RS57886B1 - Mezenhimalne stromalne ćelije i primene vezane za njih - Google Patents

Mezenhimalne stromalne ćelije i primene vezane za njih

Info

Publication number
RS57886B1
RS57886B1 RS20181203A RSP20181203A RS57886B1 RS 57886 B1 RS57886 B1 RS 57886B1 RS 20181203 A RS20181203 A RS 20181203A RS P20181203 A RSP20181203 A RS P20181203A RS 57886 B1 RS57886 B1 RS 57886B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
mscs
mesenchymal stromal
cell
hemangioblasts
Prior art date
Application number
RS20181203A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Lanza
Erin Anne Kimbrel
Jianlin Chu
Nicholas Arthur Kouris
Original Assignee
Astellas Inst For Regenerative Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48536141&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57886(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Astellas Inst For Regenerative Medicine filed Critical Astellas Inst For Regenerative Medicine
Publication of RS57886B1 publication Critical patent/RS57886B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/14—Eye parts, e.g. lenses or corneal implants; Artificial eyes
    • A61F2/141—Artificial eyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F9/00—Methods or devices for treatment of the eyes; Devices for putting in contact-lenses; Devices to correct squinting; Apparatus to guide the blind; Protective devices for the eyes, carried on the body or in the hand
    • A61F9/08—Devices or methods enabling eye-patients to replace direct visual perception by another kind of perception
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F9/00—Arrangements for program control, e.g. control units
    • G06F9/06—Arrangements for program control, e.g. control units using stored programs, i.e. using an internal store of processing equipment to receive or retain programs
    • G06F9/46—Multiprogramming arrangements
    • G06F9/54—Interprogram communication
    • G06F9/542—Event management; Broadcasting; Multicasting; Notifications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1171—Haematopoietic stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/28—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F2218/00—Aspects of pattern recognition specially adapted for signal processing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Description

Opis
Polje pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu terapija na bazo ćelija radi smanjivanja manifestacija patologije kao što je ona okarakterisana nepogodnim imunim odgovorom kod subjekta, i takođe radi uticanja na poreklo patologije kao što ta da se abnormalnost koja definiše patologiju vrati u normalan položaj. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na mezenhimalne stromalne ćelije (MSCs) koje zadržavaju fenotip "mladalačkih" ćelija koji saopštava visoku potenciju u smanjivanju manifestacije patologije kod nekog subjekta.
Pozadina pronalaska
[0002] Mnoge patologije manifestuju se klinički putem neželjenih ili prekomernih imunih odgovora unutar domaćina, npr., odbacivanje transplanta, zapaljenski i autoimuni poremećaji. Imunosupresivne terapije razvijene su radi lečenja simptoma, ali ne i uzroka koji leži ispod patologije okarakterisane prekomernim imunim odgovorima. Ove terapije su efektivne u nishodno-modulisanju imune funkcije i, kao takve, nose potencijal za teške štetne pojave, koje uključuju kancer i oportunističku infekciju, kao i sporedne efekte kao što su katarakte, hiperglikemije, stvaranje modrica, i nefrotoksičnost od agenasa kao što su prednizon, ciklosporin, i takrolimus.
[0003] Iako su razvijene terapije koje ne suzbijaju celokupan imuni sistem, postoje ograničenja koja su takođe povezana sa voim režimima. Ovi imunomodulacioni terapije ciljaju suženiju tačku intervencije unutar imunog sistema i, kao takve, imaju drugačije, ponekad manje ozbiljne sporedne efekte. Primeri takvih imunomodulacionih terapija uključuju upotrebu antitela, npr., anti-CD3 ili anti-IL2R. Iako su uspešne u indukovanju povišenog stanja ne-odgovaranja, nedostaci ovih imunomodulacionih terapija rezultuju u reverziji neželjenih patologija.
[0004] Mezenhimalne matične ćelije (MSC) su multipotentne matične ćelije sa samo-obnavljajućim kapacitetom i sposobnošću da se diferenciraju u osteoblaste, hondrocite, i adipocite, među ostalim linijama mezenhimalnih ćelija. U skorijim godinama, ovo temeljno istraživanje na multirodnom diferencijacionom potencijalu i imunomodulacionim osobinama humane MSC su pokazale da se ove ćelije mogu primeniti za tretiranje opsega kliničkih stanja, koja uključuju imunološke poremećaje kao i degenerativne bolesti. Shodno tome, broj kliničkih ispitivanja sa MSC stabilno se povećava za širok spektar različitih stanja: bolest graft-vs-domaćin (GVHD), miokardijalni infarkt i zapaljenske i autoimunog bolesti i poremećaji, između ostalih. Trenutno, klinički programi koji koriste MSCs oslanjaju se na izolovanje ovih ćelija iz odraslih izvora i krvi iz pupčane vrpce. Ove visoko ćelijske doze potrebne za MSC kliničke primene (čak do nekoliko miliona ćelija po kg pacijenta) zahtevaju pouzdan, reproduciblan i efikasan ekspanzioni protokol, sposoban za generisanje velikog broja ćelija iz onih izolovanih iz donorikog izvora.
[0005] Međutim, kako bi se dostigli klinički značajni čelijski brojevi za primene u ćelijskim terapijama i tkivnom inženjeringu, MSC ex-vivo ekspanzija je obavezna. Tokom starenja in vivo, sekvencijalnog exvivo ćelijskog prolaženja MSCs iz krvi iz pupčane vrpce, fetalni i odrasli izvori (kao što su koštana srž ili masna tkiva) mogu da izazovu replikativni stres, hromozomalne nenormalnosti, ili druge stohatične ćelijske defekte, koje su rezultat progresivnog gubitka proliferativnog, klonogenskog i diferencijacionog potencijala ekspandiranih MSCs, koja na kraju mogu ugroziti MSC kliničku bezbednost i efikasnost. Upotreba starujućih MSCs u tretmanu ne treba da se potceni budući da ćelije gube deo njihovog diferencijacionog potencijala, a njihov sekterorni profil je takođe izmenjen. MSC starenje tokom uzgajanja pronađeno je da indukuje zasutavljanje ćelijskog rasta, sa skraćivanjem telomera, a kontinulano smanjenje u adipogenom diferencijacionom potencijalu prijavljeno je za MSC iz koštane srži (BM) zajedno sa povećavajućim prolazima, dok je sklonost ka diferencijaciji u osteogenu liniju povećano.
[0006] Shodno tome, neki od suštinskih problema ostaju da se razreše pre kliničke primene MSC. MSCs izvedene iz ESCs mogu se generisati u dovoljnim količinama i na veoma kontrolisan način, čime se zaobilaze problemi sa donor-zavisnim izvorima. Kako dugoročno engraftovanje MSCs nije neophodno, praktčno ne postoji zabrinutost za neslaganjem glavne histokompatibilnosti (MHC) [7, 8]. U stanju tehnike, MSCs izvedene iz ESCs dobijene su putem raznih postupaka koji uključuju zajedničko kulitivisanje sa mišjim OP9 ćelijama ili procedure ručnog sakupljanja [9-13]. Međutim, ovi postupci su naporni i generišu MSCs niskog prinosa, sa varirajućim kvalitetom i nedostatkom potencije. Šta više, maksimiziranje potencije injektovanih ćelija je poželjno, i u smislu da su sposobne da obezbede ćelijski proizvod sa boljim terapeutskim indeksom, sposobnost da se koriste pri redukovanoj dozi (broj ćelija) u odnosu na CB-izvedene, BM-ivedene ili adipost-izvedene MSCs, i/ili sposobnost da MSCs obezbede traktabilnu terapiju za zapaljenske i autoimunog bolesti za koje CB-izvedene, BM-izvedene ili adipostizvedene MSCs nisu dovoljno efikasne.
Kratak pregled poželjnih primera izvođenja
[0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za generisanje mezenhimalnih stromalnih ćelija koji obuhvata uzgajanje hemangioblasta pod uslovima u kojima se ćelije diferenciraju radi proizvodnje mezenhimalnih stromalnih ćelija. Ovaj pronalazak odnosi se na mezenhimalne stromalne ćelije (MSCs) i postupke za generisanje MSCs. Postupci ovog pronalaska proizvode suštinske brojeve mezenhimalnih stromalnih ćelija visokog kvaliteta, okarakterisane fenotipom mladalačkih ćelija koje saopštavaju visoku potenciju. U postupcima ovog pronalaska, MSCs se izvode iz hemangioblasta. Pripravci predmetnih MSCs korisni su u lečenju patologija, koje uključuju neželjene imune odgovore, npr., autoimunog bolesti i poremećaji, kao i zapaljenske bolesti i poremećaji.
[0008] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata poboljšane pripravke MSCs generisane iz hemangioblasta upotrebom poboljšanih postupaka za uzgajanje hemangioblasta. U primernim ostvarenjima, mezenhimalne stromalne ćelije ovog pronalaska zadržavaju visoke nivoe potencije i ne zgrušavaju se ili se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz embrionskih matičnih ćelija (ESCs). Mezenhimalne stromalne ćelije generisane prema bilo kojem ili više postupaka ovog pronalaska mogu da zadrže visoke nivoe potencije, i mogu da se ne zgrušavaju ili mogu da se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs.
[0009] Ovde su dalje opisani farmaceutski pripravci koji obuhvatajuju mezenhimalne stromalne ćelije, u kojima pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu da prođu najmanje 10 populacionih dupliranja, npr., najmanje 10 populacionih dupliranja javlja se u okviru oko 22-27 dana. Ovde su opisani farmaceutski pripravci koji obuhvataju mezenhimalne stromalne ćelije, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu da prođu najmanje 15 populacionih dupliranja, npr., najmanje 15 populacionih dupliranja javlja se u okviru oko 22-27 dana. Farmaceutski pripravci mogu se proizvesti in vitro diferencijacijom hemangioblasta. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti primatne ćelije, npr., humane ćelije. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti sposobne da prođu najmanje 15 populacionih dupliranja. Na primer, mezenhimalne stromalne ćelije prolaze najmanje 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više populacionih dupliranja. Pripravak može da obuhvata manje od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, ili 0.0001% pluripotentnih ćelija. Poželjno, pripravak je lišen pluripotentnih ćelija. Pripravak može da obuhvata najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% mezenhimalnih stromalnih ćelija.
[0010] U jednom primeru, najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivne su na (i) najmanje jedan od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; (ii) najmanje jedan od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC; ili (iii) bilo koju njihovu kombinaciju. U još jednom aspektu, najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivne su na (i) najmanje dva od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; (ii) sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC. U još jednom aspektu, najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija su (i) pozitivne na sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC i (ii) ne eksprimiraju ili eksprimiraju niske nivoe najmanje jednog od CD31, 34, 45, 133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4, TLR3. Dodatno, najmanje 60%, 70%, 80% ili 90% ovakvih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) jedan ili više od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (ii) jedan ili više od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC.
[0011] Farmaceutski pripravak može da obuhvata određenu količinu Mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne da leče ili spreče neželjeni imuni odgovor kod nekog subjekta kome je to potrebno.
Farmaceutski pripravak može dalje da obuhvata druge ćelije, tkiva ili organe za transplantaciju kod primaoca kome je to potrebno. Primerne druge ćelije ili tkiva uključuju RPE ćelije, kožne ćelije, kornealne ćelije, ćelije pankreasa, ćelije jetre, ili kadriološke ćelije ili tkivo koje sadrži bilo koje od pomenutih ćelija.
[0012] U još jednom primeru, mezenhimalne stromalne ćelije nisu izvedene iz koštane srži i potencija pripravka u imunoregulatornom ogledu je veća od potencije pripravka iz koštane srži izvedenih mezenhimalnih stromalnih ćelija. Potencija se može proceniti imunoregulatornim ogledom koji određuje EC50 dozu.
[0013] U jednom primeru, pripravak zadržava između oko 50 i 100% svog proliferativnog kapaciteta nakon deset populacionih dupliranja.
[0014] U još jednom primeru, mezenhimalne stromalne ćelije farmaceutskog pripravka nisu izvedene direktno iz pluripotentnih ćelija i u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije (a) ne zgrušavaju se ili se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs; (b) lakše se disperguju kada se splituju u poređenju sa mezenhimalnim ćelijama izvedenim direktno iz ESCs; (c) brojnije su od mezenhimalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs počevši sa ekvivalentnim brojevima ESCs; i/ili (d) stiču karakteristiku mezenhimalne ćelijske površinske markere pre mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs.
[0015] Ovaj pronalazak obuhvata postupke za generisanje mezenhimalnih stromalnih ćelija koji obuhvataju uzgajanje hemangioblast ćelija pod uslovima koji daju povećanje mezenhimalnih matičnih ćelija. Hemangioblasti mogu se uzgajati u uslovima bez dohranjivanja. Dodatno, hemangioblasti mogu da se nanose na matrici, npr., koja obuhvata transformišući faktor rasta beta (TGF-beta), epidermalni faktor rasta (EGF), faktor rasta 1 sličan insulinu, faktor rasta goveđeg fibroblasta (bFGF), i/ili faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF). Matrica mogu biti odabrana iz grupe koju čine: laminin, fibronektin, vitronektin, proteoglikan, entaktin, kolagen, kolagen I, kolagen IV, heparan sulfat, Matrigel (rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mišijih sarkoma ćelija), ekstrakt iz osnovne humane membrane, i bilo koja njihova kombinacija. Matrica može da obuhvata rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm mišjih sarkoma ćelija.
[0016] U jednom aspektu, mezenhimalne stromalne ćelije su sisarske. Poželjno, mezenhimalne stromalne ćelije su humane, pseće, ili konjske.
[0017] U jednom aspektu, hemangioblasti mogu se uzgajati u podlozi koja obuhvata αMEM. U još jednom aspektu, hemangioblasti mogu se uzgajati u podlozi koja obuhvata serum ili zamenu seruma. Na primer, hemangioblast ćelije mogu se uzgajati u podlozi koja obuhvata, αMEM dopunjenja sa 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%,19%, ili 20% fetalnog telećeg seruma. Pored primernih izvođenja podloga može da obuhvata veće procente fetalnog telećeg seruma, npr., više od 20%, npr., najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, ili čak veće procente fetalnog telećeg seruma. Hemangioblasti mogu se uzgajati na pomenutoj matrici tokom najmanje oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 dana.
[0018] U jednom aspektu, hemangioblasti ili hemangio-kolona formirajuće ćelije diferenciraju se iz pluripotentnih ćelija, npr., iPS ćelije, ili blastomeri. Pluripotentne ćelije mogu biti izvedeni iz jednog ili više blastomera bez uništavanja humanog embriona. Dodatno, hemangioblasti mogu se diferenciratii iz pluripotentnih ćelija postupkom koji obuhvata (a) uzgajanje pomenutih pluripotentnih ćelija radi obrazovanja klastera ćelija. U jednom aspektu, pluripotentne ćelije uzgajaju se u prisustvu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i/ili koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4). VEGF i BMP-4 mogu se dodati pluripotentnoj ćelijskoj kulturi unutar 0-48 sati od inicijacije pomenutog ćelijskog uzgajanja, a pomenuti VEGF opciono se dodaje pri koncentraciji od 20-100 nm/mL, a pomenuti BMP-4 opciono se dodaje pri koncentraciji od 15-100 ng/mL.
[0019] U jednom aspektu, hemangioblasti se diferenciraju iz pluripotentnih ćelija postupkom koji dalje obuhvata: (b) uzgajanje pomenute jedne ćelije u prisustvu najmanje jednog faktora rasta u određenoj količini dovoljnoj da indukuje diferencijaciju pomenutih klastera ćelija u hemangioblaste. Najmanje jedan faktor rasta dodat u fazi (b) može da obuhvata jedan ili više od osnovnog fibroblastnog faktora rasta (bFGF), vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4), faktora matičnih ćelija (SCF), Flt 3L (FL), trombopoietina (TPO), EPO, i/ili tPTD-HOXB4. Jedan ili više od pomenutog najmanje jednog faktora rasta dodatog u fazi (b) može se dodati pomenutoj kulturi unutar 36-60 sati od početka faze (a). Poželjno, jedan ili više od pomenutog najmanje jednog faktora rasta dodatog u fazi (b) dodaje se pomenutoj kulturi unutar 40 - 48 sati od početka faze (a). Najmanje jedan faktor dodat u fazi (b) može da obuhvata jedan ili više od bFGF, VEGF, BMP-4, SCF, FL i/ili tPTD-HOXB4. Koncentracija pomenutih faktora rasta ukoliko su dodati u fazi (b) mogu biti u opseku od oko sledećeg: bFGF je oko 20-25 ng/ml, VEGF je oko 20-100 ng/ml, BMP-4 je oko 15-100 ng/ml, SCF je oko 20-50 ng/ml, FL je oko 10-50 ng/ml, TPO je oko 20 -50 ng/ml, i tPTD-HOXB4 je oko 1.5-5 U/ml.
[0020] U još jednom aspektu, postupak dalje obuhvata (c) disocijaciju pomenutih klastera ćelija, opciono u jedne ćelije. U još jednom aspektu, postupak dalje obuhvata (d) uzgajanje pomenutih hemangioblasta u podlozi koja obuhvata najmanje jedan dodatni faktor rasta, u kojem pomenuti najmanje jedan dodatni faktor rasta je u određenoj količini dovoljnoj da proširi hemangioblaste ili hemangio-kolona formirajuće ćelije. Najmanje jedan dodatni faktori rasta iz (d) može da obuhvata jedan ili više od: insulin, transferin, granulocit makrofaga kolona-stimulišući faktor (GM-CSF), interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6), granulocit kolona-stimulišući faktor (G-CSF), eritropoietin (EPO), faktor matičnih ćelija (SCF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), koštani morfogeni protein 4 (BMP-4), i/ili tPTD-HOXB4. Primerne koncentracije u fazi (d) uključuju insulin oko 10-100 µg/ml, transferin oko 200-2,000 µg/ml, GM-CSF oko 10-50 ng/ml, IL-3 oko 10-20 ng/ml, IL-6 oko 10-1000 ng/ml, G-CSF oko 10-50 ng/ml, EPO oko 3-50 U/ml, SCF oko 20-200 ng/ml, VEGF oko 20-200 ng/ml, BMP-4 oko 15-150 ng/ml, i/ili tPTD-HOXB4 oko 1.5-15U/ml. Podloga u fazi (a), (b), (c) i/ili (d) može biti podloga bez seruma.
[0021] U jednom aspektu, postupak generiše najmanje 80, 85, 90, 95, 100, 125, ili 150 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija. Hemangioblasti mogu se sakupiti nakon najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 dana od početka indukovanja diferencijacije pomenutih pluripotentnih ćelija.
Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti generisane unutar najmanje 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50 dana od početka indukovanja diferencijacije pomenutih pluripotentnih ćelija. U još jednom aspektu, postupak rezultuje u najmanje 80, 85, 90, 95, 100, 125, ili 150 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija koje se generišu iz oko 200,000 hemangioblasta unutar oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 dnevne kulture. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti generisane iz hemangioblasta i/ili hemangio-kolona formirajućih ćelija u odnosu hemangioblasti prema mezenhimalnim stromalnim ćelijama od najmanje 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:415, 1:425, 1:440; 1:450, 1:365, 1:475, 1:490 i 1:500 unutar oko 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 dnevne kulture. Te ćelije mogu biti humane.
[0022] Ovaj pronalazak takođe obuhvata mezenhimalne stromalne ćelije izvedene iz hemangioblasta dobijenoh opisanim postupcima. U jednom aspektu, ovaj pronalazak uključuje mezenhimalne stromalne ćelije izvedene in vitro diferencijacijom hemangioblasta. Najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu (i) biti pozitivne na sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC i (ii) ne eksprimiraju ili eksprimiraju niske nivoe najmanje jednog od CD31, 34, 45, 133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4, TLR3. Alternativno, najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (ii) sve od CD73, CD90, CD105, CD13, CD29, CD44, CD166, CD274, i HLA-ABC. Najmanje 60%, 70%, 80% ili 90% ovih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) najmanje jedan od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (ii) najmanje jedan od CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC. Poželjno, mezenhimalne stromalne ćelije ne eksprimiraju ili eksprimiraju niske nivoe najmanje jednog od CD31, CD34, CD45, CD133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4, TLR3.
[0023] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija koje su ovde opisane. Pripravak može da obuhvata manje od 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, ili 0.0001% pluripotentnih ćelija. Poželjno, pripravak je lišen pluripotentnih ćelija. Pripravak može biti suštinski prečišćen i opciono obuhvata najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% humanih mezenhimalnih stromalnih ćelija. Pripravak može da obuhvata suštinski slične nivoe p53 i p21 proteina ili u kojem su nivoi p53 proteina u poređenju sa p21 proteinom 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 puta veći.. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu sposobne za prolaženje najmanje 5 populacionih dupliranja u kulturi. Poželjno, mezenhimalne stromalne ćelije sposobne su za prolaženje najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više populacionih dupliranja u kulturi.
[0024] U jednom aspektu, mezenhimalne stromalne ćelije ovog pronalaska (a) ne zgrušavaju se ili se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs; (b) lakše se disperguju kada se splituju u poređenju sa mezenhimalnim ćelijama izvedenim direktno iz ESCs; (c) brojnije su od mezenhimalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs počevši sa ekvivalentnim brojevima ESCs; i/ili (d) stiču karakteristiku mezenhimalnih ćelijskih površinskih markera pre mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs. Ovaj pronalazak opisuje farmaceutski pripravak koji obuhvata takve mezenhimalne stromalne ćelije, koji obuhvata određenu količinu Mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne da leče neželjeni imuni odgovor. Pripravak može da obuhvata određenu količinu Mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne da leče neželjeni imuni odgovor i dalje obuhvata druge ćelije ili tkiva za transplantaciju kod primaoca kome je to potrebno. Primerne druge ćelije uključuju alogene ili singenske pankreasne, neuronske, jetrene, RPE, ili kornealne ćelije ili tkiva koja sadrže bilo koje od prethodno pomenutog. Farmaceutski pripravak može biti koristan u tretiranju autoimunog poremećaja ili imune reakcije protiv alogenih ćelija koje uključuju, ali nisu ograničene na, multiple sklerozu, sistemsku sklerozu, hematološke malignosti, miokardijalni infarkt, odbacivanje organa nakon transplantacije, hronične alograftne nefropatije, ciroze, otkazivanja jetre, otkazivanja srca, GvHD, tibijalne frakture, leve ventrikularne disfunkcije, leukemije, mijeloplastičnog sindroma, Kronove bolesti, dijabetesa, hronične opstruktivne bolesti pluća, osteogeneze imepfekta, homozigotne familijarne hipoholesterolemije, lečenje praćeno menisektomijom, periodontitisa kod odraslih, vaskulogeneze kod pacijenata sa teškom miokardijalnom ishemijom, oštećenja kičmene moždine, osteoplazije, kritične ishemije ekstremiteta, bolesti dijabetičnog stopala, primarnog Sjogrenovog sindroma, osteoartritisa, defekata hrskavice, laminitisa, multisistemske atrofije, amiotrofične lateralne skleroze, kadriološke operacije, sistemskog lupusa eritematozisa, alografta živih bubrega, nemaligne poremećaje crvenih krvnih zrnaca, toplotne opekotine, radijacione opekotine, Parkinsonove bolesti, mikrofraktura, epidermolizisa buloze, teške koronarne ishemije, idiopatske dilatirane kardiomiopatije, osteonekrozu femoralne glave, lupus nefritis, defekte koštane praznine, ishemijskog celebralnog šloga, nakon šloga, akutnog radijacionog sindroma, plućne bolesti, artritisa, koštane regeneracije, uveitisa ili njihovih kombinacija. Predmetne MSC (koje uključuju njihove formulacije ili pripravke) mogu se primeniti za lečenje respiratornih stanja, naročito onih koje uključuju zapaljenske komponente ili akutnu povredu, kao što su Respiratorni distres sindrom kod odraslih, post-traumatični Respiratorni distres sindrom kod odraslih, bolest transplantiranih pluća, Hronična opstruktivna bolest pluća, emfizem, hronični opstruktivni bronhitis, bronhitis, alergijska reakcija, oštećenje usled bakterijske ili virusne upale pluća, astma, izlaganje iritantima, i upotreba duvana. Dodatnopredmetne MSC (koje uključuju njihove formulacije ili pripravke) mogu se primeniti za lečenje atopičnog dermatitisa, alergijskog rinitisa, gubitka sluha (naročito autoimunog gubitka sluha ili bukom-indukovanog gubitka sluha), psorijaze.
[0025] Ovde su dalje opisane kompleti koji obuhvataju mezenhimalne stromalne ćelije ili pripravci mezenhimalnih stromalnih ćelija koje su ovde opisane. Ti kompleti mogu da obuhvataju mezenhimalne stromalne ćelije ili pripravke mezenhimalnih stromalnih ćelija koji su zamrznuti ili krio sačuvani.
Mezenhimalne stromalne ćelije ili pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija obuhvaćeni u kompletu mogu biti sadržani u vozilu za ćelijsku dostavu.
[0026] Šta više, ovde su opisani postupci za lečenje bolesti ili poremećaja, koji obuhvataju davanje efektivne količine Mezenhimalnih stromalnih ćelija ili pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija koje su ovde opisane subjektu kome je to potrebno. Postupak može dalje da obuhvata transplantaciju drugih ćelija ili tkiva, npr., retinalnih, RPE, kornealnih, neuronskih, imunih, koštane srži, jetre ili ćelije pankreasa. Primerne bolesti ili poremećaji koji se tretiraju uključuju, ali nisu ograničeni na, multiple sklerozu, sistemsku sklerozu, hematološke malignosti, miokardijalni infarkt, odbacivanje organa nakon transplantacije, hronične alograftne nefropatije, ciroze, otkazivanja jetre, otkazivanja srca, GvHD, tibijalne frakture, leve ventrikularne disfunkcije, leukemije, mijeloplastičnog sindroma, Kronove bolesti, dijabetesa, hronične opstruktivne bolesti pluća, osteogeneze imepfekta, homozigotne familijarne hipoholesterolemije, lečenje praćeno menisektomijom, periodontitisa kod odraslih, vaskulogeneze kod pacijenata sa teškom miokardijalnom ishemijom, oštećenja kičmene moždine, osteoplazije, kritične ishemije ekstremiteta, bolesti dijabetičnog stopala, primarnog Sjogrenovog sindroma, osteoartritisa, defekata hrskavice, laminitisa, multisistemske atrofije, amiotrofične lateralne skleroze, kadriološke operacije, upornog sistemskog lupusa eritematozisa, alografta živih bubrega, nemaligne poremećaje crvenih krvnih zrnaca, toplotne opekotine, radijacione opekotine, Parkinsonove bolesti, mikrofraktura, epidermolizisa buloze, teške koronarne ishemije, idiopatske dilatirane kardiomiopatije, osteonekrozu femoralne glave, lupus nefritis, defekte koštane praznine, ishemijskog celebralnog šloga, nakon šloga, akutnog radijacionog sindroma, plućne bolesti, artritisa, koštane regeneracije, ili njihovih kombinacija. U jednom aspektu, bolest ili poremećaj je uveitis. U još jednom aspektu, bolest ili poremećaj je autoimuni poremećaj, npr., multiple skleroza, ili imuna reakcija protiv alogenih ćelija.
[0027] Ovde su takođe opisani postupci lečenja gubitka kostiju ili oštećenja hrskavice koji obuhvataju davanje efektivne količine mezenhimalnih stromalnih ćelija ili pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija koje su ovde opisane subjektu kome je to potrebno. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu se davati u kombinaciji sa alogenom ili singenskom translpantiranom ćelijom ili tkivom, npr., retinalni pigment epitelna ćelija, retinalna ćelija, kornealna ćelija, ili mišićna ćelija.
[0028] Ovaj pronalazak obuhvata postupke uzgajanja hemangioblasta koji generiše pripravke MSCs, koje zadržavaju potenciju, uprkos povećanju brojeva populacionih dupliranja. Farmaceutski pripravci mezenhimalnih stromalnih ćelija ovog pronalaska pokazuju poboljšane terapeutske osobine kada se daju sisarskom domaćinu kome je potrebno ovakvo davanje.
Kratak opis crteža
[0029]
1
FIG.1. Generisanje FM-MA09-MSC iz pluripotentnih ćelija. Ovaj crtež pokazuje mikroskopski izgled generisanja mezenhimalnih stromalnih ćelija iz ESCs putem hemangioblasta.
FIG.2. Fenotip FM-MA09-MSC dobijen iz iz pluropotentnih ćelija-izvedenih hemangioblasta. Ovaj crtež pokazuje procenat ćelija pozitivnih na MSC površinske markere u inicijalnoj populaciji hemangioblasta (leva strana grafikona, dan 7-11 hemangioblasta) i nakon uzgajanja hemangioblasta na Matrigelom obloženim pločama (desna strana grafikona) i mikroskopski izgled Mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz hemangioblasta (desni panel fotografije).
FIG.3. Fenotipovi mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz različitih postupaka uzgajanja. Ovaj crtež pokazuje procenat ćelija pozitivnih na MSC površinske markere nakon uzgajanja humanih embrionskih matičnih ćelija (ESC) na želatinom obloženim pločama (levi panel), ESC na Matrigelom obloženim pločama (srednji panel), i hemangioblasta na Matrigelom obloženim pločama (desni panel).
FIG.4. Prinos mezenhimalnih stromalnih ćelija iz pluripotentnih ćelija. Ovaj crtež pokazuje prinose ćelija pozitivnih na MSC površinske markere dobijene iz uzgajanja ESC na želatinom obloženim pločama (prva kolona – bez prinosa), ESC na Matrigelom obloženim pločama (druga kolona), i hemangioblasta na Matrigelom obloženim pločama (treća kolona).
FIG.5. Dobijanje markera mezenhimalnih stromalnih ćelija. Ovaj crtež prikazuje vreme tokom kojeg se dobijaju MSC površinski markeri upotrebom hemangioblasta (gornja linija) i ESC (donja linija).
FIG.6. Fenotipovi mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz različitih postupaka uzgajanja. Ovaj crtež pokazuje procenat ćelija pozitivnih na MSC markere i negativnih na hematopoiezu i endotelijalne markere nakon uzgajanja ESC na Matrigelom obloženim pločama (levi panel) i hemangioblasta na Matrigelom obloženim pločama (desni panel).
FIG.7. FM-MA09-MSC prikazuju diferencijacione sposobnosti. Ovaj crtež prikazuje diferencijacione sposobnosti Mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz hemangioblasta diferenciran iz MA09 ESC radi obrazovanja adipocita i osteocita.
FIG.8. MSC hondrogena diferencijacija. Ovaj crtež prikazuje hondrogenu diferencijaciju MA09 ESC hemangioblast-izvedenih mezenhimalnih stromalnih ćelija putem mRNK ekspresije Agrekana (hondroitin proteoglikan sulfat 1) i Kolagen IIa.
FIG.9. Tranzijentna ekspresija CD309 putem FM-MA09-MSC. Ovaj crtež pokazuje tranzijentnu ekspresiju ćelijsko površinskog markera CD309.
FIG.10A. T-ćelijska proliferacija u odgovoru na mitogen suzbijena je putem FM-MA09-MSC. Ovaj crtež pokazuje suzbijanje hemangioblast-izvedenim mezenhimalnim stromalnim ćelijama T-ćelijske proliferacije izazvane hemijskom stimulacijom (PMA/jonomicin).
FIG.10B. T-ćelijska proliferacija u odgovoru na antigen koji predstavlja ćelije suzbijena je putem FM-MA09-MSC. Ovaj crtež pokazuje suzbijanje hemangioblast-izvedenim mezenhimalnim stromalnim ćelijama T-ćelijske proliferacije izazvane izlaganjem dendritskim ćelijama.
FIG.11. T-ćelijska proliferacija u odgovoru na antigen koji predstavlja ćelije suzbijena je putem FM-MA09-MSC. FIG.11A pokazuje da su hemangioblast-izvedene mezenhimalne stromalne ćelije sposobne da povećaju procenat CD4/CD25 dvostruko pozitivnih Tregs koji su indukovani u odgovoru na IL2 stimulus.
FIG.11B pokazuje da hemangioblast-izvedene mezenhimalne stromalne ćelije inhibiraju Th1 lučenje IFNγ.
FIG.12. Prozapaljenski citokin IFNg stimuliše promene u Ekspresiji FM-MA09-MSC površinskog markera. Ovaj crtež pokazuje da interferon gama stimuliše promene u Ekspresiji MSC površinskog markera i može ojačati MSC imunosupresivne efekte.
FIG.13. Povećana potencija, veći inhibitorni efekti of FM-MA09-MSCs u poređenju sa BM-MSCs. FM-MA09-MSCs exert veći inhibitorni efekti na T-ćelijsku proliferaciju u odnosu na BM -MSCs. (A.) Povećanje količine MSCs u zajedničkoj kulturi sa PBMCs izaziva dozno-zavisno smanjenje u T-ćelijskoj proliferaciji u odgovoru na PMA i jonomicin. Mlade (p4) FM-MA09-MSCs su najpotentnije od svih testiranih vrsta ćelija. (B.) FM-MA09-MSCs inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju do većeg stepena u odnosu na BM-MSCs u odgovoru na PHA.5:1 odnos PBMCs:MSCs zajedno su uzgajane tokom 6 dana. (C.) FM-MA09-MSCs inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju u odgovoru na povećanje količina dendritskih ćelija bolje u odnosu na BM-MSCs. U (A-C), procenat T-ćelijske proliferacije procenjen je BrdU inkorporacijom u CD4+ i/ili CD8+ ćelijsku populaciju.
FIG.14. FM-MA09-MSCs ojačavaju Treg indukcija: MSCs ranog prolaza imaju veće efekte u odnosu na MSCs kasnog prolaza. Ne-adherentne PBMCs (različiti donori) kulitivisane su /IL2 tokom 4 dana u odsustvu ili prisustvu FM-MA09-MSCs. Procenat CD4/CD25 dvostruko pozitivnih Tregs procenjen je protočnom citometrijom. Mlade (p6) ili stare (p16-18) FM-MA09-MSCs su korišćene. Crni stubići indikuju prosek 6 eksperimenata. MSCs su kao celina imale statistički značajan efekat na indukciju Tregs. (p=0.02).
FIG.15. Ojačana Treg ekspanzija putem FM-MA09-MSCs u poređenju sa BM-MSCs. FM-MA09-MSCs indukuju Treg ekspanziju bolje u odnosu na BM-MSCs. (A.) Broj povećanja u CD4/CD25 dvostruko pozitivnim Tregs. Minus IL2 stanje podešeno je na 1, a druge grupe grupe eksprimirane su kao broj indukcija tokom ovog nivoa. MM=MA09-MSCs, BM=koštana srž MSCs. "p" = broj prolaza. (B.) FM MA09-MSCs (MM) indukuju CD4/CD25/FoxP3 trostruko pozitivne Tregs bolje u odnosu na BM-MSCs. (C.) Procenat odgovorljivih PBMCs koje su CD4+ konzistentne su među različitim tretmanskim grupama. (D.) Procenat odgovorljivih PBMCs koje su CD25+ variraju među različitim tretmanskim grupama. FM-MA09-MSCs indukuju veću ekspresiju CD25 u odnosu na BM-MSCs. Ova razlika može objasniti razliku u indukciji Tregs.
FIG.16. FM-MA09-MSCs imaju veći proliferativni kapacitet od BM-MSCs. FM-MA09-MSCs imaju veći proliferativni kapacitet u odnosu na BM-MSCs. Kumulativna populaciona dupliranja prikazana su naspram broja dana u kulturi. Nakon inicijalnog zasađivanja ESC-izvedenih hemangioblasta ili iz koštane srži-izvedenih mononuklearnih ćelija, adherentne ćelije smatrane su p0 MSCs. Sukcesivni MSC prolazi ponovo su naneti pri gustini od 7000 ćelije/kv. cm i sakupljene kada su kulture bile približno 70% konfluentne (svakih 3-5 dana).
FIG.17. Postupak FM-MA09-MSC generisanja; Matrigel efekat. Uklanjanje ćelija iz Matrigela u ranom prolazu (tj., p2) može privremeno usporiti MSC rast u poređenju sa onim održavanim na Matrigelu do p6.
FIG.18. BM-MSCs i FM-MA09-MSCs prolaze hondrogenezu. Safranin O bojenje (indikativno za deponovanje matrice hrskavice) izvedeno je parafin-obloženim pelet masovne kulture nakon 21 dana. Slike su 40X uveličane.
FIG.19. U bazalnom stanju, FM-MA09-MSCs luče manje PGE2 u odnosu na BM-MSCs ali je broj povećanja nakon IFNγ ili TNFα stimulacije veći. (A.) Količina prostaglandin E2 lučenja (pg/ml) prikazana je za BM-MSCs versus FM-MA09-MSCs pod bazalnim ili različitim stimulacionim stanjima. PGE2 količine normalizovane su na broj ćelija. (B.) Bazalne PGE2 vrednosti podešene su na 1 (crna linija), a PGE2 lučenje pod različitim stimulansima eksprimirane su kao broj povećanja u odnosi na bazalno nivo.
FIG.20. FM-MA09-MSCs održava fenotip tokom vremena. Analiza protočne citometrije različitih MSC populacija. (A.) Ekspresija ćelijsko površinskog markera za FM-MA09-MSCs održava se na tri različita supstrata i u poređenju sa BM-MSCs. (B.) Ekspresija ćelijsko površinskog markera za FM-MA09-MSCs procenjena je tokom vremena (sa sukcesivnim prolazima, kako indikovano).
FIG.21. FM-MA09-MSCs eksprimiraju manje Stro-1 i više CD10 u poređenju sa BM-MSCs. Analiza protočne citometrije različitih MSC populacija. Stro-1 ekspresija je niža u FM-MA09-MSCs od u BM-MSCs pri indikovanom broju prolaza. CD10 ekspresija je viša u FM-MA09-MSCs od u BM-MSCs. Drugi markeri su isti za obe MSC populacije.
FIG.22. Stro-1 i CD10 ekspresija u 10 različitih količina ranog prolaza FM-MA09-MSCs konzistentno pokazuje nisko Stro-1 i srednje-opsežnu CD10 ekspresiju. Analiza protočne citometrije različitih MSC populacija. Deset različitih količina FM-MA09-MSCs evaluirane su pri indikovanom broju prolaza za ekspresiju Stro-1 i CD10. Stro-1 ekspresija je konzistentno niska u različitim količinama FM-MA09-MSCs (prosek od 5-10%). CD10 ekspresija je konzistentno nivoa srednjeg opsega u različitim količinama FM-MA09-MSCs (prosek od približno 40%).
FIG.23. FM-MA09-MSCs održavaju svoju veličinu kako stare u kulturi dok se BM-MSC ćelijska veličina povećava sa starenjem. Tačkasti dijagrami raspršivanja ka napred/bočnog raspršivanja na protočnoj citometriji (pokazani na levoj strani) korišćeni su radi beleženja veličine MSCs. Procenat ćelija u gornjem desnom kvadrantu "velikih" ćelija praćeni su i prikazani u stubičastom grafikonu.
FIG.24. CD10 i CD24 su ushodno regulisane u FM-MA09-MSCs u poređenju sa BM-MSCs. Analiza genske ekspresije prikazana je za BM-MSCs i FM-MA09-MSCs u bazalnom stanju. Kvantitativna RT-PCR sa
1
Taqman sondama korišćena je za određivanje eskpresije indikovanih gena i normalizovanih na dva konstitutivna gena. Prosek četvorostrukih čitanja prikazan je /- standardna devijacija.
FIG.25. Aire-1 i IL-11 su ushodno regulisane u FM-MA09-MSCs u poređenju sa BM-MSCs. Analiza genske ekspresije prikazana je za BM-MSCs i FM-MA09-MSCs u bazalnom stanju. Kvantitativna RT-PCR sa Taqman sondama korišćena je za određivanje eskpresije indikovanih gena i normalizovanih na dva konstitutivna gena. Prosek četvorostrukih čitanja prikazan je /- standardna devijacija.
FIG.26. Ang-1 i CXCL1 su ushodno regulisane u FM-MA09-MSCs u poređenju sa BM-MSCs. Analiza genske ekspresije prikazana je za BM-MSCs i FM-MA09-MSCs u bazalnom stanju. Kvantitativna RT-PCR sa Taqman sondama korišćena je za određivanje eskpresije indikovanih gena i normalizovanih na dva konstitutivna gena. Prosek četvorostrukih čitanja prikazan je /- standardna devijacija.
FIG.27. IL6 i VEGF su nishodno regulisane u FM-MA09-MSCs u poređenju sa BM-MSCs. Analiza genske ekspresije prikazana je za BM-MSCs i FM-MA09-MSCs u bazalnom stanju. Kvantitativna RT-PCR sa Taqman sondama korišćena je za određivanje eskpresije indikovanih gena i normalizovanih na dva konstitutivna gena. Prosek četvorostrukih čitanja prikazan je /- standardna devijacija.
FIG.28. FM-MA09-MSCs i BM-MSCs pokazuju povećan indoleamin 2,3 deoksigenaza (IDO) aktivnost u odgovoru na 3 dnevnu IFNγ stimulaciju. Poređenje MSCs stimulisanih sa 50 ng/ml IFNg tokom 3 dana, na njihovu sposobnost da konvertuju triptofan u kinurenin (indikativno za IDO aktivnost). Za svaku MSC populacijau, 1 milion ćelija lizirano je i upotrebljeno u ogledu.
FIG.29. Promene povezane sa starenjem u FM-MA09-MSC ekspresiji Aire-1 i Prion Proteina (PrP): dva proteina uključeni su u imuno suzbijanje i proliferacija, respektivno. Western blot analiza Aire-1 i PrP ekspresije u FM-MA09-MSCs celim ćelijskim lizatima u različitim brojevima prolaza (p). Aktin ekspresija prikazana je kao kontrola uvođenja. Razlike u Aire-1 i PrP ekspresiji su označene obeležavanjem aktin kontrola uvođenja.
FIG.30. FM-MA09-MSCs luče manje IL6 od BM-MSCs od u bazalnom stanju. Citokinski nizovi pokazuju pozitivne kontrole za normalizaciju (4 tačke na levoj strani) i IL6 (uokviren) u MSC kondicioniranoj podlozi. BM-MSCs dva različita donora porede se sa 4 različite količine FM-MA09-MSCs.
FIG.31. FM-MA09-MSCs luče manje IL6 od BM-MSCs u bazalnom i IFNγ-stimulisanom stanju. Citokinski nizovi pokazuju pozitivne kontrole za normalizaciju (4 tačke na levoj strani) i IL6 (uokviren) u MSC kondicioniranoj podlozi. Prolaz 7 BM-MSCs porede se sa p7 FM-MA09-MSCs nakon 48 sati /- IFNγ tretiranja.
FIG.32. FM-MA09-MSCs luče manje VEGF od BM-MSCs u bazalnom i IFNγ-stimulisanom stanju.
Citokinski nizovi pokazuju pozitivne kontrole za normalizaciju (4 tačke na levoj strani) i VEGF (uokviren) u MSC kondicioniranoj podlozi. Prolaz 7 BM-MSCs porede se sa p7 FM-MA09-MSCs nakon 48 sati /-IFNγ tretiranja.
Detaljan opis pronalaska
[0030] Ovaj pronalazak odnosi se na postupke generisanja mezenhimalnih stromalnih ćelija, takođe su opisani pripravci mezenhimalnih stromalnih ćelija iz kultivisanih hemangioblasta, postupci kultivisanja hemangioblasta, i postupci lečenja patologija upotrebom mezenhimalnih stromalnih ćelija.
[0031] Postupci ovog pronalaska, u kojima hemangioblast kulture proizvode povećane prinose mezenhimalnih stromalnih ćelija, u poređenju sa postupcima iz stanja tehnike, su efikasniji od prethodnih postupaka u proizvodnji suštinski ESC-oslobođenih mezenhimalnih stromalnih ćelija.
Hemangioblast-izvedene mezenhimalne stromalne ćelije ovog pronalaska zadržavaju nov, mladalački fenotip kako je definisano ekspresijom ili manjkom njihovih specifičnih markera.
[0032] U određenim primerima izvođenja, MSC pripravak (kao što su kulture sa najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>ili čak 10<6>MSCs) može imati, kao prosek, telomerne dužine koje su najmanje 30 procenata telomerne dužine ESC i/ili humane iPS ćelije (ili prosek populacije ESC i/ili humane iPS ćelije), i poželjno najmanje 40, 50, 60, 7080 ili čak 90 procenata telomerne dužine ESC i/ili humane iPS ćelije (ili proseka populacije ESC i/ili humane iPS ćelije). Na primer, pomenuti ESC i/ili humana iPS ćelija (ili pomenuta populacija ESC i/ili humane iPS ćelije) može biti ćelija ili ćelijska populacija iz koje se pomenute MSC ćelije diferenciraju.
[0033] MSC pripravak može, kao populacija, da ima srednju dužinu terminalne restrikcije fragmenta (TRF) koja je duža od od 4 kb, i poželjno duža od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili čak 13 kb. U primernom ostvarenju, MSCs pripravka mogu imati prosek TRF koji je 10 kb ili duži.
[0034] U određenim primerima izvođenja, MSC pripravak (kao što su kulture sa najmanje 103, 104, 10<5>, 10<6>, 10<7>ili čak 10<8>MSCs) ima replikativni životni vek koji je veći od replikativnog životnog veka MSC pripravaka dobijenih iz drugih izvora (npr., kulture izvedene iz doniranog humanog tkiva, kao što su tkiva fetusa, novorođenčeta, deteta, adolescenta ili odrasle osobe). Replikativni životni vek može biti procenjen određivanjem broja populacionih dupliranja ili prolaza u kulturi pre replikativnog starenja, tj., gde više od 10, 20, 30, 40 ili čak 50 procenata ćelija u kulturi biološki stari pre sledećeg dupliranja ili prolaza. Na primer, predmetni MSC pripravci mogu da imaju replikativni životni vek koji je najmanje 10 dupliranja veći od onog od MSC pripravak izveden iz doniranog humanog tkiva (naročito izveden iz koštane srži odrasle osobe ili adipoznog tkiva odrasle osobe), i poželjno najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90 ili čak 100 populacionih dupliranja. U određenim primerima izvođenja, MSC pripravci mogu da imaju replikativni životni vek koji omogućava najmanje 8 prolaza pre nego što više od 50 procenata ćelija biološki ostari i/ili se diferencira u ne-MSC ćelijske tipove (kao što su fibroblasti), a više od poželjno najmanje 10, 12, 14, 16, 18 ili čak 20 prolazi pre dostizanja te tačke. U određenim primerima izvođenja,
1
MSC pripravak može da ima replikativni životni vek koji omogućava najmanje 2 puta od onoliko dupliranja ili prolaza u odnosu na iz koštane srži odrasle osobe-izvedene MSC pripravke i/ili adipoznoizvedene MSC pripravke (npr., ekvivalentan početni broj ćelija) pre nego više od 50 procenata ćelija biološki ostari i/ili se diferencira u ne-MSC ćelijske tipove (kao što su fibroblasti), a poželjnije najmanje 4, 6, 8 ili čak 10 puta od onoliko dupliranja ili prolaza.
[0035] U određenim primerima izvođenja, MSC pripravak ovog pronalaska (kao što su kulture sa najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>ili čak 10<8>MSCs) ima statistički značajno smanjen sadržaj i/ili enzimatsku aktivnost proteina uključenih u regulaciju ćelijskog ciklusa i starenje u odnosu na prolaz 1 (P1), prolaz 2 (P2), prolaz 3 (P3), prolaz 4 (P4) i/ili prolaz 5 (P5) MSC pripravke izvedene iz drugih izvora (npr., kulture izvedene iz doniranog humanog tkiva, kao što su tkiva fetusa, novorođenčeta, deteta, adolescenta ili odrasle osobe), a naročito iz koštane srži-izvedenih MSCs i adipozno-izvedenih MSCs. Na primer, predmetni MSC pripravak ima proteazom 26S podjedinicu, ne-ATPaza regulatornu podjedinični 11 (PSMD11) proteinski sadržaj koji je manji od 75 procenat od sadržaja u MSCs iz doniranog humanog tkiva (naročito izvedene iz koštane srži odrasle osobe ili adipoznog tkiva odrasle osobe), i čak poželjnije manji od 60, 50, 40, 30, 20 ili čak 10 procenata.
[0036] U određenim primerima izvođenja, MSC pripravak ovog pronalaska (kao što su kulture sa najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>ili čak 10<8>MSCs) ima statistički značajno smanjen sadržaj i/ili enzimatsku aktivnost proteina uključenih u energiju i/ili lipidni metabolizam ćelije u odnosu na prolaz 1 (P1), prolaz 2 (P2), prolaz 3 (P3), prolaz 4 (P4) i/ili prolaz 5 (P5) MSC pripravke izvedene iz drugih izvora (npr., kulture izvedene iz doniranog humanog tkiva, kao što su tkiva fetusa, novorođenčeta, deteta, adolescenta ili odrasle osobe), i naročito iz koštane srži-izvedenih MSCs i adipozno-izvedenih MSCs. Kao ilustracija, predmetni MSC pripravak ima proteinski sadržaj koji je manji od 90 procenata od sadržaja u MSCs iz doniranog humanog tkiva (naročito izvedenih iz koštane srži odrasle osobe ili adipoznog tkiva odrasle osobe), i čak poželjnije manje od 60, 50, 40, 30, 20 ili čak 10 procenata, za jedan ili više proteina uključenih u metaboličkim putanjama za ATP ili NADPH sintezu kao što su glikoliza (kao što su fruktozabifosfatna aldolaza A, ALDOA; aldo-keto reduktaza familija 1, član A1, AKR1A1); glikeraldehid-3-fosfat, GAPDH), ciklus trikarboksilnih kiselina (TCA ciklus) (kao što su izocitrat dehidrogenaza 1, IDH1), pentoza fosfatna putanja (kao što su glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, G6PD) i biosinteza UDP-glukoze u biosintetičkoj putanji glukuronske kiseline (kao što su UDP-glukoza 6-dehidrogenaza, UGDH). Radi dalje ilustracije, predmetni MSC pripravak ima proteinski sadržaj koji je manji od 90 procenata od sadržaja u MSCs iz doniranog humanog tkiva (naročito izvedenih iz koštane srži odrasle osobe ili adipoznog tkiva odrasle osobe), i čak poželjnije manje od 60, 50, 40, 30, 20 ili čak 10 procenata, za jedan ili više proteina
1
uključenih u lipidni metabolizam, kao što su enoil-CoA hidrataza, kratkog lanca, 1 (ECHS1) i/ili acetil-CoA acetiltransferaza (ACAT2).
[0037] U određenim primerima izvođenja, MSC pripravak ovog pronalaska (kao što su kulture sa najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>ili čak 10<8>MSCs) ima statistički značajno smanjen sadržaj i/ili enzimatsku aktivnost proteina uključenih u apoptozu ćelije u odnosu na prolaz 1 (P1), prolaz 2 (P2), prolaz 3 (P3), prolaz 4 (P4) i/ili prolaz 5 (P5) MSC pripravke izvedene iz drugih izvora (npr., kulture izvedene iz doniranog humanog tkiva, kao što su tkiva fetusa, novorođenčeta, deteta, adolescenta ili odrasle osobe), i naročito iz koštane srži-izvedenih MSCs i adipozno-izvedenih MSCs. Kao ilustracija, predmetni MSC pripravak ima proteinski sadržaj koji je manji od 90 procenata od sadržaja u MSCs iz doniranog humanog tkiva (naročito izvedenih iz koštane srži odrasle osobe ili adipoznog tkiva odrasle osobe), a čak poželjnije manje od 60, 50, 40, 30, 20 ili čak 10 procenata, za jedan ili više proteina aneksina A1 (ANXA1), A2 (ANXA2), A5 (ANXA5), protein 1 napon-zavisnog anjon-selektivnog kanala (VDAC1), i/ili glikeraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH).
[0038] Bez vezivanja za teoriju, smatra se da se statistički značajna razlika u sadržaju i/ili enzimatskoj aktivnosti proteina uključenih u energiju i/ili lipidni metabolizam i/ili apotozu ćelije prikazane hemangioblast-izvedenim MSCs ovog pronalaska može pripisati, najmanje delom, homogenoj prirodi pripravaka. Na primer, hemangioblast-izvedene MSCs ovog pronalaska imaju homogenu MHC gensku ekspresiju, tj., potpuno MHC slaganje, za razliku od izvedenih MSC banki, u kojima su ćelije izvedene iz više različitih donora, tj., MHC neusklađivanje. Terapeutska doza MSCs je oko 2-8 miliona ćelija/kg (ili oko 130-500 miliona ćelije po dozi).
Definicije
[0039] "Pluripotentne ćelije" i "pluropotentne matične ćelije" kako se ovde koristi, široko se odnosi na ćeliju sposobnu za produženu ili virtuelno beskonačnu proliferaciju in vitro zadržavajući svoje nediferencirano stanje, ispoljavajući stabilan (poželjno normalan) kariotip, i sa kapacitetom da se diferencira u sva tri sloja klica (tj., ektoderm, mezoderm i endoderm) pod odgovarajućim uslovima. Tipično pluripotentne ćelije (a) sposobne su da indukuju teratome nakon transplantiranja u imunodeficijente (SCID) miševe; (b) sposobne su da diferenciraju u ćelijske tipove sva tri sloja klica (npr., ektodermalne, mezodermalne, i endodermalne ćelijske tipove); i (c) eksprimiraju najmanje jednan hES ćelijski marker (kao što su Oct-4, alkalin fosfataza, SSEA 3 površinski antigen, SSEA 4 površinski antigen, NANOG, TRA 160, TRA 181, SOX2, REX1). Primerne pluripotentne ćelije mogu da eksprimiraju Oct-4, alkalin fosfatazu, SSEA 3 površinski antigen, SSEA 4 površinski antigen, TRA 160, i/ili TRA 181. Dodatne primerne pluripotentne ćelije uključuju ali nisu ograničene na embrionske matične ćelije, indukovane
1
pluripotentne ćelije (iPS) ćelije, pluripotentne ćelije proizvedene iz ćelije embrionske klice (EG) (npr., uzgajanjem u prisustvu FGF-2, LIF i SCF) i partenogenetske ES ćelije. Pluripotentne ćelije za upotrebu u postupcima ovog pronalaska proizvedene su bez uništavanja embriona. Na primer, indukovane pluripotentne ćelije mogu se proizvesti od ćelija obezbeđenih bez embrionskog uništavanja. Kao dalji primer, pluripotentne ćelije mogu se proizvesti iz biopsiranih blastomera (koji se mogu sakupiti bez oštećivanja preostalog embriona); opciono, preostali embrion može biti krioprezerviran, uzgajan, i/ili implantiran u pogodnog domaćina. Pluripotentne ćelije (iz bilo kog izvora) mogu se genetski modifikovati ili drugačije modifikovati da povećaju dugovečnost, potenciju, vraćanje, ili da dostave željeni faktor u ćelije koje se diferenciraju iz takvih pluripotentnih ćelija (na primer, MSCs, i hemangioblasti). Kao njihovi neograničavajući primeri, pluripotentne ćelije mogu se genetski modifikovati da eksprimiraju Sirt1 (čime povećavaju dugovečnost), eksprimiraju jedan ili više gena telomeraza podjedinica opciono pod kontrolom inducibilnog ili represabilnog promotera, uključuju fluorescentnu oznaku, uključuju čestice oksida železa ili drugi takav reagens (koji bi mogao da se primeni za ćelijsko praćenje putem in vivo uslikavanja, MRI, itd., videti Thu et al., Nat Med.2012 Feb 26;18(3):463-7), eksprimiraju bFGF koji može poboljšati dugovečnost (videti Go et al., J. Biochem.142, 741-748 (2007)), eksprimiraju CXCR4 za vraćanje (videti Shi et al., Haematologica.2007 Jul;92(7):897-904), eksprimiraju rekombinantni TRAIL radi indukovanja kaspaza-posredovane apoptoze u ćelijama kancera poput Glioma (videti Sasportas et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Mar 24;106(12):4822-7), itd.
[0040] "Embrion" ili "embrionske," kako se ovde koristi široko se odnosi na razvijajuću ćelijsku masu koja nije implantirana u membranu materice majke domaćina. "Embrionska ćelija" je ćelija izolovana iz ili sadržana u embrionu. To takođe uključuje blastomere, dobijene rano poput dva-ćelijske faze, i agregirane blastomere.
[0041] "Embrionske matične ćelije" (ES ćelije ili ESC) obuhvataju pluripotentne ćelije proizvedene iz embrionske ćelije kao i indukovane pluripotentne ćelije (dalje opisano ispod). Često su takve ćelije ili su prolazile kao ćelijske linije. Embrionske matične ćelije mogu se primeniti kao pluropotentna matična ćelija u postupcima proizvodnje hemangioblasta kako je ovde opisano. Na primer, ES ćelije mogu se proizvesti postupcima poznatim u ovoj oblasti koji uključuju partogenezu. Kako je prethodno detaljnije objašnjeno (videti "pluripotentne ćelije), ES ćelije mogu se genetski modifikovati ili drugačije modifikovati da povećaju dugovečnost, potenciju, vraćanje, ili da dostave željeni faktor u ćelije koje se diferenciraju iz takvih pluripotentnih ćelija (na primer, MSCs, i hemangioblasti).
[0042] ES ćelije mogu biti generisane sa homozigotnosti ili hemizigotnosti u jednom ili više HLA gena,
1
npr., putem genetske manipulacije, skrininga na spontan gubitak heterozigotnosti, itd. ES ćelije mogu se genetski modifikovati ili drugačije modifikovati da povećaju dugovečnost, potenciju, vraćanje, ili da dostave željeni faktor u ćelije koje se diferenciraju iz takvih pluripotentnih ćelija (na primer, MSCs i hemangioblasti). Embrionske matične ćelije, bez obzira na njihov izvor ili određeni postupak koji se koristi radi njihove proizvodnje, tipično poseduje jedan ili više sledećih atributa: (i) sposobnost da se diferenciraju u ćelije sva tri sloja klica, (ii) ekspresiju od najmanje Oct-4 i alkalin fosfataza, i (iii) sposobnost proizvodnje teratoma nakon transplantiranja u imunokompromitovane životinje.
[0043] Primerni hES ćelijski markeri uključuju ali nisu ograničeni na: kao što su alkalin fosfataza, Oct-4, Nanog, Faza-specifični embrionski antigen-3 (SSEA-3), Faza-specifični embrionski antigen-4 (SSEA-4), TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, Sox2, faktor 3 rasta i diferencijacije (GDF3), redukovana ekspresija 1 (REX1), fibroblast faktor rasta 4 (FGF4), embrionska ćelija-specifični gen 1 (ESG1), sa razvojnom pluripotencijom-povezan 2 (DPPA2), DPPA4, telomeraza reverzna transkriptaza (hTERT), SALL4, E-CADHERIN, Klaster dezignacija 30 (CD30), Kripto (TDGF-1), GCTM-2, Geneza, Nuklearni faktor ćelije klice, i Faktor matičnih ćelija (SCF ili c-Kit ligand). Kao dodatni primer, embrionske matične ćelije mogu da eksprimiraju Oct-4, alkalin fosfatazu, SSEA 3 površinski antigen, SSEA 4 površinski antigen, TRA 160, i/ili TRA 181.
[0044] ESCs mogu se inicijalno uzgajati zajedno sa mišjim embrionskim hraniteljskim ćelijama (MEF) ćelijama. MEF ćelije mogu biti mitotički inaktivirane izlaganjem mitomicina C pre zasejavanja ESCs u zajedničkoj kulturi, a čime se MEFs ne propagiraju u kulturi. Dodatno, ESC ćelijske kulture mogu biti ispitan mikroskopski, a kolonije koje sadrže ne ESC ćelijsku morfologiju mogu se izabrati i odbaciti, npr., upotrebom instrumenta za sečenje matične ćelije, laserskom ablacijom, ili drugim sredstvima. Tipično, nakon tačke sakupljanja ESCs za zasejavanja radi obrazovanja embroidnih tela, ne koriste se dodatne MEF ćelije.
[0045] Primerni ESC ćelijski markeri uključuju ali nisu ograničeni na: kao što su alkalin fosfataza, Oct-4, Nanog, Faza-specifični embrionski antigen-3 (SSEA-3), Faza-specifični embrionski antigen-4 (SSEA-4), TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, Sox2, faktor 3 rasta i diferencijacije (GDF3), redukovana ekspresija 1 (REX1), fibroblast faktor rasta 4 (FGF4), embrionska ćelija-specifični gen 1 (ESG1), sa razvojnom pluripotencijom-povezan 2 (DPPA2), DPPA4, telomeraza reverzna transkriptaza (hTERT), SALL4, E-CADHERIN, Klaster dezignacija 30 (CD30), Kripto (TDGF-1), GCTM-2, Geneza, Nuklearni faktor ćelije klice, i Faktor matičnih ćelija (SCF ili c-Kit ligand).
[0046] "Potencija", kako se ovde koristi, široko se odnosi na koncentraciju, npr., molarnu, reagensa (kao
1
što su hemangioblast-izvedene MSCs) koji proizvede definisani efekat. Potencija može biti definisana u smislu efektivne koncentracije (EC50), koja ne uključuje merenja maksimalnog efekta već, umesto toga, efekat na različitim lokacijama duž koncentracione ose kriva doznih odgovora. Potencija se takođe može odrediti bilo iz profilisanih (EC50) ili kvantne krive doznih odgovora (ED50, TD50 i LD50); međutim, potencija se poželjno meri putem EC50. Izraz "EC50" odnosi se na koncentraciju leka, antitela ili toksikanta koji indukuje odgovor negde između početnog i maksimalnog efekta nakon nekog specificiranog vremena izlaganja. EC50 profilisane krive doznog odgovora prema tome predstavlja koncentraciju jedinjenja u kojem je primećeno 50% njegovog maksimalnog efekta. EC50 kvantne krive doznog odgovora predstavljaju koncentraciju jedinjenja u kojem 50% populacije pokazuje odgovor, nakon specificiranog trajanja izlaganja. EC50 se može odrediti upotrebom životinjskih ispitivanja u kojima definisani životinjski model pazuje merljivu, fiziološku promenu u odgovoru na primenu leka; ćelijski bazirani ogledi koji koriste specificiran ćelijski sistem, koji pored leka, pokazuje merljiv biološki odgovor; i/ili enzimatske reakcije u kojima se biološka aktivnost leka može meriti putem akumulacije proizvoda praćeno hemijskom reakcijom koja se olakšava tim lekom. Poželjno, imunoregulatorni ogled koristi se za određivanje EC50. Neograničavajući primeri ovakvih imunoregulatornih ogleda uključuju unutarćelijski citokin, citotoksičnost, regulatorni kapacitet, kapacitet ćelijske signalizacije, proliferativni kapacitet, aptotične procene, i drugi ogledi.
[0047] "Mezenhimalne matične ćelije" (MSC) kako se ovde koristi odnosi se na multipotentne matične ćelije sa samo-obnavljajućim kapacitetom i sposobnošću da se diferenciraju u osteoblaste, hondrocite, i adipocite, među ostalim linijama mezenhimalnih ćelija. Pored ovih karakteristika, MSCs mogu se identifikovati ekspresijom jednog ili više markera kakvi su ovde dalje opisani. Takvi ćelije mogu se primeniti za lečenje spektra kliničkih stanja, koja uključuju imunološke poremećaje kao i degenerativne bolesti kao što su bolest graft-vs-domaćin (GVHD), miokardijalni infarkt i zapaljenske i autoimune bolesti i poremećaji, između ostalih. Ukoliko nije drugačije naznačeno kontekstom, MSCs mogu da uključuju ćelije iz izvora odrasle osobe i krvi iz pupčane vrpce. MSCs (ili ćelija iz koje se generišu, kao što je pluropotentna ćelija) mogu se genetski modifikovati ili drugačije modifikovati da povećaju dugovečnost, potenciju, vraćanje, ili da dostave željeni faktor u MSCs ili ćelije koje se diferenciraju iz takvih MSCs. Kao njihovi neograničavajući primeri, MSCs ćelije mogu se genetski modifikovati da eksprimiraju Sirt1 (čime povećavaju dugovečnost), eksprimiraju jedan ili više gena telomeraza podjedinica opciono pod kontrolom inducibilnog ili represabilnog promotera, uključuju fluorescentnu oznaku, uključuju čestice oksida železa ili drugi takav reagens (koji bi mogao da se primeni za ćelijsko praćenje putem in vivo uslikavanja, MRI, itd., videti Thu et al., Nat Med.2012 Feb 26;18(3):463-7), eksprimiraju bFGF koji može poboljšati dugovečnost (videti Go et al., J. Biochem.142, 741-748 (2007)), eksprimiraju CXCR4 za vraćanje (videti Shi et al., Haematologica.2007 Jul;92(7):897-904), eksprimiraju rekombinantni TRAIL
2
radi indukovanja kaspaza-posredovane apoptoze u ćelijama kancera poput Glioma (videti Sasportas et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Mar 24;106(12):4822-7), itd.
[0048] "Terapija," "terapeutski," "tretiranje," "lečiti" ili "lečenje", kako se ovde koristi, široko se odnosi na tretiranje bolesti, zaustavljanje ili smanjivanje razvoja bolesti ili njihovih kliničkih simptoma, i/ili olakšavanja bolesti, izazivajući regresiju bolesti ili njenih kliničkih simptoma. Terapija obuhvata profilaksu, prevenciju, tretiranje, izlečenje, lečenje, smanjenje, ublažavanje, i/ili pružanje olakšanja u bolestima, znacima, i/ili simptomima tih bolesti. Terapija obuhvata ublažavanje znakova i/ili simptoma kod pacijenata sa znakovima i/ili simptomima bolesti koja je u toku (npr., mišićna slabost, multiple sklerozu.) Terapija takođe obuhvata "profilaksu" i "prevenciju". Profilaksa uključuje sprečavanje javljanja bolesti nakon lečenja bolesti kod nekog pacijenta ili smanjivanje incidence ili jačine te bolesti kod nekog pacijenta. Izraz "redukovana", u smislu terapije, široko se odnosi na klinički značajno smanjenje u znakovima i/ili simptomima. Terapija uključuje tretiranje recidiva ili rekurentnih znakova i/ili simptoma (npr., retinalno degenerisanje, gubitak vida.) Terapija obuhvata ali nije ograničena na sprečavanje pojave znakova i/ili simptoma u bilo kom trenutku kao i smanjivanje postojećih znakova i/ili simptoma i eliminisanje postojećih znakova i/ili simptoma. Terapija uključuje tretiranje hronične bolesti ("održavanje") i akutne bolesti. Na primer, lečenje uključuje tretiranje ili sprečavanje recidiva ili rekurentnih znakova i/ili simptoma (npr., mišićna slabost, multiple sklerozu).
[0049] U cilju održavanja regulatorno slaganje, MSC banke moraju održavati dovoljno snabdevanje ćelijama, npr., kako bi se obezbedio dovoljan broj ćelija za lečenje najmanje nekoliko hiljada do 10,000 pacijenata, MSC banke moraju imati najmanje 50 milijardi MSCs. Ovaj pronalazak obuhvata GMP-bolesti i/ili krioprezervirane MSC banke. U jednom aspektu, MSC pripravak ovog pronalaska obuhvata najmanje 10<10>hemangioblast-izvedenih MSCs. U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje MSC pripravak koji obuhvata najmanje 10<11>, 10<12>, 10<13>, ili 10<14>hemangioblast-izvedenih MSCs.
[0050] "Normalizovanje patologije", kako se ovde koristi, odnosi se na vraćanje abnormalne strukture i/ili funkcije koja je rezultat bolesti u normalnije stanje. Normalizacija sugeriše da se popravljanje abnormalnosti u strukturi i/ili funkciji tkiva, organa, ćelijskog tipa, itd. koji su rezultat bolesti, progresije patologije mogu kontrolisati i poboljšati. Na primer, nakon lečenja sa ESC-MSCs ovog pronalaska, abnormalnosti imunog sistema kao rezultat autoimunih poremećaja, npr., MS, mogu biti poboljšane, ispravljene, i/ili vraćene.
Indukovane pluripotentne matične ćelije
[0051] Dalje primerne pluropotentne matične ćelije uključuju indukovane pluropotentne matične ćelije (iPS ćelije) generisane reprogramiranjem somatske ćelije eksprimiranjem ili indukovanjem ekspresije kombinacije faktora ("reprogramirajući faktori"). iPS ćelije mogu biti generisane upotrebom somatskih ćelija fetusa, novorođenćeta, adolescenta ili odrasle osobe. iPS ćelije mogu se dobiti iz ćelijske banke. Alternativno, iPS ćelije mogu biti novo generisane (postupcima poznatim u ovoj oblasti) pre započinjanja diferencijacija u RPE ćelije ili drugi ćelijski tip. Stvaranje iPS ćelija može biti prvenstvena faza u proizvodnji diferenciranih ćelija. iPS ćelije mogu biti specifično generisane upotrebom materijala iz određenog pacijenta ili poklapajućeg donora sa ciljem generisanja tkivo-poklapajućih RPE ćelija. iPS ćelije mogu se proizvesti od ćelija koje suštinski nisu imunogene kod najmenjenog primaoca, npr., proizvedene iz autologous ćelija ili ćelija histokompatiblnih namenjenom primaocu. Kako je prethodno detaljnije objašnjeno (videti "pluripotentne ćelije"), pluripotentne ćelije koje uključuju iPS ćelije mogu se genetski modifikovati ili drugačije modifikovati radi povećanja dugovečnosti, potencije, vraćanja, ili radi dostave željeog faktora u ćelije koje se diferenciraju iz takvih pluripotentnih ćelija (na primer, MSCs i hemangioblasti).
[0052] Kao dalji primer, indukovane pluropotentne matične ćelije mogu biti generisane reprogramiranjem somatskih ili drugih ćelija dovođenjem u kontakt ćelije sa jednim ili više reprogramirajućih faktora. Na primer, reprogramirajući faktor(i) mogu biti eksprimirani od strane ćelije, npr., iz egzogene nukleinske kiseline dodate u ćeliju, ili iz endogenog gena u odgovoru na faktor kao što su mali molekul, mikroRNK, ili slično koji promoviše ili indukuje ekspresiju tog gena (videti Suh and Blelloch, Development 138, 1653-1661 (2011); Miyosh et al., Cell Stem cell (2011), doi:10.1016/j.stem.2011.05.001; Sancho-Martinez et al., Journal of Molecular Cell Biology (2011) 1-3; Anokye-Danso et al., Cell Stem cell 8, 376-388, April 8, 2011; Orkin and Hochedlinger, Cell 145, 835-850, June 10, 2011, od kojih je svaki ovde ubačen kao referenca u svojoj celosti). Reprogramirajući faktori mogu se obezbediti iz egzogenog izvora, npr., dodavanjem u podlogu za uzgajanje, i mogu biti uvedene u ćelije postupcima poznatim u ovoj oblasti kao što su putem kuplovanja za ćelijske ulazne peptide, proteinske ili nukleinske kiselinske transfekcione agense, lipofekcije, elektroporacije, sistema biolističke isporuke čestica (genski pištolj), mikroinjektovanjem, i slično. iPS ćelije mogu biti generisane upotrebom somatskih ćelija fetusa, novorođenćeta, adolescenta ili odrasle osobe. U određenim primerima izvođenja, faktori koji se mogu koristiti za reprogramiranje somatskih ćelija u pluropotentne matične ćelije uključuju, na primer, kombinaciju Oct4 (ponekat označen kao Oct 3/4), Sox2, c-Myc, i Klf4. U drugim primerima izvođenja, faktori koji se mogu koristiti za reprogramiranje somatskih ćelija u pluropotentne matične ćelije uključuju, na primer, kombinaciju Oct-4, Sox2, Nanog, i Lin28. U drugim primerima izvođenja, somatske ćelije reprogramiraju se eksprimiranjem najmanje 2 reprogramirajuća faktora, najmanje tri reprogramirajuća faktora, ili četiri reprogramirajuća faktora. U drugim primerima izvođenja, dodatni reprogramirajući faktori su identifikovati i koriste se sami ili u kombinaciji sa jednim ili više poznatih reprogramirajućih faktora za reprogramiranje somatske ćelije u pluropotentnu matičnu ćeliju. iPS ćelije tipično se mogu identifikovati ekspresijom istih markera kao embrionske matične ćelije, putem određene iPS ćelijske linije mogu varirati u svom ekspresionom profilu.
[0053] Indukovana pluropotentna matična ćelija može se proizvesti eksprimiranjem ili indukovanjem ekspresije jednog ili više reprogramirajućih faktora u somatsku ćeliju. Somatska ćelija je fibroblast, kao što su dermalni fibroblast, sinovijalni fibroblast, ili plućni fibroblast, ili ne-fibroblastična somatska ćelija. Somatska ćelija reprogramira se eksprimiranjem najmanje 1, 2, 3, 4, 5 reprogramirajućih faktora.
Reprogramirajući faktori mogu biti odabran od Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, c Myc, i Klf4. Ekspresija reprogramirajućih faktora može se indukovati dovođenjem u kontakt somatskih ćelija sa najmanje jednim agensom, kao što su agensi malog organskog molekula, koji indukuju ekspresiju reprogramirajućih faktora.
[0054] Somatska ćelija se takođe može reprogramirati upotrebom kombinatornog pristupa u kojem se reprogramirajući faktor eksprimira (npr., upotrebom virusnog vektora, plazmida, i slično) a ekspresija reprogramirajućeg faktora se indukuje (npr., upotrebom malog organskog molekula.) Na primer, reprogramirajući faktori mogu biti eksprimirani u somatskoj ćeliji infekcijom upotrebom virusnog vektora, kao što su a retrovirusni vektor ili lentivirusni vektor. Takođe, reprogramirajući faktori mogu biti eksprimirani u somatskoj ćeliji upotrebom ne-integrativnog vektora, kao što su epizomalni plazmid. Videti, npr., Yu et al., Science.2009 May 8;324(5928):797-801, koji je ovde uključen kao referenca u svojoj celosti. Kada su reprogramirajući faktori eksprimirani upotrebom ne-integrativnih vektora, ti faktori mogu biti eksprimirani u ćelijama upotrebom elektroporacije, transfekcije, ili transformacije somatskih ćelija sa vektorima. Na primer, u mišjim ćelijama, ekspresija četiri faktora (Oct3/4, Sox2, c myc, i Klf4) upotrebom integrativnih virusnih vektora dovoljno je da reprogramira somatsku ćeliju. U humanim ćelijama, ekspresija četiri faktora (Oct3/4, Sox2, NANOG, i Lin28) upotrebom integrativnih virusnih vektora je dovoljna da reprogramira somatsku ćeliju.
[0055] Kada su reprogramirajući faktori eksprimirani u ćelijama, te ćelije se mogu uzgajati. Tokom vremena, ćelije sa ES karakteristikama pojavljuju se u sudu za uzgajanje. Te ćelije mogu se odabrati i poduzgajati na bazi, na primer, ES morfologije, ili na bazi ekspresije selektabilnog ili detektabilnog markera. Te ćelije mogu se uzgajati radi proizvodnje kulture ćelija koje podsećaju na ES ćelije-ove su putativne iPS ćelije. iPS ćelije tipično se mogu identifikovati ekspresijom istih markera kao druge embrionske matične ćelije, putem određene iPS ćelijske linije mogu da variraju u svom ekspresionom
2
profilu. Primerne iPS ćelije mogu da eksprimiraju Oct-4, alkalin fosfatazu, SSEA 3 površinski antigen, SSEA 4 površinski antigen, TRA 160, i/ili TRA 181.
[0056] Kako bi se potvrdila pluripotencija iPS ćelija, ćelije se mogu ispitati jednim ili više ogleda pluripotencije. Na primer, te ćelije mogu biti ispitane na ekspresiju ES ćelijskih markera; te ćelije mogu biti procenjene na sposobnost proizvodnje teratoma nakon transplantiranja u SCID miševe; te ćelije mogu biti procenjene na sposobnost da se diferenciraju radi proizvodnje ćelijskih tipova sva tri sloja klica. Kada se dobije pluropotentna iPS ćelija, ona se može primeniti radi proizvodnje hemangioblasta i MSC ćelija.
Hemangioblasti
[0057] Hemangioblasti su multipotentni i služe kao uobičajen pekursor za obe hematopoetske i endotelijalne ćelijske loze. Tokom razvoja embriona, smatra se da oni proizilaze kao tranzicioni ćelijski tip koji se pojavljuje tokom ranog mezodermnog razvoja i kolonizuje primitivna krvna ostrvca (Choi et al. Development 125 (4): 725-732 (1998). Kada se nađu tamo, hemangioblasti su sposobni da obezbede porast i kod primitivnih i definitivnih hematopoetskih ćelija, HSCs, kao i endotelijalnih ćelija (Mikkola et al, J. Hematother. Stem Cell Res 11(1): 9-17 (2002).
[0058] Hemangioblasti mogu biti izvedeni in vitro i iz mišjih ESCs (Kennedy et al, Nature (386): 488-493 (1997); Perlingeiro et al, Stem cells (21): 272-280 (2003)) i humanih ESCs (ref.14, 15, samo reference radi, Yu et al., Blood 2010116: 4786-4794). Druga ispitivanja tvrde da su hemangioblasti izolovani iz umbilikalne krvi iz pupčane vrpce (Bordoni et al, Hepatology 45 (5) 1218-1228), cirkulišućih CD34- lin-CD45- CD133- ćelija iz periferne krvi (Ciraci et al, Blood 118: 2105-2115), i iz mišje materic (Sun et al, Blood 116 (16): 2932-2941 (2010)). I iz mišjih i iz humanih ESC-izvedeni hemangioblasti dobijeni su kultivisanjem i diferencijacijom klastera ćelija uzgajanih u tečnoj kulturi praćeno rastom ćelija u polučvrstoj podlozi koja sadrži različite citokine i faktore rasta (Kennedy, Perlingeiro, ref 14, 15); videti takođe, U.S. Patent Br.8,017,393. Za svrhu ove prijave, izraz hemangioblasti takođe uključuje hemangiokolona formirajuće ćelije opisane u U. S. Patentu Br.8,017,393, koje su pored toga što su sposobne da se diferenciraju u hematopoetske i endotelijalne ćelijske loze, sposobne i da postanu ćelije glatkih mišića, a koje nisu pozitivne na CD34, CD31, KDR, i CD133. Hemangioblasti koristni u postupcima koji su ovde opisani mogu biti izvedeni ili dobijeni bilo kojim od poznatih postupaka. Na primer, embrionidna tela mogu se formirati uzgajanjem pluripotentnih ćelija pod nepričvršćenim uslovima, npr., niskoadherentnom supstratu ili u "visećoj kapljici." U ovim kulturama, ES ćelije mogu da formiraju ugruške ili klastere ćelija imenovane kao embrionidna tela. Videti Itskovitz-Eldor et al., Mol Med.2000 Feb;6(2):88-95. Tipično, embrionidna tela inicijalno se formiraju kao čvrsti ugrušci ili klasteri pluripotentnih ćelija, a vremenom neki od tih embrionidnih tela dođu u stanje da uključuju fluidom ispunjene šupljine, pri čemu su ove ranije formirane označene u literaturi kao "jednostavne" EBs i kasnije kao "cistična" embrionidna tela. Id. Ćelije u ovim EBs (i čvrstim i cističnim oblicima) mogu da diferenciraju i tokom vremena proizvode povećane brojeve ćelija. Opciono EBs mogu se zatim uzgajati kao adherentne kulture i ostaviti ih da obrazuju izdanke. Slično tome, pluripotentne ćelije kojima je dopušteno da izrastu i obrazuju višeslojnu ćelijsku populaciju mogu da diferenciraju tokom vremena.
[0059] U jednom primeru izvođenja, hemangioblasti su generisani fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje ESC linije tokom 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana radi obrazovanja klastera ćelija, i (b) indukovanje pomenutih klastera ćelija da se diferenciraju u hemangioblaste. U daljem primeru izvođenja, klasteri ćelija u fazi (b) uzgajaju se u citokinom bogatoj bez seruma podlozi na bazi metilceluloze (14, 15).
[0060] U jednom primeru izvođenja, hemangioblasti su generisani fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje ESC linije tokom 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana radi obrazovanja klastera ćelija, i (b) indukovanje pomenutih klastera ćelija da se diferenciraju u hemangioblaste uzgajanjem u citokinom bogatoj, bez seruma, podlozi na bazi metilceluloze.
[0061] U još jednom primeru izvođenja, hemangioblasti su generisani indukovanjem bilo koje pluropotentne ćelije kakve su ovde opisane. U daljem primeru izvođenja, hemangioblasti su generisani iz iPS ćelija, pri čemu su iPS ćelije generisani upotrebom egzogeno dodatih faktora ili drugim postupcima poznatim u ovoj oblasti kao što su proteini ili mikroRNK (videti Zhou et al., Cell Stem cell (4): 1-4, 2009; Miyoshi et al. Cell Stem cell (8): 1-6, 2011; Danso et al., Cell Stem cell (8): 376-388, 2011).
[0062] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje pripravke mezenhimalnih stromalnih ćelija (MSCs) i postupke generisanja MSCs upotrebom hemangioblasta. MSC se mogu diferencirati iz predpostojećih MSC u jednom ili više aspekata, kakvi su ovde dalje opisani. U jednom primeru izvođenja, hemangioblasti su sakupljeni nakon najmanje 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 dana u kulturi upotrebom metilcelulozne podloge bez seruma plus jedan ili više sastojaka odabranih iz grupe koja obuhvata penicillin/streptomicin (pen/strp), EX-CYTE® suplement rasta ( vodo rastvoran kjednomntrat koji obuhvata 9.0-11.0 g/L holesterol i 13.0-18.0 g/L lipoproteine i masne kiseline pri pH 7-8.4), Flt3-ligand (FL), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), trombopoietin (TPO), osnovni fibroblast faktor rasta (bFGF), iz matične ćelije izvedeni faktor (SCF), faktor stimulacije kolonije granulocitne makrofage (GM-CSF), interleukin 3 (IL3), i interleukin 6 (IL6), indukovanjem pluropotentne ćelije odabrane iz grupe koja obuhvata blastociste, nanetih ICMs, jednog ili više blastomera, ili drugi delovi pred-implantaciona-faza embriona ili embrionske strukture, bez obzira na da li je proizvedena
2
oplodnjom, somatskim ćelijskim nuklearnim transferom (SCNT), partogenezom, androgenezom, ili na drugi seksualni ili neseksualni način, i ćelije izvedene putem reprogramiranja (iPS ćelije). U poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, hemangioblasti se sakupljaju između 6-14 dana, uzgajanja u, na primer, metilcelulozi bez seruma plus sastojci prethodnog primera izvođenja. U poželjnom primeru izvođenja, ti sastojci su prisutni u pomenutoj podlozi pri sledećim koncentracijama: Flt3-ligand (FL) na 50 ng/ml, vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) na 50ng/ml, trombopoietin (TPO) na 50ng/ml, i osnovni fibroblast faktor rasta (bFGF) na 20 ng/ml, 50 ng/ml iz matične ćelije izvedeni faktor (SCF), 20 ng/ml faktor stimulacije kolonije granulocitne makrofage (GM-CSF), 20 ng/ml interleukin 3 (IL3), 20ng/ml interleukin 6 (IL6), 50 ng/ml FL, 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml TPO, i 30 ng/ml bFGF.
[0063] U još jednom primeru izvođenja, klaster ćelija sastavljenih suštinski od hemangioblasta ponovo se nanose i uzgajaju tokom najmanje 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ili 36 dana formirajuću pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija. U jednom primeru izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije generiše se fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje ESCs tokom 8-12 dana, (b) sakupljanje hemangioblasta koji obrazuju klastere ćelija, (c) ponovnim nanošenjem hemangioblasta iz faze (b), i (d) uzgajanje hemangioblasta iz faze (c) tokom između 14-30 dana.
[0064] U jednom primeru izvođenja, hemangioblasti se sakupljaju, ponovo nanose i uzgajaju u tečnoj podlozi pod uslovima bez dohranjivanja u kojima u kulturi nije prisutan ni jedan hraniteljski sloj ćelija kao što su mišji embrionski fibroblasti, OP9 ćelije, ili drugi ćelijski tipovi poznati stručnjaku iz ove oblasti. U poželjnom primeru izvođenja, hemangioblasti se uzgajaju na ekstracelularnoj matrici. U dalje poželjnom primeru izvođenja, hemangioblasti uzgajaju se ekstracelularnoj matrici, gde pomenuta matrica obuhvata rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mišijih sarkoma ćelija koji se gelira na sobnoj temperaturi radi obrazovanja rekonstituisane bazalne membrane (Matrigel). U još daljem primeru izvođenja, hemangioblasti su generisani prema fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje pomenutih hemangioblasta na Matrigelu tokom najmanje 7 dana, (b) transferovanje hemangioblasta iz faze (a) u ne-obloženu posudu za uzgajanje tkiva i dalje uzgajanje pomenutih hemangioblasta iz faze (b) tokom između oko 7 do 14 dana). Hemangioblasti mogu se uzgajati na supstratu koji obuhvata jedan ili više faktora odabranih iz grupe koju čine: transformišući faktor rasta beta (TGF-beta), epidermalni faktor rasta (EGF), faktor rasta 1 sličan insulinu, faktor rasta goveđeg fibroblasta (bFGF), i/ili faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), Humani bazalni membranski ekstrakt (BME) (npr., Cultrex BME, Trevigen) ili EHS matrica, laminin, fibronektin, vitronektin, proteoglikan, entaktin, kolagen (npr., kolagen I, kolagen IV), i heparan sulfat. Pomenuta matrica ili komponente matrice mogu biti sisarskog, ili specifičnije humanog, porekla. U jednom primeru izvođenja, hemangioblasti se uzgajaju u tečnoj podlozi koja
2
obuhvata serum na Matrigelom-obloženoj ploči, u kojem podloga za uzgajanje može da obuhvata sastojcke odabrane od αMEM (Sigma-Aldrich) dopunjenja sa 10-20% fetalnog telećeg seruma (αMEM+20% FCS), αMEM dopunjenja sa 10-20% toplotom-inaktiviranim humanim AB serumom, i IMDM dopunjenja sa 10-20% toplotom-inaktiviranim AB humanim serumom.
Mezenhimalne stromalne ćelije generisane uzgajanjem hemangioblasta
[0065] Primer izvođenja ovog pronalaska obuhvata poboljšane mezenhimalne stromalne ćelije.
Mezenhimalne stromalne ćelije ovog pronalaska mogu biti generisane iz hemangioblasta upotrebom poboljšanih postupaka kultivisanja hemangioblasta.
[0066] Mezenhimalne stromalne ćelije ovog pronalaska mogu da zadrže visoke nivoe potencije i mogu da se ne zgrušavaju ili mogu da se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalne stromalne ćelije izvedene direktno iz ESCs. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisanih prema bilo kojem ili više postupaka ovog pronalaska zadržava visoke nivoe potencije, i ne zgrušavaju se ili se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz ESCs.
[0067] Primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje postupke kultivisanja hemangioblasta koji generiše pripravke mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije zadržavaju mladalački fenotip. Farmaceutski pripravci mezenhimalnih stromalnih ćelija ovog pronalaska mogu pokazati poboljšane terapeutske osobine kada se daju sisarskom domaćinu kome je potrebno takvo lečenje.
[0068] Primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisanih uzgajanjem humanih hemangioblasta. Dalji primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje postupke za generisanje pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija uzgajanjem humanih hemangioblasta. Primer izvođenja postupka ovog pronalaska, u kojem se pomenuti humani hemangioblasti uzgajaju u uslovima bez dohranjivanja, a zatim nanose na matrici. U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, pomenuta matrica bira iz grupe koja obuhvata transformišući faktor rasta beta (TGF-beta), epidermalni faktor rasta (EGF), faktor rasta 1 sličan insulinu, faktor rasta goveđeg fibroblasta (bFGF), faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), laminin, fibronektin, vitronektin, proteoglikan, entaktin, kolagen, kolagen I, kolagen IV, heparan sulfat, rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mišijih sarkoma ćelija, Matrigel, i ekstrakt iz osnovne humane membrane. U još daljem primeru izvođenja, pomenuta matrica može se izvesti iz sisarskog ili humanog porekla.
2
[0069] U još jednom primeru izvođenja, hemangioblasti uzgajaju se u podlozi koja obuhvata serum ili serumsku zamenu, kao što je αMEM dopunjenja sa 20% fetalnog telećeg seruma. U daljem primeru izvođenja, hemangioblasti uzgajaju se na matrici tokom oko 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 dana.. U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generiše se fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje hemangioblasta na Matrigelu tokom oko 7 dana, (b) transferovanje hemangioblasta iz faze (a) bez Matrigela i uzgajanje hemangioblasta na neobloženom sudu za uzgajanje tkiva tokom dodatnih 9-100 dana, oko 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 dana.
[0070] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisan je uzgajanjem hemangioblasta u podlozi koja obuhvata serum ili zamenu seruma kao što su aMEM dopunjenja sa 20% fetalnog telećeg seruma. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, pomenuti hemangioblasti uzgajaju se na matrici tokom oko 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 dana.
[0071] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska hemangioblasti se diferenciraju iz ESCs. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, hemangioblasti prethodnog primera izvođenja diferenciraju se iz ESCs u kojem, pomenute ESCs biraju se iz grupe koja obuhvata iPS, i blastomere.
[0072] Primer izvođenja ovog pronalaska obuhvata pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisanih postupkom u kojem hemangioblasti se diferenciraju iz ESCs. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, hemangioblasti prethodnog primera izvođenja diferenciraju se iz ESCs u kojem, pomenute ESCs biraju se iz grupe koja obuhvata iPS, i blastomere.
[0073] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska hemangioblasti se diferenciraju iz ESCs sledećim fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje ESCs u, na primer, prisustvu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i/ili koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4) radi obrazovanja klastera ćelija; (b) uzgajanje pomenutih klastera ćelija u prisustvu najmanje jednog faktora rasta (npr., osnovni fibroblast faktor rasta (bFGF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), i koštani morfogeni protein 4 (BMP-4), faktor matičnih ćelija (SCF), Flt 3L (FL), trombopoietin (TPO), i/ili tPTD-HOXB4) u određenoj količini dovoljnoj da indukuje diferencijaciju pomenutih klastera ćelija u hemangioblaste; i (c) uzgajanje pomenutih hemangioblasta u podlozi koja obuhvata najmanje jedan dodatni faktor rasta (npr., insulin, transferin, granulocit makrofaga kolona-stimulišući faktor (GM-CSF), interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6), granulocit kolona-stimulišući faktor (G-CSF), eritropoietin (EPO), faktor matičnih ćelija (SCF), vaskularni
2
endotelijalni faktor rasta (VEGF), koštani morfogeni protein 4 (BMP-4), i tPTD-HOXB4), u kojem se pomenuti najmanje jedan dodatni faktor rasta obezbeđuje u određenoj količini dovoljnoj da proširi pomenute klastere ćelija u pomenutoj kulturi, i u kojem se bakar opciono dodaje u bilo kojoj od faza (a)-(c).
[0074] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisan je uzgajanjem hemangioblasta, u kojem se pomenuti hemangioblasti diferenciraju iz ESCs sledećim fazama koje obuhvataju (a) uzgajanje ESCs u prisustvu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4) unutar 0-48 sati započinjanja pomenutog uzgajanja radi obrazovanja klastera ćelija; (b) uzgajanje pomenutih klastera ćelija u prisustvu najmanje jednog faktora rasta odabranog iz grupe koja obuhvata osnovni fibroblast faktor rasta (bFGF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), koštani morfogeni protein 4 (BMP-4), faktor matičnih ćelija (SCF), Flt 3L (FL), trombopoietin (TPO), i tPTD-HOXB4 u određenoj količini dovoljnoj da indukuje diferencijaciju pomenutih klastera ćelija u hemangioblaste; i (c) uzgajanje pomenutih hemangioblasta u podlozi koja obuhvata najmanje jedan dodatni faktor rasta odabran iz grupe koja obuhvata insulin, transferin, granulocit makrofaga kolona-stimulišući faktor (GM-CSF), interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6), granulocit kolona-stimulišući faktor (G-CSF), eritropoietin (EPO), faktor matičnih ćelija (SCF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), koštani morfogeni protein 4 (BMP-4), i tPTD-HOXB4, u kojem se pomenuti najmanje jedan dodatni faktor rasta obezbeđuje u određenoj količini dovoljnoj da proširi humane klastere ćelija u pomenutoj kulturi.
[0075] U još jednom primeru izvođenja, pripravak mezenhimalnih matičnih ćelija generisan je fazama koje obuhvataju (a) sakupljanje hemangioblasta nakon najmanje 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ili 14 dana da bi indukovali ESCs da se diferenciraju u pomenute hemangioblaste, i (b) sakupljanje mezenhimalnih stromalnih ćelija koje se generišu unutar oko 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ili 50 dana od indukovanja pomenutih hemangioblasta iz faze (a) da se diferenciraju u pomenute mezenhimalne ćelije.
[0076] U još jednom primeru izvođenja, pripravak od najmanje 80, 85, 90, 95, 100, 125 ili 125 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija generiše se iz oko 200,000 hemangioblasta unutar oko 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 dana kultivisanja hemangioblasta, u kojem pomenuti pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija obuhvata manje od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, ili 0.0001% humanih embrionskih matičnih
2
ćelija. U drufom primeru izvođenja, najmanje 80, 85, 90, 100, 125 ili 150 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija generiše se iz oko 200,000 hemangioblasta unutar oko 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 dana kultivisanja hemangioblasta.
[0077] U jednom primeru izvođenja postupka ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija suštinski je prečišćen u odnosu na humane embrionske matične ćelije. U daljem primeru izvođenja postupka ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija suštinski je prečišćen u odnosu na humane embrionske matične ćelije tako da pomenuti pripravak obuhvata najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% mezenhimalnih stromalnih ćelija.
[0078] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisan bilo kojim ili više postupaka ovog pronalaska ne obrazuje teratome kada se uvede u domaćina.
[0079] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska najmanje 50% pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivan je na CD105 ili CD73 unutar oko 7-20 (npr., 15) dnevne kulture. U poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska najmanje 50% pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija generisan prema bilo kojem ili više postupaka ovog pronalaska pozitivan je na CD105 ili CD73 nakon oko 7-15 dnevne kulture. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska najmanje 80% pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivan je na CD105 i CD73 unutar oko 20 dnevne kulture. U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska najmanje 80% pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija generisan prema bilo kojem ili više postupaka ovog pronalaska pozitivan je na CD105 i CD73 unutar oko 20 dnevne kulture.
[0080] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak pogodan za upotrebu na sisarskom pacijentu, koji obuhvata najmanje 10<6>mezenhimalnih stromalnih ćelija i farmaceutski prihvatljiv nosač, u kojem mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 10 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi sa manje od 25 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije desetostrukim dupliranjem.
[0081] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak pogodan za upotrebu na sisarskom pacijentu koji obuhvata najmanje 10<6>mezenhimalnih stromalnih ćelija i farmaceutski prihvatljiv nosač, u kojem mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 5 prolaza u ćelijskoj kulturi sa manje od 25 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u fibroblaste 5. prolazom.
[0082] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata najmanje 10<6>mezenhimalnih stromalnih ćelija i farmaceutski prihvatljiv nosač, u kojem se mezenhimalne stromalne ćelije diferenciraju iz ćelije hemangioblasta.
[0083] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kriogenu ćelijsku banku koja obuhvata najmanje 10<8>mezenhimalne stromalne ćelije, u kojoj mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 10 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi sa manje od 25 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u fibroblaste desetostrukim dupliranjem populacije.
[0084] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prečišćen ćelijski pripravak koji obuhvata najmanje 10<6>mezenhimalnih stromalnih ćelija i manje od jednog procenta bilo kog drugog ćelijskog tipa, u kojem mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 10 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi sa manje od 25 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije desetostrukim dupliranjem populacije.
[0085] Mezenhimalne stromalne ćelije mogu se diferencirati iz izvora pluropotentnih matičnih ćelija, kao što su embrionske matična ćelijska linija ili indukovana pluropotentna matična ćelijska linija. Na primer, sve mezenhimalne stromalne ćelije pripravka ili banke mogu se diferencirati iz uobičajenog izvora pluropotentnih matičnih ćelija. Dodatno, mezenhimalne stromalne ćelije mogu se diferencirati iz izvora pluropotentnih matičnih ćelija, provedenih u kulturi da bi se proširio broj mezenhimalnih stromalnih ćelija, i izolovane iz kulture nakon manje od dvadeset populacionih dupliranja.
[0086] Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti HLA-genotipično identične. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti genomski identične.
[0087] Najmanje 30% mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na CD10. Dodatno, najmanje 60% mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na markere CD73, CD90, CD105, CD13, CD29, CD44, i CD166 i HLA-ABC. U primernom ostvarenju, manje od 30% mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na markere CD31, CD34, CD45, CD133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4 i TLR3.
[0088] Mezenhimalne stromalne ćelije mogu imati replikativne stope prolaza od najmanje 10 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi u manje od 25 dana. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu da imaju srednju dužinu terminalne restrikcije fragmenta (TRF) koji može biti duži od 8kb. Mezenhimalne
1
stromalne ćelije mogu da imaju statistički značajno smanjen sadržaj i/ili enzimatsku aktivnost, u odnosu na pripravke mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz koštane srži koja ima provedene pet populacionih dupliranja, protein uključen u jedan ili više od (i) regulacija ćelijskog ciklusa i ćelijsko starenje, (ii) ćelijska energija i/ili lipidni metabolizam, i (iii) apoptoza. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu da imaju statistički značajno povećan sadržaj i/ili enzimatsku aktivnost proteina uključenih u strukturu cikoskeleta i ćelijske dinamike povezane sa njim, u odnosu na pripravke mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz koštane srži. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu da ne prolaze više od 75 procenata povećanja u ćelijama sa ka napred raspršenom svetlosnom vrednosti, izmereno protočnom citometrijom, više od 5,000,000 preko 10 populacionih dupliranja u kulturi. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu u stanju mirovanja, da eksprimiraju mRNK koja kodira Interleukin-6 na nivou koji može biti manji od deset procenata IL-6 mRNK nivoa eksprimiranog od strane pripravaka mezenhimalnih stromalnih ćelija, u stanju mirovanja, izvedenih iz koštane srži ili adipoznog tkiva.
[0089] Pripravak može biti pogodan za davanje humanom pacijentu. Pripravak može biti pogodan za davanje nehumanom veterinarskom sisaru.
[0090] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata mezenhimalne stromalne ćelije, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu da prođu najmanje 10 populacionih dupliranja i u kojem se 10 populacionih dupliranja javlja u okviru oko 27 dana, poželjnije manje od oko 26 dana, poželjno manje od 25 dana, poželjnije manje od oko 24 dana, još poželjnije manje od oko 23 dana, još poželjnije manje od oko 22 dana, ili manje.
[0091] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata mezenhimalne stromalne ćelije, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu da prođu najmanje 15 populacionih dupliranja.
[0092] Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti sposobne da prođu najmanje 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više populacionih dupliranja.
[0093] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata mezenhimalne stromalne ćelije, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu da prođu najmanje 15 populacionih dupliranja, najmanje 20 populacionih dupliranja, ili najmanje 25 populacionih dupliranja u kulturi.
[0094] Mezenhimalne stromalne ćelije mogu se proizvesti in vitro diferencijacijom hemangioblasta.
2
Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti primatne ćelije ili drugi sisarske ćelije. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti humane ćelije.
[0095] Pomenuta populaciona dupliranja javljaju se u okviru oko 35 dana, poželjnije unutar oko 34 dana, poželjno unutar 33 dana, poželjnije unutar 32 dana, još poželjnije unutar 31 dana, ili još poželjnije unutar oko 30 dana.
[0096] Pripravak može da obuhvata manje od oko 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, ili 0.0001% pluripotentnih ćelija.
[0097] Pripravak može biti bez pluripotentnih ćelija.
[0098] Pripravak može da obuhvata najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% mezenhimalnih stromalnih ćelija.
[0099] Najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) najmanje jedan od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; (ii) najmanje jedan od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC; (iii) CD105, CD73 i/ili CD90 ili (iv) bilo koju njihovu kombinaciju. Najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) najmanje dva od CD105, CD73 i/ili CD90 (ii) najmanje dva od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (iii) sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC. Najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija (i) mogu biti pozitivne na sve od CD105, CD73 i CD90; (ii) pozitivne na sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC i/ili (ii) mogu biti negativne na ili manje od 5% ili manje od 10% ćelija eksprimiraju CD31, 34, 45, 133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4, i/ili TLR3.
Najmanje 60%, 70%, 80% ili 90% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) jedan ili više od CD105, CD73 i CD90 (ii) jedan ili više od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (iii) jedan ili više od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC.
[0100] Farmaceutski pripravak može da obuhvata određenu količinu mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne da leče neželjeni imuni odgovor kod nekog subjekta kome je to potrebno.
[0101] Farmaceutski pripravak može da obuhvata druge ćelije, tkivo ili organ za transplantaciju kod primaoca kome je to potrebno. Druge ćelije ili tkivo mogu biti RPE ćelije, kožne ćelije, kornealne ćelije, pankreasne ćelije, ćelije jetre, kadriološke ćelije ili tkivo koje sadrži bilo koje od pomenutih ćelija.
Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije ne moraju biti izvedene iz koštane srži, a potencija pripravka u imunoregulatornom ogledu može biti veća od potencije pripravka iz koštane srži izvedenih mezenhimalnih stromalnih ćelija. Potencija se može proceniti imunoregulatornim ogledom koji određuje EC50 dozu. Pripravak može da zadrži između oko 50 i 100% svog proliferativnog kapaciteta nakon deset populacionih dupliranja.
[0102] Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije ne moraju biti izvedene direktno iz pluripotentnih ćelija, pri čemu se pomenute mezenhimalne stromalne ćelije (a) ne zgrušavaju ili se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz pluripotentnih ćelija; (b) lakše se disperguju kada se splituju u poređenju sa mezenhimalnim ćelijama izvedenim direktno iz pluripotentnih ćelija; (c) mogu biti brojnije od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz pluripotentnih ćelija kada se kreće sa ekvivalentnim brojevima pluripotentnih ćelija; i/ili (d) stiču karakteristiku mezenhimalnih ćelijskih površinskih markera pre mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz pluripotentnih ćelija.
[0103] Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti sisarske. Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti humane, pseće, goveđe, ne-humane primatne, mišje, mačije, ili konjske
[0104] U jednom primernom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za generisanje mezenhimalnih stromalnih ćelija koji obuhvata uzgajanje hemangioblasta pod uslovima koji daju povećanje mezenhimalnih matičnih ćelija. Pomenuti hemangioblasti mogu se uzgajati u uslovima bez dohranjivanja. Pomenuti hemangioblasti mogu se nanositi na matricu. Pomenuta matrica može da obuhvata jedan ili više od: transformišući faktor rasta beta (TGF-beta), epidermalni faktor rasta (EGF), faktor rasta 1 sličan insulinu, faktor rasta goveđeg fibroblasta (bFGF), i/ili faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF). Pomenuta matrica može biti odabrana iz grupe koju čine: laminin, fibronektin, vitronektin, proteoglikan, entaktin, kolagen, kolagen I, kolagen IV, heparan sulfat, Matrigel (rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mišijih sarkoma ćelija), ekstrakt iz osnovne humane membrane, i bilo koja njihova kombinacija. Pomenuta matrica može da obuhvata rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm mišjih sarkoma ćelija.
4
[0105] Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti sisarske. Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti humane, pseće, goveđe, ne-humane primatne, mišje, mačije, ili konjske.
[0106] Pomenuti hemangioblasti mogu se uzgajati u podlozi koja obuhvata αMEM. Pomenuti hemangioblasti mogu se uzgajati u podlozi koja obuhvata serum ili zamenu seruma. Pomenuti hemangioblasti mogu se uzgajati u podlozi koja obuhvata, αMEM dopunjenja sa 0%, 0.1%-0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%,19%, ili 20% fetalnog telećeg seruma. Pomenuti hemangioblasti mogu se uzgajati na pomenutoj matrici tokom najmanje oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 dana.
[0107] Pomenuti hemangioblasti mogu se diferenciratii iz pluripotentnih ćelija.
[0108] Pomenute pluripotentne ćelije mogu biti iPS ćelije ili pluripotentne ćelije izvedene iz jednog ili više blastomera bez uništavanja humanog embriona.
[0109] Pomenuti hemangioblasti mogu se diferencirati iz pluripotentnih ćelija postupkom koji obuhvata (a) uzgajanje pomenutih pluripotentnih ćelija radi obrazovanja klastera ćelija. Pluripotentne ćelije mogu se uzgajati u prisustvu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i/ili koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4). U fazi (a), pluripotentne ćelije mogu se uzgajati u prisustvu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i/ili koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4). Pomenuti VEGF i BMP-4 mogu se dodati pluripotentnoj ćelijskoj kulturi unutar 0-48 sati od inicijacije pomenutog ćelijskog uzgajanja, a pomenuti VEGF mogu se opciono dodati pri koncentraciji od 20-100 nm/mL , a pomenuti BMP-4 mogu se opciono dodati pri koncentraciji od 15-100 ng/mL. Pomenuti VEGF i BMP-4 može se dodati ćelijskoj kulturi iz faze (a) unutar 0-48 sati započinjanja pomenutog uzgajanja ćelija, a pomenuti VEGF mogu se opciono dodati pri koncentraciji od 20-100 nm/mL , a pomenuti BMP-4 mogu se opciono dodati pri koncentraciji od 15-100 ng/mL. Pomenuti hemangioblasti mogu se diferencirati iz pluripotentnih ćelija postupkom koji može dalje da obuhvata: (b) uzgajanje pomenutih klastera ćelija u prisustvu najmanje jednog faktora rasta u određenoj količini dovoljnoj da indukuje diferencijaciju pomenutih klastera ćelija u hemangioblaste. Pomenuti najmanje jedan faktor rasta dodat u fazi (b) može da obuhvata jedan ili više od osnovnog fibroblastnog faktora rasta (bFGF), vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4), faktora matičnih ćelija (SCF), Flt 3L (FL), trombopoietina (TPO), EPO, i/ili tPTD-HOXB4.
[0110] Pomenuti najmanje jedan faktor rasta dodat u fazi (b) može da obuhvata jedan ili više od: oko 20-25 ng/ml osnovnog fibroblast faktora rasta (bFGF), oko 20-100 ng/ml vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), oko 15-100 ng/ml koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4), oko 20-50 ng/ml faktora matičnih ćelija (SCF), oko 10-50 ng/ml Flt 3L (FL), oko 20 -50 ng/ml trombopoietina (TPO), EPO, i/ili 1.5-5 U/ml tPTD-HOXB4.
[0111] Jedan ili više od pomenutih najmanje jednog faktora rasta opciono dodat u fazi (b) može se dodati pomenutoj kulturi unutar 36-60 sati ili 40-48 sati od početka faze (a).
[0112] Jedan ili više od pomenutog najmanje jednog faktora rasta dodatog u fazi (b) može se dodati pomenutoj kulturi unutar 48-72 sati od početka faze (a).
[0113] Pomenuti najmanje jedan faktor dodat u fazi (b) može da obuhvata jedan ili više od bFGF, VEGF, BMP-4, SCF i/ili FL.
[0114] Postupak može dalje da obuhvata (c) disocijaciju pomenutih klastera ćelija, opciono u jedne ćelije.
[0115] Postupak može dalje da obuhvata (d) uzgajanje pomenutih hemangioblasta u podlozi koja obuhvata najmanje jedan dodatni faktor rasta, u kojem pomenuti najmanje jedan dodatni faktor rasta može biti u određenoj količini dovoljnoj da proširi hemangioblaste.
[0116] U fazi (d), pomenuti najmanje jedan dodatni faktor rasta može da obuhvata jedan ili više od: insulin, transferin, granulocit makrofaga kolona-stimulišući faktor (GM-CSF), interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6), granulocit kolona-stimulišući faktor (G-CSF), eritropoietin (EPO), faktor matičnih ćelija (SCF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), koštani morfogeni protein 4 (BMP-4), i/ili tPTD-HOXB4.
[0117] U fazi (d), pomenuti najmanje jedan dodatni faktor rasta može da obuhvata jedan ili više od: oko 10-100 µg/ml insulina, oko 200-2,000 µg/ml transferina, oko 10-50 ng/ml granulocit makrofaga kolonastimulišućeg faktora (GM-CSF), oko 10-20 ng/ml interleukina-3 (IL-3), oko 10-1000 ng/ml interleukina-6 (IL-6), oko 10-50 ng/ml granulocit kolona-stimulišućeg faktora (G-CSF), oko 3-50 U/ml eritropoietina (EPO), oko 20-200 ng/ml faktora matičnih ćelija (SCF), oko 20-200 ng/ml vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), oko 15-150 ng/ml koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4), i/ili oko 1.5-15U/ml tPTD-HOXB4.
[0118] Pomenuta podloga u fazi (a), (b), (c) i/ili (d) može biti podloga bez seruma.
[0119] Postupak kakav je prethodno opisan može dalje da obuhvata (e) mitotički inaktivirajuće mezenhimalne stromalne ćelije.
[0120] Najmanje 80, 85, 90, 95, 100, 125, ili 150 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija može biti generisano.
[0121] Pomenuti hemangioblasti mogu se sakupiti nakon najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 dana od početka indukovanja diferencijacije pomenutih pluripotentnih ćelija.
[0122] Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti generisane unutar najmanje 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50 dana od početka indukovanja diferencijacije pomenutih pluripotentnih ćelija.
[0123] Postupak može rezltovati u najmanje 80, 85, 90, 95, 100, 125, ili 150 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija koje se generišu iz oko 200,000 hemangioblasta unutar oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 dnevne kulture.
[0124] Mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti generisane iz hemangioblasta u odnosu hemangioblasti prema mezenhimalnim stromalnim ćelijama od najmanje 1:200, 1:250, 1:300, 1:350,1:400, 1:415,1:425, 1:440; 1:450, 1:365, 1:475, 1:490 i 1:500 unutar oko 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 dnevne kulture as hemangioblasti.
[0125] Pomenuti ćelije mogu biti humane.
[0126] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje mezenhimalne stromalne ćelije izvedene iz hemangioblasta dobijenih bilo kojim od ovde opisanih postupaka.
[0127] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje mezenhimalne stromalne ćelije izvedene in vitro diferencijacijom hemangioblasta.
[0128] Najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija (i) mogu biti pozitivne na sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC i (ii) mogu biti negativne na ili manje od 5% ili manje od 10% ćelija eksprimiraju CD31, 34, 45, 133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4 i/ili TLR3.
[0129] Najmanje 50% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) sve od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (ii) sve od CD73, CD90, CD105, CD13, CD29, CD44, CD166, CD274, i HLA-ABC.
[0130] Najmanje 60%, 70%, 80% ili 90% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija mogu biti pozitivne na (i) najmanje jedan od CD10, CD24, IL-11, AIRE-1, ANG-1, CXCL1, CD105, CD73 i CD90; ili (ii) najmanje jedan od CD73, CD90, CD105, CD13, CD29,CD 44, CD166, CD274, i HLA-ABC.
[0131] Mezenhimalne stromalne mogu da ne eksprimiraju ili manje od 5% ili manje od 10% ćelija mogu da eksprimiraju najmanje jedan od CD31, 34, 45, 133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4, ili TLR3.
[0132] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija kakve su prethodno opisane.
[0133] Pomenuti pripravak može da obuhvata manje od 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, ili 0.0001% pluripotentnih ćelija.
[0134] Pripravak može biti bez pluripotentnih ćelija.
[0135] Pomenuti pripravak može biti suštinski prečišćen i opciono može da obuhvata najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% humanih mezenhimalnih stromalnih ćelija.
[0136] Pripravak može da obuhvata suštinski slične nivoe p53 i p21 proteina ili u kojem nivoi p53 proteina u poređenju sa p21 proteinom mogu biti 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 puta veći.
[0137] Mezenhimalne stromalne ćelije ili MSC u pripravku mogu biti sposobne za prolaženje najmanje 5 populacionih dupliranja u kulturi, ili mogu biti sposobne za prolaženje najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više populacionih dupliranja u kulturi.
[0138] Pomenute mezenhimalne stromalne ćelije (a) ne moraju da se zgrušavaju ili se zgrušavaju suštinski manje od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz pluripotentnih ćelija; (b) mogu da se lakše disperguju kada se splituju u poređenju sa mezenhimalnim ćelijama izvedenim direktno iz pluripotentnih ćelija; (c) mogu biti brojnije od mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz pluripotentnih ćelija kada se kreće sa ekvivalentnim brojevima pluripotentnih ćelija; i/ili (d) stiču karakteristiku mezenhimalnih ćelijskih površinskih markera pre mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih direktno iz pluripotentnih ćelija.
[0139] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata bilo koje mezenhimalne stromalne ćelije ili pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija kakve su prethodno opisane.
[0140] Farmaceutski pripravak može da obuhvata određenu količinu mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivnih da leče neželjeni imuni odgovor.
[0141] Farmaceutski pripravak može da obuhvata određenu količinu mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne da leče neželjeni imuni odgovor i može dalje da obuhvata druge ćelije ili tkiva za transplantaciju kod primaoca kome je to potrebno.
[0142] Pomenuti druge ćelije ili tkiva mogu biti alogene ili singenske ćelije pankreasa, neurona, jetre, RPE, kornealne ćelije ili tkiva koja sadrže bilo koje od prethodno pomenutog.
[0143] Farmaceutski pripravak može biti za upotrebu u tretiranju autoimunog poremećaja ili imune reakcije protiv alogenih ćelija, ili za upotrebu u tretiranju multiple skleroze, sistemske skleroze, hematološke malignosti, miokardijalnog infarkta, odbacivanja organa nakon transplantacije, hronične alograftne nefropatije, ciroze, otkazivanja jetre, otkazivanja srca, GvHD, tibijalne frakture, leve ventrikularne disfunkcije, leukemije, mijeloplastičnog sindroma, Kronove bolesti, dijabetesa, hronične opstruktivne bolesti pluća, osteogeneze imepfekta, homozigotne familijarne hipoholesterolemije, lečenje praćeno menisektomijom, periodontitisa kod odraslih, vaskulogeneze kod pacijenata sa teškom miokardijalnom ishemijom, oštećenja kičmene moždine, osteoplazije, kritične ishemije ekstremiteta, bolesti dijabetičnog stopala, primarnog Sjogrenovog sindroma, osteoartritisa, defekata hrskavice, laminitisa, multisistemske atrofije, amiotrofične lateralne skleroze, kadriološke operacije, sistemskog lupusa eritematozisa, alografta živih bubrega, nemaligne poremećaje crvenih krvnih zrnaca, toplotne opekotine, radijacione opekotine, Parkinsonove bolesti, mikrofraktura, epidermolizisa buloze, teške koronarne ishemije, idiopatske dilatirane kardiomiopatije, osteonekrozu femoralne glave, lupus nefritis, defekte koštane praznine, ishemijskog celebralnog šloga, nakon šloga, akutnog radijacionog sindroma, plućne bolesti, artritisa, koštane regeneracije, uveitisa ili njihovih kombinacija.
[0144] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata bilo koje mezenhimalne stromalne ćelije ili bilo koji pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija kakve su prethodno opisane.
[0145] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata mezenhimalne stromalne ćelije ili pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija kakve su prethodno opisane, u kojem pomenuti ćelije ili pripravak ćelija može biti zamrznut ili krioprezerviran.
[0146] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata mezenhimalne stromalne ćelije ili pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija kakve su prethodno opisane, u kojem pomenute ćelije ili pripravak ćelija mogu biti sadržani u vozilu za ćelijsku dostavu.
[0147] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje bolesti ili poremećaj, koji obuhvata davanje efektivne količine mezenhimalnih stromalnih ćelija ili pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija kakve su prethodno opisane subjektu kome je to potrebno.
[0148] Postupak može dalje da obuhvata transplantaciju drugih ćelija ili tkiva. Te ćelije ili tkiva mogu da obuhvataju retinalne, RPE, kornealne, neuronske, imune, koštane srži, jetra ili ćelije pankreasa. Bolest ili poremećaj mogu biti odabrani od multiple skleroze, sistemske skleroze, hematološke malignosti, miokardijalnog infarkta, odbacivanja organa nakon transplantacije, hronične alograftne nefropatije, ciroze, otkazivanja jetre, otkazivanja srca, GvHD, tibijalne frakture, leve ventrikularne disfunkcije, leukemije, mijeloplastičnog sindroma, Kronove bolesti, dijabetesa, hronične opstruktivne bolesti pluća, osteogeneze imepfekta, homozigotne familijarne hipoholesterolemije, lečenje praćeno menisektomijom, periodontitisa kod odraslih, vaskulogeneze kod pacijenata sa teškom miokardijalnom ishemijom, oštećenja kičmene moždine, osteoplazije, kritične ishemije ekstremiteta, bolesti dijabetičnog stopala, primarnog Sjogrenovog sindroma, osteoartritisa, defekata hrskavice, multisistemske atrofije, amiotrofične lateralne skleroze, kadriološke operacije, upornog sistemskog lupusa eritematozisa, alografta živih bubrega, nemaligne poremećaje crvenih krvnih zrnaca, toplotne opekotine, Parkinsonove bolesti, mikrofraktura, epidermolizisa buloze, teške koronarne ishemije, idiopatske dilatirane kardiomiopatije, osteonekrozu femoralne glave, lupus nefritis, defekte koštane praznine, ishemijskog
4
celebralnog šloga, nakon šloga, akutnog radijacionog sindroma, plućne bolesti, artritisa, koštane regeneracije, ili njihovih kombinacija.
[0149] Ta bolest ili poremećaj mogu biti uveitis. Pomenuta bolest ili poremećaj mogu biti autoimuni poremećaj ili imunološke reakcije protiv alogenih ćelija. Autoimuni poremećaj može biti multiple skleroza.
[0150] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak lečenja gubitka kostiju ili oštećenja hrskavice koji obuhvata davanje efektivne količine mezenhimalnih stromalnih ćelija ili pripravka mezenhimalnih stromalnih ćelija subjektu kome je to potrebno.
[0151] Mezenhimalne stromalne ćelije mogu se davati u kombinaciji sa alogenom ili singenskom translpantiranom ćelijom ili tkivom. Alogeno transplantirana ćelija može da obuhvata epitelnu ćeliju retinalnih pigmenta, retinalnu ćeliju, kornealnu ćeliju, ili mišićnu ćeliju.
[0152] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata mitotički inaktivirane mezenhimalne stromalne ćelije. Mezenhimalne stromalne ćelije mogu se diferencirati iz ćelija hemangioblasta.
[0153] Farmaceutik može da obuhvata najmanje 10<6>mezenhimalnih stromalnih ćelija i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0154] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski pripravak koji obuhvata mitotički inaktivirane mezenhimalne ćelije proizvedene gornjim postupkom.
[0155] Pripravak može biti pogodan za davanje humanom pacijentu. Pripravak može biti pogodan za davanje nehumanom veterinarskom sisaru.
[0156] Farmaceutski pripravak može biti bez pluripotentnih ćelija.
[0157] Farmaceutski pripravak može da obuhvata određenu količinu mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne da leče neželjeni imuni odgovor kod nekog subjekta kome je to potrebno.
[0158] Farmaceutski pripravak može da obuhvata određenu količinu mezenhimalnih stromalnih ćelija efektivne za lečenje bolesti ili stanja odabranog iz grupe koju čine: zapaljenska respiratorna stanja, respiratorna stanja usled akutne povrede, respiratorni distres sindrom kod odraslih, post-traumatični respiratorni distres sindrom kod odraslih, bolest transplantiranih pluća, Hronična opstruktivna bolest pluća, emfizem, hronični opstruktivni bronhitis, bronhitis, alergijska reakcija, oštećenje usled bakterijske upale pluća, oštećenje usled virusne upale pluća, astma, izlaganje iritantima, upotreba duvana, atopični dermatitis, alergijski rinitis, gubitak sluha, autoimuni gubitak sluha, bukom-indukovani gubitak sluha, psorijaza i bilo koja njihova kombinacija.
Pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija
[0159] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem se željeni fenotip pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija pojavljuje ranije u poređenju sa mezenhimalnim stromalnim ćelijama iz ESC kulitivisanja (Videti FIG.5). U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem se željeni fenotip pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija pojavljuje ranije u poređenju sa mezenhimalnim stromalnim ćelijama iz ESC kulitivisanja, i gde je pomenuti željeni fenotip definisan ekspresijom od najmanje dva markera odabrana iz grupe koja obuhvata CD9, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, i HLA-abc.
[0160] Dalji primer izvođenja ovog pronalaska obuhvata pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem je fenotip pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija definisan ekspresijom od najmanje dva markera odabrana iz grupe koja obuhvata CD9, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, i HLA-ABC. U još daljem primeru izvođenja ovaj pronalazak obuhvata pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem je fenotip pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija definisan ekspresijom od najmanje dva markera odabrana iz grupe koja obuhvata CD9, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105, i u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije ne eksprimiraju CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD38, CD61, CD62E i CD133.
[0161] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ili 100% predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) predstavljaju fenotip definisan ekspresijom markera CD9, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, i HLA-abc nakon oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 dana u kulturi. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ili 100% predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) predstavljaju fenotip definisan ekspresijom od najmanje dva markera odabrana iz grupe koja obuhvata CD9, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, i HLA-abc , a nedostaje im ekspresija CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD38, CD61, CD62E, CD133 i Stro-1 nakon oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 dana u kulturi. Prethodni primer izvođenja, u kojem je pomenuti fenotip dalje definisan markerima odabranim iz grupe koja obuhvata AIRE-1, IL-11, CD10, CD24, ANG-1, i CXCL1.
[0162] Obezbeđen je poželjan postupak ovog pronalaska, u kojem broj mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz hemangioblasta iznosi oko 8 x 10<7>, 8.5 x 10<7>, 9 x 10<7>, 9.5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1.25 x 10<8>, ili 1.5 x 10<8>mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz oko 2 x 105 hemangioblasta unutar oko 30 dnevne kulture mezenhimalnih stromalnih ćelija. U alternativnom primeru izvođenja ovog pronalaska, mezenhimalne stromalne ćelije mogu biti generisane iz hemangioblasta u odnosu hemangioblasti prema mezenhimalnim stromalnim ćelijama od oko 1:200, 1:400, 1:415, 1:425, 1:440; 1:450, 1:465, 1:475, 1:490, i 1:500, unutar oko 30 dnevne kulture mezenhimalnih stromalnih ćelija.
[0163] U poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, broj mezenhimalnih stromalnih ćelija dobijenih uzgajanjem hemangioblasta je veći od broja mezenhimalnih stromalnih ćelija dobijenih direktno iz ESCs. U daljem poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, broj mezenhimalnih stromalnih ćelija dobijenih uzgajanjem hemangioblasta je najmanje 5 puta, 10 puta, 20 puta, 22 puta veći od broja mezenhimalnih stromalnih ćelija dobijenih direktno iz ESCs od broja mezenhimalnih stromalnih ćelija dobijenih direktno iz ESCs (Videti FIG.4).
[0164] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija ne formira teratome kada se uvede u sisarskog domaćina.
[0165] Primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisanih uzgajanjem hemangioblasta upotrebom bilo kog od postupaka primera izvođenja ovog pronalaska. Primer izvođenja ovog pronalaska obuhvata pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisanih uzgajanjem hemangioblasta upotrebom bilo kog od postupaka primera izvođenja ovog pronalaska, u kojem je fenotip pomenutih pripravaka definisan prisustvom nekih ili svih markera odabranih iz grupe koja obuhvata AIRE-1, IL-11, CD10, CD24, ANG-1, i CXCL1. Dalji primer izvođenja ovog pronalaska obuhvata pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisanih uzgajanjem hemangioblasta upotrebom bilo kog od postupaka primera izvođenja ovog pronalaska, u kojem je fenotip pomenutih pripravaka definisan prisustvom nekih ili svih markera odabranih iz grupe koja obuhvata AIRE-1, IL-11, CD10, CD24, ANG-1, i CXCL1, i u kojem pomenuti pripravak predstavlja redukovanu ekspresiju IL-6, Stro-1 i VEGF.
4
[0166] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski slične nivoe p53 i p21 proteina, ili u kojem su nivoi p53 u poređenju sa p21 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski slične nivoe p53 i p21 proteina, ili u kojem su nivoi p53 u poređenju sa p211.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se farmaceutski pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti farmaceutski pripravak obuhvata suštinski slične nivoe p53 i p21 proteina, ili u kojem su nivoi p53 u poređenju sa p211.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći.
[0167] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski sličan procenat ćelija pozitivnih na p53 i p21 protein, ili u kojem je procenat ćelija pozitivnih na p53 u poređenju sa p211.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski sličan procenat ćelija pozitivnih na p53 i p21 protein, ili u kojem je procenat ćelija pozitivnih na p53 u poređenju sa p211.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se farmaceutski pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti farmaceutski pripravak obuhvata suštinski sličan procenat ćelija pozitivnih na p53 i p21 protein, ili u kojem je procenat ćelija pozitivnih na p53 u poređenju sa p211.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći.
[0168] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski sličan procenat ćelija sa pozadinskim nivoima markera starenja odabranim iz grupe koja obuhvata S100A1, VIM, MYADM, PIM1, ANXA2, RAMP, MEG3, IL13R2, S100A4, TREM1,DGKA, TPBG, MGLL, EML1, MYOIB, LASS6, ROBO1, DKFZP586H2123, LOC854342, DOK5, UBE2E2, USP53, VEPH1, SLC35E1, ANXA2, HLA-E, CD59, BHLHB2, UCHL1, SUSP3, CREDBL2, OCRL, OSGIN2, SLEC3B, IDS, TGFBR2, TSPAN6, TM4SF1, MAP4, CAST, LHFPL2, PLEKHM1, SAMD4A, VAMP1, ADD1, FAM129A, HPDC1, KLF11, DRAM, TREM140, BHLHB3, MGC17330, TBC1D2, KIAA1191, C5ORF32, C15ORF17, FAM791, CCDC104, PQLC3, EIF4E3, C7ORF41, DUSP18, SH3PX3, MYO5A, PRMT2, C8ORF61, SAMD9L, PGM2L1, HOM-TES-103, EPOR, i TMEM112 ili iz grupe koja obuhvata S100A1, VIM, MYADM, PIM1, ANXA2, RAMP, MEG3, IL13R2, S100A4, TREM1, DGKA, TPBG, MGLL, EMLI, MYOIB, LASS6, ROBO1, DKFZP586H2123, LOC854342, DOK5, UBE2E2, USP53, VEPH1, i SLC35E1, ili u kojem je procenat ćelija pozitivan na markere starenja odabrane iz grupe koja obuhvata S100A1, VIM, MYADM, PIM1, ANXA2, RAMP, MEG3, IL13R2, S100A4, TREM1,DGKA, TPBG, MGLL, EML1, MYOIB, LASS6, ROBO1, DKFZP586H2123, LOC854342, DOK5, UBE2E2, USP53, VEPH1, SLC35E1, ANXA2, HLA-E, CD59, BHLHB2, UCHL1, SUSP3, CREDBL2, OCRL, OSGIN2, SLEC3B, IDS, TGFBR2, TSPAN6, TM4SF1, MAP4, CAST, LHFPL2, PLEKHM1, SAMD4A, VAMP1 ADD1, FAM129A, HPDC1, KLF11, DRAM, TREM140, BHLHB3, MGC17330, TBC1D2, KIAA1191, C5ORF32, C15ORF17, FAM791, CCDC104, PQLC3, EIF4E3, C7ORF41, DUSP18, SH3PX3, MYO5A, PRMT2, C8ORF61, SAMD9L, PGM2L1, HOM-TES-103, EPOR, TMEM112 ili iz grupe koja obuhvata S100A1, VIM, MYADM, PIM1, ANXA2, RAMP, MEG3, IL13R2, S100A4, TREM1, DGKA, TPBG, MGLL, EML1, MYOIB, LASS6, ROBO1, DKFZP586H2123, LOC854342, DOK5, UBE2E2, USP53, VEPH1, i SLC35E1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta veći od pozadine. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski sličan procenat ćelija sa pozadinskim nivoima markera odabranih iz grupe koja obuhvata HoxB3, HoxB7, MIDI, SNAPC5, PPARG, ANXA2, TIPIN, MYLIP, LAX1, EGR1CRIP1, SULT1A3, STMN1, CCT8, SFRS10, CBX3, CBX1, FLJ11021, DDX46, ACADM, KIAA0101, TYMS, BCAS2, CEP57, TDG, MAP2K6, CSRP2, GLMN, HMGN2, HNRPR, EIF3S1, PAPOLA, SFRS10, TCF3, H3F3A, LOC730740, LYPLA1, UBE3A, SUM02, SHMT2, ACP1, FKBP3, ARL5A,GMNN, ENY2, FAM82B, RNF138, RPL26L1, CCDC59, PXMP2, POLR3B, TRMT5, ZNF639, MRPL47, GTPBP8, SUB1, SNHG1, ATPAF1, MRPS24, C16ORF63, FAM33A, EPSTL1, CTR9, GAS5, ZNF711, MTO1, i CDP2, ili u kojem je procenat ćelija pozitivnih na markeri odabrane iz grupe koja obuhvata HoxB3, HoxB7, MIDI, SNAPC5, PPARG, ANXA2, TIPIN, MYLIP, LAX1, EGR1, CRIP1, SULT1A3, STMN1, CCT8, SFRS10, CBX3, CBX1, FLJ11021, DDX46, ACADM, KIAA0101, TYMS, BCAS2, CEP57, TDG, MAP2K6, CSRP2, GLMN, HMGN2, HNRPR, EIF3S1, PAPOLA, SFRS10, TCF3, H3F3A, LOC730740, LYPLA1, UBE3A, SUM02, SHMT2, ACP1, FKBP3, ARL5A,GMNN, ENY2, FAM82B, RNF138, RPL26L1, CCDC59, PXMP2, POLR3B, TRMT5, ZNF639, MRPL47, GTPBP8, SUB1, SNHG1, ATPAF1, MRPS24, C16ORF63, FAM33A, EPSTL1, CTR9, GAS5, ZNF711, MTO1, i CDP21.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta manji od pozadine.
[0169] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) u kojem pomenuti pripravak obuhvata suštinski sličan procenat ćelija sa pozadinskim nivoima markera starenja odabranim iz grupe koja obuhvata HoxB3, HoxB7, MIDI, SNAPC5, PPARG, ANXA2, TIPIN, MYLIP, LAX1, EGR1, CRIP1, SULT1A3, STMN1, CCT8, SFRS10, CBX3, CBX1, FLJ11021, DDX46, ACADM, KIAA0101, TYMS, BCAS2, CEP57, TDG, MAP2K6, CSRP2, GLMN, HMGN2, HNRPR, EIF3S1, PAPOLA, SFRS10, TCF3, H3F3A, LOC730740, LYPLA1, UBE3A, SUM02, SHMT2, ACP1, FKBP3, ARL5A,GMNN, ENY2, FAM82B, RNF138,
4
RPL26L1, CCDC59, PXMP2, POLR3B, TRMT5, ZNF639, MRPL47, GTPBP8, SUB1, SNHG1, ATPAF1, MRPS24, C16ORF63, FAM33A, EPSTL1, CTR9, GAS5, ZNF711, MTO1, i CDP2, ili iz grupe koja obuhvata HoxB3, HoxB7, MIDI, SNAPC5, PPARG, ANXA2, TIPIN, MYLIP, LAX1, EGR1, CRIP1 i SULT1A3 ili u kojem je procenat ćelija pozitivan na markere starenja odabrane iz grupe koja obuhvata HoxB3, HoxB7, MIDI, SNAPC5, PPARG, ANXA2, TIPIN, MYLIP, LAX1, EGR1, CRIP1, SULT1A3, STMN1, CCT8, SFRS10, CBX3, CBX1, FLJ11021, DDX46, ACADM, KIAA0101, TYMS, BCAS2, CEP57, TDG, MAP2K6, CSRP2, GLMN, HMGN2, HNRPR, EIF3S1, PAPOLA, SFRS10, TCF3, H3F3A, LOC730740, LYPLA1, UBE3A, SUM02, SHMT2, ACP1, FKBP3, ARL5A,GMNN, ENY2, FAM82B, RNF138, RPL26L1, CCDC59, PXMP2, POLR3B, TRMT5, ZNF639, MRPL47, GTPBP8, SUB1, SNHG1, ATPAF1, MRPS24, C16ORF63, FAM33A, EPSTL1, CTR9, GAS5, ZNF711, MTO1, i CDP2 ili grupe koja obuhvata HoxB3, HoxB7, MIDI, SNAPC5, PPARG, ANXA2, TIPIN, MYLIP, LAX1, EGR1, CRIP1, SULT1A31.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 puta manji od pozadine.
[0170] U još jednom primeru izvođenja, hemangioblast-izvedene MSCs poseduju fenotipove mlađih ćelija u poređenju sa iz odrasle osobe-izvedenih MSCs. U jednom primeru izvođenja, predmetne MSCs sposobne su za prolaženje najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ili više populacionih dupliranja u kulturi. Sa druge strane, iz odrasle osobe-izvedene mezenhimalne stromalne ćelije tipično prolaze 2-3 dupliranja u kulturi. U još jednom primeru izvođenja, hemangioblast-izvedene MSCs imaju duže telomerne dužine, veće imunosupresivne efekte, manje vakuola, brže se dele, dele se lakše u kulturi, veću CD90 ekspresiju, manje su rodno povezane, ili njihove kombinacije, u poređenju sa od odrasle osobe-izvedene MSCs. U još jednom primeru izvođenja, hemangioblast-izvedene MSC imaju povećanu ekspresiju transkripta koji promovišu ćelijsku proliferaciju (tj., imaju viši proliferativni kapacitet) i redukovanu ekspresiju transkripta uključenih u krajnju ćelijsku diferencijaciju u poređenju sa iz odrasle osobe-izvedenim MSCs.
[0171] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija generisan je bilo kojim ili više postupaka ovog pronalaska, u kojem su pomenute mezenhimalne stromalne ćelije sposobne za prolaženje najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ili više populacionih dupliranja u kulturi.
[0172] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) sposobne su za prolaženje najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ili više populacionih dupliranja u kulturi. U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija sposobne su za prolaženje najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ili više populacionih dupliranja u kulturi, u kojem nakon pomenutih populacionih dupliranja manje od 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%,
4
5%, ili 1% mezenhimalnih stromalnih ćelija imaju prolazna replikativna starenja. U daljem primeru izvođenja, pomenuti pripravak je farmaceutski pripravak.
[0173] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 dupliranja u kulturi,
[0174] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 dupliranja u kulturi, u kojem manje od 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, ili 1% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija prolaze replikativno starenje, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije zadržavaju mladalački fenotip i potenciju, i u kojem pomenuti pripravak predstavlja farmaceutski pripravak. Pomenuti pripravak može da obuhvata efektivan broj mezenhimalnih stromalnih ćelija za lečenje bolesti, kao što su imunološki poremećaj, degenerativna bolest, ili druge bolesti koja se može lečiti upotrebom MSCs.
[0175] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze najmanje ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 dupliranja u kulturi, u kojem manje od 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, ili 1% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija prolaze replikativno starenje nakon takvog dupliranja, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije zadržavaju mladalački fenotip i potenciju, i u kojem pomenuti pripravak predstavlja farmaceutski pripravak. Pomenuti pripravak može da obuhvata efektivan broj mezenhimalnih stromalnih ćelija za lečenje bolesti, kao što su imunološki poremećaj, degenerativna bolest, ili druge bolesti koja se može lečiti upotrebom MSCs..
[0176] U još jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 dupliranja u kulturi. Prethodni primer izvođenja u kojem manje od 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5% 1% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija prolaze replikativno starenje, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije zadržavaju mladalački fenotip i potenciju, u kojem je pomenuti pripravak farmaceutski pripravak, u kojem pomenuti farmaceutski pripravak obuhvata efektivan broj mezenhimalnih stromalnih ćelija, i u kojem se pomenuti farmaceutski pripravak čuva.
4
[0177] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija. U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem se čuva pomenuti pripravak. U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata farmaceutski pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta). U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata farmaceutski pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem se čuva pomenuti pripravak.
[0178] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak lečenja patologija davanjem efektivne količine mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz hemangioblasta subjektu kome je to potrebno. Pomenute patologija mogu da uključuju, ali nisu ograničene na autoimuni poremećaj, uveitis, gubitak kostiju ili oštećenje hrskavice.
[0179] Mezenhimalne stromalne ćelije dobijene uzgajanjem hemangioblasta imaju poboljšane karakteristike u poređenju sa MSCs izvedene direktno iz ESCs. Na primer, ESC-izvedene MSCs više se zgrušavaju, teško se disperguju pri deljenju, ne generiši ni približno onoliko MSCs počevši sa ekvivalentnim brojevima ESCs, i potreban im je duži period da steknu karakteristike MSC ćelijskih površinskih markera u poređenju sa hemangioblast-izvedenim MSCs. Videti Primer 2 i FIG.3-6.
[0180] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem je pomenuti pripravak efektivan u normalizovanju neke patologije. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem je pomenuti pripravak efektivan u smanjivanju prekomernih ili neželjenih imunih odgovora. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se pripravak predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), u kojem je pomenuti pripravak efektivan u poboljšavanju autoimunog poremećaja. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje se normalizacija patologije davanjem domaćinu efektivne količine predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta). Dalji primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je za normalizaciju patologije, gde je takva normalizacija patologije okarakterisana efektima odabranim iz grupe koja obuhvata citokinsko oslobađanje od strane pomenutih MSCs, stimulisanje povećanja broja regulatornih T ćelija, inhibiranje određenih količina IFN gama oslobađanja iz Th1 ćelija, i stimulisanje određene količine IL4 lučenje iz Th2 ćelija. U daljem primeru
4
izvođenja, davanje pripravka predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) rezultuje u oslobađanju iz pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija citokina odabranih iz grupe koja obuhvata transformišući faktor rasta beta, indoleamin 2, 3dioksigenazu, prostaglandin E2, hepatocitni faktor rasta, azotni oksid, interleukin 10, interleukin 6, makrofaga-kolona stimulišući faktor, i rastvorljiv humani levkocitni antigen (HLA) G5.
[0181] U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska davanje pripravka predmetnih mezenhimalnih stromalnih ćelija (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) rezultuje u oslobađanju iz pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija citokina odabranih iz grupe koja obuhvata transformišući faktor rasta beta, indoleamin 2, 3dioksigenazu, prostaglandin E2, hepatocitni faktor rasta, azotni oksid, interleukin 10, interleukin 6, makrofaga-kolona stimulišući faktor, rastvorljiv humani levkocitni antigen (HLA) G5, interleukin 4, 8, 11, faktor stimulacije kolonije granulocitne makrofage, vaskularni endotelijalni faktor rasta, faktor rasta 1 sličan insulinu, prtein klase F fosfatidilinositol-glikan biosinteze, monocit hemoatraktant protein 1, stromalno izveden faktor 1, faktor 1 tumor nekroze, transformišući faktor rasta beta, osnovni fibroblast faktor rasta, angiopoietin 1 i 2, monokin indukovan od strane interferon gama, interferon inducibilni protein 10, iz mozga izveden neurotrofični faktor, interleukin 1 receptor alfa, hemokin ligand 1 i 2.
Farmaceutski pripravci MSCs
[0182] MSCs ovog pronalaska mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Na primer, MSCs ovog pronalaska mogu se davati same ili kao komponenta farmaceutske formulacije, u kojoj pomenutr MSCs mogu biti formulisane za davanje na bilo koji pogodan način za upotrebu u medicini. Jedan primer izvođenja obezbeđuje farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija koji obuhvata pomenute mezenhimalne stromalne ćelije u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivh sterilnih izotoničnih vodenih ili ne-vodenih rastvora odabranih iz grupe koju čine: disperzije, suspenzije, emulzije, sterilni praškovi opciono rekonstituisani u sterilnim injektabilnim rastvorima ili disperzijama neposredno pre upotrebe, antioksidansi, puferi, bakteriostatici, rastvori ili agensi suspendovanja i zgušnjavanja.
[0183] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze između oko 5 i oko 100 populacionih dupliranja. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze između oko 10 i oko 80 populacionih dupliranja. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute
4
mezenhimalne stromalne ćelije prolaze između oko 25 i oko 60 populacionih dupliranja. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze manje od oko 10 populacionih dupliranja. U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze manje od oko 20 populacionih dupliranja. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze manje od oko 30 populacionih dupliranja, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije nisu prošle replikativno starenje. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze manje od oko 30 populacionih dupliranja, u kojem manje od oko 25% pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija prolazi replikativno starenje. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze manje od oko 30 populacionih dupliranja, u kojem manje od oko 10 % pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija prolazi replikativno starenje. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska obezbeđen je farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija, u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije prolaze manje od oko 30 populacionih dupliranja, u kojem manje od oko 10 % pomenutih mezenhimalnih stromalnih ćelija prolazi replikativno starenje, i u kojem pomenute mezenhimalne stromalne ćelije eksprimiraju markere odabrane iz grupe koja obuhvata AIRE-1, IL-11, CD10, CD24, ANG-1, i CXCL1.
[0184] Koncentracije za injekcije farmaceutskih pripravaka MSCs mogu biti bilo koje količine koja je efektivna i, na primer, suštinski bez ESCs. Na primer, farmaceutski pripravci mogu da obuhvataju brojeve i vrste MSCs koje su ovde opisane. U određenom primeru izvođenja, farmaceutski pripravci MSCs obuhvataju oko 1 x 10<6>predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) za sistemsko davanje domaćinu kome je to potrebno ili oko 1 x 10<4>pomenutih MSCs uzgajanjem hemangioblasta za lokalno davanje domaćinu kome je to potrebno.
[0185] Primerne kombinacije ovog pronalaska mogu biti formulacije pogodne za upotrebu u tretiranju humanog pacijenta, kao što su bez pirogena ili suštinski bez pirogena, i bez patogena. Kada se daje, farmaceutski pripravci za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti u fiziološki prihvtaljivom obliku bez pirogena, bez patogena.
[0186] Pripravak koji obuhvata MSCs koji se koriste u ovde opisanim postupcima može biti transplantiran u suspenziji, gelu, koloidu, gustoj suspneziji, ili mešavini. Takođe, u vreme injektovanja, krioprezervirane MSCs mogu se resuspendovati sa komercijalno dostupnim uravnoteženim slanim rastvorom radi postizanja željene osmolarnosti i koncentraciji za davanje injektovanjem (tj., bolus ili intravenozno).
[0187] Jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na farmaceutski pripravak pogodan za upotrebu na sisarskom pacijentu, koji obuhvata najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>ili čak 10<9>mezenhimalnih stromalnih ćelija i farmaceutski prihvatljiv nosač. Drugi aspect ovog pronalaska odnosi se na a farmaceutski pripravak koji obuhvata najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>ili čak 109mezenhimalnih stromalnih ćelija i farmaceutski prihvatljiv nosač, u kojem su mezenhimalne stromalne ćelije diferencirane iz ćelija hemangioblasta. Još jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje kriogenu ćelijsku banku koja obuhvata najmanje 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, 10<12>ili čak 10<13>mezenhimalne stromalne ćelije. Još jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje prečišćen ćelijski pripravak bez ili suštinski bez ne-humanih ćelijskih i/ili ne-humanih životinjskih proizvoda, koji obuhvata najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>ili čak 10<9>mezenhimalnih stromalnih ćelija i manje od 1% bilo kog drugog ćelijskog tipa, poželjnije manje od 0.1%, 0.01% ili čak 0.001% bilo kog drugog ćelijskog tipa. Određene opisane kombinacije i banke uključuju, ali nisu ograničeni na one navedene u sledećim pasusima:
U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 10 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi sa manje od 25, 20, 15, 10 ili čak 5 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije (kao što su fibroblasti, adipociti i/ili osteociti) do 10. dupliranja.
[0188] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 15 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi sa manje od 25, 20, 15, 10 ili čak 5 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije (kao što su fibroblasti, adipociti i/ili osteociti) do 15. dupliranja.
[0189] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 20 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi sa manje od 25, 20, 15, 10 ili čak 5 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije (kao što su fibroblasti, adipociti i/ili osteociti) do 20. dupliranja.
[0190] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 5 prolaza u ćelijskoj kulturi sa manje od 25, 20, 15, 10 ili čak 5 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije (kao što su fibroblasti, adipociti i/ili osteociti) 5. prolazom.
1
[0191] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativni kapacitet da prolaze najmanje 10 prolaza u ćelijskoj kulturi sa manje od 25, 20, 15, 10 ili čak 5 procenata ćelija koje prolaze ćelijsku smrt, biološko starenje ili diferenciranje u ne-MSC ćelije (kao što su fibroblasti, adipociti i/ili osteociti) do 10. prolaza.
[0192] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije diferenciraju se iz izvora pluropotentnih matičnih ćelija, kao što su pluropotentne matična ćelija koja eksprimira OCT-4, alkalin fosfatazu, Sox2, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, i TRA-1-80 (kao što su, i embrionska matična ćelijska linija ili matična ćelijska linija indukovana pluripotencijom), a čak poželjnije iz uobičajenog izvora pluropotentnih matičnih ćelija.
[0193] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije su HLA-genotipično identične.
[0194] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije su genomski identične.
[0195] U određenim primerima izvođenja, najmanje 30%, 35%, 40%, 45% ili čak 50% mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivne su na CD10.
[0196] U određenim primerima izvođenja, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ili čak 90% mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivne su na markere CD73, CD90, CD105, CD13, CD29, CD44, CD166 i CD274 i HLA-ABC.
[0197] U određenim primerima izvođenja, manje od 30%, 25%, 20%, 15% ili čak 10% mezenhimalnih stromalnih ćelija pozitivne su na markere CD31, CD34, CD45, CD133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4 i TLR3.
[0198] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju replikativne stope da prolaze najmanje 10 populacionih dupliranja u ćelijskoj kulturi u manje od 25, 24, 23, 22, 21 ili čak 20 dana.
[0199] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije imaju srednju dužinu terminalne restrikcije fragmenta (TRF) koja je duža od od 7kb, 7.5kb, 8kb, 8.5kb, 9kb, 9.5kb, 10kb, 10.5kb, 11kb, 11.5kb ili čak 12kb.
2
[0200] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije ne prolaze više od 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, ili čak 45% procenata povećanja u ćelijama sa vrednošću ka napred raspršenog svetla, izmereno protočnom citometrijom, većom od 5,000,000 preko 10, 15 ili čak 20 populacionih dupliranja u kulturi.
[0201] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije, u stanju mirovanja, eksprimiraju mRNK koja kodira Interleukin-6 na nivou koji je manji od 10%, 8%, 6%, 4% ili čak 2% IL-6 mRNK nivoa eksprimiranog putem pripravaka mezenhimalnih stromalnih ćelija, u stanju mirovanja, izvedenih iz krvi iz pupčane vrpce, koštane srži ili adipostnog tkiva.
[0202] U određenim primerima izvođenja, mezenhimalne stromalne ćelije su najmanje 2, 4, 6, 8, 10, 20, 50 ili čak 100 puta više potentne od MSCs izvedenih iz krv iz pupčane vrpce, koštane srži ili adipostnog tkiva.
[0203] U određenim primerima izvođenja, jedan milion mezenhimalnih stromalnih ćelija, kada se injektuju u MOG35-55 EAE mišji model (kao što su C57BL/6 miševi imunizovani sa MOG35-55 peptidom) će, u proseku, redukovati kliničku ocenu od 3.5 do manje od 2.5, a čak poželjnije redukovaće kliničku ocenu na manje od 2, 1.5 ili čak manje od 1.
[0204] U određenim primerima izvođenja, pripravak je pogodan za davanje humanom pacijentu, a poželjnije on je bez pirogena i/ili bez ne-humanih životinjskih proizvoda.
[0205] U drugim primerima izvođenja, pripravak je pogodan za davanje nehumanom veterinarskom sisaru, kao što su pas, mačka ili konj.
Bolesti i stanja koja se mogu lečiti upotrebom MSCs izvedenih iz kultivisanih hemangioblasta [0206] MSCs su se pokazale kao terapeutici za razne bolesti i stanja. Određenije, MSCs migriraju do mesta povrede, espoljavaju imunosupresivne efekte, i omogućavaju opravak oštećenog tkiva.
Obezbeđen je primer izvođenja ovog pronalaska, u kojem farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija redukuje manifestaciju patologije. Obezbeđen je primer izvođenja ovog pronalaska, u kojem farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija daje se domaćinu koji boluje od neke patologije. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) redukuje manifestaciju patologije odabrane iz grupe koja obuhvata zarastanje rana, bolest graft-vs-domaćin (GvHD), bolest, hronična bolest oka, retinalno degenerisanje, glaukom, uveitis, akutni miokardijalni infarkt, hronični bol, hepatitis, i nefritis. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija uzgajane od hemangioblasta redukuje manifestaciju konjskog laminitisa. Kao dalji primer, MSCs mogu se davati u kombinaciji sa alogeno transplantiranom ćelijom ili tkivom (npr., pripravak koji obuhvata ćelije koje su diferencirane iz ES ćelija, kao što su ćelije epitelijuma retinalnog pigmenta (RPE), oligodendrocitni pekursori, retinalni, kornealni, mišići kao što su mišići skeleta, glatki ili kadriološki mišići ili bilo koja njihova kombinacija, ili drugi) čime čime se smanjuje verovatnoća imune reakcije protiv transplantirane ćelije ili tkiva i potencijalno zaobilazi potreba za drugim imunim suzbijanjem. Predmetne MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) koje su ovde opisane mogu se primeniti u sličnim primenama. Primer izvođenja postupka ovog pronalaska u kojem davanje farmaceutskog pripravka predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) domaćinu redukuje potrebu za budućom terapijom. Obezbeđen je primer izvođenja postupka ovog pronalaska, u kojem davanje farmaceutskog pripravka predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) domaćinu redukuje potrebu za budućom terapijom, u kojem pomenuti terapija suzbija imunu funkciju.
[0207] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) daje se domaćinu radi lečenja patologije. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) daje se domaćinu radi lečenja patologija odabranih sa spiska koji obuhvata zarastanje rana, multiple sklerozu, sistemsku sklerozu, hematološke malignosti, miokardijalni infarkt, transplantaciju tkiva i organa, odbijanje tkiva i organa, hroničnu alograftnu nefropatiju, cirozu, otkazivanje jetre, otkazivanju srca, GvHD, tibijalne frakture, levu ventrikularnu disfunkciju, leukemiju, mijeloplastični sindrom, Kronovu bolest, Tip I ili Tip II dijabetes melitus, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, plućnu hipertenziju, hronični bol, osteogenezu imepfekta, homozigotnu familijarnu hipoholesterolemiju, lečenje praćeno menisektomijom, periodontitisu kod odraslih, vaskulogenezu kod pacijenata sa teškom miokardijalnom ishemijom, oštećenja kičmene moždine, osteoplazije, kritične ishemije ekstremiteta povezane sa dijabetes melitusom, bolesti dijabetičnog stopala, primarni Sjogrenovog sindrom, osteoartritis, defekte hrskavice (npr., artikularni defekat hrskavice), laminitis, multisistemsku atrofiju, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, kadriološke operacije, uporni sistemski lupus eritematozis, alograft živih bubrega, nemaligne poremećaje crvenih krvnih zrnaca, toplotne opekotine, radijacione opekotine, Parkinsonovu bolest, mikrofrakturu (npr., kod pacijenata sa defekata povrede zglobne hrskavice kolena), epidermolizis bulozu, tešku koronarnu ishemiju, idiopatsku dilatiranu kardiomiopatiju, osteonekrozu femoralne glave, lupus nefritis, defekte koštane praznine, ishemijski celebralni šlog, stanje nakon šloga, akutni radijacioni sindrom, plućne bolesti, artritis, i koštane regeneracije.
4
[0208] U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) daje se domaćinu radi lečenja autoimune patologije odabrane sa spiska koji obuhvata akutni nekrotizujući hemoragični leukoencefalitis, Adisonovu bolest, agamaglobulinemiju, alopecija areata, amiloidozu, ankilozni spondilitis, Anti-GBM/Anti-TBM nefritis, antifosfolipidni sindrom (APS), autoimuni angioedem, autoimunu aplastičnu anemiju, autoimunu disautonomiju, autoimuni hepatitis, autoimunu hiperlipidemiju, autoimunu imunodeficijenciju, autoimunu bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimuni miokarditis, autoimuni pancreatitis, autoimunu retinopatiju, autoimunu trombocitopeničnu purpuru (ATP), autoimunu tiroidnu bolest, autoimuni urtikarijal, aksonalne i neuronske neuropatije, Balo bolest, Behcet-ovu bolest, Bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, Kastleman-ovu bolest, celijakiju, Šagasova bolest, sindrom hroničnog umora, hroničnu zapaljensku demijelinacionu polineuropatiju (CIDP), hronični rekurentni multifokalni ostomijelitis (CRMO), Churg-Strauss-ov sindrom, cikatricijalni pemfigoid /benigni mukozalni pemfiogoid, Kronova bolesta, Koganov sindrom, bolest hladnih aglutinina, kogenitalnu srčanu blokadu, Koksaki miokarditis, CREST bolest, suštinski mešovite krioglobulinemije, demijelinacione neuropatije, dermatitis herpetiformis, dermatomiositis, Devic-ova bolest (neuromijelitis optica), diskoidni lupus, Dressler-ov sindrom, endometrioze, Eozinofilnic esofagitis, eozinofilni fasciitis, eritem nodozum, eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, Evans-ov sindrom, fibromijalgija, fibrotični alveolitis, arteritis velikih ćelija (temporalni arteritis), glomerulonefritis, Goodpasture-ov sindrom, granulomatozu sa poliangiitisom (GPA) videti Wegener-pvu, Graves-ovu bolest, Guillain-Barre-ov sindrom, Hashimoto-ov encefalitis, Hashimoto tiroiditis, hemolitičnu anemiju, Henoch-Schonlein-ovu purpuru, herpes gestationis, hipogamaglobulinemiju, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), IgA nefropatiju, IgG4-povezanu skeroznu bolest, imunoregulatorne lipoproteine, inkluziju telesnog miozitisa, insulin-zavisan dijabetes (tip1), intersticijalni cistitis, juvenilni artritis, juvenilni dijabetes, Kawasaki sindrom, Lambert-Eaton sindrom, Leukocitoklastični vaskulitis, Lichen planus, Lichen sclerosus, lignozni konjunktivitis, Linearne IgBolesti (LAD), Lupus (SLE), Lajmsku bolest, hronicitete, Meniere-ovu bolest, mikroskopski poliangiitis, bolest mešovitog veznog tkiva (MCTD), Mooren-ov čir, Mucha-Habermann-ova bolest, multiple sklerozu, mijasteniju gravis, miozitis, narkolepsiju, neuromijelitis optiku (Devic-ova), neutropeniju, očni cicatricijalni pemfiogoid, očni neuritis, palindromični reumatizam, PANDAS (Pedijatrijski autoimunski neuropsihijatrijski poremećaji oovezani sa Streptococcusom), paraneoplastična cereblarna degeneracija, paroksimalnu noćnu hemoglobinuriju (PNH), Parry Romberg-ov sindrom, Parsonnage-Turner-ov sindrom, Pars planitis (periferni uveitis), Pemfigus, perifernu neuropatiju, perivenozni encefalomijelitis, pernicioznu anemiju, POEMS sindrom, Poliarteritis nodosa, Tip I, II, & III autoimuni poliglandularni sindromi, reumatičnu polimijalgiju, polimiozitis, postmiokardijalni infarktni sindrom, postperikardiotomni sindrom, progesteronski dermatitis, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozni holangitis, psorijazu, psorijatični artritis, idiopatsku plućnu fibrozu, piodermu gangrenozum, čistu aplaziju crvenih ćelija, Raynaud-ov fenomen, refeksnu simatetičnu distrofiju, Reiter-ov sindrom, vraćajući polihondritis, sindrom nemirne noge, retroperitonealna fibroza, reumatičnu groznicu, reumatoidni artritis, sarkoidozu, Schmidt-ov sindrom, skleritis, sklerodermu, Sjogren-ov sindrom, autoimunost sperme i testisa, Stiff person-ov sindrom, subakutni bakterijski endokarditis (SBE), Susac-ov sindrom, simpatetična oftalmija, Takayasu-jev arteritis, privremeni arteritis/arteritis velikih ćelija, trompocitponeičnu purpuru (TTP), Tolosa-Hunt-ov sindrom, transverzni mijelitis, ulcerativni kolitis, bolst nediferenciranog veznog tkiva (UCTD), uveitisu, vaskulitis, vesikulobuloznu dermatozu, vitiligo, i Wegener-ovu granulomatozu (takođe naznava granulomatoza sa poliangiitisom (GPA).
Režimi lečenja upotrebom MSCs izvedenih iz kultivisanih hemangioblasta
[0209] MSCs i farmaceutski pripravci koji obuhvataju MSCs koje su ovde opisane mogu se primeniti za lečenja na bazi ćelija. Određenije, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje ili sprečavanje bolesti i stanja koje su ovde opisane, koje obuhvata davanje efektivne količine farmaceutskog pripravka koji obuhvata MSCs, u kojem su MSCs izvedene iz kultivisanih hemangioblasta.
[0210] MSCs ovog pronalaska mogu se davati upotrebom modaliteta poznatih u struci, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, injekcija putem intravenozne, intramiokardijalne, transendokardijalne, intravitrealne, ili intramuskularne putanje ili lokalne implantacije zavisno od određene patologije koja se leči.
[0211] Mezenhimalne stromalne ćelije ovog pronalaska mogu se davati putem lokalne implantacije, u kojem se koristi uređaj za dostavu. Uređaji za dostavu ovog pronalaska su biokompatibilni i biorazgradivi. Uređaj za dostavu ovog pronalaska može se proizvesti upotrebom materijala odabranih iz grupe koja obuhvata biokompatibilna vlakna, biokompatibilna klupka, biokompatibilne pene, alifatične poliestre, poli(amino kiseline), kopoli(etar-estre), polialkilene oksalate, poliamide, tirozin izvedene polikarbonate, poli(iminokarbonate), poliortoestre, polioksaestre, poliamidoestre, polioksaestre koji sadrže aminske grupe, poli(anhidride), polifosfazene, biopolimere; homopolimere i kopolimere laktida, glikolida, epsilon-kaprolaktona, para-dioksanona, trimetilen karbonata; homopolimere i kopolimere laktida, glikolida, epsilon-kaprolaktona, para-dioksanona, trimetilen karbonata, fibrilarni kolagen, nefibrilarni kolagen, kolagene koji se ne leče pepsinom, kolagene kombinovane sa drugim polimerima, faktore rasta, proteine esktracelularne matrice, biološki relevantne peptidne fragmente, hepatocitni faktor rasta, iz trombocita izvedene faktore rasta, plazma bogata trombocitima, insulinski faktor rasta, diferencijacioni faktor rasta, vaskularni endotelijalni iz ćelija izveden faktor rasta, nikotinamid, peptide nalik glukagonu, tenascin-C, laminin, agense protiv odbacivanja, analgezike, anti-oksodanse, antiaptotične agense anti-zapaljenske agense i citostatične agense.
[0212] Određen režim lečenja, put davanja, i terapija adjunansima mogu se prilagoditi na osnovu određenih patologija, težine patologije, i opšteg zdravlja pacijenta. Davanje farmaceutskih pripravaka koji obuhvataju MSCs može biti efektivnu u smanjivanju težine manifestacije patologije ili i/ili u sprečavanju daljeg degenerisanja te manifestacije patologije.
[0213] Modalitet lečenja ovog pronalaska može da obuhvata davanje jedne doze MSCs. Alternativno, modalitet lečenja koji je ovde opisan može da obuhvata pravac terapije u kojem se MSCs daju više puta tokom nekom vremenskog perioda. Primerni pravci lečenja mogu da obuhvataju nedeljno, dvonedeljno, mesečno, kvartalno, dvogodišnje, ili godišnje lečenje. Alternativno, lečenje može da se nastavi u fazama koje inicijalno zahtevaju više doza (npr., dnevnih doza tokom prve nedelje), i naknadno manje i ređe doze koje su potrebne.
[0214] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija dobijenih uzgajanjem hemangioblasta daje se pacijentu jednom ili više puta periodično tokom života pacijenta. U daljem primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) daje se jednom godišnje, jednom svakih 6-12 meseci, jednom svakih 3-6 meseci, jednom svakih 1-3 meseca, ili jednom svakih 1-4 nedelja. Alternativno, češće davanje može biti poželjno ta određena stanja ili poremećaje. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska farmaceutski pripravak predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta) daje se putem uređaja jednom, više od jednom, periodično tokom života pacijenta, ili kada je potrebno za određenog pacijenta i patologiju pacijenta koja se leči. Slično razmatran je terapeutski režim koji se menja tokom vremena. Na primer, češće lečenje može biti potrebno kao početno (npr., dnevno ili nedeljno lečenje). Tokom vremena, kako se stanje pacijenta poboljšava, može biti potrebno ređe lečenje ili se čak može ukinuti.
[0215] U skladu sa ovim pronalaskom, bolesti ili stanja mogu se lečiti ili prevenirati intravenoznim davanjem mezenhimalnih matičnih ćelija koje su ovde opisane. U nekim primerima izvođenja, oko 20 milions, oko 40 milions, oko 60 milions, oko 80 milions, oko 100 milions, oko 120 miliona, oko 140 miliona, oko 160 miliona, oko 180 miliona, oko 200 miliona, oko 220 miliona, oko 240 miliona, oko 260 miliona, oko 280 miliona, oko 300 miliona, oko 320 miliona, oko 340 miliona, oko 360 miliona, oko 380 miliona, oko 400 miliona, oko 420 miliona, oko 440 miliona, oko 460 miliona, oko 480 miliona, oko 500 miliona, oko 520 miliona, oko 540 miliona, oko 560 miliona, oko 580 miliona, oko 600 miliona, oko 620 miliona, oko 640 miliona, oko 660 miliona, oko 680 miliona, oko 700 miliona, oko 720 miliona, oko 740 miliona, oko 760 miliona, oko 780 miliona, oko 800 miliona, oko 820 miliona, oko 840 miliona, oko 860 miliona, oko 880 miliona, oko 900 miliona, oko 920 miliona, oko 940 miliona, oko 960 miliona, ili oko 980 miliona ćelija injektuje se intravenozno. U nekim primerima izvođenja, oko 1 milijarda, oko 2 milijarde, oko 3 milijarde, oko 4 milijarde ili oko 5 milijardi ćelije ili više injektuje se intravenozno. U nekim primerima izvođenja, broj ćelija kreće se iz između oko 20 miliona do oko 4 milijarde ćelija, između oko 40 miliona do oko 1 milijarde ćelije, između oko 60 miliona do oko 750 miliona ćelija, između oko 80 miliona do oko 400 miliona ćelija, između oko 100 miliona do oko 350 miliona ćelija, i između oko 175 miliona do oko 250 miliona ćelija.
[0216] Postupci koje su ovde opisani mogu dalje da obuhvataju fazu praćenja efikasnosti lečenja ili prevencije upotrebom postupaka poznatih u struci.
Kompleti
[0217] Ovaj pronalazak obezbeđuje komplete koji obuhvataju bilo koju od kombinacija koje su ovde opisane. Pripravak mezenhimalnih stromalnih ćelija može biti smešten u uređaj za dostavu proizveden prema postupcima poznatim stručnjaku iz ove oblasti, i uključuju postupke u US Patentnoj prijavi 2002/0103542, Evropskoj patentnoj prijavi EP 1454641, ili sačuvan prema postupcima poznatim stručnjaku iz ove oblasti, i uključuju postupke iz US Patenta 8,198,085, PCT prijave WO2004/098285, i US Patentne prijave 2012/0077181. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, komplet obuhvata pripravak od oko najmanje 8 x 10<7>, 8.5 x 10<7>, 9 x 10<7>, 9.5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1.25 x 10<8>, ili 1.25 x 10<8>MSCs izvedenih iz kultivisanih hemangioblasta. U još jednom primeru izvođenja, obezbeđen je komplet koji obuhvata pripravak od oko 8 x 10<7>, 8.5 x 10<7>, 9 x 10<7>, 9.5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1.25 x 10<8>, ili 1.25 x 10<8>predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), pri čemu je pomenuti pripravak farmaceutski pripravak. U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđen je komplet koji obuhvata farmaceutski pripravak od oko 8 x 10<7>, 8.5 x 10<7>, 9 x 10<7>, 9.5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1.25 x 10<8>, ili 1.25 x 10<8>predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), pri čemu se pomenuti farmaceutski pripravak čuva. U još daljem primeru izvođenja ovog pronalaska, obezbeđen je komplet koji obuhvata farmaceutski pripravak od oko 8 x 10<7>, 8.5 x 10<7>, 9 x 10<7>, 9.5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1.25 x 10<8>, ili 1.25 x 10<8>predmetnih MSCs (npr., generisane uzgajanjem hemangioblasta), pri čemu se pomenuti farmaceutski pripravak nalazi u vozilu za ćelijsku dostavu.
[0218] Dodatno, kompleti mogu da obuhvataju krioprezervirane MSCs ili pripravke krioprezerviranih MSCs, smrznute MSCs ili pripravke smrznutih MSCs, odmrznutih zamrznutih MSCs ili pripravke odmrznutih zamrznutih MSCs.
Kombinacije različitih primera izvođenja i koncepti
[0219] Podrazumeva se da se primeri izvođenja i koncepti koji su ovde opisani mogu primeniti u kombinaciji. Na primer, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak generisanja MSCs koji obuhvata generisanje hemangioblasta iz ESCs, uzgajanje hemangioblasta tokom najmanje četiri dana, sakupljanje hemangioblasta, ponovno zasađivanje hemangioblasta na Matrigelom-obloženu pločue, i uzgajanje hemangioblasta kakvi su ovd opisani tokom najmanje četrnaest dana, u kojem postupak generiše najmanje 85 miliona MSCs koje su suštinski bez ESCs.
Referentni primeri
[0220] Sledeći primeri nisu ograničavajući za ovaj pronalazak ni na koji način.
Primer 1- Generisanje MSCs iz hemangioblasta
[0221] Hemangioblasti su generisani iz klinički čistih, jedno-blastomerne izvedene ESC linije, MA09 [16], kako sledi:
[0222] Prvo, rano fazni klasteri ćelija su generisani iz MA09 ESC uzgajana u podlozi bez seruma dopunjenja sa kombinacijom morfogenih i rano hematopoetskih citokina, specifično koštani morfogenetski protein-4 (BMP-4), vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), osnovni fibroblast faktor rasta (bFGF), faktor matičnih ćelija (SCF), trombopoietin (Tpo) i ligand fms-povezane tirozin kinaze 3 (FL). Specifičnije, ESCs iz jednog bazenčića ploče sa 6 bazenčića tretirane kulturom tkiva nanose se u jedan bazenčić nisko adhezivne ploče sa šest bazenčića (Corning) u 3 ml Stemline II podlozi (Sigma) dopunjenjoj sa 50 ng/ml VEGF i 50 ng/ml of BMP-4 (R & D) i inkubisana na 37° C sa 5% CO2. Klasteri ćelija formirani su unutar prva 24 hr. Nakon 40-48 sati, polovina podloge (1.5 ml) zamenjena je svežom Stemline II podlogom dopunjenjom sa 50 ng/ml VEGF, 50ng/ml of BMP-4, i 20-22.5ng/ml bFGF, i inkubacija je nastavljena tokom dodatnih 40-48 sati (tj., 3.5-4 dana ukupno).
[0223] Klasteri ćelija su razdvojeni i jedne ćelije su nanete na bez seruma polučvrstu podlogu za rast blast kolonije (BGM). Specifično, klasteri ćelija razdvojeni su 0.05% trisinom-0.53 mM EDTA (Invitrogen) tokom 2-5 min. Ćelijska suspenzija pipetirana je gore i dole, a zatim je DMEM 10% FCS dodata u inaktiviran tripsin. Ćelije su zatim provučene kroz 40µm sito da bi se dobila jedna ćelijska suspenzija. Ćelije su zatim izbrojane i resuspendovane u Stemline II podlozi pri 1-1.5 X 10<6>ćelijama/ml.
[0224] Jedna ćelijska suspenzija (0.3 ml, 3do 4.5 X 10<5>ćelije) umešana je sa 2.7 ml podloge za rast hemangioblasta (H4536 zasnovan na receptu podloge kakva je prethodno opisana) sa kratkim miksovanjem, i ostavljena da se slegne 5 min. Ćelijska mešavina zatim je transferovana u jedan bazenčić ploče sa niskom adherencom sa šest bazenčića upotrebom šprica (3ml) sa 18G iglom, i inkubisana na 37° C sa 5% CO2.
[0225] Neke ćelije razvijaju se u grozdaste blast kolonije (BCs). Specifično, BCs su vidljive 3. dana (tipično sadrže manje od 10 ćelija na početku dana 3), a nakon 4-6 dana, grozdaste hES-BCs lako se identifikuju pod mikroskopom (koje sadrže više od 100 ćelije po BC). Broj BCs prisutnih u kulturi postepeno se povećava kroz nekoliko dana. Nakon 6-7 dana, BCs mogu se pokupiti upotrebom usnih-staklenih kapilarnih cevčica.
[0226] Hemangioblasti mogu se sakupiti između 7-12 dana kulture i ponovo se naneti na Matrigelomobloženu posudu za uzgajanje tkiva u α MEM+20% FCS. Analiza protočne citometrije pokazuje da ekspresioni nivoi 5 ćelijskih površinskih markera koji se tipično javljaju kod MSCs relativno su niski kod početne hemangioblast populacije. (FIG.2, levi panel, prosek 4 eksperimenta /- standardna devijacija). Međutim, nakon tri nedelje kulture u MSC uslovima rasta, homogena adherentna ćelijska populacija pokazuje bojenja >90% pozitivnih na ovih 5 karakterističnih MSC markera (FIG.2, desni panel- 22-23 dana, prosek 4 eksperimenta /- standardna devijacija). Nakon MSC uslova kulture, količina vremena koja je potrebna za diferenciranju ćelija da steknu MSC površinske markere može da varira u zavisnosti od korišćene specifične ESC linije, dana sakupljanja hemangioblasta, i broja hemangioblasta nanetih na Matrigel. U nekim eksperimentima, markeri dostižu do 90% ćelija do 7-14 dana, dok su drugim eksperimentima, može da prođe 22-24 dana kako bi ove mnoge ćelije stekle ove MSC markere.
[0227] Povezano sa gornjim eksperimentima, FIG.1 pokazuje generisanje FM-MA09-MSC iz pluripotentnih ćelija, i mikroskopski izgled generisanja mezenhimalnih stromalnih ćelija iz ESCs putem hemangioblasta. Dodatno, FIG.2 sadrži fenotip FM-MA09-MSC dobijen iz iz pluropotentnih ćelijaizvedenih hemangioblasta proizvedeni kako je gore opisano. Ovaj crtež pokazuje procenat ćelija pozitivnih na MSC površinske markere u inicijalnoj populaciji hemangioblasta (leva strana grafikona, dan 7-11 hemangioblasta) i nakon uzgajanja hemangioblasta na Matrigelom obloženim pločama (desna strana grafikona) i mikroskopski izgled mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz hemangioblasta (desni panel fotografije). Takođe, povezano sa gornjim eksperimentima FIG.17 prikazuje postupak FM-MA09-MSC generisanja; i efekte Matrigela, tj., da uklanjanje ćelija iz Matrigela u ranom prolazu (tj, p2) može privremeno usporiti MSC rast u poređenju sa onim održavanim na Matrigelu do p6.
[0228] FIG.18 dalje pokazuje da dobijene BM-MSCs i FM-MA09-MSCs prolaze hondrogenezu.
Primer 2 - Poređenje diferencijacije ESCs i MSC-izvedenih hemangioblasta.
[0229] Ovaj primer opisuje poređenje diferencijacije ESCs u MSCs putem dva postupka: ili direktna diferencijacija (u kojoj se ESCs direktno nanose na želatin ili Matrigel) ili hemangioblastni postupak (u kojem se ESCs prvo diferenciraju u hemangioblaste, a zatim nanose na Matrigel, kako je opisano u Primeru 1). Direktna diferencijacija na želatinu daje porast ćelijama nalik MSC, ali tim ćelijama nedostaje CD105 ekspresija, što ukazuje na nepotpuno usvajanje MSC sudbine (FIG.3, levi panel). Kada se ESCs nanose direktno na Matrigel, dobijene ćelije eksprimiraju CD105 kako je očekivano za MSCs (FIG.3, srednji panel). Međutim, u poređenju sa MSCs proizvedenim hemangioblastnim postupkom, direktno diferencirane MSCs ćelije koje su više zgrušane, teže se disperguju pri cepanju, i ne generišu nu približno onoliko MSCs kada počinju iz ekvivalentnih brojeva ESCs (FIG.4).
[0230] Kod MSCs diferenciranih direktno iz ESCs takođe je potrebno duže vreme da se stekne karakteristika MSC ćelijskih površinskih markera (FIG.5). Kada su MSCs dobijene, proširena imunofenotipizacija pokazuje da su MSCs iz oba postupka pozitivne na drugi markeri tipično pronađene kod MSCs, kao što su HLA-ABC, a one negativne na hematopoieza-povezane markeri kao što su CD34 i CD45 (FIG.6). Ovi rezultati sugerišu da upotreba hemangioblast-posredovanog stanja omogućava robustnu proizvodnju homogenih MSCs iz ESCs. Uzimajući u obzir ova saznanja, sprovedena su dodatna ispitivanja na MSCs sa hemangioblast-izvedenim MSCs.
[0231] Dodatno, eksperimenti čiji su rezultati sadržani na FIG.3-6, 13, 15, 16, 19, i 21-27 (opisani ispod) porede različite osobine ESC-MSCs ili BM-MSCs naspram hemangioblast-izvedenih MSC's i otkrivaju da ove ćelije ispoljavaju značajne razlike koje mogu da utiču na terapeutsku efikasnost ovih ćelija i kombinacija dobijenih od njih. Naročito, FIG.3 pokazuje procenat ćelija pozitivnih na MSC površinske markere nakon uzgajanja humanih embrionskih matičnih ćelija (ESC) na želatinom obloženim pločama (levi panel), ESC na Matrigelom obloženim pločama (srednji panel), i hemangioblasta na Matrigelom obloženim pločama (desni panel). Dodatno, FIG.4 pokazuje MSC prinos iz pluripotentnih ćelija, FIG.5 prikazuje dobijanje markera mezenhimalnih stromalnih ćelija, i FIG.6 pokazuje fenotipove mezenhimalnih stromalnih ćelija izvedenih iz različitih postupaka uzgajanja, koji uključuju ekspresiju MSC markera i manjak ekspresije hematopoieze i endotelijalnih markera. Dalje, FM-MA09-MSCs su ispitane radi detektovanja značajnih razlika (u odnosu na BM-MSCs) u potenciji i inhibitornim efektima (FIG.13), stimulaciji Treg ekspanzije (FIG.15), proliferativnom kapacitetu (FIG.16), PGE2 lučenju (FIG.
19), Stro-1 i CD10 ekspresiji (FIG.21-22), održavanju velične tokom prolaženja (FIG.23), CD10 i CD24 ekspresije (FIG.24), Aire-1 i IL-11 ekspresije (FIG.25), Ang-1 i CXCL1 ekspresije (FIG.26), i i IL6 i VEGF ekspresije (FIG.27).
Primer 3 - MSCs Izvedene iz hemangioblasta diferenciraju se u druge ćelijske tipove.
1
[0232] MSCs, po definiciji, trebalo bi da daju porast adipocitima, osteocitima, i hondrocitima.
Upotrebom standardnih postupaka, FIG.7 pokazuje sposobnost hemangioblast-izvedenih MSCs da se diferenciraju u adipocite i osteocite, dok FIG.8 pokazuje njihov potencijal da se diferenciraju u smeru hondrocita putem ekspresije hondrocit-specifičnih gena, a FIG.18 pokazuje njihov potencijal da se diferenciraju u smeru hondrocita putem safranin O bojenja peleta masovne kulture.
[0233] Očekuje se da se MSCs izvedene iz hemangioblasta diferenciraju u adipocite, osteocite, i hondrocite. Ove diferencijacione putanje mogu biti ispitane upotrebom postupaka koji su prethodno prijavljeni u struci. Videti Karlsson et al, Stem Cell Research 3: 39-50 (2009) (za diferencijaciju hemangioblast-izvedenih i direktno ESC-izvedenih MSCs u adipocite i osteocite). Naročito, FM-MA09-MSC prikazuju diferencijacione sposobnosti koje uključuju sposobnost da se diferenciraju u adipocite i osteocite (FIG.7). Za hondrocitnu diferencijaciju, postupci su prilagođeni iz iz Gong et al, J. Cell. Physiol.
224: 664-671 (2010) radi ispitivanja ovog postupka i nastavljeno je na ispitivanje dobijanja hondrocit specifičnih gena, (npr., Agrekan i Kolagen IIa) kao i glikozaminoglikan deponovanja putem safranin O, alcian plavo, i/ili toluen plavo bojenja. Naročito, hondrogena diferencijacija MA09 ESC hemangioblastizvedenih mezenhimalnih stromalnih ćelija primećena je putem mRNK ekspresije Agrekana (hondroitin proteoglikan sulfat 1) i Kolagen IIa (FIG.8). U literaturi je prijavljeno da ni jedan od ova tri ćelijska tipa, adipociti, osteociti, ili hondrociti izvedenih iz MSCs neće eksprimirati imunostimulatorni HLA DR molekul (Le Blanc 2003, Gotherstrom 2004, Liu 2006). Imunobojenje i/ili protočna citometrija izvodi se na ovim potpuno diferenciranim MSC ćelijskim tipovima kako bi se potvrdilo ova primećena zapažanja. To je značajno za potvrđivanja da diferencijacija MSCs u in vivo okruženju neće indukovati imuni odgovor domaćina primaoca. Od ova tri ćelijska tipa, hondrogena diferencijacija može biti od posebnog značaja zbog njenog potencijala da se koristi u terapiji zamene hrskavice kod sportskih povreda, bola usled starenja zglobova, osteoartritisa, itd. Za takve terapije, MSCs ne moraju potpuno biti diferencirane u hondrocite kako bi se koristile terapeutski.
Primer 4 - Potvrda da su MSCs Izvedene iz hemangioblasta suštinski bez ESCs
[0234] MSCs takođe bi trebalo da budu lišene ESC sklonosti da obrazuju teratome. Potvrđeno je da MSCs sadrže normalne kariotipove (podaci nisu prikazani) kroz prolaz 12 (∼50 dana u kulturi). Kako bi se potvrdilo da blast-izvedene MSCs ne sadrže količine traga ESCs, izvedeni su ogledi obrazovanja teratoma na NOD/SCID miševima.5 x 10<6>MSCs injektuje se subkutano u mišić leve butine 3 miša. CT2 ECs su korišćene kao pozitivne kontrole i a miševi su praćeni tokom perioda od 6 nedelja radi poređenja obrazovanja teratoma u MSC naspram ESCC-injektovanim miševima. Ni jedan teratom nije obrazovan kod miševa kojima su injektovane MSCs.
2
Primer 5 - Smanjenje EAE ocene MSCs izvedenim iz hemangioblasta.
[0235] Sprovedeno je pilot ispitivanje za lečenje eksperimentalnog autoimunog encefalolomijelitisa (EAE) kod 6-8 nedelja C57BL/6 miševa sa hemangioblast-izvedenim ESC-MSCs. EAE je indukovan s.c. injekcijom u bokove miševa na dan 0 sa 100 pL emulzije 50 pg MOG(35-55) peptida i 250 pg M. tuberculosis u adjuvansnom ulju (CFA), a miševima je takođe i.p. injektovano 500 ng pertuzijskog toksina. Šest dana kasnije, miševima je i.p. injektovan ili jedan milion ESC-MSCs u PBS (n = 3) ili vozilo kao kontrola (n = 4). Kliničke ocene životinja beležene su tokom 29 dana nakon imunizacije. Primećeno je zapanjujuće smanjenje ocena bolesti (podaci nisu prikazani).
Primer 6 - Potvrda efikasnosti hemangioblast-izvedenih ESC-MSCs u EAE lečenju i upotreba dodatnih životinjskih modela bolesti
A. Ispitivanje ESC-MSCs na EAE modeli kod miševa potvrđuje njihov anti-EAE efekat.
[0236] Kako bi se potvrdili rezultati dobijeni u Primeru 5, dodatni ispitivanja su sprovedena sa većim brojem životinja, promenjljivim dozama ćelija, različitim protokolima davanja, i više kontrola. Klinička ocena i stopa smrtnosti su beleženi. Stepen limfocitne infiltracije u mozgu i kičmenoj moždini miševa takođe je procenjena. Uopšteno smatra se da MSC anti-EAE efekti uključuju imunosupresivne aktivnosti kao što su suzbijanje Th17 ćelija i može se očekivati da smanjuju stepen limfocitne infiltracije u CNS.
B. Poređenje ESC-MSCs sa mišjim iz koštane srži (BM)-MSCs, humanim BM-MSCs i humanim UCB-MSCs.
[0237] Mišje BM-MSCs prve su primenjene za EAE lečenje i i detaljno su ispitane [1]. ESC-MSCs (uzimajući u obzir njihovu ksenogenu prirodu) mogu se direktno porediti sa mišjim BM-MSCs na anti-EAE efikasnost. Humane UCB-MSCs su se pokazale da takođe poseduju imunosupresivnu aktivnost [19]. Anti-EAE aktivnost humanih UCB-MSCs i humanih BM-MSCs takođe se može porediti sa onom kod ESC-MSCs u EAE mišjim modelima. Starost ili broj prolaza ovih različitih ćelijskih tipova može da utiče na njihovo anti-EAE ponašanje, zbog čega se takođe procenjuju posledice starosti na efikasnost MSCs u sistemu EAE mišjeg modela.
C. Optimizovanje doze davanja, puta, i tajmniga za ESC-MSCs.
[0238] Injekcija ESC-MSCs može smanjiti ocene EAE kako je zabeleženo unutar 29 dana nakon imunizacije. Da bi se ispitala dugoročna prevencija i izlečenje bolesti, ESC-MSCs se mogu davati u različitim dozama, putevima, i količinama.
[0239] MSCs su generisane iz H1gfp ESCs i potvrđeno je da one još uvek eksprimiraju GFP u MSC stanju. EAE miševima se mogu injektovati ove GFP+ ESC-MSCs, a njihove distribucije se mogu pratiti in vivo upotrebom Xenogen In Vivo Imaging Sistem. Ovim pristupima, analiziraće se različite doze davanja, putevi, i tajming ESC-MSCs, čime će se obezbediti informacija o mehanizmu aktivnosti za MSCs anti-EAE aktivnost (tj, parakrine ili endokrine efekte), dugovečnost MSCs unutar miševa i MSC biodistribucija i putevi eliminisanja/klirensa.
[0240] Anti-EAE efekti mogu se ogledati jednim ili više redukovanih kliničkih ocena, povećanim preživljavanjem, i/ili oslabljenom limfocitnom infiltracijom i demijelinacijom CNS. Različite ESC linije mogu imati različite unutrašnje osobine da generišu MSCs. Prema tome, više ESC linija mogu se primeniti u ovom ispitivanju, a dobijanje MSC markera može se pratiti tokom vremena i porediti za svaku ESC liniju. Da bi se dalje smanjile varijacije između eksperimenata sa ESC-MSCs, velika količina zamrznutih ESC-MSCs može se pripremiti u alikvotima, a svaka količina alikvota može se primeniti u više eksperimenata.
D. Potvrđivanje efikasnosti hemangioblast-izvedenih MSCs u drugim modelima bolesti.
[0241] Kao je prethodno pomenuto, MSCs takođe mogu da imaju terapeutsku aktivnost protiv drugi tipova autoimunih poremećaja kao što su Kronova bolest, ulcerativni kolitis, i očni-poremećaj, uveitis. Životinjski modeli ovih bolesti postoje i dovro su poznati u struci (videti, npr., Pizarro et al 2003, Duijvestein et al 2011, Liang et al 2011, Copland. et al 2008). In vivo ispitivanja mogu se proširiti da uključe procenu MSC terapeutske upotrebljivosti jednom ili više sistema životinjskih modela. Takvi modeli mogu da omoguće ispitivanje profila lučenja citokina humanih MSCs izolovanjem i skriningom seruma injektovanih životinja na humane citokine. Naročito, uveitis model može biti koristan kako lokalna intravitealna injekcija može da omogući ispitivanje efekata MSCs u ne-sistemskom okruženju.
[0242] MSCs mogu takođe da imaju veliku terapeutsku upotrebljivost u tretiranju osteoartritičnih stanja, koja uključuju ona koja uključuju gubitak zglobne hrskavice i zapaljenje pogođenih zglobova (Noth et al, 2008). Modeli za ispitivanje osteoartritisa, gubitka hrskavice i zapaljenje zglobova dobro su poznati u struci (videti, npr., Mobasheri et al 2009). U nekim od ovih ispitivanja, humane BM-MSCs su enkapsulirane u polu-čvrste skele ili mikrosfere i transplantirane u pogođeni zglob humanih subjekata kako bi se odredilo da li MSCs imaju lokalni, ne-sistemski terapeutski efekat u smislu redukovanja zapaljenje i/ili povraćaja hrskavice (Wakitani et al 2002). Takvi postupci pomažu u određivanju terapeutske upotrebljivosti iz ESC heamngioblasta-izvedenih MSCs za lečenje stanja degenerativnih zgloboda.
[0243] Životni vek injektovanih MSCs je veoma kratak [8], što pokazuje da nije potrebno dugoročno preživljavanje transplantiranih ćelija. Na taj način, mitotički-inaktivirane ESC-MSCs (npr., ozračene ili
4
tretirane mitomicinom C) takođe se mogu ispititati na anti-EAE efekat ili efekat protiv neke druge bolesti u prethodno pomenutim životinjskim modelima. Ako je tako, žive ESC-MSCs ne moraju biti neophodne, čime se i dalje snižava biobezbednosnu brigz prema potencijalnim zaostalom ESC kontaminaciju u transplantiranim ESC-MSCs.
E. Rezultati
[0244] MSCs iz ivora različitih donora (mišje BM-MSCs, humane BM-MSCs i humane UCB-MSCs) smatra se da pobeđuju anti-EAE efekte. Međutim, njihovi efekti mogu da variraju između eksperimenata kako i MSCs iz donor-ograničenih izvora. Sa druge strane, ESC-MSCs ovog pronalaska mogu imati konzistentnije efekte. Budući da se mnogi ćelijski površinski markeri koriste da okarakterišu MSCs, a da svaka MSC ne eksprimira sve markere, podskup markera, npr., CD73+ i CD45- može se primeniti u cilju poređenja efikasnost MSCs iz različitih izvora.
[0245] Smatra se da ESC-MSCs imaju terapeutsku upotrebljivost na životinjskim modelima Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa, i uveitisa budući da sadrže autoimune komponente i zapaljenske reakcije.
[0246] Mitotički inaktivirane MSCs (npr. ozračene ili mitomicin C inaktivirane MSCs ili ESC-MSCs) mogu da zadrže, najmanje delimično, imunosupresivnu funkciju kako i dalje luče citokine i eksprimiraju ćelijske površinske markere koji su povezani za tu funkciju [29]. Međutim, njihov efekat može biti smanjen zbog njihovog skraćenog životnog veka in vivo. Ukoliko je tako, doza ozračenih ili drugih mitotički inakiviranih ćelija i frekvencija davanja mogu se povećati radi ojačavanja imunosupresivne funkcije. Mitotički inaktivirane MSCs i ESC-MSCs mogu da zadrže, najmanje delimično, imunosupresivnu funkciju kako i dalje luče citokine i eksprimiraju ćelijske površinske markere koji su povezani za tu funkciju [29].
Međutim, njihov efekat može biti smanjen zbog njihovog skraćenog životnog veka in vivo. Ukoliko je tako, doza mitotički inaktiviranih ćelija i frekvencija davanja mogu se povećati radi ojačavanja imunosupresivne funkcije.
[0247] Sprovedeno je i drugo pilot ispitivanje za lečenje EAE. Osam do deset nedelja stari C57BL/6 miševi imunizovani su sa MOG35-55 peptidom u kompletnom Frojndovom adjuvansu putem subQ injekcije. To je izvedeno u konjukciji sa intraperitonealnom injekcijom pertuzijskog toksina. Šest dana kasnije, 1 milion živih (ili 2 miliona ozračenih) hemangioblast-izvedene pluropotentne ćelijemezenhimalnih stromalnih ćelija injektovane su intraperitonealno po mišu. Težina bolesti ocenjena je na skali 0-5 praćenjem pomeranja mišjih udova/tela, kako je prethodno objavljeno. Rezultati pokazuju značajno smanjenje u kliničkoj oceni u poređenju sa kontrolnim vozilom sa hemangioblast-izvedene pluropotentne ćelije-mezenhimalnim stromalnim ćelijama pri prolazu 4 i ozračenim hemangioblastizvedene pluropotentne ćelije-mezenhimalnim stromalnim ćelijama (podaci nisu prikazani). Ocenjivanje za oba pilot ispitivanja izvedena su prema seldećem protokolu: ocena 1 indikuje opušten rep, 2 indikuje delimičnu paralizu zadnjih nogu, 3 potpunu paralizu zadnjih nogu, 4 potpunu paralizu zadnjih i delimičnu paralizu prednjih nogu, 5 stanje na samrti.
[0248] Dodatno, efikasnost MSC's prema ovom pronalasku i proizvodi koji se mogu dobiti od njih za upotrebu u različitim terapijama mogu biti potvrđene u drugim životinjskim modelima, npr., drugi transplantacioni ili autoimuni modeli u zavisnosti od razmatrane terapeutske indikacije.
Primer 7 – Ispitivanje funckonalnih komponenti ESC-MSCs
[0249] MSCs mogu biti definisane kao plastične adherentne ćelije koje eksprimiraju sledeće ćelijski površinske markere: CD105, CD73, CD29, CD90, CD166, CD44, CD13, i HLA-klasa I (ABC) dok su istovremeno negativne na CD34, CD45, CD14, CD19, CD11b, CD79a i CD31 kada su uzgajane u neindukovanim uslovima (npr. kultura u regularnom αMEM+20%FCS bez citokina). Pod ovim uslovima, one moraju da eksprimiraju unutarćelijski HLA-G i da budu negativne na CD40 i HLA klasa II (DR).
Funkcionalno, takve ćelije takođe mnoraju da budu sposobne da se diferenciraju u adipocite, osteocite, i hondrocite kako je procenjeno standardnim in vitro ogledima kulture. Nakon 7 dana stimulacije sa interferon gama (IFNγ), MSCs bi trebalo da eksprimiraju HLA-G na svojoj ćelijskoj površini kao i CD40 i HLA-klasa II (DR) na svojoj ćelijskoj površini. I pored ovih zahteva, MSCs izvedene iz bilo kog izvora mogu dasadrže neku heterogenost, a zbog pluripotencije ESCs moguće je da MSC kulture izvedene iz ESCs mogu da sadrže ćelije bilo koje linije iz slojeva triju klica. Dok ovde opisani sistem kultivisanja indukuje da >90% ćelija rutinski pokazuje prethodno pomenuti imunofenotip i funkcionalne karakteristike, mala podpopulacija(e) ćelija unutar MSC kulture mogu da postoje kojima nedostaje ekspresija jednog ili više MSC ćelijski površinskih markera ili eksprimiraju jedan ili više markera koji bi trebalo da su odsutni. Obim ovakve podpopulacije unutar predmetne MSC kulture biće ispitan radi određivanja stepena kontaminišuće heterogenosti. Višebojna protočna citometrija (8+ boja simultano) može se izvesti na BD LSR II protočnom citometru u cilju određivanja preklapanja između gore pomenutih markera. Ovo takođe može da pomogne da se precizno odredi tačan profil ćelijsko površinskih markera koji je potreban za najveću imunosupresivnu aktivnost.
A. Karakterizacija diferencijacionog stanja, podpopulacija, i aktivacionog statusa ESC-MSCs u odnosu na njihove imunosupresivne efekte.
[0250] Postoji veliki vremenski prozor (npr., najmanje od dana 14 do 28 u MSC diferencijacionoj podlozi) za sakupljanje ESC-MSCs (videti, npr., FIG.1). Nekoliko ispitivanja je ukazalo da MSCs teže da izgube svoje imunosupresivne funkcije i mogu biološki da ostare kako kontinulano prolaze i ostare tokom dužih perioda kultivisanja. Kao takve, ćelije se mogu sakupiti u različitim vremenskim tačkama aktivnosti u cilju određivanja da li specifičan broj dana u MSC podlozi obezbeđuje veću imunosupresivnu aktivnost. Zaista, MSCs sakupljene u ranoj vremenskoj tački (npr., 14 dana u MSC uslovima kulture) mogu da sadrže pekursor ćelije koje još uvek nisu u potpunosti stekle sve od karakterističnih MSC ćelijski površinskih markera, ali koje su primile veoma potentne imunosupresivne efekte. Kako bi se definisale potencijalno koristne MSC pekursor populacije, ekspresija širokog spektra ćelijski površinskih markera praćeni su putem postupka MSC diferencijacije, od dana 7 do dana 28. Primećeno je da najmanje 50% kulture stiče ćelijski površinski marker CD309 (drugi nazivi uključuju VEGFR2, KDR) unutar 14 dana od MSC uslova kulture. CD309 je u velikoj meri odsutan kod početne hemangioblast populacije (FIG.9, prva vremenska tačka, MA09 hemangioblasti sakupljeni na d7 i 8), ali raste unutar prve dve nedelja MSC uslova kulture, a zatim opada ponovo na manje od 5% ćelija do dana 28 (FIG.9, druga, treća, i četvrta vremenska tačka). Pronađeno je da se ovaj obrazac javlja ne samo sa MA09 hemangioblast-izvedenim MSCs već i sa onim iz MA01, H1gfp, i H7 ESCs. U ovim eksperimentima, hemangioblasti su rutinski negativni (manje od 5% ćelija pozitivnih na boju) na CD309 bez obzira na datum njihovog sakupljanja (dan 6-14). Međutim, procenat razvoja MSCs koje su stekle CD309 ekspresiju može se smanjiti kada se razvijaju iz starijih hemangioblasta (npr., d10 ili d12 blasti). Na sličan način, primećeno je da se ekspanzione osobine hemangioblast-izvedenih MSCs mogu razlikovati u zavisnosti od datuma sakupljanja hemangioblasta. MSCs koje se razvijaju iz mlađih hemangioblasta (dan 6 ili 7) ne nastavljaju da se šire tako robustno kao MSCs koje se razvijaju iz starijih (d8-12) hemangioblasta. Optimalan datum sakupljanja hemangioblasta može biti onaj između (dan 8-10) budući da tada može da se omogući adekvatno dobijanje CD309 kao surogat markera MSC razvoja uz dalje održavanje robustne sposobnosti da se prošire do dana 28 i kasnije. Ovaj rad je u toku kako bi se optimizovali ovi aspekti MSC pekursorskog razvoja.
[0251] Pored CD105, CD90 i CD73 koji su potvrđeni najuobičajeniji markeri za MSCs (kako je označeno od strane Međunardnog udruženja za ćelijsku terapiju kao minimalna klasifikacija MSCs (Dominici et al., Citotherapy 8 (4): 315-317 (2006)), mnogi drugi ćelijski površinski molekuli koji nisu prethodno pomenuti kao što su CD49a, CD54, CD80, CD86, CD271, VCAM, i ICAM takođe su predloženi ili korišćeni kao MSC markeri [22]. Prema tome, moguće je da ESC-MSCs mogu da sadrže podpopulacije koje eksprimiraju različite kombinacije drugih markera tokom diferencijacije iz hemangioblasta, koji poseduju promenjljive imunosupresivne aktivnosti. Podpopulacije mogu biti sortirane (npr., upotrebom FACS) na osnovu jednog ili više markera (pojedinačno ili u kombinaciji) za analizu radi poređenja njihove imunosupresivne aktivnost upotrebom in vitro ili in vivo postupaka.
B. Optimizovanje sulova diferencijacije i ekspanzije radi dobijanja velikih količina funkcionalnih ESC-MSCs.
[0252] Dok su preliminarno eksperimenti pokazali da se MSCs mogu održavati u IMDM 10% toplotominaktiviranom humanom serumu, pronalazači još uvek nisu testirali njihovo deljenje u ovoj podlozi. Različiti uslovi kulture mogu se testirati za određivanje da li supstituišuće komponente kulture (npr. osnovna podloga, serum izvora, proizvodi za zamenu seruma, trombocitni lizat humanog seruma) mogu da obogate efektivne podpopulacije koje su ovde opisane. Biće procenjene različite osnovne podloge koje uključuju sistem kulture bez životinjskog porekla i definisane kulture (bez FBS) u kulturi ESCs i priprema MSCs. Specifično, StemPro® MSC SFM iz Invitrogena i MSCM bullet komplet od Lonza korišćeni su za ispitivanje da li sistem definisane kulture bez seruma sistem može da generiše ESC-MSCs željenog kvaliteta i kvantiteta. Takođe, za osnaživanje kvaliteta i kvantiteta ESC-MSCs, mogu se primeniti različiti faktori rasta kao što su FGFs, PDGF, i TGFI3, kao i male hemikalije koje regulišu signalne putanje ili ćelijske strukture.
C. Rezultati
[0253] ESC-MSCs eksprimiraju uobičajene markere CD73 (ekto-5'-nukleotidaza [26]), CD90 i CD105. Takođe, FIG.20 pokazuje da FM-MA09-MSCs proizvedene prema ovom pronalasku održavaju svoj fenotip tokom vremena (na bazi ekspresije markera primećene tokom analize protočne citometrije različitih MSC populacija tokom vremena i sukcesivnim prolaženjem).
Primer 8 - Mehanizam imunosuzbijanja putem ESC-MSCs
A. Ispitivanje kako ESC-MSCs mogu da suzbiju adaptivne imune odgovore posredovan T ćelijama.
[0254] Opšti odgovor T ćelija unutar PBMC je da se proliferišu kada su indukovane mitotičnim stimulatorima kao što su fitohemaglutinin (PHA) ili forbol miristat acetat (PMA)/jonomicin ili kada naiđu na ćelije koje predstavljaju antigen (APCs) kao što su dendritske ćelije. Ovo je najbolje predstavljeno opštom proliferacijom CD4+ i CD8+ T ćelija u ogledu mešane leukocitne rekacije (MLR). Pre ispitivanja indikovano je da MSCs mogu da suzbijaju T-ćelijsku proliferaciju u MLR ogledu.
[0255] Ispitana je sposobnost predmetnih ESC-hemangioblast izvedenih MSCs da inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju izazvanu ili hemijskom stimulacijom (PMA/jonomicin, FIG.10a i 13a) (PHA, FIG.13b) ili izlaganjem APCs (dendritske ćelije, FIG.10b i 13c). Primećeno je da MSCs slabe proliferativni odgovor T ćelija ili zbog hemijske stimulacije ili zajedničke kulture sa APCs i da se da suzbijunje javlja na dozno zavisan način (FIG.10b, grafikon na desnoj strani) Šta više, pronađeno je da su mitotički inaktivirane MSCs (FIG.10b) sposobne da suzbiju T-ćelijsku proliferaciju do ekvivalentnog stepena kao i žive MSCs, što ukazuje da mitotički inaktivirane MSCs zaista mogu biti korisne in vivo za imunosuzbijanje.
[0256] Postoje različiti funkcionalni podskupovi T ćelija i oni izvode specifične uloge u prozapaljenskim odgovorima, anti-zapaljenskim odgovorima, ili indukciji T ćelijske anergije. Regulatorne T ćelije (Tregs) mogu se smatratiprirodno javljajućim imunosupresivnim T ćelijama i u normalnim uslovima, sposobne su za slabljenje hipersenzitivnih auto-reaktivnih T ćelijskih odgovora. Obilno su prisutne samo u malim proporcijama telesnih T ćelija, ali se na njihovu prevalencu može uticati različitim faktorima okruženja. MSCs su se pokazale da indukuju perifere tolerance indukovanjem Treg ćelija [33-35].
[0257] U kratkom, 5 dnevnom ogledu zajedničke kulture, pronađeno je da su, kao i pre ispitivanja, hemangioblast-izvedene MSCs sposobne da povećaju procenat CD4/CD25 dvostruko pozitivnih Tregs koje su indukovane u odgovoru na IL2 stimulus (FIG.11a, 14, 15a). Zajednička kultura mešane T ćelijske populacije iz ne-adherentnih mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) sa MSCs (pri odnosu od 10 PBMCs:1 MSC) pokazuje da se Treg indukcija skoro udvostručila kada su MSCs uključene u IL2 indukovanu kulturu. Ovaj stepen Treg indukcije sličan je onom primećenom u citiranom Aggarwal et al ispitivanju objvaljenom u Blood, 2005. Količina FoxP3 indukovana unutar CD4/CD25 dvostruko pozitivne populacije ispitano je kako bi se potvrdilo da su one zaista prave Tregs (FIG.15b). Unutarćelijska protočna citometrija, korišćena je za ispitivanje FoxP3 indukcije u odsustvu i prisustvu MSCs u IL2-indukovanoj T ćelijskoj kulturi. I ne-adherentne PBMCs i prečišćene CD4+ T ćelijske populacije mogu se primeniti za ispitivanje Treg indukcije kod ovih ogleda. Bez namere da se ograniči bilo kojom teorijom, smatra se da su ES-MSC efektivnije pri indukovanju Tregs zbog povećane ekspresije CD25 efikasnije od BM-MSCs (FIG.15b)
[0258] Smatra se da Th1 i Th17 ćelije igraju značajne uloge u MS i drugim autoimunim bolestima.
Diferencijacija i funkcija Th1 i Th17 CD4+ T ćelija biće prvo analizirane, a pre svega upotrebom in vitro ogleda; one se takođe mogu ispitati u EAE modelu ili se mogu uključiti drugi životinjski modeli. Započeta su ispitivanja efekata MSCs na Th1 indukovanje in vitro. Uslovi kulture koji promovišu Th1 specifikaciju iz naivnih CD4+ T ćelija poznati su u struci (Aggarwal et al). Ovih uslovi kulture (koji uključuju anti-CD3, anti-CD28, i anti-CD4 antitela zajedno sa humanim IL3 i IL12) upolseni su da indukuju Th1 ćelije iz naivnih, ne-adherentnih PBMCs u odsustvu ili prisustvu MSCs (10 PBMCs: 1 MSC). Nakon 48 sati zajedničke kulture, ne-adherentne ćelije su izolovane, isprane, i stimulisane sa PMA/jonomicin tokom 16 sati u novom bazenčiću. Nakon 16 sati indukcije, supernantanti su sakupljeni i analizirani na lučenje Th1 citokina, IFNγ. Kao što je predviđeno, pronađeno je da PBMCs uzgajane sa MSCs u uslovima 48 časovnog Th1 indukovanja ne proizvode toliko IFNγ kao one uzgajane bez MSCs. Ovo ukazuje da MSCs mogu da suzbiju glavnu Th1 ćelijsku funkciju, tj., IFNγ lučenje. (FIG.11b) Slična ispitivanja izvode se diferenciranjem Th17 ćelija in vitro i određivanjem efekata MSCs na pro-zapaljensko IL17 lučenje upotrebom ELISA ogleda na suprenatantima kulture.
[0259] Th2 ćelije poznate su da luče citokine koji imaju anti-zapaljenske efekte, kao što su IL4. MSCs mogu ojačati Th2 diferencijaciju i lučenje IL4. Slično eksperimentima opisanim gore za Th1 ćelije, uslovi Th2 indukovanja koristiće se u sistemu 48 časovnog kultivisanja radi stimulisanja Th2 diferencijacije iz naivnih PBMC koje sadrže T ćelije. Efekti MSC zajedničke kulture na IL4 lučenje biće ispitane upotrebom ELISA ogleda.
[0260] Nedavno, ispitivanja su sugerisala da CD8 T ćelije takođe igraju ključnu ulogu u EAE modelima i da leže ispod mehanizma MS [30]. Pronalazač je ispitao da li zajednička kultura sa ESC-MSCs in vitro može da utiče na funkciju CD8 T ćelija. Da bi se to izvelo, ne-adherentne PBMCs ili prečišćene CD8+ T ćelije izložene su EAE-povezanom MBP110-118 peptidu upotrebom APCs. To izaziva pojavljivanje antigen-specifične CD8+ T ćelijske populacije, a takva populacija može se proširit upotrebom CD3/CD28 ekspander perli (Invitrogen). Postojanje angiten-specifičnih CD8+ T ćelija može se potvrditi upotrebom pentamer reagenasa specifičnih za MBP-peptid (Proimunim) u protočnoj citometriji. Re-stimulacija sa MBP110-118-uvedenim APCs izvodi se u cilju da indukuje antigen specifični imuni odgovor, koji uključuje i ekspanziju antigen-specifičnih CD8+ T ćelija i lučenje IFNγ. Odgovor T ćelija uzgajanih u odsustvu ili prisustvu MSCs poredi se radi određivanja da MSCs mogu da suzbiju indukciju ovih citotoksičnih EAE-povezanih antigen specifičnih T ćelija. Pentamer specifična protočna citometrija, BrdU inkorporacija, i ELISA ogledi uposleni su u ove svrhe.
B. Određivanje da li zapaljenski faktori i inter-ćelijski adhezioni molekuli (ICAMs) doprinose imunosupresivnom efektu ESC-MSCs.
[0261] Pokazano je da su TGFbeta, PGE2, IDO, azotni oksid (NO), i ICAMs značajni za imunosupresivnu funkciju MSCs [7]. Lučenje ovih molekula i ekspresija ICAMs by ESC-MSCs ispituje se upotrebom ELISA ogleda i protočne citometrije.
[0262] Pokazano je da je pro-zapaljenski citokin, IFNγ potreban za aktivaciju MSCs [23], a različiti agonisti za tolični receptori (TLRs) kao što su LPS i poli(I:C) mogu da indukuju različite podskupove MSCs [24]. Na primer, nedavno je pokazano da IFNγ-aktivirane MSCs imaju veću terapeutsku efikasnost u mišjem modelu kolitisa u odnosu na netretirane MSCs (Duijvestein et al 2011). Započeta su ispitivanja efektata IFNγ na MSC osobine. ESC-MSCs su tretirane in vitro sa IFNγ tokom do sedam dana i dobijene su značajne promene u ekspresiji ćelijsko površinskog markera. Ova saznanja konzistentna su sa zapažanjima prethodnih ispitivanja (Gdrugistrom et al 2004, Rasmusson et al 2006, Newman et al 2009) i potvrđuju da iz hemangionblasta izvedene ESC-MSCs funkcionišu slično kao MSCs izolovane iz tela. Na primer, u stanju mirovanja, MSCs tipično ne eksprimiraju mnogo (<10%) HLA G na svojoj ćelijskoj površini dok primaju unutarćelijske zalihe ove specijalne klase imunotolerantog HLA markera. Nakon 7 dana IFNγ lečenja, HLA G mogu se lako primetiti na ćelijskoj površini (FIG.12) i takođe mogu biti indukovane da se luče (još uvek nije testirano). Dodatno, IFNγ lečenje izaziva ushodnu regulaciju CD40 ekspresije i HLA DR ekspresiju na ćelijskoj površini (FIG.12). Smatra se da ove promene ojačavaju njihove imunosupresivne efekte. Na primer, izvedeno je određivanje da li predtretiranje MSCs sa IFNγ ojačava njihovu sposobnost da indukuju Treg populacije, da suzbiju Th1 lučenje IFNγ, ili da ojačaju IL4 lučenje iz Th2 ćelija upotrebom in vitro ogleda zajedničke kulture koji je prethodno opisan. IFNγ mogu takođe da utiču na sposobnost MSCs da inhibiraju opštu T-ćelijsku proliferaciju u MLR ogledima. Efekti TNFα, LPS, i/ili poli I:C na ovim tipovima MSC imunosupresivnih osobina takođe se mogu testirati.
C. Rezultati
[0263] Pokazano je da CD4/CD25 dvostruko pozitivna populacija Tregs indukovanih putem MSCs takođe eksprimiraju faktor transkripcije, FoxP3 budući da je prijavljeno da funkcionalne Tregs ushodno regulišu njihovu ekspresiju u odgovoru na indukujuće stimuluse (FIG 15b).
[0264] Očekivano je da MSCs inhibiraju, do neke mere, pro-zapaljensko lučenje IL17 od strane Th17 ćelija i da MSCs takođe može značajno da ojača IL4 lučenje od strane anti-zapaljenskih Th2 ćelija. Takva zapažanja izvedena du u prethodnom ispitivanju i učestvuju u potvrđivanju stvarne funkcionalnosti hemangioblast-izvedenih MSCs.
[0265] ESC-MSCs bi trebalo da inhibiraju najmanje delimično antigen-indukovanu aktivaciju CD8+ T ćelija. Funkcija NK ćelija, makrofaga, i dendritskih ćelija nakon ESC-MSC zajedničke kulture takođe može biti ispitana. Biće ispitani efekti ESC-MSCs na sazrevanje, citotoksičnost, i/ili proizvodnju specifičnih citokina ovim drugim tipovima imunih ćelija.
[0266] Na primer, eksperimenti u FIG.11A pokazuju da hemangioblast-izvedene mezenhimalne stromalne ćelije povećavaju procenat CD4/CD25 dvostruko pozitivnih Tregs koje su indukovane u odgovoru na IL2 stimulus. Takođe, eksperimenti sa FIG.12 pokazuju da prozapaljenski citokin IFNg stimuliše promene u ekspresiji FM-MA09-MSC površinskog markera i da interferon gama stimuliše promene u ekspresiji MSC površinskog markera i može ojačati MSC imunosupresivne efekte.
[0267] Šta više, eksperimenti sa FIG.14 pokazuju da FM-MA09-MSCs ojačavaju Treg indukciju, a naročito da MSCs ranog prolaza imaju veće efekte od MSCs kasnog prolaza. Ne-adherentne PBMCs
1
(različiti donori) kulitivisane su sa ili bez IL2 tokom 4 dana u odsustvu ili prisustvu FM-MA09-MSCs. Procenat CD4/CD25 dvostruko pozitivnih Tregs procenjen je protočnom citometrijom. Korišćene su mlade (p6) ili stare (p16-18) FM-MA09-MSCs. Crni stubići indikuju prosek 6 eksperimenata. MSCs su kao celina imale statistički značajan efekat na indukciju Tregs. (p=0.02).
Primer 9 - ESC-MSCs imaju povećanu potenciju i veće inhibitorne efekte od BM-MSCs
[0268] Ogled mešane limfocitne reakcije (MLR) izveden je radi određivanja da li različite MSC populacije imaju različite sposobnosti da inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju. Rezultati sugerišu da su ESC-MSCs potentnije od BM-MSCs u njihovoj sposobnosti da inhibiraju T-ćelijsku proliferaciju u odgovoru ili na mitogeni stimulus ("jednosmerna MLR") (videti FIG 13a i 13b) ili na ćelije koje predstavljaju antigen (dendritske ćelije, DCs; "dvosmerna" MLR) (videti FIG.13c).
[0269] Ogled "jednosmerne" MLR izveden je kako sledi: Humane PBMCs kupljene su od AllCells. Nakon odmrzavanja zamrnute fiole, PBMCs se nanose tokom najmanje 1 sata ili preko noći u IMDM+10% toplotom-inaktiviranom humanom serumu kako bi se selektivno adherovali monociti. Ne-adherentne ćelije (koje sadrži T ćelije) korišćene su kao sirovi izvor T ćelijskih respondera. ESC-izvedene MSCs ili BM-izvedene MSCs su korišćene as inhibitori. Ove MSCs su ili žive ili mitotički-zaustavljene mitomicinom C. Ne-adherentne PBMCs i MSCs izmešane su pri promenljivim odnosima i ostavljene u zajedničkoj kulturi tokom 5 dana. Na dan 3, mitogeni, forbol-12-miristat 13-acetat (PMA) i jonomicin ili fitohemaglutinin (PHA) dodati su kulturi radi indukovanja T-ćelijske proliferacije. Na dan 4, dodat je bromodeoksiuridin (BrdU). Na dan 5, T-ćelijska proliferacija procenjena je putem protočnog citometrijskog bojenja sa antitelima direktno protiv CD4, CD8, i BrdU upotrebom kompleta za BrdU inkorporaciju (B&D Biosistems). T-ćelijska proliferacija procenjen je kao % CD4+ i/ili CD8+ ćelija koje su inkorporirale BrdU u svoje DNK (tj., BrdU+) (prikazano na FIG.13a i 13b).
[0270] U "dvosmernoj" MLR, ESC-izvedene MSCs ili BM-izvedene MSCs korišćene su kao inhibitori, neadherentne mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) korišćene su kao sirov izvor T ćelijskih respondera, a monocit-izvedene dendritske ćelije (DCs) korišćene su kao stimulatori. Kako bi se dobile DCs, plastični-adherentni monociti izolovani su iz PBMCs PBMCs su nanete tokom najmanje 1 sata ili preko noći u IMDM+10% toplotom-inaktiviranom humanom serumu (10% HuSer) kako bi se selektivno adhezovali monociti. Ne-adherentne ćelije uklonjene su, a adherentne ćelije kulitivisane u IMDM+10% HuSer tokom 4 dana sa SCF, FL, GM-CSF, IL3, i IL4. U ovoj varijanti ogloeda, ne dodaje se mitogen na dan 3. BrdU jednostavno se dodaje 16-24 sati pre sakupljanja ćelija za protočnu citometriju isto kao i u prethodnom slučaju. I MSCs i DCs su mitotički-inaktivirane sa Mitomicinom C u ovom ogledu (prikazano na FIG.13c).
2
Primer 10 - Poboljšana indukcija Treg ekspanzije mladim ESC-MSCs u poređenju sa BM-MSCs i starim ESC-MSCs.
[0271] Eksperimenti zajedničke kulture izvedeni su sa PBMCs i MSCs radi određivanja da li prisustvo MSCs može da indukuje regulatornu T ćelijsku (Treg) ekspanziju unutar PBMC populacije. Rezultati sugerišu da mlade ESC-MSCs indukuju Treg ekspanziju bolje i od BM-MSCs i od starih ESC-MSCs (videti FIG.14 i FIG.15).
[0272] Zajedničke kulture utvrđene su sa ne-adherentnim PBMCs i različitim tipovima MSCs ("mlade" ESC-izvedene (∼p5-6), "stare" ESC-izvedene (∼p12 ili više), BM-izvedene) pri odnosu od 10:1 (PBMC:MSC). Zajedničke kulture inkubisane su u IMDM 10% toplotom inaktiviranom humanom serumu 300 jedinica/ml rekombinantnog humanog IL2 tokom 4 dana. Prisustvo Tregs određeno je procentom PBMCs koji je obojio pozitivne na CD4, CD25, i FoxP3 upotrebom kompleta za FoxP3 unutarćelijsko protočno citometrijsko bojenje (Biolegend).
Primer 11 - ESC-MSC have veći proliferativni kapacitet
[0273] Brzine rasta različitih MSC populacija praćene su tokom vremena kako bi se odredilo da li izvor MSCs utičnu na njihov proliferativni kapacitet. Rezultati pokazuju da ESC- izvedene MSCs imaju veći proliferativni kapacitet od BM-izvedenih MSCs. Rezultati takođe sugerišu da uzgajanje ESC-MSCs na supstratu (kao što su Matrigel) tokom dužeg vremenskog perioda (do 6 prolaza) može da pomogne u održavanju veće brzine rasta od onog ako se ćelije izvade iz supstrata u ranijem prolazu, kao što je p2 (videti FIG.16 i FIG.17).
[0274] ESC-izvedeni hemangioblasti zasejani su na Matrigel-obložene plastike za uzgajanje tkiva pri 50,000 ćelije/cm<2>u αMEM 20% Hiklon FBS 1-glutamin ne-esencijalne amino kiseline (= MSC podloga za rast kao p0. Mononuklearne ćelije koštane srži zasejane su na regularnoj plastici za uzgajanje tkiva pri 50,000 ćelije/cm<2>u MSC podlozi za rast kao p0. Ćelije su sakupljene sa 0.05% tripsin-edta (Gibco) kada su dostigle ∼50-60% konfluencu na p0 ili na 70-80% konfluenci iz p1 pa nadalje (obično svakih 3-5 dana). Nakon sakupljanja, ćelije su si okrenute na dole, izbrojane, i ponovo nanete pri 7000 ćelije/cm<2>. ESC-MSCs su uklonjene iz Matrigela i naknadno uzgajane na regularnoj plastici za uzgajanje tkiva počevši od p3, ukoliko nije drugačije naznačeno. Kumulativna populaciona dupliranja tokom vremena prikazana kako bi se pokazala brzina ćelijskog rasta kako se MSCs održavaju u kulturi.
Primer 12 - ESC-MSCs prolaze hondrogenu diferencijaciju
[0275] Kako bi se odredio hondrogeni potencijal različitih MSC populacija, ESC-MSCs ili BM-MSCs zasejane su kao pelet masovne kulture i indukovane da se diferenciraju u hondrocite sa diferencijacionom podlogom (ili održavane u regularnoj MSC podlozi za rast kao negativne kontrole). Rezultati sugerišu da ESC-MSCs prolaze hondrogenezu na način sličan onom BM-MSCs. I ESC-MSC i BM-MSC peleti otkrivaju deponovanje matrične hrskavice (proteoglikana) putem Safranin O bojenja (videti FIG.18).
[0276] Radi obrazovanja hondrogenih pelet kultura, 2.5 X 10<5>ćelije ESC-MSCs centrifugirane su pri 500 X g tokom 5 min u 15 mL konusnoj epruveti. Podloga za uzgajanje aspirirana je i 0.5 mL hondrogene podloge za uzgajanje, koja se sastoji od DMEM-HG (Life Technologies, Gaithersburg, MD) dopunjenja je sa 1mM Natrijum piruvatom (Life Technologies), 0.1 mM fosfatom askorbinske kiseline 2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 0.1 µM deksametazonom (Sigma-Aldrich), 1% ITS
[0277] (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), 10 ng/mL TGF-β3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ), ili podloga za uzgajanje (kontrola) dodata je u pelet. Pelet kulture održavan je tokom 21 dan sa menjanjem podloge na svaka 2-3 dana. Na kraju 21. dana, peleti su fiksirani sa 4% paraformaldehidom i poslati u MassHistology (Worcester, MA) radi oblaganja parafinom, sekcionisanje, i Safranin O bojenje upotrebom standardnih procedura.
Primer 13 – Ojačano lučenje prostaglandina E2 (PGE2) pod IFN-γ ili TNF-α stimulacijom
[0278] ESC-MSCs ispoljavaju imunomodulacione efekte delom putem lučenja PGE2. Kondicionirana podloga sakupljena iz FM ESC-MSCs i BM-MSCs pokazuje da BM-MSCs luče više nivoe PGE2 u bazalnom stanju od FM ESC-MSCs. Eksperimenti izvedeni kako bi se odredilo PGE2 lučenje pod stimulisanim uslovima (različite koncentracije IFN-γ i/ili TNF-α) pokazuju da FM ESC-MSCs značajno povećava njihovo lučenje PGE2 u odgovoru na stimulaciju (videti FIG.19). Zapravo, broj indukcija za PGE2 lučenje iz bazalnih do stimulisaih uslova znatno je veći za FM ESC-MSCs u odnosu na za BM-MSCs. Međutim, stvarne sirove količine PGE2 lučenja (u pg/ml) pod stimulisanim uslovima slično je za FM ESC-MSCs i BM-MSCs.
[0279] ESC-MSCs nanete su pri 7.5 X 10<6>ćelije/cm<2>na ploče sa 6 bazenčića (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ). Kulture su održavane u podlozi za kulturu tokom 24sata, praćeno stimulacijom sa 10, 50, 100, ili 200 ng/ml IFN-γ i/ili 10, 25, 50 ng/mL TNF-α (Peprotech). Supernatant je sakupljen nakon 3 dana indukcije i uskladišten na -20 °C. ESC-MSCs su sakupljene i izbrojane radi normalizovanja PGE2 nivoa do celog broja. PGE2koncentracija izmerena je sa ELISA kompletima (R&D PGE2 Parameter or Prostaglandin E2 Express EIA kit, Cayman Chemicals) i upotrebljeni prema protokolu proizvođača.
4
Primer 14 - ESC-MSC fenotipna evaluacija
[0280] Ekspresija različitih ćelijski površinskih markera procenjena je na različitim MSC populacijama kako bi se odredili njihovi pojedinačni imunofenotipovi. ESC-izvedene MSCs mogu se diferencirati na različitim supstratima. Panel ćelijski površinskih markera ispitan je kako bi se odredio njihov ekspresioni profil na MSCs koje su izvedene na tri različite matrice (Matrigel, fibronektin, ili kolagen I) naspram njihove ekspresije na BM-MSCs. Rezultati pokazuju slične obrasce ekspresije za ove markere bez obzira na supstrat upotrebljen na njihovu inicijalnu diferencijaciju. Pokazano je daje preko 95% pozitivno na CD13, 29, 44, 73, 90, 105, 166, i HLA-ABC a negativno na CD31, 34, 45, HLA-DR, FGFR2, CD271 (videti FIG.20A). Stro-1 ekspresija je varirala, između približno 5% za ESC-MSCs do približno30% za BM-MSCs.
[0281] MSCs usporavaju rast i populaciono dupliranje sa povećanjem broja prolaza. Cilj ovog eksperimenta je da se ispita eskpresija površinskih markera za broj različitih MSC markera iz prolaza 3 do 17 u FM-ESC-MSCs. Ćelije u svim prolazima FM-ESC-MSC obojene su pozitivno na CD90, CD73, CD105, HLA-ABC, CD166, CD13, i CD44. Ćelije su bile negativne na CD34, CD45, TLR3, HLA-DR, CD106, CD133, i CD271 (videti FIG.20B).
[0282] Za svaku liniju/broj prolaza, praćen je isti protokol. Ćelije su uzgajane u T75 ili T175 fiolama, u MSC podlozi. Ćelije su provedene svakih 3-4 dana. Prolaženje ćelije sastoji se od pranja fiola sa PBS, sakupljajući ćelije upotrebom podloge za disocijaciju ćelija TryPLE Express, i pranjem sa MSC podlogom. Ćelije su izbrojane radi vizualizacije sa tripan plavim i alikvotirane na 50-100,000 vijabilnih ćelija po uslovu. Korišćena su sledeća antitela: CD34-Fitc, CD34-PE, CD44-Fitc, CD73-PE, CD106-PE, CD45-APC (BD); HLA-DR-APC, CD90-Fitc, HLA-ABC-Fitc, CD133-APC, CD29 (ebioscience); CD166-PE, CD105-APC, CD13-PE, CD13- APC, CD271-Fitc, CD10-Fitc, Stro-1-AF647, CD10 (Biolegend); TLR3-Fitc (Santa Cruz Biotech). Propidijum jodid takođe je dodat kao vizulacioni marker. Ćelije su inkubisane na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, okrenute, provučene kroz 40µm ćelijski bojač, i analizirane sa Accuri C6 Protočnom citometru. Za svaki ćelijski tip, ćelije su uvedene u MSC populaciju (FSC vs. SSC), PI negativnu. Procenat pozitivnosti određivan je uvođenjem histogramskih grafika i upotrebom neobojene ćelijske populacije kao negativne kontrole. Videti, Wagner W, et al. Replicative Senescence of Mesenchymal Stem Cells: A Continuous and Organized Process. PLoS ONE (2008).3(5): e2213. doi:10.1371/journal.pone.0002213; i Musina, R, et al. Comparison of Mesenchymal Stem Cells Obtained from Different Human Tissues. Cell Technologies in Biology and Medicine (2005) April.1(2), 504-509.
[0283] Dodatno, FM ESC-MSCs imaju veći nivo CD10 ekspresije i manju Stro-1 ekspresiju od FM ESC-MSCs i BM-MSCs (videti FIG.21). Ovaj ekspresioni obrazac niskog Stro-1 (5-10% ćelija) i srednjeg CD10 (40% ćelija) potvrđen je u 10 različitih količina FM-MA09-MSCs (videti FIG.22). Protočna citometrija takođe je primenjena na različitim populacijama radi evaluacije ćelijske veličine (videti FIG.23). Rezultati pokazuju da dok se ćelije održavaju u kulturi tokom dužih vremenskih perioda, ćelijska veličina BM-MSCs se povećava dok FM ES-izvedene MSCs održavaju ćelijsku veličinu. Ćelijska veličina određena je raspršivanjem unapred ns. Bočno na tačkastim dijagramima protočne citomerije. Kvadratna kapia korišćena je za deljenje grafikona na 4 regije. Gornji desni kvadrat sadrži velike ćelije, tj., ćelije kod kojih postoji veliko raspršivanje ka napred (ćelijska zapremina) a takođei visoko bočno raspršivanje (granulacija).
[0284] ESC-MSCs su sakupljene, kako je prethodno pomenuto, i oprane u IX DPBS (Life Technologies).
75-100 X 10<5>ćelije su oprane protočnim puferom (3% FBS ; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), praćeno inkubisanjem sa 100 µL protočnog pufera koji sadrži ili primarno antitelo ili izotipno kontrolno antitelo tokom 45 min na ledu. Ćelije su oprane sa 2 mL protočnog pufera i inkubisane u 100 µL protočnog pufera koji sadrži sekundarno antitelo tokom 45 min na ledu. Ćelije su oprane poslednji put i resuspendovane u protočnom puferu koji sadrži propidijum jodid i analizirane na Accuri C6 protočnom citometru (Accuri Citometers Inc., Ann Arbor, MI).
Primer 15 - Analiza genske ekspresije u ESC-MSCs
[0285] Svrha ovih ispitivanja bila je da se odrede sličnosti i razlike mRNK ekspresije između FM-ESC-MSC i BM-MSC. U prvom setu eksperimenata (bazalni eksperimenti), relativne razlike mRNK ekspresije ćelija iz FM-ESC-MSC i BM-MSC upoređene su Kvantitativnom polimeraza lančanom reakcijom (QPCR).
Taqman sonde (Life Technologies) za različite gene, korišćene su kako bi se odredila relativna ekspresija ka endogenoj kontroli, GAPDH, upotrebom ΔΔCt postupka. Iz liste 28 gena, sledeći geni ushodno su regulisani u bazalnim eksperimentima u FM-ESC-MSC vs BM-MSC: AIRE, ANGPT1 (ANG-1), CXCL1, CD10, CD24, i IL11 (videti FIG.24-26). IL6 i VEGF nishodno su regulisani u FM-ESC-MSC vs BM-MSC (videti FIG.
27). Nije bilo značajne razlike za sledeće gene između izvora MSC: ALCAM, FGF7, HGF, LGALS1, NT5E, i TNFSF1B (podaci nisu prikazani). Sledeći geni nisu detektovani u bilo kojem od MSC izvora: ANGPT2, CD31, CD34, CD45, HLA-G, IL2RA, IL3, IL12B (podaci nisu prikazani). Kao negativna kontrola, sve MSCs testirane su na ekspresiju hematopoetskih progenitor markera, CD34, CD41, i CD45. Iz ovih eksperimenata, određeno je da FM-ESC-MSCs eksprimiraju neke gene u višim ili nižim nivoima u odnosu na ekvivalentne BM-MSCs.
[0286] MSCs su takođe čelendžovane na okruženje koje imitira imuni odgovor tretiranjem MSC sa T ćelijama, a zatim dodavanjem stimulatora, Fitohemaglutinin (PHA). ESC-MSC su uzgajane u prisustvu T ćelija (nestimulisane) ili T ćelije plus PHA (stimulisane) tokom dva dana pre dodavanja 2.5 µg/ml PHA tokom dodatna 2 dana pre RNK sakupljanja. Genska ekspresija ESC-MSC nestimulisanih i stimulisanih trenutno se poredi sa nestimulisanim i stimulisanim BM-MSC mRNK nivoima.
[0287] Za bazalne eksperimente: FM-ESC-MSC i BM-MSC kulitivisane su tokom 4 dana pri početnoj gustini od približno 500,000 ćelija u 10 cm sudu pod prethodno opisanim uslovima. Dodatno, negativna kontrola za bazalne eksperimente bile su iz MA09 ESC izvedeni hematopoetični progenitori.
[0288] Za stimulacione eksperimente: FM-ESC-MSC i BM-MSC kulitivisane su tokom 3-4 dana pri početnoj gustini od približno 500,000 ćelija u 10 cm sudu pod prethodno opisanim uslovima. MSCs zatim su izložene T ćelijama tokom 2 dana, a zatim /- izložene 2.5 µg/ml PHA. Kao kontrola, MSCs su uzgajane u prisustvu T ćelija bez PHA, i odvojeno, T ćelije plus PHA (bez MSCs) takođe su uzgajane. Podloga je aspirirana, isprana 2 puta u PBS, i osušena aspiriranjem. RNK je izolovana upotrebom RNAeasy kit-a (Qiagen) po uputstvima proizvođača. Koncentracija i čisrtoća RNK analizirana je upotrebom Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). cDNK sinteza izvedena je upotrebom SuperScript III First-Strand Sintesis SuperMix za qRT-PCR (Life Technologies) upotrebom 1 mikrograma RNK kao početni materijal. cDNK razblažena je približno 30 puta za 5 mikrolitara/bazenčić. Razblažena cDNK, 1 mikrolitar QPCR Taqman probe (Life Technologies), i 15 mikrolitara SSO Fast Mastermix (Biorad) umešani su po bazenčiću. QPCR izvedena je na Biorad CFX 96. Podaci su analizirani upotrebom CFX manager 2.1 (Biorad). Relativne količine mRNK ekspresije određene su upotrebom endogene kontrole, GAPDH, i ΔΔCt postupka.
Primer 16 - Indoleamin 2,3-dioksigenaza (IDO) enzimska aktivnost u ESC-MSCs
[0289] Indoleamin 2, 3-dioksigenaza (IDO) u enzimu uključen je u konverziju triptofana u kinurenin. IFNγ-aktivirane MSCs proizvode IDO, a on može biti delimično odgovoran za njihovu sposobnost da suzbiju T-ćelijsku proliferaciju budući da IDO utiče na T ćelijski metabolizam. U ovom ispitivanju, ispituje se IDO aktivnost BM- MSCs u poređenju sa ESC-MSCs. IDO ekspresija izmerena je pre i nakon stimulacije ćelija ili sa IFNγ ili putem zajedničkog uzgajanja sa T ćelijama. Eksperimenti pokazuju da sve MSC populacije značajno povećavaju IDO aktivnost nakon stimulacije sa IFNgama (videti FIG.28).
[0290] Ćelije su stimulisane dodavanjem bilo IFNγ (50ng/ml) u podlogu, ili zajedničkim uzgajanjem sa T ćelijama tokom 3 dana; merenje IDO ekspresije izvedeno je upotrebom spectrofotometrijskog ogleda. Nakon stimulacije, ćelije su sakupljene, a 1-2X10<6>ćelija su lizirane. Lizati su sakupljen, i umešani 1:1 sa 2X IDO puferom (PBS sa 40mM askorbatom, 20µM metilen plavim, 200µg/ml katalazom, i 800µM L-triptofanom) i inkubisane tokom 30 minuta na 37°C. Reakcija ja zaustavljena dodavanjem 30% trihlorosirćetne kiseline, i inkubisane tokom 30 minuta na 52°C. Lizati su okrenuti na dole, a supernatanti pomešani 1:1 sa Ehrlich-ovim reagensom (0.8% p-dimetilaminobenzaldehid u sirćetnoj kiselini, sveže pripremljen). Nakon razvijanja boje, apsorbanca je očitana na spektrofotometru pri 492nm. OD vrednosti upoređene su sa standardom kinurenina iz 0-1000 µM radi određivanja koncerzije triptofana u kinurenin.
[0291] Videti, Meisel R et. al. Human koštana srž stromalne ćelije inhibiraju alogene T-cell odgovori by indoleamin 2,3-dioksigenazu-posredovan triptofan degradation. Blood. (2004) Jun 15; 103 (12): 4619-21.
[0292] Videti, Braun, D et. al. A two-step induction of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) activity during dendritic-cell maturation. Blood. (2005) Oct 1; 106 (7):2375-81.
Primer 17 - Ekspresioni nivoi Aire-1 i Prion-Proteina u ESC-MSCs
[0293] Ekspresioni nivoi Aire-1 i Prion-Proteina (Prp) praćeni su upotrebom western blot analize kako bi se odredilo da li postoje razlike među različitim MSC populacijama (na bazi ćelijskog izvora, postupka derivacije, ili broja prolaza MSCs). Aire-1 pomažu indukovanje transkripcije retkih restrikcionih antigena u perifernom tkivu (PTA) koji su naknadno prisutni u MHC i guše odgovor susednih T ćelija. Aire-1 takođe može da suszbije ekspresiju ranog T ćelijskog aktivacionog faktora-1 (ETA-1) kako bi se inhibirali T ćelijski zapaljenski odgovori. Pokazanao je da Prion protein (PrP) ojačava proliferaciju i samoobnavljanje različitih populacija matičnih ćelija (hematopoetske, neuronske, itd) i njihova ekspresija može biti u vezi sa karakteristikama rasta različitih MSC populacija u kulturi. Rezultati pokazuju pad povezan sa starenjem u oba proteina (nakon razmatranja uvođena je kontrola, aktin za svaki uzorak). FM MA09-MSCs pokazuju da održavaju ekspresiju i Aire-1 i PrP tokom vremena (videti FIG.29).
[0294] MSCs celi ćelijski lizati provučeni su kroz 12% akrilamidne SDS-PAGE gelove prema standardnim protokolima. Proteini su transferovani na nitroceluloznu membranu i blokirani sa 5% mlekom u PBS 0.05% tween 20. Membrane su testirane antitelima direktno protiv Aire-1 (Santa Cruz Biotechnology) ili Prion Proteina (Abcam), praćeno HRP-konjugovanim sekundarnim antitelima. Ojačani hemiluminescentni reagensi korišćeni su za razvoj signala pre analize na Biorad GelDoc Imaging Sistemu.
[0295] Videti, Parekkadan et al. Molecular Therapy 20 (1): 178-186 (2011).
[0296] Videti, Mohanty et al. Stem Cells 30: 1134-1143 (2012).
Primer 18 - ESC-MSC lučenje citokina
[0297] MSCs su poznate da luče razne citokine i faktore rasta i u bazalnim uslovima i u odgovoru na različite stimulanse. Više od 20 različitih izlučenih faktora analizirani su upotrebom citokinskih nizova. Rezultati pokazuju da postoji nekoliko ključnih razlika između ESC-MSCs i BM-MSCs u odnosu na izlučene faktore i u bazalnim i stimulisanim uslovima. BM-MSCs eksprimiraju visoke nivoe VEGF i IL6 u odnosu na ESC-MSCs i u bazalnim i IFNγ-stimulisanim uslovima (videti FIG.30-32).
[0298] Ekvivalentni brojevi MSCs inicijalno se nanose, a kondicionirana podloga iz MSCs sakuplja se 3-4 dana nakon zasejavanja. CM se okreću bro radi uklanjanja ćelijskog viška, a zatim zamrzava na -20 C. CM je odmrznut radi analiziranja na RayBiotech(Norcross, GA) po meri sačinjenim membranskim nizovima ili na različitim R&D Sistemima (Minneapolis, MN) odmah spremnih citokinskih nizova u skladu sa protokolima proizvođača.
Primer 19 - Humana ES ćelijska kultura za diferencijaciju MSCs
[0299] Svrha ovog eksperimenta bila je da se procene različite podloge za rast za hESC uzgajanje pre diferencijacije u MSCs.
[0300] Human ES ćelije su generalno uzgajane na ozračenim ili mitomicinom-C tretiranim hraniteljskim ćelijama mišjih embrionskih fibroblasta (MEF) u Humanoj ES ćelijskoj podlozi za rast (nokaut DMEM ili DMEM/F12 (1:1) osnovna podloga, 20% zamenski serum, 1-glutamin, ne-esencijalne amino kiseline, i 10ng/ml bFGF). Prolaženje se izvodi upotrebom 0.05% tripsin/EDTA. Alternativno, hESCs su kulitivisane na MEF fiderima u primatnoj podlozi i provedene upotrebom rastvora za disocijaciju (obe kupljene od ReproCELL). Rezultati pokazuju da primatna podloga konzistentno daje "bolje" izglede hESC kolonija (okruglije, čvršće kolonije, sa manje spontane diferencijacije) u poređenju sa ćelijama uzgajanim u humanoj ES ćelijskoj podlozi za rast koja sadrži nokaut DMEM.
Navedene reference
[0301]
1. Zappia, E., et al., Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy. Blood, 2005.106(5): p.1755-61.
2. Gerdoni, E., et al., Mesenchymal stem cells effectively modulate pathogenic immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis. Ann Neurol, 2007.61(3): p.219-27.
3. Lanza, C., et al., Neuroprotective mesenchymal stem cells are endowed with a potent antioxidant effect in viva J Neurochem, 2009.110(5): p.1674-84.
4. Rafei, M., et al., Allogeneic mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Mol Ther, 2009.17(10): p.1799-803.
5. Rafei, M., et al., Mesenchymal stromal cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibiting CD4 Th 17 T cells in a CC chemokine ligand 2-dependent manner. J Immunol, 2009.182(10): p.5994-6002.
6. Constantin, G., et al., Adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells, 2009.27(10): p.2624-35.
7. Uccelli, A. and D.J. Prockop, Why should mesenchymal stem cells (MSCs) cure autoimmune diseases? Curr Opin Immunol, 2010.22(6): p.768-74.
8. Ohtaki, H., et al., Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proc Natl Acad Sci USA, 2008.105(38): p. 14638-43.
9. Barberi, T., et al., Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Med, 2005.2(6): p. e161.
10. Hwang, N.S., et al., In vivo commitment and functional tissue regeneration using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008.105(52): p.20641-6.
11. Olivier, E.N., A.C. Rybicki, and E.E. Bouhassira, Differentiation of human embryonic stem cells into bipotent mesenchymal stem cells. Stem Cells, 2006.24(8): p.1914-22.
12. Brown, S.E., W. Tong, and P.H. Krebsbach, The derivation of mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells. Cells Tissues Organs, 2009.189(1-4): p.256-60.
13. Karlsson, C., Emanuelsson, K., Wessberg, F., Kajic, K., Axell, M. Z., Eriksson, P. S., Lindahl, A., Hyllner, J., and Strehl, R., Human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitors-Potential in regenerative medicine. Stem Cell Res., 2009.3(1): 39-50.
14. Lu, S. J., Feng, Q., Caballero, S., Chen, Y., Moore, M. A., Grant, M. B., and Lanza, R., Generation of functional hemangioblasts from human embryonic stem cells, Nat. Methods 4 (2007) 501-509. 15. Lu, S. J., Luo, C., Holton, K., Feng, Q., Ivanova, Y., and Lanza, R., Robust generation of hemangioblastic progenitors from human embryonic stem cells, Regen. Med.3 (2008) 693-704. 16. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S.-J., and Lanza, R., Human embryonic stem-cell lines derived from single blastomeres, Nature 444 (2006) 481-485.
17. Madsen, L.S., et al., A humanized model for multiple sclerosis using HLA-DR2 and a human T-cell receptor. Nat Genet, 1999.23(3): p.343-7.
18. Stromnes, I.M. and J.M. Goverman, Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc, 2006.1(4): p.1952-60.
19. Liang, J., et al., Allogeneic mesenchymal stem cells transplantation in treatment of multiple sclerosis. Mult Scler, 2009.15(5): p.644-6.
20. Costa, M., et al., The ESC line Envy expresses high levels of GFP in all differentiated progeny. Nat Methods, 2005.2(4):p.259-60.
21. Pomper, M.G., et al., Serial imaging of human embryonic stem-cell engraftment and teratoma formation in live mouse models. Cell Res, 2009.19(3): p.370-9.
22. Phinney, D.G. and D.J. Prockop, Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells, 2007.25(11): p. 2896-902.
23. Ryan, J.M., et al., Interferon-gamma does not break, but promotes the immunosuppressive capacity of adult human mesenchymal stem cells. Clin Exp Immunol, 2007.149(2): p.353-63.
24. DelaRosa, 0. and E. Lombardo, Modulation of adult mesenchymal stem cells activity by toll-like receptors: implications on therapeutic potential. Mediators Inflamm, 2010.2010: p.865601.
25. English, K., et al., IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunol Lett, 2007.110(2): p.91-100.
26. Barry, F., et al., The SH-3 and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001.289(2): p.519-24.
27. Alhadlaq, A. and J.J. Mao, Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells Dev, 2004.13(4): p.436-48.
28. Mikami, Y., et al., CD271/p75NTR inhibites the differentiation of mesenchymal stem cells into osteogenic, adipogenic, chondrogenic, and myogenic lineages. Stem Cells Dev, 2010.
29. Di Nicola, M., et al., Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood, 2002.99(10): p.3838-43.
30. Johnson, T.A., F.R. Jirik, and S. Fournier, Exploring the roles of CD8(+) T lymphocytes in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Semin Immunopathol, 2010.32(2):p.197-209.
31. Huseby, E.S., C. Ohlen, and J. Goverman, Cutting edge: myelin basic protein-specific cytotoxic T cell tolerance is maintained in vivo by a single dominant epitope in H-2k mice. J Immunol, 1999. 163(3): p.1115-8.
32. Tang, Q. and J.A. Bluestone, Regulatory T-cell physiology and application to treat autoimmunity. Immunol Rev, 2006.212: p.217-37.
33. Boumaza, I., et al., Autologous bone marrow-derived rat mesenchymal stem cells promote PDX-1 and insulin expression in the islets, alter T cell cytokine pattern and preserve regulatory T cells in the periphery and induce sustained normoglycemia. J Autoimmun, 2009.32(1): p.33-4
34. Maccario, R., et al., Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype. Haematologica, 2005.90(4):p.516-25.
35. Locatelli, F., R. Maccario, and F. Frassoni, Mesenchymal stromal cells, from indifferent spectators to principal actors. Are we going to witness a revolution in the scenario of allograft and immune-mediated disorders? Haematologica, 2007.92(7):p.872-7.
1
36. Wan, Y.Y. and R.A. Flavell, Identifying Foxp3-expressing suppressor T cells with a bicistronic reporter. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005.102(14): p.5126-31.
37. Duijvestein et al. Stem Cells 29 (10): 1549-1558 (2011)
38. Liang et al. Cell Transplant 20 (9): 1395-1408 (2011)
39. Pizarro et al. Trends Mol Med 9 (5): 218-222 (2003)
40. Copland et al. IOVS 49 (12): 5458-5465 (2008)
41. Wakitani et al. Osteoarthritis and Cartilage 10: 199-206 (2002)
42. Mobasheri et al. Histol. Histopathol 24 (3): 347-366 (2009)
43. Noth et al. Nat Clin Pract Rheumato 4(7): 371-380 (2008)
44. Gotherstrom et al. Am J Obstet Gynecol 190(1): 239-45 (2004)
45. Rasmusson et al. Exp. Cell Research 312(12): 2169-79 (2006)
46. Newman et al. Inflamm Allergy Drug Targets 8(2): 110-123 (2009)
47. Le Blanc et al. Exp. Hematol.31: 890-896 (2003)
48. Liu et al. J. of Immunol.176: 2864-2871 (2006)
2

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Postupak za generisanje mezenhimalnih stromalnih ćelija koji obuhvata uzgajanje hemangioblasta pod uslovima u kojima se ćelije diferenciraju radi proizvodnje mezenhimalnih stromalnih ćelija.
2. Postupak prema zahtevu 1, u kojem su mezenhimalne stromalne ćelije definisane ekspresijom AIRE-1, IL-11, CD10, CD24, ANG-1 i CXCL1.
3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, u kojem se hemangioblasti uzgajaju u uslovima bez dohranjivanja.
4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-3, u kojem su mezenhimalne stromalne ćelije humane ćelije.
5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-4, u kojem se hemangioblasti nanose na matrici.
6. Postupak prema zahtevu 5, u kojem ta matrica obuhvata jedan ili više od transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta), epidermalnog faktora rasta (EGF), faktora rasta 1 sličnog insulinu, faktora rasta goveđeg fibroblasta (bFGF), i/ili faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGF).
7. Postupak prema zahtevu 5 ili 6, u kojem je ta matrica odabran iz grupe koju čine:
laminin, fibronektin, vitronektin, proteoglikan, entaktin, kolagen, kolagen I, kolagen IV, heparan sulfat, rastvorljivi preparat od Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mišijih sarkoma ćelija, ekstrakt iz osnovne humane membrane, i bilo koja njihova kombinacija.
8. Postupak prema bilo kom od zahteva 5-7, u kojem se hemangioblasti uzgajaju na matrici tokom najmanje oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 dana.
9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-8, u kojem se hemangioblasti uzgajaju u podlozi koja obuhvata αMEM.
10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-9, u kojem se hemangioblasti uzgajaju u podlozi koja obuhvata serum ili zamenu seruma.
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-10, u kojem se hemangioblasti diferenciraju od pluripotentnih ćelija.
12. Postupak prema zahtevu 11, u kojem se hemangioblasti diferenciraju od pluripotentnih ćelija postupkom koji obuhvata uzgajanje pomenutih pluripotentnih ćelija radi obrazovanja klastera ćelija.
13. Postupak prema zahtevu 12, u kojem se pluripotentne ćelije uzgajaju u prisustvu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i/ili koštanog morfogenog proteina 4 (BMP-4).
14. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-13, u kojem postupak rezultuje u najmanje 80, 85, 90, 95, 100, 125, ili 150 miliona mezenhimalnih stromalnih ćelija koje se generišu iz oko 200,000 hemangioblasta u okviru oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 dnevne kulture.
15. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-14, u kojem mezenhimalne stromalne ćelije eksprimiraju niske nivoe najmanje jednog od CD31, CD34, CD45, CD133, FGFR2, CD271, Stro-1, CXCR4 i TLR3.
4
RS20181203A 2011-11-30 2012-11-30 Mezenhimalne stromalne ćelije i primene vezane za njih RS57886B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161565358P 2011-11-30 2011-11-30
EP12854438.4A EP2785359B1 (en) 2011-11-30 2012-11-30 Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
PCT/US2012/067464 WO2013082543A1 (en) 2011-11-30 2012-11-30 Mesenchymal stromal cells and uses related thereto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57886B1 true RS57886B1 (sr) 2019-01-31

Family

ID=48536141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181203A RS57886B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-30 Mezenhimalne stromalne ćelije i primene vezane za njih

Country Status (19)

Country Link
US (5) US8962321B2 (sr)
EP (2) EP3449929B1 (sr)
JP (5) JP2015500810A (sr)
KR (4) KR102525175B1 (sr)
CN (2) CN108478599B (sr)
AU (4) AU2012345630A1 (sr)
CA (1) CA2857545A1 (sr)
CY (1) CY1122275T1 (sr)
DK (1) DK2785359T3 (sr)
ES (1) ES2690212T3 (sr)
HR (1) HRP20181515T1 (sr)
HU (1) HUE040566T2 (sr)
LT (1) LT2785359T (sr)
PL (1) PL2785359T3 (sr)
PT (1) PT2785359T (sr)
RS (1) RS57886B1 (sr)
SI (1) SI2785359T1 (sr)
TW (4) TWI698527B (sr)
WO (1) WO2013082543A1 (sr)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434527A (zh) 2006-04-14 2017-02-22 安斯泰来再生医药协会 血管瘤集落形成细胞
US20110086424A1 (en) 2008-05-06 2011-04-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enucleated erythroid cells derived from pluripotent stem cells
US8961956B2 (en) 2011-11-30 2015-02-24 Ocata Therapeutics, Inc. Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
SI2785359T1 (sl) 2011-11-30 2018-11-30 Astellas Institute For Regenerative Medicine Mezenhimske stromalne celice in uporabe povezane z njimi
JP6277187B2 (ja) 2012-07-11 2018-02-07 イムステム バイオテクノロジー，インコーポレイテッド ヒト胚性幹細胞由来の間葉系様幹細胞、方法およびその使用
HK1208054A1 (en) 2012-07-12 2016-02-19 爱姆斯坦生物技术公司 Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof
CA2896053A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Ocata Therapeutics, Inc. Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
KR101669124B1 (ko) * 2013-07-11 2016-10-25 서울대학교병원 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물
DK2840132T3 (en) 2013-08-22 2017-02-20 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffenlichen Rechts Universitätsmedizin Method of Manufacturing Constructed Heart Muscle (EHM)
CA2929310C (en) * 2013-11-18 2024-07-02 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MICROSPHERE-BASED ADMINISTRATION AND EX VIVO MANIPULATION OF DENDRITE CELLS FOR AUTOIMMUNE THERAPIES
US10624930B2 (en) * 2014-06-10 2020-04-21 Mesoblast International Sarl Treatment of immune disorders
JP6452107B2 (ja) * 2014-09-05 2019-01-16 国立大学法人 東京大学 糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞
CN104232573B (zh) * 2014-09-11 2017-01-11 安沂华 一种生长培养基及其用途和培养脐带间充质干细胞的方法
US20160095885A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 WibiWorks Therapeutics, Inc. Induction Medium & Methods for Stem Cell Culture & Therapy
CN104531613B (zh) * 2014-11-17 2017-12-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用
EP3236977B1 (en) * 2014-12-23 2023-06-21 Mesoblast International Sàrl Method for treating heart failure
SG10201907918VA (en) 2015-03-23 2019-10-30 Astellas Inst For Regenerative Medicine Improved assays for potency of human retinal pigment epithelium (rpe) cells and photoreceptor progenitors
US11066642B2 (en) 2015-08-05 2021-07-20 Cell Cure Neurosciences Ltd Preparation of retinal pigment epithelium cells
CN108697641A (zh) 2015-08-18 2018-10-23 安斯泰来再生医药协会 临床制剂
CN108368479A (zh) * 2015-09-29 2018-08-03 细胞结构公司 细胞效能分析
WO2017060240A1 (en) * 2015-10-05 2017-04-13 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and culture medium for ex vivo culturing of epidermis-derived stem cells
US11802272B2 (en) * 2015-11-04 2023-10-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Enrich and amplify highly potent human mesenchymal stem cells from elderly cell populations
EP3381458B1 (en) * 2015-11-24 2023-06-07 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for liver disease containing stromal cells derived from adipose tissue and method for producing the same
CN105326864A (zh) * 2015-11-30 2016-02-17 奥思达干细胞有限公司 一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂及其制备方法
US10383895B2 (en) * 2016-02-18 2019-08-20 Viera Bioscience, Inc. Stimulation of therapeutic angiogenesis by T regulatory cells
CN105671000A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 深圳爱生再生医学科技有限公司 重组间充质干细胞及其制备方法和应用
US10758574B2 (en) 2016-04-28 2020-09-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cartilage cells with a high regenerative potential and low immune response for use in cellular therapy
IL264205B2 (en) * 2016-07-11 2023-12-01 Bonus Therapeutics Ltd Cellular compounds for tissue regeneration
CN106267161A (zh) * 2016-09-30 2017-01-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种干细胞制剂及其制备方法和应用
CN106265899A (zh) * 2016-09-30 2017-01-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种组合物及其在制备改善慢性鼻炎的产品中的应用
CN106479968A (zh) * 2016-10-11 2017-03-08 海南博鳌龄迈迪精准医学研究院有限公司 脐带间充质干细胞的培养方法
CN106520686A (zh) * 2016-10-11 2017-03-22 海南博鳌龄迈迪精准医学研究院有限公司 脂肪间充质干细胞的培养方法
KR101971322B1 (ko) * 2016-10-17 2019-04-23 사회복지법인 삼성생명공익재단 Ｓｏｃｓ의　발현　또는　활성　억제를　이용한　고효능 줄기세포 선별방법
KR20190109389A (ko) 2016-11-03 2019-09-25 엑소스템 바이오텍 리미티드 간엽 줄기 세포 집단, 이들의 산물 및 이들의 용도
CN106563161A (zh) * 2016-11-08 2017-04-19 华南生物医药研究院 可用于美容的新型药物组合剂
CN106619721A (zh) * 2016-11-08 2017-05-10 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种增强细胞活性的新方法
CN106581760A (zh) * 2016-11-08 2017-04-26 华南生物医药研究院 增强细胞活性的特殊处理方法
KR102390909B1 (ko) * 2016-12-19 2022-04-26 주식회사 파이안바이오테크놀로지 미토콘드리아를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2018119142A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
GB201703058D0 (en) * 2017-02-24 2017-04-12 Ucl Business Plc Biomarkers
CN110494556B (zh) * 2017-04-03 2024-04-30 株式会社钟化 包含间充质系干细胞的细胞群、其制造方法、以及医药组合物
WO2018207918A1 (ja) * 2017-05-12 2018-11-15 国立大学法人 東京医科歯科大学 移植効率を向上させる間葉系幹細胞の純化方法
WO2018235834A1 (ja) * 2017-06-19 2018-12-27 国立大学法人北海道大学 表皮水疱症の治療剤
CN107490701B (zh) * 2017-08-17 2021-09-14 上海集技生物技术有限公司 一种基于局部照射的全身性骨损伤模型的建立及病理机制分析的方法
CN107714726A (zh) * 2017-10-16 2018-02-23 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重塑骨髓微环境的方法
CN109069543B (zh) * 2017-10-16 2020-02-18 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重塑骨髓微环境的方法
EP3707515A1 (en) * 2017-11-06 2020-09-16 Kings College London Therapeutic substances, their preparation and diagnostic procedure
KR102095628B1 (ko) 2018-01-05 2020-04-01 재단법인 아산사회복지재단 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및 이로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 피부질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
EP4130252A1 (en) * 2018-02-16 2023-02-08 NextCell Pharma AB Composition of allogeneic mesenchymal stem cells
WO2019171386A1 (en) * 2018-03-07 2019-09-12 The Medical Research Infrastructure And Health Services Fund Of The Tel-Aviv Medical Center Compositions and methods for treating age-related macular degeneration
CA3103043A1 (en) * 2018-06-15 2019-12-19 Luis Marinas Pardo Pharmaceutical composition for dermatology and uses thereof
KR102337954B1 (ko) * 2018-08-16 2021-12-10 차의과학대학교 산학협력단 뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법
CN109082409A (zh) * 2018-09-14 2018-12-25 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种组织修复能力强的脂肪干细胞分离培养及筛选方法
CN109182262A (zh) * 2018-09-25 2019-01-11 深圳市五零生命科技有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基
SG11202104337PA (en) * 2018-11-26 2021-05-28 Massachusetts Inst Technology Compositions and methods for immune tolerance
CN109342739A (zh) * 2018-11-27 2019-02-15 上海科医联创生物科技有限公司 一种鉴定间充质干细胞纯度的方法
CN109609584A (zh) * 2018-12-10 2019-04-12 天津长和生物技术有限公司 间充质干细胞免疫调节能力的检测方法
JP7628499B2 (ja) * 2019-02-27 2025-02-10 武田薬品工業株式会社 同種異系療法のための改良された幹細胞集団
US20220154147A1 (en) * 2019-03-12 2022-05-19 Global Stem Cell Technology Immunomodulating mesenchymal stem cells
CA3133038A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Sapporo Medical University Pharmaceutical composition for treating amyotrophic lateral sclerosis
EP4004191A4 (en) 2019-07-26 2022-10-12 Brexogen Inc. Precursor cells of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells and method for preparing the same
CN110305839A (zh) * 2019-08-02 2019-10-08 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 间充质干细胞无血清培养基
CN115003800A (zh) 2019-08-28 2022-09-02 安斯泰来再生医药协会 治疗血管疾病的方法
AU2020337444A1 (en) 2019-08-28 2022-03-24 Astellas Institute For Regenerative Medicine Compositions and methods of treating vascular diseases
CN110564674B (zh) * 2019-09-29 2021-05-11 广东工业大学 一种干细胞铺底工作液及其应用
WO2021072595A1 (zh) * 2019-10-14 2021-04-22 玛旺干细胞医学生物科技股份有限公司 间充质干细胞在治疗听力障碍上的医药用途
RU2740152C1 (ru) * 2020-01-09 2021-01-13 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН) Способ активации пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани
WO2021169017A1 (zh) * 2020-02-25 2021-09-02 上海大学 间充质干细胞在治疗重症covid19肺炎中的用途
EP4137141A4 (en) * 2020-04-13 2024-04-24 National University Corporation Tokai National Higher Education and Research System AGENT FOR INCREASING CD25-POSITIVE REGULATORY T CELLS IN THE KIDNEY
CN115701285A (zh) * 2020-04-28 2023-02-07 菲克特生物科学股份有限公司 间充质干细胞疗法
EP3909594A1 (en) * 2020-05-14 2021-11-17 Bernat Soria Escoms Mesenchymal stromal cells for the treatment of covid-19 and other inflammatory, autoimmune and degenerative diseases
CN111518761B (zh) * 2020-05-25 2022-04-29 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种间充质干细胞体外筛选、激活、扩增、冻存及其细胞库建立的方法
WO2022004938A1 (ko) * 2020-06-30 2022-01-06 주식회사 미래셀바이오 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법
EP3945133A1 (en) * 2020-07-29 2022-02-02 Georg-August-Universität Göttingen Mass production of human pluripotent stem cell derived cardiac stromal cell
CN112826833A (zh) * 2020-07-30 2021-05-25 中国人民解放军总医院第五医学中心 间充质干细胞在制备新冠肺炎引起的肺损伤修复药物中的应用
CN111808812B (zh) * 2020-08-31 2020-12-15 首都医科大学附属北京友谊医院 一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法
US20230405051A1 (en) * 2020-10-22 2023-12-21 The Catholic University Of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation Pharmaceutical composition for prevention or treatment of rheumatoid arthritis, comprising, as active ingredient, stem cells having expression of specific genes increased or decreased therein
WO2022234998A1 (ko) * 2021-05-07 2022-11-10 의료법인 성광의료재단 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 및 이의 용도
CN117835995A (zh) * 2021-07-08 2024-04-05 勃林格殷格翰比利时兽医公司 用于治疗慢性龈口炎的间充质干细胞
CN113717972B (zh) * 2021-08-16 2022-07-01 南通市肿瘤医院 MYADM靶向的siRNA及其应用
CA3234969A1 (en) * 2021-10-12 2023-04-20 Makoto Funaki Anti-aging composition using mesenchymal stem cells and methods thereof
IL314150A (en) * 2022-02-07 2024-09-01 Smartcella Solutions Ab Methods and preparations for the production of human-derived mesenchymal stem cells
CN114984051A (zh) * 2022-06-27 2022-09-02 广州惠善医疗技术有限公司 间充质干细胞在制备治疗炎症及免疫相关疾病的药物中的应用
WO2024007038A2 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Northwestern University Compositions and methods for the treatment of intestinal inflammation
EP4558154A1 (en) 2022-07-18 2025-05-28 Astellas Institute for Regenerative Medicine Methods of treating brain injury
CN115305234B (zh) 2022-09-28 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用
JP7725119B2 (ja) * 2023-01-27 2025-08-19 株式会社Rainbow 自動培養装置における細胞増殖制御方法
TW202434721A (zh) * 2023-02-14 2024-09-01 國立大學法人山口大學 細胞群、三維細胞培養體、醫藥組成物、胞泌體及製作此細胞群的方法
CN116836920B (zh) * 2023-08-21 2024-05-24 广东横琴粤澳深度合作区齐美国际干细胞医院有限公司 一种无血清培养基及其制备间充质干细胞的方法
CN117210528B (zh) * 2023-09-12 2024-08-20 长沙干细胞与再生医学工业技术研究院有限公司 一种综合评估间充质干细胞免疫调控能力的方法
WO2025084581A1 (ko) * 2023-10-18 2025-04-24 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 복막 섬유증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6416581A (en) * 1987-07-09 1989-01-20 Rikagaku Kenkyusho Frozen animal cell and production thereof
US5128259A (en) 1989-10-27 1992-07-07 Hahnemann University Factor-dependent hematopoietic cell line exhibiting epo-induced erythrocyte maturation
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
US5599705A (en) 1993-11-16 1997-02-04 Cameron; Robert B. In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells
WO1995017500A1 (en) 1993-12-23 1995-06-29 Abs Global, Inc. Embryonic stem cells as nuclear donors and nuclear transfer techniques to produce chimeric and transgenic animals
US5874301A (en) 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
US5914268A (en) 1994-11-21 1999-06-22 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
CA2278847A1 (en) 1997-01-31 1998-08-06 Hemosol Inc. Method for the production of selected lymphocytes
EP0983345A1 (en) 1997-05-21 2000-03-08 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Methods and compositions for making dendritic cells from expanded populations of monocytes and for activating t cells
US6429012B1 (en) 1997-10-06 2002-08-06 Viacell, Inc. Cell population containing non-fetal hemangioblasts and method for producing same
EP1108011A2 (en) 1998-06-08 2001-06-20 Osiris Therapeutics, Inc. In vitro maintenance of hematopoietic stem cells
WO1999067360A2 (en) 1998-06-25 1999-12-29 Hemosol Inc. Media and methods for expansion of erythroid stem cells for the production of hemoglobin
EP1270719A3 (en) 1998-08-24 2003-06-25 Viacell, Inc. Cell population containing non-fetal hemangioblasts and method for producing same
US20110171185A1 (en) 1999-06-30 2011-07-14 Klimanskaya Irina V Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof
WO2007019398A1 (en) 2005-08-03 2007-02-15 Advanced Cell Technology, Inc. Improved methods of reprogramming animal somatic cells
WO2001029206A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 Advanced Cell Technology, Inc. Methods of producing differentiated progenitor cells and lineage-defective embryonic stem cells
CN1423523A (zh) 1999-11-17 2003-06-11 罗切斯特大学 来自人体内的免疫系统
AU2927501A (en) 2000-01-07 2001-07-24 Oregon Health And Science University Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting
AU2001229731A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 The Johns Hopkins University School Of Medicine Human embryoid body-derived cells
US6602711B1 (en) 2000-02-21 2003-08-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making embryoid bodies from primate embryonic stem cells
JP2004504834A (ja) 2000-08-01 2004-02-19 イスム　リサーチ　ディベロップメント　カンパニー 胚性細胞の定方向分化
AU9109201A (en) 2000-09-18 2002-03-26 Organogenesis Inc Methods for treating a patient using a bioengineered flat sheet graft prostheses
EP1364197B1 (en) 2001-01-29 2010-04-14 Ivan N. Rich ATP-based assay for the determination of the proliferation status of hematopoietic stem and progenitor cells
WO2002078449A2 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Advanced Cell Technology, Inc. Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells
KR20020083634A (ko) 2001-04-27 2002-11-04 크레아젠 주식회사 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적조성물 및 이를 이용한 치료방법
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
US20050042751A1 (en) 2001-10-31 2005-02-24 Michel Goldman Generation and use of new types of dendritic cells
WO2003040319A2 (en) 2001-11-02 2003-05-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Endothelial cells derived from primate embryonic stem cells
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
MXPA04005010A (es) 2001-11-26 2005-04-08 Advanced Cell Tech Inc METODO PARA HACER Y USAR NUCLEOS CELULARES SOMáTICOS METODOS PARA HACER Y USAR NUCLEOS CELULARES SOMáTICOS HUMANOS REPROGRAMADOS Y CELULAS DEL TALLO HUMANAS AUTOLOGAS E ISOGENICAS.
IL162130A0 (en) 2001-12-07 2005-11-20 Robarts Res Inst Hematopoietic cells from human embryonic stem cells
EP1490107A4 (en) 2002-03-21 2005-11-09 Univ Florida MODULATION OF ANGIOGENESIS
EP1563058A4 (en) 2002-07-12 2005-12-28 Univ Singapore Haemangioblasts-Progenitor Cells
US20040052771A1 (en) 2002-07-12 2004-03-18 Lim Sai Kiang Hemangioblast progenitor cells
AR047712A1 (es) 2002-09-07 2006-02-15 Royal Veterinary College Metodo de tratamiento de una lesion de tejido esqueletico blando natural administrando una composicion de celulas madre mesenquimatosas
US7427603B2 (en) 2002-09-26 2008-09-23 The Children's Medical Center Corporation Method of enhancing proliferation and/or hematopoietic differentiation of stem cells
WO2004029231A1 (en) 2002-09-26 2004-04-08 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions and methods for amplification of human stem cells
WO2004044146A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 Piniella Carlos J Pluripotent cells from monocytes, and methods of making and using pluripotent cells
US20040156878A1 (en) 2003-02-11 2004-08-12 Alireza Rezania Implantable medical device seeded with mammalian cells and methods of treatment
US20050032210A1 (en) 2003-03-18 2005-02-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method of preparing immuno-regulatory dendritic cells and the use thereof
JP2006525006A (ja) 2003-05-08 2006-11-09 セルアーティス アーベー 閉塞ストローガラス化方法を利用するヒト胚盤胞由来幹細胞の低温保存法
US20040229350A1 (en) 2003-05-12 2004-11-18 Nikolai Strelchenko Morula derived embryonic stem cells
WO2005040391A1 (en) 2003-10-27 2005-05-06 Murdoch Childrens Research Institute Compositions and methods for differentiating stem cells
WO2005049812A1 (en) 2003-11-19 2005-06-02 Australian Stem Cell Centre Limited Methods for producing blood products from pluripotent cells in cell culture
JP2007520462A (ja) 2003-12-19 2007-07-26 バイアセル インコーポレーティッド ヒト臍帯血由来多能性細胞の疾患の処置のための使用方法
CN1286970C (zh) 2003-12-30 2006-11-29 上海伯瑞生物技术发展有限公司 由脐血cd34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法
NZ548623A (en) 2004-01-02 2010-04-30 Advanced Cell Tech Inc Novel culture systems for ex vivo development of stem cells in telolecithal or eutelolecithal eggs
KR100535326B1 (ko) 2004-01-20 2005-12-09 한국생명공학연구원 줄기 세포로부터 자연살해 세포로의 분화 조절용 유전자를유효성분으로 포함하는 분화 조절제
EP2929782A1 (en) 2004-01-23 2015-10-14 Ocata Therapeutics, Inc. Improved modalities for the treatment of degenerative diseases of the retina
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
EP1713903A2 (en) 2004-02-09 2006-10-25 Indiana University Research and Technology Corporation Isolation, expansion and use of clonogenic endothelial progenitor cells
US20080095749A1 (en) * 2004-03-22 2008-04-24 Sudeepta Aggarwal Mesenchymal stem cells and uses therefor
EP3461884B1 (en) 2004-03-22 2025-05-28 Mesoblast International Sàrl Mesenchymal stem cells and uses therefor
EP1735429A4 (en) 2004-03-31 2008-06-11 Newlink Genetics Corp METHOD AND COMPOSITIONS FOR OBTAINING EMBRYONAL STEM CELLS OF ABSTINENT HEMATOPOETIC STEM CELLS AND USES THEREOF
CA2563872C (en) 2004-05-07 2014-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of forming mesenchymal stem cells from embryonic stem cells
WO2005108981A1 (en) 2004-05-12 2005-11-17 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of cell isolation
EP1753859B1 (en) 2004-06-04 2014-07-30 Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) A method for producing red blood cells
WO2006001120A1 (ja) 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤
CN101506355B (zh) 2004-09-24 2012-06-27 成血管细胞系统公司 多能扩增间充质前体细胞子代（memp）及其应用
AU2005302258B2 (en) 2004-11-01 2010-10-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Platelets from stem cells
US7893315B2 (en) 2004-11-04 2011-02-22 Advanced Cell Technology, Inc. Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells
US20080166751A1 (en) 2005-02-23 2008-07-10 Takayuki Asahara Method of Analyzing Dynamics in the Differentiation of Vascular Endothelial Progenitor Cells
EP1860180A4 (en) 2005-02-23 2009-03-11 Found Biomedical Res & Innov METHOD FOR THE AMPLIFICATION OF AN ENDOTHEL PREPARATION CELL IN VITRO
JP2006230316A (ja) * 2005-02-25 2006-09-07 Japan Health Science Foundation 瘢痕のない創傷治癒能を有する細胞およびその調製方法
DK1863905T3 (en) 2005-03-17 2016-04-04 Ucl Business Plc PROCEDURE FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS USING VITRO TUMOR CELL PREPARATIONS
JP5020935B2 (ja) 2005-04-08 2012-09-05 アルゴス セラピューティクス，インコーポレイティド 樹状細胞組成物および方法
CA2609541A1 (en) 2005-05-27 2006-12-07 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for identifying ligands for stem cells and cells derived therefrom
AU2006252576B2 (en) 2005-06-01 2011-01-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of forming dendritic cells from embryonic stem cells
WO2007005595A1 (en) 2005-07-05 2007-01-11 The New England Medical Center Hospitals, Inc. Pregnancy-associated progenitor cells
US8198085B2 (en) 2005-08-03 2012-06-12 Core Dynamics Limited Somatic cells for use in cell therapy
US9121008B2 (en) 2005-08-31 2015-09-01 University Of Utah Research Foundation Development of natural killer cells and functional natural killer cell lines
WO2008020815A1 (en) 2006-08-15 2008-02-21 Agency For Science, Technology And Research Mesenchymal stem cell conditioned medium
EP1789435B1 (en) 2005-09-12 2010-02-24 Industry Foundation of Chonnam National University A method for production of mature natural killer cell
JP2007089432A (ja) 2005-09-27 2007-04-12 Reprocell Inc 幹細胞由来血小板産生増加法
PL1941027T3 (pl) 2005-09-28 2015-01-30 Ipd Therapeutics B V Metody i środki do proliferacji komórek macierzystych oraz wytwarzania i ekspansji komórek progenitorowych, a także produkcji komórek efektorowych jako leków klinicznych
US20090271335A1 (en) 2005-10-20 2009-10-29 Advanced Cell Technology, Inc. Totipotent, Nearly Totipotent or Pluripotent Mammalian Cells Homozygous or Hemizygous for One or More Histocompatibility Antigent Genes
US8460928B2 (en) 2005-10-24 2013-06-11 Agency For Science, Technology And Research Methods of specifying mesodermal, endodermal and mesoendodermal cell fates
WO2007062198A1 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Advanced Cell Technology, Inc. Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US20070258963A1 (en) 2006-01-13 2007-11-08 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells expressing TNF-alpha receptors
AU2007215276B2 (en) 2006-02-09 2013-09-19 Maryna E. Gumenyuk Erythroid cells producing adult-type beta-hemoglobin generated from human embryonic stem cells
EP1991664B1 (en) * 2006-02-16 2018-03-28 Ospedale San Raffaele S.r.l. Skeletal muscle periangioblasts and cardiac mesangioblasts, method for isolation and uses thereof
WO2007099337A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-07 Cartela R&D Ab Expansion and differentiation of mesenchymal stem cells
CN101045914A (zh) 2006-03-29 2007-10-03 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 体外诱导造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法与应用
CN101045915A (zh) 2006-03-29 2007-10-03 旭日干 一种卵母细胞生发泡移植技术
CN106434527A (zh) 2006-04-14 2017-02-22 安斯泰来再生医药协会 血管瘤集落形成细胞
NZ572842A (en) 2006-04-14 2012-01-12 Advanced Cell Tech Inc Hemangio-colony forming cells
AU2013201444B2 (en) 2006-04-14 2015-01-22 Astellas Institute For Regenerative Medicine Hemangio-colony forming cells
KR100791487B1 (ko) * 2006-05-29 2008-01-03 연세대학교 산학협력단 제대혈로부터 간엽줄기세포의 분리 및 배양 방법
US20070298496A1 (en) 2006-06-23 2007-12-27 Hung-Chih Kuo Method of deriving pluripotent stem cells from a single blastomere
PT2578081E (pt) 2006-10-11 2016-06-17 Massachusetts Inst Technology Composições, métodos e dispositivos para o tratamento de doenças hepáticas
WO2008067142A2 (en) 2006-11-08 2008-06-05 Wisconsin Alumni Research Foundation In vitro differentiation of hematopoietic cells from primate embryonic stem cells
EP2088190A4 (en) 2006-11-09 2011-01-05 Japan Government METHOD FOR THE CULTURE AND PASSING OF AN EMBRYONAL PRIMATIVE STEM CELL AND METHOD FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF THE EMBRYONAL STEM CELL
DE102006054041B3 (de) 2006-11-16 2008-05-08 Pierburg Gmbh Regelvorrichtung für eine Verbrennungskraftmaschine
US8796021B2 (en) 2007-02-23 2014-08-05 Advanced Cell Technology, Inc. Blastomere culture to produce mammalian embryonic stem cells
WO2008150368A1 (en) 2007-05-24 2008-12-11 Apceth Gmbh & Co. Kg Cd34 stem cell-related methods and compositions
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
WO2008151386A1 (en) 2007-06-15 2008-12-18 Australian Stem Cell Centre Ltd Megakaryocyte differentiation
US9095562B2 (en) 2007-07-05 2015-08-04 Regenerative Sciences, Inc. Methods and compositions for optimized expansion and implantation of mesenchymal stem cells
US9381216B2 (en) 2007-08-06 2016-07-05 Mesoblast, Inc. Methods of generating, repairing and/or maintaining connective tissue in vivo
KR101039235B1 (ko) * 2007-08-29 2011-06-07 메디포스트(주) 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는치료용 조성물
US7615374B2 (en) 2007-09-25 2009-11-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of clonal mesenchymal progenitors and mesenchymal stem cell lines under serum-free conditions
US20110236971A2 (en) * 2007-09-25 2011-09-29 Maksym Vodyanyk Generation of Clonal Mesenchymal Progenitors and Mesenchymal Stem Cell Lines Under Serum-Free Conditions
NZ599825A (en) 2007-09-28 2014-10-31 Anthrogenesis Corp Tumor suppression using human placental perfusate and human placenta-derived intermediate natural killer cells
DK2209888T3 (da) 2007-10-12 2020-01-20 Astellas Inst For Regenerative Medicine Forbedrede fremgangsmåder til fremstilling af rpe-celler og sammensætninger af rpe-celler
US20100304480A1 (en) 2007-10-19 2010-12-02 Goodell Margaret A Hematopoietic Fingerprints: Methods of Use
US9683232B2 (en) 2007-12-10 2017-06-20 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
US8685728B2 (en) 2008-01-31 2014-04-01 Rutgers The State University Of New Jersey Kit containing stem cells and cytokines for use in attenuating immune responses
US10046011B2 (en) 2008-01-31 2018-08-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions for inducing or suppressing an immune response
WO2009101210A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Bone Therapeutics Pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of osteoarticular diseases
WO2009104825A1 (en) * 2008-02-18 2009-08-27 Kaist Method for inducing the defferentiation of embryonic stem cells into hemangioblast
CA3186451A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Astellas Institute For Regenerative Medicine Hemangio colony forming cells and non-engrafting hemangio cells
US20110086424A1 (en) * 2008-05-06 2011-04-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enucleated erythroid cells derived from pluripotent stem cells
JP6097479B2 (ja) 2008-05-07 2017-03-15 ボーン セラピューティクス エス．アー． 新規の間葉系幹細胞及び骨形成性細胞
JP2011529706A (ja) * 2008-08-04 2011-12-15 アローキュア インコーポレイテッド 間充織間質細胞集団、ならびにそれを単離および使用する方法
EP2324109B1 (en) 2008-09-03 2016-10-26 Mesoblast, Inc. Expansion of haemopoietic precursors
FR2938947B1 (fr) 2008-11-25 2012-08-17 A Volute Procede de traitement du signal, notamment audionumerique.
EP2221362A1 (en) 2009-02-19 2010-08-25 Naturin GmbH & Co Method for the cryopreservation of cells, artificial cell constructs or three-dimensional complex tissues assemblies
KR101720961B1 (ko) 2009-02-27 2017-03-29 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 다능성 세포의 분화
CA2756670A1 (en) 2009-03-26 2010-09-30 The Regents Of The University Of California Mesenchymal stem cells producing inhibitory rna for disease modification
JP2010252778A (ja) * 2009-04-02 2010-11-11 Shizui Bank Kk 歯髄由来間葉系幹細胞の分離方法及び分離した幹細胞並びにそれらを用いた肝細胞系譜への分化
EP3150703A1 (en) 2009-07-09 2017-04-05 TiGenix, S.A.U. Cells for use in a method for treating inflammatory and/or immune disorders
EP2485741A4 (en) * 2009-10-06 2013-07-24 Cohen Mcniece Foundation PREPARATION AND USE OF STROMAL CELLS FOR THE TREATMENT OF CARDIAC DISORDERS
WO2011047345A2 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Tai June Yoo Methods of treating diseases of conditions using mesenchymal stem cells
WO2011053860A2 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Allocure, Inc. Mesenchymal stromal cell populations and methods of using same
IL281453B (en) 2009-11-17 2022-07-01 Astellas Inst For Regenerative Medicine Methods for preparing human rpe cells and pharmaceutical preparations of human rpe cells
US8900860B2 (en) * 2009-11-30 2014-12-02 National Yang-Ming University Method for expanding mesenchymal stem cells in low-density and hypoxic culture
CA3080368A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Stem Cell & Regenerative Medicine International, Inc. Method of generating natural killer cells and dendritic cells from human embryonic stem cell-derived hemangioblasts
KR20180086301A (ko) 2009-12-04 2018-07-30 스템 셀 앤드 리제너러티브 메디신 인터내셔날, 인크. 기질 없는 조건 하에서 인간 배아줄기세포로부터 기능적 거핵구 및 혈소판의 대규모 생성
AU2011213081A1 (en) * 2010-02-02 2012-08-23 University Of Rochester Methods of isolating and culturing mesenchymal stem cells
EP2363136A1 (en) * 2010-03-02 2011-09-07 Fresenius Medical Care Deutschland GmbH Microvesicles (MVs) derived from adult stem cells for use in the therapeutic treatment of a tumor disease
EP2545928B1 (en) 2010-03-10 2016-07-20 Two Cells Co., Ltd Cell preparation containing mesenchymal stem cells, and method for producing same
WO2011124741A1 (es) 2010-04-08 2011-10-13 Fundación Progreso Y Salud Uso de un medio de cultivo condicionado por células madre mesenquimales para la diferenciación de células madre pluripotentes humanas
WO2011139132A2 (ko) 2010-05-07 2011-11-10 한국생명공학연구원 줄기세포로부터 생성된 배아체를 대량 증식 및 유지하는 방법
EP2620156B1 (en) 2010-08-23 2019-03-27 Kang Stem Biotech Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases or inflammatory diseases, containing stem cells treated with nod2 agonist or cultured product thereof
US20120087868A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Gabriele Todd Nanoparticle-loaded cells
KR20120095022A (ko) 2011-02-18 2012-08-28 가톨릭대학교 산학협력단 간엽줄기세포 및 면역조절 ｔ 세포를 유효성분으로 포함하는 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
SI2785359T1 (sl) 2011-11-30 2018-11-30 Astellas Institute For Regenerative Medicine Mezenhimske stromalne celice in uporabe povezane z njimi
US8961956B2 (en) 2011-11-30 2015-02-24 Ocata Therapeutics, Inc. Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
KR101477016B1 (ko) 2012-01-19 2014-12-29 (주)차바이오텍 인간 배아줄기세포 유래 혈관주위 전구세포의 제조방법 및 이를 포함하는 세포치료 조성물
HK1208054A1 (en) 2012-07-12 2016-02-19 爱姆斯坦生物技术公司 Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof
DK2931877T3 (da) 2012-12-14 2019-11-04 Univ Rutgers Fremgangsmåder, som modulerer stamcellers immunregulerende virkning
CA2901653C (en) 2013-03-01 2019-01-08 Gunther Eissner Protection of the vascular endothelium from immunologically mediated cytotoxic reactions with human cd34-negative progenitor cells
KR101669124B1 (ko) 2013-07-11 2016-10-25 서울대학교병원 인간 배아줄기세포에서 유래된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 간섬유화 또는 간경화 예방 및 치료용 조성물
EP3052943B1 (en) 2013-10-04 2019-11-20 Cell Ideas Pty Ltd. Biomarkers for cell therapy
US10047344B2 (en) 2014-02-18 2018-08-14 National University Of Singapore Biophysically sorted osteoprogenitors from culture expanded bone marrow derived mesenchymal stromal cells (MSCs)
US10624930B2 (en) 2014-06-10 2020-04-21 Mesoblast International Sarl Treatment of immune disorders
JP6459257B2 (ja) 2014-07-08 2019-01-30 富士ゼロックス株式会社 画像形成装置
US20170204151A1 (en) 2014-07-28 2017-07-20 Darwin J. Prockop Mesenchymal Stem Cells Expressing Biomarkers that Predict the Effectiveness of Mesenchymal Stem Cells for Treating Diseases and Disorders
US11707488B2 (en) 2015-08-28 2023-07-25 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. ROR1-positive mesenchymal stem cells and method for preparing same, pharmaceutical composition containing ROR1-positive mesenchymal stem cells and method for preparing same, and method for preventing or treating disease using ROR1-positive mesenchymal stem cells
EP3369810A4 (en) 2015-10-27 2019-05-01 Kaneka Corporation METHOD FOR PRODUCING CELL POPULATION WITH MESENCHYMAL STEM CELLS, MESENCHYMAL STEM CELLS, CELL POPULATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION
KR102676761B1 (ko) 2015-12-03 2024-06-18 다카라 바이오 가부시키가이샤 중간엽 줄기세포의 제조방법
US11174461B2 (en) 2016-03-16 2021-11-16 Cynata Therapeutics Limited Colony forming medium and use thereof
US11179420B2 (en) 2016-04-27 2021-11-23 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treating a disease, comprising administering mesenchymal stem cells or culture supernatant thereof to a subject
KR101816246B1 (ko) 2016-09-07 2018-01-08 에스씨엠생명과학 주식회사 염증 자극된 중간엽 줄기세포를 포함하는 면역질환 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CA3042031A1 (en) 2016-10-27 2018-05-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Immunosuppressive mesenchymal cells and methods for forming same
CA3046576A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Health And Biotech France (H & B France) Perinatal tissue derived mesenchymal stem cells: method of preparation and uses thereof
CN110494556B (zh) 2017-04-03 2024-04-30 株式会社钟化 包含间充质系干细胞的细胞群、其制造方法、以及医药组合物
JP7132908B2 (ja) 2017-04-03 2022-09-07 株式会社カネカ 間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物
SG11201909856XA (en) 2017-05-04 2019-11-28 Mesoblast Int Sarl Mesenchymal lineage precursor or stem cells with enhanced immunosuppression

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200051827A (ko) 2020-05-13
US20160038543A1 (en) 2016-02-11
EP2785359A1 (en) 2014-10-08
AU2012345630A1 (en) 2014-07-17
CN108478599B (zh) 2022-08-02
HUE040566T2 (hu) 2019-03-28
JP2019142958A (ja) 2019-08-29
AU2019264631A1 (en) 2019-12-05
KR102811933B1 (ko) 2025-05-23
JP2024067032A (ja) 2024-05-16
TW202344258A (zh) 2023-11-16
JP2022027796A (ja) 2022-02-14
US20170252374A1 (en) 2017-09-07
PT2785359T (pt) 2018-11-06
PL2785359T3 (pl) 2018-12-31
AU2017239526A1 (en) 2017-10-26
DK2785359T3 (en) 2018-10-29
LT2785359T (lt) 2018-11-12
US8962321B2 (en) 2015-02-24
KR102525175B1 (ko) 2023-04-21
SI2785359T1 (sl) 2018-11-30
TW202537630A (zh) 2025-10-01
CN104136034A (zh) 2014-11-05
CN108478599A (zh) 2018-09-04
AU2022202639B2 (en) 2025-06-12
EP3449929A1 (en) 2019-03-06
CA2857545A1 (en) 2013-06-06
US20250090590A1 (en) 2025-03-20
US20210182552A1 (en) 2021-06-17
US20130183272A1 (en) 2013-07-18
ES2690212T3 (es) 2018-11-19
TWI698242B (zh) 2020-07-11
EP3449929B1 (en) 2025-11-19
CY1122275T1 (el) 2020-07-31
AU2022202639A1 (en) 2022-05-12
KR20210044904A (ko) 2021-04-23
JP2018027954A (ja) 2018-02-22
HK1202798A1 (en) 2015-10-09
EP2785359B1 (en) 2018-08-29
KR102108245B1 (ko) 2020-05-08
AU2017239526B2 (en) 2019-08-15
JP7777430B2 (ja) 2025-11-28
US12097223B2 (en) 2024-09-24
TWI698527B (zh) 2020-07-11
TW202037373A (zh) 2020-10-16
TW201815399A (zh) 2018-05-01
HRP20181515T1 (hr) 2018-11-16
JP6983195B2 (ja) 2021-12-17
KR102246369B1 (ko) 2021-04-29
AU2019264631B2 (en) 2022-01-20
KR20230059838A (ko) 2023-05-03
CN104136034B (zh) 2018-04-24
EP2785359A4 (en) 2015-11-11
WO2013082543A1 (en) 2013-06-06
TWI812867B (zh) 2023-08-21
JP2015500810A (ja) 2015-01-08
JP6526130B2 (ja) 2019-06-05
KR20140127209A (ko) 2014-11-03
TW201331365A (zh) 2013-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022202639B2 (en) Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
US12465621B2 (en) Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
HK40003685A (en) Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
HK40003685B (en) Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
HK1202798B (en) Mesenchymal stromal cells and uses related thereto