CZ9904360A3 - Použití amylinu nebo agonisty amylinu pro výrobu léku k léčení nebo prevenci obezity u člověka - Google Patents

Description

Použití amylinu nebo agonisty amylinu pro výrobu léku k léčení nebo prevenci obezity u člověka

Tato přihláška je částečně pokračovací přihláškou k přihlášce U.S. č. 08/870 762, podané 6. června 1997, jejíž obsah je plně zahrnut formou odkazů do této přihlášky.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká léků k léčeni obezity. Konkrétněji se vynález týká použiti amylinu nebo agonisty amylinu pro výrobu léku k léčeni nebo prevenci obezity u člověka

Dosavadní stav techniky

Amylin

Struktura a biologie amylinu byly uvedeny v přehledných publikacích již dříve, viz například Rink et al., Trends in Pharmaceutical Sciences, 14, 113-118, 1993, Gaeta a Rink,

Med. Chem. Res., 3, 483-490, 1994, a Pittner et al., J. Cell. Biochem., 55S, 19-28, 1994. Amylin je proteinový hormon o 37 aminokyselinách. Byl izolován, purifikován a chemicky charakterizován jako hlavní složka amyloidových depozit v ostrůvcích pankreatu zemřelých lidí s diabetem typu 2 (Cooper et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 8628-8632,

1987). Po translaci v molekule amylinu nastanou dvě důležité modifikace: C-konec je amidován (tj. 37. aminokyselinový zbytek je tyrosinamid) a cysteiny v pozicích 2 a 7 jsou navázány, takže vznikne N-koncová smyčka (prostřednictvím

cystinového zbytku). Sekvence otevřeného čtecího rámce lidského amylinového genu ukazuje přítomnost Lys-Arg dibazického aminokyselinového proteolytického štěpného signálu, před N-koncovým kodonem pro Lys, a Gly před Lys-Arg proteolytickým signálem v C-koncové pozici, typická sekvence pro amidaci prostřednictvím proteinového amidačního enzymu, PAM (Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014, 247-258,

1989) . Amylin byl popsán a nárokován v Patentu Spojených Států č. 5 367 052, uděleném 22. listopadu 1994.

Prokázalo se, že u diabetů typu I je množství amylinu nepostačující a jako léčba preferovaná oproti léčbě samotným inzulínem u všech forem diabetů byla navržena náhrada inzulínu v kombinaci s amylinem. Použití amylinu a dalších agonistů amylinu pro léčbu diabetes mellitus je předmětem Patentu Spojených Států č. 5 175 145, uděleného 29. prosince 1992. Farmaceutické přípravky obsahující amylin a amylin plus inzulín jsou popsány a nárokovány v Patentu Spojených států č. 5 124 314, uděleném 23. června 1992.

Bylo uvedeno, že přebytek působení amylinu napodobuje významné rysy diabetů typu 2 a jako nová léčebná strategie byla navržena blokáda amylinu. V patentu U.S. č. 5 266 561, uděleném 30. listopadu 1993, bylo odhaleno, že amylin působí snížení inkorporace značené glukózy do glykogenu v kosterních svalech, a to bazální inkorporace i stimulované inzulínem. Bylo odhaleno, že druhý účinek je také sdílen peptidem majícím vztah ke kalcitoninovému genu (CGRP) (viz také Leighton a Cooper, Nátuře, 335, 632-635, 1988) . Bylo také publikováno, že amylin snižuje inzulínem stimulované vychytávání glukózy kosterním svalstvem a snižuje obsah glykogenu (Young et al., Amer. J. Physiol., 259, 45746-1,

1990) . Je již popsáno léčení diabetů typu 2 a inzulínové rezistence pomocí antagonistů amylinu.

Sekvence amylinu je z přibližně 50 % homologní se sekvencí CGRP, a také se 37 aminokyselinami proteinů, které jsou rozšířenými neurotransmitery s moha silnými biologickými účinky, včetně vazodilatace. Amylin a CGRP sdílejí disulfidový můstek ²Cys-⁷Cys a C-koncový aminokyselinový amidový zbytek, oba jsou nezbytné pro plnou biologickou aktivitu (Cooper et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 8577637766, 1988). Bylo publikováno, že amylin je možná člen rodiny příbuzných peptidů, které zahrnují CGRP, inzulín, růstové faktory podobné inzulínu a relaxiny a které sdílejí společný genetický základ (Cooper et al., Prog. Growth Factor Research, 1, 99-105, 1989).

Amylin je primárně syntetizován v pankreatických beta-buňkách a je secernován jako odpověď na výživové stimuly, jako je glukóza a arginin. Studie s klonovanými nádorovými liniemi z beta-buněk (Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1), 1991) ukázaly, že výživové sekreční podněty, jako je glukóza a arginin stimulují uvolňování amylinu, a také inzulínu. Molární poměr amylin:inzulín secernovaných proteinů kolísá mezi preparáty od přibližně 0,01 do 0,4, ale ukazuje se, že nekolísá mnoho s akutními podněty v každém preparátu. Ale během dlouhotrvající stimulace zvýšenou glukózou se poměr amylin:inzulín může progresivně zvyšovat (Gedulin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 180(1), 782-789, 1991). Amylin a inzulín nejsou vždy secernovány v konstantním poměru.

Bylo objeveno a publikováno, že určitý účinek amylinu je podobný některým nemetabolíckým účinkům CGRP a kalcitoninu, ale metabolické účinky amylinu objevené během výzkumu tohoto nově identifikovaného proteinu se zdají odrážet jeho primární biologickou úlohu. Alespoň některé z těchto metabolických • · · · účinků jsou napodobovány CGRP, třebaže v dávkách, které jsou významně vazodilatační (viz např. Leighton et al., Nátuře, 335, 632-635, 1988, Molina et al., Diabetes, 39, 260-265, 1990) .

První objevený účinek amylinu bylo snížení inzulínem stimulované inkorporace glukózy do glykogenu v kosterním svalstvu potkanů (Leighton et al., Nátuře, 335, 632-635, 1988), sval se stal „rezistentním na inzulín. Pozdější práce s m. soleus potkana ex vivo a in vitro ukázala, že amylin snižuje aktivitu glykogensyntetázy, podporuje konverzi glykogenfosforylázy z inaktivní formy b na aktivní formu a, podporuje čistou ztrátu (odborávání) glykogenu (v přítomnosti či nepřítomnosti inzulínu), zvyšuje hladiny glukózo-6-fosfátu

a	může	zvýšit tvorbu	laktátu	(viz např. Deems et al.,
Biochem.	Biophys. Res.	Commun.,	181(1), 116-120,	1991, Young
et	al.,	FEBS Letts.,	281 (1,2) ,	149-151, 1991).	Zdá se, že

amylin neovlivňuje transport glukózy per se (např. Pittner et al., FEBS Letts., 365(1), 98-100, 1995). Studie vztahu amylinu a inzulínu závislého na dávce ukazují, že amylin působí jako nekompetitivní nebo funkční antagonista inzulínu v kosterním svalu (Young et al., Am. J. Physiol., 263(2), E274-E281, 1992) . Není žádný důkaz, že amylin interferuje s vazbou inzulínu na jeho receptory nebo s následnou aktivací inzulínového receptoru tyrozinkinázou (Follert et al., Clinical Research, 39(1), 39A, 1991, Koopmans et al.,

Diabetologia, 34, 218-224, 1991) .

Má se za to, že amylin působí prostřednictvím receptoru přítomných v plazmatických membránách. Studie amylinu a CGRP a účinek selektivních antagonistů svědčí pro to, že amylin působí prostřednictvím svého vlastního receptoru (Beaumont et al., Br. J. Pharmacol., 115(5), 713-715, 1995, Wang et al., FEBS Letts., 219, 195-198, 1991 b) , což odporuje závěru ·· · ·· · · · · · • · · · ···· · · · ♦ • · · · · ···· • · · · · «····· • · · · · · · · ···· ··» ·· ··» ·· ·» jiných vědců, že amylin může působit primárně na receptory CGRP (např. Chantry et al., Biochem. J., 277, 139-143, 1991,

Galeazza et al., Peptides, 12, 585-591, 1991, Zhu et al.,

Biochem. Biophys. Res. Commun., 177(2), 771-776, 1991).

Amylinové receptory a jejich použiti v metodách pro screening a testováni na amylinové agonisty a antagonisty jsou popsány v Patentu Spojených Států č. 5 264 372, uděleném 23.

listopadu 1993.

Zatímco amylin má výrazné účinky na jaterní zásobní (fuel) metabolismus in vivo, neexistuje obecná shoda co se týče toho, jaký účinek amylinu se pozoruje v izolovaných hepatocytech nebo perfundovaných játrech. Dostupná data nejsou příliš v souladu s představou, že amylin podporuje jaterní glykogenolýzu, tj. nepůsobí jako glukagon (např. Stephens et al., Diabetes, 40, 395-400, 1991, Gomez-Foix et al., Biochem. J., 276, 607-610, 1991). Bylo navrženo, že amylin může působit na játra tak, že podporuje konverzi laktátu na glykogen a zvyšuje množství glukózy, kterou je možné uvolnit glukagonem (viz Roden et al., Diabetologia, 35, 116-120, 1992). Tímto způsobem by amylin mohl působit jako anabolický partner inzulínu v játrech na rozdíl od svého katabolického působení ve svalech.

V tukových buňkách nemá na rozdíl od svého působení ve svalech amylin pozorovatelný účinek na vychytávání glukózy stimulované inzulínem, inkorporaci glukózy do triglyceridů, tvorbu C0₂ (Cooper et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 85, 77637766, 1988), lipolýzu stimulovanou epinefrinem nebo inzulínovou inhibici lipolýzy (Lupien a Young, „Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental, díl 6(1), 1318, únor 1993). Amylin tak projevuje účinky tkáňově specifické s přímým působením na kosterní sval, výrazné nepřímé (prostřednictvím zásoby substrátu) a snad přímé • · · · » · · i » ·· i • · · · to působení na játra, zatímco se adipocyty jeví „slepé k přítomnosti nebo nepřítomnosti amylinu.

Bylo také publikováno, že amylin může mít výrazný vliv na sekreci inzulínu. Pokusy na nedotčených laboratorních potkanech (Young et al., Mol. Cell. Endocrinol., 84, R1-R5, 1992) ukazují, že amylin inhibuje sekreci inzulínu. Ale jiní vědci nemohli zjistit působení amylinu na izolované β-buňky, na izolované ostrůvky nebo na celé zvíře (viz Broderick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177, 932-938, 1991).

Amylin nebo agonisté amylinu silně inhibují vyprazdňování žaludku u potkanů (Young et al., Diabetologia, 38(6), 642-648, 1995), psů (Brown et al., Diabetes, 43, (suppl. 1), 172A, 1994) a u lidí (Macdonald et al.,

Diabetologia, 38 (Suppl. 1), A32 (abstrakt 118), 1995). Bylo publikováno, že vyprazdňování žaludku je urychleno u amylin deficitních laboratorních potkanů BB s diabetem typu 1 (Young et al., Diabetologia, výše, Nowak et al., J. Lab. Clin. Med., 123(1), 110-6, 1994) a u potkanů léčených selektivním antagonistou amylinu, AC187 (Gedulin et al., Diabetologia, 38 Zdá se, že účinek amylinu na je fyziologický (účinný v koncentracích, které jsou normálně v oběhu).

Nemetabolické působení amylinu zahrnuje vazodilatační účinek, který může být zprostředkovaný interakcí s vaskulárními receptory CGRP. Publikované pokusy in vivo svědčí pro to, že amylin je jako vazodilatátor přinejmenším přibližně 100 až 1000 x méně účinný než CGRP (Brain et al., Eur. J. Pharmacol., 183, 2221, 1990, Wang et al., FEBS

Byl publikován účinek amylinu na činnost včetně průtoku krve ledvinami u potkanů při vědomí (Gardiner et al., Diabetes, 40, 948-951, 1991). Autoři si povšimli, že infúze potkaního (suppl. 1), A244, 1995).

vyprazdňování žaludku

Letts., 291, 195-198, 1991) regionální hemodynamickou

amylinu byla sdružena s větší vazodilatací renálních cév a menší vazokonstrikcí mezenterických cév, než co se pozoruje při infúzi lidského α-CGRP. Vyvodili závěr, že větší podporou renální hyperémie, než činí α-CGRP, může potkaní amylin způsobit méně výraznou stimulaci systému renin-angiotenzin, a tedy menší vazokonstrikcí zprostředkovanou sekundárně angiotenzinem II. Bylo také ale pozorováno, že během současné infúze lidského a-^8_37CGRP a potkaního amylinu, byla odhalena vazokonstrikce renálních a mezenterických cév, pravděpodobně díky bez odporu přijímaného vazokonstrikčního působení angiotenzinu II, a že tento nález je podobný výsledku pozorovanému během společné infúze lidského Α-CGRP a lidského a-^e'³⁷CGRP (ibid., 951).

Bylo také publikováno, že amylin působí jak na izolované osteoklasty, kde způsobuje klidové stádium buněk, tak in vivo, kdy snižuje plazmatickou hladinu kalcia až na 20 % u potkanů, u králíků a u lidí s Pagetovou nemocí (viz např. Zaidi et al., Trends in Endocrinol. and Metab., 4, 255-259, 1993) . Dostupná data svědčí pro to, že amylin je při tomto působení 10 až 30 x méně účinný než lidský kalcitonin. Je zajímavé, že podle publikací se ukazuje, že amylin zvyšuje produkci cAMP osteoklasty, ale nezvyšuje Ca²⁺ v cytosolu, zatímco kalcitonin je účinný v obou případech (Alam et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1), 134-139, 1991). Bylo navrženo, i když neověřeno, že kalcitonin může působit prostřednictvím dvou typů receptorů a že amylin může interagovat s jedním z nich.

Bylo také objeveno, že amylin výrazně zvyšuje aktivitu reninu v plazmě u nedotčených potkanů, je-li podáván subkutánně tak, aby se zabránilo jakémukoliv porušení krevního tlaku, což je překvapivé vzhledem k jeho dříve popsané schopnosti působit vazodilatačně v ledvinách a jeho • 4 • · · dalším vlastnostem. Je důležité nezměnit krevní tlak, neboť jeho snížení je silný podnět pro uvolňování reninu. Antagonisté amylinu, jako jsou antagonisté amylinového receptoru, včetně těch, které jsou ve srovnání s CGRP receptory a/nebo kalcitoninovými receptory selektivní pro amylinové receptory, mohou být použity pro blokování vzestupu plazmatické aktivity reninu vyvolaného amylinem. Použití antagonistů amylinu k léčbě chorob spojených s reninem je popsáno a nárokováno v Patentu Spojených Států U.S. č. 5 376 638, uděleném 27. prosince, 1994.

Bylo publikováno, že u zdravých lodí jsou hladiny amylinu nalačno od 1 do 10 pM a postprandiální hladina nebo hladina po podání glukózy 5 až 20 pM (např. Koda et al., The Lancet, 339, 1179-1180, 1992). U obézních jedinců rezistentních na inzulín mohou být hladiny amylinu po jídle zvýšené a dosahovat až přibližně 50 pM. Pro srovnání, hodnoty inzulínu nalačno a postprandiálně jsou 20 až 50 pM a 100 až 300 pM u zdravých lidí, u lidí rezistentních na inzulín jsou hladiny asi 3 až 4 x vyšší. U diabetů typu 1, kdy jsou zničeny beta-buňky, jsou hladiny amylinu v rozmezí hladin detekce nebo pod nimi a v odpověď na glukózu nestoupají (Koda et al., The Lancet, 339, 1179-1180, 1992). Bylo publikováno, že u zdravých myší a potkanů jsou bazální hladiny amylinu od 30 do 100 pM, zatímco u určitých diabetických kmenů hlodavců rezistentních na inzulín byly naměřeny hodnoty až do 600 pM (např. Huang et al., Hypertension, 19, I-101-I-109, 1991).

Bylo publikováno, že amylin při injekci do mozku nebo periferním podávání snižuje příjem potravy (např. Chance et al., Brain Res., 539, 352-354, 1991, a Chance et al., Brain Res., 607, 185-188, 1993), účinek, který sdílí s CGRP a kalcitoninem. Účinná koncentrace v buňkách, které zprostředkovávají toto působení, není známa. Použití amylinu

9

9 » • · · · · · · « · · · · · 9 9 9 99 9 a agonístů amylinu pro léčení anorexie je popsáno nárokováno v Patentu Spojených Států č. 5 656 590, uděleném 12. srpna 1997. Přípravky obsahující agonístů cholecystokininu a agonístů amylinu nebo hybridní molekulu pro použití v redukci příjmu potravy nebo ke kontrole chuti k jídlu nebo tělesné hmotnosti jsou popsány a nárokovány v Patentu Spojených Států č. 5 739 106, uděleném 14. dubna 1998.

Obezita

Obezita je chronická nemoc, která ma společnosti vysokou sociálním stigmatem, v moderní nejen se prevalenci a je spojena ale také se zkrácenou délkou života a četnými zdravotními problémy, včetně nepříznivého duševního vývoje, reproduktivních poruch, jako jsou polycystické vaječníky, dermatologických nemocí jako jsou infekce, varikózní žíly, acanthosis nigrícans a ekzém, intolerance, diabetes mellitus, rezistence na hypertenze, hypercholesterolémie, cholelitiáza, artritida, ortopedická poranění, pohybová inzulín, osteotromboembolická nemoc, rakovina a ischemická choroba srdeční (Rissanen et al., British Medical Journal, 301, 835-837, 1990).

Obezita, zejména obezita horní části těla, je častý a velmi vážný obecný zdravotní problém ve Spojených Státech a na celém světě. Podle nedávné statistiky má více než 25 % populace Spojených Států a 27 % kanadské populace nadváhu.

(Kuczmarski, Amer. J. of Clin. Nut., 55, 495S-502S, 1992,

Reeder et al., Can. Med. Ass. J., 23, 226-233, 1992). Obezita horní části těla je nejsilnější známý rizikový faktor pro vznik diabetes mellitus II. typu a je to silný rizikový faktor pro vznik kardiovaskulárních chorob, a také rakoviny. Nedávné odhady světových výdajů na léčbu obezity jsou

150 000 000 000 dolarů. Problém se stal natolik vážný, že úřad hlavního lékaře zahájil iniciativu na potírání stále narůstající otylosti hojně rozšířené v americké společnosti.

Mnoho z těchto obezitou vyvolaných patologických stavů se může připisovat silné vazbě s dyslipidémií, hypertenzí a inzulínovou rezistencí. Mnoho studií prokázalo, že redukce obezity dietou a cvičením tyto rizikové faktory dramaticky snižuje. Naneštěstí je tato léčba většinou neúspěšná s mírou selhání dosahující 95 %. Selhání může být způsobeno faktem, že tento stav je v silné asociaci s geneticky zděděnými faktory, které přispívají ke zvýšené chuti k jídlu, preferenci vysoce kalorické potravy, ke snížené fyzické aktivitě a zvýšenému lipogennímu metabolismu. To svědčí pro to, že lidé, kteří zdědili tyto genetické znaky, mají sklon k obezitě bez ohledu na úsilí s ní bojovat. Proto je zapotřebí nové léčivo, které může upravit tuto nevýhodu a umožní lékaři úspěšně léčit obézní pacienty navzdory jejich genetickému dědictví.

Dosavadní léčení obezity zahrnuje standardní diety a cvičení, diety s velmi malým přívodem kalorií, behaviorální terapii, farmakoterapii zahrnující léky potlačující chuť k jídlu, termogenní léky, inhibitory absorpce potravin, mechanické prostředky, jako je sdrátování čelistí, opaskové šňůry a balónky a chirurgické zákroky. (Jung a Chong, Clinical Endocrinology, 35, 11-20, 1991, Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55, 538S-544S, 1992). Publikovalo se, že při redukci hmotnosti u dospívajících bylo účinné modifikované hladovění šetřící proteiny (Lee et al., Clin. Pediatr., 31, 234-236, duben 1992). Snížení kalorického příjmu jako léčení obezity způsobuje katabolismus zásob tělesných proteinů a vytváří negativní dusíkovou bilanci. Proto získaly popularitu diety s doplňkem proteinů jako způsob snížení ztráty dusíku při snížení kalorického příjmu. Protože takové diety šetří dusík pouze mírně, je zapotřebí účinnější způsob pro zachování netučné tělesné hmoty a proteinových zásob. Kdyby takový režim měl kromě toho také za následek zrychlenou ztrátu tělesného tuku, byla by zlepšena léčba obezity. Různé přístupy k takovému léčení zahrnují způsoby uváděné autory Wintraub a Bray (Med. Clinics N. Amer., 73, 237, 1989, Bray,

Nutrition Reviews, 49, 33, 1991).

Vzhledem k vysoké prevalenci obezity v naší společnosti a vážným následkům s ní spojených, jak jsou projednány výše, každé léčivo potenciálně použitelné pro snížení hmotnosti obézních osob by mělo skutečně prospěšný účinek na jejich zdraví. Je zapotřebí léčivo, které bude snižovat celkovou tělesnou hmotnost obézních .pacientů na jejich ideální tělesnou hmotnost a bude pomáhat sníženou úroveň hmotnosti udržet.

Podstata vynálezu

Nyní jsme překvapivě zjistili, že amylin a agonisté amylinu, například analog agonisty amylinu ²⁵'²⁸'²⁹Pro-h-amylin (také nazývaný jako „pramlintid a dříve nazývaný „AC-0137), mohou být použity pro léčení obezity u lidí.

Předkládaný vynález se týká nových způsobů léčení nebo prevence obezity u lidí, které zahrnují podávání amylinu nebo agonisty amylinu, například analogu agonisty amylinu ²⁵'²⁸'²⁹Pro-h-amylinu. Amylin nebo agonista amylinu může být podáván samotný nebo ve spojení s jinými agens odstraňujícími obezitu. V jednom aspektu se vynález týká způsobu léčení obezity u lidí, který zahrnuje podávání účinného množství amylinu nebo agonisty amylinu uvedenému subjektu. „Léčením β ft ftft 4 4« 4 44 • 444 4 «44 4 44 4

444 4444 ft 4 · 4 · 4·· 44 4

4 444 4444

4444 444 44 44· ·· 4« se rozumí vedení pacienta a péče o něj za účelem potírání nemoci, chorobného stavu nebo poruchy a zahrnuje podávání amylinu nebo agonisty amylinu pro zabránění propuknutí symptomů nebo komplikací, zmírnění symptomů nebo komplikací nebo odstranění chorobného stavu či poruchy. Léčení obezity tudíž zahrnuje potlačení nárůstku hmotnosti a vyvolání ztráty hmotnosti u pacienta, který to potřebuje. Kromě toho se léčením obezity míní, že zahrnuje kontrolu hmotnosti z kosmetických důvodů u lidí, což je kontrola tělesné hmotnosti pro zlepšení tělesného vzhledu.

Rozumí se, že termín „amylin v tomto popisu zahrnuje sloučeniny, jak jsou vymezeny v Patentu Spojených Států č. 5 234 906, uděleném 10. srpna 1993, pro „Hyperglykemické přípravky, jehož obsah je formou odkazů zahrnut zde. Například zahrnuje lidský peptidový hormon uváděný jako amylin secernovaný pankreatickými beta-buňkami a jeho druhové varianty. „Agonista amylinu je také termín v oboru známý a týká se sloučeniny, která napodobuje účinky amylinu. Agonista amylinu může být peptid nebo nepeptidová sloučenina a zahrnuje také analogy agonisty amylinu.

Rozumí se, že termín „analog agonisty amylinu se vztahuje k derivátům amylinu, v současnosti se má za to, že působí jako agonisté amylinu normálně na základě vazby s receptorem amylinu nebo jinak přímo či nepřímo interagují s amylinovým receptorem nebo jiným receptorem nebo receptory, se kterými může interagovat samotný amylin, aby vyvolal biologickou odpověď. Použitelné analogy agonisty amylinu zahrnují ty, které jsou uvedeny v mezinárodni přihlášce, WPI rejstřík. č. 93-182488/22 s názvem „New Amylin Agonist Peptides Ušed for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and Diabetes Mellitus, jejíž obsah je zde také zahrnut formou odkazu.

• · · · « 9 99 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 * 9 9 · · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99

Ve výhodném provedení je agonista amylinu analog agonisty amylinu, výhodně ²⁵'^28,29Pro-h-amylin. ^{25, 28,29}Pro-hamylin a další analogy agonisty amylinu jsou popsány a nárokovány v Patentu Spojených Států č. 5 686 411, uděleném

11. listopadu 1997, jehož obsah je zde zahrnut formou odkazu.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká nových způsobů redukce přírůstku hmotnosti indukovaného inzulínem u lidí, kteří jsou léčeni inzulínem, a to podáváním léčebně účinného množství amylinu nebo agonisty amylinu. V jednom provedení má pacient diabetes mellitus, například diabetes mellitus typu 1 nebo 2. Ve výhodném provedení je agonista’ amylinu ^25,28'²⁹Pro-h-amylin.

Detailní popis vynálezu

Studie popsaná v příkladu 1 prokázala, že podávání agonisty amylinu ⁵'²⁸'²⁵Pro-h-amylinu (pramlintidu) diabetikům užívajícím inzulín (typu 2) mělo za následek snížení tělesné hmotnosti po 4 týdnech, což dosáhlo statistické významnosti ve dvou skupinách, u dávek 60 μg TID a 60 μg QID. Studie popsaná v příkladu 2 ukázala, že podávání pramlintidu (30 μς nebo 60 μg QID) pacientům s diabetem typu 1 mělo za následek statisticky významné snížení tělesné hmotnosti ve srovnání s placebem po 13, 26 a 52 týdnech. Studie popsaná v příkladu 3 ukázala, že podávání pramlintidu (30, 75 nebo 150 μg TID) pacientům s diabetem typu 2, kteří vyžadují inzulín, mělo za následek statisticky významné snížení tělesné hmotnosti ve srovnání s placebem po 13, 26 a 52 týdnech. Tyto výsledky jsou v ostrém kontrastu s léčbou samotným inzulínem u pacientů s diabetem typu 1 nebo typu 2, která je obvykle spojena s přírůstkem hmotnosti.

Analogy agonisty amylinu použitelné v tomto vynálezu zahrnují analogy agonisty amylinu popsané a nárokované ve

výše zmíněném Patentu U.S. č. 5 686 411. Agonisté amylinu zahrnují následující analogy agonistů amylinu:

1. Analog agonisty amylinu mající aminokyselinovou sekvenci:

^Ai-X-Asn-Thr-SAla-Thr-Y-Ala-Thr-^Gln-Arg-Leu-Bi-Asn¹⁵Phe-Leu-Ci-Di-Ei-²⁰Fi-Gi-Asn-Hi-Gly-²⁵Pro-Ii-Leu-Pro-Ji³⁰Thr-K₁-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z kde

Ai	je	Lys, Ala,	Ser	nebo	vodík
Bi	je	Ala, Ser	nebo	Thr,
Ci	je	Val, Leu	nebo	Ile,
Di	je	His nebo	Arg,
Ei	je	Ser nebo	Thr,
Fi	je	Ser, Thr,	Gin	nebo	Asn,
Gi	je	Asn, Gin	nebo	His,
Hi	je	Phe, Leu	nebo	Tyr,
li	je	Ile, Val,	Ala	nebo	Leu,
Ji	je	Ser, Pro	nebo	Thr,
Ki	je	Asn, Asp	nebo	Gin,

X a Y jsou nezávisle vybrané zbytky mající postranní řetězce, které jsou chemicky vázány k sobě navzájem za vzniku intramolekulární vazby, přičemž uvedená intramolekulární vazba obsahuje disulfidovou vazbu, laktamovou nebo thioéterovou vazbu; a

Z je aminoskupina, alkylamino-, dialkylamino-, cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyskupina; a za předpokladu, že když A_x je Lys, Bi je Ala, Ci je Val, Di je Arg, Ei je Ser, Fi je Ser, Gi je Asn, Hi je Leu, Ιχ je Val, J_x je Pro a Ki je Asn; pak jeden nebo více z Ai až Ki je D-aminokyselina a Z je vybráno ze skupiny obsahující alkylaminoskupinu, dialkylamino-,

cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyoskupinu.

2. Analog agonisty amylinu mající aminokyselinovou sekvenci:

¹Ai-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-Bi-Asn¹⁵Phe-Leu-Ci-Di-Ei-²⁰F₁-Gi-Asn-H₁-Gly-²⁵Pro-Ii-Leu-Ji-Pro³⁰Thr-Ki-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z kde

Ai	je	Lys, Ala,	Ser	nebo	vodík
Bi	je	Ala, Ser	nebo	Thr,
Ci	je	Val, Leu	nebo	Ile,
Di	je	His nebo	Arg,
Ei	je	Ser nebo	Thr,
Fi	je	Ser, Thr,	Gin	nebe	i Asn,
Gi	je	Asn, Gin	nebo	His,
Hi	je	Phe, Leu	nebo	Tyr,
li	je	Ile, Val,	Ala	nebo	Leu,
Ji	je	Ser, Pro,	Leu,	Ile	nebo '
Ki	je	Asn, Asp	nebo	Gin,

X a Y jsou nezávisle vybrané zbytky mající postranní řetězce, které jsou chemicky vázány k sobě navzájem za vzniku intramolekulární vazby, přičemž uvedená intramolekulární vazba obsahuje disulfidovou vazbu, laktamovou nebo thioéterovou vazbu; a

Z je aminoskupina, alkylamino-, dialkylamino-, cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyskupina; a za předpokladu, že když

a) Ai je Lys, Bi je Ala, Ci je Val, Di je Arg, E_x je Ser,

Fi je Ser, Gi je Asn, Hi je Leu, Ιχ je Val, Ji je Pro a K_x je Asn; nebo • 4 9 44 · 44 44

44·· 4 · · · 4444

444 4444

44· 4 444 44 4

4 444 4444 • 444 444 4· 444 44 44

b) Ai je Lys, Bi je Ala, Ci je Val, Di je His, Ei je Ser,

Fi je Asn, Gi je Asn, Hi je Leu, li je Val, Ji je Ser a Ki je Asn;

pak jeden nebo více z A_x až Ki je D-aminokyselina a Z je vybráno ze skupiny obsahující alkylaminoskupinu, dialkylamino-, cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyoskupinu.

3. Analog agonisty amylinu mající aminokyselinovou sekvenci:

¹Ai-X-Asn-Thr-^sAla-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-Bi-Asn¹⁵Phe-Leu-Ci-Di-Ei-²⁰Fi-Gi-Asn-Hi-Gly-²⁵Ii-Ji-Leu-Pro-Pro³⁰Thr-Ki-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z kde

A]	je	Lys, Ala,	Ser	nebo	vodík
Bi	je	Ala, Ser	nebo	Thr,
Ci	je	Val, Leu	nebo	Ile,
Di	je	His nebo	Arg,
Ei	je	Ser nebo	Thr,
Fi	je	Ser, Thr,	Gin	nebo	Asn,
Gi	je	Asn, Gin	nebo	His,
Hi	je	Phe, Leu	nebo	Tyr,
li	je	Ala nebo	Pro,
Ji	je	Ile, Val,	Ala	nebo	Leu,
Ki	je	Asn, Asp	nebo	Gin,

X a Y jsou nezávisle vybrané zbytky mající postranní řetězce, které jsou chemicky vázány k sobě navzájem za vzniku intramolekulární vazby, přičemž uvedená intramolekulární vazba obsahuje disulfidovou vazbu, laktamovou nebo thioéterovou vazbu; a

Z je aminoskupina, alkylamino-, dialkylamino-, cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-,

999 9 999 9 99 9 «9 999 9999

9999 999 99 9

9 999 9999

9999 999 99 999 99 99 aryloxy- nebo aralkyloxyskupina; a za předpokladu, že když Ai je Lys, Bi je Ala, Ci je Val, D_x je Arg, Εχ je Ser, Fi je Ser, Gi je Asn, Ηχ je Leu, Ιχ je Pro, Ji je Val a Κχ je Asn; pak jeden nebo více z Ai až Κχ je D-aminokyselina a Z je vybráno ze skupiny obsahující alkylaminoskupinu, dialkylamino-, cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyoskupinu.

4. Analog agonisty amylinu mající aminokyselinovou sekvenci:

¹Ax-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-Bx-Asn¹⁵Phe-Leu-Ci-Di-Ei-²⁰Fi-Gi-Asn-Hi-Gly-²⁵Pro-Ii-Leu-Pro-Pro³⁰Thr-Ji-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z kde

Ai	je	Lys, Ala,	Ser	nebo	vodík
Bi	je	Ala, Ser	nebo	Thr,
Ci	je	Val, Leu	nebo	Ile,
Di	je	His nebo	Arg,
Ei	je	Ser nebo	Thr,
Fi	je	Ser, Thr,	Gin	nebo	Asn,
Gi	je	Asn, Gin	nebo	His,
Hi	je	Phe, Leu	nebo	Tyr,
li	je	Ile, Val,	Ala	nebo	Leu,
Ji	je	Asn, Asp	nebo	Gin,

X a Y jsou nezávisle vybrané zbytky mající postranní řetězce, které jsou chemicky vázány k sobě navzájem za vzniku intramolekulární vazby, přičemž uvedená intramolekulární vazba obsahuje disulfidovou vazbu, laktamovou nebo thioéterovou vazbu; a

Z je aminoskupina, alkylamino-, dialkylamino-, cykloalkylamino-, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyskupina; a za předpokladu, že když Αχ ·«· 99 « ·· ··

9 ·9 9 999 9 99 9 ♦ · · 9999

9 9 9 9 999 99 9

9 999 9999

9999 999 99 999 99 99 je Lys, Bi je Ala, C_x je Val, D_x je Arg, Ei je Ser, F_x je Ser, Gi je Asn, Hi je Leu, I_x je Val a J_x je Asn; pak jeden nebo více z Αχ až Ki je D-aminokyselina a Z je vybráno ze skupiny obsahující alkylaminoskupinu, dialkylamino-, cykloalkylamino, arylamino-, aralkylamino-, alkyloxy-, aryloxy- nebo aralkyloxyoskupinu.

Výhodné analogy agonistů amylinu zahrnují ²⁵'^28,29Pro-hamylin, ¹⁸Arg^{25, 28,29}Pro-h-amylin a ¹⁸Arg²⁵'²⁸Pro-h-amylin.

Aktivita agonistů amylinu může být potvrzena a kvantifikována provedením různých screeningových testů včetně testu vazby receptorů v nucleus accumbens popsaném níže v příkladu 7, pak následuje test na m. soleus popsaný níže v příkladu 8, test vyprazdňování žaludku popsaný níže v příkladu 9 nebo 10 nebo test schopnosti indukovat hypokalcémii nebo snižovat u savců postprandiální hyperglykémii, jak je popsáno zde.

Test vazby receptorů, kompetitivní test, který měří schopnost sloučenin specificky se navázat na amylinové receptory vázané v membráně, je popsán a nárokován v Patentu U.S. č. 5 264 372, uděleném 23. listopadu 1993, jehož popis je zde zahrnut formou odkazu. Test vazby receptorů je také popsán v příkladu 7 níže. Výhodný zdroj membránových preparátů použitých v testu je bazální přední mozek, který obsahuje membrány z nucleus accumbens a okolních oblastí. Testované sloučeniny kompetují o vazbu k těmto přípravkům receptorů s potkaním amylinem ¹²⁵I Bolton Hunter. Kompetiční funkce, kde navázané množství (B) je vyneseno jako funkce logaritmu koncentrace ligandu, byly analyzovány pomocí počítače, a sice užitím nelineární regrese pro 4 parametrovou logistickou rovnici (program Inplot, GraphPAD Software, San Diego, Kalifornie) nebo programem ALLFIT autorů DeLean ** » 99 9 99 99

9 99 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99 et al., (ALLFIT, verze 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892). (Munson a Rodbard, Anal. Biochem., 107, 220-239, 1980).

Testy biologické aktivity agonistů amylinu na svalu m. soleus se mohou provádět s použitím dříve popsaných metod (Leighton, B. a Cooper, Nátuře, 335, 632-635, 1988, Cooper et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 7763-7766, 1988), ve kterých může být aktivita agonisty amylinu stanovena měřením inhibice syntézy glykogenu stimulované inzulínem. Test na m. soleus je také popsán v příkladě 8 níže.

Metody měření rychlosti vyprazdňování žaludku jsou popsány například v práci Young et al. (Diabetologia, 38(6), 642-648, 1995). V metodě s fenolovou červení, která je popsána v příkladu 9 níže, dostávají potkani při vědomí gastrickou sondou bezbarvý gel obsahující metylcelulózu a indikátor fenolovou červeň. Dvacet minut po nakrmení je zvířatům podána anestezie s použitím halotanu, žaludek je odkryt a v místě svěrače v pyloru a spodního jícnového svšrače je uzavřen svorkami, žaludek je pak vyňat a otevřen v alkalickém roztoku. Obsah žaludku se odvodí z intenzity fenolové červeně v alkalickém roztoku, měřené pomocí absorbance při vlnové délce 560 nm. Při použití metody s glukózou značenou tritiem, která je popsána v příkladu 10 níže, jsou potkani při vědomí nakrmeni roztokem značené glukózy ve vodě. Potkanům je šetrně odebrána krev z ocasu, jehož špička je umrtvena lidokainem. Tritium v plazmě oddělené z krve odebrané z ocasu se odebírá v různých časových intervalech a určuje se na počítači beta impulzů. Testované sloučeniny se normálně podávají přibližně jednu minutu před nakrmením.

Účinky amylinu nebo agonistů amylinu na tělesnou hmotnost se určují, hodnotí nebo testují s použitím metod popsaných v příkladech 1-3 níže nebo jinými metodami v oboru

0 ·

00

0 0 I

0 0 4 ···· ·

09 známými či analogickými metodami zjišťujícími ovlivnění tělesné hmotnosti. Výhodné sloučeniny agonistů amylinu projevují aktivitu v testu vazby receptorů řádově menší než přibližně 1 až 5 nM, výhodně menší než přibližně 1 nM a výhodněji menší než přibližně 50 pM. V testu na svalu m. soleus vykazují výhodné sloučeniny agonistů amylinu hodnoty EC₅₀ řádově menší než přibližně 1 až 10 gmol. V testech vyprazdňování žaludku vykazují výhodné sloučeniny agonistů hodnoty ED₅₀ řádově menší než 100 μg/potakana.

Amylin a peptidové agonisty amylinu je možno připravit s použitím standardních technik pro syntézu peptidů na pevné fázi, výhodně na automatizovaném nebo poloautomatizovaném syntetizátoru peptidů. Typicky jsou při použití těchto technik aminokyselina chráněná α-N-karbamoylovou skupinou a aminokyselina připojovaná k rostoucímu peptidovému řetězci navázaném na pryskyřici kondenzovány při teplotě místnosti v inertním rozpouštědle, jako je

N-metylpyrolidinon nebo metylenchlorid kondenzačních činidel, jako jsou dicyklohexylkarbodiimid a 1-hydroxybenzotriazol v přítomnosti báze jako je diizopropyletylamin. Ochranná ot-2N-karbamoylová skupina je odstraněna z výsledné peptid-pryskyřice s použitím činidla jako je trifluorooctová kyselina nebo piperidin a kondenzační reakce se opakuje s další požadovanou N-chráněnou aminokyselinou, která má být přidána k peptidovému řetězci. Vhodné N-ochranné skupiny jsou v oboru dobře známy, přičemž zde jsou výhodně užívány t-butyloxykarbonylová (tBoc) a fluorenylmetoxykarbonylová (Fmoc) skupina.

Rozpouštědla, deriváty aminokyselin a 4-metybenzhydrylaminovou pryskyřici používanou v syntetizátoru peptidů je možné zakoupit od firmy Applied Biosystems lne. (Foster City, CA) . Od firmy Applied Biosystems lne. je možné zakoupit dimetylformamid, za přítomnosti následující chráněné aminokyseliny s chráněným postranním řetězcem: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc) , Boc-Thr(Bzl), FmocThr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), FmocTyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), FmocGlu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) a Fmoc-Gln(Trt). BocHis(BOM) se může koupit od firmy Applied Biosystems lne. nebo od Bachem lne. (Torrance, CA) . Anizol, metylsulfid, fenol, etandithiol a thioanizol je možné získat od firmy Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) . HF dodává firma Air Products and Chemicals (Allentown, PA) . Etyléter, kyselina octová a metanol se mohou koupit od firmy Fisher Scientific /Pittsburgh, PA).

Syntéza peptidů na pevné fázi se může provádět na automatickém syntetizátoru peptidů (model 430A, Applied Biosystems lne., Foster City, CA) s použitím systému NMP/HOBt (Volba 1) a chemického postupu s Tboc nebo Fmoc (viz příručku uživatele od Applied Biosystems pro syntetizátor peptidů ABI 430A, verze 1.3B, 1. července, 1988, část 6, s. 49-70,

Applied Biosystems lne., Foster City, CA) s čepičkou (capping). Boc-peptidové pryskyřice se štěpí HF (-5 °C až 0 °C, 1 hodina). Peptid se extrahuje z pryskyřice střídáním vody a kyseliny octové a filtráty se lyofilizují. Fmocpeptidová pryskyřice se štěpí podle standardních metod (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems lne., s. 6-12, 1990). Peptidy mohou být také kondenzovány při použití syntetizátoru Advanced Chem Tech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky).

Peptidy jsou purifikovány pomocí RP-HPLC (preparativní a analytické) s použitím systému Waters Delta Prep 3000. Pro izolaci peptidů jsou použity preparativní kolony C4, C8 nebo

C18 (10 μ, 2,2 x 25 cm, Vydac, Hesperia, CA) a čistota se určuje pomocí analytických kolon C4, C8 nebo C18

průtoku 1,0 ml/min 15 ml/min. Analýzy (5 μ, 0,46 x 25 cm, Vydac). Rozpouštědla (A=0,l% TFA/voda a B=0,l% TFA/CH3CN) jsou nanášena na analytickou kolonu při a na preparativní kolonu při průtoku aminokyselin se provádějí na systému

Waters Pico Tag a zpracovávají se s použitím programu Maxima. Peptidy jsou hydrolyzovány kyselou hydrolýzou v parní fázi (115 °C, 20-24 hodin). Hydrolyzáty jsou derivatizovány a analyzovány standardními metodami (Cohen et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, s. 11-52, Millipore Corporation, Milford, MA, 1989). Analýza ostřelováním rychlými atomy se provádí pomocí M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). Hmotnostní kalibrace se provádí s použitím jodidu česného nebo jodidu cesného/glycerolu. Plazmatická desorpční ionizační analýza používající čas letové detekce se prováděla na hmotnostním spektrometru Applied Biosystems Bio-Ion 20.

Peptidové sloučeniny použitelné ve vynálezu mohou být také připraveny technikami rekombinantní DNA, použitím metod v oboru nyní známých. (Viz např. Sambrook et al., Molecular A Laboratory Manual, 2

Nepeptidové sloučeniny vynálezu se připravují metodami v oboru známými.

Sloučeniny uváděné výše mohou tvořit soli s různými anorganickými a organickými kyselinami a zásadami. Tyto soli zahrnují soli připravené s organickými a anorganickými kyselinami, jako je například HCI, HBr, H2SO4, H3PO4, kyselina trifluoroctová, kyselina octová, kyselina mravenčí, kyselina metansulfonová, kyselina toluensulfonová, kyselina maleinová, kyselina fumarová a kyselina kafrsulfonová. Soli připravené se zásadami zahrnují amonné soli, soli alkalických kovů, např. sodné a draselné soli, a soli alkalických zemin, např. vápenaté a hořečnaté soli. Výhodné jsou soli kyseliny octové, vydání, Cold Spring Harbor, použitelné v předkládaném

Cloning; 1989).

• ·

chlorovodíkové a trifluoroctové. Soli kyseliny octové jsou nejvýhodnější. Soli se tvoří obvyklými prostředky, jako reakce volné kyseliny nebo zásady, kdy se tvoří produkt s jedním nebo více ekvivalenty příslušné zásady nebo kyseliny v rozpouštědle nebo médiu, ve kterém je sůl nerozpustná, nebo v rozpouštědle, jako je voda, které je pak odstraněno ve vakuu nebo lyofilizací nebo výměnou iontů existující soli za jiný ion na vhodné iontoměničové pryskyřici.

Přípravky použitelné podle předkládaného vynálezu mohou být příhodně poskytnuty v lékových formách vhodných pro parenterální podávání (včetně intravenózního, intramuskulárního a subkutánního) nebo pro nazální či perorální podávání. Nejlépe je vhodná forma podávání určena lékařem individuálně pro každého pacienta. Vyhovující farmaceuticky přijatelné nosiče a formulace přípravků jsou popsány ve standardních odborných publikacích o formulaci přípravků, např. Remingtons Pharmaceutical Sciences od E.W. Martina. (Viz také Wang, Y.J. a Hanson, M.A., „Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parental Science and Technology, Technical Report č. 10, Supp. 42, 2S, 1988). Sloučeniny formulované jako parenterální přípravky pro injekce nebo infúze mohu být například suspendovány v inertním oleji, vhodně v rostlinném oleji, jako je sezamový, podzemnicový, olivový olej nebo jiný přijatelný nosič. Výhodně jsou suspendovány ve vodném nosiči, například v izotonickém pufrovacím roztoku s pH přibližně 5,6 až 7,4. Tyto přípravky jsou sterilizovány obvyklými sterilizačními technikami nebo jsou sterilizovány filtrací. Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, jak je vyžadováno pro přiblížení se fyziologickému stavu, jako jsou činidla pufrující pH. Použitelné pufry zahrnují například pufr acetát sodný/kyselina octová. Může

být použita forma zásobníkového nebo „depotního přípravku s pomalým uvolňováním, takže léčebně účinné množství přípravku se podává do krevního oběhu po mnoho hodin nebo dnů po transdermální injekci nebo podání.

