RS58036B1 - Derivati cis-tetrahidro-spiro(cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol)-4-amina - Google Patents

Description

Pronalazak koristi jedinjenja koja deluju na nociceptin/ORL-1-receptorni sistem kao i na µ-opioidni receptorni sistem i koja se naročito ističu selektivnom efikasnošću u lečenju hroničnog bola (između ostalog inflamatornog bola, visceralnog bola, bola usled tumora, poželjno neuropatskog bola), a istovremeno ne razvijaju izraženu efikasnost u slučaju akutnog nociceptivnog bola. Jedinjenja korišćena prema pronalasku su derivati cis-tetrahidro-spiro(cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol)-4-amina.

Hronični bol može biti podeljen u dve velike grupe. Patofiziološki nociceptorni bol je prouzrokovan posle trauma tkiva preko ekscitacije intaktnih nociceptora. U ovo naročito spada hronični inflamatorni bol. Nasuprot tome se bol, koji je uzrokovan mehaničkim, metaboličkim ili upalnim oštećenjem samih nerava, označava kao neuropatski bol. Lečenje hroničnog bola predstavlja veliki medicinski izazov, s obzirom na to da lekovi koji se nalaze na tržištu koji su visoko delotvorni u slučaju akutnog bola, u mnogim slučajevima ne rezultuju u zadovoljavajućem lečenju bola u slučaju hroničnog i, naročito, neuropatskog bola.

Inflamatorni događaji su među najvažnijim mehanizmima u formiranju bola. Tipični inflamatorni bol je izazvan oslobađanjem bradikinina, histamina i prostaglandina sa zakišeljavanjem tkiva i pritiskom eksudata na nociceptore. Kao posledica oni su česti kod fenomena senzibilizacije u centralnom nervnom sistemu, koji se ispoljavaju povećavanjem spontane neuronske aktivnosti i jačim odgovorima na stimuluse centralnih neurona (Coderre et al., Pain 1993,52,259-285). Ove promene u ponašanju kod odgovora centralnih neurona, mogu da doprinesu spontanom bolu i hiperalgeziji (povećana osetljivost bola na štetan nadražaj) koji su tipični za upaljeno tkivo (Yaksh et al., PNAS 1999,96,7680-7686).

Nesterodini antiinflamatorni lekovi (NSAID), koji pored analgetskog dejstva imaju i antiinflamatornu komponentu, dokazali su se kao naročito uspešni u lečenju inflamatornog bola (Dickensen, A., International Congress and Symposium Series-Royal Society of Medicine (2000), 246, 47-54). Njihova upotreba kod dugotrajne terapije hroničnog bola je međutim ograničena, zbog nekada značajnih sporednih efekata, kao što su gastrointestinalni čirevi ili toksično oštećenje bubrega. U slučaju jakog do veoma jakog inflamatornog bola (na primer u kontekstu hroničnog pankreatitisa) NSAID moguće smanjuju bol samo malo, ali zbog povećane opasnosti od krvarenja dovode do visokog rizika. Sledeći korak je generalno terapija µ-opioidima, pri čemu je među dotičnim osobama široko raširena zavisnost od narkotika (Vercauteren et al., Acta Anaesthesiologica Belgica 1994, 45, 99-105). Stoga postoji hitna potreba za jedinjenjima koja su visoko efikasna u slučaju inflamatornog bola i imaju smanjeni potencijal za stvaranje zavisnosti.

Neuropatski bol se javlja kada se periferni nervi oštete na mehanički, metabolički ili inflamatorni način. Profili bola koji se ovde javljaju su prevashodno okarakterisani u pojavi spontanog bola, hiperalgezije i alodinije (bol je već izazvan netoksičnim stimulusima) (videti Baron, Clin. J. Pain 2000;16 (2 Suppl), 12-20). Uzroci i karakteristike, i stoga takođe potrebe za lečenjem neuropatskog bola su višestruki, i različiti. On se javlja kao rezultat oštećenja ili bolesti mozga, kičmene moždine ili perifernih nerava. Uzroci mogu biti operacije (npr. fantomski bol nakon amputacije), povrede kičmene moždine, šlog, multipla skleroza, zloupotreba alkohola ili lekova ili drugih toksičnih supstanci, kancer i takođe metaboličke bolesti kao što su dijabetes, giht, bubrežna insuficijencija ili ciroza jetre, kao i infektivne bolesti (između ostalog herpes zoster, mononukleoza, erlihioza, tifus, difterija, HIV, sifilis ili borelioza). Doživljavanje bola ima veoma različite znake i simptome (npr. peckanje, pečenje, oštri, elektrizirajući ili prenosni bol), koji vremenom mogu menjati količinu i intenzitet.

Osnovna farmakološka terapija neuropatskog bola obuhvata triciklične antidepresive i antikonkvulzive, koji se koriste kao monoterapija ili takođe u kombinaciji sa opioidima. Ovi lekovi generalno doprinose samo određenom stepenu olakšanja bola, dok se nestanak bola često ne postiže. Učestali sporedni efekti često sprečavaju povećanja doze lekova u cilju postizanja adekvatnog ublažavanja bola. Činjenica je da zadovoljavajuće lečenje neuropatskog bola često zahteva veću dozu µ-opioida nego što to zahteva lečenje akutnog bola, čime i sporedni efekti dobijaju na većem značaju. Ovo znači da se danas neuropatski bol teško leči. On se samo delimično ublažava čak pomoću visokih doza opioida stadijuma 3 (Saudi Pharm. J.2002, 10 (3), 73-85).

Opioidi koji se koriste u lečenju neuropatskog bola su obično istovremeno takođe efikasni protiv akutnog bola. Do sada nije bilo moguće odvojiti lečenje neuropatskog bola sa jedne strane i akutnog bola sa druge strane. U zavisnosti od doze opioida, prema tome, svaki osećaj bola pacijenta se potiskuje, što stvarno može da bude nedostatak. Akutni bol ispunjava zaštitnu funkciju za telo, koja nestaje, ukoliko se osećaj akutnog bola ometa ili potiskuje. Postoji dakle potreba za održavanjem opšteg osećaja bola uz istovremeno kontrolisanje neuropatskog bola.

Derivati spirocikličnog cikloheksana koji deluju na nociceptin/ORL-1 i na µ-opioidni receptorni sistem su poznati u stanju tehnike. Ova jedinjenja se između ostalog odlikuju izuzetno velikom strukturnom varijabilnošću i pogodna su za lečenje inflamatornog i neuropatskog bola, pored ostalog. U vezi sa ovim se na primer u potpunom opsegu može uputiti na WO 2004/043967, WO2005/063769, WO2005/066183 i WO2006/108565.

Postoji potreba za lekovima koji su efikasni u lečenju hroničnog, naročito neuropatskog bola i koji istovremeno u najmanjoj mogućoj meri utiču na percepciju akutnog bola. Tamo gde je moguće ovi lekovi bi trebalo da sadrže tako malu dozu aktivne supstance kako bi se obezbedila zadovoljavajuća terapija bola bez pojave sporednih efekata koji se ne mogu tolerisati.

Cilj u osnovi pronalaska je da obezbedi nova jedinjenja koja su pogodna kao lekovi i imaju prednosti u odnosu na stanje tehnike.

Ovaj cilj se postiže predmetom patentnih zahteva.

Pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (III)

gde

R1je -H ili CH3;

R2je -H ili – halogen;

R3je -H ili – halogen;

R4je -H, - halogen ili- OC1-3- alkil; i

R5je -H, - halogen ili -OC1-3- alkil;

gde je jedinjenje prisutno kao hidrohloridna, citratna ili hemicitratna so.

Iznenađujuće je pronađeno da jedinjenja prema opštoj formuli (III) deluju na nociceptin/ORL-1 i µ-opioidni receptorni sistem, i da su naročito efikasna u lečenju hroničnog bola, naročito neuropatskog bola, bez istovremenog suzbijanja percepcije akutnog bola. Pored toga je iznenađujuće da ova jedinjenja pokazuju samo veoma male, ako uopšte pokazuju, sporedne efekte tipične za opioide u analgetički efikasnom opsegu doza.

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) pokazuju veoma visoku analgetičku efikasnost u lečenju hroničnog bola, naročito neuropatskog bola, poželjno kao rezultat poli- ili mononeuropatskih bolesti.

Iznenađujuće je pronađeno da jedinjenja nemaju efekat na normalnu nocicepciju kod zdravih životinja ili u zdravom tkivu mononeuropatskih životinja u dozama koje dovode do skoro potpune eliminacije neuropatskog bola kod mono- ili polineuropatskih modela. Ovo znači da ova jedinjenja eliminišu patološko stanje (alodiniju ili hiperalgeziju), ali istovremeno - ako i uopšte - samo malo utiču na normalan osećaj bola. Stoga je zanemarljivo antinociceptivno dejstvo jedinjenja kod akutnog bola.

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) na taj način omogućavaju selektivnu efikasnost dejstva protiv hroničnog bola, poželjno protiv neuropatskog bola, poželjnije protiv mononeuropatskog/neuralgičnog ili polineuropatskog bola, još poželjnije protiv bola u slučaju postherpetičke neuralgije ili u slučaju dijabetičke polineuropatije, poželjno sa zanemarljivom antinociceptivnom efikasnošću u slučaju akutnog bola. Ova neobična osobina jedinjenja prema pronalasku je od fundamentalnog značaja za terapiju bola kao celine.

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) predstavljaju selekciju jedinjenja otkrivenih u WO2004/043967, WO2005/066183 i WO2006/108565. Iznenađujuće je pronađeno da spiroamini prema pronalasku, koji imaju cis konfiguraciju (derivati cis-tetrahidrospiro(cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol)-4-amina) na prstenu cikloheksana u odnosu na dva azota, imaju prednosti u odnosu na druge heterocikluse.

Na taj način cis-spiroamidi prema pronalasku, za razliku od drugih jedinjenja prema WO2004/043967, WO2005/066183 i WO2006/108565, na životinjskom modelu pokazuju odlično dejstvo protiv hroničnog, poželjno neuropatskog bola, poželjnije bola u slučaju dijabetičke polineuropatije, bez pokazivanja značajnog dejstva protiv akutnog bola u terapeutskoj dozi koja je za to potrebna. Pošto su mnogobrojni sporedni efekti konvencionalnih analgetika povezani sa mehanizmom delovanja protiv akutnog bola, spirociklični cis-supstituisani derivati cikloheksana prema pronalasku se odlikuju posebno korisnim profilom sporednih efekata, naročito u pogledu sporednih efekata svojstvenih opioidima.

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) su poželjno ahiralna; osnovna struktura opšte formule (III) ne sadrži hiralni element (centar, osu ili ravan).

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) u odnosu na sistem spiro-prstena su izomeri kod kojih supstitucioni obrazac na sistemu prstena spiro-cikloheksana (ne na indolu) može da se označi i sa cis/trans, Z/E ili sin/anti. „ Cis-trans izomeri" su podgrupa stereoizomera (konfiguracioni izomeri).

U jedinjenjima prema opštoj formuli (III) dva atoma azota spiroamina su u svakom slučaju syn ili cis ili Z konfiguracija jedan prema drugom:

cis-spiroamin trans-spiroamin

U poželjnom primeru izvođenja, višak tako obeleženog cis-izomera je najmanje 50% de, poželjnije najmanje 75% de, još poželjnije najmanje 90% de, najpoželjnije najmanje 95% de i posebno najmanje 99% de.

Pogodni postupci za odvajanje izomera (diastereomera) su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Kao primeri se mogu navesti hromatografija na koloni, preparativna HPLC i postupci kristalizacije. Ciljani postupci sinteze, kod kojih se jedan od izomera formira u višku, su takođe u principu poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike.

Prednosti cis-izomera su nadalje posebno iznenađujući po tome što u slučaju strukturno srodnih spiroetara obično cis-izomer nije taj koji sa farmakološkog stanovišta pokazuje korisne osobine (ali koje su povremeno različite prirode od prednosti cis-spiroamina prema pronalasku), već je to trans- izomer.

cis-spiroetar trans-spiroetar

Za svrhu opisa ,,-halogen" poželjno označava -F, -Cl, -Br ili -I, poželjnije -F ili -Cl, naročito -F.

Za svrhu opisa“C1-3-alkil”, u svakom slučaju nezavisno, je linearan ili granat, zasićen ili mono- ili polinezasićen. Na taj način obuhvata aciklične zasićene ili nezasićene ugljovodonične ostatke koji mogu biti granati ili sa pravim lancem, tj. C1-3-alkanili, C1-3-alkenili i C1-3-alkinili.

Poželjna su jedinjenja opšte formule (III):

gde je jedinjenje prisutno kao hidrohloridna, citratna ili hemi-citratna so.

R2-H i/ili R3-F je poželjan.

R4i R5su poželjni, oba -H ili oba -OCH3.

U sledećem naročito poželjnom primeru izvođenja pronalazak se odnosi na jedinjenje opšte formule (VI)

gde je jedinjenje prisutno kao hidrohloridna, citratna ili hemi-citratna so.

Slobodna baza jedinjenja opšte formule (VI) može se sistematski označiti kao (E)-2',3',4',9'-tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer) ili takođe kao (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-(3-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido-[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-on. Ovo jedinjenje je prisutno u obliku hidrohlorida, citrata ili hemi-citrata.

Prema pronalasku jedinjenja su izabrana naročito iz grupe koja se sastoji od

u svakom slučaju u obliku hidrohloridne, citratne ili hemi-citratne soli.

U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku jedinjenja prema opštoj formuli (III) se koriste dva puta dnevno, jednom dnevno ili ređe, naročito poželjno ne više od jednom dnevno.

U dodatnom primeru izvođenja, jedinjenja prema opštoj formuli (III) se koriste u lečenju hroničnog bola. Hronični bol je poželjno izabran iz grupe koja sadrži inflamatorni bol, visceralni bol, tumorski bol i neuropatski bol. Neuropatski bol može biti mononeuropatskog/neuralgičnog ili polineuropatskog porekla.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja jedinjenja prema opštoj formuli (III) su korišćena u lečenju bola u slučaju dijabetičke polineuropatije.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja jedinjenja prema opštoj formuli (III) su korišćena u lečenju bola koji je rezultat postherpetičke neuralgije.

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) su pogodna za upotrebu u lečenju neuropatskog bola, poželjno mononeuropatskog/neuralgičnog ili polineuropatskog bola. Poželjan je periferni polineuropatski bol ili centralni polineuropatski bol.

Polineuropatija ili polineuropatični bol je poželjno akutan (do četiri nedelje), subakutni (četiri do osam nedelja) ili hronični (više od osam nedelja).

Kod polineuropatije je poželjna pogođenost motornog, senzornog, autonomnog, senzomotornog ili centralnog nervnog sistema. Poželjna je simetrična ili asimetrična raspoređenost simptoma. Bol može biti blag, umeren, srednje jačine, jak ili vrlo jak. Kao mera može da posluži neuropatska skala bola (NPS) (videti B.S. Galer, et al., Neurology 1997, 48, 332-8).

Primeri za uzroke perifernog neuropatskog bola su dijabetička polineuropatija, postherpetička neuralgija, radiokulopatija, post-traumatska neuralgija, polineuropatija indukovana hemijskim supstancama, npr. hemoterapijom, fantomski bol u ekstremitetima, kompleksni regionalni sindrom, senzorna polineuropatija indukovana HlV-om i alkoholna polineuropatija. Primeri uzroka centralnog polineuropatičnog bola su kompresivna mijelopatija usled stenoze suženog kanala, post-traumatski kičmeni bol, bol usled šloga, postishemična mijelopatija, mijelopatija indukovana zračenjem, mijelopatija indukovana multiplom sklerozom i HlV-om indukovana mijelopatija.

U jednom poželjnom primeru izvođenja, neuropatija koja uzrokuje neuropatski bol povezana je sa bolešću izabranom iz grupe koja sadrži dijabetes melitus, vaskulitis, uremiju, hipotireoidizam, zloupotrebu alkohola, postherpetičku neuralgiju, idiopatsku neuropatiju, hroničnu inflamatornu demijelinizacionu neuropatiju, multifokalnu motoričku neuropatiju, naslednu polineuropatiju, Guillain-Barre-ov sindrom, intoksikaciju [npr. uzrokovanu alkoholom, teškim metalima {naročito Pb, Hg, As}, ugljovodonicima, koja je rezultat hemoterapije citostaticima], porfiriju, infektivne bolesti, kancerozne bolesti [npr. mijelom, amiloid, leukemiju, limfom), pernicioznu anemiju, nedostatak vitamina E, Refsum-ovu bolest, Bassen-Kornzweig-ov sindrom, Fabry-evu bolest, vaskulitis i amiloidozu. Naročito su poželjne dijabetička polineuropatija i postherpetička neuralgija. Ukoliko se radi o infektivnoj bolesti, ona je poželjno izabrana iz grupe koja sadrži mononukleozu, erlihiozu, tifus, difteriju, lepru, HIV, Lajmsku bolest i boreliozu.

Polineuropatski bol je poželjno onaj bol uzrokovan polineuropatijom u skladu sa MKB-10 (Međunarodna klasifikacija bolesti i srodnih zdravstvenih problema, WHO izdanje, poželjno izdanje iz 2008).

Dodatni predmet pronalaska se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju stanja anksioznosti, stresa i sindroma koji su povezani sa stresom, depresije, epilepsije, Alzheimer-ove bolesti, senilne demencije, opštih kognitivnih disfunkcija, smetnji u učenju i pamćenju (kao nootropik), apstinencijalnih kriza, zloupotrebe i zavisnosti od alkohola i/ili droge i/ili lekova, seksualnih disfunkcija, kardiovaskularnih bolesti, hipotenzije, hipertenzije, tinitusa, pruritusa, migrene, nagluvosti, umanjene pokretljivosti creva, umanjenog unosa hrane, anoreksije, gojaznosti, lokomotornih poremećaja, dijareje, kaheksije, urinarne inkontinencije ili kao mišićni relaksant, antikonvulziv ili anestetik ili za ko-primenu u slučaju lečenja sa opioidnim analgetikom ili anestetikom, za diurezu ili antinatriurezu, anksiolizu, za modulaciju lokomotorne aktivnosti, za modulaciju izlučivanja neurotransmitera i lečenje neurodegenerativnih bolesti koje su sa ovim povezane, za lečenje apstinencijalnih kriza i/ili za redukovanje potencijala za stvaranje zavisnosti, koji imaju opioidi.

Dodatni predmet pronalaska se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu, naročito u jednoj od gore navedenih indikacija, u lečenju nehumanog sisara ili čoveka kod koga postoji potreba za lečenjem hroničnog bola, poželjno neuropatskog bola, poželjnije bola kod dijabetičke polineuropatije ili postherpetičke neuralgije, primenom individualne, terapeutske neophodne, dnevne doze jedinjenja prema pronalasku ili oblika primene prema pronalasku, poželjno bez istovremene značajne supresije osećaja za akutni nociceptivni bol i/ili bez značajnih sporednih efekata tipičnih za opioide, naročito značajno bez respiratorne depresije i/ili konstipacije i/ili urinarne retencije i/ili mučnine i/ili povraćanja i/ili hipotonije i/ili bradikardije i/ili adikcije i/ili zavisnosti i/ili euforije i/ili depresije i/ili sedacije i/ili vrtoglavice.

Dodatni predmet pronalaska se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu, naročito u jednoj od gore navedenih indikacija, u lečenju nehumanog sisara ili čoveka kod koga postoji potreba za lečenjem hroničnog bola, poželjno neuropatskog bola, poželjnije bola kod dijabetičke polineuropatije ili postherpetičke neuralgije, primenom dnevne doze X jedinjenja prema pronalasku ili oblika primene prema pronalasku, poželjno bez značajne istovremene supresije osećaja za akutni nociceptivni bol i/ili bez značajnih sporednih efekata tipičnih za opioide, naročito značajno bez respiratorne depresije i/ili konstipacije i/ili urinarne retencije i/ili mučnine i/ili povraćanja i/ili hipotonije i/ili bradikardije i/ili adikcije i/ili zavisnosti i/ili euforije i/ili depresije i/ili sedacije i/ili vrtoglavice; pri čemu je dnevna doza izabrana iz grupe koja sadrži 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg.

Dodatni predmet pronalaska se odnosi na jedinjenja prema pronalasku opšte formule (III) koja imaju afinitet za µ-opioidni receptor i ORL-1 receptor za upotrebu

- u lečenju neuropatskog bola, poželjno kod pacova, poželjnije kao mononeuropatski bol po Čungovom modelu, koja su značajno efikasna i okarakterisana polovinom maksimalne efikasne doze ED50<n>i

- koja uglavnom nisu značajno efikasna u lečenju akutnog bola. Poželjno kod pacova, poželjnije u testu izmicanja repa, u dozi koja je za faktor 5 viša od ED50<n>.

Na taj način, jedinjenja prema opštoj formuli (III) pri primeni u ovoj polovini maksimalne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu efikasnosti jedinjenja protiv neuropatskog bola i čak u dozi koja je za faktor 5 viša nego ED50<n>ispoljava - ako i uopšte – najviše zanemarljivo antinociceptivno dejstvo u slučaju akutnog bola, poželjno kod pacova, poželjnije u testu izmicanja repa.

U poželjnom primeru izvođenja neuropatski bol je mononeuropatski ili neuralgični bol, poželjno bol koji se javlja usled postherpetičke neuralgije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja bol je polineuropatski bol, poželjno bol koji se javlja usled dijabetičke polineuropatije.

Poželjno se jedinjenja prema opštoj formuli (III) koriste u u dozi koja uglavnom nije značajno efikasna u lečenju akutnog ili nociceptivnog bola koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20, 30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200, 300, 400 ili 500, najpoželjnije za faktor 600, 700, 800 ili 900, a naročito za faktor 1000.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike je poznata polovina maksimalne efikasne doze ED50<n>. Ona je poželjno definisana kao doza na kojoj se u pogledu lečenja neuropatskog bola postiže 50% maksimalnog terapijskog dejstva. Prema tome, polovina maksimalne efikasne doze ED50<a>se može definisati kao doza na kojoj se u pogledu terapije akutnog bola postiže 50% maksimalnog terapijskog dejstva. Jedinjenja prema pronalasku su međutim definisana preko ED50<n>, ali ne preko ED50<a>.

Pogodni postupci za ispitivanje efikasnosti aktivne supstance u lečenju neuropatskog bola i za određivanje polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>u lečenju neuropatskog bola su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Isto važi i za ispitivanje efikasnosti aktivne supstance protiv akutnog bola.

Na primer, određivanje se može sprovesti na životinjskom modelu (npr. miš ili pacov), pri čemu

- mononeuropatski bol može biti ispitivan po Čungu (S.H. Kim, J.M. Chung, Pain.

1992, 50(3), 355-63) ili Benetu (G.J. Bennett, Y.K. Xie, Pain.1988, 33(1), 87-107),

- bol u slučaju dijabetičke polineuropatije usled dijabetesa koji je indukovan streptozotocinom (STZ) (E.K. Joseph, J.D. Levine, Neuroscience.2003; 120(4):907-13) i

- akutni bol može biti ispitivan u takozvanom testu izmicanja repa (D'Amour and Smith, J. Pharm. Exp. Ther. 72, 1941, 74- 9).

Poželjno je da se određivanje vrši na životinjskom modelu, u pogledu efikasnosti protiv neuropatskog bola kao efikasnost protiv mononeuropatskog bola kod pacova po Čungovom modelu, i u pogledu na efikasnost protiv akutnog bola kod pacova u testu izmicanja repa, poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu.

Na taj način, jedinjenja prema pronalasku poželjno imaju afinitet za µ-opioidni receptor i za ORL-1-receptor, koja su kod pacova

- značajno efikasna u lečenju mononeuropatskog bola po Čungovom modelu i okarakterisana polovnom maksimale efikasne doze ED50<n>, i

- koja nisu značajno efikasna u lečenju akutnog bola u testu izmicanja repa u dozi koja je za faktor 5 viša od ED50<n>.

Procena eksperimentalnih nalaza se, u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem, poželjno vrši analizom varijanse sa ponavljanjem merenja (ANOVA sa ponavljanjem merenja) kao i post hoc analizom po Bonferroni-ju, poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=10.

U principu se komparativno određivanje analgetičke efikasnosti protiv neuropatskog bola i akutnog, nociceptivnog bola može sprovesti i na ljudima, ali ovo je ipak zbog, između ostalog, etičkih razloga, manje poželjno. Ispitivanje efikasnosti protiv neuropatskog bola, tj., kod pacijenata koji pate od neuropatskog bola, se može vršiti po Hansson P, Backonja M, Bouhassira D. (2007), Usefulness and limitations of quantitative sensory testing; clinical and research application in neuropathic pain states. Pain. 129(3): 256-9. Ispitivanje efikasnosti protiv akutnog bola se potom može vršiti po Posner J, Telekes A, Crowley D, Phillipson R, Peck AW. (1985). Effects of an opiate on cold-induced pain and the CNS in healthy volunteers. Pain.23(1):73-82.

Iznenađujuće je otkriveno, da se jedinjenja prema opštoj formuli (III) odlikuju jako povoljnim profilom sporednih efekata, za razliku od uobičajenih opioida stadijuma 3. Na taj način, čak prilikom primene terapeutski efikasnih doza kao što su potrebne naročito za lečenje neuropatskog bola, nisu, ili su samo neznatno izraženi, primećeni sporedni efekti karakteristični za opioide, kao što su respiratorna depresija, konstipacija, urinarna retencija, mučnina, povraćanje, hipotonija, bradikardija, adikcija, zavisnost, euforija, depresija, sedacija i vrtoglavica. Do sada je veoma smanjena pojava sporednih efekata koji su karakteristični za opioide, respiratorna depresija, konstipacija, hipotonija, bradikardija, poremećaj kapaciteta motorne koordinacije (kao merilo sporednih efekata na centralni nervni sistern), fizička i psihička zavisnost eksperimentalno prikazana na životinjskim modelima.

U poželjnom primeru izvođenja prijave prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III) kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi koja je za faktor 5 viša od ED50<n>, ne ispoljavaju značajnu respiratornu depresiju kao sporedni efekat, poželjno kod pacova, poželjnije na modelu gasne analize krvi. Poželjno jedinjenja prema opštoj formuli (III), čak kada su korišćena u dozi, koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20, 30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200, ne ispoljavaju značajnu respiratornu depresiju kao sporedni efekat.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati pogodni postupci za ispitivanje respiratorne depresije indukovane aktivnom supstancom. Poželjno je da se ispitivanje vrši na modelu gasne analize krvi kod pacova kao promena arterijskog parcijalnog pritiska O2i CO2. Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem, poželjno se vrši jednofaktorskom analizom varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i putem post hoc analize po Dunett-u, poželjno kako je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=6. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, nadalje se takođe upućuje na eksperimentalni deo.

U poželjnom primeru izvođenja prijave prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III), kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi, koja je za faktor 5 viša od ED50<n>, ne ispoljava značajnu konstipaciju kao sporedni efekat, poželjno na mišu, poželjnije u testu prolaska uglja. Poželjno jedinjenja ne ispoljavaju nikakvu značajnu konstipaciju kao spredni efekat, čak i u dozi, koja je viša nego polovina maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20, 30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200, 300, 400 ili 500, najpoželjnije za faktor 600.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati odgovarajući postupci za ispitivanje konstipacije izazvane aktivnom supstancom. Ispitivanje se poželjno vrši na modelu prolaska uglja kod miša, kao promena gastrointestinalne brzine prolaza. Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem se poželjno vrši jednofaktorskom analizom varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i putem post hoc analize po Dunett-u, poželjno kako je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=10. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, nadalje se takođe upućuje na eksperimentalni deo.

U jednom poželjnom primeru izvođenja primene prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III), kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi koja je za faktor 5 viša nego ED50<n>, ne ispoljavaju značajnu hipotoniju kao sporedni efekat, poželjno na budnim zečevima, poželjnije na cirkulatornom modelu na budnim zečevima, koji su priključeni na telemetriju. Poželjno je da jedinjenja prema pronalasku ne ispoljvaju značajnu hipotoniju kao sporedni efekat, čak i u dozi koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20, 30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati odgovarajući postupci za ispitivanje hipotonije izazvane aktivnom supstancom. Poželjno je da se ispitivanje vrši na cirkulatornom modelu na budnim telemetrisanim zečevima, kao promena u arterijskom krvnom pritisku (sistolni, dijastolni i srednja vrednost). Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem se poželjno vrši jednofaktorskom analizom varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i putem post hoc analize po Dunett-u, poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde se nivo značajnosti postavlja na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=6. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, nadalje se takođe upućuje na eksperimentalni deo.

U jednom poželjnom primeru izvođenja prijave prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III), kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi, koja je za faktor 5 viša nego ED50<n>, ne ispoljavaju značajnu bradikardiju kao sporedni efekat, poželjno na budnim zečevima, poželjnije na cirkulatornom modelu na budnim zečevima, koji su priključeni na telemetriju. Poželjno jedinjenja prema pronalasku ne ispoljavaju nikakvu značajnu bradikardiju kao sporedni efekat, čak u dozi koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20 ,30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati odgovarajući postupci za ispitivanje bradikardije izazvane aktivnom supstancom. Poželjno se isptivanje vrši na cirkulatornom modelu kod budnih zečeva, priključenih na telemetriju, kao promena srčane frekvencije. Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem se poželjno vrši jednofaktorskom analizom varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i putem post hoc analize po Dunett-u, poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=6. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, nadalje se takođe upućuje na eksperimentalni deo.

U jednom poželjnom primeru izvođenja primene prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III), kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi, koja je za faktor 5 viša nego ED50<n>, ne ispoljavaju značajan poremećaj kapaciteta motoričke koordinacije (kao merilo sporednih efekata u centralnom nervnom sistemu) kao sporedni efekat, poželjno na mišu, poželjnije u 'Rotarod' testu. Poželjno jedinjenja ne ispoljavaju nikakav značajan poremećaj kapaciteta motoričke koordinacije (kao merilo za sporedne efekte u centralnom nervnom sistemu), kao sporedni efekat, čak u dozi koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20 ,30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200, 300, 400 ili 500, najpoželjnije za faktor 600, 700, 800 ili 900 i naročito za faktor 1000. Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati odgovarajući postupci za ispitivanje poremećaja kapaciteta motoričke koordinacije izazvane aktivnom supstancom. Poželjno se isptivanje vrši na mišu u 'rotarod 'modelu (analogno sa Kuribara H., Higuchi Y., Tadokoro S. (1977), Effects of central depressants on Rota-Rod and traction performance in mice. Japan. J. Pharmacol. 27, 117-126.) kao promena u sposobnosti hodanja na rotirajućoj šipci. Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem se poželjno vrši jednofaktorskom analizom varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i putem post hoc analize po Dunett-u, poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=10. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, nadalje se takođe upućuje na eksperimentalni deo.

U jednom poželjnom primeru izvođenja prijave prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III), kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi, koja je za faktor 5 viša nego ED50<n>, ne ispoljavaju značajnu fizičku zavisnost ili apstinencijalni simptom kao sporedni efekat, poželjno kod miša, poželjnije u testu skakanja.

Poželjno jedinjenja ne ispoljavaju nikakvu fizičku zavisnost ili apstinencijalne simptome kao sporedni efekat, čak i u dozi koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20, 30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, čak poželjnije za faktor 200, 300, 400 ili 500, najpoželjnije za faktor 600, 700, 800 ili 900, i naročito za faktor 1000.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati odgovarajući postupci za ispitivanje fizičke zavisnosti izazvane aktivnom supstancom. Poželjno je da se isptivanje vrši na mišu na modelu skakanja (analogno sa Saelens JK, Arch Int Pharmacodyn 190: 213-218, 1971) kao apstinencija indukovana naloksonom. Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika izmedu određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem se poželjno vrši Fišerovim egzaktnim testom za parametar „broj životinja sa apstinencijalnim simptomima", kao i uz pomoć Kruskal-Wallis testa za parametar „učestalost skokova", poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti postavljen na p < 0.05 u svakom slučaju. Veličine grupa su obično n=12. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, nadalje se takođe upućuje na eksperimentalni deo.

U jednom poželjnom primeru izvođenja prijave prema pronalasku, jedinjenja prema opštoj formuli (III), kada su primenjena u polovini maksimalne efikasne doze ED50<n>, koja je definisana u pogledu na efikasnost jedinjenja protiv neuropatskog bola i poželjno čak u dozi, koja je za faktor 5 viša nego ED50<n>, ne ispoljavaju značajnu psihičku zavisnost ili adikciju kao sporedni efekat, poželjno kod pacova, poželjnije uslovljavanjem naklonosti ka određenom mestu. Poželjno, jedinjenja ne ispoljavaju nikakvu značajnu psihičku zavisnost ili adikciju kao sporedni efekat, čak i u dozi koja je viša od polovine maksimalne efikasne doze ED50<n>za faktor 10, 20, 30, 40 ili 50, poželjnije za faktor 75, 100, 125, 150 ili 175, još poželjnije za faktor 200, 300, 400 ili 500, najpoželjnije za faktor 600, 700, 800 ili 900 i naročito za faktor 1000.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati odgovarajući postupci za ispitivanje psihičke zavisnosti i adikcije indukovane aktivnom supstancom. Poželjno je da se ispitivanje vrši uslovljavanjem naklonosti ka određenom mestu kod pacova, poželjno kao što je opisano kod Tzschentke, T.M., Bruckmann, W. and Friedrichs, F. (2002) Lack of sensitization during place conditioning in rats is consistent with the low abuse potential of tramadol. Neuroscience Letters 329, 25-28. Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika u preferencijama životinja za aktivnu supstancu ili nosač sprovodi se parnim t-testom. Nivo značajnosti je postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=8. Što se tiče ostalih pojedinosti ovog životinjskog modela, upućuje se dalje na opis postupka u Tzschentke, T.M., Bruckmann, W. and Friedrichs, F. (2002) Neuroscience Letters 329, 25-28.

Jedinjenja prema opštoj formuli (III) su pogodna za upotrebu u lečenju hroničnog bola, poželjno neuropatskog bola, poželjnije protiv mononeuropatskog/neuralgičnog ili polineuropatskog bola, još poželjnije protiv bola u slučaju postherpetičke neuralgije ili u slučaju dijabetičke polineuropatije.

Definicije različitih oblika hroničnog bola su poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike. S tim u vezi upućivanje se vrši, na primer na Merskey H., Bogduk N. Classification of chronic pain. Seattle: IASP Press 1994, Bennett G.J., Anesth Analg. 2003, 97, 619-20 i Backonja M.M., Anesth Analg.2003, 97, 785-90.

Za svrhe opisa, hroničan bol je poželjno definisan kao simptomi bola koji postoje tokom dužeg vremenskog perioda (normalno najmanje 3, 4, 5 ili 6 meseci), i koji prevazilaze normalan period lečenja. Poželjno neuropatski bol je definisan kao bol ili senzorni fenomen, prouzrokovan lezijom, bolešću ili disfunkcijom centralnog ili perifernog nervnog sistema. Za svrhu opisa, akutni bol je poželjno opisan kao neprijatno senzorno i emocionalno iskustvo koje se javlja zajedno sa akutnom ili potencijalnom povredom tkiva ili je opisan prema takvom oštećenju (videti definiciju International Association for the Study of Pain® (IASP)).

Jedinjenja prema pronalasku u skladu sa opštom formulom (III) imaju Kivrednost na µopioidnom receptoru od poželjno ne više od 1000 nM, poželjnije ne više od 500 nM, još poželjnije 100 nM, najpoželjnije ne više od 50 nM i naročito ne više od 25 nM.

Stručnjaku iz date oblasti tehnike su poznati postupci za određivanje Kivrednosti na µopioidnom receptoru. Poželjno je da se određivanje vrši u homogenom početnom rastvoru na mikrotitarskim pločama. Za ovo je poželjno da se serijska razblaženja, koja je potrebno ispitati, inkubiraju 90 min na sobnoj temperaturi sa preparatom membranskih receptora (15-40 µg proteina na 250 µl inkubiranog početnog rastvora) CHO-K1-ćelija koje eksprimiraju humani µ-opijatni receptor (RB-HOM-receptor membrane preparation, NEN, Zaventem, Belgija) u prisustvu 1 nmol/l radioaktivnog liganda [<3>H]-naloksona (NET719, NEN, Zaventem, Belgija) kao i 1 mg WGA-SPA-Beads (Wheat germ agglutinin SPA Beads, Amersham/Pharmacia, Freiburg, Nemačka) u ukupnoj zapremini od 250 µl. Poželjno je da se kao inkubacioni pufer koristi 50 mmol/l Tris-HCI obogaćen sa 0.05 težinskih % natrijum azida i sa 0.06 težinskih % goveđeg serum albumina. Radi određivanja nespecifičnog vezivanja, poželjno je dodavanje 25 µmol/l naloksona. Nakon završetka perioda inkubacije od 90 minuta, poželjno je centrifugiranje mikrotitarskih ploča u trajanju od 20 minuta na 1000 g i radioaktivnost je merena u β brojaču (Microbeta-Trilux, PerkinElmer Wallac, Freiburg, Nemačka). Određuje se procentualno istiskivanje radioaktivnog liganda iz njegove veze sa humanim µ-opijatnim receptorom u koncentraciji test supstanci od poželjno 1 µmol/l, i navodi se kao procenat inhibicije (% inhibicije) specifičnog vezivanja. Na osnovu procentualnog istiskivanja usled različitih koncentracija jedinjenja koja se ispituju, može se izračunati IC50inhibitorna koncentracija, koje izazivaju 50 % istiskivanja radioaktivnog liganda. Kivrednosti za test supstance mogu se izračunati konverzijom pomoću Čeng-Prusof-ove jednačine.

Jedinjenja korišćena prema pronalasku u skladu sa opštom formulom (III) imaju Kivrednost na ORL1-receptoru od ne više od 500 nM, poželjnije ne više od 100 nM, najpoželjnije ne više od 50 nM i naročito ne više od 10 nM.

Postupci za određivanje Kivrednosti na ORL1-receptoru su poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike. Poželjno je da se određivanje vrši analizom vezivanja za receptor sa<3>H-nociceptin/orfanin FQ sa membranama rekombinantnih CHO-ORL1 ćelija. Ovaj sistem testiranja se poželjno vrši u skladu sa postupkom koji su predstavili Ardati et al. (Mol. Pharmacol., 51, 1997, S. 816-824). Koncentracija<3>H-nociceptin/orfanina FQ u ovim testovima je poželjno 0.5 nM. Analize vezivanja su poželjno izvedene upotrebom u svakom slučaju po 20 µg membranskog proteina na 200 µl početnog rastvora u 50 mM hepesa, pH 7,410 mM MgCl2i 1 mM EDTA. Vezivanje za ORL1-receptor se poželjno određuje korišćenjem u svakom slučaju 1 mg WGA-SPA Beads (Amersham-Pharmacia, Freiburg), jednosatnom inkubacijom početnog rastvora na sobnoj temperaturi i naknadnim merenjem u scintilacionom brojaču Trilux (Wallac, Finnland).

Dodatni predmet pronalaska se odnosi na postupak za pripremu jedinjenja prema pronalasku. Pogodni postupci za sintezu jedinjenja prema pronalasku su u principu poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike.

Poželjni putevi sinteze su opisani u daljem tekstu:

Sinteza strukturnih jedinica ketona E:

stadijum 5

Stadijum 1 (preko B)

Strukture formule B se mogu pripremiti reakcijama ketona A sa aminima i kiselim reaktantima Z-H. Pogodni Z-H reaktanti su, na primer, cijano-vodonik, 1,2,3-triazol, benzotriazol ili pirazol. Naročito poželjan put do jedinjenja strukture B je reakcija ketona sa metal cijanidima i odgovarajućim aminom u prisustvu kiseline, poželjno u alkoholu, na temperaturama od -40 do 60C°, poželjno na sobnoj temperaturi sa cijanidima alkalnih metala u metanolu. Još jedan naročito poželjan put do jedinjenja strukture B je reakcija ketona sa 1,2,3-triazolom i odgovarajućeg amina pod dehidratacionim uslovima, poželjno upotrebom aparature za odvajanje vode pri povišenoj temperaturi u inertnom rastvaraču ili korišćenjem molekulskog sita ili nekog drugog desikanta. Analogno se strukture analogne B mogu uvesti upotrebom benzotriazol ili pirazol grupa, umesto triazol grupa.

Stadijum 1 (preko Q)

Priprema imina opšte formule Q od ketona A se može naći u opštem stanju tehnike.

Stadijum 2 (preko B)

Uopšteno, acetali C mogu se dobiti supstitucijom odgovarajućih odlazećih grupa Z u strukturama formule B. Pogodne odlazeće grupe su poželjno cijano grupe: 1,2,3-triazol-1-il grupe. Dodatne pogodne odlazeće grupe su 1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il-grupe i pirazol-1-il-grupe (Katritzky et al., Synthesis 1989, 66-69). Naročito pogodan put do jedinjenja strukture C je reakcija aminonitrila B (Z = CN) sa odgovarajućim organometalnim jedinjenjima, poželjno Grignard-ovim jedinjenjima, poželjno u etrima, poželjno na sobnoj temperaturi. Organo-metalna jedinjenja se mogu ili kupiti, ili pripremiti na osnovu opšteg stanja tehnike. Dodatni naročito poželjan put do jedinjenja strukture C je reakcija aminotriazola B (Z = triazol) sa odgovarjućim organo-metalnim jedinjenjima, poželjno Grignard-ovim jedinjenjima, poželjno u etrima, poželjno na sobnoj temperaturi. Organo-metalna jedinjenja se mogu ili kupiti, ili pripremiti na osnovu opšteg stanja tehnike.

Stadijum 2 (preko Q)

Aminoacetali C sa maksimalno jednim supstituentom na atomu azota mogu se dobiti prema postupcima poznatim stručnjku iz date oblasti tehnike dodavanjem ugljenikanukleofila u imine Q, poželjno organo-metalnih jedinjenja u inertne rastvarače, posebno poželjno sa Grignard-ovim reagensima ili organo-litijumskim jedinjenjima, poželjno u etrima, poželjno na temperaturama od 100 do sobne temperature.

Stadijum 4/5:

Jedinjenja formule E se mogu osloboditi iz odgovarajućih acetala C ili njihovih soli D prema opšte poznatom stanju tehnike deprotekcijom pomoću kiselina. Ovde je X izabran od grupe alkil, alkil/alkiliden/alkiliden supstituisan sa arilom ili alkilom (zasićen/nezasićen)

Priprema

Aminoacetali Ca koji imaju maksimalno jedan supstituent na atomu azota mogu se prevesti prema postupcima u principu poznatim stručnjaku iz date oblasti tehnike, na primer reduktivnom aminacijom, u odgovarajuće aminoacetale C koji imaju jedan ili dva dodatna supstituenta na azotu.

Aminonitrilni put, iminski put i triazolski put

Potrebni ketonski intermedijer E može biti pripremljen, na primer, prema sledeća tri različita puta: (1) aminonitrilni put (2) iminski put i (3) triazolni put.

(1) Aminonitrilni put:

U aminonitrilnom putu se, kao što je opisano u narednoj šemi sinteze, iz prekursora ketona A sintetiše aminonitril Ba, koji se pomoću nukleofila MR3 prevodi u strukturne jedinice C ili D i nadalje u E. Ovaj put sinteze je već bio opisan i korišćen u WO2004/043967.

(2) Iminski put:

U iminskom putu se, kao što je opisano u narednoj šemi, iz jednog prekursora ketona A sintetiše imin Q, koji se pomoću nukleofila MR3 prevodi u strukturne elemente C ili D i nadalje u E. Potrebne strukturne jedinice Q mogu se pripremiti prema postupku poznatom stručnjaku iz date oblasti tehnike (Layer, Chem. Rev., 1963, 8, 489-510). Za dodavanje organo-metalnih jedinjenja MR3 na imin Q korišćeni su postupci, koji su poznati u literaturi (npr. Maddox et al., J. Med. Chem., 1965, 8,230-235, Kudzma et al., J. Med. Chem., 1989, 32, 2534-2542). Stadijumi 3, 4 i 5 su izvedeni analogno aminonitrilnom putu.

stadijum 5

Stage 3

(3) Triazolni put:

U triazolnom putu se, kao što je opisano u narednoj šemi, iz jednog prekursora ketona A sintetiše triazol Bb, koji se pomoću nukleofila MR3 prevodi u strukturne elemente C ili D i nadalje u E. Uslovi se mogu naći u naznačenim literaturnim referencama: (a) Katritzky et al. Synthesis, 1992, 1295- 1298. (b) Prashad, et al., Tetrahedron Lett.2005, 46, 5455-5458.

Sinteza spiroamina (AMN)

Triptamini tipa H mogu reagovati u reakcijama tipa Piktet-Špengler sa ketonima E uz dodavanje najmanje jednog reagensa iz grupe kiselina, kiselih anhidrida, estara, soli koje reaguju slabo kiselo ili Luisovih kiselina da bi se formirali proizvodi formule AMN.

Poželjno se koristi najmanje jedan reagens iz grupe karboksilnih kiselina, fosfornih kiselina, sulfonskih kiselina ili njihovih anhidrida, trialkilsililestri karboksilnih kiselina, soli koje reaguju kiselo, mineralnih kiselina ili Luisovih kiselina iz grupe koja sadrži bortrifluorid, indijum(III) hlorid, titantetrahlorid, aluminijum(III) hlorid, ili dodavanjem najmanje jedne soli prelaznog metala, naročito poželjno dodavanjem najmanje jednog triflata prelaznog metala (trifluorometansulfonat prelaznog metala), naročito poželjno uz dodavanje najmanje jednog metaltrifluormetanosulfonata prelaznog metala izabranog iz grupe koja sadrži skandijum (III) trifluormetanosulfat, iterbijum(III) trifluormetanosulfonat i indijum (III) trifluormetanosulfonat, ukoliko je potrebno uz dodavanje celita, sa reaktantima ili reagensima koji su vezani za čvrste faze, na povišenoj ili smanjenoj temperaturi, sa ili bez mikrotalasnog zračenja, ukoliko je odgovarajuće u odgovarajućem rastvaraču ili mešavini rastvarača kao što su hlorovani ili nehlorovani, zatim poželjno aromatični, ugljovodonici, acetonnitril; u etarskim rastvaračima, poželjno u dietil etru ili THF; ili nitrometanu, u odgovarajućim slučajevima takođe u alkoholima ili vodi. Naročita prednost se daje piridinijum-paratoluensulfonatu, fosfor pentoksidu u prisustvu celita, bortrifluroid eteratu, trifluorsirćetnoj kiselini, tetraizopropil estru ortotitanske kiseline zajedno se trifluorsirćetnom kiselinom, trimetilsilil estru trifluormetansulfonske kiseline, trifluormetansulfonskoj kiselini, metansulfonskoj kiselini, trifluorosirćetnoj kiselini, sirćetnoj kiselini, fosfornoj kiselini, polifosfornoj kiselini, polifosfatnim estrima, ptoluenskoj kiselini, hlorovodoničnoj kiselini, gasovitom HCl, sumpornoj kiselini zajedno sa acetatnim puferom, kalaj tetrahloridu.

Uslovi naznačeni u sledećim primerima su ponovo poželjno korišćeni.

Jedinjenja opštih formula H i E su ili komercijalno dostupna ili je njihova priprema poznata iz stanja tehnike ili se može izvesti iz stanja tehnike na način očigledan stručnjaku iz date oblasti tehnike. U ovom kontekstu su naročito relevantni sledeći citati: Jirkovsky et al., J. Heterocycl. Chem., 12, 1975, 937-940; Beck et al., J. Chem. Soc. Perkin 1, 1992, 813-822; Shinada et al., Tetrahedron Lett., 39, 1996, 7099-7102; Garden et al., Tetrahedron, 58, 2002, 8399-8412; Ledniceret al., J. Med. Chem., 23, 1980, 424-430; Bandini et al. J. Org. Chem. 67, 15; 2002, 5386 - 5389; Davis et al., J.Med.Chem. 35, 1, 1992, 177-184; Yamagishi et al., J.Med.Chem.35, 11, 1992, 2085-2094; Gleave et al.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 10, 1998, 1231-1236; Sandmeyer, Helv. Chim. Acta; 2; 1919; 239; Katz et al.; J. Med. Chem. 31, 6, 1988; 1244-1250; Bac et al. Tetrahedron Lett.1988, 29, 2819; Ma et al. J. Org. Chem.2001, 66, 4525; Kato et al. J. Fluorine Chem. 99, 1, 1999, 5 - 8.

Sinteza spiroamida (AMD)

AMN AMD

Jedinjenja opšte formule AMN mogu da reaguju sa karboksilnim kiselinama u najmanje jednom rastvaraču, poželjno izabranom iz grupe koja sadrži dihlormetan, acetonitril, dimetilformamid, dietiletar, dioksan i tetrahidrofuran, uz dodavanje najmanje jednog sredstva za kuplovanje, poželjno izabranog iz grupe koja sadrži karbonildiimidazol (CDI), 2-hloro-1-metilpiridijum jodid (Mukaijama reagens), N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid (EDCI), O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TBTU), N',N'-dicikloheksilkarbodiimid (DCC) i 1-benzotriazoliloksitris-(dimetilamino)-fosfonijum heksafluorofosfat (BOP), ukoliko je odgovarajuće u prisustvu najmanje jedne neorganske baze, poželjno izabrane iz grupe koja sadrži kalijum karbonat ili cezijum karbonat, ili organske baze, poželjno izabrane iz grupe koja se sastoji od trimetilamina, diizopropiletilamina i piridina i, ukoliko je odgovarajuće, dodavanjem 4-(dimetilamino)piridina ili 1-hidroksibenzotriazola poželjno na temperaturama od 25°C do 150°C, ukoliko je odgovarajuće uz mikrotalasno zračenje da bi se dobila jedinjenja opšte formule AMD.

Jedinjenja opšte formule AMN mogu da reaguju sa kiselim anhidridima i hloridima karboksilne kiseline u najmanje jednom rastvaraču, poželjno izabranom iz grupe koja sadrži dihlorometan, acetonitril, dimetilformamid, dietil etar, dioksan i tetrahidrofuran, ukoliko je odgovarajuće u prisustvu najmanje jedne neorganske baze, poželjno izabrane iz grupe koja sadrži kalijum karbonat i cezijum karbonat, ili organske baze, poželjno izabrane iz grupe koja sadrži trietilamin, diizopropiletilamin i piridin i, ukoliko je odgovarajuće, uz dodavanje 4-(dimetilamino)piridina ili 1-hidroksibenzotriazola na temperaturama od poželjno između 25°C do 150 °C, ukoliko je odgovarajuće sa mikrotalasnim zračenjem da bi se dobila jedinjenja opšte formule AMD.

Za dodatne pojedinosti u vezi sa sintezom jedinjenja korišćenim prema pronalasku, naročito u pogledu sinteze pogodnih početnih strukturnih jedinica, nadalje se upućuje na WO2004/043967, WO2005/063769, WO2005/066183, WO2006/018184, WO2006/108565, WO2007/124903 i WO2008/009416. Stručnjak iz date oblasti tehnike prepoznaje da se pogodne početne strukturne jedinice za sintezu jedinjenja prema pronalasku mogu pripremiti analogno šemama sinteze i ilustrativnim primerima izvođenja prikazanim u ovim publikacijama.

Jedinjenja korišćena prema pronalasku deluju, na primer na ORL-1 i µ-opioidne receptore, koji su relevantni kod različitih bolesti, tako da su pogodna kao aktivna supstanca (lek) u farmaceutskoj kompoziciji.

Dodatni predmet pronalaska se odnosi na primenu farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju neuropatskog i/ili hroničnog bola, pri čemu kompozicija sadrži fiziološki prihvatljiv nosač i najmanje jedno jedinjenje prema opštoj formuli (III).

Poželjno korišćena kompozicija je

- čvrsta, tečna ili pasta; i/ili

- sadrži jedinjenje prema pronalasku u količini od 0.001 do 99 tež. %, poželjno od 1.0 do 70 tež. %, u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.

Farmaceutska kompozicija korišćena prema pronalasku može, ukoliko je odgovarajuće, da sadrži pogodne aditive i/ili pomoćne supstance i/ili, ukoliko je odgovarajuće, druge aktivne supstance.

Primeri pogodnih fiziološki prihvatljivih nosača, aditiva i/ili pomoćnih supstanci su punioci, rastvarači, razređivači, boje i/ili vezivna sredstva. Ove supstance su poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike (videti H.P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Editio Cantor Aulendoff).

Poželjno je da kompozicija prema pronalasku sadrži jedinjenje prema pronalasku u količini od poželjno 0.001 do 99 težinskih %, poželjnije 0.1 do 90 težinskih %, još poželjnije 0.5 do 80 težinskih %, najpoželjnije 1.0 do 70 težinskih % i naročito 2.5 do 60 težinskih % u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.

Kompozicija za upotrebu prema pronalasku je proizvedena poželjno za sistemsku, topikalnu ili lokalnu primenu, poželjno za oralnu primenu.

Dodatni primer izvođenja upotrebe prema pronalasku daje farmaceutski oblik primene koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku.

U jednom poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku je proizveden za primenu dva puta dnevno, za primenu jednom dnevno ili za primenu ređe od jednom dnevno, poželjno za primenu ne više od jednom dnevno.

Primena je poželjno sistemska, naročito oralna.

U jednom poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u tako maloj dozi koja nije značajno efikasna u lečenju akutnog bola. Ova doza je poželjno unutar opsega od između 1.0 µg i 10 mg, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

Doza je poželjno 0.001 mg±50%, 0.002 mg±50%, 0.003 mg±50%, 0.004 mg±50%, 0.005 mg±50%, 0.006 mg±50%, 0.007 mg±50%, 0.008 mg±50%, 0.009 mg±50%, 0.01 mg±50%, 0.02 mg±50%, 0.03 mg±50%, 0.04 mg±50%, 0.05 mg±50%, 0.06 mg±50%, 0.07 mg±50%, 0.08 mg±50%, 0.09 mg±50%, 0.1 mg±50%, 0.15 mg±50%, 0.2 mg±50%, 0.25 mg±50%, 0.3 mg±50%, 0,35 mg±50%, 0,4 mg±50%, 0.45 mg±50%, 0.5 mg±50%, 0.55 mg±50%, 0.6 mg±50%, 0.65 mg±50%, 0.7 mg±50%, 0.75 mg±50%, 0.8 mg±50%, 0.85 mg±50%, 0.9 mg±50%, 0.95 mg±50%, 1 mg±50%, 1.5 mg±50%, 2 mg±50%, 2.5 mg±50%, 3 mg±50%, 3,5 mg±50%, 4 mg±50%, 4.5 mg±50%, 5 mg±50%, 5.5 mg±50%, 6 mg±50%, 6.5 mg±50%, 7 mg±50%, 7.5 mg±50%, 8 mg±50%, 8.5 mg±50%, 9 mg±50%, 9.5 mg±50% ili 10 mg±50%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

Poželjnije doza je 0.001 mg±25%, 0.002 mg±25%, 0.003 mg±25%, 0.004 mg±25%, 0.005 mg±25%, 0.006 mg±25%, 0.007 mg±25%, 0.008 mg±25%, 0.009 mg±25%, 0.01 mg±25%, 0.02 mg±25%, 0.03 mg±25%, 0.04 mg±25%, 0.05 mg±25%, 0.06 mg±25%, 0.07 mg±25%, 0.08 mg±25%, 0.09 mg±25%, 0.1 mg±25%, 0.15 mg±25%, 0.2 mg±25%, 0.25 mg±25%, 0.3 mg±25%, 0.35 mg±25%, 0.4 mg±25%, 0.45 mg±25%, 0.5 mg±25%, 0.55 mg±25%, 0.6 mg±25%, 0.65 mg±25%, 0.7 mg±25%, 0.75 mg±25%, 0.8 mg±25%, 0.85 mg±25%, 0.9 mg±25%, 0.95 mg±25%, 1 mg±25%, 1.5 mg±25%, 2 mg±25%, 2.5 mg±25%, 3 mg±25%, 3.5 mg±25%, 4 mg±25%, 4.5 mg±25%, 5 mg±25%, 5.5 mg±25%, 6 mg±25%, 6.5 mg±25%, 7 mg±25%, 7.5 mg±25%, 8 mg±25%, 8.5 mg±25%, 9 mg±25%, 9.5 mg±25% ili 10 mg±25%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

Naročito poželjna doza je 0.001 mg, 0.002 mg, 0.003 mg, 0.004 mg, 0.005 mg, 0.006 mg, 0.007 mg, 0.008 mg, 0.009 mg, 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.06 mg, 0.07 mg, 0.08 mg, 0.09 mg, 0.1 mg, 0.15 mg, 0.2 mg, 0.25 mg, 0.3 mg, 0.35 mg, 0.4 mg, 0.45 mg, 0.5 mg, 0.55 mg, 0.6 mg, 0.65 mg, 0.7 mg, 0.75 mg, 0.8 mg, 0.85 mg, 0.9 mg, 0.95 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg, 5 mg, 5.5 mg, 6 mg, 6.5 mg, 7 mg, 7.5 mg, 8 mg, 8.5 mg, 9 mg, 9.5 mg ili 10 mg, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

U jednom poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u količini od 10 µg±90%, poželjnije 10 µg±75%, čak poželjnije 10 µg±50%, najpoželjnije 10 µg±25%, i naročito 10 µg±10%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u količini od 100 µg±90%, poželjnije 100 µg±75%, čak poželjnije 100 µg±50%, najpoželjnije 100 µg±25%, i naročito 100 µg±10%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u količini od 250 µg±90%, poželjnije 250 µg±75%, čak poželjnije 250 µg±50%, najpoželjnije 250 µg±25%, i naročito 250 µg±10%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u količini od 500 µg±90%, poželjnije 500 µg±75%, čak poželjnije 500 µg±50%, najpoželjnije 500 µg±25%, i naročito 500 µg±10%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u količini od 750 µg±90%, poželjnije 750 µg±75%, čak poželjnije 750 µg±50%, najpoželjnije 750 µg±25%, i naročito 750 µg±10%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

U sledećem poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku sadrži jedinjenje prema opštoj formuli (III) u količini od 1000 µg±90%, poželjnije 1000 µg±75%, čak poželjnije 1000 µg±50%, najpoželjnije 1000 µg±25%, i naročito 1000 µg±10%, u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.

Oblik primene korišćen prema pronalasku može da se primenjuje, na primer, kao lek u tečnom obliku u obliku injekcionih rastvora, kapi ili napitaka, ili kao polutvrdi lek u obliku granula, tableta, peleta, flastera, kapsula, flastera/flastera u spreju ili aerosola. Izbor pomoćnih supstanci itd. kao i njihove količine koje će se koristiti zavise od toga da li je oblik primene oralni, peroralni, parenteralni, intravenski, intraperitonealni, intradermalni, intramuskularni, intranazalni, bukalni, rektalni ili lokalni, na primer primenjen na kožu, sluzokožu ili u oči.

Oblici primene u obliku tableta, obloženih tableta, kapsula, granula, kapi, napitaka i sirupa su pogodni za oralnu primenu i rastvori, suspenzije, suvi preparati koje se lako rekonstituišu kao i sprejevi su pogodni za parenteralnu, topikalnu i inhalatornu primenu. Jedinjenja kao depo-preparati u rastvorenom obliku, ako su primenljiva uz dodavanje sredstava koja stimulišu prodiranje kroz kožu su pogodni preparati za perkutanu primenu za primenu prema pronalasku.

Oblici primene koji mogu biti primenjeni oralno ili perkutano mogu da postignu odloženo oslobađanje jedinjenja korišćenih prema pronalasku. Jedinjenja korišćena prema pronalasku takođe mogu biti primenjena u parenteralnim dugotrajnim depo oblicima kao što su, na primer, implanti ili implantirane pumpe. Drugi aktivni sastojci poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike mogu, u principu, biti dodati u oblike primene korišćene prema pronalasku.

U poželjnom primeru izvođenja jedinjenja korišćena prema pronalasku su oslobođena neposredno (neposredno oslobađanje, IR) iz oblika primene, tj. poželjno najmanje 80% uključene aktivne supstance je oslobođeno pod in vitro uslovima, poželjno u skladu sa Ph. Eur., posle 20 minuta.

Iznenađujuće je nađeno da se jedinjenja korišćena prema pronalasku u skladu sa opštom formulom (III) odlikuju neobično dugim polu-životom (t1/2) ili farmakodinamičkim trajanjem dejstva, tako da je dovoljna ređa primena kako bi se postigla dugotrajnija farmakološka efikasnost, a samim tim i olakšanje bola.

Oblici primene sa produženim oslobađanjem jedinjenja korišćenim prema pronalasku nisu apsolutno neophodni za ovo, čak u slučaju neposrednog oslobađanja (IR) dugotrajno dejstvo se postiže zahvaljujući dugom polu-životu. Dodatna prednost IR osobine takvih oblika primene je ta da se kod dugotrajne efikasnosti ipak postiže brzi unos aktivne supstance i na taj način brzi početak farmakološke efikasnosti posle prve primene. Osobine IR oblika primene se prema tome kombinuju sa osobinama PR oblicima primene (PR, produženo oslobađanje).

U poželjnom primeru izvođenja oblik primene korišćen prema pronalasku je oblik primene sa neposrednim oslobađanjem (IR) aktivne supstance koja sadrži jedinjenje prema pronalasku, poželjno opšte formule (VI) kao slobodnu bazu ili fiziološki prihvatljivu so, koja je poželjno hidrohlorid, citrat ili hemicitrat i proizvodi se za oralnu primenu ne više od jednom dnevno, poželjno tačno jednom dnevno. S tim u vezi, „neposredno oslobađanje aktivne supstance" znači da se u in vitro uslovima, poželjno prema Ph. Eur., najmanje 80% aktivne supstance originalno uključene oslobodilo posle 20 minuta.

Količina jedinjenja korišćenih prema pronalasku koja se primenjuju na pacijenta varira u zavisnosti od težine pacijenta, tipa primene, indikacije i težine bolesti. Uobičajeno, primenjeno je 0.00005 do 50 mg/kg, poželjnije 0.001 do 0.5 mg/kg, poželjnije 1 do 10 µg/kg najmanje jednog jedinjenja prema opštoj formuli (III).

Za sve gore navedene primere izvođenja oblika primene korišćenog prema pronalasku naročito je poželjno za oblik primene da sadrži, pored najmanje jednog jedinjenja prema opštoj formuli (III), dodatnu aktivnu supstancu.

ORL1 receptor i µ-opioidni receptor su povezani naročito sa pojavom bola. Prema tome, jedinjenja korišćena prema pronalasku mogu biti korišćena za pripremu leka za lečenje hroničnog bola, poželjno neuropatskog bola, poželjnije mononeuropatskog/neuralgičnog ili polineuropatskog bola, čak poželjnije bola u slučaju post-herpetičke neuralgije ili u slučaju dijabetičke polineuropatije.

Sledeći primeri služe za objašnjenje pronalaska, ali ne bi ih treballo tumačiti kao ograničavajuće.

U sledećoj nomenklaturi stereohemije primera jedinjenja, “(E)” označava supstituciju na dvoguboj vezi, npr. na derivatu cimetne kiseline, i “cis” i “trans” na supstituciju na ciklohkesil prstenu.

Sinteza strukturnih jedinica indola (H)

Strukturna jedinica H-1:

2-(1H-indol-3-il)etanamin (H-1)

Komercijano dostupan u vreme sinteze iz Aldrich.

Strukturna jedinica H-2:

2-(5-fluoro-1H-indol-3-il)etanamin (H-2)

Komercijano dostupan u vreme sinteze iz Fluorochem.

Sinteza strukturnih jedinica ketona (E)

Strukturna jedinica E-1:

Dimetil-(8-fenil-1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)amin-hidrohlorid (D-1)

Aminonitril B-1 (21 g, 0.1 mol), rastvoren u THF (210 ml), dodavan je tokom 15 minuta, pod argonom i uz hlađenje ledom, u 1.82M rastvor fenilmagnezijum hlorida u THF (109 ml, 0.198 mol), i zatim mešan u trajanju od 16 časova na sobnoj temperaturi. Da bi se obradila reakciona smeša dodat je zasićeni rastvor amonijum hlorida (150 ml), uz hlađenje ledom, i ekstrahovala sa dietil etrom (3 x 100 ml). Organska faza je ekstrahovana mućkanjem sa vodom (100 ml) i zasićenim rastvorom NaCl (100 ml) i koncentrovana. Ostalo je žuto ulje (25.2 g). Sirovi proizvod je rastvoren u etil metil ketonu (280 ml), i dodat je ClSiMe3(18.8 ml, 0.15 mol) uz hlađenje ledom. Posle reakcionog vremena od 6 časova, hidrohlorid D-1 je mogao biti izolovan u obliku bele čvrste supstance u prinosu od 35 % (10.5 g).

4-dimetilamino-4-fenilcikloheksanon (E-1)

Hidrohlorid D-1 (10.5 g, 35.2 mmol) je rastvoren u 7.5N hlorovodonočnoj kiselini (36 ml) i mešan u trajanju od 96 časova na sobnoj temperaturi. Pošto je hidroliza završena reakciona smeša je ekstrahovana sa dietil etrom (2 x 50 ml). Uz hlađenje sa ledom vodena faza je napravljena alkalnom sa 5N rastvorom natrijum hidroksida, ekstrahovana sa dihlorometanom (3 x 50 ml) i koncentrovana. Keton 6 bi na taj način mogao biti izolovan kao žuta čvrsta supstanca sa tačkom topljenja od 104-108°C u prinosu od 97% (7.4 g).

Strukturna jedinica E-2:

Varijanta 1:

[8-(3-Fluorofenil)-1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il]dimetilamin-hidrohlorid (D-2)

0.5M Rastvor 3-fluorofenilmagnezijumbromida u THF (3, 750 ml, 375 mmol) dodavan je tokom 15 minuta, pod argonom i uz hlađenje ledom, u rastvor aminonitrila B-1 (19.8 g, 94 mmol) u THF (100 ml) i zatim mešan u trajanju od 16 časova na sobnoj temperaturi. Da bi se obradila reakciona smeša dodati su zasićeni rastvor amonijum hlorida (150 ml) i voda (60 ml), uz hlađenje ledom, i ekstrahovana sa dietil etrom (3 x 100 ml). Organska faza je ekstrahovana mućkanjem sa vodom (50 ml) i zasićenim rastvorom NaCl (50 ml) i koncentrovana. Ostalo je braon ulje (26.5 g), koje je pored fenil jedinjenja 4 takođe sadržalo ketal 2. Sirovi proizvod je rastvoren u etil metil ketonu (156 ml), i dodat je ClSiMe3(17.8 ml, 141 mol) uz hlađenje ledom. Posle reakcionog vremena od 6 časova, hidrohlorid D-2 je mogao biti izolovan u obliku bele čvrste supstance koja ima tačku topljenja od 275-278°C u prinosu od 55 % (16.3 g).

Varijanta 2:

[8-(3-Fluorofenil)-1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il]dimetil-amin-hidrohlorid (D-2) Rastvor 1-bromo-3-fluorobenzina (5.00 g, 28.6 mmol) u apsolutnom etru (15 mL) dodavan je ukapavanjem u suspenziju magnezijuma (694 mg, 28.6 mmol) u apsolutnom etru (10 mL) na takav način da je etar ključao. Pošto je dodavanje završeno mešanje je izvedeno u trajanju od 10 min na sobnoj temperaturi, nakon čega je magnezijum potpuno rastvoren. Reakcioni rastvor je hlađen u ledenom kupatilu i ukapavanjem je dodavan aminonitril B-1 (3.00 g, 14.3 mmol) u apsolutnom THF (30 mL) na 10°C. Punjenje je mešano preko noći na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je dodata u 20 % rastvor NH4Cl (20 mL) i vodu (30 mL) uz hlađenje ledom, i ekstrakcija je izvedena sa etrom (3 x 50 mL). Organska faza je isprana vodom (50 mL) i zatim zasićenim rastvorom NaCl (50 mL), sušena preko Na2SO4i koncentrovana in vacuo. Sirovi proizvod je rastvoren u etil metil ketonu (25 mL), ClSiMe3(3.2 mL, 25 mmol) je dodavan uz hlađenje ledom, i mešanje je izvedeno za 5 časova na sobnoj temperaturi. Dobijeni talog je otfiltriran i sušen in vacuo.

Prinos D-2: 2.8 g (62 %)

<1>H-NMR (DMSO-d6): 1.91 (8 H, m); 2.54 (6 H, s); 3.91 (4 H, d); 7.37 (1 H, m); 7.61 (3 H, m).

Varijanta 1:

4-Dimetilamino-4-(3-fluoro-fenil)-cikloheksanon (E-2)

Hidrohlorid D-2 (7.2 g, 22.75 mmol) je rastvoren u vodi (9.6 ml), dodata je koncentrovana hlorovodonična kiselina (14 ml, 455 mmol) i mešanje je nastavljeno u trajanju od 4 dana na sobnoj temperaturi. Pošto je hidroliza završena reakciona smeša je ekstrahovana sa dietil etrom (2 x 50 ml), vodena faza je napravljena alkalnom sa 5N rastvorom natrijum hidroksida uz hlađenje ledom, nakon čega je proizvod istaložen. Keton E-2 je mogao biti izolovan kao žuta čvrsta supstanca koja ima tačku topljenja od 83-88°C i prinos od 50 % (6.05 g).

Varijanta 2:

4-Dimetilamino-4-(3-fluoro-fenil)-cikloheksanon (E-2)

Hidrohlorid D-2 (2.80 g, 8.86 mmol) je rastvoren u vodi (3.7 mL), dodata je koncentrovana hlorovodonična kiselina (5.5 mL) i mešanje je izvedeno u trajanju od 4 dana na sobnoj temperaturi. Pošto je hidroliza završena reakciona smeša je ekstrahovana sa etrom (2 x 10 mL), vodeni rastvor je napravljen alkalnim sa 5 N rastvorom natrijum hidroksida uz hlađenje ledom, reakciona smeša je ekstrahovana sa dihlorometanom (3 x 50 mL), organska faza je sušena preko natrijum sulfata i koncentrovana in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen „flash“ hromatografijom sa CHCl3/MeOH (20:1).

Prinos E-2: 676 mg (32 %), bezbojna čvrsta supstanca

Tačka topljenja: 62-67 °C

<1>H-NMR (DMSO-d6): 2.02 (6 H, s); 2.12 (5 H, m); 2.45 (3 H, m); 7.24 (3 H, m); 7.43 (1 H, m).

Strukturna jedinica E-3:

[8-(4-Fluorofenil)-1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il]dimetilamin-hidrohlorid (D-3)

1M Rastvor 4-fluorofenilmagnezijum bromida u THF (3, 125 ml, 125 mmol) dodavan je tokom 15 min u rastvor aminonitrila B-1 (10.5 g, 50 mmol) u THF (150 ml) pod argonom i uz hlađenje ledom, i zatim je mešan u trajanju od 16 časova na sobnoj temperaturi. Da bi se reakciona smeša obradila, dodati su zasićeni rastvor amonijum hlorida (37 ml) i voda (50 ml) uz hlađenje ledom, i ekstrakcija je izvedena sa dietil etrom (3 x 100 ml). Organska faza je ekstrahovana mućkanjem sa vodom (50 ml) i zasićenim rastvorom NaCl (50 ml) i koncentrovana. Ostalo je braon ulje (12.55 g), koje je sadržalo, pored fenil jedinjenja C-3, takođe ketal B-1. Sirovi proizvod je rastvoren u etil metil ketonu (75 ml) i dodat je ClSiMe3(9.5 ml, 75 mmol) uz hlađenje ledom. Posle reakcionog vremena od 6 časova hidrohlorid D-3 je mogao biti izolovan kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 47 % (7.48 g).

4-Dimetilamino-4-(4-fluorofenil)cikloheksanon (E-3)

Hidrohlorid D-3 (7.2 g, 22.75 mmol) je rastvoren u vodi (9.6 ml), dodata je koncentrovana hlorovodonična kiselina (14 ml, 455 mmol) i mešanje je izvedeno u trajanju od 4 dana na sobnoj temperaturi. Pošto je hidroliza završena reakciona smeša je ekstrahovana sa dietil etrom (2 x 50 ml), vodena faza je napravljena alkalnom sa 5N rastvorom natrijum hidroksida uz hlađenje ledom, ekstrahovana sa dihlorometanom (3 x 50 ml) i koncentrovana. Keton E-3 je mogao biti izolovan kao žuta čvrsta supstanca sa tačkom topljenja od 128-133°C i prinosom od 76 % (4.05 g).

Strukturna jedinica E-4:

Dimetil-(8-tiofen-2-il-1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)amin hidrohlorid (D-4) 2-Jodtiofen (1, 22.9 g, 109 mmol) je rastvoren pod argonom u THF (80 ml) i dodat je 2M izopropilmagnezijum hlorid (2, 35.7 ml, 72 mmol) u THF na 0°C tokom 30 min. Posle reakcionog vremena od 1 časa na 3-5°C dodat je aminonitril B-1 (10 g, 47.6 mmol), rastvoren u tetrahidrofuranu (20 ml), i mešanje je izvedeno u trajanju od 20 časova na sobnoj temperaturi. Punjenje je obrađeno dodavanjem zasićenog rastvora NH4Cl (85 ml) i ekstrakcija je izvršena sa dietil etrom (3x100 ml). Organska faza je ekstrahovana mućkanjem sa vodom (50 ml) i zasićenim rastvorom NaCl (50 ml) i koncentrovana. Dobijeno je tamno braon ulje (21.3 g), koje je, pored željenog ketala, sadržalo aminonitril B-1 i 2-jodtiofen. Sirovi proizvod je rastvoren u etil metil ketonu (140 ml), i dodat je ClSiMe3(9.1 ml, 71.4 mmol). Posle reakcionog vremena od 6 časova izolovan je hidrohlorid D-4 kao belo kristalno jedinjenje u prinosu od 60 % (8.74 g).

4-Dimetilamino-4-tiofen-2-ilcikloheksanon (E-4)

Hidrohlorid D-4 (8.68 g, 28.6 mmol) je rastvoren u 7.5N hlorovodoničnoj kiselini (29 ml) i mešan u trajanju od 48 časova na sobnoj temperaturi. Pošto je hidroliza završena reakciona smeša je ekstrahovana sa dietil etrom (2 x 50 ml). Uz hlađenje ledom vodena faza je napravljena alkalnom sa 5N rastvorom natrijum hidroksida, ekstrahovana sa dihlorometanom (3 x 50 ml) i koncentrovana. Keton E-4 je tako dobijen kao žuta čvrsta supstanca sa tačkom topljenja od 108-110°C u prinosu od 89 % (5.66 g).

Strukturna jedinica E-5:

N,N-dimetil-8-(tiofen-3-il)-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-amin (D-5)

3-Jodtiofen (1.5 g, 23.8 mmol) je rastvoren pod argonom u THF (18 ml) i dodat je 2M izopropilmagnezijum hlorid (2, 7.8 ml, 15.5 mmol) u THF na 0°C tokom 8 min. Posle reakcionog vremena od 1 časa na 3-5°C dodat je aminonitril B-1 (2.16 g, 10.3 mmol), rastvoren u tetrahidrofuranu (20 ml). Mešanje je izvedeno u trajanju od 20 časova na sobnoj temperaturi. Punjenje je obrađeno dodavanjem zasićenog rastvora NH4Cl (20 ml) i ekstrakcijom sa dietil etrom (3 x 50 ml). Organska faza je ekstrahovana mućkanjem sa vodom (20 ml) i zasićenim rastvorom NaCl (20 ml) i koncentrovana. Dobijeno je svetlo braon ulje (3.95 g). Sirovi proizvod je rastvoren u etil metil ketonu (40 ml), i dodat je ClSiMe3(1.95 ml, 15.5 mmol). Posle reakcionog vremena od 3 časa željeni hidrohlorid je mogao biti izolovan u obliku belog kristalnog jedinjenja u prinosu od 60 % (1.86 g) sa tačkom topljenja od 250-251°C.

4-(Dimetilamino)-4-(tiofen-3-il)cikloheksanon (E-5)

Hidrohlorid D-5 (1.8 g, 5.9 mmol) je rastvoren u 7.5N hlorovodoničnoj kiselini (7 ml) i mešan u trajanju od 48 časova na sobnoj temperaturi. Pošto je hidroliza završena reakciona smeša je ekstrahovana sa dietil etrom (2 x 30 ml), uz hlađenje ledom vodena faza je napravljena alkalnom sa 5N rastvorom natrijum hidroksida, ekstrahovana sa dihlorometom (3 x 30 ml) i koncentrovana. Keton E-5 je mogao biti izolovan kao žuta čvrsta supstanca sa tačkom topljenja od 147-150°C i prinosom od 98 % (1.27 g).

Sinteza strukturnih jedinica spiroamina (AMN<cis>/ AMN<trans>)

Uporedni primer AMN-1<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(fenil)-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Napomena: Prema ovom receptu pretežno je dobijen cis proizvod AMN-1<cis>. Trans proizvod AMN-1<trans>je dobijen samo kao sekundarni proizvod ili nečisti oblik.

Keton E-1 (3.26 g, 15 mmol) i triptamin H-1 (2.4 g, 15 mmol) su rastvoreni u suvom MeOH (100 ml) sa isključenjem kiseonika. U ovu smešu je dodat natrijum sulfat (3 g). Posle reakcionog vremena od 17 časova rastvarač je izdestilovan u rotacionom separatoru i ostatak je apsorbovan u 1,2-dihloroetanu (100 ml). U reakcionu smešu je dodata trifluorosirćetna kiselina (15 ml) i mešanje je izvedeno u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Za obradu, H2O (40 ml) je dodata u punjenje i pH je podešena do 11 sa NaOH (5 mol/l). Bela čvrsta supstanca je istaložena i otfiltrirana sa usisavanjem preko frite. Čvrsta supstanca je isprana sa H2O (3x5 ml) i sušena. To je bio cis proizvod AMN-1<cis>koji je dobijen kao bela čvrsta supstanca sa tačkom topljenja od 214- 218°C u prinosu od 4 g (74 %). Ishodna tečnost (vodena faza) je ekstrahovana sa 1,2-dihloroetanom (3 x 25 ml). Organska faza je sušena sa Na2SO4i koncentrovana. Čvrsti braon ostatak je rekristalizovan iz MeOH (10 ml) i proizveo je smešu cis-AMN-1<cis>i trans-AMN-1<trans>spiroamina (1 : 1). Smeša je dobijena kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 940 mg (17 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): 1.61 (m, 2 H) 1.63 (m, 2 H) 1.92 (s, 6 H) 2.12 (m, 2 H) 2.39 (m, 2 H) 2.53 (t, J = 5.36 Hz, 2 H) 2.99 (t, J = 5.35 Hz, 2 H) 6.86 (m, 1 H) 6.91 (m, 1 H) 7.16 (d, J= 7.52 Hz, 1 H) 7.28 (d, J = 7.52 Hz, 1 H) 7.31 (m, 1 H) 7.43 (m, 4 H) 10.21 (s, 1 H)

Uporedni primer AMN-2<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Keton E-2 (4.71 g, 20 mmol) i triptamin H-1 (3.2 g, 20 mmol) su rastvoreni u suvom MeOH (200 ml) pod argonom. Posle reakcionog vremena od 24 časa MeOH je izdestilovan i žuti uljasti ostatak je suspendovan u 1,2-dihloroetanu (200 ml). Trifluorosirćetna kiselina (20 ml) je dodata u preostalu smešu i mešanje je izvedeno u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Za obradu, punjenje je razblaženo sa H2O (100 ml) podešeno do pH 11 sa NaOH (5 mol/l). Posle dodavanja etil acetata (50 ml), bela čvrsta supstanca je istaložena usled mešanja i otfiltrirana sa usisavanjem preko frite. Čvrsta supstanca je isprana sa H2O (3 x 25 ml) i zatim sušena. To je bio cis-diastereomer AMN-2<cis>, koji je dobijen kao bela čvrsta supstanca sa tačkom topljenja od 220-225°C u prinosu od 5.5 g (73 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): 1.61 (m, 2 H) 1.62 (m, 2 H) 1.93 (s, 6 H) 2.11 (m, 2 H) 2.38 (m, 2 H) 2.53 (t, J = 5.56 Hz, 2 H) 2.99 (t, J = 5.56 Hz, 2 H) 6.87 (m, 1 H) 6.92 (m, 1 H) 7.14 (m, 1 H) 7.17 (d, J = 8.34 Hz, 1 H) 7.20 (m, 1 H) 7.25 (d, J = 7.82 Hz, 1 H) 7.28 (d, J = 7.47 Hz, 1 H) 7.47 (m, 1 H) 10.26 (s, 1 H)

Uporedni primer AMN-2<trans>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (trans-diastereomer)

Triptamin H-1 (2.03 g, 12.7 mmol) i keton (E-2, 3.0 g, 12.7 mmol) su rastvoreni u apsolutnom metanolu (130 ml) i mešani u trajanju od 16 časova na sobnoj temperaturi pod argonom. Reakciona smeša je zatim koncentrovana. Ostatak je rastvoren u apsolutnom 1,2-dihloroetanu (130 ml), brzo je dodata trifluorosirćetna kiselina (12.7 ml) i mešanje je izvedeno u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Uz hlađenje ledom, dodati su voda (120 ml) i 5N rastvor natrijum hidroksida (40 ml) i mešanje je nastavljeno u trajanju od 1 časa. Dobijena bezbojna čvrsta supstanca je odvojena filtracijom i isprana sa 1,2-dihloroetanom (30 ml) i vodom (4 x 25 ml). Cis-spiroamin AMN-2<cis>je dobijen u prinosu od 77 % (3.7 g) sa tragovima trans-spiroamina AMN-2<trans>. Faze filtrata su odvojene. Organska faza je sušena natrijum sulfatom i koncentrovana, dodat je metanol (3 ml) i mešanje je nastavljeno u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi. Beli čvrsti talog je odvojen filtracijom i ispran metanolom (4x3 ml). Trans-spiroamin AMN-2<trans>je dobijen u prinosu od 5 % (250 mg) sa tragovima cisspiroamina AMN-2<cis>. Posle prečišćavanja hromatografijom [silika gel 60 (20 g); metanol (200 ml)] dobijen je trans-spiroamin AMN-2<trans>(170 mg) sa tačkom topljenja od 296-299°C.

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): 1.55 (m, 2 H) 1.62 (m, 2 H) 1.88 (s, 6 H) 2.26 (m, 2 H) 2.43 (m, 2 H) 2.55 (t, J = 5.49 Hz, 2 H) 2.96 (t, J = 5.25 Hz, 2 H) 6.91 (m, 1 H) 6.99 (m, 1 H) 7.08 (m, 1 H) 7.14 (m, 1 H) 7.20 (d, J= 7.64 Hz, 1 H) 7.32 (m, 2 H) 7.40 (m, 1 H) 10.63 (s, 1 H)

Uporedni primer AMN-3<cis>

6'-Fluoro-2',3',4',9'-tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Keton E-2 (9.6 g, 41.2 mmol) i fluorotriptamin H-2 (7.3 g, 41.2 mmol) su rastvoreni u etanolu (200 ml) i zagrevani u trajanju od 12 časova na refluksu. Etanol je zatim izdestilovan i sirovi proizvod je suspendovan u 1,2-dihloroetanu (100 ml). Trifluorosirćetna kiselina (90 ml) je dodata u reakcionu smešu i mešanje je izvedeno u trajanju od 12 časova na sobnoj temperaturi. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Za obradu, punjenje je napravljeno baznim sa 500 ml od 1N rastvora NaOH na 0°C i zatim ekstrahovano 3x sa 500 ml etil acetata. Kombinovane organske faze su sušene preko magnezijum sulfata i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Posle dodavanja metanola (100 ml), bela čvrsta supstanca je istaložena usled mešanja i otfiltrirana sa usisavanjem preko frite. Čvrsta supstanca je isprana metanolom (2 x 25 ml) i zatim sušena. To je bio cis-diastereomer AMN-3<cis>koji je dobijen kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 3.6 g (22 %).

<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.39(s, 1H), 7.44-7.49 (m, 1H), 7.11-7.24 (m, 4H), 7.00-7.04 (m, 1H), 6.72-6.78 (m, 1H), 2.95-2.98 (t, 2H), 2.48-2.50 (m, 1H), 2.36-2.39 (d, 2H), 1.98- 2.11 (m, 2H), 1.91 (s, 6H), 1.51-1.67 (m, 5H)

MS m/z (M+1): 396.4; čistoća (HPLC): 95.03%

Uporedni primer AMN-4<cis>

6'-Fluoro-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(fenil)-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Keton E-1 (8.4 g, 47 mmol) i fluorotriptamin H-2 (10.2g, 47 mmol) su rastvoreni u etanolu (200 ml) i zagrevani u trajanju od 12 časova na refluksu. Etanol je zatim izdestilovan i sirovi proizvod je suspendovan u 1,2-dihloroetanu (120 ml). Trifluorosirćetna kiselina (100 ml) je dodata u reakcionu smešu i mešanje je izvedeno u trajanju od 12 časova na sobnoj temperaturi. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću TLC. Za obradu, punjenje je napravljeno baznim sa 1N rastvorom NaOH na 0°C i zatim 3x sa 500 ml etil acetata. Kombinovane organske faze su sušene preko magnezijum sulfata i koncentrovane pod sniženim pritiskom. Posle dodavanja metanola (100 ml), bela čvrsta supstanca je istaložena usled mešanja i otfiltrirana sa usisavanjem preko frite. Čvrsta supstanca je isprana metanolom (2 x 25 ml) i zatim sušena. To je bio cisdiastereomer AMN-4<cis>, koji je dobijen kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 4 g (28 %).

<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.36(s, 1H), 7.45-7.42 (t, 4H), 7.32-7.29 (m, 1H), 7.14- 7.10 (m, 1H), 7.03-7.00 (m, 1H), 6.76-6.71 (m, 1H), 2.99-2.96 (t, 2H), 2.40-2.37 (d, 2H), 2.13- (m, 2H), 1.91 (s, 6H), 1.88 (s, 1H), 1.65-1.54 (m, 4H), 1.23 (s, 1H).

Uporedni primer AMN-5<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(4-fluorofenil)-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Keton E-3 (2800 mg, 11.90 mmol) i troptamin (H-1, 1910 mg, 11.90 mmol) su rastvoreni pod argonom u suvom metanolu (119 ml) i mešani u trajanju od 18 časova. Metanol je izdestilovan in vacuo i ostatak je suspendovan u 1,2-dihloroetanu (119 ml).

Trifluorosirćetna kiselina (11.9 ml) je dodata u reakcionu smešu i mešanje je izvedeno u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zatim razblažena sa 1,2-dihloroetanom (119 ml) i podešena do pH 11 sa 1N rastvorom natrijum hidroksida uz hlađenje ledom. Formiran je bledi talog. Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Talog je otfiltriran sa usisavanjem, ispran vodom i sušen in vacuo. Cisdiastereomer AMN-5<cis>(t.t. 249-250°C, u nekim slučajevima 225-230°C) je mogao biti izolovan u prinosu od 80 % (3610 mg, 9.56 mmol). Faze su odvojene. Organska faza je sušena sa natrijum sulfatom, filtrirana i oslobođena od isparljivih komponenti in vacuo. Bledi ostatak (trans-diastereoizomer AMN-5<trans>) je apsorbovan u metanolu (5 ml) i mešan 48 časova. Talog je otfiltriran i sušen in vacuo. Trans-diastereoizomer AMN-5<trans>(268-271°C) bi mogao biti izolovan u prinosu od 6 % (279 mg, 0.74 mmol).

<13>C{<1>H}-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm: 22.8 (1 C), 27.3 (2 C), 32.6 (2 C), 37.8 (2 C), 38.6 (1 C), 51.2 (1 C), 60.5 (1 C), 106.7 (1 C), 110.8 (1 C), 114.2 (2 C, d, J = 21 Hz), 117.2 (1 C), 117.9 (1 C), 120.0 (1 C), 126.9 (1 C), 129.7 (2 C, d, J = 8 Hz), 132.8 (1 C, d, J = 3 Hz), 135.4 (1 C), 141.4 (1 C), 160.7 (1 C, d, J = 242 Hz)

Sinteza primera cis-spiroamida (AMD<cis>)

Primer AMD-1<cis>:

(E)-2<,>,3',4',9'-tetrahidro-N,N-dimetil-4-fenil-2'-(2-fenilvinil)karbonil-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin metan sulfonat (1:1) (cis-diastereomer)

AMN-1<cis>je rastvoren u THF (8 ml). Zatim su dodati hlorid cimetne kiseline (254 mg, 1.53 mmol) i diizopropiletilamin (216 mg, 1.67 mmol) i mešanje je izvedeno u trajanju od 2 dana na sobnoj temperaturi. Pošto je reakcija završena čvrsta supstanca je otfiltrirana i u filtrat je dodat zasićeni rastvor Na2CO3. Vodena faza je ekstrahovana tri puta, svaki put sa 10 ml etil acetata. Organska faza je zatim sušena preko MgSO4i koncentrovana u rotacionom isparivaču. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni [silika gel 60; DCM/metanol (19 : 1, 570 ml)]. Proizvod je dobijen u prinosu od od 174 mg (26 %). U cilju pripreme metansulfonata, upravo dobijeni spiroamid (174 mg, 0.355 mmol) je suspendovan u DCM (6 ml) i dodata je metansulfonska kiselina (23.7 µl, 0.355 mmol) na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat aceton (0.8 ml) i dodata je dovoljna količina dietil etra da bi se dispergovalo zamućenje koje se javilo u toku mućkanja. Mućkanje je izvođeno u trajanju od dodatnih 30 min. i dobijena čvrsta supstanca je zatim otfiltrirana uz usisavanje, isprana dietil etrom i sušena u trajanju od 3 časa na 50°C pod vakuumom uljane pumpe. Proizvod AMD-1<cis>je dobijen u prinosu od 159 mg (76 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 1.65 (t, J =13.22 Hz, 2 H) 2.20 (t, J = 12.84 Hz, 2 H) 2.51 (d, J = 4.53 Hz, 9 H) 2.87 - 3.16 (m, 4 H) 4.13 (br. s., 2 H) 6.92 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 6.99 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 7.20 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.31 (d, J= 7.55 Hz, 1 H) 7.36 -7.51 (m, 5 H) 7.56 - 7.69 (m, 3 H) 7.74 (d, J = 7.55 Hz, 2 H) 7.82 (d, J = 7.55 Hz, 2 H) 9.62 (br, s, 1 H)

Uporedni primer AMD-2<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluoro-fenil)-2'-(4-hlorobenzil)-karbonil-spiro-[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Spiroamin (AMN-2<cis>; 396 mg, 1.05 mmol) je suspendovan u DCM (15 ml) u posudi kompatibilnoj sa mikrotalasnim reaktorom i dodati su 2-(4-hlorofenil)acetil hlorid (397 mg, 2.1 mmol) i diizopropiletilamin (269 mg, 2.1 mmol). Reakciona smeša je zračena u trajanju od 10 min. na 120°C u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage). Pošto je reakcija završena (praćenje sa TLC) reakciona smeša je prvo filtrirana, dodat je dietil etar (15 ml) i filtriranje je ponovo izvedeno. Dodat je zasićeni rastvor Na2CO3(8ml). Posle odvajanja faza vodena faza je ponovo isprana sa DCM. Kombinovane organske faze su sušene preko MgSO4i koncentrovane u rotacionom isparivaču. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni [silika gel 60; DCM/metanol (19 : 1)]. Proizvod AMD-2<cis>je dobijen u prinosu od 91 mg (16 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d ppm 1.55 (t, J = 13.60 Hz, 2 H) 1.79 (t, J = 12.84 Hz, 2 H) 1.92 (br. s., 6 H) 2.60 - 2.70 (m, 2 H) 2.73 - 2.87 (m, 2 H) 3.17 (d, J = 5.29 Hz, 2 H) 3.89 – 4.01 (m, 4 H) 6.90 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 6.97 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 7.08 - 7,16 (m, 1 H) 7.18 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.21 - 7.30 (m, 3 H) 7.34 (q, J = 8.31 Hz, 4 H) 7.46 (q, J = 7.30 Hz, 1 H) 10.53 (s, 1 H)

Uporedni primer AMD-3<cis>

2',3',4',9'-tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(benzotiofen-2-il)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Spiroamin (AMN-2<cis>264 mg, 0.7 mmol) je suspendovan u DCM (7 ml) u posudi kompatibilnoj sa mikrotalasnim reaktorom i dodati su benzo[b]tiofen-2-karbonilhlorid (239 mg, 1.21 mmol) i diizopropiletilamin (180 mg, 1.4 mmol). Reakciona smeša je zračena u trajanju od 10 min. na 100°C u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage). Pošto je reakcija završena (praćenje sa TLC) reakciona smeša je razblažena sa DCM (15 ml) i filtrirana. Zasićeni rastvor Na2CO3(8 ml) je dodat u ishodnu tečnost. Posle odvajanja faza vodena faza je isprana još dva puta sa DCM. Kombinovane organske faze su sušene preko MgSO4i koncentrovane u rotacionom isparivaču. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni [silika gel 60; DCM/metanol (19 : 1)]. Proizvod AMD-3<cis>je dobijen u prinosu od 125 mg (33 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d ppm 1.63 - 1.79 (m, 2 H) 1.83 - 1.93 (m, 2 H) 1.95 (s, 6 H) 2.60 (d, J = 13.60 Hz, 2 H) 2.65 (t, J = 5.67 Hz, 2 H) 2.78 - 2.94 (m, 2 H) 4.08 -4.22 (m, 2 H) (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 6.99 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 7.16 (t, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.23 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.26 - 7.36 (m, 3 H) 7.44 - 7.54 (m, 3 H) 7.95 (s, 1 H) 8.03 (d, J = 7.55 Hz, 1 H) 8.07 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 10.66 (s, 1 H)

Uporedni primer AMD-4<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluoro-fenil)-2'-(4-fluorobenzil)-karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin metan-sulfonat (cisdiastereomer)

Spiroamin (AMN-2<cis>;600 mg, 1.59 mmol) je suspendovan u DCM (15 ml) u posudi kompatibilnoj sa mikrotalasnim reaktorom i dodati su 2-(4-fluorofenil)acetil hlorid (548 mg, 3.18 mmol) i diizopropiletilamin (408 mg, 3.18 mmol). Reakciona smeša je zračena u trajanju od 10 min. na 130°C u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage). Pošto je reakcija završena (praćenje pomoću TLC) reakciona smeša je prvo filtrirana, ishodna tečnost je razblažena sa DCM (45 ml), i dodat je zasićeni rastvor Na2CO3(25 ml). Posle odvajanja faza organska faza je ponovo isprana zasićenim rastvorom Na2CO3. Organska faza je sušena preko MgSO4i koncentrovana u rotacionom isparivaču. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni [silika gel 60; DCM/metanol (4 : 1)]. Proizvod je dobijen u prinosu od 150 mg (18 %). U cilju pripreme metansulfonata, spiroamid (150 mg, 0.29 mmol) je rastvoren u DCM (1 ml) i dodata je metansulfonska kiselina (18.9 µl, 0.29 mmol) na sobnoj temperaturi. To je razblaženo sa dietil etrom tako da je formirana smeša koja se može mešati. Čvrsta supstanca je otfiltrirana usisavanjem, sa isključenjem vazduha, isprana dietil etrom, i sušena na 50°C pod vakuumom uljane pumpe. Proizvod AMD-4<cis>je dobijen u prinosu od 148 mg (83 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d ppm 1.58 (t, J = 12.84 Hz, 2 H) 2.16 (t, J = 12.09 Hz, 2 H) 2.31 (s, 3 H) 2.53 - 2.58 (m, 6 H) 2.58 - 2.68 (m, 2 H) 2.83 - 3.03 (m, 4 H) 3.98 (s, 2 H) 3.99 - 4.06 (m, 2 H) 6.92 (t, J = 7.18 Hz, 1 H) 6.99 (t, J = 7.18 Hz, 1 H) 7.14 (t, J = 8.31 Hz, 2 H) 7.18 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.29 (d, J = 7.55 Hz, 1 H) 7.36 (t, J = 6.42 Hz, 2 H) 7.45 (t, J = 7.93 Hz, 1 H) 7.58 - 7.75 (m, 3 H) 9.65 (br. s., 1 H)

Primer AMD-5<cis>

(E)-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Spiroamin (AMN-2<cis>; 378 mg, 1.0 mmol) je rastvoren u suvom aprotičnom rastvaraču (6 ml), dodati su cinamoil hlorid (183 mg, 1.1 mmol) i diizopropiletilamin (155 mg, 1.2 mmol) i mešanje je izvedeno preko noći na sobnoj temperaturi. Pošto je reakcija završena (praćenjem sa TLC) rastvarač je uklonjen, ostatak je podvrgnut vodenoj obradi, i ekstrakcija je izvedena sa halogenizovanim rastvaračem. Kombinovane organske faze su sušene preko Na2SO4i koncentrovane. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni. U toku koncentrovanja čvrsta supstanca je istaložena, otfiltrirana i zatim sušena. Proizvod je dobijen u prinosu od 220 mg (43 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d ppm 1.63 (t, J = 13.60 Hz, 2 H) 1.84 (t, J = 13.22 Hz, 2 H) 1.91 (s, 6 H) 2.54 - 2.63 (m, 2 H) 2.65 (t, J = 5.67 Hz, 2 H) 2.82 - 3.02 (m, 2 H) 3.17 (d, J = Hz, 2 H) 4.00 - 4.22 (m, 2 H) 6.90 (t, J = 7.18 Hz, 1 H) 6.97 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 7.11 – 7.18 (m, 1 H) 7.20 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.23 - 7.33 (m, 3 H) 7.35 - 7.54 (m, 5 H) 7.72 (d, J = 6.80 Hz, 2 H) 10.59 (s, 1 H)

Primer AMD-6<cis>:

(E)-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin citrat (cis-diastereomer)

U cilju pripreme soli, amid AMD-5<cis>(220 mg, 0.43 mmol) je rastvoren u suvom aprotičnom rastvaraču (1.5 ml) i dodata je limunska kiselina (83 mg, 0.43 mmol), rastvorena u što je moguće manjoj količini protičnog rastvarača. U cilju taloženja proizvoda, nepolarni rastvarač je dodat ukapavanjem. Čvrsta supstanca je zatim otfiltrirana usisavanjem, sa isključenjem vazduha, i sušena na 50°C pod vakuumom uljane pumpe. Proizvod AMD-6<cis>je dobijen u prinosu od 100 mg (33 %).

Uporedni primer AMD-7<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(3,4-dimetoksibenzil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Spiroamin (AMN-2<cis>; 200 mg, 0.54 mmol) je suspendovan u halogenizovanom rastvaraču (5 ml) u posudi kompatabilnoj sa mikrotalasnim reaktorom i dodati su 2-(3,4-hlorofenil)acetil hlorid (230 mg, 1.1 mmol) i diizopropiletilamin (138 mg, 1.1 mmol). Reakciona smeša je zračena u trajanju od 10 min. na 120°C u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage). Pošto je reakcija završena (praćenje sa TLC), filtriranje je prvo izvedeno i zatim je dodat rastvor NaOH (5 N, 10 ml) u ishodnu tečnost. Posle odvajanja faza, vodena faza je ekstrahovana tri puta sa polarnim aprotičnim rastvaračem (5 ml u svakom slučaju). Kombinovane organske faze su sušene preko MgSO4i koncentrovane. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni. Proizvod AMD-7<cis>je dobijen u prinosu od 140 mg (47 %).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) d ppm 1.54 (t, J = 12.46 Hz, 2 H) 1.79 (t, J = 13.22 Hz, 2 H) 1.85 - 1.96 (m, 6 H) 2.52 - 2.60 (m, 2 H) 2.62 - 2.72 (m, 2 H) 2.73 - 2.89 (m, 2 H) 3.74 (s, 3 H) 3.77 (s, 3 H) 3.82 (br. s., 2 H) 3.90 (br. s., 2 H) 6.83 - 6.93 (m, 4 H) 6.97 (t, J = 7.55 Hz, 1 H) 7.13 (t, J = 7.18 Hz, 1 H) 7.19 (d, J = 8.31 Hz, 1 H) 7.20 - 7.32 (m, 3 H) 7.41 - 7.54 (m, 1 H) 10.53 (s, 1 H)

Primer AMD-8<cis>

(E)-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-6'-fluoro-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonil-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cisdiastereomer)

Suspenzija spiroamina AMN-3<cis>(0.197 g; 0.5 mmol; 1 ekv.) u 15 ml apsolutnog DCM je postavljena u posudu za mikrotalasni reaktor. Etil-diizopropilamin (0.129 g; 1 mmol; 2 ekv.) i hlorid cimetne kiseline (0.166 g; 1 mmol; 2 ekv.) su redom dodati u ovu suspenziju. Posuda za mikrotalasni reaktor je zatvorena i zagrevana u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage) u trajanju od 10 min na 120°C. Za obradu, 4 ml vode i 4 ml 1N rastvora natrijum hidroksida je dodato u reakcionu smešu. Smeša je mešana u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Faze su zatim odvojene i vodena faza je ekstrahovana 3x sa DCM. Kombinovane organske faze su isprane vodom i sušene preko natrijum sulfata. Pošto je rastvarač uklonjen na sniženom pritisku, ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel; etil acetat/cikloheksan 1:2 → 1:0). Dobijeno je 0.087 g proizvoda AMD-8<cis>(33 %).

HPLC/MS analiza: Rt= 4.2 min; Čistoća (UV 200-400 nm) 97%; m/z = 526.1

Uporedni primer AMD-9<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-6'-fluoro-4-(3-fluorofenil)-2'-(benzil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Suspenzija spiroamina AMN-3<cis>(0.25 g; 0.63 mmol; 1 ekv.) u 19 ml apsolutnog DCM je postavljena u posudu za mikrotalasni reaktor. Etil-diizopropilamin (0.163 g; 1.26 mmol; 2 ekv.) i 2-fenilacetil hlorid (0.195 g; 1.26 mmol; 2 ekv.) su dodati redom u ovu suspenziju. Posuda za mikrotalasni reaktor je zatvorena i zagrevana u trajanju od 10 min na 120°C u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage). Za obradu, 5 ml vode i 5 ml 1N rastvora natrijuma hidroksida su dodati u reakcionu smešu. Smeša je mešana u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Faze su zatim odvojene i vodena faza je ekstrahovana 3x sa DCM. Kombinovane organske faze su isprane vodom i sušene preko natrijum sulfata. Pošto je rastvarač uklonjen na sniženom pritisku, ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel ; etil acetat → etil acetat/metanol 9:1). Dobijeno je 0.145 g proizvoda AMD-9<cis>(45 %).

HPLC/MS analiza: Rt= 3.9 min; Čistoća (UV 200-400 nm) 98%; m/z = 514.1

Primer AMD-10<cis>

(E)-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-6'-fluoro-4-fenil-2'-(2-fenilvinil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Rastvor spiroamina AMN-4<cis>(0.15 g; 0.397 mmol; 1 ekv.) u 9 ml apsolutnog THF dodat je pod azotom na sobnoj temperaturi u rastvor hlorida cimetne kiseline (0.198 g; 1.192 mmol; 3 ekv.) u 4.5 ml apsolutnog THF. Posle mešanja od 1 časa na sobnoj temperaturi, prvih 3 ml vode i, uz hlađenje ledom, 3 ml 1N rastvora natrijum hidroksida su dodati u mutan reakcioni rastvor. Mešanje je izvedeno u trajanju od 1.5 časa. Pošto je rastvarač uklonjen na sniženom pritisku dobijena čvrsta supstanca je otfiltrirana i isprana vodom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni [silika gel; etil acetat). Dobijeno je 0.043g proizvoda AMD-10<cis>(21%).

HPLC/MS analiza: Rt= 4.2 min; Čistoća (UV 200-400 nm) 98%; m/z = 508.2

Uporedni primer AMD-11<cis>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-benzilkarbonil-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer))

Cis-spiroamin AMN-2<cis>(1.29 g, 3.4 mmol) je rastvoren, sa isključenjem kiseonika, u apsolutnom tetrahidrofuranu (20 ml) i apsolutnom dihlorometanu (120 ml), dodata je Hünig-ova baza (1.167 ml, 6.8 mmol) i 2-fenilacetil hlorid (900 µl, 6.8 mmol) na sobnoj temperaturi. Posle reakcionog vremena od 30 min 5N rastvor natrijum hidroksida (100 ml) je dodat u smešu i mešanje je nastavljeno u trajanju od 2 časa. Vodena faza je odvojena i ekstrahovana sa dihlorometanom (3 x 10 ml). Kombinovane organske faze su sušene preko Na2SO4i zatim koncentrovane. Sirovi proizvod je izolovan i odvojen hromatografijom [silika gel 60 (100 g); EtOAc (1000 ml)]. Cis-amid AMD-11<cis>je dobijen kao bezbojna čvrsta supstanca u prinosu od 820 mg (49 %) sa tačkom topljenja od 95-100 °C.

<13>C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm: 22.1, 29.1, 33.0, 38.0, 40.8, 43.1, 60.0, 60.3, 105.5, 111.1, 113.7, 113.2, 114.5, 114.7, 117.3, 118.4, 120.5, 123.8, 126.2, 126.5, 128.2,129.0, 129.3, 135.3, 136.5, 139.5, 140.6, 161.1, 163.5, 173.4

Primer AMD-12<cis>

(E)-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(4-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (cis-diastereomer)

Hünig-ova baza (0.45 ml, 342 mg, 2.64 mmol) i hlorid cimetne kiseline (440 mg, 2.64 mmol), rastvoreni u apsolutnom dihlorometanu (12 ml) dodavani su redom ukapavanjem tokom 10 min, pod argonom, u suspenziju cis-spiroamina AMN-5<cis>(500 mg, 1.32 mmol) u apsolutnom dihlorometanu (40 ml). Reakciona smeša je mešana u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi, zatim su dodati voda (30 ml) i 1N rastvor natrijum hidroksida (5 ml) i mešanje je nastavljeno u trajanju od 1.5 časa. Dihlorometan je zatim uklonjen in vacuo. Bledi čvrsti talog je odvojen filtracijom i zatim ispran vodom (3 x 30 ml). Tako dobijeni sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom [silika gel 60 (70 g), etil acetat/cikloheksan 1 : 1 (500 ml), etil acetat (1000 ml), etil acetat/metanol 10:1 (330 ml), etil acetat/metanol 4 : 1 (800 ml), metanol (300 ml)]. Za nanošenje sirovog proiozvoda na kolonu, ovo mora da se rastvori u etil acetatu/cikloheksanu 1 : 1 sa malom količinom tetrahidrofurana. Cis-amid AMD-12<cis>(t.t. 145-155°C) je dobijen kao bezbojna čvrsta supstanca u prinosu od 31 % (204 mg, 0.40 mmol).

<13>C{<1>H}-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm: 22.5 (1 C), 29.3 (2 C), 32.6 (2 C), 37.8 (2 C), 41.3 (1 C), 59.5 (1 C), 60.3 (1 C, br), 105.4 (1 C), 111.1 (1 C), 114.3 (2 C, d, J = 20 Hz), 117.3 (1 C), 118.4 (1 C), 120.5 (1 C), 123.1 (1 C), 126.6 (1 C), 127.9 (2 C), 128.7 (2 C), 129.3 (2 C), 129.8 (2 C, d, J = 8 Hz), 132.4 (1 C, br), 135.1 (1 C), 135.4 (1 C), 139.4 (1 C), 140.4 (1 C), 160.9 (1 C, d, J = 243 Hz), 170.3 (1 C)

Sinteza uporednog primera trans-spiroamida (AMD<trans>)

Uporedni primer AMD-3<trans>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(benzotiofen-2-il)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin citrat (1:1) (trans-diastereomer)

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(benzotiofen-2-il)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1 'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (trans-diastereoisomer) Hlorid benzo[b]tiofen-2-karboksilne kiseline (728 mg, 3.96 mmol) je rastvoren, pod argonom, u apsolutnom tetrahidrofuranu (30 ml) i trans-spiroamin AMN-2<trans>(500 mg, 1.32 mmol), rastvoren u apsolutnom tetrahidrofuranu (60 ml), je dodavan tokom 75 min na sobnoj temperaturi. Formirano je malo taloga. Posle reakcionog vremena od 2 časa reakciona smeša je razblažena vodom (15 ml), dodat je 1N rastvor natrijum hidroksida (15 ml) uz hlađenje ledom, i mešanje je izvođeno u trajanju od 2.5 časa. Tetrahidrofuran je uklonjen in vacuo. Formirana je čvrsta supstanca, i odvojena je filtracijom i isprana vodom (3 x 20 ml). Sirovi proizvod (587 mg) je odvojen hromatografijom [silika gel 60 (80 g); etil acetat/cikloheksan 1 : 1 (1 l), etil acetat/metanol 4 : 1 (500 ml)]. Na taj način je dobijen trans-amid kao bezbojna čvrsta supstanca u prinosu od 12 % (82 mg) sa tačkom topljenja od 219-221°C.

<13>C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ ppm: 22.4, 30.0, 30.9, 38.2, 46.4, 58.3, 59.5, 106.2, 111.0, 113.5, 113.7, 114.4, 114.7, 118.0, 119.1, 121.4, 122.5, 123.1, 124.7, 125.5, 125.8, 126.4, 128.7, 136.0, 138.7, 140.1, 140.4, 141.1, 142.1, 161.2, 163.7, 167.1

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(benzotiofen-2-il)karbonil-spiro-[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin citrat (1:1) (trans-diastereomer; AMD-3<trans>)

Upravo pripremljeni trans-amid (82 mg, 0.152 mmol) je suspendovan na 80°C u etanolu (8 ml) i dodat je etanolski rastvor (3 ml) limunske kiseline (32 mg, 0.167 mmol). Posle hlađenja na sobnoj temperaturi čvrsta supstanca se istaložila iz bistrog rastvora. Posle 1.5 časa smeša je koncentrovana do 2 ml, dodat je dietil etar (20 ml) i mešanje je izvedeno u trajanju od 20 min. Bezbojna čvrsta supstanca je odvojena filtracijom i isprana sa dietil etrom (2x3 ml) (64 mg). Posle 3 dana dodatna čvrsta supstanca je istaložena iz filtrata na sobnoj temperaturi i otfiltrirana je uz usisavanje i isprana dietil etrom (2x2 ml) (35 mg). Dve frakcije su spojene. Trans-citrat AMD- 3<trans>je na taj način dobijen u prinosu od 81 % (89 mg) sa tačkom topljenja od 175-185°C.

Uporedni primer AMD-6<trans>

(E)-2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonil-spiro-[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin citrat (1:1) (trans-diastereomer)

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (trans-diastereomer)

Hlorid cimetne kiseline (1.32 g, 7.92 mmol) je rastvoren pod argonom u apsolutnom tetrahidrofuranu (30 ml) i nečisti spiroamin AMN-2<cis>(1.0 g, 2.64 mmol, sadržao je skoro 10% trans-diastereoizomera AMN-2<trans>), rastvoren u apsolutnom tetrahidrofuranu (60 ml) je dodavan tokom 40 min na sobnoj temperaturi. Posle reakcionog vremena od 1 časa voda (20 ml) i, uz hlađenje ledom, 1N rastvor natrijum hidroksida (20 ml) dodati su u mutan reakcioni rastvor i mešanje je nastavljeno u trajanju od 1.5 časa. Tetrahidrofuran je uklonjen in vacuo. Čvrsta supstanca je istaložena i odvojena je filtracijom i isprana vodom (3 x 25 ml). Sirovi proizvod (1.16 mg) je odvojen hromatografijom [silika gel 60 (200 g); etil acetat/cikloheksan 1 : 1 (1.3 l), etil acetat (1.6 l)]. Cis-amid je dobijen kao bezbojna čvrsta supstanca u prinosu od 40 % (540 mg) sa tačkom topljenja od 155-158°C. Trans-amid je izolovan u prinosu od 7 % (93 mg) sa tačkom topljenja od 151-155°C.

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(2-fenilvinil)karbonil-spiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin citrat (1:1) (trans-diastereomer; AMD-6<trans>)

Trans-amid koji je upravo dobijen (188 mg, 0.37 mmol) rastvoren je na 80°C u etanolu (35 ml) i dodat je etanolski rastvor (2 ml) limunske kiseline (77 mg, 0.4 mmol). Mešanje je izvedeno u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi, pri čemu se kristalizacija javlja postepeno. Smeša je čuvana u trajanju od 1.5 časa na 5°C, bezbojna čvrsta supstanca je odvojena filtracijom i isprana dietil etrom (3x3 ml) (146 mg). Filtrat je koncentrovan, apsorbovan u etanolu (1 ml) i dodat je dietil etar (20 ml). Posle 16 časova dodatna bezbojna so je odvojena i isprana dietil etrom (2x2 ml) (36 mg). Dve frakcije su kombinovane i trans-citrat AMD-6<trans>je dobijen u prinosu od 71 % (182 mg) sa tačkom topljenja od 161-164°C.

<13>C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm: (trans-diastereoizomer) 22.4, 29.2, 30.7, 37.9, 41.5, 58.5, 59.6, 72.0, 105.5, 111.3, 113.2, 113.4, 113.5, 113.8, 117.3, 118.4, 120.5, 122.8, 123.1, 126.5, 127.7, 128.6, 129.1, 129.2, 135.0, 135.6, 139.8, 140.1, 160.7, 163.1, 169.9, 171.2, 175.2

Uporedni primer AMD-7<trans>

2',3',4',9'-Tetrahidro-N,N-dimetil-4-(3-fluorofenil)-2'-(3,4-dimetoksibenzil)karbonilspiro[cikloheksan-1,1'(1'H)-pirido[3,4-b]indol]-4-amin (trans-diastereomer)

3,4-Dimetoksifenilsirćetna kiselina (1 g, 5.1 mmol, 2.2 ekv.) je suspendovana u 25 ml apsolutnog toluena i dodat je tionil hlorid (0.84 ml, 11.6 mmol, 5.0 ekv.). Zagrevanje je izvedeno u trajanju od 2 časa pod refluksom i rastvarač je zatim uklonjen. Ostatak je kodestilovan sa apsolutnim toluenom (3 x 50 ml) i sirovi proizvod je rastvoren u dihlorometanu (37 ml) i prebačen u posudu za mikrotalasni reaktor. Dodati su spiroamin AMN-2<trans>(0.875 mg, 2.32 mmol) i Hünig-ova baza (0.78 ml, 580 mmol, 250 ekv.), posuda za mikrotalasni reaktor je zatvorena i zagrevana u trajanju od 20 min na 120°C u mikrotalasnom reaktoru (Initiator Eight, Firma Biotage). Za obradu, 17 ml vode i 17 ml 1N rastvora natrijum hidroksida dodati su u reakcionu smešu. Ova smeša je mešana u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Faze su zatim odvojene i vodena faza je ekstrahovana 3x sa dihlorometanom. Kombinovane organske faze su isprane vodom i sušene preko natrijum sulfata. Pošto je rastvarač uklonjen na sniženom pritisku, ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel; etil acetat/n-heksan 2:1). Dobijeno je 0.236 g proizvoda AMD-7<trans>(18 %).

HPLC/MS analiza: Rt= 5.45 min; Čistoća (UV 200-400 nm) 99%; m/z = 555.8

Sinteza uporednih primera cis spiroetra (ETHER<cis>)

Uporedni primer ETHER-1<cis>

6'-Fluoro-4',9'-dihidro-N,N-dimetil-4-(3-tienil)-spiro[cikloheksan 1,1'(3'H)-pirano[3,4-b]indol]-4-amin, metan sulfonat (2:5) (cis-diastereomer)

Keton E-5 (446.6 mg, 2 mmol) je rastvoren zajedno sa 5-fluorotriptofolom (2, 394.4 mg, 2 mmol) u apsolutnom 1,2-dihloroetanu (30 ml). Metansulfonska kiselina (0.13 ml, 2 mmol) je zatim dodata u smešu, nakon čega je boja reakcionog rastvora promenjena iz crvenkasto braon u tamno sivu. Posle 5 min bledo siva čvrsta supstanca počinje da se taloži. Punjenje je mešano u trajanju od 20 časova na sobnoj temperaturi. Metansulfonat cis-spiroetra je zatim otfiltriran uz usisavanje i ispran 1,2-dihloroetanom (2 x 10 ml). Bledo siva čvrsta supstanca je dobijena u prinosu od 76 % (733 mg) i sa tačkom topljenja od 143-145°C (ETHER-1<cis>). 1N NaOH (30 ml) je zatim dodat u filtrat i mešanje je izvedeno u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Tako je istaložen transspiroetar kao bezbojna čvrsta supstanca i dobijen je posle filtracije u prinosu od 8 % (58.5 mg).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): 1.67 (m, 2 H) 1.94 (m, 2 H) 2.24 (m, 2 H) 2.44 (s, 8 H) 2.53 (s, 3 H) 2.54 (s, 3 H) 2.66 (t, J = 5.27 Hz, 2 H) 2.72 (m, 2 H) 3.95 (t, J = 5.28 Hz, 2 H) 6.84 (m, 1 H) 7.14 (m, 1 H) 7.19 (dd, J = 4.50 / 8.70 Hz, 1 H) 7.47 (d, J = 5.10 Hz, 1 H) 7.83 (m, 1 H) 8.07 (m, 1 H) 9.67 (m, 1 H) 10.80 (s, 1 H)

Uporedni primer ETHER-2<cis>

4',9'-Dihidro-N,N-dimetil-4-(2-tienil)-spiro[cikloheksan 1,1'(3'H)-pirano[3,4-b]indol]-4-amin, metansulfonat (1:2) (cis-diastereomer)

Keton E-4 (223 mg, 1 mmol) je postavljen zajedno sa triptofolom (2, 161 mg, 1 mmol) u apsolutnom dihlorometanu (40 ml). Zatim je dodata metansulfonska kiselina (0.071 ml, 1.1 mmol). Smeša je mešana u trajanju od 16 časova na sobnoj temperaturi, usled čega je istaložen metansulfonat spiroetra. Bledo siva čvrsta supstanca (ETHER-2<cis>) je otfiltrirana uz usisavanje, isprana dihlorometanom (2 x 10 ml) i dobijena u prinosu od 25 % (117 mg) sa tačkom topljenja od 132°C. 1N NaOH (20 ml) je dodat u filtrat i mešanje je izvedeno u trajanju od 16 časova na sobnoj temperaturi. Organska faza je odvojena i vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom (2 x 20 ml). Organske faze su kombinovane, sušene i koncentrovane. Smeša supstance (274 mg) je na taj način dobijena i odvojena hromatografijom [silika gel G (20 g); etil acetat/metanol 8:1]. Trans-spiroetar je dobijen u prinosu od 54 % ((196 mg, t.p.235-238 °C), cis- spiroetar u prinosu od 10 % (38 mg).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6)

1.82 (m, 2 H) 1.98 (m, 2 H) 2.33 (m, 2 H) 2.36 (s, 6 H) 2.60 (s, 3 H) 2.61 (s, 3 H) 2.53 (m, 2 H) 2.70 (t, J = 5.23 Hz, 2 H) 3.96 (t, J = 5.23 Hz, 2 H) 6.94 (m, 1 H) 7.00 (m, 1 H) 7.21 (d, J = 8.29 Hz, 1 H) 7.34 (dd, J = 3.74 / 5.28 Hz, 1 H) 7.37 (d, J = 7.37 Hz, 1 H) 7.59 (d, J = 2.76 Hz, 1 H) 7.95 (d, J = 5.32 Hz, 1 H) 9.78 (m, 1 H) 10.74 (s, 1 H)

Oprema i postupci za HPLC-MS analizu: HPLC: Waters Alliance 2795 sa PDA Waters 996; MS: ZQ 2000 MassLynx Single Quadrupol MS Detector; Kolona: Waters Atlantis™ dC18, 3 μm, 2.1 x 30 mm; Temperatura kolone: 40°C, Eluent A: prečišćena voda 0.1% mravlja kiselina; Eluent B: acetonitril (gradijent) 0.1% mravlja kiselina; Gradijent: 0% B do 100% B za 8.8 min, 100% B za 0.4 min, 100% B do 0% B za 0.01 min, 0% B za 0.8 min; Protok: 1.0 mL/min; Jonizacija: ES+, 25 V; dopuna: 100 μL/min 70% metanol 0.2% mravlja kiselina; UV: 200 - 400 nm.

Ispitivanje farmakoloških osobina jedinjenja iz primera

A) Poređenje analgetičke efikasnosti (kao ED50, ili %MPE na određenoj testiranoj dozi) na modelu akutnog bola (test izmicanja repa, pacov/miš) i na modelima mononeuropatskog bola (Čung, pacov; Benet, pacov) ili modelu polineuropatskog bola (STZ-polineuropatija, pacov).

Iznenađujuće farmakološke osobine jedinjenja prema pronalasku su opisane primarno međusobnim poređenjem rezultata mononeuropatskog modela bola prema Čungu u modelu akutnog bola izmicanja repa pacova. Ovo omogućava da se pokaže da jedinjenja prema pronalasku ne pokazuju značajno anti-nociceptivno dejstvo u modelu izmicanja repa kod pacova u višestrukoj dozi koja ima značajnu analgetičku efikasnost u modelu prema Čungu (na primer ED50<n>). Nalazi iz dodatnih modela neuropatskog bola, kao što je Benetov model kod pacova ili STZ-polineuropatija kod pacova, naglašavaju generalno veoma dobru efikasnost jedinjenja u različitim oblicima neuropatskog bola.

Test analgezije u testu izmicanja repa kod pacova

Test životinje: ženske Sprague Dawley pacova (crl: CD (SD) outbred; Uzgajivač: Charles River, Sulzfeld, Nemačka); telesne težine 130-190 g; životinje se drže u standardnim kavezima (tip IV Makrolone kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) u svakom sa najviše po 8 životinja, u ritmu svetlo-tama 12:12 časova sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: analgetička efikasnost testiranih jedinjenja je ispitivana u testu svetlosnog zraka (test izmicanja repa) kod pacova prema metodi D'Amour and Smith (J. Pharm. Exp. Ther. 72, 74 79 (1941)). Životinje su pojedinačno smeštane u specijalne test kaveze i koren repa je izložen fokusiranom toplotnom zraku lampe (Tail-flick tip 50/08/1.bc, Labtec, Dr. Hess). Intenzitet lampe je tako podešen, da je vreme između uključivanja lampe i iznenadnog izmicanja repa (latenca povlačenja) kod netretiranih životinja iznosila 2,5-5 sekundi. Pre primene testiranih jedinjenja, životinje su prethodno dva puta testirane u roku od 30 minuta i srednja vrednost ovih merenja je izračunata kao srednja vrednost pre testa. Merenje bola je generalno izvedeno 5, 20, 40, 60, 90, 120, 180 i 240 minuta nakon intravenske primene testiranih jedinjenja ili njihovih nosača. Antinociceptivna efikasnost je određena kao povećanje latence povlačenja prema sledećoj formuli: (% MPE) = [(T1- T0)/(T2- T0)] x 100, gde T0je kontrolni period latence pre primene supstance, T1period latence nakon primene supstance, T2maksimalno vreme izloženosti svetlosnom zraku (12 sekundi), MPE: maksimalni mogući efekat.

Kod testiranih jedinjenja koja deluju antinociceptivno je zavisnost od doze određena primenom 3-5 logaritamski rastućih doza, od kojih je svaka uključivala prag doze i maksimalno efikasnu dozu. Polovina maksimalne efikasne doze (ED50) sa odgovarajućim intervalima poverenja od 95% , određena je pomoću polu-logaritamske regresione analize u vreme maksimalnog dejstva.

Statistička analiza: Veličine grupa su obično bile n=10. Analiza varijanse sa ponovljenim merenjima (ANOVA sa ponovljenim merenjima) kao i post hoc analiza prema Bonferroni-ju, korišćene su za testiranje za statistički značajne razlike u %MPE podataka izmedu odgovarajućih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05.

Izmicanje repa pacova sa smanjenim intenzitetom svetiosnog zraka

Eksperimentalne životinje: mužjaci Sprague-Dawley pacova (Uzgajivač: Janvier, Le Genest St. Isle, Francuska); telesne težine: 200 – 250 g; životinje se drže u standardnim kavezima (tip IV Makrolone kavezi, Ebeco, Castrop-Rauxel, Nemačka) u kojima ima najviše do 5 životinja u ritmu 12:12 časova svetlo-mrak sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: modulatorna efikasnost testiranih supstanci na akutne, štetne termičke stimuluse je ispitivana u testu svetlosnog zraka (test izmicanja repa) na pacovima po metodi D'Amour i Smith (J. Pharm. Exp. Ther. 72, 7479 (1941)). Korišćeni su za tu svrhu. Životinje su pojedinačno stavljane u specijalne pregrade za testiranje i koren repa je izložen fokusiranom svetlosnom zraku analgeziometra (Modell 2011, Rhema Labortechnik, Hofheim, Nemačka). Intenzitet svetlosnog zraka je tako podešen, da je vreme između uključivanja svetlosnog zraka i izmicanja repa (latenca povlačenja) kod netretiranih životinja bio približno 12-13 sekundi. Pre primene supstance prema pronalasku latenca povlačenja je određena dva puta u intervalu od pet minuta i srednja vrednost je definisana kao kontrolni period latence. Merenje latence povlačenja repa je prvi put trajalo 10 minuta nakon intravenske primene testiranog jedinjenja ili nosača. Nakon prestanka antinociceptivnog efekta (nakon 2-4 sata) usledila su merenja u intervalima od 30 minuta do maksimalno 6,5 sati nakon primene supstance. Antinociceptivno ili pronociceptivno dejstvo određeno je kao povećanje ili smanjenje perioda latence povlačenja prema sledećoj formuli: [T1– T0)/(T2- T0)] x 100. gde T0je kontrola perioda latence pre primene susptance, T1je period latence nakon primene supstance, T2je maksimalno vreme izloženosti svetlosnom zraku (30 sekundi), MPE: maksimalni mogući efekat. Kod testiranih jedinjenja koja deluju antinociceptivno, zavisnost od doze je određena primenom 3-5 logaritamski rastućih doza, koje su u svakom slučaju uključivale minimalnu i maksimalnu efikasnu dozu. Polovina maksimalne efikasne doze (ED50) sa određenim intervalima poverenja od 95% je određena polu-logaritamskom regresionom analizom u vreme maksimalnog dejstva.

Statistička procena: Veličine grupa su obično bile n=10. Analiza varijanse sa ponovljenim merenjima (ANOVA sa ponovljenim merenjima) kao i post hoc analizom prema Bonferroni-ju, korišćene su za testiranje statistički značajnih razlika u %MPE podacima izmedu odgovarajućih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05.

Test analgezije u testu izmicanja repa miša

Test životinje: mužjaci NMRI miševa (uzgajivač: Charles River, Sulzfeld, Nemačka); telesne težine: 20-25 g; životinje se drže u standardnim kavezima (Tip III Makrolon kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) u kojima ima najviše po 8 životinja, u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: Analgetička efikasnost testiranih jedinjenja je ispitivana u testu svetlosnog zraka (test izmicanja repa) na mišu po metodi D'Amour and Smith (J. Pharm. Exp. Ther.72, 74 79 (1941). Životinje su pojedinačno smeštane u specijalne test kaveze i koren repa je izložen fokusiranom toplotnom zraku električne lampe (Tail-flick Typ 55/12/10.fl, Labtec, Dr. Hess). Intenzitet lampe je podešen tako, da je vreme između uključivanja lampe i iznenadnog povlačenja repa (latenca povlačenja) kod netretiranih životinja bila 2,5-5 sekundi. Pre primene testiranih jedinjenja, životinje su u toku od 30 minuta prethodno dva puta testirane i srednja vrednost ovih merenja je izračunata kao srednja vrednost pre testiranja. Merenje bola je generalno izvedeno 20, 40 i 60 minuta nakon intravenske primene testiranih jedinjenja ili njegovih nosača. Antinociceptivno dejstvo je određeno kao povećanje perioda latence povlačenja prema sledećoj formuli: (% MPE) = [(T1- T0)/(T2- T0)] x 100. Gde T0je kontrola perioda latence pre primene supstance, T1: period latence nakon primene supstance, T2: maksimalno vreme izloženosti svetlosnom zraku (12 sekundi), MPE: maksimalni mogući efekat. Kod testiranih jedinjenja koja deluju antinociceptivno je zavisnost od doze određena primenom 3-5 logaritamski rastućih doza, od kojih je svaka uključivala minimalnu dozu i maksimalnu efikasnu dozu. Polovina maksimalne efikasne doze (ED50) sa odgovarajućim intervalima poverenja od 95% je određena polu-logaritamskom regresionom analizom u vreme maksimalnog dejstva.

Statistička procena: Veličine grupa su obično bile n=10. Analiza varijanse sa ponavljenim merenjima (ANOVA sa ponovljenim merenjima) kao i post hoc analiza prema Bonferroni-ju su korišćene za testiranje statistički značajnih razlika u %MPE podacima između odgovarajućih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05.

Čungov model: mononeuropatski bol nakon ligature spinalnih nerava

Test životinje: Mužjaci Sprague Dawley pacova (RjHan: SD outbred, uzgajivač: Janvier, Genest St. Isle, Francuska) sa telesnom težinom od 140-160g su držani u standardnim kavezima (Tip IV Makrolon kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) sa po najviše 8 životinja, u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum. Od isporuke životinja do operacije napravljena je pauza od nedelju dana. Životinje su nakon operacije u periodu od 4-5 nedelja testirane više puta, pri čemu je ispoštvano vreme ispiranja od minimum nedelju dana.

Opis modela: pod pentobarbitalnom anestezijom (Narcoren<®>, 60 mg/kg i.p., Merial GmbH, Halbergmoos, Nemačka) levi L5, L6 spinalni nervi su izloženi uklanjanjem dela paravertebralnog mišića i dela levog spinalnog nastavka L5 lumbalnog pršljena. Spinalni nervi L5 i L6 su oprezno izolovani i vezani čvrstom ligaturom (NC-silk black, USP 5/0, metric 1, Braun Melsungen AG, Melsungen, Nemačka) (Kim and Chung 1992). Nakon ligature su zašiveni mišići i okolno tkivo, a rana je zatvorena metalnim kopčama. Nakon perioda oporavka od nedelju dana, životinje su radi merenja mehaničke alodinije smeštene u kaveze sa žičanim dnom. Prag vrednosti povlačenja je određen na ipsilateralnim i/ili kontralateralnim zadnjim šapama pomoću električnog von Frejevog filamenta (Somedic AB, Malmö, Švedska). Srednja vrednost od pet stimulacija je dala jedan podatak. Životinje su testirane 30 minuta pre i u različitim vremenima nakon primene testirane supstance ili rastvora nosača. Podaci su određeni kao % maksimalnih mogućih efekata (%MPE) iz pre-testova pojedinačnih životinja (=0%MPE) i test vrednosti nezavisne kontrolne grupe (=100%MPE). Alternativno su pragovi vrednosti povlačenja prikazani u gramima. Kod testiranih jedinjenja koja deluju analgetički je zavisnost od doze određena primenom 3-5 logaritamski rastućih doza, od kojih je svaka uključivala prag dozu i maksimalnu efikasnu dozu. Polovina maksimalne efikasne doze (ED50), sa određenim intervalima poverenja od 95%, određena je polulogaritamskom regresionom analizom u vreme maksimalnog dejstva.

Statistička procena: Veličine grupa su obično bile n=10. Analiza varijanse sa ponovljenim merenjima (ANOVA sa ponovljenim merenjima) kao i post hoc analizom prema Bonferroni-ju, korišćene su za testiranje statistički značajnih razlika u %MPE podacima između odgovarajućih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05.

Referenca: Kim, S.H. and Chung, J.M., An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat, Pain, 50 (1992) 355Benetov model: Mononeuropatski bol na pacovu

Test životinje: Mužjaci Sprague Dawley pacova, (RjHan: SD outbred; Uzgajivač: Janvier, Genest St. Isle, Francuska) sa težinom od 140-160g, su držani u standardnim kavezima (Tip IV Makrolon kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) sa po najviše 8 životinja, u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum. Od isporuke životinja do operacije napravljena je pauza od nedelju dana. Životinje su nakon operacije u periodu od 4 nedelje testirane više puta, pri čemu je ispoštvano vreme ispiranja od minimum nedelju dana.

Opis postupka: ispitivanje efikasosti kod neuropatskog bola je izvedeno u Benetovom modelu (hronična konstrikciona povreda; Bennett and Xie, 1988, Pain 33: 87-107). Pacovima pod narkozom narkorenom su napravljene četiri labave ligature desnog išijadičnog nerva. Životinje razvijaju preosetljivost šape koja je inervirana oštećenim nervom, koja se, nakon vremena oporavka od nedelju dana, kvantitativno određuje tokom četiri nedelje pomoću hladne ploče (hladna alodinija) na 4°C. Životinje su posmatrane na ovoj ploči tokom perioda od 2 minuta i meren je broj reakcija povlačenja oštećene šape.

Procena i statistika: Na osnovu preliminarne vrednosti pre primene supstance, dejstvo supstance je određivano tokom perioda od jednog časa na četiri vremenske tačke (npr.

15, 30, 45, 60 min nakon primene), a rezultujuća površina ispod krive (AUC) kao i inhibicija hladne alodinije na pojedinačnim mernim tačkama su izraženi kao procentualno dejstvo u odnosu na grupu sa nosačem (AUC) ili početnu vrednost (pojednačnih mernih tačaka). Veličina grupe je n=10, značajnost anti-alodinijskog dejstva (p<0.05) je određivana pomoću analize varijanse sa ponovljenim merenjima i post hoc analize prema Bonferroni-ju.

STZ-model: polineuropatski bol kod pacova

Test životinje: Mužjaci Sprague-Dawley pacova (Uzgajivač: Janvier, le Genest St. Isle, Francuska); telesna težina: 140 - 160 g; životinje se drže u standardnim kavezima (tip IV Makrolon kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) sa po najviše 8 životinja, u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: Radi indukcije dijabetesa, mužjacima Sprague Dawley pacova je intraperitonealno injektiran streptozotocin (STZ, 75 mg/kg). Pacovi sa dijabetesopm su imali nivo glukoze u krvi od najmanje 17 mM nedelju dana nakon STZ injekcije. Kontrolnim životinjama je injektiran rastvor sa nosačem. Određivanje mehaničkog nociceptivnog praga stimulusa (u gramima) je vršeno algeziometrom u testu pritiska na šapu po Randall & Selitto (1957). Ovde je povećanje stimulusa pritiska ispoljeno na dorzalnu površinu zadnje šape i beležen je pritisak koji je konačno doveo do refleksa povlačenja šape ili vokalizacija. Testovi su sprovedeni tri nedelje nakon indukcije dijabetesa. Mehanički nociceptivni prag stimulusa je meren pre i 15, 30, 45 i 60 minuta nakon primene supstance dijabetičkim životinjama i kontrolnim životinjama.

Reference: Randall LO, Selitto JJ. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharamcodyn. 1957; 111: 409-19

B) Poređenje analgetičko efikasnog opsega doza u modelu mononeuropatskog bola (Čung, pacov) sa opsegom doza u kojem su zabeleženi sporedni efekti tipični za opioide.

Iznenađujuće farmakološke osobine jedinjenja prema pronalasku su primarno opisane međusobnim poređenjem rezultata iz Čungovog modela kod pacova (kao primer za analgetičku efikasnost protiv neuropatskog bola) i modela gasne analize krvi kod pacova (kao primer za respiratornu depresiju kao veoma teškog, ali takvog sporednog efekta tipičnog za opioide koji se lako može kvantitativno odrediti). Ovo omogućava pokazivanje da jedinjenja prema pronalasku ne pokreću značajnu respiratornu depresiju kod pacova u višestrukoj dozi koja ima značajnu analgetičku efikasnost u Čungovom modelu (na primer ED50<n>). Nalazi iz drugog modela sporednih efekata tipičnih za opioide, kao što su cirkulatorni parametri kod zeca, gastrointestinalni prolazak uglja kod miša, 'rotarod' test kod miša, test skakanja kod miša kao i naklonost ka određenom mestu kod pacova, naglašavaju generalno nepostojeća ili veoma slaba sporedna dejstva jedinjenja prema pronalasku tipična za opioide.

Gasna analza krvi: postupak za merenje arterijskog pCO2i pO2kod pacova Dejstvo testiranih jedinjenja na respiratornu depresiju se ispituje posle i.v. primene na budne pacove koji su instrumentalno nadgledani. Parametar testa je promena parcijalnog pritiska ugljen dioksida (pCO2) i parcijalnog pritiska kiseonika (pO2) u arterijskoj krvi nakon primene supstance.

Test životinje: mužjaci Sprague-Dawley pacova (crl: CD (SD) outbred; uzgajivač: Charles River, Sulzfeld, Nemačka); telesne težine: 250-275g; životinje se pojedinačno držane u standardnim kavezima (Tip II Makrolon kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: Najmanje 6 dana pre primene testirane supstance, pacovima se pod pentobarbitalnom anestezijom implantira PP-kateter u femoralnu arteriju i jugularnu venu. Kateteri se pune heparinskim rastvorom (4000 I.E.) i zatvaraju žicom. Primena testirane supstance ili nosača je izvedena preko venskog katetera. Pre primene supstance ili nosača i u definisanim vremenskim tačkama nakon primene supstance ili nosača, otvara se svaki arterijski kateter i ispira sa približno 500 µl heparinskog rastvora. Zatim se približno 100 µl krvi uklanja iz katetera i prihvata pomoću heparinizovane staklene kapilare. Kateter se ponovo ispira heparinskim rastvorom i potom zatvara. Arterijska krv se odmah analizira uz pomoć aparata za gasnu analizu krvi (ABL 5, Radiometer GmbH, Willich, Nemačka). Nakon minimalnog vremena ispiranja od nedelju dana, životinje se ponovo mogu testirati.

Procena testa i statistika: Aparat za gasnu analizu krvi automatski pokazuje vrednosti za pCO2i pO2u mmHg. Efekti supstance na parcijalni pritisak se izračunavaju kao procentne promene u odnosu na preliminarne vrednosti bez supstance ili nosača. Za statističku analizu, izmerene vrednosti nakon primene supstance i istovremeno izmerene vrednosti nakon primene nosača su upoređivane uz pomoć jednofaktorske analize varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i post hoc analize po Dunett-u. Nivo značajnosti je postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=6.

Kardiovaskularni parametri: postupak za merenje krvnog pritiska i srčane frekvencije kod budnog zeca

Dejstvo testiranih supstanci na kardiovaskularni sistem je ispitivano posle i.v. primene na budne zečeve, koji su priključeni na telemetriju. Testirani parametri su promena srčane frekvencije i arterijskog krvnog pritiska nakon primene supstance.

Test životinje: ženke zečeva (New Zealand Whites; uzgajivač: Charles River, Kisslegg, Nemačka); telesna težina: približno 3-5,5 kg; životinje su držane pojedinačno u specijalnim kavezima za zečeve (ŠxDxV = 885 x 775 x 600 mm; Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Priprema testa: Najmanje 21 dan pre početka eksperimenata, životinjama je pod totalnom anestezijom (Izofluran 2-3%) implantirana telemetrijska jedinica (TL11M2-D70-PCT od DSO, St. Paul, Minnesota, USA) radi merenja krvnog pritiska i elektrokardiograma (EKG). Kateter za pritisak telemetrijske jedinice se ovde uvodi u femoralnu arteriju i dve biopotencijalne elektrode se pričvršćuju subkutano u regionu sternuma ili u regionu gornjeg levog zida grudnog koša. Emiterska jedinica se ušiva u kožni džep na levom boku životinja. Snimanje telemetrijskih signala se sprovodi prijemnicima tipa RMC-1 (Fa, DSI). Za snimanje, čuvanje i obradu podataka se koristi softverski paket Po-Ne-Mah (DSI).

Test postupak: Primena supstance ili nosača se vrši preko venskog katetera (V. auricularis). Pre primene supstance ili nosača, i u tačno određenim vremenskim tačkama nakon primene supstance ili nosača, direktno se određuju i elektronski memorišu srčana frekvencija i arterijski pritisak (sistolni, dijastolni i srednja vrednost) uz pomoć kalibrisanog telemetrijskog sistema. Nakon minimalnog vremena ispiranja od nedelju dana, životinje se mogu ponovo testirati.

Test procena i statistika: Iz izmerenih vrednosti krvnog pritiska (u mmHg) i srčane frekvencije (otkucaji u minutu) u određenim vremenskim tačkama, određuju se srednje vrednosti od 10 uzastopnih srčanih otkucaja. Efekti supstance na testirane parametre su izračunati kao procenat promene u odnosu na preliminarne vrednosti bez supstance ili nosača. Radi statističke procene, izmerene vrednosti nakon primene supstance i istovremeno izmerenih vrednosti nakon primene nosača upoređivane su uz pomoć jednofaktorske analize varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i post hoc analize po Dunett-u. Nivo značajnosti je postavljen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=6.

Test prolaza uglja: postupak za merenje brzine gastrointestinalnog prolaza kod miša Test životinje: mužjaci NMRI miševa (uzgajivač: Charles River, Sulzfeld, Nemačka), telesna težina: 30-35 g; životinje se drže u standardnim kavezima (tip IV Makrolon kavezi, Ebeco, Castrop-Rauxel, Nemačka) sa maksimalno po 18 životinja u kavezu u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis testa: pre testa životinje gladuju 20-24 časa na umecima za kaveze od nerđajućeg čelika. Kao marker supstanca za intestinalni prolaz na životinje se oralnim putem primenjuje suspenzija aktivnog uglja (10% aktivnog uglja u 0,5% CMC Lösung; primenjena zapremina: 0.1 ml/10 g telesne težine). Nakon toga se intravenski primenjuje testirano jedinjenje ili rastvor nosača. Dva časa nakon primene suspenzije aktivnog uglja životinje se žrtvuju sa CO2gasom. Nakon toga se odstranjuje intestinalni trakt od želuca sve do i uključujući slepo crevo i postavlja se na staklenu pločicu koja je navlažena 0,9% rastvorom NaCl. Nakon toga se odmah meri rastojanje od pilorusa do slepog creva, kao i rastojanje koje prelazi suspenzija uglja (najudaljenija tačka).

Test procena: Radi određivanja relativne inhibicije gastrointestinalnog prolaza formira se koeficijent prolaza suspenzije uglja (u cm) i naznačen je u % inhibicije. Radi statističke procene izmerene vrednosti posle primene supstance i istovremeno izmerenih vrednosti posle primene nosača upoređuju se uz pomoć jednofaktorske analize varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i post hoc analize po Dunett-u. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=10.

'Rotarod' test: postupak za ispitivanje motorne koordinacije kod miša

Test životinje: mužjaci CD-1 miševa (uzgajivač: Charles River, Sulzfeld, Nemačka); telesne težine: 18-25 g; životinje se drže u standardnim kavezima (Typ IV Makrolon kavezi, Ebeco, Castorp-Rauxel, Nemačka) sa po najviše 18 životinja u kavezu, u ritmu svetlo-tama 12:12 časova, sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: Za opis postupka videti: Kuribara H., Higuchi Y., Tadokoro S. (1977), Effects of central depressants on Rota-Rod and traction performance in mice. Japan. J. Pharmacol. 27, 117-126.

Statistička procena: Radi statističke procene izmerene vrednosti nakon primene supstance i istovremeno izmerenih vrednosti nakon primene nosača upoređivane su uz pomoć jednofaktorske analize varijanse (jednofaktorska ANOVA) kao i post hoc analize po Dunett-u. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=10.

Test skakanja: postupak za ispitivanje potencijala fizičke zavisnosti na mišu

Test životinje: mužjaci NMRI miševa (uzgajivač: Charles River, Sulzfeld, Nemačka); telesne težine 20-24 g; životinje se drže u standardnim kavezima (tip III Makrolon kavezi, Ebeco, Castrop-Rauxel, Nemačka) sa po maksimalno 6 životinja u kavezu, u ritmu svetlo-mrak 12:12 časova sa hranom i vodom sa česme ad libitum.

Opis postupka: testirane supstance se primenjuju intraperitonealno ukupno 7x tokom dva dana. 5 primena se vrši prvog dana u 9:00, 10:00, 11:00, 13:00 i 15:00 časova i drugog dana u 9:00 i 11:00 časova. Prve 3 primene se vrše u rastućim dozama (šema doziranja) i potom u dozi treće. Povlačenje se precipitira naloksonom 30 mg/kg (i.p.) 2 sata nakon poslednje primene poslednje supstance. Neposredno nakon toga se životinje pojedinačno smeštaju u providne kutije za posmatranje (visina 40 cm, prečnik 15 cm) i reakcije skakanja se broje 15 minuta u intervalima od po 5 minuta. Morfin se primenjuje istovremeno u dozi za poređenje/standard. Kvantitativno određivanje povlačenja se vrši prema broju skokova od 0 do 10 minuta nakon primene naloksona. Određuje se broj životinja po grupi sa više od 10 skokova /10 minuta i one se dokumentuju kao „% pozitivnih životinja". Takođe se izračunava i prosečna učestalost skakanja u grupi.

Statistička procena: Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu statistički značajnih razlika između određenih doznih grupa i kontrolnih grupa sa nosačem, poželjno se vrši uz pomoć Fišerovog egzaktnog testa za parametar „% pozitivnih životinja" kao i uz pomoć Kruskal-Wallis testa za parametar „učestalosti skakanja", poželjno kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ovde je nivo značajnosti podešen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=12.

Referenca: Saelens JK, Arch Int Pharmacodyn 190: 213-218, 1971

Naklonost ka određenom mestu: postupak za ispitivanje moguće indukcije psihičke zavisnosti/adikcije kod pacova

Opis postupka: Za ispitivanje naklonosti ka određenom mestu videti: Tzschentke, T.M., Bruckmann, W. and Friedrichs, F. (2002) Lack of sensitization during place conditioning in rats is consistent with the low abuse potential of tramadol. Neuroscience Letters 329, 25-28.

Statistička procena: Procena eksperimentalnih nalaza u pogledu na statistički značajne razlike u naklonosti životinja za aktivnu supstancu ili nosač se poželjno vrši uz pomoć parnog t-testa. Nivo značajnosti je podešen na p < 0.05. Veličine grupa su obično n=8.

ekt

ef

o

niv

en

ež

el

zab

) e/kg nij

µg(= 8 Le: 8 E d O

N a(ov a; ktodelefem gihćeskat ogu

op m g neurnoal n iz ) 50simta Dak E m efek

e g njd nu no eiči aj i srvelač L a zn E

O

av bez Nač u tiz ozn oz

) ,dijenat(tj.ic

efek

koefltata zu kao reti ogući

m nabez

ču ni jeal izraim koja

suaks

ke m dozu

zliju ra (=

rnri o PE gotM a Fak čav na

1) oz2) Zaključak: Primer AMD-6<cis>je izabran da ilustruje iznenađujuće farmakološke osobine jedinjenja korišćenih prema pronalasku.

To su visoko afinitetni ligandi za ORL1 receptor i µ-opioidni receptor koji imaju odnos afiniteta za ORL1 receptor prema afinitetu za µ-opioidni receptor od približno 5 ili približno 6. Primer AMD-6<cis>dokazuje da jedinjenja korišćena prema pronalasku imaju veoma visoku efikasnost protiv neuropatskog bola (ovde: ED50<n>između 1 i 10 µg/kg i.v. ili 88 µg/kg i.V.). U modelu akutnog bola, sa druge strane, čak u dozama koje su bile između 100 i 1000 puta više od efikasnih doza u neuropatskom modelu, nije zabeleženo značajno antinociceptivno dejstvo. Slično, kod životinja za ispitivanje sporednih efekata, nisu zabeleženi značajni opioidni sporedni efekti (kao što je respiratorna depresija, smanjenje krvnog pritiska i srčane frekvencije, konstipacija, efekti centralnog nervnog sistema, fizička zavisnost, psihička zavisnost/adikcija) u dozama koje su bile od 11 do više od 3000 puta više.

Zaključak: Jedinjenja korišćena prema pronalasku ispoljavaju veoma dobru efikasnost protiv neuropatskog bola. Iznenađujuće, sa druge strane, u modelu akutnog bola, čak u dozama koje su bile između 10 do 100 puta više od efikasnih doza u neuropatskom modelu, nije zabeleženo značajno antinociceptivvno dejstvo. Slično, iznenađujuće, nisu zabeleženi značajni sporedni efekti tipični za opioide u životnjskim modelima sporednih efekata (npr. gasna analiza krvi, gastrointestinalni prolaz uglja i RotaRod test) na 10 puta do više od 300 puta višim dozama.

Tabela 3: Poređnje cis- i trans-spiroamina

<1)>odnos afiniteta ORL1/µ definisan kao 1/[Ki(ORL1)/Ki(µ)]

<2)>NOEL (= nije zabeležen nivo efekta) označava gornju dozu koja je bez rezultata (tj., dozu bez značajnog efekta)

Zaključak: iznenađujuće, samo cis-spiroamini prema opštoj formuli (I) (ovde primer AMD-6<cis>i uporedni primer AMN-2<cis>) ispoljavaju dobru efikasnost protiv neuropatskog bola dok istovremeno nemaju antinociceptivno dejstvo kod akutnog bola. Slično, nisu zabeleženi značajni sporedni efekti tipični za opioide u životinjskim modelima sporednog efekta (gasna analiza krvi kao primer ovde) u dozama koje su višestruko više. Odgovarajući trans-spiroamini (ovde uporedni primer AMD-6<trans>i uporedni primer AMN-2<trans>), sa druge strane, ne pokazuju razliku između doza koje su efiksne protiv neuropatskog bola ili protiv akutnog bola. Slično, razlika nije zabeležena između doza u kojima se javljaju sporedni efekti tipični za opioide (gasna analiza krvi kao primer ovde). U celini poređenje AMD-5<cis>i AMD-6<cis>pokazuje najveće razlike sa najvećim mogućim analgetičkim dejstvom.

Tabela 4: Poređenje cis-spiroamina i cis-spiroetara

<1)>odnos afiniteta ORL1/µ definisan kao 1/[Ki(ORL1)/Ki(µ)]

<2)>NOEL (= nije zabeležen nivo efekta) označava gornju dozu koja je bez rezultata (tj., dozu bez značajnog efekta)

Zaključak: Iznenađujuće, kada su korišćeni prema pronalasku samo cis-spiroamini (ovde primer AMN-2<cis>) ispoljavaju dobru efikasnost protiv neuropatskog bola dok istovremeno imaju antinociceptivno dejstvo kod akutnog bola. Slično, sporedni efekti tipični za opioide nisu zabeleženi u životinjskim modelima sporednih efekata (gasna analiza krvi kao primer ovde) u dozama koje su višestruko više. Cis-Spiroetar (ovde uporedni primer Etar-2<cis>i uporedni primer Etar-1<cis>), sa druge strane, ne pokazuju izrazite razlike između doza koje su efikasne protiv neuropatskog bola ili protiv akutnog bola.

Tabela 5: Poređenje AMD-5<cis>(slobodne baze) i AMD-6<cis>(citratne soli)

<1)>odnos afiniteta ORL1/µ definisan kao 1/[Ki(ORL1)/Ki(µ)]

<2)>NOEL (= nije zabeležen nivo efekta) označava gornju dozu koja je bez rezultata (tj., dozu bez značajnog efekta)

Zaključak: Poređenje AMD-5<cis>(slobodne baze) i AMD-6<cis>(citratne soli) otkrilo je da nema relevantnih razlika u farmakološkim osobinama baze i soli.

Tabela 6: Poređenje afiniteta prema pojedinačnim receptorima

Ki [nM]

EC50[ef. %]

U dodatnom aspektu pronalazak se odnosi na jedinjenje opšte formule (III)

gde je jedinjenje prisutno kao hidrohloridna, citratna ili hemi-citratna so.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja jedinjenja prema pronalasku, R2je -H i/ili R3je -F.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja jedinjenja prema pronalasku R4i R5su oba -H ili su oba -OCH3.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja jedinjenja prema pronalasku ona su izabrana iz grupe koja se sastoji od

• (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-fenil-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-on;

• (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-(3-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-on;

• (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-6'-fluoro-4-(3-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro-[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-on;

• (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-6'-fluoro-4-fenil-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-on;

• (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-(4-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-on;

u svakom slučaju u obliku hidrohloridne, citratne ili hemi-citratne soli.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku jedinjenja prema pronalasku su lekovi.

Dodatni poželjni primer izvođenja pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fiziološki prihvatljiv nosač i jedno od jedinjenja prema pronalasku.

U jednom poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije prema pronalasku ona je:

- čvrsta, tečna ili pasta; i/ili

- sadrži jedinjenje prema pronalasku u količini od 0.001 do 99 tež. % u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.

Dodatni poželjni primer izvođenja pronalaska se odnosi na farmaceutski dozni oblik koji sadrži jednu od farmaceutskih kompozicija koje su opisane u prethodnom tekstu.

U dodatnom primeru izvođenja prema pronalasku prethodno navedeni dozni oblik je pripremljen za primenu ne više od jednom dnevno.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku dozni oblik prema pronalasku je pripremljen za sistemsku primenu.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku dozni oblik prema pronalasku je pripremljen za oralnu primenu.

U dodatnom poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku dozni oblik prema pronalasku sadrži jedno od jedinjenja prema pronalasku u dozi unutar opsega 1.0 µg do 10 mg, na bazi molekulske težine slobodne baze.

Claims (15)

1. Izmenjeni patentni zahtevi: 1. Jedinjenje opšte formule (III),

   gde R1je -H ili CH3; R2je -H ili -halogen; R3je -H ili -halogen; R4je -H, -halogen ili -OC1-3-alkil; i R5je -H, -halogen ili -OC1-3-alkil; gde je jedinjenje prisutno kao hidrohloridna, citratna ili hemi-citratna so.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što R2je -H i/ili R3je -F.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što R4i R5su oba -H ili su oba –OCH3.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, izabrano iz grupe koja se sastoji od • (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-fenil-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-ona; • (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-(3-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-ona; • (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-6'-fluoro-4-(3-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro-[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-ona; • (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-6'-fluoro-4-fenil-3',4'<,>-dihidrospiro[cikloheksan-1,1'-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-ona; • (E)-1-((1s,4s)-4-(dimetilamino)-4-(4-fluorofenil)-3',4'-dihidrospiro[cikloheksan-1,1’-pirido[3,4-b]indol]-2'(9'H)-il)-3-fenilprop-2-en-1-ona, u svakom slučaju u obliku hidrohloridne, citratne ili hemi-citratne soli.
5. 5. Jedinjenje prema jednom od patentnih zahteva 1 do 4 sa strukturom

   u obliku hidrohloridne, citratne ili hemi-citratne soli.
6. 6. Jedinjenje prema jednom od patentnih zahteva 1 do 4 za upotrebu kao lek.
7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fiziološki prihvatljiv nosač i jedinjenje prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5.
8. 8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, koja - je čvrsta, tečna ili pasta; i/ili - sadrži jedinjenje prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5 u količini od 0.001 do 99 tež. % u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.
9. 9. Farmaceutski dozni oblik koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 7 ili 8.
10. 10 Dozni oblik prema patentnom zahtevu 9, koji je pripremljen za primenu ne više od jednom dnevno.
11. 11. Dozni oblik prema patentnom zahtevu 9 ili 10, koji je pripremljen za sistemsku primenu.
12. 12. Dozni oblik prema patentnom zahtevu 11, koji je pripremljen za oralnu primenu.
13. 13. Dozni oblik prema patentnom zahtevu 12, koji sadrži jedinjenje prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5 u dozi unutar opsega od 1.0 µg do 10 mg u odnosu na molekulsku težinu slobodne baze.
14. 14. Jedinjenje prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u lečenju neuropatskog i/ili hroničnog bola.
15. 15. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je primena izvedena ne više od jednom dnevno. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5