TR201815811T4 - İduronat-2-sülfataz'ın saflaştırılması. - Google Patents

İduronat-2-sülfataz'ın saflaştırılması. Download PDF

Info

Publication number
TR201815811T4
TR201815811T4 TR2018/15811T TR201815811T TR201815811T4 TR 201815811 T4 TR201815811 T4 TR 201815811T4 TR 2018/15811 T TR2018/15811 T TR 2018/15811T TR 201815811 T TR201815811 T TR 201815811T TR 201815811 T4 TR201815811 T4 TR 201815811T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
protein
recombinant
approximately
izs
column
Prior art date
Application number
TR2018/15811T
Other languages
English (en)
Inventor
Nichols Dave
Original Assignee
Shire Human Genetic Therapies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49778401&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201815811(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Shire Human Genetic Therapies filed Critical Shire Human Genetic Therapies
Publication of TR201815811T4 publication Critical patent/TR201815811T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/095—Oxytocins; Vasopressins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, diğerlerinin yanı sıra, enzim replasman tedavisi için rekombinant olarak üretilen I2S proteinini saflaştırmaya yönelik geliştirilmiş yöntemler sunar. Mevcut buluş kısmen, rekombinant I2S proteininin, dört kromatografi kolonu kadar az sayıda kolon içeren bir işlem kullanılarak I2S içeren hücre kültürü ortamı gibi işlenmemiş biyolojik materyallerden saflaştırılabileceğine dair şaşırtıcı keşfe dayanır.

Description

TARIFNAME IDURONAT-2-SÜLFATAZ'IN SAFLASTIRILMASI BULUSUN ARKAPLANI Mukopolisakkaridoz tip II (MPS II, Hunter sendromu), iduronat- 2-sülfataz enziminin (IZS) eksikliginden kaynaklanan X- kromozomuna bagli resesif geçen bir lizozomal depo bozuklugudir. dermatan sülfat ve heparan sülfattan ayirir. Hunter sendromu olan hastalarda eksik veya defektif 128 enziminden dolayi, GAG, çesitli hücre tiplerinin lizozomlarinda ilerledikçe birikerek hücresel angorjman, organomegali, doku tahribati ve organ sistemi bozukluguna neden olur. Genel olarak, Hunter sendromu olan kisilerdeki fiziksel belirtiler hem somatik hem de nöronal semptomlari içerir. Örnegin, bazi Hunter sendromu vakalarinda, merkezi sinir sistemi tutulumu gelisme geriliklerine ve sinir sistemi sorunlarina yol açar. Hunter Sendromunun nöronal olmayan semptomlari genellikle dogumda bulunmazken, zamanla GAG'in Vücut hücrelerindeki ilerleyici birikimi, vücudun periferal dokulari üzerinde belirgin bir etkiye sahip olabilir. Periferal dokudaki GAG birikimi, bir hastanin yüz özelliklerinde belirgin bir irilige yol açar ve bir Hunter hastasinin belirleyici özellikleri olan belirgin alin, düzlestirilmis köprü ve genislemis dilden sorumludur. Benzer sekilde, GAG birikimi vücudun organ sistemlerini olumsuz yönde etkileyebilmektedir. Baslangiçta kalbin, akcigerlerin ve hava yollarinin duvarinin kalinlasmasi ve karaciger, dalak ve böbreklerin anormal genislemesi seklinde ortaya çikan bu büyük degisiklikler, sonuç olarak yaygin katastrofik organ yetmezligine yol açabilmektedir. Sonuç olarak, Hunter sendromu her zaman siddetli, ilerleyici ve yasami sinirlayicidir. Enzim. replasman tedavisi (ERT), Hunter sendromunun (MP8 II) tedavisi için onaylanmis bir tedavidir ve Hunter sendromu olan hastalara egzojen replasman IZS enziminin uygulanmasini içerir. Muenzer ve dig., 2007, cy559'da translasyon sonrasi modifikasyon ile rekombinant bir 125 formunu açiklar. Söz konusu belge, enzimatik aktivite için gerekli olan cys59'un formilglisin için translasyon sonrasi modifikasyon derecesinin yaklasik olarak %50 oldugunu açiklar. BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, SEQ ID IMM l amino asit sekansina sahip olan saflastirilmis rekombinant iduronat-2-sülfataz (IZS) içeren bir bilesim sunmakta olup burada saflastirilmis rekombinant 128, SEQ formilglisine (FGly) en az %70 dönüsümünü içerir ve burada saflastirilmis rekombinant 128, 150 ng/mg'dan daha az Konak Hücre Proteini (HCP) içerir. Mevcut bulus ayrica Hunter sendromunun tedavisinde kullanilmak üzere bulusa ait bir bilesim sunar. TARIFNAMENIN ÖZETI Mevcut tarifname, enzim replasman tedavisi için rekombinant olarak üretilen IZS proteinini saflastirmaya yönelik gelistirilmis yöntemler sunar. Mevcut bulus kismen, rekombinant içeren bir islem kullanilarak 128 içeren hücre kültürü ortami gibi islenmemis biyolojik materyallerden saflastirilabilecegine dair sasirtici kesfe dayanir. Enzini replasman tedavisi için rekombinant IZS'nin onaylanmis mevcut saflastirma islemi 6 kromatografi kolonu içerir. Örnekler bölümünde tarif edilen sekilde, mevcut tarifnameye uygun olan dört kolonlu bir islem kullanilarak saflastirilan rekombinant IZS proteinleri ABD ve diger birçok ülkede pazarlama safligi gerekliliklerine uygundur. Ayrica, mevcut bulusa uygun olan rekombinant IZS enzimi, I2S enzimi aktivitesi için önemli olan yüksek oranda (örnegin rekombinant 128 proteininin biyoyararlanimini ve/veya lizozomal hedeflenmesini kolaylastirabilen siyalik asit içerigi ve glikan haritasi gibi belirgin özelliklere sahiptir. Bu nedenle mevcut tarifname, rekombinant I2S proteinini saflastirmak için etkili, daha ucuz ve daha hizli bir islem sunar. Mevcut tarifname, serumsuz ortamda üretilen rekombinant IZS proteinini saflastirmada özellikle yararlidir. Dolayisiyla, bir yönüyle mevcut tarifname, bir veya daha fazla anyon degistirme kromatografisi, katyon degistirme kromatografisi, karisik mod kromatografisi ve hidrofobik etkilesim kromatografisine dayanan bir islem kullanilarak saf olmayan bir preparasyondan rekombinant IZS proteininin saflastirilmasina yönelik bir yöntemi tarif eder. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye uygun olan yöntem 6'dan daha az (örnegin 5'ten az, 4'ten az veya 3'ten az) kromatografi asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye uygun olan bir yöntem 2, 3, 4 veya 5 kromatografi asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye uygun olan yöntem 4 kromatografi asamasini içerir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis rekombinant IZS proteini, 100 ng/mg'dan daha az Konak Hücre Proteini (HCP) (örnegin 90 ng/mg'dan daha az HCP, 80 ng/mg'dan daha az HCP, 70 ng/mg'dan daha az HCP, 60 ng/mg'dan daha az HCP, 50 ng/mg'dan daha az HCP, 40 ng/mg'dan daha az HCP, 30 ng/mg'dan daha az HCP, 20 ng/mg'dan daha az HCP, 10 ng/mg'dan daha az HCP) Bazi somut gösterimlerde, uygun bir anyon degistirme kromatografisi, Q kromatografisidir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir anyon degistirme kromatografisi, SP kromatografisidir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir karisik mod kromatografisi, hidroksiapatit (HA) kromatografisidir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir hidrofobik etkilesim kromatografisi, fenil kromatografisidir. Anyon degistirme kromatografisi (örnegin 0 kolonu), katyon degistirme kromatografisi (örnegin SP kolonu), karisik mod kromatografisi (örnegin HA kolonu) ve hidrofobik etkilesim kromatografisihin (örnegin fenil kolonu) herhangi bir sirada uygulanabilecegi düsünülmüstür. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye uygun olan bir yöntem, anyon degistirme kromatografisi (örnegin 0 kolonu), katyon degistirme kromatografisi (örnegin SP kolonu), karisik mod kromatografisi (örnegin EU& kolonu) `ve hidrofobik etkilesini kromatografisini (örnegin fenil kolonu) bu sirayla uygular. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, anyon degistirme kromatografisi kolonuna (örnegin Q kolonu) yüklenmeden önce yaklasik pH 5.0- 17, 18, 19 veya 20 mS/cm) ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, pH, 1M sodyum asetat kullanilarak ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, iletkenlik, SM sodyum klorür kullanilarak ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, yükleme yapildiktan sonra, anyon degistirme kromatografisi kolonu, yaklasik 5.0-7.0 pH'a konsantrasyonunu içeren bir yikama tamponu kullanilarak yikanir. Bazi somut gösterimlerde, anyon degistirme kromatografisi kolonu, lineer bir tuz (örnegin NaCl) gradyani içeren bir elüsyon tamponu kullanilarak elüte edilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir lineer NaCl gradyani, yaklasik 0-500 mM NaCl (örnegin yaklasik arasindaki bir araligi içerir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, katyon degistirme kromatografisi kolonuna (örnegin SP kolonu) yüklenmeden önce yaklasik 1 mS/cm ve 20 nß/cm arasinda (örnegin yaklasik 1 nß/cm ve 15 Hß/cm arasinda, yaklasik 1 mS/cm ve 10 mS/cm arasinda, yaklasik 1 mS/cm ve 8 InS/cni arasinda, yaklasik 1 InS/CHI ve 6 InS/cni arasinda, yaklasik 1 mS/cm ve 4 mS/cm arasinda, yaklasik 2 mS/cm ve 4 mS/cm arasinda) degisen iletkenlige ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, katyon degistirme kromatografisi kolonuna (örnegin SP kolonu) yüklenmeden önce n yaklasik 2 mS/cm ve 4 mS/cm arasinda (örnegin 2, 2.5, 3, 3.5 veya 4 mS/cm) degisen iletkenlige ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, iletkenlik, elüatin yaklasik l-2:l (örnegin lzl, 1.1:l, l.2:l, 1.3:l, l.4:, anyon degistirme kromatografisi kolonundan seyreltilmesiyle ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, iletkenlik dialfiltrasyon ile ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, katyon degistirme kromatografisi kolonu, yaklasik 5.0-6.5'lik (örnegin yaklasik .0, 5.5, 6.0 veya 6.5) bir pH'da gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, katyon degistirme kromatografisi kolonu, yaklasik arasinda degisen fosfat (örnegin NaPO4) konsantrasyonunu içeren bir tampon ile gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun 6.5). Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, karisik mod kromatografisi kolonuna (örnegin HA kolonu) yüklenmeden önce yaklasik 0.001 M ila M) arasinda degisen fosfat (örnegin NaPO4) konsantrasyonunu ve ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, yükleme yapildiktan sonra, karisik mod kromatografisi kolonu (örnegin HA kolonu), nötr veya buna yakin pH'da fosfat (örnegin 1-10 mM sodyum veya potasyum fosfat) içeren bir yikama tamponu ile yikanir. Bazi somut gösterimlerde, yüklü karisik mod kromatografisi kolonu (örnegin HA kolonu), yaklasik 10-20 mM (örnegin yaklasik 10-18 mM, arasinda degisen bir fosfat konsantrasyonuna sahip bir yikama tamponu ile yikanir. Bazi somut gösterimlerde, yüklü karisik mod kromatografisi fazla bir fosfat konsantrasyonuna sahip bir yikama tamponu ile yikanir. Bazi somut gösterimlerde, bir karisik mod kromatografisi kolonundan (örnegin HA kolonu) elüsyon, bir gradyan fosfat tamponu ile gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir elüsyon tamponu, yaklasik olarak 1-400 fosfat gradyanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, HA kolonundan elüsyon, elüsyon tamponu içindeki fosfat konsantrasyonunun asamali arttirilmasiyla gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, asamali elüsyon tamponlari, 10 mM, 20 konsantrasyonuna sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, bir karisik mod kromatografisi kolonundan (örnegin HA kolonu) elüsyon, yaklasik 50 mM ila 150 mM arasinda degisen bir fosfat (örnegin sodyum fosfat) konsantrasyonuna sahip (örnegin 50 mM, ve bunun kombinasyonundan seçilen) bir elüsyon tamponu ile gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, hidrofobik etkilesim kromatografisi kolonuna (örnegin fenil kolonu) yüklenmeden önce yaklasik 4.5- M NaCl) arasinda degisen tuz (örnegin NaCl) konsantrasyonuna ayarlanir. Bazi somut gösterimlerde, yükleme yapildiktan sonra, hidrofobik. etkilesim. kromatografisi kolonu, yaklasik. 4.5-6.0 arasinda degisen tuz (örnegin NaCl) konsantrasyonunu içeren bir yikama tamponu kullanilarak yikanir. Bazi somut gösterimlerde, hidrofobik. etkilesim. kromatografisi kolonu, yaklasik. 4.5-6.0 mM ila yaklasik 0.5 mM (örnegin yaklasik 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M *veya konsantrasyonunu içeren bir elüsyon tamponu kullanilarak elüte Bazi somut gösterimlerde, anyon degistirme kromatografisi, katyon degistirme kromatografisi, karisik mod kromatografisi ve hidrofobik etkilesim kromatografisi kolonundan her biri 14-25 cm 16-18 cm) arasinda degisen bir yükseklige sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, anyon degistirme kromatografisi, katyon degistirme kromatografisi, karisik mod kromatografisi ve hidrofobik etkilesim kromatografisi kolonundan her biri yaklasik bir yükseklige sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye uygun olan yöntem, saf olmayan preparasyonun birinci kromatografi kolonuna yüklenmesi öncesinde bir Viral inaktivasyon asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, Viral inaktivasyon asamasi, saf olmayan preparasyona bir deterjan eklenmesini içerir. Bazi somut gösterimlerde, söz konusu tarifnameye uygun olan yöntem ayrica sonuncu Kromatografi kolonundan sonra bir Viral çikarma asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, tarifnameye ait bir yöntem ayrica bir ultrafiltrasyon ve/Veya dialfiltrasyon asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, ultrafiltrasyon ve/Veya dialfiltrasyon asamasi, saflastirilmis rekombinant 128 proteininin bir ilaç formülasyon tamponuna degistirilmesini Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulus, SEQ ID NO: 1 amino asit sekansina sahip rekombinant bir 128 proteinini saflastirmak için kullanilir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulus, SEQ 1D NO: 1 ile özdes bir amino asit sekansina sahip rekombinant bir 128 proteinini saflastirmak için kullanilir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifname, serumsuz bir ortamda süspansiyon halinde kültürlenmis memeli hücreleri tarafindan üretilen rekombinant bir 128 proteinini saflastirmak için kullanilir. Bazi somut gösterimlerde, tarifnameye uygun olan serumsuz bir ortam, hayvandan türetilmis bilesenlerden yoksundur. Bazi somut gösterimlerde, tarifnameye uygun olan serumsuz bir ortam, kimyasal olarak tanimlanmis bir ortamdir. Bazi somut gösterimlerde, memeli hücreleri bir biyoreaktörde kültürlenir. Bazi somut gösterimlerde, memeli hücreleri, rekombinant birlikte eksprese eder. Bazi somut gösterimlerde, memeli hücreleri insan hücreleridir. Bazi somut gösterimlerde, tarifnameye ait bir yöntemde kullanilan saf olmayan bir preparasyon, memeli hücrelerinden salgilanan rekombinant 128 proteinini içeren serumsuz ortamdan hazirlanir. Bazi somut gösterimlerde, tarifnameye ait bir yöntemde kullanilan saf olmayan bir preparasyon, dondurulmus ortam preparasyonundan çözülür. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant 128 proteini, ortalama olarak, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant 128 veya 22 siyalik asit içerir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant IZS proteini, insan IZS'deki (SEQ formilglisine (FGly) en az %70 (örnegin, en az yaklasik %77, Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant 128 proteini, insan IZS'deki (SEQ formilglisine (FGly) büyük ölçüde %lOO dönüsümüne sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant 128 proteini, substrat olarak heparin disakkarit kullanilan in Ldtro bir sülfat salim aktivitesi analizi ile U/mg, 70 U/mg, 80 U/mg, 90 U/mg veya 100 U/mg'lik spesifik bir aktiviteye sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa tarifnameye olan saflastirilmis bir rekombinant I2S proteini, in vitro bir alim daha fazla hücresel alim ile karakterize edilir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant IZS proteini, yedi adet pik grubunu içeren bir glikan haritasi ile karakterize edilmekte olup söz konusu gruplar sirasiyla asagidakilerin göstergesidir: nötr (pik grubu 1), mono-siyale (pik grubu 2), di-siyale (pik grubu 3), monofosforile (pik grubu 4), tri-siyale (pik grubu 5), tetra-siyale (pik grubu 6) ve difosforile (pik grubu 7). Bazi somut gösterimlerde, glikan haritasi bir nöraminidaz parçalamasinin ardindan olusturulur. Diger somut gösterimlerde, glikan haritasi bir alkalen fosfataz parçalamasinin ardindan olusturulur. Digerlerinin yani sira, mevcut bulus, burada tarif edilen sekilde saflastirilmis rekombinant IZS proteini ve bunu içeren farmasötik› bilesimleri ya da formülasyonu sunar. Bazi somut gösterimlerde, bir formülasyon, intravenöz, subkütan ve/veya intratekal uygulama için formüle edilir. Mevcut tarifname ayrica Hunter sendromu tedavisine ihtiyaç duyan bir hastaya saflastirilmis bir rekombinant IZS, bunu içeren farmasötik bilesim› veya formülasyonun uygulanmasini içeren tedavi yöntemlerini tarif eder. Burada kullanilan sekliyle, "128 proteini", "128", "128 enzimi" terimleri veya gramatik esdegerleri, aksi spesifik olarak belirtilmedigi sürece, rekombinant IZS proteini moleküllerinin bir preparasyonunu terimler eder. Bu basvuruda kullanilan sekliyle, "yaklasik" ve "yaklasik olarak" terimleri esdeger olarak kullanilir. Bu basvuruda yaklasik/yaklasik olarak kullanilan herhangi bir sayi belirteci, ilgili teknikte uzman kisilerce takdir edilen normal dalgalanmalari kapsar. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Asagida tarif edilen ve Çizimleri olusturan Sekiller yalnizca açiklama amaçli olup sinirlama amaçli degillerdir. Sekil 1, serumsuz ortamda üretilen rekombinant 128 için örnek bir saflastirma semasini gösterir. Sekil 2, bir referans IZS'ye kiyasla saflastirilmis rekombinant Sekil 3, saflastirilmis rekombinant IZS AF'nin örnek bir SDS- Sekil 4, iyon degistirme kromatografisi ile degerlendirilen saflastirilmis rekombinant IZS AF'nin örnek yük profili testini gösterir. Sekil 5, saflastirilmis rekombinant IZS AF'nin örnek glikan haritasi profillerini gösterir. Sekil 6, berraklastirilmis rekombinant bir 128 hasadinin viral bir` inaktivasyon UPB asamasindan sonraki örnek :bir aktivite testini (U/mg) gösterir. Sekil 7, berraklastirilmis rekombinant bir 128 hasadinin viral bir inaktivasyon UPB asamasindan sonraki örnek bir SEÇ-HPLC testini gösterir. Sekil 8, saflastirilmis rekombinant 128 proteininin gümüs boya ile muamele edilmis örnek SDS-PAGE'yi gösterir. Sekil 9, bir referansa kiyasla serumsuz kültür kosullari altinda (üst panel) büyütülen I2S-AF 2D hücre hattindan üretilen saflastirilmis bir rekombinant 125 enzimi için örnek bir peptit haritasini gösterir. Sekil 10, bir referansa kiyasla serumsuz hücre kültürü kosullari altinda büyütülen IZS-AF 2D ve 4D hücre hatlari kullanilarak üretilen saflastirilmis rekombinant 128 enzimleri için olusturulmus örnek glikan profillerini gösterir. Sekil 11, bir 128 referans kontrolüne kiyasla serumsuz hücre kültürü kosullari altinda büyütülen lZS-AF 2D hücre hatti kullanilarak üretilen saflastirilmis rekombinant I2S enzimi için olusturulmus örnek yük profilini gösterir. TANIMLAR Mevcut bulusun daha kolay anlasilabilmesi için öncelikle belirli terimler asagida tanimlanmistir. Asagidaki terimler KK: diger terimler için ek tanimlar sartnamede belirtilmistir. Yaklasik olarak veya yaklasik: Burada kullanilan sekliyle, ilgili degere uygulandigi haliyle, belirtilen bir referans degerine benzer bir degeri ifade eder. Belirli somut gösterimlerde, "yaklasik" veya "yaklasik olarak" terimleri, %25, veya aksi belirtilmedikçe veya baglamdan baska bir sekilde anlasilmadikça belirtilen referans degerinin (daha fazlasi veya azi) herhangi bir yönde daha azini (bu sayinin olasi bir degerin Biyolojik olarak aktif: Burada kullanilan sekliyle, "biyolojik olarak aktif" terimi, bir biyolojik sistemde aktiviteye sahip herhangi bir maddenin özelligini ifade eder (örnegin hücre kültürü, organizma, Vb.). Örnegin, bir organizmaya uygulandiginda, bu organizma üzerinde biyolojik bir etkiye sahip olan bir maddenin biyolojik olarak aktif oldugu kabul edilir. Biyolojik aktivite ayrica .ni vitro analizler (örnegin sülfat salim analizi gibi in vitro enzimatik analizler) ile de belirlenebilmektedir. Bir proteinin veya polipeptidin biyolojik olarak aktif oldugu belirli somut gösterimlerde, proteinin veya polipeptidin en az bir biyolojik aktivitesini paylasan söz konusu proteinin veya polipeptidin bir kismi tipik olarak somut gösterimlerde, bir denege uygulandiginda biyolojik olarak aktivite gösteren bir protein, bir hücre kültürü sisteminden üretilir ve/veya saflastirilir. Bazi somut gösterimlerde, bir protein biyolojik olarak aktif hale gelmek için daha fazla isleme gerektirir. Bazi somut gösterimlerde, bir protein, biyolojik olarak aktif hale gelmek için, glikozilasyon (örnegin siyalasyon), farnisilasyon, ayrilma, katlanma, formilglisin dönüsümü ve bunlarin kombinasyonlari gibi, ancak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, translasyon sonrasi modifikasyon gerektirir. Bazi somut gösterimlerde, bir proform olarak üretilen bir protein (baska bir ifadeyle olgun olmayan bir form), biyolojik olarak aktif hale gelmek için ek modifikasyon gerektirebilir. Katyon-bagimsiz mannoz-6-fosfat reseptörü (CI-MPR): Burada kullanilan sekliyle, "katyon-bagimsiz mannoz-6-fosfat reseptörü (CI-MPR)" terimi, lizozoma ulasmak için Golgi cihazindaki asit hidrolaz prekürsörleri üzerindeki mannoz-6-fosfat (M6P) etiketlerine baglanan hücresel bir reseptörü ifade eder. Mannoz- 6 fosfatlara ek olarak, CI-MPR ayrica IGF-II dahil olmak üzere diger proteinleri de baglar. CI-MPR ayrica "M6P/IGF-II reseptörü", "CI-MPR/IGF-II reseptörü", "IGF-II reseptörü" veya kisaltmalari burada birbirlerinin yerine kullanilir. Kromatografi: Burada kullanilan sekliyle, "kromatografi" terimi, karisimlarin ayrilmasina yönelik bir teknigi ifade eder. Tipik olarak, karisim, "hareketli faz" olarak adlandirilan bir akiskan içinde çözündürülür, bu da onu "duragan faz" adi verilen baska bir materyali tasiyan bir yapi içerisinden tasir. Kolon kromatografisi, sabit yatagin bir tüpün, baska bir ifadeyle bir kolonun içinde oldugu bir ayirma teknigidir. Seyreltici: Burada kullanilan sekliyle, "seyreltici" terimi, yeniden yapilandirilmis bir formülasyonun hazirlanmasi için yararli olan farmasötik olarak kabul edilebilir (örnegin bir insana uygulama için güvenli olan ve toksik olmayan) seyreltici maddeyi ifade eder. Örnek seyrelticiler arasinda steril su, enjeksiyon için bakteriyostatik su (BWFI), pH tamponlu bir çözelti (örnegin fosfat tamponlu salin), steril salin çözeltisi, Ringer çözeltisi veya dekstroz çözeltisi bulunur. Elüsyon: Burada kullanilan sekliyle, "elüsyon" terimi, bir materyalin bir çözücü ile yikanarak baska bir materyalden ekstrakte edilmesi islemini ifade eder. Örnegin, iyon degistirme kromatografisinde elüsyon, yakalanan iyonlari çikarmak için yüklü reçineleri yikama islemidir. Elüat: Burada kullanilan sekliyle, "elüat" terimi, tipik olarak elüsyonun bir sonucu olarak, kromatografiden çikan hareketli faz Enzim replasman tedavisi (ERT): Burada kullanilan sekliyle, bir enzim eksikligini düzelten herhangi bir terapötik stratejiyi ifade eder. Uygulanmasi durumunda, enzim hücreler tarafindan alinir ve lizozoma aktarilir, burada enzim, enzim eksikligine bagli olarak lizozomlarda biriken materyali elimine etmek için çalisir. Tipik olarak, lizozomal enzim replasman tedavisinin etkili olmasi için, terapötik enzim, depolama kusurunun ortaya çiktigi hedef dokulardaki uygun hücrelerde bulunan lizozomlara Dengelemek veya Dengeleme: Burada kullanilan sekliyle, kromatografiye iliskin olarak "dengelemek" veya "dengeleme" terimleri, sivinin bilesenlerinin (örnegin tampon) dengeli ve esit dagilimini saglamak için, birinci sivinin (örnegin tampon) bir digeriyle dengelenmesi islemini ifade eder. Örnegin, bazi somut gösterimlerde, kromatografik bir kolon, istenen bir sivinin (örnegin tampon) bir veya daha fazla kolon hacminin kolondan geçirilmesiyle dengelenebilir. Gelistirmek, arttirmak veya azaltmak: Burada kullanilan sekliyle, "gelistirmek, arttirmak veya azaltmak" terimleri veya gramatik esdegerleri, burada tarif edilen tedaviye baslamadan önce ayni bireydeki bir ölçüm gibi temel bir ölçümle ilgili veya burada tarif edilen tedavinin yoklugunda bir kontrol bireyindeki (veya çoklu kontrol bireylerindeki) bir ölçümle ilgili degerleri belirtir. Bir "kontrol bireyi", tedavisi yapilan birey ile yaklasik olarak ayni yasta olan ve tedavisi yapilan birey ile ayni formdaki lizozomal depo hastaligina yakalanmis bir bireydir (bunu saglamak için tedavisi yapilan bireydeki ve kontrol birey(ler)indeki hastalik evreleri karsilastirilabilirdir). Safsizliklar: Burada kullanilan sekliyle, "safsizliklar" terimi, hedef materyalin veya bilesigin kimyasal bilesiminden farkli olan sinirli bir miktardaki sivi, gaz veya kati içindeki maddeleri ifade eder. Safsizliklar ayrica kirleticiler olarak da adlandirilir. Baglayici: Burada kullanilan sekliyle, "baglayici" terimi, bir füzyon proteininde, dogal proteindeki belirli bir konumda ortaya çikandan baska bir amino asit sekansini ifade eder ve genellikle esnek olmak veya bir yapiyi, örnegin bir a-heliksi, iki protein parçasi arasina koymak için tasarlanir. Bir baglayici ayrica bir aralayici olarak da adlandirilir. Yükleme: Burada kullanilan sekliyle, "yükleme" terimi, kromatografide, bir kolona numune içeren bir sivinin veya katinin eklenmesini ifade eder. Bazi somut gösterimlerde, kolona yüklenen numunenin belirli bilesenleri daha sonra yüklü numune kolondan geçerken yakalanir. Bazi somut gösterimlerde, kolona yüklenen numunenin belirli bilesenleri, yüklü numune kolondan geçerken kolon tarafindan yakalanmaz veya buradan "sürekli Polipeptit: Burada kullanilan sekliyle, genel anlamda, bir amino asitten olusan bir dizidir. Bazi somut gösterimlerde, bir polipeptit, en az bir tane peptit bagi vasitasiyla her biri digerlerine baglanan en az 3-5 amino asit içerebilir. Teknikte uzman kisiler, polipeptitlerin bazen, istege bagli olarak, bir polipeptit zincirine entegre olabilen "dogal olmayan" amino asitleri veya diger varliklari içermesini takdir edeceklerdir. Havuz: Burada kullanilan sekliyle, kromatografiye iliskin olarak parçasini birlestirmeyi ifade eder. Örnegin, bazi somut gösterimlerde, kromatografiyle ayrilmis bir numunenin istenen bir bilesenini içeren bir veya daha fazla fraksiyon (örnegin Replasman enzimi: Burada kullanilan sekliyle, "replasman enzimi" terimi, tedavi edilecek bir hastalikta en azindan kismen yetersiz veya eksik enzimin yerini alacak sekilde hareket edebilen herhangi bir enzimi ifade eder. Bazi somut gösterimlerde, "replasman enzimi" terimi, tedavi edilecek bir lizozomal depo hastaliginda en azindan kismen yetersiz veya eksik lizozomal enzimin yerini alacak sekilde hareket edebilen herhangi bir enzimi ifade eder. Bazi somut gösterimlerde, bir replasman enzimi, memeli lizozomlarinda› biriken materyalleri azaltabilmekte veya bir veya daha fazla lizozomal depo hastaligi semptomunu ortadan kaldirabilmekte veya iyilestirebilmektedir. Bulusa uygun replasman enzimleri, hem yabani tip hem de modifiye edilmis lizozomal enzimleri içerir ve rekombinant ve sentetik yöntemler kullanilarak üretilebilmekte veya doga kaynaklardan saflastirilabilmektedir. Bir replasman enzimi, rekombinant, sentetik, gen aktive edici veya dogal bir enzim olabilmektedir. Çözünür: Burada kullanilan sekliyle, "çözünür" terimi, terapötik bir ajanin, homojen bir çözelti olusturma kabiliyetini ifade eder. Bazi somut gösterimlerde, terapötik ajanin, içine uygulandigi ve hedef aksiyon bölgesine aktarildigi çözelti içindeki çözünürlügü, terapötik ajanin terapötik olarak etkili bir miktarinin, hedeflenen aksiyon bölgesine iletilmesine olanak saglamada yeterlidir. Terapötik ajanlarin çözünürlügünü çesitli faktörler etkileyebilmektedir. Örnegin, protein çözünürlügünü etkileyebilen ilgili faktörler arasinda iyonik güç, amino asit sekansi ve diger birlikte-çözücü ajanlarin veya tuzlarin (örnegin kalsiyum tuzlari) varligi bulunur. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun terapötik ajanlar, ilgili farmasötik bilesiminde çözünürdür. Stabilite: Burada kullanilan sekliyle, "stabil" terimi, terapötik ajanin (örnegin rekombinant bir enzimin), terapötik etkinligini (örnegin amaçlanan biyolojik aktivitesinin ve/veya fizyokimyasal bütünlügünün tamamini veya büyük bir çogunlugunu) uzun süre boyunca sürdürme kabiliyetini ifade eder. Terapötik bir ajanin stabilitesi ve söz konusu terapötik ajanin stabilitesini sürdürmeye yönelik farmasötik.bilesimin kabiliyeti veya daha fazla) degerlendirilebilir. Bir formülasyon baglaminda, stabil bir formülasyon, buradaki terapötik ajanin fiziksel ve/veya kimyasal bütünlügünü ve biyolojik aktivitesini depolama ve islemler esnasinda (örnegin donma/çözme, mekanik karistirma ve liyofilizasyon) büyük ölçüde sürdürdügü bir formülasyondur. Protein stabilitesi için, yüksek molekül kütleli (HMW) agregatlarin olusumu, enzim aktivitesinin kaybi, peptit fragmanlarinin olusumu ve yük profillerinin kaymasi ile ölçülebilmektedir. Viral Isleme: Burada kullanilan sekliyle, "Viral isleme" terimi, virüslerin numuneden kolayca çikarildigi "viral çikarmayi" veya virüslerin bir numunede ancak enfektif olmayan bir formda kaldigi "viral inaktivasyonu" ifade eder. Bazi somut gösterimlerde, Viral çikarma, digerlerinin yani sira, nanofiltrasyon ve/veya kromatografik teknikleri kullanabilir. Bazi somut gösterimlerde, viral inaktivasyon, digerlerinin yani sira, çözücü inaktivasyonu, deterjan inaktivasyonu, pastörizasyon, asidik pH inaktivasyonu ve/veya ultraviyole inaktivasyonu kullanabilir. BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut tarifname, digerlerinin yani sira, 6'dan daha az kromatografi asamasini içeren bir isleme dayali olarak enzim replasman tedavisi için rekombinant IZS proteinini saflastirmaya yönelik gelistirilmis bir yöntemi tarif eder. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifname, bir veya daha fazla anyon degistirme kromatografisi, katyon degistirme kromatografisi, karisik mod kromatografisi ve hidrofobik etkilesim kromatografisine dayanan bir islem kullanilarak saf olmayan bir preparasyondan rekombinant 128 proteininin saflastirilmasina yönelik bir yöntemi tarif eder. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifname, Q kromatografisi, hidroksiapatit (HA) kromatografisi, SP kromatografisi ve fenil kromatografisi gerçeklestirilerek saf olmayan bir preparasyondan rekombinant IZS proteininin saflastirilmasina yönelik bir yöntemi tarif eder. Mevcut tarifname ayrica saflastirilmis rekombinant IZS proteinini ve Mevcut bulusun çesitli yönleri asagidaki alt bölümlerde ayrintili olarak tarif edilir. Alt bölümlerin kullanimi ile bulusun sinirlandirilmasi amaçlanmamistir. Her alt bölüm, bulusun herhangi bir yönüne uygulanabilir. Bu uygulamada, aksi belirtilmedikçe "veya" kelimesi "ve/veya" anlamina gelir. Rekombinant IZS Proteini Burada kullanilan sekliyle, bir 128 proteini, dogal olarak meydana gelen Iduronat-Z-sülfataz (128) proteininin en azindan kismi aktivitesini ornatabilen veya 128 eksikligi ile iliskili bir veya daha fazla fenotip veya semptomu ortadan kaldirabilen herhangi bir protein veya proteinin bir kismidir. Burada kullanilan sekliyle, "bir 128 enzimi" ve "bir 128 proteini" terimleri ve gramatik esdegerleri birbirinin yerine kullanilir. Tipik olarak, insan 128 proteini bir prekürsör formu olarak üretilir. Insan I2S'nin prekürsör formu, bir sinyal peptidini (tam uzunluktaki prekürsörün l-25 amino asit kalintilari), bir pro-peptidi (tam uzunluktaki prekürsörün 26-33 amino asit kalintilari) ve 42 kDa zincirine (tam uzunluktaki prekürsörün 34-455 kalintilari) ve 14 kDa zincirine (tam uzunluktaki prekürsörün 446-550 kalintilari) daha fazla islenebilen bir zinciri (tam uzunluktaki prekürsörün 34-550 kalintilari) içerir. Tipik olarak, prekürsör formu ayrica 550 amino asit içeren tam uzunluktaki prekürsör veya tam uzunluktaki 128 proteini olarak da adlandirilir. Çikarilmis sinyal peptidine sahip olgun formun (SEQ 1D NO: 1) ve tipik yabani tip veya dogal olarak meydana gelen insan 128 proteininin tam uzunluktaki prekürsörünün (SEQ peptidinin alti çizilmistir. Ayrica, insan 128 protein izoformu a ve b prekürsörünün amino asit sekanslari, sirasiyla Tablo 1, SEQ 1D NO: 3 ve 4'te sunulmustur. Tablo 1. Insan Iduronat-Z-sülfataz Olgun Formu SETQANSTT DP. LNVLL I IVDDL RF S LGCYG DK LVRS ?N 1 DQ LASHS LLFQNAF AQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTM SVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFFPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLC PVDVLDVPEGTLPDRQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKE FQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPV DFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHG EWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQ SMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEE DPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPÇWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVW VGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYHDSQGGDLFQLLMP(SEQ Tam Uzunluktaki MPPPRTGRGLL'NLGLVLSSVCVP-.LGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGC YGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFÃQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN Pr ekür SÖr SY'NRVHAGNFSTI PQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPEYH . PSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKM (Izoform.a) KTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYN PWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSAL DDLQLANSTIIAPTSDHGWÃLGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLP EAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRÇSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPU PSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNS DKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPL QDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ ID NOIZ) Izofornit› MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGC YGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQÄVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN prekursoru SYVIRVHAGNFST I PQY FKENGYVTMSVGKVFHPGI S SNH TDDSPYSWS FPPYH PSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKM KTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYN PWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQEDQSSTGFRLKTSSTRKYK (SEQ Izoforui:: MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVhLGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGC .. n .' YGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN Pr ekur soru SYWRVHAGNFSTI PQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYH PSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKM KTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVÄYN PWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSAL DDLQLANSTIIAFTSDHGFLMRTNT(SEQ ID No:4) Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir IZS proteini, olgun insan IZS proteinidir (SEQ ID No:1). Burada açiklanan sekilde, SEQ ID NO: 1, insan IZS proteini için kanonik amino asit sekansini temsil eder. Bazi somut gösterimlerde, IZS proteini, I2S geninin 5' UTR'si içindeki alanindan baslayan baslangiç bölgesindeki transkripsiyondan kaynaklanan bir SEQ ID NO: 1 uç birlestirme izoformu ve/veya varyanti olabilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir IZS proteini, olgun insan Örnegin, olgun insan 128 proteininin bir homologu veya bir analogu, büyük ölçüdeki 128 proteini aktivitesini sürdürürken bir yabani tip veya dogal olarak meydana gelen 128 proteinine (örnegin SEQ 1D NO: 1) kiyasla bir veya daha fazla amino asit ornatimi, silimi ve/Veya yerlestirmesini içeren modifiye edilmis bir olgun insan 128 proteini olabilir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, olgun insan 128 proteini (SEQ 1D NO: 1) ile büyük ölçüde homologtur. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 1 ile en asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant büyük ölçüde özdestir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir veya daha fazla özdes bir amino asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, olgun insan 128 proteininin bir fragmanini veya bir kismini içerir. Alternatif olarak, rekombinant bir 128 proteini, tam uzunluktaki 128 proteinidir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, tam uzunluktaki insan 128 proteininin bir homologu veya bir analogu olabilir. Örnegin, tam uzunluktaki insan 128 proteininin bir homologu veya bir analogu, büyük ölçüdeki 128 proteini aktivitesini sürdürürken bir yabani tip veya dogal olarak meydana gelen tam uzunluktaki 128 proteinine (örnegin SEQ 1D NO: 2) kiyasla bir veya daha fazla amino asit ornatimi, silimi ve/Veya yerlestirmesini içeren modifiye edilmis bir tam uzunluktaki insan 128 proteini olabilir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, olgun insan 128 proteini (SEQ 1D NO: 2) ile büyük ölçüde homologtur. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 2 ile en asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 2 ile büyük ölçüde özdestir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D bir amino asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, tam uzunluktaki insan 128 proteininin bir fragmanini veya bir kismini içerir. Burada kullanilan sekliyle, tam 'uzunluktaki bir 128 proteini tipik olarak sinyal peptidi sekansi içerir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform a proteinidir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform a proteininin bir homologu veya bir analogu olabilir- Örnegin, insan 128 izoform a proteininin bir homologu veya bir analogu, büyük ölçüdeki 128 proteini aktivitesini sürdürürken bir yabani tip veya dogal olarak meydana gelen insan 128 izoform a proteinine (örnegin SEQ 1D NO: 3) kiyasla bir veya daha fazla amino asit ornatimi, silimi ve/veya yerlestirmesini içeren modifiye edilmis bir insan 128 izoform a proteini olabilir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform a proteini (SEQ 1D NO: 3) ile büyük ölçüde homologtur. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 3 ile en asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 3 ile büyük ölçüde özdestir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 3 asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform a proteininin bir fragmanini veya bir kismini içerir. Burada kullanilan sekliyle, bir insan 128 izoform a proteini tipik olarak bir sinyal peptidi sekansi Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform b proteinidir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform b proteininin bir homologu veya bir analogu olabilir. Örnegin, insan 128 izoform b proteininin bir homologu veya bir analogu, büyük ölçüdeki 128 proteini aktivitesini sürdürürken bir yabani tip veya dogal olarak meydana gelen insan 128 izoform b proteinine (örnegin SEQ 1D NO: 4) kiyasla bir veya daha fazla amino asit ornatimi, silimi ve/Veya yerlestirmesini içeren modifiye edilmis bir insan 128 izoform, b proteini olabilir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform b proteini (SEQ 1D NO: 4) ile büyük ölçüde homologtur. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 4 ile en asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ ID NO: 4 ile büyük ölçüde özdestir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, SEQ 1D NO: 4 asit sekansina sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, insan 128 izoform b proteininin bir fragmanini veya bir kismini içerir. Burada kullanilan sekliyle, bir insan 128 izoform b proteini tipik olarak bir sinyal peptidi sekansi Insan 128 proteinlerinin homologlari veya analoglari, söz konusu yöntemleri siralayan referanslarda bulunanlar gibi teknikte siradan uzmanliga sahip bir kisi tarafindan bilinen polipeptit sekansini degistirmeye yönelik yöntemlere uygun olarak hazirlanabilmektedir. Bazi somut gösterimlerde, korunumlu amino asit ornatimlari, asagidaki gruplar içindeki amino asitler arasinda yapilan ornatimlari içerir: (a) M, 1, L, V; (b) F, Y, W; (C) K, R, H; (d) A, G; (e) 8, T; (f) Q, N; ve (g) E, D. Bazi somut gösterimlerde, bir "korunumlu amino asit ornatimi", amino asit ornatiminin yapildigi proteinin nispi yük veya boyut özelliklerini degistirmeyen bir amino asit ornatimini ifade Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS proteinleri, hücresel alim ve/Veya lizozomal hedeflemeyi kolaylastirmak için hedef hücrelerin yüzeyindeki bir reseptöre baglanan bir parça içerebilir. Örnegin, söz konusu reseptör, mannoz-6-fosfat (M6P) kalintilarini baglayan katyon-bagimsiz mannoz-G-fosfat reseptörü (CI-MPR) olabilir. Ayrica, CI-MPR, IGF-II dahil olmak üzere diger proteinleri de baglar. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir IZS proteini, proteinin yüzeyindeki M6P kalintilarini içerir. Özellikle, rekombinant bir 128 proteini, CI-MPR'ye daha yüksek baglanma afinitesine sahip olan bis- fosforile oligosakkaritleri içerebilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir enzim en fazla yaklasik, enzim basina yaklasik en az %20'lik bir bis-fosforile oligosakkarit ortalamasi içerir. Diger somut gösterimlerde, uygun bir enzim, Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS enzimleri, hedef hücrelerin yüzeyindeki bir reseptöre baglanabilen bir lizozomal hedefleyici parçaya kaynastirilabilir. Uygun bir lizozomal hedefleyici parça, (örnegin bir yabani tip olgun insan GF-I, olmak üzere) IGF-I, IGF-II, RAP, p97 ve bunlarin varyantlari, homologlari veya fragmanlari olabilmektedir. Lizozomal hedefleyici parça, N-terminus, C-terminus veya içerdeki bir 125 proteinine veya enzimine konjüge edilebilir veya kaynastirilabilir. Rekombinant IZS Proteinlerinin Üretimi Burada açiklanan yöntemler, çesitli yollarla üretilen rekombinant bir I2S proteinini saflastirilmasi için kullanilabilir. Örnegin, bir 128 proteini, bir 128 kodlayici nükleik asidi eksprese etmek üzere tasarlanmis bir konak hücre sistemi kullanilarak rekombinant olarak üretilebilir. Alternatif olarak, bir 125 proteini, bir endojenöz 125 geninin aktive edilmesiyle üretilebilir. Burada açiklanan yöntemlerin, çesitli ekspresyon sistemleri kullanilarak üretilmis rekombinant bir 125 proteinini saflastirmak için kullanilabilecegi düsünülmüstür. Uygun ekspresyon sistemleri arasinda, örnegin, yumurta, bakülovirüs, bitki, maya veya memeli hücreleri bulunur. Bazi somut gösterimlerde, 128 enzimleri memeli hücrelerinde üretilir. Burada açiklanan yöntemlere uygun olarak kullanilabilecek sinirlayici olmayan memeli hücreleri örnekleri arasinda, BALE/c fare miyelom hatti (NSO/l, ECACC No: 85110503); insan retinoblastlari (PER. C6, CruCell, Leiden, Hollanda); SV4O tarafindan dönüstürülen maymun böbrek CV1 hatti (COS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek hatti (süspansiyon kültüründe büyüme için alt klonlanmis HEK293 veya 293 hücreleri, Graham ve dig., J. Gen Virol., 36:59, 1977); insan fibrosarkom hücre hatti (örnegin HT1080); bebek hamster böbrek hücreleri (BHK21, ATCC CCL 10); Çin hamsteri yumurtalik hücreleri +/-DHFR (CHO, Urlaub maymun böbrek hücreleri (CV1 ATCC CCL 70); Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO-76, ATCC CRL-1 587); insan servikal karsinom hücreleri (HeLa, ATCC CCL 2); köpek böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo siçan karaciger hücreleri (BRL 3A, insan karaciger hücreleri (Hep G2, HB 8065); fare meme tümörü (MMT ; TR1 hücreleri (Mather ve dig., Annals ve bir insan hepatom hatti (Hep G2) bulunur. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye ait yöntemler, insan hücrelerinden (örnegim HTlO80) üretilen rekombinant 128 enzimlerini saflastirmak için kullanilir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye ait yöntemler, CHO hücrelerinden üretilen rekombinant IZS enzimlerini saflastirmak için kullanilir. Tipik olarak, rekombinant IZS'yi eksprese etmek üzere tasarlanmis hücreler, burada tarif edilen rekombinant bir 128 proteinini kodlanan bir transgen içerebilir. Rekombinant IZS'yi kodlayan nükleik asitlerin, rekombinant IZS'yi eksprese etmeye yönelik düzenleyici sekanslar, gen kontrol sekanslari, promotörler, kodlayici olmayan sekanslar ve/Veya diger uygun sekanslari içerebilecegi takdir edilmelidir. Tipik olarak, kodlama bölgesi, söz konusu bir veya daha fazla nükleik asit bileseni ile islevsel olarak baglanir. yukari akisina (5' kodlayici olmayan sekanslar), içine veya asagi akisina (3' kodlayici olmayan sekanslar) yerlestirilmis nükleotit sekanslarini ifade eder ve söz konusu sekanslar, ilgili kodlama sekansinin transkripsiyonunu, RNA islemesini veya stabilitesini ya da translasyonunu etkiler. Düzenleyici sekanslar arasinda promotörler, translasyon lider sekanslari, intronlar ve poliadenilasyon tanima sekanslari bulunabilir. Bazi durumlarda "düzenleyici sekanslar" ayrica "gen kontrol sekanslari" olarak da adlandirilir. RNA'nin ekspresyonunu kontrol edebilen bir nükleotit sekansini ifade eder. Genel olarak, bir kodlama sekansi, bir promotör sekansina 3' ucunda konumlandirilir. Promotör sekansi, proksimal ve merkezden daha uzak yukari akis elementlerinden olusur, ikinci elementler ise genellikle güçlendiriciler olarak adlandirilir. Buna uygun olarak, bir "güçlendirici", promotör aktivitesini uyarabilen ve promotörün temel bir elementi veya bir promotörün seviyesini veya doku spesifitesini güçlendirmek için yerlestirilmis heterolog bir element olabilen bir nükleotit sekansidir. Promotörler, dogal bir genden bütünüyle türetilebilir veya dogada bulunan farkli promotörlerden türetilen farkli elementlerden olusabilir veya hatta sentetik nükleotit segmentleri içerebilir. Teknikte uzman kisilerce anlasilacagi üzere, farkli promotörler, farkli doku veya hücre tiplerinde veya farkli gelisim asamalarinda veya farkli çevresel kosullara yanit olarak bir genin ekspresyonunu yönlendirebilir. sekansinin asagi akisina yerlestirilmis nükleotit sekanslarini ifade eder ve mRNA islemesini veya gen ekspresyonunu etkileyebilen düzenleyici sinyalleri kodlayan poliadenilasyon tanima sekanslarini ve diger sekanslari içerir. Poliadenilasyon sinyali genellikle poliadenilik asit yollarinin mRNA prekürsörünün 3' ucuna eklenmesini etkilemesi ile karakterize sekanslar" tipik olarak bir genin promotör sekansi ile kodlama sekansi arasina yerlestirilmis bir nükleotit sekansini ifade eder. Translasyon lider sekansi, translasyon baslangiç sekansinin tamamen islenmis mRNA asagi akisinda bulunur. Translasyon lider sekansi, birincil transkriptin mRNA'ya islenmesini, mRNA stabilitesini veya translasyon verimini etkileyebilir. Tipik olarak, "operatif sekilde bagli" veya "islevsel olarak bagli" terimi, iki veya daha fazla nükleik asit fragmaninin tek bir nükleik asit fragmani üzerinde birlesmesini ve böylece birinin fonksiyonunun digerinden etkilenmesini ifade eder. Örnegin, bir promotör, bir kodlama sekansinin ekspresyonunu etkileyebilecek durumda (baska bir ifadeyle, kodlama sekansi promotörün transkripsiyonel kontrolü altinda) oldugunda söz konusu kodlama sekansi ile operatif sekilde baglidir. Kodlama sekanslari, sens veya antisens oryantasyonundaki düzenleyici sekanslara operatif sekilde baglidir. Bir transgenin kodlama bölgesi, belirli bir hücre tipi için kodon kullanimini optimize etmek. için bir veya daha fazla sessiz mutasyon içerebilir. Örnegin, bir 128 transgeninin kodonlari, bir omurgali hücresindeki ekspresyon için optimize edilebilir. Bazi somut gösterimlerde, bir 125 transgeninin kodonlari, bir memeli hücresindeki ekspresyon için optimize edilebilir. Bazi somut gösterimlerde, bir 128 transgeninin kodonlari, bir insan hücresindeki ekspresyon için optimize edilebilir. Istege bagli olarak, bir yapi, asagidakilerden biri veya daha fazlasi gibi ek bilesenler içerebilir: bir uç birlestirme alani, bir güçlendirici sekans, uygun bir promotör kontrolü altindaki seçilebilir bir isaretleyici gen, uygun bir promotör kontrolü altindaki amplifiye edilebilir bir isaretleyici gen ve bir matriks baglanti bölgesi (MAR) veya yerlestirildigi bölgenin ekspresyonunu güçlendiren teknikte bilinen baska bir element. Konak hücrelere transfekte veya transdüse edilmesi durumunda, uygun bir vektör, kromozom disinda (epizomal olarak) eksprese edebilmekte veya konak hücre genomuna entegre olabilmektedir. Rekombinant I28 proteinlerinin aktivasyonu Tipik olarak, rekombinant bir IZS enzimi, (olgun insan IZS'nin amino asit 59'una karsilik gelen) korunmus bir sisteinin, 2- amino-3-oksopropiyonik asit veya okso-alanin olarak da bilinen formilglisine translasyon sonrasi modifikasyonu ile aktive Söz konusu translasyon sonrasi modifikasyon, Formilglisin Üreten Enzim (FGE) olarak bilinen bir enzim ile gerçeklestirilebilmektedir. Dolayisiyla, bazi somut gösterimlerde, rekombinant 128 enzimleri de FGE proteinini eksprese eden hücrelerde üretilir. Belirli somut gösterimlerde, rekombinant IZS enzimleri, artmis veya güçlendirilmis FGE proteini ekspresyonuna sahip olan hücrelerde üretilir. Örnegin, hücreler yüksek seviyede aktif enzime sahip IZS preparasyonlarinin üretimini kolaylastirmak için rekombinant 128 ile kombinasyon halinde FGE'yi asiri ifade edecek sekilde tasarlanabilir. Bazi somut gösterimlerde, FGE'nin asiri ekspresyonu, standart rekombinant teknolojisi kullanilarak egzojen bir FGE'nin ekspresyonu (örnegin asiri ekspresyonu) ile elde edilir. Bazi somut gösterimlerde, FGE'nin asiri ekspresyonu, bir endojen FGE'nin aktif veya güçlendirilmis ekspresyonu ile, Örnegin endojen FGE geninin promotörünün aktive edilmesi veya arttirilmasi yoluyla elde edilir. Bazi durumlarda, rekombinant IZS'yi kodlayan nükleik asit ve rekombinant bir FGE proteinini kodlayan nükleik asit, iç ribozomal giris bölgesine karsilik gelen bir sekansa sahip bir nükleik asit (örnegin bir aralayici sekans) ile baglanir. Sisteini formilglisine dönüstürme kabiliyetine sahip herhangi bir FGE, tarifnameye ait yöntemlerde kullanilabilir. FGE proteinlerine yönelik örnek nükleik asit ve amino asit Rekombinant FGE'yi kodlayan nükleik asitlerin, FGE'yi eksprese etmeye yönelik düzenleyici sekanslar, gen kontrol sekanslari, promotörler, kodlayici olmayan sekanslar ve/Veya diger uygun sekanslari içerebilecegi takdir edilmelidir. Tipik olarak, kodlama bölgesi, söz konusu bir veya daha fazla nükleik asit bileseni ile islevsel olarak baglanir. Rekombinant bir 128 proteini üretmek için çesitli hücre kültürü ortami ve kosullari kullanilabilir. Örnegin, rekombinant bir IZS proteini, serum içeren veya serumsuz ortamda üretilebilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini serumsuz ortamda üretilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini, hayvansiz bir ortamda, baska bir ifadeyle hayvandan türetilmis bilesenlerden yoksun bir ortamda üretilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 proteini kimyasal olarak tanimlanmis bir ortamda üretilir. Burada kullanilan sekliyle, bilesenlerinin büyük ölçüde bilindigi bir ortami ifade eder. Bazi somut gösterimlerde, kimyasal olarak tanimlanmis bir besin ortami, serum, serumdan türetilmis proteinler (örnegin albumin veya fetuin) ve diger bilesenler gibi hayvandan türetilmis bilesenleri içermez. Bazi somut gösterimlerde, kimyasal olarak tanimlanmis bir ortam, bir veya daha fazla protein (örnegin protein büyüme faktörü veya sitokin) içerir. Bazi somut gösterimlerde, kimyasal olarak tanimlanmis bir besin ortami bir veya daha fazla protein hidrolizat içerir. Diger durumlarda, kimyasal olarak tanimlanmis bir besin ortami, protein içermeyen bir ortamdir, baska bir ifadeyle bilinmeyen bilesimin proteinlerini, hidrolizatlarini veya bilesenlerini içermeyen serumsuz bir ortamdir. Bazi somut gösterimlerde, kimyasal olarak tanimlanmis bir ortam, bir veya daha fazla hayvandan türetilmis bilesenle desteklenebilir. Söz konusu hayvandan türetilmis bilesenler arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, fetal buzagi serumu, at serumu, keçi serumu, esek serumu, insan serumu ve albuminler (örnegin sigir serumu albumini veya insan serumu albumini) gibi serumdan türetilmis proteinler bulunur. Çesitli hücre kültürü kosullari, silindir sise kültürleri, biyoreaktör yigin kültürleri ve biyoreaktör kesikli beslemeli kültürleri de dahil olmak üzere, ancak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, büyük ölçüde rekombinant 128 proteinleri üretmek için kullanilabilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant I2S proteini, süspansiyon halinde kültürlenmis hücreler tarafindan üretilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS proteini yapisik hücreler tarafindan üretilir. Örnek hücre ortami ve kültür kosullari Örnekler bölümlerinde tarif edilmistir. Rekombinant 128 proteini üretmeye yönelik ek örnek yöntemler ve bilesimler, ayni tarihte kayda geçirilmis 2-Sulfatase" baslikli provizyonel basvuruda tarif edilmis ve söz konusu basvuruya ait tüm açiklamalari referans olarak buraya dahil edilmistir. Rekombinant 128 Proteininin Saflastirilmasi Mevcut tarifnamenin bazi uygulamalarinda, bir veya daha fazla anyon degistirme kromatografisi, katyon degistirme kromatografisi, karisik mod kromatografisi ve hidrofobik etkilesim kromatografisine dayanan bir islem kullanilarak saf olmayan bir preparasyondan rekombinant 128 proteininin saflastirilmasina yönelik bir yöntem gerçeklestirilebilmektedir. Bazi somut gösterimlerde, yöntem 6'dan daha az (örnegin 5'ten az, 4'ten az veya 3'ten az) kromatografi asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, yöntem, 2, 3, 4 veya 5 kromatografi asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, yöntem, 4 kromatografi asamasi içerir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut tarifnameye uygun olan yöntem, anyon degistirme kromatografisi, katyon degistirme kromatografisi, karisik mod kromatografisi ve hidrofobik etkilesim kromatografisini bu sirayla gerçeklestirir. Saf olmayan preparasyon Burada kullanilan sekliyle, saf olmayan bir preparasyon, rekombinant IZS proteinini içeren islenmemis biyolojik materyal bulunduran herhangi bir biyolojik materyal olabilmektedir. Örnegin, saf olmayan bir preparasyon, IZS proteinini veya IZS proteinini içeren ham hücre lizatlarini üreten hücrelerden (örnegin memeli hücrelerinden) salgilanan rekombinant IZS proteinini içeren islenmemis hücre kültür ortami olabilir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon, kismen islenmis hücre ortami veya hücre lizatlari olabilir. Örnegin, hücre ortami veya hücre lizatlari konsantre edilebilmekte, seyreltilebilmekte, viral inaktivasyon, Viral isleme veya Viral çikarma ile muamele edilebilmektedir. Bazi somut gösterimlerde, viral çikarma, digerlerinin yani sira, nanofiltrasyon ve/veya kromatografik teknikleri kullanabilir. Bazi somut gösterimlerde, viral inaktivasyon, digerlerinin yani sira, çözücü inaktivasyonu, deterjan inaktivasyonu, pastörizasyon, asidik pH inaktivasyonu ve/veya ultraviyole inaktivasyonu kullanabilir. Hücre ortami veya hücre lizatlari, konak hücre proteininin ve/Veya nükleik asitlerin (örnegin DNA veya RNA) seviyesini azaltmak için proteaz, DNazlar 've/veya RNazlarla da muamele edilebilir. Bazi somut gösterimlerde, islenmemis veya kismen islenmis biyolojik materyaller (örnegin hücre ortami veya hücre lizati) dondurulabilir ve istenen bir sicaklikta (örnegin 2-8°C, -4°C, -25° C, -75°) bir süre boyunca depolanabilir ve daha sonra saflastirma için çözülür. Burada kullanilan sekliyle, saf olmayan bir preparasyon, baslangiç materyali veya yükleme malzemesi olarak da adlandirilir. Anyon degistirme kromatografisi Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS'nin saflastirilmasina yönelik yöntemler anyon degistirme kromatografisini içerir. Kisacasi, anyon degistirme kromatografisi, negatif yüklü bir bilesik ile pozitif yüklü bir reçine arasindaki yük-yük etkilesimlerine dayanan kromatografik bir tekniktir. Bazi somut gösterimlerde, anyon degistirme kromatografisi, güçlü anyon degistirme kromatografisidir. Bazi somut gösterimlerde, anyon degistirme kromatografisi, bir terapötik protein (örnegin rekombinant IZS) için birinci bir saflastirma asamasi olarak kullanilir. Örnek anyon degistirme reçineleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, kuaterner amin reçineleri veya "Q-reçineleri" (örnegin Captom-Q, Q-Sefaroz®, QAE Sephadex®); dietilaminoetan (DEAE) reçineleri (Örnegin DEAE-Trisacryl®, DEAE Sefaroz®, benzoile naftoile DEAE, dietilaminoetil Sephacel®); Amberjet® reçineleri; Amberlyst® reçineleri; Amberlite® reçineler, (örnegin Amberlite® lRA-67, Amberlite® güçlü bazik, Amberlite® zayif bazik), kolestiramin reçinesi, ProPac® reçineleri (Örnegin ProPac® SAX-lO, ProPac® WAX-10, ProPac® WCX-10); TSK-GEL® reçineleri (örnegin TSKgel DEAE-NPR; TSKgel DEAE-SPW); ve Acclaimû reçineleri bulunur. Bazi somut gösterimlerde, anyon degistirme reçinesi bir Q reçinesidir. Anyonik degistirme kromatografisine yönelik tipik hareketli fazlar arasinda görece polar çözeltiler, örnegin su, asetonitril ve metanol, etanol ve izopropanol gibi organik alkoller veya 2- (N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) içeren çözeltiler bulunur. Dolayisiyla, belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, ayirma sirasinda herhangi bir zamanda yaklasik %1 ila yaklasik %100, yaklasik %5 Genel olarak, hareketli bir faz bir tuz içerir. Örnegin, bir tuz (örnegin sodyum klorür) bir anyon degistirme kolonundaki bagli bir proteini elüte edebilmektedir (örnegin, karsi iyon klorürdür ve daha sonra salinan hedef protein için degistirilir). Bazi somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 0 ila yaklasik 1.0M arasinda, örnegin yaklasik 0 ila yaklasik 0.8M arasinda, yaklasik 0 ila yaklasik 0.6M arasinda, yaklasik 0 ila yaklasik 0.5M arasinda, yaklasik 0 ila yaklasik 0.4M arasinda, yaklasik 0.05M ila yaklasik 0.5OM arasinda, yaklasik 0.10M ila yaklasik 0.45M arasinda, yaklasik 0.10M ila yaklasik 0.4OM arasinda veya yaklasik 0.15M ila yaklasik 0.4OM arasinda bir tuz konsantrasyonu içerir. Bazi somut gösterimlerde, hareketli faz, 0.9M veya 1.0M'lik bir tuz konsantrasyonu içerir. Bazi somut gösterimlerde, hareketli fazdaki tuz konsantrasyonu, bir gradyandir (örnegin lineer veya lineer olmayan gradyandir). Bazi somut gösterimlerde, hareketli fazdaki tuz konsantrasyonu sabittir. Bazi somut gösterimlerde, hareketli fazdaki tuz konsantrasyonu asamali olarak artabilir veya azalabilir. Tipik olarak, hareketli faz tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz tamponlanmaz. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 14 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 10 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik. 5 ila yaklasik 7 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 6.5'lik bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, 'lik bir pH'a tamponlanir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, anyon degistirme kromatografisi kolonuna (örnegin Q kolonu) yüklenmeden Önce yaklasik 5.0, 5.5, mS/cm veya 20 mS/cm'lik iletkenlige ayarlanir. pH, sodyum asetat (Örnegin 1M) kullanilarak ayarlanabilir ve iletkenlik sodyum klorür (örnegin 5M) kullanilarak ayarlanabilir. Yükleme yapildiktan sonra, bir anyon degistirme kromatografisi kolonu, veya 7.5) sahip yaklasik 140 mM ila yaklasik 200 mM (örnegin arasinda degisen tuz (örnegin NaCl) konsantrasyonunu içeren bir yikama tamponu kullanilarak yikanabilir. Bir anyon degistirme kromatografisi kolonu, lineer bir NaCl gradyani içeren bir elüsyon tamponu kullanilarak elüte edilebilir. Uygun bir örnek lineer NaCl gradyani, yaklasik 0-500 mM NaCl (örnegin yaklasik Katyon Degistirme Kromatografisi Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS'nin saflastirilmasina yönelik yöntemler katyon degistirme kromatografisini içerir. Kisacasi, katyon degistirme kromatografisi, pozitif yüklü bir bilesik ile negatif yüklü bir reçine arasindaki yük-yük etkilesimlerine dayanan kromatografik bir tekniktir. Bazi somut gösterimlerde, katyon degistirme kromatografisi, güçlü katyon degistirme kromatografisidir. Katyon degistirme kromatografisi genellikle ya bir sülfonyum iyonu içeren güçlü ya da zayif bir katyon degistirme kolonuyla ya da genellikle bir karboksimetil (CM) ya da karboksilat (CX) fonksiyonel grubuna sahip zayif bir katyon degistiricisi ile gerçeklestirilir. Teknikte birçok uygun katyon degistirme reçinesi bilinir` ve piyasadan temin edilebilir' ve arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, SP-Sefaroz®, CM Sefaroz®; Amberjet® reçineleri; Amberlysta reçineleri; Amberlite® reçineleri(Örnegin Amberlite® IRAlZO): ProPac® reçineleri (örnegin ProPac® Sex-10, ProPac® WCX-lO, ProPac® WCX-10); TSK- GEL® reçineleri (örnegin TSKgel BioAssist S; TSKgel SP-2SW, TSKgel SP-5PW; TSKgel SP-NPR; TSKgel SCX; TSKgel SP-STAT; TSKgel CM-5PW; TSKgel OApak-A; TSKgel CM-ZSW, TSKgel CM-3SW ve TSKgel CM-STAT); ve Acclaim® reçineleri bulunur. Belirli somut gösterimlerde, anyon degistirme reçinesi bir SP-Sefaroz reçinesidir®. Katyonik degistirme kromatografisine yönelik tipik hareketli fazlar arasinda görece polar çözeltiler, örnegin su, asetonitril ve metanol, etanol ve izopropanol gibi organik alkoller veya 2- (N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) içeren çözeltiler bulunur. Dolayisiyla, belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, ayirma sirasinda herhangi bir zamanda yaklasik %1 ila yaklasik %100, yaklasik %5 Genel olarak, hareketli bir faz bir tuz içerir. Örnegin, bir tuz (örnegin sodyum klorur, sodyum fosfat Vb.) bir katyon degistirme kolonundaki bagli bir proteini elüte edebilmektedir (örnegin, karsi iyon sodyumdur ve daha sonra salinan hedef protein için degistirilir). Bazi somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 0 ila yaklasik 1.0M arasinda, örnegin yaklasik 0 ila yaklasik 0.8M arasinda, yaklasik 0 ila yaklasik 0.6M arasinda, yaklasik 0 ila yaklasik 0.5M arasinda, yaklasik 0 ila yaklasik 0.4M arasinda, yaklasik 0.05M ila yaklasik 0.50M arasinda, yaklasik 0.10M ila yaklasik 0.45M arasinda, yaklasik 0.10M ila yaklasik 0.40M arasinda veya yaklasik 0.15M ila yaklasik 0.40M arasinda bir tuz konsantrasyonu içerir. Bazi somut gösterimlerde, içerir. Bazi somut gösterimlerde, hareketli fazdaki tuz konsantrasyonu, bir gradyandir (Örnegin lineer veya lineer olmayan gradyandir). Bazi somut gösterimlerde, hareketli fazdaki tuz konsantrasyonu sabittir. Bazi somut gösterimlerde, hareketli fazdaki tuz konsantrasyonu asamali olarak artabilir veya azalabilir. Tipik olarak, hareketli faz tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz tamponlanmaz. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 14 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 10 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 7 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 6.5'lik bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, 'lik bir pH'a tamponlanir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, katyon degistirme kromatografisi kolonuna (örnegin SP kolonu) yüklenmeden önce yaklasik 1 mS/cm ve 20 nß/cm arasinda (örnegin yaklasik 1 nß/cm ve 15 Hß/cm arasinda, yaklasik 1 mS/cm ve 10 mS/cm arasinda, yaklasik 1 mS/cm ve 8 InS/cni arasinda, yaklasik 1 InS/cni ve 6 InS/cni arasinda, yaklasik 1 mS/cm ve 4 mS/cm arasinda, yaklasik 2 mS/cm ve 4 mS/cm arasinda) degisen iletkenlige ayarlanir. Belirli somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, katyon, degistirme kromatografisi kolonuna (örnegin SP kolonu) yüklenmeden önce n yaklasik 2 mS/cm ve 4 mS/cm arasinda (örnegin 2, 2.5, 3, 3.5 veya 4 mS/cm) degisen iletkenlige ayarlanir. Iletkenlik, örnegin, lzl, l.l:l, l.2:l, oranindaki HZO ile saf olmayan bir preparasyonun veya bir ara elüatin veya sürekli akisin seyreltilmesi yoluyla ayarlanabilir. Iletkenlik ayrica istenen bir tampon içine dialfiltrasyon yoluyla da ayarlanabilir. Bazi somut gösterimlerde, bir katyon degistirme kromatografisi kolonu, yaklasik 5.0-6.5'lik (örnegin yaklasik 5.0, 5.5, 6.0 veya 6.5) bir pH'da gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, bir katyon degistirme kromatografisi kolonu, yaklasik 0.01 M ila yaklasik 0.1 M (örnegin yaklasik 0.09 M, or 0.1 M) arasinda degisen fosfat (örnegin NaPO4) konsantrasyonunu içeren bir tampon ile gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir pH yaklasik 5.0-6.5'dir (örnegin Karisik Mbd Kromatografisi Hidroksiapatit kromatografisi (HA), bir "psödo-afinite" kromatografisi veya "karisik-mod" iyon degisimi olarak kabul edilir ve burada açiklanan yöntemlere uygun olarak kullanilabilir. Hidroksiapatit, biyolojik moleküllerin parçalanmasi ve saflastirilmasinda kullanilan essiz bir kalsiyum fosfat formudur. Bazi durumlarda, kristallerin kirilganligi akis hizlarini ve/Veya kolon ömrünü sinirlayabilirse de kristalin hidroksiapatit kullanilabilir. CHT seramik hidroksiapatit Tip I ve II seklindeki iki tipteki kimyasal olarak saf seramik hidroksiapatit makro gözeneklidir, küre biçimindedir ve yüksek akis hizlarinda ve basinçlarda kullanilabilmektedir. Tip I genel olarak yüksek bir protein baglama kapasitesine sahip iken Tip II ise genellikle daha düsük bir protein baglama kapasitesine sahiptir. Genel olarak, hidroksiapatit formülü Cam(POUs(OH)2`dir (Kawasaki, ve dig. 1985). Fonksiyonel gruplar arasinda pozitif yüklü kristal kalsiyum. iyonu çiftleri (C- bölgeleri) ve üçlü kristal fosfatlar (P-bölgeleri) ile baglantili alti negatif yüklü oksijen atomunun kümeleri bulunur. C-bölgeleri, P-bölgeleri ve hidroksiller, kristal yüzeyinde sabit bir paternde dagilir ve genellikle proteinler ve diger moleküller ile karmasik etkilesimlere yol açar. Bir numune, nötr veya buna yakin pH'daki düsük iyonik güce sahip fosfat tamponunda (Örnegin bir HA kolonuna yüklenebilir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, karisik mod kromatografisi kolonuna (örnegin HA kolonu) yüklenmeden önce yaklasik 0.001 M ila yaklasik 0.01 M (örnegin (örnegin NaPO4) konsantrasyonunu ve yaklasik pH 5.0-6.5'a (örnegin yaklasik 5.0, 5.5, 6.0 veya 6.5) ayarlanir. Yüklenen HA kolonu tipik olarak yükleme tamponununkiyle karsilastirilabilir bir fosfat konsantrasyonuna sahip bir yikama tamponu ile yikanir. Bazi somut gösterimlerde, yükleme yapildiktan sonra, karisik mod kromatografisi kolonu (örnegin HA kolonu), nötr veya buna yakin pH'da fosfat (örnegin 1-10 mM sodyum veya potasyum fosfat) içeren bir yikama tamponu ile yikanir. Örnegin uygun bir yikama tamponu yaklasik 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM veya 10 mM'lik bir fosfat konsantrasyonuna sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, daha kati bir yikama kosulu olusturmak üzere yikama tamponundaki fosfat miktarinin arttirilmasi arzu edilebilir. I2S proteinlerinin yüzeyi üzerindeki M6P seviyelerinin, özellikle di-M6P seviyelerinin, 1izozoma1 hedefleme için önemli o1dugu düsünülür. Yikama tamponu içindeki artan fosfat konsantrasyonu, özellikle HA kolonundaki yüksek M6P, özellikle di-M6P, seviyeli IZS proteinlerini seçici olarak muhafaza edebilir. Bu nedenle, bazi somut gösterimlerde, fazla bir fosfat konsantrasyonuna sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, yüklü karisik mod kromatografisi kolonu (örnegin HA kolonu), yaklasik 10-20 mM (örnegin yaklasik 10-18 mM, arasinda degisen bir fosfat konsantrasyonuna sahip bir yikama tamponu ile yikanir. Bazi somut gösterimlerde, yüklü karisik mod kromatografisi fazla bir fosfat konsantrasyonuna sahip bir yikama tamponu ile yikanir. HA kolonundan elüsyon tipik olarak bir gradyan fosfat tamponu ile elde edilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir elüsyon fosfatli bir fosfat gradyanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, HA kolonundan elüsyon, elüsyon tamponu içindeki fosfat konsantrasyonunun asamali arttirilmasiyla gerçeklestirilir. Bazi somut gösterimlerde, asamali elüsyon konsantrasyonuna sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, bir karisik mod kromatografisi kolonundan (örnegin HA kolonu) elüsyon, yaklasik 50 mM ila yaklasik 150 mM arasinda degisen bir fosfat (örnegin sodyum fosfat) konsantrasyonuna sahip (örnegin konsantrasyonundan ve bunun kombinasyonundan seçilen) bir elüsyon tamponu ile gerçeklestirilir. HA kromatografisi için birçok farkli kosul kombinasyonunun bilindigi ve belirli bir ilgi konusu protein (örnegin rekombinant 128) için uygun olan parametrelerin ayarlanmasi için kullanilabilecegi takdir edilecektir. Hidrofobik Etkilesim Kromatografisi Hidrofobik Etkilesim Kromatografisi (HIC), proteinleri birbirinden ayirmak için hidrofobiklik özelliklerini kullanan bir ayirma teknigidir. Bu kromatografi tipinde, fenil, oktil veya butil gibi hidrofobik gruplar sabit kolona tutturulur. Yüzeyleri üzerinde hidrofobik amino asit yan zincirlerine sahip ve kolondan geçen proteinler, kolondaki hidrofobik gruplarla etkilesime girebilir ve söz konusu gruplara baglanabilir. HIC kolonlari bilinir ve bunlar arasinda örnegin, Fenil Sefaroz HIC ayirmalari bulunur, söz konusu ayirmalar genellikle iyon degistirme kromatografisinde kullanilanlarin karsit kosullari kullanilarak tasarlanir. Genel olarak, yüksek bir iyonik güce sahip genellikle amonyum sülfat olan bir tampon kolona baslangiçta uygulanir. Tampondaki tuz, numune çözgenlerin çözünmesini azaltir, böylece çözünme azalir, açiga çikan hidrofobik bölgeler ortam tarafindan adsorbe edilir. Sabit faz genellikle diger moleküller ile hidrofobik etkilesimler olusturmak üzere tasarlanir. Bu etkilesimler genellikle suda çok zayiftir, ancak, tuzlarin (örnegin NazsO4, K2504, (NHU2SO4, NaCl, NH4CI, NaBr ve NaSCN) tampona eklenmesi hidrofobik etkilesimlere neden olur. Bazi somut gösterimlerde, hareketli faz yaklasik 0.1M ila yaklasik 3.0M arasinda, örnegin yaklasik. O.lM ila yaklasik 1.5M arasinda, yaklasik 0.2M ila yaklasik 0.8M arasinda veya yaklasik O.3M ila yaklasik 0.5M arasinda bir tuz konsantrasyonu içerir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz tamponlanmaz. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 14 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 10 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5 ila yaklasik 7 arasindaki bir pH'a tamponlanir. Belirli somut gösterimlerde, hareketli faz, yaklasik 5.0'1ik bir pH'a tamponlanir. Bazi somut gösterimlerde, saf olmayan bir preparasyon veya bir ara elüat veya sürekli akis, hidrofobik etkilesim kromatografisi kolonuna (örnegin fenil kolonu) yüklenmeden önce yaklasik 4.5- M) arasinda degisen tuz (örnegin NaCl) konsantrasyonuna ayarlanir. Yükleme yapildiktan sonra, bir hidrofobik etkilesim kromatografisi kolonu, yaklasik 4.5-6.0 (örnegin yaklasik 4.5, (örnegin NaCl) konsantrasyonunu içeren bir yikama tamponu kullanilarak yikanabilir. Bazi somut gösterimlerde, hidrofobik etkilesim kromatografisi kolonu, yaklasik 4.5-6.0 (örnegin veya 0.5 M) arasinda degisen tuz (örnegin NaCl) konsantrasyonunu içeren bir elüsyon tamponu kullanilarak elüte edilir. Saflastirilmis IZS Proteinlerinin Karakterizasyonu Saflastirilmis rekombinant I2S proteini, çesitli yöntemler kullanilarak karakterize edilebilir. Saflik Saflastirilmis rekombinant IZS proteininin safligi tipik olarak nihai üründe bulunan çesitli safsizliklarin (örnegin konak hücre proteini veya konak hücre DNA'si) seviyesi ile ölçülür. Örnegin, konak hücre proteini (HCP) seviyesi, ELISA veya SDS-PAGE ile Ölçülebilir. Mevcut bulusta, saflastirilmis rekombinant 128 proteini, 150 ng'den daha az HCP/mg 128 proteini (örnegin 140, daha az HCP/mg IZS proteini) içerir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis rekombinant IZS proteini, gümüs boyali SDS-PAGE'ye maruz birakildiginda, %0.05, analiz kontrolünden daha fazla yogunluktaki yeni bantlara sahip degildir. Özellikle, FDA gibi düzenleyici kurumlar için kabul edilebilir olan çesitli analiz kontrolleri kullanilabilir. Spesifik Aktivite Saflastirilmis rekombinant IZS proteini, fonksiyonel ve/veya biyolojik aktivitenin degerlendirilmesiyle de karakterize edilebilir. Bir rekombinant IZS bilesiminin enzim aktivitesi, teknikte bilinen yöntemler kullanilarak belirlenebilir. Tipik olarak yöntemler, sülfat salim analizi olarak bilinen sülfatin sentetik bir substrattan çikarilmasinin tespit edilmesini içerir. Bir enzim aktivitesi analizinin bir örnegi, iyon kromatografisi kullanimini içerir. Bu yöntem, bir substrattan rekombinant IZS tarafindan enzimatik olarak salinan sülfat iyonlarinin miktarini ölçer. Substrat dogal bir substrat veya sentetik bir substrat olabilir. Bazi durumlarda, substrat, heparin sülfat (örnegin heparin disakkarit), dermatan sülfat veya bunun fonksiyonel bir esdegeridir. Tipik olarak, salinan sülfat iyonu bir iletkenlik dedektörüne sahip iyon kromatografisi ile analiz edilir. Bu örnekte, sonuçlar U/mg protein olarak eksprese edilebilir, burada 1 Birim (Unit), substrattan saat basina. 1 umol sülfat iyonu salinmasi için gereken enzim miktari olarak tanimlanir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis rekombinant IZS proteini, substrat olarak heparin disakkaritin kullanildigi in vitro sülfat salim aktivitesi analizi ile ölçülen sekilde, yaklasik O-lOO U/mg, yaklasik 40-60 U/mg arasinda degisen bir spesifik aktiviteye sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis rekombinant in vitro sülfat salim aktivitesi analizi ile ölçülen sekilde, en az yaklasik 5 U/mg, yaklasik 10 U/mg, yaklasik 15 U/mg, yaklasik U/mg, yaklasik 25 U/mg, yaklasik 30 U/mg, yaklasik 35 U/mg, 90 U/mg, yaklasik 95 U/mg veya yaklasik 100 U/mg'lik bir spesifik aktiviteye sahiptir. Substrat olarak heparin disakkaritin kullanildigi in vitro sülfat salim aktivitesi analizini gerçeklestirmeye yönelik örnek kosullar asagida sunulmustur. Tipik olarak, bu analiz, IZS'nin, dogal olarak türetilmis bir substrat olan heparin disakkaritten sülfat iyonlarini salim kabiliyetini ölçer. Salinan sülfat, iyon kromatografisi ile ölçülebilir. Bazi durumlarda, iyon kromatografisi bir iletkenlik dedektörü ile donatilmistir. Sinirlayici olmayan bir örnek olarak, numuneler, formülasyon tamponunda fosfat iyonlari ile inhibisyonu ortadan kaldirmak üzere 10 mM Na asetat, pH 6 ile degistirilen birinci tampondur. Numuneler daha sonra reaksiyon tamponu (10 mM Na asetat, pH 4.4) ile 0.075 mg/ml'ye seyreltilir ve 30 uL'lik bir reaksiyon hacminde 0.3 pg l2S/1OO ug substratlik bir enzim ila substrat oraninda heparin disakkarit ile 37°C'de 2 saat boyunca inkübe edilir. Reaksiyon daha sonra numuneleri 3 dakika boyunca 100°C'de isitmak suretiyle durdurulur. Analiz, bir IonPac AG18 koruma kolonuna sahip bir Dionex IonPac A518 analitik kolon kullanilarak gerçeklestirilir. 15 dakika boyunca 1.0 mL/dakikada 30 mM potasyum hidroksit ile bir izokratik yöntem kullanilir. 128 numunesi tarafindan salinan sülfat miktari, sülfat standartlarinin 1.7 ila 16.0 nmol araligindaki lineer regresyon testinden hesaplanir. Raporlanabilir deger, mg protein basina Birimler olarak eksprese edilir, burada 1 birim, saat basina salinan 1 ümol sülfat olarak tanimlanir ve protein konsantrasyonu A280 ölçümleri ile belirlenir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS proteininin enzimatik aktivitesi, örnegin, 4-metilumbelliferil-sülfat ila sülfat ve dogal olarak floresan 4-metilumbelliferon (4-MUF) hidrolizini ölçen 4-MUE` analizi gibi teknikte bilinen çesitli yöntemler kullanilarak belirlenebilir. Bazi somut gösterimlerde, in vitro 4-MUF analizi ile ölçülen sekilde, üretilen rekombinant IZS proteininin istenen bir enzimatik aktivitesi en az yaklasik 0.5 U/mg, 1.0 U/mg, 1.5 U/mg, U/mg'dir. Bazi somut gösterimlerde, in vitro 4-MUF analizi ile ölçülen sekilde, üretilen rekombinant IZS proteininin istenen bir enzimatik aktivitesi, yaklasik 0-50 U/mg (örnegin yaklasik arasinda degisir. In vitro 4-MUF analizini gerçeklestirmeye yönelik örnek kosullar asagida sunulmustur. Tipik olarak bir 4- MUF analizi, bir IZS proteininin, 4-metilumbelliferil-sülfat (4- MUF-SO4) ila sülfat ve dogal olarak floresan 4-metilumbelliferon (4-MUF)'u hidrolize etme kabiliyetini ölçer. Bir milibirim aktivitesi, bir 4-MUF-SO4 nanomolünü bir dakika içerisinde 37°C'de 4-MUF'a dönüstürmek için gerekli olan enzini miktari olarak tanimlanir. Tipik olarak, bilinen aktiviteye sahip 125 test numuneleri tarafindan üretilen ortalama floresan birimleri (MFU), ilgi konusu bir numunenin enzimatik aktivitesini hesaplamak için kullanilabilen standart bir egri olusturmak için kullanilabilmektedir. Spesifik aktivite daha sonra enzim aktivitesinin protein konsantrasyonu ile bölünmesiyle hesaplanabilir. Her iki örnekte, bir rekombinant IZS bilesiminin protein konsantrasyonu, protein konsantrasyonlarini saptanmaya yönelik teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntem ile belirlenebilir. Bazi durumlarda, protein konsantrasyonu bir ultraviyole isik absorbans analizi ile belirlenir. Söz konusu absorbans analizleri tipik olarak yaklasik 280 nm'lik bir dalga boyunda gerçeklestirilir (A280). Yük Profili Saflastirilmis rekombinant 128, protein ile iliskili yük profili ile karakterize edilebilir. Tipik olarak, protein yük profili, tipik olarak proteinin yüzeyi üzerinde bulunan kalinti yan zincir yüklerinin paternini yansitir. Yük profili, protein üzerinde bir iyon degistirme (IEX) kromatografisi (örnegin HPLC) analizi gerçeklestirilerek belirlenebilir. Bazi somut gösterimlerde, bir "yük profili", bir degistirme iyonu içeren bir hareketli fazin kolonuna eklendikten sonra çok kisa bir sürede bir iyon degistirme kolonundan elüte edilmis protein miktarini temsil eden bir degerler setini ifade eder. Tipik olarak, uygun bir iyon degistirme kolonu, bir anyon degistirme kolonudur. Örnegin, bir yük profili, yüksek performansli bir sivi kromatografisi (HPLC) sistemi kullanilarak güçlü anyon degistirme (SAX) kromatografisi ile belirlenebilir. Genel olarak, rekombinant 128, güçlü bir anyon degistirme kolonunun sabit pozitif yüküne adsorbe edilir ve önceden belirlenmis bir akis hizindaki bir hareketli faz kullanilarak artan iyonik güç gradyani, pozitif yüklü kolon ile iyonik etkilesimlerinin gücü ile orantili olarak rekombinant 128 türlerini kolondan elüte eder. Daha fazla negatif yüklü (daha asidik) 128 türleri, daha az negatif yüklü (daha az asidik) 128 türlerinden daha sonra elüte olurlar. Elüattaki proteinlerin konsantrasyonu, ultraviyole isik absorbansi (280 nm'de) ile tespit edilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant 128, bir Mini Q PE kolonunun sabit pozitif yüküne yaklasik 8.0 pH'da 20 mM TRIS- HCl'de adsorbe edilir ve 0.8 ml/dakikalik bir akis hizinda 20 mM TRIS-HCL, 1 M sodyum klorür, pH 8.0'dan olusan bir hareketli faz kullanilarak artan iyonik güç gradyani, pozitif yüklü kolon ile iyonik etkilesimlerinin gücü ile orantili olarak rekombinant IZS Bazi somut gösterimlerde, bir yük profili, HPLC kolonundan elüsyonun ardindan zamana karsi absorbans birimlerinin bir kromatogrami ile gösterilebilir. Kromatogram, bir veya daha fazla pikten olusan bir set içerebilir ve setteki her bir pik, benzer yüzey yüklerine sahip bilesimin rekombinant IZS'lerinin bir alt-popülasyonunu tanimlar. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir 128 protein bilesimi, yük profilinde en az alti pik sergiler. Örnekler bölümünde ve Sekil ll'de IZS'nin örnek bir yük profili gösterilmistir. Sekil ll'de gösterildigi gibi, negatif yüklerin artmasi ve kromatogramin toplam pik alanina olan katkinin azaltilmasi sirasina göre alti pik (A'dan F'ye) isaretlenmistir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant IZS bilesimine yönelik yük profili, proteinin yüzeyindeki negatif veya pozitif yüklerin miktarina bagli olarak farkli sayi, boyut, sekil veya zaman araligi içerir. Bazi somut gösterimlerde, bir rekombinant IZS bilesimi, 6'dan daha az (örnegin 5, 4, 3 veya 2'den daha az) pike sahip bir yük profiline sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant IZS'nin bir yük profili 5, 4, 3, 2 veya 1 pik(ler)e sahip olabilir. Örnegin, A, B, C, D, E ve F piklerinin herhangi bir, iki, üç, dört veya besi, saflastirilmis bir rekombinant 128 protein bilesiminde mevcut olmayabilir veya indirgenebilir. Tipik olarak, bir yük profili, daha az pik olmasi durumunda daha homojen olarak kabul edilir. Glikan Haritalamasi Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant 128 proteini, tipik. olarak. glikan haritalamasi diye adlandirilan proteoglikan bilesimi ile karakterize edilebilir. Herhangi bir teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, glikan baglantisinin, dal yapisinin sekli ve karmasikligi ile birlikte in Vivo klerans, lizozomal hedefleme, biyoyararlanim ve/Veya etkinligi etkileyebilecegi düsünülür. Tipik olarak, bir glikan haritasi, enzimatik parçalama ve sonraki kromatografik test ile belirlenebilir. Uygun glikozilazlar, peptidazlar (örnegin Endopeptidazlar, Ekzopeptidazlar), proteazlar ve fosfatazlar da dahil olmak üzere, ancak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, enzimatik parçalama için çesitli enzimler kullanilabilir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir enzim alkalin fosfatazdir. Bazi somut gösterimlerde, uygun bir enzim nöraminidazdir. Glikanlar (örnegin fosfoglikanlar), kromatografik test ile tespit edilebilir. Örnegin, fosfoglikanlar, Darbeli Amperometrik Tespitli (HPAE-PAD) Yüksek Performansli Anyon Degistirme Kromatografisi veya boyut dislama Yüksek Performansli Sivi Kromatografisi (HPLC) ile tespit edilebilir. Bir glikan haritasi üzerindeki her pik tarafindan temsil edilen. glikan (örnegin fosfoglikan) miktari, teknikte bilinen ve burada açiklanan yöntemlere uygun olarak standart. bir glikan egrisi (örnegin fosfoglikan) kullanilarak hesaplanabilir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir 128, yedi adet pik grubunu içeren bir glikan haritasi sergilemekte olup söz konusu gruplar sirasiyla asagidakilerin göstergesidir: nötr (pik grubu 1), Hwno-siyale (pik grubu 2), di-siyale (pik grubu 3), monofosforile (pik grubu 4), tri-siyale (pik grubu 5), tetra-siyale (pik grubu 6) ve difosforile (pik grubu 7). Sekil 10'da örnek 128 glikan haritalari gösterilmistir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant IZS, 7'den daha az pik grubuna sahip bir glikan haritasina (örnegin 6, 5, 4, :3 veya 2 pik grubuna sahip bir glikan haritasi) sahiptir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant IZS, 7'den fazla (örnegin, 8, 9, 10, 11, 12 veya daha fazla) pik grubuna sahip bir glikan haritasina sahiptir. Her bir pik grubuna karsilik gelen göreceli glikan miktari, önceden belirlenmis bir referans standarttaki karsilik gelen pik grubu alanina göre pik grubu alanina bagli olarak belirlenebilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 1 (nötr), bir referans standarttaki karsilik gelen pik grubu alanina göre yaklasik %50-110) arasinda degisen pik grubu alanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 2 (monosiyale), referans standarttaki karsilik gelen pik. grubu alanina göre pik grup alanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 3 (disiyale), referans standarttaki karsilik gelen pik degisen pik grup alanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 4 (monofosforile), referans standarttaki karsilik gelen pik grubu alanina göre yaklasik yaklasik %250-400) arasinda degisen pik grup alanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 5 (trisiyale), referans standarttaki karsilik gelen pik. grubu alanina göre pik grup alanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 6 (tetra-siyale), referans standarttaki karsilik gelen pik degisen pik grup alanina sahip olabilir. Bazi somut gösterimlerde, pik grubu 7 (difosforile), referans standarttaki karsilik gelen pik grubu alanina göre yaklasik %70-130 (örnegin arasinda degisen pik grup alanina sahip olabilir. Glikan haritalamasina yönelik çesitli referans standartlari, teknikte bilinir ve mevcut bulusu uygulamak için kullanilabilmektedir. Tipik olarak, pik grubu 7 (difosforile), saflastirilmis rekombinant IZS proteininin yüzeyindeki di-M6P seviyesine karsilik gelir. Saflastirilmis bir IZS'nin glikozilasyon paterninin lizozomal hedeflemeyi etkiledigi düsünülür. Çesitli in vitro hücresel alim analizleri teknikte bilinir ve mevcut bulusu uygulamak için kullanilabilmektedir. Örnegin, hücresel alim analizleri, yüzeylerinde M6P reseptörlerini eksprese eden insan fibroblastlari kullanilarak gerçeklestirilir. Içsellestirilmis IZS miktari bir ELISA yöntemi ile ölçülebilmektedir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant IZS proteini, in vitro Peptit Haritalamasi Bazi somut gösterimlerde, peptit haritalamasi, amino asit bilesimini, translasyon sonrasi modifikasyonlari ve/veya hücresel islemeyi; örnegin bir sinyal peptidinin bölünmesini, formilglisin dönüsümünü ve/Veya glikozilasyonu karakterize etmek için kullanilabilir. Tipik olarak, bir rekombinant protein, bir patern veya peptit haritasi üretmek için kontrollü ya da rastgele ayrilma yoluyla, ayri peptit fragmanlarina ayrilabilir. Bazi durumlarda, saflastirilmis bir IZS proteini, ilk olarak analitik testten önce enzimatik parçalanmaya tabi tutulabilir. Parçalanma, analitik testten önce bir peptidaz, glikozit hidrolaz, fosfataz, lipaz veya proteaz ve/veya bunlarin kombinasyonlari kullanilarak gerçeklestirilebilir. Peptitlerin yapisal bilesimi, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak belirlenebilir. Örnek yöntemler arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Kütle spektrometrisi, Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya HPLC bulunur. Yüzde Formilglisin Dönüsümü Peptit haritalamasi, Yüzde FGly dönüsümünü belirlemek için kullanilabilmektedir. Yukarida söz konusu edilen sekilde, IZS aktivasyonu, asagida gösterilen sekilde formilglisin üreten enzim (FGE) tarafindan (olgun insan IZS'nin 59 konumuna karsilik gelen) Sisteinin formilglisine dönüsümünü gerektirir: XxxXxnysXxxPrDXxxArgXxxXxx .. XxxXxxFGIyXxxProXxxArgXxxXxx (San (Am) Üreten enzim (Ah) Bu nedenle, formilglisin. dönüsüni yüzdesi (%FG) asagidaki formül kullanilarak hesaplanabilmektedir: Aktif I2S moleküllerinin sayisi Toplam (aktif+inaktif) IZS moleküllerinin sayisi proteaz (örnegin tripsin veya kimotripsin) kullanilarak kisa peptitlere parçalanabilir. Kisa peptitler, örnegin boyut dislama Yüksek Performansli Sivi Kromatografisi (HPLC) kullanilarak ayrilabilir ve karakterize edilebilir. Olgun insan IZS'nin 59 pozisyonuna karsilik gelen pozisyonu içeren peptit, 59 pozisyonundaki Cys'in bir kontrole (örnegin FGly dönüsümü olmayan bir 125 proteini veya %100 FGly dönüsümlü bir IZS proteini) kiyasla bir FGly'ye dönüstürülüp dönüstürülmedigini belirlemek üzere karakterize edilebilir. FGly içeren peptidlerin miktari (aktif I2S moleküllerinin sayisina karsilik gelir) ve hem FGly hem de Cys içeren toplam peptit miktari (toplam 128 moleküllerinin sayisina karsilik gelir), karsilik gelen pik alanlarina göre belirlenebilir ve Mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant IZS proteini, insan IZS'deki (SEQ ID NO: 1) Cy559'a karsilik gelen sistein kalintisinin Cd-formilglisine (FGly) en az %70 mevcut bulusa uygun olan saflastirilmis bir rekombinant IZS proteini, insan IZS'deki (SEQ ID NO: 1) Cys59'a karsilik gelen sistein kalintisinin Cd-formilglisine (FGly) büyük ölçüde %100 dönüsümüne sahiptir. Siyalik Asit Içerigi Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant 128 proteini, siyalik asit bilesimi ile karakterize edilebilir. Teori ile sinirlanmak istememekle birlikte, proteinler üzerindeki sialik asit kalintilarinin, hepatositlerde bulunan asiyaloglikoprotein reseptörleri araciligiyla hizli in Vivo kleransini önleyebilecegi, azaltabilecegi veya inhibe edebilecegi düsünülür. Dolayisiyla, nispeten yüksek sialik asit içerigine sahip rekombinant proteinlerin tipik olarak nispeten uzun bir in vivo sirkülasyon süresine sahip olduklari düsünülür. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant IZS proteininin siyalik asit içerigi, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak belirlenebilir. Örnegin, bir rekombinant 125 proteininin siyalik asit içerigi, enzimatik parçalama ve sonraki kromatografik analiz ile belirlenebilir. Enzimatik parçalama, herhangi bir uygun siyalidaz kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bazi durumlarda, parçalama, nöraminidaz gibi bir glikozit hidrolaz enzimi tarafindan gerçeklestirilir. Siyalik asit, örnegin, Darbeli Amperometrik, Tespitli (HPAE-PAD) Yüksek Performansli Anyon Degistirme Kromatografisi gibi kromatografik analiz ile tespit edilebilir. Bir rekombinant 128 bi1esimindeki siya1ik asit miktari, teknikte bilinen ve burada açiklanan yöntemlere uygun olarak standart bir siyalik asit egrisi kullanilarak hesaplanabilir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant IZS proteininin siyalik asit içerigi 16 mol/mol'den daha fazla olabilir. Siyalik asit içerigi baglaminda "mol/mol" birimleri, enzim molü basina siyalik asit kalintisi mollerini ifade eder. Bazi durumlarda, rekombinant bir 128 proteininin siyalik. asit içerigi yaklasik. 16.5 mol/mol, 22 mol/mol veya daha fazladir. Bazi somut gösterimlerde, saflastirilmis bir rekombinant IZS proteininin siyalik asit mol/mol arasindaki bir aralikta olabilir. Saflastirilmis rekombinant 128 proteini, bilinen yöntemlere uygun olarak bir Hunter Sendromlu hastaya uygulanabilir. Örnegin, saflastirilmis rekombinant IZS proteini intravenöz, subkütan, intramüsküler, parenteral, transdermal veya transmukozal (örnegin oral veya nazal olarak) olarak verilebilir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant. bir 125 veya bunu içeren farmasötik bir bilesim, bir denege intravenöz uygulama yoluyla uygulanir. Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 veya bunu içeren farmasötik bir bilesim, bir denege intratekal uygulama yoluyla uygulanir. Burada kullanilan sekliyle, omurga kanalina (omuriligi çevreleyen intratekal bosluk) yapilan bir enjeksiyonu ifade eder. Sinirlama olmaksizin, bir burr deligi veya sisternal veya lomber ponksiyon ya da benzeri yoluyla lateral serebroventriküler enjeksiyon dahil olmak üzere çesitli teknikler kullanilabilir. Bazi somut gösterimlerde, mevcut bulusa uygun olan "intratekal uygulama" veya "intratekal verme", lomber alani veya bölgesi araciligiyla IT uygulamasini veya vermesini, baska bir ifadeyle lomber IT uygulamasini veya vermesini ifade eder. Burada kullanilan sekliyle, "lomber bölge" veya "lomber alan" terimi, üçüncü ve dördüncü lomber (bel) omurlari ve daha çok omurganin L2-Sl bölgesi arasindaki bölgeyi ifade Bazi somut gösterimlerde, rekombinant bir 128 veya bunu içeren farmasötik bir bilesim, bir denege subkütan (örnegin deri altindan) uygulama yoluyla uygulanir. Bu gibi amaçlar için, formülasyon bir siringa kullanilarak enjekte edilebilir. Bununla birlikte, enjeksiyon cihazlari (örnegin Inject-easeTM and GenjectTM cihazlari); enjektör kalemleri (örnegin GenPenm); ignesiz cihazlar (örnegin MediJectorTM ve BioJectorm); ve subkütan yama verme sistemleri gibi formülasyonun uygulanmasina yönelik baska cihazlar da mevcuttur. Bazi somut gösterimlerde, intratekal uygulama, diger uygulama yollariyla (örnegin intravenöz, subkütan, intramüsküler, parenteral, transdermal veya transmukozal olarak (örnegin oral veya nazal olarak)) birlikte kullanilabilir. Mevcut bulus, terapötik olarak etkili bir miktardaki rekombinant bir IZS'nin veya burada tarif edilen rekombinant uygulamalarini öngörür. Rekombinant bir 125 veya bunu içeren farmasötik. bir bilesim, hastanin durumunun (örnegin bir lizozomal depo hastaligi) dogasina, siddetine ve kapsamina bagli olarak düzenli araliklarla uygulanabilmektedir. Bazi uygulamalarda, terapötik olarak etkili bir miktardaki rekombinant bir IZS veya bunu içeren farmasötik bilesim, düzenli araliklarla periyodik olarak (örnegin yilda bir, alti ayda bir, bes ayda bir, üç ayda bir, iki aylik (iki ayda bir), aylik (ayda bir), iki haftalik (iki haftada bir), haftalik, günlük veya sürekli) uygulanabilir. Rekombinant bir IZS veya bunu içeren farmasötik bir bilesim, farmasötik bir bilesimi hazirlamak için fizyolojik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyanla formüle edilebilmektedir. Tasiyici ve terapötik madde steril olabilmektedir. Formülasyon uygulama tarzina uygun olmalidir. Uygun farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, su, tuz çözeltileri, (örnegin NaCl), salin, tamponlu salin, alkoller, gliserol, etanol, arap zamki, bitkisel yaglar, benzil alkoller, polietilen glikoller, jelatin, laktoz, amiloz veya nisasta gibi karbonhidratlar, mannitol, sükroz veya digerleri gibi sekerler, dekstroz, magnezyum stearat, talk, silisik asit, Viskoz parafin, parfüm yagi, yag asidi esterleri, hidroksimetilselüloz, polivinil pirolidon, vb. ile birlikte bunlarin kombinasyonlari bulunur. Farmasötik preparasyonlar, istenmesi durumunda, aktif bilesikler ile zararli sekilde reaksiyona girmeyen veya aktivitelerine müdahale etmeyen yardimci ajanlarla (örnegin yaglayicilar, koruyucular, stabilizörler, islatici ajanlar, emülsiyonlastiricilar, ozmotik basinci etkilemeye yönelik tuzlar, tamponlar, renklendirme, tatlandirma maddeleri ve/Veya aromatik maddeler ve benzerleri) karistirilabilmektedir. Bazi uygulamalarda, intravenöz uygulama için uygun bir suda çözünür tasiyici kullanilir. Bilesim veya ilaç, istenmesi durumunda, ayrica az miktarda islatici veya emülsifiye edici ajanlar veya pH tamponlayici ajanlar da içerebilmektedir. Bilesim, bir sivi çözelti, süspansiyon, emülsiyon, tablet, hap, kapsül, sürekli salimli formülasyon veya toz olabilmektedir. Bilesim ayrica trigliseritler gibi geleneksel baglayicilar ve tasiyicilar ile bir supozituvar olarak da formüle edilebilmektedir. Oral formülasyon arasinda farmasötik kalitedeki mannitol, laktoz, nisasta, magnezyum. stearat, polivinil pirollidon, sodyum sakarin, selüloz, magnezyum karbonat vb. gibi standart tasiyicilar bulunabilir. Bilesim veya ilaç, insanlara uygulanacak sekilde uyarlanmis farmasötik bir bilesim olarak rutin prosedürlere uygun olarak formüle edilebilmektedir. Örnegin, bazi uygulamalarda, intravenöz uygulamaya yönelik bir bilesim tipik olarak steril izotonik sulu tampondaki bir solüsyondur. Gerekli olmasi durumunda, bilesim ayrica bir çözücü ajan ve enjeksiyon bölgesinde agriyi hafifletmek için bir lokal anestezik içerebilir. Genel olarak, bilesenler, ayri ayri sunulur ya da örnegin, aktif ajan miktarini belirten bir ampul veya tek dozluk paket gibi hermetik olarak kapatilmis bir kap içindeki kuru bir liyofilize toz veya su içermeyen konsantre seklinde birim dozaj formunda birlikte karistirilir. Bilesimin infüzyon yoluyla uygulanacagi durumlarda, steril farmasötik kalitesinde su, salin veya dekstroz/su içeren bir infüzyon sisesi ile dagitilabilmektedir. Bilesimin enjeksiyon yoluyla uygulandigi durumlarda, enjeksiyon veya salin için bir steril su ampulü saglanabilir, böylece bilesenler uygulamadan önce karistirilabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "terapötik olarak etkili miktar" terimi büyük ölçüde mevcut bulusa ait farmasötik bilesimlerde yer alan terapötik ajanin toplam miktarina göre belirlenir. Genel olarak, terapötik olarak etkili bir miktar, denege önemli bir yarar saglamak (örnegin altta yatan hastaligi veya durumu tedavi etmek, modüle etmek, iyilestirmek, önlemek ve/Veya hafifletmek) için yeterlidir. Örnegin, terapötik olarak etkili bir miktar, lizozomal enzim reseptörlerini veya bunlarin aktivitelerini module etmek ve böylece söz konusu lizozomal depo hastaliklarini veya bunlarin semptomlarini tedavi etmek için yeterli olan bir miktar gibi istenen bir terapötik ve/veya profilaktik etki (örnegin mevcut bulusa ait bilesimlerin bir denege uygulanmasinin ardindan "zebra Cisimcikleri" veya hücresel vakuolizasyon varliginin veya insidansinin azaltilmasi veya ortadan kaldirilmasi) elde etmek için yeterli bir miktar olabilir. Genel olarak, ihtiyaç duyan bir hastaya uygulanan terapötik bir ajanin (örnegin rekombinant bir lizozomal enzim) miktari, denegin özelliklerine bagli olacaktir. Söz konusu özellikler arasinda denegin durumu, hastalik siddeti, genel sagligi, yasi, cinsiyeti ve vücut agirligi bulunur. Teknikte uzman bir kisi, bunlara ve diger ilgili faktörlere bagli olarak uygun dozajlari kolayca belirleyebilecektir. Ayrica, optimal dozaj araliklarini tanimlamak için hem objektif hem de subjektif analizler istege bagli olarak kullanilabilir. Terapötik olarak etkili bir miktar, çoklu birim dozlar içerebilen bir dozlama rejiminde yaygin olarak uygulanir. Herhangi bir terapötik protein için, terapötik olarak etkili bir miktar (ve/veya etkili bir dozlama rejimi içindeki uygun bir* birim. doz), örnegin, uygulama sekline bagli olarak, diger farmasötik ajanlarla kombinasyon halinde degisiklik gösterebilir. Ayrica, belirli herhangi bir hasta için spesifik terapötik olarak etkili miktar (ve/veya birim doz), tedavi edilen bozukluk ve bozuklugun siddeti; kullanilan spesifik farmasötik ajanin aktivitesi; kullanilan spesifik bilesim; hastanin yasi, vücut agirligi, genel sagligi, cinsiyeti ve diyeti; uygulama süresi, uygulama sekli ve/veya kullanilan spesifik füzyon proteininin atilim veya metabolizmar hizi; tedavinin süresi; tip alanlarindai iyi bilinen benzeri faktörler dahil olmak üzere çesitli faktörlere bagli olabilir. Örnek niteligindeki ek farmasötik bilesimler ve uygulama yöntemleri, "Methods and Compositions for CNS Delivery of Yayininda ve 30 Mart 2012 tarihinde kayda geçirilen baslikli 671/618,638 numarali provizyonel basvuru dizisinde tarif edilmistir. Ayrica belirli herhangi bir denek için spesifik dozaj rejiminin bireysel ihtiyaca ve enzim replasman tedavisini uygulayan veya uygulanmasini denetleyen kisinin profesyonel degerlendirmesine göre zaman içinde ayarlanabildigi ve burada belirtilen konsantrasyon araliklarinin sadece örnek oldugu ve hak talebinde bulunulan bulusun kapsamini veya uygulamasini kisitlamayi amaçlamadigi anlasilmalidir. ÖRNEKLER Örnek 1: Rekombinant I2S AF Yakalama ve Saflastirma Islemi Bu örnek, serumsuz ortamda üretilen rekombinant IZSZ'yi yakalamak ve saflastirmak için basitlestirilmis bir asagi akis saflastirma islemini gösterir. Örnek bir saflastirma semasi Sekil 1'de gösterilmistir. Bir iduronat-Z-sülfataz enzimini (IZS) ve formilglisin üreten enzimi (FGE) stabil olarak eksprese eden bir hücre hatti gelistirilmistir. Örnek hücre hatlarinin üretilmesi ve karakterizasyonu, "Cells for Producing Recombinant Basvurusunda tarif edilmistir. Kisacasi, bir insan hücre hatti, SEQ ID NO: 2'de gösterilen amino asit sekansina sahip insan IZS proteinini ve SEQ ID NO: 5'te gösterilen amino asit sekansina sahip insan formilglisin üreten enzimi (FGE) birlikte eksprese edecek sekilde tasarlanmistir. Tam Uzunluktaki Prekürsör iduronat 2-sülfataz MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDK LVRSPN1DQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAG NFSTIPQYFKENGYVTM SVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKY ENTKTCR GPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPH PVDFQRKIRQSYFASV SYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEW AKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVE LVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPREL GELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP Tam uzunluktaki insan FGE prekürsörü: MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQ RPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDG EAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTN RLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYAN]WQGEFPVTNTGEDGFQGT APVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGS YMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD Tam uzunluktaki IZS enziminin sentezinden sonra, 25 amino asit sinyal peptidi çikarilir ve çözünebilir bir olgun I2S enzimi hücreden salgilanir. Biyoreaktör isleminde kimyasal olarak tanimlanmis bir ortam (serum/hayvan bileseni içermeyen; AF) kullanilmistir. Tek hasat materyali hacimce azaltilmis ve bir ultrafiltrasyon/dialfiltrasyon islemi ile tampon degistirilmistir. Saflastirilmamis yigin (UPB) olarak adlandirilan materyal, tek hasat için -50°C'de dondurulmustur. Asagi akis saflastirma islemi, saflastirilmamis yigin çözülmesi ve havuzu ile baslamis ve ardisik viral inaktivasyon, anyon degistirme (Capto Q), karisik mod (seramik hidroksiapatit), katyon degistirme (SP Sefaroz) ve hidrofobik etkilesim (Fenil Sefaroz) kromatografisi asamalari ve ardindan Viral filtrasyon ve nihai konsantrasyon ve diafiltrasyon asamasini içermistir. Özellikle, bu saflastirma islemi, Q, hidroksiapatit, SP ve Fenil kromatografik modalitelerini kullanmistir. IZS saflastirma isleminde geleneksel olarak kullanilan Protein G Kromatografisi ve Boyut Dislama Kromatografisi kaldirilmistir. Örnek asamalar Tablo 3'te gösterilmistir. Tablo 3: Saflastirma isleminin Örnek Asamalari falüi'lzlûxciuiünrs Slcpsiîrlhirnîrû'hîn Pvûccxx Donmus Depo l"ii'i. cn Zil-tiras.." Çözme, Havuz ve Derinlik Filtrasyonu Çözücü/Deterjan Viral Inaktivasyonu Anyon-degistirme Kromatografisi Anudi;asirtctîuvrnnngnwhw Karisik-mod Kromatografisi Seyreltme (1-1.2 kat) LJHini`\iê 1 1.2 i~IJ5 Katyon-degistirme Kromatografisi Hidrofobik etkilesim Kromatografisi Etkin Madde Saflastirilmis IZS proteini, peptit haritalamasi, SBS-PAGE (Gümüs), boyut dislama HPLC'si ile saflik açisindan degerlendirilmistir. Standart yöntemler kullanilarak enzime özgü aktivite, formilglisin içerigi, siyalik asit içerigi, glikan haritasi, yük profilleri belirlenmistir. Örnek sonuçlar Tablo 4'te gösterilmistir. Tablo 4: Saflastirilmis Rekombinant I2$ Protein Analizi Analiz Saflastirilmis 128 (10 L ölçek) M4" "aba Ion` L12 %102-102 (n=3) Peptit Haritalamasi L13 %96-97 (n=3) L14 %102-103 (n=3) L17 %101-101 (n:3) Konak Hücre <62.5 (n=5) SDS-PAGE Uygundur Iyon Degistirme %Pik A %69-69 (n=2) %20-21 91341; D ln-'7\ HPLC %Pik E+F %lO-ll (n=2) oyut is ama %99.9-99.9 (n=5) Hucresel Alim %85, 95 ve %97 (n=3) (El-::7n'1h-i-l-:I7` Spesifik Aktivite 62-78 (n=5) Glikan Haritasi Pk Grp 3 %88-93 (n=5) Pk Grp 6 %124-133 (n=5) Pk Grp 7 %78-87 (n=5) Toplam Alan %94-116 (n=5) Siyalik Asit 16-22 (n=4) Endotoksin <0.04-0.05 (n=2) Piyasadan temin edilebilen IZS referansina kiyasla örnek bir peptit haritasi Sekil 2'de gösterilmistir. Örnek SDS-PAGE (Gümüs) analiz sonuçlari Sekil 3'te gösterilmistir. Tipik olarak, burada tarif edilen bir islem kullanilarak, ilaç etkin maddesinin (DS) HCP konsantrasyonu dahil birçok pazarda gerekli olan karsilamistir. DS'nin SEC'i, %99.5 idi ve ayni zamanda birçok pazardaki mevcut %99.3'lük pazarlama spesifikasyonu ihtiyacini karsilamistir. Örnek yük profili Sekil 4'te gösterilmistir. Örnek glikan haritasi Sekil 5'te gösterilmistir. Özellikle, saflastirilmis I2S'nin glikan haritasi, elüsyon, nötr, mono-, disiyale, monofosforile, trisiyale ve hibrid (monosiyale ve baslikli M6P), tetrasiyale ve hibrid (disiyale ve baslikli M6P) ve difosforile glikanlar sirasina göre temsil eden ve siyalik asit ve mannoz-6-fosfat kalintilarindan türeyen artan miktardaki negatif yüklere göre elüte eden yedi pik grubu Birlikte ele alindiginda, bu örnek, hayvansiz ortamda üretilen rekombinant IZS'nin büyük ölçekte basarili bir sekilde saflastirilmasi için basitlestirilmis bir dört kolonlu saflastirma isleminin kullanilabilecegini gösterir. Örnek 2: Rekombinant I2S AF'nin Hasat ve Viral Inaktivasyon Stabilite Çalismalari Bu çalismanin amaci, sicaklik tutma süresinin ve donma-çözme döngülerinin rekombinant 128 ile berraklastirilmis hasat stabilitesi üzerindeki etkilerini degerlendirmektir. Berraklastirilmis hasat numuneleri ortam sicakliginda ve 2- 8°C'de yedi güne kadar depolanmis ve viral inaktive edilmis UPB numuneleri 24 saate kadar ortam sicakliginda tutulmustur. Berraklastirilmis hasatlar üzerindeki donma- çözme numuneleri -20°C, -50°C ve -80°C'de dondurulmus ve üç döngüye kadar donma-çözme deneyimlenmistir. Stabilite, Western blot, SEC HPLC ve aktivite analizi kullanilarak ölçülmüstür. istenen bir kanama oranina sahip bir B. Braun 20L biyoreaktör kullanilarak CCPD tarafindan 2D hücre hattindan üretilmistir. Sicaklik tutma çalismasi için, berraklastirilmis her hasat, ortam ve 2-8°C'de depolanmis ve seçilen tutma sürelerinde numunelenmistir. Numuneleme miktarlari ve tutma süreleri Tablo 5'te listelenmistir. Donma-çözme numuneleri -20°C, -50°C ve -80°C'de depolanmis ve 25°C'de bir su banyosu kullanilarak çözülmüstür. Tablo 5. Berraklastirilmis Hasat Tutma Noktasi Stabilitesi Numuneler Tutma Sicakligi Tutma Süresi 1900 'ICQn BerraklastirilnilS X 0.5 mLOrtam T=O, 248, 768, 9 x 0.5 mL -20°C, -50°C, ve -Donma/Çözme 1, 100:` 'IÇQÜ BerraklastirilnilS x 0.5 mLOrtam T=O, 248, 768, Ujoji- 'IQ 1'7no 1ÂQO 9 x 0.5 mL -20°C, -50°C, ve -Donma/Çözme l, Viral inaktivasyon asamasi, birinci kolona yüklemeden önce saflastirilmamis yigin asamasinda meydana gelmistir. UPB, berraklastirilmis hasat konsantrasyonu ve tampon degisimi ile üretilmistir. UF/DF, bir Pall 1 sq. Ft Centramate sistemi kullanilarak gerçeklestirilmis ve tampon, 10 mM MES, 155 mM NaCI, pH=6.5 olarak degistirilmistir. Viral inaktivasyon asamasi, her zaman noktasi için Durapore siringa filtreleri kullanilarak filtrelenen %1 Tween 80 ve %O-3 TnBP eklemistir- Tablo 6'da listelenen her zaman noktasinda numuneler alinmis ve -80°C'de dondurulmustur. Berraklastirilmis hasat tutma noktasindan ve donma-çözündürme çalismalarindan alinan numuneler, Western blot ve aktivite (4-MU analizi) ile test edilmistir. Viral inaktivasyondan alinan UPB numuneleri, SEC HPLC ile saflik açisindan test edilmistir. Tablo 5'teki Hasat 12 ve l8'den elde edilen tutma noktasi aktivitesi sonuçlari, her iki hasat için ortamda ve 2-8°C'de 7 günlük depolamada önemli degisiklikler göstermemistir. -20°C, -50°C ve -80°C'de depolanan 3 donma-çözme döngüsüne kadar olan Hasat 12 aktivitesinde önemli degisiklikler görülmemistir. Tablo 6. Saflastirilmamis Yiginin Viral Inaktivasyonu NumunelerTutma Sicakligi Tutma Süresi Viral 9 x 0.50rtam, Kontrol TîO, 68, 248 9 x 0.50rtam, Viral mL Inaktivasyon Viral inaktivasyon UPB asamasinin stabilitesine yönelik aktivite ve SEÇ-HPLC, Sekil 6 ve 7'de tarif edilmistir. Bu, 24 saate kadar aktiviteye ve safliga dayanan viral inaktivasyon stabilitesinde herhangi bir sorun olmadigini gösterir. Kisacasi, burada tarif edilen stabilite analizine dayanarak, berraklastirilmis hasat, hasat kalitesinde önemli degisiklikler olmaksizin. 2-8°C'de (örnegin '7 güne kadar) saklanabilmektedir. Berraklastirilmis hasatlar, çoklu donma- çözme döngüleri deneyimleyebilmekte ve -20°C, -50°C ve -80°C sicakliklarda stabilitede önemli degisiklikler olmadan depolanabilmektedir. SEC HPLC saflik sonuçlarina dayanarak, UPB asamasinda Viral inaktivasyon, aktivite ve saflikta hiçbir` degisiklik olmadan ortam sicakliginda (örnegin 24 saate kadar) meydana gelebilmektedir. Örnek 3: Hayvansiz IL CD Ortam Dogrulama Çalismasinin Saflastirilmasi ve Analizi Bu Çalismanin amaci, kimyasal olarak tanimlanmis ortam kullanilarak hayvan içermeyen bir perfüzyonda üretilen 128- AF'nin havuzlanmis hasadinin saflastirilmasini gerçeklestirmek ve etkin maddesini karakterize etmektir. Bu çalisma, IZS-AF saflastirma islemi performansini ve kimyasal olarak tanimlanmis bir ortam biyoreaktöründen üretilen etkin maddeyi (DS) degerlendirmistir. Hücre Kültürü formilglisin üreten enzimi (FGE) eksprese eden 2D hücre hattindan üretilmistir. Materyal, kimyasal olarak tanimlanmis serumsuz bir ortam kullanilarak bir 1L Das Gip sikma filtresi biyoreaktöründeki CCPD'de üretilmistir. Berraklastirilmis her hasattan (HI-21) alinan ayri torbalar -20°C'de dondurulmus ve gece boyunca 2-8 °C'de Çözdürülmüstür. Berraklastirilmis her hasattan alinan esit hacimler, tüm hasat havuzunu temsil edecek sekilde havuzlanmis, daha sonra 0.2ü filtrelenmis ve 1 ft2'lik toplam membran alanina sahip 30 kD Pall Omega Centramate kaseti kullanilarak konsantre edilmistir. Saflastirilmamis yigin (UPB) 0.2 um filtrelenmis ve kullanmadan önce dondurulmustur. Saflastirma Örnek kolon spesifikasyonlari ve yükleme Tablo 7'de açiklanmistir. Q Sefaroz, titre ile 3 g/L'lik bir hedefe yüklenmistir. Sonraki kolonlar, önceki kolon elüsyonundan Tablo 7. Kolon ve Yükleme Spesifikasyonlari Kolon Yükü Kolon Boyutlari Kolon Hacmi Kolon (cm x cm) (mL) Yükü (mg) tarafi ndan Bir saflatirma islemi, biyoreaktörden 1 ila 21 arasindaki hasatlarin toplanmasi için UPB kullanilarak gerçeklestirilmistir. UPB, gece boyunca 2-8°C'de çözülmüs ve her bir hasattan esit hacimde havuzlanmistir. Tek kolon islemi asamalari ve tampon formülasyonlari Tablo 8- 11'de bulunabilir. Havuzlanmis UPB, bir 0.2 um sise filtre sistemi kullanilarak filtrelenmis, 1 M sodyum asetat kullanilarak pH 6.5'e ayarlanmis ve Q Sefaroz FF kolonuna yüklenmeden önce iletkenlik, 5 M sodyum klorür ile 16 mS/cm'ye ayarlanmistir. Q Sefaroz elüsyonu, 0.25M NaPO4 kullanilarak 0.001 M NaP04 pH 5.5'e ayarlanmis ve HA kolonuna yüklenmeden önce 0.22 um PES sise üstü filtre ile filtrelenmistir. HA elüsyon iletkenligi, 5 M NaCl ile 1.55 M NaCI'ye ayarlanmis ve pH, 1 M sodyum asetat ile pH 5.5'e ayarlanmistir. Ayarlama süresi yaklasik. 1 saatti. Ayarlanan havuz, Fenil Sefaroz kolonuna yüklenmeden. önce 0.22 um PES sise üstü filtre kullanilarak filtrelenmistir. Fenil elüsyonu, 4x konsantre edilmis ve 0.02 M NaPOw 0.137 M NaCl, pH 6.0'a 6X dialfiltrelenmistir. Diafiltrelenmis ürün 2.0 g/L'ye ayarlanmis ve sahte etkin madde üretmek için %0.2 Polisorbat 20 ile formüle edilmistir. Ek karakterizasyon için DS'nin sahte bir Hl-20 havuzu olusturulmustur. Tablo 8. Q Sefaroz FF Kromatografisi için Örnek Islem Detaylari Islem asamasi Akis hizi CV Tamponlar Sanitizasyon 150 3 0.5 N NaOH Temiz/Serit 150 4 1.0 M NaOH, 2 M NaCl Depo 150 4 0.0 N NaOH Tablo 9. HA Kromatografisi için Örnek Islem Detaylari Islem asamasi Akis hizi (cm/s)CV Tamponlar Sanitizasyon 200 3 0.5 N NaOH 0.5M NaCl. nf-T 5.5 n Run niir~1 ..u : : Serit 200 4 0.4M NaPO4 pH 12 Temiz 200 4 0.5 N NaOH Depo 200 4 0.1 N NaOH Tablo 10. Fenil Sefaroz Kromatografisi için Örnek Islem Detaylari Islem asamasi Akis hiziCV Tamponlar Sanitizasyon 150 3 0.5 N NaOH Yikama 150 2 0.02 MMES, 1.5 M NaCl, pH Elüsyon 150 3 0.02 M MES, 0.2 M NaCl, pH Suyla Yikama 150 3 RO/DI Su Etanolle Yikama 150 3 %20 Etanol Temiz 150 3 0.5 N NaOH Depo 150 3 0.01 N NaOH Tablo 11. Fenil Elüsyon Havuzunun Örnek Diafiltrasyonu Filtrasyon Birimi Centricon Plus 70 Diafiltrasyon Hacimleri 6X-8X ELISA ile Islem Içi HCP Safligi Tablo 12, her asama için islem içi HOP çikarmayi tarif eder. HA asamasinda çikarilmanin çogunlugu ile islem içi HCP sonuçlari yüksek olmustur. Tablo 12. Islem içi HCP Çikarma Asama HCP (ng/mg) LRV HCP 51,957 HA 51i957 1,3 18 ,876 Fenil 5i876 0,7 5 1,870 Etkin Madde Karakterizasyonu Örnek etkin madde lot salimi sonuçlari Tablo 13'te listelenmistir. Görülebilecegi üzere, etkin madde, saflastirilmis materyalde yüksek spesifik aktiviteye ve %FG'ye sahip idi. Örnek ilaç özellikleri karakterizasyonu Tablo 13'te gösterilmistir. HCP, nihai UF/DF asamasinda 1,870 ng/mg'dan 372 ng/mg'a düsmüstür. Tablo 13. Örnek Etkin Madde Lot Salimi DS Lot Salimi lL CD ortami Glikan 3. Grup 99% . Grup %89 6. Grup 104% 7. Grup (2- 95% Toplam Alan 107% Siyalik Asit l7 Içsellestirme %83 SEÇ-HPLC %99.9 Spesifik 82 7\]/+-';171I+-a Konak Hücre 372 Hücre Alimi 98 Örnek 4. Saflastirilmis Rekombinant I2S Enziminin Fizyokimyasal ve Biyolojik Karakterizasyonu Örnegin amaci, yukarida tarif edilen yöntemler kullanilarak saflastirilmis rekombinant IZS proteininin detayli bir karakterizasyonunu gerçeklestirmekti. SBS-PAGE Deney için, iki ayri serumsuz hücre kültürü reaksiyonunda 2D ve 4D insan hücre hatlari kullanilarak rekombinant IZS proteini üretilmistir. Numuneler, yukarida tarif edilen yöntemler kullanilarak toplanmis ve saflastirilmistir. Saflastirilmis IZS enzimi SUS-PAGE ile analiz edilmis ve görsellestirme için gümüs boya kullanilarak muamele edilmistir. Örnek sonuçlar Tablo 8'de gösterilmistir. Sekil 8'den görülebilecegi üzere, burada tarif edilen yöntemler kullanilarak saflastirilmis rekombinant IZS proteini, standart yönteni kullanilarak saflastirilan IZS referans numunesine kiyasla benzer bantlama paternleri sunar. Peptit Haritasi proteini, yukarida tarif edilen yöntemler kullanilarak saflastirilmistir. Saflastirilmis rekombinant 128 ve bir referans insan IZS numunesinin her biri proteolitik parçalanmaya tabi tutulmus ve HPLC analizi ile incelenmistir. Bir referans IZS'ye kiyasla örnek bir peptit haritasi Sekil 9'da gösterilmistir. Yüzde Formilglisin Dönüsümü Peptit haritalamasi, Yüzde FGly dönüsümünü belirlemek için kullanilabilmektedir. IZS aktivasyonu, asagida gösterilen sekilde formilglisin üreten enzim (FGE) tarafindan (olgun insan IZS'nin 59 konumuna karsilik gelen) Sisteinin formilglisine dönüsümünü gerektirir: S Formilglisin XxxXxnysXxxProXxxArgXxxXxx " _i "- XxxXxxFCHyXxxProXxxArgXxxXxx Bu nedenle, formilglisin dönüsüm yüzdesi (%FG) asagidaki formül kullanilarak hesaplanabilmektedir: Aktif I2S moleküllerinin sayisi Toplam (aktif+inaktif) IZS moleküllerinin sayisi Örnegin, %50 FG, saflastirilmis rekombinant IZS'nin yarisinin, herhangi bir terapötik etki olmadan enzimatik olarak inaktif oldugu anlamina gelir. Peptit haritalamasi %FG'yi hesaplamak için kullanilmistir. Kisacasi, saflastirilmis bir rekombinant 125 proteini, bir proteaz (örnegin tripsin veya kimotripsin) kullanilarak kisa peptitlere parçalanmistir. Kisa peptitler HPLC kullanilarak ayrilmis ve karakterize edilmistir. Olgun insan IZS'nin 59 pozisyonuna karsilik gelen pozisyonu içeren peptit, 59 pozisyonundaki Cys'in bir kontrole (örnegin FGly dönüsümü olmayan bir 128 proteini veya %100 FGly dönüsümlü bir 125 proteini) kiyasla bir FGly'ye dönüstürülüp dönüstürülmedigini belirlemek üzere karakterize edilmistir. FGly içeren peptidlerin miktari (aktif 128 moleküllerinin sayisina karsilik gelir) ve hem FGly hem de Cys içeren toplam peptit miktari (toplam 128 moleküllerinin sayisina karsilik gelir), karsilik gelen pik alanlarina göre belirlenebilir ve %FG'yi yansitan oran hesaplanmistir. Örnek sonuçlar Tablo 14'te gösterilmistir. Glikan Haritasi - Mannoz-6-Fosfat ve Siyalik Asit Içerigi Saflastirilmis rekombinant I2S proteininin glikan ve siyalik asit bilesimi belirlenmistir. Bir glikan haritasi elde etmek üzere anyon degistirme kromatografisi kullanilarak glikan bilesiminin kantifikasyonu gerçeklestirilmistir. Asagida tarif edilen sekilde, burada tarif edilen kosullar altinda saflastirilan rekombinant I2S'nin glikan haritasi, en azindan kismen siyalik asitten ve enzimatik parçalanma kaynakli mannoz- 6-fosfat glikoformlardan türetilen artan miktardaki negatif yüke göre elüte edilen yedi pik grubundan olusur. Kisacasi, serumsuz hücre kültüründen (I2S-AF 2D Serumsuz ve IZS-AF 4D Serumsuz) saflastirilmis rekombinant 128 ve referans rekombinant 128, (1) siyalik asit kalintilarinin çikarilmasi için saflastirilmis nöraminidaz enzimi (Arthrobacter Ureafaciens (10 mU/uL), Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat. # 'den izole edilmistir) (2) mannoz-6-fosfat kalintilarinin tam salimi için 37±1°C'de 2 saat boyunca alkalin fosfataz, (3) alkalin fosfataz + nöraminidaz ile muamele edilmistir ya da (4) tedavi olmamistir. Her bir enzimatik parçalama, bir Dionex CarboPac PAl Koruma Kolonu ile donatilmis bir CarboPac PAl Analitik Kolonu kullanilarak Darbeli Amperometrik Tespitli (HPAE-PAD) Yüksek Performansli Anyon Degistirme Kromatografisi ile analiz edilmistir. Her bir analiz için bir dizi siyalik asit ve mannoz- 6-fosfat standartlari 0.4 ila 2.0 nmol araliginda gerçeklestirilmistir. lOO mM sodyum. hidroksit içinde 48 mM sodyum asetat kullanilan bir izokratik yöntem, her bir pikin elüte olmasi için ortam kolon sicakliginda 1.0 mL/dk'lik bir akis hizinda en az 15 dakika boyunca uygulanmistir. Her bir ayri çalismadan elde edilen veriler, hem IZS-AF hem de referans IZS numuneleri için, her biri ilgili rekombinant proteine yönelik glikan haritasini temsil etmek üzere tek bir kromatografta birlestirilmistir. Sekil lO'da gösterildigi üzere, serumsuz ortamdan saflastirilmis IZS'ye yönelik glikan haritasi, nötr, mono-, disiyale, monofosforile, trisiyale ve hibrid (monosiyale ve baslikli mannoz-6-fosfat), tetrasiyale ve hibrid (disiyale ve baslikli mannoz-6-fosfat) ve difosforile glikanlar olusturan temsili elüsyon piklerini (elüsyon sirasina göre) gösterir. Örnek glikan haritalari Sekil lO'da gösterilmistir. Her bir rekombinant 128 numunesindeki ortalama. siyalik asit içerigi (mol proteini basina mol siyalik asit), siyalik asit standartlarinin lineer regresyon analizinden hesaplanmistir. Her bir kromatogram çalismasi PeakNet 6 Yazilimi kullanilarak görsellestirilmistir. Siyalik asit standartlari ve rekombinant tek bir pik olarak kabul edilir. IZS'ye yönelik siyalik asit miktari (nmoller), asagidaki denklem kullanilarak ham bir deger olarak hesaplanmistir: (nmol siyalik asit) S.A.(mol I2S basina mol) __i______________i Burada C, numune veya rekombinant IZS analiz kontrolündeki protein konsantrasyonudur (mg/ml seklinde). Her bir test numunesi için protein molü basina siyalik asit molleri olarak .::ivalik ÂQidih düwaltilmiq Haâmri ;Raêhdaki Düzeltilmis (Numune Ham Siyalik Asit Degeri)x(5abit Idursülfaz Analiz Kontrol Degeri) 3 A :Lianliarf-QK I'IQRFihlî-IhmIRTIYI (Sample Raw Sialic Acid Value h(EStabIished Iduitx'iilfaxe Asxay Control Value) Corrected SA. : .. (Idursuifase Assay Confroi' Raw Sinif( Acid Value) lZS-AF 2D veya 4D hücre hatlarindan saflastirilmis rekombinant 128 üzerindeki siyalik asit içeriginin gösterildigi örnek veriler, Tablo l4'te gösterilmistir. Tablo 14: Serumsuz Hücre Kültüründen Saflastirilmis I2S'nin Örnek Özellikleri Analiz IZS-AF 2D (Serumsuz) Peptit Haritalamasi L10 100 L12 102 L13 97 Ll4 101 L17 100 L20 102 Konak Hücre < 62.5 ng/mg Iyon Degistirme HPLC 6 Alan Spesifik aktivite (U/mg) (sülfat 64 Glikan J Monosiyale 105 Disiyale 93 Monofosforile 139 Trisiyale 89 Tetrasiyale 125 Difosforile 95 Siyalik Asit 20 Spesifik Aktivite Burada tarif edilen yöntemler kullanilarak saflastirilan rekombinant 128 enziminin spesifik aktivitesi, in vitro sülfat salim analizi veya 4-MUF analizi kullanilarak analiz edilmistir. heparin disakkarit kullanilarak gerçeklestirilmistir. Özellikle, bu analiz, IZS'nin, dogal olarak türetilmis bir substrat olan heparin disakkaritten sülfat iyonlarini salim kabiliyetini ölçer. Salinan sülfatin miktari, bir iletkenlik detektörü ile donatilmis iyon kromatografisi ile belirlenebilir. Kisacasi, numuneler, formülasyon tamponunda fosfat iyonlari ile inhibisyonu ortadan kaldirmak üzere 10 mM Na asetat, pH 6 ile degistirilen birinci tampon idi. Numuneler daha sonra reaksiyon tamponu (10 mM Na asetat, pH 4.4) ile 0.075 mg/ml'ye seyreltilir bir enzim ila substrat oraninda heparin disakkarit ile 37°C'de 2 saat boyunca inkübe edilmistir. Reaksiyon daha sonra numuneleri 3 dakika boyunca 100°C'de isitmak suretiyle durdurulmustur. Analiz, bir 10nPac AG18 koruma kolonuna sahip bir Dionex 10nPac A818 analitik kolon kullanilarak gerçeklestirilmistir. 15 dakika boyunca 1.0 mL/dakikada 30 mM potasyum hidroksit ile bir izokratik yöntem kullanilmistir. 128 numunesi tarafindan salinan sülfat miktari, sülfat standartlarinin 1.7 ila 16.0 nmol araligindaki lineer regresyon testinden hesaplanmistir. Raporlanabilir deger, mg protein basina Birimler olarak eksprese edilir, burada 1 birim, saat basina salinan 1 umol sülfat olarak tanimlanir ve protein konsantrasyonu A280 ölçümleri ile belirlenmistir. Örnek sonuçlar Tablo 14'te gösterilmistir. 4-MUF analizi Saflastirilmis rekombinant 128 enziminin spesifik aktivitesi ayrica floresan bazli 4-MUF analizi kullanilarak da analiz edilebilir. Kisacasi, analiz, 128 substrati 4-metilumbe11iferil- sülfatin (4-MUF-SO4) hidrolizini ölçer. 4-MUF-SO4 substratinin 128 ile bölünmesinin ardindan, molekül, sülfata ve dogal olarak floresan 4-metilumbelliferona (4-MUF) dönüstürülür. Sonuç olarak, 128 enzim aktivitesi, zaman içindeki floresan sinyalindeki genel degisimi degerlendirerek belirlenebilmektedir. Bu deney için, saflastirilmis 128 enzimi, 4-metilumbelliferil-sülfat (4-MUF-SO4), Potasyum. Tuzu, Sigma Cat. # M-7133)) çözeltisi ile inkübe edilmistir. Analizin oraninda seyreltilmis piyasadan temin edilebilen 128 enzimi kullanilarak bir dizi kontrol referans numunesi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Enzimatik analiz 37°C'de gerçeklestirilmis ve kalibre edilmis bir fluorometre kullanilarak analiz edilmistir. Her bir referans standardi için elde edilen floresans degerleri kullanilarak, yüzde degisim katsayisi asagidaki denklemin kullanilmasiyla belirlenmistir: 9BCW/ (XIOOQQ Average] Fiuurexc'enc'e ,alim Yüzde CV degerleri, asagidaki formül kullanilarak mU/mL cinsinden ifade edilen, raporlanabilir enzim aktivitesini belirlemek için her bir numune için Düzeltilmis Ortalama Floresani hesaplamak üzere kullanilmistir: mU/mL :(CFU' lnmol/L I IL J 2.11mL 1 saat [1 mU ](DF') CFU = Negatif düzeltilmis ortalama floresan DF - Seyreltme Faktörü Bir milibirimlik aktivite, 37°C'de 1 dakika içinde 1 nanomol 4- metilumbelliferil-sülfatin 4-metilumbelliferona dönüstürülmesi Ham Floresan Degerlerinin Standart Sapmasi (N=3) için gel %CV. CliLiill mikcaiiuii. X %100 Ortalama Floresan Degeri Yük Profili Bu deney için, her saflastirilmis rekombinant IZS'nin yük dagilimi, Yüksek Performansli Sivi Kromatografisi (HPLC) sistemi ile Güçlü Anyon Degistirme (SAX) Kromatografisi araciligiyla belirlenmistir. Yöntem, yüzey yük farkliliklarina bagli olarak, numune içindeki rekombinant IZS varyantlarini ayirir. pH 8.00'da, negatif yüklü türler SAX kolonunun sabit pozitif yüküne adsorbe edilir. Her bir protein türünü, kolon ile iyonik etkilesimlerinin gücüyle orantili olarak elüte etmek için artan iyonik güç gradyani kullanilir. Serumsuz büyüme kosullari altinda 2D hücre hattindan izole edilen yüz mikrogram saflastirilmis 128 veya referans rekombinant 128 enzimi, ortam sicakliginda tutulan bir Amersham Biosciences Mini Q PE (4.6 x 50 mm) kolonuna yüklenmis ve 20 mM Tris-HCl, pH 8.00'a dengelenmistir. Gradyan elüsyonu, 20 mM Tris-HCl, 1.0 M sodyum klorür, pH 8.00'lik bir mobil faz kullanilarak 0.80 mL/dk'lik akis hizinda yapilmistir. 280 nm dalga boyundaki numune elüsyonunun isik absorbansi ölçülerek, çalisma esnasinda protein konsantrasyonu sürekli olarak belirlenmistir. 2D ve 4D hücre hatlarindan saflastirilmis rekombinant 128 için gözlemlenen yük profillerini gösteren örnek sonuçlar, Sekil ll'de gösterilmistir. SEKANS LISTESI <110 <120 <130 <150 <151 <160 <170 Shire Human Genetic Therapies IDURONAT-Z-SÜLFATAZ'IN SAFLASTIRILMASI 61/666,733 29.06.2012 Patentin versiyon 35 <210 <211 <212 <213 <400 sapiins 011.: (313( <210 (211› (212› <213 <4OÜ <210 (211› <212› (213› (400› aapiens Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val Vil Ala Lou Gly Sor Glu Thr Gln Ala Asu Sor (313( 8.1.8 <210 4 <211 343 <212 PRT <213› Homo <400 4 Phe Gln Glu Asp Gln Ser Ser Thr Gly Phe Arq Lou Lys sapiens <210› <211 <212› (213› (400› Asp Arg Vai Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Met Cys Tyr Arg Ty: Arg Cys Ala Ala Arg Ser Gin Asn Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala Asp KPDMÄTEGP.?I$I Em EÜIIUI FÜSFEI, FH Haci, ;E 6.` HIKRQN FILTFRBELH . -8.02 18.0: Hmzmmmhmm mNH u. -cvoi 0. 18.0: 80992.' ' BH "988 ' 9L'I 898`LZ ' 008' L8 ' (121 29699 ' [I 90V'L9 ' OV] 89929 ' V1 FIHîHNEIEJEE& iu'soi ' Sl'l S89`l0l ' 03`] 8LZ'99 ' 61 39908 " 921 981174 ' M1 9L6`17LI. 85569 3.5 mn gmos an 05: mu 9& .Hmg VS» .SE .m4 .m4 .hmm M magmazwgm Altun". H minaikuur Lu±tL Hd , . u Hmzmmmhmm mNH umpmmumCthimç uH.. . AKTIVITE (UVmg) ` 4 3 22222 SEO-HPLC 100: m 50` W` 37: "Aug /OV x\\\\\x\\\\\\\ HAT YÜK NUMUNESI YÜK. TOPLAM HACMI pg 1 PROTEIN STDS 3_uI 2 ANALIZ KONTROLÜ #18 20 "i iig 3 ANALIZ KONTROLÜ #2 20 "i 161,19 4 ms REFERANS 20"' 8% STANDARDI 125-" 2D .. .. 20 pl Bpg SERUMSUZ KULTUR 6 I2S-AF 4D 20 pl 8pg SERUMSUZ KÜLTÜR w Hmgühg mNH 89818- m :8 n09 91 8919'? ' (181 "988 ' 9L1 80992.' ' 8l1 00218 ' (131 81.971? ' 981 29699 ' L'l 90V`L9 ' 0L1 89929 ' 171 HISOL ' 9l1 $89`LOL ' 021 29908 ' 321 8LZ'99 ' 61 921171. ' M1 9L6'VLL '~ ou'oz - uszs az ' 91 /10 "180.0 DHONBZO& mzêmmmm mNH .iomoo C1 Hld .08.0 TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR
TR2018/15811T 2012-06-29 2013-06-28 İduronat-2-sülfataz'ın saflaştırılması. TR201815811T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261666733P 2012-06-29 2012-06-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201815811T4 true TR201815811T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=49778401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/15811T TR201815811T4 (tr) 2012-06-29 2013-06-28 İduronat-2-sülfataz'ın saflaştırılması.

Country Status (39)

Country Link
US (7) US9051556B2 (tr)
EP (2) EP3441398A1 (tr)
JP (4) JP6171007B2 (tr)
KR (5) KR101380740B1 (tr)
CN (3) CN107596357A (tr)
AR (1) AR091647A1 (tr)
AU (3) AU2013282395C1 (tr)
BR (1) BR112014032567B1 (tr)
CA (2) CA2877517C (tr)
CL (1) CL2014003567A1 (tr)
CO (1) CO7240396A2 (tr)
CR (1) CR20140588A (tr)
CY (1) CY1121519T1 (tr)
DK (1) DK2867245T3 (tr)
DO (1) DOP2014000294A (tr)
EA (2) EA034549B1 (tr)
ES (1) ES2689468T3 (tr)
GT (1) GT201400303A (tr)
HK (3) HK1209431A1 (tr)
HR (1) HRP20181897T1 (tr)
HU (1) HUE040769T2 (tr)
IL (4) IL236315A (tr)
LT (1) LT2867245T (tr)
MX (3) MX336715B (tr)
MY (3) MY157087A (tr)
NZ (3) NZ733366A (tr)
PE (1) PE20150720A1 (tr)
PH (3) PH12014502871B1 (tr)
PL (1) PL2867245T3 (tr)
PT (1) PT2867245T (tr)
RS (1) RS58005B1 (tr)
SG (2) SG10201703489VA (tr)
SI (1) SI2867245T1 (tr)
SM (1) SMT201800612T1 (tr)
TR (1) TR201815811T4 (tr)
TW (2) TWI587869B (tr)
UA (2) UA129561C2 (tr)
WO (1) WO2014005014A2 (tr)
ZA (2) ZA201409397B (tr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008282496B2 (en) 2007-07-27 2013-04-04 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-iduronidase activity in the CNS
EP2485761B1 (en) 2009-10-09 2019-02-27 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
KR101158673B1 (ko) 2011-06-24 2012-07-03 주식회사 지씨바이오 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
US20160145589A1 (en) 2011-06-24 2016-05-26 Green Cross Corporation Composition and formulation comprising recombinant human iduronate-2-sulfatase and preparation method thereof
KR101380740B1 (ko) 2012-06-29 2014-04-11 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 이듀로네이트-2-설파타제의 정제
US9150841B2 (en) 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
SG11201901495YA (en) 2016-08-25 2019-03-28 Jcr Pharmaceuticals Co Ltd Method for producing antibody fusion protein
CN106282231B (zh) * 2016-09-06 2020-01-03 陕西慧康生物科技有限责任公司 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
CN106428420B (zh) * 2016-10-17 2018-08-21 上海江南长兴造船有限责任公司 一种用于超大型集装箱船止裂钢舱口围的安装的方法
CR20200129A (es) 2017-10-02 2020-08-22 Denali Therapeutics Inc Proteínas de fusión que comprenden enzimas de terapia de reemplazo de enzimas
US12268733B2 (en) 2018-08-10 2025-04-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurofibromatosis type 1 and related conditions with alkaline phosphatase
US20220002688A1 (en) * 2018-12-20 2022-01-06 Armagen, Inc. Purification of iduronate-2-sulfatase immunoglobulin fusion protein
JP2022523063A (ja) * 2019-01-30 2022-04-21 アムジエン・インコーポレーテツド アフリベルセプトの属性、並びにその特性決定及び修飾方法
CA3161266A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
AU2021337652B2 (en) 2020-09-04 2025-01-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating bone mineralization disorders
EP4232150A4 (en) * 2020-10-23 2025-01-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR CONTROLLING TOTAL TIALIC ACID CONTENT DURING THE PRODUCTION OF ALKALINE PHOSPHATASE
BR112023016048A2 (pt) 2021-02-12 2023-11-14 Alexion Pharma Inc Polipeptídeos de fosfatase alcalina e métodos de uso dos mesmos

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
US5310646A (en) 1988-05-13 1994-05-10 Regents Of The University Of Minnesota Method for the detection of mucopolysaccharide storage diseases
US5932211A (en) 1991-11-12 1999-08-03 Women's And Children's Hospital Glycosylation variants of iduronate 2-sulfatase
WO1995024920A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 The Regents Of The University Of California Treating inflammation via the administration of specific sulfatase enzymes and/or sulfation inhibitor
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
DE19527054A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Charakterisierung der Glycosylierung von Glycoproteinen sowie zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit von Glycoproteinen
AU4330597A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
WO2001018022A1 (en) 1999-09-03 2001-03-15 Human Genome Sciences, Inc. 52 human secreted proteins
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US7083793B2 (en) 1999-02-26 2006-08-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tango 243 polypeptides and uses thereof
EP2301947A3 (en) 1999-02-26 2011-11-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
US6506598B1 (en) 1999-04-26 2003-01-14 Genentech, Inc. Cell culture process
JP2002017376A (ja) 1999-07-08 2002-01-22 Herikkusu Kenkyusho:Kk 分泌蛋白質、または膜蛋白質
US6780627B1 (en) 2000-01-31 2004-08-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 22438, 23553, 25278, and 26212 novel human sulfatases
AU2001238488A1 (en) 2000-02-17 2001-08-27 Incyte Genomics, Inc. Human kinases
EP1268541A1 (en) 2000-03-17 2003-01-02 Human Genome Sciences, Inc. 7 human ovarian and ovarian cancer associated proteins
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030148920A1 (en) 2000-12-27 2003-08-07 Steven Rosen Sulfatases and methods of use thereof
AU2002317700A1 (en) 2001-06-07 2002-12-16 Hemebiotech A/S Production of recombinant human arylsulfatase a
WO2003102132A2 (en) 2002-04-26 2003-12-11 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
US6890736B1 (en) 2002-09-20 2005-05-10 Immunex Corporation Methods for producing proteins in cultured cells
MXPA05006523A (es) 2002-12-23 2005-08-26 Squibb Bristol Myers Co Procesos de cultivo de celulas de mamiferos para la produccion de proteinas.
JP4606712B2 (ja) * 2003-01-08 2011-01-05 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ２−ｏスルファターゼ組成物および関連の方法
CA2515708A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Transkaryotic Therapies, Inc. Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other sulfatase deficiencies
US20050019914A1 (en) 2003-07-24 2005-01-27 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Perfusion process for producing erythropoietin
EP1713904B1 (en) 2004-01-30 2016-06-29 Shire Pharmaceuticals Ireland Limited Production and purification of recombinant arylsulfatase a
WO2005113765A2 (en) 2004-05-06 2005-12-01 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of activation of sulfatases and methods and compositions of using the same
AU2006254103B2 (en) 2005-06-03 2012-09-06 Ares Trading S.A. Production of recombinant IL-18 binding protein
CA2645739A1 (en) 2006-03-20 2007-09-27 Medarex, Inc. Protein purification
JP4458377B2 (ja) 2007-06-29 2010-04-28 キヤノン株式会社 プロセスカートリッジ及び電子写真画像形成装置
US20130195888A1 (en) 2007-11-30 2013-08-01 Abbvie Ultrafiltration and diafiltration formulation methods for protein processing
CA2711590C (en) * 2008-01-18 2021-03-23 Biomarin Pharmaceutical Inc. Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof
EP2485761B1 (en) 2009-10-09 2019-02-27 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
WO2011108451A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 日本ケミカルリサーチ株式会社 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法
KR20230159646A (ko) 2010-06-25 2023-11-21 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 이듀로네이트-2-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
AU2011270672B2 (en) * 2010-06-25 2017-01-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of Sanfilippo Syndrome type B
AR082319A1 (es) 2010-07-22 2012-11-28 Biomarin Pharm Inc Produccion de una n-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana activa altamente fosforilada y sus usos
JP5865839B2 (ja) * 2010-09-28 2016-02-17 共立製薬株式会社 粘膜アジュバント組成物
WO2012101671A1 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
KR20130114704A (ko) 2011-01-31 2013-10-17 휴렛-팩커드 디벨롭먼트 컴퍼니, 엘.피. 동적으로 튜닝 가능한 산란각을 갖는 산광기
KR101158673B1 (ko) 2011-06-24 2012-07-03 주식회사 지씨바이오 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
KR101380740B1 (ko) 2012-06-29 2014-04-11 쉐어 휴먼 제네텍 세러피스, 인코포레이티드 이듀로네이트-2-설파타제의 정제
US20140004097A1 (en) 2012-06-29 2014-01-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Method of producing recombinant iduronate-2-sulfatase
US9150841B2 (en) 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
KR20190062745A (ko) 2017-11-29 2019-06-07 주식회사 위니플 쇼핑몰 모바일앱 빌더

Also Published As

Publication number Publication date
NZ733366A (en) 2019-12-20
IL236315A (en) 2016-11-30
SI2867245T1 (sl) 2018-12-31
IL236315A0 (en) 2015-02-26
BR112014032567B1 (pt) 2022-09-13
TW201410868A (zh) 2014-03-16
US20150313972A1 (en) 2015-11-05
CY1121519T1 (el) 2020-05-29
AU2016200469B2 (en) 2017-10-12
EA034549B1 (ru) 2020-02-19
IL287057A (en) 2021-12-01
AU2013282395A1 (en) 2015-01-29
EP2867245B1 (en) 2018-09-12
MX366906B (es) 2019-07-30
TWI553120B (zh) 2016-10-11
HUE040769T2 (hu) 2019-03-28
EP2867245A2 (en) 2015-05-06
JP6171007B2 (ja) 2017-07-26
PH12014502871A1 (en) 2015-02-23
TW201703794A (zh) 2017-02-01
GT201400303A (es) 2017-08-31
MX393364B (es) 2025-03-19
UA121959C2 (uk) 2020-08-25
EA202090044A1 (ru) 2020-07-31
CN104583225A (zh) 2015-04-29
US20190359958A1 (en) 2019-11-28
MY180287A (en) 2020-11-27
MY157087A (en) 2016-04-19
DK2867245T3 (en) 2018-11-26
ZA201409397B (en) 2019-10-30
AU2013282395C1 (en) 2016-03-24
AU2018200230A1 (en) 2018-02-01
PT2867245T (pt) 2018-11-26
WO2014005014A2 (en) 2014-01-03
KR101380740B1 (ko) 2014-04-11
PL2867245T3 (pl) 2019-02-28
CA2877517A1 (en) 2014-01-03
US20240401010A1 (en) 2024-12-05
CL2014003567A1 (es) 2015-04-24
IL287057B1 (en) 2026-01-01
PE20150720A1 (es) 2015-05-16
US9492511B2 (en) 2016-11-15
EP2867245A4 (en) 2016-03-09
IL261264B (en) 2021-10-31
JP2015523072A (ja) 2015-08-13
US20210317426A1 (en) 2021-10-14
MX2015000190A (es) 2015-04-08
SG10201703489VA (en) 2017-05-30
US10344270B2 (en) 2019-07-09
AU2018200230B2 (en) 2020-01-02
PH12014502871B1 (en) 2015-02-23
US11530393B2 (en) 2022-12-20
EA201492177A1 (ru) 2015-06-30
JP6505629B2 (ja) 2019-04-24
CA2877517C (en) 2018-07-31
AR091647A1 (es) 2015-02-18
CN107596357A (zh) 2018-01-19
CO7240396A2 (es) 2015-04-17
KR20200143339A (ko) 2020-12-23
AU2016200469A1 (en) 2016-02-18
SMT201800612T1 (it) 2019-01-11
LT2867245T (lt) 2018-11-12
WO2014005014A3 (en) 2014-02-27
KR20190064542A (ko) 2019-06-10
US20170073652A1 (en) 2017-03-16
CA3008945A1 (en) 2014-01-03
PH12020500027A1 (en) 2021-03-15
SG11201408761VA (en) 2015-01-29
IL248727A0 (en) 2017-01-31
JP2018121645A (ja) 2018-08-09
MX336715B (es) 2016-01-28
RS58005B1 (sr) 2019-02-28
MX2019008914A (es) 2019-09-26
US12359178B2 (en) 2025-07-15
IL261264A (en) 2018-10-31
US9051556B2 (en) 2015-06-09
ZA201803289B (en) 2021-04-28
BR112014032567A2 (pt) 2017-08-01
PH12015502408A1 (en) 2018-03-26
MY192068A (en) 2022-07-25
UA129561C2 (uk) 2025-06-04
HK1249026A1 (zh) 2018-10-26
KR20220002227A (ko) 2022-01-06
US20140004096A1 (en) 2014-01-02
PH12015502408B1 (en) 2020-02-14
JP2020105209A (ja) 2020-07-09
CN107596358A (zh) 2018-01-19
HK1209431A1 (en) 2016-04-01
AU2013282395B2 (en) 2015-12-03
JP2016119911A (ja) 2016-07-07
EP3441398A1 (en) 2019-02-13
NZ743910A (en) 2019-12-20
HRP20181897T1 (hr) 2019-01-11
NZ703093A (en) 2017-08-25
CR20140588A (es) 2015-04-06
HK1209767A1 (en) 2016-04-08
TWI587869B (zh) 2017-06-21
JP7594365B2 (ja) 2024-12-04
DOP2014000294A (es) 2015-03-15
HK1249027A1 (zh) 2018-10-26
ES2689468T3 (es) 2018-11-14
KR20140002451A (ko) 2014-01-08
US20240043817A1 (en) 2024-02-08
KR20140004603A (ko) 2014-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201815811T4 (tr) İduronat-2-sülfataz&#39;ın saflaştırılması.
HK1209767B (en) Purification of iduronate-2-sulfatase
EA049401B1 (ru) Очистка идуронат-2-сульфатазы