ES2720150T3 - Vacuna recombinante contra el virus de la leucemia felina que contiene un gen optimizado de la envoltura del virus de la leucemia felina - Google Patents

Vacuna recombinante contra el virus de la leucemia felina que contiene un gen optimizado de la envoltura del virus de la leucemia felina Download PDF

Info

Publication number
ES2720150T3
ES2720150T3 ES12705199T ES12705199T ES2720150T3 ES 2720150 T3 ES2720150 T3 ES 2720150T3 ES 12705199 T ES12705199 T ES 12705199T ES 12705199 T ES12705199 T ES 12705199T ES 2720150 T3 ES2720150 T3 ES 2720150T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
felv
sequence
polypeptide
env
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12705199T
Other languages
English (en)
Inventor
Hervé Poulet
Thierry Heidmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut Gustave Roussy
Université Paris-Sud
Merial Ltd
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut Gustave Roussy
Université Paris-Sud
Merial Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique, Institut Gustave Roussy, Université Paris-Sud, Merial Ltd filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique
Application granted granted Critical
Publication of ES2720150T3 publication Critical patent/ES2720150T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/04—Nitro compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Composición que comprende: a) un vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de la envoltura (ENV) del virus de leucemia felina (FeLV) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, en el que el polipéptido comprende una mutación que es una sustitución de arginina (R) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 o una posición de aminoácido correspondiente equivalente de una proteína de ENV de FeLV y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12; y b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna recombinante contra el virus de la leucemia felina que contiene un gen optimizado de la envoltura del virus de la leucemia felina
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional US 61/509.912 presentada el 20 de julio de 2011.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a composiciones o vacunas para combatir infecciones por el virus de la leucemia felina en animales. Específicamente, la presente invención proporciona vectores que contienen y expresan in vivo o in vitro antígenos optimizados de la envoltura del virus de la leucemia felina que provocan una respuesta inmunitaria en animales contra el virus de la leucemia felina, incluyendo composiciones que comprenden dichos vectores, procedimientos de vacunación contra el virus de la leucemia felina, y kits para su uso con tales procedimientos y composiciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus de la leucemia felina (FeLV) es una causa común de infección de los gatos domésticos en todo el mundo y una causa de morbilidad y mortalidad significativas. La prevalencia de la antigenemia puede variar de 1 a 5 por ciento en gatos sanos a 15 a 30 por ciento en gatos enfermos (Hosie MJ et al, Veterinary Records, 1989, 128, 293­ 297; Braley J., Feline Practice, 1994, 22, 25-29; Malik R. et al, Australian Veterinary Journal, 1997, 75, 323-327; Arjona A. et al, Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38, 3448 a 3.449). El virus puede establecer una infección de por vida que se caracteriza por una viremia persistente y un desenlace fatal. La mayoría de las enfermedades relacionadas con el FeLV se producen de forma persistente en los animales infectados, y son siempre serias y muy probablemente fatales. Entre las afecciones más frecuentemente diagnosticadas están los linfomas, leucemias mieloides, la inmunodeficiencia y la anemia no regenerativa. La infección puede ser controlada por la identificación y aislamiento de los gatos persistentemente virémicos, que son la fuente de la infección. Las vacunas también han ayudado a prevenir la propagación del virus. Varias vacunas de FeLV están disponibles. La mayoría de ellas contienen virus inactivados o subunidades recombinantes. Su eficacia es controvertida (Sparkes Ah , Journal of Small Animal Practice, 1997, 38, 187-194). Se han observado fallos vacunales.
Una forma alternativa sería el uso de un vector viral recombinante. El vector del virus de viruela del canario y especialmente el vector ALVAC han sido probados para la expresión de genes de FeLV (Tartaglia J. et al, Journal of Virology, 1993, 67, 2370-2375; Poulet H. et al, Veterinary Record, 2003, 153, 141-145). También está disponible una vacuna de FeLV recombinante comercial (EURIFEL® FeLV, Merial).
El genoma de FeLV codifica tres genes: un gen GAG que codifica los principales componentes estructurales del virus, un gen ENV que codifica para la glicoproteína de la envoltura y un gen POL que codifica la proteína de la polimerasa (Thomsen DR, et al, Journal of General Virology, 73, 1819-1824, 1992). El gen de la envoltura de FeLV (ENV) codifica una proteína precursora de gp85 que se procesa proteolíticamente por una enzima o enzimas celulares para producir la glicoproteína principal g70 de la envoltura y la proteína transmembrana asociada p15E (DeNoronha, F., et al, 1978, Virology 85.: 617-621; Nunberg, JH, et al, 1983, PNAS 81: 3675 a 3679). La proteína transmembrana p15 contiene una secuencia conservada entre gammaretrovirus con propiedades inmunosupresoras (Mathes, LE et al., 1978, Nature). La glicoproteína de la envoltura de FeLV es uno de los principales inmunógenos y es la diana de las respuestas de células T citotóxicas específicas de FeLV, así como de anticuerpos neutralizantes (Flynn, JN, et al., 2002, J. Virol ). La solicitud de patente Us 2008/0008683 describió un polipéptido que es capaz de modular las propiedades inmunosupresoras de una proteína viral contra el huésped en el que se expresa. El gen GAG de FeLV codifica una poliproteína precursora que se escinde por la proteasa (gen RPO de FeLV) para generar las proteínas de la cápside. Las proteínas de la cápside son también un inmunógeno principal que induce respuestas de células T citotóxicas específicas de FeLV, así como anticuerpos neutralizantes (Flynn, JN, et al., 2002, J. Virol.). El gen POL codifica tres proteínas: la proteasa (PRO), la transcriptasa inversa y la integrasa. El autoprocesamiento por la parte proteasa del gen da origen a las tres proteínas de la región POL (Thomsen DR, et al., 1992).
Hay una necesidad general de una mejora en la eficacia y seguridad de las vacunas de FeLV y de una protección más efectiva en condiciones de campo.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
Un objetivo de la presente invención puede ser uno cualquiera o todos de proporcionar vectores o virus recombinantes, así como procedimientos para la fabricación de dichos virus, y proporcionar composiciones y/o vacunas, así como procedimientos para el tratamiento y profilaxis de la infección por FeLV.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende:
a) un vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de la envoltura (ENV) del virus de leucemia felina (FeLV)que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34, en el que el polipéptido comprende una mutación que es una sustitución de arginina (R) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 o una posición de aminoácido correspondiente equivalente de una proteína de ENV de FeLV y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12; y
b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.
En particular, la presente invención proporciona una composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en el que el primer polinucleótido codifica un polipéptido de ENV de FeLV que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2 o 4, y donde el segundo polinucleótidos codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 12.
La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV, tal como se define en el primer aspecto de la invención.
La invención proporciona además una composición o vector de expresión de la invención para usar como una vacuna contra el animal, donde la composición o el vector de expresión se formula para al menos una administración.
La invención también proporciona un kit para la vacunación principal-refuerzo que comprende al menos dos viales: un primer vial que contiene una composición o vector de expresión de la invención para la vacunación principal y un segundo vial que contiene una composición o vector de expresión de la invención, o una vacuna de subunidades de FeLV, o una vacuna de plásmido de FeLV para la vacunación de refuerzo.
Estas y otras realizaciones se describen o son obvias a partir de, y están abarcadas por, la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse conjuntamente con las figuras que se acompañan, en las cuales:
La Figura 1 proporciona una tabla que identifica la SEQ ID NO asignado a la secuencia de polinucleótidos y proteínas.
La Figura 2 representa un mapa de plásmido de pH6C5env (208,2).
La Figura 3 proporciona las secuencias para el fragmento de plásmido pCXL208.2 (pH6C5env) que contiene ADN de ENV de FeLV y los brazos izquierdo y derecho (SEQ ID NO: 36) y proteína de ENV de FeLV (SEQ ID NO: 7) del plásmido pHCMV-ENV de FeLV.
La Figura 4 proporciona el mapa de restricción para el plásmido pPB713.
La Figura 5 proporciona los alineamientos de secuencias de ADN y proteínas de ENV de FeLV.
La Figura 6 proporciona el mapa de restricción del plásmido pPB712.
La Figura 7 muestra la alineación de secuencias de ADN de GAG/PRO de tipo salvaje (SEQ ID NO: 11) y ADN de GAG/PRO de codones optimizados (SEQ ID NO: 10).
La Figura 8 proporciona el esquema de clonación.
La Figura 9 proporciona el mapa de restricción del plásmido pJY1 874.1.
La figura 10 proporciona la secuencia de proteínas GAG-PRO de FeLV.
La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de pJY1874.1 que contiene los brazos e inserto (SEQ ID NO: 38).
La Figura 12 proporciona el esquema de clonación para la fabricación del plásmido vCP2294.
La Figura 13 muestra el mapa de la regiónC3 del plásmido vCP2294 con localizaciones de cebadores.
La Figura 14 representa la secuencia del plásmido vCP2294 (anotado).
La Figura 15 proporciona el esquema de clonación para la fabricación del plásmido vCP2296.
La Figura 16 muestra el mapa de la región C5 del plásmido vCP2296 con localizaciones de cebadores.
La Figura 17 proporciona el esquema de clonación para la fabricación del plásmido vCP2295.
La Figura 18 representa la secuencia del plásmido vCP2295.
La Figura 19 es un gráfico que muestra la evolución de la proviremia promedio por grupo después de la estimulación.
La Figura 20 es un gráfico que muestra la evolución de la proviremia promedio por grupo y el estado de p27 después de la estimulación.
La Figura 21 es un gráfico que muestra la proviremia en la médula ósea en correlación con el estado de p27.
La Figura 22 muestra la respuesta de IPNg específica de FeLV en D35.
La Figura 23 muestra la respuesta de IPNg específica de FeLV (grupo de péptidos ENV No.1) en D35.
La Figura 24 muestra la respuesta de IL-10 específica de FeLV (grupos de péptidos ENV) en D35.
La Figura 25 muestra la respuesta de IL-20 específica de FeLV (grupos de péptidos GAG/PRO) en D35.
Las Figuras 26a-b muestran la proporción de IFNy/IL-10 específica de FeLV (estimulación de ENV) en D35.
La Figura 27 muestra la respuesta de IPNg específica de FeLV (estimulación de GAG/PRO) en D126.
La Figura 28a muestra la respuesta de IL-10 específica de FeLV (estimulación de ENV) en D126.
La Figura 28b muestra la respuesta de IL-10 específica de FeLV (estimulación de GAG/PRO) en D126.
La Figura 29 muestra la relación IFNy/IL-10 específica de FeLV, grupos de péptidos de ENV de FeLV y GAG/PRO en D35.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Cabe indicar que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones, los términos tales como "comprende" "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no citados de manera explícita, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V. publicadas por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Desk Comprehensive Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de los miembros de esa lista.
El término "polipéptido o ADN de ENV de FeLV" se refiere a cualquier polipéptido o ADN de ENV de FeLV nativo u optimizado/mutado, y sus derivados y variantes. Por ejemplo, el ADN de ENV de FeLV optimizado/mutado puede optimizarse de codones, el ADN de ENV de FeLV puede optimizarse para producir una única mutación de aminoácidos en el polipéptido de FeLV. El polipéptido de ENV de FeLV optimizado/mutado puede comprender una única mutación de aminoácido, o una doble mutación de aminoácidos o una mutación múltiple de aminoácidos.
El término "animal" se usa aquí para incluir todos los mamíferos, aves y peces. El animal como se usa en el presente documento se puede seleccionar del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos, incluyendo guepardos y lince), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), ovino (por ejemplo, ovejas, cabras, llamas, bisontes), aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio), los seres humanos, y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas del desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.
El término "ácido nucleico", "nucleótido", y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN y sus derivados, tales como los que contienen cadenas principales modificadas. Se debe entender que la descripción proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. Los polinucleótidos que pueden usarse en la práctica de la invención se pueden preparar de diferentes maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, mediante clonación de genes, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificado, monocatenario o doble cadena, o un híbrido de los mismos, cebadores, sondas, etc.).
El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF) a partir del codón de iniciación (codón de metionina) y terminando con una señal de terminación (codón de parada). Los genes y polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tal como el inicio de la transcripción, traducción y terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen los promotores y regiones de unión a ribosomas (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos en dirección 5' del codón de inicio de la secuencia codificante o gen; Doree SM et al.; Pandher K et al.; Chung JY et al), terminadores de la transcripción (en general el terminador se encuentra dentro de aproximadamente 50 nucleótidos en dirección 3' del codón de parada de la secuencia codificante o gen; Ward, CK et al). Un gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
El término "polipéptido inmunogénico" o "fragmento inmunogénico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido o un fragmento de un polipéptido que comprende un motivo específico de alelo, un epítopo u otra secuencia de forma que el polipéptido o el fragmento se unirán a una molécula de MHC e inducirán una respuesta de linfocito T citotóxico ("CTL") y/o una respuesta de células B (por ejemplo, producción de anticuerpos), y/o respuesta de linfocitos T auxiliares y/o una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) contra el antígeno, a partir de las cuales se deriva el polipéptido inmunogénico o el fragmento inmunogénico. Una respuesta DTH es una reacción inmunológica en la que la activación de macrófagos dependiente de células T y la inflamación causan lesión tisular. Una reacción de DTH a la inyección subcutánea de antígeno se utiliza a menudo como un ensayo para la inmunidad mediada por células.
Por definición, un epítopo es un determinante antigénico que es inmunológicamente activo en el sentido de que una vez administrado al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral (células B) y/o tipo celular (células T). Estos son grupos químicos o secuencias de péptidos particulares en una molécula que son antigénicos. Un anticuerpo se une específicamente a un epítopo antigénico particular sobre un polipéptido. Ejemplos específicos, no limitativos, de un epítopo incluyen una secuencia de tetrapéptido a pentapéptido en un polipéptido, una secuencia de triglicósido a pentaglicósido en un polisacárido. En el animal la mayoría de los antígenos presentarán varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Dicho polipéptido también puede ser calificado como un polipéptido inmunogénico y el epítopo puede ser identificado tal como se describe posteriormente.
Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce de forma natural el componente, por ejemplo, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante tecnología recombinante, así como la síntesis química.
El término "purificado/a", tal como se usa en el presente documento, no requiere pureza absoluta; más bien, se entiende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido purificado es una en la que el polipéptido está más enriquecida que el polipéptido está en su medio natural. Una preparación de polipéptido está sustancialmente purificada de tal manera que el polipéptido representa varias formas de realización de al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, del contenido total de polipéptido de la preparación. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en este documento se pueden purificar mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica.
Un polinucleótido recombinante es uno que tiene una secuencia que no es de origen natural o tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos en cualquier caso separados de la secuencia. Esta combinación artificial a menudo se logra mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. En una realización, un polinucleótido recombinante codifica una proteína de fusión.
En el presente documento se describen polipéptidos optimizados o mutados de FeLV. En el presente documento se describen polipéptidos de ENV de FeLV optimizados o mutados. Una proteína de ENV de FeLV optimizada en la que se produce una mutación en, pero no limitado a, la posición de aminoácido 527 de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34 puede usarse en la práctica de la invención. En el presente documento se describe que la mutación puede ser una sustitución de arginina (R), ácido aspártico (D) o metionina (M) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 43, o la posición del aminoácido 533 de la SEQ ID NO: 7. En la práctica de la invención, la mutación es una sustitución de arginina (R) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, o 34. Se entenderá por una persona experta en la técnica que en base a la alineación de secuencias, la mutación descrita abarca la mutación en la posición de aminoácido correspondiente en otros polipéptidos de ENV de FeLV que no se enumeran en la presente solicitud, en que la posición de aminoácido correspondiente es equivalente a la posición del aminoácido 527 de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 43, o la posición del aminoácido 533 de la SEQ ID No: 7. La alineación de secuencias de proteínas de algunos de los polipéptidos de ENV de FeLV se ejemplifica en la Figura 1d. En una realización, el polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado comprende una mutación de aminoácido en la posición del aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácido correspondiente de proteínas ENV de FeLV. En el presente documento se describe que el polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado comprende la sustitución de aminoácido de R, D o M por E en la posición de aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácidos correspondiente del polipéptido ENV de FeLV. En aún otra realización, el polipéptido ENV de FeLV optimizado o mutado comprende la sustitución de aminoácido de R por E en la posición de aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácidos correspondiente del polipéptido ENV de FeLV. En aún otra realización, el polipéptido ENV de FELV mutado tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, o 4.
Además, los homólogos de polipéptidos de FeLV pretenden estar dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido de FeLV de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido de FeLV de tipo salvaje en modificaciones posteriores a la traducción, en diferencias en la secuencia de aminoácidos, o en ambos. En particular, los homólogos de la invención exhibirán generalmente al menos el 80-85%, 85-90%, 90-95%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de las secuencias de polipéptido o polinucleótido de FeLV de tipo salvaje, y exhibirán una función similar.
Un polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34 se puede usar en la práctica de la invención.
Los fragmentos y variantes de los polipéptidos de ENV de FeLV optimizados o mutados identificadas anteriormente, que fácilmente se pueden preparar por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas, se pueden usar en la práctica de la invención.
Las variantes son polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos de al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34.
Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Tales variaciones alélicas naturales pueden resultar típicamente en 1- 5% de varianza en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse mediante la secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un conjunto de diferentes especies, que puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético del gen en estas especies. Cualquiera y todas de dichas variaciones de ácido nucleico y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés, pretenden estar dentro del alcance de la invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservativas de aminoácidos u otras modificaciones menores, de manera que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente cuando se compara con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado que pueden dar lugar a péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. Las modificaciones pueden ser cualquier cambio de aminoácido en las posiciones de aminoácido distintas de la posición 527 de SeQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 43, o la posición del aminoácido 533 de la SEQ ID NO: 7.
El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos mediante estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
Un fragmento inmunogénico de un polipéptido de ENV de FeLV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido de ENV de FeLV que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 43, o variantes de las mismas. En otra realización, un fragmento de un polipéptido de ENV de FeLV incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido de ENV de FeLV de longitud completa.
Los procedimientos para determinar fragmentos de polipéptido y epítopo, tales como, la generación de bibliotecas de péptidos superpuestos (Hemmer B. et al.), Pepscan (Geysen HM et al, 1984; Geysen HM et al, 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen HM) y algoritmos (de Groot A. et al; Hoop T. et al; Parker K. et al), se pueden utilizar en la práctica de la invención, sin gran experimentación. Generalmente, los anticuerpos se unen específicamente a un epítopo antigénico particular. Ejemplos específicos, no limitativos, de los epítopos incluyen una secuencia de tetra- a pentapéptido en un polipéptido, una secuencia de un tri- a penta-glicósido en un polisacárido. En los animales, la mayoría de los antígenos presentarán varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Preferentemente, cuando el epítopo es un fragmento de proteína de una molécula más grande, tendrá sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total.
En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido de ENV de FeLV. Un polinucleótido de ENV de FeLV que codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado, en el que la mutación se produce en la posición de aminoácido 527 de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34 se puede utilizar en la práctica de la invención. El polinucleótido ENV de FeLV que codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado en el que la mutación es una sustitución de arginina (R) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 7, 28, 29, 30, 31, 32, 33, o 34 se puede usar en la práctica de la invención. En un aspecto, el polinucleótido de ENV de FeLV codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado tiene una mutación de aminoácido en la posición del aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácidos correspondiente de proteínas ENV de FeLV. En el presente documento se describe que el polinucleótido de ENV de FeLV codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado que tiene el cambio de aminoácidos de E a R, D o M en la posición de aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácidos correspondiente del polipéptido de ENV de FeLV. En otro aspecto, el polinucleótido de ENV de FeLV codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado o mutado que tiene el cambio de aminoácidos de E a R en la posición de aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácidos correspondiente del polipéptido de ENV de FeLV. En aún otra realización, el polinucleótido de ENV de FeLV codifica un polipéptido de ENV de FeLV que tiene la secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO: 2, o 4. En el presente documento se describe que el polinucleótido de ENV de FeLV codifica un polipéptido de ENV de FeLV que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 43, o una variante conservativa, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.
Un polipéptido de GAG-PRO de FeLV que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12 puede utilizarse en la práctica de la invención.
Un polinucleótido de ENV de FeLV que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o una variante de las mismas puede usarse en la práctica de la invención. Un polinucleótido de ENV de FeLV que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o una variante de las mismas puede usarse en la práctica de la invención.
Un polinucleótido de GAG-PRO de FeLV que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 10, o 11, o una variante de las mismas puede usarse en la práctica de la invención.
Estos polinucleótidos pueden incluir secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican polipéptidos ENV o GAG-PRO de FeLV. Se entiende que todos los polinucleótidos que codifican polipéptidos ENV o GAG-PRO de FeLV también se incluyen en el presente documento, siempre que codifiquen un polipéptido con la actividad reconocida, como la unión a un anticuerpo que reconoce el polipéptido, la inducción de una respuesta inmunitaria al polipéptido, o un efecto sobre la supervivencia de la enfermedad de la leucemia cuando se administra a un sujeto expuesto al parásito o que sufre una disminución de un signo o síntoma de la infección por FeLV.
Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican un polipéptido e Nv o GAG-PRO de FeLV, la secuencia de ADN del gen de ENV o GAG-PRO de FeLV puede ser modificada para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie en particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos con el que sustancialmente se encuentra en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de la expresión de la proteína de FeLV en dicha especie se puede lograr mediante la utilización de la frecuencia de distribución de uso del codón en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso del codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales son especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de FeLV codificada por la secuencia de nucleótidos esté funcionalmente inalterada.
La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede ser establecida por la matriz “blast” en parejas o blosum62 de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) utilizando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor del "Centro Nacional de Información Biotecnológica" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.), así como en Altschul et al.; y por lo tanto, este documento habla de utilizar el algoritmo o la matriz BLAST o BLASTX y BLOSUM62 por el término “blasts”).
La identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos también se puede determinar utilizando el programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) y disponible en NCBI, así como el mismo u otros programas disponibles a través de Internet en sitios en la misma, tales como el sitio de NCBI.
Alternativamente o adicionalmente, el término "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. La homología de secuencias en porcentaje puede calcularse como:
(N ref - N dif) * 100/N ref , en la que Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2).
Alternativa o adicionalmente, la "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, en el que la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización por hueco de 4, y el análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencia que incluye alineación pueden llevarse a cabo convenientemente utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, al considerarse la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (u ) en las secuencias de ARN.
La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
Los polinucleótidos de ENV o GAG-PRO de FeLV pueden incluir un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias.
Los vectores recombinantes descritos en este documento pueden incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido, una variante del mismo o un fragmento del mismo. Los vectores recombinantes pueden incluir plásmidos y vectores virales y se pueden usar para la expresión in vitro o in vivo. Los vectores recombinantes pueden incluir además un péptido señal. Los péptidos señal son un péptido de cadena corta (3-60 aminoácidos de longitud) que dirigen el transporte posterior a la traducción de una proteína (que se sintetiza en el citosol) a ciertos orgánulos, tales como el núcleo, la matriz mitocondrial, retículo endoplásmico, cloroplasto, apoplasto y peroxisomas. Típicamente, las proteínas de ENV de FeLV de origen natural pueden ser traducidas como precursoras que tienen una secuencia de péptido señal N-terminal y un dominio de proteína "madura". El péptido señal puede ser escindido rápidamente tras la traducción. La secuencia señal puede ser la secuencia natural de la proteína de ENV de FeLV o un péptido señal de una proteína secretada, por ejemplo, el péptido señal de la proteína activadora del plasminógeno tisular (tPA), en particular tPA humana (S. Friezner Degen et al.; R . Rickles et al.; D. Berg. et al.), o el péptido señal del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), en particular el IGF1 equino (K. Otte et al.), el IGF1 canino (P. Delafontaine et al.), el IGF1 felino (WO03/022886), el IGF1 bovino (S. Lien et al.), el IGF1 porcino (M. Muller et al.), el IGF1 de pollo (Y. Kajimoto et al.), el IGF1 de pavo (número de acceso GenBank AF074980). El péptido señal de IGF1 puede ser natural u optimizado que puede conseguirse mediante la eliminación de los sitios de empalme crípticos y/o mediante la adaptación del uso de codones. Tras la traducción, el polipéptido no procesado se puede escindir en un sitio de escisión para dar lugar al polipéptido maduro. El sitio de escisión puede predecirse utilizando el procedimiento de Von Heijne (1986).
Un plásmido puede incluir una unidad de transcripción de ADN, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que permite replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación (procariota o eucariota). Un plásmido también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Las formas circulares y lineales de plásmidos están abarcadas en la presente descripción.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector de expresión in vivo que comprende una secuencia de polinucleótidos que contiene y expresa in vivo en un huésped los polipéptidos de ENV de FeLV optimizados o mutados y/o variantes o fragmentos de los mismos. El vector de expresión puede comprender además un polinucleótido que codifica un polipéptido GAG-PRO de FeLV y/o variantes o fragmentos de los mismos.
El vector de expresión in vivo puede incluir cualquier unidad de transcripción que contiene un polinucleótido o un gen de interés y los elementos esenciales para su expresión in vivo. Estos vectores de expresión pueden ser plásmidos o vectores virales recombinantes. Para la expresión in vivo, el promotor puede ser de origen viral o celular. En una realización, el promotor puede ser el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor temprano (promotor CMV-IE), el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, un promotor de un gen del citoesqueleto, tal como el promotor de desmina (Kwissa M. et al.) o el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Cuando varios genes están presentes en el mismo plásmido, se pueden proporcionar en la misma unidad de transcripción o en diferentes unidades.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "plásmido" puede incluir cualquier unidad de transcripción de ADN que comprenda un polinucleótido que se puede usar en la práctica de la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseadas; y, en este sentido, se observa que un plásmido circular, superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, se pretende que estén dentro del alcance de la invención. Los plásmidos también pueden comprender otros elementos reguladores de la transcripción tales como, por ejemplo, secuencias de estabilización de tipo intrón. En varias realizaciones, los plásmidos pueden incluir el primer intrón de CMV-IE (WO 89/01036), el intrón II del gen de beta-globina de conejo (van Ooyen et al.), la secuencia señal de la proteína codificada por el activador del plasminógeno tisular (tPA; Montgomery et al.), y/o una señal de poliadenilación (poliA), en particular la poliA del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (US 5.122.458) o poliA del gen de beta-globina de conejo o del virus SV40.
Se describe en el presente documento una composición que comprende: a) un vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de ENV de FeLV, una variante o fragmento del polipéptido de ENV de FeLV, y una mezcla de los mismos; y b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptables.
Se describe en el presente documento una composición que comprende: a) un vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de ENV de FeLV, un polipéptido de GAG/PRO de FeLV, una variante o fragmento del polipéptido de ENV de FeLV, y una mezcla de los mismos; y b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptables.
Se describe en el presente documento una composición que comprende: a) un vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de ENV de FeLV, un polipéptido de GAG/PRO de FeLV; y b) un vehículo diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptables.
Los polipéptidos ENV y GAG/PRO de FeLV se describen anteriormente.
En una realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende: a) un vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica un ENV de FeLV optimizado o mutado que tiene la sustitución de aminoácido de R por E en la posición de aminoácido 527 de la SEQ ID NO: 6 o en la posición de aminoácidos correspondiente del polipéptido de FeLV y un polinucleótido que codifica un polipéptido GA-PRO de FeLV que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12; y b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. En aún otra realización, la composición de la presente invención comprende: a) un vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de ENV de FeLV que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 4 y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido GAG/PRO de FeLV que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.
El término "composición" comprende cualquier vacuna o composición inmunológica, que una vez que se ha inyectado a un huésped, incluyendo caninos, felinos y seres humanos, induce una respuesta inmunitaria en el huésped, y/o protege al huésped de la leucemia, y/o puede prevenir la implantación del parásito, y/o puede prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados, y/o puede limitar la difusión de parásitos que se dirigen a los órganos internos. Esto se puede lograr tras la vacunación según la presente invención a través de la inducción de la secreción de citoquinas, en particular la secreción de IFN-gamma (como ejemplo de un procedimiento de medición de la secreción de IFN-gamma, podría utilizarse el inmunoensayo Quantikine de R & D Systems Inc. (número de catálogo # CAIF00) (Djoba Siawaya JF et al.)).
Los vehículos o excipientes de uso farmacéuticamente aceptables son convencionales. Remington'd Pharmaceutical Sciences, por EW Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de los polipéptidos, plásmidos, vectores virales descritos en el presente documento. En general, la naturaleza del vehículo o excipiente dependerá del modo de administración particular empleado. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables, tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares, como vehículo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, las formas de pastillas liofilizadas, polvo, píldora, comprimido o cápsula), los vehículos o excipientes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de vehículos o excipientes biológicamente neutros, las composiciones inmunogénicas a administrar pueden contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes de tamponamiento de pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.
Las composiciones o vacunas de acuerdo con la presente invención pueden incluir vectores que codifican cualquier polinucleótido de acuerdo con la presente invención tal como se describe anteriormente.
Se puede realizar múltiples inserciones en el mismo vector utilizando diferentes sitios de inserción o utilizando el mismo sitio de inserción. Cuando se utiliza el mismo sitio de inserción, cada inserto de polinucleótido, que puede ser cualquier polinucleótido de la presente invención mencionado anteriormente, se puede insertar bajo el control del mismo y/o diferentes promotores. La inserción se puede hacer cola a cola, de cabeza a cabeza, cola a cabeza o de cabeza a cola. Los elementos IRES (sitio interno de entrada al ribosoma, véase el documento EP 0.803.573) también se pueden utilizar para separar y para expresar múltiples insertos unidos operativamente al mismo y/o diferentes promotores.
En el presente documento se describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido mencionado anteriormente. El vector de expresión puede ser un vector de expresión in vivo, o un vector de expresión in vitro.
En el presente documento se describen vectores de expresión in vivo incluyendo cualquier plásmido (EP-A2-1001025; Chaudhuri P.) que contiene y expresa in vivo, en un huésped, el polinucleótido o gen de polipéptido de ENV de FeLV, variante del mismo o fragmento del mismo y los elementos necesarios para su expresión in vivo.
En un ejemplo no limitativo específico, el plásmido pVR1020 o pVR1012 (VICAL Inc.; Lucas C. et al.; Hartikka J. et al.), PVR2001-TOPA (o pVR2001-TOPO) (Oliveira F. et al.) o pAB110 (US 6,852,705) se pueden utilizar como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 deriva de pVR1012 y contiene la secuencia señal de tPA humano. El pVR1020 es un esqueleto del plásmido disponible de Vical, Inc., (San Diego, CA) que se ha utilizado previamente, véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.451.769 y 7.078.507. Como se describe en Oliveira et al., el plásmido pVR2001-TOPO (o pVR2001-TOPA) es pVR1020 modificado por la adición de topoisomerasas que flanquean el sitio de clonación y contienen la codificación para y que expresan un péptido señal de secreción, por ejemplo, péptido señal de activador del plasminógeno tisular (tPA), que aumenta la probabilidad de producir una proteína secretada, (véase la Figura 1 en Oliveira F. et al.).
Cada plásmido puede comprender o contener o consistir esencialmente en, el polinucleótido que se puede usar en la práctica de la presente invención, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependientes de un promotor, en el que el promotor puede ser ventajosamente adyacente con el polinucleótido para el que se desea la expresión. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte que sea funcional en células eucariotas. Un ejemplo de un promotor útil puede ser el promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o murino, o puede tener opcionalmente otro origen, tal como de rata o conejillo de indias. El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real, que puede o no estar asociada con la parte potenciadora. Se puede hacer referencia a los documentos EP 260 148, EP 323 597, US 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, así como al documento WO 87/03905. El promotor CMV-IE puede ser ventajosamente un CMV-iE humano (Boshart M. et al.) o murino. En términos más generales, el promotor puede tener un origen viral o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto del CMV-IE que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor fuerte celular que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como el promotor de desmina (Kwissa M. et al.) o el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Los subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen la actividad promotora adecuada, se incluyen dentro de la presente descripción, por ejemplo, promotores CMV-IE truncados, según el documento WO 98/00166 o US 6.156.567 y se pueden usar en la práctica de la invención. Un promotor útil en la práctica de la invención, por consiguiente, puede incluir derivados y/o subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y por lo tanto, funcionan como un promotor, y que pueden tener ventajosamente la actividad del promotor que es sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa del que se deriva el subfragmento o derivado, por ejemplo, similar a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de US 6.156.567 en comparación con la actividad de promotores CMV-IE de longitud completa. Por lo tanto, un promotor CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en la porción de promotor del promotor de longitud completa y/o la porción del potenciador del promotor de longitud completa, así como derivados y/o subfragmentos de los mismos.
Ventajosamente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos de control de la expresión. Es especialmente ventajoso incorporar la secuencia o secuencias de estabilización, por ejemplo, la secuencia o secuencias de intrón, por ejemplo, el primer intrón del hCMV-IE (WO 89/01036), el intrón II del gen de pglobina de conejo (van Ooyen et al.). En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede usarse la señal de poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal de poli (A) del gen de la p-globina de conejo o la señal de poli (A) del virus SV40.
Más generalmente, la presente invención abarca vectores de expresión in vivo, incluyendo cualquier vector viral recombinante que contiene un polinucleótido o gen que codifica uno o más de ENV de FeLV y/o variantes o fragmentos de los mismos, incluyendo todos los elementos necesarios para su expresión in vivo.
Dichos vectores virales recombinantes podrían seleccionarse de, por ejemplo, los poxvirus, especialmente virus de la viruela aviar, como virus de la viruela aviar o virus del canario. En una realización, el virus de la viruela aviar es un TROVAC (véase el documento WO 96/40241). En otra realización, el vector de la viruela del canario es un ALVAC. El uso de estos vectores virales recombinantes y la inserción de polinucleótidos o genes de interés se describen completamente en el documento US 5.174.993; US 5.505.941 y uS 5.766.599 para la viruela aviar, y US 5.756.103 para la viruela del canario. Puede utilizarse más de un sitio de inserción dentro del genoma viral para la inserción de múltiples genes de interés.
En una realización, el vector viral es un adenovirus, tal como un adenovirus humano (HAV) o un adenovirus canino (CAV).
En otra realización, el vector viral es un adenovirus humano, específicamente un adenovirus de serotipo 5, fabricado incompetente para la replicación por una deleción en la región E1 del genoma viral, en especial desde aproximadamente el nucleótido 459 hasta aproximadamente el nucleótido 3510 por referencia a la secuencia de la hAd5 que se describe en Genbank con el número de acceso M73260 y en la publicación de referencia Chroboczek et al, 1992. El adenovirus suprimido se propaga en 293 que expresan E1 (Graham et al., 1977) o células PER, especialmente PER.C6 (Falloux et al., 1998). El adenovirus humano puede adicional o alternativamente ser eliminado en la región E3, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 28592 hasta aproximadamente el nucleótido 30470. La deleción en la región E1 se puede realizar en combinación con una deleción en la región E3 (véase, por ejemplo Shriver et al.; Graham et al.; Ilan et al.; la patente US 6.133.028 y US 6.692.956; Tripathy et al.; Tapnell; Danthinne et al.; Berkner; Berkner et al.; Chavier et al). Los sitios de inserción pueden ser los loci (región) E1 y/o E3 opcionalmente después de una supresión parcial o completa de las regiones E3 y/o E1. Ventajosamente, cuando el vector de expresión es un adenovirus, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, tales como un promotor fuerte, de manera ventajosa un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor CMV-IE), especialmente la región potenciadora/promotora desde aproximadamente el nucleótido -734 hasta aproximadamente el nucleótido 7 en Boshart et al., o la región potenciadora/promotora del vector pCI de Promega Corp. El CMV-IE es ventajosamente de origen murino o humano. El promotor del factor de elongación 1a también se puede utilizar. También se puede utilizar un promotor específico de músculo (Li et al.). Los promotores fuertes también se discuten en este documento en relación con vectores plasmídicos. En una realización, una secuencia de empalme puede estar situada en dirección 3' de la región potenciadora/promotora. Por ejemplo, el intrón 1 aislado del gen de CMV-IE (Stenberg et al.), el intrón aislado del gen de p-globina de conejo o humano, especialmente el intrón 2 del gen de la p-globina, el intrón aislado del gen de inmunoglobulina, una secuencia de corte y empalme del gen temprano de SV40 o la secuencia de intrón quimérico aislada del vector pCI de Promege Corp. Una secuencia de poli(A) y una secuencia de terminación se pueden insertar en dirección 3' del polinucleótido a expresar, por ejemplo, un gen de la hormona de crecimiento bovina, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 2339 hasta aproximadamente el nucleótido 2550 de la secuencia con número de acceso GenBank BOVGHRH, un gen de p-globina de conejo o una señal de poliadenilación de genes tardíos de SV40.
En otra realización, el vector viral es un adenovirus canino, especialmente un CAV-2 (véase, por ejemplo, Fischer et al.; patentes US n° 5.529.780 y 5.688.920; WO 95/14102). Para CAV, los sitios de inserción pueden ser en la región E3 y/o en la región situada entre la región E4 y la región de ITR derecha (véanse las Patentes de Estados Unidos Nos. 6.090.393 y 6.156.567). En una realización, el inserto está bajo el control de un promotor, tal como un promotor de del gen inmediato temprano de citomegalovirus (promotor CMV-IE) o un promotor ya descrito para un vector de adenovirus humano. Una secuencia de poli(A) y una secuencia de terminador se pueden insertar en dirección 3' del polinucleótido que se expresa, por ejemplo, un gen de la hormona de crecimiento bovino o una señal de poliadenilación del gen de conejo p-globina.
En otra realización, el vector viral es un virus del herpes, tal como un virus del herpes felino (FHV). En una realización, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, ventajosamente un promotor CMV-IE (murino o humano). Una secuencia de poli(A) y la secuencia de terminador se pueden insertar en dirección 3' del polinucleótido que se expresa, por ejemplo, hormona del crecimiento bovina o una señal de poliadenilación del gen de p-globina de conejo.
Para los vectores recombinantes basados en un vector de poxvirus, un virus vaccinia o un virus vaccinia atenuado, (por ejemplo, MVA, una cepa Ankara modificada obtenida después de más de 570 pasajes de la cepa de la vacuna Ankara en fibroblastos de embrión de pollo; ver Stickl y Hochstein-Mintzel; Sutter et al.; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, véase el documento US 5.494.807, y la Patente de Estados Unidos N° 5.494.807 que discuten la construcción de NYVAC, así como las variaciones de NYVAC con ORFs adicionales eliminados del genoma del virus vaccinia de cepa Copenhagen, así como la inserción de moléculas de ácidos nucleicos codificantes heterólogas en los sitios de este recombinante, y también, el uso de promotores emparejados; ver también el documento WO 96/40241), se pueden utilizar un virus de la viruela aviar o un virus de la viruela aviar atenuado (por ejemplo, viruela del canario, viruela aviar, viruela de tórtola, viruela de la paloma, quailpox, ALVAC o TROVAC; véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 5.505.941, 5.494.807). El virus del canario atenuado se describe en US 5.756.103 (ALVAC) y el documento WO 01/05934. También se hace referencia a US5,766,599 que se refiere a la cepa de la viruela aviar atenuada TROVAC. Se hace referencia a la viruela del canario disponible en la ATCC bajo el número de acceso VR-111. Numerosas cepas de vacunación del virus de la viruela aviar también están disponibles, por ejemplo, la cepa DIFTOSEC TC comercializada por Merial y la vacuna NOBILIS VARIOLE comercializada por Intervet. Para obtener información sobre el procedimiento utilizado para generar recombinantes de las mismas y cómo administrar recombinantes de las mismas, el experto en la materia puede referirse a documentos citados en la presente memoria y al documento WO 90/12882, por ejemplo, en cuanto a virus vaccinia, se hace mención de las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807, y 5.762.938, entre otras; con respecto a la viruela aviar, se hace mención de las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.174.993, 5.505.941 y 5.766.599, entre otras; con respecto a la viruela del canario, se hace mención de la patente de Estados Unidos N° 5.756.103, entre otras. Cuando el vector de expresión es un virus vaccinia, el sitio o sitios de inserción para el polinucleótido o los polinucleótidos que se expresan están ventajosamente en el gen o sitio de inserción de la timidina quinasa (TK), el gen o sitio de inserción de hemaglutinina (HA), la región que codifica el cuerpo de inclusión del tipo A (ATI); véanse también los documentos citados en este documento, especialmente los relacionados con virus vaccinia. En el caso de la viruela del canario, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son ORF (s) C3, C5 y/o C6; véanse también los documentos citados aquí, especialmente aquellos relativos al virus de la viruela del canario. En el caso de la viruela aviar, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son ORFs F7 y/o F8; véanse también los documentos citados aquí, especialmente aquellos relativos al virus de la viruela aviar. El sitio o sitios de inserción para el virus MVA son ventajosamente como en varias publicaciones, incluyendo Carroll MW et al; Stittelaar KJ et al.; Sutter G. et al.; y, en este sentido también se observó que el genoma de MVA completo se describe en Antoine G., Virology, que permite al experto en la técnica usar otros sitios de inserción u otros promotores. Ventajosamente, el polinucleótido que se expresa se inserta bajo el control de un promotor específico de virus de la viruela, por ejemplo, el promotor de vaccinia 7,5 kDa (Cochran et al.), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al.), el promotor de vaccinia HA (Shida), el promotor de la viruela de vaca ATI (Funahashi et al.), el promotor de vaccinia H6 (Taylor J. et al.; Guo P. et al. J.; Perkus M. et al.), entre otros.
Cualquiera de los polinucleótidos descritos aquí pueden expresarse in vitro por transferencia de ADN o vectores de expresión en una célula huésped adecuada. La célula huésped puede ser procariota o eucariota. El término "célula huésped" también incluye cualquier progenie de la célula huésped sujeto. Los procedimientos de transferencia estable, lo que significa que el polinucleótido foráneo se mantiene continuamente en la célula huésped, son conocidos en la técnica. Las células huésped pueden incluir bacterias (por ejemplo, Escherichia coli), levaduras, células de insectos y células de vertebrados. Procedimientos de expresar secuencias de ADN en células eucariotas son bien conocidos en la técnica. Como un procedimiento para la expresión in vitro, vectores de baculovirus recombinantes (por ejemplo, Autographa California Virus Polihedrosis Nuclear (AcNPV)) se pueden utilizar con los ácidos nucleicos descritos en este documento. Por ejemplo, los promotores de polihedrina se pueden utilizar con células de insectos (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda, como las células Sf9 disponibles en la ATCC bajo el número de acceso CRL 1711, o células Sf21) (ver por ejemplo, Smith et al .; Pennock et al .; Vialard y col .; Verne A .; O'Reilly et al .; Kidd IM & Emery VC; EP 0370573; EP 0265785, US 4745051). Para la expresión, el paquete BaculoGold Starter (Cat # 21001K) de Pharmingen (Becton Dickinson) se puede utilizar. Como un procedimiento para la expresión in vitro, E. coli recombinante puede ser utilizado con un vector. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor arabinosa, pL del bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. La transformación de una célula huésped con ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales son bien conocidos para los expertos en la técnica. Cuando el huésped es procariota, tal como E. coli, las células competentes que son capaces de la absorción de ADN se pueden preparar a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y tratadas posteriormente por el procedimiento de CaCl2 usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, MgCl2 o RbCl se pueden utilizar. La transformación también puede llevarse a cabo mediante electroporación. Cuando el huésped es un eucariota, tales procedimientos de transducción de ADN como coprecipitados de fosfato de calcio, se pueden utilizar procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores de virus. Las células eucariotas también pueden cotransformarse con secuencias de polinucleótidos L. Iongipalpis, y una segunda molécula de ADN extraño que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina quinasa del herpes simple. Otro procedimiento es usar un vector viral eucariota (ver arriba), tal como un virus herpes o adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino 2), para transducir de forma transitoria células eucariotas y expresar la proteína (Gluzman EA). Además, se puede utilizar un agente de transfección, tal como dioleoil-fosfatidil-ethanolamme (DOPE).
El aislamiento y purificación de polipéptido expresado recombinantemente pueden llevarse a cabo por medios convencionales que incluyen cromatografía preparativa (por ejemplo, exclusión por tamaño, intercambio iónico, afinidad), precipitación selectiva y ultrafiltración. Ejemplos de procedimientos del estado de la técnica que se pueden utilizar, pero no limitado a, se pueden encontrar en "Protein Purification Applications", segunda edición, editado por Simon Roe y disponible en Oxford University Press. Dicho polipéptido expresado de forma recombinante es parte de la presente descripción. También se incluyen los procedimientos para la producción de cualquier polipéptido de acuerdo con la presente descripción como se ha descrito anteriormente, en particular el uso de un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la descripción y de una célula huésped.
Las vacunas que contienen los vectores virales recombinantes de acuerdo con la invención se pueden liofilizar, de manera ventajosa, con un estabilizante. La liofilización puede realizarse de acuerdo con procedimientos de liofilización convencionales bien conocidos. Los estabilizantes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables pueden ser hidratos de carbono (por ejemplo, sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T et al.; Israeli E et al.), proteínas, tales como peptona, albúmina, lactoalbúmina o caseína, agentes que contienen proteínas, tales como leche desnatada (Mills CK et al.; Wolff E et al.), y tampones (por ejemplo tampón fosfato, tampón fosfato de metal alcalino). Puede utilizarse un adyuvante para hacer solubles las preparaciones liofilizadas.
Cualquier composición de vacuna según la invención puede también contener ventajosamente uno o más adyuvantes.
Las vacunas basadas en plásmidos pueden formularse con lípidos catiónicos, ventajosamente con DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N, N-dimetil-2,3-bis (tetradeciloxi)-1-propanamonio; WO96/34109), y ventajosamente en asociación con un lípido neutro, por ejemplo DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr JP), con el fin de formar DMRIE-DOPE. En una realización, la mezcla se hace de manera extemporánea, y antes de su administración, es ventajoso que esperar de aproximadamente 10 min a aproximadamente 60 min, por ejemplo, aproximadamente 30 min, para la mezcla apropiada. Cuando se utiliza DOPe , la relación molar de DMRIE/DOPE puede ser de 95/5 a 5/95 y es ventajosamente 1/1. La relación en peso de plásmido/DMRIE o DMRIE-DOPE adyuvante es, por ejemplo, de 50/1 a 1/10, de 10/1 a 1/5 o de 1/1 a 1/2.
Opcionalmente una citoquina puede añadirse a la composición, especialmente GM-CSF o citoquinas que inducen Th1 (por ejemplo IL12). Estas citoquinas se pueden añadir a la composición como un plásmido que codifica la proteína de citoquinas. En una realización, las citoquinas son de origen canino, por ejemplo GM-CSF canino, cuya secuencia del gen ha sido depositada en la base de datos GenBank (número de acceso S49738). Esta secuencia se puede utilizar para crear dicho plásmido de una manera similar a la que se hizo en el documento WO 00/77210.
La vacuna basada en vector viral recombinante puede combinarse con fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; US 6.017.537) y/o adyuvante Carbomer (Phameuropa Vol 8, N° 2, junio de 1996.). Los expertos en la materia también pueden referirse a la patente de Estados Unidos No. 2,909.462 que describe tales polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilos sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden por sí mismos contener otros sustituyentes, tales como
Figure imgf000014_0001
metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alil sacarosa o con alil pentaeritritol. Entre todos estos, se pueden mencionar Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, los copolímeros EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados con divenil éter, son preferidos. Se puede hacer referencia a J. Fields y colaboradores.
Los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros EMA® se forman, por ejemplo, de unidades básicas de la siguiente fórmula:
en la cual:
- R1 y R2, que son idénticos o diferentes, representan H o CH3
- x= 0 o 1, preferiblemente x = 1
- y= 1 o 2, con x y = 2
Para los copolímeros EMA®, x=0 y y=2. Para los carbómeros, x=y=1.
La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que sería neutralizada, ventajosamente a pH fisiológico, con el fin de proporcionar la solución de adyuvante en la cual la propia vacuna será incorporada. Los grupos carboxílicos del polímero están entonces parcialmente en forma COO-.
En una realización, una solución de adyuvante, especialmente de carbómero (Pharmeuropa vol. 8, No.1 Junio 1996) se prepara en agua destilada, ventajosamente en presencia de cloruro de sodio, estando la solución obtenida a pH ácido. Esta solución madre se diluye al adicionar a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada), o una parte sustancial de la misma, agua cargada con NaCl, ventajosamente solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l) todo a la vez en varias porciones con neutralización concomitante o posterior (pH 7,3 a 7,4), preferiblemente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico será utilizada tal cual para la mezcla con la vacuna, que puede ser especialmente almacenarse en forma liofilizada, líquida o congelada.
La concentración de polímero en la composición de vacuna final será del 0,01% al 2% p/v, del 0,06 al 1% p/v, o del 0,1 al 0,6% p/v.
La vacuna de subunidades se puede combinar con adyuvantes, como emulsiones de aceite-en-agua, agua-enaceite-en-agua a base de aceite mineral y/o aceite vegetal y tensioactivos no iónicos, tales como copolímeros de bloque, TWEEN®, SPAN ®. Tales emulsiones son en particular las descritos en la página 147 de "Vaccine Design -The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995, o emulsiones TS, en particular la emulsión TS6, y emulsiones de baja frecuencia, especialmente emulsión LF2 (para ambas emulsiones TS y LF, véase el documento WO 04/024027). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo vitamina E, las saponinas, y CARBOPOL® (Noveon; véase el documento Wo 99/51269; WO 99/44633), hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol . 6, 1995), adyuvantes biológicos (es decir, C4b, especialmente C4b murino (Ogata RT et al.) o C4b equino, GM-CSF, en particular GM-CSF equino (US 6645740)), las toxinas (es decir, toxinas del cólera CTA o CTB, toxinas termolábiles LTA o LTB de Escherichia coli (Olsen cW et al.; Fingerut E et al.; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.), y CpG (es decir CpG # 2395 (ver Jurk M et al.), CpG # 2142 (ver SEQ ID NO: 890 en el documento EP 1221955).
La composición o vacuna también pueden contener o comprender uno o más antígenos de FeLV, por ejemplo, gen de ENV, o ENV y GAG, o ENV y GAG y PRO.
La composición o vacuna también pueden estar asociados con al menos un antígeno FeLV, por ejemplo inactivado FeLV. En una realización particular, la cepa FeLV puede ser un tipo de FeLV Una cepa, o una combinación de FeLV de tipo A y tipo B, o una combinación de FeLV de tipo A y de tipo C, o una combinación de tipo A, tipo B y tipo C son. Estas cepas de FeLV pueden inactivarse por procedimientos químicos o físicos. Los procedimientos químicos son notablemente BPL, formaldehído. Los procedimientos físicos pueden ser notablemente sonicación. Un procedimiento para la inactivación de FeLV para su uso en una vacuna se describe en R. Cordeiro Giunchetti et al., Vaccine, 2007. La vacuna FeLV inactivada puede ser combinado con adyuvantes, como los descritos anteriormente para las vacunas de subunidades.
En el presente documento se describen procedimientos de vacunación de un huésped contra FeLV usando las composiciones de vacuna descritas en este documento.
El huésped puede ser alguno o todos los felinos (por ejemplo, los gatos domésticos, gatos, grandes felinos y gatos salvajes). En una realización, el huésped es un felino.
Las vías de administración pueden ser, por ejemplo, intramuscular (IM) o intradérmica (ID) o transdérmica (TD) o subcutánea (SC). Los medios de administración pueden ser, por ejemplo, una jeringa con una aguja, o un aparato sin aguja, o una jeringa con una aguja acoplada a tratamiento por electrotransferencia (ET), o un aparato sin aguja acoplado a un tratamiento por ET.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una vacuna basada en un plásmido de acuerdo con la presente invención para administración a un huésped, en el que esta administración está acoplada al tratamiento por ET. La administración de una vacuna basada en plásmido es ventajosamente intramuscular. El medio de administración es, por ejemplo, una jeringa y una aguja. Una o varias inyecciones pueden administrarse sucesivamente. En el caso de varias inyecciones, se pueden llevar a cabo con de 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, alrededor de 3 semanas de diferencia. En una realización, se administra adicionalmente un refuerzo semianual o un refuerzo anual. Para las vacunas basadas en plásmidos, las vías ventajosas de administración pueden ser ID o IM. Esta administración puede ser a través del uso de una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.), véase el documento US 2006/0034867. La dosificación puede ser de 50 mg hasta 500 mg por plásmido. Cuando se añade DMRIE-DOPE, se pueden utilizar 100 mg por plásmido. Cuando se utilizan GM-CSF u otras citoquinas, el plásmido que codifica esta proteína puede estar presente en una dosis de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg y puede ser de 200 mg. El volumen de dosis puede ser de entre 0,01 ml y 0,5 ml, por ejemplo, 0,25 ml. La administración puede realizarse en múltiples puntos de inyección.
Alternativamente, las vacunas basadas en plásmidos pueden administrarse por vía IM acoplado a tratamiento por electrotransferencia (ET). El tratamiento por ET puede realizarse utilizando un aparato para electrotransferencia y las especificaciones del fabricante (es decir, generador G250 Sphergen (Sphergen SARL, Evry Genopole, Francia); sistema de electroporación de ADN MedPulser® (Innovio Biomedical Corporation, San Diego, California, EE.UU.)). En una realización, el aparato para electrotransferencia tiene un campo unipolar. La intensidad de campo puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 V/cm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 V/cm, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 175 V/cm. La duración del pulso puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 ms, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 ms. La frecuencia puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 Hz, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 Hz. El intervalo entre impulsos puede ser de aproximadamente 1 a 1000 ms, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 ms. El número de pulsos puede ser de 1 a 20, o de 5 a 10. La intensidad intratisular puede ser ventajosamente hasta aproximadamente 2 A. La distancia entre los electrodos puede ser de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 cm, o de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5 cm.
Para las vacunas basadas en vectores virales recombinantes, las vías de administración pueden ser, ventajosamente, SC o IM o TD o ID. Esta administración puede hacerse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser de aproximadamente 103 pfu a aproximadamente 109 pfu por vector recombinante de poxvirus. Cuando el vector es un virus de viruela del canario, la dosificación puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 105 pfu a aproximadamente 109 pfu, de aproximadamente 106 pfu a aproximadamente 108 pfu, o de aproximadamente 106 pfu a aproximadamente 107 pfu. El volumen de dosis puede ser de aproximadamente 0,01 ml a 0,2 ml, y es ventajosamente de 0,1 ml. La administración puede comprender múltiples puntos de inyección. Para la vía IM el volumen de la vacuna proporcionada puede ser de 0,2 a 2 ml, en particular de aproximadamente 0,5 a 1 ml. Las mismas dosis se utilizan para cualquiera de los vectores de la presente invención.
Para las vacunas de subunidades, la vía de administración puede ser, ventajosamente, a través de SC o IM o TD o ID. Esta administración puede realizarse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet ™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg, en particular de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 mg, y más particularmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 mg. El volumen de la vacuna de subunidades proporcionado es de 0,2 a 2 ml, en particular de aproximadamente 0,5 a 1 ml.
Se describe en el presente documento una estrategia de vacuna, que se basa en un régimen de administración principal-refuerzo, donde la administración principal y la administración o administraciones de refuerzo utilizan una composición que comprende un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y un vector de expresión in vivo que comprende una secuencia de polinucleótidos, que contiene y expresa el polipéptido de FeLV y/o variantes o fragmentos del mismo.
La presente invención se refiere al uso de vectores de expresión in vivo en un régimen de administración principalrefuerzo, que comprende una administración principal de una vacuna que comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de polinucleótido para expresar, in vivo, los polipéptidos FeLV y/o variantes o fragmentos de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de polinucleótido para expresar, in vivo, polipéptidos FeLV y/o variantes o fragmentos de los mismos, tal como se describen anteriormente, para proteger a un huésped de FeLV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en huéspedes infectados.
Un régimen principal-refuerzo comprende al menos una administración principal y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos de los mismos. La vacuna utilizada en la administración principal puede ser de naturaleza diferente de la utilizada como una vacuna de refuerzo posterior. La administración principal puede comprender una o más administraciones. Del mismo modo, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.
Las vías de administración, las dosis y los volúmenes se describen anteriormente en el presente documento.
Las administraciones principal-refuerzo pueden llevarse a cabo ventajosamente de 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, alrededor de 3 semanas de diferencia. De acuerdo con una realización, también se prevé un refuerzo semianual o un refuerzo anual, de forma ventajosa usando la vacuna basada en vector viral. Los animales pueden tener al menos de 6 a 8 semanas de vida en el momento de la primera administración.
En una realización, el régimen de administración principal-refuerzo comprende al menos una administración principal de una vacuna basada en un plásmido de acuerdo con la presente invención y al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vector viral recombinante de acuerdo con la presente invención.
En otra realización, el régimen de administración principal-refuerzo comprende al menos una administración principal de una vacuna basada en vector viral recombinante de acuerdo con la presente invención y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidad de acuerdo con la presente invención.
En otra realización, el régimen de administración principal-refuerzo comprende al menos una administración principal de una vacuna basada en vector viral recombinante de acuerdo con la presente invención y al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en un plásmido de acuerdo con la presente invención.
Se describe aquí un procedimiento de vacunación de un sujeto susceptible a FeLV que comprende un régimen de administración principal-refuerzo en el que dicho régimen comprende una administración principal de una vacuna o composición que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un plásmido que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido de FeLV, una variante o fragmento del polipéptido de FeLV, o una mezcla de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, el mismo polipéptido o polipéptidos FeLV, variante de los mismos, fragmento de los mismos, para proteger al sujeto de FeLV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados.
Se describe aquí un procedimiento de vacunación de un sujeto susceptible a FeLV que comprende un régimen de administración principal-refuerzo en el que dicho régimen comprende una administración principal de una vacuna o composición que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido de FeLV, una variante o fragmento del polipéptido de FeLV, o una mezcla de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un plásmido que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo, el polipéptido o polipéptidos FeLV, variante de los mismos, fragmento de los mismos, para proteger al sujeto de FeLV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados.
Se describe aquí un procedimiento de vacunación de un sujeto susceptible a FeLV que comprende un régimen de administración principal-refuerzo en el que dicho régimen comprende una administración principal de una vacuna o composición que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido de FeLV, una variante o fragmento del polipéptido de FeLV, o una mezcla de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, el mismo polipéptido o polipéptidos FeLV, variante de los mismos, fragmento de los mismos, para proteger al sujeto de FeLV y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para la vacunación principal-refuerzo de acuerdo con la presente invención. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna para la vacunación principal de acuerdo con la presente invención, y un segundo vial que contiene una vacuna para la vacunación de refuerzo según la presente invención. El kit puede contener ventajosamente primeros o segundos viales adicionales para vacunas principales adicionales o vacunas de refuerzo adicionales.
En una realización, el kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en plásmido para la vacunación principal de acuerdo con la presente invención, el otro vial que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente invención.
En otra realización, el kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación principal de acuerdo con la presente invención, el otro vial que contiene una vacuna de subunidades para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente invención.
En otra realización, el kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación principal de acuerdo con la presente invención, el otro vial que contiene una vacuna basada en plásmido para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente invención.
La invención se describirá a continuación adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, usando las descripciones anteriores, realizar la presente invención en su extensión más completa. Los siguientes ejemplos detallados deben interpretarse como meramente ilustrativos, y no limitaciones de la descripción precedente en modo alguno. Los expertos en la técnica reconocerán rápidamente las variaciones apropiadas de los procedimientos tanto en cuanto a reactivos como a las condiciones y técnicas de reacción.
La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados para la presente invención se aislaron usando el kit "Geneclean" (BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.).
Ejemplo 1 Construcción del plásmido de pH6C5env pPB713
Construcción de pH6C5env - pCXL208.2, un plásmido de inserción C5 para la generación de los recombinantes FeLV-ENV/ALVAC (2)
Se utilizó un virus recombinante ALVAC (1) que contiene ENV de FeLV insertado en el locus C5 y GAG/POL (+T5NT) insertado en el locus C3 (material patentado por Merial) para amplificar el gen de ENV de FeLV. Se utilizaron los cebadores 7862CXL y 7847CXL para la amplificación por PCR.
7862CXL: ACU CCG CTC GACi CGG GGA TCT CTT TAT TCT ATA CTT A (SEQ ID NO:25)
Xho 1 promotor H6
7847CXL: CTC CKíA TCC AGAAAAA TCA TGG TCG GTC CGG ATC (SEQ ID NO:26)
Bam Hi T5NT parada
El fragmento amplificado por PCR (2,1 kb) contiene el gen de ENV de FeLV, el promotor H6 inmediatamente dirección 5' de ENV y una secuencia de T5NT seguida de codón de parada de la ENV. El fragmento de PCR se digirió con Xhol/BamHl y se ligó a plásmido donante pH6C5ALVAC digerido con Xhol/BamHI (material patentado de Merial) para generar pCXL208.2, cuya secuencia se confirmó.
El mapa de plásmido de pCXL208.2 y su secuencia se muestran en las Figuras 2 y 3.
Construcción de plásmido de pH6C5env pPB713
ENV de FeLV es glicosilada y escinde para producir glicoproteína Env gp70 y p15E ENV. La secuencia de la proteína de gen mutado ENV de FeLV de 82K cepa se muestra en la Figura 5. La mutación es la sustitución de Arg por Glu en la posición 527 del gen de ENV de FeLV.
El plásmido pHCMV-FeLV ENV se recibió de Institut Gustave Roussy-(Villejuif, Francia). La secuencia del fragmento de ENV de FeLV mutada (SEQ ID NO: 3) proporcionó contiene 5 mutaciones (en nucleótidos) por comparación con la secuencia de referencia (Glasgow, GenBank n° de acceso M12500, SEQ ID NO: 35). Entre los cinco mutaciones de nucleótidos, dos mutaciones son mutaciones silenciosas (sin cambio de aminoácidos), pero introdujeron un nuevo sitio de restricción (= FspI); tres mutaciones introducidas una mutación en la secuencia de amino-ácido de ENV de FeLV (Arg en lugar de Glu; como se muestra en la Figura 5, SEQ ID NO: 4).
El plásmido phCMV-ENV de FeLV se digirió con RsrN/SacN para generar un fragmento RsrlI-SacN (fragmento B: 520 pb). El plásmido pCXL208.2 se digirió con RsrlI/SaclI para generar un fragmento RsrlI-SaclI (fragmento A: 6.231 pb). Los fragmentos A y B se ligaron para generar el plásmido pPB713 (6756 pb). La identidad de pPB713 fue confirmada por una digestión FspI. El mapa de restricción de pPB713 y las secuencias pPB713 se muestran en la Figura 4.
Construcción del plásmido de pH6C5env pPB712
El plásmido phCMV-ENV de FeLV se digirió con RsrN/SacN para generar un fragmento RsrII-SacII (fragmento A: 520 pb). El plásmido pPB575 (Material patentado por Merial) se digirió con RsrN/SacN para generar un fragmento RsrII-SacII (fragmento B: 5.971 pb). Los fragmentos A y B se ligaron para generar el plásmido pPB712 (6496 pb). La identidad de pPB712 fue confirmada por una digestión con EcoRI. La secuencia de la región mutada de FeLV presente en pPB712 clon fue controlada por la secuenciación del ADN (Cogenics, Francia) con el cebador universal de M13 y el cebador inverso M13. Se seleccionaron dos candidatos (n ° 1 y n ° 2). Las secuencias de los 2 clones eran idénticos pero eran diferentes de SEQ ID NO: 4 (mutación de un solo aminoácido Glu a Arg). Hay ocho mutaciones de nucleótidos, lo que lleva a un solo cambio de aminoácido. Las comparaciones de ADN y secuencias de proteínas entre la mutado FeLV (SEQ ID NO: 1) en pPB712 y el mutado FeLV: en pHCMV-ENV de FeLV se muestran en la Figura 5. La comparación de secuencias de proteínas de ENV de FeLV del diferente (SEQ ID NO 3) cepas se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 2 Construcción de C3 de ALVAC plásmido donante para la generación de un ALVAC FeLV que expresan recombinantes codones optimizados GAG-PRO
FeLV (virus de la leucemia felina) codón gen GAG-PRO optimizado fue utilizado en la fabricación del vCP2294. FeLV gen GAG-PRO se optimizó para la expresión génica en células de mamífero. La comparación de la secuencia a nivel de ADN entre el gen GAG-PRO codones optimizados (SEC ID NO: 10) y el gen de GAP-pro de tipo salvaje (Genbank n° de acceso M18247, SEQ ID NO: 11) es muestra en la Figura 7 .
El esquema de construcción se describe en la figura 8. El plásmido pJY1320.1 (Material patentado por Merial) que contiene H6p-FeLV codones se utilizó optimizado casete GAG-PRO como una plantilla para la amplificación por PCR. H6p es promotor H6 del virus vaccinia. Primers 13301JY y 13302JY se utilizaron para la amplificación por PCR. El fragmento de PCR se clonó a un vector pCR2.1-TOPO. El pJY1857.5 plásmido resultante se secuenció y se confirmó que las secuencias correctas de H6p-FeLV GAG-PRO. Para construir pC3 FeLV H6p-GAG-PRO. un fragmento de ADN NruI/SpeI, que contiene el promotor H63 'parcial y de longitud completa GAG-PRO, se aisló de pJY1857.5 y se ligó a pJY1738.2 digerido por Nru I/Spe I (Material patentado por Merial) para crear pJY1874. 1 (como se muestra en las Figuras 9, 10 y 11), que se confirmó que tenían las secuencias correctas.
Cebador directo 13301JY (SEQ ID NO: 13)
Nru I HÓp (SEQ ID NO: 15)
5’ ATT A TCGCGA TATCCGTT AAGTTT GTATCGTA ATG GGA CAG ACC ATC ACC ACC
CCC CTG T
Cebador inverso 13302JY (SEQ ID NO: 14)
Spe 1
5’ ATT A Ia CTAGTI CAAGAAAAA TCA TTA CAG CAC CTG CAG GGG CAG TCC TCT
En las células infectadas por FeLV, GAG-PRO se produce mediante un ensayo preliminar. GAG se escinde además a las proteínas MA (p15), CA (p30) y NC durante la etapa posterior de ensamblaje del virus.
Ejemplo 3. Generación y caracterización de recombinante de ALVAC que contiene GAG-PRO optimizado de codones de H6p FeLV insertado en el locus C3 de ALVAC (vFP2294)
El IVR (recombinante in vitro) se realizó mediante transfección de células de fibroblastos de embrión de pollo primario (1 ° CEF) con 10 g de Not I-linealizado pJY1874.1 plásmido donante usando el reactivo FuGENE-6® (Roche). Las células de embrión de pollo primario de fibroblastos (1 ° CEF) utilizados para la recombinación in vitro se cultivaron en FBS al 10% (JRH: gamma-irradiado # 12107-500M), DMEM (BRL/Gibco # 11960-051 o 11960-044) complementado con la glutamina 4 mM (BRL/Gibco # 25030-081) y 1 mM de piruvato sódico (BRL/Gibco # 11360­ 070) en presencia de antibióticos/antimicóticos 1X (P/S/a/a, BRL/Gibco # 15240-062 ) .Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC como virus de rescate a MOI (multiplicidad de infección) de 10 (ALVAC # HM1372 07 Abr 04). Después de 24 horas, se recogieron las células infectadas transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante.
Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación de elevación de placas usando un 1,4 kb FeLV GAG sonda específica marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN3001). Después de cinco rondas secuenciales de purificación en placa, el recombinante designado como vCP2294.1.1.1.1.1 se generó y se confirmó por hibridación como 100% positivos para el inserto GAG FeLV y 100% negativo para el ORF C3.
Placa individual se selecciona de entre el 5 ° ronda de purificación en placa, y se expandió para obtener P1 (1x T25 matraz), P2 (1xT75 matraz) y P3 (6 botellas x de rodillos). El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se cosechó y se concentró para producir un vCP2294.1.1.1.1.1 stock de virus.
El esquema para generar vCP2294 recombinante se representa en la Figura 12.
Análisis de recombinante: los siguientes análisis se realizaron en las soluciones madre de P3.
Confirmación de la pureza genética
Las soluciones madre de P3 fueron reconfirmadas por hibridación, como 100% positiva para GAG de FeLV y 100% negativa para ORF de C3.
Análisis genómico
Se extrajo ADN genómico de vCP2294.1.1.1.1.1, se digirió con BamHI, HindlII o PstI y ejecutar en gel de agarosa al 0,8%. El gel con BamHI, HindlII o PstI ADN genómico digerido se transfirió a una membrana de nylon y análisis de transferencia Southern se realizó mediante el sondeo con el 1,4 kb sonda FeLV GAG. se observaron múltiples bandas a los tamaños esperados, lo que indica la correcta inserción de FeLV gen GAG-PRO en el locus C3.
Figure imgf000019_0001
Análisis de expresión
1) T ransferencia Western
Células CEF primarias se infectaron con el stock de P3 de vCP2294.1.1.1.1.1 a MOI de 10 y se incubaron a 37°C durante 24 horas. A continuación, se recogieron el sobrenadante del cultivo y las células. El sedimento celular se lisó con el tampón de lisis del ensayo del gen informador fabricado por Roche (Cat. 1897675). Tanto el sobrenadante como el lisado se prepararon con el Sistema NuPAGE® con antioxidante añadido. Las proteínas se separaron en un gel de Pre-cast Bis-Tris al 10% NuPAGE®, y después se transfirieron a una membrana de PVDF. Los anticuerpos contra GAG de FeLV revelaron una proteína de ~70kDa detectada tanto en el sobrenadante como el sedimento celular, y una proteína de ~57 KDa, que se detectó sólo en el sedimento celular.
2) Ensayo de inmunoplaca
La homogeneidad de la población fue del 100% positiva para la proteína GAG de FeLV para vCP2294.1.1.1.1.1 recombinante como se evidencia mediante un ensayo de inmunoplacas, utilizando anticuerpos anti-GAG de FeLV. Análisis de secuencias
Un análisis más detallado del ADN genómico P3 de stock se realizó mediante amplificación por PCR y análisis de la secuencia de los brazos flanqueantes del locus C3 y el inserto de FeLV. Primers 8103JY y 8104JY, situado más allá de los brazos de la locus C3 en el genoma de ALVAc se utilizaron para amplificar el fragmento completo C3L-FeLV-C3R. Los resultados mostraron que las secuencias de la FeLV insertar y C3L y C3R de ALVAC son correctos.
Los cebadores para la amplificación de la sonda de GAG de FeLV:
11369JY: 5' ATGATGAACGTGGGCTGGCCT 3' (SEQ ID NO: 17)
11377JY: 5' TCTCCTAAGTTGAGCAGGGTG 3' (SEQ ID NO: 18)
Los cebadores para la amplificación por PCR del casete C3L-FeLV GAG-PRO-C3R:
8103JY: 5' GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3' (SEQ ID NO: 19)
8104JY: 5' TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3' (SEQ ID NO: 20)
La Figura 13 muestra el mapa de la región C3 de vCP2294 que muestra la situación de los cebadores. La secuencia de vCP2294 se representa en la Figura 14.
Ejemplo 4 Generación y caracterización de recombinante ALVAC que contiene FeLV modificado gen ENV insertado en c 5 locus de vCP2294, ALVAC C3 H6p FeLV de codones optimizados GAG-PRO - vCP2296
El IVR se realizó mediante transfección de 1 ° células CEF con 10 g de linealizados-I No pPB713 plásmido donante usando el reactivo FuGENE-6® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con vCP2294 (ALVAC C3 H6p FeLV de codones optimizados GAG-PRO, el Ejemplo 2) como virus de rescate a MOI de 10. Después de 24 horas, se recogieron las células infectadas transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante.
Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación de elevación de placas usando una 503 pb ENV de FeLV sonda específica marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN3001). Después de cuatro rondas secuenciales de purificación en placa, el recombinante designado como vCP2296.6.1.1.2 se generó y se confirmó por hibridación como 100% positivo para el ENV de FeLV insertar y 100% negativo para los sitios de C5 vacías.
Placa individual se selecciona de entre el 4 ° ronda de purificación en placa, y se expandió para obtener P1 (1x T25 matraz), P2 (1xT75 matraz) y P3 (botellas 6 x de rodillos) las existencias. El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se cosechó y se concentró para producir un vCP2296.6.1.1.2 stock de virus.
La construcción de vCP2296 se representa en la Figura 15.
Análisis de recombinante: los siguientes análisis se realizaron en los stocks de P3.
Confirmación de la pureza genética
Los stocks P3 fueron reconfirmados por hibridación como 100% positivos para ambos GAG de FeLV y ENV de FeLV y 100% negativos para ambos ORF C3 y C5.
Análisis de expresión
1) T ransferencia Western
Células CEF primarias se infectaron con el stock de P3 de vCP2296.6.1.1.2 a MOI de 10 y se incubaron a 37°C durante 24 horas. A continuación, se recogieron el sobrenadante del cultivo y las células. El sedimento celular se lisó con el tampón de lisis del ensayo del gen informador fabricado por Roche (Cat. 1897675). Tanto el sobrenadante como el lisado se prepararon con el Sistema NuPAGE® con antioxidante añadido. Las proteínas se separaron en un gel de Pre-cast Bis-Tris al 10% NuPAGE®, y después se transfirieron a una membrana de PVDF. Los anticuerpos contra GAG de FeLV revelaron una proteína de ~70kDa detectada tanto en el sobrenadante como el sedimento celular, y también se expresó una proteína de ~80 KDa en el sobrenadante y el sedimento celular mediante la incubación con anticuerpo anti ENV de FeLV.
2) Ensayo de inmunoplaca
La homogeneidad de la población fue del 100% positiva para la proteína ENV de FeLV para vCP2296.1.1.2 recombinante como se evidencia mediante un ensayo de inmunoplacas, utilizando anticuerpos anti-ENV de FeLV (véase la fotografía de rastreo de confirmación IP en el adjunto vCP2296 Immunoplaque.doc).
Análisis de secuencias
La inserción del gen de ENV de FeLV en los sitios C5 de vCP2296.6.1.1.2 se amplificó por PCR. Los cebadores 7931DC y 7932DC, situados más allá de los brazos del locus C5 en el genoma de ALVAC (ver Figura 16), se utilizaron para amplificar el fragmento de C5L-FeLV-C5R.
Los cebadores para la amplificación de la sonda de ENV de FeLV:
7900CXL 5'AGGAGGGCTTTAGTCCCTGTTCCGA 3' (SEQ ID NO: 21)
7934CXL 5'ACTAAAGACTGTTGGCTCTGCCTG 3' (SEQ ID NO: 22)
Los cebadores para la amplificación por PCR del casete C5L-ENV de FeLV-C5R:
7931DC 5'GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT 3' (SEQ ID NO: 23)
7932DC 5'TGATTATAGCTATTATCACAGACTC 3' (SEQ ID NO: 24)
Ejemplo 5 Generación y caracterización de recombinante ALVAC que contiene el gen de ENV de FeLV nativo insertados en el locus C5 de GAG-PRO optimizado de codones de ALVAC C3 H6p FeLV vCP2294 - vCP2295 El plásmido pCXL208.2 donante contiene el gen de ENV nativo (SEQ ID NO: 5).
El IVR se realizó mediante transfección de 1 ° células CEF con 10 g de linealizado-I No pCXL208.2 plásmido donante usando el reactivo FuGENE-6® (Roche). Las células transfectadas se infectaron posteriormente con vCP2294 (Ejemplo 2) como virus de rescate a MOI de 10. Después de 24 horas, se recogieron las células infectadas transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante.
Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación de elevación de placas usando una sonda específica 503bp ENV de FeLV marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN3001). Después de cuatro rondas secuenciales de purificación en placa, el recombinante designado como vCP2295.2.2.2.1 se generó y se confirmó por hibridación como 100% positivo para el ENV de FeLV insertar y 100% negativo para los sitios de C5 vacías.
Placa individual se selecciona de entre el 4 ° ronda de purificación en placa, y se expandió para obtener P1 (1x T25 matraz), P2 (1xT75 matraz) y P3 (6 botellas x de rodillos). El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se cosechó y se concentró para producir un vCP2295.2.2.2.1 stock de virus. El esquema para generar vCP2295 recombinante se muestra en la Figura 17.
Análisis de recombinante: los siguientes análisis se realizaron en los stocks de P3.
Confirmación de la pureza genética
Los stocks P3 fueron reconfirmados por hibridación como 100% positivos para ambos GAG de FeLV y ENV de FeLV y 100% negativos para ambos ORF C3 y C5.
Análisis de expresión
1) T ransferencia Western
Células CEF primarias se infectaron con el stock de P3 de vCP2295.2.2.2.1 a MOI de 10 y se incubaron a 37°C durante 24 horas. A continuación, se recogieron el sobrenadante del cultivo y las células. El sedimento celular se lisó con el tampón de lisis del ensayo del gen informador fabricado por Roche (Cat. 1897675). Tanto el sobrenadante como el lisado se prepararon con el Sistema NuPAGE® con antioxidante añadido. Las proteínas se separaron en un gel de Pre-cast Bis-Tris al 10% NuPAGE®, y después se transfirieron a una membrana de PVDF. Los anticuerpos contra GAG de FeLV revelaron una proteína de ~70kDa detectada tanto en el sobrenadante como el sedimento celular, y también se expresó una proteína de ~80 KDa en el sobrenadante y el sedimento celular mediante la incubación con anticuerpo anti ENV de FeLV.
2) Ensayo de inmunoplaca
La homogeneidad de la población fue del 100% positiva para la proteína ENV de FeLV para vCP2295.2.2.2.1 recombinante como se evidencia mediante un ensayo de inmunoplacas, utilizando anticuerpos anti-ENV de FeLV. Análisis de secuencias
Un análisis detallado del ADN genómico P3 de stock se realizó mediante amplificación por PCR y análisis de la secuencia de los brazos flanqueantes del locus C5 y el inserto de FeLV. Primers 7931DC y 7932DC, situado más allá de los brazos de la locus C5 en el genoma de ALVAC, se utilizaron para amplificar el fragmento completo C5L-FeLV-C5R. Los resultados mostraron que las secuencias de la FeLV insertar y C5L y C5R de ALVAC son correctos. La secuencia vCP2295 recombinante se representa en las figuras 18.
Ejemplo 6 Evaluación de la eficacia de la vacuna contra la viruela del canario vectorizada (vCP2296. ENV de FeLV) administrada por vía subcutánea a través de un modelo de vacunación/estimulación Materiales/Procedimientos
Cuarenta y cuatro gatos. masculinos y femeninos. entre 57 y 63 días de edad en la primera vacunación (promedio de 58 días; desviación estándar de 1.3 días) fueron asignados al azar en dos grupos de veinte y dos animales. Los gatos del grupo 1 se vacunaron subcutáneamente (SQ) en los días 0 y 21 con 1 ml de la vacuna FeLV-canarypox vector (vCP2296) en 1062 Tissue Culture Dosis 50 (TCID 50 )/ml. Los gatos en el Grupo 2 recibieron dos dosis de 1 ml de la vacuna placebo que contenía estéril solución salina fisiológica en los días 0 y 21 y sirvieron como controles negativos. En los días 42 y 43 (3 semanas después de la segunda vacunación). todos los gatos se estimularon con 1 ml de una cepa virulenta de FeLV (61-E) suspensión que contiene 1045 y 1047 TCID 50/ml; (Días 42 y 43 respectivamente) administrada por vía oro-nasal. Las muestras de sangre se recogieron en los días -6. 42 (antes de la estimulación). y aproximadamente a las 3 semanas después de la estimulación y a intervalos semanales durante hasta 12 semanas consecutivas (días 62 días 146) y los sueros ensayados para FeLV antigenemia (FeLV proteína p27).
La evaluación clínica se realizó a partir de 2 días antes de la primera vacunación hasta el día 42. La temperatura rectal se registró diariamente en los días -2 a 0 (antes de la vacunación). 1-2. 19-21 (antes de la vacunación) y 22-23 . Además. los sitios de inyección se evaluaron los 2 primeros días después de cada vacunación y a intervalos semanales después de la vacunación hasta el día de desafío y incluyeron la evaluación de la hinchazón. el enrojecimiento y el dolor a la palpación.
Resultados: Persistencia de antigenemia p27 de FeLV después de la estimulación
Un gato fue considerada como teniendo persistente FeLV p27 antigenemia cuando fue probado p27 FeLV positivos durante 3 semanas consecutivas o 5 semanas no consecutivas. Diecinueve de los 22 gatos (86.4%) del grupo placebo se convirtió persistentemente FeLV antigenemic en comparación con 5/21 (23.8%) del grupo vacunado. La incidencia de los gatos con persistente antigenemia FeLV atribuible al desafío FeLV fue significativamente menor (p = 0.00005) en el grupo vacunado que en el grupo placebo. La fracción de prevención estimado fue de 72.43% con un intervalo de confianza del 95% de 43.04% a 89.78%. Por lo tanto. hubo una reducción del 72% en la probabilidad de que un animal convertirse persistente FeLV antigenemic en un animal vacunado en comparación con la de un animal de Placebo.
Conclusión
Se encontraron dos dosis de la vacuna de Merial FeLV-Canarypox Vectored (vCP2296) administrada por vía SQ ser eficaz contra un desafío FeLV como se evidencia por los siguientes resultados:
1. Tras la estimulación. la vacuna de prueba demostró ser eficaz en la prevención persistente antigenemia de FeLV en 16 de los 21 (76.2%) gatos expuestas vacunadas-con un número significativamente menor de los gatos vacunados en desarrollo un antigenemia persistente en comparación con los controles (p = 0.00005; fracción de prevención 72%; variable de eficacia primaria).
2. Un desafío efectivo fue validado. como se evidencia por el desarrollo de persistente antigenemia de FeLV en 86% (19/22) de los gatos de control.
3. Ninguno de los gatos vacunados mostró reacciones locales o sistémicas después de la vacunación.
Ejemplo 7 Comparación de la eficacia de la viruela del canario-FeLV recombinante con el gen de ENV nativo (vCP2295) y la viruela del canario-FeLV recombinante con el gen de ENV optimizado (vCP2296) mediante estimulación en los gatos
Materiales/Procedimientos
Se asignaron al azar un total de treinta gatitos SPF (libres de patógenos específicos). 15 machos y 15 hembras. con edades comprendidas entre 8 y 12 semanas (9 semanas en promedio en D0). a 3 grupos de 10 gatitos según su sexo. camada y edad.
Tabla 1. Diseño experimental del estudio
Grupo No. de gatos Vacunación D0-D28 Estimulación vacuna título diana** Volumen de vía D44 A 10 vCP2295 6.0 SC** FelV-A-B 10 vCP2296 6.0 1 ml Glasgow-1 C 10* No vacunado Ruta oronasal * grupo C: No. de gatos = 9 desde D1 hasta el final debido a la muerte de un gato en D1
** en log10CCID50/ml
SC: subcutánea
BS: muestra de sangre___________________________________________________________________________ En D0 y D28, antes de la vacunación, se monitorizaron todos los gatitos de la condición corporal. Gatos de los grupos A y B fueron entonces vacunados bajo anestesia general por inyección subcutánea en la zona interescapular. En D44, la cepa de estimulación se descongeló a 37 ° C, 32 ml de la cepa se mezclaron con 8 ml de medio F15 con suero de ternero fetal al 10% y se mantuvo en hielo triturado antes de la inoculación. Todos los gatos fueron sometidos a anestesia general. Luego, cada gato se inoculó por vía oronasal con 1 ml de inóculo (0,25 ml en cada cavidad nasal) y 0,5 ml por vía oral (lengua, faringe y las amígdalas).
Resultados
Los muestreos de sangre se realizaron en gatos en vigilia el D0, D5, D7, D15, D26, D35, D49, D70, D77, DB4, D91, D96, D105, D112, D133 y bajo anestesia general (0,1 a 0,2 ml/kg de Zoletll "50, vía intramuscular) en D44, D56, D63, D119, D126, D140 y D147.
1. Prueba de Antigenemia
Las muestras de sangre se recogieron en tubos secos en D0, antes de la vacunación, en D44 antes del desafío y cada semana a partir de la tercera semana después de la estimulación, es decir, en D63, D70, D77, D84, D91, D98, D105, D112, D119, D126, D133, D140 y D147 para FeLV titulación de antígeno p27 con kit testigo FeLV (simbióticos Corporation, MO, EE.UU.). La respuesta fue un uno binario (presencia/ausencia). Se definieron tres categorías de respuesta: a) 0: no antigenemia (todas las titulaciones fueron negativos), b) 1: antigenemia transitorio (menos de tres titulaciones consecutivos positivos y menos de cinco titulaciones positivos), c) 2: antigenemia persistente (positivo en al menos cinco ocasiones o, al menos, tres titulaciones consecutivos positivos).
En el grupo vacunado con vCP2295 (grupo A), 40% de los gatos estaban protegidos contra la antigenemia persistente: 4/10 gatos nunca fueron encontrados positivos y 6/10 gatos presentó un antigenemia persistente. En el grupo vacunado con vCP2296 (grupo B), 60% de los gatos estaban protegidos contra p27 antigenemia persistente. 5/10 Nunca se encontraron positivas y 1/10 gato presentó una antigenemia transitoria: p27 se pudo detectar en el suero de este gato en D63 y D84. 4/10 gatos presentan una antigenemia persistente. En el grupo de control (grupo C), 100% de los gatos tenía antigenemia persistente. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Resultados de antigenemia p27 (tasas)
Grupo Antigenemia Antigenemia Antigenemia no Tasa de protección* persistente transitoria positiva
A 6/10* 0/10 4/10 4/10
vacunado con 60% 0% 40% 40% vCP2295
B 4/10 1/10 5/10 6/10
vacunado con 40% 10% 50% 60% vCP2296
C 9/9 0/9 0/9 NA
control 100% 0% 0%
* Número de gatos no infectados persistentemente/Número de gatos
** Un gato que murió durante el estudio se encontró positivo 4 veces consecutivas
NA: No aplicable: grupo de control__________________________________________________________________ La comparación de los 3 grupos en la frecuencia de los gatos de la presentación no (antigenemia = 0), transitorio (antigenemia = 1) o persistente (antigenemia = 2) antigenemy dio un valor de p significativo ( "prueba exacta de Fisher": p = 0,028) . Una tendencia a la significación se evidenció entre el grupo B y el grupo C (ajustado p-valor con el procedimiento de Bonferroni: A vs C: p = 0,260, B vs C: p = 0,056, A vs B: p = 1).
2. Prueba de Proviremia
Los recuentos de leucocitos se utilizaron para expresar proviremia en número de copias de provirus/50000 WBC (glóbulos blancos). Las muestras de sangre se recogieron en tubos de EDTA en D44 antes del desafío y cada 3 semanas después de la estimulación, es decir, en D63, D84, D105, D126 y D147 para el recuento de leucocitos y el seguimiento proviremia FeLV en PBMC (células mononucleadas de sangre periférica) utilizando una cuantitativa PCR. Debido a la naturaleza medición repetida del criterio y el efecto aleatorio individual, los datos proviremia se analizaron usando un modelo mixto con mediciones repetidas.
a) Proviremia en sangre
La Figura 19 muestra la evolución de la proviremia promedio por grupo después de la estimulación. La Figura 17 muestra la evolución de la proviremia promedio por grupo y el estado de antigenemia p27 después de la estimulación. En ambos grupos vacunados, la antigenemia p27 se correlacionó bien con proviremia (Figura 20). b) Proviremia en la médula
El nivel de proviremia en la médula de los gatos negativos de p27 fue entre 3 y 5 log10 mientras que alcanzó 8 a 9 log10 en gatos positivos de p27. El nivel de proviremia se correlacionó bien con el estado individual de antigenemia p27 y con la proviremia individual de sangre (como se muestra en la Figura 21).
3. Respuesta inmunitaria celular
Las muestras de sangre se recogieron en tubos tratados con heparina en D5, D7, D15, D28, D35, D49, D56, D63, D119, y D126 para la monitorización inmunológica FeLV. respuesta IPNy -Cell mediada inmune se controló mediante ELISpot después de la estimulación de PBMC por las células dendríticas (DC) cargadas con piscinas de FeLV de péptidos en D35 y D126. IL10 inmunidad mediada se controló mediante ELISpot después de la estimulación de PBMC por piscinas FeLV de péptidos en D35, D63 y D126. Se monitorizaron las células T reguladoras en D5, D15, D35, D49, D63 y D126.
A) Procedimientos
a) Aislamiento de PBMC felinas
PBMCs se aislaron por PANCOLL® gradiente de densidad de centrifugación (600 g durante 30 minutos sin freno). Las PBMC se lavaron dos veces en PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato) (400 g centrifugación durante 10mintites) y posteriormente se contó con un contador de células ABX Pentra 120 robotizado. Las células se lavaron una última vez en PBS y se resuspendieron a una concentración de 5,106/ml en estéril RPMI completo (RPMI = Penicilina-Estreptomicina (PS) pMercaptoethanol (pM)) 10% de suero de ternera fetal (FCS).
b) Generación de células dendríticas
PBMCs aisladas de Ficoll-se cultivaron durante 20 horas en placas de 6 pozos planas. Las células no adherentes se retiraron y medio completado fresco suplementado con felino IL-4 y GM-CSF felino se añadió a los pocillos. La diferenciación de los monocitos en DC duró 7 días. do). ensayo ELISpot IPNy:
La intensidad de las respuestas inmunes celulares FeLV-específicas en los diferentes grupos de animales se cuantificó mediante la utilización de ensayos de IPNy ELISPOT. placas de HA de ELISPOT se recubrieron durante la noche a 4 ° C con 100? l,/pocillo de mAb purificado IFN Anti-canino diluido (1/25) en tampón carbonato/bicarbonato (0. 2 M, pH 9,6). Las placas recubiertas se lavaron tres veces en PBS estéril y los sitios no ocupados fueron bloqueadas con RPMI completo 10% de FCS estéril durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). Las células dendríticas se cargaron con reservas de péptidos de codificación para ENV de FeLV y proteínas Gag en D 15, D 35 y D 126. Brevemente, 100,103 DC fueron re-estimularon individualmente por reservas de péptidos n ° 1 y 2 para EnV de FeLV o péptido piscinas No. 2, 3, 6 y 8 FeLV GAG-PRO a 1? G/ml en un volumen final de 100? L completado RPMI 10 % de FCS. Células dendríticas cargadas se transfirieron a placas de ELISPOT y 500.103 se añadieron PBMCs en cada pocillo. Las células dendríticas se cargaron con un péptido irrelevante como control negativo. Las células se estimularon durante 20-24h a 37 ° C 5% de CO 2. Las células fueron luego eliminados y para permitir la lisis celular. Se añadió agua destilada fría a cada pocillo (200? L) durante 5 min a RT. A continuación, las placas se lavaron tres veces en PBS-Tween al 0,05% y se incubaron a 4 ° C con 100 l de biotina anti-felino yIFN MAb (diluido a 1/100 en PBS-Tween al 0,05%). A continuación, las placas se lavaron tres veces en PBS-Tween al 0,05% y 100? L de solución de HRP-estreptavidina diluida se añadieron a cada pocillo durante 1 hora a 37 ° C. Después las placas se lavaron tres veces en PBS-Tween al 0,05% y se incubaron durante 15 minutos a TA en la oscuridad con la solución de sustrato AEC. Las placas se lavaron exhaustivamente con agua del grifo y se secan. Las manchas se contaron con un sistema de cámara CCD (Microvision, Redmond, WA, EE.UU.). La frecuencia de células formadoras de IFN-punto específicas de péptido (SFC) se calculó de la siguiente manera: número de-péptido específico IPNy SFC = número de IFN SFC al péptido FeLV individual Piscina re-estimulación -número de IFN SFC al péptido irrelevante piscina re- estímulo. Los resultados se expresaron como el log10. d) Ensayo de ELISpot de IL-10
El ELISpot IL-10 se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (R & D systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). 500.103 PBMCs purificadas se directamente re-estimularon usando superposición reservas de péptidos de codificación para ENV de FeLV y las secuencias GAG-PRO, a 1? G/ml en un volumen final de 200? L completado RPMI 10% de FCS, y establecidos en placas recubiertas ELIspot IPNy.500.103PBMCs fueron re-estimularon con un péptido irrelevante como control negativo. La frecuencia de 10 IL-células específicas de péptido formadoras de manchas (SFC) se calculó de la siguiente manera: número de péptido específico de la agrupación IL-10 SFC = número de IL-10 SFC sobre FeLV piscina péptido re-estimulación individuo - número de IL- 10 SFC en péptido re­ estimulación irrelevante. Los resultados se expresaron como el log10.
B) Resultados
a) Respuesta inmunitaria celular después de la vacunación
i) Monitorización de respuestas de células secretoras de IPNg específica de FeLV después de la vacunación La capacidad de las PBMC para producir IFN En respuesta a re-estimulación con ENV de FeLV y DC cargadas con péptido piscinas GAG-PRO se analizó utilizando un ensayo IFN-ELISPOT. Análisis de la suma de IFN SFC (manchas de formación de células) inducida después de la activación in vitro con células dendríticas cargadas con reservas de péptidos de codificación para ENV de FeLV y las secuencias GAG-PRO mostró que la vacunación vCP2296 indujo una mayor frecuencia de FeLV-específica IPNy células secretoras en day35 en comparación con la vacunación vCP2295. Los grupos no vacunados no indujeron ningún células secretoras de IPNy (Figura 22).
Las diferencias entre vCP2295 y vCP2296 en su capacidad para inducir a las células IFN-productoras eran más claros cuando se centra en ENV de FeLV piscinas No.1 y la respuesta específica No.2. Análisis de la frecuencia de IPNy SFC dentro de PBMCs después de la activación in vitro con células dendríticas cargadas con péptido piscina No. 1 de ENV de FeLV (que codifica para el comienzo de la secuencia de ENV de FeLV) mostró una diferencia entre vCP2296 (grupo B) y la vacunación vCP2295 (grupo a) en el día 35, en la sangre. Los grupos no vacunados no indujeron ningún células secretoras de IFN (Figura 23).
ii) Monitorización de células secretoras de IL-10 específica de FeLV después de la vacunación
Monitorización de células secretoras de IL10 específica de FeLV: análisis de respuestas específicas de ENV de FeLV en sangre
En el día 35 después de la vacunación, la capacidad de las PBMC para producir IL-10 en respuesta a grupos de péptidos ENV de FeLV se analizó re-estimulación usando un ensayo de IL-10 ELISPOT. vacunación vCP2295 indujo una mayor frecuencia de células secretoras de ENV de FeLV-específicos de IL-10 en comparación con vCP2296 vacunación y el grupo control (Figura 24).
Monitorización de células secretoras de IL10 específica de FeLV: análisis de respuestas específicas de GAG-PRO de FeLV en sangre
En el día 35 después de la vacunación, la capacidad de las PBMC para producir IL-10 en respuesta a FeLV péptidos piscinas GAG-PRO se analizó re-estimulación usando un ensayo de IL-10 ELISPOT. vacunación vCP2295 tendió a inducir a más IL-10 células secretoras específicas FeLV GAG-PRO que la vacunación vCP2296 (Figura 25).
En conclusión, vCP2295 vacunación (grupo A) indujo una mayor frecuencia de células secretoras de FeLV específicos de IL-10 en la sangre periférica, en comparación con la vacunación vCP2296 (grupo B) y el grupo control (grupo C).
iii) Proporción de células productoras de IFNg e IL-10 específica de FeLV después de la vacunación.
Con el fin de evaluar más a fondo las dos vacunas recombinantes y el equilibrio entre la respuesta Th1 y respuesta reguladora, la relación entre el número de FeLV-específica IPNy SFC y el número de FeLV específico IL-10 SFC después ENV o GAG-PRO in vitro re- se calculó la estimulación para cada grupo vacunado. La comparación de la relación de FeLV-específico IFN IL-10 SFC para cada grupo demostró que la vacunación vCP2296 indujo una respuesta más equilibrada en comparación con la respuesta inmunitaria inducida por la vacunación vCP2295 que fue sesgada hacia IL-10 de respuesta. Esta diferencia fue más evidente en respuesta a ENV de FeLV re­ estimulación que a GAG-PRO re-estimulación (Figuras 26a y 26b).
b) Monitorización de respuesta inmunitaria celular después de la estimulación experimental
i) Monitorización de respuestas de células secretoras de IFNg específica de FeLV después de la estimulación Después de que el desafío (D126) la capacidad de las PBMC para producir IPNy en respuesta a se analizó utilizando un ensayo IFN-ELIspot re-estimulación con FeV ENV y OC cargado-reservas de péptidos GAG-PRO. gatos vacunados con vCP2296 mantuvieron una mayor frecuencia de ENV de FeLV-específico IFN células secretoras en PBMCs últimamente después del desafío (D126) en comparación con los gatos vacunados con vCP2295. No hay células secretoras de IPNy FeLV GAG-PRO-específicas se pudieron observar en este punto de tiempo, para cualquier grupo (Figura 27).
ii) Monitorización de respuestas de células secretoras de IL-10g específica de FeLV después de la estimulación Después de que el desafío (D126), la capacidad de las PBMC para producir IL-10 en respuesta a ENV de FeLV o GAG-PRO péptidos piscinas re-estimulación se analizó usando un ensayo de IL-10 ELISPOT. desafío FeLV aumentó específicamente la respuesta de las células IL-10 ENV-específica FeLV en todos los grupos, en comparación con la respuesta en el día 35, sin diferencia entre los 3 grupos (Figura 28a). El reto no afectó a la respuesta específica de antígeno dirigido contra FeLV región GAG-PRO, y los gatos vacunados con vCP2295 mantiene su específico de respuesta FeLV GAG-PRO IL-10 (Figura 28b). Después del desafío, vCP2295 vacunados gatos (grupo A) exhibieron IL-10 respuesta inmunitaria solamente un FeLV-específico mientras que los gatos vacunados con vCP2296 (grupo B) desarrollado una respuesta FeLV-específico IL-10 inmune sino también mantuvieron su respuesta FeLV-específica IPNy .
c) Frecuencia de células productoras de IPNg e IL-10 específica de FeLV en animales protegidos e infectados
Animales protegidos y infectadas se identifican de acuerdo a los resultados de p27 antigenemia. Protegidas y animales infectados se separaron dentro de cada grupo (Figura 29) y la relación IFN/IL-10 para cada sub-grupo se calculó para evaluar si la relación de IFN/IL-I0 SFC después de la vacunación podría ser indicativo de protección.
En el grupo vacunado con vCP2296: cuatro gatos de cada 10 presentan una alta relación/IL-10 IFN relacionada con una alta respuesta IPNy y una baja respuesta de IL-10 y fueron protegidos. Dos gatos de cada 10 no presentaron ninguna respuesta de IFN o IL-10 y fueron protegidos. Cuatro gatos de cada 10 presentan una relación de/IL-10 bajo IFN relacionada con una alta respuesta de IL-10. Tres de estos gatos presentan una alta respuesta IPNy y uno de ellos no presentaron ninguna respuesta IPNy . Estos gatos no estaban protegidos.
En el grupo vacunado con vCP2295: ocho gatos de cada 10 presentan una baja relación de IFN/IL-10 en relación con una alta respuesta de IL-10 y una baja respuesta IPNy . Seis de ellos estaban infectados y dos de ellos fueron protegidos. Dos gatos de cada 10 presentan tanto IFN e IL-10 respuestas y una alta relación de IFN/1L-10. Estos gatos estaban protegidos.
Los gatos protegidos del grupo vacunado con vCP2295 o el grupo vacunado con vCP2296 mostraron una mayor relación IFNg/IL-10 en la sangre (Figuras 26) en comparación con los gatos infectados. Por otra parte, los gatos protegidos del grupo vacunado con vCP2296 tienen una mayor proporción IFNg/IL-10 SFC en comparación con los gatos protegidos del grupo vacunado con vCP2295.
La protección se correlacionó con un aumento de la relación IFNg/IL-10 y los gatos protegidos a partir de la vacunación vCP2296 desarrollaron una inmunidad mediada por células específica de FeLV sesgada hacia la producción de IPNy en comparación con los gatos vacunados con vCP2295.
Conclusión
El sesenta por ciento de los gatos vacunados con vCP2296 (gen de ENV optimizado) estaban protegidos contra la antigenemia persistente y 40% de los gatos vacunados con vCP2295 (gen ENV nativo) fueron protegidos contra antigenemia persistente. La comparación de los tres grupos muestra una diferencia significativa de la protección entre los grupos vacunados y no vacunados y una tendencia a una diferencia significativa entre el grupo B vacunados con el gen ENV optimizado (vCP2296) y el grupo A vacunado con el gen ENV nativo (vCP2295) .
Proviremia y antigenemia resultados se correlacionan bien: los gatos con antigenemia persistente tuvieron un proviremia fuerte y sostenido hasta el final del estudio. Los gatos no tenían antigenemic inferior y una regresión proviremia. P27 gatos negativos fueron capaces de controlar el proviremia. se evidenciaron diferencias entre vCP2295 y vCP2296 vacunación, de acuerdo con la inducción de FeLV IPNy específica y IL-10 la producción de células durante las fases de vacunación y desafío. La inducción de FeLV-específicas células productoras de IPNy por las vacunas del canario FeLV especialmente cuando el gen ENV se mutó en su secuencia inmunosupresora (vCP2296) se demostró. Curiosamente, estos IPNy células productoras de FeLV-específicos inducidos por la vacunación vCP2296 fueron todavía detectan más de 100 días después de la estimulación que demuestra que la vacunación vCP2296 induce la generación de células T de memoria FeLV-específicos. A la inversa, vCP2295 era más potente para inducir la diferenciación de las células IL-10 de producción de FeLV-específico. La frecuencia de FeLV-específico IL-10 células que producen fue mayor en vCP2295 vacunados gatos en comparación con vCP2296 y gatos control no vacunados después de la vacunación. IL-10 es conocida por sus propiedades reguladoras, participando ya sea en la inhibición de la respuesta inmunitaria o en su terminación. El iFn/IL-10 relación de SFC-FeLV específica más alta después de la vacunación fue correlacionada con la protección (evaluadas por antigenemia). Todos los gatos que presentan una alta relación de IFN/IL-10 y una baja respuesta de IL-10 fueron protegidos. Esta observación estaba en línea con el papel potencialmente inmunosupresor de las células IL-10-producir y con una función de anti-viral de las células IFN-productores. Modificación del gen env en la vacuna vCP2296 disminuyó las propiedades inmunosupresoras de la construcción y proporciona una ventaja inmunológica a esta construcción, en comparación con el gen ENV nativo en vCP2295.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende:
a) un vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de la envoltura (ENV) del virus de leucemia felina (FeLV) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, en el que el polipéptido comprende una mutación que es una sustitución de arginina (R) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 o una posición de aminoácido correspondiente equivalente de una proteína de ENV de FeLV y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 12; y
b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.
2. Composición, según la reivindicación 1, en la que el polinucleótido codifica un polipéptido de ENV de FeLV que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34, y en la que el polipéptido comprende una mutación que es una sustitución de arginina (R) por ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 527 o la posición del aminoácido correspondiente equivalente de una proteína de ENV de FeLV.
3. Composición, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polinucleótido que codifica el polipéptido de ENV de FeLV tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, o 5.
4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer polinucleótido codifica un polipéptido de ENV de FeLV que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 4, y en la que el segundo polinucleótido codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12.
5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polinucleótido que codifica el polipéptido de ENV de FeLV tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, o 5, y el polinucleótido que codifica el polipéptido GAG/PRO de FeLV tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 10 o 11.
6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el vector de expresión es un vector de la viruela aviar.
7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la composición se administra a un animal en un intervalo de dosificación de 105 pfu a 109 pfu.
8. Vector de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de ENV de FeLV optimizado y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de GAG/PRO de FeLV, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Vector de expresión, según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión es un vector de la viruela aviar.
10. Composición o vector de expresión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso como una vacuna para el animal, en que la composición o el vector de expresión se formulan para al menos una administración.
11. Composición para su uso, según la reivindicación 10, en la que la composición se formula para un régimen de administración principal-refuerzo.
12. Composición para su uso, según la reivindicación 10 o 11, en la que la composición se administra en un intervalo de dosificación de 105 pfu a 109 pfu.
13. Vector de expresión para su uso, según la reivindicación 10, en el que: el vector de expresión se formula para un régimen de administración principal-refuerzo; y/o el vector de expresión se administra en un intervalo de dosificación de 105 pfu a 109 pfu.
14. Kit para la vacunación principal-refuerzo que comprende al menos dos viales: un primer vial que contiene una composición o vector de expresión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la vacunación principal, y un segundo vial que contiene una composición o vector de expresión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una vacuna de subunidades contra FeLV, o una vacuna de plásmidos contra FeLV para la vacunación de refuerzo.
15. Kit, según la reivindicación 14, en el que el primer vial contiene la composición de la reivindicación 4 y el segundo vial contiene la composición de la reivindicación 4, y en el que la composición se administra en un intervalo de dosificación de 105 pfu a 109 pfu.
ES12705199T 2011-07-20 2012-02-02 Vacuna recombinante contra el virus de la leucemia felina que contiene un gen optimizado de la envoltura del virus de la leucemia felina Active ES2720150T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161509912P 2011-07-20 2011-07-20
PCT/US2012/023658 WO2013012446A1 (en) 2011-07-20 2012-02-02 Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2720150T3 true ES2720150T3 (es) 2019-07-18

Family

ID=45722710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12705199T Active ES2720150T3 (es) 2011-07-20 2012-02-02 Vacuna recombinante contra el virus de la leucemia felina que contiene un gen optimizado de la envoltura del virus de la leucemia felina

Country Status (25)

Country Link
US (2) US8895027B2 (es)
EP (1) EP2734230B1 (es)
JP (2) JP6084970B2 (es)
CN (1) CN103957932B (es)
AU (2) AU2012284558B2 (es)
BR (1) BR112014001287B1 (es)
CA (1) CA2842055C (es)
CY (1) CY1125328T1 (es)
DK (1) DK2734230T3 (es)
ES (1) ES2720150T3 (es)
HR (1) HRP20190271T1 (es)
HU (1) HUE043547T2 (es)
IL (1) IL230460B (es)
IN (1) IN2014CN00547A (es)
LT (1) LT2734230T (es)
MX (1) MX351642B (es)
PL (1) PL2734230T3 (es)
PT (1) PT2734230T (es)
RS (1) RS58289B1 (es)
RU (1) RU2591817C2 (es)
SI (1) SI2734230T1 (es)
SM (1) SMT201900129T1 (es)
TR (1) TR201901466T4 (es)
WO (1) WO2013012446A1 (es)
ZA (1) ZA201400349B (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015343369B2 (en) 2014-11-03 2018-11-22 Georgia Tech Research Corporation Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
EP3691679A2 (en) * 2017-10-06 2020-08-12 Virbac Feline vaccines conferring early protection
EP3706788A1 (en) * 2017-11-06 2020-09-16 Intervet International B.V. Feline leukemia virus vaccine
CN111848785B (zh) * 2020-07-10 2022-09-06 青岛博隆基因工程有限公司 猫疱疹病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
GB2197321B (en) 1986-09-12 1990-10-03 Genentech Inc Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line
IL84154A0 (en) 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
DE3743138A1 (de) 1987-12-18 1989-09-14 Mayr Christian Gmbh & Co Kg Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
EP0377842B1 (en) * 1988-12-13 1995-10-04 President And Fellows Of Harvard College Prototype FeLV isolates for use in disease models and vaccines
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
EP0575491B1 (en) 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US6133028A (en) 1993-05-28 2000-10-17 Transgene S.A. Defective adenoviruses and corresponding complementation lines
FR2712603B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
US5529780A (en) 1994-03-30 1996-06-25 Virogenetics Corporation Nucleotide and amino acid sequences of canine herpesvirus gB and gC
JPH11504631A (ja) 1995-04-25 1999-04-27 バイカル インコーポレイテッド Ｄｎａ／脂質複合体の単一バイアル製剤
EP0803573A1 (en) 1996-04-25 1997-10-29 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Polycistronic expression construct with cytokines for multivalent vaccines
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
AU737243B2 (en) 1996-07-03 2001-08-16 Merial, Inc. Recombinant canine adenovirus (CAV) containing exogenous DNA
US6156567A (en) 1996-07-03 2000-12-05 Merial Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
US6090393A (en) 1996-07-03 2000-07-18 Merial Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
FR2776928B1 (fr) 1998-04-03 2000-06-23 Merial Sas Vaccins adn adjuves
TWI224107B (en) 1998-10-22 2004-11-21 Pfizer Prod Inc Novel proteins from actinobacillus pleuropneumoniae
US6017537A (en) 1998-12-18 2000-01-25 Connaught Laboratories, Inc. Formyl methionyl peptide vaccine adjuvant
US6645740B1 (en) 1999-06-10 2003-11-11 Merial Limited Nucleic acids encodings equine GM-CSF
FR2796397B1 (fr) 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines
WO2001022972A2 (en) 1999-09-25 2001-04-05 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acids
US6852705B2 (en) 2000-01-21 2005-02-08 Merial DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines
EP1203819A3 (en) 2000-10-06 2002-08-07 Transgene S.A. Anti-inflammatory vectors
AU2002327338A1 (en) * 2001-07-25 2003-02-17 New York University Use of glycosylceramides as adjuvants for vaccines against infections and cancer
FR2829498B1 (fr) 2001-09-11 2003-11-28 Merial Sas Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins
WO2003062374A2 (en) 2001-11-09 2003-07-31 Entremed, Inc. Synthetic genes for malarial proteins and methods of use
AU2003245416A1 (en) 2002-06-07 2004-04-30 University Of Florida Endodontic files made using bulk metallic glasses
WO2004028562A2 (de) * 2002-09-23 2004-04-08 Mologen Ag Impfstoff gegen infektionen mit onkoviren, wie dem felinen leukosevirus der katze
AU2005229411B2 (en) * 2004-03-30 2010-11-18 Centre National De La Recherche Scientifique Polypeptide sequence involved in the modulation of the immunosuppressive effect of viral proteins
US7582302B2 (en) 2004-06-04 2009-09-01 Merial Limited Needle-free administration of FeLV vaccines
US7998733B2 (en) * 2004-10-05 2011-08-16 Merial Limited Chimeric vectors
ME01965B (me) * 2005-09-16 2012-04-30 Merial Ltd Stabilizatori za vakcine osušene zamrzavanjem
EP2155883A1 (en) * 2007-05-30 2010-02-24 Wyeth LLC Raccoon poxvirus expressing genes of feline antigens

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012284558A1 (en) 2014-02-20
CA2842055C (en) 2019-04-02
JP2014528699A (ja) 2014-10-30
HUE043547T2 (hu) 2019-08-28
BR112014001287B1 (pt) 2020-12-08
LT2734230T (lt) 2019-03-25
RS58289B1 (sr) 2019-03-29
AU2012284558B2 (en) 2017-06-29
JP6240294B2 (ja) 2017-11-29
WO2013012446A1 (en) 2013-01-24
PL2734230T3 (pl) 2019-07-31
DK2734230T3 (en) 2019-01-28
AU2017204298A1 (en) 2017-07-13
MX2014000625A (es) 2015-06-02
CY1125328T1 (el) 2023-03-24
NZ620566A (en) 2016-02-26
BR112014001287A2 (pt) 2017-02-21
JP2017052774A (ja) 2017-03-16
ZA201400349B (en) 2015-08-26
US20150030623A1 (en) 2015-01-29
US20130022632A1 (en) 2013-01-24
TR201901466T4 (tr) 2019-02-21
SI2734230T1 (sl) 2019-04-30
IN2014CN00547A (es) 2015-04-03
CN103957932A (zh) 2014-07-30
PT2734230T (pt) 2019-02-27
JP6084970B2 (ja) 2017-02-22
SMT201900129T1 (it) 2019-05-10
CN103957932B (zh) 2017-06-23
RU2591817C2 (ru) 2016-07-20
IL230460B (en) 2018-11-29
IL230460A0 (en) 2014-03-31
HRP20190271T1 (hr) 2019-03-22
RU2014106295A (ru) 2015-08-27
US8895027B2 (en) 2014-11-25
US9856295B2 (en) 2018-01-02
EP2734230A1 (en) 2014-05-28
CA2842055A1 (en) 2013-01-24
MX351642B (es) 2017-10-23
EP2734230B1 (en) 2018-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2866108T3 (es) Vectores poxvirales recombinantes que expresan proteínas de la rabia y OX40 y vacunas fabricadas a partir de los mismos
ES2711878T3 (es) Vacuna contra el virus del herpes equino 1 recombinante que contiene glicoproteína C mutada y usos de la misma
AU2009308331B2 (en) Vaccine against African Horse Sickness Virus
JP6240294B2 (ja) 最適化ネコ白血病ウイルスエンベロープ遺伝子を含む組換えネコ白血病ウイルスワクチン
BRPI0915605B1 (pt) Vacina de leishmania usando imunógeno salivar de mosca tipo borrachudo
US9682138B2 (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
AU2014218358B2 (en) Vaccine against african horse sickness virus
NZ620566B2 (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
HK1192454A (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
HK1192454B (en) Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene