RS58289B1 - Rekombinantna vakcina protiv virusa mačje leukemije koja sadrži optimizovani gen omotača virusa mačje leukemije - Google Patents

Rekombinantna vakcina protiv virusa mačje leukemije koja sadrži optimizovani gen omotača virusa mačje leukemije

Info

Publication number
RS58289B1
RS58289B1 RS20190039A RSP20190039A RS58289B1 RS 58289 B1 RS58289 B1 RS 58289B1 RS 20190039 A RS20190039 A RS 20190039A RS P20190039 A RSP20190039 A RS P20190039A RS 58289 B1 RS58289 B1 RS 58289B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
felv
polypeptide
sequence
env
composition
Prior art date
Application number
RS20190039A
Other languages
English (en)
Inventor
Hervé Poulet
Thierry Heidmann
Original Assignee
Merial Ltd
Centre Nat Rech Scient
Roussy Inst Gustave
Univ Paris Sud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Ltd, Centre Nat Rech Scient, Roussy Inst Gustave, Univ Paris Sud filed Critical Merial Ltd
Publication of RS58289B1 publication Critical patent/RS58289B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/04—Nitro compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA REFERENCA SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava ima prioritet SAD privremene prijave 61/509,912 podnete 20.7.2011.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije ili vakcine za borbu protiv infekcija virusom mačje leukemije kod životinja. Specifično, predmetni pronalazak daje vektore koji sadrže i eksprimiraju in vivo ili in vitro optimizovane antigene omotača virusa mačje leukemije koji izazivaju imuni odgovor kod životinja protiv virusa mačje leukemije, uključujući kompozicije koje sadrže navedene vektore, postupke za vakcinaciju protiv virusa mačje leukemije i komplete za upotrebu sa takvim postupcima i kompozicijama.
OSNOVA PRONALASKA
[0003] Virus mačje leukemije (FeLV) je čest uzrok infekcije domaćih mačaka širom sveta i uzrok značajnog morbiditeta i mortaliteta. Prevalenca antigenemije može da varira od 1 do 5 procenata kod zdravih mačaka do 15 do 30 procenata kod bolesnih mačaka (Hosie M.J. et al., Veterinary Records, 1989, 128, 293-297; Braley J., Feline Practice, 1994, 22, 25-29; Malik R. et al., Australian Veterinary Journal, 1997, 75, 323-327; Arjona A. et al., Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38, 3448-3449). Virus može da uspostavi infekciju koja traje ceo život okarakterisanu perzistentnom viremijom i fatalnim ishodom. Većina bolesti povezanih sa FeLV javlja se perzistentno kod inficiranih žviotinja, i one su uvek ozbiljne i najverovatnije fatalne. Među najčešće dijagnostifikovanim stanjima su limfomi, mijeloidne leukemije, imunodeficijencija i ne-regenerativna anemija. Infekcija može biti kontrolisana identifikacijom i izolacijom perzistentno viremičnih mačaka, koje su izvor infekcije. Vakcine su takođe pomogle u prevenciji širenja virusa. Dostupno je nekoliko FeLV vakcina. Većina njih sadrže inaktivirani virus ili rekombinantne podjedinice. Njihova efikasnost je kontraverzna (Sparkes A.H., Journal of Small Animal Practice, 1997, 38, 187-194). Zabeleženo je razlaganje vakcine.
[0004] Alternativan način bio bi upotreba rekombinantnog virusnog vektora. Vektor Canarypox virusa i naročito ALVAC vektor su testirani za ekspresiju FeLV gena (Tartaglia J.
et al., Journal of Virology, 1993, 67, 2370-2375; Poulet H. et al., Veterinary Record, 2003, 153, 141-145). Komercijalna rekombinantna FeLV vakcina je takođe dostupna (EURIFEL® FeLV, Merial).
[0005] FeLV genom kodira tri gena: GAG gen koji kodira glavne strukturne komponente virusa, ENV gen koji kodira glikoprotein omotača i POL gen koji kodira protein polimerazu (Thomsen D.R., et al., Journal of General Virology, 73, 1819-1824, 1992). Gen omotača FeLV (ENV) kodira gp85 prekursorski protein koji je proteolitički obrađen ćelijskim enzimom (enzimima) da bi se proizveo glavni glikoprotein omotača gp70 i povezani transmembranski protein p15E (DeNoronha, F., et al., 1978, Virology 85:617-621; Nunberg, J.H., et al., 1983, PNAS 81:3675-3679). Transmembranski protein p15E sadrži sekvencu konzervativnu među gamaretrovirusima sa imunosupresivnim osobinama (Mathes, L.E. et al., 1978, Nature). Glikoprotein omotača FeLV je jedan od glavnih imunogena i on je ciljno mesto FeLV-specifičnih citotoksičnih T ćelijskih odgovora kao i neutralizujućih antitela (Flynn, J.N., et al., 2002, J. Virol.). SAD patentna prijava US 2008/0008683 razmatrala je polipeptid koji sposoban za modulaciju imunosupresivnih osobina virusnog proteina protiv domaćina u kome je eksprimiran. Gen GAG FeLV kodira prekursorski poliprotein koji je odcepljen pomoću proteaze (gen PRO FeLV) za generisanje proteina kapsida. Proteini kapsida su takođe glavni imunogen koji indukuje FeLV-specifične citotoksične T ćelijske odgovore kao i neutralizujuća antitela (Flynn, J.N., et al., 2002, J. Virol.). POL gen kodira tri proteina: proteazu (PRO), reverznu transkriptazu i integrazu. Auto-obrada pomoću proteaznog dela gena daje dva tri proteina POL regiona (Thomsen D.R., et al., 1992).
[0006] Postoji generalna potreba za poboljšanjem u efikasnosti i bezbednosti vakcina FeLV i za efikasnijom zaštitom u uslovima na polju.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0007] Cilj pronalaska može biti bilo koji ili svi od obezbeđivanja rekombinantnih vektora ili virusa kao i postupci za pripremu takvih virusa, i obezbeđivanje kompozicija i/ili vakcina kao i postupci za lečenje i profilaksu infekcije sa FeLV.
[0008] U prvom aspektu, pronalazak daje kompoziciju koja sadrži:
a) ekspresioni vektor koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira polipeptid omotača (ENV) virusa mačje leukemije (FeLV) koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34, pri čemu polipeptid sadrži mutaciju koja je supstitucija arginina (R) za glutaminsku kiselinu (E) na aminokiselinskom položaju 527 ili ekvivalentnom odgovarajućem aminokiselinskom položaju proteina omotača virusa mačje leukemije i drugog polinukleotida koji kodira FeLV GAG/PRO polipeptid koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i
b) farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens.
[0009] Naročito, pedmetni pronalazak daje kompoziciju prema prvom aspektu prema pronalasku, gde prvi polinukleotid kodira polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2 ili 4, i gde drugi polinukleotid kodira FeLV GAG/PRO polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:12.
[0010] Pronalazak dalje obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira optimizovani polipeptid omotača virusa mačje leukemije i drugi polinukleotid koji kodira FeLV GAG/PRO polipeptid kao što je definisan u prvom aspektu pronalaska.
[0011] Pronalazak dalje daje kompoziciju ili ekspresioni vektor prema pronalasku za upotrebu kao životinjski vektor, pri čemu je kompozicija ili ekspresioni vektor formulisan za najmanje jednu primenu.
[0012] Pronalazak takođe obezbeđuje komplet za prvu buster vakcinaciju koja sadrži najmanje dve bočice: prvu bočicu koja sadrži kompoziciju ili ekspresioni vektor prema pronalasku za prvu vakcinaciju i drugu bočicu koja sadrži kompoziciju ili ekspresioni vektor prema pronalasku, ili subjediničnu FeLV vakcinu ili pazmidnu FeLV vakcinu za buster vakcinaciju.
[0013] Ovi i ostali primeri izvođenja su otkriveni ili su očigledni iz i obuhvaćeni sa, sledećim Detaljnim opisom.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0014] Sledeći detaljan opis, dat radi ilustracije, i koji nije namenjen da ograniči pronalazak na opisane specifične primere izvođenje, može se razumeti zajedno sa pratećim crtežima, u kojima:
Slika 1 daje tabelu koja identifikuje SEQ ID NO dodeljenu polinukleotidnoj i proteinskoj sekvenci.
Slika 2 prikazuje plazmidnu mapu pH6C5env (208.2).
Slika 3 daje sekvence za fragment plazmid pCXL208.2 (pH6C5env) koji sadrži DNK omotača virusa mačje leukemije i desnu i levu granu (SEQ ID NO:36) i protein omotača virusa mačje leukemije (SEQ ID NO:7) iz plazmida pHCMV-ENV FeLV.
Slika 4 daje restrikcionu mapu za plazmid pPB713.
Slika 5 daje poravnanja sekvence DNK i proteina omotača virusa mačje leukemije.
Slika 6 daje restrikcionu mapu plazmida pPB712.
Slika 7 prikazuje poravnanje DNK sekvence između divljeg tipa DNK GAG/PRO (SEQ ID NO:11) i kodon-optimizovane DNK GAG/PRO (SEQ ID NO:10).
Slika 8 daje šemu kloniranja.
Slika 9 daje restrikcionu mapu plazmida pJY1874.1.
Slika 10 daje sekvencu proteina GAG-PRO FeLV.
Slika 11 prikazuje nukleotidnu sekvencu pJY1874.1 DNK fragmenta koji sadrže grane i insert (SEQ ID NO:38).
Slika 12 daje šemu kloniranja za pripremu vCP2294 plazmida.
Slika 13 prikazuje mapu regiona C3 plazmida vCP2294 sa lokacijama prajmera.
Slika 14 prikazuje sekvencu plazmida vCP2294 (anotirana).
Slika 15 daje šemu kloniranja za pripremu plazmida vCP2296 plazmid.
Slika 16 prikazuje mapu regiona C5 plazmida vCP2296 sa lokacijama prajmera.
Slika 17 daje šemu kloniranja za pripremu plazmida vCP2295.
Slika 18 prikazuje sekvencu plazmida vCP2295.
Slika 19 je grafikon koji prikazuje razvoj srednje proviremije po grupi posle zaraze.
Slika 20 je grafikon koji prikazuje razvoj srednje proviremije po grupi i p27 status posle zaraze.
Slika 21 je grafikon koji prikazuje proviremiju u koštanoj srži u korelaciji sa p27 statusom. Slika 22 prikazuje FeLV-specifičan- IPNγ odgovor na D35.
Slika 23 prikazuje FeLV-specifičan (pul pepeptida omotača br.1) IPNγ odgovor na D35.
Slika 24 prikazuje FeLV-specifičan (pulovi peptida omotača) IL-10 odgovor na D35.
Slika 25 prikazuje FeLV-specifičan (pulovi peptida GAG/PRO) - IL-20 odgovor na D35. Slike 26a-b prikazuje FeLV-specifičan (stimulacija omotača) - IFNy/IL-10 odnos na D35. Slika 27 prikazuje FeLV-specifičan (stimulacija GAG/PRO) - IPNγ odgovor na D126.
Slika 28a prikazuje FeLV-specifičan (stinulacija omotača) - IL-10 odgovor na D126.
Slika 28b prikazuje FeLV-specifičan (stimulacija GAG/PRO) - IL-10 odgovor na D126.
Slika 29 prikazuje FeLV-specifičan IFNy/IL-10 odgovor pulova peptida FeLV ENV i GAG/PRO na D35.
DETALJAN OPIS
[0015] U ovom otkriću i naročito patentnim zahtevima navedeno je da termini kao što su "sadrži", "sadržan", "koji sadrži" i slično imaju značenje koje im je dodeljeno u Zakonu o patentima SAD-a; npr., oni mogu da označavaju "obuhvata", "uključen", "uključujući", i slično; i da termini kao što su "koji se uglavnom sastoji od" i "uglavnom se sastoji od" imaju značenje koje im je dodeljeno u Zakonu o patentima SAD-a, npr., oni omogućavaju elemente koji nisu eksplicitno navedeni, ali isključuju elemente koji se nalaze u stanju tehnike ili koji mogu da utiču na osnovnu ili novu karakteristiku prema pronalasku.
[0016] Osim ukoliko je drugačije navedeno, tehnički termini su korišćeni prema konvencionalnoj upotrebi. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji mogu se naći u Benjamin Lewin, Genes V. published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0017] Termini u jednini, "a," "an," i "the" (na engleskom jeziku, prim. prev.) obuhvataju množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne označava drugačije. Slično, reč "ili" je oređena tako da obuhvata "i", osim ukoliko kontekst jasno ne označava drugačije. Reč "ili" označava bilo kog člana određenog spiska i takođe obuhvata bilo koju kombinaciju članova tog spiska.
[0018] Termin "polipeptid ili DNK omotača virusa mačje leukemije" označava bilo koji nativni ili optimizovani/mutirani polipeptid ili DNK omotača virusa mačje leukemije, i njihove derivate i varijante. Na primer, optimizovana/mutirana DNK omotača virusa mačje leukemije može biti kodon-optimizovana DNK virusa mačje leukemije, DNK omotača virusa mačje leukemije može biti optimizovana tako da proizvodi jednu aminokiselinsku mutaciju u polipeptidu virusa mačje leukemije. Optimizovani/mutirani polipeptid omotača virsa mačje leukemije može da sadrži jednu aminokiselinsku mutaciju, ili dvostruku aminokiselinsku mutaciju ili višestruku aminokiselinsku mutaciju.
[0019] Termin "životinja" je korišćen ovde tako da obuhvata sve sisare, ptice i ribe. Životinja kao što je ovde korišćena može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od konja (npr., konja), pasa (npr., pasa, vukova, lisica, kojota, šakala), mačaka (npr., lavova, tigrova, domaćih mačaka, divljih mačaka, drugih velikih mačaka, i ostalih mačaka uključujući geparde i risove), goveda (npr., stoke), svinja (npr., praseta), ovaca (npr., ovaca, koza, lama, bizona), ptica (npr., kokošaka, pataka, gusaka, ćurki, prepelica, fazana, papagaja, zeba, sova, vrana, nojeva, emua i kazuare), primata (npr., prosimiana, tarzier, majmuna, gibona, bezrepog majmuna), ljudi i riba. Termin "životinja" takođe obuhvata pojedinačnu životinju u svim stadijumima razvoja, uključujući embrionalne i fetusne stadijume.
[0020] Termini "polipeptid" i "protein" su korišćeni naizmenično ovde za označavanje polimera uzastopnih aminokiselinskih ostataka.
[0021] Termin "nukleinska kiselina", "nukleotid", i "polinukleotid" označava RNK ili DNK i njihove derivate, kao što su oni koji sadrže modifikovane osnove. Biće jasno da opis daje polinukleotide koji sadrže sekvence komplementarne onima koje su ovde opisane. Polinukleotidi koji mogu biti korišćeni u izvođenju pronalaska mogu biti pripremljeni na različite načine (npr. hemijskom sintezom, genskim kloniranjem itd.) i mogu da imaju različite oblike (npr. linearne ili granate, jednolančane ili dvolančane ili njihov hibrid, prajmere, probe itd.).
[0022] Termin "gen" je korišćen široko za označavanje bilo kog segmenta polinukleotida povezanog sa biološkom funkcijom. Na taj način, geni ili polinukleotidi obuhvataju introne i egzone kao u genomskoj sekvenci ili samo kodirajuće sekvence kao u cDNK, kao što je otvoreni okvir čitanja (ORF), počevši od start kodona (metioninski kodon) i završavajući se da terminacionim signalom (stop kodon). Geni i polinukleotidi takođe mogu da obuhvataju regione koji regulišu njihovu ekspresiju, kao što je inicijacija transkripcije, terminacija translacije i transkripcije. Na taj način, takođe su uključeni promotori i ribozom-vezujući regioni (uopšteno ovi regulatorni elementi leže približno između 60 i 250 nukleotida ushodno od start kodona kodirajuće sekvence ili gena; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), transkripcioni terminatori (uopšteno terminator je lociran unutar približno 50 nukleotida nishodno od stop kodona kodirajuće sekvence ili gena; Ward C K et al.). Gen ili polinukleotid takođe označava fragment nukleinske kiseline koji eksprimira iRNK ili funkcionalnu RNK, ili kodira specifičan protein, i koji obuhvata regulatorne sekvence.
[0023] Termin "imunogeni polipeptid" ili "imunogeni fragment" kao što je ovde korišćen označava polipeptid ili fragment polipeptida koji sadrži alel-specifičan motiv, epitop ili drugu sekvencu tako da će polipeptid ili fragment vezati MHC molekul i indukovati odgovor citotoksičnih T limfocita ("CTL") i/ili odgovor B ćelija (na primer, proizvodnju antitela), i/ili odgovor T-pomoćnih limfocita i/ili odloženi tip hipersenzitivnog odgovora (DTH) protiv antigena od koga je izveden imunogeni polipeptid ili imunogeni fragment. DTH odgovor je imuna reakcija u kojoj T ćelijski zavisna aktivacija makrofaga i inflamacija uzrokuju povredu tkiva. DTH reakcija na subkutanu injekciju antigena je često korišćena kao analiza za ćelijskiposredovani imunitet.
[0024] Po definiciji, epitop je antigena determinanta koja je imunološki aktivna u smislu da pošto je primenjena na domaćina, sposobna je da izazove imuni odgovor humoralnog (B ćelije) i/ili ćelijskog tipa (T ćelije). To su naročito hemijske grupe ili peptidne sekvence na molekulu koje su antigene. Antitelo specifično vezuje određeni antigeni epitop na polipeptidu. Specifični, neograničavajući primeri epitopa obuhvataju tetra- do pentapeptidnu sekvencu u polipeptidu, tri- do penta-glikozidnu sekvencu u polisaharidu. U životinji većina antigena će predstavljati nekoliko ili čak mnoge antigene determinante istovremeno. Takav polipeptid može takođe biti kvalifikovan kao imunogeni polipeptid i epitop može biti identifikovan kao što je dalje opisan.
