RS58275B1

RS58275B1 - Lipoproteinski kompleksi i njihova proizvodnja i upotrebe

Info

Publication number: RS58275B1
Application number: RS20190093A
Authority: RS
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Daniela Carmen Oniciu; Rose Ackermann
Original assignee: Cerenis Therapeutics Holding Sa
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2019-03-29
Also published as: HUE042314T2; JP7009559B2; IL227634B; SG10201801372YA; TW201240671A; AU2015271986A1; US20240000887A1; NZ613524A; US20250302916A1; JP6219170B2; AU2012214672A1; PT2767546T; US20230372441A1; US11969456B2; SI2673296T1; US11998587B2; RU2627173C2; US20190298800A1; US20120232005A1; DK2767546T3

Description

Opis

1. OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje lipoproteinske komplekse, farmaceutske kombinacije koje obuhvataju komplekse, postupke proizvodnje i prečišćavanja apolipoproteina za takve komplekse, postupke izrade kompleksa i postupke primene kompleksa za lečenje ili sprečavanje kardiovaskularnih bolesti, poremećaja, i/ili stanja povezanih sa njima.

2. POZADINA

2.1. Pregled

[0002] Cirkulišući holesterol nošen je plazmatičnim lipoproteinima--kompleksne čestice kombinacije lipida i proteina koje transportuju lipide u krvi. Četiri glavne klase čestica lipoproteina cirkulišu u plazmi i uključene su u sistem transporta masti: hilomikroni, lipoprotein veoma male gustine (VLDL), lipoprotein male gustine (LDL) i lipoprotein visoke gustine (HDL). Hilomikroni grade kratkotrajni proizvod intestinalne apsorpcije masti. VLDL i, naročito, LDL odgovorni su za isporuku holesterola iz jetre (gde se sintetiše ili dobija iz izvora hrane) u ekstrahepatična tkiva, uključujući arterijske zidove. HDL, nasuprot tome, posreduje u reverzni transportu holesterola (RCT), uklanjanju lipida holesterola, naročito iz ekstrahepatičnih tkiva u jetru, gde se skladište, katabolišu, eliminišu ili recikliraju. HDL takođe ima korisnu ulogu kod zapaljenja, u transportu oksidovanih lipida i interleukina, što zauzvrat može da smanji zapaljenje zidova krvnih sudova.

[0003] Čestice lipoproteina imaju hidrofobno jezgro koje se sastoji od holesterola (obično u obliku holesteril estra) i triglicerida. Jezgro je okruženo površinskim slojem koji obuhvata fosfolipide, neesterifikovan holesterol i apolipoproteine. Apolipoproteini posreduju transport lipida, i neki mogu da budu interakciji sa enzimima uključenim u metabolizam lipida. Najmanje deset apolipoproteina je identifikovano, uključujući: ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ i ApoH. Ostali proteini kao što je LCAT (lecitin:holesterol aciltransferaza), CETP (holesteril estar transfer protein), PLTP (fosfolipid transfer protein) i PON (paraoksonaza) pronađeni su takođe povezani sa lipoproteinima.

[0004] Kardiovaskularne bolesti kao što su koronarna bolest srca, koronarna arterijska bolest i ateroskleroza pretežno su povezane sa povišenim nivoima holesterola u serumu. Na primer, ateroskleroza je sporo napredujuća bolest okarakterisana akumulacijom holesterola unutar arterijskog zida. Ubedljivi dokazi podržavaju teoriju da su lipidi istaloženi u aterosklerotičnim lezijama izvedeni primarno iz plazmatičnih LDL; tako, LDL su postali veoma poznati kao "loš" holesterol. Nasuprot tome, nivoi HDL u serumu u obrnutoj su korelaciji sa koronarnom bolesti srca. Zaista, visoki serumski nivoi HDL odnose se kao negativni faktor rizika. Postoji hipoteza da su visoki nivoi plazmatičnih HDL ne samo zaštita protiv koronarne arterijske bolesti, već mogu da indukuju regresiju aterosklerotičkog plaka (videti, npr.,Badimon et al, 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94; Dansky i Fisher, 1999, Circulation 100:1762-63; Tangirala et al., 1999, Circulation 100(17):1816-22; Fan et al., 1999, Atherosclerosis 147(1):139-45;Deckert et al., 1999, Circulation 100(11):1230-35; Boisvert et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.19(3):525-30; Benoit et al., 1999, Circulation 99(1):105-10; Holvoet et al., 1998, J. Clin. Invest.102(2):379-85; Duverger et al., 1996, Circulation 94(4):713-17; Miyazaki et al., 1995, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.15(11):1882-88; Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113(2):237-46; Liu et al., 1994, J. Lipid Res.35(12):2263-67; Plump et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91(20):9607-11; Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest.94(2):899-903; She et al, 1992, Chin. Med. J. (Engl). 105(5):369-73; Rubin et al., 1991, Nature 353(6341):265-67; She et al., 1990, Ann. NY Acad. Sci.

598:339-51; Ran, 1989, Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih (takođe preveden kao: Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi) 18(4):257-61; Quezado et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther.272(2):604-11; Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.16(12):1424-29; Kopfler et al., 1994, Circulation; 90(3):1319-27; Miller et al., 1985, Nature 314(6006):109-11; Ha et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta 1125(2):223-29; Beitz et al., 1992, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 47(2):149-52). Posledično, HDL postali su poznati kao "dobar" holesterol, (videti, npr., Zhang, et al., 2003 Circulation 108:661-663).

[0005] "Zaštitna" uloga HDL potvrđena je u brojnim studijama (npr., Miller et al., 1977, Lancet 1(8019):965-68; Whayne et al., 1981, Atherosclerosis 39:411-19). U ovim studijama, povišeni nivoi LDL izgleda da su povezani sa povećanim kardiovaskularnim rizikom, pri čemu visoki HDL nivoi čini se da dodeljuju kardiovaskularnu zaštitu. In vivo studije dalje su demonstrirale zaštitnu ulogu HDL, što pokazuje da HDL infuzije u zečeve mogu da ometaju razvoj arterijskih lezija indukovanih holesterolom (Badimon et al., 1989, Lab. Invest.60:455-61) i/ili indukuju njihovu regresiju (Badimon et al., 1990, J. Clin. Invest.85:1234-41).

2.2. Reverzni transport holesterola, HDL i Apolipoprotein A-I

[0006] Staza reverznog transporta holesterola (RCT) funkcioniše da eliminiše holesterol iz većine ekstrahepatičnih tkiva i ključna je za održavanje strukture i funkcije većine ćelija u telu. RCT se uglavnom sastoji od tri faze: (a) efluks holesterola, tj., inicijalno uklanjanje holesterola iz različitih grupa perifernih ćelija; (b) esterifikacija holesterola delovanjem lecitin:holesterol aciltransferaze (LCAT), sprečavajući ponovni ulazak isteklog holesterola u ćelije; i (c) unos HDL-holesterola i estara holesterila u ćelije jetre radi hidrolize, zatim recirkulisanje, skladištenje, izlučivanje u žuči ili katabolizam do žučnih kiselina.

[0007] LCAT, ključni enzim u RCT, proizvodi se u jetri i cirkuliše u plazmi povezan sa HDL frakcijom. LCAT konvertuje holesterol dobijen iz ćelija u holesteril estre, koji su sekvestrirani u HDL namenjen za uklanjanje (videti Jonas 2000, Biochim. Biophys. Acta 1529(1-3):245-56). Holesteril estar transfer protein (CETP) i fosfolipid transfer protein (PLTP) doprinose daljem remodelovanju cirkulišuće HDL populacije. CETP pomera holesteril estre izrađene od strane LCAT do drugih lipoproteina, naročito lipoproteina koji obuhvataju ApoB, kao što su VLDL i LDL. PLTP isporučuje lecitin do HDL. HDL trigliceridi katabolišu se od strane ekstracelularne hepatične triglicerid lipaze, a holesterol lipoproteina se uklanja od strane jetre preko nekoliko mehanizama.

[0008] Funkcionalne karakteristike HDL čestica uglavnom su određene njihovim glavnim apolipoproteinskim komponentama kao što su ApoA-I i ApoA-II. Manje količine ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoA-IV, ApoE, i ApoJ takođe su primećene povezane sa HDL. HDL postoji u širokom spektru različitih veličina i različitih mešavina gore pomenutih sastojaka, zavisno od statusa remodelovanja tokom metaboličke RCT kaskade ili staze.

[0009] Svaka HDL čestica obično obuhvata najmanje 1 molekul, a obično dva do 4 molekula, od ApoA-I. HDL čestice mogu takođe da obuhvataju samo ApoE (gama-LpE čestice), koji su poznati da su takođe odgovorni za efluks holesterola, kao što je opisano od strane Prof. Gerd Assmann (videti, npr., von Eckardstein et al., 1994, Curr Opin Lipidol.5(6):404-16). ApoA-I je sintetizovan u jetri i tankom crevom kao preproapolipoprotein A-I, koji se izlučuje kao proapolipoprotein A-I (proApoA-I) i brzo se cepa kako bi se generisao plazmatični oblik ApoA-I, jedan polipeptidni lanac od 243 aminokiseline (Brewer et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun.80:623-30). PreproApoA-I koji se injektira eksperimentalno direktno u krvotok takođe se cepa u plazmatičan oblik ApoA-I (Klon et al., 2000, Biophys. J.79(3):1679-85; Segrest et al., 2000, Curr. Opin. Lipidol.11(2):105-15; Segrest et al., 1999, J. Biol. Chem.274 (45):31755-58).

[0010] ApoA-I obuhvata 6 do 8 različitih alfaheliksa 22-aminokiselina ili funkcionalnih ponavljanja razmaknutih ostatkom linkera koji je često prolin. Ponavljajuće jedinice postoje u amfipatičnoj spiralnoj konformaciji (Segrest et al., 1974, FEBS Lett.38: 247-53) i dodeljuju glavne biološke aktivnosti ApoA-I, tj., vezivanje lipida i aktivaciju lecitin holesterol acil transferaze (LCAT).

[0011] ApoA-I formiraju tri tipa stabilnih kompleksa sa lipidima: mali kompleksi siromašni lipidima koji se nazivaju pre-beta-1 HDL; spljoštene diskoidne čestice koje obuhvataju polarne lipide (fosfolipid i holesterol) koji se nazivaju pre-beta-2 HDL; i sferične čestice, koje obuhvataju i polarne i nepolarne lipide, koje se nazivaju sferični ili zreli HDL (HDL3i HDL2). Većina HDL u cirkulišućoj populaciji obuhvata i ApoA-I i ApoA-II ("AI/AII-HDL frakcija"). Međutim, frakcija HDL koja obuhvata samo ApoA-I ("AI-HDL frakcija") izgleda da je efikasnija u RCT. Određene epidemiološke studije podržavaju hipotezu da je ApoA-I-HDL frakcija anti-aterogena (Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb.12:701-07; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest.27:299-307).

[0012] HDL čestice izrađene su od nekoliko populacija čestica koje imaju različite veličine, sastav lipida i sastav apolipoproteina. One mogu da se razdvoje prema njihovim svojstvima, uključujući njihovu hidratizovanu gustinu, sastav apolipoproteina i karakteristike naelektrisanja. Na primer, pre-beta-HDL frakcija karakteriše se manjim površinskim naelektrisanjem nego zreo alfa-HDL. Zbog ove razlike naelektrisanja, pre-beta-HDL i zreli alfa-HDL imaju različite elektroforetske pokretljivosti u agaroznom gelu (David et al., 1994, J. Biol. Chem.269(12):8959-8965).

[0013] Metabolizam pre-beta-HDL i zrelog alfa-HDL takođe se razlikuje. Pre-beta-HDL ima dve metaboličke sudbine: ili uklanjenje iz plazme i katabolizam od strane bubrega ili remodelovanje do HDL srednje veličine koji se pretežno razgrađuju u jetri (Lee et al., 2004, J. Lipid Res.45(4):716-728).

[0014] Iako je mehanizam za transfer holesterola sa površine ćelije (tj., efluks holesterola) nepoznat, veruje se da je kompleks siromašan lipidima, pre-beta-1 HDL, poželjan akceptor za holesterol prenet iz perifernog tkiva uključenog u RCT (videti Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem.269:22975-82; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res.33:1699-1709; Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res.33:1091-97; i Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-28; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-25). Tokom ovog procesa regrutovanje holesterola sa površine ćelija, pre-beta-1 HDL brzo se konvertuje u pre-beta-2 HDL. PLTP može da poveća brzinu formiranja pre-beta-2 HDL diska, ali podaci koji ukazuju na ulogu za PLTP u RCT nedostaju. LCAT pretežno reaguje sa diskoidnim, malim (pre-beta) i sferičnim (tj., zrelim) HDL, koji prenosi 2-acil grupu lecitina ili ostale fosfolipide do slobodnog hidroksilnog ostatka holesterola kako bi se generisali holesteril estri (zadržani u HDL) i lizolecitin. LCAT reakcija zahteva ApoA-I kao aktivator; tj., ApoA-I je prirodni kofaktor za LCAT. Konverzija holesterol sekvestriranog u HDL do njegovog estra sprečava ponovni ulazak holesterola u ćeliju, pri čemu je rezultat toga da se holesterol uklanja iz ćelije.

[0015] Holesteril estri u zrelim HDL česticama u ApoAI-HDL frakciji (tj., koja obuhvata ApoA-I i nema ApoA-II) se uklanjaju od strane jetre i obrađuju u žuči efikasnije nego oni izvedeni iz HDL koji obuhvata i ApoA-I i ApoA-II (Al/AII-HDL frakcija). Ovo može da bude zahvaljujući, delimično, efektivnijem vezivanju ApoAI-HDL za membranu hepatocita. Postojanje HDL receptora je pretpostavka, a skavendžer receptor, klase B, tipa I (SR-BI) identifikovan je kao HDL receptor (Acton et al., 1996, Science 271:518-20; Xu et al., 1997, Lipid Res.38:1289-98). SR--BI je najizraženiji u steroidogenim tkivima (npr., adrenali), i u jetri (Landschulz et al., 1996, J. Clin. Invest.98:984-95; Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem.271:33545-49). Za pregled HDL receptora, videti Broutin et al., 1988, Anal. Biol. Chem.46:16-23.

[0016] Inicijalna lipidacija ATP-vezujućim kasetnim transporterom AI izgleda da je ključna za formiranje plazmatičnog HDL i za sposobnost pre-beta-HDL čestica da deluju na efluks holesterola (Lee i Parks, 2005, Curr. Opin. Lipidol.16(1):19-25). Prema ovim autorima, ova inicijalna lipidacija omogućava prebeta-HDL da funkcioniše efikasnije kao akceptor holesterola i sprečava ApoA-I od brzog povezivanja sa prethodno postojećim plazmatičnim HDL česticama, što rezultuje većom raspoloživošću pre-beta-HDL čestica za efluks holesterola.

[0017] CETP može takođe da ima ulogu u RCT. Promene u CETP aktivnosti ili njegovi akceptori, VLDL i LDL, imaju ulogu u "remodelovanju" HDL populacije. Na primer, u odsustvu CETP, HDL postaju uvećane čestice koje nisu očišćene. (Za pregled RCT i HDL, videti Fielding i Fielding, 1995, J. Lipid Res.36:211-28; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85; Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.17(6):1053-59).

[0018] HDL takođe ima ulogu u reverznom transportu ostalih lipida i nepolarnih molekula, i u detoksifikaciji, tj., transportu lipida iz ćelija, organa, i tkiva u jetru za katabolizam i izlučivanje. Takvi lipidi uključuju sfingomijelin (SM), oksidovane lipide, i lizofosfatidilholin. Na primer, Robins i Fasulo (1997, J. Clin. Invest.99:380-84) pokazali su da HDL stimulišu transport biljnog sterola jetrom u žučne sekrete.

[0019] Glavna komponenta HDL, ApoA-I, može da bude povezana sa SM in vitro. Kada se ApoA-I rekonstituiše in vitro sa SM goveđeg mozga (BBSM), maksimalna brzina rekonstitucije javlja se na 28°C, temperatura se približava temperaturi faznog prelaza za BBSM (Swaney, 1983, J. Biol. Chem.258(2), 1254-59). Pri BBSM:ApoA-I odnosima od 7,5:1 ili manjim (masa/masa), formira se jedna rekonstituisana homogena HDL čestica koja obuhvata tri ApoA-I molekula po čestici i koja ima BBSM:ApoA-I molarni odnos od 360:1. Pod elektronskim mikroskopom vidi se da je diskoidni kompleks sličan onom dobijenom rekombinacijom ApoA-I sa fosfatidilholinom pri povišenim odnosima fosfolipid/protein. Pri BBSM:ApoAI odnosima od 15:1 (masa/masa), međutim, diskoidni kompleksi većeg prečnika formiraju one koji imaju veći molarni odnos fosfolipid:protein (535:1). Ovi kompleksi značajno su veći, stabilniji, i otporniji na denaturaciju nego ApoA-I kompleksi formirani sa fosfatidilholinom.

[0020] Sfingomijelin (SM) je povišen kod ranih akceptora holesterola (pre-beta-HDL i lipoproteina koji obuhvata gama-migrirajući ApoE), što ukazuje da SM možda poboljšava sposobnost ovih čestica da promovišu efluks holesterola (Dass i Jessup, 2000, J. Pharm. Pharmacol.52:731-61; Huang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-38; Fielding i Fielding 1995, J. Lipid Res.36:211-28).

2.3. Zaštitni mehanizam HDL i ApoA-I

[0021] Studije zaštitnog(ih) mehanizma(ama) HDL fokusirane su na apolipoproteinu A-I (ApoA-I), glavna komponenta HDL. Visoki nivoi ApoA-I u plazmi povezani su sa odsustvom ili smanjenjem koronarnih lezija (Maciejko et al., 1983, N. Engl. J. Med.309:385-89; Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84).

[0022] Infuzija ApoA-I ili HDL kod eksperimentalnih životinja vrši značajne biohemijske promene, kao i da smanjuje obim i ozbiljnost aterosklerotičnih lezija. Nakon inicijalnog izveštaja od strane Maciejko i Mao (1982, Arteriosclerosis 2:407a), Badimon et al., (1989, Lab. Invest.60:455-61; 1989, J. Clin. Invest.

85:1234-41) otkrili su da oni mogu značajno da smanje obim aterosklerotičnih lezija (redukcija 45%) i njihov sadržaj holesterol estara (redukcija 58,5%) kod zečeva hranjenih holesterolom, infuzijom HDL (d=1,063-1,325 g/ml). Takođe su otkrili da infuzije HDL dovode do približno 50% regresije utvrđenih lezija. Esper et al. (1987, Arteriosclerosis 7:523a) pokazali su da infuzije HDL mogu značajno da promene sastav plazmatičnih lipoproteina Watanabe zečeva sa nasleđenom hiperholesterolemijom, koji su razvili rane arterijske lezije. Kod ovih zečeva, HDL infuzije mogu više od toga da udvostruče odnos između zaštitnog HDL i aterogenog LDL.

[0023] Potencijal HDL da spreči arterijsku bolest kod životinjskih modela dalje je podvučen opažanjem da ApoA-I može da vrši fibrinolitičku aktivnost in vitro (Saku et al., 1985, Thromb. Res.39:1-8).

Ronneberger (1987, Xth Int. Congr. Pharmacol., Sydney, 990) su demonstrirali da ApoA-I može da poveća fibrinolizu kod pasa rase bigl i kod cinomolgus majmuna. Slična aktivnost može da se zabeleži in vitro na humanoj plazmi. Ronneberger mogao je da potvrdi smanjenje taloženja lipida i formiranje arterijskih plakova kod životinja tretiranih sa ApoA-I.

[0024] In vitro studije ukazuju da kompleksi ApoA-I i lecitina mogu da promovišu efluks slobodnog holesterola iz kultivisanih arterijskih glatko mišićnih ćelija (Stein et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta, 380:106-18). Ovim mehanizmom, HDL može takođe da redukuje proliferaciju ovih ćelija (Yoshida et al., 1984, Exp. Mol Pathol.41:258-66).

[0025] Infuziona terapija sa HDL koji obuhvata ApoA-I ili ApoA-I mimetičke peptide takođe je pokazala da reguliše nivoe HDL u plazmi ABC1 transporterom, što dovodi do efikasnosti u lečenju kardiovaskularne bolesti (videti, npr., Brewer et al., 2004, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.24:1755-1760).

[0026] Izolovana su dva humana polimorfizma ApoA-I koji se javljaju u prirodi u kojima je ostatak arginina supstituisan sa cisteinom. U apolipoproteinu A-IMilano(ApoA-IM), ova supstitucija se javlja na ostatku 173, dok u apolipoproteinu A-IParis(ApoA-IP), ova supstitucija se javlja na ostatku 151 (Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest.66:892-900; Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem.258:2508-13; Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28; Daum et al., 1999, J. Mol. Med.77:614-22; Klon et al., 2000, Biophys. J.79(3):1679-85). Još dodatni humani polimorfizam ApoA-I koji se javljaja u prirodi je izolovan, u kom je leucin supstituisan sa argininom u položaju 144. Ovaj polimorfizam je nazvan apolipoprotein A-I Zaragoza (ApoA-IZ) i povezan je sa teškom hipoalfalipoproteinemijom i poboljšanim efektom reverznog transporta holesterola lipoproteina (HDL) velike gustine (Recalde et al., 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623; Fiddyment et al., 2011, Protein Expr. Purif.80(1):110-116).

[0027] Rekonstituisane HDL čestice koje obuhvataju homodimere povezane disulfidnom vezom od ili ApoA-IMili ApoA-Ip su slični sa rekonstituisanim HDL česticama koje obuhvataju ApoA-I divljeg tipa u njihovoj sposobnosti da razbistre emulzije dimiristoilfosfatidilholina (DMPC) i njihovoj sposobnosti da promovišu efluks holesterola (Calabresi et al., 1997b, Biochemistry 36:12428-33; Franceschini et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.19:1257-62; Daum et al., 1999, J. Mol. Med.77:614-22). Kod obe mutacije, heterozigotni pojedinci smanjili su nivoe HDL ali paradoksalno, su pod smanjenim rizikom za aterosklerozu (Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest.66:892-900; Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem.258:2508-13; Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28). Rekonstituisane HDL čestice koje obuhvataju bilo koju varijantu sposobne su da aktiviraju LCAT, iako sa smanjenom efikasnošću u poređenju sa rekonstituisanim HDL česticama koje obuhvataju ApoA-I divljeg tipa (Calabresi et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun.232:345-49; Daum et al., 1999, J. Mol. Med.77:614-22).

[0028] ApoA-IMmutacija prenosi se kao autozomalna dominantna osobina; osam generacija nosača unutar familije je identifikovano (Gualandri et al., 1984, Am. J. Hum. Genet.37:1083-97). Status pojedinca koji nosi ApoA-IMkarakteriše se izvanrednim smanjenjem nivoa HDL-holesterola. Uprkos tome, noseći pojedinci očigledno ne pokazuju nikakav povećani rizik od arterijske bolesti. Zaista, ispitivanjem genealoških zapisa, izgleda da ovi subjekti mogu da se „zaštite“ od ateroskleroze (Sirtori et al., 2001, Circulation, 103: 1949-1954; Roma et al., 1993, J. Clin. Invest.91(4):1445-520).

[0029] Mehanizam mogućeg zaštitnog efekta ApoA-IMu nosačima mutacije izgleda da je povezan sa modifikacijom u strukturi mutanta ApoA-IM, sa gubitkom jednog alfa-heliksa i povećanom izloženošću hidrofobnih ostataka (Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem.260:1632-35). Gubitak čvrste strukture višestrukih alfa-heliksa dovodi do povećane fleksibilnosti molekula, koji se lakše povezuje sa lipidima, u poređenju sa normalnim ApoA-I. Štaviše, lipoproteinski kompleksi su podložniji denaturaciji, što ukazuje da je isporuka lipida takođe poboljšana u slučaju mutanta.

[0030] Bielicki, et al. (1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.17 (9):1637-43) demonstrirali su da ApoA-IMima ograničen kapacitet da regrutuje membranski holesterol u poređenju sa ApoA-I divljeg tipa. Dodatno, nascentni HDL formiran povezivanjem ApoA-IMsa membranskim lipidima pretežno je bio čestice od 7,4 nm pre nego veći kompleksi od 9 i 11 nm formirani pomoću ApoA-I divljeg tipa. Ova opažanja ukazuju na to da Arg173→Cys173supstitucija u ApoA-I primarnoj sekvenci ima veze sa normalnim procesom ćelijskog regrutovanja holesterola i sklopa nascentnog HDL. Mutacija je očigledno povezana sa smanjenom efikasnošću za uklanjanje holesterola iz ćelija. Njegova antiaterogena svojstva mogu, prema tome, da budu nepovezana sa RCT.

[0031] Najizrazitija strukturna promena pripisana Arg173→Cys173supstituciji je dimerizacija ApoA-IM(Bielicki et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.17 (9): 1637-43). ApoA-IMmože da formira homodimere sa sobom i heterodimere sa ApoA-II. Studije frakcija krvi koje obuhvataju mešavinu apolipoproteina ukazuju da prisustvo dimera i kompleksi u cirkulaciji mogu da budu odgovorni za povećanu eliminaciju poluživota apolipoproteina. Takva povećana eliminacija poluživota primećena je u kliničkim studijama nosača mutacije (Gregg et al., 1988, NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone S G). Ostale studije ukazuju da ApoA-IMdimeri (ApoA-IM/ ApoA-IM) deluju kao inhibirajući faktor u interkonverziji HDL čestica in vitro (Franceschini et al., 1990, J. Biol. Chem.265:12224-31).

2.4. Trenutni tretmani za dislipidemiju i povezane poremećaje

[0032] Dislipidemijski poremećaji su bolesti povezane sa povišenim holesterolom u serumu i nivoima triglicerida i smanjuju odnose HDL:LDL u serumu, i uključuju hiperlipidemiju, naročito hiperholesterolemiju, koronarnu bolest srca, koronarnu arterijsku bolest, vaskularne i perivaskularne bolesti, i kardiovaskularne bolesti kao što je ateroskleroza. Sindromi povezani sa aterosklerozom kao što su prolazni ishemijski napad ili intermitentna klaudikacija, izazvani arterijskom insuficijencijom, takođe su uključeni. Brojni tretmani su trenutno dostupni za smanjenje povišenog holesterola u serumu i triglicerida povezanih sa dislipidemijskim poremećajem. Međutim, svaki ima svoje sopstvene nedostatke i ograničenja u pogledu efikasnosti, nuspojava i kvalifikacije populacije pacijenata.

[0033] Smole koje vezuju žučne kiseline su klasa lekova koji prekidaju recikliranje žučnih kiselina iz creva u jetru; npr., holestiramin (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb), kolestipol hidrohlorid (Colestid®, The Upjohn Company), i kolesevelam hidrohlorid (Welchol®, Daiichi-Sankyo Company). Kada se uzimaju oralno, ove pozitivno naelektrisane smole vezuju se za negativno naelektrisane žučne kiseline u crevu. Zbog toga što smole ne mogu da se apsorbuju iz creva, izlučuju se noseći žučne kiseline sa sobom. Upotreba tih smola u najboljem slulčaju, međutim, samo smanjuje nivoe holesterola u serumu za oko 20%, i povezana je sa gastrointestinalnim nuspojavama, uključujući konstipaciju i nedostatke određenih vitamina. Štaviše, budući da smole vezuju druge lekove, ostali oralni lekovi moraju se uzimati najmanje jedan sat pre ili četiri do šest sati nakon uzimanja smole; čime se komplikuju u suštini režimi uzimanja lekova kod pacijenata.

[0034] Statini su agensi za smanjenje holesterola koji blokiraju sintezu holesterola inhibiranjem HMGCoA reduktaze, ključni enzim uključen u biosintetski put holesterola. Statini, npr., lovastatin (Mevacor®), simvastatin (Zocor®), pravastatin (Pravachol®), fluvastatin (Lescol®) i atorvastatin (Lipitor®), ponekad se koriste u kombinaciji sa smolama koje vezuju žučne kiseline. Statini značajno smanjuju nivoe holesterola u serumu i LDL-serum nivoe, i usporavaju razvoj koronarne ateroskleroze. Međutim, serumski nivoi HDL holesterola su samo umereno povišeni. Mehanizam efektra smanjenja LDL može da uključuje i smanjenje VLDL koncentracije i indukciju ćelijske ekspresije LDL-receptora, što dovodi do smanjene proizvodnje i/ili povećanog katabolizma LDL. Nuspojave, koje uključuju disfunkciju jetre i bubrega povezane su sa upotrebom ovih lekova (The Physicians Desk Reference, 56th Ed., 2002, Medical Economics).

[0035] Niacin (nikotinska kiselina) je kompleks vitamina B rastvoran u vodi koji se koristi kao dodatak ishrani i antihiperlipidemijski agens. Niacin smanjuje proizvodnju VLDL i efikasan je u smanjenju LDL. U nekim slučajevima, koristi se u kombinaciji sa smolama koje vezuju žučne kiseline. Niacin može da poveća HDL kada se koristi u adekvatnim dozama, međutim, njegova korisnost je ograničena ozbiljnim nuspojavama kada se koristi u tako visokim dozama. Niaspan® je oblik niacina sa produženim oslobađanjem koji proizvodi manje nuspojava u odnosu na čist niacin. Niacin/Lovastatin (Nicostatin®) je formulacija koja sadrži i niacin i lovastatin i kombinuje koristi svakog leka.

[0036] Fibrati su klasa lekova koji smanjuju lipide korišćenih za lečenje raznih oblika hiperlipidemije (tj., povišenih serumskih triglicerida) koja takođe može da bude povezana sa hiperholesterolemijom. Fibrati izgleda da smanjuju VLDL frakciju i skromno povećavaju HDL, međutim efekat ovih lekova na holesterol u serumu je promenljiv. U Sjedinjenim Američkim Državama, fibrati kao što su klofibrat (Atromid-S®), fenofibrat (Tricor®) i bezafibrat (Bezalip®) odobreni su za upotrebu kao antilipidemijski lekovi, ali nisu dobili odobrenje kao agensi hiperholesterolemije. Na primer, klofibrat je antilipidemijski agens koji deluje (preko nepoznatog mehanizma) na smanjenje serumskih triglicerida smanjenjem VLDL frakcije. Iako holesterol u serumu može da bude smanjen kod određenih podpopulacija pacijenata, biohemijski odgovor na lek je varijabilan, i nije uvek moguće da se predvidi koji će pacijenti imati poželjne rezultate. Atromid-S® nije pokazao da je efikasan za sprečavanje koronarne bolesti srca.

Hemijski i farmakološki povezani lek, gemfibrozil (Lopid®) je agens koji reguliše lipide koji umereno smanjuje serumske trigliceride i VLDL holesterol, i umereno povećava HDL holesterol-- HDL2i HDL3subfrakcije kao i ApoA-I i A-II (tj., AI/AMT-HDL frakcija). Međutim, lipidni odgovor je heterogeni, naročito među različitim populacijama pacijenata. Međutim, dok je primećena prevencija koronarne bolesti srca kod muških pacijenata između 40-55 bez istorije ili simptoma postojaće koronarne bolesti srca, nije jasno do koje mere ova otkrića mogu da se iskoriste kod ostalih populacija pacijenata (npr., žene, stariji i mlađi muškarci). Zaista, nije primećena efikasnost kod pacijenata sa utvrđenom koronarnom bolesti srca. Ozbiljne nuspojave povezane su sa upotrebom fibrata uključujući toksičnost kao što je malignost (naročito gastrointestinalni kancer), bolest žučne kese i povećana incidenca u nekoronarnom mortalitetu.

[0037] Oralna terapija zamene estrogena može da se razmatra za ublažavanje hiperholesterolemije kod žena nakon menopauze. Međutim, povećanja HDL mogu da budu praćena povećanjem triglicerida. Tretman estrogenom je, naravno, ograničen na određenu populaciju pacijenata (postmenopauzne žene) i povezan je sa ozbiljnim nuspojavama uključujući indukciju malignih neoplazmi, bolest žučne kese, tromboemboličnu bolest, adenom jetre, povišen krvni pritisak, intoleranciju na glukozu, i hiperkalcemiju.

[0038] Ostali agensi korisni za lečenje hiperlipidemije uključuju ezetimib (Zetia®; Merck), koji blokira ili inhibira apsorpciju holesterola. Međutim, inhibitori ezetimiba pokazalo se da imaju određene toksičnosti.

[0039] HDL, kao i rekombinantni oblici ApoA-I koji je obrazovao kompleks sa fosfolipidima može da služi kao sinkovi/skavendžeri za nepolarne ili amfipatične molekule, npr., holesterol i derivate (oksisteroli, oksidovani steroli, biljni steroli, itd.), holesterol estre, fosfolipide i derivate (oksidovani fosfolipidi), trigliceridi, proizvodi oksidacije, i lipopolisaharidi (LPS) (videti, npr., Casas et al., 1995, J. Surg. Res. Nov 59(5):544-52). HDL može takođe da služi kao skavendžer za TNF-alfa i ostale limfokine. HDL može takođe da služi kao nosač za humane serumske paraoksonaze, npr., PON-1,-2,-3. Paraoksonaza, esteraza povezana sa HDL, je značajna za zaštitu ćelijskih komponenata od oksidacije. Oksidacija LDL, koja se javlja tokom oksidativnog stresa, javlja se direktno povezana sa razvojem ateroskleroze (Aviram, 2000, Free Radic. Res.33 Suppl:S85-97). Paraoksonaza izgleda da ima ulogu u osetljivosti na aterosklerozu i kardiovaskularnu bolest (Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86). Humana serumska paraoksonaza (PON-1) je vezana za lipoproteine visoke gustine (HDL). Njena aktivnost obrnuto je povezana sa aterosklerozom. PON-1 hidrolizuje organofosfate i može da zaštiti od ateroskleroze inhibicijom oksidacije HDL i lipoproteina male gustine (LDL) (Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86).

Eksperimentalne studije ukazuju da ova je zaštita povezana sa sposobnošću PON-1 da hidrolizuje specifične lipidne perokside u oksidovanim lipoproteinima. Intervencije koje očuvaju ili poboljšaju PON-1 aktivnost mogu da pomognu u kašnjenju pojave ateroskleroze i koronarne bolesti srca.

[0040] HDL dalje ima ulogu kao antitrombotični agens i reduktor fibrinogena, i kao agens u hemoragijskom šoku (Cockerill et al., WO 01/13939, objavljen 1. marta 2001.). HDL, i ApoA-I naročito, pokazao je da olakšava izmenu lipopolisaharida proizvedenog sepsom u lipidne čestice koje obuhvataju ApoA-I, što rezultuje funkcionalnom neutralizacijom lipopolisaharida (Wright et al., WO9534289, objavljen 21. decembra 1995.; Wright et al., U.S. Patent br.5,928,624 objavljen 27. jula 1999.; Wright et al., U.S. Patent br.5,932,536, objavljen 3. avg.1999.).

[0041] Postoje razni postupci dostupni za izradu lipoproteinskih kompleksa in vitro. U.S. Patent br. 6,287,590 i 6,455,088 opisuju postupak koji podrazumeva ko-liofilizaciju apolipoproteina i lipidnih rastvora u organskom rastvaraču (ili mešavine rastvarača) i formiranje naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa tokom hidratacije liofilizovanog praška. Lipoproteinski kompleksi takođe mogu da se formiraju postupkom dijalize deterdženta; npr., mešavina lipida, lipoproteina i deterdženta kao što je holat se dijalizira i rekonstituiše kako bi se formirao kompleks (videti, npr., Jonas et al., 1986, Methods Enzymol.128:553-82). Primer 1 U.S. objave 2004/0067873 opisuje postupak disperzije holata, u kom se disperzija lipida kombinuje sa holatom pod uslovima za formiranje micela, a one se zauzvrat inkubiraju sa rastvorom apoliproteina kako bi se formirali kompleksi. Ultimativno, holat, koji je toksičan, mora da se ukloni, npr., dijalizom, ultrafiltracijom ili apsorpcijom sa adsorpcijom na afinitetnom zrnu ili smoli. U.S. Patent br.6,306,433 opisuje formiranje lipoproteinskog kompleksa podvrgavanjem fluidne mešavine proteina i lipida homogenizaciji pod visokim pritiskom. Međutim, proteini koji su osetljivi na velike smicajne sile mogu da izgube aktivnost kada se izlože homogenizaciji pod visokim pritiskom.

[0042] Tako, trenutno dostupni proizvodni postupci rezultuju rasipanjem polaznih materijala, kao što je degradacija proteina, i/ili potrebno prečišćavanje dobijenog proizvoda, kao što je uklanjanje toksičnog agensa, i zbog toga su neefikasni i skupi. Dodatno, preparati lipoproteinskih kompleksa mogu biti heterogeni, koji sadrže mešavinu kompleksa koji variraju po veličini i po sastavu. Videti, npr., U.S. Patent br. 5,876,968. Prema tome, postoji potreba da se razviju novi postupci za proizvodnju lipoproteinskih kompleksa koji su efikasni i daju više homogenih kompleksa, pri čemu poželjno imaju visok stepen čistoće. Ti procesi mogu da omoguće ekonomičniju proizvodnju širokih razmera dok generišu ujednačeniji farmaceutski prihvatljivi proizvod sa manje rizika od nuspojava zbog kontaminenata.

[0043] Štaviše, terapeutska upotreba ApoA-I, ApoA-IM, ApoA-Ip i ostalih varijanti, kao i rekonstituisanog HDL, međutim, trenutno je ograničena velikom količinom apolipoproteina potrebnog za terapeutsko davanje i troškovima proizvodnje proteina, uzimajući u obzir mali ukupan prinos poizvodnje i pojavu degradacije proteina u kulturama rekombinantno eksprimiranih proteina. (Videti, npr., Mallory et al., 1987, J. Biol. Chem.262(9):4241-4247; Schmidt et al., 1997, Protein Expression & Purification 10:226-236). Sugerisano je ranim kliničkim probama da je dozni opseg između 1,5-4 g proteina po infuziji za lečenje kardiovaskularnih bolesti. Broj infuzija potrebnih za celo lečenje je nepoznat. (Videti, npr., Eriksson et al., 1999, Circulation 100(6):594-98; Carlson, 1995, Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis.5:85-91; Nanjee et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.20(9):2148-55; Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.19(4):979-89; Nanjee et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.16(9):1203-14).

[0044] Rekombinantni humani ApoA-I eksprimira se u heterolognim domaćinima, međutim, prinos zrelog proteina je nedovoljan za terapeutske primene velikih razmera, naročito kada je povezano sa postupcima prečišćavanja koji dalje smanjuju prinose i rezultuju sa nečistim proizvodom.

[0045] Weinberg et al., 1988, J. Lipid Research 29:819-824, opisuje razdvajanje apolipoproteina A-I, A-II i A-IV i njihovih izoformi prečišćenih iz humane plazme reverzno-faznom tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom.

[0046] WO 2009/025754 opisuje razdvajanje i prečišćavanje proteina alfa-1-antitripsin i ApoA-I od humane plazme.

[0047] Hunter et al., 2009, Biotechnol. Prog.25(2):446-453, opisuje prečišćavanje varijante ApoA-I Milano velikih razmera koji je rekombinantno eksprimiran u E. coli.

[0048] Caparon et al., 2009, Biotechnol. i Bioeng.105(2):239-249 opisuje ekspresiju i prečišćavanje ApoA-I Milano iz domaćina E. coli koji je genetski modifikovan kako bi se obrisala dva ćelijska proteina domaćina kako bi se smanjili nivoi ovih proteina u prečišćenom proizvodu apolipoproteina.

[0049] U.S. Patent br.6,090,921 opisuje prečišćavanje ApoA-I ili apolipoprotein E (ApoE) iz frakcije humane plazme koja sadrži ApoA-I i ApoE upotrebom hromatografije anjonske izmene.

[0050] Brewer et al., 1986, Meth. Enzymol.128:223-246 opisuje izolovanje i karakterizaciju apolipoproteina iz humane krvi upotrebom hromatografskih tehnika.

[0051] Weisweiler et al., 1987, Clinica Chimica Acta 169:249-254 opisuje izolovanje ApoA-I i ApoA-II iz humanog HDL upotrebom brze-proteinske tečne hromatografije.

[0052] deSilva et al., 1990, J. Biol. Chem.265(24):14292-14297 opisuje prečišćavanje apolipoproteina J imunoafinitetnom hromatografijom i reverzno-faznom tečnom hromatografijom visoke performanse.

[0053] Lipoproteini i lipoproteinski kompleksi trenutno su razvijeni za kliničku upotrebu, sa kliničkim studijama koje koriste različite agense na bazi lipoproteina ustanovljavanjem izvodljivosti terapije lipoproteinima (Tardif, 2010, Journal of Clinical Lipidology 4:399-404). Jedna studija procenila je autologno delipidiran HDL (Waksman et al., 2010, J Am. Coll. Cardiol.55:2727-2735). Druga srudija procenila je ETC-216, kompleks rekombinantnog ApoA-IMi palmitoil-oleoil-PC (POPC) (Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300). CSL-111 je rekonstituisani humani ApoA-I prečišćen iz plazme u kompleksu sa sojinim fosfatidilholinom (SBPC) (Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-1682). Trenutno korišćeni lekovi pokazali su efikasnost u smanjenju aterosklerotičnog plaka ali taj efekat je praćen sekundarnim efektima kao što su povećanje transaminaza ili formiranje ApoA-I antitela (Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Vasc. Throm. Biol.19:979-89; Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300; Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-1402; Nieuwdorp et al., 2004, Diabetologia 51:1081-4; Drew et al., 2009, Circulation 119, 2103-11; Shaw et al., 2008, Circ. Res.103:1084-91; Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682; Waksman, 2008, Circulation 118:S 371; Cho, U.S. Patent br.7,273,849 B2, objavljen 25. septembra 2007.). Na primer, ERASE klinička proba (Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682) koristila je dve doze CSL-111: 40 mg/kg i 80mg/kg ApoA-I. Dozna grupa sa 80 mg/kg morala je da se stopira zbog toksičnosti jetre (što se pokazalo ozbiljnim porastom transaminaza). Čak i kod dozne grupe sa 40 mg/kg, nekoliko pacijenata doživelo je porast transaminaza.

[0054] Zbog toga, postoji potreba za bezbednijim lekovima koji su efikasniji u smanjenju holesterola u serumu, povećanju serumskih nivoa HDL, sprečavanju i/ili lečenju dislipidemije i/ili bolesti, stanja i/ili poremećaja povezanih sa dislipidemijom. Postoji potreba u tehnici za lipoproteinskim formulacijama koje nisu povezane sa toksičnošću jetre, a poželjno indukuju samo minimalno (ili ne) povećanje triglicerida, LDL-triglicerida, ili VLDL-triglicerida, kao i za robusne postupke proizvodnje koji se mogu koristiti da bi se pouzdano izradile ove lipoproteinske formulacije u komercijalnoj razmeri.

3. SUŠTINA

[0055]

1. Ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja obuhvata populaciju lipoproteinskih kompleksa, pri čemu svaki obuhvata:

(a) lipidnu frakciju koja obuhvata najmanje jedan neutralni lipid i najmanje jedan negativno naelektrisan lipid; i

(b) apolipoproteinsku frakciju koja se suštinski sastoji od apolipoproteina A-I ("ApoA-I"),

pri čemu

(i) najmanje 80% apolipoproteina u kombinaciji je u obliku kompleksa;

(ii) najmanje 80% lipida u kombinaciji je u obliku kompleksa;

(iii) ne više od 20% ostataka metionina u apolipoproteinu su oksidovani;

(iv) raspodela veličina lipoproteinskih kompleksa je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97% homogena, kao što se reflektuje jednim pikom u gel-propusnoj hromatografiji, i

(v) populacija ne sadrži bilo koji deterdžent.

Takođe obezbeđuje jediničnu dozu koja obuhvata terapeutski efektivnu količinu farmaceutske kombinacije ovog pronalaska.

[0056] Ovaj pronalazak obezbeđuje populacije lipoproteinskih kompleksa, pri čemu svaki obuhvata lipidnu frakciju i apolipoproteinsku frakciju koja se suštinski sastoji od apolipoproteina A-I ("ApoA-I"), pri čemu je raspodela veličina lipoproteinskih kompleksa najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97% homogena, kao što se reflektuje jednim pikom u gel-propusnoj hromatografiji. Populacije ovog pronalaska naročito su pogodne za lečenje i/ili sprečavanje dislipidemije i bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa dislipidemijom. Otkriveno je da populacije kompleksa koji imaju veću čistoću i/ili homogenost, i/ili obuhvataju određene odnose lipida i proteina, kao što je ovde opisano, povećavaju sposobnost da mobilišu holesterol kombinovano sa smanjenim rizikom od nuspojava.

[0057] Lipoproteinski kompleksi obuhvataju proteinsku frakciju (npr., apolipoproteinsku frakciju) i lipidnu frakciju (npr., fosfolipidnu frakciju). Proteinska frakcija uključuje jedan ili više proteina koji vezuju lipide, kao što su apolipoproteini, peptidi, ili analozi peptida apolipoproteina ili mimetike koji mogu da mobilišu holesterol kada je prisutan u lipoproteinskom kompleksu. Neograničavajući primeri takvih apolipoproteina i peptida apolipoproteina uključuju preproapoliproteine, preproApoA I, proApoA-I, ApoA-I, preproApoA-II, proApoA-II, ApoA-II, preproApoA-IV, proApoA- IV, ApoA-IV, ApoA-V, preproApoE, proApoE, ApoE, preproApoA-IM, proApoA-IM, ApoA-IM, preproApoA-IP, proApoA-IP, ApoA-IP, preproApoA-IZ, proApoA-IZ, i ApoA-IZ. Apolipoprotein(i) može da bude u obliku monomera, dimera, ili trimera, ili njihove mešavine. U specifičnom primeru izvođenja, apolipoproteinska frakcija suštinski se sastoji od ApoA-I, najpoželjnije od jedne izoforme. ApoA-I u lipoproteinskim kompleksima mogu da imaju najmanje 90% ili najmanje 95% identiteta sekvenci sa proteinom koji reaguje sa aminokiselinama 25 do 267 iz SEQ ID NO:1. Opciono, ApoA-I dalje obuhvata asparaginsku kiselinu u položaju koji odgovara celoj dužini ApoA-I aminokiseline 25 iz SEQ ID NO:1 (i položaj 1 zrelog proteina). Poželjno, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% ApoA-I je ispravno obrađen, zreli protein (tj., bez signalnih i propeptidnih sekvenci) i ne oksidovan, deamidiran i/ili skraćen.

[0058] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćelije domaćina sisara modifikovane kako bi eksprimirale ApoA-I, ćelijske kulture koje obuhvataju ApoA-I, i postupke proizvodnje zrelog, biološki aktivnog ApoA-I. Otkriveno je da je moguće da se modifikuju ćelije sisara kako bi eksprimirale velike količine zrelog ApoA-I, koji je suštinski bez oba nezrela ApoA-I (proApoA-I) i skraćena oblika ApoA-I generisana degradacijom proteazama. Ovi rezultati su iznenađujući. Kao prvo, mašinerija ćelije domaćina za obradu proteina moglo se očekivati da će biti nadjačana prekomernom ekspresijom heterolognog proteina kao što je ApoA-I, što dovodi do proizvodnje neobrađenog, nezrelog proteina. Kao drugo, ApoA-I izlučen u podlogu za kulturu podvrgava se degradaciji proteazama i još se samo niski nivoi skraćenog ApoA-I primećuju u podlozi za kulturu. Ćelije domaćina sisara, ćelijska kultura i postupci proizvodnje ApoA-I posebno su pogodni za proizvodnju zrelog proteina, korisnog u terapeutskim primenama, u komercijalno značajnim količinama.

[0059] Kao što je opisano ovde, ćelija domaćina sisara je modifikovana da bi eksprimirala protein koji poželjno obuhvata (ili se sastoji od) aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identiteta sa položajima 25 do 267 iz SEQ ID NO:1. Protein poželjno ima ostatak asparaginske kiseline u položaju koji odgovara položaju 25 iz SEQ ID NO:1. Ćelija domaćina sisara može opciono dalje da izlučuje taj protein. U nekim slučajevima, protein eksprimiran i/ili izlučen od strane ćelije domaćina sisara može dalje da obuhvata signalnu sekvencu od 18 aminokiselina (MKAAVLTLAVLFLTGSQA, SEQ ID NO:2) i/ili propeptidnu sekvencu od 6 aminokiselina (RHFWQQ, SEQ ID NO:3). U nekim slučajevima, ćelija domaćina je modifikovana da bi eksprimirala protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identitet sa SEQ ID NO:1.

[0060] Ćelija domaćina može biti iz bilo koje ćelijske linije sisara, uključujući, ali bez ograničenja na, jajnik kineskog hrčka (npr., CHO-K1 ili CHO-S), VERO, BHK, BHK 570, HeLa, COS-1, COS-7, MDCK, 293, 3T3, PC12 i W138, ili iz nemijelomske ćelije ili ćelijske linije (npr., mišja mijelomska ćelija ili ćelijska linija).

[0061] Ćelija domaćina sisara može dalje da sadrži višestruke kopije neke nukleinske kiseline koja kodira ApoA-I protein, npr., protein koji obuhvata ili se sastoji od položaja 25 do 267 iz SEQ ID NO:1. Na primer, ćelija domaćina sisara može da sadrži najmanje oko 5, 6, 7, 8, ili više kopija, i do oko 10, 11, 12, 13, ili 14 kopija nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina može dalje da bude operativno vezana za promoter koji može da eksprimira protein na visokom nivou u ćeliji domaćina sisara, kao što je, na primer, majmunski citomegalovirusni promoter ili određenije, neposredno rani majmunski citomegalovirusni promoter.

[0062] Ćelije domaćina sisara poželjno mogu da proizvedu najmanje oko 0,5, 1, 2, ili 3 g/L ApoA-I u kulturi i/ili do oko 20 g/L ApoA-I u kulturi, npr., do 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, ili 15 g/L ApoA-I u kulturi.

Kultura može biti bilo koje veličine, u opsegu od oko 150 mL do oko 500L, 1000L, 2000L, 5000L, 10.000L, 25.000L, ili 50.000 L ili veća. U različitim primerima izvođenja, zapremina kulture može da bude u opsegu od 10L do 50L, od 50L do 100L, od 100L do 150L, od 150L do 200L, od 200L do 300L, od 300L do 500L, od 500L do 1000L, od 1000L do 1500L, od 1500L do 2000L, od 2000L do 3000L, od 3000L do 5000L, od 5000L do 7500L, od 7500L do 10.000L, od 10.000L do 20.000L, od 20.000L do 40.000L, od 30.000L do 50.000L. U nekim slučajevima, kultura je kultura velike zapremine, kao što je 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 50 L, 100 L, 200L, 300L, 500L, 1000L, 5000L, 10.000L, 15.000L, 20.000L, 25.000L, do 50.000L ili veća.

[0063] Ćelije domaćina sisara ovog pronalaska mogu da se uzgajaju u kulturi. Tako, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ćelijsku kulturu sisara, koja obuhvata mnoštvo ćelija domaćina sisara kao što je opisano gore ili u odeljku 5.1.2 dole. Ćelijska kultura može da uključuje jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) kultura (koja je opciono šaržna kultura velike zapremine od najmanje 10 litara, najmanje 20 litara, najmanje 30 litara, najmanje 50 litara, najmanje 100 litara, 300L, 500L, 1000L, 5000L, 10.000L, 15.000L, 20.000L, 25.000L, do 50.000L ili kontinuirana kultura od najmanje 10 litara, najmanje 20 litara, najmanje 30 litara, najmanje 50 litara, najmanje 100 litara, 300L, 500L, 1000L, 5000L, ili do 10.000L) obuhvata najmanje oko 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 g/L ili više srelog ApoA-I proteina koji obuhvata ili se sastoji od amino sekvence koja odgovara aminokiselinama 25 do 267 iz SEQ ID NO:1; (b) najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% proteina u podlozi za kulturu je ApoA-I protein bez signalne sekvence; (c) najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% proteina u podlozi za kulturu je zreo ApoA-I protein bez signalne sekvence i propeptidne sekvence; i (d) najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% zrelog ApoA-I nije skraćen, oksidovan, ili deamidiran.

[0064] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupke proizvodnje zrelog, biološki aktivnog ApoA-I. Uopšteno, postupci obuhvataju kultivisanje bilo koje od ćelija domaćina sisara opisanih gore ili u odeljku 5.1.2 pod uslovima u kojima se ApoA-I eksprimira i izlučuje. Postupak može dalje da uključuje fazu izdvajanja iz supernatanta kultivisane ćelije domaćina sisara, i opciono prečišćavanje zrelog, biološki aktivnog ApoA-I (kao što je postupcima opisanim u odeljcima 5.1.3 i 5.1.4 dole).

[0065] ApoA-I dobijen ili koji može da se dobije postupcima opisanim gore može dalje da obrazuje kompleks sa lipidom kako bi se formirao lipoproteinski kompleks kao što je opisano ovde, i/ili da se ugradi u farmaceutske kombinacije u terapeutski efektivnim količinama. Farmaceutske kombinacije poželjno su rastvori puferovani fosfatom koji takođe sadrže saharozu i/ili manitol kao ekscipijense.

[0066] Dalje je otkriveno da, prečišćavanjem ApoA-I upotrebom nove kombinacije hromatografije i faza filtracije, velike količine čistog ApoA-I mogu da se proizvedu koje sadrže nivoe proteina ćelije domaćina, DNK ćelije domaćina, endotoksine i skraćene oblike proteina koji su dovoljno niski da dodele jednu ili više osobina, uključujući smanjeni rizik nispojava i nisku ili nikakvu toksičnost, čineći protein naročito pogodnim za terapeutske upotrebe. Poželjno, ApoA-I prečišćen postupcima opisanim ovde proizvodi se rekombinantno u ćelijama sisara i izlučuje se u podlogu za rast. Prema tome, ovaj pronalazak odnosi se na postupak prečišćavanja ApoA-I koji obuhvata faze: (a) dovođenja u kontakt rastvora koji sadrži ApoA-I sa matricom anjonske izmene pod uslovima tako da se ApoA-I ne vezuje za matricu; (b) filtriranja rastvora koji sadrži ApoA-I dobijenog u fazi (a) kroz membranu koja ima veličinu pora dovoljnu za uklanjanje virusa ili virusnih čestica; (c) prolazak filtrata dobijenog u fazi (b) kroz prvu kolonu reverznofazne hromatografije pod uslovima tako da se ApoA-I vezuje za matricu; (d) eluiranja iz prve matrice reverzno-fazne hromatografije prvog ApoA-I koji sadrži reverzno-fazni eluat upotrebom gradijenta rastućih koncentracija organskog rastvarača; (e) prolazak prvog ApoA-I reverzno-faznog eluata iz faze (d) kroz drugu kolonu reverzno-fazne hromatografije pod uslovima tako da se ApoA-I vezuje za matricu; i (f) eluiranja iz druge matrice reverzno-fazne hromatografije drugog ApoA-I koji sadrži reverzno-fazni eluat upotrebom gradijenta rastućih koncentracija organskog rastvarača. Redosled u kom se faze izvode nije kritičan, na primer, u nekom primeru izvođenja faza filtriranja kroz membranu radi uklanjanja virusa ili virusnih čestica izvodi se nakon faze (f) gore, pre nego posle faze (a).

[0067] Ovde je takođe opisan suštinski čist ApoA-I proizvod dobijen ili koji može da se dobije postupcima prečišćavanja opisanim ovde u kojima je koncentracija ApoA-I najmanje 10 g/L. Suštinski čist ApoA-I proizvod proizveden postupcima prečišćavanja opisanim ovde poželjno obuhvata manje od oko 10 pg DNK ćelije domaćina po mg ApoA-I, manje od oko 100 ng proteina ćelije domaćina po mg ApoA-I, i/ili manje od 0,1 EU endotoksina po mg ApoA-I. ApoA-I proizvod može biti najmanje 95% čist, najmanje 96% čist, najmanje 97% čist, najmanje 98% čist ili najmanje 99% čist.

[0068] Dalje, suštinski čist ApoA-I proizvod može da se ugradi u bilo koju od farmaceutskih kombinacija i/ili lipoproteinskih kompleksa opisanih ovde koji obuhvataju ApoA-I.

[0069] Lipidna frakcija obično uključuje jedan ili više fosfolipida moji mogu biti neutralni, negativno naelektrisani, pozitivno naelektrisani, ili njihova kombinacija. Lanci masnih kiselina na fosfolipidima su poželjno dužine od 12 do 26 ili 16 do 26 atoma ugljenika i mogu da variraju u stepenu zasićenja od zasićenih do mono-nezasićenih. Primeri fosfolipida uključuju male fosfolipide sa alkil lancem, fosfatidilholin iz jaja, sojin fosfatidilholin, dipalmitoilfosfatidilholin, dimiristoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidilholin 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilholin, 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilholin, 1-palmitoil-2-stearoilfosfatidilholin, 1-stearoil-2-palmitoilfosfatidilholin, dioleoilfosfatidilholin dioleofosfatidiletanolamin, dilauroilfosfatidilglicerol fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol, fosfatidilgliceroli, difosfatidilgliceroli kao što su dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, distearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidinska kiselina, dipalmitoilfosfatidinska kiselina, dimiristoilfosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidiletanolamin, dimiristoilfosfatidilserin, dipalmitoilfosfatidilserin, moždani fosfatidilserin, moždani sfingomijelin, sfingomijelin iz jaja, mlečni sfingomijelin, palmitoil sfingomijelin, fitosfingomijelin, dipalmitoilsfingomijelin, distearoilsfingomijelin, so dipalmitoilfosfatidilglicerola, fosfatidinska kiselina, galaktocerebrozid, gangliozidi, cerebrozidi, dilaurilfosfatidilholin, (1,3)-D-manozil-(1,3)diglicerid, aminofenilglikozid, 3-holesteril-6'-(glikoziltio)heksil etar glikolipidi, i holesterol i njegovi derivati.

Fosfolipidne frakcije uključujući SM i palmitoilsfingomijelin mogu, opciono, da uključuju male količine bilo kog tipa lipida, uključujući, ali bez ograničenja na, lizofosfolipide, sfingomijeline koji nisu palmitoilsfingomijelin, galaktocerebrozid, gangliozide, cerebrozide, gliceride, trigliceride, i holesterol i njegove derivate.

[0070] Najpoželjnije, lipidna frakcija sadrži najmanje jedan neutralni fosfolipid i, opciono, jedan ili više negativno naelektrisanih fosfolipida. U lipoproteinskim kompleksima koji uključuju i neutralne i negativno naelektrisane fosfolipide, neutralni i negativno naelektrisani fosfolipidi mogu da imaju lance masnih kiselina sa istim ili različitim brojem atoma ugljenika i istim ili različitim stepenom zasićenja. U nekim slučajevima, neutralni i negativno naelektrisani fosfolipidi imaće isti acil kraj, na primer C16:0, ili palmitoil, acil lanac.

[0071] Kada lipidna komponenta kompleksa obuhvata ili se sastoji od neutralnih i negativno naelektrisanih fosfolipida, maseni odnos (masa:masa) neutralni prema negativno naelektrisani fosfolipid(i) je poželjno u masenom odnosu u opsegu od oko 99:1 do oko 90:10, poželjnije od oko 99:1 do oko 95:5, i najpoželjnije od oko 98:2 do oko 96:4. U jednom primeru izvođenja, neutralni fosfolipid(i) i negativno naelektrisan fosfolipid(i) su prisutni u masenom odnosu (masa:masa) neutralnog(ih) fosfolipida prema negativno naelektrisani fosfolipid(i) od oko 97:3.

[0072] Neutralni fosfolipid može biti prirodni ili sintetički. Poželjno, fosfolipid je sfingomijelin ("SM"), kao što je palmitoil sfingomijelin, fitosfingomijelin, difitosfingomijelin, fosfosfingolipid, ili glikosfingolipid, opciono sa zasićenim ili mono-nezasićenim masnim kiselinama sa dužinama lanaca od 16 do 26 atoma ugljenika. SM može da bude iz bilo kog izvora. Na primer, SM može da se dobije iz mleka, jaja, mozga, ili da se sintetički proizvede. U specifičnom primeru izvođenja, SM se dobija iz jajeta kokoške ("SM iz jaja"). U drugom specifičnom primeru izvođenja, SM je palmitoilsfingomijelin.

[0073] Bilo koji fosfolipid koji nosi najmanje delimično negativno naelektrisanje pri fiziološkom pH može da se koristi kao negativno naelektrisan fosfolipid. Neograničavajući primeri uključuju negativno naelektrisane oblike, npr., soli, fosfatidilinozitola, fosfatidilserina, fosfatidilglicerola i fosfatidinske kiseline. U specifičnom primeru izvođenja, negativno naelektrisan fosfolipid je 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], ili DPPG, fosfatidilglicerol. Poželjne soli uključuju soli kalijuma i natrijuma.

[0074] Fosfolipidi korišćeni za proizvodnju kompleksa ovog pronalaska su poželjno najmanje 95% čisti, a poželjnije su najmanje 99% čisti, i/ili imaju nivoe oksidacije ispod 4 meq O/kg, poželjnije ispod 3 meq O/kg (npr., ispod 2 meq O/kg). Glavni proizvod inicijalne reakcije oksigena i masnih kiselina je hidroperoksid. Upotrebom jodometrijskog postupka, moguće je da se mere nivoi oksidacije testiranjem prisustva peroksida u uzorku.

[0075] Lipoproteinski kompleksi ovog pronalaska poželjno imaju odnose apolipoproteina prema lipidu koji rezultuju formiranjem kompletnijeg i homogenijeg kompleksa, kao što je prikazano u primerima dole. Lipoproteinski kompleksi karakterišu se molarnim odnosom apolipoproteinska frakcija: lipidna frakcija u opsegu od 1:80 do 1:120, od 1:100 do 1:115, ili od 1:105 do 1:110, gde se apolipoprotein eksprimira u ApoA-I ekvivalentima. U specifičnim primerima izvođenja, molarni odnos apolipoproteinska frakcija: lipidna frakcija je 1:80 do 1:90 (npr., 1:82, 1:85 ili 1:87), od 1:90 do 1:100 (npr., 1:95 ili 1:98), od 1:100 do 1:110 (npr., 1:105 ili 1:108).

[0076] U specifičnim primerima izvođenja, naročito onim u kojima se SM iz jaja koristi kao neutralni lipid, maseni odnos apolipoproteinska frakcija: lipidna frakcija je u opsegu od oko 1:2,7 do oko 1:3 (npr., 1:2,7).

[0077] Lipoproteinski kompleksi ovog pronalaska takođe mogu da se koriste kao nosači za isporuku hidrofobnih, lipofilnih ili nepolarnih aktivnih agenasa. Za takve primene, lipidna frakcija može dalje da uključuje, ili lipoproteinski kompleks može da sadrži, jedan ili više hidrofobnih, lipofilnih ili nepolarnih aktivnih agenasa, uključujući, ali bez ograničenja na, masne kiseline, lekove, nukleinske kiseline, vitamine, i/ili nutrijente. Specifični primeri aktivnih agenasa opisani su u odeljku 5.2.

[0078] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje populacije lipoproteinskih kompleksa. Obično:

● populacije sadrže većinu lipoproteinskih kompleksa, pri čemu svaki obuhvata proteinsku frakciju i lipidnu frakciju;

● proteinska frakcije sadrži lipoprotein ili analog lipoproteina kao što je opisano gore, i u odeljku 5.1 ili u odeljku 5.5.3; najpoželjnije proteinska frakcija obuhvata ili suštinski se sastoji od lipoproteina (npr., ApoA-I protein) koji se dobija ili može da se dobije postupcima opisanim u odeljku 5.1.2 i/ili prečišćenim postupcima opisanim u odeljku 5.1.4;

● lipidne frakcije sadrže lipid kao što je opisano gore, i u odeljku 5.2 ili u odeljku 5.5.2;

● lipoproteinski kompleksi se poželjno proizvode postupcima termičkog cikliranja opisanim u odeljku 5.5.4.

[0079] Prijavioci su otkrili nekoliko karakteristika za koje se smatra da doprinose pojedinačno ili u kombinaciji potenciji i bezbednosnom profilu populacija lipoproteinskih kompleksa. Ove karakteristike uključuju:

● homogenost u veličini kompleksa u populaciji, uglavnom je u opsegu između 4 nm i 15 nm (npr., između 5 nm i 12 nm, između 6 nm i 15 nm, ili između 8 nm i 10 nm);

● čistoća apolipoproteina korišćenog za izradu kompleksa (npr., bez oksidovanih, deamidiranih, skraćenih, i/ili nezrelih oblika apolipoproteina i/ili bez endotoksina, i/ili bez proteina koji nisu apolipoprotein(i) (kao što su proteini ćelija domaćina), i/ili DNK ćelija domaćina koji su često prisutni u rekombinantnoj proizvodnji);

● čistoća samih kompleksa u populaciji (okarakterisana nedostatkom kontaminanata, kao što su rastvarači ili deterdženti koji se koriste za pripremu kompleksa; bez oksidovanih lipida; bez deamidiranih, oksidovanih ili skraćenih proteina; i/ili smanjenih količina ili bez nekompleksiranih apolipoproteina i/ili lipida).

[0080] Od ovih karakteristika, homogenost kompleksa i prevalenca zrelog, nemodifikovanog apolipoproteina u kompleksima, smatra se da povećava potenciju. Čistoća apolipoproteina, lipida, i kompleksa smanjuje rizik od nuspojava kao što su oštećenje jetre koje se odražava povećanjem enzima jetre (npr., transaminaze). Dodatno, pronalazači učinili su izvodljivim da se izrade populacije lipoproteinskih kompleksa postupcima koji rezultuju ugradnjom najvećeg dela apolipoproteina u komplekse, a smanjenje količine nekompleksiranih apolipoproteina takođe je korisno jer smanjuje rizik od imunogenskog odgovora kod subjekta koji može da bude izazvan davanjem heterolognog proteina.

[0081] Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje populacije lipoproteinskih kompleksa koje se karakterišu jednom ili više, ili čak svim, od sledećih karakteristika:

(a) najmanje 75mas.%, najmanje 80mas.%, najmanje 85mas.%, najmanje 90mas.%, ili najmanje 95mas.% lipoproteina, obično ApoA-I, u pomenutoj populaciji je u zrelom obliku;

(b) ne više od 25mas.%, ne više od 20mas.%, ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.% ili ne više od 5mas.% lipoproteina, obično ApoA-I, u pomenutoj populaciji je u nezrelom obliku;

(c) populacija sadrži ne više od 100 pikograma, ne više od 50 pikograma, ne više od 25 pikograma, ne više od 10 pikograma ili ne više od 5 pikograma DNK ćelija domaćina po miligramu lipoproteina, obično ApoA-I;

(d) populacija sadrži ne više od 500 nanograma, ne više od 200 nanograma, ne više od 100 nanograma, ne više od 50 nanograma, ili ne više od 20 nanograma proteina ćelija domaćina po miligramu lipoproteina, obično ApoA-I;

(e) ne više od 25mas.%, ne više od 20mas.%, ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.% ili ne više od 5mas.% lipoproteina, obično ApoA-I, u populaciji je u skraćenom obliku;

(f) lipoproteinska komponenta obuhvata ili sastoji se od zrelog ApoA-I, i ne više od 20%, ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% svakog od metionina 112 i metionina 148 u pomenutom ApoA-I u pomenutoj populaciji je oksidovana; (g) najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% lipoproteinskih kompleksa su u obliku čestica veličine od 4 nm do 15 nm, npr., veličine od 6 nm do 15 nm, ili veličine 8 do 12 nm, još poželjnije veličine 5 nm do 12 nm, kao što je izmereno gel-propusnom hromatografijom ("GPC") ili dinamičkim rasipanjem svetlosti ("DLS");

(i) populacija sadrži ne više od 1 EU, ne više od 0,5 EU, ne više od 0,3 EU ili ne više od 0,1 EU endotoksina po miligramu lipoproteina, obično ApoA-I;

(j) ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% aminokiselina u lipoproteinu, obično ApoA-I, u pomenutoj populaciji je deamidirano;

(k) ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.%, ne više od 5mas.%, ne više od 2mas.% ili 0mas.% lipida u lipidnoj frakciji u pomenutim kompleksima je holesterol;

(l) populacija sadrži ne više od 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm nevodenog rastvarača;

(m) populacija ne sadrži bilo koji deterdžent (npr., holat);

(n) populacija može biti najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% homogena, mereno procentom populacije u jednom piku u gel-propusnoj hromatografiji;

(o) populacija je u kombinaciji u kojoj je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 97% proteina u kompleksnom obliku;

(p) ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% lipida u pomenutoj populaciji je oksidovano; i

(q) ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% ostataka metionina i/ili triptofana u pomenutoj populaciji su oksidovani.

[0082] U specifičnim primerima izvođenja, populacija ima karakteristike odabrane iz sledećih grupa:

[0083] U određenim aspektima, populacija se karakteriše jednom ili više karakteristika nezavisno odabranih iz svake od Grupe I i Grupe IV; opciono, populacija se karakteriše sa tri karakteristike nezavisno odabrane iz svake od Grupe I i Grupe IV. Populacija može dodatno da se karakteriše sa jednom, dve ili tri karakteristike nezavisno odabrane iz svake od Grupe II i/ili Grupe III. Populacija može još dodatno da se karakteriše jednom ili dvema karakteristika nezavisno odabranih iz Grupe V i/ili jednom karakteristikom nezavisno odabranom iz Grupe VI.

[0084] Određene lipidne i proteinske komponente mogu da formiraju mnoštvo različitih ali homogenih lipoproteinskih kompleksa. Prema tome, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kombinacije koje obuhvataju dve, tri, ili četiri populacije lipoproteinskih kompleksa koji obuhvataju različite količine molekula apolipoproteina (npr., dva, tri ili četiri ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenata). U nekom primeru izvođenja, kombinacija obuhvata dve populacije lipoproteinskih kompleksa, pri čemu prva populacija obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 2 ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta po lipoproteinskom kompleksu, a druga populacija obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 3 ili 4 ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta po lipoproteinskom kompleksu i, opciono, treća populacija obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 4 ili 3 ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta po lipoproproteinskom kompleksu, respektivno.

[0085] Kombinacije koje obuhvataju dve ili više populacija lipoproteinskih kompleksa poželjno imaju niske nivoe lipoproteina i/ili lipida koji nisu obrazovali kompleks. Prema tome, poželjno ne više od 15%, ne više od 12%, nego 10%, ne više od 9%, ne više od 8%, ne više od 7%, ne više od 6%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ili ne više od 1% lipida u kombinaciji je u obliku van kompleksa i/ili ne više od 15%, ne više od 12%, ne više od 10%, ne više od 9%, ne više od 8%, ne više od 7%, ne više od 6%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ili ne više od 1% lipoproteina u kombinaciji je u nekompleksiranom obliku.

[0086] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za izradu lipoproteinskih kompleksa. Postupci su na bazi, inter alia, otkrića da podvrgavanje suspenzije koja sadrži nekompleksirane lipide i proteine ili peptide koji vezuju lipide, uslovima termičkog cikliranja rezultuje formiranjem lipoproteinskih kompleksa sa povoljnim rezultatima u odnosu na ostale postupke, kao što su oni u kojima se lipoproteinski kompleksi proizvode inkubiranjem komponenata na fiksnoj temperaturi.

[0087] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke termičkog cikliranja za pripremu lipoproteinskih kompleksa, kao što su oni opisani u odeljcima 5.5.1 do 6.5.4. Postupci obično obuhvataju podvrgavanje suspenzije koja obuhvata lipidne čestice ("lipidna komponenta") i proteine ili peptide koji vezuju lipide ("proteinska komponenta") većem broju temperaturnih ciklusa dok se veći deo proteinske komponente ne ugradi u lipoproteinske komplekse. Postupci uopšteno podrazumevaju cikliranje suspenzije između temperature u prvom opsegu viših temperatura i temperature u drugom opsegu nižih temperatura dok se ne oforme lipoproteinski kompleksi. Opsezi visokih i niskih temperatura postupka termičkog cikliranja su na bazi temperatura faznog prelaza lipidnih i proteinskih komponenti lipoproteinskih kompleksa. Alternativno, gde lipidna komponenta ne pokazuje definisanu ili zasebnu faznu promenu, kao što se javlja kada se koriste fosfolipidi koji imaju lance nezasićenih masnih kiselina ili mešavina fosfolipida, opsezi visokih i niskih temperatura termičkog cikliranja razlikuju se za najmanje oko 20°C, do oko 40°C ili još više. Na primer, u nekim primerima izvođenja, opsezi niskih i visokih temperatura razlikuju se za 20°C-30°C, 20°C-40°C, 20°C-50°C, 30°C-40°C, 30°C-50°C, 25°C-45°C, 35°C-55°C.

[0088] Za lipid, fazna promena uključuje promenu od zbijeno upakovane, uređene strukture, poznate kao stanje gela, u labavo upakovanu, manje uređenu strukturu, poznatu kao fluidno stanje.

Lipoproteinski kompleksi se obično formiraju u tehnici inkubiranjem lipidnih čestica i apolipoproteina na temperaturama bliskim temperaturi prelaza određenog lipida ili korišćene mešavine lipide. Temperatura faznog prelaza lipidne komponente (koja može da se odredi kalorimetrijom) /-12°C, poželjnije /- 10°C, predstavlja opseg "niskih" temperatura u postupcima ovog pronalaska. U određenim primerima izvođenja, opseg niskih temperatura je /-3°C, /-5°C, ili /-8°C od temperature faznog prelaza lipidne komponente. U jednom specifičnom primeru izvođenja, opseg niskih temperatura je od nemanje od 5°C ili ne manje od 10°C ispod do 5°C iznad temperature faznog prelaza lipidne komponente.

[0089] Za protein, temperatura faznog prelaza uključuje promenu od tercijarne strukture u sekundarnu strukturu. Temperatura faznog prelaza proteinske komponente /-12°C, poželjnije /- 10°C, predstavlja opseg "visokih" temperatura u postupcima ovog pronalaska. U specifičnim primerima izvođenja, opseg visokih temperatura je /-3°C, /-5°C, ili /-8°C od temperature faznog prelaza proteinske komponente. U jednom specifičnom primeru izvođenja, opseg niskih temperatura je od 10°C ispod do ne više od 5°C, ne više od 10°C, ili ne više od 15°C iznad temperature faznog prelaza proteinske komponente.

[0090] Llipidna komponenta polazne suspenzije, tj., suspenzije koja još uvek nije podvrgnuta termičkom cikliranju, poželjno obuhvata čestice lipida, npr., pretežno obuhvata lipide koji nisu obrazovali kompleks sa proteinima koji vezuju lipide. Izrada lipidne komponente je uopšteno kao što je opisano u odeljku 5.5.2 dole.

[0091] Proteinska komponenta polazne suspenzije poželjno sadrži peptide i/ili proteine koji vezuju lipide koji nisu obrazovali kompleks sa lipidima, ili su u kombinaciji sa lipidima u odnosu protein/peptid prema lipidu koji je najmanje 5-puta veći (npr., najmanje 5-puta, najmanje 10-puta ili najmanje 20-puta veći) od odnosa protein/peptid prema lipidu u željenom kompleksu. Izrada proteinske komponente je uopšteno kao što je opisano u odeljku 5.1 i u odeljku 5.5.3 dole. Proteinska komponenta se poželjno izrađuje prema postupcima opisanim u odeljku 5.1.2 i/ili prečišćava prema postupcima opisanim u odeljku 5.1.3 ili 5.1.4.

[0092] U postupcima ovog pronalaska, suspenzija koja sadrži proteinsku komponentu i lipidnu komponentu je obično termički ciklirana između opsega visokih temperatura i opsega niskih temperatura, poželjno polazeći od temperature u opsegu visokih temperatura, sve dok se ne oforme lipoproteinski kompleksi. Korišćenjem pogodnih količina lipidnih i proteinskih komponenti (npr., kao što je opisano u U.S. objavi patenta br.2006-0217312 A1), suštinski potpuno obrazovanje kompleksa lipidnih i proteinskih komponenti može da se postigne nakon nekoliko ciklusa. Dalji detalji stehiometrije proteina i lipida pogodne za postupke termičkog cikliranja opisani su u odeljku 5.5.4.

[0093] Kompleksi proizvedeni postupcima obično su supramolekularni sklopovi u obliku micela, vesikula, sferičnih ili diskoidnih čestica u kojima je proteinska komponenta fizički vezana za lipidnu komponentu u specifičnom stehiometrijskom opsegu i sa homogenom raspodelom veličina. Ovi postupci povoljno rezultuju suštinski potpunim obrazovanjem kompleksa lipida i/ili proteina u polaznoj suspenziji, što rezultuje kombinacijom koja je suštinski bez slobodnih lipida i/ili slobodnog proteina, kao što se primećuje separacionim postupcima kao što je hromatografija. Tako, postupci ovog pronalaska mogu se izvesti u odsustvu faze prečišćavanja.

[0094] Llipidna komponenta u polaznoj suspenziji je obično u čestičnom obliku. Poželjno je da su čestice pretežno najmanje 45 nm, najmanje 50 nm, najmanje 55 nm ili najmanje 60 nm veličine u opsegu do 65 nm, do 70 nm, do 75 nm, do 80 nm veličine, do 100 nm, do 120 nm, do 150 nm, do 200 nm, do 250 nm, do 300 nm, do 500 nm, na primer, u opsegu veličina 45 nm do 100 nm ili 45 do 250 nm, poželjnije u opsegu veličina 50 nm do 90 nm, i najpoželjnije u opsegu veličina 55 nm do 75 nm. U poželjnom primeru izvođenja, lipidne čestice pretežno obuhvataju sfingomijelin iz jaja i veličine su 55 do 75 nm. U drugom poželjnom primeru izvođenja, lipidne čestice pretežno obuhvataju jedan ili više sintetičkih sfingomijelina (npr., palmitoilsfingomijelin ili fitosfingomijelin) i veličine su 175 nm do 250 nm. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, lipidne čestice pretežno obuhvataju jedan ili više sintetičkih lipida (npr., palmitoil sfingomijelin ili fitosfingomijelin) i veličine su 250 nm do 1000 nm. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, lipidne čestice pretežno obuhvataju jedan ili više sintetičkih lipida (npr., palmitoil sfingomijelin ili fitosfingomijelin) i veličine su 1000 nm do 4000 nm. Veličine koje se ovde pominju su zeta (Z) prosečne veličine kao što je određeno dinamičkim rasipanjem svetlosti. Homogenizacija pod visokim pritiskom, na primer mikrofluidizacija, povoljno proizvedene lipidne čestice odgovarajućih veličina. Ostali postupci za formiranje čestica opisani su u odeljku 5.5.2 dole, i mogu da se koriste kao alternativa za homogenizaciju. Ako takvi postupci proizvode čestice izvan poželjnih opsega veličina, čestice mogu da se podvrgnu filtriranju kako bi se dobile čestice pogodne veličine.

[0095] Postupci pripreme lipoproteinskih kompleksa opisani ovde povoljno proizvode komplekse koji su homogeni u njihovoj raspodeli veličina, pri čemu se zaobilazi potreba za frakcionisanjem prema veličini. Štaviše, postupci ovog pronalaska rezultuju suštinski potpunom ugradnjom (npr., najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%) polaznog proteina u lipoproteinske čestice. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinacaju koja obuhvata lipoproteinske komplekse i u kojima je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% proteina koji vezuje lipide u kombinaciji obrazovalo kompleks sa lipidom, na primer kao što je određeno upotrebom gel-propusne hromatografije. U specifičnim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 4 nm do 20 nm zeta prosečnu veličinu, npr., 4 nm do 20 nm zeta prosečnu veličinu, 4 nm do 15 nm zeta prosečnu veličinu, 4 nm do 12 nm zeta prosečnu veličinu, 5 nm do 15 nm zeta prosečnu veličinu, 5 nm do 12 nm zeta prosečnu veličinu, 5 nm do 10 nm zeta prosečnu veličinu, 5 nm do 20 nm zeta prosečnu veličinu, 6 nm do 15 nm zeta prosečnu veličinu, ili 8 nm do 12 nm zeta prosečnu veličinu, i u kojima je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% proteina koji vezuje lipide u kombinaciji obrazovalo kompleks sa lipidom, na primer kao što je određeno upotrebom gel-propusne hromatografije.

Podvrgavanje lipidnih čestica termičkom cikliranju sa lipoproteinom prema postupcima opisanim ovde obično rezultuje populacijom lipoproteinskih čestica veličine od 4 nm do 15 nm, na primer populacijom lipoproteinskih čestica veličine od 6 nm do 15 nm, veličine 5 nm do 12 nm, ili veličine 8 nm do 12 nm. Veličina lipidnih čestica podvrgnutih termičkom cikliranju može da bude u opsegu od 50 nm do 250 nm. U poželjnom primeru izvođenja, lipidne čestice pretežno obuhvataju sfingomijelin iz jaja i veličine su od 55 do 75 nm. U drugom poželjnom primeru izvođenja, lipidne čestice pretežno obuhvataju jedan ili više sintetičkih sfingomijelina (npr., fitosfingomijelin) i veličine su 175 nm do 250 nm.

[0096] Jedna ili više faza u postupcima pripreme lipoproteinskih kompleksa može se izvesti pod inertnim gasom. Na taj način može da se smanji ili spreči oksidacija apolipoproteina i/ili lipida, čime se smanjuje rizik od nuspojava, kao što je oštećenje jetre. Pogodni inertni gasovi uključuju azot, helijum, i argon.

[0097] Lipoproteinski kompleksi dobijeni ili koji mogu da se dobiju postupcima opisanim gore posebno su pogodni za terapeutske upotrebe jer nije potrebna dodatna faza prečišćavanja nakon formiranja kompleksa.

[0098] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje populacije lipoproteinskih kompleksa, i farmaceutske kombinacije koje obuhvataju lipoproteinske komplekse ili njihove populacije, kao što je opisano ovde, i mogu opciono da uključuju jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijenasa i/ili razblaživača. U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kombinacije upakovane su u jedinične dozne količine pogodne za davanje. Na primer, u nekim primerima izvođenja, kombinacije obuhvataju jedinične dozne količine osušenih (na primer liofilizovanih) lipoproteinskih kompleksa upakovane u zaptivene fiolice. Te kombinacije pogodne su za rekonstituciju sa vodom, fiziološkim rastvorom (kao što je slani rastvor) ili puferom, i daju se injekcijom. Te kombinacije mogu opciono da uključuju jedan ili više agenasa protiv pretvaranja u pogaču i/ili protiv aglomeracije kako bi se olakšala rekonstitucija naelektrisanih kompleksa, ili jedan ili više puferujućih agenasa, agenasa za izotonizaciju (npr., saharoza i/ili manitol), šećere ili soli (npr., natrijum hlorid) dizajnirane za podešavanje pH, osmolaliteta i/ili saliniteta rekonstituisane suspenzije. Populacije lipoproteinskih kompleksa i/ili farmaceutske kombinacije opisane gore mogu da se proizvedu pod uslovima koji minimiziraju oksidaciju, čime se smanjuje rizik od nuspojava, kao što je oštećenje jetre, izazvanih oksidovanim proizvodima. Na primer, farmaceutske kombinacije mogu da se proizvedu pod nekim inertnim gasom, kao što je azot, helijum, ili argon.

[0099] Za komercijalne primene, korisna je proizvodnja preparata lipoproteinskih kompleksa i farmaceutskih kombinacija velikih razmera. Prema tome, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje pripremu najmanje 1L, 2L, 5L ili 10L i do 15L, 20L, 30L, 50L, ili veće (npr., pripremu 5L do 30L, 10L do 15L, ili 30L do 50L) koji obuhvataju lipoproteinske komplekse u količini dovoljnoj da se postigne koncentracija proteina koji vezuje lipide od najmanje oko 3 mg/mL, najmanje oko 4 mg/mL, ili najmanje oko 5 mg/mL, i do oko 10 mg/mL, oko 15 mg/mL, ili oko 20 mg/mL, poželjno u opsegu od oko 8 mg/mL do oko 12 mg/mL, najpoželjnije oko 8 mg/mL. U specifičnom primeru izvođenja, preparat ima zapreminu od 15L do 25L i sadrži oko 100 g do oko 250 g ApoA-I. U drugom specifičnom primeru izvođenja, preparat ima zapreminu 30L do 50L i sadrži oko 240 g do oko 780 g ApoA-I.

[0100] Lipoproteinski kompleksi opisani ovde korisni su za lečenje dislipidemijskih poremećaja kod životinja, najpoželjnije kod ljudi. Takva stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, hiperlipidemiju, i naročito hiperholesterolemiju (uključujući heterozigotnu i homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju), i kardiovaskularnu bolest kao što je ateroskleroza (uključujući lečenje i prevenciju ateroskleroze) i mnoštvo kliničkih manifestacija ateroskleroze, kao što je, na primer, šlog, ishemijski šlog, prolazni ishemijski napad, infarkt mijokarda, akutni koronarni sindrom, angina pektoris, intermitentna klaudikacija, kritična ishemija ekstremiteta, stenoza zalistaka, i skleroza zalistaka aorte; restenoza (npr., prevencija ili lečenje aterosklerotičnih plakova koji se razvijaju kao posledica medicinskih procedura kao što je balonska angioplastika); i ostale poremećaje, kao što su endotoksemija, koja često rezultuje septičkim šokom.

[0101] Lipoproteinski kompleksi i kombinacije kao što je opisano ovde otkriveno je da deluju na i/ili olakšavaju efluks holesterola kada se daju u dozama nižim od onih korišćenih za ostale lipoproteinske komplekse u studijama do danas. Videti, npr., Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-1402 (upotreba doze od 80 mg/kg); Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300 (upotreba doza od 15 mg/ kg ili 40 mg/kg); Tardif et al., 2007 JAMA 297:1675-1682 (upotreba doza od 40 mg/kg do 80 mg/kg), upotreba doza koje su u opsegu od 15 mg/kg do 80 mg/kg. Dodatno, lipoproteinski kompleksi kao što je opisano ovde otkriveno je da smanjuju nuspojave. Kao što je prikazano u primerima dole, otkriveno je da lipoproteinski kompleksi ovog pronalaska efikasno mobilišu holesterol u dozama niskim kao 2 mg/kg, i, nasuprot lipoproteinskih kompleksa prethodno davanih pacijentima ljudima, ne podižu značajno nivoe triglicerida, VLDL, i enzima jetre kao što su transaminaze (c.f., Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Vasc. Throm. Biol.19:979-89). Štaviše, primećene su smanjene nuspojave čak iako su doze povećane do oko 15 mg/kg (bez porasta triglicerida) ili čak visoke kao 45 mg/kg (bez porasta transaminaza) kod normalnih subjekata sa normalnom funkcijom jetre i/ili bubrega. Tako, sposobnost kompleksa ovog pronalaska da se daju bez nuspojava je poželjno ispitivana kod pojedinca sa normalnom funkcijom jetre, normalnom funkcijom bubrega, ili oba.

[0102] Bez vezivanja za teoriju, pronalazači pripisuju koristi lipoproteinskih kompleksa ovog pronalaska homogenijoj raspodeli veličina kompleksa i smanjenju količina oštećenog proteina i/ili lipida (npr., oksidovan protein, deamidiran protein, i oksidovan lipid) u poređenju sa prethodnim tretmanima. Dalje se veruje da će negativno naelektrisani fosfolipidi koji obuhvataju lipidnu frakciju dati komplekse i kombinacije opisane ovde sa poboljšanim terapeutskim svojstvima u odnosu na konvencionalne lipoproteinske komplekse. Jedna od ključnih razlika između malih diskoidnih pre-beta HDL čestica, koje se razgrađuju u bubrezima, i velikih diskoidnih i/ili sferičnih HDL, koji se prepoznaju od strane jetre gde se njihov holesterol ili skladišti, reciklira, metaboliše (kao žučne kiseline) ili eliminiše (u žuči), je naelektrisanje čestica. Male, diskoidne pre-beta HDL čestice imaju manje negativno površinsko naelektrisanje nego velike, diskoidne i/ili sferične HDL čestice koje su negativno naelektrisane. Veruje se da je veće negativno naelektrisanje jedan od faktora koji pokreće prepoznavanje čestica od strane jetre, i zbog toga izbegava katabolizam čestica od strane bubrega. Dalje, pokazalo se da bubreg ne apsorbuje lako apsorbuje naelektrisane čestice (videti Hacker et al., 2009, Pharmacology: Principles i Practice, 183). Tako, delimično zahvaljujući prisustvu naelektrisanih fosfolipida, veruje se da će negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi i kombinacije opisane ovde ostati u cirkulaciji duže nego konvencionalni lipoproteinski kompleksi, ili da će naelektrisanje da deluje na poluživot lipoproteina na način zavisan od naelektrisanja. Očekuje se da će njihovo duže vreme cirkulacije (zadržavanja), u kombinaciji sa smanjenjem brzine i/ili mere do koje kompleksi spajaju i fuziraju sa postojećim HDL kao rezultat negativnog naelektrisanja, olakšati mobilizaciju holesterola (davanjem kompleksima više vremena da akumuliraju holesterol) i esterifikaciju (obezbeđivanjem više vremena LCAT da katalizuje reakciju esterifikacije). Naelektrisanje može takođe da poveća brzinu hvatanja i/ili uklanjanja holesterola, čime se olakšava uklanjanje holesterola u većim količinama. Kao posledica, očekuje se da će negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi i kombinacije opisane ovde obezbediti terapeutsku korist u odnosu na konvencionalne terapije lipoproteinima, jer je potrebno da se daje manje kompleksa i/ili kombinacije i ređe, sa smanjenim nuspojavama.

[0103] Prema tome, postupci opisani ovde uopšteno uključuju davanje subjektu terapeutski efektivne količine lipoproteinskog kompleksa, populacije lipoproteinskih kompleksa, ili farmaceutske kombinacije opisanih ovde za lečenje ili sprečavanje dislipidemijskog poremećaja. Lipoproteinski kompleks može da se daje u dozi u opsegu od oko 0,25 mg/kg ApoA-I ekvivalenata do oko 45 mg/kg, npr., dozi od oko 0,5 mg/kg do oko 30 mg/kg ili oko 1 mg/kg ApoA-I ekvivalenata do oko 15 mg/kg ApoA-I ekvivalenata po injekciji. Doza dalje može da se prilagodi pojedincu koji se leči odabirom doze koja minimizira povećanje nivoa triglicerida, VLDL-holesterola i/ili VLDL-triglicerida. U specifičnim primerima izvođenja, doza je oko 3 mg/kg, oko 6 mg/kg, ili oko 12 mg/kg.

[0104] Postupci dalje obuhvataju davanje lipoproteinskog kompleksa u intervalu u opsegu od 5 do 14 dana, ili od 6 do 12 dana, kao što je interval od jedne ili dve nedelje. Postupci mogu dalje da obuhvataju davanje lipoproteinskog kompleksa 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili do 52 puta u bilo kom od intervala opisanih gore, i poželjno u intervalu od jedne nedelje. Na primer, u jednom primeru izvođenja, lipoproteinski kompleks se daje šest puta, sa intervalom od 1 nedelje između svakog davanja. Za hronična stanja, više od 52 davanja može da se izvede. Opciono, postupcima može da prethodi inicijalna faza indukcije gde se lipoproteinski kompleks daje češće.

[0105] Kompleksi i/ili njihove farmaceutske kombinacije, mogu da se daju parenteralno, npr., intravenozno. Intravenozno davanje može da se izvede kao infuzija tokom vremenskog perioda u opsegu od oko 1 do oko 24 sata, ili oko 1 do 4 sata, oko 0,5 do 2 sata, ili oko 1 sata.

[0106] Primeri dole pokazuju mala povećanja nivoa triglicerida nakon davanja doza od 30 mg/kg i 45 mg/kg, što se objašnjava porastom VLDL i LDL koji su rezultat visokog stepena mobilizacije holesterola. Ovi parametri mogu da se kontrolišu tokom tretmana, rutinskim merenjem u bolničnim laboratorijama sa standardnim lipidnim panelima. Na osnovu primera dole, odabir doza može da se izvede kako bi se minimizirao porast nivoa triglicerida i VLDL-holesterola i VLDL-triglicerida zavisno od reakcije pacijenta na lečenje, što omogućava personalizovani tip lečenja.

[0107] Kompleksi i/ili kombinacije mogu da se daju sami (kao monoterapija) ili, alternativno, mogu da se daju dopunski sa ostalim terapeutskim agensima korisnim za lečenje i/ili sprečavanje dislipidemije i/ili njenih povezanih stanja, bolesti i/ili poremećaja. Neograničavajući primeri terapeutskih agenasa sa kojima negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi i kombinacije opisane ovde mogu da se daju dopunski uključuju smole koje vezuju žučne kiseline, inhibitore HMG CoA-reduktaza (statini), niacin, smole, inhibitore apsorpcije holesterola, inhibitore agregacije trombocita, fibrate, antikoagulante, CETP inhibitore (npr., anacetrapib i dalcetrapib), i/ili PCSKG antitela ili ligande.

4. KRATAK OPIS SLIKA

[0108]

FIG.1: aminokiselinska sekvenca humanog prepro-apolipoprotein A-I (SEQ ID NO: 1; GenBank Pristupni br. AAB59514.1). Aminokiseline 1-18, podebljanim slovima, odgovaraju signalnoj sekvenci ApoA-I, a aminokiseline 19-24 odgovaraju propeptidnoj sekvenci, podvučeno. I signalna sekvenca i propeptid cepaju se u ćelijama kako bi se proizveo zreli humani ApoA-I cele dužine (aminokiseline 25-267).

FIG.2: ApoA-I titri u prihranjivanim šaržnim kulturama od 12-dana rekombinantnih S-CHO ćelija koje eksprimiraju ApoA-I. Ćelije su kontinuirano kultivisane serijskom pasažom od generacije 0 do generacije 43. ApoA-I proizvodnja je praćena u generacijama 4, 8, 14, 19, 25, 21, 36 i 43 reverzno faznom HPLC. Količina ApoA-I u podlozi za kulturu varirala je od 1259 mg/L do 1400 mg/L.

FIG.3A-3B: FIG.3A prikazuje gustinu vijabilnih ćelija u 200 L kulture od 13 dana rekombinantnih S-CHO ćelija koje eksprimiraju ApoA-I. Gustina vijabilnih ćelija imala je pik u danu 9 sa 33,20 x 105 ćelija/mL sa vijabilnošću od 92,5%. FIG.3B prikazuje koncentraciju ApoA-I u podlozi za kulturu kulture od 13 dana. Koncentracija ApoA-I u podlozi za kulturu imala je pik u danu 12 sa oko 2 mg/mL.

FIG.4: SDS poliakrilamidni gel ApoA-I prečišćen postupcima opisanim ovde. Traka sa leve strane prikazuje markere molekulske mase. Traka sa desne strane prikazuje prečišćen ApoA-I koji ima molekulsku masu od približno 28kD.

FIG.5A-5D: HPLC hromatogrami proApoA-I/ SM kompleksa sa masenim odnosima protein:lipid od 1:2,5 (Formula A; FIG.5A), 1:2,7 (Formula B; FIG.5B), 1:3,1 (Formula C; FIG.5C), i proApoA-I/SM/DPPC kompleksi sa masenim odnosom protein : lipid od 1:2,7 (Formula D; FIG.5D).

FIG.6A-6D: HPLC hromatogrami lipoproteinskih kompleksa Formule D u 10, 20, 30, i 60 minutu, respektivno.

FIG.7A-7D: HPLC hromatogrami lipoproteinskih kompleksa Formule B u 10, 20, 30, i 50 minutu, respektivno.

FIG.8A-8D: HPLC hromatogrami lipoproteinskih kompleksa Formule F u 20, 40, 60, i 120 minutu, respektivno.

FIG.9: Grafikon formiranja pre-beta HDL kompleksa tokom vremena koji ilustruje formiranje lipoproteinskih kompleksa sa masenim odnosom lipoprotein:ukupan fosfolipid od 1:2,7 koji obuhvata proApoA-I i SM (Formula B), proApoA-I, SM, DPPC i DPPG sa masenim odnosom SM:DPPC:DPPG od 48:48:4 (Formula F), i proApoA-I, SM, DPPC i DPPG sa masenim odnosom SM:DPPC:DPPG od 73:23:4 (Formula G).

FIG.10A-10D: HPLC hromatogrami za Formule E, H, I, i J, respektivno.

FIG.11: Šematski dijagram primera postupka za izradu lipoproteinskih kompleksa.

FIG.12: Primer uređaja za termičko cikliranje korišćen za izvođenje termičkog cikliranja u nekomercijalnoj razmeri.

FIG.13A-13E: Gel-propusni hromatogram SM/DPPG/ApoA-I protein kompleksa sa većim brojem temperaturnih ciklusa. Komponente su podvrgnute termičkom cikliranju između 57°C i 37°C tokom 5 minuta na svakoj temperaturi, za ukupno 30 minuta (FIG.13A), 60 minuta (FIG.13B), 120 minuta (FIG.13C), 180 minuta (FIG.13D) ili 210 minuta (FIG.13E).

FIG.14: Gel-propusni hromatogram SM/ApoA-I kompleksa.

FIG.15: Gel-propusni hromatogram N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (oblik biljnog SM ili fitosfingomijelina)/DPPG/ApoA-I kompleksa.

FIG.16: Gel-propusni hromatogram sintetičkih palmitoil SM/DPPG/ApoA-I kompleksa.

FIG.17: Gel-propusni hromatogram fitosfingomijelin/DPPG/ApoA-I kompleksa.

FIG.18: Gel-propusni hromatogram SM/DPPC/DPPG/ApoA-I peptid kompleksa.

FIG.19A-19D: Karakterizacija lipidnih čestica sistemom dinamičkog rasipanja svetlosti upotrebom Malvern Instruments Zetasizer (Malvern Instruments Inc.). Na FIG.19A, Z prosek je 84,49 nm ("84 nm čestice"); na FIG.19B, Z prosek je 76,76 nm ("77 nm čestice"); na FIG.19C, Z prosek je 66,21 nm ("66 nm čestice"); i na FIG.19D, Z prosek je 59,50 nm ("60 nm čestice"). FIG.20A-20D: Gel-propusni hromatogrami kompleksa nakon pet temperaturnih ciklusa sa 84 nm (FIG.20A), 77 nm (FIG.20B), 66 nm (FIG.20C) i 60 nm (FIG.20D) lipidnim česticama.

FIG.21A-21B: Gel-propusni hromatogrami kompleksa nakon šest temperaturnih ciklusa polazeći od lipidnih čestica od 450 nm (FIG.21A) i 40 nm (FIG.21B).

FIG.22: Gel-propusni hromatogram kompleksa nakon šest temperaturnih ciklusa polazeći od lipidnih čestica od 65 nm, sa prvim ciklusom iniciranim na "niskoj temperaturi" od 37°C.

FIG.23: Šematski dijagram nekog primera izvođenja za izradu farmaceutskih kombinacija koje obuhvataju lipoproteinske komplekse, koji uključuje formulisanje lipoproteinskih kompleksa proizvedenih postupcima ovog pronalaska u komercijalno korisne farmaceutske kombinacije. FIG.24: Povećanje plazmatičnih nivoa VLDL-ukupnog holesterola nakon infuzije lipoproteinskog kompleksa prema Formuli B i Formuli H. Lipoproteinski kompleksi prema Formuli H (■) i Formuli B (▼) ubrizgani su u izgladnele zečeve u dozama od 5 mg/kg. Vrednosti osnovne linije, u opsegu od 0,03 do 0,3 g/L za tri grupe, su bile oduzete kako bi se odredilo povećanje plazmatičnih nivoa VLDL-ukupnog holesterola.

FIG.25: Povećanje plazmatičnih nivoa triglicerida nakon infuzije lipoproteinskog kompleksa prema Formuli B i Formuli H. Lipoproteinski kompleksi prema Formuli H (■) i Formuli B (▲) ubrizgani su u izgladnele zečeve u dozama od 5 mg/kg. Vrednosti osnovne linije, u opsegu od 0,31 do 0,71 g/L za tri grupe, su bile oduzete kako bi se odredilo povećanje plazmatičnih nivoa triglicerida.

FIG.26A-26D: Povećanje plazmatičnih ukupnih holesterola (FIG.26A), triglicerida (FIG.26B), fosfolipida (FIG.26C), i ApoA-I (FIG.26D) nakon infuzije od 5 mg/kg ili 20 mg/kg i 20 mg/kg kod zečeva kompleksa ApoA-I/SM jajeta (●, ▲) ili kompleksa ApoA-I/sintetički SM (◆,▼), u poređenju sa razblaživačem (■). Vrednosti osnovne linije bile su u opsegu kao što sledi za različite izmerene plazmatične lipide: od 0,28 do 0,4 g/L za plazmatični holesterol, od 0,23 do 0,29 g/L za plazmatične trigliceride, i od 0,45 do 0,61 g/L za plazmatične fosfolipide.

FIG.27A-27C: Povećanje plazmatičnih HDL-ukupnog holesterola (FIG.27A), LDL-ukupnog holesterola (FIG.27B), i VLDL-ukupnog holesterola (FIG.27C) nakon infuzije u zečeve od 5 mg/kg kompleksa ApoA-I/SM jajeta (●) i kompleksa ApoA-I/sintetički SM (◆) u poređenju sa razblaživačem (■). Vrednosti osnovne linije bile su u opsegu kao što sledi: između 0,20 do 0,31 g/L za plazmatični HDL-ukupni holesterol, između 0,06 do 0,09 g/L za plazmatični LDL-ukupni holesterol, i između 0,007 do 0,011 g/L za plazmatični VLDL-ukupni holesterol.

5.DETALJAN OPIS

[0109] Ovaj pronalazak obezbeđuje lipoproteinske komplekse, njihove populacije, zajedno sa postupcima izrade lipoproteinskih kompleksa. Kompleksi, i njihove populacije i kombinacije (npr., farmaceutske kombinacije), korisne su, između ostalog, za lečenje i/ili profilaksu dislipidemije i/ili bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa dislipidemijom. Kao što je opisano u odeljku Suština, lipoproteinski kompleksi obuhvataju dve glavne frakcije, apolipoproteinska frakcija i fosfolipidna frakcija, poželjno u definisanim masenim ili molarnim odnosima, i poželjno uključuju određenu količinu neutralnog fosfolipida i, opciono, jedan ili više negativno naelektrisanih fosfolipida.

5.1. Proteinska frakcija

[0110] Ovaj pronalazak obezbeđuje lipoproteinske komplekse koji obuhvataju proteinsku frakciju. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupke izrade lipoproteinskih kompleksa. Proteinska komponenta lipoproteinskih kompleksa nije kritična za uspeh u ovim postupcima. Praktično bilo koji protein koji vezuje lipide, kao što je neki apolipoprotein i/ili njegov derivat ili analog koji obezbeđuje terapeutsku i/ili profilaktičku korist može da bude uključen u kompleksima. Štaviše, bilo koji alfa-helični peptid ili analog peptida, ili bilo koji drugi tip molekula koji "imitira" aktivnost nekog apolipoproteina (kao što je, na primer ApoA-I) u tome što može da aktivira LCAT ili formira diskoidne čestice kada se vezuje sa lipidima, može da bude uključen u lipoproteinske komplekse, i obuhvaćen je izrazom "protein koji vezuje lipide."

5.1.1. Proteini koji vezuju lipide

[0111] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupke prečišćavanja rekombinantno proizvedenog proteina, npr., za upotrebu u izradi lipoproteinskih kompleksa. Rekombinantno proizveden protein je najpogodniji apolipoprotein. Pogodni proteini uključuju apolipoproteine ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V i ApoE; poželjno u zrelom obliku. Proteini koji vezuju lipide takođe aktiviraju polimorfne oblike, izoforme, varijante i mutante kao i skraćene oblike gore navedenih apolipoproteina, od kojih su najčešći Apolipoprotein A-IMilano(ApoA-IM), Apolipoprotein A-IParis(ApoA-Ip), i Apolipoprotein A-IZaragoza(ApoA-IZ). Mutanti apolipoproteina koji sadrže ostatke cisteina takođe su poznati, i takođe mogu da se koriste (videti, npr., U.S. objavu br.2003/0181372). Apolipoproteini mogu da budu u obliku monomera ili dimera, koji mogu da budu homodimeri ili heterodimeri. Na primer, homo- i heterodimeri (gde je to moguće) ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.16(12):1424-29), ApoA-IM(Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem.260:1632-35), ApoA-Ip (Daum et al., 1999, J. Mol. Med.

77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem.260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem.259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem.201(2):373-83), ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem.258(14):8993-9000), ApoJ i ApoH mogu da se koriste.

Apolipoproteini mogu da uključuju ostatke koji odgovaraju elementima koji olakšavaju njihovo izolovanje, kao što su His tagovi, ili ostali elementi dizajnirani za ostale svrhe, sve dok apolipoprotein zadržava neku biološku aktivnost kada je uključen u kompleksu.

[0112] Takvi apolipoproteini mogu da se prečiste iz životinjskih izvora (i, određenije, iz humanih izvora) ili proizvedu rekombinantno kao što je dobro poznato u tehnici, videti, npr., Chung et al., 1980, J. Lipid Res.21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res.28(8):913-29. Videti takođe U.S. Patent br.

5,059,528, 5,128,318, 6,617,134; U.S. objavu br.20002/0156007, 2004/0067873, 2004/0077541, i 2004/0266660; i PCT objave br. WO/2008/104890 i WO/2007/023476. Ostali postupci prečišćavanja takođe su mogući, na primer, kao što je opisano u odeljcima 5.1.3 i 5.1.4 dole.

[0113] Neograničavajući primeri peptida i analoga peptida koji odgovaraju apolipoproteina, kao i agonista koji imitiraju aktivnost ApoA-I, ApoA-IM, ApoA-II, ApoA-IV, i ApoE, koji su pogodni za upotrebu kao apolipoproteini u kompleksima i kombinacijama opisanim ovde opisani su u U.S. Pat. br.

6,004,925, 6,037,323 i 6,046,166 (objavljen od strane Dasseux et al.), U.S. Pat. br.5,840,688 (objavljen od strane Tso), U.S. objava br.2004/0266671, 2004/0254120, 2003/0171277 i 2003/0045460 (od Fogelman), U.S. objava br.2003/0087819 (od Bielicki) i PCT objava od. WO/2010/093918 (od Dasseux et al.). Ovi peptidi i analozi peptida mogu da se sastoje od L-aminokiseline ili D-aminokiselina ili mešavina L- i D-aminokiselina. Mogu takođe da uključuju jednu ili više ne-peptidnih ili amidnih veza, kao što su jedan ili više dobro poznatih peptid/amid izostera. Takvi "peptidni i/ili peptid mimetički" apolipoproteini mogu da se sintetizuju ili proizvedu upotrebom bilo koje tehnike za sintezu peptida poznate u tehnici, uključujući, npr., tehnike opisane u U.S. Pat. br.6,004,925, 6,037,323 i 6,046,166.

[0114] Kompleksi mogu da uključuju jednu vrstu proteina koji vezuje lipide, ili mešavine dva ili više različitih proteina koji vezuju lipide, koji mogu da se dobiju od istih ili različitih vrsta. Iako nije neophodno, lipoproteinski kompleksi poželjno će obuhvatati proteine koji vezuju lipide koji se dobijaju od, ili odgovaraju u aminokiselinskoj sekvenci, životinjskim vrstama koje se tretiraju, kako bi se izbeglo indukovanje imunog odgovora na terapiju. Tako, za lečenje humanih pacijenata, proteini koji vezuju lipide humanog porekla se poželjno koriste u kompleksima ovog pronalaska. Upotrebom peptidnih mimetičkih apolipoproteina može takođe da se smanji ili izbegne imuni odgovor.

[0115] U određenim poželjnim primerima izvođenja, protein koji vezuje lipide je protein koji ima aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 95% identiteta sekvenci zrelog humanog ApoA-I proteina, npr., protein koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara položajima 25 do 267 iz SEQ ID NO:1. U određenim primerima izvođenja, zreli humani ApoA-I protein ima aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvenci položajima 25 do 267 iz SEQ ID NO:1. U nekim primerima izvođenja, zreli humani ApoA-I protein ima aminokiselinsku sekvencu koja ima asparaginsku kiselinu u položaju 1 (tj. položaj koji odgovara položaju 25 iz SEQ ID NO: 1). U specifičnom primeru izvođenja, zreli humani ApoA-I protein ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara položajima 25 do 267 iz SEQ ID NO:1. U poželjnom primeru izvođenja, ApoA-I protein je rekombinantno proizveden u ćelijama domaćina sisara, najpoželjnije ćelije jajnika kineskog hrčka ("CHO"), kao što je opisano u sledećem pododeljku.

5.1.2. Rekombinantna ekspresija apolipoproteina

[0116] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke rekombinantne ekspresije za proizvodnju proteina koji vezuju lipide kao što je ApoA-I, i povezanih nukleinskih kiselina, ćelija domaćina sisara, ćelijskih kultura. Dobijeni rekombinantni protein koji vezuje lipide može da se prečisti i/ili ugradi u lipoproteinske komplekse kao što je opisano ovde.

[0117] Uopšteno, za rekombinantnu proizvodnju, polinukleotidna sekvenca koja kodira protein ili peptid koji vezuje lipide umeće se u odgovarajući ekspresioni nosač, tj., vektor koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju umetnute kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju. Ekspresioni vektor može da se dobije iz virusa kao što su adenovirus, adeno-povezani virus, herpesvirus, retrovirus ili lentivirus. Ekspresioni nosač se zatim transfektuje u pogodnu ciljnu ćeliju koja će da eksprimira protein ili peptid. Pogodne ćelije domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, bakterijske vrste, sisteme ćelija domaćina sisara ili insekata uključujući bakulovirusne sisteme (videti, npr., Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47 (1988)), i ustanovljene ćelijske linije kao što su 293, COS-7, C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK, itd. Zavisno od korišćenog ekspresionog sistema, eksprimirani peptid zatim se izoluje po procedurama dobro ustanovljenim u tehnici. Postupci za proizvodnju rekombinantnih proteina i peptida dobro su poznati u tehnici (videti, npr., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; i Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).

[0118] Gde je ApoA-I protein koji vezuje lipide, ApoA-I protein se eksprimira iz rekombinantne nukleotidne sekvence koja kodira ApoA-I. U nekim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira ApoA-I je humana. Neograničavajući primeri humanih ApoA-I nukleotidnih sekvenci opisane su u U.S. Patentima br.5,876,968; 5,643,757; i 5,990,081, i WO 96/37608. U određenim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca kodira aminokiselinsku sekvencu zrelog ApoA-I proteina, poželjno operativno vezana za signalnu sekvencu (npr., aminokiseline 1-18 iz SEQ ID NO:1) za izlučivanje ApoA-I iz ćelije domaćina i/ili proproteinske sekvence (npr., aminokiseline 19-25 iz SEQ ID NO:1). Ostale signalne sekvence pogodne za usmereno izlučivanje ApoA-I mogu biti ili heterologne sa ApoA-I, npr., humani albumin signalni peptid ili humani IL-2 signalni peptid, ili homologne sa ApoA-I.

[0119] Poželjno, nukleotidna sekvenca kodira zreli humani ApoA-I polipeptid, na primer polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja odgovara položajima 25 do 267 iz SEQ ID NO:1, opciono gde aminokiselinska sekvenca obuhvata asparaginsku kiselinu u položaju 25. U poželjnom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:1. Nukleotidna sekvenca takođe može da kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci humanog ApoA-I proteina navedenoj u jednom od GenBank pristupnih br. NP_000030, AAB59514, P02647, CAA30377, AAA51746 ili AAH05380.1, pri čemu opciono obuhvata asparaginsku kiselinu u položaju koji odgovara prvoj aminokiselini zrelog humanog ApoA-I proteina.

[0120] Polinukleotidi koji kodiraju ApoA-I mogu biti kodon optimiziran za ekspresiju u rekombinantnim ćelijama domaćina. Poželjne ćelije domaćina su ćelije domaćina sisara, uključujući, bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (npr. CHO-K1; ATCC br. CCL 61; CHO-S (GIBCO Life Technologies Inc., Rockville, MD, Katalog #11619012)), VERO ćelije, BHK (ATCC br. CRL 1632), BHK 570 (ATCC br. CRL 10314), HeLa ćelije, COS-1 (ATCC br. CRL 1650), COS-7 (ATCC br. CRL 1651), MDCK ćelije, 293 ćelije (ATCC br. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.36:59-72, 1977), 3T3 ćelije, ćelije mijeloma (naročito mišje), PC12 ćelije i W138 ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelije sisara, kao što su CHO-S ćelije (Invitrogen™, Carlsbad CA), adaptirane su za rast u podlozi bez seruma. Dodatne pogodne ćelijske linije poznate su u tehnici i dostupne su iz javnih depoa kao što su American Type Culture Collection, Manassas, Va.

[0121] Za rekombinantnu ekspresiju ApoA-I, polinukleotidi koji kodiraju ApoA-I operativno su povezani sa jednom ili više kontrolnih sekvenci, npr., promoter ili terminator, koje regulišu ekspresiju ApoA-I u ćeliji domaćina od interesa. Kontrolna sekvenca(e) mogu biti domaće ili strane u odnosu na ApoA-I-kodirajuću sekvencu, i takođe domaće ili strane u odnosu na ćeliju domaćina u kojoj se eksprimira ApoA-I. Kontrolne sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter, mesta vezivanja ribozoma, lidere, sekvence poliadenilacije, propeptidne sekvence, signalne peptidne sekvence, i transkripcione terminatore. U nekim primerima izvođenja, kontrolne sekvence uključuju promoter, mesto vezivanja ribozoma, i transkripcione i translacione stop signale. Kontrolne sekvence mogu takođe da uključuju jedan ili više linkera za svrhu uvođenja specifičnih restrikcionih mesta koja olakšavaju vezivanje kontrolnih sekvenci sa kodirajućim regionom nukleotidne sekvence koja kodira ApoA-I.

[0122] Promoteri koji pogone rekombinantnu ekspresiju ApoA-I mogu biti konstitutivni promoteri, regulisani promoteri, ili inducibilni promoteri. Odgovarajuće sekvence promotera mogu da se dobiju iz gena koji kodiraju ekstracelularne ili intracelularne polipeptide koji su ili endogeni ili heterologni sa ćelijom domaćina. Postupci za izolovanje, identifikaciju i manipulaciju promotera promenljivih jačina dostupni su u ili lako se adaptiraju iz tehnike. Videti npr., Nevoigt et al. (2006) Appl. Environ. Microbiol.

72:5266-5273.

[0123] Jedna ili više od kontrolnih sekvenci može da se dobije iz virusnih izvora. Na primer, u određenim aspektima, promoteri se dobijaju iz glavnog kasnog promotera polioma ili adenovirus. U drugim aspektima, promoter se dobija iz majmunskog virusa 40 (SV40), koji može da se dobije kao fragment koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije (Fiers et al., 1978, Nature, 273:113-120), ili od citomegalovirusa, npr., majmunski citomegalovirusni neposredno rani promoter. (Videti U.S. Pat. br. 4,956,288). Ostali pogodni promoteri uključuju one iz metalotionein gena (Videti U.S. Pat. br.4,579,821 i 4,601,978).

[0124] Ovde su takođe opisani rekombinantni ApoA-I ekspresioni vektori. Rekombinantni ekspresioni vektor može biti bilo koji vektor, npr., plazmid ili virus, koji može da se manipuliše tehnikama rekombinantne DNK kako bi se olakšala ekspresija heterolognog ApoA-I u rekombinantnoj ćeliji domaćina. Ekspresioni vektor može da se umetne u hromozom rekombinantne ćelije domaćina i obuhvata jedan ili više heterolognih gena operativno povezanih sa jednom ili više kontrolnih sekvenci korisnih za proizvodnju ApoA-I. U ostalim primerima izvođenja, ekspresioni vektor je ekstrahromozomalni replikativni DNK molekul, npr., linearni ili zatvoren kružni plazmid, koji se nalazi ili u malom broju kopija (npr., od oko 1 do oko 10 kopija po ekvivalentu genoma) ili u velikom broju kopija (npr., više od oko 10 kopija po ekvivalentu genoma). U raznim primerima izvođenja, ekspresioni vektor uključuje selektabilni marker, kao što je gen koji dodeljuje otpornost na neki antibiotik (npr., otpornost na ampicilin, kanamicin, hloramfenikol ili tetraciklin) rekombinantnom organizmu domaćina koji obuhvata vektor. U određenim aspektima, DNK konstrukti, vektori i polinukleotidi pogodni su za ekspresiju ApoA-I u ćelijama sisara. Vektori za ekspresiju ApoA-I u ćelijama sisara mogu da uključuju poreklo replikacije, promoter i bilo koja neophodna mesta vezivanja ribozoma, mesta RNK splajsovanja, mesto poliadenilacije, i sekvence transkripcionog terminatora koje su kompatibilne sa sistemima ćelija domaćina. U nekim aspektima, poreklo replikacije je heterologno sa ćelijom domaćina, npr., je virusnog porekla (npr., SV40, Poliom, Adeno, VSV, BPV). U ostalim aspektima, poreklo replikacije je obezbeđeno mehanizmom hromozomalne replikacije ćelija domaćina.

[0125] Postupci, reagensi i alati za uvođenje strane DNK u ćelije domaćina sisara poznati su u tehnici i uključuju, ali nisu ograničeni na, kalcijum fosfat-posredovanu transfekciju (Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro et al., 1981, Somatic Cell Genetics 7:603; Graham et al., 1973, Virology 52:456), elektroporaciju (Neumann et al., 1982, EMBO J.1:841-5), DEAE-dekstran posredovanu transfekciju (Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995)), i lipozom-posredovanu transfekciju (Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15:73; Ciccarone et al., 1993, Focus 15:80).

[0126] Za proizvodnju sa visokim prinosom, poželjna je stabilna ekspresija ApoA-I. Na primer, nakon uvođenja strane DNK u ćelije domaćina, može da se omogući da ćelije domaćina rastu tokom 1-2 dana u obogaćenoj podlozi, a zatim da se prebace u selektivnu podlogu. Pre nego da se koriste ekspresioni vektori koji sadrže virusna porekla replikacije, ćelije domaćina mogu da se transformišu sa vektorom koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja obuhvata ApoA-I-kodirajuću sekvencu kontrolisanu osdovarajućim kontrolnim elementima ekspresije i selektabilnim markerom. Selektabilni marker u vektoru dodeljuje otpornost na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno umetnu vektor u svoje hromozome i rastu radi formiranja žarišta koja zauzvrat mogu da se kloniraju i šire u ćelijskim linijama. Brojni selekcioni sistemi mogu da se koriste, uključujući, ali bez ograničenja na, gene timidin kinaze herpes simpleks virusa (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), i adenin fosforiboziltransferaze (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) mogu da se koriste u tk-, hgprt<->ili aprt<->ćelijama, respektivno. Takođe, antimetabolitna otpornost može da se koristi kao osnova selekcije upotrebom, na primer, dhfr, koji dodeljuje otpornost na metotreksat (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, koji dodeljuje otpornost na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072; neo, koji dodeljuje otpornost na aminoglikozid G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol.150: 1); i/ili hyg, koji dodeljuje otpornost na higromicin (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).

[0127] Stablna ekspresija sa visokim prinosom takođ može da se postigne upotrebom retrovirusnih vektora koji se integrišu u genom ćelija domaćina (videti, npr., U.S. objave patenata br.2008/0286779 i 2004/0235173). Alternativno, stabilna ekspresija sa visokim prinosom ApoA-I može se potići postupci genske aktivacije, koji podrazumevaju aktiviranje ekspresije i amplifikaciju gena za endogeni ApoA-I u genomnoj DNK ćelije sisara po izboru, na primer kao što je opisano u WO 1994/012650. Povećanje broja kopija ApoA-I gena (koji sadrži ApoA-I kodirajuću sekvencu i jedan ili više kontrolnih elemenata) može da olakša ekspresiju ApoA-I sa visokim prinosom. Poželjno, ćelija domaćina sisara u kojoj se ApoA-I eksprimira ima indeks genske kopije za ApoA-I od najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, ili najmanje 5. U specifičnim primerima izvođenja, ćelija domaćina sisara u kojoj se ApoA-I eksprimira ima indeks kopije gena za ApoA-I od najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, ili najmanje 10.

[0128] U određenim primerima izvođenja, ćelije sisara adaptirane su da proizvode ApoA-I u količinama od najmanje 0,5 g/L, najmanje 1 g/L, najmanje 1,5 g/L, najmanje 2 g/L, najmanje 2,5 g/L, najmanje 3 g/L, najmanje 3,5 g/L, i opciono do 4 g/L, do 4,5 g/L, do 5 g/L, do 5,5 g/L, ili do 6 g/L. Ćelije domaćina sisara poželjno mogu da proizvode najmanje oko 0,5, 1, 2, ili 3 g/L ApoA-I u kulturi i/ili do oko 20 g/L ApoA-I u kulturi, npr., do 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, ili 15 g/L ApoA-I u kulturi.

[0129] U određenim primerima izvođenja, ćelije sisara adaptirane su za rast u podlozi bez seruma. U ovim primerima izvođenja, ApoA-I se izlučuje iz ćelija. U ostalim primerima izvođenja, ApoA-I se ne izlučuje iz ćelija.

[0130] Ćelije domaćina sisara opisane ovde mogu da se koriste za proizvodnju ApoA-I. Uopšteno, postupci obuhvataju kultivisanje ćelije domaćina sisara kao što je opisano ovde pod uslovima u kojima se eksprimira ApoA-I. Dalje, postupci mogu da obuhvataju izdvajanje i, opciono, prečišćavanje zrelog ApoA-I iz supernatanta ćelijske kulture sisara.

[0131] Uslovi kultivisanja, uključujući podlogu za kulturu, temperaturu, pH, mogu da se prilagode ćeliji domaćina sisara koja se kultiviše i odabranom načinu kultivisanja (mućkajuća boca, bioreaktor, valjkasta boca, itd...). Ćelije sisara mogu da se uzgajaju u šaržnoj kulturi velike zapremine, u kontinuiranoj ili semikontinuiranoj kulturi.

[0132] Ovde je takođe opisana ćelijska kultura sisara koja obuhvata mnoštvo ćelija domaćina sisara koje proizvode ApoA-I opisanih ovde. U nekim primerima izvođenja, ćelijska kultura sisara obuhvata najmanje 0,5 g/L, najmanje 1 g/L, najmanje 1,5 g/L, najmanje 2 g/L, najmanje 2,5 g/L, najmanje 3 g/L, najmanje 3,5 g/L, i opciono do 4 g/L, do 4,5 g/L, do 5 g/L, do 5,5 g/L, ili do 6 g/L ApoA-I. Kultura može biti bilo koje veličine, u opsegu od oko 150 mL do oko 500 mL, 1L, 10L, 15L, 50L, 100L, 200L, 250L, 300L, 350L, 400L, 500L, 750L, 1000L, 1500L, 2000L, 2500L, 3000L, 5000L, 7500L, 10000L, 15000L, 20000L, 25000L, 50000 L ili veća. U nekim slučajevima, kultura je kultura velike zapremine, kao što je 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 50 L, 100 L, 200L, 300L, 500L, 1000L, 5000L, 10000L, 15000L, 20000L, 25000L, do 50000L ili veća.

5.1.3. Prečišćavanje apolipoproteina

[0133] Ovaj pronalazak odnosi se na postupke za dobijanje visoko prečišćenog apolipoproteina, koji je koristan u izradi lipoproteinskih kompleksa i njihovih kombinacija kao što je opisano ovde. Postupci se mogu primeniti na bilo koji apolipoprotein, uključujući, ali bez ograničenja na, ApoA-I, -II, -III ili - IV; ApoB48 i ApoB100; ApoC-I, -II, -III ili -IV; ApoD; ApoE, ApoH; ApoJ. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na postupke za dobijanje visoko prečišćenog ApoA-I. U nekim primerima izvođenja, ApoA-I je humani protein koji ima sekvencu odabranu od, ali neograničavajuće, sekvenci datih u Genbank pristupnim br. NP_000030, AAB59514, P02647, CAA30377, AAA51746 i AAH05380.1. U određenim primerima izvođenja, ApoA-I je humani protein kao što je opisano gore u odeljku 5.1.2. U ostalim primerima izvođenja, postupci ovog pronalaska mogu da se koriste za prečišćavanje ApoA-I dobijenog iz nehumanih životinja (videti, npr., U.S. objava br.2004/0077541), na primer, krave, konji, ovce, majmuni, babuni, koze, zečevi, psi, ježevi, jazavci, miševi, pacovi, mačke, zamorci, hrčci, patka, kokoška, losos i jegulja (Brouillette et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta.1531:4-46; Yu et al., 1991, Cell Struct. Funct. 16(4):347-55; Chen i Albers, 1983, Biochim Biophys Acta.753(1):40-6; Luo et al., 1989, J Lipid Res.

30(11):1735-46; Blaton et al., 1977, Biochemistry 16:2157-63;Sparrow et al., 1995, J Lipid Res.

36(3):485-95; Beaubatie et al., 1986, J. Lipid Res.27:140-49; Januzzi et al., 1992, Genomics 14(4):1081-8; Goulinet i Chapman, 1993, J. Lipid Res.34(6):943-59; Collet et al., 1997, J Lipid Res.38(4):634-44; i Frank i Marcel, 2000, J. Lipid Res.41(6):853-72).

[0134] Primeri ApoA-I proteina koji mogu da se prečiste postupcima opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, preproapolipoproteinski oblik ApoA-I, pro- i zrele oblike ApoA-I, i aktivne polimorfne oblike, izoforme, varijante i mutante kao i skraćene oblike, npr., ApoA-IM, ApoA-IZ, i ApoA-Ip. ApoA-IMje R173C molekulska varijanta ApoA-I (videti, npr., Parolini et al., 2003, J Biol Chem.278(7):4740-6; Calabresi et al., 1999, Biochemistry 38:16307-14; i Calabresi et al., 1997, Biochemistry 36:12428-33). ApoA-Ip je R151C molekulska varijanta ApoA-I (videti, npr., Daum et al., 1999, J Mol Med.77(8):614-22). ApoA-IZje L144R molekulska varijanta ApoA-I (videti Recalde et al., 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623; Fiddyment et al., 2011, Protein Expr. Purif.80(1):110-116). Apolipoprotein A-I mutanti koji sadrže ostatke cisteina takođe su poznati, i takođe mogu da se prečiste postupcima opisanim ovde (videti, npr., U.S. objavu br.2003/0181372). ApoA-I za upotrebu u postupcima opisanim ovde može biti u obliku monomera, homodimera, ili heterodimera. Na primer, homo- i heterodimeri pro- i zrelog ApoA-I koji mogu da se pripreme uključuju, između ostalih, ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler Thromb Vasc Biol.16(12):1424-29), ApoA-IM(Franceschini et al., 1985, J Biol Chem.260:1632-35), i ApoA-Ip (Daum et al., 1999, J Mol Med.77:614-22).

[0135] Postupci prečišćavanja opisani ovde mogu da se izvedu u bilo kojim razmerama pogodnim za stručne tehničare.

[0136] U nekim aspektima, ApoA-I protein koji može da se prečisti postupcima opisanim ovde ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična, najmanje 80% identična, najmanje 85% identična, najmanje 90% identična, najmanje 91% identična, najmanje 92% identična, najmanje 93% identična, najmanje 94% identična, najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična, najmanje 99% identična ili najmanje 100% identična aminokiselinama 25-267 iz SEQ ID NO: 1.

[0137] Apolipoprotein može biti iz bilo kog izvora, uključujući iz krvne plazme ili iz rekombinantne ekspresije u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. U određenim primerima izvođenja, apolipoprotein je ApoA-I, npr., humani ApoA-I. U nekim aspektima, ApoA-I se eksprimira u citoplazmi ili periplazmi prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina. U ovim primerima izvođenja, ćelije se razaraju kako bi oslobodio ApoA-I u supernatant pre prečišćavanja ApoA-I. Postupci razaranja ćelija dobro su poznati u tehnici. Primeri postupaka razaranja ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, enzimske postupke, sonikaciju, postupke sa deterdžentima, i mehaničke postupke. U određenim poželjnim aspektima, ApoA-I se eksprimira u ćelijama sisara, poželjno CHO ćelijama, i izlučuje se u podlogu za rast. U ovim primerima izvođenja, ApoA-I prečišćava se iz bistre podloge bez ćelija. Podrazumeva se da, iako su postupci prečišćavanja detaljno opisani ovde u vezi sa humanim ApoA-I, prosečan stručnjak moćiće da prilagodi uslove prečišćavanja ostalim apolipoproteina, kao i ne-humanom ApoA-I, polimorfnim oblicima, izoformama, varijantama, mutantima i skraćenim oblicima ApoA-I ili ostalim apolipoproteinima, zavisno od specifičnih karakteristika proteina koje se lako mogu utvrditi od strane prosečnog stručnjaka (npr., molekulska masa, izoelektrična tačka, Stokesov radijus, hidrofobnost, multimerno stanje, itd.).

[0138] Gde se ApoA-I priprema iz krvne plazme, može se odvojiti od krvne plazme bilo kojim poznatim postupkom, uključujući, ali bez ograničenja na, postupke hladnog frakcionisanja kao što su oni opisani od strane Cohn et al., 1946, J. Am. Chem. Soc.68:459-475 ("Cohn postupak") ili od strane Oncley et al., 1949, J. Am. Chem. Soc.71:541-550 ("Cohn-Oncley postupak"). Ostali postupci za izolovanje apolipoproteina iz krvne plazme uključuju varijacije Cohn i Cohn-Oncley postupaka, kao što su Kistler-Nitschmann postupak. (Videti Nitschmann et al., 1954, Helv. Chim. Acta 37:866-873; Kistler et al., 1962, Vox Sang.7:414-424).

[0139] U ovim primerima izvođenja, apolipoprotein se dobija taloženjem iz plazme sa hladnim alkoholom, npr., etanol. Ostali alkoholi za upotrebu u hladnom frakcionisanju plazme uključuju C1-C6 alkohole sa ravnim ili razgranatim lancem, kao što su metanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol, secbutanol, izobutanol i tert-butanol. U raznim primerima izvođenja, agensi koji nisu alkoholi koji smanjuju rastvorljivost proteina mogu da se koriste za taloženje apolipoproteina iz plazme. Takvi agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, etre, amonijum sulfat, 7-etoksiakridin-3,9-diamin (rivanol) i polietilen glikole. Istaloženi proteini mogu da se odvoje iz supernatanta bilo kojim postupkom koji je poznat u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, sedimentaciju, centrifugiranje i filtriranje.

[0140] ApoA-I može da se izdvoji iz bilo koje frakcije krvne plazme koja sadrži protein. U nekim primerima izvođenja, ApoA-I se izdvaja iz serumske frakcije humane plazme iz koje se količina fibrinogena smanjuje taloženjem sa oko 8mas.% etanola. U ostalim primerima izvođenja, apolipoprotein se izdvaja iz serumske frakcije humane plazme iz koje su koncentracije ostalih serumskih proteina (npr., β-globulini i γ-gama globulini) smanjene taloženjem sa oko 25mas.% etanola. U još nekim drugim primerima izvođenja, apolipoprotein se izdvaja kao talog iz humanog seruma dobijenog povećanjem koncentracije etanola do oko 38mas.% do oko 42mas.%. U određenom primeru izvođenja, apolipoprotein se izdvaja kao talog iz humanog seruma dobijenog povećanjem koncentracije etanola do oko 40mas.% (Cohn frakcija IV). Istaloženi ApoA-I može da se izdvoji iz serumskih frakcija bilo kojim postupkom koji je poznat u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, centrifugiranje i filtriranje.

[0141] U nekim primerima izvođenja, temperatura plazmatičnih frakcija iz kojih se apolipoprotein izdvaja je dovoljno niska kako bi se sprečila denaturacija proteina. U ovim primerima izvođenja, temperatura ApoA-I frakcija je u opsegu od oko -10° C do oko 0° C, kao što je od oko -8 ° C do oko -2 ° C. U raznim primerima izvođenja, pH plazmatičnih frakcijea iz kojih se ApoA-I izdvaja je u opsegu koji sprečava denaturaciju proteina. U ovim primerima izvođenja, pH frakcija koje sadrže ApoA-I je u opsegu od oko 5 do oko 7, kao što je od oko 5,5 do oko 6,5.

5.1.4. Poboljšani postupci prečišćavanja lipoproteina

[0142] Prijavioci dalje su otkrili poboljšan postupak prečišćavanja, opisan dole i ilustrovan u Primerima, koji proizvodi lipoproteine koji su zreli, netaknuti, i suštinski bez kontaminanata. Postupci prečišćavanja opisani ovde mogu se izvesti u bilo kojoj razmeri pogodnoj za prosečnog stručnjaka.

[0143] Postupci mogu da se primene na bilo koji apolipoprotein, uključujući, ali bez ograničenja na, ApoA-I, -II, -III ili -IV; ApoB48 i ApoB100; ApoC-I, -II, -III ili -IV; ApoD; ApoE, ApoH; ApoJ. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na postupke dobijanja visoko prečišćenog ApoA-I. U nekim primerima izvođenja, ApoA-I je humani protein koji ima sekvencu odabranu od, ali bez ograničenja na, sekvence navedene u Genbank Pristupnom br. NP_000030, AAB59514, P02647, CAA30377, AAA51746 i AAH05380.1. U određenim primerima izvođenja, ApoA-I je humani protein kao što je opisano gore u odeljku 5.1.2. U ostalim primerima izvođenja, postupci ovog pronalaska mogu da se koriste za prečišćavanje ApoA-I dobijenog iz ne-humanih životinja (videti, npr., U.S. objavu 2004/0077541), na primer, krave, konji, ovce, majmuni, babuni, koze, zečevi, psi, ježevi, jazavci, miševi, pacovi, mačke, zamorci, hrčci, patka, kokoška, losos i jegulja (Brouillette et al., 2001, Biochim Biophys Acta.1531:4-46; Yu et al., 1991, Cell Struct Funct.16(4):347-55; Chen i Albers, 1983, Biochim Biophys Acta.753(1):40-6; Luo et al., 1989, J Lipid Res.

30(11):1735-46; Blaton et al., 1977, Biochemistry 16:2157-63; Sparrow et al., 1995, J Lipid Res.

36(3):485-95; Beaubatie et al., 1986, J Lipid Res.27:140-49; Januzzi et al., 1992, Genomics 14(4):1081-8; Goulinet i Chapman, 1993, J Lipid Res.34(6):943-59; Collet et al., 1997, J Lipid Res.38(4):634-44; i Frank i Marcel, 2000, J Lipid Res.41(6):853-72).

[0144] Primeri ApoA-I proteina koji se mogu prečistiti postupcima opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, preproapolipoproteinski oblik ApoA-I, pro- i zrele oblike ApoA-I, i aktivne polimorfne oblike, izoforme, varijante i mutante kao i skraćene oblike, npr.,ApoA-IM, ApoA-IZ, i ApoA-Ip.

Apolipoprotein A-I mutanti koji sadrže ostatke cisteina takođe su poznati, i takođe se mogu prečistiti postupcima opisanim ovde (videti, npr., U.S. objavu 2003/0181372). ApoA-I za upotrebu u postupcima opisanim ovde može biti u obliku monomera, homodimera, ili heterodimera. Na primer, homo- i heterodimeri pro- i zrelog ApoA-I koji se mogu pripremiti uključuju, između ostalog, ApoA-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler Thromb Vasc Biol.16(12):1424-29), ApoA-IM(Franceschini et al., 1985, J Biol Chem.260:1632-35), i ApoA-IP(Daum et al., 1999, J Mol Med.77:614-22).

[0145] U nekim aspektima, ApoA-I protein koji se može prečistiti postupcima opisanim ovde ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična, najmanje 80% identična, najmanje 85% identična, najmanje 90% identična, najmanje 91% identična, najmanje 92% identična, najmanje 93% identična, najmanje 94% identična, najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična, najmanje 99% identična ili najmanje 100% identična aminokiselinama 25-267 iz SEQ ID NO: 1.

[0146] Apolipoprotein može biti iz bilo kog izvora, uključujući iz krvne plazme ili iz rekombinantne ekspresije u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. U određenim primerima izvođenja, apolipoprotein je ApoA-I, npr., humani ApoA-I. U nekim aspektima, ApoA-I se eksprimira u citoplazmi ili periplazmi prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina. U ovim primerima izvođenja, ćelije se razaraju kako bi se oslobodio ApoA-I u supernatant pre prečišćavanja ApoA-I. Postupci razaranja ćelija dobro su poznati u tehnici. Primeri postupaka razaranja ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, enzimske postupke, sonikaciju, postupke sa deterdžentima, i mehaničke postupke. U određenim poželjnim aspektima, ApoA-I se eksprimira u ćelijama sisara, poželjno CHO ćelije, i izlučuje se u podlogu za rast. U ovim primerima izvođenja, ApoA-I se prečišćava iz izbistrene podloge bez ćelija. Podrazumeva se da, iako su postupci prečišćavanje detaljno opisani ovde u vezi sa humanim ApoA-I, prosečan stručnjak u tehnici moći će da prilagodi uslove prečišćavanja ostalim apolipoproteinima, kao i ne-humanom ApoA-I, polimorfnim oblicima, izoformama, varijantama, mutantima i skraćenim oblicima ApoA-I ili ostalim apolipoproteinima, zavisno od specifičnih karakteristika proteina koje se lako mogu utvrditi od strane prosečnog stručnjaka (npr., molekulska masa, izoelektrična tačka, Stokesov radijus, hidrofobnost, multimerno stanje, itd.).

[0147] Uopšteno, postupci prečišćavanja obuhvataju faze: (a) dovođenja u kontakt rastvora koji sadrži ApoA-I sa matricom anjonske izmene pod uslovima tako da se ApoA-I ne vezuje za matricu; (b) filtriranja rastvora koji sadrži ApoA-I dobijenog u fazi (a) kroz membranu koja ima veličinu pora dovoljnu da se uklone virusi ili virusne čestice; (c) prolaska filtrata dobijenog u fazi (b) kroz prvu kolonu reverzno-fazne hromatografije pod uslovima tako da se ApoA-I vezuje za matricu; (d) eluiranja iz prve matrice reverznofazne hromatografije prvog reverzno-faznog eluata koji sadrži ApoA-I upotrebom gradijenta rastućih koncentracija organskog rastvarača; (e) prolaska prvog reverzno-faznog eluata ApoA-I iz faze (d) kroz drugu kolonu reverzno-fazne hromatografije pod uslovima tako da se ApoA-I vezuje za matricu; i (f) eluiranja iz druge matrice reverzno-fazne hromatografije drugog reverzno-faznog eluata koji sadrži ApoA-I upotrebom gradijent rastućih koncentracija organskog rastvarača. Redosled kojim se izvode faze nije kritičan. Kao što će biti čigledno prosečnom stručnjaku u tehnici, različite permutacije u redosledu faza su moguće, od kojih su neke opisane dole.

[0148] U određenim aspektima, rastvor koji sadrži ApoA-I se kondicionira pre njegovog dovođenja u kontakt sa matricom anjonske izmene u fazi (a). Kondicioniranje se izvodi kako bi se podesio pH rastvora proteina tako da je u opsegu gde se ApoA-I ne vezuje za matricu anjonske izmene u fazi (a) (tj., protein nema neto negativno naelektrisanje i faza (a) se izvodi u negativnom režimu). U ovim aspektima, pH rastvora koji sadrži ApoA-I je od oko 5 do oko 7, poželjno od oko 5,0 do oko 5,6. U određenim aspektima, pH je od oko 5,1 do oko 5,5. U još nekim drugim aspektima, pH je oko 5,3. Podešavanja pH mogu se izvesti ddavanjem odgovarajuće kiseline (npr., hlorovodonične kiseline) ili baze (npr., natrijum hidroksid) dok se ne dobije pH u okviru željenog opsega. U nekim primerima izvođenja, rastvor koji sadrži ApoA-I filtrira se pre faze kondicioniranja kako bi se uklonile ćelije i ostaci ćelija. U ostalim primerima izvođenja, kada nema faze kondicioniranja, rastvor koji sadrži ApoA-I se opciono filtrira pre faze (a) kako bi se uklonile ćelije i ostaci ćelija.

[0149] U nekim primerima izvođenja, faza (a) dovođenja u kontakt rastvora koji sadrži ApoA-I sa matricom anjonske izmene izvodi se prolaskom rastvora proteina kroz hromatografsku kolonu. U ovim primerima izvođenja, kolona se pakuje sa sloje visine od oko 10 cm do oko 50 cm, poželjno od oko 10 cm do oko 30 cm, a poželjnije sa slojem visine od oko 20 cm. U određenim aspektima, kolona se puni rastvorom proteina koji obuhvata od oko 10 g do oko 50 g, kao što je od oko 10 g do oko 30 g, kao što je od oko 25 g do oko 35 g ApoA-I po litru. U određenim primerima izvođenja, kolona se puni rastvorom proteina koji obuhvata do oko 32 g ApoA-I po litru. U ostalim primerima izvođenja, faza (a) se izvodi u šaržnom režimu, tj., dodavanjem matrice anjonske izmene rastvoru proteina u boci, mešanjem tokom vremenskog perioda dovoljnog za vezivanje kontaminanata za matricu, i zatim odvajanjem materijala matrice od rastvora proteina, npr., filtriranjem ili centrifugiranjem. U određenim primerima izvođenja, rastvor proteina filtrira se kako bi se uklonile čestice u rastvoru pre njegovog dovođenja u kontakt sa matricom anjonske izmene.

[0150] Matrice anjonske izmene za upotrebu u fazi (a) postupaka opisanih ovde može da bude bilo koja matrica anjonske izmene poznata u tehnici. Pogodne matrice anjonske izmene uključuju, ali nisu ograničeni na, Q-Sefarozu FF, Q-Sferozil, DEAE-Sefarozu FF, Q-Celulozu, DEAE-Celulozu i Q-Sferodeks. U određenom primeru izvođenja, matrica anjonske izmene je Q-Sefaroza FF (GE Healthcare). U određenim aspektima, pre dovođenja u kontakt rastvora proteina u fazi (a) sa matricom anjonske izmene, matrica je ekvilibrisana u puferu sa pH unutar poželjnih opsega opisanih gore tako da se ApoA-I ne vezuje za matricu. Puferi korisni za ekvilibraciju matrice anjonske izmene pre faze (a) i za izvođenje faze (a) su poznati prosečnom stručnjaku. U određenim primerima izvođenja, pufer je TAMP A (20mM natrijum fosfat, pH 5,3).

[0151] U raznim primerima izvođenja, faza (a) koristi se kako bi se prečistio ApoA-I od proteina koji nisu ApoA-I (npr., proteini ćelija domaćina), DNK ćelija domaćina i endotoksina, koji se vezuju za matricu anjonske izmene i time se odvajaju od ApoA-I, koji se ne vezuje za matricu pod uslovima pH i soli opisanim gore. U nekim aspektima, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, ili najmanje 90% ili više od količine ApoA-I u polaznom rastvoru se izdvaja iz faze anjonske izmene.

[0152] U raznim primerima izvođenja, postupci prečišćavanja obuhvataju fazu (b) u kojoj se ApoA-I rastvor iz faze (a) filtrira upotrebom filtera sa veličinom pora koja je dovoljna da zarobi viruse i virusne čestice. Opciono, faza (b) filtriranja kroz membranu kako bi se uklonili virusi ili virusne čestice izvodi se nakon faze (f) gore, pre nego posle faze (a). U određenim aspektima, pH eluata iz matrice anjonske izmene podešava se pre faze filtriranja virusa (b) dodavanjem natrijum hidroksida ili druge pogodne baze. Rastvor koji sadrži ApoA-I iz faze (a) podešava se na pH od oko 7,8 do oko 8,2. U određenom aspektu, rastvor koji sadrži ApoA-I podešava se na pH od oko 8,0. Filter korišćen u fazi (b) može biti bilo koji filter sa odgovarajućom veličinom pora za zarobljavanje virusa, npr., sa veličinom pora od oko 15 nm do oko 75 nm. U određenim primerima izvođenja, veličina pora filtera je oko 20 nm (npr., Planova 20N, Asahi Kasei Medical). Prosečan stručnjak znaće da se protok rastvora proteina kroz filter za viruse određuje prema osobinama rastvora (npr., njegova viskoznost, koncentracija čestica, itd.). Uobičajen potok za filtriranje virusa je oko 12,5 L/h/m2, međutim, protok može da se podesi višim ili nižim kako bi se održao pritisak filtera od 1 bar ili manji. Filtrat iz faze (b) sadrži ApoA-I. U određenim aspektima, izdvajanje ApoA-I iz faze filtriranja virusa je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% ili veće od količine ApoA-I u eluatu anjonske izmene iz faze (a).

[0153] U određenim primerima izvođenja, postupci prečišćavanja opisani ovde obuhvataju fazu (c) nakon faze (b) u kojoj filtrat iz faze (b) prolazi kroz prvu kolonu reverzno-fazne hromatografije pod uslovima pufera i soli koji omogućavaju da se apolipoprotein A-I veže za matricu. U ovim primerima izvođenja, ApoA-I prečišćava se od DNK ćelija domaćina, proteina ćelija domaćina, endotoksina i skraćenih oblika upotrebom gradijenta rastućih koncentracija organskog rastvarača. Reverzno-fazna hromatografija može se izvesti upotrebom širokog spektra matrica poznatih u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, silicijum dioksid, polistiren, ili podlogu na bazi umrežene agaroze na kojoj su C4 do C18 hidrofobni ligandi kalemljeni. Komercijalno dostupne hidrofobne matrice korisne u postupcima opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, Butil Sefaroza-FF, Oktil Sefaroza-FF, Dianon HP20ss, C18 Hypersil i Source 30 RPC. U određenim primerima izvođenja, matrica korišćena u fazi (c) je Source 30 RPC (GE Healthcare). U određenim aspektima, reverzno-fazna hromatografska kolona ima sloj visine od oko 10 cm do oko 50 cm, kao što je od oko 10 cm do oko 30 cm. U određenom aspektu, reverzno-fazna hromatografska kolona ima sloj visine oko 25 cm.

[0154] U nekim primerima izvođenja, ApoA-I filtrat iz faze filtriranja virsa (b) puni se na reverzno-faznu kolonu u koncentraciji od oko 1 do oko 20 g ApoA-I, kao što je u koncentraciji od oko 1,5 g do oko 5 g ApoA-I, a poželjnije u koncentraciji od oko 2,5 g do oko 3,5 g ApoA-I po litru. U određenom aspektu, ApoA-I filtrat iz faze (b) puni se na reverzno-faznu kolonu u koncentraciji od oko 3,4 g ApoA-I po litru. Uslovi pufera koji mogu da se koriste da se ekvilibriše reverzno-fazna kolona pre punjenja ApoA-I i kako bi se osiguralo da će protein da se veže za kolonu po punjenju što će lako utvrditi prosečni stručnjaci u tehnici. Poželjno, pufer za ekvilibraciju kolone je jak pufer koji može da smanji pH kolone do oko 9,5. U određenim primerima izvođenja, pufer za ekvilibraciju je TAMP D (20 mM amonijum karbonat).

Poželjno, nakon ekvilibracije, filtrat koji sadrži ApoA-I iz faze (b) (sa pH od oko 8,0) napunjen je na kolonu sa protokom oko 0,5 cm do oko 5,0 cm po minuti, kao što je od oko 2,0 cm do oko 4,0 cm po minuti. U određenom primeru izvođenja, filtrat koji sadrži ApoA-I napunjen je na kolonu sa protokom od oko 2,8 cm po minuti.

[0155] Nakon vezivanja ApoA-I za reverzno-faznu matricu u fazi (c), protein se eluira u fazi (d) izlaganjem gradijentu rastućih koncentracija organskog rastvarača u puferu, kao što je od oko 35% do oko 50% acetonitrila u TAMP D puferu. U nekim aspektima, linearni gradijent od oko 35% do oko 50% acetonitrila tokom perioda od oko 60 do oko 90 minuta, kao što je oko 70 minuta ili poželjnije oko 80 minuta može da se koristi za eluiranje ApoA-I iz kolone. U određenim aspektima, linearni gradijent je praćen sa oko 10 minuta izokratskog eluiranja sa 50% acetonitrila. Tačni uslovi za eluiranje ApoA-I iz reverzno-fazne kolone moći će lako da odredi prosečan stručnjak. U raznim primerima izvođenja, oko 60%, kao što je oko 65%, oko 70%, oko 75% ili oko 80% ili više ApoA-I u punjenju kolone prisutno je eluatu kolone u fazi (d).

[0156] U određenim aspektima, postupci prečišćavanja opisani ovde dalje obuhvataju nakon faze (d) fazu (e) prolaska reverzno-faznog eluata apolipoproteina A-I iz faze (d) kroz drugu reverzno-faznu hromatografsku kolonu kako bi se dalje uklonili DNK, proteini ćelija domaćina i skraćeni oblici ApoA-I iz proteina pune dužine. Poželjno, reverzno-fazni eluat iz faze (d) napunjen je na drugu reverzno-faznu kolonu pod uslovima koji omogućavaju da se apolipoprotein A-I veže za matricu. Reverzno-fazna matrica za upotrebu u fazi (e) može da bude istog tipa matrice ili različitog tipa matrice kao što se koristi u fazi (d). U određenim primerima izvođenja, reverzno-fazna matrica korišćena u fazi (e) je C18 silicijum dioksid matrica, kao što je Daisogel SP-300-BIO C18 matrica (300 Å, 10 µm; Daiso Co., Ltd.). Uslovi pufera koji mogu da se koriste za ekvilibraciju C18 kolone pre punjenja ApoA-I i kako bi se osiguralo da će se protein vezati za kolonu usled punjenja lako će da odrede prosečni stručnjaci u tehnici. Poželjno, pufer za ekvilibraciju kolone je snažan pufer koji može da smanji pH kolone do oko 9,5. U određenim primerima izvođenja, pufer za ekvilibraciju je TAMP E (100 mM amonijum karbonat). U raznim primerima izvođenja, reverzno-fazna kolona korišćena u fazi (e) postupaka prečišćavanja opisanih ovde ima visinu sloja od oko 10 cm do oko 50 cm, kao što je od oko 10 cm do oko 30 cm. U određenim primerima izvođenja, reverzno-fazna kolona korišćena u fazi (e) ima visinu sloja od oko 25 cm.

[0157] U raznim primerima izvođenja, ApoA-I eluat iz faze (d) je napunjen na C18 reverzno-faznu kolonu u koncentraciji od oko 0,5 g do oko 30 g ApoA-I, kao što je u koncentraciji od oko 1 g do oko 10 g ApoA-I, i poželjnije u koncentraciji od oko 4 g do oko 5 g ApoA-I po litru. U određenim primerima izvođenja, ApoA-I eluat iz faze (d) napunjen je na C18 kolonu u koncentraciji od oko 4,7 g ApoA-I po litru. Poželjno, nakon ekvilibracije, eluat koji sadrži ApoA-I iz faze (d) napunjen je na kolonu sa protokom od oko 0,5 cm do oko 5,0 cm po minuti, kao što je od oko 1,0 cm do oko 3,0 cm po minuti. U određenom primeru izvođenja, filtrat koji sadrži ApoA-I napunjen je na kolonu sa protokom od oko 2,1 cm po minuti.

[0158] Nakon vezivanja ApoA-I za reverzno-faznu matricu u fazi (e), protein se eluira u fazi (f) upotrebom gradijenta rastućih koncentracija organskog rastvarača u puferu, kao što je od oko 40% do oko 50% acetonitrila u TAMP E puferu. U nekim aspektima, linearni gradijent od oko 40% do oko 50% acetonitrila koristi se kako bi se eluirao ApoA-I iz kolone tokom perioda od oko 40 do oko 80 minuta, kao što je oko 50 minuta, oko 60 minuta ili oko 70 minuta. U određenim primerima izvođenja, linearni gradijent od oko 40% do oko 50% acetonitrila u TAMP E puferu tokom perioda od oko 60 minuta koristi se kako bi se eluirao ApoA-I iz reverzno-fazne matrice. U određenim aspektima, linearni gradijent praćen je sa oko 15 minuta izokratskog eluiranja sa 50% acetonitrila. Tačni uslovi za eluiranje ApoA-I iz reverzno-fazne kolone lako će moći da budu određeni od strane prosečnog stručnjaka. U raznim primerima izvođenja, oko 60%, kao što je oko 65%, oko 70%, oko 75% ili oko 80% ili više ApoA-I u punjenju kolone izdvaja se u eluatu kolone u fazi (f).

[0159] U određenim primerima izvođenja, organski rastvarač uklanja se iz eluata koji sadrži ApoA-I dobijenog u fazi (f) postupaka opisanih ovde. Uklanjanje rastvarača može se postići bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, koncentrovanje eluata koji sadrži ApoA-I dobijenog u fazi (f) i diafiltriranje koncentrata u vodeni pufer. U određenim primerima izvođenja, eluat iz faze (f) se koncentruje oko 2-puta, oko 2,5-puta, oko 3-puta, oko 3,5-puta, oko 4-puta, oko 4,5-puta ili oko 5-puta u odnosu na zapreminu eluata iz reverzno-fazne kolone u fazi (f). U određenom primeru izvođenja, eluat se koncentruje oko 2,5-puta i zatim se diafiltrira na približno 10, 15, ili 20, poželjno 15 zapremina stabilnog vodenog pufera. Pogodni vodeni puferi poznati su u tehnici. Naročito poželjan pufer je TAMP C (3 mM natrijum fosfat, pH 8,0).

[0160] U nekim primerima izvođenja, redosled hromatografiskih kolona je obrnut.

[0161] Opciono, nakon koncentrovanja i puferske izmene, vodeni rastvor ApoA-I se dalje prečišćava hromatografijom anjonske izmene u negativnom režimu (tj., pod uslovima gde se ApoA-I ne vezuje za matricu anjonske izmene) kako bi se uklonila zaostala DNK i ostali negativno naelektrisani kontaminanti kao što su proteini ćelija domaćina. (Faza (g)). U nekim primerima izvođenja, faza anjonske izmene izvodi se u šaržnom režimu. U ostalim primerima izvođenja, faza anjonske izmene izvodi se kolonskom hromatografijom. Pogodne matrice anjonske izmene za upotrebu u šaržnom režimu ili u kolonskoj hromatografiji uključuju, ali nisu ograničeni na, Q Sefaroza-FF ili bilo koju od matrica anjonske izmene opisanu gore za upotrebu u fazi (a). U određenim aspektima, faza anjonske izmene izvodi se prolaskom ApoA-I rastvora kroz membranu za anjonsku izmenu, kao što je membrana koja ima veliku površinsku oblast i jako katjonsko naelektrisanje, npr., Sartobind Q ili Mustang Q. Poželjno, faza anjonske izmene izvodi se upotrebom Mustang Q membrane za anjonsku izmenu (Pall Life Sciences). U određenim aspektima, pH vodenog ApoA-I rastvora se smanjuje do oko 5,5, do oko 6,0 ili do oko 6,5 pre ove faze anjonske izmene upotrebom bilo koje pogodne kiseline. U određenim aspektima, pH vodenog ApoA-I rastvora se smanjuje do oko 6,0 upotrebom razblažene fosforne kiseline. U poželjnim primerima izvođenja, ApoA-I rastvor propušta se kroz Mustang Q kasetu sa približno 12,5 L/m2/h.

[0162] U nekim primerima izvođenja, filtrat iz membrane anjonske izmene koncentruje se i opciono dialfiltira radi izmene rastvarača sa onim koji je pogodan za skladišenje ili za dalju obradu ApoA-I, kao što je obrazovanje kompleksa sa lipidima kao što je opisano gore u odeljku 5.5.1 i/ili formulisanje u farmaceutskim kombinacijama kao što je opisano dole u odeljku 5.6. Pogodne pufere za skladištenje ili dalju obradu ApoA-I lako može da utvrdi prosečan stručnjak. U određenim primerima izvođenja, prečišćen ApoA-I razmenjuje se u TAMP C puferu. Bilo koja ultrafiltraciona membrana može da se koristi u ovoj fazi, što obezbeđuje da membrana ima odsečak molekulske mase koja je ispod molekulske mase zrelog ApoA-I pune dužine tako da omogućava prolazak pufera ali ne i proteina. U određenim primerima izvođenja, polietarsulfonska membrana (npr., Filtron Omega series) odsečka nominalne molekulske mase od 10.000 se koristi. Poželjno, ApoA-I koncentracija u rastvoru nakon ultrafiltracije je najmanje 10 g/L, najmanje 12 g/L, najmanje 15 g/L, najmanje 20 g/L, najmanje 25 g/L, najmanje 30 g/L, najmanje 35 g/L, najmanje 40 g/L, najmanje 45 g/L ili najmanje 50 g/L.

5.1.5. Apolipoproteinski proizvodi

[0163] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje suštinski čiste zrele apolipoproteine pune dužine. Kao što se ovde koristi, izraz "suštinski čist" odnosi se na protein koji je najmanje 95% čist. U određenim primerima izvođenja, suštinski čist protein je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5%, najmanje 99,9% ili 100% čist. U određenim aspektima, suštinski čist apolipoproteinski proizvod proizveden postupcima prečišćavanja opisanim ovde je izbistren do rastvora boje blago opalne bez vidljivih čestica kada se vizuelno ispituje upotrebom svetlosnog izvora na beloj podlozi. U raznim primerima izvođenja, suštinski čist apolipoprotein dobijen ili koji može da se dobije postupcima opisanim u odeljku 5.1.4 gore, obuhvata male ili nedetektibilne količine jednog ili više od DNK ćelija domaćina, proteina koji nisu apolipoprotein (npr., poteini ćelija domaćina), endotoksin, zaostali rastvarač, kao i malo biološkog opterećenja (tj., mali broj mikroba na ili u uzorku), kao što je dalje detaljno opisano dole. Čistoća apolipoproteinskog proizvoda može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, N-terminalno Edman sekvenciranje, MALDI-MS, gel elektroforezu, HPLC, i/ili imunotest.

[0164] U raznim primerima izvođenja, suštinski čist apolipoproteinski proizvod dobijen postupcima opisanim ovde je zreli humani ApoA-I pune dužine koji ima masu koja je oko 28,1 kilodaltona. Masa ApoA-I u proizvodu može da se odredi bilo kojim postupkom koji je poznat u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, MALDI-MS. U raznim primerima izvođenja, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% ApoA-I proteina u proizvodu je zreli ApoA-I pune dužine (npr., ApoA-I koji obuhvata aminokiseline 25 do 267 iz SEQ ID NO: 1). U određenim aspektima, suštinski čist ApoA-I proizvod obuhvata oko 15mas.% ili manje, oko 10mas.% ili manje, oko 5mas.% ili manje, oko 4% ili manje, oko 3mas.% ili manje, oko 2mas.% ili manje ili oko 1mas.% ili manje N-terminalno produženih ApoA-I izoformi (npr., proApoA-I). Kao što je očigledno prosečnom stručnjaku, bilo koji N-terminalno produženi ApoA-I u proizvodu brzo će da se konvertuje u zreli ApoA-I u krvi po davanju. U raznim primerima izvođenja, ApoA-I proizvod obuhvata oko 25mas.% ili manje, oko 20mas.% ili manje, oko 15mas.% ili manje, oko 10mas.% ili manje, oko 5mas.% ili manje, oko 4mas.% ili manje, oko 3mas.% ili manje, oko 2mas.% ili manje, oko 1mas.% ili manje, oko 0,75mas.% ili manje, oko 0,5mas.% ili manje, oko 0,25mas.% ili manje, ili oko 0,1mas.% ili manje skraćenih oblika ApoA-I. Količina skraćenog ili produženog ApoA-I može da se odredi, na primer, N-terminalnim Edman sekvenciranjem i/ili MALDI-MS i/ili izvođenjem i skeniranjem SDS-PAGE gela kako bi se odredio odnos intenziteta trakaste oblasti prečišćenog ApoA-I u odnosu na ukupan intenzitet svih traka, ako su prisutne. U raznim primerima izvođenja, ApoA-I proizvod obuhvata oko 20mas.% ili manje, oko 10mas.% ili manje, oko 5mas.% ili manje, oko 4mas.% ili manje, oko 3mas.% ili manje, oko 2mas.% ili manje, oko 1mas.% ili manje, oko 0,75mas.% ili manje, oko 0,5mas.% ili manje, oko 0,25mas.% ili manje, ili oko 0,1mas.% ili manje oksidovanih oblika ApoA-I, naročito ApoA-I oksidovanog u položaju Met112i/ili Met148.

[0165] U određenim primerima izvođenja, suštinski čist apolipoprotein proizveden postupcima opisanim ovde obuhvata proteine ćelija domaćina u količini koja je manja od oko 100 ppm (npr., ng/mg), kao što je manje od oko 75 ppm, manje od oko 50 ppm, manje od oko 40 ppm, manje od oko 30 ppm, manje od oko 20 ppm, ili manje than oko 10 ppm. U određenim primerima izvođenja, suštinski čist apolipoproteinski proizvod obuhvata manje od oko 20 ppm proteina ćelija domaćina. Poželjnije, apolipoproteinski proizvod obuhvata manje od oko 10 ppm proteina ćelija domaćina. Prisustvo i količina proteina ćelija domaćina u uzorku apolipoproteina mogu da se odrede bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Kada se apolipoprotein proizvodi rekombinantno u, npr., ćelijama sisara, komercijalno dostupni ELISA kompleti (npr., Kit F015 od Cygnus Technologies) mogu da se koriste za detekciju i kvantifikaciju nivoa proteina ćelija domaćina.

[0166] U nekim aspektima, suštinski čist apolipoproteinski proizvod prečišćen kao što je opisano ovde obuhvata DNK ćelija domaćina u količini koja je manja od oko 50 pg/mg apolipoproteina, kao što je manje od oko 40 pg/mg, manje od oko 30 pg/mg, manje od oko 20 pg/mg, manje od oko 10 pg/mg, ili manje od oko 5 pg/mg apolipoproteina. U poželjnim primerima izvođenja, suštinski čist apolipoproteinski proizvod obuhvata manje od oko 10 pg proteina ćelija domaćina po mg apolipoproteina. Prisustvo i količina DNK ćelija domaćina u uzorku apolipoproteina može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući PCR u stvarnom vremenu ili detekciju kompleksa sa jednolančanim vezujućim proteinom upotrebom anti-SSB antitela (Glikotype Biotechnology), poželjno kvantitativnim PCR.

[0167] U određenim primerima izvođenja, suštinski čist apolipoproteinski proizvod proizveden postupcima opisanim ovde obuhvata endotoksin u količini koja je manja od oko 0,5 EU po mg apolipoproteina, kao što je manje od oko 0,4 EU po mg, manje od oko 0,3 EU po mg, manje od oko 0,2 EU po mg ili manje od oko 0,1 EU po mg apolipoproteina. Poželjno, suštinski čist apolipoproteinski proizvod opisan ovde obuhvata manje od oko 0,1 EU endotoksina po mg apolipoproteina. Detekcija i kvantifikacija endotoksina mogu da se postignu bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, na primer upotrebom Limulus amebocit lizat (LAL) kvantitativnog testa za endotoksine gram-negativnih bakterija. (Cambrex; osetljivost 0,125 EU/mL).

[0168] Suštinski čist apolipoproteinski proizvod opisan ovde ima malo biološko opterećenje. Izraz "biološko opterećenje" odnosi se na nivo aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, kvasac i plesni u proizvodu. U raznim primerima izvođenja, biološko opterećenje suštinski čistog apolipoproteinskog proizvoda prečišćenog kao što je opisano ovde je manje od oko 1 CFU po mL. Ispitivanje biološkog opterećenja može da se izvede prema bilo kom poznatom postupku, na primer prema harmonizovanom postupku poglavlja Evropske farmakopeje 2.6.12.B, 2.6.1 i USB poglavlju 61.

[0169] Suštinski čist apolipoproteinski proizvod opisan ovde obuhvata male količine zaostalih rastvarača. U određenim primerima izvođenja, zaostali rastvarač prisutan je u količini koja je manja od oko 50 ppm, manja od oko 45 ppm, manja od oko 40 ppm, manja od oko 35 ppm, manja od oko 30 ppm, manja od oko 25 ppm, manja od oko 20 ppm, manja od oko 15 ppm ili manja od oko 10 ppm za 10 mg/L apolipoproteina. Poželjno, zaostali rastvarač je prisutan u količini koja je manja od oko 41 ppm za 10 mg/L apolipoproteina. Količina zaostalog rastvarača može da se ispita bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, GC-MS i HPLC.

[0170] Poželjno, apolipoprotein je ApoA-I (npr., ApoA-I koji obuhvata aminokiseline 25-267 iz SEQ ID NO: 1). U nekim primerima izvođenja, zreli humani ApoA-I protein ima aminokiselinsku sekvencu koja ima asparaginsku kiselinu u položaju 1 (tj., položaj koji odgovara položaju 25 iz SEQ ID NO: 1).

5.2. Lipidna frakcija

[0171] Lipoproteinski kompleksi i kombinacije ovog pronalaska obuhvataju lipidnu frakciju. Lipidna frakcija uključuje jedan ili više lipida. U raznim primerima izvođenja, jedan ili više lipida mogu biti zasićeni i/ili nezasićeni, i prirodni ili sintetički lipidi. Lipidna frakcija poželjno uključuje najmanje jedan fosfolipid.

[0172] Pogodni lipidi koji mogu da budu prisutni u lipidnoj frakciji uključuju, ali nisu ograničeni na, male fosfolipide sa alkil lancem, fosfatidilholin iz jaja, sojin fosfatidilholin, dipalmitoilfosfatidilholin, dimiristoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidilholin 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilholin, 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilholin, 1-palmitoil-2-stearoilfosfatidilholin, 1-stearoil-2-palmitoilfosfatidilholin, dioleoilfosfatidilholin dioleofosfatidiletanolamin, dilauroilfosfatidilglicerol fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol, fosfatidilglicerole, difosfatidilglicerole kao što su dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, distearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidinsku kiselinu, dipalmitoilfosfatidinsku kiselinu, dimiristoilfosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidiletanolamin, dimiristoilfosfatidilserin, dipalmitoilfosfatidilserin, moždani fosfatidilserin, moždani sfingomijelin, palmitoilsfingomijelin, dipalmitoilsfingomijelin, sfingomijelin iz jaja, mlečni sfingomijelin, fitosfingomijelin, distearoilsfingomijelin, so dipalmitoilfosfatidilglicerola, fosfatidinsku kiselinu, galaktocerebrozid, gangliozide, cerebrozide, dilaurilfosfatidilholin, (1,3)-D-manozil-(1,3)diglicerid, aminofenilglikozid, 3-holesteril-6'-(glikoziltio)heksil etar glikolipide, i holesterol i njegovi derivati. Sintetički lipidi, kao što je sintetički palmitoilsfingomijelin ili N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (oblik fitosfingomijelina) mogu da se koriste kako bi se minimizirala oksidacija lipida. Fosfolipidne frakcije uključujući palmitoilsfingomijelin mogu opciono da uključuju male količine bilo koje vrste lipida, uključujući, ali bez ograničenja na, lizofosfolipide, sfingomijeline koji nisu palmitoilsfingomijelin, galaktocerebrozid, gangliozide, cerebrozide, gliceride, trigliceride, i holesterol i njegove derivate.

