RS58159B1 - Postupci i kompozicije za ciljanu modifikaciju genoma - Google Patents

Postupci i kompozicije za ciljanu modifikaciju genoma

Info

Publication number
RS58159B1
RS58159B1 RS20181418A RSP20181418A RS58159B1 RS 58159 B1 RS58159 B1 RS 58159B1 RS 20181418 A RS20181418 A RS 20181418A RS P20181418 A RSP20181418 A RS P20181418A RS 58159 B1 RS58159 B1 RS 58159B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
cell
human
locus
interest
Prior art date
Application number
RS20181418A
Other languages
English (en)
Inventor
David Frendewey
Wojtek Auerbach
Ka-Man Venus Lai
David M Valenzuela
George D Yancopoulos
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56885593&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58159(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Priority claimed from PCT/US2014/060788 external-priority patent/WO2015088643A1/en
Publication of RS58159B1 publication Critical patent/RS58159B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
    • C12N2999/007—Technological advancements, e.g. new system for producing known virus, cre-lox system for production of transgenic animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
UPUĆIVANJE NA LISTING SEKVENCI PODNET KAO TEKSTUALNI FAJL PREKO EFS WEB
[0001] Zvanična kopija listinga sekvenci je elektronski podneta preko EFS-Web kao ASCII formatirani listing sekvenci sa nazivom fajla 453460SEQLIST.TXT, napravljenog 15. Oktobra 2014, i sa veličinom od 27.5 kilobajta, i podnet je istovremeno sa specifikacijom.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Iako su pacovi smatrani važnim životinjskim model sistemom koji može rekapitulirati patologiju različitih humanih oboljenja, uključujući, ali se ne ograničavajući na, kardiovaskularne (npr., hipertenzija), metaboličke (npr., gojaznost, dijabetes), neurološke (npr., patologije vezane za bol), i različite kancere, korišćenje pacova u modeliranju humanih bolesti bilo je ograničeno u odnosu na miševe, delimično usled toga što nisu bile dostupne pluripotentne ćelije klicine linije pacova koje se mogu prenositi, koje mogu zadržati njihovu pluripotentnost nakon serije genetičkih modifikacija in vitro, npr., jedne ili više elektroporacija, i delimično usled nedostatka efikasnih tehnologija za ciljano dejstvo koje omogućavaju introdukciju ili deleciju velikih genomskih DNK sekvenci, ili zamenu velikih endogenih sekvenci genomske DNK sa egzogenim sekvencama nukleinske kiseline u pluripotentnim ćelijama pacova.
[0003] U tehnici postoji potreba za kompozicijama i postupcima koji omogućavaju precizne ciljane promene u genomu organizma, koji mogu otvoriti ili proširiti trenutne oblasti otkrivanja ciljnih struktura i validirati terapeutska sredstva brže i lakše.
[0004] Mali et al (Science vol. 339, No.6121, pages 823-826) i Cong et al (Science vol 339, No.
6121, pages 819-823) otkrivaju postupak za modifikaciju genoma na genomskom lokusu od interesa u ćeliji miša ili humanoj ćeliji, koja sadrži upotrebu CRISPR RNK, Cas proteina, tracRNK i vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu flankiranu sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom. WO2006044962 i WO2007117410 otkrivaju insercije velikih genomskih fragmenata u genom miša ili čoveka.
REZIME
[0005] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0006] Pronalazak se odnosi na in vitro postupak za modifikaciju genoma na genomskom lokusu od interesa u mišjoj embrionalnoj matičnoj (ES) ćeliji, koji sadrži:
dovođenje u kontakt mišje ES ćelije sa Cas9 proteinom, CRISPR RNK koja hbridizuje sa ciljnom sekvencom na genomskom lokusu od interesa, tracrRNK, i veliki vektor sa ciljanim dejstvom (LTVEC) koji je najmanje 10 kb veličine i sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa:
(i) 5’ homologom rukom koja je homologa 5’ ciljnoj sekvenci na genomskom lokusu od interesa i
(ii) 3’ homologom rukom koja je homologa 3’ ciljnoj sekvenci na genomskom lokusu od interesa,
naznačeno time da nakon dovođenja u kontakt mišje ES ćelije sa Cas9 proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu LTVEC, genom mišje ES ćelije je modifikovan da sadrži ciljnu genetičku modifikaciju koja sadrži deleciju regiona genomskog lokusa od interesa naznačeno time da je delecija najmanje 30 kb i/ili insercija inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa naznačeno time da je insercija najmanje 30 kb.
[0007] U jednom primeru izvođenja, ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija.
[0008] U jednom primeru izvođenja, LTVEC je najmanje 15 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. U sledećem primeru izvođenja, LTVEC je najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb.
[0009] Ovo otkiće opisuje da eukariotska ćelija je ćelija sisara. Ovo okriće opisuje da je ćelija sisara fibroblast.
[0010] Ovo otkriće opisuje da je eukariotska ćelija pluripotentna ćelija. Ovo otkriće opisuje da je pluripotentna ćelija humana pluripotentna ćelija. Ovo otkriće opisuje da humana pluripotentna ćelija je humana embrionalna matična (ES) ćelija ili humana adultna matična ćelija. Ovo otkriće opisuje da humana pluripotentna ćelija je razvojno ograničena humana progenitorska ćelija. Ovo otkriće opisuje da, humana pluripotentna ćelija je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija.
[0011] U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas9.
[0012] U jednom primeru izvođenja, ciljna sekvenca je flankirana sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). U jednom primeru izivođenja, ciljna sekvenca je neposredno flankirana na 3’ kraju sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM).
[0013] U nekim primerima izvođenja, ukupna suma 5’ i 3’ homologih ruku je od oko 10 kb do oko 150 kb. U nekim primerima izvođenja, ukupna suma 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do 150 kb.
[0014] Otkriće dalje obezbeđuje da ciljana genetička modifikacija sadrži: (a) zamenu sekvence endogene nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukleinske kiseline; (b) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline; (c) deleciju sekvence endogene nukelinske kiseline, naznačeno time da je delecija u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (d) inserciju sekvence egzogene nukelinske kiseline; (e) inserciju sekvence egzogne nukleinske kiseline u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (f) inserciju sekvence nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline; (g) inserciju himerne sekvence nukleinske kiseline koja sadrži humanu i ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline; (h) inserciju uslovnog alela flankiranog sa ciljnim sekvencama za mesto specifičnu rekombinazu; (i) inserciju selektabilnog marker ili reporter gena operativno povezanog sa trećim promotorom aktivnim u pluripotentnoj ćeliji; ili (j) njihovu kombinaciju.
[0015] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus od interesa sadrži (i) 5’ ciljnu sekvencu koja je homologa 5’ homologoj ruci; i (ii) 3’ ciljnu sekvencu koja je homologa 3’ homologoj ruci.
[0016] U nekim primerima izvođenja, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca je razdvojena sa najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. U nekim primerima izvođenja, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca je razdvojena sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1 Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 2.5 Mb, ili najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb.
[0017] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus od interesa sadrži Interleukin-2 receptor gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, ili oba Rag1 i Rag2 lokuse.
[0018] U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline.
[0019] Dodatno je obezbeđen postupak za modifikaciju genoma, koji sadrži izlaganje genoma Cas proteinu i CRISPR RNK u prisustvu velikog vektora sa ciljanim dejstvom (LTVEC) koji sadrži sekvencu nukelinske kiseline od najmanje 10 kb, naznačeno time da nakon izlaganja Cas proteinu, CRISPR RNK, i LTVEC, genom je modifikovan da sadrži najmanje 10 kb sekvencu nukleinske kiseline.
[0020] U nekim takvim postupcima, LTVEC sadrži sekvencu nukelinske kiseline od najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. U nekim takvim postupcima, LTVEC sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb.
[0021] Dodatno je obezbeđen postupak za modifikaciju genoma, koja sadrži dovođenje u kontakt sa Cas proteinom, CRISPR RNK koja hidrolizuje ciljnu sekvencu, i tracrRNK u prisustvu velikog vektora sa ciljanim dejstvom (LTVEC), naznačeno time da je LTVEC najmanje 10 kb i sadrži prvi molekul nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da nakon kontakta sa Cas proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu LTVEC, genom je modifikovan na genomskom lokusu od interesa da sadrži prvu nukleinsku kiselinu. Ciljna sekvenca može biti na ili blizu genomskog lokusa od interesa.
[0022] U nekim takvim postupcima, genom je u eukariotskoj ćeliji, i Cas protein, CRISPR RNK, tracrRNK, i LTVEC su introdukovani u eukariotsku ćeliju. Neki takvi postupci dodatno sadrže identifikaciju modifikovane eukariotske ćelije koja sadrži ciljnu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa.
[0023] U nekim takvim postupcima, CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovani zajedno u obliku jedne vodeće RNK (gRNK). U drugim postupcima, CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane zasebno.
[0024] U nekim takvim postupcima (a) Cas protein je introdukovan u eukariotsku ćeliju u obliku proteina, informacione RNK (iRNK) koja kodira Cas protein, ili DNK koja kodira Cas protein; (b) CRISPR RNK je introdukovana u eukariotsku ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira CRISPR RNK; i (c) tracrRNK je introdukovana u eukariotsku ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira tracrRNK.
[0025] U nekim postupcima (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno povezan sa drugom nukelinskom kiselinom koja kodira Cas protein; (b) DNK koja kodira CRISPR RNK je u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira CRISPR RNK; i (c) DNK koja kodira tracrRNK je u obliku trećeg ekspresionog konstrukta koji sadrži treći promotor operativno vezan sa četvrtom nukleinskom kiselinom koja kodira tracrRNK, naznačeno time da prvi, drugi, i treći promotor su aktivni u eukariotskoj ćeliji. Izborno, prvi, drugi, i/ili treći ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline.
[0026] U nekim postupcima (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan za drugu nukleinsku kiselinu koja kodira Cas protein; i (b) DNK koja kodira CRISPR RNK i DNK koja kodira tracrRNK su u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan za treću nukleinsku kiselinu koja kodira gRNK koja sadrži CRISPR RNK i tracrRNK; naznačeno time da su prvi i drugi promotor aktivni u eukariotskoj ćeliji. Izborno, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline.
[0027] U nekim postupcima, Cas protein, CRISPR RNK, i tracrRNK su introdukovani u eukariotsku ćeliju kao protein-RNK kompleks.
[0028] U nekim postupcima, ciljana genetička modifikacija sadrži istovremenu deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju prve nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa. U nekim postupcima, deletirana sekvenca endogene nukleinske kiseline je oko 30 kb do oko 110 kb, i inserirana prva nukleinska kiselina je oko 40 kb do oko 140 kb. U nekim postupcima, deletirana sekvenca endogene nukleinske kiseline je oko 38 kb do oko 110 kb, i inserirana prva nukleinska kiselina je oko 43 kb do oko 134 kb.
[0029] U nekim postupcima, ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija. Izborno, bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma.
[0030] U nekim postupcima, modifikovana eukariotska ćelija je složeni heterozigot na genomskom lokusu od interesa. U nekim postupcima, modifikovana eukariotska ćelija je hemizigotna na genomskom lokusu od interesa. Izborno, ciljana genetička modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i inserciju prve nukelinske kiseline. Izborno, ciljana genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; i (2) inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom hromozomu i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom hromozomu. Prvi hromozom može biti jedan od dva homologa hromozoma, i drugi hromozom može biti drugi homolog hromozom.
[0031] U nekim postupcima, LTVEC je najmanje 15 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. Izborno, LTVEC je najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb.
[0032] U nekim postupcima, prva nuklinska kiselina je najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, ili najmanje 300 kb. U nekim postupcima, prva nuklinska kiselina je oko 40 kb do oko 140 kb. U nekim postupcima, prva nuklinska kiselina je oko 43 kb do oko 134 kb.
[0033] U nekim postupcima prema otkriću, eukariotska ćelija je sisarska ćelija, fibroblast, pluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, pluripotentna ćelija glodara, embrionalna matična (ES) ćelija miša ili pacova, humana pluripotentna ćelija, humana embrionalna matična (ES) ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitorska ćelija, ili humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija.
[0034] U nekim postupcima, Cas protein je Cas9. U nekim postupcima, ciljna sekvenca je neposredno flankirana sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM).
[0035] U nekim postupcima, ukupna suma 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC je od oko 10 kb do oko 150 kb. Izborno, ukupna suma 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb.
[0036] U nekim postupcima prema otkriću, ciljana genetička modifikacija sadrži: (a) zamenu sekvence endogene nukelinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukelinske kiseline; (b) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline; (c) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline, naznačeno time da je delecija u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (d) inserciju sekvence egzogene nukleinske kiseline; (e) inserciju sekvence nukleinske kiseline u opsegu od oko 5kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (f) inserciju sekvence egzogene nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline; (g) insercija sekvence himerne nukleinske kiseline koja sadrži humanu i ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline; (h) inserciju uslovnog alela flankiranog sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifične za mesto; (i) inserciju selektabilnog marker ili reporter gena operativno vezanog sa trećim promotorom aktivnim u pluripotentnoj ćeliji; ili (j) njihovu kombinaciju.
[0037] U nekim postupcima, genomski lokus od interesa sadrži (i) 5’ ciljnu sekvencu koja je homologa 5’ homologoj ruci; i (ii) 3’ ciljnu sekvencu koja je homologa 3’ homologoj ruci. Izborno, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojene najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. Izborno, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 2.5 Mb, ili najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb. Izborno, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojene sa najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 110 kb, najmanje 120 kb, najmanje 130 kb, najmanje 140 kb, najmanje 150 kb, najmanje 160 kb, najmanje 170 kb, najmanje 180 kb, najmanje 190 kb, ili najmanje 200 kb. U nekim postupcima, 5’ i 3’ ciljne sekvence su razdvojene sa oko 30 kb do oko 110 kb. U nekim postupcima, 5’ i 3’ ciljne sekvence su razdvojene sa oko 38 kb do oko 110 kb.
[0038] U nekim postupcima, genomski lokus od interesa sadrži Interleukin-2 receptor gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, ili oba Rag1 i Rag2 lokuse. U drugim postupcima, genomski lokus od interesa sadrži Adamts5 lokus, Trpa1 lokus, Folh1 lokus, ili Erbb4 lokus. U sledećim postupcima, genomski lokus od interesa sadrži Lrp5 lokus. U sledećim postupcima, genomski lokus od interesa sadrži C5 (Hc) lokus, Ror1 lokus, ili Dpp4 lokus.
[0039] Dodatno je obezbeđen postupak za proizvodnju F0 generacije ne-humane životinje koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa, gde postupak sadrži: (a) dovođenje u kontakt genoma u ne-humanoj ES ćeliji sa Cas proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu velikog vektora sa ciljanim dejstvom (LTVEC) dabi se formirala modifikovana ne-humana ES ćelija, naznačeno time da LTVEC je najmanje 10 kb i sadrži prvu mukleinsku kiselinu flankiranu sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom; (b) identifikaciju modifikovane ne-humane ES ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa; (c) introdukciju modifikovane ne-humane ES ćelije u ne-humani embrion domaćin; i (d) gestaciju ne-humanog embriona domaćina u surogat majci, naznačeno time da surogat majka proizvodi F0 generaciju ne-humane životinje koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa.
[0040] U nekim takvim postupcima, CRISPR RNK i tracrRNK su zajedno introdukovane u obliku jedne vodeće RNK (gRNK). U drugim takvim postupcima, CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane zasebno.
[0041] U nekim takvim postupcima, (a) Cas protein je introdukovan u ne-humanu ES ćeliju u obliku proteina, informacione RNK (iRNK) koja kodira Cas protein, ili DNK koja kodrira Cas protein; (b) CRISPR RNK je introdukovana u ne-humanu ES ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira CRISPR RNK; i (c) tracrRNK je introdukovana u ne-humanu ES ćelija u obliku RNK ili DNK koja kodira tracrRNK.
[0042] U nekim takvim postupcima, (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein; (b) DNK koja kodira CRISPR RNK je u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira CRISPR RNK; i (c) DNK koja kodira tracrRNK je u obliku trećeg ekspresionog konstrukta koji sadrži treći promotor operativno vezan sa četvrtom nukleinskom kiselinom koja kodira tracrRNK, naznačeno time da prvi, drugi, i treći promotor su aktivni u nehumanoj ES ćeliji. Izborno, prvi, drugi, i treći ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline.
[0043] U nekim takvim postupcima, (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein; i (b) DNK koja kodira CRISPR RNK i DNK koja kodira tracrRNK su u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukelinskom kiselinom koja kodira gRNK koja sadrži CRISPR RNK i tracrRNK; naznačeno time da su prvi i drugi promotor aktivni u ne-humanoj ES ćeliji. Izborno, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline.
[0044] U nekim takvim postupcima, Cas protein, CRISPR RNK, i tracrRNK su introdukovani u ne-humanu ES ćeliju kao protein-RNK kompleks.
[0045] U nekim takvim postupcima, ciljana genetička modifikacija sadrži istovremenu deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa.
[0046] U nekim takvim postupcima, ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija. Izborno, bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u dva homologa hromozoma.
[0047] U nekim takvim postupcima, modifikovana ne-humana ES ćelija je složena heterozigotna na genomskom lokusu od interesa. U nekim takvim postupcima, modifikovana ne-humana ES ćelija je hemizigotna na genomskom lokusu od interesa. Izborno, ciljana genetička modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju sekvence endogene nukelinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline. Izborno, ciljana genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; i (2) inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom hromozomu i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom hromozomu. Prvi hromozom može biti jedan od dva homologa hromooma, i drugi hromozom može biti drugi homologi hromozom.
[0048] U nekim takvim postupcima, Cas protein je Cas9.
[0049] Dodatno su u ovom otkriću obezbeđeni postupci za modifikaciju genoma na genomskom lokusu od interesa u eukariotskoj ćeliji, ćeliji miša, ili humanoj ćeliji, koji sadrže dovođenje u kontakt genoma sa Cas proteinom, CRISPR RNK koji hibridizuje sa ciljnom sekvencom na genomskom lokusu od interesa, i tracrRNK u prisustvu velikog vektora sa ciljanim dejstvom (LTVEC), naznačeno time da LTVEC je najmanje 10 kb i sadrži prvu nukleinsku kiselinu flankiranu sa 5’ homologom rukom koja je homologa sa 5’ ciljnom sekvencom na genomskom lokusu od interesa i 3’ homologom rukom koja je homologa 3’ ciljnoj sekvenci na genomskom lokusu od interesa, naznačeno time da je prva nukleinska kiselina najmanje 30 kb i/ili 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojene sa najmanje 30 kb, naznačeno time da je nakon dovođenja u kontakt sa Cas proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu LTVEC, genom modifikovan tako da sadrži ciljnu genetičku modifikaciju koja sadrži inserciju prve nukelinske kiseline na genomskom lokusu od interesa.
[0050] Bilo koji od prethodnih postupaka prema otkriću može dodatno sadržati introdukovanje Cas proteina, CRISPR RNK, tracrRNK, i LTVEC u eukariotsku ćeliju, mišju ćeliju, ili humanu ćeliju. Bilo koji od prethodnih postupaka može dodatno sadržati identifikaciju modifikovane eukariotske ćelije, modifikovane mišje ćelije, ili modifikovane humane ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa.
[0051] U nekim od prethodnih postupaka, CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovani zajedno u obliku jednog transkripta. U nekim od prethodnih postupaka, CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovani zasebno.
[0052] U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, (a) Cas protein je introdukovan u eukariotsku ćeliju, ćeliju miša, ili humanu ćeliju u obliku proteina, informacione RNK (iRNK) koja kodira Cas protein, ili DNK koja kodira Cas protein; (b) CRISPR RNK je introdukovana u eukariotsku ćeliju, ćeliju miša, ili humanu ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira CRISPR RNK; i (c) tracrRNK je introdukovan u eukariotsku ćeliju, ćeliju miša, ili humanu ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira tracrRNK. U nekim od prethodnih postupaka, Cas protein, CRISPR RNK, i tracrRNK su introdukovani u eukariotsku ćeliju, ćeliju miša, ili humanu ćeliju kao protein-RNK kompleks.
[0053] U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein; (b) DNK kodira CRISPR RNK je u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira CRISPR RNK; i (c) DNK koja kodira tracrRNK je u obliku trećeg ekspresionog konstrukta koji sadrži treći promotor operativno vezan za četvrtu nukleinsku kiselinu koja kodira tracrRNK; naznačeno time da prvi, drugi, i treći promotori su aktivni u eukariotskoj ćeliji, ćeliji miša, ili humanoj ćeliji. U nekim od prethodnih postupaka, prvi, drugi, i/ili treći ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukelinske kiseline.
[0054] U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein; i (b) DNK koja kodira CRISPR RNK i DNK koja kodira tracrRNK su u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira gRNK sadrži CRISPR RNK i tracrRNK u jednom transkriptu; naznačeno time da prvi i drugi promotori su aktivni u eukariotskoj ćeliji, ćeliji miša, ili humanoj ćeliji. U nekim od prethodnih postupaka, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline.
[0055] U nekim od prethodnih postupaka, LTVEC je najmanje 15 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. U nekim od prethodnih postupaka, LTVEC je najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb.
[0056] U nekim od prethodnih postupaka, prva nukleinska kiselina je najmanje najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, ili najmanje 300 kb. U nekim od prethodnih postupaka, prva nukleinska kiselina je oko 40 kb do oko 140 kb.
[0057] U nekim od prethodnih postupaka, ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 10 kb do oko 150 kb. U nekim od prethodnih postupaka, ukupna suma 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb.
[0058] U nekim od prethodnih postupaka, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. U nekim od prethodnih postupaka, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 2.5 Mb, ili najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb. U nekim od prethodnih postupaka, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojeni sa najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 110 kb, najmanje 120 kb, najmanje 130 kb, najmanje 140 kb, najmanje 150 kb, najmanje 160 kb, najmanje 170 kb, najmanje 180 kb, najmanje 190 kb, ili najmanje 200 kb. U nekim od prethodnih postupaka, 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su rszdvojene sa oko 30 kb do oko 110 kb.
[0059] U nekim od prethodnih postupaka, eukariotska ćelija nije ćelija pacova. U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, eukariotska ćelija je pluripotentna ćelija, ne-pluripotentna ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, ne-humana sisarska ćelija, ćelija glodara, ćelija miša, ćelija hrčka, ne-humana pluripotentna ćelija, humana pluripotentna ćelija, pluripotentna ćelija glodara, ili fibroblast. U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, eukariotska ćelija je primarna ćelija ili imortalizovana ćelija. U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, pluripotentna ćelija glodara je embrionalna matična (ES) ćelija miša ili pacova.
[0060] U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, mišja ćelija, ili humana ćelija je primarna ćelija ili imortalizovana ćelija. U nekim od prethodnih postupaka prema pronalasku, mišja ćelija, ili humana ćelija je pluripotentna ćelija. U nekim od prethodnih postupaka, mišja pluripotentna ćelija je mišja embrionalna matična (ES) ćelija. U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, humana pluripotentna ćelija je humana embrionalna matična (ES) ćelija, humana adultna matična ćelija, razvojno ograničena humana progenitorska ćelija, ili humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. U nekim od prethodnih postupaka prema otkriću, humane iPS ćelije su održavane u medijumu koji sadrži osnovni medijum i suplemente, naznačeno time da medijum sadrži: (a) polipeptid inhibitorni faktor leukemije (LIF); (b) inhibitor glikogen sintaza kinaze (GSK3); i (c) MEK inhibitor; naznačeno time da medijum ima osmolalnost od oko 175 mOsm/kg do oko 280 mOsm/kg.
[0061] U nekim od prethodnih postupaka, Cas protein je Cas9. U nekim od prethodnih postupaka, ciljna sekvenca je neposredno flankirana sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM).
[0062] U nekim od prethodnih postupaka, ciljna genetička modifikacija sadrži simultanu deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju prve nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u jednom koraku. U nekim od prethodnih postupaka, deletirana sekvenca endogene nukleotidne sekvence je od oko 30 kb do oko 110 kb, i inserirana prva nukleinska kiselina je od oko 40 kb do oko 140 kb.
[0063] U nekim od prethodnih postupaka, ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija. U nekim od prethodnih postupaka, bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i insercija prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u dva homologa hromozoma. U nekim od prethodnih postupaka, modifikovana eukariotska ćelija, modifikovana mišja ćelija, ili modifikovana humana ćelija je složeni heterozigot na genomskom lokusu od interesa. U nekim od prethodnih postupaka, modifikovana eukariotska ćelija, modifikovana mišja ćelija, ili modifikovana humana ćelija je hemizigot na genomskom lokusu od interesa. U nekim od prethodnih postupaka, ciljane genetičke modifikacije na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrže deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline. U nekim od prethodnih postupaka, ciljana genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u prvom i drugom homologom hromozomu; i (2) inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom hmologom hromozomu i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugi homologi hromozom.
[0064] U nekim od prethodnih postupaka opisanih ovde, ciljana genetička modifikacija sadrži: (a) zamenu sekvence endogene nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukelinske kiseline; (b) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline; (c) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline, nazančeno time da je delecija u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (d) inserciju sekvence egzogene nukleinske sekvence; (e) inserciju egzogene nukleinske kiseline od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (f) inserciju sekvence nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukelinske kiseline; (g) insercija himerne sekvence nukleinske kiseline koja sadrži humanu i ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline; (h) inserciju uslovnog alela flankiranog sa ciljnim sekvencama za mesto specifične rekombinaze; (i) inserciju selektabilnog marker ili reporter gena operativno vezanog za promotor aktivan u pluripotentnoj ćeliji; ili (j) njihovu kombinaciju.
[0065] U nekim od prethodnih postupaka, genomski lokus od interesa sadrži Interleukin-2 receptor gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, both of Rag1 i Rag2 loci, Adamts5 lokus, Trpa1 lokus, Folh1 lokus, Erbb4 lokus, Lrp5 lokus, C5 (Hc) lokus, Ror1 lokus, ili Dpp4 lokus. U nekim od prethodnih postupaka, genomski lokus od interesa sadrži ekstrahromozomsku DNK.
[0066] Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju F0 generacije ne-humane životinje ili miša koji sadrži ciljanu gentičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa, koji sadrže: (a) modifikovanje ne-humanih ili mišjih ES ćelija korišćenjem, bilo kojih od prethodnih postupaka; (b) identifikaciju modifikovanih ne-humanih ili mišjih ES ćelija koje sadrže ciljane genetičke modifikacije na genomskom lokusu od interesa; (c) introdukciju modifikovanog ne-humanih ili mišjih ES ćelija u ne-humani ili mišji embrion domaćin; i (d) gestaciju ne-humanog ili mišjeg embriona domaćina u surogat majku, naznačeno time da surogat majka proizvodi F0 generaciju ne-humanne životinje ili miša koji sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0067]
Slika 1 prikazuje ESCs pacova, koje rastu kao kompaktne loptaste kolonije koje se rutinski otkidaju i plutaju u posudi.
Slika 2A do D prikazuje različite markere pluripotencije eksprimirane od strane ESC pacova: prikazuje Oct-4 (zeleno); B prikazuje Sox-2 (crveno); C prikazuje DAPI (plavo); D prikazuje markere pluripotencije eksprimirane od strane rESCs.
Slika 3 prikazuje da ESCs pacova eksprimiraju blage nivoe alkalne fosfataze (marker pluripotencije).
Slika 4 prikazuje kariotip za liniju DA.2B, koja je 42X,Y. Kariotipizacija je urađena jer su ESCs pacova često bile tetraploidne; stoga je izvršen skrining linija brojanjem metafaznih hromozomskih niti, i linije sa pretežno normalnim brojem su zatim formalno kariotipizovane. Slika 5A-B obezbeđuje fotografije koje pokazuju analizu broja hromozoma ACI.G1 ES ćelijske linije pacova.
Slika 6A-B obezbeđuje fotografije koje pokazuju analizu broja hromozoma DA.2B ES ćelijske linije pacova.
Slika 7A-B obezbeđuje fotografije koje pokazuju analizu broja hromozoma DA.2C ES ćelijske linije pacova.
Slika 8 prikazuje uvećani izgled ESC pacova sa Slike 1.
Slika 9 prikazuje proizvodnju himera sa injekcijom blastocista i transmisiju ESC genoma pacova preko klicine linije. Himere su proizvedene sa injekcijom blastocista korišćenjem roditeljskih ACI.G1 ESCs pacova. Visok procenat himera obično ima albino njuške.
Slika 10 prikazuje F1 aguti mladunce sa albino mladuncima iz istog legla, sa očevom ACI/SD himerom obeleženom sa asteriskom (*) na Slici 9. ;Slika 11 obezbeđuje šemu ApoE lokus pacova i obeleženo je sa sivim kolonama mesto isecanja sa nukleazama cink prsta (ZFN1 i ZFN2). Genomski regioni koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (5 kb i 5.4 kb, respektivno) su obeleženi tamno sivim boksovima. Egzon 1 ApoE gena je nekodirajući i prikazan je kao otvoreni boks najbliži 5’ homologoj ruci. Tri introna ApoE gena su obeleženi kao linije. Egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao istačkani sivi boksovi. Egzon 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što je označeno sa tačkastim sivim senčenjem i praznim boksom. ;Slika 12 prikazuje targeting Rosa26 lokusa pacova, koji leži između Setd5 i Thumpd3 gena kao kod miša, sa istim razmakom. Panel prikazuje strukturu Rosa26 lokusa miša. Mišji Rosa26 transkripti se sastoje od 2 ili 3 egzona. Panel B opisuje strukturu Rosa26 lokusa pacova; lokus pacova sadrži drugi egzon 1 (Ex1b) kao dodatak homologom egzonu mišjem exon1 (Ex1a); kod pacova nije identifikovan treći egzon. Panel C prikazuje targetovani Rosa26 alel pacova; homologe ruke od 5 kb svaka su klonirane sa PCR korišćenjem genomske DNK od DA rESC; targetirani alel sadrži splajsing akceptor (SA)-lacZ-hUB-neo kaseta zamenjujući 117 bp deleciju kod Rosa26 introna pacova. ;Slika 13A prikazuje kontrolni mozak 14-nedelja starog pacova divljeg tipa, koji je obojen sa X-gal. Kontrolni mozak je pokazao nizak nivo pozadinskog bojenja za LacZ (dorzalni pogled). Slika 13B prikazuje LacZ ekspresiju u mozgu rRosa26 heterozigotnog pacova (14-nedelja star). lacZ reporter je sveprisutno eksprimiran u mozgu rRosa26 heterozigota. ;Slika 13C prikazuje kontrolno srce i timus (ubačena slika) 14-nedelja starog pacova divljeg tipa, koji je tretiran sa X-gal. Kontrolno srce i timus prikazali su nizak nivo pozadinskog bojenja za LacZ. ;Slika 13D prikazuje LacZ ekspresiju u srcu i timusu (ubačena slika) 14-nedelje stari rRosa26 heterozigotni pacovi. lacZ reporter je eksprimiran sveprisutno u srcu i timusu rROSA26 heterozigota. ;Slika 13E prikazuje kontrolna pluća 14-nedelja starog pacova divljeg tipa, koji je tretiran sa X-gal. Kontrolna pluća su pokazala nizak nivo pozadinskog bojenja za LacZ. ;Slika 13F prikazuje LacZ ekspresiju u plućima 14-nedelja starog rRosa26 heterozigotnog pacova. lacZ reporter je eksprimiran sveprisutno u plućima rRosa26 heterozigota. ;Slika 13G i H prikazuju LacZ ekspresiju u E12.5 embrionima pacova. Za razliku od kontrolnog embriona divljeg tipa (H), koji pokazuje nizak nivo pozadinskog LacZ bojenja, rRosa26 heterozigotni enbrion je prikazao sveprisutnu ekspresiju LacZ reportera u embrionu. ;Slika 13I i J prikazuju LacZ ekspresiju u E14.5 embrionima pacova. Za razliku od kontrolnog embriona divljeg tipa (J), koji ipokazuje nizak nivo pozadinskog LacZ bojenja, rRosa26 heterozigotni embrion pacova pokazao je sveprisutnu ekspresiju LacZ reportera u embrionu. Slika 14 ilustruju događaj homologe ili nehomologe rekombinacije koja se dešava unutar ES ćelija pacova nakon elektroporacije targeting vektora koji sadrži selekcionu kasetu (lacZ-neo kaseta). ;Slika 15 ilustruje mehanizam kojim genom-uređujuće endonukleaze (npr., ZFNs i TALENs) introdukuju prekid u dvostrukom lancu (DSB) u ciljnoj genomskoj sekvenci i aktiviraju spajanje nehomologih krajeva (NHEJ) u ES ćelijima. ;Slika 16 ilustruje tehniku ciljnog dejstva na gene koja koristi ZFN/TALENs da bi poboljšala efikasnost homologe rekombinacije targeting vektora. DSB predstavlja prekid dvostrukog lanca. Slika 17 pokazuje ApoE-ZFN-AB5 himere proizvedene proizvodnjom himera i transmisijom klicine linije modifikovanog ApoE lokus pacova. Ciljana modifikacija je potpomognuta sa nukleazama cink prsta. ;Slika 18 obezbeđuje šemu IL2r-y targeting događaja u kombinaciji sa cink prst nukleazma koje ciljno deluju na ZFN U i ZFN D. Region IL2r-y lokusa pacova na koji ciljno deluju ZFN U i ZFN D je prikazan (SEQ ID NO: 93). ZFN mesta isecanja su označena na slici. ;Slika 19 obezbeđuje šemu IL2r-y targeting događaja u kombinaciji sa cink prst nukleazama koje ciljno deluju na ZFN U i ZFN D ili u kombinaciji sa gRNKs (gRNK1, gRNK2, gRNK3, gRNK4). Regioni IL2r-y lokusa pacova na koje ciljno deluju ZFN U i ZFN D ili gRNKs 1-4 su prikazani, i ZFN mesta isecanja su obeležena. ;Slika 20 obezbeđuje šemu ApoE lokus pacova i targeting plazmid. Gornja šema pokazuje genomsku strukturu ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovoaraju 5’ i 3’ homologim rukama (5 kb i 5.4 kb respektivno; tamnosivi boksevi). Egzon 1 ApoE gena je nekodirajući i prikazan je kao prazan boks najbliži 5’ homologoj ruci. Tri introna ApoE gena su obeležena kao linije. Egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao istačkani sivi boksevi. Egzon 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što je obeleženo istačkanim sivim osenčenim i praznim boksom. Donji panel prikazuje targeting plazmid. 5’ i 3’ homologe ruke (5 kb i 5.4 kb, respektivno) su obeležene sa tamno sivim boksevima. targeting vektor sadrži reporter gen (lacZ) i samo deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice). Samodeletirajuća kaseta sadrži mišji Prm1 promotor operativno vezan sa Crei genom i selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno povezan sa genom za rezistenciju na neomicin. Slika 21A obezbeđuje šemu za targeting ApoE lokusa u ES ćelijama pacova korišćenjem cink prst nukleaza i targeting vektora koji sadrži reporter gen (LacZ) i samo deletirajuću kasetu koja sadrži mišji Prm1 promotor operativno vezan sa Crei genom i selekcionom kasetom za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. Slika 21B prikazuje homozigotni ciljani ApoE lokus. ;Slika 22 obezbeđuje šemu ApoE lokusa pacova i velikog vektora za ciljno dejstvo (LTVEC). Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (45 kb i 23 kb, respektivno; tamno sivi boksevi). Egzon 1 ApoE je nekodirajući i prikazan je kao prazan boks najbliži 5’ homologoj ruci. Tri introna ApoE gena su označeni kao linije i egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao istačkani svi boksevi. Egzon 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što je obeleženo sa istačkanim sivim senčenjem i praznim boksom. Donji panel prikazuje LTVEC za modifikovanje ApoE lokusa pacova. 5’ i 3’ homologe ruke (45 kb i 23 kb, respektivno) su označene tamno sivim boksevima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i samodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice), koji sadrže mišji Prm1 promotor operativno vezan sa Crei genom i selekcionom kasetom za lek koja sadrži humani ubikvitin prmotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 23 obezbeđuje šemu ApoE lokusа pacova i obeležava sa sivim kolonama mesta isecanja za cink prst nukleaze (ZFN1 i ZFN2) korišćene zajedno sa velikim vektorom sa ciljanim dejstvom (LTVEC) da bi se poboljšala homologa rekombinacija između vektora sa ciljanim dejstvom i ciljni srodni region hromozoma. ;Slika 24 prikazuje IL2r-y lokus pacova koji je disruptovan sa 3.2 kb delecijom i insercijom reporter gena (eGFP) i samo deletirajuće kasete koja sadrži selekcionu kasetu za lek (hUb-neo) i Crei gen operativno vezan za mišji Prm1 promotor. ;Slika 25 obezbeđuje sledeći prikaz IL2r-y lokusa pacova koji je disruptovan sa 3.2 kb delecijom i insercijom reporter gena (eGFP) i samo deletirajućom kasetom koja sadrži Crei gen operativno vezan sa mišjim Prm1 promotorom i selekcionom kasetom za lek (hUb-Neo). ;Slika 26 obezbeđuje šemu Rag2 lokusa pacova i veliki vektor za ciljno dejstvo (LTVEC) za modifikovanje Rag2 lokusa pacova. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Rag2 lokus pacova i srodne genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (48 kb i 84 kb, respektivno; tamno sivi boksevi). Rag2 sadrži pojedinačni egzon obeležen sa istačkanim sivim senčenjem. Donji panel je LTVEC. 5’ i 3’ homologe ruke (48 kb i 84 kb, respektivno) su obeležene sa tamno sivim boksevima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i samo deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice) koji sadrži Prm1 promotor pacova operativno vezan sa Crei genom i selekcionom kasetom za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 27 obezbeđuje genomsku strukturu Rag1/Rag2 lokus pacova i genomske regione deletirane ili sa Rag2 targeting (Rag2 delecija) ili Rag2/Rag1 dvostruko targeting (Rag2/Rag1 delecija). Slika 28 obezbeđuje šemu Rag2 i Rag1 lokusa pacova i veliki vektor za ciljano dejstvo (LTVEC) korišćen za modifikovanje lokusa. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Rag1 i Rag2 lokusa i srodne genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (48 kb i 15 kb, respektivno; tamo sivi boksevi). Svaki Rag2 i Rag1 sadrži jedan egzon obeležen istačkanim sivim senčenjem. Donji panel je LTVEC. 5’ i 3’ homologe ruke (48 kb i 15 kb, respektivno) su obeležene sa tamnosivim boksovima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i samo deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice), koji sadrži Prm1 promotor pacova operativno vezan sa Crei gen i selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 29 prikazuje analizu protočne citometrije za GFP ekspresiju i za T-ćelijski marker CD3 (paneli A i D), B-ćelijski marker B220 (paneli B i E), i NK ćelija marker CD161a (paneli C i F) u monocitima periferne krvi (PBMCs) iz II2rg-/y himernog pacova (paneli A-C) i WT DA pacova (paneli D-F). Dvostruko pozitivne ćelije su prikazane u kvadrantu R8. Slika 29 prikazuje da II2rg-/y PBMC ne eksprimiraju markere zrelih limfocita. ;Slika 30 prikazuje da su GFP-pozitivni limfociti detektovani u perifernoj krvi u 2 od 3 II2rg-/y himera. ;Slika 31 obezbeđuje šemu Il2rg lokusa pacova i targeting plazmid za potpunu humanizaciju Il2rg lokusa pacova. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Il2rg lokusa pacova i srodnih genomskih regiona koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (4.3 kb i 4.0 kb, respektivno; sivi boksevi). Donji panel je targeting plazmid. 5’ i 3’ homologe ruke 4.3 kb i 4.0 kb, respektivno) su obeležene sivim boksovima. Targeting plazmid sadrži humani IL-2rg genomski region i delecionu kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice) koja sadrži selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. Slika 32 obezbeđuje šemu Il2rg lokusa pacova i targeting plazmid za ekto-domen humanizaciju Il2rg lokusa pacova. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Il2rg lokusa pacova i srodne genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (4.3 kb i 4.0 kb, respektivno; sivi boksovi). Donji panel je targeting plazmid. 5’ i 3’ homologe ruke (4.3 kb i 4.0 kb, respektivno) su obeležene sivim boksevima. Targeting plazmid sadrži humani ekto-domen IL-2Rg genomskog regiona i samo deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice) koja sadrži Prm1 promotor pacova operativno vezan sa Crei genom i selekcionom kasetom za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 33 obezbeđuje poravnanje sekvence humanog IL-2rg proteina (SEQ ID NO: 20; NP_000197.1); IL-2rg proteina pacova (SEQ ID NO: 21; NP_543165.1); i himernog IL-2rg proteina (SEQ ID NO: 22) koji sadrži humani ekto-domen IL-2rg fuzionisanog sa ostatkom IL-2rg proteina pacova. Veza između humanog i IL-2rg pacova je obeležena vertikalnom linijom. ;Slika 34 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije mišjeg Lrp5 gena; LTVEC je prikazan na gornjem panelu i mišji Lrp5 lokus je prikazan na donjem panelu. Humanizovani region je ektodomen. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) i ZFN (a-d). ;Slika 35 prikazuje procenat targeting efikasnosti LTVECs targetinga gena rastuće veličine za deleciju (Slika 35A) i LTVECs sa insercijama humanog gena rastuće veličine (Slika 35B). LTVECs su korišćeni zasebno (sivi kvadrati ili trouglovi) ili u kombinaciji sa ZFNs (crni kvadrati ili trouglovi). ;Slika 36 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije celog kodirajućeg regiona mišjeg Trpa1 gena; LTVEC je prikazna na gornjem panelu i mišji Trpa1 lokus je prikazna na donjem panelu. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF). ;Slika 37 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije ektodomena (egzon 2 do stop kodona) mišjeg Folh1 gena; LTVEC je prikazna na gornjem panelu i mišji Folh1 lokus je prikazan na donjem panelu. Strelice prikazuju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, gF). ;Slika 38 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije regiona iz egzona 2 do stop kodona mišjeg C5 (Hc) gena; LTVEC je prikazan na gornjem panelu i mišji C5 (Hc) lokus je prikazan na donjem panelu. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF). ;Slika 39 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije celog kodirajućeg regiona mišjeg Adamts5 gena; LTVEC je prikazna na gornjem panelu i mišji Adamts5 lokus je prikazan na donjem panelu. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF). ;Slika 40 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije egzona 4-15 mišjeg Erbb4 gena; LTVEC je prikazan na gornjem panelu i mišji Erbb4 lokus je prikazan na donjem panelu. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF). ;Slika 41 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije egzona 2-7 mišjeg Ror1 gena; LTVEC je prikazan na gornjem panelu i mišji Ror1 lokus je prikazan na donjem panelu. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gB, gC, gD, gE, gF). ;Slika 42 obezbeđuje šemu CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije regiona iz egzona 2 do stop kodona mišjeg Dpp4 gena; LTVEC je prikazan na gornjem panelu i mišji Dpp4 lokus je prikazan na donjem panelu. Strelice označavaju ciljna mesta za svaku gRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF). ;Slika 43 prikazuje mozgove 12-nedelja starih ženki pacova obojene sa X-gal. Slika 43A-C prikazuje mozag od pacova divljeg tipa, i Slika 43D-F prikazuje mozak od ApoE+/- pacova. Slika 43A i D pokazuju dorzalni izgled, Slika 43B i E pokazuju ventralni izgled, i Slika 43C i F prikazuju uveličani izgled. ;Slika 44 prikazuje srca 12-nedelja starih ženki pacova (A i C) i odgovarajuće uveličane slike krvnih sudova (B i D) obojene sa X-gal. Slika 44A i B prikazuju srce i krvne sudove, respektivno, od pacova divljeg tipa, i Slika 44C i D prikazuju srce i krvne sudove, respektivno, ApoE+/- pacova. Bojenje je prisutno u strijumima srca i u nekim krvnim sudovima (npr., vena cava). ;Slika 45 prikazuje jetre 12-nedelja starih ženki pacova obojene sa X-gal. Slika 45A i B prikazuju jetru od divljeg tipa pacova, i Slika 45C i D prikazuju jetru od ApoE+/- pacova. Slika 45B i D su uveličani izgledi jetri. ;Slika 46 prikazuje detekciju nivoa holesterola, LDL, HDL, i triglicerida (Slika 46A-D, respektivno) kod homozigotnih ApoE-targetovanih pacova, heterozigotnih ApoE-targetovanih pacova, i pacova divljeg tipa na 6 nedelja, 9 nedelja, 12 nedelja, i 15 nedelja. ;Slika 47 prikazuje šemu ApoE lokusa pacova (gornji panel) i velikog vektora za ciljno dejstvo (LTVEC) koji ciljno deluje na ApoE lokus pacova (donji panel). Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (45 kb i 23 kb, respektivno; tamno sivi boksovi). Egzon 1 ApoE je nekodirajući i prikazan je kao prazan boks najbliži 5’ homologoj ruki. Tri introna ApoE gena su označeni kao linije i egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao istačkani sivi boksovi. Egzon 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što je označeno sa istačkanim sivim senčenjem i praznim boksom. Ciljna mesta za ApoE gRNK2 (SEQ ID NO: 87) i gRNK3 (SEQ ID NO: 88) su označena. Donji panel prikazuje LTVEC za modifikovanje ApoE lokusa pacova. 5’ i 3’ homologe ruke (45 kb i 23 kb, respektivno) su označene tamno sivim boksovima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i samodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice), koja sadrži mišji Prm1 promotor operativno vezan sa Crei genom i selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 48 prikazuje šemu Rag2 lokusa (gornji panel) i velikog vektora za ciljano dejstvo (LTVEC) koje ciljno deluje na Rag2 lokus pacova (donji panel). Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Rag2 lokus pacova i srodne genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (48 kb i 84 kb, respektivno; tamno sivi boksovi). Rag2 sadrži jedan egzon označen istačkanim sivim senčenjem. Ciljna mesta Rag2 gRNK1 (SEQ ID NO: 89) i gRNK4 (SEQ ID NO: 90) su označena. Donji panel je LTVEC. 5’ i 3’ homologe ruke (48 kb i 84 kb, respektivno) su obeležene tamno sivim boksovima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i samo deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice) koji sadrže Prm1 promotor pacova operativno vezan za Crei gene i selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na higromicin. ;Slika 49 prikazuje šemu Il2rg lokusa pacova (gornji panel) i targeting plazmid za ektodomen humanizacije Il2rg lokusa pacova (donji panel). Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Il2rg lokusa pacova i srodne genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (4.3 kb i 4.0 kb, respektivno; sivi boksevi). Ciljna mesta za Il2rg gRNK2 (SEQ ID NO: 91) i gRNK4 (SEQ ID NO: 92) su označena. Donji panel je targeting plazmid. 5’ i 3’ homologe ruke (4.3 kb i 4.0 kb, respektivno) su označene sivim boksevima. Targeting plazmid sadrži humani ekto-domen IL-2Rg genomskog regiona i samodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice) koja sadrži Prm1 promotor pacova operativno vezan sa Crei genom i selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 50 prikazuje šemu Rag2 i Rag1 lokusa pacova i veliki vektor sa ciljanim dejstvom (LTVEC) korišćenih za modifikaciju lokusa u Il2rg-targetiranim ES ćelijama pacova (klon Il2rg-CG12). Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju Rag1 i Rag2 lokusa i srodnih genomskih regiona koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama (48 kb i 15 kb, respektivno; sivi boksovi). Svaki Rag2 i Rag1 sadrži jedan egzon označen neosenčenim strelicana. Donji panel je LTVEC. ;5’ i 3’ homologe ruke (48 kb i 15 kb, respektivno) su označene sa sivim boksovima. LTVEC sadrži reporter gene (eGFP) i gen za rezistenciju na puromicin razdvojen internim mestom za ulazak ribozoma (IRES) i operativno vezan sa aktin promotorom. LTVEC dodatno sadrži samodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice), koja sadrži Prm1 promotor pacova operativno vezan sa Crei genom i selekcionu kasetu za lek koja sadrži humani ubikvitin promotor operativno vezan sa genom za rezistenciju na neomicin. ;Slika 51 prikazuje šemu za zamenu dela humanog ADAM6 lokusa sa nukleinskom kiselinom koja sadrži mišji Adam6a i mišji Adam6b lokuse korišćenjem LTVEC i vodeće RNK u humane iPS ćelije. Ciljno mesto za vodeću RNK je označeno strelicom. ;Slika 52A prikazuje morfologiju prikazanu od strane humanih iPS ćelija kultivisanih 8 dana u 2i medijumu. Slika 52B prikazuje morfologiju humanih iPS ćelija kultivisanih 12 dana u 2i medijumu. ;Slike 53A-53D prikazuju morfologiju humannih iPS ćelija kultivisanih u mTeSR™-hLIF medijumu ili VG2i medijumu sa niskom osmolalnošću 6 dana. Slike 53A i 53B prikazuju morfologiju humanih iPS ćelija kultivisanih u mTeSR™-hLIF medijumu (Slika 3A) ili VG2i medijumu (Slika 53B) 6 dana. Slike 53C i 53D prikazuju morfologiju humanih iPS ćelija kultivisanih na hranljivim ćelijama fibroblasta prepucijuma humanog novorođenčeta (NuFF) u mTeSR™-hLIF medijumu (Slika 53C) ili VG2i medijumu (Slika 53D) 6 dana. ;Slika 54A prikazuje reprogramirane humane iPS ćelije kultivisane u VG2i medijumu koje su obojene za alkalnu fosfatazu. Slike 54B i 54C prikazuju reprogramirane humane iPS ćelije kultivisane u VG2i medijumu koje su imunoobojene u odnosu na ekspresiju NANOG. ;Slike 55A-55C ilustruju enzimatsku disocijaciju i subkulturu reprogramiranih humanih iPS ćelija kultivisanih u VG2i medijumu. Slika 55A prikazuje reprogramirane humane iPS ćelije kultivisane u VG2i medijumu pre enzimatske disocijacije sa tripsinom u odsustvu ROCK inhibitora. Slika 55B prikazuje humane iPS ćelije kultivisane u VG2i medijumu 1 dan nakon subkulture. Slika 55C prikazuje humane iPS ćelije kultivisane u VG2i medijumu 4 dana nakon subkulture. ;;DETALJAN OPIS PRONALASKA ;;[0068] Obezbeđene su kompozicije i postupci za modifikovanje pacovskog, eukariotskog, nepacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg, ili genomskog lokusa od interesa hrčka preko bakterijske homologe rekombinacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji. Takođe su obezbeđene kompozicije i postupci za gentičku modifikaciju genomskog lokusa od interesa, na primer, pacovskog, eukariotskog, nepacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, ili mišjeg genomskog lokusa od interesa korišćenjem velikog vektora sa ciljnim dejstvom (LTVEC) u kombinaciji sa endonukleazama. Takođe su obezbeđene kompozicije i postupci za proizvodnju genetički modifikovane ne-humane životinje, na primer, pacova, miša, glodara, ili ne-pacovskog glodara, koja sadrži jednu ili više ciljanih genetičkih modifikacija. Takođe su obezbeđene izolovane humane i ne-humane totipotentne ili pluripotentne matične ćelije, naročito embrionalne matične ćelije pacova, koje su sposobne da zadrže pluripotenciju nakon jedne ili serije genetičkih modifikacija in vitro, i koje su sposobne da prenesu ciljane genetičke modifikacije sledećim generacijama preko klicine linije. ;;Rečnik termina ;;[0069] Termin "embrionalna matična ćelija" ili "ES ćelija" kao što je ovde korišćeno uključuje totipotentnu ili pluripotentnu ćeliju koja je izvedena iz embriona i koja je sposobna da doprinese bilo kom tkivu embriona u razvoju nakon introdukcije u embrion. Termin "pluripotentna ćelija" kao što je ovde korišćeno uključuje nediferenciranu ćeliju koja poseduje sposobnost da se razvije u više od jednog tipa diferencirane ćelije. Termin "ne-pluripotentna ćelija" uključuje ćelije koje nisu pluripotentne ćelije. ;[0070] Termin "homologa nukleinska kiselina " kao što je ovde korišćeno uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja je ili identična ili značajno slična poznatoj referentnoj sekvenci. U jednom primeru izvođenja, termin "homologa nukleinska kiselina" je korišćena da se karakterizuje sekvenca koja ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100% identična poznatoj referentnoj sekvenci. ;[0071] Termin "ortologna nukleinska kiselina" kao što je ovde korišćeno uključuje sekvencu nukleinske kiseline od jedne vrste koja je funkcionalno ekvivalentna poznatoj referentnoj sekvenci kod druge vrste. ;[0072] Termin "veliki vektor za ciljano dejstvo" ili "LTVEC" kao što je ovde korišćeno uključuje velike vektore za ciljano dejstvo za eukariotske ćelije koji je izveden iz fragmenata klonirane genomske DNK veće od onih tipično korišćenih od strane drugih pristupa kojima je namera izvođenje ciljnog dejstva na homologe gene u eukariotskim ćelijama. Primeri LTVEC, uključuju, ali nisu ograničeni na, bakterijske homologe hromozome (BAC) i veštačke hromozome kvasca (YAC). ;[0073] Termin "modifikacija alela" (MOA) kao što je ovde korišćeno uključuje modifikaciju tačne DNK sekvence jednog alela gena(ili više gena) ili hromozomskog lokusa (ili više njih) u genomu. Primeri "modifikacije alela (MOA)" kao što je ovde opisano uključuju, ali nisu ograničeni na, delecije, supstitucije, ili insercije pojedinačnog nuleotida ili delecije gena ili hromozomskih lokusa (ili više njih) od interesa veličine više kilobaza, kao i bilo kojih i svih mogućih modifikacija između ova dva ekstrema. ;[0074] Termin "mesto rekombinacije" kao što je ovde korišćeno uključuje nukleotidnu sekvencu koja je prepoznata rekombinazom specifičnom za mesto i koja može služiti kao supstrat za rekombinacioni događaj. ;[0075] "Serijske" genetičke modifikacije uključuju dve ili više modifikacija izvedenih nezavisno na ćeliji (npr., eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, ne-humana sisarska ćelija, pluripotentna ćelija, ne-pluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna matična ćelija, razvojnoograničena humana progenitorska ćelija, humana iPS ćelija, humana ćelija, glodarska ćelija, nepacovska glodarska ćelija, ćelija pacova, mišja ćelija, ćelija hrčka, fibroblast, ili ćelija ovarijuma kineskog hrčka (CHO)). Prva modifikacija može biti postignuta elektroporacijom, ili bilo koji drugi postupak poznat u tehnici. Druga modifikacija je načinjana genomu iste ćelije koja upotrebljava pogodni konstrukt druge nukleinske kiseline. Druga modifikacija može biti postignuta drugom elektroporacijom, ili bilo kojim drugim postupkom poznatim u tehnici. U različitim primerima izvođenja, nakon prvih i drugih genetičkih modifikacija iste ćelije, treće, četvrte, pete, šeste, i tako dalje, serijske genetičke modifikacije (jedna nakon druge) mogu se postići korišćenjem, npr., serijskih elektroporacija ili bilo kog drugog pogodnog postupka (serijski) poznatog u tehnici. ;[0076] Termin "rekombinaza specifična za mesto" kao što je ovde korišćeno uključuje grupu enzima koji mogu olakšati rekombinaciju između "mesta rekombinacije" gde dva rekombinantna mesta su fizički razdvojena unutar jednog molekula nukleinske kiseline ili na različitim molekulima nukleinske kiseline. Primeri "rekombinaze specifične za mesto" uključuju, ali nisu ograničeni na, Cre, Flp, i Dre rekombinaze. ;[0077] Termin "klicina linija" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline uključuju sekvencu nukleinske kiseline koja može biti preneta potomstvu. ;[0078] Izraz "teški lanac," ili "teški lanac imunoglobulina" uključuje sekvencu teškog lanca imunoglobulina, uključujući sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, iz bilo kog orgabnizma. Varijabilni domeni uključuju tri teška lanca CDRs i četiri FR regiona, ukoliko nije drugačije specifikovano. Fragmenti teških lanaca uključuju CDRs, CDRs i FRs, i njihove kombinacije. ;Tipični teški lanac ima, posle varijabilnog regiona (od N-terminalnog do C-terminalnog), CH1 domen, zglob, CH2 domen, i CH3 domen. funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment koji je sposoban da specifično prepoznaje epitop (npr., prepoznaje epitop sa KD u mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban da eksprimira i izlučuje iz ćelije, i koji sadrži najmanje jedan CDR. Varijabilni domeni teškog lanca su kodirani nukleotiddnom sekvencom varijabilnog regiona, koji generalno sadrži VH, DH, i JH segmente izvedene iz repertoara VH, DH, i JH segmenata prisutnih u klicinim linijama. Sekvence, lokacije i nomenklatura za V, D, i J segmenti teškog lanca za razlilčite organizme mogu se naći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna preko interneta na world wide web (www) na URL "imgt.org." ;[0079] Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i ukoliko nije drugačije specifikovano uključuje humani kapa (κ) i lambda (λ) lake lance i VpreB kao i surogat lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca tipično uključuju tri CDRs lakog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, ukoliko nije drugačije specifikovano. generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino terminusa do karboksi terminusa, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni regioni lakog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca, koja generalno sadrži genske segmente VL lakog lanca i JL lakog lanca, izvedene iz repertoara genskih segmenata V i J lakog lanca prisutne u klicinoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za genske segmente V i J lakog lanca za različite organizme mogu se naći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna preko interneta na world wide web (www) na URL "imgt.org." Laki lanci uključuju one, npr., koji ne vezuju selektivno ili prvi ili drugi epitop selektivno vezan sa epitop-vezujućim proteinom u kom se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji se vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu sa vezivanjem i prepoznavanjem, jednog ili više epitopa selektivno vezanog od strane epitop-vezujućeg proteina u kome se pojavljuju. ;[0080] Izraz "operativno vezan" sadrži odnos naznačeno time da komponente operativno vezane funkcionišu na njihov nameravani način. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može biti operativno vezana sa regulatornim sekvencama (npr., promotor, enhanser, sekvenca za utišavanje, itd.) tako da se zadrži ispravna transkripciona regulacija. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina (ili V(D)J segmenata) može biti operativno vezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulina tako da bi omogućavala ispravnu rekombinaciju između sekvenci u sekvencu teškog ili lakog lanca imunoglobulina. ;1. Ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu ;;[0081] Obezbeđeni su različiti postupci i kompozicije, koji omogućavaju integraciju najmanje jednog inserta nukleinske kiseline na ciljnom lokusu. Kao što je ovde korišćeno, "genomski lokus od interesa" sadrži bilo koji segment ili region DNK unutar genoma po želji za integrisanje inserta nukleinske kiseline. Termini "genomski lokus od interesa" i "ciljni genomski lokus od interresa" mogu se koristit naizmenično. Genomski lokus od interesa može biti nativan ćeliji, ili alternativno može sadržati heterologi ili egzogeni segment DNK koji je integrisan u genom ćelije. Takvi heterologi ili egzogeni segmenti DNK mogu uključivati transgene, ekspresione kasete, selekcione markere koji kodiraju polinukleotide, ili heterologe ili egzogene regione genomske DNK. Termin "lokus" je ovde definisan kao segment DNK unutar genomske DNK. Genetske modifikacije kao što su ovde opisane mogu uključivati jednu ili više delecija od lokusa od interesa, adicije lokusu od interesa, zamene lokusa od interesa, i/ili bilo koja njihova kombinacija. Lokus od interesa može sadržati kodirajuće regione ili nekodirajuće regulatorne regione. ;[0082] Genomski lokus od interesa može dodatno sadržati bilo koju komponentu ciljanog integracionog sistema uključujući, na primer, mesto prepoznavanja, selekcioni marker, prethodno integrisani insert nukleinske kiseline, polinukleotide koji kodiraju nukleazna sredstva, promotori, itd. Alternativno, genomski lokus od interesa može se nalaziti unutar ekstrahromozomske DNK unutar ćelije, kao što je veštački hromozom kvasca (YAC), veštački hromozom bakterije (BAC), humani veštački hromozom, ili bilo koji inženjeringom dobijeni genomski region sadržan u odgovarajućoj ćeliji domaćinu. Otkriće opisuje da ciljani lokus može sadržati nativne, heterologe, ili sekvence egzogene nukleinske kiseline od prokariota, eukariota, ne-pacovskog eukariota, kvasca, bakterije, ne-humanog sisara, ne-humane ćelije, glodara, ne-pacovskog glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, goveda, jelena, ovce, koze, kokoške, mačke, psa, lasice, primata (npr., marmozeta, rezus majmuna), domestifikovanog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo kog drugog organizma od interesa ili njihove kombinacije. Otkriće opisuje da genomski lokus od interesa sadrži sekvencu nukleinske kiseline od čoveka, miša, ili njihovu kombinaciju. ;[0083] Otkriće opisuje da je ciljni lokus iz, na primer, eukariotske ćelije, ne-pacovske eukariotske ćelije, sisarske ćelije, humane ćelije, ne-humane sisarske ćelije, pluripotentne ćelije, nepluripotentne ćelije, ne-humane pluripotentne ćelije, humane pluripotentne ćelije, humane ES ćelije, humane adultne embrionalne ćelije, razvojno-ograničene humane progenitor ćelije, humane iPS ćelije, humane ćelije, glodarske ćelije, ne-pacovske glodarske ćelije, pacovske ćelije, mišje ćelije, ćelije hrčka, fibroblasta, ili CHO ćelije. ;[0084] Otkriće opisuje da genomski lokus od interesa sadrži ciljni lokus "nukleinske ksieline pacova." Takav region sadrži nukleinsku kiselinu od pacova koja je integrisana unutar genoma ćelije. Ne-ograničavajući primeri ciljnog lokusa uključuju genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u B ćeliji, genomski lokus koji eksprimira polipeptid u nezreloj B ćeliji, genomski lokus koji eksprimira polipeptid u zreloj B ćeliji, imunoglobulin (Ig) lokuse, ili lokuse T ćelijskog receptora, uključujući, na primer, lokus T ćelijskog alfa receptora. Dodatni primeri ciljnog genomskog lokusa uključuju Fcer1a lokus, Tlr4 lokus, Prlr lokus, Notch4 lokus, Accn2 lokus, Adamts5 lokus, Trpa1 lokus, Folh1 lokus, Lrp5 lokus, IL2 receptor lokus, uključujući, na primer, IL2 receptor gama (Il2rg) lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, Rag1/Rag2 lokus, i Erbb4 lokus. Bilo koji takav ciljni lokus može biti od pacova ili može biti od eukariotske ćelije, nepacovske eukariotske ćelije, sisarske ćelije, humane ćelije, ili ne-humane sisarske ćelije. ;[0085] Otkiće opisuje da, ciljni lokus kodira sisarskuaminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca. Otkriće opisuje da ciljni lokus kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Otkriće opisuje da ciljni lokus sadrži genomsku DNK sekvencu koja sadrži nerearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša, ili čoveka operativno vezanu sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Otkriće opisuje da sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša, ili čoveka izabrana od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-zglob-CH2-CH3. Otkriće opisuje da ciljni lokus sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša, ili čoveka operativno vezanu sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Otkriće opisuje da sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša, ili čoveka izabrana od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-zglob-CH2-CH3. ;[0086] U jednom primeru izvođenja, ciljni lokus sadrži genomsku DNK sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara. U jednom primeru izvođenja, genomska DNK sekvenca sadrži nerearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i/ili κ lakog lanca. ;[0087] U jednom primeru izvođenja, genomska DNK sekvenca sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i/ili κ lakog lanca sisara. U jednom primeru izvođenja, nerearanžirana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i/ili κ lakog lanca je operativno vezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca sisara izabrane od sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona λ lakog lanca i sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona κ lakog lanca. Otkriće opisuje da sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina pacova. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša. Otkriće opisuje da sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara je humana sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina. ;[0088] Kao što je ovde korišćeno, ApoE lokus, interleukin-2 receptor gama (Il2rg) lokus, Rag2 lokus, Rag1 lokus i/ili Rag2/Rag1 lokus sadrži respektivne regione genoma (tj., sisarskog genoma, humanog genoma ili ne-humanog sisarskog genoma) u kojima se nalaze svaki od ovih gena ili genskih kombinacija. Modifikacija bilo kog od ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama (Il2rg) lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa (tj., sisarski, humani, ili nehumani sisarski ApoE lokus, interleukin-2 receptor gama lokus, Rag2 lokus, Rag1 lokus i/ili kombinovani Rag2/Rag1 lokus) može sadržati bilo koju željenu izmenu datog lokusa. Neograničavajući primeri modifikacije datog lokusa (tj., sisarski, humani, ili ne-humani sisarski lokus) su ovde razmatrani detaljnije. ;[0089] Na primer, u predmetnom otkriću, jedan ili više ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama (Il2rg) lokus, Rag2 lokus, Rag1 lokus i/ili Rag2/Rag1 lokus (tj., sisarski, humani, ili ne-humani sisarski ApoE lokus, sisarski, humani, ili ne-humani sisarski interleukin-2 receptor gama lokus, sisarski, humani, ili ne-humani sisarski Rag2 lokus, i/ili Rag2/Rag1 lokus) je modifikovan tako da aktivnost i/ili nivo kodiranog ApoE proteina ili interleukin-2 receptor gama proteina ili Rag1 proteina ili Rag2 proteina ili kombinacije Rag1 i Rag2 proteina su smanjene. U drugim primerima izvođenja, odsustvuje aktivnost ApoE proteina, interleukin-2 receptor gama proteina, Rag1 proteina, ili Rag2 proteina, ili kombinacije Rag1 i Rag2 proteina. ;[0090] Pod "smanjenim" je označeno bilo koje smanjenje u nivou ili aktivnosti gena/proteina kodirana na lokusu od interesa. Na primer, smanjenje aktivnosti može sadržati ili (1) statistički značajno smanjenje u ukupnom nivou aktivnosti datog proteina (tj., ApoE, interleukin-2 receptor gama, Rag2, Rag2 ili kombinacije Rag1 i Rag2) uključujući, na primer, smanjeni nivo ili aktivnost 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ili veću u poređenju sa odgovarajućom kontrolom. Postupci za analizu smanjenja koncentracije i/ili aktivnosti bilo kog od ApoE, interleukin-2 receptor gama, Rag1 i Rag2 su poznati u tehnici. ;[0091] Otkriće opisuje da, jedan ili više sisarski, humani, ili ne-humani sisarski ApoE lokus, sisarski, humani, ili ne-humani sisarski interleukin-2 receptor gama lokus, sisarski, humani, ili ne-humani sisarski Rag2 lokus, sisarski, humani, ili ne-humani sisarski Rag1 lokus i/ili sisarski, humani, ili ne-humani sisarski Rag2/Rag1 lokus sadrži modifikaciju tako da je aktivnost i/ili nivo kodiranog ApoE polipeptida, interleukin-2 receptor gama polipeptida, Rag2 polipeptida, Rag1 polipeptida, ili oba Rag1 i Rag2 polipeptida je povećan. Pod "povećan" označeno je bilo koje povećanje u nivou ili aktivnosti gena/polipeptida kodiranog na lokusu od interesa. Na primer, povećanje aktivnosti može sadržati ili (1) statistički značajno povećanje u ukupnom nivou ili aktivnosti datog proteina (tj., ApoE, interleukin-2 receptor gama, Rag1, Rag2 ili Rag1 i Rag2) uključujući, na primer, povećani nivo ili aktivnost od 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ili veću u poređenju sa odgovarajućom kontrolom. Postupci za analizu povećanja koncentracije i/ili aktivnosti bilo kog od ApoE, Rag1, Rag2 i interleukin-2 receptor gama proteina su poznati u tehnici. ;[0092] Genetičke modifikacije sisarskog, humanog, ili ne-humanog sisarskog ApoE lokusa, sisarskog, humanog, ili ne-humanog sisarskog interleukin-2 receptor gama lokusa, sisarskog, humanog, ili ne-humanog sisarskog Rag2 lokusa, sisarskog, humanog, ili ne-humanog sisarskog Rag1 lokusa i/ili sisarskog, humanog, ili ne-humanog sisarskog Rag2/Rag1 lokusa može sadržati deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu, inserciju egzogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu, ili njihovu kombinaciju. Delecija i/ili insercija se mogu odigrati bilo gde unutar datog lokusa kao što je ovde na drugim mestima razmatrano. ;[0093] Otkriće opisuje da modifikacija jednog ili više sisarskih, humanih, ili ne-humanih sisarskih ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa preko zamene dela ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama (Il2rg) lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa sa odgovarajućim homologim ili ortologim delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0094] Otkriće opisuje da modifikacija jednog ili više sisarskih, humanih, ili ne-humanih sisarskih ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa, i/ili Rag2/Rag1 lokusa je izvedeno preko zamene dela ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama (Il2rg) lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokus i/ili Rag2/Rag1 lokusa sa insertom polinukleotida koji celom svojom dužinom imazajednički najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sa delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa koga zamenjuje. ;[0095] Dati insert polinukleotida i/ili odgovarajući region lokusa koji je deletiran može biti kodirajući region, intron, egzon, netranslatirani region, regulatorni region, promotor, ili enhanser ili bilo koja njihova kombinacija ili bilo koji njihov deo. Dodatno, dati insert polinukleotid i/ili region lokusa, na primer, koji je deletiran može biti bilo koje željene dužine, uključujući na primer, između 10-100 nukleotida dužine, 100-500 nukleotida dužine, 500-1 kb nukleotida dužine, 1 Kb do 1.5 kb nukleotida dužine, 1.5 kb do 2 kb nukleotida dužine, 2 kb do 2.5 kb nukleotida dužine, 2.5 kb do 3 kb nukleotida dužine, 3 kb do 5 kb nukleotida dužine, 5 kb do 8 kb nukleotida dužine, 8 kb do 10 kb nukleotida dužine ili više. U drugim slučajevima, veličina insercije ili zamene je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, od oko 350 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 800 kb, od oko 800 kb to 1 Mb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb to 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, od oko 2.5 Mb do oko 2.8 Mb, od oko 2.8 Mb do oko 3 Mb. U drugim primerima izvođenja, dati insert polinukleotida i/ili region lokusa koji je deletiran je najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ili 900 nucleotides ili najmanje 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb ili veći. U drugim primerima izvođenja, dati insert polinukleotida i/ili region lokusa koji je deletiran je najmanje 10 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, ili najmanje 300 kb ili veći. ;[0096] Dati insert polinukleotid može biti od bilo kog organizma, uključujući, na primer, glodara, ne-pacovskog glodara, pacova, miša, hrčka, sisara, ne-humanog sisara, eukariota, ne-pacovskog eukariota, čoveka, poljoprivredne životinje ili domaće životinje. ;[0097] Kao što je ovde detaljnije razmatrano, različiti postupci su obezbeđeni da bi se generisale ciljane modifikacije bilo kog lokusa od interesa, uključujući na primer, ciljane modifikacije ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama (Il2rg) lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa. Dodatno su obezbeđene u predmetnom otkriću genetički modifikovane ne-humane životinje, genetički modifikovani ne-humani sisari, genetički modifikovani ne-pacovski eukarioti, genetički modifikovane ne-pluripotentne ćelije, ili genetički modifikovane pluripotentne ćelije (npr., pluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitor ćelija, ili humana iPS ćelija), koja sadrži deleciju, inserciju, zamenu i/ili bilo koju njihovu kombinaciju na interleukin-2 receptor gama lokusu, na ApoE lokusu, na Rag2 lokusu, na Rag1 lokusu, i/ili na Rag2/Rag1 lokusu. Takve genetičke modifikacije (uključujući one koje rezultuju u odsustvu, smanjenju, povećanju ili modulaciji u aktivnosti ciljnog lokusa) i koje su takođe sposobne da se prenose preko klicine linije. U specifičnim primerima izvođenja, genetičke modifikacije rezultuju u nokautu željeno ciljnog lokusa. Takve ne-humane životinje, na primer, nalaze upotrebu u različitim eksperimentalnim sistemima kao što je ovde na drugim mestima razmatrano. ;[0098] Na primer, ApoE (Apolipoprotein E) nokaut nudi životinjski model za proučavanje funkcije endotela, uključujući, ali se ne ograničavajući na, formiranje plaka, transkripcione promene (Whole Transcriptome Shotgun Sequencing (RNK-Seq), i ex vivo funkciju. ApoE je veža transportni molekul i može transportovati lipide, kao što je holesterol, preko krvotoka. ApoE može takođe funkcionisati u nervnom sistemu, na primer, da čisti β-amiloid iz mozga. Modifikacije u ApoE su implicirane u različitim uslovima, uključujući, na primer, aterosklerozu, hiperlipidemiju, i Alzheimer-ovu bolest. ApoE nokaut miševi prikazuju oštećeno čišćenje lipoproteina iz krvi i razvijaju aterosklerozu. Stoga, ApoE nokaut životinje obezbeđuju model za proučavanje uslova i/ili procesa kao što su, na primer, funkcija endotela, formiranje plaka, transkripcione promene (RNK-Seq), hiperlipidemija, ateroskleroza i Alzheimer-ova bolest. Analize za merenje ApoE aktivnosti su poznate u tehnici. Na primer, smanjenje u ApoE aktivnosti može se meriti analizom smanjenja ApoE nivoa u uzorku krvi dobijenom od subjekta preko imunoeseja, kao što je preko ELISA ili preko tehnika imunoblotinga. Dodatno, velika veličina pacova olakšava sve ove analize i poboljšava kvalitet podataka. ;[0099] RAG1 (Rekombinacija-Aktivacija Gena 1) i RAG2 (Rekombinacija-Aktivacija Gena 2) su enzimi koji su deo multi-subjediničnog kompleksa koji ima VDJ rekombinacionu aktivnost i igra važnu ulogu u rearanžmanu i rekombinaciji gena imunoglobulina i T-ćelijskih receptora u limfocitima. RAG1 i RAG2 indukuju cepanje dvolančane DNK da bi olakšale rekombinaciju i spolije segmente T ćelijskog receptora i B ćelijskog receptora (tj., imunoglobulin) gena. Nokaut RAG1 i/ili RAG2 izaziva gubitak B ćelija i T ćelija kod životinja što rezultuje u teškoj imunodeficijenciji. RAG1 i/ili RAG2 nokaut životinje nalaze primenu, na primer, u studijama ksenografta (tj., ksenografti humane ćelije kod pacova), kanceru, razvoju vakcine, autoimunoj bolesti, infektivnoj bolesti i bolesti graft protiv domaćina (GVHD). Različite analize za merenje RAG1 i/ili RAG2 aktivnosti su poznate u tehnici i uključuju, na primer, merenje efikasnosti rekombinacije ili analizu prisustva ili odsustva B ćelija i/ili T ćelija kod subjekta. ;[0100] IL-2 receptor (IL-2R) je eksprimiran na površini određenih imunih ćelija i vezuje se za citokin interleukin-2 (IL-2). IL-2R je integralni membranski protein koji sadrži najmanje tri zasebna lanca podjedinice, uključujući, alfa lanac (IL-2Ra, CD25), beta lanac (IL-2Rb, CD122) i gama lanac (IL2-Rg, CD132). IL-2 receptor gama (takođe označen kao IL2r-y ili IL2Rg) lanac je zajednički gama lanac koji je zajednički za različite citokinske receptore, uključujući, na primer, receptore za IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21. IL-2Rg sadrži ektodomen na ekstracelularnoj površini ćelije, koji doprinosi vezivanju liganda, transmembranskog domena, i intracelularnog domena, koji može interagovati sa različitim molekulima za indukciju intracelularnih puteva prenosa signala. Il2rg gen se nalazi na X-hromozomu kod sisara i određene mutacije u genu gama lanca kod ljudi mogu izazvati humanu X-povezanu tešku kombinovanu imunodeficijenciju (XSCID) karakterisanu ozbiljnim T-ćelijskim defektima. Dodatno, ekto-domen gama lanca može se odbaciti od transmembranskog receptora i osloboditi kao rastvorljivi gama lanac receptor. Rastvorljivi gama lanac receptor može se detektovati u krvi subjekta i može funkcionisati da bi se regulisala citokinska signalizacija. ;[0101] U nekim primerima izvođenja, ne-humani IL-2Rg lanac je zamenjen sa humanim IL2-Rg lancem tako da genetički modifikovana životinja eksprimira potpuno humani IL-2Rg lanac. U drugim slučajevima, može biti korisno zameniti samo ektodomen ne-humanog IL-2Rg lanca sa ektodomenom humanog IL-2Rg lanca. U takvim slučajevima, rezultujući humanizovani IL-2Rg lanac eksprimiran ne-humano sadrži humani ektodomen, sa ostatakom molekula iz nativnog organizma. ;[0102] Humanizacija IL-2Rg pune dužine je korisna jer ne-humani sisari sa ovim modifikovanim lokusom će proizvoditi humani IL-2Rg. Ovo će omogućiti detekciju humanog IL-2Rg u nehumanim sisarima sa antitelima specifičnim za humani IL-2Rg. ekto-humanizacije (tj., zamena ekto-domena IL-2Rg ne-humanog sisara sa humanim ekto-domenom IL-2Rg) će rezultovati u IL-2Rg polipeptidu koji će vezati humane ligande za IL2-Rg, ali usled toga što je citoplazmatski domen još uvek iz ne-humanog sisara, ekto-humanizovani oblik IL-2Rg će takođe interagovati sa signalnom mašinerijom ne-humanog sisara. ;;2. Modifikacija ciljnog lokusa ;;A. Targeting vektori i insert nukleinskih kiselina ;;i. Insert nukleinske kiseline ;;[0103] Kao što je ovde korišćeno, "insert nukleinske kiseline" sadrži segment DNK po želji za integraciju na ciljnom lokusu. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više polinukleotida od interesa. U drugim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline može sadržati jednu ili više ekspresionih kaseta. Data ekspresiona kaseta može sadržati polinukleotid od interesa, polinukleotid koji kodrira selekcioni marker i/ili reporter gen zajedno sa različitim regulatornim komponentama koje utiču na ekspresiju. Neograničavajući primeri polinukleotida od interesa, selekcionih markera, i reporter gena koji se mogu uključiti unutar inserta nukleinske kiseline su detaljno razmatrani ovde na drugim mestima. ;[0104] U specifičnim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline može sadržati nukleinsku kiselinu pacova, koja može uključiti segment genomske DNK, cDNK, regulatorni region, ili biolo koji deo ili njegovu kombinaciju. U drugim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline može sadržati nukleinsku kiselinu od eukariota, ne-pacovskog eukariota, sisara, čoveka, nehumanog sisara, glodara, ne-pacovskog glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, goveda, jelena, ovce, koze, kokoške, mačke, psa, lasice, primata (npr., marmozeta, rezus majmuna), domestifikovane životinje, ili poljoprivrednog sisara ili bilo kog drugog organizma od interesa. Kao što je ovde dato detaljnije, insert nukleinske kiseline upotrebljen u različitim postupcima i kompozicijama može rezultovati u "humanizaciji" ciljnog lokusa od interesa. ;[0105] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži nok-in alel od najmanje jednog egzona endogenog gena. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži nok-in alel celog endogenog gena (tj., "geneswap knock-in"). ;[0106] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži regulatorni element, uključujući na primer, promotor, enhanser, ili transkripcioni represor-vezujući element. ;[0107] U sledećim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži uslovni alel. U jednom primeru izvođenja, uslovni alel je multifunkcionalni alel, kao što je opisano u SAD 2011/0104799. U specifičnim primerima izvođenja, uslovni alel sadrži: (a) aktuacionu sekvencu u sens orijentaciji u odnosu na transkripciju target gena, i drugu selekcionu kasetu u sens ili antisens orijentaciji; (b) nukleotidna sekvenca od interesa u antisens orijentaciji (NSI) i uslovno sa inverzionim modulom (COIN, koja koristi intron koji deli egzon i invertabilni modul sličan genskoj zamci; videti, na primer, US 2011/0104799; i (c) jedinice koje se mogu rekombinovati koje se rekombinuju po izlaganju prvoj rekombinazi da bi formirale uslovni alel kome (i) nedostaje aktuaciona sekvenca i DSC, i (ii) sadrži NSI u sens orijentaciji i COIN u antisens orijentaciji. ;[0108] Otkriće opisuje da insert nukleinske kiseline je u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;[0109] Ovo otkriće opisuje da insert nukleinske kiseline sadrži deleciju, na primer, sekvence genomske DNK eukariotske ćelije, ne-pacovske eukariotske ćelije, sisarske ćelije, humane ćelije ili ne-humane sisarske ćelije u opsegu od oko 1 kb do oko 200 kb, od oko 2 kb do oko 20 kb, ili od oko 0.5 kb do oko 3 Mb. stepen delecije genomske DNK sekvence je veći od ukupne dužine 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke. U jednom primeru izvođenja, stepen delecije sekvence genomske DNK je u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 70 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 110 kb do oko 120 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, od oko 190 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, od oko 350 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 800 kb, od oko 800 kb to 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb, do oko 2.5 Mb, od oko 2.5 Mb do oko 2.8 Mb, od oko 2.8 Mb do oko 3 Mb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb. ;[0110] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži inserciju ili zamenu eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, humane ili ne-humane sisarske sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži inserciju ili zamenu DNK sekvence sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline na endogenom lokusu koji sadrži odgovarajuću DNK sekvencu. ;[0111] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija je adicija sekvence nukleinske kiseline. Ovo otkriće opisuje da dodata nukleotidna sekvenca je u opsegu od 5 kb do 200 kb. ;[0112] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži genetičku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži delecionu mutaciju kodirajuće sekvence. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži fuziju dve endogene kodirajuće sekvence. Ovo otkriće opisuje da insert nukleinske kiseline sadrži inserciju ili zamenu eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, humane, ili ne-humane sisarske, sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline. Ovo otkriće opisuje da insert nukleinske kiseline sadrži inserciju ili zamenu DNK sekvence pacova sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline na endogenom lokusu pacova koji sadrži odgovarajuću DNK sekvencu pacova. ;[0113] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži deleciju ne-protein-kodirajuće sekvence, ali ne sadrži deleciju protein-kodirajuće sekvence. U jenom primeru izvođenja, delecija ne-protein-kodirajuće sekvence sadrži deleciju regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži deleciju promotora. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži adiciju promotora ili regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži zamenu promotora ili regulatornog elementa. ;[0114] Ovo otkriće opisuje da sekvenca nukleinske kiseline targeting vektora može sadržati polinukleotide koji kada su integrisani u genom će proizvesti genetičke modifikacije regiona sisarskog, humanog, ili ne-humanog sisarskog ApoE lokusa, naznačeno time da genetička modifikacija na ApoE lokusu rezultuje u smanjenju ApoE aktivnosti, povećanju ApoE aktivnosti, ili modulaciji ApoE aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, generisan je ApoE nokaut ("nulti alel). ;[0115] Ovo otkriće opisuje da sekvenca nukleinske kiseline targeting vektora može sadržati polinukleotid koji kada je integrisan u genom će proizvesti genetičku modifikaciju regiona sisarskog, humane ćelije, ili ne-humanog sisarskog interleukin-2 receptor lokusa, naznačeno time da genetička modifikacija na interleukin-2 receptor lokusu rezultuje u smanjenju interleukin-2 receptor aktivnosti. U jenom primeru izvođenja, generisan je interleukin-2 receptor nokaut ("nulti alel"). ;[0116] Otkriće opisuje da insert nukleinske kiseline rezultuje u zameni del sisarskog, humane ćelije, ili ne-humanog sisarskog ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa i/ili Rag2 lokusa, i/ili Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa sa odgovarajućim homologim ili ortologim delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0117] Sledeći primeri izvođenja, inserta nukleinske ksieline sadrže polinukleotid koji u punoj dužini ima zajedničko najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sa delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa koga zamenjuje. ;[0118] Ovo otkriće opisuje da dati insert polinukleotida i odgovarajući region sisarskog, humane ćelije, ili ne-humanog sisarskog lokusa koji je zamenjen može biti kodirajući region, intron, egzon, netranslatirani region, regulatorni region, promotor, ili enhanser ili bilo koja njihova kombinacija. Dodatno, dati insert polinukleotida i/ili region sisarskog, humane ćelije, ili nehumani sisarski lokus koji je deletiran može biti bilo koje željene dužine, uključujući, na primer, između 10-100 nukleotida dužine, 100-500 nukleotida dužine, 500-1 kb nukleotida dužine, 1 Kb do 1.5 kb nukleotida dužine, 1.5 kb do 2 kb nukleotida dužine, 2 kb to 2.5 kb nukleotida dužine, 2.5 kb do 3 kb nukleotida dužine, 3 kb do 5 kb nukleotida dužine, 5 kb do 8 kb nukleotida dužine, 8 kb do 10 kb nukleotida dužine ili više. U drugim slučajevima, veličina insercije ili zamene je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, od oko 350 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 800 kb, od oko 800 kb to 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb, do oko 2.5 Mb, od oko 2.5 Mb do oko 2.8 Mb, od oko 2.8 Mb do oko 3 Mb. Otkriće opisuje da dati insert polinukleotida i/ili region sisarskog, humane ćelije, ili ne-humani sisarski lokus koji je deletiran najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ili 900 nukleotida ili najmanje 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb ili veći. ;[0119] U jednom primeru izvođenja, promotor je konstitutivno aktivni promotor. ;[0120] U jednom primeru izvođenja, promotor je inducibilni promotor. U jednom primeru izvođenja, inducibilni promotor je hemijski regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, hemijski regulisani promotor je alkohol-regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, alkohol-regulisani promotor je promotor gena alkohol dehidrogenaze (alcA). U jednom primeru izvođenja, hemijski regulisani promotor je tetraciklin-regulisani promotor. U jenom primeru izvođenja, tetraciklin regulisani promotor je tetraciklin-responsivni promotor. U jednom primeru izvođenja, tetraciklin-regulisani promotor je tetraciklin operator sekvenca (tetO). U jednom primeru izvođenja, tetraciklin-regulisani promotor je tet-On promotor. U jednom primeru izvođenja, tetraciklin-regulisani promotor je tet-Off promotor. U jednom primeru izvođenja, hemijski regulisan promotor je steroidom regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, steroid regulisan promotor je promotor glukokortikoidnog receptora. U jednom primeru izvođenja, steroid regulisani promotor je promotor estrogen receptora. U jednom primeru izvođenja, steroid-regulisani promotor je promotor egdizon receptora. U jednom primeru izvođenja, hemijski regulisani promotor je metal-regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, metal-regulisani promotor je metaloprotein promotor. U jednom primeru izvođenja, inducibilni promotor je fizički-regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, fizičkiregulisani promotor je temperaturom-regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, temperaturom-regulisani promotor promotor toplotnog šoka. U jednom primeru izvođenja, fizički-regulisani promotor je lako-regulisani promotor. U jednom primeru izvođenja, lakoregulisani promotor je blago-inducibilni promotor. U jednom primeru izvođenja, laki-regulisani promotor je blago-represivni promotor. ;[0121] U jednom primeru izvođenja, promotor je tkivno-specifični promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je neuron specifični promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je glia-specifični promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za mišićnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za srčanu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za bubrežnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za koštanu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za endotelnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, promotor je promotor specifičan za imunu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, promotor imune ćelije je B ćelija promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor imune ćelije je T ćelijski promotor. ;[0122] U jednom primeru izvođenja, promotor je razvojno-regulisan promotor. U jednom primeru izvođenja, razvojno-regulisani promotor je aktivan samo tokom embrionalnog stadijuma razvića. U jednom primeru izvođenja, razvojno-regulisani promotor je aktivan samo u adultnoj ćeliji. ;[0123] Otkriće opisuje da promotor može biti izabran na osnovu tipa ćelije. Stoga različiti promotori nalaze upotrebu u eukariotskoj ćeliji, ne-pacovskoj eukariotskoj ćeliji, sisarskoj ćeliji, ne-humanoj sisarskoj ćeliji, pluripotentnoj ćeliji, ne-pluripotentnoj ćeliji, ne-humanoj pluripotentnoj ćeliji, humanoj pluripotentnoj ćeliji, humanoj ES ćeliji, humanoj adultnoj matičnoj ćeliji, razvojno-ograničenoj humanoj progenitorskoj ćeliji, humana iPS ćelija, humana ćelija, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćelija, pacovska ćelija, mišja ćelija, ćelija hrčka, fibroblast ili CHO ćelija. ;[0124] U nekim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži nukleinsku kiselinu flankiranu sa ciljnim sekvencama mesto specifične rekombinacije. Podrazumeva se da ceo insert nukleinske kiseline može biti flankiran sa takvim ciljnim sekvencama mesto specifične rekombinacije, bilo kojim regionom ili pojedinačnim polinukleotidom od interesa unutar inserta nukleinske kiseline može takođe biti flankiran takvim mestima. Rekombinaza specifična za mesto može se introdukovati u ćeliju na bilo koji način, uključujući preko introdukcije polipeptid rekombinaze u ćelije ili preko introdukcije polinukleotida koji kodira rekombinazu specifičnu za mesto u ćeliju domaćina. Polinukleotid koji kodira rekombinazu specifičnu za mesto može se locirati unutar inserta nukleinske kiseline ili unutar zasebnog polinukleotida. Rekombinaza specifična za mesto može biti operativno vezana za promotor aktivan u ćeliji uključujući, na primer, inducibilni promotor, promotor koji je endogen ćeliji, promotor koji je heterolog ćeliji, promotor specifičan za ćeliju, promotor specifičan za tkivo, ili promotor specifičan za razvojni stadijum. Ciljne sekvence rekombinacije specifične za mesto, koje mogu flankirati insert nukleinske kiseline ili bilo koji polinukleotid od interesa u insertu nukleinske kiseline mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, i njihovu kombinaciju. ;[0125] U nekim primerima izvođenja, rekombinaciona mesta specifična za mesto flankiraju polinukleotid koji kodira selekcioni marker i/ili reporter gen sadržan unutar insert nukleinske kiseline. U takvim slučajevima nakon integracije inserta nukleinske kiseline na ciljanim lokus sekvencama mesta između rekombinacije specifičnih za mesto se mogu ukloniti. ;[0126] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji kodira selekcioni marker. Selekcioni marker može se nalaziti u selekcionoj kaseti. Takvi selekcioni markeri uključuju, ali nisu ograničeni na, neomicin fosfotransferazu (neor), higromicin B fosfotransferazu (hygr), puromicin-N-acetiltransferazu (puror), blasticidin S deaminazu (bsrr), ksantin/guanin fosforibozil transferaza (gpt), ili herpes simpleks virus timidin kinazu (HSVk), ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid koji kodira selekcioni marker je operativno vezan za promotor aktivan u ćeliji, ćeliji pacova, pluripotentnoj ćeliji pacova, ES ćeliji pacova, eukariotskoj ćeliji, ne-pacovskoj eukariotskoj ćeliji, pluripotentnoj ćeliji, nepluripotentnoj ćeliji, ne-humanoj pluripotentnoj ćeliji, humanoj pluripotentnoj ćeliji, humanoj ES ćeliji, humanoj adultnoj embrionalnoj ćeliji, razvojno-ograničenoj humanoj progenitorskoj ćeliji, humanoj iPS ćeliji, sisarskoj ćeliji, ne-humanoj sisarskoj ćeliji, humanoj ćeliji, glodarskoj ćeliji, ne-pacovskoj glodarskoj ćeliji, ćeliji miša, ćeliji hrčka, fibroblastu, ili CHO ćeliji. Kada se serijski poređaju polinukleotidi od interesa u ciljani lokus, selekcioni marker može sadržati mesto prepoznavanja za nukleazno sredstvo, kao što je prethodno dato. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid koji kodira selekcioni marker je flankiran sa ciljnim sekvencama rekombinacije specifične za mesto. ;[0127] Insert nukleinske kiseline može dodatno sadržati reporter gen operativno vezan sa promotorom, naznačeno time da reporter gen kodira reporter protein izabran iz grupe koja se sastoji od ili sadrži LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, pojačani žuti fluorescentni protein (eYFP), Emerald, pojačani zeleni fluorescentni protein (EGFP), CyPet, cijan fluorescentni protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu, i/ili njihovu kombinaciju. Takvi reporter geni mogu biti operativno vezani sa promotorom aktivnim u ćeliji. Takav promotor može biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za reporter gen ili ćeliju, promotor koji je heterolog reporter genu ili ćeliji, promotor specifičan za ćeliju, promotor specifičan za tkivo, ili promotor specifičan za razvojni stadijum. ;[0128] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline može sadržati sisarsku nukleinsku kiselinu koja sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, cirkulatornom sistemu, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu, ili njihovoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u kostnoj srži ili ćeliji izvedenoj iz kostne srži. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u ćeliji slezine. ;[0129] U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, cirkulatornom sistemu, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu, ili njihovoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u kostnoj srži ili ćelije izvedene iz kostne srži. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u ćeliji slezine. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži sekvencu genomske DNK miša, sekvencu genomske DNK pacova, eukariotsku genomsku DNK sekvencu, ne-pacovsku eukariotsku genomsku DNK sekvencu, sisarsku genomsku DNK sekvencu, humanu genomsku DNK sekvencu, ili ne-humanu DNK sekvencu sisara, ili njihovu kombinaciju. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence pacova i čoveka. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence miša i čoveka. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence miša i pacova. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence pacov, miša i čoveka. ;[0130] Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži mišju genomsku DNK sekvencu, genomsku DNK sekvencu pacova, genomsku DNK sekvencu hrčka, humanu genomsku DNK sekvencu, eukariotsku genomsku DNK sekvencu, ne-pacovsku eukariotsku genomsku DNK sekvencu, sisarsku genomsku DNK sekvencu, ili ne-humanu DNK sekvencu sisara, ili njihovu kombinaciju. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence pacova i čoveka. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, mišje i humane genomske DNK sekvence. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence miša i pacova. Otkriće opisuje da genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, genomske DNK sekvence pacova, miša i čoveka. ;[0131] Otkriće opisuje da genetička modifikacija sadrži najmanje jedan alel humane bolesti humanog gena. Otkriće opisuje da je humana bolest neurološka bolest. Otkriće opisuje da je humana bolest kardiovaskularna bolest. Otkriće opisuje da je humana bolest bolest bubrega.Otkriće opisuje da je humana bolest bolest mišića. Otkriće opisuje da je humana bolest bolest krvi. Otkriće opisuje da je humana bolest kancer. Otkriće opisuje da je humana bolest imuna sistemska bolest. ;[0132] Otkriće opisuje da je alel humane bolesti dominantni alel. Otkriće opisuje da je alel humane bolesti recesivni alel. Otkriće opisuje da alel humane bolesti sadrži alel sa polimorfizmom jednog nukleotida (SNP). ;[0133] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi mutantni oblik proteina sa izmenjenim karakteristikama vezivanja, izmenjenom lokalizacijom, izmenjenom ekspresijom, i/ili izmenjenim obrascem ekspresije. ;[0134] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži selekcionu kasetu. U jednom primeru izvođenja, selekciona kaseta sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker, naznačeno time da je sekvenca nukleinske kiseline operativno vezana za promotor aktivan u ES ćeliji pacova. U jednom primeru izvođenja, selekcioni marker je izabran ili sadrži gen za rezistenciju na higromicin ili genom za rezistenciju na neomicin. ;[0135] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koij kodira protein eksprimiran u B ćeliji. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u nezreloj B ćeliji. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u zreloj B ćeliji. ;[0136] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži regulatorni element. U jednom primeru izvođenja, regulatorni element je promotor. U jednom primeru izvođenja, regulatorni element je enhanser. U jednom primeru izvođenja, regulatorni element je transkripcioni represor-vezujući element. ;[0137] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži deleciju sekvencu koja ne kodira protein, ali ne sadrži deleciju sekvencu koja kodira protein. U jednom primeru izvođenja, delecija sekvence koja ne kodira protein sadrži deleciju regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži deleciju regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, gentička modifikacija sadrži adiciju promotora ili regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži zamenu promotora ili regulatornog elementa. ;;ii. Ekspresione kasete ;;[0138] Ovde su obezbeđeni polinukleotidi ili molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže različite komponente upotrebljene u ciljanom genomskom integracionom sistemu obezbeđenom ovde (tj., bilo koji od ili bilo koja kombinacija nukleaznih sredstava, mesta prepoznavanja, inserta nukleinskih kiselina, polinukleotida od interesa, vektora sa ciljanim dejstvom, selekcionih markera, i drugih komponenti). ;[0139] Termin "polinukleotid," "polinukleotidna sekvenca," sekvenca nukleinske kiseline," i "fragment nukleinske kiseline" korišćeni su ovde naizmenično. Ovi termini obuhvataju nucleotidne sekvence i slično. Polinukleotidi mogu biti polimer RNK ili DNK koji je ejdnolančan ili dvolančan, koji izborno sadrži sintetičke, ne-prirodne ili izmenjene nukleotidne baze. Polinukleotid u obliku polimera DNK može se sadržati od jednog ili više segmenata cDNK, genomske DNK, sintetičke DNK, ili njihovih smeša. Polinukleotidi mogu sadržati dezoksiribonukleotide i ribonukleotide koji uključuju i prirodne molekule i sintetičke analoge, i bilo koju njihovu kombinaciju. Ovde obezbeđeni polinukleotidi takođe obuhvataju sve oblike sekvenci uključujući, ali se ne ograničavajući na, jednolančane oblike, dvolančane oblike, ukosnice, stablo-i-petlja strukture, i slično. ;[0140] Dodoatno su obeubeđeni rekombinantni polinukleotidi koji sadrže različite komponente ciljanog sistema za genomsku integraciju. Termini "rekombinantni polinukleotid" i "rekombinantni DNK konstrukt" ovde su korišćeni naizmenično. Rekombinantni konstrukt sadrži veštačku ili heterolognu kombinaciju sekvenci nukleinske kiseline, npr., regulatorne i kodirajuće sekvence koe se ne nalaze zajedno u prirodi. U drugim primerima izvođenja, rekombinantni konstrukt može sadržati regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence koje su izvedene iz različitih izvora, ili regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence izvedene iz istog izvora, ali aranžirane na način različit od onoga koji se nalazi u prirodi. Takva konstrukt se može koristiti zasebno ili se može korisiti zajedno sa vektorom. Ukoli je korišćen vektor, onda je izbor vektora zavisan od postupka koji je korišćen da transformiše ćelije domaćine kao što je dobro poznato stručnjacima. Na primer, može se koristiti plazmidni vektor. Takođe su obezbeđeni neophodni genetički elementi da se uspešno transformišu, izaberu, i propagiraju ćelije domaćini koje sadrže bilo koji od izolovanih fragmenta nukleinske kiseline obezbeđenih. Skrining se može postići, između ostalog, Southern analizom DNK, Northern analizom iRNK ekspresije, imunobloting analizom ekspresije proteina, ili fenotimskom analizom. ;[0141] U specifičnim primerima izvođenja, jedna ili više komponenata ciljanog sistema za genomsku integraciju opisanog ovde može se obezbediti u ekspresionoj kaseti za ekspresiju u prokariotskoj ćeliji, eukariotskoj ćeliji, ne-pacovskoj eukariotskoj ćeliji, bakterijskoj, ćeliji kvasca, ili sisarskoj ćeliji ili drugom organizmu ili tipu ćelije od interesa. Kaseta može uključivati 5’ i 3’ regulatorne sekvence operativno vezane sa polinukleotidom obezbeđenim ovde. "Operativno vezan" sadrži međusobni odnos naznačen time da komponentne operativno vezane funkcionišu na nameravani način. Na primer, operativna veza između polinukleotida od interesa i regulatorne sekvence (tj., promotora) je funkcionalna veza koja omogućava ekspresiju polinukleotida od interesa. Operativno vezani elementi mogu biti neprekidni ili isprekidani. Kada se korisiti u odnosu na spajanje dva protein kodirajuća regiona, operativno vezan označava da su kodirajući regioni u istom okviru čitanja. U sledećem slučaju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može biti operativno vezana sa regulatornim sekvencama (npr., promotorom, enhanserom, utišavajućom sekvencom, itd.) tako da bi se zadržala ispravna transkripciona regulacija. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona (ili V(D)J segmenti) imunoglobulina mogu biti operativno vezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulina tako da bi se omogućilal ispravna rekombinacija između sekvenci u sekvencu teškog ili lakog lanca imunoglobulina. ;[0142] Kasete mogu dodatno sadržati najmanje jedan dodatni polinukleotid od interesa koji će se ko-introdukovati u organizam. Alternativno, doatni polinukleotid od interesa može se obezbediti na više ekspresionih kaseta. Takva ekspresiona kaseta je obezbeđena sa više restrikcionih mesta i/ili rekombinacionih mesta za inserciju rekombinantnog polinukleotida koji će biti pod transkripcionom regulacijom regulatornih regiona. Ekspresiona kaseta može dodatno sadržati gene selekcionih markera. ;[0143] Ekspresiona kaseta može uključivati u 5’-3’ smeru transkripcije, transkripcioni i translacioni inicijacioni region (tj., promotor), ovde obezbeđeni rekombinantni polinukleotid, i transkripcioni i translacioni terminacioni region (tj., terminacioni region) funkcionalan u sisarskoj ćeliji ili ćeliji domaćinu od interesa. Regulatorni regioni (tj., promotori, transkripcioni regulatorni regioni, i translacioni terminacioni regioni) i/ili polinukleotid obezbeđen ovde može biti nativan/analog ćeliji domaćinu ili međusobno. Alternativno, regulatorni regioni i/ili polinukleotid obezbeđeni ovde mogu biti heterologni ćeliji domaćinu ili međusobno. Na primer, promotor operativno vezan za heterlogni polinukleotid je od vrste različite od vrste iz koje je izveden polinukleotid, ili, ako je iz iste/analogne vrste, jedan ili oba su značajno modifikovani u odnosu na njihov originalni oblik i/ili genomski lokus, ili promotor nije nativni promotor za operativno vezani polinukleotid. Alternativno, regulatorni regioni i/ili rekombinantni polinukleotid obezbeđen ovde može biti u potpunosti sintetički. ;[0144] Terminacioni region može biti nativan sa inicijacionim regionom transkripcije, može biti nativan sa operativno vezanim rekombinantnim polinukleotidom, može biti nativan sa ćelijom domaćinom, ili može biti izveden iz drugog izvora (tj., stranog ili heterolognog) sa promotorom, rekombinantnim polinukleotidom, ćelijom domaćinom, ili bilo kojom njihovm kombinacijom. ;[0145] Pri pripremi ekspresione kasete, različitim DNK fragmentima može se manipulisati, tako da se obezbede DNK sekvence u ispravnoj orijentaciji. U tu svrhu, mogu se upotrebiti adapteri ili linkeri da bi se spojili DNK fragmenti ili mogu biti uključene druge manipulacije da bi se obezbedila pogodna restrikciona mesta, uklanjanje suvišne DNK, uklanjanje restrikcionih mesta, ili slično. U tu svrhu, mogu biti uključene in vitro mutageneza, popravka prajmera, restrikcija, aniling, resupstitucije, npr., tranzicije i transverzije. ;[0146] Određen broj promotora može se koristiti u ekspresionim kasetama obezbeđenim ovde. Promotori mogu biti izabrani na osnovu željenog ishoda. Prepoznato je da različite primene mogu biti pojačane korišćenjem različitih promotora u ekspresionim kasetama da se modulira tajming, lokacija i/ili nivo ekspresije polinukleotida od interesa. Takvi ekspresioni konstrukti mogu takođe sadržati, ukoliko je poželjno, regulatorni region promotora (npr., onaj koji daje inducibilnu, konstitutivnu, sredinski- ili razvojno-regulisanu, ili ćelija- ili tkivno-specifičnu/selektivnu ekspresiju), početno mesto transkripcione inicijacije, mesto vezivanja ribozoma, signal za obradu RNK, mesto terminacije transkripcije, i/ili poliadenilacioni signal. ;[0147] Ekspresiona kaseta koja sadrži polinukleotide obezbeđene ovde može takođe sadržati gen selekcionog markera za selekciju transformisanih ćelija. Geni selektabilnih markera se koriste za selekciju transformisanih ćelija ili tkiva. ;[0148] Gde je odgovarajuće, sekvence upotrebljene u postupcima i kompozicijama (tj., polinukleotid od ineteresa, nukleazno sredstvo, itd.) mogu biti optimizovani za povećanu ekspresiju u ćeliji. Odnosno, mogu se sintetisati geni koji koriste kodone poželjne u datoj ćeliji od interesa uključujući, na primer, sisarski-poželjni kodoni, humano-poželjni kodoni, glodarskipoželjni kodoni, ne-pacovski-glodarski-poželjni kodoni, mišji-poželjni kodoni, pacovski-poželjni kodoni, hrčak-poželjni kodoni, itd. za poboljšanu ekspresiju. ;[0149] Različiti postupci i kompozicije obezbeđeni ovde mogu koristiti selekcione markere. Različiti selekcioni markeri mogu se korisiti u postupcima i kompozicijama otkrivenim ovde. Takvi selekcioni markeri mogu, na primer, dati rezistenciju na antibiotik G418, higromicin, blasticidin, neomicin, ili puromicin. Takvi selekcioni markeri uključuju neomicin fosfotransferazu (neor), higromicin B fosfotransferazu (hygr), puromicin-N-acetiltransferazu (puror), i blasticidin S deaminazu (bsrr). U drugim primerima izvođenja, selekcioni marker je operativno vezan sa inducibilnim promotorom i ekspresija selekcionog markera je toksična za ćeliju. Ne-ograničavajući primeri takvih selekcionih markera uključuju ksantin/guanin fosforibozil transferazu (gpt), hipoksantin-guanine fosforibozil transferazu (HGPRT) ili timidin kinazu herpes simpleks virusa (HSV-TK). Polinukleotid koji kodira selekcione markere su operativno vezani sa promotorom aktivnim u ćeliji. ;;iii. Targeting vektori ;;[0150] Targeting vektori su korišćeni da introdukuju insert nukleinske kiseline u ciljni lokus pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili nukleinske kiseline hrčka. Targeting vektor sadrži insert nukleinske kiseline i dodatno sadrži 5’ i 3’ homologu ruku, koja flankira insert nukleinske kiseline. Homologe ruke, koje flankiraju flank insert nukleinske kiseline, odgovaraju regionima unutar ciljnog lokusa pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili nukleinske kiseline hrčka. Radi lakoće označavanja, odgovarajući srodni genomski regioni unutar ciljanog genomskog lokusa se ovde označavaju kao "ciljna mesta". Na primer, targeting vektor može sadržati prvi insert nukleinske kiseline flankiran sa prvom i drugom homologom rukom komplementarnom prvom i drugom ciljnom mestu. Kao takav, targeting vektor na taj način pomaže u integraciji inserta nukleinske kiseline u ciljni lokus pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, nehumane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili nukleinske kiseline hrčka preko homologe rekombinacije koja se dešava između homologe ruke i komplementarnih ciljnih mesta unutar genoma ćelije. ;[0151] Otkriće opisuje da ciljni lokus pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, nehumane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili nukleinske kiseline hrčka sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna 5’ homologoj ruci i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna 3’ homologoj ruci. U jednom primeru izvođenja, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su razdvojene sa najmanje 5 kb. U sledećem primeru izvođenja, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 200 kb. U jednom primeru izvoeđenja, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su razdvojene sa najmanje 10 kb. U jednom primeru izvođenja, prbva i druga sekvenca nukleinske kiseline su razdvojene sa najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 110 kb, najmanje 120 kb, najmanje 130 kb, najmanje 140 kb, najmanje 150 kb, najmanje 160 kb, najmanje 170 kb, najmanje 180 kb, najmanje 190 kb, ili najmanje 200 kb. U sledećim primerima izvođenja, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od 2.5 Mb, najmanje oko 2.5 Mb ali manje od 3 Mb, ili najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 3 Mb. ;[0152] Homologa ruka targeting vektora može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše homologu rekombinaciju sa odgovarajućim ciljnim mestom, uključujući na primer, najmanje 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb dužine ili veće. Kao što je detaljnije dato u nastavku, veliki targeting vektori mogu upotrebiti targeting ruke veće dužine. U specifičnom primeru izvođenja, ukupna suma 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke je najmanje 10 kb ili ukupna suma 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke je najmanje oko 16 kb do oko 100 kb ili oko 30 kb do oko 100 kb. U drugim primerima izvođenja, veličina ukupne sume 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je oko 10 kb do oko 150 kb, oko 10 kb do oko 100 kb, oko 10 kb do oko 75 kb, oko 20 kb do oko 150 kb, oko 20 kb do oko 100 kb, oko 20 kb do oko 75 kb, oko 30 kb do oko 150 kb, oko 30 kb do oko 100 kb, oko 30 kb do oko 75 kb, oko 40 kb do oko 150 kb, oko 40 kb do oko 100 kb, oko 40 kb do oko 75 kb, oko 50 kb do oko 150 kb, oko 50 kb do oko 100 kb, ili oko 50 kb do oko 75 kb, oko 10 kb do oko 30 kb, oko 20 kb do oko 40 kb, oko 40 kb do oko 60 kb, oko 60 kb do oko 80 kb, oko 80 kb do oko 100 kb, oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do oko 150 kb. U jednom primeru izvođenja, veličina delecije je ista ili slična veličini ukupne sume 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC. ;[0153] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus od interesa sadrži (i) 5’ target sekvencu koja je homologa 5’ homologoj ruci; i (ii) 3’ target sekvencu koja je homologa 3’ homologoj ruci. U jednom primeru izvođenja, 5’ target sekvenca i 3’ target sekvenca su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. U dodatnim primerima izvođenja, 5’ target sekvenca i 3’ target sekvenca su razdvojene sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od 2.5 Mb, najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb, ili najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 3 Mb. ;[0154] Kada se koriste nukleazna sredstva, srodni genomski regioni koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama targeting vektora se "nalaze u dovoljnoj blizini" ciljnih mesta nukleaze tako da promovišu pojavu homologe rekombinacije između srodnih genomskih regiona i homologe ruke na zarezu ili prelomu dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja. Na primer, ciljna mesta nukleaze mogu se nalaziti bilo gde između srodnih genomskih regiona koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukama. U specifičnim primerima izvođenja, mesto prepoznavanja je u neposrednom susedstvu najmanje jednog ili oba srodna genomska regiona. ;[0155] Kao što je ovde korišćeno, homologa ruka i ciljno mesto (tj., srodni genomski region) "komplement" ili su "komplementarni" međusobno kada dva regiona dele dovoljan nivo međusobne identičnosti sekvence da bi delovali kao supstrati za reakciju homologe rekombinacije. Pod "homologijom" podrazumevaju se DNK sekvence koje su ili identične ili dele identičnost sekvence sa odgovarajućom ili "komplementarnom" sekvencom. Identičnost sekvenci između datog ciljnog mesta i odgovarajuće homologe ruke koja se nalazi na targeting vektoru može biti bilo kog stepena identičnosti sekvence koji omogućava da se odigra homologa rekombinacija. Na primer, količina identičnosti sekvence koju dele homologa ruka targeting vektora (ili njegovog fragmenta) i ciljnog mesta (ili njegovog fragmenta) može biti najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, tako da sekvence podležu homologoj rekombinaciji. Dodatno, komplementarni region homologije između homologe ruke i komplementarnog ciljnog mesta mogu biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše homologu rekombinaciju na isečenom mestu rekombinacije. Na primer, data homologa ruka i/ili komplementarno ciljno mesto može sadržati komplementarni region homologije koji je najmanje 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb, 200 kb do 300 kb dužine ili veći (kao što je opisan u LTVEC vektorima opisanim ovde na drugim mestima) tako da homologa ruka ima dovoljnu homologiju da podleže homologoj rekombinaciji sa odgovarajućim ciljnim mestima unutar genoma ćelije. Za lakše označavanje homologe ruke su ovde označene kao 5’ i 3’ homologe ruke. Ova terminologija se odnosi na relativni položaj homologe ruke prema insertu nukleinske kiseline unutar targeting vektora. ;[0156] Homologe ruke targeting vektora su stoga dizajnirane da budu komplementarne ciljnom mestu sa ciljnim lokusom. Stoga, homologe ruke mogu biti komplementarne lokusu koji je nativan ćeliji, ili alternativno mogu biti komplementarne regionu heterologog ili egzogenog segmenta DNK koji je integrisan u genom ćelije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, transgene, ekspresione kasete, ili heterologne ili egzogene regione genomske DNK. Alternativno, homologe ruke targeting vektora mogu biti komplementarne regionu humanog veštačkog hromozoma ili bilo kog drugog inženjeringom dobijenog genomskog regiona koji se nalazi u odgovarajućoj ćeliji domaćinu. Dodatno, homologe ruke targeting vektora mogu biti komplementarne ili mogu biti izvedene iz regiona BAC biblioteke, kozmid biblioteke, ili P1 fag biblioteke. Stoga, ovo otkriće opisuje homologe ruke targeting vektora koje su komplementarne pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili genomskom lokusu hrčka koji je nativan, heterolog ili egzogen datoj ćeliji. U dodatnim primerima izvođenja, homologe ruke su komplementarne pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, nepacovske glodarske, mišje ili genomskom lokusu hrčka na koji se ne može ciljno delovati korišćenjem konvencionalnog postupka ili se može ciljano delovati samo nekorektno ili samo sa značajno niskom efikasnošću, u odsustvu zareza ili prekida dvostrukog lanca indukovanog sa nukleaznim sredstvom. U jednom primeru izvođenja, homologe ruke su izvedene iz sintetičke DNK. ;[0157] U dodatnim drugim primerima, 5’ i 3’ homologe ruke su komplementarne istom genomu kao što je ciljni genom. U jednom primeru, homologe ruke su iz srodnog genoma, npr., ciljni genom je genom pacova prvog soja, i targeting ruke su iz genoma pacova drugog soja, naznačeno time da prvi i drugi soj su različiti. U drugom primeru, homologe ruke su iz genoma iste životinje ili su iz genoma istog soja, npr., ciljni genom je genom pacova prvog soja, i targeting ruke su od genoma pacova od istog pacova ili od istog soja. ;[0158] Targeting vektor (kao što je veliki targeting vektor) može takoše sadržati selekcionu kasetu ili reporter gen kao što je ovde razmatrano na drugim mestima. Selekciona kaseta može sadržati sekvencu nukleonske kiseline koja kodira selekcioni marker, naznačeno time da je sekvenca nukleinske kiseline operativno vezana sa promotorom. Promotor može biti aktivan u prokariotskoj ćeliji od interesa i/ili aktivan u eukariotskoj ćeliji od interesa. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen reporter genu ili ćeliji, promotor koji je heterolog reporter genu ili ćeliji, promotor specifičan za ćeliju, promotor specifičan za tkivo ili promotor specifičan za razvojni stadijum. U jednom primeru izvođenja, selekcioni marker je izabran od ili sadrži neomicin fosfotransferazu (neor), higromicin B fosfotransferazu (hygr), puromicin-N-acetiltransferazu (puror), blasticidin S deaminazu (bsrr), ksantin/guanin fosforibozil transferazu (gpt), i timidin kinazu herpes simpleks virusa (HSV-k), i/ili njihovu kombinaciju. Selekcioni marker targeting vektora može biti flankiran sa 5’ i 3’ homologim rukama ili se može nalaziti ili 5’ ili 3’ u odnosu na homologe ruke. ;[0159] U jednom primeru izvođenja, targeting vektor (kao što je veliki targeting vektor) sadrži reporter gen operativno vezan sa promotorom, naznačeno time da reporter gene kodira reporter protein izabran iz grupe koja se sastoji od ili sadrži LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Emerald, enhanced green fluorescent protein (EGFP), CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu, i/ili njihovu kombinaciju. Takvi reporter geni mogu biti operativno vezani sa promotorom aktivnim u ćeliji. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za report gen ili ćeliju, promotor koji je heterolog reporter genu ili ćeliji, promotor specifičan za ćeliju, promotor specifičan za tkivo ili promotor specifičan za razvojni stadijum. ;[0160] U jednom primeru izvođenja, kombinovana upotreba targeting vektora (uključujući, na primer, veliki targeting vektor) sa nukleaznim sredstvom rezultuje u povećanoj ciljanoj efiaksnosti u poređenju sa upotrebom targeting vektora zasebno. U jednom primeru izvođenja, kada se koristi targeting vektor zajedno sa nukelaznim sredstvom, efikasnost ciljanog dejstva targeting vektora je povećana najmanje dva puta, najmanje tri puta, ili najmanje četiri puta u poređenju sa korišćenjem targeting vektor zasebno. ;[0161] Kada se koristi targeting vektor, dizajn vektora prema ovom otkriću može biti takav da se omogući insercija date sekvence koja je od oko 5 kb do oko 200 kb kao što je ovde opisano. U jednom primeru, insercija je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 110 kb do oko 120 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, ili od oko 190 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;[0162] Kada se upotrebljava targeting vektor, dizajn vektora može biti takav da omogući zamenu date sekvence koja je od oko 5 kb do oko 200 kb ili od oko 5 kb do oko 3.0 Mb kao što je ovde opisano. U jednom primeru, zamena je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 110 kb do oko 120 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb to oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, od oko 190 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb. ;[0163] U jednom primeru izvođenja, targeting vektor sadrži gen rekombinaze specifične za mesto. U jednom primeru izvođenja, gen rekombinaze specifične za mesto kodira Cre rekombinazu. U jednom primeru izvođenja, gen Cre rekombinaze je Crei, naznačen time da dva su dva egzona koja kodiraju Cre rekombinazu razdvojena intronom da bi se sprečila njena ekspresija u prokariotskoj ćeliji. ;[0164] U jednom primeru izvođenja, gen Cre rekombinaze dodatno sadrži signal za jedarnu lokalizaciju da bi se olakšala lokalizacija Cre (ili bilo koje rekombinaze ili nukleaznog sredstva) u jedru (npr., gen je NL-Cre gen). U specifičnom primeru izvođenja, gen Cre rekombinaze dodatno sadrži signal za jedarnu lokalizaciju i intron (npr., NL-Crei). ;[0165] U različitim primerima izvođenja, pogodni promotor za ekspresiju nukleaznog sredstva (uključujući Cre ili Crei rekombinazu razmatranu prethodno) je izabran od ili sadrži Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, i/ili Pax3. U specifičnom primeru izvođenja, promotor je Gata6 ili Gata4 promotor. različiti promotori mogu biti od bilo kog organizma, uključujući na primer, glodare kao što su pacov ili miš, ne-pacovski glodar, eukariot, ne-pacovski eukariot, nehumani sisar, sisar, čovek ili hrčak. U drugom specifičnom primeru izvođenja, promotor je Prm1 promotor. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je Prm1 promotor pacova. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je Prm1 promotor miša. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je Blimp1 promotor ili njegov fragment, npr., 1 kb ili 2 kb fragment Blimp1 promotora. Videti, na primer, U.S. Patent 8,697,851 i U.S. prijava objava 2013-0312129. ;;iv. Veliki targeting vektori ;;[0166] Termin "veliki targeting vektor" ili "LTVEC" kao što je ovde korišćeno sadrži velike targeting vektore koji sadrže homologe ruke koje odgovaraju i izvedene su iz sekvenci nukleinske kiseline veće od onih koje se tipično koriste u drugim pristupima namenjenim da izvedu homologi targeting u ćelijama i/ili koje sadrže insert nukleinske kiseline koji sadrži sekvence nukleinske kiseline veće od onih koje se tipično koriste u drugim pristupima nameravanim da izvedu targeting homologe rekombinacije u ćelijama. Na primer, LTVEC omogućavaju modifikaciju velikih lokusa koji se ne mogu smestiti u tradicionalne targeting vektore na plazmidnoj osnovi usled njihovih ograničenja u pogledu veličine. U specifičnim primerima izvođenja, homologe ruke i/ili insert nukleinske kiseline iz LTVEC sadrži genomsku sekvencu eukariotske ćelije ili ne-pacovske eukariotske ćelije. Veličina LTVEC je prevelika da omogući skrining targeting događaja konvencionalnim analizama, npr., southern bloting i long-range (npr., 1 kb-5 kb) PCR. Primeri LTVEC, uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore izvedene iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), humanog veštačkog hromozoma ili veštačkog hromozoma kvasca (YAC). Neograničavajući primeri LTVECs i postupci za njihovo pravljenje su opisani, npr., u US Pat. No. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, i WO 2002/036789 (PCT/USO1/45375), i US 2013/0137101. ;[0167] Otkriće opisuje da LTVEC može biti bilo koje dužine, uključujući, ali se ne ograničavajući na, od oko 20 kb do oko 400 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb to 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 75 kb, od oko 75 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb to 125 kb, od oko 125 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 175 kb, oko 175 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 225 kb, od oko 225 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 275 kb ili od oko 275 kb do oko 300 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, od oko 350 kb do oko 400 kb, od oko 350 kb do oko 550 kb. U jednom primeru izvođenja, LTVEC je oko 100 kb. ;[0168] U nekim primerima izvođenja, LTVEC je najmanje 10 kb, najmanje 15 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb ili najmanje 200 kb. ;[0169] U nekim primerima izvođenja, LTVEC sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb ili najmanje 200 kb. ;[0170] Otkriće opisuje da LTVEC sadrži insert nukleionske kiseline u raponu od oko 5 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 0.5 kb do oko 30 kb, od oko 0.5 kb do oko 40 kb, od oko 30 kb do oko 150 kb, od oko 0.5 kb do oko 150 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, ili od oko 190 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;[0171] U jednom primeru izvođenja, LTVEC sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb. ;[0172] Kada se primenjuje LTVEC, dizajn vektora može biti takav da omogući zamenu date sekvence koja je od oko 5 kb do oko 200 kb ili od oko 5 kb do oko 3 Mb kao što je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, zamena je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 110 kb do oko 120 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, od oko 190 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb. ;[0173] U jednom primeru izvođenja, homologe ruke of LTVEC su izvedene iz BAC biblioteke, kozmidne biblioteke, ili P1 fag biblioteke. U drugim primerima izvođenja, homologe ruke su izvedene iz ciljanog genomskog lokusa ćelije i u nekim slučajevima ciljno deluju na genomski lokus, pri čemu je LTVEC dizajniran da ciljno deluje što nije moguće postići korišćenjem konvencionalnog postupka. U sledećim primerima izvođenja, homologe ruke su izvedene iz sintetičke DNK. ;[0174] U jednom primeru izvođenja, ukupna suma 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke u LTVEC je najmanje 10 kb. U drugim primerima izvođenja, ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 10 kb do oko 30 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, from 100 kb do oko 120 kb, od oko 120 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 200 kb. U jednom primeru izvođenja ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 30 kb do oko 100 kb. U drugim primerima izvođenja, veličina ukupne sume 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je oko 10 kb do oko 150 kb, oko 10 kb do oko 100 kb, oko 10 kb do oko 75 kb, oko 20 kb do oko 150 kb, oko 20 kb do oko 100 kb, oko 20 kb do oko 75 kb, oko 30 kb do oko 150 kb, oko 30 kb do oko 100 kb, oko 30 kb do oko 75 kb, oko 40 kb do oko 150 kb, oko 40 kb do oko 100 kb, oko 40 kb do oko 75 kb, oko 50 kb do oko 150 kb, oko 50 kb do oko 100 kb, ili oko 50 kb do oko 75 kb, oko 10 kb do oko 30 kb, oko 20 kb do oko 40 kb, oko 40 kb do oko 60 kb, oko 60 kb do oko 80 kb, oko 80 kb do oko 100 kb, oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do oko 150 kb. U jednom primeru izvođenja, veličina delecije je ista ili slična veličini ukupne sume 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC. ;[0175] U drugim primerima izvođenja, 5’ homologa ruka je u rasponu od oko 5 kb do oko 100 kb. U jednom primeru izvođenja, 3’ homologa ruka je u rasponu od oko 5 kb do oko 100 kb. U drugim primerima izvođenja, ukupna suma 5’ i 3’ homologih ruku je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 70 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 110 kb do oko 120 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, od oko 190 kb do oko 200 kb, ili od oko 30 kb do oko 100 kb, oko 10 kb do oko 30 kb, oko 20 kb do oko 40 kb, oko 40 kb do oko 60 kb, oko 60 kb do oko 80 kb, oko 80 kb do oko 100 kb, oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do oko 150 kb. ;[0176] U jednom primeru izvođenja, LTVEC sadrži insert nukleinske kiseline koji je homolog ili ortolog sekvenci nukleinske kiseline pacova flankiranoj sa LTVEC homologim rukama. U jednom primeru izvođenja, insert sekvenca nukleinske kiseline je iz vrste različite od pacova. U jednom primeru izvođenja, insert sekvenca nukleinske kiseline je iz eukariota. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline koji je homolog ili ortolog sekvenci nukleinske kiseline pacova je sisarska nukleinska kiselina. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline koji je homolog ili ortolog sekvenci nukleinske kiseline pacova je ne-humana sisarska nukleinska kiselina. U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina je nukleinska kiselina miša. U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina je humana nukleinska kiselina. U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina je nukleinska kiselina hrčka. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline je genomska DNK. U jednom primeru izvođenja, insert je 5 kb do 200 kb kao što je prethodno opisano. ;[0177] U jednom primeru izvođenja, LTVEC sadrži selekcionu kasetu ili reporter gen. Različiti oblici selekcione kasete i reporter gena koji se mogu upotrebiti razmatrani su ovde na drugim mestima. Kao što je opisano ovde na drugim mestima, LTVEC takođe može biti korišćen u postupcima obezbeđenim ovde u kombinaciji sa nukleaznim sredstvom koji promoviše homologu rekombinaciju između targeting vektora i ciljnog lokusa pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili nukleinske kiseline hrčka kod pluripotentne ili ne-pluripotentne ćelije pacova, eukariotske, nepacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili ćelije hrčka. ;[0178] U jednom primeru izvođenja, veliki targeting vektor (LTVEC) sadrži gen rekombinaze specifične za mesto. U jednom primeru izvođenja, gen rekombinaze specifične za mesto kodira Cre rekombinazu. U jednom primeru izvođenja, gen Cre rekombinaze je Crei, naznačen time da su dva egzona koja kodiraju Cre rekombinazu razdvojena intronom da bi se sprečila njegova ekspresija u prokariotskoj ćeliji. U jednom primeru izvođenja, gen Cre rekombinaze dodatno sadrži signal za jedarnu lokalizaciju da bi se olakšala lokalizacija Cre (ili bilo koje rekombinaze ili nukelaznog sredstva) u jedru (npr., gen je NL-Cre gen). U specifičnom primeru izvođenja, gen Cre rekombinaze dodatno sadrži signal za lokallizaciju u jedru i intron (npr., NL-Crei) ;[0179] U različitim primerima izvođenja, pogodni promotor za ekspresiju nukleaznog sredstva (uključujući Cre ili Crei rekombinazu razmatranu prethodno) je izabran od ili sadrži Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, i/ili Pax3. U specifičnom primeru izvođenja, promotor je Gata6 ili Gata4 promotor. Različiti promotori mogu biti od bilo kog organizma, uključujući na primer, glodara kao što su miš ili pacov, ne-pacovski glodar, eukariot, ne-pacovski eukariot, nehumani sisar, sisar, čovek ili hrčak. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je Prm1 promotor. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je rat Prm1 promotor. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je Prm1 promotor miša. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, promotor je Blimp1 promotor ili njegov fragment, npr., 1 kb ili 2 kb fragment Blimp1 promotora. Videti, na primer, U.S. Patent 8,697,851 i U.S. objavu prijave 2013-0312129. ;[0180] U jednom primeru izvođenja, LTVEC sadrži insert nukleinske kiseline koji može proizvesti deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona ApoE lokusa, Il2rg lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili hrčka kao što je ovde na drugim mestima detaljno razmatrano. U specifičnom primeru izvođenjas, genetička modifikacija na ApoE lokusu rezultuje u smanjenju, povećanju ili modulaciji ApoE aktivnosti, IL-2Rg aktivnosti, Rag2 aktivnosti, Rag1 aktivnosti i/ili Rag2 i Rag1 aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, ApoE nokaut, i Il2rg nokaut, Rag2 nokaut, Rag1 nokaut, Rag2/Rag1 nokaut je stvoren. Kao što je razmatrano u nastavku, nukelazna sredstva mogu se upotrebiti sa bilo kojim LTVEC targeting sistemima za ciljno delovanje na bilo koji genomski lokus od interesa. ;[0181] U sledećem primeru izvođenja, genom je izložen Cas proteinu i CRISPR RNK u prisustvu velikog targeting vektora (LTVEC) koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 10 kb. U takvim slučajevima, nakon izlaganja Cas proteinu, CRISPR RNK, i LTVEC, genom je modifikovan da sadrži najmanje 10 kb sekvencu nukleinske kiseline. U specifičnim primerima izvođenja, LTVEC sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb ili najmanje 200 kb. ;;v. Nukleazna sredstva i mesta prepoznavanja za nuklezna sredstva ;;[0182] Kao što je navedeno u ovom otkriću, nukleazna sredstva se mogu upotrebiti u postupcima i kompozicijama otkrivenim ovde da bi se pomoglo u modifikaciji ciljnog lokusa i u prokariotskoj ćeliji ili unutar pluripotentne ili ne-pluripotentne ćelije pacova, eukariotske, nepacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje ili ćelije hrčka. Takvo nukleazno sredstvo može promovisati homologu rekombinaciju između targeting vektora i ciljnog lokusa. U jednom primeru izvođenja, nukelazno sredstvo sadrži endonukleazno sredstvo. ;[0183] Kao što je ovde korišćeno, termin "mesto prepoznavanja za nukelazno sredstvo " sadrži DNK sekvencu na kome je zarez ili prekid dvostrukog lanca indukovan nukelaznim sredstvom. Mesto prepoznavanja za nukelazno sredstvo može biti endogeno (ili nativno) ćeliji ili mesto prepoznavanja može biti egzogeno ćeliji. U specifičnim primeroma izvođenja, mesto prepoznavanja je egzogeno u odnosu na ćeliju i na taj način nije prirodno u genomu ćelije. U sledećim primerima izvođenja, mesto prepoznavanja je egzogeno u odnosu na ćeliju i u odnosu na polinukleotide od interesa koji se žele smestiti u ciljni genomski lokus. U sledećim primerima izvođenja, egzogeno ili endogeno mesto prepoznavanja je prisutno samo jednom u genomu ćelije domaćina. U specifičnom primeru izvođenja, endogeno ili nativno mesto koje se javlja samo jednom unutar genoma je identifikovano. Takvo mesto onda može biti iskorišćeno za dizajn nukelaznih sredstava koja će proizvesti zarez ili prekid dvostrukog lanca na endogenom mestu prepoznavanja. ;[0184] Dužina mesta prepoznavanja moež varirati, i uključuje, na primer, mesta prepoznavanja koja su najmanje dužine 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ili više nukleotida. U jednom primeru izvođenja, svaki monomer nukleaznog sredstva prepoznaje mesto prepoznavanja od najmanje 9 nukelotida. U drugim primerima izvođenja, mesto prepoznavanja je dužine od oko 9 do oko 12 nukelotida, dužine od oko 12 do oko 15 nukleotida, dužine od oko 15 do oko 18 nukleotida, ili dužine od oko 18 do oko 21 nukleotida, ili bilo koje kombinacije takvih podopsega (npr., 9-18 nucleotida). Mesto prepoznavanja može biti palindromsko, odnosno, sekvenca na jednom lancu se čita isto u suprotnom smeru na komplementarnom lancu. Prepoznato je da dato nukleazno sredstvo može vezati mesto prepoznavanja i iseći to mesto vezivanja ili alternativno, nukleazno sredstvo može se vezati za sekvencu koja je različita od mesta prepoznavanja. Dodatno, termin mesto prepoznavanja sadrži i mesto vezivanja nukleaznog sredstva i mesto zareza/isecanja nezavisno od toga da li mesto zareza/isecanja je unutar ili van mesta vezivanja nukleaze. U sledećoj varijaciji, isecanje nukleaznim sredstvom može se desiti na nukleotidnim položajima neposredno međusobno naspramnim da bi se proizvelo isecanje sa tupim krajevima ili, u drugim slučajevima, isecanja mogu biti nazubljena da proizvedu duže jednolančane delove, takođe nazvane "lepljivi krajevi", koji mogu biti ili 5’ lepljivi krajevi, ili 3’ lepljivi krajevi. ;[0185] Bilo koje nukleazno sredstvo koje indukuje zarez ili prekid dvostrukog lanca u željenom mestu prepoznavanja može se koristiti u postupcima i kompotzicijama koje su ovde otkrivene. Prirodno ili nativno nukelazno sredstvo može se upotrebiti sve dok nukleazno sredstvo indukuje zarez ili prekid dvostrukog lanca u željenom mestu prepoznavanja. Alternativno, može se upotrebiti modifikovano ili inženjeringom dobijeno nukleazno sredstvo. "Inženjeringom dobijeno nukleazno sredstvo" sadrži nukleazu koja je inženjeringom dobijeno (modifikovano ili izvedeno) iz njegovog nativnog oblika da specifično prepozna i indukuje zarez ili prekid dvostrukog lanca u željenom mestu prepoznavanja. Stoga, inženjeringom dobijeno nukleazno sredstvo može se izvesti iz nativnog, prirodnog nukleaznog sredstva ili može biti veštački stvoreno ili sintetisano. Modifikacija nukleaznog sredstva može biti mala kao jedna aminokiselina u proteinu sredstva za isecanje ili jednog nukleotida u nukleinskoj kiselini sredstva za isecanje. U nekim primerima izvođenja, inženjeringom dobijena nukleaza indukuje zarez ili prekid dvostrukog lanca u mestu prepoznavanja, naznačeno time da mesto prepoznavanja nije sekvenca koju bi prepoznalo nativno (koja nije dobijena inženjeringom ili nemodifikovana) nukleazno sredstvo. Stvaranje zareza ili prekida dvostrukog lanca u mestu prepoznavanja ili drugoj DNK ovde se može označiti kao "sečenje" ili "isecanje" mesta prepoznavanja ili druge DNK. ;[0186] Aktivne varijante i fragmenti primera mesta prepoznavanja su takođe obezbeđeni. Takve aktivne varijante mogu sadržati najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa datim mestomm prepoznavanja, naznačeno time da aktivne varijante zadržavaju biološku aktivnost i stoga su sposobne da budu prepoznate i isečene sa nukleaznim sredstvom na sekvenca-specifičan način. Analize za merenje prekida dvostrukog lanca mesta prepoznavanja nukleaznog sredstva su poznate u tehnici i generalno mere sposobnost nukleaze da iseku mesto prepoznavanja. ;[0187] Mesto prepoznavanja nukleaznog sredstva može biti pozicionirano bilo gde u ili blizu ciljnog lokusa. Mesto prepoznavanja može se nalaziti unutar kodirajućeg regiona gena, ili unutar regulatornih regiona, koji utiču na ekspresiju gena. Stoga, mesto prepoznavanja nukleaznog sredstva može se nalaziti u intronu, egzonu, promotoru, enhanseru, regulatornom regionu, ili bilo kom regionu koji ne kodira proteine. ;[0188] Otkriće opisuje da je nukleazno sredstvo efektor nukleaza slična transkripcionom aktivatoru (TALEN). TAL efektor nukleaze su klasa sekvenca-specifičnih nukleaza koja se može koristiti da stvori prekide dvostrukog lanca na specifičnim ciljnim sekvencama u genomu prokariotskog ili eukariotskog organizma. TAL efektor nukleaze su stvorene fuzijom nativnog ili inženjeringom dobijenog efektora sličnog transkripcionom aktivatoru (TAL), ili njihov funkcionalni deo, sa katalitičkim domenom endonukleaze, kao što je, na primer, FokI. Jedinstveni, modularni TAL efektor DNK vezujući domen omogućava dizajn proteina with sa potencijalno bilo kojom specifičnošću prepoznavanja DNK. Stoga, DNK vezujući domeni TAL efektor nukelaza može se dobiti inženjeringom da prepozna specifična DNK ciljna mesta i stoga, korišćeni da stvore prekide dvostrukog lanca na željenim ciljnim sekvencama. Videti, WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; i Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148. ;[0189] Primeri pogodnih TAL nukleaza, i postupci za pripremanje pogodih TAL nukleaza, su otkriveni, npr., u SAD patentnim prijavama br. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, i 2006/0063231 A1. U različitim primerima izvođenja, TAL efektor nukleaze su dobijene inženjeringom koje seku u ili blizu ciljne sekvence nukleinske kiseline u, npr., genomskom lokusu od interesa, naznačeno time da je ciljna sekvenca nukleinske kiseline je na ili blizu sekvence koju treba modifikovati sa targeting vektorom. TAL nukleaze pogodne za upotrebu sa različitim postupcima i kompozicijama obezbeđenim ovde uključuju one koje su specifično dizajnirani na ili blizu ciljne sekvence nukleinskih kiselina koje treba modifikovati sa targeting vektorima kao što je ovde opisano. ;[0190] Otkriće opisuje da svaki monomer TALEN sadrži 12-25 TAL ponovaka, naznačeno time da svaki TAL ponovak vezuje 1 bp submesto. U jednom primeru izvođenja, nukelazno sredstvo je himerni protein koji sadrži DNK vezujući domen operativno vezan sa nezavisnom nukleazom zasnovanom na TAL ponovku. U jednom primeru izvođenja, nezavisna nukleaza je Fokl endonukleaza. U jednom primeru izvođenja, nukelazno sredstvo sadrži prvi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku, naznačeno time da svaki od prvog i drugog DNK vezujućeg domena zasnovanog na TAL-ponovku koji je operativno vezan sa Fokl nukleazu, naznačeno time da prvi i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku prepoznaje dve neprekidne DNK sekvence u svakom lancu ciljne sekvence DNK razdvojene sa oko 6 bp do oko 40 bp mesto isecanja, i naznačeno time da FokI nukelaze se dimerizuju i stvaraju prekid dvostrukog lanca na ciljnoj sekvenci. ;[0191] Otkriće opisuje da nukleazno sredstvo sadrži prvi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku, naznačeno time da svaki prvi i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku je operativno vezan sa FokI nukleazom, naznačeno time da prvi i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL-ponovku prepoznaje dve neprekidne DNK sekvence u svakom lancu ciljne sekvence DNK razdvojene sa 5 bp ili 6 bp mestom isecanja, i naznačeno time da FokI nukleaze dimerizuju i stvaraju prekid dvostrukog lanca. ;[0192] Nukleazna sredstva upotrebljena u različitim postupcima i kompozicijama koje su ovde otkrivene mogu dodatno sadržati nukleazu cink prsta (ZFN). Otkriće opisuje da svaki monomer ZFN sadrži 3 ili više DNK vezujućih domena zasnovanih na cink prstu, naznačeno time da svaki DNK vezujući domen zasnovan na cink prstu se vezuje za 3 bp submesto. U drugim primerima izvođenja, ZFN je himerni protein koji sadrži c DNK vezujući domen zasnovan na cink prstu operativno vezan sa nezavisnom nukleazom. Otkriće opisuje da je nezavisna endonukleaza FokI endonukleaza. Otkriće opisuje da nukleazno sredstvo sadrži prvi ZFN i drugi ZFN, naznačeno time da svaki od prvog ZFN i drugog ZFN je operativno vezan sa FokI nukleazom, naznačeno time da prvi i drugi ZFN prepoznaju dve neprekiden ciljne DNK sekvence u svbakom lancu ciljne DNK sekvence razdvojene sa oko 6 bp do oko 40 bp mestom isecanja ili oko 5 bp do oko 6 bp mestom isecanja, i naznačeno time da FokI nukleaze dimerizuju i stvaraju prekid dvostrukog lanca. Videti, na primer, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; i, WO/2011/017293A2. ;[0193] Otkriće opisuje da u postupcima obezbeđenim ovde, nukleazno sredstvo sadrži (a) himerni protein koji sadrži DNK vezujući domen zasnovan na cink prstu fuzionisan sa FokI endonukleazom; ili (b) himerni protein koji sadrži efektonu nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN) fuzionisanom sa FokI endonukleazom. ;[0194] Otkriće opisuje da je nukleazno sredstvo meganukleaza. Meganukleaze su klasifikovane u četiri familije na osnovu motiva konzervativne sekvence, familije su LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16), GIY-YIG, H-N-H, i His-Cys box faamilije. Ovi motivi učestvuju u koordinaciji jona metala i hidrolizi fosfodiestarskih veza. Heaze su značajne zbog njihovih dugačkih mesta prepoznavanja, i zbog tolerancije nekoliko polimorfizama sekvence u njihovim DNK supstratima. Domeni, struktura i funkcija nukelaza su poznati, videti na primer, Guhan i Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica i Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; i Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764. U nekim primerima korišćena je prirodna varijanta, i/ili inženjeringom dobijeni derivat meganukleaze. Postupci za modifikovanje kinetike, kofatktorske interakcije, ekspresija, optimalni uslovi, i/ili specifičnost mesta prepoznavanja, i skrining za aktivnost su poznati, videti na primer, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen i Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; i WO2004031346. ;[0195] Otkriće opisuje da bilo koje meganukleaze mogu biti korišćene ovde, uključujući, ali se ne ograničavajući na, I-SceI, ISceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, ICeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, ICrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-L1aI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, INgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, ISpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, ISthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PITfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, ili bilo oja aktivna varijanta ili njihovi fragmenti. ;[0196] Otkriće opisuje da meganukleaze prepoznaju dvolančane DNK sekvence od 12 do 40 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, meganukleaza prepoznaje jednu savršeno poklapajuću ciljnu sekvencu u genomu. U jednom primeru izvođenja, meganukleaza je homing nukleaza. U jednom primeru izvođenja, homing nukleaza je LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) familija homing nukleaze. U jednom primeru izvođenja, LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) familija homing nukleaze je izabrana od I-SceI, I-CreI, i I-Dmol. ;[0197] Nukleazna sredstva mogu dodoatno sadržati restrikcione endonukleaze, koje uključuju endonukleaze Tip I, Tip II, Tip III, i Tip IV. Tip I i Tip III restrikcione endonukleaze prepoznaju specifična mesta prepoznavanja, ali tipično isecaju na varijabilnim položajima od vezujućeg mesta nukelaze, koje može biti stotinama baznih parova daleko od mesta isecanja (mesto prepoznavanja). Kod Tip II sistemima restrikciona aktivnost je nezavisna od aktivnosti bilo koje metilaze, i isecanje se tipično dešava na specifičnim mestima unutar ili blizu mesta vezivanja. Većina Tip II enzima iseca palindromske sekvence, međutim Tip IIa enzimi prepoznaju nepalinsromska mesta prepoznavanja i isecaju van mesta prepoznavanja, Tip IIb enzimi isecaju sekvence dva puta sa obe strane van mesta prepoznavanja, i Tip IIs enzimi prepoznaju asimetrično mesto prepoznavanja i isecaju na jednoj strani i na definisanom rastvojanju od oko 1-20 nukleotida od mesta prepoznavanja. Tip IV restrikcioni enzimi ciljno deluju na metilovanu DNK. Restrikcioni enzimi su dalje opisani i klasifikovani, na primer u REBASE bazi podataka (web strana rebase.neb.com; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, i Belfort et al., (2002) in Mobile DNK II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC). ;[0198] Nukleazno sredstvo upotrebljeno u različitim postupcima i kompozicijama može takođe sadržati CRISPR/Cas sistem. Takvi sistemi mogu koristiti, na primer, Cas9 nukleazu, koja u nekim slučajevima, je kodon-optimizovana za željeni tip ćelije u kojoj će biti eksprimirana. Takvi sistemi mogu takođe koristiti vodeću RNK (gRNK) koja sadrži dva zasebna molekula. Primer dvo-molekulske gRNK obuhvata crRNK-slični ("CRISPR RNK" ili "targeter-RNK" ili "crRNK" ili "crRNK ponovak") molekul i odgovarajuću tracrRNK-slični ("trans-aktivnu CRISPR RNK" ili "aktivator-RNK" ili "tracrRNK" ili "scaffold") molekul. crRNK sadrži i DNK-targeting segment (jednolančani) gRNK i nukleotidni lanac koji formira jednu polovinu dvolančanog RNK (dsRNK) dupleksa segmenta gRNK koji vezuje protein. Odgovarajuća tracrRNK (aktivator-RNK) sadrži nukletidni lanac koji formira drugi deo dsRNK dupleksa segment gRNK koji vezuje protein. Stoga, nukleotidni lanac crRNK su komplementarni i hibridizuju sa lancem nukleotida tracrRNK da bi formirali dsRNK dupleks domena gRNK koij vezuje protein. Kao takav, može se reći da svaki crRNK ima odgovarajući tracrRNK. crRNK dodatno obezbežuje jednolančani DNK-targeting segment. Shodno tome, gRNK sadrži sekvencu koja hibridizuje sa ciljnom sekvencom, i tracrRNK. Stoga, crRNK i tracrRNK (kao odgovarajući par) hibridizuju da bi formirali gRNK. Ukoliko se koristi za modifikaciju unutar ćelije, tačna sekvenca i/ili dužina datog crRNK ili tracrRNK molekula može biti dizajnirana da bude specifična vrstama u kojima će se koristiti RNK molekuli. ;[0199] Prirodni geni koji kodiraju tri elementa (Cas9, tracrRNK i crRNK) su tipično organizovani u operon(e). Prirodne CRISPR RNKs razlikuju se u zavisnosti od Cas9 sistema i organizma ali često sadrže targeting segment dužine od između 21 do 72 nukleotida, flankiran sa dva direktna ponovka (DR) dužine između od 21 do 46 nukleotida (videti, npr., WO2014/131833). U slučaju S. pyogenes, DRs su dugački 36 nukleotida i targeting segment je dugačak 30 nukleotida. 3’ locirani DR je komplemetaran sa i hibridizuje sa odgovarajućom tracrRNK, koja se zauzvrat vezuje sa Cas9 proteinom. ;[0200] Alternativno, sistem dodatno upotrebljava fuzionisani crRNK-tracrRNK konstrukt (tj., pojedinačni transkript) koji funkcioniše sa kodon-optimizovanim Cas9. Ova zasebna RNK je često označena kao vodeća RNK ili gRNK. Unutar gRNK, crRNK deo je identifikovan kao’target sekvenca’ za dato mesto prepoznavanja i tracrRNK je često označena kao ’scaffold.’ Ukratko, kratki DNK fragment koji sadrži target sekvencu je inseriran u ekspresioni plazmid vodeće RNK. gRNK ekspresioni plazmid sadrži target sekvencu (u nekim primerima izvođenja oko 20 nukleotida), oblik tracrRNK sekvence (scaffold) kao i pogodni promotor koji je aktivan u ćeliji i neophodne elemente za ispravnu obradu u eukariotskim ćelijama. Mnogi od sistema oslanjaju se na prilagođene, komplementarne oligo koji su anilovani da bi formirali dvolanćanu DNK i zatim klonirani u gRNK ekspresioni plazmid. gRNK ekspresiona kaseta i Cas9 ekspresiona kaseta su zatim introdukovane u ćeliju. Videti, na primer, Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb 15;339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):233-9; i Cong L et al. Science 2013 Feb 15;339(6121):819-23. Videti takođe, na primer, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, i WO/2013142578A1. ;[0201] U nekim primerima izvođenja, Cas9 nukleaza može biti obezbeđena u obliku proteina. U nekim primerima izvođenja, Cas9 protein može biti obezbeđen u obliku kompleksa sa gRNK. U drugim primerima izvođenja, Cas9 nukleaza može biti obezbeđena u obliku nukleinske kiseline koja kodira protein. Nukleinska kiselina koja kodira Cas9 nukleazu može biti RNK (npr., informaciona RNK (mRNK)) ili DNK. ;[0202] U nekim primerima izvođenja, gRNK može biti obezbeđena u obliku RNK. U drugim primerima izvođenja, gRNK može biti obezbeđena u obliku RNK koja kodira DNK. U nekim primerima izvođenja, gRNK može biti obezbeđena u obliku zasebnih crRNK i tracrRNK molekula, ili zasebnih DNK molekula koji kodiraju crRNK i tracrRNK, respektivno. ;[0203] U jednom primeru izvođenja, postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u ćeliji dodatno sadrži introdukovanje u ćeliju: (a) prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated (Cas) protein; (b) drugi ekspresioni konstrukt koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa genomskom target sekvencom vezanom sa vodećom RNK (gRNK), naznačeno time da genomska target sekvenca je flankirana sa motivom susednim protospejseru. Izborno, genomska target sekvenca je flankirana na 3’end sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM) sekvencu. Otkriće opisuje da ćelija sadrži eukariotsku ćeliju, ne-pacovsku eukariotsku ćeliju, sisarsku ćeliju, humanu ćeliju, ne-humanu sisarsku ćeliju, pluripotentnu ćeliju, ne-pluripotentu ćeliju, ne-humanu pluripotentnu ćeliju, humanu pluripotentu ćeliju, humanu ES ćeliju, humanu adultnu embrionalnu ćeliju, razvojno-ograničenu humanu progenitor ćeliju, humanu iPS ćeliju, humanu ćeliju, glodarsku ćeliju, ne-pacovsku glodarsku ćeliju, pacovsku ćeliju, mišju ćeliju, ćeliju hrčka, fibroblast, ili CHO ćeliju. ;[0204] U jednom primeru izvođenja, genomska target sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20 GG; SEQ ID NO: 1). U jednom primeru izvođenja, genomska target sekvenca sadrži SEQ ID NO: 23, gde N je dužine između 1 i 20 nukleotida. U sledećem primeru izvođenja, genomska target sekvenca sadrži između 14 i 20 nukleotida u dužini SEQ ID NO: 1. ;[0205] U jednom primeru izvođenja, gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline kojakodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNK (crRNK) i transaktivnu CRISPR RNK (tracrRNK). U specifičnim primerima izvođenja, Cas protein je Cas9. ;[0206] U nekim primerima izvođenja, gRNK sadrži (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’ (SEQ ID NO: 2); ili (b) himernu RNK sekvencu nukleinske kiseline 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3’ (SEQ ID NO: 3). ;[0207] U sledećem primeru izvođenja, crRNK sadrži 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3’ (SEQ ID NO: 4); 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAG (SEQ ID NO: 5); ili 5’-GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUA-3’ (SEQ ID NO: 6). ;[0208] U sledećim primerima izvođenja, tracrRNK sadrži, 5’-AAGGCUAGUCCG-3’ (SEQ ID NO: 7) ili 5’-AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’ (SEQ ID NO: 8). ;[0209] U jednom primeru izvođenja, Cas protein je tip I Cas protein. U jednom primeru izvođenja, Cas protein je tip II Cas protein. U jednom primeru izvođenja, tip II Cas protein je Cas9. U jednom primeru izvođenja, prva sekvenca nukleinske kiseline kodira humani kodonoptimizovani Cas protein. ;[0210] U određenim primerima izvođenja, Cas protein je "nikaza" koja može stvoriti prekide jednog lanca (tj., "zareze") na ciljnom mestu bez isecanja oba lanca dvolančane DNK (dsDNK). Cas9, na primer, sadrži dva domena-a nukleaze - RuvC-sličan domen nukleaze i HNH-sličan domen nukleaze – koji su odgovorni za isecanje suprotnih DNK lanaca. Mutacija u bilo kom od ovih domena može stvoriti nikazu. Primeri mutacija koji stvaraju nikaze mogu se naći, na primer, WO/2013/176772A1 i WO/2013/142578A1. ;[0211] U određenim primerima izvođenja, dva zasebna Cas proteina (npr., nikaze) specifični za ciljno mesto na svakom lancu dsDNK mogu stvoriti sekvence sa lepljivim krajevima komplemetarne sekvencama sa lepljivim krajevima na drugoj nukelinskoj kiselini, ili zasebnim regionom na istoj nukelinskoj kiselini. Lepljivi krajevi stvoreni dovođenjem u kontakt nukleinske kiseline sa dve nikaze specifične za ciljna mesta na oba lanca dsDNK mogu biti ili 5’ ili 3’ lepljivi krajevi. Na primer, prva nikaza može stvoriti prekid jednog lanca na prvom lancu dsDNK, dok druga nikaza može stvoriti prekid jednog lanca na drugom lancu dsDNK tako da su stvorene sekvence sa lepljivim krajevima. Ciljna mesta svake nikaze koje stvaraju prekide jednog lanca mogu se tako izabrati da su stvoreni lepljivi krajevi sekvenci komplementarni lepljivim krajevima sekvenci na različitom molekulu nukleinske kiseline. Komplementarni lepljivi krajevi dva različita molekula nukleinske kiseline mogu biti anilovani postupcima otkrivenim ovde. U nekim primerima izvođenja, ciljno mesto nikaze na prvom lancu je različito od ciljnog mesta nikaze na drugom lancu. ;[0212] U jednom primeru izvođenja, prva nukleinska kiselina sadrži mutaciju koja remeti najmanje jedan aminokiselinski ostatak aktivnih mesta nukleaze u Cas proteinu, naznačeno time da mutantni Cas protein stvara prekid samo u jednom lancu ciljnog DNK regiona, i naznačeno time da mutacija poništava nehomologu rekombinaciju u ciljnom DNK regionu. ;[0213] U jednom primeru izvođenja, prva nukleinska kiselina koja kodira Cas protein dodatno sadrži jedarni lokalizacioni signal (NLS). U jednom primeru izvođenja, jedarni lokalizacioni signal je SV40 jedarni lokalizacioni signal. ;[0214] U jednom primeru izvođenja, drugi promotor koji vodi ekspresiju genomske ciljne sekvence i vodeća RNK (gRNK) je promotor RNK plimeraze III. U jednom primeru izvođenja, promotor RNK polimeraze III je humani U6 promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor RNK polimeraze III promotor je promotor U6 polimeraze III pacova. U jednom primeru izvođenja, promotor RNK polimeraze III je promotor U6 polimeraze III miša. ;[0215] U jednom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline koja kodiraju crRNK i tracrRNK su povezane preko sintetičke petlje, naznačeno time da da, nakon ekspresije, crRNK i tracrRNK formira crRNK:tracrRNK dupleks. ;[0216] Ovo otkriće opisuje da CRISPR/Cas sistem kao što je prethodno opisan može biti korišćen u kombinaciji sa velikim targeting vektorima sa bilo kojim od sledećih tipova ćelije: eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, ne-humana sisarska ćelija, pluripotentna ćelija, ne-pluripotenta ćelija, ne-humana pluripotentnu ćelija, humana pluripotenta ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno-ograničena humana progenitor ćeliju, humanu iPS ćeliju, humana ćelija, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćeliju, pacovska ćelija, mišja ćelija, ćelija hrčka, fibroblast, ili CHO ćeliju. ;[0217] U jednom primeru izvođenja, prvi ekspresioni konstrukt i drugi ekspresioni konstrukt su eksprimirani iz istog plazmida. ;[0218] U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su introdukovani zajedno sa LTVEC. U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su introdukovani zasebno iz LTVEC tokom vremenskog perioda. ;[0219] U jednom primeru izvođenja, postupak sadrži introdukciju više drugih konstrukata i više LTVEC za multipleksno uređivanje različitih ciljnih lokusa kao što je ovde opisano. ;[0220] Aktivne varijante i fragmenti nukleaznih sredstava (npr., inženjeringom dobijeno nukleazno sredstvo) su takođe obezbeđeni. Takve aktivne varijante mogu sadržati sadrži najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa nativnim nukleaznim sredstvom, naznačeno time da aktivne varijante zadržavaju sposobnost da iseku na željenom mestu prepoznavanja i stoga zadržavaju sposobnost aktivnosti indukovanja zareza ili prekida dvostrukog lanca. Na primer, bilo koje od nukleznih sredstava opisanih ovde mogu se modifikovati od nativne sekvence endonukleaze i dizajnirati da prepoznaju i indukuju zarez ili prekid dvostrukog lanca na mestu preopoznavanja koje nije prepoznato sa nativnim nukleaznim sredstvom. Stoga u nekim preimerima izvođenja, inženjeringom dobijena nukleaza ima specifičnost da indukuje zarez ili prekid dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja koje je različito od odgovarajućeg mesta prepoznavanja nativnog nukleaznog sredstva. Analize za aktivnost indukovanja zareza ili prekida dvostrukog lanca su poznate i generalno mere ukupnu aktivnost i specifičnost endonukleaze na DNK supstratima koji sadrže mesto prepoznavanja. ;[0221] Nukleazno sredstvo može biti introdukovano u ćeliju bilo kojim načinom poznatim u tehnici. Polipepid koji kodira nukleazno sredstvo može biti direktno introdukovan u ćeliju. Alternativno, polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo može biti introdukovan u ćeliju. Kada je polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo je introdukovan u ćeliju, nukleazno sredstvo može biti prolazno, uslovno ili konstitutivno eksprimirano unutar ćelija. Stoga, polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo može biti sadržan u ekspresionoj kaseti i može biti operativno vezan sa uslovnim promotorom, inducibilnim promotorom, konstitutivnim promotorom, ili tkivnospecifičnim promotorom. Takvi promotori od interesa su razmatrani detaljnije ovde na drugim mestima. Alternativno, nukleazno sredstvo je introdukovano u ćeliju kao iRNK koja kodira ili sadrži nukleazno sredstvo. ;[0222] U jednom primeru izvođenja, crRNK i tracrRNK su eksprimirani kao zasebni RNK transkripti. ;[0223] U specifičnim primerima izvođenja, polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo je stabilno integrisan u genom ćelije i operativno vezan sa promotorom aktivnim u ćeliji. U drugim primerima izvođenja, polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo je u istom targeting vektoru koji sadrži insert nukleinske kiseline, dok jeu drugim slučajevima polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo je u vektoru ili plazmidu koji je zasebno od targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline. ;[0224] Kada je nukleazno sredstvo obezbeđeno ćeliji preko introdukcije polinukleotida koji kodira nukleazno sredstvo, takav polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo može biti modifikovan da supstituiše kodone koji imaju učestaliju upotrebu u ćeliji od interesa, u poređenju sa prirodnom sekvencom polinukleotida koji kodira nukleazno sredstvo. Na primer polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo može biti modifikovan da zameni kodone koji imaju veću učestalost u datoj prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji od interesa, uključujući bakterijsku ćeliju, ćeliju kvasca, humanu ćeliju, ne-humanu ćeliju, ne-pacovsku eukariotsku ćeliju, sisarsku ćeliju, glodarsku ćeliju, ne-pacovsku glodarsku ćeliju, mišju ćeliju, ćeliju pacova, ćeliju hrčka ili bilo koju drugu ćeliju domaćina od interesa, u poređenju sa prirodnom sekvencom polinukleotida. ;[0225] U jednom primeru izvođenja, endonukleazno sredstvo je introdukovano zajedno sa LTVEC. U jednom primeru izvođenja, endonukleazno sredstvo je introdukovano zasebno od LTVEC tokom vremenskog perioda. U jednom primeru izvođenja, endonukleazno sredstvo je introdukovano pre introdukcije LTVEC. U jednom primeru izvođenja, endonukleazno sredstvo je introdukovano u ćeliju pacova, eukariotsku, ne-pacovsku eukariotsku, sisarsku, ne-humanu sisarsku, humanu, glodarsku, ne-pacovsku glodarsku, mišju ili ES ćeliju hrčka ćelija nakon introdukcije LTVEC. ;[0226] U jednom primeru izvođenja, endonukleazno sredstvo je ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira endonukleazu, naznačeno time da sekvenca nukleinske kiseline je operativno vezana sa promotorom. U jednom primeru izvođenja, promotor je konstitutivno aktivni promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je inducibilni promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je aktivan u pluripotentnoj ili ne-pluripotentnoj ćeliji pacova, eukariotskoj, ne-pacovskoj eukariotskoj, sisarskoj, ne-humanoj sisarskoj, humanoj, glodarskoj, ne-pacovskoj glodarskoj, mišjoj ili ćeliji hrčka. U jednom primeru izvođenja, endonukleazno sredstvo je iRNK koja kodira endonukleazu. ;;B. Postupci za integrisanje polinukleotida od interesa u ciljni lokus ;;[0227] Postupci za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa su obezbeđeni. Ovo otkriće opisuje da ciljni lokus u pluripotentnoj ili ne-pluripotentnoj ćeliji pacova, eukariotskoj, ne-pacovskoj eukariotskoj, sisarskoj, ne-humanoj sisarskoj, humanoj, glodarskoj, ne-pacovskoj glodarskoj, mišjoj ili ćeliji hrčka je targetiran za genetičku modifikaciju. Takav postupak sadrži: (a) introdukciju u pluripotentnu ili ne-pluripotentnu ćeliju pacova, eukariotsku, ne-pacovsku eukariotsku, sisarsku, ne-humanu sisarsku, humanu, glodarsku, ne-pacovsku glodarsku, mišju ili ćeliju hrčka targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom pacova, eukariotskom, ne-pacovskom eukariotskom, sisarskom, ne-humanom sisarskom, humanom, glodarskom, ne-pacovskom glodarskom, mišjom ili homologom rukom hrčka i 3’ rat, homologom rukom pacova, eukariotskom, ne-pacovskom eukariotskom, sisarskom, ne-humanom sisarskom, humanom, glodarskom, ne-pacovskom glodarskom, mišjom ili homologom rukom hrčka; i (b) identifikaciju genetički modifikovane pluripotentne ili ne-pluripotentne ćelije pacova, eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, ne-humane sisarske, humane, glodarske, nepacovske glodarske, mišje ili ćelije hrčka koja sadrži ciljnu genetičku modifikaciju na ciljnom lokusu, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija je sposobna da se prenese preko klicine linije. U specifičnim primerima izvođenja, ukupna suma 5’ homologa ruka i 3’ homologa ruka je najmanje 10 kb i/ili veliki targeting vektor je upotrebljen. ;[0228] U drugim primerima izvođenja, veličina ukupne sume ukupnih 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC je oko 10 kb do oko 150 kb, oko 10 kb do oko 100 kb, oko 10 kb do oko 75 kb, oko 20 kb do oko 150 kb, oko 20 kb do oko 100 kb, oko 20 kb do oko 75 kb, oko 30 kb do oko 150 kb, oko 30 kb do oko 100 kb, oko 30 kb do oko 75 kb, oko 40 kb do oko 150 kb, oko 40 kb do oko 100 kb, oko 40 kb do oko 75 kb, oko 50 kb do oko 150 kb, oko 50 kb do oko 100 kb, ili oko 50 kb do oko 75 kb, oko 10 kb do oko 30 kb, oko 20 kb do oko 40 kb, oko 40 kb do oko 60 kb, oko 60 kb do oko 80 kb, oko 80 kb do oko 100 kb, oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do oko 150 kb. U jednom primeru izvođenja, veličina delecije je ista ili slična veličini ukupne sume 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC. ;[0229] Pluripotentna ćelija, na primer, ćelija pacova, može biti embrionalna matična ćelija, na primer, embrionalna matična ćelija pacova. Ovo otkriće opisuje da (a) ES ćelija je pacova izvedena iz DA soja ili ACI soja; ili (b) ES ćelija pacova se karakteriše ekspresijom markera pluriptentnosti koji sadrži Oct-4, Sox-2, alkalnu fosfatazu, ili njihovu kombinaciju. U drugom slučajevima, upotrebljena embrionalna matična ćelija pacova sadrži ES ćeliju pacova kao što je opisano u SAD patentnoj prijavi br. 14/185,103, podnetoj 20. februara 2014. ;[0230] Ovo otkriće opisuje da bilo koja pluripotentna ili ne-pluripotenta ćelija može ser koristiti u postupcima obezbeđenim ovde. Na primer, pluripotentna ili ne-pluripotentna ćelija može biti od eukariota, ne-pacovskog eukariota, ne-humanog sisara, sisara, glodara, ne-pacovskog glodara, pacova, miša, čoveka ili hrčka. ;[0231] Kao što je ovde opisano na drugim mestima, insert nukleinske kiseline može biti bilo koja sekvenca nukleinske kiseline. Ovo otkriće opisuje da (a) insert nukleinske kiseline sadrži zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline pacova, eukariotska, ne-pacovska eukariotska, sisarska, humana, glodarska, ne-pacovska glodarska, mišja ili endogene sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sisarskom sekvencom nukleinske kiseline; (b) insert nukleinske kiseline sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova, eukariotska, ne-pacovska eukariotska, sisarska, humana, glodarska, ne-pacovska glodarska, mišja ili endogene sekvence nukleinske kiseline; (c) insert nukleinske kiseline sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova, eukariotska, ne-pacovska eukariotska, sisarska, humana, glodarska, ne-pacovska glodarska, mišja ili endogene sekvence nukleinske kiseline, naznačeno time da je delecija u opsegu od 5 kb do 200 kb ili od 5 kb do 3 Mb (kao što je detaljno razmatrano ovde na drugim mestima); (d) insert nukleinske kiseline sadrži adiciju egzogene sekvence nukleinske kiseline (uključujući na primer egzogenu sekvencu nukleinske kiseline u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb); (e) insert nukleinske kiseline sadrži egzogenu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline; (f) homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline iz (a) naznačeno time da sekvenca nukleinske kiseline je humana sekvenca nukleinske kiseline; (g) insert nukleinske kiseline sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline iz (a) naznačeno time da sekvenca nukleinske kiseline je himerna sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži humanu i sekvencu nukleinske kiseline pacova; (h) insert nukleinske kiseline sadrži egzogenu sekvencu nukleinske kiseline iz (e), naznačeno time da insert nukleinske kiseline jeu opsegu od oko 5 kb do oko 200 kb; (i) insert nukleinske kiseline sadrži uslovni alele flankiran sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifične za mesto; (j) insert nukleinske kiseline sadrži reporter gen operativno vezan sa promotorom; (k) insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više nerearanžiranih segmenta VHgena teškog lanca humanog imunoglobulina, jedan ili više nerearanžiranih segmenta D gena teškog lanca humanog imunoglobulina, i jedan ili više nerearanžiranih segmenta JH gena teškog lanca humanog imunoglobulina, koji su operativno vezani sa heavy sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca; (1) insert nukleinske kiseline sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnoog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezanog sa glodarskom sekvencom nukelinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca; (m) insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više nerearanžiranih humanih imunoglobulin Vκili Vλgenskih segmenata i jedan ili više nerearabžiranih humanih imunoglobulin Jκili Jλgenskih segmenata, koji su operativno vezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca sisarskog imunoglobulina; (n) insert nukleinske kiseline koji sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog λ ili κ lakog lanca humanog imunoglobulina operativno vezan sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca sisarskog imunoglobulina; (o) sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara iz (k) i/ili (1) sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona, ili njihovu konbinaciju; ili (p) nukleinska kiselina konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca sisarskog imunoglobulina iz (m) i/ili (n) sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona, ili njihovu kombinaciju. ;[0232] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata koji sadrže VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, ili njihovu kombinaciju. ;[0233] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih D genskih segmenata koji sadrže D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D215, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0234] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih JH genskih segmenata koji sadrže JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih VK genskih segmenata koji sadrže VΚ4-1, VΚ5-2, VΚ�7-3, VΚ�2-4, VΚ1-5, VΚ1-6, VΚ3-7, VΚ1-8, VΚ1-9, VΚ2-10, VΚ3-11, VΚ1-12, VΚ1-13, VΚ2-14, VΚ3-15, VΚ1-16, VΚ1-17, VΚ2-18, VΚ2-19, VΚ3-20, VΚ6-21, VΚ1-22, VΚ1-23, VΚ2-24, VΚ3-25, VΚ2-26, VΚ1-27, VΚ2-28, VΚ2-29, VΚ2-30, VΚ3-31, VΚ1-32, VΚ1-33, VΚ3-34, VΚ1-35, VΚ2-36, VΚ1-37, VΚ2-38, VΚ1-39, VΚ2-40, ili njihovu kombinaciju. ;[0235] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više humanih Vλgenskih segmenata koji sadrže Vλ3-1, Yλ4-3, Yλ2-8, Yλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0236] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više humanih JK genskih segmenata koji sadrže JΚ1, JΚ2, JΚ3, JΚ4, JΚ5, ili njihovu kombinaciju. ;[0237] Otkriće opisuje da nakon modifikacije ciljnog lokusa u pluripotentnoj ili ne-pluripotentnoj ćeliji pacova, eukariotskoj, ne-pacovskoj eukariotskoj, sisarskoj, ne-humanoj sisarskoj, humanoj, glodarskoj, ne-pacovskoj glodarskoj, mišjoj ili ćeliji hrčka, genetička modifikacije je preneta preko klicine linije. ;[0238] Otkriće opisuje da insert sekvence nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji će kada je integrisan u genom proizvesti genetičku modifikaciju regiona ApoE lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, nepacovskog glodarskog, mišjeg ili ApoE lokusa hrčka, naznačeno time da genetička modifikacija na ApoE lokusu rezultuje u smanjenju ApoE aktivnosti, povećanju u ApoE aktivnosti ili modulaciji ApoE aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je ApoE nokaut. ;[0239] Otkriće opisuje da insert sekvence nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji će kada je integrisan u genom proizvesti genetičku modifikaciju regiona interleukin-2 receptor gama lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili interleukin-2 receptor gama lokusa hrčka, naznačeno time da genetička modifikacija na interleukin-2 receptor gama lokusu rezultuje u smanjenju aktivnosti interleukin-2 receptora, smanjenje u aktivnosti interleukin-2 receptor gama, ili modulacija aktivnosti interleukin-2 receptora. U jednom primeru izvođenja, stvoren je interleukin-2 receptor nokaut. ;[0240] Otkriće opisuje da insert sekvence nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji će kada je integrisan u genom proizvesti genetičku modifikaciju regiona Rag1 lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, nepacovskog glodarskog, mišjeg ili Rag1 lokusa hrčka, Rag2 lokusa pacova, eukariotskog, nepacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili Rag2 lokusa hrčka i/ili Rag1/Rag2 lokusa pacova, eukariotskog, nepacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili Rag1/Rag2 lokusa hrčka naznačeno time da genetička modifikacija na Rag1, Rag2 i/ili Rag2/Rag1 lokusu pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili Rag1, Rag2 i/ili Rag2/Rag1 lokusa pacova rezultuje u smanjenju aktivnosti Rag1, Rag2 ili Rag1 i Rag2 proteina, povećanju aktivnosti Rag1, Rag2 ili Rag1 i Rag2 proteina, ili modulaciji aktivnosti Rag1, Rag2 ili Rag 1 i Rag2 proteina. U jednom primeru izvođenja, Rag1, Rag2 ili Rag2/Rag1 stvoren je nokaut. ;[0241] Otkriće opisuje da insert nukleinske kiseline rezultuje u zameni dela ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa i/ili Rag2 lokusa, i/ili Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili dela ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa i/ili Rag2 lokusa, i/ili Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa hrčka, sa odgovarajućim ortologim delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0242] U sledećim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji celom svojom dužinom deli najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa koji zamenjuje. ;[0243] Otkriće opisuje da dati insert polinukleotida i odgovarajući region lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili lokusa hrčka koji se zamenjuje može biti kodirajući region, intron, egzon, netranslatirani region, regulatorni region, promotor, ili enhanser ili bilo oja njihova kombinacija. Dodatno, dati insert polinukleotida i/ili region lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili lokusa hrčka koji se zamenjuje može biti bilo koje željen edužine, uključujući na primer, između 10-100 nukleotida dužine, 100-500 nukleotida dužine, 500-1 kb nukleotida dužine, 1 kb do 1.5 kb nukleotida dužine, 1.5 kb do 2 kb nukleotida dužine, 2 kb do 2.5 kb nukleotida dužina, 2.5 kb do 3 kb nukleotida dužine, 3 kb do 5 kb nukleotida dužine, 5 kb do 8 kb nukleotida dužine, 8 kb do 10 kb nukleotida dužine ili više. U drugim slučajevima, veličina insercije ili zamene je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, od oko 350 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 800 kb, od oko 800 kb to 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb, do oko 2.5 Mb, od oko 2.5 Mb do oko 2.8 Mb, od oko 2.8 Mb do oko 3 Mb. U drugim primerima izvođenja, dati insert polinukleotida i/ili region lokusa pacova, eukariotskog, ne-pacovskog eukariotskog, sisarskog, ne-humanog sisarskog, humanog, glodarskog, ne-pacovskog glodarskog, mišjeg ili lokusa hrčka koji se zamenjuje je najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ili 900 nukleotida ili najmanje 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb ili veći. ;;i. Postupci za modifikaciju ciljnog lokusa nukleinske kiseline preko bakterijske homologe rekombinacije (BHR) ;;[0244] Ovo otkriće obezbeđuje postupke i kompozicije za modifikaciju ciljnog lokusa eukariotske, ne-pacovske, eukariotske, sisarske, humane ili ne-humane sisarske nukleinske kiseline, preko bakterijske homologe replikacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji. Takvi postupci pronalaze upotrebu u korišćenju bakterijske homologe rekombinacije u prokariotskoj ćeliji da bi se gentički modifikovao ciljni lokus eukariotske, ne-pacovske eukariotske, sisarske, humane ili ne-humane sisarske nukleinske kiseline da bi se stvorio targeting vektor. Takav targeting vektor koji sadrži genetički modifikovani ciljni lokus može biti introdukovan u eukariotsku ćeliju, na primer, eukariotsku ćeliju, ne-pacovsku eukariotsku ćeliju, sisarsku ćeliju, humanu ćeliju, nehumanu sisarsku ćeliju, pluripotentnu ćelija, ne-pluripotentnu ćeliju, ne-humanu pluripotentnu ćeliju, humanu pluripotentu ćeliju, humanu ES ćeliju, humanu adultnu embrionalnu ćeliju, razvojno- ograničenu humanu progenitor ćeliju, humanu iPS ćeliju, humanu ćeliju, glodarsku ćeliju, ne-pacovsku glodarsku ćeliju, pacovsku ćeliju, mišju ćeliju, ćeliju hrčka, fibroblast, ili CHO ćeliju. "Homologa rekombinacija" uključuje izmenu DNK fragmenata između dva DNK molekula na-kros over mestima unutar regiona homologije. Stoga, "bakterijska homologa rekombinacija" ili "BHR" uključuje homologu rekombinaciju koja se dešava u bakterijama. ;[0245] Postupci za modifikaciju ciljnog lokusa nukleinske kiseline iz eukariotske ćelije, nepacovske eukariotske ćelije, sisarske ćelije, humane ćelije, ne-humane sisarske ćelije, pluripotentne ćelije, ne-pluripotentne ćelije, ne-humane pluripotentne ćelije, humane pluripotentne ćelije, humane ES ćelije, humane adultne embrionalne ćelije, razvojno-ograničene humane progenitor ćelije, humane iPS ćelije, humane ćelije, glodarske ćelije, ne-pacovske glodarske ćelije, ćelije pacova, mišje ćelije, ćelije hrčka, fibroblasta, ili CHO ćelije preko bakterijske homologe rekombinacije (BHR) su obezbeđeni u ovom otkriću. Postupci sadrže introdukciju u prokariotsku ćeliju targeting vektora koij sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da prokariotska ćelija sadrži ciljni lokus nukleinske kiseline i sposobna je da eksprimira rekombinazu koja posreduju u BHR na ciljnom lokusu. Takvi targeting vektori mogu uključivati bilo koje od velikh targeting vektora opisanih ovde. ;[0246] U jednom primeru izvođenja, postupak sadrži introdukciju u prokariotsku ćeliju: (i) prvog konstrukta koji sadrži nukleinsku kiselinu koja ima DNK sekvencu od interesa; (ii) drugi targeting konstrukt koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, i (iii) treći konstrukt koji kodira rekombinazu koja posreduju u bakterijskoj homologoj rekombinaciji. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, i treći konstrukt su introdukovani zasebno u prokariotsku ćeliju tokom određenog vremenskog perioda. U jednom primeru izvođenja, prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazu, i postupak ne zahteva introdukciju trećeg konstrukta. U jednom primeru izvođenja, rekombinaza je eksprimirana pod kontrolom inducibilnog promotora. ;[0247] U jednom primeru izvođenja prvi konstrukt koji sadrži nukleinsku kiselinu, izveden je iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) ili veštačkog hromozoma kvasca (YAC). Prokariotska ćelija koja sadrži insert nukleinske kiseline na ciljnom genomskom lokusu može biti izabrana. Ovaj postupak može biti serijski ponovljen kao što je otkriveno ovde da bi se omogućila introdukcija višestrukog inserta nukleinskih kiselina na ciljne lokuse u prokariotskoj ćeliji. Kada je lokus ciljne nukleinske kiseline "ugrađen" unutar prokariotske ćelije, targeting vektor koij sadrži modifikovani ciljni lokus može biti izolovan iz prokariotske ćelije i introdukovan u ciljni genomski lokus unutar eukariotske ćelije, ne-pacovske eukariotske ćelije, sisarske ćelije, humane ćelije, ne-humane sisarske ćelije, pluripotentne ćelije, ne-pluripotentne ćelije, ne-humane pluripotentne ćelije, humane pluripotentne ćelije, humane ES ćelije, humane adultne embrionalne ćelije, razvojno-ograničene humane progenitor ćelije, humane iPS ćelije, humane ćelije, glodarske ćelije, ne-pacovske glodarske ćelije, pacovske ćelije, mišje ćelije, ćelije hrčka, fibroblasta, ili CHO ćelije prema ovom otkriću. ;[0248] Poželjne pacovske ćelije za primanje targeting vektora prema ovom ptkriću su opisane u SAD prijavi 14/185,703, podnetoj 20. februara 2014, čiji je sadržaj ovde rezimiran. Ove pacovske ćelije su pluripotentne pacovske ćelije sposobne da održe njihovu pluripotenciju nakon jedne ili više ciljanih genetičkih modifikacija in vitro, i sposobne su da prenesu ciljane genetičke modifikacije preko klicine linije. ;[0249] Elektroporisane pluripotentne ćelije su, na primer, postavljene na ploču pri velikoj gustini za selekciju ćelija rezistentnih na lek koje sadrže targeting vektor. Proces selekcije sa lekom uklanja većinu ćelija na ploči (∼99%), ostavljajući pojedinačne kolonije, od kojih je svaka klon izveden iz jedne ćelije. Od preostalih ćelija, većina ćelija (∼80-100%) sadrži targeting vektor (koji sadrži selekcionu kasetu za lek) integrisan na slučajnoj lokaciji u genomu. Stoga, kolonije su uzimane pojedinačno i genotipizovane da bi se identifikovale ES ćelije koje nose targeting vektor na korektoj genomskoj lokaciji (npr., korišćenjem testa modifikacije alela opisanog u nastavku). ;[0250] Kvantitativni test visoke propusnosti, odnosno, test modifikacije alela (MOA), može se koristiti za genotipizaciju. Takav test omogućava skrining velikih razmera modifikovanog alela (ili više njih) u roditeljskom hromozomu nakon genetičke modifikacije. MOA test se može izvesti preko različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali se ne ograničavajući na, kvantitativnu PCR, npr., real-time PCR (qPCR). Na primer, real-time PCR sadrži prvi set prajmera koji prepoznaje ciljni lokus i drugi set prajmera koji prepoznaje ne-targetirani referentni lokus. Dodatno, set prajmera sadrži fluorescentnu probu koja prepoznaje amplifikovanu sekvencu. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko Invader Probes®. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko MMP assays®. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko TaqMan® Molecular Beacon. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko Eclipse™ probe technology. (Videti, na primer, US2005/0144655). ;[0251] Izabrana pluripotentna ćelija (tj., ne-humana pluripotentna ćelija, ne-humana ES ćelija) koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju može zatim biti introdukovana u embrion domaćin, na primer, stadijum pre-morule ili stadijum blastocista embriona i implantirana u matericu surogat majke da bi se stvorila osnivačka ne-humana životinja (F0 životinja). Nakon toga, osnivačka životinja, na primer, može biti ukrštena sa životinjom divljeg tipa da bi se stvorila F1 progenija heterozigotna u odnosu na genetičku modifikaciju. Parenje heterozigotne F1 životinje može proizvesti progeniju homozigotnu u odnosu na genetičku modifikaciju. Parenje heterozigotne F1 životinje može proizvesti progeniju homozigotnu u odnosu na genetičku modifikaciju. U nekim primerima izvođenja, različite genetičke modifikacije ciljnih lokusa opisane ovde mogu se izvesti korišćenjem velikog targeting vektora (LTVEC) kao što je detaljno opisano ovde na drugim mestima. Na primer, LTVEC može biti izveden iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetičkog inženjerstva (videti, npr., US Pat. No. 6,586,251 i Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of mouse genome coupled with high resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659). ;[0252] Korišćenje bakterijske homologe rekombinacije (BHR) za stvaranje velikog targeting vektora (LTVEC) prevazilazi ograničenja plazmida u odnosu na smeštanje velikog fragmenta genomske DNK i posledičnu nisku efikasnost introdukovanja ciljane modifikacije u endogeni lokus u pluripotentne ili ne-pluripotentne ćelije. Jedna ili više ciljanih genetičkih modifikacija može se izvesti za stvaranje LTVEC. Primer LTVEC proizvedenog u prokariotskoj ćeliji može sadržati insert nukleinske kiseline koji nosi genomsku sekvencu sa jednom ili više genetičkih modifikacija ili egzogenu nukleinsku kiselinu (npr., homolog ili ortolog nukleinske kiseline pacova), koja je flankirana sa homologim rukama, komplementarna specifičnim genomskim regionima. ;[0253] Prokariotske ćelije domaćini koje sadrže različite targeting vektore opisane ovde su takođe obezbeđeni. Takve prokariotske ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, bakterije kao što je E. coli. U jednom primeru izvođenja, prokariotsku ćelija domaćin sadrži targeting vektor koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da je insert nukleinske kiseline u opsegu od oko 5 kb do oko 200 kb. ;[0254] Prokariotska ćelija domaćin može dodatno sadržati nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid rekombinaze ili nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid rekombinaze koji je operativno vezan sa inducibilnim promotorom. ;[0255] Dodatno su obezbeđeni različiti postupci i kompozicije, koji upotrebljavaju LTVEC kao što je ovde opisano u kombinaciji sa prokariotskom ćelijom da bi se proizvela ciljna genetička modifikacija. Takve kompozicije i postupci su razmatrani ovde na drugim mestima. ;[0256] Obezbeđeni su postupci za modifikaciju ciljnog lokus nukleinske kiseline preko bakterijske homologe rekombinacije (BHR) koij sadrže introdukciju u prokariotsku ćeliju targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da prokariotska ćelija sadrži nukleinske kiseline koje odgovaraju 5’ i 3’ homologim rukamae i prokariotska ćelija je sposobna da eksprimira rekombinazu koja posreduje BHR na ciljnom lokusu. Takvi targeting vektori mogu uključiti bilo koji od velikih targeting vektora opisanih ovde. Takvi postupci mogu korisiti LTVEC kao što je ovde detaljno razmatrano i dodatno koriste CRISPR/Cas sistem kao što je ovde razmatrano na drugim mestima. ;[0257] U jednom primeru izvođenja, CRISPR/Cas sistem se može kontrolisani promotorom aktivnim u prokariotskoj ćeliji, kao što je, na primer, E.coli. ;;ii. Postupci za modifikaciju ciljnog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji ili ne-pluripotentnoj ćeliji. ;;[0258] Otkriće dalje obezbeđuje postupak za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji ili nepluripotentnoj ćeliji preko ciljane genetičke modifikacije, koji sadrži (a) introdukciju u pluripotentnu ćeliju ili ne- pluripotentnu ćeliju targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačen time da ukupna suma 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke je najmanje 10 kb; i (b) identifikacija genetički modifikovane pluripotentne ili ne-pluripotentne ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na ciljnom lokusu od interesa. U jednom primeru izvođenja, ukupna suma 5’ homologe ruke i 3’ homologe ruke je najmanje oko 16 kb do oko 30 kb. U specifičnim primerima izvođenja, ciljana genetička modifikacija je sposobna da se prenese preko klicine linije. Takvi targeting vektori mogu uključivati bilo koji od targeting vektora opisanih ovde. ;[0259] Otkriće opisuje da se takođe mogu koristiti različite ćelije u postupcima z amodifikaciju ciljnog lokusa od interesa obezbeđenog ovde. na primer, ćelija je eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, pluripotentna ćelija, ne-pluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitorska ćelija, humana indukovana pluripotentna ćelija (iPS) ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, fibroblast, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćelija, mišja ćelija, ćelija hrčka ili CHO ćelija. ;[0260] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnu ćeliju preko ciljane genetičke modifikacije, koji sadrži: (a) obezbeđivanje pluripotentne ćelije koja je sposobna da zadrži svoju pluripotenciju nakon najmanje jedne ciljane genetičke modifikacije svog genoma i sposobna je da prenese ciljnu modifikaciju klicinoj liniji F1 generacije; (b) introdukciju velikog targeting vektora (LTVEC) u pluripotentnu ćelija, naznačeno time da LTVEC sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da 5’ homologa ruka i 3’ homologa ruka sadrže fragment genomske DNK; i (c) identifikaciju genetički modifikovane pluripotentne ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju. ;[0261] Različiti postupci se mogu korisiti da bi se identifikovale ćelije koje imaju insert nukleinske kiseline integrisan na ciljnom lokusu od interesa. Insercija inserta nukleinske kiseline na ciljnom lokusu od interesa rezultuje u "modifikaciji alela". Termin "modifikacija alela" i postupci za detekciju modifikovanog alela su detaljnije razmatrani na drugim mestima ovde. ;[0262] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji preko endonukleaza-posredovanog targetiranja gena, koji sadrži: (a) obezbeđivanje izolovane ne-pluripotentne ćelije ili izolovane pluripotentne ćelije koja je sposobna da prenese genetički modifikovani genom klicinoj liniji F1 generacije; (b) introdukciju endonukleaznog sredstva u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju; naznačenu time da endonukleazno sredstvo stvara zarez ili prekid dvostrukog lanca na ciljnoj DNK sekvenci lociranoj u genomskom lokusu od interesa, i naznačeno time da zarez ili prekid dvostrukog lanca na target ciljnoj DNK sekvenci u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji indukuje: (i) DNK popravljanje posredovano spajanjem nehomologih krajeva (NHEJ) zareza ili prekida dvostrukog lanca, naznačeno time da NHEJ-posredovano DNK popravljanje stvara mutant alel koji sadrži inserciju ili deleciju sekvence nukleinske kiseline na ciljnoj DNK sekvenci; ili (ii) DNK popravljanje posredovano homologom rekombinacijom koje rezultuje u obnavljanju sekvence nukleinske kiseline divljeg tipa; i (c) identifikaciju modifikovanog genomskog lokusa od interesa. ;[0263] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u izolovanoj embrionalnoj matičnoj ćeliji (ES) preko nukleaznog sredstva, koji sadrži: (a) obezbeđivanje izolovane ES ćelije koja je sposobna da prenese ciljnu genetičku modifikaciju klicinoj liniji F1 generacije; (b) introdukciju u ES ćeliju: (i) velikog targeting vektor (LTVEC) koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da je sekvenca nukleinske kiseline najmanje 5 kb; i (ii) endonukleazno sredstvo, naznačeno time da endonukleazno sredstvo stvara zarez ili prekid dvostrukog lanca na ciljanoj DNK sekvenci lociranoj u genomskom lokusu od interesa, i naznačeno time da ciljna sekvenca nije prisutna u insertu nukleinske kiseline; i (c) identifikaciju genetičke modifikacije u embrionalnoj matičnoj (ES) ćeliji. ;[0264] Otkriće opisuje da, obezbeđen je postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji preko RNK-vođenog inženjeringa genoma, pri čemu postupak sadrži: (a) obezbeđivanje ne-pluripotentne ćelije ili pluripotentne ćelije koja je sposobna da prenese genetički modifikovani genom klicinoj liniji F1 generacije; (b) introdukciju u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju: (i) prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezani (Cas) protein, (ii) drugi ekspresioni konstrukt koji sadrži drugi promotor operativno povezan sa genomskom ciljnom sekvencom vezanom sa vodećom RNK (gRNK), naznačeno time da genomska ciljna sekvenca je flankirana sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). Izborno genomska ciljna sekvenca je flankirana na 3’kraju sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). U jednom primeru izvođenja, Cas protein i CRISPR RNK i/ili tracrRNK ne ne pojavljuju prirodno zajedno (npr., Cas protein i CRISPR RNK se ne pojavlkjuju prirodno zajedno). U jednom primeru izvođenja, genomska ciljna sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu od GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20GG; SEQ ID NO: 1). U jednom primeru izvođenja, genomska ciljna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 1, naznačeno time da N je između 14 i 20 nukleotida dužine. U jednom primeru izvođenja, gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNK (crRNK) i četvrtu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira trans-aktivnu CRISPR RNK (tracrRNK). U jednom primeru izvođenja, nakon ekspresije, Cas protein formira CRISPR-Cas kompleks koji sadrži crRNK i tracrRNK, i CRISPR-Cas kompleks stvara zarez ili prekid dvostrukog lanca na ciljnoj DNK sekvenci lociranoj u genomskom lokusu od interesa, i naznačeno time da zarez ili dvolančani prekid na ciljnoj DNK sekvenci u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji indukuje: (i) DNK popravljanje posredovano spajanjem nehomologih krajeva (NHEJ) zareza ili prekida dvostrukog lanca stvoreno sa CRISPRCas kompleksom, naznačeno time da NHEJ stvara mutant alel koji sadrži inserciju ili deleciju sekvence nukleinske kiseline na ciljnoj DNK sekvenci; ili (ii) DNK popravljanje posredovano homologom rekombinacijom koje rezultuje u obnavljanju sekvence nukleinske kiseline divljeg tipa; i (c) identifikaciju modifikovanog genomskog lokusa od interesa. ;[0265] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji preko RNK-vođenog inženjeringa genoma, pri čemu postupak sadrži introdukciju u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju koja je sposobna da prenese modifikovani genom preko klicine linije: (i) Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezanog (Cas) proteina ili nukleinske kiseline koja kodira Cas protein; i (ii) gRNK ili DNK koja kodira gRNK, naznačeno time da gRNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje sa genomskom ciljnom sekvencom i transaktivnom CRISPR RNK (tracrRNK); naznačeno time da genomska ciljna sekvenca je flankirana sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). ;[0266] Otkriće opisuje da Cas protein može biti introdukovan u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju kao izolovani protein. U nekim primerima izvođenja, Cas protein može dodatno sadržati domen za penetraciju ćelije koji olakšava ćelijsko usvajanje proteina. U drugim primerima izvođenja, Cas protein se može introdukovani u ćeliju kao molekul informacione RNK (iRNK) koji kodira Cas protein. U drugim primerima izvođenja, Cas protein se može introdukovati u ćeliju kao DNK molekul koji kodira Cas protein. Na primer, DNK molekul koji kodira Cas protein može biti obezbeđen u konstruktu i biti operativno vezan sa promotorom sposobnim da se eksprimira u ne-pluripotentoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji. U određenim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira Cas protein je kodon-optimizovana za ekspresiju u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji. ;[0267] Otkriće opisuje da gRNK može biti introdukovana u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju kao RNK molekul. Na primer, gRNK molekul može se transkribovati in vitro. Otkriće opisuje da, gRNK može biti introdukovana u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju kao DNK molekul koji kodira gRNK. Na primer, DNK molekul koji kodira gRNK može biti u konstruktu i može biti operativno vezan sa promotorom sposobnim da eksprimira gRNK u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji. U drugim primerima izvođenja, gRNK može biti hemijski sintetisana. ;[0268] Otkriće opisuje da gRNK može biti introdukovana u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju kao fuzionisani crRNK-tracrRNK molekul (tj., pojedinačni transkript). Otkriće opisuje da gRNK može biti introdukovana u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju kao zasebni crRNK i tracrRNK molekuli (tj., zasebni transkripti). Otkriće opisuje da gRNK može biti introdukovana u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju kao zasebni DNK molekuli koji kodiraju crRNK i tracrRNK, respektivno. Na primer, zasebni DNK molekuli koji kodiraju crRNK i tracrRNK mogu biti u zasebnim konstruktima i biti operativno vezani sa promotorima sposobnim za ekspresiju u ne-pluripotentnoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji. U bilo kom od prethodnih primera izvođenja, bilo koja kombinacija konstrukata može biti u zasebnim molekulima nukleinske kiseline ili zajedno u jednom molekulu nukleinske kiseline ;[0269] Otkriće opisuje da Cas protein i gRNK mogu biti introdukovani u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju simultano ili sekvencijalno. Slično tome, crRNK i tracrRNK od gRNK mogu biti introdukovani u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju simultano ili sekvencijalno. Odnos Cas proteina (ili kodirajuće nukleinske kiseline) prema gRNK (ili kodirajućoj DNK) i/ili odnos crRNK prema tracrRNK može biti oko stehiometrijskog tako da mogu formirati RNK-protein kompeks. ;[0270] Otkriće opisuje da Cas protein može biti introdukovan u ne-pluripotentnu ćeliju ili pluripotentnu ćeliju u obliku kompleksa sa gRNK. ;[0271] Otkriće opisuje da pluripotentna ćelija je indukovana pluripotentna embrionalna ćelija (iPS). U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je razvojno ograničena progenitor ćelija. ;[0272] Presence zareza ili prekida dvostrukog lanca u mestu prepoznavanja unutar selekcionog markera, u različitim primerima izvođenja, povećava efikasnost i/ili učestalost rekombinacije između targeting vektora (kao što je LTVEC) i ciljanog lokusa od interesa. U jednom primeru izvođenja, rekombinacija je homologa rekombinacija. U sledećem primeru izvođenja, rekombinacija je insercija preko spajanja nehomologih krajeva. U različitim primerima izvođenja, u prisustvu zareza ili prekida dvostrukog lanca, efikasnost ciljnog dejstva targeting vektora (kao što je LTVEC) na ciljni genomski lokus je najmanje oko 2-puta veće, najmanje oko 3-puta veće, najmanje oko 4-puta veće nego u odsustvu zareza ili prekida dvostrukog lanca (korišćenjem, npr., istog targeting vektora i iste homologe ruke i odgovarajućih ciljnih mesta na genomskom lokusu od interesa ali u odsustvu dodatog nukleaznog sredstva koje stvara zarez ili prekid dvostrukog lanca). ;[0273] U jednom primeru izvođenja, ciljana genetička modifikacija na ciljanom lokusu je bialelna. Pod "bialelnim" podrazumeva se da oba alela gena sadrže ciljanu genetičku modifikaciju. Ciljana genetička modifikacija može biti ista ili različita u svakom alelu. Na primer, bialelna modifikacija može rezultovati iz iste modifikacije koja je načinjena na odgovarajućim alelima na odgovarajućim homologim hromozomima, ili iz različitih modifikacija načinjenih odgovarajućim alelima na odgovarajućim homologim hromozomima. Stoga, bialelne mnodifikacije mogu rezultovati, na primer, u homozigotnosti za specifičnu modifikaciju na genomskom lokusu od interesa (tj., specifične modifikacije u oba alela), složenoj heterozigotnosti na genomskom lokusu od interesa (npr., specifična modifikacija u jednom alelu i inaktivacija ili disrupcija drugog alela), ili hemizigotnosti na genomskom lokusu od interesa (npr., specifična modifikacija u jednom alelu i gubitak drugog alela). U određenim primerima izvođenja, kombinovana upotreba targeting vektora (uključujući, na primer, LTVEC) sa nukleaznim sredstvom rezultuje u bialelnoj ciljanoj genetičkoj modifikaciji genomskog lokusa od interesa u ćeliji u poređenju sa upotrebnom samo targeting vektora. Kada se targeting vektor koristi zajedno sa nukleaznim sredstvom, efikasnost bialelnog targetinga je povećana najmanje dva puta, najmanje tri puta, najmanje 4-puta ili više u poređenju sa time kada je targeting vektor korišćen zasebno. U sledećim primerima izvođenja, efikasnost bialelnog targetiranja je najmanje 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4% ili 5% ili veća. ;[0274] Bialelna ciljana genetička modifikacija na ciljanom lokusu može rezultovati u homozigotnoj genetički modifikovanoj ćeliji. Pod "homozigotnom" podrazumeva se da su oba alela ciljanog lokusa (tj., aleli na oba homologa hromozoma) modifikovana na isti način. U određenim primerima izvođenja, kombinovana upotreba targeting vektora (uključujući, na primer, LTVEC) sa nukleaznim sredstvom rezultuje u bialelnoj homozigotnoj ciljanoj genetičkoj modifikaciji genomskog lokusa od interesa u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma (tj., par prvog i drugog homologog hromozoma) i insercija inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma (tj., par prvih i drugih homologih hromozoma). U nekim primerima izvođenja, insert nukleinske kiseline zamenjuje endogenu sekvencu nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u oba homologa hromozoma. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline je homolog ili ortolog deletiranoj endogenoj sekvenci nukleinske kiseline. ;[0275] U jednom primeru izvođenja, ciljana genetička modifikacija na ciljanom lokusu rezultuje u hemozigotnoj genetički modifikovanoj ćeliji. Pod "hemizigotnim" podrazumeva se da samo jedan alele (tj., alele na jednom od dva homologa hromozoma) ciljanog lokusa je prisutan ili samo jedan alel je sposoban da se eksprimira i funkcionalan je. U drugim primerima izvođenja, ciljana genetička modifikacija rezultuje u opštijem slučaju u složenoj heterozigotnosti. Složena heterozigotnost uključuje situacije u kojima oba alela ciljanog lokusa (tj., aleli na oba homologa hromozoma) su modifikovani, ali su modifikovani na različite načine (npr., insercija u jednom alelu i inaktivacija ili disrupcija drugog alela). U određenim primerima izvođenja, kombinovana upotreba targeting vektora (uključujući, na primer, LTVEC) sa nukleaznim sredstvom rezultuje u hemizigotnoj ciljanoj genetičkoj modifikaciji genomskog lokusa od interesa u ćeliji. U određenim primerima izvođenja, kombinovana upotreba targeting vektora (uključujući, na primer, LTVEC) sa nukleaznim sredstvom rezultuje u ciljanim genetičkim modifikacijama koje stvaraju složenu heterozigotnost na genomskom lokusu od interesa u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, ciljana genetička modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline i inserciju inserta nukleinske kiseline. U drugim primerima izvođenja, ciljana genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomsklom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; i (2) inserciju inserta nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom hromozomu i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom hromozomu. Prvi hromozom može biti prvi od dva homologa hromozoma, i drugi hromozom može biti drugi od dva homologa hromozoma. U drugim primerima izvođenja, ciljana modifikacija sadrži: (1) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju inserta nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvi homologi hromozom; i (2) disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom homologom hromozomu. Disrupcija endogene sekvence nukleinske kiseline može rezultovati, na primer, kada je prekid dvostrukog lanca na genomskom lokusu od interesa stvoren sa nukleaznim sredstvom popravljen spajanjem nehomologih krajeva (NHEJ)-posredovanim DNK popravljanjem, što stvara mutant alel koji sadrži inserciju ili deleciju sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i time izaziva disrupciju genomskog lokusa od interesa. Primeri disrupcije uključuju izmenu regulatornog elementa (npr., promotora ili enhansera) na genomskom lokusu od interesa, missens mutaciju, mutaciju usled skraćivanja, nultu mutaciju, ili inserciju ili deleciju malog broja nukleotida (npr., izazivajući mutaciju pomeranja okvira čitanja). Sledeći primer disrupcije je nonsens mutacija. Disrupcija može rezultovati u inaktivaciji (tj., gubitku funkcije) ili gubitku alela. ;[0276] Homozigotne i hemizigotne ciljane genetičke modifikacije su prednost jer kada se genetički modifikovane ćelije koje sadrže ove mutacije koriste za stvaranje genetički modifikovanih životinja kao što je razmatrano u nastavku, proces za stvaranje genetički modifikovanih životinja koje su ne-heterozigotne (tj., homozigoti ili hemizigoti) za nameravanu ciljanu genetičku modifikaciju je efikasnije i manje vremenski zahtevno jer je neophodno manje koraka uzgajanja. Ciljane genetičke modifikacije koje rezultuju u složenoj heterozigotnosti ili hemizigotnosti (npr., insercija u jednom alelu i inaktivacija, disrupcija, ili gubitak drugog alela) može iz nekog razloga biti prednost. ;[0277] Otkriće opisuje da se takođe mogu koristiti različiti tipovi ćelija u bilo kojim od različitih postupaka opisanih prethodno za modifikovanje genomskog lokusa preko nukleaznog sredstva. Ovo otkriće opisuje da je ćelija eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, pluripotentna ćelija, ne-pluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitor ćelija, humana indukovana pluripotentna ćelija (iPS), sisarska ćelija, humana ćelija, fibroblast, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćelija, mišja ćelija, ćelija hrčka ili CHO ćelija. ;[0278] Obezbeđene su kompozicije koje sadrže genetički modifikovane ne-humane životinje, koje imaju ciljane genetičke modifikacije u interleukin-2 receptor gama lokusu ili u ApoE lokusu. Različiti postupci i kompozicije obezbeđeni ovde omogućuju da se ovi modifikovan i lokusi prenesu preko klicine linije. ;[0279] U specifičnim primerima, genetički modifikovana ne-humana životinja, ili genetički modifikovana pluripotentna ili nepluripotentna ćelija sadrži genomski lokus koji ima ciljanu genetičku modifikaciju u interleukin-2 gama receptor lokusu ili ima ciljanu genetičku modifikaciju u ApoE lokus, naznačeno time da interleukin-2 gama receptor genomski lokus ili ApoE lokus sadrži: (i) deleciju najmanje dela interleukin-2 gama receptor lokusa ili najmanje dela ApoE lokusa; (ii) inserciju heterologe sekvence nukleinske kiseline u ApoE lokus ili u interleukin-2 gama receptor lokus; ili (iii) njihovu kombinaciju, naznačeno time da gentički modifikovani genomski lokus je sposoban da se prenese preko klicine linije. ;[0280] Dalje su obezbeđeni postupci koji omogućavaju da se stvore takve genetički modifikovane ne-humane životinje, i takve genetički modifikovane pluripotentne ćelije. Takvi postupci uključuju postupak za modifikaciju ApoE genomskog lokusa ili interleukin-2 gama receptor lokusa u pluripotentnoj ćeliji preko ciljane genetičke modifikacije. Postupak sadrži (a) introdukciju u pluripotentnu ćeliju targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom, sa ApoE lokusom i 3’ homologom rukom, sa ApoE lokusom, (b) identifikovanje genetički modifikovanih pluripotentnih ćelija koje sadrže ciljanu genetičku modifikaciju na ApoE genomskom lokusu od interesa, naznačeno time da je ciljana genetička modifikacija sposobna da se prenese preko klicine linije. ;[0281] Dodatni postupci uključuju (a) introdukciju u pluripotentnu ćeliju targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankirane sa 5’ homologom rukom sa interleukin-2 receptor gama lokusom i 3’ homologom rukom sa interleukin-2 receptor gama lokusom, (b) identifikovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelija koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na interleukin-2 receptor gama lokusu, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija je sposobna da se pšrenese preko klicine linije. ;;iii. Postupci za integraciju više polinukleotida od interesa u ciljani lokus ;;[0282] Različiti postupci i kompozicije obezbeđeni ovde omogućavaju ciljanu integraciju više polinukleotida od interesa sa datim ciljanim lokusom. Različiti postupci dati prethodno mogu se sekvencijalno ponavljati da bi se omogućila ciljana integracija bilo kog broja inserata nukleinskih kiselina u dati ciljani lokus. Stoga, različtii postupci obezbeđuju inserciju najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više inserata nukleinskih kiselina u ciljani lokus. U naročitim primerima izvođenja, takvi postupci sekvencijalnog ređanja omogućavaju rekonstrukciju velikih genomskih regiona iz eukariotske ćelije, na primer, ne-pacovske eukariotske ćelije, sisarske ćelije (tj., humane, nehumane, glodarske, ne-pacovske glodarske, mišje, majmunske, pacovske, hrčka, domestifikovanog sisara ili poljoprivredne životinje) u ciljani lokus. U takvim slučajevima, transfer i rekontrukcija genomskih regiona koji uključuju i kodirajuće i nekodirajuće regione omogućava da se očuva kompleksnost datog regiona preko zadržavanja, najmanje delimično, kodirajućih regiona, ne-kodirajućih regiona i varijacija broja kopija koji se nalaze unutar nativnog genomskog regiona. Stoga, različiti postupci otkrića obezbeđuju, na primer, postupke za stvaranje "heterolognih" ili "egzogenih" genomskih regiona unutar bilo koje eukariotske ćelije, bilo koje ne-pacovske eukariotske ćelije, bilo koje sisarske ćelije ili životinje od interesa, naročito unutar prokariotske ćelije domaćina ili unutar nepluripotentne ćelije, pluripotentne ćelije ili ES ćelije. U jednom neograničavajućem primeru, "humanizovani" genomski region unutar ne-humane životinje (tj., unutar pacova) je stvoren. Postupci za stvaranje genomskih regiona unutar bilo koje ćelije su obezbeđeni ovde. Otkriće opisuje da je ćelija eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, pluripotentna ćelija, nepluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitor ćelija, humana indukovana pluripotentna ćelija (iPS) ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, fibroblast, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćelija, mišja ćelija, ćelija hrčka ili CHO ćelija. ;;3. Humanizovani genomski lokus ;;[0283] Ovde su obezbeđeni različiti postupci i kompozicije koje sadrže humanizovani genomski lokus. Kao što je ovde korišćeno, pod "humanizovanim" genomskim lokusom podrazumevan je region ne-humanog genoma koji sadrži najmanje jednu humanu sekvencu nukleinske kiseline. Humanizovani genomski lokus može sadržati region DNK iz bilo kog organizmaa koji ima humanu DNK sekvencu ubačenu u njega. Otkriće opisuje da je organizam eukariot, ne-pacovski eukariot, ne-humani sisar, sisar, čovek, glodar, ne-pacovski glodar, pacov, miš ili hrčak. Na primer, "humanizovani lokus pacova" sadrži region DNK pacova koji ima humanu DNK sekvencu ubačenu u njega. ;[0284] Humana DNK sekvenca može biti prirodna humana DNK sekvenca ili može biti modifikovana u odnosu na svoj nativni oblik. U specifičnom primeru izvođenjas, humana DNK ima najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa nativnom humanom sekvencom. Ukoliko humana sekvenca nije nativna humana sekvenca najmanje ima veću identičnost sekvence sa nativnom humanom sekvencom nego što ima sa ortologom ne-humane sekvence. Dodatno, humana DNK sekvenca može sadržati cDNK, region humane genomske DNK, nekodirajući regulatorni region, ili bilo koji deo kodirajućeg, genomskog, ili regulatornog regiona humane DNK. Humana DNK sekvenca inserirana u nehumani lokus može sadržati bilo koji od inserta polinukleotida kao što je ovde opisano na drugim mestima. U specifičnim primerima izvođenja, humana DNK sekvenca je ortolog ne-humanog ciljanog lokusa, dok je u drugim slučajevima, humana DNK sekvenca je homolog ne-humanog ciljanog lokusa. ;[0285] U jednom primeru izvođenja, ciljana genetička modifikacija je insercija ili zamena sekvence endogene nukleinske kiseline, sa homologom ili ortologom humane sekvence nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, ciljana genetička modifikacija sadrži inserciju ili zamenu sekvence endogene nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom humane sekvence nukleinske kiseline na endogenom lokusu koij sadrži odgovarajuću ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline. ;[0286] Postupci za stvaranje humanizovanog lokusa sadrže introdukciju u ciljani lokus koji sadrže nukleinsku kiselinu humanu sekvencu nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za stvaranje humanizovane ne-humane životinje. Takav postupak sadrži (a) modifikovanje genoma ne-humane pluripotentne ćelije ili ne-pluripotentne ćelije sa ciljanim vektorom koji sadrži insert nukleinske kiseline koji sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline da bi se formirala donor ćelija; (b) introdukcija donor ćelije u embrion domaćin; i (c) gestaciju embriona domaćina u surogat majci; naznačeno time da surogat majka proizvodi potomstvo koje sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline. U specifičnim primerima izvođenja, humanizovani lokus je sposoban da se prenese preko klicine linije. U dodatnom primeru izvođenja, targeting vektor sadrži veliki targeting vektor (LTVEC) i insert nukleinske kiseline koji sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline je najmanje 5 kb. ;[0287] U drugim postupcima, humanizovani genomski lokus je stvoren modifikacijom ciljanog lokusa nukleinske kiseline preko bakterijske homologe rekombinacije (BHR). Postupak sadrži introdukciju u prokariotsku ćeliju targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da insert nukleinske kiseline sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline, i naznačeno time da prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu i sposobna je da eksprimira rekombinazu koja posreduje BHR na ciljanom lokusu. ;[0288] Humanizovani genomski lokus može sadržati (a) inserciju homologa ili ortologa humane sekvence nukleinske kiseline; (b) zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline; ili (c) njihovu kombinaciju. U specifičnim primerima izvođenja, humanizovani genomski lokus je sposoban da se prenosi preko klicine linije. U sledećim primerima izvođenja, humana ortologa sekvenca zamenjuje odgovarajuću sekvencu nađenu u ne-humanom lokusu. ;[0289] Bilo koja humana sekvenca nukleinske kiseline može se koristiti u postupcima i kompozicijama koje su obezbeđene ovde. Neograničavajući primeri humane sekvence nukleinske kiselines koji se mogu korisiti u postupcima i kompozicijama su detaljno razmatrani ovde na drugim mestima. ;[0290] Humana sekvenca nukleinske kiseline za inserciju u lokus od interesa može biti bilo koje veličine. Otkriće opisuje da humana sekvenca nukleinske kiseline može biti od oko 500 nukleotida do oko 200 kb, od oko 500 nukleotida do oko 5 kb, od oko 5 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, ili od oko 190 kb do oko 200 kb. Otkriće opisuje da humana sekvenca nukleinske kiseline je najmanje 5 kb. ;[0291] U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je genomski lokus naznačen time da homologa ili ortologa humana sekvenca nukleinske kiseline sadrži (a) jedan ili više nerearanžiranih VHgenskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina, jedan ili više nerearanžiranih D genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina, i jedan ili više nerearanžiranih JHgenskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina, koji su operativno vezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara; (b) rearanžiranu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezanu sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara; (c) jedan ili više nerearanžiranih Vκ ili Vκ genskih segmenata humanog imunoglobulina i jedan ili više nerearanžiranih JK ili Jλ genskih segmenata humanog imunoglobulina, koji su operativno vezani sa sisarskom, sekvencom nukleinske kiseline λ ili κ konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina; ili (d) rearanžirane sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ ili κ lakog lanca operativno vezane sa sisarskomm sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca imunoglobulina. ;[0292] U sledećem primeru izvođenja, obezbeđen je genomski lokus naznačen time da (a) sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisarskog imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona, sekvenca nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona, ili njihova kombinacija; ili (b) sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca sisarskog imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona čoveka, ili njihova kombinacija. ;[0293] U specifičnom primeru izvođenja, obezbeđen je genomski lokus naznačen time da sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je izabrana od ili sadrži CH1, zglob, CH2, CH3, i/ili njihovu kombinaciju. ;[0294] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata koji sadrži VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, ili njihova kombinacija. ;[0295] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih D genskih segmenata koji sadrži Dl-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0296] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih JH genskih segmenata koji sadrži JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, i/ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih Vκ genskih segmenata koji sadrži Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ 7-3, Vκ 2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40, ili njihovu kombinaciju. ;[0297] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata koij sadrži Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0298] U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata koji sadrži Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, ili njihovu kombinaciju. ;[0299] U sledećem primeru izvođenja, obezbeđen je genomski lokus koji sadrži humanizovani genomski lokus koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline humanog interleukin-2 receptora (IL2R) ili njenu varijantu ili fragment. U specifičnim primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline IL2R sadrži sekvencu nukleinske kiseline interleukin-2 receptora alfa, interleukin-2 receptora beta, ili interleukin-2 receptor gama ili njene varijante ili fragmente. ;[0300] U sledećim primerima izvođenja, genomski lokus, sadrži humanizovani genomski lokus koji sadrži deo humanog ApoE lokusa, humanog interleukin-2 receptor gama lokusa, humanog Rag2 lokusa, humanog Rag1 lokusa i/ili humanog Rag2/Rag1 lokusa koji zamenjuje odgovarajuće homologe ili ortologe delove ne-humanog ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa. U jednom primeru izvođenja, nehumani ekto-domen IL-2Rg je zamenjen sa ekto-domenom humanog IL-2Rg, pri čemu je ostatak molekula ne-human. ;[0301] U sledećem primeru izvođenja, obezbeđena je genetički modifikovana ne-humana životinja, koja sadrži humanizovani genomski lokus. Takve genetički modifikovane ne-humane životinje sadrže (a) inserciju homologe ili ortologe humane sekvence nukleinske kiseline; (b) zamenu sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom humane sekvence nukleinske kiseline na endogenom genomskom lokusu; ili (c) njihovu kombinaciju, naznačenu time da je humanizovani genomski lokus sposoban da seprenese preko klicine linije. ;[0302] Genetički modifikovane životinje, uključujući ne-humane životinje) koje sadrže različite humanizovane genomske lokuse obezbeđene ovde i opisane prethodno su takođe obezbeđeni. ;;4. Polinukleotidi od interesa ;;[0303] Bilo koji polinukleotid od interesa može se sadržati u različitim insertima nukleinskih kiselina i time integrisan u ciljani lokus. Ovde otkriveni postupci, obezbeđuju najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više polinukleotida od interesa da se integriše u ciljani genomski lokus. ;[0304] Polinukleotid od interesa unutar insert nukleinske kiseline kada je integrisan na ciljnom genomskom lokusu može introdukovati jednu ili više genetičkih modifikacija u ćeliju. Genetička modifikacija može sadržati deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline i/ili adiciju egzogenog ili heterologog ili ortologog polinukleotida u ciljani genomski lokus. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline sa egzogenim polinukleotidom od interesa na ciljanom genomskom lokusu. Stoga, ovde obezbeđeni postupci omogućavaju stvaranje genetičke modifikacije koja sadrži nokaut, deleciju, inserciju, zamenu ("knock-in"), tačkastu mutaciju, zamenu domena, zamenu egzona, zamenu introna, zamenu regulatorne sekvence, zamenu gena, ili njihovu kombinaciju. Takve modifikacije se mogu desiti nakon integracije prvog, drugog, trećeg, četvrtog, petog, šestog, sedmog, ili bilo kog narednog inserta nukleinskih kiselina u ciljani genomski lokus. ;[0305] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan na ciljnom lokusu može sadržati sekvencu koja je nativna ćeliji u koju je introdukovana; polinukleotid od interesa može biti heterologan ćeliji u koju je introdukovan; polinukleotid od interesa može biti egzogen ćeliji u koju je introdukovan; polinukleotid od interesa može biti ortolog ćeliji u koju je introdukovan; ili polinukleotid od interesa može biti od različite vrste od ćelije u koju je introdukovan. Kao što je ovde korišćeno "nativan" u odnosu na sekvencu inseriranu u ciljni lokus je sekvenca koja je nativna ćeliji koja ima ciljni lokus ili nativna ćeliji iz koje je ciljni lokus izveden (tj., ut pacova). Kao što je ovde korišćeno, "heterologne" u odnosu na sekvencu uključuje sekvencu koja potiče od druge vrste, ili, ukoliko je od iste vrste, značajno je različita ili modifikovana u odnosu na njen nativni oblik u kompoziciji i/ili genomskom lokusu preko namerne ljudske intervencije. Kao što je ovde korišćeno, "egzogena" u odnosu na sekvencu je sekvenca koja potiče od druge vrste. Polinukleotid od interesa može biti od bilo kog organizma od interesa uključujući, ali se ne ograničavajući na, ne-humani, glodarski, ne-pacovski glodarski, hrčka, miša, pacova, humani, majmuna, poljoprivrednog sisara ili ne-poljoprivrednog sisara. Polinukleotid od interesa može dodatno sadržati kodirajući region, nekodirajući region, regulatorni region, ili genomsku DNK. Stoga, prvi, drugi, treći, četvrti, peti, šesti, sedmi, i/ili bilo koji od narednih inserata nukleinskih kiselina može sadržati takve sekvernce. ;[0306] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan na ciljnom lokusu je nativan sekvenci nukleinske kiseline miša, humanoe nukleinske kiseline, ne-humane nukleinske kiseline, eukariotske nukleinske kiseline, ne-pacovske eukariotske nukleinske kiseline, ne-humane sisarske nukleinske kiseline, sisarske nukleinske kiseline, glodarske nukleinske kiseline, ne-pacovske glodarske nukleinske kiseline, pacovske nukleinske kiseline, nukleinske kiseline hrčka, nukleinske kiseline majmuna, nukleinske kiseline poljoprivrednog sisara, ili nukleinske kiseline ne-poljoprivrednosg sisara. U sledećim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa integrisan na ciljnom lokusu je fragment genomske nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, genomska nukleinska kiselina je mišja genomska nukleinska kiselina, humana genomska nukleinska kiselina, ne-humana nukleinska kiselina, eukariotska nukleinska kiselina, ne-pacovska eukariotska nukleinska kiselina, nehumana sisarska nukleinska kiselina, sisarska nukleinska kiselina, glodarska nukleinska kiselina, ne-pacovska glodarska nukleinska kiselina, nukleinska kiselina pacova, nukleinska kiselina hrčka, nukleinska kiselina majmuna, nukleinska kiselina poljoprivrednog sisara ili nukleinska kiselina ne-poljoprivrednosg sisara ili njihova kombinacija. ;[0307] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa može biti u opsegu od oko 500 nukleotida do oko 200 kb kao što je prethodno opisano. polinukleotid od interesa može biti od oko 500 nukleotida do oko 5 kb, od oko 5 kb do oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 60 kb do oko 70 kb, od oko 80 kb do oko 90 kb, od oko 90 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 110 kb, od oko 120 kb do oko 130 kb, od oko 130 kb do oko 140 kb, od oko 140 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 160 kb, od oko 160 kb do oko 170 kb, od oko 170 kb do oko 180 kb, od oko 180 kb do oko 190 kb, ili od oko 190 kb to oko 200 kb, od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;[0308] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili inseriran u ciljni genomski lokus može kodirati polipeptid, može kodirati miRNK, ili može sadržati bilo koje regulatorne regione ili nekodirajuće regione od interesa uključujući, na primer, regulatornu sekvencu, promotor sekvencu, enhanser sekvencu, sekvencu vezivanja represora transkripcije, ili deleciju sekvence koja ne kodira protein, ali ne sadrži deleciju sekvence koja kodira protein. Dodatno, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili inseriran u ciljni genomski lokus može kodirati protein eksprimiran u nervnom sistenu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, cirkulatornom sistemu, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu, ili njihovoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili inseriran u ciljni genomski lokus kodira protein eksprimiran u kostnoj srži ili bone ćeliji izvedenoj iz kostne srži. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni genomski lokus kodira protein eksprimiran u ćeliji slezine. U sledećim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili inseriran u ciljni genomski lokus kodira protein eksprimiran u B ćeliji, kodira protein eksprimiran u nezreloj B ćelija ili kodira protein eksprimiran u zreloj B ćeliji. ;[0309] Polinukleotid od interesa unutar inserta polinukleotida može sadržati deo ApoE lokusa, Il2rg lokusa, Rag1 lokusa, Rag2 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa. Takvi delovi ovih datih lokusa su razmatrani ovde na drugim mestima, kao što su i različiti homologi i ortologi regioni od bilo kog organizma od interesa koji se može upotrebiti. ;[0310] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili inseriran u ciljni genomski lokus sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Izraz "teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina" su opisani ovde na drugim mestima. ;[0311] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni genomski lokus sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina. ;[0312] U jednom primeru izvođenja, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži jedan ili više nerearanžiranih segmenata VHgena teškog lanca humanog imunoglobulina, jedan ili više nerearanžiranih segmenata D gena teškog lanca humanog imunoglobulina, i jedan ili više nerearanžiranih segmenata JH gena teškog lanca humanog imunoglobulina, koij su operativno vezani za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara. U jednom primeru izvođenja, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezan sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara. U jednom primeru izvođenja, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži jedan ili više nerearanžirani humani imunoglobulin Vκ ili Vλ genske segmente i jedan ili više nerearanžiranih humanih imunoglobulin Jκ ili Jλ genskih segmenata, koji su operativno vezani sa sekvencom nukleinske kiseline imunoglobulin konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca sisara. U jednom primeru izvođenja, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona λ ili κ lakog lanca operativno vezanu sa sisarskom sekvencim nukleinske kiseline imunoglobulin konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, humanu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, humanu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona, ili njihovu kombinaciju. ;[0313] U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je izabrana od ili sadrži CH1, zglob, CH2, CH3, i/ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-zglob-CH2-CH3. ;[0314] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni genomski lokus sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina. Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i opisana je ovde na drugim mestima. ;[0315] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni genomski lokus sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina. ;[0316] U jednom primeru izvođenja, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži jedan ili više nerearanžiranih humanih imunoglobulinskih Vκ ili Vλ genskih segmenata i jedan ili više nerearanžiranih humanih imunoglobulinskih Jκ ili Jλ genskih segmenata, koji su operativno vezani sa glodarskom sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulinskog λ ili κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži rearanžiranu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog λ ili κ lakog lanca operativno vezanu sa glodarskom sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulinskog λ ili κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, humanu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina konstantnog regiona imunoglobulinskog λ ili κ lakog lanca sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, humanu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona, ili njihovu kombinaciju. ;[0317] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može kodirati ekstraćelijski protein ili ligand za receptor. U specifičnim primerima izvođenja, kodirani ligand je citokin. Citokini od interesa uključuju hemokin izabran od ili koji sadrži CCL, CXCL, CX3CL, i/ili XCL. Citokin takođe može sadržati faktor nekroze tumora (TNF). U sledećim primerima izvođenja, citokin je interleukin (IL). U jednom primeru izvođenja, interleukin je izabran od ili sadrži IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, i/ili IL-36. U jednom primeru izvođenja, interleukin je IL-2. U specifičnim primerima izvođenja, takvi polinukleotidi od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisani u ciljni genomski lokus su od čoveka i, u specifičnijim primerima izvođenja, mogu sadržati humanu genomsku sekvencu. ;[0318] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može kodirati Apolipoprotein E (ApoE). ;[0319] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može kodirati citoplazmatski protein ili membranski protein. U jednom primeru izvođenja, membranski protein je receptor, kao što je, citokinski receptor, interleukin receptor, interleukin 2 receptor-alfa, interleukin-2 receptor beta, interleukin-2 receptor gama ili receptor tirozin kinaze. U drugim slučajevima, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati ortologi ili homologi region ciljnog lokusa. ;[0320] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati polinukleotid koji kodira najmanje region T ćelijskog receptora, uključujući T ćelijski receptor alfa. U specifičnim postupcima svaki od inserata nukleinskih kiselina sadrži genomski region lokusa T ćelijskog receptora (tj., lokus T ćelijskog receptora alfa) tako da nakon završetka serijske integracije, deo ili ceo genomski lokus T ćelijskog receptora je integrisan u ciljni lokus. Takav insert nukleinskih kiselina može sadržati najmanje jedan ili više varijabilnih segmenata ili zglobnih segmenata lokusa T ćelijskog receptora (tj., lokusa T ćelijskog receptora alfa). U sledećim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa koji kodira region T ćelijskog receptora može biti od, na primer, polinukleotida koji kodira mutant protein eukariota, nepacovskog eukariota, sisara, ne-humanog sisara, glodara, ne-pacovskog glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, hrčka, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara. ;[0321] U drugim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa integrisan u ciljni lokus kodira jedarni protein. U jednom primeru izvođenja, jedarni protein je jedarni receptor. U specifičnim primerima izvođenja, takvi polinukleotidi od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisani na ciljnom lokusu su od čoveka, u specifičnijim primerima izvođenja, mogu sadržati humanu genomsku sekvencu. ;[0322] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati genetičku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci. Takve genetičke modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, delecionu mutaciju kodirajuće sekvence ili fuziju dve kodirajuće sekvence. ;[0323] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati polinukleotid koji kodira mutant protein, uključujući, na primer, humani mutant protein. U jednom primeru izvođenja, mutant protein je karakterisan izmenjenim karakteristikama vezivanja, izmenjenom lokallizacijom, izmenjenom ekspresijom, i/ili izmenjenim obrascem ekspresije. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljnom lokusu sadrži najmanje jedan bolesni alel, uključujući na primer, alel neurološke bolesti, alele kardiovaskularne bolesti, alel bolesti bubrega, alel bolesti mišića, alel bolesti krvi, alel gena koji izaziva kancer, ili alel bolesti imunog sistema. U takvim slučajevima, alel bolesti može biti dominantni alel ili alel bolesti može biti recesivni alel. Dodatno, alel bolesti može sadržati alel sa polimorfizmom jednog nukleotida (SNP). Polinukleotid od interesa koji kodira mutant protein može biti od bilo kog organizma, uključujući, ali se ne ograničavajući na, polinukleotid koji kodira mutant protein eukariota, nepacovskog eukariota, sisara, ne-humanog sisara, glodara, ne-pacovskog glodara, miša, pacova, čoveka, hrčka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara. ;[0324] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi mutantni oblik proteina sa izmenjenim karakteristikama vezivanja, izmenjenom lokalizacijom, izmenjenom ekspresijom, i/ili izmenjenim obrascem ekspresije. ;[0325] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona ApoE lokusa, na primer, ApoE lokusa pacova, naznačeno time da genetička modifikacija na ApoE lokusu rezultuje u smanjenju ApoE aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je ApoE nokaut. ;[0326] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona Rag1 lokusa, na primer, Rag1 lokus pacova, naznačeno time da genetička modifikacija na Rag1 lokusu rezultuje u smanjenju Rag1 aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je Rag1 nokaut. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona Rag2 lokusa, na primer, Rag2 lokus pacova, naznačeno time da genetička modifikacija na Rag2 lokusu rezultuje u smanjenju Rag2 aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je Rag2 nokaut. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona Rag1/Rag2 lokus, na primer, Rag1/Rag2 lokusa pacova, naznačeno time da genetička modifikacija na Rag1/Rag2 lokusu rezultuje u smanjenju Rag1 aktivnosti i smanjenju Rag2 aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je Rag1/Rag2 nokaut. ;[0327] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona interleukin-2 receptor gama lokusa, na primer, interleukin-2 receptor gama lokusa pacova, naznačeno time da genetička modifikacija na interleukin-2 receptor gama lokusu rezultuje u smanjenju interleukin-2 receptor gama aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je interleukin-2 receptor gama nokaut. ;[0328] Kao što je razmatrano ovde na drugim mestima, dodatni primeri izvođenja obezbeđeni ovde sadrže jedan ili više ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa, na primer, ApoE lokus pacova, interleukin-2 receptor gama lokus pacova, Rag2 lokus, Rag1 lokus i/ili Rag2/Rag1 lokus, koji je modifikovan zamenom dela of ApoE lokusa pacova, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa sa odgovarajućim ortolognim delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptor gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i/ili Rag2/Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0329] U jednom primeru izvođenja, stvoreno je više genetičkih modifikacija. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona interleukin-2 receptor gama lokusa, na primer, interleukin-2 receptor gama lokusa pacova, naznačeno time da genetička modifikacija na interleukin-2 receptor gama lokusu rezultuje u smanjenju interleukin-2 receptor gama i druga genetička modifikacija proizvodi deleciju, adiciju, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona Rag2 lokusa pacova, naznačeno time da genetička modifikacija Rag2 lokusa rezultuje u smanjenju Rag2 aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, stvoren je interleukin-2 receptor gama/Rag2. Takav pacov ima SCID fenotip. ;[0330] U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, cirkulatornom sistemu, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu, ili njihovoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, sisarska nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u kostnoj srži ili ćeliji izvedenoj iz kostne srži. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein eksprimiran u ćeliji slezine. U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži mišju genomsku DNK sekvencu, pacovsku genomsku DNK sekvencu, humanu genomsku DNK sekvencu, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, pacovske i humane genomske DNK sekvence. U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, mišje i humane genomske DNK sekvence. U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, mišje i pacovske genomske DNK sekvence. U jednom primeru izvođenja, genomski lokus sadrži, u bilo kom redosledu, pacovske, mišje, i humane genomske DNK sekvence. ;[0331] U jednom primeru izvođenja, insert nukleinske kiseline sadrži genetičku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci gena. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži delecionu mutaciju u kodirajućoj sekvenci. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži fuziju dve endogene kodirajuće sekvence. ;[0332] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži deleciju sekvence koja ne kodira protein, ali ne sadrži deleciju sekvence koja kodira protein. U jednom primeru izvođenja, delecija sekvence koja ne kodira protein sadrži deleciju regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži adiciju promotora. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži zamenu promotora ili regulatornog elementa. U jednom primeru izvođenja, regulatorni element je enhanser. U jednom primeru izvođenja, regulatorni element je element vezivanja represora transkripcije. ;[0333] U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži postavljanje humane sekvence nukleinske kiseline koja kodira mutant humani protein. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži najmanje jedan alel humane bolesti humanog gena. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je neurološka bolest. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je kardiovaskularna bolest. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je bolest bubrega. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je mišićna bolest. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je bolest krvi. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je kancer. U jednom primeru izvođenja, humana bolest je bolest imunog sistema. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je dominantni alel. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je recesivni alel. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti sadrži alel sa polimorfizmom jednog nukleotida (SNP). ;[0334] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni lokus može takođe sadržati regulatornu sekvencu, uključujući na primer, promotor sekvencu, enhanser sekvencu, ili sekvencu vezivanja transkripcionog represora. U specifičnim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i/ili integrisan u ciljni genomski lokus sadrži polinukleotid koji ima deleciju sekvence koja ne kodira protein, ali ne sadrži deleciju sekvence koja kodira protein. U jednom primeru izvođenja, delecija sekvence koja ne kodiraprotein sadrži deleciju regulatorne sekvence. U sledećem primeru izvođenja, delecija regulatornog elementa sadrži deleciju promotor sekvence. U jednom primeru izvođenja, delecija regulatornog elementa sadrži deleciju enhanser sekvence. Takav polinukleotid od interesa može biti od bilo kog organizma, uključujući, ali se ne ograničavajući na polinukleotid koji kodira mutant protein, eukariota, ne-pacovskog eukariota, sisara, ne-humanog sisara, glodara, nepacovskog glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljopriovrednog sisara ili domaćeg sisara. ;;5. Postupci za introdukciju sekvenci i stvaranje transgenih životinja ;;[0335] Kao što je prethodno dato, ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije da se omogući ciljana integracija jednog ili više polinukleotida od interesa u ciljni lokus. Takvi sistemi koriste različite komponente i za lakše referenciranje, ovde termin "ciljani integracioni sistem" generički sadrži sve komponente neophodne za integracioni događaj (tj., u ne-ograničavajućim primerima, različita nukleazna sredstva, mesta prepoznavanja, insert DNK polinukleotida, targeting vektore, ciljni genomski lokus, i/ili polinukleotide od interesa). ;[0336] Ovde obezbeđeni postupci sadrže introdukciju u ćeliju jednog ili više polinukleotidnih ili polipeptidnih konstrukata koji sadrže različite komponente ciljanog genomskog integracionog sistema. "Introdukcija" označava predstavljanje sekvence ćeliji (polipeptida ili polinukleotida) na takav način da sekvence dobije pristup unutrašnjosti ćelije. Postupci obezbeđeni ovde ne zavise od naročitog postupka za introdukciju bilo koje komponente ciljanog genomskog integracionog sistema u ćeliju, samo da polinukleotid dobije pristup unutrašnjosti bar jedne ćelije. Postupci za introdukciju polinukleotida u različite tipove ćelija su poznati u tehnici i uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke stabilne transfekcije, postupke prolazne transfekcije, i postupke posredovane virusom. ;[0337] U ovom otkriću, bilo koje ćelije od bilo kog organizma mogu se koristiti u postupcima obezbeđenim ovde. Ovo otkriće opisuje da su ćelije od eukariota, ne-pacovskog eukariota, sisara, ne-humanog sisara, čoveka, glodara, ne-pacovskog glodara, pacova, miša ili hrčka. U specifičnim primerima izvođenja, ćelije su eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, pluripotentna ćelija, ne-pluripotentna ćelija, ne-humana pluripotentna ćelija, ne-humana sisarska ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitor ćelija, humana indukovana pluripotentna ćelija (iPS) ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, fibroblast, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćelija, pacovska ćelija, mišja ćelija, ćelija hrčka ili CHO ćelija. ;[0338] U nekim primerima izvođenja, ćelije upotrebljene u postupcima i kompozicijama imaju DNK konstrukt stablino inkorporisan u njihov genom. "Stabilno inkorporisan" ili "stabilno introdukovan" označava introdukciju polinukleotida u ćeliju tako da se nukleotidna sekvenca integriše u genom ćelije i sposobna je da se nasledi u njenom potomstvu. Bilo koji protokol se može koristiti za stabilnu inkorporaciju DNK konstrukata ili različitih komponenti ciljanog genomskog integracionog sistema. ;[0339] Transfekcioni protokoli kao i protokoli za introdukciju polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci u ćelije može varirati. Neograničavajući transfekcioni postupci uključuju hemijske transfekcione postupke koji uključuju upotrebu lipozoma; nanočestica; kalcijum fosfata (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 and, Kriegler, M (1991). Transfer i Expression: Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman i Company. pp. 96-97); dendrimera; ili katjonskih polimera kao što su DEAE-dekstran ili polietilenimin. Ne-hemijski postupci uključuju elektroporaciju; Sono-poraciju; i optičku transfekciju. Transfekcija zasnovana na česticama uključuje upotrebu genskog topa, magnetnu transfekciju (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). Virusni postupci se takođe mogu koristiti za transfekciju. ;[0340] U jednom primeru izvođenja, introdukcija jednog ili više polinukleotida u ćeliju je posredovana elektroporcijom, intracitoplazmatskom injekcijom, virusnom infekcijom, sa adenovirusom, sa lentivirusom, sa retrovirusom, sa transfekcijom, sa lipid posredovanom transfekcijom ili je posredovana preko Nucleofection™. ;[0341] U jednom primeru izvođenja, introdukcija jednog ili više polinukleotida u ćeliju dodatno sadrži: introdukciju ekspresionog konstrukta koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline od interesa operativno vezanu sa promotorom. U jednom primeru izvođenja, promotor je konstitutivnoaktivni promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je inducibilni promotor. U jednom primeru izvođenja, promotor je aktivan u embrionalnoj ćeliji, na primer, embrionalnoj matičnoj ćelija. ;[0342] U jednom primeru izvođenja, expression construct je introdukovan zajedno sa LTVEC. U jednom primeru izvođenja, ekspresioni konstrukt je introdukovan zasebno od LTVEC tokom određenog vremenskog perioda. ;[0343] U jednom primeru izvođenja, introdukcija jednog ili više polinukleotida u ćeliju može biti izvedena više puta tokom određenog vremenskog perioda. U jednom primeru izvođenja, introdukcija jednog ili više polinukleotida u ćeliju je izvedena najmanje dva puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje tri puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje četiri puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje pet puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje šest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje sedam puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje osam puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje devet puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje deset puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje jedanaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje dvanaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje trinaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje četrnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje petnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje šesnaset puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje sedamnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje osamnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje devetnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, ili najmanje dvadeset puta tokom određenog vremenskog perioda. ;[0344] U jednom primeru izvođenja, nukleazno sredstvo je introdukovano u ćeliju istovremeno sa targeting vektorom ili velikim targeting vektorom (LTVEC). Alternativno, nukleazno sredstvo je introdukovano zasebno od targeting vektora ili LTVEC tokom određenog perioda vremena. U jednom primeru izvođenja, nukleazno sredstvo je introdukovano pre introdukcije targeting vektora ili LTVEC, dok u drugim primerima izvođenja, nukleazno sredstvo je introdukovano nakon introdukcije targeting vektora ili LTVEC. ;[0345] U jednom primeru izvođenja, korak skrininga sadrži kvantitativni test za procenu modifikacije alela (MOA) roditeljskog hromozoma. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko kvantitativne PCR. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni PCR je realtime PCR (qPCR). U jednom primeru izvođenja, real-time PCR sadrži prvi set prajmera koji prepoznaje ciljani lokus i drugi set prajmera koji prepoznaje ne-ciljani referentni lokus. U jednom primeru izvođenja, set prajmera sadrži fluorescentnu probu koja prepoznaje umnoženu sekvencu. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko in situ hibridizacije posredovane fluorescencijom (FISH). U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko komparativne genomske hibridizacije. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko izotermne DNK amplifikacije. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko izotermne DNK amplifikacije. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko kvantitativne hibridizacije sa imobilisanom probom (probama). U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko Invader Probes®. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko MMP assays®. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko TaqMan® Molecular Beacon. U jednom primeru izvođenja, kvantitativni test je izveden preko Eclipse™ probe tehnologije. (Videti, na primer, US2005/0144655). ;[0346] Dodatno je obezbeđen postupak za stvaranje humanizovane ne-humane životinje, koji sadrži: (a) modifikovanje genoma pluripotentne ćelija sa targeting vektorom koji sadrži insert nukleinske kiseline koji sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline da bi se formirala donor ćelija; (b) introdukciju donor ćelije u embrion domaćina; i (c) gestaciju embriona domaćina u surogat majku; naznačeno time da surogat majka proizvodi potomstvo koje sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, donor ćelija je introdukovana u embrion domaćin koji je na stadijumu blastocista ili na stadijumu pre-morule (tj., 4 ćelijskom stadijumu ili 8 ćelijskom stadiujumu). Dodatno, korak (a) takođe može biti izveden sa velikim targeting vektorom (LTVEC) i/ili humanom sekvencom nukleinske kiseline najmanje 5 kb dužine. U sledećim primerima izvođenja, genetička modifikacija je sposobna da se prenese preko klicine linije. ;[0347] Genetički modifikovane ne-humane životinje mogu biti stvorene upotrebom različitih postupaka otkrivenih ovde. Takvi postupci sadrže (1) integrisanje jednog ili više polinukleotida od interesa u ciljni lokus pluripotentne ćelije da bi se stvorila genetički modifikovana pluripotentna ćelija koja sarži insert nukleinske kiseline u ciljanom genomskom lokusu korišćenjem postupaka otkrivenih ovde; (2) selekciju genetički modifikovane pluripotentne ćelije koja ima jedan ili više polinukleotida od interesa u ciljnom genomskom lokusu; (3) introdukciju genetički modifikovane pluripotentne ćelije u embrion domaćin; i (4) implantaciju embriona domaćina koji sadrži genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majku. Potomstvo genetički modifikovane pluripotentne ćelije je stvoreno. U jednom primeru izvođenja, donor ćelija je introdukovana u embrion domaćin na stadijum blastocista ili na stadijumu pre-morule (tj., 4 ćelijski stadijum ili 8 ćelijski stadijuma). Potomstvo koje je sposobno da prenese genetičku modifikaciju preko klicine linije je stvoreno. Pluripotentna ćelija može biti ES ćelija kao što je ovde razmatrano na drugim mestima. ;[0348] Tehnike jedarnog transfera se takođe mogu koristiti da bi se stvorile genetički modifikovane ne-humane životinje. Ukratko, postupci jedarnog transfera uključuju korake: (1) enukleacije oocite; (2) izolovanje donor ćelija ili jedra koje će se kombinovati sa enukleisanom oocitom; (3) ubacivanje ćelije ili jedra u enukleisanu oocitu da bi se formirala rekonstituisana ćelija; (4) implantaciju rekonstituisane ćelija u matericu životinje da bi se formirao embrion; i (5) omogućavanje razvića embriona. U takvim postupcima oocite su generalno dobijene od preminulih životinja, iako se mogu izolovati takođe ili iz jajovoda i/ili jajnika živih životinja. Oocite mogu sazrevati u različitim medijumima poznatim stručnjacima pre enukleacije. ;Enukleacija oocite može se izvesti na više načina koji su dobro poznati stručnjaku. Insercija donor ćelija ili jedra u enukleisanu oocitu da bi se formirala rekonstituisana ćelija je obično mikroinjekcijom donor ćelije ispod zone pelucide pre fuzije. Fuzija može biti indukovana primenom DC električnog pulsa duž ravni kontakta/fuzije (elektrofuzija), izlaganjem ćelija hemikalijama koje promovišu fuziju, kao što je polietilen glikol, ili putem inaktiviranog virusa, kao što je Sendai virus. Rekonstituisana ćelija je tipično aktivirana električnim i/ili ne-električnim sredstvima pre, tokom, i/ili nakon fuzije donora jedra i oocite primaoca. Postupci aktivacije uključuju električni puls, hemijski indukovani šok, penetraciju spermom, povećanje nivoa divalentnih katjona u oociti, i smanjenjem fosforilacije ćelijskih proteina (kao što je preko inhibitora kinaze) u oociti. Aktivirane rekonstituisane ćelije, ili embrioni, se tipično kultivišu u medijumu koji je dobro poznat stručnjacima i zatim su preneti u matericu životinje. Videti, na primer, US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, i US Patent No. 7,612,250. ;[0349] U jednom aspektu, postupak za stvaranje genetički modifikovane ne-humane životinje je obezbeđen, koji sadrži modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji korišćenjem endonukleaza-posredovanog gena koji ciljano deluje da introdukuje modifikaciju u genomski lokus od interesa da bi se formirala modifikovana pluripotentna ćelija, zadržavajući modifikovanu pluripotentnu ćeliju pod uslovima dovoljnim da se zadrži pluripotencija, korišćenjem modifikovane pluripotentne ćelije kao donor ćelije u embrionu domaćinu, i gestaciju embriona domaćina koji sadrži modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majci, naznačeno time da se gestacija embriona domaćina odigrava u surogat majci i rođeno je genetički modifikovano potomstvo. ;[0350] U jednom primeru izvođenja, target sekvenca je locirana u intronu. U jednom primeru izvođenja, target sekvenca je locirana u egzonu. U jednom primeru izvođenja, target sekvenca je locirana u promotoru. U jednom primeru izvođenja, target sekvenca je locirana u regulatornom regionu promotora. U jednom primeru izvođenja, target sekvenca je locirana u regionu enhansera. ;[0351] U jednom primeru izvođenja, korak introdukcije je izveden više puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju različite ciljane sekvence. U jednom primeru izvođenja, korak je izveden najmanje dva puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju različite ciljane sekvence, najmanje tri puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje četiri puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje pet puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje šest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje sedam puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje osam puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje devet puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje deset puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje jedanaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje dvanaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje trinaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje četrnaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje petnaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje šesnaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje sedamnaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje osamnaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, najmanje devetnaest puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence, ili najmanje dvadeset puta tokom određenog vremenskog perioda korišćenjem više endonukleaza koje prepoznaju ciljane sekvence. ;[0352] U jednom primeru izvođenja, korak introdukcije je posredovan elektroporacijom, intracitoplazmatskom injekcijom, adenovirusom, lentivirusom, retrovirusom, transfektovanjem, lipid-posredovanim transfektovanjem ili je posredovan preko Nucleofection™. ;[0353] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži introdukciju egzogene nukleinske kiseline u genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je transgena. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je introdukovana u endogeni lokus. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je introdukovana ektoppično (npr., na lokusu koji je različit od njegovog endogenog lokusa). ;[0354] U jednom aspektu, obe zbeđen je postupak za stvaranje genetički modifikovane nehumane životinje, koji sadrži modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnu ćeliju koji koristi RNK-vođeni genomski inženjering da bi se introdukovala modifikacija u genomski lokus od interesa da bi se formirala modifikovana pluripotentna ćelija, zadržavajući modifikovanu pluripotentnu ćeliju pod uslovima dovoljnim da se održi pluripotencija, upotrebom pluripotente ćelije kao donor ćelije u embrionu domaćinu i gestacijom embriona domaćina koji sadrži modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majci, naznačeno time da je gestacija embriona domaćina u surogat majci i rođeno je genetički modifikovano potomstvo. ;[0355] U jednom primeru izvođenja, postupak ima stopu targetinga od oko 2% do oko 80%. ;[0356] U jednom primeru izvođenja, postupak sadrži ko-introdukciju više drugih ekspresionih konstrukata koji sadrže različite genomske ciljane sekvence za multipleksno uređivanje različitih genomskih lokusa. U jednom primeru izvođenja, postupak sadrži introdukciju više drugih ekspresionih konstrukata koji sadrže različite genomske target sekvence za multipleksno uređivanje različitih genomskih lokusa tokom određenog vremenskog perioda. ;[0357] U jednom primeru izvođenja, korak introdukcije je izveden više puta tokom određenog vremenskog perioda. U jednom primeru izvođenja, korak introdukcije (b) je izveden najmanje dva puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje tri puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje četiri puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje pet puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje šest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje sedam puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje osam puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje devet puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje deset puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje jedanaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje dvanaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje trinaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje četrnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje petnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje šesnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje sedamnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje osamnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje devetnaest puta tokom određenog vremenskog perioda, najmanje dvadeset puta tokom određenog vremenskog perioda. ;[0358] U jednom primeru izvođenja, prvi ekspresioni konstrukt i drugi ekspresioni konstrukt su eksprimirani iz istog plazmida. ;[0359] U jednom primeru izvođenja, korak introdukcije je posredovan elektroporacijom, intracitoplazmatskom injekcijom, adenovirusom, lentivirusom, retrovirusom, transfektovanjem, lipid-posredovanim transfektovanjem ili je posredovan preko Nucleofection™. ;[0360] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži introdukciju egzogene nukleinske kiseline u pluripotentnu ćeliju koja sadrži mutant alel. ;[0361] U jednom primeru izvođenja, egzogena nukelinska kiselina je transgena. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je introdukovana u endogeni lokus. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je postavljena ektopijski (npr., u lokus različit od njegovog endogenog lokusa). ;[0362] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži introdukciju egzogene nukleinske kiseline u genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je transgena. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je je introdukovana u endogeni lokus. U jednom primeru izvođenja, egzogena nukleinska kiselina je introdukovana ektopično (npr., na lokusu različitom od njenog endogenog lokusa). ;[0363] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za stvaranje humanizovane ne-humane životinje, koji sadrži modifikovanje pluripotentne ćelije sa LTVEC koji sadrži insert koji sadrži humanu sekvencu od najmanje 5 kb, i koristi pluripotentnu ćeliju kao donor ćeliju, introdukciju donor ćelije u embrion domaćin, i gestaciju embriona domaćina u surogat majci, naznačeno time da majka rađa potomstvo koje sadrži humanizaciju. ;[0364] Drugi postupci za stvaranje genetički modifikovane ne-humane životinje sadrže u svojoj klicinoj liniji jednu ili više genetičkih modifikacija kao što je ovde opisano su obezbeđeni, koji sadrže: (a) modifikaciju ciljanog lokusa koji se sadrži u prokariotskoj ćeliji korišćenjem različitih postupak aopisanih ovde; (b) selekciju modifikovane prokariotske ćelije koja sadrži genetičku modifikaciju na ciljanom lokusu; (c) izolaciju genetički modifikovanog targeting vektora iz genoma modifikovane prokariotske ćelije; (d) introdukciju genetički modifikovanog targeting vektora u pluripotentnu ćeliju da bi se stvorila genetički modifikovana pluripotentna ćelija koja sadrži insert nukleinske kiseline na ciljanom genomskom lokusu; (e) selekciju genetički modifikovane pluripotentne ćelije; (f) introdukciju genetički modifikovane pluripotentne ćelije u embrion domaćin na stadijumu pre-morule; i (g) implantaciju embriona domaćina koji sadrži genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majku da bi se stvorila F0 generacija izvedena iz genetički modifikovane pluripotentne ćelije. U takvim postupcima targeting vektor može sadržati veliki targeting vektor. Pluripotentna ćelija može biti ES ćelija. U dodatnim postupcima, korak izolacije (c) dodatno sadrži (c1) linearizaciju genetički modifikovanog targeting vektora (tj., genetički modifikovanog LTVEC). U sledećim primerima izvođenja, korak introdukcije (d) dodatno sadrži (d1) introdukciju nukleaznog sredstva kao što je ovde opisano u pluripotentnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, koraci selekcije (b) i/ili (e) su izvedeni primenom selektabilnog sredstva kao što je ovde opisano u prokariotsku ćeliju ili pluripotentnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, koraci selekcije (b) i/ili (e) su izvedeni preko testa modifikacije alela (MOA) kao što je ovde opisano. ;[0365] Dodatni postupci za modifikovanje ciljnog genomskog lokusa sisarske ćelije preko bakterijske homologe rekombinacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji su obezbeđeni i sadrže: (a) obezbeđivanje prokariotske ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu, (b) introdukciju u prokariotsku ćeliju targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da insert nukleinske kiseline sadrži sisarski region (uključujući, na primer, DNK insert od čoveka), i (c) selekciju ciljane prokariotske ćelije koja sadrži insert nukleinske kiseline u ciljni lokus, naznačeno time da je prokariotska ćelija sposobna da eksprimira rekombinazu koja posreduje BHR. Korak (a1) može sadržati obezbeđivanje prokariotske ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži prvi polinukleotid koji sadrži prvo mesto prepoznavanja za prvo nukleazno sredstvo, i korak (b1) može dodatno sadržati ekspresiju u prokariotskoj ćeliji nukleaznog sredstva koje stvara zarez ili prekid dvostrukog lanca na ili blizu prvog mesta prepoznavanja. Koraci (a)-(c) se mogu serijski ponavljati kao što je ovde otkriveno da bi se omogućila introdukcija više inserata nukleinske kiselines u ciljni lokus u prokariotskoj ćeliji. Kada je ciljani genomski lokus "izgrađen" sa prokariotskom ćelijom, targeting vektor koji sadrži modifikovani ciljni lokus može biti izolovan iz prokariotske ćelije i introdukovan u ciljni genomski lokus unutar pluripotentne ćelije. Pluripotentne ćelije (tj., ES ćelije) koje sadže modifikovani genomski lokus mogu zatim biti napravljene u genetički modifikovanim ne-humanim životinjama. ;[0366] U nekim primerima izvođenja, različite genetičke modifikacije ciljnih genomskih lokusa opisanih ovde mogu se izvesti serijom reakcija homologih rekombinacija (BHR) u bakterijskim ćelijama korišćenjem LTVEC izvedenog iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjerstva (videti, npr., US Pat. No. ;6,586,251 i Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of mouse genome coupled with high resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659. ;[0367] U nekim primerima izvođenja, ciljane ES ćelije koje sadrže različite genetičke modifikacije kao što je ovde opisano korišćene su kao insert ES ćelije i introdukovane u premorula stadijum embriona iz odgovarajućeg organizma, npr., 8-ćelijski stadijum mišjeg embriona, preko VELOCIMOUSE® postupka (videti, npr., US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, i US 2008-0078000 A1). Embrion koji sadrži genetički modifikovane ES ćelije je inkubiran do stadijuma blastocista i zatim implantiran u surogat majku da bi se proizvela F0. Životinje koje nose genetički modifikovani genomski lokus mogu se identifikovati preko testa modifikacije alela (MOA) kao što je ovde opisano. Rezultujuća F0 generacija ne-humane životinje izvedena iz genetički modifikovane ES ćelije je ukrštena sa divljim tipom ne-humane životinje da bi se dobilo potomstvo F1 generacije. Nakon genotipizacije sa specifičnim prajmerima i/ili probama, F1 ne-humane životinje koje su heterozigotne u odnosu na genetički modifikovani genomski lokus su međusobno ukrštene da bi se proizveče životinje koje su homozigotne za genetički modifikovani genomski lokus. Alternativno, F0 ženka ne-humane životinje i F0 mužjak ne-humane životinje od kojih svako ima genetičku modifikaciju može se ukrstiti da bi se dobile F1 ne-humane životinje homozigotne u odnosu na genetičku modifikaciju. ;[0368] U jednom aspektu, genetički modifikovani genom pacova, na primer, je obezbeđen, koji sadrži ciljanu modifikaciju endogene sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukleinske kiseline iz drugog organizma. ;[0369] U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa sekvenca nukleinske kiseline je dužine od oko 5 kb do oko 200 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa nepacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 10 kb do oko 20 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 20 kb do oko 30 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 30 kb do oko 40 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 40 kb do oko 50 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 50 kb do oko 60 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 60 kb do oko 70 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa nepacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 70 kb do oko 80 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 80 kb do oko 90 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 90 kb do oko 100 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 100 kb do oko 110 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 110 kb do oko 120 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 120 kb do oko 130 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 140 kb do oko 150 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 150 kb do oko 160 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 160 kb do oko 170 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 170 kb do oko 180 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 180 kb do oko 190 kb. U jednom primeru izvođenja, homologa ili ortologa ne-pacovska sekvenca nukleinske kiseline je u opsegu od oko 190 kb do oko 200 kb. Različiti polinukleotidi od interesa koji se mogu upotrebiti u insertu nukleinske kiseline su opisani na drugim mestima ovde. ;[0370] Drugi postupci za ciljanu genomsku modifikaciju ne-humane životinje su obezbeđeni. Takvi postupci mogu sadržati (a) modifikovanje genomskog lokusa od interesa u ne-humanoj pluripotentnoj ćeliji prema bilo kom od različitih postupaka obezbeđenih ovde za modifikaciju genomskog lokusa od interesa, čime se proizvodi genetički modifikovana ne-humana pluripotentna ćelija koja sadrži coljnu genomsku modifikaciju; (b) introdukciju modifikovane nehumane pluripotentne ćelije iz koraka (a) u ne-humani embrion domaćin; i (c) gestaciju nehumanog embriona domaćina koji sadrži modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majci, naznačeno time da surogat majka proizvodi F0 potomstvo koje sadrži ciljnu genomsku modifikaciju, i naznačeno time da je ciljna genomska modifikacija sposobna da se prenese preko klicine linije. ;[0371] U nekim primerima izvođenja, ciljna genomska modifikacija sadrži istovremenu deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju egzogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa (tj., deleciju i inserciju u istom koraku). U nekim primerima izvođenja, ciljana genomska modifikacija sadrži bialelnu genetičku modifikaciju. Bialelna genetička modifikacija može sadržati deelciju endogene sekvence nukleinske ksieline i inserciju sekvence egzogene nukleinske kiselinena genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma (tj., par prvog i drugog homologog hromozoma). ;[0372] U drugim primerima izvođenja, ciljna genomska modifikacija stvara modifikovanu pluripotentnu ćeliju koja je složeni heterozigot na genomskom lokusu od interesa. U drugim primerima izvođenja, ciljna genomska modifikacija stvara modifikovanu pluripotentnu ćeliju koja je hemizigotna na genomskom lokusu od interesa. U nekim primerima izvođenja, ciljna genomska modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i inserciju egzogene nukleinske kiseline. Na primer, ciljna genetička modifikacija može sadržati: (1) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; i (2) inserciju egzogene nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom hromozomu i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom hromozomu. Prvi hromozom može biti prvi od dva homologa hromozoma, i drugi hromozom može biti drugi od dva homologa hromozoma. ;;6. Ćelije ;;[0373] Različiti postupci i kompozicije opisane ovde koriste targeting sistem genomskog lokusa u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, ćelija je pluripotentna ćelija. Otkriće opisuje da je ćelija nepluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je ne-humana pluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, ne-humana pluripotentna ćelija je sisarska pluripotentna ćelija. Otkriće opisuje da je pluripotentna ćelija humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. ;[0374] Otkriće opisuje da je ćelija eukariotska ćelija, ne-pacovska eukariotska ćelija, humana pluripotentna ćelija, humana ES ćelija, humana adultna embrionalna ćelija, razvojno ograničena humana progenitor ćelija, ne-humana sisarska ćelija, sisarska ćelija, humana ćelija, fibroblast, glodarska ćelija, ne-pacovska glodarska ćelija, ćelija pacova, mišja ćelija, ćelija hrčka ili CHO ćelija. ;[0375] Otkriće opisuje da je eukariotska ćelija primarna ćelija. Primarne ćelije uključuju ćelije ili kulture ćelija koje su izolovane direktno iz organizma, organa, ili tkiva. Primarne ćelije uključuju ćelije koje nisu ni transformisane niti besmrtne. One uključuju bilo koju ćeliju dobijenu od organizma, organa, ili tkiva koje nije prethodno prošlo kroz kulturu tkiva ili je prethodno prošlo kroz kulturu tkiva ali je nesposobno da se beskonačno pasažira kroz kulturu tkiva. Takve ćelije mogu biti izolovane konvencionalnim tehnikama i uključuju, na primer, hematopoetske ćelije, endotelne ćelije, epitelne ćelije, fibroblaste, mezenhimalne ćelije, keratinocite, melanocite, monocite, mononuklearne ćelije, adipocite, preadipocite, neurone, glijalne ćelije, hepatocite, skeletne mioblaste, i glatke mišićne ćelije. U nekim primerima izvođenja, primarne ćelije su izvedene iz vezivnih tkiva, mišićnih tkiva, tkiva nervnog sistema, ili epitelnih tkiva. ;[0376] Otkriće opisuje da je eukariotska ćelija imortalizovana ćelija. Imortalizovane ćelije ukljućuju ćelije iz višećelijskog organizma koje u normalnim slučajevima ne bi proliferisale beskonačno ali, usled mutacije ili izmene, izbegle su ćelijsku senscenciju i umesto toga zadržale su stalnu deobu. Takve mutacije ili izmene mogu se desiti prirodno ili mogu biti namerno indukovane. Primeri imortalizovanih ćelija uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), humane embrionalne ćelije bubrega (npr., HEK 293 ćelije), i mišje embrionalne fibroblast ćelije (npr., 3T3 ćelije). Brojni tipovi imortalizovanih ćelija su dobro poznate u tehnici. ;[0377] Otkriće opisuje da su imortalizovane ćelije izvedene iz ćelija kancera. U sledećem primeru izvođenja, primarna ili imortalizovana ćelija je ona koja se tipično koristi za kultivaciju ili za ekspesiju rekombinantnih gena ili proteina. ;[0378] U drugim primerima izvođenja, pluripotentna ćelija je sposobna da zadrži sopstvenu pluripotenciju nakon najmanje jedne ciljane genetičke modifikacije svog genoma i sposobna je da prenese ciljanu modifikaciju klicinoj liniji F1 generacije. ;[0379] U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je ne-humano oplođeno jaje na stadijumu jedne ćelije. U jednom primeru izvođenja, ne-humano oplođeno jaje je sisarsko oplođeno jaje. U jednom primeru izvođenja, sisarsko oplođeno jaje je glodarsko oplođeno jaje na stadijumu jedne ćelije. Otkriće opisuje da je sisarsko oplođeno jaje oplođeno jaje pacova ili miše na stadijumu jedne ćelije. ;[0380] Otkriće opisuje da različite ćelije korišćene u postupku i kompozicijama otkrivenim ovde mogu takođe sadržati prokariotske ćelije, kao što je bakterijska ćelija, uključujući E. coli. U specifičnim primerima, prokariotska ćelija je rekombinaciono-kompetentni soj E. coli. U jednom primeru, prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazu, dok u drugim slučajevima, prokariotska ćelija ne sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazu, i nukleinska kiselina koja kodira rekombinazu je introdukovana u prokariotsku ćeliju. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira rekombinazu sadrži DNK ili iRNK. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira rekombinazu je pABG. U jednom primeru izvođenja, rekombinaza je eksprimirana pod kontrolom inducibilnog promotora. U jednom primeru izvođenja, ekspresija rekombinaze je kontrolisana arabinzom. ;;A. Medijum niske osmolalnosti za stvaranje i održavanje humane indukovane pluripotentne matične ćelije ;;[0381] Medijum kulture ćelija je obezbeđen za upotrebu u postupcima i kompozicijama pronalaska. Otkriće opisuje da je medijum pogodan za stvaranje populacije humanih iPS ćelija. Otkriće opisuje da je medijum pogodan za održavanje humanih iPS ćelija u kulturi. Otkriće opisuje da su humane iPS ćelije naivne ili izgledaju kao naivne. ;[0382] Ovde obezbeđeni medijum sadrži najmanje osnovni medijum, supslemente, polipeptid inhibitorni faktor leukemije (LIF), inhibitor glikogen sintaza kinaze 3 (GSK3), i MEK inhibitor. ;[0383] Predmetni medijum je medijum niske osmolalnosti. U jednom primeru, osmolalnost je između oko 175-280 mOsm/kg. U dodatnim primerima, osmolalnost medijuma je oko 180-270 mOsm/kg, oko 200-250 mOsm/kg, oko 220-240 mOsm/kg, ili oko 225-235 mOsm. U naročitom primeru izvođenja, osmolalnost medijuma je oko 233 mOsm/kg. ;[0384] Osnovni medijum obezbeđen za pronalazak je osnovni medijum niske osmolalnosti u koji su dodati suplementi. Predmetni osnovni medijum razlikuje se od osnovnih medijuma tipično korišćenih da održe humane iPS ćelije u kulturi, koji uključuju Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), u različitim oblicima (npr., Invitrogen DMEM, Cat. No. 1 1971 -025), i DMEM sa niskom količinom soli dostupan komercijalno kao KO-DMEM™ (Invitrogen Cat. No. ;10829-018). ;[0385] Osnovni medijum obezbeđen ovde medijum niske osmolalnosti ali pokazuje karakteristike koje nisu ograničene na nisku osmolalnost. Na primer, DMEM formulacija prikazana u Tabeli može se pogodno napraviti za svrhe pronalaska preko izmene koncentracija natrijumm hlorida i/ili natrijum bikarbonata kao što je ovde obezbeđeno, što će rezultovati u različitoj osmolalnosti u poređenju sa standardnim DMEM osnovnim medijumom ili DMEM osnovnim medijumom sa niskom količinom soli (KODMEM) prikazanim u Tabeli A. ;;Tabela A: formulacija DMEM osnovnog medijuma. ;;; ; ; ;;; [0386] Predmetni osnovni medijum može uključiti so alkalnog metala i halid, kao što je natrijum hlorid (NaCl). Primeri koncentracija NaCl u osnovnom medijumu uključuju 50 ± 5 mM ili oko 3 mg/mL. ;[0387] U sledećem primeru izvođenja, osnovni medijum pokazuje koncentraciju soli ugljene kiseline. So ugljene kiseline može biti natrijumova so. U takvom primeru, natrijumova so može biti natrijum bikarbonat. U naročitom primeru izvođenja, natrijum bikarbonat je prisutan u osnovnom medijumu sa koncentracijom od oko 266 5 mM ili oko 2.2 mg/mL. ;[0388] U sledećem primeru izvođenja, osnovni medijum je osnovni medijum niske osmolalnosti. Osmolalnost osnovnog medijuma može biti unutar opsega od oko 175-280 mOsm/kg, oko 180-250 mOsm/kg, oko 190-225 mOsm/kg, ili oko 195-205 mOsm/kg. Primer osmolalnosti osnovnog medijuma može biti 200, 214, 216, ili 218 mOsm/kg. U naročitom primeru izvođenja, osmolalnost osnovnog medijuma je 200 mOsm/kg. Osmolalnost se može odrediti kada su ćelije kultivisane u različitim koncentracijama CO2. U nekim primerima, ćelije su kultivisane na 3% CO2ili 5% CO2. ;[0389] U poželjnom primeru izvođenja, osnovni medijum sadrži NaCl sa koncentracijom od 3.0 mg/mL, natrijum bikarbonat sa koncentracijom od oko 2.2 mg/mL, i ima osmolalnost od 200 mOsm/kg. ;[0390] Suplementi formulisani sa osnovnim medijumom prema predmetnom pronalasku su pogodni za stvaranje, održavanje, ili obogaćivanje populacija humanih iPS ćelija otkrivenih ovde. Takvi suplementi su označeni kao "suplementi" ili "+ suplementi" u ovom otkriću. Termin "suplementi" ili izraz "+ suplementi," uključuje jedan ili više dodatnih elemenata dodatih komponentama osnovnog medijuma opisanih u Tabeli A. Na primer, suplementi mogu uključiti, bez ograničenja, F-12® medijum (Gibco), N2® suplement (Gibco; 100X rastvor), NEUROBASAL® medijum (Gibco), B-27® suplement (Gibco; 50X solution), L-glutamin, glukozu, 2-merkaptoetanol, polipeptid inhibitorni faktor leukemije (LIF), inhibitor glikogen sintaze kinaze 3, MEK inhibitor, ili bilo koju njihovu kombinaciju. ;[0391] U naročitom primeru izvođenja, LIF polipeptid je humani LIF (hLIF) polipeptid. U nekim primerima, hLIF polipeptid je korišćen sa koncentracijom od oko 1-1000 jedinica/mL, oko 20-800 jedinica/mL, oko 50-500 jedinica/mL, oko 75-250 jedinica/mL, ili oko 100 jedinica/mL. ;[0392] U sledećem naročitom primeru izvođenja, GSK3 inhibitor sadrži CHIR99021. U nekim primerima, CHIR99021 je korišćen u koncentraciji od oko 0.1 to 10 mM, oko 1-5 mM, oko 2-4 mM, ili oko 3 mM. ;[0393] U sledećem naročitom primeru izvođenja, MEK inhibitor sadrži PD0325901. U nekim primerima, PD0325901 je korišćen u koncentraciji od oko 0.1-5 mM, oko 0.2-1 mM, oko 0.3-0.7 mM, ili oko 0.5 mM. ;[0394] Primer medijuma sadrži osnovni medijum niske osmolalnosti opisan ovde sa oko 24.75% (zapr/zapr), F-12 medijum sa oko 24.75% (zapr/zapr), N2 suplement sa oko 0.5% (zapr/zapr), NEUROBASAL medijum sa oko 49% (zapr/zapr), B-27 suplement sa oko 1% (zapr/zapr), Lglutamin sa oko 2 mM, 2-merkaptoetanol sa oko 0.1 mM, hLIF sa oko 100 jedinica/mL, CHIR99021 sa oko 3 mM, i PD0325901 sa oko 0.5 mM. ;[0395] U sledećem naročitom primeru izvođenja, medijum može ili ne mora sadržati osnovni faktor rasta fibroblasta (bFGF, takođe poznat kao FGF2 ili FGF-β). Poželjno predmetni medijum ne sadrži bFGF. ;;B. Humane indukovane pluripotentne matične ćelije ;;[0396] Ovo otkriće opisuje postupke i kompozicije za stvaranje populacije humanih iPS ćelija. U ovom otkriću su dodatno obezbeđeni postupci i kompozicije za održavanje humanih iPS ćelija u kulturi. Humane iPS ćelije koje su poroizvedene ili održavane u kulturi su takođe obezbeđene u ovom otkriću. ;[0397] Termin "pluripotentna ćelija" ili "pluripotentna embrionalna ćelija" uključuje nediferenciranu ćeliju koja poseduje sposobnost da se razvije u više od jednog diferenciranog ćelijskog tipa. Takva pluripotentna ćelije može biti, na primer, sisarska embrionalna matična (ES ćelija) ćelija ili sisarska indukovana pluripotentna embrionalna ćelija (iPS ćelija). Primeri pluripotentnih ćelija uključuju humane iPS ćelije. ;[0398] Termin "embrionalna matična ćelija" ili "ES ćelija" označava totipotentnu ili pluripotentnu embrionalnu ćeliju izvedenu iz embriona, izvedenu iz unutrašnje ćelijske mase blastocista, koja se može održavati u in vitro kulturi pod stabilnim uslovima. ES ćelije su sposobne da se diferenciraju u ćelije bilo kog od tri kičmenjačka klicina sloja, npr., endoderm, ektoderm, ili mezoderm. ES ćelije se takođe karakterišu njihovom sposobnošću da se beskonačno propagiraju pod pogodnim in vitro uslovima kulture. Videti, na primer, Thomson et al. (Science (1998) Vol. 282(5391), pp. 1145-1147). ;[0399] Termin "indukovana pluripotentna embrionalna ćelija" ili "iPS ćelija" uključuje pluripotentnu embrionalnu ćeliju koja se može izvesti direktno iz diferencirane adultne ćelije. Humane iPS ćelije se mogu stvoriti introdukcijom specifičnih setova faktora reprogramiranja u ne-pluripotentnu ćeliju koja može uključiti, na primer, Oct3/4, Sox familiju transkripcionih faktora (npr., Sox1, Sox2, Sox3, Sox15), Myc familiju transkripcionih faktora (npr., c-Myc, l-Myc, n-Myc), Krüppel-sličnu familiju transkripcionih faktora (KLF) (npr., KLF1, KLF2, KLF4, KLF5), i/ili srodnih transkripcionih faktora, kao što su NANOG, LIN28, i/ili Glis1. Humane iPS ćelije se takođe mogu stvoriti, na primer, upotrebom miRNKs, malih molekula koji imitiraju aktivnost transkripcionih faktora, ili specifikatora linije. Humane iPS ćelije su karakterisane njihovom sposobnošću da se diferenciraju u bilo koji tip ćelija tri kičmenjačka klicina sloja, npr., endoderm, ektoderm, ili mezoderm. Humane iPS ćelije se takođe karakterišu njihovom sposobnošću da se beskonačno propagiraju pod pogodnim in vitro uslovima kulture. Videti, na primer, Takahashi i Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676). ;[0400] Termini "naivne" i "prajmovane" identifikuju različita pluripotentna stanja humanih iPS ćelija. Termin "naivnog izgleda" identifikuju ćeliju koja eksprimira pluripotentno stanje koje pokazuje jednu ili više karakteristika naivne pluripotentne ćelije. Humane iPS ćelije naivnog izgleda se takođe mogu označiti kao "naivnim-slične" humane iPS ćelije. Otkriće opisuje da humane iPS ćelije naivnog-izgleda pokazuju jednu ili više morfoloških karakteristika naivnih humanih iPS ćelija, kao što je morfologija karakterizovana kompaktnim kolonijama u obliku kupole. Otkriće opisuje da humane iPS ćelije naivnog-izgleda eksprimiraju jedan ili više markera pluripotentnosti koji su opisani ovde. Otkriće opisuje da naivne ili humane iPS ćelije naivnog izgleda su naivne humane iPS ćelije. Otkriće opisuje da su naivne ili humane iPS ćelije naivnog izgleda iPS ćelije. ;[0401] Karakteristike naivnih i prjamovanih iPS ćelija su opisaneu tehnici. Videti, na primer, Nichols i Smith (Cell Matična Cell (2009) Vol. 4(6), pp. 487-492). Naivne humane iPS ćelije pokazuju stanje pluripotencije slično onome kod ES ćelija unutrašnje ćelijske mase preimplantacionog embriona. Takve naivne ćelije nisu prajmovane za linijsku specifičnost i determinaciju. Ženske naivne iPS ćelije se karakterišu sa dva aktivna X hromozoma. U kulturi, samo-obnavljanje naivnih humanih iPS ćelija je zavisno od inhibitornog faktora leukemije (LIF) i drugih inhibitora. Kultivisane naivne humane iPS ćelije prikazuju klonsku morfologiju karakterisanu sa zaobljenim kolonijama u obliku kupole i nedostatkom apikalno-bazalne polarnosti. Kultivisane naivne ćelije mogu dodatno prikazivati jedan ili vipe markera pluripotencije kao što je opisano ovde na drugim mestima. Pod odgovarajućim uslovima, vreme udvostručavanja naivnih humanih iPS ćelija u kulturi može biti između 16 i 24 časa. ;[0402] Prajmovane humane iPS ćelije eksprimiraju stanje pluripotencije slično onome kod ćelija postimplantacionog epiblasta. Takve ćelije su prajmovane u odnosu na linijsku specifičnost i determinaciju. Ženske prajmovane iPS ćelije se karakterišu sa jednim aktivnim X hromozomom i jednim neaktivnim X hromozomom. U kulturi, samo-obnavljanje prajmovanih humanih iPS ćelija je zavisno od faktora rasta fibroblasta (FGF) i aktivina. Kultivisane prajmovane humane iPS ćelije prikazuju klonsku morfologiju koja se karakteriše sa epitelnim monoslojem i prikazuju apikalno-bazalnu polarnost. Pod odgovarajućim uslovima, vreme udvostručavanja prajmovanih humanih iPS ćelija u kulturi može biti između 24 časa ili više. ;[0403] Otkriće opisuje da humane iPS ćelije mogu biti izvedene iz ne-pluripotentnih ćelija transformisaih da eksprimiraju pluripotentno stanje. Takve transformisane ćelije uključuju, na primer, ćelije koje su transformisane da eksprimiraju gene reprogramiranja koji indukuju pluripotenciju. Pluripotentno stanje može uključiti, na primer, ekspresiju jednog ili više markera pluripotencije opisanih ovde. Takve ćelije (kao što su fibroblasti prepucijuma) mogu se transformisati da eksprimiraju gene za reprogramiranje, ili bilo koje dodatne gene od interesa, bilo kojim načinima poznatim u tehnici. Videti, na primer, Takahashi and Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676). Na primer, mogu se introdukovati u ćelije korišćenjem jednog ili više plazmida, lentvirusnih vektora, ili retrovirusnih vektora. U nekim slučajevima, vektori se integrišu u genom i mogu se ukloniti nakon što je završeno reprogramiranje. Otkriće opisuje da, ne-pluripotentne ćelije su transformisane sa geneima za reprogramiranje koji sadrže Oct4, Sox2, Klf4, Myc, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Otkriće opisuje da tansformisane ćelije sadrže prajmovane humane iPS ćelije. ;[0404] Otkriće opisuje da humane iPS ćelije kultivisane u medijumu sa niskom osmolalnošću opisane ovde eksprimiraju jedan ili više fenotipa, profila genske ekspresije, ili markera karkaterističnih za naivno stanje. U jednom primeru, humane iPS ćelije eksprimiraju jedan ili više markera pluripotencije čija ekspresija je indikativna za naivno stanje. Takvi markeri pluripotencije mogu uključivati alkalnu fosfatazu, NANOG, 5T4, ABCG2, Aktivin RIB/ALK-4, Aktivin RIIB, ECadherin, Cbx2, CD9, CD30/TNFRSF8, CD117/c-kit, CDX2, CHD1, Cripto, DNMT3B, DPPA2, DPPA4, DPPA5/ESG1, EpCAM/TROP1, ERR beta/NR3B2, ESGP, F-box protein 15/FBXO15, FGF-4, FGF-5, FoxD3, GBX2, GCNF/NR6A1, GDF-3, Gi24/VISTA/B7-H5, integrin alfa 6/CD49f, integrin alfa 6 beta 1, integrin alfa 6 beta 4, integrin beta 1/CD29, KLF4, KLF5, L1TD1, Lefty, Lefty-1, Lefty-A, LIN-28A, LIN-28B, LIN-41, cMaf, cMyc, Oct-3/4, Oct-4A, Podocalyxin, Rex-1/ZFP42, Smad2, Smad2/3, SOX2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, Stella/Dppa3, SUZ12, TBX2, TBX3, TBX5, TERT, TEX19, TEX19.1, THAP11, TRA-1-60(R), TROP-2, UTF1, i/ili ZIC3. U specifičnom primeru, eksprimirani marker pluripotencije je alkalna fosfataza, NANOG, ili oba. ;[0405] Otkriće opisuje da humane iPS ćelije kultivisane u medijumu sa niskom osmolalnošću opisane ovde prikazuju morfološke karakteristike indikativne za naivno stanje. Primer morfologije je karakterisan ćelijama koje imaju kompaktne kolonije u obliku kupole u kulturi. ;[0406] Otkriće opisuje da humane iPS ćelije kultivisane u medijumu niske osmolalnosti opisanom ovde mogu biti mehanički ili enzimatski razdvojene u suspenziju pojedinačnih ćelija, pasažirane, i/ili subkultivisane. U jednom primeru, enzimatska disocijacija može biti izvedena korišćenjem tripsina. Kada su kultivisane u predmetnom medijumu niske osmolalnosti, humane iPS ćelije mogu obezbediti veću efikasnost transformacije usled poboljšane disocijacije u suspenziju pojedinačnih ćelija. Sa drugim tipovima medijuma (npr., mTeSR™ medijum ili 2i medijum) tipično korišćenim za održavanje humanih iPS ćelija u kulturi, disocijacija humanih iPS ćelija mora se izvesti mehanički ili sa enzimima kao što je kolagenaza koji su manje agresivni od tripsina. Kao posledica toga, ćelije nisu tako efikasno ili tako kompletno disocirane. Nasuprot tome, sa predmetnim medijumom niske osmolalnosti, tripsin se može koristiti da disocira ćelije, i poboljša rezultate disocijacije u povećanoj efikasnosti transformacije. Dodatno, za razliku od drugih tipova medijuma tipično korišćenih za održavanje humanih iPS ćelija u kulturi (npr., mTeSR™ medijum ili 2i medijum), enzimatska disocijacija humanih iPS ćelija kultivisanih sa predmetnim medijumom niske osmolalnosti (poželjno medijum niske osmolalnosti koji ne sadrži bFGF) može se izvesti u odsustvu jednog ili više inhibitora koji su generalno neophodni za pasažiranje takvih ćelija. Primer inhibitora koji se može izostaviti je inhibitor Rho-povezane protein kinaze (ROCK). ROCK inhibitor je gneralno neophodan kada se pasažiraju humane iPS ćelije da se inhibira aktivacija pro-apoptotskih puteva. ;[0407] Otkriće opisuje da subkultivisane humane iPS ćelije kultivisane u medijumu sa niskom osmolalnošću opisane ovde mogu zadržati naivni ili stanje naivnog-izgleda nakon enzimatske disocijacije i subkulture. U nekim primerima, subkultivisane humane iPS ćelije mogu nastaviti da prikazuju morfologiju karkaterisanu kompaktnim kolonijama u obliku kupole. Subkultivisane humane iPS ćelije mogu takođe nastaviti da eksprimiraju jedan ili markere pluripotentnosti kao što je ovde opisano. ;;C. Postupci za stvaranje i održavanje populacije humanih indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija ;;[0408] Otkriće opisuje postupke i kompozicije za stvaranje humanih iPS ćelija u in vitro kulturi. Otkriće opisuje postupke i kompozicije za održavanje humanih iPS ćelija u in vitro kulturi. ;[0409] Termin "stvaranje" uključuje kultivisanje ne-pluripotentnih ćelija transformisanih da eksprimiraju jedan ili više faktora za reprogramiranje kao što je ovde opisano, pod pogodnim uslovima da se indukuje promena u fenotipu ćelije, genskoj ekspresiji, ili oba, tako da ćelije prikazuju naivno ili stanje naivnog-izgleda, tj., eksprimiraju jednu ili više karakteristika naivnih humanih iPS ćelija. Naivno ili stanje naivnog-izgledda može se eksprimirati kao odgovor na određene uslove kulture, npr., kulturu u medijumu sa niskom osmolalnošću kao što je opisano ovde. U nekim primerima, proporcija ćelija koje eksprimiraju naivno ili stanje naivnog-izgleda je najmanje oko 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, i do 100% ćelija u kulturi. ;[0410] Otkriće opisuje postupak koji obogaćuje in vitro kulturu za populaciju naivnih ili naivnogizgleda humanih iPS ćelija. Otkriće opisuje da naivne ili humane iPS ćelije naivnog izgleda mogu biti propagirane u kulturi poželjno u odnosu na ćelije koje ne eksprimiraju naivno ili stanje naivnog-izgleda. Otkriće opisuje da naivne ili humane iPS ćelije naivnog izgleda mogu biti selektovane iz kulture, mogu biti enzimatski disocirane, i subkultivisane da bi se proizvela obogaćenja populacija naivnih ili humanih iPS ćelija naivnog izgleda. ;[0411] Otkriće opisuje da, ne-pluripotentne ćelije transformisane da eksprimiraju pluripotentno stanje, su kultivisane in vitro u medijumu obezbeđenom ovde koji je pogodan za indukovanje ekspresije naivnog ili stanja naivnog izgleda u periodu od najmanje 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21, ili 28 dana, ili bilo kom periodu vremena dovoljnom da indukuje ekspresiju naivnog ili stanja naivnog izgleda u kulturi. Transformisane ćelije se mogu kultivisati u predmetnom medijumu najmanje 1, 2, 3, ili 4 nedelje. Nekada transformisane ćelije su kultivisane 1-4 nedelje. Ekspresija naivnog ili stanja naivnog izgleda može se odrediti posmatranjem morfoloških karakteristika ili ekspresijom markera pluripotencije, karakterističnih za naivno ili stanje naivnog izgleda, koi su opisani ovde na drugim mestima. ;[0412] Otkriće opisuje da su ne-pluripotentne ćelije transformisane da eksprimiraju pluripotentno stanje, kultivisane u predmetnom medijumu niske molalnosti dok ne eksprimiraju karakteristike naivnog ili stanja naivnog izgleda. Ćelije zatim mogu biti kultivisane u predmetnom medijumu da bi se održalo naivno ili stanje naivnog izgleda. U sledećem primeru izvođenja, ne-pluripotentne ćelije transformisane da eksprimiraju pluripotentno stanje, su prvo kultivisane u medijumu visoke osmolalnosti pre kultivisanja u predmetnom medijumu niske osmolalnosti. Takav medijum visoke osmolalnosti pokazuje osmolalnost veću od predmetnog medijuma niske osmolalnosti i može sadržati bFGF. Neki medijum visoke osmolalnosti sadrži jedan ili više od albumina goveđeg seruma, bFGF, transformišući faktor rasta β (TGFβ), litijum hlorid, pipekolnu kiselinu, i gama-aminobuternu kiselinu (GABA). Primeri medijuma visoke osmolalnosti uključuju mTeSR™ medijum (Stemcell Technologies). ;[0413] Otkriće opisuje da ne-pluripotentne ćelije transformisane da eksprimiraju pluripotentno stanje, mogu biti prvo kultivisane u medijumu sa visokom osmolalnošću koji sadrži bFGF dok ne počnu da eksprimiraju karkateristike naivnog ili stanja naivnog izgleda, u koje vreme su ćelije kultivisane u predmetnom medijumu niske osmolalnosti. U jednom primeru, ćelije mogu biti kultivisane u medijumu visoke osmolalnosti koji sadrži bFGF u periodu od najmanje 1, 2, 5, 10, 30, 60, ili 90 dana, periodu od 1, 2, 4, 8, ili 12 nedelja, ili periodu između 1 dana do 3 meseca. Primer vremenskog perioda za kulturu u medijumu visoke osmolalnosti koji sadrži bFGF je 2 meseca. ;[0414] Otkriće opisuje da ne-pluripotentne ćelije transformisane da eksprimiraju pluripotentno stanje, mogu biti prvo kultivisane u medijumu koji sadrži bFGF dok ne počnu da pokazuju morfologiju karakterisanu grumenom ćelija, kada su ćelije kultivisane u predmetnom medijumu niske osmolalnosti. Otkriće opisuje da ćelije koje pokazuju trodimenzionalne grumene mogu biti selektovane, disocirane (npr., sa tripsinom), i prenete u novu kulturu u medijum niske osmolalnosti opisan ovde. ;[0415] Termini "održati," "održavati," i "održavanje" uključuju očuvanje najmanje jedne ili više karakteristika ili fenotipa humanih iPS ćelija opisanih ovde. Takve karakteristike mogu uključivati pluripotenciju, morfologiju ćelije, profile genske ekspresije, i/ili druge funkcionalne karakteristike naivnih ćelija. Termini "održati," "održavati," i "održavanje" mogu takođe obuhvatati propagaciju ćelija i/ili povećanje broja naivnih ćelija koje se kultivišu. Termini uključuju uslove kulture koji sprečavaju ćelije da se konvertuju u prajmovano ili ne-pluripotentno stanje. Termini dodatno uključuju uslovwe kulture koje dozvoljavaju ćelijama da ostanu pluripotentne i/ili naivne, dok ćelije mogu ili ne moraju nastaviti da se dele i povećavaju broj. ;[0416] Otkriće opisuje da humane iPS ćelije su kultivisane in vitro u medijumu obezbeđenom ovde koji je pogodan za održavanje takvih ćelija u naivnom ili stanju naivnog izgleda. U naročitom primeru, humane iPS ćelije mogu biti kultivisane u pogodnom medijumu u periodu od 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21, ili 28 dana, ili periodu od oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, ili više, sve dok su kultivisane ćelije održavane u naivnom ili stanju naivnog izgleda. Ćelije mogu biti kultivisane najmanje 1, 2, 3 ili 4 nedelje. Nekada su ćelije kultivisane 1-4 nedelja. Humane iPS ćelije mogu biti održavane, na primer, bilo koji vremenski period dovoljan za propagaciju ćelija u kulturi, genetičku modifikaciju ćelija, i/ili subkulturu ćelija. ;[0417] Otkriće opisuje da humane iPS ćelije ili ne-pluripotentne ćelije transformisane da eksprimiraju pluripotentno stanje, mogu biti kultivisane na supstratu ili sloju hranljivih ćelija pogodnih za in vitro kulturu. U naročitom primeru, ćelije su kultivisane na MATRIGEL™ (BD Biosciences). U sledećem primeru, ćelije su kultivisane na hranljivim ćelijama novorođenog humanog fibroblasta prepucijuma (NuFF). U sledećem primeru, ćelije su kultivisane na GELTREX™ (Life Technologies). ;[0418] Otkriće opisuje da vreme udvostručavanja humanih iPS ćelija kultivisanih u predmetnom medijumu niske osmolalnosti je smanjeno u poređenju sa prajmovanim humanim iPS ćelijama ili ne-pluripotentnim ćelijama transformisanim da eksprimiraju pluripotentno stanje. U naročitom primeru, vreme udvostručavanja predmetnih humanih iPS ćelija je između oko 16-24 časova. ;;7. Identičnost sekvenci ;;[0419] Postupci i kompozicije obezbeđeni ovde koriste više različitih komponenti ciljanog genomskog integracionog sistema (tj., nukleazna sredstva, mesta prepoznavanja, insert nukleinskih kiselina, polinukleotidi od interesa, targeting vektori, selekcioni markeri i druge komponente). U opisu se podrazumeva da neke komponente ciljanog genomskog integracionog sistema mogu imati aktivne varijante i fragmente. Takve komponente uključuju, na primer, nukleazna sredstva (tj., inženjeringom dobijena nukleazna sredstva), mesta prepoznavanja nukleaznog sredstva, polinukleotide od interesa, ciljna mesta i odgovarajuće homologe ruke targeting vektora. Biološka aktivnost za svaku od ovih komponenti je opisana ovde na drugim mestima. ;[0420] Kao što je ovde korišćeno, "identičnost sekvence" ili "identičnost" u kontekstu dve polinukleotidne ili polipeptidne sekvence odnosi se na ostatke u dve sekvence koje su iste kada se poravnaju u odnosu na maksimalno podudaranje u okviru specifikovanog prozora poređenja. Kada je procenat identičnosti sekvence korišćen u odnosu na proteine podrazumeva se da položaji ostatka koji nisu identični često se razlikuju u odnosu na konzervativnu supstituciju aminokiselina, gde su aminokiselinski ostaci supstituisani sa drugim aminokiselinskim ostacima sa sličnim hemisjkim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost) i stoga ne menjaju funkcionalne osobine molekula. Kada se sekvence razlikuju u konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvence može se podesiti na više da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Kaže se da sekvence koje se razlikuju u takvim konzervativnim supstitucijama imaju "sličnost sekvenci" ili "sličnost". Sredstva za stvaranje ovog podešavanja su dobro poznata stručnjacima. U tipičnom slučaju ovo uključuje bodovanje konzervativne supstitucije kao delimičnog pre nego potpunog nepoklapanja, čime se povećava procenat identičnosti sekvence. Stoga, na primer, gde je za identičnu aminoksielinu dat skor od 1 i za nekonzervativnu supstituciju je dat skor od nula, konzervativnoj supstituciji je dat skor između nula i 1. Bodovanje konzervativnih supstitucija je izračunato, npr., kao što je implementirano u program PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). ;[0421] Kao što je ovde korišćeno, "procenat identičnosti sekvence" označava vrednost određenu poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u okviru prozora poređenja, naznačeno time da deo polinukleotidne sekvence u prozoru poređenja može sadržati adicije ili delecije (tj., gapove) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnanjedve sekvence. Procenat je izračunat određivanjem brojem položaja na kojima se javljaju identične baze nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak u obe sekvence da bi se dobio broj podudarajućih položaja, deljenjem broja poklapajućih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru za poređenje, i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence. ;[0422] Ukoliko nije drugačije naznačeno, vrednosti identičnosti/sličnosti sekvence obezbeđene ovde odnose se na vrednost dobijenu korišćenjem GAP verzija 10 korišćenjem sledećih parametara: % identičnosti i % sličnosti za nukleotidnu sekvencu korišćenjem ponderisanog GAP od 50 i i ponderisane dužine od 3, i nwsgapDNK.cmp skoring matrice; % identičnostii % sličnosti za aminokiselinsku sekvencu korišćenjem ponderisanog GAP od 8 i ponderisane dužine od 2, i BLOSUM62 skoring matrice; ili bilo kog njihovog ekvivalentnog programa. "Ekvivalentni program" označava bilo koji program za poređenje sekvenci koji, za bilo koje dve sekvence u pitanju, stvara poravnanje koje ima identična poklaapanja nukleotida ili aminokiselinskih ostataka i identičan procenat identičnosti sekvence u poređenju sa odgovarajućim poravnanjem stvorenim sa GAP verzija 10. ;[0423] Ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja kao što se podrazumeva od strane stručnjaka u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde takođe mogu biti korišćeni u izvođenju ili testiranju opisanog pronalaska, poželjni postupci i materijali su sada opisani. ;[0424] Mora se napomenuti da kao što je ovde korišćeno i u priključenim patentnim zahtevima, oblici jednine "a", "and", i "the" uključuju množinu ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje. ;[0425] Ovde razmatrane publikacije su obezbeđene isključivo u odnosu na njihov otkriće pre datuma podnošenja predmetne prijave. Ništa od ovoga ne treba shvatiti kao priznanje da opisani pronalazak ne može da antidatira takvu objavu putem prethodnog pronalaska. Dodatno, obezbeđeni datumi objave mogu biti različiti od stvarnih datuma objave, koji se moraju nezavisno potvrditi. ;[0426] Opisani pronalazak može biti sadržan u drugim specifičnim oblicima bez udaljavanja od duha ili njegovih esencijalnih atributa i, u skladu sa tim, upućuje se na priključene patentne zahteve, pre nego na prethodnu specifikaciju, kao indikativno za pronalazak. ;[0427] Otkriće opisuje: ;;1. Postupak za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova, koji sadrži (a) introdukciju u pluripotentnu ćeliju pacova velikog targeting vektora (LTVEC) koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ homologom rukom pacova i 3’ homologom rukom pacova, naznačeno time da je ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke je najmanje 10 kb ali manje od 150 kb; i (b) idrntifikacija genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa, naznačeno time da je ciljana genetička modifikacija sposobna da se prenese preko klicine linije. ;2. Postupak prema primeru 2, naznačen time da je ciljana genetička modifikacija bialelna. 3. Postupak prema primeru 1 ili 2, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je embrionalna matična (ES) ćelija pacova. ;4. Postupak prema primeru 1, 2 ili 3, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je izvedena iz DA soja ili ACI soja. ;5. Postupak prema bilo kom od primera 1-4, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je karakterisana ekspresijom najmanje jednog markera pluripotencije koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ili njihovu kombinaciju. ;6. Postupak prema bilo kom od primera 1-4 naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je karakterisana jednom ili više od sledećih karakteristika: ;(a) nedostatak ekspresije jednog ili više markera pluripotencije koji sadrži c-Myc, Ecat1, i/ili Rexo1; (b) nedostatak ekspresije mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i/ili Bmpr2; (c) nedostatak ekspresije jednog ili više endodermalmalnih markera koji sadrže Gata6, Sox17 i/ili Sox7; ili (d) nedostatak ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i/ili Pax6. ;7. Postupak prema bilo kom od primera 1-6, naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 10 kb do oko 30 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb. ;8. Postupak prema bilo kom od primera 1-6, naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 16 kb do oko 150 kb. ;9. Postupak prema bilo kom od primera -8, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži: (a) zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homologom ili ortologom sekvencom nukleinske kiseline; (b) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova; (c) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova, naznačeno time da je delecija u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (d) egzogenu sekvencu nukleinske kiseline u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (e) egzogenu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline; (f) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu i sekvencu nukleinske kiseline pacova; (g) uslovni alel flankiran sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifične za mesto; ili (h) reporter gen operativno vezan sa promotorom aktivnim u ćeliji pacova. ;10. Postupak prema bilo kom od primera 1-9, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži (i) prvu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 5’ homologom rukom pacova; i (ii) drugu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna 3’ homologoj ruci pacova. ;11. Postupak prema primeru 10, naznačeno time da prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je razdvojena sa najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. ;12. postupak prema primeru 10, naznačeno time da prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je razdvojena sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od than 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1 Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 2.5 Mb, ili najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb. ;13. Postupak prema bilo kom od primera 1-12, naznačeno time da korak introdukcije (a) dodatno sadrži introdukciju druge nukleinske ksieline koja kodira nukleazno sredstvo koje promoviše homologu rekombinaciju između ciljanog konstrukta i genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova. ;14. Postupak prema primeru 13, naznačeno time da nukleazno sredstvo sadrži (a) himerni protein koji sadrži vezujući domen DNK na osnovu cink prsta fuzionisanog sa FokI endonukleazom; ili (b) himerni protein koji sadrži efektornu nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN) fuzionisanim sa FokI endonukleazom. ;15. Postupak prema bilo kom od primera 1-12, naznačeno time da korak introdukcije (a) dodatno sadrži introdukciju u pluripotentnu ćeliju pacova: (i) prvi ekspresioni konstrukt koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezani (Cas) protein, (ii) drugi ekspresioni konstrukt koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa genomskom ciljnom sekvencom povezanom sa vodećom RNK (gRNK), naznačeno time da genomska target sekvencu je neposredno flankirana na 3’ kraju sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). ;16. Postupak prema primeru 15, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži nucleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1. ;17. Postupak prema primeru 15 ili 16, naznačeno time da gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNK (crRNK) i trans-aktivnu CRISPR RNK (tracrRNK). ;18. Postupak prema primeru 15, 16 ili 17, naznačeno time da Cas protein je Cas9. ;19. Postupak prema primeru 15, 16, 17, ili 18, naznačeno time da gRNK sadrži: (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 2; ili (b) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 3. ;20. Postupak prema primeru 17, naznačeno time da crRNK sadrži SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; ili SEQ ID NO: 6. ;21. Postupak prema primeru 17, naznačeno time da tracrRNK sadrži SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8. ;22. Modifikovani genomski lokus pacova koji sadrži: (i) inserciju homologe ili ortologe humane sekvence nukleinske kiseline; (ii) zamenu endogenu sekvencu nukleinske kiseline pacova sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline; ili (iii) njihovu kombinaciju, naznačeno time da modifikovani genomski lokus pacova je sposoban da se prenese preko klicine linije. ;23. Modifikovani genomski lokus pacova prema primeru 22, naznačeno time da veličina insercije ili zamene je od oko 5 kb do oko 400 kb. ;24. Modifikovani genomski lokus pacova prema primeru 22, naznačeno time da veličina insercije ili zamene je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;25. Postupak za stvaranje humanizovanog pacova, koji sadrži: (a) ciljani genomski lokus od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova sa ciljanim konstruktom koji sadrži humanu nukleinsku kiselinu da formira genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova; ;(b) introdukcija genetički modfikovane pluripotentne ćelije pacova u embrion domaćin; i (c) gestaciju embrioan domaćina pacova u surogat majci; naznačeno time da surogat majka proizvodi potomstvo pacova koje sadrži genomski lokus koji sadrži: (i) inserciju humane sekvence nukleinske kiseline; (ii) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu od interesa sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline; (iii) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu i sekvencu nukleinske kiseline pacova; ili (iv) njihovu kombinaciju, naznačeno time da modifikovani genomski lokus je sposoban da se prenese preko klicine linije. ;26. Postupak prema primeru 25, naznačeno time da ciljani konstruk je veliki targeting vektor (LTVEC), i ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je najmanje 10 kb ali manje od 150 kb. ;27. Postupak prema primeru 26, naznačeno time da je ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke ciljanog konstrukta od oko 10 kb do oko 30 kb, od oko 20 kb to 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, ili od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb. ;28. Postupak prema primeru 25, 26 ili 27, naznačeno time da human sekvenca nukleinske kiseline je najmanje 5 kb ali manje od 400 kb. ;29. Postupak prema primeru 25, 26, ili 27, naznačeno time da humana sekvenca nukleinske kiseline je najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje 200 kb ali manje od 250 kb, najmanje 250 kb ali manje od 300 kb, najmanje 300 kb ali manje od 350 kb, ili najmanje 350 kb ali manje od 400 kb. 30. method of any one of example25-29, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je embrionalna matična (ES) ćelija pacova. ;31. Postupak prema bilo kom od primera 25-30, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je izvedena iz DA soja ili ACI soja. ;32. Postupak prema bilo kom od primera 25-31, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je karakterisana ekspresijom najmanje jednog markera pluripotencije koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ili njihovu kombinaciju. ;33. Postupak prema bilo kom od primera 25-31, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je karakterisana sa jednom ili više sledećih karakteristika: (a) nedostatak ekspresije jednog ili više markera pluripotencije koji sadrže c-Myc, Ecat1, i/ili Rexo1; (b) nedostatak ekspresije jednog ili više mezodermalnih markera koji sadrži Brachyury i/ili Bmpr2; (c) nedostatak ekspresije jednog ili više endodermalnih markera koji sadrži Gata6, Sox17, i/ili Sox7; ili (d) nedostatak ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i/ili Pax6. ;34. Modifikovani pacov koji sadrži humanizovani genomski lokus, naznačeno time da humanizovani genomski lokus sadrži: (i) inserciju homologe ili ortologe humane sekvence nukleinske kiseline; (ii) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova na endogenom genomskom lokusu sa homologom ili ortologom humanom sekvencom nukleinske kiseline; (iii) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu i sekvencu nukleinske kiseline pacova ili (iv) njihovu kombinaciju, naznačeno time da humanizovani genomski lokus je sposoban da se prenese preko klicine linije. ;35. Pacov ili ćelija pacova koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju u svom genomskom lokusu, naznačeno time da genomski lokus je Interleukin-2 receptor gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, ili Rag2/Rag1 lokus, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži: (a) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu; (b) insercija homologe nukleinske ksieline, ortologe nukleinske kiseline, ili himerne nukelinske kiseline koja sadrži humanu i sekvencu nukleinske kiseline pacova, ili (c) njihovu kombinaciju, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija se može preneti preko klicine linije pacova ili se može propagirati pacovom iz ćelije pacova. ;36. Pacov ili ćelija pacova prema primeru 35, naznačeno time da (a) delecija endogene nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu je najmanje oko 10 kb; ili (b) delecija endogene nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (c) insercija egzogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu je najmanje oko 5 kb; ili (d) insercija egzogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;37. Pacov ili ćelija pacova prema primeru 35 ili 36, naznačeno time da (a) ciljana genetička modifikacija na Interleukin-2 receptor gama lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Interleukin-2 receptor gama proteina; (b) ciljana genetička modifikacija na ApoE lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti ApoE proteina; (c) ciljana genetička modifikacija na Rag1 lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag1 proteina; (d) ciljana genetička modifikacija na Rag2 lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag2 proteina; ili (e) ciljana genetička modifikacija na Rag2/Rag1 lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag2 i Rag1 proteina. ;38. Pacov ili ćelija pacova prema primeru 35, 36, ili 37, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija Interleukin-2 receptor gama lokusa sadrži: (a) delecija celokupnog Interleukin-2 receptor gama kodirajućeg regiona pacova ili njegovog dela; (b) zamenu celokupnog Interleukin-2 receptor gama kodirajućeg regiona pacova ili njegovog dela sa humanim Interleukin-2 receptor gama kodirajućim regionom ili njegovim delom; (c) zamenu ektodomena Interleukin-2 receptor gama kodirajućeg regiona pacova sa ekto-domenom humanog Interleukin-2 receptorom gama; ili (d) najmanje 3 kb deleciju Interleukin-2 receptor gama lokusa. ;39. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-37, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija ApoE lokusa sadrži: (a) deleciju celokupnog ApoE kodirajućeg regiona ili njegovog dela; ili (b) najmanje 1.8 kb deleciju ApoE lokusa koji sadrži ApoE kodirajući region. ;40. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-37, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija Rag2 lokusa sadrži: (a) deleciju celokupnog Rag2 kodirajućeg regiona ili njegovog dela; (b) najmanje 5.7 kb deleciju Rag2 lokusa koji sadrži Rag2 kodirajući region. ;41. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-37, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija Rag2/Rag1 lokusa sadrži: (a) deleciju celokupnog Rag2 kodirajućeg regiona ili njegovog dela i deleciju celokupnog Rag1 kodirajućeg regiona ili njegovog dela; ili (b) deleciju najmanje 16 kb Rag2/Rag1 lokusa koji sadrži Rag2 kodirajući region. ;42. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-41, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži inserciju ekspresione kasete koja sadrži selekcioni marker na Interleukin-2 receptor gama lokusu, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu, ili Rag2/Rag1 lokusu. ;43. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 42, naznačeno time da ekspresiona kaseta sadrži lacZ gen operativno povezan sa endogenim promotorom na genomskom lokusu i humani ubikvitin promotor operativno vezan sa selekcionim markerom. ;44. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-43, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija u Interleukin-2 receptor gama lokusu, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu ili Rag2/Rag1 lokusu sadrži inserciju samo-deletirajuće selekcione kasete. ;45. Pacov ili ćelija pacova prema primeru 44, naznačeno time da samo-deletirajuća selekciona kaseta sadrži selekcioni marker gen operativno vezan sa promotorom aktivnim u ćeliji pacova i gena ekombinaze operativno vezan sa ćelijski-specifičan promotor klicine linije mužjaka, naznačeno time da samo-deletirajuća kaseta je flankirana mestima prepoznavanja rekombinaze prepoznatim od strane rekombinaze. ;46. Pacov ili ćelija pacova prema primeru 45, naznačeno time da (a) ćelijski-specifični promotor klicine linije mužjaka je Protamine-1 promotor; ili (b) gen rekombinaze kodira Cre, i mesta prepoznavanja rekombinaze su loxP mesta. ;47. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-46, naznačeno time da insercija egzogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu sadrži reporter nukleinsku kiselinu operativno vezanu sa endogenim Interleukin-2 receptor gama promotorom, endogenim ApoE promotorom, endogenim Rag1 promotorom, ili endogenim Rag2 promotorom. ;48. Pacov ili ćelija pacova prema primeru 47, naznačeno time da reporter nukleinska kiselina kodira reporter koji sadrži β-galaktozidaza, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Emerald, enhanced green fluorescent protein (EGFP), CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferaza, alkalna fosfataza, ili njihovu kombinaciju. ;49. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-48, naznačeno time da ćelija pacova je pluripotentna ćelija pacova ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova. ;50. Ćelija pacova prema primeru 49, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova (a) je izvedena iz DA soja ili ACI soja; (b) je karakterisana ekspresijom najmanje jednog markera pluripotencije koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ili njihovu kombinaciju; ili (c) karakterisana sa jednom ili više sledećih karakteristika: (i) nedostatak ekspresije jednog ili više markera pluripotencije koji sadrže c-Myc, Ecat1, i/ili Rexo1; (ii) nedostatak mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i/ili Bmpr2; (iii) nedostatak ekspresije jednog ili više endodermalnih markera koj sadrže Gata6, Sox17 i/ili Sox7; ili (iv) nedostatak ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i/ili Pax6. ;51. Postupak za modifikovanje ciljnog genomskog lokusa u Interleukin-2 receptor gama lokusu, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu ili Rag2/Rag1 lokusu u pluripotentnoj ćeliji pacova, postupak koji sadrži: (a) introdukciju u pluripotentnu ćeliju pacova targeting vektora koji sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa 5’ i 3’ homologom rukom homologom sa ciljnim genomskim lokusom, (b) identifikaciju genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na ciljanom genomskom lokusu, naznačeno time da je ciljana genetička modifikacija sposobna da se prenese preko klicine linije pacova propagirane iz pluripotentne ćelije pacova. ;52. Postupak prema primeru 51, naznačeno time da targeting vektor je veliki targeting vektor (LTVEC) naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke pacova je najmanje oko 10 kb ali manje od oko 150 kb. ;53. postupak prema primeru 51 ili 52, naznačeno time da introdukcija targeting vektora u pluripotentnu ćeliju pacova dovodi do: ;(i) delecije endogene sekvence nukleinske kiseline pacova na ciljnom genomskom lokusu; (ii) insercije egzogene sekvence nukleinske kiseline na ciljnom genomskom lokusu; ili (iii) njihovu kombinaciju. ;54. Postupak prema primeru 53, naznačeno time da (a) delecija endogene nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu je najmanje oko 10 kb; ili (b) delecija endogene nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (c) insercija egzogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu je najmanje oko 5 kb; ili. (d) insercija egzogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu je od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. ;55. Postupak prema bilo kom od primera 51-54, naznačeno time da (a) ciljana genetička modifikacija na Interleukin-2 receptor gama lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Interleukin-2 receptor gama proteina; (b) ciljana genetička modifikacija na ApoE lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti ApoE proteina; (c) ciljana genetička modifikacija na Rag1 lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag1 proteina; (d) ciljana genetička modifikacija na Rag2 lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag2 proteina; ili (e) ciljna genetička modifikacija na Rag2/Rag1 lokusu rezultuje u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag2 proteina i aktivnosti Rag1 proteina. ;56. Postupak prema bilo kom od primera 51-54, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija Interleukin-2 receptor gama lokus sadrži (a) deleciju celokupnog Interleukin-2 receptor gama kodirajućeg regiona pacova ili njegov deo; (b) zamena celokupne Interleukin-2 receptor gama kodirajućeg regiona pacova ili njegovog dela sa humanim Interleukin-2 receptor gama kodirajućim regionom ili njegovim delom; (c) zamena ekto-domena Interleukin-2 receptor gama kodirajućeg regiona pacova sa ekto-domenom humanog Interleukin-2 receptor gama; ili (d) najmanje 3 kb delecija Interleukin-2 receptor gama lokusa koji sadrži Interleukin-2 receptor gama kodirajući region. ;57. Postupak prema bilo kom od primera 51-55, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija ApoE lokusa sadrži: ;(a) deleciju celokupnog ApoE kodirajućeg regiona ili njegovog dela; ili (b) najmanje 1.8 kb delecija ApoE lokusa koja sadrži ApoE kodirajući region. ;58. Postupak prema bilo kom od primera 51-55, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija Rag2 lokusa sadrži: ;(a) deleciju celokupnog Rag2 kodirajućeg regiona ili njegovog dela; ili (b) najmanje 5.7 kb deleciju Rag2 lokusa koja sadrži Rag2 kodirajući region. ;59. Postupak prema bilo kom od primera 51-55, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija Rag1/Rag2 lokusa sadrži: (a) deleciju celokupnog Rag2 kodirajućeg regiona ili njegovog dela i deleciju celokupnog Rag1 kodirajućeg regiona ili njegovog dela; ili (b) delecija najmanje 16 kb Rag2/Rag1 lokusa koji sadrži Rag2 i Rag1 kodirajuće regione. ;60. Postupak prema bilo kom od primera 51-59, naznačeno time da insert nukleinske kiseline sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira selekcioni marker. ;61. Postupak prema primeru 60, naznačeno time da eskpresiona kaseta sadrži lacZ gen operativno vezan sa endogenim promotorom na genomskom lokusu i humani ubikvitin promotor operativno vezan sa selekcionim marker genom. ;62. Postupak prema bilo kom od primera 51-60, naznačeno time da insert nukleinske kiseline sadrži samo-deletirajuću selekcionu kasetu. ;63. Postupak prema primeru 62, naznačeno time da samo-deletirajuća selekciona kaseta sadrži selekcioni marker operativno vezan sa promotorom aktivnim u pluripotentnom ćelijom pacova i polinukleotid koji kodira rekombinazu operativno vezan sa ćelijski-specifičnim promotorom klicine linije mužjaka, naznačeno time da samo-deletirajuća kaseta je flankirana sa mestima prepoznavanja rekombinacije prepoznatim sa rekombinazom. ;64. Postupak prema primeru 63, naznačeno time da (a) ćelijski-specifični promotor klicine linije mužjaka je Protamine-1 promotor; ili (b) gen rekombinaze kodira Cre i mesta prepoznavanje rekombinacije su loxP mesta. ;65. Postupak prema primeru 53, naznačeno time da insercija ezogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu sadrži reporter sekvencu nukleinske kiseline operativno vezan sa endogenim Interleukin-2 receptor gama promotorom, endogenim ApoE promotorom, endogenim Rag1 promotorom, ili endogenim Rag2 promotorom. ;66. Postupak prema primeru 65, naznačeno time da reporter sekvenca nukleinske kiseline kodira reporter koji sadrži β-galaktozidazu, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Emerald, enhanced green fluorescent protein (EGFP), CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alaklnu fosfatazu, ili njihovu kombinaciju. ;67. Postupak prema bilo kom od primera 51-66, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova je embrionalna matična (ES) ćelija pacova. ;68. Postupak prema bilo kom od primera 51-67, naznačeno time da pluripotentna ćelija pacova (a) je izvedena iz DA soja ili ACI soja; ili (b) je karakterisana ekspresijom markera pluripotencije koji sadrži Oct-4, Sox-2, alkalnu fosfatazu, ili njihovu kombinaciju; ili (c) je karakterisana sa jednom ili više sledećih karakteristika: (i) nedostatak ekspresije jednog ili više markera pluripotencije koji sadrže c-Myc, Ecat1, i/ili Rexo1; (ii) nedostatak ekspresije mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i/ili Bmpr2; (iii) nedostatak ekspresije jednog ili više endodermalnih markera koji sadrže Gata6, Sox17 i/ili Sox7; ili (iv) nedostatak ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrži Nestin i/ili Pax6. ;69. Postupak prema bilo kom od primera 51-68, koji dodatno sadrži identifikaciju ciljane genetičke modifikacije na ciljnom genomskom lokusu, naznačeno time da korak identifikacije koristi kvantitativnu analizu za procenu modifikacije alela (MOA) na ciljnom genomskom lokusu. ;70. Postupak prema bilo kom od primera 51-69, naznačeno time da korak introdukcije (a) dodatno sadrži introdukciju druge nukleinske kiseline koja kodira nukleazno sredstvo koje promoviše homologu rekombinaciju između targeting vektora i ciljnog genomskog lokusa u pluripotentnoj ćeliji pacova. ;71. Postupak prema primeru 70, naznačeno time da nukleazno sredstvo sadrži himerni protein koji sadrži vezujući domen DNK zasnovan na cink prstu fuzionisan sa Fokl endonukleazom. ;72. Postupak prema primeru 71, naznačeno time da postupak rezultuje u bi-alelnoj modifikaciji ciljnog genomskog lokusa. ;73. Postupak prema bilo kom od primera 51-70, naznačeno time da korak introdukcije (a) dodatno sadrži introdukciju u pluripotentnu ćeliju pacova: (i) pvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezani (Cas) protein, (ii) drugi ekspresioni konstrukt koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa genomskom ciljnom sekvencom povezanom sa vodećom RNK (gRNK), naznačeno time da genomska ciljna sekvenca je neposredno flankirana na 3’ kraju sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). ;74. Postupak prema primeru 73, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1. ;75. Postupak prema primeru 73 ili 74, naznačeno time da gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNK (crRNK) i trans-aktivnu CRISPR RNK (tracrRNK). ;76. Postupak prema primeru 73, naznačeno time da Cas protein je Cas9. ;77. Postupak prema primeru 73, 74, ili 75, naznačeno time da gRNK sadrži: (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 2; ili (b) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 3. ;78. Postupak prema primeru 75, naznačeno time da crRNK sadrži SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; ili SEQ ID NO: 6. ;79. Postupak prema primeru 75, naznačeno time da tracrRNK sadrži SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8. ;80. Pacov ili ćelija pacova prema bilo kom od primera 35-50, naznačeno time da pacov ili ćelija pacova sadrži ciljane genetičke modifikacije na Interleukin-2 receptor gama lokusu, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu, i/ili Rag2/Rag1 lokusu. ;81. Pacov ili ćelijapacova prema primeru 80, naznačeno time da pacov rat ili ćelija pacova sadrži ciljane genetičke modifikacije na Interleukin-2 receptor gama lokusu i Rag2/Rag1 lokusu. ;[0428] Otkriće opisuje: ;1. Postupak za modifikaciju genomskog lokusa od interesa u eukariotskoj ćeliji, koji sadrži: (a) introdukciju u eukariotsku ćeliju: (i) velikog targeting vektora (LTVEC) koji sadrži prvu nukleinsku kiselinu flankiranu sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da LTVEC je najmanje 10 kb; (ii) prvi ekspresioni konstrukt koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein, (iii) drugi ekspresioni konstrut koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira vodeću RNK (gRNK) koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje sa ciljnom sekvencom i trans-aktivnu CRISPR RNK (tracrRNK), naznačeno time da prvi i drugi promotori su aktivni u eukariotskoj ćeliji; i (b) identifikaciju eukariotske ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa. ;2. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija. ;3. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da LTVEC je najmanje 15 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. ;4. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da LTVEC je najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb. ;5. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da eukariotska ćelija je sisarska ćelija. ;6. Postupak prema primeru 5, naznačeno time da sisarska ćelija je fibroblast. ;7. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da eukariotska ćelija je pluripotentna ćelija. 8. Postupak prema primeru 7, naznačeno time da pluripotentna ćelija je humana pluripotentna ćelija. ;9. Postupak prema primeru 8, naznačeno time da humana pluripotentna ćelija je humana embrionalna matična (ES) ćelija ili humana adultna embrionalna ćelija. ;10. Postupak prema primeru 8, naznačeno time da humana pluripotentna ćelija je razvojno ograničena humana progenitorska ćelija. ;11. Postupak prema primeru 8, naznačeno time da humana pluripotentna ćelija je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. ;12. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da Cas protein je Cas9. ;13. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da ciljna sekvenca je neposredno flankirana na 3’ kraju sa sekvencom motiva susednog prtospejseru (PAM). ;14. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke je od oko 10 kb do oko 150 kb. ;15. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb. ;16. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži:(a) zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukleinske kiseline; (b) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline; (c) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline, naznačeno time da je delecija u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (d) inserciju egzogene sekvence nukleinske kiseline; (e) inserciju egzogene sekvence nukleinske kiseline u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (f) inserciju egzogene sekvence nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline; (g) inserciju sekvence himerne nukleinske ksieline koja sadrži humanu i ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline; (h) inserciju uslovnog alela flankiranog sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifične za mesto; (i) inserciju selektabilnog marker ili reporter gena operativno vezanog sa trećim promotorom aktivnim u pluripotentnoj ćeliji; ili (j) njihovu kombinaciju. ;17. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži (i) 5’ ciljnu sekvencu koja je homologa sa 5’ homologom rukom; i (ii) 3’ ciljnu sekvencu koja je homologa sa 3’ homologom rukom. ;18. Postupak prema primeru 17, naznačeno time da 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljana sekvenca je razdvojena sa najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. ;19. Postupak prema primeru 17, naznačeno time da 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca je razdvojena sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali manje od oko 1 Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 2.5 Mb, ili najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb. ;20. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži Interleukin-2 receptor gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, ili oba Rag1 i Rag2 lokusa. ;21. Postupak prema primeru 1, naznačeno time da su prvi i drugi ekspresioni konstrukt mna jednom molekjulu nukleinske kiseline. ;22. Postupak za modifikaciju genoma, koji sadrži izlaganje genoma Cas proteinu i CRISPR RNK u prisustvu velikog targeting vektora (LTVEC) koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 10 kb, naznačeno time da nakon izlaganja Cas proteinu, CRISPR RNK, i LTVEC, genom je modifikovan da sadrži najmanje 10 kb sekvencu nukleinske kiseline. ;23. Postupak prema primeru 22, naznačeno time da LTVEC sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. ;24. Postupak prema primeru izvođenja 22, naznačeno time da LTVEC sadrži sekvencu nukleinske kiseline od najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb. ;25. Postupak za modifikaciju genoma, koji sadrži dovođenje u kontakt genoma sa Cas proteinom, CRISPR RNK koja hibridizuje sa ciljnom sekvencom, i tracrRNK u prisustvu velikog targeting vektora (LTVEC), naznačeno time da LTVEC je najmanje 10 kb i sadrži prvu nukleinsku kiselinu flankiranu sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom, naznačeno time da nakon dolaska u kontakt sa Cas proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu LTVEC, genom je modifikovan na genomskom lokusu od interesa da sadrži prvu nukleinsku kiselinu. ;26. Postupak prema primeru 25, naznačeno time da genome je u eukariotskoj ćeliji, i Cas protein, CRISPR RNK, tracrRNK, i LTVEC su introdukovani u eukariotsku ćeliju ;27. Postupak prema primeru 26, koji dodatno sadrži identifikaciju modifikovane eukariotske ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa. ;28. Postupak prema primeru 26 ili 27, naznačeno time da CRISPR RNK i tracrRNK su zajedno introdukovani u obliku jedne vodeće RNK (gRNK). ;29. Postupak prema primeru 26 ili 27, naznačeno time da CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane zasebno. ;30. Postupak prema bilo kom od primera 26-29, naznačeno time da: (a) Cas protein je introdukovan u eukariotsku ćeliju u obliku proteina, informacione RNK (mRNK) koja kodira Cas protein, ili DNK koja kodira Cas protein; (b) CRISPR RNK je introdukovana u eukariotsku ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira CRISPR RNK; i (c) tracrRNK je introdukovana u eukariotsku ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira tracrRNK. ;31. Postupak prema primeru 30, naznačeno time da Cas protein, CRISPR RNK, i tracrRNK su introdukovani u eukariotsku ćeliju kao protein-RNK kompleks. ;32. Postupak prema primeru 30, naznačeno time da: (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugu nukleinsku kiselinu koja kodira Cas protein; (b) DNK koja kodira CRISPR RNK je u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira CRISPR RNK; i (c) DNK koja kodira tracrRNK je u obliku trećeg ekspresionog konstrukta koji sadrži treći promotor operativno vezan sa četvrtom nukleinskom kiselinom koja kodira tracrRNK, naznačeno time da prvi, drugi, i treći promotor su aktivni u eukariotskoj ćeliji. ;33. Postupak prema primeru 32, naznačeno time da prvi, drugi, i/ili treći ekspresioni konstrukt su na jednom molekulu nukleinske kiseline. ;34. Postupak prema primeru 30, naznačeno time da: (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukelinskom kiselinom koja kodira Cas protein; i (b) DNK koja kodira CRISPR RNK i DNK koja kodira tracrRNK su u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira gRNK koja sadrži CRISPR RNK i tracrRNK; naznačeno time da prvi i drugi promotor su aktivni u eukariotskoj ćeliji. 35. Postupak prema primeru 34, naznačeno time da su prvi i drugi ekspresioni konstrukt na jednom molekulu nukleinske kiseline. ;36. Postupak prema bilo kom primeru izvođenja 27-35, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži istovremenu deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju prve nukleinske ksieline na genomskom lokusu od interesa. ;37. Postupak prema bilo kom od primera 27-36, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija. ;38. Postupak prema primeru 37, naznačeno time da bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju endogene sekvence nukleionske ksieline i inserciju prve nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma. ;39. Postupak prema bilo kom od primera 27-36, naznačeno time da modifikovana eukariotska ćelija je hemizigotna na genomskom lokusu od interesa. ;40. Postupak prema primeru 39, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline. ;41. Postupak prema primeru 39, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; i (2) inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvi hromozom i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom hromozomu. ;42. Postupak prema bilo kom od primera 25-41, naznačeno time da LTVEC je najmanje 15 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, ili najmanje 90 kb. ;43. Postupak prema bilo kom od primera 25-42, naznačeno time da LTVEC je najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb. ;44. Postupak prema bilo kom od primera 25-43, naznačeno time da prva nukleinska kiselina je najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, ili najmanje 300 kb. ;45. Postupak prema bilo kom od primera 26-44, naznačeno time da eukariotska ćelija je sisarska ćelija. ;46. Postupak prema primeru 45, naznačeno time da sisarska ćelija je fibroblast. ;47. Postupak prema bilo kom od primera 26-43, naznačeno time da eukariotska ćelija je pluripotentna ćelija. ;48. Postupak prema primeru 47, naznačeno time da pluripotentna ćelija je ne-humana pluripotentna ćelija. ;49. Postupak prema primeru 48, naznačeno time da ne-humana pluripotentna ćelija je glodarska pluripotentna ćelija. ;50. Postupak prema primeru 49, naznačeno time da glodarska pluripotentna ćelija je mišja ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova. ;51. Postupak prema primeru 47, naznačeno time da pluripotentna ćelija je humana pluripotentna ćelija. ;52. Postupak prema primeru 51, naznačeno time da humana pluripotentna ćelija je humana embrionalna matična (ES) ćelija ili humana adultna embrionalna ćelija. ;53. Postupak prema primeru 51, naznačeno time da humana pluripotentna ćelija je razvojno ograničena humana progenitorska ćelija. ;54. Postupak prema primeru 51, naznačeno time da humana pluripotentna ćelija je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. ;55. Postupak prema bilo kom od primera 25-54, naznačeno time da Cas protein je Cas9. ;56. Postupak prema bilo kom od primera 25-55, naznačeno time da ciljna sekvenca je neposredno flankirana sa sekvencom motiva susednog protospejseru (PAM). ;57. Postupak prema bilo kom od primera 25-56, naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 10 kb do oko 150 kb. ;58. Postupak prema bilo kom od primera e25-57, naznačeno time da ukupna suma 5’ i 3’ homologe ruke LTVEC je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb. ;59. Postupak prema bilo kom od primera 27-58, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži: (a) zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukleinske kiseline; (b) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline; (c) deleciju endogene sekvencu nukleinske kiseline, naznačeno time da je delecija u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb; (d) inserciju egzogene sekvence nukleinske kiseline; (e) inserciju egzogene sekvencu nukleinske kiseline u opsegu od oko 5kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (f) inserciju egzogene sekvence nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline; (g) inserciju himerne sekvence nukleinske kiseline koja sadrži humanu i ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline; (h) inserciju uslovnog alela flankiranog sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifične za mesto; (i) inserciju selektabilnog marker ili reporter gena operativno vezanog sa trećim promotorom aktivnim u pluripotentnoj ćeliji; ili (j) njihovu kombinacija. ;60. Postupak prema bilo kom od primera 25-59, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži (i) 5’ ciljnu sekvencu koja je homologa 5’ homologoj ruci; i (ii) 3’ ciljnu sekvencu koja je homologa 3’ homologoj ruci. ;61. Postupak prema primeru 60, naznačeno time da 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojeni sa najmanje 5 kb ali manje od 3 Mb. ;62. Postupak prema primeru 60, naznačeno time da 5’ ciljna sekvenca i 3’ ciljna sekvenca su razdvojeni sa najmanje 5 kb ali manje od 10 kb, najmanje 10 kb ali manje od 20 kb, najmanje 20 kb ali manje od 40 kb, najmanje 40 kb ali manje od 60 kb, najmanje 60 kb ali manje od 80 kb, najmanje oko 80 kb ali manje od 100 kb, najmanje 100 kb ali manje od 150 kb, ili najmanje 150 kb ali manje od 200 kb, najmanje oko 200 kb ali manje od oko 300 kb, najmanje oko 300 kb ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb ali ne manje od oko 1Mb, najmanje oko 1 Mb ali manje od oko 1.5 Mb, najmanje oko 1.5 Mb ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb ali manje od oko 2.5 Mb, ili najmanje oko 2.5 Mb ali manje od oko 3 Mb. ;63. Postupak prema primeru 60, naznačeno time da 5’ ciljna sekvencu i 3’ ciljna sekvenca su razdvojeni sa najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 110 kb, najmanje 120 kb, najmanje 130 kb, najmanje 140 kb, najmanje 150 kb, najmanje 160 kb, najmanje 170 kb, najmanje 180 kb, najmanje 190 kb, ili najmanje 200 kb. ;64. Postupak prema bilo kom od primera 25-63, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži Interleukin-2 receptor gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, ili oba Rag1 i Rag2 lokusa. ;65. Postupak prema bilo kom od primera 25-63, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži Adamts5 lokus, Trpa1 lokus, Folh1 lokus, ili Erbb4 lokus. ;66. Postupak prema bilo kom od primera 25-63, naznačeno time da genomski lokus od interesa sadrži Lrp5 lokus. ;67. Postupak za stvaranje F0 generacije ne-humane životinje koji sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa, pri čemu postupak sadrži: (a) dovođenje u kontakt genoma u ne-humanoj ES ćelija sa Cas proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu velikog targeting vektora (LTVEC) da bi se formirala ne-humana ES ćelija, naznačeno time da LTVEC je najmanje 10 kb i sadrži prvu nukleinsku kiselinu flankiranu sa 5’ homologom rukom i 3’ homologom rukom; (b) identifikaciju modifikovane ne-humane ES ćelije koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa; (c) introdukciju modifikovane ne-humane ES ćelija u ne-humanog embriona domaćina; i (d) gestaciju ne-humanog embriona domaćina u surogat majci, naznačeno time da surogat majka proizvodi F0 generaciju ne-humane životinje koja sadrži ciljanu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa. ;68. Postupak prema primeru izvođenja 67, naznačeno time da CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane zajedno u obliku jedne vodeće RNK (gRNK). ;69. Postupak prema primeru izvođenja 67, naznačeno time da CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane zasebno. ;70. Postupak prema bilo kom primeru izvođenja 67-69, naznačeno time da: (a) Cas protein je introdukovan u ne-humanu ES ćeliju u obliku proteina, informacione RNK (iRNK) koja kodira Cas protein, ili DNK koja kodira Cas protein; (b) CRISPR RNK je introdukovana u ne-humanu ES ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira CRISPR RNK; i (c) tracrRNK je introdukovana u ne-humanu ES ćeliju u obliku RNK ili DNK koja kodira tracrRNK. ;71. Postupak prema primeru izvođenja 70, naznačeno time da Cas protein, CRISPR RNK, i tracrRNK su introdukovani u ne-humanu ES ćeliju kao protein-RNK kompleks. ;72. Postupak prema primeru izvođenja 70, naznačeno time da: (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukrta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein; (b) DNK koja kodira CRISPR RNK je u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukelinskom kiselinom koja kodira CRISPR RNK; i (c) DNK koja kodira tracrRNK je u obliku trećeg ekspresionog konstrukta koji sadrži treći promotor operativno vezan sa četvrtom nuleinskom kiselinom koja kodira tracrRNK, naznačeno time da prvi, drugi, i treći promotor su aktivni u ne-humanoj ES ćeliji. ;73. Postupak prema primeru izvođenja 72, naznačeno time da prvi, drugi, i treći ekspresioni konstrukti su na jednom molekulu nukleinske kiseline. ;74. Postupak prema primeru izvođenja 70, naznačeno time da: (a) DNK koja kodira Cas protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno vezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas protein; i (b) DNK koja kodira CRISPR RNK i DNK koja kodira tracrRNK su u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno vezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira gRNK koja sadrži CRISPR RNK i tracrRNK; naznačeno time da prvi i drugi promotor su aktivni u nehumanoj ES ćelija. ;75. Postupak prema primeru izvođenja 74, naznačeno time da prvi i drugi ekspresioni konstrukt su na jednom molekulu nukleinske kiseline. ;76. Postupak prema bilo kom primeru izvođenja 67-75, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži istovremeno deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju prve nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa. ;77. Postupak prema bilo kom primeru izvođenja 67-76, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija. ;78. Postupak prema primeru izvođenja 77, naznačeno time da bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma. ;79. Postupak prema bilo kom primeru izvođenja 67-76, naznačeno time da modifikovana nehumana ES ćelija je hemizigotna na genomskom lokusu od interesa. ;80. Postupak prema primeru izvođenja 79, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline i inserciju prve nukleinske kiseline. ;81. Postupak prema primeru izvođenja 79, naznačeno time da ciljana genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; i (2) inserciju prve nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom hromozomu i disrupciju genomskog lokusa od interesa u drugom hromozomu. ;82. Postupak prema bilo kom primeru izvođenja 67-81, naznačeno time da Cas protein je Cas9. ;;PRIMERI ;;[0429] Sledeći primeri su dati da obezbede stručnjaku kompletno otkriće i opis kako da koristi predmetni pronalazak, i nije nameravano da ograničavaju obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom niti je nameravano da predstavlja da su eksperimenti dati u nastavku svi ili jedini izvedeni eksperimenti. Načinjeni su napori da se osigura preciznost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperatura, itd.) ali neke eksperimentalne greške i devijacije su očekivane. Ukoliko nije naznačeno drugačije, delovi su delovi potežini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, i pritisak je ili blizu atmosferskog. ;;Primer 1. Derivatizacija i karakterizacija ES ćelija pacova ;;1.1. Karakterizacija ES ćelija pacova ;;[0430] Kao što je prikazano na Slici 1, ESC pacova rastu kao kompaktne sferične kolonije, koje se rutinski otkačinju i plutaju u sudu (uveličano, Slika 8). ESC pacova eksprimiraju markere pluripotencije uključujući Oct-4 (Slika 2A) i Sox2 (Slika 2B), i eksprimiraju visoke nivoe alkalne fosfataze (Slika 3). Kariotip za liniju DA.2B je 42X,Y (Slika 4). ESC pacova često postaju tetraploidne; stoga, izvršen je pre-skrining linija prebrojavanjem metafanih hromozoma; linije sa uglavnom normalnim brojem su zatim formalno kariotipizirane. ;[0431] ACI blastoccisti su sakupljeni od super-ovulisanih ženki dobijenih komercijalno. DA blastocisti su kultivisani od smrznutih 8-ćelijskih embriona dobijenih komercijalno. Zona pelucida su uklonjene sa kiselim Tirodovim rastvorom; i blastocisti su postavljeni na ploču na mitotski inaktivirane MEFs. Izdanci su poklupljeni i ekspandirani korišćenjem standardnih postupaka. Svi blastocisti su postavljeni na ploče, kultivisani i ekspandirani korišćenjem 2i medijuma (Li et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135:1299-1310. ;;; ;;; 1.2. : Proizvodnja pacova ;;[0432] Himerni pacovi su proizvedeni injekcijom blastocista i prenošenjem ESC genoma pacova. Himere proizvedene mikroinjekcijom blastocista korišćenjem roditeljskih ACI.G1 ESC pacova su prikazani na Slici 9. F1 aguti mladunci sa albino mladuncima iz istog legla, ukršteni sa mužjakom ACI/SD himera označenim sa asteriskom (*) na Slici 9 prikazani su na Slici 10.
Prenošenje roditeljske ESC pacova klicinom linijom.
[0433] Tri euploidne linije ESC pacova su procenjene u odnosu na pluripotenciju sa mikroinjekcijom u albino SD blastociste. Himere su identifikovane preko aguti boje krzna, koja označava doprinos ESC pacova (videti Sliku 10). Za svaku liniju, većina himera prenela je rESC genom na F1 potomstvo (Tabela 2).
1.3. : Derivatizacija embrionalnih matičnih ćelija pacova.
Protokol superovulacije, pacovi
[0434]
Dan 0: data injekcija da serumom trudne kobile: IP, 20 U (0.4 ml).
Dan 1: nema aktivnosti
Dan 2: (46 č. kasnije): injekcija sa hCG, IP, 50 U (1 ml).
- podešavanje parenja pojedinačnih ženki.
Dan 3: provera čepova. Ženke su začepljene. Ovo je dan 0.5.
Dan 6 (e3.5): Eutanazija ženki i ispiranje embriona.
Protokol derivatizacije ES ćelija (superovulacija)
[0435]
Dan 0:
1) Eutanazija ženke pacova sa CO2.
2) Uzet bris ventralnog abdomena sa 70% etanolom; korišćenjem makaza, otvoren ventralni telesni zid da bi se izložila utroba.
3) Disekcija jajovoda i rogova materice i njihovo stavljanje u posudu za kulturu tkiva koja sadrži topao N2B27 medijum. Ispiranje koliko je maksimalno moguće krvi i prenošenje na novu posudu sa N2B27.
4) Korišćenjem šprica od 1 ml i tupe 27g igle, ispran medijum preko rogova uterusa i jajovoda da bi se blastocisti izbacili u medijum.
5) Sakupljanje blastocista pipetom i transfer u posudu za kulturu embriona koja sadrži KSOM 2i (1mMPD0325901, 3 mM CHIR99021). KSOM je medijum kulture proizveden od strane Millipore. Kataloški broj je MR-106-D.
6) Kultivisano preko noći na 37°; 7.5% CO2.
Protokol derivatizacije ES ćelije (zamrznuti embrioni)
[0436]
Dan 0:
1) Odmrzavanje zamrznutih 8-ćelijskih embriona (komercijalno dobijeni) u M2 medijumu. Kultivacija 10 minuta na sobnoj temepraturi.
2) Preneto na KSOM 2i i kultivisano preko noći.
Protok derivatizacije ES ćelije (isto za oba)
[0437]
Dan 1:
1) Preneti embrioni u 2i medijum & kultivisani preko noći.
2) Nastavljeno kultivisanje nekavitiranih embriona u KSOM 2i
Dan 2:
1) Preneti svi preostali embrioni u 2i medijum (bez obzira na kavitaciju).
2) Kultivisani preko noći; nastavljeno kultivisanje ranijih embriona u 2i medijumu.
Dan 3:
1) Preneti embrioni 30 - 60 sekundi sa kiselim Tirodovim rastvorom da bi se uklonila zona pelucida.
2) Isprani embrioni 3x u 2i medijumu da bi se uklonio kiseli Tirodov rastvor.
3) Odlaganje svakog embriona u zasebni bunarčić ploče za ishranu sa 96 bunarčića (bunarčić sadrži monosloj mitotski inaktiviranih mišjih embrionalnih fibroblasta (MEFs).
4) Kultivisano preko noći u 2i medijum.
Dan 4 - 5:
1) Praćeni embrioni na pločama u odnosu na orisustvo izdanaka (amorfna nediferencirana masa ćelija). Izdanci su spremni za prenošenje kada su približno dvostruko veći od embriona na ploči.
2) Svaki dan: ukloniti potrošeni medijum sa mikropipetom i zameniti sa svežim 2i medijumom.
3) Preneti izdanci na nove bunarčiće za ishranu:
a. Uklonjen potrošeni medijum i nežno ispirani bunarčić sa PBS.
b. Uklonjen PBS i dodato 30 ml 0.05% tripsina; inkubirati 10 minuta.
c. Zaustavljena reakcija tripsina dodavanjem 30ml 2i 10% FBS.
d. Nežno disocirane ćelije sa mikropipetorom i celokupan sadržaj bunarčića prenet u novi bunarčić u ploču za ishranu sa 24 bunarčića. Ovo je bio pasaž 1 (P1).
e. Kultivisano preko noći u 2i medijumu.
Dan 5 - 8: (tajming zavisi od toga koliko brzo se svaka linija proširuje)
1) Promenjen medijum svaki dan (2i medijum) i praćeno u odnosu na prisustvo kolonija sa ESC morfologijom.
2) Kada se kolonije pojave, nastavljena kultivacija do proširenja kolonija ~ 50% konfluence. 3) Tripsinizovane i pasažirane kolonije kao prethodno; postavljene na ploče za hranjenje, 1 bunarčić po liniji, u posudi sa 6 bunarčića. This Ovo je bio pasaž 2 (P2).
[0438] Kontinuirano:
1) Nastavljeno hranjenje i praćenje svake linije do približno 50% konfluence.
2) Tripsinizacija ćelije kao i obično.
3) zaustavljen tripsin sa 2i 10% FBS; ćelije peletirane centrifugiranjem (5’, 1200 rpm u stonoj Beckman-Coulter centrifugi).
4) Aspiracija supernatanta i nežno resuspendovanje ćelija u 400 ml medijuma za zamrzavanje (70% 2i, 20% FBS, 10% DMSO).
5) Distribucija ćelija u 2 vijalice i zamrzavanje na -80°. Ovo je bio pasaž 3 (P3).
6) Za dugoročno skladištenje, prenošenje vijalica u skladište sa tečnim N2.
[0439] 2i medijum je pripremljen kao što sledi u Tabeli 3.
Materijali: Gonadotropin iz seruma trudne kobile (PMSG)
[0440]
Horionski gonadotropin iz urina humane trudnoće (HCG)
Ženke pacova (5-12 nedelja stare)
Mužjaci pacova (12 nedelja do 8 meseci stari), jedan po kavezu
Špricevi/igle
Ssvetlo u sobama za životinje 6:00-18:00
Procedura:
[0441]
Dan 1: 8:00-10:00 pre podne
Ženkama data injekcija sa 20 IU PMSG (0.4 ml), IP
Odbacivanje neiskorišćenog PMSG.
Dan 3: 8:00-10:00 pre podne (48 časova nakon PMSG injekcije)
Ženkama data injekcija sa 50 IU HCG (1 ml), IP
Staviti jednu ženku po mužjaku u kavez za parenje.
Odbaciti neiskorišćeni HCG.
Dan 4: 8:00-10:00 pre podne (24 časa nakon HCG injekcije)
Proveriti ženke u odnosu na čepove.
Dobavljači hormona
[0442] PMSG: Sigma #G-4877 (1000 IU). Resuspendovati u PBS do finalne [] 50 IU/ml. Skladištiti na -20° u 1 ml alikvotama.
[0443] HCG: Sigma #CG-5 (5000 IU). Resuspendovati u PBS do finalne [] 50 IU/ml. Skladištiti na -20° u 1 ml alikvotama.
1.4.: Kariotipizacija linija embrionalnih matičnih ćelija pacova
[0444] Linije ES ćelija pacova stvorene ovde su kariotipizirane, i rezultati su rezimirani u Tabelama 4-7.
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
1.5.: Elektroporacija vektora u embrionalnu matičnu ćeliju pacova
[0445]
1. Pasažirane ES ćelije pacova 24-48 č pre elektroporacije.
2. Medijum promenjen u RVG2i ROCKi (10mM Y-27632) 24 č pre elektroporacije
3. Medijum promenjen 30’ pre tripsinizacije.
4. Alikvotirana DNK za elektroporaciju.
5. Dozvoljeno da se DNK ugreje na RT >10 min.
6. Zagrejana DNK 5’ @ 62°C. Staviti DNK na led.
7. Tripsinizovane ćelije:
a. Sakupljene plutajuće kolonije. Isprana ploča da se sakupi što je moguće više plutajućih kolonija.
b. Peletirane kolonije: 3’ @ 750 rpm.
c. Ispran pelet 1x sa 5-10ml PBS i re-spin/pelet
d. Aspiriran supernatant; dodati 500λ tripsin, 0.05% 1% kokošijeg seruma.
i. Nije pulovano više od 1 10 cm ploče kolonija po epruveti. Ukoliko postoji previše kolonija spakovanih na dnu epruvete tokom tripsinizacije one će napraviti grumen i većina ćelija će biti izgubljena.
e. 4’ @ 37°. Pipetirane kolonije nekoliko puta da bi se minimizovalo stvaranje grumena.
f. Ponovljeni koraci 1-2 X: 4’ @ 37°.
g. Zaustavljen tripsin sa 500λ RVG2i 10% FBS.
8. peletirane ćelije: 5’ @ 1200 rpm.
9. Resupsendovane ćelije u 10 ml PBS. Prebrojati dve 20λ alikvote da bi se odredio ukupan broj ćelija.
10. Peletirane ćelije (5’/1200rpm); izračunati ukupan broj ćelija i ukupnu zapreminu resuspenzije da bi se postigla ispravna koncentracija ćelija (ciljana #/75 ml EP pufer).
11. Resuspendovati u minimalnoj zapremini EP pufera; izmeriti ukupnu zapreminu i podesiti do ciljne zapremine sa EP puferom. Elektroporacioni pufer prodaje Millipore. Kataloški # je ES-003-D. Videti, Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21:652-659.
12. Dodati 75λ ćelija 50λ DNK; preneti 125λ ćelija/DNK rastvora u jedan bunarčić BTX kivete sa 48 bunarčića.
a. Napunjeni prazni bunarčići u istoj koloni sa 125λ EP puferom.
13. Pulsirana kiveta jednom u BTX elektroporatoru:
a. podešavanja: 400V; Ω; 100 mF (podešavanja mogu varirati)
14. Postaviti kivetu na led 15’ za rekuperaciju.
15. Uklonjene ćelije u 5 ml RVG2i 10 mM ROCKi.
16. Dodato u 15 cm ploču sa 20 ml RVG2i 10mM ROCKi. Ploča ima 2x neoR MEFs (ili drugih MEFs u zavisnosti od projekta). neoR selektabilni marker je neomicin fosfotransferaza (neo) gen od Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36 ili in US Patent No, 7,205,148 ili 6,596,541.
17. Inkubirano @ 37°. Započeti selekciju 48 časova kasnije.
[0446] Korišćeni ROCK inhibitor bio je Y-27632.
1.6: Selekcija ciljane genetičke modifikaciea u embrionalnoj matičnoj ćeliji pacova.
[0447]
1. pasažirane ćelije 24-48 časova pre elektroporacije.
2. Promenjen medijum RVG2i ROCKi (10mM Y-27632) 24 č. pre elektroporacije
3. Promenjen medijum 30’ pre tripsinizacije.
4. Alikvotovana DNK za elektroporaciju.
5. Dozvoljeno da se DNK ugreje na RT >10 min.
6. Zagrevana DNK 5’ @ 62°C. Staviti DNK na led.
7. Tripsinizovane ćelije:
a. Sakupljene plutajuće kolonije. Isprana ploča da se sakupi što je moguće više plutajućih kolonija.
b. Peletirane kolonije: 3’ @ 750 rpm.
c. Ispran pelet 1x sa 5-10ml PBS i re-spin/pelet
d. Aspiriran supernatant; dodati 500λ tripsina, 0.05% 1% kokošijeg seruma.
i. Nije pulovano više od 1 10 cm ploče kolonija po epruveti. Ukoliko postoji previše kolonija spakovanih na dnu epruvete tokom tripsinizacije one će napraviti grumen i većina ćelija će biti izgubljena.
e. 4’ @ 37°. Pipetirane kolonije nekoliko puta da bi se minimizovalo stvaranje grumena
f. Ponovljeno 1-2 X: 4’ @ 37°.
g. Zaustavljen tripsin sa 500λ RVG2i 10% FBS.
8. Peletirane ćelije: 5’ @ 1200 rpm.
9. Resuspendovane ćelije u 10 ml PBS. Izbrojati dve 20λ alikvote da bi se odredio ukupan broj ćelija.
10. Peletirane ćelije (5’/1200rpm); izračunati ukupan broj ćelija i ukupnu zapreminu resuspenzije da bi se postigla ispravna koncentracija ćelija (ciljni #/75 ml EP pufer).
11. Resuspendovati u minimalnoj zapremini EP pufera; izmeriti ukupnu zapreminu i podesiti do ciljne zapremine sa EP puferom.
12. Dodati 75λ ćelija 50λ DNK; preneti 125λ ćelija/DNK rastvora u jedan bunarčić BTX kivete sa 48 bunarčića.
a. Napunjeni prazni bunarčići u istoj koloni sa 125λ EP puferom.
13. Pulsirana kiveta jednom u BTX elektroporatoru:
a. podešavanja: 400V; 100 mF (podešavanja mogu varirati)
14. Postaviti kivetu na led 15’ za rekuperaciju.
15. Uklonjene ćelije u 5 ml RVG2i 10 mM ROCKi.
16. Dodato u 15 cm ploču sa 20 ml RVG2i 10mM ROCKi. Ploča ima 2x neoR MEFs (ili drugih MEFs u zavisnosti od projekta).
17. Inkubirano @ 37°. Započeti selekciju 48 časova kasnije.
18. G418 selekcioni protokol bio je kao što sledi:
a. Dan 2 (drugi dan nakon EP): inkubirane ćelije u 2i medijumu G418, 75 μg/ml.
b. Dan 3: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
c. Dan 4: inkubirane ćelije u 2i medijumu G418, 75 μg/ml.
d. Dan 5: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
e. Dan 6: inkubirane ćelije u 2i medijumu G418, 75 μg/ml.
f. Dan 7: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
g. Dan 8: inkubirane ćelije u 2i medijumu G418, 75 μg/ml.
h. Dan 9: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
i. Dan 10: inkubirane ćelije u 2i medijumu G418, 75 μg/ml.
j. Dan 11: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
k. Dan 12: uzeti kolonije za ekspanziju za skrining. Svaka kolonija je disocirana u 0.05% tripsin 1% kokošiji serum 10 minuta i zatim postavljene na ploče u 1 bunarčić ploče za hranjenje sa 96 bunarčića.
19. Ekspanzija kolonija 3 dana u 2i medijumu.
20. Pasažirani klonovi 1:1 u nove ploče za hranjenje sa 96 bunarčića.
21. Ekspanzija klonova 3 dana u 2i medijumu.
22. Za svaki klon, disocirane kolonije u tripsinu. Zamrznuti 2/3 svakog klona i uskladištiti na -80°; postaviti preostalu 1/3 na laminin ploče (ploče sa 96 bunarčića obložene sa 10 μg/ml laminina).
23. Kada su laminin ploče konfluentne, pasažirane u laboratoriju za skrining za genotipizaciju klonova.
1.7. Molekulski potpis za embrionalne matične ćelije pacova
[0448] Geni navedeni u Tabeli 8 eksprimirani su 20-puta manje u ES ćelijama pacova od odgovarajućih gena u mišjim ES ćelijama. Geni navedeni u Tabeli 8 eksprimirani su 20-puta više u ES ćelijama pacova od odgovarajućih gena u mišjim ES ćelijama.
[0449] Podaci iz mikronizova u Tabelama 8 i 9 su stvoreni kao što sledi. ES ćelije pacova (ACI.G2 i DA.2B) i mišje ES ćelije (F1H4) su kultivisane u 2i medijumu 3 pasaža do konfluence. F1H4 ćelije su kultivisane na pločama obloženim želatinom u odsustvu hranilaca. F1H4 mišje ES ćelije su izvedene iz 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac heterozigotnih embriona (videti, npr., US Pat. No. 7,294,754 i Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela,D.M. (2007).
[0450] Sledeći protokol je korišćen za pripremu uzorka: 1.5mL Eppendorf epruvete su obeležene sa ID uzorka. Ćelije uzgajane na ploči su isprane u 37°C fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS). PBS je uklonjen i dodato je 300 ul Trizol®. Korišćen je skrejper da bi se razdvojile ćelije u Trizol® (Life Technology). Lizirane ćelije su prikupljene u Trizol® in u 1.5mL Eppendorf epruveti. Za ćelije uzgajane u suspenziji, ćelije su isprane u 37°C PBS i sakupljene u 1.5mL epruveti. Ćelije su iscentrifugirane; PBS je uklonjen; i 300 ul Trizol® je dodat ćelijama. Ćelijske membrane su pokidane pipetiranjem. Uzorci su sortirani u odnosu na FACS sa 10 do 10<5>ćelija, zapremina je koncentrovana na manje od 100uL. Dodato je 4 zapremine RNK pufera za liziranje i mešano pieptiranjem. Za uzorak, dodato je 320uL RNK pufera za liziranje u 80uL uzorak. Uzorci su uskladišteni na -20°C.
[0451] RNK-Seq je korišćen za merenje ekspresionog nivoa gena miša i pacova. Očitavanja sekvenciranja su mapirana u odnosu na referentni genom miša i pacova od Tophat, i RPKM (fragmenti po kilobazi egzona po milion mapiranih fragmenata) su izračunati za gene miša i pacova. Homologi geni na osnovu genskog simbola su selektovani, i zatim je korišćen t-test da bi se poredio nivo ekspresije svakog gena između miša i pacova. miR-32 je bio u vrhu 10 najviše eksprimiranih u ESC pacova ali nije bio eksprimiran u ES ćelijama miša. Iako ne postoje komparativni podaci za miR-632, na osnovu nivoa njegove ekspresije u poređenju sa drugim genima eksprimiranim u ESC pacova i njihovim poznatim funkcijama u embrionalnom razviću, miR-632 je izabran kao marker za ES ćelije pacova.
Tabela 8. Navedeni geni eksprimirani u nivoima 20-puta nižim u ES ćelijama pacova nego u odgovarajućim genima u ES ćelijama miša.
Tabela 9. Navedeni geni eksprimirani u nivoima 20-puta višim u ES ćelijama pacova nego u odgovarajućim genima u ES ćelijama miša.
Tabela 10. Subset gena iz Tabele 9, koji su eksprimirani na nivoima 20-puta većim u ES ćelijama pacova nego u odgovarajućim genima u ES ćelijama miša.
[0452] Dodatni molekularni potpis koji koristi markere/gene pluripotencije za ES ćelije pacova je takođe razvijen. Tabela 11 obezbeđuje spisak gena i njihove ekspresiono rangiranje iz podataka RNK profilisanja. iRNA je izolovana iz ES ćelija pacova i ekspresioni nivoi različitih markera su međusobno upoređeni. Termin "rang" označava komparativne ekspresione nivoe pojedinačnih gena: što je veći rang (1 je najveći), veća je ekspresija. Na primer, Oct4’s rang od 13 označava da, od svih analiziranih gena, eksprimiran je više od svih osim 12 gena. Referentna vrednost u ovom eksprerimentu je bila bilo koja vrednost ekspresije ispod 30; 6107 gena je imala vrednosti ekspresije od 30 ili više.
Tabela 11. Molekulami potpis ES ćelija pacova koji koristi različite pluripotentne, mezodermalne, endodermalne, nervne i trofoektodermske markere/gene.
Primer 2: Inaktivacija genomskih lokusa pacova
2.1: Inaktivacija endogenih genomskih lokusa korišćenjem endonukleaznog sredstva
[0453] Da bi se introdukovao mutant alel u endogeni genomski lokus pacova, ES ćelije pacova opisane ovde su elektroporisane sa ekspresionim vektorima (ili iRNA) koja eksprimira ZFNs 1 i 2 (ili TALENs 1 i 2). Ovi proteini vezuju njiihove ciljne sekvence na suprotnim lancima, razdvojene sa oko 6 bp do oko 40 bp. Prekid dvostrukog lanca je formiran unutar ciljnog lokusa, koje ćelije pokušavaju da poprave spajanjem nehomologih krajeva (NHEJ). U mnogim slučajevima, NHEJ rezultuje u stvaranju delecije, koja često remeti funkciju gena (najčešće proizvodnjom mutacije pomeranja okvira čitanja). Da bi se identifikovao pozitivni klon koji sadrži mutant alel, elektroporisane ćelije su postavljene naploču sa niskom gustinom, jer nije urađena selekcija lekom. Kolonije su uzete i testirane na ciljnom mestu da bi se videlo da li je proizvedena mutacija (npr., korišćenjem testa modifikacije alela (MOA) opisanog prethodno). Izabrane ES ćelije koje sadrže mutant alel su zatim introdukovane u embrion domaćin pacova, na primer, pre-morula stadijum ili blastocist stadijum embrion pacova, i implantirane u matericu surogat majke da bi se stvorio pacov osnivač (F0 pacov). Nakon toga, osnivački pacov je ukršten sa pacovom divljeg tipa da bi se stvorilo F1 potomstvo heterozigotno za mutant alel. Parenje heterozigotnog F1 pacova može proizvesti potomstvo homozigotno za mutant alel.
2.2.: Targeting ESC pacova za inaktivaciju gena apolipoproteina E (ApoE) pacova korišćenjem nukleaza cinkovog prsta
[0454] Cink prsten nukleaze koriste sekvenca specifične modularne DNK vezujuće domene da bi usmerile endonukleaznu aktivnost na jedinstvenu ciljnu sekvencu u genomu. ZFNs su stvoreni inženjeringom kao par monomera. Svaki monomer sadrži nespecifični domen za isecanje iz FokI endonukleazu fuzionisanu sa 3 ili više cink prst DNK-vezujućih domena. Svaki cink prst vezuju 3 bp submesto i specifičnost je postignuta kombinovanim ciljnim mestima oba monomera. ZFNs proizvode dvolančane prekide (DSBs) u DNK, i mutacije (insercije ili delecije) često se pojavlju tokom spajanja ne-homologih krajeva (NHEJ). Slika 15 ilustruje mehanizam preko koga genome-uređujuće endonukleaze kao što su ZFNs i TALENs uvode dvolančane prekide u ciljnoj genomskoj sekvenci i aktiviraju NHEJ u ćeliji. DSBs takođe stimulišu homologo popravljanje (HDR) preko homologe rekombinacije ukoliko je donor sekvenca obezbeđena sa ZFN.
[0455] Takvi ZFNs su korišćeni u kombinaciji sa različitim postupcima i kompozicijama opisanim ovde da bi se poboljšala efikasnost ciljanog delovanja. Apolipoprotein E (ApoE) lokus pacova je ciljan kao što je opisano u Primeru 3.2(a)(i), izuzev što su ekspresioni vektori koji eksprimiraju ZFNs 1 i 2 takođe introdukovani u ES ćelije pacova. Videti Sliku 11, koja obezbeđuje šemu ApoE targeting događaja u kombinaciji sa rTZFNIP i rTZFN2P. Efikasnost targetinga je određena kao što je razmatrano u nastavku u Primeru 5 i rezultati su prikazani u Tabeli 12. Da bi se izvršio skrining heterozigotnog targetinga, homozigotnog targetinga, i "mešovitih" dublova (npr., složeno heterozigotni targeting), specifične probe prajmera su korišćene za određivanje genotipa. Iznenađujuće, efikasnost targeting je išla naviše 8-10 puta.
Tabela 12. ApoE ZFNs pacova: Poboljšana efikasnost targetinga.
[0456] Plasmid targeting vektor je stvoren sa samo-deletirajućom selekcionom kasetom u odnosu na lek i lacZ genom kao reporter genom (videti Sliku 14 za ilustraciju homologih i ne-homologih rekombinacionih događaja koji se mogu dogoditi nakon elektroporacije targeting vektora koji sadrži selekcionu kasetu). Dobra efikasnost targetinga je postignuta i visok % himera je proizveden. Cink prst nukelaze (ZFNs) su takođe testirane u kombinaciji sa targeting vektorima da se istraži njihov efekat na poboljšanje efikasnosti targetinga (videti Sliku 16 za ilustraciju tehnike targetinga gena korišćenjem ZFNs ili TALENs da bi se poboljšala efikasnost homologe rekombinacije targeting vektora). Targeting vektor je ko-eksprimiran sa ekspresionim vektorima za 2 ZFN parove koji isecaju ApoE lokus. ESC klonovi pacova elektroporisani i sa targeting vektorom i sa setom ZFNs pokazali su targeting efikasnost od 8-10 puta veću od one kod ESC klonova pacova elektroporisanih samo sa targeting vektorom. Dodatno, bi-alelno homozigotno targetiranje u oko 2% naših klonova je detektovano. Visok % himera iz dva od ovih targetiranih klonova je dobijeno.
[0457] ApoE-targetirani (sa ZFN asistiranjem) ESC klonovi pacova su mikroinjektirani u SD blastociste, koji su zatim preneti u pseudotrudne SD primaoce ženke, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane po boji krzna (videti Sliku 17, koja prikazuje ApoE-ZFN-AB5 himere (tj., ApoE-/- himere); F0 jimera mužjaci su ukrštani sa SD ženkama. F1 mladunci klicine linije su genotipizirani u odnosu na prisustvo targetiranog ApoE alela (Tabela 13). Visok % himera je dobijen od dva od ovih targetiranih klonova.
Tabela 13. Rezultati mikroinjekcije.
[0458] ApoE nokaut pacov obezbeđuje sredstva da se proučavaju različiti tipovi poremećaja i bolesti. Kod ljudi, Apolipoprotein je pronađen u hilomukronu, HDL, LDL i VLDL. ApoE je esencijalan za normalni katabolizam trigliceridom-bogatih lipoprotein sastojaka. Defekti u APOE rezultuju u brojnim bolesnim stanjima uključujući, na primer, porodičnu hiperholesterolemiju, hiperlipidemiju, betalipoproteinemiju, porodićnu disbetalipoproteinemiju, tip III hiperlipoproteinemiju (HLP III), rizik od bolesti koronarne arterije. Jedna izoforma (ApoE4) je povezana sa porodičnom i sporadičnom Alzheimer-ovom bolešću koja se kasno javlja, moguće takođe sa MS.
[0459] Kod miševa, ApoE je primarno pronađen u HDL; transportuje holesterol, kao kod ljudi. ApoE-deficijentni miševi (2 nezavisna KO) imaju 5 puta normalnog plazma holesterola; razvijene depozite bogate penastim ćelijama u njihovim proksimalnim aortama do starosti od 3 meseca (uporedivo sa humanim sindromom).
[0460] ApoE nokaut kod pacova nudi životinjski model za istraživanje endotelne funkcije, uključujući, ali se ne ograničavajući na, formiranje plaka, promene transkripcije (RNK-Seq), ex vivo funkciju. Dodatno, veća veličina pacova će olakšati sve ove analize i potencijalno poboljšati kvalitet RNK-Seq podataka.
2.3. Inaktivacija Interleukin-2 Receptor Gama (IL2r-γ) lokusa pacova korišćenjem nukleaza sa cinkovim prstom
[0461] Interleukin-2 receptor gama (IL2r-y ili Il2rg) lokus pacova je targetiran kao što je opisanou Primeru 3.3(a), izuzev što ekspresioni vektori koji eksprimiraju ZFN U (ZFN ushodno) i ZFN D (ZFN nishodno) su takođe introdukovani u ES ćelije pacova. Slika 18 obezbeđuje šemu IL2r-γ targeting događaja u kombinaciji sa ZFN U i ZFN D. Sekvenca IL2r-γ lokusa za koju se ovi cink prsti vezuju data je na Slici 18 unutar SEQ ID NO: 93. Targeting efikasnost je određena kao što je razmatrano u nastavku u Primeru 3.3(a) i rezultati su prikazani u Tabeli 14. Ukratko, homozigotno targetirani klonovi potvrđeni su sa PCR. Za ZFN1 par: 173 mutant klonova od 192 koja su učestvovala u skriningu (90%) i za ZFN2 par: 162 klona od 192 (84%) koji su bili u skriningu.
Tabela 14. Targeting IL2r-γ lokusa pacova.
[0462] IL2r-γ–targetirani (uz ZFN asistiranje) ESC klonovi pacova mikroinjektirani su u SD blastociste, koji su zatim preneti u pseudotrudne SD primaoce ženke, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane na osnovu bolje krzna; F0 himere mužjaci su ukršteni sa SD ženkama. F1 mladunci klicine linije su genotipizirani u odnosu na prisustvo targetiranog IL2r-γ alela.
2.4.: Inaktivacija Interleukin-2 Receptor Gama (IL2r-γ) pacova korišćenjem CRISPR/Cas9
[0463] IL2r-y lokus pacova je targetiran kaošto je opisano u Primeru 3.3(a), izuzev što je CRISPR/Cas9 sistem takođe introdukovan u ES ćelije pacova da bi se pomoglo efikasnosti targetiranja. SBI: System Biosciences Cas9 "SmartNuclease" sve-u-jednom vektori su korišćeni i Cas9 ekspresija je vođena sa CAG, EF1a, PGK, ili CMV promotorom. Prilagođena gRNK je vezana u vektor i eksprimirana sa HI promotorom. 4 gRNK nasuprot Il2rg su dizajnirane. Regioni IL2r-γ lokusa pacova targetirani sa gRNK1-4 su prikazani na Slici 19. Da bi se izvršio skrining za targeting (npr., heterozigotni targeting, homozigotni targeting, i složeni heterozigotni targeting), specifični prajmeri i probe su korišćeni za određivanje genotipa. Rezultati targetiranja kada su upotrebljene različite vodeće RNK je prikazan na Tabeli 15. "Jako" i "slabo" odnosi se na snagu dokaza na osnovu skrininga da kolonija ima targetiranu modifikaciju.
Tabela 15. Targeting Il2rg lokusa pacova sa vodećim RNK.
2.5.: Inaktivacija mišjeg hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (Hprt) gena korišćenjem CRISPR/Cas9
[0464] Mišji Hprt lokus je targetiran u mišjim ES ćelijama korišćenjem samo LTVECs ili u kombinaciji sa CRISPR/Cas9. Kompletna Hprt kodirajuća sekvenca od 32.9 kb je targetirana u odnosu na deleciju i zamenu sa pCAGG-Puro puromicin rezistencija selekcionom kasetom, koja je takođe eksprimirala eGFP. Krajnje tačke delecije bile su start i stop kodoni. Korišćena sekvenca vodeće RNK bila je 5’-GACCCGCAGUCCCAGCGUCG-3’ (SEQ ID NO: 84), koja je targetirala egzon 1 mišjeg Hprt gena. Predviđeni položaj mesta isecanja ciljanog mesta bila je 22 bazna para od 5’ kraja delecije. Uočena Cas9/gRNK efikasnost isecanja na ciljnom mestu u ES ćelijama bila je ≥ 93%. Rezime je prikazan na Tabeli 16. Korišćenje CRISPR/Cas9 da bi se asistiralo u targetingu kompletnog Hprt lokusa od 32.9 kb rezultovalo je u petostrukom poboljšanju targetinga u odnosu na upotrebu samo LTVEC.
Primer 3: Ciljna modifikacija genomskih lokusa pacova
3.1: Ciljno delovanje na ESC pacova: Rosa26 lokus pacova.
[0465] Rosa26 lokus pacova leži između Setd5 i Thumpd3 gena kao kod miša, sa istim razmakom. Rosa26 lokus pacova (Slika 12, Panel B) se razlikuje od mišjeg Rosa26 lokusa (slika 12, panel A). Mišji Rosa26 transkripti se sastoje od 2 ili 3 egzona. Lokus pacova sadrži drugi egzon 1 (Exlb) pored homologog egzona za mišji egzon 1 (Exla). Treći egzon nije identifikovan od pacova. Ciljno delovanje na Rosa26 alel pacova je prikazano na slici 12C, gde su homologe grane svaka od po 5 kb klonirane pomoću PCR-a upotrebom genomske DNK iz DA ESC pacova. Ciljni alel sadrži SA (splajsing akceptor)-lacZ-hUb-neo kasetu koja menja 117 bp deleciju u Rosa26 intronu pacova.
[0466] Efikasnost ciljnog delovanja na Rosa26 lokus pacova je određena (Tabela 17). Linearizovani vektor je elektroporisan u DA ili ACI ESC pacova, i transficirane kolonije su kultivisane u 2i medijumu G418, upotrebom standardnih tehnika. Pojedinačne kolonije su sakupljene i ispitivane upotrebom analize izgubljenog alela (LOA) (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660.
[0467] Proizvodnja himere i prenos klicine linije upotrebom Rosa26-ciljanih ESC klonova pacova. Ponovo potvrđeni Rosa26-ciljani ESC klonovi pacova su mikroinjektirani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u pseudo-trudne SD recipijentne ženke, upotrebom standardnih tehnika. Himere su identifikovane preko boje omotača; muške F0 himere su ukršatane sa SD ženkama. F1 mladunci klicine linije (aguti) su genotipizirani za prisustvo ciljnog Rosa26 alela; devet od 22 aguti mladunaca genotipiziranih kao heterozigot na Rosa26 lokusu (Tabela 18).
[0468] Da bi se potvrdilo da je genetički modifikovani alel na Rosa26 lokusu prenet preko klicine linije, ekspresija lacZ je potvrđena pomoću X-gal bojenja u heterozigotnim Rosa26-ciljnim pacovima. X-gal bojenje mozga, srca i timusa, i pluća iz 14-nedelja starih heterozigotnih Rosa26-ciljnih pacova pokazalo je ekspresiju lacZ (slika 13B, D i F, respektivno), dok su kontrole divljeg tipa poklapajuće starosti pokazale nizak nivo pozadinskog X-gal bojenja (slika 13A, C i E, resprektivno). X-gal bojenje u E12.5 i E 14.5 heterozigotnim Rosa26-ciljnim embrionima pacova pokazalo je sveprisutnu ekspresiju lacZ (slika 13G i I, respektivno), dok su kontrolni embrioni pacova pokazali niske nivoe X-gal bojenja pozadine (slika 13H i J, respektivno).
3.2.(a)(i): Ciljno delovanje na lokus apolipoproteina E pacova (ApoE).
[0469] Na lokus apolipoproteina E pacova (ApoE) je ciljno delovano da bi se prekinula ApoE funkcija. Ciljno delovanje na ApoE lokus je izvedeno upotrebom ciljnog vektora koji sadrži lacZ-hUb-neo kasetu flankiranu sa 5’ i 3’ homologim granama homologim sa ApoE lokusom. Slika 20 prikazuje genetički modifikovani ApoE lokus pacova koji je prekinut sa 1.8 kb delecijom i insercijom lacZ-hUb-neo kasete, koji dalje obuhvata auto-deletirajuću Cre kasetu koja sadrži Crei gen vođen promotorom protamina. Uslovi elektroporacije su kao što sledi: 6 ug DNK; 2.05 x 10<6>ćelija; 400V; 200 uF: 342 V, 593 usec; ploča na 15 cm 2x gustine neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi.
[0470] Efikasnost ciljnog delovanja na ApoE lokusu je određena i prikazana u Tabeli 19. Linearizovani vektor je elektroporisan u DA.2B ESCs pacova poreklom od DA soja, i transficirane kolonije su kultivisane upotrebom standardnih tehnika. Pojedinačne kolonije su sakupljene i ispitane upotrebom analize gubitka alela (LOA).
[0471] Izvedena je proizvodnja himere i prenos klicine linije upotrebom ApoE-ciljnih ESC klonova pacova. ApoE-ciljni ESC klonovi pacova su mikroinjektirani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u pseudo-trudne SD recipijentne ženke, upotrebom standardnih tehnika. Himere su identifikovane preko boje omotača; muške F0 himere su ukrštene sa SD ženkama. Postignut je prenos klicine linije. F1 mladunci su genotipizirani za prisustvo ciljnog ApoE alela (Tabela 20).
Tabela 20 Rezultati mikroinjekcije
[0472] Ekspresija LacZ vođena preko endogenog ApoE promotora je potvrđena pomoću X-gal bojenja kod 12-nedelja-starih ApoE /- ženki pacova u mozgu, krvnim sudovima i jetri (slike 43-45, respektivno). Slike 43-45 prikazuju obrazac ekspresije za lacZ koje ogledaju obrazac ekspresije endogenog ApoE. Kontrole divljeg tipa poklapajuće starosti pokazale su nizak nivo X-gal bojenja pozadine.
[0473] Dalje su ispitivani fenotipovi ApoE-deletiranih pacova. Longitudinalne hemijske studije seruma izvedene suza merenje nivoa holesterola, LDL, HDL i triglicerida u intervalima od tri nedelje. Slika 46A-D prikazuje nivoe holesterola, LDL, HDLi triglicerida u serumu kod homozigotnih ciljnih, heterozigotnih ciljnih i pacova divljeg tipa na 6 nedelja, 9 nedelja, 12 nedelja i 15 nedelja starosti. Uzimanje krvi iz oka je urađeno na kohorti sa poklopljenom starošću koja se sastoji od 2 dilja tipa, 7 heterozigotna i 8 homozigotnih pacova. Između mužjaka i ženki nisu zabeležene značajne razlike. Homozigotni ApoE-deletirani pacovi su pokazali povišene nivoe holesterola i LDL i snižene nivoe HDL. Za razliku od ApoE-/- miševa, nije zabeleženo značajno povećanje u trigliceridima kod ApoE-deletiranih pacova.
[0474] Dodatna fenotipska analiza koja je izvedena obuhvata histološki/ex vivo imadžing za formiranje plaka na aortnom luku, in vivo imadžing za formiranje plaka na aortnom luku i transkripcione promene (Whole Transcriptome Shotgun Sequencing (RNA-Seq)) za endotel aortinog luka. Vreme ovih analiza zavisi od vremena formiranja plake. Plakovi su detektabilni kod ApoE -/- miševa na 24 nedelje.
[0475] Dodatni podaci o ciljnom delovanju za ApoE takođe su dati u Tabeli 22.
3.2.(a)(ii). Ciljno delovanje na ApoE kod pacova sa ciljnim vektorom
[0476] Slika 20 daje šematski prikaz ApoE lokusa pacova i ciljni plazmid. Gornji šematski prikaz sa slike 20 prikazuje genomsku strukturu ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim granama (5 kb i 5.4 kb, respektivno; tamno siva polja). Egzon 1 od ApoE je nekodirajući i prikazan je kao prazno polje najbliže 5’ homologoj grani. 3 introna ApoE su označena kao linije i egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao tačkasta siva polja. Egzon 4 sadrži kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao štp su prikazane pomoću tačkastih sivih i praznih polja.
[0477] donji šematski prikaz na slici 20 je ciljni vektor. 5’ i 3’ homologe grane (5 kb i 5.4 kb respektivno) su označene pomoću tamno sivih polja. Ciljni vektor sadrži reporter gen (lacZ) i auto-deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice). Auto-deletirajuća kaseta sadrži Crei gen operativno vezan za mišji Prm1 promotor i selekcionu kasetu koja sadrži gen za rezistenciju na neomicin operativno vezan za humani ubikvitin promotor.
[0478] Crei gen sadrži dva egzona koja kodiraju Cre rekombinazu, koji su odvojeni intronom (Crei) za prevenciju njene ekspresije u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, SAD patent 8,697,851 i SAD objavu prijave 2013-0312129, koji detaljno opisuju auto-deletirajuću kasetu. Upotrebom Prm1 promotora, auto-deletirajuća kaseta može biti deletirana specifično u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova. Ciljni vektor je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane na 15 cm 2x guste neomicin-rezistentne MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0479] Kao što je prikazano u Tabeli 44, 384 kolonija je ispitano i dobijena su 23 ciljna klona. Ciljna efikasnost je bila 5.99%. 3 klona su injektirana u blastociste kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijena su 3 klona koji proizvode himere i 1 od klonova je preneo ciljnu modifikaciju preko klicine linije.
3.2.(a)(iii). Ciljni ApoE kod pacova sa ciljnim vektorom u kombinaciji sa cink-prst nukleazama
[0480] Cikljni vektor korišćen u Primeru 3.2(a)(ii) je korišćen u kombinaciji sa cink-prst nukleazama za ciljno delovanje na ApoE lokus pacova. Tabela 21 daje rezime genomske organizacije ApoE lokusa pacova. Položaji prikazani u Tabeli 21 su uzeti od build 5.0 referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). ApoE je na hromozomu 1 na (-) lancu.
Tabela 21. Rezime ApoE lokusa pacova i položaji vezivanja i mesta isecanja cink-prsten nukleaze.
[0481] Slika 11 daje šematski prikaz ApoE lokusa pacova i označava sa sivim trakama mersto isecanja za ZFN1 i ZFN2. Mesto isecanja za ZFN1 je u egzonu 3 i mesto isecanja za ZNF2 je u intronu 3. Tačan položaj oba ZFN mesta je naveden u Tabeli 21. Genomski regioni koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim granama (5 kb i 5.4 kb, respektivno) su označeni tamno sivim poljima. Egzon 1 ApoE je nekodirajući i prikazan je kao prazno polje najbliže 5’ homologoj grani. Tri introna ApoE gena su označeni kao linije i egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao tačkasta siva polja. Egzon 4 sadrži kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što su označene sa tačkasto sivim senčenjem i praznim poljem.
[0482] Korišćeni ciljni vektor je bio isti kao onaj u Primeru 3.2(a)(ii) i prikazan je na slici 20, i slika 21A daje šematski prikaz za ciljno delovanje na ApoE lokus u ES ćelijama pacova upotrebom cink-prsten nukleaza i ciljni vektor prikazan na slici 20. ZFNs su uvedene kao dva ekspresiona plazmida, po jedan za svaku polovinu ZFN para. Korišćeno je 20 ug plazmida za ZFN1 i 20 ug plazmida za ZFN2. ZFNs su kupljeni iz Sigma. Ekspresija svakog ZFN je vođena pomoću CMV promotora.
[0483] Ciljni vektor je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane na 15 cm 2x gustini neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je prikazano u Primeru 1.
[0484] Kao što je prikazano u Tabeli 22 i Tabeli 44, 384 kolonija je ispitano i dobijeno 290 ciljnih klonova. Ciljna efikasnost je bila 75.52%. 2 klona su injektirana u blastociste kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijena su dva klona koji proizvode himere i jedan od klonova je preneo ciljnu modifikaciju preko klicine linije.
[0485] Pored toga, upotreba ZFN1 i ZFN2 proizvela je 8 bialelskih ciljnih klonova sa efiasnošću od 2.08%.
Tabela 22. Ciljno delovanje na ApoE lokus.
3.2.(b)(i): Ciljna modifikacija lokusa apolipoproteina E pacova (ApoE) upotrebom velikog ciljnog vektora (LTC).
[0486] Ciljno delovanje na ApoE lokus je izvedeno upotrebom velikog ciljnog vektora (LTVEC) koji sadrži lacZ-mišju Prm1-Crei kasetu flankiranu sa 5’ homologom granom za ApoE lokus od oko 45 kb i 3’ homologom granom za ApoE lokus od oko 23 Kb. Slika 22 prikazuje ApoE lokus pacova u kojoj je ApoE lokus prekinut sa 1.83 kb delecijom i insercijom lacZ gena i autodeletirajućom kasetom koja sadrži mPrm1-Crei kasetu i hUb-neo selekcionu kaseru. Postupci korišćeni u primeru 3.2(a)(i) mogu biti korišćeni za uvođenje ovog vektora u ES ćelije pacova.
Primer 3.2.(b)(ii). Ciljno delovanje na lokus ApoE pacova sa velikim ciljnim vektorom (LTVEC)
[0487] Slika 22 daje šematski prikaz ApoE lokusa pacova i veliki ciljni vektor (LTVEC). Gornji šematski prikaz sa slike 22 prikazuje genomsku organizaciju ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim granama (45 kb i 23 kb, respektivno; tamno siva polja). Egzon 1 od ApoE je nekodirajući i prikazan je kao prazno polje najbliže 5’ homologoj grani. 3 introna od ApoE su označena kao linije i egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao tačkasta siva polja. Egzon 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što su označene tačkasto sivim senčenjem i praznim polje.
[0488] Donji šematski prikaz na Slici 22 je LTVEC. 5’ i 3’ homologe grane (45 kb i 23 kb, respektivno) su označene tamno sivim poljima. Ciljni vektor sadrži reporter gen (lacZ) i autodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice), koji sadrži Crei gen operativno vezan za mišji Prm1 promotor i kasetu za selekciju leka koja sadrži gen za rezistenciju na neomicin operativno vezan za humani ubikvitin promotor. Crei sadrži dva egzona koja kodiraju Cre rekombinazu koji su odvojeni intronom (Crei) da bi se sprečila njena ekspresija u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, SAD patent 8,697,851 i SAD objavu prijave 2013-0312129, koja detaljno opisuje auto-deletirajuću sekvencu. Upotrebom mišjeg Prm1 promotora, auto-deletirajuća kaseta može biti deletirana specifično u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova.
[0489] LTVEC je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane na 15 cm 2x gustini neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0490] Kao što je prikazano u Tabeli 44, 288 kolonija je ispitano i dobijeno je 8 ciljnih klonova. Efikasnost ciljnog delovanja je bila 2.78%. 3 klona su injektirana u embrion domaćin na stadijumu blastocista kao što je ovde opisano u Primeru 2 da bi se proizveli himerni pacovi (F0). Pored toga, jedan bialski ciljni klon je proizveden obezbeđivanjem bialelske efikasnosti od 0.35%.
3.2.(b)(iii). Ciljno delovanje na ApoE kod pacova sa velikim ciljnim vektorom (LTVEC) u kombinaciji sa cink-prst nukleazama
[0491] LTVEC korišćen u Primeru 3.2.(b)(ii) je korišćen u kombinaciji sa cink-prst nukleazama za ciljno delovanje na ApoE lokus pacova. Tabela 21 daje rezime genomske organizacije ApoE lokusa pacova i prikazani položaji su uzeti od build 5.0 referentne sekvence genoma pacopva (ENSMBL).
[0492] Slika 23 daje šematski prikaz ApoE lokusa pacova i označava sa sivim trakama mesto isecanja za ZFN1 i ZFN2. Mesto isecanja za ZFN1 je u egzonu 3 i mesto isecanja za ZNF2 je u intronu 3. Tačan položaj oba ZFN mesta je naveden u Tabeli 21. 5’ i 3’ homologe grane (45 kb i 23 kb, respektivno) su označene tamno sivim poljima. Egzon 1 ApoE gena ne nekodirajući i prikazan je kao prazno polje najbliže 5’ homologoj grani. Tri introna ApoE gena su označena kao linije. Egzoni 2 i 3 sadrže kodirajuće regione i prikazani su kao tačkasta siva polja. Egzon 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence kao što je naznačeno pomoću tačkasto sivim senčenjem i praznim poljem.
[0493] Korišćeni LTVEC je bio isti kao onaj u Primeru 3.2(b)(ii) i prikazan na Slici 22. ZFNs su uvedeni kao dva ekspresiona plazmida, po jedan za svaku polovinu ZFN para. Korišćeno je 20 ug plazmida za ZFN 1 i 20 ug plazmida za ZFN2. ZFNs su kupljene iz Sigma. Ekspresija svakog ZFN je vođena pomoću CMV promotora.
[0494] Ciljni vektor je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane na 15 cm 2x gustini neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0495] Kao što je prikazano u Tabeli 44, 288 kolonija je ispitano i dobijeno je 16 ciljnih klonova. Ciljna efikasnost je bila 5.56%. Jedan klon je injektiran u blastociste kao što su opisani ovde u Primeru 2.
[0496] Pored toga, upotreba ZFN1 i ZFN2 proizvela je jedan bialelski ciljni klon, sa efikasnošću od 0.35%.
3.2.(b)(iv). Ciljno delovanje na ApoE kod pacova sa velikim ciljnim vektorom (LTVEC) u kombinaciji sa CRISPR/Cas9
[0497] LTVEC korišćen u Primeru 3.2.(b)(ii) je korišćen u kombinaciji sa CRISPR/Cas9 za ciljno delovanje na ApoE lokus pacova. Tabela 23 prikazuje poređenje rezultata eksperimenata u kojima je ApoE LTVEC korišćen pojedinačno za ciljno delovanje na ApoE lokus pacova ili je korišćen ukombinaciji sa CRISPR/Cas9 nukleazom za ciljno delovanje na ApoE lokus pacova. U svakom eksperimentu, elektroporisane ćelije su zasejane u visokoj gustini i podvrgnute selekciji prema leku da bi se našle kolonije koje su rezistentne na lek. Kolonije rezistentne na lek su sakupljene i ispitane za ciljnu modifikaciju upotrebom modifikacije analize alela (MOA) kao što je ovde opisana. Specifično, 4 x 10<6>ćelija je elektroporisano sa 2 ug ApoE LTVEC na voltaži od 400V, kapacitetu od 100 uF i otporu od 0. U poslednje navedenom eksperimentu, 6 ug Cas9 ekspresionog plazmida i 3 ug ApoE gRNK2 ili 3 ug ApoE gRNK3 su takođe elektroporisani. Selekcija je izvedena upotrebom 75 ug/mL G418. ApoE gRNK2 ima sekvencu od GCAGGCCCTGAACCGCTTCTTGG (SEQ ID NO: 87) i ciljno deluje na region 67 bp 3’ početka ApoE egzona 3 pacova. ApoE gRNK3 ima sekvencu od CCTGCGCTGGGTGCAGACGCTTT (SEQ ID NO: 88) i ciljno deluje na region 97 bp 3’ početka ApoE egzona 3 pacova (videti sliku 47). Kao što je prikazano u Tabeli 23, kada su Cas9 i bilo koja od gRNK uvedeni u ćelije zajedno sa ApoE LTVEC, efikasnost ciljnog delovanja je povećana (od 43% do 53% ili 47%). Bialelsko ciljno delovanje je zabeleženo u pet kolonija na kojke je ciljno delovano sa ApoE LTVEC u kombinaciji sa ApoE gRNK2 ili 3, ali bialelsko ciljno delovanje je zabeleženo samo sa ApoE LTVEC.
Tabela 23. Poređenje Rag2 LTVEC targetinga sa i bez CRISPR/Cas9
3.3(a): Ciljno delovanje na lokus receptora gama interleukina-2 pacova (IL2r-γ)
[0498] Na lokus receptora gama interleukina-2 pacova (IL2r-γ ili Il2rg) ciljno je delovano da bi se prekinula IL2r-γ funkcija. IL2r-γ ima važnu ulogu za prenos signala pomoću IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 i mutacije u IL2r-γ su povezane sa teškim deficitima u razvoju T, B i NK ćelija.
[0499] Ciljno delovanje na IL2r-γ lokus je izvedeno upotrebom ciljnog vektora koji sadrži eGFP-hUb-neo kasetu flankiranu sa 5’ i 3’ homologim granama homogim sa IL2r-γ lokusom, kao što je prikazano na slici 24. Slika 25 prikazuje genomsku strukturu IL2r-γ lokusa pacova u kome je IL2r-γ lokus prekinut delecijom od 3.2 kb. Ciljni IL2r-γ lokus je takođe sadržao eGFP gen i autodeletirajuću kasetu koja sadrži Crei operativno vezan za mišji Protamine1 promotor i kasetu za selekciju leka koja sadrži hUb promotor operativno vezan za gen za rezistenciju na neomicin.
[0500] Efikasnost ciljnog delovanja na IL2r-γ lokusu je određena i prikazana u Tabeli 24. Linearizovani vektor je elektroporisan u DA.2B ESCs pacova, i transficirane kolonije su kultivisane upotrebom standardnih tehnika. Pojedinačne kolonije su sakupljene i ispitane upotrebom analize gubitka alela (LOA).
[0501] Izvedena je proizvodnja himere i prenos klicine linije upotrebom IL2r-γ-ciljnih ESC klonova pacova. IL2r-γ-ciljni ESC klonovi pacova su mikroinjektirani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u pseudo-trudne SD recipijentne ženke, upotrebom standardnih tehnologija. Himere su identifikovane preko boje omotača; muške F0 himere su su ukrštene sa SD ženkama. Mladunci F1 klicine linije su genotipizirani za prisustvo ciljnog IL2r-γ alela (Tabela 25). U sledećem mikroinjekcionom eksprimentu sa klonom Il2rg-CG12, prenos klicine linije je takođe potvrđen preko boja omotača i genotipizacije.
Tabela 25. Rezultati mikroinjekcije
[0502] Fenotip Il2rg-/Y himere #3 je dalje ispitivan. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) su obojene antitelima koja prepoznaju antigene u nekoliko limfoidnih linija. GFP-pozitivne PBMCs su detektovane iz 2 od himera, kao što je prikazano na slici 30. Pored toga, GFP+ ćelije su bile negativne za T-ćelijski marker CD3 (slika 29A), i većinom su bile negativne za B-ćelijski marker B220 i NK ćelijski marker CD161a (slika 29B i C, respektivno). PBMCs iz pacova divljeg tipa su korišćene kao negativne kontrole za ekspresiju GFP. Videti sliku 29D-F. mužjak dvostruko-pozitivne populacije su u skladu sa objavljenim Il2rg nokaut fenotipom kod miševa. Ovi podaci su dobijeni iz himernog pacova, koji sadrži IL2 receptor gama-pozitivne ćelije, i ovo može da komplikuje analizu fenotipa. Analiza protočne citometrije takođe se može izvesti na ćelijskim populacijama iz koštane srži i slezine da bi se otkrila odgovarajuća smanjenja u broju limfocita. Videti Mashimo et al. (2010) PLoS One 5(1):e8870.
3.3(b): Ciljna modifikacija lokusa receptora gama interleukin-2 pacova (IL2r-�)
[0503] Na lokus receptora gama interleukina-2 pacova (IL2r-y) je ciljno delovano tako da se prekine IL2r-γ funkcija kod pacova. Slika 25 prikazuje genomsku strukturu Il2rg lokusa pacova (gornji panel slike 25) i ciljni vektor uveden u lokus (donji panel slike 25). eGFP je izabran kao reporter tako da bi imunofenotip genetički modifikovanih pacova mogao biti ispitan upotrebom FACS. Auto-deletirajuća kaseta (hUb-Neo; Prm1-Cre) je korišćena za deleciju kasete za selekciju leka i Cre gena specifično kod muških germinativnih ćelija F0 pacova. Dodatno, ciljni vektor je dizajniran tako da se deletirao ceo kodirajući region (oko 3.2 kb) Il2rg gena pacova.
[0504] Veličina delecije u ESCs pacova je potvrđena pomoću PCR-a upotrebom prajmera specifičnih za Il2rg lokus pacova. Posle mikroinjekcije ciljnih klonova u embrione domaćine na stadijumu blastocista, dobijeni su visoki procenti himera. Te himere su podešene za ukrštanje. Da bi se utvrdilo da li ciljno delovanje funkcioniše kao što je očekivano, periferna krv iz himera je sakupljena pre ukrštanja, i fenotip imunih ćelija u perifernoj krvi je analiziran preko FACS. Kao što je prikazano na slici 30, GFP-pozitivne ćelije su detektovane u perifernoj krvi u 2 od 3 ispitane himere 3, i himerni pacovi su sadržali manje od 1% T ćelija, manje od 1% od B ćelija i manje od 1% od NK ćelija, koje su pozitivne za GFP (tj., Il2rg KO ćelije) (slika 29A-C).
3.4(a)(i). Ciljno delovanje na Rag2 lokus kod pacova sa velikim ciljnim vektorom (LTVEC)
[0505] Tabela 26 daje rezime genomske organizacije Rag2 lokusa pacova i prikazani položaji su uzeti od build 5.0 referenetne sekvence genoma pacova (ENSMBL). Rag2 je na hromozomu 3 na (+) lancu.
Tabela 26. Rezime genomske organizacije lokusa Rag2 pacova.
[0506] Slika 26 daje šematski prikaz Rag2 lokusa pacova i veliki ciljni vektor (LTVEC). LTVEC je 140 kb i ciljno deluje na približno 5.7 kb deo Rag2 lokusa pacova za deleciju. Gornji šematski prikaz sa slike 26 prikazuje genomsku organizaciju ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim granama (48 kb i 84 kb, respektivno; tamno siva polja). Rag2 sadrži jedan egzon označen tačkasto sivim senčenjem.
[0507] Donji šematski prikaz sa slike 26 je LTVEC. 5’ i 3’ homologe grane (48 kb i 84 kb, respektivno) su označene tamno sivim poljima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i autodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice). Auto-deletirajuća kaseta sadrži mišji Prm1 promotor operativno vezan za Crei gen i kasetu za selekciju leka koja sadrži humani ubikvitin protor operativno vezan za gen za rezistenciju na neomicin. Generisana je sledeća verzija LTVEC u kojoj je gen za rezistenciju na neomicin zamenjen genom za rezistenciju na higromicin da bi se omogućilo ciljno delovanje na Il2rg-ciljne ES ćelije pacova. Crei sadrži dva egzona koja kodiraju Cre rekombinazu koji su odvojeni intronom (Crei) da bi se sprečila njena ekspresija u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, SAD patent 8,697,851 i SAD objavu prijave 2013-0312129, koji opisuju auto-deletirajuću kasetu. Upotrebom mišjeg Prm1 promotora, autodeletirajuća kaseta može biti deletirana specifično u ćelijama klicine linije mužjaka F0 pacova.
[0508] LTVEC je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane na 15 cm 2x gustim neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0509] Kolonije su ispitivane kao što je opisano ovde na drugom mestu i dobijeni su ciljni klonovi. Ciljni klonovi su zatim injektirani u embrion domaćin kao što je opisano ovde na drugom mestu da bi se proizveo F0 pacov.
3.4(a)(ii). Ciljno delovanje na Rag2 lokus kod pacova sa velikim ciljnim vektorom (LTVEC) i CRISPR/Cas9
[0510] Tabela 27 prikazuje poređenje rezultata eksperimenata u kojima je verzija Rag2 LTVEC koji ima gen za rezistenciju na higromicin (videti sliku 48) korišćena pojedinačno za ciljno delovanje na Rag2 lokus pacova ili je korišćena u kombinaciji sa CRISPR/Cas9 nukleazom za ciljno delovanje na Rag2 lokus pacova. U svakom eksperimentu, elektroporisane ćelije su zasejane u visokoj gustini i podvrgnute selekciji leka da bi se našle kolonije koje su bile rezistentne na lek. Kolonije rezistentne na lek su sakupljene i ispitivane za ciljnu modifikaciju upotrebom modifikacije analize alela (MOA) kao što je ovde opisana. Specifično, 4 x 10<6>ćelija je elektrporisano sa 2 ug Rag2 LTVEC na voltaži od 400V, kapacitetu od 100 uF i otporu od 0. U kasnijem eksperimentu, 6 ug Cas9 ekspresionog plazmida i 3 ug Rag2 gRNK1 ili 3 ug Rag2 gRNK4 su takođe elektroporisani. Selekcija je izvedena upotrebom 75 ug/mL G418. Rag2 gRNK1 ima sekvencu CCAGCTACTTGCTCGTACAA (SEQ ID NO: 89) i ciljno deluje na region 219 bp 3’ od Rag2 start kodona pacova (ATG). Rag2 gRNK4 ima sekvencu od CCCCTCAGATTCACGTGCGT (SEQ ID NO: 90) i ciljno deluje na region 12 bp 3’ od Rag2 stop kodona pacova (TAG) (videti sliku 48). Kao što je prikazano u tabeli 27, kada su Cas9 i bilo koja od gRNK uvedeni u ćelije zajedno sa Rag2 LTVEC, povećana je efikasnost ciljnog delovanja (od 0 do 10% ili 38%). Bialelsko ciljno delovanje je zabeleženo u jednoj koloniji.
Tabela 27. Poređenje ciljnog delovanja na Rag2 LTVEC sa i bez CRISPR/Cas9
3.4.(b)(i): Ciljno delovanje na Rag1 i Rag 2 lokusa pacova
[0511] Slika 27 obezbeđuje genomsku strukturu Rag1/Rag2 lokusa pacova. CDS označava kodirajuću sekvencu i siva polja predtavljaju egzone. Rag2 je na "plus" lancu sa transkripcijom na desno. Rag1 je na "minus" lancu sa transkripcijom na levo. Mbp = milion baznih parova.
[0512] Tabela 28 daje rezime genomske organizacije Rag2 i Rag1 lokusa pacova i prikazani položaji su uzeti od build 5.0 referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). Rag1 je na hromozomu 3 na (-) lancu.
Tabela 28. Rezime genomske organizacije Rag1 lokusa pacova.
[0513] Slika 28 daje šemu Rag2 i Rag1 lokusa pacova i veliki ciljni vektor (LTVEC). LTVEC je oko 70 kb i ciljno deluje na približno 16.6 kb genomski lokus pacova koji sadrži Rag1 i Rag2 lokuse za deleciju. Gornji šematski prikaz Slike 28 prikazuje genomsku organizaciju Rag1 i Rag2 lokusa i genomske regione koji odgovaraju 5’ i 3’ homologim granama (48 kb i 15 kb, respektivno; tamno siva polja). Rag2 i Rag1 svaki sadrži jedan egzon označen tačkasto sivim senčenjem. Donji šematski prikaz na slici 28 je LTVEC. 5’ i 3’ homologe grane (48 kb i 15 kb, respektivno) su označene tamno sivim poljima. LTVEC sadrži reporter gen (lacZ) i autodeletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice). Auto-deletirajuća sekvenca sadrži Prm1 promotor pacova operativno vezan za Crei gen i kasetu za selekciju leka koja sadrži humani ubikvitin promotor operativni vezan za gen za rezistenciju na neomicin. Generisana je druga verzija LTVEC u kojoj je gen za rezistencijom na neomicin zamenjen genom za rezistenciju na higromicin da bi se omogućilo ciljno delovanje na Il2rg-ciljne ES ćelije pacova. Crei sadrži dva egzona koji kodiraju Cre rekombinazu su odvojeni intronom (Crei) da bi se sprečila njena ekspresija u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, SAD patent 8,697,851 i SAD objavu prijave 2013-0312129, koji detaljno opisuju auto-deletirajuću kasetu. Upotrebom Prm1 promotora pacova koji vodi ekspresiju Crei specifično u klicinim ćelijama mužjaka, autodeletirajuća kaseta može biti deletirana iz jklicinih ćelija mužjaka F0 pacova.
[0514] LTVEC je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane u gustini 15 cm 2x u neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0515] Kolonije su ispitivane kao što je opisano ovde na drugom mestu i dobijene su ciljane kolonije. Ciljane kolonije su zatim injektirane u embrion domaćin kao što je opisano ovde na drugom mestu da bi se proizveo F0 pacov.
3.4.(b)(ii): Ponovno ciljno delovanje na Rag1 i Rag2 lokus u ES ćelijama pacova u kojima je već ciljno delovano na Il2rg lokus
[0516] LTVEC kao na slici 50 je pripremljen za ciljno delovanje na Rag1 i Rag2 lokuse za deleciju. Ukupna dužina LTVEC bila je 72 kb. LTVEC je elektroporisan u ES ćelije pacova na koje je već ciljno delovano za deleciju Il2rg lokusa kao u Primeru 3.3. Specifično, ES ćelije pacova su bile iz klona Il2rg-CG12, za koji je potvrđen prenos klicine linije u Primeru 3.3(a). Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1. Klonovi na koje je dvostruko ciljno delovano su ispitivani kao što je opisano ovde na drugom mestu, i dobijeni su ciljni klonovi. Na Il2rg-CG12 ćelije je ponovo ciljno delovano na efikasnosti od 85%, i Il2rg mutacije su bile još uvek prisutne u ciljnim klonovima. Elektrporacija je izvedena kao što je opisano ovde na drugom mestu, i selekcija za rezistenciju na antibiotik je izvedena upotrebom 1.5 ug/ml puromicina. Ciljni klonovi će tada biti injektirani u embrion domaćin kao što je opisano ovde na drugom mestu da bi se proizveo F0 pacov. Ponovno ciljno delovanje je korisno zbog toga što brže od međusobnog ukrštanja Rag1/Rag2-targetiranih pacova sa Il2rg-targetiranim pacovima.
Primer 4. Humanizacija
4.1. Humanizacija genomskih lokusa pacova
[0517] Humanizacija genomskih lokusa pacova izvedena je upotrebom ES ćelija pacova koje su ovde opisane, koje su sposobne da održavaju njihovu pluripotenciju posle jedne ili više elektroporacija in vitro, i sposobne su za prenos ciljnih genetičkih modifikacija na naredne generacije. Pored toga, u cilju zaobilaženja ograničenja plazmida u akomodaciji velikog geomskog DNK fragmenta, i da bi se prevazišla niska efikasnost uvođenja ciljne genetičke modifikacije u endogeni lokus u ES ćelije pacova, jedna ili više ciljnih genetičkih modifikacija su izvedene u bakterijama, npr., E. coli, upotrebom bakterijske homologe rekombinacije (BHR) i upotrebom velikog ciljnog vektora (LTVEC). LTVEC koji je ovde opisan, na primer, obuhvata veliki fragment endogene genomske sekvence pacova sa jednom ili više modifikacija ili sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu (npr., homologu ili ortolognu humanu nukleinsku kiselinu) flankiranu sa homologim granama pacova komplementarnim sa specifičnim genomskim regionima.
4.2. Humanizacija lokusa imunoglobulina pacova
[0518] Humanizacija endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina pacova je izvedena uklanjanjem jedne ili više endogenih sekvenci nukleinskih kiselina teškog lanca imunoglobulina pacova (npr., jednog ili više endogenih VHgenskih segmenata, jednog ili više humanih D genskih segmenata i jednog ili više humanih JH genskih segmenata); i uvođenjem u modifikovani imunoglobulinski lokus ciljnog vektora, npr., velikog ciljnog vektora (LTVEC) koji sadrži: (i) jednu ili više nerearanžiranih sekvenci nukleinskih kiselina humango varijabilnog regiona (npr., jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih D genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata), ili jednu ili više rearanžiranih sekvenci nukleinskih kiselina humanog varijabilnog regiona (npr., jednog ili više humanih rearanžiranih V-D-J genskih segmenata); (ii) selekcionu kasetu (npr., gen za rezistenciju na neomicin flankiran sa loxP mestima); i (iii) 5’ i 3’ homologe grane pacova.
[0519] Ukratko, jedan ili v iše endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova (tj., jedan ili više VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih D genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata) u BAC klonu pacova su uklonjeni ili inaktivirani ciljnim delovanjem na endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina pacova sa elekcionom kasetom flankiranom homologim granama pacova. Specifičnije, ciljni vektor je konstruisan tako da sadrži selekcionu kasetu (npr., gen za rezistenciju na neomicin flankiran sa loxP mestima) flankiran sa 5’ i 3’ homologim granama pacova koje su komplementarne sa ciljnim genomskim sekvencama pacova (npr., ushodne i nishodne genomske DNK sekvence pacova koje obuhvataju jedan ili više VHgenskih segmenata pacova, jedan ili više humanih D genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata).
[0520] Sledeće, bakterijske ćelije koje sadrže veliki pacovski genomski DNK fragment koji obuhvata lokus teškog lanca imunoglobulina pacova su selekcionisane i uvedene sa plazmidom (npr., pABG) koji kodira rekombinazu operativno vezanu za prolazno inducibilni promotor. Ciljni vektor konstruisan u prethodnom tekstu je zatim uveden u rekombinaciono-kompetentne bakterijske ćelije. Posle elektroporacije, bakterijske ćelije tretirane sa induktorom (npr., arabinozidom) da bi se započela homologa rekombinacija između ciljnog vektora i ciljne genomske sekvence pacova u BAC klonu. Transformisane ćelije su zasejane u visokoj gustini i podvrgnute selekciji leka da bi se našle kolonije koje su rezistentne na lek. Kolonije rezistentne na lek su sakupljene i ispitane za ciljanu modifikaciju.
[0521] U cilju olakšanja identifikacije ciljne genetičke modifikacije, korišćena je kvantitativna analiza visoke propustljivosti, naime, analiza modifikacije alela (MOA), koja omogućava ispitivanje u velikim razmerama modifikovanog alela (ili više alela) u roditeljskomm hromozomu posle genetičke modifikacije. MOA analiza se može izvesti preko različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na, kvantitativni PCR, npr., PCR u realnom vremenu (qPCR). Na primer, PCR u realnom vremenu sadrži prvi set prajmera koji prepoznaje ciljni lokus i drugi set prajmera koji prepoznaje neciljni referentni lokus. Pored toga, set prajmera može da sadrži fluorescentna proba koja prepoznaje amplifikovanu sekvencu. Alternativno, kvantitativna analiza može biti izvedena preko različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na, fluorescencijom-posredovanu in situ hibridizaciju (FISH), komparativnu genomsku hibridizaciju, izotermnu DNK amplifikaciju, kvantitativnu hibridizaciju za imobilizovanu probu (probe), Invader Probes®, MMP assays®, TaqMan® Molecular Beacon i Eclipse™ tehnologiju probe. (Videti, na primer, US2005/0144655.
[0522] Bakterijske ćelije koje sadrže modifikovani BAC klon pacova, tj., BAC klon koji sadrži genomsku DNK sekvencu pacova u kojoj su jedan ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca (VH, D i/ili JH genski segmenti) deletirani ili inaktivirani, zatim su elektroporisane sa velikim ciljnim vektorom (LTVEC) koji sadrži: (i) jednu ili više nerearanžiranih sekvenci nukleinskih kiselina humanog varijabilnog regiona (npr., jedan ili više nerearanžiranih humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih D genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata), ili jednu ili više rearanžiranih sekvenci nukleinskih kiselina humanog varijabilnog regiona (npr., jedan ili više rearanžiranih humanih V-D-J genskih segmenata).
[0523] Inicijacija homologe rekombinacije u bakterijskim ćelijama i selekcija pozitivnih klonova su izvedeni kao što je opisano u prethodnom tekstu. Nerearanžirane ili rearanžirane sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, kada su targetirani u endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina, postaju operativno vezane za endogenu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova. Alternativno, endogeni lokus konstantnog regiona teškog lanca pacova može biti inaktiviran, na primer, delecijom jednog ili više genskih segmenata konstantngo regiona teškog lanca pacova (CH) iz endogenog lokusa konstantngo regiona teškog lanca, i može biti zamenjen sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona humanog teškog lanca.
[0524] Slično, humanizacija endogenog lokusa κ ili λ lakog lanca imunoglobulina pacova izvedena je uklanjanjem jedne ili više endogenih sekvenci nukleinskih kiselina varijabilnog regiona κ i/ili λ lakog lanca imunoglobulina pacova (npr., jedan ili više endogenih genskih segmenata Vκ i jedan ili više ensogenih genskih segmenata Jκ pacova); i ciljnim delovanjem na modifikovani lokus lakog lanca imunoglobulina sa ciljnim vektorom, npr., veliki ciljni vektor (LTVEC), koji sadrži: (i) jednu ili više nerearanžiranih sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina (npr., jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata), ili jednu ili više rearanžiranih sekvenci nukleinskih kiselina humanog varijabilnog regiona (npr., jedan ili više humanih rearanžiranih Vκ-Jκ genskih segmenata); (ii) selekcionu kasetu (npr., gen za rezistenciju na neomicin flankiran sa loxP mestima); i (iii) 5’ i 3’ homologe grane pacova.
[0525] Nerearanžirane ili rearanžirane sekvence nukleinskih kiselina varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina, kada su targetirani u endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina, postaju operativno vezane za endogenu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina pacova.
[0526] LTVEC tako proizveden u bakterijskim ćelijama sadrži, na primer, insert nukleinske kiseline koji sadrži lokus lakog lanca ili teškog lanca humanizovanog imunoglobulina pacova u kome su jedan ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca pacova zamenjeni jednim ili više genskih segmenata varijabilnog regiona huimanog teškog ili lakog lanca; i homologe grane pacova (npr., u opsegu od 5 kb do 150 kb) komplementarne sa specifičnim genomskim ciljnim sekvencama. LTVEC koji sadrži genetičku modifikaciju opisanu u prethodnom tekstu je zatim linearizovana i elektroporisana u ES ćelije pacova. Elektroporisane ES ćelije pacova su zasejane u visokoj gustini za selekciju ES ćelija rezistentnih na lek koje sadrže ciljni vektor. Postupak selekcije leka uklanja većinu zasejanih ćelija (-99%), ostavljajući indiovidualne kolonije, od kojih je svaka klon poreklom od jedne ćelije. Od preostalih ćelija, većina ćelija (~80-100%) sadrži ciljni vektor ugrađen u slučajnu lokaciju u genom. Prema tome, kolonije su sakupljene i genotipizirane pojedinačno u cilju identifikacije ES ćelija pacova koje sadrže ciljni vektor na ispravnoj genomskoj lokaciji (npr., upotrebom modifikacije analize alela (MOA) opisane u prethodnom tekstu).
[0527] U cilju povećanja efikasnosti ciljane genetičke modifikacije, ES ćelije pacova su elektroporisane sa ekpresionim vektorima (ili iRNK) koji eksprimiraju ZFNs 1 i 2 (ili TALENs 1 i 2) zajedno sa LTVEC. Homologe grane ciljnog vektora leže izvan ZFN ciljnog mesta, prema tome, ciljni vektor nije odcepljen pomoću ZFNs. Dvolančani prekid proizveden pomoću ZFNs stimuliše homologo popravljanje (HDR), koja inače čini veoma mali procenat popravki koje se normalno javljaju u sisarskim ćelija (u poređenju sa nehomologim spajajem kraja; NHEJ).
[0528] Alternativno, ekspresioni vektori koji sadrže CRISPR-povezanu nukleazu tipa II (npr., Cas9), vodeću RNK (uključujući CRISPR-RNK (cr-RNK) i trans-aktivnu CRISPR RNK (tracrRNK)), kao što je ovde opisana, mogu biti uvedeni u bakterijske ćelije zajedno sa LTVEC da bi se povećala efikasnost homologe rekombinacije na ciljnom genomskom lokusu. Elektroporisane ćelije su zasejane u visokoj gustini i podvrgnute selekciji leka da bi se našle kolonije koje su rezistentne na lek. Kolonije rezistentne na lek su sakupljene i ispitane za ciljnu modifikaciju upotrebom modifikacije analize alela (MOA) kao što je ovde opisano. Posle ovih postupaka, može se postići poboljšanje u efikasnosti ciljnog delovanja. Na primer, količina poboljšanja može biti mala (npr., poboljšanje od 10% do 15%) ili velika (npr., poboljšanje od 10% do 80%).
[0529] ES ćelije pacova koje sadrže ciljni genetičku modifikaciju su selekcionisane i zatim uvedene u embrion domaćin pacova, na primer, embrion pacova stadijuma pre-morule ili stadijuma blastocista, i on je implantiran u matericu majke surogata da bi se generisao pacov osnivač (F0 pacov). Zatim, pacov osnivač je uzgajan do pacova divljeg tipa da bi se stvorilo F1 potomstvo heterozigotno za genetičku modifikaciju. Parenje heterozigotnog F1 pacova može da proizvede potomstvo homozigotno za genetičku modifikaciju.
4.3(a). Zamena IL2rg pacova sa humanim IL2 receptorom gama
[0530] Tabela 29 daje rezime genomske organizacije gama lokusa receptora interleukina 2 pacova i prikazani položaji su uzeti od build 5.0 referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). Il2rg je na hromozomu X na (-) lancu.
Tabela 29. Rezime genomske organizacije pacovskog Il2rg lokusa
[0531] Donja šema na slici 25 je ciljni vektor za Il2rg 3.2 kb deleciju. Ciljni vektor sadrži reporter gen (eGFP) operativno vezan za endogeni promotor i auto-deletirajuću kasetu flankiranu sa loxP mestima (prazne strelice). Auto-deletirajuća sekvenca sadrži Crei gen operativno vezan za mišji Prm1 promotor i selekcionu kasetu koja sadrži gen za rezistenciju na neomicin operativno nalno vezan za humani ubikvitin promotor.
[0532] Crei gen sadrži dva egzona koja kodiraju Cre rekombinazu, koji su odvojeni intronom (Crei) da bi se sprečila njena ekspresija u u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, SAD patent 8,697,851 i SAD objava patentne prijave 2013-0312129, koji opisuju auto-deletirajuću kasetu. Upotrebom mišjeg Prm1 promotora Cre ekspresiona kaseta i kaseta za selekciju leka može biti deletirana u klicinoj liniji mužjaka F0 pacova. Ciljni vektor je elektroporisan u ES ćelijama pacova dobijenim u Primeru 1 i ćelije su zasejane u gustini 15 cm 2x u neomicin-rezistentnim MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0533] Plazmidni ciljni vektor je konstruisan tako da zameni gama kodirajući region receptora interleukina 2 pune dužine pacova sa humanim kodirajućim regionom receptora interleukina 2 pune dužine kao što je prikazano na slici 31. Ciljni vektor je elektroporisan u ES ćelijama pacova dobijenim u Primeru 1, i ćelije su zasejane u gustini 15 cm 2x u neomicin rezistentnim MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Specifično, 4 x 10<6>ćelije su elektroporisane sa 2 ug Il2rg humanizacionog vektora pune dužine na voltaži od 400V, kapaciteta od 100 uF, i rezistencije od 0. Selekcija je izvedena upotrebom 75 ug/mL G418. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0534] Kao što je prikazano u Tabeli 44, 168 kolonija je ispitano i dobijeno je 6 ciljnih klonova. Efikasnost ciljnog delovanja bila je 3.57%. Jedan klon je injektiran u blastociste kao što je opisano u Primeru 1, i dobijen je jedan klon koji proizvodi himere.
[0535] Klonovi su injektirani u blastociste kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijeni su klonovi koji proizvode F0 himerne pacove. Blastocisti su transformisani do pseudo-trudnih ženki recipijenata upotrebom standardnih tehnika, i dobijeni su himerni F0 pacovi. Dobijeni su F0 pacovi koji prenose ciljnumodifikaciju preko klicine linije.
4.3(b)(i). Zamena IL2rg ekto-domena pacova sa humanim IL2rg ekto-domenom
[0536] Humanizacija pune dužine IL 2 receptora gama je korisna zbog toga što će pacovi koji imaju ovaj modifikovani lokus proizvoditi humani Il2rg; i ovo biomogućilo detekciju humanog Il2rg kod pacova sa antitelima specifičnim za humani Il2rg.
[0537] Ekto-humanizacija (tj., zamena pacovskog ekto-domena Il2rg sa humanim ektodomenom Il2rg) rezultovaće u Il2rg polipeptidu koji će da vezuje humane ligande za Il2rg, ali zbog toga što je citoplazmatični domen još uvek pacovski, njegov ekto-humanizovani oblik Il2rg će takođe da interaguje sa mašinerijom prenosa signala pacova. Slika 33 daje poravnanje sekvenci humanog IL-2rg proteina (SEQ ID NO: 20; NP_000197.1); pacovskog IL-2rg proteina (SEQ ID NO: 21; NP_543165.1); i himernog IL-2rg proteina (SEQ ID NO: 22) koji sadrži humani ekto-domen IL-2rg fuzionisan za ostatak pacovskog IL-2rg proteina. Spj između humanog i pacovskog IL-2rg je zabeležen vertikalnom linijom.
[0538] Tabela 30 daje rezime genomske organizacije lokusa receptora gama pacovskog interleukina 2 i prikazani položaji su uzeti od build 5.0 Referenetne sekvence pacovskog genoma (ENSMBL). Il2rg je na hromozomu X na (-) lancu. Dalje je zabeležen položaj ekto-domena Il2rg.
Tabela 30. Rezime genomske organizacije Il2rg lokusa pacova
[0539] Vektor za ciljno delovanje na plazmid je konstruisan za zamenu pacovskog ekto-domena regiona koji kodira interleukin 2 receptor gama sa humanim ekto domenom kao što je prikazano na slici 32. Ciljni vektor je elektroporisan u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su zasejane u gustini 15 cm 2x u neomicin-rezistentnim MEFs u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane pacovske ES ćelije su kultivisane, selekcionisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0540] Kao što je prikazano u Tabeli 44, 192 kolonija je ispitano i 13 ciljnih kolonija je dobijeno. Efikasnost ciljnog delovanja je bila 6.77%.
[0541] Dve kolonije su injektirane u blastociste kao što je opisano ovde u Primeru 1, i dobijene su dve kolonije koje proizvode himere. Dobijeni su klonovi koji proizvode F0 pacove. Dobijeni su F0 pacovi koji prenose ciljanu modifikaciju preko klicine linije.
4.3(b)(ii). Zamena IL2rg ekto-domena pacova sda humanim IL2rg ekto-domenom upotrebom plazmida u kombinaciji sa CRISPR/Cas9
[0542] Tabela 31 prikazuje poređenje rezultata eksperimenata u kojima je verzija vektora za humanizaciju Il2rg ekto-domena prikazana na slici 32 korišćena pojedinačno za ciljno delovanje na pacovski Il2rg lokus ili je korišćena u kombinaciji sa CRISPR/Cas9 nukleazom za ciljno delovanje na pacovski Il2rg lokus. U svakom eksperimentu, elektroporisane ćelije su zasejane u visokoj gustini i podvrgnute selekciji lekom da bi se našle kolonije koje su rezistentne na lek. Kolonije rezistentne na lek su sakupljene i ispitivane za ciljanu modifikaciju upotrebom analize modifikacije alela (MOA) kao što je ovde opisana. Specifično, 4 x 10<6>ćelija je elektroporisano sa 2 ug vektora za humanizaciju Il2rg ekto-domena na voltaži od 400V, kapacitetu od 100 uF i otporu od 0. U poslednjem eksperimentu, 6 ug Cas9 ekspresionog plazmida i 3 ug Il2rg gRNK2 ili 3 ug Il2rg gRNK4 je taklođe elektroporisano. Selekcija je izvedena upotrebom 75 ug/mL G418. Il2rg gRNK2 ima sekvencu GAAGCTCTTTCTATACAATCTGG (SEQ ID NO: 91) i ciljno deluje na region 190 bp 3’ pacovskog Il2rg egzona 1. Il2rg gRNK4 ima sekvencu CCCCCGAAAGGAGGAGCCCTAGG (SEQ ID NO: 92) i ciljno deluje na region 80 bp 5’ pacovskog Il2rg stop kodona (TGA) (videti sliku 49).
Tabela 31. Poređenje targetiranja Il2rg ekto domen humanizacionog vektora sa i bez
CRISPR/Cas9
4.4(a). Pojačano ciljno delovanje pomoću CRISPR/Cas9 endonukleaza velikih delecija nehumanog životinjskog gena sa istovrmenim zamenama humanog gena
[0543] Novo-razvijeni lekovi za humane bolesti, kao što su potpuno humana antitela, su često visoko specifični za njihova ciljna mesta u humanim ćelijama i tkivima i ne prepoznaju homologa ciljna mesta glodara. Ovaj visoki nivo selektivnosti onemogućava testiranje efikasnosti i mehanizma delovanja lekova kod glodara pre njihove prve upotrebe kod ljudi.
[0544] Veoma efikasno rešenje ovog problema je stavranje genetički modifikovanog miša ili pacova u kome humani gen koji kodira ciljno mesto leka menja glodarski homolog. Jedan način za stvaranje takvog humanizovanog alela kod glodara je prvo delecija glodarskog gena u embrionalnoj matičnoj (ES) ćeliji i zatim, u drugom događaju modifikacije gena, insercija humanog gena precizno na deletirani lokus. ES ćelije su zatim injektirane u embrion glodara i implantirane u matericu glodarske majke surogata, koja zatim rađa genetički modifikovane maldunce koji nose humanizovani alel.
[0545] Efikasniji postupak za stvaranje modifikacije humanizovanog gena je upotreba velikog ciljnog vektora (LTVEC) koji usmerava istovremenu deleciju glodarskog gena i zamenu humanim parnjakom. Upotrebom VELOCIGENE® postupaka genetičkog inženjeringa, takve humanizacije od jednog koraka mogu se postići sa relativno visokom efikasnošću kada su delecija glodarskog gena i insercija humanog gena manje od oko 20 kilobaznih parova (kb). Veće humanizacije od jednog koraka koje obuhvataju delecije i zamene veće od 100 kb su moguće sa LTVECs i postupcima genetičkog inženjeringa kao što su VELOCIGENE® postupci genetičkog inženjeringa, ali zbog smanjene efikasnosti ciljnog delovanja nekada se susreću sa veoma velikim modifikacijama, uspeh često zahteva ispitivanje stotina do hiljada kolonija ES ćelija da bi se našla ona koja nosi željenu modifikaciju gena.
[0546] Da bi se poboljšala efikasnost velikih humaniozacija razvili smo postupke koji kombinuju LTVEC targeting gena sa clustered regularly interspaced short palindromic repeat RNA-guided Cas9 endonukleazama (CRISPR/Cas9). CRISPR/Cas9 nukleaze su ribonukleoproteinski enzimi koji se sastoje od bakterijske Cas9 DNK endonukleaze vezane za CRISPR RNK koja vodi Cas9 za cepanje na specifičnoj DNK sekvenci pomoću Watson-Crick sparivanja baza između vodeće RNK i jednog lanca ciljne DNK. Zbog jednostavnosti mehanizma ciljnog delovanja, lako je dizajnirati CRISPR/Cas9 endonukleaze koje ciljno deluju na dvolančani prekid na skoro bilo kom genomskom lokusu. Dvolančani prekidi indukuju ćelijsku genomsku popravku pomoću nehomologih i spajajućih (NHEJ) puteva, koji su podložni greški i često rezultuju u delecijama ili indercijama na mestu dvolančanog prekida. Alternativan mehanizam popravke dvolančanog prekida je popravka usmerena na homologiju (HDR) u kojoj endogeni ili egzogeni deo DNK koji deli identičnost ili sličnost sekvence sa prekinutim mestom besprekorno porpavlja prekinute krajeve delovanjem ćelijske homologe rekombinacione mašinerije. HDR može da rezultuje u perfektnoj popravci koja vraća originalnu sekvencu na prekinutom mestu, ili se može koristiti za ciljno delovanje na dizajnirane modifikacije, kao što je delecija, insercija ili zamena sekvence na mestu svolančanog prekida. CRISPR/Cas9 nukleaze mogu veoma da pojačaju stopu konstruisanih HDR događaja ciljnimdelovanjem na precizna cepanja lanaca na mesta nameravanih genskih modifikacija.
[0547] Da bi se postigla precizna delecija od jednog koraka celog ili dela glodarskog gena i istovremena zamena sa celim ili delom njegovog humanog homologa, uveli smo elektroporacijom u glodarske ES ćelije tri molekula nukleinske kiseline: (1) LTVEC; (2) plazmid ili iRNK koja kodira Cas9 endonukleazu; i (3) plazmid koji kodira CRISPR jednu vodeću RNK (sgRNK) ili samu sgRNK. LTVEC je sadržao ceo ili deo humanog gena koji kodira genski proizvod (protein ili RNK) flankiran homologim granama glodarske DNK dizajnirane za ciljno delovanje na HR događaj koji deletira glodarski gen i inserira humani gen. Humanizujući LTVEC je takođe nosio kasetu za selekciju leka koja ciljno deluje na ekspresiju enzima (npr., neomicin fosfotransferaze) koji pružaju rezistenciju na antibiotski lek (na primer, G418). ES ćelije koje su preuzele LTVEC i ugradile ga u njihove genome bile su sposobne da rastu i formiraju kolonije na petri šolji u medijumu za rast koji sadrži antibiotski lek. Kako smo uveli 500 do 1,000 puta više CRISPR/Cas9-kodirajućih nukleinskih molekula od LTVEC molekula, većina kolonija rezistentnih na lek koje sadrže LTVEC takođe su sadržale, najmanje prolazno, CRISPR/Cas9 komponente. Sakupili smo kolonije rezistentne na lek i ispitali smo ih pomoću postupka gubitka alela (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with highresolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660; Frendewey, D. et al. (2010) The loss-of-alele assay for ES cell screening and mouse genotyping, Methods Enzymol. 476:295-307 za identifikaciju kolonija koje su imale humanizovani alel na koje je izvršeno ispravno ciljno delovanje.
[0548] U jednom posebnom eksperimentu LTVEC je dizajniran tako da stvori 68 kb deleciju mišjeg gena Lrp5 (protein 5 povezan sa receptorom za lipoprotein niske gustine) i istovremenu zamenu sa 91 kb fragmentom homologog humanog gena LRP5 (slika 34). LTVEC je sadržao 91-kb fragment humanog LRP5 gena flankiran homologim granama koje sadrže 7 kb i 33 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Lrp5 lokusa koji flankira 68 kb sekvencu mišjeg Lrp5 gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Lrp5 humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugim plazmidom koji kodira jedan od osam sgRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) dizajniranih za stvaranje svolančanih prekida unutar regiona mišjeg Lrp5 gena na koji se ciljno deluje za deleciju. sgRNK su dizajnirane tako da se izbegne prepoznavanje bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog LRP5 gena.
[0549] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Lrp5 gena prikazani su u Tabeli 32. Kada je LTVEC pojedinačno uveden u ES ćelije, našli smo da je 1.0% ispitivanih kolonija rezistentnih na lek nosilo mono-alelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazama vođenim pomoću sedam od osam testiranih sgRNK (sgRNK-5’A, sgRNK-5’B, sgRNK-5’B2, sgRNK-C, sgRNK-D, sgRNK-3’E2 i sgRNK-3’F; sekvence obezbeđene u Tabeli 33) proizvelo je monoalelske heterozigotne mutacije na koje je ispravno ciljno delovano na efikasnostima koje su bile u opsegu od 2.1 do 7.3%, predstavljajući 2-do 9-struko pojačanje ciljnog delovanja humanizovanog gena od jednog koraka u poređenju sa nepotpomognutim LTVEC. Za Cas9-vođeno cepanje pomoću sgRNK-5’B2, pored monoalelskog ciljnog delovanja, detektovali smo bialelsku homozigotnu humanizaciju na učestalosti od 1%. Homozigotne Lrp5 humanizovane ES ćelije mogu biti prevedene pomoću VELOCIMOUSE® postupka genetičkog inženjeringa (Poueymirou, W. T. et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25:91-99), direktno u miševe potpuno poreklom od ES ćelije spremne za fenotipske studije i studije efikasnosti leka.
Tabela 32. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju Lrp5 gena.
Tabela 33. Sekvenca vođenih delova šest sgRNK koja ciljno deluje na na mišji Lrp5 gen.
[0550] Pojačano ciljno delovanje na humanizaciju velikog Lrp5 pomoću CRISPR/Cas9 endonukleaza je izvanredno u poređenju sa ekvivalentnim eksperimentima izvedenim sa cinkprst nukleazama (ZFNs). Dobili smo četiri ZFNs dizajnirane tako da se naprave dvolančani prekidi na mestima unutar regiona mišjeg Lrp5 gena na koj se ciljno deluje radi delecije (slika 34). Jedna ZFN usmerena sekvenca blizu 5’ kraja delecije (a), jedna usmerena sekvenca u sredini delecije (b), i dve usmerene sekvence blizu 3’ kraja delecije (c, d). U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Lrp5 humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira jedan od četiri ZFNs (ad) dizajnirana za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Lrp5 gena na koje se ciljno deluje radi delecije. Utvrdili smo da su svi ZFNs bili aktivni i sposobni da indukuju NHEJ mutacije u Lrp5 genu (podaci nisu prikazani), ali u poređenju sa LTVEC, nijedan nije pojačao HDR-posredovano ciljno delovanje na gen u poređenju samo sa LTVEC.
[0551] Pojačana efikasnost ciljnog delovanja na humanizaciju velikpg Lrp5 pomoću CRISPR/Cas9 endonukleaza je takođe izuzetna u poređenju sa serijom eksperimenata ZFN-potpomognute humanizacije. U ovim eksperimentima, izvedena je serija ZFN-potpomognutih humanizacija u kojima su delecije mišjeg ciljnog gena i insercije humanog gena generalno bile rastuće veličine (Tabela 34; slika 35). Slika 35A prikazuje procenat efikasnosti ciljnog delovanj na LTVECs ciljne gene rastuće veličine za deleciju. LTVECs su korišćeni pojedinačno (sivi kvadrati) ili u kombinaciji sa ZFNs (crni kvadrati). Slika 35B prikazuje procenat efikasnosti ciljnog delovanja LTVECs sa insercijama humanog gena rastuće veličine. Ponovo, LTVECs su korišćeni pojedinačno (sivi trouglovi) ili u kombinaciji sa ZFNs (crni trouglovi). Kao što je prikazano u Tabeli 34 i na slici 35, sposobnost ZFN-posredovanog cepanja DNK da pojača efikasnost ciljnog delovanja LTVEC je nestala kada je veličina delecije mišjeg ciljnog gena bila veća od 24.7 kb i kada je veličina insercije humanog gena bila veća od 22.2 kb (Tabela 34; slika 35A). Nasuprot tome, CRISPR/Cas9 je bio sposoban da pojača efikasost ciljnog delovanja LTVEC na Lrp5 gen, koji je uključivao deleciju mišjeg gena od 68.3 kb i inserciju humanog gena od 91.0 kb (Tabela 32; slika 34). Ovo pokazuje da su CRISPR/Cas9 endonukleaze sposobne da pojačaju efikasnost ciljnog delovanja LTVEC u situacijama pri čemu ostale nukleaze (npr., cink-prst nukleaze) ne mogu.
Tabela 34. Rezime ZFN-potpomognutih humanizacija.
[0552] Slični eksperimenti su izvedeni za humanizaciju ostalih mišjih gena. U jednom eksperimentu, LTVEC je dizajniran tako da se stvori delecija od 45 kb mišjeg Trpa1 (receptor katjonskog kanala prolaznog potencijala subfamilija A član 1) gena i istovremena zamena sa 55 kb fragmentom homogog humanog TRPA1 gena (slika 36). LTVEC je sadržao 55 kb fragment humanog TRPA1 gena flankiran homologim granama koje sadrže 41 kb i 58 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Trpa1 lokusa koji flankira 45 kb sekvencu mišjeg Trpa1 gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Trpa1 humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugim plazmidom koji kodira jednu od osam sgRNK (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2 i gF) dizajniranih za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Trpa1 gena na koji se ciljno deluje radi delecije. sgRNK su dizajnirane tako da se izbegne prepoznavanje bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog TRPA1 gena.
[0553] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Trpa1 gena prikazani su u Tabeli 35. Kada je LTVEC pojedinačno uveden u ES ćelije, našli smo da je 1.0% ispitivanih kolonija rezistentnih na lek nosilo monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravnu ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođeno pomoću šest od osam testiranih sgRNK (A, A2, B, C, D i F; sekvence obezbeđene u Tabeli 43) proizvelo je i monoalelske heterozigotne mutacije ili heterozigotne ili homozigotne mutacije bialelskog jedinjenja na koje je ispravno ciljno delovano, na efikasnostima koje su bile u opsegu od 1.0 do 3.1%. Za Cas9-vođeno cepanje pomoću gRNK A i gRNK F, detektovali smo heterozigotne mutacije jedinjenja na učestalosti od 1.0%.
Tabela 35. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju Trpal gena.
[0554] U sledećem eksperimentu, LTVEC je dizajniran tako da stvori 55 kb deleciju mišjeg Folh1 gena (glutamat karboksipeptidazu 2) i istovremenu zamenu sa 61 kb fragmentom homologog humanog FOLH1 gena (slika 37). LTVEC je sadržao 61 kb fragment humanog FOLH1 gena flankiranog homologim granama koje sadrže 22 kb i 46 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Folh1 lokusa koji je flankirao 55 kb sekvencu mišjeg Folh1 gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Folh1 humanizujući LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugim plazmidom koji kodira jedan od šest sgRNK (gA, gA2, gC, gD, gE i gE2) dizajniranih za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Folh1 gena na koji je ciljno delovano radi delecije. sgRNK su dizajnirane tako da se izbegne prepoznavanje bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog FOLH1 gena.
[0555] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Folh1 gena prikazani su u Tabeli 36. Kada je LTVEC pojedinačno uveden u ES ćelije, našli smo da nijedna od 96 ispitivanih kolonija rezistentnih na lek nije nosila monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođeno pomoću tri od šest testiranih sgRNK (A, D i E2; sekvence obezbeđene u Tabeli 43) proizvelo je monoalelske heterozigotne mutacije na koje je ispravno ciljno delovano na efikasnostima koje su bile u opsegu od 1.0 do 3.1%.
Tabela 36. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju Folhl gena.
[0556] U sledećem eksperimentu, LTVEC je dizajniran za stvaranje 76 kb delecije mišjeg gena za komponentu komplementa 5 (C5 ili Hc) i istovremenu zamenu sa 97 kb fragmentom homologog humanog C5 gena (slika 38). LTVEC je sadržao 97 kb fragment humanog C5 gena flankiran homologim granama koje sadrže 34.1 kb i 31.2 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg C5 (Hc) lokusa koji flankiraju 76 kb sekvencu mišjeg C5 (Hc) gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo C5 (Hc) humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugim plazmidom koji kodira jednu od šest sgRNK (gA, gB, gC, gD, gE i gE2) dizajniranih za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg C5 (Hc) gena na koji je ciljno delovano radi delecije. sgRNK su dizajnirane za izbegavanje prepoznavanja bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog C5 gena.
[0557] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije C5 (Hc) gena su prikazani u Tabeli 37. Kada je LTVEC pojedinačno uveden u ES ćelije, našli smo da je 1.0% ispitivanih kolonija rezistentnih na lek nosilo monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođeno pomoću svih šest testiranih sgRNK (A, B, C, D, E i E2; sekvenece obezbeđene u Tabeli 43) proizvelo je monoalelske heterozigotne mutacije ili heterozigotne ili homozigotne mutacije bialelskog jedinjenja na koje je ispravno ciljno delovano na efikasnostima koje su bile u opsegu od 4.2 do 16.7%. Za Cas9-vođeno cepanje pomoću gRNK A i E, detektovali smo heterozigotne mutacije jedinjenja na učestalostima od 5.2% i 4.2%, respektivno.
Tabela 37. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju C5 (He) gena.
[0558] U sledećem eksperimentu, LTVEC je dizajniran tako da stvara 38 kb deleciju mišjeg gena Adamts5 (dezintegrin i metaloproteinaze sa trombospondin motivima 5) i istovremenu zamenu sa 43 kb fragmentom homologog humanog ADAMTS5 gena (slika 39). LTVEC je sadržao 43 kb fragment humanog ADAMTS5 gena flankiranog sa homologim granama koje sadrže 22 kb i 46 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Adamts5 lokusa koji flankira 38 kb sekvencu mišjeg Adamts5 gena namenjenu za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Adamts5 humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugiom plazmidom koji kodira jednu od osam sgRNK (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2 i gF) dizajniranih za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Adamts5 gena na koji se ciljno deluje radi delecije. sgRNK su dizajnirane za izbegavanje prepoznavanja bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog ADAMTS5 gena.
[0559] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Adamts5 gena su prikazani u Tabeli 38. Kada je samo LTVEC uveden u ES ćelije, našli smo da nijedna od 96 ispitanih kolnija rezistentnih na lek nije nosila monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođeno pomoću dve od osam testiranih sgRNK (B i F; sekvence obezbeđene u Tabeli 43) proizvele su monoalelske heterozigotne mutacije ili heterozigotne mutacije bialelskog jedinjenja na koje je ispravno ciljno delovano na efikasnosti od 1.0%. Za Cas9-vođeno cepanje pomoću gRNK E2, detektovali smo heterozigotne mutacije jedinjenja na učestalosti od 1.0%.
Tabela 38. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju Adamts5 gena.
[0560] U sledećem eksperimentu, LTVEC je dizajniran za stvaranje 102 kb delecije mišjeg Erbb4 (receptor tirozin-protein kinaza erbB-4) gena i istovremenu zamenu sa 127 kb fragmentom homologog humanog ERBB4 gena (Slika 40). LTVEC je sadržao 127 kb fragment humanog ERBB4 gena flankiranog sa homologim granama koje sadrže 48 kb i 26 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Erbb4 lokusa koji flankira 102 kb sekvencu mišjeg Erbb4 gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Erbb4 humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugi plazmid koji kodira jedan od osam sgRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE, gE2 i gF) dizajniranih za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Erbb4 gena na koji se ciljno deluje radi delecije. sgRNK su dizajnirane tako da se izbegne prepoznavanje bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog ERBB4 gena.
[0561] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Erbb4 gena su prikazani u Tabeli 39. Kada je sam LTVEC uveden u ES ćelije, našli smo da nijedna od 96 ispitivanih kolonija rezistentnih na lek ne nosi monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođenom pomoću jedne od osam testiranih sgRNK (D; sekvenca obezbeđena u Tabeli 43) proizvedenih monoalelskih heterozigotnih mutacija ili heterozigotnih mutacija bialelskog jedinjenja na koje je ispravno ciljno delovano u efikasnosti od 1.0%. Za Cas9-vođeno cepanje pomoću gRNK D, detektovali smo heterozigotne mutacije jedinjenja u učestalosti od 1%.
Tabela 39. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju Erbb4 gena.
[0562] U sledećem eksperimentu, LTVEC je dizajniran tako da stvori 110 kb deleciju mišjeg Rorl (tirozin-protein kinaza transmembranski receptor ROR1) gena i istovremenu zamenu sa 134 kb fragmentom homologog humanog ROR1 gena (Slika 41). LTVEC je sadržao 134 kb fragment humanog ROR1 gena flankiranog sa homologim granama koje sadrže 41.8 kb i 96.4 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Ror1 lokusa koji flankira 110 kb sekvencu mišjeg Rorl gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Rorl humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugim plazmidom koji kodira jednu od šest sgRNK (gA, gB, gC, gD, gE i gF) dizajniram za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Ror1 gena na koji je ciljno delovano radi delecije. sgRNK su dizajnirane tako da se izbegne prepoznavanje bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog ROR1 gena.
[0563] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Rorl gena prikazani su u Tabeli 40. Kada je samo LTVEC uveden u ES ćelije, našli smo da nijedna od 96 ispitanih kolonija rezistentnih na lek nije nosila monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koji je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođeno pomoću dve od šest testiranih sgRNK (D i F; sekvence obezbeđene u Tabeli 43) proizvelo je monoalelske heterozigotne ili bialelske mutacije na koje je ispravno ciljno delovano na efikasnosti od 1.0%. Za Cas9-vođeno cepanje pomoću gRNK F, takođe smo detektovali heterozigotne muztacije jedinjenja u učestalosti od 1%.
Tabela 40. Rezultati skrininga za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju Rorl gena.
[0564] U sledećem eksperimentu, LTVEC je dizajniran za stvaranje 79 kb delecije mišjeg gena Dpp4 (dipepetidil peptidaze 4) i istovremenu zamenu sa 82 kb fragmentom homologog humanog DPP4 gena (slika 42). LTVEC je sadržao 82 kb fragment humanog DPP4 gena flankiranog sa 5’ i 3’ homologim granama, od kojih svaki sadrži 46 kb genomske DNK poreklom od delova mišjeg Dpp4 lokusa koji flankira 79 kb sekvencu mišjeg Dpp4 gena namenjenog za deleciju. U posebnim eksperimentima, kombinovali smo Dpp4 humanizaciju LTVEC sa plazmidom koji kodira Cas9 i drugi plazmid koji kodira jedan od osam sgRNK (gA, gB, gB2, gC, gD, gE, gE2 i gF) dizajniranih za stvaranje dvolančanih prekida unutar regiona mišjeg Dpp4 gena na koji je ciljno delovano radi delecije. sgRNK su dizajnirane tako da se izbegne prepoznavanje bilo koje sekvence u inseriranom delu humanog DPP4 gena.
[0565] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Dpp4 gena prikazani su u Tabeli 41. Kada je LTVEC pojedinačno uveden u ES ćelije, našli smo da je 2.1% ispitivanih kolonija rezistentnih na lek nosilo monoalelski heterozigotni humanizovani alel na koje je ispravno ciljno delovano. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 endonukleazom vođenom preko bilo koje od osam testiranih sgRNK (A, B, B2, C, D, E, E2 i F; sekvence obezbeđene u Tabeli 43) proizvelo je monoalelske heterozigotne mutacije na koje je ispravno ciljno delovano u efikanosti koja je bila u opsegu od 2.1 do 7.3%.
Tabela 41. Rezultati skrininga CRISPR/Cas9-potpomognute humanizacije Dpp4 gena.
[0566] Tabela koja rezimira rezultate za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju različitih mišjih gena obezbeđena je u Tabeli 42. Prvi red označava genski lokus na koji je ciljno delovano. Drugi red označava veličinu delecije (Del) endogenog mišjeg lokusa i veličinu insercije (Ins) odgovarajućeg humanog lokusa. Preostali redovi prikazuju broj kolonija (od 96) za svako stanje koje je imalo monoalelske heterozigotne mutacije, heterozigotne mutacije bialelskog jedinjenja ili bialelske homozigotne mutacije na koje je ispravno ciljno delovano. "Bez gRNK" predstavlja samo LTVEC, dok ostali redovi predstavljaju LTVEC plus odgovarajuće gRNK (naznačene relativnim položajem unutar delecionog lokusa).
Tabela 43. Vodeće RNK sekvence korišćene za CRISPR/Cas9-potpomognutu humanizaciju
mišjih gena.
Primer 5. Kratak opis ciljane modifikacije genomskih lokusa pacova
[0567] Tabela 44. Kratak opis ciljnog delovanja na pacova sa različitim tipovima vektora i agensima nukleaze razmatranim u primerima 3 i 4.
Tabela 44. Kratak opis ciljnog delovanja na pacova
[0568] Tabela 45 prikazuje kratak opis ciljnog delovanja na ES ćelije pacova sa plazmidima ili LTVECs u kombinaciji sa CRISPR/Cas9. Dve gRNK su testirane posebno za svaki ciljni lokus: Rag2, ApoE i Il2rg. Efikasnost cepanja CRISPR/Cas9 bila je > 20% na sva tri lokusa. Povećana efikasnost ciljnog delovanja i povećano bialelsko ciljno delovanje zabeleženo je kada je CRISPR/Cas9 korišćen u kombinaciji sa ciljnim plazmidima i LTVECs.
Tabela 45. Rezime ciljnog delovanja na ES ćeliju pacova sa plazmidima ili LTVECs u kombinaciji sa CRISPR/Cas9
[0569] Tabela 46 prikazuje kratak opis podataka prenosa klicine linije za ciljnu modifikaciju genomskih lokusa pacova. Prenos klicine linije je potvrđen za ApoE-ciljne pacove i Il2rgciljne pacove. ES ćelije pacova bile su XY (mužjak) i na njih je heterozigtno ciljno delovano. Prema tome, kada ciljne ES ćelije doprinose klicinoj liniji, približno 50% sperme poreklom od ES ćelija će da nosi mutantni alel i proizvodiće heterozigotne F1 mladunce.
Tabela 46. Podaci prenosa klicine linije za ciljnu modifikaciju genomskih lokusa pacova
Primer 6. Stvaranje, održavanje i ciljno delovanje na humane indukovane pluripotentne matične ćelije
6.1. Stvaranje humanih iPS ćelija
[0570] Ovaj primer opisuje stvaranje humanih iPS ćelija od ne-pluripotentnih humanih ćelija. PiggyBac (System Biosciences) vektori (PB-600A_CAGGS Bst XI (0.64 mg/mL) i PB-200 (0.99 mg/mL) koji sadrže gene koji kodiraju četiri reprogramirajuća faktora (hOct4, hSox2, hKLF-4, hMYC) operativno vezana za CM7 promotor su uvedeni u neonatalne humane fibroblaste prepucijuma upotrebom RED i BLUE GeneIn™ transfekcionih reagenasa (GlobalStem). Transficirane ćelije su inkubirane na NuFF1 hranljivim ćelijama u E7 medijumu da bi se omogućila ugradnja vektora i ekspresija reprogramirajućih faktora. E7 medijum je sadržao DMEM/F-12, NaHCO3, L-askorbinsku kiselinu, insulin, transferin, selen i FGF-2.
[0571] Selekcija puromicinom započela je 10 dana posle transfekcije upotrebom 2 mg/mL puromicina u E7 medijumu. Na dan 21, kolonije su selekcionisane i kultivisane u mTeSR™ medijumu, koji je sadržao DMEM/F-12, NaHCO3, L-askorbinsku kiselinu, insulin, transferin, selen, FGF-2, TGF-β1, glutation, L-glutamin, definisane lipide, tiamin, mikroelemente B i C, β-merkaptoetanol, goveđi serum albumin, pipekolinsku kiselinu, litijum hlorid i GABA. Na dane 29 do 57, ćelije su umnožene i pasažirane u mTeSR™ medijumu do postizanja ~50% konfluence u 6-komornim pločama. Na dane 65 do 73, umnožavanje i pasažiranje je nastavljeno upotrebom mTeSR™ medijuma i Gentle Cell Dissociation Reagent (Stem Cell Technologies). Na dan 76, medijum je promenjen u VG2i medijum niske osmolalnosti za dalje umnožavanje, pasažiranje i održavanje ćelija koje sadrže naivne ili koje izgleaju naivne hiPSCs.
Tabela 45. Rezime ciljnog delovanja na ES ćeliju pacova sa plazmidima ili LTVECs u kombinaciji sa CRISPR/Cas9
Tabela 46. Podaci prenosa klicine linije za ciljanu modifikaciju genomskih lokusa pacova
6.2. Ciljno delovanje LTVEC u humanim iPS ćelijama
[0572] Ovaj primer opisuje upotrebu ciljnog delovanja LTVEC u humanim iPS ćelijama. Kao što je prikazano na slici 51, uveli smo putem leketroporacije u humane iPS ćelije umnožene u VG2i medijumu sledeće molekule nukleinskih kiselina: (1) LTVEC (0.67 mg); (2) plazmid koji kodira Cas9 endonukleazu (5 mg); i (3) plazmid koji kodira CRISPR jednu vodeću RNK (gRNK) (10 mg). U jednoj grupi primera, Cas9 i gRNK su isključeni. Specifično, 3 x 10<6>ćelija je elektroporisano na voltaži od 700V, kapaciteta od 25 uF, i rezistencije od 400 oma. LTVEC je sadržao 16.7 kb nukleinsku kiselinu koja sadrži mišje Adam6a i Adam6b gene flankirane homologim granama koje sadrže 34 kb i 105 kb genomske DNK poreklom od genomskih regiona koji flankiraju 4.1 kb sekvencu humanog ADAM6 lokusa namenjenog za deleciju. LTVEC je takođe nosio kasetu za selekciju prema leku koja ciljno deluje na ekspresiju enzima koji pruža rezistenciju na antibiotski lek (higromicin). Korišćena humana ADAM6 gRNK imala je sledeću sekvencu: GTATAGCCCTGTTACACATT (SEQ ID NO: 94).
[0573] Ćelije koje su preuzele LTVEC i ugradile ga u svoje genome bile su sposobne da rastu i formiraju kolonije na GELTREX™-obloženoj posudi za kulturu tkiva u medijumu za rast koji sadrži antibiotski lek. Kako smo uveli 500 do 1,000 puta više CRISPR/Cas9-kodirajućih nukleinskih molekula od LTVEC molekula, većina kolonija rezistentnih na lek koje sadrže LTVEC takođe su sadržale, najmanje prolazno, CRISPR/Cas9 komponente. Pokupili smo kolonije rezistentne na lek i ispitivali ih pomoću postupka gubitka alela (Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotech.21:652-660; Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol.476:295-307 da bi se identifikovale kolonije koje su imale ispravno ciljani alel.
[0574] Rezultati CRISPR/Cas9-potpomognutog ciljnog delovanja LTVEC ADAM6 lokusa prikazani su u Tabeli 47.
Tabela 47. CRISPR/Cas9-potpomognuto ciljno delovanje LTVEC
[0575] Kada je LTVEC pojedinačno uveden u humane iPS ćelije, zabeležena je efikasnost ciljnog delovanja od 3.1%. Nasuprot tome, kombinovanje LTVEC sa Cas9 vođeno pomoću ADAM6 gRNK rezultovalo je u efikasnosti ciljnog delovanja od 7.3%.
6.3. Efekat medijuma niske osmolalnosti na morfologiju humane iPS ćelije
[0576] Ovaj primer opisuje efekat koncentracije soli, jonske snage i/ili osmolalnosti na stanje pluripotencije humanih iPS ćelija u kulturi. Humane iPS ćelije su kultivisane na MATRIGEL™ ili GELTREX™ supstratu u medijumu opisanom u Tabeli 48 ili u mTeSR™-hLIF medijumu.
Tabela 48. Medijum za iPS ćelijsku kulturu.
[0577] Kada je korišćeni bazni medijum bio DMEM, ovajmedijum je označen kao 2i medijum. Kada je korišćeni bazni medijum bio VG-DMEM, ovaj medijum niske osmolalnosti je označen kao VG2i medijum. Osmolalnost VG2i medijuma (233 mOsm/kg) je niža od osmolalnosti tradicionalnog 2i medijuma (261 mOsm/kg).
[0578] Kao što je prikazano na slici 52, humane iPS ćelije kultivisane na MATRIGEL™ u 2i medijumu tokom perioda od 8 dana (slika 52A) ili 12 dana (slika 52B) ispoljile su morfologiju karakterističnu za iPS ćelije u prajmovanom stanju, naročito rast u epitelijalnom mono-sloju i izgled apiko-bazalne polarnosti.
Tabela 47. CRISPR/Cas9-potpomognuto ciljnod elovanje LTVEC
[0579] mTeSR-hLIF medijum i VG2i medijum su dalje procenjeni za njihove efekte na morfologiju i stanje pluripotencije humanih iPS ćelija. U ovoj studiji, humane iPS ćelije su kultivisane na MATRIGEL™ ili NuFF hranljivim ćelijama u mTeSR™-hLIF medijumu (slike 53A i 53C) ili u VG2i medijumu (slike 53B i 53D) tokom perioda od 6 dana. Kada su kultivisane u mTeSR™-hLIF medijumu na MATRIGEL™ ili NuFF hranjljivim ćelijama, humane iPS ćelije su ispoljile morfologiju karakterističnu za prajmovane stanje pluripotencije, naročito rast u epitelijalnom mono-sloju i izgled apiko-bazalne polarnosti. Neke ćelije kultivisane u mTeSR™-hLIF medijumu počele su da ispoljavaju morfologiju okarakterisanu stvaranjem trodimenzionalnog grumena. Nasuprot tome, kada su kultivisane u VG2i medijumu na MATRIGEL™ ili NuFF hranljivim ćelijama, humane iPS ćelije su ispoljile morfologiju karakterističnu za naivno stanje pluripotencije, naročito rast u okruglim, kolonijama oblika kupole i nedostatak apiko-bazalne polarnosti.
6.4. Efekat medijuma niske osmolalnosti na ekspresiju markera pluripotencije u humanim iPS ćelijama
[0580] Ovaj primer opisuje efekat koncentracije soli, jonske snage i/ili osmolaliteta na ekspresiju markera pluripotencije u humanim iPS ćelijama koje su reprogramirane iz prajmovanog stanja u naivno stanje. Posle 24 dana kulture u VG2i medijumu na MATRIGEL™ supstratu, reprogramirane naivne humane iPS ćelije su obojene za ekspresiju alkalne fosfataze ili NANOG. Zabeleženo je da su reprogramirane ćelije snažno eksprimirale alkalnu fosfatazu (slika 54A) i NANOG (slike 54B i 54C), koji su indikativni za stanje naivne pluripotencije.
6.5. Efekat medijuma niske osmolalnosti na enzimatsku disocijaciju i subkulturu humanih iPS ćelija
[0581] U ovom primeru, humane iPS ćelije koje su reprogramirane do naivnog stanja upotrebom VG2i medijuma niske osmolalnosti enzimatski su disocirane upotrebom tripsina za stvaranje jedne suspenzije ćelije (slika 55A). Ćelijska suspenzija je pasažirana na nove GELTREX™-obložene ploče za subkulturu u VG2i medijumu. Posle 1 dana (slika 55B) i 4 dana (slika 55C) zabeleženo je da su subkultivisane ćelije nastavile da ispoljavaju morfologiju karakterističnu za ćelije u stanju naivne pluripotencije. Naročito, ćelije su rasle kao okrugle kolonije oblika kupole i nisu ispoljile apiko-bazalni polaritet. Može se videti da bi se enzimatska disocijacija mogla izvesti u odsustvu ROCK inhibitora, koji je tipično neophodan za prevenciju aktivacije pro-apoptotičkih puteva. Ovo sugeriše da pro-apoptotički putevi nisu snažno aktivirani u toku enzimatske disocijacije i subkulture u naivnim humanim iPS ćelijama kultivisanim pod uslovima koji su ovde identifikovani.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. In vitro postupak za modifikaciju genoma na genomskom lokusu od interesa u mišjoj embrionalnoj stem (ES) ćeliji, koji sadrži:
dovođenje u kontakt mišje ES ćelije sa Cas9 proteinom, CRISPR RNK koja hibridizuje sa ciljnom sekvencom na genomskom lokusu od interesa, tracrRNK, i veliki vektor sa ciljanim dejstvom (LTVEC) koji je najmanje veličine 10 kb i sadrži insert nukleinske kiseline flankiran sa:
(i) 5’ homologom rukom koja je homologa 5’ ciljnoj sekvenci na genomskom lokusu od interesa; i
(ii) 3’ homologom rukom koja je homologa 3’ ciljnoj sekvenci na genomskom lokusu od interesa,
naznačeno time da nakon dovođenja u kontakt mišje ES ćelije sa Cas9 proteinom, CRISPR RNK, i tracrRNK u prisustvu LTVEC, genom mišje ES ćelije je modifikovan tako da sadrži ciljnu genetičku modifikaciju koja sadrži deleciju regiona genomskog lokusa od interesa naznačeno time da je delecija najmanje 30 kb i/ili insercija inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa naznačeno time da je insercija najmanje 30 kb.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da:
(a) CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane kao pojedinačni transkript koji sadrži CRISPR RNK i tracrRNK, i izborno naznačen time da pojedinačni transkript sadrži CRISPR RNK i tracrRNK fuzionisane zajedno u obliku pojedinačne vodeće RNK (sgRNK); ili
(b) CRISPR RNK i tracrRNK su introdukovane zasebno.
3. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da:
(a) Cas9 protein je introdukovan u obliku proteina, informacione RNK (iRNK) koja kodira Cas9 protein, ili DNK koja kodira Cas9 protein;
(b) CRISPR RNK je introdukovana u obliku RNK ili DNK koja kodira CRISPR RNK; i
(c) tracrRNK je introdukovana u obliku RNK ili DNK koja kodira tracrRNK.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time da Cas9 protein, CRISPR RNK, i tracrRNK su introdukovane kao protein-RNK kompleks.
5. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time da:
(a) DNK koja kodira Cas9 protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno povezan sa prvom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas9 protein;
(b) DNK koja kodira CRISPR RNK je u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno povezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira CRISPR RNK; i
(c) DNK koja kodira tracrRNK je u obliku trećeg ekspresionog konstrukta koji sadrži treći promotor operativno povezan sa trećom nukleinskom kiselinom koja kodira tracrRNK;
naznačeno time da prvi, drugi, i treći promotor su aktivni u mišjoj ES ćeliji, i
naznačeno time da prvi, drugi, i treći ekspresioni konstrukt su na pojedinačnom molekulu nukleinske kiseline ili na više molekula nukleinske kiseline.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time da:
(a) DNK koja kodira Cas9 protein je u obliku prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvi promotor operativno povezan sa prvom nukleinskom kiselinom koja kodira Cas9 protein; i (b) DNK koja kodira CRISPR RNK i DNK koja kodira tracrRNK su u obliku drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugi promotor operativno povezan sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira gRNK koja sadrži CRISPR RNK i tracrRNK; naznačeno time da su prvi i drugi promotor aktivni u mišjoj ES ćeliji, i
naznačeno time da su prvi i drugi ekspresioni konstrukt na pojedinačnom molekulu nukleinske kiseline ili na zasebnim molekulima nukleinske kiseline.
7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da
(a) ciljna genetička modifikacija sadrži istovremenu deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa i inserciju inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa, izborno naznačeno time da deletirana sekvenca endogene nukleinske kiseline je od 30 kb do oko 110 kb, i insert nukleinske kiseline je od oko 40 kb do oko 140 kb;
(b) ciljana genetička modifikacija je bialelna genetička modifikacija, i izborno naznačeno time da bialelna genetička modifikacija sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i i inserciju inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u dva homologa hromozoma; ili
(c) naznačeno time da modifikovana mišja ES ćelija je složena heterozigotna ili hemizigotna na genomskom lokusu od interesa, i izborno naznačeno time da ciljna genetička modifikacija na genomskom lokusu od interesa u jednom hromozomu sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline i inserciju inserta nukleinske kiseline, i izborno naznačeno time da ciljna genetička modifikacija sadrži: (1) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa u prvom i drugom homologom hromozomu; i (2) inserciju inserta nukleinske kiseline u genomski lokus od interesa u prvom homologom hromozomu i disrupciju u genomskom lokusu od interesa u drugom homologom hromozomu.
8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da LTVEC je najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da ciljna genetička modifikacija sadrži inserciju inserta nukleinske kiseline, naznačeno time da insert nukleinske kiseline je najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, najmanje 300 kb, ili od oko 40 kb do oko 140 kb; ili
naznačeno time da ciljna genetička modifikacija sadrži inserciju inserta nukleinske kiseline i deleciju regiona na genomskom lokusu od interesa, naznačeno time da delecija je najmanje 30 kb, i insert nukleinske kiseline je najmanje 10 kb, najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, ili najmanje 300kb.
10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da ciljna sekvenca je neposredno flankirana sa Protospacer Adjacent Motif (PAM) sekvencom.
11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da ukupni zbir 5’ i 3’ homologih ruku LTVEC je od 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb to 150 kb.
12. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da ciljna genetička modifikacija sadrži:
(a) zamenu sekvence endogene nukleinske kiseline sa homologom ili ortologom sekvencom nukleinske kiseline;
(b) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline;
(c) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline, naznačeno time da je delecija u opsegu od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb;
(d) inserciju sekvence egzogene nukleinske kiseline;
(e) inserciju sekvence egzogene nukleinske kiseline u opsegu od od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb;
(f) inserciju sekvence egzogene nukleinske kiseline koja sadrži homologu ili ortologu sekvencu nukleinske kiseline;
(g) inserciju sekvence himerne nukleinske kiseline koja sadrži humanu i ne-humanu sekvencu nukleinske kiseline;
(h) inserciju uslovnog alela flankiranog sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifične za mesto;
(i) inserciju selektabilnog markera ili reporter gena operativno povezanog sa promotorom aktivnim u mišjoj ES ćeliji; ili
(j) njihovu kombinaciju.
13. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da ciljna genetička modifikacija sadrži deleciju regiona genomskog lokusa od interesa, naznačeno time da delecija je najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje oko 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, najmanje 200 kb, najmanje 250 kb, najmanje 300 kb; ili
naznačeno time da ciljna genetička modifikacija dodatno sadrži inserciju inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa naznačeno time da je insercija najmanje 30 kb, i delecija je najmanje 20 kb, najmanje 30 kb, najmanje 40 kb, najmanje 50 kb, najmanje 60 kb, najmanje 70 kb, najmanje 80 kb, najmanje 90 kb, najmanje 100 kb, najmanje 150 kb, ili najmanje 200 kb.
14. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da ciljna genetička modifikacija sadrži deleciju regiona genomskog lokusa od interesa naznačeno time da je delecija najmanje 30 kb i inserciju inserta nukleinske kiseline na genomskom lokusu od interesa naznačeno time da je insercija najmanje 30 kb.
15. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji dodatno sadrži:
(b) identifikaciju modifikovane mišje ES ćelije koja sadrži ciljnu genetičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa;
(c) introdukciju modifikovane mišje ES ćelije u mišji embrion domaćin; i
(d) gestaciju mišjeg embriona domaćina u surogat majci,
naznačeno time da surogat majka proizvodi F0 mišju generaciju koja sadrži ciljnu gentičku modifikaciju na genomskom lokusu od interesa.
RS20181418A 2013-12-11 2014-10-15 Postupci i kompozicije za ciljanu modifikaciju genoma RS58159B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361914768P 2013-12-11 2013-12-11
US201462017416P 2014-06-26 2014-06-26
US201462029261P 2014-07-25 2014-07-25
US201462052906P 2014-09-19 2014-09-19
US201462059527P 2014-10-03 2014-10-03
PCT/US2014/060788 WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2014-10-15 Methods and compositions for the targeted modification of a genome
EP14790457.7A EP3080279B1 (en) 2013-12-11 2014-10-15 Methods and compositions for the targeted modification of a genome

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58159B1 true RS58159B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=56885593

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181418A RS58159B1 (sr) 2013-12-11 2014-10-15 Postupci i kompozicije za ciljanu modifikaciju genoma

Country Status (12)

Country Link
EP (3) EP3080279B1 (sr)
CY (1) CY1121367T1 (sr)
DK (1) DK3080279T3 (sr)
ES (2) ES2700596T3 (sr)
HR (1) HRP20181632T1 (sr)
HU (1) HUE041331T2 (sr)
LT (1) LT3080279T (sr)
PL (1) PL3080279T3 (sr)
PT (1) PT3080279T (sr)
RS (1) RS58159B1 (sr)
SI (1) SI3080279T1 (sr)
SM (1) SMT201800653T1 (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018216022A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Eggxyt Ltd Methods for gender determination of avian embryos in unhatched eggs and means thereof
MX2021015122A (es) * 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
CN112522206A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 苏州恒康生命科学有限公司 一种ror1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法及其应用

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3605750A (en) 1969-04-07 1971-09-20 David S Sheridan X-ray tip catheter
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2002228841C1 (en) 2000-12-07 2006-11-23 Sangamo Biosciences, Inc Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
WO2002057293A2 (en) 2001-01-22 2002-07-25 Sangamo Biosciences, Inc. Modified zinc finger binding proteins
AU2002225187A1 (en) 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
WO2003087341A2 (en) 2002-01-23 2003-10-23 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
AU2003215869B2 (en) 2002-03-15 2008-04-24 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
WO2003080809A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
AU2003290518A1 (en) 2002-09-06 2004-04-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US7205148B2 (en) 2003-06-11 2007-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genome mutation by intron insertion into an embryonic stem cell genome
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
AU2005287278B2 (en) 2004-09-16 2011-08-04 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
EP1863909B2 (en) 2005-03-15 2014-09-10 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
ES2586210T3 (es) 2006-12-14 2016-10-13 Sangamo Biosciences, Inc. Proteínas de dedo de zinc no canónicas optimizadas
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2408921B1 (en) 2009-03-20 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
WO2011017293A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
US8518392B2 (en) 2009-08-14 2013-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
CA2779858C (en) 2009-10-29 2019-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional alleles
WO2011072246A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
AU2013259647B2 (en) 2012-05-07 2018-11-08 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
DK3456831T3 (da) * 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
EP3988649B1 (en) 2013-09-18 2024-11-27 Kymab Limited Methods, cells and organisms
HRP20200529T1 (hr) 2014-06-06 2020-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20181632T1 (hr) 2019-01-11
PT3080279T (pt) 2018-12-17
EP3080279B1 (en) 2018-09-26
ES2975317T3 (es) 2024-07-04
EP3080279A1 (en) 2016-10-19
DK3080279T3 (en) 2018-11-05
EP4349980A3 (en) 2024-06-26
PL3080279T3 (pl) 2019-03-29
EP3460063B1 (en) 2024-03-13
CY1121367T1 (el) 2020-05-29
ES2700596T3 (es) 2019-02-18
EP4349980A2 (en) 2024-04-10
SMT201800653T1 (it) 2019-01-11
LT3080279T (lt) 2018-10-25
HUE041331T2 (hu) 2019-05-28
EP3460063A1 (en) 2019-03-27
SI3080279T1 (sl) 2019-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6670412B2 (ja) ゲノムの標的改変のための方法及び組成物
ES2888250T3 (es) Modificación direccionada del genoma de rata
DK3080279T3 (en) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED MODIFICATION OF A GENOM
RU2751237C1 (ru) Способы и композиции для направленной модификации генома
NZ721985B2 (en) Methods and compositions for the targeted modification of a genome