[0025] "Izolovana" biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina ili protein ili organela) označava komponentu koja je značajno odvojena ili prečišćena od ostalih bioloških komponenti u ćeliji organizma u kome se komponenta prirodno javlja, na primer, ostale hromozomske i ekstra-hromozomske DNK i RNK, proteine i organele. Nukleinske kiseline i proteini koji su "izolovani" obuhvataju nukleinske kiseline i proteine prečišćene pomoću standardnih postupaka prečišćavanja. Ovaj termin takođe obuhvata nukleinske kiseline i proteine pripremljene rekombinantnom tehnologijom kao i hemijskom sintezom.
[0026] Termin "prečišćen" kao što je ovde korišćen ne zahteva apsolutnu čistoću; radije, određen je kao relativni termin. Na taj način, na primer, prečišćeni polipeptidni preparat je onaj u kome je polipeptid obogaćeniji od polipeptida u njegovoj prirodnoj sredini. Polipeptidni preparat je značajno prečišćen tako da polipeptid predstavlja nekoliko primera izvođenja najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%, ukupnog sadržaja polipeptida preparata. Isto važi za polinukleotide. Polipeptidi otkriveni ovde mogu biti prečišćeni pomoću bilo kojih sredstava poznatih u stanju tehnike.
[0027] Rekombinantni polinukleotid je onaj koji ima sekvencu koja se ne nalazi u prirodi ili ima sekvencu koja je pripremljena veštačkom kombinacijom dva inače odvojena segmenta sekvence. Ova veštačka kombinacije je često postignuta hemijskom sintezom ili uobičajenije, veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata nukleinskih kiselina, na primer, pomoću tehnika genetičkog inženjeringa. U jednom primeru izvođenja, rekombinantni polinukleotid kodira fuzioni protein.
[0028] Ovde su opisani optimizovani ili mutirani polipeptidi iz virusa mačje leukemije. Ovde su opisani optimizovani ili mutirani polipeptidi omotača virusa mačje leukemije. Optimizovani protein omotača virusa mačje leukemije gde se mutacija javlja na, ali bez ograničenja na, aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ili 34 može se koristiti u izvođenju pronalaska. Opisana ovde, mutacija može biti supstitucija arginina (R), asparaginske kiseline (D) ili metionina (M) za glutaminsku kiselinu (E) na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 43, ili aminokiselinskom položaju 533 od SEQ ID NO:7. U izvođenju pronalaska, mutacija je supstitucija arginina (R) za glutaminsku kiselinu (E) na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34. Stručnjaku iz date oblasti tehnike je jasno da na osnovu poravnanja sekvence, opisana mutacija obuhvata mutaciju na odgovarajućem aminokiselinskom položaju u drugim polipeptidima omotača virusa mačje leukemije koji nisu navedeni u predmetnoj prijavi, pri čemu je odgovarajući aminokiselinski položaj ekvivalentan aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 43, ili aminokiselinskom položaju 533 od SEQ ID NO:7. Poravnanje sekvence proteina nekih od polipeptida omotača virusa mačje leukemije je ilustrovano na Slici 1d. U jednom primeru izvođenja, optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije sadrži aminokiselinsku mutaciju na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju proteina omotača virusa mačje leukemije. Opisani ovde, optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije sadrži aminokiselinsku supstituciju R, D ili M za E na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju polipeptida omotača virusa mačje leukemije. U sledećem primeru izvođenja, optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije sadrži aminokiselinsku supstituciju R za E na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju polipeptida omotača virusa mačje leukemije. U sledećem primeru izvođenja, mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2 ili 4.
[0029] Pored toga, homolozi polipeptida iz virusa mačje leukemije su određeni tako da su unutar obima predmetnog pronalaska. Kao što je ovde korišćen, termin "homolozi" obuhvata ortologe, analoge i paraloge. Termin "anolozi" označava dva polinukleotida ili polipeptida koji imaju istu ili sličnu funkciju, ali koji su se razvili posebno u nepovezanim organizmima. Termin "ortolozi" označava dva polinukleotida ili polipeptida iz različitih vrsta, ali koji su se razvili iz zajedničkog predačkog gena putem specijacije. Normalno, ortolozi kodiraju polipeptide koji imaju iste ili slične funkcije. Termin "paralozi" označavaju dva polinukleotida ili polipeptida koji su povezani duplikacijom unutar genoma. Paralozi obično imaju različite funkcije, ali te funkcije mogu biti povezane. Analozi, ortolozi i paralozi divljeg tipa polipeptida virusa mačje leukemije mogu da se razlikuju od divljeg tipa polipeptida virusa mačje leukemije preko post-translacionih modifikacija, rauzlika aminokiselinske sekvence ili u oba. Naročito, homolozi prema pronalasku će generalno ispoljavati najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95% ili 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sekvence, sa svim ili delom sekvenci divljeg tipa polipeptida ili polinukleotida virusa mačje leukemije, i ispoljiće sličnu funkciju.
[0030] Optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34 može se koristiti u izvođenju pronalaska.
[0031] Fragmenti i varijante optimizovanih ili mutiranih polipeptida omotača omotača virusa mačje leukemije identifikovani u prethodnom tekstu, koji mogu biti lako pripremljeni od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike upotrebom dobro poznatih tehnika molekularne biologije, mogu se koristiti u izvođenju pronalaska.
[0032] Varijante su homologi polipeptidi koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34.
[0033] Varijante obuhvataju alelske varijante. Termin "alelska varijanta" označava polinukleotid ili polipeptid koji sadrži polimorfizme koji vode ka promenama u aminokiselinskim sekvencama proteina i koje postoje unutar prirodne populacije (npr., virusne vrste ili sorte). Takve prirodne alelske varijacije mogu tipično da rezultuju u 1 - 5% varijanse u polinukleotidu ili polipeptidu. Alelske varijante mogu biti identifikovane sekvenciranjem sekvence nukleinske kiseline od interesa u određenom broju različitih vrsta, koje se može lako izvesti upotrebom hibridizacionih proba za identifikaciju genetičkog lokusa istog gena u tim vrstama. Bilo koja i sve takve varijacije nukleinske kiseline i rezultujući aminokiselinski polimorfizmi ili varijacije koje su rezultat prirodne alelske varijacije i koje ne menjaju funkcionalnu aktivnost gena od interesa, su određene da su unutar obima pronalaska.
[0034] Kao što je ovde korišćen, termin "derivat" ili "varijanta" označava polipeptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid, koja ima jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih varijacija ili ostalih manjih modifikacija tako da (1) odgovarajući polipeptid ima značajno ekvivalentnu funkciju u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa ili (2) antitelo uzgajano protiv polipeptida je imunoreaktivno sa polipeptidom divljeg tipa. Ove varijante ili derivati obuhvataju polipeptide koji imaju manje modifikacije primarne aminokiselinske sekvence optimizovanog ili mutiranog polipeptida omotača virusa mačje leukemije koje mogu da rezultuju u peptidima koji imaju značajno ekvivalentnu aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim parnjačkim polipeptidom. Takve modifikacije mogu biti namerne, kao preko mutageneze usmerene na mesto ili mogu biti spontane. Termin "varijanta" dalje razmatra delecije, adicije i supstitucije sekvence, sve dok polipeptid funkcioniše tako da proizvodi imunološki odgovor kao što je ovde definisan. Modifikacije mogu biti bilo koja aminokiselinska promena na aminokiselinskim položajima osim položaja 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 43, ili aminokiselinskog položaja 533 od SEQ ID NO:7.
[0035] Termin "konzervativna varijacija" označava zamenu aminokiselinskog ostatka drugim biološki sličnim ostatkom ili zamenu nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline tako da kodirani aminokiselinski ostatak ne menja ili je drugi biološki sličan ostatak. U tom smislu, naročito poželjne supstitucije će generalno biti konzervativne po prirodi, tj., one supstitucije koje se odigravaju unutar familije aminokiselina. Na primer, aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: (1) kisele--aspartat i glutamat; (2) bazne--lizin, arginin, histidin; (3) ne-polarni--alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisane polarne--glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin su nekada klasifikovani kao aromatične aminokiseline. Primeri konzervativnih varijacija obuhvataju supstituciju jednog hidrofobnog ostatka kao što je izoleucin, valin, leucin ili metionin za drugi hidrofobni ostatak ili supstituciju jednog polarnog ostatka za drugi polarni ostatak, kao što je supstitucija arginina za lizin, glutaminske kiseline za asparaginsku kiselinu ili glutamina za asparagin, i slično; ili slična konzervativna zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom koja neće imati veliki efekat na biološku aktivnost. Proteini koji imaju značajno istu aminokiselinsku sekvencu kao referentni molekul, ali poseduju manje aminokiselinske supstitucije koje značajno ne utiču na imunogenost proteina su, prema tome, unutar definicije referentnog polipeptida. Svi polipeptidi proizvedeni pomoću ovih modifikacija su uključeni ovde. Termin "konzervativna varijacija" takođe obuhvata upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane ishodne aminokiseline uz uslov da antitela uzgajena na supstituisani polipeptid takođe imunološki reaguju sa nesupstituisanim polipeptidom.
[0036] Imunogeni fragment polipeptida omotača virusa mačje leukemije obuhvata najmanje 8, 10, 15 ili 20 uzastopnih aminokiselina, najmanje 21 aminokiselinu, najmanje 23 aminokiseline, najmanje 25 aminokiselina ili najmanje 30 aminokiselina polipeptida omotača virusa mačje leukemije koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 43, ili njihove varijante. U sledećem primeru izvođenja, fragment polipeptida omotača virusa mačje leukemije obuhvata specifičan antigeni epitop koji se nalazi na polipeptidu cele dužine omotača virusa mačje leukemije.
[0037] Postupci za određivanje fragmenata polipeptida i epitopa kao što su, generisanje preklapajućih peptidnih biblioteka (Hemmer B. et al.), Pepscan (Geysen H. M. et al., 1984; Geysen H. M. et al., 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen H. M.) i algoritmi (De Groot A. et al.; Hoop T. et al.; Parker K. et al.), mogu se koristiti u izvođenju pronalaska, bez nepotrebnog eksperimentisanja. Generalno, antitela specifično vezuju određeni antigeni epitop. Specifični, neograničavajući primeri epitopa obuhvataju tetra- do penta- peptidnu sekvencu u polipeptidu, tri- do penta glikozidnu sekvencu u polisaharidu. Kod životinja većina antigena će predstavljati nekoliko ili čak mnoge antigene determinante istovremeno. Poželjno pri čemu je epitop proteinski fragment većeg molekula imaće značajno istu imonološku aktivnost kao ukupni protein.
[0038] Ovde je opisan polinukleotid koji kodira polipeptid omotača virusa mačje leukemije. Polinukleotid omotača virusa mačje leukemije koji kodira optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije, pri čemu se mutacija javlja na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34 može biti korišćen u izvođenju pronalaska. Polinukleotid omotača virusa mačje leukemije koji kodira optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije pri čemu je mutacija supstitucija arginina (R) za glutaminsku kiselinu (E) na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 7, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34 može biti korišćen u izvođenju pronalaska. U jednom aspektu, polinukleotid omotača virusa mačje leukemije kodira optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima aminokiselinsku mutaciju na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju proteina omotača virusa mačje leukemije. Opisan ovde, polinukleotid omotača virusa mačje leukemije kodira optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima aminokiselinsku promenu E u R, D ili M na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju polipeptida omotača virusa mačje leukemije. U sledećem aspektu, polinukleotid omotača virusa mačje leukemije kodira optimizovani ili mutirani polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima aminokiselinsku promenu E u R na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju polipeptida omotača virusa mačje leukemije. U sledećem primeru izvođenja, polinukleotid omotača virusa mačje leukemije kodira polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2 ili 4. Opisan ovde, polinukleotid omotača virusa mačje leukemije kodira polipeptid omotača virusa mačje leukemije koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 43, ili konzervativna varijanta, alelska varijanta, homolog ili imunogeni fragment koji sadrži najmanje osam ili najmanje deset uzastopnih aminokiselina jednog od ovih polipeptida ili kombinaciju ovih polipeptida.
[0039] Polipeptid GAG-PRO virusa mačje leukemije koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 12 može biti korišćen u izvođenju pronalaska.
[0040] Polinukleotid omotača virusa mačje leukemije koji ima nukleotidnu sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3 ili 5, ili njegova varijanta može se koristiti u izvođenju pronalaska. Polinukleotid omotača virusa mačje leukemije koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polinukleotidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3 ili 5, ili njegova varijanta može se koristiti u izvođenju pronalaska.
[0041] Polinukleotid GAG-PRO virusa mačje leukemije koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polinukleotidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 10, ili 11, ili njegova varijanta može se koristiti u izvođenju pronalaska.
[0042] Ti polinukleotidi mogu da obuhvataju DNK, cDNK i RNK sekvence koje kodiraju polipeptide omotača ili GAG-PRO virusa mačje leukemije. Razume se da su svi polinukleotidi koji kodiraju polipeptide omotača ili GAG-PRO virusa mačje leukemije takođe obuhvaćeni ovde, sve dok oni kodiraju polipeptid sa prepoznatom aktivnošću, kao što je vezivanje za antitelo koje prepoznaje polipeptid, indukcija imunog odgovora na polipeptid, ili efekat na preživljavanje od bolesti leukemije kada je primenjen na subjekta izloženom parazitu ili kod koga postoji smanjenje u znaku ili simptomu infekcije virusom mačje leukemije.
[0043] Polinukleotidi otkrića obuhvataju sekvence koje su degenerisane kao rezultat genetičkog koda, npr., upotrebe optimizovanog kodona za specifičnog domaćina. Kao što je ovde korišćen, "optimizovani" označava polinukleotid koji je genetički konstruisan za povećanje njegove ekspresije u datoj vrsti. Da bi se obezbedili optimizovani polinukleotidi koji kodiraju polipeptid omotača ili GAG-PRO virusa mačje leukemije, DNK sekvenca gena omotača ili GAG-PRO virusa mačje leukemije može se modifikovati tako da 1) sadrži kodone poželjne za visoko eksprimirane gene u određenoj vrsti; 2) sadrži A+T ili G+C sadržaj u kompoziciji nukleotidnih baza kao onaj koji se značajno nalazi u navedenoj vrsti; 3) formira inicijacionu sekvencu navedene vrste; ili 4) eliminišu sekvence koje uzrokuju destabilizaciju, neodgovarajuću poliadenilaciju, razgradnju i terminaciju RNK, ili koje formiraju sekundarnu strukturu ukosnice ili RNK splajs mesta. Povećana ekspresija proteina virusa mačje leukemije u navedenoj vrsti može se postići upotrebom učestalosti raspodele upotrebe kodona u eukariotima i prokariotima, ili u određenoj vrsti. Termin "učestalost upotrebe poželjnog kodona" označava preferencu ispoljenu od strane specifične ćelije domaćina u upotrebi nukleotidnih kodona da bi se specificirala data aminokiselina. Postoji 20 prirodnih aminokiselina, od kojih je većina specificirana sa više od jednog kodona. Prema tome, sve degenerisane nukleotidne sekvence su uključene u otkriće sve dok je aminokielina polipeptida virusa mačje leukemije kodirana nukleotidnom sekvencom funkcionalno nepromenjena.
[0044] Identičnost sekvence između dve aminokiselinske sekvence može biti ustanovljena pomoću NCBI (National Center for Biotechnology Information) parnog „blast“ i „blosum62 matrix“, upotrebom standardnih parametara (videti, npr., BLAST ili BLASTX algoritam dostupan na "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA) serveru, kao i u Altschul et al.; i na taj način, ova dokument opisuje upotrebu algoritma ili BLAST ili BLASTX i BLOSUM62 matriksa pomoću termina "blasts").
[0045] Identičnost sekvence između dve nukleotidne sekvence takođe može biti određena upotrebom "Align" programa od Myers and Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) i dostupna na NCBI, kao i istih ili drugačijih programa dostupnih preko interneta na njegovim stranicama kao što je NCBI stranica.
[0046] Alternativno ili dodatno, termin "identičnost", na primer, u vezi sa nukleotidnom ili aminokiselinskom sekvencom, može da označi kvantitativnu meru homologije između dve sekvence. Procenat homologije sekvence može se izračunati kao:
[0047] (Nref- Ndif)*100/Nref, gde Ndifje ukupan broj neidentičnih ostataka u dve sekvence kada su poravnate i gde Nrefje broj ostataka u jednoj od sekvenci. Stoga, DNK sekvenca AGTCAGTC će imati identičnost sekvence od 75% sa sekvencom AATCAATC (Nref= 8; Ndif=2).
[0048] Alternativno ili dodatno, "identičnost" u vezi sa sekvencama može da označava broj položaja sa identičnim nukleotidima ili aminokiselinama podeljen sa brojem nukleotida ili aminokiselina u kraćoj od dve sekvence gde se poravnanje dve sekvence može odrediti u skladu sa algoritmom Wilbur-a i Lipman-a (Wilbur and Lipman), na primer, upotrebom veličine prozora od 20 nukleotida, dužine reči od 4 nukleotida, i kazne praznine od 4, i kompjuterski potpomonognuta analiza i tumačenje podataka o sekvenci uključujući poravnanje može se pogodno izvesti upotrebom komercijalno dostupnih programa (npr., Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Kada je za RNK sekvence navedeno da su slične, ili da imaju stepen identičnosti ili homologije sekvence sa DNK sekvencama, timidin (T) u DNK sekvenci smatra se jednakim uracilu (U) u RNK sekvenci. Na taj način, RNK sekvence su unutar obima pronalaksa i mogu se izvesti od DNK sekvenci, pri čemu se timidin (T) u DNK sekvenci smatra jednakim uracilu (U) u RNK sekvencama.
[0049] Identičnost sekvence ili sličnost sekvence dve aminokiselinske sekvence, ili identičnost sekvence između dve nukleotidne sekvence može biti određena upotrebom Vector NTI softverskog paketa (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
[0050] Polinukleotidi omotača ili GAG-PRO virusa mačje leukemije mogu da obuhvataju rekombinantnu DNK koja je ugrađena u vektor, u autonomno replicirajući plazmid ili virus, ili u genomsku DNK prokariota ili eukariota, ili koji postoji kao posebni molekul (na primer, cDNK) nezavisno od drugih sekvenci.
[0051] Rekombinantni vektori koji su ovde otkriveni mogu da obuhvataju polinukleotid koji kodira polipeptid, njegovu varijantu varijantu ili njegov fragment. Rekombinantni vektori mogu da obuhvataju plazmide i virusne vektore i mogu biti korišćeni za in vitro ili in vivo ekspresiju. Rekombinantni vektori mogu da obuhvataju dodatni signalni peptid. Signalni peptidi su kratki peptidni lanac (dužine 3-60 aminokiselina) koji usmerava post-translacioni transport proteina (koji su sintetisani u citosolu) do određenih organela kao što su jedro, mitohondrijalni matriks, endoplazmatični retikulum, hloroplast, apoplast i peroksizom. Tipično, proteini omotača virusa mačje leukemije koji se javljaju u prirodi mogu biti translatirani kao prekusori, koji imaju N-terminalnu signalnu peptidnu sekvencu i "zreli" proteinski domen. Signalni peptid može biti odcepljen brzo posle translacije. Signalna sekvenca može biti prirodna sekvenca iz proteina omotača virusa mačje leukemije ili peptidni signal iz izlučenog proteina npr. signalni peptid iz tkivnog plazminogen aktivator proteina (tPA), naročito humani tPA (S. Friezner Degen et al.; R. Rickles et al.; D. Berg. et al.), ili signalni peptid iz faktora rasta 1 sličnog insulinu (IGF1), naročito konjskog IGF1 (K. Otte et al.), psećeg IGF1 (P. Delafontaine et al.), mačjeg IGF1 (WO03/022886), goveđeg IGF1 (S. Lien et al.), svinjskog IGF1 (M. Muller et al.), kokošjeg IGF1 (Y. Kajimoto et al.), ćurećeg IGF1 (GenBank pristupni broj AF074980). Signalni peptid iz IGF1 može biti prirodan ili optimizovan što se može postići uklanjanjem kriptičnih splajs mesta i/ili prilagođavanjem upotrebe kodona. Posle translacije, neobrađeni polipeptid može biti odcepljen na mestu cepanja da bi se došlo do zrelog polipeptida. Mesto cepanja može biti predviđeno upotrebom postupka Von Heijne (1986).
[0052] Plazmid može da obuhvata DNK transkripcionu jedinicu, na primer sekvencu nukleinske kiseline koja mu dozvoljava da se replicira u ćeliji domaćinu, kao što je oridžin replikacije (prokariotski ili eukariotski). Plazmid takođe može da obuhvata jedan ili više selektabilnih marker gena i druge genetičke elemente poznate u stanju tehnike. Cirkularni ili linearni oblici plazmida su obuhvaćeni u predmetnom otkriću.
[0053] U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na in vivo ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu, koja sadrži i eksprimira in vivo u domaćinu optimizovane ili mutirane polipeptide ENV FeLV i/ili njhove varijante ili fragmente. Ekspresioni vektor može dalje da sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid GAG-PRO FeLV i/ili njegove varijante ili fragmente.
[0054] In vivo ekspresioni vektor može da obuhvata bilo koju transkripcionu jedinicu koja sadrži polinukleotid ili gen od interesa i one esencijalne elemente za njegovu in vivo ekspresiju. Ovi ekspresioni vektori mogu biti plazmidi ili rekombinantni virusni vektori. Za in vivo ekspresiju, promotor može biti virusnog ili ćelijskog porekla. U jednom primeru izvođenja, promotor može biti rani promotor citomegalovirusa (CMV) (CMV-IE promotor), rani ili kasni promotor SV40 virusa ili LTR promotor virusa Rous Sarcoma, promotor gena za citoskelet, kao što je desminski promotor (Kwissa M. et al.), ili aktinski promotor (Miyazaki J. et al.). Kada je nekoliko gena prisutno u istom plazmidu, oni mogu biti obezbeđeni u istoj transkripcionoj jedinici ili u različitim jedinicama.
[0055] Kao što je ovde korišćen, termin "plazmid" može da obuhvata bilo koju DNK transkripcionu jedinicu koja sadrži polinukleotid koji može biti korišćen u izvođenju pronalaska i elemente neophodne za njenu in vivo ekspresiju u ćeliji ili ćelijama željenog domaćina ili ciljnog mesta; i, u tom smislu, zabeleženo je da su super-namotan ili ne-supernamotan, cirkularni plazmid, kao i linearni oblik, su određeni tako da su unutar obima pronalaska. Plazmidi takože sadrže ostale elemente za regulaciju transkripcije kao što su, na primer, stabilizujuće sekvence intronskog tipa. U nekoliko primera izvođenja, plazmidi mogu da obuhvataju prvi intron od CMV-IE (WO 89/01036), intron II od zečjeg beta-globin gena (van Ooyen et al.), signalnu sekvencu proteina kodiranog tkivnim plazminogen aktivatorom (tPA; Montgomery et al.), i/ili poliadenilacioni signal (polyA), naročito polyA gen goveđeg hormona rasta (bGH) (US 5,122,458) ili polyA gena zečjeg beta-globina ili od SV40 virusa.
[0056] Ovde je opisana kompozicija koja sadrži: a) in vivo ekspresioni vektor, pri čemu vektor sadrži polinukleotid koji kodira jedan ili više polipeptida izabranih iz grupe koja se sastoji od polipeptida ENV FeLV, varijante ili fragmenta polipeptida ENV FeLV i njihove smeše; i b) farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens.
[0057] Ovde je opisana kompozicija koja sadrži: a) in vivo ekspresioni vektor, pri čemu vektor sadrži polinukleotid koji kodira jedan ili više polipeptida izabranih iz grupe koja se sastoji od polipeptida ENV FeLV, polipeptida GAG/PRO FeLV, varijante ili fragmenta polipeptida ENV FeLV i njihove smeše; i b) farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens.
[0058] Ovde je opisana kompozicija koja sadrži: a) in vivo ekspresioni vektor, pri čemu vektor sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid ENV FeLV, polipeptid GAG/PRO FeLV; farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens.
[0059] Polipeptidi ENV FeLV i polipeptidi GAG/PRO FeLV su opisani u prethodnom tekstu.
[0060] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži: a) in vivo ekspresioni vektor, pri čemu vektor sadrži polinukleotid koji kodira optimizovani ili mutirani ENV FeLV koji ima aminokiselinsku supstituciju R za E na aminokiselinskom položaju 527 od SEQ ID NO:6 ili na odgovarajućem aminokiselinskom položaju polipeptida FeLV i polinukleotid koji kodira polipeptid GAG/PRO FeLV koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:12; i b) farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens. U sledećem primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku sadrži: a) ekspresioni vektor koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira polipeptid ENV FeLV koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2 ili 4 i drugi polinukleotid koji kodira polipeptid GAG/PRO FeLV koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:12; i b) farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens.
[0061] Termin "kompozicija" sadrži bilo koju vakcinu ili imunološku kompoziciju, pošto je injektirana u domaćina, uključujući pse, mačke i ljude, koja indukuje imuni odgovor u domaćinu, i/ili štiti domaćina od leukemije i/ili koja može da spreči implantaciju parazita, i/ili koja može da spreči napredovanje bolesti kod inficiranih subjekata, i/ili koja može da ograniči difuziju parazita do unutrašnjih organa. Ovo se može postići vakcinacijom prema predmetnom pronalasku preko indukcije izlučivanja citokina, posebno izlučivanja IFN-gama (kao primer postupka za merenje izlučivanja IFN-gama, mogla bi se koristiti Quantikine® imunološka analiza iz R&D Systems Inc. (kataloški broj # CAIF00) (Djoba Siawaya JF et al.)).
[0062] Farmaceutski prihvatljivi vehikulumi ili ekscipijensi koji se koriste su konvencionalni. Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), opisuje kompozicije i formulacije pogodne za faraceutsku isporuku polipeptida, plazmida, virusnih vektora koji su ovde otkriveni. Uopšteno, priroda vehikuluma ili ekscipijensa će zavisiti od određenog režima primene koji se koristi. Na primer, parenteralne formulacije obično sadrže injektabilne tečnosti koje obuhvataju farmaceutski i fiziološki prihvatljive tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, ravnotežni rastvori soli, vodeni rastvor dekstroze, glicerol ili slično kao vehikulum. Za čvrste kompozicije (na primer, oblici pastile osušene zamrzavanjem, praška, pilule, tablete ili kapsule), konvencionalni netoksični čvrsti vehikulumi ili ekscipijensi mogu da obuhvataju, na primer, manitol, laktorzu, skrob ili magnezijum stearat farmaceutskog kvaliteta. Pored biološki neutralnih vehikuluma ili ekscipijenasa, imunogene kompozicije za primenu mogu da sadrže manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje, konzervansi i pH puferujuća sredstva i slično, na primer natrijum acetat ili sorbitan monolaurat.
[0063] Kompozicije ili vakcine prema ovom pronalasku mogu da obuhvataju vektore koji kodiraju bilo koji polinukleotid prema predmetnom pronalasku kao što je opisano u prethodnom tekstu.
[0064] Višestruke insercije mogu biti izvedene u isti vektor upotrebom različitih mesta insercije ili upotrebom istog mesta insercije. Kada je korišćeno isto mesto insercije, svaki polinukleotidni insert, koji može biti bilo koji polinukleotid prema predmetnom pronalasku navedenom u prethodnom tekstu, može biti inseriran pod kontrolom istih i/ili različitih promotora. Insercija može biti izvedena rep-na-rep, glava-na-glavu, rep-na-glavu ili glava-narep. IRES elementi (unutrašnje mesto ulaska ribozoma, videti EP 0803573) takođe mogu biti korišćeni za odvajanje i za ekspresiju višestrukih inserata operativno vezanih za iste i/ili različite promotore.
[0065] Ovde je opisan ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji je naveden u prethodnom tekstu. Ekspresioni vektor može biti in vivo ekspresioni vektor, ili in vitro ekspresioni vektor.
[0066] Ovde su opisani in vivo ekspresioni vektori uključujući bilo koji plazmid (EP-A2-1001025; Chaudhuri P.) koji sadrži i eksprimira in vivo u domaćinu polinukleotid ili gen polipeptida ENV FeLV, njegovu varijantu ili njegov fragment i elemente neophodne za njegovu in vivo ekspresiju.
[0067] U specifičnom, neograničavajućem primeru, pVR1020 ili pVR1012 plazmid (VICAL Inc.; Luke C. et al.; Hartikka J. et al.), pVR2001-TOPA (ili pVR2001-TOPO) (Oliveira F. et al.) ili pAB110 (US 6,852,705) može biti korišćen kao vektor za inserciju polinukleotidne sekvence. pVR1020 plazmid je poreklom od pVR1012 i sadrži humanu tPA signalnu sekvencu. pVR1020 je plazmidna osnova dostupna iz Vical, Inc., (San Diego, CA) koja je prethodno korišćena, videti, npr., SAD patente br.6,451,769 i 7,078,507. Kao što je opisano u Oliveira et al., plazmid pVR2001-TOPO (ili pVR2001-TOPA) je pVR1020 modifikovan dodavanjem klonirajućeg mesta topoizomeraza flankin g i koji sadrži kodiranje za i ekspresiju signalnog sekretornog peptida, na primer, tkivni plazminogen aktivator signalni peptid (tPA), koji povećava verovatnoću proizvodnje izlučenog proteina, (videti Sliku 1 u Oliveira F. et al.).
[0068] Svaki plazmid može da sadrži ili obuhvata ili se uglavnom sastoji od, polinukleotida koji se može koristiti u izvođenju predmetnog pronalaska, operativno vezan za promotor ili pod kontrolom promotora ili zavistan od promotora, pri čemu promotor može biti povoljno susedan polinukleotidu za koji je ekspresija željena. Uopšteno, povoljno je koristiti snažan promotor koji je funkcionalan u eukariotskim ćelijama. Jedan primer korisnog promotora može biti neposredni rani citomegalovirus promotor (CMV-IE) humanog ili mišjeg porekla, ili može izborno da ima drugo poreklo kao što je od pacova ili zamorčeta. CMV-IE promotor može da sadrži stvarni promoterski deo, koji može ili ne mora biti povezan sa pojačivačkim delom. Referenca se može napraviti na EP 260 148, EP 323597, US 5,168,062, 5,385,839 i 4,968,615, kao i na WO 87/03905. CMV-IE promotor može povoljno biti humani CMVIE (Boshart M. et al.) ili mišji CMV-IE. U uopštenijim terminima, promotor može imati virusno ili ćelijsko poreklo. Snažan virusni promotor osim CMV-IE koji može biti korisno korišćen u izvođenju pronalaska je rani/kasni promotor SV40 virusa ili LTR promotor Rous sarcoma virusa. Snažan ćelijski promotor koji se može korisno koristiti u izvođenju pronalaska je promotor gena citoskeleta, kao što je desmin promotor (Kwissa M. et al.), ili aktinski promotor (Miyazaki J. et al.). Funkcionalni sub-fragmenti ovih promotora, tj., delovi ovih promotora koji zadržavaju adekvatnu promotorsku aktivnost, uključeni su unutar predmetnog opisa, npr. skraćeni CMV-IE promotori prema WO 98/00166 ili US 6,156,567 i mogu biti korišćeni u izvođenju pronalaska. Promotor koristan u izvođenju pronalaska posledično može da obuhvata derivate i/ili subfragmente promotora pune dužine koji zadržavaju adekvatnu promotorsku aktivnost i stoga funkcionišu kao promotor, i koji mogu korisno da imaju promotosku aktivnost koja je značajno slična onoj od stvarnog promotora ili promotora pune dužine od koga je poreklom derivat ili subfragment, npr., slično aktivnosti skraćenih CMV-IE promotora US 6,156,567 u poređenju sa aktivnošću CMV-IE promotora pune dužine. Na taj način, CMV-IE promotor u izvođenju pronalaska može da sadrži ili se uglavnom sastoji od promotorskog dela promotora pune dužine i/ili pojačivačog dela promotora pune dužine, kao i njegovih derivata i/ili subfragmenata.
[0069] Povoljno, plazmidi sadrže ili se uglavnom sastoje od drugih kontrolnih elemenata ekspresije. Naročito je korisno obuhvatiti stabilizujuću sekvencu (sekvence), npr., intronsku sekvencu (sekvence), na primer, prvi intron hCMV-IE (WO 89/01036), intron II zečjeg βglobin gena (van Ooyen et al.). Kao za poliadenilacioni signal (polyA) za plazmide i virusne vektore osim oksvirusa, može se koristiti poly(A) signal gena goveđeg hormona rasta (bGH) (videti US 5,122,458), ili poly(A) signal gena zečjeg β-globina ili poly(A) signal SV40 virusa.
[0070] Uopštenije, predmetni pronalazak obuhvata in vivo ekspresione vektore uključujući bilo koji rekombinantni virusni vektor koji sadrži polinukleotid ili gen koji kodira jedan ili više ENV FeLV i/ili njegovih varijanti ili fragmenata, uključujući bilo koje elemente neophodne za njegovu in vivo ekspresiju.
[0071] Navedeni rekombinantni virusni vektori bi mogli biti izabrani od, na primer, poksvirusa, naročito avipox virusa, kao što su fowlpox virusi ili canarypox virusi. U jednom primeru izvođenja, fowlpox virus je TROVAC (videti WO 96/40241). U sledećem primeru izvođenja, canarypox vektor je ALVAC. Upotreba ovih rekombinantnih virusnih vektora i insercija polinukleotida ili gena od interesa su potpuno opisani u US 5,174,993; US 5,505,941 i US 5,766,599 za fowlpox, i u US 5,756,103 za canarypox. Više od jednog insercionog mesta unutar virusnog genoma moglo bi se koristiti za inserciju višestrukih gena od interesa.
[0072] U jednom primeru izvođenja virusni vektor je adenovirus, kao što je humani adenovirus (HAV) ili pseći adenovirus (CAV).
[0073] U sledećem primeru izvođenja virusni vektor je humani adenovirus, specifično adenovirus serotipa 5, napravljen nesposobnim za replikaciju delecijom u E1 regionu virusnog genoma, naročito od oko nukleotida 459 do oko nukleotida 3510 pomoću reference na sekvencu hAd5 otkrivenu u Genbank pod pristupnim brojem M73260 i u referentnoj publikaciji Chroboczek et al, 1992. Deletirani adenovirus je umnožen u E1-eksprimirajućim 293 (Graham et al., 1977) ili PER ćelijama, naročito PER.C6 (Falloux et al., 1998). Humani adenovirus može dodatno ili alternativno biti deletiran u E3 regionu, naročito od oko nukleotida 28592 do oko nuleotida 30470. Delecija u E1 regionu može biti izvedena u kombinaciji sa delecijom u E3 regionu (videti, npr. Shriver et al.; Graham et al.; Ilan et al.; SAD patenti br. 6,133,028 i 6,692,956; Tripathy et al.; Tapnell; Danthinne et al.; Berkner; Berkner et al.; Chavier et al.). Mesta insercije mogu biti E1 i/ili E3 lokusi (region) konačno posle delimične ili potpune delecije E1 i/ili E3 regiona. Korisno, kada je ekspresioni vektor -adenovirus, polinukleotid koji se eksprimira je inseriran pod kontrolom promotora funkcionalnog u eukariotskim ćelijama, kao što je snažan promotor, korisno neposredni rani genski promotor citomegalovirusa (CMV-IE promotor), naročito pojačivački / promotorski region od oko nukleotida -734 do oko nukleotida 7 u Boshart et al., ili pojačivački / promotorski region iz pCI vektora iz Promega Corp. CMV-IE promotor je povoljno mišjeg ili humanog porekla. Promotor elongacionog faktora 1α takođe može biti korišćen. Mišićni specifični promotor takođe može biti korišćen (Li et al.). Snažni promotori su takođe razmatrani ovde u vezi sa plazmidnim vektorima. U jednom primeru izvođenja, splajsing sekvenca može biti locirana nishodno od pojačivačkog / promotorskog regiona. Na primer, intron 1 izolovan iz CMV-IE gena (Stenberg et al.), intron izolovan iz zečjeg ili humanog gena za β-globin, naročpito intron 2 iz gena za β-globin, intron izolovan iz gena za imunoglobulin, splajsing sekvenca iz SV40 ranog gena ili himerna intronska sekvenca izolovana iz pCI vektora iz Promege Corp. Poly(A) sekvenca i terminatorska sekvenca može biti inserirana nishodno od polinukleotida koji se eksprimira, npr. gena za goveđi hormon rasta, naročito od oko nukleotida 2339 gena za β-globin ili poliadenilacionog signala SV40 kasnog gena.
[0074] U sledećem primeru izvođenja virusni vektor je pseći adenovirus, naročito CAV-2 (videti, npr. Fischer et al.; SAD patenti br. 5,529,780 i 5,688,920; WO 95/14102). Za CAV, inserciona mesta mogu biti u E3 regionu i/ili u regionu lociranom između E4 regiona i desnog ITR regiona (videti SAD patente br. 6,090,393 i 6,156,567). U jednom primeru izvođenja insert je pod kontrolom promotora, kao što je neposredni-rani genski promotor citomegalovirusa (CMV-IE promotor) ili promotor već opisan za humani adenovirusni vektor. Poly(A) sekvenca i terminatorska sekvenca mogu biti inserirane nishodno od polinukleotida koji se eksprimira, npr. gen goveđeg hormona rasta ili poliadenilacioni signal gena zečjeg βglobina.
[0075] U sledećem primeru izvođenja, virusni vektor je herpesvirus kao što je mačji herpesvirus (FHV). U jednom primeru izvođenja polinukleotid koji se eksprimira je inseriran pod kontrolom promotora funkcionalnog u promotoru funkcionalnom u eukariotskim ćelijama, povoljno CMV-IE promotora (mišjeg ili humanog). Poly(A) sekvenca i terminatorska sekvenca mogu biti inserirane nishodno od polinukleotida koji se eksprimira, npr. poliadenilacioni signal gena goveđeg hormona rasta ili zečjeg β-globina.
[0076] Za rekombinantne vektore na bazi poxvirus vektora, vaccinia virusa ili atenuiranog vaccinia virusa, (na primer, MVA, modifikovani Ankara soj dobijen posle više od 570 pasaža soja vakcine Ankara na fibroblastima embriona pileta; videti Stickl & Hochstein-Mintzel; Sutter et al.; dostupan kao ATCC VR-1508; ili NYVAC, videti US 5,494,807 i SAD patent br. 5,494,807 koji razmatraju konstrukciju NYVAC, kao i varijacije NYVAC sa dodatnim ORFs deletiranim iz genoma virusa vaccinia soja Copenhagen, kao i insercijom heterolognih molekula kodirajuće nukleinske kiseline u mesta ovog rekombinanta, i takođe, upotrebom poklapajućih promotora; videti takođe WO 96/40241), mogu se koristiti avipox virus ili atenuirani avipox virus (npr., canarypox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC ili TROVAC; videti, npr., SAD patente br. 5,505,941, 5,494,807). Atenuirani canarypox virusi su opisani u US 5,756,103 (ALVAC) i WO 01/05934. Referenca je takođe napravljena na US5,766,599 koja se odnosi na atenuirani fowlpox soj TROVAC. Referenca je napravljena na canarypox dostupan iz ATCC pod pristupnim brojem VR-111. Brojni sojevi vakcinacije fowlpox virusa su takođe dostupni, npr. DIFTOSEC CT soj koji prodaje MERIAL i NOBILIS VARIOLE vakcina koji prodaje INTERVET. Za informaciju o postupku korišćenom za generisanje njegovih rekombinanti i kako primenjivati njegove rekombinante, stručnjak iz date oblasti tehnike može da uputi na dokumente koji su ovde citirani i na WO 90/12882, npr., kao na vaccinia virus, koji se navodi u SAD patentima br. 4,769,330, 4,722,848, 4,603,112, 5,110,587, 5,494,807 i 5,762,938 inter alia; kao na fowlpox, navode se SAD patente br. 5,174,993, 5,505,941 i 5,766,599 inter alia; kao na canarypox, navodi se SAD patent br. 5,756,103 inter alia. Kada je ekspresioni vektor vaccinia virus, mesto ili mesta insercije za polinukleotid ili polinukleotide koji se eksprimiraju su povoljno na genu ili mestu insercije timidin kinaze (TK), genu ili mestu insercije hemaglutinina (HA), regionu koji kodira inkluziono telo A tipa (ATI); videti takođe dokumente koji su ovcde citirani, naročito one koji se odnose na vaccinia virus. U slučaju canarypox, povoljno su mesto ili mesta insercije jednaka ORF(s) C3, C5 i/ili C6; videti takođe dokumente koji su ovde citirani, naročito one koji se odnose na canarypox virus. U slučaju fowlpox, povoljno mesto ili mesta insercije su ORFs F7 i/ili F8; videti takođe dokumeta koja su ovde citirana, naročito ona koja se odnose na fowlpox virus. Mesto ili mesta insercije za MVA virus su povoljno kao u različitim publikacijama, uključujući Carroll M. W. Et al.; Stittelaar K. J. et al.; Sutter G. et al.; i, u tom smislu takođe je zabeleženo da je kompletni MVA genom opisan u Antoine G., Virology, koji omogućava stručnjaku iz date oblasti tehnike upotrebu drugih insercionih mesta ili drugih promotora. Povoljno, polinukleotid koji se eksprimira je inseriran pod kontrolom specifičnog poxvirus promotora, npr., vaccinia promotora 7.5 kDa (Cochran et al.), vaccinia promotora I3L (Riviere et al.), vaccinia promotora HA (Shida), cowpox promotora ATI (Funahashi et al.), vaccinia promotora H6 (Taylor J. et al.; Guo P. et al. J.; Perkus M. et al.), inter alia.
[0077] Bilo koji od polinukleotida koji su ovde otkriveni može biti eksprimiran in vitro pomoću DNK transfer ili ekspresionih vektora u pogodnu ćeliju domaćina. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Termin "ćelija domaćin" takođe obuhvata bilo koje potomtsvo ćelije domaćina subjekta. Postupci stabilnog transfera, koji znače da je strani polinukleotid kontinuirano održavan u ćeliji domaćinu, su poznati u stanju tehnike. Ćelije domaćini mogu da obuhvataju bakterije (na primer, Escherichia coli), kvasac, ćelije insekata i ćelije kičmenjaka. Postupci za ekspresiju DNK sekvenci u eukariotskim ćelijama su dobro poznati u stanju tehnike. Kao postupak za in vitro ekspresiju, rekombinantni Baculovirus vektori (na primer, Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV)) mogu biti korišćeni sa nukleinskim kiselinama koje su ovde otkrivene. Na primer, polihedrin promotori mogu biti korišćeni sa ćelijama insekata (na primer, Spodoptera frugiperda ćelijama, kao Sf9 ćelije dostupne na ATCC pod pristupnim brojem CRL 1711, ili Sf21 ćelije) (videti na primer, Smith et al.; Pennock et al.; Vialard et al.; Verne A.; O’Reilly et al.; Kidd I. M. & Emery V.C.; EP 0370573; EP 0265785; US 4,745,051). Za ekspresiju, može se koristiti BaculoGold Starter Package (Cat # 21001K) iz Pharmingen (Becton Dickinson). Kao pstupak za in vitro ekspresiju, rekombinantna E. coli može se koristiti sa vektorom. Na primer, kada se kloniranje izvodi u bakterijskim sistemima, mogu se koristiti inducibilni promotori kao što je promotor arabinoze, pL bakteriofaga lambda, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibridni promotor), i slično. Transformacija ćelije domaćina sa rekombinantnom DNK može se izvesti pomoću konvencionalnih tehnika koje su dobro poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike. Tamo gde je domaćin prokariotski, kao što je E. coli, kompetentne ćelije koje su sposobne za unos DNK mogu biti pripremljene od ćelija sakupljenih posle faze eksponencijalnog rasta i zatim tretirane pomoću CaCl2postupka upotrebom postupaka dobro poznatih u stanju tehnike. Alternativno, mogu se koristiti MgCl2ili RbCl. Transformacija takođe može biti izvedena elektroporacijom. Kada je domaćin eukariot, takvi postupci transdukcije DNK kao kalcijum fosfat koprecipitati, mogu se koristiti konvencionalni mehanički postupci kao što su mikroinjekcija, elektroporacija, insercija plazmida obuhvaćenog u lipozome, ili virusni vektori. Eukariotske ćelije takođe mogu biti kotransformisane sa L. Iongipalpis polinukleotidnim sekvencama i drugim stranim DNK molekulom koji kodira selektabilni fenotip, kao što je gen timidin kinaze herpes simplex. Sledeći postupak je koristiti eukariotski virusni vektor (videti u prethodnom tekstu), kao što je herpes virus ili adenovirus (na primer, pseći adenovirus 2), za prolaznu transdukciju eukariotskih ćelija i eksprimiranje proteina (Gluzman EA). Pored toga, može se koristiti transfekciono sredstvo, kao što je dioleoilfosfatidil-etanolamin (DOPE).
[0078] Izolacija i prečišćavanje rekombinantno eksprimiranog polipeptida može se izvesti konvencionalnim sredstvima uključujući preparativnu hromatografiju (na primer, ekskluzionu prema veličini, jono-izmenjivačku, afinitetnu), selektivnu precipitaciju i ultra-filtraciju. Primeri tehnika iz stanja tehnike koji se mogu koristiti, ali bez ograničenja na, mogu se naći u "Protein Purification Applications", Second Edition, Edited by Simon Roe i dostupni su u Oxford University Press. Takav rekombinantno eksprimirani polipeptid je deo predmetnog otkrića. Postupci za proizvodnju bilo kog polipeptida prema predmetnom opisu kao što je opisan u prethodnom tekstu su takođe obuhvaćeni, naročito upotreba rekombinantnog ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid prema otkriću i ćelije domaćina.
[0079] Vakcine koje sadrže rekombinantne virusne vektore prema pronalasku mogu biti osušene zamrzavanjem, povoljno sa stabilizatorom. Sušenje zamrzavanjem može se izvesti prema dobro poznatim standardnim postupcima sušenja zamrzavanjem. Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi stabilizatori mogu biti ugljeni hidrati (npr. sorbitol, manitol, laktoza, saharoza, glukoza, dekstran, trehaloza), natrijum glutamat (Tsvetkov T et al.; Israeli E et al.), proteini kao što su pepton, albumin, laktalbumin ili kazein, sredstva koja sadrže protein kao što je obrano mleko (Mills C K et al.; Wolff E et al.) i puferi (npr. fosfatni pufer, fosfatni pufer alkalnog metala). Ađuvans može biti korišćen za pripremu rastvorljivih preparata osušenih zamrzavanjem.
[0080] Bilo koja kompozicija vakcine prema pronalasku takođe može povoljno da sadrži jedan ili više ađuvanasa.
[0081] Vakcine na bazi plazmida mogu biti formulisane sa katjonskim lipidima, povoljno sa DMRIE (N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloksi)-1-propanamonijum; WO96/34109), i povoljno u vezi sa neutralnim lipidom, na primer DOPE (dioleoil-fosfatidiletanolamin; Behr J. P.), u cilju formiranja DMRIE-DOPE. U jednom primeru izvođenja, smeša je pripremljena ex tempore, i pre njegove primene povoljno je sačekati oko 10 min do oko 60 min, na primer, oko 30 min, za odgovarajuću smešu. Kada je korišćen DOPE, molarni odnos DMRIE/DOPE može biti od 95/5 do 5/95 i povoljno je 1/1. Maseni odnos plazmida/DMRIE ili DMRIE-DOPE ađuvans je, na primer, od 50/1 do 1/10, od 10/1 do 1/5 ili od 1/1 do 1/2.
[0082] Izborno citokin može biti dodat u kompoziciju, naročito GM-CSF ili citokini koji indukuju Th1 (npr. IL12). Ovi citokini mogu biti dodati u kompozicju kao plazmid koji kodira protein citokina. U jednom primeru izvođenja citokini su poreklom od pasa, npr. pseći GMCSF čija je genska sekvenca deponovana u GenBank bazi podataka (pristupni broj S49738). Ova sekvenca može biti korišćena za stvaranje navedenog plazmida na način sličan onome koje je pripremljen u WO 00/77210.
[0083] Rekombinantna vakcina na bazi virusnog vektora može biti kombinovana sa fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanin; US 6,017,537) i/ili karbomer ađuvansom (Phameuropa Vol. 8, No.2, June 1996). Stručnjaci iz date oblasti tehnike mogu takođe da se upute na US 2,909,462, koji opisuje takve akrilne polimere unakrsno vezane sa polihidroksilovanim jedinjenjem koje ima najmanje 3 hidroksil grupe, povoljno ne više od 8, atomi vodonika od najmanje tri hidroksila su zamenjeni nezasićenim alifatičnim radikalima koji imaju najmanje 2 atoma ugljenika. Na primer, radikali su oni koji sadrže od 2 do 4 atoma ugljenika, npr. vinili, alili i ostale etilenski nezasiće grupe. Nezasićeni radikali mogu sami da sadrže druge supstituente, kao što je
metil. Proizvodi koji se prodaju pod nazivom CARBOPOL® (BF Goodrich, Ohio, USA) su odgovarajući. Proizvodi su unakrsno vezani sa alil saharozom ili sa alil pentaeritritolom. Pored ostalih, povoljno se može navesti CARBOPOL® 974P, 934P i 971P.
[0084] Među kompolimerima anhidrida maleinske kiseline i alkenin derivatom, povoljni su kopolimeri EMA® (Monsanto) koji su kopolimeri anhidrida maleinske kiseline i etilen, linearni ili unakrsno vezani, na primer unakrsno vezan sa divinil etrom. Referenca se može napraviti na J. Fields et al.
[0085] Polimeri akrilne i metakrilne kiseline i kopolimeri EMA® su formirani, na primer, od osnovnih jedinica sledeće formule u kojoj:
- R1i R2, koji su identični ili različiti, predstavljaju H ili CH3
- x = 0 ili 1, poželjno x = 1
- y = 1 ili 2, sa x y = 2
[0086] Za kopolimere EMA®, x = 0 i y = 2. Za karbomere, x = y =1.
[0087] Rastvaranje ovih polimera u vodi dovodi do kiselog rastvora, koji je neutralizovan, povoljno do fiziološke pH, u cilju obezbeđivanja rastvora ađuvansa u koji je inkorporisana sama vakcina. Karboksil grupe polimera su zatim delimično u COO- obliku.
[0088] U jednom primeru izvođenja, rastvor ađuvansa, naročito karbomera (Pharmeuropa, vol. 8, No.2, June 1996), je pripremljen u destilovanoj vodi, povoljno u prisustvu natrijum hlorida, pri čemu je dobijeni rastvor na kiseloj pH. Ovaj stok rastvor je razblažen njegovim dodavanjem u željenu količinu (za dobijanje željene krajnje koncentracije), ili njen značajan deo, vode napunjene sa NaCl, povoljno fiziološkim rastvorom (NaCl 9 g/1) odjednom celu količinu u nekoliko porcija sa istovremenom ili kasnijom neutralizacijom (pH 7.3 do 7.4), povoljno sa NaOH. Ovaj rastvor na fiziološkoj pH je korišćen za mešanje sa vakcinom, koji može biti naročito čuvan u obliku osušenom zamrzavanjem, tečnom ili zamrznutom obliku.
[0089] Koncentracija polimera u krajnjoj kompoziciji vakcine može biti od 0.01% do 2% tež./zapr., od 0.06 do 1% tež./zapr., ili od 0.1 do 0.6% tež./zapr.
[0090] Subjedinična vakcina može biti kombinovana sa ađuvansima, kao što su ulje-u-vodi, voda-u-ulju-u-vodi emulzije na bazi mineralnog ulja i/ili biljnog ulja i nejonski surfaktanti kao što su blok kopolimeri, TWEEN®, SPAN®. Takve emulzije su posebno one opisane na stranici 147 u "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995, ili TS emulzije, posebno TS6 emulzija i LF emulzije, posebno LF2 emulzija (za TS i LF emulzije, videti WO 04/024027). Ostali pogodni ađuvansi su na primer vitamin E, saponini i CARBOPOL® (Noveon; videti WO 99/51269; WO 99/44633), aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol.6, 1995), biološkji ađuvansi (tj. C4b, posebno mišji C4b (Ogata R T et al.) ili konjski C4b, GM-CSF, posebno konjski GM-CSF (US 6,645,740)), toksini (tj. toksini kolere CTA ili CTB, Escherichia coli toksini osetljivi na toplotu, LTA ili LTB (Olsen C W et al.; Fingerut E et al.; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.) i CpG (tj. CpG #2395 (videti Jurk M et al.), CpG #2142 (videti SEQ. ID. NO: 890 u EP 1,221,955).
[0091] Kompozicija ili vakcina takođe može da obuhvata ili sadrži jedan ili više FeLV antigena, na primer, ENV ili ENV i GAG, ili ENV i GAG i PRO gen.
[0092] Kompozicija ili vakcina takođe može biti povezana sa najmanje jednim FeLV antigenom, na primer inaktiviranim FeLV. U posebnom primeru izvođenja, soj FeLV može biti soj FeLV tipa A, ili kombinacija FeLV tipa A i tipa B, ili kombinacija FeLV tipa A i tipa C, ili kombinacija sojeva tipa A, tipa B i tipa C. Ovi sojevi FeLV mogu biti inaktivirani pomoću hemijskih ili fizičkih postupaka. Hemijski postupci su posebno BPL, formaldehid.
Fizički postupci mogu posebno biti ultrazvučna obrada. Jedan postupak za inaktivaciju FeLV za upotrebu u vakcini je opisan u R. Cordeiro Giunchetti et al., Vaccine, 2007. Inaktivirana FeLV vakcina može biti kombinovana sa ađuvansima, kao što su oni opisani prethodno za subjedinične vakcine.
[0093] Ovde su opisani postupci za vakcinaciju domaćina protiv FeLV upotrebom kompozicija vakcine opisanih ovde.
[0094] Domaćin može biti bilo koji ili sve od mačaka (na primer, domestifikovanih mačaka, mačića, velikih mačaka i divljih mačaka). U jednom porimeru izvođenja, domaćin je mačka.
[0095] Putevi primene mogu biti, na primer, intramuskularni (IM) ili intradermalni (ID) ili transdermalni (TD) ili subkutani (SC). Sredstva primene mogu biti, na primer, špric sa iglom ili aparat bez igle, ili špric sa iglom spojenom za elektrotransfer (ET) tretman, ili aparat bez igle spojen sa ET tretmanom.
[0096] Sledeći aspekt prema pronalasku se odnosi na upotrebu vakcine na bazi plazmida prema predmetnom pronalasku za primenu na domaćina, pri čemu je ova primena spojena sa ET tretmanom. Primena vakcine na bazi plazmida je povoljno intramuskularna. Sredstvo primene je, na primer, špric i igla. Jedna ili nekoliko injekcija mogu biti primenjene uzastopno. U slučaju nekoliko injekcija, one mogu biti izvedene sa razmakom od 2 do 6 nedelja, na primer, sa razmakom od oko 3 nedelje. U jednom primeru izvođenja, polu-godišnji buster ili godišnji buster je dalje primenjen.
[0097] Za vakcine na bazi plazmida, povoljni putevi primene mogu biti ID ili IM. Ova primena može biti preko upotrebe šprica sa iglom ili sa aparatom bez igle kao što je Dermojet ili Biojector (Bioject, Oregon, USA) ili Vetjet™ (Merial) ili Vitajet™ (Bioject Inc.), videti US 2006/0034867. Doza može biti od 50 µg do 500 µg po plazmidu. Kada je dodat DMRIE-DOPE, može se koristiti 100 µg po plazmidu. Kada se koristi GM-CSF ili drugi citokini, plazmid koji kodira ovaj protein može biti prisutan u dozi od oko 200 µg do oko 500 µg i može biti 200 µg. Zapremina doza može biti između 0.01 ml i 0.5 ml, na primer, 0.25 ml. Primena može biti obezbeđena sa višestrukim tačkama injekcije.
[0098] Alternativno, vakcine na bazi plazmida mogu biti primenjivane preko IM puta zajedno sa elektrotransfer (ET) tretmanom. ET tretman može biti izveden upotrebom aparata za elektrotransfer i specifikacija proizvođača (tj. Sphergen G250 generator (Sphergen SARL, Evry Genopole, France); MedPulser® DNK elektroporacioni sistem (Innovio Biomedical Corporation, San Diego, California, USA)). U jednom primeru izvođenja, aparat za elektrotransfer ima unipolarno polje. Intenzitet polja može biti od oko 50 do oko 250 V/cm, od oko 50 do oko 200 V/cm, ili od oko 50 do oko 175 V/cm. Trajanje pulsa može biti od oko 1 do oko 50 msek, ili od oko 15 do oko 25 msek. Učestalost može biti od oko 1 do oko 50 Hz, ili od oko 5 do oko 15 Hz. Interpulsni interval može biti od oko 1 do 1000 msek, ili od oko 1 do oko 200 msek. Broj pulseva može biti od 1 do 20, ili od 5 do 10. Intra-tkivni intenzitet može povoljno biti do oko 2 A. Udaljenost između elektroda može biti od oko 0.2 do oko 1 cm, ili od oko 0.2 do oko 0.5 cm.
[0099] Za rekombinantne vakcine na bazi virusnih vektora, putevi primene mogu povoljno biti SC ili IM ili TD ili ID. Ova primena može biti izvedena pomoću šprica sa iglom ili sa paratom bez igle kao što je Dermojet ili Biojector (Bioject, Oregon, USA) ili Vetjet™ (Merial) ili Vitajet™ (Bioject Inc.). Doza može biti od oko 10<3>pfu do oko 10<9>pfu po rekombinantnom poxvirus-nom vektoru. Kada je vektor canarypox virus, dotza može biti, na primer, od oko 105 pfu do oko 109 pfu, od oko 106 pfu do oko 108 pfu, ili od oko 106 pfu do oko 107 pfu. Zapremina doza može biti od oko 0.01 ml do 0.2 ml, i povoljno je 0.1 ml. Primena može da sadrži višestruke tačke injekcije.
[0100] Za IM put obezbeđenba zapremina vakcine može biti od 0.2 do 2 ml, naročito od oko 0.5 do 1 ml. Iste doze su korišćene za bilo koje od vektora prema predmetnom pronalasku.
[0101] Za sub-jedinične vakcine, put primene može povoljno biti preko SC ili IM ili TD ili ID. Ova primena može biti izvedena pomoću šprica sa iglom ili sa aparatom bez šprica kao što je Dermojet ili Biojector (Bioject, Oregon, USA) ili Vetjet™ (Merial) ili Vitajet™ (Bioject Inc.). Doza može biti od oko 50 do oko 500 µg, naročito od oko 50 do oko 150 µg, i naročito od oko 50 do oko 100 µg. Obezbeđena zapremina subjedinične vakcine je od 0.2 do 2 ml, naročito od oko 0.5 do 1 ml.
[0102] Ovde je opisana strategija vakcine, koja je zasnovana na režimu primene prajming bustera, gde prva-primena i buster primena (primene) koriste kompoziciju koja sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv ekscipijens, razblaživač ili vehikulum i in vivo ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu, koja sadrži i eksprimira polipeptid FeLV i/ili njegove varijante ili fragmente.
[0103] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu in vivo ekspresioni vektora u prajminbuster režimu primene, koji sadrži prvu primenu vakcine koja sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens, in vivo ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu za ekspresiju, in vivo, FeLV polipeptida i/ili njihovih varijanti ili fragmenata, nakon čega sledi buster primena vakcine koja sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum ili ekscipijens, in vivo ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu za ekspresiju, in vivo, polipeptida FeLV i/ili njihovih varijanti ili fragmenata kao što je opisano u prethodnom tekstu, za zaštitu domaćina od FeLV i/ili za prevenciju napredovanja bolesti kod inficiranih domaćina.
[0104] „Prime-boost“ režim sadrži najmanje jednu prvu-primenu i najmanje jednu buster primenu upotrebom najmanje jednog uobičajenog polipeptida i/ili njegovih varijanti ili fragmenata. Vakcina korišćena u prvoj primeni može biti različita po prirodi od onih korišćenih kao kasnija buster vakcina. Prva primena može da sadrži jednu ili više primena. Slično, buster primena može da sadrži jednu ili više primena.
[0105] Putevi primene, doze i zapremine su kao što su prethodno ovde otkriveni.
[0106] „Prime-boost“ primene mogu se povoljno izvesti sa razmakom od 2 do 6 nedelja, na primer, sa razmakom od oko 3 nedelje. Prema jednom primeru izvođenja, polu-godišnji buster ili godnišnji buster, povoljno upotrebom vakcina na bazi virusnog vektora, takođe je predviđen. Životinje mogu biti starosti najmanje 6 do 8 nedelja u vreme prve primene.
[0107] U jednom primeru izvođenja, „prime-boost“ režim primene sadrži najmanje jednu prvu primenu vakcine na bazi plazmida prema predmetnom pronalasku i najmanje jednu buster vakcinu vakcine na bazi rekombinantnoig virusnog vektora prema predmetnom pronalasku.
[0108] U sledećem primeru izvođenja, „prime-boost“ režim primene sadrži najmanje jednu prvu primenu vakcine na bazi rekombinantnog virusnog vektora prema predmetnom pronalasku i najmanje jednu buster primenu subjedinične vakcine prema predmetnom pronalasku.
[0109] U sledećem primeru izvođenja, „prime-boost“ režim primene sadrži najmanje jednu prvu primenu vakcine na bazi rekombinantnog virusnog vektora prema predmetnom pronalasku i najmanje jednu buster primenu vakcine na bazi plazmida prema predmetnom pronalasku.
[0110] Ovde je opisan postupak za vakcinaciju subjekta koji je podložan FeLV koji sadrži „prime-boost“ režim primene, pri čemu navedeni režim sadrži prvu primenu vakcine ili kompozicije koja sadrži, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom vehikulumu, razblaživač ili ekscipijens, plazmid koji sadrži polinukleotid za ekspresiju, in vivo, FeLV polipeptida, varijantu ili fragment FeLV polipeptida, ili njihovu smešu, nakon čega sledi buster primena vakcine koja sadrži, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom vehikulumu ili ekscipijensu, rekombinantni virusni vektor koji sadrži polinukleotid za ekspresiju, in vivo, istog FeLV polipeptida (jednog ili više), njegove varijante, njegovog fragmenta, za zaštitu subjekta od FeLV i/ili za prevenciju napredovanja bolesti kod inficiranog subjekta.
[0111] Ovde je opisan postupak za vakcinaciju subjekta podložnog na FeLV koji sadrži „prime-boost“ režim primene, pri čemu navedeni režim sadrži prvu primenu vakcine ili kompozicije koja sadrži, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom vehikulumu, razblaživaču ili ekscipijensu, rekombinantni virusni vektor koji sadrži polinukleotid za ekspresiju, in vivo, FeLV polipeptid, varijantu ili fragment FeLV polipeptida, ili njihovu smešu, nakon čega sledi buster primena vakcine koja sadrži, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom vehikulumu ili eskcipijensu, plazmid koji sadrži polinukleotid za ekspresiju, in vivo, FeLV polipeptida (jednog ili više), njegove varijante, njegovog fragmenta, za zaštitu subjekta od FeLV i/ili za prevenciju napredovanja bolesti kod inficiranog subjekta.
[0112] Ovde je opisan postupak za vakcinaciju subjekta podložnog FeLV koji sadrži „primeboost“ režim primene, pri čemu navedeni režim sadrži prvu primenu vakcine ili kompozicije koja sadrži, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom vehikulumu, razblaživaču ili ekscipijensu, rekombinantni virusni vektor koji sadrži polinukleotid za ekspresiju, in vivo, FeLV polipeptida, varijante ili fragmenta FeLV polipeptida ili njihove smeše, nakon čega sledi buster primena vakcine koja sadrži, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom vehikulumu ili ekscipijensu, isti FeLV polipeptid (polipeptide), njegovu varijantu, njegov fragment, za zaštitu subjekta od FeLV i/ili za prevenciju napredovanja bolesti kod inficiranog subjekta.
[0113] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na komplet za „prime-boost“ vakcinaciju prema predmetnom pronalasku. Komplet može da sadrži najmanje dve bočice: prvu bočicu koja sadrži vakcinu za prvu vakcinaciju prema predmetnom pronalasku, i drugu bočicu koja sadrži vakcinu za buster vakcinaciju prema predmetnom pronalasku. Komplet može povoljno da sadrži dodatnu prvu ili drugu bočicu za dodatne prve vakcinacije ili dodatne buster vakcinacije.
[0114] U jednom primeru izvođenja, komplet može da sadrži dve bočice, jednu koja sadrži vakcinu na bazi plazmida za prvu vakcinaciju prema predmetnom pronalasku, drugu bočicu koja sadrži vakcinu na bazi rekombinantnog virusnog vektora za buster vakcinaciju prema predmetnom pronalasku.
[0115] U sledećem primeru izvođeja, komplet može da sadrži dve bočice, jednu koja sadrži vakcinu na bazi rekombinantnog virusnog vektora za prvu vakcinaciju prema predmetnom pronalasku, drugu bočicu koja sadrži subjediničnu vakcinu za buster vakcinaciju prema predmetnom pronalasku.
[0116] U sledećem primeru izvođenja, komplet može da sadrži dve bočice, jednu koja sadrži vakcinu na bazi rekombinantnog virusnog vektora za prvu vakcinaciju prema predmetnom pronalasku, drugu bočicu koja sadrži vakcinu na bazi plazmida za buster vakcinaciju prema predmetnom pronalasku.
[0117] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih primera.
PRIMERI
[0118] Bez dalje elaboracije, veruje se da stručnjak iz date oblasti tehnike može, upotrebom prethodnih opisa, izvesti predmetni pronalazak u njegovom najpunijem obimu. Sledeći detaljni primeri bi trebalo da se tumače samo kao ilustrativni, i ne kao ograničenja prethodnog otkrića ni na koji način. Stručnjaci iz stanja tehnike će brzo da prepoznaju odgovarajuće varijacije od postupaka kako u vezi reaktanata tako i u vezi reakcionih uslova i tehnika.
[0119] Konstrukcija DNK inserta, plazmida i rekombinantnih virusnih ili biljnih vektora je izvedena upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije opisanih od strane J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Svi restrikcioni fragmenti korišćeni za predmetni pronalazak izolovani su upotrebom "Geneclean" kompleta (BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.).
Primer 1 Konstrukcija pH6C5env plazmida pPB713
Konstrukcija pH6C5env - pCXL208.2, C5 insercionog plazmida za generisanje FeLV-ENV/ALVAC(2) rekombinanata
[0120] ALVAC(1) rekombinantni virus koji sadrži FeLV ENV inseriran na C5 lokusu i GAG/POL (+T5NT) inseriran na C3 lokusu (vlasnički materijal od Merial-a) korišćen je za amplifikaciju FeLV ENV gena. Prajmeri 7862CXL i 7847CXL su korišćeni za PCR amplifikaciju.
[0121] Amplifikovani PCR fragment (2.1Kb) sadrži FeLV ENV gen, H6 promotor neposredno ushodno od ENV i T5NT sekvencu, nakon koje sledi stop kodon ENV. PCR fragment je zatim digestiran sa XhoI/BamHI i ligatiran za XhoI/BamHI digestirani pH6C5ALVAC donorski plazmid (vlasnički materijal od Merial-a) za generisanje pCXL208.2, čija je sekvenca potvrđena.
[0122] Plazmidna mapa pCXL208.2 i njegova sekvenca su prikazani na Slikama 2 i 3.
Konstrukcija pH6C5env plaszida pPB713
[0123] FeLV ENV je glikozilovan i skraćen tako da proizvodi glikoprotein gp70 ENV i p15E ENV. Proteinska sekvenca mutiranog FeLV ENV gena soja 82K je prikazana na Slici 5. Mutacija je supstitucija Arg za Glu na položaju 527 FeLV ENV gena.
[0124] Plazmid pHCMV- ENV FeLV je primljen iz Institut Gustave-Roussy (Villejuif, France). Obezbeđena sekvenca mutiranog FeLV ENV fragmenta (SEQ ID NO:3) sadrži 5 mutacija (u nukleotidima) poređenjem sa referentnom sekvencom (Glasgow, GenBank pristupni br. M12500, SEQ ID NO:35). Među pet nukleotidnih mutacija, dve mutacije su tihe mutacije (bez aminokiselinske promene), ali su uvele novo restrikciono mesto (= FspI); tri mutacije su uvele mutaciju u aminokiselinskoj sekvenci FeLV ENV (Arg umesto Glu; kao što je prikazano na Slici 5, SEQ ID NO:4).
[0125] Plazmid phCMV-ENV FeLV je digetiran sa RsrII/SacII da bi se generisao RsrII-SacII fragment (fragment B: 520 bp). Plazmid pCXL208.2 je digestiran sa RsrII/SacII da bi se generisao RsrII-SacII fragment (fragment A: 6231 bp). Fragmenti A i B su ligatirani tako da stvaraju plazmid pPB713 (6756 bp). Identitet pPB713 je potvrđen pomoću FspI digestije. Restrikciona mapa pPB713 i pPB713 sekvence su prikazani na slici 4.
Konstrukcija pH6C5env plazmida pPB712
[0126] Plazmid PhCMV-ENV FeLV je digestiran sa RsrII/SacII da bi se generisao RsrII-SacII fragment (fragment A: 520 bp). Plazmid pPB575 (vlasnički materijal od Merial-a) je digestiran sa RsrII/SacII da bi se generisao RsrII-SacII fragment (fragment B: 5971 bp). Fragmenti A i B su ligatirani da bi se generisao plazmid pPB712 (6496 bp). Identitet PB712 je potvrđen pomoću EcoRI digestije. Sekvenca mutiranog regiona FeLV prisutnog u pPB712 klonu je kontrolisana pomoću DNK sekvenciranja (Cogenics, France) sa univerzalnim M13 prajmerom i reverznim M13 prajmerom. Dva kandidata su izabrana (n°1 i n°2). Sekvence 2 klona su bile identične, ali su se razlikovale od SEQ ID NO:4 (jedna aminokiselinska mutacija Glu u Arg). Postoji osam nukleotidnih mutacija, koje dovode do samo jedne aminokiselinske promene. Poređenja DNK i proteinske sekvence između mutiranog FeLV (SEQ ID NO:1) u pPB712 i mutiranog FeLV (SEQ ID NO:3) u pHCMV-ENV FeLV prikazana su na Slici 5. Poređenje sekvence FeLV ENV proteina različitih sojeva prikazano je na slici 5.
Primer 2 Konstrukcija C3 ALVAC donorskog plazmida za generisanje ALVAC rekombinantnog eksprimirajućeg FeLV kodon optimizovanog GAG-PRO
[0127] Kodon-optimizovani gen GAG-PRO FeLV (virusa mačje leukemije) korišćen je u pripremi vCP2294. Hen GAG-PRO FeLV je optimizovan za gensku ekspresiju u sisarskim ćelijama. Poređenje sekvence na nivou DNK između kodon-optimizovanog gena GAG-PRO (SEQ ID NO:10) i divljeg tipa gena gap-pro (Genbank pristupni br. M18247, SEQ ID NO:11) je prikazano na Slici 7.
[0128] Konstrukciona šema je navedena na Slici 8. Plazmid pJY1320.1 (vlasnički materijal od Merial-a) koji sadrži H6p-FeLV kodon optimizovanu GAG-PRO kasetu je korišćen kao obrazac za PCR amplifikaciju. H6p je H6 promotor Vaccinia virusa. Prajmeri 13301JY i 13302JY su korišćeni za PCR amplifikaciju. PCR fragment je kloniran u pCR2.1-TOPO vektor. Rezultujući plazmid pJY1857.5 je sekvenciran i potvrđeno je da ima ispravne sekvence H6p-FeLV GAG-PRO. U cilju konstrukcije pC3 FeLV H6p-GAG-PRO NruI/SpeI DNK fragment, koji sadrži 3’-delimični H6 promotor i GAG-PRO pune dužine, je izolovan iz pJY1857.5 i ligatiran za Nru I/Spe I digestirani pJY1738.2 (vlasnički materijal od Merial-a) da bi se stvorio pJY1874.1 (kao što je prikazano na Slikama 9, 10 i 11), za koji je potvrđeno da ima ispravne sekvence.
Direktni prajmer 13301JY (SEQ ID NO:13)
Obrnuti prajmer 13302JY (SEQ ID NO :14)
[0129] U ćelijama inficiranim sa FeLV, GAG-PRO je proizveden pomoću čitanja. GAG je dalje odcepljen do MA (p15), CA (p30) i NC proteina u toku kasnijeg stadijuma sklapanja virusa.
Primer 3. Generisanje i karakterizacija ALVAC rekombinanta koji sadrži H6p FeLV kodon optimizovani GAG-PRO inseriran u C3 lokus od ALVAC (vFP2294)
[0130] IVR (in vitro rekombinant) je izveden transfekcijom primarnih ćelija fibroblasta embriona pileta (1°CEF) sa 10 µg Not I-linearizovanog donorskog plazmida pJY1874.1 upotrebom FuGENE-6® reagensa (Roche). Primarne ćelije fibroblasta embriona pileta (1°CEF) korišćene za in vitro rekombinaciju gajene su u 10% FBS (JRH: γ-zračene # 12107-500M), DMEM (BRL/Gibco#11960-051 ili 11960-044) dopunjene sa 4 mM glutaminom (BRL/Gibco#25030-081) i 1 mM natrijum piruvatom (BRL/Gibco#11360-070) u prisustvu 1x antibiotika/antimikotika (P/S/A/A, BRL/Gibco#15240-062). Transficirane ćelije su kasnije inficirane sa ALVAC kao spašavajućim virusom na MOI (multiplicitet infekcije) od 10 (ALVAC #HM1372 07 Apr 04). Posle 24 časa, transficirane-inficirane ćelije su sakupljene, ultrazvučno obrađene i korišćene za skrining rekombinantnog virusa.
[0131] Rekombinantni plakovi su ispitivani na osnovu postupka „lift hybridization“ upotrebom 1.4 kb FeLV GAG specifične probe obeležene renovom peroksidazom (HRP) prema protokolu proizvođača (Amersham Cat# RPN3001). Posle pet uzastopnih rundi prečišćavanja plaka, rekombinant označen kao vCP2294.1.1.1.1.1 je generisan i potvrđen pomoću hibiridizacije kao 100% pozitivan za FeLV GAG insert i 100% negativan za C3 ORF.
[0132] Jedan plak je izabran iz pete runde prečišćavanja plaka i proširen da bi se dobio P1 (1x T25 posuda), P2 (1xT75 posuda) i P3 (6 x roler boce). Tečnost inficirane ćelijske kulture iz roler boca je sakupljena i koncentrovana da bi se proizveo stok virusa vCP2294.1.1.1.1.1.
[0133] Šema za generisanje rekombinantnog vCP2294 je prikazana na Slici 12.
Analiza rekombinanta: sledeće analize su izvedene na P3 stokovima.
Potvrđivanje genetičke čistoće
[0134] P3 stokovi su ponovo potvrđeni hibridizacijom, kao 100% pozitivni za FeLV GAG i 100% negativni za C3 ORF.
Genomska analiza
[0135] Genomska DNK iz vCP2294.1.1.1.1.1 je ekstrahovana, digestirana sa BamHI, HindIII ili Pst I i propuštena na 0.8% agarozni gel. Gel sa BamHI, HindIII ili PstI digestiranom genomskom DNK je prebačen u najlonsku membranu i Southern blot analiza je izvedena sondiranjem sa 1.4 kb FeLV GAG probom. Višestruke trake su zabeležene na očekivanim veličinama, što ukazuje na ispravnu inserciju FeLV GAG-PRO gena u C3 lokus.
Ekspresiona analiza
1) Western blot
[0136] Primarne CEF ćelije su inficirane sa P3 stokom vCP2294.1.1.1.1.1 na MOI od 10 i inkubirane na 37°C u trajanju od 24 časa. Supernatant kulture i ćelije su zatim sakupljeni. Ćelijski talog je liziran sa Reporter Gene Assay Lysis Buffer proizvedenim od strane Roche (kat. 1 897 675). Supernatant i lizat su pripremljeni sa NuPage® sistemom sa dodatnim antioksidansom. Proteini su odvojeni na NuPage® 10% Bis-Tris Pre-cast gelu, i zatim prebačeni u PVDF membranu. Anti FeLV GAG antitela su otkrila ~70kDa protein detektovan u supernatantu i ćelijskom talogu, i ~57 kDa protein, koji je detektovan samo u ćelijskom talogu.
2) Analiza imuno-plaka
[0137] Homogenost populacije je bila 100% pozitivna za FeLV GAG protein za rekombinantni vCP2294.1.1.1.1.1 kao što je dokazano analizom imuno-plaka, upotrebom anti-FeLV GAG antitela.
Analiza sekvence
[0138] Detaljnija analiza P3 stok genomske DNK je izvedena pomoću PCR amplifikacije i analize sekvence flankirajućih grana C3 lokusa i FeLV inserta. Prajmeri 8103JY i 8104JY, locirani izvan grana C3 lokusa u ALVAC genomu su korišćeni za amplifikaciju celog C3L-FeLV-C3R fragmenta. Rezultati su pokazali da sekvence FeLV inserta i C3L i C3R od ALVAC su ispravne.
[0139] Prajmeri za amplifikaciju FeLV GAG probe:
[0140] Prajmeri za PCR amplifikaciju C3L-FeLV GAG-PRO kasete-C3R:
[0141] Slika 13 prikazuje mapu C3 regiona vCP2294 koja prikazuje lokacije prajmera. vCP2294 sekvenca je prikazana na Slici 14.
Primer 4 Generisanje i karakterizacija ALVAC rekombinanta koji sadrži FeLV modifikovani ENV gen inseriran na C5 lokusu od vCP2294, ALVAC C3 H6p FeLV kodon optimizovani GAG-PRO - vCP2296
[0142] IVR je izveden transfekcijom 1°CEF ćelija sa 10 µg Not I-linearizovanog donorskog plazmida pPB713 upotrebom FuGENE-6® reagensa (Roche). Transficirane ćelije su zatim inficirane sa vCP2294 (ALVAC C3 H6p FeLV kodon-optimizovani GAG-PRO, Primer 2) kao spašavajućim virusom na MOI od 10. Posle 24 časa, transficirane inficirane ćelije su sakupljene, ultrazvučno obrađene i korišćene za skrining rekombinantnog virusa.
[0143] Rekombinantni plakovi su ispitivani na bazi metode „lift hybridization“ upotrebom 503 bp FeLV ENV specifične probe obeležene renovom peroksidazom (HRP) prema protokolu proizvođača (Amersham kat# RPN3001). Posle četiri uzastopne runde prečišćavanja plaka, rekombinant označen kao vCP2296.6.1.1.2 je generisan i potvrđen hibridizacijom kao 100% pozitivan za FeLV ENV insert i 100% negativan za prazna C5 mesta.
[0144] Jedan plak je izabran iz četvrte runde prečišćavanja plaka, i proširen za dobijanje P1 (1x T25 posuda), P2 (1xT75 posuda) i P3 (6 x roler boce) stokova. Tečnost inficirane ćelijske kulture iz roler boca je sakupljena i koncentrovana da bi se proizveo stok virusa vCP2296.6.1.1.2.
[0145] Konstrukcija vCP2296 je prikazana na Slici 15.
Analiza rekombinanta: sledeće analize su izvedene na P3 stokovima.
Potvrda genetičke čistoće
[0146] P3 stokovi su ponovo potvrđeni hibridizacijom, kao 100% pozitivni za FeLV GAG i FeLV ENV i 100% negativni za C3 i C5 ORF.
Ekspresiona analiza
1) Western blot:
[0147] Primarne CEF ćelije su inficirane sa P3 stokom vCP2296.6.1.1.2 na MOI od 10 i inkubirane na 37°C u trajanju od 24 časa. Supernatant kulture i ćelije su zatim sakupljeni. Ćelijski talog je liziran sa Reporter Gene Assay Lysis Buffer proizvedenim od strane Roche (kat. 1 897 675). Supernatant i lizat su pripremljeni sa NuPage® sistemom sa dodatim antioksidansom. Proteini su odvojeni na NuPage® 10% Bis-Tris Pre-cast gelu, i zatim prebačeni u PVDF membranu. Anti FeLV GAG antitela su oktrila ~70kDa protein detektovan u supernatantu i ćelijskom talogu, i ~80 kDa protein je takođe eksprimiran u supernatantu i ćelijskom talogu inkubacijom sa anti FeLV ENV antitelom.
2) Analiza imuno-plaka:
[0148] Homogenost populacije je bila 100% pozitivna za FeLV ENV protein za rekombinantni vCP2296.1.1.2 kao što je dokazano pomoću analize imuno-plaka, upotrebom anti-FeLV ENV antitela (videti IP konfirmacionu skeniranu sliku u atačmentu vCP2296 Immunoplaque.doc).
Analiza sekvence
[0149] Insercija FeLV ENV gena na C5 mestima vCP2296.6.1.1.2 je amplifikovana pomoću PCR. Prajmeri 7931DC i 7932DC, locirani izvan grana C5 lokusa u ALVAC genomu (videti Sliku 16), korišćeni su za amplifikaciju celog C5L-FeLV-C5R fragmenta.
Prajmeri za amplifikaciju FeLV ENV probe:
Prajmeri za PCR amplifikaciju C5L-FeLV ENV kasete-C5R:
Primer 5 Generisanje i karakterizacija ALVAC rekombinanta koji sadrži FeLV nativni ENV gen inseriran na C5 lokusu od vCP2294, ALVAC C3 H6p FeLV kodon-optimizovani GAG-PRO - vCP2295
[0150] Donorski plazmid pCXL208.2 sadrži nativni ENV gen (SEQ ID NO:5).
[0151] IVR je izveden transfekcijom 1°CEF ćelija sa 10 µg Not I-linearizovanog donorskog plazmida pCXL208.2 upotrebom FuGENE-6® reagensa (Roche). Transficirane ćelije su zatim inficirane sa vCP2294 (Primer 2) kao spašavajućim virusom na MOI od 10. Posle 24 časa, transficirane-inficirane ćelije su sakupljene, ultrazvučno obrađene i korišćene za skrining rekombinantnog virusa.
[0152] Rekombinantni plakovi su ispitivani na bazi metode „lift hybridization“ upotrebom 503bp FeLV ENV specifične probe obeležene renovom peroksidazom (HRP) prema protokolu proizvođača (Amersham kat# RPN3001). Posle četiri uzastopne runde prečišćavanja plaka, rekombinant označen kao vCP2295.2.2.2.1 je generisan i potvrđen hibridizacijom kao 100% pozitivan za FeLV ENV insert i 100% negativan za prazna C5 mesta.
[0153] Jedan plak je izabran iz četvrte runde prečišćavanja plaka, i proširen da bi se dobio P1 (1x T25 posuda), P2 (1xT75 posuda) i P3 (6 x roler boce). Tečnost inficirane ćelijske kulture iz roler boca je sakupljena i koncentrovana da bi se proizveo virusni stok vCP2295.2.2.2.1. Šema za generisanje rekombinantnog vCP2295 je prikazana na Slici 17.
Analiza rekombinanta: sledeće analize su izvedene na P3 stokovima.
Potvrda genetičke čistoće
[0154] P3 stokovi su ponovo potvrđeni hibridizacijom, kao 100% pozitivni za FeLV GAG i FeLV ENV i 100% negativni za C3 i C5 ORF.
Analiza ekspresije
1) Western blot
[0155] Primarne CEF ćelije su inficirane sa P3 stokom vCP2296.6.1.1.2 na MOI od 10 i inkubirane na 37°C u trajanju od 24 časa. Supernatant kulture i ćelije su zatim sakupljeni. Ćelijski talog je liziran sa Reporter Gene Assay Lysis Buffer proizvedenim od strane Roche (kat. 1 897 675). Supernatant i lizat su pripremljeni sa NuPage® sistemom sa dodatim antioksidansom. Proteini su odvojeni na NuPage® 10% Bis-Tris Pre-cast gelu, i zatim prebačeni u PVDF membranu. Anti FeLV gag antitela su oktrila ~70kDa protein detektovan u supernatantu i ćelijskom talogu, i ~80 kDa protein je takođe eksprimiran u supernatantu i ćelijskom talogu inkubacijom sa anti FeLV ENV antitelom.
2) Analiza imuno-plaka:
[0156] Homogenost populacije je bila 100% pozitivna za FeLV ENV protein za rekombinantni vCP2296.1.1.2 kao što je dokazano pomoću analize imuno-plaka, upotrebom anti-FeLV ENV antitela.
Analiza sekvence
[0157] Detaljna analiza P3 stoka genomske DNK je izvedena pomoću PCR amplifikacije i analize sekvence ogračivajućih grana C5 lokusa i FeLV inserta. Prajmeri 7931DC i 7932DC, locirani izvan grana C5 lokusa u ALVAC genomu, korišćeni su za amplifikaciju celog C5L-FeLV-C5R fragmenta. Rezultati su pokazali da su sekvence FeLV inserta i C5L i C5R ALVAC ispravne.
[0158] Rekombinantna vCP2295 sekvenca je prikazana na Slikama 18.
Primer 6 Efikasnost procene Canarypox vektorske vakcine (vCP2296, FeLV ENV) primenjene subkutano preko modela vakcinacije/infekcije
Materijal/metode
[0159] Četrdeset i četiri mačke, mužjaci i ženke, starosti između 57 i 63 dana prilikom prve vakcinacije (prosečno 58 dana; standardna decijacija 1.3 dana) su po slučajnom izboru dodeljene u dve grupe od po dvadeset i dve životinje. Mačke u grupi 1 su vakcinisane subkutano (SQ) na dane 0 i 21 sa 1ml FeLV-canarypox vektorske vakcine (vCP2296) na 106.2 doze kulture tkiva50(TCID50)/ml. Mačke u grupi 2 primile su dve doze od po 1ml placebo vakcine koja sadrži sterilni fiziološki rastvor na dane 0 i 21 i služile su kao negativne kontrole. Na dane 42 i 43 (3 nedelje posle druge vakcinacije), sve mačke su inficirane sa 1 ml suspenzije virulentnog soja FeLV (61-E) koja sadrži 10<4.5>i 10<4.7>TCID50/ml; (dani 42 i 43 respektivno) primenjene preko oro-nazalnog puta. Uzorci krvi su sakupljeni na dane -6, 42 (pre infekcije), i približno 3 nedelje posle infekcije i u nedeljnim intervalima do 12 uzastopnih nedelja (dani 62-dan 146) i serumi su testirani za FeLV antigenemiju (FeLV p27 protein).
[0160] Klinička procena je izvedena počevši 2 dana pre prve vakcinacije do dana 42. Rektalna temperatura je beležena dnevno na dane -2-0 (pre vakcinacije), 1-2, 19-21 (pre vakcinacije) i 22-23. Pored toga, mesta injekcije su procenjivana prva 2 dana posle svake vakcinacije i u nedeljnim intervalima posle vakcinacije do dana infekcije i uključena u procenu za otok, crvenilo i bol posle pipanja.
Rezultati: Perzistencija FeLV p27 antigenemije posle infekcije
[0161] Smatrano je da mačka ima perzistentnu FeLV p27 antigenemiju kada je testirana kao FeLV p27 pozitivna tokom 3 uzastopne nedelje ili 5 neuzastopnih nedelja. Devetnaest od 22 mačke (86.4%) iz placebo grupe postale su perzistentno FeLV antigenemične u poređenju sa 5/21 (23.8%) iz vakcinisane grupe. Incidenca mačaka sa perzistentnom FeLV antigenemijom koja se može se pripisati FeLV infekciji bila je značajno niža (p=0.00005) u vakcinisanoj grupi nego u placebo grupi. Procenjena sprečena frakcija bila je 72.43% sa 95% intervalom poverenja od 43.04% do 89.78%. Na taj način, postojalo je 72% smanjenje u verovatnoći da životinja postane perzistentno FeLV antigenemična kod vakcinisane životinje u poređenju sa Placebo životinjom.
Zaključak
[0162] Nađeno je da su dve doze Merial-ove FeLV-Canarypox vektorske vakcine (vCP2296) primenjene preko SQ puta efikasne protiv FeLV infekcije kao što je dokazano pomoću sledećih rezultata:
1. Posle infekcije, pokazano je da je test vakcina efikasna u prevenciji perzistentne FeLV antigenemije kod 16 od 21 (76.2%) vakcinisanih-inficiranih mačaka sa značajno niskim brojem vakcinisanih mačaka koje razvijaju perzistentnu antigenemije u poređenju sa kontrolama (p=0.00005; prevenirana frakcija 72%; promenljiva primarne efikasnosti).
2. Efikasna infekcije je validirana, kao što je dokazano preko razvoja perzistentne FeLV antigenemije kod 86% (19/22) kontrolnih mačaka.
3. Nijedna od vakcinisanih mačaka nije pokazala lokalne ili sistemske reakcije posle vakcinacije.
Primer 7 Poređenje efikasnosti rekombinantnog canarypox-FeLV sa nativnim ENV genom (vCP2295) i rekombinantnog canarypox-FeLV sa optimizovanim ENV genom (vCP2296) preko infekcije kod mačaka
Materijal/metode
[0163] Ukupno trideset SPF (bez specifičnog patogena) mačića, 15 mužjaka i 15 ženki, starosti između 8 i 12 nedelja (9 nedelja u proseku na D0), po slučajnom izboru su raspoređeni u 3 grupe od 10 mačića pema polu, leglu i starosti.
[0164] Na D0 i D28, pre vakcinacije, svi mačići su praćeni za stanje bolesti. Mačke iz grupa A i B su zatim vakcinisane pod opštom anestezijom putem subkutane injekcije u interskapularnu oblast. Na D44, soj kojim se vrši infekcija je odmrznut na 37°C, 32mL soja je mešano sa 8mL F15 medijuma sa 10% fetusnog telećeg seruma i održavano na izmrvljenom ledu pre inokulacije. Sve mačke su podvrgnute opštoj anesteziji. Zatim je svaka mačka inokulisana preko oro-nazalnog puta sa 1mL inokuluma (0.25mL u svaku nazalnu šupljinu) i 0.5mL oralno (jezik, ždrelo i krajnik).
Rezultati
[0165] Uzorkovanja krvi su izvedena na budnim mačkama na D0, D5, D7, D15, D26, D35, D49, D70, D77, DB4, D91, D96, D105, D112, D133 i pod opštom anestezijom (0.1 do 0.2mL/kg Zoletll" 50, intramuskularni put) na D44, D56, D63, D119, D126, D140 i D147.
1. Test antigenemije
[0166] Uzorci krvi su sakupljeni u suve epruvete na D0, pre vakcinacije, na D44 pre infekcije i svake nedelje od treće nedelje posle infekcije, tj., na D63, D70, D77, D84, D91, D98, D105, D112, D119, D126, D133, D140 i D147 za titraciju FeLV p27 antigena sa Witness FeLV kompletom (Synbiotics Corporation, MO, USA). Odgovor je bio binarni (prisustvo/odsustvo). Definisane su tri kategorije odgovora: a) 0: nema antigenemije (sve titracije su bile negativne), b) 1: prolazna antigenemija (manje od tri pozitivne uzastopne titracije i manje od pet pozitivnih titracija), c) 2: perzistencija antigenemije (pozitivna u najmanje pet slučajeva ili najmanje tri pozitivne uzastopne titracije).
[0167] U vCP2295-vakcinisanoj grupi (grupa A), 40% mačaka je bilo zaštićeno protiv perzistentne antigenemije: 4/10 mačke nikada nisu bile pozitivne i 6/10 mačaka je imalo perzistentnu antigenemiju. U vCP2296-vakcinisanoj grupi (grupa B), 60% mačaka je bilo zaštićeno protiv p27 perzistentne antigenemije. 5/10 nikada nisu bile pozitivne i 1/10 mačka je imala prolaznu antigenemiju: p27 je mogao da se detektuje u serumu ove mačke na D63 i D84. 4/10 mačke su imale perzistentnu antigenemiju. U kontrolnoj grupi (grupa C), 100% mačaka je imalo perzistentnu antigenemiju. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.
[0168] Poređenje 3 grupe u vezi sa učestalošću mačaka koje nemaju antigenemiju (antigenemija = 0), koje imaju prolaznu antigenemiju (antigenemija = 1) ili koje imaju perzistentnu antigenemiju (antigenemija = 2) dalo je značajnu p-vrednost ("Fisher-ov egzaktni test": p = 0.028). Trend ka značajnosti je dokazan iznmeđu grupe B i grupe C (podešena pvrednost sa Bonferroni-ovim metodom: A naspram C: p = 0.260, B naspram C: p = 0.056, A naspram B: p = 1).
2. Test proviremije
[0169] Broj leukocita je korišćen za ekspresiju proviremije u broju kopija provirusa / 50,000 WBC (leukocita). Uzorci krvi su sakupljeni u EDTA epruvete na D44 pre infekcije i svake 3 nedelje posle infekcije, tj., na D63, D84, D105, D126 i D147 za broj leukocita i praćenje FeLV proviremije na PBMC (mononuklearnim ćelijama periferne krvi) upotrebom kvantitativnog PCR-a. Zbog prirode kriterijuma ponovljenog merenja i individualnog slučajnog efekta, podaci o proviremiji su analizirani upotrebom mešanog modela sa ponovljenim merenjima.
a) Proviremija u krvi
[0170] Slika 19 ispoljava razvijanje srednje proviremije po grupi posle infekcije. Slika 17 ispoljava razvijanje srednje proviremije po grupi i statusa p27 antigenemije posle infekcije. U obe vakcinisane grupe, p27 antigenemija je bila u dobroj korelaciji sa proviremijom (Slika 20).
b) proviremija u koštanoj srži
[0171] Nivo proviremije u koštanoj srži p27 negativnih mačaka je bio između 3 i 5 log10, dok je dostigao 8 do 9 log10 kod p27 pozitivnih mačaka. Nivo proviremije je bio u dobroj korelaciji sa pojedinačnim statusom p27 antigenemije i sa pojedinačnom proviremijem krvi (kao što je prikazano na Slici 21).
3. Ćelijski imuni odgovor
[0172] Uzorci krvi su sakupljeni na heparinom tretiranim epruvetama na D5, D7, D15, D28, D35, D49, D56, D63, D119 i D126 za FeLV imunološki monitoring. IPNγ –ćelijski posredovani imuni odgovor je praćen pomoću ELISpot posle stimulacije PBMC pomoću dendritskih ćelija (DC) napunjenih sa FeLV pulovima peptida na D35 i D126. IL10 posredovani imunitet je praćen pomoću ELISpot posle stimulacije PBMC pomoću FeLV pulova peptida na D35, D63 i D126. Regulatorne T ćelije su praćene na D5, D15, D35, D49, D63 i D126.
A) Metode
a). Izolacija mačjih PBMCs
[0173] PBMCs su izolovane pomoću PANCOLL® centrifugiranje gradijentom gustine (600g za 30minuta bez pauze). PBMCs su isprane dva puta u sterilnom PBS (fosfatno-puferisani fiziološki rastvor) (centrifugiranje 400g za 10 minuta) i zatim brojane sa robotizovanim ABX Pentra 120 ćelijskim brojačem. Ćelije su isprane jedan poslednji put u PBS i resuspendovane u koncentraciji od 5.106/ml u sterilnom kompletnom RPMI (=RPMI penicilin-streptomicin (PS) βMerkaptoetanol (βM)) 10% fetusni teleći serum (FCS).
b). Generisanje dendritskih ćelija
[0174] Ficoll-izolovane PBMCs su kultivisane u toku 20 časova u ravnim 6-komornim pločama. Neprijanjajuće ćelije su uklonjene i sveži kompletni medijum dopunjen sa mačjim IL-4 i mačjim GM-CSF je dodat u komorice. Diferencijacija monocita u DC trajala je 7 dana.
c). IPNγ ELISpot analiza:
[0175] Intenzitet FeLV-specifičnih ćelijskih imunih odgovora u različitim grupama životinja je kvantitativno određen upotrebom IPNγ ELISPOT analiza. HA ELISPOT ploče su obložene preko noći na 4°C sa 100µl/komorici prečišćenog anti-psećeg IFNγ mAb razblaženog (1/25) u karbonatnom/bikarbonatnom puferu (0. 2M, pH9.6). Obložene ploče su isprane tri puta u sterilnom PBS i prazna mesta su blokirana sa sterilnim kompletnim RPMI 10% FCS za 2 časa na sobnoj temperaturi (RT).
[0176] Dendritske ćelije su napunjene peptidnim pulovima koji kodiraju ENV FeLV i GAG proteinima na D+15, D+35 i D+126. Ukratko, 100.103 DC su ponovo stimulisane pojedinačno pomoću peptidnih pulova n°1 i 2 za ENV FeLV ili peptidnih pulova br. 2, 3, 6 i 8 FeLV GAG-PRO u 1µg/ml u finalnoj zapremini od 100µl kompletnog RPMi 10% FCS. Napunjene dendritske ćelije su prebačene u ELISpot ploče i 500.10<3>PBMCs su dodate u svaku komoricu. Dendritske ćelije su napunjene irelevantnim peptidom kao negativna kontrola. Ćelije su stimulisane u toku 20-24 časa na 37°C 5% CO2. Ćelije su eliminisane i da bi se obezbedila ćelijska liza. Hladna destilovana voda je dodata u svaku komoricu (200µl) na 5min na sobnoj temperatri. Ploče su zatim isprane tri puta u PBS-0.05% Tween i inkubirane na 4°C sa 100 µl biotinilovanog anti-mačjeg γIFN MAb (razblaženo u 1/100 u PBS-0.05% Tween). Ploče su zatim isprane tri puta u PBS-0.05% Tween i 100µl razblaženog rastvora HRP-streptavidina je dodato u svaku komoricu na 1 čas na 37°C. Ploče su zatim isprane tri puta u PBS-0.05%Tween i inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku sa rastvorom AEC supstrata. Ploče su ekstenzivno isprane vodom sa česme i sušene. Tačke su brojane sa sistemom CCD kamere (Microvision, Redmond, WA, USA). Učestalost peptid-specifičnih ćelija koje formiraju IFNγ-tačku (SFC) je izračunata na sledeći način: broj peptid-specifičnih IPNγ SFC = broj IFNγ SFC posle ponovne stimulacije pojedinačnog peptidnog pula FeLV – broj IFNγ SFC posle ponovne stimulacije irelevantnog peptidnog pula. Rezultati su izraženi kao log10.
d). IL-10 ELISpot analiza
[0177] ELISpot IL-10 je izvedena prema uputstvima proizvođača (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). 500.103 prečišćenih PBMCs direktno su ponovo stimulisane upotrebom preklapajućih peptidnih pulova koji kodiraju FeLV ENV i GAG-PRO sekvence, u 1µg/ml u krajnjoj zapremini od 200µl kompletnog RPMI 10% FCS, i spuštene u ELIspot IPNγ obložene ploče. 500.10<3>PBMCs su ponovo stimulisane sa irelevantnim peptidom kao negativnom kontrolom. Učestalost peptid-specifičnih ćelija koje formiraju IL-10 tačku (SFC) je izračunata na sledeći način: broj peptidni pul-specifičnih IL-10 SFC = broj IL-10 SFC posle ponovne stimulacije pojedinačnog FeLV peptidnog pula – broj IL-10 SFC posle irelevantne peptidne ponovne stimulacije. Rezultati su izraženi kao log10.
B) Rezultati
a) Ćelijski imuni odgovor posle vakcinacije
i) Praćenje FeLV-specifičnih odgovora ćelija koje izlučuju IPNγ posle vakcinacije [0178] Sposobnost PBMCs da proizvode IFNγ kao odgovor na ponovnu stimulaciju sa FeLV ENV i GAG-PRO peptidnim pulovima-napunjenim DC analizirana je upotrebom IFNγ-ELIspot analize. Analiza zbira IFNγ+ SFC (ćelije koje formiraju tačke) indukovana posle in vitro aktivacije sa dendritskim ćelijama napunjenim peptidnim pulovima koji kodiraju FeLV ENV i GAG-PRO sekvence pokazala je da je vCP2296 vakcinacija indukovala veću učestalost FeLV-specifičnih ćelija koje izlučuju IPNγ na dan 35 u poređenju sa vCP2295 vakcinacijom. Nevakcinisane grupe nisu indukovale nikakve ćelije koje izlučuju IPNγ (Slika 22).
[0179] Razlike između vCP2295 i vCP2296 u njihovoj sposobnosti da indukuju ćelije koje proizvode IFNγ bile su jasnije kod fokusiranja na specifičan odgovor FeLV ENV pulova br.1 i br.2. Analiza učestalosti IPNγ+ SFC unutar PBMCs posle in vitro aktivacije sa dendritskim ćelijama napunjenim peptidnim pulom br. 1 FeLV ENV (koji kodira početak FeLV ENV sekvence) pokazala je razliku između vCP2296 (grupa B) i vCP2295 vakcinacije (grupa A) na dan 35, u krvi. Nevakcinisane grupe nisu indukovale nikakve ćelije koje izlučuju IFNγ (Slika 23).
ii) Praćenje ćelija koje izlučuju FeLV-specifičan IL-10 posle vakcinacije
Praćenje ćelija koje izlučuju FeLV-specifičan IL-I0: analiza FeLV ENV-specifičnih odgovora u krvi
[0180] Na dan 35 posle vakcinacije, sposobnost PBMCs da proizvode IL-10 kao odgovor na ponovnu stimulaciju FeLV ENV peptidnim pulovima je analizirana upotrebom IL-10 ELIspot analize. vCP2295 vakcinacija indukovala je veću učestalost ćelija koje izlučuju FeLV ENV specifičan IL-10 u poređenju sa vCP2296 vakcinacijom i kontrolnom grupom (Slika 24).
Praćenje ćelija koje izlučuju FeLV-specifičan IL-10: analiza FeLV GAG-PRO specifičnih odgovora u krvi
[0181] Na dan 35 posle vakcinacije, sposobnost PBMCs da proizvode IL-10 kao odgovor na ponovnu stimulaciju FeLV GAG-PRO peptidinim pulovima analizirana je upotrebom IL-10 ELIspot analize. vCP2295 vakcinacija imala je težnju da indukuje više ćelija koje izlučuju FeLV GAG-PRO specifičan IL-10 od vCP2296 vakcinacije (Slika 25).
[0182] U zaključku, vCP2295 vakcinacija (grupa A) indukovala je veću učestalost ćelija koje izlučuju FeLV specifičan IL-10 u perifernoj krvi, u poređenju sa vCP2296 vakcinacijom (grupa B) i kontrolnom grupom (grupa C).
iii) Odnos ćelija koje proizvode FeLV-specifičan IFNγ i IL-10 posle vakcinacije.
[0183] U cilju dalje procene dve rekombinantne vakcine i ravnoteže između Th1 odgovora i regulatornog odgovora, izračunavan je odnos između broja FeLV-specifičnih IPNγ SFC i broja FeLV specifičnih IL-10 SFC posle ponovne stimulacije sa ENV ili GAG-PRO in vitro za svaku vakcinisanu grupu. Poređenje odnosa FeLV-specifičnih IFNγ IL-10 SFC za svaku grupu pokazalo je da je vCP2296 vakcinacija indukovala uravnoteženiji odgovor u poređenju sa imunim odgovorom indukovanim sa vCP2295 vakcinacijom koje je bilo naklonjeno IL-10 odgovoru. Ova razlika je bila vidljivija u odgovoru na ponovnu stimulaciju sa FeLV ENV nego na ponovnu stimulaciju sa GAG-PRO (Slike 26a i 26b).
b) Praćenje ćelijskog imunog odgovora posle eksperimentalne infekcije
i) Praćenje odgovora ćelija koje izlučuju FeLV-specifičan IFNγ posle infekcije
[0184] Posle infekcije (D126) analizirana je sposobnost PBMCs da proizvode IPNγ kao odgovor na ponovnu stimulaciju FeV ENV i GAG-PRO peptidim pulovima napunjenih OC upotrebom IFNγ-ELIspot analize. vCP2296-vakcinisane mačke održavale su veću učestalost ćelija koje izlučuju FeLV ENV-specifičan IFNγ u PBMCs posle infekcije (D126) u poređenju sa vCP2295-vakcinisanim mačkama. U ovoj vremenskoj tački, nije bilo moguće zabeležiti nikakve ćelije koje izlučuju FeLV GAG-PRO-specifičan IPNγ, za bilo koju grupu (Slika 27).
ii) Praćenje odgovora ćelija koje izlučuju FeLV-specifičan IL-10 posle infekcije
[0185] Posle infekcije (D126), sposobnost PBMCs da proizvode IL-10 kao odgovor na ponovnu stimulaciju sa FeLV ENV ili GAG-PRO peptidnim pulovima analizirana je upotrebom IL-10 ELIspot analize. FeLV infekcija specifično je pojačala FeLV ENV-specifičan IL-10 ćelijski odgovor u svim grupama, u poređenju sa odgovorm na dan 35, bez razlike između 3 grupe (Slika 28a). Infekcija nije uticala na antigen-specifičan odgovor usmeren protiv FeLV GAG-PRO regiona, i vCP2295-vakcinisane mačke su održavale svoj FeLV GAG-PRO-specifičan IL-10 odgovor (Slika 28b). Posle infekcije, vCP2295 vakcinisane mačke (grupa A) ispoljile su samo FeLV-specifičan IL-10 imuni odgovor, dok su vCP2296-vakcinisane mačke (grupa B) razvile FeLV-specifičan IL-10 imuni odgovor, ali su takođe održavale svoj FeLV-specifičan IPNγ odgovor.
c) Učestalost ćelija koje proizvode FeLV-specifičan IPNγ i IL-10 kod zaštićenih i inficiranih životinja
[0186] Zaštićene i inficirane životinje su identifikovane prema rezultatima p27 antigenemije. Zaštićene i inficirane životinje su odvojene unutar svake grupe (Slika 29) i IFNy/IL-10 odnos za svaku sub-grupu je izračunavan da bi se se procenilo da li bi IFNγ/IL-I0 SFC odnos posle vakcinacije mogao biti indikativan za zaštitu.
[0187] U vCP2296 vakcinisanoj grupi: četiri mačke od 10 imale su visok IFNγ/IL-I0 odnos u vezi sa visokim IPNγ odgovorom i niskim IL-10 odgovorom i bile su zaštićene. Dve mačke od 10 nisu imale nikakav IFNγ ili IL-10 odgovor i bile su zaštićene. Četiri mačke od 10 imale su nizak IFNγ/IL-I0 odnos u vezi sa visokim IL-10 odgovorom. Tri od ovih mačaka imale su visok IPNγ odgovor i jedna od njih nije imala nikakav IPNγ odgovor. Ove mačke nisu zaštićene.
[0188] U vCP2295 vakcinisanoj grupi: osam mačaka od 10 imale su nizak IFNγ/IL-10 odnos u vezi sa visokim IL-10 odgovorom i niskim IPNγ odgovorom. Šest od njih su inficirane i dve od njih su zaštićene. Dve mačke od 10 imale su IFNγ i IL-10 odgovore i visok IFNγ/1L-10 odnos. Ove mačke su bile zaštićene.
[0189] Zaštićene mačke iz vCP2295- ili vCP2296-vakcinisane grupe ispoljile su viši IFNy/IL-10 odnos u krvi (slike 26) u poređenju sa inficiranim mačkama. Pored toga, zaštićene mačke iz vCP2296-vakcinisane grupe imaju viši IFNγ/IL-10 SFC odnos u poređenju sa zaštićenim mačkama iz vCP2295-vakicinisane grupe.
[0190] Zaštita je bila u korelaciji sa povećanim IFNγ/IL-10 odnosom i zaštićene mačke iz vCP2296 vakcinacije razvile su FeLV-specifičan ćelijski posredovani imunitet naklonjen ka proizvodnji IPNγ u poređenju sa vCP2295-vakcinisanim mačkama.
Zaključak
[0191] Šezdeset procenata mačaka vakcinisanih sa vCP2296 (optimizovani gen ENV) bile su zaštićene protiv perzistentne antigenemije i 40% mačaka vakcinisanih sa vCP2295 (nativni gen ENV) bile su zaštićene protiv perzistentne antigenemije. Poređenje tri grupe ispoljilo je značajnu razliku zaštite između vakcinisanih i nevakcinisanih grupa i trend ka značajnoj razlici između grupe B vakcinisane optimizovanim genom ENV (vCP2296) i grupe A vakcinisane nativnim genom ENV (vCP2295).
[0192] Rezultati proviremije i antigenemije su u dobroj korelaciji: mačke sa perzistentnom antigenemijom imale su snažnu i produženu proviremiju do kraja studije. Ne-antigenemične mačke su imale nižu i regresirajuću proviremiju. P27 negativne mačke su bile sposobne da kontrolišu proviremiju. Dokazane su razlike između vCP2295 i vCP2296 vakcinacije, prema indukciji FeLV specifičnih ćelija koje proizvode IPNγ i IL-10 u toku faza vakcinacije i infekcije. Pokazana je indukcija FeLV-specifičnih ćelija koje proizvode IPNγ pomoću FeLV canarypox vakcina naročito kada je ENV gen mutiran u njegovoj imunosupresivnoj sekvenci (vCP2296). Zanimljivo, ove FeLV-specifične ćelije koje proizvode IPNγ indukovane pomoću vCP2296 vakcinacije su bile još uvek detektovane više od 100 dana posle infekcije, što pokazuje da je vCP2296 vakcinacija indukovala generisanje FeLV-specifičnih memorijskih T ćelija. Obrnuto, vCP2295 je bio potentniji za indukciju diferencijacije FeLV-specifičnih ćelija koje proizvode IL-10. Učestalost FeLV-specifičnih ćelija koje proizvode IL-10 bila je viša kod vCP2295 vakcinisanih mačaka u poređenju sa vCP2296 i nevakcinisanim kontrolnim mačkama posle vakcinacije. IL-10 je poznat zbog njegovih regulatornih osobina, učestvujući u inhibiciji imunog odgovora ili u njegovom završetku. Viši odnos FeLV-specifičnih IFNγ/IL-10 SFC posle vakcinacije je bio u korelaciji sa zaštitom (procenjeno pomoću antigenemije). Sve mačke koje imaju visok IFNγ/IL-10 odnos i nizak IL-10 odgovor bile su zaštićene. Ovo zapažanje je bilo u skladu sa potencijalno imunosupresivnom ulogom ćelija koje proizvode IL-10 i sa anti-virusnom funkcijom ćelija koje proizvode IFNγ. Modifikacija ENV gena u vCP2296 vakcini smanjila je imunosupresivne osobine kontrukta i obezbedila je imunološku prednost ovom konstruktu u poređenju sa nativnim ENV genom u vCP2295.
[0193] Ova studija je pokazala da je modifikacija ENV gena FeLV rezultovala u različitom kvalitetu imunog odgovora povezanog sa boljom zaštitom protiv perzistentne antigenemije. Modifikacija ENV gena FeLV omogućava canarypox-FeLV da funkcioniše na nižoj dozi od istog konstrukta sa nativnim ENV FeLV genom.
LISTING SEKVENCI
[0194]
<110> Merial Limited
Centre National de la Recherche Scientifique
INSTITUT GUSTAVE ROUSSY

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja sadrži:
a) ekspresioni vektor koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira polipeptid omotača (ENV) virusa mačje leukemije koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34, pri čemu polipeptid sadrži mutaciju koja je supstitucija arginina (R) za glutaminsku kiselinu (E) na aminokiselinskom položaju 527 ili ekvivalentu koji odgovara aminokiselinskom položaju proteina ENV FeLV i drugi polinukleotid koji kodira polipeptid GAG/PRO FeLV koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO:12; i
b) farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv vehikulum, razblaživač ili ekscipijens.
2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što polinukleotid kodira polipeptid ENV FeLV koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ili 34, i pri čemu polipeptid sadrži mutaciju koja je supstitucija arginina (R) za glutaminskukiselinu (E) na aminokiselinskom položaju 527 ili ekvivalentu koji odgovara aminokiselinskom položaju proteina ENV FeLV.
3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time što polinukleotid koji kodira polipeptid ENV FeLV ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO:1, 3 ili 5.
4. Kompozicija prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što prvi polinukleotid kodira polipeptid ENV FeLV koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:2 ili 4, i pri čemu drugi polinukleotid kodira polipeptid GAG/PRO FeLV koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:12.
5. Kompozicija prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što polinukleotid koji kodira polipeptid ENV FeLV ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO:1, 3 ili 5, i polinukleotid koji kodira polipeptid GAG/PRO FeLV ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 10 ili 11.
6. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačena time što ekspresioni vektor je avipox vektor.
7. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačena time što kompozicija se primenjuje na životinju u opsegu doza od 10<5>pfu do 10<9>pfu.
8. Ekspresioni vektor koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira optimizovani polipeptid ENV FeLV i drugi polinukleotid koji kodira polipeptid GAG/PRO FeLV kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.
9. Ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što ekspresioni vektor je avipox vektor.
10. Kompozicija ili ekspresioni vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu kao životinjska vakcina, pri čemu, kompozicija ili ekspresioni vektor je formulisan za najmanje jednu primenu.
11. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što kompozicija je formulisana za „prime-boost“ režim primene.
12. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 ili 11, naznačena time što se kompozicija primenjuje u opsegu doza od 105 pfu do 109 pfu.
13. Ekspresioni vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što: ekspresioni vektor je formulisan za „prime-boost“ režim primene; i/ili ekspresioni vektor je primenjen u opsegu doza od 105 pfu do 109 pfu.
14. Komplet za „prime-boost“ vakcinaciju koji sadrži najmanje dve bočice: prvu bočicu koja sadrži kompoziciju ili ekspresioni vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za prvu vakcinaciju i drugu bočicu koja sadrži kompoziciju ili ekspresioni vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili subjediničnu FeLV vakcinu ili plazmidnu FeLV vakcinu za buster vakcinaciju.
15. Komplet prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što prva bočica sadrži kompoziciju prema patentnom zahtevu 4 i druga bočica sadrži kompoziciju prema patentnom zahtevu 4, i pri čemu se kompozicija primenjuje u opsegu doza od 10<5>pfu do 10<9>pfu.
RS20190039A 2011-07-20 2012-02-02 Rekombinantna vakcina protiv virusa mačje leukemije koja sadrži optimizovani gen omotača virusa mačje leukemije RS58289B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161509912P 2011-07-20 2011-07-20
EP12705199.3A EP2734230B1 (en) 2011-07-20 2012-02-02 Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
PCT/US2012/023658 WO2013012446A1 (en) 2011-07-20 2012-02-02 Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58289B1 true RS58289B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=45722710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190039A RS58289B1 (sr) 2011-07-20 2012-02-02 Rekombinantna vakcina protiv virusa mačje leukemije koja sadrži optimizovani gen omotača virusa mačje leukemije

Country Status (25)

Country Link
US (2) US8895027B2 (sr)
EP (1) EP2734230B1 (sr)
JP (2) JP6084970B2 (sr)
CN (1) CN103957932B (sr)
AU (2) AU2012284558B2 (sr)
BR (1) BR112014001287B1 (sr)
CA (1) CA2842055C (sr)
CY (1) CY1125328T1 (sr)
DK (1) DK2734230T3 (sr)
ES (1) ES2720150T3 (sr)
HR (1) HRP20190271T1 (sr)
HU (1) HUE043547T2 (sr)
IL (1) IL230460B (sr)
IN (1) IN2014CN00547A (sr)
LT (1) LT2734230T (sr)
MX (1) MX351642B (sr)
PL (1) PL2734230T3 (sr)
PT (1) PT2734230T (sr)
RS (1) RS58289B1 (sr)
RU (1) RU2591817C2 (sr)
SI (1) SI2734230T1 (sr)
SM (1) SMT201900129T1 (sr)
TR (1) TR201901466T4 (sr)
WO (1) WO2013012446A1 (sr)
ZA (1) ZA201400349B (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2966191A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Merial, Inc. Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
EP3691679A2 (en) * 2017-10-06 2020-08-12 Virbac Feline vaccines conferring early protection
CN111848785B (zh) * 2020-07-10 2022-09-06 青岛博隆基因工程有限公司 猫疱疹病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB2197321B (en) 1986-09-12 1990-10-03 Genentech Inc Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line
IE872748L (en) 1986-10-16 1988-04-16 Arjomari Europ Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
DE3743138A1 (de) 1987-12-18 1989-09-14 Mayr Christian Gmbh & Co Kg Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
ATE128730T1 (de) * 1988-12-13 1995-10-15 Univ Harvard Prototypische felv-isolate für die verwendung als krankheitsmuster oder impfstoffe.
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
DE69233158T2 (de) * 1991-03-07 2004-05-13 Connaught Technology Corp., Greenville Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe
US6133028A (en) 1993-05-28 2000-10-17 Transgene S.A. Defective adenoviruses and corresponding complementation lines
FR2712603B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
US5529780A (en) 1994-03-30 1996-06-25 Virogenetics Corporation Nucleotide and amino acid sequences of canine herpesvirus gB and gC
CA2214029A1 (en) 1995-04-25 1996-10-31 Magda Marquet Single-vial formulations of dna/lipid complexes
EP0803573A1 (en) 1996-04-25 1997-10-29 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Polycistronic expression construct with cytokines for multivalent vaccines
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
EP0979101B1 (en) 1996-07-03 2010-10-27 Merial, Inc. Recombinant canine adenovirus 2 (cav2) containing exogenous dna
US6090393A (en) 1996-07-03 2000-07-18 Merial Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof
US6156567A (en) 1996-07-03 2000-12-05 Merial Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
FR2776928B1 (fr) 1998-04-03 2000-06-23 Merial Sas Vaccins adn adjuves
TWI224107B (en) 1998-10-22 2004-11-21 Pfizer Prod Inc Novel proteins from actinobacillus pleuropneumoniae
US6017537A (en) 1998-12-18 2000-01-25 Connaught Laboratories, Inc. Formyl methionyl peptide vaccine adjuvant
US6645740B1 (en) 1999-06-10 2003-11-11 Merial Limited Nucleic acids encodings equine GM-CSF
FR2796397B1 (fr) 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines
SK287400B6 (sk) 1999-09-25 2010-08-09 University Of Iowa Research Foundation Prostriedok s obsahom imunostimulačnej nukleovej kyseliny a jeho použitie na stimuláciu imunitnej reakcie
US6852705B2 (en) 2000-01-21 2005-02-08 Merial DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines
EP1203819A3 (en) 2000-10-06 2002-08-07 Transgene S.A. Anti-inflammatory vectors
CN1561389A (zh) * 2001-07-25 2005-01-05 纽约大学 糖基神经酰胺作为用于抗传染病和癌症的疫苗的佐剂的用途
FR2829498B1 (fr) 2001-09-11 2003-11-28 Merial Sas Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins
WO2003062374A2 (en) 2001-11-09 2003-07-31 Entremed, Inc. Synthetic genes for malarial proteins and methods of use
WO2004024027A2 (en) 2002-06-07 2004-03-25 University Of Florida Endodontic files made using bulk metallic glasses
AU2003281917A1 (en) * 2002-09-23 2004-04-19 Mologen Ag Vaccine against infections caused by oncoviruses such as the feline leucosis virus of cats
ZA200608178B (en) * 2004-03-30 2008-10-29 Roussy Inst Gustave Polypeptide sequence involved in the modulation of the immunosuppresive effect of viral proteins
CA2570156C (en) 2004-06-04 2014-09-30 Merial Limited Needle-free administration of felv vaccines
US7998733B2 (en) * 2004-10-05 2011-08-16 Merial Limited Chimeric vectors
PT1954308E (pt) * 2005-09-16 2011-11-03 Merial Ltd Estabilizadores para vacinas liofilizadas
EP2155883A1 (en) * 2007-05-30 2010-02-24 Wyeth LLC Raccoon poxvirus expressing genes of feline antigens

Also Published As

Publication number Publication date
CY1125328T1 (el) 2023-03-24
JP6240294B2 (ja) 2017-11-29
JP2014528699A (ja) 2014-10-30
IL230460B (en) 2018-11-29
IL230460A0 (en) 2014-03-31
MX2014000625A (es) 2015-06-02
US20130022632A1 (en) 2013-01-24
BR112014001287B1 (pt) 2020-12-08
CN103957932A (zh) 2014-07-30
MX351642B (es) 2017-10-23
CN103957932B (zh) 2017-06-23
TR201901466T4 (tr) 2019-02-21
ES2720150T3 (es) 2019-07-18
DK2734230T3 (en) 2019-01-28
US9856295B2 (en) 2018-01-02
SMT201900129T1 (it) 2019-05-10
JP6084970B2 (ja) 2017-02-22
US20150030623A1 (en) 2015-01-29
PT2734230T (pt) 2019-02-27
AU2012284558A1 (en) 2014-02-20
JP2017052774A (ja) 2017-03-16
EP2734230B1 (en) 2018-11-21
BR112014001287A2 (pt) 2017-02-21
RU2014106295A (ru) 2015-08-27
CA2842055A1 (en) 2013-01-24
HRP20190271T1 (hr) 2019-03-22
US8895027B2 (en) 2014-11-25
EP2734230A1 (en) 2014-05-28
RU2591817C2 (ru) 2016-07-20
CA2842055C (en) 2019-04-02
PL2734230T3 (pl) 2019-07-31
AU2017204298A1 (en) 2017-07-13
HUE043547T2 (hu) 2019-08-28
SI2734230T1 (sl) 2019-04-30
WO2013012446A1 (en) 2013-01-24
ZA201400349B (en) 2015-08-26
AU2012284558B2 (en) 2017-06-29
LT2734230T (lt) 2019-03-25
NZ620566A (en) 2016-02-26
IN2014CN00547A (sr) 2015-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2013221502B2 (en) Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and OX40 proteins, and vaccines made therefrom
US9555101B2 (en) Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein C and uses thereof
CA2741333C (en) Vaccine against african horse sickness virus
JP6240294B2 (ja) 最適化ネコ白血病ウイルスエンベロープ遺伝子を含む組換えネコ白血病ウイルスワクチン
US9682138B2 (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
NZ620566B2 (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
AU2014218358B2 (en) Vaccine against african horse sickness virus
HK1192454A (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
HK1192454B (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene