RS58070B1 - Upotreba laminina za diferencijaciju pluripotentnih ćelija u ćelije hepatocitne linije - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA:

[0005] Pronalazak se odnosi na oblast ćelijske diferencijacije i ćelijske terapije.

[0007] OSNOVA PRONALASKA:

[0009] Od njihovog otkrića, humane indukovane pluripotentne ćelije (hiPSC) i humane embrionske matične ćelije (hESC) su intenzivno istraživane kao obnovljivi izvor bilo kojih specijalizovanih ćelija tela za zamenu obolelih ćelija [1, 2]. One su predviđene za lečenje širokog opsega bolesti, kao što su teške kardiološke bolesti [3], neurološke bolesti [4], oboljenja jetre [5] i oboljenje mrežnjače [6], i dijabetes [7, 8].

[0011] Oboljenje jetre pogađa milione ljudi širom sveta. Do danas, transplantacija jetre je jedina opcija lečenja kod pacijenata sa ozbiljnim metaboličkim poremećajima jetre. Oko 25 000 pacijenata je na listama čekanja za transplantaciju jetre u Evropi i Sjedinjenim Američkim Državama. Više od 5500 transplantaciju jetre se godišnje uradi u Evropi, a nasledne metaboličke bolesti čine 26% indikacija (Evropski registar transplantacije jetre). Međutim, samo trećina pacijenata na listi čekanja za jetru može da primi transplantat jetre svake godine, i broj pacijenata koji umiru dok su na listama čekanja za transplantaciju jetre (oko 10%) povećao se tokom poslednjih godina kao rezultat nedostatka donatorskih organa.

[0013] [0004] Tokom poslednjih 15 godina, transplantacija hepatocita izolovanih iz kadaveričnih jetri u jetru pacijenata pojavila se kao klinička alternativa transplantaciji jetre [9, 10], naročito za urođene metaboličke bolesti u kojima su funkcije jetre očuvane i postoji defekt u jednom enzimu. Nedvosmisleni dokaz metaboličke funkcije transplantiranih humanih hepatocita prvo je pružen kod pacijenta sa sindromom Krigler—Najar (CN1) tipa 1 [11]. Posle ćelijske transplantacije, klinički status i kvalitet života pacijenta bili su poboljšani sa obnavljanjem 5% aktivnosti UGT1A1 što je vodilo smanjenju bilirubinemije i fototerapijskog tretmana od 50%. Ova seminalna studija otvorila je put za lečenje više od 40 pacijenata pogođenih uglavnom bolešću CN1 i poremećajima ciklusa uree, ali i glikogenozom tipa 1, infantilnom Refsumovom bolešću, progresivnom familijarnom intrahepatičkom holestazom tipa 2, i hemofilijom tipa VII [9]. Transplantacija hepatocita je omogućila nekolicini dece da izbegnu nova neurološka oštećenja dok čekaju transplantaciju jetre. Relativno mala količina infuzijom datih hepatocita (1.5-2x10<9>ćelija) bila je dovoljna da popravi metabolički nedostatak kod nekih pacijenata pogođenih bolešću. Međutim, dugotrajan efekat stabilizacije svakako zahteva ponovljene infuzije ćelija [12]. Ovaj pristup ima i druga važna ograničenja kada je u pitanju njegova opšta i rutinska primena u kliničkoj praksi. Dostupni transplantati jetre se prvenstveno koriste za transplantaciju jetre i samo oni slabijeg kvaliteta se koriste za izolovanje hepatocita. Zbog toga, izolovani hepatociti su različitog kvaliteta i kvantiteta. Oni se brzo dediferenciraju i ne mogu da se umnože u kulturi, i ne tolerišu dobro krioprezervaciju. Sve ukupno, ova ograničenja naglašavaju potrebu za istraživanjem drugih izvora funkcionalnih humanih hepatičnih ćelija.

[0015] Poslednjih godina, nekoliko grupa prijavilo je in vitro diferencijaciju ćelija hESC i hiPSC ćelija u ćelije slične hepatocitima (HLC) upotrebom različitih uslova kultivisanja koji imitiraju stadijume razvoja embrionalne jetre [5, 13-21]. HLC ćelije nisu ispoljile funkcije potpuno zrelog hepatocita, već su imale fenotip bliži humanim fetalnim hepatocitima, eksprimirajući na primer AFP [22]. One mogu da se implantiraju, umnože u izvesnom stepenu i zadrže hepatičnu funkcionalnost posle transplantacije u jetre imunokompromitovanih životinja koje su pretrpele hemijsko oštećenje, zračenje ili genetičku manipulaciju da bi transplantirani hepatociti imali selektivnu prednost za rast, kao što su miševi koji prekomerno eksprimiraju urokinazni aktivator plazminogena za indukciju konstitutivnog oštećenja jetre recipijenta i regenerativnih stimulusa [5, 14, 17, 23-25].

[0017] [0006] Neke studije su istraživale terapijski potencijal HLC ćelija i uspešno tretirale različite mišje modele hemijski indukovane smrtonosne insuficijencije jetre [26-33]. Ipak, jetra ima značajnu sposobnost regeneracije iz endogenih hepatocita. Stoga, privremena podrška hepatičnih metaboličkih funkcija pomoću HLC ćelija dovoljna je da spasi miševe od akutne insuficijencije jetre. Nasuprot tome, za lečenje naslednih bolesti jetre, HLC ćelije moraju u potpunosti da se diferenciraju in vivo i da budu dugotrajno funkcionalne da bi ispoljile nedostajuće metaboličke funkcije zrele jetre kod obolelih životinja. Do sada, uspešna korekcija metaboličke funkcije u životinjskom modelu humane nasledne bolesti jetre u kojoj transplantirane HLC ćelije nemaju selektivnu prednost za preživljavanje i rast u jetri recipijenata, još uvek nije pokazana.

[0019] Pacov Gunn soja, životinja sa CN1, ima prirodnu mutaciju u UGT1A1 koja dovodi do potpunog gubitka aktivnosti UGT1A1 i hiperbilirubinemije nedugo nakon rođenja. Potpuno odsustvo konjugata bilirubina u žuči obezbeđuje lako, nedvosmisleno i osetljivo očitavanje za procenu obnavljanja aktivnosti UGT1A1. Na taj način, pacov Gunn soja predstavlja neprocenjiv i pogodan model za praćenje in vivo sazrevanja hepatičnih ćelija i terapijskog potencijala transplantiranih hepatocita. Kao kod CN1 pacijenata, delimično obnavljanje aktivnosti UGT1A1 posle transplantacije hepatocita rezultuje značajnom korekcijom metaboličke funkcije [37-39].

[0021] Pre razmatranja kliničke upotrebe HLC ćelija, ključno pitanje je takođe njihova proizvodnja upotrebom protokola hepatične diferencijacije koji je kompatibilan sa DPP-om (Dobra proizvođačka praksa). Aktuelni protokoli hepatične diferencijacije obično sadrže medijum modifikovan hraniteljskim ćelijama, serum, matrice životinjskog porekla (kao što je Matrigel<TM>;), mišje hraniteljske ćelije, virusne vektore za poboljšanje hepatične diferencijacije, ili male molekule koji nisu dostupni u DPP-u [15, 34-36]. Sve ovo su izvori nepoznatih faktora što rezultujuća tkiva čini nekompatibilnim sa budućim kliničkim primenama.

[0023] Prema tome, postoji klinički zahtev za humanim hepatocitima za terapije alogenim ćelijama. Pluripotentne matične ćelije su intenzivno ispitivane kao obnovljivi izvor HLC ćelija koje mogu da se transplantiraju. Međutim, još uvek nije pokazano da pomoću HLC ćelija može da se leči nasledno metaboličko oboljenje jetre u odsustvu bilo kakve selektivne prednosti rasta transplantiranih ćelija nad rezidentnim hepatocitima glodara. Pored toga, prethodno stvorene HLC ćelije proizvedene su upotrebom protokola koji ih čine nepodesnim za kliničke upotrebe.

[0025] [0010] Nedavno, laminini kao što su laminin-521 i laminin-111, opisani su kao relevantna matrica za ćelijsku kulturu, konkretnije, za održavanje funkcionalnih svojstava dugotrajne in vitro kulture ćelija od interesa kao što su pluripotentne ćelije ili HLC, međutim laminini nikada nisu opisani niti predloženi kao korisni za indukciju i/ili poboljšanje hepatične diferencijacije.

[0027] Tako, međunarodna patentna prijava WO 2012/080844 se odnosi na novu upotrebu laminina-521. Zaista, laminin-521 može da održava pluripotentnost matičnih ćelija in vitro, da omogući samo-obnavljanje, i da omogući preživljavanje pojedinačnih ćelija humanih embrionskih matičnih ćelija. Kada se pluripotentne humane embrionske matične ćelije kultivišu na pločama obloženim rekombinantnim lamininom-521 u odsustvu inhibitora diferencijacije ili hraniteljskih ćelija, embrionske matične ćelije proliferišu i zadržavaju svoju pluripotentnost.

[0029] Osim toga, pokazano je da humane ćelije slične hepatoblastima mogu prvo da se stvore iz pluripotentnih ćelija u posudama obloženim Matrigelom (indukcija hepatične diferencijacije), a zatim da se kultivišu u posudama obloženim lamininom-111 da bi se umnožavale, više od 3 meseca, uz očuvanje potencijalne sposobnosti da se diferenciraju u ćelije slične hepatocitima, kao i u ćelije slične holangiocitima [36].

[0031] KRATAK OPIS PRONALASKA:

[0033] U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na in vitro upotrebu laminina (LN) kao matrice za hepatičnu diferencijaciju.

[0035] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na in vitro upotrebu LN za indukciju i/ili poboljšanje diferencijacije populacije pluripotentnih ćelija, ili populacije multipotentnih ćelija, ili populacije ćelija definitivnog endoderma (DE), u populaciju ćelija hepatocitne linije.

[0037] U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na in vitro metod za indukciju humane hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

[0039] (i) obezbeđivanja populacije humanih ćelija DE, i

[0040] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima, i

[0041] (iii) opciono kultivisanja navedene populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za sazrevanje hepatičnih ćelija da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih fetalnim hepatocitima.

[0043] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na in vitro metod za indukciju hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

[0045] (i) obezbeđivanja populacije humanih pluripotentnih ćelija,

[0046] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE,

[0047] (iii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija DE na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima, i

[0048] (iv) opciono kultivisanja navedene populacije humanih hepatoblasta na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za sazrevanje hepatičnih ćelija da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih fetalnim hepatocitima.

[0050] U petom aspektu, opis se odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih hepatoblastima dobijenih postupkom prema pronalasku.

[0052] U šestom aspektu, opis se odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih hepatoblastima prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog tela.

[0054] U sedmom aspektu, opis se odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih fetalnim hepatocitima dobijenih pomoću postupka prema pronalasku.

[0056] U osmom aspektu, opis se odnosi na komplet za indukciju humane hepatične diferencijacije, koji sadrži podlogu obloženu lamininom, BMP4 i člana familije faktora rasta fibroblasta (FGF) kao što je FGF2 ili FGF10.

[0058] DETALJAN OPIS PRONALASKA:

[0060] [0021] Pronalazak se bavi ovim potrebama, budući da se odnosi na identifikaciju hemijski definisanog medijuma korisnog za diferencijaciju populacije pluripotentnih ćelija ili populacije ćelija definitivnog endoderma (DE) u populaciju ćelija hepatocitne linije. Pronalazači su iznenađujuće pokazali da je laminin-111 efikasan kao i Matrigel za pokretanje i podržavanje hepatične diferencijacije hiPSC u našim uslovima kultivisanja, ali sa rekombinantnom matricom.

[0062] Pronalazači su zatim pokazali da je laminin-521 (LN-521) takođe koristan kao matrica i omogućava bolju diferencijaciju hiPSC u definitivni endoderm i HLC ćelije.

[0064] Pronalazači su zaista proizveli hepatoblaste dobijene od humanih pluripotentnih matičnih ćelija (IDHB) sa protokolima bez ksenogenih komponenti, bez hraniteljskih ćelija, i sa hemijski definisanim protokolima upotrebom rekombinantnog laminina-111 (LN-111) kao ekstracelularne matrice za pokretanje i podržavanje procesa hepatične diferencijacije. Ove IDHB ćelije sa konkretnim nizom markera (kombinacija eksprimiranih ili neeksprimiranih markera) su transplantirane u jetru pacova Gunn soja, životinjskog modela za sindrom Krigler—Najar, koji se odlikuje visokim nivoima nekonjugovanog bilirubina. Nakon transplantacije ćelija, autori su pokazali značajnu korekciju hiperbilirubinemije, koja je ostala stabilna tokom studije koja je trajala 6 meseci bez neželjenih događaja. Oni su pokazali i da transplantirane IDHB ćelije podležu daljem sazrevanju in situ da bi se obnovila nedostajuća hepatična metabolička funkcija (glukuronidacija bilirubina pomoću UGT1A1). U zaključku, oni su prvi put pokazali efikasnost regeneracije zasnovane na hiPSC prema protokolu usklađenim sa DPP-om, za lečenje nasledne hepatične metaboličke bolesti u odsustvu bilo kakve selektivne prednosti za rast transplantiranih ćelija u odnosu na rezidentne hepatocite, što je situacija koja se javlja kod transplantacije hepatocita kod ljudi.

[0066] Postupci za hepatičnu diferencijaciju i upotrebe laminina

[0068] U skladu sa tim, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu laminina (LN) kao matrice za hepatičnu diferencijaciju.

[0070] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu LN za indukciju i/ili poboljšanje diferencijacije populacije pluripotentnih ćelija, populacije multipotentnih ćelija, ili populacije ćelija definitivnog endoderma (DE), u populaciju ćelija hepatocitne linije.

[0072] [0026] Kako se ovde koristi, pojam „laminin“ (LN) se odnosi na protein iz familije heterotrimernih glikoproteina koji se prvenstveno nalaze u bazalnoj lamini. Oni funkcionišu putem interakcija vezivanja sa receptorima susednih ćelija sa jedne strane, i vezivanja za druge molekule laminina, ili druge proteine matrice, kao što su kolageni, nidogeni ili proteoglikani. Molekuli laminina su takođe važni signalni molekuli koji mogu snažno da utiču na ponašanje i funkciju ćelija. Laminini su značajni i za održavanje fenotipa ćelija/tkiva, kao i za podsticanje ćelijskog rasta i diferencijacije pri popravci i razviću tkiva. Laminini su veliki, multidomenski proteini, sa uobičajenom strukturnom organizacijom. Molekul laminina integriše različite interaktivne funkcije matrice i ćelije u jednom molekulu. Molekul proteina laminina sadrži jednu subjedinicu a-lanca, jednu subjedinicu β-lanca, i jednu subjedinicu γ-lanca, sve spojene zajedno u trimer preko domena spiralnog kalema. Dvanaest poznatih subjedinica lanaca laminina može da obrazuje najmanje 15 tipova trimernog laminina u nativnim tkivima. Unutar trimernih struktura laminina mogu da se identifikuju domeni koji poseduju vezujuću aktivnost prema drugim lamininima i molekulima bazalne lamine, i receptorima vezanim za membranu.

[0074] Treba dalje primetiti da pojam „laminin“ obuhvata laminin, bilo intaktni, kao odvojene lance, ili kao njegove fragmente. Kako se ovde koristi, pojam „intaktni“ se odnosi na protein sačinjen od svih domena α-lanca, β-lanca i γ-lanca, sa tri lanca spojena zajedno tako da obrazuju heterotrimernu strukturu. Protein nije podeljen na posebne lance, fragmente, ili funkcionalne domene. Na primer, laminin-111 i laminin-521 (kao što je ispod opisano) su intaktni proteini. Kako se ovde koristi, pojam „lanac“ se odnosi na celokupnost alfa, beta, ili gama lanca proteina laminina. Kako se ovde koristi, pojam „fragment“ se odnosi na bilo koji proteinski fragment koji sadrži jedan, dva, ili tri funkcionalna domena koji poseduju aktivnost vezivanja za drugi molekul ili receptor. Međutim, lanac ne treba smatrati fragmentom, jer svaki lanac poseduje više od tri takva domena. Slično, intaktni protein laminina ne treba smatrati fragmentom. Primeri funkcionalnih domena uključuju domene I, II, III, IV, V, VI i G domen.

[0076] [0028] Postoji pet različitih alfa lanaca, tri beta lanca i tri gama lanca koji su u humanim tkivima nađeni u najmanje petnaest različitih kombinacija. Ovi molekuli su označeni kao laminin-1 do laminin-15 na osnovu istorije njihovog otkrivanja, ali alternativna nomenklatura opisuje izoforme na osnovu sastava njihovih lanaca, npr., laminin-111 (laminin-1) koji sadrži alfa-1, beta-1 i gama-1 lanac. Identifikovane su četiri grupe strukturno definisanih familija laminina. Članovi prve grupe od pet identifikovanih molekula laminina dele β1 i γ1 lance, i razlikuju se po sastavu svog a-lanca (α1 do α5 lanac). Članovi druge grupe od pet identifikovanih molekula laminina, uključujući laminin-521, dele β2 i γ1 lanac, i ponovo se razlikuju po sastavu svog a-lanca. Treća grupa identifikovanih molekula laminina ima jednog identifikovanog člana, laminin-332, sa sastavom lanaca α3β3γ2. Četvrta grupa identifikovanih molekula laminina ima jednog identifikovanog člana, laminin-213, sa novoidentifikovanim γ3 lancem (α2β1γ3).

[0078] Identifikovano je najmanje 15 podtipova (ili „izoformi“) laminina (LN), na osnovu sastava njihovih lanaca, uključujući LN-111 (α1β1γ1), LN-121 (α1β2γ1), LN-211 (α2β1γ1), LN-213 (α2β1γ3), LN-221 (α2β2γ1), LN-311 (α3β3γ1), LN-321 (α3β2γ1), LN-332 (α3β3γ2), LN-411 (α4β1γ1), LN-421 (α4β2γ1), LN-423 (α4β2γ3), LN-511 (α5β1γ1), LN-521 (α5β2γ1), LN-522 (α5β2γ2) i LN-523 (α5β2γ3).

[0080] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin odabran je iz grupe koja se sastoji od laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) i laminina-521 (LN-521).

[0082] U pronalasku, navedeni laminin je humani laminin.

[0084] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je humani rekombinantni laminin.

[0086] U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je rekombinantni humani laminin-111 (LN-111) ili rekombinantni humani laminin-521 (LN-521).

[0088] Kako se ovde koristi, pojam „rekombinantni“ polipeptid se odnosi na polipeptid koji je proizveden ekspresijom sa molekula kodirajuće nukleinske kiseline. Sistemi za kloniranje i ekspresiju polipeptida u različitim ćelijama-domaćinima su dobro poznati.

[0090] Kada je eksprimiran u rekombinantnom obliku, polipeptid je poželjno stvoren ekspresijom sa kodirajuće nukleinske kiseline u ćeliji-domaćinu. Može da se koristi bilo koja ćelija-domaćin, u zavisnosti od pojedinačnih zahteva određenog sistema. Pogodne ćelije-domaćini uključuju bakterije, sisarske ćelije, biljne ćelije, kvasce i bakulovirusne sisteme.

[0091] Rekombinantni humani laminini kao što je rekombinantni humani LN-111 ili LN-521 mogu da se nabave od kompanije Biolamina, Sundbiberg, Švedska.

[0093] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga kao što je ploča obložena je lamininom u količini od 0,5 do 50 mikrograma po mililitru (µg/mL), poželjno od 1 do 10 µg/mL, poželjnije 5 µg/mL.

[0095] Kako se ovde koristi, pojam „matrica“ se odnosi na komponentu/materijal (prirodni, sintetski ili njihovu kombinaciju) koji obrazuje polimernu mrežu koja obezbeđuje ćelijama koje se kultivišu in vitro (npr., u posudi za kultivisanje kao što je ravna laboratorijska plastika) morfologiju sličnu onoj kao u in vivo uslovima i fiziološki relevantna okruženja za prirodniju biologiju ćelije i bolje međućelijske interakcije za ćelijsku kulturu, olakšavanje pričvršćivanja ćelije za podlogu, rasta, diferencijacije.

[0097] U jednom primeru izvođenja, matrica sadrži laminin kao što je rekombinantni humani laminin-111 (LN-111) ili rekombinantni humani laminin-521 (LN-521) ili njihova smeša.

[0099] U drugom primeru izvođenja, matrica sadrži smešu laminina i druge komponente (kao što su proteini matrice uključujući kolagen I i fibronektin).

[0101] Kako se ovde koristi, pojam „populacija“ se odnosi na populaciju ćelija, gde većina (npr., najmanje oko 50%, poželjno najmanje oko 60%, poželjnije najmanje oko 70%, i još poželjnije najmanje oko 80%) od ukupnog broja ćelija, ima specifikovana svojstva ćelija od interesa za najmanje jedan od markera od interesa (npr., populacija humanih ćelija sličnih hepatocitima sadrži najmanje oko 60%, poželjno najmanje oko 70%, poželjnije najmanje oko 80% ćelija koje imaju hepatične funkcije i koje eksprimiraju markere koje tipično eksprimiraju humane ćelije slične hepatocitima navedene u tekstu ispod, kao što je na primer hepatocitni nuklearni faktor 4alfa (HNF4α)).

[0103] [0042] Kako se ovde koristi, pojam „marker“ se odnosi na protein, glikoprotein, ili drugi molekul koji je eksprimiran na površini ćelija, ili u ćelijama, i koji može da se koristi da pomogne u identifikaciji ćelije. Marker može uopšteno da se detektuje konvencionalnim metodama. Specifično, neograničavajući primeri metoda koje mogu da se koriste za detekciju markera ćelijske površine su imunocitohemija, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS), i enzimska analiza, ali i RT-PCR i metode molekularne biologije za detekciju iRNK proteina.

[0105] Kako se ovde koristi, pojam „pluripotentne“ se odnosi na ćelije sa sposobnošću da daju potomstvo koje može da podlegne diferencijaciji, pod odgovarajućim uslovima, u ćelije onih vrsta koje zajedno pokazuju karakteristike povezane sa ćelijskim linijama iz tri germinativna sloja (endoderm, mezoderm i ektoderm). Pluripotentne matične ćelije mogu da doprinesu tkivima prenatalnog, postnatalnog ili adultnog organizma. Standardni test prihvaćen u stanju tehnike, kao što je sposobnost obrazovanja teratoma kod SCID miševa starosti 8-12 nedelja, može da se koristi da bi se ustanovila pluripotentnost ćelijske populacije. Međutim, identifikacija odlika različitih pluripotentnih matičnih ćelija može takođe da se koristi za identifikaciju pluripotentnih ćelija.

[0107] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, pluripotentne matične ćelije su humane pluripotentne matične ćelije.

[0109] Specifičnije, humane pluripotentne matične ćelije mogu da eksprimiraju bar neke, i opciono sve, markere sa sledeće neograničavajuće liste: SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-I -81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox 2, E-kadherin, UTF-I, Oct4, Lin28, Rexl i Nanog.

[0111] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, humane pluripotentne matične ćelije su humane indukovane pluripotentne matične ćelije (hiPSC).

[0113] Kako se ovde koristi, pojam „indukovana pluripotentna matična ćelija“ se odnosi na pluripotentnu matičnu ćeliju veštački dobijenu iz ćelije koja nije pluripotentna. Ćelija koja nije pluripotentna može da bude ćelija manje sposobnosti da se sama obnovi i diferencira nego pluripotentna matična ćelija. Ćelije manje sposobnosti mogu da budu, ali nisu ograničene na somatske matične ćelije, tkivno-specifične progenitorske ćelije, primarne ili sekundarne ćelije. Ćelije iPSC su bile ponovljivo dobijene reprogramiranjem različitih ćelijskih tipova forsiranom ekspresijom koktela transkripcionih faktora OCT4, SOX2, c-MYC i KLF4, ili alternativnom kombinacijom faktora, zamenom KLF4 i c-MYC sa, ili dodavanjem NANOG i LIN28, ili bilo kojim postupcima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti za poboljšanje postupka reprogramiranja (upotrebom malih molekula kao što su inhibitori DNK metiltransferaze (DNMT), miRNK, itd.).

[0114] Kako se ovde koristi, pojam „reprogramiranje“ se odnosi na postupak promene sudbine ciljne ćelije u ćeliju drugog tipa, izazvan ekspresijom malog niza faktora (ili faktora za reprogramiranje) u ciljnim ćelijama.

[0116] Postupci za stvaranje indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija zasnovani na ekspresionim vektorima koji kodiraju faktore za reprogramiranje su opisani u stanju tehnike, videti na primer WO2007/69666, EP2096169-A1 ili WO2010/042490.

[0118] Ekspresioni vektori za ektopičnu ekspresiju faktora za reprogramiranje mogu da budu, na primer, plazmidni vektor, kozmidni vektor, vektor na bazi bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), vektor na bazi transpozona (kao što je PiggyBac) ili virusni vektor.

[0120] Alternativno, faktori za reprogramiranje, na primer, Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc, ili odgovarajuće kodirajuće DNK ili RNK, uvode se u ciljne ćelije bez integracije egzogenog genetskog materijala u DNK domaćina, tj., bez uvođenja nukleotidne sekvence u genom ćelije. Ekspresioni vektor kao što je plazmidni vektor može da bude isporučen u navedene ćelije za ektopičnu ekspresiju faktora za reprogramiranje, u obliku gole DNK. Alternativno, RNK koje kodiraju za navedene faktore za reprogramiranje, bilo da su hemijski modifikovani ili ne, mogu da budu uvedene u ćelije da bi se one reprogramirale (videti na primer Warren L, et al, 2010, Cell Stem Cell. Nov 5;7(5):618-30). Drugi ekspresioni vektori su opisani na primer u WO 2009115295.

[0122] U jednom primeru izvođenja, hiPSC ćelije su izvedene iz ćelija dobijenih od zdravog subjekta. U drugom primeru izvođenja, hiPSC ćelije su izvedene iz ćelija dobijenih od subjekta sa bolešću jetre, kao što je nasledno metaboličko oboljenje jetre, i ćelije slične hepatocitima ispoljavaju fenotip bolesti.

[0124] Alternativno, populacija ćelija hepatocitne linije od interesa može da se dobije diferencijacijom multipotentnih ćelija, kao što su mezenhimske matične ćelije, na matrici za hepatičnu diferencijaciju sastavljenoj od laminina prema pronalasku.

[0126] Kako se ovde koristi, pojam „multipotentne“ se odnosi na ćelije sposobne da se diferenciraju u najmanje dva terminalno diferencirana ćelijska tipa.

[0128] [0055] Kako se ovde koristi, pojam „mezenhimske matične ćelije“ uopšteno se odnosi na ćelije strome nađene u diferenciranom (specijalizovanom) tkivu, koje su sposobne da naprave identične kopije samih sebe (samo-obnavljanje) tokom životnog veka organizma i imaju multipotentni potencijal diferencijacije (kao što je diferencijacija u osteoblaste, adipocite, hondroblaste). Poželjno, humane mezenhimske matične ćelije koje mogu da se koriste u kontekstu predmetnog pronalaska prema tome uključuju bilo koje pogodne humane multipotentne matične ćelije (tj., ćelije sa sposobnošću samo-obnavljanja i multipotentnosti) koje potiču iz bilo kog pogodnog tkiva upotrebom bilo kog pogodnog postupka za izolaciju. Na primer, humane mezenhimske matične ćelije koje mogu da se koriste u postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na adultne multilinijske inducibilne (MIAMI) ćelije (D'Ippolito et al., J. Cell Sci., 2004, 117: 2971-2981), MAPC (poznate i kao MPC) (Reyes al., Blood, 2001, 98: 2615-2625), matične ćelije poreklom iz krvi pupčane vrpce (Kogler G et al., J. Exp. Med., 2004, 200(2): 123-135), mezangioblaste (Sampaolesi M et al., Nature, 2006, 444(7119): 574-579; Dellavalle A et al., Nat. Cell Biol., 2007, 9: 255-267), i amnionske matične ćelije (De Coppi P et al., Nat Biotechnol 2007, 25:100-106). Osim toga, banke krvi pupčane vrpce (npr., Etablissement Français du Sang, u Francuskoj) obezbeđuju sigurne i lako dostupne izvore takvih ćelija za transplantaciju.

[0130] Alternativno, populacija ćelija hepatocitne linije može da se dobije diferencijacijom ćelija izolovanih iz adultnih humanih jetri (npr., hepatocitne progenitorske ćelije) na matrici za hepatičnu diferencijaciju koja se sastoji od laminina. Takođe alternativno, populacija ćelija hepatocitne linije od interesa može da se dobije konverzijom somatskih ćelija kao što su fibroblasti na matrici za hepatičnu diferencijaciju koja se sastoji od laminina.

[0132] [0057] Kako se ovde koristi, pojmovi „ćelije hepatocitne linije“ ili „ćelije slične hepatocitima“ (HLC) odnose se na ćelije dobijene diferencijacijom pluripotentne ćelije, endodermalnih ćelija ili drugih vrsta ćelija kao što su multipotentne ćelije na opisani način. Diferencirane ćelije imaju najmanje jednu od raznovrsnih posebnih fenotipskih karakteristika poznatih hepatocitnih progenitora, hepatoblasta, fetalnih i zrelih hepatocita, kao što je kasnije prikazano u ovom opisu. Pri potrebi ovog izraza, ne podrazumeva se nikakvo posebno ograničenje kada je u pitanju fenotip ćelije, ćelijski markeri, ćelijska funkcija, ili proliferativni kapacitet, osim tamo gde se to izričito zahteva. Ćelije hepatocitne linije ispoljavaju hepatične markere uključujući, ali bez ograničenja hepatocitni nuklearni faktor 4alfa (HNF4α), albumin (ALB), alfa-fetoprotein (AFP), citohrom P450 i citokeratin 19 (CK19).

[0134] Postupci za određivanje nivoa ekspresije biomarkera prema pronalasku:

[0136] Određivanje nivoa ekspresije markera uključujući hepatične markere (npr., gene HNF4α, ALB, AFP, CK19) može da se izvede različitim tehnikama. Uopšteno, nivo ekspresije kakav je određen, predstavlja relativni nivo ekspresije. Na primer, određivanje obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa selektivnim reagensima kao što su probe ili ligandi, i time detektovanje prisustva, ili merenje količine nukleinskih kiselina ili polipeptida od interesa, koja je originalno prisutna u navedenom biološkom uzorku. Dovođenje u kontakt može da se izvede u bilo kom pogodnom uređaju, kao što je ploča, mikrotitarska posuda, epruveta, bunarčić, staklena posuda, kolona, i tako dalje. U specifičnim primerima izvođenja, dovođenje u kontakt se izvodi na supstratu obloženom reagensom, kao što je niz nukleinske kiseline ili niz specifičnog liganda. Supstrat može da bude čvrst ili polu-čvrst supstrat, kao što je bilo koja pogodna podloga koja sadrži staklo, plastiku, najlon, papir, metal, polimere i slično. Supstrat može da bude različitih oblika i veličina, kao što je pločica, membrana, perla, kolona, gel, itd. Dovođenje u kontakt može da se izvede pod bilo kojim uslovom pogodnim za obrazovanje detektabilnog kompleksa, kao što je hibrid nukleinske kiseline ili kompleks antitelo-antigen, između reagensa i nukleinskih kiselina ili polipeptida biološkog uzorka.

[0138] U konkretnom primeru izvođenja, nivo ekspresije gena za biomarkere može da se odredi određivanjem količine iRNK.

[0140] Postupci za određivanje količine iRNK su dobro poznati u stanju tehnike. Na primer, nukleinska kiselina sadržana u ćelijama od interesa kao što su HLC prema pronalasku se prvo ekstrahuje prema standardnim postupcima, na primer upotrebom litičkih enzima ili hemijskih rastvora ili ekstrahuje pomoću smola koje vezuju nukleinske kiseline prema uputstvima proizvođača. Ekstrahovana iRNK se zatim detektuje hibridizacijom (npr., Northern blot analiza) i/ili amplifikacijom (npr., RT-PCR). Kvantitativni ili polu-kvantitativni RT-PCR je poželjan. Naročito je pogodan kvantitativni ili polu-kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu.

