RS58352B1 - Multivalentni antigen-vezujući fv molekul - Google Patents
Multivalentni antigen-vezujući fv molekulInfo
- Publication number
- RS58352B1 RS58352B1 RS20190201A RSP20190201A RS58352B1 RS 58352 B1 RS58352 B1 RS 58352B1 RS 20190201 A RS20190201 A RS 20190201A RS P20190201 A RSP20190201 A RS P20190201A RS 58352 B1 RS58352 B1 RS 58352B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- antigen
- domain
- binding molecule
- vhb
- vlb
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/626—Diabody or triabody
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis
[0001] Pronalazak se odnosi na nova tandemska Fv di-antitela i njihove upotrebe.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Različiti formati fragmenata multivalentnih rekombinantnih antitela su dizajnirani kao alternative za antitela dobijena iz kvadroma.
[0003] US 7,129,330, Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41- 56 i Kipriyanov Meth. Mol. Biol. (2009) 562, 177-193 opisuju konstruisanje i proizvodnju određenog oblika multivalentnih fragmenata antitela nazvanih „tandemska di-antitela“ (TandAb®), budući da je njihov dizajn zasnovan na intermolekularnom sparivanju varijabilnih domena VHi VLdva različita polipeptida kao što je opisano za di-antitela (Holliger et al.,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448). Opisana antitela su bispecifična za CD19 i CD3. Nasuprot bivalentnim tandemima scFvscFv (scFv)2, tandemska di-antitela su tetravalentna, jer imaju četiri antigen-vezujuća mesta. Opisani su polipeptidi sa redosledom domena VHA-VLB-VHBVLA od N-terminusa ka C-terminusu polipeptida koji obrazuju tandemska di-antitela. Redosledi varijabilnih domena i linkerskih peptida između njih su dizajnirani tako da se svaki domen povezuje sa komplementarnim domenom u drugom identičnom molekulu obrazujući tako dimerizovana tetravalentna tandemska di-antitela. Tandemska di-antitela su lišena konstantnih domena imunoglobulina. Objavljeno je da tandemska di-antitela poseduju prednosti, kao što je visok afinitet, viši aviditet, niže stope klirensa, i pokazuju povoljnu in vitro i in vivo efikasnost.
[0004] Le Gall et al. Protein Engineering (2004) 17(4):357-366 opisuje dejstvo sekvenci linkera između varijabilnih domena antitela na obrazovanje, stabilnost i biološku aktivnost tandemskih di-antitela sa redosled domena VHA-VLB-VHB-VLA od N-terminusa ka C-terminusu.
[0005] Poznato je nekoliko dodatnih tandemskih di-antitela koja sadrže specifičnosti antitela kao, na primer, anti-CD16, anti-EpCAM i anti-CD30. U svim slučajevima, međutim, redosled četiri domena antitela duž polipeptidnih lanaca tandemskih di-antitela od N-terminusa ka C-terminusu uvek je VHA-VLB-VHBVLA, gde VHi VLpredstavljaju varijabilne domene teškog i lakog lanca antitela sa specifičnostima za antigene A odnosno B.
Takva bispecifična tandemska di-antitela mogu da naprave most između tumorske ćelije (npr. B-CLL ćelije) i efektorske ćelije humanog imunskog sistema (NK ćelija, T ćelija, monocit, makrofag ili granulocit) omogućavajući tako ubijanje tumorske ćelije. Čvrsto vezivanje tumorske ćelije i citotoksične ćelije indukuje uništavanje tumorske ćelije. Iako su se takva tandemska diantitela pokazala povoljnim za terapijske primene, npr. za terapijske koncepte za lečenje tumora, i dalje postoji potreba za poboljšanim antigen-vezujućim molekulima.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje dimerni antigen-vezujući molekul koji sadrži prvi i drugi polipeptidni lanac, gde svaki od prvog i drugog polipeptidnog lanca sadrži (a) prvi domen VLA koji predstavlja varijabilni domen lakog lanca specifičan za prvi antigen A; (b) drugi domen VHB koji predstavlja varijabilni domen teškog lanca specifičan za drugi antigen B; (c) treći domen VLB koji predstavlja varijabilni domen lakog lanca specifičan za drugi antigen B; i (d) četvrti domen VHA koji predstavlja varijabilni domen teškog lanca specifičan za prvi antigen A, gde su navedeni domeni raspoređeni u svakom od navedenih prvih i drugih polipeptidnih lanaca redosledom VLA-VHB-VLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu u navedenim polipeptidnim lancima, i prvi domen VLA prvog polipeptidnog lanca je povezan sa četvrtim domenom VHA drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za prvi antigen A; i drugi domen VHB prvog polipeptidnog lanca je povezan sa trećim domenom VLB drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za drugi antigen B; i treći domen VLB prvog polipeptidnog lanca povezan sa drugim domenom VHB drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za drugi antigen B; i četvrti domen VHA prvog polipeptidnog lanca povezan sa prvim domenom VLA drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za prvi antigen A.
[0007] Antigen-vezujući molekul kao što je ovde opisano je homodimer i prvi i drugi polipeptidni lanac imaju istu aminokiselinsku sekvencu. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi polipeptidni lanac su nekovalentno povezani. Antigen-vezujući molekul je tetravalentan. Antigen-vezujući molekul je bispecifičan. U nekim primerima izvođenja, domeni su humani domeni ili humanizovani domeni. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući molekul sadrži najmanje jednu dodatnu funkcionalnu jedinicu. Antigen-vezujući molekul je specifičan za CD3 i specifičan za tumorsku ćeliju.
[0008] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptidni lanac dimernog antigen-vezujućeg molekula kao što je ovde opisano. U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antigen-vezujući molekul kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0009] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje medicinsku upotrebu antigenvezujućeg molekula kao leka za lečenje kancera.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0010]
Sl. 1 ilustruje organizaciju gena u konstruktu koji kodira antigen-vezujući molekul prema pronalasku, gde VLA predstavlja varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina specifičan za antigen A, VHB predstavlja varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen B, VLB predstavlja varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina specifičan za antigen B, VHA predstavlja varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen A, L1 peptidni linker ili peptidnu vezu koja spaja VLA i VHB, L2 peptidni linker ili peptidnu vezu koja spaja VHB i VLB, i L3 peptidni linker ili peptidnu vezu koja spaja VLB i VHA.
Sl. 2 ilustruje obrazovanje dimernog antigen-vezujućeg molekula prema pronalasku od nefunkcionalnih monomernih polipeptidnih lanaca (A) intramolekulskim međusobnim sparivanjem varijabilnih domena prvog polipeptidnog lanca 1 i drugog polipeptidnog lanca 2 (B) u funkcionalni antigen-vezujući molekul prema pronalasku u obliku tandemskog di-antitela, gde „1“ predstavlja prvi polipeptid lanac, „2“ predstavlja drugi polipeptid lanac, VLA predstavlja varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina specifičan za antigen A, VHB predstavlja varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen B, VLB predstavlja varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina specifičan za antigen B, VHA predstavlja varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen A, L1 peptidni linker ili peptidnu vezu koja spaja VLA i VHB, L2 peptidni linker ili peptidnu vezu koja spaja VHB i VLB, i L3 peptidni linker ili peptidnu vezu koja spaja VLB i VHA.
Sl. 3 prikazuje poređenje CD19xCD3 tandemskog di-antitela u testu citotoksičnosti. Opcija 0 = antitelo A1 sa redosledom domena VHA-VLB-VHB-VLA. Opcija 2 = antitelo B sa redosledom domena VLA-VHB-VLBVHA prema pronalasku. 1x104 Raji ćelija obeleženih kalceinom inkubirano je sa 5x105 PBMC u prisustvu rastućih koncentracija naznačenih CD19xCD3 tandemskih di-antitela. PBMC su kultivisane preko noći u prisustvu 25 U/mL humanog IL-2 pre nego što su korišćene kao efektorske ćelije u testu. Posle 4 časa inkubacije, fluorescentni kalcein u medijumu za kulturu ćelija oslobođen iz apoptotskih ciljnih ćelija izmeren je na 520 nm i % specifične lize je izračunat. Vrednosti EC50su analizirane nelinearnom regresijom upotrebom kompjuterskog programa GraphPad. Grafički su prikazane srednje vrednosti i standardne devijacije duplikata.
Sl. 4 prikazuje poređenje CD19xCD3 tandemskih di-antitela u testu citotoksičnosti. Opcija 0 = antitelo A2 sa redosledom domena VHA-VLB-VHB-VLA. Opcija 2 = antitelo C sa redosledom domena VLA-VHB-VLBVHA prema pronalasku. 1x104 Raji ćelija obeleženih kalceinom inkubirano je sa 5x105 sveže izolovanih PBMC u prisustvu rastućih koncentracija naznačenih CD19xCD3 tandemskih di-antitela. Posle 4 časa inkubacije, fluorescentni kalcein u medijumu za kulturu ćelija oslobođen iz apoptotskih ciljnih ćelija izmeren je na 520 nm i % specifične lize je izračunat. Vrednosti EC50su analizirane nelinearnom regresijom upotrebom kompjuterskog programa GraphPad. Grafički su prikazane srednje vrednosti i standardne devijacije duplikata.
Sl. 5 prikazuje mapu vektora sa restrikcionim mestima pCDNA5FRT koji kodira antitelo B. VH i VL: varijabilni domeni teškog i lakog lanca.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0011] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni dimerni i tetravalentni antigen-vezujući molekul sa četiri imunoglobulinska domena (dva varijabilna domena teškog lanca i dva varijabilna domena lakog lanca) međusobno povezana u polipeptidni lanac i uređena redosledom VLA-VHB-VLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu polipeptidnog lanca. Takav antigen-vezujući molekul prema predmetnom pronalasku pokreće pojačanu biološku aktivnost, kao što je, npr., pojačani imunski odgovor.
[0012] U jednom primeru izvođenja, ilustrovano je da je dimerni, bispecifični antigen-vezujući molekul oblika tandemskog di-antitela koji je specifičan za CD3 i CD19 i ima polipeptidne lance sa redosledom domena VLA-VHB-VLBVHA više od 6o puta aktivniji in vitro, tj. citotoksičniji, od odgovarajućeg molekula tandemskog di-antitela sa istim domenima, ali sa obrnutim redosledom domena VHA-VLB-VHB-VLA.
[0013] Na taj način, tandemska di-antitela sa redosledom domena VLA-VHB-VLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu polipeptidnih lanaca imaju povećani potencijal za imunoterapiju. Sledeća prednost pojačane biološke aktivnosti sastoji se u tome što efikasne terapijske doze za takva tandemska di-antitela mogu da se smanje. Osim toga, sporedni efekti izazvani primenjenim antigen-vezujućim molekulima mogu takođe da se redukuju zahvaljujući nižim dozama. Bez vezivanja za neku teoriju, novi redosled domena omogućava modifikovano unakrsno vezivanje dimernog antigen-vezujućeg molekula između antigena A, tj. CD3, i antigena B, tj. tumorspecifičnog antigena, u poređenju sa tandemskim di-antitelima stanja tehnike i, u određenim aspektima pronalaska, ovo će omogućiti molekulu da se veže za ciljne antigene, npr., receptore, efikasnije nego dimerni antigen-vezujući molekuli prema stanju tehnike.
[0014] Stoga, biološka aktivnost dimernog, antigen-vezujućeg molekula kao što je tandemsko diantitelo može da se pojača, kada su četiri varijabilna domena svakog polipeptidnog lanca koja obrazuju dimerni antigen-vezujući molekul raspoređena redosledom VLA-VHB-VLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu svakog polipeptidnog lanca. Izazvana „biološka aktivnost“ zavisi od specifičnosti antigen-vezujućeg molekula i može da obuhvati citotoksičnost, fagocitozu, prezentovanje antigena, oslobađanje citokina, na primer ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ćelijski posredovanu fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP) i/ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC).
[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje dimerni antigen-vezujući molekul koji sadrži prvi i drugi polipeptidni lanac, gde svaki od prvog i drugog polipeptidnog lanca sadrži prvi domen VLA koji predstavlja varijabilni domen lakog lanca specifičan za prvi antigen A, drugi domen VHB koji predstavlja varijabilni domen teškog lanca specifičan za drugi antigen B, treći domen VLB koji predstavlja varijabilni domen lakog lanca specifičan za drugi antigen B, četvrti domen VHA koji predstavlja varijabilni domen teškog lanca specifičan za prvi antigen A, i navedeni domeni su uređeni u svakom od navedenog prvog i drugog polipeptidnog lanca redosledom VLA-VHB-VLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu navedenih polipeptidnih lanaca.
[0016] Prvi, drugi, treći i četvrti varijabilni domen su orjentisani tako da je sprečeno intramolekulsko sparivanje unutar istog polipeptidnog lanca i prvi polipeptidni lanac je povezan, tj. dimerizovan, sa drugim polipeptidnim lancem tako da je prvi domen VLA prvog polipeptidnog lanca povezan sa četvrtim domenom VHA drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za prvi antigen A, drugi domen VHB prvog polipeptidnog lanca povezan sa trećim domenom VLB drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za drugi antigen B, treći domen VLB prvog polipeptidnog lanca povezan sa drugim domenom VHB drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za drugi antigen B i četvrti domen VHA prvog polipeptidnog lanca povezan sa prvim domenom VLA drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto za prvi antigen A.
[0017] Izraz „antigen-vezujući molekul“ odnosi se na derivat imunoglobulina sa multivalentnim antigen-vezujućim svojstvima, koji ima najmanje četiri antigen-vezujuća mesta. Svako antigenvezujuće mesto je obrazovano pomoću varijabilnog domena VHteškog lanca i varijabilnog domena VLlakog lanca sa istom antigenom, tj. epitopskom, specifičnošću. Poželjno, antigenvezujući molekul prema pronalasku je bez konstantnih domena imunoglobulina ili fragmenata konstantnih domena imunoglobulina, ali u izvesnim slučajevima koji su opisani ispod u tekstu, konstantni domen ili njegovi delovi mogu da budu vezani za antigen-vezujući molekul.
[0018] Antigen-vezujući molekul je „dimerni“, pri čemu se ovaj pojam odnosi na kompleks dva polipeptidna monomera. Ova dva polipeptidna monomera su prvi i drugi polipeptidni lanac. Antigen-vezujući molekul je „homodimer“, pri čemu ovaj pojam znači da je antigen-vezujući molekul sačinjen od identičnih polipeptidnih monomera. U poželjnom homodimernom antigenvezujućem molekulu prema pronalasku prvi i drugi polipeptidni lanac mogu da imaju istu aminokiselinsku sekvencu, tj. prvi i drugi polipeptidni lanci su identični i, stoga su kodirani i eksprimirani sa jednog istog polinukleotida. Ovo je drugačije u slučaju takozvanih bispecifičnih di-antitela, koja su heterodimeri kodirani sa dva odvojena polinukleotida. U prvom slučaju svaki prvi i drugi polipeptidni lanac sadrži četiri varijabilna domena, obrazovana su četiri vezujuća mesta i antigen-vezujući molekul je tetravalentan. Takvi tetravalentni homodimerni antigenvezujući molekuli su u izvesnoj meri prepoznati u stanju tehnike kao tandemska di-antitela.
[0019] Poželjno, u antigen-vezujućem molekulu, prvi i drugi polipeptidni lanac su nekovalentno povezani jedan sa drugim, naročito pod uslovom da ne postoji kovalentna veza između prvog i drugog polipeptidnog lanca. Međutim, ako je poželjno, dva polipeptidna lanca mogu da budu dodatno stabilizovana najmanje jednom kovalentnom vezom, npr. disulfidnim mostom između cisteinskih rezidua različitih polipeptidnih lanaca.
[0020] Izraz „polipeptidni lanac“ se odnosi na polimer aminokiselinskih rezidua vezanih amidnim vezama. Prvi i drugi polipeptidni lanac su, poželjno, fuzioni proteini pojedinačnog lanca koji nisu granati. U svakom od prvog i drugog polipeptidnog lanca četiri domena su raspoređena tako da se drugi domen VHB nalazi C-terminalno od prvog domena VLA, treći domen VLB se nalazi C-terminalno od drugog domena VHB i četvrti domen VHA se nalazi C-terminalno od trećeg domena VLB. Prvi i drugi polipeptidni lanac mogu da imaju susedne aminokiselinske rezidue kao dodatak N-terminalno od prvog domena VLA i/ili C-terminalno od četvrtog domena VHA. Na primer, polipeptidni lanac može da sadrži Tag sekvencu, poželjno na C-terminusu što može da bude korisno za prečišćavanje polipeptida. Primer Tag sekvence je His-Tag, npr. His-Tag koji se sastoji od šest His-rezidua.
[0021] Prvi, drugi, treći i četvrti domen su kovalentno vezani tako da se domeni istog polipeptidnog lanca ne povezuju, tj. sparuju, jedan sa drugim. Domeni mogu da budu vezani tako da je prvi domen VLA vezan za drugi domen VHB pomoću prvog linkera L1, drugi domen VHB je vezan za treći domen VLB pomoću drugog linkera L2 i treći domen VLB je vezan za četvrti domen VHA pomoću trećeg linkera L3, pri čemu se prvi linker L1 i treći linker L3 nalaze distalno od centralnog linkera L2 na svakom prvom i drugom polipeptidnom lancu. Dužina svakog od linkera L1, L2 i L3 je takva da domeni prvog polipeptidnog lanca mogu da se povezuju sa domenima drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovao dimerni antigen-vezujući molekul. Dužina linkera utiče na fleksibilnost antigen-vezujućeg molekula. Željena fleksibilnost antigen-vezujućeg molekula zavisi od gustine ciljnog antigena i dostupnosti ciljnog antigena, tj. epitopa. Duži linkeri obezbeđuju fleksibilnije antigen-vezujuće molekule sa pokretljivijim antigen-vezujućim mestima. Dejstvo dužine linkera na obrazovanje dimernih antigen-vezujućih molekula opisano je, na primer, kod Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods 248:47-66; Perisic et al., 1994 Structure 2:1217-1226; Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366 i WO 94/13804.
[0022] Linkeri L1, L2 i/ili L3 su „kratki“, tj. sastoje se od 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih rezidua. Takvi kratki linkeri favorizuju ispravnu dimerizaciju prvog sa drugim polipeptidnim lancem vezivanjem i obrazovanjem antigen-vezujućih mesta između varijabilnih domena lakog lanca i varijabilnih domena teškog lanca različitih polipeptidnih lanaca. Posebno centralni linker L2 treba da bude kratak tako da spreči obrazovanje jednolančane Fv (scFv) antigen-vezujuće jedinice unutar istog polipeptidnog lanca pomoću dva susedna domena VHB i VLB. Centralni linker L2 utiče na fleksibilnost polipeptidnog lanca. Ako je centralni linker L2 dugačak, i fleksibilan (uopšteno se sastoji od 12 ili više aminokiselinskih rezidua) polipeptidni lanac može da se savije „od glave ka repu“ i da obrazuje jednolančani antigen-vezujući molekul poznat u stanju tehnike kao jednolančano di-antitelo. Ako je centralni linker L2 kratak i rigidan polipeptidni lanac ne može da se savije „od glave ka repu“ i dimerizuje sa drugim polipeptidnim lancem. Broj aminokiselinskih rezidua linkera za sprečavanje savijanja „od glave ka repu“ takođe zavisi od vrste varijabilnih domena koji se kombinuju u polipeptidu. Uopšteno, skraćivanje linkera na oko 12 ili manje aminokiselinskih rezidua uopšteno sprečava susedne domene istog polipeptidnog lanca da interaguju jedan sa drugim. Stoga, centralni linker L2 i distalni linkeri L1 i L3 treba poželjno da se sastoje od oko 12 ili manje aminokiselinskih rezidua da bi se sprečilo sparivanje susednih domena istog polipeptidnog lanca. U primerima izvođenja pronalaska linkeri L1, L2 i/ili L3 se sastoje od 4 do 10 susednih aminokiselinskih rezidua. Linkeri mogu da se sastoje od različitog broja aminokiselinskih rezidua, ali je poželjno da distalni linkeri L1 i L3 imaju isti broj aminokiselinskih rezidua ili da se ne razlikuju po dužini za više od jedne ili dve aminokiselinske rezidue. U određenom aspektu pronalaska najmanje jedan od linkera L1, L2 i/ili L3 sastoji se od devet aminokiselinskih rezidua. U određenom primeru izvođenja pronalaska sva tri linkera L1, L2 i L3 sastoje se od devet aminokiselinskih rezidua.
[0023] Kada je u pitanju aminokiselinski sastav linkera, u nekim primerima izvođenja, peptidi su odabrani tako da ne interferiraju sa dimerizacijom prvog i drugog polipeptidnog lanca. Na primer, linkeri koji sadrži glicinske i serinske rezidue uopšteno obezbeđuju fleksibilnost i otpornost na proteazu. Aminokiselinska sekvenca linkera može da se optimizuje, na primer, metodama prikaza na fagu da bi se poboljšalo vezivanje za antigen i prinos proizvodnje molekula. U konkretnim primerima izvođenja pronalaska linker može da sadrži aminokiselinsku sekvencu GGSGGSGGS.
[0024] Prvi domen VLA, drugi domen VHB, treći domen VLB i četvrti domen VHA su varijabilni domeni lakog lanca i teškog lanca imunoglobulina. Varijabilni domeni sadrže hipervarijabilne petlje ili regione za određivanje komplementarnosti (CDR) koji sadrže rezidue u kontaktu sa antigenom i segmente koji doprinose pravilnom savijanju i prikazivanju regiona CDR. Svaki od varijabilnih domena teškog lanca i lakog lanca sadrži odgovarajuća tri CDR. Domeni mogu da potiču iz bilo koje klase imunoglobulina, npr., IgA, IgD, IgE i IgM ili njihovih potklasa. Imunoglobulin može da bude životinjskog, posebno sisarskog porekla. Svaki domen može da bude kompletan varijabilni domen teškog ili lakog lanca imunoglobulina, mutant, fragment ili derivat prirodnog varijabilnog domena, ili sintetski, npr. rekombinantni domen koji je genetski modifikovan. Derivat je varijabilni domen koji se razlikuje po deleciji, supstituciji, adiciji ili inserciji najmanje jedne aminokiseline od aminokiselinske sekvence prirodnog varijabilnog domena. Sintetski, npr. rekombinantni domeni, mogu da se dobiju, na primer, dobro poznatim ponovljivim metodama iz antitela koja potiču iz hibridoma ili biblioteka imunoglobulina prikazanih na fagu. Na primer, metode prikaza na fagu mogu da se koriste za dobijanje varijabilnih domena humanih antitela protiv antigena putem skrininga biblioteka sekvenci humanih imunoglobulina. Afinitet polazno selektovanog antitela može dalje da se poveća sazrevanjem afiniteta, na primer mešanjem lanaca ili nasumičnom mutagenezom. Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa metodama za dobijanje domena iz prirodnih ili rekombinantnih antitela (za laboratorijske priručnike videti, na primer, Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). Uopšteno, bilo koje antitelo poznato u stanju tehnike može da se koristi kao izvor varijabilnih domena pronalaska.
[0025] U određenom aspektu pronalaska najmanje jedan, poželjno svi, od prvog domena VLA, drugog domena VHB, trećeg domena VLB i četvrtog domena VHA su u potpunosti humani, humanizovani ili himerni domeni. Humanizovani varijabilni domen sadrži okvirni region koji suštinski ima aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i CDR nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu da se proizvedu dobro ustanovljenim metodama kao, na primer kalemljenje CDR (videti, na primer, Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). Tako, stručnjak u oblasti lako može da napravi humanizovanu ili potpuno humanu verziju antigen-vezujućih molekula i varijabilnih domena iz nehumanih, npr. mišjih, izvora pomoću standardnih tehnika molekularne biologije poznatih u stanju tehnike za smanjenje imunogenosti i poboljšanje efikasnosti antigen-vezujućeg molekula u humanom imunskom sistemu. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska svi domeni (npr. VLA, VHB, VLB i VHA) su humanizovani ili potpuno humani; najpoželjnije, dimerni antigen-vezujući molekul prema pronalasku je humanizovan ili potpuno human. Izraz „potpuno human“, kako se ovde koristi, označava da aminokiselinske sekvence varijabilnih domena i peptida koji povezuju varijabilne domene u prvom i drugom polipeptidnom lancu potiču ili mogu da se nađu kod ljudi. U određenim primerima izvođenja pronalaska varijabilni domeni mogu da budu humani ili humanizovani, ali ne i peptidi koji povezuju varijabilne domene.
[0026] Prvi domen VLA, drugi domen VHB, treći domen VLB i četvrti domen VHA su specifični za različite antigene tako da VLA i VHA obrazuju antigen-vezujuće mesto za antigen A prve specifičnosti i VHB i VLB obrazuju antigen-vezujuće mesto za antigen B druge specifičnosti. Takvi antigen-vezujući molekuli prema pronalasku su bispecifični.
[0027] Dimerni antigen-vezujući molekul je bispecifičan za tumorsku ćeliju i T ćeliju. Pogodne specifičnosti za tumorske ćelije mogu da budu tumorski antigeni i antigeni ćelijske površine na odgovarajućoj tumorskoj ćeliji, na primer specifični tumorski markeri. Takav bispecifični dimerni antigen-vezujući molekul vezuje se i za tumorsku ćeliju i za T ćeliju pokrećući tako citotoksični odgovor indukovan T ćelijom. Izraz „tumorski antigen“, kako se ovde koristi, obuhvata antigen povezan sa tumorom (TAA) i tumor-specifični antigen (TSA). „Antigen povezan sa tumorom“ (TAA), kako se ovde koristi, odnosi se na protein koji je prisutan na tumorskim ćelijama, i na normalnim ćelijama tokom fetalnog života (jednokratni fetalni antigeni), i posle rođenja u odabranim organima, ali u mnogo nižoj koncentraciji nego na tumorskim ćelijama. TAA može da bude prisutan i u stromi u neposrednoj blizini tumorske ćelije, ali se eksprimira u manjim količinama u stromi drugde u telu. Nasuprot tome, izraz „tumor-specifični antigen“ (TSA) odnosi se na protein koji eksprimiraju tumorske ćelije. Izraz „antigen ćelijske površine“ odnosi se na bilo koji antigen ili njegov fragment koji ima sposobnost da ga antitelo prepozna na površini ćelije.
[0028] Primeri specifičnosti za tumorske ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na CD19, CD20, CD30, prekursorski protein receptora za laminin, EGFR1, EGFR2, EGFR3, Ep-CAM, PLAP, antigen Thomsen-Friedenreich (TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL4-R alfa, IL13-R, FcεRI i IgE kao što je opisano u stanju tehnike.
[0029] Specifičnost za T ćelije je CD3 i specifičnost za tumorske ćelije može da bude odabrana od CD19, CD20, CD30, prekursora receptora za laminin, Ep-CAM, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, antigena Thomsen-Friedenreich (TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL4-R alfa, IL13-R, FceRI i IgE. Konkretni primeri takvih antigen-vezujućih molekula su bispecifični za CD3 i CD19.
[0030] Prvi domen VLA i četvrti domen VHA imaju specifičnost za CD3, a druga dva domena, naime drugi domen VHB i treći domen VLB, imaju specifičnost za tumorsku ćeliju. U konkretnom poželjnom primeru izvođenja prvi domen VLA i četvrti domen VHA imaju specifičnost za CD3, a druga dva domena, naime drugi domen VHB i treći domen VLB, imaju specifičnost za tumorsku ćeliju odabranu iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD30, prekursora receptora za laminin, Ep-CAM, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, antigena Thomsen-Friedenreich (TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL4-R alfa, IL13-R, FcεRI i IgE.
[0031] CD3 antigen je povezan sa T-ćelijskim receptorskim kompleksom na T-ćelijama. U slučaju kada je specifičnost za efektorsku ćeliju CD3, vezivanje dimernog antigen-vezujućeg molekula prema pronalasku za CD3 može da pokrene citotoksičnu aktivnost T-ćelija prema ciljnim ćelijama. Naime, bispecifičnim vezivanjem dimernog antigen-vezujućeg molekula za CD3 i za ciljnu ćeliju, npr. tumorsku ćeliju, može da bude indukovana ćelijska liza ciljne ćelije. Dimerni antigen-vezujući molekuli sa specifičnošću prema CD3 i njihova proizvodnja poznata je u stanju tehnike (i opisana, na primer kod Kipriyanov et al., 1999, Journal of Molecular Biology 293:41-56, Le Gall et al., 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17/4:357-366).
[0032] Dimerni antigen-vezujući molekuli prema pronalasku, u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema CD19 antigenu, mogu da se koriste za imunoterapiju maligniteta B-ćelija, jer se CD19 antigen eksprimira na praktično svim malignitetima B-linije od limfoblastne leukemije (ALL) do non-Hodgkin-ovog limfoma (NHL). Dimerni antigen-vezujući molekuli koji imaju specifičnost prema CD19 ili CD20 mogu naročito da se koriste za lečenje non-Hodgkin-ovog limfoma. Dimerni antigen-vezujući molekuli koji imaju specifičnost prema CD19 i njihova proizvodnja poznati su u stanju tehnike (i opisani, na primer, kod Cochlovius et al., 2000, Cancer Research 60:4336-4341).
[0033] Dimerni antigen-vezujući molekuli prema pronalasku, u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema receptoru za laminin ili prekursoru receptora za laminin mogu da se koriste, na primer, ali bez ograničenja, za lečenje hronične limfocitne leukemije B-ćelija (B-CLL), non-Hodgkin-ovog limfoma, Hodgkin-ovog limfoma, kancera pluća, karcinoma debelog creva, karcinoma mlečne žlezde, karcinoma pankreasa, kancera prostate, posebno u stanju metastaznog kancera ili minimalnog rezidualnog kancera. Antigen-vezujući molekuli koji imaju specifičnost prema prekursoru receptora za laminin opisani su, na primer, kod Zuber et al., 2008, J. Mol. Biol., 378:530-539.
[0034] Dimerni antigen-vezujući molekuli prema pronalasku u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema EGFR1 mogu da budu posebno korisni u lečenju kancera kod kojih je ekspresija EGFR1 ushodno regulisana ili izmenjena, na primer u kancerima dojke, bešike, glave i vrata, prostate, bubrega, nesitnoćelijskog kancera pluća, kolorektalnog kancera i kod glioma.
[0035] Dimerni antigen-vezujući molekuli prema pronalasku u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema TF-antigenu mogu da budu posebno korisni u lečenju kancera dojke ili debelog creva i/ili metastaza jetre.
[0036] Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema CD30 mogu da budu posebno korisni u lečenju Hodgkin-ove bolesti. Antigen-vezujući molekuli koji imaju specifičnost prema CD30 opisani su, na primer, kod Arndt et al., 1999, Blood, 94:2562-2568.
[0037] Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema alfa lancu receptora za IL4 (IL4R alfa) mogu da budu posebno korisni u lečenju solidnih tumora, posebno karcinoma dojke, jajnika, bubrežnog sistema, glave i vrata, malignog melanoma i Kapošijevog sarkoma povezanog sa AIDS-om. Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je najmanje jedna dodatna specifičnost usmerena prema EGFR3/HER3 i/ili EGFR2/neu mogu da budu posebno korisni u lečenju kancera dojke. Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema IGFR mogu da budu posebno korisni u lečenju kancera prostate, kolorektalnog kancera, kancera jajnika ili kancera dojke.
[0038] Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema CD5 mogu da budu posebno korisni u lečenju hronične limfocitne leukemije.
[0039] Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema MUC-I mogu da budu posebno korisni u lečenju kancera želuca i kancera jajnika. Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema EpCAM mogu da budu posebno korisni u lečenju karcinoma debelog creva, bubrega i dojke.
[0040] Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema PLAP mogu da budu posebno korisni u lečenju kancera jajnika ili testisa.
[0041] Dimerni antigen-vezujući molekuli u kojima je specifičnost za tumor usmerena prema OFA-iLR mogu da budu posebno korisni u lečenju metastatskih tumora.
[0042] U određenom aspektu pronalaska antigen-vezujući molekul kao što je ovde opisano je dimeran i bispecifičan za CD3 i CD19. Prvi domen VLA i četvrti domen VHA su specifični za CD3, dok su drugi domen VHB i treći domen VLB specifični za CD19. Prvi i drugi polipeptidni lanac imaju redosled domena od N-terminusa ka C-terminusu polipeptidnih lanaca. U poželjnom primeru izvođenja prvi, drugi, treći i četvrti domen su humanizovani ili u potpunosti humani. U najpoželjnijem primeru izvođenja, prvi i drugi polipeptidni lanac kao što je gore definisano su humanizovani ili u potpunosti humani. U drugom aspektu pronalaska dimerni antigen-vezujući molekul može da bude bispecifičan, na primer, prema EpCAM i CD3; ili EGFR i CD3.
[0043] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje dimerni antigen-vezujući molekul prema bilo kom od primera izvođenja koji su gore opisani, koji je vezan za dodatnu funkcionalnu jedinicu, npr. funkcionalni domen ili sredstvo, koja nezavisno posreduje u biološkoj funkciji, posebno u biohemijskom događaju. Dodatna funkcionalna jedinica može da bude u kompleksu sa, ili kovalentno vezana za najmanje jedan od dva pojedinačna polipeptidna lanca dimernog antigenvezujućeg molekula. U jednom aspektu, dodatna funkcionalna jedinica može da bude kovalentno vezana za samo jedan od pojedinačnih polipeptidnih lanaca i u drugom aspektu dodatna funkcionalna jedinica može da bude kovalentno vezana za oba polipeptidna lanca dimernog antigen-vezujućeg molekula povezujući tako dva polipeptidna lanca. U sledećem aspektu, svaki od dva polipeptidna lanca je pojedinačno kovalentno vezan za dodatnu funkcionalnu jedinicu. Kada je dodatna funkcionalna jedinica kovalentno vezana za najmanje jedan od dva polipeptidna lanca, dodatna funkcionalna jedinica može da bude fuzionisana sa najmanje jednim od dva polipeptidna lanca peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. Alternativno, dodatna funkcionalna jedinica može da bude vezana hemijskom konjugacijom kao što je disulfidni most, npr. između cisteinskog ostatka najmanje jednog polipeptidnog lanca i cisteinske rezidue dodatne funkcionalne jedinice, estarskom vezom ili hemijskim unakrsnim vezivanjem. U određenom aspektu pronalaska dodatna funkcionalna jedinica može da bude vezana za antigen-vezujući molekul putem linkera koji može da se iseče kao što je, na primer, disulfidna veza.
[0044] Dodatna funkcionalna jedinica može da bude vezana za N-terminus ili C-terminus prvog i/ili drugog polipeptidnog lanca. Ako je jedna dodatna funkcionalna jedinica vezana za oba, prvi i drugi, polipeptidni lanac, dodatna funkcionalna jedinica može da bude vezana N-terminalno za jedan polipeptidni lanac i C-terminalno za drugi polipeptidni lanac. Homobifunkcionalni i heterobifunkcionalni reagensi za hemijsko unakrsno povezivanje polipeptidnog lanca sa dodatnom funkcionalnom jedinicom, kao što je dodatni polipeptid ili sredstvo, dobro su poznati u stanju tehnike. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na 5,5"-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (o-PDM), sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), N-sukcinimidil S-acetiltio acetat (SATA), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC) ili hidrazid 4-(4-N-maleimidofenil) buterne kiseline (MPBH). Metode za unakrsno vezivanje polipeptidnih lanaca koji sadrže imunoglobulinske lance sa dodatnim polipeptidom ili hemijskim sredstvom opisane su na primer kod Graziano et al., Methods in Molecular Biology, 2004, vol. 283, 71-85 i Hermanson, G.T. "Bioconjugate Techniques" Academic Press, London 1996.
[0045] U jednom aspektu, dodatna funkcionalna jedinica može da bude najmanje jedan dodatni varijabilni imunoglobulinski domen. Dodatni varijabilni imunoglobulinski domen može da bude specifičan za prvi antigen A ili drugi antigen B za koje su vezivna mesta dimernog antigenvezujućeg molekula specifična ili, alternativno, specifičan za treći antigen C koji je drugačiji od antigena A i antigena B. U određenom aspektu, dodatni varijabilni domen VLlakog lanca i dodatni varijabilni domen VHteškog lanca mogu da budu fuzionisani za svaki od dva polipeptidna lanca tako da je jedan dodatni domen, konkretno VH, fuzionisan za N-terminus i drugi dodatni domen, konkretno VL, fuzionisan za C-terminus, rezultujući u polipeptidu koji ima šest varijabilnih domena koji će se povezati sa drugim identičnim polipeptidom u dimerni antigen-vezujući molekul koji ima šest antigen-vezujućih mesta. U drugom aspektu jedan dodatni varijabilni imunoglobulinski domen može da bude fuzionisan sa jednim od polipeptidnih lanaca antigen-vezujućeg molekula koji se zatim nekovalentno povezuje sa komplementarnim varijabilnim imunoglobulinskim domenom sa istom specifičnošću dodatnog trećeg polipeptida čime se obrazuje dodatno antigen-vezujuće mesto između dimernog antigen-vezujućeg molekula i dodatnog trećeg polipeptida. U još jednom aspektu dodatna antigen-vezujuća jedinica koja uključuje scFv ili di-antitelo može da bude vezana kao dodatna funkcionalna jedinica za dimerni antigen-vezujući molekul.
[0046] U određenom aspektu dodatna funkcionalna jedinica može da bude najmanje jedan dodatni dimerni antigen-vezujući molekul kao što je ovde opisano. Prema tome, dva ili više dimerna antigen-vezujuća molekula prema pronalasku mogu da budu vezana jedan za drugi da bi se povećala valenca i aviditet antigen-vezujućih molekula.
[0047] U drugom aspektu dodatna funkcionalna jedinica može da bude efektorski domen uključujući Fc domen, CH2 domen, CH3 domen, domen zgloba ili njihov fragment. Takva jedinica može da doprinosi efektorskim svojstvima antigen-vezujućeg molekula u slučaju vezivanja za Fc receptore. Takve funkcionalne jedinice mogu dodatno da se koriste za povećanje polu-života u serumu antigen-vezujućeg molekula.
[0048] U još jednom aspektu dodatna funkcionalna jedinica može da bude enzim. U slučaju kada enzim ima sposobnost pretvaranja proleka u aktivni lek, takav antigen-vezujući molekul može da se koristi u enzimskoj terapiji prolekom zavisnoj od antitela (ADEPT). U tu svrhu, antigenvezujući molekul usmerava enzim u tkivo od interesa i kada se antigen-vezujući molekul veže za tkivo, prolek se aktivira na tom mestu. Dalje, upotreba bispecifičnih antigen-vezujućih molekula za usmeravanje enzima na terapeutike za kancer poznata je u stanju tehnike, na primer, ali nije ograničena na bispecifične antigen-vezujuće molekule koji imaju specifičnost za CD30 i alkalnu fosfatazu koja katalizuje pretvaranje mitomicin fosfata u mitomicin alkohol, ili specifičnosti za placentalnu alkalnu fosfatazu i β-laktamazu koje aktiviraju anti-kancerske prolekove na bazi cefalosporina. Pogodni su i bispecifični antigen-vezujući molekuli koji imaju specifičnost za fibrin i tkivni aktivator plazminogena za fibrinolizu i upotreba antigen-vezujućih molekula konjugovanih sa enzimom u imunoesejima na bazi enzima.
[0049] U drugom aspektu funkcionalna jedinica može da bude lek, toksin, radioizotop, limfokin, hemokin ili molekul za obeležavanje. Takav antigen-vezujući molekul dostavlja funkcionalnu jedinicu na željeno mesto delovanja. Na primer, hemioterapijski lek vezan za antigen-vezujući molekul koji je specifičan za tumorski antigen može da se dostavi u tumorsku ćeliju, a toksini mogu da budu dostavljeni do patogenih ili tumorskih ćelija. Antigen-vezujući molekul vezan sa toksinom može da se koristi za ciljno delovanje na NK ćelije ili makrofage i poželjno je specifičan za CD16. Primeri toksina su, ali nisu ograničeni na ribozil transferazu, serin proteazu, aktivator guanil ciklaze, adenil ciklazu zavisnu od kalmodulina, ribunukleazu, sredstvo za alkilaciju DNK ili inhibitor mitoze, npr. doksorubicin. Molekul za obeležavanje može da bude, na primer, fluorescentni, luminescentni ili radioaktivno obeleženi molekul, helat metala ili enzim (npr. peroksidaza rena, alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, malat dehidrogenaza, oksidaza glukoze, ureaza, katalaza itd.) koji će, za uzvrat, kada se naknadno izloži supstratu reagovati sa supstratom na taj način da proizvede hemijski fragment koji može da se detektuje i može da se koristi za in vivo snimanje ili imunoeseje, kada je vezan za antigen-vezujući molekul prema pronalasku. Kada se koristi za imunoesej, dimerni antigen-vezujući molekul može da bide i imobilizovan na nerastvorljivom nosaču, npr. staklu, polistirenu, polipropilenu, polietilenu, dekstranu, najlonu, prirodnim i modifikovanim celulozama, poliakrilamidima, agarozi i magnetnim perlama.
[0050] Za povećanje serumskog polu-života antigen-vezujućih molekula prema pronalasku u telu, antigen-vezujući molekul, po želji, može da bude fuzionisan sa albuminom ili pegilovan, sijalilovan ili glikozilisan (videti, na primer, Stork et al., 2008, J. Biol. Chem., 283:7804-7812). Alternativno fuziji dodatnog albumina sa antigen-vezujućim molekulom prema predmetnom pronalasku, sam antigen-vezujući molekul može da bude specifičan za albumin i drugi antigen kao što je prethodno opisano.
[0051] Dimerni antigen-vezujući molekul prema bilo kom od primera izvođenja koji su ovde prethodno opisani može da bude proizveden eksprimiranjem polinukleotida koji kodiraju pojedinačne polipeptidne lance koji se međusobno povezuju da bi se obrazovao dimerni antigenvezujući molekul. Stoga, sledeći primer izvođenja pronalaska su polinukleotidi, npr. DNK ili RNK, koji kodiraju polipeptidne lance dimernog antigen-vezujućeg molekula kao što je ovde prethodno opisano.
[0052] Polinukleotidi mogu da budu konstruisani metodama koje su poznate stručnjaku u oblasti, npr. kombinovanjem gena koji kodiraju prvi domen VLA, drugi domen VHB, treći domen VLB i četvrti domen VHA, bilo razdvojene peptidnim linkerima, ili direktno spojene peptidnom vezom, u jedan genetički konstrukt funkcionalno vezan za pogodni promotor, i opciono pogodni transkripcioni terminator, i njegovim eksprimiranjem u bakterijskom ili drugom pogodnom ekspresionom sistemu. U zavisnosti od korišćenog vektorskog sistema i domaćina, bilo koji broj pogodnih transkripcionih i translacionih elemenata, uključujući konstitutivne i inducibilne promotore, može da se koristi. Promotor je odabran tako da pokreće ekspresiju polinukleotida u odgovarajućoj ćeliji.
[0053] Polinukleotidi mogu da budu podvrgnuti optimizaciji kodona odstupanjem od upotrebe kodona, na takav način da odgovaraju konkretnoj ekspresiji u odabranom domaćinu.
[0054] Polinukleotid može da bude ubačen u vektore, poželjno ekspresione vektore, koji predstavljaju dodatni primer izvođenja pronalaska. Ovi rekombinantni vektori mogu da budu konstruisani metodama koje su dobro poznate stručnjaku u oblasti; videti, npr., Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.
[0055] Mogu da se upotrebe različiti sistemi ekspresioni vektor/domaćin koji će da sadrže i eksprimiraju polinukleotide koji kodiraju polipeptidne lance prema predmetnom pronalasku. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme kao što su bakterije transformisane rekombinantnim bakteriofagom, plazmidnim, ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima, kvasce transformisane ekspresionim vektorima kvasca; sisteme insekatskih ćelija inficiranih virusnim ekspresionim vektorima (npr., bakulovirus); sisteme biljnih ćelija transformisane virusnim ekspresionim vektorima (npr., mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili bakterijskim ekspresionim vektorima (npr., Ti ili pBR322 plazmidi); ili sisteme životinjskih ćelija, za koje mogu da se koriste, npr., ekspresioni sistemi na bazi virusa.
[0056] Posebno poželjan ekspresioni vektor za ekspresiju u E.coli je pSKK (LeGall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1) :111-27) ili pcDNA5 (Invitrogen) za ekspresiju u sisarskim ćelijama.
[0057] Tako, dimerni antigen-vezujući molekul kao što je ovde opisano može da bude proizveden uvođenjem polinukleotida ili vektora koji kodira polipeptidni lanac kao što je gore opisano u ćeliju-domaćinu i kultivisanjem navedene ćelije-domaćina pod uslovima u kojima se polipeptidni lanac eksprimira. Dimerni antigen-vezujući molekul dobijen od eksprimiranih polipeptidnih lanaca može da bude izolovan i, opciono, dalje prečišćen. Uslovi za rast i održavanje ćelija-domaćina, ekspresiju, izolaciju i prečišćavanje dimernih antigen-vezujućih molekula prema pronalasku iz ovih ćelija-domaćina su u potpunosti opisani u stanju tehnike.
[0058] U sledećem primeru izvođenja pronalaska obezbeđene su kompozicije koje sadrže dimerni antigen-vezujući molekul ili polinukleotid kao što je ovde gore opisano i najmanje jednu dodatnu komponentu. Za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti ili poremećaja, kompozicija koja sadrži dimerni antigen-vezujući molekul ili polimerni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptidne lance koji obrazuju antigen-vezujući molekul se poželjno kombinuje sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ namenjen je da obuhvati bilo koji nosač koji ne interferira sa efikasnošću biološke aktivnosti sastojaka i koji nije toksičan za pacijenta kod koga se primenjuje. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju fosfatno puferisane slane rastvore, vodu, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, različite tipove sredstava za kvašenje, sterilne rastvore itd. Takvi nosači mogu da budu formulisani konvencionalnim metodama i mogu da se primene kod subjekta u pogodnoj dozi. Poželjno, kompozicije su sterilne. Ove kompozicije mogu da sadrže i adjuvanse kao što je konzervans, emulgujuća sredstva i sredstva za dispergovanje. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može da bude osigurano uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava. Primena pogodnih kompozicija može da se ostvari na različite načine, npr. intravenskom, intraperitonealnom, subkutanom, intramuskularnom, topikalnom ili intradermalnom primenom. Put primene, naravno, zavisi od vrste terapije i vrste jedinjenja sadržanog u farmaceutskoj kompoziciji. Dozni režim će biti određen od strane nadležnog lekara i drugih kliničkih faktora. Kao što je dobro poznato u medicinskoj struci, doziranje za bilo kog pacijenta zavisi od mnogo faktora, uključujući veličinu, površinu tela, starost, pol pacijenta, konkretno jedinjenje koje se primenjuje, vreme i put primene, vrstu terapije, opšte zdravlje i druge lekove koji se primenjuju istovremeno.
[0059] Pronalazak dalje obezbeđuje medicinsku upotrebu ili metod u kome se dimerni antigenvezujući molekul kao što je ovde gore opisano primenjuje u efikasnoj dozi kod subjekta, npr., pacijenta, za lečenje kancera (npr. non-Hodgkin-ovog limfoma; hronične limfocitne leukemije; Hodgkin-ovog limfoma; solidnih tumora npr. onih koji se javljaju kod kancera dojke, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera bubrega, ili kancera žučnih kanala; minimalne rezidualne bolesti; metastatskih tumora npr. onih koji metastaziraju na pluća, kosti, jetru ili mozak). Antigen-vezujući molekul može da se koristi u profilaksi ili lečenju, sam, ili u kombinaciji sa aktuelnim terapijama.
[0060] Kanceri koji mogu da se leče upotrebom antigen-vezujućeg molekula prema predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na primarni i metastatski kancer kore nadbubrega, analni kancer, aplastičnu anemiju, kancer žučnih kanala, kancer bešike, kancer kostiju, metastaze na kostima, tumore CNS, kancer perifernog CNS, kancer dojke, Kastlemanovu bolest, kancer grlića materice, non-Hodgkin-ov limfom dečijeg doba, kancer debelog creva i rektuma, endometrijalni kancer, kancer jednjaka, Juingovu familiju tumora (npr. Juingov sarkom), kancer oka, kancer žučne kese, gastrointestinalne karcinoidne tumore, gastrointestinalne stromalne tumore, gestacijsku trofoblastičnu bolest, leukemiju vlasastih ćelija, Hodgkin-ovu bolest, Kapošijev sarkom, kancer bubrega, kancer grkljana i hipofarinksa, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, dečiju leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, kancer jetre, kancer pluća, karcinoidne tumore pluća, Non-Hodgkin-ov limfom, kancer dojke kod muškaraca, maligni mezoteliom, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativne poremećaje, kancer nazalne šupljine i paranazalni kancer, kancer nazofarinksa, neuroblastom, kancer usne duplje i orofarinksa, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer penisa, tumor hipofize, kancer prostate, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer pljuvačne žlezde, sarkom (kancer mekog tkiva kod odraslih), melanom kože, nemelanomski kancer kože, kancer želuca, kancer testisa, kancer timusa, kancer tiroidne žlezde, kancer matrice (npr. sarkom materice), kancer vagine, kancer vulve i Waldenstrom-ovu makroglobulinemiju.
[0061] „Efikasna doza“ se odnosi na količine aktivnog sastojka koje su dovoljne da utiču na tok i ozbiljnost bolesti, vodeći smanjenju ili remisiji takve patologije. „Efikasna doza“ korisna za lečenje i/ili prevenciju ovih bolesti ili poremećaja može da bude određena upotrebom metoda poznatih stručnjaku u ovoj oblasti (videti na primer, Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goddman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975)).
[0062] U drugom aspektu pronalaska dimerni antigen-vezujući molekul kao što je ovde gore opisano koristi se u proizvodnji leka za lečenje kancera (npr. non-Hodgkin-ovog limfoma; hronične limfocitne leukemije; Hodgkin-ovog limfoma; solidnih tumora npr. onih koji se javljaju kod kancera dojke, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera bubrega, ili kancera žučnog kanala; minimalne rezidualne bolesti; metastatskih tumora npr. onih koji metastaziraju na pluća, kosti, jetru ili mozak). Tamo gde su specifični, multispecifično-vezujući molekuli opisani gore u tekstu kao oni koji imaju određenu korisnost u tretmanu određene bolesti, ovi vezujući molekuli mogu takođe da se koriste u proizvodnji lekova za tu specifičnu bolest.
[0063] Metode za pripremu farmaceutskih kompozicija, tj. lekova, i kliničku primenu antigenvezujućih molekula u prevenciji i/ili lečenju bolesti kao što je, na primer, kancer poznate su stručnjaku u ovoj oblasti.
[0064] U konkretnom aspektu pronalaska dimerni antigen-vezujući molekul je bispecifičan i koristi se za terapiju kancera, jer takva antitela mogu da se koriste za preusmeravanje citotoksičnih efektorskih ćelija na tumorske ćelije. Ovaj terapijski koncept je dobro poznat u stanju tehnike. Na primer, klinička ispitivanja su pokazala regresiju tumora kod pacijenata lečenih sa anti-CD3 x antitumorsko bispecifično antitelo (npr. Canevari, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 87:1463-1469,1996) ili kod pacijenata lečenih sa anti-CD16 x antitumorsko bispecifično antitelo (npr. Hartmann et al.; Clin Cancer Res.2001;7(7):1873-81). Dokaz ispravnosti koncepta je pružen za različite rekombinantne molekule bispecifičnog antitela koji sadrže samo varijabilne domene (Fv) kao što su, na primer, dimerni i tetravalentni CD3xCD19 antigen-vezujući molekuli koji imaju redosled domena VHA-VLB-VHB-VLA (Cochlovius et al.; Cancer Research, 2000, 60:4336-4341), ili nedavno u kliničkim ispitivanjima monomernih jednolančanih Fv molekula antitela sa BiTE®-formatom (dva jednolančana antitela različitih specifičnosti vezana zajedno; Micromet AG, Germany; Bargou R. et al., Science, 2008, 321(5891):974-977; Baeuerle PA i Reinhardt C., Cancer Res. 2009, 69(12):4941-4944). Dimerni antigen-vezujući molekuli koji su ovde opisani mogu da se koriste kao lekovi i da se primene u metodama lečenja na sličan način kao bispecifična antitela prema stanju tehnike, budući da su sposobni za preusmeravanje terapeutskih, npr. citotoksičnih mehanizama korišćenjem istih kombinovanih specifičnosti antitela.
[0065] Antigen-vezujući molekul i njegove kompozicije mogu da budu u obliku oralnog, intravenskog, intraperitonealnog, ili drugog farmaceutski prihvatljivog doznog oblika. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se primenjuje oralno i dozni oblik je tableta, kapsula, kapleta ili drugi oralno raspoloživi oblik. U nekim primerima izvođenja, kompozicija je parenteralna, npr. intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, ili subkutana, i primenjuje se putem rastvora koji sadrži antigen-vezujući molekul.
[0066] Stručnjak u oblasti će lako moći bez nepotrebnog napora da konstruiše i dobije antigenvezujuće molekule koji su ovde opisani upotrebom uspostavljenih tehnika i standardnih metoda poznatih u stanju tehnike, videti na primer Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.; The Protein Protocols Handbook, edited by John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); ili Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). Pored toga, stručnjak u oblasti će moći da napravi antigen-vezujuće molekule koji su ovde opisani upotrebom standardnih metoda poznatih u stanju tehnike i modifikovanjem metoda opisanih u US 7,129,330, Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41- 56 ili Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366 tako da se dobiju dimerni antigen-vezujući molekuli kao što je gore opisano koji sadrže dva polipeptidna lanca koji imaju redosled domena VLA- VHBVLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu svakog polipeptidnog lanca.
[0067] Primeri dole u tekstu dalje ilustruju pronalazak bez ograničavanja obima pronalaska.
Primer:
[0068] Za konstruisanje funkcionalnih dimernih tandemskih di-antitela (TandAb®) upotrebom rasporeda domena drugačijeg od VHA-VLB-VHB-VLA, nekoliko takvih dimernih tandemskih diantitela je konstruisano sa rasporedom domena VLA-VHB-VLB-VHA prema pronalasku upotrebom dva domena humanizovanog anti-CD19 jednolančanog antitela, odnosno humanizovanog anti-CD3 jednolančanog antitela. Nalazi su potvrđeni upotrebom dve varijante svakog antigen-vezujućeg molekula, koje predstavljaju proizvode različitih stadijuma postupka sazrevanja afiniteta koji je sproveden i za humanizovana anti-CD19 i za humanizovana anti-CD3 antitela.
[0069] Mišja monoklonska antitela HD37 i UCHT usmerena protiv CD19 odnosno CD3, bila su polazni materijal za dobijanje humanizovanih antitela sa relativno visokim afinitetima. U svakom slučaju, VHdomen je prvo kombinovan sa bibliotekom humanih VLu scFv fagmidnom vektoru da bi se selektovao pogodan humani VLlanac prikazom na fagu. U drugom koraku selektovani humani VLlanac je kombinovan sa bibliotekom VHdomena u kojoj CDR3 region ostaje konstantan. Ovaj postupak je rezultovao u humanizovanom anti CD19, odnosno anti CD3, koji sadrži samo kratku mišju sekvencu u VHCDR3 regionu. Ovi klonovi su zatim podvrgnuti sazrevanju afiniteta uvođenjem tačkastih mutacija na reziduama za koje se smatra da učestvuju u vezivanju antigena. Mutanti koji se najbolje vezuju su zatim selektovani prikazom na fagu. Klonovi koji su odabrani za konstruisanje TandAb bili su M13 i M39 koji se vezuju za CD19 i C4, i LcHC21 koji se vezuje za CD3.
[0070] Stvorena su sledeća antitela:
[0071] Plazmidi koji kodiraju hibridne monomere antitela
antitela C su generisani od strane provajdera
za inženjering i obradu DNK. Okosnica sekvence monomera V
sadrži DNK sekvence dva scFv antitela, naime scFvCD19<M39>odnosno scFvCD3<C4>.
Sekvenca monomera V kombinuje varijabilne domene jednog lanca Fv CD19M13 i jednog lanca Fv CD3LCHC21. Sva četiri scFv su dobijena selekcijom pomoću prikaza na fagu jednolančanih antitela naspram antigena CD19 i CD3. U oba slučaja podaci o sekvenci su korišćeni za konstruisanje gore navedenih hibridnih monomera. Linker od 9 aminokiselina (G2S)3korišćen je za međusobno vezivanje domena. Sintetisani gen koji kodira kloniran je u sisarski ekspresioni vektor pCDNA5FRT (Invitrogen). Gen za takođe je kloniran u ekspresioni vektor i amplifikovan pomoću PCR metode upotrebom direktnog prajmera koji uvodi mesto isecanja Ncol i reverznog prajmera koji uvodi mesto isecanja NotI. Posle analize i izolovanja na agaroznom gelu, proizvod PCR reakcije je zatim podvrgnut dvostrukoj digestiji sa Ncol i NotI i kloniran u pSKK3 vektor linearizovan pomoću NcoI i NotI. Ispravnost kloniranja je potvrđena DNK sekvenciranjem. Mapa vektora pCDNA5FRT koji kodira antitelo B prikazana je na sl. 6. Mapa vektora pSKK3 koji kodira antitelo C prikazana je na sl.7.
[0072] Za visok nivo proizvodnje vektor koji sadrži gen V
je prolazno transficiran (upotrebom CaPO4) u adherentne ćelije HEK293. Fermentacija proteina je izvedena pod uslovima za rast koji su dobro poznati u stanju tehnike. Rekombinantni protein je eksprimiran kao His-Tag fuzioni protein sa jednim peptidom. Protein je izolovan iz supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom sa imobilisanim metalnim jonom (IMAC) kao što je opisano (Kipriyanov et al., 1999, J.Mol.Biol., 293, 41-56). Prečišćeni materijal je zatim analiziran pomoću SDS-PAGE. Pomoću bojenja SDS PAGE gela komazi bojom i ekskluzione hromatografije na kalibrisanoj koloni Superdex 200 HR10/30 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) u natrijum-fosfatnom puferu (30 mM NaPO4, 0,75M arginin/HCl, pH6,0) pokazano je da je rekombinantni protein (antitelo B) čist i ispravno sklopljen.
[0073] Za visok nivo ekspresije, gen koji kodira humanizovani
monomer praćen sa 6x His-Tag kloniran je u plazmid pSKK3 koji sadrži
gene ćelijskog suicidnog sistema hok/sok i gen skp koji kodira periplazmatski faktor Skp/OmpH (LeGall et al., 2004, J. Immunol. Methods, 285, 111-127). Plazmid je zatim transficiran u soj E.coli K12 (ATCC 31608™).
[0074] Transformisane bakterije su zatim gajene u mućkanim bocama i indukovane suštinski kao što je prethodno opisano (Cochlovius et al., 2000, J. Immunol., 165, 888-895). Rekombinantni proteini su izolovani i iz rastvorljive periplazmatske frakcije i iz supernatanta bakterijskog medijuma afinitetnom hromatografijom sa imobilisanim metalnim jonom (IMAC) kao što je već opisano (Kipriyanov et al., 1999, J.Mol.Biol., 293, 41-56).
[0075] Prečišćeni materijal je zatim analiziran pomoću SDS-PAGE obojene bojom komazi plavo i ekskluzionom hromatografijom na kalibrisanoj koloni Superdex 200 HR10/30 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) u natrijum-fosfatnom puferu (30 mM NaPO4, 0,75M arginin/HCl, pH6,0). Proizvod je bio čist i ispravno sklopljen.
[0076] Komparativna antitela A1 odnosno A2 su napravljena na isti način kao antitela B odnosno C, pri čemu je redosled domena antitela A1 odnosno A2, bio obrnut u poređenju sa njihovim redosledom kod antitela B odnosno C.
[0077] Testovi citotoksičnosti su izvedeni suštinski kao što je opisano kod T. Dreier et al. (2002, Int J Cancer 100, 690-697). PMBC koji su korišćeni kao efektorske ćelije, izolovani su iz periferne krvi zdravih dobrovoljaca centrifugiranjem u gradijentu gustine. U nekim slučajevima, PBMC su kultivisani preko noći u 25 U/mL humanog IL-2 pre nego što su upotrebljeni kao efektorske ćelije u testu citotoksičnosti. Čistoća i ekspresija antigena izolovanih PBMC proverena je protočnom citometrijom u svakom slučaju (podaci nisu prikazani).
[0078] Ciljne ćelije CD19<+>JOK-1 ili Raji kultivisane su u medijumu RPMI 1640 obogaćenom sa 10% FCS, 2 mM L-glutamina i 100 IU/mL penicilin G natrijuma i 100 µg/mL streptomicin sulfata (u ovom tekstu označen kao RPMI medijum; sve komponente su nabavljene od kompanije Invitrogen). Za test citotoksičnosti ćelije su obeležene sa 10 µM kalceina AM (Molecular Probes/Invitrogen) tokom 30 minuta u medijumu RPMI bez FCS na 37°C. Posle blagog pranja, obeležene ćelije su resuspendovane u medijumu RPMI do gustine od 1x10<5>/mL. Zatim je zasejano 1x104 ciljnih ćelija zajedno sa 5x10<5>PBMC sa naznačenim antitelima u pojedinačne bunarčiće mikroploče sa 96 bunarčića okruglog dna u ukupnoj zapremini od 200 µL/bunarčiću. Posle centrifugiranja tokom 2 minuta na 200 g, test je inkubiran 4 časa na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2. U bunarčiće koji sadrže samo ciljne ćelije, 15 minuta pre kraja inkubacije dodato je 20 µL 10% Triton X-100 u medijumu RPMI. U sve druge bunarčiće dodato je 20 µL medijuma RPMI. Posle dodatnog centrifugiranja tokom 5 minuta na 500 g, iz svakog bunarčića je sakupljeno 100 µL supernatanta ćelijske kulture, i fluorescencija oslobođenog kalceina je merena na 520 nm upotrebom fluorescentnog čitača ploča (Victor 3, Perkin Elmer). Na osnovu izmerenih impulsa, specifična ćelijska liza je izračunata prema sledećoj formuli:
[fluorescencija (uzorak) – fluorescencija (spontana)] / [fluorescencija (maksimum) -fluorescencija (spontana)] x 100%. Fluorescencija (spontana) predstavlja fluorescentne impulse iz ciljnih ćelija u odsustvu efektorskih ćelija i antitela, a fluorescencija (maksimum) predstavlja ukupnu lizu ćelija indukovanu dodatkom Triton X-100. Sigmoidne krive doza-odgovor i vrednosti EC50su izračunate upotrebom kompjuterskog programa Prism (GraphPad Software).
Rezultati:
[0079] Rezultati ispitivanja citotoksičnosti za tandemska di-antitela koja imaju sledeći redosled domena počevši od N-terminusa VHA-VLB-VHB-VLA (antitelo A) odnosno VLA-VHB-VLB-VHA (antitelo B), upotrebom varijante M39 antitela protiv CD19 i varijante C4 antitela protiv CD3 prikazani su na slici 3.
[0080] Iznenađujuće, postojala je veoma velika razlika u citotoksičnoj aktivnosti dva tandemska di-antitela. Tandemsko di-antitelo koje ima raspored domena prema pronalasku označeno kao „antitelo B“ bilo je više od 60x aktivnije od tandemskog di-antitela označenog kao „antitelo B“ određeno na osnovu poređenja njihovih EC50vrednosti pod datim uslovima.
Superiornost rasporeda domena predstavljenog predmetnim pronalaskom (antitelo C) u smislu bolje citotoksičnosti potvrđena je upotrebom dve dodatne varijante anti CD19 i anti CD3 antitela (videti sliku 4).
[0081] Vrednost EC50tandemskog di-antitela sa redosledom domena prema pronalasku predstavljenim opcijom 2 je izuzetno niska (0.1 pM). To je 27x veća aktivnost nego kod TandAb predstavljenog opcijom 0 na osnovu poređenja vrednosti EC50pod datim uslovima.
Claims (12)
1. Dimerni antigen-vezujući molekul koji se sastoji od prvog i drugog polipeptidnog lanca, gde svaki od prvog i drugog polipeptidnog lanca sadrži
- prvi domen VLA koji predstavlja varijabilni domen lakog lanca specifičan za prvi antigen A;
- drugi domen VHB koji predstavlja varijabilni domen teškog lanca specifičan za drugi antigen B;
- treći domen VLB koji predstavlja varijabilni domen lakog lanca specifičan za drugi antigen B; i
- četvrti domen VHA koji predstavlja varijabilni domen teškog lanca specifičan za prvi antigen A,
naznačen time, što
- VLA je vezan za VHB prvim linkerom L1, VHB je vezan za VLB drugim linkerom L2 i VLB je vezan za VHA trećim linkerom L3;
- prvi domen VLA i četvrti domen VHA su specifični za CD3;
- drugi domen VHB i treći domen VLB su specifični za tumorsku ćeliju;
- navedeni linkeri L1, L2 i L3 se sastoje od 4 do 12 aminokiselinskih rezidua;
- navedeni domeni su raspoređeni u svakom od navedenog prvog i drugog polipeptidnog lanca redosledom VLA-VHB-VLB-VHA od N-terminusa ka C-terminusu navedenih polipeptidnih lanaca, i
- prvi domen VLA prvog polipeptidnog lanca je povezan sa četvrtim domenom VHA drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto specifično za CD3;
- drugi domen VHB prvog polipeptidnog lanca je povezan sa trećim domenom VLB drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto specifično za tumorsku ćeliju;
- treći domen VLB prvog polipeptidnog lanca je povezan sa drugim domenom VHB drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto specifično za tumorsku ćeliju;
- četvrti domen VHA prvog polipeptidnog lanca je povezan sa prvim domenom VLA drugog polipeptidnog lanca da bi se obrazovalo antigen-vezujuće mesto specifično za CD3.
2. Antigen-vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što su prvi i drugi polipeptidni lanac nekovalentno povezani.
3. Antigen-vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što su domeni humani domeni ili humanizovani domeni.
4. Antigen-vezujući molekul prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time, što navedeni antigen-vezujući molekul sadrži najmanje jednu dodatnu funkcionalnu jedinicu.
5. Antigen-vezujući molekul prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time, što je specifičnost za tumorsku ćeliju tumorski antigen ili antigen ćelijske površine na tumorskoj ćeliji.
6. Antigen-vezujući molekul prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time, što je antigen-vezujući molekul specifičan za CD3 i CD19.
7. Molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptidni lanac dimernog antigen-vezujućeg molekula prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6.
8. Kompozicija koja sadrži antigen-vezujući molekul prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
9. Antigen-vezujući molekul prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu kao lek.
10. Antigen-vezujući molekul prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu u lečenju kancera.
11. Antigen-vezujući molekul prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u lečenju maligniteta B-ćelija.
12. Antigen-vezujući molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačen time, što je malignitet B-ćelija izabran iz grupe koja se sastoji od limfoblastne leukemije i non-Hodgkinovog limfoma.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30820510P | 2010-02-25 | 2010-02-25 | |
| EP10154751.1A EP2361936B1 (en) | 2010-02-25 | 2010-02-25 | Antigen-binding molecule and uses thereof |
| EP11156113.0A EP2371866B1 (en) | 2010-02-25 | 2011-02-25 | Multivalent antigen-binding Fv molecule |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS58352B1 true RS58352B1 (sr) | 2019-03-29 |
Family
ID=42232726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20190201A RS58352B1 (sr) | 2010-02-25 | 2011-02-25 | Multivalentni antigen-vezujući fv molekul |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP2361936B1 (sr) |
| DK (1) | DK2371866T3 (sr) |
| ES (2) | ES2582001T3 (sr) |
| HR (1) | HRP20190288T1 (sr) |
| HU (1) | HUE041615T2 (sr) |
| LT (2) | LT2361936T (sr) |
| PL (2) | PL2361936T3 (sr) |
| PT (2) | PT2361936T (sr) |
| RS (1) | RS58352B1 (sr) |
| SI (1) | SI2371866T1 (sr) |
| SM (1) | SMT201900115T1 (sr) |
| TR (1) | TR201902400T4 (sr) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5938473B2 (ja) * | 2011-07-22 | 2016-06-22 | アフィメート テラポイティクス アーゲー | 多価抗原結合Ｆｖ分子 |
| US20160122436A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-05-05 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Single chain binding molecules comprising n-terminal abp |
| NZ726514A (en) | 2014-05-29 | 2019-01-25 | Macrogenics Inc | Tri-specific binding molecules and methods of use thereof |
| RU2016151645A (ru) | 2014-07-01 | 2018-08-03 | Пфайзер Инк. | Биспецифические гетеродимерные диантитела и их применение |
| EP3212232A4 (en) * | 2014-10-31 | 2019-01-23 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | TETRAVALENT TLR9 BISPECIFIC ANTIBODIES |
| TWI688572B (zh) | 2015-01-26 | 2020-03-21 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 包含dr5-結合結構域的多價分子 |
| HUE051661T2 (hu) | 2015-05-18 | 2021-03-29 | Tcr2 Therapeutics Inc | Készítmények és gyógyászati felhasználások a TCR újraprogramozására fúziós fehérjék felhasználásával |
| TWI773646B (zh) | 2015-06-08 | 2022-08-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 結合lag-3的分子和其使用方法 |
| MA58293B1 (fr) | 2015-07-30 | 2024-11-29 | Macrogenics, Inc. | Molécules de liaison pd-1 et leurs procédés d'utilisation |
| CN108367069B (zh) | 2015-12-14 | 2022-08-23 | 宏观基因有限公司 | 对于pd-1和ctla-4具有免疫反应性的双特异性分子及其使用方法 |
| UY37127A (es) | 2016-02-17 | 2017-08-31 | Macrogenics Inc | Moléculas de unión a ror1, y métodos de uso de las mismas |
| PE20190353A1 (es) | 2016-04-15 | 2019-03-07 | Macrogenics Inc | Moleculas de union b7-h3 novedosas, conjugados anticuerpo-farmaco de los mismos y metodos de uso de los mismos |
| JP7109789B2 (ja) | 2016-08-02 | 2022-08-01 | ティーシーアール２ セラピューティクス インク． | 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法 |
| WO2018067993A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins |
| AU2017363311A1 (en) | 2016-11-22 | 2019-06-13 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins |
| AR110424A1 (es) | 2016-12-23 | 2019-03-27 | Macrogenics Inc | Moléculas de unión a adam9 y métodos de uso de las mismas |
| JP2020510657A (ja) * | 2017-02-28 | 2020-04-09 | アッフィメッド・ゲー・エム・ベー・ハーＡｆｆｉｍｅｄ Ｇｍｂｈ | 抗ｃｄ１６ａ抗体のサイトカインとの組み合わせ |
| CN110382539B (zh) * | 2017-02-28 | 2023-08-08 | 阿菲姆德股份有限公司 | 用于cd16a定向的nk细胞结合的串联双抗体 |
| CA3085432A1 (en) | 2017-12-12 | 2019-06-20 | Macrogenics Inc. | Bispecific cd16-binding molecules and their use in the treatment of disease |
| JP7337079B2 (ja) | 2018-02-15 | 2023-09-01 | マクロジェニクス，インコーポレーテッド | 変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用 |
| KR20200143436A (ko) * | 2018-04-13 | 2020-12-23 | 아피메트 게엠베하 | Nk 세포 결합 항체 융합 구조체 |
| TWI905099B (zh) | 2019-05-21 | 2025-11-21 | 瑞士商諾華公司 | Cd19 結合分子及其用途 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3720353B2 (ja) | 1992-12-04 | 2005-11-24 | メディカル リサーチ カウンシル | 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用 |
| DE19819846B4 (de) | 1998-05-05 | 2016-11-24 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Multivalente Antikörper-Konstrukte |
| DE10060140A1 (de) * | 2000-12-04 | 2002-06-06 | Vectron Therapeutics Ag Imt | Multimerer mehrfach-antigenbindender einzelkettiger Antikörper |
| AU2003227504A1 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD OF CONSTRUCTING scDb LIBRARY |
| EP1400534B1 (en) | 2002-09-10 | 2015-10-28 | Affimed GmbH | Human CD3-specific antibody with immunosuppressive properties |
| GB0510790D0 (en) | 2005-05-26 | 2005-06-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Anti-CD16 binding molecules |
-
2010
- 2010-02-25 LT LTEP10154751.1T patent/LT2361936T/lt unknown
- 2010-02-25 ES ES10154751.1T patent/ES2582001T3/es active Active
- 2010-02-25 PT PT101547511T patent/PT2361936T/pt unknown
- 2010-02-25 PL PL10154751.1T patent/PL2361936T3/pl unknown
- 2010-02-25 EP EP10154751.1A patent/EP2361936B1/en active Active
-
2011
- 2011-02-25 DK DK11156113.0T patent/DK2371866T3/en active
- 2011-02-25 PT PT11156113T patent/PT2371866T/pt unknown
- 2011-02-25 PL PL11156113T patent/PL2371866T3/pl unknown
- 2011-02-25 LT LTEP11156113.0T patent/LT2371866T/lt unknown
- 2011-02-25 TR TR2019/02400T patent/TR201902400T4/tr unknown
- 2011-02-25 ES ES11156113T patent/ES2711377T3/es active Active
- 2011-02-25 RS RS20190201A patent/RS58352B1/sr unknown
- 2011-02-25 EP EP11156113.0A patent/EP2371866B1/en active Active
- 2011-02-25 SI SI201131675T patent/SI2371866T1/sl unknown
- 2011-02-25 HU HUE11156113A patent/HUE041615T2/hu unknown
- 2011-02-25 SM SM20190115T patent/SMT201900115T1/it unknown
-
2019
- 2019-02-13 HR HRP20190288TT patent/HRP20190288T1/hr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2371866A2 (en) | 2011-10-05 |
| DK2371866T3 (en) | 2019-03-18 |
| LT2361936T (lt) | 2016-09-12 |
| SI2371866T1 (sl) | 2019-04-30 |
| PT2361936T (pt) | 2016-07-15 |
| HUE041615T2 (hu) | 2019-05-28 |
| LT2371866T (lt) | 2019-03-12 |
| TR201902400T4 (tr) | 2019-03-21 |
| ES2582001T3 (es) | 2016-09-08 |
| EP2371866B1 (en) | 2018-11-21 |
| HRP20190288T1 (hr) | 2019-04-05 |
| EP2361936A1 (en) | 2011-08-31 |
| ES2711377T3 (es) | 2019-05-03 |
| EP2361936B1 (en) | 2016-04-20 |
| PL2361936T3 (pl) | 2016-10-31 |
| SMT201900115T1 (it) | 2019-02-28 |
| PL2371866T3 (pl) | 2019-05-31 |
| PT2371866T (pt) | 2019-02-27 |
| EP2371866A3 (en) | 2013-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2371866B1 (en) | Multivalent antigen-binding Fv molecule | |
| JP5938473B2 (ja) | 多価抗原結合Ｆｖ分子 | |
| US20180346590A1 (en) | Antigen-binding molecule and uses thereof | |
| TWI830761B (zh) | 針對cldn18.2和cd3之抗體構建體 | |
| JP2024174865A (ja) | ヘテロ二量体四価特異性抗体およびこれらの使用 | |
| US10066015B2 (en) | CD3 binding domains | |
| US20220002398A1 (en) | ANTI-oxMIF/ANTI-CD3 ANTIBODY FOR CANCER TREATMENT | |
| JP7466442B2 (ja) | 抗原結合分子および組合せ | |
| JP2023504620A (ja) | 抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３二重特異性抗体構築物 | |
| JP2022547718A (ja) | 抗ｃｄ３７１抗体およびその使用 | |
| TW202241967A (zh) | 基於茚地那韋的化學二聚化ｔ細胞銜接器組成物 | |
| CN114539420B (zh) | 抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3×cd3双特异性抗体、制备方法及其应用 | |
| WO2023086897A1 (en) | Siglec-6 antibodies, derivative compounds and related uses | |
| CA3211935A1 (en) | Anti-vaccinia virus antigen antibodies and related compositions and methods | |
| CN120530135A (zh) | 抗b7h3抗体和使用方法 | |
| CN117836321A (zh) | 抗牛痘病毒抗原抗体以及相关组合物和方法 | |
| JP2023547662A (ja) | Ｃｌｄｎ６及びｃｄ３に選択的に結合するポリペプチド構築物 | |
| HK1240236A1 (en) | Cd3 binding domain |