Tyto parenterální lékové formy se výhodně připravují podle patentové přihlášky (v obecném vlastnictví) s názvem „Parenteral, Liquid Formulations for Amylin Agonist Peptides, pořadové č. 60/035 140, podané 8. ledna 1997, a podle patentové přihlášky U.S. pořadové č. 09/005 262, podané 8. ledna 1998, na které se tímto odkazujeme: Parenterální lékové formy obsahují přibližně 0,01 až 0,5 % (hmotnost/objem) amylinu nebo agonisty amylinu ve vodném systému spolu s přibližně 0,02 až 0,5 % (hmotnost/objem) acetátového, fosfátového, citrátového nebo glutamátového pufru tak, aby se dosáhlo pH konečného přípravku přibližně 3,0 až 6,0 (výhodněji 3,0 až 5,5), a také přibližně 1,0 až 10 % (hmotnost/objem) sacharidu nebo polyhydrického alkoholu jako tonizačního činidla ve vodné spojité . fázi . Ve výhodné formulaci produktu navrženého tak, aby bylo pacientovi umožněno odstranění častého dávkování, je také přítomno přibližně 0,005 až 1,0 % (hmotnost/objem) antimikrobiálního konzervačního prostředku vybraného ze skupiny skládající se z m-krezolu, benzylalkoholu, metyl-, etyl-, propyla butylparabenu a fenolu. Stabilizátor není nezbytný. Aby se získala požadovaná koncentrace roztoku, je použito postačující množství vody pro injekce. Je-li žádoucí, může být také přítomen chlorid sodný, a také další excipienty. Tyto excipienty ale musí udržovat celkovou stabilitu amylinu nebo peptidového agonisty amylinu. Tekuté přípravky jsou v podstatě izotonické, tj. v mezích ± 20 % izotonie a výhodně v mezích 10 % izotonie. Nejvýhodněji v přípravku amylinu nebo agonisty amylinu pro parenterální podávání polyhydrický

alkohol je mannit, pufr je acetátový pufr, konzervační činidlo je přibližně 0,1 až 0,3 % (hmotnost/objem) m-krezolu a pH je přibližně 3,7 až 4,3. Požadované izotonie je dosaženo použitím chloridu sodného nebo jiné farmaceuticky přijatelné soli.

Je-li žádoucí, roztoky výše uvedených přípravků mohou být zahuštěny pomocí zahušťovadla, jako je metylcelulóza. Mohou být připraveny ve formě emulze, buď voda v oleji nebo olej ve vodě. Může být použit každý z celé řady farmaceuticky přijatelných emulgátorů včetně například arabské gumy, neionogenního surfaktantu (jako je Tween) nebo iontového surfaktantu (jako jsou sulfáty nebo sulfonáty alkalického polyéterového alkoholu, např. Triton).

Přípravky použitelné ve vynálezu jsou připraveny smísením složek podle obecně přijatých postupů. Například vybrané složky se jednoduše smísí v mixéru nebo jiném standardním zařízení za vzniku koncentrované směsi, která pak může být upravena na konečnou koncentraci a viskozitu přidáním vody nebo zahušťovadla a možná pufru ke kontrole pH nebo dalšího solutu ke kontrole tonicity.

Pro používání lékařem jsou přípravky poskytnuty v jednotkových lékových formách obsahujících množství amylinu nebo agonisty amylinu, například sloučeniny analogu agonisty amylinu, která účinně v jedné nebo několika dávkách kontroluje obezitu na zvolené úrovni. Tarapeuticky účinné množství amylinu nebo agonisty amylinu, jako je analog agonisty amylinu pro použití kontroly obezity, je takové množství, které snižuje tělesnou hmotnost. Jak odborníci rozpoznávají, účinné množství léčebného přípravku se bude měnit v závislosti na mnoha faktorech včetně věku a hmotnosti pacienta, pacientova fyzického stavu, účinku, který má být dosažen, a dalších faktorech.

• · • ·

Účinné jednotlivé, rozdělené nebo kontinuální účinné dávky sloučenin, obsahujících například ²⁵'²⁸'²⁹Pr_O-h-amylin, ¹⁸Arg²⁵'^28,29Pro-h-amylin a ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylin, jsou typicky v rozmezí přibližně 0,01 až přibližně 5 mg/den, výhodně přibližně 0,05 až 2 mg/den a výhodněji přibližně 0,1 až 1 mg/den, pro 70 kg pacienta, podávané v jednotlivé, rozdělené nebo kontinuální dávce. Přesná dávka, která bude podávána, je určena ošetřujícím lékařem a závisí na řadě faktorů včetně těch, které jsou uvedeny výše. Podávání by mělo začít při první známce obezity. Podávání může být injekcí nebo infúzí, výhodně intravenózní, subkutánní nebo intramuskulární. Perorálně aktivní sloučeniny se mohou brát ústy, ale dávky se zvýší 5 až 10 x.

Obecně v léčení nebo prevenci obezity jsou sloučeniny tohoto vynálezu podávány pacientům, kteří tuto léčbu potřebují, v rozmezí dávek podobnému rozmezí uvedenému výše, ale sloučeniny se mohou podávat častěji, například jednou, dvakrát nebo třikrát denně nebo kontinuálně. Výhodně jsou dávky peptidových agonistů, například pramlintidu, podávány subkutánně v dávce 30 až 300 g podávané jednou až čtyřikrát denně a výhodněji v dávkách 30 až 120 gg podávaných dvakrát až čtyřikrát denně.

Pro lepší porozumění předkládanému vynálezu jsou připojeny následující příklady, které popisují výsledky série pokusů. Studie týkající se tohoto vynálezu nelze v žádném případě považovat za omezení vynálezu. Varianty vynálezu, nyní neznámé a vyvinuté později, které jsou v kompetenci průměrného odborníka, spadají také do rámce předkládaného vynálezu, jak je zde popsán a definován v patentových nárocích.

♦ * • · · ·· ··

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Měření tělesné hmotnosti: 4-týdenní studie diabetiků typu 2, kteří potřebují inzulín

Účastníci studie byli muži a ženy ve věku od 25 do 78 let s anamnézou diabetes mellitus typu II vyžadující léčbu inzulínem alespoň 6 měsíců před testovací návštěvou. Tělesná hmotnost pacientů se nelišila více než o 45 % od žádoucí hmotnosti před přijetím do studie (na základě tabulek Metropolitan Life). Studie použila metody popsané v práci Thompson et al. (Diabetes, 46, 632-636, 1997). Po úvodním období s placebem byli pacienti randomizováni do skupin pro příjem placeba nebo jednoho ze tří dávkových režimů ²⁵'^2a,29proh-amylinu (pramlintidu) po dobu 4 týdnů: 30 μ5 QID (před snídaní, obědem, večeří a večerním zákuskem), 60 TID (před snídaní, obědem a večeří) nebo 60 μ5 QID (před snídaní, obědem, večeří a večerním zákuskem). Během lékového období studie si pacienti sami podávali čtyři injekce studovaného léčiva denně, během 15 minut před každým jídlem a večerním zákuskem. V období dvojitě slepé studie dostávali pacienti randomizovaní na pramlintid 60 μg TID před večerním zákuskem placebo. Jak pramlintid, tak placebo byly podávány jako nezávislé injekce do subkutánní tkáně přední břišní stěny, specifické místo se měnilo po každé injekci. Pacienti byli instruováni, aby zůstali na své obvyklé dietě, inzulínu a pohybovém režimu v průběhu studie, dokud nebudou instruováni výzkumnými pracovníky jinak a aby před všemi klinickými návštěvami abstinovali od alkoholických nápojů.

Jak je ukázáno v tabulce I, nastala statisticky významná redukce hmotnosti proti výchozí hmotnosti v týdnu 4 ve skupinách s pramlintidem 60 μς TID (průměr = -0,89 kg, p = 0,0056) a pramlintidem 60 μg QID (průměr = -0,72 kg, p = 0,0014). S Hochbergovou korekcí pro vícenásobné srovnání nenastala žádná statisticky významné změna tělesné hmotnosti proti výchozí hmotnosti v týdnu 4 v žádné ze tří skupin s pramlintidem ve srovnání se skupinou s placebem. Podávání pramlintidu při nepřerušeném užívání inzulínu tedy vylepšilo kontrolu glykémie se snížením tělesné hmotnosti, které dosáhlo statistické významnosti ve skupinách se 60 μg TID a QID. Toto snížení je v ostrém kontrastu s hmotnostním přírůstkem obvykle spojeným se zlepšenou kontrolou glukózy dosaženou samotným inzulínem u pacientů s diabetem typu 2.

Tabulka I

Tělesná hmotnost:	změna od	výchozí	hmotnosti	do týdnu	4
		Výchozí hmotnost	Změna v	týdnu 4	Hodnota	p*
Skupina	Počet	Průměr	Průměr	Medián	Ve skupině	Srovnání
ošetřená:		(kg)	(kg)	(kg)	s léčivem	s	placebem
Placebo	47	87,0	-0, 04	0, 0	NV		NP
Pramlintid	47	88,5	-0,36	-0,45	NV		NV
30 gg QID
Pramlintid	48	86,2	-0,89	-1,05	0,0056		NV
60 gg TID
Pramlintid	51	91,5	-0,72	-0,45	0,0014		NV
60 gg QID

* Studentův t-test (srovnání ve skupinách s léčivem). Dvourozměrná analýza ANOVA (srovnání s placebem) s Hochbergovou korekcí.

NV = statisticky nevýznamné, NP = nepoužitelné «· « · · · ·* 99 ···· ···· · · · · ·· · · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · · · · ·

9999 999 99 99· 99 99

Příklad 2

Měření tělesné hmotnosti: 52 týdnů dlouhá studie s diabetiky typu 1

Tato studie byla multicentrická, dvojitě slepá, s kontrolním placebem a paralelními skupinami s potenciálním zvyšováním dávky. Účastníci studie byli muži a ženy ve věku od 16 do 70 let s diabetes mellitus typu 1. Pacienti si sami podávali čtyři subkutánní injekce s 30 ng pramlintidu nebo placeba denně, před každým jídlem a zákuskem před spaním. Určití pacienti (ti z těch, co brali pramlintid, kteří měli snížený HbAlc proti výchozí hodnotě méně než 1,0 % po 13 týdnech léčby) byli znovu randomizováni ve 20 týdnech na buď 30 nebo 60 μg QID pro zbytek studie. Pacienti v této studii bylo ošetřováni studovaným léčivem formulovaným na pH 4,0 v koncentraci umožňující injekci 0,1 ml na dávku. 477 pacientů dostalo alespoň jednu dávku studovaného léčiva (pramlintid nebo placebo). Ze 477 pacientů randomizovaných a pacientů, kterým bylo podáváno léčivo, 52 týdenní studii ukončilo 341.

Pacienti léčení pramlintidem prodělali klinicky a statisticky významné snížení tělesné hmotnosti ve srovnání s placebem, v době 13, 26 a 52 týdnů (tabulka II) . Největší rozdíl proti placebu byl pozorován ve 26 a 52 týdnech (snížení alespoň 1,2 kg ve srovnání s placebem v každém časovém bodu). Ztráta hmotnosti nastala zejména u pacientů, kteří měli výchozí index tělesné hmotnosti (BMI) alespoň 27,0 kg/m², což ukazuje největší přínos u obézních pacientů (tabulka III).

Pacienti, kteří brali pramlintid v podskupině pacientů s výchozími hladinami HbAlc alespoň 8,0 % a stabilní dávkou

inzulínu, prodělali průměrné snížení tělesné hmotnosti ve srovnání s placebem ve všech třech časových bodech (tabulka IV). Toto pozorování je v souladu s dobře známým účinkem inzulínu napomáhat růstu tělesné hmotnosti. Zdá se tedy, že pramlintid snižuje nárůst tělesné hmotnosti indukovaný inzulínem.

Data vykazující normální rozložení byla analyzována použitím dvourozměrné analýza variance. V případech, kdy bylo shledáno, že data nesledují normální rozložení, byly použity neparametrické metody (Kruskal-Wallisův test) založené na kategoriích. V těchto případech je uveden Hodges-Lehmanův estimační koeficient místo průměru.

Tabulka II

Tělesná hmotnost: změny proti výchozí hmotností

Hmotnosti v týdnech	13, 26 a 52
Časový bod/tělesná	Placebo (n=154)	Pramlintid 30 nebo
hmotnost (kg)		60 μg QID (n=163)
Výchozí hmotnost
Průměr (SE)	76,3 (1,1)	76,4 (1,1)
Medián	75, 0	75, 9
Rozmezí	47, 121,8	46,4, 113,6
Týden 13 (3 měsíce)
Průměr (SE)	76,5 (1,1)	75,4 (1,1)
Medián	75, 1	75, 6
Rozmezí	45, 125,7	47,3, 110,5
Změna od výchozí hmotnosti
Průměr (SE)	0,2 (0,2)	-1,0 (0,2)
Medián	0	-i,o
Rozmezí	-6,0, 8,2	-7,6, 8,2
Hodgesův-Lehmanův	-	-1,2

• φφ · • · · · · · · · « · • · · · ····· • ·· · · · · · · · • · φ · · · · · ··· ·· ··· ·· <· estimační koeficient pro rozdíl proti placebu

Hodnota pf	-		0,0001*
Týden 26 (6 měsíců)	76,9 (1,1)		75,5 (1,1)
Průměr (SE)	75, 9		76,4
Medián	45, 8, 126,	8	46,4, 111,2
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti
Průměr (SE)	0,6 (0,2)		-0,9 (0,3)
Medián	0, 55		-0, 5
Rozmezí Hodgesův-Lehmanův estimační koeficient pro rozdíl proti placebu	-7,3, 9,3		-23,5, 9,1 -1,3
Hodnota pf	-		0,0001*
Týden 52 (12 měsíců)
Průměr (SE)	77,1 (1,1)		76,0 (1,1)
Medián	75, 7		76, 4
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	44, 8, 126,	8	48,2, 109,9
Průměr (SE)	0,8 (0,3)		-0,5 (0,3)
Medián	0, 8		-0, 5
Rozmezí Průměrný rozdíl proti placebu	-11,5, 11,	2	-12,0, 13,7 -1,3
Hodnota p*	-		0,0137*

t Kruskal-Wallisův test

Φ dvourozměrná ANOVA * statisticky významný rozdíl ve srovnání s placebem ♦ · « ·· · ·· ·* • · · · · · · · · · « · • · · · · ···· • ···* ······ • · ♦ · · · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ft·

Tabulka III

Tělesná hmotnost: změny proti výchozí hmotnosti u pacientů s výchozí hmotností BMI □ 27,0 kg/m² nebo < 27,0 kg/m² Hmotnosti v týdnech 13, 26 a 52

Podskupina BMI/tělesná hmotnost (kg)	Placebo (n=154)	Pramlintid 30 nebo 60 pg QID (n=164)
Výchozí BMI □ 27,0 kg/m2 Změna v týdnu 52 Počet	51	53
Průměr (SE)	0,4 (0,53)	-1,8 (0,65)
Rozmezí	-6,4, 11,2	-12,0, 9,1
Výchozí BMI < 27,0 kg/m2 Změna v týdnu 52 Počet	103	110
Průměr (SE)	1,0 (0,36)	0,1 (0,28)
Rozmezí	-11,5, 11,2	-5,0, 13,7

Tabulka IV

Tělesná hmotnost: změny proti výchozí hmotnosti

Pacienti s HbAic □ hmotnosti v týdnech	8,0 %, 13, 26 a	inzulín v 52	± 10 % od výchozí
Časový bod/tělesná	Placebo	(n=31)	Pramlintid 30 nebo
hmotnost (kg)			60 pg QID (n=39)
Výchozí hmotnost
Průměr (SE)	75, 9	(2,2)	81,3 (2,2)
Medián	74, 6		79, 4
Rozmezí	52,4	, 113,6	55,5, 113,6
Týden 13 (3 měsíce)
Průměr (SE)	75, 8	(2,1)	80,3 (2,1)

• ··· · · · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99

Medián	74,1		78, 6
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	56, 5, 108,	2	56,4, 110,	5
Průměr (SE)	-0,1 (0,4)		-1,0 (0,4)
Medián	0		-1,4
Rozmezí Průměrný rozdíl proti placebu	-6,4, 4,1		-7,6, 8,2 -0,9
Hodnota p+	-		0,0745
Týden 26 (6 měsíců)	76,2 (2,0)		80,8 (2,1)
Průměr (SE)	75, 9		80, 5
Medián	54, 9, 108,	2	55,5, 111,	2
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti
Průměr (SE)	0,3 (0,5)		-0,5 (0,6)
Medián	0,4		0
Rozmezí Průměrný rozdíl proti placebu	-5,4, 5,9		-10,5, 9,1 -0, 8
Hodnota pT	-		0,1197
Týden 52 (12 měsíců)
Průměr (SE)	76,5 (2,1)		81,7 (2,1)
Medián	75, 9		79, 6
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	54,5, 109,	1	56, 4, 109,	9
Průměr (SE)	0,6 (0,7)		0,4 (0,6)
Medián	0,7		0,2
Rozmezí Průměrný rozdíl proti placebu	-7,0, 11,2		10,0, 13,7 -0,2
Hodnota p*	-		0,2441

t dvourozměrná ANOVA * statisticky významný rozdíl ve srovnání s placebem

0 • 0 000 0 0 0 0 0·00 000 00 00· 00 00

Příklad 3

Měření tělesné hmotnosti: 52 týdnů dlouhá studie s diabetiky typu 2, kteří potřebují inzulín

Tato studie byla multicentrická, dvojitě slepá, s kontrolním placebem a paralelními skupinami s dávkami v daném rozmezí. Účastníci studie byli muži a ženy ve věku od 18 do 75 let s diabetes mellitus typu 2, kteří potřebují inzulín. Pacienti si sami podávali tři subkutánní injekce pramlintidu (30, 75 nebo 150 μ5 TID) nebo placeba (TID) denně, před každým jídlem, po dobu 52 týdnů. Pacienti v této studii bylo ošetřováni studovaným léčivem formulovaným na pH 4,7 v koncentraci umožňující injekci 0,3 ml na dávku. Dvojitě slepému období s léčbou předcházelo úvodní slepé období pouze s placebem dlouhé 3 až 10 dnů. Z 539 pacientů randomizovaných a pacientů, kterým bylo podáváno léčivo, 52 týdenní studii ukončilo 381.

Pacienti léčení každou ze tří dávek pramlintidu prodělali klinicky a statisticky významné snížení tělesné hmotnosti ve srovnání s placebem, v době 13, 26 a 52 týdnů (tabulka V) . Největší rozdíl proti placebu byl pozorován ve 26 a 52 týdnech (snížení alespoň 2,3 a 2,7 kg ve srovnání s placebem v těchto časových bodech). Hmotnost pacientů ošetřovaných placebem se vzhledem k výchozí hmotnosti zvýšila ve všech třech časových bodech, na rozdíl od redukce hmotnosti u tří skupin s pramlintidem ve všech časových bodech. Ztráta hmotnosti nastala jak u pacientů, kteří měli výchozí index tělesné hmotnosti (BMI) alespoň 27,0 kg/m², tak u pacientů, kteří měli výchozí BMI méně než 27,0 kg/m² (tabulka VI).

• · ftft ftft ftft · · · · • ft ftft· ···· • · · · · ftftft··· • · ftftft ···· • ••ft ··· ftft ··· ftft ♦ ·

Pacienti ve všech třech skupinách s pramlintidem s výchozí hladinou HbAlc alespoň 8,0% a se stabilní dávkou inzulínu prodělali snížení tělesné hmotnosti ve srovnání s placebem ve všech časových bodech (tabulka VII) . Velikost reakce byla obvykla u všech pacientů srovnatelná, což svědčí pro účinek nezávislý na změnách v dávce inzulínu.

Normálně distribuovaná data byla analyzována použitím dvourozměrné analýza variance (s Hochbergovou korekcí pro Bonferroniho postup pro vícenásobné srovnání). V případech, kdy bylo shledáno, že data nesledují normální distribuci, byly použity neparametrické metody (Kruskal-Wallisův test) založené na kategoriích. V těchto případech je uveden HodgesLehmanův estimační koeficient místo průměru.

Tabulka V

Tělesná hmotnost: změny proti výchozí hmotnosti

Hmotnosti v týdnech 13, 26 a 52

Časový bod/tělesná	Placebo	Pramlintid	Pramlintid	Pramlintid
hmotnost (kg)	(n=89)	30 μς TID	75 μg TID	150 μ9 TID
		(n=86)	(n=93)	(n=77)
Výchozí hmotnost
Průměr (SE)	90,6 (1,6)	90,3 (1,8)	93,2 (1,8)	94,3 (2,1)
Medián	90,3	89,15	92,3	95,7
Rozmezí	59,5, 130,9	60,0, 140,0	51,8, 165,0	57,3, 158,1

Týden 13 (3 měsíce)

Průměr (SE)	91,3 (1,6)	89, 8	(1,8)	92,5	(1,9)	92,7	(2,1)
Medián	90, 0	89,3		92,3		92,3
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	60,5, 132,9	57,7,	142,7	49,1,	166,8	56,4,	156,8
Průměr (SE)	0,6 (0,2)	-0,5	(0,3)	-0, 6	(0,4)	-1,6	(0,3)
Medián	0, 5	-0,7		-0,4		-1,4

Rozmezí Hodgesův-Lehmanův estimační koeficient pro rozdíl proti placebu	-6,9, 8,7	-7,7, 10,5 1,1	-23,4, 9,5 -0,9	9,5, 2,7 -2,0
Hodnota pŤ	-	0,0006*	0,0066*	0,0001*
Týden 26 (6 měsíců)
Průměr (SE)	91,5 (1,7)	89,7 (1,8)	92,3 (1,8)	92,6 (2,1)
Medián	90,5	89,1	92,3	92,3
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	58, 6, 133,0	55, 9, 140,9	46,4, 162,5	58,2, 156,4
Průměr (SE)	0,8 (0,3)	-0,6 (0,3)	-0,9 (0,5)	-1,7 (0,3)
Medián	0,9	-0,45	0	-1,5
Rozmezí Hodgesův-Lehmanův estimační koeficient pro rozdíl proti placebu	-5,3, 8,3	-10,7, 11,4 -1,3	-24,7, 9,0 -1,3	-10,0, 3,2 -2,3
Hodnota p1	-	0,0005*	0,0029*	0,0001*
Týden 52 (12 měsíců)
Průměr (SE)	91,9 (1,7)	89,6 (1,9)	92,3 (1,9)	92,4 (2,1)
Medián	90, 0	89,05	92,7	92,7
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	60,5, 136,6	55,9, 147,3	46,6, 170,8	56,4, 158,2
Průměr (SE)	1,2 (0,4)	-0,6 (0,4)	-0,9 (0,5)	-1,9 (0,7)
Medián	0,9	-0,4	-0,3	-1,8
Rozmezí Průměrný rozdíl proti placebu	-8,0, 20,5	-13,6, 11,9 -1,6	-31,1, 10,0 -1,4	-43,2, 7,3 -2,7
Hodnota pŤ	-	0,0009*	0,0106*	0,0001*

t Kruskal-Wallisův test s Hochbergovou korekcí pro vícenásobná srovnání proti placebu * statisticky významný rozdíl ve srovnání s placebem ·· · ·♦ 9 ·· ·· • · 9· 9 9 99 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99

Tabulka VI

Tělesná hmotnost: změny proti výchozí hmotnosti u pacientů s výchozí hmotností BMI >27,0 kg/m² nebo < 27,0 kg/m² Hmotnosti v týdnech 13, 26 a 52

Podskupina BMI	Placebo	Pramlintid	Pramlintid	Pramlintid
/tělesná hmotnost	(n=91)	30 gg TID	75 pg TID	150 pg TID
(kg)		(n=88)	(n=97)	(n=80)
Výchozí BMI > 27,0 kg/m2
Změna v týdnu 52
Počet	67	67	80	62
Průměr (SE)	0,7 (0,43)	-0,3 (0,52)	-0,7 (0,47)	-1,8 (0,80)
Rozmezí	-8,0, 10,0	-13,6, 11,9	-13,7, 10,0	-43,2, 7,3
Výchozí BMI < 27,0 kg/m2
Změna v týdnu 52
Počet	24	21	17	18
Průměr (SE)	2,4 (1,08)	-0,7 (0,56)	-1,7 (2,07)	-1,9 (0,71)
Rozmezí	-3,4, 20,5	-4,7, 6,4	-31,1, 9,0	-7,2, 6,5

