RS58233B1

RS58233B1 - Humanizovana anti-faktor d antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS58233B1
Application number: RS20181476A
Authority: RS
Inventors: Herren Wu; Sanjaya Singh; Sek Chung Fung; Ling-Ling An; Henry B Lowman; Robert F Kelley
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-10-31
Publication date: 2019-03-29
Also published as: HK1138018A1; JP2014110810A; CR10827A; NO20092121L; JP2013017490A; US20110123528A1; WO2008055206A9; PE20081259A1; NZ609813A; RU2009120699A; US8067002B2; JP5918794B2; US8187604B2; EP2471818A1; KR20160092061A; ES2700609T3; KR20150046389A; AU2007313685B2; RU2012147286A; TW200827373A

Description

Opis

Pozadina ovog pronalaska

[0001] Sistem komplementa igra centralnu ulogu u klirensu imunih kompleksa i imunog odgovora na infektivne agense, strane antigene, virusom inficirane ćelije i ćelije tumora. Međutim, komplement je takođe uključen u patološko zapaljenje i u autoimunim bolestima. Prema tome, inhibicija prekomerne ili nekontrolisane aktivacije komplement kaskada može da obezbedi klinički dobrobit za pacijente sa takvim bolestima i stanjima.

[0002] Sistem komplementa obuhvata dve distinktne putanje aktivacije, označene kao klasična i alternativna putanja (V.M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). Klasična putanja je kalcijum/magnezijum-zavisna kaskada koja se uobičajeno aktivira formiranjem antigen-antitelo kompleksa. Alternativna putanja je magnezijum-zavisna kaskada koja se aktivira deponovanjem i aktivacijom C3 na određenim podložnim površinama (npr. polisaharidi kvasca i bakterija na zidovima ćelija, i određeni biopolimerni materijali). Aktivacija putanje komplementa generiše biološki aktivne fragmente komplement proteina, npr. C3a, C4a i C5a anafilatoksine i C5b-9 komplekse membranskog napada (MAC), koji posreduju zapaljenske aktivnosti koje uključuju leukocitnu hemotaksu, aktivaciju makrofaga, neutrofila, trombocita, mastocita i endotelijalnih ćelija, vaskularnu propustljivost, citolizu, i povredu tkiva.

[0003] Faktor D je veoma specifična serinska proteaza suštinska za aktivaciju alternativne putanje komplementa. On cepa faktor B vezan za C3b, gnerišući C3b/Bb enzim koji je aktivna komponenta C3/C5 konvertaza alternativne putanje. Faktor D može biti pogodan cilj za inhibiciju, budući da je njegova koncentracija u plazmi kod ljudi veoma niska (1.8 µg/ml), i pokazano je da je ograničavajući enzim za aktivaciju alternativne putanje komplementa (P.H. Lesavre i H.J. Müller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401).

[0004] Pokazano je da je nishodna regulacija aktivacije komplementa efektivna u lečenju nekoliko indikacija bolesti u životinjskim modelima i u ex vivo ispitivanjima, npr. kao što je sistemski lupus eritematozus i glomerulonefritis (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568), reumatoidni artritis (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959), kardiopulmonarni bajpas i hemodijaliza (C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572), hiperakutno odbacivanje kod translpantacije organa (T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), miokardijalni infarkt (J. W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146151), povreda reperfuzije (E.A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457), i respiratorni distres sindrom kod odraslih (R. Rabinovici et al., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750). Dodatno, druga zapaljenska stanja i bolesti autoimunog/imunog kompleksa takođe su blisko povezana sa aktivacijom komplementa (V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994: 24: 219-228), uključujući toplotnu povredu, tešku astmu, anafilaktički šok, zapaljenje creva, urtikariu, angioedem, vaskulitis, multiple sklerozu, mijasteniju gravis, membranaproliferativni glomerulonefritis, i Sjögren-ov sindrom.

[0005] E. J. Tanhehco et al. (Transplant Proc.1999: 31: 2168-2171) opisuje mišje monoklonalno antifaktor D antitelo 166-32 koje inhibira alternativnu putanju ljudskog sistema komplementa.

[0006] M. Harboe et al. (Clin. Exp. Immunol.2004: 138: 439-446) koriste mišji monoklonalni anti-faktor D za ispitivanje kvantitativne uloge amplifikacije alternativne putanje u klasičnoj putanji indukovana terminalnom aktivacijom komplementa.

[0007] Postoji potreba za terapeuticima antitela u oblasti komplementom-posredovanih poremećaja, a humanizovana antitela ovog pronalaska obezbeđuju visoko afinitetna antitela korisna da ispune ovu potrebu.

Suština ovog pronalaska

[0008] Ovaj pronalazak odnosi se generalno na antitela koja obuhvataju sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca izvedene iz sekvenci varijabilnog domena teškog i lakog lanca mišjeg antitela 166-32, koje antitelo je sposobno za inhibiranje biološke aktivnosti povezane sa Faktorom D. Na primer, pri koncentraciji od 18 µg/ml (ekvivalentno sa oko 1.5 puta molarne koncentracije humanog faktora D u krvi; molarni odnos anti-faktor D antitela prema Faktoru D od oko 1.5:1), može se primetiti značajna inhibicija aktivnosti aalternativnog komplementa antitelom (videti, npr., US Patent Br.6,956,107).

[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment, koje obuhvata:

(i) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:17, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO: 18; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:13; CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14; i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:15;

(ii) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:7, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:17, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO: 19; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:8, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:13, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20;

(iii) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:9, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:21, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:22; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:10, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:23, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20; ili

(iv) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:24, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO: 19; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:25, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20,

u kojem regioni varijabilnog domena lakog lanca i varijabilnog domena teškog lanca izvan CDR regiona predstavljaju regione okvira, i

u kojem najmanje jedan region okvira obuhvata ni jednu, jednu, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.

[0010] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(i), obuhvata:

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5 i

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6.

[0011] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(ii), obuhvata:

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:7,

ili neku aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 7, pri čemu aminokiselina na položaju 104 iz SEQ ID NO:7 predstavlja valin, i

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:8.

[0012] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iii), obuhvata:

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:9 i

varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:10.

[0013] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata:

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 11 i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12.

[0014] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(ii), obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:7, pri čemu aminokiselina na položaju 104 iz SEQ ID NO:7 predstavlja valin.

[0015] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKX8PKLLIX9DG NTLRPGVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTK

LEIK (SEQ ID NO:26), u kojem X6je V ili M; X7je M ili A; X8je P ili V; X9je S ili Y; X10je S ili G, a X11je A ili T.

[0016] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKX8PKLLIX9DG NTLRPGVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTK LEIK (SEQ ID NO:26), u kojem X6je V ili M; X7je M ili A; X8je P ili V; X9je S ili Y; X10je S ili G, a X11je A ili T, i pri čemu aminokiselina na položaju 104 iz SEQ ID NO: 26 predstavlja valin ili leucin.

[0017] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv)obuhvata varijabilni domen teškog lanca aminokiselinske sekvence:

QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGMNWVX3QAPGQGLEWM GWINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4YYCX5RE GGVNNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:27), u kojem X1je I ili V; X2je P ili S; X3je K ili R; X4je T ili V; i X5je E ili A.

[0018] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata:

(ii) varijabilni domen teškog lanca aminokiselinske sekvence:

QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGMNWVX3QAPGQGLEWM GWINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4YYCX5RE GGVNNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27), u kojem X1je I ili V; X2je P ili S; X3je K ili R; X4je T ili V; i X5je E ili A; i

(i) varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKX8PKLLIX9DG NTLRPGVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTK LEIK (SEQ ID NO: 26), u kojem X6je V ili M; X7je M ili A; X8je P ili V; X9je S ili Y; X10je S ili G, a X11je A ili T.

[0019] U nekim primerima izvođenja, faktor D-vezujući fragment je Fab, Fab', F(ab')2ili Fv fragment.

[0020] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antifaktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment ovog pronalaska.

[0021] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu ovog pronalaska.

[0022] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata vektor ovog pronalaska.

[0023] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja obuhvata anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment ovog pronalaska.

[0024] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja obuhvata anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanih sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa.

[0025] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu kombinacije ovog pronalaska za pripremanje leka za lečenje poremećaja povezanih sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa.

[0026] U nekim primerima izvođenja, taj poremećaj je:

(i) očna bolest kao što je degeneracija makule povezana sa starenjem ili dijabetična retinopatija; ili (ii) je povezan sa: kardiopulmonarnim bajpas operacijama, ishemijskom-reperfuzijom nakon akutnog miokardijalnog infarkta, aneurizme, moždanog udara, hemoragičnog šoka, povrede gnječenjem, otkazivanja više organa, hiperbolemičnog šoka, crevne ishemije ili drugih događaja koji izazivaju ishemiju; zapaljenskim stanjima kao što su teške opekotine, endotoksemija, septički šok, respiratorni distres sindrom kod odraslih, hemodijaliza; anafilaktičkim šokom, teškom astmom, angioedemom, Kron-ovom bolešću, anemijom srpastih ćelija, poststreptokoknim

glomerulonefritisom i pankreatitisom; sporednom reakcijom na lek, alergijom na lek, Sindromom vaskularnog curenja indukovanog sa IL-2 ili alergijom na kontrasni medijum; autoimunom bolešću kao što je sistemski lupus eritematozus, mijastenija gravis, reumatoidni artritis, Alchajmerova bolest i multiple skleroza; ili odbacivanjem transplantata.

[0027] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za detektovanje Faktora D kod pojedinca, koji obuhvata upotrebu anti-faktor D antitela ili njegovog Faktor D-vezujućeg fragmenta ovog pronalaska.

[0028] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak pripremanja anti-faktor D antitela ili njegovog Faktor D-vezujućeg fragmenta, koji obuhvata:

(i) uzgajanje ćelije domaćina ovog pronalaska u nekoj podlozi; i

(ii) prečišćavanje antitela ili u njemu izraženog fragmenta.

Kratak opis nacrta

[0029]

FIG.1A i 1B prikazuju aminokiselinsku sekvencu iz mišjeg MAb 166-32 Varijabilnog teškog lanca (FIG.1A) i varijabilnog lakog lanca (FIG.1B).

FIG.2A i 2B prikazuju sekvencu nukleinske kiseline mišjeg MAb 166-32 Varijabilnog teškog lanca (FIG.

2A) i varijabilnog lakog lanca (FIG.2B).

FIG.3 prikazuje poređenje teškog lanca mišjeg MAb 166-32.

FIG.4 prikazuje poređenje lakog lanca mišjeg MAb 166-32.

FIG.5 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca za svaki klon humanizovanog antitela #56, #111, # 250, i #416.

FIG.6 prikazuje rezultate hemolitičkog ogleda za Fab klon humanizovanog antitela #56, #111, # 250, i #416.

FIG.7 prikazuje inhibiciju alternativne komplement aktivnosti od strane Fab klonova humanizovanog antitela #56, #111, # 250, i #416.

FIG.8A-B (varijabilni teški (VH) konsenzus okviri) i FIG.9A-B (varijabilni laki (VL) konsenzus okviri) prikazuju primerne akceptor humane konsenzus sekvence okvira koje se mogu primeniti u primenjivanju ovog pronalaska sa identifikatorima sekvenci kako sledi: (FIG.8A-B) humana VH podgrupa I konsenzus okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 28), humana VH podgrupa I konsenzus okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 29-31), humana VH podgrupa II konsenzus okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 32), humana VH podgrupa II konsenzus okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 33-35), humana VH podgrupa III konsenzus okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 36), humana VH podgrupa III konsenzus okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 37-39), humana VH podgrupa VII konsenzus okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 55), humana VH podgrupa VII konsenzus okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 56-58), human VH akceptor okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 40), human VH akceptor okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 41-42), human VH akceptor 2 okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 43) i human VH akceptor 2 okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 44-46) i (FIG.9A-B) human VL kapa podgrupa I konsenzus okvir (SEQ ID NO: 47), human VL kapa podgrupa II konsenzus okvir (SEQ ID NO: 48), human kapa podgrupa III konsenzus okvir (SEQ ID NO: 49) i human kapa podgrupa IV konsenzus okvir (SEQ ID NO: 50).

Deataljan opis ovog pronalaska

[0030] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment, koje obuhvata:

[0031] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(i), obuhvata:

[0032] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(ii), obuhvata:

[0033] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iii), obuhvata:

[0034] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata:

[0035] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(ii), obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:7, pri čemu aminokiselina na položaju 104 iz SEQ ID NO:7 predstavlja valin.

[0036] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKX8PKLLIX9DG NTLRPGVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTK LEIK (SEQ ID NO:26), u kojem X6je V ili M; X7je M ili A; X8je P ili V; X9je S ili Y; X10je S ili G, a X11je A ili T.

[0037] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

[0038] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv)obuhvata varijabilni domen teškog lanca aminokiselinske sekvence:

[0039] U nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment iz tačke 1(iv), obuhvata:

(ii) varijabilni domen teškog lanca aminokiselinske sekvence:

(i) varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

[0040] U nekim primerima izvođenja, faktor D-vezujući fragment je Fab, Fab', F(ab')2ili Fv fragment.

[0041] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antifaktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment ovog pronalaska.

[0042] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu ovog pronalaska.

[0043] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata vektor ovog pronalaska.

[0044] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja obuhvata anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment ovog pronalaska.

[0045] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja obuhvata anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanih sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa.

[0046] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu kombinacije ovog pronalaska za pripremanje leka za lečenje poremećaja povezanih sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa.

[0047] U nekim primerima izvođenja, taj poremećaj je:

(i) očna bolest kao što je degeneracija makule povezana sa starenjem ili dijabetična retinopatija; ili (ii) je povezan sa: kardiopulmonarnim bajpas operacijama, ishemijskom-reperfuzijom nakon akutnog miokardijalnog infarkta, aneurizme, moždanog udara, hemoragičnog šoka, povrede gnječenjem, otkazivanja više organa, hiperbolemičnog šoka, crevne ishemije ili drugih događaja koji izazivaju ishemiju; zapaljenskim stanjima kao što su teške opekotine, endotoksemija, septički šok, respiratorni distres sindrom kod odraslih, hemodijaliza; anafilaktičkim šokom, teškom astmom, angioedemom, Kron-ovom bolešću, anemijom srpastih ćelija, poststreptokoknim glomerulonefritisom i pankreatitisom; sporednom reakcijom na lek, alergijom na lek, Sindromom vaskularnog curenja indukovanog sa IL-2 ili alergijom na kontrasni medijum; autoimunom bolešću kao što je sistemski lupus eritematozus, mijastenija gravis, reumatoidni artritis, Alchajmerova bolest i multiple skleroza; ili odbacivanjem transplantata.

[0048] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za detektovanje Faktora D kod pojedinca, koji obuhvata upotrebu anti-faktor D antitela ili njegovog Faktor D-vezujućeg fragmenta ovog pronalaska.

[0049] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak pripremanja anti-faktor D antitela ili njegovog Faktor D-vezujućeg fragmenta, koji obuhvata:

(i) uzgajanje ćelije domaćina ovog pronalaska u nekoj podlozi; i

(ii) prečišćavanje antitela ili u njemu izraženog fragmenta.

[0050] Prijavioci imaju želju da seledeći pojmovi imaju određene definicije kako je definisano u nastavku.

[0051] Fraza "suštinski identičan" u odnosu na polipeptidnu sekvencu lanca antitela može se konstruisati kao lanac antitela koji ispoljava najmanje 70%, ili 80%, ili 90% ili 95% sekvencionog identiteta prema referentoj polipeptidnoj sekvenci. Tak pojam u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline može se konstruisati kao sekvenca nukleotida koji ispoljavaju najmanje oko 85%, ili 90%, ili 95% ili 97% sekvencionog identiteta prema referentoj sekvenci nukleinske kiseline.

[0052] Pojam "identitet" ili "homologija" konstruisani su da označavaju procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa ostatkom odgovarajuće sekvence sa kojom se poredi, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je potrebno da se postigne maksimalni procenat identiteta za celu sekvencu, a ne uzimajući u obzir bilo koju konzerviranu supstituciju kao deo sekvencionog identiteta. Ni jedan od N- ili C-terminalnih produženja niti umetaka ne treba da bude konstruisan da redukuje identitet ili homologiju. Postupci i komopjuterski programi za poravnanje dobro su poznati u struci. Sekvencioni identitet može se izmeriti upotrebom softvera za analizu sekvenci.

[0053] Pojam "antitelo" koristi se u najširem smislu, a naročito pokriva monoklonalna antitela (koja uključuju monoklonalna antitela pune dužine), poliklonalna antitela, i multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela). Antitela (Abs) i imunoglobulini (Igs) su glikoproteini sa istim strukturalnim karakteristikama. Dok antitela ispoljavaju vezivanje specifično za specifični cilj, imunoglobulini obuhvataju i antitela i druge molekule nalik antitelu kojima nedostaje ciljana specifičnost. Nativna antitela i imunoglobulini obično su heterotetramerni glikoproteini od oko 150,000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) praćen brojnim kontantnim domenima. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantan domen na svom drugom kraju.

[0054] Kako se ovde koristi, "anti-humani Faktor D antitelo" označava antitelo koje se specifično vezuje za humani Faktor D na takav način tako da inhibira ili suštinski redukuje aktivaciju komplementa.

[0055] Pojam "varijabilni" u kontekstu varijabilnog domena antitela, odnosi se na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena razlikuju u velikoj meri po sekvenci među antitelima i koriste se u vezivanju i specificiranju svakog pojedinačnog antitela za svoj određeni cilj. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Ona je koncetrisana u tri segmenta koja se nazivaju regioni određivanja komplementarnosti (CDR-ovi) takođe poznati kao hipervarijabilni regioni (HVR-i) u varijabilnim domenima i lakog lanca i teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvir (FR). Varijabilni domeni of nativni teških i lakih lanaca svaki obuhvata četiri FR regiona, u velikoj meri usvajajući konfigiraciju β-lista, povezani putem CDR-a, koji obrazuju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima obrazuju deo, strukture β-lista. CDR-ovi u svakom lancu drže se zajedno u velikoj blizini putem FR regiona i, sa CDR-ovima iz drugog lanca, učestvuju u obrazovanju ciljanog mesta vezivanja antitela (videti Kabat et al.). Kako se ovde koristi, numerisanje imunoglobulinskih aminokiselinih ostataka izvedeno je prema sistemu numerisanja imunoglobulinskih aminokiselinskih ostataka prema Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md.1987), ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0056] Pojam "hipervarijabilni region", "HVR", ili "HV", kada se ovde koristi odnosi se na regione varijabilnih domena antitela koji su hipervarijabilni u sekveni i/ili obrazuju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela obuhvataju šest hipervarijabilnih regiona; tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). Broj razgraničenja hipervarijabilnih regiona ovde su korišćene i obuhvaćene. Kabat Regioni određivanja komplementarnosti (CDR-ovi) bazirani su na sekvencionoj varijabilnosti i najčešće se koriste (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Čotija se sa druge strane odnosi na lokaciju strukturalne petlje (Chothia and Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabat CDR-ovi i Čotija strukturalnih petlja, i koriste se u softveru za modelovanje antitela od Oxford Molecular's AbM. "Kontakt" hipervarijabilnih regiona bazirani su na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih hipervarijabilnih regiona navedeni su ispod.

Petlja Kabat AbM Čotija Kontakt

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Kabat Numerisanje)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Čotija Numerisanje)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[0057] Hipervarijabilni regioni mogu da obuhvataju "produženi hipervarijabilni regioni" kako sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena numerisani su prema Kabat et al., gore za svaku od ovih definicija.

[0058] "Okvir" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena različiti od ostataka hipervarijabilnog regiona ili CDR ostataka koji su ovde definisani.

[0059] Pojam "numerisanje ostataka varijabilnih domena prema Kabat-u" ili "numerisanje položaja aminokiselina prema Kabat-u", i njegove varijacije, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela iz Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Upotrebom ovog sistema numerisanja, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline koje odgovarajuju skraćivanju, ili umetanju u, FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da obuhvata jedno aminokiselinsko umetanje (ostatak 52a prema Kabat-u) posle ostatka 52 za H2 i umetnute ostatke (npr. ostaci 82a, 82b, i 82c, itd prema Kabat-u) posle ostatka FR teškog lanca 82. Kabat numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnanjem na regionima homologije antitela sekvenca "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom.

[0060] Kabat sistem numerisanja generalno se koristi kada se poziva na ostatak u varijabilnom domenu (približno ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (npr., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest.5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU sistem numerisanja" ili "EU indeks" generalno se koristi kada se poziva na ostatak u konstantnom regionu imunoglobulinskih teških lanaca (npr., EU indeks prijavljen u Kabat et al., gore; region zakretanja u konstantnom domenu teškog lanca su približno ostaci 216-230 (EU numerisanje) teškog lanca). "EU indeks prema Kabat-u" odnosi se na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela. Ukoliko nije drugačije naznačeno, pozivanja na brojeve ostataka u varijabilnom domenu antitela označavaju numerisanje ostataka prema Kabat sistemu numerisanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, pozivanja na brojeve ostataka u konstantnom domenu antitela označava numerisanje ostataka prema EU sistemu numerisanja (npr., videti US Provizionu prijavu Br.60/640,323, nacrt za EU numerisanje).

[0061] Pojam "fragment antitela" odnosi se na deo antitela pune dužine, generalno na ciljano vezivanje ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela obuhvataju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmenti. Fraza "funkcionalni fragment ili analog" antitela je jedinjenje sa kvalitativnom biološkom aktivnošću zajedničkom sa antitelom pune dužine. Na primer, funkcionalni fragment ili analog anti-humani Faktor D antitela je je jedan koji se može vezati za Faktor D na takav način da sprečava ili suštinski smanjuje aktivaciju komplementa. Kako se ovde koristi, "funkcionalni fragment" u odnosu na antitela, odnosi se na Fv, F(ab) i F(ab')2fragmente. "Fv" fragment je minimum fragmenta antitela koji sadrži potpuno ciljano prepoznavanje i mesto vezivanja. Ovaj region sastoji se od dimera jednog varijabilnog domena teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji (VH-VLdimer). U ovoj konfiguraciji tri CDR-a svakog varijabilnog domena ulazi u međusobnu reakciju radi definisanja ciljanog mesta vezivanja na površini VH -VLdimera. Zajedno, šest CDR-ova dodeljuju ciljano vezivanje specifično antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja obuhvata samo tri CDR-a specifična za cilj) može da prepozna i da se veže za tu metu. "Jedno-lančani Fv" ili "sFv" fragmenti antitela obuhvataju VH i VLdomene antitela, u kojem su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje obuhvata polipeptidni linker između VH i VLdomena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za ciljano vezivanje.

[0062] Fab fragment sadrži konstantan domen lakog lanca i prvi konstantan domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksilnu terminus CH1 domena teškog lanca koji uključuju jedan ili više cisteina iz regiona zakretanja antitela. F(ab') fragmenti proizvode se cepanjem disulfidne veze na zakretanju cisteina F(ab')2pepsinskog digestionog proizvoda. Dodatna hemijska kuplovanja fragmenata antitela poznata su stručnjacima iz ove oblasti.

[0063] Pojam "monoklonalno antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijen iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju si identična osim za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u minornim količinama. Monoklonalna antitela su veoma specifična, usmerena na jedno ciljano mesto. Dalje, nasuprot pripremanju konvencionalnih (poliklonalnih) antitela koja tipično obuhvataju različita antitela usmerena ka različitim odrednicama (epitopima), svako monoklonalno antitelo usmereno je ka jednoj deteminanti cilja. Pored njihove specifičnosti, monoklonalna antitela su poželjna u tome što mogu biti sintetizovana kulturom hibridoma, nekontaminiranom drugim imunoglobulinima. Modifikujuće "monoklonalno" ukazuje na karakter antitela budući da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i nije konstruisano da zahteva proizvodnju bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonalna antitela za upotrebu prema ovom pronalasku mogu se izolovati iz faga biblioteka antitela upotrebom dobro poznatih tehnika. Roditeljska monoklonalna antitela koja se koriste prema ovom pronalasku mogu se pripremiti postupkom hibridoma koji su prvi opisali Kohler i Milstein, Nature 256, 495 (1975), ili se mogu pripremiti rekombinantnim postupcima.

[0064] "Humanizovani" oblici ne-humanih (npr. mišja) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što je Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili druge ciljano-vezujuće podsekvence antitela) koji sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina.

Uopšteno, humanizovano antitelo obuhvataće suštinski sve najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi od CDR regiona odgovaraju onim ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR regioni su oni humane imunoglobulin konsenzus sekvence. Humanizovano antitelo takođe može da obuhvata najmanje deo imunoglobulin konstantnog regiona (Fc), tipično od obaranog humanog imunoglobulinskog templejta.

[0065] Postupci za humanizovanje ne-humanih atitela dobro su poznati u struci. Generalno, humanizovano antitelo ima jednu ili više aminokiselinskih ostataka koji se uvode u njega iz izvora koji je ne-human. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci često su označeni kao "uvozni" ostaci, koji se uobičajeno uzimaju iz "uvoznih" varijabilnih domena. Humanizacija može suštinski biti izvedena praćeno postupkom Winter i saradnika [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], supstituiasnjem glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Shodno tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (U.S. Patent Br.4,816,567), u kojima je suštinski manje netaktnutog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz ne-humanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela tipično su humana antitelo u kojima su CDR ostaci i moguće neki FR ostaci supstituisani iz analognih mesta u glodarskim antitelima.

[0066] Odabir humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji će se koristiti u pripremi humanizovanih antitela u nekim slučajevima može biti značajan za smanjivanje antigeničnosti i/ili HAMA odgovora (humano anti-mišje antitelo) kada je to antitelo namenjeno za humanu terapeutsku upotrebu.

Redukovanje ili eliminacija HAMA odgovora je generalno značajan aspekt kliničkog razvoja pogodnih terapeutskih agenasi. Videti, npr., Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol.

Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Kako je ovde opisano, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja su humanizovana tako da je HAMA odgovor smanjen ili eliminisan. Varijante ovih antitela dalje se mogu dobiti upotrebom rutisnkih postupaka poznatih u struci, od kojih su neki opisani u nastavku. Prema takozvanom postupku "najboljeg naleganja", sekvenca varijabilnog domena glodarskog antitela skrinovana je prema celoj biblioteci poznatoh humanih sekvecni varijabilnih domena. Humana sekvenca V domena koja je najbliža onoj od glodara, identifikovana je, a humani region okvira (FR) unutar nje je prihvaćen za humanizovano antitelo (Sims et al., J. Immunol.151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Još jedan postupak koristi određeni region okvira izveden iz konsenzus sekvence celog humanog antitela određene podgrupe of lakih ili teških lanaca. Isti okvir može se koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J.

Immunol.151:2623 (1993)).

[0067] Na primer, aminokiselinska sekvenca iz antitela kakvo je ovde opisano može da služi kao početna (roditeljska) sekvenca za diverzifikaciju okvira i/ili hipervarijabilne sekvence(a). Odabrana sekvenca okvira za koju je početna hipervarijabilna sekvenca povezana ovde je označena kao akceptor humani okvir. Dok akceptor humani okviri mogu biti iz, ili izvedeni iz, humanog imunoglobulina (njihovi VL i/ili VH regioni), akceptor humani okviri mogu biti iz, ili izvedeni iz, okvira humane konsenzus sekvence budući da su takvi okviri pokazalai da imaju mininalnu, ili nemaju uopšte, immunogeničnost na humanim pacijentima. "akceptor humani okvir" za ovde opisani svrhe je okvir koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz VL ili VH okvira izvedenog iz humanog imunoglobulinskog okvira, ili iz humanog konsenzus okvira. Akceptor humani okvir "izveden iz" humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzus okvira može da obuhvata istu njegovu aminokiselinsku sekvencu, ili može da sadrži pred-postojeće promene aminokiselinske sekvence. Tamo gde su prisutne pred-postojeće aminokiselinske promene, poželjno je prisutno ne više od 5 i poželjno 4 ili manje, ili 3 ili manje, predpostojećih aminokiselinskih promena. U jednom primeru izvođenja, VH akceptor humani okvir je identičan u sekvenci sa VH humanom imunoglobulinskom sekvencom okvira ili humanom konsenzus sekvencom okvira. U jednom primeru izvođenja, VL akceptor humani okvir je identičan u sekvenci sa VL humanom imunoglobulinskom sekvencom okvira ili humanom konsenzus sekvencom okvira. A "humani konsenzus okvir" je okvir koji predstavlja najuobičajenije javjajući aminokiselinski ostatak u odabiru humane imunoglobulinske VL ili VH sekvence okvira. Generalno, odabir humane imunoglobulinske VL ili VH sekvence je iz podgrupe sekvenci varijabilnih domena. Generalno, podgrupa of sekvence je podgrupa prema Kabat et al. U jednom primeru izvođenja, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I prema Kabat et al. U jednom primeru izvođenja, za VH, podgrupa je podgrupa III prema Kabat et al.

[0068] Kada je akceptor izveden iz humanog imunoglobulina, opciono se može selektovati humana sekvenca okvira koja je odabrana na njegovoj homologiji prema donorskoj sekvenci okvira poravnavanjem donorske sekvence okvira sa raznim humanim sekvencama okvira u kolekciji humanih sekvenci okvira, i odabrati najhomolognija sekvenca okvira kao akceptor. Akceptor humani okvir može biti iz ili izveden iz germinativnih sekvenci humanog antitela iz javnih baza.

[0069] Na primer, humani konsenzus okviri mogu biti iz, ili izveden iz, VH podgrupe VII i/ili VL kapa podgrupe I konsenzus sekvence okvira.

[0070] Templejt humanog okvira koji se koristi za generisanje anti-faktor D antitela ovog pronalaska može da obuhvata sekvence okvira iz templejta koji obuhvata kombinaciju VI-4.1b+ (VH7 familija) i JH4d za VH lanac (FIG.3) i/ili kombinaciju DPK4 (YκI familija) i JK2 za VL lanac (FIG.4).

[0071] Na taj način, VH akceptor humani okvir može da obuhvata jednu, dve, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira: FR1 koji obuhvata QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKAS (aminokiseline 1-25 iz SEQ ID NO: 27), u kojem X1je I ili V, X2je P ili S; FR2 koji obuhvata WVX3QAPGQGLE (aminokiseline 36-46 iz SEQ ID NO: 27), u kojem X3je K ili R; FR3 koji obuhvata RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4YYCX5R (aminokiseline 67-98 iz SEQ ID NO: 27), u kojem X4je T ili V, X5je E ili A; FR4 koji obuhvata WGQGTLVTVSS (aminokiseline 105-115 iz SEQ ID NO: 8 ili aminokiseline 105-115 iz SEQ ID NO: 27)

[0072] Primeri VH konsenzus okvira obuhvataju:

humana VH podgrupa I konsenzus okvira minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 28);

humana VH podgrupa I konsenzus okvira minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 29-31); humana VH podgrupa II konsenzus okvira minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 32);

humana VH podgrupa II konsenzus okvira minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 33-35); humana VH podgrupa III konsenzus okvira minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 36);

humana VH podgrupa III konsenzus okvira minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 37-39); humana VH podgrupa VII konsenzus okvira minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 55);

humana VH podgrupa VII konsenzus okvira minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 56-58); humani VH akceptor okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 40);

humani VH akceptor okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 41-42);

humani VH akceptor 2 okvir minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO: 43); ili humani VH akceptor 2 okvir minus produženi hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO: 44-45).

[0073] VH akceptor humani okvir može da obuhvata jednu, dva, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira: FR1 koji obuhvata QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS (aminokiseline 1-25 iz SEQ ID NO: 8),

FR2 koji obuhvata WVRQAPGQGLE (aminokiseline 36-46 iz SEQ ID NO: 8),

FR3 koji obuhvata RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCER (aminokiseline 67-98 iz SEQ ID NO: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE (aminokiseline 67-97 iz SEQ ID NO: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC (aminokiseline 67-96 iz SEQ ID NO: 8),

RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 51), ili

RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 52)

FR4 koji obuhvata WGQGTLVTVSS (aminokiseline 105-115 iz SEQ ID NO: 8 ili aminokiseline 105-115 iz SEQ ID NO: 27).

[0074] VL akceptor humani okvir može da obuhvata jednu, dve, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira: FR1 koji obuhvata DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITC (aminokiseline 1-23 iz SEQ ID NO: 26), u kojem X6je V ili M, X7je M ili A;

FR2 koji obuhvata WYQQKPGKX8PKLLIX9(aminokiseline 35-49 iz SEQ ID NO: 26), u kojem X8je P ili V, X9je S ili Y;

FR3 koji obuhvata GVPSRFSX10SGSGX110FTL TISSLQPEDVATYYC (aminokiseline 57-88 iz SEQ ID NO: 26), u kojem X10je S ili G, X11je A ili T;

FR4 koji obuhvata FGQGTKX12EIK (SEQ ID NO: 54), u kojem X12je V ili L.

[0075] Primeri VL konsenzus okvira obuhvataju:

human VL kapa podgrupa I konsenzus okvira (SEQ ID NO: 47);

human VL kapa podgrupa II konsenzus okvira (SEQ ID NO: 48);

human VL kapa podgrupa III konsenzus okvira (SEQ ID NO: 49); ili

human VL kapa podgrupa IV konsenzus okvira (SEQ ID NO: 50)

[0076] VL akceptor humani okvir može da obuhvata jednu, dve, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira: FR1 koji obuhvata DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC (aminokiseline 1-23 iz SEQ ID NO: 7),

FR2 koji obuhvata WYQQKPGKVPKLLIS (aminokiseline 35-49 iz SEQ ID NO: 7),

FR3 koji obuhvata GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (aminokiseline 57-88 iz SEQ ID NO: 7), FR4 koji obuhvata FGQGTKLEIK (aminokiseline 98-107 iz SEQ ID NO: 7), ili FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 53).

[0077] Dok akceptor može biti identičan po sekvenci sa odabranom humanom sekvencom okvira, bilo da je iz humanog imunoglobulinskog il humanog konsenzus okvira, akceptor sekvenca takođe može da obuhvata pred-postojeće aminokiselinske supstitucije u odnosu na humanu imunoglobulinsku sekvencu ili humanu konsenzus sekvencu okvira. Ove pred-postojeće supstitucije su poželjno minimalne; obično četiri, tri, dve ili jedna aminokiselinska različitost samo u odnosu na humanu imunoglobulinsku sekvencu ili konsenzus sekvencu okvira.

[0078] Hipervarijabilni region ostaci ne-humanog antitelo inkorporirani su u VL i/ili VH akceptor humane okvire. Na primer, mogu se inkorporirati ostaci koji odgovaraju Kabat CDR ostacima, Čotija ostacima hipervarijabilne petlje, Abm ostacima, i/ili kontaktnim ostacima. Opciono, produženi hipervarijabilni region ostaci inkorporirani su kako sledi: 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3).

[0079] Anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju sledeće hiper-varijabilne regione (CDR-ovi):

(i) u varijabilnom domenu lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:17 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:18; i u varijabilnom domenu teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO: 13, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:14 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:15;

(ii) u varijabilnom domenu lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:7, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:17 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:19; i u varijabilnom domenu teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:8, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO: 13, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:14 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20;

(iii) u varijabilnom domenu lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:9, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:21 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:22; i u varijabilnom domenu teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:10, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:23, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:14 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20; i

(iv) u varijabilnom domenu lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:24 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:19; i u varijabilnom domenu teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12, CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:25, CRD2 je definisan putem SEQ ID NO:14 i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20.

[0080] Ovde je takođe opisano antitelo koje obuhvata najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a odabranih iz (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 20; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 i SEQ ID NO: 24; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO:19.

[0081] Ovde je dalje opisano anti-faktor D antitelo koje obuhvata najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a odabranih iz (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom odabranom iz SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom odabranom iz SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO: 20; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 81%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom odabranom iz SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:24; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom odabranom iz SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO: 19. HVR sa aminokiselinskom sekvencom sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta može da sadrži supstitucije, umetanja, brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antitelo koje obuhvata tu aminokiselinsku sekvencu zadržava sposobnost da se veže za Faktor D. Na primer, ukupno od 1 do 10 aminokiselina supstituisano je, umetnuto, ili obrisano u referentnoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO; 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 24. Ovde je dalje opisano antitelo koje obuhvata najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a odabranih iz (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 20; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 i SEQ ID NO:24; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 19.

[0082] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca odabran iz SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, i antitelo koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca odabran iz SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 11. Na primer antitelo može da obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 6, ili varijabilni domen lakog lanca obuhvata SEQ ID NO: 5. U jednom primeru izvođenja antitelo ovog pronalaska koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 6 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 5. Ovde je takođe opisano antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:8 ili varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 7. U jednom primeru izvođenja, antitelo ovog pronalaska obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 8 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 7. Ovde je dalje opisano antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 10, ili antitelo koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 9. U jednom primeru izvođenja antitelo ovog pronalaska obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 9. Ovde je dalje opisano antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 12, ili varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 11. U jednom primeru izvođenja antitelo ovog pronalaska obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 11.

[0083] Ovde je opisano anti-faktor D antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, 8, 10 i 12. Aminokiselinska sekvenca sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta može da sadrži supstitucije, umetanja, brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antitelo koje obuhvata tu aminokiselinsku sekvencu zadržava sposobnost da se veže za Faktor D. Na primer, ukupno od 1 do 10 aminokiselina može biti supstituisano, umetnuto, ili obrisano u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, 8, 10 ili 12. Te supstitucije, umetanja ili brisanja mogu se javiti u regionima izvan HVR-a (tj., u FR-a). Anti-faktor D antitelo može da obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, 8, 10 ili 12.

[0084] Ovde je takođe opisano anti-faktor D antitelo koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa nekom aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9 i 11. Aminokiselinska sekvenca sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta može da sadrži supstitucije, umetanja, brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antitelo koje obuhvata tu aminokiselinsku sekvencu zadržava sposobnost da se veže za Faktor D. Na primer, ukupno od 1 do 10 aminokiselina može biti supstituisano, umetnuto, ili obrisano u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9 i 11. Te supstitucije, umetanja ili brisanja mogu se javiti u regionima izvan HVR-a (tj., u FR-a). Anti-faktor D antitelo može da obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9 i 11.

[0085] Anti-faktor D antitelo može da obuhvata bilo koju pogodnu sekvencu varijabilnog domena okvira, pod uslovom da to antitelo zadržava sposobnost da se veže za Faktor D. Na primer, anti-faktor D antitela mogu da obuhvataju sekvencu okvira varijabilnog domena teškog lanca koja je kombinacija VI.4.1 b+ i JH4d (Videti FIG.3). Alternativno, anti-faktor D antitela mogu da obuhvataju humanu podgrupu VII konzensus sekvence okvita teškog lanca. Anti-faktor D antitela mogu da obuhvataju sekvencu okvira varijabilnog domena teškog lanca koji obuhvata FR1 koji obuhvata aminokiseline 1-25 iz SEQ ID NO: 8, FR2 koji obuhvata aminokiseline 36-46 iz SEQ ID NO: 8, FR3 koji obuhvata aminokiseline 67-98 iz SEQ ID NO: 8 i FR4 koji obuhvata aminokiseline 105-115 iz SEQ ID NO: 8 U jednom primeru izvođenja ovih antitela, sekvenca varijabilnog domena teškog lanca obuhvata supstituciju(e) na položaju 40 i/ili 88 (Kabat numerisanje). U jednom primeru izvođenja ovih antitela, položaj 40 je cistein (C) ili alanin (A) i/ili položaj 88 je cistein (C) ili alanin (A). Anti-faktor D antitela takođe mogu da obuhvataju sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca koja je kombinacija DPK4 i JK2 (Videti FIG.4). Alternativno, anti-faktor D antitela mogu da obuhvataju konsenzus sekvencu humanog okvira kapa I (κI) lakog lanca. Anti-faktor D antitela mogu da obuhvataju sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca koji obuhvata FR1 koji obuhvata aminokiseline 1-23 iz SEQ ID NO: 7, FR2 koji obuhvata aminokiseline 35-49 iz SEQ ID NO: 7, FR3 koji obuhvata aminokiseline 57-88 iz SEQ ID NO: 7 i FR4 koji obuhvata aminokiseline 98-107 iz SEQ ID NO: 7. U nekim od ovih antitela, sekvenca okvira varijabilnog lakog lanca obuhvata jedan ili više supstituciju(e) na položaju 15, 43 i/ili 104 (Kabat numerisanje). U nekim od ovih antitela, položaj 15 je cistein (C) ili valin (V), položaj 43 je cistein (C) ili alanin (A) i/ili položaj 104 je valin (V) ili leucin (L).

[0086] Dalje, anti-faktor D antitelo ovog pronalaska mogu da obuhvataju bilo koji pogodan konstantan domen sekvenca, pod uslovom da to antitelo zadržava sposobnost da se veže za Faktor D. Na primer, u nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju najmanje deo konstantnog domena teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen teškog lanca bilo kog ili kombinacije α, δ, ε, γ, ili µ teškog lanca. Zavisno od aminokiselinske sekvence iz konstantnog domena njegovih teških lanaca (CH), imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama ili izotpovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, sa teškim lancima onačenim kao α, δ, ε, γ, i µ, respektivno. γ i α klase dalje se dele na podklase na osnovu relativno minornih razlika u CHsekvenci i funkciji, npr., ljudi koji ekspimiraju sledeće podklase: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen teškog lanca koji obuhvata supstitucije na aminokiselinskim položajima koje rezultuju u željenom efektu na efektorskoj funkciji (npr. afinitet vezivanja). U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen teškog lanca koji obuhvata supstitucije na aminokiselinskim položajima koji ne rezultuju kao efekat na efektorsku funkciju (npr. afinitet vezivanja). U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen teškog lanca IgG tipa (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) i dalje obuhvataju supstituciju na položaju 114 (Kabat numerisanje; ekvivalentno sa 118 u EU numerisanju), 168 (Kabat numerisanje; ekvivalentno sa 172 u EU numerisanju), 172 (Kabat numerisanje; ekvivalentno sa 176 u EU numerisanju) i/ili 228 (EU numerisanje). U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen teškog lanca IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) tipa i dalje obuhvataju supstituciju na položaju 114 u kojem položaj 114 je cistein (C) ili alanin (A), položaj 168 je cistein (C) ili alanin (A), položaj 172 je cistein (C) ili alanin (A) i/ili položaj 228 je prolin (P), arginin (R) ili serin (S).

[0087] Dalje, na primer, u nekim primerima izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju najmanje deo konstantnog domena lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen lakog lanca bilo kog ili kombinacije kapa ili lambda lakog lanca, jer lakom lancu bilo koje vrste kičmenjaka može biti dodeljen jedan od dva jasno dinstiktivna tipa, koji se nazivaju kapa i lambda, na osnovu aminokiselinske sekvence njihovih konstantnih domena. U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen lakog lanca koji obuhvata supstitucije na aminokiselinskim položajima koje rezultuju u željenom efektu na efektorskoj funkciji (npr. afinitet vezivanja). U jednom primeru izvođenja, antifaktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen lakog lanca koji obuhvata supstitucije na aminokiselinskim položajima koji ne rezultuju kao efekat na efektorsku funkciju (npr., afinitet vezivanja). U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen lakog lanca kapa tipa i dalje obuhvataju supstituciju na položaju 110, 144, 146 i/ili 168 (Kabat numerisanje). U jednom primeru izvođenja, anti-faktor D antitela ovog pronalaska obuhvataju konstantan domen lakog lanca kapa tipa i dalje obuhvataju supstituciju na položaju 110 u kojem 110 je cistein (C) ili valin (V), na položaju 144 u kojem 144 je cistein (C) ili alanin (A), na položaju 146 u kojem 146 je izolucein (I) ili valin (V) i/ili na položaju 168 u kojem 168 je cistein (C) ili serin (S).

[0088] Ovde su takođe opisana antitela koja ulaze u kompeticiju sa mišjim antitelom 166-32 i/ili humanizovanim anti-faktor D antitelo klon #56, #111, #250 ili #416, i/ili antitelo koje obuhvata varijabilni domen ili HVR sekvence humanizovanog anti-faktor D antitelo klona #56, #111, #250 ili #416. Antitela koja se vezuju za isti epitop kao što je mišje antitelo 166-32 i/ili humanizovano anti-faktor D antitelo klon #56, #111, #250 ili #416, i/ili antitelo koje obuhvata varijabilni domen ili HVR sekvence humanizovanog anti-faktor D antitelo klona #56, #111, #250 ili #416, takođe su opisani.

[0089] Ovde je opisano anti-faktor D antitelo u kojem je monovalentni afinitet antitela prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) niži, na primer najmanje 1-struko ili 2-struko niži od monovalentnog afiniteta himernog antitela (npr. afinitet himernog antitela kao Fab fragment prema Faktoru D), koji obuhvata, sastoji ili se sastoji suštinski od varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO: 2 i varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO: 1.

[0090] Ovde je dalje opisano anti-faktor D antitelo u kojem bivalentni afinitet antitela prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) je niži, na primer najmanje 1-struko ili 2-struko niži od bivalentnog afiniteta himernog antitela (npr. afinitet himernog antitela kao IgG prema Faktoru D), koji obuhvata, sastoji ili se sastoji suštinski od varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO: 2 i varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO: 1.

[0091] Ovde je takođe opisano anti-faktor D antitelo u kojem monovalentni afinitet antitela prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) je veći, na primer najmanje 1-struko ili 2-struko veći od monovalentnog afiniteta himernog antitela (npr. afinitet himernog antitela kao Fab fragment prema Faktoru D), koji obuhvata, sastoji ili se sastoji suštinski od varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO: 2 i varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO: 1.

[0092] Ovde je opisano anti-faktor D antitelo u kojem bivalentni afinitet antitela prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) je veći, na primer najmanje 1-struko ili 2-struko veći od bivalentnog afiniteta himernog antitela (npr. afinitet himernog antitela kao IgG prema Faktoru D), koji obuhvata, sastoji ili se sastoji suštinski od varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO: 2 i varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO: 1.

[0093] Afinitet anti-faktor D antitela ovog pronalaska u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti 1.0 nM (1.0x10<-9>M) ili bolji. Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti 0.5 nM (0.5x10<-9>M) ili bolji. Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti 1.0 pM (1.0x10<-12>M) ili bolji. Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti 0.5 pM (0.5x10<-12>M) ili bolji.

[0094] Afinitet antitela ovog pronalaska u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti 1.0 nM (1.0x10<-9>M) ili bolji. Dalje, afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti 0.5 nM (0.5x10<-9>M) ili bolji. Dalje, afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti 1.0 pM (1.0x10<-12>M) ili bolji. Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti 0.5 pM (0.5x10<-12>M) ili bolji.

[0095] Afinitet anti-faktor D antitela ovog pronalaska u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti između 0.5 mM (0.5x10<-6>M) i 0.5 pM (0.5x10<-12>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti između 15 nM (15x10<-9>M) i 0.1 nM (0.1x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti između 5.5 nM (5.5x10<-9>M) i 1 nM (1x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti između 0.5 pM (0.5x10<-9>M) i 2 pM (2x10<-12>M).

[0096] Afinitet antitela ovog pronalaska u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti između 0.5 mM (0.5x10<-6>M) i 0.5 pM (0.5x10<-12>M). Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti između 10 nM (10x10<-9>M) i 0.05 nM (0.05x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti između 5.5 nM (5.5x10<-9>M) i 1 nM (1x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti između 0.5 pM (0.5x10<-12>M) i 2 pM (2x10<-12>M).

[0097] Na primer, afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 3.7 nM (3.7x10<-9>M) ili 0.37 nM (3.7 x 10<-10>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 3.3 nM (3.3x10<-9>M) ili 0.33nM (3.3 x 10<-10>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 5.1 nM (5.1x10<-9>M) ili 0.51nM (5.1 x 10<-10>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 2.7 nM (2.7x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 1.4 nM (1.4x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 1.4 pM (1.4x10<-12>M). Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti oko 1.1 pM (1.1x10<-12>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 0.19 nM (0.19x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti oko 0.08 nM (0.08x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 12.3 nM (12.3x10<-9>M). Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti oko 9.0 nM (9.0x10<-9>M).

[0098] Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 1.4 pM (1.4x10<-12>M) /- 0.5. Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti oko 1.1 pM (1.1x10<-12>M) /- 0.6. Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 0.19 nM (0.19x10<-9>M) /-.01. Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti oko 0.08 nM (0.08x10<-9>M) /- 0.01. Afinitet antitela u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) može biti oko 12.3 nM (12.3x10<-9>M) /- 2. Afinitet antitela u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) može biti oko 9.0 nM (9.0x10<-9>M) /-1.

[0099] Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 3.7 nM (3.7x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 3.3 nM (3.3x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 5.1 nM (5.1x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 2.7 nM (2.7x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 1.4 nM (1.4x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 1.4 pM (1.4x10<-12>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) od oko 1.1 pM (1.1x10<-12>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 0.19 nM (0.19x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) od oko 0.08 nM (0.08x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom monovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao Fab fragment prema Faktoru D) od oko 12.3 nM (12.3x10<-9>M) /- 2. Anti-faktor D antitelo može imati afinitet u njegovom dvovalentnom obliku prema Faktoru D (npr., afinitet antitela kao IgG prema Faktoru D) od oko 9.0 nM (9.0x10<-9>M) /- 2.

[0100] Kako je već dobro utvrđeno u stanju tehnike, afinitet vezivanja liganda prema njegovom receptoru može se odrediti upotrebom bilo kog od raznih ogleda, i izraziti u smislu različitih kvantitativnih vrednosti. Shodno tome, afinitet vezivanja može biti izražen kao Kd vrednosti i reflektuje unutrašnji afinitet vezivanja (npr., sa minimiziranim efektima avidnosti). Generalno i poželjno, afinitet vezivanja meri se in vitro, bilo u postavci bez ćelija ili sa ćelijama. Kako je ovde detaljnije opisano, višestruka razlika u afinitetu vezivanja može se kvantifikovati u smislu odnosa vrednosti monovalentnog afiniteta vezivanja humanizovanog antitela (npr., u Fab obliku) i vrednosti monovalentnog afiniteta referentnog/poredbenog antitela (npr., u Fab obliku) (npr., mišje antitelo sa donorskom sekvencom hipervarijabilnog regiona), u kojem su vrednosti afiniteta vezivanja određene pod sličnim oglednim uslovima. Tako, na primer, višestruka razlika u afinitetu vezivanja može se odrediti kao odnos Kd vrednosti humanizovanog antitela u Fab obliku i povezanog referentnog/poredbenog Fab antitela. Na primer, ako antitelo (A) ima afinitet koji je "3-struko niži" od afiniteta referentnog antitela (M), zatim ako Kd vrednost za A iznosi 3x, Kd vrednost M iznosila bi 1x, a odnos Kd od A prema Kd od M iznosio bi 3:1. Obrnuto, ako antitelo (C) ima afinitet koji je "3-struko veći" od afiniteta referentnog antitela (R), zatim ako Kd vrednost za C iznosi 1x, Kd vrednost R iznosila bi 3x, a odnos Kd od C prema Kd od R iznosio bi 1:3. Bilo koji broj ogleda poznatih u struci, koji uključuju one ovde opisane, mogu se primeniti za dbijanje merenja afiniteta vezivanja, koja uključuju, na primer, Biacore, radioimunološki ogled (RIA) i ELISA.

[0101] Dalje, Kd vrednosti za antitelo mogu varirati zavisno od uslova određenog upotrebljenog. Na primer, merenja afiniteta vezivanja mogu se dobiti u ogledu u kojem je Fab ili antitelo imibilizovano, a vezivanje liganda, tj. Faktora D, je izmereno ili alternativno, ligand, tj. Faktor D, za Fab ili antitelo je imibilizovan i vezivanje Fab-a ili antitela je izmereno. Merenja afiniteta vezivanja takođe mogu da se dobiju u ogledu u kojem uslovi regenerisanja mogu da obuhvataju (1) 10mM glicein ili 4M MgCl2pri pH 1.5, i (2) pH između pH od 1.0 i pH od 7.5, koja uključuju pH od 1.5, pH od 5.0, pH od 6.0 i pH od 7.2. U jednom primeru izvođenja, merenja afiniteta vezivanja mogu se dobiti u ogledu u kojem uslovi vezivanja mogu da obuhvataju (1) PBS ili HEPES-puferovan slani rastvor i (2) Tween-20, tj.0.1% Tween-20. U jednom primeru izvođenja, merenja afiniteta vezivanja mogu se dobiti u ogledu u kojem izvor liganda, tj. Faktor D, mogu biti komercijalno dostupnih izvora. U jednom primeru izvođenja, merenja afiniteta vezivanja mogu se dobiti u ogledu u kojem je (1) Fab ili antitelo imibilizovano, a vezivanje liganda, tj. Faktora D je izmereno, (2) uslovi regenerisanja obuhvataju 4M MgCl2pri pH 7.2 i (3) uslovi vezivanja obuhvataju HEPES-puferovan slani rastvor, pH 7.2 koji sadrži 0.1% Tween-20. U jednom primeru izvođenja, merenja afiniteta vezivanja mogu se dobiti u ogledu u kojem (1) ligand, tj. Faktor D, je imibilizovano, a vezivanje Fab ili antitela je izmereno, (2) uslovi regenerisanja obuhvataju 10mM glicin pri pH 1.5 i (3) uslovi vezivanja obuhvataju PBS pufer.

[0102] Pojmovi "ćelija", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" obuhvataju potomstvo. Takođe se podrazumeva da svo potomstvo ne mora biti isključivo identično u DNK sadržaju, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Obuhvaćene seu varijante potomstva koja ima istu funkciju ili biološku osobinu, kako je skrinovano u originalno transformisanoj ćeliji. "Ćelije domaćin" koje se koriste u ovom pronalasku generalno su prokariotski ili eukariotski domaćini.

[0103] Pojam "vektor" označava DNK konstrukt koji sadrži DNK sekvencu koja je operativno vezana za pogodnu kontrolnu sekvencu sposobnu za realizovanje ekspresije DNK u odgovarajućem domaćinu. Takve kontrolne sekvence obuhvataju promoter za realizovanje transkripcije , opcionu operator sekvencu za kontrolu takve transkripcije, sekvencu koja kodira odgovarajuća mesta vezivanja mRNK ribozoma, i sekvence koje kontrolišu prekid transkripcije i translacije. Vektor može biti plazmid, čestica fage, ili jednostavno potencijalni genomski umetak. Kada se transformiše u odgovarajućem domaćinu, vektor se može replikovati i delovati nezavisno od domaćinskog genoma, ili se može do neke mere, integrisati u sam genom. U ovom opisu, "plazmid" i "vektor" ponekad se koriste naizmenično, budući da se plazmid najuobičajenije koristi u obliku vektora. Međutim, ovaj pronalazak ima za cilj da obuhvati takve druge oblike vektora koji ekvivalentno izvode funkciju koja je i koje su, ili će postati, poznate u struci.

[0104] Reč "oznaka" kada se ovde koristi odnosi se na detektabilno jedinjenje ili kombinaciju koja može biti konjugovana direktno ili indirektno u molekul ili protein, npr., antitelo. Ta oznaka sama po sebi može biti detektabilna (npr., radioizotopne oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimatskih oznaka, može katalizovati hemijsku izmenu supstratnog jedinjenja ili kombinacije koja je detektabilna.

[0105] Kako se ovde koristi, "čvrsta faza" označava ne-vodenu matricu za koju se antitelo može prilepiti. Primer ovde obuhvaćenih čvrstih faza obuhvata one koji su fomrirani delimično ili u potpunosti od stakla (npr. staklo kontrolisanoh pora), polisaharida (npr., agaroza), poliakrilamida, polistirena, polivinil alkohola i silikona. U određenim primerima izvođenja, zavisno od sadržaja, čvrsta faza može da obuhvata bazenčić ogledne ploče; u drugim to je kolona za prečišćavanje (npr. kolona afinitetne hromatografije).

GENERISANJE ANTITELA

ODABIR I TRANSFORMACIJA ĆELIJA DOMAĆINA

[0106] Odgovarajuće ćelije domaćini za kloniranje ili koji eksprimiraju DNK u vektorima ovde su prokariotske, kvasca, ili više eukariotske ćelije. Odgovarajući prokarioti u ove svrhe obuhvataju i Gramnegativne i Gram-pozitivne organizme, na primer, Enterobakterija kao što je E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, i Shigella, kao i Bacilli, Pseudomonas, i Streptomyces. Poželjan domaćin E. coli kloniranja E. coli 294 (ATCC 31,446), iako su odgovarajući i drugi sojevi kao što je E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 27,325). These primeri su ilustrativni, a ne i ograničavajući.

[0107] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne glivice ili kvasca odgovaraju za kloniranje ili ekspresiju domaćina za vektore koji kodiraju antitela. Saccharomyces cerevisiae je najčešće korišćena među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćinima. Međutim, broj drugih rodova, vrsta, i sojeva uobičajeno su dostupni i ovde korisni, kao što je Schizosaccharomyces pombe;

Kluyveromyces; Candida; Trichoderma; Neurospora crassa; i filamentozne gljivice kao što je npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini, kao što je A. nidulans i A. niger.

[0108] Odgovarajuće ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanih antitela izvedene su iz višećelijskih organizama. Principijalno, upotrebljiva je bilo koja viša eukariotska ćelijska kultura, bilo iz kulture kičmenjaka ili beskičmenjaka. Primeri beskičmenjačkih ćelija obuhvataju ćelije biljaka i insekata, Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al. eds. Vol.8, pp.

277-279 (Plenam publishing 1986); Mseda et al., Nature 315, 592-594 (1985). Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne insektne ćelije domaćini od domaćina kao što je Spodoptera frugiperda (guenica), Aedes (komarac), Drosophila melanogaster (voćna muva), i Bombyx mori. Javno su dostupni razni virusni sojevi za transfekciju, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu se koristiti kao virus prema ovom pronalasku, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija. Štaviše, biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajiza, i duvana takođe se mogu primeniti kao domaćini.

[0109] Ćelije kičmenjaka, i propagacija ćelija kičmenjaka, u kulturi (tkivna kultura) postala je rutinska procedura. Videti Tissue Culture, Academic Press, Kruse i Patterson, eds. (1973). Primeri korisnih sisarskih linija ćelija domaćina su iz bubrega majmuna; humana embrionska linija bubrega; ćelije bubrega bebe hrčka; jajne ćelije kineskog krčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje sertolijeve ćelije; humane čelije karcinoma grlića materice (HELA); pseće ćelije bubrega; humane ćelije pluća; humane ćelije jetre; tumor mlečnih žlezda kod miševa; i NS0 ćelije.

[0110] Ćelije domaćini transformišu se prethodno navedenim vektorima za proizvodnju antitela i uzgajanje u uobičajenoj hranljivoj podlozi modifikovanoj kako je pogodno za indukovanje promotera, odabiranje transformanata, ili amplifikovanje gena koji kodiraju željene sekvence.

[0111] Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju varijante antitela prema ovom pronalasku mogu se uzgajati u raznim podlogama. Komercijalno dostupna podloga kao što je Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), O/MINI-1640 (Sigma), i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) pogodna je za uzgajanje ćelija domaćina. Dodatno, bilo koja od podloga opisana u Ham et al., Meth. Enzymol.58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102: 255 (1980), U.S. Pat. Br.4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; ili 6,048,728 može se primeniti kao podloga za uzgajanje za ćelije domaćine. Bilo koja od ovih podloga može biti dopunjena ukoliko je potrebno sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin, ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su X-hloridi, gde X je natrijum, kalcijum, magnezijum; i fosfati), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što je adenozin i timidin), antibioticima (kao što je GENTAMYCIN.TM. lek), mikroelementi (dnisani kao neorganska jedinjena koja su oubičajeno prisutna pri finalnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i gluzom ili nekim ekvivalentom energetskog izvora. Bilo koji drugi potrebni suplementi takođe mogu biti obuhvaćeni u odgovarajućim koncentracijama koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti. Uslovi kultivisanja, kao što je temperatura, pH, i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i jasne su stručnjaku iz ove oblasti.

PREČIŠĆAVANJE ANTITELA

[0112] Kada se primenjuju rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti unutarćelijski, u periplazmičnom prostoru, ili direktno izlučiti u podlogu. Ukoliko je varijanta antitela proizvedena unutarćelijski, kao prva faza, određenije debris, bilo ćelije domaćina ili liziranih fragmenata, može se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltriranjem. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju postupak izolovanja antitela koje je izlučeno u periplazmični prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je odmrznuta u prisustvu natrijum acetata (pH 3.5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorid (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ćelijski debris može se ukloniti centrifugiranjem. Kada je varijanta antitela izlučena u podlogu, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema generalno se prvo koncetruju upotrebom komercijalno dostupnog proteinskog koncentracionog filtera, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltrirajuća jedinica. Proteaza inhibitor kao što je PMSF može biti obuhvaćen u bilo kojoj od gore pomenutih faza radi inhibiranja proteolize, i mogu biti obuhvaćeni antibiotici radi sprečavanja rasta zagađivača.

[0113] Kombinacija antitela pripremljena iz ćelija može se prečistiti upotrebom, na primer, hidroksilapatit hromatografijom, gel elektroforezom, dijalizom, i afinitetnom hromatografijom, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u varijanti antitela. Protein A može se primeniti za prečišćavanje antitela baziranih na humanim IgG1, IgG2 ili IgG4 teškim lancima (Lindmark et al., J. Immunol Meth.62: 1-13 (1983)). Protein G preporučuje se za sve mišje izotipove i za humaneIgG3 (Guss et al., EMBO J.5: 1567-1575 (1986)). Matricu za koju je prikačen afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge materice. Mehanički stabilne matrice kao što je staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stirenedivinil)benzen omogućavaju veće brzine protoka i kraća vremena obrade od onih koja se postižu agarozom. Kada varijanta antitela obuhvata CH3 domen, Bakerbond ABXTM smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) korisna je za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što je frakcionisanje na jono-izmenjivačkoj koloni, taloženje etanola, reverzno fazna HPLC, hromatografija na silicijumdioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE™ hromatografija na anjon ili katjon izmenjivačkoj smoli (kao što je poliaspartamska kisela kolona), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i amonijum sulfat taloženje tkođe su dostupni zavisno od varijante antitela koje se izoluje.

[0114] Praćeno bilo kojom prelimiranom fazom(ama) prečišćavanja, mešavina koja obuhvata varijantu antitela od intersa i kontaminanti mogu biti podvrgnuti hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji pri niskoj pH upotrebom elucionog pufera na pH između oko 2.5-4.5, poželjno izvedeno pri niskim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0.25M so).

FARMACEUTSKE FORMULACIJE

[0115] Terapeutske formulacije polipeptida ili antitelo mogu se pripremiti za čuvanje kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori mešanjem polipeptida željenog stepena čistoće sa opcionim "farmaceutski-prihvatljivim" nosačima, ekscipijesima ili stabilizatorima koji se uobičajeno upošljavaju u struci (od kojih su svi nazvani "eksicipijenci"). Na primer, puferući agensi, stabilišući agensi, prezervativi, izotonifieri, ne-jonski deterdženti, antioksidansi i drugi rzni aditivi. (Videti Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980)). Takvi aditivi moraju biti netoksični za primaoce pri uposlenim dozama i koncentracijama.

[0116] Puferući agensi pomažu održavanje pH u opsegu koji je približan fiziološkim uslovima. Oni su obično prisutni pri koncentraciji koja je u opsegu od oko 2 mM do oko 50 mM. Odgovarajući puferući agensi za upotrebu sa ovim pronalaskom obuhvataju i organske i neorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr., mononatrijum citrat-dinatrijum citrat mešavina, limunska kiselina-trinatrijum citrat mešavina, limunska kiselina-mononatrijum citrat mešavina, itd.), sukcinatni puferi (npr., ćilibarna kiselina-mononatrijum sukcinat mešavina, ćilibarna kiselina-natrijum hidroksid mešavina, ćilibarna kiselina-dinatrijum sukcinat mešavina, itd.), tartratni puferi (npr., tartaratna kiselina-natrijum tartrat mešavina, tartaratna kiselina-kalijum tartrat mešavina, tartaratna kiselina-natrijum hidroksid mešavina, itd.), fumaratni puferi (npr., fumarna kiselina-mononatrijum fumarat mešavina, itd.), fumaratni puferi (npr., fumarna kiselina-mononatrijum fumarat mešavina, fumarna kiselina-dinatrijum fumarat mešavina, mononatrijum fumarat-dinatrijum fumarat mešavina, itd.), glukonatni puferi (npr., glukonska kiselina-natrijum glikonate mešavina, glukonska kiselina-natrijum hidroksid mešavina, glukonska kiselina-kalijum glukonat mešavina, itd.), oksalatni pufer (npr., oksalna kiselina-natrijum oksalat mešavina, oksalna kiselina-natrijum hidroksid mešavina, oksalna kiselina-kalijum oksalat mešavina, itd.), laktat puferi (npr., mlečna kiselina-natrijum laktat mešavina, mlečna kiselina-natrijum hidroksid mešavina, mlečna kiselina-kalijum laktat mešavina, itd.) i acetatni puferi (npr., sirćetna kiselina-natrijum acetat mešavina, sirćetna kiselina-natrijum hidroksid mešavina, itd.). Dodatno, mogu se pomenuti fosfatni puferi, histidinski puferi i trimetilamin soli kao što je Tris.

[0117] Prezervativi mogu se dodati kako bi se usporio rast mikroba, i mogu se dodati u količinama koje se kreću od 0.2%-1% (w/v). Odgovarajući prezervativi za upotrebu prema ovom pronalasku obuhvataju fenol, benzil alkohol, meta-kresol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halidi (npr., hlorid, bromid, jodid), heksametonijum hlorid, alkil parabeni kao što je metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, i 3-pentanol.

[0118] Izotonicifkatori ponekat poznati kao "stabilizatori" mogu se dodati radi obezbeđivanja izotoničnosti tečnim kombinacijama ovog pronalaska i obuhvataju polihidrične šećerne alkohole, poželjno trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što je glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.

[0119] Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenasa koji mogu da se koristie u funkciji od agensa za dodavanje mase do aditiva koji razblažava terapeutski agens ili pomaže u sprečavanju denaturizacije ili prijanjanja na zid suda. Tipični stabilizatori mogu biti polihidrični šećerni alkoholi (prethodno nabrojani); aminokiseline kao što je argininska, lizinska, glicinska, glutaminska, asparaginska, histidinska, alaninska, ornitinska, L-leucinska, 2-fenilalaninska, glutaminska kiselina, treonin, itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što je laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinisitol, galaktitol, glicerol i slično, koji uključuju ciklitole kao što je inozitol; polietilen glikol; aminokiselinske polimere; sumpor koji sadrži redukujuće agense, kao što je urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, .alfa.-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; polipeptidi niske molekularne mase (tj. <10 ostataka); proteini kao što je humani serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon monosaharidi, kao što je ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi kao što je laktoza, maltoza, saharoza i disaharidi kao što je rafinoza; polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u opsegu od 0.1 do 10,000 masa u odnosu na deo mase aktivnog proteina.

[0120] Ne-jonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao "agensi vlaženja") mogu se dodati radi boljeg rastvaranja terapeutskog agensa kao i radi zaštite terapeutskog proteina od agitacijom indukovane agregacije, što takođe omogućava da je formulacija izložena površini smicanja koja je pomerena bez izazivanja denaturacije proteina. Odgovarajući ne-jonski surfaktanti obuhvataju polisorbate (20, 80, itd.), polioksamere (184, 188 itd.), Pluronic.RTM. poliole, poliooksietilen sorbitan monoetre (Tween.RTM.-20, Tween.RTM.-80, itd.). Ne-jonski surfaktanti mogu biti prisutni u opsegu od oko 0.05 mg/ml do oko 1.0 mg/ml, poželjno oko 0.07 mg/ml do oko 0.2 mg/ml.

[0121] Dodatni različiti ekscipijensi obuhvataju agense za dodavanje mase, (npr. skrob), helirajuće agense (npr. EDTA), antioksidanse (npr., askorbinska kiselina, metionin, vitamin E), i kosolvente. Ovda pomenuta formulacija takođe može da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja ako je potrebno za određenu indikaciju koja se leči, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koje međusobno nemaju štetne efekte. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbedi imunosupresivni agens. Takvi molekuli pogodno su prisutni u kombinaciji u količinama koj su efektivne za namenjene svrhe. Aktivni sastojci takođe mogu da budu zarobljeni u mikrokapsuli pripremljenoj, na primer, koacervacionim tehnikama ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsula i poli-(metilmetacilat) mikrokapsula, respektivno, u sistemima za dostavu koloidnih lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosferes, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike opisane su u Remington 's Farmaceutske Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980).

[0122] Formulacije za upotrebu u in vivo davanju moraju biti sterilne. To se lako postiže, na primer, filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Preparati sa produženim oslobađanjem mogu se pripremiti. Odgovarajući primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju polu-propustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže varijantu antitela, pri čemu se te matrice u obliku formiranih oblika, npr., filmovi, ili mikrokapsule. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem obuhvataju poliestere, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. Br.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamat, ne-degradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne mlečna kiselina-glikolna kiselina kopolimere kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sastavljene od mlečna kiselina-glikolna kiselina kopolimera i leuprolid acetata), i poli-D- (-)-3-hidroksibuterne kiseline. Dok polimeri kao što je etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda. Kada enkapsulirana antitela ostanu u telu tokom dužeg vremenskog perioda, mogu se raspasti ili nagomilati kao rezultat izlaganja vlagi na 37° C što rezultuje u gubitku biološke aktivnosti i moguće promene u imunogeničnosti. Racionalne strategije mogu se osmisliti za stabilizaciju zavisno od uključenog mehanizma. Na primer, ukoliko se otkrije da jhe agregacioni mehanizam formacija intermolekularne S--S veze kroz tio-disulfidnu izmenu, stabilizacija se može postići modifikovanjem sulfohidrilnih ostaci, liofilizovanjem iz kiselih rastvora, kontrolisanja sadržaja vlage, upotrebe pogodnih aditiva, i razvijanja specifičnih kombinacija polimerne matrice.

[0123] Količina terapeutskog polipeptida, antitela ili njegovog fragmenta koja će biti efektivna u lečenju određenog poremećaja ili stanja zavisiće od prirode poremećaja ili stanja, i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Kada je to moguće, poželjno je odrediti krive doza-odgovor i farmaceutske kombinacije ovog pronalaska prvo in vitro, a zatim u korisnim sistemima životinjskih modela pre testiranja na ljudima.

[0124] U poželjnom pimeru izvođenja, vodeni rastvor terapeutskog polipeptida, antitela ili njegovog fragmenta daje se subkutanom injekcijom. Svaka doza može biti u rasponu od oko 0.5 µg do oko 50 µg po kilogramu telesne mase, ili poželjnije, od oko 3 µg do oko 30 µg po kilogramu telesne mase.

[0125] Raspored doziranja za subkutano davanje može varirati od jednom mesečno do dnevno u zavisnosti od broja kliničkih faktora, koji uključuju tip bolesti, težinu bolesti, i osetljivost subjekta na terapeutski agens.

UPOTREBE HUMANIZOVANOG ANTITELA

[0126] Ovde opisana humanizovana antitela korisna su u dijagnostičkim ogledima, npr., za detektovanje ekspresije ciljanog interesa u specifičnim ćelijama, tkivima, ili serumu. Za dijagnostičke primene, varijanta antitela tipično će biti označena sa detektabilnim ostatakom. Dostupne su brojne oznake. Tehnike za kvantifikovanje promene u fluorescenciji prethodno su opisane. Hemiluminescentni supstrat postaje elektronski uzbuđen hemijskom reakcijom i tada može emitovati svetlo koje se može izmeriti (upotrebom hemiluminometra, na primer) ili donira energiju fluorescentnom akceptoru. Primeri enzimatskih oznaka obuhvataju luciferaze (npr., luciferaza svitca i bakterijska luciferaza; U.S. Pat. Br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, malat dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza kao što je peroksidaza rena (HRPO), alkalina fosfataza, .beta.-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze (npr., glukozna oksidaza, galaktozna oksidaza, i glukoza-6-fosfatna dehidrogenaza), heterociklične oksidaze (kao što je urikaza i ksantin oksidaza), laktoperoksidaza, mikroperoksidaza, i slično. Tehnike za konjugovanje enzima za antitela opisane su u O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoogled, in Methods in Enzym. (Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981).

[0127] Nekad, oznaka je indirektno konjugovana za varijantu antitela. Stručnjak je svestan raznih tehnika za postizanje toga. Na primer, varijanta antitela može biti konjugovana za biotin i bilo koja od tri široke kategorije prethodno pomenutih oznaka može biti konjugovana za avidin, ili obrnuto. Biotin se vezuje selektivno za avidin i tako, oznaka može biti konjugovana sa varijantom antitela na ovaj indirektan način. Alternativno, kako bi se postigla indirektna konjugacija oznake sa varijantom antitela, varijanta antitela je konjugovana za mali hapten (npr. digloksin), a jedna od prethodno pomenutih različitih vrsta oznaka je konjugovana za anti-hapten varijantu antitela (npr. anti-digloksin antitelo). Na taj način, može se postići indirektna konjugacija oznaka za varijantu antitela.

[0128] Alternativno, varijanta antitela ne mora biti označena, a njeno prisustvo može biti detektovano upotrebom označenog antitela koje se vezuje za varijantu antitela.

[0129] Ove opisana i zaštićena antitela, mogu se uposliti u bilo kom poznatom oglednom postupku, kao što je ogled kompetetivnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič ogledi, i ogledi immunotaloženja. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc.1987).

[0130] Ogledi kompetitivnog vezivanja oslanjaju se na sposobnosti označenih standarda da uđu u kompeticiju sa test uzorkom za vezivanje sa ograničenim količinom varijante antitela. Količina ciljanja u test uzorku je inverzno proporcionalna količini standarda koji postaje vezan za antitela. Kako bi se odredila količina standarda koja postaje vezana, antitela se generalno insolubilizuju pre ili posle kompeticije. Kao rezultat, standard i test uzorak koji su vezani za antitela mogu se pogodno razdvojiti od standarda i test uzorka koji ostaju nevezani.

[0131] Sendvič ogledi uključuju upotrebu dva antitela, svako sposobno za vezivanje za različit imunogeni deo, ili epitop, ili protein koji treba da se detektuje. U sendvič ogledu, test uzorak koji se analizira vezan je prvim antitelom koje je imibilizovano na ćvrstoj podlozi, a zatim se drugo antitelo vezuje za test uzorak, čime se formira nerastvorljiv tro-delni kompleks. Videti npr., U.S. Pat. Br.4,376,110. Drugo antitelo može samo za sebe biti označeno detektabilnim ostatkom (direktni sendvič ogledi) ili mogu biti izmereni upotrebom anti-imunoglobulin antitela koje je označeno detektabilnim ostatkom (indirektni sendvič ogled). Na primer, jedan tip sendvič ogleda je ELISA ogled, gde detektabilni ostatak predstavlja enzim.

[0132] Za imunohistohemiju, tumor uzorak može biti svež ili zamrznut ili može obuhvaćen u parafinu i fiksiran sa prezervativom kao što je formalin, na primer.

[0133] Antitela takođe mogu da soriste u in vivo dijagnostičkim ogledima. Generalno, varijanta antitela je označena radionukleotidom (kao što je .sup.111 In, .sup.99 Tc, .sup.14 C, .sup.131 I, .sup.3 H, .sup.32 P ili .sup.35 S) tako da tumor može biti lokalizovan upotrebom imunoscintiografije. Na primer, visoko afinitetno anti-IgE antitelo može se koristiti za detektovanje količine IgE prisutnog u , npr., plućima asmatičnog pacijenta.

[0134] Antitelo ovog pronalaska može se obezbediti u kompletu, tj., spakovanoj kombinaciji reagenasa u prethodno određenim količinaa sa instrukcijama za izvođenje dijagnostičkog ogleda. Kada je varijanta antitela označena enzimom, komplet može da obuhvata suptrate i kofaktore koji su potrebni enzimu (npr., substratni prekursos koji obezbeđuje detektabilni hromofor ili fluorofor). Dodatno, drugi aditivi mogu biti obuhvaćeni kao što su stabilizatori, puferi (npr., blokirajući pufer ili pufer za liziranje) i slično. Relativne količine raznih reagenasa mogu varirati široko kako bi se obezbedile koncentracije u rastvorima reagenasa koje suštinski optimizuju osetljivost ogleda. Određenije, reagensi se mogu obezbediti kao suvi prahovi, obično liofilizovani, koji uključuju ekscipijense koji u raspadanju obezbeđuju rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.

IN VIVO UPOTREBE ANTITELA

[0135] Razmatrano je da se antitela ovog pronalaska mogu primeniti za lečenje sisara. Antitelo se može davati nehumanom sisaru radi dobijanja predkliničkih podataka, na primer. Primerni nehumani sisari koji se leče obuhvataju nehumane primate, pse, mačke, glodare i druge sisare na kojima se izvode predklinička ispitivanja. Takvi sisari mogu biti utvrđen životinjski modeli za bolesti koje se leče antitelom ili se mogu primeniti za ispitivanje toksičnosti antitela od interesa. U svakom od ovih primera izvođenja, ispitivanje dozne eskalacije može se izvesti na sisaru.

[0136] Antitelo ili polipeptid daje se na bilo koji pogodan način, koji uključuje parenteralno, subkutano, intraperitonealno, intraplućno, i intranazalno, i, ukoliko je poželjno za lokalnu imunosupresivno lečenje, intralezionalno davanje. Parenteralne infuzije obuhvataju intramuskularno, intravenozno, intraarterijalno, intraperitonealno, ili subkutano davanje. Dodatno, varijanta antitela pogodno se daje pulsnom infuzijom, naročito sa opadajućim dozama varijante antitela. Poželjno, doza se daje injekcijama, najpoželjnije intravenoznim ili subkutanim injekcijama, deličino zaviseći od toga da li je davanje je kratko ili hronično.

[0137] Za prevenciju ili lečenje bolest, odgovarajuća doza antitela ili polipeptida zavisiće od tipa bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, da li se varijanta antitela daje za preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecije nadležnog lekara.

[0138] Zavisno od tipa i težine bolesti, oko 0.1 mg/kg do 150 mg/kg (npr., 0.1-20 mg/kg) antitela je prvenstvena kandidatna doza za davanje pacijentu, bilo, na primer, jednim ili putem više odvojenih davanja, ili kontinualnom infuzijom. Tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 mg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od prethodno pomenutih faktora. Za ponavljajuće davanje tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, lečenje je produženo dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti.

Međutim, drugi dozni režimi mogu biti korisni. Progres ovog lečenja lako se prati konvencionalnim tehnikama i ogledima. Primerni dozni režim opisan je u WO 94/04188.

[0139] Kombinacija antitela može se formulisati, dozirati i davati na način konzistentan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za uzimanje u obzir u skladu sa ovim kontekstom obuhvataju određene poremećaje koji se tretiraju, određenog sisara koji se treira, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzroka poremećaja, mesta dostave agensa, postupka davanja, rasporeda davanja, i drugih faktora poznatih lekarima. "terapeutski efektivna količina" antitela koja se daje biće vođena tim vodiljama, a ona je minimalna količina potreba da speči, ublaži, ili leči bolest ili poremećaj. Antitelo ne treba da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili agenasa koji se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje poremećaja koji je u pitanju. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine anitela prisutne u formulaciji, tipa poremećaja ili lečenja, i drugih prethodno pomenutih faktora. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa outanjama davanja kakva su korišćne i pre ili oko od 1 do 99% do sada uposlenih doza.

[0140] Antitela ovog pronalaska koja prepoznaju Faktor D kao njihov cilj, mogu se primeniti za lečenje komplementom-posredovanih poremećaji. Ovi poremećaji povezani su sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa. Oni obuhvataju: Aktivaciju komplementa tokom kardiopulmonarne bajpas operacije; aktivaciju komplementa usled ishemije-reperfuzije nakon akutnog miokardijalnog infarkta, aneurizme, moždanog udara, hemoragičnog šoka, povrede gnječenjem, višestrukog otkazivanja organa, hipobolemičkog šoka i intestinalne ishemije. Ovi poremećaji takođe mogu da obuhvataju bolest ili stanje koje je neko zapaljensko stanje kao što su teške opekotine, endotoksemija, septički šok, respiratorni distres sindrom kod odraslih, hemodijaliza; anafilaktički šok, teška astma, angioedem, Kron-ova bolest, anemija srpastih ćelija, poststreptokokni glomerulonefritis i pankreatitis. Taj poremećaj može biti rezultat sporedne reakcije na lek, alergije na lek, Sindroma vaskularnog curenja indukovanog sa IL-2 ili alergije na kontrasni medijum. Ona takođe obuhvata autoimunu bolest kao što je sistemski lupus eritematozus, mijastenija gravis, reumatoidni artritis, Alchajmerova bolest i multiple skleroza. Aktivacija komplementa je takođe povezana sa odbacivanjem transplantata. Nedavno je postojala snažna veza između aktivacije komplementa i očnih bolesti kao što je degeneracija makule povezana sa starenjem, dijabetična retinopatija.

PRIMERI

[0141] Sledeće primeri dati su samo radi lustracije, a ne na ograničavajući način.

Primer 1: Humanizacija Faktor D Mišjeg MAb 166-32

[0142] Sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) mišjeg mAb 166-32 upoređene su sa germinativnom sekvncom humanog antitela dostupne u javnim bazama. Korišćeno je nekoliko kriterijuma pri biranju templejta kako je opisano u fazi 1, koji uključuju ukupnu dužinu, slične CDR položaje unutar okvira, ukupnu homologiju, veličinu CDR, itd. Svi ovi kriterijumi uzeti zajedno daju rezultat za odabir optimalnog humanog templejta kako je prikazano u sekvencionom poravnanju između 166-32 MAb sekvenci teškog i lakog lanca i respektivnog humane templejt sekvence prikazane na FIG.3 i 4.

[0143] U ovom slučaju, više od jednog humanog templejt okvira korišćen je za konstruisanje ovog antitela. Humani templejt koji se bira za VH lanac bio je kombinacija VI-4.1b+ (7-04.1 lokus)(pristupni# X62110)(VH7 familija) i JH4d (Videti FIG.3). Humani templejt koji se bira za VL lanac bio je kombinacija DPK4 (VK I familija) kombinovan sa JK2 (Videti FIG.4).

[0144] Kada je templejt odabran, Fab biblioteka konstruisana je DNK sintezom i preklapanjem PCR. Ta biblioteka sastavljena je za sintetizovanje MAb 166-32 CDR-ova sintetizovanih sa respektivnim humanim templejtima. Preklapajući nukleotidi koji kodiraju delimično VHi VLsekvence, sintetizovani su u opsegu od oko 63 do oko 76 nukleotida sa 18 do 21 nukleotidnih preklapanja. Vektori koji eksprimiraju biblioteku humanizovanih Fabs prema Faktor D antigenu konstruisani su, i transformisani u E. coli DH10B zatim zasejani na XL-1B bakterijskoj koloniji.

[0145] Kvalitet biblioteke procenjen je na veličinu (broj nezavinsih klonova) i različitost (distribuciju mutacija). Pojedinačni klonovi sa dvostrukim umetanjem i lakog i teškog lanca bio je oko 14 od 20 sekvenciranih. Okvirne mutne mutacije su ravnomerno raspoređene.

[0146] PCR amplifikacija VLi VHgena izvedena je upotrebom biotinilovanog forvardnog prajmera koji sadrži specifičnu sekvencu prema regionu okvira FR1 i prepuštajuću sekvencu pričvršćena za kraj vodeće sekvence (Genelll) i reverzni prajmer od konzerviranog konstantnog regiona (CKili CH1) pod standardnim PCR uslovima. PCR proizvod prečišćen je agaroza gel elektroforezom, ili komercijalnim PCR kompletom za prečišćavanje radi uklanjanja neinkorporiranih biotinilovani prajmera i ne-specifičnog PCR.

PRIMER 2: Skrining bibiloteke

[0147] Podizanje hvatačkim filterima korišćeno je za primarni skrinig. Stvarna veličina skriniga je veća od 3 puta veće od teoretske veličine biblioteke. Kandidati su dalje skrinovani ELISA ogledom jedne tačke. Najbolja veziva dalje su potvrđena direktnom antigen titracijom upotrebom Faktora D na osnovu Fab koncentracije.

Skrinig hvatačkog podizanja

[0148] Ogled podizanja hvatačkim filterima korišćen je za primarni skrinig za vezivanje Fab-a prema Faktoru D. Fage visokog titra posađene su i inkubisane na 37°C do upotrebe (oko 6-8 sati). Kozije antihumana kapa razblaženo je do 10ug/ml u 10 ml PBST; Nitrocelulozni filteri za podizanje plakova pripremljeni su prema standardnim procedurama pozizanja plaka, a zatim uronjeni u 10ml blokirajućeg pufera tokom 2 na šejkeru. Filteri su isprani 3x sa PBST. Filteri su naneti na koloniju plaka i inkubisani na ST tokom približno 15-24 sati. Filteri su zatim uklonjeni sa ploča i isprani sa TBST 3x.

[0149] Faktor D (50ug/ml) razblažen je u PBST do 0.1 ug/ml i 4ml po filteru je dodato. Filteri su inkubisani u rastvoru tokom 2h na šejkeru na ST praćeno ispiranjem 3x, svaki put 5min. Razblažen 166-222-HRP (1:10, 000 sa PBST) dodat je u zapremini od 4 ml po filteru, a filteri su inkubisani tokom 1h na šejkeru. Filteri su isprani 4x. Filteri su osušeni, a zatim uronjeni u TMB supstrat praćeno uranjanjem u vodu radi zaustavljanja reakcije.

PRIMER 3: ELISA skrinig jedne tačke

[0150] ELISA ogled jedne tačke korišćen je za sekundarni skrinig. Immulon II ploče obložene su kozjim anti-humanim Fab (1:12,000, 50ul/bazenčićl) preko noći na ST. Sledećeg dana, ploče su oprane 4x peračem ploča. Blokirajući pufer dodat je u zapremini od 100ul po bazenčiću, a ploče su inkubisane tokom 1h na ST. Ploče su zatim oprane 4x.

[0151] Svaki Fab koji se skrinuje dodat je u zapremini od 50ul po bazenčiću (ili iz 15ml periplasmičnog pripravka ili supernatanta) i inkubisan 1h na ST. Ploče su oprane 4x praćeno dodavanjem 50ul/bazenčić biotinilovanog faktora D pri 0.01 ug/ml. Ploče su inkubisane tokom 1h na ST, a zatim oprane 4x.

StreptAvidin-HRP dodat je (1:10,000 u PBST) i inkubisan tokom 1h na ST. Ploče su oprane 5x, a zatim razvijene dodavanjem TMB supstrata pri 50ul/bazenčić. Zaustavni pufer dodat je u zapremini od 50ul kada su bazenčići-razvijeni (10-45 min), a ploče su iščitane na 450nm.

Primer 4: Serkvenciranje humanizovanih anti-faktor D klonova

[0152] Šesnaest humanizovanih klonova sa dobrim afinitetom vezivanja za humani Faktor D su sekvencirani (videti Tabelu 1). Među njima, položaj 2 (100% humani) i 49 (100% mišji) u lakom lancu, i položaj 93 (100% mišji) u teškom lancu su veoma konzervirani što ukazuje da su značajni u održavanju sposobnosti vezivanja antitela.

Tabela 1. Analize aminokiselinskih sekvenci humanizovanih klonova iz humanizacione biblioteke

[0153] Klon #56 Procenjen je BIAcore analizom i ogledom hemolitičke inhibicije. BIAcore analize pokazale su da klon #56 ima sličan afinitet za humani Faktor D kao himerno 166-32 Fab (videti Tabelu 4). Ogled hemolitičke inhibicije pokazao je da je klon #56 nekako potentniji od himernog 166-32 Fab (videti FIG.6). Klon # 56 sadrži dva mišja ostatka u okviru lakog lanca i četiri mišja ostatka u teškom lancu. (videti Tabelu 1). Na osnovu ovih rezultata, izvedena je dalja optimizacija.

Tabela 2. Analiza aminokiselinskih sekvenci optimizovanih antitela iz humanizacione/CDR3

optimizacione biblioteke

[0154] Klon #111 i #114 okarakterisani su BIAcore analizama (videti Tabelu 4). Klon #104, #111, #114 i #130 takođe su okarakterisani ogledom hemolitičke inhibicije (videti FIG.6). Ovi klonovi imaju više afinitete od himernih 166-32, i potentniji su od himernog Fab-a u inhibiranju alternativne putanje kako je prikazano ogledom hemolitičke inhibicije (FIG.7). Klon #111 sadrži ista dva mišja ostatka u lakom lancu (položaj 4 i 49) kao klon # 56. On takođe sadrži konzervirani mišji ostatak u položaju 97 teškog lanca kako je pronađeno kod klona #56. Postoji dobrobitna mutacija i u oba CDR3 i lakog lanca i teškog lanca u klonu #111. Iz dve nezavisne skrinovane biblioteke (humanizaciona biblioteka, i humanizacina/CDR3 optimizaciona biblioteka), pronađeno je da najbolji klonovi imaju slične konsenzus ostatke.

[0155] Radi dalje optimizacije klona #111, biblioteka antitela konstruisana je uvođenjem pojedinačnih mutacija u CDR-H1 i CDR-L2 simultano. Ukratko, pristup mutageneze usmerene ka nekom položaju korišćen je da konstruiše takve biblioteke poravnavanjem oligonukleotida koji kodiraju pojedinačne mutacije do templejta klona #111. Sekvencirano je ukupno 24 klonova sa veoma visokim afinitetom prema humanom Faktoru D. Među ta 24 klona, identifikovano je nekoliko redundantnih dobrobitnih mutacija. Klonovi #250, #315, #345 i #416 odabrani su za BIAcore analize (videti Tabelu 4). BIAcore podaci pokazuju da ovi klonovi imaju viši afinitet za humani Faktor D od prvobitnog klona #111. Klon #250, #315, #348 i #416 takođe su testirani u ogledu hemolitičke inhibicije (videti FIG.6) i inhibicije alternativne putanje (FIG.7).

Primer 5: Ogled AP Hemolize

[0156] Biološka funkcija humanizovanih klonova određena je upotrebom ogledom hemolitičke inhibicije i BIAcore analiza (Videti Primer 6 ispod). Hemolitički ogled izveden je prema sledećoj proceduri.20 ul 1:20 razblaženih zečijih crvenih krvnih ćelija (RRBC) (0.5 ml 9.5 ml GVB/Mg-EGTA pufer) u 20 ml slanog rastvora (0.9% NaCl) u približno 1 : 2x10<4>razblaženju, izbrojane su putem uređaja za brojanje Coulter Counter. Koncentracija ćelija zatim je podešena na oko 2-5x10<4>ćelije/ml. U svaku ploču naneto je oko 500x10<6>/ploča RRBC ili oko 1 ml RRBC/ploča (500x10<6>/2-5 x10<4>).

[0157] Ćelije su razblažene u 6 ml GVB/Mg-EGTA pufer/ploča, umešane i oprane 3 puta centrifugiranjem na 1360 o/min x 4 min na 4 °C. RRBC pelet je suspendovan 3 ml GVB/Mg-EGTA pufer/ploča i održavan na ledu.

[0158] Humani serum uzet iz zamrzivača na -80°C, odmrznut je neposredno pre upotrebe. Serum je razblažen do koncentracije od 20 % seruma u GVB/Mg-EGTA pufer, 5 ml/ploča (finalna je bila 10 %) i održavan na ledu.

Tablela 3

[0159] Uzorci su protresani tokom 30 sekundi na 5-6°C, a zatim tokom 40 minuta na 37 °C. Uzorci su ohlađeni na 5-6°C uz protresanje, a zatim centrifugiranje na 2,000 o/min x 3 min na 4 °C. Približno 80 ul supernatanta transferovano je u ploču ravnog dna sa 96 bazenčića, a OD vrednost na 590 nm očitana je upotrebom standardnom čitača ploča. Procenat inhibicije izračunat je kako sledi: % Inhibicije = {[(S-SB) -(U-SB)]/(S-SB)} x 100%. (U = uzorak 1, 2 ili 3 (kolone 1, 2 ili 3 Tabele 3, respektivno).

Primer 6: Kinetic Analize of anti-Human Faktor D Fab by BiaCore

[0160] Imobilizacija- Humani faktor D (Advanced Research Inc, 0.1 mg/ml) direktno je imibilizovan na CM5 čip (BiaCore) upotrebom postupka aminskog kuplovanja. Postupak je ukratko opisan kako sledi: (1) Konstantan protok (PBS) je na 5 µl/min. (2) Injekcija od 35 µl EDC/NHS (1:1). (3) Injekcija od 35 µl humanog faktora D u acetatnom puferu, pH 4.5. (4) Blokiranje aktivirane grupe injekcijom od 35 µl etolamina. (5) Čišćenje površine sa 5 µl 10 mM Glicina pH 1.5. Ligand (humani faktor D) imobilizacioni nivo bio je oko 1,000 RU. Test je izveden upotrebom α-humanog faktora D (huDi, 40 µl, 31.5 µg/ml) dajući relativni odgovor oko 900 RU.

[0161] Kinetičke analize- Sva anti-humana faktor D Fab-a razblažena su u PBS puferu. Svaki uzorak je pripremljen u serijama koncentracija: 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 75nM, 100 nM, 125 nM, i 150 nM, sa 40 µl injekcionim pulsom pri visokoj brzini akvizicije. Regeneracija je postignuta dodavanjem 5 µl pulsiranja 10 mM Glicina pri pH 1.5. Kinetički parametri dobijeni su poklapanjem tragova vezivanja Fab-a prema 1:1 modelu vezivanja pod pseudo-prvi red kinetičke upotrebom BIAvaluation-a verzija 3.0. Rezultati su prikazani u Tabeli 4 ispod. Svi podaci dobijeni su globalnom rutinom poklapanja.

Tabela 4 BIAcore Rezultati

[0162] Stručnjaci iz ove oblasti prepoznaće, ili će moći da odrede rutinskim ispitivanjem, mnoge ekvivalente sprecifično opisanim primerima izvođenja.

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment, koje obuhvata:

(i) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:17, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:18; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:13; CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14; i CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:15;

(ii) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:7, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:17, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:19; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:8, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:13, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20;

(iv) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:16, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:24, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:19; i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12, u kojem CDR1 je definisan putem SEQ ID NO:25, CDR2 je definisan putem SEQ ID NO:14, a CDR3 je definisan putem SEQ ID NO:20,

2. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(i), koje obuhvata: varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5 i

3. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(ii), koje obuhvata: varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:7, ili aminokiselinsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 7, pri čemu aminokiselina na položaju 104 iz SEQ ID NO:7 predstavlja valin, i

4. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(iii), koje obuhvata: varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:9 i

5. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(iv), koje obuhvata: varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11 i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12.

6. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(ii), koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO:7, pri čemu aminokiselina na položaju 104 iz SEQ ID NO:7 predstavlja valin.

7. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(iv), koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

8. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(iv), koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

9. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(iv), 7 ili 8, koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca aminokiselinske sekvence:

10. Anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema zahtevu 1(iv), koje obuhvata: (i) varijabilni domen lakog lanca aminokiselinske sekvence:

DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKX8PKLLIX9DG NTLRPGVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTK LEIK (SEQ ID NO: 26), u kojem X6je V ili M; X7je M ili A; X8je P ili V; X9je S ili Y; X10je S ili G, a X11je A ili T; i

(ii) varijabilni domen teškog lanca aminokiselinske sekvence:

QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGMNWVX3QAPGQGLEWM GWINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4YYCX5RE GGVNNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27), u kojem X1je I ili V; X2je P ili S; X3je K ili R; X4je T ili V; i X5je E ili A.

11. Anti-faktor D antitelo ili faktor D-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 10, u kojem faktor D-vezujući fragment je Fab, Fab', F(ab')2ili Fv fragment.

12. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

13. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 12.

14. Ćelija domaćin koja obuhvata vektor prema zahtevu 13.

15. Kombinacija koja obuhvata anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

16. Kombinacija koja obuhvata anti-faktor D antitelo ili njegov Faktor D-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 11 za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanih sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa.

17. Upotreba kombinacije prema zahtevu 15 za pripremanje leka za lečenje poremećaja povezanih sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa.

18. Kombinacija za upotrebu prema zahtevu 16 ili upotreba prema zahtevu 17, gde taj poremećaj predstavlja:

(i) očnu bolest kao što je degeneracija makule povezana sa starenjem ili dijabetična retinopatija; ili (ii) je povezan sa: kardiopulmonarnim bajpas operacijama, ishemijskom-reperfuzijom nakon akutnog miokardijalnog infarkta, aneurizme, moždanog udara, hemoragičnog šoka, povrede gnječenjem, otkazivanja više organa, hiperbolemičnog šoka, crevne ishemije ili drugih događaja koji izazivaju ishemiju; zapaljenskim stanjima kao što su teške opekotine, endotoksemija, septički šok, respiratorni distres sindrom kod odraslih, hemodijaliza; anafilaktičkim šokom, teškom astmom, angioedemom, Kronovom bolešću, anemijom srpastih ćelija, poststreptokoknim glomerulonefritisom i pankreatitisom; sporednom reakcijom na lek, alergijom na lek, Sindromom vaskularnog curenja indukovanog sa IL-2 ili alergijom na kontrasni medijum; autoimunom bolešću kao što je sistemski lupus eritematozus, mijastenija gravis, reumatoidni artritis, Alchajmerova bolest i multiple skleroza; ili odbacivanjem transplantata.

19. In vitro postupak za detektovanje Faktora D kod pojedinca, koji obuhvata upotrebu anti-faktor D antitela ili njegovog Faktor D-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

20. Postupak pripremanja anti-faktor D antitela ili njegovog Faktor D-vezujućeg fragmenta, koji obuhvata:

(i) uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 14 u nekoj podlozi; i

(ii) prečišćavanje antitela ili u njemu izraženog fragmenta.