[0173] U poželjnim primerima izvođenja, lipidna frakcija uključuje dve vrste fosfolipida: sfingomijelin (SM) i neki negativno naelektrisan fosfolipid. SM je "neutralni" fosfolipid po tome jer ima neto nalektrisanje od oko nule pri fiziološkom pH. Identitet korišćenog SM nije kritičan za uspeh. Prema tome, kao što se ovde koristi, ekspresija "SM" uključuje sfingomijeline izvedene ili dobijene iz prirodnih izvora, kao i analoge i derivate SM-a koji se javljaju u prirodi koji su nepristupačni za hidrolizu pomoću LCAT, kao što je SM koji se javlja prirodi. SM je fosfolipid veoma slične strukture lecitinu, ali, za razliku od lecitina, on nema glicerolsku kičmu, i, stoga, nema estarske veze koje povezuju acil lance. Nego, SM ima kičmu ceramida, sa amidnim vezama koje povezuju acil lance. SM nije supstrat za LCAT, i uopšteno ne može da se hidrolizuje pomoću nje. Može da deluje, međutim, kao inhibitor LCAT ili može da smanji LCAT aktivnost razblaženjem koncentracije fosfolipida supstrata. Zato što se SM ne hidrolizuje, on ostaje u cirkulaciji duže. Očekivano je da će ova karakteristika da omogući da negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi opisani ovde imaju duže trajanje farmakološkog efekta (mobilizacija holesterola) i da pokupe više lipida, određenije holesterol, nego apolipoproteinski kompleksi koji ne uključuju SM. Rezultat ovog efekta su ređe ili manje doze koje su potrebne za lečenje nego one potrebne za lipoproteinske komplekse koji ne uključuju SM.

[0174] SM može da se dobije praktično iz bilo kog izvora. Na primer, SM može da se dobije iz mleka, jaja ili mozga. SM analozi ili derivati takođe mogu da se koriste. Neograničavajući primeri korisnih SM analoga i derivata uključuju, ali nisu ograničeni na, palmitoilsfingomijelin, N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (oblik fitosfingomijelina), palmitoilsfingomijelin, stearoilsfingomijelin, D-eritro-N-16:0-sfingomijelin i njegov dihidro izomer, D-eritro-N-16:0-dihidro-sfingomijelin. Sintetički SM kao što je sintetički palmitoilsfingomijelin ili N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (fitosfingomijelin) može da se koristi kako bi se proizveli homogeniji kompleksi i sa nekoliko kontaminanata i/ili proizvoda oksidacije nego sfingolipidi životinjskog porekla.

[0175] Pimeri sfingomijelina palmitoilsfingomijelin i fitosfingomijelin prikazani su dole.

[0176] Sfingomijelini izolovani iz prirodnih izvora mogu da budu veštački obogaćeni u jednom određenom zasićenom ili nezasićenom acil lancu. Na primer, mlečni sfingomijelin (Avanti Fosfolipid, Alabaster, Ala.) se karakteriše dugim zasićenim acil lancima (tj., acil lanci koji imaju 20 ili više atoma ugljenika). Nasuprot tome, sfingomijelin iz jaja se karakteriše kratkim zasićenim acil lancima (tj., acil lanci koji imaju manje od 20 atoma ugljenika). Na primer, dok samo oko 20% mlečnog sfingomijelina obuhvata C16:0 (16 ugljenik, zasićen) acil lanaca, oko 80% sfingomijelina iz jaja obuhvata C16:0 acil lanaca. Upotrebom ekstrakcije sa rastvaračem, sastav mlečnog sfingomijelina može da se obogati da ima acil lanac sastav koji može da se uporedi sa onim sfingomijelina iz jaja, ili vice versa.

[0177] SM može biti semi-sintetički tako da ima određene acil lance. Na primer, mlečni sfingomijelin može prvo da se prečisti iz mleka, zatim jedan određeni acil lanac, npr., C16:0 acil lanac, može da se odcepi i zameni drugim acil lancem. SM može takođe u potpunosti da se sintetizuje, npr., sintezom velikih razmera. Videti, npr., Dong et al., U.S. Pat. br.5,220,043, pod nazivom Synthesis of D-erythrosphingomyelins, izdato 15. juna 1993.; Weis, 1999, Chem. Phys. Lipids 102 (1-2):3-12.

[0178] Dužine i nivoi zasićena acil lanaca koji obuhvataju semi-sintetički ili sintetički SM mogu selektivno da variraju. Acil lanci mogu biti zasićeni ili nezasićeni, i mogu da sadrže od oko 6 do oko 24 atoma ugljenika. Svaki lanac može da sadrži isti broj atoma ugljenika ili, alternativno svaki lanac može da sadrži različite brojeve atoma ugljenika. U nekim primerima izvođenja, semi-sintetički ili sintetički SM obuhvata mešane acil lance tako da je jedan lanac zasićen a jedan lanac je nezasićen. U takvim SM mešanih acil lanaca, dužine lanaca mogu biti iste ili različite. U ostalim primerima izvođenja, acil lanci semisintetičkog ili sintetičkog SM ili su oba zasićena ili su oba nezasićena. Ponovo, lanci mogu da sadrže iste ili različite brojeve atoma ugljenika. U nekim primerima izvođenja, oba acil lanca koji obuhvataju semisintetički ili sintetički SM su identična. U specifičnom primeru izvođenja, lanci odgovaraju acil lancima masne kiseline koja se javlja u prirodi, kao što je na primer oleinska, palmitinska ili stearinska kiselina. U nekom drugom primeru izvođenja, SM sa zasićenim ili nezasićenim funkcaniolizovanim lancima se koristi. U drugom specifičnom primeru izvođenja, oba acil lanca su zasićena i sadrže od 6 do 24 atoma ugljenika. Neograničavajući primeri acil lanaca prisutnih u masnim kiselinama koje se obično javljaju koji mogu da se uključe u semi-sintetičke i sintetičke SM dati su u Tabeli 1, dole:

[0179] U poželjnim primerima izvođenja, SM je palmitoil SM, kao što je sintetički palmitoil SM, koji ima C16:0 acil lance, ili je SM iz jaja, koji uključuje kao glavnu komponentu palmitoil SM.

[0180] U specifičnom primeru izvođenja, koristi se funkcionalizovani SM, kao što je fitosfingomijelin.

[0181] Lipidna frakcija poželjno uključuje negativno naelektrisan fosfolipid. Kao što se ovde koristi, "negativno naelektrisani fosfolipidi" su fosfolipidi koji imaju neto negativno naelektrisanje pri fiziološkom pH. Negativno naelektrisan fosfolipid može da obuhvata jednu vrstu negativno naelektrisanog fosfolipida, ili mešavinu dva ili više različita, negativno naelektrisana, fosfolipida. U nekim primerima izvođenja, naelektrisani fosfolipidi su negativno naelektrisani glicerofosfolipidi. Identitet(i) naelektrisanih fosfolipida nisu kritični za uspeh. Specifični primeri pogodnih negativno naelektrisanih fosfolipida uključuju, ali nisu ograničeni na, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], fosfatidilglicerol, fosfatidilinozitol, fosfatidilserin, i fosfatidinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, negativno naelektrisan fosfolipid obuhvata jedan ili više od fosfatidilinozitola, fosfatidilserina, fosfatidilglicerola i/ili fosfatidinske kiseline. U specifičnom primeru izvođenja, negativno naelektrisan fosfolipid sastoji se od 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], ili DPPG.

[0182] Poput SM, negativno naelektrisani fosfolipidi mogu da se dobiju iz prirodnih izvora ili pripreme hemijskom sintezom. U primerima izvođenja koji koriste sintetičke negativno naelektrisane fosfolipide, identiteti acil lanaca mogu selektivno da variraju, kao što je opisano gore u vezi sa SM. U nekim primerima izvođenja negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa opisanih ovde, oba acil lanca na negativno naelektrisanim fosfolipidima su identična. U nekim primerima izvođenja, acil lanci na SM i negativno naelektrisani fosfolipidi su svi identični. U specifičnom primeru izvođenja, negativno naelektrisan fosfolipid(i), i/ili SM svi imaju C16:0 ili C16:1 acil lance. U specifičnom primeru izvođenja ostatak masne kiseline iz SM je pretežno C16:1 palmitoil. U jednom specifičnom primeru izvođenja, acil lanci naelektrisanog(ih) fosfolipida i/ili SM odgovaraju acil lancu palmitinske kiseline.

[0183] Korišćeni fosfolipidi su poželjno najmanje 95% čisti, i/ili imaju smanjene nivoe oksidativnih agenasa. Lipidi dobijeni iz prirodnih izvora poželjno imaju manje ostataka polinezasićenih masnih kiselina i/ili ostataka masnih kiselina koji nisu podložni oksidaciji. Nivo oksidacije u uzorku može da se odredi upotrebom jodometrijskog postupka, koji obezbeđuje peroksidnu vrednost, eksprimiran u miliekvivalentnom broju izolovanog joda po kg uzorka, skraćeno meq O/kg. Videti, npr., Gray, J.I., Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal of the American Oil Chemists Society, Vol.55, p. 539-545 (1978); Heaton, F.W. and Uri N., Improved Iodometric Methods for the Determination of Lipid Peroxides, Journal of the Science of food and Agriculture, vol 9. P, 781-786 (1958). Poželjno, nivo oksidacije, ili peroksidni nivo, je nizak, npr., manji od 5 meq O/kg, manji od 4 meq O/kg, manji od 3 meq O/kg, ili manji od 2 meq O/kg.

[0184] Lipidne frakcije koje uključuju SM i palmitoilsfingomijelin mogu opciono da uključuju male količine dodatnih lipida. Praktično bilo koja vrsta lipida može da se koristi, uključujući, ali bez ograničenja na, lizofosfolipide, galaktocerebrozid, gangliozide, cerebrozide, gliceride, trigliceride, i holesterol i njegove derivate.

[0185] Kada su uključeni, takvi opcioni lipidi će obično da obuhvataju manje od oko 15 mas.% lipidne frakcije, iako u nekim slučajevima više opcionih lipida može da bude uključeno. U nekim primerima izvođenja, opcioni lipidi obuhvataju manje od oko 10 mas.%, manje od oko 5 mas.%, ili manje od oko 2 mas.%. U nekim primerima izvođenja, lipidna frakcija ne uključuje opcione lipide.

[0186] U specifičnom primeru izvođenja, fosfolipidna frakcija sadrži SM iz jaja ili palmitoil SM ili fitosfingomijelin i DPPG u masenom odnosu (SM: negativno naelektrisan fosfolipid) u opsegu od 90:10 do 99:1, poželjnije u opsegu od 95:5 do 98:2. U jednom primeru izvođenja, maseni odnos je 97:3.

[0187] Lipoproteinski kompleksi ovog pronalaska takođe mogu da se koriste kao nosači za isporuku hidrofobnih, lipofilnih ili nepolarnih aktivnih agenasa za različite terapeutske ili dijagnostičke primene. Za takve primene, lipidna frakcija može dalje da uključuje jedan ili više hidrofobnih, lipofilnih ili nepolarnih aktivnih agenasa, uključujući, ali bez ograničenja na, masne kiseline, lekove, nukleinske kiseline, vitamine, i/ili nutrijente. Pogodni hidrofobni , lipofilni ili nepolarni aktivni agensi nisu ograničeni terapeutskom kategorijom, i mogu biti, na primer, analgetici, antiinflamatorni agensi, antihelmimtici, antiaritmički agensi, antibakterijski agensi, antivirusni agensi, antikoagulansi, antidepresanti, antidijabetici, antiepileptici, antigljivični agensi, agensi protiv gihta, antihipertenzivni agensi, agesni protiv malarije, agensi protiv migrene, antimuskarinski agensi, antineoplastični agensi, agensi za poboljšanje erektilne disfunkcije, imunosupresanti, anti-protozoalni agensi, anti-tiroidni agensi, anksiolitički agensi, sedativi, hipnotici, neuroleptici, β-blokatori, kardiološki inotropni agensi, kortikosteroidi, diuretici, agensi protiv parkinsonizma, gastro-intestinalni agensi, antagonisti histaminskih receptora, keratolitici, agensi za regulaciju lipida, anti-anginalni agensi, cox-2 inhibitori, inhibitori leukotriena, makrolidi, mišićni relaksanti, nutritivni agensi, nukleinske kiseline (npr., kratke ometajuće RNK), opioidni analgetici, inhibitori proteaza, polni hormoni, stimulansi, mišićni relaksanti, agensi protiv osteoporoze, agensi protiv gojaznosti, pojačavače kognicije, agensi protiv urinarne inkontinencije, prehrambena ulja, agensi protiv benigne hipertrofije prostate, esencijalne masne kiseline, ne-esencijalne masne kiseline, i njihove mešavine.

[0188] Specifični, neograničavajući primeri pogodnih hidrofobnih, lipofilnih, ili nepolarnih aktivnih agenasa su: acetretin, albendazol, albuterol, aminoglutetimid, amiodaron, amlodipin, amfetamin, amfotericin B, atorvastatin, atovakvon, azitromicin, baklofen, beklometazon, benezepril, benzonatat, betametazon, bikalutanid, budezonid, bupropion, busulfan, butenafin, kalcifediol, kalcipotrien, kalcitriol, kamptotecin, kandesartan, kapsaicin, karbamezepin, karoteni, celekoksib, cerivastatin, cetirizin, hlorfeniramin, holekalciferol, cilostazol, cimetidin, cinarizin, ciprofloksacin, cisaprid, klaritromicin, klemastin, klomifen, klomipramin, klopidogrel, kodein, koenzim Q10, ciklobenzaprin, ciklosporin, danazol, dantrolen, dekshlorfeniramin, diklofenak, dikoumarol, digoksin, dehidroepiandrosteron, dihidroergotamin, dihidrotahisterol, diritromicin, donezepil, efavirenz, eposartan, ergokalciferol, ergotamin, izvori esencijalnih masnih kiselina, etodolak, etopozid, famotidin, fenofibrat, fentanil, feksofenadin, finasterid, flukonazol, flurbiprofen, fluvastatin, fosfenitoin, frovatriptan, furazolidon, gabapentin, gemfibrozil, glibenklamid, glipizid, gliburid, glimepirid, griseofulvin, halofantrin, ibuprofen, irbesartan, irinotekan, izosorbid dinitrat, izotretinoin, itraconazol, ivermektin, ketokonazol, ketorolak, lamotrigin, lansoprazol, leflunomid, lizinopril, loperamid, loratadin, lovastatin, L-triroksin, lutein, likopen, medroksiprogesteron, mifepriston, meflokvin, megestrol acetat, metadon, metoksalen, metronidazol, mikonazol, midazolam, miglitol, minoksidil, mitoksantron, montelukast, nabumeton, nalbufin, naratriptan, nelfinavir, nifedipin, nilzolidipin, nilutanid, nitrofurantoin, nizatidin, omeprazol, oprevelkin, oestradiol, oksaprozin, paklitaksel, parakalcitol, paroksetin, pentazocin, pioglitazon, pizofetin, pravastatin, prednizolon, probukol, progesteron, pseudoefedrin, piridostigmin, rabeprazol, raloksifen, rofekoksib, repaglinid, rifabutin, rifapentin, rimeksolon, ritanovir, rizatriptan, rosiglitazon, sakvinavir, sertralin, sibutramin, sildenafil citrat, simvastatin, sirolimus, spironolakton, sumatriptan, takrin, takrolimus, tamoksifen, tamsulosin, targretin, tazaroten, telmisartan, tenipozid, terbinafin, terazosin, tetrahidrokanabinol, tiagabin, tiklopidin, tirofibran, tizanidin, topiramat, topotekan, toremifen, tramadol, tretinoin, troglitazon, trovafloksacin, ubidekarenon, valsartan, venlafaksin, verteporfin, vigabatrin, vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, zafirlukast, zileuton, zolmitriptan, zolpidem, i zopiklon. Soli , izomeri i derivati gore navedenih agenasa takođe mogu da se koriste, kao i mešavine.

5.3. Lipoproteinski kompleksi

[0189] Ovaj pronalazak obezbeđuje lipoproteinske komplekse koji obuhvataju proteinsku frakcija i lipidnu frakciju, a sastav svake od njih je opisan gore u odeljcima 5.1 i 5.2, respektivno.

[0190] Uopšteno, proteinska frakcija uključuje jedan ili više proteina koji vezuje lipide, kao što su apolipoprotein i/ili njegov derivat ili analog koji obezbeđuje terapeutsku i/ili profilaktičku korist.

Kompleksi mogu da uključuju jednu vrstu proteina koji vezuje lipide, ili mešavine dva ili više različitih proteina koji vezuju lipide, koji mogu da se izvedu od istih ili različitih vrsta. Pogodni proteini koji vezuju lipide opisani su gore u odeljku 5.1. Iako nije potrebno, lipoproteinski kompleksi će poželjno obuhvatati proteine koji vezuju lipide koji su izvedeni iz, ili odgovaraju u aminokiselinskoj sekvenci, životinjskim vrstama koje se tretiraju, kako bi se izbegao indukovanje imuni odgovor na terapiju. Tako, za lečenje humanih pacijenata, proteini koji vezuju lipide humanog porekla se poželjno koriste u kompleksima ovog pronalaska. Upotreba apolipoproteina peptidnih mimetika takođe može da smanji ili izbegne imuni odgovor.

[0191] Upotreba apolipoproteina koji ima visok stepen čistoće (npr., zreo i neskraćen, oksidovan, deamidiran, kontaminiran endotoksinom i/ili kontaminiran ostalim proteinima ili nukleinskim kiselinama) smatra se da poboljšava terapeutsku potentnost i/ili poboljšava bezbednost lipoproteinskog kompleksa. Prema tome, proteinska frakcija može da obuhvata najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% zrelog ApoA-I pune dužine, opciono, koji ima ne više od 25%, ne više od 20%, ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ili oko 0% oksidovanog metionin-112 ili metionin-148, i/ili ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ili oko 0% deaminovane aminokiseline. Apolipoprotein može da se prečisti prema bilo kom od postupaka opisanih ovde. Poželjno, apolipoprotein može da se izradi kao što je opisano u odeljku 5.1.4.

[0192] U specifičnom primeru izvođenja, proteinska frakcija obuhvata ili suštinski se sastoji od ApoA-I, na primer, suštinski čist zreo ApoA-I pune dužine, kao što je opisano gore u odeljku 5.1.5.

[0193] Lipidna frakcija uključuje jedan ili više lipida, koji mogu biti zasićeni, nezasićeni, prirodni i sintetički lipidi i/ili fosfolipidi. Pogodni lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, male fosfolipide sa alkil lancem, fosfatidilholin iz jaja, sojin fosfatidilholin, dipalmitoilfosfatidilholin, dimiristoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidilholin 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilholin, 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilholin, 1-palmitoil-2-stearoilfosfatidilholin, 1-stearoil-2-palmitoilfosfatidilholin, dioleoilfosfatidilholin dioleofosfatidiletanolamin, dilauroilfosfatidilglicerol fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol, fosfatidilgliceroli, difosfatidilgliceroli kao što je dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, distearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidinsku kiselinu, dipalmitoilfosfatidinsku kiselinu, dimiristoilfosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidiletanolamin, dimiristoilfosfatidilserin, dipalmitoilfosfatidilserin, moždani fosfatidilserin, moždani sfingomijelin, sfingomijelin iz jaja, mlečni sfingomijelin, fitosfingomijelin, palmitoilsfingomijelin, dipalmitoilsfingomijelin, distearoilsfingomijelin, so dipalmitoilfosfatidilglicerola, fosfatidinsku kiselinu, galaktocerebrozid, gangliozide, cerebrozide, dilaurilfosfatidilholin, (1,3)-D-manozil-(1,3)diglicerid, aminofenilglikozid, 3-holesteril-6'-(glikoziltio)heksil etar glikolipide, i holesterol i njegove derivate.

Fosfolipidne frakcije uključujući SM i palmitoilsfingomijelin mogu opciono da uključuju male količine bilo kog tipa lipida, uključujući, ali bez ograničenja na, lizofosfolipide, sfingomijeline koji nisu palmitoilsfingomijelin, galaktocerebrozid, gangliozide, cerebrozide, gliceride, trigliceride, i holesterol i njegove derivate. Sintetički lipidi su poželjni, kao što je sintetički palmitoil sfingomijelin ili N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (fitosfingomijelin). Dalji lipidi su opisani gore u odeljku 5.2. Poželjno, lipoproteinski kompleksi obuhvataju sfingomijelin.

[0194] Opciono, lipoproteinski kompleksi ovog pronalaska mogu da sadrže hidrofobne, lipofilne ili nepolarne aktivne agense, uključujući, ali bez ograničenja na, masne kiseline, lekove, nukleinske kiseline, vitamine, i/ili nutrijente, za različite terapeutske ili dijagnostičke primene. Pogodni agensi opisani su gore u odeljku 5.2.

[0195] Lipoproteinski kompleksi mogu da se izrade upotrebom bilo kog od postupaka opisanih ovde. Poželjno, kompleksi se izrađuju kao što je opisano u odeljcima 5.5.1 do 5.5.4.

[0196] Molarni odnos lipidnih frakcija prema proteinskoj frakciji negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa opisanih ovde može da varira, i zavisiće od, pored ostalih faktora, identiteta apolipoproteina koji obuhvata proteinsku frakciju, identiteta i količina naelektrisanih fosfolipida koji obuhvataju lipidnu frakciju, i željene veličine naelektrisanog lipoproteinskog kompleksa. Zato što se smatra da je biološka aktivnost apolipoproteina kao što je ApoA-I posredovana amfipatičnim heliksima koji obuhvataju apolipoprotein, pogodno je da se eksprimira apolipoproteinska frakcija molarnog odnosa lipid:apolipoprotein upotrebom ApoA-I proteinskih ekvivalenata. Opšte je prihvaćeno da ApoA-I sadrži 6-10 amfipatičnih heliksa, zavisno od postupka korišćenog za izračunavanje heliksa. Ostali apolipoproteini mogu da se eksprimiraju u smislu ApoA-I ekvivalenata na osnovu broja amfipatičnih heliksa koje sadrže. Na primer, ApoA-IM, koji obično postoji kao dimer sa disulfidnim mostom, može da se eksprimira kao 2 ApoA-I ekvivalenti, zato što svaki molekul ApoA-IMsadrži dvaput više amfipatičnih heliksa kao molekul ApoA-I. Obrnuto, peptidni apolipoprotein koji sadrži jedan amfipatični heliks može da se eksprimira kao 1/10-1/6 ApoA-I ekvivalent, jer svaki molekul sadrži 1/10-1/6 onoliko koliko ima amfipatičnih heliksa kao molekul ApoA-I. Uopšteno, molarni odnos lipid:ApoA-I ekvivalent lipoproteinskih kompleksa (definisan ovde kao "Ri") biće u opsegu od oko 105:1 do 110:1. U nekim primerima izvođenja, Ri je oko 108:1. Maseni odnosi mogu da se dobiju upotrebom MW od približno 650-800 za fosfolipide.

[0197] U nekim primerima izvođenja, molarni odnos lipid : ApoA-I ekvivalenti ("RSM") je u opsegu od oko 80:1 do oko 110:1, npr., oko 80:1 do oko 100:1. U specifičnom primeru, RSM za lipoproteinske komplekse može biti oko 82:1.

[0198] Različiti molekuli apolipoproteina i/ili fosfolipida koji obuhvataju negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse mogu da budu obeleženi bilo kojim detektabilnim markerom koji je poznat u tehnici, uključujući stabilne izotope (npr.,<13>C,<15>N,<2>H, itd.); radioaktivne izotope (npr.,<14>C,<3>H,<125>I, itd.); fluorofore; hemiluminescere; ili enzimske markere.

[0199] U poželjnim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleksi su negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi koji obuhvataju proteinsku frakciju koja je poželjno zreo ApoA-I pune dužine, i lipidnu frakciju koja obuhvata neutralni fosfolipid, sfingomijelin (SM), i negativno naelektrisan fosfolipid.

[0200] Otkriveno je da sastav i relativne količine SM i negativno naelektrisani fosfolipid koji obuhvata lipidnu frakciju lipoproteinskih kompleksa deluje na homogenost i stabilnost kombinacija koje obuhvataju komplekse. Kao što je ilustrovano u odeljku Primeri, kombinacije koje obuhvataju komplekse u kojima je lipidna frakcija sastavljena od SM i negativno naelektrisanog fosfolipida su homogeniji, i stabilniji nego slične kombinacije u kojima lipidna frakcija uključuje DPPC pored SM.

[0201] Tako, kompleksi ovog pronalaska koji sadrže SM i negativno naelektrisan lipid se poželjno formiraju u odsustvu lecitina kako bie poboljšala njihova homogenost i stabilnost. Jednom kada se homogeni kompleksi koji sadrže SM i negativno naelektrisane lipide formiraju, dodatni lipidi kao što je lecitin mogu da se uvedu.

[0202] Kada su uključeni, opcioni lipidi će obično da obuhvataju manje od oko 15% lipidne frakcije, iako u nekim slučajevima više opcionih lipida može da bude uključeno. U nekim primerima izvođenja, opcioni lipidi obuhvataju od oko 10%, manje od oko 5%, ili manje od oko 2% mas.%. U nekim primerima izvođenja, lipidna frakcija negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa ne uključuje opcione lipide.

[0203] U specifičnom primeru izvođenja, fosfolipidna frakcija sadrži SM jajeta ili palmitoil SM ili fitoSM i DPPG u masenom odnosu (SM : negativno naelektrisan fosfolipid) u opsegu od 90:10 do 99:1, poželjnije u opsegu od 95:5 do 98:2, npr., 97:3.

[0204] Neki apolipoproteini razmenjuju se in vivo od jednog lipoproteinskog kompleksa do drugog (ovo je istina za apolipoprotein ApoA-I). Tokom takve razmene, apolipoprotein obično nosi sa sobom jedan ili više molekula fosfolipida. Zahvaljujući ovom svojstvu, očekivano je da će negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi opisani ovde "zasejati" negativno naelektrisane fosfolipide u endogeni HDL, čime se oni transformišu u alfa čestice koje su otpornije kako bi se eliminisali bubrezima. Tako, očekivano je da će davanje negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa i kombinacija opisanih ovde povećati serumske nivoe HDL, i/ili nakon poluživota endogenog HDL kao i metabolizam endogenog HDL. Očekivano je da će ovo da rezultuje izmenom metabolizma holesterola i reverznog lipidnog transporta.

[0205] Kao što je ilustrovano u odeljku Primeri, kombinacije koje obuhvataju komplekse u kojima je maseni odnos ApoA-I : SM i DPPG fosfolipid oko 1:2,7 su homogeniji i stabilniji od sličnih kombinacija sa ostalim masenim odosima. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje lipoproteinske kombinacije u kojima je maseni odnos protein : lipid optimiziran za formiranje homogene populacije kompleksa.

Maseni odnos je u opsegu od 1:2,6 do 1:3, i optimalno je 1:2,7, za komplekse ApoA-I, SM, i DPPG, i za komplekse komponenata slične molekulske mase. U specifičnim primerima izvođenja, odnos ApoA-I proteinske frakcije prema lipidnoj frakciji obično je u opsegu od oko 1:2,7 do oko 1:3, pri čemu je poželjno 1:2,7. Ovo odgovara molarnom odnosu ApoA-I protein prema fosfolipid u opsegu od približno 1:90 do 1:140. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje komplekse u kojima je molarni odnos proteina prema lipidu oko 1:90 do oko 1:120, oko 1:100 do oko 1:140, ili oko 1:95 do oko 1:125. Specifično pri ovom optimizovanom odnosu, ApoA-I proteinska frakcija i SM i DPPG lipidna frakcija iz suštinski homogenih kompleksa sa istom veličinom i karakteristikama naelektrisanja, kao što je ispitano kolonskom hromatografijom i gel elektroforezom, respektivno, kao prirodan HDL.

[0206] Veličina negativno naelektrisanog lipoproteinskog kompleksa može da se kontroliše variranjem Ri. To jest, što je manje Ri, manji je disk. Na primer, veliki diskoidni diskovi će obično da imaju Ri u opsegu od oko 200:1 do 100:1, dok će mali diskoidni diskovi obično da imaju Ri u opsegu od oko 100:1 do 30:1.

[0207] U nekim specifičnim primerima izvođenja, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi su veliki diskoidni diskovi koji sadrže 2-4 ApoA-I ekvivalenta (npr., 2-4 molekula ApoA-I, 1-2 molekula ApoA-IMdimera ili 12-40 molekula jednog peptida heliksa), 1 molekul negativno naelektrisanog fosfolipida i 400 molekula SM. U ostalim specifičnim primerima izvođenja, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi su mali diskoidni diskovi koji sadrže 2-4 ApoA-I ekvivalente; 1-10, poželjnije 3-6, molekula negativno naelektrisanog fosfolipida; i 90-225 molekula, poželjnije 100-210 molekula SM.

5.3.1. Merenje veličine kompleksa i čestica

[0208] Sastav lipoproteinskih kompleksa, kao i njihova veličina i ona lipidnih čestica korišćenih u pripremi lipoproteinskih kompleksa, može da se odredi upotrebom različitih tehnika poznatih u tehnici.

[0209] Koncentracija proteina i lipida lipoproteinskih kompleksa u rastvoru može da se izmeri bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, ispitivanja proteina i fosfolipida, hromatografski postupci kao što je HPLC, gel filtriranje, GC kuplovan sa raznim detektorima uključujući masenu spektroskopiju, UV ili diodni-niz, fluorescentno, elastično rasipanje svetlosti i ostalo. Integritet lipida i proteina može takođe da se odredi istim hromatografskim tehnikama kao i mapiranjem peptida, SDS-page gel elektroforezom, N- i C-terminalnim sekvenciranjem ApoA-I, i standardnim ispitivanjima za određivanje oksidacije lipida.

[0210] Lipoproteinski kompleks kao i lipidne čestice korišćene u pripremi lipoproteinskih kompleksa, može da bude u opsegu veličina kao što je opisano ovde. Veličina lipidnih čestica i/ili veličina kompleksa lipida i proteina može da se odredi upotrebom postupaka poznatih u tehnici. Primeri postupaka uključuju dinamičko rasipanje svetlosti i gel-propusnu hromatografiju.

[0211] Dinamičko rasipanje svetlosti (DLS), takođe poznato kao fotonska korelaciona spektroskopija, merenje i pomeranje talasne dužine udarca svetlosnog snopa čestica koje se kreću u rastvoru Brovnovskog pokreta. Specifično, raspršena svetlost krećućih čestica kada se osvetli laserom i rezulutujuće fluktuacije intenziteta u raspršenoj svetlosti mogu da se koriste da bi se izračunala raspodela sferičnih čestica u rastvoru. Videti, Zetasizer Nano Series User Manual, MAN0317 Issue 2.1 (Jul 2004). DLS određuje raspodelu intenziteta i prosek čestica u rastvoru, na osnovu koje može da se izračuna zapremina čestica i broj raspodela i prosek. DLS tehnika može da se koristi kako bi se odredila veličina lipidnih čestica korišćenih za izradu lipoproteinskih kompleksa, kao i veličina samih lipoproteinskih kompleksa. Pogodan DLS instrument je Zetasizer Nano od strane Malvern Instruments.

[0212] Gel-propusna hromatografija (GPC) takođe može da se koristi kako bi se odredila veličina kompleksa koji sadrže proteine. Gel-propusna hromatografija razdvaja komponente u mešavini na osnovu veličine molekula. Veličina lipid-protein kompleksa može da se odredi poređenjem profila eluiranja kompleksa sa onim poznatih standarda ili referentnih uzoraka, obično poređenjem kalibracione krive. Referentni uzorci komercijalno su dostupni i mogu da uključuju i proteinske i neproteinske standarde, kao što je albumin, feritin, i vitamin B12. Current Protocols in Molecular Biology (1998), Odeljak IV, 10.9.1-10.9.2.

[0213] Lipidne čestice korisne u pripremi lipoproteinskih kompleksa ovog pronalaska mogu biti veličine najmanje 45 nm, najmanje 50 nm, najmanje 55 nm, najmanje 60 nm, kao što je mereno DLS (npr., upotrebom merenja na bazi intenziteta). Dalje, lipidna čestica može biti veličine do 65 nm, do 70 nm, do 80 nm, do 90 nm, do 100 nm, do 120 nm, do 150 nm, do 200 nm, do 250 nm, do 300 nm, ili do 500 nm, kao što je izmereno pomoću DLS.

[0214] Lipoproteinski kompleksi ovog pronalaska mogu da budu veličine u opsegu od 4 nm do 15 nm, 6 nm do 15 nm, 4 nm do 12 nm, 5 do 12 nm, 6 nm do 12 nm, 8 nm do 12 nm, ili 8 nm do 10 nm kao što je izmereno tehnikama opisanim ovde.

5.4. Populacije lipoproteinskih kompleksa

[0215] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje populacije lipoproteinskih kompleksa opisanih ovde.

Populacije obuhvataju mnoštvo lipoproteinskih kompleksa kao što je opisano ovde, pri čemu svaki obuhvata proteinsku frakciju i lipidnu frakciju, npr. kao što je opisano gore u odeljku 5.3. Prijavioci su otkrili nekoliko karakteristika za koje se smatra da utiču pojedinačno ili u kombinaciji na potentnost i bezbednosni profil populacija lipoproteinskih kompleksa. Populacije lipoproteinskih kompleksa mogu da inkorporiraju bilo koji broj karakteristika, opisanih ovde same ili u kombinaciji.

[0216] Prvo, homogenost lipoproteinskih kompleksa u populaciji, tj., prevalenca jednog ili više zasebnih lipoproteinskih kompleksa u populaciji, kao što je naznačeno jednim ili više izolovanih pikova lipoproteinskih kompleksa u populacija, i prevalenca u lipoproteinskim kompleksima zrelog, nemodifikovanog apolipoproteina, smatra se da povećavaju potentnost. Prema tome, populacija lipoproteinskih kompleksa može da obuhvata proteinsku frakciju koja obuhvata ili se suštinski sastoji od apolipoproteina, npr., ApoA-I, i lipidne frakcije, gde je populacija najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% homogena kao što je izmereno procentom populacije u jednom piku gel-propusne hromatografije.

[0217] U nekim primerima izvođenja, veličina lipoproteinskog kompleksa u populaciji može da bude u opsegu između 4 nm i 15 nm, npr., između 5 nm i 12 nm, između 6 nm i 15 nm, ili između 8 nm i 10 nm.

[0218] Apolipoprotein, npr., ApoA-I, u populaciji može biti zreo, poželjno (neskraćen) ApoA-I pune dužine, a populacija može da sadrži najmanje 75mas.%, najmanje 80mas.%, najmanje 85mas.%, najmanje 90mas.%, najmanje 95mas.%, najmanje 96mas.%, najmanje 97mas.%, najmanje 98mas.%, najmanje 99mas.% zrelog, (neskraćen) ApoA-I poželjno pune dužine. U nekim primerima izvođenja, populacija uključuje ne više od 25mas.%, ne više od 20mas.%, ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.%, ili ne više od 5mas.% nezrelog ili nepotpuno obrađenog ApoA-I i/ili ne više od 20mas.%, ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.%, ili ne više od 5mas.% skraćenog ApoA-I.

[0219] Drugo, čistoća apolipoproteina i lipida u kompleksima i relativno odsustvo kontaminanata u lipoproteinskim kompleksima, takođe se naziva čistoća lipoproteinskih kompleksa, smatra se da smanjuje rizik od nuspojava kao što je oštećenje jetre, reflektovano povećanjem enzima u jetri (npr., transaminaza). Čistoća apolipoproteina može da se izmeri relativnim nedostatkom oksidacije i/ili deamidacije. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, populacije lipoproteinskih kompleksa mogu da smanje količine oksidovanog apolipoproteina, kao što je ne više od 20%, ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ne više od 1% oksidovanog metionina, naročito metionin-112 ili metionin-148, ili ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ili ne više od 1% oksidovanog triptofana. Populacije lipoproteinskih kompleksa takođe mogu da imaju smanjeni procenat deamidiranih aminokiselina, na primer ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ili ne više od 1% deaminovanih aminokiselina.

[0220] Takođe je poželjno da se kontroliše čistoća lipida u lipoproteinskom kompleksu. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% lipida u pomenutoj populaciji je oksidovano.

[0221] Drugo merenje čistoće kompleksa i njihovih populacija je smanjene, ili odsustvo, kontaminanata što rezultuje iz postupaka proizvodnje ili prečišćavanja apolipoproteina ili postupaka izrade samih lipoproteinskih kompleksa. Prema tome, gde je apolipoprotein prečišćen iz ćelija domaćina, na primer ćelija domaćina sisara, populacije lipoproteinskih kompleksa su poželjno bez DNK ili proteina ćelija domaćina. U specifičnim primerima izvođenja, populacija sadrži ne više od 500 nanograma, ne više od 200 nanograma, ne više od 100 nanograma, ne više od 50 nanograma, ili ne više od 20 nanograma proteina ćelija domaćina po miligramu lipoproteina, i/ili ne više od 100 pikograma, ne više od 50 pikograma, ne više od 25 pikograma, ne više od 10 pikograma ili ne više od 5 pikograma DNK ćelija domaćina po miligramu lipoproteina, obično ApoA-I.

[0222] Ostali kontaminanti koji mogu da se jave i koje treba izbeći su endotoksin, koji može da bude prisutan, inter alia, u ćelijskim kulturama i u uzorcima plazme, i rastvarači i deterdženti, koji mogu da budu prisutni zavisno od korišćenog postupka za izradu i/ili prečišćavanje lipoproteinskog kompleksa. Populacije lipoproteinskih kompleksa mogu da sadrže najviše oko 1 EU, oko 0,5 EU, oko 0,3 EU, ili oko 0,1 EU endotoksina po miligramu lipoproteina, npr. ApoA-I. Populacije lipoproteinskih kompleksa mogu takođe da budu ograničene da sadrže ne više od 200 ppm, 250 ppm, 100 ppm ili nevodenog rastvarača. U specifičnom primeru izvođenja, populacija ne sadrži bilo koji deterdžent, npr., holat.

[0223] Dodatno, upotrebom postupaka opisanih ovde, moguće je da se ugradi veći deo polaznog materijala apolipoproteina u komplekse, čime se ograničava količina nekompleksiranog apolipoproteina prisutnog u populaciji. Smanjenje količine nekompleksiranog apolipoproteina je korisno jer smanjuje rizik od imunogenskog odgovora zbog izlaganja heterolognom proteinu. Populacija lipoproteinskih kompleksa može da bude u kombinaciji u kojoj je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% proteina u lipoproteinskom kompleksu, tj., u obliku kompleksa. Opciono, populacija lipoproteinskih kompleksa može biti u kombinaciji u kojoj je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% lipida u lipoproteinskom kompleksu.

[0224] Opciono, populacija može da obuhvata komplekse u kojima lipidna frakcija obuhvata ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.%, ne više od 5mas.%, ne više od 4mas.%, ne više od 3mas.%, ne više od 2mas.%, ne više od 1mas.%, ili 0mas.% holesterola lipida.

[0225] Određene lipidne i proteinske komponente mogu da formiraju veći broj različitih ali homogenih lipoproteinskih kompleksa. Prema tome, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kombinacije koje obuhvataju dve, tri, ili četiri populacije lipoproteinskih kompleksa koji obuhvataju različite količine molekula apolipoproteina (npr., dva, tri ili četiri ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta). U nekom primeru izvođenja, kombinacija obuhvata dve populacije lipoproteinskih kompleksa, pri čemu prva populacija obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 2 ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta po lipoproteinskom kompleksu, a druga populacija obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 3 ili 4 ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta po lipoproteinskom kompleksu i opciono treću populaciju koja obuhvata lipoproteinske komplekse koji imaju 4 ili 3 ApoA-I molekula ili ApoA-I ekvivalenta po lipoproproteinskom kompleksu, respektivno.

[0226] Kombinacije koje obuhvataju dve ili više populacija lipoproteinskih kompleksa poželjno imaju niske nivoe nekompleksiranog lipoproteina i/ili lipida. Prema tome, poželjno ne više od 15%, ne više od 12%, than 10%, ne više od 9%, ne više od 8%, ne više od 7%, ne više od 6%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ili ne više od 1% lipida u kombinaciji je u nekompleksiranom obliku i/ili ne više od 15%, ne više od 12%, ne više od 10%, ne više od 9%, ne više od 8%, ne više od 7%, ne više od 6%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ili ne više od 1% lipoproteina u kombinaciji je u nekompleksiranom obliku.

[0227] Ovde su takođe obezbeđeni preparati velikih razmera lipoproteinskih kompleksa, ili njihove populacije, koje su naročito korisne za komercijalne primene, kao što je proizvodnja lipoproteinskih kompleksa velikih razmera za terapeutske svrhe. Ovde opisani preparati obuhvataju populaciju lipoproteinskih kompleksa, npr., negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse, kao što je opisano ovde.

[0228] Preparati obezbeđeni su u zapreminama, količinama i dobijenoj koncentraciji lipoproteinskih kompleksa pogodnih za proizvodnju kombinacija, npr., farmaceutske kombinacije i dozni oblici, u komercijalnoj razmeri. Uobičajene zapremine preparata su u opsegu od oko 5L do oko 50L, ili veće, na primer, oko 10L do oko 40L, oko 15L do oko 35L, oko 15L do oko 30L, oko 20L do oko 40L, oko 20L do oko 30L, oko 25L do oko 45L, oko 25L do oko 35L. Preparati mogu da imaju zapreminu od oko 5L, oko 6L, oko 7L, oko 8L, oko 9L, oko 10L, oko 11L, oko 12L, oko 13L, oko 14L, oko 15L, oko 16L, oko 17L, oko 18L, oko 19L, oko 20L, oko 25L, oko 30L, oko 35L, oko 40L, oko 45L, ili oko 50L. U poželjnom primeru izvođenja, preparat ima zapreminu od oko 20L.