Tabulka VII
Tělesná hmotnost: změny proti Pacienti s HbAic > 8,0 %,	výchozí hmotnosti
inzulín v 52	± 10 % od výchozí
hmotnosti v týdnech	13, 26 a
Časový bod/tělesná	Placebo	Pramlintid	Pramlintid	Pramlintid
hmotnost (kg)	(n=26)	30 μg TID	75 pg TID	150 pg TID
		(n=20)	(n=22)	(n=18)
Výchozí hmotnost
Průměr (SE)	84,3 (2,9)	92,7 (3,5)	93,3 (3,2)	99,8 (5,6)
Medián	82,15	89,75	90, 9	98, 9

φφ φ* φ φ • φ

.·

ΦΦΦΦ • φφ φφ φφ · φ φ φ φ ΦΦΦΦ • φ φ φ φ φ φ ΦΦΦΦ φφφ φφ φφ

Týden 13 (3 měsíce)

Průměr (SE)	84,3 (2,8)	92,5 (3,6)	93,3 (3,3)	98,3 (5,7)
Medián	81,5	88, 85	91, 6	97,4
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	60,5, 112,3	65,9, 123,4	67,3, 121,8	57,7, 156,8
Průměr (SE)	0,0 (0,2)	-0,2 (0,5)	-0,0 (0,7)	-1,5 (0,4)
Medián	0,45	-0,55	0	-1,55
Rozmezí Hodgesův-Lehmanův estimační koeficient pro rozdíl proti placebu	-3,4, 1,9	-4,6, 6,4 -0,5	-5,9, 6,4 -0,4	-3,9, 2,7 1,9
Hodnota pŤ	-	0,2812	0,5827	0,0005*
Týden 26 (6 měsíců)
Průměr (SE)	84,8 (2,9)	92,4 (3,6)	93,1 (3,3)	98,1 (5,6)
Medián	83,15	89,75	91, 8	97,5
Rozmezí Změna od výchozí hmotnosti	60,9, 117,5	64,1, 123,6	71,8, 121,1	58,9, 156,4
Průměr (SE)	0,5 (0,3)	-0,3 (0,5)	-0,1 (0,8)	-1,8 (0,5)
Medián	0,7	-0,45	0	-1,4
Rozmezí Hodgesův-Lehmanův estimační koeficient pro rozdíl proti placebu	-2,7, 4,7	-3,7, 4,1 -0, 8	-6,8, 7,3 -0,6	-5,4, 2,0 -2,2
Hodnota pŤ	-	0,8903	0,3616	0,0552

Týden 52 (12 měsíců)
Průměr (SE)	85,2 (2,9)	91, 9	(3,5)	93,4 (3,1)	95,3 (	:5,5)
Medián	83,3	89, 05		92,05	94, 0
Rozmezí	60,9, 115,0	66, 7,	122,7	70,0, 116,2	57,3,	158,2
Změna od výchozí
hmotnosti
Průměr (SE)	0,9 (0,7)	-0, 8	(0,4)	0,1 (1,0)	-4,6 (	2,3)
Medián	0,45	-0, 65		0,7	-2,55
Rozmezí	-4,6, 14,3	-4,1,	3,2	-8,6, 10,0	-43,2,	2,3

• · · ·

Průměrný rozdíl proti -	-1,8	-0, 8	-5,5
placebu
Hodnota p*	0,1837	0,2377	0,0069*

t Kruskal-Wallisův test s Hochbergovou korekcí pro vícenásobná srovnání proti placebu t dvourozměrná ANOVA s Hochbergovou korekcí pro vícenásobná srovnání proti placebu * statisticky významný rozdíl ve srovnání s placebem

Příklad 4

Příprava ²⁵'²⁸'²⁹Pro-h-amylinu

Syntéza na pevné fázi ^{25, 28,29}Pro-h-amylinu se prováděla pomocí standardních metod pro syntézu peptidů s použitím metylbenzhydrylaminové vazebné pryskyřice a řetězcem chráněným N^a-Boc/benzylovou skupinou.

postranním

Pryskyřice ²'⁷-[disulfid]amylin-MBHA se získala ošetřením Acm-chráněných cysteinů trifluoroacetátem thallitým (III) v kyselině trifluoroctové. Poté, co bylo dosaženo cyklizace, byly pryskyřice a skupiny chránící postranní řetězce odštěpeny tekutým HF v přítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. ²⁵'²⁸'²⁹proh-amylin byl purifikován preparativní HPLC s reverzní fází. Analytickou HPLC a kapilární elektroforézou se zjistilo, že peptid je homogenní a struktura byla ověřena analýzou aminokyselin a sekvenční analýzou. Produkt měl požadovaný hmotnostní ion. Fab hmotnostní spektrum: (M+H)⁺ =3,949.

• · · · · ··· · · · to ·· ··· · to · ·

Příklad 5

Příprava ¹⁸Arg²⁵' ^28,29Pro-h-amylinu

Syntéza na pevné fázi ¹⁸Arg²⁵' ^28,29Pro-h-amylinu se prováděla pomocí standardních metod pro syntézu peptidů s použitím metylbenzhydrylaminové vazebné pryskyřice a postranním řetězcem chráněným N^a-Boc/benzylovou skupinou. ²'⁷-[disulf id] amylin-MBHA-pryskyřice se získala ošetřením Acmchráněných cysteinů trifluoroacetátem thallitým (III) v kyselině trifluoroctové. Poté, co bylo dosaženo cyklizace, byly pryskyřice a skupiny chránící postranní řetězce odštěpeny tekutým HF v přítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. ¹⁸Arg²⁵'²⁸'²⁹Pro-h-amylin byl purifikován preparativní HPLC s reverzní fází. Analytickou HPLC a kapilární elektroforézou se zjistilo, že peptid je homogenní a struktura byla ověřena analýzou aminokyselin a sekvenční analýzou. Produkt měl požadovaný hmotnostní ion. Fab hmotnostní spektrum: (M+H)⁺ = 3,971.

Příklad 6

Příprava ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylinu

Syntéza na pevné fázi ¹⁸Arg^25,28'²⁹Pro-h-amylinu se prováděla pomocí standardních metod pro syntézu peptidů s použitím metylbenzhydrylaminové vazebné pryskyřice a postranním řetězcem chráněným skupinou N^a-Boc/benzyl. ²'⁷-[disulfid] amylin-MBHA-pryskyřice se získala ošetřením Acmchráněných cysteinů trifluoroacetátem thallitým (III) v kyselině trifluoroctové. Poté, co bylo dosaženo cyklizace,

byly pryskyřice a skupiny chránící postranní řetězce odštěpeny tekutým HF v přítomnosti dimetylsulfidu a anizolu. ¹⁸Arg²⁵'²⁸Pro-h-amylin byl purifikován preparativní HPLC s reverzní fází. Analytickou HPLC a kapilární elektroforézou se zjistilo, že peptid je homogenní a struktura byla ověřena analýzou aminokyselin a sekvenční analýzou. Produkt měl požadovaný hmotnostní ion. Fab hmotnostní spektrum: (M+H)⁺ = 3,959.

Příklad 7

Test vazby receptorů

Hodnocení vazby sloučenin na receptory amylinu se provádělo následujícím způsobem. Potkaní amylin značený ¹²⁵I (Bolton Hunter značený v N-koncovém lysinu) byl zakoupen od firmy Amersham Corporation (Arlington Hights, IL) . Specifické aktivity v době použití se pohybovaly v rozmezí od 1950 do 2000 Ci/mmol. Neznačené peptidy byly získány od firmy BACHEM lne. (Torrance, CA) a od Peninsula Laboratories (Belmont, CA) .

Samci laboratorního potkana kmene Sprague-Dawley (200 až 250 gramů) byli usmrceni dekapitací. Mozky byly přeneseny do chladného fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnany (PBS). Od ventrálního povrchu se dělaly řezy rostrálně k hypotalamu, laterálně ohraničené tractus olfactorius a táhly se ve 45° úhlu mediálně od těchto traktů. Tato tkáň bazálního předního mozku, obsahující nucleus accumbens a sousední oblasti, se zvážila a homogenizovala v ledově chladném 20 mM pufru HEPES (20 mM kyselina HEPES, pH upravené na 7,4 s NaOH ve 23 °C). Membrány se promyly třikrát

v čerstvém pufru pomocí stočení po dobu 15 minut ve 48000xg. Konečný pelet membrán byl resuspendován ve 20 mM pufru HEPES obsahujícím 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF).

Aby se měřila vazba ¹²⁵I, membrány ze 4 mg původní vlhké hmotnosti tkáně se inkubovaly se ^lz5I-amylinem ve 12-16 pM ve 20 mM pufru HEPES obsahujícím 0,5 mg/ml bacitracinu, 0,5 mg/ml bovinního sérového albuminu a 0,2 mM PMSF. Roztoky se inkubovaly 60 minut ve 23 °C. Inkubace se ukončila filtrací přes filtry ze skleněných vláken GF/B (Whatman lne., Clifton, NJ) , které byly předem namočeny po dobu 4 hodin do 0,3% polyetyleniminu, aby se snížila nespecifická vazba radioaktivně značených peptidů. Filtry byly bezprostředně před filtrací propláchnuty 5 ml chladného PBS a ihned po filtraci 15 ml chladného PBS. Filtry byly vyjmuty a radioaktivita byla vyhodnocena pomocí gamma-počítače s účinností 77 %. Kompetiční křivky byly naměřeny v přítomnosti 10’¹“ až ΙΌ⁶ M testované sloučeniny a byly analyzovány pomocí počítače, a sice užitím nelineární regrese pro 4 parametrovou logistickou rovnici (program Inplot, GraphPAD Software, San Diego, Kalifornie).

V tomto testu se purifikovaný humánní amylin vázal na svůj receptor při naměřené IC50 přibližně 50 pM. Výsledky pro testované sloučeniny jsou uvedeny v tabulce VIII, která ukazuje, že každá ze sloučenin má významnou vazebnou aktivitu pro receptor.

Příklad 8

Test na svalu musculus soleus

Stanovení aktivity agonisty amylinu se provádělo testem na m. soleus následujícím způsobem. V pokusu byly užiti samci potkanů kmene Harlan Sprague-Dawley o hmotnosti přibližně 200 g, aby se hmotnost odděleného m. soleus udržela nižší než 40 mg. Zvířata hladověla 4 hodiny před utracením dekapitací. Z dolní končetiny byla odpreparována kůže a končetina byla špendlíky připevněna ke korkové podložce. Achilova šlacha byla přeťata právě nad os calcis a m. gastrocnemicus byl odtažen od zadní části tibie. M. soleus, malý plochý sval dlouhý 15 až 20 mm a silný 0,5 mm, ležící na povrchu m. gastrocnemicus směrem ke kosti, byl obnažen a očištěn pomocí jemných nůžek a pinzety. M. soleus byl pak rozdělen na stejné části čepelí skalpelu předozadním směrem bříškem svalu, takže byly získány celkem 4 svalové proužky z každého zvířete. Po vyjmutí svalu ze zvířete byl po krátkou dobu sval uchován ve fyziologickém roztoku. Nebylo nutné, aby byl sval udržován napnutý, neboť bylo prokázáno, že to nemá žádný vliv na inkorporaci radioaktivně značené glukózy do glykogenu.

Svaly byly přeneseny do 50ml Erlenmeyerovy baňky obsahující 10 ml probublaného Krebs-Ringerova bikarbonátového pufru, který obsahoval (na 1 litr) 118,5 mmol (6,93 g) NaCl, 5,94 mmol (443 mg) KC1, 2,54 mmol (282 mg) CaCl2, 1,19 mmol (143 mg) MgSO₄, 1,19 mmol (162 mg) KH₂PO₄, 25 mmol (2,1 g) NaHCOa, 5,5 mmol (1 g) glukózy, rekombinantní humánní inzulín (Humulin-R, Eli Lilly, IN) a testovanou sloučeninu, jak je podrobněji uvedeno dále. Hodnota pH ověřená při 37 °C byla 7,1 až 7,4. Svalové proužky byly rozděleny do různých baněk tak, že 4 svalové proužky z jednoho zvířete byly rovnoměrně

přiřazeny do různých testů. Inkubační médium bylo jemně probubláváno karbogenem (95 % O2, 5 % CO2) při současném protřepávání v 37 °C v kmitající vodní lázni. Po půlhodinové preinkubaci bylo přidáno do každé banky 0,5 μΰί

U-¹⁴C-glukózy a inkubace pak pokračovala dalších 60 minut. Každý svalový proužek byl pak rychle vyjmut, osušen a zmražen v tekutém dusíku, zvážen a uložen pro následné stanovení

C-glykogenu.

Stanovení C-glykogenu se provádělo v 7ml scintilační viálce. Každý vzorek zmrzlého svalu byl vložen do viálky a natráven v 1 ml 60% hydroxidu draselného v 70 °C při stálém třepání po 45 minut. Rozpuštěný glykogen byl pak precipitován přidáním 3 ml absolutního alkoholu a zchlazením přes noc na teplotu -20 °C. Supernatant pak byl jemně odsát, glykogen byl opláchnut etanolem, etanol byl odsát a precipitát byl usušen pod vakuem. Všechen etanol byl před měřením odpařen, aby se zabránilo zhášení při scintilačním měření. Glykogen se pak znovu rozpustil v 1 ml vody a 4 ml scintilačního roztoku a byl pak změřen na ¹⁴C.

Rychlost inkoroporace glukózy do glykogenu (vyjádřená v μιηοΐ/g/hod) byla získána z hodnot specifické aktivity ¹⁴C-glukózy v 5,5mM glukóze v inkubační médiu a z celkového ¹⁴C v glykogenu extrahovaném ze svalu, získaných scintilačním měřením. Křivky závislosti odpovědi na dávce byly získány proložením dat 4 parametrovým logistickým modelem metodou čtverců iterativním postupem (program ALLFIT, NIH, MD) a z ní byly stanoveny hodnoty EC50.

Jelikož hodnoty EC50 mají logaritmicko-normální rozložení, je uvedena ± střední chyba logaritmu. Párové srovnání bylo provedeno pomocí t-testu pomocí programu SYSTAT (Wilkinson, SYSTAT: the systém for statistics, SYSTAT lne., Evanston, IL, 1989).

nejmenších verze 2.7, • ·

Křivky závislosti odpovědi na dávce byly vyneseny pro svaly v médiu s 7,1 nM (1000 μυ/ml) inzulínem a každou z testovaných sloučenin v konečné (nominální) koncentraci 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 a 1000 nM. Každý test obsahoval také vnitřní pozitivní kontroly obsahující potkaní amylin z jednoho vzorku amylinu uschovaného v lyofilizovaném stavu v -70 °C.

Humánní amylin je známý hyperglykemický peptid a naměřené hodnoty EC50 amylinových preparátů v testu s m. soleus jsou typicky v rozmezí 1 až 10 nM, ačkoliv některé komerční preparáty s čistotou nižší než 90 % mají vyšší EC50 díky přítomnosti kontaminujícíh příměsí, které snižují měřenou aktivitu. Výsledky pro testované sloučeniny jsou uvedeny v následující tabulce VIII.

Tabulka VIII

	ECso(nM) pro sval	Test vazby receptorů ICso(pM)	Test na m. soleus
1)	25Pro26Val28'29Pro-h-amylin	18,0	4, 68
2)	2,7cyklo- [2Asp, 7Lys] -h-amylin	310, 0	6, 62
3)	2-37h-amylin	236, 0	1, 63
4)	1Ala-h-amylin	148, 0	12,78
5)	1Ser-h-amylin	33, 0	8,70
6)	25,28Pro-h-amylin	26, 0	13, 20
7)	des-1Lys25,28Pro-h-amylin	85, 0	7,70
8)	18Arg25,28Pro-h-amylin	32,0	2, 83
9)	des-1Lys18Arg 25,28Pro-h-amylin	82,0	3,77
10)	18Arg25,28'29Pro-h-amylin	21, 0	1,25
11)	des-1Lys18Arg25,28,29Pro-h-amylin	21,0	1,86
12)	25,28,29Pro-h-amylin	10, 0	3, 71
13)	des-1Lys25,28'29Pro-h-amylin	14,0	4, 15

• · · · • ♦ ♦ · • · · · • · · · ·· ·*

Příklad 9

Test vyprazdňování žaludku s fenolovou červení

Vyprazdňování žaludku bylo měřeno modifikovanou metodou (Plourde et al., Life Sci. 53: 857-862, 1993), kterou původně popsali Scarpignato et al. (Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246: 286-295, 1980). Stručně shrnuto, potkanům při vědomí bylo podáno gastrickou sondou 1,5 ml bezbarvého gelu obsahujícího 1,5% metylcelulózu (M-0262, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) a indikátorem 0,05% fenolovou červení. Dvacet minut po intubaci žaludku byly potkani anestetizováni 5% halotanem, žaludek byl zasvorkován v místě pylorického a spodního esofagálního svěrače cévní svorkou, vyjmut a otevřen do alkalického roztoku, který byl pak doplněn na konstantní objem. Obsah žaludku pak byl stanoven na základě intenzity fenolové červeně v alkalickém roztoku měřením absorbance při vlnové délce 560 nm. Ve většině experimentů byl žaludek čistý. V jiných experimentech byl obsah žaludku centrifugován, aby se roztok pro měření absorbance projasnil. Pokud zředěný obsah žaludku zůstal zakalený, spektrofotometrická absorbance způsobená fenolovou červení byla určena jako rozdíl v alkalickém a okyseleném rozpouštědle. V samostatném experimentu se 7 potkany byl jak žaludek tak tenké střevo vyjmuty a otevřeny do alkalického roztoku. Množství fenolové červeně, která byla získána z horní části gastrointestinálního traktu do 29 minut po nakrmění sondou byla 89 ± 4%, barvivo, které se nevratně navázalo na lumen střev, lze započítat pro vyrovnání. Pro kompenzaci této malé ztráty, procento obsahu žaludku zbylé po 20 minutách bylo vyjádřeno jako frakce celkového obsahu žaludku u kontrolní skupiny potkanů utracených bezprostředně • Φ »00 »000 0 po krmení sondou v tomtéž experimentu. Procento zbývajícího obsahu žaludku = (absorbance ve 20 minutách)/(absorbance v čase 0) . Křivka závislosti odpovědi na dávce pro vyprazdňování žaludku byla získána proložením dat 4parametrovým logistickým modelem metodou nejmenších čtverců iterativním postupem (program ALLFIT, verze 2.7, NIH, MD) a z ní byly stanoveny hodnoty EC₅₀. Jelikož hodnoty EC₅o mají logaritmicko-normální rozložení, je uvedena ± střední chyba logaritmu. Párové srovnání bylo provedeno pomocí jednorozměrnou analýzou rozptylu vícenásobným srovnávacím testem Student-Jewman-Keulse pomocí programu Instat, verze 2.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) na hladině významnosti P < 0,05.

Ve studii dávkové odpovědi byl potkaní amylin (Bachem, Torrance, CA) rozpuštěn v 0,15M solném roztoku a byl podáván jako 0,lml subkutánní bolus v dávce 0, 0,01, 0,1, 1, 10 a 100 μς 5 minut před podáním gelu gastrickou sondou potkanů kmene Harlan Spargue-Dawley (bez diabetů) hladovějícím 20 hodin a diabetickým potkanům BB hladovějícím 6 hodin. Pokud byly injekce amylinu podány 5 minut před sondou s indikátorem fenolovou červení, došlo k potlačení vyprazdňování žaludku závislém na dávce (data nejsou uvedena). Potlačení vyprazdňování žaludku bylo úplné u normálních potkanů HSD po podání 1 μg amylinu a u diabetických potkanů po podání 10 μg (P = 0,22, 0,14). Hodnota ED50 pro inhibici vyprazdňování žaludku byla 0,43 (0,60 nmol/kg) ± 0,19 log jednotek u normálních potkanů a 2,2 μg (2,3 nmol/kg) ± 0,18 log jednotek u diabetických potkanů.

·· · ·# · ·· ·· • · · · · ··· · » · · • · · · · · · · «

Příklad 10

Test vyprazdňování žaludku s glukózou značenou tritiem

Potkani Harlan Spargue-Dawley, bez hladovění a při vědomí, byly znehybněni uchycením za ocas, jehož špička byla umrtvena 2% lidokainem. Tritium v plazmě oddělené z krve odebrané z ocasu 0, 15, 30, 60, 90 a 120 minut po krmení gastrickou sondou bylo stanoveno na počítači beta impulzů. Potkanům byl jednu minutu před krmením sondou injikován subkutánně 1 ml solného roztoku obsahující 0, 0,1, 0,3, 1, 10 nebo 100 μg potkaního amylinu (n - 8, 7, 5, 5, 5 v témže pořadí). Po nakrmení preinjikovaných potkanů glukózou se značeným tritiem hladina tritia v plazmě stoupla rychle (ti/2 přibližně 8 minut) k asymptotě a pak pomalu klesala. Subkutánní injekce amylinu snížila a/nebo zpozdila absorpci značka způsobem závislým na dávce. Aktivita tritia byla integrována za dobu 30 minut, aby se získala plocha pod křivkou, která se vynesla jako funkce dávky amylinu. Hodnota EDso získaná proložením logistické funkce je 0,35 μg amylinu.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití amylinu nebo agonisty amylinu pro výrobu léku k léčení nebo prevenci obezity u člověka.
2. 2. Použití podle nároku 1, kdy agonista amylinu je analog agonisty amylinu.
3. 3. Použití podle nároku 2, kdy analog agonisty amylinu je ^25,28'²⁹Pro-h-amylin.

   4 . amylinu Použití člověku podle podává nároku 1, subkutánně kdy se amylin nebo agonista 5. Použití podle nároku 1, kdy se amylin nebo agonista amylinu podává 1 . x až 4 x denně. 6. Použití podle nároku 5, kdy se amylin nebo agonista amylinu podává v množství 30 pg v jedné dávce až 3 00 pg v jedné dávce. 7. Použití podle nároku 6, kdy se amylin nebo agonista amylinu podává třikrát denně v množství 60 pg na dávku. 8. Použití podle nároku 6, kdy se amylin nebo agonista amylinu podává čtyřikrát denně v množství 60 pg v jedné

   dávce.

   » 9. Použití podle nároku 7 nebo 8, kdy se podává agonista amylinu.

   • · · · » ·♦*· ·· ·· ···· ·♦ · · ♦ « ♦ ··· · · · « · · · • · · ··· · · · · ··· ·· ·» ♦ ·· ··

   10. Použití podle nároku 9, kdy agonista amylinu je ^{25,28, 29}Pro-h-amylin.

   11. Použití amylinu nebo agonisty amylinu pro výrobu léku ke snížení přírůstku hmotnosti indukovaného inzulínem u člověka užívajícího inzulín.

   12. Použití amylinu. podle nároku Hz kdy se podává agonista 13. Použití ^25,28,29Pro-h-amylin podle nároku liz kdy agonista amylinu je 14. Použití mellitus. podle nároku liz kdy člověk trpí diabetes 15. Použití podle nároku 14, kdy člověk trpí diabetes

   mellitus typu 1.