RS57978B1

RS57978B1 - Inhibotori pirimidinil tirozin kinaze

Info

Publication number: RS57978B1
Application number: RS20180950A
Authority: RS
Inventors: Brian T Hopkins; Patrick Conlon; Timothy R Chan; Tracy J Jenkins; Xiongwei Cai; Michael Humora; Xianglin Shi; Ross A Miller; Andrew Thompson
Original assignee: Biogen Ma Inc; Sunesis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2019-01-31
Also published as: LT2858499T; BR112014030655B1; ES2684268T3; JP2015518903A; AU2017201536B2; US9394277B2; NZ702715A; TWI792158B; EA027823B1; CY1120638T1; CN104540385B; DK2858499T3; JP2023052415A; US20190047986A1; IN2014DN10576A; KR20150036020A; AR091273A1; TW202142535A; HK1209284A1; AU2017201536A1

Description

Opis

Unakrsna referenca sa srodnim prijavama

[0001] Predmetna prijava traži pravo prvenstva U.S. privremene prijave 61/657,360, podnete 8 juna 2012.

Oblast pronalaska

[0002] Tec – kinaze su nereceptorske tirozin kinaze uključujući: Tec (tirozin kinaza eksprimovana u hepatocelularnom karcinomu), Btk (Bruton's tirozin kinaza), Itk (interleukin-2 (IL-2)-induciblilna T-ćelijska kinaza; takođe poznata kao Emt ili Tsk), Rlk (mirujuća limfocit kinaza; takođe poznata i kao Txk), Lck (limfocit-specifična protein tirozin kinaza) i Bmx (tirozin kinaza gena koštane srži na hromozomu X; takođe poznata i kao Etk)). Ove kinaze prvenstveno se eksprimiraju u hematopoietskim ćelijama, iako je ekspresija Bmx i Tec detektovana u endotelnim ćelijama i ćelijama jetre. Tec kinaze (Itk, Rlk i Tec) su eksprimirane u T ćelijama i sve su aktivirane nizhodno od receptora T- ćelija (TCR). Btk je nishodno medijator receptora B ćelija (BCR) čija je signalizacija uključena u regulaciju aktivacije, proliferacije i diferencijacije B ćelija. Detaljnije, Btk sadrži domen PH koji vezuje fosfatidilinozitol (3,4,5)-trisfosfat (PIP3). Vezivanje PIP3 indukuje Btk da fosforiluje fosfolipazu C (PLCγ), koja s druge strane hidrolizuje PIP2 za proizvodnju dva sekundarna mesendžera, inzitol trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG), koji aktiviraju protein kinazi PKC, koja zatim indukuje dodatnu signalizaciju B-ćelija. Mutacije koje onemogućavaju enzimsku aktivnost Btk dovode do XLA sindroma (X-vezana agamaglobulinemija), primarna imunodeficijencija. Zbog kritične uloge koje Tec kinaze imaju u signalizaciji B-ćelija i T-ćelija , Tec kinaze su ciljevi od interesa za autoimunske poremećaje. Jedinjenja korisna kao inhibitori Btk opisana su na primer u WO 2011/029046.

[0003] Shodno ovom, postoji potreba u tehnici za efiaksnim inhibitorima Tec kinaza kao što je Btk. Predmetni pronalazak ispunjava ove i ostale potrebe.

Opis pronalaska

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde R<1>i Prsten A su kao što je definisano u zahtevu 1. Ova jedinjenja su inhibitori familije Tec kinaza, uključujući Btk. Shodno tome, data jedinjenja se mogu upotrebiti u raziličitim metodama uključujući in vitro testove skrininga i aktivnosti kao i in vivo pred-klinička, klinička i terapeutska ispitivanja, kao što je ovde detaljno opisano.

[0005] U određenim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže data jedinjenja.

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja za upotrebu u metodi smanjenja enimske aktivnosti Btk.

[0007] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja za upotrebu u postupku lečenja poremećaja osetljivih na inhibiciju Btk kod subjekta kojem je to potrebno. Ovi poremećaji i postupci opisani su ovde detaljno opisani.

Detaljan opis određenih realizacija

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; gde:

svaka R<1>je nezavisno vodonik, po izboru supstituisana C1-6alifatična grupa, po izboru supstituisana 3-7 –člana heterociklična grupa ili po izboru supstituisana heterociklilalkil grupa sa 3-7 atoma ugljenika i 1-3 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika ili sumpora; ili dve R<1>grupe zajedno sa svojim atomima obrazuju po izboru supstituisan 3-7-člani zasićen ili nezasićen monocikličan heterocikličan prsten sa 1-2 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika ili sumpora; pri čemu po izboru supstituisane grupe mogu da budu supstituisane halogenom, sa

-NO2, -CN, -OR, - SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -N(R)C(O)OR, -C(O)N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, ili -S(O)2N(R)2;

svaka R je nezavisno vodonik ili C1-6alifatična grupa; ili dve R grupe vezane za isti vodonik zajedno sa svojim obuhvaćenim atomima formiraju po izboru supstituisan 3-7 člani zasićen ili delimično nezasićen monocikličan heterocikličan prsten sa 1-2 heteroatoma, gde je svaki drugi heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika ili sumpora;

Prsten A is

R<2>je -Cl ili -F; i

R<3>je -CF3, -OCF3, ili -F.

Definicije

[0009] Jedinjenja predmetnog pronalaska uključuju ona koja su prethodno opisana uopšteno i dalje su ilustrovana klasama, podklasama i vrstama koje su ovde opisane. Kao što je ovde korišćeno, primenjuju se sledeće definicije, osim ako nije drugačije naznačeno. Za potrebe ovog pronalaska, hemijski elementi su identifikovani u skladu sa Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. Dodatno, opšti principi organske hemije opisani su u "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, and "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001.

[0010] Skraćenice koje se ovde koriste imaju svoje konvencionalno značenje u okviru hemijskih i bioloških nauka. Ovde date hemijske strukture i formule izrađene su u skladu sa standardnim pravilima hemijske valence poznate u hemiji.

[0011] Izraz "alifatičan" ili "alifatična grupa", kao što je ovde upotrebljen, označava ugljovodonik sa pravim lancem (tj. nerazgranat) ili razgranat, supstituisan ili nesupstituisan ugljovodoničan lanac koji je potpuno zasićen ili sadrži jednu ili više nezasićenosti ili monocikličan ugljovodonik ili bicikličan ugljovodonik koji je potpuno zasićen ili koji sadrži jednu ili više nezasićenosti, ali koji nije aromatičan (ovde takođe naveden kao "karbocikl," "cikloalifatičan" ili "cikloalkil"), koji ima jednu tačku vezivanja za ostatak molekula. Osim ako je drugačije naznačeno, alifatične grupe sadrže 1-6 alifatičnih atomau ugljenika. U nekim realizacijama, alifatične grupe sadrže 1-5 alifatičnih atoma ugljenika. U drugim realizacijama, alifatične grupe sadrže 1-4 alifatična atoma ugljenika. U nekim realizacijama, alifatične grupe sadrže 1-3 alifatična atoma ugljenikai u drugm realizacijama, alifatične grupe sadrže 1-2 alifatična atoma ugljenika. Odgovarajuće alifatične grupe su, ali ne isključivo, linearne ili razgranate, supstituisane ili nesupstituisane alkil, alkenil, alkinil grupe ili njihovi hibridi poput (cikloalkil)alkila, (cikloalkenil)alkila ili (cikloalkil)alkenila.

[0012] Kao što je ovde upotrebljem, izraz "cikloalifatičan" (ili "karbocikl" ili "cikloalkil") odnosi se na monocikličan C3-C6ugljovodonik koji je potpuno zasićen ili koji sadrži jedno ili više nezasićenja, ali koji nije aromatičan, te koji ima jednu tačku vezivanja za ostatak molekula.

[0013] Kao što su ovde upotrebljeni, izrazi "heterocikl," "heterociklil," i "heterociklični prsten" korišćeni su naizmenično i odnose se na odgovarajuće 3- do 7-člane monociklične heterociklične grupe koje su ili zasićene ili delimično nezasićene ili imaju, pored ugljenikoviih atoma, jedan iil više, poželjno jedan do četiri heteroatoma, kao što je prethodno definisano. Izraz “azot” kada se odnosi na atom u prstenu heterocikla , izraz "azot" uključuje obuhvata supstituisan azot. Kao primer, u zasićenom ili delimično nezasićenom prstenu sa 0-3 heteroatoma odabrana od kiseonika, sumora ili azota, azot može da bude N (kao u 3,4-dihidro-2H-pirolilu), NH (kao u pirolidinilu), ili<+>NR (kao u N-supstituisanom pirolidinilu). Izraz "heterociklilalkil" odnosi se na alkil grupu supstituisanu heterociklilom, gde alkil i heterociklil delovi su nezavisno po izboru supstituisani.

[0014] Heterocikličan prsten može se vezati za svoju viseću grupu na bilo kom heteroatomi ili ugljenikovom atomu što dovodi do stabline strukture i bilo koji od ugljenikovih atoma može po izboru da bude supstituisan. Primeri ovih zasićenih ili delimično nezasićenih heterocikličnih radikala su, bez ograničenja, tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofenil pirolidinil, piperidinil, pirolinil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil, dekahidrohinolinil, oksazolidinil, piperazinil, dioksanil, dioksolanil, diazepinil, oksazepinil, tiazepinil, morfolinil, i hinuklidinil.

[0015] Kao što je ovde korišćen, izraz "delimično nezasićen" odnosi se prstenast ostatak koji sadrži jednu dvostruku ili trostruku vezu. Izraz "delimično nezasićen" namenjen je da obuhvati prstenove sa većim brojem nezasićenja, ali ne obuhvata aril ili heteroaril ostatke, kao što je ovde definisano.

[0016] Izraz "heteroatom" označava jedan ili više kiseonika, sumpora, azota, fosfora, ili silicijum (uključujući, bilo koji oksidovani oblik azota, sumpora, fosfora ili silicijuma; kvaterniziran oblik bilo kog baznog azota ili; odgovarajućeg azota u heterocikličnom prstenu, na primer N (kao u 3,4-dihidro-2H-pirolilu), NH (kao u pirolidinilu) ili NR<+>(kao u N-supstituisanom pirolidinilu)).

[0017] Kao što je ovde korišćen, izraz "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na one soli koje su u okviru smislenog medicinskog rasuđivanja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi ili nižih životinja bez nepotrebne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora i slično i primere su razcionalnom odnosu koristi/rizika.

Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u tehnici. Na primer, S. M. Berge et al., detaljno opisuje farmaceutski prihvatljive soli u J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19.

[0018] U određenim realizacijama, neutralni oblici jedinjenja su regenerisani reakcijom soli sa bazama ili kiselinama i izolovanjem osnovnog jedinjenja na uobičajeni način. U nekim realizacijama, oblik osnovnog jedinjenja razlikuje se od različitih oblika soli po karakterističnim fizičkim osovinama, kao što je rastvorljivost u polarnim rastvaračima.

[0019] Osim ako je drugačije dato, ovde prikazane strukture takođe obuhvataju sve izomere (npr., enantiomerne, diastereomerne i geometrijske (ili konformacione)) oblike struktura; na primer, R i S konfiguracije za svaki asimetričan centar, izomeri Z i E na dvostrukoj vezi, i Z i E konformacioni izomeri. Tako, pojedinačni stereohemijski izomeri kao i enantiomerne, diastereomerne i geometrijske (ili konformacione smeše) predmetnog jedinjenja su obuhvaćena obimom pronalaska. Osim ako je drugačije naznačeno, svi tautomerni oblici jedinjenja pronalaska su obuhvaćeni obimom pronalaska. Dodatno, osim ako je drugačije naznačeno, ovde opisane strukture takođe uključuju jedinjenja koja se razlikuju samo po prisustvu jednog ili više izotopno obogaćenih atoma. Na primer, jedinjenja sa datim strukturama uključujući i zamenu vodonika deuterijumom ili tricijumom, ili zamenu ugljenika sa<13>C- ili<14>C-obogaćenim ugljenikom su obuhvaćena obimom predmetnog pronalaska. Ova jedinjenaj su korisna, na primer, kao analitička sredstva, kao probe u biološkim testovima, ili kao terapeutski agensi u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Jedinjenja

[0020] Kao što je prethodno opisano, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde R<1>i prsten A su kao što je definisano u zahtevu 1.

[0021] Za jedinjenja formule I neočekivano je pronađeno da ispoljavaju povoljne osobine u odnosu na poznate inhibitore Btk. U određenim realizacijama, jedinjenja formule I imaju povećanu jaćinu/potentnost. Bez želje za vezivanjem za bilo koju posebnu teoriju, pretpostavlja se da ovde opisana jedinjenja poseduju poboljšanu jačinu kao inhibitori Btk, poboljšan nespecifičan (off-target) profil kao što je mereno inhibicijom hERG ili testom indukcije PXR ili njihovom kombinacijom.

Eksperimentalni podaci koji pokazuju pogodne osobine dati su u pratećim Primerima.

[0022] U nekim realizacijama, oba R<1>je vodonik. U drugim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno C1-6alifatičan. U nekim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno C1-5alifatičan. U drugim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno C1-4alifatičan. U nekim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno C1-3alifatičan. U drugm realizacijama, svaki R<1>je nezavisno C1-2alifatičan. U nekim realizacijama, oba R<1>su metil.

[0023] U nekim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno vodonik ili C1-6alifatična grupa. U drugim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno vodonik ili C1-5alifatična grupa. U određenim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno vodonik ili C1-4alifatična grupa. U nekim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno vodonik ili C1-3alifatična grupa. U drugim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno vodonik ili C1-2alifatična grupa. U određenim realizacijama, svaki R<1>je nezavisno vodonik ili metil.

[0024] U određenim realizacijama, jedan R<1>je vodonik a drugi R<1>je C1-6alifatična grupa. U nekim realizacijama, jedan R<1>je vodonik i drugi R<1>je metil. U sledećim realizacijama, jedan R<1>je vodonik, a drugi R<1>je etil. U nekim realizacijama, jedan R<1>je vodonik, a drugi R<1>je C1-6(cikloalkil)alkil. U određenim realizacijama, jedan R<1>je vodonik, a drugi R<1>je C1-6(cikloalkil).

[0025] U određenim realizacijama, jedan R<1>je vodonik za drugi R<1>je C1-6alifatična grupa po izboru supstituisana sa -OR, gde R je vodonik ili C1-6alifatična grupa.

[0026] U nekim realizacijama, jedan R<1>je vodoniki drugi R<1>je heterociklilalkil grupa sa 3-7 atoma ugljenika i 1-3 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika ili sumpora. U određenim realizacijama, jedan R<1>je vodonik, a drugi R<1>je po izboru supstituisan 3-7 članim monocikličnim heterociklom.

[0027] U nekim realizacijama, sve R<1>grupe zajedno sa svojim atomima koje uključuju, obrazuju po izboru supstituisan 3-5 člani zasićen ili delimično nezasićen monocikličan heterocikličan prsten sa 1-2 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika ili sumpora. U određenim realizacijama, dve R<1>grupe zajedno sa svojim atomima uključuju, obrazuju po izboru supstituisana piperazin prsten.

[0028] Kao što je prethodno opisano, prsten A je

[0029] U određenim realizacijama, R<2>je -Cl. U drugim realizacama, R<2>je -F. U nekim realizacijama, R<3>je -CF3. U određenim realizacijama, R<3>je -OCF3. U nekim realizacijama, R<3>je -F.

[0030] U nekim realizacijama, prsten A je odabran iz grupe koju čine:

[0031] U određenim realizacijama, u ovde opisanim jedinjenjima postoji trans stereohemijski odnos između supstituenta piperidina sa karboksamidnom grupom i supstituenat piperidina sa laktamskom grupom.

[0032] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule II-a:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde je svaki od R<1>, R<2>i R<3>kao što je prethodno definisano u klasama i podklasama.

[0033] U određenim realizacijama predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule II-b:

[0034] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule III:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde je svaki od R<2>i R<3>kao što je prethodno definisano u klasama i podklasama.

[0035] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule IV:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde je svaki od R<1>i R<3>kao što je prethodno definisano u klasama i podklasama. U određenim realizacijama, oba R<1>su vodonik. U pojedinim realizacijama, jedan R<1>je vodonik, adrugi R<1>je metil.

[0036] U pojedinim realizacijama, dato jedinjenje je jedinjenje dato u Tabeli 1, u daljem tekstu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0037] Jedinjenja pronalaska su sintetisana odgovarajućom kombinacijom opšte poznatih metoda sinteze. Tehnike su korisne u sintezi jedinjenja pronalaska su i jasne i dostupne stručnjacima u relevantnoj tehnici. Opis koji sledi je ponuđen kako bi ilustrovao određene raznovrsne metode dostupne za upotrebu u dobijanju jedinjenja pronalaska. Međutim, opis nije namenjen definisanju obima reakcija ili reakcionih sekvenci koje su korisne za dobijanje jedinjenja predmetnog pronalaska.

[0038] Jedinjenja formule I mogu se genralno dobiti prema Shemi 1.

[0039] Jedinjenja formule I takođe se mogu dobiti i prema Shemama 2, 3, 3a, 4, 4a, 5, ili 5a.

[0040] Svaka od grupa PG, PG1, PG2i PG3jedinjenja u Shemama 1 do 5a su nezavisno pogodne zaštitne grupe. Ove zaštitne grupe za estar i amin su poznate u tehnici i detaljno su opisane u Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999. U nekim realizacijama, zaštita grupa je Boc grupa.

[0041] U određenim izvođenjima, svaki od sintetičkih koraka u Shemama od 1 do 5a se može izvršiti sekvencijalno uz izolovanje svakog intermedijera koje se izvodi nakon svakog koraka. Alternativno, svaki od koraka kao što je opisano u Shemama 1, 2, 3 i 4, može se izvesti na način kojim se ne izvodi izolovanje jednog ili više intermedijera.

[0042] U izvesnim izvođenjima, svi koraci pomenute sinteze mogu se izvesti tako da se dobije željeni krajnji proizvod. U drugim izvođenjima, mogu se izvesti dva, tri, četiri, pet ili više sekvencijalnih koraka da se dobije intermedijer ili željeni krajnji proizvod.

Upotrebe, formulacije i primena

[0043] U nekim realizacijama, jedinjenja predmetnog pronalaska su za upotrebu u medicini. U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja za upotrebu u metodi za smanjivanje enzimske aktivnosti kinaze u familiji Tec kinaza (e.g., Tec, Btk, Itk, Txk, Lck, i Bmx). U nekim realizacijama, takva upotreba uključuje dovođenje u kontant kinaze familije Tec kinaza sa efikasnom količinom inhibitora familije Tec kinaze. Prema tome, predmetni pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenja za upotrebu u metodi inhibicije enzimske aktivnosti familije Tec kinaze dovođenjem u kontakt člana familije Tec kinaze sa inhibitorom familije Tec kinaze predmetnog pronalaska. Kako je ovde korišćeno, izraz “član familije Tec kinaze" odnosi se na bilo koje nereceptorske tirozin kinaze u familiji Tec kinaze. U nekim realizacijama, članovi familije Tec kinaze su Tec, Btk, Itk, Txk, Lck, i Bmx.

[0044] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja za upotrebu u metodi smanjivanja enzimske aktivnosti Btk. U nekim realizacijama, takva upotreba uključuje dovođenje u kontakt Btk sa efikasnom količinom inhibitora Btk. Prema tome, predmetni pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenja za upotrebu u metodi inhibicije enzimske aktivnosti Btk dovođenjem u kontakt Btk sa efikasnom količinom inhibitora Btk predmetnog pronalaska.

[0045] Enzimska aktivnost Btk, kako je ovde korišćeno, odnosi se na enzimsku aktivnost Btk kinaze. Na primer, kad je enzimska aktivnost Btk smanjena, smanjeno je vezivanje PIP3 i/ili fosforilacija PLCγ, U nekim realizacijama, polovina maksimalne koncentracije inhibitora (IC50) inhibitora Btk protiv Btk je manja od 1 µM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je manja od 500 nM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je manja od 100 nM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je manja od 10 nM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je manja od 1 nM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je od 0.1 nM do 10 µM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je od 0.1 nM do 1 µM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je od 0.1 nM do 100 nM. U nekim realizacijama, IC50inhibitora Btk protiv Btk je od 0.1 nM do 10 nM.

[0046] U nekim realizacijama, inhibitori takvih Tec kinaza su od koristi za lečenje bolesti i poremećaja koji se mogu ublažiti inhibicijom tj., smanjivanjem enzimske aktivnosti jedne ili više Tec kinaze. Jedinjenje pronalaska su efikasni inhibitori familije Tec kinaza i i stoga bi bile od koristi u tretitranju bolesti povezanih sa aktivnošću jedne ili više familija Tec kinaza. Izraz "bolesti" označava bolesti, sindrome, ili simptome bolesti. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje metode za tretiranje autoimunih poremećaja, inflamatorskih poremećaja i kancera kod subjekta kome je to potrebno. Takve metode uključuju primenu kod takvih subjekata terapijski efikasne količine inhiibitora Tec, Btk, Itk, Txk, Lck, i/ili Bmx kinaze.

[0047] Izraz "autoimunski poremećaji" obuhvata bolesti i poremećaje koji uključuju neprikladni imunski odgovor na prirodne antigene, kao što su akutni diseminirani encefalomijelitis (ADEM), Addison-ova bolest, alopecia areata, antifosfolipidni sindrom (APS), hemolitična naemija, autoimuni hepatitis, bulozni pemfigoid (BP), celijačna bolest, dermatomiozitis, dijabetes melitus tip 1, Good Pastureov sindrom, Gravesova bolset, Guillain-Barréov sindrom (GBS), Hashimotova bolest, idiopatska trombocitopenijska purpura, lupus ili sistemski lupus ertematozus (SLE), mešovita bolest vezivnih tkiva, multipla skleroza, mijastenjia gravis, pemfigus vulgaris, hemofilija sa inhibitorima, perniciozna anelija, polimiozitis, primarna bilijarna ciroza, Sjögren-ov sindrom, temporalni arteritis, i Wegener-ova granulomatoza. Izraz "inflamatorni poremećaji" obuhvata bolesti i poremećaje koji uključuju akutnu ili hroničnu inflamaciju kao što su alergije, astma (npr. alergijska astma), atopični dermatitis, prostatitis, glomerulonefritis, pelvična inflamatorska bolest (PID), inflamatorska bolest creva (IBD, npr., Crohn-ova bolest, ulcerativni kolitis), reperfuziona povreda, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantanta (uključujući pacijente sa kompatibilnim transplantimma) i vaskulitis. U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje metode za tretiranje bolesti, poremećaja, ili stanja koji su odobreni za tretiranje sa rituksimabom (monoklonalno antitelo protiv CD20), ukljčujući non-Hodgkin-ov limfom (NHL), hroničnu limfocitičnu leukemiju (CLL), RA, Wegener-ovu granulomatozu (WG), i mikroskopski poliangiitis (MPA). U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za tretiranje reumatoidnog artritisa (RA), SLE, ili atopičnog dermatitisa upotrebom ovde otkrivenih jedinjenja.

[0048] Izraz "kancer" obuhvata bolesti ili poremećaje koji uključuju abnormalni rast i/ili proliferaciju ćelija, kao što je glioma, tiroidni karcinom, karcinom dojke, kancer pluća (npr. mikroćelijski karcinompluća, nemikroćelijski karcinom pluća), karcinom želuca, gastrointestinalni stromanil tumori, karcinom pankreasa, karcinom žučne kese, karcinom jajnika, endometriski karcinom, karcinom prostate, karcinom bubrežnih ćelija, limfom (npr., anaplastični velikoćelijski limfom), leukemija (npr. akutna mijeloidna leukemija, leukemija T-ćelija, hronična limfocitična leukemija), multipli mijelom, maligni mezoteliom, maligni melanom, i kancer debelog creva (npr. kolorektalni kancer sa visokim stepenom mikrosatelitne nestabilnostu). U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za lečenje leukemije ili limfoma.

[0049] Izraz "subjekt," kako je ovde upotrebljen, odnosi se na sisara kome je dat farmaceutski sastav. Primeri subjekata uključuju ljude, kao veterinarske i laboratorijske životinje, kao što su konji, svinje, goveda, psi, mačke, zečevi, pacovi, miševi i vodeni sisari.

Izabrane indikacije i inhibicija B-ćelija [0050]

Kako je prethodno opisano, obezbeđena jedinjenja su od koristi za lečenje bolesti, uključujući RA i SLE. Kako će detaljnije biti opisano u tekstu koji sledi, ove bolesti su povezane sa B ćelijama. Stoga, predmetni pronalazak obuhvata saznanje da su obezbeđena jedinjenja korisna kao terapeutici za ove i druge indikacije.

[0051] Deregulacija imunskog sistema je glavna za patogenezu (Panayi GS, et al. Rheum Dis Clin North Am 2001; 27:317-334) RA. Kako većina infilitrirajućih leukocita u sinovjiumu su T limociti (pre svega aktivirane CD4+ T ćelije) i ćelije monocitnog/makrofagnog porekla (koje oslobađajuju proinflamatorne citokine kao što su IL-1, TNF-alfa i IL-6 i proteolitički enzimi uključujući kolagenaze i metaloproteinaze), u sinovijalnoj tečnosti takođe su nađene B-ćelije i plazma ćelije (Zhang Z, Bridges SL. Rheum Dis Clin North Am 2001; 27:335-353). Jasna uloga B ćelija i njihovih povezanih efektorskih funkcija u RA je prikazana efikasnošću rituximaba, selektivnim lekom deplecije B ćelija, koji je odobren za lečenje ksRA (Cohen SB, et al.; REFLEX Trial Group. Arthritis Rheum.2006 Sep; 54(9):2793-806).

[0052] Mada etiologija SLE nije potpuno razumljiva, smatra se da su patogena antitela i depozicija imunskih kompleksa krititčni za razvoj rasprostranjenog oštećenja tkiva (Klippel JH, et al. Example on the rheumatic diseases. Atlanta:

Arthritis Foundation; 2001). Autoantitela i imunskim kompleksom posredovana aktivacija mogu se ispitivati merenjem inhibicije makrofaga pomoću makrofaga koji su stimulisani Fc receptorims (videti objašnjenje u primeru - FcγR aktivacija primarnih humanih makrofaga). Gubitak tolerancije na sopstvene antigene na kraju dovodi do stimullisanja B ćelija da proizvode uto-antitela često usmerena protiv nuklearnih i citoplazmatskih komponenti. Antitela protiv nuklearnih komponenti (antinuklerna antitela [ANA]) ciljaju nuklearne antigene uključujući DNK (tipično dvolančanu DNK [dsDNK]), RNK, histone i malomolekularne ribonukleoproteine. Ova antitela se kombinuju sa sopstvenim antigenima stvarajući imunske komplekse koji se deponuju u tkivima, podstiču inflamatorske reakcije i vode do oštećenja tkiva. Osim njihove uloge u stvaranju patogenih autoantitela, B ćelije takođe deluju kao antigen prezentujuće ćelije (APCs) za T-ćelije i tako učestvuju u inicijaciji antigen specifičnog odgovora. Glavna uloga humoralnog odgovora imunskog sistema u patoogenezi SLE, B ćelije ili putanja B-ćelija predstavljaju poželjne terapijske ciljeve. Belimumab, monoklonalno antitelo koje je nedavno odobreno za SLE, blokira vezivanje BAFF za njegove receptore koji su eksprimirane B ćelije. Ovi receptori služe da aktiviraju i potenciraju preživljavanje B ćelija u skladu sa smanjenjem B ćelija u cirkulaciji koje je primećeno posle tretiranja sa belimumabom. Videti takođe Chan OT, et al. Immunol Rev.1999b;169:107-121; Navarra SV, et al. Lancet.2011 Feb 26;377(9767):721-31; Furie R, et al. Arthritis Rheum.2011 Dec;63(12):3918-30. Uloga B ćelija i mijeloidno poreklo ćelija u autoimunim bolestima kao što je SLE su dodatno podržani nedavnom publikacijom koja opisuje efikasnost prekliničkog SLE animalnog modela kada su miševi tretirani malomolekulskim ireverzibilnim Btk inhibitorima (Honigberg, L.A. PNAS.2010; 107: 13075).

Kombinacije

[0053] U nekim realizacijama, jedinjenje predmetnog pronalaska je primenjeno u kombinaciji sa drugim sredstvom. U nekim realizacijama, jedinjenje predmetnog pronalaska je od koristi u lečenju RA i primenjeno je u kombinaciji sa antireumatskim lekovima koji modifikuju bolest (DMARD), uključujući, bez ograničenja: metotreksat, abatacept, azatioprin, certolizumab, hlorokvin i hidroksihlorokvin, ciklosporin, D-penicllamin, adalimumab, etanercept, golimumab, soli zlata (uključujući auranofin i natrijum aurotiomalat), infliksimab, leflunomid, minociklin, rituksimab, sulfasalazin, tocilizumab, ili njihove kombinacije. U nekim realizacijama, jedinjenje predmetnog pronalaska je primenjeno u kombinaciji sa NSAID ili kortikosteroidom. U nekim realizacijama, jedinjenje predmetnog pronalaska je korisno za lečenje SLE i primenjeno je u kombinaciji sa sredstvom za lečenje SLE, uključujući, bez ograničenja, kortikosteroide, antimalarike, belimumab, mikofenolat mofetil (MMF) ili mikofenolat natrijum, azatioprin, ili njihove kombinacije. U nekim realizacijama, jedinjenje predmetnog pronalaska je korisno za lečenje atopičnog dermatitisa i primenjeno je u kombinaciji sa topikalnim sredstvom za lečenje atopičng dermatitisa, uključujući, bez ograničenja, topikalne steroide, takrolimus, metotreksat, mometazon furoat (MMF), azatioprin, retinoide ili njihove kombinacije.

Analize

[0054] Da bi se razvil korisni inhibitori familije Tec kinaze, kandidati za inhibitore koji mogu da smanje enzimsku aktivnost familije Tec kinaze mogu se identifikovati in vitro. Aktivnost inhibitorskih jedinjenja se može analizirati korišćenjem metoda koje su poznate u tehnici i/ili ovde predstavljenim metodama.

[0055] Jedinjena koja smanjuju ennzimsku aktivnost članova familije Tec kinaze mogu se identifikovati i testirati upotrebom biološki aktivnog člana familije Tec kinaze, koji se javlja bilo kao rekombinant ili kao prirodan. Tec kinaze se mogu naći u prirodnim ćelijama, izdvojene in vitro, ili koeksprimirane u ćeliji. Merenje smanjenja enzimske aktivnosti članova familije Tec u prisustvu inhibitora u odnosu na aktivnost u odustvu inhibitora može biti izvedeno korišćenjem raznih metoda poznatih u tehnici, kao što su POLYGAT-LS analize koje su opisane u Primerma koji slede. Druge metode za analizu aktivnosti Btk i drugih Tec kinaza su poznate u tehnici. Izbor odgovarajućih metoda analize je u okviru znanja prosečnog stručnjaka.

[0056] Kad su jedinjenja koja mogu da smanje enzimsku aktivnost članova familije Tec kinaze identifikovana, može se testirati sposobnost jedinjenja da selektivno inihibiraju članove familije Tec kinaze u odnosu na druge enzime.

[0057] Jedinjenja se dalje mogu testirati u modelima ćelija ili animalnim modelima na njihovu sposobnost da izazovu promene u fenotipu koji se odnosi na aktivnost člana familije koje se mogu detektovati. Osim kulture ćelija, animalni modeli se mogu upotrebiti za testiranje sposobnosti inhibitora člana familije Tec kinaze za lečenje autoimunskih poremećaja, inflamatornih poremećaja ili kancera u animalnom modelu.

Farmaceutske kompozicije

[0058] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje formule I ili jedinjenje formule I u komibnaciji sa farmaceutski prihvatljivim eksipijensom (npr, nosačem).

[0059] Farmaceutski sastavi uključuju opričke izomere, diastereomere, ili farmaceutski prihvatljive soli ovde opisanih inhibitora. Jedinjenje formule I uključeno u farmaceitski sastav može biti kovalentno pripojeno za grupu nosača, kako je ranije opisano. Alternativno, jedinjenje formule I uključeno u farmaceutski sastav nije kovalentno vezano za grupu nosača.

[0060] "Farmaceutski prihvatljiv nosač," kako je ovde upotrebljeno odnosi se na farmaceutske eksipijense, na primer, farmaceutski, fiziološki, prihvatljive organske ili neorganske supstance nosača pogodne za enteralnu ili parenteralnu primenu koje ne reaguju štetno sa aktivnim sredtvom. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju vodu, rastvore soli (kao što je Ringeov rastvor), alkohole, ulja, želatine i ugljene hidrate kao što je laktoza, amiloza ili skrob, estre masnih kiselina, hidroksimeticelulozu, i polivinil pirolidin. Takvi preparati se mogu sterilisati i, po želji, mešati sa dodatnim sredstvima kao što su maziva, konzervansi, stabilizatori, ovlaživači, emulzifikatori, soli za delovanje na osmostski pritisak, puferi, boje, i/ili aromatične supstance i slično koji ne reaguju štetno sa jedinjenjima pronalaska.

[0061] Jedinjenja pronalaska se mogu davati subjektu sama ili primenjivati zajedno sa drugima. Primena zajedno sa drugima označava istovremeno ili uzastopno davanje jedinjenja pojedinačno ili u kombinaciji (više od jednog jedinjenja). Preparati se takođe mogu kombinovati, po želji, sa drugim aktivnim supstancama (npr. radi smanjenja metaboličke degradacije).

[0062] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se pripremiti i primeniti u širokom spektru oralni, parenteralnih, i topikalnih doznih oblika. Tako, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se davati injekcijom (npr. intravenozno, intramuskularno, intracutano, supkutano, intraduodenalno ili intraperitonealno). Takođe, ovde opisana jedinjenja se mogu primenjivati inhalacijom, na primer, intranazalno. Osim toga, jedinjenje predmetnog pronalaska mogu se davati transdermalno. Takođe je predviđeno da se može upotrebiti više načina primene (npr. intramuskularni, oralni, transdermalni) za primenu jedinjenja pronalaska.

[0063] Za pripremu farmaceutskog sastava od jedinjenja predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti bilo čvrsti ili tečni. Čvrsti oblici uključuju prahove, tablete, pilule, kapsule, vrećice, supozitorije i disperzibiljne granule. Čvrsti nosač može biti jedna ili više supstanci koje mogu takođe da deluju kao razblaživači, aromati, veziva, konzervansi, sredstva za dezintegraciju tableta ili kao eknapsulirajući materijali.

[0064] U prahovima, nosač je fino podeljena čvrsta supstanca u smeši sa fino podeljenom aktivnom komponentom. U tabletama, aktivna komponenta je mešana sa nosačem koji ima potrebne osobine vezivanja u pogodnom odnosu i sabijena u željeni oblik i veličinu.

[0065] Prahovi i tablete poželjno sadrže od 5% dto 70% aktivnog jedinjenja . Pogodni nosači su magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktoza, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza, vosak niske tačke topljenja, kakao buter, i slični. Izraz "preparat" je namenjen da uključi formulaciju aktivnog jedinjenja sa enkapsulirajućim materijalom kao što je nosač dajući kapsulu u kojoj je aktivna komponenta sa ili bez drugih nosača, koja je okužena nosačem, sa kojim je tako povezana. Slično, uključene su vrećice i lozenge. Tablete, prahovi, kapsule, pilule, vrećice, i lozenge se mogu upotrebiti kao čvrsti dozni oblici pogodni za oralnu primenu.

[0066] Za pripremu supozitorija, vosak niske tačke topljenja, kao što je smeša glicerida masne kiseline ili kakao buter, prvo se topi i aktivna komponenta se u njemu homogeno disperguje, mešanjem. Istopljena homogena smeša je zatim sipana u kalupe pogodne veličine, ostavljena da se hladi, i tako očvrsne.

[0067] Preparati u tečnom obliku uključuju rastvore, suspenzije, i emulzije, na primer, vodene ili voda/propilen glikol rastvore. Za parenteralne injekcije, tečni preparati se mogu formulisati kao rastvor u voda/propilen glikol rastvoru.

[0068] Kad je parenteralna primena potrebna ili poželjna, naročito pogodni dodaci za jedinjenja pronalaska su injekcioni, sterilni rastvori, poželjno uljani ili vodeni rastvori, kao i suspenzije, emulzije, ili implantati, uključujući supozitorije. Posebno, nosači za parenteralnu primenu uključuju vodene rastvore dekstroze, solanu, čistu vodu, etanol, glicerol, propilen glikol, ulje kikirikija, susamovo ulje, polioksietilen-blok polimere i slično. Ampule su pogodni jedinični dozni oblici. Jedinjenja pronalaska se takođe mogu ugraditi u lipozome ili primenjivati transdermalnim pumpama ili kao flasteri. Farmaceutski dodaci pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju one opisane, na primer u Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) and WO 96/05309.

[0069] Vodeni rastvori pogodni za oralnu upotrebu mogu se pripremiti rastvaranjem aktivne komponente u vodi i dodavanjem pogodnih boja, ukusa, stabilizatora i sredstava za zgušnjavanje po želji. Vodene suspenzije pogodne za oralnu upotrebu mogu se proizvoditi dispergovanjem fino podeljene aktivne komponente u vodi sa viskoznim materijalom, kao što su prirodne ili sintetičke gume, smole, metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza i drugi dobro poznati agensi za suspendovanje.

[0070] Obuhvaćeni su i preparati čvrste forme koji su namenjeni da budu konvertovani, neposredno pre upotrebe, u tečne oblike preparata za oralnu primenu. Takvi oblici tečnosti uključuju rastvore, suspenzije i emulzije. Ovi preparati mogu, pored aktivne komponente, da sadrže i boje, ukuse, stabilizatore, pufere, veštačke i prirodne zaslađivače, sredstva za raspršivanje, sredstva za zgušnjavanje, solubilizatore i slično.

[0071] Farmaceutski preparat je poželjno u jediničnom doznom obliku. U ovom obliku preparat je podeljen u jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Jedinični oblik doziranja može biti upakovani preparat, paket koji sadrži diskretne količine preparata, kao što su pakovane tablete, kapsule i praškovi u bočicama ili ampulama. Takođe, jedinični oblik doziranja može biti kapsula, tableta, vrećica ili lozengeta ili može biti odgovarajući broj bilo kog od ovih u pakovanju.

[0072] Količina aktivne komponente u jediničnom doznom preparatu može da varira ili bude podešena od 0.1 mg do 10000 mg, bolje od 1.0 mg do 1000 mg, najčešće od 10 mg do 500 mg, prema datoj primeni i potentnosti/jačini aktivne komponente. Kompozicija može, po potrebi, takođe da sadrži i druge kompatibilne terapeutske agense.

[0073] Neka jedinjenja mogu da imaju ograničenu rastvorljivost u vodi i shodno tome mogu da zahtevaju prisustvo površinski aktivnog sredstva (surfaktanta) ili drugih korastvarača u kompoziciji. Ovakvi ko-rastvarači su: Polisorbat 20, 60, i 80; Pluronic F-68, F-84, i P-103; ciklodekstrin; i polioksil 35 ricinusovo ulje. Ovi ko-rastvarači su primenjeni na nivou između oko 0.01 tež. % i oko 2 tež.%.

[0074] Viskozitet veći od onog kod jednostavnih vodenih rastvora može biti poželjan da smanji varijabilnost u doziranju formulacija, da smanji fizičko razdvajanje komponenti suspenzije ili emulzije formulacije i/ili na drugi način da poboljša formulaciju. Takvi agensi za viskoznost uključuju, na primer, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, metil celulozu, hidroksi propil metilcelulozu, hidroksietil celulozu, karboksimetil celulozu, hidroksi propil celulozu, hondroitin sulfat i njihove soli, hijaluronsku kiselinu i njihove soli i kombinacije prethodno navedenog. Takvi agensi se obično koriste na nivou između oko 0,01 tež.% i oko 2 tež.% po težini.

[0075] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu dodatno uključiti komponente koje obezbeđuju produženo oslobađanje i/ili komfor. Takve komponente uključuju velike molekulske mase, anionske mukomimetičke polimere, želirajuće polisaharide i fino podeljene supstrate nosača leka. Ove komponente su detaljnije razmatrane u US Pat. Br.4,911,920; 5,403,841; 5,212,162; i 4.861.760.

Efektivne doze

[0076] Farmaceutske kompozicije koje su predviđene ovim pronalaskom uključuju sastave u kojima je aktivni sastojak sadržan u terapeutski efikasnoj količini, tj. u količini koja je efikasna da bi postigla svoju namenu. Stvarni iznos koji važi za određenu aplikaciju/primenu zavisiće, između ostalog, od stanja koje se tretira. Na primer, kada se primenjuju u postupcima za lečenje raka, takve kompozicije sadrže količinu aktivnog sastojka efikasnog za postizanje željenog rezultata (npr. smanjenje broja ćelija raka kod subjekta).

[0077] Doziranje i frekvencija (pojedinačne ili višestruke doze) primljenog jedinjenja mogu varirati u zavisnosti od različitih faktora, uključujući način primene; veličine, starosti, pola, zdravlja, telesne težine, indeksa telesne mase i ishrane primaoca; prirode i obima simptoma oboljenja koja se tretira (npr., bolest koja odgovara Btk inhibiciji); prisustvo drugih bolesti ili drugih zdravstvenih problema; vrsta istovremenog lečenja; i komplikacije nastale od bilo kojeg oboljenja ili režima lečenja. Ostali terapeutski režimi ili sredstva mogu se koristiti zajedno s postupcima i jedinjenjima predmetnog pronalaska.

[0078] Za bilo koje ovde opisano jedinjenje, terapeutski efektivna količina može se inicijalno odrediti iz testova ćelijske kulture. Ciljne koncentracije će biti one koncentracije aktivnih jedinjenja koje mogu da smanjuju aktivnost enzimske kinaze, kao što je mereno, na primer, primenjujući opisane metode.

[0079] Terapeutski efikasne količine za upotrebu kod ljudi mogu se odrediti na osnovu životinjskih modela. Na primer doza za ljude može se formulisati tako da se postigne koncentracija za koju je utvrđeno da je efikasna kod životinja. Doziranje kod ljudi se može prilagoditi praćenjem inhibicije kinaze i prilagođavanjem doze na manju ili veću, kao što je prethodno opisano. U određenim realizacijama, administrirana doza je u opsegu od oko 10 mg do oko 1000 mg dnevno, bilo jednom, dva puta ili više od dva puta dnevno.

[0080] Doziranje može varirati u zavisnosti od zahteva pacijenta i upotrebljenog jedinjenja. Doza data pacijentu, u kontekstu predmetnog pronalaska, treba da bude dovoljna da utiče na korisni terapijski odgovor kod pacijenta tokom vremena. Veličina doze će takođe biti određena postojanjem, prirodom i obimom bilo kakvih neželjenih efekata. Generalno, lečenje se započinje sa manjim dozama, koje su manje od optimalne doze jedinjenja. Nakon toga, doza se povećava malim porastom dok se ne postigne optimalni efekat pod datim okolnostima. U nekim realizacijama, dozni opseg je 0,001% do 10% v/v. U nekim realizacijama, dozni opseg je od 0,1% do 5% v/v.

[0081] Količina doziranja i intervali mogu se individualno prilagođavati kako bi se nivoi administriranog jedinjenja učinili efikasnim za određenu kliničku indikaciju koja se tretira. Ovo će obezbediti terapeutski režim koji je srazmeran težini stanja bolesti pojedinca.

[0082] Kako bi pronalazak koji je ovde opisan mogao biti bolje razumljiv, prikazani su sledeći primeri. Treba shvatiti da su ovi primeri dati samo u ilustrativne svrhe i da ih ne treba tumačiti kao ograničavajuće za predmetnipronalazak na bilo koji način. Primeri

[0083] Kao što je dato u Primerima koji slede, u određenim realizacijama datim kao primer, jedinjenja su pripremljena prema opštim procedurama. Treba naglasiti da, iako opšti postupci opisuju sintezu određenih jedinjenja predmetnog pronalaska, opšti postupci koji slede i druge metode poznate stručnjacima u oblasti tehnike mogu da se primene na sva jedinjenja i podklase i vrste svakog od ovih jedinjenja, kao što je ovde opisano.

Primer 1

Sinteza (3'R,4'S)-1'-terc-butil 4'-etil 2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1',4'-dikarboksilata

[0084]

[0085] Dobijanje etil 3-oksopiperidin-4-karboksilat intermedijera. Etil 1-benzil-3-oksopiperidin-4-karboksilat 1 (15.0 g, 50.5 mmol, 1.0 ekviv) hidrogenizovan je u prisustvu 10% Pd/C (1.5 g) katalizatora pod H2pri atmosferskom pritisku u MeOH (250 mL) tokom 16 h. Katalizator je profiltriran i rastvarač je koncetrovan u vakuumu pri čemu se dobija etil 3-oksopiperidin-4-karboksilat 2 kao svetli žuti čvrsti ostatak (10.2 g, prinos: 98.0%). ESI-MS (M+H)<+>: 172.1.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 4.23 (q, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.20-3.16 (m, 2H), 2.44 (t, 1H), 1.25 (t, 3H).

[0086] Dobijanje 1-terc-butil 4-etil 3-oksopiperidin-1,4-dikarboksilata. Etil 3-oksopiperidin-4-karboksilat 2 (10.2 g, 60.0 mmol, 1.0 ekviv) rastvoren je u suvom MeOH (200 mL) i dodat je Et3N (33.1 mL, 240 mmol, 4.0 ekviv). Smeša je mešana 1 h i dodat je Boc2O (19.5 g, 90.0 mmol, 1.5 ekviv) i smeša mešana 16 h. Rastvarač je koncentrovan u vakuumu i sirov proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, petrole etar/EtOAc =9:1) pri čemu se dobija 1-terc-butil 4-etil 3-oksopiperidin-1,4-dikarboksilate 3 kao žuto ulje (11.5 g, prinos: 86%). ESI-MS (M+H

56)<+>: 216.0.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.24 (q, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.49 (t, 2H), 2.33 (t, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.31 (t, 3H).

[0087] Dobijanje (S)-1-terc-butil 4-etil 3-((1-feniletil)amino)-5,6-dihidro piridin-1,4-(2H)-dikarboksilata. U suvoi balom opremljen Dean-stark –ovim trapom i refluks kondenzatorom, 1-terc-butil 4-etil 3-oksopiperidin-1,4-dikarboksilat 3 (10.0 g, 37.0 mmol, 1.1 ekviv) je rastvoren u toluenu (100 mL). Dodati su S-(-)-α-Metilbenzilamine (4.9 g, 40.5 mmol, 1.1 ekviv) i p-toluenesulfonska kiselina monohidrat (0.7 g, 3.7 mmol, 0.1 ekviv) i smeša je zagrevana da refluksuje 16 h. Sirova reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu dajući (S)-1-terc-butil 4-etil 3-((1-feniletil)amino)-5,6-dihidro piridin-1,4(2H)-dikarboksilat 4 (12.0 g, P: 88%) kao gusto narandžasto ulje koje je upotrebljeno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja, ESI-MS (M+H)<+>: 375.2.

[0088] Dobijanje 1-terc-butil 4-etil 3-(((S)1-feniletil)amino)-5,6-dihidro piridin-1,4(2H) -dikarboksilata.1-terc-Butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-1,4-dikarboksilat 4 (11.2 g, 30.0 mmol, 1.0 ekviv) je rastvoren u smeši CH3CN (60 mL) i sirćetne kiseline (60 mL) i ohlađen na 0 °C. Pažljivo je dodat NaBH(OAc)3(19.0 g, 90.0 mmol, 3.0 ekviv) i reakciona smeša je ostavljena da se meša na mešalici 2 h na 0°C. Pažljivo je dodat NaHCO3za neutralizaciju rastvora pri čemu je održavana unutrašnja temperatura balona ispod 10°C. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (50 mL x 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni (Na2SO4), profiltrirani, koncentrovani U vakuumu, i zatim prečišćeni hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, petrol etar/EtOAc =9:1) dajući tako 4-etil 3-(((S)1-feniletil)amino)-5,6-dihidro piridin-1,4(2H)-dikarboksilat 5 (8.2 g, P: 73%) kao svetlo žuto ulje. ESI-MS (M+H)<+>: 377.2.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.31-7.22 (m, 5H), 4.20 (q, 2H), 4.11-3.86 (m, 3H), 3.15 (s, 1H), 3.00-2.90 (m, 2H), 2.64 (d, 2H), 1.87-1.85 (m, 1H), 1.68 (s, 1H), 1.50-1.25 (m, 15H).

[0089] Dobijanje trans-1-terc-butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil)amino) piperidin-1,4-dikarboksilata. 1-terc-butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-1,4- dikarboksilat 5 (8.0 g, 21.2 mmol, 1.0 ekviv) je rastvoren u suvom EtOH (20 mL) pod N2. U poseban Schlenk-ov balon osušen na plamenu, dodati su suvi EtOH (150 mL), i natrijum (0.450 g, 63.6 mmol, 3.0 ekviv) u porcijama, pod N2. Smeša je ostavljena pod N2i ispuštani su gasovi koji su se razvili sve dok sav natrijum nije rastvoren. Bistar rastvor 1-terc-butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-1,4-dikarboksilata je zatim prebačen u rastvor NaOEt, i smeša je mešana 80°C pod N2tokom 16 h.

Rastvarač je uparen u vakkumu i dodat je rastvor soli (150 mL) i podešeno je pH smeše na pH =10 dodatkom 1 N NaOH i ekstrahovano je sa EtOAc (100 mL x 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni (Na2SO4) i koncentrovani u vakuumu.

Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, petrol etar/EtOAc = 5:1) pri čemu se dobija (trans)-1-terc-butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil) amino)piperidin-1,4-dikarboksilat 6 kao žućkasti čvrsti ostatak (3.7 g, prinos: 46%). ESI-MS (M+H)<+>: 377.2.

[0090] Dobijanje trans-1-terc-butil 4-etil 3-aminopiperidin-1,4-dikarboksilata. Trans-1 -terc-butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-1,4-dikarboksilat 6 (3.7 g, 8.3 mmol, 1.0 ekviv) hidrogenizovan je u prisustvu katalizatora 10% Pd/C (0.37 g) pod H2na 30 atmosferskom pritisku u MeOH (100 mL) na 50°C tokom 8 h.

Katalizator je profiltriran i rastvarač je uparen u vakuumu dajući tako (trans)-1-tercbutil 4-etil 3-aminopiperidin-1,4-dikarboksilat 7 kao svetlo žuto ulje (2.5 g, prinos: 92%). ESI-MS (M+H)<+>: 273.1.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.18 (q, 2H), 3.97-3.94 (m, 2H), 3.37 (s, 1H), 3.07-3.02 (m, 1H), 2.89-2.85 (m, 1H), 2.60-2.55 (m, 1H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.70-1.54 (m, 3H), 1.46 (s, 9H), 1.28 (t, 3H).

[0091] Sinteza trans-1-terc-butil 4-etil 3-(5-brompentanamido)piperidin - 1,4-dikarboksilata. U rastvor trans-1-terc-butil 4-etil 3-aminopiperidin -1,4-dikarboksilata 7 (2.5 g, 9.2 mmol, 1.0 ekviv) u CH2Cl2(50 mL), dodat je Et3N (2.5 mL, 18.4 mmol, 2.0 ekviv) na rt. Nakon što je reakcioni rastvor mešan na rt 10 min, dodat je 5-bromovaleril hlorid (1.9 g, 9.6 mmol, 1.05 ekv). Reakcioni rastvor je mešan na rt tokom 2 h. Smeši je dodata H2O (20 mL) i ektrahovana sa CH2Cl2(50 mL x 3).

Organski sloj je sakupljen, koncentrovan u vakuumu i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, petrol etar/EtOAc =1:1) dajući (trans)-1-terc-butil 4-etil 3-(5-bromopentanamido)piperidin -1,4-dikarboksilat 8 kao žuto ulje (3.2 g, prinos: 80%). ESI-MS (M+H-56)<+>: 379.0.<1>HNMR(400 MHz, CDCl3) δ: 5.99 (d, 1H), 4.39-4.38 (m, 1H), 4.15 (q, 2H), 3.79-3.74 (m, 1H), 3.66-3.60 (m, 1H), 3.41 (t, 2H), 3.30-3.26 (m, 1H), 3.21-3.14 (m, 1H), 2.78-2.74 (m, 1H), 2.19 (t, 2H), 1.99-1.85 (m, 3H), 1.80-1.72 (m, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.27 (t, 3H).

[0092] Sinteza trans-1'-terc-butil 4'-etil 2-okso-[1,3'-bipiperidin] -1',4'-dikarboksilata. U rastvor trans-1-terc-butil 4-etil 3-(5-bromopentanamido)piperidin-1,4-dikarboksilata 8 (3.0 g, 6.9 mmol, 1.0 ekviv) u THF (20 mL), pažljivo, u malim porcijama na 0 °C dodat je NaH (276 mg, 6.9 mmol, 1.0 ekviv). Reakcioni rastvor je mešan pod uslovima refluksovanja tokom 4 h. Smeši je dodata H2O (20 mL),i eksktrahovana je sa EtOAc (30 mL x 3). Organski sloj je sakupljen, osušen (Na2SO4), profiltriran i konentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silicijum dioksid, petrolm etar/EtOAc = 1:2) dajući (trans)-1'-terc-butil 4'-etil 2-okso-[1,3'-bipiperidin] -1',4'-dikarboksilat 9 kao žućkasto ulje (2.1 g, prinos: 88%). ESI-MS (M+H-56)<+>: 299.1.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.10 (q, 4H), 3.38-3.19 (m, 4H), 2.70-2.61 (m, 1H), 2.36-2.31 (m, 2H), 1.95-1.92 (m, 1H), 1.75-1.71 (m, 6H), 1.46 (s, 9H), 1.23 (t, 3H).

Primer 2

Dobijanje trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(triflurometil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida

[0093]

[0094] Sinteza trans-1'-terc-butil-4'-etil-3-jod-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1',4'-dikarboksilata. U rastvor trans-1'-terc-butil 4'-etil 2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1',4'-dikarboksilata 8 (141 mg, 2.58 mmol, 1.0 ekviv) u suvom toluenu (10 mL) na 0 °C, dodati su redom TMEDA (0.89 g, 7.7 mmol, 3.0 ekviv) i TMSCl (0.6 mg, 1.0 mmol, 2.0 ekviv) pod N2. Nakon 0.5 h, pažljivo, u malim procijama dodat je I2(0.98 g, 3.87 mmol, 1.5 ekviv). Reakcioni rastvor je mešan na 0 °C do rt tokom16 h. Smeša je razblažena sa EtOAc (100 mL), isprana zasićenim rastvorom Na2S2O3(20 mL × 2) i rastvorom soli (20 mL), osušena (Na2SO4), profiltrirana i koncentrovana u vakuumu. Sirov proizvod 9 (2.2 g, P: 81%) je upotrebljen direktno u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. ESI-MS (M+H-56)<+>: 424.9.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.78-4.73 (m, 1H), 4.19-4.04 (m, 4H), 3.55-3.30 (m, 4H), 3.24-3.16 (m, 2H), 2.73-2.60 (m, 1H), 2.22-2.14 (m, 2H), 1.96-1.78 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H),1.44 (s, 9H), 1.25 (t, J= 7.2 Hz, 3H).

[0095] Sinteza trans-1'-terc-butil 4'-etil 3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1',4'-dikarboksilata. 1.0 M rastvor litijum bis(trimetildisilil)amida u THF (13 mL, 12 mmol, 2.0 ekviv) dodat je iz kapalice na 10-15 °C u rastvor 3-hlor-5-(trifluormetil)anilina (15 g, 78 mmol, 1.2 ekviv) u THF (13 mL). Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi, 20 min i iz kapalice na 10-15 °C tokom 30 min dodat je rastvor sirovog trans-1'-terc-butil-4'-etil-3-jod-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1',4'- dikarboksilata 9 (3.7 g, 65 mmol, 1.0 ekviv) u THF (13 mL). Nakon dodavanja, reakciona smeša je ostavljena da se međa na istoj temperaturi 30 min. Po završetku, reakciona smeša je ohlađena na 5 °C i pažljivo je dodata voda (10 mL), održavajući temperaturu ispod 20 °C. Smeša je zatim ekstrahovana sa EtOAc (2 x 30 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim rastvorom soli (30 mL), osušeni (Na2SO4), profiltrirani i koncentrovani u vakuumu. Dobijeni sirov proizvod je prečišćen na silika gelu, eluiranjem sa gradijentom od 10% do 75% EtOAc u heptanu dajući željeni proizvod 10. ESI-MS (M+H-56)<+>: 463.1.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.92 (s, 1H), 6.71-6.69 (m, 2H), 4.17-4.06 (m, 4H), 3.78-3.68 (m, 2H), 3.46-3.36 (m, 3H), 3.23-3.07 (m, 2H), 2.73-2.65 (m, 1H), 2.44-2.37 (m, 1H), 2.03-1.85 (m, 3H), 1.71-1.61 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.27-1.19 (m, 3H).

[0096] Sinteza trans-1'-(terc-butoksikarbonil)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil) amino) -2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilne kiseline. U rastvor trans-1'-tercbutil 4'-etil 3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1',4'-dikarboksilata 10 (180 mg, 0.33 mmol, 1.0 ekviv) u EtOH (5 mL) dodat je NaOH (40 mg, 0.99 mmol, 3.0 ekviv) i rastvor je mešan na 80 °C tokom 1 h. Rastvarač je koncentrovan u vakuumu i ostatak je suspendovani u vodi (10 mL) i podešeno je pH = 6 dodatkom HCl (4 N). Talog je profiltriran dajući (trans)-1'-(terc-butoksikarbonil)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilnu kiselinu 11 (150 mg, P: 82%) kao žuti čvrsti ostatak koji je upotrebljen u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. ESI-MS (M+H-85)<+>: 463.1.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.85 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.12-3.96 (m, 4H), 3.53-3.37 (m, 2H), 3.113.04 (m, 2H), 2.75-2.67 (m, 1H), 2.24-2.18 (m, 1H), 1.98-1.89 (m, 3H), 1.71-1.58 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).

[0097] Sinteza trans-terc-butil 4'-karbamoil-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-l'-karboksilata. U rastvor trans 1'-(tercbutoksikarbonil)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilne kiseline 11 (70 mg, 0.14 mmol, 1.0 ekviv) u DMF (2 mL), dodat je NH4Cl (22 mg, 0.41 mmol, 3.0 ekviv), HBTU (103 mg, 0.270 mmol, 2.0 ekviv) i DIPEA (52 mg, 0.41 mmol, 3.0 ekviv). Reakcioni rastvor je mešan na rt tokom 16 h, razblažen dodatkom EtOAc (10 mL) i ispran vodom (5 mL) i rastvorom soli (5 mL). Organska faza je odvojena i koncetrovana u vakuumu dajući sirovo ulje koje je prečišćeno pre-HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% TFA kao mobilnom fazom) dajući jedinjenje (trans)-tercbutil4'-karbamoil-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil) amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1'-karboksilat 12 (60 mg, prinos: 86%) kao svetli čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H-56)<+>: 463.1.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.87-6.86 (m, 1H), 6.84-6.83 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.11-4.03 (m, 3H), 3.53-3.35 (m, 2H), 3.20-3.08 (m, 2H), 2.77-2.74 (m, 1H), 2.25-2.18 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 3H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).

[0098] Sinteza trans-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida. U rastvor trans-terc-butil 4'-karbamoil-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1'-karboksilata 12 (60 mg, 0.11 mmol) u CH2Cl2(1.0 mL) dodat je CF3CO2H (1.0 mL) na rt. Reakciona smeša je mešana na rt tokom 2 h, koncetrovana u vakuumu dajući željeni proizvod 13 (43 mg, 90%) koji je upotrebljen direktno u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. ESI-MS (M+H)<+>: 419.0.

[0099] Sinteza trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3- ((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida. U rastvor trans-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino) -2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 13 (42 mg, 0.10 mmol, 1.0 ekviv) u 1-butanola (2 mL), 6-hlor-5-fluorpirimidin-4-amina (18 mg, 0.12 mmol, 1.2 ekviv) dodat je DIPEA (26 mg, 0.20 mmol, 2.0 ekviv).

Reakcioni rastvor je mešan na 120 °C tokom 16 h. Smeša je razvlažena sa EtOAc (20 mL), isprana sa H2O (10 mL) i rastvorom soli (10 mL), osušena (Na2SO4), profiltrirana i koncentrovana u vakuumu. Sirov proizvod je prečićen na pre-HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% TFA kao mobilnom fazom) dajući jedinjenje (trans)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid 14 (44 mg, prinos: 83%) kao žut čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H)<+>: 530.0. HPLC: (214 nm: 100%, 254 nm: 100%).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.97 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 4.58-4.52 (m, 2H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.52-3.35 (m, 3H), 3.29-3.27 (m, 4H), 3.12-3.05 (m, 1H), 2.24-2.17 (m, 1H), 2.02-1.91 (m, 3H), 1.80-1.63 (m, 2H).

[0100] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera jedinjenja 14 je razdvojena na tri pika pomoću SFC (IA(2 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) i traženo jedinjenje je odgovaralo piku 3. LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) @ 1.20 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.94 (s, 2H), 6.75 - 6.87 (m, 2H), 6.41 - 6.66 (m, 3H), 4.29 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 3.96 - 4.18 (m, 2H), 3.44 (td, J = 6.15, 12.30 Hz, 1H), 3.24 - 3.33 (m, 1H), 3.10 (br. s., 1H), 2.88 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.13 (qd, J = 5.94, 12.30 Hz, 1H), 1.74 - 1.93 (m, 3H), 1.58 - 1.74 (m, 1H), 1.41 - 1.58 (m, 1H).

[0101] (3S,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera jedinjenja 14 razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA(2 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) traženo jedinjenje odgovaralo je piku 2. LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) @ 1.19 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (br. s., 1H), 6.98 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.72 - 6.88 (m, 2H), 6.57 (s, 2H), 6.54 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.05 4.33 (m, 4H), 3.37 (t, J = 6.27 Hz, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.02 - 2.16 (m, 1H), 1.75 - 1.92 (m, 3H), 1.57 - 1.74 (m, 1H), 1.36 -1.54 (m, 1H).

[0102] (3S,3'S,4R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid . Smeša četiri diastereomera jedinjenja 14 razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA(2 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 1 od 3 je dalje prečišćen pomoću SFC (AD-H (2 x 15cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući traženo jedinjenje. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) @ 1.20 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.94 (s, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.42 - 6.66 (m, 3H), 4.18 - 4.47 (m, 2H), 3.95 - 4.18 (m, 2H), 3.39 - 3.52 (m, 1H), 3.24 - 3.31 (m, 1H), 3.10 (br. s., 1H), 2.88 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.13 (qd, J = 5.91, 12.39 Hz, 1H), 1.73 - 1.92 (m, 3H), 1.58 - 1.73 (m, 1H), 1.42 - 1.58 (m, 1H).

[0103] (3R,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera jedinjenja 14 razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA(2 x 15cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 1 od 3 je dalje prečišćen pomoću SFC (AD-H (2 x 15cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući traženo jedinjenje . LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) @ 1.20 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (br. s., 1H), 6.98 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.73 - 6.88 (m, 2H), 6.57 (s, 2H), 6.54 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.05 - 4.35 (m, 4H), 3.37 (t, J = 6.15 Hz, 2H), 3.12 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.09 (skst, J = 5.80 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.73 (m, 1H), 1.36 - 1.52 (m, 1H).

Primer 3

Alternativna sinteza (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida.

[0104] Pored postupaka opisanih u Primeru 2, (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid (jedinjenje I-1) je takođe sintetisan prema shemi 6.

[0105] 1-terc-butil 4-etil 3-oksopiperidin-1,4-dikarboksilat 3-2. U rastvor 3-1 (5.0 kg, 19.1 mol, 1.0 ekviv) u EtOH (50 L) pod N2dodati su (Boc)2O (4.2 kg, 19.1 mol, 1.0 ekviv), Et3N (1.9 kg, 19.1 mol, 1.0 ekviv) i 10% Pd(OH)2/C (250 g, 10%t/t). Nakon izvlačenja i ponovnog punjenja vodonikom, tri puta, smeša je mešana pod 1 atm vodonika na 50°C tokom 15 hr. LC-MS je pokazala potpun utrošak 3-1. Nakon što je smeša ohlađena na ambijentalnu temperaturu, katalizator je profiltriran kroz sloj

celita i ispran sa EtOH (2.5 L). Filtrat je koncentrovan u vakuumu dajući sirovo jedinjenje 3-2 (5.2 kg) u obliku ulja, koje je upotrebljeno u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja.

[0106] (S)-1-terc-butil 4-etil 3-((1-feniletil)amino)-5,6-dihidropiridin-1,4 (2H)-dikarboksilat (3-3). U reaktor od 100 L opremljen Dean-Stark –ovim aparatom dodati su: toluen (20 L), sirovo jedinjenje 3-2 (5.2 kg, 19.1 mol, 1.0 ekviv) isprano toluenom (30 L), pTSA (329 g, 0.2 mol, 0.01 ekviv) i S-(-)-α-metilbenzilamin, 95 kg, 16.2 mol, 0.85 ekviv). Smeša je zagrevana da refluksuje pod azotnim pokrivačem i voda je uklonjena kroz Dean-Stark-a. Nakon 18 sati, LC-MS je pokazala da je potpuno utrošeno jedinjenje 3-2. Smeša je zatim ohlađena na sobnu temperaturu. Nerastvorni ostatak je profiltriran, filtrat je koncentrovan u vakuumu do suva pri čemu se dobija sirovo jedinjenje 3-3 kao gusto ulje. Ovaj sirov proizvod je upotrebljen u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. U ovoj reakciji dobijeno je 3-10% amida kao sporednog proizvoda i njegova struktura je eksperimentalno određena na osnovu podataka dobijenih LC-MS -om.

[0107] (3R)-1-terc-butil 4-etil 3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-1,4-dikarboksilat (3-4). U reakcioni sud od 100 L u koji su dodati NaBH4(1.16 kg, 30.5 mol, 2.0 ekviv) i anhidrovani THF (60 L) pod azotom, pažljivo, tokom 30 min dodata je TFA (10.5 kg, 92 mol, 6.0 ekviv) održavajući pri tome temperaturu na 0∼5 °C. Smeša je zatim ohlađena na -45 °C. U posebnom realcionom sudu, sirov proizvod 3-3 je rastvoren u anhidrovanom acetonitrilu (30 L), koji je pažljivo dodat u prethodni rastvor NaBH4/TFA održavajući pri tome unutrašnju temperaturu na između -45∼-30 °C.

Smeša je mešana na -45 °C tokom 1 h, nakon čega je, HPLC pokazala da je jedinjenje 3-3 u potpunosti potrošeno. Smeša je pažljivo razblažena dodatkom ledene vode (50 kg) i smeša je zatim zagrejana na 10°C. Proizvod je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 40 L) i kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim rastvorom NaHCO3(20 L). pH vodene faze iznosilo je ∼8. Organski slojevi su osušeni (Na2SO4) i koncentrovani u vakuumu skoro do suva dajući ostatak koji je dalje azeotropiran sa MeOH (10 L x 3) kako bi se uklonio višak EtOAc. Na kraju, dobijeno je 10 L rastvora sirovog proizvoda 3-4 u MeOH, koji je dorektno upotrebljen u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. ESI-MS (M+H-1)<+>: 377.2.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.31-7.22 (m, 5H), 4.20 (q, 2H), 4.11-3.86 (m, 3H), 3.15 (s, 1H), 3.00-2.90 (m, 2H), 2.64 (d, 2H), 1.87-1.85 (m, 1H), 1.68 (s, 1H), 1.50-1.25 (m, 15H).

[0108] (3R)-1-(terc-butoksikarbonil)-3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-4-karboksilna kiselina (3-5). U reakcioni sud od 100 L u koji je dodat THF/MeOH (1:1, 80 L), dodat je rastvor LiOH·H2O (2.5 kg, 60 mol, 4.0 ekviv) u vodi (10 L) i rastvor sirovog 3-4 u MeOH (10 L) iz prethodnog koraka. Dobijena smeša je mešana na 22 °C tokom 18 sati, nakon čega je analiza LC/MS pokazala da je polazni materijal 3-4 potpuno iskorišćen. Rastvor je razblažen sa MTBE (40 L) i mešan 20 min. Vodeni sloj je odvojen, ohlađen na 0 °C i neutralisan sa 3N rastvorom HCl do pH između 7-8, održavajući unutrašnju temperaturu ispod 10°C. Rastvor je ispran sa DCM (5 x 30 L) ili dok analiza LC/MS ne pokaže da nema zaostalog proizvoda 3-5 u vodenom sloju. Kombinovani organski slojevi su koncentrovani u vakuumu do suva, suspendovani u EtOAc i petrol etru (2:1, 10 L) i mešani 2 sata, čvrsti ostatak je profiltriran, ispran petrol etrom (5 L) i osušen pod vakuumom na 50°C tokom 18 sati dajući proizvoda (3.5 Kg, 53% prinosa) kao čvrsti ostatak 95% čistoće. Jedinjenje 3-5 je smeša ∼30:70 trans/cis na C-4 i ∼93:7 R:S na C-3. Ukupan prosečan prinos od 3-1 je 43-55%. ESI-MS (M+H-1)<+>: 349.2.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.22-8.06 (m, 5H) 4.11 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.59-3.56 (m, 1H), 2.79-2.65 (m, 1H), 3.22- 2.62 (m, 2H), 2.06 - 2.16 (m, 12H).

[0109] (3R)-1-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-(((S)-1-feniletil)amino)piperidin-4-karboksilna kiselina (3-7). U reakcioni sudo do 50 L dodatno je 10 L 2N HCl i jedinjenje 3-5 (850 g, 2.44 mol, 1.0 ekviv). Smeša je zagrejana na 30 °C i mešana 2 sata, kada je analiza HPLC pokazala poptuni utrošak polaznog 3-5. Rastvor je razblažen dodatkom MTBE (4 L) i smeša je mešana 20 min, slojevi su razdvojeni i u vodeni sloj je dodat čvrst K2CO3(660 g) tokom 1 sata do pH ∼7. Dodata je dodatnaa količina K2CO3(660 g, 4.8 mol, 2.0 ekviv) pa zatim i 6-hlor-5-fluorpirimidine-4-ilamin (360 g, 2.44 mol 1.0 ekviv) i 1,4-dioksan (5 L). Smeša je zagrevana da blago reflukcuje na 100 °C i mešana na ovoj temperaturi 16 sati. HPLC analiza je pokazala da je preostalo <2% jedinjenja 3-6. Smeša je isprana sa DCM (2 x 5 L) i organske frakcije od ispiranja su odbačene. Vodeni sloj je tretiran aktivnim ugljenikom (425 g) mešanjem guste smeše 1 sat na 30 °C nakon čega je profiltriran kroz diatomit. Ovaj tretman aktivnim ugljenikom je ponovljen. Dobijeni vodeni rastvor je neutralisan do pH ∼7 dodatkom koncentrovane HCl i mešan na 22 °C tokom 3 sata, Dobijena gusta smeša je profiltrirana i vlažni kolač je ispran sa 1,4-dioksan/vodom (1:1, 1.2 L), osušen u vakuumu na 50°C tokom 18 hr do postizanja vrednosti KF ∼0.5%. Proizvod 3-7 je dobijen kao svetlo beličast čvrsti ostatak (690 g, 81% prinos) čistoće od 98.6%. Proizvod sadrži smešu 1:9 cis/trans izomera na položajima C3 i C4. ESI-MS (M+H-1)<+>: 460.2.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.49 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 8.21-8.14 (m, 5H) 4.94-4.90 (m, 1H), 4.63 (d, J = 11.55 Hz, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.59 - 3.72 (m, 3H), 2.84 - 2.93 (m, 1H), 2.20 - 2.31 (m, 1H), 2.15 (d, J = 6.78 Hz, 3H).

[0110] (3R)-3-amino-1-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)piperidin-4-karboksilna kiselina (3-8). U reakcioni sud od 10 L u struji N2, dodati su i-PrOH (3.5 L), H2O (3.5 L), 3-7 (1.0 ekviv, 0.97 mol, 350 g), kalijum fluorid mono hidrat (290 g, 3.0 ekv., 3.0 mol) and 35 g 20% Pd(OH)2/C (10% z/m). Nakon pražnjenja/punjenja vodonikom tri puta, smeša je zagrejana na 40-50 °C i nežno mešana na toj temperaturi pod pritiskom vodonika od 1 atmosfere. Posle 18 sati, analiza LC/MS je pokazala prisustvo <1% polaznog materijala 3-7. Smeša je produvavana sa N2toko 20 min, ohlađena na 22 °C i profiltrirana. Vlažni kolač i filtrat sadrže proizvod i obrađeni su zasebno.

[0111] Filtrat je koncentrovan u vakuumu na 50 °C na zapreminu od ∼200 mL. Nakon hlađenja na 20 °C i mešanja na ovoj temperaturi u trajanju od 2 sata, dobijena je gusta smeša, i čvrsti ostatak je profiltriran, ispran vodom (400 mL) i osušen u vakuumu i na 50°C dajući proizvod 3-8 (65 g). Vlažni kolač dobijen filtracijom je mešan u 1N HCl (1 L) tokom 2 sata kako bi se rastvorio proizvod i preostali katalizator je profiltriran. Zakišeljen filtrat je neutralisan dodatkom čvrstog LiOH na pH ∼7 kako bi se staložio proizvod 3-8. Proizvod je ispran vodom (200 mL), osušen u vakuumu i na 50°C pri čemu se dobija 120 g proizvoda. Dobijeno je ukupno 185 g proizvoda čistoće 98.7% i u prinosu od 75% na osnovu<1>H NMR. Svi matični rastvori su kombinovani i koncentrovani na zapreminu od ∼400 mL dajući gustu smešu, koja zatim je isprana vodom i osupena dajući dodatnih 64 g čvrstog ostatka čistoće ∼50%.<1>H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.77 (s, 1H) 4.12 (d, J = 14.05 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 3.26 (d, J = 13.80 Hz,1), 2.99 - 3.10 (m, 1H), 2.64 - 2.73 (m, 1H), 1.98 (dd, J = 3.39, 14.18 Hz, 1H), 1.74 - 1.87 (m, 1H).

[0112] ((3R,3'R)-1'-(terc-butoksikarbonil)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilna kiselina (3-10). U rastvor 3-8 (440 g, 1.9 mol, 1.0 ekviv) uDMSO (10 L) redom su dodati 3-8A (640 g, 1.9 mol, 1.0 ekviv) i natrijum triacetoksiborohidrid (STAB, 402.0 g, 3.8 mol, 2 ekviv) i Et3N (, 190 g, 1.9 mol, 1.0 ekviv). Smeša je zagrevana na 50°C i mešana 3 sata nakon čega je HPLC analizom pokazana potpuna konverzija u intermedijer 3-9.

[0113] Rastvor je razblažen sa MeOH (182 g, 5.7 mol, 3.0 ekv.,) da bi se eliminisao višak STAB, i reakciona smeša je zagrevana na 70∼80 °C . Posle 16 sati, HPLC analiza je pokazala ida je formirano 22% proizvoda 3-10 i da je preostalo 61% intermedijera 3-9 i hiralna HPLC analiza je pokala da je ostalo ∼3% epimera laktama. Smeša je ostavljena da stoji na 70-80 °C još 24 sata pri čemu je dobijeno 50% 3-10, 35% 3-9, i 7% epimera laktama. Posle još 40 sati mešanja, dobijeno je 80% 3-10, preostalo je 4% 3-9 i količina epimera laktama je povećana 14%. Smeša je ohlađena na 22 °C, i dodat je 2N rastvor NH4Cl (5 L) pri čemu se dobija gusta smeša. Posle 30 minuta mešanja, smeša je profiltrirna i vlažni kočač je ispran vodom (3 L), osušen u vakuumu i na 55 °C do KF<0.1. Dobijen je sirov proizvod 3-10 kao braon čvrsta supstanca (850 g, 97.7%); analiza hiralnom HPLC pokazala je prisustvo 12.5% epimera laktam. Ovaj proizvod je upotrebljen direktno bez dodatnog prečišćavanja

[0114] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilna kiselina (3-10-trans). U reakcioni sud od 10 L u pod N2dodat je 3-10 (850 g, 1.9 mol, 1.0 ekviv) u DMF (4.25 L, 5 z/m) kako bi se dobio bistar ratvor, zatim su dodat 4-dimetilaminopiridin (DMAP 116g, 0.95 mol, 0.5 ekviv) and 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDCI, 36.5 g, 0.19 mol, 0.1 ekviv). Nakon što je smeša mešana na 15 do 22 °C oko 1 sat, dodato je još EDCI (36.5 g, 0.19 mol, 0.1 ekviv) i mešanje nastavljeno još 1 sat. Analiza HPLC pokazala je prisustvo 69:1 trans/cis smeše. Proizvod 3-10-trans nije izolovan i konvertovan je u jedinjenje I-1 u jednom balonu.<1>H NMR (300 MHz, DMSO d6): δ 1.47-1.55 (m, 1H), 1.63-1.68 (m, 1H), 1.81-1.87 (m, 1H), 1.90-1.97 (m, 1H), 2.93-3.19 (m, 1H), 3.16-3.23 (m, 1H), 3.33-3.45 (m, 2H) 4.07-4.33 (m, 3H), 6.80 (m, 1H), 6.94-6.98 (m, 1H), 7.10-7.16 (m, 2H), 7.91 (s, 1H).

[0115] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid (I-1). U prethodnu reakcionu smešu, na 22 °C, dodati su O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU, 600 g, 1.9 mol, 1.0 ekviv), N,N-diizopropiletilamin (DIPEA, 1.0 kg, 9.5 mol, 5.0 ekviv) i na kraju NH4Cl (260 g,

5.7 mol, 3.0 ekviv). Dobijena smeša je mešana na 15 °C tokom 1 sata, HPLC analiza pokazala je jedinjenje 3-10-trans potpuno utrošeno, smeša je dodata u rastvor soli (25 L) i ekstrahovana sa EtOAc (2 x 2L). Kombinovnai organski slojevi su isprani rastvorom soli (2 x 2L) i koncentrovani u vakuumu ispod 45°C do suva dajući sirov proizvod I-1, koji je dalje prečišćen hromatiografijom sa EtOAc/petroleum etar/MeOH (1:1:0 do 50:50:10) dajući tri frakcije, koje sadrže 316 g, hemijske čistoće 98.8% i 10.8% epimer, 160 g, hemijske čistoće 82.3% i 17.5% epimer i 180 g, čistoće 61% i 11.3% epimer, respektivno. Prve dve prethodno date frakcije su kombinovane i dalje prečišćene sa prep-HPLC dajući 200 g proizvoda čistoće >99% i <1% epimera.<1>H NMR (400 MHz, DMSO d6): δ 1.48-1.53 (m, 1H), 1.66-1.69 (m, 1H), 1.77-1.79 (m, 3H), 2.11-2.16 (m, 1H), 2.80-2.88 (m, 2H), 3.11 (s, 1H), 3.42-3.48 (m, 1H), 4.0-4.25 (m, 4H), 6.58 (s, 3H), 6.80-6.85 (d, J= 10.2, 2H), 6.95 (s, 2H), 7.40 (s, 1H), 7.77 (s, 1H).

Primer 4

[0116] Pored postupaka opisanih u Primerima 2 i 3, takođe je sintetisan (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid (jedinjenje I-1) prema Shemi 6.

[0117] (3R)-3-amino-1-(terc-butoksikarbonil)piperidin-4-karboksilna kiselina (4-L-6). U reakcioni sud od 10 L pod azotom dodato je jedinjenje 4-5 (100 g, 0.287 mole), MeOH (6 L, 60 z/m) i 10 g 20% Pd(OH)2/C. Reakcioni sud je punjen/pražnjen vodonikom tri puta i smeša je zagrejana na 40-50 °C uz mešanje pod vodonikom od 3 Mpa tokom 40 sati. LC/MS analiza je pokazala potpun utrošak polaznog materijala 4-5. Smeša je ohlađena na 22 °C i profiltrirana i filtrat je koncentrovan u vakuumu do suva dajući čvrsti proizvod. Sirov proizvod je razmućen u EtOH (500 mL) na 22 °C tokom 2 sata, profiltriran i osušen u vakuumu na 50 °C dajući proizvod 4-L-6 (60 g, 0.245 mol) u prinosu od 85%, kao belu čvrstu supstancu.

[0118] (3R)-1-(terc-butoksikarbonil)-3-(((R)-4-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-5-ethoksi-5-oksopentil)amino)piperidin-4-karboksilna kiselina (4-L-8). U rastvor 4-L-6 (48.4 g, 0.197 mole) u DMSO (450 mL) dodat je Et3N (20.2 g, 0.199 mol, 1 ekviv), 3-8A (67.4 g, 0.199 mol, 1 ekviv) i natrijum triacetoksiborohidrid (STAB, 84.8 g, 0.40 mol, 2.0 ekviv). Smeša je zagrevana na 50°C tokom 30 min i mešana na toj temperaturi 3 sata. LC/ analiza je pokazala utrošak najvećeg dela polaznog materijala 4-L-6 i formiranje 4-L-8.

[0119] Reakcionoj smeši je dodat EtOH (35 mL) i mešana na 50 °C tokom 30 min. Smeša je zagrevana na 75-85°C tokom 3 dana. Smeša je ohlađena na 18 °C i i pažljivo dodata u vodu (6 L) uz snažno mešanje dajući tako gustu smešu. Posle 2 sata, čvrsti ostatak je profiltriran i ispran vodom (3 x 3 L), osušen pod vakuumom na 60-70 °C toko 24 sata dajući proizvod 4-L-9 (114 g) kao braon čvrsti ostatak. Ovaj čvrsti ostatak je upotrebljen direktno u narednom koraku.

[0120] (3R,3'R,4'S)-1'-(terc-butoksikarbonil)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso- [1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilna kiselina (4-L-9-trans). U rastvor sirovog 4-L-9 (100 g), u DMF-u (500 mL) was dodat je 4-dimetilaminopiridin (11 g, 0.09 mol, 0.5 ekviv) i mešan je 20 °C tokom 10 min. Dodat je 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (7.0 g, 0.036 mol, 0.2 ekviv) i reakciona smeša je mešana 20 °C tokom 3 sata. HPLC analizom pokazano je da je odnos komponenti 57:43 cis/trans smeše i dodato je još EDAC (3.5 g, 0.018 mol, 0.1 ekviv). Posle 5 sati, HPLC analizom pokazano je da je izvršena potpuna konverzija u 4-L-9-trans. Smeša je pažljivo dodata u vodu (2.25 L) i smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2 x 500 mL) i organski slojevi su isprani rastvorom soli (500 mL) i vodom (500 mL), koncentrovani u vakuumu do suva dajući sirovi proizvod 4-L-9-trans (100 g) kao braon čvrsti ostatak. Sirov proizvod je rastvoren u EtOAc (135 mL) na 60 °C i zatim

ohlađen na 20 °C tokom 1 sata i dodato je 50 mL petrol etra. Smeša je ostavljena da stoji 2 sata. Čvrsti ostatak je profiltriran i ispran sa 3:1 EtOAc/petrol etrom (50 mL), osušen pod vakuumom na 50°C tokom 16 sati dajući 4-L-9-trans (23 g, prinos 22% sa 99% čistoće).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.94 (s, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.54 -6.61 (m, 1H), 3.99 - 4.08 (m, 1H), 3.42 - 3.38 (m, 2H), 2.07 - 2.16 (m, 1H), 1.74 -1.92 (m, 3H), 1.39 (s, 9H).

[0121] (3R,3'R,4'S)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilna kiselina hidrohlorid (4-L-10 trans). U rastvor 0.5N HCl u EtOAc (76 mL) dodat je 4-L-9 trans (20 g, 38 mmol) i zagrevan na 20 °C tokom 18 dajući gustu smešu. Čvrsti ostatak je profiltriran, ispran sa EtOAc (5 mL) i osušen u vakuumu na 45 °C tokom 18 h dajući 4-L-10 kao HCl so (17 g, 97% prinos ).

[0122] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilna kiselina (3-10-trans). Rastvor 4-L-10 (2.0 g, 4.38 mole), 6-hlor-5-fluoro-pirimidin-4-ilamina (711 mg, 4.82 mmol, 1.1 ekviv), DIPEA (1.52 mL, 8.77 mol, 2 ekv.) u 40 mL nBuOH zagrevan je na 130-140 °C tokom 72 h. Smeša je ohlađena na 22 °C i koncentrovana u vakuumu dajući ostatak koji je prečišćen na koloni pri čemu se dobija 3-10-trans (1.1 g, 47%). Uočeno je prisustvo elativno male količine epimera (3S,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilne kiseline. Intermedijer 3-10-trans može se konvertovati u jedinjenje I-1 via prethodno opisane procedure.

[0123] Jedinjenje I-1 takođe je sintetisano prema Shemi 8.

[0124] Sinteza (R)-terc-butil 1-(3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)-5-oksopirolidin-2-karboksilata 4-e izvedena je prema procedurama sličinim onim opisanim u Phillips, D. P.; Zhu, X. -F.; Lau, T. L.; Yang, K.; Liu, H. Tetrahedron Letters, 2009, 50, 7293, pri čemu su (S)-metil 5-oksopirolidin-2-karboksilat i 1-hlor-4-jodbenzen zamenjeni (R)-terc-butil 5-oksopirolidin-2-karboksilatom i 1-hlor-3-jod-5-(trifluormetil)benzenom.

[0125] (2R)-terc-butil 1-(3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)-5-hidroksipirolidin-2-karboksilat. Anhidrovani rastvor 4-e (11 g, 30 mmol) u Me-THF (100 mL) ohlađen je na -35 °C u atmosferi azota. Rastvor DIABL-H (5.9 g, 42 mmol) u toluenu (42 mL) je dodat u kapima uz održavanje temperature na - 35 °C. Reakcija je praćena HPLC-om i po završetku, dodat je rastvor 1N Rochell-ove soli (100 mL) održavajući pri tome reakcionu temperaturu ispod 0 °C. Organska faza je odvojena, isprana 1N Rochellvom soli (50 mL x 3) i odvojena, razblažena dodatkom Et3N (4 mL), osušena (Na2SO4) i koncentrovana u vakuumu dajući 4-f (8.3 g) u obliku ulja

[0126] (3R)-1-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-(((R)-5-(terc-butoksi)-4-((3-hlor-5-(trifluormetil) fenil)amino)-5-oksopentil)amino)piperidin-4-karboksilna kiselina.

Rastvor 4-f (37.4 g, 0.146 mmol) u DMF-u (700 mL) tretiran je sa 3-8 (40.2 g, 0.11 mmol), Et3N (10.1 g, 0.1 mmol) STAB (42.4 g, 0.2 mmol) i smeša je zagrevana 5 h na 55 °C. Reakciona smeša je razblažena vodom (2.5 L), eksstrahovana sa EtOAc (500 mL x 3), organske faze su kombinovane i isprane rastvorom soli, razdvojene, osušene (Na2SO4) i koncnetrovaneu vakuumu dajući 4-a (40.2 g) kao čvrsti ostatak koji je upotrebljen bez dodatnog prečišćavanja.

[0127] (3R)-1-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-(((R)-4-karboksi-4-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)butil)amino)piperidin-4-karboksilna kiselina. U rastvor 5 N HCl (250 mL) dodat je t-butil estar 4-a i suspenzija je zagrevana 5 h na 55 °C dok je hidroliza praćena pomoću HPLC. Po završenom formiranju proizvoda, voa je uparena u vakuumu dajući čvrsti 4-b koji je osušen u vakuumu i upotrebljen bez dodatnog prečišćavanja.

[0128] (3R,3'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksilna kiselina. U rastvor kiseline 4-b (55 g, 0.1 mol) u DMF (500 mL) dodati su DIEA (64.5 g, 0.5 mol), CDI (32.5 g, 0.2 mol) na 0 °C. Rastvor je mešan 1.5 h na 0 °C, razblažen je vodom (3 L), podešen na pH 3 dodatkom HCl i ekstrahovan sa EtOAc (2 L x 3). Organske faze su kombinovane, osušene (Na2SO4) i koncentrovane u vakuumu dajući tako 4-c (48 g).

[0129] Preostali koraci do jedinjenja I-1 izvedene su prema prethodno opisanim procedurama.

Primer 5

Sinteza trans-terc-butil 3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil) amino)-4'-(metilkarbamoil)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1'-karboksilata.

[0131] Sinteza trans-terc-butil 3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil) amino)-4'-(metilkarbamoil)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-1'-karboksilata. Korošćena je procedura slična onoj opisanoj za sintezu (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 14 pri čemu se dobija sirov materijal koji je prečišćen na pre-HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% NH3.H2O kao mobilnom fazom) pri čemu se dobija traženo jedinjenje (360 mg, prinos: 67%) kao žut čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H)<+>: 544.18. HPLC: (214 nm:

100.0%, 254 nm: 100.0%).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) (smeša izomera) δ: 7.69-7.68 (m, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 4.39-4.36 (m, 2H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.53-3.31 (m, 3H), 3.20-3.10 (m, 1H), 2.99-2.92 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.28-2.19 (m, 1H), 1.96-1.77 (m, 5H), 1.68-1.58 (m, 1H).

[0132] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N-metil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera je razdvojena na dva pika pomoću SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:metanol (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 2 je dalje prečišćen SFC razdvajanjem (AD-H (2 x 15 cm), 30% iPrOH(0.15% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući tražno jedinjenje . LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) @ 1.24 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.72 - 7.85 (m, 2H), 6.92 (s, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.43 - 6.64 (m, 3H), 4.34 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 3.93 - 4.19 (m, 2H), 3.37 - 3.49 (m, 1H), 3.22 - 3.30 (m, 1H), 3.13 (br. s., 1H), 2.84 (t, J = 12.05 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.13 (qd, J = 6.05, 12.45 Hz, 1H), 1.60 - 1.89 (m, 4H), 1.40 - 1.58 (m, 1H).

[0133] (3S,3'R,4'5)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N-metil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera je razdvojena u dva pika pomoću SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:metanol (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 2 je dalje prečišćen SFC razdvajanjem (AD-H (2 x 15cm), 30% iPrOH (0.15% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući traženo jedinjenje . LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) @ 1.24 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.83 (q, J = 4.60 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 6.78 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.58 (s, 2H), 6.53 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.90 - 4.19 (m, 2H), 3.14 (br. s., 1H), 2.92 (br. s., 1H), 2.74 - 2.90 (m, 1H), 2.55 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.00 -2.18 (m, 1H), 1.74 - 1.89 (m, 3H), 1.56 - 1.74 (m, 1H), 1.34 - 1.50 (m, 1H).

[0134] (3S,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N-metil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera je razdvojena u dva pika pomoću SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:metanol (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 1 je dalje prečišćen SFC razdvajanjem (AD-H (2 x 15cm), 30% MeOH (0.15% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući traženo jedinjenje . LCMS (Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) @ 1.23 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.72 - 7.85 (m, 2H), 6.92 (s, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.54 (d, J = 7.53 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 13.30 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 3.26, 12.30 Hz, 1H), 4.08 (td, J = 7.06, 10.48 Hz, 1H), 3.36 - 3.47 (m, 1H), 3.23 - 3.30 (m, 1H), 3.13 (br. s., 1H), 2.84 (t, J = 11.80 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.13 (qd, J = 6.17, 12.61 Hz, 1H), 1.62 - 1.91 (m, 4H), 1.42 - 1.57 (m, 1H).

[0135] trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N-metil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera je razdvojena u dva pika pomoću SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:metanol (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 1 je dalje prečišćen SFC razdvajanjem (AD-H (2 x 15 cm), 30% MeOH (0.15% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući traženo jedinjenje. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) @ 1.23 min. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) @ 1.24 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.80 - 7.89 (m, 1H), 7.72 - 7.80 (m, 1H), 6.97 (d, J = 6.53 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.58 (s, 2H), 6.53 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.89 - 4.19 (m, 2H), 3.13 (br. s., 1H), 2.74 - 3.02 (m, J= 12.42, 12.42 Hz, 2H), 2.55 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.08 (qd, J = 5.97, 12.20 Hz, 1H), 1.81 (td, J = 6.24, 12.36 Hz, 3H), 1.56 - 1.74 (m, 1H), 1.33 - 1.51 (m, 1H).

Primer 6

[0136]

[0137] Sinteza trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid.

Slična procedura je upotrenljena za opis sinteze (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 14 pri čemu se dobija sirov materijal koji je prečišćen na pre-HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% TFA kao ombilnom fazom) dajući traženo jedinjenje (45 mg, prinos: 90%) kao žut čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H)<+>: 558.0. HPLC: (214 nm: 98.2%, 254 nm: 100.0%).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.77 (s, 1H), 6.92-6.89 (m, 1H), 6.83-6.81 (m, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.38-4.38 (m, 2H), 4.05-4.00 (m, 2H), 3.55-3.53 (m, 1H), 3.45-3.40 (m, 2H), 3.15-2.89 (m, 7H), 2.21-2.16 (m, 1H), 1.90-1.86 (m, 3H), 1.66-1.56 (m, 2H).

[0138] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid.

Traženo jedinjenje dobijeno je hiralnim razdvajanjem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil) amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 - (trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida) koristeći ChiralPak IC (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1 DEA) kolonu i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) kolonu. ESI-MS (M+H)<+>: 558.0<1>H NMR (400 MHz, CDCl3)1 δ: 7.92 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.72 (d, J = 7.78 Hz, 2H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.45 (dd, J = 2.76, 12.80 Hz, 2H), 4.17 - 4.32 (m, 1H), 3.64 - 3.80 (m, 2H), 3.44 - 3.58 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.00 - 3.09 (m, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.40 (dd, J = 5.52, 13.30 Hz, 1H), 1.63 - 1.99 (m, 3H), 1.26 - 1.43 (m, 1H).

[0139] (3S,3'R,4S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid.

Traženo jedinjenje dobijeno je hiralnim razdvajanjem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena na dva pika koji sadrže smeđu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 - (trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida) koristeći ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% metanol w/0.1 DEA) koloni i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) column. ESI-MS (M+H)<+>: 558.0<1>H NMR (400 MHz, (400 MHz, CDCl3) δ: 7.93 (d, J = 1.26 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.69 (br. s., 2H), 5.06 (d, J = 4.27 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.45 (d, J = 12.55 Hz, 2H), 4.16 - 4.26 (m, 1H), 3.66 - 3.81 (m, 2H), 3.54 - 3.64 (m, 1H), 3.40 - 3.54 (m, 2H), 3.01 - 3.10 (m, 4H), 2.95 (s, 3H), 2.37 (dd, J = 5.27, 13.05 Hz, 1H), 1.91 - 2.02 (m, 2H), 1.48 - 1.75 (m, 2H).

[0140] (3S,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid.

Traženo jedinjenje hiralnim razdvjanajem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluorometil)fenil)amino)-N,N-etil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 -(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid) koristeći ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1 DEA) kolonu i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol w/0.1% DEA 100 bar) kolonu. ESI-MS (M+H)<+>: 558.0<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.92 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.72 (d, J = 7.78 Hz, 2H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.45 (dd, J = 2.76, 12.80 Hz, 2H), 4.19 - 4.30 (m, 1H), 3.66 - 3.79 (m, 2H), 3.47 - 3.56 (m, 3H), 3.09 (s, 3H), 2.97 - 3.07 (m, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.40 (dd, J= 5.52, 13.30 Hz, 1H), 1.81 - 1.97 (m, 3H), 1.73 (dd, J= 3.76, 12.80 Hz, 1H).

[0141] (3R,3'S,4R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid.

Traženo jedinjenje hiralnim razdvjanajem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,Ndimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 -(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid) koristeći ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1 DEA) kolonu i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol w/0.1% DEA 100 bar) column. ESI-MS (M+H)<+>: 558.0<1>H NMR (400 MHz, (400 MHz, CDCl3) δ: 7.93 (d, J = 1.26 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.69 (br. s., 2H), 5.06 (d, J = 4.27 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.45 (d, J = 12.55 Hz, 2H), 4.16 - 4.26 (m, 1H), 3.66 - 3.81 (m, 2H), 3.54 - 3.64 (m, 1H), 3.40 -3.54 (m, 2H), 3.01 - 3.10 (m, 4H), 2.95 (s, 3H), 2.37 (dd, J = 5.27, 13.05 Hz, 1H), 1.91 - 2.02 (m, 2H), 1.48 - 1.75 (m, 2H).

Primer 7

[0142]

[0143] Sinteza trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-4'-(4-metilpiperazine-1-karbonil)-[1,3'-bipiperidin]-2-on Primenjena je slična procedura kao ona opisana za sintezu trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 14 pri čemu se dobija proizvod 23 koji je prečišćen reversno faznom HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% NH3.H2O kao mobilnom fazom) dajući tražno jedinjenje (100 mg, prinos: 70%) kao žut čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H)<+>: 613.24.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.94 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.73-6.67 (m, 2H), 5.25-5.03 (m, 1H), 4.71 (s, 2H), 4.49-4.40 (m, 2H), 4.35-4.16 (m, 1H), 3.82-3.64 (m, 3H), 3.62-3.41 (m, 6H), 3.08-2.97 (m, 1H), 2.52-2.34 (m, 3H), 2.30-2.25 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 1.85-1.64 (m, 2H), 1.72-1.64 (m, 2H), 1.49-1.31 (m, 1H).

[0144] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-4'-(4-metilpiperazine-1-karbonil)-[1,3'-bipiperidin]-2

on. Traženo jedinjenje hiralnim razdvjanajem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-etil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 23 primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 -(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid) koristeći ChiralPak IC (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1 DEA) kolonu i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) kolonu. ESI-MS (M+H)<+>: 613.2<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.95 (s, 1H), 6.83 - 6.97 (m, 3H), 4.50 - 4.68 (m, 2H), 4.28 - 4.40 (m, 1H), 3.66 - 3.91 (m, 8H), 3.30 - 3.52 (m, 4H), 3.14 (t, J = 12.42 Hz, 2H), 2.73 (br. s., 2H), 2.27 (dd, J = 5.65, 12.93 Hz, 1H), 1.83 - 2.05 (m, 2H), 1.54 - 1.79 (m, 2H).

[0145] (3S,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-4'-(4-metilpiperazine-1-karbonil)-[1,3'-bipiperidin]-2-on. Traženo jedinjenje hiralnim razdvjanajem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-etil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 23 primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il) -3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 - (trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid) koristeći ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1 DEA) kolonu i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) kolonu. ESI-MS (M+H)<+>: 613.2.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.91 - 7.99 (m, 1H), 6.84 - 6.97 (m, 3H), 4.57 (dd, J = 14.18, 19.70 Hz, 2H), 4.34 (br. s., 1H), 3.42 - 3.53 (m, 1H), 3.37 (d, J = 1.51 Hz, 3H), 3.05 - 3.19 (m, 1H), 2.86 (t, J= 7.53 Hz, 1H), 2.68 - 2.78 (m, 2H), 2.26 (dd, J= 5.65, 12.93 Hz, 1H), 1.82 - 2.03 (m, 3H), 1.55 - 1.79 (m, 2H).

[0146] (3S,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-4'-(4-metilpiperazine-1-karbonil)-[1,3'-bipiperidin]-2-on. Traženo jedinjenje hiralnim razdvjanajem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid 23 primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 -(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid) primenom ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% metanol w/0.1 DEA) kolone i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) kolonu. ESI-MS (M+H)<+>: 613.2.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.94 (s, 1H), 6.87 - 6.93 (m, 3H), 4.57 (dd, J = 14.18, 19.70 Hz, 1H), 4.34 (br. s., 1H), 3.43 - 3.51 (m, 1H), 3.36 - 3.38 (m, 2H), 3.13 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 7.53 Hz, 1H), 2.73 (br. s., 1H), 2.26 (dd, J = 5.65, 12.93 Hz, 1H), 1.96 - 2.03 (m, 1H), 1.83 - 1.94 (m, 1H), 1.51 - 1.75 (m, 1H).

[0147] ((3R,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-4'-(4-metilpiperazine-1-karbonil)-[1,3'-bipiperidin]-2-on. Traženo jedinjenje hiralnim razdvjanajem trans-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-etil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 23 primenom hiralnog SFC razdvajanja u dva koraka. Prvo, smeša je razdvojena u dva pika koji sadrže smešu dva diastereomera ((3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il) -3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid i (3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5 -(trifluormetil)fenil)amino)-N,N-dimetil-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid) na ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) koloni i zatim je dobijena smeša koja sadrži par izomera dalje razdvojena u pojedinačne enantiomere koristeći ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% metanol t/0.1% DEA 100 bar) column.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.96 (br. s., 1H), 6.90 (br. s., 1H), 6.76 (d, J = 10.04 Hz, 2H), 4.60 (t, J = 14.06 Hz, 2H), 4.19 - 4.32 (m, 1H), 3.67 - 3.78 (m, 1H), 3.43 - 3.54 (m, 3H), 3.35 - 3.38 (m, 3H), 3.16 (t, J= 12.42 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 7.40 Hz, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.32 (dd, J = 5.02, 12.80 Hz, 1H), 1.89 - 2.07 (m, 4H), 1.62 - 1.76 (m, 5H),

Primer 8

[0148]

[0149] Sinteza 1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-fluoro-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida. Primenjena je slična procedura onoj opisanoj za sintezu (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 14 pri čemu se dobija sirov amterijal koji je prečišćen sa pre-HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% NH3.H2O kao mobilna faza) dajući tako traženo jedinjenje (175 mg, prinos: 69%) kao žut čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H)<+>: 514.19. HPLC: (214 nm: 96.13%, 254 nm: 96.53%).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.79-7.78 (m, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.63-6.54 (m, 2H), 4.41-4.36 (m, 2H), 4.08-4.06 (m, 1H), 3.55-3.41 (m, 3H), 3.28-3.25 (m, 1H), 2.99-2.93 (m, 1H), 2.28-2.21 (m, 1H), 1.98-1.78 (m, 6H).

[0150] (3R,3'R,4'5)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-fluoro-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA(3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min) i pik 3 odgovara traženom jedinjenju. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) @ 1.09 min.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.91 (br. s., 1H), 6.66 (d, J = 8.53 Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.46 (d, J = 10.79 Hz, 1H), 6.12 (br. s., 1H), 5.47 (br. s., 1H), 5.16 (d, J = 3.51 Hz, 1H), 4.91 (br. s., 2H), 4.35 - 4.54 (m, 2H), 3.82 (td, J = 5.11, 10.60 Hz, 2H), 3.51 - 3.60 (m, 1H), 3.34 - 3.48 (m, 3H), 2.96 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.35 - 2.47 (m, 1H), 1.91 - 2.06 (m, 3H), 1.84 (dq, J= 3.89, 12.76 Hz, 1H), 1.48 - 1.62 (m, 1H).

[0151] (3S,3R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-fluoro-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA (3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min). Pik 2 od 3 odgovara tražnom jedinjenju. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) @ 1.10 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.74 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.47 - 6.66 (m, 4H), 4.23 (d, J = 12.80 Hz, 2H), 3.90 - 4.18 (m, 2H), 3.34 - 3.46 (m, 2H), 3.12 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.42 Hz, 1H), 2.10 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.72 (m, 1H), 1.37 - 1.52 (m, 1H).

[0152] (3R,3'S,4R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-fluoro-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA (3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min). Pik 1 od 3 dalje je prečišćen pomoću SFC (IA (3 x 15 cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min) dajući traženo jedinjenje. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) @ 1.10 min.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, 1.5 Hz, 1H), 7.39 (s., 1H), 6.85 (s, 1H), 6.81 (s., 1H), 6.74 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.47 - 6.66 (m, 4H), 4.16 - 4.46 (m, 2H), 3.95 - 4.16 (m, 2H), 3.34 - 3.48 (m, 2H), 3.12 (br. s., 1H), 2.87 - 3.01 (m, 2H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.10 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.54 - 1.74 (m, 1H), 1.35 - 1.52 (m, 1H).

[0153] (3S,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-fluoro-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IA (3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min). Pik 1 od 3 je dalje prečišćen pomoću SFC (IA (3 x 15cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min) dajući traženo jedinjenje. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) @ 1.10 min.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.84 (s, 2H), 6.70 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.47 - 6.65 (m, 4H), 4.18 - 4.48 (m, 2H), 3.92 - 4.18 (m, 2H), 3.38 - 3.49 (m, 1H), 3.20 - 3.30 (m, 1H), 3.11 (br. s., 1H), 2.88 - 2.99 (m, 1H), 2.83 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.14 (qd, J = 6.03, 12.52 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.59 - 1.74 (m, 1H), 1.41 - 1.58 (m, 1H).

Primer 9

[0154]

[0155] Sinteza (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-fluorofenil) amino)-2-okso- [1,3'-bipiperidin] -4'-karboksamida. Primenjena je slična procedura onoj opisanoj za sintezu (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 14 dajući pri tome sirov amterijal koji je prečišćen pre-HPLC (MeOH/H2O sa 0.05% NH3.H2O kao mobilna faza) pri čemu se dobija traženo jedinjenje (141 mg, P: 30%) kao beli čvrsti ostatak solid. ESI-MS (M+H)<+>: 479.9. HPLC: (214 nm: 100%, 254 nm: 100%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO d6) δ: 7.78-7.77 (m, 1H), 7.40-7.38 (m, 1H), 6.86-6.82 (m,

1H), 6.62-6.55 (m, 3H), 6.45-6.37 (m, 3H), 4.26-3.94 (m, 4H), 3.47-3.39 (m, 1H), 3.20-3.03 (m, 2H), 2.90-2.78 (m, 2H), 2.18-2.04 (m, 1H), 1.86-1.34 (m, 5H).

[0156] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-fluorofenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IC (2 x 15 cm), 25% MeOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući tako traženo kedinjenje kao pik 3. LCMS (Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) @ 1.01 min.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.90 (br. s., 1H), 6.44 (d, J = 8.53 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.30 (br. s., 1H), 6.23 (d, J = 11.04 Hz, 1H), 5.63 (br. s., 1H), 5.09 (br. s., 1H), 4.94 (br. s., 2H), 4.45 (d, J = 12.80 Hz, 2H), 3.68 - 3.95 (m, 2H), 3.49 - 3.56 (m, 2H), 3.35 - 3.46 (m, 2H), 2.89 - 2.99 (m, 1H), 2.31 - 2.44 (m, 1H), 1.90 - 2.04 (m, 3H), 1.76 - 1.89 (m, 1H), 1.49 - 1.61 (m, 1H).

[0157] (3S,3'R,4S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-fluorofenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IC (2 x 15 cm), 25% MeOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajuči pri tome traženo jedinjenje kao pik 1. LCMS (Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) @ 1.01 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (s., 1H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 3H), 6.46 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 1.76, 8.78 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 7.53 Hz, 1H), 4.28 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 2.76, 12.30 Hz, 1H), 4.03 (td, J = 6.56, 10.98 Hz, 1H), 3.33 - 3.46 (m, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.94 (br.

s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.09 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.72 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.72 (m, 1H), 1.29 - 1.50 (m, 1H).

[0158] (3S,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-fluorofenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IC (2 x 15 cm), 25% MeOH(0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 2 od 3 je dalje prečišćen pomoću SFC (IA (3 x 15 cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) dajući tako traženo title jedinjenje . LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) @ 1.01 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.37 (br. s., 1H), 6.84 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.55 (br. s., 1H), 6.30 - 6.48 (m, 3H), 4.28 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 3.39, 12.67 Hz, 1H), 3.97 (td, J = 6.84, 10.42 Hz, 1H), 3.38 - 3.50 (m, 1H), 3.22 - 3.29 (m, 1H), 3.10 (br. s., 1H), 2.71-2.97 (m, 1H), 2.83 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.13 (qd, J = 6.13, 12.49 Hz, 1H), 1.73 - 1.91 (m, 3H), 1.58 - 1.73 (m, 1H), 1.39 - 1.53 (m, 1H).

[0159] (3R,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-fluorofenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (IC (2x15cm), 25% MeOH(0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min). Pik 2 od 3 je dalje prečišćen pomoću SFC (IA (3 x 15 cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 60 ml/min) pri čemu se dobija traženo jedinjenje . LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) @ 1.01 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 3H), 6.46 (td, J = 2.01, 12.30 Hz, 1H), 6.39 (td, J = 1.95, 8.66 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 7.53 Hz, 1H), 4.18 - 4.48 (m, 2H), 4.09 - 4.18 (m, 1H), 3.79 -4.09 (m, 1H), 3.33 - 3.45 (m, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.92 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.42 Hz, 1H), 2.09 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.93 (m, 3H), 1.51 - 1.74 (m, 1H), 1.32 - 1.51 (m, 1H).

Primer 10

[0160]

[0161] Sinteza (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormethoksi)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid.

Primenjena je procedura slična onoj opisanoj sa sintezu (3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormetil)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamida 14 dajuči tako sirov materijal koji je prečišćen sa pre-HPLC (MeOH/H2O with 0.05% NH3.H2O kao mobilna faza) dajući traženo jedinjenje (320 mg, prinos: 44%) kao žut čvrsti ostatak. ESI-MS (M+H)<+>: 546.16. HPLC: (214 nm:

98.4%, 254 nm: 98.0%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.84-6.81 (m, 1H), 6.75-6.72 (m, 1H), 6.62-6.57 (m, 3H), 6.52-6.47 (m, 2H), 4.24-3.98 (m, 4H), 3.47-3.40 (m, 1H), 3.17-2.99 (m, 2H), 2.86-2.79 (m, 2H), 2.15-1.99 (m, 1H), 1.86-1.60 (m, 4H), 1.48-1.39 (m, 1H).

[0162] (3R,3'S,4R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormethoksi)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (AD-H(2 x 25 cm), 30% EtOH(0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min) pri čemu se dobija traženo jedinjenje . LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) @ 1.20 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (br. s., 1H), 6.81 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.38 - 6.52 (m, 2H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.92 - 4.18 (m, 2H), 3.34 - 3.45 (m, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.93 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.08 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.73 (m, 1H), 1.36 - 1.50 (m, 1H).

[0163] (3S,3'S,4'R)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormethoksi)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (AD-H(2 x 25 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min) pri čemu se dobija traženo jedinjenje .

LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) @ 1.23 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.37 (br. s., 1H), 6.84 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.43 - 6.54 (m, 2H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 4.22 (br. s., 1H), 4.13 (dd, J = 3.26, 12.30 Hz, 1H), 4.01 (td, J = 6.81, 10.23 Hz, 1H), 3.44 (td, J = 6.18, 12.49 Hz, 1H), 3.20 - 3.29 (m, 1H), 3.11 (br. s., 1H), 2.88 (br. s., 1H), 2.83 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.12 (qd, J = 6.05, 12.46 Hz, 1H), 1.73 - 1.91 (m, 3H), 1.59 - 1.73 (m, 1H), 1.48 (td, J = 9.41, 19.33 Hz, 1H).

[0164] (3S,3'R,4S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormethoksi)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (AD-H (2 x 25 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO2, 100 bar, 70 ml/min) pri čemu se dobija traženo jedinjenje . LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) @ 1.22 min.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.81 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.42 - 6.51 (m, 2H), 4.23 (d, J = 12.80 Hz, 2H), 3.97 - 4.18 (m, 2H), 3.34 - 3.44 (m, 2H), 3.10 (br. s., 1H), 2.93 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.17 Hz, 1H), 2.03 - 2.15 (m, 1H), 1.77 - 1.90 (m, 3H), 1.57 - 1.73 (m, 1H), 1.37 - 1.48 (m, 1H).

[0165] (3R,3'R,4'S)-1'-(6-amino-5-fluorpirimidin-4-il)-3-((3-hlor-5-(trifluormethoksi)fenil)amino)-2-okso-[1,3'-bipiperidin]-4'-karboksamid. Smeša četiri diastereomera razdvojena je na tri pika pomoću SFC (AD-H (2 x 25cm), 30% EtOH(0.1% DEA)/CO2, 100bar, 70ml/min) pri čemu se dobija traženo jedinjenje . LCMS(Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) @ 1.23 min.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.93 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.85 (br. s., 1H), 5.32 (br. s., 1H), 4.97 - 5.15 (m, 1H), 4.78 (br. s., 2H), 4.46 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.67 - 3.87 (m, 2H), 3.34 - 3.60 (m, 4H), 2.99 (t, J = 12.17 Hz, 1H), 2.34 - 2.49 (m, 1H), 1.91 - 2.08 (m, 3H), 1.83 (dq, J = 3.76, 12.72 Hz, 1H), 1.47 - 1.74 (m, 1H).

Primer 11

[0166] In vitro analize BTK kinaze: BTK-POLYGAT-LS ASSAY. Cilj in vitro analize BTK je odrediti potentost (jačinu) jedinjenja na BTK merenjem IC50. Inhibicija jedinjenja merena je nakon praćenja količine fosforilacije fluoresceinom-obeleženog poliGAT peptida (Invitrogen PV3611) u prisustvu aktivnog enzima BTK (Upstate 14-552), ATP i inhibitora. Reakcija BTK kinaze izvedena je na crnoj ploči sa 96 ležišta (costar 3694). Za uobičajenu analizu, alikvot od 24 µL ATP/peptid master smeše (finalna koncetracija; ATP 10 uM, poliGAT 100 nM) u kinaza puferu (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 200 uM Na3PO4, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, i 0.2 mg/ml kazeina) dodato je u svako ležište. Zatim, dodato je 1 µL 4-strukog, 40X jedinjenja titracijau 100% DMSO rastvaraču, pa zatim i 15 µL BTK enzmiske smeše u 1X kinaza puferu (sa krajnjom koncetracijom od 0.25 nM). Test je inkubiran 30 minuta pre nego što je reakcija zaustavljena dodatkom 28 µL 50 mM rastvora EDTA.

Alikvoti (5 µL) reakcije kinaze je prebačena na belu pločusa 384 ležišta male zapremine (Corning 3674), i dodato je 5 µL 2X detekcionog pufera (Invitrogen PV3574, sa 4 nM Tb-PY20 antitelom, Invitrogen PV3552). Ploča je pokrivena i inkubirana 45 minuta na sobnoj temperaturi. Merena je vremenski razložena fluorescencija (TRF) na Molecular Devices M5 (332 nm ekscitacija; 488 nm emisija; 518 nm emisija fluoresceina). Izračunate su vrednsoti za IC50fitovanje četiri parametra sa 100% enzimskom aktivnošću određenom za DMSO kontrolu i 0% aktivnosti EDTA kontrole.

[0167] Testirana su odabrana jedinjenja formule I i nađeno je da su aktivna u poliGAT analizi. Jedinjenja 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 i 1-7 ispoljila su IC50vrednosti od 0.73 nM, 0.68 nM, 2.07 nM, 0.63 nM, 1.6 nM,i 1.2 nM, respektivno. Jedinjenje 1-6 pokazuje IC50vrednost ispod 1 nM. Jedinjenje za poređenje I<C>, prikazano niže, ispoljava vrednsot od IC50za 2.0 nM.

Primer 12

PROTOKOL ISPITIVANJA ZA ODREĐIVANJE AKTIVACIJE PXR NUKLEARNOG

RECEPTORA U HUMANIM DPX2 ĆELIJAMA

[0168]

a) Opis protokola: pokazalo se da je PXR primarni nuklearni receptor koji podreduje u lekom –indukovanoj ekspesiji CYP3A4 (Bertilsson G, et al.; Proc Natl Acad Sci U S A.1998 Oct 13;95(21):12208-13). Na osnovu ove putanje indukcije CYP3A4, test ekspresije ćelijski-baziranog PXR reporter gena se obično koristi za skrining novih molekulskih entitia (NMEs) u ranoj fazi ispitivanja lekov, zbog njihovog potencijala da indukuju CYP3A4 (Luo G, et al.; Drug Metab Dispos. 2002 Jul;30(7):795-804.) Ispitivanja su osmišljena tako da to procene efekat novih molekulskih entiteta (NMEs) na aktivaciju humanog PXR u DPX2 ćelijama. Ćelijske linije stabilno transfektovane sa nulearnim PXR receptorima i odgovarajući elementi za odgovor su zasejani na ploču sa 96-ležišta. Dvadeset četiri sata nakon zasejavanja, ćelije su tretirane sa 6 različitih koncentracija NMEs u ležištima u triplikatu (videti niže) i ćelije su vraćene u inkubator na još 24 hr. Na kraju ovog perioda inkubacije, određen je broj živih ćelija/ležištu pomoću testa Promega's Cell Titer Fluor citotoksičnosti. Nakon ovog testa, Promega's ONE-Glo je dodat u ista ležošta i procenjena je aktivnost reporter gena.

b) Sistem testiranja: Sistem tesktiranja sastoji se od stabilno transformisanih ćelijskih linija DPX2 tumora na ploču od 96-ležišta mikrotitar ploča. Ekspresioni vektor koji štiti PXR nuklearni receptor sa odgovarajućim pojačivačima i promotorima povezanim za luciferaza reporter gen he stabilno integrisan u ive ćelijske linije tumora. Aktivacija receptora određena je praćenjem aktivnost reporter gena, i poređenjem rezultata sa ćelija tretiranim vehikulumom. Pozitivne kontrole line ćelije tretirane sa 6 različitih koncentracija (0.1, 0.5, 1, 5, 10 i 20 µM) rifampicina. Na ovaj način, jedinjenja koja aktiviraju PXR se mogu lako i brzo identifikovati. Budući da su korišćene stabilno integrisane ćelije, moguće uočiti 3- do 70-struku aktivaciju receptora.

c) Obrada podataka i kinetička aktivacija receptora:

Podaci obrađeni korišćenjem MS-Excel -a izračunati su kao srednja vrednost (n = 3) i % CV stepena aktivacije PKSR u odnosu na ćelije tretirane vehikulomom za svaku od 6 različitih doza. Svi podaci o aktivaciji su normalizovani na broj održivih ćelija / ležištu. Rezultati su takođe izraženi kao procenat odgovora koji daje odgovarajuća pozitivna kontrola u dozi od 10 µM. EC50i Emaxvrednosti su izvedene za test jedinjenja koje daju aktivaciju receptora koristeći nelinearnu regresiju tipičnih log krivi doza-odgovora (Prism V5.0c, GraphPad Softvare, San Diego, CA). Agensi koji pokazuju atipične krive doza-odgovora nisu analizirani na ovaj način.

d) Novi Molekulski Entitieti (NMEs): Test jedinjenja su testirana u koncentracijama od 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, i 10 µM

[0169] Odabrana jedinjenja formule I testirana su analizom PXR . Jedinjenja 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, i 1-5 omogućila su % indukcije PXR (u odnosu na 10 uM rifampin) od 62%, 42%, 47%, 67% i 90%, respektivno. Jedinjenje za poređenje I<C>, prethodno dato, proizvelo je % indukcije PXR od 95%.

Primer 13

Protokol za test FastPatch inhibicije hERG:

[0170] Humani srčani kanal za kalijum, hERG, odgovoran je za brzo odloženu ispravljačku struju (IKr) u ventrikuli čoveka i inhibicija Ikrje najčešći uzrok potencijalnog produžetka srčanog dejstva nesrčanih lekova (videti, npr., Weirich and Antoni, Basic Res. Cardiol., 93, Suppl.1, 125-32, 1998; Yap and Camm, Clin. Exp. Allergy, 29, Suppl.3, 174-81, 1999). Povećano dejstvo potencijalnog trajanja je navedeno kao faktor koji izaziva produžetak QT intervala koji je povezan sa opasnim ventrikularnim aritmijama, torsade de pointes (Brown and Rampe, Pharmaceutical News, 7, 15-20, 2000).

[0171] Ispitivani su in vitro efekti datih jedinjena na hERG (human ether-à-go-gorelated gene) humanom srčanom kanalu za kalijum (surogat za IKr, brzo aktivirajući, odložea ispravljačka struja kalijuma) eksprimiranom u embrionalnim ćelijama bubrega čovek (HEK293) koje su stabilno transfektovane sa cDNK hERG. Ćelije su stavljene u HEPES-puferovani fiziološki rastvor soli na ploči sa 96 ležišta koja je presvučena staklom i dodate su odgovarajuće količine test i kontrolnog rastvora radi izlaganja u trajanju od 3-minuta pri svakoj koncentraciji. Test jedinjenje je razblaženo u 0.3% DMSO. Automatski paralelni sistem sa klemamam (engl.parallel patch clamp system, QPatch HT (Sophion Bioscience A/S, Denmark)), je korišćen za određivanje različitih koncentracija (npr., 10 µM). Vrednosti IC50su određene na osnovu rezultata inhibicije hERG. Analiza je izvedena na ChanTest (14656 Neo Parkway, Cleveland, OH). QPatch skrining su dalje objasnili Janzen and Bernasconi (eds.), High Throughput Screening, Methods and Protocols, Second Edition, vol.565, chapter 10, pg.209-223, 2009.

[0172] Odabrana jedinjenja formule I testirana su na hERG. Jedinjenja I-1, 1-2, 1-3, i 1-4 pokazala su hERG IC50od 15.6 uM, 30 uM, 14.6 uM, i 13.7 uM, pojedinačno. Jedinjenje 1-5 nije pokazalo primetnu aktinvnost u testiranje hERG na 10 uM (nema podataka za IC50). Jedinjenje 1-6 pokazuje slabo primetnu aktivnost hERG (< 20% inhibicije) pri 10uM (nema podataka za IC50). Jedinjenje 1-7 pokazuje aktivnost ERG (65% inhibicije) pri 10uM (nema podataka za IC50). Jedinjenje za poređenje I<C>, prethodno dato, proizvelo je hERG IC50od 1.18 uM ili aktivnost (87% inhibicije) pri 10 uM.

Primer 14

Formiranje GSH konjugata (trapping) mikrozomima jetre čovek: Protokol

[0173] Test jedinjenje (krajnja koncentracija 10 uM) inkubirano je sa mikrozomima jestre čoveka ili pacova (krajnja koncentracija 1 mg/mL), zajedno sa aktivirajućim kofaktorima NADPH (krajnja koncentracija 1 mM), kalijum fosfatom (krajnja koncentracija 100 mM pH 7.4), magnezijum hloridom (krajnja koncentracija 3.3 mM) i trapping agens GSH (krajnja koncentracija 5 mM). Inkubaciona smeša je inkubirana 60 min na 37 °C i inkubacija je prekinuta dodatkom ledeno hladnog acetonitrila (jednaka zapremina kao zapremina inkubacione smeše) i supernatenti su izolovani. Supernatanti su bilo injektirani direktno za LC/MS/MS analizu ili su osušeni pod N2i rekonstituisani u smeši vode:acetonitrila (80:20) pre LC/MS/MS analize.

Odgovarajući konjugat sa GSH je određen via LC/MS/MS, koristeći Triple TOF5600/Xevo Qtof MSe.

Primer 15

Model artirtisa indukovanog kolagenom kod pacova

[0174] Model artirtisa indukovanog kolagenom (CIA) na ženkama pacova Lewis zahteva primarne T i B ćelijske imunske odgovore na imunizaciju tipom II kolagena (CII) za razvoj teškog oblika inflamatorne bolesti (videti Goldschmidt TJ, Holmdahl R. Cell Immunol.154(1):240-8, 1994; Helfgott, S. M., et al,; Clin. Immunol.

Immunopathol.31:403, 1984; Holmdahl R. et al., J Autoimmun.7(6):739-52, 1994; and Stuart, J. M., et al., J. Exp. Med.155:1, 1982). Početak kliničke bolesti nastupio je posle sekundarnog izazivanja sa CII challenge i bolest se razvijala tokom osam dana.

[0175] Generalno, ženke Lewis pacova su imunizovane sa goveđim kolagenom tipa II u nepotpunom Freund-ovom adjuvansu. Pacovi (N=10/grupi) su dnevno primali oralnu dozu test jedinjenja ili vehikuluma BID oralnim gavažom počevši od dana 1 (terapeutski). Kliničko stanje artritisa je procenjeno merenjem članaka nonijusom svakog dana počevši od Dana 0.

[0176] Detaljan protokol: Ženke Lewis pacova su imunizovane sa goveđim kolagenom tipa II (1:1 emulzija 2 mg/ml goveđi CII u 0.01 N sirćetnoj kiselini : nepotpun Freund-ov Adjuvans) na tri mesta na koži na leđima. Šest dana posle imunizacije pacovi su primili drugu subkutanu injekciju goveđeg CII. Suspenzija jedinjenja formule I ili vehikulum (0.5% CMC, 0.1% Tween 80) je administrirana oralnim gavažom BID počevši na Dan 0 (profilaktički) (n=10 životinja/grupi Kliničko stanje CIA je procenjeno merenjem članaka nonijusom svakog dana počevši od Dana 9. Izmerena su osnovna merenja veličine članka i potvrđeno je da klinički normalan (0.260-0.264 in) za profilaktički tretman. Osnovna merenja članka nonijusom za utvrđivanje stanja bolesnih životnja određeno je na Dan 1 terapeutskog doziranja i životnje su nasumično podeljene u grupe za tretman nakon potvrde o početku kliničke bolesti (0.2751-0.2755 in). Rezultati svih grupa su analizirani primenom jednostruke analiza varijanse (1-way ANOVA), zajedno sa odgovarajućim višestrukim post-test poređenjem. Statistički značaj za sve testove je podešena na p ≤ 0.05.

Primer 16

Analiza aktivacije putanje BCR putem inhibicije fosforilacije PLCγ2

[0177] Protokol: jedan dan pre tretmana, Ramos ćelije su nanete pri gustini od 3x10<5>ćelija po ležištu u 200 µL kompletnog medijum na filter ploče za tkiva sa 96-ležišta (Millipore, Billerica, MA). Na dan tretmana, upotrebljen medijum je profiltriran i ćelije su resuspendovane u 200 µL medijuma bez seruma koji sadrži serijska razblaženja jedinjenjea i DMSO do 0.1%, zatim je inkubiran tokom 2 sata na 37 °C. Ćelije su stimulisan 5 minuta sa kozjim 10 µg/mL anti-humanim IgM na 37 °C. Sav medijum je profiltriran i ćelije su isprane ledeno hladnim PBS –om zatim lizirane na ledu u trajanju od 1 sata dodatkom pufera za lizu koji sadrži; 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, koktela proteaza inhibitora , 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, (PMSF), inhbitor fosfataza miks 2 (Sigma cat # P5726 od Sigma, St. Louis, Mo.), i inhibitor fosfataze miks 3 (Sigma cat # P0044 od Sigma, St. Louis, Mo.). Lizati su zatim prebačene na standardne MSD ploče (Meso Scale Discovery, (MSD), (Gaithersburg, Mariland)), prethodno tretirane antitelom hvatačem (anti-total PLCγ2 antitelo B10, (SantaCruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)) i blokirani sa BSA prema uputstvima proizvođača. Lizati su inkubirani na MSD pločama pripremljenim preko noći na 4 °C uz blago mešanje. Ležišta su isprana tri puta sa TBST i tretirani sa anti pPLCγ2 (SantaCruz) u 1% BSA u PBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ležišta su ponovo isprana tri puta sa TBST i tretirana anti-zečijim antitelom sa sulfo-tagom (MSD), tokom 1 sata na sobnoj temperaturiNakon ispiranja sa TBST, dodat je pufer za očitavanje MSD i izmerena je luminiscencija u MSD SECTOR Imager 6000. Maksimalni odgovor određen je kao prosečna luminescencija u ležištima sa stimulisanim ćelijama tretiranim sa anti-IgM i DMSO. Minimalni odgovor određen je kao prosečna luminescencija u ležištima sa nestimulisanim ćelijama tretiranim samo sa DMSO. Maksimalne i minimalne vrednosti su korišćene za normalizaciju luminescencije u ležištima koja su tratirana jedinjenjem. Normalizovane vrednosti su prikazana u odnosu na koncentraciju jedinjenja na log skali zatim alaizirane pomoću softvera Prizm software (GraphPad Software, Inc.). za fitovanje podataka korišćena je sigmoidalna jednačina dozaodgovor i dobijanje 50% koncetracije inhibicije (IC50).

[0178] Ramos ćelije su inkubirane na pločama sa 96 ležišta sa širokim opsegom koncentracija jedinjenjea formule I tokom 2 sata, stimulisanim sa 10 µg/mL anti-IgM tokom 5 minuta i merena je fosforilacija PLCy2 pomoću elektrohemijskogluminescentnog imunotesta. Vrednost za EC50je izračunata primenom GraphPad Prism softvera.

Primer 17

Inhibicija BCR-indukovane proliferacije humanih B ćelija

[0179] Humane CD19+ B ćelije su stimulisane sa anti-IgM antitelom i određena je aktivnost jedinjenja formule I u smislu menjanja ćelijskog metabolizma nakon 72 sata. U tom smislu, ćelijski metabolizam je u direktnoj vezi sa aktivacijom i proliferacijom ćelija i takođe može da utiče na relativno ćelijsko preživljavanje tokom proliferacije. Određene je efekat anti-IgM antitela na proliferaciju B ćelija i određeno je da osšpčjava polovinu maksimalne koncentracije za aktivaciju 10 µg/ml. Pod ovim uslovima, ispitivane su varirajuće koncetracije test jedinjenja, u triplikatu u 0.1% DMSO, na uticaj ćelijskog metabolizma CD19+ B ćelija izolovanih od različitih donora.

[0180] Protokol: Humane B ćelije su izlovane iz mononukelarnih ćelija perferne krvi ili neprečišćenih podloga od goveđih ćelija primenom Ficoll-Hypaque gradijenata (Amersham) i negativno odabranih magnetnim sortiranjem ćelija (Human B Cell Isolation Kit II, Miltenyi Biotec). Čistoća ciljnih ćelija određena je protočnom citometrijom bojenjem markerima za B ćelije, T ćelije i monocite (CD19, CD3, CD14, pojedinačno; BD Biosciences). Podaci su sakupljeni na protočnom citometru FACsCaliber flow cytometer i analizirane primenom FloJo softvera (BD Biosciences). Čistoća prepara humanih B ćelija je rutinski veća od 95%. Negativno selektovane humane B ćelije stimulisane sa 10 µg/mL anti-IgM F(ab')2(Jackson ImmunoResearch) na ploči sa 96 ležišta.100,000 B ćelija u 0.2 mL RPMI 10% FBS tretirano je različitim koncentacijama (titrovani od 5000 nM do 0 nM u 0.5% DMSO) jedinjenja formule I u triplikatu u ležištima ili kontrole sa vehikulumom u 0.5% DMSO krajnje koncentracije tokom 30 minuta na 37 °C, 5% CO2, ćelije su zatim stimulisane sa 10 µg/mL anti-IgM F(ab')2. B ćelije su stimulisane 72 hr na 37°C, 5% CO2. Proliferacije je merena pomoću CellTiter-Glo reagent (Promega), merenjem na luminometru. Srednje vrrdnosti su nacrtane u odnosu na maksimalnu proliferaciju i određene su vrednosti za IC50pooću GraphPad Prism v5 softvera.

Primer 18

Određivanje efekta jedinjenja na in vitro aktivaciju mijeloidnih ćelija

[0181] Aktivacija FcγR primarnih humanih makrofaga. Antitelo i aktovacija posredovana imuni-kompleksom preko FcyR može se izvesti po uzoru na aktivaciju makrofaga sa imobilizovanim IgG. Primarne humane makrofage izvdene od monocita tretiranih sa GM-CSF vrše regulaciju na više aktivacije markera kao što su CD80, CD86, MHC antigeni FcγRIII receptori. Humane makrofage dobijene od monocita mogu se aktivirati humanim IgG prečišćenim vezivanjem na ploču. Ova stimulacija umrežava receptor FcγRIII i indukuje sekreciju pro-inflamatornih citokina kao što su TNFα, IL-6, IE1β i MCP-1. Jedinjenja formule I procenjena su inhibiciju ekspresije citokina nakon aktivacije FcR humanih makrofaga.

[0182] Generalno, makrofage su gajene na pločama koje su prethodno inkubirane sa prečišćenim IgG pa zatim isprane. Titri test jedinjenja (10,000 nM do 0 nM) su dodati u ove kulture. Supernatanti ćelijskih kulutra su analizirane sa ELISA na ekspresiju TNFα i IL-6.

[0183] Protokol: Humani monociti su izolovani iz podloge od goveđih ćelija dravih donora i podvrgnute negativnoj slekeciji magnetnim sortiranjem ćelija (Monocyte Isolation Kit II, Miltenyi Biotec). Prečišćeni monociti su gajeni u standardnom mediju u koji su dodati niski-IgG FBSi 100 ng/mL GM-CSF tokom 5-7 dana da indukuju diferencijaciju makrofage. Gajene makrofage su stimulisane sa 100 µg/mL prečišćenim IgG vezanim za ploču ± titrar test jedinjenja (10 µM do 0 nM).

Supernatantisu sakupljeni posle 4 sata i 18 sati i analizirani na TNFα i IL-6, pojedinačno.

Primer 19

Efikasnost na kolagen antitelo-indukovani artiritis kod miševa

[0184] Ovaj primer odnosi se ne samo na artritis, već određuje i aktivnost autoantitela i imunske komplekse in vivo i shodno tome je relevantan za druge inflamatorne poremećaje kao što je SLE. U ovom eksperimentu, aktivnost autoantitela i imunaskih kompleksa proizvodi patološku krajnju završnu tačku što zavisi od FcR signallizacije i deo Fc ovih antitela je inhibirano administracijom jedinjenja formule I.

[0185] Model kolagen antitelo-indukovanog artritisa (CAIA) kod ženki DBA/1 miševa ne zahteva srodne T i B ćelijske odgovore na indukciju inflamacije već se pre oslanja na mehanizme imunskog efektora za razvoj kliničke bolesti. Koktel od četiri antikolagen II (CII) specifičnih monoklonalnih antitela i imunskih stimulatornih lipopolisaharida (LPS) administrirano je 3 dana nakon transfera CII specifičnih antitela pospešuje vezivanje antitelo-Fc-Receptor (Kagari T.et al.; J Immunol.170:4318-24 (2003)), obrazovanja imunskog kolmpleksa, završene aktivacije (Banda NK, et al.; Clin Exp Immunol.159:100-8 (2010)) i proizvodnje proinflamatornih citokina za indukovanje teških oblika inflamatornih bolesti tokom perioda od 10 dana.

[0186] Generalno, artritis je indukovan injekcijom koktela monoklonalnih antikolagen antitela u DBA/1 miševe na Dan 0. Miševi (N=10/grupi) su primali dnevno oralnu dozu test jedinjenjea bilo QD bilo BID kao što je naznačno počevši od Dana 0. Inflamacija šape je praćena na dnevnom nivou.

[0187] Protokol: Ženke DBA/1 miiševa starosti 6-8 nedelja primali su 2 mg koktela artitogenska četiri klona monoklonalnog antitela (Chondrex#10100) i.v. na dan 0 pa zatim i 50 ug dose LPS posle 3 daba. Suspenzija test jedinjenja ili nosač (0.5% CMC, 0.1% Tween 80) su davani BID oralnom gavažom počevši od dana 0 (10 životinja /grupi) neposredno pre i.v. transfera koktela antitela. Klinički stepen ozbiljnosti CIA određen je praćenjem inflamacije na sve četiri šape, primenjujući skalu sa opsegom od 0 do 4. Svaka šapa je ocenjena na sledeći način: 0, normalna; 1, blago ali prisutno crvenilo i oticanje zgloba noge ili šake, ili crvenilo i oticanje bilo kakve ozbiljnosti sa 1 ili 2 cifre; 2, umereno do ozbiljno crvenilo i oticanje zgloba šape ili zgloba ruke, ili više od dve cifre; 3, crvenilo i otok (izrazeni edem) cele šape; i 4, maksimalno zapaljen deo sa uključivanjem više zglobova. Suma četiri pojedinačne ocene je indeks artritisa, sa maksimalnim mogućim rezultatom od 16 za svaku životinju.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule I:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde: svaki R<1>je nezavisno vodonik, po izboru supstituisana C1-6alifatična grupa, po izboru supstituisana 3-7 člana monociklična heterociklilna grupa, ili po izboru supstituisana heterociklilalkil grupa sa 3-7 atoma ugljenika i 1-3 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika ili sumpora; ili dve R<1>grupe zajedno sa svojim obuhvaćenim atomima po izboru supstituisan 3-7 člani zasićen ili delimično nezasićen monocikličan heterocikličan prsten sa 1-2 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika ili sumpora; pri čemu po izboru supstituisane grupe mogu da budu supstituisane halogenom, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -N(R)C(O)OR, -C(O)N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, ili -S(O)2N(R)2; svaki R je nezavisno vodonik ili C1-6alifatična grupa; ili dve R grupe vezane za isti azot zajedno sa svojim obuhvaćenim atomima formira po izboru supstituisan 3-7 člani zasićen ili delimično nezasićen monocikličan heterocikličan prsten sa 1-2 heteroatoma, u kojem svaki drugi heteroatom je nezavisno odabran od azota, kiseonika ili sumpora; prsten A je 2. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačeno time, što je formule II-a:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili: gde jedinjenje je formule II-b:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili: gde jedinjenje je formule III: 3. Jedinjenje iz zahteva1, naznačeno time, što je formule IV:

4. Jedinjenje iz zahteva 3, naznačeno time, što R<3>je -CF3, ili R<3>je -F. 5. Jedinjenje iz zahteva 3, naznačeno time, što oba R<1>su vodonik. 6. Jedinjenje iz zahteva 3, naznačeno time, što jedan R<1>je vodonik i drugi R<1>je po izboru supstituisana C1-6alifatilna grupa, poželjno jedan R<1>je vodonik, a drugi R<1>je metil. 7. Jedinjenje iz zahteva 3, naznačeno time, što (i) oba R<1>su po izboru supstituisane C1-6alifatične grupe, ili: (ii) jedan R<1>je vodonik, a drugi je po izboru supstituisana C1-6alifatična grupa, ili: (iii) oba R<1>su po izboru supstituisane C1-6alifatične grupe, ili: (iv) oba R<1>su po vodonik. 8. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačeno time, što R<2>je -Cl, ili R<2>i je -F. 9. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačeno time, što R<3>je -CF3, ili R<3>je-OCF3, ili R<3>je -F. 10. Jedinjenje iz zahteva 1, odabrano iz grupe koju čine:

11. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1-10 ili njegova kompozicija za upotrebu u smanjenju enzimske aktivnosti Bruton-ove tirozin kinaze. 12. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1-10 ili njegova kompozicija za upotrebu u lečenju poremećaja koji su respozivni na inhibiciju Bruton-ove tirozin kinaze. 13. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1-10 ili njegova kompozicija za upotrebu u lečenju poremećaja odabranih iz grupe koju čine autoimunski poremećaji, inflamatorni poremećaji ili karcinomi. 14. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 13, gde poremećaj je reumatoidni artritis, ili gde je poremećaj, sistemski eritematozni lupus ili gde poremećaj je atopijski dermatitis, ili gde poremećaj je leukemija ili limfom. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5