RS58201B1 - Vegf/dll4 vezujući agensi i njihova upotreba - Google Patents

Vegf/dll4 vezujući agensi i njihova upotreba

Info

Publication number
RS58201B1
RS58201B1 RS20190023A RSP20190023A RS58201B1 RS 58201 B1 RS58201 B1 RS 58201B1 RS 20190023 A RS20190023 A RS 20190023A RS P20190023 A RSP20190023 A RS P20190023A RS 58201 B1 RS58201 B1 RS 58201B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
dll4
vegf
antibody
heavy chain
Prior art date
Application number
RS20190023A
Other languages
English (en)
Inventor
Austin L Gurney
Aaron Ken Sato
Christopher John Bond
Original Assignee
Oncomed Pharm Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncomed Pharm Inc filed Critical Oncomed Pharm Inc
Publication of RS58201B1 publication Critical patent/RS58201B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Solid Fuels And Fuel-Associated Substances (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se uglavnom odnosi na antitela i druge VEGF, DLL4 vezujuće agense ili oba VEGF i DLL4, posebno anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela, kao i na metode korišćenja antitela ili drugih agenasa za lečenje bolesti kao što je kancer.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Angiogeneza igra važnu ulogu u patogenezi brojnih poremećaja, uključujući čvrste tumore i metastaze. Proizvodnja novih krvnih sudova je od suštinskog značaja za obezbeđivanje kiseonika i hranljivih materija za rast i širenje tumora, pa je angiogeneza dobra meta za terapiju kancera.
[0003] Angiogeneza uključuje porodicu proteina koji deluju kao angiogeni aktivatori, uključujući vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF-A), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E i njihove odgovarajuće receptore (VEGFR-1, VEGFR-2 i VEGFR- 3). VEGF-A, takođe poznat kao faktor VEGF ili faktor vaskularne propustljivosti (VPF), postoji u nekoliko izoformi koji proizlaze iz alternativnog spajanja mRNK jednog jedinog VEGF gena, pri čemu je VEGF165najvažniji biološki relevantan izoform.
[0004] Anti-VEGF antitela su pokazala da potiskuju rast tumorskih ćelija in vitro i in vivo. Humanizovano anti-VEGF monoklonsko antitelo, bevacizumab (AVASTIN) je razvijen i odobren u Sjedinjenim Američkim Državama kao terapijski lek za kancer.
[0005] Notch signalizacijski put je univerzalno konzervisani sistem prenosa signala. Uključuje se u određivanje ćelijske sudbine tokom razvoja, uključujući nastanak embrionalnih šablona i post-embrionalno održavanje tkiva. Osim toga, Notch signalizacija je identifikovana kao kritičan faktor u održavanju hematopoetskih matičnih ćelija.
[0006] Notch put je povezan sa patogenezom hematoloških i čvrstih tumora i karcinoma. Pokazano je da su brojne ćelijske funkcije i mikroelektronski znaci povezani sa tumorogenezom modulisanom pomoću signalizacije Notch puta, uključujući proliferaciju ćelija, apoptozu, adheziju i angiogenezu (Leong i dr., 2006, Blood, 107:2223-2233). Osim toga, dokazano je da Notch receptori i/ili Notch ligandi igraju potencijalne onkogene uloge u nizu humanih karcinoma, uključujući akutnu mijelogenu leukemiju, B ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, Hodgkinov limfom, višestruki mijelom, akutnu limfoblastnu leukemiju T-ćelije, kancer mozga, karcinom dojke, kancer grlića materice, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer pankreasa, kancer prostate i kancer kože. (Leong i dr., 2006, Blood, 107:2223-2233).
[0007] Ligand nalik Delta 4 (DLL4) je važna komponenta Notch puta i identifikovana je kao meta za terapiju kancera. DLL4 je Notch ligand, koji se karakteriše N-terminalnim domenom, domenom Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) i tandemom EGF-nalik ponavljanju unutar vanćelijskog domena. Prijavljeno je da je DLL4 indukovan od strane VEGF-a i da DLL4 može delovati kao regulator negativne povratne sprege za vaskularnu proliferaciju.
[0008] Anti-DLL4 antitela su pokazala da povećavaju angiogensko kaljenje i grananje što dovodi do neproduktivne angiogeneze i smanjenog rasta tumora (Noguera-Troise i dr., 2006, Nature, 444:1032-1037). Pored toga, pokazano je da anti-DLL4 antitelo, 21M18, inhibira rast tumora i smanjuje učestalost matičnih ćelija karcinoma u tumorskim modelima ksenografta (Hoey i dr., 2009, Cell Stem Cell, 5:168-177; patent SAD br. 7,750,124; US2011/165162; WO2008042236) i u kliničkim ispitivanjima (WO2012068098; Smith i dr (2010) European Journal of Cancer 8773).
[0009] Iako je došlo do značajnih koraka u razvoju monoklonskih antitela za upotrebu u lečenju karcinoma, i dalje postoji veliki potencijal za dalje poboljšanje. Jedna klasa molekula antitela sa potencijalom povećane potencije i/ili smanjenih neželjenih efekata (npr., toksičnosti) su bispecifična antitela (WO2010129304; US2010/076178).
[0010] Rani bispecifični molekuli uglavnom su generisani korišćenjem hemijskog unakrsnog povezivanja dva antitela, ili su bili hibridni hibridomi ili "kvadromi". Jedan boljitak formata kvadroma je triomabi, koji su kombinacije miševa i pacova koji pokazuju preferencijalno upoređivanje teškog/lakog lanca specifičnog po vrsti. U skorije vreme, napredak u inženjerstvu antitela obezbedio je širok spektar novih formata antitela, uključujući, ali bez ograničenja, tandem scFv (bi-scFv), diatela, tandem diatela (tetra-tela), diatela sa jednim lancem i antitela dvojnih varijabilnih domena.
[0011] Jedan od ciljeva ovog pronalaska je obezbeđivanje poboljšanih molekula za lečenje karcinoma, naročito bispecifičnih antitela koja specifično vezuju humani VEGF i humani DLL4.
REZIME PRONALASKA
[0012] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje vezujuće agense, kao što su antitela koja vezuju VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4 (agensi za vezivanje VEGF/DLL4), kao i sastave, kao što su farmaceutski sastavi, koji sadrže agense za vezivanje. Takođe su obezbeđeni vezivni agensi koji vezuju VEGF ili DLL4, kao i najmanje jedan dodatni antigen ili cilj i farmaceutske sastave takvih vezujućih agenasa. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agensi su novi polipeptidi, kao što su antitela, fragmenti antitela i drugi polipeptidi vezani za takva antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agensi su antitela koja specifično vezuju humani VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agensi su antitela koja specifično vezuju humani DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agensi su bispecifična antitela koja vezuju humani VEGF i humani DLL4. Obelodanjivanje dalje daje metode inhibicije rasta tumora davanjem vezujućih agenasa subjektu s tumorom. Obelodanjivanje dalje obezbeđuje metode za lečenje kancera davanjem vezujućih agenasa subjektu kojem je to potrebno. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metode lečenja kancera ili inhibicije rasta tumora obuhvataju ciljanje ćelija matičnih ćelija kancera sa vezujućim agensima. U izvesnom ovdašnjem obelodanjivanju, metode sadrže redukciju frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru, smanjujući broj matičnih ćelija kancera u tumoru, smanjujući tumorogeničnost tumora i/ili smanjujući tumorogeničnost tumora smanjenjem broja ili učestalost matičnih ćelija kancera u tumoru.
[0013] Obelodanjivanje obezbeđuje vezujući agens, kao što je antitelo, koje specifično vezuje humani VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens inhibira vezivanje VEGF na najmanje jedan VEGF receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens inhibira vezivanje VEGF na VEGFR-1 i/ili VEGFR-2. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens moduliše angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo ili drugi vezujući agens dodatno se specifično vezuje i/ili inhibira humani DLL4 pored humanog VEGF.
[0014] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens je antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), teški lanac CDR2 sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19); i laki lanac CDR1 sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0015] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12.
[0016] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, vezujući agens je antitelo 219R45, 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75, ili 219R45-MB-21R83.
[0017] Obelodanjivanje obezbeđuje vezujući agens, kao što je antitelo, koje specifično vezuje humani DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens inhibira vezivanje DLL4 na najmanje jedan Notch receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens inhibira vezivanje DLL4 na Notch1, Notch2, Notch3 i/ili Notch4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens inhibira Notch signalizaciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens promoviše neproduktivnu angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo ili drugi vezujući agens dodatno se specifično vezuje i/ili inhibira humani VEGF pored humanog DLL4.
[0018] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezivno sredstvo je antitelo koje vezuje humani DLL4 i sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), teški lanac CDR2 koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde X1je serin ili alanin, X2je serin, asparagin, ili glicin, X3je asparagin ili lizin, i X4je glicin, arginina ili asparaginska kiselina i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens je antitelo sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), ili AYYIH (SEK ID Br:79), i teški lanac CDR2 sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14); i laki lanac CDR3 sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), laki lanac CDR1 sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), i laki lanac CDR2 sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0019] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% ili barem 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:10; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:10 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12.
[0020] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, vezujući agens je antitelo 21R79 ili antitelo 219R45-MB-21R79.
[0021] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens je antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), ili AYYIH (SEK ID Br:79), i teški lanac CDR2 sadrži YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59); i laki lanac CDR3 sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), laki lanac CDR1 sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), i laki lanac CDR2 sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0022] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% ili barem 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:58; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:58 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br: 12.
[0023] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, vezujući agens je antitelo 21R75 ili antitelo 219R45-MB-21R75.
[0024] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens je antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), ili AYYIH (SEK ID Br:79), i teški lanac CDR2 sadrži YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:65); i laki lanac CDR3 sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), laki lanac CDR1 sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), i laki lanac CDR2 sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0025] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% ili barem 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:64; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens je antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:64 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br: 12.
[0026] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, vezujući agens je antitelo 21R83 ili antitelo 219R45-MB-21R83.
[0027] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju vezujući agens je bispecifično antitelo. Jedan aspekt pronalaska obezbeđuje bispecifično antitelo koje specifično vezuje i humani VEGF i humani DLL4 kao što je navedeno u patentnom zahtevu 1. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo modulira angiogenezu. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo inhibira Notch signalizaciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens modulira angiogenezu inhibira Notch signalizaciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo smanjuje broj učestalosti matičnih ćelija karcinoma. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo sadrži dva identična laka lanca. U određenom ovdašnjem otelotvorenju bispecifično antitelo specifično vezuje IgG antitelo (npr., IgG2).
[0028] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani VEGF, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), teški lanac CDR2 sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), teški lanac CDR2 koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0029] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), teški lanac CDR2 koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde X1je serin ili alanin, X2is serin, asparagin, ili glicin, X3je asparagin ili lizin, i X4je glisin, arginina ili asparaginske kiseline i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br: 13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), ili YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), ili YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0030] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži: a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR težeg lanca koji sadrži NIVMH (SEK ID Br:17), CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19); gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), teški lanac CDR2 koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde je X1serin ili alanin, X2je serin, asparagin, ili glicin, X3je asparagin ili lizin, i X4je glisin, arginin, ili asparaginska kiselina, i teški lanac CDR3 sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i laki lanac CDR1 sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0031] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo koje specifično vezuje humani VEGF i sadrži: varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11 i/ili varijabilnim regionom lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo koje specifično vezuje humani VEGF i sadrži: varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11 i/ili varijabilnim regionom lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12.
[0032] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo specifično vezuje humani DLL4 i sadrži: varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:58 ili SEK ID Br:64; i/ili varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo specifično vezuje humani DLL4 i sadrži: varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:58 ili SEK ID Br:64; i/ili varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12.
[0033] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo specifično vezuje humani VEGF i humani DLL4, i sadrži: (a) prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; (b) drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:58 ili SEK ID Br:64; i (c) prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži (a) prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; (b) drugog varijabilnog regiona teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9; i (c) prvog i drugog varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju bispecifična antitela VEGF/DLL4 sadrže prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; (b) drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence SEK ID Br:10 i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju Bispecifična VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11;(b) drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence SEK ID Br:58 i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži (a) prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; (b) drugog varijabilnog regiona teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:64; i (c) prvog i drugog varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12.
[0034] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži (a) prvo mesto za vezivanje antigena koji vezuje humani VEGF sa KDizmeđu oko 0.1 nM i oko 1.0 nM i (b) drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje čoveka DLL4 sa KDizmeđu oko 0.1 nM i oko 20 nM. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo sadrži dva identična laka lanca.
[0035] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji iz 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83.
[0036] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju svakog od iznad pomenutih aspekata, kao i drugih aspekata i/ili obelodanjivanja ovde opisanih na drugim mestima ovde, vezujući agens ili antitelo se izoluje.
[0037] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje polipeptid izabran iz grupe koju čine: SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:3, SEK ID Br:4, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:7, SEK ID Br:8, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:11, SEK ID Br:12, SEK ID Br:46, SEK ID Br:47, SEK ID Br:48, SEK ID Br:49, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63 i SEK ID Br:64. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polipeptid je izolovan. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polipeptid je suštinski čist. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polipeptid je antitelo ili deo antitela, kao što je fragment antitela
[0038] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje izolovane polinukleotidne molekule koji sadrže polinukleotid koji kodira opisujući vezujuće agense i/ili polipeptide koji su ovde opisani. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotid sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:29, SEK ID Br:30, SEK ID Br:31, SEK ID Br:32, SEK ID Br:33, SEK ID Br:34, SEK ID Br:35, SEK ID Br:36, SEK ID Br:37, SEK ID Br:38, SEK ID Br:39, SEK ID Br:40, SEK ID Br:50, SEK ID Br:51, SEK ID Br:52, SEK ID Br:53, SEK ID Br:54, SEK ID Br:55, SEK ID Br:60, SEK ID Br:61, SEK ID Br:66, SEK ID Br:67, SEK ID Br:68, SEK ID Br:69, SEK ID Br:70, SEK ID Br:71, SEK ID Br:72, SEK ID Br:73, i SEK ID Br:74. Obelodanjivanje dalje daje vektore ekspresije koji sadrže polinukleotide, kao i ćelije koje sadrže vektore ekspresije i/ili polinukleotide. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelija je prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija.
[0039] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metode inhibicije rasta tumora, koje sadrže kontaktiranje tumora sa efektivnom količinom antitela (ili nekog drugog vezujućeg agensa) koje vezuje VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4, uključujući svako od tih antitela (ili druge vezujuće agense) koja su opisana ovde.
[0040] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metodu inhibicije rasta tumora kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela (ili nekog drugog vezujućeg agenta) koje vezuje VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4, uključujući svako od onih antitela (ili drugih vezujućih agenasa) opisanih ovde.
[0041] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metodu modulacije angiogeneze kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela (ili nekog drugog vezujućeg agenta) koje vezuje VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4, uključujući svako od onih antitela (ili drugih vezujućih agenasa) opisanih ovde.
[0042] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metodu smanjenja tumorogeniciteta kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela (ili nekog drugog vezujućeg agenta) koje vezuje VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4, uključujući svako od onih antitela (ili drugih vezujućih agenasa) opisanih ovde.
[0043] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metodu smanjenja tumorogeniciteta tumora kod subjekta, smanjujući učestalost matičnih ćelija kancera u tumoru, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela (ili nekog drugog vezujućeg agenta) koje vezuje VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4, uključujući svako od onih antitela (ili drugih vezujućih agenasa) opisanih ovde.
[0044] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metodu tretiranja kancera kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela (ili nekog drugog vezujućeg agenta) koje vezuje VEGF, DLL4 ili oba VEGF i DLL4, uključujući svako od onih antitela (ili drugih vezujućih agenasa) opisanih ovde.
[0045] Farmaceutski sastavi koji sadrže vezujući agens (npr., antitelo) koji je ovde opisan i farmaceutski prihvatljiv nosač su dalje obezbeđeni, kao i ćelijske linije koje eksprimiraju i/ili proizvode vezujuće agense. Metode lečenja kancera i/ili inhibicije rasta tumora kod subjekta (npr., čoveka) koji uključuju davanje subjektu efikasne količine sastava koji sadrži vezujuće agense takođe su obezbeđeni.
[0046] Tamo gde je obelodanjivanje ovde prikazano opisano u smislu grupe Markuš ili druge grupe alternativa, predmetno obelodanjivanje obuhvata ne samo čitavu grupu koja je navedena kao celina, već i svaki član grupe pojedinačno i sve moguće podgrupe glavne grupe, a takođe i glavna grupa odsutna jedna ili više članova grupe. Predmetno obelodanjivanje takođe predviđa eksplicitno isključenje jednog ili više članova grupe u predmetnom obelodanjivanju.
KRATAK OPIS SLIKA
[0047]
Slika 1.1A) CDR teškog lanca i lakog lanca anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21M79, 219R45-MB-21M75 i 219R45-MB-21M83; 1B) Varijabilni region teškog lanca i lakog lanca SEK ID Br; 1C) Teški lanac i laki lanac SEK ID Br.
Slika 2. HTRF test za istovremeno vezivanje bispecifičnih antitela na humani VEGF i humani DLL4. Rezultati su objavljeni u relativnim jedinicama fluorescencije (RFU), koji predstavljaju odnos relativnog intenziteta fluorescencije na 665nm do relativnog intenziteta fluorescencije na 620nm.219R45-MB-21M18 (-●-); 219R45MB-21R79 (-■-); 219R45 plus 21M18 (-▲-); 219R45 plus 21R79 (-□-); 219R45 (-▼-); 21M18 (-◊-); 21R79 (-○-); kontrolno antitelo LZ-1 (-Δ-).
Slika 3. Inhibicija proliferacije HUVEC izazvane VEGF-om pomoću anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela. Intenzitet fluorescencije se čita koristeći talasnu dužinu ekscitacije od 530nm i talasnu dužinu emitovanja od 590.219R45-MB-21M18 (-●-); 219R45-MB-21R79 (-▲-); 219R45 (-■-); Medijum bez VEGF (-◊-).
Slika 4. Inhibicija DLL4-indukovane Notch signalizacije pomoću anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela. Aktivnost luciferaze je merena pomoću dvostrukog luciferaznog testa s aktivacijom luciferaze vatrenog oka normalizovana je na aktivnost Renilla luciferaze.219R45-MB-21M18 (-●-); 219R45-MB-21R79 (-■-); 21M18 (-○-); 21R79 (-□-).
Slika 5. Inhibicija rasta tumora kolona in vivo pomoću anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela. OMP-C8 tumorske ćelije debelog creva su subkutano ubačene u humani kožni graft u miševima NOD/SCID. Miševi su tretirani kontrolnim antitelima (-■-), anti-hDLL4 antitelo 21M18 (-▲-), anti-VEGF antitelo bevacizumab (-○-), ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 (-▼-). Podaci se prikazuju kao volumen tumora (fotoni/sek) tokom dana nakon tretmana. Antitela su davana intraperitonealno u dozi od 25 mg/kg jednom nedeljno.
Slika 6. Tumorigeničnost ćelija tumora pankreasa nakon lečenja anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnim antitelima. OMP-PN8 tumorske ćelije miševa tretirane kontrolnim antitelom, anti-hDLL4 antitelom 21M18, anti-VEGF antitelo bevacizumab ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 ili 219R45-MB-21R79 sa ili bez gemcitabina obrađeni na pojedinačne suspenzije ćelija, i serijski presađeni u miševe.90 ćelija iz svake terapijske grupe ubrizgane su subkutano u miševe NOD/SCID. Tumorima je dozvoljeno da rastu bez tretmana. Podaci su prikazani kao volumen tumora (mm<3>) na dan 55. Tumorna frekvencija je prikazana kao broj tumora u odnosu na ukupan broj injekcija miševa u svakoj grupi.
Slika 7. Bispecifično antitelo ELISA. Bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83 su razblažena u blokirajuće puferu (1 x PBS, 0.1% želatin, 0.1% Polisorbat-20, pH 7.4)/ml biotin-DLL4-hFc. Antitela su serijski razblažena 3 puta od 500ng/ml do 0.008ng/ml. Uzorci antitela su inkubirani 2 sata u blokirajućem puferu koji sadrži biotin-DLL4-hFc. Nakon inkubacije, uzorci antitela se prenose na VEGF-obloženu ploču testa (100 ul/otvoru) i inkubiraju 2 sata. Streptavidin-HRP je dodat u svaki otvor i inkubiran tokom 1 h. TMB supstrat je dodat u otvore sa razvojem boje od 10 minuta i reakcija je zaustavljena sa 2M sumpornom kiselinom. Apsorbancija je pročitana na 450-650nm, a podaci analizirani korišćenjem 4-parametarskog odgovora unutar Softmax Pro programa za analizu.
Slika 8. Izražena kapilarna izoelektrična fokusiranja anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela.
Slika 9. Inhibicija rasta tumora kolona anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnim antitelima u modelu ponovnog tumora. OMP-C8 tumorske ćelije tumora su injektirane subkutano u miševe NOD/SCID. Miševi su tretirani kontrolnim antitelom (-■-), anti-hDLL4 antitelo 21M18 (-●-), anti-VEGF antitelo bevacizumab (-▲-), kombinacija 21M18 i bevacizumab (-▼-), anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 (-◊-) ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 (-○-), sve u kombinaciji sa irinotekanom. Antitela 21M18 i bevacizumab dati su intraperitonealno u dozi od 7.5 mg/kg jednom nedeljno, bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 su davana intraperitonealno u dozi od 15 mg/kg jednom nedeljno, a irinotekan je davan tokom prve 4 nedelje u dozi od 45 mg/kg. Podaci prikazuju kao volumen tumora (mm<3>) tokom dana nakon tretmana.
Slika 10. Tumorigeničnost OMP-C3 ćelija tumora pankreasa nakon lečenja anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnim antitelima. Tumori od miševa tretirani kontrolnim antitelom, anti-hDLL4 antitelo 21M18, anti-VEGF antitelo bevacizumab, kombinacija 21M18 i bevacizumab, ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 ili 219R45-MB-21R79 sa ili bez irinotekana su obrađeni na pojedinačne ćelijske suspenzije i serijski transplantirani u miševe. 150 ćelija iz svake terapijske grupe ubrizgane su subkutano u NOD/SCID miševe. Tumorima je dozvoljeno da rastu bez tretmana. Podaci su prikazani kao volumen tumora (mm<3>) na dan 68.
Slika 11. Inhibicija rasta tumora kolona in vivo pomoću anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela. OMP-C8 tumorske ćelije tumora su injektirane subkutano u miševe NOD/SCID. Miševi su lečeni kontrolnim antitelima (-I-), anti-VEGF antitela bevacizumab (-▲-) ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela 219R45-MB-21M18 (-◊-), 219R45-MB-21R75 (-●-), 219R45-MB-21R79 (-○-) ili 219R45-MB-21R83 (-▼-). Miševi su tretirani antitelima kao pojedinačni agensi (Slika 10A) ili u kombinaciji sa irinotekanom (Slika 10B). Antitela su davana intraperitonealno u dozi od 15 mg/kg jednom nedeljno i irinotekana u dozi od 7.5 mg/kg jedan nedeljno. Podaci prikazuju kao volumen tumora (mm<3>) tokom dana nakon tretmana.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0048] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje nove vezujuće agense, uključujući ali ne ograničavajući se na polipeptide kao što su antitela koja vezuju VEGF i/ili DLL4 (npr., vezujući agens VEGF/DLL4). Srodni polipeptidi i polinukleotidi, sastavi koji sadrže VEGF/DLL4 vezujuće agense i metode izrade VEGF/DLL4 vezujućih agenasa takođe su obezbeđeni. Metode korišćenja novih VEGF/DLL4 vezujućih agenasa, kao što su metode inhibicije rasta tumora, metode lečenja kancera, metode smanjivanja tumorogencije tumora, metode smanjivanja frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru i/ili metoda modulirajuće angiogeneze.
[0049] Identifikovano je monoklonsko antitelo koje specifično vezuje humani VEGF, 219R45. Ovo antitelo ima afinitet vezivanja za humani VEGF od oko 0.67nM, a afinitet vezivanja za VEGF miša od oko 23nM. Identifikovano je nekoliko monoklonskih antitela koja specifično vezuju humani DLL4, 21R79, 21R75 i 21R83. Antitelo 21R79 ima afinitet vezivanja za humani DLL4 manji od 0.1nM. Bispecifična antitela koja specifično vezuju humani VEGF i humani DLL4 su proizvedena, 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83 (CDR sekvence na slici 1). Kao što se ovde koristi, "MB" u nazivu antitela odnosi se na "monovalentna/bispecifična". Bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 ima afinitet vezivanja za humani VEGF manji od 1.0nM i afinitet vezivanja za humani DLL4 od oko 16nM. Bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 ima afinitet vezivanja za humani VEGF manji od 1.0nM i afinitet vezivanja za humani DLL4 od oko 1.0nM. Bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75 ima afinitet vezivanja za humani DLL4 od oko 5nM, dok bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83 ima afinitet vezivanja za humani DLL4 od oko InM. Bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 vezuju mišiji VEGF (primer 1, tabela 3). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela vezuju humanu VEGF i humani DLL4 istovremeno (Primer 2, Slika 2). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela inhibiraju VEGF-indukovanu proliferaciju HUVEC ćelija (primer 3, slika 3). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela inhibiraju DLL4-indukovanu Notch signalizaciju (primer 4, slika 4). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela inhibiraju rast tumora (Primeri 5, 9, 11 i Slike 5, 9, 11). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela inhibiraju tumorogenicitet (Primeri 6 i 10 i Slike 6, 10). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela vezuju humanu VEGF i humani DLL4 u bispecifičnoj analizi ELISA (Primer 7, Slika 7). Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela se izoluju i prečišćavaju na proizvod koji sadrži najmanje 90% heterodimernih antitela (Primer 8, Tabela 7).
I. Definicije
[0050] Da bi se olakšalo razumevanje predmetnog obelodanjivanja, nekoliko termina i fraza su definisani u nastavku.
[0051] Termin "antitelo" kao što se ovde koristi odnosi se na molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično vezuje metu, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid ili kombinacije prethodno navedenog, putem najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena unutar varijabilnog regiona molekula imunoglobulina. Kao što se ovde koristi, termin obuhvata netaknuta poliklonska antitela, netaknuta monoklonska antitela, jednolančana antitela, fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmenti), jednolančana antitela Fv (scFv), multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela, monospecifična antitela, monovalentna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzioni proteini koji sadrže antigen vezujuće mesto antitela i bilo koji drugi modifikovani imunoglobulinski molekul koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena (tj., antigen vezujuće mesto) sve dok antitela pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koja od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM ili podklase (izotipovi) istog (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta , epsilon, gama i mu, respektivno. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate podjediničke strukture i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti gola ili konjugovana drugim molekulima, uključujući, ali bez ograničenja, toksine i radioizotope.
[0052] Termin "fragment antitela" odnosi se na deo netaknutog antitela i odnosi se na antigenske determinantne varijabilne regione netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, antitela sa jednim lancem i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela. "Antigen fragment", kako se ovde koristi, sadrži mesto za vezivanje antigena ili mesto za vezivanje epitopa.
[0053] Termin "varijabilni region" antitela se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo sam ili u kombinaciji. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca svaki se sastoji od četiri okvirna regiona (FR) povezanih sa tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), poznatih i kao "hipervarijabilni regioni". CDR-i u svakom lancu držani su u neposrednoj blizini okružnih oblasti i, s CDR-ima iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen vezujućeg mesta antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR-a: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci unakrsnih vrsta (tj. Kabat i dr., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD), i (2) pristup zasnovan na kristalografskim istraživanjima kompleksa antigen-antitela (Al-Lazikani i dr., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). Osim toga, kombinacije ova dva pristupa ponekad se koriste u tehnici za određivanje CDR-ova.
[0054] Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na homogenu populaciju antitela koja je uključena u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje jedne antigenske determinante ili epitopa. Ovo je u suprotnosti sa poliklonalnim antitelima koja tipično uključuju mešavinu različitih antitela usmerenih protiv različitih antigenskih determinanti. Termin "monoklonsko antitelo" obuhvata i netaknuta monoklonska antitela i monoklonska antitela celokupne dužine kao i fragmente antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančana antitela (scFv), fuzione proteine koji sadrže deo antitelo i bilo koji drugi modifikovani imunoglobulinski molekul koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena (mesto za vezivanje antigena). Pored toga, "monoklonsko antitelo" odnosi se na takva antitela napravljena pomoću bilo koje od brojnih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na, proizvodnju hibridoma, selekciju faga, rekombinantnu ekspresiju i transgenske životinje.
[0055] Termin "humanizovano antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na oblike ne-humanih (npr., mišijih) antitela koja su specifični imunoglobulinski lanci, himerni imunoglobulini ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne nehumane sekvence. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima se ostaci CDR-a zamenjuju ostacima iz CDR-ova ne-humane vrste (npr., miš, pacov, zec ili hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i/ili vezujuću sposobnost (Jones i dr., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann i dr., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen i dr., 1988, Science, 239:1534-1536). U nekim slučajevima, ostaci humanog imunoglobulina okvirnog regiona Fv zamenjuju se odgovarajućim ostacima u antitelu od ne-humane vrste koja ima željenu specifičnost, afinitet i/ili sposobnost vezivanja. Humanizovano antitelo može se dalje modifikovati supstitucijom dodatnih ostataka ili u okvirima Fv okvira i/ili unutar zamenjenih ne-humanih ostataka radi poboljšanja i optimizacije specifičnosti, afiniteta i/ili vezivanja antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva ili tri varijabilna domena koji sadrže sve ili suštinski sve CDR koji odgovaraju ne-humanom imunoglobulinu, dok su svi ili suštinski svi okvirni regioni oni humane imunoglobulinske konsenzusne sekvence. Humanizovano antitelo može takođe sadržati barem deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), tipično onog humanog imunoglobulina. Primeri metoda koje se koriste za dobijanje humanizovanih antitela opisani su, na primer, u patentu SAD br.5,225,539.
[0056] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo proizvedeno od strane čoveka ili antitela koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu proizvedenom od strane čoveka. Humano antitelo može se napraviti koristeći bilo koju od tehnika poznatih u stanju tehnike. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane CDR-ove.
[0057] Termin "himerno antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo u kome je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina izvedena iz dve ili više vrsta. Tipično, varijabilni region i lakih i teških lanaca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenih iz jedne vrste sisara (npr., miša, pacova, zeca i sl.) Sa željenom specifičnošću, afinitetom i/ili sposobnošću vezivanja, dok konstantni regioni odgovaraju sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste (obično čoveka).
[0058] Izraz "antitelo zrelog afiniteta", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo sa jednim ili više izmena u jednom ili više CDR-ova, što rezultira poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa roditeljskim antitelom koji ne poseduje one izmene. Definicija obuhvata i izmene u ne-CDR ostacima napravljene u kombinaciji sa izmenama sa CDR ostacima. Poželjna srodna antitela sa afinitetom će imati nanomolarne ili čak i pikomolarne afinitete za ciljani antigen. Antitela koja su zrelog afiniteta proizvedena su metodama poznatim u struci. Na primer, Marks i dr., 1992, Bio/Technology 10:779-783, opisuje sazrevanje afiniteta pomoću VH i VL domena. Nasumična mutageneza CDR i/ili okvirnih ostataka opisuje se Barbas i dr., 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier i dr., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton i dr., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson i dr., 1995, J. Immunol., 154:3310-9; i Hawkins i dr., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896. Mnogageneza usmerena na lokaciju može se takođe koristiti za dobijanje srodnih antitela.
[0059] Izrazi "epitop" i "antigenska determinanta" se ovde zamenjuju i odnose se na onaj deo antigena koji je sposoban da bude prepoznat i specifično vezan određenim antitelom. Kada je antigen polipeptid, epitopi se mogu formirati i od susednih aminokiselina i nespecifičnih aminokiselina uporedih tercijarnim preklapanjem proteina. Epitopi formirani iz susednih aminokiselina (koji se takođe nazivaju linearni epitopi) se obično zadržavaju nakon denaturiranja proteina, dok se epitopi formirani tercijarnim preklapanjem (takođe nazvani kao konformacioni epitopi) obično gube nakon denaturiranja proteina. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a najčešće najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenu prostornu konformaciju.
[0060] Izrazi "heteromultimerni molekul" ili "heteromultimer" ili "heteromultimerni kompleks" ili "heteromultimerni polipeptid" se ovde koriste izmenično kako bi se odnosili na molekul koji sadrži barem prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu se drugi polipeptid razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od prvog polipeptida sa najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom. Heteromultimerni molekul može da sadrži "heterodimer" formiran od strane prvog i drugog polipeptida ili može formirati tercijarne strukture višeg reda gde su prisutni dodatni polipeptidi.
[0061] Izrazi "antagonist" i "antagonistički" kako se ovde koriste odnose se na bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira, smanjuje ili neutrališe biološku aktivnost mete i/ili signalne staze (npr., Notch put). Termin "antagonist" se ovde koristi da uključi bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira, smanjuje ili neutrališe aktivnost proteina. Pogodni antagonistički molekuli specifično uključuju, ali nisu ograničeni na, antagonistička antitela ili fragmente antitela.
[0062] Izrazi "modulacija" i "modulirati" kako se ovde koriste odnose se na promenu ili izmenu u biološkoj aktivnosti. Modulacija uključuje, ali nije ograničena na, stimulisanje ili inhibiranje aktivnosti. Modulacija može biti povećanje ili smanjenje aktivnosti (npr., smanjenje angiogeneze ili povećanje angiogeneze), promena karakteristika vezivanja ili bilo koja druga promena u biološkim, funkcionalnim ili imunološkim svojstvima koja su povezana sa aktivnošću proteina, putanja ili druge biološke tačke interesa.
[0063] Izrazi "selektivno vezivanje" ili "specifično vezivanje" znače da vezujući agens ili antitelo reaguje ili se povezuje često, brže, sa većim trajanjem, sa većim afinitetom ili sa nekom kombinacijom gornjeg na epitop, protein ili ciljani molekul nego sa alternativnim supstancama, uključujući nepovezane proteine. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, "specifično vezuje" znači, na primer, da antitelo vezuje protein sa KDod oko 0.1mM ili manje, ali obično manje od oko 1 µM. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, "specifično vezuje" znači da antitelo s vremena na vreme vezuje metu sa KDod najmanje oko 0.1µM ili manje, nekad najmanje oko 0.01 µM ili manje, a u drugim vremenima najmanje oko 1 nM ili manje. Zbog identiteta sekvence između homolognih proteina u različitim vrstama, specifično vezivanje može uključivati antitelo koje prepoznaje protein u više od jedne vrste (npr., humani VEGF i miš VEGF). Takođe, zbog homologije u određenim regionima polipeptidnih sekvenci različitih proteina, specifično vezivanje može uključivati antitelo (ili drugi polipeptid ili vezivno sredstvo) koje prepoznaje više od jednog proteina (npr., humanog VEGF-A i humanog VEGF-B). Razumljivo je da, u određenom obelodanjivanju ovde, antitelo ili veziva grupa koja specifično vezuje prvu metu može ili ne mora posebno vezati drugu metu. Kao takvo, "specifično vezivanje" ne zahteva nužno (mada može uključivati) ekskluzivno vezivanje, tj., vezivanje za jednu metu. Tako, antitelo može, u određenom ovdašnjem obelodanjivanju, specifično vezati više od jedne mete. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, višestruke mete mogu biti vezane istim antigen vezujućim mestom na antitelu. Na primer, antitelo može u određenim slučajevima da sadrži dva identična mesta za vezivanje antigena, od kojih svako specifično vezuje isti epitop na dva ili više proteina. U određenom alternativnom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo može biti multispecifično i obuhvata najmanje dva mesta za vezivanje antigena sa različitim specifičnostima. Neograničavajućim primerom, bispecifično antitelo može da sadrži jedno mesto za vezivanje antigena koji prepoznaje epitop na jednom proteinu (npr., humani VEGF) i dalje sadrži drugo, različito mesto za vezivanje antigena koji prepoznaje različiti epitop na sekundi proteina (npr., humani DLL4). Generalno, ali ne i nužno, referenca na vezivanje znači specifično vezivanje.
[0064] Izrazi "polipeptid" i "peptid" i "protein" se ovde zamenjuju i odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može sadržati modifikovane aminokiseline i može se prekinuti neaminokiselinama. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiselina koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidnih veza, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugacija sa obeležavajućom komponentom. Takođe uključeni u definiciju su, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline), kao i druge modifikacije poznate u struci. Razumljivo je da, pošto se polipeptidi ovog obelodanjivanja mogu zasnivati na antitelima, u određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polipeptidi mogu nastati kao pojedinačni lanci ili pridruženi lanci.
[0065] Izrazi "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" se ovde zamenjuju i odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine i uključuju DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analogi ili bilo koji supstrat koji se može inkorporirati u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze.
[0066] "Uslovi visoke strogosti" mogu biti identifikovani od strane onih koji: (1) primenjuju nisku jonsku jačinu i visoku temperaturu za pranje, na primer 15mM natrijum hlorid/1.5mM natrijum citrat/0.1% natrijum dodecil sulfat na 50°C; (2) primenjuju tokom hibridizacije agens za denaturisanje, kao što je formamid, na primer 50% (v/v) formamid sa 0.1% goveđeg serumskog albumina/0.1% Ficoll/0.1% polivinilpirolidon/50mM natrijum fosfatnog pufera na pH 6.5 u 5x SSC (0.75M NaCl, 75mM natrijum citrat) na 42°C; ili (3) primenjuju tokom hibridizacije 50% formamida u 5x SSC, 50mM natrijum-fosfata (pH 6.8), 0.1% natrijum-pirofosfata, 5x Denhardtovog rastvora, sonifikovana DNK sperme lososa (50µg/ml), 0.1% SDS i 10% dekstran sulfata na 42°C, ispiranjem na 42°C u 0.2x SSC i 50% formamidu, nakon čega sledi veoma strogo pranje koje se sastoji iz 0.1k SSC koja sadrži EDTA na 55°C.
[0067] Izrazi "identični" ili procenat "identičnosti" u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju specifičan procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti, kada se uporede i poravnaju (uvodeći praznine ako je potrebno) za maksimalnu korespondenciju, ne uzimajući u obzir konzervativne supstitucije aminokiselina kao deo identiteta sekvence. Procenat identiteta se može izmeriti pomoću softvera ili algoritama za upoređivanje sekvence ili vizuelnim pregledom. Različiti algoritmi i softver koji se mogu koristiti za dobijanje poravnanja aminokiselinskih ili nukleotidnih sekvenci su dobro poznati u struci. Ovo uključuje, ali bez ograničenja, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Paket i njihove varijacije. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju su dve nukleinske kiseline ili polipeptidi obelodanjivanja suštinski identični, što znači da imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, i u nekim ovdašnjim obelodanjivanjima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nukleotida ili identiteta ostataka aminokiseline, u poređenju i poravnanju za maksimalnu korespondenciju, mereno korišćenjem algoritma upoređivanja sekvence ili vizuelnim pregledom. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, identitet postoji u oblasti sekvenci koja je najmanje oko 10, najmanje oko 20, najmanje oko 40-60 ostataka, najmanje oko 60-80 ostataka u dužini ili bilo kojoj integralnoj vrednosti između njih. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, identitet postoji u dužem regionu od 60-80 ostataka, kao što je bar oko 80-100 ostataka, a kod nekog ovdašnjeg obelodanjivanja su sekvence u suštini identične u celoj dužini sekvenci koje se upoređuju, kao što je kodirajući region nukleotidne sekvence.
[0068] "Konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona u kojoj se jedan aminokiselinski ostatak zamenjuje drugim aminokiselinskim ostacima koji imaju sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisani u stanju tehnike, uključujući osnovne bočne lance (npr., lizin, arginin, histidin), kiselinske bočne lance (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisani polarni bočni lanci (npr., glinamin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta razgranati bočni lanci (npr., treonin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Na primer, zamena fenilalanina za tirozin je konzervativna supstitucija. Poželjno, konzervativne supstitucije u sekvencama polipeptida i antitela obelodanjivanja ne ukidaju vezivanje polipeptida ili antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu, antigen na koji se vezuje polipeptid ili antitelo. Metode identifikacije konzervativnih supstitucija nukleotida i aminokiselina koje ne eliminišu vezivanje antigena su dobro poznate u stanju tehnike.
[0069] Termin "vektor" koji se ovde koristi, znači konstrukt, koji je sposoban da isporučuje i obično eksprimira jedan ili više gena ili sekvence koji se interesuju u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, viralne vektore, vektore ekspresije golih DNK ili RNK, plazmidne, kosmidne ili fagne vektore, vektore ekspresije DNA ili RNK, povezane sa katjonskim kondenzacionim agensima, i vektori ekspresije DNA ili RNK koji su inkapsulirani u lipozome.
[0070] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je "izolovan" je polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili sastavi uključuju one koji su prečišćeni u tolikoj meri da nisu više u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je izolovan je u suštini čist.
[0071] Izraz "suštinski čist" kako se ovde koristi odnosi se na materijal koji je najmanje 50% čist (tj., bez zagađivača), najmanje 90% čist, najmanje 95% čist, najmanje 98% čist ili najmanje 99% čist.
[0072] Izrazi "kancer" i "kancerogeni", kako se ovde koriste, odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara u kojem se populacija ćelija karakteriše neregulisanim rastom ćelija. Primeri kancera uključuju, ali bez ograničenja, karcinom, blastom, sarkom i hematološki kancer kao što su limfom i leukemija.
[0073] Izrazi "tumor" i "neoplazme" kako se ovde koriste odnose se na bilo koju masu tkiva koja je rezultat prekomernog rasta ćelija ili proliferacije, bilo benignih (nekancerogenih) ili malignih (kancerogenih) uključujući pred-kancerogene lezije.
[0074] Termin "metastaze", kako se ovde koristi, odnosi se na proces kojim se kancer širi ili prenosi sa mesta porekla u druge regione tela sa razvojem slične kancerozne lezije na novoj lokaciji. "Metastatska" ili "metastazna" ćelija je ona koja gubi adhezivne kontakte sa susednim ćelijama i migrira preko krvotoka ili limfe od primarne lokacije bolesti kako bi napadala susedne strukture tela.
[0075] Izrazi "matične ćelije kancera" i "CSC" i "tumorske matične ćelije" i "ćelije koja iniciraju tumor" se ovde zamenjuju i odnose se na ćelije iz kancera ili tumora koji: (1) imaju veliki proliferativni kapacitet; 2) su sposobni za asimetričnu podelu ćelija da generišu jedan ili više tipova diferenciranih ćelijskih potomaka gde su diferencirane ćelije smanjile proliferativni ili razvojni potencijal; i (3) su sposobni za simetričnu podelu ćelija za samo-obnavljanje ili samoodržavanje. Ova svojstva prenose matične ćelije kancera sposobnost da formiraju ili uspostave tumor ili kancer nakon serijskog transplantacije u imuno-kompromitovanog domaćina (npr., miša) u poređenju sa većinom tumorskih ćelija koje ne uspevaju da stvore tumore. Matične ćelije kancera podležu samoobnavljanju protiv diferencijacije na haotičan način da bi se formirale tumori sa abnormalnim tipovima ćelija koje se mogu menjati tokom vremena kako se pojavljuju mutacije.
[0076] Izrazi "ćelije kancera" i "tumorske ćelije" odnose se na ukupnu populaciju ćelija izvedenih iz kancera ili tumora ili pre-kancerozne lezije, uključujući i ne-tumorogene ćelije, koje čine većinu populacije ćelija karcinoma i tumorogeni stub ćelije (matične ćelije kancera). Kako se ovde koristi, pojmovi "ćelija kancera" ili "tumorska ćelija" biće izmenjeni pojam "ne-tumorogeni" kada se govore isključivo za one ćelije kojima nedostaje kapacitet da se obnavljaju i razlikuju kako bi se razlikovale ove tumorske ćelije iz matičnih ćelija karcinoma.
[0077] Termin "tumorogeni" koji se ovde koristi odnosi se na funkcionalne karakteristike matične ćelije kancera uključujući i osobine samoobnavljanja (što dovodi do dodatnih tumorogenih matičnih ćelija kancera) i proliferaciju da generišu sve druge tumorske ćelije (što dovodi do diferencijacije i na taj način ne-tumorogene tumorske ćelije).
[0078] Termin "tumorogenicitet", kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost slučajnog uzorka ćelija iz tumora da formira palpabilne tumore na serijskoj transplantaciji u imunokompromitovanim domaćinima (npr., miševima). Ova definicija takođe uključuje obogaćene i/ili izolovane populacije matičnih ćelija karcinoma koji formiraju palpabilne tumore nakon serijske transplantacije u imunokompromitovanim domaćinima (npr., mišem).
[0079] Termin "subjekt" odnosi se na bilo koju životinju (npr. ,sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, primate bez čoveka, kanine, felne, glodare i slično, koji će biti primalac određenog tretmana . Tipično, termini "subjekt" i "pacijent" se ovde koriste izmenjeno u odnosu na ljudski subjekt.
[0080] Termin "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na proizvod ili smešu odobrenu (ili odobrivu) od strane regulatorne agencije federalne vlade ili državne vlade ili navedene u američkoj farmakopeji ili druge opšte priznate farmakopeje za korišćenje kod životinja, uključujući ljude.
[0081] Izrazi "farmaceutski prihvatljivi ekscipijens, nosač ili adjuvans" ili "prihvatljivi farmaceutski nosač" odnose se na ekscipijens, nosač ili adjuvans koji se može davati subjektu, zajedno sa najmanje jednom vezujućem agensom (npr., antitelo) ovog obelodanjivanja i koji ne uništava aktivnost vezujućeg agensa. Ekscipijens, nosač ili adjuvans treba biti netoksičan kada se daje sa vezujućim agensom u dozama dovoljnim da isporuči terapeutski efekat.
[0082] Termini "efikasna količina" ili "terapeutski efektivna količina" ili "terapeutski efekat" odnose se na količinu agensa za vezivanje, antitela, polipeptida, polinukleotida, malog organskog molekula ili drugog leka koji je efikasan da "tretira" bolest ili poremećaj kod subjekta ili sisara. U slučaju kancera, terapeutski efikasna količina leka (npr., antitela) ima terapeutski efekat i kao takav može smanjiti broj ćelija karcinoma; smanjiti tumorogenicitet, tumorogenu frekvenciju ili tumorogeni kapacitet; smanjiti broj ili učestalost matičnih ćelija karcinoma; smanjiti veličinu tumora; smanjiti populaciju ćelija karcinoma; inhibirati i/ili zaustaviti infiltracije ćelija kancera u periferne organe uključujući, na primer, širenje kancera u meko tkivo i kosti; inhibiranje i/ili zaustavljanje metastaze tumorske ili kancerogene ćelije; inhibirati i/ili zaustaviti rast tumora ili kancera; u određenoj meri osloboditi jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom; smanjiti morbiditet i mortalitet; poboljšati kvalitet života; ili kombinacija takvih efekata. U meri u kojoj agens, na primer antitelo, sprečava rast i/ili ubija postojeće ćelije kancera, može se nazvati citostatskim i/ili citotoksičnim.
[0083] Termini "lečenje" ili "lečenje" ili "lečenje" ili "ublažavanje" ili "ublaženje" odnose se na 1) terapijske mere koje leče, usporavaju, smanjuju simptome i/ili zaustavljaju napredovanje dijagnostifikovanog patološkog stanja ili poremećaja i 2) profilaktičke ili preventivne mere koje sprečavaju ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Stoga oni koji trebaju lečenje uključuju one koji već imaju poremećaj; oni koji su skloni da imaju poremećaj; i onima u kojima je poremećaj sprečen. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, subjekt se uspešno "tretira" prema metodama obelodanjivanja ako pacijent pokazuje jedno ili više od sledećih stanja: smanjenje broja ili potpunog odsustva ćelija karcinoma; smanjenje veličine tumora; inhibicija ili odsustvo infiltracije ćelija karcinoma u periferne organe, uključujući širenje ćelija kancera u meko tkivo i kost; inhibicija ili odsustvo metastaze tumorske ili ćkancerogene ćelije; inhibicija ili odsustvo kancera; olakšanje jednog ili više simptoma povezanih sa specifičnim kancerom; smanjenje morbiditeta i mortaliteta; poboljšanje kvaliteta života; smanjenje tumorogencije; smanjenje broja ili učestalosti matičnih ćelija karcinoma; ili neku kombinaciju efekata.
[0084] Kao što se koristi u predmetnom obelodanjivanju i tvrdnjama, jedinstveni oblici "a", "an" i "the" uključuju množinu oblika osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.
[0085] Podrazumeva se da svako ovde opisano obelodanjivanje sa jezikom "obuhvata", inače se daju i analogno ovdašnje obelodanjivanje u obliku "sastoji se iz" i/ili "koji se sastoji uglavnom iz". Takođe se shvata da je ovde opisano obelodanjivanje sa jezikom "koji se sastoji uglavnom iz", inače su obezbeđeni analogno ovdašnje obelodanjivanje opisano u smislu "sastoji se iz".
[0086] Izraz "i/ili" koji se koristi u frazi kao što je "A i/ili B" ovde ima za cilj da uključi i A i B; A ili B; A (samo); i B (samo). Isto tako, izraz "i/ili" koji se koristi u frazi kao što su "A, B i/ili C" ima za cilj da obuhvati svako od sledećih obelodanjivanja u ovom tekstu: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).
II. Antitela
[0087] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje agense koji specifično vezuju humane VEGF proteine i/ili humane DLL4 proteine. Ovi agensi se ovde nazivaju "VEGF/DLL4 vezujući agensi". Fraza "VEGF/DLL4 vezujući agens" obuhvata agense koji vezuju samo VEGF, agense koji vezuju samo DLL4 i bispecifične agense koji vezuju i VEGF i DLL4. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, pored specifično vezujućeg VEGF i/ili DLL4, VEGF/DLL4 vezujući agensi dalje specifično vezuju barem jedan dodatni cilj ili antigen. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je polipeptid. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens specifično vezuje humani VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens specifično vezuje humani DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifična antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/ DLL4 vezujući agensi su bispecifična antitela koja vezuju humani VEGF i humani DLL4. Celokupne dužine aminokiselina (aa) sekvence za humani VEGF (VEGF-A) i humani DLL4 su poznate u struci i ovde su date kao SEK ID Br:27 (VEGF) i SEK ID Br:23 (DLL4).
[0088] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens ili antitelo vezuje VEGF i/ili DLL4 sa konstantom disociacije (KD) od oko 1µM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko InM ili manje ili oko 0.1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju VEGF i/ili DLL4 sa KDod oko 20nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju VEGF i/ili DLL4 sa KDod oko 10nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju VEGF i/ili DLL4 sa KDod oko InM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju VEGF i/ili DLL4 sa KDod oko 0.1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens vezuje i humani VEGF i mišiji VEGF sa KDod oko 100nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens vezuje i humani VEGF i mišiji VEGF sa KDod oko 50nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens vezuje i humani DLL4 i mišiji DLL4 sa KDod oko 100nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens vezuje i humani DLL4 i mišiji DLL4 sa KDod oko 50nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, konstanta disociacije vezujućeg agensa (npr., antitela) u VEGF je konstanta disocijacije koja se određuje korišćenjem VEGF fuzionog proteina koji sadrži barem deo VEGF-a koji je imobilizovan na Biacore čipu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, konstanta disociacije vezujućeg agensa (npr., antitela) u DLL4 je konstanta disocijacije koja se određuje korišćenjem DLL4 fuzionog proteina koji sadrži barem deo DLL4 koji je imobilizovan na Biacore čipu.
[0089] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju i VEGF i DLL4 sa KDod oko 100nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju i VEGF i DLL4 sa KDod oko 50nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju i VEGF i DLL4 sa KDod oko 20nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju i VEGF i DLL4 sa KDod oko 10nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo vezuju i VEGF i DLL4 sa KDod oko 1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, afinitet jednog od mesta za vezivanje antigena može biti slabiji od afiniteta drugog antigen vezujućeg mesta. Na primer, KDjednog mesta za vezivanje antigena može biti oko 1nM, a KDdrugog antigen vezujućeg mesta može biti oko 10nM. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, razlika u afinitetu između dva mesta za vezivanje antigena može biti oko 2 puta ili više, oko 3 puta ili više, oko 5 puta ili više, oko 8 puta ili više, oko 10 puta ili više, oko 15 puta ili više, oko 20 puta ili više, oko 30 puta ili više, oko 50 puta ili više, ili oko 100 puta ili više. Modulacija afiniteta dva mesta vezivanja antigena može uticati na biološku aktivnost bispecifičnog antitela. Na primer, smanjenje afiniteta mesta za vezivanje antigena za DLL4 ili VEGF, može imati poželjan efekat, na primer smanjenje toksičnosti agensa za vezivanje ili povećan terapeutski indeks.
[0090] Kao neograničavajući primer, bispecifično antitelo može sadržati (a) prvo mesto za vezivanje antigena koji vezuje humani VEGF sa KDizmeđu oko 0.1 nM i oko 1.0 nM, i (b) drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani DLL4 sa KDizmeđu oko 0.1 nM i oko 20 nM, između oko 0.5 nM i oko 20 nM, između oko 1.0 nM i 10 nM. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo sadrži dva identična laka lanca.
[0091] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje VEGF i/ili DLL4 sa polu-maksimalnom efektivnom koncentracijom (EC50) od oko 1µM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1nM ili manje ili oko 0.1nM ili manje. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje VEGF i/ili DLL4 sa polu-maksimalnom efektivnom koncentracijom (EC50) od oko 1µM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1nM ili manje ili oko 0.1nM ili manje.
[0092] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens VEGF/DLL4 je antitelo. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je rekombinantno antitelo. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je himerno antitelo. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je humanizovano antitelo. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je humano antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je IgG1 antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je IgG2 antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je fragment antitela koje sadrži antigen vezujuće mesto. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je bispecifično antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je monovalentno, monospecifično, bivalentno ili multispecifično. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je konjugovano za citotoksični deo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je izolovano. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je suštinski čisto.
[0093] VEGF/DLL4 vezujući agensi (npr., antitela) predmetnog obelodanjivanja mogu se analizirati za specifično vezivanje bilo kojom metodom koja je poznata u stanju tehnike. Imuno analize koje se mogu koristiti uključuju, ali se ne ograničavaju na, konkurentske i nekonkurentne sisteme analize koristeći tehnike kao što su Biacore analiza, FACS analiza, imunofluorescencija, imunocitokemija, zapadna blot analiza, radio imuno testovi, ELISA, imunološki test "imunološki test" imunoprecipitationa , reakciju precipitacije, reakciju precipitina gelova difuzije, ispitivanje imunodifuzije, analiza aglutinacije, analiza vezivanja komplementa, imunoderomiometrijski test, fluorescentni imuno testovi, homogeni test fluorescencije (HTRF) i proteinski A imuno testovi. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci (videti, na primer, Ausubel i dr., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY).
[0094] Na primer, specifično vezivanje antitela na humani VEGF i/ili humani DLL4 može se odrediti pomoću ELISA. Analiza ELISA obuhvata pripremu antigena, premaznih otvora sa mikrotitarskom pločom od 96 otvora sa antigenom, dodajući antitelo ili drugo vezivno sredstvo konjugovano sa detektabilnim jedinjenjem kao što je enzimski supstrat (npr., renova peroksidaza ili alkalna fosfataza) u otvor, inkubirajući za vremenski period i otkrivanje prisustva vezujućeg agensa vezanog za antigen. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens ili antitelo nije konjugovano sa detektabilnim jedinjenjem, već umesto drugog antitela koji prepoznaje vezujući agens ili antitelo (npr., anti-Fc antitelo) i konjugovano je za detektabilno jedinjenje se dodaje u otvor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, umesto premazivanja otvora sa antigenom, vezujući agens ili antitelo može biti premazano na otvor, a drugo antitelo konjugovano sa detektabilnim jedinjenjem može se dodati nakon dodavanja antigena u premazani otvor. Jedan od stručnjaka bi bio upoznat sa parametrima koji se mogu modifikovati kako bi se povećao otkriveni signal, kao i druge varijacije ELISA-a poznate u struci.
[0095] U drugom primeru, specifično vezivanje antitela na humani VEGF i/ili humani DLL4 može se odrediti korišćenjem FACS. FACS skrining test može obuhvatiti generisanje cDNA konstrukta koji eksprimira antigen kao fuzioni protein, transfektuje konstrukt u ćelije, eksprimirajući antigen na površini ćelija, mešajući vezujući agens ili antitelo sa transfektovanim ćelijama i inkubirajući za period vremena. Ćelije koje vezuju vezujući agens ili antitelo mogu se identifikovati pomoću sekundarnog antitela konjugovanog sa detektabilnim jedinjenjem (npr., PE-konjugovano anti-Fc antitelo) i protočnog citometra. Jedan od stručnjaka u struci bi bio upoznat sa parametrima koji se mogu modifikovati kako bi se optimizovao otkriveni signal, kao i druge varijacije FACS-a koje mogu poboljšati skrining (npr., skrining za blokiranje antitela).
[0096] Vezujući afinitet antitela ili nekog drugog vezujućeg agensa na antigen (npr., VEGF ili DLL4) i smanjene interakcije antitela i antigena mogu se odrediti pomoću kompetetivnih vezivanja. Jedan primer kompetetivnog testa vezivanja je radioimunsko ispitivanje koje obuhvata inkubaciju označenog antigena (npr.,<3>H ili<125>I), ili njegov fragment ili varijanta, sa antitelom koji je u interesu u prisustvu povećanih količina neoznačenog antigena, nakon čega sledi otkrivanje antitela vezana za označeni antigen. Afinitet antitela za antigen i obavezne manje brzine mogu se odrediti iz podataka pomoću Scatchard analize parcele. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima se koristi Biacore kinetička analiza za određivanje vezivanja i isključivanja stope antitela ili antigen vezujućeg agensa (npr., VEGF ili DLL4). Biacore kinetička analiza obuhvata analizu vezivanja i disocijacije antitela od čipova imobilizovanim antigenom (npr., VEGF ili DLL4) na njihovoj površini.
[0097] ovdašnje obelodanjivanje. Obelodanjivanje takođe sadrži VEGF vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani VEGF, pri čemu vezujući agens VEGF (npr., antitelo) sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-a antitela 219R45 (videti Tabelu 1). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens sadrži jedan ili više CDR-a od 219R45, dva ili više CDR-a od 219R45, tri ili više CDR-a od 219R45, četiri ili više CDR-a od 219R45, pet ili više CDR-a od 219R45 ili svih šest CDR-a od 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens VEGF je humani VEGF i mišiji VEGF.
Tabela 1
[0098] Ovim obelodanjivanjem, obelodanjivanje takođe pruža VEGF vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani VEGF, pri čemu VEGF vezujući agens sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br: 17), teški lanac CDR2 koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens sadrži: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), teški lanac CDR2 koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0099] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje VEGF vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani VEGF, pri čemu VEGF vezujući agens obuhvata: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br: 19), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (e) CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21),ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; i (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, aminokiselinske supstitucije su konzervativne supstitucije.
[0100] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje VEGF vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje VEGF, pri čemu VEGF vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:11. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br: 12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući agens sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:11, i laki lanac varijabilnog regiona koji se suštinski sastoji iz SEK ID Br:12 U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:49 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući antitelo ili drugi agens sadrži teški lanca koji sadrži SEK ID Br:7 i laki lanac koji sadrži SEK ID Br:8.
[0101] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens vezuje VEGF sa KDod 10nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens vezuje VEGF sa KDod 1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens vezuje VEGF sa KDod 0.1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens vezuje VEGF sa KDod 0.01nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u najmanje jednom CDR vezujućem agensu VEGF je supstituisan sa različitu aminokiselinu tako da se afinitet VEGF vezujućeg agensa za VEGF menja. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet VEGF-vezujućeg agensa povećan. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet VEGF-vezujućeg agensa smanjen. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens VEGF je humani VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens VEGF je humani VEGF i mišiji VEGF.
[0102] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 219R45 antitela. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF vezujući agens sadrži teški lanac i laki lanac 219R45 antitela (sa ili bez liderske sekvence). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens je 219R45 antitelo.
[0103] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens sadrži, sastoji se u suštini iz ili sastoji se iz antitela 219R45.
[0104] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na VEGF kao antitelo obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na VEGF koje se preklapa sa epitopom na VEGF vezanom sa antitelom obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na VEGF kao antitelo obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na VEGF koje se preklapa sa epitopom na VEGF vezanom sa antitelom 219R45.
[0105] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens inhibira vezivanje VEGF na najmanje jedan VEGF receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens inhibira vezivanje humanih VEGF na VEGFR-1 ili VEGFR-2. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF-vezujući agens specifično vezuje VEGF i moduliše angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF-vezujući agens specifično vezuje VEGF i inhibira angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF-vezujući agens specifično vezuje VEGF i inhibira rast tumora.
[0106] Obelodanjivanje takođe sadrži DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu vezujući agens DLL4 (npr., antitelo) sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-a antitela 21R79 (videti Tabelu 2). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4 vezujući agens sadrži jedan ili više CDR-a od 21R79, dva ili više CDR-a od 21R79, tri ili više CDR-a od 21R79, četiri ili više CDR-a od 21R79, pet ili više CDR-a od 21R79 ili svih šest CDR-a od 21R79. Obelodanjivanje takođe sadrži DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu vezujući agens DLL4 (npr., antitelo) sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-a antitela 21R75 (videti Tabelu 2). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4 vezujući agens sadrži jedan ili više CDR-a od 21R75, dva ili više CDR-a od 21R75, tri ili više CDR-a od 21R75, četiri ili više CDR-a od 21R75, pet ili više CDR-a od 21R75 ili svih šest CDR-a od 21R75. Obelodanjivanje takođe sadrži DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu vezujući agens DLL4 (npr., antitelo) sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-a antitela 21R83 (videti Tabelu 2). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4 vezujući agens sadrži jedan ili više CDR-a od 21R83, dva ili više CDR-a od 21R83, tri ili više CDR-a od 21R83, četiri ili više CDR-a od 21R83, pet ili više CDR-a od 21R83 ili svih šest CDR-a od 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens DLL4 vezuje humani DLL4 i mišiji DLL4.
Tabela 2
[0107] U izvesnom ovdašnjem obelodanjivanju, CDR1 teškog lanca DLL4 vezujućeg antitela je minimalni HC CDR1 koji sadrži AYYIH (SEK ID Br:79).
[0108] U izvesnom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujuću agens je antitelo koje vezuje humani DLL4 i sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde je X1serin ili alanin, X2je serin, asparagin ili glicin, X3je asparagin ili lizin, a X4je glinin, arginin ili asparaginska kiselina, a CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br: 16); i laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0109] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koje specifično vezuje humani DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens sadrži: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0110] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens obuhvata: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br: 13) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20),ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (e) CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; i (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, aminokiselinske supstitucije su konzervativne supstitucije.
[0111] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje vezujući agens DLL4 (npr., antitelo) koje specifično vezuje DLL4, pri čemu vezujući agens DLL4 sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br: 10 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:10. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br: 10 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br: 12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br: 10, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji suštinski SEK ID Br: 10 i laki lanac koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID Br:48 i laki lanac koji sadrži SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući antitelo ili drugi agens sadrži teški lanca koji sadrži DLL4 SEK ID Br:6 i laki lanac koji sadrži SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je bispecifično antitelo.
[0112] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koje specifično vezuje humani DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens sadrži: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0113] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens obuhvata: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20),ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (e) CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; i (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, aminokiselinske supstitucije su konzervativne supstitucije.
[0114] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:58. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:12. U određenom objašnjenju ovde, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:58 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:58 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:58, i laki lanac varijabilnog regiona koji se suštinski sastoji iz SEK ID Br:12 U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID Br:56 i laki lanac koji sadrži SEK ID Br:8.
[0115] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koje specifično vezuje humani DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens sadrži: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0116] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens obuhvata: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br: 13) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20),ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (e) CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; i (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, aminokiselinske supstitucije su konzervativne supstitucije.
[0117] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) koji specifično vezuje DLL4, pri čemu DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:64 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:64. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:58 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br: 12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:64 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br: 2. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:64, i laki lanac varijabilnog regiona koji se suštinski sastoji iz SEK ID Br:12 U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID Br:62, a laki lanac koji sadrži SEK ID Br:8. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens je bispecifično antitelo.
[0118] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4 vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID Br:5 i laki lanac koji sadrži SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je bispecifično antitelo.
[0119] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens vezuje DLL4 sa KDod 25nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens vezuje DLL4 sa KDod 10nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens vezuje DLL4 sa KDod 1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens vezuje DLL4 sa KDod 0.1nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens vezuje DLL4 sa KDod 0.01nM ili manje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u najmanje jednom CDR vezujućem agensu DLL4 je supstituisan sa različitu aminokiselinu tako da se afinitet DLL4 vezujućeg agensa za DLL4 menja. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet DLL4-vezujućeg agensa povećan. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet DLL4-vezujućeg agensa smanjen.
[0120] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 21R79 antitela. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži teški lanac i laki lanac 21R79 antitela (sa ili bez liderske sekvence). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je 21R79 antitelo.
[0121] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4-vezujući agens sadrži, sastoji se u suštini iz ili sastoji se iz antitela 21R79.
[0122] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 21R75 antitela. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži teški lanac i laki lanac 21R75 antitela (sa ili bez liderske sekvence). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je 21R75 antitelo.
[0123] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4-vezujući agens sadrži, sastoji se u suštini iz ili sastoji se iz antitela 21R75.
[0124] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 21R83 antitela. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, DLL4-vezujući agens sadrži teški lanac i laki lanac 21R83 antitela (sa ili bez liderske sekvence). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je 21R83 antitelo.
[0125] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4-vezujući agens sadrži, sastoji se u suštini iz ili sastoji se iz antitela 21R83.
[0126] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4-vezujući agens vezuje N-terminalni fragment humanog DLL4 (aminokiseline 1-191 od SEK ID Br:24). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4-vezujući agens vezuje epitop koji sadrži aminokiseline 40-47 SEK ID Br:25. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens vezuje epitop koji sadrži aminokiseline 113-120 SEK ID Br:25. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4-vezujući agens vezuje epitop koji sadrži aminokiseline 40-47 SEK ID Br:25 i aminokiseline 113-120 SEK ID Br:25.
[0127] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom 21R83.
[0128] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens inhibira vezivanje DLL4 na najmanje jedan Notch receptor.
U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, Notch receptor je Notch1, Notch2, Notch3 ili Notch4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens specifično vezuje DLL4 i inhibira aktivnost DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens specifično vezuje DLL4 i inhibira Notch signalizaciju. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4 vezujući agens specifično vezuje DLL4 i moduliše angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens specifično vezuje DLL4 i inhibira rast tumora. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4-vezujući agens specifično vezuje DLL4 i inhibira tumorogenicitet. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4 vezujući agens specifično vezuje DLL4 i smanjuje broj ili učestalost CSC u tumoru.
[0129] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje, VEGF/DLL4 vezujući agens koji je bispecifično antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4, vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje specifično vezuje humani VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje metu u vezi sa tumorom. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani VEGF, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), teški lanac CDR2 sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), teški lanac CDR2 koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18), i teški lanac CDR3 koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), i (b) laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0130] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo za vezivanje VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% % sekvencijalnog identiteta sa SEK ID Br:11 i varijabilnim regionom lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identiteta sekvence SEK ID Br:12.
[0131] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje, VEGF/DLL4 vezujući agens koji je bispecifično antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4, vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje specifično vezuje humani DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4 i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje metu u vezi sa tumorom. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), teški lanac CDR2 koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde X1je serin ili alanin, X2is serin, asparagin, ili glicin, X3je asparagin ili lizin i X4je glisin, arginina ili asparaginske kiseline i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), ili YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14) i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15) i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59) i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65) i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži: CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14) YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), ili YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16) i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i svetlo lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0132] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, sredstvo za vezivanje VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje obuhvata varijabilni region prvog teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:58, ili SEK ID Br:64. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence SEK ID Br:9, SEK ID Br: 10, SEK ID Br:58 ili SEK ID Br:64; i/ili varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12.
[0133] Obelodanjivanje takođe pruža VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., bispecifično antitelo) koje specifično vezuje humani VEGF i human DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži: a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži težak lanac CDR1 koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br: 19); gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br: 13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), teški lanac CDR2 koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde X1je serin ili alanin, X2je serin, asparagin ili glicin, X3je asparagin ili lizin, a X4je glinin, arginin ili asparaginska kiselina, a CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br: 16); i laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59) ili YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65) CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0134] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je 219R45-MB-21R79.
[0135] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je 219R45-MB-21M18.
[0136] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je 219R45-MB-21R75.
[0137] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je 219R45-MB-21R83.
[0138] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo ) sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:58, ili SEK ID Br:64, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični agens za vezivanje VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; drugi varijabilni region teškog lanca koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:58 ili SEK ID Br:64; i prvog i drugog varijabilnog regiona lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence SEK ID Br:9 i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence SEK ID Br:10 i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence SEK ID Br:58 i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence SEK ID Br:64 i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:9, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:10, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:58, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:64, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:9, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/ DLL4-vezujući agens sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:11, drugi region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br: 10 i prvog i drugog varijabilnog regiona lakog lanca koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:58, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4 sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:11, drugi varijabilni region teškog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:64, i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji suštinski se sastoji od SEK ID Br:12.
[0139] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od anti-VEGF antitela 219R45. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21M18. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21R79. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21R75. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21R83. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata varijabilni region teškog lanca od antitela anti-VEGF 219R45, varijabilnog regiona teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21R79 i dva identična varijabilna regiona lakog lanca . U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata varijabilni region teškog lanca od antitela anti-VEGF 219R45, varijabilnog regiona teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21M18 i dva identična varijabilna regiona lakog lanca . U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata varijabilni region teškog lanca od antitela anti-VEGF 219R45, varijabilnog regiona teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21R75 i dva identična varijabilna regiona lakog lanca . U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata varijabilni region teškog lanca od antitela anti-VEGF 219R45, varijabilnog regiona teškog lanca od anti-DLL4 antitela 21R83 i dva identična varijabilna regiona lakog lanca .
[0140] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi CH3 domen i drugi CH3 domen, od kojih je svaki modifikovan da promoviše formiranje heteromultimera. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, prvi i drugi CH3 domeni su modifikovani korišćenjem tehnike čvor-u-rupi. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, prvi i drugi CH3 domeni sadrže promene u aminokiselinama koje rezultiraju izmenjenim elektrostatičkim interakcijama. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, prvi i drugi CH3 domeni sadrže promene u aminokiselinama koje rezultiraju izmenjenim hidrofobnim/hidrofilnim interakcijama.
[0141] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantne regione teških lanaca izabranih iz grupe koja se sastoji iz: (a) prvog humanog konstantnog regiona IgG1, pri čemu su aminokiseline na pozicijama 253 i 292 supstituisane sa glutamatom ili aspartatom i drugi humani konstantni region IgG1, pri čemu su aminokiseline na pozicijama 240 i 282 supstituisane
sa lizinom; (b) prvi humani konstantni region IgG2, pri čemu su aminokiseline na pozicijama 249 i 288 supstituisane sa glutamatom ili aspartatom, a drugi humani konstantni region IgG2 gde su aminokiseline na pozicijama 236 i 278 supstituisane sa lizinom; (c) prvi humani konstantni region IgG3, pri čemu su aminokiseline na pozicijama 300 i 339 supstituisane sa glutamatom ili aspartatom, a drugi humani konstantni region IgG3 gde su aminokiseline na pozicijama 287 i 329 supstituisane sa lizinom; i (d) prvi humani konstantni region IgG4, pri čemu su aminokiseline na pozicijama 250 i 289 supstituisane sa glutamatom ili aspartatom, a drugi konstantni region IgG4 gde su aminokiseline na pozicijama 237 i 279 zamenjene lizinom.
[0142] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni humani region IgG1 sa aminokiselinskim supstancama na pozicijama 253 i 292, pri čemu su aminokiseline glutamat ili aspartat i drugi humani IgG1 konstantni region sa aminokiselinskim supstitucijama na pozicijama 240 i 282, pri čemu su aminokiseline lizin. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni humani region IgG2 sa aminokiselinskim supstancama na pozicijama 249 i 288, pri čemu su aminokiseline glutamat ili aspartat i drugi humani IgG2 konstantni region sa aminokiselinskim supstitucijama na pozicijama 236 i 278, pri čemu su aminokiseline lizin. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni humani region IgG2 sa aminokiselinskim supstancama na pozicijama 300 i 339, pri čemu su aminokiseline glutamat ili aspartat i drugi humani IgG2 konstantni region sa aminokiselinskim supstitucijama na pozicijama 287 i 329, pri čemu su aminokiseline lizin. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni humani region IgG4 sa aminokiselinskim supstancama na pozicijama 250 i 289, pri čemu su aminokiseline glutamat ili aspartat i drugi humani IgG4 konstantni region sa aminokiselinskim supstitucijama na pozicijama 237 i 279, pri čemu su aminokiseline lizin.
[0143] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni humani region IgG2 sa aminokiselinskim supstancama na pozicijama 249 i 288, pri čemu su aminokiseline glutamat ili aspartat i drugi humani IgG2 konstantni region sa aminokiselinskim supstitucijama na pozicijama 236 i 278, pri čemu su aminokiseline lizin. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, vezujući agens VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni humani region IgG2 sa aminokiselinskim supstancama na pozicijama 249 i 288, pri čemu su aminokiseline glutamat ili aspartat i drugi humani IgG2 konstantni region sa aminokiselinskim supstitucijama na pozicijama 236 i 278, pri čemu su aminokiseline lizin.
[0144] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:7. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:5. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:56. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:62. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži laki lanac SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:7, teški lanac SEK ID Br:5 i dva laka lanca SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:7, teški lanac SEK ID Br:6 i dva laka lanca SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:7, teški lanac SEK ID Br:56 i dva laka lanca SEK ID Br:8. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac SEK ID Br:7, teški lanac SEK ID Br:62 i dva laka lanca SEK ID Br:8.
[0145] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje vezuje VEGF sa KDod oko 50nM ili manje, oko 25nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1nM ili manje, ili oko 0.1nM ili manje. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje vezuje DLL4 sa KDod oko 50nM ili manje, oko 25nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1nM ili manje, ili oko 0.1nM ili manje. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4-vezujući agens je bispecifično antitelo koje vezuje VEGF sa KDod oko 50nM ili manje i vezuje DLL4 sa KDod oko 50nM ili manje. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo vezuje VEGF sa KDod oko 25nM ili manje i vezuje DLL4 sa KDod oko 25nM ili manje. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo vezuje VEGF sa KDod oko 10nM ili manje i vezuje DLL4 sa KDod oko 10nM ili manje. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo vezuje VEGF sa KDod oko 1nM ili manje i vezuje DLL4 sa KDod oko 1nM ili manje.
[0146] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži jedno mesto za vezivanje antigena sa afinitetom vezivanja koja je slabija od afiniteta vezivanja za drugo mesto za vezivanje antigena. Na primer, u određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo može vezati VEGF sa KDu rasponu od oko 0.1nM do 1nM i može vezati DLL4 sa KD u rasponu od oko 1nM do 10nM. Ili bispecifično antitelo može vezati VEGF sa KDu rasponu od oko 1nM do 10nM i može vezati DLL4 sa KDu rasponu od oko 0.1nM do 1nM. Na primer, u određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo može vezati DLL4 sa KDu rasponu od oko 0.1nM do 1nM i može vezati VEGF sa KD u rasponu od oko 1nM do 10nM. Ili bispecifično antitelo može vezati DLL4 sa KDu rasponu od oko 1nM do 10nM i može vezati VEGF sa KDu rasponu od oko 0.1nM do 1nM. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjem, razlika u afinitetu između dva mesta za vezivanje antigena može biti oko 2- ili više, oko 3 puta ili više, oko 5 puta ili više, oko 8 puta ili više, oko 10 puta ili više, oko 15 puta ili više, oko 30 puta ili više, oko 50 puta ili više, ili oko 100 puta ili više. U nekom obelodanjivanju ovde, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u najmanje jednom CDR antigen vezujućeg mesta za VEGF je supstituisan sa različitom aminokiselinom tako da je afinitet VEGF vezujućeg mesta izmenjen. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet VEGF-vezujućeg agensa povećan. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet VEGF-vezujućeg agensa povećan. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u najmanje jednom CDR za za DLL4 antigena je supstituisan sa različitu aminokiselinu tako da se afinitet DLL4 vezujućeg mesta menja. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet DLL4-vezujućeg agensa povećan. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima je afinitet DLL4-vezujućeg agensa smanjen. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima afiniteti obe VEGF i DLL4 antigen vezujuće lokacije su izmenjeni.
[0147] Obelodanjivanje obezbeđuje polipeptide, uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitela koja specifično vezuju VEGF i/ili DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, polipeptid vezuje humani VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, polipeptid vezuje humani DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, polipeptid vezuje humani VEGF i mišiji VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polipeptid vezuje humani DLL4 i mišiji DLL4.
[0148] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:3, SEK ID Br:4, SEK ID Br:7, SEK ID Br:8, SEK ID Br:11, SEK ID Br:12, SEK ID Br:47 i SEK ID Br:49.
[0149] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:4, SEK ID Br:5, SEK NO ID:6, SEK ID Br:8, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:12, SEK ID Br:46, SEK ID Br:48, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63, i SEK ID Br:64.
[0150] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:3, SEK ID Br:4, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:7, SEK ID Br:8, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:11, SEK ID Br:12, SEK ID Br:46, SEK ID Br:47, SEK ID Br:48, SEK ID Br:49, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63 i SEK ID Br:64.
[0151] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:46, SEK ID Br:48, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63, i SEK ID Br:64. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:3, SEK ID Br:7, SEK ID Br:11, SEK ID Br:47, i SEK ID Br:49. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:4, SEK ID Br:8, i SEK ID Br:12.
[0152] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:3, SEK ID Br:7, SEK ID Br:11, SEK ID Br:47, i SEK ID Br:49. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:46, SEK ID Br:48, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63, i SEK ID Br:64. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:4, SEK ID Br:8, i SEK ID Br:12.
[0153] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) se takmiči za specifično vezivanje za VEGF sa antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens takmiči se sa antitelom 219R45 za specifično vezivanje za humani VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens ili antitelo se takmiče za specifično vezivanje za VEGF u in vitro kompetetivnom vezivnom testu. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF je humani VEGF. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF je mišiji VEGF.
[0154] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF-DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na VEGF kao antitelo obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na VEGF koje se preklapa sa epitopom na VEGF vezanom sa antitelom obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na VEGF kao antitelo 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na VEGF koje se preklapa sa epitopom na VEGF vezanom sa antitelom 219R45.
[0155] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje VEGF sa antitelom 219R45 (npr., u konkurentnom vezivnom testu).
[0156] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) se takmiči za specifično vezivanje za DLL4 sa antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID Br:9 SEK ID Br:10, SEK ID Br:58, or SEK ID Br:64 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens takmiči se sa antitelom 21R79 za specifično vezivanje humanog DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens takmiči se sa antitelom 21R75 za specifično vezivanje humanog DLL4 . U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens takmiči se sa antitelom 21R83 za specifično vezivanje humanog DLL4 . U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens ili antitelo se takmiče za specifično vezivanje za DLL4 u in vitro kompetetivnom vezivnom testu. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 je humani DLL4. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, DLL4 je mišiji DLL4.
[0157] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom obelodanjivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, na DLL4 kao antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop na DLL4 koje se preklapa sa epitopom na DLL4 vezanom sa antitelom 21R83.
[0158] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 sa antitelom 21R79 (npr., u konkurentnom vezivnom testu). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 sa antitelom 21R75 (npr., u konkurentnom vezivnom testu). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 sa antitelom 21R83 (npr., u konkurentnom vezivnom testu). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 sa antitelom 21M18 (npr., u konkurentnom vezivnom testu).
[0159] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 i/ili DLL4 sa antitelom 219R45-MB-21M18 (npr., u konkurentnom vezivnom testu). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 i/ili DLL4 sa antitelom 219R45-MB-21M79 (npr., u konkurentnom vezivnom testu). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 i/ili DLL4 sa antitelom 219R45-MB-21M75 (npr., u konkurentnom vezivnom testu). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je agens koji se takmiči za specifično vezivanje DLL4 i/ili DLL4 sa antitelom 219R45-MB-21M83 (npr., u konkurentnom vezivnom testu).
[0160] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) opisan ovde vezuje VEGF i modulira VEGF aktivnost. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je VEGF antagonist i inhibira VEGF aktivnost. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je VEGF antagonist i modulira angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je VEGF antagonist i inhibira angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je VEGF antagonist i inhibira rast tumora.
[0161] U određenom obelodanjivanju ovde, agens za vezivanje VEGF/DLL4 (npr., antitelo) opisano ovde vezuje humani DLL4 i modulira DLL4 aktivnost. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je DLL4 antagonist i inhibira DLL4 aktivnost. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je DLL4 antagonist i inhibira Notch aktivnost. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je DLL4 antagonist i inhibira Notch signalizaciju. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je DLL4 antagonist i modulira angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je DLL4 antagonist i promoviše aberantnu angiogenezu. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je DLL4 antagonist i inhibira rast tumora.
[0162] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4-vezujući agens (npr. antitelo) opisan ovde je bispecifično antitelo koje vezuje humani VEGF i moduliše VEGF aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4-vezujući agens (npr. antitelo) opisan ovde je bispecifično antitelo koje vezuje humani DLL4 i moduliše DLL4 aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, agens za vezivanje VEGF/DLL4 (npr., antitelo) opisano ovde vezuje humani VEGF i humani DLL4 i modulira i VEGF i DLL4 aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i inhibira i VEGF aktivnost i DLL4 aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i inhibira i VEGF aktivnost i Notch aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i inhibira i VEGF aktivnost i Notch signalizaciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i moduliše angiogenezu. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i promoviše abernatnu angiogenezu. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i inhibira angiogenezu. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo je VEGF antagonist i DLL4 antagonist i inhibira rast tumora.
[0163] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo ili bispecifično antitelo) je VEGF antagonist. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je VEGF antagonist i inhibira VEGF aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira aktivnost VEGF za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% %, ili oko 100%. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu VEGF aktivnost je antitelo 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu VEGF aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 219R45. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu VEGF aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu VEGF aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu VEGF aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu VEGF aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83.
[0164] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) je DLL4 antagonist. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je DLL4 antagonist i inhibira DLL4 aktivnost. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira aktivnost DLL4 za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% %, ili oko 100%. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R83. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83.
[0165] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) je Notch signalizacija. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira Notch signalizaciju za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% %, ili oko 100%. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 219R45-MB21M18. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 219R45-MB-21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 219R45-MB-21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira Notch signalizaciju je antitelo 219R45-MB-21R83.
[0166] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) inhibira vezivanje VEGF na najmanje jedan receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira vezivanje VEGF na VEGFR-1 ili VEGFR-2. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira VEGF vezivanje za barem jedan VEGF receptor za najmanje oko 10%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% %, ili bar oko 95%. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog VEGF na barem jedan VEGF receptor antitelo 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje VEGF za najmanje jedan VEGF receptor je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog VEGF na barem jedan VEGF receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog VEGF na barem jedan VEGF receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog VEGF na barem jedan VEGF receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog VEGF na barem jedan VEGF receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83.
[0167] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) inhibira vezivanje DLL4 na najmanje jedan Notch receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira vezivanje DLL4 na Notch1, Notch2, Notch3 i/ili Notch4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens inhibira barem jedan Notch receptor za najmanje oko 10%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% %, ili bar oko 95%. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezujući humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezujući humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezujući humanu DLL4 aktivnost je bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji inhibira vezivanje humanog DLL4 na barem jedan Notch receptor je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83.
[0168] In vivo i in vitro analize za određivanje da li VEGF/DLL4 vezujući agens (ili kandidat za vezivanje VEGF/DLL4-veziva) inhibira VEGF ili utiče na angiogenezu su poznati u tehnici. In vitro testovi angiogeneze uključuju, ali nisu ograničeni na, HUVEC analize proliferacije, testove formiranja endotelnih ćelija, ispitivanja kaljenja (ili formiranja kalupa), HUVEC testova migracije ćelija i analiza invazije. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, ćelije u prisustvu VEGF i prisustvo vezujućeg agensa VEGF/DLL4-a se upoređuju sa ćelijama u prisustvu VEGF bez prisutnog vezujućeg agensa VEGF/DLL4 i procenjene za efekte na angiogenezu (ili biološke efekti povezani sa angiogenezom). In vivo ispitivanja angiogeneze uključuju, ali se ne ograničavaju na, testove matrigel plugova, analize mikrodžepa rožnjače i analize pilula hlorioalantoične membrane (CAM).
[0169] In vivo i in vitro analize za određivanje da li VEGF/DLL4 vezujući agens (ili kandidat za vezivanje VEGF/DLL4-veziva) inhibira Notch aktivaciju ili signalizaciju su poznati u tehnici. Na primer, testovi reportera luciferaze bazirani na ćeliji koje koriste reporter vektor TCF/Luc koji sadrže više kopija TCF vezujućeg domena uzvodno od gena luciferaze svitca, može se koristiti za merenje nivoa signalizacije Notch in vitro (Gazit i dr., 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA). U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, može se koristiti ćelijski izveštaj o luciferazi, baziran na ćeliji, sa izveštajem luciferaze koji koristi CBF/Luc reporter vektor koji sadrži višestruke kopije CBF-vezujućeg domena uzvodno od luciferaze svitca. Nivo Notch signalizacije u prisustvu jednog ili više Notch liganda (npr., DLL4 izražen na površini transfektovanih ćelija ili rastvorljivog DLL4-Fc fuzionog proteina) i u prisustvu agenasa za vezivanje VEGF/DLL4 se upoređuje sa nivoom Notch signala bez prisutnog VEGF/DLL4 vezujućeg sredstva.
[0170] U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi maju jedan ili više od sledećih efekata: inhibiraju proliferaciju tumorskih ćelija, inhibiraju rast tumora, umanjuju tumorogeničnost tumora, smanjuju učestalost matičnih ćelija kancera u tumoru, okidači su ćelijske smrti tumorskih ćelija, sprečavaju metastazu tumorskih ćelija, smanjuju preživljavanje tumorskih ćelija, moduliraju angiogenezu, inhibiraju angiogenezu, inhibiraju produktivnu angiogenezu ili promovišu aberantnu angiogenezu.
[0171] U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je sposoban inhibira rast tumora. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi mogu da inhibiraju rast tumora in vivo (npr., u modelu ksenografta miša i/ili kod čoveka koji ima kancer). U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, rast tumora je inhibiran barem oko dva puta, oko tri puta, oko pet puta, oko deset puta, oko 50 puta, oko 100 puta ili oko 1000 puta u poređenju sa netretiranim tumorom.
[0172] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4-vezujući agensi mogu da smanjuju tumorogeničnost tumora. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4-vezujući agens ili antitelo može da smanji tumorogeničnost tumora koji sadrži matične ćelije kancera u životinjskom modelu, kao što je model ksenografta miša. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući ili antitelo može smanjiti tumorogeničnost tumora smanjujući broj ili učestalost matičnih ćelija kancera u tumoru. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, broj ili učestalost matičnih ćelija kancera u tumoru je smanjen za najmanje oko dva puta, oko tri puta, oko pet puta, oko deset puta, oko 50 puta, oko 100 puta , ili oko 1000 puta. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, smanjenje broja ili učestalosti matičnih ćelija kancera određuje se ograničavanjem analize razblaženja pomoću modela životinja. Dodatni primeri i smernice u vezi s korišćenjem ograničavajućih analiza dilucije za određivanje smanjenja broja ili učestalosti matičnih ćelija karcinoma u tumoru mogu se naći, npr., u međunarodnom broju objave WO 2008/042236; patenta SAD br.2008/0064049; i patenta SAD br.2008/0178305.
[0173] U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je sposoban modulacije angiogenezu. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi mogu da moduliraju angiogenezu in vivo (npr., u modelu ksenografta miša i/ili kod čoveka koji ima kancer). U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je sposoban da inhibira angiogenezu. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je sposoban da inhibira angiogenezu. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je sposoban da inhibira angiogenezu i/ili da promoviše aberantnu angiogenezu, što dovodi do neproduktivne vaskularizacije.
[0174] U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens, opisan ovde, ima cirkulišući polu-raspad kod miševa, majmuna makaki ili ljudi od najmanje oko 2 sata, najmanje oko 5 sati, najmanje oko 10 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 3 dana, najmanje oko 1 nedelje, ili bar oko 2 nedelje. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je IgG (npr. IgG1 ili IgG2) antitelo koje ima cirkulišući polu-raspad kod miševa, makaki majmuna ili ljudi od najmanje oko 2 sata, najmanje oko 5 sati , najmanje oko 10 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 3 dana, najmanje oko 1 nedelje ili najmanje oko 2 nedelje. Metode povećanja (ili smanjenja) polu-raspada agenasa kao što su polipeptidi i antitela poznate su u stanju tehnike. Na primer, poznate metode povećanja cirkulišućeg poluraspada IgG antitela uključuju uvođenje mutacija u regionu Fc koji povećavaju pH-zavisno vezivanje antitela na neonatalni Fc receptor (FcRn) na pH 6.0 (videti, npr., patentne objave SAD br. 2005/0276799, 2007/0148164 i 2007/0122403). Poznate metode povećanja cirkulišućeg polu-raspada fragmenata antitela koji nedostaju Fc region uključuju takve tehnike kao što je PEGilacija.
[0175] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi su antitela. Poliklonska antitela mogu se pripremiti bilo kojom poznatom metodom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, poliklonska antitela se proizvode imunizacijom životinje (npr., zeca, pacova, miša, koze, magarca) sa antigenom od interesa (npr., prečišćeni peptidni fragment, rekombinantni protein u punoj dužini ili fuzioni protein) putem više subkutanih ili intraperitonealnih injekcija. Antigen može biti opciono konjugovan sa nosačem kao što je hemocijanin (KLH) ili serumski albumin. Antigen (sa ili bez nosećeg proteina) se razblaži u sterilnom fiziološkom rastvoru i obično se kombinuje sa adjuvansom (npr., kompletnim ili nekompletnim Freundovim adjuvansom) kako bi se formirala stabilna emulzija. Posle dovoljnog vremenskog perioda, poliklonska antitela se obnavljaju od imunizirane životinje, obično iz krvi ili ascita. Poliklonska antitela mogu biti prečišćena od seruma ili ascita prema standardnim metodama u struci uključujući, bez ograničavanja, afinitetnu hromatografiju, jonizujuću hromatografiju, gel elektroforezu i dijalizu.
[0176] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi su antitela. Monoklonska antitela mogu biti pripremljena korišćenjem metoda hibridoma poznatih u struci (videti, na primer, Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, koristeći hibridom metod, miš, hrčak ili druga odgovarajuća životinjska životinja, imunizirana je kako je opisano u prethodnom tekstu, kako bi iz limfocita nastala proizvodnja antitela koja specifično vezuju imunizovani antigen. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, imunizovani antigen može biti humani protein ili njegov deo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, imunizovani antigen može biti mišiji protein ili njegov deo.
[0177] Nakon imunizacije, limfociti su izolovani i spojeni s pogodnom ćelijskom linijom mijeloma koristeći, na primer, polietilen glikol. Ćelije hibridoma se biraju koristeći specijalizovane medije kao što je poznato u struci i neiskorišćeni limfociti i ćelije mijeloma ne prežive proces selekcije. Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela usmerena specifično protiv odabranog antigena mogu se identifikovati različitim metodama uključujući, ali ne ograničavajući se na imunoprecipitacije, imunoblotiranje i testove vezivanja in vitro (npr., Protočna citometrija, FACS, ELISA i radioimunotest). Hibridomi se mogu propagirati ili u in vitro kulturi koristeći standardne metode (J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA) ili in vivo kao ascitni tumori kod životinja. Monoklonska antitela mogu biti prečišćena od medijuma kulture ili ascita prema standardnim metodama u struci uključujući, bez ograničavanja, afinitetnu hromatografiju, jonizujuću hromatografiju, gel elektroforezu i dijalizu.
[0178] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, monoklonska antitela se mogu napraviti pomoću tehnika rekombinantne DNK kao što je poznato stručnjaku u struci. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo se izoluju iz zrelih B-ćelija ili hibridoma ćelija, kao što je RT-PCR koristeći oligonukleotidne prajmere koji specifično pojačavaju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela, a njihova sekvenca se određuje koristeći standardne tehnike. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance zatim se kloniraju u odgovarajuće vektore ekspresije koji proizvode monoklonska antitela kada se transfektuju u ćelije domaćina kao što su E. coli, simian COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje ne u suprotnom proizvode proteine imunoglobulina.
[0179] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, rekombinantna monoklonalna antitela ili njihovi fragmenti mogu biti izolovani iz biblioteka fagnog prikaza koji izražavaju varijabilne domene ili CDR željene vrste (videti npr., McCafferty i dr., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson i dr., 1991, Nature, 352:624-628; i Marks i dr., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
[0180] Polinukleotid(i) koji kodiraju monoklonsko antitelo mogu se modifikovati, na primer, korišćenjem rekombinantne DNK tehnologije za stvaranje alternativnih antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, konstantni domeni lakih i teških lanaca, na primer, monoklonsko antitelo za miš može biti zamenjen onim regionima, na primer, ljudskim antitelom za stvaranje himernog antitela ili za ne-imunoglobulinski polipeptid da generišu fuziono antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, konstantni regioni su skraćeni ili uklonjeni da bi se dobio željeni fragment antitela monoklonskog antitela. Lokalno usmerena ili mutageneza velike varijante varijabilnog regiona može se koristiti za optimizaciju specifičnosti, afiniteta i slično monoklonskih antitela.
[0181] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, monoklonsko antitelo protiv VEGF i/ili DLL4 je humanizovano antitelo. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima se ostaci CDR-a zamenjuju ostatkom CDR-a ne-humane vrste (npr., miš, pacov, zec, hrčak i sl.) Koji imaju željenu specifičnost, afinitet i/ili sposobnost vezivanja koristeći metode poznate stručnjaku. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ostaci humanog imunoglobulina okvirnog regiona Fv zamenjuju se odgovarajućim ostacima u antitelu od ne-humane vrste koja ima željenu specifičnost, afinitet i/ili sposobnost vezivanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, humanizovano antitelo može se dalje modifikovati supstitucijom dodatnih ostataka ili u okvirima Fv okvira i/ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka radi poboljšanja i optimizacije specifičnosti, afiniteta i/ili vezivanja antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva ili tri varijabilna regiona domena koji sadrže sve ili suštinski sve CDR koji odgovaraju ne-humanom imunoglobulinu, dok su svi ili suštinski svi okvirni regioni oni humane imunoglobulinske konsenzusne sekvence. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, humanizovano antitelo može takođe sadržati barem deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), tipično onog humanog imunoglobulina. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, takva humanizovana antitela se koriste terapeutski, jer mogu da smanjuju antigeničnost i HAMA (human anti-mišija antitela) reakcije kada se daju humanom subjektu. Stručnjak bi mogao da dobije funkcionalno humanizovano antitelo sa smanjenom imunogenosti nakon poznatih tehnika (videti npr., patente SAD br.5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; i 5,693,762).
[0182] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je humano antitelo. Humana antitela mogu se direktno pripremati korišćenjem različitih tehnika poznatih u stanju tehnike. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, humana antitela mogu biti generisana od imortalizovanih humanih B limfocita imuniziranih in vitro ili iz limfocita izolovanih od imuniziranog pojedinca. U svakom slučaju, ćelije koje proizvode antitelo usmereno protiv ciljnog antigena mogu se generisati i izolovati (videti, npr., Cole i dr., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer i dr., 1991, J. Immunol., 147:86-95; i patent SAD br. 5,750,373; 5,567,610; i 5,229,275). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, humano antitelo može se odabrati iz biblioteke faga, gde ta biblioteka eksprimira humana antitela (Vaughan i dr., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets i dr., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks i dr., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Alternativno, tehnologija fagnog prikaza se može koristiti za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, od repertoara genskih varijabli domena iz neimunizovanih donora. Takođe su opisane tehnike za generisanje i upotrebu biblioteka faga antitela patent SAD br.5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; i 7,264,963; i Rothe i dr., 2008, J. Mol. Bio., 376:1182-1200. Kada se identifikuju antitela, strategija zrelosti afiniteta koja je poznata u struci, uključujući, ali bez ograničenja, lančano pomeranje (Marks i dr., 1992, Bio/Technology, 10:779-783) i mutageneza usmerena na lokaciju, mogu se koristiti za generisanje humanih antitela sa visokim afinitetom.
[0183] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, humana antitela se mogu napraviti u transgenskim miševima koji sadrže humane imunoglobulinske lokuse. Nakon imunizacije, ovi miševi mogu da proizvedu potpuni repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulin Ovaj prilaz je opisana u patent SAD br.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016.
[0184] Ovo obelodanjivanje takođe obuhvata bispecifična antitela. Bispecifična antitela mogu da prepoznaju i vezuju najmanje dva različita antigena ili epitopa. Različiti epitopi mogu biti u istom molekulu (npr., dva epitopa na jednom proteinu) ili na različitim molekulima (npr., jedan epitop na proteinu i jedan epitop na drugom proteinu). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo ima povećanu potenciju u poređenju sa pojedinačnim antitelom ili kombinacijom više od jednog antitela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo ima smanjenu toksičnost u poređenju sa pojedinačnim antitelom ili kombinacijom više od jednog antitela. Poznato je stručnjacima da bilo koji vezujući agens (npr., antitelo) može imati jedinstvenu farmakokinetiku (PK) (npr., polu-raspad u cirkulaciji). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da sinhronizuje PK dva aktivna agensa za vezivanje, pri čemu dva pojedinačna veziva imaju različite PK profile. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da koncentriše postupke dva vezujuća agensa (npr., antitela) u zajedničkom području (npr., tumor i/ili tumorsko okruženje). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da koncentriše dejstva dva vezujuća sredstva (npr., antitela) u zajedničku ciljanu (npr., tumor ili tumorsku ćeliju). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da cilja akcije dva vezujuća agensa (npr., antitela) za više od jednog biološkog puta ili funkcije.
[0185] U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo specifično vezuje VEGF i drugi cilj. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo specifično vezuje DLL4 i drugi cilj. U određenom ovdašnjem otelotvorenju, bispecifično antitelo specifično vezuje VEGF i DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo specifično vezuje humani VEGF i humanih DLL4. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo je monoklonski humano antitelo ili humanizovano antitelo. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo inhibira angiogenezu i smanjuje broj ili frekvencu matičnih ćelija kancera. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo inhibira rast krvnih sudova i sprečava sazrevanje krvnih sudova. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo sprečava entotelijalnu hiperproliferaciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo ima smanjenu toksičnost i/ili neželjene efekte. U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo ima smanjenu toksičnost i/ili neželjene efekte u poređenju sa mešavinom dva individualna antitela ili antitela kao pojedinačnih agenasa. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo ima povećan terapeutski indeks. U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo ima povećan terapeutski indeks u poređenju sa mešavinom dve pojedinačne antitela ili antitela kao pojedinačnih agenasa.
[0186] U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifično antitelo može specifično prepoznati i vezati prvi ciljani antigena (npr., DLL4), kao i drugi antigenski cilj, kao što je efektorski molekul na leukocitu (npr., CD2, CD3, CD28 ili B7) ili Fc receptor (npr., CD64, CD32 ili CD16) kako bi se ćelijski odbrambeni mehanizmi fokusirali na ćeliju koja eksprimira prvu antigensku metu. U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifična antitela mogu se koristiti za usmeravanje citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju određeni ciljni antigen. Ova antitela poseduju mesto za vezivanje antigena (npr., za humanu DLL4) i drugo mesto koje vezuje citotoksični agens ili kelator radionuklida, kao što su EOTUBE, DPTA, DOTA ili TETA.
[0187] Tehnike za izradu bispecifičnih antitela su poznati stručnjacima, videti, na primer, Millstein i dr., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan i dr., 1985, Science, 229:81; Suresh i dr., 1986, Methods in Enzymol., 121:120; Traunecker i dr., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby i dr., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny i dr., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruber i dr., 1994, J. Immunol., 152:5368; patent SAD br. 5,731,168; međunarodna objava br.. WO 2009/089004; i patent objava SAD br.2011/0123532. U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifična antitela sadrže konstantne regione težeg lanca sa modifikacijama u aminokiselinama koje su deo interfejsa između dva teška lanca. U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifična antitela mogu se generisati pomoću strategije "čvorova u rupama" (videti npr.., patent SAD br. 5,731,168; Ridgway et. al., 1996, Prot. Engin., 9:617-621). Ponekad terminologija "čvorovi" i "rupe" zamenjuje se terminima "protuberance" i "šupljine". U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, bispecifična antitela mogu da sadrže varijantne zglobne regione nesposobne za formiranje disulfidnih veza između teških lanaca (videti, npr., WO 2006/028936). U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, modifikacije mogu sadržati promene aminokiselina koje rezultiraju izmenjenim elektrostatičkim interakcijama. U nekim ovdašnjem obelodanjivanju, modifikacije mogu sadržati promene aminokiselina koje rezultiraju izmenjenim hidrofobnim/hidrofilnim interakcijama.
[0188] Bispecifična antitela mogu biti netaknuta antitela ili fragmenti antitela koji sadrže antigen vezujuća mesta. Takođe su razmatrane antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela (Tutt i dr., 1991, J. Immunol., 147:60). Prema tome, u određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitela na VEGF i/ili DLL4 su multispecifična.
[0189] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitela (ili drugi polipeptidi) opisani ovde mogu biti monospecifični. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, svako od jednog ili više antigen vezujućih mesta koje antitelo sadrži sposobnost vezivanja (ili vezuje) homolognog epitopa na različitim proteinama.
[0190] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je fragment antitela. Frakcije antitela mogu imati različite funkcije ili sposobnosti od netaknutih antitela; na primer, fragmenti antitela mogu povećati penetraciju tumora. Poznate su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela uključujući, ali ne ograničavajući se na, proteolitičku digestiju netaknutih antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, fragmenti antitela uključuju F(ab')2 fragment proizveden digestijom pepsina molekula antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, fragmenti antitela uključuju Fab fragment dobijen redukcijom disulfidnih mostova F(ab')2 fragmenta. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, fragmenti antitela uključuju Fab fragment dobijen tretmanom molekula antitela sa papainom i agensom za redukciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju ovde se fragmenti antitela stvaraju rekombinantno. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju fragmenti antitela uključuju Fv ili jednolančane Fv (scFv) fragmente. Fab, Fv i scFv fragmenti antitela mogu se eksprimirati i izlučiti iz E. coli ili drugih ćelija domaćina, omogućavajući proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, fragmenti antitela su izolovani iz fagnih biblioteka antitela, kao što je ovde diskutovano. Na primer, metode se mogu koristiti za konstrukciju Fab ekspresnih biblioteka (Huse i dr., 1989, Science, 246:1275-1281) kako bi se omogućila brza i efektivna identifikacija monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za VEGF i/ili DLL4 ili derivati, fragmenti, analogi ili homologi. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, fragmenti antitela su fragmenti linearnih antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, fragmenti antitela su monospecifični ili bispecifični. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je scFv. Različite tehnike mogu se koristiti za proizvodnju jednolančanih antitela specifičnih za VEGF ili DLL4 (videti, npr., patent SAD br.4,946,778).
[0191] Takođe je poželjno, naročito u slučaju fragmenata antitela, da modifikuje antitelo kako bi se promenilo (npr., povećalo ili smanjilo) njegov polu-raspad u serumu. Ovo se može postići, na primer, inkorporiranjem epitopa vezujućeg receptorskog receptora u fragment antitela mutacijom odgovarajućeg regiona u fragmentu antitela ili inkorporiranjem epitopa u peptidnu oznaku koja se onda spaja na fragment antitela na bilo kom kraju ili u sredini (npr., putem DNK ili sinteze peptida).
[0192] Heterokonjugatna antitela su takođe u okviru predmetnog obelodanjivanja. Heterokonjugatna antitela su sastavljena od dva kovalentno vezana antitela. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju imune ćelije na neželjene ćelije (videti, na primer, patent SAD br.4,676,980). Takođe se razmišlja da heterokonjugatna antitela mogu biti pripremljena in vitro korišćenjem poznatih metoda u hemijskoj sintetičkoj proteini, uključujući ona koja uključuju agense za ukrštanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati koristeći reakciju disulfidne razmene ili formiranjem tioeterske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
[0193] U svrhe predmetnog obelodanjivanja, treba imati u vidu da modifikovana antitela mogu da sadrže bilo koji tip varijabilnog regiona koji obezbeđuje povezivanje antitela sa ciljem (tj., humanog VEGF ili humanog DLL4). U tom pogledu varijabilni region može sadržati ili biti dobijen iz bilo koje vrste sisara koji se može indukovati da montira humoralni odgovor i generiše imunoglobulin protiv željenog antigena. Kao takav, varijabilni region modifikovanih antitela može biti, na primer, čoveka, glodara, primata koji nije čovek (npr., majmuni makaki, makaki, itd.) Ili porekla zeca. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, i varijabilni i konstantni regioni modifikovanih imunoglobulina su humani. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično izvedeni iz izvora koji nisu čovek) mogu biti projektovani ili posebno prilagođeni radi poboljšanja vezivanja ili smanjenja imunogenosti molekula. U tom pogledu, varijabilni regioni korisni u ovom obelodanjivanju mogu biti humanizovani ili na drugi način izmenjeni kroz uključivanje uvezenih amino kiselinskih sekvenci.
[0194] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, varijabilni domeni u teškim i lakim lancima su izmenjeni barem delimičnom zamenom jednog ili više CDR-ova i, ako je potrebno, zamenom delimičnog okvira i modifikacijom i/ili promenom sekvence. Iako CDR mogu biti izvedeni iz antitela iste klase ili čak podklase kao antitelo iz koje se izvode okvirni regioni, predviđeno je da CDR-i mogu biti izvedeni iz antitela različite klase i često iz antitela iz drugog vrste. Možda nije neophodno da se svi CDR-ovi zamene sa svim CDR-om iz varijabilnog regiona donatora da bi se prenosili kapaciteti vezivanja antigena jednog varijabilnog domena u drugi. Umesto toga, može biti neophodno samo preneti one ostatke koji su potrebni da bi se održala aktivnost lokacije za vezivanje antigena.
[0195] Bez obzira na promene u varijabilnom regionu, stručnjaci će znati da će modifikovana antitela ovog obelodanjivanja sadržavati antitela (npr., antitela u punoj dužini ili njihovi imunoreaktivni fragmenti) u kojima je najmanje frakcija jednog ili više konstantnog regiona domeni su izbrisani ili na drugi način izmenjeni kako bi se obezbedile željene biohemijske karakteristike kao što je povećana lokalizacija tumora ili povećan polu-raspad u serumu u poređenju sa antitelom približno iste imunogenosti koje sadrži prirodni ili nepromenjeni konstantni region. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, konstantni region modifikovanih antitela će sadržati humani konstantni region. Modifikacije konstantnog regiona kompatibilnog sa ovim obelodanjivanjem sadrže dodavanje, brisanje ili supstituciju jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena. Modifikovana antitela koja su ovde prikazana mogu da sadrže izmene ili modifikacije jednog ili više od tri konstanta domena teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) i/ili konstantnog domena lakog lanca (CL). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, jedan ili više domena delimično ili potpuno se brišu iz konstantnih regiona modifikovanih antitela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, modifikovana antitela će sadržati konstrukcije ili varijante koje su izbrisane u domenu, u kojima je uklonjen čitav CH2 domen (konstrukcije ΔCH2). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, se izostavljeni domen konstantnog regiona zamenjuje kratkim aminokiselinskim odstojnicima (npr.,10 aminokiselinskih ostataka) koji obezbeđuju neku molekularnu fleksibilnost koja se tipično prenose bez prisutnog konstantnog regiona.
[0196] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, modifikovana antitela su konstruisana kako bi se domen CH3 direktno spojio sa zglobnim regionom antitela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, peptidni distancer je ubačen između šarka i modifikovanih CH2 i/ili CH3 domena. Na primer, konstrukti mogu biti eksprimirani gde je CH2 domena izbrisana, a preostali CH3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) je spojen sa zglobnim regionom sa 5-20 aminokiselinskim odstojnikom. Takav odstojnik se može dodati kako bi se osiguralo da regulatorni elementi konstantnog domena ostaju slobodni i pristupačni ili da region zgloba ostaje fleksibilan. Međutim, treba napomenuti da se odstojnici aminokiselina u nekim slučajevima mogu pokazati imunogenim i izazvati neželjeni imuni odgovor na konstrukciju. Shodno tome, u nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bilo koji distancer koji je dodan konstruktu će biti relativno ne-imunogen, kako bi se održali željeni biološki kvaliteti modifikovanih antitela.
[0197] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, modifikovana antitela mogu imati samo delimično brisanje konstantnog domena ili supstituciju nekoliko ili čak jedne aminokiseline. Na primer, mutacija jedne aminokiseline u odabranim oblastima CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji vezivanje Fc i na taj način povećava lokalizaciju ćelija kancera i/ili penetraciju tumora. Slično tome, može biti poželjno jednostavno izbrisati deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontrolišu specifičnu efektorsku funkciju (npr., komplementiranje C1q vezivanja) koja se moduliše. Ovakva delimična brisanja konstantnih regiona mogu poboljšati odabrane karakteristike antitela (polu-raspad u serumu) dok istovremeno ostavljaju druge poželjne funkcije povezane sa domenom predmetnog konstantnog regiona. Štaviše, kako je navedeno u prethodnom tekstu, konstantni regioni obelodanjenih antitela mogu se modifikovati putem mutacije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina koja poboljšava profil dobijenog konstrukta. U tom pogledu može biti moguć poremećaj aktivnosti obezbeđene od strane konzerviranog mesta vezivanja (npr., vezivanje Fc) dok se u suštini održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, modifikovana antitela uključuju dodavanje jedne ili više aminokiselina u konstantni region radi poboljšanja poželjnih karakteristika kao što je smanjenje ili povećanje efektorske funkcije ili obezbeđivanje više mesta za vezivanje citotoksina ili ugljenih hidrata.
[0198] U struci je poznato da konstantni region posreduje u nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa Fc regionu IgG ili IgM antitela (vezanih za antigen) aktivira sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše inflamatorni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunsku preosetljivost. Pored toga, region Fc antitela može da veže ćeliju koja eksprimira Fc receptor (FcR). Postoji nekoliko Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje antitela na Fc receptore na površinama ćelija pokreće niz važnih i raznovrsnih bioloških odgovora uključujući hvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelom, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljanih ćelija obloženih antitelima pomoću ćelija ubica (nazvan citotoksičnost ćelija zavisna od antitela ili ADCC), oslobađanje inflamatornih medijatora, placentalni transfer i kontrola proizvodnje imunoglobulina.
[0199] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, modifikovana antitela obezbeđuju izmenjene efektorske funkcije koje, pak, utiču na biološki profil antitela koji se primenjuje. Na primer, u određenom ovdašnjem obelodanjivanju, brisanje ili inaktivacija (preko tačaka mutacija ili drugih agenasa) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje Fc receptora na cirkulišu modifikovano antitelo, čime se povećava lokalizacija ćelija karcinoma i/ili penetracija tumora. U drugom ovdašnjem obelodanjivanju, modifikacije konstantnog regiona povećavaju polu-raspad antitela u serumu. U drugom ovdašnjem obelodanjivanju, modifikacije konstantnog regiona smanjuju polu-raspad antitela u serumu. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, konstantni region je modifikovan da eliminiše disulfidne veze ili oligosaharidne grupe. Modifikacije konstantnog regiona u skladu sa ovim obelodanjivanjem mogu se lako napraviti koristeći poznate tehnike biohemijske ili molekularne tehnike poznate stručnjacima u tehnici.
[0200] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens koji je antitelo nema jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, u nekim ovdašnjim otelotvorenjima, antitelo nema aktivnost ADCC-a, i/ili nema citotoksičnu aktivnost zavisnu od komplementa (CDC). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo ne vezuje Fc receptor i/ili faktore komplementa. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo nema efektorsku funkciju.
[0201] Predmetno obelodanjivanje dalje obuhvata varijante i ekvivalente koji su u suštini homologni himernim, humanizovanim i humanim antitelima ili fragmentima antitela, koji su ovde navedeni. One mogu sadržati, na primer, konzervativne supstitucione mutacije, tj. supstituciju jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama. Na primer, konzervativna supstitucija se odnosi na supstituciju aminokiseline sa drugom aminokiselinom u istoj opštoj klasi, kao što je, na primer, jedna kiselina aminokiselina sa drugom kiselom aminokiselinom, jedna bazna aminokiselina sa drugom baznom aminokiselinom ili jedna neutralna aminokiselina sa drugom neutralnom aminokiselinom. Ono što želi konzervativna supstitucija aminokiselina je dobro poznato u ovoj oblasti i opisano ovde.
[0202] Prema tome, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje metode za proizvodnju antitela koja vezuju VEGF i/ili DLL4, uključujući bispecifična antitela koja se specifično vezuju za VEGF i DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda za proizvodnju antitela koja vezuju VEGF i/ili DLL4 obuhvata upotrebu tehnike hibridoma. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja antitela koja vezuju VEGF ili DLL4 ili bispecifično antitelo koje vezuje VEGF i DLL4 obuhvata skrining biblioteke humanih faga. Predmetno obelodanjivanje dalje daje metode identifikacije antitela koja vezuju VEGF i/ili DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano FACS skriningom za vezivanje EGF ili njegovog dela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano FACS skriningom za vezivanje DLL4 ili njegovog dela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano FACS skriningom za vezivanje i VEGF i DLL4 ili njihovog dela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo se identifikuje skriningom pomoću ELISA za vezivanje VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo se identifikuje skriningom pomoću ELISA za vezivanje DLL4 . U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo se identifikuje skriningom pomoću ELISA za vezivanje VEGF i DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano FACS skriningom za blokiranje vezivanja humanog VEGF na humani VEGF receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano FACS skriningom za blokiranje vezivanja humanog DLL4 na humani Notch receptor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano skriningom za inhibiranje ili blokiranje Notch signalizacije. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano skriningom za inhibiranje ili blokiranje VEGF aktivnosti (npr., indukcija HUAVEC proliferacije). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je identifikovano skriningom za modulaciju angiogenze.
[0203] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja antitela prema humanom VEGF obuhvata imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži aminokiseline 27-232 humanog VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja antitela prema humanom VEGF obuhvata imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži deo aminokiselina 27-232 humanog VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dalje obuhvata izolovanje antitela ili ćelija za proizvodnju antitela od sisara. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja monoklonskog antitela koji veže VEGF obuhvata: imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži barem deo aminokiselina 27-232 humanog VEGF i izolovanje ćelija koje proizvode ćelije za antitelo od imuniziranog sisara. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dalje obuhvata fiksiranje ćelija koje proizvode ćelije antitela sa ćelijama ćelijske linije mijeloma da bi se formulisale ćelije hibridoma. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dalje sadrži selekciju ćelije hibridoma koja eksprimira antitelo koje se vezuje za VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, sisar je miš. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je odabrano koristeći polipeptid koji sadrži barem deo aminokiselina 27-232 humane VEGF .
[0204] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja antitela prema humanom DLL4 obuhvata imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži aminokiseline 27-529 humanog DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja antitela prema humanom DLL4 obuhvata imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži deo aminokiselina 27-529 humanog DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda stvaranja monoklonskog antitela koji veže DLL4 obuhvata: imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži barem deo aminokiselina 27-232 humanog DLL4 i izolovanje ćelija koje proizvode ćelije za antitelo od imuniziranog sisara. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dalje obuhvata fiksiranje ćelija koje proizvode ćelije antitela sa ćelijama ćelijske linije mijeloma da bi se formulisale ćelije hibridoma. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dalje sadrži selekciju ćelije hibridoma koja eksprimira antitelo koje se vezuje za DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, sisar je miš. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo je odabrano koristeći polipeptid koji sadrži barem deo aminokiselina 27-529 humane DLL4.
[0205] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dobijanja antitela za humani VEGF obuhvata skrining biblioteku koja eksprimira antitela za antitela koja vezuju humani VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dobijanja antitela za humani DLL4 obuhvata skrining biblioteku koja eksprimira antitela za antitela koja vezuju humani DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda dobijanja antitela za humani VEGF i/ili DLL4 obuhvata skrining biblioteku koja eksprimira antitela za bispecifična antitela koja vezuju humani VEGF i humani DLL4. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, biblioteka koja eksprimira antitelo je biblioteka faga. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, skrining obuhvata panovanje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, biblioteka koja eksprimira antitela (npr. biblioteka faga) se pregleda sa barem delom amino kiselina 27-232 humane VEGF. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitela koja su identifikovana u prvom skriningu, ponovo se prikazuju korišćenjem najmanje jednog dela amino kiselina 27-529 humane DLL4 za identifikaciju bispecifičnog antitela koji vezuje VEGF i DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, biblioteka koja eksprimira antitela (npr. biblioteka faga) se pregleda sa barem delom amino kiselina 27-232 humane DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitela koja su identifikovana u prvom skriningu, ponovo se prikazuju korišćenjem najmanje jednog dela amino kiselina 27-529 humane VEGF za identifikaciju bispecifičnog antitela koji vezuje VEGF i DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo identifikovano u skriningu je VEGF antagonist. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo identifikovano u skriningu inhibira biološke aktivnosti izazvane VEGF-om. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo identifikovano u skriningu je DLL4 antagonist. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo identifikovano u skriningu inhibira Notch signalizaciju indukovanu DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo identifikovano u skriningu vezuje i humani VEGF i mišiji VEGF U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, antitelo identifikovano u skriningu vezuje i humani DLL4 i mišiji DLL4.
[0206] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, opisana antitela su izolovana. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, opisana antitela su suštinski čista.
[0207] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi su polipeptidi. Polipeptidi mogu biti rekombinantni polipeptidi, prirodni polipeptidi ili sintetički polipeptidi koji sadrže antitelo ili njegov fragment koji vezuje VEGF i/ili DLL4. Biće poznato u struci da neke aminokiselinske sekvence vezujućih agenasa opisanih ovde mogu da variraju bez značajnog uticaja na strukturu ili funkciju proteina. Tako obelodanjivanje dalje uključuje varijacije polipeptida koji pokazuju značajnu aktivnost ili koji uključuju regione antitela ili njegovog fragmenta protiv humanog VEGF i/ili DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, varijacije aminokiselinskih sekvenci polipeptida vezanih za VEGF/DLL4 uključuju delecije, ubacivanja, inverzije, ponavljanje i/ili druge vrste supstitucija.
[0208] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ovde opisani polipeptidi su izolovani. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ovde opisani polipeptidi su suštinski čisti.
[0209] Polipeptidi, njihovi analogi i njihove varijante mogu se dalje modifikovati tako da sadrže dodatne hemijske grupe koje uopšte nisu deo polipeptida. Derivatizovani delovi mogu poboljšati ili na drugi način modulirati rastvorljivost, biološki polu-raspada i/ili apsorpciju polipeptida. Delovi takođe mogu smanjiti ili eliminisati neželjene efekte polipeptida i varijanti. Pregled hemijskih sastojaka može se naći u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences, Philadelphia, PA.
[0210] Ovde opisani polipeptidi mogu da se proizvedu bilo kojom pogodnom metodom koja je poznata u tehnici. Takve metode variraju od direktnih metoda sinteze proteina do konstrukcije sekvence DNK koja kodira polipeptidne sekvence i ekspresije tih sekvenci u odgovarajućem domaćinu. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sekvenca je DNK konstruisana pomoću rekombinantne tehnologije izolovanjem ili sintetizacijom DNK sekvence koja kodira interesni protein divljeg tipa. Opciono, sekvenca se može mutagenizovati mutagenezom specifičnom za lokaciju da bi se obezbedio funkcionalni analog. Videti, npr., Zoeller i dr., 1984, PNAS, 81:5662-5066 i patent SAD br.4,588,585.
[0211] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sekvenca DNK koja kodira polipeptid koji je od interesa može se izgraditi hemijskom sintezom pomoću sintetizatora oligonukleotida. Oligonukleotidi se mogu dizajnirati na bazi aminokiselinske sekvence željenog polipeptida i selekcije onih kodona koji su favorizovani u ćeliji domaćinu u kojoj će se proizvoditi rekombinantni polipeptid od interesa. Standardne metode mogu se primeniti za sintetizaciju polinukleotidne sekvence koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, potpuna aminokiselinska sekvenca može se koristiti za izgradnju nazad prevedenog gena. Nadalje, može se sintetisati DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni izolovani polipeptid. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu se sintetizovati i zatim lizirati. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5 'ili 3' ispusta za komplementarno sklapanje.
[0212] Jednom sklopljeni (sintezom, mestom-usmerenom mutagenezom ili drugim postupkom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni polipeptid od interesa mogu biti ubačene u ekspresioni vektor i operativno vezane za sekvencu kontrole ekspresije koja je pogodna za ekspresiju proteina u željenom domaćinu . Odgovarajući sastav se može potvrditi sekvenciranjem nukleotida, mapiranjem ograničenja enzima i/ili ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u odgovarajućem domaćinu. Kao što je dobro poznato u struci, kako bi se postigli visoki nivoi ekspresije transficiranog gena u domaćinu, gen mora biti operativno vezan za sekvence transkripcionog i translacionog ekspresivne sekvence koji su funkcionalni u izabranom izraznom domaćinu.
[0213] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju se rekombinantni ekspresioni vektori koriste za amplifikaciju i ekspresiju antitela koja kodiraju DNK ili njihove fragmente protiv humanog VEGF i/ili DLL4. Na primer, rekombinantni vektori ekspresije mogu biti replicirani DNK konstrukti koji imaju sintetičke ili cDNK-izvedene DNK fragmente koji kodiraju polipeptidni lanac agensa za vezivanje VEGF/DLL4, kao što je anti-VEGF antitelo ili anti-DLL4 antitelo, ili njegov fragment, operativno povezan sa odgovarajućim transkripcijskim i/ili translacionim regulatornim elementima izvedenim iz sisara, mikrobioloških, virusnih ili insektnih gena. Jedinica transkripcije obično sadrži skup: (1) genetičkog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, transkripcionih promotera ili pojačivača, (2) strukturne ili kodirajuće sekvence koja je transkribovana u mRNK i prevedena u protein, i (3) odgovarajuće sekvence iniciranja i završetka transkripcije i prevođenja. Regulatorni elementi mogu uključivati sekvencu operatora za kontrolu transkripcije. Mogućnost replikacije u domaćinu, obično podrazumevaju poreklo replikacije, i selekcioni gen za olakšavanje prepoznavanja transformanti mogu dodatno biti inkorporirani. DNK regioni su "operativno povezani" kada su funkcionalno povezani jedni sa drugima. Na primer, DNK za signalni peptid (sekretorni lider) operativno je povezan sa DNK za polipeptid ako se izrazi kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter je operativno povezan sa kodnom sekvencom ako kontroliše transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma je operativno vezan za kodnu sekvencu ako je postavljen tako da omogući prevođenje. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, strukturni elementi namenjeni za upotrebu u sistemima za ekspresiju kvasca uključuju sekvencu lidera koja omogućava ekstracelularnu sekreciju prevedenog proteina od strane ćelije domaćina. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, u situacijama gde se rekombinantni protein izražava bez liderske ili transportne sekvence, on može uključiti ostatak N-terminalnog metionina. Ovaj ostatak se može opciono kasnije odvojiti iz izraženog rekombinantnog proteina kako bi se dobio konačni proizvod.
[0214] Izbor kontrolne sekvence ekspresije i ekspresionog vektora zavisi od izbora domaćina. Može se upotrebiti širok spektar kombinacija domaćina/vektora. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji sadrže sekvence kontrolne ekspresije iz SV40, goveđi papiloma virus, adenovirus i citomegalovirus. Korisni ekspresioni vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pCR1, pBR322, pMB9, i njihove derivate, kao i šire domene domaćina plazmida, kao što su M13 i drugi filamentni jednolančanih DNK faga.
[0215] VEGF/DLL4 vezujući agensi (npr., polipeptidi) ovog prikazivanja mogu se eksprimirati od jednog ili više vektora. Na primer, u nekim ovdašnjim obelodanjivanjima jedan polipeptid teškog lanca je eksprimiran jednim vektorom, drugi polipeptid teškog lanca je eksprimiran drugim vektorom i polipeptid lakog lanca je eksprimiran trećim vektorom. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, prvi polipeptid teškog lanca i polipeptid lakog lanca eksprimiraju se jednim vektorom, a drugi polipeptid teškog lanca eksprimira se drugim vekom. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, dva polipeptida teškog lanca su eksprimirana jednim vektorom, a polipeptid lakog lanca je eksprimiran drugim vektorom. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima su tri polipeptida eksprimirana iz jednog vektora. Tako, u nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, prvi polipeptid teškog lanca, drugi polipeptid teškog lanca i polipeptid lakog lanca eksprimiraju se jednim vektorom.
[0216] Odgovarajuće ćelije domaćina za ekspresiju polipeptida ili antitela (ili VEGF ili DLL4 proteina za vezivanje VEGF/DLL4 proteina za upotrebu kao antigen) uključuju prokariote, ćelije kvasca, ćelije insekata ili više eukariotske ćelije pod kontrolom odgovarajućih promotera. Prokarioti uključuju gram-negativne ili gram-pozitivne organizme, na primer E. coli ili Bacillus. Visoke eukariotske ćelije uključuju utvrđene ćelijske linije porekla sisara kao što je opisano u nastavku. Mogu se koristiti i sistemi za prevođenje bez ćelija. Odgovarajući vektori kloniranja i ekspresije za upotrebu sa bakterijskim, gljivičnim, kvasnim i sisarskim ćelijskim domaćinima opisani su u Pouwels i dr., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY. Dodatne informacije o metodi proizvodnje proteina, uključujući proizvodnju antitela, mogu se pronaći, npr., u patentnoj objavi SAD br.2008/0187954; patentnima SAD br.
6,413,746; 6,660,501; i internacionalnoj patentnoj objavi SAD br. WO 04/009823.
[0217] Za ekspresiju rekombinantnih polipeptida mogu se koristiti različiti sistemi za kulturu ćelija sisara ili insekata. Eksprimiranje rekombinantnih proteina u sisarskim ćelijama može biti poželjno jer su ovi proteini uglavnom ispravno savijeni, adekvatno modifikovani i biološki funkcionalni. Primeri pogodnih sisarskih ćelija domaćih ćelija uključuju, ali nisu ograničeni samo na njih, COS-7 (proizvedeni bubreg iz majmuna), L-929 (mišiji fibroblast derivat), C127 (mišiji tumor sisara), 3T3 (mišiji fibroblast derivat ), CHO (proizvedeni iz jajnika iz kineskog hrčka), HeLa (dobijeni čovek od karcinoma grlića materice), BHK (bubrežni fibroblast), ćelijske linije HEK-293 (humane embrionalne bubrege) i varijante ovih ćelijskih linija. Vektori ekspresije sisara mogu da sadrže nepropisane elemente kao što je poreklo replikacije, pogodan promoter i pojačivač povezan sa genom koji se eksprimira, kao i druge 5 ili 3 bočne nepropisane sekvence i 5’ ili 3' prevedene sekvence, kao što su neophodne lokacije za vezivanje ribozoma, poliadenilaciono mesto, donor spojnice i akceptorske lokacije i transkripcijske završne sekvence. Eksprimiranje rekombinantnih proteina u bakulovirusu takođe nudi robustan metod za proizvodnju pravilno preklopljenih i biološki funkcionalnih proteina. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u ćelijama insekata su dobro poznati stručnjacima u struci (videti, npr., Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47).
[0218] Prema tome, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje ćelije koje sadrže VEGF/DLL4 vezujuće agense koja su ovde opisana. U nekim ovdašnjim obelodanjivanja, ćelije proizvode VEGF/DLL4-vezujuće agense koje su ovde opisane. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode VEGF vezujući agens, kao što je anti-VEGF antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje vezuje VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode DLL4 vezujući agens, kao što je anti-DLL4 antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje vezuje DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifični vezujući agens VEGF/DLL4, kao što je bispecifično antitelo koje vezuje VEGF i DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode antitelo 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 219R45 i mesto vezivanja antigena iz antitela 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 219R45 i mesto vezivanja antigena iz antitela 21M18. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 219R45 i mesto vezivanja antigena iz antitela 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo koje sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela 219R45 i mesto vezivanja antigena iz antitela 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelije proizvode bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83.
[0219] Proteini koje proizvodi transformisani domaćin mogu se prečistiti prema bilo kojoj pogodnoj metodi. Standardne metode uključuju hromatografiju (npr., jonsko razmenjivačku hromatografiju, afinitet i veličinu kolone), centrifugiranje, diferencijalna rastvorljivost ili bilo koju drugu standardnu tehniku za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta, kao što su heksa-histidin, domen vezivanja maltoze, sekvenca prevlaka gutanja i glutation-S-transferaza mogu se pridržavati proteina kako bi se omogućilo lako prečišćavanje prolazom kroz odgovarajuću afinitetnu kolonu. Afinitetna hromatografija koja se koristi za prečišćavanje imunoglobulina može da obuhvati proteinu A, proteinu G i proteinsku L hromatografiju. Izolovani proteini mogu se fizički obeležiti korišćenjem takvih tehnika kao što su proteoliza, hromatografija za isključivanje veličine (SEC), masena spektrometrija (MS), nuklearna magnetna rezonanca (NMR), izoelektrično fokusiranje (IEF), tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) kristalografija. Čistoća izolovanih proteina može se odrediti pomoću tehnika poznatih stručnjacima u struci, uključujući, ali bez ograničenja, SDS-PAGE, SEC, kapilarni gel elektroforeza, IEF i kapilarno izoelektrično fokusiranje (cIEF).
[0220] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, supernatanti iz ekspresionih sistema koji luče rekombinantni protein u podlogu za kulturu mogu se prvo koncentrisati koristeći komercijalno dostupni filter za koncentraciju proteina, na primer Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracionu jedinicu. Nakon koraka koncentracije, koncentrat se može primeniti na odgovarajuću matricu prečišćavanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju se može koristiti anjonska izmena smola, na primer, matrica ili supstrat koji ima pendant dietilaminoetil (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaroz, dekstran, celuloza ili drugi tipovi koji se obično koriste u prečišćavanju proteina. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju se može koristiti korak razmene katjona. Pogodni katjonski izmenjivači uključuju različite nerastvorne matrice koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju može koristiti agens hidroksiapatita, uključujući, ali bez ograničenja, keramički hidroksiapatit (CHT). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, jedan ili više HPLC koraka reverzne faze koristeći hidrofobne RP-HPLC medije, npr., silika gel koji ima pendant metil ili druge alifatske grupe, može se koristiti za dalje prečišćavanje rekombinantnog proteina (npr., VEGF/DLL4 vezujući agens). Neki ili svi prethodni koraci prečišćavanja, u različitim kombinacijama, mogu se koristiti za dobijanje homogenog rekombinantnog proteina.
[0221] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, heterodimerni proteini kao što su bispecifična antitela se prečišćavaju prema bilo kojoj od opisanih metoda. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela se izoluju i/ili prečišćavaju koristeći najmanje jedan korak hromatografije. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bar jedan korak hromatografije sadrži afinitetnu hromatografiju. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bar jedan korak hromatografije sadrži anjonsko-razmenjivačku hromatografiju. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, izolovani i/ili prečišćen proizvod antitela sadrži najmanje 90% heterodimernih antitela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, izolovani i/ili prečišćen proizvod antitela sadrži najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% heterodimernih antitela. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, izolovani i/ili prečišćen proizvod antitela sadrži najmanje 100% heterodimernih antitela.
[0222] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, rekombinantni protein proizveden u bakterijskoj kulturi može se izolovati, na primer, inicijalnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, nakon čega sledi jedna ili više koncentracija, soljenje, vodena jonska razmena ili koraka hromatografije za isključivanje veličine. HPLC se može koristiti za završne korake prečišćavanja. Mikrobiološke ćelije koje se koriste u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu biti poremećene bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući biciklizam sa zamrzavanjem-otapanjem, ultrazvukom, mehaničkim poremećajem ili upotrebom agenasa za lizanje ćelija.
[0223] Metode poznate u struci za pročišćavanje antitela i drugih proteina takođe uključuju, na primjer, one opisane u patentnim objavama SAD br.2008/0312425; 2008/0177048; i 2009/0187005.
[0224] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je polipeptid koji nije antitelo. Različite metode za identifikaciju i proizvodnju ne-antitelskih polipeptida koji se vezuju sa visokim afinitetom prema proteinskom metu su poznati u stanju tehnike. See, e.g., Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse i dr., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill i dr., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; and Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, tehnologija faga ili ćelije sisara može se koristiti za proizvodnju i/ili identifikaciju polipeptida vezanog za VEGF/DLL4 koji nije antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polipeptid obuhvata proteinsku skelu tipa koji je izabran iz grupe koja se sastoji od proteina A, proteina G, lipokalina, fibronektinskog domena, ankirinskog konsenzusnog ponavljajućeg domena i tioroksina.
[0225] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi ili antitela mogu se koristiti u bilo kojem od više konjugovanih (tj., imunokonjugata ili radiokonjugata) ili nekonjugovanih oblika. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitela se mogu koristiti u nekonjugovanom obliku za zaštitu prirodnih mehanizama odbrane subjekta, uključujući citotoksičnost zavisnu od komplementa i ćelijsku toksičnost zavisnu od antitela za eliminaciju malignih ili ćelija karcinoma.
[0226] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., antitelo) je DLL4 antagonist. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, citotoksični agens je hemoterapeutski agens, uključujući, ali bez ograničenja, metotreksat, adriamicin, doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili drugi interkalirajući agensi. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, citotoksični agens je enzimatski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njegovih fragmenata, uključujući, ali ne ograničavajući se na, difterijin A lanac, neobavezujući aktivni fragmenti difterijskog toksina, egzotoksin A lanac, ricin A lanac, lanac abrin A, modecin lanac, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, proteini dianthin, proteini Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordice charantia, curcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrikozin, fenomicin, enomicin i trikotecen. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, citotoksični agens je radioizotop za proizvodnju radiokonjugata ili antitela sa radiokonjugulacijom. Na raspolaganju su različiti radionuklidi za proizvodnju antitela uključenih radiokonjugulacije, uključujući, ali ne ograničavajući se na,<90>Y,<125>I,<131>I,<123>I,<111>In,<131>In,<105>Rh,<153>Sm,<67>Cu,<67>Ga,<166>Ho,<177>Lu,<186>Re,<188>Re i<212>Bi. Mogu se koristiti i konjugati antitela i jedan ili više toksina malih molekula, kao što su kalheheamicini, maitansinoidi, trioteceni i CC1065, kao i derivati ovih toksina koji imaju toksičnu aktivnost. Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina uključujući, ali ne ograničavajući se na, N-sukcinimidil-3-(2-pirididitioiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoze (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što su bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bisdiazoniuma (kao što je bis- (p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).
III. Polinukleotidi
[0227] Obelodanjivanje obuhvata polinukleotide koji sadrže polinukleotide koji kodiraju polipeptid (ili fragment polipeptida) koji specifično vezuju VEGF, DLL4, i VEGF i DLL4. Termin "polinukleotidi koji kodiraju polipeptid" obuhvata polinukleotid koji uključuje samo kodirajuće sekvence za polipeptid, kao i polinukleotid koji uključuje dodatne kodirajuće i/ili nekodirajuće sekvence. Na primer, obelodanjivanje obezbeđuje polinukleotid koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo humanom VEGF ili kodira fragment takvog antitela (npr., fragment koji sadrži mesto za vezivanje antigena). Obelodanjivanje obezbeđuje polinukleotid koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo humanom DLL4 ili kodira fragment takvog antitela (npr., fragment koji sadrži mesto za vezivanje antigena). Polinukleotidi obelodanjivanja mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK; i može biti dvolančana ili jednolančana, i ako je jednolančani može biti kodirajući ili nekodirajući (antisens) lanac.
[0228] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotid sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji iz SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:3, SEK ID Br:4, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:7, SEK ID Br:8, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:11, SEK ID Br:12, SEK ID Br:46, SEK ID Br:47, SEK ID Br:48, SEK ID Br:49, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63 i SEK ID Br:64. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotid sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:7, SEK ID Br:8, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:11, SEK ID Br:12, SEK ID Br:48, SEK ID Br:49, SEK ID Br:56, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62 i SEK ID Br: 64. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, polinukleotid sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji iz SEK ID Br:29, SEK ID Br:30, SEK ID Br:31, SEK ID Br:32, SEK ID Br:33, SEK ID Br:34, SEK ID Br:35, SEK ID Br:36, SEK ID Br:37, SEK ID Br:38, SEK ID Br:39, SEK ID Br:40, SEK ID Br:50, SEK ID Br:51, SEK ID Br:52, SEK ID Br:53, SEK ID Br:54, SEK ID Br:55, SEK ID Br:60, SEK ID Br:61, SEK ID Br:66, SEK ID Br:67, SEK ID Br:68, SEK ID Br:69, SEK ID Br:70, SEK ID Br:71, SEK ID Br:72, SEK ID Br:73, SEK ID Br:74, SEK ID Br:75, SEK ID Br:76, SEK ID Br:77, i SEK ID Br:78.
[0229] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotid sadrži polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, barem oko 95% identičnu, a kod nekog ovdašnjeg obelodanjivanja, najmanje oko 96%, 97 %, 98% ili 99% identično polinukleotidu koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji iz SEK ID Br:29, SEK ID Br:30, SEK ID Br:31, SEK ID Br:32, SEK ID Br:33, SEK ID Br:34, SEK ID Br:52, SEK ID Br:53, SEK ID Br:55, SEK ID Br:60, SEK ID Br:61, SEK ID Br:66, SEK ID Br:67, SEK ID Br:68, SEK ID Br:69, SEK ID Br:70, SEK ID Br:71, SEK ID Br:72, SEK ID Br:73, SEK ID Br:74, SEK ID Br:75, SEK ID Br:76, SEK ID Br:77 i SEK ID Br:78. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotid sadrži polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, barem oko 95% identičnu, a kod nekog ovdašnjeg obelodanjivanja, najmanje oko 96%, 97 %, 98% ili 99% identično polinukleotidu koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji iz SEK ID Br:35, SEK ID Br:36, SEK ID Br:37, SEK ID Br:38, SEK ID Br:39, SEK ID Br:40, SEK ID Br:50, SEK ID Br:51, SEK ID Br:54, SEK ID Br:68, SEK ID Br:69, SEK ID Br:70, SEK ID Br:71, SEK ID Br:72, SEK ID Br:73, SEK ID Br:74, SEK ID Br:75, SEK ID Br:76, SEK ID Br:77 i SEK ID Br:78. Obezbeđen je i polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji hibridizuje SEK ID Br:29, SEK ID Br:30, SEK ID Br:31, SEK ID Br:32, SEK ID Br:33, SEK ID Br:34, SEK ID Br:35, SEK ID Br:36, SEK ID Br:37, SEK ID Br:38, SEK ID Br:39, SEK ID Br:40, SEK ID Br:50, SEK ID Br:51, SEK ID Br:52, SEK ID Br:53, SEK ID Br:54, SEK ID Br:55, SEK ID Br:60, SEK ID Br:61, SEK ID Br:66, SEK ID Br:67, SEK ID Br:68, SEK ID Br:69, SEK ID Br:70, SEK ID Br:71, SEK ID Br:72, SEK ID Br:73, SEK ID Br:74, SEK ID Br:75, SEK ID Br:76, SEK ID Br:77, i SEK ID Br:78. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, hibridizacija je u uslovima visoke strogosti.
[0230] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidi sadrže sekvencu kodiranja zrelog polipeptida spojenog u istom očitanom okviru sa polinukleotidom koji pomaže, na primer, za ekspresiju i sekreciju polipeptida iz ćelije domaćina (npr., liderska sekvenca koja funkcioniše kao sekretorna sekvenca za kontrolu transporta polipeptida iz ćelije). Polipeptid koji ima sekvencu lidera je preprotein i može imati sekvencu lidera koja se cepi od strane ćelije domaćina kako bi se formirao zreli oblik polipeptida. Polinukleotidi mogu takođe kodirati proprotein koji je zrelog proteina plus dodatnih 5’ aminokiselinskih ostataka. Zreli protein koji ima projekciju je proprotein i neaktivan je oblik proteina. Jednom kada se procepi rascepa aktivni zreli protein ostaje.
[0231] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidi sadrže sekvencu kodiranja zrelog polipeptida spojenog u istom čitačkom okviru sa markerskom sekvencom koja omogućava, na primer, za prečišćavanje kodiranog polipeptida. Na primer, markerska sekvenca može biti oznaka heksa-histidina koja se dobija od vektora pQE-9 da bi se obezbedilo prečišćavanje zrelog polipeptida spojenog sa markerom u slučaju bakterijskog domaćina, ili markerska sekvenca može biti hemaglutinin (HA) oznaka izvedena iz hemaglutininskog proteina influence kada se koristi sisar (npr., ćelije COS-7). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, markerska sekvenca je FLAG-oznaka, peptid sekvence DYKDDDDK (SEK ID Br:45) koji se može koristiti zajedno sa drugim afinitetnim oznakama.
[0232] Predmetno obelodanjivanje se dalje odnosi na varijante ovde opisanih polinukleotida koji kodiraju, na primer, fragmente, analoge i/ili derivate.
[0233] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje polinukleotide koji sadrže polinukleotide koji imaju nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, najmanje oko 95% identičnu, a u nekim ovdašnjem obelodanjivanju, najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% identične polinukleotidu koji kodira polipeptid koji sadrži sredstvo za vezivanje VEGF/DLL4 (npr., antitelo) ili njegov fragment, koji je ovde opisan.
[0234] Kako se ovde koristi, fraza polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu barem, na primer, 95% "identičan" referentnoj nukleotidnoj sekvenci, znači da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci osim što je polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačaka mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja je barem 95% identična referentnoj nukleotidnoj sekvenci, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može se izbrisati ili zameniti drugim nukleotidom ili nizom nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može se ubaciti u referentnu sekvencu. Ove mutacije referentne sekvence mogu se desiti na položajima 5’ ili 3' terminala referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između onih terminalnih pozicija, koje su pojedinačno podeljene između nukleotida u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence.
[0235] Polinukleotidne varijante mogu sadržati izmene u regionima kodiranja, nekodirajućih regiona ili oboje. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidna varijanta sadrži izmene koje proizvode tihi zamene, dodatke ili delecije, ali ne menjaju osobine ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidna varijanta sadrži silentne zamene koje ne rezultiraju promenom aminokiselinske sekvence polipeptida (zbog degeneracije genetskog koda). Polinukleotidne varijante mogu se proizvesti iz raznih razloga, na primer, da se optimizuje ekspresija kodona za određenog domaćina (tj., promeni kodone u humanoj mRNI na one koje preferiraju bakterijski host kao što je E. coli). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidna varijanta sadrži najmanje jednu tihu mutaciju u nekodirajućem ili kodirajućem regionu sekvence.
[0236] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, proizvedena je polinukleotidna varijanta za moduliranje ili promenu ekspresije (ili nivoa ekspresije) kodiranog polipeptida. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, proizvedena je polinukleotidna varijanta za povećanje ekspresije kodiranog polipeptida. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, proizvedena je polinukleotidna varijanta za povećanje ekspresije kodiranog polipeptida. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidna varijanta povećava ekspresiju kodiranog polipeptida u poređenju sa roditeljskom polinukleotidnom sekvencom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidna varijanta povećava ekspresiju kodiranog polipeptida u poređenju sa roditeljskom polinukleotidnom sekvencom.
[0237] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, proizvedena je najmanje jedna polinukleotidna varijanta (bez promene aminokiselinske sekvence kodiranog polipeptida) radi povećanja proizvodnje heteromultimernog molekula. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, proizvedena je najmanje jedna polinukleotidna varijanta (bez promene aminokiselinske sekvence kodiranog polipeptida) radi povećanja proizvodnje bispecifičnog antitela.
[0238] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidi su izolovani. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, polinukleotidi su suštinski čisti.
[0239] Vektori i ćelije koje sadrže polinukleotide opisane ovde su takođe dati. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ekspresioni vektor sadrži polinukleotidni molekul. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelija domaćina sadrži ekspresioni vektor koji sadrži molekul polinukleotida. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, ćelija domaćina sadrži polinukleotidni molekul.
IV. Metode korišćenja i farmaceutski sastavi
[0240] Vezujući agensi (uključujući polipeptide i antitela) obelodanjivanja koja se vezuju (npr., specifično vezuju) VEGF i/ili DLL4 su korisna u različitim primenama uključujući, ali ne ograničavajući se na, terapijske metode lečenja, kao što je lečenje kancera . U određenom ovdašnjem obelodanjivanju su agensi korisni za inhibiranje VEGF aktivnosti, inhibiranje signalizacije Notch-a, izazvane DLL4, inhibiranje rasta tumora, smanjenje zapremine tumora, smanjenje frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru, smanjenje tumorogencije tumora, modulacija angiogeneze, i/ili inhibiranje angiogeneze. Metode upotrebe mogu biti in vitro, ex vivo, ili in vivo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antagonist humanog VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je antagonist humanog DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je antagonist i VEGF i DLL4.
[0241] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4-vezujući agensi se koriste u lečenju bolesti povezanih sa angiogenezom, tj. povećanom angiogenezom i/ili aberantnom angiogenezom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, bolest je bolest zavisna od angiogeneze. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agensi se koriste u lečenju poremećaja koje karakterišu povećani nivoi matičnih ćelija i/ili progenitorskih ćelija.
[0242] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje metode za inhibiranje rasta tumora korišćenjem vezujućih agenasa VEGF/DLL4 ili antitela koja su ovde opisana. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, metoda inhibicije rasta tumora sadrži kontaktiranje tumorske ćelije sa vezujućim agensom VEGF/DLL4 (npr., antitelom) in vitro. Na primer, imortalizovana ćelijska linija ili ćelijska linija kancera se kultiviše na podlozi na koji se dodaje anti-VEGF antitelo, anti-DLL4 antitelo ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo za inhibiranje rasta tumorskih ćelija. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju su tumorske ćelije izolovane iz uzorka pacijenta kao što je, na primer, biopsija tkiva, pleuralni izliv ili uzorak krvi i kultivisani u medijumu kojima se dodaje vezujući agens VEGF/DLL4 za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.
[0243] U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, metoda inhibicije rasta tumora sadrži kontaktiranje tumorske ćelije sa vezujućim agensom VEGF/DLL4 (npr., antitelom) in vivo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, kontaktiranje tumora ili tumorske ćelije sa VEGF/DLL4 veznim agensom se preduzima u životinjskom modelu. Na primer, anti-VEGF antitelo, anti-DLL4 antitelo ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo mogu se davati imunokompromitovanim životinjama domaćinima (npr., miševima NOD/SCID) koji imaju tumorski ksenograft. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju su tumorske ćelije i/ili matične ćelije kancera izolirane iz uzorka pacijenta, kao što su, na primer, biopsija tkiva, pleuralni izliv ili uzorak krvi i injektirani u imunokompromitovanu životinju domaćina (npr., miševi NOD/SCID) koji se onda primenjuje vezujući agens VEGF/DLL4 za inhibiranje rasta tumorskih ćelija. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens se primenjuje istovremeno ili ubrzo nakon uvođenja tumorogenskih ćelija u životinju radi sprečavanja rasta tumora ("preventivni model"). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens se administrira kao terapeutik nakon što su tumori porasli na određenu veličinu ("terapeutski model"). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/ DLL4 vezujući agensi su bispecifična antitela koja vezuju humani VEGF i humani DLL4.
[0244] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda inhibicije rasta tumora obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine vezujućeg agensa VEGF/DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, subjekat je čovek. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, subjekt ima tumor ili ima tumor koji je uklonjen. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, tumor sadrži matične ćelije kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, frekvenca karcinoma matičnih ćelija u tumoru se smanjuje primenom vezujućeg agensa VEGF/DLL4. Obelodanjivanje takođe obezbeđuje metodu smanjivanja frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru, koji obuhvata kontaktiranje tumora sa efektivnom količinom vezujućeg agensa VEGF/DLL4 (npr., anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda smanjivanja frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru kod subjekta, obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine vezujućeg agensa VEGF/DLL4.
[0245] U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, tumor je čvrsti tumor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, tumor jr odabran iz grupe koja se sastoji iz kolorektalnog tumora, tumora debelog creva, tumora pankreasa, plućnog tumora, tumora jajnika, tumora jetre, tumora dojke, tumora bubrega, tumora prostate, gastrointestinalnog tumora, melanoma, tumora cerviksa , tumor mokraćne bešike, glioblastoma i tumor glave i vrata. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, tumor je kolorektalni tumor ili tumor debelog creva. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, tumor je tumor jajnika. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, tumor je tumor pluća. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, tumor je tumor pankreasa. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, tumor je tumor dojki.
[0246] Predmetno obelodanjivanje dalje obezbeđuje metode za lečenje kancera koji uključuju davanje terapeutski efikasne količine vezujućeg agensa VEGF/DLL4 na subjekt. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF vezujući agens specifično vezuje VEGF i smanjuje rast kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens specifično vezuje DLL4 i smanjuje rast kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje vezuje VEGF i DLL4 i inhibira ili smanjuje rast kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens specifično vezuje VEGF, ometa interakcije VEGF/VEGF receptora i inhibira ili smanjuje rast kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens specifično vezuje DLL4/Notch interakcije, i inhibira ili smanjuje rast kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens vezuje i VEGF i DLL4, ometa interakcije VEGF/VEGF receptora i DLL4/Notch interakcije i inhibira ili smanjuje rast kancera. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens specifično vezuje DLL4 i smanjuje broj ili učestalost matičnih ćelija kancera.
[0247] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje metode za lečenje kancera koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine vezujućeg agensa VEGF/DLL4 na subjekt (npr., subjekt koji treba tretirati). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, subjekat je čovek. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, subjekat je kancerogeni tumor. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, subjekatu je uklonjen tumor.
[0248] Kancer/tumor subjekta može, u nekom ovdašnjem obelodanjivanju, biti otporan na određeni tretman. Kao neograničavajući primer, karcinom subjekta (ili tumor) može biti takav na ne reaguje na hemoterapiju.. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, karcinom subjekta može biti otporan na terapiju anti-VEGF ili anti-DLL4 terapiju ili oboje.
[0249] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera pluća, raka jajnika, kancera jetre, kancera dojke, kancera bubrega, kancera prostate, gastrointestinalnog karcinoma, melanoma, kancera grlića materice, kancera bešike, glioblastom i kancera glave i vrata. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je kancer jajnika. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je kolorektalni kancer ili kancer debelog creva. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je kancer pankreasa. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je kancer dojke. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je kancer prostate. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je kancer pluća. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, kancer je hematološki kancer kao što je leukemija ili limfom. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, leukemija ili limfom je leukemija ili limfom B-ćelija. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, leukemija ili limfom je leukemija ili limfom T-ćelija. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, hematološki kancer akutna mijelogena leukemija, Hodgkinov limfom, ne-Hodgkinov limfom, akutna limfocitna leukemija, leukemija dlakavih ćelija, hronična limfocitna leukemija, multiple mijeloma, kožni T-ćelijski limfom ili akutna limfoblastna leukemija T-ćelija.
[0250] Obelodanjivanje takođe pruža metode lečenja bolesti ili poremećaja kod subjekta, pri čemu je bolest ili poremećaj povezan sa angiogenezom. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, bolest ili poremećaj je povezan sa aberantnom angiogenezom. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, bolest ili poremećaj je povezan sa povećanom angiogenezom. Prema tome, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje metode za modulaciju angiogeneze kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine bilo kojeg agensa za vezivanje VEGF/DLL4 koji su ovde opisani. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4, vezujući agens je antitelo koje vezuje humani VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4, vezujući agens je antitelo koje vezuje humani DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4, vezujući agens je bispecifično antitelo koje vezuje humani VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4, vezujući agens je bispecifično antitelo koje vezuje humani DLL4. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/ DLL4 vezujući agensi su bispecifična antitela koja vezuju humani VEGF i humani DLL4.
[0251] Metode tretiranja bolesti ili poremećaja kod subjekta, pri čemu bolest ili poremećaj karakteriše povećan nivo matičnih ćelija i/ili progenitorskih ćelija. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, metode lečenja obuhvataju davanje terapeutski efikasne količine agensa za vezivanje VEGF/DLL4, polipeptida ili antitela subjektu.
[0252] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju bilo koje od ovde opisanih metoda, agens za vezivanje VEGF/DLL4 je bispecifično antitelo koje specifično vezuje humani VEGF i human DLL4. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži: a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži težak lanac CDR1 koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br: 19), i drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), ili YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde je i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži: a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži težak lanac CDR1 koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br: 19),a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto vezivanja antigena sadrže laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži: a) prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF, i b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži težak lanac CDR1 koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br: 19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto vezivanja antigena sadrže laki lanac CDR1 koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), laki lanac CDR2 koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22). U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani VEGF i drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani DLL4, gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17) CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br: 18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19), a drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH ( SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
[0253] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju bilo koje od opisanih metoda, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11, drugom varijabilnom regionu teškog lanca koji ima najmanje oko 80% sekvencijalnog identiteta sa SEK ID Br:9, SEK ID Br: 10, SEK ID Br:58 ili SEK ID Br:64, i varijabilni region prvog i lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9; i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9; i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9; i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 bispecifično antitelo sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:11; drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:9; i prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12.
[0254] U određenom obelodanjivanju bilo koje od ovde opisanih metoda, VEGF/DLL4 vezujući agens je antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je anti-VEGF antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, anti-VEGF antitelo je antitelo 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je anti-DLL4 antitelo. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, anti-DLL4 antitelo je antitelo 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, anti-DLL4 antitelo je antitelo 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, anti-DLL4 antitelo je antitelo 21R83. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži mesto za vezivanje antigena iz antitela 219R45. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži mesto za vezivanje antigena iz antitela 21R79. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži mesto za vezivanje antigena iz antitela 21R75. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži mesto za vezivanje antigena iz antitela 21R83. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz antitela 219R45 i drugo mesto za vezivanje antigena iz antitela 21R79. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz antitela 219R45 i drugo mesto za vezivanje antigena iz antitela 21M18. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz antitela 219R45 i drugo mesto za vezivanje antigena iz antitela 21R75. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena iz antitela 219R45 i drugo mesto za vezivanje antigena iz antitela 21R83. U ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. U ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens je bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83.
[0255] Predmetno obelodanjivanje dalje pruža farmaceutske sastave koji sadrže vezujuće agense koji su ovde opisani. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, farmaceutski sastavi dalje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovi farmaceutski preparati pronalaze upotrebu u inhibiciji rasta tumora i/ili lečenja kancera kod subjekta (npr., pacijenta čoveka).
[0256] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, obelodanjivanje obezbeđuje farmaceutske sastave koji sadrže bispecifična antitela, pri čemu najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% antitela u sastavu su bispecifična antitela ili heterodimerna antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju bispecifična antitela su IgG (npr., CH2 IgG2) antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 2% ili manje od oko 1% ukupnih antitela u sastavima su monospecifična antitela ili homodimerna antitela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitela u sastavu su bar oko 98% heterodimerna.
[0257] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, se pripremaju formulacije za skladištenje i upotrebu kombinovanjem prečišćenog antitela ili agensa predmetnog obelodanjivanja sa farmaceutski prihvatljivim sredstvom (npr., nosačem ili ekscipijensom). Pogodna farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali se ne ograničavaju na, netoksične pufera kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidansi uključujući askrobinsku kiselinu i metionin; konzervansi kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni, kao što su metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol; polipeptidi niske molekulske mase (npr., manje od oko 10 aminokiselinskih ostataka); proteini kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulin; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; ugljeni hidrati kao što su monosaharidi, disaharidi, glukoza, manoza ili dekstrini; helatske agense kao što je EDTA; šećeri, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji formiraju soli, kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonskih surfakanata, kao što su TWEEN, ili polietilen glikol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences, Philadelphia, PA).
[0258] Farmaceutski sastavi predmetnog obelodanjivanja mogu se primenjivati na bilo koji broj načina za bilo lokalno ili sistemsko lečenje. Upotreba može biti topikalna epidermalnim ili transdermalnim zakrpama, mastima, losionima, kremama, gelovima, kapljicama, supozitorijama, sprejevima, tečnostima i prahovima; plućnim putem udisanjem ili insuflacijom praha ili aerosola, uključujući nebulizator, intratrahealni i intranazalni; oralno; ili parenteralno, uključujući intravenoznu, intraarterijalnu, intratumornu, subkutanu, intraperitonealno, intramuskularno (npr., injekciju ili infuziju) ili intrakranijalnu (npr., intratekalno ili intraventrikularno).
[0259] Terapeutska formulacija može biti u jediničnoj doznoj formi. Takve formulacije uključuju tablete, pilule, kapsule, prahove, granule, rastvore ili suspenzije u vodi ili ne-vodenim podlogama ili supozitorije. U čvrstim sastavima kao što su tablete glavni aktivni sastojak se pomeša sa farmaceutskim nosačem. Konvencionalni sastojci za tabletiranje uključuju kukuruzni skrob, laktozu, saharozu, sorbitol, talk, stearinsku kiselinu, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat ili gume i razblaživače (npr., vodu). Ovi se mogu koristiti za stvaranje čvrstog preformulacionog sastava koji sadrži homogenu smešu jedinjenja predmetnog obelodanjivanja ili netoksične farmaceutski prihvatljive soli od toga. Sastav preformulisanog sastava je potom podeljen u jedinične dozne oblike tipa opisanog iznad. Tablete, pilule , itd. formulacije ili sastava mogu se premazati ili inače spojiti kako bi se dobilo dozni oblik koji daje prednost produženom dejstvu. Na primer, tableta ili pilula može sadržati unutrašnji sastav pokriven spoljnom komponentom. Pored toga, dve komponente mogu biti odvojene pomoću enteričnog sloja koji služi da se odupre dezintegraciji i dozvoljava unutrašnjoj komponenti da prolazi netaknuto kroz stomak ili da se odloži u oslobađanju. Za takve enterične slojeve ili prevlake mogu se koristiti različiti materijali, takvi materijali uključuju brojne polimerne kiseline i smeše polimernih kiselina sa materijalima kao što su šelak, cetil alkohol i acetat celuloze.
[0260] VEGF/DLL4 vezujući agensi ili antitela opisana ovde mogu takođe biti upleteni u mikrokapsule. Takve mikrokapsule se pripremaju, na primer, tehnikom koacervacije ili međusobnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili mikrokapsulama želatina i mikrokapsulama poli-(metilmetakilat), respektivno u koloidnim sistemima za dostavu lekova (na primer, lipozomi, mikro-mikrosprima albuminima, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama kako je opisano u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PA.
[0261] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, farmaceutske formulacije uključuju VEGF/DLL4 vezujući agens (na primer, antitelo) predmetnog obelodanjivanja kompleksiranog sa lipozomima. Metode za proizvodnju lipozoma su poznate stručnjacima. Na primer, neki lipozomi mogu se generisati isparavanjem reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovan fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se mogu ekstrudirati kroz filtere definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom.
[0262] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, preparati sa produženim oslobađanjem mogu biti proizvedeni. Pogodni primeri preparata za kontinuirani oslobađanje uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže agens za vezivanje VEGF/DLL4 (npr., antitelo), gde su matrice u obliku oblikovanih proizvoda (npr., filmova ili mikrokapsula). Dodatni primeri matriksa sa trajnim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove kao što su poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinil alkohol), polilaktidi, kopolimeri L-glutaminske kiseline i 7 etil-L-glutamata, nerastvorljivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON DEPOT™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), saharoze acetat izobutirat i poli-D-(-)-3-hidroksibutirne kiseline.
[0263] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, pored davanja VEGF/DLL4 vezujućeg agensa (npr., antitela), metoda ili tretman dalje obuhvata davanje najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa. Dodatni terapeutski agens može se primenjivati pre, istovremeno sa i/ili nakon davanja vezujućeg agensa VEGF/DLL4. Farmaceutski preparati koji sadrže vezujući agens VEGF/DLL4 i dodatni terapeutski agensi takođe su obezbeđeni. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo sadrži 1, 2, 3 ili više dodatnih terapeutskih agenasa.
[0264] Kombinovana terapija sa najmanje dva terapeutska agensa često koristi agense koji rade različitim mehanizmima delovanja, iako to nije potrebno. Kombinovana terapija pomoću agenasa sa različitim mehanizmima delovanja može rezultirati aditivnim ili sinergijskim efektima. Kombinovana terapija može dozvoliti manju dozu svakog agensa nego što se koristi u monoterapiji, čime se smanjuju toksični neželjeni efekti i/ili povećavaju terapeutski indeks najmanje jednog od agensa. Kombinovana terapija može smanjiti verovatnoću da će se otporne ćelije kancera razviti. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, kombinovana terapija sadrži terapeutski agens koji prvenstveno utiče (na primer, inhibira ili ubija) ne-tumorogene ćelije i terapeutsko sredstvo koje prvenstveno utiče (na primer, inhibira ili ubija) tumorogene CSC.
[0265] Korisne klase terapijskih agenasa uključuju, na primer, antitubulin agense, auristatine, DNK manje vezujuće žlebove inhibitore replikacije DNK, agense za alkilovanje (npr., kompleksi platine kao što su cisplatin, mono (platinum), bis (platinum) i tri-nuklearni platinasti kompleksi i karboplatin), antraciklini, antibiotici, antifolati, antimetaboliti, senzitizatori za hemoterapiju, duokarmicine, etopozide, fluorirane pirimidine, jonofore, lekitropsine, nitro-izvore, platinole, purinske antimetabolite, puromicine, senzitizere zračenja, steroide, taksane, inhibitore topoizomeraze, vinca alkaloide ili kao. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je agens za alkilovanje, antimetabolit, antimitotik, inhibitor topoizomeraze ili inhibitor angiogeneze. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je kompleks platine kao što je karboplatin ili cisplatin. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, dodatni terapeutski agens je kompleks platine u kombinaciji sa taksanom.
[0266] Terapeutski agensi koji se mogu primenjivati u kombinaciji sa VEGF/DLL4 vezujućim agensima uključuju hemoterapeutske agense. Tako, u nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda ili tretman podrazumeva davanje agensa za vezivanje anti-VEGF ili antitela predmetnog obelodanjivanja u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom ili koktelom više različitih hemoterapeutskih agenasa. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda ili tretman podrazumeva davanje agensa za vezivanje anti-DLL4 ili antitela predmetnog obelodanjivanja u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom ili koktelom više različitih hemoterapeutskih agenasa. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda ili tretman podrazumeva davanje bispecifičnog antitela predmetnog obelodanjivanja koja vezuje VEGF i DLL4 u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom ili koktelom više različitih hemoterapeutskih agenasa.
[0267] Hemoterapeutski agensi korisni za trenutno otkrivanje uključuju, ali bez ograničenja, sredstva za alkilovanje kao što su tiotepa i ciklofosfamid (CITOKSAN); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbo kun, meturedopa i uredopa; etilenimin i metilamelamin uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilenetiofosfamoamid i trimetilolomelamin; azotni gorčici, kao što su hlorambucil, hlornapazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembikin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrosurea kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici kao što su aclacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bromomicin, kaktinomicin, kaliheamicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norlucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcolomicin, mitomicin, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini , peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, stretonigrin, streptozocin, tuberkidin, ubenimek, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analogi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analogi pirimidina kao što su ankitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citozin arabinoza, dideokuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolonski propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalin kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za popunjavanje folne kiseline kao što su folinska kiselina; aceglatone; aldofosfamidni glikozid; aminolevulinična kiselina; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatrakate; defofamin; demekolcin; diazikon; elfomitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitratin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilična kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuon; 2,2 ', 2 "-trihlorotrietilamin, uretan, vindesin, dakarbazin, manomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman; gacitosin; arabinoza (Ara-C); taksoidi, npr. paklitaksel (TAKSOL) i docetaksel (TAKSOTERE); hlorambucil; gemcitabin; 6-tiogvanin; merkaptopurin; platinasti analogi kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; ibandronat; CPT11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoična kiselina; esperamicin; kapecitabin (KSELODA); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od gornjih. Hemoterapeutski agensi takođe uključuju antihormonske agense koji deluju da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumorima kao što su antiestrogeni uključujući, na primer, tamoksifen, raloksifen, aromataze koji inhibiraju 4 (5)-imidazol, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston , i toremifen (FARESTON); i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od gornjih. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je cisplatin. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je karboplatin. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je paklitaksel.
[0268] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, hemoterapeutski agens je inhibitor topoizomeraze. Inhibitori topoizomeraze su hemoterapeutski agensi koji ometaju delovanje enzima topoizomeraze (npr., topoizomeraze I ili II). Inhibitori topoizomeraze uključuju, ali nisu ograničeni na, doksorubicin HCl, daunorubicin citrat, mitoksantron HCl, aktinomicin D, etopozid, topotekan HCl, tenipozid (VM-26) i irinotekan, kao i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kojeg ovih. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je irinotecan.
[0269] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, hemoterapeutski agens je anti-metabolit. Anti-metabolit je hemikalija sa strukturom koja je slična metabolitu koji je potreban za normalne biohemijske reakcije, ali dovoljno različit da bi ometao jednu ili više normalnih funkcija ćelija, kao što je ćelijska podela. Anti-metaboliti obuhvataju, ali bez ograničenja, gemcitabin, fluorouracil, kapecitabin, metotreksat natrijum, ralitreksed, permetreksed, tegafur, citozin arabinoza, tioguanin, 5-azacitidin, 6-merkaptopurin, azatioprin, 6-tioguanin, pentostatin, fludarabin fosfat, i kladribin, kao i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo koje od ovih. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je gemcitabin.
[0270] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, hemoterapeutski agens je antimitotično sredstvo, uključujući, ali ne ograničavajući se na, agense koji se vezuju za tubulin. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, agens je taksan. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, agens je paklitaksel ili docetaksel, ili farmaceutski prihvatljiva so, kiselina ili derivat paklitaksela ili docetaksela. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, agens je paklitaksel (TAKSOL), docetaksel (TAKSOTERE), paklitaksel vezan za albumin (ABRAKSANE), DHA-paklitaksel ili PG-paklitaksel. U određenom alternativnom ovdašnjem obelodanjivanju, antimitotski agens sadrži vinca alkaloid, kao što su vinkristin, binblastin, vinorelbin ili vindezin, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili njihove derivate. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antimitotički agens je inhibitor kinezina Eg5 ili inhibitor mitotske kinaze, kao što je Aurora A ili Plk1. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, gde je hemoterapeutski agens koji se daje u kombinaciji sa agens za vezivanje VEGF/DLL4 antimotično sredstvo, kancer ili tumor koji se tretira je kancer dojke ili tumor dojke.
[0271] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens sadrži agens kao što je malo molekul. Na primer, lečenje može uključiti kombinovanu primenu VEGF/DLL4 vezujućeg agensa (npr. antitela) predmetnog obelodanjivanja sa malim molekulom koji deluje kao inhibitor protiv dodatnih proteina povezanih sa tumorom, uključujući, ali bez ograničenja, EGFR, ErbB2, HER2 i/ili VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je mali molekul koji inhibira putanje matičnih ćelija karcinoma. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je mali molekul koji inhibira Notch put U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je mali molekul koji inhibira Wnt put U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je mali molekul koji inhibira BMP put U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je mali molekul koji inhibira β-katenin signalizaciju.
[0272] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens sadrži biološki molekul kao što je antitelo. Na primer, lečenje može uključiti kombinovanu primenu VEGF/DLL4 vezujućeg agensa (npr. antitela) predmetnog obelodanjivanja sa deluje kao inhibitor protiv dodatnih proteina povezanih sa tumorom, uključujući, ali bez ograničenja, antitela koja vezuju koji EGFR, ErbB2, HER2, i/ili VEGF. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje antitelo za označavanje matičnih anti-kancerogenih ćelija. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje vezuje komponentu Notch puta. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje vezuje komponentu Wnt puta. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje inhibira putanje matičnih ćelija karcinoma. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje inhibira Notch put U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje inhibira Wnt put U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje inhibira BMP put U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje inhibira β-katenin signalizaciju. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je antitelo koje je inhibitor angiogeneze ili modulator (npr., anti-VEGF ili VEGF receptor antitelo). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi terapeutski agens je bevacizumab (AVASTIN), trastuzumab (HERCEPTIN), panitumumab (VECTIBIX) ili cetukimab (ERBITUX). Kombinovano davanje može uključiti zajedničko davanje, bilo u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili koristeći odvojene formulacije, ili uzastopnu primenu u bilo kojem redu, ali uglavnom u vremenskom periodu tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno vršiti svoje biološke aktivnosti.
[0273] Dalje, tretman sa VEGF/DLL4 veznim agensom opisanim ovde može uključivati kombinovani tretman sa drugim biološkim molekulima, kao što su jedan ili više citokina (npr., limfokini, interleukini, faktori tumorske nekroze i/ili faktori rasta) ili mogu biti praćeni hirurško uklanjanje tumora, ćelija karcinoma ili bilo koju drugu terapiju koja je potrebna lekaru koji leči.
[0274] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, lečenje podrazumeva davanje vezujućeg agensa VEGF/DLL4 (na primer, antitela) predmetnog obelodanjivanja u kombinaciji sa terapijom zračenjem. Tretman sa VEGF/DLL4 vezujućim agensom može se javiti pre, istovremeno sa ili nakon davanja zračenja. Raspored doziranja za takvu radioterapiju može odrediti stručni lekar.
[0275] Biće prihvaćeno da kombinacija VEGF/DLL4 vezujućeg agensa i dodatnog terapeutskog agensa može biti primenjena u bilo kom redosledu ili istovremeno. Tretman sa agensom za vezivanje VEGF/DLL4 (npr., antitelo) može se javiti pre, istovremeno sa ili nakon primene hemoterapije. Kombinovano davanje može uključiti zajedničko davanje, bilo u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili koristeći odvojene formulacije, ili uzastopnu primenu u bilo kojem redu, ali uglavnom u vremenskom periodu tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno vršiti svoje biološke aktivnosti. Priprema i doziranje rasporeda za takve hemoterapeutske agense mogu se koristiti prema uputstvima proizvođača ili kao što je empirijski određen od strane stručnjaka. Priprema i doziranje rasporeda za takvu hemoterapiju su takođe opisane u The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
[0276] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, VEGF/DLL4 vezujući agens će se davati pacijentima koji su prethodno bili podvrgnuti terapiji drugim terapijskim agensom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, agens za vezivanje VEGF/DLL4 i drugi terapeutski agens će se primenjivati u suštini istovremeno ili istovremeno. Na primer, subjektu se može dati agens za vezivanje VEGF/DLL4 (npr., antitelo) dok prolazi kroz terapiju sa drugim terapeutskim agensom (npr., Hemoterapijom). U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens će se davati u roku od 1 godine od tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens će se primenjivati u roku od 10, 8, 6, 4 ili 2 meseca bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens će se primenjivati u roku od 4, 3, 2 ili 1 nedelja bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, VEGF/DLL4 vezujući agens će se primenjivati u roku od 5, 4, 3, 2 ili 1 dana bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. Dalje će biti priznato da se dva (ili više) agenasa ili tretmana mogu davati subjektu u roku od nekoliko sati ili minuta (tj., u suštini istovremeno).
[0277] Za lečenje bolesti, odgovarajuća doza VEGF/DLL4 vezujućeg agensa (npr. antitela) predmetnog obelodanjivanja zavisi od vrste bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, odziv bolest, da li se agens za vezivanje VEGF/DLL4-a ili antitela primenjuje u terapijske ili preventivne svrhe, prethodnu terapiju, kliničku istoriju pacijenta i tako dalje, sve po odlučivanju lekara koji leči. VEGF/DLL4 vezujući agens ili antitelo može se primenjivati jednokratno ili kao niz tretmana koji se šire tokom nekoliko dana do nekoliko meseci, ili dok se ne izleči ili se postigne smanjenje stanja bolesti (npr., smanjenje veličine tumora). Optimalni raspored doziranja se može izračunati iz merenja akumulacije lekova u telu pacijenta i varirati u zavisnosti od relativne potencije pojedinačnog antitela ili agensa. Lekar može odrediti optimalne doze, metodologije doziranja i stope ponavljanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, doziranje VEGF/DLL4 vezujućeg agensa ili antitela je od oko 0.01µg do oko 100mg/kg telesne težine, od oko 0.1µg do oko 100mg/kg telesne težine, od oko 1mg do oko 100mg/kg telesne težine, od oko 1µg do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 1 mg do oko 80 mg/kg telesne težine od oko 10 mg do oko 100 mg/kg telesne težine, od oko 10 mg do oko 75 mg/kg telesne težine, ili od oko 10 mg do oko 50 mg/kg telesne težine. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, doziranje antitela ili drugog vezujućeg agensa VEGF/DLL4 je od oko 0.1 mg do oko 20 mg/kg telesne težine. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, doziranje se može davati jednom ili više dnevno, nedeljno, mesečno ili godišnje. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, antitelo ili drugi vezujući agens VEGF/DLL4 se daje jednom svake nedelje, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje ili jednom mesečno.
[0278] U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, vezujući agens VEGF/DLL4 (npr., antitelo) može se primenjivati u početnoj većoj dozi "opterećenja", praćena jednim ili više nižim dozama. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju može se promeniti i učestalost davanja. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, režim doziranja može obuhvatati davanje početne doze, praćene dodatnim dozama (ili "održavanjem" doza) jednom nedeljno, jednom svake dve sedmice, jednom svake tri sedmice ili jednom mesečno. Na primer, režim doziranja može obuhvatati davanje početne doze, praćene nedeljnom dozom, na primer, polovinom početne doze. Ili režim doziranja može obuhvatati primenu početne opterećene doze, praćene dozama održavanja, na primer, pola početne doze svake druge nedelje. Ili režim doziranja može obuhvatati administriranje tri inicijalne doze u trajanju od 3 nedelje, nakon čega sledi održavanje doza, na početne, isti iznos svake druge nedelje. Ili režim doziranja može obuhvatati primenu početne doze praćene dodatnim dozama svake 3 nedelje ili jednom mesečno. Lekar koji leči može da proceni brzinu ponavljanja doziranja na osnovu merenih vremena boravka i koncentracija leka u telesnim tečnostima ili tkivima. Napredak terapije može se pratiti konvencionalnim tehnikama i testovima.
[0279] Kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti, primena nekog terapeutskog agensa može dovesti do neželjenih dejstava i/ili toksičnosti. U nekim slučajevima, neželjeni efekti i/ili toksičnosti su toliko ozbiljni da sprečavaju davanje određenog agensa u terapeutski efikasnoj dozi. U nekim slučajevima terapija lekom mora biti prekinuta, a drugi agensi se mogu dati. Međutim, mnogi agensi u istoj terapijskoj klasi često prikazuju slične neželjene efekte i/ili toksičnost, što znači da pacijent ili treba da zaustavi terapiju ili, ako je moguće, pate od neprijatnih neželjenih efekata povezanih sa terapijskim agensom.
[0280] Neželjeni efekti terapijskih agensa mogu uključivati, ali bez ograničenja na njih, koprivnjače, kožni osip, svrab, mučnina, povraćanje, smanjeni apetit, dijareja, drhtavica, groznica, umor, bolove u mišićima i bol, glavobolja, niskog krvnog pritiska, hiperkalemija, niskih krvnih slika, krvarenja i srčanih problema.
[0281] Prema tome, jedan aspekt ovog otelotvorenja je usmeren na metode lečenja karcinoma kod pacijenta koji obuhvata davanje anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela koristeći isprekidan režim doziranja, što može smanjiti neželjene efekte i/ili toksičnosti povezane sa primenom anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela Kao što se ovde koristi, " isprekidano doziranje" se odnosi na režim doziranja koristeći interval doziranja više od jednom nedeljno, npr., doziranje jednom na svake 2 nedelje, jednom svake 3 nedelje, jednom svake 4 nedelje, itd. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, metode za lečenje kancera kod ljudi pacijenta obuhvata davanje pacijentu efikasne doze anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela prema isprekidanom režimu doziranja. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, metoda za lečenje kancera kod pacijenta kod ljudi obuhvata davanje pacijentu efikasne doze anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela prema isprekidanom režimu doziranja, i povećanje terapeutskog indeksa anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži davanje inicijalne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 pacijentu i davanje naknadnih doza bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 oko jednom na 2 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži davanje inicijalne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 pacijentu i davanje naknadnih doza bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 oko jednom na 3 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži davanje inicijalne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 pacijentu i davanje naknadnih doza bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 oko jednom na 4 nedelje.
[0282] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, naknadne doze u isprekidanom režimu doziranja su približno iste količine ili manje od inicijalne doze. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, naknadne doze su veća količina od početne doze. Kao što su poznati stručnjacima, doze koje se koriste će se razlikovati u zavisnosti od kliničkih ciljeva koje treba postići. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početne doze su oko 0.25mg/kg do oko 20mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početne doze su oko 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 20mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 0.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 1mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 2.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 7.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 10mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 12.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 15mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, početna doza je oko 20mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 0.25mg/kg do oko 15mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 0.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 1mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 2.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 7.5mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 10mg/kg. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, sledeće doze su oko 12.5mg/kg.
[0283] U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži: (a) davanje pacijentu početne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 od oko 2.5 mg/kg i (b) davanje naknadnih doza od oko 2.5 mg/kg jednom na svake 2 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži: (a) davanje pacijentu početne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 od oko 5mg/kg i (b) davanje naknadnih doza od oko 5 mg/kg jednom na svake 2 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži: (a) davanje pacijentu početne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 od oko 2.5 mg/kg i (b) davanje naknadnih doza od oko 2.5 mg/kg jednom na svake 3 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži: (a) davanje pacijentu početne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 od oko 5mg/kg i (b) davanje naknadnih doza od oko 5 mg/kg jednom na svake 3 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži: (a) davanje pacijentu početne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 od oko 2.5 mg/kg i (b) davanje naknadnih doza od oko 2.5 mg/kg jednom na svake 4 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, isprekidan režim doziranja sadrži: (a) davanje pacijentu početne doze bispecifičnog antitela anti-VEGF/anti-DLL4 od oko 5mg/kg i (b) davanje naknadnih doza od oko 5 mg/kg jednom na svake 4 nedelje. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, početna doza i doze održavanja su različite, na primer, inicijalna doza je oko 5 mg/kg, a naknadne doze su oko 2.5 mg/kg. U nekim ovdašnjim obelodanjivanjima, intermitentni režim doziranja može sadržati punjenje doze, na primer, početna doza je oko 20 mg/kg, a naknadne doze su isprekidan 2.5 mg/kg ili oko 5 mg/kg dati jednom na svake 2 nedelje, jednom na 3 nedelje ili jednom u 4 nedelje.
[0284] Obelodanjivanje je takođe usmereno na metode za smanjenje toksičnosti anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela kod humanog pacijenta koji obuhvata davanje pacijentu anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela koristeći isprekidan režim doziranja. Obelodanjivanje je takođe usmereno na metode za smanjenje neželjenih efekata anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela kod humanog pacijenta koji obuhvata davanje pacijentu anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela koristeći isprekidan režim doziranja. Obelodanjivanje je takođe usmereno na metode za povećanje terapeutskog indeksa anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela kod humanog pacijenta koji obuhvata davanje pacijentu anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela koristeći isprekidan režim doziranja.
[0285] Izbor metoda isporuke za početnu i narednu dozu se pravi u skladu sa sposobnošću životinjskog ili ljudskog pacijenta da toleriše unošenje anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela u telo. Prema tome, u bilo kom od aspekata i/ili obelodanjivanja ovde opisanih, primena anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela može biti intravenskom injekcijom ili intravenozno. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, davanje je intravenozna infuzija. U bilo kom od aspekata i/ili obelodanjivanja ovde opisanih, primena anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnog antitela može biti neintravenoznim putem.
V. Kompleti koji sadrže VEGF/DLL4 vezujuće agense
[0286] Predmetno obelodanjivanje sadrži komplete koji sadrže VEGF/DLL4 vezujuće agense (npr., antitela) koja su ovde opisana i koja se mogu koristiti za izvođenje metoda opisanih ovde. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, komplet sadrži najmanje jedno prečišćeno antitelo protiv VEGF i/ili DLL4 u jednom ili više kontejnera. U nekom ovdašnjem obelodanjivanju, kompleti sadrže sve potrebne komponente i/ili dovoljne za obavljanje testa detekcije, uključujući sve kontrole, uputstva za obavljanje analiza i svaki potreban softver za analizu i prezentaciju rezultata. Stručnjak će lako prepoznati da obelodanjeni VEGF/DLL4 vezujući agensi predmetnog obelodanjivanja mogu biti lako inkorporirani u jedan od utvrđenih formata kitova koji su dobro poznati u struci.
[0287] Dalje su obezbeđeni kompleti koji sadrže VEGF/DLL4 vezujući agens (npr., anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo), kao i najmanje jedan dodatni terapeutski agens. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi (ili više) terapeutski agens je hemoterapeutski agens. U određenom ovdašnjem obelodanjivanju, drugi (ili više) terapeutski agens je inhibitor angiogenze.
[0288] Predmetno obelodanjivanje može se dalje definirati upućivanjem na sledeće neograničavajuće primere, koji detaljno opisuju pripremu određenih antitela iz predmetnog obelodanjivanja i metode za korišćenje antitela iz predmetnog obelodanjivanja. Stručnjacima će biti očigledno da se mnoge modifikacije, kako materijala, tako i metoda, mogu praktikovati bez napuštanja obima predmetnog obelodanjivanja.
PRIMERI
Primer 1
Vezujući afiniteti anti-VEGF/anti-DLL4 antitela
[0289] KDroditeljskih antitela anti-VEGF 219R45 (IgG format), anti-DLL421R79 (IgG format), anti-DLL421M18 (IgG format) i bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 su određeni pomoću Biacora 2000 sistem Biacore LifeSciences (GE Healthcare). Rekombinantni humani DLL4-Fc ili mišji DLL4-Fc proteini su imobilisani na CM5 karboksilnim čipovima koristeći standardnu hemiju na bazi amina (NHS/EDC) i blokirani etanolaminom. Rekombinantni humani VEGF165ili VEGF165miševi bili su biotinilovani i imobilisani na streptavidinskim čipovima. Antitela su serijski razblažena 2 puta od 100nM do 0.78nM u HBS-P (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005% v/v Polysorbate 20). Za svako antitelo, svih 8 razređivanja su sekvencijalno ubrizgana preko određenog čipa. Kinetički podaci su sakupljeni tokom vremena i prilagođeni su istovremenom globalnom fit funkcijom da bi se dobijale konstante afiniteta (vrednosti KD) za svako bispecifično antitelo.
Tabela 3
[0290] Kao što je prikazano u Tabeli 3, bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 imalo je afinitetnu konstantu (KD) za humani VEGF od 0.36nM i KDza humanu DLL4 od 16nM. Bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 imalo je KDza humani VEGF od 0.68nM i KD za humani DLL4 od 0.53nM. Oba bispecifična antitela pokazala su slabije vezivanje za VEGF miš u poređenju sa humanim VEGF-om i mišijim DLL4 vezanim za antitelo. Tako su i bispecifična antitela pokazala sličan vezujući afinitet prema humanom VEGF i 219R45-MB-21R79 pokazali približno 30 puta jače vezivanje za DLL4 čoveka nego 219R45-MB-21M18. Pored toga, bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 imalo je sličan vezujući afinitet prema humanom VEGF uprkos činjenici da je bispecifično antitelo monovalentno za VEGF u odnosu na bivalentno roditeljsko antitelo.
[0291] Identifikovano je nekoliko dodatnih anti-DLL4 antitela koje su vezivale afinitet u odnosu na KDod 21M18 i 21R79. Dva od ovih anti-DLL4 antitela korišćena su za proizvodnju anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83. Koristeći sistem Biacore 2000 kao što je gore opisano, određeni su KDbispecifičnih antitela 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83 na humani DLL4. Poređenje afiniteta vezivanja za humani DLL4 ovih četiri anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela prikazano je u Tabeli 4.
[0292] CDR-i za anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83 su prikazani na slici 1A. Lažni lanac i varijabilni region lakog lanca SEK ID Br su prikazani na slici 1B, teški lanac i laki lanac SEK ID Br (sa i bez signalne sekvence) prikazani su na Slici 1C.
[0293] Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 sadrži (a) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:75 deponovana u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13233, (b) teški lanac kodairan sa DNK koja sadrži SEK ID Br:33 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13236, i (c) laki lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:34 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13235.
[0294] Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 sadrži (a) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:31 deponovana ATCC, pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13232, (b) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:33 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13236, i (c) laki lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:34 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13235.
[0295] Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R83 sadrži (a) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:72 deponovana ATCC, pod uslovima Budapest Treaty Oktobra 24, 2012 i dodeljeni broj PTA-13278, (b) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:33 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13236, i (c) laki lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:34 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13235.
[0296] Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R75 sadrži (a) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:74 deponovana ATCC, pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13234, (b) teški lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:33 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13236, i (c) laki lanac kodiran sa DNK koja sadrži SEK ID Br:34 deponovan u ATCC pod uslovima Budapest Treaty Septembra 21, 2012 i dodeljeni broj PTA-13235.
Tabela 4
Primer 2
HTRF test za istovremeno vezivanje bispecifičnih antitela na humani VEGF i humani DLL4.
[0297] Da bi se karakterizirale sposobnosti vezivanja određenih antitela i/ili smeša antitela na VEGF i DLL4, izvedene su homogene ispitane fluorescencije sa vremenom (HTRF). Ispitivana antitela su anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79, roditeljska antitela 219R45 (anti-VEGF), 21M18 (anti-DLL4), 21R79 (anti-DLL4) 219R45 i 21M18, ili kombinacija 219R45 i 21R79. Antitela ili smeše antitela serijski su razblažene 2 puta od 3000nM do 2,9nM u puferu za vezivanje (IX PBS, 0.1% želatin, 0.1% Polisorbat 20, 400mM kalijum fluorida) i smešteni su u belu ploču sa 96 otvora. Jednak volumen rastvora koji sadrži 4µg/ml hDLL4-Fc s oznakom d2 i 21.4ng/ml hVEGF165sa oznakom Europium cripate dodato je u svaku vrelu za završni volumen od 100ml (konačne koncentracije akceptora i doniranih fluoroforova su bile 2mg/ml i 10.7ng/ml, respektivno). Testne ploče su inkubirane 2 sata do noći i čitane na SpectraMax M5e Microplate čitaču (Molekularni uređaji, Sunnyvale CA) na talasnoj dužini ekscitacije od 314nm.
[0298] Kao što je prikazano na slici 2, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 su uspeli da istovremeno vezuju i hVEGF i hDLL4. Važno je da ni jedna od kombinacija roditeljskih antitela (tj., 219R45 i 21M18 ili 219R45 i 21R79) nije mogla da istovremeno veže VEGF i DLL4. Ovi rezultati jasno pokazuju da anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 mogu da funkcionišu drugačije nego samo mešavina dve pojedinačne antitela.
Primer 3
Inhibicija proliferacije HUVEC om pomoću anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela
[0299] HUVEC ćelije su dobijene od Lonza (Walkersville MD) i kultivisane na podlozi za rast (M199, 10% toplotno inaktiviran FBS (HI-FBS), 50µg/ml EGS, IX heparin, ImM L-glutamin). Za ispitivanje proliferacije HUVEC-a ploča sa 96 otvora prethodno je obložena sa 50µl 10µg/ml pacovskog kolagena tipa 1 pacova kolagena (kolagen I u 0.02 N sirćetnoj kiselini) i inkubirana na 4°C preko noći. Posle inkubacije, ploča je bila temeljno isparena da bi se uklonio nevezani kolagenski rastvor I i oprali jednom sa 200µl DPBS. HUVEC ćelije su uklonjene sa površine rastvorenih boca koristeći subklon reagens endotelne ćelije i centrifugirane na 1200 o/min tokom 5 minuta na 4°C. Ćelije su ponovo resuspendovane na podlozi za gladovanje/ispitivanje (M199 i 2% HI-FBS, 1X heparin, 5U/ml heparin-glutamin) u gustini od 10<5>ćelija/ml. Ćelije su sjeme u ploču za testiranje sa kolagenom na 5000 ćelija/bunar, 50 ul/bunar. Ćelije su inkubirane u trajanju od 3 sata na 37°C, oprane jednokratno, prenošene sa 100 ul testiranom podlogom i inkubirane preko noći na 37°C. Sledećeg dana bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, roditeljsko antitelo 219R45 ili kontrolno antitelo LZ1 su pripremljene u smeši sa humanim VEGF (R&D Biosistems, Minneapolis MN). Antitela su serijski razblažena 5 puta od 20µM do 0.25nM u puferu za testiranje u kombinaciji sa hVEGF (konačna koncentracija 5ng/ml). Smeša se prethodno inkubira na 37°C na 3 sata. Podloga je uklonjena sa ploče za testiranje, i 100µl smeše antitela/hVEGF je dodato u svaki otvor. Posle 3-4 dana inkubacije, sredstvo je uklonjeno i sveži alikvot antitela/hVEGF smeše je dodan u svaku bazu i ostavljen da se inkubira još 4 dana. Na dan 7, 20µl Alamar Blue reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) je dodato u svaku bazu i inkubirano na 37°C tokom 5-6 sati. Ploča je pročitana pomoću SpectraMax M5e čitača mikroploča (Molekularni uređaji, Sunnyvale CA) koristeći talasnu dužinu uzbude od 539nm i emisiju talasne dužine od 590nm.
[0300] Kao što je prikazano na slici 3, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79, kao i roditeljsko anti-VEGF antitelo 219R45 inhibiraju HUVEC proliferaciju. Ovi rezultati su pokazali da su bispecifična antitela sposobna da inhibiraju proliferaciju HUVEC ćelija izazvane VEGF-om.
Primer 4
Inhibicija DLL4-indukovane Notch signalizacije pomoću bispecifičnih antitela
[0301] Human PC3 ćelije su transfektovane ekspresionim vektorom koji kodira celovit čovek Notch2 receptor i reporter vektor luciferaze (8xCBF-luciferaze reporter) koji odgovara Notchovoj signalizaciji. Ćelije su takođe transfektovane sa reporterom Renilla luciferase (Promega, Madison WI) kao unutrašnjom kontrolom efikasnosti transfekcije. Pročišćeni humani DLL4 protein je prevučen na ploče sa 96 otvora na 100ng/bunar i u otvore su dodati PC3-luc ćelije koje izražavaju Notch2. Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, roditeljska anti-DLL4 antitela 21M18, 21R79 ili kontrolno antitelo LZ1 su serijski razblažene 5 puta od 20ug/ml do 0.064ug/ml, dodati u odgovarajuće otvore i inkubirati preko noći. Aktivnost Luciferase je određena pomoću dvostrukog luciferaznog testa (Promega, Madison, VI) sa aktivnošću luciferaze svetlosti koja je normalizovana prema aktivnosti Renilla luciferaze.
[0302] Kao što je prikazano na slici 4, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 i roditeljska anti-DLL4 antitela 21M18 i 21R79 inhibiraju DLL4-indukovano Notch signalizaciju. Bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 inhibirala je DLL4-indukovano Notch signalizaciju samo pri visokim koncentracijama antitela. Ovi rezultati pokazuju da bi bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79, i u manjoj meri bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18, bilo sposobno da inhibira signalizaciju Notch-indukovane sa DLL4. Tako, u kombinaciji sa rezultatima prikazanim u Primeru 3, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21R79 i 219R45-MB-21M18 pokazali su sposobnost da inhibiraju oba indukovana VEGF i DLL4-indukovana signalizacija i/ili funkcija proliferacije.
Primer 5
Inhibicija rasta tumora in vivo od strane bispecifičnog antitela u modelu grafta kod ljudi
[0303] Prijavljen je model grafta ljudske kože koji obuhvata humani kožni graft i humane tumorske ćelije. Ljudska koža grafta se uspostavlja, a onda se humane tumorske ćelije implantiraju u kožni graft, omogućavajući tumorskim ćelijama da rastu u okruženju sa ljudskom stromom i vaskulatom (Tahtis i dr., 2003, Mol. Cancer Ther. 2:229-737). Uzorci ljudske kože dobijeni su iz tkiva neonatalnih kožica i nakalemljeni na bočni deo miša NOD-SCID. Posle uspostavljanja kožnog grafta, luciferaze obeležene tumorske ćelije OMP-C8 (20.000 ćelija) intradermalno su injektirane u ljudsku kožu. Rast tumora je pratio bioluminiscentnom prikazom pomoću IVIS sistema za snimanje (Caliper Life Sciences, Mountain View, CA). Tumorima je dozvoljeno da raste dok ne dostignu 1.2 x 10<6>fotona u sekundi. Nasumični tumorski miševi (n = 6 miševa/grupa) su birani i tretirani kontrolom Ab, anti-hDLL4 antitelo 21M18, anti-VEGF antitelo bevacizumab ili anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18. Životinje su tretirane jednom nedeljno i antitela su davana intraperitonealno u dozi od 25 mg/kg. Rast tumora je nadgledan bioluminiscencijom u naznačenim danima.
[0304] Kao što je prikazano na slici 5, oba anti-hDLL4 antitela 21M18 i anti-VEGF antitelo bevacizumab inhibiraju rast tumora u ovom modelu tumora čoveka kože/čoveka. Pored toga, bispecifično anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 je bilo efikasnije od bilo onih anti-DLL4 antitela ili samo anti-VEGF antitela. Ovi podaci pokazuju korisnost istovremenog usmeravanja DLL4 i VEGF sa bispecifičnim antitelima.
Primer 6
Tumorigeničnost OMP-PN8 tumorskih ćelija pankreasa nakon lečenja anti-VEGF/anti-DLL4 bispecificnim antitelima.
[0305] Miševi koji nose OMP-PN8 tumor pankreasa tretirani su kontrolnim antitelom (15 mg/kg), anti-hDLL4 antitelom 21M18 (15 mg/kg), anti-VEGF antitelom bevacizumab (15 mg/kg) ili anti-VEGF/DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 ili 219R45-MB-21R79 (30 mg/kg) sa ili bez gemcitabina (70 mg/kg). Nakon četiri nedelje lečenja, tumori su sakupljeni, obrađeni na pojedinačne suspenzije ćelija, a humane tumorske ćelije su prečišćene imunomagnetnom osiromašenjem ćelija mišića. 90 humane tumorske ćelije iz svake terapijske grupe prebačene su u novu grupu miševa (n = 10 miševa/grupa). Tumorima je bilo dozvoljeno da rastu 55 dana bez ikakvog lečenja, a zapremina tumora je meren elektronskim čeljustima.
[0306] Slika 6 prikazuje zapremina tumora od pojedinih miševa u svakoj grupi. Ćelije izolovane od miševa tretiranih anti-hDLL4 antitelom 21M18 značajno su smanjile tumorogenicnost, 5 od 10 miševa imale su tumore, u poređenju sa ćelijama izolovanim od miševa tretiranih kontrolnim antitelima gde je 9 od 10 miševa imalo tumore. Smanjenje frekvencije rasta tumora ukazuje na smanjenje frekvencije matičnih ćelija karcinoma. Za razliku od toga, tretman bevacizumaba nije rezultirao smanjenjem frekvencije rasta tumora, 10 od 10 miševa imalo je tumore. Slično bevacizumabu, lečenje gemcitabinom kao jedinstvenim agensom nije uticalo na frekvenciju rasta tumora, jer je 10 od 10 miševa imalo tumore. Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 su smanjili frekvenciju rasta tumora (5 od 10 miševa imale su tumore i 4 od 10 miševa imale su tumore, respektivno). Kombinovani tretman sa gemcitabinom nije imao uticaja na frekvenciju rasta tumora. Ovi podaci ukazuju na to da ciljanje DLL4 smanjuje frekvenciju matičnih ćelija raka dok ciljanje samo na VEGF ne. Važno je da ovi podaci ukazuju na to da je anti-CSC aktivnost anti-DLL4 antitela zadržana u bispecifičnom antitelu.
Primer 7
Bispecifično antitelo ELISA
[0307] VEGF (ATGEN, Južna Koreja) je prevučen na Nunc makisorb ploče na 2ug/ml (100µl/bunar) i inkubiran preko noći na 2-8°C. Bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB-21R75 i 219R45-MB-21R83 su razblažena u blokirnom puferu (1x PBS, 0.1% želatin, 0.1% Polisorbat-20, pH 7.4) 2µg/ml biotin-DLL4-hFc. Antitela su serijski razblažena 3 puta od 500ng/ml do 0.008ng/ml. Uzorci antitela su inkubirani 2 sata u blokirajućem puferu koji sadrži biotin-DLL4-hFc. Nakon inkubacije, uzorci antitela se prenose na VEGF-obloženu ploču testa (100 ul/otvoru) i inkubiraju 2 sata. Streptavidin-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) je dodat u svaki otvor i inkubiran tokom 1 h. TMB supstrat je dodat u otvore sa razvojem boje od 10 minuta i reakcija je zaustavljena sa 2M sumpornom kiselinom. Apsorbancija je pročitana na 450-650nm, a podaci analizirani korišćenjem 4-parametarskog odgovora unutar Softmax Pro programa za analizu (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[0308] Na slici 7 prikazane su krive titracije specifičnih antitela 219R45-MB-21M18 (otvoreni krugovi), 219R45-MB-21R79 (otvoreni kvadrati), 219R45-MB-21R75 (otvoreni trouglovi) i 219R45-MB-21R83 (otvoreni dijamanti) u poređenju na referentno anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo (čvrsti krugovi). Relativna potencija za bispecifična antitela u odnosu na referentno bispecifično antitelo prikazana je u Tabeli 5.
Tabela 5
[0309] Bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 je bilo najpotentnije, oko 7 puta više potentno nego 219R45-MB-21M18, što je odrazilo veći afinitet 21R79 antigen vezujućeg mesta.
Primer 8
Proizvodnja bispecifičnog antitela
[0310] Bispecifična antitela su proizvedena korišćenjem GS-CHO ćelijske linije. Ćelije CHOK1SV (Lonza Biologics) su transfektovane putem elektroporacije sa genima koji su u interesu s glutamin-sintetazom (GS) kao odabranim markerom. Transfektanti i subklonovi su prikazani za produktivnost antitela, a visoki proizvođači su izabrani za skaliranu proizvodnju. Ćelije su uzgajane korišćenjem procesa prihranjivanja gomile i bioreaktora prihranjivanja gomile. Akumulirano antitelo u tekućoj ćelijskoj kulturi (HCCF) je izolovano i prečišćeno primenom hromatografskih tehnika.
[0311] Ćelijske linije bispecifičnog antitela 219R45-MB-21M18.010.017 i 219R45-MB-21R79.017.003 bili su kultivisani u 5L mešajućem rezervoaru bioreaktora na 14 dana. Ćelijska linija 219R45-MB-21M18.010.017 proizvela je konačni titar antitela 3.0g/L i ćelijska linija 219R45-MB-21R79.017.003 proizvela je konačni titar antitela 0.8g/L. Ćelijske linije 219R45-MB-21R75.101 i 219R45-MB-21R83.113 su kultivisane u 25L WAVE sistemima bioreaktora (GE Healthcare) koristeći nahranjene-smeše procesa koji je postigao konačne titre antitela od 0.4g/L. Ćelijske linije bispecifičnog antitela 219R45-MB-21M18AG.138.007, 219R45-MB-21M18AG.038.009, 219R45-MB-21M18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014 i 219R45-MB-21R83AG.129.003 su kultivisane u bioreaktorima mešavine rezervoara od 5 L za 14 - 15 dana. Ćelijska linija 219R45-MB-21M18AG.138.007 proizvela je konačni titar antitela od 1.0 g/L nakon 14 dana. Ćelijska linija 219R45-MB-21M18AG.038.009 proizvela je konačni titar antitela od 1.6 g/L nakon 14 dana. Ćelijska linija 219R45-MB-21M18AG.142.002 proizvela je konačni titar antitela od 2.6 g/L nakon 14 dana. Ćelijska linija 219R45-MB-21R79AG.072.014 proizvela je konačni titar antitela od 2.1 g/L nakon 15 dana. Ćelijska linija 219R45-MB-21M18AG.038.009 proizvela je konačni titar antitela od 2.4 g/L nakon 15 dana. Tečnost za kultivisanje se sakuplja filtracijom iz ove četiri ćelijske linije i podvrgnuta je afinitetnoj hromatografiji proteina A. Kolona proteina A je isprana serijom pufera i antitela su eluirana korišćenjem pufera za nisko pH eluiranje. Početna karakterizacija čistoće bispecifičnih antitela obavljena je pomoću hromatografije isključivanja (SEC-HPLC) i izoelektričnog fokusiranja (IEF).
[0312] Za određivanje čistoće proizvoda antitela korišćena je hromatografija za isključivanje veličine (SEC). SEC je poznata hromatografska metoda u kojoj su molekuli (npr., antitela) u rastvoru odvojeni po veličini. SEC se može koristiti za razlikovanje proizvoda antitela od agregata i/ili nečistoća i za određivanje procenta proizvoda antitela u odnosu na ukupnu smešu. Kao što je ovde korišćeno, SEC ne pravi razliku između homomernog antitela i heterodimernog bispecifičnog antitela.
[0313] Izmereni kapilarni izoelektričng fokusiranja (ICIEF) korišten je za određivanje identiteta i čistote heterodimera bispecifičnih antitela. Korišćenjem ICIEF, izoforme naboja antitela su odvojene prema njihovom pI, a rezultat je "otisak prsta" distribucije zarade antitela. ICIEF metoda takođe može služiti kao određivanje čistote separacijom heterodimera bispecifičnih antitela od strane njihovih različitih pI iz bilo kojih homodimernih proizvoda ili nečistoća.
[0314] ICESF je analizirao uzorke bispecifičnih antitela na ProteinSimple ICE280 instrumentu (ProteinSimple, Santa Clara, CA). Za ovu analizu, proteinsku smešu se unosi u kapilar, visoki napon se nanosi preko kapilare, a amfoliti uspostavljaju linearni gradijent pH duž dužine kapilare. Pod uticajem električnog polja, pI markeri i proteinska smeša migriraju dužinu kapilare dok se ne dostigne pH vrednost kada je neto naboj nula. Jednom fokusiran, ICE280 instrument koristi detekciju slike celog kolona sa UV-kamerom od 280 nm za praćenje uzorka proteinskih izoformi unutar kapilare. Dobijeni elektroforest kalibrira se pomoću unutrašnjih pI markera i integrira se kako bi se ustanovile odgovarajuće procentualne oblasti različitih zaručenih izoformi proteinske smeše. Profili punjenja iz nekoliko anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela su prikazani na slici 8. Za ovaj eksperiment, proteini A eluati su razređeni sa MilliQ vodom do koncentracije od 6.6 mg/ml. Ukupno 18µl uzorka pomešano je sa 100µL 8M ureje, 70µL od 0,5% metilceluloze, 8µL od 3-10 Pharmalite, 2µL visokog pI markera i 2µL niske pI marker do konačnog volumena od 200µL. Tabela 6 prikazuje procenat proizvoda antitela iz ćelijskih linija 219R45-MB-21M18.010.017, 219R45-MB-21R79.017.002, 219R45-MB21R75.101, 219R45-MB-21R83.113, 219R45-MB-21M18.138.007, 219R45-MB-21M18AG.038.009, 219R45-MB-21M18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014, i 219R45-MB-21R83AG.129.003 posle afinitetne hromatografije proteina kao što je utvrđeno SEC-HPLC. Tabela 6 prikazuje procenat proizvoda heterodimernih antitela iz ćelijskih linija 219R45-MB-21M18.010.017, 219R45-MB-21R79.017.002, 219R45-MB-21R75.101, 219R45-MB-21R83.113, 219R45-MB-21M18.138.007, 219R45-MB-21M18AG.038.009, 219R45-MB-21M18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014, i 219R45-MB-21R83AG.129.003 posle afinitetne hromatografije proteina A kao što je analizirano pomoću icIEF.
Tabela 6
[0315] Čistoća proizvoda bispecifičnog antitela može se dodatno povećati dodatnim koracima hromatografije. Nakon afinitetne hromatografije proteina, eluatna frakcija je držana pri niskoj pH vrednosti ne manje od 60 minuta na sobnoj temperaturi za inaktivaciju virusa. Rastvor antitela (proteinski A eluat kolone, pH podešen) je natovaren na jaku kolonu za razmenu anjona. Prikupljene su nečistoće vezane za proizvod i proces vezane za hromatografsku smolu za anjonsku razmenu i frakciju protoka (proizvod antitela). U nekim slučajevima, čistoća je dodatno poboljšana upotrebom multimodalne hromatografske smole kao što je keramički hidroksiapatit. U nekim slučajevima je obavljena puferna razmena proizvoda antitela korišćenjem tehnike ultrafiltracije i dijafiltracije, nakon čega su dodati ekscipijensi. Formulisano antitelo je sterilno filtrirano u sterilne kontejnere i skladišteno u frižideru ili zamrznuto. Čistoća bispecifičnih antitela ponovo je procenjena korišćenjem SEC-HPLC i IEF.
Tabela 7
[0316] Kao što je prikazano u Tabeli 7, prečišćavanje anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela sa dodatnim hromatografskim koracima nakon proteina A dovelo je do izolacije proizvoda antitela koji su bili čistiji od 95% do oko 99%, kako je analizirano od strane SEC. Analiza pomoću IEF-a utvrdila je da je prečišćeno anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21M18.010.017 bilo 98.5% heterodimernih, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnih antitela iz ćelijske linije 219R45-MB-21R79.017.002 99.3% heterodimerni anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21R75.101 je bio 98.2% heterodimerni, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21R83.113 je bilo 91.4% heterodimerna, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21M18.138.007 je bila 100% heterodimerna, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21M18AG.142.002 bila je 100% heterodimerna, Anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21R79AG.072.014 je bilo 100% heterodimerno, a anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo iz ćelijske linije 219R45-MB-21R83AG.129.003 bilo je 100% heterodimerno. Ovi rezultati pokazuju da je stepen hromatografije anjonske razmene značajno povećao procenat heterodimernih antitela u poređenju sa prečišćavanjem samo s Hromatografijom proteina A. Dodavanje višemodalnog koraka hromatografije kao što je keramički hidroksiapatit takođe može poboljšati monomernu čistoću (kao što je utvrđeno SEP-HPLC).
Primer 9
Inhibicija OMP-C8 rasta tumora debelog creva in vivo modela ponavljanja tumora
[0317] Suspenzije jednolančanih ćelija ksenografta tumora kolona OMP-C8 (20.000 ćelija) subkutano su injektirane u bokove starih 6-8 nedelja NOD/SCID miševa Tumorima je bilo dozvoljeno da rastu 33 dana dok ne dostignu prosečnu zapreminu od 240mm<3>. Miševi su birani nasumično (n = 10 po grupi) i tretirani sa anti-hDLL4 antitelo 21M18, anti-VEGF antitelo bevacizumab, kombinacija antitela 21M18 i bevacizumab, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 ili kontrolno antitelo, sve u kombinaciji sa irinotekanom. Antitela i irinotekan se doziraju nedeljno injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Antitela 21M18 i bevacizumab su dozirane u 7.5mg/kg, bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 su dozirana na 15 mg/kg, a irinotekan je doziran na 45 mg/kg. Irinotekan je doziran četiri nedelje, u kom vremenom je prekinut, a davanje antitela se nastavilo. Kontrolo tumora je nadgledano i zapremine tumora su merene elektronskim čeljustima u navedenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja ± S.E.M.
[0318] Kao što je prikazano na Slici 9, anti-hDLL4 antitelo 21M18 nastavilo je da inhibira rast tumora nakon obustave tretmana sa irinotekanom. Suprotno tome, anti-VEGF antitelo bevacizumab nije uspeo da inhibira regeneraciju tumora nakon što je irinotekan prekinut. Kombinacija anti-DLL4 antitela 21M18 i anti-VEGF antitela bevacizumab dovela je do veće inhibicije ponovnog rasta tumora od bilo kog agensa. Osim toga, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 je bilo efikasnije u inhibiranju regeneracije tumora od mešavine dva antitela.
Primer 10
Smanjivanje tumorogeniciteta OMP-C8 tumora debelog creva
[0319] Suspenzije jednolančanih ćelija ksenografta tumora kolona OMP-C8 (20.000 ćelija) subkutano su injektirane u bokove starih 6-8 nedelja NOD/SCID miševa Tumorima je bilo dozvoljeno da rastu 33 dana dok ne dostignu prosečnu zapreminu od 300mm<3>. Miševi su birani nasumično (n = 10 po grupi) i tretirani sa anti-DLL4 antitelo 21M18, anti-VEGF antitelo bevacizumab, kombinacija antitela 21M18 i bevacizumab, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifično antitelo 219R45-MB-21R79 ili kontrolno antitelo, sve u kombinaciji sa irinotekanom. Antitela i irinotekan se doziraju nedeljno injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Antitela 21M18 i bevacizumab su dozirane u 7.5mg/kg, bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79 su dozirana na 15 mg/kg, a irinotekan je doziran na 45 mg/kg. Tumori su sakupljeni nakon 4 nedelje, obrađeni u suspenzije pojedinačnih ćelija, a humane tumorske ćelije su izolovane. 150 tumorskih ćelija iz svake eksperimentalne grupe su subkutano injektirane u novu grupu miševa (n = 10 po grupi) i tumoru je dozvoljeno da raste bez lečenja. Rast tumora je nadgledan i volumen tumora je meren pomoću elektronskih čeljusti.
[0320] Pojedinačne zapremine tumora na dan 68 su prikazani na slici 1 Anti-DLL4 antitelo 21M18, kombinacija 21M18 sa anti-VEGF antitelom bevacizumab, bispecifična antitela 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R79, i irinotekan sve smanjene frekvencije rasta tumora kao pojedinačni agensi. Suprotno tome, anti-VEGF bevacizumab kao jedan agens nije imao efekta na frekvenciju rasta tumora u poređenju sa kontrolnim antitelima. U grupama tretiranim kombinacijom irinotekana i antitela, bispecifično antitelo 219R45-MB-21M18 imalo je najveći efekat u smanjenju frekvencije rasta tumora.
Primer 11
Inhibicija OMP-C8 rasta tumora debelog creva in vivo
[0321] Suspenzije jednolančanih ćelija ksenografta tumora kolona OMP-C8 (50.000 ćelija) subkutano su injektirane u bokove starih 6-8 nedelja NOD/SCID miševa Tumorima je bilo dozvoljeno da rastu 21 dana dok ne dostignu prosečnu zapreminu od 80mm<3>. Miševi su birani nasumično (n = 8 po grupi) i tretirani sa anti-DLL4 antitelo 21M18, anti-VEGF antitelo bevacizumab, anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB -21R79, 219R45-MB-21R83 ili kontrolnim antitelima, bilo sama ili u kombinaciji sa irinotekanom. Antitela i irinotekan se doziraju nedeljno injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Bevacizumab i bispecifična antitela 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB-21R79 i 219R45-MB-21R83 su dozirane na 15 mg/kg, a irinotekan je doziran na 7.5 mg/kg. Kontrolo tumora je nadgledano i zapremine tumora su merene elektronskim čeljustima u navedenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja ± S.E.M.
[0322] Kao pojedinačni agensi, sva četiri anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifična antitela pokazala su poboljšanu antitumorsku aktivnost u odnosu na anti-VEGF antitelo bevacizumab. U kombinaciji sa irinotekanom, lečenje anti-VEGF/anti-DLL4 bispecifičnim antitelima 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R83 dovelo je do najveće inhibicije rasta tumora (Slika 11).
[0323] Nakon faze lečenja, sekcije tumora su pripremljene i analizirane pomoću hematokilin i eosin (H & E) bojenja. Tumori tretirani 219R45-MB-21M18 i 219R45-MB-21R83 u kombinaciji sa irinotekanom pokazali su tamno-roze boje za bojenje koje pružaju dokaze o ekstenzivnoj kalcifikaciji. Ovo je karakteristično za visoko nekrotično tumorsko tkivo.
Primer 12
Studija toksičnosti ne-GLP bispecifičnih antitela kod cinomolgus majmuna
[0324] Studija toksičnosti ne-GLP kod majmuna cinomolgus započela je da proceni i uporede profil toksičnosti nekih bispecifičnih antitela. Životinje su dozirane sa 0 mg/kg (kontrola), 5 mg/kg (niske doze) ili 30 mg/kg (visoka doza) anti-DLL4/anti-VEGF bispecifičnog antitela (219R45-MB-21M18, 219R45- MB-21R83, ili 219R45-MB-21R79) svake 2 nedelje putem IV infuzije.3 muškarca i 3 ženke su dozirane u svaku grupu. Posle 15 nedelja, srednja težina tela je bila niža kod životinja koje su primile visoku dozu 219R45-MB-21R79 nego kod životinja koje su primile visoku doza bilo 219R45-MB-21R18 ili 219R45-MB-21R83. Pored toga, srednja vrednost serumskih albumina bila je niža kod životinja koje su primale 219R45-MB-21R79 nego kod onih koje su primile ili 219R45-MB-21R18 ili 219R45-MB-21R83. Iako su preliminarni u prirodi, ovi rani podaci pokazuju da 219R45-MB-21R18 i 219R45-MB-21R83 mogu imati superiorni profil toksičnosti u poređenju sa 219R45-MB-21R79.
SEKVENCE
[0325]
i

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi
    1. Bispecifično antitelo sadrži:
    a) prvo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje faktor rasta na humani vaskularni endotel (VEGF), i
    b) drugo mesto za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani ligand nalik delta-4 (DLL4),
    gde prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži NYWMH (SEK ID Br:17), CDR2 teškog lanca koji sadrži DINPSNGRTSYKEKFKR (SEK ID Br:18) i CDR3 teškog lanca koji sadrži HYDDKYYPLMDY (SEK ID Br:19) ;
    13) ili AYYIH (SEK ID Br:79), teški lanac CDR2 koji sadrži YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEK ID Br:80), gde X1je serin ili alanin, X2je serin, asparagin ili glicin, X3je asparagin ili lizin, a X4je glinin, arginin ili asparaginska kiselina, a CDR3 teškog lanca koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16); i
    gde i prvo i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže CDR1 lakog lanca koji sadrži RASESVDNYGISFMK (SEK ID Br:20), CDR2 lakog lanca koji sadrži AASNQGS (SEK ID Br:21) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSKEVPWTFGG (SEK ID Br:22).
    2. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br:15), ili YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br:59), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16).
    3. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), i teški lanac CDR2 koji sadrži YISNYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:65), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16).
    4. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br:13), i teški lanac CDR2 koji sadrži YIANYNRATNYNQKFKG (SEK ID Br:14), i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16).
    5. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br: 13) teški lanac CDR2 koji sadrži YISSYNGATNYNQKFKG (SEK ID Br: 81) i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16).
    6. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, gde drugo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TAYYIH (SEK ID Br: 13) teški lanac CDR2 koji sadrži YIAGYKDATNYNQKFKG (SEK ID Br: 59) i teški lanac CDR3 koji sadrži RDYDYDVGMDY (SEK ID Br:16).
    7. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koje obuhvata
    (a) prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:1;
    (b) drugi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:64, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10 ili SEK ID Br:58; i
    (c) prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID Br:12.
    8. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje obuhvata
    (a) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:11;
    (b) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:64; i
    (c) prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12.
    9. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje obuhvata
    (a) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:11;
    (b) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:9; i
    (c) prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12.
    10. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje obuhvata
    (a) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:11;
    (b) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:10; i
    (c) prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12.
    11. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 7, koje obuhvata
    (a) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:11;
    (b) teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži SEK ID:58; i
    (c) prvi i drugi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID Br:12.
    12. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, koje obuhvata prvi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 249 i 288 SEK ID Br:42, pri čemu se aminokiseline zamenjuju glutamatom ili aspartatom i drugi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 236 i 278 SEK ID Br:42, pri čemu se aminokiseline zamenjuju lizinom.
    13. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, obuhvata:
    (a) teški lanac SEK ID Br:7;
    (b) teški lanac SEK ID Br:62, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6 ili SEK ID Br:56; i
    (c) dva laka lanca SEK ID Br:8.
    14. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 13, obuhvata:
    (a) teški lanac SEK ID Br:7;
    (b) teški lanac SEK ID Br:62; i
    (c) dva laka lanca SEK ID Br:8.
    15. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 14, koje je monoklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, IgG1 antitelo, IgG2 antitelo ili fragment antitela koji sadrži antigen-vezujuće mesto.
    16. Farmaceutski sastav koja sadrži bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
    17. Izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15.
    18. Polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID Br:1, SEK ID Br:2, SEK ID Br:5, SEK ID Br:6, SEK ID Br:9, SEK ID Br:10, SEK ID Br:46, SEK ID Br:48, SEK ID Br:56, SEK ID Br:57, SEK ID Br:58, SEK ID Br:62, SEK ID Br:63, i SEK ID Br:64.
    19. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15 za upotrebu u metodi terapijskog tretmana.
    20. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15 za upotrebu u metodi lečenja kancera.
    21. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15 za upotrebu u metodi inhibiranja rasta tumora kod subjekta.
    22. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 20 ili 21, gde metoda obuhvata davanje antitela i najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa.
RS20190023A 2011-09-23 2012-09-24 Vegf/dll4 vezujući agensi i njihova upotreba RS58201B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161538454P 2011-09-23 2011-09-23
US201261597409P 2012-02-10 2012-02-10
US201261692978P 2012-08-24 2012-08-24
PCT/US2012/056886 WO2013044215A1 (en) 2011-09-23 2012-09-24 Vegf/dll4 binding agents and uses thereof
EP12833767.2A EP2758073B1 (en) 2011-09-23 2012-09-24 Vegf/dll4 binding agents and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58201B1 true RS58201B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=47914946

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190023A RS58201B1 (sr) 2011-09-23 2012-09-24 Vegf/dll4 vezujući agensi i njihova upotreba
RS20230110A RS63965B1 (sr) 2011-09-23 2012-09-24 Vegf/dll4 vеzujući agensi i njihova upotreba

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230110A RS63965B1 (sr) 2011-09-23 2012-09-24 Vegf/dll4 vеzujući agensi i njihova upotreba

Country Status (34)

Country Link
US (8) US8858941B2 (sr)
EP (2) EP3485903B1 (sr)
JP (1) JP6170496B2 (sr)
KR (1) KR102091293B1 (sr)
CN (2) CN104168914B (sr)
AU (1) AU2013201095C1 (sr)
BR (1) BR112014007035B1 (sr)
CA (1) CA2849562C (sr)
CL (1) CL2014000725A1 (sr)
CO (1) CO6940382A2 (sr)
CR (1) CR20140172A (sr)
CY (1) CY1121148T1 (sr)
DK (2) DK2758073T3 (sr)
EA (1) EA029958B1 (sr)
ES (2) ES2707580T3 (sr)
FI (1) FI3485903T3 (sr)
HR (2) HRP20190044T1 (sr)
HU (2) HUE061002T2 (sr)
IL (1) IL231628B (sr)
IN (1) IN2014KN00871A (sr)
LT (2) LT3485903T (sr)
MX (2) MX361712B (sr)
MY (1) MY188192A (sr)
NI (1) NI201400024A (sr)
PE (1) PE20141537A1 (sr)
PH (1) PH12014500655B1 (sr)
PL (2) PL2758073T3 (sr)
PT (2) PT3485903T (sr)
RS (2) RS58201B1 (sr)
SG (1) SG11201400870WA (sr)
SI (2) SI2758073T1 (sr)
SM (2) SMT201900075T1 (sr)
TW (1) TWI583699B (sr)
WO (1) WO2013044215A1 (sr)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2066694T3 (en) 2006-09-29 2016-02-08 Oncomed Pharm Inc Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Cancer
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
BR112012004546A8 (pt) 2009-08-29 2017-12-05 Abbott Lab Terapêutica por proteínas ligantes dll4-ligantes
HUE029661T2 (en) 2009-10-16 2017-03-28 Oncomed Pharm Inc A therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and antihypertensive agents
KR101853278B1 (ko) 2010-03-02 2018-05-02 애브비 인코포레이티드 치료학적 ｄｌｌ４ 결합 단백질
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
LT3485903T (lt) 2011-09-23 2023-02-27 Mereo Biopharma 5, Inc. Vegf/ dll4 surišantys agentai ir jų panaudojimas
US9550830B2 (en) 2012-02-15 2017-01-24 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
ES2702315T3 (es) 2012-08-24 2019-02-28 Univ California Anticuerpos y vacunas para su uso en tratar cánceres ROR1 e inhibir metástasis
EP2906295A4 (en) * 2012-10-15 2016-06-01 Oncomed Pharm Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF EYE DISEASES
US9599620B2 (en) 2012-10-31 2017-03-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist
TW202037609A (zh) 2012-11-01 2020-10-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
ES2742855T3 (es) * 2013-07-09 2020-02-17 Ablbio Nueva proteína de objetivo doble que se une específicamente a DLL4 y CEGF, y uso de la misma
WO2015130751A1 (en) * 2014-02-26 2015-09-03 Medimmune, Llc Methods of treatment with dll4 antagonists
EP3125937A4 (en) * 2014-04-04 2017-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gastric cancer
TWI593967B (zh) * 2014-05-01 2017-08-01 高雄醫學大學 二級抗體所辨識之抗原決定位及其用途
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
EA037844B1 (ru) 2014-07-17 2021-05-27 Ново Нордиск А/С Сайт-направленный мутагенез антител к trem-1
KR102390359B1 (ko) * 2014-09-29 2022-04-22 삼성전자주식회사 폴리펩타이드, 이를 포함하는 항 VEGF 항체 및 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체
ES2808153T3 (es) * 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US11339213B2 (en) 2015-09-23 2022-05-24 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
WO2017175086A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-12 Pfizer Inc. Cell culture process
CN105669871A (zh) * 2016-04-19 2016-06-15 中国药科大学 一种胸腺肽α1的融合蛋白
TWI767915B (zh) 2016-06-27 2022-06-21 加州大學董事會 Ror-1與btk拮抗劑的組合
EA201992546A1 (ru) 2017-04-24 2020-03-06 Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер Средства на основе антител к cd33
JP7399845B2 (ja) * 2017-08-18 2023-12-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 試料マトリックスにおいてタンパク質変異体を分析するための画像キャピラリー等電点電気泳動法
WO2019195126A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Bristol-Myers Squibb Company Anti-trem-1 antibodies and uses thereof
CA3119458A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with vegf/dll4 binding agent
WO2021092071A1 (en) 2019-11-07 2021-05-14 Oncxerna Therapeutics, Inc. Classification of tumor microenvironments
CN111234003B (zh) * 2020-02-07 2022-02-01 中国人民解放军第四军医大学 一种用于癌症靶向治疗的短肽及基于其的超声响应纳米载药微泡和应用
IL306090A (en) 2021-03-25 2023-11-01 Oncxerna Therapeutics Inc Targeted cancer treatments
CN114369158B (zh) * 2021-09-28 2024-04-19 北京亦科信息菌素研究院有限公司 一种抗新冠病毒的信息菌素及其应用

Family Cites Families (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US994637A (en) 1910-09-14 1911-06-06 Dexter Folder Co Paper-cutting machine.
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
CA1176659A (en) 1981-09-14 1984-10-23 Gerhard Degischer Process for producing n-substituted-n-acetyl-2,6- dialkylanilines
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
IL101728A (en) 1991-05-03 2007-08-19 Univ Yale Human Abandonment and Delta, Restrictive Areas of Effect in Tophoric Proteins, and Methods Based on Them
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US20050112121A1 (en) 1992-04-30 2005-05-26 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
DE69638023D1 (de) 1995-06-28 2009-10-22 Univ Yale Nukleotid- und proteinsequenzen von delta-genen von vertebraten und darauf basierende methoden
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US7264963B1 (en) 1995-08-18 2007-09-04 Morphosys Ag Protein(poly)peptide libraries
US5730977A (en) 1995-08-21 1998-03-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Anti-VEGF human monoclonal antibody
JPH09124697A (ja) 1995-11-01 1997-05-13 Toagosei Co Ltd ペプチド及びモノクローナル抗体
US6337387B1 (en) 1995-11-17 2002-01-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation-suppressive polypeptide
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030180784A1 (en) 1997-04-04 2003-09-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
AU6952498A (en) 1997-04-04 1998-10-30 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Novel human delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
US6121045A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Millennium Biotherapeutics, Inc. Human Delta3 nucleic acid molecules
US20060122373A1 (en) 1997-04-04 2006-06-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Delta3, FTHMA-070, Tango85, Tango77, SPOIL,NEOKINE, Tango129 and integrin alpha subunit protein and nucleic acid molecules and uses thereof
KR100816621B1 (ko) 1997-04-07 2008-03-24 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6664098B1 (en) 1997-05-14 2003-12-16 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation inhibitory agent
WO1998057621A1 (en) 1997-06-18 1998-12-23 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Angiogenic modulation by notch signal transduction
US6004528A (en) 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
CA2333893A1 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Yale University Delta cleavage products and methods based thereon
EP1100899A2 (en) 1998-07-27 2001-05-23 Amgen Inc. Delta-related polypeptides
US6342219B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody compositions for selectively inhibiting VEGF
WO2001002588A2 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Morphosys Ag Generation of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests
US6703221B1 (en) 1999-08-19 2004-03-09 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
CA2491433A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20110131679A2 (en) * 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20020028488A1 (en) 2000-06-19 2002-03-07 Sujay Singh Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
US6689744B2 (en) 2000-09-22 2004-02-10 Genentech, Inc. Notch receptor agonists and uses
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
EP1410018A1 (en) 2001-07-25 2004-04-21 Lorantis Limited Method for detecting modultators of notch signalling
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
DE60235761D1 (de) 2001-08-01 2010-05-06 Univ Bristol Clifton Isoform des vegfs
WO2003042246A2 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
US20050137130A1 (en) 2001-11-14 2005-06-23 Bodmer Mark W. Medical treatment
JP2005518785A (ja) 2001-11-14 2005-06-30 ロランティス リミテッド 内科療法
AU2002364537A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Regents Of The University Of Michigan Prospective identification and characterization of breast cancer stem cells
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
DK2314629T4 (da) 2002-07-18 2023-02-06 Merus Nv Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
GB0218879D0 (en) 2002-08-14 2002-09-25 Lorantis Ltd Medical treatment
AU2003267563A1 (en) 2002-09-10 2004-04-30 Lorantis Limited Pharmaceutical composition and medical treatments comprising notch ligand proteins
JP5401001B2 (ja) 2002-09-11 2014-01-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
US7365168B2 (en) 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN1511850A (zh) 2002-12-31 2004-07-14 王小宁 Mhc-肽抗体多聚体的制备方法
WO2004110490A2 (en) 2003-06-06 2004-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for tumor regression
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
WO2005014618A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
FR2859725B1 (fr) 2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
AU2004295654A1 (en) 2003-12-05 2005-06-16 Bioinvent International Ab Angiogenesis affecting polypeptides, proteins, and compositions, and methods of use thereof
WO2005074633A2 (en) 2004-02-03 2005-08-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer
US20080187954A1 (en) 2004-03-10 2008-08-07 Lonza Ltd. Method For Producing Antibodies
CA2567686A1 (en) 2004-06-10 2005-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for the treatment of human cancer
EP1759214B1 (en) 2004-06-15 2013-04-24 F.Hoffmann-La Roche Ag The use of cardiac hormones for diagnosing the risk of suffering from a cardiovascular complication as a consequence of cardiotoxic medication
MXPA06014689A (es) 2004-06-18 2008-03-11 Regeneron Pharma Inhibidores del vegf para el tratamiento de efusion pleural maligna.
EP1615036B1 (en) 2004-07-07 2007-09-19 F.Hoffmann-La Roche Ag Multimarker panel for diabetes type 1 and 2
CA2581208A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
WO2006028936A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
WO2006027693A2 (en) 2004-09-09 2006-03-16 Exonhit Therapeutics Sa Tumor specific genes and variant rnas and uses thereof as targets for cancer therapy and diagnosis
EP1810979B1 (en) 2004-09-22 2012-06-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. STABILIZED HUMAN IgG4 ANTIBODIES
US8048418B2 (en) 2004-10-29 2011-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with combination of Dll4 antagonists and VEGF antagonists
US20060134121A1 (en) 2004-10-29 2006-06-22 Gavin Thurston DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof
NZ555216A (en) 2004-11-10 2010-05-28 Hubrecht Lab Treatment of an intestinal adenoma and/or adenocarcinoma by inhibition of notch pathway activation
WO2006083355A2 (en) 2004-11-19 2006-08-10 Cornell Research Foundation, Inc. Use of vascular endothelial growth factor receptor 1+ cells in treating and monitoring cancer and in screening for chemotherapeutics
US7432107B2 (en) 2005-01-24 2008-10-07 Roche Diagnostics Operations, Inc. Cardiac hormones for assessing cardiovascular risk
DK1849009T3 (da) 2005-01-24 2009-01-12 Hoffann La Roche Ag F Anvendelse af cardiachormoner til diagnose af cardiovaskulære risici som fölge af en administration af antiinflammatoriske lægemidler
EP1853298A2 (en) 2005-02-11 2007-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic combination of a vegf antagonist (vegf trap) and an anti-hypertensive agent
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
ES2971647T3 (es) 2005-04-15 2024-06-06 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
EP1891107B1 (en) 2005-05-12 2011-07-06 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
CA2607699A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Galaxy Biotech, Llc Methods of treating brain tumors with antibodies
CA2615636A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of diseases by subcutaneous administration of a vegf antagonist
US7774903B2 (en) 2005-08-16 2010-08-17 Lummus Corporation Roller gin apparatus, method and system
US7906116B2 (en) 2005-09-01 2011-03-15 Parkash Gill Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4
JP2009507796A (ja) 2005-09-01 2009-02-26 バスジーン セラピューティクス， インコーポレイテッド デルタ様リガンド４のモジュレーターの利用及び同定方法
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
CA2628255C (en) 2005-10-31 2016-04-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
CA2630839C (en) 2005-12-16 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists
EP1993541A2 (en) 2006-02-17 2008-11-26 Gilead Colorado, Inc. Antihypertensive therapy
WO2011053822A2 (en) 2009-11-01 2011-05-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Notch inhibition in the treatment and prevention of obesity and metabolic syndrome
WO2007103114A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Notch inhibition in the treatment or prevention of atherosclerosis
US7354582B2 (en) 2006-03-10 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF antagonists for the treatment of malignant gliomas
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
NZ572177A (en) 2006-06-06 2012-02-24 Genentech Inc Anti-dll4 antibodies and methods using same
EP2029159A2 (en) 2006-06-06 2009-03-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
ES2413087T3 (es) 2006-06-13 2013-07-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
HRP20130271T1 (hr) 2006-08-07 2013-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Upotreba dii4 antagonista kod ishemijskih ozljeda ili vaskularne insuficijencije
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
DK2066694T3 (en) 2006-09-29 2016-02-08 Oncomed Pharm Inc Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Cancer
UA110315C2 (uk) * 2006-09-29 2015-12-25 Oncomed Pharm Inc Композиція та спосіб лікування раку
JP2010507594A (ja) 2006-10-20 2010-03-11 シェーリング コーポレイション 完全ヒト抗ｖｅｇｆ抗体および使用方法
US8466154B2 (en) 2006-10-27 2013-06-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions related to wrapping of dehydrons
US20100166746A1 (en) 2006-12-04 2010-07-01 Medlmmune Way High potency recombinant antibodies, methods for producing them and use in cancer therapy
CA2670707A1 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating a neoplasm
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
HUE029445T2 (en) 2006-12-19 2017-02-28 Genentech Inc VEGF-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and treatment of early-stage tumors
EP2120996A2 (en) 2006-12-20 2009-11-25 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
JP2010517944A (ja) 2007-01-26 2010-05-27 バイオインヴェント インターナショナル アーベー Ｄｌｌ４シグナリング阻害薬およびその使用
EP2671584A3 (en) 2007-05-04 2014-03-26 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating disorders associated with salt or fluid retention
GB0709333D0 (en) 2007-05-15 2007-06-20 Smart Targeting Ltd Binding protein
JP2011500086A (ja) 2007-10-22 2011-01-06 シェーリング コーポレイション 完全ヒト抗ｖｅｇｆ抗体および使用方法
EP2203480A1 (en) 2007-10-25 2010-07-07 University Of Bristol Antibodies specific to pro-angiogenic isoforms of vascular endothelial growth factor (vegf)
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
WO2009075565A1 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling vasculogenesis
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
EP2238154B1 (en) 2008-01-18 2015-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography
JP2011516520A (ja) 2008-04-07 2011-05-26 アブリンクス エン．ヴェー． Ｎｏｔｃｈ経路に指向性を有するアミノ酸配列及びその使用
SG10202112838YA (en) 2008-04-09 2021-12-30 Genentech Inc Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CN102112490B (zh) 2008-07-08 2014-10-22 昂考梅德药品有限公司 Notch1受体结合剂和其使用方法
JP2011528798A (ja) 2008-07-23 2011-11-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗血管形成療法のモニター
EP2321651B1 (en) 2008-07-23 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Identification of subjects being susceptible to anti-angiogenesis therapy
AU2009294415B2 (en) 2008-09-19 2015-09-24 Medimmune Llc Antibodies directed to DLL4 and uses thereof
CA2742969A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
NZ597692A (en) * 2008-12-12 2013-08-30 Boehringer Ingelheim Int Anti-IGF antibodies
AR076344A1 (es) 2009-04-20 2011-06-01 Genentech Inc Metodo de terapia complementaria contra el cancer
WO2010124009A2 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
TWI513465B (zh) 2009-06-25 2015-12-21 Regeneron Pharma 以ｄｌｌ４拮抗劑與化學治療劑治療癌症之方法
JP2012532608A (ja) 2009-07-08 2012-12-20 アムジェン インコーポレイテッド ＣＨ３ドメイン界面操作を通じた、安定でそして凝集しない抗体Ｆｃ分子の設計
BR112012004546A8 (pt) 2009-08-29 2017-12-05 Abbott Lab Terapêutica por proteínas ligantes dll4-ligantes
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20110172398A1 (en) 2009-10-02 2011-07-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy
UY32917A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de unión a dll-4
HUE029661T2 (en) 2009-10-16 2017-03-28 Oncomed Pharm Inc A therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and antihypertensive agents
AU2010310895A1 (en) 2009-10-23 2012-05-03 Garvan Institute Of Medical Research Modified variable domain molecules and methods for producing and using same
CA2782299A1 (en) * 2009-12-01 2011-06-09 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancers comprising k-ras mutations
JO3183B1 (ar) 2010-01-29 2018-03-08 Regeneron Pharma طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4
CA2789446A1 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
TWI619509B (zh) 2010-02-23 2018-04-01 建南德克公司 治療先前未經治療之ⅲ期或ⅳ期卵巢癌、輸卵管癌或原發性腹膜癌之卡鉑、太平洋紫杉醇與抗-vegf抗體之組合
KR101853278B1 (ko) * 2010-03-02 2018-05-02 애브비 인코포레이티드 치료학적 ｄｌｌ４ 결합 단백질
MX2013004979A (es) 2010-11-02 2013-07-30 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
US20130323265A1 (en) 2010-11-15 2013-12-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with dll4 antagonists
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
TWI530489B (zh) 2011-03-22 2016-04-21 必治妥美雅史谷比公司 雙（氟烷基）－１，４－苯二氮呯酮化合物
US8685401B2 (en) 2011-06-17 2014-04-01 Adrian Harris Methods of enhancing the response to radiation in tumor therapy using anti-DLL4 antibodies
LT3485903T (lt) 2011-09-23 2023-02-27 Mereo Biopharma 5, Inc. Vegf/ dll4 surišantys agentai ir jų panaudojimas
US20150005475A1 (en) 2012-02-03 2015-01-01 Medimmune Limited Process for reducing antibody aggregate levels and antibodies produced thereby
DK2825558T3 (da) 2012-03-13 2019-07-22 Hoffmann La Roche Kombinationsterapi til behandling af ovariecancer
HK1203971A1 (en) 2012-05-15 2015-11-06 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
JP2015520172A (ja) 2012-05-31 2015-07-16 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｄｌｌ−４に結合する抗原結合蛋白質
AR092325A1 (es) 2012-05-31 2015-04-15 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-dll4 y kit
KR101535341B1 (ko) 2012-07-02 2015-07-13 한화케미칼 주식회사 Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
SG11201408538PA (en) 2012-07-13 2015-02-27 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
KR20150060686A (ko) 2012-09-28 2015-06-03 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 이중 안지오포이에틴-2/Dll4 결합제 및 항-VEGF 제제를 포함하는 약제학적 조합물
EP2906295A4 (en) 2012-10-15 2016-06-01 Oncomed Pharm Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF EYE DISEASES
US9599620B2 (en) 2012-10-31 2017-03-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist
TW202037609A (zh) 2012-11-01 2020-10-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
ES2742855T3 (es) 2013-07-09 2020-02-17 Ablbio Nueva proteína de objetivo doble que se une específicamente a DLL4 y CEGF, y uso de la misma
BR112016000853A2 (pt) 2013-07-16 2017-12-12 Genentech Inc métodos para tratar ou retardar, reduzir ou inibir a recidiva ou a progressão do câncer e a progressão de uma doença imune-relacionada em um indivíduo, para aumentar, melhorar ou estimular uma resposta ou função imune em um indivíduo e kit
WO2015130751A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Medimmune, Llc Methods of treatment with dll4 antagonists
EP3125937A4 (en) 2014-04-04 2017-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gastric cancer
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
EP3169363A4 (en) 2014-07-16 2018-02-21 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cancer using tigit inhibitors and anti-cancer agents
MD4733C1 (ro) 2014-08-19 2021-07-31 Merck Sharp & Dohme Corp Anticorpi anti-TIGIT
ES2808153T3 (es) 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
JP6180663B2 (ja) 2014-12-23 2017-08-16 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｔｉｇｉｔに対する抗体
US11339213B2 (en) 2015-09-23 2022-05-24 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
PE20181046A1 (es) 2015-09-25 2018-07-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-tigit y metodos de uso
CA3119458A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with vegf/dll4 binding agent

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013201095B2 (en) 2015-09-17
FI3485903T3 (fi) 2023-01-31
SI2758073T1 (sl) 2019-02-28
AU2013201095A1 (en) 2013-04-11
US11512128B2 (en) 2022-11-29
PL2758073T3 (pl) 2019-04-30
HRP20230078T1 (hr) 2023-05-12
PT2758073T (pt) 2019-02-01
NZ623724A (en) 2016-09-30
NI201400024A (es) 2014-06-26
CR20140172A (es) 2014-06-19
PT3485903T (pt) 2023-02-17
EP2758073B1 (en) 2018-10-31
HK1199209A1 (en) 2015-06-26
LT3485903T (lt) 2023-02-27
BR112014007035A2 (pt) 2017-04-11
MY188192A (en) 2021-11-24
EA029958B1 (ru) 2018-06-29
US8858941B2 (en) 2014-10-14
JP6170496B2 (ja) 2017-07-26
SG11201400870WA (en) 2014-04-28
HUE061002T2 (hu) 2023-04-28
SMT201900075T1 (it) 2019-02-28
US9376488B2 (en) 2016-06-28
CA2849562A1 (en) 2013-03-28
CN104168914A (zh) 2014-11-26
US9879084B2 (en) 2018-01-30
WO2013044215A4 (en) 2013-06-27
ES2938628T3 (es) 2023-04-13
MX2018010331A (es) 2020-09-02
CN107722122B (zh) 2022-05-27
US20210061903A1 (en) 2021-03-04
US9574009B2 (en) 2017-02-21
IL231628B (en) 2018-12-31
US20150098949A1 (en) 2015-04-09
ES2707580T3 (es) 2019-04-04
CA2849562C (en) 2020-07-21
CN104168914B (zh) 2017-08-08
PE20141537A1 (es) 2014-11-17
WO2013044215A1 (en) 2013-03-28
MX361712B (es) 2018-12-14
RS63965B1 (sr) 2023-03-31
EP3485903A1 (en) 2019-05-22
KR102091293B1 (ko) 2020-03-20
US20190062424A1 (en) 2019-02-28
CL2014000725A1 (es) 2014-09-05
IN2014KN00871A (sr) 2015-08-21
MX2014003558A (es) 2014-06-23
KR20140082719A (ko) 2014-07-02
EP2758073A1 (en) 2014-07-30
EP3485903B1 (en) 2022-11-16
WO2013044215A9 (en) 2014-04-03
JP2014530599A (ja) 2014-11-20
CN107722122A (zh) 2018-02-23
DK3485903T3 (da) 2023-02-06
PH12014500655B1 (en) 2019-01-23
TW201326204A (zh) 2013-07-01
TWI583699B (zh) 2017-05-21
DK3485903T5 (da) 2024-09-02
HRP20190044T1 (hr) 2019-02-22
CY1121148T1 (el) 2020-05-29
EA201490622A1 (ru) 2014-08-29
US10730940B2 (en) 2020-08-04
US20170183406A1 (en) 2017-06-29
SMT202300033T1 (it) 2023-03-17
IL231628A0 (en) 2014-05-28
US20130164295A1 (en) 2013-06-27
DK2758073T3 (en) 2019-01-14
US20230279101A1 (en) 2023-09-07
LT2758073T (lt) 2019-01-10
HUE042192T2 (hu) 2019-06-28
CO6940382A2 (es) 2014-05-09
PH12014500655A1 (en) 2014-05-05
US20180305449A1 (en) 2018-10-25
PL3485903T3 (pl) 2023-06-12
BR112014007035B1 (pt) 2021-05-04
AU2013201095C1 (en) 2019-12-05
EP2758073A4 (en) 2015-04-29
SI3485903T1 (sl) 2023-02-28
US20160362499A1 (en) 2016-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230279101A1 (en) Vegf/dll4 binding agents and uses thereof
US20160319034A1 (en) Met-binding agents and uses thereof
US20160137744A1 (en) Met-binding agents and uses thereof
WO2015153974A1 (en) Treatment of gastric cancer
AU2017210673B2 (en) VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
CA2999160C (en) Methods and compositions for treatment of cancer
NZ623724B2 (en) Vegf/dll4 binding agents and uses thereof
HK1199209B (en) Vegf/dll4 binding agents and uses thereof