dvolančani molekul nukleinske kiseline obuhvata strukturu (A1):
(A1) 5' (N)x-Z 3' (antismisaoni lanac) 3' Z'-(N')y-z" 5' (smisaoni lanac)
u kojoj svako od N i N' je nukleotid koji može biti nemodifikovan ili modifikovan, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od (N)xi (N')yje oligonukleotid u kojem je svako uzastopno N ili N' spojeno sa narednim N ili N' kovalentnom vezom;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno uključuje 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihovu kombinaciju kovalentno vezanu na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna;
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od (N')y;
u kojoj svako od x i y nezavisno je neki ceo broj između 18 i 40;
u kojoj je sekvenca (N')ykomplementarna sekvenci (N)x;
u kojoj (N)xuključuje antismisaonu sekvencu u mRNK kodirajućoj sekvenci za humani hsp47 predstavljen sa SEQ ID NO:1; i
u kojoj lipid obuhvata lipid odabran iz grupe koju čine
ili
(ii) dvolančani molekul nukleinske kiseline koji obuhvata smisaoni lanac i antismisaoni lanac pri čemu su ti smisaoni i antismisaoni lanci odabrani od oligonukleotida opisani kao SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165), i SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168), i nosač leka koji obuhvata mešavinu lipidne vezikule i retinoida ili konjugat retinoida, pri čemu lipid te lipidne vezikule obuhvata lipid odabran iz grupe koju čine
2. Farmaceutska kombinacija tačke 1, u kojoj konjugat retinoida predstavlja PEG-konjugat.
3. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 1, 5, 6, ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata najmanje jedan 2'-5'-ribonukleotid ili 2'-O-metil modifikovan ribonukleotid; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju.
4. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
5. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; i C3C3 nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata C3Pi nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
6. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
7. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3 ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
8. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:98, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:165; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima na ili blizu 3’-kraja; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2’-O-metil modifikovan ribonukleotid; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
9. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:98, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:165; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-OH 3' ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
10. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane pirimidin ribonukleotide; opcioni 2'-5'-ribonukleotid u jednom od položaja 9 ili 10; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2’-O-metil modifikovan ribonukleotid; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6, ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. 11. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
12. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 13 i 15; a 2-5-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
13. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0010] Ovaj pronalazak odnosi se na nosač leka i komplet nosača leka koji omogućavaju da se dijagnostički i/ili terapeutski lek specifično transportuje do stelatnih ćelija. Nosač leka u ovom opisu može biti odabran od polimernih micela, lipozoma, emulzija, mikrosfera, i nanosfernih oblika, a njihovim vezivanjem unutar njega ili njihovim uključivanjem u njega, retinoid ili konjugat retinoida i terapeutski lek koji se može transportovati specifično u HSC. Retinoidi uključuju vitamin A, retinalnu, retinoinsku kiselinu, zasićen Vitamin A, tretinoin, adapalen, ili retinol palmitat, i fenretinid (4-HPR). Pored toga, pripremanjem nosača leka da uključi jedan molekul ili više molekula odabranih između inhibitora TGFβ aktivnosti kao što je okrnjen TGFβ tip II receptor i rastvorljiv TGFβ tip II receptor, preparati faktora rasta kao što je HGF, promoteri proizvodnje MMP kao što je MMP u genu sadržavajući adenovirusni vektor, inhibitori ćelijske aktivacije i/ili inhibitori rasta koji uključuju PPARy-ligand, angiotenzin-II vrsta I receptor antagonist, PDGF tirozin kinaza inhibitor, i inhibitor natrijumskog kanala kao što je amilorid, i induktori apoptoze kao što je jedinjenje 861 i gliotoksin; i njegovim davanjem primera radi, oralno, parenteralno, intravenozno ili intraperitonealnano pacijentu koji su u riziku od fibroze ili simptoma fibroze, ili pacijentima koji imaju razne sa fibrozom povezane poremećaje kao što je, na primer, hepatična ciroza, otkazivanje jetre, kancer jetre, ili hronični pankreatitis, aktivacija stelatnih ćelija može se suzbiti, i čime se sprečava, inhibira ili poboljšava fibroza i/ili sa fibrozom povezana stanja bolesti kod pomenutog pacijenta. Alternativno, ili pored toga, upotrebom nosača leka koji u sebi obuhvata ribozim, antismisaonu RNK, ili siRNK koja specifično inhibira HSP47 ili TIMP, koji je MMP inhibitor, istovremeno se može inhibirati lučenje tipa I do IV kolagena, a kao rezultat, fibrogeneza se može efikasno inhibirati.
[0011] Jedan primer izvođenja ovog pronalaska je farmaceutska kombinacija koja obuhvata dvolančani molekul nukleinske kiseline koji obuhvata smisaoni lanac i antismisaoni lanac pri čemu su ti smisaoni i antismisaoni lanci odabrani od oligonukleotida opisani kao SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165), i SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168) u Tabeli 4, ispod, i nosač leka koji obuhvata mešavinu lipidne vezikule i retinoida ili konjugat retinoida. Retinoid može biti jedan ili više od sledećih: vitamin A, retinoinska kiselina, zasićen Vitamin A, retinal, tretinoin, adapalen, retinol palmitat, ili fenretinid. Poželjno, retinoid obuhvata konjugat retinoinske kiseline, najpoželjnije konjugat retinoid-PEG. Lipidna vezikula može se sastojati od dvosloja lipidnih molekula, i dalje se može sastojati od retinoida. Retinoid je poželjno pri koncentraciji od 0.2 do 20 mas.% u nosaču leka. Lipidna vezikula može se sastojati od unutrašnje površine koja enkapsulira unutrašnje lipidne vezikule, i spoljašnje površine koja je dostupna vodenoj sredini izvan lipidne vezikule. Retinoid može biti povezan sa lipidnim dvoslojem. Dvo-lančana nukleinska kiselina može biti izložena na spoljnoj površini lipidne vezikule.
[0012] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul nukleinske kiseline uključuje antismisaoni lanac sa SEQ ID NO:127, i obuhvata 2'-O-metil šećerom (2'OMe)-modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 1, 5, 6, ili 7; i 3'-terminalni ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac sa SEQ ID NO:60, i koji obuhvata najmanje jedan 2'-5'-ribonukleotid ili 2'OMe modifikovan ribonukleotid; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju. U poželjnim primerima izvođenja antismisaoni lanac je SEQ ID NO:127 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60 i obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja dvolančani molekul nukleinske kiseline dalje uključuje 2’OMe modifikovan ribonukleotid ili 2’-5’-ribonukleotid na položaju 1 antismisaonog lanca. (sve reference u vezi sa nukleotidnim položajima ovde su izražene na osnovu 5'>3' pravca oligonukleotida i za smisaoni i za antismisaoni lanac dvolančanog molekula nukleinske kiseline.)
[0013] U raznim primerima izvođenja, smisaoni lanac je SEQ ID NO:98 i obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima na 3’-kraju; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:165 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. U poželjnim primerima izvođenja smisaoni lanac je SEQ ID NO:98 i obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-OH 3' ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:165 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. U nekim primerima izvođenja dvolančana nukleinska kiselina dalje obuhvata 2’OMe modifikovan ribonukleotid na položaju 2.
[0014] U raznim primerima izvođenja, smisaoni lanac je SEQ ID NO:101 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide; opcioni 2'-5'-ribonukleotid u jednom od položaja 9 ili 10; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6, ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. U poželjnim primerima izvođenja smisaoni lanac je SEQ ID NO:101 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168 i obuhvata 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. U određenim primerima izvođenja dvolančani molekul nukleinske kiseline dalje obuhvata 2’OMe modifikovan ribonukleotid na položaju 13 u antismisaonom lancu i ili na položaju 2 u smisaonom lancu.
[0015] Još jedan aspekt predstavlja farmaceutsku kombinaciju koja obuhvata dvolančani molekul nukleinske kiseline i nosač leka koji obuhvata mešavinu retinoida i lipida, u kojem dvolančano oligonukleotidno jedinjenje obuhvata strukturu (A1):
(A1) 5' (N)x-Z 3'(antismisaoni lanac) 3' Z'-(N')y-z" 5'(smisaoni lanac)
u kojoj svako od N i N' je nukleotid koji može biti nemodifikovan ili modifikovan, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od (N)xi (N')yje oligonukleotid u kojem je svako uzastopno N ili N' spojeno sa narednim N ili N' kovalentnom vezom;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno uključuje 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihovu kombinaciju kovalentno vezanu na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna;
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od (N')y;
u kojoj svako od x i y nezavisno je neki ceo broj između 18 i 40; u kojoj je sekvenca
(N')ykomplementarna sekvenci (N)x; i u kojoj (N)xuključuje antismisaonu sekvencu u mRNK kodirajućoj sekvenci za humani hsp47 predstavljen sa SEQ ID NO:1, što je prikazano u nastavku.
[0016] Ovde su obezbeđene kombinacije, postupci i kompleti za modulisanje ekspresija ciljanih gena. U raznim aspektima i primerima izvođenja, ovde obezbeđene kombinacije, postupci i kompleti modulišu ekspresiju protein 47 toplotnog šoka (hsp47), takođe poznat kao SERPINH1 (SEQ ID NO:1). Kombinacije, postupci i kompleti mogu da uključe upotrebu molekula nukleinske kiseline (na primer, kratka ometajuća nukleinska kiselina (siNK), kratka ometajuća RNK (siRNK), dvolančana RNK (dsRNK), mikroRNK (miRNK), ili kratka u obliku ukosnice RNK (shRNK)) koji se vezuje za nukleotidnu sekvencu (kao što je mRNK sekvenca) koja kodira hsp47, SEQ ID NO:1. U određenim poželjnim primerima izvođenja, ovde opisane kombinacije, postupci i kompleti inhibiraju ekspresiju hsp47. Na primer, siNK molekuli (npr.,RNK-indukovan kompleks supresije (RISC) dužine dsNK molekula ili Dicer dužine dsNK molekula) su obezbeđeni koji redukuju ili inhibiraju hsp47 ekspresiju. Takođe su obezbeđene kombinacije, postupci i kompleti za lečenje i/ili sprečava bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa hsp47, kao što je fibroza jetre, ciroza, plućna fibroza koja uključuje fibrozu pluća (koja uključuje intersticijalnu fibrozu pluća (ILF)), fibrozu bubrega koja je rezultat bilo kog stanja (npr., hronična bolest bubrega (CKD) koja uključuje Krajnji stadijum bubrežne bolesti (ESRD)), peritonealnu fibrozu, hronično hepatično oštećenje, fibrilogenezu, fibrozne bolesti u drugim organima, abnormalno stvaranje ožiljaka (keloidi) povezano sa svim mogućim vrstama kožnih povreda slučajnim i jatrogenim (operacije); skleroderma; kardiofibroza, neuspeh operacije filtriranja glaukoma; i crevne priraslice.
[0017] U jednom aspektu, obezbeđene su gornje farmaceutske kombinacije koje obuhvataju molekule nukleinske kiseline (npr., siNK molekule) kao komponenta farmaceutske formulacije u kojoj molekul nukleinske kiseline uključuje smisaoni lanac i antismisaoni lanac; pri čemu je svaki lanac molekula nukleinske kiseline nezavisno 15 do 49 nukleotida u dužini; 15 do 49 nukleotidna sekvenca antismisaonog lanca komplementarna je sekvenci mRNK koja kodira humani hsp47 (npr.,SEQ ID NO: 1); i 15 do 49 nukleotidna sekvenca smisaonog lanca komplementarna je sekvenci antismisaonog lanca i uključuje 15 do 49 nukleotidnu sekvencu mRNK koja kodira humani hsp47 (npr., SEQ ID NO: 1).
[0018] U određenim primerima izvođenja, sekvenca antismisaonog lanca koja je komplementarna sekvenci mRNK koja kodira humani hsp47 uključuje sekvencu komplementarnu sekvenci između nukleotida 600-800; ili 801-899; ili 900-1000; ili 1001-1300 iz SEQ ID NO: 1; ili između nukleotida 650-730; ili 900-975 iz SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni lanac uključuje sekvencu koja je komplementarna sekvenci mRNK koja kodira humani hsp47 koja odgovara nukleotidima 674-693 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 698-716 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 698-722 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 701-720 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 920-939 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 963-982 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 947-972 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 948-966 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 945-969 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu; ili nukleotidima 945-963 iz SEQ ID NO: 1 ili njihovom delu.
[0019] U određenim primerima izvođenja, antismisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 4 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 6 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 8 ili njenom delu;
1
ili SEQ ID NO: 10 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 12 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 14 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 16 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 18 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 20 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 22 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 24 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 26 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 28 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 30 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 32 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 34 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 36 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 38 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 40 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 42 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 44 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 46 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 48 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 50 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 52 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 54 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 56 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 58 ili njenom delu. U određenim primerima izvođenja, smisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan uključuje sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 3 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 5 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 7 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 9 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 11 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 13 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 15 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 17 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 19 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 21 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 23 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 25 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 27 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 29 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 31 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 33 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 35 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 37 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 39 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 41 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 43 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 45 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 47 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 49 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 51 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 53 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 55 ili njenom delu; ili SEQ ID NO: 57 ili njenom delu.
[0020] U određenim poželjnim primerima izvođenja, antismisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje sekvencu koja odgovara bilo kojoj od antismisaonih sekvenci prikazanih u Tabeli 4. U određenim poželjnim primerima izvođenja antismisaoni lanac i lanac odabrani su između parova sekvenci prikazanih u Tabeli 4. U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 i SERPINH1_88. U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4 (SEQ ID NO:195 i 220), SERPINH1_12 (SEQ ID NO:196 i 221), SERPINH1_30 (SEQ ID NO:199 i 224), i SERPINH1_58 (SEQ ID NO:208 i 233).
[0021] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje parove sekvenci navedene u SERPINH1_4 (SEQ ID NO:195 i 220). U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan uključuje antismisaone i smisaone lance parova sekvenci navedenih u SERPINH1_12 (SEQ ID NO:196 i 221). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kakvi su ovde opisani uključuju parove sekvenci navedene u SERPINH1_30 (SEQ ID NO:199 i 224). U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan uključuje antismisaone i smisaone lance parova sekvenci navedenih u SERPINH1_58 (SEQ ID NO:208 i 233).
[0022] U određenim primerima izvođenja, antismisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje sekvencu koja odgovara bilo kojoj od antismisaonih sekvenci prikazanih u bilo kojoj od Tabela B ili C.
[0023] U određenim poželjnim primerima izvođenja, antismisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje sekvencu koja odgovara bilo kojoj od antismisaonih sekvenci prikazanih u Tabeli 5. U određenim poželjnim primerima izvođenja antismisaoni lanac i lanac odabrani su između parova sekvenci prikazanih u Tabeli 5. U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan uključuje antismisaone i smisaone lance odabrane između parova sekvenci navedenih u
● SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127),
● SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130),
● SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 i 135),
● SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 i 136),
● SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 i 164),
● SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165),
● SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168),
● SERPINH1_52 (SEQ ID NO: 102 i 169) ili
● SERPINH1_86 (SEQ ID NO: 123 i 190).
[0024] U nekim poželjnim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u
● SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127),
● SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130),
● SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165), i
● SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168).
[0025] U nekim poželjnim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje antismisaone i smisaone lance odabrane između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci uključuju parove sekvenci navedene u SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130). U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan uključuje antismisaone i smisaone lance parova sekvenci navedenih u SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 i 135). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 i 136). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 i 164). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168).
[0026] U određenim primerima izvođenja, antismisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) koji je opisan kao komponenta farmaceutske formulacije ovde uključuje sekvencu koja odgovara bilo kojoj od antismisaonih sekvenci prikazanih u bilo kojoj od Tabela D ili E.
[0027] U raznim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani kao komponenta farmaceutske formulacije, antismisaoni lanac može biti 15 do 49 nukleotida u dužini (npr., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49 nukleotida u dužini); ili 17-35 nukleotida u dužini; ili 17-30 nukleotida u dužini; ili 15-25 nukleotida u dužini; ili 18-25 nukleotida u dužini; ili 18-23 nukleotida u dužini; ili 19-21 nukleotida u dužini; ili 25-30 nukleotida u dužini; ili 26-28 nukleotida u dužini. U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani, antismisaoni lanac može biti 19 nukleotida u dužini Slično tome smisaoni lanac molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani može biti 15 do 49 nukleotida u dužini (npr., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49 nukleotida u dužini); ili 17-35 nukleotida u dužini; ili 17-30 nukleotida u dužini; ili 15-25 nukleotida u dužini; ili 18-25 nukleotida u dužini; ili 18-23 nukleotida u dužini; ili 19-21 nukleotida u dužini; ili 25-30 nukleotida u dužini; ili 26-28 nukleotida u dužini. U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani, smisaoni lanac može biti 19 nukleotida u dužini. U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani, antismisaoni lanac i smisaoni lanac mogu biti 19 nukleotida u dužini. Region dupleksa molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani može biti 15-49 nukleotida u dužini (npr., oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49 nukleotida u dužini), 15-35 nukleotida u dužini; ili 15-30 nukleotida u dužini; ili oko 15-25 nukleotida u dužini; ili 17-25 nukleotida u dužini; ili 17-23 nukleotida u dužini; ili 17-21 nukleotida u dužini; ili 25-30 nukleotida u dužini; ili 25-28 nukleotida u dužini. U raznim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisanio, region dupleksa može biti 19 nukleotida u dužini.
1
[0028] U određenim primerima izvođenja, smisaoni i antismisaoni lanci nukleinske kiseline (npr., siNK molekul nukleinske kiseline) kakvi su ovde obezbeđeni kao komponenta farmaceutske formulacije su odvojeni polinukleotidni lanci. U nekim primerima izvođenja, odvojeni antismisaoni i smisaoni lanci formiraju dvolančanu strukturu preko vezivanja vodonika, na primer, Watson-Crick bazno uparivanje. U nekim primerima izvođenja smisaoni i antismisaoni lanci su dva odvojena lanca koji su kovalentno povezani jedan sa drugim. U drugim primerima izvođenja, smisaoni i antismisaoni lanci su deo jednog polinukleotidnog lanca sa oba i smisaonim i antismisaonim regionom; u nekim poželjnim primerima izvođenja polinukleotidni lanac ima strukturu u obliku ukosnice.
[0029] U određenim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) je molekul dvolančane nukleinske kiseline (dsNK) koji je simteričan u pogledu prepusta, i ima tupi kraj na oba kraja. U drugim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) je dsNK molekul koji je simteričan u pogledu prepusta, i ima prepust na oba kraja dsNK molekula; poželjno molekul ima prepuste od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 nukleotida; poželjno molekul ima 2 nukleotidna prepusta. U nekim primerima izvođenja, prepusti su 5' prepusti; u alternativnim primerima izvođenja prepusti su 3' prepusti. U određenim primerima izvođenja, nukleotidi prepusta modifikovani su modifikacijama kakve su ovde opisane. U nekim primerima izvođenja, nukleotidi prepusta su 2'-dezoksinukleotidi.
[0030] U određenim poželjnim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kao komponenta farmaceutske formulacije je dsNK molekul koji je asimetričan u pogledu prepusta, i ima tupi kraj na jednom kraju molekula i prepust na drugom kraju molekula. U određenim primerima izvođenja, prepust je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 nukleotida; poželjno prepust je 2 nukleotida. U nekim poželjnim primerima izvođenja, asimetričan dsNK molekul ima 3'-prepust (na primer dva nukleotidna 3’-prepusta) na jednoj strani dupleksa koji se javlja na smisaonom lancu; i tupi kraj na drugoj strani molekula. U nekim poželjnim primerima izvođenja, asimetričan dsNK molekul ima 5'-prepust (na primer dva nukleotidna 5’-prepusta) na jednoj strani dupleksa koji se javlja na smisaonom lancu; i tupi kraj na drugoj strani molekula. U drugim poželjnim primerima izvođenja, asimetričan dsNK molekul ima 3'-prepust (na primer dva nukleotidna 3’-prepusta) na jednoj strani dupleksa koji se javlja na antismisaonom lancu; i tupi kraj na drugoj strani molekula. U nekim poželjnim primerima izvođenja, asimetričan dsNK molekul ima 5'-prepust (na primer dva nukleotidna 5’-prepusta) na jednoj strani dupleksa na kojem se javlja antismisaoni lanac; i tupi kraj na drugoj strani molekula. U određenim poželjnim primerima izvođenja, prepusti su 2'-dezoksinukleotidi.
[0031] U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kao komponenta farmaceutske formulacije ima strukturu u obliku ukosnice (koja ima smisaoni lanac i antismisaoni lanac na jednom polinukleotidu), sa petljastom strukturom na jednom kraju i tupim krajem na drugom kraju. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline ima strukturu u obliku ukosnice, sa petljastom strukturom na jednom kraju i prepustnim krajem na drugom kraju (na primer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 nukleotidnih prepusta); u određenim primerima izvođenja, prepust je 3'-prepust; u određenim primerima izvođenja prepust je 5'-prepust; u određenim primerima izvođenja prepust je na smisaonom lancu; u određenim primerima izvođenja prepust je na antismisaonom lancu.
[0032] U nekim poželjnim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline odabran je između molekula nukleinske kiseline prikazanih u Tabeli 3.
[0033] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) ovde opisani kao komponentu farmaceutske formulacije mogu da uključe jednu ili više modifikacija ili modifikovanih nukleotida kao što je ovde opisano. Na primer, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kakav je ovde obezbeđen, može da uključi modifikovan nukleotid koji ima modifikovan šećer; modifikovan nukleotid koji ima modifikovanu nukleobazu; ili modifikovan nukleotid koji ima modifikovanu fosfatna grupa. Slično tome, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kakav je ovde obezbeđen može da uključi modifikovanu fosfodiestarsku kičmu i/ili mogu da uključe modifikovanu terminalnu fosfatnu grupu.
[0034] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) obezbeđeni kao komponenta farmaceutske formulacije mogu imati jedan ili više nukleotida koji uključuju modifikovan šećerni ostatak, na primer kako je ovde opisano. U nekim poželjnim primerima izvođenja, modifikovani šećerni ostatak odabran je iz grupe koju čine 2'OMe, 2'-metoksietoksi, 2'-dezoksi, 2'-fluoro, 2'-alil, 2'-O-(2-(metilamino)-2-oksoetil), 4'-tio, 4'-(CH2)2-O-2'-most, 2'-LNK (riboza ostatak LNK nukleotida modifikovan je dodatim mostom koji povezuju 2' kiseonik i 4' ugljenik), i 2'-O-(N-metilkarbamat).
[0035] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) obezbeđeni kao komponenta farmaceutske formulacije mogu imati jednu ili više modifikovanih nukleobaza(a) na primer kakve su ovde opisane, koje mogu poželjno biti odabrane iz grupe koju čine ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkilni derivati adenina i gvanina, 2-propil i drugi alkilni derivati adenina i gvanina, 5-halo uracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, amino, tiol, tioalkil, hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin, i aciklonukleotidi.
[0036] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) obezbeđeni kao komponenta farmaceutske formulacije mogu imati jednu ili više modifikacija na fosfodiestarskoj kičmi, na primer kako je ovde opisano. U nekim poželjnim primerima izvođenja, fosfodiestarska veza modifikovan je supstituisanjem
1
fosfodiestarske veze fosforotioatom, 3'-(ili 5’-)dezoksi-3'-(ili 5’-)tio-fosforotioatom, fosforoditioatom, fosforoselenatima, 3'-(ili -5’)dezoksi fosfinatima, borano fosfatima, 3'-(ili 5’-)dezoksi-3'-(ili 5’-)amino fosforamidatima, vodonik fosfonatima, estrima borano fosfata, fosforamidatima, alkil ili aril fosfonatima i fosfodiestarskim ili fosfornim vezama.
[0037] U raznim primerima izvođenja, obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kao komponentu farmaceutske formulacije mogu da uključe jednu ili modifikacije u smisaonom lancu, ali ne i u antismisaonom lancu. U nekim primerima izvođenja obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) uključuju jednu ili više modifikacija u antismisaonom lancu, ali ne i u smisaonom lancu. U nekim primerima izvođenja obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) uključuju jednu ili više modifikacija i u smisaonom lancu i antismisaonom lancu.
[0038] U nekim primerima izvođenja u kojoj obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kao komponentu farmaceutske formulacije imaju modfikacije, smisaoni lanac uključuje obrazac naizmeničnih modifikovanih i nemodifikovanih nukleotida, i/ili antismisaoni lanac uključuje obrazac naizmeničnih modifikovanih i nemodifikovanih nukleotida; u nekim poželjnim verzijama takvih primera izvođenja, ta modifikacija je 2'OMe ostatak. Obrazac naizmeničnih modifikovanih i nemodifikovanih nukleotida može započeti sa modifikovanim nukleotidom na 5’-kraju ili 3’-kraju jednog od lanaca; na primer obrazac naizmeničnih modifikovanih i nemodifikovanih nukleotida može započeti sa modifikovanim nukleotidom na 5’-kraju ili 3’-kraju smisaonog lanca i/ili obrazac naizmeničnih modifikovanih i nemodifikovanih nukleotida može započeti sa modifikovanim nukleotidom na 5’-kraju ili 3’-kraju antismisaonog lanca. Kada i antismisaoni i smisaoni lanac uključuju obrazac naizmeničnih modifikovanih nukleotida, obrazac modifikovanih nukleotida može biti konfigurisan tako da su modifikovani nukleotidi u smisaonom lancu naspramni modifikovanim nukleotidima u antismisaonom lancu; ili može postojati fazni pomak u obrascu tako da su modifikovani nukleotidi smisaonog lanca naspramni nemodifikovanim nukleotidima u antismisaonom lancu i obrnuto.
[0039] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde obezbeđeni kao komponentu farmaceutske formulacije mogu da uključe jedan do tri (tj., 1, 2 ili 3) dezoksinukleotida na 3’-kraju smisaonog i/ili antismisaonog lanca.
[0040] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde obezbeđeni kao komponentu farmaceutske formulacije mogu da uključe fosfatnu grupu na 5’-kraju smisaonog i/ili antismisaonog lanca.
1
[0041] U jednom aspektu, obezbeđeni kao komponenta farmaceutske formulacije su dvolančani molekuli nukleinske kiseline strukture (A1):
(A1) 5' (N)x-Z 3' (antismisaoni lanac)
3' Z'-(N')y-z" 5' (smisaoni lanac)
u kojoj svako od N i N' je nukleotid koji može biti nemodifikovan ili modifikovan, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od (N)xi (N')yje oligonukleotid u kojem je svako uzastopno N ili N' spojeno sa narednim N ili N' kovalentnom vezom;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno uključuje 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihovu kombinaciju kovalentno vezanu na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna;
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od (N')y;
u kojoj svako od x i y nezavisno je neki ceo broj između 18 i 40; u kojoj je sekvenca
(N')ykomplementarna sekvenci (N)x; i u kojoj (N)xuključuje antismisaonu sekvencu iz SEQ ID NO:1.
[0042] U nekim primerima izvođenja, (N)xuključuje antismisaoni oligonukleotid predstavljen u Tabeli 4. U drugim primerima izvođenja, (N)xodabran je između antismisaonog oligonukleotida predstavljenog u Tabelama B ili C.
[0043] U nekim primerima izvođenja, kovalentna veza koja spaja svaki od uzastopnih N ili N' je fosfodiestarska veza.
[0044] U nekim primerima izvođenja, x = y, a svako od x i y je 19, 20, 21, 22 ili 23. U raznim primerima izvođenja, x = y =19.
[0045] U nekim primerima izvođenja molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde opisani, dvolančani molekul nukleinske kiseline je siRNK, siNK ili miRNK.
[0046] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u
● SERPINH1_4 (SEQ ID NO:195 i 220),
1
● SERPINH1_12 (SEQ ID NO:196 i 221),
● SERPINH1_30 (SEQ ID NO:199 i 224), i
● SERPINH1_58 (SEQ ID NO:208 i 233).
[0047] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_4 (SEQ ID NO:195 i 220). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_12 (SEQ ID NO:196 i 221). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_30 (SEQ ID NO:199 i 224). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_58 (SEQ ID NO:208 i 233).
[0048] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekuli nukleinske kiseline kao komponentu farmaceutske formulacije obuhvataju DNK ostatak ili neslaganje sa metom na položaju 1 antismisaonog lanca (5'-kraj). Ovde je opisana takva struktura. Prema jednom primeru izvođenja obezbeđene su modifikovani molekuli nukleinske kiseline koji imaju strukturu (A2) navedenu u nastavku:
(A2) 5' N<1>-(N)x-Z 3' (antismisaoni lanac) 3' Z'-N<2>-(N')y-z" 5' (smisaoni lanac)
u kojoj svako od N<2>, N i N' je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak; u kojoj svako od (N)xi (N')yje oligonukleotid u kojem je svako uzastopno N ili N' spojeno sa susednim N ili N' kovalentnom vezom;
u kojoj svako od x i y nezavisno je neki ceo broj između 17 i 39;
u kojoj je sekvenca (N')ykomplementarna sekvenci (N)x, a (N)xje komplementarrna uzastopnoj sekvenci u ciljanoj RNK;
u kojoj N<1>je kovalentno povezano sa (N)xi ne slaže se sa metom RNK ili je komplementaran DNK ostatak sa metom RNK;
u kojoj N<1>je ostatak odabran iz grupe koju čine prirodni ili modifikovan uridin, dezoksiribouridin, ribotimidin, dezoksiribotimidin, adenozin ili dezoksiadenozin;
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y; i
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno, nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida, uzastopnih ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna.
[0049] U nekim primerima izvođenja, sekvenca (N')ypotpuno je komplementarna sekvenci (N)x. U raznim primerima izvođenja, sekvenca N<2>-(N')ykomplementarna je sekvenci N<1>-(N)x. U nekim primerima
1
izvođenja, (N)xobuhvata antismisaonu koja je potpuno komplementarna sa oko 17 do oko 39 uzastopnih nukleotida u ciljanoj RNK. U drugim primerima izvođenja, (N)xobuhvata antismisaonu koja je suštinski komplementarna sa oko 17 do oko 39 uzastopnih nukleotida u ciljanoj RNK.
[0050] U nekim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju Watson-Crick bazni par. U nekim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju ne-Watson-Crick bazni par. U nekim primerima izvođenja, bazni par se formira između ribonukleotida i dezoksiribonukleotida.
[0051] U nekim primerima izvođenja, x =y=18, x =y=19 ili x =y=20. U poželjnim primerima izvođenja, x=y=18. Kada x=18 u N<1>-(N)x, N<1>odnosi se na položaj 1, a položaji 2-19 uključeni su u (N)18. Kada y=18 u N<2>-(N')y, N<2.>odnosi se na položaj 19, a položaji 1-18 uključeni su u (N')18.
[0052] U nekim primerima izvođenja, N<1>je kovalentno povezano sa (N)x i ne slaže se sa metom RNK. U raznim primerima izvođenja, N<1>je kovalentno povezano sa (N)xi predstavlčja DNK ostatak komplementaran sa metom RNK.
[0053] U nekim primerima izvođenja, uridin na položaju 1 antismisaonog lanca supstituisan je sa N<1>odabranim između adenozina, dezoksiadenozina, dezoksiuridina (dU), ribotimidina ili dezoksitimidina. U raznim primerima izvođenja, N<1>je odabrano između adenozina, dezoksiadenozina ili dezoksiuridina.
[0054] U nekim primerima izvođenja, gvanozin na položaju 1 antismisaonog lanca supstituisan je sa N<1>odabranim između adenozina, dezoksiadenozina, uridina, dezoksiuridina, ribotimidina ili dezoksitimidina. U raznim primerima izvođenja, N<1>je odabran između adenozina, dezoksiadenozina, uridina ili dezoksiuridina.
[0055] U nekim primerima izvođenja, citidin na položaju 1 antismisaonog lanca supstituisan je sa N<1>odabranim između adenozina, dezoksiadenozina, uridina, dezoksiuridina, ribotimidina ili dezoksitimidina. U raznim primerima izvođenja, N<1>odabran je između adenozina, dezoksiadenozina, uridina ili dezoksiuridina.
[0056] U nekim primerima izvođenja, adenozin na položaju 1 antismisaonog lanca supstituisan je sa N<1>odabranim između dezoksiadenozina, dezoksiuridina, ribotimidina ili dezoksitimidina. U raznim primerima izvođenja, N<1>je odabrano između dezoksiadenozina ili dezoksiuridina.
[0057] U nekim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju bazni par između uridina ili dezoksiuridina, i
1
adenozina ili dezoksiadenozina. U drugim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju bazni par između dezoksiuridina i adenozina.
[0058] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul nukleinske kiseline kao komponenta farmaceutske formulacije je siRNK, siNK ili miRNK. Dvolančani molekuli nukleinske kiseline kakvi su ovde obezbeđeni takođe se nazivaju "dupleksi".
[0059] U nekim primerima izvođenja (N)xuključuje i antismisaoni oligonukleotid predstavljen u Tabeli 5. U nekim primerima izvođenja, x=y=18 i N'-(N)xuključuje antismisaoni oligonukleotid predstavljen u Tabeli 4. U nekim primerima izvođenja x=y=19, ali x=y=20. U određenim poželjnim primerima izvođenja, x =y=18. U nekim primerima izvođenja x=y-18 i sekvence N<1>-(N)xi N<2>-(N')yodabrani su između para oligonukleotida navedeni u Tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, x=y-18 i sekvence N<1>-(N)xi N<2>-(N')yodabrani su između para oligonukleotida navedeni u Tabelama D i E. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u
● SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127),
● SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130),
● SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 i 135),
● SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 i 136),
● SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 i 164),
● SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165),
● SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168),
● SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 i 172),
● SERPINH1_52 (SEQ ID NO:102 i 169), i
● SERPINH1_86 (SEQ ID NO: 123 i 190).
[0060] U nekim poželjnim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u
● SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127),
● SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130),
● SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165),
● SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168), i
● SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 i 172).
[0061] U nekim poželjnim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130). U nekim
2
primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 i 135). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 i 136). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 i 164). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 i 172). U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u SERPINH1_52 (SEQ ID NO:102 i 169). U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci su parovi sekvenci navedenih u (SEQ ID NO: 123 i 190). U nekim poželjnim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1 _2 (SEQ ID NO: 60 i 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168), i SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 i 172).
[0062] U nekim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju Watson-Crick bazni par. U drugim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju ne-Watson-Crick bazni par. U nekim primerima izvođenja N<1>je modifikovan riboadenozin ili modifikovan ribouridin.
[0063] U nekim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju Watson-Crick bazni par. U drugim primerima izvođenja, N<1>i N<2>formiraju ne-Watson-Crick bazni par. U određenim primerima izvođenja, N<1>odabran je iz grupe koju čine riboadenozin, modifikovan riboadenozin, dezoksiriboadenozin, modifikovan dezoksiriboadenozin. U drugim primerima izvođenja, N<1>odabran je iz grupe koju čine ribouridin, dezoksiribouridin, modifikovan ribouridin, i modifikovan dezoksiribouridin.
[0064] U određenim primerima izvođenja, položaj 1 u antismisaonom lancu (5'-kraj) uključuje dezoksiribouridin (dU) ili adenozin. U nekim primerima izvođenja, N<1>odabran je iz grupe koju čine riboadenozin, modifikovan riboadenozin, dezoksiriboadenozin, modifikovan dezoksiriboadenozin, a N<2>odabran je iz grupe koju čine ribouridin, dezoksiribouridin, modifikovan ribouridin, i modifikovan dezoksiribouridin. U određenim primerima izvođenja, N<1>odabran je iz grupe koju čine riboadenozin i modifikovan riboadenozin, a N<2>odabran je iz grupe koju čine ribouridin i modifikovan ribouridin.
[0065] U određenim primerima izvođenja, N<1>odabran je iz grupe koju čine ribouridin, dezoksiribouridin, modifikovan ribouridin, i modifikovan dezoksiribouridin, a N<2>odabran je iz grupe koju čine riboadenozin, modifikovan riboadenozin, dezoksiriboadenozin, i modifikovan dezoksiriboadenozin. U određenim primerima izvođenja, N<1>odabran je iz grupe koju čine ribouridin i dezoksiribouridin, a N<2>odabran je iz grupe koju čine riboadenozin i modifikovan riboadenozin. U određenim primerima izvođenja, N<1>is ribouridin, a N<2>is riboadenozin. U određenim primerima izvođenja, N<1>je dezoksiribouridin, a N<2>is riboadenozin.
[0066] U nekim primerima izvođenja Strukture (A2), N<1>uključuje 2'OMe modifikovan ribouracil ili 2'OMe modifikovan riboadenozin. U određenim primerima izvođenja Strukture (A2), N<2>uključuje 2’OMe modifikovan ribonukleotid ili dezoksiribonukleotid.
[0067] U nekim primerima izvođenja Strukture (A2), N<1>uključuje 2'OMe modifikovan ribouracil ili 2'OMe modifikovan ribocitozin. U određenim primerima izvođenja Strukture (A2), N<2>uključuje 2’OMe modifikovan ribonukleotid.
[0068] U nekim primerima izvođenja svako od N i N' je nemodifikovan nukleotid. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od N ili N' uključuje hemijski modifikovan nukleotid ili nekonvencionalan ostatak. U nekim primerima izvođenja, nekonvencionalan ostatak odabran je između invertni nukleotid, bezbazni riboza ostatak i bezbazni dezoksiriboza ostatak. U nekim primerima izvođenja, nekonvencionalan ostatak je invertni nukleotid, poželjno L-DNK ostatak. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od N ili N' uključuje 2’OMe modifikovan ribonukleotid.
[0069] U nekim primerima izvođenja, sekvenca (N')ypotpuno je komplementarna sekvenci (N)x. U drugim primerima izvođenja, sekvenca (N')ysuštinski je komplementarna sekvenci (N)x.
[0070] U nekim primerima izvođenja, (N)xuključuje antismisaonu sekvencu koja je potpuno komplementarna sa oko 17 do oko 39 uzastopnih nukleotida u ciljanoj mRNK. U drugim primerima izvođenja, (N)xuključuje antismisaonu koja je suštinski komplementarna sa oko 17 do oko 39 uzastopnih nukleotida u ciljanoj mRNK.
[0071] U nekim primerima izvođenja Strukture A1 i Strukture A2, jedinjenje ima tupi kraj, na primer u kojem su oba i Z i Z' odsutni. U alternativnom primeru izvođenja, najmanje jedan od Z ili Z' je prisutan. Z i Z' nezavisno uključuju jedan ili više kovalentno povezanih modifikovanih i ili nemodifikovanih nukleotida, koji uključuju dezoksiribonukleotide i ribonukleotide, ili nekonvencionalan ostatak na primer invertni bezbazni dezoksiriboza ostatak ili bezbazni riboza ostatak; ne-nukleotid C3, C4 ili C5 ostatak, amino-6 ostatak, invertni nukleotid, i slično. U nekim primerima izvođenja svako od Z i Z' nezavisno uključuje C3 ostatak ili amino-C6 ostatak. U nekim primerima izvođenja Z' je odsutno, a Z je prisutno i uključuje ne-nukleotidni C3 ostatak. U nekim primerima izvođenja Z je odsutno, a Z' je prisutno i uključuje ne-nukleotidni C3 ostatak.
[0072] U nekim primerima izvođenja Strukture A1 i Strukture A2, svako N sastoji se od nemodifikovanog ribonukleotida. U nekim primerima izvođenja Strukture A1 i Strukture A2, svako N' sastoji se od nemodifikovanog nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, najmanje jedan od N i N' je modifikovan ribonukleotid ili nekonvencionalan ostatak.
[0073] U drugim primerima izvođenja, jedinjenje Strukture A1 ili Strukture A2 uključuje najmanje jedan ribonukleotid modifikovan u šećernom ostatku. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje uključuje modifikaciju na 2’ položaju tog šećernog ostatka. U nekim primerima izvođenja, modifikacija u 2' položaju uključuje prisustvo amino, fluoro, alkoksi ili alkil ostatka. U određenim primerima izvođenja, 2' modifikacija uključuje alkoksi ostatak. U poželjnim primerima izvođenja, alkoksi ostatak je metoksi ostatak (2'OMe). U nekim primerima izvođenja, jedinjenje nukleinske kiseline uključuje 2'OMe modifikovane naizmenične ribonukleotide u jednom ili oba od antismisaonog i smisaonog lanca. U drugim primerima izvođenja, jedinjenje uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide u antismisaonom lancu, (N)xili N<1>-(N)x, samo. U određenim primerima izvođenja, srednji ribonukleotid antismisaonog lanca; npr. ribonukleotid na položaju 10 u 19-mer lancu je nemodifikovan. U raznim primerima izvođenja, jedinjenje nukleinska kiselina uključuje najmanje 5 naizmeničnih 2'OMe modifikovanih i nemodifikovanih ribonukleotida. U dodatnim primerima izvođenja, jedinjenje Strukture A1 ili Strukture A2 uključuje modifikovane ribonukleotide na naizmeničnim položajima u kojima su svaki ribonukleotid na 5’ i 3’-krajevima (N)xili N<1>-(N)xmodifikovani u svojim šećernim ostacima, a svaki ribonukleotid na 5’ i 3’-krajevima (N')yili N<2>-(N)ysu nemodifikovani u svojim šećernim ostacima.
[0074] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje jednu ili više od sledećih modifikacija
● N u najmanje jednom od položaja 5, 6, 7, 8, ili 9 antismisaonog lanca odabran je između 2'-5'-nukleotida ili invertnog nukleotida;
● N' u najmanje jednom od položaja 9 ili 10 smisaonog lanca odabran je između 2’-5’-nukleotida i pseudo-uridina; i
● N' u 4, 5, ili 6 uzastopnih položaja na 3’-kraju položaja (N')yobuhvata 2’-5’-nukleotid.
[0075] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul uključuje kombinaciju sledećih modifikacija ● antismisaoni lanac uključuje 2’-5'-nukleotid ili invertni nukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6, 7, 8, ili 9; i
● smisaoni lanac uključuje najmanje jedan od 2’-5’-nukleotida i pseudo-uridin na položajima 9 ili 10.
2
[0076] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul uključuje kombinaciju sledećih modifikacija ● antismisaoni lanac uključuje 2’-5'-nukleotid ili invertni nukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6, 7, 8, ili 9; i
● smisaoni lanac uključuje 4, 5, ili 6 uzastopnih 2'-5'-nukleotidi na 3’-pretposlednjem ili 3'-terminalnom položaju.
[0077] U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac ((N)xili N<1>-(N)x) uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili 9 2'OMe modifikovane ribonukleotide. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni lanac uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 i 19. U drugim primerima izvođenja, antismisaoni lanac uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19. U drugim primerima izvođenja, antismisaoni lanac uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19. U nekim primerima izvođenja antismisaoni lanac uključuje jedan ili više 2’OMe modifikovanih pirimidina. U nekim primerima izvođenja, svi pirimidin nukleotidi u antismisaonom lancu su 2'OMe modifikovani. U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac uključuje 2'OMe modifikovane pirimidine.
[0078] U nekim primerima izvođenja Strukture A1 i Strukture A2, niti je smisaoni lanac, niti antismisaoni lanac fosforilisan na 3'- i 5'-krajevima. U drugim primerima izvođenja, jedan ili oba od smisaonog lanca ili antismisaonog lanca are fosforilisani na 3'-krajevima.
[0079] U nekim primerima izvođenja Strukture A1 i Strukture A2, (N)yuključuje najmanje jedan nekonvencionalan ostatak odabran između invertnog nukleotida, 2’-5’-nukleotida i TNA. U nekim primerima izvođenja, nekonvencionalan ostatak je invertni nukleotid. U raznim primerima izvođenja, invertni nukleotid odabran je između L-ribonukleotida (L-RNK) i L-dezoksiribonukleotida (L-DNK). U poželjnim primerima izvođenja, invertni nukleotid je L-DNK. U određenim primerima izvođenja, smisaoni lanac obuhvata nekonvencionalan ostatak na položaju 9 ili 10 (od 5'-kraja). U poželjnim primerima izvođenja, smisaoni lanac uključuje nekonvencionalan ostatak na položaju 9 (od 5’-kraja). U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac je 19 nukleotida u dužini i obuhvata 4, 5, ili 6 uzastopnih nekonvencionalnih ostataka na položajima 15, (od 5’-kraja). U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac uključuje 4 uzastopna 2'-5'-ribonukleotida na položajima 15, 16, 17, i 18. U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac uključuje 5 uzastopna 2'-5'-ribonukleotida na položajima 15, 16, 17, 18 i 19. U raznim primerima izvođenja, smisaoni lanac dalje obuhvata Z'. U nekim primerima izvođenja, Z' uključuje C3OH ostatak ili C3Pi ostatak.
[0080] U nekim primerima izvođenja, Strukture A1 (N')yuključuje najmanje jedan L-DNK ostatak. U nekim primerima izvođenja, x=y=19, a (N')y, sastoji se od nemodifikovanih ribonukleotida na položajima 1-17 i 19 i jednog L-DNK na 3’ pretposlednjem položaju (položaj 18). U drugim primerima izvođenja, x=y=19, a (N')ysastoji se od nemodifikovanih ribonukleotida na položajima 1-16 i 19 i dva uzastopna L-DNK na 3’ pretposlednjem položaju (položaji 17 i 18). U raznim primerima izvođenja, nekonvencionalan ostatak je nukleotid povezan sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom fosfatnom vezom. Prema raznim primerima izvođenja, (N')yuključuje 2, 3, 4, 5, ili 6 uzastopnih ribonukleotida na 3’-kraju povezani 2’-5’ internukleotidnim vezama. U jednom primeru izvođenja, četiri uzastopna nukleotida na 3’-kraju (N')yvezani su putem tri 2'-5' fosfodiestarske veze, u kojoj jedan ili više 2’-5’ nukleotida koji obrazuju 2'-5' fosfodiestarske veze dalje uključuju 3'-O-metil (3'OMe) šećernu modifikaciju. Poželjno 3’-terminalni nukleotid od (N')yuključuje 2’OMe modifikaciju. U određenim primerima izvođenja, x=y=19, a (N')yuključuje dva ili više uzastopnih nukleotida na položajima 15, 16, 17, 18 i 19 uključujujući nukleotid povezan sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom vezom (2'-5' nukleotid). U raznim primerima izvođenja nukleotid koji obrazuje 2’-5’ internukleotidnu vezu uključuje 3’ nukleotid dezoksiriboze ili 3’ metoksi nukleotid (3' H ili 3'OMe umesto 3' OH). U nekim primerima izvođenja x=y=19, a (N')yuključuje 2'-5' nukleotide na položajima 15, 16 i 17 tako da su susedni nukleotidi povezani 2’-5’ internukleotidnom vezom između položaja 15-16, 16-17 i 17-18; ili na položajima, 15, 16, 17, 18, i 19 tako da su susedni nukleotidi povezani 2’-5’ internukleotidnom vezom između položaja 15-16, 16-17, 17-18 i 18-19, a 3'OH je dostupan na 3'-terminalnom nukleotidu ili na položajima 16, 17 i 18 tako da su susedni nukleotidi povezani 2’-5’ internukleotidnom vezom između položaja 16-17, 17-18 i 18-19. U nekim primerima izvođenja x=y=19, a (N')yuključuje 2'-5'-nukleotide na položajima 16 i 17 ili na položajima 17 i 18 ili na položajima 15 i 17 tako da su susedni nukleotidi povezani 2’-5’ internukleotidnom vezom između položaja 16-17 i 17-18 ili između položaja 17-18 i 18-19 ili između položaja 15-16 i 17-18, respektivno. U drugim primerima izvođenja, pirimidin ribonukleotidi (rU, rC) u (N')ysupstituisani su nukleotidima spojenim sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom vezom. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 ili SERPINH1_88, i x=y=19, a (N')yobuhvata pet uzastopnih nukleotida na 3’-kraju vezani putem četiri 2’-5’ veze, specifično vezama između nukleotidnih položaja 15-16, 16-17, 17-18 i 18-19.
[0081] U nekim primerima izvođenja, te veze uključuju fosfodiestarske veze. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 ili SERPINH1_88 i x=y=19, a (N')yobuhvata pet uzastopnih nukleotida na 3’-kraju vezani putem četiri 2’-5’ veze i opciono dalje uključuje Z' i z' nezavisno odabrane između invertnog bezbaznog ostatka i C3 alkil [C3; 1,3-propandiol mono(dihidrogen fosfat)] kape. C3 alkil kapa kovalentno je povezana sa 3' ili 5' terminalnim nukleotidom. U nekim
2
primerima izvođenja, 3’ C3 terminalna kapa dalje obuhvata 3' fosfat. U nekim primerima izvođenja, 3’ C3 terminalna kapa dalje obuhvata 3'-terminalnu hidroksi grupu.
[0082] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci kao komponente farmaceutske formulacije odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 ili SERPINH1_88 i x=y=19, a (N')yuključuje L-DNK položaj 18; i (N')yopciono dalje uključuje Z' i z' nezavisno odabrane između invertnog bezbaznog ostatka i C3 alkil (C3; 1,3-propandiol mono(dihidrogen fosfat)) kape.
[0083] U nekim primerima izvođenja, (N')yuključuje 3’-terminalni fosfat. U nekim primerima izvođenja, (N')yuključuje 3’-terminalni hidroksil.
[0084] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci kao komponente farmaceutske formulacije odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 ili SERPINH1_88 i x=y=19, a (N)xuključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ili na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 i SERPINH1_88 i x=y=19, a (N)xuključuje 2’OMe modifikovane pirimidine. U nekim primerima izvođenja, svi pirimidini u (N)xuključuju 2’OMe modifikaciju.
[0085] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPIN51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<2>je riboadenozin ostatak.
[0086] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a , SERPINH1_51, SERPIN51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18, i N<2>-(N')yuključuje pet uzastopnih nukleotida na 3’-kraju vezani putem četiri 2’-5’ veze, specifično vezama između nukleotidnih položaja 15-16, 16-17, 17-18 i 18-19. U nekim primerima izvođenja te veze uključuju fosfodiestarske veze.
[0087] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<2>-(N')yuključuje pet uzastopnih nukleotida na 3’-kraju vezani putem četiri 2’-5’ veze i opciono dalje uključuje Z' i z' nezavisno odabrane između invertnog bezbaznog ostatka i C3 alkil [C3; 1,3-propandiol mono(dihidrogen fosfat)] kape.
2
[0088] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<2>-(N')yuključuje L-DNK položaj 18; i (N')yopciono dalje uključuje Z' i z' nezavisno odabrane između invertnog bezbaznog ostatka i C3 alkil [C3; 1,3-propandiol mono(dihidrogen fosfat)] kape.
[0089] U nekim primerima izvođenja, N<2>-(N')yobuhvata 3'-terminalni fosfat. U nekim primerima izvođenja, N<2>-(N')yobuhvata 3'-terminalni hidroksil.
[0090] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci kao komponente farmaceutske formulacije odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1 _45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<1>-(N)xuključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ili na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, ili na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, ili na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<1>-(N)xuključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 11, 13, 15, 17 i 19. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1-45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<1>-(N)xuključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ili na položajima 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<1>-(N)xuključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima položaji 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19.
[0091] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci kao komponente farmaceutske formulacije odabrani su između parova sekvenci navedenih u SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 ili SERPINH1_86 i x=y=18 i N<1>-(N)<x>uključuje 2’OMe modifikovane pirimidine. U nekim primerima izvođenja, svi pirimidini u (N)xuključuju 2’OMe modifikaciju. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni lanac dalje uključuje L-DNK ili 2'-5' nukleotid na položaju 5, 6 ili 7. U drugim primerima izvođenja, antismisaoni lanac dalje uključuje ribonukleotid kji generiše 2'-5' internukleotidnu vezu između ribonukleotida na položajima 5-6 ili 6-7.
2
[0092] U dodatnim primerima izvođenja, N<1>-(N)xdalje uključuje Z u kojoj Z uključuje ne-nukleotidni prepust. U nekim primerima izvođenja taj ne-nukleotidni prepust je C3 -C3 [1,3-propandiol mono(dihidrogen fosfat)]2.
[0093] U nekim primerima izvođenja, Strukture A2, (N)yuključuje najmanje jedan L-DNK ostatak. U nekim primerima izvođenja x=y=18, a (N')ysastoji se od nemodifikovanih ribonukleotida na položajima 1-16 i 18 i jednog L-DNK na 3’ pretposlednjem položaju (položaj 17). U drugim primerima izvođenja, x=y=18, a (N')ysastoji se od nemodifikovanih ribonukleotida na položaju 1-15 i 18 i dva uzastopna L-DNK na 3’ pretposlednjem položaju (položaji 16 i 17). U raznim primerima izvođenja, nekonvencionalan ostatak je nukleotid povezan sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom fosfatnom vezom. Prema raznim primerima izvođenja, (N')yuključuje 2, 3, 4, 5, ili 6 uzastopnih ribonukleotida na 3’-kraju povezani 2’-5’ internukleotidnim vezama. U jednom primeru izvođenja, četiri uzastopna nukleotida na 3’-kraju od (N')yvezani su putem tri 2'-5' fosfodiestarske veze, u kojoj jedan ili više 2’-5’ nukleotida koji obrazuju 2'-5' fosfodiestarske veze dalje uključuju 3'-O-metil (3'OMe) šećernu modifikaciju. Poželjno, 3’-terminalni nukleotid od (N')yuključuje 2’OMe modifikaciju. U određenim primerima izvođenja, x=y=18 i u (N')y dva ili više uzastopnih nukleotida na položajima 14, 15, 16, 17, i 18 uključuju nukleotid povezan sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom vezom . U raznim primerima izvođenja, u kojima nukleotid obrazuje 2’-5’ internukleotidnu vezu uključuje 3’ nukleotid dezoksiriboze ili 3’ metoksi nukleotid. U nekim primerima izvođenja, x=y=18, a (N')yuključuje nukleotide spojene sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom vezom između položaja 15-16, 16-17 i 17-18 ili između položaja 16-17 i 17-18. U nekim primerima izvođenja, x=y=18, a (N')yuključuje nukleotide spojene sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom vezom između položaja 14-15, 15-16, 16-17, i 17-18 ili između položaja 15-16, 16-17, i 17-18 ili između položaja 16-17 i 17-18 ili između položaja 17-18 ili između položaja 15-16 i 17-18. U drugim primerima izvođenja, pirimidin ribonukleotidi (rU, rC) u
(N')ysupstituisani su nukleotidima spojenim sa susednim nukleotidom 2’-5’ internukleotidnom vezom .
[0094] U nekim primerima izvođenja, antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između oligonukleotidnih parova navedeni u Tabeli 5 i identifikovani ovde kao SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 i 130), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168), i SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 i 172).
[0095] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul nukleinske kiseline kao komponentu farmaceutske formulacije uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:127 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:60; identifikovani ovde kao SERPINH1_2. U nekim primerima izvođenja dvolančani molekul nukleinske kiseline ima strukturu
2
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida; u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y.
[0096] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje jedan ili više 2’OMe modifikovanih pirimidina i ili purina, 2’-5’-ribonukleotid na položaju 5, 6, 7 ili 8, i 3’-terminalni nukleotid ili ne-nukleotidni prepust. U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 4 ili 5 uzastopnih 2'-5'-nukleotida na 3'-terminalnom ili pretposlednjem položaju, i nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U drugim primerima izvođenja, smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje jedan ili više 2'OMe pirimidina, i nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0097] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17 i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) odabran je između smisaonog lanca koji uključuje
● 2'-5'-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18 i 19; C3OH 3'-terminalni ne-nukleotidni prepust; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili ● 2'-5'-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18 i 19; 3'-terminalni fosfat; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 5, 7, 13, i 16; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
2
● 2'-5'-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-Pi ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0098] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C33'-terminalni prepust; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0099] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH 3'-terminalni prepust; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; 3'-terminalni fosfat; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0100] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7 i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 5, 7, 13, i 16; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0101] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7 i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0102] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-Pi ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0103] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19; i C3-C33'-terminalni prepust; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 9, 13, 16 i 18; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0104] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:60) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; 3’-terminalni fosfat; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:127) uključuje antismisaoni lanac odabran između jednog od
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 18; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0105] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline kao komponenta farmaceutske formulacije koji uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:130 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:63; identifikovani ovde kao SERPINH1_6. U nekim primerima izvođenja dupleks obuhvata strukturu
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida; u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y.
[0106] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje jedan ili više 2’OMe modifikovanih pirimidina; 3’-terminalni nukleotid ili ne-nukleotidni prepust; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja, antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) uključuje jedan ili više 2'OMe modifikovanih
1
pirimidina; nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0107] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 14 i 18; C3OH ili C3Pi ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) odabran je od antismisaonog lanca koji uključuje
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; dU na položaju 1; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0108] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0109] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen molekul oligonukleotidnog dupleksa u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18 i opciono na položaju 2; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0110] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen molekul oligonukleotidnog dupleksa u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) odabran je od antismisaonog lanca koji uključuje
2
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
● 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0111] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0112] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:63) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:130) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH 3'-terminalni prepust.
[0113] U nekim primerima izvođenja, dupleks kao komponenta farmaceutske formulacije uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:165 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:98; identifikovan ovde kao SERPINH1_45a. U nekim primerima izvođenja, dupleks obuhvata strukturu
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida;
u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y
[0114] U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac (SEQ ID NO:98) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, i 18 ili 15, 16, 17, 18, i 19; nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja antismisaoni lanac (SEQ ID NO:165) uključuje 2'OMe modifikovan pirimidin i ili purine; 2’-5’ nukleotid na položaju 5, 6, 7, ili 8 ; i nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0115] U nekim primerima izvođenja, smisaoni lanac (SEQ ID NO:98) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ili C3-OH 3'-terminalni ne-nukleotidni ostatak; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:165) uključuje antismisaoni lanac odabran između jednog od
● 2'OMe modifikovanih ribonukleotida na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotida na položaju 7; i C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH 3'-terminalnog prepusta; ili
● 2'OMe modifikovanih ribonukleotida na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 i 19; i C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH 3'-terminalnog prepusta;
● 2'OMe modifikovanih ribonukleotida na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotida na položaju 7; i C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH 3'-terminalnog prepusta; ili
● 2'OMe modifikovanih ribonukleotida na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19; i C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH 3'-terminalnog prepusta.
[0116] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:98) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-OH 3'-terminalni ostatak; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:165) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-COH 3'-terminalni prepust.
[0117] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul nukleinske kiseline kao komponenta farmaceutske formulacije uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:168 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:101; identifikovan ovde kao SERPINH1_51. U nekim primerima izvođenja, dupleks obuhvata strukturu
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida;
u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
4
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y.
[0118] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:101) uključuje 2’OMe modifikovane pirimidine, opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9 ili 10; nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i opciono kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja antismisaoni lanac (SEQ ID NO:168) uključuje 2'OMe modifikovan pirimidin i ili purine; 2’-5’ nukleotid na položaju 5, 6, 7, ili 8 ; i nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0119] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:101) uključuje 2’OMe modifikovane pirimidine na položajima 4, 11, 13, i 17; opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9 ili 10; C3Pi ili C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:168) odabran je od antismisaonog lanca koji uključuje
a) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 8, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6 ili 7; i C3Pi-C3OH prepust kovalentno vezan na 3’-kraju; ili
b) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6 ili 7; i C3Pi-C3OH prepust kovalentno vezan na 3’-kraju; ili
c) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH prepust kovalentno vezan na 3’-kraju; ili
d) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 8, 12, 13, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0120] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:101) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3-OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:168) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 8, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0121] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:101) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; opciono 2’-5’ribonukleotid na položaju 9; C3-OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:168) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0122] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:101) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:168) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0123] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:101) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:168) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 8, 12, 13, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0124] U nekim primerima izvođenja, dvolančani molekul nukleinske kiseline je komponenta farmaceutske formulacije koja uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:168 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:101; identifikovan ovde kao SERPINH1_51a. U nekim primerima izvođenja dupleks obuhvata strukturu
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida;
u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y.
[0125] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:105) uključuje 2’OMe modifikovane pirimidine; opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9 ili 10; nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i opciono kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja antismisaoni lanac (SEQ ID NO:172) uključuje 2'OMe modifikovan pirimidin i ili purine; 2’-5’ nukleotid na položaju 5, 6, 7, ili 8 ; i nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0126] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:105) uključuje 2’OMe modifikovane pirimidine na položajima 4, 11, 13, i 17; opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9 ili 10; C3Pi ili C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:172) odabran je od antismisaonog lanca koji uključuje
a) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 8, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6 ili 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; ili
b) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6 ili 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; ili
c) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; ili
d) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 8, 12, 13, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0127] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:105) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3-OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:172) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 8 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0128] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:105) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; opciono 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3-OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:172) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0129] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:105) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3-OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:172) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0130] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:105) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:172) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 8, 12, 13, i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0131] U nekim primerima izvođenja antismisaoni i smisaoni lanci odabrani su između oligonukleotidnih parova navedeni u Tabeli 5 i identifikovani ovde kao SERPINH1_4 (SEQ ID NO: 195 i 220) i SERPINH1_12 (SEQ ID NO: 196 i 221).
[0132] U nekim primerima izvođenja dvolančani molekul nukleinske kiseline je komponenta farmaceutske formulacije uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:220 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:195; identifikovan ovde kao SERPINH1_4. U nekim primerima izvođenja dvolančani molekul nukleinske kiseline ima strukturu
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida;
u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y.
[0133] U nekim primerima izvođenja obezbeđen je dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 15, 17 i 19, 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7, i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) odabran je između smisaonog lanca koji uključuje
a) 2'-5'-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18 i 19, C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
b) 2'-5'-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18 i 19, 3'-terminalni fosfat; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
c) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 5, 7, 13, i 16; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 18; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
d) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; ili
e) 2'-5'-ribonukleotidi na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0134] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3 ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0135] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; 3’-terminalni fosfat; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0136] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 5, 7, 13, i 16; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 18; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0137] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0138] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2-5'-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0139] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; a smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 9, 13, 16 i 18; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0140] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:195) uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; 3’-terminalni fosfat i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje antismisaoni lanac odabran između jednog od
a) 2'OMe modifikovanih ribonukleotida na položajima 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; i C3Pi-C3OH ostataka kovalentno vezanog za 3'-kraj; ili
b) 2'OMe modifikovanih ribonukleotida na položajima 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 18; i C3Pi-C3OH ostatka kovalentno vezanog za 3'-kraj.
[0141] U nekim primerima izvođenja ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline kao komponenta farmaceutske formulacije koji uključuje antismisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:130 i smisaoni lanac naveden u SEQ ID NO:63; identifikovan ovde kao SERPINH1_12. U nekim primerima izvođenja dupleks obuhvata strukturu
4
u kojoj svako "|" predstavlja bazno uparivanje između ribonukleotida; u kojoj svako od A, C, G, U nezavisno je nemodifikovan ili modifikovan ribonukleotid, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno je 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihova kombinacija kovalentno vezana na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; i
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od N<2>-(N')y.
[0142] U nekim primerima izvođenja obezbeđen je dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje jedan ili više 2’OMe modifikovanih pirimidina; 3’-terminalni nukleotid ili ne-nukleotidni prepust; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja antismisaoni lanac (SEQ ID NO:221) uključuje jedan ili više 2’OMe modifikovanih pirimidina; nukleotid ili ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0143] U nekim primerima izvođenja obezbeđen je dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 14 i 18; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:221) odabran je od antismisaonog lanca koji uključuje
a) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
b) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 7, 9, 12, 13 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0144] U nekim primerima izvođenja obezbeđen je dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:221) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0145] U nekim primerima izvođenja obezbeđen je molekul oligonukleotidnog dupleksa u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18 i opciono na položaju 2; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:221) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 7, 9, 12, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0146] U nekim primerima izvođenja obezbeđen je molekul oligonukleotidnog dupleksa u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:221) odabran je od antismisaonog lanca koji uključuje a) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj; ili
b) 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 7, 9, 12, 13 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0147] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0148] Ovde je obezbeđen dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac (SEQ ID NO:196) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 14 i 18; C3-OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac (SEQ ID NO:220) uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan za 3'-kraj.
[0149] In dalje embodiments Struktures A1 i A2, (N')y uključuje 1-8 modifikovane ribonukleotide u kojoj modifikovani ribonukleotid je DNA nukleotid. U određenim primerima izvođenja (N')yuključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili čak i do 8 DNK ostataka.
[0150] U nekim primerima izvođenja, ili Z ili Z' je prisutno i nezavisno uključuje dva ne-nukleotidna ostatka.
[0151] U dodatnim primerima izvođenja, Z i Z' su prisutni i svako nezavisno uključuje dva nenukleotidna ostatka.
[0152] U nekim primerima izvođenja, svako od Z i Z' uključuje bezbazni ostatak, na primer dezoksiribobezbazni ostatak (ovde označen kao "dAb") ili ribo-bezbazni ostatak (ovde označen kao "rAb"). U nekim primerima izvođenja svako od Z i/ili Z' uključuje dva kovalentno povezana bezbazna ostatka i on je na primer dAb-dAb ili rAb-rAb ili dAb-rAb ili rAb-dAb, u kojem svaki ostatak je kovalentno vezan za susedni ostatak, poželjno putem fosfo-bazirane veze. U nekim primerima izvođenja fosfo-bazirana veza uključuje fosforotioatnu, fosfonoacetatnu ili fosfodiestarsku vezu. U poželjnim primerima izvođenja fosfo-bazirana veza uključuje fosfodiestarsku vezu.
[0153] U nekim primerima izvođenja, svako od Z i/ili Z' nezavisno uključuje alkil ostatak, opciono propan ((CH2)3) ostatak ("C3") ili njegov derivat koji uključuje propandiol (C3OH) i fosfo derivat propandiola ("C3Pi"). U nekim primerima izvođenja svako od Z i/ili Z' uključuje dva alkil ostatka kovalentno povezana za 3'-kraj antismisaonog lanca ili smisaonog lanca putem fosfodiestarske ili fosforotioatne veze i kovalentno povezani jedan sa drugim putem fosfodiestarske ili fosforotioatne veze i u nekim primerima je C3Pi-C3Pi ili C3Pi-C3OH.3'-kraj antismisaonog lanca i/ili 3'-kraj smisaonog lanca kovalentno je vezan za C3 ostatak putem fosfo-bazirane veze, a C3 ostatak je kovalentno konjugovan C3OH ostatak putem fosfo-bazirane veze. U nekim primerima izvođenja fosfo-bazirane veze uključuju fosforotioatnu, fosfonoacetatnu ili fosfodiestarsku vezu. U poželjnim primerima izvođenja fosfobazirana veza uključuje fosfodiestarsku vezu.
[0154] U raznim primerima izvođenja Strukture A1 ili Struktura A2, Z i Z' su odsutni. U drugim primerima izvođenja Z ili Z' je prisutno. U nekim primerima izvođenja, svako od Z i/ili Z' nezavisno uključuje C2, C3, C4, C5 ili C6 alkil ostatak, opciono C3 ostatak ili njegov derivat koji uključuje propanol (C3OH/C3OH), propandiol, i fosfodiestarski derivat propandiola (C3Pi). U poželjnim primerima izvođenja, svako od Z i/ili Z' uključuje dva ugljovodonična ostatka i u nekim primerima je C3Pi-C3OH ili C3Pi-C3Pi. Svako C3 je kovalentno konjugovan sa susednim C3 putem kovalentne veze, poželjno fosfobazirane veze. U nekim primerima izvođenja, fosfo-bazirana veza je fosforotioatna, fosfonoacetatna ili fosfodiestarska veza.
[0155] U specifičnim primerima izvođenja, x=y=19, Z obuhvata najmanje jedan C3 alkilni prepust. U nekim primerima izvođenja C3-C3 prepust je kovalentno vezan za 3'-kraj od (N)xili (N')yputem neke kovalentne veze, poželjno fosfodiestarske veze. U nekim primerima izvođenja, veza između prvog C3 i drugog C3 je fosfodiestarska veza. U nekim primerima izvođenja, 3' ne-nukleotidni prepust je C3Pi-C3Pi.
4
U nekim primerima izvođenja 3’ ne-nukleotidni prepust je C3Pi-C3Pi. U nekim primerima izvođenja 3’ ne-nukleotidni prepust je C3Pi-C3OH.
[0156] U raznim primerima izvođenja, alkil ostatak obuhvata alkil derivat koji uključuje C3 alkil, C4 alkil, C5 alki ili C6 alkil ostatak koja obuhvata terminalnu hidroksil, terminalnu amino, ili terminalnu fosfatnu grupu. U nekim primerima izvođenja, alkil ostatak je ostatak C3 alkila ili C3 alkil derivata. U nekim primerima izvođenja, C3 alkil ostatak obuhvata propanol, propilfosfat, propilfosforotioat ili njihovu kombinaciju. C3 alkil ostatak kovalentno je povezan za 3'-kraj od (N')yi/ili 3'-kraj od (N)xputem fosfodiestarske veze. U nekim primerima izvođenja, alkil ostatak obuhvata propanol, propil fosfat ili propil fosforotioat. U nekim primerima izvođenja, svako od Z i Z’ nezavisno je odabrano između propanola, propil fosfata propil fosforotioata, njihovih kombinacija ili više njih određenije 2 ili 3 kovalentno povezana propanola, propil fosfata, propil fosforotioata ili njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, svako od Z i Z’ nezavisno je odabrano između propil fosfata, propil fosforotioata, propil fosfo-propanola; propil fosfo-propil fosforotioata; propilfosfo-propil fosfata; (propil fosfata)3, (propil fosfat)2-propanola, (propil fosfat)2-propil fosforotioata. Bilo koji propan ili propanol konjugovani ostatak može biti uključen u Z ili Z'.
[0157] Strukture primernih 3'-terminalnih ne-nukleotidnih ostataka su kako sledi:
[0158] U nekim primerima izvođenja, svako od Z i Z’ nezavisno je odabrano između propanola, propil fosfata, propil fosforotioata, njihovih kombinacija ili više njih.
[0159] U nekim primerima izvođenja, svako od Z i Z’ nezavisno je odabrano između propil fosfata, propil fosforotioata, propil fosfo-propanola; propil fosfo-propil fosforotioata; propilfosfo-propil fosfata; (propil fosfata)3, (propil fosfat)2-propanola, (propil fosfat)2-propil fosforotioata. Bilo koji propan ili propanol konjugovan ostatak može biti uključen u Z ili Z'.
[0160] U dodatnim primerima izvođenja, svako od Z i/ili Z' uključuje kombinaciju bezbaznog ostatka i nemodifikovanog deoksiribonukleotida ili ribonukleotida ili kombinaciju ugljovodoničnog ostatka i nemodifikovanog dezoksiribonukleotida ili ribonukleotida ili kombinaciju bezbaznog ostatka (dezoksiribo ili ribo) i ugljovodoničnog ostatka. U takvim primerima izvođenja, svako od Z i/ili Z' uključuje C3-rAb ili C3-dAb u kojem je svaki ostatak kovalentno vezan sa susednim ostatkom putem fosfo-bazirane veze, poželjno fosfodiestarske, fosforotioatne ili fosfonoacetatne veze.
[0161] U određenim primerima izvođenja, molekuli nukleinske kiseline kavi su ovde opisani uključuju smisaonu oligonukleotidnu sekvencu odabranu između bilo kog od oligonukleotida prikazan ispod u Tabelama 4 i 5 (SEQ ID NO:60-126 i 194-218).
[0162] U određenim poželjnim primerima izvođenja, obezbeđena jedinjenja uključuju Jedinjenje_1, Jedinjenje_2, Jedinjenje_3, Jedinjenje_4, Jedinjenje_5, Jedinjenje_6, Jedinjenje_7, Jedinjenje_8, i Jedinjenje_9, opisana ispod.
[0163] U nekim primerima izvođenja, (kao što je, na primer, Jedinjenje_1, Jedinjenje_5, i Jedinjenje_6) obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima je antismisaoni lanac SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima je antismisaoni lanac SEQ ID NO:127 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 1, 5, 6, ili 7; i nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60 i uključuje najmanje
4
jedan 2'-5'-ribonukleotid ili 2'OMe modifikovan ribonukleotid; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem je antismisaoni lanac SEQ ID NO:127; i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60 i uključuje pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0164] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_1 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem je antismisaoni lanac SEQ ID NO:127 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60 i uključuje pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i koje dalje uključuje 2’OMe modifikovan ribonukleotid na položaju 1 antismisaonog lanca.
[0165] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_6 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem je antismisaoni lanac SEQ ID NO:127 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60 i uključuje pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i koje dalje uključuje 2’-5’-ribonukleotid na položaju 1 antismisaonog lanca.
[0166] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_5 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem je antismisaoni lanac SEQ ID NO:127 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; a smisaoni lanac je SEQ ID NO:60 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
[0167] U nekim primerima izvođenja, (kao što je, na primer, Jedinjenje_2, i Jedinjenje_7, opisana ispod) obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:63, a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:130. U nekim primerima izvođenja obezbeđeni su 19-mer dvolančani
4
molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:63 i uključuje 2'OMe modifikovane pirimidin ribonukleotide; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:130 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. U nekim primerima izvođenja obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:63 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:130 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0168] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_2 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac je SEQ ID NO:63 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 14 i 18; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:130 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 12, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0169] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_7 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac je SEQ ID NO:63 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 14 i 18; C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:130 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0170] U nekim primerima izvođenja, (kao što je, na primer, Jedinjenje_3, opisano ispod) obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:98, a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:165. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:98 i uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima na 3’-kraju; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:165 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_3 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac je SEQ ID NO:98 i uključuje 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-OH 3' ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:165 i
4
uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH kovalentno vezana na 3’-kraju.
[0171] U nekim primerima izvođenja, (kao što je, na primer, Jedinjenje_4, Jedinjenje_8 i Jedinjenje_9, opisana ispod) obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168. U nekim primerima izvođenja obezbeđeni su 19-mer dvolančani molekuli nukleinske kiseline u kojima smisaoni lanac je SEQ ID NO:101 i uključuje 2'OMe modifikovane pirimidin ribonukleotide; opcioni 2'-5'-ribonukleotid u jednom od položaja 9 ili 10; nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6, ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0172] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_4 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac je SEQ ID NO:101 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; C3Pi-C3OH prepust kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0173] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_8 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac je SEQ ID NO:101 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH prepust kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0174] U jednom primeru izvođenja, obezbeđeno je Jedinjenje_9 koje je 19-mer dvolančani molekul nukleinske kiseline u kojem smisaoni lanac je SEQ ID NO:101 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac je SEQ ID NO:168 i uključuje 2'OMe modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
[0175] U još jednom aspektu, obezbeđeni su postupci za redukovanje ekspresije hsp47 u ćeliji uvođenjem u ćeliju molekula nukleinske kiseline kakav je ovde obezbeđen u količini dovoljnoj da
4
redukuje ekspresiju hsp47. U jednom primeru izvođenja, ćelija je hepatocelularna stelatna ćelija. U još jednom primeru izvođenja, ćelija je stelatna ćelija u bubrežnom ili plućnom tkivu. U određenom primeru izvođenja, postupak se izvodi in vitro. U još jednom primeru izvođenja, postupak se izvodi in vivo.
[0176] U još jednom aspektu, obezbeđeni su postupci za lečenje pjedinca koji boluje od bolesti povezane sa hsp47. Postupci uključuju davanje pojedincu molekula nukleinske kiseline kakav je ovde obezbeđen u količini dovoljnoj da redukuje ekspresiju hsp47. U određenim primerima izvođenja, ta bolest povezana sa hsp47 je bolest odabrana iz grupe koju čine fibroza jetre, ciroza, plućna fibroza koja uključuju fibrozu pluća (koja uključuje ILF), bilo koje stanje koje izaziva fibrozu bubrega (npr., CKD koji uključuju ESRD), peritonealna fibroza, hronično hepatično oštećenje, fibrilogeneza; fibrozne bolesti u drugim organima; abnormalno stvaranje ožiljaka (keloidi) povezano sa svim mogućim vrstama kožnih povreda, slučajne i jatrogene (operacije), skleroderma, kardiofibroza, neuspela operacija filtriranja glaukoma, i crevne priraslice. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje može biti korisno u tretiranju organ-specifičnih indikacija, na primer, indikacija koje uključuju one prikazane u Tabeli 1 ispod, koja navodi organe i respektivne indikacije:
TABELA 1
4
[0177] Još jedan primer izvođenja ovog pronalaska je postupak za lečenje poremećaja povezanog sa stelatnim ćelijama, postupak koji obuhvata davanje efektivne količine farmaceutske kombinacije opisane ispod subjektu kome je to potrebno. Taj poremećaj uključuje hepatitis, hepatičnu fibrozu, hepatičnu cirozu, kancer jetre, pankreatitis, fibrozu pankreasa, kancer pankreasa, formiranje ožiljaka na glasnim žicama, mukozalnu fibrozu glasnih žica, i fibrozu grkljana. U nekim primerima izvođenja poželjne indikacije uključuju, cirozu jetre usled hepatitisa C nakon transplantacije jetre; cirozu jetre usled nealkoholnog steatohepatitisa (NASH); idiopatsku plućnu fibrozu; pneumonitis izazvan zračenjem koji
1
vodi ka plućnoj fibrozi; dijabetičnu nefropatiju; peritonealnu sklerozu povezanu sa kontinuiranom ambulantnom peritonealnom dijalizom (CAPD) i očni cikatricijski pemfigoid.
[0178] Indikacije fibrotične jetre uključuju alkoholnu cirozu, cirozu hepatitisa B, cirozu hepatitisa C, cirozu hepatitisa C (Hep C) nakon ortotopske transplantacije jetre (OLTX), nealkoholni steatohepatitis/nealkoholnu bolest masne jetre (NASH/NAFLD), primarnu bilijarnu cirozu (PBC), primarni sklerozni holangitis (PSC), bilijarnu atreziju, alfa-1 antitripsin deficijenciju (A1AD), bolesti taloženja bakra (Wilson-ova bolest), fruktosemiju, galaktosemija, bolesti taloženja glikogena (naročito vrste III, IV, VI, IX, i X), sindrome predoziranja železom (hemohromatoza), lipidne abnormalitete (npr., Gaucher-ova bolest), peroksizomalne poremećaje (npr., Zellweger-ov sindrom), tirosinemiju, kongenitalnu hepatičnu fibrozu, bakterijske infekcije (npr., bruceloza), parazitske (npr., ehinokokoza), Budd-Chiari-jev sindrom (hepatična veno-okluzivna bolest).
[0179] Plućne indikacije uključuju Idiopatsku plućnu fibrozu, silikozu, pneumokoniozu, broncoplućnu displaziju kod novorođenčeta praćeno neonatalnim respiratorim distrestnim sindromom, bleomicin/hemopulmonarna povreda, brochiolitis obliterans (BOS) nakon transplantacije pluća, hronični opstruktivni plućni poremećaj (COPD), cističnu fibrozu, i astmu.
[0180] Srčane indikacije uključuju kardiomiopatiju, Aterosklerozu (Bergers-ova bolest, itd), endomiokardijalnu fibrozu, atrijalnu fibrilaciju, formiranje ožiljaka nakon miokardijalnog infrakta (MI)
[0181] Ostale torakalne indikacije uključuju radijacijom indukovane reakcije kapsulastog tkiva oko teksturisanih implanta dojki, i oralnu podmukozalnu fibrozu.
[0182] Bubrežne indikacije uključuju autozomalnu dominantnu policističnu bolest bubrega (ADPKD), Dijabetičnu nefropatiju (dijabetična glomeruloskleroza), fokalnu segmentalnu glomerulosklerozu (FSGS) (kolaps protiv drugih histoloških varijanti), IgA Nefropatiju (Berger Bolest), Lupus Nefritis, Wegner-ova, Sklerodermu, Goodpasture-ov Sindrom, tubulointersticijalnu fibrozu: indukovana supstancom (zaštitnom) pencilina, cefalosporina, analgezičnu nefropatiju, membrana-proliferativni glomerulonefritis (MPGN), Henoch-Schonlein purpura, Kongenitale nefropatije: Medularnu cističnu bolest, Nail-Patella Sindrom i Alport Sindrom.
[0183] Indikacije koštane srži uključuju limfangioliomiositozu (LAM), hroničnu graft vs. host bolest, Policitemija vera, suštinsku trombocitemiju, i mijelofibrozu.
[0184] Očne indikacije uključuju retinopatije premenosti (RoP), očni cikatricijski pemfigoid, fibrozu
2
lakrimalne žlezde, operaciju odvajanja mrežnjače, prozirnost rožnjače, herpetični keratitis, pterigijum, Glaukom, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem (AMD/ARMD), fibrozu mrežnjače povezana sa retinopatijama dijabetes melitusa (DM)
[0185] Ginakološke indikacije uključuju endometriozu pored hormonske terapije za prevenciju formiranja ožiljaka, post-STD fibrozu/salfingitis,
[0186] Sistemske indikacije uključuju Dupuytren-ovu bolest, Palmarnu fibromatozu, Peyronie-ovu bolest, Ledderhose-ovu bolest, keloide, multifokalnu fibrosklerozu, nefrogenu sistemsku fibrozu i mijelofibrozu (anemija).
[0187] Sa povredama povazane fibrozne bolesti uključuju opekotinom indukovano (uključujući i hemijski) formiranje ožiljaka na koži i mekom tkivu i kontrakciju, zračenjem indukovano formiranje ožiljaka na koži i organima, post kancer terapeutsko radijaciobez tretiranja, keloid (koža).
[0188] Hirurške indikacije uključuju peritonealnu fibrozu nakon peritonealnog dijaliznog katetera, kornealnog implanta, kohlearnog implanta, drugih implanta, silikonskih implanata grudi, hroničnog sinuzitisa; priraslice, pseudointimalnu hiperplaziju dijaliznih graftova.
[0189] Druge indikacije uključuju hronični pankreatitis.
[0190] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za lečenje subjekta koji boluje od fibroze jetre koje obuhvata davanje subjektu efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan, čime se leči fibrozu jetre. U nekim primerima izvođenja subjekat je onaj koji boluje od ciroze jetre zbog hepatitisa. U nekim primerima izvođenja subjekat je onaj koji boluje od ciroze jetre zbog NASH.
[0191] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je upotreba molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan za proizvodnju leka za lečenje fibroze jetre. U nekim primerima izvođenja, fibroza jetre je zbog hepatitisa. U nekim primerima izvođenja, fibroza jetre je zbog NASH.
[0192] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak ze remodelovanje tkiva ožiljka koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan, čime se ostvaruje remodelovanje tkiva ožiljka. U nekim primerima izvođenja, tkivo ožiljka je u jetri. U nekim primerima izvođenja, subjekat je onaj koji boluje od ciroze jetre zbog hepatitisa. U nekim primerima izvođenja, subjekat je onaj koji boluje od ciroze jetre zbog NASH.
[0193] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za modulisanje fibrozne regresije koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan, čime se ostvaruje regresija fibroze.
[0194] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za redukovanje tkiva ožiljka kod subjekta koji obuhvata fazu davanja subjektu efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan radi smanjivanja tkiva ožiljka. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za redukovanje tkiva ožiljka kod subjekta koji obuhvata fazu topikalnog nanošenja na tkivo ožiljka efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan radi smanjivanja tkiva ožiljka.
[0195] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za poboljšavanje izgleda tkiva ožiljka koji obuhvata fazu topikalnog nanošenja na tkivo ožiljka efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan radi poboljšanja izgleda tkiva ožiljka.
[0196] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za lečenje subjekta koji boluje od fibroze pluća koja obuhvata davanje subjektu efektivne količine molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan, čime se leči fibrozu pluća. U nekim primerima izvođenja, subjekat je onaj koji boluje od intersticijalne fibroze pluća (ILF). U nekim primerima izvođenja, subjekat je onaj koji boluje od Pneumonitisa izazvanog zračenjem koje vodi ka plućnoj fibrozi. U nekim primerima izvođenja, subjekat je onaj koji boluje od fibroze pluća indukovane nekom supstancom.
[0197] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je upotreba molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan za proizvodnju leka za lečenje fibroze pluća. U nekim primerima izvođenja, fibroza pluća je ILF. U nekim primerima izvođenja, fibroza pluća je fibroza pluća indukovana nekom supstancom ili zračenjem.
[0198] U jednom aspektu, obezbeđene su farmaceutske kombinacije koje uključuju molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kakav je ovde opisan u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska formulacija uključuje, ili obuhvata, sistem dostave pogodan za dostavu molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) pojedincu kao što je pacijent; na primer sistemi dostave opisani su detaljnije u nastavku.
[0199] U povezanom aspektu, obezbeđene su kombinacije ili kompleti koji uključuju molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) zapakovan za upotrebu od strane pacijenta. Pakovanje može biti obeleženo ili uključuje etiketu ili ceduljicu koja ukazuje na sadržaj pakovanja i pruža određene informacije u vezi sa tim kako bi molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) trebao ili sme da koristi od strane pacijenta,
4
na primer etiketa može da uključu informacije o doziranju i/ili indikacijama za upotrebu. U određenim primerima izvođenja, sadržaji etikete nose obaveštenje u obliku propisanom od strane državne agencije, na primer United States Food and Drug administration (FDA). U određenim primerima izvođenja, ta etiketa može da ukaže da je molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) pogodan za upotrebu u lečenju pacijenta koji boluje od bolesti povezane sa hsp47; na primer, etiketa može da ukaže da je molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) pogodan za upotrebu u lečenju fibroids; ili na primer etiketa može da ukaže da je molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) pogodan za upotrebu u lečenju bolesti odabrane iz grupe koju čine fibroza, fibroza jetre, ciroza, plućna fibroza, fibroza bubrega, peritonealna fibroza, hronično hepatično oštećenje, i fibrilogeneza.
[0200] Kako se ovde koristi, izrazi "protein 47 toplotnog šoka" ili "hsp47" ili "HSP47" koriste se naizmenično i odnose se na bilo koji protein 47 toplotnog šoka, peptid, ili polipeptid koji ima bilo koju hsp47 protein aktivnost. Protein 47 toplotnog šoka je inhibitor serinske proteinaze (serpin) koji je takođe poznat, na primer, kao inhibitor serpin peptidaze, klada H, član 1 (SERPINH1), SERPINH2, kolagen vezujući protein 1 (CBP1), CBP2, gp46; arsenikom-transaktiviran protein 3 (AsTP3); HSP47; proliferacijaindukujući gen 14 (PIG14); PPROM; antigen reumatoidnog artritisa A-47 (RA-A47); koligin-1; i koligin-2. U određenim poželjnim primerima izvođenja, "hsp47" odnosi se na humani hsp47. Protein 47 toplotnog šoka (ili određenije humani hsp47) može imati aminokiselinska sekvenca koja je ista, ili suštinski ista, kao SEQ ID NO.2.
[0201] Kako se ovde koristi izraz "nukleotidna sekvenca koja kodira hsp47" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira hsp47 protein, ili njegov deo. Izraz "nukleotidna sekvenca koja kodira hsp47" takođe se odnosi na to da uključuje hsp47 kodirajuće sekvence kao što su hsp47 izoforme, mutant hsp47 geni, splajs varijante hsp47 gena, i hsp47 genski polimorfizmi. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira hsp47 uključuje mRNK sekvence koja kodiraju hsp47, koje se takođe nazivaju "hsp47 mRNK." Primerna sekvenca humane hsp47 mRNK je SEQ ID. NO.1.
[0202] Kako se ovde koristi, izraz "molekul nukleinske kiseline" ili "nukleinska kiselina" koriste se naizmenično i odnose na oligonukleotid, nukleotid ili polinukleotid. Varijacije "molekula nukleinske kiseline" ovde su opisane detaljnije. Molekul nukleinske kiseline obuhvata i modifikovane molekule nukleinske kiseline i nemodifikovane molekule nukleinske kiseline kako je ovde opisano. Molekul nukleinske kiseline može da uključi dezoksiribonukleotide, ribonukleotide, modifikovane nukleotide ili nukleotidne analoge u bilo kojoj kombinaciji.
[0203] Kako se ovde koristi, izraz "nukleotid" odnosi se na hemijski ostatak koji ima šećer (ili njegov analog, ili modifikovan šećer), nukleotidnu bazu (ili njegov analog, ili modifikovana baza), i fosfatnu grupu (ili njen analog, ili modifikovana fosfatna grupa). Nukleotid obuhvata modifikovane nukleotide ili nemodifikovane nukleotide kako je ovde opisano. Kako se ovde koristi, nukleotidi mogu da uključe dezoksiribonukleotide (npr., nemodifikovane dezoksiribonukleotide), ribonukleotide
(npr., nemodifikovane ribonukleotide), i analoge modifikovanog nukleotida koji uključuju, između ostalog, LNK i UNK, peptidne nukleinske kiseline, L-nukleotide (koje se takođe nazivaju invertni nukleotidi), etilen-premošćenu nukleinsku kiselinu (ENA), arabinozid, PACE, nukleotide sa 6 ugljeničnih šećera, kao i analoge nukleotida (koji uključuju bezbazne nukleotide) koji se često smatraju nenukleotidima. U nekim primerima izvođenja, nukleotidi mogu biti modifikovani u šećeru, nukleotidnoj bazi i/ili u fosfatnoj grupi bilo kojom modifikacijom poznatoj u ovoj oblasti, kao što su ovde opisane modifikacije. "Polinukleotid" ili "oligonukleotid" kako se ovde koristi, odnosi se na lanac vezanih nukleotida; polinukleotidi i oligonukleotidi isto tako mogu imati modfikacije u nukleotidnom šećeru, nukleotidnoj bazi i fosfatnim kičmama što je dobro poznato u ovoj oblasti i/ili je ovde opisano.
[0204] Kako se ovde koristi, izraz "kratka ometajuća nukleinska kiselina", "siNK", ili "molekul kratke ometajuće nukleinske kiseline" odnosi se na bilo koji molekul nukleinske kiseline sposoban za modulisanje genske ekspresije ili virusne replikacije. Poželjno siNK inhibira ili nishodno reguliše gensku ekspresiju ili virusne replikacije. siNK uključuje bez ograničenja molekule nukleinske kiseline koji su sposobni da posreduju sekvenca specifičnu RNKi, na primer kratku ometajuću RNK (siRNK), dvolančanu RNK (dsRNK), mikro-RNK (miRNK), kratku u obliku ukosnice RNK (shRNK), kratki ometajući oligonukleotid, kratku ometajuću nukleinsku kiselinu, kratki ometajući modifikovani oligonukleotid, hemijski-modifikovan siRNK, post transkripcionu gensku utišavajuću RNK (ptgsRNK), i druge. Kako se ovde koristi, "kratka ometajuća nukleinska kiselina", "siNK", ili "molekul kratke ometajuće nukleinske kiseline" ima značenje koje je ovde detaljnije opisano.
[0205] Kako se ovde koristi, izraz "komplementaran" označava da nukleinska kiselina može da formira vodoničnu vezu(e) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline bilo uobičajenog Watson-Crick ili drugog neuobičajenog tipa. Kada se poziva na nukleinske molekule koji su ovde opisani, vezujuća slobodna energija za molekul nukleinske kiseline sa svojom komplementarnom sekvencom dovoljna je da omogući relevantnu funkciju nukleinskoj kiselini da nastavi, npr., RNKi aktivnost. Određivanje vezujućih slobodnih energija za molekule nukleinske kiseline dobro je poznato u ovoj oblasti (videti, npr., Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc.109:3783-3785). Procenat komplementarnosti ukazuje na procenat susednih ostataka u molekulu nukleinske kiseline koji može da obrazuje vodonične veze (npr.,Watson-Crick bazno uparivanje) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr., 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nukleotida od ukupno 10 nukleotida u prvom oligonukleotidu koji su bazno sparen sa drugom sekvencom nukleinske kiseline koja ima 10 nukleotida predstavlja 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, i 100% komplementarnosti respektivno). "Potpuno komplementaran" označava da su svi susedni ostaci sekvence nukleinske kiseline vezani ugljenikom sa istim brojem susednih ostataka u drugoj sekvenci nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, ovde opisan molekul nukleinske kiseline uključuje oko 15 do oko 35 ili više (npr., oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 ili više) nukleotida koji su komplementarni sa jednim ili više ciljanih molekula nukleinske kiseline ili njihovim delom.
[0206] Kako se ovde koristi, izraz "smisaoni region" odnosi se na nukleotidnu sekvencu siNK molekula komplementarna (delimično ili potpuno) sa antismisaonim regionom siNK molekula. Smisaoni lanac siNK molekula može da uključi sekvencu nukleinske kiseline koja poseduje homologiju sa ciljanom sekvencom nukleinske kiseline. Kako se ovde koristi, "smisaoni lanac" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji uključuje smisaoni region i takođe može da uključi dodatne nukleotide. Nukleotidni položaji smisaonog lanca ovde su numerisani 5'>3'.
[0207] Kako se ovde koristi, izraz "antismisaoni region" odnosi se na nukleotidnu sekvencu siNK molekula komplementarna (delimično ili potpuno) ciljanoj sekvenci nukleinske kiseline. Antismisaoni lanac siNK molekula može opciono da uključi sekvencu nukleinske kiseline komplementarnu smisaonom regionu siNK molekula. Kako se ovde koristi, "antismisaoni lanac" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji uključuje antismisaoni region i može takođe da uključi dodatne nukleotide. Nukleotidni položaji antismisaonog lanca ovde su numerisani 5'>3'.
[0208] Kako se ovde koristi, izraz "RNk" odnosi se na molekul koji uključuje najmanje jedan ribonukleotidni ostatak.
[0209] Kako se ovde koristi, izraz "region dupleksa" odnosi se na region u dva komplementarna ili suštinski komplementarna oligonukleotida koji formiraju bazne parove jedan sa drugim, bilo Watson-Crick baznim uparivanjem ili na neki drugi način koji omogućava dupleks između oligonukleotidnih lanaca koji su komplementarni ili suštinski komplementarni. Na primer, oligonukleotidni lanac sa 21 nukleotidnom jedinicom može postati bazni par sa drugim oligonukleotidom od 21 nukleotidne jedinice, a samo 19 baza na svakom lancu je komplementarno ili suštinski komplementarno, tako da se "region dupleksa" sastoji od 19 baznih parova. Preostali bazni parovi mogu, na primer, da postoje kao 5' i 3' prepusti. Dalje, unutar regiona dupleksa, 100% komplementarnost nije neophodna; poprilična komplementarnost dozvoljena je unutar regiona dupleksa. Poprilična komplementarnost odnosi se na komplementarnost između lanaca tako da su sposobni da se povežu pod biološkim uslovima. Tehnike za empirijsko određivanje da li je dva lanca sposobno za povezivanje pod biološkim uslovima dobro su poznate u ovoj oblasti. Alternativno, dva lanca se mogu sintetizovati i dodati jedan dugom pod biološkim uslovima kako bi se odredilo da li odgovaraju jedan drugom.
[0210] Kako se ovde koristi, izrazi "ne-uparujući analog nukleotida" označava analog nukleotida koji uključuje ostatak ne-baznog uparivanja koji uključuju ali nije ograničen na: 6-des-amino adenozin (nebularin), 4-Me-indol, 3-nitropirol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3-Me dC. U nekim primerima izvođenja analog nukleotida ne-baznog uparivanja je ribonukleotid. U drugim primerima izvođenja on je dezoksiribonukleotid.
[0211] Kako se ovde koristi, izraz, "krajnja funkcionalna grupa" uključuje bez ograničenja halogen, alkoholne, amin, karboksilne, estar, amidne, aldehidne, ketonske, etarske grupe.
[0212] "Bezbazni nukleotid" ili " analog bezbaznog nukleotida" kako se ovde koristi može se takođe odnositi i ovde i u stanju tehnike na pseudo-nukleotid ili nekonvencionalan ostatak. Dok je nukleotid monomerna jedinica nukleinske kiseline, koja se generalno sastoji od šećera riboze ili dezoksiriboze, fosfata, i baze (adenin, gvanin, timin, ili citozin u DNK; adenin, gvanin, uracil, ili citozin u RNK), bezbaznom ili pseudo-nukleotidu nedostaje baza, te prema tome nukleotid nije striktan izraz koji se generalno koristi u ovoj oblasti. Bezbazni dezoksiriboza ostaci uključuju na primer, bezbazni dezoksiriboza-3'-fosfat; 1,2-didezoksi-D-ribofuranoza-3-fosfat; 1,4-anhidro-2-dezoksi-D-ribitol-3-fosfat. Invertni bezbazni dezoksiriboza ostaci uključuju invertovan dezoksiribobezbazni; 3',5' invertovan dezoksibezbazni 5'-fosfat.
[0213] Izraz "ostatak dodavanja kape" (z") kako se ovde koristi uključuje ostatak koji se može kovalentno povezati za 5'-kraj od (N')yi uključuje bezbazni riboza ostatak, bezbazni dezoksiriboza ostatak, modifikacije bezbaznih riboza i bezbaznih dezoksiriboza ostataka koji uključuju 2' O alkil modifikacije; invertne bezbazne riboza i bezbazne dezoksiriboza ostatke i njihove modifikacije; C6-imino-Pi; invertni nukleotid koji uključuje L-DNK i L-RNK; 5'OMe nukleotid; i nukleotidne analoge koji uključuju 4',5'-metilen nukleotid; 1-(β-D-eritrofuranozil)nukleotid; 4'-tio nukleotid, karbociklični nukleotid; 5'-amino-alkil fosfat; 1,3-diamino-2-propil fosfat, 3-aminopropil fosfat; 6-aminoheksil fosfat; 12-aminododecil fosfat; hidroksipropil fosfat; 1,5-anhidroheksitol nukleotid; alfa-nukleotid; treopentofuranozil nukleotid; aciklični 3',4'-seko nukleotid; 3,4-dihidroksibutil nukleotid; 3,5-dihidroksipentil nukleotid, 5'-5'-invertni bezbazni ostatak; 1,4-butanediol fosfat; 5'-amino; i premošćujući ili nepremošćujući metilfosfonat i 5'-merkapto ostaci.
[0214] Određeni ostaci dodavanja kape mogu biti bezbazni riboza ili bezbazni dezoksiriboza ostaci; invertni bezbazni riboza ili bezbazni dezoksiriboza ostaci; C6-amino-Pi; invertni nukleotid koji uključuje L-DNK i L-RNK. Molekuli nukleinske kiseline kakvi su ovde opisani mogu biti sintetizovani upotrebom jednog ili više invertovanih nukleotida, na primer invertovanog timidina ili invertovanog adenina (na primer videti Takei, et al., 2002. JBC 277(26):23800-06).
[0215] Izraz "nekonvencionalan ostatak" kako se ovde koristi odnosi se na ne-nukleotidne ostatke koji uključuju bezbazni ostatak, invertni bezbazni ostatak, ugljovodonični (alkilni) ostatak i njihove derivate, a dalje uključuje dezoksiribonukleotid, modifikovan dezoksiribonukleotid, invertni nukleotid (L-DNK ili L-RNK), ne-bazno uparujući analog nukleotida i nukleotid povezan sa susednim nukleotidom 2'-5' internukleotidnom fosfatnom vezom; premošćene nukleinske kiseline koje uključuju LNK i etilen premošćene nukleinske kiseline, vezom modifikovane (npr. PACE) i bazom modifikovane nukleotide kao i dodatne ostatke koji su ovde eksplicitno opisani kao nekonvencionalni ostaci.
[0216] Kako se ovde koristi, izraz "inhibiranje", "nishodna regulacija", ili "redukovanje" u odnosu na gensku ekspresiju označava da je ekspresija gena, ili nivo RNK molekula ili ekvivalentnih RNK molekula koji kodiraju jedan ili više proteina ili proteinskih podjedinica (npr., mRNK), ili aktivnost jednog ili više proteina ili proteinskih podjedinica, redukovana ispod one primećene u odsustvu inhibitornog faktora (kao što je molekul nukleinske kiseline, npr., siNK, na primer sa strukturalnim karakteristikama kakve su ovde opisane); na primer ekspresija može biti redukovana do 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ili manje u odnosu na ovu zapaženu u odsustvu inhibitora.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0217]
FIG.1 je dijagram koji prikazuje protokol u odnosu na procenu efekta gp46-siRNK in vitro upotrebom NRK ćelija, i određivanje optimalne sekvence, tajminga, i koncentracije.
FIG.2 je fotografski dijagram koji prikazuje rezultat western blotting-a za gp46 i aktin (24 časovno uzgajanje, ispitivanje optimalne sekvence).
FIG.3 je fotografski dijagram koji prikazuje rezultat western blotting-a za gp46 i aktin (24 časovno uzgajanje, ispitivanje optimalne koncentracija).
FIG.4 je fotografski dijagram koji prikazuje rezultat western blotting-a za gp46 i aktin (koncentracija 50 nM, ispitivanje optimalnog vremena za uzgajanje).
FIG.5 je dijagram koji prikazuje protokol za procenu inhibicije eskpresije kolagena putem gp46-siRNK u NRK ćelijama.
FIG.6 je grafikon koji prikazuje inhibiciju sinteze kolagena putem siRNK.
FIG.7 je fotografski dijagram koji prikazuje HSC-specifičnu siRNK transfekciju.
FIG.8 je fotografski dijagram za procenu procenta HSC-specifične siRNK transfekcije.
FIG.9 je fotografski dijagram za procenu inhibicije eskpresije gp46 putem siRNK.
FIG.10 je fotografski dijagram koji prikazuje bojenje azanom jetre pacova kojima je dat DMN.
FIG.11 je dijagram koji prikazuje protokol tretiranja LC pacova.
FIG.12 je fotografski dijagram koji prikazuje bojenje azanom jetre LC pacova kojima je data VA-Lipgp46siRNK.
FIG 13. je dijagram koji prikazuje postupak za ekstraktovanje obojenog dela upotrebom NIH Image (6 položaja koji su nasumično uzeti iz azanom obojene slike).
FIG.14 je grafikon koji prikazuje odnos površinom okupiranom fibrotičnim delovima u histologiji jetre (Odnos kolagena po površini, %).
FIG.15 je grafikon koji prikazuje količina hidroksiprolina u hepatičnom tkivu.
FIG.16 je grafikon koji prikazuje krivu preživljavanja za hepatičnu cirozu pacova kojima je VA-Lipgp46siRNK data intraportalno.
FIG.17 je fotografski dijagram koji prikazuje bojenje azanom hepatičnog tkiva hepatične ciroze pacova kojima je VA-Lip-gp46siRNK data intraportalno.
FIG.18 je grafikon koji prikazuje krivu preživljavanja za hepatičnu cirozu pacova kojima je VA-Lipgp46siRNK data intraportalno.
FIG.19 je fotografski dijagram koji prikazuje bojenje azanom hepatičnog tkiva hepatične ciroze pacova kojima je VA-Lip-gp46siRNK data intraportalno.
FIG.20 je grafikon koji prikazuje krivu preživljavanja za hepatičnu cirozu pacova kojima je VA-Lipgp46siRNK data intravenozno.
FIG.21 je grafikon koji prikazuje krivu preživljavanja za hepatičnu cirozu pacova kojima je VA-Lipgp46siRNK data intravenozno.
FIG.22 je fotografski dijagram koji prikazuje bojenje azanom hepatičnog tkiva hepatične ciroze pacova kojima je VA-Lip-gp46siRNK data intravenozno.
FIG.23 je dijagram koji prikazuje poboljšanje efikasnosti VA-Lip-gp46siRNK transfekcije putem RBP. FIG.24 je dijagram koji prikazuje inhibiciju VA-Lip-gp46siRNK transfekcije anti-RBP antitelom.
Fig.25 je stubičasti grafikon koji prikazuje efekat GFP siNK na razne reporter ćelijske linije. Ćelijske linije utvrđene su lenti-virusnom indukcijom humanog HSP47 cDNK-GFP ili pacovskog GP46 cDNK-GFP konstrukta u HEK293, humanu fibrosarkom ćelijsku liniju HT1080, humanu HSC liniju hTERT ili NRK ćelijsku liniju. Negativna kontrola siNK ili siNK protiv GFP uvedena je u ćelije i izmerena je GFP fluorescencija. Rezultati pokazuju da siNK protiv GFP obara fluorescenciju u različitoj meri u različitim ćelijskim linijama.293_HSP47-GFP i 293_GP46-GFP ćelijske linije odabrane su za siHsp47 skrining zbog svoje lakoće transfektovanja i osetljivosti na obaranje fluorescencije.
Fig.26A, 26B, 26C, i 26D su serije stubičastih grafikona koji prikazuju citotoksičnost i efikasnost obaranja raznih siHsp47s in 293_HSP47-GFP i 293_GP46-GFP ćelijskih linija. Rezultati pokazuju da siHsp47-C, siHsp47-2 i siHsp47-2d efikasno obara i humani HSP47 i pacovski GP46 (humani hsp47 homolog) bez poprilične citotoksičnosti. siGp46A protiv GP46 ne obara humani HSP47. Dodatno, novo dizajnirani siHsp47s nadmašuju siGp46A u obaranju pacovskog GP46.
Fig.27 je stubičasti grafikon koji prikazuje efekat obaranja raznih siHsp47s na hsp47 mRNK, izmereno pomoću TaqMan® qPCR upotrebom humane HSC ćelijske linije hTERT. Y osa predstavlja preostao mRNK nivo hsp47. HSP47-C bla je najefikasnija među svim testiranim hsp47 siNKs.
Fig.28 je stubičasti grafikon koji prikazuje efekat različitih hsp47 siNKs na kolagen I ekspresiju u hTERT ćelijama. Nivoi nivoa kolagen I mRNK izmereni su pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu upotrebom TaqMan® sonda. Y osa predstavlja preostali nivo mRNK ekspresije kolagena I. Rezultat pokazuju da kolagen I mRNK nivo je značajno redukovan u ćelijama tretiranim nekim kandidatima (siHsp47-2, siHsp47-2d, i njihovim kombinacijama sa with siHsp47-1).
Fig.29 je grafikon koji prikazuje smanjenje u fibrotični oblastima jetre kod životinja tretiranih sa siHSP47.
Fig.30 je šema rasporeda tretiranja i postupka evaluacije koji je korišćen u Primeru 22.
Fig.31 pokazuj rezultate histološkog bojenja Azanom u plućnoj blasti. Slike prikazuju reprezentativne oblasti pluća Azanom obojenih sekcija svake grupe pri uvećanju od 80X. (a) Predtretiranje (BLM IT -2W); (b) Bolest pacova (BLM IT-5W+PBS i.v.); i (c) Tretiranje (BLM IT siRNK i.v.), (d) Lažno (Slani rastvor-IT+PBS i.v.).
Fig.32 prikazuje ocenjivanje fibroze, koje prikazuje rezultate ocenjivanja dvadeset nasumično odabranih oblasti pluća pod uvećanjem od 80X za svakog pacova. Stubičasti grafikon sumira ocenjivanje fibroze Azanom obojene sekcije za svaku grupu. Statistička analiza koristila jhe One-way-ANOVA Bonferroni multi uporedno ispitivanje upotrebom Prism5 softvera.
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA RNK Interferencija i siNK Molekuli nukleinske kiseline
[0218] RNK interferencija odnosi se na proces sekvenca-specifičnog post transkripcionog genskog utišavanja kod životinja koje je posredovano kratkim ometajućim RNKs (siRNKs) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141; i Strauss, 1999, Science, 286, 886). Prisustvo dsRNK u ćelijama izaziva RNKi odgovor putem mehanizma koji tek treba da se potpuno okarakteriše.
[0219] Dicer je uključen u obrađivanje dsRNK u kratke delove dsRNK poznate kao kratke ometajuće RNKs (siRNKs) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). siRNKs izvedene iz dicer aktivnost mogu iznositi oko 21 do oko 23 nukleotida u dužini i uključuju oko dupleksa 19 baznih parova (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Dicer je takođe impliciran u eksciziji 21- i 22-nukleotidnih malih privremenih RNKs
1
(stRNKs) iz prekursor RNK konzervativnih struktura koje su implicirane u translacionu kontrolu (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). RNKi odgovor takođe učestvuje u endonukleaznom kompleksu, koji se često naziva RNK-indukovan kompleks supresije (RISC), koji posreduje cepanje jednolančane RNK sa sekvencom komplementarnom sa antismisaonim lancem siRNK dupleksa. Cepanje ciljane RNK odvija se u srednjem delu regiona komplementarnog antismisaonom lancu siRNK dupleksa (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188).
[0220] RNKi je ispitivana u raznim sistemima. Fire et al., 1998, Nature, 391, 806, su prvi primetili RNKi u C. elegans. Bahramian i Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283and Wianny i Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, opisuju RNKi posredovan pomoću dsRNK us sisraskim sistemima. Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 i Tuschl et al., WO0175164, opisuju RNKi indukovanu uvođenjem dupleksa sintetičkih 21-nukleotidnih RNKs u uzgajanim sisarskim ćelijama koje uključuju humani embrionski bubreg i HeLa ćelije. Nedavni rad (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 i Tuschl et al., WO0175164) otkrio je određene zahteve za siRNK dužinu, strukturu, hemijsku kombinaciju, i sekvencu koja suštinski posreduje efikasnu RNKi aktivnost.
[0221] Molekuli nukleinske kiseline (na primer koja obuhvata strukturalne osobine kakve su ovde opisane) mogu da inhibiraju ili niskodno regulišu gensku ekspresiju ili virusne replikacije posredovanjem RNK interferencije "RNKi" ili utišavanjem gena na sekvenca-specifičan način. (Videti ,npr., Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; i Kreutzer et al., WO0044895; Zemicka-Goetz et al., WO0136646; Fire, WO9932619; Plaetinck et al., WO0001846; Mello i Fire, WO0129058; Deschamps-Depaillette, WO9907409; i Li et al., WO0044914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; i Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner i Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNK, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; i Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831)
[0222] siNK molekul nukleinske kiseline može biti sastavljen od dva odvojena polinukleotidna lanca, pri čemu je jedan lanac smisaoni lanac, a drugi je antismisaoni lanac, pri čemu su i antismisaoni i smisaoni lanci samo-komplementarni (tj. svaki lanac uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci u drugom lancu); kao kada antismisaoni lanac i smisaoni lanac formiraju dupleks ili dvolančanu strukturu koja ima bilo koju dužinu i strukturu kako je ovde opisano za obezbeđene molekule nukleinske kiseline, na primer u kojoj dvolančani region (region dupleksa) iznosi oko 15 do oko 49 (npr., oko 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ili 49 baznih parova); antismisaoni lanac uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci u ciljanom molekulu nukleinske kiseline (tj., hsp47
2
mRNK) ili njegovom delu i smisaoni lanac uključuje nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljanoj sekvenci nukleinske kiseline ili njenom delu (npr., oko 17 do oko 49 ili više nukleotida molekula nukleinske kiseline ovde su komplementarni sa ciljanom nukleinskom kiselinom ili njenim delom).
[0223] U određenim aspektima i primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) ovde obezbeđen može biti "RISC dužine" molekul ili može biti Dicer supstrat kako je detaljnije opisano u nastavku.
[0224] siNK molekul nukleinske kiseline može da uključi odvojene smisaone i antismisaone sekvence ili regione, pri čemu su smisaoni i antismisaoni regioni kovalentno povezani nukleotidnim ili nenukleotidnim molekulima linkerima što je poznato u ovoj oblasti, ili su alternativno ne-kovalentno povezani jonskim interakcijama, vodoničnim vezivanjem, van der Waals interakcijama, hidrofobnim interakcijama, i/ili slagajućim interakcijama. Molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci ciljanog gena. Molekuli nukleinske kiseline mogu da međusobno reaguju sa nukleotidnom sekvencom ciljanog gena na način koji izaziva inhibiciju eskpresije ciljanog gena.
[0225] Alternativno, siNK molekul nukleinske kiseline sastavljen je od jednog polinukleotida, pri čemu su samo-komplementarni smisaoni i antismisaoni regioni molekula nukleinske kiseline povezani putem linkera(a) na bazi nukleinske kiseline ili koji nisu na bazi nukleinske kiseline, tj., antismisaoni lanac i smisaoni lanac su deo jednog polinukleotida koji ima antismisaoni region i smisaoni region koji se presavijaju radi obrazovanja regiona dupleksa (na primer radi obrazovanja strukture u obliku "ukosnice" što je dobro poznato u ovoj oblasti). Takvi siNK molekuli nukleinske kiseline mogu biti polinukleotid sa dupleks, asimetričnom dupleks, u obliku ukosnice ili asimetričnom u obliku ukosnice sekundarnom strukturom, koja ima samo-komplementarne smisaone i antismisaone regione, u kojima antismisaoni region uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci u odvojenom ciljanom molekulu nukleinske kiseline ili njegovom delu, a smisaoni region ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljanoj sekvenci nukleinske kiseline (npr., sekvenca hsp47 mRNK). Takvi siNK molekuli nukleinske kiseline mogu biti kružni jednolančani polinukleotid sa dve ili više petljastih struktura i stablom koje obuhvata samo-komplementarni smisaoni i antismisaoni region, u kojima antismisaoni region uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci u ciljanom molekulu nukleinske kiseline ili njegovom delu, a smisaoni region ima nukleotidna sekvenca koja odgovara ciljanoj sekvenci nukleinske kiseline ili njenom delu, i u kojima kružni polinukleotid može biti obrađen bilo in vivo ili in vitro radi generisanja aktivnog molekula nukleinske kiseline sposobnog da posreduje RNKi.
[0226] Sledeća nomenklatura često se koristi u stanju tehnike da opiže dužine i prepuste siNK molekula i može se pominjati kroz specifikaciju i Primere. U svim opisima oligonukleotida, identifikacija nukleotida u sekvenci data je u 5' do 3' pravcu za oba i smisaoni i antismisaoni lanac. Imena data dupleksima ukazuju na dužine oligomera i prisustvo ili odsustvo prepusta. Na primer, "21+2" dupleks sadrži dva lanca nukleinske kiseline od koji su oba 21 nukleotid u dužini, koji se takođe naziva 21-mer siRNK dupleks ili 21-mer nukleinska kiselina i koja ima 2 nukleotida 3'-prepust. "21-2" dizajn se odnosi na dupleks 21-mer nukleinske kiseline sa 2 nukleotida 5'-prepustom.21-0 dizajn je dupleks 21-mer nukleinske kiseline bez prepusta (zatupljena). "21+2UU" je 21-mer dupleks sa 2-nukleotida 3'-prepustom, a krajna 2 nukleotida na 3’-krajevima su oba U ostaci (što može da rezultuje kao neslaganje sa ciljanom sekvencom). Prethodno pomenuta nomeklatura može se primeniti na siNK molekule lanaca raznih dužina, duplekse i prepuste (kao što je 19-0, 21+2, 27+2, i slično). U alternativnoj, ali sličnoj nomeklaturi, "25/27" je asimetrični dupleks koji ima 25 bazni smisaoni lanac i 27 bazni antismisaoni lanac sa 2- nukleotida 3'-prepustom. "27/25" je asimetrični dupleks koji ima 27 bazni smisaoni lanac i 25 bazni antismisaoni lanac.
Hemijske Modifikacije
[0227] U određenim aspektima i primerima izvođenja, molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde obezbeđeni uključuju jednu ili više modifikacija (ili hemijskih modifikacija). U određenim primerima izvođenja, takve modifikacije uključuju bilo koje promene na molekulu nukleinske kiseline ili polinukleotidu koji bi učinio molekul različit od standardog ribonukleotida ili RNK molekula (tj., da uključuje standardne adenozin, citozin, uracil, ili gvanozin ostatke); što se može nazvati "nemodifikovan" ribonukleotid ili nemodifikovana ribonukleinska kiselina. Uobičajene DNK baze i polinukleotidi koji imaju 2'-dezoksi šećer predstavljen adenozin, citozin, timin, ili gvanozin ostacima može se nazvati "nemodifikovan dezoksiribonukleotid" ili "nemodifikovana dezoksiribonukleinska kiselina"; shodno tome, izraz "nemodifikovan nukleotid" ili "nemodifikovana nukleinska kiselina" kako se ovde koristi odnosi se na "nemodifikovan ribonukleotid" ili "nemodifikovanu ribonukleinsku kiselinu" ukoliko se jasno ne odnosi na nešto drugo. Takve modifikacije mogu biti u nukleotidnom šećeru, nukleotidnoj bazi, nukleotidnoj fosfatnoj grupi i/ili fosfatnoj kičmi polinukleotida.
[0228] U određenim primerima izvođenja, modifikacije kave su ovde opisane mogu se primeniti da se poveća RNKi aktivnost molekula i/ili da se poveća in vivo stabilnost molekula, naročito stabilnost u serumu, i/ili da se poveća biodostupnost molekula. Neograničavajući primeri modifikacija uključuju internukleotidne ili internukleozidne veze; dezoksinukleotide ili didezoksiribonukleotide na bilo kom položaju i lanac molekula nukleinske kiseline; nukleinsku kiselinu (npr., ribonukleinska kiselina) sa modifikacijom na 2'-položaju poželjno odabrani između amino, fluoro, metoksi, alkoksi i alkila; 2'-
4
dezoksiribonukleotide, 2'OMe ribonukleotide, 2'-dezoksi-2'-fluoro ribonukleotide, nukleotide "univerzalne baze", "aciklične" nukleotide, 5-C-metil nukleotide, biotin grupu, i krajnji gliceril i/ili invertovan dezoksi bezbazni preostali umetak, sterično sprečeni molekuli, kao što su fluorescentni molekuli i slično. Drugi nukleotidi modifikatori mogu da uključe 3'-dezoksiadenozin (kordicepin), 3'-azido-3'-dezoksitimidin (AZT), 2',3'-didezoksiinozin (ddl), 2',3'-didezoksi-3'-tiacitidin (3TC), 2',3'-didehidro-2',3'-didezoksitimidin (d4T) i monofosfatne nukleotide 3’-azido-3’-dezoksitimidina (AZT), 2’,3’-didezoksi-3’-tiacitidina (3TC) i 2’,3’-didehidro-2’,3’-didezoksitimidina (d4T). Dodatni detalji raznih modifikacija opisani detaljnije u nastavku.
[0229] Modifikovani nukleotidi uključuju one koji imaju Severnu konfortaciju (npr., Severni pseudorotacioni ciklus, videti na primer Sanger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Neograničavajući primeri nukleotida koji imaju severnu kinfuguraciju uključuju LNK nukleotide (npr., 2'-O, 4'-C-metilen-(D-ribofuranozil) nukleotide); 2'-metoksietoksi (MOE) nukleotide; 2'-metil-tioetil, 2'-dezoksi-2'-fluoro nukleotide, 2'-dezoksi-2'-hloro nukleotide, 2'-azido nukleotide, i 2'OMe nukleotide. LNKs opisane su, na primer, u Elman et al., 2005; Kurreck et al., 2002; Crinelli et al., 2002; Braasch i Corey, 2001; Bondensgaard et al., 2000; Wahlestedt et al., 2000; i
WO0047599, WO9914226, WO9839352, i WO04083430. U jednom primeru izvođenja, LNK je inkorporisana na 5'-kraju smisaonog lanca.
[0230] Hemijske modifikacije takođe uključuju UNKs, koje su ne-nukleotidni, aciklični analozi, u kojima C2'-C3' veza nije prisutna (iako UNKs nisu zaista nukleotidi, one su izričito uključene u obim "modifikovanih" nukleotida ili modifikovanih nukleinskih kiselina kako je ovde naznačeno). Određeniji primeri izvođenja, molekuli nukleinske kiseline sa prepustom mogu biti modifikovani da imaju UNKs na položajima prepusta (tj., 2 nukleotidna prepusta). U drugim primerima izvođenja, UNKs su uključene na 3'- ili 5'- krajevima. UNK može biti smeštena bilo gde duž lanca nukleinske kiseline, tj. na položaju 7. Molekuli nukleinske kiseline mogu da sadrže jedan ili više od UNK. Primerne UNKs opisane su u Nucleic Acids Symposium Series No.52 p.133-134 (2008). U određenim primerima izvođenja, molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kako je ovde opisano, uključuju jednu ili više UNKs; ili jednu UNK. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan koji ima 3'-prepust uključuje jednu ili dve UNKs u 3' prepustu. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kaav je ovde opisan uključuje UNK (na primer jednu UNK) u antismisaonom lancu; na primer na položaju 6 ili položaju 7 antismisaonog lanca. Hemijske modifikacije takođe uključuju ne-uparujuće nukleotidne analoge, na primer kako je ovde opisano. Hemijske modifikacije dalje uključuju nekonvencionalne ostatke kakvi su ovde opisani.
[0231] Hemijske modifikacije takođe uključuju krajnje modifikacije na 5' i/ili 3' delu oligonukleotida, a takođe su poznate kao ostaci dodavanja kape. Takve krajnje modifikacije odabrane su između nukleotida, modifikovanog nukleotida, lipida, peptida, i šećera.
[0232] Hemijske modifikacije takođe uključuju šestočlane "analoge nukleotida šestočlanog prstena." Primeri analoga nukleotida šestočlanog prstena opisani su u Allart, et al (Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17:1523-1526,; i Perez-Perez, et al., 1996, Bioorg. i Medicinal Chem Letters 6:1457-1460) Oligonukleotidi koji uključuju analoge nukleotida 6-članog prstena koji uključuju heksitol i altritol nukleotidne monomere opisani su u WO2006047842.
[0233] Hemijske modifikacije takođe uključuju "invertne" nukleotide koji imaju obrnutu hiralnost u poređenju sa prirodno javljajućim nukleotidom; to jest, invertni nukleotid može biti analog "L-nukleotida" prirodno javljaućeg D-nukleotida (videti US6602858). Invertni nukleotidi mogu dalje da uključuju najmanje jednu modifikaciju šećera ili baze i/ili modifikaciju kičme, na primer, kako je ovde opisano, kao što je fosforotioat ili fosfonat ostatak. US6602858 opisuje katalizatore nukleinske kiseline koji uključuju najmanje jednu L-nukleotidnu supstituciju. Invertni nukleotidi uključuju na primer L-DNK (L-dezoksiriboadenozin-3'-fosfat (invertni dA); L-dezoksiribocitidin-3'-fosfat (invertni dC); L-dezoksiribogvanozin-3'-fosfat (invertni dG); L-dezoksiribotimidin-3'-fosfat (invertna slika dT)) i L-RNK (L-riboadenozin-3'-fosfat (invertni rA); L-ribocitidin-3'-fosfat (invertni rC); L-ribogvanozin-3'-fosfat (invertni rG); L-ribouracil-3'-fosfat (invertni dU).
[0234] U nekim primerima izvođenja, modifikovani ribonukleotidi uključuju modifikovane dezoksiribonukleotide, na primer 5'OMe DNK (5-metil-dezoksiribogvanozin-3'-fosfat) koja može biti korisna kao nukleotid u 5' krajnjem položaju (položaj broj 1); PACE (dezoksiriboadenozin 3' fosfonoacetat, dezoksiribocitidin 3' fosfonoacetat, dezoksiribogvanozin 3' fosfonoacetat, dezoksiribotimidin 3' fosfonoacetat).
[0235] Modifikacije mogu biti prisutne u jednom ili više lanaca molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan, npr., u smisaonom lancu, antismisaonom lancu, ili oba lanca. U određenim primerima izvođenja, antismisaoni lanac može da uključi modifikacije, a smisaoni lanac može da uključi samo nemodifikovanu RNK.
Nukleobaze
[0236] Nukleobaze ovde opisane nukleinske kiseline mogu da uključe nemodifikovane ribonukleotide (purini i pirimidini) kao što je adenin, gvanin, citozin, uracil. Te nukleobaze u jednom ili oba lanca mogu biti modifikovane prirodnim i sintetičkim nukleobazama kao što je, timin, ksantin, hipoksantin, inozin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkilni derivati adenina i gvanina, bilo koji nukleotidi "univerzalne baze"; 2propil i drugi alkilni derivati adenina i gvanina, 5-halo uracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudo-uracil), 4-tiouracil, 8-halo, amino, tiol, tioalkil, hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin, deazapurini, heterociklični supstituisani analozi purina i pirimidina, npr., aminoetioksi fenoksazin, derivati purina i pirimidina (npr., 1-alkil-, 1-alkenil-, heteroaromatični- i 1-alkinil derivati) i njihovi tautomeri, 8-okso-N6-metiladenin, 7-diazaksantin, 5-metilcitozin, 5-metiluracil, 5-(1-propinil)uracil, 5-(1-propinil) citozin i 4,4-etanocitozin). Ostali primeri pogodnih baza uključuju ne-purinil i ne-pirimidinil baze kao što je 2-aminopiridin i triazini.
Šećerni ostaci
[0237] Šećerni ostaci u ovde opisanoj nukleinskoj kiselini mogu da uključe 2'-hidroksil-pentofuranozil šećerni ostatak bez bilo koje modifikacije. Alternativno, šećerni ostaci mogu se modifikovati kao što je, 2'-dezoksi-pentofuranozil šećerni ostatak, D-riboza, heksoza, modifikacija na 2’ položaju pentofuranozilnog šećernog ostatka kao što je 2'-O-alkil (koji uključuju 2'OMe i 2'-O-etil), tj., 2'-alkoksi, 2'-amino, 2'-O-alil, 2'-S-alkil, 2'-halogen (koji uključuju 2'-fluoro, hloro, i bromo), 2'-metoksietoksi, 2'-O-metoksietil, 2'-O-2-metoksietil, 2'-aliloksi (-OCH2CH=CH2), 2'-propargil, 2'-propil, etinil, etenil, propenil, CF, cijano, imidazol, karboksilat, tioat, C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril ili aralkil, OCF3, OCN, O-, S-, ili N-alkil; O-, S, ili N-alkenil; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterozikloalkil; heterozikloalkaril; aminoalkilamino; polialkilamino ili supstituisani silil, kao, između ostalog, na primer kako je opisano u Evropskim patentima EP0586520 ili EP0618925.
[0238] Alkil grupa uključuje zasićene alifatične grupe, kojei uključuju ravno lančane alkil grupe (npr., metil, etil, propil, butil, pentil, heksil, heptil, oktil, nonil, decil, itd.), razgranate alkil grupe (izopropil, tert-butil, izobutil, itd.), cikloalkil (aliciklični) grupe (ciklopropil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil), alkil supstituisane cikloalkil grupe, i cikloalkil supstituisane alkil grupe. U određenim primerima izvođenja, ravno lančani ili razgranati alkil ima šest ili manje atoma ugljenika u svojoj kičmi (npr., C1-C6za ravno lančani, C3-C6za razgranati), a poželjnije četiri ili manje. Nalik tome, poželjni cikloalkili mogu imati od tro do osam atoma ugljenika u svojoj strukturi prstena, a poželjnije pet ili šest ugljenika u strukturi prstena. Izraz C1-C6uključuje alkil grupe koje sadrže jedan do šest atoma ugljenika. Alkil grupa može biti supstituisana alkil grupa kao što su alkil ostaci sa supstituentima koji menjaju vodonik na jenom ili više ugljenika ugljovodonične kičme. Takvi supstituenti mogu da uključe, na primer, alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, cijano, amino (koji uključuju alkil amino, dialkilamino, arilamino, diarilamino, i alkilarilamino), acilamino (koji uključuju alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfati, alkiliulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatični ili heteroaromatični ostatak.
[0239] Alkoksi grupa uključuje supstituisane i nesupstituisane alkil, alkenil, i alkinil grupe kovalentno povezane atomom kiseonika. Primeri alkoksi grupa uključuju metoksi, etoksi, izopropiloksi, propoksi, butoksi, i pentoksi grupe. Primeri supstituisanih alkoksi grupa uključuju halogenovane alkoksi grupe. Te alkoksi grupe mogu biti supstituisane grupama kao što je alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, cijano, amino (koji uključuju alkil amino, dialkilamino, arilamino, diarilamino, i alkilarilamino), acilamino (koji uključuju alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfati, alkiliulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatični ili heteroaromatični ostaci. Primeri halogen supstituisanih alkoksi grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorometoksi, difluorometoksi, trifluorometoksi, hlorometoksi, dihlorometoksi, trihlorometoksi, itd.
[0240] U nekim primerima izvođenja, pentafuronozilni prsten može biti zamenjen acikličnim derivatima kojima nedostaje C2'-C3'-veza pentafuronozil prstena. Na primer, aciklonukleotidi se mogu supstituisati 2-hidroksietoksimetil grupom za- 2'-dezoksiribofuranozil šećer koji je uobičajeno prisutan u dNMPs.
[0241] Halogeni uključuju fluor, brom, hlor, jod.
Kičma
[0242] Nukleozidne podjedinice ovde opisane nukleinske kiseline mogu biti međusobno povezane fosfodiestarskom vezom. Fosfodiestarska veza može biti opciono supstituisana drugim vezama. Na primer, fosforotioat, tiofosfat-D-riboza entiteti, triestar, tioat, 2'-5' premošćena kičma (takođe se može označiti i kao 5'-2' ili 2'-5'-nukleotid ili 2'-5'-ribonukleotid), PACE, 3'(ili -5’)-dezoksi-3'(ili -5’)-tiofosforotioat, fosforoditioatom, fosforoselenat, 3'(ili -5’)-dezoksi fosfinat, borano fosfati, 3'(ili -5’)-dezoksi-3'(ili 5’-)-amino fosforamidati, vodonik fosfonati, fosfonati, estri borano fosfata, fosforamidati, alkil ili aril fosfonati i fosfodiestarske modifikacije kao što su alkilfosfodiestri, fosfodiestarske fosforne veze, 5'-etoksifosfodiestarske, P-alkiloksifosfodiestarske, metilfosfonat, i nefosforne koje sadrže veze na primer, karbonatne, karbamatne, sililne, sumporne, sulfonatne, sulfonamidne, formacetalne, tioformacetilne, oksimne, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo i metilenoksimetilimino veze.
[0243] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe kičmu peptidne nukleinske kiseline (PNK). PNK kičma uključuje ponavljanje N-(2-aminoetil)-glicin jedinica vezane peptidnim vezama. Razne baze kao što su purinske, pirimidinske, prirodne i sintetičke baze, vezane su za kičmu metilen karbonilnim vezama.
Krajnji Fosfati
[0244] Modifikacije se mogu izvesti na terminalnim fosfatnim grupama. Neograničavajući primeri različitih stabilizacionih hemija mogu se primeniti, npr.,radi stabilizovanja 3'-kraja sekvence nukleinske kiseline, koje uključuju (3'-3')-invertovanu dezoksiribozu; dezoksiribonukleotid; (5'-3')-3'-dezoksiribonukleotid; (5'-3')-ribonukleotid; (5'-3')-3'-O-metil ribonukleotid; 3'-gliceril; (3'-5')-3'-dezoksiribonukleotid; (3'-3')-dezoksiribonukleotid; (5'-2')-dezoksiribonukleotid; i (5-3')-didezoksiribonukleotid. Dodatno, hemije nemodifikovane kičme mogu se kombinovati sa jednom ili više ovde opisanih modifikacija kičme.
[0245] Primerne hemijski modifikovane terminalne fosfatne grupe uključuju one prikazane u nastavku:
Konjugati
[0246] Modifikovani nukleotidi i molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) kakvi su ovde obezbeđeni mogu da uključe konjugate, na primer, konjugat kovalentno vezan za hemijski-modifikovan molekul nukleinske kiseline. Neograničavajući primeri konjugata uključuju konjugate i ligande opisane u Vargeese et al., U.S. Ser. No.10/427,160. Taj konjugat može biti kovalentno vezan za molekul nukleinske kiseline (kao što je siNK molekul) putem biorazgradivog linkera. Taj molekul konjugata može se povezati na 3’-kraju bilo smisaonog lanca, antismisaonog lanca, ili oba lanca hemijski-modifikovanog molekula nukleinske kiseline. Taj molekul konjugat može se povezati na 5’-kraju bilo smisaonog lanca, antismisaonog lanca, ili oba lanca hemijski-modifikovanog molekula nukleinske kiseline. Taj molekul konjugat može se povezati i na 3'-kraj i 5'-kraj bilo smisaonog lanca, antismisaonog lanca, ili oba lanca hemijski-modifikovanog molekula nukleinske kiseline, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, konjugat molekul može da uključi molekul koji olakšava dostavu hemijskimodifikovanog molekula nukleinske kiseline u biološkom sistemu, kao što je ćelija. U još jednom primeru izvođenja, taj molekul konjugat koji je vezan za hemijski-modifikovan molekul nukleinske kiseline predstavljha polietilen glikol, humani serum albumin, ili ligand za celularni receptor koji može da posreduje ćelisjko preuzimanje. Primeri specifičnih konjugat molekula razmatrani u ovom opisu koji se mogu vezati za hemijski-modifikovane molekule nukleinske kiseline opisani su u Vargeese et al., U.S. Ser. No.10201394.
Linkeri
[0247] Molekul ovde obezbeđenog molekula nukleinske kiseline (npr., siNK) može da uključi nukleotidni, ne-nukleotidni, ili kombinovani nukleotidni/ne-nukleotidni linker koji spaja smisaoni region nukleinske kiseline sa antismisaonim regionom nukleinske kiseline. Nukleotidni linker može biti linker od ≥2 nukleotida u dužini, na primer oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nukleotida u dužini. Nukleotidni linker može biti aptamer nukleinske kiseline. Pod "aptamer" ili "aptamer nukleinske kiseline" kako se ovde koristi misli se na molekul nukleinske kiseline koji se specifično vezuje za ciljani molekul u kojem molekul nukleinske kiseline ima sekvencu koja uključuje sekvencu prepoznatu od strane ciljanog molekula u njegovom prirodnom stanju. Alternativno, aptamer može biti molekul nukleinske kiseline koji se vezuje za ciljani molekul (kao što je hsp47 mRNK) pri čemu se taj ciljani molekul prirodno ne vezuje za nukleinsku kiselinu. Na primer, taj aptamer može se primeniti za vezivanje sa ligand-vezujućim domenom proteina, čime se sprečava interakcija prirodno javljajućeg liganda sa tim proteinom. To je neograničavajući primer, a stručnjacima iz ove oblasti je jasno da se i drugi primeri izvođenja mogu lako generisati upotrebom tehnika koje su generalno poznate u ovoj oblasti. Videti npr., Gold et al.; 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74,27; Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820; i Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628.
[0248] Ne-nukleotidni linker može da uključi bezbazni nukleotid, polietar, poliamin, poliamid, peptid, ugljeni hidrat, lipid, poliugljovodonik, ili druga polimerna jedinjenja (npr. polietilen glikole kao što su oni koji imaju između 2 i 100 etilen glikol jedinica). Specifični primeri uključuju one opisane od
strane Videtila i Kaiser, Nucleic Acids Res.1990, 18:6353 i Nucleic Acids Res.1987, 15:3113; Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc.1991, 113:6324; Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc.1991, 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Res.1993, 21:2585 i Biochemistry 1993, 32:1751; Durand et al., Nucleic Acids Res.1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287; Jschke et al., Tetrahedron Lett.1993, 34:301;Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914; Arnold et al., WO8902439; Usman et al., WO9506731; Dudycz et al., WO9511910 i Ferentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc.1991, 113:4000.
5'-krajevi, 3'-krajevi, i prepusti
[0249] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) mogu biti zatupljenih krajeva na obe strane, imati prepuste na obe strane, ili kombinaciju zatupljenih krajeva ili krajeva sa prepustima. Prepusti se mogu javiti ili na 5'- ili 3'-kraju smisaonog ili antismisaonog lanca.
[0250] 5'- i/ili 3'-krajevi dvolančanih molekula nukleinske kiseline (npr., siNK) mogu biti tupi krajevi ili imati prepust. Taj 5'-kraj može biti tupi kraj, a 3'-kraj može imati prepust bilo u smisaonom lancu ili antismisaonom lancu. U drugim primerima izvođenja, 3'-kraj može biti tupi kraj, a 5'-kraj može imati prepust bilo u smisaonom lancu ili antismisaonom lancu. U još nekim drugim primerima izvođenja, i 5'- i 3'-kraj su tupi kraj ili oba i 5'- i 3'-krajevi imaju prepuste.
[0251] 5’- i/ili 3’-kraj jednog ili oba lanca nukleinske kiseline mogu da uključe slobodnu hidroksil grupu.
5’- i/ili 3’-kraj bilo kojeg lanca molekula nukleinske kiseline može biti modifikovan da uključi hemijsku modifikaciju. Takva modifikacija može stabilizovati molekule nukleinske kiseline, npr., 3'-kraj može imati povećanu stabilnost zbog prisustva modifikacije molekula nukleinske kiseline. Primeri krajnjih modifikacija (npr., krajnje kape) uključuju, ali nisu ograničeni na, bezbazne, dezoksi bezbazne, invertovane (dezoksi) bezbazne, gliceril, dinukleotidne, aciklično nukleotidne, amino, fluoro, hloro, bromo, CN, CF, metoksi, imidazol, karboksilat, tioat, C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril ili aralkil, OCF3, OCN, O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocikloalkil; heterocikloalkaril; aminoalkilamino; polialkilamino ili supstituisani silil, koje su, između ostalog, opisane u Evropskim patentima EP586520 i EP618925 i druge ovde opisane modifikacije.
[0252] Molekuli nukleinske kiseline uključuju one sa tupim krajevima, tj., krajevima koji ne uključuju bilo koje prepuštajuće nukleotide. molekul nukleinske kiseline može da uključi jedan ili više tupih krajeva. Tupi kraj molekula nukleinske kiseline poseduje broj baznih parova jednak broju nukleotida prisutnih u svakom lancu molekula nukleinske kiseline. Molekul nukleinske kiseline može da uključi jedan tupi kraj, na primer gde 5'-kraj antismisaonog lanca i 3'-kraj smisaonog lanca nemaju bilo kakve prepuštajuće nukleotide. Molekul nukleinske kiseline može da uključi jedan tupi kraj, na primer kada 3'-kraj antismisaonog lanca i 5'-kraj smisaonog lanca nemaju bilo kakve prepuštajuće nukleotide. Molekul nukleinske kiseline može da uključi dva tupa kraja, na primer kada 3'-kraj antismisaonog lanca i 5'-kraj smisaonog lanca kao i 5'-kraj antismisaonog lanca i 3'-kraj smisaonog lanca nemaju bilo kakve prepuštajuće nukleotide. Drugi nukleotidi prisutni u tupom kraju molekula nukleinske kiseline mogu da
1
uključe, na primer, neslaganja, ispupčenja, petlje, ili klimajuće bazne parove za modulisanje aktivnosti molekula nukleinske kiseline radi posredovanja RNK interferencije.
[0253] U određenim primerima izvođenja ovde obezbeđenih molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli), najmanje jedan kraj molekula ima prepust od najmanje jednog nukleotida (na primer jedan do osam nukleotida prepusta). Na primer, jedan ili oba lanca dvolančanog molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan može imati prepust na 5'-kraju ili na 3’-kraju ili na oba. Prepust može biti prisutan ili na nekom ili na oba smisaonom lancu i antismisaonom lancu molekula nukleinske kiseline. Dužine prepusta mogu biti male kolike su i jedan nukleotid i duge koliko su i do osam ili više nukleotida (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 nukleotida; u nekim poželjnim primerima izvođenja prepust je 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 nukleotida; na primer prepust može biti 2 nukleotida. Nukleotid(i) koji formira prepust može uključiti dezoksiribonukleotid(e), ribonukleotid(e), prirodne i ne-prirodne nukleobaze ili bilo koji nukleotid modifikovan u šećeru, bazi ili fosfatnoj grupi kao što je ovde opisano. Dvolančani molekul nukleinske kiseline može imati i 5'- i 3'-prepuste. Prepusti na 5'- i 3'-kraju mogu biti različitih dužina. Prepust može da uključi najmanje jednu modifikaciju nukleinske kiseline koja može biti dezoksiribonukleotid. Jedan ili više dezoksiribonukleotida mogu biti na 5'-kraju.3'-kraj respektivnog kontra-lančanog molekula nukleinske kiseline ne mora imati prepust, poželjnije ne dezoksiribonukleotidni prepust. Jedan ili više dezoksiribonukleotida mogu biti na 3'-kraju.5'-kraj rspektivnog kontra-lanca dsRNK ne mora imati prepust, poželjnije ne dezoksiribonukleotidni prepust. Prepust u bilo kom ili 5'- ili the 3'-kraju lanca može biti jedan do osam (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) neuparenih nukleotida, poželjno, prepust je dva do tri neuparena nukleotida; poželjnije dva neuparena nukleotida. Molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe dupleks molekule nukleinske kiseline sa prepuštajućim krajevima od oko 1 do oko 20 (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20); poželjno jedan do osam (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) nukleotida, na primer, oko 21-nukleotidnih dupleksa sa oko 19 baznih parova i 3'-krajnjim mononukleotidnim, dinukleotidnim, ili trinukleotidnim prepustima. Molekuli nukleinske kiseline ovde mogu da uključe dupleks molekule nukleinske kiseline sa tupim krajevima, pri čemu su oba kraja zatupljena, ili alternativno, gde je jedan od krajeva zatupljen. Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline može da uključi jedan ili više tupih krajeva, tj. gde tupi kraj nema bilo kakve prepuštajuće nukleotide. U jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline tupog kraja ima broj baznih parova jednak broju nukleotida prisutnih u svakom lancu molekula nukleinske kiseline. Molekul nukleinske kiseline može da uključi jedan tupi kraj, na primer gde 5'-kraj antismisaonog lanca i 3'-kraj smisaonog lanca nemaju bilo kakve prepuštajuće nukleotide. Molekul nukleinske kiseline može da uključi jedan tupi kraj, na primer gde 3'-kraj antismisaonog lanca i 5'-kraj smisaonog lanca nemaju bilo kakve prepuštajuće nukleotide. Molekul nukleinske kiseline može da uključi dva tupa kraja, na primer gde 3'-kraj antismisaonog lanca i 5'-kraj smisaonog lanca kao i 5'-kraj antismisaonog lanca i 3'-kraj smisaonog lanca nemaju bilo kakve prepuštajuće nukleotide. U određenim poželjnim primerima izvođenja jedinjenja nukleinske kiseline
2
imaju tupi kraj. Drugi nukleotidi prisutni siNK molekulu sa tupim krajem mogu da uključe, na primer, neslaganja, ispupčenja, petlje, ili klimajuće bazne parove za modulisanje aktivnosti molekula nukleinske kiseline radi posredovanja RNK interferencije.
[0254] U mnogim primerima izvođenja, jedan ili više, ili svi, nukleotida prepusta molekula nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kakvi su ovde opisani uključuju modifikovanje kakvo je ovde opisano; na primer jedan ili više, ili svi, nukleotidi mogu biti 2'-dezoksinukleotidi.
Količina, lokacija i obrasci modifikacija
[0255] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) mogu da uključe modifikovane nukleotide kao procenat ukupnog broja nukleotida prisutnih u molekulu nukleinske kiseline. Kao takvi, molekul nukleinske kiseline može da uključi oko 5% do oko 100% modifikovanih nukleotida (npr., oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% modifikovanih nukleotida). Stvarni procenat modifikovanih nukleotida prisutnih u datom molekulu nukleinske kiseline zavisiće od ukupnog broja nukleotida prisutnih u nukleinskoj kiselini. Ukoliko je molekul nukleinske kiseline jedno-lančani, procentualna modifikacija može bazira se na osnovu ukupnog broja nukleotida prisutnih u jedno-lančanom molekulu nukleinske kiseline. Nalik tome, ukoliko je molekul nukleinske kiseline dvo-lančan, procentualna modifikacija može da se bazira na osnovu ukupnog broja nukleotida prisutnih u smisaonom lancu, antismisaonom lancu, ili u oba i smisaonim i antismisaonim lancima.
[0256] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe nemodifikovanu RNK kao procenat ukupnih nukleotida u molekulu nukleinske kiseline. Kao takvi, molekul nukleinske kiseline može da uključi oko 5% do oko 100% modifikovanih nukleotida (npr., oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% ukupnih nukleotida prisutnih u molekulu nukleinske kiseline.
[0257] Molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) može da uključi smisaoni lanac koji uključuje oko jednu do oko pet, specifično oko 1, 2, 3, 4, ili 5 fosforotioat internukleotidnih veza, i/ili jedan ili više (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, ili više) 2'-dezoksi, 2'OMe, 2'-dezoksi-2'-fluoro, i/ili jedan ili više (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, ili više) univerzalnom bazom modifikovanih nukleotida, i opciono molekul krajnje kape na 3-kraju, 5'-kraju, ili oba 3'- i 5'-kraja smisaonog lanca; i u kojem antismisaoni lanac uključuje oko jedne do oko pet ili više, specifično oko 1, 2, 3, 4, 5, ili više fosforotioat internukleotidnih veza, i/ili jedan ili više (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više) 2'-dezoksi, 2'OMe, 2'-dezoksi-2'-fluoro, i/ili jedan ili više (npr.,oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više) univerzalnom bazom modifikovanih nukleotida, i opciono a molekul krajnje kape na 3’-kraju, 5'-kraju, ili oba 3'- i 5'-kraja antismisaonog lanca. Molekul nukleinske kiseline može da uključi oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više, pirimidin nukleotida smisaonog i/ili antismisaonog lanca nukleinske kiseline koji su hemijski-modifikovani sa 2'-dezoksi, 2'OMe i/ili 2'-dezoksi-2'-fluoro nukleotidima, sa ili bez oko jedan do oko pet ili više, na primer oko 1, 2, 3, 4, 5, ili više fosforotioat internukleotidnih veza i/ili molekula krajnje kape na 3’-kraju, 5'-kraju, ili oba 3'- i 5'-kraja, koja su prisutna u istom ili različitom lancu.
[0258] Molekul nukleinske kiseline može da uključi oko jedna do oko pet ili više (specifično oko 1, 2, 3, 4, 5, ili više) fosforotioat internukleotidnih veza u svakom lancu molekula nukleinske kiseline.
[0259] Molekul nukleinske kiseline može da uključi 2'-5' internukleotidne veze, na primer na 3’-kraju, 5'-kraju, ili oba 3'- i 5'-kraja jednog ili oba lanca sekvence nukleinske kiseline. Dodatno, 2'-5' internukleotidna veza(e) može biti prisutna na raznim drugim položajima u jednom ili oba lanca sekvence nukleinske kiseline, na primer, oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više koji uključuju svaku internukleotidnu vezu pirimidin nukleotida u jednom ili oba lanca siNK molekula koji može da uključi 2'-5' internukleotidnu vezu, ili oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više uključujući svaku internukleotidnu vezu purinskog nukleotida u jednom ili oba lanca siNK molekula ukljuujući 2'-5' internukleotidnu vezu.
[0260] Hemijski-modifikovan molekul kratke ometajuće nukleinske kiseline (siNK) može da uključi antismisaoni region, u kojem bilo koji od (npr., jedan ili više ili svi) pirimidin nukleotida prisutnih u antismisaonom regionu su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi (npr., u kojem su svi pirimidin nukleotidi 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi ili alternativno više pirimidin nukleotida su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi), i u kojem bilo koji od (npr., jedan ili više ili svi) purin nukleotidi prisutni u antismisaonom regionu su 2'-dezoksi purin nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi 2'-dezoksi purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'-dezoksi purin nukleotidi).
[0261] Hemijski-modifikovan molekul kratke ometajuće nukleinske kiseline (siNK) može da uključi antismisaoni region, u kojem bilo koji od (npr., jedan ili više ili svi) pirimidin nukleotida prisutnih u antismisaonom regionu su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi (npr., u kojem su svi pirimidin nukleotidi 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi ili alternativno više pirimidin nukleotida su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi), i u kojem bilo koji od (npr., jedan ili više ili svi) purin nukleotidi prisutni u antismisaonom regionu su 2'OMe purin nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi 2'OMe purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'OMe purin nukleotidi).
[0262] Hemijski-modifikov siNK molekul sposoban da posreduju RNK interferenciju (RNKi) protiv hsp47 unutar ćelije ili rekonstruisan in vitro sistem može da uključi smisaoni region, u kojem su jedan ili više pirimidin nukleotida prisutni u smisaonom regionu 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi (npr., u
4
kojem su svi pirimidin nukleotidi 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi ili alternativno više pirimidin nukleotida su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi), a jedan ili više purin nukleotidi prisutni u smisaonom regionu su 2'-dezoksi purin nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi 2'-dezoksi purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'-dezoksi purin nukleotidi), i antismisaonom regionu, u kojem jedan ili više pirimidin nukleotida prisutnih u antismisaonom regionu su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi (npr., u kojem su svi pirimidin nukleotidi 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi ili alternativno više pirimidin nukleotida su 2'-dezoksi-2'-fluoro pirimidin nukleotidi), a jedan ili više purin nukleotidi prisutni u antismisaonom regionu su 2'OMe purin nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi 2'OMe purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'OMc purin nukleotidi). Smisaoni region i/ili antismisaoni region može imati modifikaciju krajnje kape, kao što je bilo koja modifikacija koja je opciono prisutna na 3’-kraju, 5'-kraju, ili oba 3' i 5'-kraja smisaone i/ili antismisaone sekvence. Smisaoni i/ili antismisaoni region može opciono da dalje uključi 3’-terminalni nukleotidni prepust sa oko 1 do oko 4 (npr., oko 1, 2, 3, ili 4) 2'-dezoksinukleotida. Nukleotidi prepusta mogu dalje da uključe jednu ili više (npr., oko 1, 2, 3, 4 ili više) fosforotioat, fosfonoacetat, i/ili tiofosfonoacetat internukleotid veza. Purin nukleotidi u smisaonom regionu mogu alternativno da budu 2'OMe purin nukleotidi (npr.,u kojem su svi purin nukleotidi 2'OMe purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'OMe purin nukleotidi) i jedan ili više purin nukleotida prisutni u antismisaonom regionu su 2'OMe purin nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi 2'OMe purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'OMe purin nukleotidi). Jedan ili više purin nukleotida u smisaonom regionu mogu alternativno biti purin ribonukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi purin ribonukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su purin ribonukleotidi) i bilo koji purin nukleotidi prisutni u antismisaonom regionu su 2'OMe purin nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi 2'OMe purin nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su 2'OMe purin nukleotidi). Jedan ili više purin nukleotida u smisaonom regionu i/ili prisutni u antismisaonom regionu mogu alternativno biti odabrani iz grupe koju čine 2'-dezoksi nukleotidi, LNK nukleotidi, 2'-metoksietil nukleotidi, 4'-tionukleotidi, i 2'OMe nukleotidi (npr., u kojem su svi purin nukleotidi odabrani iz grupe koju čine 2'-dezoksi nukleotidi, LNK nukleotidi, 2'-metoksietil nukleotidi, 4'-tionukleotidi, i 2'OMe nukleotidi ili alternativno više purin nukleotida su odabrani iz grupe koju čine 2'-dezoksi nukleotidi, LNK nukleotidi, 2'-metoksietil nukleotidi, 4'-tionukleotidi, i 2'OMc nukleotidi).
[0263] U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kako je ovde opisan uključuje modifikovan nukleotid (na primer jedan modifikovan nukleotid) u antismisaonom lancu; na primer na položaju 6 ili položaju 7 antismisaonog lanca.
Obrasci modifikacije i naizmenične modifikacije
[0264] Ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) mogu imati obrasce modifikovane i nemodifikovane nukleinske kiseline. Obrazac modifikacije nukleotida u kontinuiranom pružanju nukleotida može biti modifikacija sadržana unutar jednog nukleotida ili grupe nukleotida koji su kovalentno povezani jedan sa drugim standardim fosfodiestarskim vezama ili, najmanje delimično, fosforotioatnim vezama. Shodno tome, "obrazac" kako se ovde koristi, ne mora nužno da uključi ponavljajuće jedinice, iako može. Primeri obrazaca modifikacije koji se mogu primeniti u konjukciji sa ovde obezbeđenim molekulima nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) uključuju one opisane u Giese, US7452987. Na primer, ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) uključuju one sa obrascima modifikacije kao što je, slično, ili isto kao, obrascima prikazanim putem dijagrama na Fig.2 iz US7452987.
[0265] Modifikovani nukleotid ili grupa modifikovanih nukleotida može biti na 5’-kraju ili 3'-kraju smisaonog ili antismisaonog lanca, flankirajući nukleotid ili grupa nukleotida raspoređeni su na obe strane modifikovanog nukleotida ili grupe, pri čemu je taj flankirajući nukleotid ili grupa ili nemodifikovan ili nema istu modifikaciju prethodnog nukleotida ili grupe nukleotida. Flankirajući nukleotid ili grupa nukleotida može, međutim, da ima različitu modifikaciju. Ta sekvenca modifikovanog nukleotida ili grupe modifikovanih nukleotida, respektivno, i nemodifikovani ili različito modifikovan nukleotid ili grupa nemodifikovanih ili različito modifikovanih nukleotida može se ponoviti jednom ili više puta.
[0266] U nekim obrascima, 5’-krajnji nukleotid lanca je modifikovan nukleotid dok je u drugim obrascima 5’-krajnji nukleotid lanca nemodifikovan nukleotid. U nekim obrascima, 5'-kraj lanca počinje grupom modifikovanih nukleotida dok je u drugim obrascima , 5'-krajnji kraj nemodifikovana grupa nukleotida. Ovaj obrazac može biti ili na prvom pružanju ili na drugom pružanju molekula nukleinske kiseline ili na oba.
[0267] Modifikovani nukleotidi jednog lanca molekula nukleinske kiseline mogu biti komplementarni na položaju do modifikovanih ili nemodifikovanih nukleotida ili grupe nukleotida drugog lanca.
[0268] Može postojati fazni pomak između modifikacije ili obrazaca modifikacija na jednom lancu u odnosu na obrazac modifikacije drugog lanca tako da se modifikacione grupe ne preklapaju. U jednom primeru, pomeraj je takav da modifikovana grupa nukleotida smisaonog lanca odgovara nemodifikovanoj grupi nukleotida antismisaonog lanca i obrnuto.
[0269] Može postojati delimično pomeranje obrasca modifikacije tako da se modifikovane grupe preklapaju. Te grupe modifikovanih nukleotida u bilo kom datom lancu mogu opciono da budu iste dužine, ali mogu biti i različitih dužina. Slično tome, grupe nemodifikovanih nukleotida u bilo kom datom lancu mogu opsiono biti istih dužina, ili različitih dužina.
[0270] U nekim obrascima, drugi (pretposlednji) nukleotid na kraju lanca, je nemodifikovan nukleotid ili početak grupe nemodifikovanih nukleotida. Poželjno, ovaj nemodifikovan nukleotid ili nemodifikovana grupa nukleotida smeštena je na 5’-kraju bilo kog ili oba smisaonog i antismisaonog lanca, a čak poželjnije na kraju smisaonog lanca. Nemodifikovan nukleotid ili nemodifikovana grupa nukleotida može biti smeštena na 5’-kraju smisaonog lanca. U poželjnom primeru izvođenja obrazac se sastoji od naizmenično jednog modifikovanog i nemodifikovanog nukleotida.
[0271] Kod nekih dvolančanih molekula nukleinske kiseline koji uključuju 2'OMe modifikovan nukleotid i ne-modifikovan nukleotid, poželjno nukleotid koji nije 2'OMe modifikovan, koji su uključeni u oba lanca na naizmeničan način, što rezultuje u obrascu naizmeničnih 2'OMe modifikovanih nukleotida i nukleotida koji su ili nemodifikovani ili najmanje ne uključuju 2'OMe modifikaciju. U određenim primerima izvođenja, ista sekvenca 2'OMe modifikacije i ne-modifikacije postoji i na drugom lancu; u drugim primerima izvođenja naizmenični 2'OMe modifikovani nukleotidi prisutni su samo u smisaonom lancu i nisu prisutni u antismisaonom lancu; i u još nekim drugim primerima izvođenja naizmenični 2'OMe modifikovani nukleotidi prisutni su samo u smisaonom lancu i nisu prisutni u antismisaonom lancu. U određenim primerima izvođenja, postoji fazni pomak između ta dva lanca tako da 2'OMe modifikovan nukleotid na prvom lancu bazno se uparuje sa ne-modifikovanim nukleotidom(ima) na drugom lancu i obrnuto. Ovaj određeni redosled, tj. bazno uparivanje 2'OMe modifikovanog i nemodifikovanog nukleotida(a) na oba lanca, naročito je poželjno u određenim primerima izvođenja. U određenim primerima izvođenja, obrazac naizmeničnih 2'OMe modifikovanih nukleotida postoji kroz celokupan molekul nukleinske kiseline; ili celokupan region dupleksa. U drugim primerima izvođenja obrazac naizmeničnih 2'OMe modifikovanih nukleotida postoji samo u delu nukleinske kiseline; ili celokupnog regiona dupleksa.
[0272] U obrascima "faznog pomaka", može biti poželjno ako antismisaoni lanac počinje sa 2'OMe modifikovanim nukleotidom na 5’-kraju dok je shodno tome drugi nukleotid ne-modifikovan, treći, peti, sedmi i tako dalje nukleotidi su prema tome ponovo 2'OMe modifikovani dok su drugi, četvrti, šesti, osmi i tako dalje nukleotidi ne-modifikovani nukleotidi.
Modifikacione lokacije i obrasci
[0273] Dok su primerni obrasci obezbeđeni detaljnije u nastavku, sve permutacije obrazaca sa svim mogućim karakteristikama molekula nukleinske kiseline koji je ovde opisan i poznato u ovoj oblasti su razmatrani (npr., te karakteristike uključuju, ali nisu ograničene na, dužine smisaonog lanca, dužine antismisaonog lanca, dužine regiona dupleksa, dužine prepusta, da li je jedan ili oba kraja dvolančanog molekula nukleinske kiseline zatupljen ili ima prepust, lokacije modifikovane nukleinska kiselina, broj modifikovane nukleinske kiseline, vrste modifikacija, da li molekul nukleinske kiseline ssssvostrukim prepustom ima isti ili različit broj nukleotida na prepustu svake strane, da li se jedna ili više od jedne vrste modifikacije koristi u molekulu nukleinske kiseline, i broj susednih modifikovanih/nemodifikovanih nukleotida). U odnosu na sve detaljne primeri obezbeđene u nastavku, dok jer region dupleksa prikazan kao 19 nukleotida, ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline mogu imati region dupleksa koji se kreće od 1 do 49 nukleotida u dužini dok svaki lanac regiona dupleksa nezavisno može biti 17-49 nukleotida u dužini Primerni obrasci obezbeđeni su ovde.
[0274] Molekuli nukleinske kiseline mogu imati tupi kraj (kada n je 0) na oba kraja koji uključuju pojedinačan ili kontinuirani set modifikovane nukleinske kiseline. Modifikovana nukleinska kiselina može biti smeštena na bilo kom položaju bilo duž smisaonog ili antismisaonog lanca. Molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe grupu od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ili 49 kontinuiranih modifikovanih nukleotida. Modifikovane nukleinske kiseline mogu sačiniti 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 100% lanca nukleinske kiseline. Modifikovane nukleinske kiseline primera koji slede mogu biti samo u smisaonom lancu, samo u antismisaonom lancu, ili i u smisaonom i u antismisaonom lancu.
[0275] Uopšteni obrasci nukleinske kiseline prikazani su u nastavku gde X = nukleotid smisaonog lanca u regionu dupleksa; Xa= 5'-nukleotid prepusta u smisaonom lancu; Xb= 3'-nukleotid prepusta u smisaonom lancu; Y = antinukleotid smisaonog lanca u regionu dupleksa; Ya= 3'-nukleotid prepusta u antismisaonom lancu; Yb= 5'-nukleotid prepusta u antismisaonom lancu; i M = modifikovan nukleotid u regionu dupleksa. Svako a i b nezavisno su 0 do 8 (npr., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8). Svako X, Y, a i b nezavisno su modifikovani ili nemodifikovani. Smisaoni i antismisaoni lanci mogu svaki biti nezavisno 17-49 nukleotida u dužini. Dole obezbeđeni primeri imaju region dupleksa od 19 nukleotida; međutim, ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu imati region dupleksa bilo gde između između 17 i 49 nukleotidi i gde svaki lanac nezavisno ima između 17 i 49 nukleotida u dužini.
[0276] Dalje primerni obrasci molekula nukleinske kiseline prikazani su ispod u kojima X = nemodifikovani nukleotidi smisaonog lanca; x = nemodifikovan nukleotid prepusta u smisaonom lancu; Y = nemodifikovani antinukleotidi smisaonog lanca; y = nemodifikovan nukleotid prepusta u antismisaonom lancu; i M = modifikovan nukleotid. Smisaoni i antismisaoni lanci mogu svaki biti nezavisno 17-49 nukleotida u dužini. Dole obezbeđeni primeri imaju region dupleksa od 19 nukleotida; međutim, ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu imati region dupleksa bilo gde između između 17 i 49 nukleotida i gde svaki lanac nezavisno ima između 17 i 49 nukleotida u dužini.
[0277] Molekuli nukleinske kiseline mogu imati tupe krajeve na oba kraja sa naizmeničnim modifikovanim nukleinskim kiselinama. Modifikovane nukleinske kiseline mogu biti smeštene na bilo kom položaju bilo duž smisaonog ili antismisaonog lanca.
[0278] Molekuli nukleinske kiseline sa zatupljenim 5'-krajem i 3'-krajem imaju prepustni kraj sa jednom modifikovanom nukleinskom kiselinom.
[0279] Molekuli nukleinske kiseline sa 5'-krajem prepusta i zatupljenim 3'-krajem sa jednom modifikovanom nukleinskom kiselinom.
[0280] Molekuli nukleinske kiseline sa prepustima na oba kraja i svi prepusti su modifikovane nukleinske kiseline. U obrascu koji odamh sledi, M je n broj modifikovanih nukleinskih kiselina, pri čemu je n ceo broj od 0 do 8 (tj., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8).
[0281] Molekuli nukleinske kiseline sa prepustima na oba kraja i neki nukleotidi prepusta su modifikovani nukleotidi. U obrascima koji slede odmah ispod, M je n broj modifikovanih nukleotida, x je n broj nemodifikovanih nukleotida prepusta u smisaonom lancu, y je n broj nemodifikovanih nukleotida prepusta u antismisaonom lancu, pri čemu je svako n nezavisno ceo broj od 0 do 8 (tj., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8), i pri čemu je svaki prepust maksimalno 20 nukleotida; poželjno maksimum od 8 nukleotida (modifikovanih i/ili nemodifikovanih).
�
� Modifikovani nukleotidi na 3’-kraju smisaonog regiona.
[0282] Prepust na 3’-kraju antismisaonog regiona.
Modifikovani nukleotid(i) unutar smisaonog regiona
[0283] Primerni molekuli nukleinske kiseline obezbeđeni su u nastavku zajedno sa ekvivalentnom uopštenom strukturom u liniji sa prethodno korišćenim simbolima:
[0284] siHSP47-C siRNK prema humanom i pacovskom hsp47 koji ima 19 nukleotidni (tj., 19mer) region
4
dupleksa i modifikovane 2 nukleotidne (tj., dezoksinukleotidne) prepuste na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
[0285] siHSP47-Cd siRNK prema humanom i pacovskom hsp47 koji ima 25-mer region dupleksa, 2 nukleotidni prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca i 2 modifikovane nukleotide na 5'-krajnjem i pretposlednjim položajima smisaonog lanca.
[0286] siHSP47-1 siRNK prema humanom i pacovskom hsp47 cDNK 719-737 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovan 2 nukleotidne (tj., dezoksinukleotidne) prepuste na 3’-krajevima smisaonim i antismisaonim lancima.
[0287] siHSP47-ld siRNK prema humanom hsp47 cDNK 719-743 koji ima 25-mer sa tupim krajem na 3’-kraju smisaonog lanca i 2 nukleotidni prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca, i 2 modifikovana nukleotida na 5’- krajnjim i pretposlednjim položajima smisaonog lanca.
[0288] siHSP47-2 siRNK prema humanom hsp47 cDNK 469-487 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovana 2 nukleotidna (tj., dezoksinukleotidna) prepusta na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
[0289] siHSP47-2d siRNK prema humanom hsp47 cDNK 469-493 koji ima 25-mer region dupleksa sa tupim krajem na 3’-kraju smisaonog lanca i 2 nukleotidni prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca, i 2 modifikovana nukleotida na 5’- krajnjim i pretposlednjim položajima smisaonog lanca.
[0290] siHSP47-2d pacovska siRNK prema pacovskoj GP46 cDNK 466-490 koja ima 25-mer region dupleksa sa tupim krajem na 3’-kraju smisaonog lanca i 2 nukleotidni prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca, i 2 modifikovana nukleotida na 5’- krajnjim i pretposlednjim položajima smisaonog lanca.
[0291] siHSP47-3 siRNK prema humanom hsp47 cDNK 980-998 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovana 2 nukleotidna (tj., dezoksinukleotidna) prepusta na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
[0292] siHSP47-3d siRNK prema humanom hsp47 cDNK 980-1004 koji ima 25-mer region dupleksa sa tupim krajem na 3’-kraju smisaonog lanca i 2 nukleotidni prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca, i 2 modifikovana nukleotida na 5’- krajnjim i pretposlednjim položajima smisaonog lanca.
[0293] siHSP47-4 siRNK prema humanom hsp47 cDNK 735-753 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovana 2 nukleotidna (tj., dezoksinukleotidna) prepusta na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
[0294] siHSP47-4d siRNK prema humanom hsp47 cDNK 735-759 koji ima 25-mer region dupleksa sa tupim krajem na 3’-kraju smisaonog lanca i 2 nukleotidni prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca, i 2 modifikovana nukleotida na 5’- krajnjim i pretposlednjim položajima smisaonog lanca.
siHSP47-5 siRNK prema humanom hsp47 cDNK 621-639 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovana 2 nukleotidna (tj., dezoksinukleotidna) prepusta na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
siHSP47-6 siRNK prema humanom hsp47 cDNK 446-464 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovana 2 nukleotidna (tj., dezoksinukleotidna) prepusta na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
siHSP47-7 siRNK prema humanom hsp47 cDNK 692-710 koji ima 19-mer region dupleksa, i modifikovana 2 nukleotidna (tj., dezoksinukleotidna) prepusta na 3’-krajevima smisaonih i antismisaonih lanaca.
Urezi i šupljine u lancima nukleinske kiseline
[0295] Ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) mogu imati lanac, poželjno, smisaoni lanac, koji ima ureze i šupljine. Kao takvi, molekuli nukleinske kiseline mogu imati tri ili više lanaca, na primer, kao što je merodupleks RNK (mdRNK) opisan u PCT/US07/081836. Molekuli nukleinske kiseline sa lancem koji ima ureze i šupljine mogu biti između oko 1-49 nukleotida, ili mogu biti RISC dužine (npr., oko 15 do 25 nukleotida) ili Dicer supstrat dužine (npr., oko 25 do 30 nukleotida) kao što je ovde opisan.
[0296] Molekuli nukleinske kiseline sa tri ili više lanaca uključuju, na primer, 'A' (antismisaoni) lanac, 'S1' (drugi) lanac, i 'S2' (treći) lanac u kojem su 'S1' i 'S2' lanci komplementarni i obrazuju bazne parove sa ne-preklapajućim regionima 'A' lanca (npr., mdRNK može imati oblik A:S1S2). S1, S2, ili više lanaca zajedno obrazuju ono što je suštinski slično smisaonom lancu prema 'A' antismisaonom lancu.
Dvolančani region obrazovan povezivanjem 'S1' i 'A' lanaca razlikuje se od i ne-preklapa se sa dvolančanim regionom obrazovanim povezivanjem 'S2' i 'A' lanaca. Molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) može biti molekul "sa prazninom", što znači da ima "šupljinu" koja se kreće od 0 nukleotida pado do oko 10 nukleotida (npr., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida). Poželjno, smisaoni lanac je sa šupljinama. U nekim primerima izvođenja, A:S1 dupleks odvojen je od A:S2 dupleksa šupljinom koja je rezultat najmanje jednog neuparenog nukleotida (pa do oko 10 neuparenih nukleotida) u 'A' lancu koja je smeštena između A:S1 dupleksa i A:S2 dupleksa i koja se razlikuje od bilo kog jednog ili više neuparenih nukleotida na 3’-kraju jednog ili više 'A', 'S1', ili 'S2 lanaca. A:S1 dupleks može biti odvojen od A:B2 dupleksa prazninom od nula nukleotida (tj., urezom u kojem je samo fosfodiestarska veza između dva nukleotida pokidana ili nedostaje u polinukleotidnom molekulu) između A:S1 dupleksa i A:S2 dupleksa-koja se takođe naziva dsRNK sa urezima(ndsRNK). Na primer, A:S1S2 može da uključuju dsRNK koja ima najmanje dva dvolančana regiona koja kombinuju ukupno oko 14 baznih parova do oko 40 baznih parova, a dvolančani regioni su odvojeni prazninom od oko 0 do oko 10 nukleotida, opciono sa tupim krajevima, ili A:S1S2 mogu da uključe dsRNK koja ima najmanje dva dvolančana regiona odvojena prazninom od do deset nukleotida, gde najmanje jedan od dvolančanih regiona uključuju između oko pet baznih parovia i trinaest baznih parova.
Dicer supstrati
[0297] U određenim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK molekuli) mogu biti prekursor "Dicer supstrat" molekul, npr., dvolančana nukleinska kiselina, obrađen in vivo radi proizvodnje aktivnih molekula nukleinske kiseline, na primer kako je opisano u Rossi, US20050244858. U određenim uslovima i situacijama, pronađeno je da ove relativno duže dsRNK siNK vrste, npr., od oko 25 do oko 30 nukleotida, mogu da daju neočekivano efektivne rezultate u smislu potencije i trajanja aktivnosti. Bez želje uza vezivanjem za bilo koju određenu teoriju, smatra se da duže dsRNK vrste služe kao supstrat za enzimski Dicer u citoplazmi ćelije. Pored cepanja dvolančane nukleinske kiseline u kraće segmente, Dicer može da olakša inkorporisanje jedno-lančanog proizvoda cepanja izveden iz pocepane dsRNK u RNK-indukovani kompleks supresije (RISC kompleks) koji je odgovoran za destrukciju citoplazmatične RNK izvedene iz ciljanog gena.
[0298] Dicer supstrati mogu imati određena svojstva koja osnažuju njihovu obradu od strane Dicera. Dicer supstrati su dužine dovoljne tako da se obrađuje od strane Dicera radi proizvodnje aktivnog molekula nukleinske kiseline i mogu dalje da uključe jedan ili više od sledećih svojstava: (i) dsRNK je asimetrična, npr., ima 3'-prepust na prvom lancu (antismisaoni lanac) i (ii) dsRNK ima modifikovan 3'-kraj na antismisaonom lancu (smisaonom lancu) radi usmeravanja orijentacije Dicer vezivanja i obrade dsRNK u aktivnu siRNK. U određenim primerima izvođenja, najduži lanac u Dicer supstratu može biti 24-30 nukleotida.
[0299] Dicer supstrati mogu biti simetrični ili asimetrični. Dicer supstrat može imati smisaoni lanac koji uključuje 22-28 nukleotida i antismisaoni lanac koji može da uključi 24-30 nukleotida; tako, u nekim primerima izvođenja dobijen Dicer supstrat može imati prepust na 3’ kraju antismisaonog lanca. Dicer supstrat može imati smisaoni lanac sa 25 nukleotida u dužini, i antismisaoni lanac sa 27 nukleotida u dužini sa dva bazna 3'-prepusta. Prepust može biti 1-3 nukleotida, na primer 2 nukleotida. Smisaoni lanac može takođe imati 5 '-fosfat.
[0300] Asimetrični Dicer supstrat može dalje da sadrži dva dezoksinukleotida na 3’-kraju smisaonog lanca umesto dva ribonukleotida. Neki primerne dužine i strukture Dicer supstrata su 21+0, 21+2, 21-2, 22+0, 22+1, 22-1, 23+0, 23+2, 23-2, 24+0, 24+2, 24-2, 25+0, 25+2, 25-2, 26+0, 26+2, 26-2, 27+0, 27+2, i 27-2.
[0301] Smisaoni lanac Dicer supstrata može biti između oko 22 do oko 30 (npr., oko 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30); oko 22 do oko 28; oko 24 do oko 30; oko 25 do oko 30; oko 26 do oko 30; oko 26 i 29; ili oko 27 do oko 28 nukleotida u dužini. U određenim poželjnim primerima izvođenja Dicer supstrati sadrže smisaone i antismisaone lance, koji su najmanje oko 25 nukleotida u dužini i ne duži od oko 30 nukleotida; između oko 26 i 29 nukleotida; ili 27 nukleotida u dužini. Smisaoni i antismisaoni lanci mogu biti iste dužine (tupi kraj), različitih dužina (imati prepuste), ili kombinovano. Smisaoni i antismisaoni lanci mogu da postoje na istom polinukleotidu ili na različitim polinukleotidima. Dicer supstrat može imati region dupleksa od oko 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili 27 nukleotida.
[0302] Poput drugih ovde obezbeđenih siNK molekula, antismisaoni lanac Dicer supstrata može imati bilo koju sekvencu koja se povezuje sa antismisaonim lancem pod biološkim uslovima, kao što je unutar citoplazme kukariotske ćelije.
[0303] Dicer supstrati mogu imati bilo kakve modifikacije na nukleotidnoj bazi, šećeru ili fosfatnoj kičmi kako je poznato u ovoj oblasti i/ili kako je ovde opisano za druge molekule nukleinske kiseline (kao što su siNK molekuli). U određenim primerima izvođenja, Dicer supstrati mogu imati smisaoni lanac modifikovan za Dicer obradu pogodnim modifikatorima smeštenim na 3’-kraju smisaonog lanca, tj., dsRNK je dizajnirano za usmeravanje orijentacije Dicer vezivanja i obrade. Pogodni modifikatori uključuju nukleotide kao što su dezoksiribonukleotidi, didezoksiribonukleotidi, aciklo-nukleotidi i slično i sterično sprečene molekule, kao što su fluorescentni molekuli i slično. Aciklo-nukleotidi supstituišu 2-hidroksietoksimetil grupu za-2’-dezoksiribofuranozil šećer normalno prisutan u dNMPs. Drugi nukleotidi modifikatori koji bi se mogli primeniti u Dicer supstrat siNK molekulima uključuju 3'-dezoksiadenozin (kordicepin), 3'-azido-3'-dezoksitimidin (AZT), 2',3'-didezoksiinozin (ddI), 2',3'-didezoksi-3'-tiacitidin (3TC), 2',3'-didehidro-2',3'-didezoksitimidin (d4T) i monofosfatne nukleotide 3’-azido-3’-dezoksitimidina (AZT), 2’,3’-didezoksi-3’-tiacitidina (3TC) i 2’,3’-didehidro-2’,3’-didezoksitimidina (d4T). U jednom primeru izvođenja, dezoksinukleotidi koriste se kao modifikatori. Kada se koriste nukleotidni modifikatori, mogu da zamene ribonukleotide (npr., 1-3 nukleotidni modifikatori, ili 2 nukleotidni modifikatori supstituisani su za za ribonukleotide na 3’-kraju smisaonog lanca) tako da se dužine Dicer supstrata ne menjaju. Kada se primenjuju sterično sprečeni molekuli, oni mogu biti vezani za ribonukleotid na 3’-kraju antismisaonog lanca. Tako, u određenim primerima izvođenja dužine lanca ne menjaju se sa uključivanjem modifikatora. U određenim primerima izvođenja, dve DNK baye u dsRNK supstituisane su u direktnu orijentaciju Dicer obrade antismisaonog lanca. U daljem primeru izvođenja, dve krajnje DNK baze supstituisane su za dva ribonukleotida na 3’-kraju smisaonog lanca koji obrazuju tupi kraj dupleksa na 3’-kraju smisaonog lanca i 5'-kraju antismisaonog lanca, a dva-nukleotidna RNK prepusta smeštena su na 3’-kraju antismisaonog lanca. To je asimetrična kombinacija sa DNK na tupom kraju i RNK bazama prepuštajućem kraju.
[0304] U određenim primerima izvođenja modifikacije su uključene u Dicer supstrat tako da ta modifikacija ne sprečava molekul nukleinske kiseline da se ponaša kao supstrat za Dicer. U jednom primeru izvođenja, izvodi se jedna ili više modifikacija koje ojačavaju Dicer obradu Dicer supstrata. Može se izvesti jedna ili više modifikacija koje rezultuju u efektivnijoj RNKi generaciji. Može se izvesti jedna ili više modifikacija koje podržavaju veći RNKi efekat. Može se izvesti jedna ili više modifikacija koje rezultuju u većoj potenciji za svaki Dicer supstrat koji se dostavlja u ćeliju. Modifikacije može biti uključene u 3'-krajnji region, 5'-krajnji region, u oba the 3'-krajnji i 5'-krajnji region ili na raznim položajima unutar sekvence. Bilo koji broj ili kombinacija modifikacije može se uključiti u Dicer supstrat dokle god ta modifikacija ne sprečava molekul nukleinske kiseline da se ponaša kao supstrat za Dicer. Kada su prisutne višestruke modifikacije, one mogu biti iste ili različite. Razmatrane su modifikacije na bazama, šećernim ostacima, fosfatnoj kičmi, i njihove kombinacije. Bilo koji 5'-kraj može biti fosforilisan.
[0305] Primeri Dicer supstrat modifikacija na fosfatnoj kičmi uključuju fosfonate, koji uključuju metilfosfonat, fosforotioat, i fosfodiestarske modifikacije kao što su alkilfosfodiestri, i slično. Primeri Dicer supstrat modifikacija na šećernom ostatku uključuju 2'-alkil pirimidin, kao što je 2'OMe, 2'-fluoro, amino, i dezoksi modifikacije i slično (videti, npr., Amarzguioui et al., 2003). Primeri Dicer supstrat modifikacija na baznoj grupi uključuju bezbazne šećere, 2-O-alkil modifikovane pirimidine, 4-tiouracil, 5-bromouracil, 5-jodouracil, i 5-(3-aminoalil)-uracil i slično. LNKs takođe mogu biti uključene.
[0306] Smisaoni lanac može biti modifikovan za Dicer obradu pogodnim modifikatorima smeštenim na 3’-kraju smisaonog lanca, tj., Dicer supstrat je dizajniran za usmeravanje orijentacije Dicer vezivanja i obrade. Pogodni modifikatori uključuju nukleotide kao što su dezoksiribonukleotidi, didezoksiribonukleotidi, aciklo-nukleotidi i slično i sterično sprečeni molekuli, kao što su fluorescentni molekuli i slično. Aciklo-nukleotidi supstituišu 2-hidroksietoksimetil grupu za-2’-dezoksiribofuranozil šećer normalno prisutan u dNMPs. Drugi nukleotidi modifikatori mogu da uključe kordicepin, AZT, ddI, 3TC, d4T i monofosfatne nukleotide AZT, 3TC i d4T. U jednom primeru izvođenja, dezoksinukleotidi koriste se kao modifikatori. Kada se koriste nukleotidni modifikatori, 1-3 nukleotid modifikatori, ili 2 nukleotid modifikatori supstituisani su za ribonukleotide na 3’-kraju smisaonog lanca. Kada se primenjuju sterično sprečeni molekuli, oni su vezani za ribonukleotid na 3’-kraju antismisaonog lanca. Tako, dužine lanca se ne menjaju uključivanjem modifikatora. U još jednom primeru izvođenja, u opisu se razmatra supstituisanje dve DNK baze u Dicer supstratu radi usmeravanja orijentacije Dicer obrade antismisaonog lanca. U daljem primeru izvođenja ovog opisa, dve krajnje DNK baze supstituisane su za dva ribonukleotida na 3’-kraju smisaonog lanca obrazujući tupi kraj dupleksa na 3’-kraju smisaonog lanca i 5'-kraju antismisaonog lanca, a dva-nukleotidna RNK prepusta smeštena su na 3’-kraju antismisaonog lanca. To je asimetrična kombinacija sa DNK na tupom kraju i RNK bazama na prepuštajućem kraju.
[0307] Antismisaoni lanac može biti modifikovan za Dicer obradu pogodnim modifikatorima smeštenim na 3’-kraju antismisaonog lanca, tj., dsRNK je dizajnirana za usmeravanje orijentacije Dicer vezivanja i obrade. Pogodni modifikatori uključuju nukleotide kao što su dezoksiribonukleotidi, didezoksiribonukleotidi, aciklo-nukleotidi i slično i sterično sprečeni molekuli, kao što su fluorescentni molekuli i slično. Aciklo-nukleotidi supstituišu 2-hidroksietoksimetil grupu za 2’-dezoksiribofuranozil šećer normalno prisutan u dNMPs. Drugi nukleotidi modifikatori mogu da uključe kordicepin, AZT, ddI, 3TC, d4T i monofosfatne nukleotide AZT, 3TC i d4T. U jednom primeru izvođenja, dezoksinukleotidi koriste se kao modifikatori. Kada se koriste nukleotidni modifikatori, 1-3 nukleotid modifikatori, ili 2 nukleotid modifikatori supstituisani su za ribonukleotide na 3’-kraju antismisaonog lanca. Kada se primenjuju sterično sprečeni molekuli, oni su vezabi za ribonukleotid na 3’-kraju antismisaonog lanca. Tako, dužine lanca se ne menjaju uključivanjem modifikatora. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak razmatra supstituisanje dve DNK baze u dsRNK radi usmeravanja orijentacije Dicer obrade. U daljem opisu, dve krajnje DNK baze smeštene su na 3’-kraju antismisaonog lanca umesto dva
1
ribonukleotida formirajući tupi kraj dupleksa na 5'-kraju smisaonog lanca i 3'-kraju antismisaonog lanca, a dva-nukleotidna RNK prepusta smeštena su na 3’-kraju smisaonog lanca. To je asimetrična kombinacija sa DNK na tupom kraju i RNK bazama na prepuštajućem kraju.
[0308] Dicer supstrati sa smisaonim i antismisaonim lance mogu biti povezani trećom strukturom. Ta treća struktura neće blokirati Dicer aktivnost na Dicer supstratu i neće se mešati u direktnu destrukciju RNK prepisane iz ciljanog gena. Ta treća struktura može biti hemijska vezujuća grupa. Pogodne hemijski vezujuće grupe poznate su u ovoj oblasti i može se koristiti. Alternativno, ta treća struktura može biti oligonukleotid koji vezuje dva oligonukleotida od dsRNK na način tako da se struktura u obliku ukosnice proizvodi nakon povezivanja ta dva oligonukleotida stvarajući Dicer supstrat. Ta struktura u obliku ukosnice poželjno ne blokira Dicer aktivnost na Dicer supstratu ili se ne meša sa direktnom destrukcijom RNK prepisane iz ciljanog gena.
[0309] Nije potrebno da su smisaoni i antismisaoni lanci Dicer supstrata potpuno komplementarni. Potrebno je da su suštinski komplementarni radi povezivanja pod biološkim uslovima i radi obezbeđivanja supstrata za Dicer koji proizvodi siRNK dovoljno komplementarnu sa ciljnom sekvencom.
[0310] Dicer supstrat može imati određena svojstva koja ojačavaju njegovu obradu od strane Dicera. Dicer supstrat može imati dužine dovoljne tako da se obrađuje od strane Dicera radi proizvodnje aktivnih molekula nukleinske kiseline (npr., siRNK) i može imati jedan ili više od sledećih svojstava: Dicer supstrat je asimetričan, npr., ima 3'-prepust na prvom lancu (antismisaoni lanac) i/ili Dicer supstrat ima modifikovan 3' kraj na drugom lancu (smisaoni lanac) radi usmeravanja orijentacije Dicer vezivanja i obrade Dicer supstrata u aktivnu siRNK. Dicer supstrat može biti asimetričan tako da smisaoni lanac uključuje 22-28 nukleotida, a antismisaoni lanac uključuje 24-30 nukleotida. Tako, dobijeni Dicer supstrat ima prepust na 3’ kraju antismisaonog lanca. Prepust je 1-3 nukleotida, na primer dva nukleotida. Smisaoni lanac može takođe imati 5' fosfat.
[0311] Dicer supstrat može imati prepust na 3’-kraju antismisaonog lanca i smisaonog lanca modifikovan za Dicer obradu.5'-kraj smisaonog lanca može imati fosfat. Smisaoni i antismisaoni lanci mogu se povezati pod biološkim uslovima, kao što su uslovi koji se mogu naći u citoplazmi ćelije. Region jednog od lanaca, naročito antismisaonog lanca, Dicer supstrata može imati sekvencu dužine od najmanje 19 nukleotida, u kojoj su ovi nukleotidi u 21-nukleotidnom regionu blizu 3'-kraja antismisaonog lanca i dovoljno su komplementarni nukleotidnoj sekvenci RNK proizvedene iz ciljanog gena. Dicer supstrat takođe može imati jedno ili više od sledećih dodatnih svojstava: antismisaoni lanac ima desni pomeraj od odgovarajućeg 21-mer (tj., antismisaoni lanac uključuje nukleotide na desnoj strani molekula kada se poredi sa odgovarajućim 21-mer), pri čemu lanci ne moraju biti potpuno
2
komplementarni, tj., lanci mogu da sadrže jednostavno neslaganje uparujućih i baznih modifikacija tako da LNK može biti uključena u 5'-kraj smisaonog lanca.
[0312] Antismisaoni lanac molekula nukleinske kiseline Dicer supstrata može biti modifikovan da uključi 1-9 ribonukleotida na 5' –kraju kako bi se obezbedile dužine od 22-28 nukleotida. Kada antismisaoni lanac ima dužine od 21 nukleotida, tada 1-7 ribonukleotida, ili 2-5 ribonukleotida i ili 4 ribonukleotida može biti dodato na 3’-kraj. Dodati ribonukleotidi mogu imati bilo koju sekvencu. Iako dodati ribonukleotidi mogu biti komplementarni sa ciljanom genskom sekvencom, potpuna komplementarnost između ciljane sekvence i antismisaonih lanaca nije neophodna. To jest, dobijeni antismisaoni lanac je dovoljno komplementaran siljanom sekvencom. Smisaoni lanac tako može imati 24-30 nukleotida. Smisaoni lanac može biti suštinski komplementaran sa antismisaonim lancem radi povezivanja sa antismisaonim lancem pod biološkim uslovima. U jednom primeru izvođenja, antismisaoni lanac može biti sintetizovan tako da sadrži modifikovan 3' -kraj radi usmeravanja Dicer obrade. Smisaoni lanac može imati 3' prepust. Antismisaoni lanac može biti sintetizovan da sadrži modifikovan 3' -kraj za Dicer vezivanje i obradu, a smisaoni lanac ima 3' prepust.
Protein 47 toplotnog šoka
[0313] Protein 47 toplotnog šoka (HSP47) je kolagen-specifičan molekularni pratilac i prebiva u endoplazmičnom retikulumu. On ulazi u međsobnu reakciju sa prokolagenom tokom procesa savijanja, slaganja i transportovanja iz endoplazmatičnog retikuluma (Nagata Trends Biochem Sci 1996; 21:22-6; Razzaque et al.2005; Contrib Nephrol 2005; 148: 57-69; Koide et al.2006 J. Biol. Chem.; 281: 3432-38; Leivo et al. Dev. Biol.1980; 76:100-114; Masuda et al. J. Clin. Invest.1994; 94:2481-2488; Masuda et al. Cell Stress Chaperones 1998; 3:256-264). Prijavljeno je da HSP47 ima ushodno regulisanu ekspresiju u raznim tkivima fibroza (Koide et al. J Biol Chem 1999; 274: 34523-26), kao što je ciroza jetre (Masuda et al. J Clin Invest 1994; 94:2481-8), plućna fibroza (Razzaque et al. Virchows Arch 1998; 432:455-60; Kakugawa et al. Eur Respir J 2004; 24: 57-65), i glomeruloskleroza (Moriyama et al. Bubreg Int 1998; 54: 110-19). Primerna sekvenca nukleinske kiseline ciljanog humanog hsp47 cDNK opisana je u GenBank pristupnom broju: NM_001235 , a koja odgovara mRNK sekvenci, na primer kako je navedeno u SEQ ID NO:1. Stručnjaku je jasno da se data sekvenca može vremenom promeniti te prema tome može da uključi bilo koje potrebne izmene u molekulima nukleinske kiseline shodno tome.
[0314] Specifična asocijacija hsp47 sa različitim vrstama kolagena čini HSP47 potencijalnom metom u lečenju fibroze. Inhibicija hsp47 ekspresije može sprečiti ekstracelularnu sekreciju kolagena I. Sato et al. (Nat Biotechnol 2008; 26:431-442) istražili su tu mogućnost upotrebom siRNK za inhibiciju hsp47 ekspresije i sprečavanje progresije hepatične fibroze kod pacova. Slično tome, Chen et al. (Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195) i Wang et al. (Plast. Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7) ispitali su inhibiciju hsp47 ekspresije putem RNK interferencione tehnologije.
Postupci i kombinacije za inhibiranje hsp47
[0315] Obezbeđene su kombinacije i postupci za inhibiciju hsp47 ekspresije upotrebom malih molekula nukleinske kiseline, kao što su molekuli kratke ometajuće nukleinske kiseline (siNK), ometajuće RNK (RNKi), kratke ometajuće RNK (siRNK), dvolančane RNK (dsRNK), mikro-RNK (miRNK), i kratke u obliku ukosnice RNK (shRNK) sposobni da posreduju ili koji posreduju RNK interferenciju protiv hsp47 genske ekspresije. Ovde opisana kombinacija i postupci takođe su korisni u lečenju raznih fibroza kao što je fibroza jetre, fibroza pluća, i fibroza bubrega.
[0316] Molekul(i) nukleinske kiselinei/ili postupci ovog pronalaska koriste se da nishodno regulišu ekspresiju gena(a) koji kodira RNK na koju se odnosi, primera radi, Genbank Accession NM_001235.
[0317] Ovde obezbeđene kombinacije, postupci i kompleti mogu da uključe jedan ili više molekula nukleinske kiseline (npr., siNK) i postupaka koji nezavisno ili u kombinaciju modulišu (npr., nishodno regulišu) ekspresiju hsp47 proteina i/ili gena koji kodiraju hsp47 proteine, proteina i/ili gena koji kodiraju hsp47 (npr., geni koji kodiraju sekvence koje obuhvataju one sekvence koje se odnose na GenBank Pristupne Br. NM_001235), ili člana hsp47 genske familije pri čemu geni ili genska familija deli sekvencionu homologiju povezanu sa održavanjem i/ili razvojem bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa hsp47, kao što je fibroza jetre, ciroza, plućna fibroza, fibroza bubrega, peritonealna fibroza, hronično hepatično oštećenje, i fibrilogeneza. Opis raznih aspekata i primera izvođenja obezbeđen je sa pozivanjem na primerni gen hsp47. Međutim, razni aspekti i primeri izvođenja takođe su usmereni na druge povezane hsp47 gene, kao što su homologni geni i transkript varijante, i polimorfizmi (npr., jedan nukleotidni polimorfizam, (SNPs)) povezani sa određenim hsp47 genima. Kao takvi, razni aspekti i primeri izvođenja takiođe su usmereni na druge gene koji su uključeni u hsp47 posredovane putanje signalne transdukcije ili genske ekspresije koje su uključene, na primer, u održavanje ili razvoj bolesti, karakteristika, ili ovde opisanih stanja. Ti dodatni geni mogu se analizirati na ciljna mesta upotrebom postupaka opisanih za hsp47 gen. Tako, mogu se izvest, odrediti, i izmeriti, kako je ovde opisano, modulacije drugih gena i efekata takvih modulacija drugih gena.
[0318] U jednom primeru izvođenja, ovde obezbeđene kombinacije i postupci uključuju dvolančani molekul kratke ometajuće nukleinske kiseline (siNK) koji nishodno reguliše ekspresiju hsp47 gena (npr., humani hsp47 ilustrovan sa SEQ ID NO:1), pri čemu taj molekul nukleinske kiseline uključuje oko 15 do oko 49 baznih parova.
4
[0319] U jednom primeru izvođenja, opisana nukleinska kiselina može se primeniti za inhibiranje ekspresije hsp47 gena ili hsp47 genske familije kada sekvence tih gena ili genske familije dele sekvencionu hologiju. Takve homologne sekvence mogu se identifikovati kako je poznato u ovoj oblasti, na primer upotrebom sekvencionih poravnavanja. Molekuli nukleinske kiseline mogu biti dizajniran da cilja takve homologne sekvence, na primer upotrebom perfektno komplementarne sekvence ili inkorporisanjem ne-kanonskih baznih parova, na primer neslaganja i/ili klimajućih baznih parova koji obezbeđuju dodatnu ciljanu sekvencu. U slučajevima u kojima su identifikovana neslaganja, nekanonskih bazni parovi (na primer, neslaganja i/ili klimajuće baze) mogu se primeniti za generisanje molekula nukleinske kiseline koji ciljaju više od jedne genske sekvence. U neograničavajućem primeru, ne-kanonski bazni parovi kao što je UU i CC bazni parovi koriste se da generišu molekule nukleinske kiseline koji su sposobni za ciljanje sekvenci radi razlikovanja hsp47 meta koje dele sekvencionu homologiju. Kao takvi, jedna prednost upotrebe ovde opisanih siNKs jeste jedna nukleinska kiselina može biti dizajnirana da uključi sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci koja je konzervirana između homolognih gena. U tom pristupu, jedna nukleinska kiselina može se primeniti za inhibiranje ekspresije više od jednogh gena umesto upotrebe više od jednog molekula nukleinske kiseline za ciljanje različitih gena.
[0320] Molekuli nukleinske kiseline mogu se primeniti za ciljanje konzerviranih sekvenci koje odgovaraju genskoj familiji ili genskim familijama kao što je hsp47 genska familija. Kao takvi, molekuli nukleinske kiseline koji ciljaju višestruke hsp47 mete mogu da obezbede povećan terapeutski efekat. Dodatno, nukleinska kiselina se može primeniti za karakterizovanje putanja genske funkcije u raznim primenama. Na primer, molekuli nukleinske kiseline mogu se primeniti za inhibiranje aktivnosti ciljanog gena(a) u putanjama radi određivanja funkcije nekarakterizovanog gena(a) u analizi genskih funkcija, analizi mRNK funkcija, ili translacionoj analizi. Molekuli nukleinske kiseline mogu se primeniti za određivanje potencijalnih putanji ciljanog gena uključenih u razne bolesti i stanja ka farmaceutskom razvoju. Molekuli nukleinske kiseline mogu se upotrebiti za shvatanje putanja genske ekspresije uključenih u, na primer fibroze kao što je fibroza jetre, bubrega ili pluća, i/ili zapaljenske i proliferativne karakteristike, bolesti, poremećaji, i/ili stanja.
[0321] U jednom primeru izvođenja, ovde obezbeđene kombinacije i postupci uključuju molekul nukleinske kiseline sa RNKi aktivnošću protiv hsp47 RNK, gde taj molekul nukleinske kiseline uključuje sekvencu komplementarnu bilo kojoj RNK koja ima hsp47 kodirajuću sekvencu, kao što su one sekvence koje imaju sekvence kakve su prikazane u Tabeli 3. U još jednom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline može imati RNKi aktivnost protiv hsp47 RNK, gde molekul nukleinske kiseline uključuje sekvencu komplementarnu sa RNK koja ima varijantu hsp47 kodirajuće sekvence, na primer druge mutant hsp47 geni koji nisu prikazani u Tabeli 3, ali su poznati u ovoj oblasti koji su povezani sa održavanjem i/ili razvojem fibroze. Hemijske modifikacije kakve su prikazane u Tabeli 3 ili na drugi način ovde opisane, mogu se primeniti na bilo koji ovde opisan konstrukt nukleinske kiseline. U još jednom primeru izvođenja, ovde opisan molekul nukleinske kiseline uključuje nukleotidnu sekvencu koja može da uđe u međusobnu reakciju sa nukleotidnom sekvencom hsp47 gena i čime se posreduje utišavanje hsp47 genske ekspresije, na primer, u kojoj molekul nukleinske kiseline posreduje regulaciju hsp47 genske ekspresije ćelijskim procesima koji modulišu hromatin strukturu ili metilacione obrasce hsp47 gena i sprečavaju transkripciju hsp47 gena.
[0322] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu imati RNKi aktivnost protiv hsp47 RNK, gde ti molekul nukleinske kiseline uključuje sekvencu komplementarnu bilo kojoj RNK koja ima hsp47 kodirajuću sekvencu, kao što su one sekvence sa GenBank Pristupnim Br. NM_001235. Molekuli nukleinske kiseline mogu imati RNKi aktivnost protiv hsp47 RNK, gde taj molekul nukleinske kiseline uključuje sekvencu komplementarnu sa RNK koja ima varijantu hsp47 kodirajuće sekvence, na primer druge mutant hsp47 gene poznate u ovoj oblasti koji bi se povezali sa održavanje i/ili razvojem fibroze.
[0323] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline uključuju nukleotidnu sekvencu koja može da uđe u unakrsnu reakciju sa nukleotidnom sekvencom hsp47 gena i čime se posreduje utišavanje hsp47 genske ekspresije, npr., gde molekul nukleinske kiseline posreduje regulaciju hsp47 genske ekspresije ćelijskim procesima koji modulišu hromatin strukturu ili metilacione obrasce hsp47 gena i sprečavaju transkripciju hsp47 gena.
Postupci tretiranja
[0324] Specifična asocijacija hsp47 sa različitim vrstama kolagena čini hsp47 metom za lečenje fibroze. Inhibicija hsp47 ekspresije može sprečiti ekstracelularnu sekreciju kolagena I. Sato et al. (Nat Biotechnol 2008; 26:431-442) istražili su tu mogućnost upotrebom siRNK za inhibiciju hsp47 ekspresije i sprečavanje progresije hepatične fibroze kod pacova. Slično tome, Chen et al. (Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195) i Wang et al. (Plast Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7) ispitali su inhibiciju hsp47 ekspresije putem RNK interferencione tehnologije.
[0325] U jednom primeru izvođenja, molekuli nukleinske kiseline mogu se upotrebiti da niskodno regulišu ili inhibiraju ekspresiju hsp47 i/ili hsp47 proteina koji proizilaze iz hsp47 i/ili hsp47 haplotip polimorfizama koji su povezani sa bolešću ili stanjem, (npr., fibroza). Analiza hsp47 i/ili hsp47 gena, ili hsp47 i/ili hsp47 proteina ili RNK nivoa može se upotrebiti za identifikovanje subjekata sa takvim polimorfizmima ili onih subjekata koji su u riziku od razvoja ovde opisanih karakteristika, stanja, ili bolesti. Ti subjekti su pogodni za lečenje, na primer, tretiranjem ovde opisanim molekulima nukleinske kiseline i bilo kojom drugom kombinacijom korisnom u lečenju bolesti povezanih sa hsp47 i/ili hsp47 genskom ekspresijom. Kao takva, analiza hsp47 i/ili hsp47 proteina ili RNK nivoa može se upotrebiti za određivanje tretmanskog tipa i kursa terapije u lečenju subjekta. Praćenje hsp47 i/ili hsp47 proteina ili RNK nivoa može se upotrebiti za predviđanje ishoda tretiranja i za određivanje efikasnosti jedinjenja i kombinacija koje modulišu nivo i/ili aktivnost određenog hsp47 i/ili hsp47 proteina povezanih sa karakteristikom, stanjem, ili bolešću.
[0326] Obezbeđene su kombinacije i postupci za inhibiciju hsp47 ekspresije upotrebom malih molekula nukleinske kiseline kakvi su ovde obezbeđeni, kao što su molekuli siNK, RNKi, siRNK, dvolančane RNK (dsRNK), mikro-RNK (miRNK), i kratke u obliku ukosnice RNK (shRNK) sposobni da posreduju ili koji posreduju RNK interferenciju protiv hsp47 genske ekspresije. Ovde opisana kombinacija i postupci takođe su korisni u lečenju raznih fibroza kao što je fibroza jetre, fibroza pluća, i fibroza bubrega.
[0327] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline pojedinačno, ili u kombinaciji ili u konjukciji sa drugim lekovima, mogu se primeniti za sprečavanje ili lečenje bolesti, karakteristike, stanja i/ili poremećaja povezanih sa hsp47, kao što je fibroza jetre, ciroza, plućna fibroza, fibroza bubrega, peritonealna fibroza, hronično hepatično oštećenje, i fibrilogeneza.
[0328] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline sposobni su da inhibiraju ekspresiju hsp47 na sekvenca specifičan način. Molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe smisaoni lanac i antismisaoni lanac koji uključuju kontinuirane nukleotie koji su najmanje delimično komplementarni (antismisaoni) sa hsp47 mRNK.
[0329] U nekim primerima izvođenja, dsRNK specifična za hsp47 može se primeniti u konjukciji sa drugim dsRNK specifičnim za druge molekularne pratioce koji učestvuju u savijanju novo sintetizovanih proteina kao što je, ckalneksin, kalretikulin, i/ili BiP (Bergeron et al. Trends Biochem. Sci.1994; 19:124-128; Herbert et al.1995; Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.60:405-415)
[0330] Fibroza se može lečiti RNK interferencijom upotrebom molekula nukleinske kiseline kakvi su ovde opisani. Primerni fibroze uključuju fibrozu jetre, peritonealnu fibrozu, fibrozu pluća, fibrozu bubrega. Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu da inhibiraju ekspresiju hsp47 na sekvenca specifičan način.
[0331] Lečenje fibroze može se pratiti određivanjem nivoa ekstracelularnog kolagena upotrebom pogodnih tehnika poznatih u ovoj oblasti kao što je, upotrebom anti-kolagen I antitela. Lečenje se takođe može pratiti određivanjem nivoa hsp47 mRNK ili nivoa hsp47 proteina u ćelijama pogođenog tkiva. Lečenje se takođe može pratiti neinvazivnim skeniranjem pogođenog organa ili tkiva kao što je pomoću kompjuterskog tomografskog skeniranja, skeniranja elastografije magnetnom rezonancom.
[0332] Postupak za lečenje ili sprečavanje hsp47 povezane bolesti ili stanjea kod subjekta ili organizma može da uključi dovođenje u kontakt subjekta ili organizma sa molekulom nukleinske kiseline kakav je ovde obezbeđen pod uslovima pogodnim za modulisanje ekspresije hsp47 gena kod subjekta ili organizma.
[0333] Postupak za lečenje ili sprečavanje fibroze kod subjekta ili organizma može da uključi dovođenje u kontakt subjekta ili organizma sa molekulom nukleinske kiseline pod uslovima pogodnim za modulisanje ekspresije hsp47 gena kod tog subjekta ili organizma.
[0334] Postupak za lečenje ili sprečavanje jedne ili više fibroza koja je odabrana iz grupe koju čine fibroza jetre, fibroza bubrega, i plućna fibroza kod subjekta ili organizam može da uključi dovođenje u kontakt subjekta ili organizma sa molekulom nukleinske kiseline pod uslovima pogodnim za modulisanje ekspresije hsp47 gena kod tog subjekta ili organizma.
Fibrozne bolesti
[0335] Fibrozne bolesti su one koje su generalno okarakterisane prekomernim deponovanjem fibroznog materijala unutar ekstracelularnog matriksa, što doprinosi abnormalnim promenama u tkivnoj arhitekturi i utiče na normalno funkcionisanje organa.
[0336] Sva tkiva oštećena povredom odgovaraju započinjanjem programa za zarastanje rana. Fibroza, vrsta poremećaja okarakterisana prekomernim formiranjem ožiljaka, javlja se kada je normalan odgovor samo-ograničavajućeg zarastanja rana poremećen, i izaziva prekomernu proizvodnuju i deponovanje kolagena. Kao rezultat, normalno tkivo organa menja se tkivom ožiljka, što vremenom vodi ka prestanku rada tog organa.
[0337] Fibroza može biti inicirana različitim uzrocima i u različitim organima. Ciroza jetre, plućna fibroza, sarkoidoza, keloidi i fibroza bubrega su sve hronična stanja povezana sa progresivnom fibrozom, čime se izaziva kontinulani gubitak normalne funkcije tkiva.
[0338] Akutna fibroza (obično sa iznenadnim i ozbiljnim započinjanjem i kratkog trajanja) javlja se kao uobičajen odgovor na različite oblike povreda koje uključuju slučajne povrede (naročito povrede kičme i centralnog nervnog sistema), infekcije, operaciju, ishemijsku bolest (npr. formiranje ožiljaka na srcu praćeno infarktom), opekotine, zagađivače životne sredine, alkohol i druge vrste toksina, akutni respiratorni distres sindrom, radijaciono i hemoterapijsko lečenje).
[0339] Fibroza, sa fibrozom povezana patologija ili patologija povezana sa nestandardnim umrežavanjem ćelijskih proteina sve se mogu tretirati ovde opisanim siRNKs. Fibrozne bolesti ili bolesti u kojoj je fibroza evidentna (sa fibrozom povezana patologija) uključuju i akutne i hronične oblike fibroze organa, koje uključuju sve etiološke varijante sledećih: plućna fibroza, koja uključuje intersticijalnu plućnu bolest i fibrotičnu plućnu bolest, fibroza jetre, srčana fibroza koja uključuju miokardijalnu fibrozu, fibroza bubrega koja uključuje hronični otkazivanje bubrega, fibroza kože koja uključuje sklerodermu, keloidi i hipertrofični ožiljci; mijelofibroza (fibroza koštane srži); sve vrste formiranja ožiljaka u oku koje uključuje proliferativne vitreoretinopatije (PVR) i formiranje ožiljaka koje je rezultat operacije radi lečenja katarakte ili glaukoma; zapaljenska bolest creva različite etiologije, makularna degeneracija, Grave-ova oftalmopatija, ergotizam indukovan nekom supstancom, keloidni ožiljci, skleroderma, psorijaza, glioblastom u Li-Fraumeni sindromu, sporadični glioblastom, mileoidna leukemija, akutna mijelogenus leukemia, mijelodisplastični sindrom, mijeloproferativni sindrom, ginekološki kancer, Kaposijev sarkom, Hansen-ova bolest, i kolagenozni kolitis.
[0340] U raznim primerima izvođenja, jedinjenja (molekuli nukleinske kiseline) kakva su ovde opisana mogu se upotrebiti za lečenje fibroznih bolesti, na primer kakve su ovde opisane, kao i mnogih drugih bolesti i stanja nevezana za fibrozne bolesti, na primer kao što je ovde opisano. Drua stanja koja se mogu lečiti uključuju fibrozne bolesti u drugim organima - fibroza bubrega bilo kog uzroka (CKD koja uključuje ESRD); fibroza pluća (koja uključuje ILF); mijelofibroza, abnormalno stvaranje ožiljaka (keloidi) povezano sa svim mogućim vrstama kožnih povreda slučajnim i jatrogenim (operacije); skleroderma; kardiofibroza, neuspeh operacije filtriranja glaukoma; crevne priraslice.
Operacija oka i fibrotične komplikacije
[0341] Kontraktura tkiva ožiljka koja je rezultat operacije oka, često se može javiti. Operacija glaukoma kojom bi se stvorili novi drenažni kanali često ne uspeva zbog formiranja ožiljaka i kontrakcije tkiva, a generisani drenažni sistem može biti blokiran zahtevajući dodatnu hiruršku intervenciju. Trenutni režimi protiv formiranja ožiljaka (Mitomycin C ili 5FU) ograničeni su zbog uključenih komplikacija
(npr. slepilo) npr. videti Cordeiro MF, et al., Human anti-transforming rast factor-beta2 antibody: a new glaucoma anti-scarring agent Invest Ophthalmol Vis Sci.1999 Sep;40(10):2225-34. Takođe može postojati kontrakcija tkiva ožiljka obrazovanog nakon povrede rožnjače ili operacije rožnjače, na primer laserkog ili hirurškog lečenja kratkovidosti ili refrakcione greške u kojoj kontrakcija tkiva mogu dovesti do nepreciznih rezultata. Tkivo ožiljka može se formirati na/u staklastom telu ili mrežnjači, na primer, i vremenom mogu izazvati slepilo kod nekih dijabetičara, i može se formirati nakon operacije dvajanja, nazivajući se proliferativne vitreoretinopatije (PVR). PVR je naučestalija komplikacija praćena odvajanjem mrežnjače i povezana je sa rupom ili cepanjem mrežnjače. PVR se odnosi rast ćelijskih membrana unutar staklaste šupljine i na prednjim i zadnjim površinama mrežnjače koje sadrže retinalni pigmentni epitel (RPE) ćelije. Ve membrane, koje su suštinski tkiva ožiljka, ispoljavaju trakciju na mrežnjaču i mogu da rezultuju kao recidiv odvajanja mrežnjače, čak i nakon uspešne operacije odvajanja mrežnjače.
[0342] Tkivo ožiljka može se formirati u očnoj šupljini ili na mišićima oka i kapaka nakon operacije zrikavosti, očne šupljine ili kapka, ili tiroidne bolesti očiju, i kada se javlja formiranje ožiljaka konjuktive koje se može desiti nakon operacije glaukoma ili kod cikatricijske bolesti, zapaljenske bolesti, na primer, pemfigoid, ili infektivne bolesti, na primer, trahome. Dodatni očni problemi povezani sa kontrakcijom tkiva koja uključuju kolagena predstavljaju zamućenje i kontrakturu kapsule sočiva nakon ekstakcije katarakte. Značajna uloga MMPs prepoznata je u kod očnih bolesti koje uključuju zarastanje rana, suvo oko, sterilna ulceracija rožnjače, rekurentna epitelijalna erozija, neovaskularizacija rožnjače, pterigijum, konjuktivnohalaza, glaukom, PVR, i očna fibroza.
Fibroza jetre
[0343] fibroza jetre (LF) je generalno nepovratna posledica ošteđenja jetre nekoliko etiologija. Na Zapadu, glavna etiološke kategorije su: alkoholna bolest jetre (30-50%), virusni hepatitis (30%), bilijarna bolest (5-10%), primarna hemohromatoza (5%), i ciroza povezana sa nekom supstancom i kriprogena ciroza, nepoznate etiologije, (10-15%). Wilson-ova bolest, α1-antitripsin deficijencija i druge retke bolesti imaju fibrozu jetre kao jedan od simptoma. Ciroza jetre, krajnji stadijum fibroze jetre, trenutno zahteva transplantaciju jetre i spada u prvih deset uzroka smrti na Zapadu.
Fibroza bubrega i povezana stanja
Hronična bubrežna insuficijencija (CRF)
[0344] Hronična bubrežna insuficijencija je postepen i progresivan gubitak sposobnosti bubrega da izluče štetne materije, koncentruju urin, i sačuvaju elektrolite. CRF je sporo progresivna. Najčešće rezultuje iz bilo koje bolesti koja izaziva postepen gubitak bubrežne funkcije, a fibroza je glavna patologija koja proizvodi CRF.
Dijabetična nefropatija
[0345] Dijabetična nefropatija, čija su obeležja glomeruloskleroza i tubulointersticijalna fibroza, je jedan od najčešćih uzroka krajnjeg stadijuma bubrežne bolesti u modernom svetu, i dijabetični pacijenti čine najveću populaciju na dijalizi. Takva terapija je skupa i daleko od optimalne. Transplantacija pruža bolji ishod, ali pati od teškog nedostatka donora.
1
Hronična bolest bubrega
[0346] Hronična bolest bubrega (CKD) je svetski problem javnog zdravlja i prepoznata je kao učestalo stanje koje je povezano sa povišenim rizikom od kardiovaskularne bolesti i hronične bubrežne insuficijencije (CRF).
[0347] Inicijativa za kvalitetan ishoda bolesti bubrega (K/DOQI) Nacionalne bubrežne fondacije (NKF) definiše hroničnu bolest bubrega ili kao oštećenje bubrega ili smanjenu brzinu glomerularne filtracije bubrega (GFR) tokom tri ili više meseci. Drugi pokazivači CKD su takođe poznati i primenjuju se za dijagnoziranje. Generalno, uništavanje mase bubrega sa nepovratnom sklerozom i gubitak nefrona vodi ka progresivnog pada u GFR. Nedavno, K/DOQI je objavila klasifikaciju stadijuma CKD, koja je kako sledi: Stadijum 1: Oštećenje bubrega sa normalnom ili uvećanom GFR (>90 mL/min/1.73 m2)
Stadijum 2: Blago smanjenje GFR (60-89 mL/min/1.73 m2)
Stadijum 3: Umereno smanjenje GFR (30-59 mL/min/1.73 m2)
Stadijum 4: Značajno smanjenje GFR (15-29 mL/min/1.73 m2)
Stadijum 5: Otkazivanje bubrega (GFR <15 mL/min/1.73 m2 ili dijaliza)
[0348] U stadijumima 1 i 2 CKD, GFR sama ne potvrđuje dijagnozu. Može se osloniti na druge pokazivače oštećenja bubrega, koji uključuju abnormalnosti u kombinaciji krvi ili urina ili abnormalnosti prilikom snimanja.
Patofiziologija CKD
[0349] Približno 1 milion nefrona prisutno je u svakom bubregu, pri čemu svaki doprinosi ukupnoj GFR. Bez obzira na etiologiju povrede bubrega, sa progresivnom destrukcijom nefrona, bubreg može da održi GFR hiperfiltracijom i kompenzatornom hipertrofijom preostalih zdravih nefrona. Ova prilagodljivost nefrona omogućava nastavljen normalan klirens plazma rastvora tako da supstance kao što je urea i kreatinin počinju da pokazuju značajno povećanje u plazma nivoima samo nakon ukupnog GFR smanjenja do 50%, kada je bubrežna rezerva iscrpljena. Vrednosti kreatinina u plazmi približno je udvostručeno sa 50% smanjenjem u GFR. Prema tome, udvostručavanje u kreatininu iz plazme u odnosu na vrednost osnovne linije od 0.6 mg/dL do 1.2 mg/dL kod pacijenta zapravo predstavlja gubitak 50% mase funkcionišućih nefrona.
[0350] Preostala nefronska hiperfiltracija i hipertrofija, iako korisne iz navedenih razloga, smatra se da predstavljaju glavni uzrok progresivne bubrežne disfunkcije. Smatra se da se do javlja zbog povišenog glomerularnog kapilarnog pritiska, koji oštećuje kapilare i vodi inicijalno ka fokalnoj i segmentacionoj glomerulosklerozi, a vremenom do opšte glomeruloskleroze. Ova hipoteza je bazirana na ispitivanjima
1 1
pet šestina nefrorectomizovanih pacova, kod kojih su se razvile lezije koje su odentične onima primećenim kod ljudi sa CKD.
[0351] Dva najučestalija uzroka hronične bolesti bubrega su dijabetes i hipertenzija. Drugi faktori uključuju akutna napade nefrotoksina, koji uključuju agense za kontrast, ili smanjenu perfuziju; proteinuriu; povišenu bubrežnu amonijagenezu sa intersticijalnom povredom; hiperlipidemiu;
Hiperfosfatmiu sa deponovanjem kalcijum fosfata; smanjenje nivoe nitroznog oksida i pušenje.
[0352] U Sjedinjenim Državama, incidenca i prevalenca CKD je u porastu, sa slabim ishodima i velikim troškovima prema zdravstvenom sistemu. Bolest bubrega je deveti vodeći uzrok smrti u US. Visok stepen mortaliteta doveo je da Mandat saveta američkih hirurga za američko građanstvo, pod nazivom Healthy People 2010, da sadrži odeljak fokuisan na CKD. Predmeti ovog odeljka bili su da se artikulišu ciljevi i da se obezbede strategije radi smanjivanja incidence, morbidnosti, mortaliteta, i zdravstvenih troškova hronične bolesti bubrega u Sjedinjenjim Državama.
[0353] Stope incidence krajnjeg stadijuma bubrežne bolesti (ESRD) stalno se povećavaju na međunarodnom nivou od 1989. Sjedinjenje Države imaju najveću stopu incidence ESRD, nakon Japana. Japan ima najvišu prevalencu na milionskoj populaciji nakon Sjedinjenjih Država.
[0354] Stope mortaliteta povezane sa hemodijalizom su uepčatljive i ukazuju da je očekivano trajanje života pacijenata koji ulaze u hemodijalizu značajno skraćeno. U bilo kom dobu, pacijenti sa ESRD na dijalizi imaju značajno povišen mortalitet kada se uporedi sa pacijentima koji nisu na dijalizi i pojedincima koji ne boluju od bolesti bubrega. U dobu od 60 godina, zdrava osoba može da očekuje da će živeti još više od 20 godina, dok je očekivano trajanje života 60-godišnjaka koji je započeo sa hemodijalizom blizu 4 godine.
Plućna fibroza
[0355] Intersticijalna plućna fibroza (IPF) je formiranje ožiljaka na plućima izazvano raznim udahnutim agensima koji uključuju mineralne čestice, organsku prašinu, i oksidantne gasove, ili nepoznatim razlozima (idiopatska fibroza pluća). Bolest pogađa milione pojedinaca širom sveta, i ne postiji efektivni terapeutski pristupi. Glavni razlog za manjak korisnog lečenja je da je mali broj molekularnih mehanizama bolesti definisano dovoljno čime bi se konstruisali pogodni ciljevi terapije (Lasky, et al., 2000, Environ Health Perspect;108:751-62).
Fibroza srca
1 2
[0356] Srčana insuficijencija je jedinstvena među glavnim kardiovaskularnim poremećajima jer se ona samo povećava u rasprostranjenosti, dok je uočen pad u drugim uslovima. Neki od njih se mogu pripisati starenju populacija Sjedinjenjih Država i Evrope. Sposobnost da se spase pacijenti sa miokardijalnim oštećenjem je takođe glavni faktor, budući da ovi pacijenti mogu da razviju progresiju leve ventrikularne disfunkcije zbog štetnog remodeliranja srca.
[0357] Normalan miokardium je sačinjen od različitih ćelija, srčanih miocita i nekardiomiocita, koji uključuju endotelijalne i vaskularne ćelije glatkih mišića i fibroblaste.
[0358] Strukturalno remodelovanje ventrikularnog zida je klučni pokazatelj kliničkog ishoda kod srčane bolesti. Takvo remodelovanje uključuje proizvodnju i uništavanje ekstracelularnih proteina matriksa, ćelijsku proliferaciju i migraciju, i apoptotsku i nekrotičnu ćelijsku smrt. Srčani fibroblasti su značajno uključeni u ove procese, proizvodeći faktore rasta i citokine koji deluju kao autokrini i parakrini faktori, kao i ekstracelularni proteini matriksa i proteinaze. Nedavna ispitivanja su pokazala da su interakcije između srčanih fibroblasta i kardiomiocita glavne za progresiju srčanog remodelovanja čiji je umreženi efekat pogoršanje srčane funkcije i početak otkazivanja srca (Manabe, et al., 2002, Circ Res.13:1103-13).
Opekotine i ožiljci
[0359] Poseban problem koji se može javiti, naročito kod fibrotične bolesti, jeste kontrakcija tkiva, na primer kontrakcija ožiljaka. Kontrakcija tkiva koja uključuju ekstracelularne komponente matriksa, naročito tkiva koja uključuju kolagen, može se javiti u vezi sa mnogim različitim patološkim stanjima i sa hirurškim ili kozmetičkim procedurama. Kontraktura, na primer, ožiljaka, može da izazove fizičke probleme, koji mogu dovesti do potrebe za medicinskim lečenjem, ili može izazvati probleme čisto kozmetičke prirode. Kolagen je glavna komponenta ožiljka i drugog kontrahovanog tkiva i kao takav je treba da se shvati kao najznačajnija strukturalna komponenta. I pored toga, ožiljak i drugo kontrahovano tkivo takođe uključuju druge strukturalne komponente, naročito druge ekstracelularne komponente matriksa, na primer, elastin, koji takođe može da doprinese kontrakciji tkiva.
[0360] Kontrakcija tkiva koje uključuje kolagen, koje takođe može da uključuje druge ekstracelularne komponente matriksa, često se javlja tokom zarastanja opekotina. Opekotine mogu biti hemijske, toplotne ili radijacione opekotine i može biti na oku, površini kože ili kože i tkiva koje se nalazi ispod nje. Takođe se možće desiti da se jave opekotine unutrašnjeg tkiva, na primer, izazvane radijacionim lečenjem. Kontrakcija opečenog tkiva često je problem i može dovesti do fizičkih i/ili kozmetičkih problema, na primer, gubitak kretanja i/ili onesposobljavanje.
1
[0361] Kožni graftovi mogu se primeniti iz različitih razloga i mogu često da podlegnu kontakciji nakon nanošenja. Što se tiče lečenja spaljenog tkiva, kontrakcija može dovesti i do fizičkih i do kozmetičkih problema. Naročito je ozbiljan problem kada je neophodno mnogo kožnih graftova što je, na primer, u slučaju ozbiljnih opekotina.
[0362] Kontrakcija je takođe problem u proizvodnji veštačke kože. Kako bi se izradila prava veštačka koža, potrebno je posedovati epidermis izrađen od epitelijalnih ćelija (keratinocita) i dermis izrađen od kolagena nastanjen fibroblastima. Važno je da postoje obe vrste ćelija jer se međusobno signaliziraju i stimulišu upotrebom faktora rasta. Komponenta kolagena veštačke kože često kontahuje manje od desetine svoje originalne površine kada je nastanjena fibroblastima.
[0363] Cikatricijska kontrakcija, kontrakcija skraćivanja fibroznog tkiva ožiljka, je česta. U nekim slučajevima ožiljak može postati opasan cicatriks, ožiljak čija kontrakcija izaziva ozbiljnu deformaciju. Želudac pacijenta se može efikasno odvojiti na dve odvojene komore u kontrakturi peščanog sata kontrahovanjem tkiva ožiljka obrazovanog kada zarastaju čirevi na želucu. Opstrukcija prolaza i kanala, cikatricijska stenoza, može se javiti zbog kontrakcije tkiva ožiljka. Kontrakcija kvrnih sudova može se pojaviti zbog primarne opstrukcije ili hirurške povrede, na primer, nakon operacije ili angioplastike. Takođe se može javiti stenoza drugih šupljih viskusa, na primer, uretera. Problemi se mogu javiti kada dođe do bilo kog formiranja ožiljaka, bilo kao rezultat slučajnog ranjavanja ili od opreacije. Stanja kože i tetiva koje uključuju kontrakcija tkiva koje uključuje kolagen uključuju post-traumatska stanja koja su rezultat operacije ili nesreća, na primer, povrede tetiva ruku ili noge, post-graftna stanja i patološka stanja, kao što je skleroderma, Dupuytren-ova kontraktura i epidermolizija buloza. Formiranje ožiljaka i kontrakcija tkiva u oku može se javiti u razlčitim uslovima, na primer, kao posledica odvajanja mrežnjače ili dijabetične očne bolesti (kako je prethodno pomenuto). Kontrakcija otvora u lobanji za očne jabučice i povezane strukture, koje uključuju ekstra-očne mišiće i kapke, mogu se javiti ukoliko postoji povreda ili zapaljensko oštećenje. Tkiva kontahuju unutar otvora izazivajući razne probleme koji uključuju dupliran vid i ružan izgled.
[0364] Za dalje informacije o različitim vrstama fibroze videti: Molina V, et al., 2002, Harefuah, 141: 973-8, 1009; Yu, et al., 2002, , Curr Opin Pharmacol.2(2):177-81; Keane, et al., 2003, Am J Kidney Dis.
41: S22-5; Bohle, et al., 1989, Pathol Res Pract.185:421-40; Kikkawa, et al., 1997, Kidney Int Suppl. 62:S39-40; Bataller et al., 2001, Semin liver Dis.21:437-51; Gross, et al., 2001 N Engl J Med.345:517-25; Frohlich, 2001, Am J Hypertens;14:194S-199S; Friedman, 2003, J Hepatol.38:S38-53;Albanis, et al., 2003, Curr Gastroenterol Rep.5:48-56; Weber, 2000, Curr Opin Kardiol.15:264-72).
1 4
Dostava molekula nukleinske kiseline i farmaceutske formulacije
[0365] Retinoid ili konjugat retinoida koristan za dostavu nukleinske kiseline je u stanju u kojem se rastvara u ili umešava sa medijumom koji ga može rastvoriti i zadržati.
[0366] Bilo koji retinoid ili konjugat retinoida može se primeniti u ovom opisu dokle god ga stelatne ćelije mogu aktivno akumulirati; primeri retinoida uključuju, ali nisu ograničeni na, tretinoin, adapalen, retinol palmitat, a određenije vitamin A, zasićen vitamin A, retinoinsku kiselinu, i retinal. Primeri retinoid-konjugata uključuju konjugate PEG-retinoida. Ovaj pronalazak primenjuje karakteristiku stelatnih ćelija da pozitivno uključe retinoid i/ili konjugat retinoida, i upotrebom retinoida i/ili konjugata retinoida kao nosača leka ili vezivanjem za ili uključivanjem u neku drugu komponentu nosača leka, željeni materijal ili telo transportuje se specifično do stelatnih ćelija. Retinoid je član klase jedinjenja koja imaju skelet u kojem su četiri izoprenoid jedinice vezane od-glave-do-repa. Videti G. P. Moss, " Biochemical Nomenclature and Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992). Vitamin A je generički deskriptor za retinoid koji kvalitativno prikazuje biološku aktivnost retinola. Retinoid u ovom opisu promoviše dostavu specifične supstance do kancerogenih ćelija i CAF (to jest, ta supstanca je ciljana od strane ovih ćelija). Takav retinoid nije naročito ograničen, a njegovi primeri uključuju retinol, Vitamin A, zasićen Vitamin A, retinal, retinoinsku kiselinu, estar retinola i masnu kiselinu, estar alifatičnog alkohola i retinoinske kiseline, etretinat, tretinoin, izotretinoin, adapalen, acitretin, tazaroten, i retinol palmitat, i vitamin A analoge kao što su fenretinid, i beksaroten. Retinoidkonjugati uključuju PEG-konjugate, npr., diVA-PEG-diVA, prikazane u sledećoj strukturi.
[0367] Nosač leka prema ovom pronalasku prema tome može da sadrži komponentu nosača leka koja se razlikuje od retinoida i/ili retinoid-konjugata. Takva komponenta nije naročito ograničena, i mo\e se primeniti bilo koja komponenta poznata u oblasti lek i farmacije, ali ali je poželjno da je sposobna da uključuje retinoid i/ili konjugat retinoida. Primeri takve komponente uključuju lipid, na primer, fosfolipid kao što je glicerofosfolipid, sfingolipid kao što je sfingomijelin, sterol kao što je holesterol, biljno ulje kao što je sojino ulje ili ulje maka, mineralno uljel, i lecitin kao što je lecitin iz žumanca, ali njihovi primeri nisu ograničeni samo na na pomenute. Među njima, oni koji mogu da obrazuju lipozom su poželjni, na primer, prirodni fosfolipidi kao što je lecitin, polusintetički fosfolipidi kao što je dimiristoilfosfatidilholin (DMPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), i distearoilfosfatidilholin (DSPC), i holesterol.
1
[0368] Pored toga, nosač leka prema ovom pronalasku može da sadrži supstancu koja poboljšava inkorporaciju u stelatne ćelije, na primer, retinol-vezujući protein (RBP).
[0369] Vezivanje ili uključivanje retinoida i/ili konjugata retinoida sa nosačem leka prema ovom pronalasku takođe se može izvesti vezivanjem ili uključivanjem retinoida i/ili konjugata retinoida sa još jednom komponentom nosača leka hemijskim i/ili fizičkim postupcima. Alternativno, vezivanje ili uključivanje retinoida i/ili konjugata retinoida sa nosačem leka prema ovom pronalasku takođe se može izvesti kombinovanjem retinoida i/ili konjugata retinoida sa afinitetom formiranja i bazičnih komponenata nosača leka, u komponentne nosača leka tokom pripreme nosača leka. Količina retinoida i/ili konjugata retinoida vezana za ili uključena u nosaču leka prema ovom pronalasku može biti 0.01% do 100% kao maseni odnos u odnosu na komponente nosača leka, poželjno 0.2% do 20%, a poželjnije 1% do 5%.
[0370] Sistemi dostave nukleinske kiseline mogu da uključe, na primer, vodene i nevodene gelove, kreme, višestruke emulzije, mikroemulzije, lipozome, masti, vodene i nevodene rastvore, losione, aerosole, ugljovodonične baze i prahove, i mogu da sadrže ekscipijense kao što su sredstva za rastvaranje, pojačivači propuštanja (npr., masne kiseline, estri masnih kiselina, masni alkoholi i aminokiseline), i hidrofilni polimeri (npr.,polikarbofil i polivinilpirolidon). U jednom primeru izvođenja, farmaceutski prihvatljiv nosač je lipozom ili transdermalni poboljšivač. Primeri lipozoma koji se mogu primeniti u ovom opisu uključuju sledeće:
● CellFectin, 1:1.5 (M/M) lipozomska formulacija katjonskog lipid N,N<I>,N<II>,N<III>-tetrametil-N,N<I>,N<II>,N<III>-tetrapalmitil-spermina i dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) (GIBCO BRL);
● Cytofectin GSV, 2:1 (M/M) lipozomska formulacija katjonskog lipida i DOPE (Glen Research); ● DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloksi)-N,N,N-tri-metil-amonijummetilsulfat) (Boehringer Manheim); ● Lipofectamin, 3:1 (M/M) lipozomska formulacija polikatjonskog lipid DOSPA, neutralni lipid DOPE (GIBCO BRL) i Di-Alkilovana Aminokiselina (DiLA2);
● Lipotrust, 4:3:3 (M/M) lipozomska formulacija O,O'-ditetradekanoil-N-(α-trimetilamonioacetil) dietanolamin hlorid (DC-6-14, holesterol i dioleoilfosfatidiletanolamin (Hokkaido Sistem Science). DC-6-14 sastoji se od sledećih struktura.
1
[0371] Ostali lipidi koji mogu biti korisni: permanentni katjonski lipidi i jonizabilni katjonski lipidi, koji uključuju
i PEG-lipidi, koji uključuju
● 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DMPE)
● 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DPPE),
● 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DSPE), ili
● 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-PEG (PEG-DOPE) i/ili
● PEG-ceramid.
[0372] Sistemi dostave mogu da uključe flastere, tablete, supozitorije, pesare, gelove i kreme, i mogu da sadrže ekscipijense kao što su sredstva za rastvaranje i pojačivači (npr., propilen glikol, žučne soli i aminokiseline), i druge nosače (npr., polietilen glikol, estri masnih kiselina i derivati, i hidrofilni polimeri kao što je hidroksipropilmetilceluloza i hijaluronska kiselina).
[0373] Nosač leka prema ovom pronalasku može biti u bilo kom obliku dokle god željeni materijal ili telo može da se transportuje tako da cilja stelatne ćelije, a primeri tog oblika uključuju, ali nisu ograničeni na, polimerna micela, lipozom, emulzija, mikrosfera, i nanosfera. Pored toga, nosač leka prema ovom pronalasku može da uključi u svojoj unutrašnjosti supstancu koja se transportuje, da bude pričvršćen za spoljašnjost supstancu koja se transportuje, ili ukombinovan sa supstancom koja se transportuje dokle god je ovde uključen retinoid i/ili konjugat retinoida najmanje delimično izložen na spoljašnjosti preparata pre nego što najkasnije dođe do stelatnih ćelija.
[0374] Nosač leka prema ovom pronalasku specifično cilja stelatne ćelije i omogućava željeni efekat kao što je, na primer, inhibicija ili prevencija fibroze koja treba da se ispolji sa maksimalnim efektom i minimalnim sporednim efektima tako što efikasno transportuje do stelatnih ćelija željeni materijal ili
1
telo kao što je, na primer, lek za kontrolisanje aktivnosti ili rasta stelatnih ćelija. Taj materijal ili telo koje prisutni nosač leka dostavlja nije naročito ograničen, ali je poželjno veličine koja omogućava fizičko pomeranje u živom telu od mesta davanja do jetre, pankreasa, itd., gde su pristne stelatne ćelije. Nosač leka prema ovom pronalasku prema tome može da transportuje ne samo materijal kao što je atom, molekul, jedinjenje, protein, ili nukleinska kiselina, ali je takođe i telo kao što je vektor, virusna čestica, ćelija, sistem za oslobađanje leka koji se sastoji od jednog ili više elemenata, ili mikrouređaj. Taj materijal ili telo poželjno poseduje svojstvo ispoljavanja nekih efekata na stelatne ćelije, a njihovi primeri uključuju one koji obeležavaju stelatne ćelije i one koji kontrolišu aktivnost ili rast stelatnih ćelija.
[0375] Prema tome, u jednom primeru izvođenja prema ovom pronalasku, nosač leka dostavlja lek za kontrolisanje aktivnosti ili rasta stelatnih ćelija. To može biti bilo koji lek koji direktno ili indirektno inhibira fizičkohemijske aktivnosti stelatnih ćelija uključene u promovisanje fibroze, a njihovi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore TGFβ aktivnosti kao što je okrnjen TGFβ tip II receptor i rastvorljiv TGFβ tip II receptor, preparati faktora rasta kao što je HGF i njihovi ekspresioni vektori, promoteri proizvodnje MMP kao što je MMP u genu sadržavajući adenovirusni vektor, inhibitori TIMP proizvodnje kao što je antismisaona TIMP nukleinska kiselina, PPARγ ligand, inhibitori ćelijske aktivacije i/ili inhibitori ćelijskog rasta kao što je inhibitor angiotenzinske aktivnost, inhibitor PDGF aktivnosti, i inhibitor natrijumskog kanala, a takođe i induktori apoptoze kao što su jedinjenje 861 i gliotoksin, adiponektin, i jedinjenje koje poseduje Rho kinaza inhibitornu aktivnost kao što je (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilkarbamoil)cikloheksan. Pored toga, 'lek za kontrolisanje aktivnosti ili rasta stelatnih ćelija' u ovom opisu može biti bilo koji lek koji direktno ili indirektno promoviše fizičkohemijske aktivnosti stelatnih ćelija direktno ili indirektno uključen u inhibiciju fibroze, a njihovi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, lek za promovisanje sistema za degradaciju kolagena, npr., promoteri proizvodnje MMP kao što je MMP ekspresioni vektor, HGF, i lekovi koji poseduju aktivnost nalik HGF kao što su HGF analozi i njihovi ekspresioni vektori.
[0376] Ostali primeri leka za kontrolisanje aktivnosti ili rasta stelatnih ćelija u ovom opisu uključuju lek za kontrolisanje metabolizma ekstracelularnog matriksa kao što je kolagen, na primer, supstanca koja ima efekat u inhibiranju ekspresije ciljanog molekula, kao što su siRNK, ribozim, i antismisaona nukleinska kiselina (koji uključuju RNK, DNK, PNK, i njihov kompozit), supstancu koji ima dominantno negativan efekat, i vektori koji ispoljavaju isto, koji ciljaju, na primer, sastavni molekul ekstracelularne matrice proizveden od strane stelatnih ćelija ili ciljaju jedan ili više molekula koji poseduju funkciju proizvodnje il ilučenja sastavnog molekula ekstracelularne matrice.
[0377] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na lek za lečenje poremećaja povezanog sa stelatnim ćelijama,
1
pri čemu taj lek sadrži nosač leka i lek za kontrolisanje aktivnosti ili rasta stelatnih ćelija, i odnosi se na upotrebu nosača leka u proizvodnji farmaceutskih kombinacija za lečenje poremećaja povezanog sa stelatnim ćelijama. Poremećaj povezan sa stelatnim ćelijama koji se ovde pominj odnosi se na poremećaj u kojem su stelatne ćelije direktno ili indirektno uključene u proces poremećaja, to jest, početak, pogoršanje, poboljšanje, remisija, lečenje, itd. poremećaja, i njihovi primeri uključuju hepatične poremećaje kao što je hepatitis, određenije hronični hepatitis, hepatična fibroza, hepatična ciroza, i kancer jetre, i poremećaji pankreasa kao što su pankreatitis, određenije hronični pankreatitis, fibroza pankreasa, i kancer pankreasa.
[0378] U leku prema ovom pronalasku, nosač leka može da uključi lek u svojoj unutrašnjosti, da bude pričvršćen za spoljašnjost supstance koja sadrži taj lek, ili pomešan sa lekom dokle god je retinoid i/ili retinoid-konjugat uključen u nosaču leka najmanje delimično izložen na spoljašnjosti preparata pre nego što najkasnije dođe do stelatnih ćelija. Prema tome, u zavisnosti od puta davanja ili načina na koji se lek oslobađa, taj lek može biti obložen pogodnim materijalom, kao što je, na primer, enterična obloga ili materijal koji se vremenom raspada, ili može biti inkorporiran u pogodan sistem za oslobađanje leka.
[0379] Ovaj pronalazak prema tome uključuje nosač leka ili komplet za pripremanje leka koji sadrži jedan ili više kontejnera koji sadrže jedan ili više sastavnih delova nosača leka, retinoid i/ili konjugat retinoida, i/ili lek, a takođe uključuje suštinsku komponentu za nosač leka ili lek obezbeđen u obliku takvog kompleta. Komplet prema ovom pronalasku može da sadrži, pored prethodno opisanog, uputstvo, itd. u kojem su opisani postupak za pripremu ili postupak za davanje nosača leka i leka prema ovom pronalasku. Pored toga, komplet prema ovom pronalasku može da sadrži sve komponente za pripremanje nosača leka ili leka prema ovom pronalasku, ali ne mora nužno da sadrži sve komponente. Komplet prema ovom pronalasku prema tome ne mora da sadrži reagens ili rastvarač koji je uobičajeno dostupan na mestu medicinskog lečenja, ustanova u kojoj se obavljaju ispitivanja, itd. kao što je, na primer, sterilna voda, slani rastvor, ili glukozni rastvor.
[0380] Ovaj pronalazak dalje odnosi se na postupak za lečenje poremećaja povezanog sa stelatnim ćelijama, postupak koji uključuje davanje efektivne količine leka subjektu kome je to potrebno.
Efektivne količine koje se ovde pominju su količina koja suzbija početak ciljanog poremećaja poremećaja, redukuje njegove simptome, ili sprečava njegovu progresiju, i to je poželjno količina koja sprečava početak ciljanih poremećaja ili leči ciljani poremećaj. To je poželjno količina koja ne izaziva sporedni efekat koji prevazilazi dobrobit davanja. Takva količina može biti pogodno određena in vitro ispitivanjem upotrebom kultivisanih ćelija, itd. ili ispitivanjem u životinjskom modelu na životinji kao što je miš, pacov, pas, ili svinja, a takvo ispitivanje dobro je poznato stručnjaku iz ove oblasti.
1
[0381] U postupku prema ovom pronalasku, izraz 'subjekat' odnosi se na bilo kojeg živog pojedinca, poželjno životinju, poželjnije sisar, a još poželjnije čovek. U ovom opisu, subjekat može biti zdrav ili oboleo od nekog poremećaja, a u slučaju tretiranja namenjenog poremećaja, subjekat obično označava subjekta koji je oboleo od tog poremećaja ili koji je u riziku da od njega oboli.
[0382] Pored toga, izraz 'lečenje' uključuje sve vrste medicinski prihvatljive profilaktičke i/ili terapeutske intervencije u cilju lečenja, privremene remisije, prevencije, itd. poremećaja. Na primer, kada je taj poremećaj hepatična fibroza, izraz 'lečenje' uključuje medicinski prihvatljivu intervenciju za razne svrhe koja uključuje odlaganje ili zaustavljanje progresije fibroze, regresiju ili nestanak lezija, prevenciju početka fibroze, ili prevenciju ponovnog javljanja.
[0383] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za dostavu leka do stelatnih ćelija upotrebom nosača leka. Ovaj postupak uključuje, ali nije ograničen na, fazu nošenja supstance koja se dostavlja na nosaču leka, i fazu davanja ili dodavanja nosača leka koji nosi supstancu koja se dostavlja živom biću ili medijumu koji sadži stelatne ćelije, kao što je, na primer, medijum kulture. Ove faze mogu se postići poželjno u skladu sa bilo kojim poznatim postupkom, postupkom opisanim u ovom opisu, itd. Taj postupak dostave može se kombinovati sa nekim drugim postupkom dostave, na primer, još jedan postupak dostave kod kojeg je meta organ u kojem su prisutne stelatne ćelije, itd.
[0384] Molekuli nukleinske kiseline mogu se prilagoditi za upotrebu za sprečavanje ili lečenje fibrozne (npr., jetre, bubrega, peritonealna, i plućne) bolesti, karakteristike, stanja i/ili poremećaja, i/ili bilo koje druge karakteristike, bolesti, poremećaja ili stanja koje je povezano sa ili koje će imati odgovor na nivoe hsp47 u ćeliji ili tkivu, sami ili u kombinaciji sa drugim terapijama. Molekul nukleinske kiseline može da uključi nosač dostave, koji uključuje lipozome, za davanje subjektu, nosače i razblaživače i njhove soli, i/ili može biti prisutan u farmaceutski prihvatljivim formulacijama.
[0385] Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu da uključe sekvence prikazane u Tabeli 3. Primeri takvih molekula nukleinske kiseline suštinski se sastoje od sekvenci obezbeđenih u Tabeli 3.
[0386] Molekuli nukleinske kiseline mogu se davati plućnom dostavom, kao što je inhalacijom aerosolne ili formulacije suvog spreja koja se daje uređajem za inhaliranje ili nebulizatorom, obezbeđujući rapidno lokalno preuzimanje molekula nukleinske kiseline u relevantnom plućnom tkivu. Kombinacije čvrstih čestica koje sadrže respirabilne suve čestice mikronizovane kombinacije nukleinske kiseline, mogu se pripremiti usitnjavanjem suvih ili liofilizovanih kombinacija nukleinske kiseline, a zatim prosleđivanjem tako mikronizovane kombinacije kroz, na primer, 400 meša sito kako bi se razbili ili
11
izdvojili veliki aglomerati. Kombinacija čvrstih čestica koja obuhvata kombinacije nukleinske kiseline ovog pronalaska može opciono da sadrži disperzant koji služi da se olakša formiranje aerosola kao i druga terapeutska jedinjenja. Pogodan disperzant je laktoza, koja se može umešati sa jedinjenjem nukleinske kiseline u bilo kom pogodnom odnosu, kao što je maseni odnos 1 prema 1.
[0387] Aerosol tečnih čestica može da uključi ovde opisane molekule nukleinske kiseline i može biti proizveden na bilo koji pogodan način, kao što je nebulizatorom (videti npr., U.S. Pat. No.4,501,729). Nebulizatori su komercijalno dostupni uređaji koji transformišu rastvore ili suspenzije aktivnog sastojka u terapeutsku aerosolnu maglu ili putem ubrzavanja komprimovanog gasa, obično vazduh ili kiseonik, putem suženog venturi otvora ili putem ultrasonične agitacije. Pogodne formulacije za upotrebu u nebulizatorima uključuju aktivni sastojak u tečnom nosaču u količini od do 40mas.% poželjno manje od 20mas.% formulacije. Nosač uobičajeno je voda ili razblaženi vodeni alkoholni rastvor, poželjno izrađen izotoničan sa telesnim fluidima dodavanjem, npr., natrijum hlorida ili drugih pogodnih soli. Opcioni aditivi uključuju prezervative uoliko formulacija nije pripremljena sterilno, npr., metil hidroksibenzoat, anti-oksidansi, arome, isparljiva ulja, agensi za puferovanje i emulzifikatori i drugi formulacioni surfaktanti. Aerosol čvrstih čestica koje uključuju aktivnu kombinaciju i surfaktant tako se mogu proizvesti bilo kojim generatorom aerosola čvrstih čestica. Aerosolni generatori za davanje subjektu terapeutika čvrstih čestica proizvode ćelije koje su respirabilne, kako je prethodno opisano, i generišu zapreminu aerosola koja sadrži prethodno odmerenu dozu terapeutske kombinacije pri stopi pogodnoj za davanje ljudima. Jedna primerna vrsta generatora aerosolnih čvrstih čestica je insuflator. Pogodne formulacije za davanje insuflacijom uključuju fino usitnjene prahove koji se mogu dostaviti putem insuflatora. U insuflatoru, prah, npr., njegova odmerena doza efektivna da izvede ovde opisabez tretiranja, sadržan je u kapsulama ili kertridžima, uobičajeno izrađeni od želatina ili plastike, koje su ili perforirane ili otvorene ili opened in situ i prah se dostavlja uvlačenjem vazduha kroz uređaj nakon inhalacije ili putem ručno pogonjene pumpe. Prah koji se upošljava u insuflatoru sastoji se ili u potpunosti od aktivnog sastojka ili od mešavine praha koja obuhvata aktivni sastojak, pogodan razblaživač praha, kao što je laktoza, i opciono surfaktant. Aktivni sastojak uobičajeno uključuje od 0.1 do 100 w/w formulacije. Druga vrsta primernog aerosol generatora uključuje inhalator za prethodno odmerenim dozama. Inhalatori sa prethodno odmerenim dozama su aerosolni dispanzeri pod pritiskom, koji uobičajeno sadrže suspenziju ili rastvor formulacija aktivnog sastojka u tečnom sredstvu za pogonjenje. Tokom upotrebe ovi uređaji otpuštaju formulaciju kroz ventil prilagođen za dostavu odmerene zapremine radi proizvodnje spreja finih čestica koje sadrže aktivni sastojak. Pogodna sredstva za pogonjenje uključuju određena hlorofluorougljenična jedinjenja, npr.,dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan i njihove mešavine. Ta formulacija dodatno može da sadrži jedan ili više ko-rastvarača, na primer, etanol, emulzifikatore i druge formulacije surfaktanata, kao što je oleinska kiselina ili sorbitan trioleat, anti-oksidanse i pogodne agense arome. Drugi postupci za plućnu dostavu opisani su u, npr., US20040037780, US6592904, US6582728, i US6565885. WO08132723 odnosi se na aerosolnu dostavu oligonukleotida generalno, a određenije siRNK, do respiratornog sistema.
[0388] Molekuli nukleinske kiseline mogu se primeniti na centralni nervni sistem (CNS) ili periferni nervni sistem (PNS). Eksperimenti su pokazali efikasno in vivo preuzimanje nukleinske kiseline od strane neurona. Videti npr., Sommer et al., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8:75; Epa et al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10:469; Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88:734; Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340:153; Bannai et al., 1998, Brain Research, 784:304; Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26:199; Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12:32; Bannai et al., 1998, Brain Res. Protoc., 3:83; and Simantov et al., 1996, Neuroscience, 74:39. Molekuli nukleinske kiseline su prema tome podložno dostavi i preuzimanju od strane ćelija u CNS i/ili PNS.
[0389] Dostava molekula nukleinske kiseline do CNS obezbeđena je raznim različitim strategijama. Tradicionalni pristupi CNS dostave koji se mogu primeniti uključuju, ali nisu ograničeni na, intratekano i intracerebroventrikularno davanje, implantaciju katereta i pupmi, direktno injektovanje ili perfuziju na mestu povrede ili lezije, injektovanje u moždani arterijski sistem, ili hemijskim ili osmotskim otvaranjima krvno-moždane barijere. Drugi pristupi mogu da uključe upotrebu raznih transportnih i prenosnih sistema, na primer putem upotrebe konjugata i biorazgradivih polimera. Pored toga, pristupi koji se bave genskom terapijom, npr., kako je opisano u Kaplitt et al., U.S. Pat. No.6,180,613 i Davidson, WO 04/013280, mogu se upotrebiti za eksprimiranje molekula nukleinske kiseline u CNS.
[0390] Molekuli nukleinske kiseline mogu biti formulisani ili ukompleksovani sa polietileniminom (npr., ravni ili razgranati PEI) i/ili derivatima polietilenimina, koji uključuju na primer graftovane PEIs kao što su derivati galaktoza PEI, holesterol PEI, antitelo derivatizovani PEI, i polietilen glikol PEI (PEG-PEI) njihovi derivati (videti na primer Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11; Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharm Res 19:810-17; Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22:46-52; Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:558-561; Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem.13:845-54; Erbacher et al., 1999, J Gene Med 1:1-18; Godbey et al., 1999., PNAS, 96:5177-81; Godbey et al., 1999, J Controlled Release, 60:149-60; Diebold et al., 1999, J Biol Chem, 274:19087-94; Thomas et al., 2002, PNAS, 99, 14640-45; and Sagara, U.S. Pat. No.
6,586,524).
[0391] Molekuli nukleinske kiseline mogu da uključe biokonjugat, na primer konjigat nukleinske kiseline kakav je opisan u Vargeese et al., U.S. Ser. No.10/427,160; U.S. Pat. No.6,528,631; U.S. Pat. No.
6,335,434; U.S. Pat. No.6,235,886; U.S. Pat. No.6,153,737; U.S. Pat. No.5,214,136; U.S. Pat. No.
5,138,045.
[0392] Kombinacije, postupci i kompleti ovde opisani mogu da uključe ekspresioni vektor koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska na način koji omogućava ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Postupci uvođenja molekula nukleinske kiseline ili jednog ili više vektora sposobnih za eksprimiranje lanaca dsRNK u u okruženju ćelije zavisiće od vrste ćelije i sastava njene okoline. Molekul nukleinske kiseline ili vektorski konstrukt može biti direktno uveden u ćeliju (tj., intracelularno); ili uveden esktracelularno u šupljinu, intersticijalni prostor, u cirkulaciju organizma, uveden oralno, ili može biti uveden kupanjem organizma ili ćelije u rastvoru koji sadrže dsRNK. Ćelija je poželjno sisarska ćelija; poželjnije humana ćelija. Eskpresioni vektor molekula nukleinske kiseline može da uključi smisaoni region i antismisaoni region. Antismisaoni region može da uključi sekvencu komplementarnu sa RNK ili DNK sekvencom koja kodira hsp47, a smisaoni region može da uključi sekvencu komplementarnu sa antismisaonim regionom. Molekul nukleinske kiseline može da uključi dva različita lanca koji imaju komplementarne smisaone i antismisaone regione. Molekul nukleinske kiseline može da uključi jedan lanac sa komplementarnim smisaonim i antismisaonim regionima.
[0393] Molekuli nukleinske kiseline koji ulaze u reakciju sa ciljanim RNK molekulima i nishodno regulišu gene koji kodiraju ciljane RNK molekule (npr., ciljani RNK molekuli koji su ovde označeni Genbank pristupnim brojevima) mogu biti eksprimirani iz transkripcione jedinice umetnuta u DNK ili RNK vektore. Rekombinantni vektori može biti DNK plazmidi ili virusni vektori. Molekul nukleinske kiseline koji eksprimira virusne vektore može biti konstruisan na osnovu, ali nije ograničen na, adeno-povezanog virusa, retrovirusa, adenovirusa, ili alfavirusa. Ti rekombinantni vektori sposobni za eksprimiranje molekula nukleinske kiseline mogu se dostaviti kako je ovde opisano, i perzistirati u ciljanim ćelijama. Alternativno, virusni vektori mogu se primeniti tako da obezbede tranzijentnu ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Takvi vektori mogu se iznova davati ukoliko je to potrebno. Kada su eksprimirani, molekuli nukleinske kiseline se vezuju i nishodno regulišu gensku funckiju ili ekspresiju putem RNK interferencije (RNKi). Dostava molekula nukleinske kiseline koji eksprimira vektore može biti sistemska, kao što je intravenoznim ili intramuskularnim davanjem, davanjem do ciljanih ćelija prethodno uzgajane iz subjekta nakon ćega sledi ponovno uvođenje u subjekta, ili drugim sredstvima koja omogućavaju uvođenje do željene ciljane ćelije.
[0394] Ekspresioni vektori mogu da uključe sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan ovde opisan molekul nukleinske kiseline, na način koji omogućava ekspresiju molekula nukleinske kiseline. Na primer, taj vektor može da sadrži sekvencu(e) koja kodira oba lanca molekula nukleinske kiseline koji uključuju dupleks. Taj vektor takođe može da sadrži sekvencu(e) koja kodira jedan molekul nukleinske kiseline koja je samo-komplementarna te prema tome formira molekul nukleinske kiseline.
11
Neograničavajući primeri takvih ekspresionih vektora opisani su in Paul et al., 2002, Nature Biotech 19, 505; Miyagishi et al., 2002, Nature Biotech 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotech 19, 500; i Novina et al., 2002, Nature Med:10.1038/nm725. Ekspresioni vektori takođe mogu biti uključeni u sisarsku (npr., ljudsku) ćeliju.
[0395] Ekspresioni vektor može da uključi sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dva ili više molekula nukleinske kiseline, koje mogu biti iste ili različite. Ekspresioni vektori mogu da uključe sekvencu za molekul nukleinske kiseline komplementaran molekulu nukleinske kiseline koji je označen Genbank pristupni brojem NM_001235, na primer oni prikazani u Tabeli 2.
[0396] Ekspresioni vektor može da kodira jedan ili oba lanca dupleksa nukleinske kiseline, ili jedan samo-komplementaran lanac koji se samo hibridizuje u dupleks nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina sekvence koja kodira molekule nukleinske kiseline može biti radno vezana na način koji omogućava ekspresiju molekula nukleinske kiseline (videti na primer Paul et al., 2002, Nature Biotech, 19:505; Miyagishi i Taira, 2002, Nature Biotech 19:497; Lee et al., 2002, Nature Biotech 19:500; i Novina et al., 2002, Nature Med, 10.1038/nm725).
[0397] Ekspresioni vektor mogu da uključe jedan ili više od sledećih: a) region inicijacije transkripcije (npr., eukariotski pol I, II ili III region inicijacije); b) region terminacije transkripcije (npr., eukariotski pol I, II ili III region terminacije); c) intron i d) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan molekul nukleinske kiseline, pri čemu je pomenuta sekvenca radno vezana za region inicijacije i region terminacije na način koji omogućava ekspresiju i/ili dostavu molekula nukleinske kiseline. Taj vektor može opciono da uključi otvoreni okvir čitanja (ORF) za protein radno vezan na 5' strani ili 3'-strani sekvence koja kodira molekul nukleinske kiseline; i/ili intron (intevencione sekvence).
[0398] Transkripcija sekvenci molekula nukleinske kiseline može se voditi od promotera za eukariotsku RNK polimerazu I (pol I), RNK polimerazu II (pol II), ili RNK polimerazu III (pol III). Transkripti iz pol II ili pol III prmotera eksprimirani su u visokim nivoima u svim ćelijama; nivoi datog pol II promotera u datoj ćelijskoj vrsti zavisi od prirode genske regulatorne sekvence (pojačivači, oslabljivači, itd.) prisutni i blizini. Prokariotski RNK polimeraza promoteri takođe se kortiste, pod uslovom da je prokariotski RNK polimeraza enzim izražen u pogodnim ćelijama (Elroy et al., 1990, PNAS, 87:6743-47; Gao et al., 1993, Nuclecic Acids Res 21:2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217:47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol.10:4529-37). Nekoliko ispitivača je pokazalo da molekuli nukleinske kiseline izraženi od takvih promotera mogu da funkcionišu u sisarskim ćelijama (npr. Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2:3-15; Ojwang et al., 1992, PNAS 89:10802-06; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:4581-89; Yu et al., 1993, PNAS, 90:6340-44; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11:4411-18; Lisziewicz et al., 1993, PNAS 90: 8000-04; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259; Sullenger et al., 1993, Science, 262:1566). Specifičnije, transkripcione jedinice kao što su one izvedene iz gena koji kodira U6 malu nuklearnu (snRNK), transfer RNK (tRNK) i adenovirusnu VA RNK korisni su u generisanju vioke koncentracije željenih RNK molekula kao što je siNK u ćelijama (Thompson et al., supra; Couture and Stinchcomb, 1996, gore; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res.22:2830; Noonberg et al., U.S. Pat. No.
5,624,803; Good et al., 1997, Gene Ther., 4:45; Beigelman et al., Int'l PCT Publication No. WO 96/18736. Prethodno pomenute transkripcione jedinice nukleinske kiseline mogu se uključiti u razne vektore radi uvođenja u sisarske ćelije, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmidne DNK vektori, virusni DNK vektori (kao što su adenovirusni ili adeno-povezani virusni vektori), ili virusni RNK vektori (kao što je retrovirusni ili alfavirusni vektori) (videti Couture and Stinchcomb, 1996 gore).
[0399] Molekul nukleinske kiseline može biti eksprimiran unutar ćelija iz eukariotskih promotera (npr., Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry and Lindquist, 1986, PNAS 83,
399; Scanlon et al., 1991, PNAS 88:10591-95; Kashani-Sabet et al., 1992, Antismisaoni Res. Dev., 2:3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66:1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65:5531-34; Ojwang et al., 1992, PNAS, 89:10802-06; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:4581-89; Sarver et al., 1990 Science, 247:1222-25; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4:45. Stručnjacima iz ove oblasti jasno je da bilo koja nukleinska kiselina može biti eksprimirana u eukariotskim ćelijama iz pogodnog DNK/RNK vektora. Aktivnost takvih nukleinskih kiselina može biti uvećana njihovim oslobađanjem iz primarnog transkripta putem enzimatske nukleinske kiseline (Draper et al., PCT WO 93/23569, i Sullivan et al., PCT WO 94/02595; Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27:15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19:5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21:3249-55; Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:25856.
[0400] Virusni konstrukt upakovan u virusnu česticu ispunio bi i efikasno uvođenje ekspresionog konstrukta u ćeliju i transkripciju dsRNK konstrukta kodiranog od strane ekspresionog konstrukta.
[0401] Postupci za oralno uvođenje uključuju direktno mešanje RNK sa hranom organizma, kao i konstruisane pristupe u kojima su vrste koje se koriste za hranu konstruisane da eksprimiraju neku RNK, zatim uvođenje u organizam na koji treba da se utiče. Fizički postupci mogu se uposliti za uvođenje rastvora molekula nukleinske kiseline u ćeliju. Fizički postupci uvođenja nukleinske kiseline uključuju injektovanje rastvora koji sadrži molekul nukleinske kiseline, bombardovanje česticama obloženim molekulom nukleinske kiseline, potapanjem ćelija ili organizma u rastvoru RNK, ili elektroporacija ćelijskih membrana u prisustvu molekula nukleinske kiseline.
[0402] Mogu se primeniti i drugi postupci poznati u ovoj oblasti za uvođenje nukleinskih kiselina u
11
ćelije, kao što je lipidom-posredovani prenosni transport, hemijski posredovan transport, kao što je kalcijum fosfat, i slično. Takvi molekuli nukleinske kiseline mogu se uvesti zajedno sa komponentama koje izvode jednu ili više od sledećih aktivnosti: poboljšavaju RNK preuzimanje od strane ćelija, promovišu povezivanje dupleks lanaca, stabilizuju povezane lance, ili na neki drugi način povećavaju inhibiciju ciljanog gena.
Doziranja
[0403] Korisna doza koja je namenjena za davanje i određeni način davanja razlikovaće se u zavisnosti od takvih faktora kao što su ćelijska vrsta, ili za in vivo upotrebu, starost, težina i određena životinja i region koji treba da se tretira, određene nukleinske kiseline i upotrebljeni postupak dostave, razmatrana terapeutska ili dijagnostička upotreba, i oblika formulacije, na primer, suspenzija, emulzija, micela ili lipozom, što će stručnjacima iz ove oblasti biti jasno. Uobičajeno, doza se daje pri nižim nivoima i povećava dok se ne postigne željeni efekat.
[0404] Kada se lipidi koriste radi dostave nukleinske kiseline, količina lipdnog jedinjenje koja se daje može da varira a generalno će zavisiti od količine nukleinske kiseline koja se daje. Na primer, maseni odnos lipidnog jedinjenje prema nukleinskoj kiselini poželjno je od oko 1:1 do oko 30:1, pri čemu je maseni odnos od oko 5:1 do oko 15:1 poželjniji.
[0405] Pogodna dozna jedinica molekula nukleinske kiseline može biti u opsegu od 0.001 do 0.25 miligrama po kilogramu telesne mase onoga koji je dobija na dan, ili u opsegu od 0.01 do 20 mikrograma po kilogramu telesne mase na dan, ili u opsegu od 0.01 do 10 mikrograma po kilogramu telesne mase na dan, ili u opsegu od 0.10 do 5 mikrograma po kilogramu telesne mase na dan, ili u opsegu od 0.1 do 2.5 mikrograma po kilogramu telesne mase na dan.
[0406] Pogodne količine molekula nukleinske kiseline mogu biti uvedeni, a ove količine se mogu empirijski odrediti upotrebom standardnih postupaka. Efektivne koncentracije pojedinačne vrste molekula nukleinske kiseline u okruženju ćelije može biti oko 1 femtomola, oko 50 femtomola, 100 femtomola, 1 pikomola, 1.5 pikomola, 2.5 pikomola, 5 pikomola, 10 pikomola, 25 pikomola, 50 pikomola, 100 pikomola, 500 pikomola, 1 nanomola, 2.5 nanomola, 5 nanomola, 10 nanomola, 25 nanomola, 50 nanomola, 100 nanomola, 500 nanomola, 1 mikromolar, 2.5 mikromolar, 5 mikromolar, 10 mikromolar, 100 mikromolar ili više.
[0407] Dozni nivoi reda veličine od from oko 0.1 mg do oko 140 mg po kilogramu telesne mase na dan korisni su u lečenju prethodno navedenih stanja (oko 0.5 mg do oko 7 g po subjektu na dan). Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalima nosača radi proizvodnje jednog doznog
11
oblika variraće u zavisnosti od domaćina koji se tretira i određenog načina davanja. Oblici doznih jedinica forms generalno sadrže između from oko 1 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka.
[0408] Podrazu,eva se da specifičan dozni nivo za bilo kog određenog subjekta zavisi od različitih faktora koji uključuju aktivnost specifičnog jedinjenja koje se upošljava, starost, telesne mase, opšte zdravstveno stanje, pol, dijeta, vreme davanja, put davanja, i brzina izlučivanja, kombinacija lekova i težine određene bolesti zbog koje se sprovodi terapija.
[0409] Farmaceutske kombinacije koje uključuju ovde opisan molekul nukleinske kiseline mogu se davati jednom dnevno, qid, tid, bid, QD, ili u bilo kom intervalu i tokom bilo kojeg trajanja koji je medicinski pogodan. Međutim, terapeutski agens takođe se može dozirati u doznim jedinicama koje sadrže dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza datih u pogodnim intervalima tokom dana. U tom slučaju, molekuli nukleinske kiseline sadržani u svakoj pod-dozi mogu biti odgovarajuće manji kako bi se postigla ukupna dnevna dozna jedinica. Dozna jedinica takođe može biti sastavljenja za jedno doziranje tokom nekoliko dana, npr., upotrebom konvencionalne formulacije sa produženim oslobađanjem koje omogućava produženo i konzistentno oslobađanje dsRNK tokom nekoliko dana. Formulacije sa produženim oslobađanjem su dobro poznate u ovoj oblasti. Dozna jedinica može da sadrži odgovarajuće višestruke dnevne doze. Kombinacija može biti sastavljena tako da sabiranjem tih višestrukih jedinica nukleinske kiseline zajedno daje dovoljnu dozu.
Farmaceutske kombinacije, kompleti, i kontejneri
[0410] Takođe su obezbeđene kombinacije, kompleti, kontejneri i formulacije koji uključuju molekul nukleinske kiseline (npr., siNK molekul) kakav je ovde obezbeđen za redukovanje ekspresije hsp47 za davanje ili distribuciju molekula nukleinske kiseline pacijentu. Komlet može da uključi najmanje jedan kontejner i najmanje jednu oznaku. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, fiole, špriceve, i ispitne epruvete. Kontejneri se mogu izraditi od raznih materijala kao što je staklo, metal ili plastika. Kontejner može da nosi aminokiselinsku sekvencu(e), mali molekul(e), sekvencu(e) nukleinske kiseline, ćelijsku popilaciju(e) i/ili antitelo(a). U jednom primeru izvođenja, taj kontejner nosi polinukleotid za upotrebu u ispitivanju mRNK ekspresionog profila ćelije, zajedno sa reagensima koji se koriste za tu svrhu. U još jednom primeru izvođenja kontejner uključuje antitelo, njegov vezujući fragment ili specifičan vezujući protein za upotrebu u procenjivanju hsp47 proteinske ekspresije ćelije i tkiva, ili za elevantne laboratorijske, prognostičke, dijagnostičke, profilaktičke i terapeutske svrhe; indikacije i/ili pravci za takve primene mogu biti uključeni na ili uz takav kontejner, kao i reagensi i druge kombinacije ili alat za ove svrhe. Kompleti mogu dalje da uključe povezane pokazatelje i/ili smernice; reagense i druge kombinacije ili alat koji se koristi za takvu svrhu takođe može biti uključen.
11
[0411] Taj kontejner alternativno može da sadrži kombinaciju koja je efektivna za lečenje, dijagnozu, prognozu ili profilakciju stanja i može imati sterilni prisutpni port (na primer taj kontejner može biti kesa sa intravenoznim rastvorom ili fiola koja ima stoper koji se može probušiti hipodermalnom injekcionom iglom). Aktivni agensi u kombinaciji mogu biti molekuli nukleinske kiseline sposobni za specifično vezivanje hsp47 i/ili modulisanje funkcije hsp47.
[0412] Komplet može dalje da uključi drugi kontejner koji uključuje farmaceutski-prihvatljiv pufer, kao što je fosfat-puferovan slani rastvor, Ringerov rastvor i/ili rastvor dekstroze. On dalje može da ukljući druge materijale koji su poželjni sa stanovišta komercijalnosti i upotrebe, koji uključuju druge pufere, razblaživače, filtere, umešivače, igle, špriceve, i/ili umetke sa pokazateljima i/ili instrukcijama za upotrebu.
[0413] Jedinične dozne ampule ili višedozni kontejneri, u koje su molekuli nukleinske kiseline upakovani pre upotrebe, mogu da uključe hermetički zatvoren kontejner koji obuhvata neku količinu polinukleotida ili rastvora koji sadrži polinukleotid pogodan za njegovo farmaceutski efektivno doziranje, ili više efektivnih doza. Taj polinukleotid je upakovan kao sterilna formulacija, a hermetički zatvoren kontejner dizajniran je da sačuva sterilnost te formulacije do njene upotrebe.
[0414] Kontejner u koji je smešten polinukleotid koji uključuje sekvencu koja kodira element celularnog imunog odgovora ili njegov fragment može da uključi pakovanje koje je obeleženo, a etiketa može nositi obaveštenje u obliku propisanom od strane vladine agencije, na primer the Primena hrane i lekova, koje obaveštenje odražava odobrenje te agencije pod federalnim zakonom, za proizvodnju, upotrebu, ili prodaju polinukleotidnog materijala za humano davanje.
[0415] Federalni zakon zahteva da upotreba farmaceutske kombinacije u terapiji ljudi bude odobrena od strane agencije Federalne vlade. U Sjedinjenjim Državama, stavljanje na snagu je odgovornost Primene hrane i lekova, sa pitanjima pognih regulacija radi osiguravnja takvog odobrenja, detaljnije navedeno u 21 U.S.C. § 301-392. Regulacija za biološki materijal, koji uključuje proizvode izrađene od tkiva životinja, obezbeđena je pod 42 U.S.C. § 262. Slična odobrenja zahtevaju se i u većini stranih zemalja. Regulacije variraju od zemlje do zemlje, ali pojedinačne procedure dobro su poznate stručnjacima ite te oblasti, a ovde obezbeđene kombinacije i postupci poželjno su usaglašene sa tim.
[0416] Doza koja se daje zavisi u velikoj meri od stanja i veličine subjekta koji se tretira, kao i frekvencije tretiranja i puta davanja. Režimi za kontinuiranu terapiju, koja uključuju dozu i frekvenciju mogu se voditi inicijalnim odgovorom i kliničkom procenom. Parenteralna putanja injektovanja u intersticijalni
11
prostor tkiva je poželjna, iako i druge parenteralne putanje, kao što je inhalacija aerosolne formulacije, mogu biti zahtevane u specifičnim primenama, kao na primer na mukoznu membranu nosa, grla, bronhijalnog tkiva ili pluća.
[0417] Kao takvi, ovde je obezbeđen farmaceutski proizvod koji može da uključi polinukleotid koji uključuje sekvencu koja kodira element celularnog imunog odgovora ili njegov fragment u rastvoru u farmaceutski prihvatljivom injektabilnom nosaču i pogodan za uvođenje intersticijalno u tkivo radi izazivanja ćelija da eksprimiraju element celularnog imunog odgovora ili njegov fragment, kontejner koji obuhvata taj rastvor, i napomenu povezanu sa kontejnerom u obliku propisanom od strane vladine agencije za regulaciju proizvodnje, upotrebe, ili prodaje farmaceutika, koja napomena odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu, ili prodaju rastvora polinukleotida za davanje čoveku.
Indikacije
[0418] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu se upotrebiti za lečenje bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa hsp47, kao što je fibroza jetre, ciroza, plućna fibroza, fibroza bubrega, peritonealna fibroza, hronično hepatično oštećenje, i fibrilogeneza i bilo koje druge bolesti ili stanja koje je povezano sa ili odgovara na nivoe hsp47 u ćeliji ili tkivu, sam ili u kombinaciji sa drugim terapijama. Kao takve, kombinacije, kompleti i postupci ovde opisani mogu da uključe pakovanje ovde opisanog molekula nukleinske kiseline koje uključuje etiketu ili umetak. Etiketa može da uključi indikacije za upotrebu molekula nukleinske kiseline kao što je upotreba za lečenje ili prevenciju fibroze jetre, peritonealne fibroze, fibroze bubrega i plućne fibroze, i bilo koje druge bolesti ili stanja koja su povezana sa ili odgovara na nivoe hsp47 u ćeliji ili tkivu, samog ili u kombinaciji sa drugim terapijama. Etiketa može da uključi smernicu za upotrebu u redukovanju ekspresije hsp47. "Umetak u pakovanju" koristi se da ukaže na instrukcije koje su uobičajeno uključene u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koji sadrže informacije u vezi sa indikacijama, upotrebom, doziranju, davanju, kontraindikacijama, drugim terapeutskim proizvodima koji se mogu kombinovati sa upakovanim proizvodom, i/ili upozorenja koja se tiču upotrebe takvih terapeutskih proizvoda, itd.
[0419] Stručnjacima iz ove oblasti je jasno da druga anti-fibrozna lečenja, lekovi i terapije poznate u ovoj oblasti mogu se lako kombinovati sa ovim molekulima nukleinske kiseline (npr. siNK molekuli) te su ovde razmatrane.
[0420] Ovde obezbeđeni postupci i kombinacije sada će biti detaljnije opisani pozivanjem na prateće neograničavajuće primere.
PRIMER 1 Pripremanje siRNK za gp46
11
[0421] Među optimalnim sekvencama za siRNK prepoznavanje u kojima se cilja bazna sekvenca hsp47, koja je uobičajeni molekularni pratilac za kolagene (vrste I do IV), Sekvence A i B su pripremljene u skladu sa siRNK oligo dizajn programom od iGENE Therapeutics, Inc. Sekvenca C was pripremljena je pretraživanjem na internetu upotrebom siRNK Target Finder-a od Ambion, Inc. i biranjem 19 baznih sekvenci koje bi postale cilj pacovskom GP46 (humani HSP47 homologuc, GenBank pristupni br.
M69246). Kada se izvodi dizajn, obraća se pažnja na početni 75 do 100 bazni niskodni tok od inicijacionog kodona, pozicionirajući prvi AA dimer, i osiguravajući da je GC sadržaj 30% do 70%. U ovom primeru, siRNKs pripremljene su sa donjim sekvencama.
1. A: GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAAC
2. B: CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGC
3. C: GAAACCUGUAGAGGCCGCA
PRIMER 2 Inhibicija gp46 ekspresije putem pripremljene siRNK
[0422] Normalne ćelije bubrega pacova (NRK ćelije), koje imaju pacovski GP46 i koje su fibroblasti koji proizvode kolagen, transfektovane su sa 0.1 nM do 50 nM siRNK i uzgajane tokom 12 do 48 sati (FIG.1). Količina eskpresije gp46 proverena je western blot postupkom (FIG.2 do 4, gornja traka koja odgovara gp46, donja traka koja odgovara aktin kontroli). Sve od siRNKs inhibirale su ekspresiju gp46 proteina zapanjujuće u odnosu na vozilo (FIG.2). U eksperimentima koji slede, korišćena je siRNK Sekvenca A, koja pokazuje najjači efekat. Inhibicija putem siRNK bila je zavisna od koncentracije (FIG.3); proteinska ekspresija od strane gp46 iznosila je oko 90% inhibirano sa 50 nM siRNK na 48 sati (FIG.4).
PRIMER 3 Inhibicija sinteze kolagena putem pripremljene siRNK
[0423] Kako bi se ispitala količina sintetizovanog kolagena,<3>H-prolin dodat je supernatantu kulture pacovskih fibroblasta (NRK ćelije) ispod gore pomenutih uslova (siRNK koncentracija 50 nM, vreme 48 sati), a nakon transfekcije količina<3>H u izlučenom proteinu je ispitana (FIG.5). Izračunata je količina sintetizovanog kolagena iz odnosa proteina izlučenog u supernatantu prema proteinu degradiranim od strane kolagenaze tokom kultivisanja gp46siRNK-transfektovanih fibroblasta u prisustvu<3>H-prolina u skladu sa Peterkofsky et al., 1971 Biochemistry 10:988-94.
[0424] Odnos sinteze kolagena u pacovskim fibroblastima smanjen je za oko 40% u odnosu na kontrolnu grupu (FIG.6).
PRIMER 4 Specifična transfekcija nukleinske kiseline u HSC
12
[0425] Emulzija (VA-Lip-GFP) pripremljena je kombinovanjem GFP ekspresionog plazmida i lipozomenkapsuliranog VA obrazovan kombinovanjem 10% Vitamin A (VA) i lipozoma. Katjonski lipozomi koji sadrže O,O'-ditetradekanolil-N-(α-trimetilamonioacetil) dietanolamin hlorid (DC-6-14) kao katjonski lipid, holesterol, i dioleoilfosfatidiletanolamin pri molarnom odnosu od 4:3:3 rastvoreni su u hloroformmetanol mešavini (4:1, v:v), a rastvarač je uklonjen isparavanjem pod vakuumom. Lipidi su umešani sa vodenim 9% rastvorom saharoze i hidatisani na 60° C. i homogenizovani do uniformnosti. Disperzija je ekstrudirana dva puta kroz polivinilidendifluroidni membranski filter sa porama 0.22 µm veličine.
Disperzija je alikvotirana u staklene fiole i zamrznuta, a zatim liofilizovana. Osušeni lipozomi rekonstruisani su sa destilovanom vodom pri koncentraciji od 1 mM DC-6-14 uz protresanje pre upotrebe. Specifično, 25 mg Vitamina A prvo je rastvoreno u 87 µL DMSO čime se daje 100 mM matični rastvor. Kako bi se pripremili VA-kuplovani lipozomi, 200 nmol VA rastvorenog u DMSO umešano je sa 100 nmole DC-6-14 protresanjem na sobnoj temperaturi. VA-siRNK-lipozomi intraportalno su dati pacovu, hepatično tkivo je sakupljeno i fiksirano. Emulzija je pripremljena pod pretpostavkom da je količina plazme za 200 g pacova oko 10 mL, i podešavanjem koncentracija VA i GFP u portalnoj krvi na 10 µM.1 µL tog VA matičnog rastvora umešano je sa 10 µL VA-lipozoma i 179 µL PBS, a 10 µg GFP ekspresionog plazmida dalje je dodato u to radi dobijanja ukupno 200 µL, a ta mešavina je uzburkana tokom tri minuta da bi dala VA-Lip-GFP. Abdomen SD pacova je otvoren, a VA-Lip-GFP polako injektovan u a perifernu portalnu venu. Četvrdeset-osam sati nbakon injektovanja, hepatično tkivo je sakupljeno. U poređenju sa drugim hepatičnim ćelijama intemedijarni vlaknasti desmin specifično je eksprimiran u HSC, kada je fiksirano hepatično tkivo obojeno sa Alexa Fluor 568-obeleženim anti-desmin antitelom, a fluorescenciona dvostruka slika sa GFP ispitana, potvrđeno je da je GFP eksprimiran unutar HSC (FIG.7). Za netretirane kontrole i grupu za koju je GFP ekspresioni plazmidni vektor dat samo, ekspresija kod pacovske HSC nije primećena, ali u grupi u kojoj je dat VA-Lip-GFP, ekspresija GFP primećena je specifično u stelatnim ćelijama.
PRIMER 5 Kvantitativni Analiza transfekcione brzine nukleinske kiseline
[0426] Na isti način kao u Primeru 4, osim što je korišćen FITC-obeležena gp46siRNK umesto GFP ekspresionog plazmida, pripremljena je emulzija (VA-Lip-gp46siRNK (FITC)) koja sadrži VA-enkapsuliran lipozom i FITC-obeležen gp46siRNK. Rastvor siRNKgp46 (580 pmol/ µl u destilovanoj vodi) dodat je VA-kuplovanom lipozomskom rastvoru Primera 4 uz umešavanje na sobnoj temperaturi. Odnos siRNK prema DC-6-14 bio je 1:11.5 (mol/mol) a odnos siRNK prema lipozomu (wt/wt) bio je 1:1. Slobodan VA ili siRNK uklonjen je mikrousitnjavanjem upotrebom VIVASPIN koncentratora, 30K MWCO, putem tri provlačenja. Materijal zarobljen na membrani bio je rekonstruisan sa PBS i intraportalno dat SD pacovu (10 µg kao količina siRNK/200 µL). Četrdeset osam sati nakon davanja hepatično tkivo je sakupljeno, αSMA (aktin glatkih mišića), koji je u odnosu na druge hepatične ćelije eksprimiran specifično u HSC, obojen je sa Alexa Fluor 568-obeleženim anti-aSMA antitelom, ćelijska jezgra obojena su sa DAPI, a fluorescenciona slika ispitana je konfokalnim laser skenirajućim mikroskopom (LSM). Kako je prikazano na levoj strani FIG.8, u grupi u kojoj je data VA-Lip-gp46siRNK (FITC), primećen je veliki broj ćelija koje emituju i zelenu fluorescenciju zbog FITC i crvenu fluorescenciju zbog Alexa Fluor 568, a kada je kvantitativna analiza izvedena putem NIH Image (broj ćelija je izbrojan biranjem bilo kojih 10 polja od X1000 fluorescencionog mikroskopskog fotografikona), transfekciona efikasnost iznosila je 77.6% (prosek od 10 polja). Sa druge strane, u grupi kojima je Lip-gp46siRNK (FITC) koja ne sadrži VA data, transfekciona efikasnost bila je niska poput 14.0% a, štaviše, transfekcija u ćelije koje nisu stelatne ćelije primećena je u 3.0% (desna strana FIG.8). Pronađeno je iz rezultata da je gore pomenuta transfekciona efikasnost u stelatne ćelije zaanjujuće povećana uključivanjem VA.
PRIMER 6 Inhibicija eskpresije gp46 putem VA-Lip-gp46siRNK
[0427] U pogledu još jedne sekcije tkiva sakupljene u Primeru 5, gp46 obojen je Alexa Fluor 568-obeleženim anti-HSP47 antitelom, a ćelijska jezgra su obojena sa DAPI, a fluorescenciona slika ispitana je konfokalnim laserskim skenirajućim mikroskopom. Kako je prikazano na FIG.9, it was observed that in a grupa to which VA-Lip-gp46siRNK data je, ekspresija of gp46, koji se može observed as a red fluorescencija (right-hand side in the figure), značajno je redukujed u odnosu na kontrolnu grupu kojoj je data VA-Lip-nasumična siRNK koja sadrži nasumičnu siRNK, koja nije specifična za gp46 (leva strana na crtežu). Stopa inhibicije ekspresije u odnosu na prosek od šest polja kontrolne grupe bio je 75%, što je izuzetno velika, kada je broj gp46-negativnih ćelija ispitan biranjem bilo kojih deset polja iz X1000 fluorescencionog mikroskopskog fotografikona upotrebom NIH Image na isti način kao u Primeru 7.
PRIMER 7 Lečenje LC pacova (Intraportalna Davanja 1)
[0428] U skladu sa izveštajem od Jezequel et al. (Jezequel et al., 1987, J Hepatol.5:174-81), LC model pacova pripremljen je upotrebom dimetilnitrozamina (DMN) (FIG.10). Specifično, 1 mL/kg doza 1% DMN (intraperitonealna davanja) data je pet nedelja starim SD pacovima (mužijaci) tri puna dana nedeljno. Kako9 je već prijavljeno, povećanje u vlaknu primećeno je od 2-ge nedelje, a u 4-toj nedelji ono je praćeno primećivanjem obeležene fibroze, destrukcijom hepatične lobularne strukture, i formiranjem regenerativnih čvorića (FIG.11). Zatim, istim postupkom kao i u Primerima 4 i 5, pripremljena je emulzija (VA-Lip-gp46siRNK) formulisanjem gp46siRNK kao lipozoma i mešanjem sa 10% VA, i koja je data. Davanja VA-Lip-gp46siRNK započeto je 3-ću nedelju, do kog momenta je primećena značajna fibroza, a procena je izvedena 4-te i 5-te nedelje. Budući da je putem Primera 2 potvrđeno sda su efekti primećeni tokom do 48 sati in vitro, davanje se može izvesti dva puta nedeljno (FIG.11). Data količina određena je u skladu sa izveštajem u kojem je siRNK direktno injektovana (McCaffery et al., 2002, Nature 418: 38-39), i bila je 40 µg kao ukupna količina siRNK. U jetri obojenoj azanom nakon davanja siRNK, 4-te nedelje nije bilo značajne razlike između grupe u kojoj je dat slani rastvor, grupe kojoj je data siRNK (nasumična), i grupe kojoj je data siRNK (gp46), ali u 5-toj nedelji smanjenje u količini vlakna primećeno je za grupu kojoj je data gp46siRNK (FIG.12). Kako bi se kvantitativno analizirala količina vlakna, neobojen deo ekstrahovan je upotrebom NIH Image, izmerena je njegova površina (FIG.
13), i primećeno je značajno smanjenje u površini za grupu kojoj je data gp46siRNK (FIG.14). Pored toga, kako bi se procenio stepen fibroze upotrebom još jednog merenja, količina hidroksiprolina, koji je pokazatelj fibroze, kvantitativno je izmeren pomoću standardnim postupkom. Specifično, kada je 20 mg zamrzavanjem osušenog hepatičnog tkiva hidrolizovano sa HCl tokom 24 sata, reakciona tečnost je centrifugirana, a supernatant je tretiran sa reagensom kao što je Ehrlich-ov rastvor i centrifugiran. Supernatant je izdvojen, a količina hidroksiprolina u hepatičnom tkivu izmerena je merenjem apsorbancije na 560 nm (Hepatology 1998, 28:1247-52). Kako je prikazano na FIG.15, u grupi u kojoj je data gp46siRNK, količina hidroksiprolina postala je veoma mala.
PRIMER 8 Lečenje LC pacova (Intraportalna Davanja 2)
[0429] Pored toga, kako bi se ispitala promena u stopi preživljavanja davanjem leka prema ovom pronalasku, u skladu sa postupkom od Qi Z et al. (PNAS 1999; 96:2345-49), LC model pacova pripremljen je upotrebom DMN u količini koja je povećana za 20% u odnosu na normalnu količinu. U ovom modelu, ukupna četiri intraportalna davanja izvedena su u prvoj i drugoj nedelji. Detalji davanja bili su: PBS, Lip-gp46siRNK, VA-Lip-nasumična siRNK, i VA-Lip-gp46siRNK (n=7 za svaku grupu). Nakon treće nedlje, sve kontrole (grupa kojoj je dat PBS, gupa kojoj je data VA-Lip-nasumična siRNK, i gupa kojoj je data Lip-gp46siRNK) bile su mrtve, ali 6 od 7 preživelih po grupi kojoj je data VA-Lip-gp46siRNK (FIG.16). Pored toga, u jetrama obojenih azanom jetre 21-og dana, primećeno je značajno smanjenje un količini vlakana za gupu kojoj je data gp46siRNK (FIG.17).
PRIMER 9 Lečenje LC pacova (Intraportalna Davanja 3)
[0430] U još jednom eksperimentu, intraportalna davanja izvedena su od 3-će nedelje za LC model pacova (1% DMN 1 mg/kg intraperitonealnano dat 3 puta nedeljno) pripremljena u skladu sa postupkom prema Qi et al. i postupkom prema Ueki et al., 1999, Nat Med.5:226-30, kakvi su prikazani u Tabeli 2 ispod(n=6 za svaku grupu). PBS je dodat u svaku supstancu koja se daje kako bi se postigla ukupna zapremina od 200 µL, a frekvencija davanja bila je jednom nedeljno.
TABELA 2
12
[0431] Iz rezultata, u grupama koje nisu grupa kojoj je dat lek prema ovom pronalasku(tretmanska grupa 9-4), svih 6 pacova bili su mrtvi do 45tog dana nakon započetog davanja DMN, a u gupi kojoj je dat lek prema ovom pronalasku, sve jedinke osim jednog slučaja, koji je uginuo 36tog dana, su preživele tokom više od 70 sana nakon započetog davanja DMN (FIG.18). Za mrtve jedinke, količina hepatičnog vlakna kvantitativno je analizirano na osnovu površine kolagena na isti način kao u Primeru 7, a povećanje u količini hepatičnog vlakna zapanjujuće je inhibirano davanjem VA-Lip-gp46siRNK (FIG.19).
PRIMER 10 Lečenje LC pacova (Intravenozno Davanje)
[0432] Intravenozno davanje izvedeno je od 3-će nedelje za LC model pacova (1% DMN 1 µg/BW (g) intraperitonealnano dat 3 puta nedeljno) pripremljen na isti način kao u Primeru 9, kako je prikazano u tabeli ispod (n=6 za svaku grupu). PBS dodat je svakoj supstanci koja se daje kako bi se postigao ukupna zapremina od 200 µL. Period davanja bio je do smrti osim kod grupe 10-4 koji je trajao do 7 nedelja, a za grupu 10-10 do 6 nedelja.
[0433] Iz rezultata, u grupama koje nisu grupe kojima je dat lek prema ovom pronalasku (tretmanske grupe 10-4 i 10-10), svih 6 pacova uginulo je do 45tog dana nakon započetog davanja DMN, a u grupama kojima je dat lek prema ovom pronalasku, sve jedinke, osim u slučaju u kojem su dva pacova uginula na dan 45 u tretmanskoj grupi 10-4, preživeli su više od 70 dana nakon započetog davanja DMN (FIG.20 i 21). Za mrtve jedinke, količina hepatičnog vlakna kvantitativno je analizirana na isti način kao u Primeru 7, a povećanje u količini hepatičnog vlakna zapanjujuće je inhibirano davanjem VA-Lip-gp46siRNK (FIG.
22).
[0434] Gore pomenuti rezultati pokazuju da je lek prema ovom pronalasku izuzetno efektivan za prevenciju i lečenje fibroze, u kojima su uključene stelatne ćelije.
PRIMER 11 Poboljšanje rezultata putem RBP (Retinol-vezujući protein)
[0435] Uticaj RBP na VA-Lip-gp46siRNK transfekcionu efikasnost ispitan je upotrebom LI90, ćelijske linije izvedene iz humane HSC.100 nM VA-Lip-gp46siRNK (FITC) pripremljena u Primeru 5, zajedno sa različitim koncentracijama (tj.0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, ili 10%) FBS (fetalni goveđi serum), dodati su u LI90 tokom uzgajanja i inkubirani tokom 48 sati, primećena je fluorescenciona slika putem LSM, a količina siRNK inkorporirana u pojedinačne ćelije kvantitativno je analizirana putem FACS. FBS je sadržavao oko 0.7 mg/dL RBP. Kako je prikazano na FIG.23, FBS (RBP) daje koncentracija-zavisno povećanje u količini siRNK transfekcije. Naknadno, 100 nM VA-Lip-gp46siRNK (FITC) i 4% FBS, zajedno sa 10 µg (21.476 nmol) anti-RBP antitela, dodati su u LI90 tokom uzgajanja, a siRNK transfekciona efikasnost procenjena je na isti način. Kako je prikazano na FIG.24, povećanje u količini transfekcije putem RBP značajno je smanjeno doavanjem anti-RBP antitela. Gore pomenuti rezultati pokazuju da je RBP efektivan u daljem poboljšanju transfekcija leka prema ovom pronalasku.
PRIMER 12 Biranje sekvenci hsp47 molekula nukleinske kiseline
[0436] Molekuli nukleinske kiseline (npr., siNK ≤ 25 nukleotidi) protiv Hsp47 dizajnirani su upotrebom nekoliko kompjuterskih programa koji uključuju siRNK na Whitehead Institutu za Biomedicinska istraživanja, siRNA Design (Integrated DNA Technologies), BLOCK-iT RNAi Designer (Invitrogen), siDESIGN Center (Dharmacon), i BIOPREDsi (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research). Sekvence najviše ocenjenih siRNKs od ovih programa upoređene su i odabrane (videti Tabelu 3) na osnovu algoritama kao i sekvencione homolgije između čoveka i pacova. Sekvence kandidati potvrđene su putem in vitro obarajućeg ispitivanja.
[0437] Nekoliko parametara uzeti su u obzir za biranje sekvence molekula nukleinske kiseline (npr., 21-mer siRNK). Primerni parametara uključuju:
● termodinamička stabilnost (RISC daje prednost lancu sa manje stabilnim 5'-krajem)
● 30-52% GC sadržaj
● položajal nukleotidne preference:
(C/G)1NNNNNNNN(A/U)10NNNNNNNN(A/U)19
u kojoj N je bilo koji nukleotid
● lišena navodnih imunostimulatornih motiva
● 2-nukleotid 3' prepust
● položaj siRNK unutar transkripta (poželjno unutar cDNK regiona)
12
● sekvenciona specifičnost (proverena upotrebom BLAST)
● varijacije u jednom nukleotidu proverom SNP baze podataka
[0438] iRNK sekvence koje imaju ≤ 25 nukleotida dizajnirane su na osnovu gore pomenutih postupaka. Odgovarajuća siRNK Dicer supstrata (npr., ≥ 26 nukleotida) dizajnirana je na osnovu manje sekvence i proširuje ciljano mesto siNK ≤ 25 nukleotida dodavanjem četiri baze 3'-kraju smisaonog lanca i 6 baza 5'-kraju antismisaonog lanca. Dicer supstrati koji su prpremljeni generalno imaju 25 bazni smisaonog lanca i 27 bazni antismisaonog lanca molekul sa asimetričnim tupim krajem i 3'-prepustom. Sekvence smisaonog i antismisaonog lanca bez bazne modifikacije (bazna sekvenca) i sa modifikacijama (eksperimentalna sekvenca) obezbeđene su u Tabeli 3.
TABELA 3
12
12 PRIMER 13
[0439] Kako bi se skrinovali potentni razni siNK molekuli protiv oba i humanog i pacovskog hsp47 gena, različite reporter ćelijske linije utvrđene su lenti-virusnom indukcijom humana HSP47 cDNK-zelenim fluorescentnim proteinom (GFP) ili pacovskim GP46 cDNK-GFP konstruktom u 293, HT1080, humana HSC linija hTERT, ili NRK ćelijskim linijama. Ove ćelijske linije dalje su ispitane putem siRNK protiv GFP. Preostali fluorescencioni signal izmeren je i normalizovan do šifrovane siRNK (Ambion) i naknadno normalizovan do ćelijske vijabilnosti. Rezultati pokazuju da siRNK protiv GFP obara fluorescenciju u različitoj meri u različitim ćelijskim linijama (FIG.25).293_HSP47-GFP i 293_GP46-GFP ćelijske linije odabrane su za siHsp47 skrining zbog njihove lake transfekcije i osetljivosti na obaranje fluorescencije.
[0440] Ćelije su transfektovane sa 1.5 pmol po bazenčiću siNK protiv GFP u pločama za uzgajanje tkiva sa 96-bazenčića upotrebom Lipofectamin RNKiMAX (Invitrogen) na reverzno trasfekcioni način. Ćelije su zasejane pri 6,000 ćelija po bazenčiću i pomešane sa siNK kompleksima. Fluorescenciona čitanja uzeta su nakon 72 sata inkubacije na Synergy 2 Multi-Mode Mikroplate čitaču (BioTek).
[0441] Izmerene su ćelije tretirane sa ili bez siNK radi procene vijabilnosti nakon 72 sata inkubacije upotrebom CellTiter-Glo Luminescent Cell Vijabilnost Assay Kit-a u skladu sa uputstvom (Promega). Čitanja su normalizovana do uzoraka tretiranih sa molekulima šifrovane siNK.
PRIMER 14 Evaluacija inhibitorne efikasnosti za siHsp47 na hsp47 ekspresiju u reporter ćelijskim linijama
[0442] siNKs protiv hsp47 procenje su na njihovu inhibitornu efikasnost u 293_HSP47-GFP i 293_GP46-GFP ćelijskim linijama evaluacijom promena u fluorescentnom signalu iz reporter GFP. Ti eksperimenti izvedeni su kako je opisano u Primeru 2. Fluorescentni signali normalizovani su u fluorescentne signale iz ćelija tretiranih šifrovanom siRNK (Ambion) koja je služila kao kontrola. Rezultati ukazuju da su ispitani hsp47 siNK molekuli bili efektivni u inhibiranju hsp47 mRNK u obe ćelijske linije. Međutim, siNK protiv GP46 mRNK (kako je objavljeno u 2008 Sato et al paper) bila je efektivna samo u 293_GP46-GFP ćelijskoj liniji. Rezultati su prikazani na FIG.26A i 26B.
[0443] 293_HSP47-GFP i 293_GP46-GFP ćelijske linije tretiran sa siRNK protiv hsp47 i gp46 procenjene su na vijabilnost upotrebom postupaka opisanih u Primeru 2. Ćelijska vijabilnost je normalizovana u ćelije tretirane šifrovanom siRNK (Ambion). Rezultati ukazuju da ćelijska vijabilnost nije značajno pogođena tretiranjem siNK molekulima. Međutim, ćelijska vijabilnost 293_HSP47-GFP ćelijskih linija tretiranih različitim hsp47 siNK molekulima varirala je u zavisnosti od upotrebljenih siNK molekula, dok je vijabilnost 293_GP46-GFP ćelijskih linija bila slična. Vijabilnost za 293_HSP47-GFP ćelije bila je niža za siHsp47-6 i Hsp47-7 tretirane ćelije u odnosu na ostale. Rezultati su prikazani na FIG.26C i 26D.
12
PRIMER 15 Evaluacija siHsp47 inhibitornog efekta na hsp47 mRNK putem TaqMan® qPCR
[0444] U Primeru 14, obaranje efikasnost siHsp47s u reporter ćelijskim linijama procenjeno je promenom u fluorescentnom signalu. Kako bi se potvrdili rezultati nas mRNK nivou, siRNKs koje ciljaju endogeni hsp47 transfektovane su u ćelije humane HSC ćelijske linije hTERT upotrebom Lipofektamina RNKiMAX (Invitrogen) na reverzno transfekcioni način kako je opisano u Primeru 13
[0445] hsp47 mRNK nivo procenjen je za oba obaranja efikasnost različitih ispitanih siHsp47 siNK molekula. Ukrakto, mRNK su izolovane iz hTERT ćelija nakon 72 sata nakon transfekcije upotrebom RNeasy mini kit-a (Qiagen). Nivo hsp47 mRNK određen je reverznom transkripcijom kuplovanom sa kvantitativnom PCR upotrebom TaqMan® sonde. Ukratko, cDNK sinteza izvedena je upotrebom High-Capacity cDNK Reverse Transcription Kit (ABI) prema uputstvu proizvođača, i podvrgnuta TaqMan Ogledu genske ekspresije (ABI, hsp47). Nivo hsp47 mRNK je normalizovan do nivoa GAPDH mRNK prema uputstvu proizvođača (ABI). Rezultati ukazuju da je siHsp47-C najefikasnija među svim hsp47 siRNKs, siHsp47-2 i siHsp47-2d su sledeće po efikasnosti. Kombinacije siHsp47-1 with siHsp47-2 ili siHsp47-1 sa siHsp47-2d bile su efektivnije od same siHsp47-1. Rezultati su prikazani na FIG.27.
PRIMER 16 Potvrda siHsp47 obarajućeg efekta na nivou proteina
[0446] Inhibitorni efekat različitih Hsp47 siNK molekula (siHsp47) na hsp47 mRNK ekspresiju potvrđen je na nivou proteina merenjem HSP47 u hTERT ćelijama transfektovanim sa različitim siHsp47.
Transfekcija hTERT ćelija sa različitim siHsp47 izvedena je kako je opisano u Primeru 13. Transfektovane hTERT ćelije lizirane su, a ćelijski lizati razbistreni centrifugiranjem. Proteini u razbistrenom ćelijskom lizatu rastvorene su SDS poliakrilamidnom gel electroforezom. Nivo hsp47 proteina u ćelijskom lizatu određen je upotrebom anti-HSP47 antitela (Assay Designs) kao primarno antitelo, Kozje anti-mišje IgG konjugovano sa HRP (Millipore) kao sekundarno antitelo, i naknadno detektovan Supersignal West Pico Chemiluminescence kit-om (Pierce). Anti-aktin antitelo (Abcam) korišćeno je kao kontrola uvođenja proteina. Rezultat pokazuje značajno smanjenje u nivou hsp47 proteina u ćelijama tretiranim sa siHsp47-C, siHsp47-2d, samim ili kombinacijom siHsp47-1 sa siHsp47-2d.
PRIMER 17 Nishodna regulacija kolagen I ekspresije putem hsp47 siRNK
[0447] Kako bi se odredio efekat siHsp47 na nivo kolagen I ekspresije, izmeren je kolagen I mRNK nivo u hTERT ćelijama tretiranim različitim siRNK protiv hsp47. Ukratko, hTERT ćelije transfektovane su različitim siHsp47 kako je opisano u Primeru 13. Te ćelije lizirane su nakon 72 sata , a mRNK su izolovane upotrebom RNeasy mini kit-a prema uputstvu (Qiagen). Nivo kolagen 1 mRNK određen je reverznom transkripcijom kuplovanom sa kvantitativnom PCR upotrebom TaqMan® sonde. Ukratko, cDNK sinteza izvedena je upotrebom High-Capacity cDNK Reverse Transcription Kit-a (ABI) prema uputstvu, i
12
podvrgnuta TaqMan Ogledu genske ekspresije (ABI, COL1A1 ogled). Nivo kolagen I mRNK je normalizovan do nivoa GAPDH mRNK prema uputstvu proizvođača (ABI). Signali su normalizovani do signala dobijenog iz ćelija transfektovanih šifrovanom siNK. Rezultat ukazuje da je kolagen 1 mRNK nivo značajno redukovan u ćelijama tretiranim sa nekim od kandidata siHsp47-2, siHsp47-2d, i njihovom kombinacijom sa siHsp47-1 i prikazan je na FIG.28.
PRIMER 18 Imunofluorescenciono bojenje hsp47 siRNK tretirane hTERT ćelijama
[0448] Kako bi se vizualizovala ekspresija dva markera fibroze, kolagen I i alfa-aktin glatkih mišića (SMA), u hTERT ćelijama transfektovanim sa ili bez siHsp47, ćelije su obojene zečijim anti-kolagen I antitelom (Abcam) i mišjim anti-alfa-SMA antitelom (Sigma). Alexa Fluor 594 kozji anti-mišji IgG i Alexa Fluor 488 kozji anti-zečji IgG (Invitrogen (Molecular Probes)) korišćeni su kao sekundarna antitela kako bi se vizualizovao kolagen I (zeleno) i alfa-SMA (crveno). Hoescht je korišćen kako bi se vizualizovalo jezgro (plvo). Rezultati ukazuju na vezu između siRNK obaranja nekih ciljanih gena i kolagen/SMA ekspresije.
PRIMER 19 In vivo ispitivanje siHSP47 u životinjskim modelima fibroze jetre
[0449] siRNK dupleks sekvenca za HSP47 (siHSP47C) je kako je navedeno u nastavku.
[0450] 10 mg/ml siRNK matični rastvor pripremljen je rastvaranjem u vodi bez nukleaze (Ambion). Za lečenje ciroznih pacova, siRNK je ormulisana sa vitamin A-kuplovanom lipozom kako je opisano od strane Sato et al (Sato Y. et al.2008 Nature Biotech.26:431) radi ciljanja aktivirane HSC koja proizvodi kolagen. Vitamin A (VA)-lipozom-siRNK formulacija sastoji se od 0.33 µmol/ml VA, 0.33 µmol/ml lipozoma (Coatsome EL, NOF Corporation) i 0.5 µg/µl siRNK u 5% glukoznom rastvoru.
[0451] Četiri nedelje stari mužijaci SD pacova indukovani su sa cirozom jetre pomoću 0.5% dimetilnitrozoamina (DMN) (Wako Chemicals, Japan) u fosfat-puferovanom slanom rastvoru (PBS). Doza 2 ml/kg telesne mase data je intraperitonealnano tokom 3 uzastopna dana nedeljno na dane 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 28, 30, 32, 34, 36, 38 i 40
[0452] siRNK tretiranje: siRNK tretiranje izvedeno je od dana 32 i tokom 5 intravenoznih injekcija. Detaljnije, pacovi su tretirani sa siRNK na dan-32, 34, 36, 38 i 40. Pacovi su zatim žrtvovani na dan-42 ili 43. 3 različite siRNK doze (1.5 mg siRNK po kg telesne mase, 2.25 mg siRNK po kg telesne mase, 3.0 mg siRNK po kg telesne mase) su ispitane.
1
[0453] Detalji ispitne grupe i broj životinja u svakoj grupi bili su kako sledi:
1) Ciroza je indukovana DMN injekcijom, zatim je 5% glukoza injektovana umesto siRNK) (n=10) 2) VA-Lip-siHSP47C 1.5 mg/kg (n=10)
3) VA-Lip-siHSP47C 2.25 mg/kg (n=10)
4) VA-Lip-siHSP47C 3.0 mg/Kg (n=10)
5) Lažna (PBS je injektovan umesto DMN; 5%Glukoza je injektovana umesto siRNK) (n=6)
6) kontrola bez tretiranja (Netaknute) (n=6)
VA-Lip odnosi se na kompleks vitamin A - lipozom.
[0454] Evaluacija terapeutske efikasnosti: Na dan 43, 2 od 10 životinja u grupi "oboleo pacov" i 1 od 10 životinja u "VA-Lip-siHSP47C siRNK 1.5 mg/kg" uginulo je zbog razvoja ciroze jetre. Preostale životinje su preživele. Pošto su pacovi žrtvovani, tkiva jetra su fiksirani u 10% formalinu. Zatim, leva lobula svake jetre smeštena je u parafin radi histologije. Isečci tkiva obojeni su Sirius crvenim, hematoksilinom i eozinom (HE). Sirius crveno bojenje uposleno je kako bi se vizualizovali kolagen-depoziti i kako bi se odredio nivo ciroze. HE bojenje za jezgra i citoplazma kao kontra-bojenje. Svaki isečak posmatrabn je pod mikroskopom (BZ-8000, Keyence Corp. Japan) i procenat Sirius crveno-obojene površine po isečku određen je softverom za analizu slika pridružen mikroskopu. Najmanje 4 isečka po svakoj jetri pripremljeni su za analizu slike, a cela površina svakog isečka (isečci jetre) zabeleženi su kamerom i analizirani. Statistička analiza izvedena pomoću Studentovog t-testa.
[0455] Rezultati: FIG.29 prikazuje fibrotične površine. Površina fibroze kod "obolelih pacova" bila je veća nego kod "lažne" ili "kontrolne bez tretiranja" grupe. Prema tome, DMN lečenje indukovalo je kolagensko taloženje u jetri, što je uobičajena opservacija fibroze jetre. Međutim, površina fibroze je značajno redukovana lečenjem siRNK koja cilja HSP47 gen, u odnosu na grupu "obolelih pacova" (FIG.
29). Ovaj rezultat ukazuje da siRNK kakva je ovde opisana ima terapeutsku efikasnost u stvarnoj bolesti.
[0456] Dodatna siRNK jedinjenja ispitana su u životinjskom modelu fibroze jetre, i pokazano je da smanjuju fibrotičnu površinu u jetri.
PRIMER 20 Generisanje sekvenci za aktivno dvolančano RNK jedinjenja prema HSP47/SERPINH1 i proizvodnji siRNKs prikazane u Tabelama 4, 5, B, C, D i E.
[0457] Dupleksi su generisani povezivanjem komplementarnih jedno-lančani oligonukleotida. In a laminarnom protočnom boksu, 500 µM matičnog rastvora jedno-lančanog oligonukleotida pripremljeno je razblaživanjem u WFI (voda za ijnekcije). Stvarne ssRNK koncentracije određene su razblaživanjem svake sa 500 µM ssRNK 1:200 upotrebom WFI, i merenjem OD upotrebom Nano Drop-a. Procedura je
1 1
ponovljena 3 puta, i izračunata je prosečna koncentracija. Matični rastvor zatim je razblažen do konačne koncentracije od 250 µM. Komplementarni jedno-lanci povezani su zagrevanje do 85°C i ostavljanjem da se ohlade do sobne temperature tokom najmanje 45 minuta. Dupleksi su ispitani na porpuno povezivanje ispitivanjem 5µl na 20% poliakrilamidnom gelu i bojenju. Uzorci su odloženi na -80°C.
[0458] Tabele 4, 5, B, C, D i E obezbeđuju siRNKs za HSP47/SERPINH1. Za svaki gen odvojena je lista 19-mer siRNK sekvenci, koje su prioritetizovane na osnovu njihove ocene u algoritmu prijavioca kao najbolje sekvence za ciljanje humane genske ekspresije.
[0459] Skraćenice koje slede koroste se u Tabelama 4, 5, B, C, D i E: "druge vrste ili Sp." odnosi se na identitet ukrštene vrste sa drugim životinjama: D-pac, Rt-pacov, Rb-Zec, Rh-makaki majmun, P- Svinja, M-Miš; ORF: otvoreni okvir čitanja.19-merovi (Tabele 5, B, C), i 18+1-(Tabele 4, D, E) merovi se odnose na oligomere od 19 i 18+1 (U na položaju 1 antismisaonog, A na položaju 19 smisaonog lanca) ribonukleinske kiseline u dužini, respektivno.
[0460] siRNK oligonukleotidi korisni u generisanju molekula dvolančane RNK opisani su u Tabelama 4, 5, B, C, D i E koje slede.
TABELA 4
1 2
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
TABELA C: Ukrštene vrste 19-mer SERPINH1 siRNKs
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
Tabela D: SERPINH1 Aktivne 18+1-mer siRNKs
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
TABELA E: SERPINH1 Ukrštene vrste 18+1-mer siRNKs
1
1
11
12
1
[0461] Najaktivnije sekvence odabrane su između daljih ispitivanja. Iz Tabele 4 siRNK jedinjenja SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_13, SERPINH1_45 SERPINH1_45a,, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 i SERPINH1_86 oabrana su kao poželjna jedinjenja (Tabele 6-A i B).
TABELA 6-A: Odabrane siRNKs
1 4
TABELA 6B
[0462] Iz Tabele 5, siRNK jedinjenja SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 i SERPINH1_88 izabrana su kao poželjna jedinjenja (Tabela 7).
TABELA 7: Odabrane siRNKs
PRIMER 21: Sistemi životinjskog modela fibrotičnih stanja
[0463] Ispitivanje aktivnih siRNKs ovog pronalaska može se izvesti u prediktivnim životinjskim modelima. Modeli fibroze bubrega usled dijabetesa i starenja kod pacova uključuju Zucker dijabetične debele (ZDF) pacove, ostarele fa/fa (gojazni Zucker) pacovi, ostareli Sprague-Dawley (SD) pacovi, i Goto Kakizaki (GK) pacovi; GK pacovi su uzgajani soj izveden od Wistar pacova, odabran zbog spontanog razvoja NIDDM (dijabetesa tipa II). Indukovani modeli fibroze bubrega uključuju model permanentne unilateralne osptrukcije uretera (UUO) koji je model akutne intersticijalne fibroze koja se javlja kod
1
zdravih ne-dijabetičnih životinja; bubrežna fibroza razvija se unutar nekoliko dana nakon opstrukcije. Još jedan indukovani model fibroze bubrega je 5/6 nefrektomija.
[0464] Dva modela fibroze jetre kod pacova su Ligacija žučnog kanala (BDL) lažnom opreacijom kao kontrole, i CC14 trovanje, sa životinjama hranjenim maslinovim uljem kao kontrole, kako je opisano u sledećim referencama: Lotersztajn S, et al Hepatic Fibrosis: Molecular Mechanisms and Drug Targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol.2004 Oct 07; Uchio K, et al., Downregulation of connective tissue growth factor and type I collagen mRNA expression by connective tissue growth factor antisense oligonucleotide during experimental liver fibrosis. Wound Repair Regen.2004 Jan-Feb;12(1):60-6; Xu XQ, et al., Molecular classification of liver cirrhosis in a rat model by proteomics and bioinformatics Proteomics.2004 Oct;4(10):3235-45.
[0465] Modeli formiranja ožiljaka u oku dobro su poznati u ovoj oblasti npr. Sherwood MB et al., J Glaucoma.2004 Oct;13(5):407-12. A new model of glaucoma filtering surgery in the rat; Miller MH et al., Ophthalmic Surg.1989 May;20(5):350-7. Wound healing in an animal model of glaucoma fistulizing surgery in the Rb; vanBockxmeer FM et al., Retina.1985 Fall-Winter; 5(4): 239-52. Models for assessing scar tissue inhibitors; Wiedemann P et al., J Pharmacol Methods.1984 Aug; 12(1): 69-78. Proliferative vitreoretinopathy: the Rb cell injection model for screening of antiproliferative drugs.
[0466] Modeli katarakte opisani su u sledećim publikacijama: Zhou et al., 2002. Invest Ophthalmol Vis Sci.43:2293-300; Wang et al.2004 Curr Eye Res.29:51-58.
[0467] Jedinjenja iz Tabele 5 i Tabele 4 ispitana su u ovim modelima fibrotičnih stanja, gde je pronađeno da su efektivna u lečenju fibroze jetre i drugih fibrotičnih stanja.
Sistemi modela glaukoma
[0468] Ispitivanje aktivne siRNK ovog pronalaska za lečenje ili sprečavanje glaukoma izvedeno je u pacovskom životinjskom modelu za drobljenje optičkog nerva opisano na primer u: Maeda et al., 2004 Investigative Ophthalmology and visual Science (IOVS), 45:851. Specifično, za optičku nervnu transekciju, orbitalni optički nerv (ON) anesteziranih pacova izložen putem supraorbitalnog pristupa, prekidanjem meninga i svih aksona u ON transektovanom drobljenjem pincetom tokom 10 sekundi, 2 mm od lamine kribroze.
[0469] Molekuli nukleinske kiseline kakvi su ovde opisani ispitani su u ovom životinjskom modelu, a rezultati pokazuju da su siRNK jedinjenja korisna u lečenju i/ili sprečavanju glaukoma.
1
Model drobljenja optičkog nerva (ONC) kod pacova: intravitrealna siRNK dostava i dostava ukapavanjem u oko
[0470] Za optičku nervnu transekciju, orbitalni optički nerv (ON) anesteziranih pacova izložen putem supraorbitalnog pristupa, prekidanjem meninga i svih aksona u ON transektovanom drobljenjem pincetom tokom 10 sekundi, 2 mm od lamine kribroze.
[0471] siRNK jedinjenja dostavljena su sama ili u kombinaciji u 5uL zapremini (10 ug/uL) kao kapi za oči. Odmah nakon drobljenja očnog nerva (ONC), 20 ug/10ul test siRNK ili 10 ul PBS dato je u jedno ili oba oka odraslih Wistar pacova, i određeni su nivoi siRNK uzetih u disektovanim i trenutno zamrznutim celim mrežnjačama 5 h i 1 d, i kasnije 2 d, 4 d, 7 d, 14 d i 21 d nakon inketovanja post injection. Slični eksperimenti izvedeni su kako bi se ispitala aktivnost i efikasnost siRNK date putem kapi za oči.
Sistemi modela ishemijske reperfuzione povrede nakon translpantacij pluća kod pacova
[0472] Plućna ishemija/reperfuziona povreda postignuta je u pacovskom životinjskom modelu kako je opisano u Mizobuchi et al., 2004 J Heart Lung Transplantation, 23 and in Kazuhiro et al., 2001 Am. J. Respir. Cell Mol Biol, 25:26-34.
[0473] Specifično, nakon indukovanja anestezije izofluoranom, traheja je kanulirana Teflon kateterom promera 14, a pacovi su mehanički ventilirani glodarskim ventilatorom upotrebom 100% kiseonika, pri brzini od 70 udaha po minutu i 2 cm H2O pozitivnog krajnjeg respiratornog pritiska. Leva plućna arterija, vene i glavno stablo bronhija začepljene su Castaneda klemom. Tokom operacije, pluća su održavana vlažna slanim rastvorom, a rez je obložen kako bi se minimizirao gubitak isparavanjem. Period ishemije je 60 minuta dug. Na kraju ishemijskog perioda, klema je uklonjena, a plućima je omogućeno da se ventiliraju i ponovo vlaže tokom daljih 4h, 24h, i 5 d nakon indukovanja plućne ishemije. Na kraju eksperimenta, pluća su nežno sakupljena i ili zamrznuta radi RNK ekstrakcije ili fiksirana u glutaraldehidnom koktelu radi naknadnih histoloških analiza.
Bleomicinski životinjski model kao model idiopatske plućne fibroze (IPF)
[0474] Studija izvodljivosti of plućne i herpetične dostave vitamin A-Coatsome formulisane siRNK date intravenoznom injekcijom i intratrahealnim davanjem siRNK-vitaminA-Coatsome kompleksa zdravim miševima i bleomicinom tretiranim miševima
[0475] Cilj: Da se ispitaju dve putanje davanja na izvodljivost vitamin A-Coatsome formulisane siRNK dostave do normalnih i fibrotičnih mišjih pluća. Glavna hipoteza koja se testira u trenutnoj studiji je da li sistemsko davanje vitamin A-Coatsome formulisane modifikovane siRNK obezbeđuje efikasno preuzimanje i ćelija-specifičnu distribuciju u fibrotičnim i normalnim mišjim plućima. Intratrahealna
1
putanja vitaminA-Coatsome formulisane modifikovane siRNK biće paralelno ispitana. siRNK detekcija i ćelija-specifična distribucija u plućima i jetri izvedeni su hibridizacijom na licu mesta (ISH)
[0476] Bleomicin model plućne fibroze dobhro je razvijen i okarakterisan tokom poslednje tri dekade (Moeller, et al.2008 Int J Biochem Cell Biol, 40:362-82,; Chua et al., 2005Am J Respir Cell Mol Biol 33:9-13,). Histološka obeležja, kao što su intra-alveolarne izrasline, zidna inkorporacija kolagena i uništavanje alveolarnog prostora prisutni su kod BLM-tretiranih životinja slično kao kod IPF pacijenata. Rana ispitivanja pokazala su da su C57/B1 miševi bili su konzistentno skloni BLM-indukovanoj fibrozi pluća, dok su Balb/C miševi bili inherentno otporni. U zavisnosti od puta davanja, razvijen je različit fibrotični obrazac. Intratrahealno usađivanje BLM rezultuje kao bronhiocentričan naglašena fibroza, dok intravenozno ili intraperitonealno davanje indukuje podpleuralno formiranje ožiljaka slično kao kod ljudske bolesti (Chua et al. ibid.). Primenjuje se mišji model uobičajene intersticijalne pneumonije (UIP). Ovaj model prikazuje heterogenu distribuciju fibroproliferacije, distribuirana uglavnom podpleuralno, formirajući slične lezije kao one primećene u plućima pacijenata sa idiopatskom plućnom fibrozom (IPF) (Onuma, et al., 2001 J Exp Med 194:147-56, i Yamaguchi et al., 1988 Nature 336:244-46). UIP će biti indukovana intraperitonealnom injekcijom bleomicina svaki drugi day tokom 7 dana za konstantnu kombinaciju podpleuralne fibroproliferacije u mišjim plućima (Swiderski et al.1998 Am J Pathol 152: 821-28, i Shimizukawa et al., 2003 Am J Physiol Pluća Cell Mol Physiol 284: L526-32,).
[0477] Vitaminom A-ispunjeni lipozomi koji sadrže siRNK ulaze u reakciju sa retinol-vezujućim proteinom (RBP) i obezbeđuju efikasnu dostavu do HSC putem RBP receptora. Ovi lipozomi efikasno se preuzimaju od strane RBP receptor-eksprimirajućih aktiviranih miofibroblasta u plućima bleomicintretiranih miševa.
Dizaj ispitivanja
Miševi - C57 B1 mužijaci
Početni N (BLM I.P.) - 40 (6 za prvu pilot grupu, 34 za ispitivanje, uzimajući u obzir očekivanu 25% smrtnost)
Početni N (Ukupno) - 60
Ispitna siRNK: ovde opisana SERPINHI jedinjenja.
TABELA 8: Grupe:
1
[0478] Bleomicin-indukovana plućna fibroza. Plućna fibroza 12-ned-starih ženki C57BL/6 miševa indukovana je intraperitonealnim usađivanjem bleomicin hlorata: 0.75 mg/kg telesne mase rastvoreno u 0.1 ml slani rastvora svaki drugi dan tokom 7 dana, na dane 0, 2, 4, i 6.
[0479] Pilot evaluacija utvrđivanja fibroze. Miševi (N=30) su podvrgnuti BLM lečenju u grupama, kako bi se omogućio interval od jedne nedelje između prve tretirane grupe (N=5) i ostatka životinja. Na dan 14, dva miša iz prve grupe su žrtvovani, a pluća sakupljena radi brzog HE bojenja i brze histopatološke evaluacije fibroze. Kada je fibroza pluća potvrđena, preostali pacovi sortiraju se u grupe i tretirju sa siRNK na dan 14 nakon prvog BLM tretiranja. U slučaju da nije razvijena dovoljna fibroza develops u plućima do dana 14, preostali miševi iz prve tretirane grupe žrtvovane su na dan 21, p0raćeno brzom histopatološkom evaluacijom fibroze. Ostatak životinja tretira se ispitnim siRNK kompleksom počevši od dana 21 nakon BLM tretiranja.
[0480] siRNK tretiranje. Na dan 14 ili dan 21 nakon prvog BLM tretiranja (TBD tokom ispitivanja, na osnovu pilot evaluacija utvrđivanja fibroze), životinje su sortirane u grupe, u skladu sa BW. Životinje iz grupe 1 i 2 dobijaju intravenozno (injekcija u repnu venu) siRNK/vitA/Coatsome kompleks, pri siRNK koncentraciji od 4.5 mg/kg BW. Netaktnute životinje iste starosti (Grupe 5 i 6) tretirane su na isti način. BLM tretirane životinje (Grupa 9) koristiće se kao vitA-coatsome vozilo kontrola). U 24 sata, injekcija je ponovljena na svim životinjama, kako je opisano.
[0481] BLM životinje iz grupe 3 i 4, i netaknuti miševi iz grupe 7 i 8 anestezirane su izoflutranom i podvrgnute Intratrahealnom usađivanju 2.25 mg/kg BW siRNK formulisane u vitA-ispunjenim
1
lipozomima. Mice iz BLM grupe 10 primili su samo vitA/Coatsome vozilo. Intratrahealno usađivanje ponovljeno je nakon 24 sata.
[0482] Prekidanje ispitivanja. Životinje iz grupe 1, 3, 5, 7, 9 žrtvovane su 2 sata nakon drugog injektovanja ili usađivanja siRNK kompleksa. Životinje iz grupe 2, 4, 6, 8, 10 žrtvovane su 24 sata nakon drugog injektovanja ili usađivanja siRNK kompleksa.
[0483] Nakon žrtvovanja životinja, miševi su perfuzovani transkardijalno sa 10% neutralnim puferovanim formalinom. Pluća su naduvana sa 0.8-1.0 ml 10% NBF, a traheja ligatirana. Pluća su isečena i fiksirana tokom 24 h u 10 % NBF. Jetra je sakupljena iz svake živptinje i fiksirana u 10% NBF tokom 24 h.
[0484] Isecanje i evaluacija. Uzastopni isečci pripremljeni su iz pluća i jetre. Prvi uzastopni isečak obojen je hematoksilinom i eozom radi procene morfologije pluća i jetre, drugi isečak obojen je Sirius crvenim (trihrom) radi identifikovanja kolagena Treći uzastopni isečci podvrgnuti su hibridizaciji na licu mesta (ISH) radi detektovanja siRNK.
PRIMER 22: In vivo anti-pulmonarna-fibroza aktivnost siRNK-sadržavajućeg VA-vezanog lipozoma (1) Indukcija plućne fibroze i davanje leka
[0485] Mužijacima S-D pacova (8 pacova/grupa, 8 nedelja stari, Charles River Laboratories Japan, Inc.) jednom je dat 0.45 mg bleomicin (BLM) rastvoren u 0.1 mL slanog rastvora u pluća intratrahealnom kanulacijom (MikroSprayer, Penn-Century, Inc.) pod anestezijom, radi proizvodnje bleomicin plućnog fibroznog modela. Sa ovim postupkom, značajna fibroza javlja se u plućima koja se generalno nakon približno 2 nedelje. Lipozomska formulacija (1.5 mg/kg kao količina siRNK, 1 ml/kg u zapremini, tj., 200 µl za pacove od 200 g) ili PBS (1 ml/kg u zapremini) data je pacovima putem repne vene, počevši od 2 nedelje nakon davanja bleomicin, tokom ukupno deset puta (svaki drugi dan). Pacovi su žrtvovani dva dana nakon poslednjeg tretiranja, izvedeno je histološko ispitivanje plućnog tkiva (videti FIG.30).
Jednosmerna ANOVA i Bonferroni multi uporedno ispitivanje korišćeno je za evaluaciju statističkiznačajne razlike.
[0486] Kombinacija lipozoma bila je HEDC/S-104/DOPE/Holesterol/PEG-DMPE/diVA-PEG-diVA (20:20:30:25:5:2 Molarni %. Detalji siRNK bili su kako sledi:
S lanac: 5' -idAB-rG-rA-rG-rA-rC-rA-rC-rA-rU-rG-rG-rG-rU-rG-25rC-25rU-25rA-25rU-25rA-C3-P-3' GS lanac: 5'-mU-rA-mU-rA-mG-rC-25rA-rC-mC-rC-mA-rU-mG-rU-mG-rU-mC-rU-mC-C3-C3-3' u kojima: rX predstavlja ribonukleotide; mX predstavlja 2'-O-metil ribonukleotide; 25rX predstavlja ribonukleotide sa 2'-5' vezama; C3 predstavlja 1,3-propandiol spejser; idAB predstavlja invertovanu 1,2-
1
didezoksi-D-ribozu; P predstavlja fosfatnu grupu na 3’-kraju.3'-kraj C3 uveden je nosećim-uvedenim 1,3-propandiol spejserom.3'-kraj fosfatna grupa (P) uvedena je upotrebom nosećeg-uvedenog dietil sulfonil (Pi) spejsera.
(2) Histološko ispitivanje
[0487] Deo uklonjenog pluća fiksiran je u formalinu u skladu sa rutinskim postupkom, i podvrgnut bojenjem azanom (azokarmin, anilin plavo narandžasto G rastvor). Kako je prikazano rezultatima bojenja azanom na FIG.31, u grupi kojoj je dat PBS (Bolest), primećena je značajna fibrotična slika okarakterisana uvećanjem međuprostora zbog velike količine plavo-obojenih kolagenoznih fibrila, dok je u grupi koja je primila formulaciju (Lečenje), fibroza bila očigledno potisnuta.
[0488] Kako je prikazano rezultatima histološkog ocenjivanja (T. Ashcroft ocena) na FIG.32, u grupi koja je primila formulaciju (Lečenje), ocena fibroze značajno je smanjena.
PRIMER 23: In-vivo Redukcija hsp47 mRNK (DMN Model)
[0489] In vivo aktivnost HSP47 lipozoma Primera 22 procenjena je u modelu kratkoročnog oštećenja jetre (koji se naziva Brzi Model). U ovom modelu, Kratkoročno oštećenje jetre indukovano je tretiranjem sa hepatotoksičnim agensom kao što je dimetilnitrosamin (DMN) koji je praćen povećavanjem hsp47 mRNK nivoa. Kako bi se indukovale ove promene, mužijacima Sprague-Dawley pacova injektovan je intraperitonealnano DMN tokom šest uzastopnih dana. Na kraju perioda tretiranja sa DMN, životinje su nasumično grupisane u grupe na osnovu pojedinačne telesne mase žvotinje. Uzorak lipozoma dat je kao jedna IV doza (0.375 ili 0.75 mg/kg, što se ogledakao siRNK doza) jedan sat nakon poslednje injekcije DMN. Jedan dan kasnije, isečeni su režnjevi jetre i određeni su i HSP47 i GAPDH mRNK nivoi kvantitativnim RT-PCR (TaqMan) ogledom. HSP47 mRNK nivoi normalizovani su do GAPDH nivoa. Kako je prikazano na FIG.33, robustna i dozno-zavisna mRNK redukcija za HSP47 primećena je u jetri. Nakon jedne doze 0.75 mg/kg ND-L02-0101, primećena je 80% redukcija hsp47 mRNK. Čak i pri nižoj dozi od 0.375 mg/kg, primećeno je značajno obaranje od 40%.
[0490] Prijavioci zadržavaju pravo da fizički inkorporiraju u ovaj pronalazak bilo koji i sve materijale i informacije iz bilo kakvih povezanih članaka, patentata, patentnih prijava, ili drugih fizičkih i elektronskih dokumenata.
[0491] Ovaj pronalazak daje saznanje stručnjaku iz ove oblasti da ispita različitie kombinacije i/ili supstitucije ovde opisanih hemijskih modifikacija u cilju generisanja konstrukata nukleinske kiseline sa poboljšanom aktivnosti za posredovanje RNKi aktivnosti. Takva poboljšana aktivnost može da uključi poboljšanu stabilnost, poboljšanu biodostupnost, i/ili poboljšanu aktivaciju ćelijskih odgovora koji
1 1
posreduju RNKi. Prema tome, ovde opisan specifičan primer izvođenja nije ograničen i stručnjaku je jeasno da specifične kombinacije ovde opisanih modifikacija mogu da se ispitaju bez nepotrebnog eksperimentisanja ka identifikovanju molekula nukleinske kiseline sa poboljšanom RNKi aktivnosti.
[0492] Ovde opisni opisi mogu se pogodno izvesti u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ograničenja ili ograničenja, koja nisu specifično opisana. Tako, na primer, izrazi određenog i neodređenog člana "a" i "an" i "the" i sličnih pozivnih oznaka u kontekstu opisivanja (naročito u kontekstu patentnih zahteva koji slede) konstruisani su radi pokrivanja i jednine i množine, ukoliko nije drugačije ukazano ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom. Izrazi "koja obuhvata", "koja ima," "koja uključuje," koja sadrži", itd. shvataju se široko i bez ograničenja (npr., značenje "koji uključuju, ali nisu ograničeni na,"). Navođenje opsega vrednosti imaju nameru da služi samo kao skraćeni metod odnoseći se pojedinačno na svaku odvojena vrednost koja potpada unutar tog opsega, ukoliko nije drugačije naznačeno, a svaka odvojena vrednost je inkorporirana u specifikaciji kao da su pojedinačno navedene. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom ukoliko nije drugačije naznačeno ili je jasno kontradiktorno sa kontekstom. Upotreba bilo kog i svih ovde obezbeđenih primera, ili primernog jezika (npr., "kao što je"), namenjena je samo za bolje osvetljavanje opisa i ne predstavlja ograničenje na obim ovog pronalaska ukoliko nije drugačije izrečeno. Ni jedna fraza u ovoj specifikaciji ne sme biti konstruisana da ukazuje na neki nezatićeni element kao suštinu u praksi ovog pronalaska. Dodatno, izrazi i termini koji su ovde uključeni koriste se u smislu opisa, a ne i ograničenja, i ne postoji namera da se koriste takvi termini izrazi u isključivanju bilo kog ekvivalenta pokazane osobine i opisa ili njihovog dela, već se podrazumeva da su različite modifikacije moguće unutar obima ovog pronalaska takođe zaštićene. Tako, treba razumeti da iako je ovaj pronalazak specifično opisan poželjnim primerima izvođenja i opcionim osobinama, stručnjaci iz ove oblasti mogu pribeći modifikacijama i varijacijama ovog pronalaska ostvarenog i ovde opisanog, i da se takve modifikacije i varijacije smatraju unutar obima ovog pronalaska.
[0493] Ovaj pronalazak je ovde opisan široko i uopšteno. Svaka od suženih vrsta i podgeneričkog grupisanja unutar generičkog opisa takođe čini deo ovog pronalaska. To uključuje generički opis ovog pronalaska pod uslovom ili negativnim ograničenjem uklanjajući bilo koju suštinsku stvar od genusa, bez obzira da li ili ne prevazilazi materijal koji je ovde specifično izrečen. Drugi primeri izvođenja su unutar patentnih zahteva koji slede. Dodatno, gde su osobine ili aspekti ovog pronalaska opisani u smislu Markush grupa, stručnjacima iz ove oblasti biće jasno da se tak opis takođe odnosi i u smislu na bilo koji pojedinačni član ili podgrupu članova te Markush grupe.
[0494] Takođe su opisane i sledeće tačke:
1 2
1. Farmaceutska kombinacija koja obuhvata nosač leka i dvolančani molekul nukleinske kiseline, u kojoj nosač leka obuhvata stelatna ćelija-specifičnu količinu retinoida, i pri čemu taj dvolančani molekul nukleinske kiseline obuhvata strukturu:
5' (N)x-Z 3' (antismisaoni lanac)
3' Z'-(N')y-z" 5' (smisaoni lanac)
u kojoj svako od N i N' je nukleotid koji može biti nemodifikovan ili modifikovan, ili nekonvencionalan ostatak;
u kojoj svako od (N)xi (N')yje oligonukleotid u kojem je svako uzastopno N ili N' spojeno sa narednim N ili N' kovalentnom vezom;
u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno uključuje 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihovu kombinaciju kovalentno vezanu na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna;
u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od (N')y;
u kojoj svako od x i y nezavisno je neki ceo broj između 18 i 40;
u kojoj je sekvenca (N')ykomplementarna sekvenci (N)x; i
u kojoj (N)xuključuje antismisaonu sekvencu u mRNK kodirajućoj sekvenci za humani hsp47 predstavljen sa SEQ ID NO:1.
2. Farmaceutska kombinacija tačke 1, u kojoj siRNK obuhvata oligonukleotidne sekvence odabrane iz grupe koju čine sekvence SEQ ID NO: 60 i 127 (SERPINH1_2), SEQ ID NO: 98 i 165 (SERPINH1_45a), i SEQ ID NO: 101 i 168 (SERPINH1_51).
3. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, u kojoj se retinoid sastoji od molekula odabranog iz grupe koju čine vitamin A, retinoinska kiselina, retinal, tretinoin, adapalen, retinol palmitat, i fenretinid (4-HPR).
4. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, u kojoj nosač leka dalje obuhvata polietilen glikol molekulkonjugovan retinoidni molekul.
5. Farmaceutska kombinacija prema tački 4, u kojoj polietilen glikol molekul-konjugovani retinoid molekul je diVA-PEG-diVA.
6. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, u kojoj retinoid je najmanje delimično izložen na spoljašnjosti nosača leka pre nego što nosač leka dostigne stelatne ćelije.
7. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, u kojoj nosač leka je u obliku odabranom iz grupe koju čine polimerna micela, lipozom, emulzija, mikrosfera, i nanosfera.
8. Farmaceutska kombinacija prema tački 7, u kojoj je nosač leka u obliku lipidne vezikule koja obuhvata dvosloj lipidnih molekula.
9. Farmaceutska kombinacija prema tački 8, u kojoj je retinoid 0.2 mas.% do 20 mas.% lipidnih molekula.
1
10. Farmaceutska kombinacija prema tački 8, u kojoj lipidni molekuli obuhvataju HEDC.
11. Farmaceutska kombinacija prema tački 10, u kojoj lipidni molekuli obuhvataju S104.
12. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, pri čemu taj dvolančani molekul nukleinske kiseline je izložen na spoljašnjoj površini lipidne vezikule.
13. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, pri čemu je taj dvolančani molekul nukleinske kiseline enkapsuliran lipidnom vezikulom.
14. Farmaceutska kombinacija prema tački 13, pri čemu je taj dvolančani molekul nukleinske kiseline rezistentan prema nukleazama.
15. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-14, u kojoj jedan lanac dvolančanog molekula nukleinske kiseline obuhvata SEQ ID NO:127, a drugi lanac obuhvata SEQ ID NO:60.
16. Farmaceutska kombinacija prema tački 15, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60.
17. Farmaceutska kombinacija prema tački 16, u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 1, 5, 6, ili 7; i nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata najmanje jedan 2'-5'-ribonukleotid ili 2'-O-metil modifikovan ribonukleotid; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju.
18. Farmaceutska kombinacija prema tački 16, u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2-'O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
19. Farmaceutska kombinacija prema tački 16, u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; i C3C3 ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
20. Farmaceutska kombinacija prema tački 16, u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
21. Farmaceutska kombinacija prema tački 16, u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ne-
1 4
nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
22. Farmaceutska kombinacija prema tački 16, u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2-'O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi- C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3 ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
23. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-14, u kojoj jedan lanac dvolančanog molekula nukleinske kiseline obuhvata SEQ ID NO:98 i drugi lanac obuhvata SEQ ID NO:165.
24. Farmaceutska kombinacija prema tački 23, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:98, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:165.
25. Farmaceutska kombinacija prema tački 24, u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima na ili blizu 3’-kraja; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac dalje obuhvata 2’-O-metil modifikovan ribonukleotid; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
26. Farmaceutska kombinacija prema tački 24, u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-OH 3' ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; a antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
27. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-14, u kojoj jedan lanac dvolančanog molekula nukleinske kiseline obuhvata SEQ ID NO:101 i drugi lanac obuhvata SEQ ID NO:168.
28. Farmaceutska kombinacija prema tački 1, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168.
29. Farmaceutska kombinacija prema tački 28, u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane pirimidin ribonukleotide; opcioni 2'-5'-ribonukleotid u jednom od položaja 9 ili 10; nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; i the u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2’-O-metil modifikovan ribonukleotid; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6, ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
30. Farmaceutska kombinacija prema tački 28, u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane
1
ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
31. Farmaceutska kombinacija prema tački 28, u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
32. Farmaceutska kombinacija prema tački 28, u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
33. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-32, pri čemu taj dvolančani molekul nukleinske kiseline redukuje hsp47 ekspresiju u stelatnim ćelijama.
34. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-32, u kojoj kombinacija sprečava ili leči bolest povezanu sa hsp47.
35. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči bolest odabranu iz grupe koju čine fibroza organa i tkiva koja uključuju jetru, pluća, bubreg, pankreas, kožu, srce, mozak, creva, debelo crevo, glasne žice, peritoneum, oko, mišić, koštanu srž, kost, jajnike, ureter, i matericu; i kancer i kancer-povezana fibrotični tkiva.
36. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj farmaceutska kombinacija sprečava ili leči fibrozu jetre.
37. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj farmaceutska kombinacija sprečava ili leči plućnu fibroza.
38. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj farmaceutska kombinacija sprečava ili leči fibrozu bubrega.
39. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči peritonealnu fibrozu.
40. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči hronično hepatično oštećenje.
41. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči fibrilogenezu.
42. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči cirozu jetre usled hepatitisa C nakon transplantacije jetre ili nealkoholni steatohepatitis (NASH); idiopatsku plućnu fibrozu; pneumonitis izazvan zračenjem koji vodi ka plućnoj fibrozi; dijabetičnu
1
nefropatiju; peritonealnu sklerozu povezanu sa kontinuiranom ambulantnom peritonealnom dijalizom (CAPD) ili očni cikatricijski pemfigoid.
43. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči cirozu jetre usled hepatitisa C nakon transplantacije jetre ili nealkoholni steatohepatitis (NASH).
44. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči idiopatsku plućnu fibrozu.
45. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči pneumonitis izazvan zračenjem koji vodi ka plućnoj fibrozi.
46. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči dijabetičnu nefropatiju.
47. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči peritonealnu sklerozu povezanu sa kontinuiranom ambulantnom peritonealnom dijalizom (CAPD). 48. Farmaceutska kombinacija prema bilo kojoj od tačaka 1-34, u kojoj kombinacija sprečava ili leči očni cikatricijski pemfigoid.
49. Postupak za lečenje ili sprečavanje bolesti, postupak koji obuhvata davanje efektivne količine farmaceutske kombinacije prema bilo kojoj od tačaka 1-48 subjektu kome je to potrebno.
50. Postupak tačke 49 u kojoj je bolest odabrana iz grupe koju čine hepatitis, hepatična fibroza, hepatična ciroza, kancer jetre, pankreatitis, pankreasa fibroza, kancer pankreasa, formiranje ožiljaka na glasnim žicama, mukozalna fibroza glasnih žica, i fibroza grkljana.
51. Postupak tačke 49, u kojoj je ta bolest hepatitis ili hepatična fibroza.
52. Postupak tačke 49, u kojoj je ta bolest povezana sa hroničnom hepatitis C virusnom (HCV) infekcijom.
53. Postupak prema tački 49, u kojoj se preparat daje parenteralno.
1

Claims (13)

  1. Patentni zahtevi 1. Farmaceutska kombinacija koja obuhvata: (i) dvolančani molekul nukleinske kiseline i nosač leka koji obuhvata mešavinu retinoida i lipida, pri čemu taj dvolančani molekul nukleinske kiseline obuhvata strukturu (A1): (A1) 5' (N)x-Z 3' (antismisaoni lanac) 3' Z'-(N')y-z" 5' (smisaoni lanac) u kojoj svako od N i N' je nukleotid koji može biti nemodifikovan ili modifikovan, ili nekonvencionalan ostatak; u kojoj svako od (N)xi (N')yje oligonukleotid u kojem je svako uzastopno N ili N' spojeno sa narednim N ili N' kovalentnom vezom; u kojoj svako od Z i Z' nezavisno je prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno nezavisno uključuje 1-5 uzastopnih nukleotida ili ne-nukleotidnih ostataka ili njihovu kombinaciju kovalentno vezanu na 3’-kraju lanca u kojem je prisutna; u kojoj z" može biti prisutno ili odsutno, ali ako je prisutno predstavlja kapu kovalentno vezanu na 5’-kraju od (N')y; u kojoj je svako od x i y nezavisno ceo broj između 18 i 40; u kojoj je sekvenca (N')ykomplementarna sekvenci (N)x; u kojoj (N)xuključuje antismisaonu sekvencu u mRNK kodirajućoj sekvenci za humani hsp47 predstavljen sa SEQ ID NO:1; i u kojoj lipid obuhvata lipid odabran iz grupe koju čine
    ili (ii) dvolančani molekul nukleinske kiseline koji obuhvata smisaoni lanac i antismisaoni lanac pri čemu su ti smisaoni i antismisaoni lanci odabrani od oligonukleotida opisani kao SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 i 127), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 i 165), i SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 i 168), i nosač leka koji obuhvata mešavinu lipidne vezikule i retinoida ili konjugat retinoida, pri čemu lipid te lipidne vezikule obuhvata lipid odabran iz grupe koju čine
  2. 2. Farmaceutska kombinacija prema zahtevu 1, u kojoj konjugat retinoida predstavlja PEG-konjugat.
  3. 3. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 1, 5, 6, ili 7; i nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata najmanje jedan 2'-5'-ribonukleotid ili 2'-O-metil modifikovan ribonukleotid; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju.
  4. 4. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
  5. 5. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; i C3C3 ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju. 1
  6. 6. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata pet uzastopnih 2’-5’-ribonukleotida u 3’-terminalnim položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3Pi ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
  7. 7. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:127, a smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:60; u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 7, 13, 16 i 18; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3 ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju.
  8. 8. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:98, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:165; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima na ili blizu 3’-kraja; ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2’-O-metil modifikovan ribonukleotid; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje jednom od položaja 5, 6 ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
  9. 9. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:98, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:165; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2’-5’-ribonukleotide na položajima 15, 16, 17, 18, i 19; C3-OH 3' ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, i 19; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 7; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
  10. 10. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane pirimidin ribonukleotide; opcioni 2'-5'-ribonukleotid u jednom od položaja 9 ili 10; nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i kapa deo kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2’-O-metil modifikovan ribonukleotid; 2’-5’-ribonukleotid u najmanje 2 jednom od položaja 5, 6, ili 7; i ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
  11. 11. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 9; C3OH nenukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
  12. 12. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 4, 11, 13, i 17; C3OH ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 13 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C3OH ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju.
  13. 13. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj smisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:101, a antismisaoni lanac obuhvata SEQ ID NO:168; u kojoj smisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 2, 4, 11, 13, i 17; C30H ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju; i invertni bezbazni dezoksiribonukleotidni ostatak kovalentno vezan na 5’-kraju; i u kojoj antismisaoni lanac dalje obuhvata 2'-O-metil modifikovane ribonukleotide na položajima 1, 4, 8, 11 i 15; 2’-5’-ribonukleotid na položaju 6; i C3Pi-C30H ne-nukleotidni ostatak kovalentno vezan na 3’-kraju. 2 1
RS20181081A 2011-06-08 2012-06-08 Retinoid-lipozomi za poboljšanje modulacije hsp47 ekspresije RS57824B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161494832P 2011-06-08 2011-06-08
US201161497447P 2011-06-15 2011-06-15
EP16169874.1A EP3075855B1 (en) 2011-06-08 2012-06-08 Retinoid-liposomes for enhancing modulation of hsp47 expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57824B1 true RS57824B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=46395700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181081A RS57824B1 (sr) 2011-06-08 2012-06-08 Retinoid-lipozomi za poboljšanje modulacije hsp47 ekspresije

Country Status (21)

Country Link
US (4) US8664376B2 (sr)
EP (2) EP3075855B1 (sr)
JP (1) JP5873168B2 (sr)
KR (1) KR102002771B1 (sr)
CN (1) CN103781909B (sr)
AU (1) AU2012267472B2 (sr)
CA (1) CA2836925C (sr)
CY (2) CY1117683T1 (sr)
DK (2) DK2717921T3 (sr)
ES (2) ES2586593T3 (sr)
HR (1) HRP20181440T8 (sr)
HU (1) HUE039379T2 (sr)
LT (1) LT3075855T (sr)
PL (2) PL2717921T3 (sr)
PT (2) PT2717921T (sr)
RS (1) RS57824B1 (sr)
RU (1) RU2628694C2 (sr)
SI (1) SI3075855T1 (sr)
SM (1) SMT201800584T1 (sr)
TW (1) TWI658830B (sr)
WO (1) WO2012170957A2 (sr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9393315B2 (en) * 2011-06-08 2016-07-19 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing siRNA activity
US20160038593A1 (en) * 2004-12-22 2016-02-11 Nitto Denko Corporation Drug carrier and drug carrier kit for inhibiting fibrosis
KR101718534B1 (ko) * 2009-12-09 2017-03-22 닛토덴코 가부시키가이샤 Ｈｓｐ４７ 발현의 조절
JP5950428B2 (ja) * 2010-08-05 2016-07-13 日東電工株式会社 線維化組織から正常組織を再生するための組成物
US9011903B2 (en) 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
TWI658830B (zh) * 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
CN107043334B (zh) * 2011-06-08 2020-06-16 日东电工株式会社 用于定向药物输送和增强siRNA活性的化合物
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
IN2014MN00908A (sr) * 2011-11-18 2015-04-17 Nitto Denko Corp
SI2858974T1 (sl) 2012-06-08 2019-01-31 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije za dostavo terapevtskega sredstva
EP3116512B1 (en) * 2014-03-11 2020-06-10 Dai Niann-tzyy Pharmaceutical composition and method for reducing scar formation
CN104174034A (zh) * 2014-08-20 2014-12-03 南京大学 肝星状细胞靶向的基因药物输送载体及其制备方法和应用
US10792299B2 (en) 2014-12-26 2020-10-06 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
US20180002702A1 (en) 2014-12-26 2018-01-04 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
US11045488B2 (en) 2014-12-26 2021-06-29 Nitto Denko Corporation RNA interference agents for GST-π gene modulation
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
JP6457704B2 (ja) 2015-12-13 2019-01-23 日東電工株式会社 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造
CA3024129A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Cationic sulfonamide amino lipids and amphiphilic zwitterionic amino lipids
JP6833456B2 (ja) * 2016-11-02 2021-02-24 日東電工株式会社 皮膚線維症処置剤
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
EP3596117A4 (en) * 2017-03-17 2021-01-13 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY AGAINST THE DISTAL EXPRESSION REGULATORY ELEMENT OF TGFB2
US20200318113A1 (en) * 2019-03-05 2020-10-08 MiRagen Therapeutics, Inc. Polynucleotide conjugates and uses thereof
TWI740533B (zh) 2020-06-11 2021-09-21 國立中央大學 評估個體罹患腹膜硬化症之風險的方法、其分析器及其套組
IL299197A (en) * 2020-06-24 2023-02-01 Bristol Myers Squibb Co A process for the synthesis of targeting molecules
JP2023539847A (ja) * 2020-08-25 2023-09-20 ローレン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 肺線維症を治療するためのフェンレチニド又はその類似体の使用
WO2023150258A1 (en) * 2022-02-04 2023-08-10 New York University Use of retinoids for treatment of atrial fibrillation
AU2023249281B2 (en) 2022-04-08 2026-02-05 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Treatment for ocular fibrosis
WO2024059714A1 (en) * 2022-09-15 2024-03-21 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating advanced hepatic fibrosis associated with hcv infection with targeted lipid nanoparticle compositions

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4501729A (en) 1982-12-13 1985-02-26 Research Corporation Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions
US5811119A (en) 1987-05-19 1998-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas Formulation and use of carotenoids in treatment of cancer
KR970005898B1 (ko) 1987-09-21 1997-04-21 젠- 프로우브 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
KR940703846A (ko) 1991-12-24 1994-12-12 비. 린네 파샬 갭(gap)이 형성된 2′ 변성된 올리고뉴클레오티드(gapped 2′ modifed oligonucleotides)
EP0642589A4 (en) 1992-05-11 1997-05-21 Ribozyme Pharm Inc METHOD AND REAGENT TO INHIBIT VIRAL REPLICATION.
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6235886B1 (en) 1993-09-03 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesis and use
WO1995006731A2 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
EP0725788B1 (en) 1993-10-27 1998-12-16 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-amido and 2'-peptido modified oligonucleotides
US6051256A (en) 1994-03-07 2000-04-18 Inhale Therapeutic Systems Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use
CA2187626C (en) 1994-04-13 2009-11-03 Michael G. Kaplitt Aav-mediated delivery of dna to cells of the nervous system
CA2207593A1 (en) 1994-12-13 1996-06-20 John Gustofson Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19640092A1 (de) 1996-09-28 1998-04-16 Beiersdorf Ag Strukturen mit Lipid-Doppelmembranen, in deren lipophilen Bereich längerkettige Moleküle eintauchen oder durch hydrophobe Wechselwirkungen an solche Moleküle angedockt sind
DE19641672A1 (de) 1996-10-10 1998-04-16 Beiersdorf Ag Kosmetische oder dermatologische Zubereitungen auf der Basis von ethylenoxidfreien und propylenoxidfreien Emulgatoren zur Herstellung von Mikroemulsionsgelen
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6251666B1 (en) 1997-03-31 2001-06-26 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid catalysts comprising L-nucleotide analogs
TW589189B (en) 1997-08-04 2004-06-01 Scras Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6565885B1 (en) 1997-09-29 2003-05-20 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Methods of spray drying pharmaceutical compositions
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
EP2314700A1 (en) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
CZ296576B6 (cs) 1999-02-12 2006-04-12 Sankyo Company Limited Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
DE10012151A1 (de) 2000-03-13 2001-09-27 Gsf Forschungszentrum Umwelt Mittel zur Behandlung von Erkrankungen des Tracheo-Brochialtraktes, insbesondere der COPD
PT1309726E (pt) 2000-03-30 2010-03-08 Whitehead Biomedical Inst Mediadores de interferência por rna específicos de sequência de rna
US20050209179A1 (en) * 2000-08-30 2005-09-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
KR20050042013A (ko) 2001-10-30 2005-05-04 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 레티노산의 수용성 중합체 콘쥬게이트
AUPR894201A0 (en) 2001-11-19 2001-12-13 Women's And Children's Hospital Respiratory delivery for gene therapy and lentiviral delivery particle
US20050106731A1 (en) 2002-08-05 2005-05-19 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing with viral vectors
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
CA2519860C (en) 2003-03-21 2018-01-16 Santaris Pharma A/S Short interfering rna (sirna) analogues
WO2004089311A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Vectramed, Inc. Polymeric drug agents for the treatment of fibrotic disorders
US7407973B2 (en) * 2003-10-24 2008-08-05 Intermune, Inc. Use of pirfenidone in therapeutic regimens
AU2005222965B8 (en) 2004-03-15 2010-07-01 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20080261905A1 (en) 2004-11-08 2008-10-23 K.U. Leuven Research And Development Modified Nucleosides for Rna Interference
ES2900801T3 (es) * 2004-12-22 2022-03-18 Nitto Denko Corp Portador de fármacos y kit de portador de fármacos para inhibir la fibrosis
JP2009221164A (ja) * 2008-03-17 2009-10-01 Nitto Denko Corp 肺線維症処置剤
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
US9393315B2 (en) 2011-06-08 2016-07-19 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing siRNA activity
JP5342834B2 (ja) * 2008-09-05 2013-11-13 日東電工株式会社 骨髄線維症処置剤
US7718629B2 (en) * 2006-03-31 2010-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
DE202006005347U1 (de) * 2006-04-03 2007-08-02 Efbe Elektrogeräte GmbH Infrarotleuchte
CA2666657A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
US20100215588A1 (en) 2007-04-26 2010-08-26 Rami Skaliter Therapeutic delivery of inhibitory nucleic acid molecules to the respiratory system
KR20100065190A (ko) * 2007-09-14 2010-06-15 닛토덴코 가부시키가이샤 약물 담체
WO2009059450A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
AU2008359989A1 (en) 2008-07-30 2010-02-04 Nitto Denko Corporation Drug carriers
JP5744723B2 (ja) 2008-09-12 2015-07-08 日東電工株式会社 線維性疾患のイメージング剤
CN102361985B (zh) 2008-12-04 2017-06-20 库尔纳公司 通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病
KR101718534B1 (ko) 2009-12-09 2017-03-22 닛토덴코 가부시키가이샤 Ｈｓｐ４７ 발현의 조절
CA2801066C (en) * 2010-06-02 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
US9011903B2 (en) 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體

Also Published As

Publication number Publication date
EP3075855A1 (en) 2016-10-05
PT2717921T (pt) 2016-07-08
TWI658830B (zh) 2019-05-11
WO2012170957A8 (en) 2013-12-27
US20130071478A1 (en) 2013-03-21
JP5873168B2 (ja) 2016-03-01
US20140356413A1 (en) 2014-12-04
PL3075855T3 (pl) 2019-02-28
KR102002771B1 (ko) 2019-07-23
AU2012267472B2 (en) 2017-07-27
KR20140035997A (ko) 2014-03-24
DK3075855T3 (en) 2018-10-08
CY1120685T1 (el) 2020-05-29
RU2628694C2 (ru) 2017-08-21
ES2586593T3 (es) 2016-10-17
ES2689696T3 (es) 2018-11-15
LT3075855T (lt) 2018-09-25
SI3075855T1 (sl) 2018-10-30
PT3075855T (pt) 2018-10-19
CA2836925A1 (en) 2012-12-13
SMT201800584T1 (it) 2019-01-11
US9456984B2 (en) 2016-10-04
EP2717921B1 (en) 2016-05-18
CN103781909A (zh) 2014-05-07
US20170175115A1 (en) 2017-06-22
WO2012170957A3 (en) 2013-04-11
WO2012170957A2 (en) 2012-12-13
RU2013158469A (ru) 2015-07-20
US8741867B2 (en) 2014-06-03
TW201315473A (zh) 2013-04-16
DK2717921T3 (en) 2016-07-04
CN103781909B (zh) 2017-12-05
CA2836925C (en) 2021-11-16
PL2717921T3 (pl) 2016-10-31
US20130071467A1 (en) 2013-03-21
HRP20181440T8 (hr) 2018-12-14
HRP20181440T1 (hr) 2018-11-02
US10195145B2 (en) 2019-02-05
EP2717921A2 (en) 2014-04-16
EP3075855B1 (en) 2018-08-15
HUE039379T2 (hu) 2018-12-28
US8664376B2 (en) 2014-03-04
JP2014519516A (ja) 2014-08-14
AU2012267472A1 (en) 2014-01-23
CY1117683T1 (el) 2017-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012267472B2 (en) Retinoid-liposomes for enhancing modulation of HSP47 expression
KR101900588B1 (ko) hsp47 발현의 조절
AU2011307259A1 (en) Modulation of TIMP1 and TIMP2 expression
AU2015200064B2 (en) Modulation of hsp47 expression
HK1229845A1 (en) Retinoid-liposomes for enhancing modulation of hsp47 expression
HK1229845A (en) Retinoid-liposomes for enhancing modulation of hsp47 expression
HK1229845B (en) Retinoid-liposomes for enhancing modulation of hsp47 expression