[0141] U drugom primeru izvođenja, nivo ekspresije gena za biomarkere može da se odredi određivanjem količine proteina kodiranih navedenim genima.

[0143] Takvi postupci obuhvataju dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa vezivnim partnerom sposobnim da selektivno interaguje sa proteinom prisutnim u navedenom uzorku. Vezivni partner je uopšteno antitelo koje može da bude poliklonalno ili monoklonalno, poželjno monoklonalno.

[0145] Na primer, nivo proteinskog biomarkera, kao što su HNF4α, ALB, AFP i CK19, može da se meri upotrebom standardnih elektroforetskih i imunodijagnostičkih tehnika, uključujući imunološke testove kao što su testovi kompeticije, direktne reakcije, ili tipa sendvič-testa. Testovi uključuju, ali nisu ograničeni na Western blot testove; testove aglutinacije; enzimski obeležene i posredovane imunološke testove, kao što su ELISA; testove tipa biotin/avidin; radioimunološke testove; imunoelektroforezu; imunoprecipitaciju.

[0147] Uslovi u kojima se održava ćelijska kultura mogu da uključuju jednu ili više dodatnih komponenti da bi se obezbedilo podsticajno okruženje tokom usmerene diferencijacije u ciljni diferencirani tip ćelije (npr., ćelije hepatocitne linije). Postupci za dobijanje populacije diferenciranih ciljnih ćelija dodatno uključuju korak indukcije diferencijacije. Indukcija diferencijacije može da se postigne promenom sastava faktora rasta u medijumu za kulturu na jednom ili više stadijuma diferencijacije, kao što je opisano dole u tekstu.

[0149] Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za indukciju humane hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

[0151] (i) obezbeđivanja populacije humanih ćelija definitivnog endoderma (DE), i (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima.

[0153] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za dobijanje humanih ćelija sličnih hepatoblastima koji obuhvata korake:

[0155] (i) obezbeđivanja populacije humanih ćelija DE, i

[0156] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima.

[0158] Kako se ovde koristi, pojam „ćelije definitivnog endoderma“ se odnosi na ćelije koje eksprimiraju karakteristične biohemijske markere, uključujući, ali bez ograničenja Sox 17 i FoxA2 i ne eksprimiraju Nanog.

[0160] Kako se ovde koristi, pojmovi „ćelije slične hepatoblastima“ (HB) ili „hepatične progenitorske ćelije“ su međusobno zamenljivi i odnose se na ćelije koje eksprimiraju karakteristične biohemijske markere, uključujući, ali bez ograničenja hepatocitni nuklearni faktor 4 alfa (HNF4α), citokeratin 19 (CK19) i citohrom P450 3A7 (CYP3A7), i koje ne eksprimiraju ili suštinski ne eksprimiraju alfa-fetoprotein (AFP) i koje ne eksprimiraju albumin (ALB), alfa-1 antitripsin (AAT), citohrom P4503A7 (CYP3A7) i uridin difosfat (UDP)-glukuronozil transferazu 1A1 (UGT1A1).

[0162] Kako se ovde koristi, pojam „suštinski ne“, odnosi se na populaciju ćelija sličnih hepatoblastima koje eksprimiraju nizak nivo proteina od interesa kao što je AFP. Prema tome, takve ćelije mogu samo da eksprimiraju nizak nivo ili količinu AFP proteina koja se ne može detektovati ELISA testom, kao što je nekoliko pikograma (pg) što je ispod granice detekcije (LOD) za AFP pomoću ELISA testa. Međutim, treba primetiti da nizak nivo AFP iRNK može da se detektuje pomoću RT-PCR (ali ta količina je na kraju nedovoljna za detekciju ekspresije AFP proteina).

[0164] Kako se ovde koristi, izrazi „medijum za hepatičnu indukciju“ ili „medijum za kulturu koji indukuje hepatičnu diferencijaciju“, odnose se na medijum za kulturu koji je sposoban da indukuje diferencijaciju definitivnog endoderma u ćelije slične hepatoblastima (i prema tome sposoban da indukuje ekspresiju hepatičnih markera kao što su HNF4α, CK19 i CYP3A7).

[0166] Kako se ovde koristi, pojam „medijum za kulturu“ se odnosi na bilo koji medijum sposoban da podrži rast i diferencijaciju ćelija definitivnog endoderma u hepatične progenitorske ćelije. Poželjne formulacije medijuma koji će podržati rast i diferencijaciju ćelija definitivnog endoderma u hepatične progenitorske ćelije uključuju hemijski definisani medijum (CDM).

[0167] Kako se ovde koristi, pojam „hemijski definisani medijum“ (CDM) se odnosi na hranljivi rastvor za kultivisanje ćelija koji sadrži samo specificirane komponente, poželjno komponente poznate hemijske strukture. Hemijski definisani medijum je medijum bez seruma i bez hraniteljskih ćelija. Kako se ovde koristi, „bez seruma“ se odnosi na medijum za kulturu koji ne sadrži dodati serum. Kako se ovde koristi, „bez hraniteljskih ćelija“ se odnosi na medijum za kulturu koji ne sadrži dodate hraniteljske ćelije.

[0169] Medijum za kulturu može da bude medijum na bazi vode koji uključuje kombinaciju supstanci kao što su soli, nutrijenti, minerali, vitamini, aminokiseline, nukleinske kiseline, proteini kao što su citokini, faktori rasta i hormoni, koji su svi potrebni za preživljavanje ćelije. Na primer, medijum za kulturu može da bude sintetski medijum za kulturu tkiva kao što je RPMI (medijum memorijalnog instituta Roswell Park) ili CMRL-1066 (Laboratorija za medicinska istraživanja Connaught) za humanu upotrebu obogaćen potrebnim aditivima po potrebi kao što je dodatno opisano u tekstu ispod (odeljak sa primerima) kao što je B27. Suplement B-27 (Invitrogen) sadrži, između ostalih sastojaka, SOD, katalazu i druge anti-oksidanse (GSH), i jedinstvene masne kiseline, kao što su linolna kiselina, linolenska kiselina, lipoinske kiseline.

[0171] Korak kultivisanja ćelija DE sa medijumom za hepatičnu indukciju treba da se sprovodi tokom neophodnog vremena potrebnog za proizvodnju ćelija sličnih hepatoblastima. Trajanje ovog koraka kultivisanja može lako da odredi stručnjak u odgovarajućoj oblasti. Na primer, tokom kultivisanja stručnjak u odgovarajućoj oblasti može da prati odsustvo kod kultivisanih ćelija najmanje jednog od ekspresionih markera koje eksprimiraju samo ćelije definitivnog endoderma (DE) (npr., Sox17 i FoxA2) i/ili ekspresiju markera koje specifično eksprimiraju ćelije slične hepatoblastima (npr., HNF4α, CK19, CYP3A7). Kada ekspresija jednog ili nekoliko markera koji su specifični za DE ćelije ne može da se detektuje i/ili kada se ekspresija jednog ili nekoliko markera koji su specifični za ćelije slične hepatoblastima detektuje, kultivisanje sa medijumom za hepatičnu indukciju može da se prekine. Praćenje ovih markera može da se izvede upotrebom na primer RT-PCR analize RNK ekstrahovane iz kultivisanih ćelija sa specifičnim prajmerima, imunofluorescentnom analizom sa antitelima specifičnim za markere, i FACS ili bilo kojim postupkom za detekciju iRNK koja odgovara proteinima.

[0173] Tipično, korak ii) može da se izvede za 3 do 10 dana, poželjno 6 dana.

[0174] Ako je neophodno, medijum za kulturu može da se obnavlja, delimično ili potpuno, u pravilnim intervalima. Tipično, medijum za kulturu prema pronalasku može da se zamenjuje svežim medijumom za kulturu svakog drugog dana, tokom 6 dana.

[0176] Ćelije slične hepatoblastima proizvedene gore opisanim postupkom mogu da budu izolovane i/ili prečišćene upotrebom bilo kog pogodnog postupka, na primer FACS.

[0178] Pojam „FGF familija faktora rasta“, kada se koristi u vezi sa postupkom za dobijanje humanih ćelija sličnih hepatoblastima, odnosi se na bilo koju prirodnu supstancu (npr., protein) sposobnu da stimuliše rast ćelija, proliferaciju i ćelijsku diferencijaciju vezivanjem za jedan receptor faktora rasta fibroblasta (FGFR). Vezivanjem za jedan FGFR, supstanca povećava na primer fosforilaciju tirozina navedenog receptora.

[0180] U jednom primeru izvođenja opisa medijum za hepatičnu indukciju je hemijski definisan medijum koji sadrži koštani morfogenetski protein 4 (BMP4) i FGF.

[0182] U poželjnom primeru izvođenja opisa medijum za hepatičnu indukciju je hemijski definisani medijum koji sadrži koštani morfogenetski protein 4 (BMP4) i protein familije faktora rasta 10 (FGF10).

[0184] Prirodni humani FGF10 protein ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u bazi podataka Uniprot pod pristupnim brojem O15520. Tipično, FGF10 se dodaje u medijum za kulturu prema pronalasku u koncentraciji u opsegu od 1 do 50 ng/mL, poželjno oko 10 ng/mL. FGF10 može da se nabavi od kompanije Peprotech ili Miltenyi Biotec.

[0186] Prirodni humani BMP4 protein ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u bazi podataka Uniprot pod pristupnim brojem P12644. Tipično, BMP4 se dodaje u medijum za kulturu prema pronalasku u koncentraciji u opsegu od 1 do 50 ng/mL, poželjno oko 10 ng/mL. BMP4 može da se nabavi od kompanije R& D systems.

[0188] U drugom primeru izvođenja opisa medijum za hepatičnu indukciju je hemijski definisani medijum koji sadrži koštani morfogenetski protein 4 (BMP4) i FGF2 (poznat i kao bazni faktor rasta fibroblasta).

[0189] Prirodni humani FGF2 protein ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u bazi podataka Uniprot pod pristupnim brojem P09038. Tipično, FGF2 se dodaje u medijum za kulturu prema pronalasku u koncentraciji u opsegu od 1 do 50 ng/mL, poželjno oko 10 ng/mL. FGF2 može da se nabavi od kompanije Peprotech ili Miltenyi Biotec.

[0191] U nekim primerima izvođenja prema pronalasku, kultivisanje populacije ćelija DE može dodatno da uključuje pasažiranje populacije ćelija DE pre, ili tokom procesa diferencijacije. Postupak pasažiranja populacije ćelija može da se ponavlja jednom ili više puta, i može da uključuje odvajanje od podloge ćelija koje podržava matrica za vezivanje ćelija, razređivanje odvojenih ćelija u medijumu. Prema tome, korak ii) može dalje da obuhvata korak pasažiranja najmanje jednom, i/ili brojanje ćelija.

[0193] U nekim primerima izvođenja prema pronalasku, za povećanje klonogenosti, ćelije mogu da se obrade sa ROCK inhibitorom 4 časa pre odvajanja od podloge i 24 časa pre zasejavanja.

[0195] Kako se ovde koristi, pojam „inhibitor Rho-povezane protein kinaze (ROCK)“, odnosi se na jedinjenje (prirodno ili sintetsko) koje inhibira aktivnost ROCK1 i/ili ROCK2 kao što je kinazna aktivnost.

[0197] U određenom primeru izvođenja prema pronalasku, inhibitor ROCK je Y27632 (Watanabe et al. Nature Biotechnology 25, 681 - 686 (2007)).

[0199] Tipično, koncentracija Y27632 u medijumu za kulturu može da bude od 1 do 100 ng/mL, poželjno oko 10 ng/mL.

[0201] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je odabran iz grupe koja se sastoji od LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 i LN-521.

[0203] U pronalasku, navedeni laminin je humani laminin.

[0205] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je humani rekombinantni laminin.

[0206] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga kao što je ploča obložena je lamininom u količini od 0.5 do 50 mikrograma po mililitru (µg/mL), poželjno od 1 do 10 µg/mL, poželjnije 5 µg/mL.

[0208] Podloga je tipično površina u posudi za kultivisanje.

[0210] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od ploče, pločice, boce, i slično. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga ima bar deo površine obložen matricom prema pronalasku kao što je humani rekombinantni LN-111 ili humani rekombinantni LN-521.

[0212] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za indukciju humane hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

[0214] (i) obezbeđivanja populacije humanih pluripotentnih ćelija, i

[0215] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE.

[0217] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za dobijanje humanih ćelija DE koji obuhvata korake:

[0219] (i) obezbeđivanja populacije humanih pluripotentnih ćelija, i

[0220] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE.

[0222] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za indukciju humane hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

[0224] (i) obezbeđivanja populacije humanih pluripotentnih ćelija,

[0225] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE, i

[0226] (iii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija DE na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ranih ćelija sličnih hepatoblastima.

[0228] Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje humanih ćelija sličnih hepatoblastima koji obuhvata korake:

[0229] (i) obezbeđivanja populacije humanih pluripotentnih ćelija,

[0230] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE, i

[0231] (iii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija DE na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima.

[0233] Kako se ovde koriste, izrazi „medijum za indukciju endoderma“ ili „medijum za kulturu za indukciju diferencijacije endoderma“ odnose se na medijum za kulturu koji ima sposobnost da indukuje diferencijaciju pluripotentnih matičnih ćelija u ćelije definitivnog endoderma (i time sposobnost indukovanja ekspresije endodermnih markera kao što su Sox 17 i FoxA2).

[0235] U poželjnom primeru izvođenja opisa medijum za indukciju endoderma je hemijski definisani medijum koji sadrži najmanje Aktivin A i opciono WNT3A.

[0237] Aktivin A je dobro poznat u stanju tehnike i predstavlja dimerni polipeptid koji obavlja niz ćelijskih efekata putem stimulacije puta Aktivin/Nodal (Vallier et al., Cell Science 118:4495-4509 (2005)). Prirodni humani protein aktivin A ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bazi podataka GeneBank pod pristupnim brojem NP_002183. Aktivin je lako dostupan iz komercijalnih izvora (npr., Stemgent Inc. MA SAD ili Miltenyi Biotec).

[0239] Tipično, koncentracija Aktivina A u medijumu za kulturu može da bude od 10 do 1000 ng/mL, poželjno oko 100 ng/mL.

[0241] Prirodni humani WNT3A protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bazi podataka Uniprot pod pristupnim brojem P56704. Tipično, koncentracija WNT3A u medijumu za kulturu može da sadrži 10 do 100 ng/mL WNT3A, poželjno oko 50 ng/mL. WNT3A može da se nabavi od kompanije Miltenyi Biotec.

[0243] [0105] Korak kultivisanja pluripotentnih matičnih ćelija sa medijumom za indukciju endoderma treba da se sprovodi tokom neophodnog vremena potrebnog za proizvodnju definitivnog endoderma (DE). Trajanje ovog koraka kultivisanja može lako da odredi stručnjak u ovoj oblasti. Na primer, tokom kultivisanja stručnjak u ovoj oblasti može da prati u kultivisanim ćelijama ekspresiju markera koje specifično eksprimira definitivni endoderm (DE) (npr., Sox 17 i FoxA2). Kada se ekspresija jednog ili nekoliko markera specifičnih za DE ćelije detektuje, kultivisanje sa medijumom za hepatičnu indukciju može da se prekine. Praćenje ovih markera može da se izvede upotrebom na primer RT-PCR analize RNK ekstrahovane iz kultivisanih ćelija sa specifičnim prajmerima, imunofluorescentnom analizom sa antitelima koja su specifična za markere, ELISA i FACS testom, ili bilo kojim postupkom za detekciju RNK/proteina/aktivnosti koja odgovara specifičnom markeru.

[0245] Tipično, korak ii) može da se izvede za 1 do 10 dana, poželjno 5 dana.

[0247] Ako je neophodno, medijum za kulturu prema opisu može da se obnavlja, delimično ili potpuno, u pravilnim intervalima. Tipično, medijum za kulturu prema opisu može da se zamenjuje svežim medijumom za kulturu prema opisu svaki drugi dan, tokom 5 dana.

[0249] Ćelije slične hepatoblastima proizvedene gore opisanim postupkom mogu da budu izolovane i/ili prečišćene upotrebom bilo kog pogodnog postupka, na primer FACS.

[0251] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je odabran iz grupe koja se sastoji od LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 i LN-521.

[0253] U pronalasku, navedeni laminin je humani laminin.

[0255] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je humani rekombinantni laminin.

[0257] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga kao što je ploča obložena je lamininom u količini od 0.5 do 50 mikrograma po mililitru (µg/mL), poželjno od 1 do 10 µg/mL, poželjnije 5 µg/mL.

[0259] Podloga je tipično površina u posudi za kultivisanje.

[0261] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga je odabrana iz grupe koja se sastoji od ploče, pločice, boce, i slično. U pronalasku, podloga ima bar deo površine obložen matricom prema pronalasku kao što je humani rekombinantni LN-111 ili humani rekombinantni LN-521.

[0262] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje ćelija humanih fetalnih hepatocita koji obuhvata korake:

[0264] (i) obezbeđivanja populacije humanih pluripotentnih ćelija,

[0265] (ii) kultivisanja populacije na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE,

[0266] (iii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija DE na podlozi obloženoj lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima, i

[0267] (iv) kultivisanja populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima u medijumu za sazrevanje hepatičnih ćelija da bi se proizvela populacija ćelija sličnih fetalnim hepatocitima.

[0269] Kako se ovde koriste, izrazi „ćelije slične fetalnim hepatocitima“ ili „diferencirani hepatoblasti“, ovde se koriste međusobno zamenljivo i odnose se na ćelije koje eksprimiraju karakteristične biohemijske markere, uključujući, ali bez ograničenja HNF4α, CYP3A7, AFP i CK19, i mogu da eksprimiraju neke zrele hepatične proteine, uključujući, ali bez ograničenja ALB, AAT, UGT1A1, i citohrom P4503A4 (CYP3A4).

[0271] Kako se ovde koriste, izrazi „medijum za sazrevanje hepatičnih ćelija“ ili „medijum za kulturu koji stimuliše sazrevanje hepatičnih ćelija“ odnose se na medijum za kulturu koji ima sposobnost indukcije sazrevanja ćelija sličnih hepatoblastima u ćelije slične fetalnim hepatocitima.

[0273] U poželjnom primeru izvođenja opisa medijum za hepatičnu indukciju je hemijski definisani medijum koji sadrži HGF i OSM.

[0275] Kako se ovde koristi, pojam „hepatični faktor rasta“ (HGF) se odnosi na faktor rasta koji reguliše rast ćelija, pokretljivost ćelija i morfogenezu aktivacijom signalne kaskade tirozin kinaze posle vezivanja za protoonkogeni c-MET receptor. Prirodni humani HGF protein ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u bazi podataka Uniprot pod pristupnim brojem P14210.

[0276] Tipično, HGF se dodaje u medijum za sazrevanje hepatičnih ćelija u koncentraciji u opsegu od 1 do 100 ng/mL, poželjno od 5 do 50 ng/mL, i još poželjnije oko 20 ng/mL. HGF može da se nabavi od kompanije Peprotech.

[0278] Kako se ovde koristi, pojam „onkostatin M“ (OSM) se odnosi na citokin koji inhibira proliferaciju brojnih tumorskih ćelijskih linija. Prirodni humani OSM protein ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u bazi podataka Uniprot pod pristupnim brojem P13725.

[0280] Tipično, Onkostatin M se dodaje u medijum za sazrevanje hepatičnih ćelija u koncentraciji u opsegu od 1 do 100 ng/mL, poželjno od 5 do 50 ng/mL, i još poželjnije oko 20 ng/mL. OSM može da se nabavi od kompanije Miltenyi Biotec.

[0282] Korak kultivisanja ćelija sličnih hepatoblastima sa medijumom za sazrevanje hepatičnih ćelija treba da se sprovodi tokom vremena neophodnog za proizvodnju ćelija sličnih fetalnim hepatocitima. Trajanje ovog koraka kultivisanja može lako da odredi stručnjak u ovoj oblasti. Na primer, tokom kultivisanja stručnjak u ovoj oblasti može da prati pri kultivisanju ćelija odsustvo ekspresije specifičnih markera pluripotentnih matičnih ćelija (npr., Sox 2 i Nanog), odsustvo ekspresije specifičnih markera definitivnog endoderma (DE) (npr., Sox 17 i FoxA2), ekspresiju specifičnih markera hepatoblasta i/ili ekspresiju markera koje specifično eksprimiraju ćelije slične fetalnim hepatocitima (npr., AFP i ALB). Kada se ekspresija jednog ili nekoliko markera specifičnih za ćelije slične fetalnim hepatocitima detektuje, kultivisanje sa medijumom za sazrevanje hepatičnih ćelija može da se prekine. Praćenje ovih markera može da se sprovede upotrebom na primer RT-PCR analize RNK ekstrahovane uz kultivisanih ćelija sa specifičnim prajmerima, imunofluorescentnom analizom sa antitelima specifičnim za markere, ELISA i FACS metodom, ili bilo kojim postupkom za detekciju RNK/proteina/aktivnosti koja odgovara specifičnom markeru.

[0284] Tipično, korak ii) može da se izvede za 3 do 60 dana, poželjno 30 dana.

[0286] Ako je neophodno, medijum za kulturu prema opisu može da se obnavlja, delimično ili potpuno, u pravilnim intervalima. Tipično, medijum za kulturu prema opisu može da se zamenjuje svežim medijumom za kulturu prema opisu svaki drugi dan, tokom 30 dana.

[0287] Ćelije slične fetalnim hepatocitima proizvedene gore navedenim postupkom mogu da budu izolovane i/ili prečišćene upotrebom bilo kog pogodnog postupka, na primer FACS.

[0289] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je odabran iz grupe koja se sastoji od LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 i LN-521.

[0291] U pronalasku, navedeni laminin je humani laminin.

[0293] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, navedeni laminin je humani rekombinantni laminin.

[0295] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga kao što je ploča obložena je lamininom u količini od 0.5 do 50 mikrograma po mililitru (µg/mL), poželjno od 1 do 10 µg/mL, poželjnije 5 µg/mL.

[0297] Podloga je tipično površina u posudi za kultivisanje.

[0299] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, podloga je odabrana iz grupe koja se sastoji od ploče, pločice, boce, i slično. U pronalasku, podloga ima bar deo površine obložen matricom prema pronalasku kao što je humani rekombinantni LN-111 ili humani rekombinantni LN-521.

[0301] Populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima u skladu sa opisom i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže

[0303] U sledećem aspektu, opis se odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih hepatoblastima dobijenih postupkom koji je definisan gore u tekstu.

[0305] Opis se odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih hepatoblastima dobijenih postupkom koji je definisan gore u tekstu, pri čemu navedene ćelije eksprimiraju hepatocitni nuklearni faktor 4alfa (HNF4α), i ne eksprimiraju, ili suštinski ne eksprimiraju alfa-fetoprotein (AFP).

[0307] [0135] Opis se odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih hepatoblastima dobijenih postupkom koji je definisan gore u tekstu, gde navedene ćelije eksprimiraju HNF4α, citokeratin 19 (CK19) i citohrom P4503A7 (CYP3A7), i ne eksprimiraju, ili suštinski ne eksprimiraju AFP, albumin (ALB), alfa-1 antitripsin (AAT), citohrom P450 3A4 (CYP3A4), uridin difosfat (UDP)-glukuronozil transferazu 1A1 (UGT1A1).

[0309] U još jednom aspektu, opis se odnosi na populaciju ćelija humanih fetalnih hepatocita dobijenih postupkom koji je definisan gore u tekstu.

[0311] Opis se takođe odnosi na populaciju humanih ćelija sličnih fetalnim hepatocitima dobijenih postupkom koji je definisan gore u tekstu, gde navedene ćelije eksprimiraju HNF4α, CK19, CYP3A7, AFP, ALB, AAT i UGT1A1 i citohrom P4503A4 (CYP3A4).

[0313] U jednom primeru izvođenja, humane ćelije slične hepatocitima (tj., hepatoblasti ili ćelije slične fetalnim hepatocitima ili zreli hepatociti) ispoljavaju normalan fenotip.

[0315] U drugom primeru izvođenja, humane ćelije slične hepatoblastima (tj., hepatoblasti ili ćelije slične fetalnim hepatocitima) ispoljavaju genetsku mutaciju, konkretno genetsku mutaciju koja utiče na ključni protein u humanim ćelijama sličnim hepatoblastima i koja je udružena sa oboljenjem jetre. Treba napomenuti da genetska mutacija ili defekt koji je odgovoran za fenotip oboljenja može da se popravi in vitro ili ex vivo. Različite tehnike za popravljanje genetskih mutacija ili defekata su dostupne u izolovanim sisarskim ćelijama.

[0316] Genetske modifikacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima prema opisu

[0318] Pojam „genetski modifikovane“ ukazuje na to da humane ćelije slične hepatocitima (tj., hepatoblasti ili ćelije slične fetalnim hepatocitima ili zreli hepatociti) sadrže molekul nukleinske kiseline koji prirodno nije prisutan u nemodifikovanim humanim ranim hepatičnim progenitorskim ćelijama, ili je molekul nukleinske kiseline prisutan u stanju koje nije prirodno u navedenim humanim ranim hepatičnim progenitorskim ćelijama (npr., amplifikovan je). Molekul nukleinske kiseline može da bude uveden u navedene ćelije ili u njihove predačke ćelije (kao što je iPS koja sadrži genetsku mutaciju udruženu sa oboljenjem jetre).

[0320] Brojni pristupi mogu da se koriste za genetsko modifikovanje humanih ćelija sličnih hepatocitima, kao što je isporuka gena posredovana virusom, isporuka gena koja nije posredovana virusom, gola DNK, fizička obrada, itd. U tom cilju, nukleinska kiselina se obično ugrađuje u vektor, kao što je rekombinantni virus, plazmid, fag, epizom, veštački hromozom, itd.

[0321] U određenom primeru izvođenja prema opisu, ćelije slične hepatocitima (HLC) ili pluripotentne matične ćelije su genetski modifikovane upotrebom virusnog vektora (ili rekombinantnog virusa) ili postupkom koji ne uključuje virus. U ovom primeru izvođenja, heterologa nukleinska kiselina se, na primer, uvodi u rekombinantni virus koji se zatim koristi za inficiranje humanih ćelija sličnih hepatocitima (HLC). Različiti tipovi rekombinantnih virusa mogu da se koriste, naročito lentivirusi.

[0323] U opisu pronalaska navedeni lentivirus kodira imortalizujući protein, kao što je SV40T, hTERT, CDK4, itd.

[0325] U opisu pronalaska navedeni lentivirus kodira protein divljeg tipa (takav protein obično ispoljava genetsku mutaciju udruženu sa oboljenjem kod pacijenata koji pate od oboljenja jetre) kao što je divlji tip α1-antitripsin (AAT) proteina ili polipeptida A1 (UGT1A1) iz familije UDP glukuronoziltransferaze 1. Druge genetske mutacije uključene u oboljenja jetre su prethodno opisane.

[0327] U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein od interesa (na primer imortalizujući protein ili protein divljeg tipa koji se koristi za popravku fenotipa oboljenja) operativno je povezan sa promotorom.

[0329] Alternativno, navedeni lentivirus kodira reporterski protein ili marker protein. Navedeni marker protein, koji može da bude fluorescentni protein ili protein eksprimiran na površini ćelije, omogućava brzu identifikaciju i izolovanje humanih ćelija sličnih hepatocitima (HLC) od interesa.

[0331] Marker protein može, na primer, da bude odabran iz grupe koja se sastoji od:

[0333] - fluorescentnog proteina, naročito zelenog fluorescentnog proteina (GFP) ili njegovih derivata, na primer pojačanog zelenog fluorescentnog proteina, plavih fluorescentnih proteina (EBFP, EBFP2, Azurit, mKalamal), cijan-fluorescentnih proteina (ECFP, Cerulean, CyPet), i žutih fluorescentnih proteina (YFP, EYFP, Citrin, Venus, YPet); i

[0334] - bilo kojih proteina eksprimiranih na površini ćelije koje ćelije HLC ne eksprimiraju prirodno.

[0335] Kako se ovde koristi, pojam „operativno vezan“ označava da su opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na predviđeni način. Tako, sekvenca nukleinske kiseline je „operativno vezana“ kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promotor je „operativno vezan“ sa kodirajućom sekvencom ako promotor dovodi do transkripcije kodirajuće sekvence. Uopšteno, operativno vezan označava da su sekvence nukleinske kiseline susedne.

[0337] Kako se ovde koristi, pojam „promotor“ se odnosi na sekvencu DNK koja određuje mesto započinjanja transkripcije za RNK polimerazu. Promotor može da sadrži promotor RNK polimeraze III koji može da obezbedi visoke nivoe konstitutivne ekspresije u različitim tipovima ćelija i koji će biti dovoljan da usmerava transkripciju udaljenih sekvenci, kakva je sekvenca vezana za 3' kraj promotorske sekvence u ćeliji. Pogodni promotori uključuju, na primer, konstitutivne, regulisane, tkivno-specifične ili opšte prisutne promotore, koji mogu da budu ćelijskog, virusnog ili sintetskog porekla.

[0339] U jednom primeru izvođenja, promotor je konstitutivni promotor kao što je humani elongacioni faktor-1 alfa (EF-1 alfa), itd.

[0341] U drugom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za jetru, kao što je humani 1-antitripsin, albumin, itd.

[0343] U drugom primeru izvođenja, promotor je endogena sekvenca (konstitutivna ili specifična). U tom slučaju, protein od interesa je spojen sa endogenim promotorom pomoću tehnologije za editovanje genoma zasnovane na upotrebi veštačke nukleaze (npr: CRISPR/cas, ZFN, TALEN).

[0345] U drugom primeru izvođenja, modifikacija gena humanih ćelija sličnih hepatoblastima se sprovodi pomoću tehnologije editovanja genoma da bi se modifikovala endogena genska sekvenca.

[0347] [0154] Značajno, ćelije hepatocitne linije (HLC) su ciljno mesto delovanja bolesti u različitim stanjima poznatim kao „oboljenja jetre“ (označenim i kao „patologija povezana sa oštećenjem jetre“). Ovi izrazi se odnose na bilo koju bolest ili kliničko stanje koje se odlikuje oštećenjem, povredom, disfunkcijom, defektom, ili abnormalnošću jetre. Prema tome, pojam obuhvata, na primer, povrede, degenerativne bolesti i genetske bolesti.

[0349] Oboljenja jetre postaju jedan od najčešćih uzroka smrti u zemljama u razvoju. Ova grupa bolesti koje ciljno deluju na ćelije hepatocitne linije kao što su hepatociti koji predstavljaju dominantne ćelije jetre, obuhvata nasledne metaboličke poremećaje (kao što je tip 1 sindroma Krigler-Najar, glikogenoza, defekti ciklusa uree, familijarna hiperholesterolemija, tirozinemija i Vilsonova bolest), hroničnu insuficijenciju jetre, kao i akutnu insuficijenciju jetre koja može da bude uzrokovana virusnom infekcijom (posebno infekcijom sa HBV ili HCV), toksičnim materijama (alkohol) i drogama, ili autoimunski poremećaj (autoimunski hronični hepatitis, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozirajući holangitis).

[0351] U drugom aspektu, opis takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži populaciju humanih ćelija sličnih hepatoblastima (npr., ćelija sličnih hepatoblastima ili ćelija sličnih fetalnim hepatocitima) u skladu sa pronalaskom.

[0353] Farmaceutska kompozicija može uopšteno da uključuje jedan ili više farmaceutski prihvatljivih i/ili odobrenih nosača, aditiva, antibiotika, konzervansa, adjuvanasa, razblaživača, rastvarača i/ili stabilizatora. Takve pomoćne supstance mogu da budu voda, slani rastvor, glicerol, etanol, sredstva za kvašenje ili emulgovanje, pH puferske supstance, ili slično. Pogodni nosači su tipično veliki, molekuli koji se sporo metabolišu, kao što su proteini, polisaharidi, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina, agregati lipida, ili slično. Ova farmaceutska kompozicija može da sadrži dodatne aditive kao što su manitol, dekstran, šećer, glicin, laktoza ili polivinilpirolidon, ili druge aditive kao što su antioksidansi ili inertni gas, stabilizatore ili rekombinantne proteine (npr. humani serum albumin) ili vitamine pogodne za primenu in vivo.

[0355] Kako se ovde koristi, pojam „farmaceutski prihvatljiv“ se odnosi na molekulske entitete i kompozicije koje ne proizvode nikakvu štetnu, alergijsku ili drugu nepovoljnu reakciju kada se primene kod sisara, posebno čoveka, po potrebi. Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens se odnosi na netoksični čvrsti, polu-čvrsti ili tečni punilac, razblaživač, materijal za inkapsulaciju ili pomoćno sredstvo za formulaciju bilo koje vrste.

[0356] Postupci skrininga prema opisu

[0358] U drugom aspektu, humane ćelije slične hepatocitima (tj., hepatoblasti ili ćelije slične fetalnim hepatocitima) prema opisu, dobijene od zdravih ili obolelih pacijenata mogu takođe da se pogodno koriste za primene u skriningu u farmaceutskoj industriji.

[0360] Takvi skrining testovi mogu da se koriste za potragu za novim lekovima sa kliničkim primenama, ili za toksikološke testove procene hepatotoksičnosti jedinjenja kao što su farmaceutska jedinjenja-kandidati. Humane ćelije slične hepatoblastima prema pronalasku mogu na primer da budu korisne za stvaranje ćelijskih modela oboljenja jetre kao što je gore opisano.

[0362] Prema tome, opis pronalaska obezbeđuje postupak za skrining jedinjenja koje je korisno u lečenju oboljenja jetre, koji obuhvata korake:

[0364] (a) dovođenja u kontakt populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima ili ćelija sličnih fetalnim hepatocitima proizvedenih pomoću postupka prema pronalasku sa ispitivanim jedinjenjem, i;

[0365] (b) određivanja dejstva ispitivanog jedinjenja na navedene humane ćelije slične hepatoblastima ili ćelije slične fetalnim hepatocitima.

[0367] Sledeći aspekt opisa se odnosi na postupak za skrining jedinjenja koja imaju hepatoprotektivno ili hepatotoksično ili hepatoproliferativno dejstvo pri čemu navedeni postupak obuhvata korake:

[0369] (a) dovođenja u kontakt populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima ili ćelija sličnih fetalnim hepatocitima proizvedenih pomoću postupka prema pronalasku sa ispitivanim jedinjenjem;

[0370] (b) poređenja preživljavanja ćelija iz koraka a) sa onim kod populacije navedenih ćelija kao što je gore definisano, kultivisanih u odsustvu navedenog ispitivanog jedinjenja.

[0372] Pojam „hepatotoksično“ se odnosi na jedinjenje koje izaziva smanjenje preživljavanja hepatičnih progenitorskih ćelija. Smatra se da jedinjenje ima hepatotoksično dejstvo ako je broj vijabilnih ćelija kultivisanih u prisustvu navedenog jedinjenja niži od broja vijabilnih ćelija kultivisanih u odsustvu navedenog jedinjenja.

[0373] Pojam „hepatoprotektivno“ se odnosi na jedinjenje koje rezultuje povećanjem preživljavanja hepatičnih progenitorskih ćelija. Smatra se da jedinjenje ima hepatoprotektivno dejstvo ako je broj vijabilnih ćelija kultivisanih u prisustvu navedenog jedinjenja viši od broja vijabilnih ćelija kultivisanih u odsustvu navedenog jedinjenja.

[0375] Tipično, hepatoprotektivno dejstvo može da se ispituje u odsustvu hepatotrofnih faktora. Alternativno, hepatoprotektivno dejstvo može da se ispituje u prisustvu poznatog hepatotoksičnog leka. Poznati hepatotoksični lekovi uključuju, ali nisu ograničeni na amiodaron, metotreksat, nitrofurantoin.

[0377] Pojam „hepatoproliferativno“ se odnosi na jedinjenje koje rezultuje u povećanju proliferacije hepatičnih progenitorskih ćelija. Smatra se da jedinjenje ima hepatoproliferativno dejstvo ako je broj proliferativnih ćelija kultivisanih u prisustvu navedenog jedinjenja viši od broja vijabilnih ćelija kultivisanih u odsustvu navedenog jedinjenja. Tipično, hepatoproliferativno dejstvo može da se ispituje u odsustvu faktora rasta.

[0379] Ispitivana jedinjenja prema opisu

[0381] U jednom primeru izvođenja, ispitivano jedinjenje može da bude odabrano iz grupe koja se sastoji od peptida, proteina, peptidomimetika, malih organskih molekula, aptamera ili nukleinskih kiselina. Na primer, ispitivano jedinjenje prema opisu može da bude odabrano iz biblioteke jedinjenja koja su prethodno sintetisana, ili biblioteke jedinjenja kojima je struktura određena u bazi podataka, ili iz biblioteke jedinjenja koja su sintetisana de novo.

[0383] U određenom primeru izvođenja, ispitivano jedinjenje može da bude odabrano od malih organskih molekula. Kako se ovde koristi, pojam „mali organski molekul“ se odnosi na molekul čija je veličina uporediva sa onim organskim molekulima koji se uopšteno koriste u farmaceuticima. Pojam isključuje biološke makromolekule (npr., proteine, nukleinske kiseline, itd.); poželjni mali organski molekuli imaju raspon veličine do 2000 Da, i najpoželjnije do oko 1000 Da.

[0384] U drugom primeru izvođenja, ispitivano jedinjenje može da bude odabrano iz grupe koja se sastoji od biblioteke nukleinskih kiselina, uključujući, ali bez ograničenja RNK u vidu kratke ukosnice, miRNK, iRNK.

[0386] Životinjski modeli

[0388] Dostupnost ćelija sličnih hepatoblastima koje mogu da budu izvedene iz humanih ćelija ES ili iPS dalje čini mogućim stvaranje in vitro i in vivo modela humanih oboljenja jetre i hepatotropnih virusa, konkretno hepatitisa B ili C. Specifičnije, in vivo model humanih oboljenja jetre i hepatotropnih virusa može da se obezbedi repopulacijom jetre nehumanog sisara humanim ranim hepatičnim progenitorskim ćelijama.

[0390] U skladu sa tim, opis se dalje odnosi na upotrebu humanih ćelija sličnih hepatocitima (tj., ćelija sličnih hepatoblastima ili ćelija sličnih fetalnim hepatocitima) dobijenih pomoću postupka u skladu sa opisom za proizvodnju nehumanog sisarskog domaćina koji sadrži funkcionalne humane hepatocite.

[0392] Pogodni postupak za proizvodnju himernog nehumanog sisara koji sadrži funkcionalne humane hepatocite može da obuhvata korak koji se sastoji od injektovanja humanih ćelija sličnih hepatocitima (tj., ćelija sličnih hepatoblastima ili ćelija sličnih fetalnim hepatocitima) prema opisu u jetru navedenog nehumanog sisara. Da bi se podstaklo prihvatanje kalema HLC ćelija, nehumani sisar može da primi antimakrofagni tretman za kontrolu neadaptivne odbrane. Ovo može da se izvede, na primer primenom dihlorometilen difosfonata, npr., intraperitonealnom injekcijom dihlorometilen difosfonata inkapsuliranog u lipozom. Druge strategije za podsticanje prihvatanja kalema HLC ćelija mogu da se zasnivaju na stimulaciji regeneracije jetre pre injekcije ćelija. Ovo može da se izvede na primer, izazivanjem oštećenja jetre (npr., delimičnom hepatektomijom, hemijskom embolizacijom, zračenjem jetre, hepatotoksinima, transgenim postupkom) ili primenom bilo kog jedinjenja koje stimuliše proliferaciju hepatocita (faktor rasta hepatocita, hormon T3).

[0394] [0173] Prema drugoj strategiji, prihvatanje kalema HLC ćelija može da se podstakne i inhibicijom proliferativnog potencijala endogenih hepatocita pri regeneraciji jetre (mlade životinje ili povređena jetra). Ovo može da se izvede na primer primenom retrorzina (intraperitonealnom injekcijom), mitomicina C (intraperitonealnom injekcijom) ili propranolol hidrohlorida (u vodi za piće). Najzad, prihvatanje kalema HLC ćelija može da se podstakne primenom vazodilatornog jedinjenja. Ovo može da se izvede na primer primenom gliceril trinitrata.

[0396] Opis pronalaska se dalje odnosi na himernog nehumanog sisara koji sadrži funkcionalne humane hepatocite dobijene, ili koji mogu da se dobiju, pomoću postupka prema opisu.

[0398] Nehumani sisar u skladu sa opisom može da bude bilo koji sisar koji nije primat u koga humani hepatociti mogu da budu ubačeni i održavani u njemu. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na konje, ovce, krave, mačke, pse, pacove, hrčke, zečeve, gerbile, zamorce, i miševe. Poželjno, životinja-domaćin je glodar, još poželjnije miš. To može da bude i nehumani primat (makaki).

[0400] Nehumani sisar može naročito da bude imunokompromitovani sisar koji će uopšteno biti nesposoban da zaokruži potpuni imunski odgovor na ksenogene ćelije (humani hepatociti). Imunokompromitovani sisarski domaćini pogodni za implantaciju postoje, ili mogu da se stvore, npr., primenom jednog ili više jedinjenja (npr., ciklosporin, takrolimus) ili zahvaljujući genetskom defektu koji rezultuje, npr., u nesposobnosti obavljanja rearanžmana DNK klicine linije na lokusima koji kodiraju imunoglobuline i T-ćelijske antigene receptore.

[0402] Funkcionalnost humanih hepatocita može da se prati posmatranjem surogat markera za aktivnost hepatocita, uključujući fiziološke proizvode humanih hepatocita koji mogu da se razlikuju od svojih nehumanih sisarskih, posebno glodarskih, analoga pomoću imunoloških ili kvantitativnih kriterijuma, npr., ekspresije humanog serum albumina, ili serumskih nivoa bilirubina kod životinja kojima nedostaje aktivnost UGT1A1 (označeno i kao bilirubinemija), itd. Ovi markeri mogu da se koriste za određivanje prisustva ćelija bez žrtvovanja primaoca.

[0404] Himerni nehumani sisar koji sadrži funkcionalne humane hepatocite može da se koristi naročito kao in vivo model za humanu infekciju hepatitisom B.

[0406] Terapijski postupci i upotrebe

[0407] Jedna od glavnih oblasti primene je ćelijska terapija ili regenerativna medicina. Regenerativna medicina može da se koristi za potencijalno izlečenje bilo koje bolesti koja je rezultat neispravnog funkcionisanja, oštećenja ili propadanja tkiva, regeneracijom oštećenih tkiva in vivo direktnom in vivo implantacijom farmaceutske kompozicije koja sadrži ćelije slične hepatocitima (npr. ćelije slične hepatoblastima) prema opisu.

[0409] Opis se takođe odnosi na populaciju humanih ćelija svrstanih u hepatocitnu liniju koje nisu u potpunosti diferencirane, za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog tela. Opis se odnosi i na populaciju humanih ćelija svrstanih u hepatocitnu liniju koje nisu u potpunosti diferencirane za upotrebu u lečenju oboljenja jetre.

[0411] Još jedan aspekt opisa se prema tome odnosi na populaciju ćelija sličnih hepatocitima (npr., ćelija sličnih hepatoblastima) prema opisu, za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog tela. U jednom primeru izvođenja, navedena populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima je populacija navedenih ćelija koje eksprimiraju hepatocitni nuklearni faktor 4alfa (HNF4α), i koje ne eksprimiraju ili suštinski ne eksprimiraju alfafetoprotein (AFP) kao što je gore opisano.

[0413] Konkretnije, aspekt opisa se odnosi na populaciju ćelija sličnih hepatocitima (npr., ćelija sličnih hepatoblastima) prema opisu za upotrebu u lečenju oboljenja jetre. U jednom primeru izvođenja, navedena populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima je populacija navedenih ćelija koje eksprimiraju hepatocitni nuklearni faktor 4alfa (HNF4α), i koje ne eksprimiraju ili suštinski ne eksprimiraju alfa-fetoprotein (AFP) kao što je gore opisano.

[0415] Opis se odnosi i na postupak za lečenje oboljenja jetre koji obuhvata korak primene farmaceutski efikasne količine populacije ćelija sličnih hepatocitima (npr., ćelija sličnih hepatoblastima) prema opisu kod pacijenta kome je to potrebno.

[0417] U kontekstu opisa, pojmovi „lečenje“ ili „tretman“, kako se ovde koriste, odnose se na postupak koji ima za cilj odlaganje ili sprečavanje pojave patologije, vraćanje unazad, ublažavanje, inhibiranje, usporavanje ili zaustavljanje progresije, pojačavanja ili pogoršanja simptoma patologije, donošenje poboljšanja simptoma patologije i/ili lečenje patologije.

[0418] Kako se ovde koristi, pojam „farmaceutski efikasna količina“ se odnosi na bilo koju količinu populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima prema opisu (ili njihove farmaceutske kompozicije) koja je dovoljna za postizanje predviđene svrhe.

[0420] Efikasne doze i režimi primene mogu lako da se odrede dobrom medicinskom praksom na osnovu prirode patologije kod subjekta, i zavisiće od brojnih faktora uključujući, ali bez ograničenja, stepen simptoma patologije i stepen oštećenja ili degeneracije tkiva ili organa od interesa, i svojstava subjekta (npr., starost, telesna težina, pol, opšte zdravlje, i slično).

[0422] Za terapiju, populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima i farmaceutske kompozicije prema opisu mogu da se primene različitim putevima. Dozu i broj primena mogu da optimizuju stručnjaci u ovoj oblasti na način koji je poznat.

[0424] U jednom primeru izvođenja, humane ćelije slične hepatoblastima u skladu sa opisom mogu da budu korisne za autologu regenerativnu terapiju pacijenta koji pati od oboljenja jetre kome je potrebna regenerativna terapija zbog specifičnih poremećaja ili tretmana povezanih sa takvim poremećajima, uključujući bez ograničenja, tip 1 sindroma Krigler-Najar (CN1) zbog deficita u jednom identifikovanom genu koji može da se zameni in vitro.

[0426] U jednom primeru izvođenja, opis se odnosi na humane ćelije slične hepatoblastima prema opisu za upotrebu u vidu proizvoda za ćelijsku terapiju za implantaciju u humanog pacijenta, u vidu alogenog kalema, ili, posle genetske popravke, u vidu autologog kalema (tj., ćelije imaju isti genotip kao ćelije pacijenta).

[0428] U jednom primeru izvođenja, humane ćelije slične hepatoblastima prema opisu mogu da se koriste za jetre dobijene bio-inženjeringom, njihovom infuzijom zajedno sa drugim ćelijama hepatične linije u decelularizovanu jetru, stvaranjem vaskularizovane i funkcionalne humane jetre iz humanih iPSC ćelija transplantacijom pupoljaka jetre stvorenih in vitro (Takebe et al Nature 2013499), 3D štampanjem, ili bilo kojim drugim postupkom za stvaranje tkiva jetre. U još jednom primeru izvođenja, humane ćelije slične hepatoblastima prema pronalasku mogu da se koriste za bio-veštačke jetre, bilo njihovom infuzijom u uređaje izvan tela, ili njihovim ugrađivanjem u biomatricu ili hidrogel (kao što je alginat, silanizovana hidroksipropil metilceluloza) pre infuzije u telo.

[0429] Pronalazak će biti dalje ilustrovan slikama i primerima koji slede. Međutim, ove primere i slike ne treba shvatiti ni u kom smislu kao ograničavajuće za obim ovog pronalaska.