[0229] Preparati dalje sadrže lipoproteinske komplekse, ili njihovu populaciju, u količinama dovoljnim da se postigne koncentracija apolipoproteina u opsegu od oko 5 mg/mL do oko 15 mg/mL, od 5 mg/mL do oko 10 mg/mL, od oko 10 mg/mL do oko 15 mg/mL, ili oko 8 mg/mL do oko 12 mg/mL apolipoproteina. Zavisno od zapremine preparata, količine mogu da budu u opsegu od oko 25g do oko 350g, izražene kao količina apolipoproteina, npr., ApoA-I, u preparatu. U specifičnom primeru izvođenja, preparat sadrži oko 8 mg/mL ApoA-I.

[0230] U specifičnom primeru izvođenja, preparat ima zapreminu od 15L do 25L i sadrži oko 100 g do oko 250 g ApoA-I. U drugom specifičnom primeru izvođenja, preparat ima zapreminu od 30L do 50L i sadrži oko 240 g do oko 780 g ApoA-I.

5.5. Postupci izrade lipoproteinskih kompleksa

5.5.1. Postupci izrade lipoproteinskih kompleksa na bazi termičkog cikliranja

[0231] Otkriveno je da postupci koji koriste termičko cikliranje proteinskih i lipidnih komponenata kao što je opisano ovde mogu da se koriste za generisanje lipoproteinskih kompleksa sa prednostima u odnosu na ostale postupke. U postupcima termičkog cikliranja opisanim ovde, proteinska komponenta i lipidna komponenta, koje su podvrgnute termičkom cikliranju dok veći deo proteinske komponente (npr., najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90%) ne obrazuje kompleks sa lipidnom komponentom, formirajući lipoproteinski kompleks. Kao što će biti poznato prosečnim stručnjacima, prednosti ovih postupaka u odnosu na ostale postupke za proizvodnju lipoproteinskih kompleksa uključuju visoku efikasnost obrazovanja kompleksa što rezultuje suštinski homogenim i čistim krajnjim proizvodom, sa malo ili nimalo sporednih proizvoda (npr., nekompleksiran protein) ili nečistoća proizvodnje (npr., deterdženti ili surfaktanti, razgrađeni proteini, oksidovane komponente) prisutnih u dobijenom proizvodu, zaobilazeći potrebu za skupim i rasipnim fazama prečišćavanja. Tako, postupci su efikasni i daju malo ili ni malo otpada polaznih materijala. Dalje, može lako da se poveća razmera postupaka i i da se postignu niski troškovi na opremu. Sposobnost da se izvode ovi postupci bez industrijskih rastvarača čini ih takođe ekološkim.

[0232] Poželjno, kako bi se minimizirala oksidacija proteinskih i lipidnih komponenta, jedna, više od jedne ili sve faze formiranja kompleksa (uključujući homogenizaciju lipidne komponente) izvode se pod nekim slojem inertnog gasa (npr., azot, argon ili helijum).

5.5.2. Lipidna komponenta

[0233] Postupci termičkog cikliranja ovog pronalaska mogu da koriste različite lipide, same ili u kombinaciji, uključujući zasićene, nezasićene, prirodne i sintetičke lipide i/ili fosfolipide, kao što je opisano gore u odeljku 5.2.

[0234] Lipidi mogu da se pripreme za termičko cikliranje sa proteinskom komponentom upotrebom bilo kog postupka koji generiše lipidne čestice, kao što su multilamelarne vezikule ("MLV"), male unilamelarne vezikule ("SUV"), velike unilamelarne vezikule ("LUV"), micele, disperzije i slično.

[0235] Poznat je opseg tehnologija za proizvodnju lipidnih čestica. Lipidne čestice proizvode se upotrebom raznih protokola, koji formiraju različite vrste vezikula. Poželjno je da su korišćene čestice u postupcima termičkog cikliranja ovog pronalaska pretežno u opsegu veličina 45-80 nm, najpoželjnije u opsegu veličina 55 nm do 75 nm.

[0236] Homogenizacija pod visokim pritiskom, na primer mikrofluidizacija, povoljno proizvodi čestice odgovarajućih veličina. Pritisak homogenizacije je poželjno najmanje 1.000 bara, najmanje 1.200 bara, najmanje 1.400 bara, najmanje 1.600 bara, najmanje 1.800 bara, i najpoželjnije je najmanje 2.000 bara, na primer najmanje 2.200 bara, najmanje 2.400 bara, najmanje 2.600 bara, najmanje 2.800 bara, najmanje 3.000 bara, najmanje 3.200 bara, najmanje 3.400 bara, najmanje 3.600 bara, najmanje 3.800 bara, ili najmanje 4.000 bara. U specifičnim primerima izvođenja, pitisak homogenizacije je u opsegu između bilo kog para gore navedenih vrednosti, npr., 1.600 do 3.200 bara; 1.800 do 2.800 bara; 1.900 do 2.500 bara; 2.000 do 2.500 bara; 2.000 do 3.000 bara; 2.400 do 3.800 bara; 2.800 do 3.400 bara; i tako dalje i tako dalje. Jedan bar jednak je 100 kPa, 1.000.000 dina po centimetru kvadratnom (baryes), 0,987 atm (atmosfera), 14,5038 psi, 29,53 inHg i 750,06 torr.

[0237] U jednom pogodnom postupku homogenizacije, emulzija lipida prenosi se na napojnu posudu Microfluidizer Model 110Y (Microfluidics Inc, Newton, Mass.). Jedinica se uranja u kupatilo kako bi se održala procesna temperatura (npr., 55°C, 58°C, 62°C, itd.) tokom homogenizacije, i ispira se inertnim gasom kao što je argon pre upotrebe. Posle prvog sloja, emulzija se propušta kroz homogenizator u kontinuiranom re-ciklusu tokom 5-20 minuta pri gradijentu pritiska preko glave interakcije.

Homogenizacija lipidne komponente u odsustvu proteinske komponente izbegava razaranje proteinske komponente visokim smicanjem korišćenim u tehnikama homogenizacije.

[0238] Ostali postupci mogu pogodno da se koriste, obezbeđeni da se dobiju čestice pogodne veličine. Na primer, hidratacija lipida vodenim rastvorom može da rezultuje disperzijom lipida i spontanim formiranjem multimelarnih vezikula ("MLV"). MLV je čestica sa višestrukim lipidnim bislojevima koji okružuju centralno vodeno jezgro. Ove vrste čestica su veće od malih unilamelarnih vezikula (SUVS) i mogu biti prečnika 350-400 nm. MLV mogu da se pripreme rastvaranjem lipida u hloroformu u boci sa okruglim dnom i isparavanjem hloroforma dok lipid ne formira tanak sloj na zidu boce. Vodeni rastvor se dodaje i omogući se da lipidni sloj rehidrira. Vezikule se formiraju kada se boca vrti ili vorteksuje.

Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (navode Bangham et al, 1965, J. Mol. Biol.13:238). Ovaj postupak takođe može da se koristi za generisanje pojedinačnih lamelarnih vezikula. Johnson et al, 1971, Biochim. Biophys. Acta 233:820.

[0239] Mala unilamelarna vezikula (SUV) je čestica sa jednim lipidnim bislojem koji okružuje vodeno jezgro. Zavisno od postupka korišćenog za generisanje SUVS, mogu da budu u opsegu veličine prečnika od 25-110 nm. Kao prvo, SUV su pripremljene sušenjem fosfolipidnog preparata hloroformu pod azotom, dodavanjem vodenog sloja kako bi se proizveo lipid koncentracije u milimolarnom opsegu, i sonikacijom rastvora na 45°C do izbistrenja. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. SUV pripremljene na ovaj način daju čestice u opsegu prečnika od 25-50 nm.

[0240] Drugi postupak izrade SUV je brzo injektiranje etanol/lipid rastvora u vodeni rastvor da bi se inkapsulirao. Deamer et al, 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (navode Batzri et al, 1973, Biochim. Biophys. Acta 298:1015). SUV proizvedene ovim postupkom u opsegu su veličine prečnika od 30-110 nm.

[0241] SUV takođe mogu da se proizvedu propuštanjem multilamelarnih vezikula kroz French Press četiri puta pri 20.000 psi. Proizvedene SUV biće u opsegu veličine prečnika od 30-50 nm. Deamer et al, 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (navode Barenholz et al, 1979, FEBS Letters 99:210).

[0242] Multilamelarne i unilamelarne fosfolipidne vezikule takođe mogu da se formiraju izvlačenjem vodenih preparata fosfolipida pod visokim pritiskom kroz membrane sa malim porama (Hope et al., 1996, Chemistry and Physics of Lipids, 40:89-107)

[0243] Velike unilamelarne vezikule slične su sa SUV po tome da su one pojedinačni lipidni bislojevi koji okružuju centralno vodeno jezgro, ali LUV su mnogo veće od SUV. Zavisno od njihovih sastavnih delova i postupka korišćenog za njihovu pripremu, LUV mogu da budu u opsegu veličina prečnika od 50-1000 nm. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. LUV se obično pripremaju upotrebom jednog od tri postupka: razblaženja deterdženta, reverzno-fazno uparavanje, i infuzija.

[0244] U tehnici razblaženja deterdženta, rastvori deterdženta kao što su holat, dezoksiholat, oktil glukozid, heptil glukozid i Triton X-100 koriste se za formiranje micela iz preparata lipida. Rastvor se zatim dijalizira kako bi se uklonio deterdžent. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York.

[0245] Tehnika reverzno-faznog uparavanja rastvara lipid u vodenim-nepolarnim rastvorima, formirajući invertovane micele. Nepolarni rastvarač isparava i micele se nagomilavaju radi formiranja LUV. Ovaj postupak uopšteno zahteva mnogo lipida.

[0246] Postupak infuzije injektira lipid rastvoren u nepolarnom rastvoru u vodeni rastvor da bi se enkapsulirao. Kako nepolarni rastvor isparava, lipidi se prikupljaju na gas/voda međupovršini. Lipidni slojevi formiraju LUV i oligolamelarne čestice jer prolaze mehurići gasa kroz vodeni rastvor. Čestice su dimenzionisane filtriranjem. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (navode Deamer et al, 1976, Biochim. Biophys. Acta 443:629 i Schieren et al., 1978, Biochim.

Biophys. Acta 542:137).

[0247] Alikvot dobijenog preparata lipida može da se karakteriše kako bi se potvrdilo da su lipidne čestice pogodne za upotrebu kao lipidna komponenta u postupcima termičkog cikliranja opisanim ovde. Karakterizacija pripreme lipida može se izvesti upotrebom bilo kog postupka poznatog u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, filtriranje isključivanja veličina, gel filtriranje, kolonsko filtriranje, gelpropusna hromatografija, i ne-denaturišuća gel elektroforeza.

5.5.3. Proteinska komponenta

[0248] Proteinska komponenta lipoproteinskih kompleksa nije kritična za uspeh u ovim postupcima termičkog cikliranja. Praktično bilo koji protein koji vezuje lipide, kao što je apolipoprotein i/ili njegov derivat ili njegov analog koji obezbeđuje terapeutsku i/ili profilaktičku korist može da se uključi u komplekse. Štaviše, bilo koji alfa-helični peptid ili peptidni analog, ili bilo koji drugi tip molekula koji "imitira" aktivnost apolipoproteina (kao što je, na primer ApoA-I) po tome što može da aktivira LCAT ili formira diskoidne čestice kada se poveže sa lipidima, može da se uključi u lipoproteinske komplekse, i prema tome uključen je u definiciju "protein koji vezuje lipide." Proteini koji vezuju lipide koji mogu da se koriste u postupcima termičkog cikliranja uključuju one opisane u odeljku 5.1 gore. Proteini koji vezuju lipide mogu rekombinantno da se proizvode kao što je opisano u odeljku 5.1.2 gore. Proteini koji vezuju lipide mogu da se prečiste bilo kojim od postupaka opisanim ovde, uključujući kao što je opisano u odeljku 5.1.3 ili odeljku 5.1.4 gore.

[0249] Proteinska komponenta može da se prečisti iz životinjskih izvora (i naročito iz humanih izvora), hemijski sintetiše ili proizvede rekombinantno kao što je dobro poznato u tehnici, videti, npr., Chung et al., 1980, J. Lipid Res.21(3):284-91; Cheung et al, 1987, J. Lipid Res.28(8):913-29. Videti takođe U.S. Patent br.5,059,528, 5,128,318, 6,617,134; U.S. objavu br.20002/0156007, 2004/0067873, 2004/0077541, i 2004/0266660; i PCT objave br. WO/2008/104890 i WO/2007/023476.

[0250] Proteinska komponenta može da uključuje lipide u odnosu protein/peptid prema lipidu koji je najmanje 5-puta veći (npr., najmanje 5-puta, najmanje 10-puta ili najmanje 20-puta veći) nego odnos protein/peptid prema lipidu u željenom kompleksu. Na primer, kako bi se proizveo lipoproteinski kompleks u kom je željeni odnos protein prema lipidu 1:200 na molarnoj bazi, protein u proteinskoj komponenti može da se kombinuje sa lipidom, obično onaj koji će da predstavlja samo malu frakciju lipida u krajnjem kompleksu, npr., u odnosu od 1:10 do 1:20. Bez ikakvog mehanizma, ovo "pred-" obrazovanje kompleksa proteina sa malom količinom lipida korisno je kada željeni kompleks ima više od jedne vrste lipida, što omogućava homogeniju raspodelu lipida koji je prisutan u malim količinama u lipoproteinskom kompleksu proizvedenom termičkim cikliranjem (npr., 10mas.% ili manje od ukupnog lipida, 5mas.% ili manje od ukupnog lipida, 3mas.% ili manje od ukupnog lipida, 2mas.% ili manje od ukupnog lipida, ili 1mas.% ili manje od ukupnog lipida u željenom lipoproteinskom kompleksu).

5.5.4. Generisanje lipoproteinskih kompleksa termičkim cikliranjem

[0251] Postupci uopšteno podrazumevaju termičko cikliranje suspenzije koja obuhvata lipidne čestice i proteine koji vezuju lipide između opsega "visokih" temperatura i opsega "niskih" temperatura dok se ne formiraju lipoproteinski kompleksi.

[0252] Suspenzija koja je termički ciklirana sadrži lipidnu komponentu i proteinsku komponentu koje se dovode zajedno, poželjno na temperaturi u opsegu visokih temperatura, kako bi se formirala "polazna" suspenzija koja se zatim podvrgava termičkom cikliranju.

[0253] Optimalni odnos lipida i proteina u polaznoj suspenziji određuje se željenom stehiometrijom komponenata u krajnjim lipoproteinskim kompleksima koji se proizvode. Kao što će biti prepoznato od strane prosečnog stručnjaka, molarni odnos lipidnih frakcija prema proteinskoj frakciji zavisiće, pored ostalih faktora, od identiteta proteina i/ili peptida u proteinskoj komponenti, identiteta i količina lipida u lipidnoj frakciji, i željene veličine lipoproteinskog kompleksa. Pogodni odnosi lipida prema proteinu u lipoproteinskim kompleksima mogu da se odrede upotrebom bilo kog broja funkcionalnih testova poznatih u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, test pokretljivosti gel elektroforezom, hromatografiju isključivana veličina, interakciju sa HDL receptorima, prepoznavanje ATP-vezujućeg kasetnog transportera (ABCA1), unos jetrom, i farmakokinetike/farmakodinamike. Na primer, testovi pokretljivosti gel elektroforezom mogu da se koriste za određivanje optimalnog odnosa lipidne komponente prema proteinskoj komponenti u kompleksima. Gde su kompleksi proizvedeni postupcima ovog pronalaska naelektrisani, kao rezultat inkluzija fosfolipida u lipidnoj komponenti, kompleksi mogu da se dizajniraju da imaju elektroforetsku pokretljivost koja je slična prirodnim pre-beta-HDL ili alfa-HDL česticama. Tako, u nekim primerima izvođenja, naturalne pre-beta-HDL ili alfa-HDL čestice mogu da se koriste kao standard za određivanje pokretljivosti kompleksa.

[0254] U poželjnom primeru izvođenja, krajnji kompleks ima najmanje jedan apolipoprotein ili apoliproteinski imitator (najpoželjnije zreli humani ApoA-I ili ApoA-I peptid, respektivno), najmanje jedan neutralni lipid, i najmanje jedan negativno naelektrisan lipid, kao što su oni opisani u PCT WO2006/100567.

[0255] Zato što se smatra da je aktivnost apolipoproteina kao što je ApoA-I posredovana amfipatičnim heliksima koji obuhvataju apolipoprotein, pogodno je da se eksprimira apolipoproteinska frakcija molarnog odnosa lipid:apolipoprotein upotrebom ApoA-I proteinskih ekvivalenata. Uopšteno je prihvaćeno da ApoA-I sadrži 6-10 amfipatičnih heliksa, zavisno od postupka korišćenog da se izračunaju heliksi. Ostali apolipoproteini mogu da se eksprimiraju u pogldu ApoA-I ekvivalenata na osnovu broja amfipatičnih heliksa koje sadrže. Na primer, ApoA-IM, koji obično postoji kao dimer sa disulfidnim mostom, može da se eksprimira kao 2 ApoA-I ekvivalenta, jer svaki molekul ApoA-IMsadrži dvaput više amfipatičnih heliksa kao molekul ApoA-I. Obrnuto, apolipoprotein peptida koji sadrži jedan amfipatični heliks može da se eksprimira kao 1/10 do 1/6 ApoA-I ekvivalent, jer svaki molekul sadrži 1/10 do 1/6 koliko mnogo amfipatičnih heliksa kao molekul ApoA-I.

[0256] Uopšteno, molarni odnos lipid: ApoA-I ekvivalent lipoproteinskih kompleksa (definisanih ovde kao "Ri") biće u opsegu od oko 2:1 do 200:1. U nekim primerima izvođenja, Ri je oko od 50:1 do 150:1, ili od 75:1 do 125:1, od 10:1 do 175:1. Maseni odnosi mogu da se dobiju upotrebom MW od približno 650-800 za fosfolipide.

[0257] U određenim primerima izvođenja, molarni odnos komponenata je 2-6 (negativno naelektrisan lipid, npr., DPPG) : 90-120 (neutralni lipid, npr., SM) : 1 (ApoA-I ekvivalenti). U specifičnom primeru izvođenja, opisan u Primeru 1, kompleks obuhvata DPPG, SM i ApoA-I u molarnom odnosu lipid prema protein od približno 108:1, sa DPPG koji predstavlja 3mas.% (+/- 1%) od ukupnog lipida i SM koji predstavlja 97mas.% (+/-5%) lipida.

[0258] Koncentracija lipidnih i proteinskih komponenata u polaznoj suspenziji pre početka termičkog cikliranja može da bude u opsegu koncentracije od 1 do 30 mg/ml ApoA-I ekvivalenata i od 1 do 100 mg/ml koncentracija lipida. U specifičnim primerima izvođenja, koncentracija proteinske komponente odabrana je od 1 do 30 mg/ml, 2 do 20 mg/ml, od 5 do 20 mg/ml, od 2 do 10 mg/ml, od 5 do 15 mg/ml, od 5 do 20 mg/ml, i od 10 do 20 mg/ml, a koncentracija lipidne komponente je nezavisno odabrana od 10 do 100 mg/ml, od 10 do 75 mg/ml, od 25 do 50 mg/ml, od 10 do 75 mg/ml, od 25 do 100 mg/ml, od 25 do 75 mg/ml, i od 1 do 75 mg/ml.

[0259] Opsezi visokih i niskih temperatura postupka termičkog cikliranja na bazi su temperatura faznog prelaza lipidnih i proteinskih komponenti lipoproteinskih kompleksa. Alternativno, gde lipidna komponenta ne pokazuje definisanu ili izolovanu faznu promenu, kao što se može dogoditi kada se koriste fosfolipidi koji imaju lance nezasićenih masnih kiselina ili mešavinu fosfolipida, opsezi visokih i niskih temperatura termičkog cikliranja razlikuju se za najmanje oko 20°C, do oko 40°C ili čak više. Na primer, u nekim primerima izvođenja, opsezi niskih i visokih temperatura razlikuju se za 20°C-30°C, 20°C-40°C, 20°C-50°C, 30°C-40°C, 30°C-50°C, 25°C-45°C, 35°C-55°C.

[0260] Za lipid, fazna promena uključuje promenu od zbijeno upakovane, uređene strukture, poznate kao gel stanje, u labavo upakovanu, manje uređenu strukturu, poznatu kao fluidno stanje.

Lipoproteinski kompleksi se obično formiraju u tehnici inkubiranjem lipidnih čestica i apolipoproteina na temperaturama blizu temperature prelaza određenog lipida ili korišćene mešavine lipida. Temperatura faznog prelaza lipidne komponente (koja može da se odredi kalorimetrijski) /- 5°C-10°C predstavlja opseg "niskih" temperatura u postupcima ovog pronalaska.

[0261] Za protein, temperatura faznog prelaza uključuje promenu od uvijene trodimnzionalne strukture u dvodimenzionalnu strukturu. Za lipid, fazna promena uključuje promenu od zbijeno upakovane, uređene strukture, poznate kao gel stanje, u labavo upakovanu, manje uređenu strukturu, poznatu kao fluidno stanje. Lipoproteinski kompleksi se obično formiraju u tehnici inkubiranjem lipidnih čestica i apolipoproteina na temperaturama blizu temperature prelaza određenog lipida ili korišćene mešavine lipida.

[0262] Temperatura faznog prelaza lipidne komponente (koja može da se odredi kalorimetrijski) /-12°C, poželjnije /- 10°C, predstavlja opseg "niskih" temperatura u postupcima ovog pronalaska. U određenim primerima izvođenja, opseg niskih temperatura je /-3°C, /-5°C, ili /-8°C temperature faznog prelaza lipidne komponente. U jednom specifičnom primeru izvođenja, opseg niskih temperatura je od ne manje od 5°C ili ne manje od 10°C ispod do 5°C iznad temperature faznog prelaza lipidne komponente.

[0263] Za protein, temperatura faznog prelaza uključuje promenu od tercijarne strukture u sekundarnu strukturu. Temperatura faznog prelaza proteinske komponente /-12°C, poželjnije /- 10°C, predstavlja opseg "visokih" temperatura u postupcima ovog pronalaska. U specifičnim primerima izvođenja, opseg visokih temperatura je /-3°C, /-5°C, ili /-8°C temperature faznog prelaza proteinske komponente. U jednom specifičnom primeru izvođenja, opseg niskih temperatura je od 10°C ispod do ne više od 5°C, ne više od 10°C, ili ne više od 15°C iznad temperature faznog prelaza proteinske komponente.

[0264] Polazna suspenzija podvrgnuta je termičkom cikliranju između visoke temperature i niske temperature, poželjno počevši na visokoj temperaturi, dok se najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% proteina u polaznoj suspenziji ne ugradi u liproteinske komplekse. Upotrebom pogodnih stehiometrijskih količina lipidnih i proteinskih komponenata, suštinski potpuno obrazovanje kompleksa lipidnih i proteinskih komponenti može se postići nakon nekoliko ciklusa. Broj ciklusa zavisiće od proteinskih i lipidnih komponenti, trajanja ciklusa, ali obično 5 ili više ciklusa, 10 ili više ciklusa, ili 15 ili više ciklusa (i na visokim i na niskim temperaturama) biće potrebno za suštinski potpuno obrazovanje kompleksa. Ciklusi su obično u opsegu od 2 minuta do 60 minuta. U specifičnim primerima izvođenja, ciklusi su u opsegu 5 do 30 minuta, od 10 do 20 minuta, od 5 do 20 minuta, od 2 do 45 minuta, ili od 5 do 45 minuta na svakoj temperaturi.

[0265] Kompleksi proizvedeni postupcima su obično supramolekularni sklopovi u obliku micela, vezikula, sferičnih ili diskoidnih čestica u kojima je proteinska komponenta fizički vezana za fosfolipide u specifičnom stehiometrijskom opsegu između fosfolipida i proteina i sa homogenom raspodelom veličina. Ovi postupci povoljno rezultuju suštinski kompletnim obrazovanjem kompleksa lipida i/ili proteina u polaznoj suspenziji, što rezultuje kombinacijom koja je suštinski bez lipida i/ili bez proteina, što je primećeno separacionim postupcima kao što je hromatografija. Tako, postupci ovog pronalaska mogu da se izvedu u odsustvu faze prečišćavanja.

[0266] Postupci ovog pronalaska povoljno proizvode komplekse koji su homogeni u njihovoj raspodeli veličina, zaobilazeći potrebu za frakcionisanjem prema veličini.

[0267] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, lipoproteinski kompleksi sadržaće više od jedne vrste lipida, uključujući jedan ili više lipida u relativno malim količinama (npr., manje od 10%, manje od 5%, manje od 3% ili manje od 1% lipidne komponente). Kako bi se optimizovala disperzija, lipidi korišćeni u malim količinama mogu da budu prethodno umešani sa proteinskom komponentom pre nego inkorporirani u lipidne čestice u lipidnoj komponenti.

[0268] Alikvot dobijenih lipoproteinskih kompleksa može da se okarakteriše kako bi se potvrdilo da kompleksi imaju željene karakteristike, npr., suštinski potpuna (npr., >90%, >95%, >97% ili >98%) inkorporacija proteinske komponente u lipidnu komponentu. Karakterizacija kompleksa može da se izvede upotrebom bilo kakvog postupka poznatog u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, filtriranje isključenjem veličina, gel filtriranje, kolonsko filtriranje, gel-propusnu hromatografiju, i ne-denaturišuću gel elektroforezu.

[0269] Homogenost i/ili stabilnost lipoproteinskih kompleksa ili kombinacije opisanih ovde može da se izmeri bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, hromatografske postupke kao što je gel-filtraciona hromatografija. Na primer, u nekim primerima izvođenja jedan pik ili ograničen broj pikova može da se poveže sa stabilnim kompleksom. Stabilnost kompleksa može da se odredi praćenjem pojave novih pikova tokom vremena. Pojava novih pikova je znak reorganizacije među kompleksima zbog nestabilnosti čestica.

[0270] Poželjno, kako bi se minimizirala oksidacija proteinskih i lipidnih komponenti, termičko cikliranje izvodi se pod slojem nekog inertnog gasa (npr.,azot, argon ili helijum).

5.5.5. Ostali postupci izrade lipoproteinskih kompleksa

[0271] Lipoproteinski kompleksi opisani ovde, uključujući negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse, mogu da se pripreme u različitim oblicima, uključujući ali neograničavajući se na vezikule, lipozome, proteolipozome, micele, i diskoidne čestice. Pored postupaka termičkog cikliranja opisanih gore, različiti postupci poznati prosečnim stručnjacima u tehnici mogu da se koriste za pripremu lipoproteinskih kompleksa. Različite tehnike za pripremu lipozoma ili proteolipozoma mogu da se koriste. Na primer, apolipoprotein može biti ko-sonikovan (upotrebom ultrasoničnog kupatila ili ultrasonične sonde) sa odgovarajućim fosfolipidima kako bi se formirali kompleksi. Alternativno, apolipoprotein, npr., ApoA-I, može da se kombinuje sa izvedenom lipidnim vezikulama što rezultuje spontanim formiranjem lipoproteinskih kompleksa. Lipoproteinski kompleksi takođe mogu da se formiraju postupkom dijalize deterdženta; npr., mešavina apolipoproteina, naelektrisan fosfolipid(i), i SM i deterdžent kao što je holat dijalizuje se kako bi se uklonio deterdžent i rekonstituiše kako bi se formirali negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi (videti, npr., Jonas et al., 1986, Methods in Enzymol.128:553-82), ili upotrebom uređaja za izvlačenje ili homogenizacijom.

[0272] U nekim primerima izvođenja, kompleksi se pripremaju homogenizacijom upotrebom visokog pritiska (npr., oko 32000 p.s.i.) za oko 40, oko 50, ili oko 60 minuta. U specifičnom primeru izvođenja, kompleks koji obuhvata ApoA-I, SN, i DPPG priprema se kao što sledi. ApoA-I se rastvara u fosfatnom puferu i inkubira na 50°C sa disperzijom DPPG u fosfatnom puferu izrađenom upotrebom mešača sa velikim smicajnim silama. ApoA-I/ DPPG mešavina se zatim kombinuje sa disperzijom SM, i homogenizuje na pritiscima preko 30.000 p.s.i. na 30-50 °C dok se formiranje kompleksa suštinski ne završi, kako je praćeno dinamičkim rasipanjem svetlosti ili gel-propusnom hromatografijom.

[0273] U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleksi mogu da se pripreme postupkom disperzije holata opisanim u Primeru 1 iz U.S. objave 2004/0067873. Ukratko, suvi lipid se hidratizuje u NaHCO3puferu, zatim se vorteksuje i sonikuje dok se sav lipid ne disperguje. Rastvor holata se dodaje, mešavina se inkubira tokom 30 minuta, periodičnim vorteksovanjem i sonikacijom, dok se ne izbistri, što ukazuje da su formirane lipidne holatne micele. Dodaje se ProApoA-I u NaHCO3puferu, i rastvor se inkubira tokom 1 sata na približno 37°C-50°C.

[0274] Holat može da se ukloni postupcima koji su dobro poznati u tehnici. Na primer holat može da se ukloni dijalizom, ultrafiltracijom ili uklanjanjem holatnih molekula apsorpcijom sa adsorpcijom na afinitetnim perlama ili smoli. U jednom primeru izvođenja, afinitetne perle, npr., BIO-BEADS® (Bio-Rad Laboratories) dodaju se preparatu negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa i holatu kako bi se adsorbovao holat. U nekom drugom primeru izvođenja, preparat, npr., micelarni preparat lipoproteinskih kompleksa i holata, propušta se kroz kolonu upakovanu sa afinitetnim perlama.

[0275] U specifičnom primeru izvođenja, holat se uklanja iz preparata lipoproteinskih kompleksa punjenjem preparata na BIO-BEADS® unutar šprica. Špric se zatim zaptiva barijernim filmom i inkubira uz mućkanje na 4°C preko noći. Pre upotrebe, holat se uklanja injektiranjem rastvora kroz BIO-BEADS®, gde se adsorbuje od strane perli.

[0276] Očekuje se da će lipoproteinski kompleksi, kao što su negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi opisani ovde, imati povećan poluživot u cirkulaciji kada kompleksi imaju sličnu veličinu i gustinu sa HDL, naročito sa HDL u pre-beta-1 ili pre-beta-2 HDL populacijama. Stabilni preparati koji imaju dug rok trajanja mogu da se izrade liofilizacijom. U nekim primerima izvođenja, postupci koliofilizacije obično poznati u tehnici koriste se za pripremu ApoA-I-lipidnih kompleksa. Ukratko, faze koliofilizacije uključuju ili rastvaranje mešavine ApoA-I i lipida u organskom rastvaraču ili mešavini rastvarača, ili rastvaranje ApoA-I i lipida odvojeno i njihovo mešanje. Poželjne karakteristike rastvarača ili mešavina rastvarača za ko-liofilizaciju uključuju: (i) relativnu polarnost sredine kako bi mogli da se rastvore hidrofobni lipidi i amfipatični protein, (ii) rastvarače klase 2 ili klase 3 prema FDA smernicama za rastvarače (Federal Register, tom 62, br.247) kako bi se izbegla moguća toksičnost povezana sa zaostalim organskim rastvaračem, (iii) niska temperatura ključanja kako bi se osiguralo lako uklanjanje rastvarača tokom liofilizacije, (iv) visoka temperatura topljenja kako bi se postiglo brže zamrzavanje, više temperature kondenzacije i manje habanje i kidanje na sušaču zamrzavanjem. U nekim primerima izvođenja, koristi se glacijalna sirćetna kiselini. Kombinacije metanola, glacijalne sirćetne kiseline, ksilena, ili cikloheksana mogu takođe da se koriste.

[0277] ApoA-I-lipidni rastvor se zatim liofilizuje kako bi se dobio homogeni prašak. Uslovi liofilizacije mogu da se optimizuju kako bi se dobilo brzo isparavanje rastvarača sa minimalnom količinom zaostalog rastvarača u liofilizovanom apolipoprotein-lipid prašku. Odabir uslova sušenja zamrzavanjem može da se odredi od strane prosečnog stručnjaka, zavisno od prirode rastvarača, vrste i dimenzija prijemnika, držećeg rastvora, zapremine punjenja, i karakteristika korišćenog sušača zamrzavanjem.

[0278] Liofilizovani lipoproteinski kompleksi mogu da se koriste da bi se pripremile zalihe mase za farmaceutsku reformulaciju, ili da bi se pripremili pojedinačni alikvoti ili dozne jedinice koje mogu da se rekontituišu kako bi se dobio rastvor ili suspenzija lipoproteinskih kompleksa. Za rekonstituciju, liofilizovan prašak je rehidratizovan vodenim rastvorom do odgovarajuće zapremine (npr.,5 mg polipeptid/ml, što je pogodno za intravenoznu injekciju). U nekim primerima izvođenja, liofilizovan prašak je rehidratizovan sa puferovanim slanim rastvorom fosfata ili fiziološkim slanim rastvorom. Mešavine mogu da se mešaju ili vorteksuju kako bi se olakšala rehidratacija. Faza rekonstitucije može da se izvodi na temperaturi jednakoj ili većoj od temperature faznog prelaza lipidne komponente kompleksa.

[0279] ApoA-I-lipidni kompleksi mogu da se formiraju spontano nakon hidratacije liofilizovanog apolipoprotein-lipid praška sa vodenom sredinom odgovarajućeg pH i osmolaliteta. U nekim primerima izvođenja, sredina hidratacije sadrži stabilizatore odabrane od, ali ne ograničavajući se na, saharoze, trehaloze i glicerina. U nekim primerima izvođenja, rastvor se zagreva nekoliko puta iznad temperature prelaza lipida u redosledu u kom se formiraju kompleksi. Odnos lipid prema protein može da bude od 1:1 do 200:1 (mol/mol), i poželjno je 3:1 do 2:1 lipid:protein (masa/masa), poželjnije 2,7:1 do 2,1:1 lipid:protein (masa/masa), npr., 2,7:1 lipid:protein (masa/masa). Prašak je hidratizovan kako bi se dobila krajnja koncentracija kompleksa od 5-30 mg/ml izražena u ekvivalentima proteina.

[0280] U raznim primerima izvođenja, ApoA-I prašak može da se dobije sušenjem zamrzavanjem rastvora polipeptida u vodenom rastvoru NH4HCO3. Homogeni rastvor ApoA-I i lipida (npr., sfingomijelin) zatim se formira rastvaranjem lipidnog praška i ApoA-I praška u glacijalnoj sirćetnoj kiselini. Rastvor se zatim liofilizuje, i HDL-slični apolipoprotein-lipid kompleksi formiraju se hidratacijom dobijenog praška u vodenoj sredini.

[0281] U nekim primerima izvođenja, ApoA-I-lipid kompleksi formiraju se ko-liofilizacijom rastvora ili suspenzija fosfolipida i proteina. Homogeni rastvor ApoA-I i lipida (npr., fosfolipidi) u organskom rastvaraču ili mešavini organskih rastvarača je liofilizovan, i ApoA-I-lipid kompleksi zatim se formiraju spontano hidratacijom liofilizovanog praška u vodenom puferu. Primeri organskih rastvarača i mešavina rastvarača za upotrebu u ovom postupku uključuju, ali nisu ograničeni na, sirćetnu kiselinu, mešavinu sirćetna kiselina/ksilen, mešavinu sirćetna kiselina/cikloheksan, i mešavinu metanol/ksilen.

[0282] Alikvot dobijenih rekonstituisanih preparata može da se karakteriše kako bi se potvrdilo da kompleksi imaju željenu raspodelu veličina; npr., raspodela veličina HDL. Primer postupka za karakterizaciju veličine je gel-filtraciona hromatografija. Serije proteina poznate molekulske mase i Stokesovog prečnika, kao i humani HDL, mogu da se koriste kao standardi za kalibrisanje kolone.

[0283] U ostalim primerima izvođenja, rekombinantni ApoA-I-lipid kompleksi izrađuju se obrazovanjem kompleksa ApoA-I sa lipidima opisanim u U.S. objavi patenta br.2006/0217312 i međunarodnoj objavi br. WO 2006/100567 (PCT/IB2006/000635).

[0284] U.S. Pat. br.6,004,925, 6,037,323, 6,046,166 i 6,287,590 opisuju jednostavan postupak za pripremu negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa koji imaju dve karakteristike slične sa HDL. Ovaj postupak, koji uključuje ko-liofilizaciju rastvora apolipoproteina i lipida u organskom rastvaraču (ili mešavinama rastvarača) i formiranje negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa tokom hidratacije liofilizovanog praška, ima sledeće prednosti: (1) postupak zahteva veoma malo faza; (2) postupak koristi rastvarač(e) koji nisu skupi; (3) većina ili svi uključeni sastojci koriste se za formiranje dizajniranih kompleksa, čime se izbegava gubitak polaznog materijala što je česta pojava kod drugih postupaka; (4) formiraju se liofilizovani kompleksi koji su veoma stabilni tokom čuvanja tako da dobijeni kompleksi mogu da se rekonstituišu neposredno pre upotrebe; (5) dobijeni kompleksi obično ne treba dalje da se prečišćavaju nakon formiranja i pre upotrebe; (6) toksična jedinjenja, uključujući deterdžente kao što je holat, su izbegnuta; i (7) može lako da se poveća razmera proizvodnog postupka i pogodan je za GMP proizvodnju (tj., u sredini bez endotoksina).

[0285] Ostali pogodni postupci opisani su u US objavljenoj prijavi br.2006/0217312 i međunarodnoj objavi WO 2006/100567(PCT/IB 2006/000635).

[0286] Poželjno, kako bi se minimizirala oksidacija proteinskih i lipidnih komponenti, jedna, više od jedne ili sve faze obrazovanja kompleksa izvode se pod nekim slojem inertnog gasa (npr., azot, argon ili helijum).

[0287] Koncentracija proteina i lipida apolipoprotein-lipidnih čestica u rastvoru može da se izmeri bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, testove proteina i fosfolipida, hromatografske postupke kao što je HPLC, gel filtriranje, GC kuplovan sa raznim detektorima uključujući masenu spektroskopiju, UV ili diodni-niz, fluorescentno, elastično rasipanje svetlosti i ostalo. Integritet lipida i proteina takođe može da se odredi istim hromatografskim tehnikama kao i mapiranje peptida, SDS-page gel elektroforeza, N- i C-terminalno sekvenciranje ApoA-I, i standardni testovi za određivanje lipidne oksidacije.

5.6. Farmaceutske kombinacije

[0288] Farmaceutske kombinacije razmatrane ovim pronalaskom obuhvataju negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse kao aktivni sastojak u farmaceutski prihvatljivom nosaču pogodnom za davanje i isporuku in vivo. Budući da peptidi mogu da obuhvataju kisele i/ili bazne krajeve i/ili bočne lance, apolipoproteini peptidnog mimetika mogu da budu uključeni u kombinacije ili u obliku slobodnih kiselina ili baza, ili u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Modifikovani proteini kao što su amidirani, acilovani, acetilovani ili pegilovani proteini, mogu takođe da se koriste. Opciono, farmaceutske kombinacije mogu da obuhvataju lipoproteinske komplekse napunjene sa jednim ili više hidrofobnih, lipofilnih, ili nepolarnih aktivnih agenasa, kao što je opisano gore u odeljcima 5.2 i 5.3.

[0289] Injektibilne kombinacije uključuju sterilne suspenzije, rastvore ili emulzije aktivnog sastojka u vodenim ili uljanim nosačima. Kombinacije mogu takođe da obuhvataju agense za formulisanje, kao što su suspendujući, stabilišući i/ili dispergujući agens. U nekim primerima izvođenja, injektibilna kombinacija obuhvata negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse u puferovanom slanom rastvoru fosfata (10 mM natrijum fosfat, 80 mg/mL saharoza, pH 8,2). Kombinacije za injekciju mogu da budu prisutne u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama ili u višedoznim kontejnerima, i mogu da obuhvataju dodate konzervanse. Za infuziju, kombinacija može da se isporuči u infuzionoj vreći izrađenoj od materijala koji je kompatabilan sa negativno naelektrisanim lipoproteinskim kompleksima, kao što je etilen vinil acetat ili bilo koji drugi kompatabilan materijal poznat u tehnici.

[0290] Pogodni dozni oblici obuhvataju negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse u krajnjoj koncentraciji od oko 5 mg/mL do oko 15 mg/mL lipoproteina. U specifičnom primeru izvođenja, dozni oblik obuhvata negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse u krajnjoj koncentraciji od oko 8 mg/mL do oko 10 mg/mL apolipoproteina A-I, poželjno oko 8 mg/mL.

[0291] Poželjno, kako bi se minimizirala oksidacija proteinskih i lipidnih komponenata, farmaceutske kombinacije se formulišu i/ili pune pod slojem nekog inertnog gasa (npr., azot, argon ili helijum).

5.7. Postupci lečenja

[0292] Lipoproteinski kompleksi, npr., negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi, i kombinacije opisani ovde mogu da se koriste praktično za svaku svrhu za koju se pokazalo da su lipoproteinski kompleksi korisni. Lipoproteinski kompleksi, kao što su negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi, efikasni su u mobilizaciji holesterola, čak i kada se daju u dozama značajno manjim od količina apolipoproteina (20 mg/kg do 100 mg/kg po davanju svaka 2 do 5 dana, 1,4 g do 8 g po čoveku prosečne veličine) koje su potrebne za trenutno dostupne režime lečenja.

[0293] Kao posledica toga, kompleksi i kombinacije ovog pronalaska naročito su korisni za lečenje ili sprečavanje kardiovaskularnih bolesti, poremećaja, i/ili povezanih stanja. Postupci lečenja ili sprečavanja neke kardiovaskularne bolesti, poremećaja, i/ili povezanog stanja kod subjekta uopšteno obuhvataju davanje subjektu male (<15 mg/ kg) doze ili količine lipoproteinskog kompleksa ili farmaceutske kombinacije opisane ovde prema režimu efikasnom za lečenje ili sprečavanje određene indikacije.

[0294] Lipoproteinski kompleksi daju se u količini dovoljnoj ili efikasnoj da obezbedi terapeutsku korist. U kontekstu lečenja neke kardiovaskularne bolesti, poremećaja, i/ili povezanog stanja, terapeutska korist može se zaključiti ako dođe do pojave jednog ili više od sledećih: povećanje mobilizacije holesterola u poređenju sa osnovnom linijom, smenjenja zapremine aterosklerotičnog plaka, porasta lipoproteinske (HDL) frakcije visoke gustine slobodnog holesterola u poređenju sa nivoem osnovne linije, bez porasta srednje koncentracije plazmatičnog triglicerida ili porasta iznad nivoa normalnog opsega transaminaza jetre (ili alanin aminotransferaza). Potpuno izlečenje, dok je poželjno, nije neophodno za postojanje terapeutske koristi.

[0295] U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleks se daje u dozi od oko 2 mg/kg ApoA-I ekvivalenata do oko 12 mg/kg ApoA-I ekvivalenata po injekciji. U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleks daje se u dozi od oko 3 mg/kg ApoA-I ekvivalenata. U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleks daje se u dozi od oko 6 mg/kg ApoA-I ekvivalenata. U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleks daje se u dozi od oko 12 mg/kg ApoA-I ekvivalenata.

[0296] Subjekti koji će se lečiti su pojedinci koji pate od, ili kod kojih treba sprečiti, kardiovaskularnu bolest, poremećaj, i/ili povezano stanje. Neograničavajući primeri takvih kardiovaskularnih bolesti, poremećaja i/ili povezanih stanja koji mogu da se leče ili spreče sa lipoproteinskim kompleksima i kombinacijama opisanim ovde uključuju, perifernu vaskularnu bolest, restenozu, aterosklerozu, i mnoštvo kliničkih manifestacija ateroskleroze, kao što je, na primer, šlog, ishemijski šlog, prolazni ishemijski napad, infarkt mijokarda, akutni koronarni sindrom, angina pektoris, intermitentna klaudikacija, kritična ishemija ekstremiteta, stenoza zalistaka, i skleroza zalistaka aorte. Subjekti mogu biti pojedinci sa prethodnom incidencom akutnog koronarnog sindroma, kao što je infarkt mijokarda (ili sa ili bez ST elevacije) ili nestabilna angina. Tretiran subjekt može da bude bilo koja životinja, na primer, sisar, naročito čovek.

[0297] U jednom primeru izvođenja, postupci obuhvataju postupak lečenja ili sprečavanja neke kardiovaskularne bolesti, koji obuhvata davanje subjektu nekog naelektrisanog lipoproteinskog kompleksa ili kombinaciju opisane ovde u količini koja ne menja osnovni ApoA-I pacijenta nakon davanja.

[0298] U ostalim primerima izvođenja, postupci obuhvataju postupak lečenja ili sprečavanja neke kardiovaskularne bolesti, koji obuhvata davanje subjektu nekog lipoproteinskog kompleksa (npr., neki naelektrisan kompleks) ili kombinacije opisane ovde u količini koja je efikasna da se postigne serumski nivo slobodnog ili kompleksiranog apolipoproteina viši od osnovnog (početnog) nivoa pre davanja za oko 5 mg/dL do 100 mg/dL približno dva sata nakon davanja i/ili za oko 5 mg/dL do 20 mg/dL približno 24 sata nakon davanja.

[0299] U nekom drugom primeru izvođenja, postupci obuhvataju postupak lečenja ili sprečavanja neke kardiovaskularne bolesti, koji obuhvata davanje subjektu nekog lipoproteinskog kompleksa (npr., neki naelektrisan kompleks) ili kombinacije opisane ovde u količini koja je efikasna da se postigne cirkulišuće plazmatične koncentracije HDL-holesterol frakcije za najmanje jedan dan nakon davanja koja je najmanje oko 10% veća od početne HDL-holesterol frakcije pre davanja.

[0300] U nekom drugom primeru izvođenja, postupci obuhvataju postupak lečenja ili sprečavanja neke kardiovaskularne bolesti, koji obuhvata davanje subjektu nekog lipoproteinskog kompleksa (npr., neki naelektrisan kompleks) ili kombinacije opisane ovde u količini koja je efikasna da se postigne cirkulišuća plazmatična koncentracija HDL-holesterol frakcije koja je između 30 i 300 mg/dL između 5 minuta i 1 dana nakon davanja.

[0301] U nekom drugom primeru izvođenja, postupci obuhvataju postupak lečenja ili sprečavanja neke kardiovaskularne bolesti, koji obuhvata davanje subjektu nekog lipoproteinskog kompleksa (npr., neki naelektrisan kompleks) ili kombinacije opisane ovde u količini koja je efikasna da se postigne cirkulišuća plazmatična koncentracija holesteril estara koaj je između 30 i 300 mg/dL između 5 minuta i 1 dana nakon davanja.

[0302] U još nekom drugom primeru izvođenja, postupci obuhvataju postupak lečenja ili zaštite od neke kardiovaskularne bolesti, koji obuhvata davanje subjektu nekog lipoproteinskog kompleksa (npr., neki naelektrisan kompleks) ili kombinacije opisane ovde u količini koja je efikasna da se postigne povećanje fekalnog izlučivanja holesterola za najmanje jedan dan nakon davanja koje je najmanje oko 10% iznad osnovnog (početnog) nivoa pre davanja.

[0303] Lipoproteinski kompleksi, uključujući negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse, ili kombinacije opisane ovde mogu da se koriste sami ili u kombinovanoj terapiji sa ostalim lekovima korišćenim za lečenje ili sprečavanje gore navedenih stanja. Takve terapije uključuju, ali nisu ograničene na, istovremeno ili sekvencijalno davanje uključenih lekova. Na primer, u lečenju hiperholesterolemije, kao što je familijarna hiperholesterolemija (homozigotna ili heterozigotna) ili ateroskleroza, formulacije naelektrisanih lipoproteina mogu da se daju sa jednom ili više terapija za spuštanje holesterola koje su u tom trenutku koriste; npr., smole žučnih kiselina, niacin, statini, inhibitori apsorpcije holesterola i/ili fibrati. Takav kombinovani režim može da proizvede naročito korisne terapeutske efekte budući da svaki lek deluje na različitu metu u sintezi i transportu holesterola; tj., smole žučnih kiselina deluju na recikliranje holesterola, hilomikron i LDL populaciju; niacin primarno deluje na VLDL i LDL populaciju; statini inhibiraju sintezu holesterola, smanjenje LDL populacije (i možda povćanje ekspresije LDL receptora); dok lipoproteinski kompleksi, uključujući negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse, opisani ovde, deluju na RCT, povećanje HDL, i promovisanje efluksa holesterola.

[0304] U nekom drugom primeru izvođenja, lipoproteinski kompleksi, uključujući negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse, ili kombinacije opisane ovde mogu da se koriste u vezi sa fibratima za lečenje ili sprečavanje koronarne bolesti srca; koronarne arterijske bolesti; kardiovaskularne bolesti, restenoze, vaskularnih ili perivaskularnih bolesti; ateroskleroze (uključujući lečenje i prevenciju ateroskleroze); Primeri režima formulacije i lečenja opisani su dole.

[0305] Lipoproteinski kompleksi, uključujući negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse, ili kombinacije opisane ovde mogu da se daju u dozama koje povećavaju malu HDL frakciju, na primer, prebeta, pre-gama i pre-beta-poput HDL frakciju, alfa HDL frakciju, HDL3 i/ili HDL2 frakciju. U nekim primerima izvođenja, doze su efikasne kako bi se postiglo smanjenje aterosklerotičnog plaka kako je izmereno, na primer, tehnikama imidžinga kao što je magnetna rezonatna tomografija (MRI) ili intravaskularni ultrazvuk (IVUS). Parametri za praćenje pomoću IVUS uključuju, ali nisu ograničeni na, promenu procenta zapremine ateroma od osnovne linije i promenu ukupne zapremine ateroma.

Parametri za praćenje pomoću MRI uključuju, ali nisu ograničeni na, one za IVUS i sastav lipida i kalcifikaciju plaka.

[0306] Regresija plaka može da se izmeri upotrebom pacijenta kao sopstvene kontrole (nulto vreme versus vreme t na kraju poslednje infuzije, ili unutar nedelja nakon poslednje infuzije, ili u okviru 3 meseca, 6 meseca, ili 1 godine nakon početka terapije.

[0307] Davanje može najbolje da se postigne parenteralnim putevima davanja, uključujući intravenozne (IV), intramuskularne (IM), intradermalne, subkutane (SC), i intraperitonealne (IP) injekcije. U određenim primerima izvođenja, davanje je pomoću perfuzora, infiltratora ili katetera. U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleksi, npr., negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi, daju se injekcijom, pomoću pumpe koja može da se supkutano implantira ili pripremom depoa, u količinama koje postižu cirkulišuću serumsku koncentraciju jednaku onoj dobijenoj parenteralnim davanjem. Kompleksi takođe mogu da se apsorbuju u, na primer, stentu ili nekom drugom sredstvu.

[0308] Davanje može da se postigne različitim režimima tretmana. Na primer, nekoliko intravenoznih injekcija može da se daje periodično tokom jednog dana, sa kumulativnom ukupnom zapreminom injekcija koja ne prelazi dnevnu toksičnu dozu. Postupci obuhvataju davanje lipoproteinskog kompleksa u intervalu od 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 dana. U nekim primerima izvođenja, lipoproteinski kompleks daje se u intervalu od jedne nedelje.

[0309] Postupci mogu dalje da obuhvataju davanje lipoproteinskog kompleksa 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 puta u bilo kom od intervala opisanih gore. Na primer, u jednom primeru izvođenja, lipoproteinski kompleks daje se šest puta, sa intervalom od 1 nedelje između svakog davanja. U nekim primerima izvođenja, davanje može da se izvede kao serije injekcija i zatim zaustavi tokom 6 meseci do 1 godine, i zatim druge serije počinju. Serije injekcija za održavanje mogu onda da se daju svake godine ili svake 3 do 5 godina. Serije injekcija mogu da se obave tokom jednog dana (perfuzija radi održavanja određenog plazmatičnog nivoa kompleksa), nekoliko dana (npr., četiri injekcije tokom perioda od osam dana) ili nekoliko nedelja (npr., četiri injekcije tokom perioda od četiri nedelje), i zatim ponovno pokretanje nakon šest meseci do godine. Za hronična stanja, davanje može da se izvodi na stalnoj osnovi. Opciono, postupcima može da prethodi indukciona faza, kada se lipoproteinski kompleksi daju češće.

[0310] U još nekoj drugoj alternativi, eskalirajuća doza može da se daje, počevši sa oko 1 do 5 doza u dozi između (50-200 mg) po davanju, zatim praćeno ponovljenim dozama između 200 mg i 1 g po davanju. Zavisno od potreba pacijenata, davanje može da bude sporom infuzijom sa trajanjem više od jednog sata, brzom infuzijom od jednog sata ili manje, ili jednom bolusnom injekcijom.

[0311] Toksičnost i terapeutska efikasnost različitih lipoproteinskih kompleksa može da se odredi upotrebom standardnih farmaceutskih procedura u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama za određivanje LD50 (doza letalna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efektivna u 50% populacije). Dozni odnos između toksičnih i terapeutskih efekata je terapeutski indeks i može da se eksprimira kao odnos LD50/ED50. Lipoproteinski kompleksi, kao što su negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi, koji imaju velike terapeutske indekse su poželjni. Neograničavajući primeri parametara koji mogu da se prate uključuju funkciju transaminaza jetre (ne više od 2X normalnih osnovnih nivoa). Ovo je indikacija da se previše holesterola dovodi u jetru i ne može da asimilira takvu količinu. Efekat na crvena krvna zrnca takođe može da se prati, jer mobilizacija holesterola iz crvenih krvnih zrnaca izaziva da postanu krhke, ili utiče na njihov oblik.

[0312] Pacijenti mogu da se tretiraju od nekoliko dana do nekoliko nedelja pre medicinskog čina (npr., preventivni tretman), ili tokom ili nakon medicinskog čina. Davanje može da bude istovremeno sa ili paralelno sa drugom invazivnom terapijom, kao što je, angioplastika, karotidna ablacija, rotoblator ili transplant organa (npr., srce, bubreg, jetra, itd.).

[0313] U određenim primerima izvođenja, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi daju se pacijentu čija je sinteza holesterola kontrolisana statinom ili nekim inhibitorom sinteze holesterola. U ostalim primerima izvođenja, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi daju se pacijentu koji je podvrgnut tretmanu sa nekom vezujućom smolom, npr. semi-sintetička smola kao što je holestiramin, ili sa nekim vlaknom, npr., biljno vlakno, kako bi se zarobile žučne soli i holesterol, kako bi se povećalo izlučivanje žučne kiseline i smanjile koncentracije holesterola u krvi.

5.8. Ostale upotrebe

[0314] Lipoproteinski kompleksi, npr., negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi, i kombinacije opisane ovde mogu da se koriste u testovima in vitro kako bi se merio serumski HDL, npr., za dijagnostičke svrhe. Zato što se ApoA-I, ApoA-II i Apo peptidi povezuju sa HDL komponentom seruma, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi mogu da se koriste kao "markeri" za HDL populaciju, i pre-betaI i pre-beta2 HDL populacije. Štaviše, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi mogu da se koriste kao markeri za podpopulaciju HDL koji su efikasni u RCT. Za ovu svrhu, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi mogu da se dodaju ili umešaju sa serumskim uzorkom pacijenta; nakon odgovarajućeg vremena inkubacije, HDL komponenta može da se testira detektovanjem inkorporiranih negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa. Ovo može da se postigne upotrebom obeleženih negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa (npr., radioobeleživači, fluorescentni obeleživači, enzimski obeleživači, boje, itd.), ili imunotestovima upotrebom antitela (ili fragmenata antitela) specifičnih za negativno naelektrisane lipoproteinske komplekse.

[0315] Alternativno, obeleženi negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi mogu da se koriste u procedurama imidžinga (npr., CAT skenovi, MRI skenovi) kako bi se vizuelizovao cirkulišući sistem, ili kako bi se pratio RCT, ili kako bi se vizuelizovala akumulacija HDL u masnim prugama, aterosklerotične lezije, i slično, gde HDL treba da je aktivan u efluksu holesterola.

[0316] Primeri i podaci povezani sa pripremom i karakterizacijom određenih proApoA-I-lipid kompleksa opisani su u U.S. objavi patenta br.2004/0067873.

[0317] Podaci dobijeni u sistemu životinjskog modela upotrebom određenih proApoA-I-lipidnih kompleksa opisani su u U.S. objavi patenta br.2004/0067873.

6. PRIMER 1: RAZVOJ SISTEMA APOA-I EKSPRESIJE

6.1. Kloniranje i ekspresija humanog ApoA-I u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO)

6.1.1. Priprema ApoA-I ekspresionog vektora

[0318] PreproApoA-I genska sekvenca dobijena je iz NCBI (P02647) i flankirajuće sekvence dodate su za lako kloniranje i poboljšanu ekspresiju. DNK koja kodira preproApoA-I sa flankirajućim sekvencama sintetizovana je i klonirana u Bluescript KS+ vektoru.5' flankirajuća sekvenca sadržala je optimizovanu Kozak translacionu sekvencu. PreproApoA-I umetak odsečen je od Bluescript KS+ vektora sa Hind III i Bgl II restrikcionim enzimima. Ovaj fragment bio je gel-prečišćen i ligiran u retrovirusni ekspresioni vektor koji nosi sledeće genetske elemente: humani citomegalovirusni promoter fuziran sa 5' LTR Moloney mišjeg virusa sarkoma, region pakovanja MoMuLV/SV, neposredno rani majmunski citomegalovirusni promoter, mesto multikloniranja, 3' LTR iz MoMuLV, i bakterijsko poreklo replikacije i gen za betalaktamazu. Klonovi dobijenog konstrukta su sekvencirani preko genskih i flankirajućih regiona. Krajnji klon (klon #17) odabran je na osnovu podudarnosti sa predviđenom DNK sekvencom. Retrovektor zatim je pripremljen za transdukciju upotrebom 293GP ćelija ko-transfektovanih sa plazmidom ekspresije za virus vezikularnog stomatitisa koji obuhvata glikoprotein. Supernatant izveden iz ko-transfektovanih ćelija i koncentrovan korišćen je za CHO-S transdukcionu fazu opisanu dole u odeljku 6.1.2.

6.1.2. Proizvodnja ćelijske linije sisara za ekspresiju ApoA-I

[0319] Ćelije jajnika kineskog hrčka prilagođene za uzgoj u podlozi bez seruma (CHO-S) podvrgnute su sa tri runde transdukcije (IX, 2X, i 3X) upotrebom retrovirusnog vektora opisanog gore u odeljku 6.1.1. Udružena populacija proširena je za krioprezervaciju nakon svake transdukcije i uzorak ćelija predat je na analizu genske kopije. Indeks genske kopije prikazan je dole u Tabeli 2.3X transduktovana ćelijska linija analizirana je za produktivnost u testu prihranjivane šarže od 16-dana u duplim bocama od 125 mL. Rezultati su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3

6.1.3. Stabilnost ćelijske linije koja eksprimira ApoA-I

[0320] Ne-GMP karakterizaciona studija izvedena je na CHO-S-ApoA-I-R (3X) klonu, 17, banka glavnih ćelija koje proizvode ApoA-I, u cilju procene njegove stabilnosti u vijabilnosti, brzine rasta, očuvanja genskih umetaka, i doslednog izlučivanja proizvoda tokom dugotrajne kulture.

[0321] Ćelijska linija je odmrznuta iz banke glavnih ćelija i kultivisana u mučkajućim bocama od 125 mL upotrebom PF CHO LS podloge (HyClone, Logan UT). Ćelije su kontinuirano kultivisane serijskom pasažom od generacije 0 do generacije 43. Uzorci generacija 4, 8, 14, 19, 25, 31, 36 i 43 ćelija zamrznuti su. Na kraju kultivisanja, uzorci ćelija iz svih generacija odmrznuti su i korišćeni za sprovođenje terminalne kulture kako bi se uporedila proizvodnja ApoA-I proteina ćelijske linije u različitim generacijama u istom eksperimentu. Supernatant iz svakog od uzoraka ispitivan je dana 12 upotrebom reverzno-fazne HPLC analize kako bi se odredio nivo ApoA-I proizvodnje. Otkriveno je da ApoA-I koncentracija varira od 1259 mg/L do 1400 mg/L za različite uzorke (FIG.2).

[0322] Kako bi se uporedila stabilnost genskih umetaka, uzorci CHO ćelija u generacijama 0, 4, 14, 25, 36 i 43 korišćene su za DNK izolovanje. Broj genetičkih umetaka za svaki uzorak određen je upotrebom PCR u stvarnom vremenu na genomsku DNK. Kao što je prikazano u Tabeli 3, PCR-bazirani indeksi broja kopija nisu se značajno razlikovali na osnovu standardnih devijacija preklapanja između generacije 0 i generacije 43. Otkriveno je da su proizvodnja ApoA-I i vrednosti indeksa genske kopije iz ćelijske linije banke glavnih ćelija stabilni kod 43 testirane generacije.

Tabela 4

6.2. Ćelijski rast i prikupljanje ApoA-I

6.2.1. Povećavanje razmera inokuluma i proizvodnja u bioreaktoru od 200 L

[0323] Bočica sa CHO-S ćelijama stabilno transfektovanih sa humanim ApoA-I genom iz banke glavnih ćelija odmrznuta je u vodenom kupatilu na 37°C i dodate su u jednu mućkajuću bocu (250 mL) (Thermo Fisher Scientific) koja sadrži 35 mL podloge za kulturu ćelija HyQ PF-CHO LS. Inicijalni broj ćelija, određen upotrebom hemacitometra, bio je 2,48 x 10<5>ćelija/mL i vijabilnost od 93,8%. Kultura je zatim postavljena na Orbit šejker (90 o/min) u inkubatoru održavanom na 37°C u vlažnoj sredini sa 5% CO2. Faze subkultivisanja ciljale su gustine inokulacije od približno 1,6 x 10<5>ćelija/mL. Dana 4 broj ćelija i procenat vijabilnosti u boci bio je 15,01 x 10<5>ćelija/mL sa vijabilnošću od 93,9%. Boca od 250 mL je subkultivisana u boci od 1 L. Dana 3 prosečan broj vijabilnih ćelija iz boce od 1 L bio je 13,56 x

10<5>ćelija/mL sa vijabilnošću od 95,3%. Boca od 1 L je subkultivisana u Wave Bioreactor System 20EH sa 10 L jednokratnom Wave Bag (GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp, Somerset, NJ) u početnoj zapremini kulture i početnoj gustina ciljnih ćelija od 1000 mL i 1,75 x 10<5>ćelija/mL, respektivno. Radne postavke Wave Bioreactor bile su temperatura inkubacije od 37°C, brzina ljuljanja od 15,0 cpm, ugao ljuljanja od 10,9°, i koncentracija CO2od 5,0% u gasu za aeraciju sa protokom gasa od 0,25 L/minuti. Nakon 3 dana kultivisanja, gustina vijabilnih ćelija u Wave Bag bila je 10,73X10<5>ćelija/mL, i sveža HyQ PF-CHO LS je dodata što je dovelo zapreminu kulture do 5000 mL. Nakon dodatna tri dana, gustina vijabilnih ćelija bila je 13,25 x 10<5>ćelija/mL, a zapremina u Wave Bag preneta je u bioreaktor od 30 L. Radna podešavanja u bioreaktoru od 30 L za temperaturu, pH, rastvoren kiseonik, pritisak, i brzinu agitacije bila su 37°C, pH 7,0, 40% zasićenje vazduhom, 1 psig pritisak, i brzina agitacije 50 o/min, respektivno.

[0324] Gustina vijabilnih ćelija u bioreaktoru od 30 L bila je 10,80 x 10<5>ćelija/mL trećeg dana kultivisanja, što je bilo dovoljno da se inokuliše bioreaktor od 200 L u početnoj ciljnoj gustini od 2,40 x 10<5>ćelija/mL. Celokupni sadržaji od 30 L preneti su i post inokulum masa, ćelijska gustina i vijabilnost su bile respektivno 134,5 Kg, 2,37 x 10<5>ćelija/mL i 90,9%. Radna podešavanja u bioreaktoru od 200 L za temperaturu, pH, rastvoren kiseonik, pritisak, i brzinu agitacije bili su 37°C, pH 7,0, 40% zasićenje vazduha, 1 psig pritisak, i 35 o/min brzina agitacije, respektivno. Dana 3, ćelijska gustina bila je 15,71 x 10<5>ćelija/mL, što je bilo dovoljno da se doda 60 L (vol./vol.) završne podloge (AGT CD CHO 5X, Invitrogen) i 200 mM rastvora L-glutamina (krajnja koncentracija 10 mM) u bioreaktor. Dana 8 i 12, nivo glukoze pao je ispod 5 g/L što je pokrenulo dodavanje 3 g/L rastvora glukoze (20%). Gustina vijabilnih ćelija sa pikom dana 9 sa 33,20 x 10<5>ćelija/mL sa vijabilnošću od 92,5%. Bioreaktor prikupljen je dana 13 sa ćelijskom vijabilnošću od 78,5%. Broj ćelija i vijabilnost kulture tokom perioda kulture prikazani su na FIG.3A, a ApoA-I koncentracija u podlozi za kulturu tokom perioda kulture prikazana je na FIG.3B.

6.2.2. Prikupljanje, separacija ćelija i skladištenje ćelija

[0325] Podloge iz bioreaktora prikupljene su prolaskom sadržaja bioreaktora kroz dvostruke Cuno (Rutherford, NJ, USA) 60M02 Maximizer filtre praćeno Millipore 0,22 µm Opticap (Billercia, MA, USA) u vreći od 200 L. Izbistrena podloga zatim je čuvana na 2-8°C do postupka disperzije. Izbistrena podloga filtrirana je kroz Millipore 0,22 µm filter (Billerica, MA, SAD) i sipana u sterilne PETG boce od 2 L (ThermoFisher, Marietta, OH, SAD) i zatim zamrznuta na -20°C dok se ne oslobodi za isporuku.

7. PRIMER 2: RAZVOJ SISTEMA ZA PREČIŠĆAVANJE APOA-I

7.1. Materijali i postupci

[0326] Ekspresija, primarna separacija i kondicioniranje. Izbistrena podloga za rast ćelija ApoA-I dobijena kao što je opisano u Primeru 1 (približno 1,8 L) odmrznuta je čuvanjem na temperaturi okoline.

Odmrznuta podloga kondicionirana je za hromatografiju anjonske izmene smanjenjem pH 5,3 ± 0,2 sa 1M HCl.

[0327] Prečišćavanje Apo A-I. Kolona anjonske izmene sa Q-Sefaroza FF (GE Healthcare) upakovana sa visinom sloja od 20 cm ekvilibrisana je sa TAMP A puferom (20 mM natrijum fosfat, pH 5,3). Procenjeno je da je ekvilibracija gotova kada je pH efluenta kolone bila približno 5,5. Kondicionirani filtrat napunjen je na kolonu sa 25-35 g ApoA-I/L smole anjonske izmene sa protokom od 3,7 cm/min. ApoA-I je ispran kroz kolonu u protoku kroz TAMP A, koji je prikupljen.

[0328] Tok koji sadrži ApoA-I iz kolone anjonske izmene bio je pH podešen na 8,0 ± 0,2 sa 1M NaOH. Rastvor je zatim isfiltriran kroz 0,2 µm Planova 20N filter (Asahi Kasei Medical) sa protokom od oko 12,5 L/h/m<2>kako bi se uklonili virusi i virusne čestice.

[0329] Source 30 kolona reverzno-fazne fromatografije sa slojem visine od 25 cm isprana je TAMP D puferom (20 mM amonijum karbonat, pH 9,5) dok se nije ekvilibrisala, kada je efluent kolone dostigao pH 9,5. Filtrat koji sadrži ApoA-I iz faze filtriranja virusa napunjen je na kolonu sa protokom od 2,8 cm/min. ApoA-1 u uzorku je adsorbovan za matricu i eluiran sa gradijentom od 35-50% acetonitrila u TAMP D puferu.

[0330] Reverzno-fazna silica C18 kolona (300Å 10µm) upakovana sa slojem viseine od 25 cm isprana je u TAMP E puferu (100 mM amonijum karbonat, pH 9,5) dok se nije ekvilibrisala, kada je efluent kolone dostigao pH 9,5. C18 kolona je zatim napunjena sa 4,7 g ApoA-I/L matrice. Adsorbovan ApoA-I na matricu kolone eluirao je u gradijentu 40-50% acetonitrila u TAMP E puferu.

[0331] Acetonitril je uklonjen iz frakcija koje sadrže ApoA-I eluirane iz C18 kolone udruživanjem i koncentrovanjem frakcija približno 2,5-puta i zatim diafiltriranjem koncentracije na 15 zapremina TAMP C pufera (3 mM natrijum fosfat, pH 8). pH diafiltriranog ApoA-I rastvora je smanjena do oko 6,0 upotrebom razblažene fosforne kiseline i zatim propuštanjem kroz Mustang Q membranu anjonske izmene (Pall Life Sciences) kako bi se uklonila DNK i proteini ćelija domaćina. Mustang Q filtrat je diafiltriran na 5 zapremina TAMP C pufera.

[0332] Diafiltriran filtrat zatim je podvrgnut krajnjoj ultrafiltraciji upotrebom polietarsulfonske membrane (Filtron Omega series) sa odsečkom molekulske mase od 10.000 daltona tako da membrana zadržava 28.000 daltona ApoA-I. Rastvor proteina sadržao je Rastvor proteina sadržao je 7,8-17 g/L čistog ApoA-I kao što je određeno skeniranjem SDS-PAGE gela i merenjem odnosa intenziteta trakaste oblasti prečišćenog ApoA-I i ukupnog intenziteta svih traka.

7.2. Rezultati

[0333] Karakterizacija ApoA-I. Čistoća ApoA-I proizvoda ispitana je pomoću SDS-PAGE da je veća od čistoće od 99%, sa malim nivoima DNK i proteina ćelija domaćina, i bez detektabilne količine skraćenog ApoA-I. Videti FIG.4.

8. PRIMER 3: OPTIMIZACIJA KOMPONENATA LIPOPROTEINSKIH KOMPLEKSA

8.1. Priprema apolipoproteinskih i fosfolipidnih komponenata

[0334] proApoA-I: Protein proApoA-I nabavljen je od Unité de Biotechnologie, Institut Meurice, Hte Ecole Lucia De Brouckère, 1 Avenue Emile Gryzon, B-1070 Anderlecht, Belgija u liofilizovanim pojedinačnim bocama od 100 mL koje sadrže približno 90 mg proteina. Broj serije bio je 20060202. Protein je čuvan na približno 4°C do upotrebe. Pre liofilizacije, sadržaj proApoA-I bio je 3,225 mg/mL sa sadržajem uree oko 0,011 mg/mL. Rastvor proApoA-I je izrađen rastvaranjem približno 630 mg proApoA-I u 25,6 mL sirćetne kiseline/vode 5%. Krajnja koncentracija rastvora bila je 25 mg/mL.

[0335] ApoA-I: ApoA-I je pripremljen kao što je opisano u Primeru 1 gore.

[0336] Sfingomijelin: Sfingomijelin iz jaja (Coatsome® NM-10) nabavljen je od NOF Corporation, 1-56, Oohama-Cho, Amagasaki-Shi, 660-0095, Japan. Broj serije bio je 0502ES1. Sfingomijelin je čuvan na približno -20°C do upotrebe. Čistoća sfingomijelin bila je 99,1%. Rastvor sfingomijelina izrađen je rastvaranjem 799,4 mg prečišćenog sfingomijelina u 16 mL sirćetne kiseline/vode 5% kako bi se dobila krajnja koncentracija od 50 mg/mL.

[0337] Fosfatidilglicerol: 1,2-dipalmitoil-SN-glicero-3-fosfatidil glicerol kao natrijumova so (DPPG-Na, Coatsome® MG-6060LS) nabavljen je od NOF Corporation, 1-56, Oohama-Cho, Amagasaki-Shi, 660-0095, Japan. Broj serije bio je 0309651L. DPPG-Na je čuvan na približno -20°C do upotrebe. Čistoća DPPG-Na bila je 99,2%. Rastvor DPPG-Na izrađen je rastvaranjem 49,1 mg DPPG-Na u 1 mL sirćetne kiseline/vode 5% kako bi se dobila krajnja koncentracija od 50 mg/mL.

[0338] Fosfatidilholin: di-palmitoil fosfatidilholin (DPPC) dobijen je iz komercijalnog izvora.

8.2. Priprema lipoproteinskih kompleksa

[0339] Sledeći lipoproteinski kompleksi su pripremljeni:

(a) Neutralni lipoproteinski kompleksi:

a. Formula A: proApoA-I i SM u masenom odnosu protein : fosfolipid od 1:2,5;

b. Formula B: proApoA-I i SM u masenom odnosu protein : fosfolipid od 1:2,7;

c. Formula C: proApoA-I i SM u masenom odnosu protein : fosfolipid od 1:3,1;

d. Formula D: proApoA-I, SM, i DPPC u masenom odnosu lipoprotein: ukupan fosfolipid od 1:2,7 sa masenim odnosom SM: DPPC od 50:50;

e. Formula E: ApoA-I i SM u masenom odnosu protein : fosfolipid od 1:2,7.

(b) Negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi:

a. Formula F: proApoA-I, SM, DPPC i DPPG u masenom odnosu lipoprotein : ukupan fosfolipid od 1:2,7 sa masenim odnosom SM:DPPC:DPPG od 48:48:4;

b. Formula G: proApoA-I, SM, DPPC i DPPG u masenom odnosu lipoprotein: ukupan fosfolipid od 1:2,7 sa masenim odnosom SM:DPPC: DPPG od 73:23:4;

c. Formula H: ApoAI, SM, i DPPG u masenom odnosu lipoprotein : ukupan fosfolipid od 1:2,7 sa masenim odnosom SM: DPPG od 97:3;

d. Formula I: ApoAI, SM, i DPPG u masenom odnosu lipoprotein : ukupan fosfolipid od 1:3,0 sa masenim odnosom SM: DPPG od 97:3;

e. Formula J: ApoAI, SM, i DPPG u masenom odnosu lipoprotein : ukupan fosfolipid od 1:3,3 sa masenim odnosom SM: DPPG od 97:3;

8.3. Brzina formiranja i homogenost lipoproteinskih kompleksa

[0340] Formiranje lipoproteinskih kompleksa formula A do J testirano je injektiranjem uzorka u HPLC sistemu za proveru veličine i raspodele lipoproteinskih kompleksa. Kompleksi su proizvedeni kohomogenizacijom i uzorkovani u naznačeno vreme.

[0341] FIG.5 prikazuje primere HPLC hromatograme za neutralne lipoproteinske komplekse prema formulama A do C koje obuhvataju različite masene odnose lipoprotein:SM, i formule D koja obuhvata lipoprotein i neutralne fosfolipide u odnosu 1:2,7, gde je neutralni fosfolipid 50:50 SM:DPPC. Maseni odnos lipoprotein:SM od 1:2,7 je bio optimalan. Formula D, koja je sadržala mešavinu SM i DPPC, pokazala je slabo formiranje kompleksa.

[0342] Dodatak fosfatidil holina kao drugog neutralnog fosfolipida rezultovalo je sporim i nepotpunim formiranjem kompleksa. FIG.6 prikazuje HPLC hromatograme lipoproteinskih kompleksa formule D u 10, 20, 30, i 60 minutu. Nasuprot tome, kao što je prikazano na FIG.7, formula B brzo je obrazovala komplekse.

[0343] Dodatak negativno naelektrisanog fosfolipida, DPPG, u SM i DPPC doveli su do čak manjeg obrazovanja kompleksa, kao što je prikazano u FIG.8 HPLC hromatogramima lipoproteinskih kompleksa formule F u 20, 40, 60, i 120 minutu.

[0344] Kao što je prikazano u FIG.9, lipoproteinski kompleksi koji sadrže samo SM kao fosfolipid, u masenom odnosu protein prema lipid od 1:2,7 obrazuju više pre-B HDL kompleksa i čine to brže od lipoproteinskih kompleksa sa istim masenim odnosom protein prema lipid ali koji sadrži DPPC i/ili DPPG. Prema tome, lipoproteinski kompleksi koji obuhvataju samo SM kao neutralni lipid obrazuju više homogenih lipoproteinskih kompleksa većom brzinom nego kompleksi koji obuhvataju DPPC pored SM, sa ili bez dodavanja DPPG.

[0345] Konačno, negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi koji obuhvataju maseni odnos apolipoprotein: fosfolipid između 1:2,7 i 1:3, u kom fosfolipidna frakcija sadrži SM i DPPG u masenom odnosu 97 prema 3 pokazali su optimalnu homogenost i nisu pokazali pik slobodnog lipida, u poređenju sa kompleksima koji obuhvataju maseni odnos apolipoprotein: fosfolipid od 1:3,3 i nenaelektrisanim lipoproteinskim kompleksima. Videti FIG.10, koja prikazuje HPLC hromatograme za formule E, H, I, i J. Lipoproteinski kompleksi prema formulama B i H odabrani su za dalje ispitivanje kod životinja (Primer 6) i, na osnovu rezultata ispitivanja životinja, a lipoproteinski kompleksi formule H odabrani su za kliničke procene kod humanih pacijenata (Primeri 6 i 8).

9. PRIMER 4: FORMIRANJE LIPOPROTEINSKIH KOMPLEKSA UPOTREBOM POSTUPAKA NA BAZI TERMIČKOG CIKLIRANJA

9.1. Pregled procedura za izradu ApoA-I/DPPG/sfingomijelin kompleksa

[0346] Zamrznuti ApoA-I rastvor u fosfatnom puferu (pH 7-9) sa koncentracijom proteina od 1 do 30 mg/ml, obično 5 do 20 mg/ml, pripremljen je odmrzavanjem tokom približno 24-96 h na 2-8°C i odmeren. Natrijum monobazni fosfat i natrijum dibazni fosfat dodati su ApoA-I rastvoru kako bi se dobila krajnja koncentracija peptida od 10 mM u puferu sa pH 7,4.

[0347] DPPG rastvor je pripremljen zagrevanjem fosfatnog pufera (10 mM natrijum fosfat, pH 8,0) za cilj od 50°C. DPPG prašak (NOF Corporation) je odmrznut na temperaturi okoline tokom najmanje 1,5 h i zatim izmeren i dodat posudi sa puferom. DPPG je zatim dispergovan na temperaturi od 50°C upotrebom ULTRA-TURRAX® raspršivača visoke performanse (IKA® Works, Inc.). Nakon disperzije, DPPG suspenzija i ApoA-I rastvor su zagrejani do 57°C. Kombinovani su i zagrevani na 57°C tokom 30 minuta pod azotom. Ovaj rastvor predhodnog kompleksa ohlađen je do sobne temperature.

[0348] Sfingomijelin (SM) prašak (NOF Corporation) je odmrznut na temperaturi okoline zatim odmeren u staklenom rezervoaru. Fosfatni fosfatni pufer (10 mM natrijum fosfat, pH 8,0) zagrejan je do 50°C kombinovano sa SM praškom za SM koncentraciju od 220 mg/ml. SM prašak je dispergovan u suspenziji upotrebom ULTRA-TURRAX® i disperzija je ohlađena do 4°C i zatim propuštena kroz homogenizator. SM čestice su praćene dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) do 55 do 70 nm zeta (Z) prosečne veličine (upotrebom merenja intenziteta). Ovo se može postići, npr., upotrebom Nano DeBee homogenizatora na 32000 /- 3000 bara, sa temperaturom na ulazu na 10-18°C i temperaturom na izlazu poželjno na 30-40°C (a ne prelazeći 59°C), što rezultuje česticom sa Z-prosečnom veličinom od 58 nm.

[0349] Za obrazovanje kompleksa, ApoA-I/DPPG mešavina i SM disperzija odvojeno su zagrejani do 57°C. Zagrejana SM disperzija dodata je ApoA-I/DPPG mešavini sa početnom temperaturom podešenom na 57°C. Nakon mešanja radi kombinovanja, rastvor je ohlađen na 37°C i zatim je prošao serije temperaturnih ciklusa (57°C do 37°C) kako bi se obrazovali ApoA-I/DPPG/SM kompleksi. Ovaj postupak zagrevanja-hlađenja nastavljen je sa kontaktnim vremenom između temperatura od 5 minuta i 30 minuta. Ciklusi zagrevanja-hlađenja ponavljani su sve dok se veći deo proteinske komponente nije ugradio u lipoproteinske komplekse. Veličina i raspodela kompleksa tokom termičkog cikliranja praćena je gel-propusnom hromatografijom (GPC).

[0350] ApoA-I/DPPG/SM kompleksi izrađeni su prema proceduri opisanoj gore (i ilustrovani u FIG.11). ApoA-I protein imao je aminokiselinsku sekvencu koja odgovara položajima 25 do 267 sekvence naznačene na FIG.1. Kompleksi sadrže sfingomijelin (SM), i 1, 2-diheksadekanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'rac-glicerol) (Dipalmitoilfosfatidilglicerol ili DPPG) u masenom odnosu 97:3. Maseni odnos ApoA-I protein-prema-ukupni lipidi je 1:2,7 (masa/masa) koji je ekvivalentan molarnom odnosu od 1:108.

Kombinovane lipidne i proteinske komponente podvrgnute su ciklusima između 57°C i 37°C tokom 5 minuta na svakoj temperaturi upotrebom razmenjivača toplote smeštenog kao što je prikazano na FIG.

5, koji uključuje na levoj strani Lauda Ecoline Star edition Type 26LE vodeno kupatilo (u kom je uzorak termički cikliran) i na desnoj strani razmenjivač toplote cev u cevi (model EF-C50-HE), koji ima zapreminu 18-ml, povezane peristaltičkom pumpom.

[0351] 180 mg DPPG dodato je u 2,82 grame 10 mM fosfatnog pufera pH 8,0. Suspenzija dispergovana je sa ULTRA-TURRAX® raspršivačem tokom 10 minuta na 50°C.22 grama SM praška kombinovano je sa 78 grama 10mM fosfatnog pufera pH 8,0. Suspenzija je dispergovana sa ULTRA-TURRAX® raspršivačem za 20 do 40 minuta na 50°C. SM je homogenizovan upotrebom NanoBEE seta do prosečne veličine čestica od 60 nm. DPPG, SM i protein doveden je na 57°C.18 mg (0,3 ml) DPPG dodato je u 214 mg ApoA-I proteina u 10 mM fosfatnom puferu pH 7,4 na 57°C. Nakon 30 minuta na 57°C, dodato je 559 mg SM čestica (2,54 ml). Ovaj rastvor zatim je podvrgnut termičkom cikliranju kako bi se formirao kompleks.

[0352] Gel-propusna hromatografija koja pokazuje formiranje ApoA-I/DPPG/SM kompleksa nakon termičkog cikliranja tokom 30 minuta, 60 minuta, 120 minuta, 180 minuta i 210 minuta je prikazana na FIG.13A-13E, respektivno. Kompaktniji kompleks proizveden je sa rastućim ciklusnim vremenom, kao što je prikazano by povećanjem oštrine glavnog GPC pika. Pik koji odgovara nekompleksiranom proteinu takođe nestaje tokom vremena.

9.2. Formiranje ApoA-I/sfingomijelin kompleksa

[0353] ApoA-I/ SM kompleksi izrađeni su prema proceduri opisanoj gore, ali bez predhodnog obrazovanja kompleksa ApoA-I sa DPPG. Proteinska komponenta bila je 5 ml ApoA-I u koncentraciju od 8,9 mg/ml i lipidna komponenta bila je 0,5 ml sfingomijelina iz jaja (220 mg/ml) koja je suspendovana u 10mM fosfatnom puferu pH 8,0 i homogenizovana radi formiranja lipidnih čestica od 60 nm. Proteinske i lipidne komponente umešane su na 50°C u masenom odnosu od 1:2,5. Dobijena suspenzija podvrgnuta je termičko cikliranju tokom 18 sati (108 ciklusa i vreme siklusa od 10 minuta) upotrebom uređaja za termičko cikliranje kao što je prikazano na FIG.5. Gel-propusna hromatografija pokazuje da je formirani protein/lipid kompleks suštinski homogen (videti GPC hromatogram sa FIG.14).

9.3. Formiranje ApoA-I/DPPG/N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (fitosfingomijelin) kompleksa

[0354] ApoA-I/ DPPG/fitosfingomijelin kompleksi izrađeni su prema proceduri opisanoj gore. Čestice fitosfingomijelina homogenizovane su do veličine od oko 183 nm (izmereno pomoću DLS) i dodate su u 7,8g/L protein:DPPG mešavinu kako bi se dobio konačan odnos protein prema lipid (SM i DPPG) od 1:2,7. Suspenzija koja sadrži N-palmitoil-4-hidroksisfinganin-1-fosfoholin (fito-sfingomijelin) i protein: DPPG komponenta je termički ciklirana za šest ciklusa od 10 minuta na 37°C i 10 minuta na 57°C, tokom ukupno dva sata. Gel-propusna hromatografija pokazuje da je formirani protein/lipid kompleks suštinski homogen (videti GPC hromatogram sa FIG.15).

9.4. Formiranje ApoA-I/DPPG/sintetički palmitoil sfingomijelin

[0355] ApoA-I/DPPG/sintetički palmitoil sfingomijelin kompleksi izrađeni su kao što sledi.8,8 mL rastvora sintetičkog palmitoil sfingomijelina (220 mg/ml) u 10mM fosfatnom puferu pH 7,4 je umešano dok se nije dobila veličina čestica od 3300 nm. ApoA-I (945 mg pri 14mg/ml) kombinovano je sa 0,03mas.% DPPG (60mg/ml) i zagrejano na 50°C tokom 30 minuta. Micele sintetičkog palmitoil sfingomijelina kombinovane su sa protein/DPPG kompleksom u masenom odnosu apolipoprotein : fosfolipid od 1:2,7. Suspenzija proteina i lipida je termički ciklirana sa ciklusima zagrevanja-hlađenja na 37°C i 57°C alternativno svakih deset minuta tokom ukupno 240 minuta ili dok nije postignuta odgovarajuća raspodela veličine čestica. Veličina i raspodela kompleksa tokom termičkog cikliranja praćena je pomoću GPC. Nakon obrazovanja kompleksa, koncentracija je dovedena na 8,0 mg ApoA-I/ml, zatim su dodati saharoza (40mg/ml) i manitol (20mg/ml) kompleksu za izotoničnost. Lipoproteinski kompleksi testirani su pomoću GPC i otkriveno je da su suštinski homogeni (videti GPC hromatogram sa FIG.16).

9.5. Formiranje ApoA-I/DPPG/fitosfingomijelin

[0356] ApoA-I/DPPG/fitosfingomijelin kompleksi izrađeni su kao što sledi.2,0 mL rastvora fitosfingomijelina (220 mg/ml) u 10mM fosfatnom puferu pH 7,4 dispergovano je u ULTRA-TURRAX® za 40 minuta na 50°C dok nije dostignuta veličina čestica od 990 nm. ApoA-I (15,6 mg pri koncentraciji 7,8 mg/ml) je kombinovan sa 0,03mas.% DPPG (60mg/ml) i zagrejan na 57°C tokom 30 minuta. Rastvor fitosfingomijelina kombinovan je sa mešavinom protein/DPPG u masenom odnosu apolipoprotein : fosfolipid od 1:2,7. Suspenzija proteina i lipida zatim je termički ciklirana sa ciklusima zagrevanjahlađenja na 37°C i 57°C alternativno svakih deset minuta tokom ukupno 240 minuta ili dok nije postignuta odgovarajuća raspodela veličine čestica. Populacija lipoproteinskih kompleksa izmerena je pomoću GPC i otkriveno je od oko 92,6% homogena (videti GPC hromatogram na FIG.17).

9.6. Formiranje kompleksa sa ApoA-I peptidom

[0357] Kompleksi ApoA-I peptida, DPPG i sfingomijelin generisani su kao što je opisano gore (videti odeljak 9.1), upotrebom rastvora ApoA-I peptida (H-Lys-Leu-Lys-Gln-Lys<5>-Leu-Ala-Glu-Leu-Leu<10>-Glu-Asn-Leu-Leu-Glu<15>-Arg-Phe-Leu-Asp-Leu<20>-Val-Inp<22>-OH; SEQ ID NO:4). Fosfolipidna komponenta sastoji se od sfingomijelina iz jaja (SM), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholin (dipalmitoilfosfatidilholin, DPPC) i 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (dipalmitoilfosfatidil-glicerol, DPPG) u masenom odnosu 48.5:48.5:3. Maseni odnos peptida prema fosfolipidima kompleksa je 1:2,5. Kompleks leka je rastvor CER-522 kompleksa u puferovanom fosfatom slanom rastvoru (12 mM natrijum fosfat, 130 mM natrijum hlorid, pH 8,2). Kompleks je formiran podvrgavanjem polaznog rastvora termičkom cikliranju između 50°C i 37°C za dva sata, protok 1 ml/min.

[0358] Gel-propusna hromatografija pokazuje da je formirani protein/lipid kompleks suštinski homogen, sa ogromnom većinom proteina koji su inkorporirani u lipoproteinske komplekse (videti GPC hromatogram sa FIG.18).

9.7. Efekat veličine lipidnih čestica i broja temperaturnih ciklusa na formiranje kompleksa

[0359] Efekat veličine lipidnih čestica i broja temperaturnih ciklusa na veličinu čestica je ispitivan.

Preparati četiri različite veličine polaznih lipidnih čestica (sa zeta prosecima od 85 nm, 77 nm, 66 nm, i 60 nm) (FIG.19A do 19D, respektivno) generisani su propuštanjem SM rastvora kroz NanoBEE u pojedinačnim prolazima. Svaki prolaz je analiziran za njegov zeta prosek. Veličina lipidnih čestica smanjila se sa svakim prolazom i lipidne čestice su prikupljene kada je postignuta željena veličina. Četiri različite veličine lipidnih čestica testirane su u postupku formiranja kompleksa iz odeljka 9.1, za pet ili sedam ciklusa od 3 minuta na 37°C i 10 minutna na 57°C.

[0360] Kada je lipidna komponenta umešana sa proteinskom komponentom, dobijena suspenzija je zamućena. Zamućenost se smanjuje, i rastvor postaje prozirniji, jer se formiraju kompleksi.

[0361] Nakon pet ciklusa, suspenzija kompleksa proizvedenih od lipidnih čestica od 60 nm bila je najprozirnija. GPC hromatogrami (FIG.20A do 20D) pokazali su potpuno ili skoro potpuno obrazovanje kompleksa u svim uzorcima, kao što je dokazano homogenošću glavnog pika. Kada se polazi sa lipidnim česticama od 66 nm, nema nekompleksiranog proteina koji može da se detektuje pomoću GPC u dobijenoj suspenziji lipoproteinskih kompleksa, što ukazuje na to da je sav protein obrazovao komplekse sa lipidom nakon pet ciklusa, a dobijeni kompleksi bili su 98% čisti. Nakon sedam ciklusa, sve četiri suspenzije postale su prozirnije, što pokazuje još veću meru obrazovanja kompleksa. Suspenzija izrađena upotrebom lipidnih čestica od 60 nm pojavila se najbistrija.

[0362] U odvojenoj studiji, SM čestice od 450 nm i 40 nm obrazovale su komplekse sa ApoA-I i DPPG upotrebom postupka opisanog u odeljku 9.1. Najviše, ali ne sav, ApoA-I ugrađen je u lipoproteinske komplekse upotrebom 450 nm SM čestica kao lipidne komponente, kao što je prikazano u GPC hromatogramu sa FIG.21A (9,8 minutni pik). Mnogo manja frakcija ApoA-I ugrađena je u lipoproteinske komplekse upotrebom 40 nm SM čestica kao lipidne komponente, kao što je prikazano u GPC hromatogramu sa FIG.21B (9,551 minutni pik).

9.8. Efekat početne temperature na formiranje kompleksa

[0363] Efekat početne temperature termičkog cikliranja na formiranje kompleksa je ispitivan. ApoA-I/DPPG/SM kompleksi generisani su kao što je opisano u odeljku 9.1, osim što su lipidna komponenta i proteinska komponenta zagrejane do, i kombinovane na 37°C umesto 57°C. GPC hromatogram dobijenog kompleksa prikazan je na FIG.22. Suštinski manje proteinske komponente je ugrađeno u lipoproteinske komplekse onda kada je termičko cikliranje započelo na 57°C, što je dokazano relativno velikim proteinskim pikom (eluiranje 9,455 minuta na FIG.22).

9.9. Komercijalna proizvodnja lipoproteinskih kompleksa upotrebom postupaka termičkog cikliranja

[0364] Za komercijalnu proizvodnju velikih razmera, postupci ovog pronalaska mogu da povećaju razmeru i opciono se kombinuju sa fazom formulacije. Komercijalni primer izvođenja prikazan je na FIG.

23. U ovom primeru izvođenja, nakon faza termičkog cikliranja, lipoproteinski kompleks je razblažen, mešan sa jednim ili više agenasa za izotonizaciju (npr., saharoza i/ili manitol), filteriran, i alikvotiran u fiolicama. Sadržaji fiolica mogu da budu osušeni zamrzavanjem kako bi se produžio rok trajanja dobijene formulacije.

[0365] ApoA-I/DPPG/SM kompleksi opisani u odeljku 9.1 proizvedeni su u razmeri od 20 litara upotrebom DaBEE2000. Ovi kompleksi razblaženi su sa fosfatnim puferom (pH 7-8) i umešani sa saharozom i manitolom do krajnje formulacije koja sadrži fosfatni pufer 10mM pH 7,4, 8 mg/ml ApoA-I, 4mas.% saharoze i 2mas.% manitola.

9.10. Poređenje lipoproteinskih kompleksa izrađenih termičkim cikliranjem vs. ko-homogenizacijom

[0366] ApoA-I/DPPG/SM kompleksi izrađeni postupcima termičkog cikliranja opisanim ovde upoređeni su sa kompleksima izrađenim ko-homogenizacijom lipidnih i proteinskih komponenata. Čistoća kompleksa izrađenih termičkim cikliranjem poboljšana je do 97% u poređenju sa ko-homogenizacijom kao što je izmereno gel-propusnom hromatografijom. Upotrebom SDS-PAGE, kompleks izrađen termičkim cikliranjem ima povećanu čistoću glavne trake od 98% sa manje traka skraćenih proteina prisutnih u poređenju sa ko-homogenizovanim kompleksima.

[0367] Oksidacija ApoA-I takođe se smanjuje postupkom termičkog cikliranja u poređenju sa kohomogenizacijom. RP-HPLC (C18) pokazuje dva pika oksidacija u RT 0,93 i 0,99 u ko-homogenizovanim kompleksima koji nisu prisutni u postupku termičkog cikliranja. Peptidna mapa takođe pokazuje smanjenje u oksidaciji metionina ApoA-I na Met 112 i Met 148 u kompleksima proizvedenim termičkim cikliranjem u poređenju sa kompleksima proizvedenim ko-homogenizacijom.

[0368] Pregled podataka dat je u Tabeli 5 dole.

Skraćenice u Tabeli 5: GPC = Gel-propusna hromatografija Rt = Retenciono vreme; NMT = Ne više od; SDS-PAGE = Natrijum Dodecil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforeza; HP-SEC = hromatografija visoke performanse isključenjem na osnovi veličina; RP-HPLC = Reverzno-fazna tečna hromatografija visoke performanse; RRT = Relativno retenciono vreme; RP-UPLC = Reverzno-fazna tečna hromatografija ultra performansi; M112ox = ApoA-I ostatak 112 Metionin Oksidacija; M148ox = ApoA-I ostatak 148 Metionin

Oksidacija.

9.11. Upotreba inertnog gasa u proizvodnim postupcima

[0369] ApoA-I je delikatan protein koji je podložan hemijskoj nestabilnosti (npr., oksidacija). Kako bi se poboljšala stabilnost ApoA-I u farmaceutskim kombinacijama koje sadrže ApoA-I/SM/DPPC, farmaceutske kombinacije pripremaju se (uključujući termičko cikliranje, faze punjenja i završne obrade) pod atmosferom azota, inertni gas. Dole su rezultati ispitivanja koji porede ApoA-I/SM/DPPC komplekse izrađene ko-homogenizacijom i ApoA-I/SM/DPPC komplekse izrađene termičkim cikliranjem pod azotom.

10. PRIMER 5: IN VITRO ISPITIVANJA EFLUKSA HOLESTEROLA

[0370] Biološka aktivnost ApoA-I-lipid kompleksa ispitana je u ćelijama hepatoma Fu5AH pacova, merenjem ABCA1-posredovanog efluksa holesterola.

[0371] Ćelije hepatoma Fu5AH pacova imale su visoku ekspresiju skavendžer receptora klase B tipa I (SRB1), što je olakšalo dvosmerni fluks holesterola između ćelija i zrelog HDL. Ovaj model obezbeđuje specifičan test za HDL-posredovanu aktivnost efluksa holesterola. Test je izveden upotrebom postupka opisanog od strane Mweva et al., 2006, "Comparison of different cellular models measuring in vitro the whole human serum cholesterol efflux capacity," Eur. J. Clin. Invest.36, 552-559. Fu5AH ćelije su obeležene sa<3>H-holesterolom za 24 sata. Akceptorske podloge za efluks pripremljene su za svaki testni uzorak (ApoA-I/DPPG/palmitoil SM, ApoA-I/DPPG/SM iz jaja, ili ApoA-I/DPPG/fitoSM sa 30, 20 i 10 µg/ml, razblaženi sa MEM puferovani sa 25 mM HEPES) i za kontrolne uzorke (ApoA-I prečišćen iz humane plazme (20 µg/mL), HDL3, 2% humanog seruma, samo podloge). Akceptorska podloga koja sadrži testne ili kontrolne uzorke dodavana je ćelijama tokom 4 sata i holesterol je izmeren u podlogama sa efluksom i ćelijskim monoslojevima kako bi se odredio procenat holesterola oslobođenog iz Fu5AH ćelija. Biološka aktivnost testnih uzoraka izračunata je i izražena je kao procenat efluksa holesterola u odnosu na referentni standard Formule H opisane gore u istoj koncentraciji kao lipoproteinski kompleks u testnom uzorku, koji služi kao pozitivna eksperimentalna kontrola. Rezultati su prikazani dole u Tabeli 7, i demonstriraju da ispitivani lipoproteinski kompleksi imaju značajnu biološku aktivnost kao što je izmereno u testu efluksa holesterola.

Tabela 7 - Biološka aktivnost (indukovanim efluksom holesterola) u testu na bazi Fu5AH ćelija

11. PRIMER 6: FARMAKODINAMIČKO ISPITIVANJE JEDNOG DAVANJA MALE DOZE KOMPLEKSA FORMULE B I FORMULE H ZEČEVIMA

[0372] Normalni zečevi primili su jednu injekciju: (a) 5 mg/kg doze preparata Formule B (neutralni lipoproteinski kompleksi koji sadrže ApoA-I i SM u masenom odnosu apolipoprotein: fosfolipid 1:2,7); (b) 5 mg/kg doze preparata Formule H (negativno naelektrisani lipoproteinski kompleksi koji sadrže ApoA-I, SM, i DPPG u masenom odnosu apolipoprotein: fosfolipid 1:2,7 i u masenom odnosu SM : DPPG 97:3); ili (c) kontrolnog preparata, koji sadrži razblaživač za preparate lipoproteinskih kompleksa. Četiri zeca su testirana sa svakom od Formule B, Formule H i kontrolom.

[0373] Plazmatični nivoi VLDL ukupnog holesterola i triglicerida tokom vremena prikazani su na FIG.24 i 25. Plazmatični nivoi VLDL ukupnog holesterola povećali su se manje i vratili su se na osnovnu liniju brže kod životinja tretiranih sa Formulom H (ApoA-I/DPPG/SM kompleksi) (b), nego nivoi kod životinja tretiranih sa Formulom B (lipoproteinski kompleksi ApoA-I i SM). Sličan efekat je primećen za nivoe triglicerida. Ovo ispitivanje pokazalo je da je prolazno povećanje ovih nivoa kraće trajalo sa ApoA-I/DPPG/SM kompleksima kompleksima nego sa neutralnim lipoproteinskim kompleksima. Ovaj rezultat je u skladu sa rezultatima studije faze I lipoproteinskih kompleksa Formule H kod humanih subjekata (opisano u Primeru 8 dole).

12. PRIMER 7: KOMPARATIVNA FARMAKODINAMIČKA ISPITIVANJA SM IZ JAJA I SINTETIČKOG PALMITOIL SM

[0374] Farmakodinamički efekat lipoproteinskih kompleksa apolipoprotein A-I (ApoA-I)/SM iz jaja i ApoA-I/sintetički palmitoilSM intravenozno injektiranih u zečeve je ispitivan. Nakon injekcije lipoproteinskih kompleksa, promene plazmatičnih nivoa lipida i lipoproteina su izmerene.

[0375] Lipoproteinski kompleksi ili ApoA-I/SM iz jaja ili ApoA-I/sintetički SM dati su zečevima u dozama od 5 mg/kg ili 20 mg/kg intravenoznom infuzijom u ušnu venu, brzinom 1 mL/min.4 životinje po grupi su ispitivane. Uzorci plazme uzeti su pre doziranja, odmah nakon završetka infuzije, i 30min, 45min, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h i 30h nakon početka infuzije. Uzorci plazme zatim su analizirani upotrebom komercijalnih enzimskih kompleta za ukupan holesterol, neesterifikovan holesterol, fosfolipide i ukupne trigliceride. ApoA1 je testiran u uzorcima plazme upotrebom komercijalnih ELISA kompleta. Uzorci plazme analizirani su pomoću GPC kako bi se odredili profili ukupnog i neesterifikovanog holesterola. Za tretmane od 5 mg/kg doze, rezultati su kvantifikovani na osnovu procenta ukupne površine ispod krive za trag hromatograma.

[0376] FIG.26A-26D prikazuju plazmatične nivoe holesterola, triglicerida, fosfolipida i apoA-I tokom vremena kod zečeva kojima je ubrizgano 5 mg/kg i 20 mg/kg ili ApoA-I/SM iz jaja ili ApoA-I/sintetički SM. Brza i značajna mobilizacija holesterola primećena je u okviru 30 minuta nakon početka infuzija kod obe date doze: pik mobilizacije holesterola javio se u 30 minutu nakon davanja za 5 mg/kg doze, i veliko povećanje mobilizacije holesterola primećeno je za dozu od 20 mg/kg. Za svaku testiranu dozu, obe formulacije imale su slične profile za plazmatične trigliceride, plazmatične fosfolipide i plazmatični rekombinantni humani apoA-I.

[0377] FIG.27A-27C prikazuju plazmatične nivoe HDL-ukupnog holesterola, plazmatične nivoe LDL-ukupnog holesterola, i plazmatične nivoe VLDL- ukupnog holesterola. Porast HDL-ukupnog holesterola za ApoA-I/SM iz jaja i ApoA-I/sintetički SM bio je sličan (FIG.27A). Postoji mala varijacija plazmatičnih LDL-C i VLDL-C nivoa, i nivoi nisu suštinski promenjeni injekcijom lipoproteinskih kompleksa obe formulacije (FIG.27B-27C).

[0378] Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da ApoA-I/SM iz jaja i ApoA-I/sintetički SM lipoproteinski kompleksi izazivaju slične odgovore in vivo.

13. PRIMER 8: ISPITIVANJE FAZE I APOA-I/DPPG/SM KOMPLEKSA KOD ZDRAVIH DISLIPIDEMIČNIH SUBJEKATA

13.1. Materijali i postupci

[0379] Klinička proba faze I sprovedena je sa lipoproteinskim kompleksima Formule H kao randomizirana, dvostruko slepa, placebo kontrolisana, prelazna, pojedinačna studija rastuće doze kod zdravih volontera sa LDL/HDL odnosom većim od 3,0. Predmeti ovog ispitivanja faze I bili su da proceni bezbednost, toleranciju, farmakokinetike i farmakodinamike negativno naelektrisanog lipoproteinskog kompleksa kada se daje kao jedna doza. Rastuće doze od 0,25, 0,75, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0, 30,0 i 45,0 mg/kg su ispitivane. Subjekti su primili infuzijom sterilni rastvor koji sadrži lipoproteinske komplekse ApoA-I (pripremljene kao što je opisano u Primeru 1), SM i DPPG (u masenom odnosu protein: lipid od 1:2,7 i lipidni sastav od 97mas.% SM /3mas.% DPPG) koji su izrađeni ko-homogenizacijom proteinskih i lipidnnih komponenata. Sterilni rastvor bio je 10 mM puferovani rastvor fosfata sa pH 8,0 koji sadrži manitol i saharozu (4mas.% saharoze, 2mas.% manitola) pored lipoproteinskih kompleksa.

13.2. Rezultati

[0380] Dole su data klinička otkrića iz ovog ispitivanja faze I.

[0381] Ukupan holesterol: Srednje plazmatične koncentracije ukupnog holesterola u svakoj vremenskoj tački date su u Tabeli 8 dole:

Tabela 8 - Srednje plazmatične koncentracije ukupnog holesterola po vremenu nakon davanja pojedinačne IV

[0382] VLDL, LDL i HDL u ukupnom holesterolu: Srednje vrednosti za VLDL, LDL i HDL u ukupnom holesterolu date su po vremenskoj tački i dozi u Tabelama 9-11 dole:

Tabela 9 – Srednja vrednost VLDL u ukupnom holesterolu nakon davanja pojedinačne IV

Tabela 10 – Srednja vrednost LDL u ukupnom holesterolu nakon davanja pojedinačne IV

Tabela 11 – Srednja doza HDL u ukupnom holesterolu nakon davanja pojedinačne IV

[0383] Neesterifikovani (slobodni) holesterol: Srednje plazmatične koncentracije slobodnog (neesterifikovanog) holesterola u svakoj vremenskoj tački date su u Tabeli 12 dole:

Tabela 12 - Srednje plazmatične koncentracije slobodnog holesterola po vremenu nakon davanja pojedinačne IV

[0384] VLDL, LDL i HDL u slobodnom holesterolu: Srednje vrednosti za VLDL, LDL i HDL u slobodnom holesterolu date su po vremenskoj tački i dozi u Tabelama 13-15 dole:

Tabela 13 – Srednje vrednosti VLDL u slobodnom holesterolu nakon davanja pojedinačne IV

[0385] Trigliceridi: Srednje plazmatične koncentracije triglicerida u svakoj vremenskoj tački date su u Tabeli 16 dole:

Tabela 16 - Srednje plazmatične koncentracije triglicerida po vremenu nakon davanja pojedinačne IV

[0386] ApoA-I: Promena ApoA-I osnovne linije subjekata u mg/dL tokom vremena prikazana je u Tabeli 17 dole. Maksimalne promene u plazmatičnom ApoA-I podebljane su za svaku dozu.

Tabela 17 – Srednje promene u plazmatičnom ApoA-I po vremenu nakon davanja pojedinačne IV

[0387] Transaminaza: Srednje vrednosti za nivoe alanin aminotransferaze jetre, ili transaminaze, koji su u korelaciji sa toksičnošću, date su u Tabeli 18 dole. Normalan opseg alanin aminotransferaze je 9 do 60 IU/L.

Tabela 18 - Pregled srednjih vrednosti za odabranu alanin aminotransferazu po tretmanu i vremenskoj tački

[0388] Neželjeni efekti: Ukupno 7 (22%) subjekata imalo je neželjene efekte. Nijedan od subjekata nije imao neželjene efekte za koje je istraživač smatrao da su najmanje moguće povezani sa ispitivanim lekom. Čini se da nema trendova u vezi sa pojavom neželjenih efekata. Nijedan od subjekta nije imao ozbiljan neželjeni efekat, i nijedan subjekt nije povučen iz studije zbog neželjenih efekata. Tabela 19 dole obezbeđuje pregled neželjenih efekata po telesnom sistemu:

13.3. Zaključci

[0389] Ovo ispitivanje faze I, gde je davan preparat sterilnog rastvora koji obuhvata negativno naelektrisani lipoproteinski kompleks Formule H u pojedinačnim IV dozama od 0,25, 0,75, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0, 30,0 i 45,0 mg/kg, rezultovalo je sledećim zaključcima.

[0390] Preparat je dobro tolerisan u svim dozama kod svih subjekata sa profilom neželjenih efekata sličnim onom primećenom za placebo. Kompleks izgleda da ne utiče na parametre kliničke hemije, hematologije ili koagulacije drugačije od placebo. Nisu primećeni neželjeni efekti na ECG. Nisu detektovana antitela za ApoA-I nakon davanja pojedinačne doze.

[0391] Plazmatične koncentracije ApoA-I i sfingomijelina porasle su sa dozom: ApoA-I nivoi vratili su se na osnovnu liniju za 24 sata nakon doziranja za doze do 10 mg/kg i za 72 sata nakon doziranja za doze iznad 10 mg/kg. Nivoi sfingomijelina vratili su se na osnovnu liniju za 24 sata nakon doziranja za doze do 5 mg/kg, za 72 sata nakon doziranja za doze od 10 do 30 mg/kg, i za 7 dana nakon doziranja za subjekte dozirane sa 45 mg/kg.

[0392] Mobilizacija holesterola porasla je sa povećanjem doza: Mobilizacija u HDL frakciji slobodnog holesterola primećena je sa dozama niskim kao što je 2,0 mg/kg (srednji porast 23% od osnovne linije) i povećala se sa dozom. Nivoi triglicerida su prolazno porasli iznad nivoa primećenih za placebo u dozama od 15 mg/kg i iznad.

[0393] Dodatno, davanje kompleksa nije značajno povećalo nivoe transaminaze jetre, i u svim slučajevima, nivoi ostali su u normalnom opsegu. Ovo je nasuprot CSL-111, rekonstituisani prečišćeni humani ApoA-I iz plazme koji je obrazovao kompleks sa sojinim fosfatidilholinom, za koji se videlo da podiže nivoe alanin aminotransferaze do više od 100-puta gornje normalne granice kod nekih pacijenata, kada se daje u dozi od 80 mg/kg mase pacijenta. Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-1682.

[0394] Prema tome, kompleksi ovog pronalaska mogu da se daju u dozama nižim od onih prijavljenih za ostale preparate koji imitiraju HDL, a da se i dalje postignu klinički značajna poboljšanja lipidnih parametara bez štetnih nuspojava.

14. PRIMER 9: KLINIČKO ISPITIVANJE FAZE II APOA-I/SM/DPPG KOMPLEKSA U TRETMANU SUBJEKATA SA AKUTNIM KORONARNIM SINDROMOM

[0395] Klinička proba sprovedena je da se dalje potvrdi terapeutska korist niskih doza negativno naelektrisanih lipoproteinskih kompleksa Formule H (ApoA-I, sfingomijelin iz jaja (SM iz jaja), i DPPG, u masenom odnosu apolipoprotein : fosfolipid od 1:2,7, sa masenim odnosom SM iz jaja prema DPPG od 97:3) u lečenju kardiovaskularnih bolesti. ApoA-I je pripremljen ekspresijom u CHO ćelijama kao što je opisano gore u Primerima 1, i kompleksi su generisani postupcima termičkom cikliranja Primera 4.

[0396] Subjekti koji predstavljaju sa simptomima ACS mogu se pregledati za ovo ispitivanje. U vreme karakterizacije osnovne linije, subjekti treba da imaju adekvatni procenu intravaskularnim ultrazvukom (IVUS) jedne "ciljne" arterije za IVUS na koju ne utiče prethodni ili prisutni PCI, i približno 4 cm ciljne arterije treba da ima stenozu prečnika između 0 i 50% vizuelnom angiografskom procenom, referentni prečnik ≥2,5 mm i da budu bez defekata punjenja koji ukazuju na tromb. Jednom kada se proceni IVUS osnovne linije pomoću IVUS Core Laboratory za ukupan kvalitet, prisustvo pogodnog ciljnog krvnog suda i odsustvo tehničkih faktora koji mogu da spreče precizno čitanje IVUS slika, Subjekt se randomizira da primi intravenoznu infuziju, davanu tokom jednog sata, placebo ili jedne od tri doze kompleksa (3, 6, ili 12 mg/kg). Randomizirani subjekti vraćali su se u nedeljnim intervalima (tj., svakih 7 do 11 dana) za pet dodatnih infuzija. Labaratorije za kraj tretmana uzete su jednu nedelju (5 do 9 dana) nakon poslednje infuzije. Nastavak IVUS sproveden je približno 3 nedelje (14 do 35 dana) nakon poslednje infuzije.

Nastavak poseta trajao je približno 6 meseci (+/- 2 nedelje) nakon poslednje infuzije kako bi se prikupili uzorci za testiranje Anti-ApoAl antitela i kako bi se ispratile krajnje tačke glavnih neželjenih srčanih efekata (MACE).

[0397] Primarna krajnja tačka je nominalna promena ukupne zapremine plaka u segment od 30 mm ciljne koronarne arterije ocenjene pomoću trodimenzionalne IVUS. Ostala merenja efikasnosti uključuju procentnu promenu zapremine plaka i promenu procenta zapremine ateroma u ciljnom segmentu od 30 mm, promenu ukupne zapremine krvnog suda u ciljnom segmentu od 30 mm, kao i promene plaka, lumena i ukupne zapremine krvnog suda od osnovne linije za praćenje u anatomski uporedivim segmentima od 5 mm usmereno na mesto sa najmanjim opterećenjem plaka na osnovnoj liniji, i najvećim opterećenjem plaka na osnovnoj liniji na trodimenzionalnom IVUS. Procentna promena zapremine plaka izračunava se kao nominalna promena podeljena sa vrednošću osnovne linije, pomnoženo sa 100. Procentna zapremina ateroma (opstuktivna) se izračunava deljenjem zapremine plaka sa zapreminom elastične spoljašnje membrane (EEM) i zatim množenjem sa 100.

LISTA SEKVENCI

Claims

Patentni zahtevi

1. Kombinacija koja obuhvata populaciju lipoproteinskih kompleksa, pri čemu svaki obuhvata

(b) apolipoproteinsku frakciju koja se suštinski sastoji od apolipoproteina A-I ("ApoA-I"), pri čemu

(i) najmanje 80% apolipoproteina u kombinaciji je u obliku kompleksa;

(ii) najmanje 80% lipida u kombinaciji je u obliku kompleksa;

(iii) ne više od 20% ostataka metionina u apolipoproteinu su oksidovani;

(iv) raspodela veličina lipoproteinskih kompleksa je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97% homogena, kao što se reflektuje jednim pikom u gel-propusnoj hromatografiji, i (v) populacija ne sadrži bilo koji deterdžent.

2. Kombinacija prema zahtevu 1, dalje okarakterisana sa jednom, dve, tri, ili četiri, od sledećih karakteristika:

(a) najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% lipoproteinskih kompleksa su u obliku čestica veličine od 4 nm do 15 nm, veličine 6 nm do 15 nm, veličine 4 nm do 12 nm, veličine 6 nm do 12 nm, ili veličine 8 nm do 12 kako je mereno gel-propusnom hromatografijom ("GPC") ili dinamičkim rasipanjem svetlosti ("DLS");

(b) najmanje 75mas.%, najmanje 80mas.%, najmanje 85mas.%, najmanje 90mas.%, ili najmanje 95mas.% ApoA-I u pomenutoj populaciji je u zrelom obliku;

(c) ne više od 25mas.%, ne više od 20mas.%, ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.% ili ne više od 5mas.% ApoA-I u pomenutoj populaciji je u nezrelom obliku; i

(d) ne više od 25mas.%, ne više od 20mas.%, ne više od 15mas.%, ne više od 10mas.%, ne više od 5mas.% ApoA-I u populaciji je u skraćenom obliku.

3. Kombinacija prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, u kojoj najmanje 98mas.% ApoA-I u populaciji je neskraćeni ApoA-I.

4. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, dalje okarakterisana sa jednom, dve, tri, četiri, ili pet od sledećih karakteristika:

(a) ne više od 20%, ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% svakog od metionina 112 i metionina 148 u pomenutom ApoA-I u pomenutoj populaciji je oksidovano;

(b) ne više od 15%, ne više od 10%, ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2% ili ne više od 1% aminokiselina iz ApoA-I u pomenutoj populaciji je deamidirano;

(c) populacija sadrži ne više od 1 EU, ne više od 0,5 EU, ne više od 0,3 EU ili ne više od 0,1 EU endotoksina po miligramu ApoA-I;

(d) populacija sadrži ne više od 100 pikograma, ne više od 50 pikograma, ne više od 25 pikograma, ne više od 10 pikograma ili ne više od 5 pikograma DNK ćelija domaćina po miligramu ApoA-I; i (e) populacija sadrži ne više od 500 nanograma, ne više od 200 nanograma, ne više od 100 nanograma, ne više od 50 nanograma, ili ne više od 20 nanograma proteina ćelija domaćina po miligramu ApoA-I.

5. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koja sadrži ne više od 200 ppm, ne više od 100 ppm, ili ne više od 50 ppm nevodenog rastvarača.

6. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, proizvedena postupkom koji ne obuhvata fazu frakcionisanja prema veličini za prečišćavanje lipoproteinskih kompleksa.

7. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, u kojoj ne više od 15mas.%, ili ne više od 10mas.%, ne više od 5mas.% ili ne više od 2mas.% lipida u lipidnoj frakciji u pomenutim kompleksima predstavlja holesterol.

8. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 7, u kojoj pomenuti ApoA-I predstavlja humani ApoA-I protein.

9. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 8, u kojoj pomenuti ApoA-I predstavlja rekombinantni ApoA-I.

10. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, u kojoj pomenuti ApoA-I ima najmanje 95% identiteta sekvenci sa proteinom koji odgovara aminokiselinama 25 do 267 iz SEQ ID NO: 1.

11. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 10, u kojoj pomenuta lipidna frakcija obuhvata neutralne fosfolipide, opciono gde se neutralni fosfolipidi suštinski sastoje od sfingomijelina.

12. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde se negativno naelektrisani lipid suštinski sastoji od 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DPPG).

13. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 12, u kojoj je molarni odnos komponenata negativno naelektrisanog lipida prema neutralnom fosfolipidu prema ApoA-I u populaciji 2-6:90-120:1.

14. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 10, u kojoj se pomenuta lipidna frakcija suštinski sastoji od

(a) 95 do 99 mas.% neutralnog fosfolipida i 1 do 5 mas.% negativno naelektrisanog fosfolipida; ili (b) 96 do 98 mas.% neutralnog fosfolipida i 2 do 4 mas.% negativno naelektrisanog fosfolipida.

15. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 10, u kojoj se pomenuta lipidna frakcija suštinski sastoji od 97 mas.% neutralnog fosfolipida i 3 mas.% negativno naelektrisanog fosfolipida, opciono u kojoj je neutralni lipid prirodni sfingomijelin ili sintetički sfingomijelin, i opciono u kojoj lipid ima peroksidni broj manji od 5 meq O/kg, manji od 4 meq O/kg, manji od 3 meq O/kg, ili manji od 2 meq O/kg.

16. Kombinacija prema zahtevu 15, u kojoj sfingomijelin predstavlja sfingomijelin iz jaja.

17. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 14 do 16, u kojoj negativno naelektrisani fosfolipid obuhvata fosfatidilglicerol.

18. Kombinacija prema zahtevu 17, u kojoj negativno naelektrisan fosfolipid obuhvata ili se sastoji od soli 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DPPG).

19. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 18, koja ima maseni odnos apolipoproteinska frakcijaprema-fosfolipidna frakcija u opsegu od 1:2 do oko 1:3.

20. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 19, u kojoj je najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97% lipoproteina u obliku kompleksa.

21. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 20, u kojoj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% lipida u obliku kompleksa.

22. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 21, u kojoj lipoproteinski kompleksi dalje obuhvataju hidrofobni, hidrofilni, ili nepolarni aktivni agens, pri čemu opciono aktivni agens obuhvata:

(a) neku masnu kiselinu, neki lek, neku nukleinsku kiselinu, neki vitamin, neki nutrijent, ili neku njihovu kombinaciju;

(b) neki analgetik, neki antiinflamatorni agens, neki antelmintik, neki antiaritmijski agens, neki antibakterijski agens, neki antivirusni agens, neki antikoagulans, neki antidepresiv, neki antidijabetik, neki antiepileptik, neki antifungalni agens, neki agens protiv gihta, neki antihipertenzivni agens, neki antimalarijski agens, neki agens protiv migrene, neki antimuskarinski agens, neki antineoplastični agens, neki agens za poboljšanje erektilne disfunkcije, neki imunosupresant, neki anti-protozoalni agens, neki antitiroidni agens, neki anksiolitički agens, neki sedativ, neki hipnotik, neki neuroleptik, neki β-blokator, neki kardiološki inotropni agens, neki kortikosteroid, neki diuretik, neki agens protiv parkinsonizma, neki gastro-intestinalni agens, neki antagonist histaminskih receptora, neki keratolitik, neki agens za regulaciju lipida, neki antianginalni agens, neki COX-2 inhibitor, neki inhibitor leukotriena, neki makrolid, neki mišićni relaksant, neki nutritivni agens, neku nukleinsku kiselinu, koja je opciono mala ometajuća RNK, neki opioidni analgetik, neki inhibitor proteaze, neki polni hormon, neki stimulans, neki mišićni relaksant, neki agens protiv osteoporoze, neki agens protiv gojaznosti, neki pojačavač kognicije, neki agens protiv urinarne inkontinencije, neko hranljivo ulje, neki agens protiv benigne hipertrofije prostate, neku esencijalnu masnu kiselinu, neku ne-esencijalnu masnu kiselinu, ili neku njihovu mešavinu; ili (c) acetretin, albendazol, albuterol, aminoglutetimid, amiodaron, amlodipin, amfetamin, amfotericin B, atorvastatin, atovakvon, azitromicin, baklofen, beklometazon, benezepril, benzonatat, betametazon, bikalutanid, budezonid, bupropion, busulfan, butenafin, kalcifediol, kalcipotrien, kalcitriol, kamptotecin, kandesartan, kapsaicin, karbamezepin, karoteni, celekoksib, cerivastatin, cetirizin, hlorfeniramin, holekalciferol, cilostazol, cimetidin, cinarizin, ciprofloksacin, cisaprid, klaritromicin, klemastin, klomifen, klomipramin, klopidogrel, kodein, koenzim Q10, ciklobenzaprin, ciklosporin, danazol, dantrolen, dekshlorfeniramin, diklofenak, dikoumarol, digoksin, dehidroepiandrosteron, dihidroergotamin, dihidrotahisterol, diritromicin, donezepil, efavirenz, eposartan, ergokalciferol, ergotamin, izvori esencijalnih masnih kiselina, etodolak, etopozid, famotidin, fenofibrat, fentanil, feksofenadin, finasterid, flukonazol, flurbiprofen, fluvastatin, fosfenitoin, frovatriptan, furazolidon, gabapentin, gemfibrozil, glibenklamid, glipizid, gliburid, glimepirid, griseofulvin, halofantrin, ibuprofen, irbesartan, irinotekan, izosorbid dinitrat, izotretinoin, itrakonazol, ivermektin, ketokonazol, ketorolak, lamotrigin, lansoprazol, leflunomid, lizinopril, loperamid, loratadin, lovastatin, L-triroksin, lutein, likopen, medroksiprogesteron, mifepriston, meflokvin, megestrol acetat, metadon, metoksalen, metronidazol, mikonazol, midazolam, miglitol, minoksidil, mitoksantron, montelukast, nabumeton, nalbufin, naratriptan, nelfinavir, nifedipin, nilzolidipin, nilutanid, nitrofurantoin, nizatidin, omeprazol, oprevelkin, oestradiol, oksaprozin, paklitaksel, parakalcitol, paroksetin, pentazocin, pioglitazon, pizofetin, pravastatin, prednizolon, probukol, progesteron, pseudoefedrin, piridostigmin, rabeprazol, raloksifen, rofekoksib, repaglinid, rifabutin, rifapentin, rimeksolon, ritanovir, rizatriptan, rosiglitazon, sakvinavir, sertralin, sibutramin, sildenafil citrat, simvastatin, sirolimus, spironolakton, sumatriptan, takrin, takrolimus, tamoksifen, tamsulosin, targretin, tazaroten, telmisartan, tenipozid, terbinafin, terazosin, tetrahidrokanabinol, tiagabin, tiklopidin, tirofibran, tizanidin, topiramat, topotekan, toremifen, tramadol, tretinoin, troglitazon, trovafloksacin, ubidekarenon, valsartan, venlafaksin, verteporfin, vigabatrin, vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, zafirlukast, zileuton, zolmitriptan, zolpidem, zopiklon, ili neka so bilo koje od prethodno navedenih.

23. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 22, koja je u obliku farmaceutske kombinacije i dalje obuhvata jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa.

24. Jedinični dozni oblik koji obuhvata terapeutski efektivnu količinu neke farmaceutske kombinacije prema zahtevu 23.

25. Kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 21, u kojoj lipoproteinski kompleksi dalje obuhvataju neki obeleživač, opciono gde:

(a) ApoA-I obeležen je obeleživačem;

(b) jedan ili više lipida u lipidnoj frakciji obeleženi su obeleživačem;

(c) obeleživač obuhvata:

(i) neki radioobeleživač, koji je opciono<125>I,<14>C,<3>H;

(ii) neki fluorescentni obeleživač;

(iii) neki enzimski obeleživač;

(iv) neku boju;

ili

(d) neka kombinacija (a)-(c).

26. Kombinacija prema zahtevu 25, koja je u obliku neke farmaceutske kombinacije i dalje obuhvata jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa.