RS58005B1 - Prečišćavanje iduronat-2-sulfataze - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Mukopolisaharidoza tipa II (MPS II, Hanterov sindrom) je recesivni X-vezani poremećaj lizozomskog nakupljanja koji nastaje iz deficijencije u enzimu iduronat-2-sulfataze (I2S). I2S iseca terminalne 2-O sulfatne grupe glikozaminoglikana (GAG) dermatan sulfata i heparan sulfata. Zbog nedostatka ili defektivnog I2S enzima kod pacijenata koji imaju Hanterov sindrom, GAG se progresivno nakuplja u različitim tipovima ćelija, što dovodi do ćelijskog uvećanja, organomegalije, uništenja tkiva, i disfunkcije sistema organa.

[0002] Uopšteno, fizičke manifestacije kod ljudi sa Hanterovim sindromom uključuju i somatske i neurološke simptome. Na primer, u nekim slučajevima Hanterovog sindroma, uključivanje centralnog nervnog sistema vodi kasnom razvoju i problemima sa centralnim nervnim sistemom. Dok su neneuralni simptomi Hanterovog sindroma generalno odsutni na rođenju, tokom vremena progresivno nakupljanje GAG u telesnim ćelijama može da ima dramatičan uticaj na periferna tkiva u telu. Nakupljanje GAG u perifernom tkivu dovodi do karakterističnog grubog izraza u facijalnim karakteristikama kod pacijenta koje su odgovorne za istaknuto čelo, ravan most i uvećan jezik, što su oznake koje definišu pacijenta sa Hanterovim sindromom. Slično, nakupljanje GAG može negativno da utiče na sisteme organa u telu. Inicijalno se manifestuje kao zadebljanje srčanog zida, pluća i vazdušnih puteva, i abnormalnim uvećanjem jetre, slezine i bubrega, ove duboke promene mogu na kraju da dovedu do široko rasprostanjenog katastrofalnog otkazivanja rada organa. Kao rezultat, Hanterov sindrom uvek ima teške simptome, progresivan je, i ograničava trajanje životnog veka.

[0003] Terapija zamene enzima (ERT) je terapija koja je odobrena za lečenje Hanterovog sindroma (MPS II), i uključuje davanje endogene zamene I2S enzima pacijentima koji imaju Hanterov sindrom. Muenzer et al., 2007 prikazuje rekombinovani oblik I2S sa post-translacionom modifikacijom cys59. Pomenuti dokument pokazuje da obim post-translacione modifikacije cys59 u formilglicin koji je neophodan za enzimsku aktivnost iznosi približno 50%.

SUŠTINA PRONALASKA

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži prečišćenu rekombinovanu iduronat-2-sulfatazu (I2S) koja ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1, pri čemu porečišćena rekombinovana I2S sadrži najmanje 70% konverziju cisteinskog ostatka koji odgovara Cys59 SEQ ID NO:1 u Cα-formilglicin (FGly), i gde prečišćeni rekombinovani I2S sadrži manje od 150 ng/mg proteina ćelije domaćina (HCP). Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju pronalaska, za upotrebu u lečenju Hanterovog sindroma.

SUŠTINA OPISA

[0005] Predmetni prikaz obezbeđuje unapređene postupke za prečišćavanje I2S proteina koji je proizveden postupkom rekombinacije za terapiju zamene enzima. Predmetni pronalazak je, delom, zasnovan na iznenađujućem otkriću da rekombinovani I2S protein može da bude prečišćen iz prethodno neobrađenih bioloških materijala, kao što su, medijum za gajenje ćelija u kulturi koje sadrže I2S, upotrebom postupka koji uključuje samo četiri kolone hromatografije. Odobreni postojeći postupak za prečišćavanje rekombinovanog I2S za terapiju zamene enzima uključuje 6 hromatografskih kolona. Kao što je opisano u odeljku Primera, rekombinovani I2S proteini su prečišćeni upotrebom postupka koji obuhvata četiri kolone prema opisu koji je u skladu sa zahtevima za čistoću u skladu sa tržištem u SAD-u i mnogim drugim zemljama. Dodatno, rekombinovani I2S enzim prema predmentnom pronalasku zadržava visoki procenat Cα-formilglicina (FGly) (npr., veći od 70% i do 100%), što je važno za aktivnost I2S enzima, i različite karakteristike kao što je sadržaj sijalinske kiseline i mape glikana koje mogu da olakšaju biodostupnost i/ili lizozomsko ciljanje rekombinovanog I2S proteina. Prema tome, predmetni prikaz obezbeđuje efikasan, jeftiniji, i brži postupak za prečišćavanje I2S proteina. Predmetni prikaz je posebno koristan za prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina proizvedenog u medijumu oslobođenog od seruma.

[0006] Prema tome, u jednom opsegu, predmetni pronalazak opisuje postupak za prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina iz preparata koji sadrži nečistoće upotrebom postupka koji je zasnovan na jednoj ili više hromatografiji koja je zasnovana na izmeni anjona, hromatografiji koja je zasnovana na izmeni katjona, hromatografiji sa mešanim načinom rada, i hromatografiji koja sadrži hidrofobnu interakciju. U nekim izvođenjima, postupak prema predmetnom pronalasku uključuje manje od 6 (npr., manje od 5, manje od 4, ili manje od 3) koraka u hromatografiji. U nekim izvođenjima, postupak prema predmetnom pronalasku uključuje 2, 3, 4 ili 5 koraka u hromatografiji. U nekim izvođenjima, postupak prema predmetnom pronalasku uključuje 4 koraka u hromatografiji. U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku sadrži manje od 100 ng/mg proteina ćelije domaćina (HCP) (npr., manje od 90 ng/mg HCP, manje od 80 ng/mg HCP, manje od 70 ng/mg HCP, manje od 60 ng/mg HCP, manje od 50 ng/mg HCP, manje od 40 ng/mg HCP, manje od 30 ng/mg HCP, manje od 20 ng/mg HCP, manje od 10 ng/mg HCP).

[0007] U nekim izvođenjima, pogodna hromatografija koja je zasnovana na izmeni anjona je Q hromatografija. U nekim izvođenjima, pogodna hromatografija koja je zasnovana na izmeni katjona je SP hromatografija. U nekim izvođenjima, pogodna hromatografija sa mešanim načinom rada je hromatografija koja je zasnovana na hidroksiapatitu (HA). U nekim izvođenjima, pogodna hromatografija koja je zasnovana na hidrofobnim interakcijama je fenil hromatografija.

[0008] Razmatra se da hromatografija koja je zasnovana na izmeni anjona (npr., O kolona), hromatografija koja je zasnovana na izmeni katjona (npr., SP kolona), hromatografija sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona), i hromatografija koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji (npr., kolona koja sadrži fenil) može da se izvede na bilo koji način. U nekim izvođenjima, postupak prema predmetnom pronalasku se redom izvodi hromatografijom koja je zasnovana na izmeni anjona (npr., O kolona), hromatografijom koja je zasnovana na izmeni katjona (npr., SP kolona), hromatografijom sa mešanim načinom rada (npr., HA kolonom), i hromatografijom koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji (npr., kolona koja sadrži fenil).

[0009] U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili srednji eluat ili protok je prilagođen na pH od oko 5.0-7.0 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 ili 7.0) i na provodljivost od oko 10-20 mS/cm (npr., 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 mS/cm) pre nanošenja na hromatografsku kolonu za izmenu anjona (npr., Q kolonu). U nekim izvođenjima, pH je podešen upotrebom 1M natrijum acetata. U nekim izvođenjima, provodljivost je prilagođena upotrebom 5 M natrijum hlorida. U nekim izvođenjima, hromatografska kolona koja je zasnovana na izmeni anjona, kada je jednom napunjena, ispira se upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži so (npr., NaCl) u opsegu koncentracije oko 140 mM do 200 mM (npr., oko 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM, ili 200 mM) sa pH od oko 5.0-7.0 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 ili 7.0). U nekim izvođenjima, hromatografska kolona koja je zasnovana na izmeni anjona ispira se upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži linearni gradijent soli (npr., NaCl) gradijent. U nekim izvođenjima, pogodni linearni gradijent NaCl obuhvata opseg od oko 0-500 mM NaCl (npr., oko 0-400 mM, oko 0-350 mM, oko 0-300 mM, oko 50-500 mM, oko 150-500 mM, oko 150-450 mM, oko 150-400 mM).

[0010] U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili srednji eluat ili protok je prilagođen na provodljivost opsega između oko 1 mS/cm i 20 mS/cm (npr., između oko 1 mS/cm i 15 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 10 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 8 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 6 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 4 mS/cm, između oko 2 mS/cm i 4 mS/cm) pre nanošenja na hromatografsku kolonu za izmenu katjona (npr., SP kolonu). U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili srednji eluat ili protok je prilagođen na provodljivost opsega između oko 2 mS/cm i 4 mS/cm (npr., 2, 2.5, 3, 3.5, ili 4 mS/cm) pre nanošenja na hromatografsku kolonu za izmenu katjona (npr., SP kolonu). U nekim izvođenjima, provodljivost je prilagođena rastvaranjem eluata iz kolone hromatografije za izmenu anjona sa H2O u oko 1-2:1 (npr.,.1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, ili 2:1) odnosu. U nekim izvođenjima, provodljivost je podešena dvostrukim ceđenjem. U nekim izvođenjima, hromatografska kolona koja je zasnovana na izmeni katjona je radi na pH od oko 5.0-6.5 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0 ili 6.5). U nekim izvođenjima, hromatografska kolona za izmenu katjona radi sa puferom koji sadrži fosfat (npr., NaPO4) u koncentraciji opsega oko 0.01 M oko 0.1 M (npr., oko 0.01 M, 0.02 M, 0.03 M, 0.04 M, 0.05 M, 0.06 M, 0.07 M, 0.08 M, 0.09 M, ili 0.1 M). U nekim izvođenjima, pogodan pH je oko 5,0-6,5 (npr., oko 5,0, 5,5, 6,0, ili 6,5).

[0011] U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili srednji eluat ili protok je prilagođen na fosfat (npr., NaPO4) u koncentraciji opsega od oko 0,001 M do oko 0.01 M (npr., oko 0,001 M, 0,002 M, 0,003 M, 0,004 M, 0,005 M, 0,006 M, 0,007 M, 0,008 M, 0,009 M, ili 0,01 M) i pH od oko 5,0-6,5 (npr., oko 5,0, 5,5, 6,0, ili 6,5) pre nanošenja na hromatografsku kolonu sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona). U nekim izvođenjima, kolona hromatografje sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona), kada se jednom napuni, ispira se sa puferom za ispiranje koji sadrži fosfat (npr., 1-10 mM natrijum ili kalijum fosfat) ili blizu neutralnog pH. U nekim izvođenjima, napunjena hromatografska kolona sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona) ispira se sa puferom za ispiranje koji ima koncentraciju fosfata u opsegu od oko 10-20 mM (npr., oko 10-18 mM, 10-16 mM, 10-15 mM, 12-20 mM, 14-18 mM, 14-16 mM). U nekim izvođenjima, napunjena hromatografska kolona sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona) ispira se puferom za ispiranje koji ima koncentraciju fosfata veću od 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM. U nekim izvođenjima, ispiranje sa kolone hromatografije sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona) postignuto je gradijentom fosfatnog pufera. U nekim izvođenjima, pogodan pufer za ispiranje može da ima fosfatni gradijent od približno 1-400 mM (npr., 1-300 mM, 1-200 mM, 1-150 mM, 1-100 mM, 10-350 mM, 10-300 mM, 10-250 mM, 10-200 mM, 10-150 mM, 10-140 mM, 10-130 mM, 10-120 mM, 10-110 mM, 10-100 mM, 10-90 mM, 10-80 mM, 10-70 mM, 10-60 mM, 10-50 mM) natrijum fosfata ili kalijum fosfata. U nekim izvođenjima, eluiranje sa HA kolone se postiže u koracima povećavanjem koncentracije fosfata u puferu za eluiranje. U nekim izvođenjima, puferi za eluiranje u koracima mogu da imaju fosfat (npr., natrijum fosfat) u koncentraciji koja se bira od 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM. U nekim izvođenjima, eluiranje sa kolone hromatografije sa mešanim načinom rada (npr., HA kolone) se postiže sa puferom za eluiranje koji ima fosfat (npr., natrijum fosfat) u koncentraciji opsega od oko 50 mM do 150 mM (npr., koji se biraju iz fosfata (npr., natrijum fosfat) u koncentraciji od 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, i njihove kombinacije).

[0012] U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili srednji eluat ili protok je prilagođen na koncentraciju soli (npr., NaCl) u opsegu od oko 0,5 M do oko 2,0 M (npr., oko 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, ili 2.0 M NaCl) na pH oko 4.5-6.0 (npr., oko 4.5, 5.0, 5.5, ili 6.0) pre nanošenja na hromatografsku kolonu koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji (npr., kolona koja sadrži fenil). U nekim izvođenjima, hromatografska kolona koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji, kada se jednom napuni, eluira se upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži so (npr., NaCl) u opsegu koncentracija od oko 0,5 M do 2,0 M (npr., oko 0,5 M, 1,0 M, 1,1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M, ili 2,0 M NaCl) na pH od oko 4,5-6,0 (npr., oko 4,5, 5,0, 5,5, ili 6,0). U nekim izvođenjima, hromatografska kolona koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji eluira se upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži so (npr., NaCl) u opsegu koncentracija od oko 0,1 M to oko 0,5 M (npr., oko 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, ili 0,5 M NaCl) na pH od oko 4,5-6,0 (npr., oko 4,5, 5,0, 5,5, ili 6,0).

[0013] U nekim izvođenjima, svaka od hromatografija koja je zasnovana na izmeni anjona, hromatografija koja je zasnovana na izmeni katjona, hromatografija sa mešanim načinom rada, i hromatografska kolona koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji ima visinu u opsegu 14-25 cm (npr., 15-25 cm, 15-20 cm, 14-24 cm, 14-22 cm, 14-20 cm, ili 16-18 cm). U nekim izvođenjima, svaka hromatografija koja je zasnovana na izmeni anjona, hromatografija koja je zasnovana na izmeni katjona, hromatografija sa mešanim načinom rada, i hromatografska kolona koja je zasnovana na hidrofobnoj interakciji ima visinu približno 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 cm.

[0014] U nekim izvođenjima, postupak prema predmetnom pronalasku uključuje korak inaktivacije virusa pre nanošenja preparata koji sadrži nečištoće na prvu hromatografsku kolonu. U nekim izvođenjima, korak inaktivacije virusa uključuje dodavanje deterdženta u preparat koji sadrži nečistoće. U nekim izvođenjima, postupak prema ovom pronalasku dalje uključuje korak uklanjanja virusa nakon poslednje kolone hromatografije. U nekim izvođenjima, postupak pronalaska dalje uključuje korak ultraceđenja i/ili dvostrukog ceđenja. U nekim izvođenjima, korak ultraceđenja i/ili dvostrukog ceđenja uključuje izmenu prečišćenog rekombinovanog I2S proteina u pufer formulacije leka.

[0015] U nekim izvođenjima, predmetni pronalazak se koristi za prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1. U nekim izvođenjima, predmetni pronalazak se koristi za prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina koji ima sekvencu aminokiselina identičnu sa SEQ ID NO:1.

[0016] U nekim izvođenjima, predmetni prikaz se korsiti za prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina koji je proizveden od sisarskih ćelija koje su gajene u kulturi u suspenziji u medijumu koji ne sadrži serum. U nekim izvođenjima, medijum oslobođen seruma je pogodan za prikaz kome nedostaju komponente koje su poreklom iz životinja. U nekim izvođenjima, medijum oslobođen seruma koji je pogodan za prikaz je hemijski definisan medijum. U nekim izvođenjima, sisarske ćelije su gajene u kulturi u bioreaktoru. U nekim izvođenjima, sisarske ćelije istovremeno eksprimiraju rekombinovani I2S protein i enzim za obrazovanje formilglicina (FGE). U nekim izvođenjima, sisarske ćelije su humane ćelije.

[0017] U nekim izvođenjima, preparat sa nečistoćama koji se koristi u postupku pronalaska se priprema iz medijuma koji je oslobođen od seruma koji sadrži rekombinovani I2S protein sekretovan iz sisarskih ćelija. U nekim izvođenjima, preparat sa nečistoćama koji se koristi u postupku prikaza je otopljen iz zamrznutog medijuma preparata.

[0018] U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku sadrži, u proseku, 16-22 (npr., 16-21, 16-20, 16-19, 17-22, 17-21, 17-20, 17-19) sijalinskih kiselina po molekulu. U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku sadrži, u proseku, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ili 22 sijalinskih kiselina po molekulu.

[0019] U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku ima najmanje 70% (npr., najmanje oko 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) konverzije cisteinskog ostatka koji odgovara Cys59 humanog I2S (SEQ ID NO:1) u Cα-formilglicin (FGly). U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku ima u suštini 100% konverziju cisteinskog ostatka koji odgovara Cys59 humanog I2S (SEQ ID NO:1) u Cα-formilglicin (FGly). U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku ima specifičnu aktivnost od najmanje 20 U/mg, 30 U/mg, 40 U/mg, 50 U/mg, 60 U/mg, 70 U/mg, 80 U/mg, 90 U/mg, ili 100 U/mg kao što je određeno in vitro testom aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata.

[0020] U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku se karakteriše ćelijskim unošenjem većim od 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, kao što je određeno pomoću in vitro testa unošenja.

[0021] U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku se karakteriše mapom glikana koja sadrži nekoliko grupa frakcija koje redom ukazuju na neutralni (grupa frakcija 1), mono-sijalizovani (grupa frakcija 2), disijalizovani (grupa frakcija 3), monofosforilovani (grupa frakcija 4), tri-sijalizovani (grupa frakcija 5), tetra-sijalizovani (grupa frakcija 6), ili difosforilovani (grupa frakcija 7) I2S protein. U nekim izvođenjima, mapa glikana se dobija nakon digestije sa neuroaminidazom. U drugim izvođenjima, mapa glikana se dobija nakon digestije sa alkalnom fosfatazom.

[0022] Između ostalog, predmetni pronalazak obezbeđuje prečišćeni rekombinovani I2S protein kao što je ovde opisano, i farmaceutske kompozicije ili formulacije koje sadrže isti. U nekim izvođenjima, formulacija je formulisana za intravenozno, subkutano i/ili intratekalno davanje. Predmetni pronalazak takođe opisuje postupke za lečenje Hanterovog sindroma davanjem tretmana prečišćenog rekombinovanog I2S subjektu kome je potrebno, farmaceutske kompozicije ili formulacije koja sadrži isti.

[0023] Kao što se ovde koriste, termini "I2S protein," "I2S," "I2S enzim," ili gramatički ekvivalenti, se odnose na dobijanje rekombinovanih I2S proteinskih molekula osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0024] Kao što se koristi u ovoj aplikaciji, termini "oko" i "približno" se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji brojevi koji se koriste u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno su namenjeni da pokriju bilo koje normalne fluktuacije koje su jasne prosečnom stručnjaku iz relevantne oblasti tehnike.

KRATAK OPIS SLIKA

[0025] Slike koje su opisane u tekstu ispod, koje zajedno čine nacrt, su predstavljene samo u ilustrativne svrhe, ne za ograničavanje.

Slika 1 prikazuje primer šeme prečišćavanja rekombinovanog I2S koji je proizveden u serumu koji je oslobođen medijuma.

Slika 2 prikazuje primere peptidnih mapa prečišćenog rekombinovanog I2S AF u poređenju sa referentnim I2S.

Slika 3 prikazuje primer SDS-PAGE (Srebro) analize prečišćenog rekombinovanog 12S AF.

Slika 4 prikazuje primer analize profila naelektrisanja prečišćenog rekombinovanog I2S AF koja je procenjena jonoizmenjivačkom hromatografijom.

Slika 5 prikazuje primere profila mape glikana izbistrenog sakupljenog rekombinovanog I2S AF.

Slika 6 prikazuje primer analize aktivnosti (U/mg) nakon koraka inaktivacije virusa UPB nakon sakupljanja rekombinovanog I2S.

Slika 7 prikazuje primer analize SEC-HPLC nakon koraka inaktivacije virusa UPB izbistrenog sakupljenog rekombinovanog I2S.

Slika 8 prikazuje primer SDS-PAGE koji je tretiran srebrnim bojenjem prečišćenog rekombinovanog I2S proteina.

Slika 9 pokazuje primer peptidne mape za prečišćeni rekombinovani I2S enzim koji je proizveden iz I2S-AF 2D ćelijske linije koja se gaji u kulturi u uslovima bez prisustva seruma (gornji panel) u poređenju sa referencom.

Slika 10 prikazuje primer profila glikana koji su dobijeni za prečišćene rekombinovane I2S enzime koji su proizvedeni upotrebom I2S-AF 2D i 4D ćelijskih linija koje se gaje u ćelijskoj kulturi u uslovima bez prisustva seruma u poređenju sa referencom.

Slika 11 prikazuje primer profila naelektrisanja koji se dobija za prečišćeni rekombinovani I2S enzim koji je proizveden upotrebom I2S-AF 2D ćelijske linije gajene u kulturi ćelija pod uslovima bez seruma u poređenju sa I2S referentnom kontrolom.

DEFINICIJE

[0026] U svrhu jasnijeg razumevanja predmetnog pronalaska, u tekstu ispod, prvo su definisani određeni termini. Dodatne definicije sledećih termina i drugih termina su predstavljene kroz specifikaciju.

[0027] Približno ili oko: Kao što se ovde koristi, termin "oko" ili "približno," kao što je primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, se odnosi na vrednost koja je slična sa navedenom referentnom vrednosti. U određenim izvođenjima, termin "približno" ili "oko" se odnosi na opseg vrednosti koji se nalaze unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u svakom smeru (veći od ili manji od) navedene referentne vrednosti osim ukoliko nije drugačije navedeno ili drugačije jasno na osnovu konteksta (izuzev kada taj broj prelazi 100% moguće vrednosti).

[0028] Biološki aktivan: Kao što se ovde koristi, fraza "biološki aktivan" se odnosi na karakteristiku bilo koje supstance koja ima aktivnost u biološkom sistemu (npr., ćelijska kultura, organizam, itd.). Na primer, smatra se da biološki aktivna supstanca, kada se daje organizmu, ima biološki efekat na taj organizam. Biološka aktivnost takođe može da se odredi in vitro testovima (na primer, in vitro enzimskim testovima kao što su testovi za ispitivanje oslobađanja sulfata). U posebnim izvođenjima, u kojima je protein ili polipeptid biološki aktivan, porcija proteina ili polipeptida koja ima zajedničku najmanje jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida je obično naznačena sa "biološki aktivnom" porcijom. U nekim izvođenjima, protein je proizveden i/ili prečišćen iz sistema ćelijske kulture, koji ispoljava biološku aktivnost kada se daje subjektu. U nekim izvođenjima, protein zahteva dalju obradu da bi postao biološki aktivan. U nekim izvođenjima, protein zahteva posttranslacionu modifikaciju kao što je, ali bez ograničenja, glikozilacija (npr., sijalilacija), farnizilacija, isecanje, savijanje, konverzija formilglicina i njihove kombinacije, da bi postao biološki aktivan. U nekim izvođenjima, proizveden je pro-oblik proteina (tj. nezreli oblik), koji može da zahteva dodatnu modifikaciju da bi postao biološki aktivan.

[0029] Katjonski-nezavisan receptor manoza-6-fosfata (CI-MPR): Kao što se ovde koristi, termin "katjonski-nezavisan receptor manoza-6-fosfata (CI-MPR)" se odnosi na ćelijski receptor koji vezuje obeleživače manoza-6-fosfata (M6P) na kiselim prekursorima hidrolaze u Goldžijevom aparatu koji su namenjeni transportu u lizozome. Zajedno sa manoza-6-fosfatima, CI-MPR takođe vezuje druge proteine uključujući IGF-II. CI-MPR je takođe poznat pod imenom "M6P/IGF-II receptor," "CI-MPR/IGF-II receptor," "IGF-II receptor" ili "IGF2 receptor." Ovi termini i njihove skraćenice se ovde koriste naizmenično.

[0030] Hromatografija: Kao što se ovde koristi, termin "hromatografija" se odnosi na postupak za razdvajanje smeša. Obično, smeša je rastvorena u tečnosti koja se naziva "mobilna faza," koja je prenosi kroz strukturu koja drži drugi materijal koji se zove "stacionarna faza." Hromatografija na koloni je postupak razdvajanja u kome se stacionarno postolje nalazi u okviru cevi, tj., kolone.

[0031] Rastvarač: Kao što se ovde koristi, termin "rastvarač" se odnosi na farmaceutski prihvatljivu (npr., bezbednu i koja nije toksična za davanje ljudima) razblaženu supstancu korisnu za dobijanje rekonstituisane formulacije. Primeri rastvarača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fosfatni pufer), sterilni rastvor soli, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.

[0032] Eluiranje: Kao što se ovde koristi, termin "eluiranje" se odnosi na postupak ekstrakcije jednog ili više materijala od drugog ispiranjem sa rastvaračem. Na primer, u jonoizmenjivačkoj hromatografiji, eluiranje je postupak za pranje napunjenih smola kako bi se uklonili uhvaćeni joni.

[0033] Eluat (ostatak nakon ispiranja): Kao što se ovde koristi, termin "eluat" se odnosi na kombinaciju mobilne faze "nosača" i materijala analita koji se dobija iz hromatografije, obično kao rezultat eluiranja.

[0034] Terapija zamene enzima (ERT): Kao što se ovde koristi, termin "terapija zamene enzima (ERT)" se odnosi na bilo koju terapeutsku strategiju koja koriguje deficijenciju enzima načinom kojim se obezbeđuje enzim koji nedostaje. Jednom kada se daje, ćelije uzimaju enzim i transportuju do lizozoma, gde enzim deluje na način da eliminiše materijal koji se nakupio u lizozomima usled deficijencije enzima. Obično, da bi terapija zamene lizozomskog enzima bila efikasna, terapeutski enzim se ciljano dostavlja u lizozomima odgovarajućih ćelija u ciljanim tkivima u kojima je izražen defekt u nakupljanju.

[0035] Ekvilibrisan ili Ekvilibracija: Kao što se ovde koriste, termini "ekvilibrisati" ili "ekvilibracija" u vezi sa hromatografijom se odnose na postupak u kome se prva tečnost (npr., pufer) dovodi u ravnotežu sa drugom, generalno da bi se postigla stabilna i jednaka distribucija komponenti u tečnosti (npr., pufer). Na primer, u nekim izvođenjima, hromatografska kolona može da bude ekvilibrisana prolazom jedne ili više zapremine kolone željene tečnosti (npr., pufera) kroz kolonu.

[0036] Poboljšati, povećati, ili smanjiti: Kao što se ovde koristi, termini "poboljšati," "povećati" ili "smanjiti," ili njihovi gramatički ekvivalenti, ukazuju na vrednosti koje su relativne sa merenjima osnovnog nivoa, kao što su merenja u istoj individui pre inicijacije tretmana koji se ovde opisuju, ili merenja u kontrolnoj individui (ili kod više kontrolnih individua) u odsustvu tretmana koji se ovde opisuje. "Kontrolna " je individua koja je pogođena sa istim oblikom bolesti nakupljanja u lizozomima kao i individua koja se leči, koja je otprilike istog starosnog doba kao i individua koja se leči (da bi se osiguralno da mogu da se porede stadijumi bolesti kod individua koje primaju tretman i kontrolnih individua).

[0037] Nečistoće: Kao što se ovde koristi, termin "nečistoće" se odnosi na supstance koje se nalaze unutar ograničene količine tečnosti, gasa, ili čvrste supstance, koji se razlikuju od hemijske kompozicije ciljanog materijala ili jedinjenja. Nečistoće se takođe nazivaju kontaminanti.

[0038] Grupe za povezivanje: Kao što se ovde koristi, termin "grupa za povezivanje" se odnosi na, u kombinovanom proteinu, sekvencu aminokiseline osim one koja se pojavljuje na određenom položaju u prirodnom proteinu i generalno je dizajnirana da bude fleksibilna ili da uklopi stukturu, kao što je a-heliks, između dve proteinske grupe. Grupa za povezivanje je takođe naznačena kao spejser.

[0039] Nanošenje: Kao što se ovde koristi, termin "nanošenje" se odnosi na, u hromatografiji, dodavanje uzorka-koji je u tečnom ili čvrstom obliku na kolonu. U nekim izvođenjima, posebne komponente uzorka koji se nanosi na kolonu se zatim hvataju u obliku dodatog uzorka koji prolazi kroz kolonu. U nekim izvođenjima, posebne komponente uzorka koji je nanet na kolonu nisu uhvaćene sa, ili "su prošle kroz", kolonu kako naneti uzorak prolazi kroz kolonu.

[0040] Polipeptid: Kao što se ovde koristi, "polipeptid", uopšteno, je lanac najmanje dve aminokiseline koje su vezane jedna sa drugom petidnom vezom. U nekim izvođenjima, polipeptid može da uključi najmanje 3-5 aminokiselina, od kojih je svaka vezana za drugu najmanje jednom peptidnom vezom. Stručnjacima iz oblasti tehnike je jasno da polipeptidi nekada uključuju "neprirodne" aminokiseline ili druge entitete koji ipak mogu da se integrišu u polipeptidni lanac, opciono.

[0041] Spojene frakcije: Kao što se ovde koristi, termin engl. "pool" u vezi sa hromatografijom se odnosi na spajanje jedne ili više frakcija tečnosti koje su zajedno prošle kroz kolonu. Na primer, u nekim izvođenjima, jedna ili više frakcija koja sadrži željenu komponentu uzorka koja je razdvojena hromatografijom (npr., "signalne frakcije") mogu da budu "spojene" zajedno da se dobije jedinstvena (engl. "pooled") frakcija.

[0042] Zamena enzima: Kao što se ovde koristi, termin "zamena enzima" se odnosi na bilo koji enzim koji može da deluje tako da najmanje delom zameni deficijent ili enzima koji nedostaje u bolesti koja treba da se leči. U nekim izvođenjima, termin "zamena enzima" se odnosi na bilo koji enzim koji može da deluje da zameni najmanje delom deficijentni ili nedostajući lizozomalni enzim u bolesti nakupljanja u lizozomima koja treba da se leči. U nekim izvođenjima, zamenom enzima je moguće smanjenje nakupljenih materijala u sisarskim lizozomima ili mogu da spasu ili ublaže jedan ili više simptoma bolesti nakupljanja u lizozomima. Enzimi zamene koji su pogodni za pronalazak uključuju i divlji tip ili modifikovane lizozomske enzime i može da se proizvede upotrebom rekombinovanih i sintetičkih postupaka ili da bude prečišćen iz prirodnih izvora. Enzim zamene može da bude rekombinovani, sintetički, genski aktiviran ili prirodni enzim.

[0043] Rastvorljivi: Kao što se ovde koristi, termin "rastvorljivi" se odnosi na sposobnost terapetuskog sredstva da obrazuje homogeni rastvor. U nekim izvođenjima, rastvorljivost terapeutskog sredstva u rastvoru u kome se daje i pomoću koga se prenosi do ciljnog mesta delovanja je dovoljna da omogući dostavljanje terapeutskog sredstva do ciljnog mesta delovanja. Nekoliko faktora može da utiče na rastvorljivost terapeutskih sredstava. Na primer, relevantni faktori koji mogu da utiču na rastvorljivost proteina uključuju jonsku jačinu, aminokiselinsku sekvencu i prisustvo drugih sredstava ili agenasa za ko-rastvaranje (npr., kalcijumove soli). U nekim izvođenjima, terapeutska sredstva u skladu sa terapeutskim pronalaskom u rastvorljiva u njegovoj odgovarajućoj farmaceuskoj kompoziciji.

[0044] Stabilnost: Kao što se ovde koristi, termin "stabilan" se odnosi na sposobnost terapeutskog sredstva (npr., rekombinovanog enzima) da održi svoju terapeutsku efikasnost (npr., sve ili većinu njegove namenjene biološke aktivnosti i/ili fizičkohemijskog integriteta) tokom produženih vremenskih perioda. Stabilnost terapeutskog sredstva, i sposobnost farmaceutske kompozicije da održi stabilnost takvog terapeutskog sredstva, može da bude procenjena u produženim vremenskim periodima (npr., najmanje 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili više). U kontekstu formulacije, stabilna formulacija je ona u kojoj terapeutsko sredstvo koje se u njoj nalazi u suštini zadržava svoj fizički i/ili hemijski integritet i biološku aktivnost tokom skladištenja i postupaka (kao što su zamrzavanje/otapanje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Za proteinsku stabilnost, može da bude mera obrazovanja agregata visoke molekulske mase (HMW), gubitka enzimske aktivnosti, stvaranje peptidnih fragmenata i menjanja profila naelektisanja.

[0045] Virusna obrada: Kao što se ovde koristi, termin "virusna obrada" se odnosi na "uklanjanje virusa," u kome su virusi jednostavno uklonjeni iz uzorka, ili "inaktivacije virusa," u kojoj virusi ostaju u uzorku ali u obliku koji nije infektivan. U nekim izvođenjima, uklanjanje virusa može da se vrši između ostalih, pomoću nanoceđenja ili/ili postupcima hromatografije. U nekim izvođenjima, virusna inaktivacija može da koristi inaktivaciju rastvarača, inaktivaciju deterdženta, pasterizaciju, inaktivaciju kiselim pH, i/ili inaktivaciju ultraviolentnim zračenjem, između ostalih.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0046] Predmetni prikaz opisuje, između ostalog, unapređen postupak prečišćavanja rekombinovanog I2S proteina za terapiju zamene enzima koji je zasnovan na postupku koji uključiuje manje od 6 koraka hromatografije. U nekim izvođenjima, predmetni prikaz opisuje postupak prečišćavanja rekombinovanog I2S proteina iz preparata koji sadrži nečištoće, upotrebom postupka zasnovanog na jednoj ili više od hromatografija koje je zasnovana na izmeni njona, hromatografije koja je zasnovana na izmeni katjona, hromatografije sa pomešnim načinom, i hromatografije sa hidrofobnom interakcijom. U nekim izvođenjima, predmetni prikaz opisuje postupak prečišćavanja rekombinovanog I2S proteina iz preparata koji sadrži nečištoće sprovođenjem Q hromatografije, hidroksiapatit (HA) hromatografije, SP hromatografije, i fenil hromatografije. Predmetni prikaz dalje opisuje prečišćeni rekombinovani I2S protein i postupke upotrebe.

[0047] Različiti aspekti pronalaska su detaljnije opisani u paragrafima koji slede. Upotreba paragrafa nije namenjena da ograniči pronalazak. Svaki paragraf može da se primeni na jedan aspekt pronalaska. U ovoj prijavi, upotreba "ili" označava "i/ili" osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

Rekombinovani I2S protein

[0048] Kao što se ovde koristi, I2S protein je bilo koji protein ili porcija proteina koji najmanje delom zamenjuje aktivnosti prirodnog proteina iduronat-2-sulfataze (I2S) ili oslobađa jedan ili više fenotipova ili simptoma koji su u vezi sa I2S-deficijencijom. Kao što se ovde koristi, termini "I2S enzim" i "I2S protein", i gramatički ekvivalenti, ovde se koriste naizmenično.

[0049] Obično, humani I2S protein se proizvodi u obliku prekursora. Prekursorski oblik humanog I2S sadrži signalni peptid (ostatke aminokiselina 1-25 prekursora pune dužine), pro-peptid (ostatke aminokiselina 26-33 prekursora pune dužine), i lanac (ostaci 34-550 prekursora pune dužine) koji dalje mogu da budu obrađeni u 42 kDa lanac (ostaci 34-455 prekursora pune dužine) i 14 kDa lanac (ostaci 446-550 prekursora pune dužine). Obično, prekursorski oblik je takođe naznačen sa prekursorom pune dužine ili 12S proteinom pune dužine, koji sadrži 550 aminokiselina. Sekvence aminokiselina zrelog oblika (SEQ ID NO:1) koje imaju uklonjen signalni peptid i prekursor pune dužine (SEQ ID NO:2) tipičnog divljeg tipa ili prirodnog humanog I2S proteina su prikazane u Tabeli 1. Signalni peptid je podvučen. Dodatno, sekvence aminokiselina prekursora humanog I2S proteina izooblika a i b su redom obezbeđene u Tabeli 1, SEQ ID NO:3 i 4.

Tabela 1. Humana Iduronat-2-sulfataza

[0050] Prema tome, u nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je zreli humani I2S protein (SEQ ID NO:1). Kao što je ovde prikazano, SEQ ID NO:1 predstavlja kanonsku aminosekvencu za humani I2S protein. U nekim izvođenjima, I2S protein može da bude splajsovana izooblik i/ili varijanta SEQ ID NO:1, koja nastaje iz transkripcije na alternativnom start mestu u okviru 5’ UTR (netranslatirajućeg) I2S gena. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein može da bude homolog ili analog zrelog humanog I2S proteina. Na primer, homolog ili analog zrelog humanog I2S proteina može da bude modifikovani zreli humani 2S protein koji sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina, delecija, i/ili insercija u poređenju sa divljim tipom ili prirodnim I2S proteinom (npr., SEQ ID NO:1), dok se u suštini zadržava I2S proteinska aktivnost. Prema tome, u nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini homolog sa zrelim humanim I2S proteinom (SEQ ID NO:1). U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein ima sekvencu aminokiselina najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologu sa SEQ ID NO:1. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini identičan sa zrelim humanim I2S proteinom (SEQ ID NO:1). U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnih sa SEQ ID NO:1. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein sadrži fragment ili deo zrelog humanog I2S proteina.

[0051] Alternativno, rekombinovani I2S protein je I2S protein pune dužine. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein može da bude homolog ili analog humanog I2S proteina pune dužine. Na primer, homolog ili analog humanog I2S proteina pune dužine može da bude modifikovani humani I2S protein pune dužine koji sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina, delecija, i/ili insercija u poređenju sa divljim tipom ili prirodnim I2S proteinom pune dužine (npr., SEQ ID NO:2), dok se u suštini zadržava I2S proteinska aktivnost. Prema tome, u nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini homolog sa humanim I2S proteinom pune dužine (SEQ ID NO:2). Na primer, rekombinovani I2S protein može da ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologu sa SEQ ID NO:2. U nekim izvođenjima, rekobinovani I2S protein je u suštini identičan sa SEQ ID NO:2. Na primer, rekombinovani I2S protein može da ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnu sa SEQ ID NO:2. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein sadrži fragment ili deo humanog I2S proteina pune dužine. Kao što se ovde koristi, I2S protein pune dužine obično sadrži signalnu peptidnu sekvencu.

[0052] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je izooblik humanog I2S proteina. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein može da bude homolog ili analog sa humanom I2S izooblikom a proteina. Na primer, homolog ili analog humanog izooblika a I2S proteina može da bude modifikovana izorma a I2S proteina koja sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina, delecija, i/ili insercija u poređenju sa divljim tipom ili prirodno humanom izooblikom a I2S proteina (npr., SEQ ID NO:3), dok se u osnovi zadržava I2S proteinska aktivnost. Prema tome, u nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini homolog sa humanom izooblikom a I2S proteina (SEQ ID NO:3). Na primer, rekombinovani I2S protein može da ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologom sa SEQ ID NO:3. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini identičan sa SEQ ID NO:3. Na primer, rekombinovani I2S protein može da ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnu sa SEQ ID NO:3. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein sadrži fragment ili deo humane izooblika a I2S proteina. Kao što se ovde koristi, humana izooblik a I2S proteina obično sadrži signalnu peptidnu sekvencu.

[0053] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je humani I2S protein izooblika b. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein može da bude homolog ili analog humanom I2S proteinu izooblika b. Na primer, homolog ili analog humanog I2S proteina izooblika b može da bude modifikovani I2S protein izooblika b koji sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina, delecija, i/ili insercija u poređenju sa divljim tipom ili prirodnim humanim I2S proteinom izooblika b (npr., SEQ ID NO:4), dok se u suštini zadržava I2S proteinska aktivnost. Prema tome, u nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini homolog sa humanim I2S proteinom izooblika b (SEQ ID NO:4).

Na primer, rekombinovani I2S protein može da ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologu sa SEQ ID NO:4. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je u suštini identičan sa SEQ ID NO:4. Na primer, rekombinovani I2S protein može da ima sekvencu aminokiselina od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnu sa SEQ ID NO:4. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein sadrži fragmenti ili porciju humanog I2S proteina izooblika b. Kao što se ovde koristi, humani I2S protein izooblika b obično sadrži signalnu peptidnu sekvencu.

[0054] Homolozi ili analozi humanih I2S proteina mogu da se dobiju prema postupcima za menjanje polipeptidne sekvence koji su poznati stručnjaku koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike kao što se mogu naći u referencama koje čine takve postupke. U nekim izvođenjima, konzervativne supstitucije aminokiselina uključuju supstitucije između aminokiselina koje su napravljene sa sledećim grupama: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; i (g) E, D. U nekim izvođenjima, "konzervativna supstitucija aminokiselina" se odnosi na supstituciju aminokiselina koja ne menja relativno naelektrisanje ili karakteristiku veličine proteina u kome se pravi supstitucija aminokiselina.

[0055] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S proteini mogu da sadrže grupu koja se vezuje za receptor na površini ciljanih ćelija da bi se olakšalo ćelijsko preuzimanje i/ili ciljanje lizozoma. Na primer, takav receptor može da bude katjon nezavisni manoza-6-fosfat receptor (CI-MPR) koji vezuje ostatke manoza-6-fosfata (M6P). Dodatno, CI-MPR takođe vezuje druge proteine uključujući IGF-II. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein sadrži M6P ostatke na površini proteina. Posebno, rekombinovani I2S protein može da sadrži bis-fosforilovane oligosaharide koji imaju veći afinitet vezivanja prema CI-MPR. U nekim izvođenjima, odgovarajući enzim sadrži do približno proseka od oko najmanje 20% bis-fosforilovanih oligosaharida po enzimu. U drugim izvođenjima, odgovarajući enzim može da sadrži oko 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% bisfosforilovanih oligosaharida po enzimu.

[0056] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S enzimi mogu da budu spojeni sa grupom za ciljanje lizozoma koja može da se veže za receptor na površini ciljanih ćelija. Pogodna grupa za ciljanje lizozoma može da bude IGF-I, IGF-II, RAP, p97, i varijante, njihovi homolozi i fragmenti (npr., uključujući one peptide koji imaju sekvencu od najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% identičnu sa divljim tipom zrelog humanog IGF-I, IGF-II, RAP, p97 peptidna sekvenca). Grupa za ciljanje lizozoma može da bude konjugovana sa ili spojena sa I2S proteinom ili enzimom na N-kraju, C-kraju ili u unutrašnjosti.

Proizvodnja Rekombinovanih I2S Proteina

[0057] Ovde prikazani postupci mogu da budu korisni za prečišćavnje I2S proteina koji je proizveden upotrebom različitih postupaka. Na primer, I2S protein može da bude proizveden postupkom rekombinacije upotrebom sistema ćelije domaćina koji je konstruisan za eksprimiranje nukleinske kiseline koja kodira I2S. Alternativno, I2S protein može da bude proizveden aktiviranjem endogenog I2S gena.

[0058] Razmatra se da postupci koji su ovde prikazani mogu da se koriste za prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina koji je proizveden upotrebom različitih ekspresionih sistema. Pogodni sistemi za ekspresiju uključuju, na primer, jaje, baculovirus, biljne ćelije, kvasac, ili sisarske ćelije.

[0059] U nekim izvođenjima, I2S enzimi su proizvedeni u sisarskim ćelijama. Primeri sisarskih ćelija koji ne ograničavaju koji mogu da se kroriste u skladu sa postupcima koji su ovde prikazani uključuju BALB/c mijeloma liniju miša (NSO/1, ECACC No: 85110503); humane retinoblaste (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlis); CV1 liniju bubrega majmuna transformisanu sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); liniju iz humanih bubrega embriona (HEK293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi u suspenziji, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); ćelijsku liniju humanog fibrosarkoma (npr., HT1080); ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK21, ATCC CCL 10); ćelije ovarijuma kineskog hrčka /-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); sertolijeve ćelije poreklom iz miša (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); ćelije bubrega iz majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma humanog cerviksa (HeLa, ATCC CCL 2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre „buffalo“ pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije iz pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije jetre čoveka (Hep G2, HB 8065); tumora mišjih mlečnih žlezda (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linije humanog hepatoma (Hep G2).

[0060] U nekim izvođenjima, postupci predmetnog prikaza se koriste za prečišćavanje rekombinovanih I2S enzima koji su proizvedeni iz humanih ćelija (npr., HT1080). U nekim izvođenjima, postupci predmetnog prikaza se koriste za prečišćavanje rekombinovanih I2S enzima koji su proizvedeni iz CHO ćelija.

[0061] Obično, ćelije koje su konstruisane tako da eksprimiraju I2S mogu da sadrže transgen koji kodira ovde opisani rekombinovani I2S protein. Treba razumeti da nukleinska kiselina koja kodira rekombinovani I2S može da sadrži regulatorne sekvence, sekvece za kontrolu gena, promotore, nekodirajuće sekvence i/ili druge pogodne sekvence za eksprimiranje rekombinovanog I2S. Obično, kodirajući region je operativno povezan sa jednom ili više ovih komponenti nukleinskih kiselina.

[0062] "Regulatorne sekvence" se obično odnosi na nukleotidne sekvence koje su locirane uzvodno (5’ ne-kodirajuće sekvence), unutar, ili nishodno (3’ ne-kodirajućih sekvenci) kodirajuće sekvence, i koje imaju uticaj na transkripciju, obradu RNK ili stabilnost, ili translaciju povezane kodirajuće sekvence. Regulatorne sekvence mogu da uključe promotore, vodeće sekvence translacije, introne, i sekvence za prepoznavanje poliadenilacije. Nekada, "regulatorne sekvence", su takođe naznačene sa "sekvence za gensku kontrolu."

[0063] "Promotor" se obično odnosi na nukleotidnu sekvencu koja može da kontroliše ekspresiju kodirajuće sekvence ili funkcionalne RNK. Generalno, kodirajuća sekvenca je locirana 3’ do sekvence promotora. Sekvenca promotora se sastoji iz proksimalnog i više distalnih uzvodnih elemenata, pri čemu se drugi elementi često nazivaju pojačivači. Prema tome, "pojačivač" je nukleotidna sekvenca koja stimuliše promotorsku aktivnost i može da bude sastavni deo promotora ili heterologni element koji je insertovan da pojača nivo ili tkivnu specifičnost promotora. Promoteri mogu u celosti da budu izvedeni od prirodnog gena, ili mogu da budu sastavljeni iz različitih elemenata koji se dobijaju iz različitih elemenata koji se mogu naći u prirodi, ili čak sadrže sintetičke nukleotidne segmente. Stučnjacima iz oblasti tehnike je jasno da različiti promotori mogu da usmere ekspresiju gena u različitim tkivima ili ćelijskim tipovima, ili na različitim razvojnim stupnjevima, ili u odgovoru na različite uslove spoljšnje sredine.

[0064] "3’ ne-kodirajuće sekvence" se obično odnosi na nukleotidne sekvence koje su locirane nizvodno od kodirajuće sekvence i uključuju mesta prepoznavanja za poliadenilaciju i druge sekvence koje kodiraju regulatorne signale koji mogu da utiču na obradu iRNK ili gensku ekspresiju. Signal za poliadenilaciju se obično karakteriše uticajem dodavanja trakta polidenilne kiseline u 3’ kraj prekursora iRNK.

[0065] "Vodeća sekvenca translacije" ili "5’ ne-kodirajuće sekvence" se obično odnosi na nukleotidnu sekvencu koja je locirana između sekvence promotora gena i kodirajuće sekvence. Vodeća sekvenca translacije je prisutna u potpuno obrađenoj iRNK ushodno od start sekvence za početak translacije. Vodeća sekvenca translacije može da utiče na obradu primarnog transkripta do iRNK, stabilnost iRNK ili efikasnost translacije.

[0066] Obično, termin "operativno povezana" ili "operativno vezana" se odnosi na povezanost dva ili više fragmenata nukleinske kiseline na jedan fragment nukleinske kiseline tako da je funkcija jednog pod uticajem funkcije drugog. Na primer, promoter je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom kada je sposoban da utiče na ekspresiju te kodirajuće sekvence (tj., da je kodirajuća sekvenca pod transkripcionom kontrolom promotora). Kodirajuće sekvence mogu operativno da budu povezane sa regulatornim sekvencama u sens ili antisens orijentaciji.

[0067] Kodirajući region transgena može da uključi jednu ili više tihih (engl.“silent) mutacija za optimizaciju upotrebe kodona za posebni ćelijski tip. Na primer, kodoni I2S transgena mogu da budu optimizovani za eksprimiranje u ćeliji kičmenjaka. U nekim izvođenjima, kodoni I2S transgena mogu da budu optimizovani za eksprimiranje u sisarskoj ćeliji. U nekim izvođenjima, kodoni I2S transgena mogu da budu optimizovani za eksprimiranje u humanoj ćeliji.

[0068] Opciono, konstrukt može da sadrži dodatne komponente kao što su jedna ili više od sledećih: mesto splajsovanja, sekvencu pojačivača, gen koji kodira selektivni marker koji je pod kontrolom odgovarajućeg promotora, marker gen za umnožavanje koji je pod kontrolom odgovarajućeg promotora, region za vezivanje za matriks (MAR) ili drugi element koji je poznat iz oblasti tehnike koji pojačava eksprimiranje regiona u kome je konstrukt insertovan.

[0069] Jednom kada je izvršena transfekcija ili transdukcija u ćelije domaćina, pogodni vektor može da se eksprimira ekstrahromozomalno (epizomalno) ili može da se integriše u genom ćelije domaćina.

Aktivacija rekombinovanih I2S proteina

[0070] Obično, rekombinovani I2S enzim je aktiviran postranslacionom modifikacijom konzervisanog cisteina (koji odgovara aminokiselini 59 u zrelom humanom I2S) u formilglicin, koj je takođe poznat pod imenom 2-amino-3-oksopropionska kiselina, ili okso-alanin. Takva post-translaciona modifikacija može da se izvede pomoću enzima koji je poznat pod imenom enzim koji katalizuje konverziju u formilglicin (engl. „Formylglycine Generating Enzyme“ FGE). Prema tome, u nekim izvođenjima, rekombinovani I2S enzimi su proizvedeni u ćelijama koje takođe eksprimiraju FGE protein. U posebnim izvođenjima, rekombinovani I2S enzimi su proizvedeni u ćelijama koje imaju povećanu ili pojačanu ekspresiju proteina FGE. Na primer, ćelije mogu da budu konstruisane tako da imaju povećanu ili pojačanu ekspresiju FGE u kombinaciji sa rekombinovanim I2S da bi se olakšala proizvodnja I2S preparata koji imaju visoke nivoe aktivnog enzima. U nekim izvođenjima, prekomerna ekspresija FGE je postignuta ekspresijom (npr., prekomernom ekspresijom) egzogenog FGE upotrebom standardnih postupaka rekombinacije. U nekim izvođenjima, prekomerna ekspresija FGE se postiže aktivacijom ili pojačanom ekspresijom endogenog FGE pomoću, na primer, aktiviranjem ili pojačanjem endogenog FGE gena. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja kodira rekombinovani I2S i nukleinska kiselina koja kodira rekombinovani FGE protein su povezane nukleinskom kiselinom (npr., „spacer“ sekvencom) koja ima sekvencu koja odgovara unutrašnjem mestu za vezivanje ribozoma.

[0071] Bilo koji FGE koji ima sposobnost da konvertuje cistein u formilglicin može da se koristi u postupcima pronalaska. Primeri sekvence nukleinske kiseline i sekvenci aminokiselina za FGE proteine su prikazani u US 2004-0229250. Treba razumeti da nukleinske kiseline koje kodiraju rekombinovani FGE mogu da sadrže regulatorne sekvence, sekvence za gensku kontrolu, promotere, ne-kodirajuće sekvence i/ili druge odgovarajuće sekvence za eksprimiranje FGE. Obično, kodirajući region je operativno povezan sa jednom ili više komponenti nukleinske kiseline.

Medijum ćelijske kulture i uslovi

[0072] Za proizvodnju rekombinovanog I2S proteina može da se koristi različiti medijum ćelijske kulture i uslovi. Na primer, rekombinovani I2S protein može da se proizvodi u medijumu koji sadrži ili je oslobođen od seruma. U nekim izvođenjima, reokmbinovani I2S protein je proizveden u medijumu bez seruma. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je proizveden u medijumu koji nije životinjski, tj., medijumu koji ne sadrži komponente životinjskog porekla. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je proizveden u hemijski definisanom medijumu. Kao što se ovde koristi, termin "hemijski definisani hranljivi medijum" se odnosi na medijum u kome su sve komponente u suštini hemijski poznate. U nekim izvođenjima, hemijski definisani hranljivi medijum je oslobođen komponenti životinjskog porekla kao što je serum, proteina koji se dobijaju iz seruma (npr., albumin ili fetuin), ili drugih komponenti. U nekim slučajevima, hemijski definisani medijum sadrži jedan ili više proteina (npr., proteini faktora rasta ili citokini.) U nekim slučajevima, hemijski definisani hranljivi medijum sadrži jedan ili više proteinskih hidrolizata. U drugim slučajevima, hemijski definisani hranljivi medijum je medijum koji je oslobođen proteina, tj., medijum oslobođen seruma koji ne sadrži proteine, hidrolizate ili komponente nepoznatog sastava.

[0073] U nekim izvođenjima, hemijski definisani medijum može da bude dopunjen sa jednom ili više komponenti životinjskog porekla. Takve komponente životinjskog porekla uključuju, ali bez ograničenja, serum fetusa govečeta, serum konja, serum koze, serum magarca, humani serum, i proteini koji se dobijaju iz seruma kao što su albumini (npr., albumin iz seruma govečeta ili albumin iz humanog seruma).

[0074] Različiti uslovi ćelijske kulture mogu da se korste za proizvodnju rekombinovanih I2S proteina na velikoj skali uključujući, ali bez ograničenja, kulture u cilindričnim spororotirajućim bocama, kulture u serijama bioreaktora i kulture u bioreaktorima gde se medijum u koracima zamenjuje. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je proizveden od ćelija koje se gaje u suspenziji u kulturi. U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S protein je proizveden od adherentnih ćelija.

[0075] Primeri ćelijskog medijuma i uslova kulture su opisani u odeljku Primeri. Dodatni postupci primera i kompozicija za proizvodnju rekombinovanog I2S proteina su opisani u prijavi pod imenom "Methods i Compositions for Producing Recombinant Iduronate-2-Sulfatase" koja je ovde podneta istog dana, pri čemu je čitav prikaz uključen referencom.

Prečišćavanje rekombinovanog I2S proteina

[0076] U nekim izvođenjima predmetnog prikaza postupak prečišćavanja rekombinovanog I2S proteina iz preparata koji sadrži nečistoće može da se postigne upotrebom postupka koji je zasnovan na jednom ili više hromatografiji za izmenu anjona, hromatografiji za izmenu katjona, hromatografiji sa mešanim načinom rada, i hromatografiji hidrofobne interakcije. U nekim izvođenjima, postupak uključuje manje od 6 (npr., manje od 5, manje od 4, ili manje od 3) koraka hromatografije. U nekim izvođenjima, postupak uključuje 2, 3, 4 ili 5 koraka hromatografije. U nekim izvođenjima, postupak uključuje 4 koraka hromatografije. U nekim izvođenjima, postupak prema predmetnom pronalasku redom sprovodi hromatografiju koja je zasnovana na izmeni anjona, hromatografiju sa mešanim načinom rada, hromatografiju koja je zasnovana na izmeni katjona, i hromatografiju hidrofobne interakcije.

Preparat koji sadrži nečistoće

[0077] Kao što se ovde koristi, preparat koji sadrži nečištoće može da bude bilo koji biološki materijal uključujući neobrađeni biološki materijal koji sadrži rekombinovani I2S protein. Na primer, preparat koji sadrži nečistoće može da bude nobrađeni medijum ćelijske kulture koji sadrži rekombinovani I2S protein sekretovan iz ćelija (npr., sisarskih ćelija) koje proizvode I2S protein ili neobrađenih ćelijskih lizata koje sadrrže I2S protein. U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečištoće može da bude delom obrađeni ćelijski medijum iil ćelijski lizati. Na primer, ćelijski medijum ili ćelijski lizati mogu da budu koncentrovani, razblaženi, tretirani za inaktivaciju virusa, obradu virusa ili uklanjanjem virusa. U nekim izvođenjima, za uklanjanje virusa može da se koristi nanoceđenje i/ili postupci hromatografije, između ostalih. U nekim izvođenjima, inaktivacija virusa može da koristi inaktivaciju rastvaračem, inaktivaciju deterdžentom, pasterizacijom, inaktivaciju kiselom pH, i/ili inaktivaciju uv zračenjem, između ostalih. Ćelijski medijum ili ćelijski lizati mogu takođe da budu tretirani sa proteazom, DNazama, i/ili Rnazama da bi se smanjio nivo proteina u ćeliji domaćinu i/ili nukleinskih kisleina (npr., DNK ili RNK). U nekim izvođenjima, neobrađeni ili delom obrađeni biološki materijali (npr., ćelijski medijum ili ćelijski lizat) mogu da budu zamrznuti i skladišteni na željenoj temperaturi (npr., 2-8 °C, -4 °C, -25 °C, -75 °C) u određenom vremenskom periodu i zatim otapani za prečišćavanje. Kao što se ovde koristi, preparat koji sadrži nečistoće je takođe naznačen kao početni materijal ili materijal za dodavanje.

Anjon-izmenjivačka hromatografija

[0078] U nekim izvođenjima, postupci za prečišćavanje rekombinovanog I2S uključuju hromatografiju za izmenjivanje anjona. Ukratko, hromatografija za izmenjivanje anjona je postupak hromatografije koji se oslanja na interakcije naelektrisanje-naelektrisanje između negativno naelektrisanog jedinjenja i pozitivno naelektrisane smole. U nekim izvođenjima, anjon-izmenjivačka hromatografija je jaka anjon-izmenjivačka hromatografija. U nekim izvođenjima, anjon-izmenjivačka hromatografija se koristi kao prvi korak prečišćavanja za terapeutski protein (npr., rekombinovani I2S).

[0079] Primeri smola za izmenu anjona uključuju, ali bez ograničenja, smole kvaternarnih amina ili "Q-smole" (npr., Capto™-Q, Q-Sepharose®, QAE Sephadex®); dietilaminoetanske (DEAE) smole (npr., DEAE-Trisacryl®, DEAE Sepharose®, benzoilovane naftoilovane DEAE, dietilaminoetil Sephacel®); Amberjet® smole; Amberlyst® smole; Amberlite® smole (npr., Amberlite® IRA-67, Amberlite® jako bazne, Amberlite® slabo bazne), holestiraminsku smolu, ProPac® smole (npr., ProPac® SAX-10, ProPac® WAX-10, ProPac® WCX-10); TSK-GEL® smole (npr., TSK ® gel DEAENPR; TSKg ® el DEAE-5PW); i Acclaim® smole. U određenim izvođenjima, smola za izmenu anjona je Q smola.

[0080] Tipična mobilna faza za hromatografiju koja je zasnovana na izmeni anjona uključuje relativno polarne rastvore, kao što je voda, acetonitril, organske alkohole kao što su metanol, etanol, i izopropanol, ili rastvore koji sadrže 2-(N-morfolino)-etansulfonsku kiselinu (MES). Prema tome, u određenim izvođenjima, mobilna faza uključuje oko 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili oko 100% polarnog rastvora. U određenim izvođenjima, mobilna faza sadrži između oko 1% do oko 100%, oko 5% do oko 95%, oko 10% do oko 90%, oko 20% do oko 80%, oko 30% do oko 70%, ili oko 40% do oko 60% polarnog rastvora u bilo kom datom vremenu u toku trajanja razdvajanja.

[0081] Generalno, mobilna faza uključuje so. Na primer, so (npr., natrijum hlorid) može da ispere vezani protein iz anjon izmenjivačke kolone (npr., suprotni jon je hloridni i zamenjen je za ciljni protein, koji se zatim oslobađa). U nekim izvođenjima, mobilna faza uključuje koncentraciju soli između oko 0 do oko 1,0M, npr., između oko 0 do oko 0.8M, između oko 0 do oko0.6M, između oko 0 do oko 0.5M, između oko 0 do oko 0.4M, između oko 0.05M do oko 0.50M, između oko 0.10M do oko 0.45M, između oko 0.10M do oko 0.40M, ili između oko 0.15M do oko 0.40M. U nekim izvođenjima, mobilna faza uključuje koncentraciju soli od približno 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, ili 1.0M. U nekim izvođenjima, koncentracija soli u mobilnoj fazi je gradijent (npr., linearni ili ne-linearni gradijent). U nekim izvođenjima, koncentracija soli u mobilnoj fazi je konstanta. U nekim izvođenjima, koncentracija soli u mobilnoj fazi može da se u koracima povećava ili smanjuje.

[0082] Obično, mobilna faza je puferovana. U određenim izvođenjima mobilna faza, nije puferovana. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko 14. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko 10. I U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko7. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH oko 6.5. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH oko 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, ili 10.

[0083] U određenim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili intermedijarni eluat ili protok je podešen do pH oko 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ili 7.5 i provodljivosti oko 2 mS/cm, 4 mS/cm, 6 mS/cm, 8 mS/cm, 10 mS/cm, 12 mS/cm, 14 mS/cm, 16 mS/cm, 18 mS/cm, ili 20 mS/cm pre nanošenja na hromatografsku kolonu za izmenjivanje anjona (npr., Q kolonu). Vrednost pH može da bude podešena upotrebom natrijum acetata (npr., 1M) i provodljivost može da bude podešena upotrebom natrijum hlorida (npr., 5M). Jednom kada je napuni, hromatografska kolona sa izmenjivanjem anjona može da bude isprana upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži so (npr., NaCl) u opsegu koncentracija od oko 140 mM do oko 200 mM (npr., oko 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM, ili 200 mM) sa pH oko 5.0-7.5 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ili 7.5). Hromatografska kolona za izmenjivanje anjona može da bude eluirana upotrebom pufera za eluiranje koji sadrži linearni gradijent NaCl. Pogodni primer linearnog NaCl gradienta može da sadrži opseg od oko 0-500 mM NaCl (npr., oko 0-400 mM, oko 0-350 mM, oko 0-300 mM, oko 50-500 mM, oko 150-500 mM, oko 150-450 mM, oko 150-400 mM).

Katjon-izmenjivačka hromatografija

[0084] U nekim izvođenjima, postupci za prečišćavanje rekombinovanog I2S uključuju katjonizmenjivačku hromatografiju. Ukratko, katjon izmenjivačka hromatografija je postupak hromatografije koji se oslanja na interakcije naelektrisanje-naelektrisanje između pozitivno naelektrisanog jedinjenja i negativno naelektrisane smole. U nekim izvođenjima, katjon-izmenjivačka hromatografija je jaka katjon-izmenjivačka hromatografija.

[0085] Katjon-izmenjivačka hromatografija se generalno praktikuje sa ili jakom ili slabom kolonom za izmenu katjona, koja sadrži sulfonijum jon, ili sa slabim katjonskim izmenjivačem, koji obično ima karboksimetil (CM) ili karboksilat (CX) funkcionalnu grupu. Mnoge pogodne katjon-izmenjivačke smole su poznate u oblasti tehnike i komercijalno su dostupne i uključuju, ali bez ograničenja SP-Sepharose®, CM Sepharose®; Amberjet® smole; Amberlyst® smole; Amberlite® smole (npr., Amberlite® IRA120); ProPac® smole (npr., ProPac® ScX-10, ProPac® WCX-10, ProPac® WCX-10); TSK-GEL® smole (npr., TSKgel BioAssist S; TSKgel SP-2SW, TSKgel SP-5PW; TSKgel SP-NPR; TSKgel SCX; TSKgel SP-STAT; TSKgel CM-5PW; TSKgel OApak-A; TSKgel CM-2SW, TSKgel CM-3SW, i TSKgel CM-STAT); i Acclaim® smole. U određenim izvođenjima, anjon-izmenjivačka smola je SP-Sepharose resin®.

[0086] Tipične mobilne faze za hromatografiju koja je zasnovana na izmeni katjona uključuju relativno polarne rastvore, kao što je voda, acetonitril, organske alkohole kao što su metanol, etanol, i izopropanol, ili rastvori koji sadrže 2-(N-morfolino)-etansulfonsku kiselinu (MES). Prema tome, u određenim izvođenjima, mobilna faza uključuje oko 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili oko 100% polarnog rastvora. U određenim izvođenjima, mobilna faza uključuje između oko 1% do oko100%, oko 5% do oko 95%, oko 10% do oko 90%, oko 20% do oko 80%, oko 30% do oko 70%, ili oko 40% do oko 60% polarnog rastvora u bilo kom datom vremenu tokom trajanja razdvajanja.

[0087] Generalno, mobilna faza uključuje so. Na primer, so (npr., natrijum hlorid, natrijum fosfat, itd.) može da eluira vezani protein iz kolone za izmenivanje katjona (npr., suprotni jon je hloridni i zamenjen je za ciljni protein, koji se zatim oslobađa). U nekim izvođenjima, mobilna faza uključuje koncentraciju soli između oko 0 do oko 1.0M, npr., između oko 0 do oko 0.8M, između oko 0 do oko 0.6M, između oko 0 do oko 0.5M, između oko 0 do oko 0.4M, između oko 0.05M do oko 0.50M, između oko 0.10M do oko 0.45M, između oko 0.10M do oko 0.40M, ili između oko 0.15M do oko 0.40M. U nekim izvođenjima, mobilna faza uključuje koncentraciju soli od približno 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, ili 1.0M. U nekim izvođenjima, koncentracija soli u mobilnoj fazi je gradijent (npr., linearni ili ne-linearni gradijent). U nekim izvođenjima, koncentracija soli u mobilnoj fazi je konstanta. U nekim izvođenjima, koncentracija soli u mobilnoj fazi može da se u koracima povećava ili smanjuje.

[0088] Obično je mobilna faza puferovana. U određenim izvođenjima, mobilna faza nije puferovana. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko14. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko 10. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko7. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH oko 6.5. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH oko 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, ili 10.

[0089] U određenim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili intermedijarni eluat ili protok je podešan do provodljivosti opsega između oko 1 mS/cm i 20 mS/cm (npr., između oko 1 mS/cm i 15 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 10 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 8 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 6 mS/cm, između oko 1 mS/cm i 4 mS/cm, između oko 2 mS/cm i 4 mS/cm) pre nanošenja na hromatografsku kolonu za izmenjivanje katjona (npr., SP kolonu). U posebnim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili intermedijer eluat ili protok je podešen do provodljivosti opsega n oko 2 mS/cm i 4 mS/cm (npr., 2, 2.5, 3, 3.5, ili 4 mS/cm) pre nanošenja na hromatografsku kolonu za izmenjivanje katjona (npr., SP kolonu). Provodljivost može da bude podešena razblaživanjem preparata koji sadrži nečistoće sa intermedijerom eluata ili protokom sa H2O na, npr., 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2.0:1, 2.5:1, 3.0:1, 4.0:1, 5.0:1, ili 10:1 odnosu. Provodljivost može da bude podešena dvostukim ceđenjem u željeni pufer. U nekim izvođenjima, hromatografska kolona za izmenjivanje katjona se pokreće na pH oko 5.0-6.5 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0 ili 6.5). U nekim izvođenjima, hromatografska kolona za izmenjivanje katjona se pokreće sa puferom koji sadrži fosfat (npr., NaPO4) sa opsegom koncentracija od oko 0.01 M do oko 0.1 M (npr., oko 0.01 M, 0.02 M, 0.03 M, 0.04 M, 0.05 M, 0.06 M, 0.07 M, 0.08 M, 0.09 M, ili 0.1 M). U nekim izvođenjima, pogodan pH je oko 5.0-6.5 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0, ili 6.5).

Hromatografija sa mešanim načinom rada

[0090] Smatra se da je hidroksiapatit hromatografija (HA) "pseudo-afinitetna" hromatografija ili "pomešani način" izmene jona i može da se korisiti u skladu sa postupcima koji su ovde prikazani. Hidroksiapatit je jedinstven oblik kalcijum fosfata koji se koristi za frakcionisanje i prečišćavanje biološkog materijala. U nekim slučajevima, može da se koristi kristalni hidroksiapatit, iako osetljivost kristala može da ograniči brzine protoka i/ili trajanje kolone. Dva tipa hemijski čistog keramičkog hidroksiapatita, CHT keramičkog hidroksiapatit Tipa I i II su makroporozni, sferični i mogu da se koriste za visoku brzinu protoka i pritiske. Tip I generalno ima visok kapacitet vezivanja proteina, dok Tip II generalno ima niži kapacitet za vezivanje proteina. Generalno, formula hidroksiapatita je Ca10(PO4)6(OH)2(Kawasaki, et al 1985). Funkcionalne grupe uključuju pozitivno naelektrisane parove kristalnih kalcijumovih jona (C-mesta) i klastere šest negativno naelektrisanih kiseonikovih atoma povezanih sa tripletima kristalnih fosfata (P-mesta). C-mesta, P-mesta i hidroksili su raspoređeni u fiksiranoj matrici na kristalnoj površini, što generalno dovodi do kompleksnih interakcija sa proteinima i drugim molekulima.

[0091] Uzorak može da bude nanet na HA kolonu u fosfatnom puferu niske jonske jačine (npr., 1-10 mM natrijum ili kalijum fosfat) ili blizu neutralnog pH. U nekim izvođenjima, preparat sa nečistoćama ili intermedijerni eluat ili protok je prilagođen koncentraciji fosfata (npr., NaPO4) opsega od oko 0.001 M do oko 0.01 M (npr., oko 0.001 M, 0.002 M, 0.003 M, 0.004 M, 0.005 M, 0.006 M, 0.007 M, 0.008 M, 0.009 M, ili 0.01 M) i pH oko 5.0-6.5 (npr., oko 5.0, 5.5, 6.0, ili 6.5) pre nanošenja na kolonu sa mešanim načinom rada (npr., HA kolonu). Napunjene HA kolone se obično ispiraju sa puferom za ispiranje koji imaju fosfatnu koncentraciju uporedivu sa puferom za nanošenje. U nekim izvođenjima, hromatografska kolona sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona), jednom kada se napuni, ispira se sa puferom za ispiranje koji sadrži fosfat (npr., 1-10 mM natrijum ili kalijum fosfat) ili blizu neutralnog pH. Na primer, pogodni pufer za ispiranje može da ima koncentraciju fosfata od oko 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ili 10 mM. U nekim izvođenjima, može biti poželjno povećati količinu fosfata u puferu za ispiranje da se dobiju strožiji uslovi za pranje. Smatra se da su M6P nivoi, posebno di-M6P nivoi, na površini I2S proteina važni za lizozomsko ciljanje. Povećana koncentracija fosfata u puferu za ispiranje može selektivno da zadrži I2S proteine sa visokim nivoima M6P, posebno, di-M6P na HA koloni. Prema tome, U nekim izvođenjima, željeni pufer za ispiranje može da ima koncentraciju fosfata veću od 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM. U nekim izvođenjima, napunjena hromatografska kolona sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona) se ispira sa puferom za ispiranje koji ima koncentraciju fosfata opsega od oko 10-20 mM (npr., oko 10-18 mM, 10-16 mM, 10-15 mM, 12-20 mM, 14-18 mM, 14-16 mM). U nekim izvođenjima, napunjena kolona sa mešanim načinom rada (npr., HA kolona) se ispira sa puferom za ispiranje koji ima koncentraciju fosfata opsega koji je veći od 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM.

[0092] Ispiranje sa HA kolone se obično postiže gradijentom fosfatnog pufera. Na primer, pogodan pufer za ispiranje može da ima fosfatni gradijent od približno 1-400 mM (npr., 1-300 mM, 1-200 mM, 1-150 mM, 1-100 mM, 10-350 mM, 10-300 mM, 10-250 mM, 10-200 mM, 10-150 mM, 10-140 mM, 10-130 mM, 10-120 mM, 10-110 mM, 10-100 mM, 10-90 mM, 10-80 mM, 10-70 mM, 10-60 mM, 10-50 mM) natrijum fosfata. U nekim izvođenjima, ispiranje sa HA kolone se postiže u koracima povećavanjem koncentracije fosfata u puferu za ispiranje. U nekim izvođenjima, puferi za ispiranje u koracima mogu da imaju koncentraciju fosfata koja se bira od 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM. U nekim izvođenjima, ispiranje sa kolone hromatografije pomešanog načina (npr., HA kolone) se postiže puferom za ispiranje koji ima koncentraciju fosfata (npr., natrijum fosfata) od oko 50 mM do oko 150 mM (npr., odabranu od koncentracije fosfata (npr., natrijum fosfata) od oko 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, i njihove kombinacije).

[0093] Jasno je da su poznate mnoge različite kombinacije uslova za HA hromatografiju i mogu da se koriste za podešavanje parametara da budu pogodni za poseban protein od interesa (npr., rekombinovani I2S).

Hromatografija hidrofobne interakcije

[0094] Hromatografija hidrofobne interakcije (HIC) je postupak razdvajanja koji koristi svojstva hidrofobnosti za međusobno razdvajanje proteina. U ovom tipu hromatografije, hidrofobne grupe kao što su fenil, oktil, ili butil, su vezane za stacionarnu kolonu. Proteini koji prolaze kroz kolonu koji imaju hidrofobne bočne grupe aminokiselina na njihovim površinama su pogovni za interakciju sa i vezivanje sa hidrofobnim grupama na koloni. Poznate su HIC kolone, i uključuju na primer, Fenil Sefarozu

[0095] HIC razdvajanja su često označena upotrebom suprotnih uslova od onih koji se koriste u jonoizmenjivačkoj hromatografiji. Uopšteno, pufer sa snažnom jonskom jačinom, obično amonijum sulfat, se inicijalno nanosi na kolonu. So u puferu smanjuje solvataciju uzorka rastvornih supstanci prema tome kako solvatacija opada, hidrofobni regioni koji postaju izloženi se apsorbuju medijumu. Stacionarna faza je generalno dizajnirana da obrazuje hidrofobne interakcije sa drugim molekulima. Ove interakcije su generalno previše slabe u vodi, međutim, dodavanjem soli (npr., Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, NaCl, NH4Cl, NaBr, i NaSCN) u pufer dobijaju se hidrofobne interakcije. U nekim izvođenjima, mobilna faza uključuje koncentraciju soli između oko 0.1M do oko 3.0M, npr., između oko 0.1M do oko 1.5M, između oko 0.2M do oko 0.8M, ili između oko 0.3M do oko 0.5M.

[0096] U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana. U određenim izvođenjima, mobilna faza nije puferovana. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko 14. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko 10. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH između oko 5 do oko 7. U određenim izvođenjima, mobilna faza je puferovana do pH od oko 5.0.

[0097] U nekim izvođenjima, preparat koji sadrži nečistoće ili intermedijer eluat ili protok je podešen do koncentracije soli (npr., NaCl) opsega od oko 0.5 M do oko 2.0 M (npr., oko 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, or 2.0 M) na pH od oko 4.5-6.0 (npr., oko 4.5, 5.0, 5.5, ili 6.0) pre nanošenja na hromatografsku kolonu sa hidrofnom interakcijom (npr., fenil kolonom). Jednom kada je napunjena, hromatografska kolona sa hidrofobnom interakcijom može da se ispere upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži koncentraciju soli (npr., NaCl) od oko 0.5 M do oko 2.0 M (npr., oko 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, ili 2.0 M) na pH od oko 4.5-6.0 (npr., oko 4.5, 5.0, 5.5, ili 6.0). U nekim izvođenjima, hromatografska kolona sa hidrofobnom interakcijom se ispira upotrebom pufera za ispiranje koji sadrži koncentraciju soli (npr., NaCl) opsega od oko 0.1 M do oko 0.5 M (e.g,. oko 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, ili 0.5 M) na pH od oko 4.5-6.0 (npr., oko 4.5, 5.0, 5.5, ili 6.0).

Karakterizacija prečišćenih I2S proteina

[0098] Prečišćeni rekombinovani I2S protein može da se karakteriše upotrebom različitih postupaka.

Čistoća

[0099] Čistoća prečišćenog rekombinovanog 12S proteina je obično mera prisustva nivoa različitih nečistoća (npr., proteina iz ćelije domaćina ili DNK iz ćelije domaćina) koje se nalaze u finalnom proizvodu. Na primer, nivo proteina ćelije domaćina (HCP) može da se izmeri sa ELISA ili SDS-PAGE. U ovom pronalasku prečišćeni rekombinovani I2S protein sadrži manje od 150 ng HCP/mg I2S proteina (npr., manje od 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 30, 20, 10 ng HCP/mg I2S proteina). U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombnovani I2S protein, kada je izložen SDS-PAGE sa srebnim bojenjem, nema novih traka intenziteta većeg od 0.05%, 0.01%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, ili 0.5% test kontrole. Mogu da se koriste različite kontrole, posebno, one koje su prihvatljive regulatornim telima kao što je FDA.

Specifična aktivnost

[0100] Prečišćeni rekombinovani I2S protein takođe može da bude karakterisan procenom funkcionalne i/ili biološke aktivnosti. Enzimska aktivnost rekombinovane I2S kompozicije može da se odredi upotrebom postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike. Obično, postupci uključuju detekciju uklanjanja sulfata sa sintetičkog supstrata, što poznato pod imenom test oslobađanja sulfata. Jedan primer testa za procenu enzimske aktivnosti uključuje upotrebu jonske hromatografije. Ovaj postupak kvantifikuje količinu sulfatnih jona koji se enzimski oslobađaju od supstrata u rekombinovanim I2S. Supstrat može da bude prirodni supstrat ili sinetički supstrat. U nekim slučajevima, supstrat je heparin sulfat (npr., heparin disaharid), dermatan sulfat, ili njihov funkcionalni ekvivalent. Obično, oslobođeni sulfatni jon se analizira jonskom hromatografijom pomoću detektora provodljivosti. U ovom primeru, rezultati mogu da budu izraženi kao U/mg proteina pri čemu se 1 Jedinica definiše kao količina enzima koja je neophodna za oslobađanje 1 µmola sulfatnog jona iz supstrata po satu. U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombnovani I2S protein ima specifičnu aktivnost, kao što se meri in vitro testom aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata, opseg aod oko 0-100 U/mg, oko 10-100 U/mg, oko 10-80 U/mg, oko 20-80 U/mg, oko 20-70 U/mg, oko 20-60 U/mg, oko 20-50 U/mg, oko 30-100 U/mg, oko 30-90 U/mg, oko 30-80 U/mg, oko 30-70 U/mg, oko 30-60 U/mg, oko 40-100 U/mg, oko 40-90 U/mg, oko 40-80 U/mg, oko 40-70 U/mg, oko 40-60 U/mg. U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost, kao što se meri in vitro testom aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata, najmanje oko 5 U/mg, oko 10 U/mg, oko 15 U/mg, oko 20 U/mg, oko 25 U/mg, oko 30 U/mg, oko 35 U/mg, oko 40 U/mg, oko 45 U/mg, oko 50 U/mg, oko 55 U/mg, oko 60 U/mg, oko 65 U/mg, oko 70 U/mg, oko 75 U/mg, oko 80 U/mg, oko 85 U/mg, oko 90 U/mg, oko 95 U/mg, or oko 100 U/mg. Primeri uslova za izvođenje in vitro testa aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata su obezbeđeni u tekstu ispod. Obično, ovaj test meri sposobnost I2S da oslobodi sulfatne jone iz supstrata prirodnog porekla, heparin disaharida. Oslobođeni supstrat može da se kvantifikuje jonskom hromatografijom. U nekim slučajevima, jonska hromatografija je opremljena sa detektorom provodljivosti. Kao ne ograničavajući primer, uzorci su prvo izmenjeni puferom do 10 mM Na acetata, pH 6 to da bi se uklonila inhibicija fosfatnih jona u puferu za formulaciju. Uzorci su zatim razblaženi do 0.075 mg/ml sa reakcionim puferom (10 mM Na acetat, pH 4.4) i inkubirani 2 sata na 37°C sa heparin disaharidom na odnosu enzima prema supstratu od 0.3 µg I2S/100 mg supstrata u 30 µL zapremine reakcije. Reakcija se zatim zaustavlja zagrevanjem uzoraka na 100°C 3 min. Analiza se izvodi upotrebom Dionex IonPac AS 18 analitičke kolone sa IonPac AG18 guard kolone. Izokratski postupak se koristi sa 30 mM kalijum hidroksidom na 1.0 mL/min 15 minuta. Količina sulfata koji se oslobađa od I2S uzorka se računa pomoću analize linearne regresije standarda sulfata u opsegu od 1.7 do 16.0 nmola. Prijavljena vrednost je izražena kao jedinice po mg proteina, gde je 1 jedinica definisana kao 1 µmol sulfata oslobođenih po satu i koncentracija proteina je određena merenjima A280.

[0101] U nekim izvođenjima, enzimska aktivnost rekombinovanog I2S proteina može takođe da se odredi upotrebom drugih različitih postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike kao što su, na primer, 4-MUF test koji meri hidrolizu 4-metilumbeliferilsulfata do sulfata i prirodno fluorescentni 4-metilumbeliferon (4-MUF). U nekim izvođenjima, željena enzimska aktivnost, kao što se meri in vitro 4-MUF testom, proizvedenog rekombinovanog I2S proteina je najmanje oko 0.5 U/mg, 1.0 U/mg, 1.5 U/mg, 2 U/mg, 2.5 U/mg, 3 U/mg, 4 U/mg, 5 U/mg, 6 U/mg, 7 U/mg, 8 U/mg, 9 U/mg, 10 U/mg, 12 U/mg, 14 U/mg, 16 U/mg, 18 U/mg, ili 20 U/mg. U nekim izvođenjima, željena enzimska aktivnost, kao što se meri in vitro 4-MUF testom, proizvedenog rekombinovanog I2S proteina ima opseg od 0-50 U/mg (npr., oko 0-40 U/mg, oko 0-30 U/mg, oko 0-20 U/mg, oko 0-10 U/mg, oko 2-50 U/mg, oko 2-40 U/mg, oko 2-30 U/mg, oko 2-20 U/mg, oko 2-10 U/mg, oko 4-50 U/mg, oko 4-40 U/mg, oko 4-30 U/mg, oko 4-20 U/mg, oko 4-10 U/mg, oko 6-50 U/mg, oko 6-40 U/mg, oko 6-30 U/mg, oko 6-20 U/mg, oko 6-10 U/mg). Primeri uslova za izvođenje in vitro 4-MUF testa su obezbeđeni u tekstu ispod. Obično, 4-MUF test meri sposobnost I2S proteina za hidrolizu 4-metilumbeliferil-sulfata (4-MUF-SO4) do sulfata i prirodnog fluorescentnog 4-metilumbeliferona (4-MUF). Jedna milijedinica aktivnosti se definiše kao količina enzima koja je potrebna za konverziju jednog nanomola 4-MUF-SO4 do 4-MUF u jednom minutu na 37°C. Obično, srednje jedinice fluorescencije (MFU) koje se dobijaju sa I2S uzorcima koji se ispituju sa poznatom aktivnosti mogu da se koriste za dobijanje standardne krive, koja može da se koristi za računanje enzimske aktivnosti uzorka od interesa. Specifična aktivnost može zatim da se izračuna deljenjem enzimske aktivnosti sa koncentracijom proteina.

[0102] U bilo kom primeru, koncentracija proteina rekombinovane I2S kompozicije može da se odredi bilo kojim pogodnim postupkom iz oblasti tehnike za određivanje koncentracija proteina. U nekim slučajevima, koncentracija proteina se određuje pomoću testa aporpcije ulatrvioletnog zračenja. Takvi testovi apsorbance se obično izvode na talasnoj dužini oko 280 nm (A280).

Profil naelektrisanja

[0103] Prečišćeni rekombinovani I2S može da bude karakterisan profilom naelektrisanja koji je povezan sa proteinom. Obično, profil naelektrisanja proteina odražava uzorak naelektrisanja grupa u bočnom lancu, koje se obično nalaze na površini proteina. Profil nelektrisanja može da se odredi pomoću testa jonoizmenjivačke hromatografije (IEX) (npr., HPLC) na proteinu. U nekim izvođenjima, "profil naelektrisanja" se odnosi na skup vrednosti koje predstavljaju količinu proteina koja se ispira sa jonoizmenjivačke kolone u tački u vremenu nakon dodavanja mobilne faze na kolonu koja sadrži izmenjivački jon.

[0104] Obično, pogodna kolona za izmenjivanje jona je kolona u kojoj se vrši izmenjivanje anjona. Na primer, profil naelektrisanja može da se odredi pomoću jake hromatografije za izmenu anjona (SAX) upotrebom sistema tečne hromatografije visoke performanse (HPLC). Generalno, rekombinovani I2S se apsorbuje na fiksirano pozivno naelektrisanje kolone sa jakim izmenjivanjem anjona i gradijentom povećavanja jonske jačine upotrebom mobilne faze na prethodno određenoj brzini protoka eluira rekombinovane vrste I2S sa kolone u proporciji sa jačinom njihove jonske jačine sa pozitivno naelektrisanom kolonom. Više negativno nelektrisane (kiselije) vrste I2S se eluiraju kasnije od manje negativno naelektrisanih (manje kiselih) vrsta I2S. Koncentracije proteina u eluatu se detektuju aporpcijom ultravioletnog zračenja (na 280 nm).

[0105] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S se apsorbuje na oko pH 8.0 u 20 mM TRIS-HCl na fiksiranu Mini Q PE pozitivno naelektrsianu kolonu i gradijentu rastuće jonske jačine upotrebom mobilne faze koja se sastoji iz 20 mM TRIS-HCL, 1 M natrijum hlorida, pH 8.0 na brzini protoka od 0.8 ml/min ispira rekombinovane vrste I2S sa kolone u proporciji sa jačinom njihove jonske jačine sa pozitivno nelektrisanom kolonom.

[0106] U nekim izvođenjima, profil naelektrisanja može da bude predstavljen hromatogramom jedinica apsorbancije prema vremenu nakon eluiranja sa HPLC kolone. Hromatogram može da sadrži skup jedne ili više frakcija, pri čemu svaka frakcija u skupu identifikuje subpopulaciju rekombinovanih I2S-a kompozicije koji imaju slična površinka naelektrisanja.

[0107] U nekim izvođenjima, prečišena kompozicija I2S proteina ispoljava najmanje šest frakcija u njenom profilu naelektrisanja. Primer profila naelektrisanja I2S je predstavljen u odeljku Primeri i na Slici 11. Kao što je prikazano na Slici 11, šest frakcija je obeleženo (A do F) redom povećanja negativnog naelektrisanja i smanjenja doprinosa u ukupnoj površini frakcija u hromatogramu. U nekim izvođenjima, profil naelektrisanja za prečišćenu rekombinovanu I2S kompoziciju sadrži različit broj, veličinu, oblik ili vremenski interval frakcija u zavisnosti od količine negativnih ili pozitivnih naelektrisanja na površini proteina. U nekim izvođenjima, rekombinovana I2S kompozicija ima profil naelektrisanja koji ima manje od 6 (npr., manje od 5, 4, 3, ili 2) frakcija. U nekim izvođenjima, profil nelektrisanja rekombinovanog I2S može da ima 5, 4, 3, 2, ili 1 frakciju. Na primer, bilo koji jedan, dva, tri, četiri, ili pet frakcija A, B, C, D, E, i F mogu da budu odsutne ili redukovane u prečišćenoj rekombinovanoj kompoziciji I2S proteina. Obično, smatra se da je profil naelektrisanja homogeniji ukoliko postoji manje frakcija.

Mapiranje glikana

[0108] U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein može da se karakteriše njegovom kompozicijom proteoglikana, koja se obično naziva mapiranje glikana. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da veza glikana zajedno sa oblikom i kompleksnosti razgranate strukture može da utiče in vivo na čišćenje, lizozomalno ciljanje, biodostupnost, i/ili efikasnost.

[0109] Obično, mapa glikana može da se odredi enzimskom digestijom i naknadnom hromatografskom analizom. Za enzimsku digestiju mogu da se koriste različiti enzimi uključujući, ali bez ograničenja, pogodne glikozilaze, peptidaze (npr., Endopeptidaze, Egzopeptidaze), proteaze, i fosfataze. U nekim izvođenjima, pogodan enzim je alkalna fosfataza. U nekim izvođenjima, pogodan enzim je neuraminidaza. Glikani (npr., fosfoglikani) mogu da se detektuju hromatografskom analizom. Na primer, fosfoglikani mogu da se detektuju pomoću hromatografije za izmenjivanje anjona viske performanse sa pulsiranom Amperometrijskom Detekcijom (HPAE-PAD) ili tečnom ekskluzivnom hromatografijom visoke performance sa isključivanjem veličina (HPLC). Količina glikana (npr., fosfoglikana) koja je predstavljena pomoću svake frakcije na mapi glikana može da se računa upotrebom standardne krive glikana (npr., fosfoglikana), prema postupcima koji su poznati iz oblasti tehnike i koji su ovde prikazani.

[0110] U nekim izvođenjima, prečišćeni I2S prema predmetnom pronalasku ispoljava mapu glikana koja sadrži sedam grupa frakcija koje redom ukazuju na neutralni (grupa frakcija 1), mono-sijalizovani (grupa frakcija 2), di-sijalizovani (grupa frakcija 3), monofosforilovani (grupa frakcija 4), tri-sijalizovani (grupa frakcija 5), tetra-sijalizovani (grupa frakcija 6), i difosforilovani (grupa frakcija 7) I2S protein. Primeri mapa glikana I2S su predstavljeni na Slici 10. U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S ima mapu glikana koja ima manje od 7 grupa frakcija (npr., mapa glikana sa 6, 5, 4, 3, ili 2 grupe frakcija). U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S ima mapu glikana koja ima više od 7 grupa frakcija (npr., 8, 9, 10, 11, 12 ili više).

[0111] Relativna količina glikana koja odgovara svakoj grupi frakcija može da se odredi na osnovu površine frakcija grupe u odnosu na odgovarajuću količinu grupa frakcija u prethodno određenom referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 1 (neutralni) može da ima površinu frakcija grupe opsega od oko 40-120% (npr., oko 40-115%, oko 40-110%, oko 40-100%, oko 45-120%, oko 45-115%, oko 45-110%, oko 45-105%, oko 45-100%, oko 50-120%, oko 50-110%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 2 (monosijalizovani) može da ima površinu frakcija grupe opsega od oko 80-140% (npr., oko 80-135%, oko 80-130%, oko 80-125%, oko 90-140%, oko 90-135%, oko 90-130%, oko 90-120%, oko 100-140%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 3 (disijalizovani) može da ima površinu frakcija grupe opsega oko 80-110% (npr., oko 80-105%, oko 80-100%, oko 85-105%, oko 85-100%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 4 (monofosforilovani) može da ima površinu frakcija grupe u opsegu od oko 100-550% (npr., oko 100-525%, oko 100-500%, oko 100450%, oko 150-550%, oko 150-500%, oko 150-450%, oko 200-550%, oko 200-500%, oko 200-450%, oko 250-550%, oko 250-500%, oko 250-450%, ili oko 250-400%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 5 (trisializovani) može da ima površinu frakcija grupe opsega od oko 70-110% (npr., oko 70-105%, oko 70-100%, oko 70-95%, oko 70-90%, oko 80-110%, oko 80-105%, oko 80-100%, ili oko 80-95%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 6 (tetra-sijalizovani) može da ima površinu frakcija grupe opsega od oko 90-130% (npr., oko 90-125%, oko 90-120%, oko 90-115%, oko 90-110%, oko 100-130%, oko 100-125%, ili oko 100-120%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U nekim izvođenjima, frakcija grupe 7 (difosforilovani) može da ima površinu frakcija grupe opsega od oko 70-130% (npr., oko 70-125%, oko 70-120%, oko 70-115%, oko 70-110%, oko 80-130%, oko 80-125%, oko 80-120%, oko 80-115%, oko 80-110%, oko 90-130%, oko 90-125%, oko 90-120%, oko 90-115%, oko 90-110%) u odnosu na odgovarajuću površinu frakcija grupe u referentnom standardu. U oblasti tehnike su poznati različiti referentni standardi za mapiranje glikana i mogu da se koriste u praksi predmetnog pronalaska. Obično, frakcija grupe 7 (difosforilovani) odgovara nivou di-M6P na površini prečišćenog rekombinovanog I2S proteina.

[0112] Smatra se da obrazac glikozilacije prečišćenog I2S utiče na lizozomsko ciljanje. Razni testovi in vitro za ispitivanje ćelijskog preuzimanja su poznati u oblasti tehnike i mogu da se koriste u praksi predmetnog pronalaska. Na primer, za procenjivaje preuzimanja I2S od M6P receptora, testovi ćelijskog preuzimanja se izvode upotrebom humanih fibroblasta koji eksprimiraju M6P receptore na njihovoj površini. Internalizovana količina I2S može da se meri postupkom ELISA. U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku se karakteriše ćelijskim preuzimanjem većim od 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, kao što se određuje testom in vitro preuzimanja.

Peptidno mapiranje

[0113] U nekim izvođenjima, mapiranje peptida može da se koristi za karakterisanje aminokiselina kompozicija, post-translacionih modifikacija, i/ili obrade u ćeliji; kao što je isecanje signalnog peptida, konverziju formilglicina i/ili glikozilaciju. Obično, rekombinovani protein može da se prekine u diskretnim peptidnom fragmentima, ili kontrolisanim ili nasumičnim prekidanjem, da bi se proizveo uzorak ili mapa peptida. U nekim slučajevima, prečišćeni I2S protein može prvo da bude izložen enzimskoj digestiji pre analitičke analize. Pre analitičke analize, digestija može da se izvede upotrebom peptidaze, glikozid hidrolaze, fosfataze, lipaze ili proteaze i/ili njihovim kombinacijama. Strukturna kompozicija peptida može da se odredi upotrebom postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. Primeri postupaka uključuju, ali bez ograničenja, Masenu spektrometriju, Nuklearnu magnetnu rezonancu (NMR) ili HPLC.

Procenat konverzije formilglicina

[0114] Peptidno mapiranje može da se koristi za određivanje procenta konverzije FGly. Kao što je gore u tekstu navedeno, aktivacija I2S zahteva konverziju Cisteina (koji odgovara položaju 59 u zrelom humanom I2S) do formilglicina upotrebom enzima za konvezuju u formilglicina (FGE) kao što se prikazuje u tekstu ispod:

Prema tome, procenat konverzije formilglicina (%FG) može da se izračuna upotrebom sledeće formule:

Broj aktivnih I2S molekula

ro u upn a vn nea vn moe ua

[0115] Da bi se izračunao %FG, može da se izvede digestija rekombinovanog I2S proteina u kratke peptide upotrebom proteaze (npr., tripsin ili himotripsin). Kratki peptidi mogu da se razdvoje i karakterišu upotrebom, npr., tečne hromatografije visoke performance za isključivanje veličina (HPLC). Peptid koji sadrži položaj koji odgovara položaju 59 u zrelom humanom I2S može da se karakteriše da bi se odredilo da li je Cys na položaju 59 konvertovan u FGly u poređenju sa kontrolom (npr., I2S protein bez FGly konverzije ili I2S protein sa 100% FGly konvezijom). Količina peptida koji sadrže FGly (koji odgovaraju broju aktivnih I2S molekula) i ukupna količina peptida sa oba FGly i Cys (koji odgovaraju broju ukupnih I2S molekula) mogu da se odrede na osnovu odgovarajućih površina frakcija i može da se izračuna odnos koji odražava %FG.

[0116] Prečišćeni rekombinovani 12S protein prema predmetnom pronalasku ima najmanje 70% (npr., najmanje oko 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) konverzije ostatka cisteina koji odgovara Cys59 humanog I2S (SEQ ID NO:1) di Cα-formilglicina (FGly). U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein prema predmetnom pronalasku ima u suštini 100% konverziju ostatka cisteina koji odgovara Cys59 humanog I2S (SEQ ID NO:1) do Cα-formilglicina (FGly).

Sadržaj sijalinske kiseline

[0117] U nekim izvođenjima, prečišćeni rekombinovani I2S protein može da se karakteriše njegovom kompozicijom sijalinske kiseline. Bez želje za vezivanjem za teoriju, predviđa se da sadržaj grupa sijalinske kiseline može da spreči, smanji ili inhibira njihovo brzo in vivo čišćenje pomoću asialoglikoproteinskih receptora koji su prisutni na hepatocitima. Prema tome, veruje se da rekombinovani proteini koji imaju relativno visok sadržaj sijalinske kiseline obično imaju relativno dugo trajanje in vivo u cirkulaciji.

[0118] U nekim izvođenjima, sadržaj sijalinske kiseline prečišćenog rekombinovanog I2S proteina može da se odredi upotrebom postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. Na primer, sadržaj sijalinske kiseline rekombinovanog I2S proteina može da se odredi enzimskom digestijom i naknadnom hromatografskom analizom. Enzimska digestija može da se postigne upotrebom bilo koje pogodne sijalidaze. U nekim slučajevima, digestija se izvodi enzimom glikozid hidrolazom, kao što je neuroaminidaza. Sijalinska kiselina može da se detektuje hromatografskom analizom kao što je, na primer, hromatografija za izmenjivanje anjona visoke perfomanse sa pulsiranom amperometrijskom detekcijom (HPAE-PAD). Količina sijalinske kiseline u kompoziciji rekombinovanog I2S može da se izračuna upotrebom standardne krive za sijalinsku kiselinu, prema postupcima iz oblasti tehnike i postupcima koji su ovde prikazani.

[0119] U nekim izvođenjima, sadržaj sijalinske kiseline prečišćenog rekombinovanog I2S proteina može da bude veći od 16 mol/mol. Jedinice "mol/mol" u kontekstu sadržaja sijalinske kiseline se odnose na molove ostatka sijalinske kiseline po molu enzima. U nekim slučajevima, sadržaj sijalinske kiseline rekombinovanog I2S proteina je veći od oko oko 16.5 mol/mol, oko 17 mol/mol, oko 18 mol/mol, oko 19 mol/mol, oko 20 mol/mol, oko 21 mol/mol, oko 22 mol/mol ili više. U nekim izvođenjima, sadržaj sijalinske kiseline prečišćenog rekombinovanog I2S proteina može da bude u opsegu između oko 16-20 mol/mol, 16-21 mol/mol, oko 16-22 mol/mol, 16-23 mol/mol, 16-24 mol/mol, oko 16-25 mol/mol, oko 17-20 mol/mol, 17-21 mol/mol, oko 17-22 mol/mol, 17-23 mol/mol, 17-24 mol/mol, ili oko 17-25 mol/mol.

Farmaceutska kompozicija i davanje

[0120] Prečišćeni rekombinovani I2S protein može da se daje pacijentu koji ima Hanterov sindrom prema poznatim postupcima. Na primer, prečišćeni rekombinovani I2S protein može da se daje intravenozno, subkutano, intramuskularno, parenteralno, transdermalno, ili transmukozalno (npr., oralno ili nazalno)).

[0121] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S ili farmaceutska kompozicija koja ga sadrži se subjektu daje intravenozno.

[0122] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S ili farmaceutska kompozicija koja ga sadrži daje se subjektu intratekalnim davanjem. Kao što se ovde koristi, termin "intratekalno davanje" ili "intratekalna injekcija" se odnosi na injekciju u kičmenom kanalu (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu). Mogu da se koriste različiti postupci uključujući, bez ograničenja, lateralnu cerebroventrikularnu injekciju kroz šupljinu ili cisternalnu ili lumbarnu punkturu ili slično. U nekim izvođenjima, "intratekalno davanje" ili "intraktekalna isporuka" prema predmetnom pronalasku se odnosi na IT davanje ili isporuku pomoću lumbalne oblasti ili regiona, tj., lumbalnim IT davanjem ili isporukom. Kao što se ovde koristi, termin "lumbalni region" ili "lumbalna oblast" se odnosi na oblast između trećeg i četvrtog (niži deo leđa) kičmenog pršljena i, inkluzivnije, L2-S1 region kičmenog stuba.

[0123] U nekim izvođenjima, rekombinovani I2S ili farmaceutska kompozicija koja ga sadrži daje se subjektu subkutanim načinom davanja (tj., ispod kože). Za takve svrhe, fomulacija može da se da injekcijom pomoću šprica. Međutim, dostupne su druge naprave za davanje formulacije kao što naprave za davanje injekcija (npr., Inject-ease™ i Genject™ naprave); olovke za injekciju (kao što je GenPen™); naprave bez igala (npr., MediJector™ i BioJector™); i sistemi flastera za subkutanu isporuku.

[0124] U nekim izvođenjima, intratekalno davanje može da se koristi zajedno sa drugim načinima davanja (npr., intravenozno, subkutano, intramuskularno, parenteralno, transdermalno, ili transmukozalno (npr., oralno ili nazalno)).

[0125] Predmetni pronalazak obuhvata jedno kao i višestuka davanja terapeutski efikasne količine rekombinovanog I2S ili farmaceutske kompozicije koja ga sadrži kao što se ovde opisuje. Rekombinovani I2S ili farmaceutska kompozicija koja ga sadrži može da se daje u regularnim intervalima, u zavisnosti od prirode, ozbiljnosti i obima stanja subjekta (npr., bolesti nakupljanja u lizozomima). U nekim izvođenjima, terapeutski efikasna količina rekombinovanog I2S ili farmaceutske kompozicjie koja ga sadrži može da se daje periodično ili u regularnim intervalima (npr., jednom dvake godine, jednom u svakih šest meseci, jednom svakih pet meseci, jednom svaka tri meseca, dvomesečno (jednom tokom svaka dva meseca), mesečno (jednom svakog meseca), dvonedeljno (jednom u svake dve nedelje), nedeljno, dnevno ili kontinuirano).

[0126] Rekombinovani I2S ili farmaceutska kompozicija koja ga sadrži može da bude formulisana sa fiziološki prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom da se dobije farmaceutska kompozicija. Nosač i terapeutsko sredstvo mogu da budu sterilni. Formulacija treba da odgovara načinu davanja.

[0127] Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju ali bez ograničenja vodu, rastvore soli (npr., NaCl), fiziološki rastvor, puferovani fiziološki rastvor, alkohole, glicerol, etanol, gumu arabiku, biljna ulja, benzil alkohole, polietilen glikole, želatin, ugljene hidrate kao što je laktoza, amiloza ili skrob, šećere kao što je manitol, saharoza, ili druge, dekstroza, magnezijum stearat, talk, silicijumska kiselina, viskozni parafin, parfemsko ulje, estre masnih kiselina, hidroksimetilcelulozu, polivinil pirolidon, itd., kao i njihove kombinacije. Farmaceutski preparati mogu, po potrebi, da se mešaju sa pomoćnim sredstvima (npr., lubrikantima, konzervansima, stabilizatorima, sredstvima za vlaženje, emulgatorima, solima za uticanje na osmotski pritisak, pufere, sredstva za bojenje, sredstva za davanje ukusa i/ili aromatične supstance i slično) koji ne reaguju štetno sa aktivnim jedinjenjima ili interferiraju sa njihovom aktivnošću. U nekim izvođenjima, koristi se nosač koji je rastvorljiv u vodi koji je pogodan za intravenozno davanje.

[0128] Kompozicija ili lek, po potrebi, takođe može da sadrži manje količine sredstva za vlaženje ili sredstva za emulgovanje, ili pH sredstva za puferovanje. Kompozicija može da bude tečni rastvor, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa odloženim oslobađanjem, ili prah. Kompozicija takođe može da bude formulisana kao supozitorija, sa tradicionalnim sredstvima za povezivanje i nosačima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može da uključi standardne nosače kao što su farmaceutske klase manitola, laktoza, skrob, magnezijum stearat, polivinil pirolidon, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd.

[0129] Kompozicija il lek može da bude formulisan u skladu sa rutinskim postupcima za prilagođavanje farmaceutske kompozicije za davanje ljudima. Na primer, u nekim izvođenjima, kompozicija za intravenozno davanje je obično rastvor u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Gde je potrebno, kompozicija može da uključi sredstvo za solubilizaciju i lokalni anestetik za ublažavanje bola na mestu injekcije. Generalno, sastojci su obezbeđeni ili zasebno ili su zajedno pomešani u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u termički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kesica što ukazuje na količinu aktivnog sredstva. Gde je kompozicija namenjena za davanje infuzijom, može se izdati sa infuzionom bocom koja sadrži sterilnu vodu farmaceutske čistoće, rastvor soli ili dekstrozu/u vodi. Gde se kompozicija daje injekcijom, može da bude obezbeđena ampula sterilne vode za davanje injekcijom ili rastvor soli tako da sastojci mogu da se mešaju pre davanja.

[0130] Koa što se ovde koristi, termin "terapeutski efikasna količina" se uglavnom određuje na osnovu ukupne količine terapeutskog sredstva koje se nalazi u terapeutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Generalno, terapeutski efikasna količina je dovoljna de bi se postigao značajan koristan efekat kod subjekta (npr., tretiranje, modulacija, lečenje, prevencija i/ili ublažavanje osnovnog oboljenja ili stanja). Na primer, terapeutski efikasna količina može biti količina koja je dovoljna da se postigne željeni terapeutski i/ili profilaktički efekat, kao što je količina koja je dovoljna za modulaciju receptora lizozomalnih enzima ili njihove aktivnosti da bi se na taj način tretirala bolest nakupljanja u lizozomima ili njeni simptomi (npr., smanjenje u ili eliminaciji prisustva ili pojavljivanja "zebra tela" ili vakuolizacije ćelija nakon davanja subjektu kompozicije predmetnog pronalaska). Generalno, količina terapeutskog sredstva (npr., rekombinovani lizozomski enzim) koje se daje subjektu kome je potrebno zavisi od karakteristika subjekta. Takve karakteristike uključuju stanje, ozbiljnost simptoma bolesti, opšte zdravstveno stanje, starosnu dob, pol i telesnu težinu subjekta. Stručnjak koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike brzo može da odredi odgovarajuće doze u zavisnosti od ovih i drugih povezanih faktora. Dodatno, oba i objektivni i subjektivni testovi mogu opciono da se koriste za identifikovanje optimalnih doznih opsega.

[0131] Terapeutski efikasna količina se obično primenuje u režimu doziranja koji može da sadrži višestruke dozne jedinice. Za bilo koji posebni terapeutski protein, terapeutski efikasna količina (i/ili odgovarajuća jedinična doza sa efikasnim režimom doziranja) može da se razlikuje, na primer, u zavisnosti od načina davanja, od kombinacije sa drugim terapeutskim sredstvima. Takođe, specifična terapeutski efikasna količina (i/ili jedinična doza) za bilo kojeg posebnog pacijenta može da zavisi od različitih faktora uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost simptoma poremećaja; aktivnost specifičnog farmaceutskog sredstva koje se koristi; specifične kompozicije koja se koristi; starosnog doba, telesne težine, opšteg zdravstvenog stanja, pola i ishrane pacijenta; vremena davanja, načina davanja, i/ili brzine ekskrecije ili metabolizma specifičnog kombinovanog proteina koji se koristi; trajanja tretmana; i sličnih faktora koji su poznati u medicinskoj oblasti tehnike.

[0132] Dodatni primeri farmaceutskih kompozicija i postupaka davanja su opisani u PCT Objavi WO2011/163649 pod nazivom "Postupci i kompozicije za dostavljanje Iduronat-2-Sulfataze u CNS;" i prijava serijskog br. 61/618,638 pod nazivnom "Subkutano davanje iduronat 2 sulfataze" koja je podneta 30 marta 2012..

[0133] Smatra se da za bilo koji poseban subjekat, specifični dozni režimi treba da budu podešeni tokom vremena prema individualnoj potrebi i profesionalnoj proceni osobe koja daje ili nadgleda davanje terapije zamene enzima i da su ovde predstavljeni dozni opsezi dati samo za primer i nisu namenjeni da ograniče obim ili praksu pronalaska koji se štiti.

PRIMERI

Primer 1: Hvatanje i postupak prečišćavanja rekombinovanih I2S AF

[0134] Ovaj primer pokazuje uprošćeni nishodni postupak prečišćavanja koji može da se koristi za hvatanje i prečišćavanje rekombinovanog I2S koji se prozvodi u medijumu koji je oslobođen od seruma. Primer šeme za prečišćavanje je prikazan na Slici 1.

[0135] Razvijena je ćelijska linija koja stabilno eksprimira enzim iduronat-2-sulfatazu (I2S) i enzim za konverzuju u formilglicin (FGE). Dobijanje i karakterisanje ćelijskih linija iz primera se opisuje u U.S. Provisional Application pod imenom "Ćelije za proizvodnju rekombinovane Iduronat-2-Sulfataze". Ukratko, humana ćelijska linija je konstruisana tako da ko-eksprimira humani I2S protein sa sekvencom aminokiselina koja je prikazana u SEQ ID NO:2 i humanim enzimom za konveziju u formilglicin (FGE) sa sekvencom aminokiselina koja je prikazana u SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO: 2

> Prekursor iduronat 2-sulfataze pune dužine

SEQ ID NO: 5

Prekursor humanog FGE pune dužine:

[0136] Nakon sinteze I2S enzima pune dužine, signalni peptid dužine 25 aminokiselina se uklanja i rastvorljivi zreli I2S enzim se sekretuje iz ćelije.

[0137] Hemijski definisani medijum (oslobođen od seruma/oslobođen od životinjske komponente; AF) se koristi u postupku u bioreaktoru.

[0138] Individualni sakupljeni materijal se redukuje u zapremini i izmenjuje u puferu kroz postupak ultraceđenja/dvostrukog ceđenja. Materijal, koji se naziva neprečišćena masa (UPB), se zamrzava na -50°C po individualnom sakupljanju. Nishodni postupak prečišćavanja počinje sa otapanjem i uzorkovanjem neprečišćene mase i uključuje sukcesivnu inaktivaciju virusa, korake hromatografije za izmenjivanje anjona (Capto Q), hromatografije sa mešanim načinom rada (keramički hidroksiapatit), hromatografije za izmenjivanje katjona (SP Sefaroza) i hromatografije sa hidrofobnom interakcijom (Fenil Sefaroza) nakon čega sledi ceđenje virusa, i konačno koncentrovanje i korak dvostrukog ceđenja. Posebno, ovaj postupak prečišćavanja koristi Q, hidroksiapatit, SP i Fenil hromatografske modalitete. Hromatografija koja sadrži Protein G i Hromatografija ekskluzija veličine koji se tradicionalno koriste u I2S postupku prečišćavanja su uklonjeni. Primeri koraka su predstavljeni u Tabeli 3.

[0139] Prečišćeni I2S protein je procenjen za čistoću peptidnim mapiranjem, SDS-PAGE (Srebro), HPLC sa ekskluzijom veličine. Upotrebom standardnih postupaka su određeni specifična aktivnost enzima, sadržaj formilglicina, sadržaj sijalinske kiseline, mapa glikana, profili naelektrisanja su određeni. Primeri rezultata su prikazani na Tabeli 4.

[0140] Primer peptidne mape u poređenju sa komercijalno dostupnom referencom I2S je prikazana na Slici 2. Primeri rezultata analize SDS-PAGE (Srebro) su prikazani na Slici 3. Obično, upotrebom postupka koji je ovde prikazan, HCP koncentracija lekovite supstance (DS) je <100 ppm, ispunjavajući <100 ppm specifikacije koja je neophodna na mnogim tržištima uključujući SAD. SEC od DS je bio ≥99.5%, takođe ispunjavajući trenutnih >99.3% potreba specifikacije u mnogim tržištima. Primer profila naelektrisanja je prikazan na Slici 4. Primer mape glikana je prikazan na Slici 5. Posebno, mapa glikana prečišćenog I2S uključuje nekoliko grupa frakcija, eluiranje prema rastućoj količini negativnih naelektrisanja koji se dobijaju iz sijalinske kiseline i grupa manoza-6-fosfata, koji redom prestavljaju eluirane, neutralne, mono-, disijalizovane, monofosforilovane, trisijalizovane i hibridne (monosijalizovane i M6P sa kapom (engl. „capped“), tetrasijalizovane i hibridne (disijalizovane i M6P sa kapom) i difosforilovane glikane.

[0141] Zajedno, ovaj primer pokazuje da uprošćeni postupak prečišćavanja na četiri kolone može da se koristi za uspešno prečišćavanje rekombinovanog I2S proizvedenog u medijumu koji nije životinjskog porekla na velikoj skali.

Primer 2: Ispitivanja stabilnosti sakupljenog materijala i virusne inaktivacije kod rekombinovanog I2S AF

[0142] Cilj ovog ispitivanja je procenjivanje efekata vremena zadržavanja temperature i ciklusa zamrzavanja-otapanja na stabilnost izbistrenog sakupljenog rekombinovanog I2S.

[0143] Izbistreni sakupljeni uzorci se skladište na sobnoj temperaturi i 2-8°C do sedam dana i virusno inaktivirani UPB uzroci se drže na sobnoj temperaturi 24 časova. Uzorci iz zamrzavanja-otapanja na izbistrenim sakupljenim materijalima su zamrznuti na -20°C, -50°C, i -80°C i prolaze kroz tri ciklusa zamrzavanja-otapanja. Stabilnost je procenjena upotrebom Western blot, SEC HPLC, i testa za procenjivanje stablinosti.

[0144] I2S-AF sakupljeni materijal je proizveden iz 2D ćelijske linije pomoću CCPD upotrebom B. Braun 20L bioreaktora sa spravom za zadržavanje centrifugiranja i željenom brzinom krvarenja. Za ispitivanje održanja temperature, svaki izbistreni sakupljeni materijal se skladišti na ambijentalnoj temperaturi i 2-8°C i uzorkuje se na odabranim vremenima trajanja. Uzorkovanje količina i vreme zadržavanja je navedeno u Tabeli 5. Uzorci zamrzavanja-otapanja se skladište na -20°C, -50°C, i -80°C i otapaju se upotrebom vodenog kupatila na 25°C.

Tabela 5. Stabilnost tačke zadržavanja izbistrenog sakupljenog materijala

[0145] Korak inaktivacije virusa koji se dešava u koraku neprečišćenog mase pre nanošenja na prvu kolonu. UPB je proizveden koncentrovanjem i puferskom izmenom prečišćenog sakupljanja. UF/DF se izvodi upotrebom Pall 1 sq. ft. Centramate sistema i puferom izmenjuje u 10 mM MES, 155 mM NaCl, pH=6.5. Korak inaktivacije virusa dodaje 1% Tween 80 i 0,3% TnBP, proceđen upotrebom Durapore šriceva sa filterima za svaku vremensku tačku. Uzorci se uzimaju u svakoj vremenskoj tački koja se navodi u Tabeli 6 i koja je zamrznuta na -80°C. Uzorci iz perčišćene tačke zadržavanja sakupljanjem i ispitivanja zamrzavanjem-otapanjem su testirani sa Western blot (4-MU testom) aktivnosti. UPB uzorci iz aktivacije virusa se ispituju za čistoću pomoću SEC HPLC. Aktivnost u tački zadržavanja koja se dobija iz Sakupljanja 12 i 18 na Tabeli 5 ne pokazuje značajne promene do 7 dana skladištenja na ambijentalnoj temperaturi i 2-8°C za oba skupljanja. Nisu uočene zanačajne promene u aktivnosti kod Sakupljanja 12 do 3 ciklusa zamrzavanja-otapanja koje se skladišti na -20°C, -50°C, i -80°C.

Tabela 6. Virusna inaktivacija neprećišćene mase

[0146] Aktivnost i SEC-HPLC za stabilnost inaktivacije virusa u UPB koraku se opisuju na Slikama 6 i 7. Ovo pokazuje da ne postoji nužno pitanje u stabilnosti inaktivacije virusa na osnovu aktivnosti i čistoće tokom 24 časa.

[0147] U sažetku, na osnovu analize stabilnosti koja se ovde opisuje, izbistreni sakupljeni materijal može da se skladišti na 2-8°C (na primer, do 7 dana) bez značajnih promena u kavlitetu sakupljanja. Izbistreni sakupljeni materijalii mogu da prolaze kroz višestruke cikluse zamrzavanja-otapanja i da se skladište na -20°C, - 50°C, i -80°C temperaturama bez značajnih promena u stabilnosti. Na osnovu SEC HPLC rezultata čistoće, inaktivacija virusa u UPB koraku može da se dogodi na ambijentalnoj temperaturi (npr., do 24 sata) bez promena u aktivnosti i čistoći.

Primer 3: Prečišćavanje i analiza konfirmacionog rada sa IL CD Medijumom koji nije životinjskog porekla

[0148] Cilj ovog ispitivanja je da se izvede prečišćavanje uzorka sakupljenog I2S-AF koji je proizveden u perfuziji bez životinjskog porekla upotrebom hemijski definisanog medijuma i da se karakteriše lekovita supstanca.

[0149] Ovo ispitivanje procenjuje postupak učinka prečiščavanja I2S-AF i lekovite supstance (DS) koja je proizvedena iz hemijski definisanog medijuma bioreaktora.

Ćelijska kultura

[0150] I2S-AF materijal je proizveden iz 2D ćelijske linije koja eksprimira I2S i enzim za generisanje formilglicina (FGE)) kao što se opisuje u Primeru 1. Materijal je proizveden u CCPD u 1L Das Gip bioreaktoru sa spin filterom upotrebom hemijski definisanog medijuma koji je oslobođen seruma. Individualne kesice od svakog prečišćenog sakupljanja (HI-21) su primljene zamrznute na - 20°C i otopljene na 2-8°C preko noći. Jednake zapremine iz svakog izbistrenog sakupljenog materijala su uzorkovane da bi predstavile ukupni uzorak sakupljanja, zatim je proceđene kroz pore od 0.2µm i koncentrovane upotrebom 30 kD Pall Omega Centramate kasete sa ukupnom površinom membrane 1 ft2. Neprečišćena masa (UPB) je proceđena kroz pore prečnika od 0,2 um i zamrznuta pre upotrebe.

Prečišćavanje

[0151] Primeri specifikacija kolone i nanošenja su opisani u Tabeli 7. Q Sepharose je naneta sa ciljanim titrom na 3 g/L. Sledeće kolone su napunjene na 100% sa ispiranjem od prethodne kolone i materijal nije uklonjen.

[0152] Jedno pokretanje prečišćavanja se izvodi upotrebom UPB iz uzorkovanja sakupljanja 1 kroz 21 iz bioreaktora. UPB je otopljen na 2-8°C preko noći i uzorkovan u jednakim zapreminama iz svakog sakupljanja.

[0153] Postupci koraka individualne kolone i formulacije pufera mogu da se nađu u Tabelama 8-11. Uzorkovani UPB se cedi upotrebom sistema filtera sistema u balonu sa prečnikom pora 0.2 µm, koji je podešen do pH 6.5 upotrebom 1 M natrijum acetata, i provodljivosti koja je prilagođena do 16 mS/cm sa 5 M natrijum hloridom pre nanošenja na Q Sepharose FF kolonu. Eluiranje Q Sefaroze je podešeno do 0.001 M NaP04upotrebom 0.25M NaP04, pH 5.5 i proceđeno sa PES bocom koja ima filter na površini prečnika 0.22 µm pre nanošenja na HA kolonu. Provodljivost HA ispiranja je podešena do 1.55 M NaCl sa 5 M NaCl i pH koji je podešen do pH 5.5 sa 1 M natrijum acetatom. Vreme podešavanja je približno 1 sat. Podešeni uzorak je proceđen sa PES balonom koji ima filter na površini prečnika 0.22 µm pre nanošenja na kolonu od fenil sefaroze. Fenil eluiranje je koncetrovano 4X i dvostruko proceđeno 6X u 0.02 M NaP04, 0.137 M NaCl, pH 6.0. Dvostruko proceđeni proizvod je podešen do 2.0 g/L i formulisan sa 0.2% Polisorbatom 20 da bi se dobila ekvivalentna lekovita supstanca. Ekivalentni uzorak od H1-20 DS se dobija za dodatnu karakterizaciju.

Tabela 8. Primeri detalja postupka Q Sefarozne FF Hromatografije

Tabela 9. Primeri detalja postupka za HA Hromatografiju

Tabela 10. Detalji postupka primera za Fenil Sefaroznu Hromatografiju

Tabela 11. Primer diafiltracije ukupnog fenil eluata

Čistoća u postupku upotrebom HCP sa ELISA

[0154] Tabela 12 opisuje HOP uklanjanje u postupku (engl. „in-process“) za svaki korak. Rezultati HCP u postupku su visoki sa većinom uklanjanja na HA koraku.

Tabela 12. HCP uklanjanje u postupku

Karakterizacija lekovite supstance

[0155] Primeri rezultata oslobađanja partije lekovite supstance su navedeni u Tabeli 13. Kao što se može videti, lekovita supstanca je imala visoku specifičnu aktivnost i % FG u prečišćenom materijalu. Primer karakterizacije svojstva leka je prikazan na Tabeli 13. HCP je smanjen od 1,870 ng/mg do 372 ng/mg na konačnom UF/DF koraku.

Tabela 13. Primer oslobađanja partije lekovite supstance

Primer 4. Fizičkohemijska i biološka karakterizacija prečišćenog rekombinovanog I2S enzima

[0156] Svrha ovog primera je izvođenje detaljne karakterizacije rekombinovanog I2S proteina koji je prečišćen upotrebom postupaka koji su opisani gore u tekstu.

[0157] Za eksperiment, rekombinovani I2S protein se dobija upotrebom 2D i 4D humanih ćelijskih linija, kroz dve odvojene reakcije ćelijskih kultura koje su oslobođene od seruma. Uzorci su sakupljeni prečišćeni upotrebom gore opisanih postupaka. Prečišćeni I2S enzim se analizira sa SDS-PAGE, i tretiran srebrnim bojenjem za vizuelizaciju. Primeri rezultata su prikazani na Slici 8. Kao što se može videti na Slici 8, prečišćeni rekombinovani I2S protein upotrebom ovde opisanih postupaka predstavlja uporedive uzorke traka u poređenju sa I2S referentnim uzorkom koji je prečišćen upotrebom standardnog postupka.

Peptidna mapa

[0158] Rekombinovani I2S protein koji je proizveden od I2S-AF 2D ćelijske linije je prečišćen upotrebom gore opisanih postupaka. Prečišćeni rekombinovani I2S i uzorak referentnog humanog I2S svaki je podvrgnut proteolitičkoj digestiji i ispitan HPLC analizom. Primer peptidne mape u poređenju sa referentnom I2S je prikazan na Slici 9.

Procenat konverzije formilglicina

[0159] Mapiranje peptida može da se koristi za određivanje procenta koverzije u FGly. Aktivacija I2S zahteva Cistein (koji odgovara položaju 59 u zrelom humanom I2S) da konverzije u formilglicin pomoću enzima za konverziju u formilglicin (FGE) kao što se prikazuje u tekstu ispod:

Prema tome, procenat konverzije formilglicina (%FG) može da se izračuna upotrebom sledeće formule:

Broj aktivnih I2S molekula

ro u upn a tvn nea tvn moe ua

[0160] Na primer 50% FG znači da je pola prečišćenog rekombinovanog I2S je enzimski inaktivno bez bilo kojeg terapeutskog efekta.

[0161] Mapiranje peptida se korsti za računanje %FG. Ukratko, prečišćeni rekombinovani I2S protein se digestijom razlaže na kratke peptide upotrebom proteaze (npr., tripsin ili himotripsin). Kratki peptidi se razdvajaju i karakterišu upotrebom HPLC. Peptid koji sadrži položaj koji odgovara položaju 59 u zrelom humanom I2S se karakteriše da bi se odredilo da li je Cys na položaju 59 konvertovan u FGly u poređenju sa kontrolom (npr.,I2S protein bez Fgly konverzije ili I2S protein sa 100% FGly konverzijom). Izračunata je količina peptida koji sadrže FGly (koji odgovara broju aktivnih I2S molekula) i ukupna količina peptida sa oba FGly i Cys (koji odgovaraju broju ukupnih I2S molekula) može da se odredi na osnovu površine frakcija i odnosa %FG. Primeri rezultata su prikazani na Tabeli 14.

Mapa glikana - Manoza-6-Fosfat i sadržaj sijalinske kiseline

[0162] Određuje se kompozicija glikana i sijalinske kiseline prečišćenog rekombinovanog I2S proteina. Izvedena je kvantifikacija kompozicije glikana, upotrebom anjon izmenjivačke hromatografije da bi se proizvela mapa glikana. Kao što je opisano u tekstu ispod, mapa glikana rekombinovanog prečišćenog I2S pod ovde opisanim uslovima, se sastoji iz sedam grupa frakcija, ispiranja prema rastućoj količini negativnih naelektrisanja, barem delom izvedenog iz sijalinske kiseline i manoza-6-fosfatnih glikoformi koje se dobijaju nakon enzimske digestije. Ukratko, prečišćeni rekombinovani I2S iz ćelijske kulture koja je oslobođena seruma (I2S-AF 2D bez seruma i I2S-AF 4D bez seruma) i referentni rekombinovani I2S, tretirani su sa ili (1) prečišćenim neuraminidaza enzimom (izolovanim iz Arthrobacter Ureafaciens (10 mU/µL), Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat.# 269611 (1U/100 µL)) za uklanjanje njihovih grupa sijalinske kiseline, (2) alkalinom fosfatazom 2 dva sata na 3761°C za potpuno oslobađanje manoza-6-fosfatnih grupa, (3) alkalnom fosfatazom neuraminidazom, ili (4) bez tretmana. Svaka enzimska digestija je analizirana sa Hromatografijom za izmenjivanje anjona visoke performanse sa pulsiranom Amperometrijskom Detekcijom (HPAE-PAD) upotrebom CarboPac PA1 Analitičke kolone koja je opremljena sa Dionex CarboPac PA1 Guard Kolonom. Serije standarda sijalinske kiseline i manoza-6-fosfata u opsegu od 0,4 do 2,0 nmola su pokrenuti za svaki test. Izokratski postupak upotrebom 48 mM natrijum acetata u 100 mM natrijum hidroksidu pokrenut je za najamanje 15 minuta na brzini protoka od 1,0 mL/min na koloni u ambijentalnoj temperaturi da bi se eluirao svaka frakcija. Podaci dobijeni iz svakog individualnog nanošenja, za oba I2S-AF i referentne I2S uzorke, se svaki kombinuju u jednu hromatografiju da bi se predstavila mapa glikana redom za svaki rekombinovani protein. Kao što je naznačeno na Slici 10, mapa glikana za I2S koji se prečišćava iz medijuma bez seruma pokazuje reprezentativne frakcije eluiranja (redom prema ispiranju) koji se sastoje iz neutralnih, mono-, disijalizovanih, monofosforilovanih, trisijlizovanih i hibridnih (monosijalizovanog i manoza-6-fosfata sa kapom), tetrasijalizovanih i hibridnih (disijalizovanog i manoza-6-fosfata sa kapom) i difosforilovanih glikana. Primeri mapa glikana su prikazani na Slici 10.

[0163] Prosečan sadržaj sijalinske kiseline (molovi sijalinske kiseline po molu proteina) u svakom rekombinovanom I2S uzorku je izračunat iz analize linearne regresije iz standarda sijalinske kiseline. Svako pokretanje hromatograma je vizuelizovano upotrebom PeakNet 6 Softvera. Standardi sijalinske kiseline i sijalinske kiseline koje su oslobođene iz test kontrole rekombinovanog I2S i test uzoraka se pojavljuju kao jedna frakcija. Količina sijalinske kiseline (nmoli) za I2S je izračunata kao sirova vrednost upotrebom sledeće jednačine:

Gde C je koncentracija proteina (u mg/ml) uzorka ili test kontrole rekombinovanog I2S. Korigovana vrednost sijalinske kiseline kao molovi sijalinske kiseline po molu proteina za svaki uzorak koji se ispituje je izračunata upotrebom sledeće formule:

Korigovana S.A

Neobrađena vrednost Sijalinske kiseline kontrolnog testa idursulfaze

[0164] Primeri podataka koji ukazuju na sadržaj sijalinske kiseline na rekombinovanom I2S koji je prečišćen iz I2S-AF 2D ili 4D ćelijskih linija su prikazani na Tabeli 14.

Tabela 14: Primeri karakteristika I2S prečišćenog iz ćelijske kulture bez seruma

Specifična aktivnost

[0165] Specifična aktivnost rekombinovanog I2S enzima koji je prečišćen upotrebom ovde opisanih postupaka je analizirana upotrebom testa in vitro oslobađanja sulfata ili testa 4-MUF.

Test In vitro oslobađanja sulfata

[0166] Test in vitro aktivnosti oslobađanja sulfata se izvodi upotrebom heparin diasaharida kao supstrata. Posebno, ovim testom se meri sposobnost I2S da oslobodi jone sulfata iz prirodnog izvedenog supstrata, heparin diasaharida. Oslobođeni sulfat može da bude kavantifikovan jonskom hromatografijom koja je opremljena sa detektorom provodljivosti. Ukratko, uzorci su prvo puferom izmenjeni do 10 mM Na acetata, pH 6 to da bi se uklonila inhibicija fosfatnim jonima u puferu formulacije. Uzorci su zatim razblaženi do 0,075 mg/ml sa reakcionim puferom (10 mM Na acetatom, pH 4,4) i inkubirani 2 sata na 37°C sa heparin disaharidom na odnosu enzima prema supstratu od 0,3 µg I2S/100 µg supstrata u 30 µL zapremine reakcije. Reakcija je zatim prekinuta zagrevanjem uzoraka na 100°C 3 min. Analiza se izvodi upotrebom Dionex IonPac AS18 analitičke kolone sa IonPac AG18 guard kolonom. Izokratksi postupaka se koristi sa 30 mM kalijum hidroksidom na 1,0 mL/min u trajanju od 15 minuta. Količina sulfata koji je oslobođen iz I2S uzorka je izračunata pomoću analize linearne regresije standarda sulfata u opsegu od 1,7 do 16,0 nmola. Prijavljena vrednost je izražena kao Jedinice po mg proteina, pri čemu se 1 jedinica definiše kao 1 µmolovi oslobađanja sulfata po satu i koncentracija proteina je određena merenjima A280. Primeri rezultata su prikazani u Tabeli 14.

4-MUF test

[0167] Specifična aktivnost prečišćenog rekombinovanog I2S enzima može takođe da se analizira upotrebom 4-MUF testa zasnovanog na fluorescenciji. Ukratko, test merihidrolizu I2S supstrata 4-metilumbeliferil-sulfata (4-MUF-SO4). Nakon isecanja 4-MUF-SO4 supstrata sa I2S, molekul se konvertuje u sulfat i prirodno fluorescentni 4-metilumbeliferon (4-MUF). Kao rezultat, aktivnost I2S enzima može da se odredi procenjivanjem sveukupne promene u fluorescentnom signalu tokom vremena. Za ovaj eksperiment, prečišćeni I2S enzim se inkubira sa rastvorom 4-metilumbeliferilsulfata (4-MUF-SO4), kalijumova so, Sigma Cat. # M-7133). Kalibracija testa se izvodi upotrebom serija kontrolnih referentnih uzoraka, upotrebom komercijalno dostupnog I2S enzima sa razblažanjem 1:100, 1:200 i 1:20,000 iz štoka rastvora. Enzimski test je pokrenut na 37°C i analiziran upotrebom upotrebom kalibrisanog fluorometra. Korićenje fluorescentnih vrednosti dobijenih za svaki referentni standard, procenat koeficijenta varijanse je određen upotrebom sledeće jednačine:

Standardna deviacia neobrađenih vrednosti fluorescencie N=3

Srednja vrednost fluorescencije

[0168] Procenat CV vrednosti se zatim koristi za računanje korigovane srednje vrednosti fluorescencije za svaki uzorak, da bi se odredila aktivnost enzima koja može da se prijavi, koja je izražena u mU/mL upotrebom sledeće formule:

CFU = Negativna korigovana srednja vrednost fluorescencije

DF – Faktor razblaženja

[0169] Jedna milijedinica aktivnosti je količina enzima koja je neophodna da bi se konvertovao 1 nanomol 4-metilumbeliferil-sulfata do 4-metilumbeliferona u 1 minutu na 37°C.

Profil naelektrisanja

[0170] Za ovaj eksperiment, raspored naelektrisanja za svaki prečišćeni rekombinovani I2S se određuje jakom hromatografijom za izmenjivanje anjona (SAX), sistemom tečne hromatografije viskoke perfomanse (HPLC). Postupak razdvaja rekombinovane I2S varijante unutar uzorka, na osnovu razlika u površinom naelektrisanju. Na pH 8.00, negativno naelektrisane vrste se apsorbuju na fiskirano pozitivno naelektrisanje u SAX koloni. Gradijent rastuće jonske jačine se koristi za eluiranje svake proteinske vrste u odnosu na jačinu njihove jonske interakcije sa kolonom. Sto mikrograma prečišćenog I2S, izolovanog iz 2D ćelijske linije pod uslovima rasta bez prisustva seruma ili referentnog rekombinovanog I2S enzima, se dodaje na Amersham Biosciences Mini Q PE (4,6 x 50 mm) kolonu koja se drži na ambijentalnog temperaturi i ekvilibrisan je na 20 mM Tris-HCl, pH 8,00. Gradient eluiranja je napravljen na brzini protoka od 0,80 mL/min, upotrebom mobilne faze 20 mM Tris-HCl, 1,0 M natrijum hlorid, pH 8,00. Koncentracija proteina je kontinuirano određena tokom pokretanja, merenjem apsorbancije svetlosti na eluirani uzorak na talasnoj dužini od 280 nm. Primeri rezultata pokazuju profile naelektrisanja koji su uočeni za rekombinovani I2S koji je prečišćen iz 2D i 4D ćelijskih linija su prikazani na Slici 11.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži prečišćenu rekombinovanu iduronat-2-sulfatazu (I2S) koja ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1, pri čemu prečišćena rekombinovana I2S sadrži najmanje 70% konverzije cisteinskog ostatka koji odgovara Cys59 SEQ ID NO:1 u Cα-formilglicin (FGly), i gde prečišćena rekombinovana I2S sadrži manje od 150 ng/mg proteina ćelije domaćina (HCP).

2. Kompozicija prema zahtevu 1, u kome prečišćeni rekombinovani I2S protein:

i. sadrži najmanje 10% bis-fosforilovanih oligosaharida po molekulu;

ii. sadrži u proseku najmanje 16 sijalinskih kiselina po molekulu;

iii. se karakteriše mapom glikana koja sadrži sedam ili manje grupa frakcija koje se biraju iz grupa frakcija koje ukazuju na neutralni (grupa frakcija 1), mono-sijalizovani (grupa frakcija 2), disijalizovani (grupa frakcija 3), monofosforilovani (grupa frakcija 4), tri-sijalizovani (grupa frakcija 5), tetra-sijalizovani (grupa frakcija 6), ili difosforilovani (grupa frakcija 7) I2S protein;

iv. ima specifičnu aktivnost od najmanje 40 U/mg kao što je određeno testom in vitro aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata; ili

v. ima specifičnu aktivnost od najmanje 20 U/mg kao što je određeno testom in vitro koverzije 4-MUF-SO4 u 4-MUF.

3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein sadrži manje od 100 ng/mg HCP.

4. Kompozicija prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein sadrži manje od 80 ng/mg HCP.

5. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S sadrži najmanje 50% bis-fosforilovanih oligosaharida po molekulu.

6. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost od najmanje 50 U/mg kao što je određeno testom in vitro aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata.

7. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost od najmanje 60 U/mg kao što je određeno testom in vitro aktivnosti oslobađanja sulfata upotrebom heparin disaharida kao supstrata.

8. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost od najmanje 30 U/mg kao što je određeno testom in vitro konverzije 4-MUF-SO4 u 4-MUF.

9. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost od najmanje 40 U/mg kao što je određeno testom in vitro konverzije 4-MUF-SO4 u 4-MUF.

10. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost od najmanje 50 U/mg kao što je određeno testom in vitro konverzije 4-MUF-SO4 u 4-MUF.

11. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S protein ima specifičnu aktivnost od najmanje 60 U/mg kao što je određeno testom in vitro konverzije 4-MUF-SO4 u 4-MUF.

12. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S sadrži najmanje 75% konverzije cisteinskog ostatka koji odgovara Cys59 SEQ ID NO:1 u Cα-formilglicin (FGly).

13. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva, gde prečišćeni rekombinovani I2S sadrži sadrži najmanje 85% konverzije cisteinskog ostatka koji odgovara Cys59 SEQ ID NO:1 u Cα-formilglicin (FGly).

14. Kompozicija prema bilo kojim od prethodnih zahteva 1-13, za upotrebu u lečenju Hanterovog sindroma.