[0431] SLIKE:

[0433]

[0435] Slika 1: Hepatična diferencijacija humanih pluripotentnih matičnih ćelija u posudama obloženim sa LN111. (A) Protokol za diferenciranje pluripotentnih humanih ćelija u ćelije slične hepatocitima. (B-D) Hepatična diferencijacija je praćena tokom vremena pomoću RT-qPCR analize za ekspresiju iRNK markera za pluripotentnost (panel B, SOX2), markera endoderma (panel C, SOX17, FOXA2) i hepatičnih markera (panel D, HNF4a, AAT, AFP, ALB, CK19, CYP3A4, CYP3A7, UGT1A1). (E) Sekrecija hepatičnih proteina AFP u ćelijskim supernatantima pomoću ELISA metode. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM. LN111: rezultati sa hiPSC diferenciranim na posudama obloženim sa LN111; Matrigel: rezultati sa hiPSC diferenciranim na posudama obloženim matricom Matrigel<TM>.

[0437] Slika 2: Transplantacija HLCS u jetre pacova Gunn soja. Nivoi bilirubina u serumu kod pacova Gunn soja. Bilirubinemija je praćena tokom vremena kod takrolimusom imunosuprimiranih pacova Gunn soja koji primaju IDHB 24 časa posle dvotrećinske delimične hepatektomije. Kontrolni pacovi su podvrgnuti istim hirurškim postupcima ali im nije urađena transplantacija.

[0439] Slika 3: Hepatična diferencijacija humanih pluripotentnih matičnih ćelija u posudama obloženim sa LN521. Hepatična diferencijacija je praćena tokom vremena pomoću RT-qPCR analiza za ekspresiju iRNK markera endoderma (SOX17) i hepatičnih markera (HNF4a, AAT, AFP, ALB i CK19).

[0441] PRIMER 1: UPOTREBA LN-111 KAO MATRICE ZA DIFERENCIJACIJU PLURIPOTENTNIH ĆELIJA U ĆELIJE HEPATOCITNE LINIJE I UPOTREBA TAKO DOBIJENIH ĆELIJA SLIČNIH ĆELIJAMA SLIČNIM HEPATOBLASTIMA U TERAPIJI.

[0442] Materijal i postupci

[0444] Ovo ispitivanje je sprovedeno u skladu sa francuskim i evropskim propisima.

[0446] Održavanje hiPSC: Linija BBHX8 hiPSC [46] je održavana u bunarčićima za kulturu obloženim Matrigelom (BD Biosciences, San Hoze, CA, SAD) u mTeSR1 (Stemcell Technologies, Vankuver, BC, Kanada) na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2 uz dnevne promene medijuma. Ćelije su pasažirane svakih 5-7 dana upotrebom reagensa Gentle Cell Dissociation Reagent (Stemcell Technologies, Vankuver, BC, Kanada).

[0448] [0195] Hepatična diferencijacija in vitro: Hepatična diferencijacija humanih pluripotentnih matičnih ćelija je izvedena praćenjem protokola koji ima tri koraka zasnovanom na prethodnim ispitivanjima [16, 20, 40] sa izvesnim modifikacijama. Prvo, za diferencijaciju definitivnog endoderma, ćelije su sakupljene upotrebom TrypLE (Life Technologies, Karlsbad, CA, SAD), izbrojane upotrebom automatskog brojača ćelija ADAM (Labtech, Palezo, Francuska) i zatim zasejane u ploče (Costar; Corning Life Sciences, Akton, MA) prethodno obložene ili sa 5 µg/mL laminina 111 (Biolamina, Sundbiberg, Švedska) ili 2 mg/mL Matrigela (BD Biosciences, San Hoze, CA, SAD) pri gustini ćelija od 75x10<3>ćelija/cm<2>. Kultivisane su u RPMI 1640 obogaćenom sa B27 suplementom bez seruma (Life technologies, Karlsbad, CA, SAD) (RPMI/B27), 100 ng/mL Aktivina A (Miltenyi Biotec, Pariz, Francuska), 50 ng/mL WnT3A (R&D systems, Mineapolis, MN, SAD) i 10 µM inhibitora rock (Stemcell Technologies, Vankuver, BC, Kanada) tokom 1 dana. Rock inhibitor i Wnt3A su izostavljeni iz medijuma tokom sledeća 2 dana, odnosno 3 dana. Sledeća 4 dana, ćelije su gajene u RPMI 1640/B27 koji sadrži 100 ng/mL Aktivina A, i medijum je ćelijama menjan dnevno. Drugo, za hepatičnu specijalizaciju, ćelije su zatim kultivisane tokom 2 dana u RPMI/B27 obogaćenom sa 10 ng/mL faktora rasta fibroblasta (FGF) 10 (Miltenyi Biotec, Pariz, Francuska) i 10 ng/mL koštanog morfogenetskog proteina (BMP) 4 (R& D systems, Mineapolis, MN, SAD) sa dnevnom promenom medijuma. Ćelije su zatim podeljene upotrebom TrypLE u 3 ploče prethodno obložene sa 5 µg/mL laminina 111 ili 2 mg/mL Matrigela pri gustini ćelija od 70x10<3>ćelija/cm<2>. One su kultivisane u RPMI/B27 obogaćenom sa 10 ng/mL FGF10, 10 ng/mL BMP-4 i 10 µM rock inhibitora tokom 1 dana, i rock inhibitor je izostavljen iz medijuma sledećeg dana. Najzad, za sazrevanje hepatičnih ćelija, ćelije su kultivisane u medijumu za kulturu za hepatocite (Lonza, Bazel, Švajcarska) obogaćenom sa 20 ng/mL faktora rasta hepatocita (HGF) (Miltenyi Biotec, Paris, Francuska) i 20 ng/mL onkostatina M (OSM) (Miltenyi Biotec, Pariz, Francuska) (medijum za sazrevanje) tokom 4 dana. Sledećih dana, HGF je izostavljen iz medijuma za kulturu i medijum je menjan svaka 2 dana.

[0450] Test imunofluorescencije: Kultivisane ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehida 20 minuta na sobnoj temperaturi, permeabilizovane sa 0.5% Triton X-100 u PBS tokom 15 minuta i blokirane sa 3% BSA u PBS tokom 15 minuta. Ćelije su inkubirane sa primarnim antitelima jedan čas na sobnoj temperaturi. Primarna antitela protiv humanih AAT (1:100), CK19 (1:50) i AFP (1:300) su nabavljena od kompanije DAKO (DakoCytomation, Trap, Francuska); antitela protiv humanih Oct4 (1:100), HNF4α (1:100) su nabavljena od kompanije TebuBio (Pere-an-Ivlin, Francuska). Posle nekoliko pranja sa PBS 0.1% Triton, inkubirane su sa anti-mišjim, anti-kozjim (oba Life Technologies) ili anti-zečjim (Abcam) IgG sekundarnim antitelima, konjugovanim sa ALEXA 488, 555 ili 647, razblaženim 1/1000 u PBS 1% BSA 0.1% Triton, tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim kontrastno obojene sa DAPI, razblaženim 1/10 000 u PBS, tokom 1 minuta na sobnoj temperaturi, i očitane na invertnom fluorescentnom mikroskopu (EvosFL od AMG). Za procenu proporcije diferenciranih ćelija, snimljene su nasumične slike iz 10 nezavisnih diferencijacija, zatim su izbrojane ćelije koje su pozitivne na markere diferencijacije zajedno sa svim ćelijama.

[0452] Protočna citometrija: Za protočnu citometriju, diferencirane ćelije su inkubirane 2 minuta sa Akutazom na 37°C. Razdvojene ćelije su fiksirane 0.25% paraformaldehidom 30 minuta na 4°C, zatim su permeabilizovane sa 0.2% Tween-20 u PBS tokom 15 minuta na 37°C. Ćelije su blokirane sa 3% BSA/PBS tokom 30min/4°C u prisustvu ili odsustvu primarnih antitela razblaženih u 0.5% BSA u PBS. Posle pranja (sa PBS) ćelije su inkubirane sa 3% BSA/PBS nakon čega su inkubirane 20 minuta na 4°C sa magarećim anti-mišjim antitelom konjugovanim sa Alexa Fluor 488. Analiza protočne citometrije urađena je upotrebom uređaja za protočnu citometriju BD LSR II (BD Biosciences).

[0454] [0198] Ispitivanja na životinjama: Životinje su bile smeštene u objektima za životinje univerzitetske medicinske škole u Nantu (Nant, Francuska) i držane pod 12-časovnim ciklusom svetla, hranjene po volji, uz humanu negu prema smernicama Ministarstva poljoprivrede Francuske. Za ispitivanje su korišćeni homozigotni (j/j) pacovi Gunn soja težine 120±30 g (starosti: 8-9 nedelja).

[0456] Ispitivanja funkcije jetre: Krv je izvlačena iz retro-orbitalnog sinusa. Ukupni bilirubin i alanin i aspartat aminotransferaze u serumu su merene na rutinskom odeljenju za biohemiju u Univerzitetskoj bolnici u Nantu.

[0458] Histologija i imunohistohemija: Histologija i imunohistohemija su izvedene pomoću platforme MicroPiCell (Nant). Isečci jetre u parafinu (5 µm) inkubirani su sa humanim Hep Par-1 antitelima (Clone OCH1E5, Dako). Isečci jetre su kontrastno obojeni hematoksilinom.

[0460] RT-qPCR: Ukupna iRNK je izolovana iz kultivisanih ćelija upotrebom kompleta RNeasy minikit (QIAGEN) prema specifikaciji proizvođača ili TRIzol® (Lifetechnology, Karlsbad, CA), prema uputstvima proizvođača. Izolovana iRNK je kvantitativno određena upotrebom uređaja Nanodrop, i ukupna količina od 10 ng je korišćena za reakciju. Analize transkripata su sprovedene sistemom za detekciju sekvenci ViiA7 (Life Technology, Karlsbad, CA, SAD) upotrebom kompleta Power EXPRESS One-Step SYBR®GreenER<TM>, (Life Technology, Karlsbad, CA, SAD).

[0462] PCR metod i analiza podataka o relativnoj genskoj ekspresiji upotrebom postupka za kvantitativno određivanje 2-ΔΔ<Ct>, posle normalizacije prema vrednostima GAPDH, izvedena je kao što je prethodno opisano. Nivo ekspresije iRNK se definiše kao umnožak promene u nivoima iRNK u datom uzorku u odnosu na nivoe u nediferenciranim ćelijama. Nivo ekspresije iRNK se izračunava prema sledećem: Nivo ekspresije iRNK = 2-ΔΔ<Ct>gde je ΔΔCt = (Ct<Ciljno>- Ct<GAPDH>)<uzorka>- (Ct<Ciljno>- Ct<GAPDH>). Specifične amplifikacije su proverene pomoću krivih topljenja amplikona.

[0464] ELISA: Sekrecija humanog alfa-fetoproteina (AFP) (Calbiotech) i albumina (Bethyl Laboratories) u supernatant kulture procenjena je pomoću ELISA testa prema uputstvima proizvođača.

[0466] [0204] Transplantacija hepatocita: Ćelije (1 x 10<7>ćelija) su odvojene od ploča upotrebom TrypLE, oprane, resuspendovane u 200 µl fiziološkog seruma, i injektovane pomoću leptiraste igle promera 26 u donji pol slezine pacova Gunn soja koji su 24 časa ranije bili podvrgnuti dvotrećinskoj delimičnoj hepatektomiji da bi se stvorila sredina koja je optimalna za transplantaciju ćelija [48]. Pacovi su imunosuprimirani dnevno primenom takrolimusa u dozi od 0.2 mg/kg jedan dan pre transplantacije ćelija tokom 3 dana i u dozi od 0.1 mg/kg posle toga.

[0468] Statistička analiza: Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± SEM. Statističke analize su urađene upotrebom kompjuterskog programa GraphPad® 5.04 za Windows (GraphPad Software, San Dijego, CA). Statistička značajnost je procenjena pomoću Man-Vitni testa za poređenje između grupa. P-vrednost <0.05 je smatrana statistički značajnom.

[0470] Rezultati

[0472] [0206] Modifikovali smo i kombinovali prethodno prikazane protokole [16, 20, 36, 40] da bi smo razvili postupak koji je usaglašen sa DPP-om, upotrebom hemijski definisanih uslova bez ksenogenih komponenti, bez hraniteljskih ćelija, i rekombinantnih faktora za proizvodnju HLC ćelija od hiPSC. Laminin-111 (LN111) se eksprimira u fetalnoj jetri [41] i izoforma laminina je uglavnom prisutna u matrici Matrigel<TM>. Pretpostavili smo da će LN111 stvoriti efikasnu ekstracelularnu matricu za pokretanje i podržavanje hepatične diferencijacije u hiPSC. Naš protokol diferencijacije u 3 koraka za proizvodnju HLC ćelija in vitro prikazan je na slici 1A. Koristili smo humanu iPSC ćelijsku liniju BBHX8, kao reprezentativnu ćelijsku liniju za koju je poznato da se diferencira u HLC ćelije [40, 42]. Kada su hiPSC ćelije postigle konfluentnost od 70-90%, ćelije su sakupljene i zasejane u posude obložene rekombinantnim LN111. Da bi se dobio ponovljiviji proces hepatične diferencijacije, ćelije su enzimski sakupljene i suspenzije pojedinačnih ćelija su brojane i zasejane u nove posude obložene sa LN111, umesto upotrebe standardnih postupaka zasnovanih na empirijskoj vizualizaciji gustine ćelija za procenu vremena i odnosa podele ćelija za pokretanje proizvodnje HLC ćelija. Na dan 0, hiPSC su bile pozitivne na pluripotentne markere (Nanog, Sox 2) (slika 1B) i negativne na markere definitivnog endoderma (Sox 17, FoxA2) (slika 1C) i hepatične markere (HNF4a, ALB, AFP, Citohrom P450) (slika 1D). Ćelije su obrađene sa Aktivinom A i baznim faktorom rasta fibroblasta za stvaranje definitivnog endoderma. Kratko izlaganje Wnt3a i rock inhibitoru korišćeno je za poboljšanje ekspresije definitivnog endoderma, odnosno preživljavanja ćelija posle enzimskog sakupljanja ćelija [16, 36]. Na dan 5, više od 80-90% ćelija je snažno eksprimiralo markere definitivnog endoderma SOX17 i FOXA2 i izgubilo ekspresiju pluripotentnih gena (slika 1B). Rezultujuće ćelije definitivnog endoderma su zatim kultivisane u prisustvu FGF10 i BMP4, 2 kritična faktora uključena u puteve inicijalne signalizacije ranog razvoja embrionalne jetre, kao što je prethodno opisano [43]. Posle 3 dana od obrade ćelija (8. dan diferencijacije), ćelije su enzimski pasažirane na nove sudove obložene sa LN111 da bi se umnožile i ostale u stadijumu hepatične specijalizacije tokom 3 dana.

[0474] Na dan 11, skoro sve ćelije su pozitivne na markere koji se eksprimiraju u hepatičnim progenitorima tokom ranih stadijuma razvoja jetre (HNF4a, CK19 i CYP3A7) (slika 1D). Ćelije su bile negativne na alfa-fetoprotein (AFP), marker hepatoblasta, albumin (ALB), AAT (alfa-1 antitripsin) i citohrom P450 3A4 (CYP3A4), koji predstavljaju markere zrelog hepatocita. Nisu eksprimirale SOX17 i imale su snižen nivo FOXA2. Sve zajedno, rezultati su pokazali da one imaju fenotip ranih hepatoblasta [44, 45]. Za usmeravanje diferencijacije u ćelije slične hepatoblastima (ekspresija AFP), ćelije su kultivisane u prisustvu OSM i HGF tokom 4 dana. Posle 20. dana, hepatoblasti dobijeni iz hiPSC su eksprimirali HNF4a, CK19, AFP i CYP3A7 (enzim CYP450 koji se eksprimira u fetalnim hepatocitima) i stekle ekspresiju nekih markera zrelih hepatocita (ALB, AAT, UGT1A1, CYP3A4), a izgubile su ekspresiju FOXA2, kao što je procenjeno pomoću RT-qPCR analiza (slika 1D). U skladu sa ovim rezultatima, sekrecija AFP u ćelijskom supernatantu potvrđena je ELISA testom. Međutim, nismo detektovali sekreciju albumina, verovatno zbog niskih nivoa ekspresije iRNK za albumin (slika 1E). Slični rezultati su dobijeni kada su hiPSC ćelije diferencirane na posudama obloženim Matrigelom.

[0476] [0208] Zajedno uzevši, rezultati su pokazali da je LN111 jednako efikasan kao Matrigel u pokretanju i podržavanju hepatične diferencijacije hiPSC u našim uslovima kultivisanja, ali sa rekombinantnom matricom. Naša studija je proširila nedavnu studiju koja pokazuje da posude obložene sa LN111 omogućavaju održavanje hiPSC u stadijumu ćelija sličnih hepatoblastima posle endodermske i hepatične specijalizacije hiPSC na posudi obloženoj Matrigelom [36]. To je u skladu sa prethodnim studijama koje pokazuju da HLC ćelije slabo sazrevaju in vitro. Na dan 20-30, naše HLC ćelije nisu sekretovale albumin, verovatno zato što nismo sprovodili kultivisanje u prisustvu deksametazona ili DMSO koji povećavaju zrelost HLC ćelija. Veoma zrele HLC ćelije koje liče na humane primarne hepatocite mogu da se proizvedu ako se kultivišu u 3D kulturi ili u uslovima ko-kultivacije sa mikrošablonom [34, 46].

[0478] [0209] Da bi se ispitala terapijska efikasnost, nivoi bilirubina u serumu praćeni su tokom vremena posle transplantacije IDHB (11. dan hepatične diferencijacije na posudama obloženim sa LN111) u imunosuprimiranim pacovima Gunn soja. Kao što je prikazano na slici 2, došlo je do progresivnog snižavanja bazalnih nivoa bilirubina u tretiranoj grupi nakon transplantacije ćelija tokom 60 dana. Nakon toga, snižavanje serumske bilirubinemije opstalo je na nivou od 28 ± 5% tokom trajanja studije i bilo je statistički značajno u odnosu na vrednosti pre transplantacije (P<0.05). Serumski bilirubin u tretiranoj grupi bio je 57 ± 5 µM u vreme žrtvovanja nasuprot vrednostima pre transplantacije od 84 ± 11 µM (p=0.005). Nasuprot tretiranim pacovima, serumski bilirubin u kontrolnoj grupi nije opao i ostao je povišen sa vrednostima do 150 µM. Imunohemijske analize otkrile su prisustvo ćelija koje eksprimiraju antigen specifičan za humane hepatocite Hep Par-1 potvrđujući da transplantirane IDHB ćelije imaju kapacitet da doprinesu parenhimu jetre. Humane ćelije predstavljale su manje od 1% jetre i bile su raspoređene u parenhimu jetre, ali pretežno u periportalnom području i uglavnom kao pojedinačne ćelije. Ovo je u saglasnosti sa niskom efikasnošću prihvatanja normalnih hepatocita kao kalema u jetri životinja kod kojih nema selektivnih prednosti za rast transplantiranih ćelija [37, 47-50]. Histologija jetre, kao i drugih organa (nije prikazano), kod svih životinja je bila normalna. Serumski nivoi aspartat aminotransferaze (AST) i alanin aminotransferaze (ALT) (ustanovljeni markeri za oštećenje hepatocita) kod tretiranih pacova bili su 1.59 ± 0.21 µkat/L odnosno 1.07 ± 0.16 µkat/L 10. dana posle transplantacije, i 2.07 ± 0.85 µkat/L odnosno 0.95 ± 0.19 µkat/L u vreme žrtvovanja. Ove vrednosti nisu bile drugačije od vrednosti pre operacije (AST:2.44 ± 1 µkat/L i ALT:1.46 ± 0.75 µkat/L) ili vrednosti kod kontrolnih pacova 10. dana posle transplantacije (AST:1.59 ± 0.12 µkat/L i ALT:1.03 ± 0.12 µkat/L) i u vreme žrtvovanja (AST:1.61 ± 0.53 µkat/L i ALT:1.13 ± 0.33 µkat/L). Vrednosti gama-glutamiltransferaze su takođe bile normalne (<0.05 µkat/L) u ovim vremenskim tačkama. Ovi rezultati su pokazali da su se životinje dobro oporavile od hirurških postupaka. Za praćenje in vivo funkcionalnosti transplantiranih humanih ćelija, merili smo humani AFP i humani albumin u serumima životinja tokom vremena. Kod jedne životinje mogli smo da detektujemo značajne nivoe serumskog humanog AFP (iznad pozadinskog šuma seruma kontrolnih pacova) 11. dana posle transplantacije ćelija (16 ng/mL), koji su progresivno postajali nedetektabilani nakon toga. Kod druge dve životinje, mogli smo da detektujemo pojavu serumskog humanog albumina posle 5 meseci nakon transplantacije, mada na veoma niskom nivou (6 i 23 pg/mL). Detektabilni nivoi humanog albumina i humanog AFP nisu detektovani u serumima drugih pacova Gunn soja koji su primili kalemove, verovatno zbog veoma niskog broja humanih ćelija u jetri.

[0480] Ukratko, mi smo, prvi put, pokazali efikasnost regeneracije zasnovane na hiPSC za lečenje nasledne hepatične metaboličke bolesti u odsustvo bilo kakve selektivne prednosti za rast transplantiranih ćelija nad rezidentnim hepatocitima glodara, što je situacija koja se javlja kod transplantacije hepatocita kod ljudi [9]. Posle transplantacije ćelija u ikterične adultne pacove Gunn soja, pokazali smo dugotrajno značajno smanjenje hiperbilirubinemije. Terapijska efikasnost bila je ekvivalentna onoj dobijenoj sa ex vivo genskom terapijom kod pacova Gunn soja upotrebom primarnih hepatocita koji su popravljeni pomoću lentivirusa [51]. Vredno je pažnje da je efikasnost bila jednaka kao kod transplantacije hepatocita izolovanih iz neonatalnih humanih jetri i veća nego kod transplantacije hepatocita izolovanih iz adultnih humanih jetri, koji predstavljaju zlatni standard ćelija za terapiju humanim ćelijama za lečenje pacova Gunn soja. U predmetnoj studiji, hiPSC ćelije su diferencirane u ćelije slične hepatoblastima koje ne eksprimiraju UGT1A1 za transplantaciju ćelija. Naši rezultati pružili su nedvosmisleni dokaz da je in situ došlo do sazrevanja kako bi se stekla aktivnost UGT1A1, koja je bila najviša na 8 nedelja nakon transplantacije. Kod nekih životinja smo mogli takođe da detektujemo prolaznu ekspresiju serumskog AFP i pojavu proizvodnje serumskog albumina. Naši rezultati su u skladu sa prethodnim studijama koje pokazuju da hepatociti izolovani iz fetalne jetre repopulišu veoma efikasno jetru domaćina, gde stiču punu zrelost unutar 4-6 nedelja [52, 53]. Nedavno, saopšteno je da su hiPSC ćelije koje su se specijalizovale u diferencirane hepatoblaste (koji eksprimiraju AFP i ALB) sposobne da se dalje diferenciraju u mišjoj jetri, gde gube ekspresiju AFP [14, 23, 54]. Naša studija sada ukazuje na to da su hiPSC ćelije koje su specijalizovane u hepatoblaste sposobne da repopulišu jetru druge vrste i steknu zrelost in situ na dovoljnom nivou da osiguraju metaboličke hepatične funkcije u kontekstu regeneracije normalne jetre.

[0482] [0211] Značajno je da je prihvatanje kalema IDHB ćelija u jetri bilo kontinuirano tokom dugog perioda (6 meseci) bez znakova obrazovanja tumora (karcinoma ili teratoma) i oštećenja jetre što je procenjeno histološkim analizama i analizama parametara krvi. Kao normalni primarni hepatociti transplantirani u adultne jetre [51], IDHB ćelije su repopulisale jetru kao pojedinačne ćelije, sugerišući da su odgovorile na anti-proliferativne stimuluse kada je regeneracija jetre završena i kada se jetra vratila u stanje mirovanja mitoze. Pored toga, ni 2 meseca posle direktne injekcije IDHB ćelija u testis, nije zapažena pojava teratoma, što potvrđuje odsustvo rezidualnih nediferenciranih hiPSC ćelija u preparatu HLC ćelija.

[0484] Najzad, naša studija takođe obezbeđuje ključni korak ka kliničkoj primeni hiPSC za lečenje naslednih oboljenja jetre, budući da smo proizveli HLC ćelije upotrebom protokola bez seruma, bez ksenogenih komponenti, i upotrebom hemijski definisanog protokola za hepatičnu diferencijaciju koji ispunjava kriterijume proizvodnje prema DPP. Odabrali smo da sakupljamo HLC ćelije u stadijumu ranih hepatičnih progenitora (ekspresija HNF4-alfa i izostanak ekspresije AFP) jer hepatični progenitori izolovani iz humanih fetalnih jetri imaju sposobnost da budu prihvaćeni kao kalem i da migriraju u transplantiranoj jetri-primaocu efikasnije nego adultni hepatociti [55-57]. Takođe je pokazano da ćelije endoderma izvedene iz hiPSC imaju veću sposobnost da budu prihvaćene kao kalem nego ćelije slične hepatičnim progenitorima koje eksprimiraju AFP i hepatociti koji sazrevaju (koji eksprimiraju albumin) [31]. Nasuprot tome, mi nismo transplantirali ćelije slične endodermu (5. dan diferencijacije) zbog smanjenja rizika od rezidualnih nediferenciranih hiPSC ili nepotpuno diferenciranih ćelija u finalnim ćelijskim preparatima. Loh et al. su primetili da rani hepatični progenitori izvedeni iz hiPSC nisu uspeli da budu prihvaćeni kao kalem u mišjim neonatalnim jetrama. Ovo neslaganje gore navedenih studija sa našom studijom može da bude povezano ili sa različitim protokolima za hepatičnu diferencijaciju koji vode različitoj sposobnosti prihvatanja kalema proizvedenih HLC ćelija (na primer, Loh et al. su koristili nekoliko malih molekula inhibitora), do različitosti u jetri-primaocu (neonatalne nasuprot adultnim jetrama).

[0486] Sakupljanje 11. dana hepatične diferencijacije (kraj koraka hepatične specijalizacije) takođe je pojednostavilo i skratilo vreme kultivisanja, i olakšaće standardizaciju, reproducibilnost i smanjiti troškove masovne proizvodnje ćelija.

[0488] [0214] U zaključku, postoji klinička potreba za humanim hepatocitima za lečenje naslednih oboljenja jetre, uključujući CN-1. Rani hepatični progenitori izvedeni iz hiPSC, ili iz hESC, kultivisani na pločama obloženim lamininom mogli bi da budu bezbedna klinička alternativa za transplantate jetre i humane hepatocite izolovane iz kadaveričnih jetri. Iako je studija bila usmerena na terapije za CN-1, ona je obezbedila i značajan napredak u lečenju drugih naslednih oboljenja jetre, kao što su bolesti ciklusa uree. Zaista, ove bolesti bi mogle da se leče alogenom transplantacijom hepatocita [9], i stoga su direktno podložne pristupu regenerativne medicine upotrebom normalnih humanih pluripotentnih matičnih ćelija. Kako pristup HLC ćelijama neće biti ograničen, transplantacija hepatocita bi mogla da se ponavlja da bi se održale ili postigle zadovoljavajuće terapijske prednosti.

[0490] Zanimljivo, rekombinantni humani laminin-521 (LN-521) može da zameni LN-111 kao ekstracelularnu matricu i omogući bolju diferencijaciju hiPSC u definitivni endoderm i HLC ćelije, kako je procenjeno pomoću RT-qPCR analiza genske ekspresije HNF4alfa, AFP, Albumina, AAT ekspresije (slika 3).

[0492] REFERENCE:

[0494] U ovoj prijavi, različite reference opisuju stanje tehnike na koje se ovaj pronalazak odnosi. Opisi ovih referenci su time inkorporirani po referenci u predmetni opis.

[0496] [1] K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T. Ichisaka, K. Tomoda, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131 (2007) 861-872.

[0497] [2] J. Yu, M.A. Vodyanik, K. Smuga-Otto, J. Antosiewicz-Bourget, J.L. Frane, S. Tian, J. Nie, G.A. Jonsdottir, V. Ruotti, R. Stewart, Slukvin, II, J.A. Thomson, Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells, Science, 318 (2007) 1917-1920.

[0498] [3] P. Menasche, V. Vanneaux, J.R. Fabreguettes, A. Bel, L. Tosca, S. Garcia, V. Bellamy, Y. Farouz, J. Pouly, O. Damour, M.C. Perier, M. Desnos, A. Hagege, O. Agbulut, P. Bruneval, G. Tachdjian, J.H. Trouvin, J. Larghero, Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience, European heart journal, (2014).

[0499] [4] S. Nedelec, B. Onteniente, M. Peschanski, C. Martinat, Genetically-modified human pluripotent stem cells: new hopes for the understanding and the treatment of neurological diseases?, Curr Gene Ther, 13 (2013) 111-119.

[0500] [5] N. Dianat, C. Steichen, L. Vallier, A. Weber, A. Dubart-Kupperschmitt, Human pluripotent stem cells for modelling human liver diseases and cell therapy, Curr Gene Ther, 13 (2013) 120-132.

[0501] [6] S.D. Schwartz, C.D. Regillo, B.L. Lam, D. Eliott, P.J. Rosenfeld, N.Z. Gregori, J.P. Hubschman, J.L. Davis, G. Heilwell, M. Spirn, J. Maguire, R. Gay, J. Bateman, R.M. Ostrick, D. Morris, M. Vincent, E. Anglade, L.V. Del Priore, R. Lanza, Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: followup of two open-label phase 1/2 studies, Lancet, (2014).

[0502] [7] F.W. Pagliuca, J.R. Millman, M. Gurtler, M. Segel, A. Van Dervort, J.H. Ryu, Q.P. Peterson, D. Greiner, D.A. Melton, Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro, Cell, 159 (2014) 428-439.

[0503] [8] A. Rezania, J.E. Bruin, P. Arora, A. Rubin, I. Batushansky, A. Asadi, S. O’Dwyer, N. Quiskamp, M. Mojibian, T. Albrecht, Y.H. Yang, J.D. Johnson, T.J. Kieffer, Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells, Nat Biotechnol, 32 (2014) 1121-1133.

[0504] [9] A. Dhawan, J. Puppi, R.D. Hughes, R.R. Mitry, Human hepatocyte transplantation: current experience and future challenges, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 7 (2010) 288-298.

[0505] [10] J.H. Waelzlein, J. Puppi, A. Dhawan, Hepatocyte transplantation for correction of inborn errors of metabolism, Current opinion in nephrology and hypertension, 18 (2009) 481-488.

[0506] [11] I.J. Fox, J.R. Chowdhury, S.S. Kaufman, T.C. Goertzen, N.R. Chowdhury, P.I. Warkentin, K. Dorko, B.V. Sauter, S.C. Strom, Treatment of the Crigler-Najjar syndrome type I with hepatocyte transplantation, N Engl J Med, 338 (1998) 1422-1426.

[0507] [12] C. Ribes-Koninckx, E.P. Ibars, M.A. Agrasot, A. Bonora-Centelles, B.P. Miquel, J.J. Vila Carbo, E.D. Aliaga, J.M. Pallardo, M.J. Gomez-Lechon, J.V. Castell, Clinical outcome of hepatocyte transplantation in four pediatric patients with inherited metabolic diseases, Cell Transplant, 21 (2012) 2267-2282.

[0508] [13] K. Takayama, Y. Morisaki, S. Kuno, Y. Nagamoto, K. Harada, N. Furukawa, M. Ohtaka, K. Nishimura, K. Imagawa, F. Sakurai, M. Tachibana, R. Sumazaki, E. Noguchi, M. Nakanishi, K. Hirata, K. Kawabata, H. Mizuguchi, Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes, Proc Natl Acad Sci U S A, 111 (2014) 16772-16777.

[0509] [14] A. Carpentier, A. Tesfaye, V. Chu, I. Nimgaonkar, F. Zhang, S.B. Lee, S.S. Thorgeirsson, S.M. Feinstone, T.J. Liang, Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model, J Clin Invest, 124 (2014) 4953-4964.

[0510] [15] S. Gerbal-Chaloin, N. Funakoshi, A. Caillaud, C. Gondeau, B. Champon, K. Si-Tayeb, Human Induced Pluripotent Stem Cells in Hepatology: Beyond the Proof of Concept, Am J Pathol, 184 (2014) 332-347.

[0511] [16] M. Kajiwara, T. Aoi, K. Okita, R. Takahashi, H. Inoue, N. Takayama, H. Endo, K. Eto, J. Toguchida, S. Uemoto, S. Yamanaka, Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (2012) 12538-12543.

[0512] [17] H. Basma, A. Soto-Gutierrez, G.R. Yannam, L. Liu, R. Ito, T. Yamamoto, E. Ellis, S.D. Carson, S. Sato, Y. Chen, D. Muirhead, N. Navarro-Alvarez, R.J. Wong, J. Roy-Chowdhury, J.L. Platt, D.F. Mercer, J.D. Miller, S.C. Strom, N. Kobayashi, I.J. Fox, Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes, Gastroenterology, 136 (2009) 990-999.

[0513] [18] J. Cai, Y. Zhao, Y. Liu, F. Ye, Z. Song, H. Qin, S. Meng, Y. Chen, R. Zhou, X. Song, Y. Guo, M. Ding, H. Deng, Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells, Hepatology, 45 (2007) 1229-1239.

[0514] [19] D.C. Hay, J. Fletcher, C. Payne, J.D. Terrace, R.C. Gallagher, J. Snoeys, J.R. Black, D. Wojtacha, K. Samuel, Z. Hannoun, A. Pryde, C. Filippi, I.S. Currie, S.J. Forbes, J.A. Ross, P.N. Newsome, J.P. Iredale, Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling, Proc Natl Acad Sci U S A, 105 (2008) 12301-12306.

[0515] [20] K. Si-Tayeb, F.K. Noto, M. Nagaoka, J. Li, M.A. Battle, C. Duris, P.E. North, S. Dalton, S.A. Duncan, Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells, Hepatology, 51 (2010) 297-305.

[0516] [21] G.J. Sullivan, D.C. Hay, I.H. Park, J. Fletcher, Z. Hannoun, C.M. Payne, D. Dalgetty, J.R. Black, J.A. Ross, K. Samuel, G. Wang, G.Q. Daley, J.H. Lee, G.M. Church, S.J. Forbes, J.P. Iredale, I. Wilmut, Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells, Hepatology, 51 (2010) 329-335.

[0517] [22] M. Baxter, S. Withey, S. Harrison, C.P. Segeritz, F. Zhang, R. Atkinson-Dell, C. Rowe, D.T. Gerrard, R. Sison-Young, R. Jenkins, J. Henry, A.A. Berry, L. Mohamet, M. Best, S.W. Fenwick, H. Malik, N.R. Kitteringham, C.E. Goldring, K.P. Hanley, L. Vallier, N.A. Hanley, Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes, J Hepatol, (2014).

[0518] [23] K.M. Loh, L.T. Ang, J. Zhang, V. Kumar, J. Ang, J.Q. Auyeong, K.L. Lee, S.H. Choo, C.Y. Lim, M. Nichane, J. Tan, M.S. Noghabi, L. Azzola, E.S. Ng, J. Durruthy-Durruthy, V. Sebastiano, L. Poellinger, A.G. Elefanty, E.G. Stanley, Q. Chen, S. Prabhakar, I.L. Weissman, B. Lim, Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations, Cell stem cell, 14 (2014) 237-252.

[0519] [24] K. Yusa, S.T. Rashid, H. Strick-Marchand, I. Varela, P.Q. Liu, D.E. Paschon, E. Miranda, A. Ordonez, N.R. Hannan, F.J. Rouhani, S. Darche, G. Alexander, S.J. Marciniak, N. Fusaki, M. Hasegawa, M.C. Holmes, J.P. Di Santo, D.A. Lomas, A. Bradley, L. Vallier, Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells, Nature, 478 (2011) 391-394.

[0520] [25] S.E. Kim, S.Y. An, D.H. Woo, J. Han, J.H. Kim, Y.J. Jang, J.S. Son, H. Yang, Y.P. Cheon, J.H. Kim, Engraftment potential of spheroid-forming hepatic endoderm derived from human embryonic stem cells, Stem cells and development, 22 (2013) 1818-1829.

[0521] [26] S. Asgari, M. Moslem, K. Bagheri-Lankarani, B. Pournasr, M. Miryounesi, H. Baharvand, Differentiation and transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells, Stem cell reviews, 9 (2013) 493-504.

[0522] [27] M. Vosough, E. Omidinia, M. Kadivar, M.A. Shokrgozar, B. Pournasr, N. Aghdami, H. Baharvand, Generation of Functional Hepatocyte-Like Cells from Human Pluripotent Stem Cells in a Scalable Suspension Culture, Stem cells and development, 22 (2013) 2693-2705.

[0523] [28] T. Takebe, K. Sekine, M. Enomura, H. Koike, M. Kimura, T. Ogaeri, R.R. Zhang, Y. Ueno, Y.W. Zheng, N. Koike, S. Aoyama, Y. Adachi, H. Taniguchi, Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant, Nature, 499 (2013) 481-484.

[0524] [29] Y.F. Chen, C.Y. Tseng, H.W. Wang, H.C. Kuo, V.W. Yang, O.K. Lee, Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol, Hepatology, 55 (2012) 1193-1203.

[0525] [30] H.Y. Li, Y. Chien, Y.J. Chen, S.F. Chen, Y.L. Chang, C.H. Chiang, S.Y. Jeng, C.M. Chang, M.L. Wang, L.K. Chen, S.I. Hung, T.I. Huo, S.D. Lee, S.H. Chiou, Reprogramming induced pluripotent stem cells in the absence of c-Myc for differentiation into hepatocyte-like cells, Biomaterials, 32 (2011) 5994-6005.

[0526] [31] H. Liu, Y. Kim, S. Sharkis, L. Marchionni, Y.Y. Jang, In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins, Science translational medicine, 3 (2011) 82ra39.

[0527] [32] S. Agarwal, K.L. Holton, R. Lanza, Efficient differentiation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells, Stem Cells, 26 (2008) 1117-1127.

[0528] [33] A. Soto-Gutierrez, N. Kobayashi, J.D. RivasCarrillo, N. Navarro-Alvarez, D. Zhao, T. Okitsu, H. Noguchi, H. Basma, Y. Tabata, Y. Chen, K. Tanaka, M. Narushima, A. Miki, T. Ueda, H.S. Jun, J.W. Yoon, J. Lebkowski, N. Tanaka, I.J. Fox, Reversal of mouse hepatic failure using an implanted liver-assist device containing ES cell-derived hepatocytes, Nat Biotechnol, 24 (2006) 1412-1419.

[0529] [34] D.R. Berger, B.R. Ware, M.D. Davidson, S.R. Allsup, S.R. Khetani, Enhancing the functional maturity of iPSC-derived human hepatocytes via controlled presentation of cell-cell interactions in vitro, Hepatology, (2014).

[0530] [35] K.G. Chen, B.S. Mallon, R.D. McKay, P.G. Robey, Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics, Cell stem cell, 14 (2014) 13-26.

[0531] [36] K. Takayama, Y. Nagamoto, N. Mimura, K. Tashiro, F. Sakurai, M. Tachibana, T. Hayakawa, K. Kawabata, H. Mizuguchi, Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes, Stem cell reports, 1 (2013) 322-335.

[0532] [37] J. Birraux, O. Menzel, B. Wildhaber, C. Jond, T.H. Nguyen, C. Chardot, A step toward liver gene therapy: efficient correction of the genetic defect of hepatocytes isolated from a patient with Crigler-Najjar syndrome type 1 with lentiviral vectors, Transplantation, 87 (2009) 1006-1012.

[0533] [38] P.A. Lysy, M. Najimi, X. Stephenne, A. Bourgois, F. Smets, E.M. Sokal, Liver cell transplantation for Crigler-Najjar syndrome type I: update and perspectives, World J Gastroenterol, 14 (2008) 3464-3470.

[0534] [39] T.H. Nguyen, N. Ferry, Gene therapy for liver enzyme deficiencies: What have we learned from models for Crigler-Najjar and Tyrosinemia, Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 1 (2007) 155-177.

[0535] [40] N.R. Hannan, C.P. Segeritz, T. Touboul, L. Vallier, Production of hepatocytelike cells from human pluripotent stem cells, Nature protocols, 8 (2013) 430-437.

[0536] [41] P. Ekblom, P. Lonai, J.F. Talts, Expression and biological role of laminin-1, Matrix Biol, 22 (2003) 35-47.

[0537] [42] S. Pauklin, L. Vallier, The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity, Cell, 155 (2013) 135-147.

[0538] [43] T. Touboul, N.R. Hannan, S. Corbineau, A. Martinez, C. Martinet, S. Branchereau, S. Mainot, H. Strick-Marchand, R. Pedersen, J. Di Santo, A. Weber, L. Vallier, Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development, Hepatology, 51 (2010) 1754-1765.

[0539] [44] G. Lanzoni, T. Oikawa, Y. Wang, C.B. Cui, G. Carpino, V. Cardinale, D. Gerber, M. Gabriel, J. Dominguez-Bendala, M.E. Furth, E. Gaudio, D. Alvaro, L. Inverardi, L.M. Reid, Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas, Stem Cells, 31 (2013) 2047-2060.

[0540] [45] S.N. de Wildt, G.L. Kearns, J.S. Leeder, J.N. van den Anker, Cytochrome P450 3A: ontogeny and drug disposition, Clinical pharmacokinetics, 37 (1999) 485-505.

[0541] [46] R.L. Gieseck Iii, N.R. Hannan, R. Bort, N.A. Hanley, R.A. Drake, G.W. Cameron, T.A. Wynn, L. Vallier, Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture, PloS one, 9 (2014) e86372.

[0542] [47] T.H. Nguyen, J. Birraux, B. Wildhaber, A. Myara, F. Trivin, C. Le Coultre, D. Trono, C. Chardot, Ex vivo lentivirus transduction and immediate transplantation of uncultured hepatocytes for treating hyperbilirubinemic Gunn rat, Transplantation, 82 (2006) 794-803.

[0543] [48] T.H. Nguyen, J. Oberholzer, J. Birraux, P. Majno, P. Morel, D. Trono, Highly efficient lentiviral vector-mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary hepatocytes, Mol Ther, 6 (2002) 199-209.

[0544] [49] S. Gupta, P. Rajvanshi, R. Sokhi, S. Slehria, A. Yam, A. Kerr, P.M. Novikoff, Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium, Hepatology, 29 (1999) 509-519.

[0545] [50] C. Guha, A. Sharma, S. Gupta, A. Alfieri, G.R. Gorla, S. Gagandeep, R. Sokhi, N. Roy-Chowdhury, K.E. Tanaka, B. Vikram, J. Roy-Chowdhury, Amelioration of radiation-induced liver damage in partially hepatectomized rats by hepatocyte transplantation, Cancer Res, 59 (1999) 5871-5874.

[0546] [51] T.H. Nguyen, M. Bellodi-Privato, D. Aubert, V. Pichard, A. Myara, D. Trono, N. Ferry, Therapeutic lentivirus-mediated neonatal in vivo gene therapy in hyperbilirubinemic Gunn rats, Mol Ther, 12 (2005) 852-859.

[0547] [52] T. Cantz, D.M. Zuckerman, M.R. Burda, M. Dandri, B. Goricke, S. Thalhammer, W.M. Heckl, M.P. Manns, J. Petersen, M. Ott, Quantitative gene expression analysis reveals transition of fetal liver progenitor cells to mature hepatocytes after transplantation in uPA/RAG-2 mice, Am J Pathol, 162 (2003) 37-45.

[0548] [53] J.S. Sandhu, P.M. Petkov, M.D. Dabeva, D.A. Shafritz, Stem cell properties and repopulation of the rat liver by fetal liver epithelial progenitor cells, Am J Pathol, 159 (2001) 1323-1334.

[0549] [54] S. Zhu, M. Rezvani, J. Harbell, A.N. Mattis, A.R. Wolfe, L.Z. Benet, H. Willenbring, S. Ding, Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts, Nature, 508 (2014) 93-97.

[0550] [55] J.E. Allain, I. Dagher, D. Mahieu-Caputo, N. Loux, M. Andreoletti, K. Westerman, P. Briand, D. Franco, P. Leboulch, A. Weber, Immortalization of a primate bipotent epithelial liver stem cell, Proc Natl Acad Sci U S A, 99 (2002) 3639-3644.

[0551] [56] J.P. Delgado, V. Vanneaux, J. Branger, T. Touboul, L. Sentilhes, S. Mainot, P. Lainas, P. Leclerc, G. Uzan, D. Mahieu-Caputo, A. Weber, The role of HGF on invasive properties and repopulation potential of human fetal hepatic progenitor cells, Exp Cell Res, 315 (2009) 3396-3405.

[0552] [57] D. Mahieu-Caputo, J.E. Allain, J. Branger, A. Coulomb, J.P. Delgado, M. Andreoletti, S. Mainot, R. Frydman, P. Leboulch, J.P. Di Santo, F. Capron, A. Weber, Repopulation of athymic mouse liver by cryopreserved early human fetal hepatoblasts, Hum Gene Ther, 15 (2004) 1219-1228.

[0553] [58] M. Black, B.H. Billing, K.P. Heirwegh, Determination of bilirubin UDP-glucuronyl transferase activity in needle-biopsy specimens of human liver, Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 29 (1970) 27-35.

[0554] [59] M. Muraca, N. Blanckaert, Liquid-chromatographic assay and identification of mono- and diester conjugates of bilirubin in normal serum, Clin Chem, 29 (1983) 1767-1771.

Claims (11)

1. Patentni zahtevi

1. Upotreba in vitro humanog laminina (LN) kao matrice za hepatičnu diferencijaciju.

2. Upotreba in vitro humanog LN za indukciju i/ili poboljšanje diferencijacije populacije pluripotentnih ćelija, populacije multipotentnih ćelija ili populacije ćelija definitivnog endoderma (DE) u populaciju ćelija hepatocitne linije.

3. Upotreba prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što je LN odabran iz grupe koja se sastoji od laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) i laminina-521 (LN-521).

4. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što je LN humani rekombinantni LN-111 ili humani rekombinantni LN-521.

5. In vitro postupak za indukciju humane hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

(i) kultivisanja populacije humanih ćelija DE na podlozi obloženoj humanim lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima, i

(ii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima na podlozi obloženoj humanim lamininom u medijumu za sazrevanje hepatičnih ćelija da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih fetalnim hepatocitima.

6. In vitro postupak za indukciju humane hepatične diferencijacije koji obuhvata korake:

(i) kultivisanja populacije humanih pluripotentnih ćelija na podlozi obloženoj humanim lamininom u medijumu za indukciju endoderma da bi se proizvela populacija humanih ćelija DE,

(ii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija DE na podlozi obloženoj humanim lamininom u medijumu za hepatičnu indukciju da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih hepatoblastima, i

(iii) kultivisanja navedene populacije humanih ćelija sličnih hepatoblastima na podlozi obloženoj humanim lamininom u medijumu za sazrevanje hepatičnih ćelija da bi se proizvela populacija humanih ćelija sličnih fetalnim hepatocitima.

7. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 5 ili 6, naznačen time što je medijum za hepatičnu indukciju hemijski definisani medijum koji sadrži koštani morfogenetski protein 4 (BMP4) i faktor rasta fibroblasta odabran od FGF10 i FGF2.

8. In vitro postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, naznačen time što je medijum za sazrevanje hepatičnih ćelija hemijski definisani medijum koji sadrži hepatični faktor rasta (HGF) i onkostatin M (OSM).

9. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što je medijum za indukciju endoderma hemijski definisani medijum koji sadrži najmanje Aktivin A i opciono WNT3A.

10. In vitro postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 9, naznačen time što medijum za hepatičnu indukciju i/ili medijum za indukciju endoderma dodatno sadrži ROCK inhibitor.

11. In vitro postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 10, naznačen time što humane ćelije slične hepatoblastima eksprimiraju hepatocitni nuklearni faktor 4-alfa (HNF4α) i ne eksprimiraju, ili suštinski ne eksprimiraju alfa-fetoprotein (AFP)

4