RS58237B1 - Fragmenti neacilovanog grelina za upotrebu u lečenju prader-willi sindroma - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu neacilovanog grelina, njegovih fragmenata i/ili analoga za modulaciju nivoa grelina i/ili odnosa grelin/neacilovani grelin kod subjekta, pri čemu je takva modulacija korisna za subjekta. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinaciju koja obuhvata neacilovani grelin, njegove fragmente i/ili analoge za modulaciju nivoa grelina i/ili odnosa grelin/neacilovani grelin kod subjekta, pri čemu je takva modulacija korisna za subjekta. Ovaj pronalazak dalje se odnosi na upotrebu nivoa grelina i/ili odnosa grelin/neacilovani grelin kao biomarkera za određivanje verovatnoće da subjekt reaguje na i/ili ima koristi od davanja neacilovanog grelina.

POZADINA

[0002] Grelin (takođe se naziva "acilovani grelin" ili skraćeno kao "AG") je peptid od 28 aminokiselina, prečišćen i identifikovan iz želuca pacova i okarakterisan prisustvom modifikacije n-oktanoila na Ser3 ostatku (Ref.1). Acilovanje grelina katalizovano je enzimom grelin O-acil transferaza (GOAT). Ekspresija GOAT je uglavnom u želucu i crevima. Grelin je endogeni ligand receptora secretagogue (GHSR-1a) hormona rasta (GH) (Ref.2, 3). Grelin se sada uglavnom prepoznaje kao potentni oreksigenski faktor koji stimuliše unos hrane i koji moduliše potrošnju energije (Ref.4, 5 i 6). Na perifernom nivou, grelin verovatno ispoljava njegovo glavno fiziološko delovanje regulišući metabolizam glukoze i lipida (Ref.7). Ustvari, grelin ima dijabetogeno dejstvo (Ref.8) i potiskuje sekreciju insulina stimulisanu glukozom i pogoršava toleranciju glukoze (Ref.9). Kao takav, povišeni grelin u plazmi je od značaja u određenim poremećajima metabolizma i rasta kao što su dijabetes i gojaznost. Povišeni nivoi grelina u plazmi takođe su se pokazali i kod odraslih kao i kod dece sa Prader-Willi sindromom (PWS) (Ref.10 i 11). PWS je genetski sindrom gojaznosti povezan, kod većine pacijenata, sa GH nedostatkom. Deca sa PWS brzo dobijaju na masi zajedno sa proždrvljivim apetitom. Ispitivanja o učešću grelina u PWS dala su značajno obrazloženje da je hiperfagija opažena kod PWS u pozitivnoj vezi sa povišenim nivoima grelina, u skladu sa poznatim oreksigenskim efektom grelina (Ref.12).

[0003] Neacilovani grelin (takođe se naziva "des-acil grelin" ili skraćeno kao "UAG"), je neacilovani oblik grelina. Njegova koncentracija u plazmi i tkivu je veća u odnosu na grelin. UAG je dugo smatran kao proizvod bez fiziološke uloge jer ne uspeva da veže jedini poznat receptor grelina GHSR-1a u fiziološkim koncentracijama i nema fiziološko dejstvo na GH sekreciju (Ref.15). Međutim, UAG je biološki aktivan peptid, naročito na metaboličkom nivou i pokazalo se da njegovo davanje indukuje negativni energetski balans smanjenjem unosa hrane i odlaganjem pražnjenja želuca (Ref.16). Prekomerna ekspresija UAG kod miševa rezultuje smanjenjem akumulacije masti sa povećanjem insulinske osetljivosti i tolerancije na glukozu (Ref.16 i 17).

[0004] Pokazalo se da UAG sprečava hiperglikemijske efekte grelina, kada se daje istovremeno, zdravim volonterima. Videti posebno U.S. Patent 7,825,090, koji je ovde inkorporiran u svojoj celosti referencom. Ovo inicijalno zapažanje praćeno je sa nekoliko izveštaja o anti-dijabetogenom potencijalu UAG (Ref.18, 19, 30, 31 i 32).

[0005] In vitro, in vivo i klinički dokaz ukazuju da UAG sprečava dijabetogene efekte grelina kod zdravih volontera i kod GH-deficijentnih pacijenata (Ref.18 i 19). Inhibira i osnovnu i grelinom indukovanu sekreciju glukoze od strane humanih hepatocita (Ref.31). Kod pacova, UAG pojačava portalni insulinski odgovor na glukozu (Ref.32) i smanjuje deponovanje masti i nivoe triglicerida, kao što je primećeno kod transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju UAG (Ref.16). In vitro, UAG stimuliše sekreciju insulina iz ćelija insulinoma (Ref.32) i promoviše proliferaciju i inhibira apoptozu beta ćelija (Ref.33).

[0006] Anti-dijabetogeni efekti i grelin-antagonizujući efekti od UAG, njegovih fragmenata i analoga prijavljeni su u U.S. Patentu broj 7,485,620; U.S. Patentu broj 8,222,217; U.S. Patentu broj 8,318,664 i u WO 2008/145749.

[0007] Nedavni eksperimenti na cirkulišuće angiogene ćelije (CAC) ukazuju da UAG korisno napada vaskularni proces remodelovanja za koji je poznato da se pogoršava kod pacijenata sa dijabetesom tipa 2. Efekti UAG na CAC objavljeni su u U.S. prijavi patenta sa serijskim brojem 2010/0016226 i u WO 2009/150214.

[0008] Prijavljeno je da gojazni miševi i ljudi imaju niže UAG nivoe u odnosu na subjekte normalne mase, što ukazuje na to da je gojaznost možda u vezi sa relativnim UAG nedostatkom (Ref.34, 35 i 21).

Primećeno je da gojazni subjekti otporni na insulin imaju povišen AG/UAG odnos kada se uporede sa gojaznim subjektima osetljivim na insulin (Ref.20 i 22).

[0009] Tretmani koji ciljaju grelin i GHS-R (tj., antagonisti grelina) predloženi su kao atraktivni farmakološki pristupi za borbu protiv gojaznosti i ostalih stanja, poremećaja i bolesti povezanih sa grelinom. Nekoliko GHS-R liganada i vakcina protiv gojaznosti je predloženo (Ref.24). Ostali farmakološki pristupi koji indukuju antitela protiv grelina, enantiomere grelina i inhibiciju grelin aciltransferaze (GOAT) (Ref.25) su istraživani: međutim, zbog nedostatka efikasnosti, neselektivnosti i nedostatka održivog gubitka mase, ovi farmakološki pristupi još nisu došli na tržište (Ref.26).

[0010] Zbog toga, postoji potreba u tehnici za efikasnim i direktnijim načinom modulacije nivoa cirkulišućeg grelina i/ili odnosa cirkulišući grelin/neacilovani grelin kod subjekata kod kojih je takva modulacija korisna za subjekta i za efikasnije načine identifikovanja tih subjekata koji mogu imati koristi od modulacije nivoa grelina i odnosa grelin/neacilovani grelin.

SUŠTINA PRONALASKA

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje fragmente neacilovanog grelina koji se sastoje od peptida kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6 ili kao što je navedeno u SEQ ID NO: 25, i neku njihovu farmaceutski prihvatljivu so, za njihovu upotrebu u lečenju Prader-Willi sindroma kod subjekta koji ima povišene nivoe grelina, naročito povišene nivoe cirkulišućeg grelina. Ovaj pronalazak posebno obezbeđuje fragmente neacilovanog grelina i njihovu so za njihovu upotrebu u lečenju Prader-Willi sindroma kod subjekta koji ima povišene nivoe grelina, pri čemu ona obuhvata davanje efektivne količine pomenutog fragmenta neacilovanog grelina i soli od oko 0,001 µg/kg do oko 10 mg/kg, poželjnije od oko 1 µg/kg do oko 1 mg/kg.

[0012] Prema ovom pronalasku, pomenuti fragment neacilovanog grelina i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se dati putem odabranim iz grupe koju čine intravenozni, subkutani, transdermalni, oralni, bukalni, sublingvalni, nazalni i inhalacijoni put.

[0013] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje fragmente neacilovanog grelina koji se sastoje od peptida kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6 ili kao što je navedeno u SEQ ID NO: 25, i neku njihovu farmaceutski prihvatljivu so, za njihovu upotrebu u lečenju Prader-Willi sindroma kod subjekta koji ima povišene nivoe grelina,, pri čemu je pacijent identifikovan

- određivanjem nivoa cirkulišućeg grelina iz subjekta, i

- obradom nivoa cirkulišućeg grelina najmanje delimično na osnovu referentnog nivoa cirkulišućeg grelina da bi se dobila informacija koja saopštava da li je nivo cirkulišućeg grelina povišen.

KRATAK OPIS SLIKA

Fig.1 je šematski prikaz protokola studije koji uključuje subjekte sa Diabetes Mellitus tipa 2 (T2DM) prema jednom primeru izvođenja ovog pronalaska. SBM odnosi se na standardni obrok za doručak.

Fig.2A i 2B su grafici koji ilustruju efekat UAG infuzije na nivoe AG seruma kod T2DM subjekata. Na Fig.2A, nivoi AG seruma u pg/ml izmereni su nakon davanja placebo ili UAG pre i jedan sat posle SBM. Na Fig.2B, nivoi UAG serum u pg/ml izmereni su nakon davanja placebo ili UAG pre i jedan sat posle SBM.

Fig.3A i 3B su grafici koji ilustruju srednje nivoe glukoze nakon obroka kod T2DM subjekata merene sredstvom za kontinuirano praćenje glukoze (CGMS® iPro™ Continuous Glucose Recorder, Medtronic trading. The Netherlands). Fig.3A prikazuje srednje apsolutne nivoe glukoze nakon SBM i nakon infuzija placebo, UAG 3 mcg/kg/h i UAG 10 mcg/kg/h. Ponovljena merenja ANOVA p<0,0001; Bonferroni-jeva višestruka poređenja placebo vs.3 mcg NS; placebo vs. 10 mcg p<0,001; 3 mcg vs.10 mcg p<0,001. Fig.3B prikazuje srednje nivoe glukoze t0-t180 za tri tretirane grupe.

Fig.4A i 4B su grafici koji ilustruju srednje nivoe glukoze nakon obroka kod T2DM subjekata. Fig. 4A prikazuje promenu u nivoima glukoze od osnovne linije pre obroka, nakon infuzija placebo, UAG 3 mcg/kg/h i UAG 10 mcg/kg/h. Ponovljena merenja ANOVA p<0,0001; Sonferroni-jeva višestruka poređenja placebo vs.3 mcg p<0,001; placebo vs.10 mcg p<0,001; 3 mcg vs.10 mcg p<0,05. Fig.4B prikazuje srednje nivoe glukoze t0-t180 za tri tretirane grupe.

Fig.5A i 5B su grafici koji ilustruju pik nivoe glukoze u plazmi nakon SBM kod osam subjekata studije nakon infuzija placebo, UAG 3 mcg/kg/h i UAG 10 mcg/kg/h. Vilkoksonov test ekvivalentnih parova ranga sa znakom; *: 10 mcg vs. Placebo, p<0,05.

Fig.6A, 6B i 6C su grafici koji ukazuju na postojanje korelacije između osnovnih koncentracija AG i/ili UAG pri gladovanju i glikemijskog odgovora na UAG davanje. Grafik na Fig.6A ilustruje korelaciju između osnovnih nivoa AG pri gladovanju i promenu (nakon davanja UAG vs. placebo) u pik nivoima glukoze nakon SBM. Grafik na Fig.6B ilustruje korelaciju između osnovnih nivoa AG pri gladovanju i promenu (nakon davanja UAG vs. placebo) u AUC nivoima glukoze nakon SBM upotrebom iPro kontinuiranih merenja glukoze. Grafik na Fig.6C ilustruje korelaciju između odnosa osnovnih nivoa AG u odnosu na UAG pri gladovanju i promenu (nakon davanja UAG vs. placebo) u AUC nivoima glukoze nakon SBM upotrebom iPro kontinuiranih merenja glukoze.

Fig.7A je šematski prikaz protokola studije hiperinsulinskog euglikemijskog klampa kod T2DM subjekata prema daljem primeru izvođenja ovog pronalaska.

Fig.7B je grafik koji ilustruje efekte UAG na M-indeks, koji odražava insulinsku osetljivost, tokom protokola kao što je šematski prikazano na Fig.7A. Promena M-indeksa od osnovne linije izmerena je nakon infuzija placebo i UAG. *: p<0,05, jednosmerni Mann Whitney test.

Fig.7C i 7D su grafici koji ilustruju efekte kratkog perioda UAG infuzije na osnovne AG nivoe kod T2DM subjekata. Fig.7C prikazuje nivoe cirkulišućeg AG pre UAG infuzije i nakon 2,5 sata UAG infuzije. Fig.7D prikazuje AG promenu od osnovne linije nakon 2,5 sata UAG infuzije ([AG] nivo u 12:00 - [AG] nivoi u 9:30). Dvosmerni Vilkoksonov test ekvivalentnih parova ranga sa znakom; *: p<0,05; **: p<0,01.

Fig.8 je grafik koji ilustruje efekte cikličnog UAG fragmenta (6-13) na AG-indukovani unos hrane tokom naznačenog perioda studije. *p<0,001: Kruskal-Wallis jednosmerna ANOVA. Razlike između grupa ocenjene su Dunn testom.

DETALJAN OPIS

[0015] Ovaj pronalazak proizilazi iz, ali nije ograničen na, otkrića od strane pronalazača da davanje UAG smanjuje nivoe cirkulišućeg AG kod subjekata sa T2DM. Ovaj pronalazak dalje proizilazi iz otkrića da što je viši nivo osnovnog AG, značajniji su efekti UAG na smanjenje AG nivoa i na smanjenje štetnih efekata povezanih sa AG nivoima kao što su, na primer, gojaznost, hiperglikemija, otpornost na insulin, nagomilavanje masti, hiperfagija i gojaznost povezana sa otpornošću na insulin. Pronalazači takođe su otkrili da što je veći odnos cirkulišućeg AG/UAG, efikasniji je UAG i u smanjenju tog odnosa i u suzbijanju štetnih efekata povezanih sa AG/UAG odnosom.

[0016] Sa obzirom na ovo, nivo cirkulišućeg AG i odnos cirkulišućeg AG/UAG može svaki da se korsti kao biomarkeri za identifikovanje verovatnoće subjekta da reaguje na i/ili ima koristi od davanja UAG. Ovi biomarkeri mogu, zbog toga, da se koriste za identifikovanje unutar neke populacije subjekata koji boluju od stanja kao što su, ali bez ograničenja na, gojaznost, dijabetes, otpornost na insulin, Prader-Willi, hiperfagija i hipergrelinemija, koji od subjekata će verovatno reagovati na i/ili imati koristi od davanja UAG. Što su viši nivoi cirkulišućeg AG i/ili veći odnos cirkulišućeg AG/UAG kod subjekta, verovatnije je da će ovaj subjekat reagovati na i/ili imati koristi od davanja UAG.

[0017] Do danas, studije su prijavile da UAG suzbija periferna delovanja grelina na, na primer, metabolizme glukoze i insulina. Ova studija obezbeđuje prvi dokaz da davanje UAG takođe suzbija nivoe cirkulišućeg grelina i obezbeđuje prvi dokaz postojanja korelacije između nivoa cirkulišućeg AG i efikasnosti UAG u poboljšanju metaboličkih parametara pogođenih AG nivoima i/ili AG/UAG odnosom.

[0018] Iznenađujuće demonstracije predstavljene u njoj omogućavaju da se prošire primene i indikacije za koje može neacilovani grelin da se korsti tako da uključuje olakšavanje, poboljšavanje i/ili lečenje stanja koja rezultuju iz AG nivoa i/ili AG/UAG odnosa. Ove demonstracije takođe omogućavaju da se prošire primene i indikacije za koje može neacilovani grelin da se koristi tako da uključuje olakšavanje, poboljšavanje i/ili lečenje stanja koja rezultuju iz povišenih AG nivoa i/ili povišenog AG/UAG odnosa. Kako se ovde koristi, izraz "povišeni AG nivo(i)" odnosi se na nivo cirkulišućeg AG koji je iznad AG nivoa primećenog kod normalnih i/ili zdravih subjekata. U nekim primenama, izraz "povišeni AG nivo(i)" odnosi se na nivo cirkulišućeg AG pri kojem se jedan ili više štetnih fizioloških simptoma povezanih sa AG javljaju, istrajavaju ili se pogoršavaju kod subjekta.

[0019] Kao što se ovde koristi, izraz "povišeni AG/UAG odnos" odnosi se na odnos cirkulišućeg AG/UAG koji je iznad AG/UAG odnosa primećenog kod normalnih i/ili zdravih subjekata. U nekim primenama, izraz "povišeni AG/UAG odnos" odnosi se na odnos cirkulišućeg AG/UAG pri kojem se jedan ili više štetnih fizioloških simptoma povezanih sa AG/UAG odnosom javljaju ili istrajavaju ili se pogoršavaju kod subjekta.

[0020] Podrazumeva se da nekoliko faktora može da deluje na nivoe cirkulišućeg grelina i neacilovanog grelina kod normalnih subjekata. Primeri tih faktora uključuju, ali nisu ograničeni na, pol, starost, fizičku spremnost, indeks telesne mase (BMI), navike u ishrani, itd.

[0021] Kao što se ovde koristi, izraz "inhibicija grelina" odnosi se na pogoršanje biološke aktivnosti grelina koja se javlja zbog smanjenja nivoa grelina i/ili zbog pogoršanja njegove biološke aktivnosti.

[0022] Prosečan stručnjak u tehnici biće upoznat sa tehnikama i testovima za merenje AG i UAG nivoa kod subjekta. Takve tehnike mogu da uključuju tehnike koje uključuju upotrebu inhibitora proteaza kao što je 4-(2-aminoetil) benzensulfonil fluorid hidrohlorid (AEBSF) ili ostali kokteli inhibitora proteaza.

[0023] U jednoj primeni ovog primera izvođenja, gojazni subjekt okarakterisan je da ima telesnu masu približno 20%, približno 25%, približno 30% ili veću od normalne telesne mase za pomenuti subjekt. Normalna telesna masa može da se odredi poređenjem mase subjekta u prethodnom trenutku, kao što je kada su AG nivoi bili normalni i/ili kada je AG/UAG odnos bio normalan, ili poređenjem AG nivoa i/ili AG/UAG odnosa subjekta u odnosu na proseke ostalih subjekata sličnog uzrasta i/ili stanja.

[0024] U drugoj primeni ovog primera izvođenja, subjekt sa prekomernom masom okarakterisan je da ima telesnu masu približno 5% veću do približno 20% veću u odnosu na normalnu telesnu masu za pomenutog subjekta. Normalna telesna masa može da se odredi poređenjem mase subjekta u prethodnom trenutku, kao što je kada su AG nivoi bili normalni i/ili kada je AG/UAG odnos bio normalan, ili poređenjem AG nivoa i/ili AG/UAG odnosa u odnosu na proseke ostalih subjekata sličnog uzrasta i/ili stanja.

[0025] U drugoj primeni ovog primera izvođenja, normalan subjekt okarakterisan je da ima telesnu masu približno 5% veću od do približno 5% manju od normalne telesne mase za pomenuti subjekt. Normalna telesna masa može da se odredi poređenjem mase subjekta u prethodnom trenutku, kao što je kada su AG nivoi bili normalni i/ili kada je AG/UAG odnos bio normalan, ili poređenjem AG nivoa i/ili AG/UAG odnosa u odnosu na proseke ostalih subjekata sličnog uzrasta i/ili stanja. Subjekt sa normalnom masom može da ima BMI u približnom opsegu od 19-22.

[0026] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni ovde imaju isto značenje kao što obično razume prosečan stručnjak u tehnici kojoj ovaj pronalazak pripada.

i) Neacilovani grelin, i fragmenti

[0027] Pojmovi "neacilovani grelin", "des-acil grelin" i skraćenica "UAG" namenjeni su da označavaju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1, koja aminokiselinska sekvenca je:

[0028] Neacilovani grelin može takođe da se naziva UAG (1-28).

[0029] "Peptid", "polipeptid" ili "protein" znači bilo koji lanac aminokiselina, bez obzira na dužinu ili post-translacionu modifikaciju (npr., glikozilat ili fosforilacija), ili hemijsku modifikaciju, ili oni koji sadrže neprirodne ili neuobičajene aminokiseline kao što su D-Tyr. ornitin, amino-adipinska kiselina. Pojmovi se koriste naizmenično u ovoj prijavi.

[0030] Izrazi "fragmenti" i "njihovi fragmenti" odnose se na aminokiselinske fragmente peptida kao što je UAG.

[0031] Fragmenti iz UAG su kraći od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 1, zbog toga su kraći od 28 aminokiselinskih ostataka. Fragmenti iz UAG mogu, prema tome, da budu dužine 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 aminokiselinska ostatka. Na primer, fragmenti iz UAG mogu da imaju aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 1 dole:

Tabela 1:

Neki UAG fragmenti prijavljeni su u U.S. Patentu broj 8,222,217; U.S. Patentu broj 8,318,664 i u WO/2008/145749, gde je demonstrirano da najmanji UAG fragment kako bi se zadržala biološka aktivnost UAG predstavlja UAG (9-12) naveden ovde kao SEQ ID NO: 11.

[0032] U prvom primeru izvođenja ovog pronalaska, fragment iz UAG je UAG (6-13) kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6.

[0033] U jednom primeru izvođenja, polipeptidi kao što su UAG, njegovi fragmenti ili analozi, koriste se u obliku koji je "prečišćen", "izolovan" ili "suštinski čist". Polipeptidi su "prečišćeni", "izolovani" ili "suštinski čisti" kada se odvoje od komponenata koje ih prirodno prate. Obično, neko jedinjenje je suštinski čisto kada ono čini najmanje 60mas.%, 65mas.%, 70mas.%, 75mas.%, 80mas.%, 85mas.%, 90mas.%, 95mas.%, 96mas.%, 97mas.%, 98mas.%, ili 99mas.% ukupnog materijala u uzorku.

[0034] Određeni peptidi prema ovom pronalasku mogu takođe da budu u cikličnom obliku, tako da su Nor C-krajevi povezani glava-sa-repom. Takvi derivati peptida mogu imati poboljšanu stabilnost i bioraspoloživost u odnosu na neciklizovane peptide.

[0035] Primeri cikličnih peptida uključuju: ciklični UAG (1-14), ciklični UAG (1-18), ciklični UAG (17-28), ciklični UAG (6-13), ciklični UAG (8-13), ciklični UAG (8-12), ciklični UAG (8-11), ciklični UAG (9-12) i ciklični UAG (9-11).

[0036] U nekom drugom primeru izvođenja ovog pronalaska, fragment iz UAG je ciklični UAG (6-13) kao što je navedeno u SEQ ID NO: 25.

[0037] Postupci za ciklizaciju peptida dobro su poznati u tehnici a, na primer, mogu se postići formiranjem disulfidne veze između dve funkcionalne grupe bočnog lanca, formiranjem amidne ili estarske veze između jedne funkcionalne grupe bočnog lanca i α-amino ili karboksilne funkcije kičme, formiranjem amidne ili estarske veze između između dve funkcionalne grupe bočnog lanca, ili formiranjem amidne veze između α-amino i karboksilnih funkcija kičme. Ove reakcije ciklizacije tradicionalno se izvode pri visokom razblaženju u rastvoru. Ciklizacija obično se postiže dok je peptid vezan za smolu. Jedan od najčešćih puteva sinteze cikličnih peptida na čvrstom nosaču je vezivanje bočnog lanca aminokiseline za smolu. Upotrebom odgovarajućih strategija zaštite, C-i N-krajevi mogu da se selektivno deprotektuju i cikluju na smoli nakon sklapanja lanca. Ova strategija se veoma koristi, i kompatabilna je ili sa tert-butiloksikarbonil (Boc) ili 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) protokolima. Međutim, ovo je ograničeno na peptide koji sadrže odgovarajuću funkcionalnost bočnog lanca da se veže za čvrsti nosač. Brojni pristupi mogu da se koriste da bi se postigla efikasna sinteza cikličnih peptida. Jedna procedura za sintezu cikličnih peptida zasnovana je na ciklizaciji sa istovremenim odcepljivanjem od smole. Nakon što se odgovarajuća peptidna sekvenca sklopi sintezom u čvrstoj fazi na smoli ili se linearna sekvenca doda smoli, deprotektovana amino grupa može da reaguje sa njenom ankerišućom aktivnom vezom kako bi se proizveli zaštićeni ciklični peptidi. Uopšteno, krajnja faza deprotekcije potrebna je da bi se dobio ciljni ciklični peptid.

[0038] Laktamazacija, oblik ciklizacije, može se izvesti kako bi se formirao laktamski most upotrebom Fmoc sinteze, mogu se uvesti aminokiseline sa različitim zaštitnim grupama na bočnim lancima, kao što je, ali bez ograničenja, asparaginska kiselina (ili glutaminska) zaštićena sa alil estrom na beta estru (ili gama estar za glutaminsku kiselinu) i lizin zaštićen sa aliloksi karbamatom na N-ε. Na kraju sinteze, sa N-krajem peptida zaštićenim sa Fmoc, Boc ili nekom drugom zaštitnom grupom koja nije Alloc, alil i alloc zaštitne grupe asparaginske kiseline i lizina mogu da budu deprotektovane sa, na primer, paladijumom (0) praćeno ciklizacijaom upotrebom PyAOP (7-Azabenzotriazol-1-iloksitris(pirolidino) fosfonijumheksafluorofosfat) kako bi se proizveo laktamski most.

[0039] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, aminokiselina koja se ovde navodi odnosi se na L-oblik. Biće korišćene dobro poznate skraćenice u tehnici kako bi opisale aminokiseline, uključujući levorotirajuće aminokiseline (L-aminokiseline ili L ili L-oblik) i desnorotirajuće aminokiseline (D-aminokiseline ili D ili D-oblik), alanin (Ala ili A), arginin (Arg ili R), asparagin (Asn ili N), asparaginska kiselina (Asp ili D), cistein (Cys ili C), glutaminska kiselina (Glu ili E), glutamin (Gin ili Q), Glicin (Gly ili G), histidin (His ili H), izoleucin (Ile ili I), leucin (Leu ili L), lizin (Lys ili K), metionin (Met ili M), fenilalanin (Phe ili F), prolin (Pro ili P), serin (Ser ili S), treonin (Thr ili T), triptofan (Trp ili W), tirozin (Tyr ili Y) i valin (Val ili V). L-aminokiselinski ostatak unutar prirodne peptidne sekvence može biti promenjen u bilo koju od 20 L-aminokiselina koje se obično nalaze u proteinima ili bilo koju od odgovarajućih D-aminokiselina, retkih aminokiselina, kao što su, ali bez ograničenja, 4-hidroksiprolin ili hidroksilizin, ili neproteinska aminokiselina, kao što je P-alanin ili homoserin.

[0040] Određeni aspekti ovog pronalaska koriste UAG polinukleotide. Oni uključuju izolovane polinukleotide koji kodiraju UAG polipeptide, fragmente i analoge definisane u prijavi.

[0041] Kao što se ovde koristi, pojam "polinukleotid" odnosi se na molekul koji se sastoji od većeg broja dezoksiribonukleotida ili nukleozidnih podjedinica. Veza između nukleozidnih podjedinica može da se obezbedi fosfatima, fosfonatima, fosforamidatima, fosforotioatima, ili slično, ili nefosfatnim grupama kao što je poznato u tehnici, kao što su peptoid-tip veze korišćene u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNA). Vezujuće grupe mogu biti hiralne ili ahiralne. Oligonukleotidi ili polinukleotidi mogu biti u opsegu dužine od 2 nukleozidne podjedinice do nekoliko stotina ili hiljada nukleozidnih podjedinica. Dok su oligonukleotidi poželjno dužine 5 do 100 podjedinica, a poželjnije dužine 5 do 60 podjedinica, dužina polinukleotida može biti mnogo veća (npr., do 100). Polinukleotid može biti bilo koji od DNK i RNK. DNK može biti u bilo kom obliku genomske DNK, biblioteke genomske DNK, cDNK izvedene iz ćelije ili tkiva, i sintetičke DNK. Štaviše, ovaj pronalazak može, u određenim aspektima, da koristi vektore koji uključuju bakteriofag, plazmid, kozmid, ili fagemid.

[0042] Izrazi "biološka aktivnost" ili "biološko svojstvo", ili pojam "aktivnost" kada se odnose na polipeptide ovog pronalaska, ovde se koriste naizmenično i pdnose se na farmakološke, biološke ili ćelijske sposobnosti polipeptida ovog pronalaska i uključuju, ali nisu ograničeni na, kapacitet zamene UAG u biološkim funkcijama UAG kao što je opisano u ovoj prijavi, kao što su, ali bez ograničenja, modulacija AG; inhibicija AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg povišenog AG; smanjenje odnosa cirkulišućeg AG/UAG; smanjenje odnosa cirkulišućeg povišenog AG/UAG; ublažavanje simptoma indukovanih AG nivoima i/ili AG/UAG nivoima; olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa cirkulišućim AG i/ili odnosom cirkulišućeg AG/UAG i olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa povišenim cirkulišućim AG i/ili povišenim odnosom cirkulišućeg AG/UAG.

[0043] Dejstva UAG prethodno su se pokazala da su očuvana kod fragmenata UAG (6-13) (SEQ ID NO: 6), UAG (8-13) (SEQ ID NO: 7), UAG (8-12) (SEQ ID NO: 8), UAG (8-11) (SEQ ID NO: 12), UAG (9-12) (SEQ ID NO: 11) i UAG (9-11) (SEQ ID NO: 29). U.S. Patenti 8,222,217 i 8,318,664, pokazali su da ovi fragmenti zadržavaju aktivnost UAG pune dužine na metabolizme glukoze, insulina i lipida. Peptid sa inverznom sekvencom UAG (1-14) (SEQ ID NO: 3) i nazvanom UAG (14-1) (SEQ IDNO: 30) koristi se kao negativna kontrola u eksperimentima za testiranje UAG fragmenata. UAG (8-11) (SEQ ID NO: 10) je pokazao da je najmanji UAG fragment koji je zadržao UAG aktivnosti. Ovde obezbeđeni rezultati dalje ukazuju da UAG fragmenti, UAG (6-13) (SEQ ID NO: 6) i ciklični UAG (6-13) (SEQ ID NO: 25) zadržavaju sposobnost UAG da smanji AG nivoe i smanji AG/UAG odnos.

[0044] UAG, njegovi fragmenti i/ili analozi koriste se za smanjenje povišenih AG nivoa povezanih sa Prader-Willi sindromom (PWS). Ljudi koji boluju od PWS boluju od usporenog razvoja, ozbiljne gojaznosti i nezasitog apetita. Njihova glad je tako jaka da često zahteva strogu primenu dostupnosti hrani kako bi se sprečila rana smrt kao rezultat hiperfagije. AG koncentracije kod ovih subjekata su više od normalnih. Ova korelacija između hiperfagije i povišenih AG nivoa u skladu je sa poznatim oreksigenskim efektom AG. Ovde dati podaci demonstriraju da davanje UAG može da smanji povišene AG nivoe kod PWS subjekata. Fragmenti UAG ovog pronalaska mogu da se koriste da pomognu pacijentima sa Prader-Willi sindromom da se smanje njihovi nivoi grelina do normalnijih/zdravijih nivoa, da se obuzda njihov apetit, i/ili ublaže ostale manifestacije ovog poremećaja. Očekuje se da će se ovo smanjenje AG prevesti u smanjenje apetita i u kasnije smanjene mase masti povezane sa PWS.

[0045] Kao što se ovde koristi, pojam "hiperfagija" odnosi se na preteranu glad i abnormalno veliki unos čvrstih materija u usta. Stanja hiperfagije mogu da se jave u vezi sa, na primer, poremećajima centralnog nervnog sistema (CNS) uključujući gangliocitom treće komore, astrocitom hipotalamusa, Kleine-Levin sindrom, Froehlich-ov sindrom, Parkinsonovu bolest, genetičkim poremećajima uključujući Praeder-Willi sindrom, značajnim psihijatrijskim poremećajima uključujući anksioznost, značajan depresivni poremećaj, depresivnu fazu bipolarnog poremećaja, sezonski afektivni poremećaj, i šizofreniju, psihotropnim lekovima, uključujući delta-9 tetrahidrokanabinol, antidepresive i neuroleptike i poremećajima sna uključujući apneju u toku spavanja. Hiperfagija može da se javi kod psihijatrijskih poremećaja kao što je depresija, anksioznost i šizofrenija.

[0046] Kao što se ovde koristi, pojam "tretman" odnosi se i na terapeutske tretmane kao i na profilaktičke mere. Oni kojima je potreban tretman uključuju one koji već imaju poremećaj, bolest ili stanje kao i one kod kojih će se sprečiti bolest, poremećaj ili stanje. Oni kojima je potreban tretman su takođe oni kod kojih se javio poremećaj, bolest ili stanje i ostavili su posledice ili ožiljke. Tretman se takođe odnosi na davanje terapeutske supstance efikasne da poboljša ili ublaži, smanji simptome povezane sa nekom bolesti, nekim poremećajem ili nekim stanjem, da smanji ozbiljnost ili izleči bolest, poremećaj ili stanje, ili da spreči pojavu ili recidiv bolesti, poremećaja ili stanja.

[0047] Studije su demonstrirale stalno povećanje AG nivoa u plazmi do jedne godine nakon gubitka mase indukovanog dijetom kod gojaznih subjekata (Ref.28 i 29). Smanjenje povišenih AG nivoa kod ovih subjekata može tako da spreči povraćaj gojaznosti dok je subjekt na dijeti.

[0048] Za terapeutske i/ili farmaceutske upotrebe, polipeptidi kao što su definisani ovde mogu da se formulišu za, ali bez ograničenja, intravenozno, subkutano, transdermalno, topikalno, oralno, bukalno, sublingvalno, nazalno, inhalacijono, pulmonarno, ili parenteralno davanje prema uobičajenim postupcima. Intravenozna injekcija može biti putem bolusa ili infuzije tokom uobičajenog vremenskog perioda. Polipeptidi kao što su definisani ovde takođe mogu da se daju direktno u ciljno mesto kod subjekta npr., biolističnom isporukom u unutrašnje ili spoljašnje ciljno mesto ili putem katetera u mesto u arteriji.

[0049] U jednom primeru izvođenja, polipeptidi ovde definisani daju se kao bolus. Prema tome, u jednoj primeni ovog primera izvođenja, lek se daje kao bolus pre obroka, pri čemu bolus obuhvata efektivnu količinu UAG, njegovog fragmenta i/ili njegovog analoga njegove soli. Bolus može da se daje jedanput, dvaput, triput ili više puta dnevno ili može da se daje prema drugim doznim režimima.

[0050] Odgovarajući dozni režimi određuju se uzimanjem u obzir faktora dobro poznatih u tehnici kao što su, ali bez ograničenja, tip subjekta kom se daje doza, starost, masa, pol i zdravstveno stanje subjekta, put davanja, željeni efekat, itd.

[0051] Aktivni sastojci, kao što su polipeptidi ovde definisani, mogu da se daju oralno kao suspenzija i mogu da se pripreme prema tehnikama dobro poznatim u oblasti farmaceutske formulacije i mogu da sadrže, ali bez ograničenja na, mikrokristalnu celulozu za dobijanje mase, algininsku kiselinu ili natrijum alginat kao suspendujući agens, metilcelulozu kao poboljšivač viskoznosti, i zaslaćivače/agense za ukus. Kao tablete sa trenutnim oslobađanjem, ove kombinacije mogu da sadrže, ali bez ograničenja na, mikrokristalnu celulozu, dikalcijum fosfat, skrob, magnezijum stearat i laktozu i/ili ostale ekscipijense, veziva, dodatke, dezintegrante, razblaživače i lubrikante. Aktivni sastojci mogu da se daju putem sistema isporuke sa kontrolisanim oslobađanjem.

[0052] Davanje nazalnih aerosola ili inhalacijonih formulacija može da se pripremi, na primer, kao rastvori u slanom rastvoru, korišćenjem benzil alkohola ili drugih pogodnih konzervanasa, promotera apsorpcije kako bi se poboljšala bioraspoloživost, korišćenjem fluorougljenika, i/ili korišćenjem ostalih agenasa za rastvaranje ili dispergovanje.

[0053] Polipeptidi ovog pronalaska mogu da se daju u intravenoznom (i bolus i infuzija), intraperitonealnom, subkutanom, topikalnom sa ili bez okluzije, ili intramuskularnom obliku. Kada se daju injekcijom, injektibilni rastvor ili suspenzija može da se formuliše upotrebom pogodnih netoksičnih, parenteralno prihvatljivih razblaživača ili rastvarača, dobro poznatih u tehnici.

[0054] Polipeptidi ovog pronalaska takođe mogu da se formulišu za topikalno davanje. Pojam "topikalni" kao što se ovde koristi uključuje bilo koji put davanja koji omogućava da jedinjenja prekriju kožu ili mukozna tkiva.

[0055] Formulacija pogodna za topikalnu primenu može biti u obliku, na primer, kreme, losiona, rastvora, gela, masti, paste, melema, boje, bioadheziva, ili slično, i/ili može da se pripremi tako da sadrži lipozome, micele, mikročestice i/ili mikrosfere. Formulacija može biti vodena, tj., da sadrži vodu, ili može biti nevodena i opciono da se koristi u kombinaciji sa okluzivnim slojem tako da se vlaga koja isparava sa površine tela održava unutar formulacije usled primene na površinu tela i nakon toga.

[0056] Masti, kao što je dobro poznato u oblasti farmaceutske formulacije, su polučvrsti preparati koji su obično na bazi vazelina ili drugih derivata vazelina.

[0057] Formulacije se takođe mogu pripremiti sa lipozomima, micelama, mikročesticama i/ili mikrosferama. Lipozomi su mikroskopske vezikule koje imaju lipidni zid koji obuhvata lipidni dvostruki sloj, i može da se koristi kao sistemi za dostavu leka. Poznato je u tehnici da se micel sastoje od molekula surfaktanta raspoređenih tako da njihove polarne prednje grupe formiraju spoljašnji sferični omotač, dok su hidrofobni, ugljovodonični lanci orijentisani ka centru sfere, formirajući jezgro.

Mikročestice su čestični noseći sistemi u opsegu mikronskih veličina, normalno pripremljene sa polimerima, koje mogu da se koriste kao sistemi isporuke za lekove ili vakcine koje su obično zarobljene unutar čestica. Mikrosfere, slično, mogu da se inkorporiraju u postojeće formulacije i sisteme za isporuku leka. Poput lipozoma i micela, mikrosfere suštinski obuhvataju lek ili formulaciju koja sadrži lek. Mikrosfere su uopšteno, iako ne nužno, formirane od sintetičkih polimera ili biokompatiblnih polimera koji se javljaju u prirodi, ali takođe mogu da se sastoje od naelektrisanih lipida kao što su fosfolipidi.

[0058] Preparati formulacija pogodni za topikalno davanje dobro su poznati u tehnici i opisani u relevantnim tekstovima i literaturi.

[0059] Uopšteno, farmaceutske kombinacije obuhvataće najmanje jedan od polipeptida ovog pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem koji će biti dobro poznat prosečnim stručnjacima u tehnici. Kombinacije mogu dalje da obuhvataju, na primer, jedan ili više pogodnih ekscipijenasa, razblaživača, punioca, sredstava za rastvaranje, konzervanasa, nosača, soli, puferujućih agenasa i ostalih materijala koji su dobro poznati u tehnici u zavisnosti od korišćenog doznog oblika. Postupci kombinacija dobro su poznati u tehnici.

[0060] U ovom kontekstu, izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" označava bilo koji materijal, koji je inertan u smislu da suštinski nema bilo kakav terapeutski i/ili profilaktički efekat per se i da je netoksičan. Farmaceutski prihvatljiv nosač može da se doda polipeptidima ovog pronalaska sa svrhom da omogući da se dobije farmaceutska kombinacija, koja ima prihvatljiva tehnička svojstva. Primeri tih nosača uključuju jonoizmenjivače, aluminu, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što su humani serumski albumin, puferujuće supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, mešavine parcijalnih glicerida zasićenih biljnih masnih kiselina, voda, soli, ili elektroliti kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidalni silicijumdioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, i PEG.

[0061] Nosači za topikalne oblike ili oblike na bazi gela polipeptida uključuju polisaharide kao što su natrijum karboksimetilceluloza ili metilceluloza, polivinilpirolidon, poliakrilati, polioksietilenpolioksipropilen-blok polimeri, PEG, i alkoholi voštanog drveća.

[0062] Polipeptidi korišćeni za in vivo davanje moraju biti sterilni. Ovo se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane, pre ili nakon liofilizacije i rekonstrukcije. Polipeptidi će se obično čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Terapeutske kombinacije polipeptida uopšteno se stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni port, na primer, vrećica sa intravenoznim rastvorom ili fiolica koja ima čep koji može da se probuši hipodermskom injekcionom iglom.

[0063] Fragmenti iz UAG ovog pronalaska mogu da se koriste u nekom predmetu proizvodnje ili komercijalnoj ambalaži ili kompletu, koji obuhvata: kontejner, nalepnicu na kontejneru i kombinaciju koja obuhvata polipeptide ovog pronalaska kao aktivni agens unutar kontejnera kada se koristi na naznačenom nivou, pri čemu je kombinacija efektivna za, inter alia, modulaciju AG; inhibiciju AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg povišenog AG; smanjenje odnosa cirkulišućeg AG/UAG; smanjenje odnosa cirkulišućeg povišenog AG/UAG; ublažavanje simptoma indukovanih AG nivoima i/ili AG/UAG nivoima; olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa cirkulišućim AG i/ili odnosom cirkulišućeg AG/UAG i/ili olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa povišenim cirkulišućim AG i/ili povišenim odnosom cirkulišućeg AG/UAG.

[0064] "Efektivna količina" ili "terapeutski efektivna količina" odnosi se na količinu efektivnu, u dozama i za potrebne vremenske periode, kako bi se postigao željeni terapeutski rezultat. Terapeutska efektivna količina peptida navedena ovde može da varira prema faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol, i masa pojedinca, i sposobnost jedinjenja da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Dozni režimi mogu da se podese kako bi se obezbedio optimalni terapeutski odgovor. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj se bilo koji toksični ili štetni efekti jedinjenja nadmašuju terapeutski korisnim efektima. "Profilaktički korisna količina" odnosi se na količinu efektivnu, u dozama i za potrebne vremenske periode, kako bi se postigao željeni profilaktički rezultat, kao što je modulacija AG; inhibicija AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg povišenog AG; smanjenje odnosa cirkulišućeg AG/UAG; smanjenje odnosa cirkulišućeg povišenog AG/UAG; ublažavanje simptoma indukovanih AG nivoima i/ili AG/UAG nivoima; olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa cirkulišućim AG i/ili odnosom cirkulišućeg AG/UAG i/ili olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa povišenim cirkulišućim AG i/ili povišenim odnosom cirkulišućeg AG/UAG. Profilaktička efektivna količina može da se odredi kao što je prethodno opisano za terapeutski efektivnu količinu. Za bilo kog posebnog subjekta, specifični dozni režimi mogu se podesiti tokom vremena prema potrebi pojedinca i profesionalnom mišljenju osobe koja daje ili nadgleda davanje kombinacija.

[0065] Na primer, terapeutski efektivna količina ili efektivna doza peptida ovog pronalaska (ovde se takođe naziva "aktivno jedinjenje") je količina dovoljna za modulaciju AG; inhibiciju AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg AG; smanjenje nivoa cirkulišućeg povišenog AG; smanjenje odnosa cirkulišućeg AG/UAG; smanjenje odnosa cirkulišućeg povišenog AG/UAG; ublažavanje simptoma indukovanih AG nivoima i/ili AG/UAG nivoima; olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa cirkulišućim AG i/ili odnosom cirkulišućeg AG/UAG i/ili olakšavanje, sprečavanje i/ili lečenje stanja povezanih sa cirkulišućim AG i/ili povišenim odnosom cirkulišućeg AG/UAG. Postupci i/ili testovi za merenje tih parametara poznati su prosečnim stručnjacima u tehnici.

[0066] Terapeutski efektivna količina ovog pronalaska uopšteno će varirati od oko 0,001 µg/kg do oko 10 mg/kg, određenije od oko 0,01 µg/kg do oko 10 mg/kg, a još određenije od oko 1 µg/kg do oko 1 mg/kg. Terapeutski efektivne količine ili efektivne doze koje su izvan ovog opsega ali koje imaju željeni terapeutski efekat takođe su obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0067] U jednom primeru izvođenja, subjekt pomenut gore je sisar, u daljem aspektu, čovek.

[0068] U daljem primeru izvođenja, predstavljeni polipeptidi mogu da se daju u kombinaciji sa dodatnim farmakološkim aktivnim supstancama ili mogu da se daju u kombinaciji sa drugim terapeutskim postupkom. Kombinacija može da bude u obliku sistema komplet-u-delu, pri čemu kombinovane aktivne supstance mogu da se koriste za istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno davanje.

iii) AG nivoi i AG/UAG odnos kao biomarkeri

[0069] Prema drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu nivoa cirkulišućeg AG i upotrebu odnosa cirkulišućeg AG/UAG kao biomarkera za identifikaciju subjekata koji boluju od Prader Willi sindroma koji će verovatno da reaguju na i/ili imaju koristi od tretmana koji obuhvata davanje terapeutski efektivne količine UAG, nekog njegovog fragmenta i/ili nekog njegovog analoga.

[0070] U jednoj primeni ovog primera izvođenja, nivoi cirkulišućeg AG i/ili odnos cirkulišućeg AG/UAG mere se u uzorku krvi dobijenom od subjekta prema poznatim postupcima u tehnici. Nivo cirkulišućeg AG i/ili odnosa cirkulišućeg AG/UAG zatim se delimično obrađuju zavisno od reference cirkulišućih nivoa AG i reference odnosa cirkulišućeg AG/UAG (dobijeni, na primer, od samog subjekta ili od populacije kontrolnih subjekata) tako da se dobija informacija koja saopštava da li subjekt ima abnormalni nivo cirkulišućeg AG (tj., ispod ili iznad normalnog ili zdravog nivoa) i/ili abnormalni odnos cirkulišućeg AG/UAG (tj., ispod ili iznad normalnog ili zdravog odnosa). Informacija koja saopštava da subjekt ima povišeni nivo cirkulišućeg AG i/ili povišeni odnos cirkulišućeg AG/UAG ukazuje da će subjekt verovatno da reaguje na davanje UAG, nekog njegovog fragmenta ili nekog njegovog analoga. Davanje UAG, nekog njegovog fragmenta ili nekog njegovog analoga takvom subjektu verovatno će smanjiti nivoe cirkulišućeg AG i/ili odnos cirkulišućeg AG/UAG kao i da smanji efekte povezane sa povišenim nivoima cirkulišućeg AG i povišenim odnosom cirkulišućeg AG/UAG.

[0071] U nekoj drugoj primeni ovog primera izvođenja, biomarkeri mogu da se koriste za identifikovanje subjekata unutar populacije subjekata koji će verovatno da reaguju na i/ili imaju koristi od davanja terapeutski efektivne količine UAG fragmenta. U ovoj primeni, subjekti populacije pate od Prader-Willi sindroma (PWS).

EKSPERIMENTI I ANALIZA PODATAKA

[0072] Podaci ovde predstavljeni izveštavaju o snažnom suzbijajućem efektu UAG na serumske AG nivoe i na odnos serumog AG/UAG kod T2DM subjekata.

[0073] Kontinuirana prekonoćna (15 sati) infuzija dve doze UAG (3 µg UAG/kg/h i 10 µg UAG/kg/h) versus placebo u modelu prelaza na AG koncentracije izvedena je kod osam subjekata sa prekomernom masom sa dijabetesom tipa 2. Fig.1 pokazuje šematski prikaz protokola studije. Glukozni i insulinski odgovori na standardni obrok za doručak (SBM) kod subjekata i razumna metabolička kontrola su ocenjeni. Tokom infuzija sa UAG, subjekti nisu prijavili više nuspojva od placebo. Laboratorijske procene nisu pokazale značajne promene u hemiji ili parametrima i nuspojave nisu bile dozno zavisne.

Infuzija UAG smanjuje nivoe AG u plazmi

[0074] Podaci prikazani na Fig.2A i 2B pokazuju promene nivoa serumskog AG (Fig.2A) i UAG nivoe (Fig. 2B) pre i posle SBM. Pre iniciranja SBM, AG nivoi značajno su smanjeni od 21,01 ± 8,9 pg/ml (srednja vrednost ± SD) tokom placebo infuzije do 3,0 ± 6,7 pg/ml u prisustvu 3 mcg/kg.h UAG infuzije i do 1,4 ± 3,2 pg/ml u prisustvu 10 mcg/kg.h UAG infuzije. AG nivoi takođe su smanjeni nakon SMB od 14,03 ± 9,4 pg/ml u placebo na 0,8 ± 1,8 pg/ml u prisustvu 3 mcg/kg.h UAG infuzije i na 0,8 ± 1,8 pg/ml u prisustvu 10 mcg/kg.h UAG infuzije (Fig.2A). Paralelno, prekonoćna infuzija UAG rezultovala je povećanjem UAG nivoa (Fig.2B). UAG nivoi povećani su od 105,9 ± 31,4 (srednja vrednost ± SD) pg/ml u placebo infuziji i pre početka SBM do 10998 ± 2623 pg/ml u prisustvu 3 mcg/kg.h UAG infuzije i do 12085 ± 1616 pg/ml u prisustvu 10 mcg/kg.h UAG infuzije. Ovi rezultati ukazuju da davanje UAG smanjuje serumske AG nivoe kod T2DM subjekata.

Infuzija UAG fragmenta suzbija AG-indukovani unos hrane

[0075] Ciklizovan fragment iz UAG, naime ciklični UAG (6-13) kao što je naveden u SEQ ID NO: 25, mogao je da suzbije oreksigenske efekte indukovane od strane AG kod pacova (Fig.8). Ovi rezultati demonstrirali su da UAG fragmenti kako su ovde definisani koji zadržavaju sekvencu jezgra odgovornu za UAG-povezana delovanja/aktivnosti takođe zadržavaju nihove efekte na AG nivoe. Kao što je opisano gore, postoji korist inhibicije efekta AG ili njegovih nivoa (npr. smanjenje konzumiranja hrane) kod određenih subjekata. Ovi rezultati demonstriraju korisnu ulogu UAG u lečenju pacijenata sa Prader Willi sindromom, kod kojih povišeni AG nivoi povezani sa hiperfagijom. Inhibicija AG nivoa i/ili bioloških efekata prema tome će da rezultuje smanjenjem apetita i/ili konzumiranja hrane.

Infuzija UAG smanjuje nivoe glukoze u plazmi nakon obroka

[0076] Prekonoćna infuzija UAG značajno smanjuje nivoe glukoze nakon obroka kao što je ocenjeno iPro kontinuiranim praćenjem glukoze (Fig.3A i 3B). Oblast ispod krivih smanjila se od 1618 mmol/3h za infuziju placebo na 1601 mmol/3 h i 1540 mmol/3 h za infuzije UAG od 3 i 10 mcg, respektivno. Fig.4A i 4B prikazuju rezultate dobijene kao promene od osnovne linije glukoze pred-SBM. Oblast ispod krivih smanjila se za doze infuzija UAG od 3 i 10 mcg kada se uporedi sa placebo. Fig.5A i 5B ukazuju na smanjenje pika glukoze u plazmi nakon SBM kada se UAG daje. Ukupno smanjenje pikova glukoze u plazmi nakon obroka može da se primeti kod subjekata (Fig.5B). Sveukupno, ovi podaci ukazuju da davanje UAG smanjuje nivoe glukoze u plazmi nakon obroka kod subjekata sa T2DM.

UAG-indukovano smanjenje nivoa AG u plazmi i AG/UAG odnosa povezano sa smanjenjem nivoa glukoze

[0077] Pronalazači su mogli da pokažu postojanje korelacije između AG nivoa pri gladovanju i/ili UAG nivoa i glikemijskog odgovora nakon UAG davanja upotrebom standardnog testa glukokinaza. Dalje, kako bi se demonstrirala takva korelacija, Fig.6A pokazuje da što su povišeniji nivoi AG pri gladovanju, najbolji je hipoglikemijski efekat UAG davanja. Fig.6B takođe prikazuje istu korelaciju i efekat upotrebom iPro kontinuiranih merenja glukoze. Odnos AG/UAG pri gladovanju takođe je u vezi sa glikemijskim odgovorom nakon UAG davanja (Fig.6C). Viši AG/AUG odnosi u korelaciji su sa najboljim hipoglikemijskim efektom UAG infuzije upotrebom iPro kontinuiranih merenja glukoze.

Infuzija UAG poboljšava insulinsku osetljivost

[0078] Insulinska osetljivost kod T2DM subjekata ocenjena je upotrebom protokola hiperinsulinskog euglikemijskog klampa kao što je prikazano na Fig.7A. Kod pacijenata koji su primili efektivni euglikemijski insulinski klamp na početku 2,5 h placebo/UAG infuzije, promena M-indeksa od osnovne linije povećala se za 36% u UAG vs. placebo grupi (p=0,02) (Fig.7B). Ovi rezultati demonstriraju da UAG infuzija poboljšava otpornost na insulin kod T2DM subjekata.

Kraća UAG infuzija je dovoljna da se smanje nivoi AG u plazmi

[0079] AG nivoi izmereni su kod T2DM subjekata pre UAG infuzije i nakon UAG infuzije od 2,5 sata. Podaci prikazani na Fig.7C prikazuju da je skraćeni period UAG infuzije bio dovoljan da se smanje nivoi AG u plazmi. Fig.7D ukazuje na promene AG nivoa od osnovne linije što demonstrira da je kratak period UAG infuzije dovoljan da se smanje nivoi AG u plazmi.

[0080] Ovi podaci ukazuju, inter alia, da davanje UAG poboljšava nivoe glukoze tokom SBM smanjenjem AG. Značajno smanjenje pik nivoa glukoze nakon obroka takođe je primećeno. Nije primećena značajna promena nivoa serumskog insulina tokom infuzije male i velike doze UAG infuzija (podaci nisu prikazani), što ukazuje da je poboljšana glikemijska kontrola u korelaciji sa poboljšanom insulinskom osetljivošću. Podaci takođe pokazuju da davanje UAG poboljšava hiperglikemiju na način zavisno od koncentracije grelina što čini UAG hipoglikemijske efekte snažnijim pri višim AG nivoima ili pri višem AG/UAG odnosu.

[0081] Ovi rezultati su prvi pokazatelji da je UAG potentni inhibitor nivoa grelina što čini UAG snažnim kandidatom za razvoj inhibitora grelina u lečenju metaboličkih poremećaja.

MATERIJALI I TEHNIČKI PROTOKOLI

[0082] Dizajn studije – jedan centar, pokrenuta od strane istraživača, dvostruko slepa i placebo kontrolisana randomizirana studija. Tokom prve posete istorija bolesti, upotreba lekova i vitalni znaci subjekata su provereni. Uzorci krvi takođe su uzeti za hemijsku i hematološku analizu. Studija koja se sastoji od tri runde hospitalizacije (poseta 2, 3 i 4) od dva dana svaka.

[0083] Prvi dan je počeo približno u 15:00 i nastavio se do 14:00 sledećeg dana. Osam subjekata podeljeno je u 3 grupe za studiju. Doze korišćene tokom ovih rundi bile su ili 3 mcg/kg.h UAG, 10 mcg/kg.h UAG ili placebo/slani rastvor pripremljene od strane bolničkog farmaceuta i dostavljene u 3 vrećice za svakog subjekta. Nijedan subjekt i nijedan istraživač nisu bili svesni leka datog u ovim rundama. Period ispiranja od jedne nedelje izveden je između perioda tretmana.

[0084] Pre, tokom i nakon studije, uzorci krvi uzeti su za, AG, UAG, hemiju, hematologiju i CAC ćelije. Uzorci krvi za glukozu takođe su uzeti putem i.v katetera. Za kontinuirano praćenje glukoze Continuous Glucose monitor (iPro2, Medtronic trading, Holandija) stavljen je u stomak subjekata. Masa i krvni pritisak mereni su tokom svake posete. Period ispiranja od najmanje 1 nedelje izveden je između perioda tretmana.

[0085] Subjekti – Osam subjekata je uključeno (2 žene i 6 muškaraca; prosečne starosti od 53 godina (u opsegu od 31-65 godina starosti) sa srednjim indeksom telesne mase (BMI) od 31,5 kg/m<2>, opseg 26-36 kg/m<2>. Sedam od osam subjekata koristilo je metformin svakodnevno. Kod svih subjekata dijagnostifikovan je dijabetes tipa 2 najmanje 3 meseca pre upisa. Monoterapija metformina za najmanje 3 meseca pre skrininga bila je dozvoljena, ali tretman metforminom prekinut je 1 dan pre početka svakog perioda tretmana. U populaciji srednji nivo glikozilovanog hemoglobina (HbA1c) bio je 52 mmol/mol u opsegu od 48 mmol/mol do 57 mmol/mol (6,9%; opseg 6,5-7,4%).) i indeks telesne mase bio je iznad 25 kg/m<2>. Kriterijumi isključivanja sastojali su se od istorije ili prisustva dugotrajnih komplikacija dijabetesa tipa 2; klinički značajnih abnormalnosti u laboratorijskoj evaluaciji pri skriningu, i upotrebi sistemskih kortikosteroida u okviru 60 dana pre skrininga. Pre infuzije, subjekti su primili dva prebivajuća katetera: prvi kateter umetnut je pre tretmana; a drugi kateter umetnut je pre SBM za uzorkovanje krvi. Drugi kateter je održavao patent sporom infuzijom izotoničnog slanog

rastvora. Ispitivani lek - UAG korišćen u ovoj studiji proizveden je od strane Bachem AG, Hauptstrasse 144, Bubendorf CH-4416, Švajcarska. UAG je isporučen kao liofilizovani prašak (fiolice koje sadrže 5 mg leka) i čuvan u lokalnoj apoteci prema specifikacijama proizvođača.

[0086] Procedure studije – Infuzije su izvedene u lokalnoj kliničkoj istraživačkoj jedinici za 15 sati od 9 posle podne do 12 pre podne. Svaka zapremina UAG rastvora je filtrirana i razblažena u 0,9% slanom rastvoru kako bi se dobila odgovarajuća doza za davanje. Placebo se sastojao od 0,9% slanog rastvora. Doza je izračunata na osnovu mase subjekta. Svaka fiolica je rekonstituisana sa 5 ml vode za injekciju, filtrirana kroz filter od 0,22 µm. Doza je zatim injektirana u vrećici od 500 ml sa 0,9% NaCl. Tri vrećice su pripremljene kako bi se osigurala kontinuirana 15-časovna infuzija sa 100 ml/sat.

[0087] Standardni obrok za doručak (SBM) sastoji se od:

● 3 parčeta pšeničnog hleba;

● 3 porcije margarina;

● 2 parčeta sira (48 % masti);

● 1 porcijom džema;

● 1 šoljom punomasnog mleka; i

● 1 kuvanog jajeta;

za ukupno 714 kcal (17% proteina; 46 % masti; i 37 % ugljenih hidrata). SBM je konzumiran u okviru 15 minuta, od 8:00 pre podne do 8:15 pre podne. Pri svakoj od 3 posete, sledeći bezbednosni parametri su ispitivani: hemoglobin, hematokrit, broj trombocita, WBC broj, RBC broj, i diferencijalni i određeni su upotrebom Sysmex XE 2100, Firma Sysmex, Ecustraat 11, 4879 NP Etten-Leur. AST, ALT, alkalina fosfataza, ukupni bilirubin, kreatin fofokinaza (CPK), laktat dehidrogenaza (LDH), kreatinin, urea, amilaza, lipaza, urinska kiselina, glukoza, holesterol, LDL, HDL, trigliceridi, natrijum, kalijum, kalcijum, hlorid, protein i albumin određeni su upotrebom Hitachi Modular P800, Roche Transistorstraat 41, 1332 CK Almere. Nivoi glukoze u krvi izmereni su upotrebom sredstva za kontinuirano praćenje glukoze (Medtronic CGMS iPro™ Continuous Glucose Recorder, Medtronic; Holandija) koji je subkutano umetnut za ceo period tretmana. Nivoi glukoze u serumu (upotrebom internog testa glukokinaze) takođe su ispitivani svakih 30 minuta a započeti pre, i nastavljeni 4 sata nakon, SBM. Tokom CGMS, svi subjekti morali su da izvedu najmanje četiri kapilarna glikemijska testa po danu. Prikupljeni podaci ušli su u CGMS monitor kako bi se dobili koeficijenti korelacije između SMBG i CGMS vrednosti. Svi SMBG testovi izvedeni su upotrebom digitalnog glukometra (Contour, Bayer). AG i UAG nivoi ispitani su pre početka prekonoćne infuzije, 10 minuta pre početka i 30 minuta nakon SBM. Kako bi se očuvalo acilovanje grelina, uzorci krvi prikupljeni su direktno u EDTA epruvete, zatim u okviru 2 minuta 1 ml EDTA-krvi dodat je u 1 ml rastvora za konzerviranje na ledu (0,0295 N HCI koji sadrži 72 mM NaCl, 58 mM NaF, 4 mM 4-(2-aminoetil) benzensulfonil fluorid hidrohlorida (u vodi rastvorljiv, nepovratni inhibitor serin proteaze; AEBSF), pH 3,0, 295 mOsm/KgPlazma pripremljeno je centrifugiranjem na 4°C, zatim je 1 ml zakišeljen sa 100 µl 1N HCl i čuvan na - 80°C do izvođenja testova.

[0088] Za testiranje grelina koristile su se MSD ELISA ploče sa 96 bazenčića (Meso Scale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD, SAD) obložene inkubacijom sa 30 µl/bazenčić antitela za hvatanje (D4 razblažen do 1 µg/ml u PBS; anti-C-terminalni grelin (Gutierrez et al.2008 PNAS 105:6320-6325)), preko noći na sobnoj temperaturi. Antitelo za hvatanje uklonjeno je i bazenčići su blokirani sa 150 µl kazeinskog pufera (Pierce) tokom 1 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Standardi za AG i UAG pripremljeni su upotrebom osam 4x serijskih razblaženja u kazeinskom puferu počevši sa 8 ng/ml i 30 ng/ml, respektivno. Konzervirana plazma razblažena je 1:1 u kazeinskom puferu. Posebne ploče korišćene su za detekciju AG i UAG. Standardi i uzorci (25 µl/bazenčić) napunjeni su na obložene ELISA ploče, i inkubirani na sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 2 sata, isprani 3x sa PBS-T (150 µl/bazenčić). C2-4a1 i E8 detekciona antitela (N-terminalni AG i N-terminalni UAG, respektivno) su sulfoobeležena upotrebom standardnog protokola iz MSD. Zatim su razblažena 1:10000 u 0,2X kazeinu/0,05% Tween 20 i dodata pločama sa AG ili UAG, respektivno, sa 25 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 1 sata uz mućkanje. Ploče su isprane tri puta sa PBS-T (150 µl/bazenčić). Konačno, 150 µl 1X pufer za očitavanje (MSD) dodat je svakom bazenčiću, i ploče su odmah očitane na MSD Sector Imager 6000. AG i UAG vrednosti za uzorke izračunate su interpolacijom iz njihovih respektivnih standardnih krivih upotrebom Sector Imager softvera.

[0089] Studija klamp - Randomizirana 2-perioda, 2-tretmana, dvostruko slepa studija infuzije UAG vs. nosač, pri čemu je ocenjena jedna doza (10 µg/kg/h) UAG datog kontinuiranom iv infuzijom tokom 2,5 h. Kod pacijenata koji su primili efektivni euglikemijski insulinski klamp na početku placebo/UAG infuzije od 2,5 h.

[0090] Statističke analize – Analize podataka izvedene su sa Graph Pad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA 92037 SAD). Rezultati su dati kao srednje vrednosti (±SE). Poređenja su izračunata upotrebom Bonferroni-jevih višestrukih poređenja, Vilkoksonovog testa ekvivalentnih parova ranga sa znakom i ANOVA analiza.

[0091] U odnosu na eksperimentalne podatke predstavljene na Fig.8, Sprague-Dawley pacovi 7 nedelja stari, mase između 275g i 300g, hranjeni su pelet hranom ad libitum i bili su pojedinačno smešteni u plastični kavez. Eksperiment je izveden 2,5 h nakon početka svetlosnog ciklusa kod pacova koji su se slobodno hranili. Količine su i.p. injektirane istovremeno sa nosačem plus nosač, nosač AG (13 µg/kg) ili ciklizovan UAG (6-13) (SEQ ID NO: 25) (42 µg/kg) AG (13 µg/kg). Odmah nakon završetka i.p. injekcije kod pacova, noćna-ad-libitum hrana uklonjena je i zamenjena 2 peletima za svaku životinju, prethodno izmerena, stavljena u gornji deo kaveza. Unos hrane je izračunat kao razlika između mase hrane pre i posle perioda hranjenja u svakom vremenskom intervalu (30 min, 1h, i 2h). Kumulativni unos hrane je izračunat sabiranjem vrednosti različitih vremenskih perioda.

[0092] Dok je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim primerima izvođenja, podrazumeva se da mogu da se izvedu dalje modifikacije i ova prijava namenjena je da pokrije bilo koje varijacije, upotrebe, ili adaptacije ovog pronalaska prema, uopšteno, principima ovog pronalaska i uključujući takva odstupanja od ovog opisa kao što dolaze unutar poznate ili uobičajene prakse u okviru tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada i kao može da se primeni na osnovne karakteristike prethodno navedene ovde, i kako sledi u obimu priloženih patentnih zahteva.

LISTA REFERENCI

[0093]

1. Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H and. Kangawa K; Ghrelin is a growthhormone-releasing acylated peptide from stomach, Nature 402:656-660 (1999).

2. Gnanapavan S, Kola B, Bustin SA, Morris DG, McGee P, Fairclough P, Bhattacharya S, Carpenter R, Grossman AB and Korbonits M; The tissue distribution of the mRNA of ghrelin and subtypes of its receptor, GHS-R, in humans, J. Clin. Endocrinol. Metab.87:2988-2991 (2002).

3. Howard AD, Feighner SD, Cully DF, Arena JP, Liberator PL, Rosenblum CI, Hamelin M, Hreniuk DL, Palyha OC, Anderson J, Paress PS, Diaz C, Chou M, Liu KK, McKee K-K, Pong S-S, Chaung L-Y, Elbrecht A, Dashkevicz M, Heavens R, Rigby M, Sirinathsinghji D, Dean DC, Melillo DG, Patchett AA, Nargund R, Griffin PR, DeMartino JA, Gupta SK, Schaeffer JA, Smith RG, Van der Ploeg LHT; A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release. Science 273:974-977 (1996).

4. Ariyasu H, Takaya K, Tagami T, Ogawa Y, Hosoda K, Akamizu T, Suda M, Koh T, Natsui K, Toyooka S, Shirakami G, Usui T, Shimatsu A, Doi K, Hosoda H, Kojima M, Kangawa K, Nakao K.; Stomach is a major source of circulating ghrelin, and feeding state determines plasma ghrelinlike immunoreactivity levels in humans. J Clin Endocrinol Metab. Oct;86(10):4753-8 (2001)

5. Date Y, Murakami N, Toshinai K, Matsukura S, Niijima A, Matsuo H, Kangawa K, Nakazato M. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology 123(4):1120-1128, 2002.

6. Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K. Ghrelin is a growthhormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 402(6762):656-660, 1999.

7. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature 407(6806):908-913, 2000.

8. Broglio F, Gianotti L, Destefanis S, Fassino S, Abbate Daga G, Mondelli V, Lanfranco F, Gottero C, Gauna C, Hofland L, Van Der Lely AJ, Ghigo E. The endocrine response to acute ghrelin administration is blunted in patients with anorexia nervosa, a ghrelin hypersecretory state. Clin Endocrinol (Oxf) 60(5):592-599, 2004.

9. Tong J, Prigeon RL, Davis HW, Bidlingmaier M, Kahn SE, Cummings DE, Tschöp MH, D'Alessio D. Ghrelin suppresses glucose-stimulated insulin secretion and deteriorates glucose tolerance in healthy humans. Diabetes Sep;59(9):2145-51 (2010).

10. Cummings DE, Clement K, Purnell JQ, Vaisse C, Foster KE, Frayo RS, Schwartz MW, Basdevant A, Weigle DS. Elevated plasma ghrelin levels in Prader Willi syndrome. Nat Med 8(7):643-644 (2002).

11. Haqq AMF, Farooqi IS, O'Rahilly S, Stadler DD, Rosenfeld RG, Pratt KL, Lafranchi SH, Purnell JQ. Serum ghrelin levels are inversely correlated with body mass index, age, and insulin concentrations in normal children and are markedly increased in Prader-Willi syndrome. J Clin Endocrinol Metab 88(1):174-178 (2003).

12. Mifune H, Nishi Y, Tajiri Y, Masuyama T, Hosoda H, Kangawa K, Kojima M. Increased production of active ghrelin is relevant to hyperphagia in nonobese spontaneously diabetic Torii rats. Metabolism.2011 Oct 14. [Epub ahead of print]

13. Misra M, Miller KK, Kuo K, Griffin K, Stewart V, Hunter E, Herzog DB, Klibanski A. Secretory dynamics of ghrelin in adolescent girls with anorexia nervosa and healthy adolescents. Am J Physiol Endocrinol Metab 289(2):E347-E356 (2005).

14. Nikolopoulos D, Theocharis S, Kouraklis G. Ghrelin: a potential therapeutic target for cancer. Regul Pept 163(1-3):7-17 (2010).

15. van der Lely AJ, Tschop M, Heiman ML, Ghigo E; Biological, physiological, pathophysiological, and pharmacological aspects of ghrelin. Endocr Rev 25:426-457 (2004).

16. Asakawa A, Inui A, Fujimiya M, Sakamaki R, Shinfuku N, Ueta Y, Meguid MM, Kasuga M. Stomach regulates energy balance via acylated ghrelin and desacyl ghrelin. Gut. Jan;54(1):18-24 (2005).

17. Zhang W, Chai B, Li JY, Wang H, Mulholland MW. Effect of des-acyl ghrelin on adiposity and glucose metabolism. Endocrinology. Sep;149(9):4710-6. (2008)

18. Broglio F, Gottero C, Prodam F, Gauna C, Muccioli G, Papotti M, Abribat T, Van Der Lely AJ, Ghigo E. Non-acylated ghrelin counteracts the metabolic but not the neuroendocrine response to acylated ghrelin in humans. J Clin Endocrinol Metab. Jun;89(6):3062-5 (2004).

19. Gauna C, Meyler FM, Janssen JA, Delhanty PJ, Abribat T, van Koetsveld P, Hofland LJ, Broglio F, Ghigo E, van der Lely AJ. Administration of acylated ghrelin reduces insulin sensitivity, whereas the combination of acylated plus unacylated ghrelin strongly improves insulin sensitivity. J Clin Endocrinol Metab. Oct;89(10):5035-42 (2004).

20. St-Pierre DH, Karelis AD, Coderre L, Malita F, Fontaine J, Mignault D, Brochu M, Bastard JP, Cianflone K, Doucet E, Imbeault P, Rabasa-Lhoret R. Association of acylated and nonacylated ghrelin with insulin sensitivity in overweight and obese postmenopausal women. J Clin Endocrinol Metab. Jan;92(1):264-9 (2007).

21. Pacifico L, Poggiogalle E, Costantino F, Anania C, Ferraro F, Chiarelli F, Chiesa. Acylated and nonacylated ghrelin levels and their associations with insulin resistance in obese and normal weight children with metabolic syndrome. Eur J Endocrinol. Dec;161(6):861-70 (2009).

22. Barazzoni R, Zanetti M, Ferreira C, Vinci P, Pirulli A, Mucci M, Dore F, Fonda M, Ciocchi B, Cattin L, Guarnieri G. Relationships between desacylated and acylated ghrelin and insulin sensitivity in the metabolic syndrome. J Clin Endocrinol Metab. Oct;92(10):3935-40 (2007).

23. Rodríguez A, Gómez-Ambrosi J, Catalán V, Gil MJ, Becerril S, Sáinz N, Silva C, Salvador J, Colina I, Frühbeck G. Acylated and desacyl ghrelin stimulate lipid accumulation in human visceral adipocytes. Int J Obes (Lond). May;33(5):541-52 (2009).

24. Schellekens H, Dinan TG, Cryan JF. Lean mean fat reducing "ghrelin" machine: Hypothalamic ghrelin and ghrelin receptors as therapeutic targets in obesity. Neuropharmacology 58(1):2-19 (2010).

25. Gualillo O, Lago F, Dieguez C. Introducing GOAT: a target for obesity and anti-diabetic drugs? Trends Pharmacol Sci 29(8):398-401 (2008).

26. Hillman JB, Tong J, Tschop M. Ghrelin biology and its role in weight-related disorders. Discov Med. Jun;11(61):521-8 (2011).

27. Kumar R, Salehi A, Rehfeld JF, Höglund P, Lindström E, Håkanson R. Proghrelin peptides: Desacyl ghrelin is a powerful inhibitor of acylated ghrelin, likely to impair physiological effects of acyl ghrelin but not of obestatin A study of pancreatic polypeptide secretion from mouse islets. Regul Pept. Sep 24;164(2-3):65-70 (2010)

28. Cummings DE, Weigle DS, Frayo RS, Breen PA, Ma MK, Dellinger EP, Purnell JQ. Plasma ghrelin levels after diet-induced weight loss or gastric bypass surgery. N Engl J Med. May 23;346(21):1623-30 (2002).

29. Sumithran P, Prendergast LA, Delbridge E, Purcell K, Shulkes A, Kriketos A, Proietto J. Longterm persistence of hormonal adaptations to weight loss. N Engl J Med. Oct 27;365(17):1597-604 (2011).

30. Kiewiet RM, van Aken MO, van der Weerd K, Uitterlinden P, Themmen AP, Hofland LJ, de Rijke YB, Delhanty PJ, Ghigo E, Abribat T, van der Lely AJ. Effects of acute administratio of acylated and unacylated ghrelin on glucose and insulin concentratios in morbidly obese subjects without overt diabetes. Eur J Endocrinol 161:567-573 (2009).

31. Gauna C, Delhanty PJD, Hofland LJ, Janssen J, Broglio F, Ross RJM, Ghigo E, van der Lely AJ. Ghrelin stimulates, whereas des-octanoyl ghrelin inhibits, glucose output by primary hepatocytes. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 90:1055-1060 (2005).

32. Gauna C, Kiewiet RM, Janssen JA, van de Zande B, Delhanty PJ, Ghigo E, Hofland LJ, Themmen AP, van der Lely AJ. Unacylated ghrelin acts as a potent insulin secretagogue in glucose-stimulated conditions. Am J Physiol Endocrinol Metab 293:E697-704 (2007).

33. Granata R, Settanni F, Gallo D, Trovato L, Biancone L, Cantaluppi V, Nano R, Annunziata M, Campiglia P, Arnoletti E, Ghe C, Volante M, Papotti M, Muccioli G, Ghigo E. Obestatin promotes survival of pancreatic beta-cells and human islets and induces expression of genes involved in the regulation of beta-cell mass and function. Diabetes 57:967-979 (2008).

34. Longo KA, Charoenthongtrakul S, Giuliana DJ, Govek EK, McDonagh T, Qi Y, DiStefano PS, Geddes BJ. Improved insulin sensitivity and metabolic flexibility in ghrelin receptor knockout mice. Regul Pept 150:55-61 (2008).

35. Nonogaki K, Nozue K, Oka Y. Hyperphagia alters expression of hypothalamic 5-HT2C and 5-HT1B receptor genes and plasma des-acyl ghrelin levels in Ay mice. Endocrinology 147:5893-5900 (2006).

36. Kitamura S, Yokota I, Hosoda H, Kotani Y, Matsuda J, Naito E, Ito M, Kangawa K, Kuroda Y. Ghrelin concentration in cord and neonatal blood: relation to fetal growth and energy balance. J Clin Endocrinol Metab.2003 Nov;88(11):5473-7.

LISTA SEKVENCI

[0094]

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Fragmenti neacilovanog grelina koji se sastoje od peptida kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6 ili kao što je navedeno u SEQ ID NO: 25, i neka njihova farmaceutski prihvatljiva so, za njihovu upotrebu u lečenju Prader-Willi sindroma kod subjekta koji ima povišene nivoe grelina.

2. Fragmenti neacilovanog grelina i njihova so za njihovu upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu ona obuhvata davanje efektivne količine pomenutog fragmenta neacilovanog grelina i soli od oko 0,001 µg/kg do oko 10 mg/kg.

3. Fragmenti neacilovanog grelina i njihova so za njihovu upotrebu prema jednom od zahteva 1 ili 2, pri čemu ona obuhvata davanje efektivne količine pomenutog fragmenta neacilovanog grelina i soli od oko 1 µg/kg do oko 1 mg/kg.

4. Fragmenti neacilovanog grelina i njihova so za njihovu upotrebu prema jednom od zahteva 1 do 3, pri čemu se pomenuti fragment neacilovanog grelina i njegove farmaceutski prihvatljive soli daju putem odabranim iz grupe koju čine intravenozni, subkutani, transdermalni, oralni, bukalni, sublingvalni, nazalni i inhalacijoni put.

5. Fragmenti neacilovanog grelina i njihova so za njihovu upotrebu prema jednom od zahteva 1 do 4, pri čemu povišeni nivoi grelina predstavljaju povišene nivoe cirkulišućeg grelina.

6. Fragmenti neacilovanog grelina i njihova so za njihovu upotrebu prema jednom od zahteva 1 do 5, pri čemu je pacijent identifikovan

- određivanjem nivoa cirkulišućeg grelina iz subjekta, i

- obradom nivoa cirkulišućeg grelina najmanje delimično na osnovu referentnog nivoa cirkulišućeg grelina da bi se dobila informacija koja saopštava da li je nivo cirkulišućeg grelina povišen.