RS58518B1

RS58518B1 - Vezujući proteini, uključujući antitela, derivate antitela i fragmente antitela, koji specifično vezuju cd154 i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS58518B1
Application number: RS20190252A
Authority: RS
Inventors: Linda C Burkly; Janine L Ferrant-Orgettas; Ellen A Garber; Yen-Ming Hsu; Lihe Su; Frederick R Taylor; Ralph Adams; Derek Thomas Brown; Andrew George Popplewell; Martyn Kim Robinson; Anthony Shock; Kerry Louise Tyson
Original assignee: Biogen Ma Inc; Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2019-04-30
Also published as: JP6053744B2; CR11030A; CO6231038A2; SG196697A1; BRPI0809042A2; EA200970879A1; NZ580245A; DK2125894T3; ECSP099683A; JP2010521967A; US20130045219A1; JP5721951B2; US8784823B2; EP2125894B1; SI2125894T1; CA2681530C; LT2125894T; US8293237B2; HUE041818T2; MX2009010120A

Description

Opis

Tehnička oblast pronalaska

[0001] Ovo otkriće generalno obezbeđuje vezujuće proteine, uključujući antitela, derivate antitela i fragmente antitela, koji specifično vezuju CD154 (CD40L) protein. Naročito, pronalazak se odnosi na anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment, koji sadrži: (a) sekvencu VH domena prema SEQ ID NO: 1 na Slici 5; i (b) sekvencu VL domena prema SEQ ID NO: 2 na Slici 6. Takođe je otkriveno himerno, humanizovano ili potpuno humano antitelo, derivat antitela ili fragment antitela koji specifično vezuje epitop za koje se specifično vezuje humanizovani Fab fragment koji sadrži sekvencu varijabilnog teškog lanca prema SEQ ID NO: 1 i koji sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca prema SEQ ID NO: 2. CD154 vezujući proteini prema ovom otkriću mogu izazvati smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na drugo anti-CD154 antitelo. CD154 vezujući proteini prema ovom pronalasku su korisni u dijagnostičkim i terapeutskim postupcima, kao što je u lečenju i prevenciji bolesti uključujući one koje uključuju neželjene imunske odgovore koji su posredovani sa CD154-CD40 interakcijama.

Osnova pronalaska

[0002] Stvaranje humoralnog i ćelijski posredovanog imuniteta je orkestrirano interakcijom aktiviranih pomoćnih T ćelija sa antigen-prikazujućim ćelijama ("APCs") i efektornim T ćelijama. Aktivacija pomoćnih T ćelija nije zavisna samo od interakcije antigen-specifičnog T-ćelijskog receptora ("TCR") sa njegovim srodnim peptid-MHC ligandom, već takođe zahteva koordinisano vezivanje i aktivaciju od strane brojnih molekula za ćelijsku adheziju i kostimulaciju. Videti, npr. Salazar-Fontana, L. I., i B. E. Bierer (2001) Curr. Opin. Hemat.

8:5.

[0003] Jedan kritični kostimulatorni molekul je CD154, transmembranski protein Tipa II koji je eksprimiran na površini CD4+ T ćelija na zavisan od aktivacije i vremenski ograničen način. CD154 je takođe eksprimiran, nakon aktivacije, na subsetu CD8+ T ćelija, bazofilima, mast ćelijama, eozinofilima, ćelijama prirodnim ubicama, B ćelijama, makrofagama, dendritskim ćelijama i trombocitima. CD154 suprotni-receptor, CD40, je membranski protein Tipa I koji je konstitutivno i široko eksprimiran na površini mnogih ćelijskih tipova, ukljućujući APCs. Videti, npr., Foy, T. M. et al. (1996) Ann. Rev. Immunol.14:591.

[0004] Signalizacija preko CD40 sa CD154 inicijalizuje kaskadu događaja koji rezultuju u aktivaciji ćelija koje nose CD40 receptori optimalnom prajmingu CD4+ T ćelije. Specifičnije, vezivanje CD154 sa CD40 promoviše diferencijaciju B ćelija u ćelije koje izlučuju antitela i memorijske B ćelije. Videti, npr., Burkly, L. C. (2001) In Adv. Exp. Med. Bio., Vol.489. D. M. Monroe et al. eds. Kluwer Academic/Plenum Publishers, p. 135 (ovde "Burkly, supra"). Dodatno, CD154-CD40 interakcija promoviše ćelijski posredovan imunitet preko aktivacije makrofaga i denditskih ćelija i stvaranja ćelija prirodnih ubica i citotoksičnih T limfocita. Videti, npr., Burkly, ibid.

[0005] Centralna uloga CD154 u regulisanju funkcije i humoralnog i ćelijski posredovanog imunog odgovora izazvala je veliko interesovanje za upotrebu inhibitora ovog puta za terapeutsku imunomodulaciju. Kao takva, pokazano je da su anti-CD154 antitela korisna u mnogim modelima imunog odgovora na druge terapeutske proteine ili gensku terapiju, alergene, autoimunitet i transplantaciju. Videti, npr., US 5,474,771; Burkly, supra.

[0006] Pokazano je da je CD40-CD154 interakcija važna u nekoliko eksperimentalno indukovanih autoimunih bolesti gde je pokazano da indukcija bolesti može biti blokirana sa CD154 antagonistima u vreme primene antigena (Burkly, supra). Blokada bolesti korišćenjem anti-CD154 antagonista je takođe uočena u životinjskim modelima spontane autoimune bolesti. Videti, npr., Burkly, supra.

[0007] Trenutno postoji potreba za poboljšanim anti-CD154 antitelima sa većim afinitetima vezivanja i manjim neželjenim sporednim efektima. Povećane "efektorne funkcije" kao što je direktna citotoksičnost, komplement-zavisna citotoksičnost ("CDC"), antitelo-zavisna citotoksičnost ("ADCC") i abnormalna proizvodnja antitela, su neželjeni sporedni efekti koji se mogu povezati sa terapeutskim antitelima.

[0008] Nekoliko efektornih funkcija antitela je posredovano najmanje delimično sa Fc receptorima (FcRs), koji vezuju Fc region antitela u konstantnom domenu tipičnog imunoglobulina. Postoji više Fc receptora koji su specifični za različite klase imunoglobulina. Klase imunoglobulina uključuju IgG, IgE, IgA, IgM, i IgD. Klase imunoglobulina su dalje podeljene u potklase: IgG je podeljen u četiti potklase (IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4) i IgA je podeljen na dva potklase (IgAl i IgA2). Postoje tri poznata receptora za IgG: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), i FcyRIII (CD 16)). Svaka FcyR potklasa je kodirana sa dva ili tri gena, i alternativni splajsing RNK dovodi do višestrukih transkripata i velike raznovrsnosti FcyR izoformi.

[0009] Tipično, imunoglobulini su molekuli Y-oblika koji sadrže dva identična teška lanca i dva identična laka lanca. Disulfidne veze međusobno povezuju parove teškog i lakog lanca kao i dva teška lanca. Svaki lanac se sastoji od jednog varijabilnog domena čija sekvenca varira i odgovorna je za vezivanje antigena; ovi domeni su poznati kao VH i VL domeni za teške i lake lance, respektivno. U lakom lancu postoji jedan konstantni domen (CL) i u teškom lancu postoje tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Molekuli koji sadrže sve varijabilne i konstantne domene mogu se označiti kao cela antitela.

[0010] Ostaci u varijabilnim domenima antitela su konvencionalno numerisani u skladu sa sistemom napravljenim od strane Kabat et al. Ovaj sistem je dat u Kabat et al., 1987, u Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health i Human Services, NIH, USA (nadalje "Kabat et al., supra"). Ovaj sistem numerisanja je korišćen u predmetnoj specifikaciji osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Treba napomenuti da označavanje Kabat ostataka ne odgovara uvek direktno linearnom numerisanju aminokiselinskih ostataka. Stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline u odnosu na striktno Kabat numerisanje koje odgovara skraćenju, ili inserciji u, strukturnu komponentu, bilo da je okvirni ili region koji određuje komplementarnost (CDR), osnovne strukture varijabilnog domena. Ispravno Kabat numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnanjem homologih ostataka u sekvenci antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom.

[0011] Postoje tri regiona unutar varijabilnih domena sa hipervarijabilnom sekvencom smešteni unutar još četiri visoko konzervativna okvirna regiona. Ovi hipervarijabilni CDRs su primarno odgovorni za prepoznavanje antigena. CDRs varijabilnog domena teškog lanca su smešteni na ostacima 31-35 (CDR-H1), ostacima 50-65 (CDR-H2) i ostacima 95-102 (CDR-H3) prema Kabat sistemu numerisanja. Međutim, prema Chothia (Chothia, C. i Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 1987, 196:901-917), ekvivalent petlje CDR-H1 prostire se od ostataka 26 do ostataka 32. Stoga ’CDR-H1’, kao što je ovde korišćeno, takođe uključuje CDR lociran na ostacima 26 do 35, kao što je opisano kombinacijom Kabat sistema numerisanja i Chothia definicije topološke petlje. CDRs varijabilnog domena lakog lanca su locirani na ostacima 24-34 (CDR-L1), ostacima 50-56 (CDR-L2) i ostacima 89-97 (CDR-L3) prema Kabat sistemu numerisanja.

[0012] Iako su prirodna antitela, kao cela antitela ili fragmenti koji zadržavaju specifične vezujuće osobine, originalno izvedena iz jedne vrste, antitela dobijena inženjeringom mogu biti izvedena iz više od jedne vrste životinja, npr., himerna antitela. Do danas, mišja/humana himerna i antitela mišja/ne-humanog primata su uglavnom stvorena, iako su moguće druge kombinacije hibridnih vrsta. Sada su poznate mnoge različite konfiguracije prirodnih i polipeptida antitela dobijenih inženjeringom, i njihovi derivati i fragmenti. Osobina zajednička za sve je da polipeptid ili polipeptidi zadržavaju antigen-vezujuću specifičnost preko jednog ili više epitop-vezujućih domena. Osim vezivanja epitopa, funkcionalne osobine polipeptida antitela mogu se razlikovati u odnosu na to koje su druge sekvence prisutne, npr., Fc domeni ili druge sekvence koje aktiviraju efektorne funkcije i/ili interaguju sa drugim ćelijskim putevima.

[0013] CD154 vezujući proteini koji sadrže epitop-vezujuće domene (kao što su CDRs ili varijabilni domeni) inkorporisane u ne-imunoglobulin potporni ili okvirni deo (videti, na primer, Binz et al.2005 Nat Biotech 23: 1257-1268; Hosse et al.2006 Protein Science 15: 14-27) mogu pokazivati smanjene efektorne funkcije. Anti-CD154 antitela su otkrivena u WO 01/68860 i WO2005/011376. Bilo bi poželjno imati nove vezujuće proteine koji specifično antagonizuju CD154 vezivanje sa CD40 i smanjuju ili eliminišu nishodne funkcije CD154-CD40 kompleksa. Takođe bi bilo poželjno imati CD154 vezujuće proteine, kao što su anti-CD 154 antitela, sa smanjenim efektornim funkcijama u poređenju sa poznatim anti-CD 154 antitelima.

Rezime pronalaska

[0014] Predmetno otkriće obezbeđuje rešenje ovih i drugih problema obezbeđivanjem vezujućeg proteina, kao što je izolovano, rekombinantno ili sintetičko antitelo, ili njegov fragment ili derivat, koji se specifično vezuje sa CD154 proteinom, koji može biti humani CD154 protein. Anti-CD154 antitela prema pronalasku, uključujući njihove fragmente i derivate, mogu biti monoklonska, poliklonska, mišja, himerna, primatizovana, humanizovana ili potpuno humana antitela. Anti-CD154 antitela prema pronalasku mogu biti multimerna, heterodimerna, hemidimerna, monovalentna, bivalentna, tetravalentna, bispecifična i mogu uključivati jednolančana antitela; i njihove derivate.

[0015] Predmetni pronalazak je usmeren na sledeće stavke:

[1] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment, koji sadrži:

(a) Sekvencu VH domena prema SEQ ID NO: 1 na Slici 5; i

(b) Sekvencu VL domena prema SEQ ID NO: 2 na Slici 6.

[2] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavci [1], koji sadrži: (a) Sekvencu teškog lanca izabranu od SEQ ID NO: 12 sa Slike 7, SEQ ID NO: 13 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 72 sa Slike 16; i

(b) Sekvencu lakog lanca izabranu od SEQ ID NO: 15 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 69 sa Slike 15.

[3] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavci [2], koji sadrži sekvence teškog i lakog lanca izabrane od:

(a) SEQ ID NO: 12 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 15 sa Slike 7, respektivno;

(b) SEQ ID NO: 13 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 15 sa Slike 7, respektivno; i

(c) SEQ ID NO: 72 sa Slike 16 i SEQ ID NO: 69 sa Slike 15, respektivno.

[4] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavci [3], koji sadrži sekvence teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 13 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 15 sa Slike 7, respektivno.

[5] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavkama [1]-[4], naznačeno time da:

(a) Anti-CD 154 antitelo je anti-CD 154 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od multimernog antitela, heterodimernog antitela, hemidimernog antitela, tetravalentnog antitela, bispecifičnog antitela, jednolančanog antitela, i njihovih derivata; ili (b) anti-CD 154 antitelo je antigen-vezujući fragment anti-CD 154 antitela, i pomenuti antigen-vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, F(ab)2, Fab’, F(ab’)2, F(ab’)3, Fd, i Fv;

[6] Anti-CD 154 vezujuće antitelo prema stavci [5], naznačeno time da pomenuto anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment je modifikovan sa kovalentnim vezivanjem poli(etilenglikola) ili njegovog derivata.

[7] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavci [6], naznačeno time da CD 154 antitelo je Fab’ fragment naznačeno time da tiol grupa u modifikovanom regionu zgloba je kovalentno vezana sa maleimid grupom koja je kovalentno vezana za lizinski ostatak, naznačeno time da metoksipoli(etilenglikol) polimer sa molekulskom težinom od približno 20,000 Da je vezan za svaku od amin grupa lizina.

[8] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavci [1], naznačeno time da:

(a) antitelo ili njegov fragment nema imunoglobulinski Fc region; ili

(b) antitelo ili njegov fragment sadrži imunoglobulinski Fc region izabran od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 Fc regiona, ili je izveden iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc regiona.

[9] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema stavci [1], naznačeno time da antitelo ili njegov fragment dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja je hibrid Fc regiona koji sadrži sekvence iz više od jednog tipa Ig Fc domena.

[10] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[9], naznačeno time da antitelo ili njegov fragment nije glikozilovano.

[11] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[10], naznačeno time da je antitelo ili njegov fragment povezan sa funkcionalnim delom izabranim od blokirajuće grupe, detektabilne grupe, terapeutskog dela ili njihove kombinacije.

[12] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[11], naznačeno time da fragment je fuzija Fab, Fab’, Fd, Fv, scFv, scFab, ili scFab bez cisteina.

[13] Molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[12].

[14] Molekul nukleinske kiseline prema stavki [13], naznačeno time da molekul nukleinske kiseline je DNK molekul koji kodira anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment, DNK molekul koji sadrži sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17 sa Slike 6, SEQ ID NO: 18 sa Slike 6, SEQ ID NO: 22 sa Slike 5, SEQ ID NO: 23 sa Slike 7, SEQ ID NO: 24 sa Slike 7, SEQ ID NO: 25 sa Slike 6, SEQ ID NO: 26 sa Slike 7, SEQ ID NO: 27 sa Slike 7, SEQ ID NO: 28 sa Slike 8, SEQ ID NO: 41 sa Slike 8, SEQ ID NO: 70 sa Slike 15 i SEQ ID NO: 73 sa Slike 16.

[15] Vektor koji sadrži molekul nukelinske kiseline prema stavki 13 ili DNK molekul prema stavki [14].

[16] Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema stavki [15].

[17] Postupak za proizvodnju anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta, naznačeno time da pomenuti postupak sadrži korake:

(a) kultivacije ćelije domaćina prema stavki [16] pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta, od strane ćelije domaćina; i (b) rekuperacije anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta.

[18] Postupak prema stavki [17], naznačeno time da je ćelija domaćin prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija.

[19] Kompozicija koja sadrži anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[12] i pogodan farmaceutski nosač.

[20] Kompozicija prema stavki [19], naznačeno time da pomenuta kompozicija dodatno sadrži dodatno imunosupresivno ili imunomodulatorno jedinjenje ili sredstvo.

[21] Upotreba anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta prema bilo kojoj od stavki [1]-[12] ili kompozicije prema stavki [19] ili [20] za pripremu medikamenta za tretiranje ili prevenciju humanog stanja, poremećaja ili bolesti posredovane u celosti ili delimično sa CD40 signalizacijom ili simptom bilo čega prethodnog, naznačeno time da pomenuto stanje, poremećaj ili bolest je poželjno inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza.

[22] Upotreba prema stavki [21], naznačeno time da inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza je izabrana od reumatoidnog artritisa, sistemskog eritemskog lupusa, spondilartritisa, inflamatorne bolesti, Crohn bolesti, psorijaze, skleroderme, lupus nefritisa, idiopatske trombocitopenije purpure, vaskularne bolesti i multiple skleroze.

[23] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[12] ili kompozicija prema stvaki [19] ili [20] za upotrebu u tretiranju ili prevenciji humanog stanja, poremećaja ili bolesti posredovane u celosti ili delimično sa CD40 signalizacijom ili simptom bilo čega od prethodnog, naznačeno time da pomenuto stanje, poremećaj ili bolest je poželjno inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza.

[24] Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki [1]-[12] ili kompozicija prema stavki [19] ili [20] za upotrebu u tretiranju ili prevenciji inflamatornog ili autoimunog odgovora ili fibroze prema stavki [23], naznačeno time da inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza je izabrana od reumatoidnog artritisa, sistemskog eritemskog lupusa, spondilartritisa, inflamatorne bolesti, Crohn bolesti, psorijaze, skleroderme, lupus nefritisa, idiopatske trombocitopenije purpure, vaskularne bolesti i multiple skleroze.

[0016] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini, npr., anti-CD 154 antitela, prema predmetnom otkriću imaju visoku selektivnost za CD 154 i, u nekim primerima izvođenja, takođe imaju jednu ili više smanjenih efektorskih funkcija u poređenju sa, na primer, anti-CD 154 antitelom 5c8 (proizvedenim od strane hibridoma deponovanim pod ATCC pristupnim brojem. HB 10916, kao što je opisano u US 5,474,771; ili humanizovanim 5c8). Određeni od CD154 vezujućih proteina, npr., anti-CD154 antitela, otkirća su monovalentni u odnosu na vezivanje CD154.

[0017] CD154 vezujući proteini i anti-CD 154 antitela (uključujući fragment antitela i derivate) prema otkriću korisni su za inhibiciju vezivanja CD154 sa CD40 i to rade sa visokom specifičnošću, npr., sa IC50u opsegu od 20 pM do 1.5 mM, uključujući njih. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini, npr., anti-CD 154 antitela, prema otkriću mogu imati IC50u opsegu od 20 pm do 500 pm, 50 pm do 500 pm ili 100 pm do 500 pm. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini i anti-CD 154 antitela (uključujući fragment antitela i derivate) prema otkriću ne agonizuju suštinski CD40 aktivnost.

[0018] Određeni primeri izvođenja prema predmetnom otkriću odnose se na CD154 vezujuće proteine, npr., anti-CD154 antitela, koja pokazuju visok afinitet za humani CD154. Na primer, u određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, npr. anti-CD154 antitelo, disocira sa humanog CD154 (humani CD40L) sa KDu opsegu od 50 nM do 1 pM, uključujući njih, kao što je određeno površinskom plazmon rezonancom (npr., Biacore®). Na primer, KDza humani CD154 može biti 50 pm do 1 pm, 20 pm do 1 pm ili čak 10 pm do 1 pm. U nekim primerima izvođenja, KDza humani CD154 je manja od 20 pM. U drugim primerima izvođenja, KDza humani CD154 je manji od 10 pM.

[0019] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće proizvodi CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, koja kada je prisutno sa ili iznad zasićujućih koncentracija za CD154 vezivanje na osnovu njegovog vezujućeg afiniteta, je sposobno da blokira vezivanje antitela 5c8 sa CD154 kada je prvo dodato CD154, i takođe je sposobno da izmesti antitelo 5c8 vezano za CD154 kada je dodato nakon što je antitelo 5c8 dodato CD154.

[0020] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD154 protein i koje sadrži ili se sastoji od jedne ili više CDR sekvenci teškog lanca (H) izabranih od CDRH1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). U sledećim primerima izvođenja, CD 154 vezujući protein ili natitelo sadrži ili se sastoji od najmanje dva CDRs izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). U sledećim primerima izvođenja vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR H sekvence, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

[0021] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD154 protein i koje sadrži ili se sastoji od jedne ili više CDR sekvenci lakog lanca (L) izabranih od CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). U sledećim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od najmanje dva CDRs izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). U sledećim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR L sekvence, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8).

[0022] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD154 protein i koje sadrži ili se sastoji od CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), i naznačeno time da vezujući protein ili antitelo dodatno sadrži ili se sastoji od CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDRH2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5.)

[0023] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD154 protein, naznačeno time da CD154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od VH sekvence izabrane od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11. U određenim drugim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD 154 protein, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13.

[0024] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD 154 protein, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od VL sekvence izabrane od SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 14. U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD 154 protein, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sekvence lakog lanca SEQ ID NO: 15.

[0025] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr. antitelo, koje specifično vezuje CD 154 protein, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od VL sekvence izabrane od SEQ ID NO: 2, i SEQ ID NO: 14 i VH sekvence izabrane od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11. U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr. antitelo, koje specifično vezuje CD 154 protein, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sekvence lakog lanca SEQ ID NO: 15 i sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sekvence lakog lanca SEQ ID NO: 15 i teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 13.

[0026] U drugim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na vezujući protein, npr. antitelo, koje specifično vezuje CD 154, i sadrži ili se sastoji od jedne ili više CDR sekvenci teškog lanca (H) izabranih od CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). U dodatnim primerima izvođenja, vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od najmanje CDRs izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). U sledećim primerima izvođenja, vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR H sekvence, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44.)

[0027] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr. antitelo, koje specifično vezuje CD154 protein, naznačeno time da vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od jedne ili više CDR sekvenci lakog lanca (L) izabranih od CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). U sledećim primerima izvođenja, vezujući protein ili natitelo sadrži ili se sastoji od najmanje dva CDRs izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). U sledećim primerima izvođenja, vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR L sekvence, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47.)

[0028] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo prema predmetnom otkriću sadrži komplementarnu sekvencu koja sadrži ili se sastoji od jednog ili više CDRs lakog lanca od CDR-L1, CDR-L2 i CDRL3, prethodno, ili komplementarne sekvence koja sadrži ili se sastoji od jednog ili više CDRs teškog lanca od CDR-H1, CDRH2 i CDR-H3, prethodno, respektivno. Stoga, u određenim primerima izvođenja, vezujući protein ili antitelo prema predmetnom otkriću sadrži ili se sastoji od CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) ili CDR-H3 (SEQ ID NO: 44), i CDRL1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) ili CDR-L3 (SEQ ID NO: 47).

[0029] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje CD154 vezujući protein, npr., anti-CD 154 antitelo, naznačeno time da vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sledeće tri CDR L sekvence: CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), i naznačeno time da vezujući protein ili antitelo dodatno sadrži ili se sastoji od sledeće tri CDR H sekvence: CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44.)

[0030] U sledećim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, npr., antitelo, koje specifično vezuje CD154 i koje sadrži ili se sastoji od sekvence varijabilnog lakog lanca (VL) od SEQ ID NO: 54. Otkriće se takođe odnosi na CD154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo koje sadrži ili se sastoji od sekvence varijabilnog teškog lanca (VH) od SEQ ID NO: 56. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo prema otkriću može se sastojati i od VL sekvence SEQ ID NO: 54 i od VH sekvence SEQ ID NO: 56.

[0031] U sledećim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na CD154 vezujući protein, npr., anti-CD 154 antitelo, koje specifično vezuje CD154, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo sadrži ili se sastoji od jedne ili više CDR sekvenci teškog lanca (H) izabranih od CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). U sledećim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo sadrži ili se sastoji od najmanje dva CDRs izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). U sledećim primerima izvođenja, CD 154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR H sekvence, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50.)

[0032] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, koje specifično vezuje CD154 protein, naznačeno time da CD 154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo sadrži ili se sastoji od jedne ili više CDR sekvence lakog lanca (L) izabrane od CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). U sledećim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili anti-CD154 antitelo sadrži ili se sastoji od najmanje dva CDRs izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). U sledećim primerima izvođenja, CD 154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR L sekvence, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53.)

[0033] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, prema predmetnom otkriću sadrži komplementarnu sekvencu koja sadrži ili se sastoji od jednog ili više CDRs lakog lanca od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, prethodno, ili komplementarne sekvence koja sadrži ili se sastoji od jednog ili više CDRs teškog lanca od CDRH1, CDR-H2 i CDR-H3, prethodno, respektivno. Stoga, u određenim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži ili se sastoji od CDR H izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), ili CDR L izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

[0034] U određenim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, naznačeno time da CD154 vezujući protein ili anti-CD154 antitelo sadrži ili se sastoji od sve tri CDR L sekvence, koje su CDRL1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), i naznačeno time da vezujući protein, npr., antitelo, dodatno sadrži ili se sastoji od sve tri CDR H sekvence, koje su: CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

[0035] U sledećim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje CD154 vezujući protein, npr., anti-CD 154 antitelo, koje specifično vezuje CD154, naznačeno time da CD154 vezujući protein ili anti-CD 154 antitelo sadrži ili se sastoji od VL sekvence od SEQ ID NO: 58. U dodatnim primerima izvođenja, antitelo sadrži ili se sastoji od VH sekvence od SEQ ID NO: 60. U sledećim primerima izvođenja, antitelo sadrži ili se sastoji od VH sekvence od SEQ ID NO: 60 i VL sekvence od SEQ ID NO: 58.

[0036] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ovog otkrića sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 62 i sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 65. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein predmetnog otkrića sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 63 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 66.

[0037] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein predmetnog otkrića sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 68 i sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 71. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema predmetnom otkriću sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 69 i sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 72. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein sadrži najmanje jednu od sekvenci prema SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 i SEQ ID NO: 72.

[0038] CDR sekvence od SEQ ID NOS: 3-8 su izivedene iz monoklonskog antitela 342 pacova. U alternativnom primeru izvođenja otkrića, anti-CD154 antitelo je 342 antitelo pacova koje sadrži sekvencu VH domena od SEQ ID NO: 29 i sekvencu VL domena od SEQ ID NO: 30. Otkriće takođe obezbeđuje izolovani, rekombinantni ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane od SEQ ID NO: 31 i SEQ ID NO: 32. Dodatno je obezbeđen vektor koji sadrži najmanje jednu sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.

[0039] Otkriće takođe obezbeđuje CD154 vezujuće proteine, npr., anti-CD154 antitela, koja se selektivno vezuju za isti epitop kao i bilo koje od anti-CD154 antitela otkrivenih ovde (npr., 342, 381 i 338 antitela i njihova epitop vezujuća sekvenca). Naročito, antitela 342 i 338 prema predmetnom otkriću pokazuju slične CD 154 vezujuće osobine kada se koriste kao prva ili druga antitela u kompetitivnim analizama sa anti-CD 154 antitelom 5c8, kao što je ovde opisano.

[0040] Stoga, u određenim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje CD154 vezujuće proteine i anti-CD 154 antitela koja se vezuju za isti epitop kao i humanizovano antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO. 12 ili SEQ ID NO. 13 i sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO.15 (342 Fab i Fab’ fragmenti), i koje pokazuje slične CD154 vezujuće osobine kada se koriste kao prva ili druga antitela u kompetitivnim analizama sa anti-CD154 antitelom 5c8, kao što je ove opisano. U drugim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje CD 154 vezujuće proteine i anti-CD 154 antitela koja se vezuju za isti epitop kao što se vezuje humanizovano antitelo koje sadrži sekvencu VL domena prema SEQ ID NO. 58 i sekvencu VH domena prema SEQ ID NO. 60 (varijabilne sekvence 338 antitela), i koje prikazuju slične CD154 vezujuće osobine u kompetitivnim analizama sa anti-CD 154 antitelom 5c8, kao što je ovde opisano.

[0041] U bilo kom od prethodno opisanih primera izvođenja koji se odnose na CD154 vezujući protein otkrića, vezujući protein može biti PEGilovan. U primerima izvođenja u kojima CD154 vezujući protein je anti-CD 154 antitelo, polipeptid antitela ili njegov fragment ili derivat, antitelo može biti PEGilovano na teškom lancu, lakom lancu, ili na oba lanca.

[0042] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje izolovani, rekombinantni i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 25.

[0043] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće takođe obezbeđuje izolovani, rekombinantni i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane od SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 i SEQ ID NO: 73.

[0044] U drugim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje izolovani, rekombinantni i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane od SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 41.

[0045] Ovo otkriće takođe obezbeđuje vektor koji sadrži bilo koji od izolovanih, rekombinantnih i/ili sintetičkih DNK molekula prema predmetnom otkriću. U jednom primeru izvođenja, vektor sadrži najmanje jednu sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 41.

[0046] U dodatnim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje izolovani, rekombinantni, i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane od SEQ ID NO: 55 i SEQ ID NO: 57. U nekim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje izolovani, rekombinantni, i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji i od SEQ ID NO: 55 i od SEQ ID NO: 57.

[0047] U dodatnim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje izolovani, rekombinantni, i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane od SEQ ID NO: 59 i SEQ ID NO: 61. U nekim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje izolovani, rekombinantni, i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži ili se sastoji od i SEQ ID NO: 59 i od SEQ ID NO: 61.

[0048] U bilo kojim primerima izvođenja otkrića koji se odnose na CD154 vezujuće proteine i anti-CD 154 antitela koja sadrže sekvence koje doprinose efektornim funkcijama, pomenuti vezujući proteini ili anti-CD 154 antitela mogu biti dodatno izabrana ili stvorena inženjeringom da izazovu smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa anti-CD154 antitelom koje ima Fc region, kao što je ovde na drugim mestima opisano. Na primer, CD 154 vezujući proteini i anti-CD 154 antitela koja nemaju Fc region ili sekvence konstantnog regiona, ili koji nemaju funkcionalni Fc region ili sekvence konstantnog regiona, mogu se izabrati za upotrebu u otkriću.

[0049] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini i anti-CD 154 antitela prema otkriću su monovalenta za vezivanje za CD154 i poželjno izazivaju smanjene efektorne funkcije kada se primene na subjekta u odnosu na uporedivi CD154 vezujući protein kao što je bivalentno anti-CD 154 antitelo.

[0050] U određenim drugim primerima izvođenja, Fc ili sekvence konstantnog regiona, ukoliko su prisutne u CD154 vezujućem proteinu, npr., polipeptid anti-CD 154 antitela, mogu se izabrati ili stvoriti inženjeringom da sadrže jednu ili više modifikacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, insercija, priključenja ili delecija) koje smanjuju ili eliminišu jednu ili više efektornih funkcija u odnosu na kontrolno anti-CD 154 antitelo koje sadrži nativni, roditeljski ili nemodifikovani Fc ili sekvence konstantnog regiona.

[0051] U nekim primerima izvođenja otkrića, Fc region, kada je prisutan, je Fc region od ili je izveden iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitela. U nekim primerima izvođenja, mogu se koristiti hibridni Fc regioni, tj., IgG1/IgG4 hibridnih Fc sekvenci. U specifičnim primerima izvođenja, Fc region sadrži IgG4 Fc sekvence ili je izveden iz IgG4 antitela. Podrazumeva se da se prema otkriću može koristiti bilo koja hibridna kombinacija između različitih Fc regiona koja smanjuje jednu ili više efektornih funkcija.

[0052] U određenim drugim primerima izvođenja, glikozilacija Fc dela antitela je smanjena ili eliminisana, ili je izmenjen glikozilacioni profil antitela, kao što je ovde dodatno opisano. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili polipeptid anti-CD 154 antitela sadrži CH2 domen sa Fc regionom koji ima modifikacije na ili blizu konzervativnog N-vezanog glikozilacionog mesta. Modifikacija na konzervativnom N-vezanom glikozilacionom mestu može sadržati mutaciju u ili blizu glikozilacionog mesta teškog lanca, naznačeno time da mutacija smanjuje, menja ili sprečava glikozilaciju na mestu. U sledećim primerima izvođenja, modifikacija sadrži mutaciju N298Q (N297 korišćenjem EU Kabat numerisanja). U određenim primerima izvođenja, modifikacija sadrži uklanjanje glikana CH2 domena ili njihovih delova. U određenim alternativnim primerima izvođenja, modifikacija sprečava formiranje zrelog N-glikana na glikozilacionom mestu.

[0053] U nekim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, koje sadrži CDR3 sekvencu teškog lanca izabranu od SEQ ID NOS: 5, 44 i 50, i varijantu Fc regiona, varijantu Fc region koji sadrži prvi aminokiselinski ostatak i N-glikozilaciono mesto, prvi aminokiselinski ostatak modifikovan hemijski sa bočnim lancem ili aminokiselinskom supstitucijom da bi se postigla povećana sterička masa ili povećano elektrostatičko naelektrisanje u poređenju sa nemodifikovanim prvim aminokiselinskim ostatkom, čime se smanjuje nivo ili na drugi način menja glikozilacija na N-glikozilacionom mestu. U određenim od ovih primera izvođenja, varijanta Fc regiona prenosi smanjenu efektornu funkciju u odnosu na kontrolni, ne-varijatni Fc region.

[0054] U određenim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, koje sadrži CDR3 sekvencu teškog lanca izabranu od SEQ ID NOS: 5, 44 i 50, i varijanu Fc regiona, varijantu Fc regiona koji sadrži prvi aminokiselinski ostatak i N-glikozilaciono mesto, gde prvi aminokiselinski ostatak sadrži cistein tiol čime se smanjuje nivo ili menja glikozilacija na N-glikozilacionom mestu, naznačeno time da varijanta Fc regiona daje smanjenu efektornu funkciju.

[0055] U određenim primerima izvođenja, prvi aminokiselinski ostatak i N-glikozilaciono mesto anti-CD154 antitela koje sadrži varijantu Fc regiona opisanih prethodno su blizu ili unutar N-vezanog glikozilacionog motiva. U sledećim primerima izvođenja, N-vezani glikozilacioni motiv sadrži amninokiselinsku sekvencu NXT ili NXS. U određenim primerima izvođenja, N-vezani glikozilacioni motiv sadrži aminokiselinsku sekvencu NXT. U određenim primerima izvođenja, N-glikozilaciono mesto se nalazi na aminokiselini 297 prema Kabat sistemu numerisanja. U dodatnim primerima izvođenja, modifikovani prvi aminokiselinski ostatak je aminokiselina 299 prema Kabat sistemu numerisanja.

[0056] U određenim od prethodnih primera izvođenja, redukovana efektorna funkcija koju pokazuje bilo koje od antitela ili fragment antitela koji sadrži vezujuće proteine opisane ovde je smanjeno vezivanje za Fc receptor (FcR). U određenim primerima izvođenja, Fc receptor (FcR) je izabran od FcyRI, FcyRII i FcγRIII, i jednog ili više njegovih subtipova, kao što je, na primer, FcyRIIa. U nekim primerima izvođenja, FcR vezivanje je smanjeno sa faktorom od najmanje 1.5-puta ili više, oko 2-puta ili više, oko 3- puta ili više, oko 4- puta ili više, oko 5-puta ili više, oko 6- puta ili više, oko 7- puta ili više, oko 8- puta ili više, oko 9- puta ili više, oko 10- puta ili više, oko 15- puta ili više, oko 50-puta puta ili više, ili oko 100- puta ili više.

[0057] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD 154 antitelo, iz otkrića sa jednom ili više smanjenih efektornih funkcija kao što je ovde opisano ne vezuje se za specifični efektorni receptor ili subtip efektornog receptora. U određenim od ovih primera izvođenja, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, ne vezuje se za FcyRIIa.

[0058] U određenim primerima izvođenja, redukovana efektorna funkcija koju pokazuje bilo koje od antitela opisanih ovde je smanjeno vezivanje za protein komplementa. U nekim primerima izvođenja, protein komplementa je C1q. U određenim primerima izvođenja, smanjeno vezivanje za protein komplementa je za faktor od oko 1.5-puta ili više, oko 2-puta ili više, oko 3-puta ili više, oko 4-puta ili više, oko 5-puta ili više, oko 6-puta ili više, oko 7-puta ili više, oko 8-puta ili više more, oko 9-puta ili više, oko 10-puta ili više, ili oko 15-puta ili više.

[0059] U sledećim primerima izvođenja predmetnog otkrića, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, prema otkriću sadrži jednu ili više modifikacija ili varijacija u Fc regionu, nije glikozilovano i izaziva jednu ili više redukovanih efektornih funkcija kada je primenjeno na subjekta.

[0060] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, prema otkriću izaziva manje tromboemboličkih efekata nego primena anti-CD154 antitela 5c8 kada je primenjeno na subjekta.

[0061] U određenim primerima izvođenja predmetnog otkrića, modifikovani prvi aminokiselinski ostatak CD154 vezujućih proteina ili anti-CD154 antitela koja sadrže varijantu Fc regiona opisanih prethodno vezan je za funkcionalni deo. U dodatnim primerima izvođenja, funkcionalni deo je blokirajući deo, detektabilni deo, dijagnostički deo ili terapeutski deo, ili njihova kombinacija. Blokirajući deo, u određenim primerima izvođenja, može biti, na primer, cisteinski adukt, mešoviti disulfid, polietilen glikol ili polietilen glikol maleimid. Detektabilni deo, u određenim primerima izvođenja, može biti, na primer, fluorescentni, luminescentni deo ili izotopski deo. U primerima izvođenja gde se koristi dijagnostički deo, dijagnostički deo može biti sposoban da otkrije prisustvo stanja, bolesti ili poremećaja. U drugim primerima izvođenja, može se koristiti terapeutski deo kao što je, na primer, anti-inflamatorno sredstvo, anti-kancer sredstvo, anti-neurodegenerativno sredstvo, antitelo koje je selektivno za molekul različit od CD154, ili anti-infektivno sredstvo.

[0062] U određenim primerima izvođenja predmetnog otkrića, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, sadrži modifikovani aminokiselinski ostatak, gde modifikacija dozvoljava konjugaciju specifičnu za mesto proteina ili antitela sa funkcionalnim delom, kao što je za pegilaciju specifičnu za mesto. U određenim primerima izvođenja, modifikovani aminokiselinski ostatak je cisteinski ostatak modifikovan cisteinom ili mešovitim disulfid aduktom. Stoga, u određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein je polipeptid anti-CD154 antitela koji je pegilovan na modifikovanom aminokiselinskom ostatku, npr., na cisteinskom ili lizinskom ostatku. U određenim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo je Fab ili Fab’ fragment pegilovan sa PEG-maleimidom.

[0063] Ovo otkriće takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu, npr., DNK sekvence koje kodiraju CD154 vezujuće proteine, npr., anti-CD154 antitela, otkrića. DNK sekvence prema predmetnom otkriću mogu sadržati sintetičku DNK, na primer proizvedenu hemijskom obradom, cDNK, genomsku DNK ili bilo koju njihovu kombinaciju. Ovo otkriće dalje obezbeđuje klonirajuće ili ekspresione vektore koji sadrže jednu ili više nukleinskih kiselina, npr., DNK sekvence predmetnog otkrića. Otkriće se takođe odnosi, u nekim primerima izvođenja, na vektor koji sadrži bilo koju od sintetičkih, izolovanih, i/ili rekombinantnih nukleinskih kiselina opisanih prethodno.

[0064] Ovo otkriće takođe obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži DNK sekvencu ili vektor prema pronalasku. U određenim aspektima, predmetno otkriće se odnosi na postupak za proizvodnju CD154 vezujućeg proteina, npr., anti-CD 154 antitela, koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži bilo koji od vektora opisanih prethodno pod uslovima pogodnim za proizvodnju CD154 vezujućeg proteina ili anti-CD 154 antitela od strane ćelije domaćina. U nekim primerima izvođenja, postupak sadrži rekuperaciju CD154 vezujućeg proteina ili anti-CD 154 antitela iz kulture ćelije domaćina.

[0065] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, anti-CD 154 antitelo ili nukleinska kiselina prema predmetnom otkriću je obeležena sa detektabilnim markerom, koji može biti radioaktivni izotop, enzim, boja ili biotin. U određenim drugim primerima izvođenja, antitelo prema predmetnom otkriću je konjugovano sa najmanje jednim drugim terapeutskim sredstvom, koje može biti radioizotop, radionuklid, toksin, toksoid, polipeptid ne-CD 154 specifičnog antitela ili fragment (tj., koji stvara bispecifično ili multispecifično antitelo), ili hemoterapeutsko sredstvo, na primer. U sledećim primerima izvođenja, antitelo prema predmetnom otkriću je konjugovano sa sredstvom za vizuelizaciju, koje može biti deo za obeležavanje. Sredstvo za obeležavanje može takođe biti biotin, fluorescentni ili luminescentni deo, radioaktivni deo, histidinski tag, ili peptidni tag.

[0066] Predmetno otkriće se takođe odnosi na varijane sekvence CD154 vezujućih proteina, npr., anti-CD154 antitela, opisanih ovde, i sekvence nukleinskih kiselina koje ih kodiraju. Varijante sekvenci otkrića poželjno imaju najmanje 90%, 91%, 92%, 93% ili 94% identičnosti sa polipeptidom prema otkriću ili sa sekvencom nukleinske kiseline koja ih kodira. Poželjnije, varijanta sekvence ima najmanje 95%, 96%, 97% ili 98% identičnosti na nivou aminokiseline ili nukleinske kiseline. Najpoželjnije, varijanta sekvence ima najmanje 99%, 99.5%, 99.9% ili više identičnosti sa polipeptidom otkrića ili sekvencom nukleinske kiseline koja ga kodira.

[0067] Shodno tome, predmetno otkriće obezbeđuje izolovani protein koji sadrži sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 ili SEQ ID NO: 72.

[0068] U određenim primerima izvođenja, polipeptid himernog, humanizovanog ili humanog anti-CD 154 antitela otkrića je, na primer, dAb, Fab, Fab’, scFv, Fv, disulfidno-vezani Fv ili sadrži jedan imunoglobulinski varijabilni region, kao što je VH ili VL domen, koji je specifičan i monovalentan za CD154 vezivanje. Određeni CD154 vezujući proteini, npr., polipeptidi himernog, humanizovanog ili humanog anti-CD154 antitela, prema otkriću sadrže jedan, dva ili više CDRs otkrića i alternatine sekvence za potporu ili univerzalni okvirni region. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini i anti-CD154 antitela otkrića sadrže jedan varijabilni domen izabran od varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL).

[0069] Otkriće takođe obezbeđuje CD154 vezujući protein, npr., polipeptid himernog, humanizovanog ili humanog anti-CD 154 antitela, koji je monovalentan za vezivanje sa CD154 koji je konjugovan sa funkcionalnim delom koji povećava njegov in vivo polu-život u odnosu na isti polipeptid kome nedostaje funkcionalni deo. U određenim primerima izvođenja, funkcionalni deo sadrži ili se sastoji od polietilen glikola. U određenim primerima izvođenja, funkcionalni deo sadrži ili se sastoji od molekula albumina, kao što je humani serum albumin. Shodno tome, otkriće obezbeđuje PEG-vezani CD154 vezujući protein, npr., PEG-vezujući polipeptid himernog, humanizovanog ili humanog anti-CD154 antitela koji se specifično i monovalentno vezuje za CD154, i koji ima povećani in vivo polu-život u odnosu na isti polipeptid kome nedostaje povezani polietilen glikol.

[0070] Ovo otkriće takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, predmetnog otkrića, koje može, u nekim primerima izvođenja, dodatno sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija prema otkriću može izborno dodatano sadržati dodatno bioaktivno ili terapeutsko sredstvo, kao što je, na primer, imunosupresivno ili imunomodulatorno jedinjenje ili sredstvo; ili dijagnostičko sredstvo. U određenim primerima izvođenja, kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu pegilovanog, anti-CD 154 Fab’ antitela koje ima epitop specifičnost anti-CD 154 antitela 342 ili 338, kao što je ovde opisano.

[0071] Predmetno otkriće dalje obezbeđuje postupak za tretiranje ili prevenciju humanog stanja, poremećaja, bolesti posredovane u celosti ili delimično sa CD40 signalizacijom, ili simptoma bilo čega prethodnog, gde postupak sadrži korak primene na subjekta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži CD154 vezujući protein, npr., anti-CD 154 antitelo, prema predmetnom otkriću, tako da se postigne terapija ili prevencija stanja, bolesti ili poremećaja.

[0072] Otkriće takođe obezbeđuje postupak za inhibiciju ili prevenciju jednog ili više imunih, auto-imunih ili inflamatornih odgovora posredovanih u celosti ili delimično sa CD40 signalizacijom, ili simptoma bilo čega od prethodnog, gde postupak sadrži korak primene na subjekta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži CD 154 vezujući protein, npr., anti-CD 154 antitelo, predmetnog opisa, tako da se postigne terapeutski ili preventivni odgovor. U određenim primerima izvođenja, postupak je korišćen da se tretira subjekt koji ima znake ili je dijagnostifikovan sa sistemskim eritemskim lupusom (SLE). U drugim primerima izvođenja, postupak je korišćen da se tretira subjekt koji ima znake ili je dijagnostifikovan sa reumatoidnim stanjem, kao što je, na primer, reumatoidni artritis (RA).

[0073] Ovo otkriće obezbeđuje polipeptid humanog antitela koji je monovalentan za vezivanje sa CD154. U određenim primerima izvođenja, polipeptid humanog antitela koji je monovalentan za vezivanje sa CD154, kada je prisutan na ili iznad koncentracija zasićenih za CD 154 vezivanje na osnovu njegovog afiniteta vezivanja, pri čemu oba blokiraju vezivanje antitela 5c8 sa CD154 kada su dodati CD154 prvo, i izmeštaju antitelo 5c8 vezano za CD154 kada su dodati nakon što je dodato antitelo 5c8. U određenim primerima izvođenja, polipeptid humanog antitela je PEG-vezan. U određenim primerima izvođenja, polipeptid humanog antitela je bez Fc domena. U određenim od prethodnih primera izvođenja, CD 154 vezujući protein ili polipeptid humanog antitela ne izmešta CD154 vezan za CD40.

[0074] U određenim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje pegilovano anti-CD 154 Fab’ antitelo koje je monovalentno za CD154 vezivanje i dodatno obezbeđuje postupke za tretiranje ili prevenciju jednog ili veše simptoma artritisa, kao što je reumatoidni artritis, ili sistemski eritemski lupus (SLE), koji sadrži korak primene na subjekta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži pegilovano, anti-CD 154 Fab’ antitelo, tako da se postigne terapeutski ili preventivni odgovor.

Kratak opis crteža

[0075]

Slika 1 je tabela koja obezbeđuje aminokiselinske sekvence za regione za određivanje komplementarnosti (CDRs) anti-CD 154 antitela 342, 381, i 338.

Slika 2 je tabela koja obezbeđuje aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence za VH i VL domene anti-CD154 antitela 342 pacova. Podvučene sekvence odgovaraju nukleotidnoj sekvenci koja kodira (tj., signalni) peptid.

Slika 3 je tabela koja obezbeđuje aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence humanih akceptorskih okvirnih regiona korišćenih da se proizvedu humanizovana anti-CD154 antitela u Primerima.

Slika 4 je tabela koja obezbeđuje aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence VH i VL domena u kojima su 342 CDRs graftovani u okvirne regione prikazane na Slici 3.

Slika 5 je tabela koja obezbeđuje aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence VH domena antitela 342 (VH3 gH1 i VH4 gH1) u kojem su 342 CDRs graftovani u humane akceptorske okvirne regione i naznačeno time da su zadržani određeni ključni donorski ostaci.

Slika 6 je tabela koja obezbeđuje aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence VL domena antitela 342 (VK1 gL4) u kojem su 342 CDRs graftovani u humane akceptorske okvirne regione i naznačeno time da su zadržani određeni ključni donorski ostaci.

Slika 7 je tabela koja obezbeđuje sekvence za kompletne regione lakog lanca (varijabilne i konstantne regione lakog lanca) i regione teškog lanca antitela 342. Sekvence koje odgovaraju signalnim/lider peptidima su podvučene.

Slika 8 prikazuje nukleotidnu sekvencu ekspresionih inserata koji su korišćeni da se naprave Fab (SEQ ID NO: 28) i Fab’ (SEQ ID NO: 41) verzije graft 342 gL4gH1. Signalne/lider sekvence su podvučene i restrikciona mesta (korišćena za kloniranje u E. coli ekspresioni vektor kao što je opisano u Primeru 2) su data velikim slovima i prikazana u boldu.

Slika 9 pokazuje poravnanje aminokiselinske sekvence lakih i teških lanaca 342 anti-CD 154 antitelo pacova (donor) sa okvirnim regionima humane klicine linije (akceptor) korišćenim u humanizaciji 342 antitela. "Laki 342" je sekvenca VL domena pacova. "Teški 342" je sekvenca VH domena pacova. CDR ostaci su dati u boldu i podvučeni. Akceptorski okvirni laki (21 1 O12; SEQ ID NO: 35) i teški (1-13-66; SEQ ID NO: 37 i 1-14-59; SEQ ID NO: 39) lanci su prikazani. Graftovi samo sa CDR u akceptorskim okvirnim regionima humane klicine linije su takođe prikazani (VK1 gL3, VH3 gH7 i VH4 gH6). U određenim humanizovanim teškim i lakim lancima, donor ostaci 342 antitela su zadržani unutar okvirnog regiona, i ovi ključni ostaci donor okvirnog regiona su prikazani sa bold italik i naglašeni su. VK1 gL4 donor sadržaj je R38, Y71 i S85. VH3 gH1 donor sadržaj je V24, M48, G49, T73 i V78. VH4 gH1 donor sadržaj je M48, R71 i V78. SEQ ID NOs za prikazane lake lance, u redosledu od gore ka dole su SEQ ID NO: 30 ("342"), SEQ ID NO: 35 ("21 1 O12"), SEQ ID NO: 14 ("342 gL3") i SEQ ID NO: 2 ("342 gL4"). SEQ ID NOs za prikazane teške lance (VH3 graftovi), u redosledu od gore ka dole, su SEQ ID NO: 29 ("342"), SEQ ID NO: 37 (" 1-1 3-66"), SEQ ID NO: 10 ("342 gH7"), i SEQ ID NO: 1 ("342 gHl"). SEQ ID NOs za prikazane teške lance (VH4 graftovi), u redosledu od gore ka dole, su SEQ ID NO: 29 ("342"), SEQ ID NO: 39 ("1-14-59"), varijanta SEQ ID NO: 9 ("VH4 gH6"), i varijanta SEQ ID NO: 11 ("VH4 gH1"). SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 11 varijante prikazane na Slici 9 počinju sa aminokiselinom "E" (umesto "Q" kao na Slikama 4 i 5, respektivno) za ekspresiju u E. coli. Shodno tome, nukleotidne sekvence koje odgovaraju ovim varijantama SEQ ID NOs: 9 i 11 razlikuju se od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 21 po tome što one počinju sa nukleotidom "g" umesto "c".

Slika 10 obezbeđuje VL i VH aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence za anti-CD 154 antitelo 381. CDR aminokiselinske sekvence su podvučene.

Slika 11 obezbeđuje VL i VH aminokiselinske i odgovarajuće nukleotidne sekvence za anti-CD 154 antitelo 338. CDR aminokiselinske sekvence su podvučene.

Slika 12 je tabela koja navodi anti-humana CD154 antitela pacova izolovana sa Selected Lymphocyte Antitelo Method (SLAM) postupkom. Tabela obezbeđuje Kdi IC50vrednosti dobijene sa ovim antitelima u Biacore®, CD40 analizi vezivanja i ICAM-1 ushodno regulisanim analizama. Podaci dobijeni sa antitelom 342 su naglašeni.

Slika 13 obezbeđuje sekvence kapa lakog lanca i odgovarajuće nukleotidne sekvence aglikozilovanog anti-CD 154 antitela hu5c8 (hu5c8 aglyP-huIgG4).

Slika 14 obezbeđuje sekvence aminokiselina teškog lanca i odgovarajuće nukleotidne sekvence aglikozilovanog anti-CD 154 antitela hu5c8 (hu5c8 aglyP-huIgG4). Mutacije urađene da načine varijantu aglikozilovanom (S228P/T299A u Kabat EU nomenklaturi; ostaci 226 i 297) su prikazane podvučeno i u boldu u sekvenci zrelog proteina.

Slika 15 obezbeđuje sekvence kapa lakog lanca i odgovarajuće nukleotidne sekvence aglikozilovanog anti-CD 154 antitela hu342 (hu342 aglyP-huIgG4).

Slika 16 obezbeđuje sekvence aminokiselina teškog lanca i odgovarajuće nukleotidne sekvence aglikozilovanog anti-CD154 antitela hu342 (hu342 aglyP-huIgG4). Mutacije urađene da načine varijantu aglikozilovanom (S228P/T299A u Kabat EU nomenklaturi; ostaci 226 i 297) su prikazane podvučeno i u boldu u sekvenci zrelog proteina.

Slika 17 prikazuje primer Fab’ fragmenata i gel koji prikazuje PEGilaciju Fab’ fragmenta specifičnu za mesto anti-CD154 antitela. Fab’ je pegilovan reakcijom PEG-maleimida sa jednim cisteinskim ostatkom u zglobu.

Slika 18 je tabela koja obezbeđuje Kdi IC50vrednosti dobijene u Biacore®, analizi vezivanja CD40, ICAM-1 analizi ushodne regulacije i analiza kompetitivnog vezivanja CD40L za različite primere izvođenja humanizovanog 342 gL4gH1 antitela, uključujući Fab’ fragmente i antitelo-PEG konjugate.

Slika 19 prikazuje dva grafika anti-TT (tetanus toksoid) IgG vrednosti titra u funkciji vremena kod makaki majmuna koji su primali ili kontrolu sa fiziološkim rastvorom ili različite doze anti-CD 154 antitela. Gornji grafik prikazuje vrednosti IgG titra za dane 0-20 nakon tretmana antitelom i TT provokacije (primarni imuni odgovor), i donji grafik prikazuje vrednosti za dane 30-50 nakon tretmana antitelom i drugu TT provokaciju na dan 30.

Slika 20 je grafik anti-TT (tetanus toksoid) vrednosti IgG titra u funkciji vremena kod makaki majmuna koji su primali različite formate anti-CD 154 antitela sa jednom dozom (20 mg/kg za hu5c8, aglikozil 5c8 i aglikozil 342 i 40 mg/kg za 342 Fab’-PEG i 342 DFM-PEG). DFM-PEG je fragment antitela u kome su dva Fab’ fragmenta unakrsno vezana sa PEGilovanim dimaleimid mostom.

Slika 21 je grafik anti-TT (tetanus toksoid) vrednosti IgM titra u funkciji vremena kod makaki majmuna koji su primali ili kontrolu sa fiziološkim rastvorom ili različite doze anti-CD 154 antitela. Grafik prikazuje vrednosti IgM titra za dane 0-20 nakon provokacije sa TT (primarni odgovor).

Slika 22 je grafik koji poredi farmakokinetiku 342 Fab’-PEG antitela i hu5c8 antitela kod makaki majmuna.

Slika 23 prikazuje rezultate analize protočne citometrije unakrsnog-blokiranja vezivanja obeleženog 342 Fab’ sa CD154-eksprimirajućim D1.1 Jurkat ćelijama prethodno vezanim sa neobeleženim prvim anti-CD154 Fab’, kao što je naznačeno na svakom panelu (23A - A33;

23B - 338; 23C - 402; 23D - 381; 23E - 300; 23F - 294; 23G - 335; 23H - 303) (videti Primer 9). A33 je izotip-podudarno kontrolno antitelo i potvrđuje da ne postoji ne-specifično unakrsno blokiranje.

Slika 24 prikazuje rezultate analize protočne citometrije unakrsnog-blokiranja vezivanja obeleženog Hu5c8 Fab’ sa CD154-eksprimirajućim D1.1 Jurkat ćelijama prethodno vezanim sa neobeleženim prvim anti-CD154 Fab’, kao što je naznačeno na svakom panelu (24A - 338;

24B - 402; 24C - 381; 24D - 303; 24E - 335; 24F - 300; 24G- 294; 24H - A33) (videti Primer 9). A33 je izotip-podudarno kontrolno antitelo i potvrđuje da ne postoji ne-specifično unakrsno blokiranje.

Slike 25 A-F prikazuje rezultate Biacore® analize ompetitivnog vezivanja različitih oblika 342 i Hu5c8 antitela sa rastvorljivim CD154 proteinom (ECD) ili CD40:CD154 kompleksom. FL – puna dužina. CD40hFc - humani CD40 fuzioni protein.

Slika 26 je grafik koji prikazuje rezultate analize agregacije trombocita opisane u Primeru 11 (Analiza 1) izvedene sa Hu5c8 anti-CD 154 antitelom, 342 Fab’-PEG anti-CD154 antitelom, i kontrolnim antitelima. Prvi panel prikazuje rezultate dobijene sa CD40L kompleksima formiranim sa celim IgG i drugi panel prikazuje komplekse formirane sa Fab’-PEG ili diFab’-PEG. Treći panel prikazuje rezultate dobijene sa triFab’-PEG i aglikozilovanim anti-CD 154 antitelom hu342.

Slika 27 je grafik koji prikazuje rezultate analize agregacije trombocita opisane u Primeru 11 (Analiza 2) izvedene sa pozitivnim i negativnim kontrolnim antitelima. Rezultati pokazuju da je agregacija trombocita specifično pojačana sa kompleksima pozitivne kontrole anti-CD 154 antitela i rekombinantnog humanog rastvorljivog CD40L (sCD154).

Slika 28 prikazuje poravnanje sekvenci humanih i mišjih rastvorljivih CD40L aminokiselinskih sekvenci. Razlike između humanih i mišjih sekvenci su naznačene crvenom bojom. Sekvence Hu5c8 epitopa su naznačene plavom bojom. Unutrašnji ostaci su označeni sa "|". Izabrano je šest regiona (1-6) sekvence gde su humani ostaci introdukovani u rastvorljivi mišji CD40L.

Slika 29 prikazuje rezultate kompetitivne ELISA analize da bi se pokazalo unakrsnoblokiranje 342 Fab’ i hu5c8 Fab’ (videti Primer 14). Slika 29A prikazuje rezultate titracije biotin 342 Fab’ na CD154. 1 nM koncentracija je na linearnom delu krive. Slika 29B prikazuje rezultate titracije biotin hu5c8 Fab’ na CD154. 0.3 nM koncentracija je na linearnom delu krive. Slika 29C prikazuje unakrsno-blokiranje biotin 342 i biotin 5c8 sa neobeleženim 342 Fab’. ch342 Fab je himerni 342 Fab’. Slika 29D prikazuje unakrsnoblokiranje biotin 342 sa neobeleženim 5c8 Fab’.

Detaljan opis pronalaska

[0076] Da bi se ovde opisani pronalazak potpunije razumeo, dat je sledeći detaljan opis. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni terminini korišćeni ovde imaju isto značenje kao uobičajeno podrazumevani od strane stručnjaka iz oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Primeri postupaka i materijali su opisani u nastavku, iako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu takođe biti korišćeni u izvođenju predmetnog pronalaska i biće očigledni stručnjacima.

[0077] Standardni referentni radovi koji daju opšte principe tehnologije rekombinantne DNK poznate stručnjacima uključuju Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular and Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991).

[0078] Standardni referentni radovi koji daju opšte principe imunologije poznate stručnjacima uključuju: Harlow i Lane, Antibodies: Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999); i Roitt et al., Immunology, 3d Ed., Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993). Standardni referentni radovi koji daju opšte principe medicinske fiziologije i farmakologije poznate stručnjacima uključuju: Fauci et al., Eds., Harrison’s Principles Of Internal Medicine, 14th Ed., McGraw-Hill Companies, Inc. (1998).

Definicije

[0079] Kao što je ovde korišćeno, termin "CD154 vezujući protein" uključuje bilo koji molekul, uključujući antitelo, koje se specifično vezuje za ili antagonizuje CD 154. Stoga, kao što je ovde korišćeno, anti-CD 154 antitelo je jedna klasa CD154 specifičnih vezujućih proteina. CD154 vezujući protein otkrića može sadržati najmanje jedan, poželjno dva, tri ili više CDRs kao što je ovde dato. CD154 vezujući protein ili drugi takav CD 154 antagonist može obuhvatati vrste koje nisu klasični fragment antitela ili derivati ali koji ipak sadrže aminokiselinske sekvence i/ili hemijske strukture koje daju CD154 epitop specifinost vezivanja. Takvi CD154 antagonisti mogu se napraviti, npr., od alternativnih potpornih regiona (videti, na primer, Binz et al. 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268 i Hosse et al. 2006 Protein Science 15: 14-27). Takav CD154 vezujući protein ili antagonist može biti fuzionisan sa Fc regionom antitela koji je funkcionalno deficijentan ili sa heterlognim funkcionalnim delom kao što je ovde opsiano da bi se poboljšao polu-život i/ili druge in vivo osobine CD154 vezujućeg proteina.

[0080] CD154 vezujući proteini mogu sadržati najmanje jedan od CDRs opisanih ovde inkorporisan u strukturu biokampatibilnog okvirnog regiona. U jednom primeru, struktura biokaompatibilnog okvirnog regiona polipeptida ili njegovog dela koja je dovoljna da formira konformaciono stabilnu strukturnu potporu, ili okvirni region, ili potporni region, koji je sposoban da prikaže jednu ili više sekvenci aminokiselina koje se vezuju sa antigenom (npr. , CDRs, varijabilni domen, itd.) u lokalizovanom površinskom regionu. Takve strukture mogu biti prirodni polipeptid ili "pakovanje" polipeptida (strukturni motiv), ili mogu imati jednu ili više modifikacija, kao što su adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina, u odnosu na prirodne polipeptide ili pakovanje. Ovi potporni regioni mogu se izvesti iz polipeptida bilo koje vrste (ili iz više od jedne vrste), kao što je čovek, drugi sisar, drugi kičmenjak, beskičmenjak, biljka, bakterija ili virus.

[0081] Tipične biokompatibilne strukture okvirnog regiona su zasnovane na proteinskim potporama ili skeletima različitim od imunoglobulinskih domena. Na primer, mogu se koristiti oni zasnovani na fibronektinu, ankirinu, lipokalinu, neokarcinostainu, citochromu b, CP1 cink prstu, PST1, zavijenoj zavojnici, LACI-D1, Z domenu i tendramisat domenima (videti npr., Nygren i Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).

[0082] Termin "antitelo" kao što je ovde korišćeno u odnosu na pronalazak, uključuje izolovano, rekombinantno ili sintetičko antitelo, konjugat antitela ili derivat antitela. Često je namera da termin "antitelo" uključuje fragment antitela, uključujući antigen-vezujući fragment, ukoliko nije drugačije naznačeno ili podrazumevano od strane konteksta. Antigenvezujući fragment je u kompeticiji sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje. Videti generalno, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Antigen-vezujući fragmenti se mogu proizvesti tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. U nekim primerima izvođenja, antigenvezujući fragmenti uključuju Fab, F(ab)2, Fab’, F(ab’)2, F(ab’)3, Fd, Fv, domen antitela (dAb), druge monovalentne i divalentne fragmente, fragmente regiona koji određuju komplementarnost (CDR), jednolančana antitela (npr., scFv, scFab, i scFabΔC), himerna antitela, diatela, triatela, minitela, nanotela, i polipeptide koji sadrže najmanje deo antitela koji je dovoljan da omogući specifično vezivanje antigena sa polipeptidom; i fuzije i derivati prethodnog. Videti, npr., Holliger i Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005) i Hust et al., BMC Biotech 7: 14 (2007).

[0083] "Fd fragment" je fragment antitela koji se sastoji od VH i CH1 domena; "Fv fragment" se sastoji od VL i VH domena jedne ruke antitela; "scFv fragment" je jednolančano antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL) spojene sa peptidnim linkerom; "scFab fragment" je jednolančano antitelo koje sadrži teški fragment (Fd) spojen sa lakim lancem peptidnim linkerom; "scFabΔC" fragment je scFab varijanta bez cisteina (videti, npr., Hust et al., supra); i "dAb fragment" (antitelo sa jednim domenom) sadrži jedan varijabilni domen (npr., VH ili VL domen) (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)). Dodatno, diatela i triatela su takođe uključena. Diatela i triatela prema predmetnom pronalasku uključuju, na primer, homodimerna i heterodimerna diatela i triatela. Na primer, u određenim primerima izvođenja, varijabilni domeni koji čine triatelo mogu se vezivati sa tri različita epitopa ili za identične epitope.

[0084] Ukoliko nije drugačije naznačeno ili gde je drugačije naznačeno kontekstom, "antitelo" prema predmetnom pronalasku uključuje cela antitela i bilo koje njihove antigenvezujuće fragmente, derivat antitela ili varijante koje mogu sadržati jednu ili više modifikacija (npr., aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, post-translacionih modifikacija ili ih nemaju, itd.), uključujući konjugate antitela (tj., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment konjugovan sa ili povezan sa funkcionalnim delom). Derivat antitela, uključujući konjugate antitela, može biti zasnovan na ili može sadržati antigen-vezujući fragment prema pronalasku koji specifično vezuje CD154. Dodatno, primeri izvođenja antitela prema otkriću mogu biti, mišja, hrčka, kozja, zečja, himerna, humanizovana, ili potpuno humana antitela, fragmenti, derivati, ili konjugati. Podrazumeva se da u određenim aspektima otkrića, termin "antitelo" može isključivati jedan ili više primera izvođenja antitela navedenih prethodno; takvi uslovi će biti očigledni stručnjaku.

[0085] Termin "pegilacija," "polietilen glikol" ili "PEG" uključuje polialkilen glikol jedinjenje ili njegov derivat, sa ili bez kuplujućeg sredtva ili derivatizacije sa kuplujućim ili aktivirajućim delovima (npr., sa tiolom, triflatom, trezilatom, azirdinom, oksiranom, ili poželjno sa maleimid delom, npr., PEG-maleimidom). Druga odgovarajuća polialkilen glikol jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, maleimido monometoksi PEG, aktivirani PEG polipropilen glikol, ali takođe naelektrisane ili neutralne polimere sledećih tipova: dekstran, kolominske kiseline, ili polimeri zasnovani na drugim ugljenim hidratima, polimeri aminokiselina, i biotin i drugi derivati afinitetnih reagenasa.

[0086] Termin "efektorna funkcija" odnosi se na funkcionalnu sposobnost Fc ili konstantnog regiona antitela da se vezuje za protein i/ili ćelije imunog sistema. Antitela koja imaju smanjenu efektornu funkciju i postupci za inženjering takvih antitela su dobro poznati u tehnici (videti, npr., WO 05/18572, WO 05/03175, i US 6,242,195) i opisani su ovde detaljnije. Tipične efektorne funkcije uključuju sposobnost da vezuju protein komplementa (npr., protein komplementa Clq), i/ili Fc receptor (FcR) (npr., FcyRI, FcyRII, FcyRIIa, FcyRIII, i/ili FcyRIIIb). Funkcionalne posledice sposobnosti vezivanja za jedan ili više prethodnih molekula uključuju, bez ograničenja, opsonizaciju, fagocitozu, antigen-zavisnu citotoksičnost (ADCC), komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC) i/ili modulaciju efektorne ćelije. Smanjenje u efektornoj funkciji odnosi se na smanjenje u jednoj ili više biohemijskih ili ćelijskih aktivnosti indukovanih najmanje delimično vezivanjem Fc sa njegovim srodnim receptorom ili sa proteinom komplementa ili efektornom ćelijom, uz zadržavanje antigenvezujuće aktivnosti varijabilnog regiona antitela (ili njegovog fragmenta), iako sa smanjenim, sličnim, identičnim, ili povećanim afinitetom vezivanja. Određena antitela prema pronalasku pokazuju smanjenu efektornu funkciju. Smanjenja u efektornoj funkciji, npr., Fc vezivanje sa Fc receptorom ili proteinom komplementa, može se izraziti u odnosu na umnožak smanjenja (npr., smanjeno 1.5-puta, 2-puta, i slično) i može se izračunati na osnovu, npr., procenata smanjenja vezujuće aktivnosti određene korišećnjem analiza vezivanja poznatih u tehnici (videti, na primer, WO 05/18572).

[0087] Ukoliko nije drugačije zahtevano kontekstom, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu.

[0088] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, reč "sadržati," ili varijante kao što su "sadrži " ili "koij sadrži" podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili grupe celih brojeva ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili grupa celih brojeva.

CD154

[0089] CD154 je poznat pod nekoliko drugih naziva u tehnici, kao što je CD40 ligand (CD40L), CD40 suprotni receptor (CD40CR), gp39, T-BAM, T-ćelijski aktivacioni molekul, TRAF, TNF-srodni aktivacioni protein (TRAP), i Član 5 superfamilije liganda faktora nekroze tumora (TNFSF5) (Gauchat et al., 1993 FEBS Lett. 315: 259-266; Graf et al. 1992, Europ. J. Immun. 22: 3191-3194; Hollenbaugh et al., 1992 EMBO J. 11: 4313-4321). Ovi termini su korišćeni naizmenično u ovoj prijavi. CD154 vezujući proteini, uključujući antitela, prema predmetnom otkriću specifično se vezuju sa humanim CD154 i mogu unakrsno reagovati i stoga se specifično vezivati sa CD154 drugih vrsta. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini, uključujući antitela, prema predmetnom otkriću specifično se vezuju za humani CD154, mišji CD154 ili ne-humani CD154 primata.

Anti-CD 154 antitela i CD154 vezujući proteini

[0090] Termin "anti-CD 154 antitelo" kao što je ovde korišćeno odnosi se na molekul imunoglobulina koji je sposoban da se veže specifično za epitop na CD154 antigenu. Anti-CD 154 antitela mogu biti intaktni imunoglobulini izvedeni iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih izvora i mogu biti imunoreaktivni delovi intaktnih imunoglobulina. Antitela su tipično tetrameri imunoglobulinskih molekula.

[0091] Shodno tome, kao što se poziva na u svim primerima izvođenja i postupcima prema predmetnom otkriću "anti-CD 154 antitelo" obuhvata (osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili gde je drugačije predloženo kontekstom) monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, mišje antitelo, antitelo hrčka, kozje antitelo, zečje antitelo, himerno antitelo, primatizovano antitelo, humanizovano antitelo, (potpuno) humano antitelo, multimerno antitelo, heterodimerno antitelo, hemidimerno antitelo, bi-, tri-, ili tetravalentno antitelo, bispecifično antitelo, jednolančano antitelo (npr., scFv, scFab, i scFabΔC), Bis-scFv, diatelo, triatelo ili tetratelo, antitela sa jednim domenom, i modifikovani Fab fragmenti. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo je antitelo koje sadrži samo jedan varijabilni imunoglobulinski domen. Shodno tome, monovalentna antitela uključuju antitela koja sadrže samo jedan imunoglobulinski varijabilni domen (tj., jedan laki ili teški varijabilni lanac) i koja se specifično vezuju sa CD 154. Dodatno, anti-CD 154 antitela pronalaska mogu biti monovalentna, divalentna, ili multivalentna za CD154.

[0092] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, sa smanjenom efektornom funkcijom sadrži bilo koji deo anti-CD 154 antitela koji je dovoljan da zadrži specifičlno vezivanje sa CD154 antigenom. Na primer, antitelo može sadržati samo jedan varijabilni imunoglobulinski domen - VH ili VL domen.

[0093] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, na primer, Fab fragment, F(ab)2 fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2 fragment, F(ab’)3, fragment, jednolančani F(v) fragment ili F(v) fragment i epitope-vezujuće fragmente bilo čega od prethodnog (videti na primer Holliger i Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136). Fragmenti antitela pronalaska su opisani detaljnije u nastavku.

[0094] U jednom primeru, CD154 vezujući proteini ili anti-CD154 antitela su antitela (npr., antitela IgG4 subtipa) ili fragmenti (npr., Fab’ fragmenti) koji poseduju nativni ili modifikovani zglobni region. Određen broj modifikovanih zglobnih regiona je opisan, na primer, u US 5,677,425, WO 99/15549, i WO 98/25971. U drugom primeru, antitela of prema pronalasku su modifkovana u njihovim konstantnim regionima kao ona antitela opisana u WO 05/003169, WO 05/003170 i WO 05/003171. Bilo koja od prethodno pomenutih anti-CD154 antitela, derivata antitela ili fragmenata antitela mogu se koristiti da formiraju konjugate antitela predmetnog pronalaska. Bilo koja od prethodnih antitela, fragmenata, i konjugata mogu izazvati smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa drugim anti-CD 154 antitelom.

[0095] Molekuli antitela pronalaska mogu biti bilo koje klase (npr. IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA) ili subklase imunoglobulinskog molekula. Domeni konstantnog regiona antitela, ukoliko su prisutni, mogu biti izabrani u odnosu na predloženu funkciju molekula antitela. Na primer, domeni konstantnog regiona mogu biti humani IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM domeni. Naročito, mogu se koristiti humani domeni IgG konstantnog regiona, naročito IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgG2 i IgG4 izotipovi mogu se koristiti u određenim primerima izvođenja gde je molekul antitela namenjen terapeutskim upotrebama za koje su poželjne smanjene ili eliminisane efektorne funkcije antitela. Alternativno, mogu se koristiti IgG1 i IgG3 izotipovi kada je molekul antitela namenjen u terapeutske svrhe za koje su zahtevane smanjene efektorne funkcije.

[0096] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više od CDRs CD154 vezujućeg proteina, npr., antitelo, prema otkriću može biti inkorporisano u jedan ili više imunoglobulinskih domena, univerzalnih okvirnih regiona, proteinskih potpornih regiona ili drugih struktura biokampatiblih okvirnih regiona zasnovanih na proteinskim potpornim regionima ili skeletima različitim od imunoglobulinskih domena (Nygren & Uhlén, 1997, Curr. Opin. Strural Biol. 7:463-469; Saragovi et al, 1992, Bio/Technology 10:773-779; Skerra, 2000, J. Mol. Recognition 13:167-187). U određenim primerima izvođenja, CDRs anti-CD154 antitela su inkorporisani u univerzalni okvirni region (tj., okvirni region koji se može koristiti da se stvori puna varijabilnost funkcija, specifičnosti, ili osobina koje su originalno podržane od strane velike kolekcije različitih okvirnih regiona, videti U.S. 6,300,064). U drugim primerima izvođenja, alternativni potporni regioni (videti, na primer, Binz et al. 2005 Nat Biotech 23: 1257-1268 i Hosse et al.2006 Protein Science 15: 14-27) mogu se koristiti da se stvore CD154 vezujući proteini prema otkriću.

[0097] Termin "anti-CD154 antitelo" takođe obuhvata sintetičko antitelo ili rekombinantno antitelo koje je generisano korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK, kao što je, na primer, antitelo eksprimirano od strane bakteriofaga. Termin "anti-CD154 antitelo" treba takođe biti shvaćen tako da uključuje antitelo koje je generisano sintezom DNK molekula koji kodira antitelo i pri čemu DNK molekul eksprimira protein antitela, ili aminokiselinsku sekvencu koja specifikuje antitelo, naznačeno time da DNK ili aminokiselinska sekvenca je dobijena korišćenjem tehnologije sintetičke DNK ili aminokiselinske sekvence koja je dostupna i dobro poznata u tehnologiji.

[0098] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje "anti-CD 154 antitelo" koje monoklonsko antitelo. Monoklonsko antitelo se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim u odnosu na moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u minornim količinama. Modifikator "monoklonska" ukazuje na karakter antitela da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga shvatiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim naročitim postupkom. Na primer, monoklonska antitela za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se stvoriti hibridoma (mišjeg ili humanog) postupkom prvi put opisanim od strane Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili se mogu stvoriti postupcima rekombinantne DNK (videti, npr., US 4,816,567). "Monoklonska antitela" se takođe mogu izolovati iz biblioteka fag antitelo korišćenjem tehnika opisanih u Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), na primer. Takođe se podrazumeva da se određeni primeri izvođenja predmetnog otkrića odnose na kompozicije koje sadrže jedno ili više različitih monoklonskih antitela koja specifično vezuju CD154, tj., kompoziciju poliklonskog antitela koja sadrži više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima za epitop.

[0099] U sledećem primeru izvođenja otkrića, "anti-CD154 antitelo" se odnosi na antitelo koje je himerno antitelo, ili derivat antitela ili konjugat ili njegov antigen-vezujući fragment. Tipično, himerna antitela uključuju varijabile regione teškog i/ili lakog lanca, uključujući i CDR i ostatke okvirnog regiona, jedne vrste (tipično miša) fuzionisane sa konstantnim regionima druge vrste (tipično čoveka). Ova himerna mišja/humana antitela sadrže oko 75% humanih i 25% mišjih aminokiselinskih sekvenci. Humane sekvence predstavljaju konstantne regione antitela, dok mišje sekvence predstavljaju varijabilne regione (i stoga sadrže antigenvezujuća mesta) antitela.

[0100] U sledećem primeru izvođenja, CD154 vezujući proteini, anti-CD154 antitela prema predmetnom otkriću uključuju antitela, derivat antitela i antigen-vezujuće fragmente koji sadrže varijabilni domen koji sadrži okvirne regione iz jednog antitela i CDR regione iz drugog antitela.

[0101] U specifičnijem primeru izvođenja, CD154 vezujući proteini i anti-CD 154 antitela prema predmetnom otkriću uključuju himerna antitela koja sadrže okvirne regione i CDR regione iz različitih humanih antitela.

[0102] Postupci za stvaranje svih himernih antitela opisanih prethodno su dobro poznati stručnjacima. Videti, npr., US 5,807,715; Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(21):6851-5; Sharon et al. (1984) Nature 309(5966):364-7; Takeda et al. (1985) Nature 314(6010):452-4.

[0103] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo, koje vezuje CD154 je generisano sa Selected Lymphocyte Antitelo Method (SLAM) postupkom (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, 93, 7843-7848; WO 92/02551; de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 i in Lagerkvist, et al., 1995, BioTechniques 18:862-869) koji omogućava izolaciju iz bilo koje vrste ćelija koje proizvode antitela visokog afiniteta tokom in vivo imunih odgovora. Druge tehnike uključuju one opisane od strane de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 i Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques 18(5):862-869. Prethodni postupci se zasnivaju na izolaciji pojedinačnih ćelija koje proizvode antitela koja zatim podležu klonskoj ekspanziji nakon čega sledi skrining za one klonove koji proizvode anti-CD 154 antitela praćeno sa naknadnom identifikacijom sekvence njihovih gena varijabilnog teškog (VH) i lakog (VL) lanca. Naročiti postupak skrininga je detaljno dat u WO 04/051268. Stoga, B ćelije koje su pozitivne na antitela za CD154 su izolovane. B ćelije mogu biti humane, mišje, pacovske, hrčka, zečje, kozje, ili drugih vrsta sisara. Geni antitela u ovim B ćelijama se mogu klonirati i eksprimirati u ćeliji domaćinu, npr., konvencionalnom tehnologijom rekombinantne DNK. U određenim primerima izvođenja, ćelija domaćin je E. coli. Druge ćelije domaćini su detaljno date u nastavku. Antitela (koja uključuju fragmente antitela kao što su Fab’ fragmenti) eksprimirana u ovim ćelijama mogu se prečistiti konvencionalnim načinima. Ukoliko su antitela iz ne-humanog izvora, ona mogu biti humanizovana konvencionalnim postupcima, kao što je mutageneza njihovih gena. Humanizovana antitela se zatim mogu eksprimirati u ćeliji domaćinu i mogu se prečistiti.

[0104] Monoklonska antitela se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici kao što je tehnika hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495-497), tehnika trioma, tehnika humanog B-ćelijskog hibridoma (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) i tehnika EBV-hibridoma (Cole et al., "Monoclonal Antitela and Cancer therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). Postupci za stvaranje i proizvodnju rekombinantnih antitela su dobro poznati u tehnici (videti na primer, US 4,816,397; US 6,331,415; Simmons et al., 2002, Journal of Immunological Methods, 263, 133-147; WO 92/02551; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; US 5,585,089; WO91/09967; Mountain i Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, J. Immunol. Methods, 216:165-181; Holliger i Hudson, 2005, Nature Biotech.

23(9):1126-1136).

[0105] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu se takođe generisati korišćenjem različitih postupaka fagnog prikaza poznatih u tehnici i uključuju one otkrivene od strane Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186; Kettleborough et al. 1994, Eur. J. Immunol., 24, 952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18; i Burton et al., 1994, Advances in Immunol., 57, 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; i WO 95/20401; i US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; i 5,969,108.

[0106] Takođe, transgeni (npr., genetičkim inženjeringom dobijeni) miševi, ili drugi organizmi, uključujući druge sisare, mogu se koristiti za proizvodnju vezujućih proteina i antitela predmetnog pronalaska (videti na primer US 6,300,129). Na primer, poznato je da miševi dobijeni inženjeringom da zamene samo imuna mesta varijabilnih regiona miša (segmenti V, D, i J teškog lanca, i segmenti V i J lakog lanca) sa odgovarajućim humanim varijabilnim sekvencama mogu se koristiti da proizvedu velike količine antitela visokog afiniteta sa humanim varijabilnim sekvencama (videti, npr., US 6,586,251; US 6,596,541, i US. 7,105,348).

[0107] U sledećem primeru izvođenja prema predmetnom otkriću, "anti-CD 154 antitelo" odnosi se na antitelo, derivat antitela ili konjugat, ili antigen-vezujući fragment koji je primatizovan ili humanizovan. Primatizovana i humanizovana antitela tipično uključuju CDRs teškog i/ili lakog lanca iz mišjeg antitela graftovane u V okvirni region ne-humanog primatskog ili humanog antitela, i obično dodatno sadrže humani konstantni region. Videti, npr., Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; US 6,054,297; 5,821,337; 5,770,196; 5,766,886; 5,821,123; 5,869,619; 6,180,377; 6,013,256; 5,693,761; i 6,180,370.

[0108] Razlog za korišćenje takvih primatizovanih ili humanizovanih antitela je zadržavanje (humane) antigen specifičnosti mišjeg antitela preneto sa mišjim CDRs ali da se smanji imunogenost mišjeg antitela (mišje antitelo bi izazvalo imuni odgovor protiv njega u vrsti različitoj od miša) korišćenjem koliko je god moguće više humane sekvence okvirnog regiona. Takva antitela se mogu korisiti u humanim terapijama za minimizovanje ili eliminaciju neželjenih sporednih efekata, kao što su imuni odgovori. Opisana su antitela koja sadrže donor CDRs graftovane iz antigen-specifičnih ne-humanih antitela u homologe akceptor okvirne regione ne-humanog primata koji imaju smanjenu imunogenost kod ljudi (US 2005/0208625; US 2002/0062009; US 7,338,658).

[0109] Shodno, humanizovani oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su specifični himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ili druge antigen-vezujuće subsekvence antitela) koji sadrže sekvence izvedene iz sekvenci ne-humanog imunoglobulina i humanog imunoglobulina. U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijent antitelo) u kojima ostaci iz regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) iz recipijentnog antitela su zamenjeni sa ostacima CDRs ne-humanih vrsta (donor antitelo) kao što su miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirni region (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajućim ne-humanim FR ostacima.

[0110] Dodatno, humanizovano antitelo može sadržati ostatke kojih nema ni u recipijent antitelu ni u importovanim CDR ili FR sekvencama. Ove modifikacije su napravljene da dodatno rafinišu i optimizuju performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo može sadržati suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR ostaci su oni iz humane konsenzus sekvence imunoglobulina. Humanizovano antitelo izborno može takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od humanog imunoglobulina.

[0111] Humanizovano antitelo (koje uključuje, npr., fragmente antitela, i derivati antitela ili konjugati) može biti proizvedeno tehnologijom rekombinantne DNK, u kojem su neke ili sve aminokiseline humanog lakog ili teškog lanca imunoglobulina koij nisu neophodni za vezivanje antigena (npr., konstantni regioni i okvirni regioni varijabilnih regiona) su korišćeni da zamene odgovarajuće aminokiseline iz lakog i teškog lanca srodnog, ne-humanog antitela. Postupci za stvaranje humanizovanog antitela su dobro poznati stručnjacima iz oblasti antitela. Videti, npr., EP 239400; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; Queen et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029; Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833; US 6,180,370, i EP 519596, koji opisuju oblaganje površinskih ostataka antitela.

[0112] Shodno tome, u jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, anti-CD 154 antitelo se odnosi na humanizovano antitelo (koje uključuje bez ograničenja humanizovani antigenvezujući fragment i humanizovani derivat antitela ili konjugat), koji je generisan transplantacijom mišjih ili pacovskih (ili drugih ne-humanih) CDRs na humano antitelo. Specifičnije, ova humanizacija je postignuta kao što sledi: (1) cDNKs koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca su izolovani iz hibridoma ili B ćelije koja izlučuje antitelo; (2) DNK sekvence varijabilnih domena, uključujući CDRs, su određeni sekvenciranjem; (3) DNKs koje kodiraju CDRs su preneti na odgovarajuće kodirajuće sekvence regiona varijabilnog domena teškog ili lakog lanca humanog antitela mutagenezom usmerenom na mesto; i (4) segmenti gena humanog konstantnog regiona željenog izotipa (npr., 1 za CH i k za CL) su dodati. Konačno, humanizovani geni teškog i lakog lanca su koeksprimirani u sisarskim ćelijama domaćinima (npr., CHO ili NS0 ćelije) da bi se proizvelo rastvorljivo humanizovano antitelo.

[0113] Povrremeno, direktni transfer CDRs u humani okvirni region dovodi do gubitka antigen-vezujućeg afiniteta rezultujućeg vezujućeg proteina ili antitela. Gubitak antigenvezujućeg afiniteta može se dogoditi jer u nekim srodnim antitelima, određene aminokiseline unutar okvirnih regiona interaguju sa CDRs i stoga utiču na ukupan afinitet vezivanja antigena sa antitelom. U takvim slučajevima, stručnjaku će biti jasno da je od kritičnog značaja introdukcija "povratnih mutacija" u okvirne regione akceptor antitela da bi se zadržala antigen-vezujuća akrtivnost srodnog antitela. Generalni pristupi za stvaranje povratnih mutacija su dobro poznati stručnjacima. Videti, npr., Queen et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029; Co et al. 1991. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873; WO 90/07861; Tempest 1991. Biotechnology 9: 266-271. Primeri povratnih mutacija za antitela prema predmetnom otkriću uključuju one ostatke prikazane na Slici 9 pod sadržajem donora.

[0114] U određenim primerima izvođenja vezujući protein ili antitelo prema predmetnom otkriću može sadržati VH domen koji nije varijabilni domen imunoglobulina kamila ili miša. U određenim primerima izvođenja, polipeptid antitelamože sadržati VH domen koji ne sadrži jednu ili više aminokiselina koje su psecifične za varijabilne domene imunoglobulina kamila u poređenju sa humanim VH domenima.

[0115] U jednom primeru izvođenja prema predmetnom otkriću, "anti-CD154 antitelo" se odnosi na antitelo (koje uključuje antigen-vezujući fragment i derivat antitela ili konjugat) koje je potpuno humano. Potpuno "humano" antitelo sadrži polipeptid antitela ili varijabilni domen imunoglobulina koji ima sekvencu izvedenu iz humanog imunoglobulina (npr., dobijenog iz humane kodirajuće sekvence imunoglobulina). Termin "humano antitelo" uključuje, na primer, antitela koja imaju varijabilen i konstantne regione (ukoliko je prisutno) izvedeno iz sekvenci humane klicine linije imunoglobulina. Termin "humano" kao što je ovde primenjeno na antitelo ili na fragment kao što je varijabilni domen ne obuhvata antitelo iz drugih vrsta, npr., miša, koje je "humanizovano" preko graftinga sekvenci humanog konstantnog regiona u polipeptid antitela (tj., zamenom ne-humanih konstantnih regiona sa humanim konstantnim regionima) ili preko graftinga sekvenci humanog V regiona okvirnog regiona na varijabilni domen imunoglobulinaiz ne-humanog sisara (tj., zamenom ne-humanih okvirnih regiona V domena sa humanim okvirnim regionima). Opisani su postupci humanizovanja varijabilnih regiona imunoglobulina preko racionalne modifikacije ostataka koji određuju komplementarnost (US 2006/0258852).

[0116] Humana antitela mogu, u određenim primerima izvođenja, uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sa sekvencama humane klicine linije imunoglobulina (npr., mutacije introdukovane randomizovanom ili za mesto specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). U određenim primerima izvođenja stoga, predmetno otkriće odnosi se na anti-CD 154 antitelo koje sadrži varijabilni domen koji ima jedan ili više okvirnih regiona (npr., FW1, FW2, FW3, i/ili FW4) koje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ista kao aminokiselinska sekvenca odgovarajućeg okvirnog regiona kodirana sa segmentom gena humane klicine linije antitela, ili aminokiselinskim sekvencama jednog ili više pomenutih okvirnih regiona koji kolektivno sadrže do 5 aminokiselinskih razlika u odnosu na aminokiselinsku sekvencu pomenutog odgovarajućeg okvirnog regiona kodiranog sa segmentom gena humane klicine linije antitela. U sledećim primerima izvođenja, aminokiselinske sekvence okvirnih regiona (FW1, FW2, FW3, i FW4) varijabilnog domena su iste kao aminokiselinske sekvence odgovarajućih okvirnih regiona kodiranih sa segmentom gena humane klicine linije antitela, ili sekvence FW1, FW2, FW3, i FW4 kolektivno sadrže do 10 aminokiselinskih razlika u odnosu na sekvence koje odgovaraju okvirnim regionima kodiranim sa segmentom gena humane klicine linije antitela. Primeri segmenata gena klicine linije antitela uključuju, na primer, DP47, DP45, DP48, i DPK9 (US 2006/0062784), i segmenti koji kodiraju sekvence akceptorskog okvirnog regiona opisane u Primerima i Slikama.

[0117] U nekim primerima izvođenja, humano antitelo (koje uključuje fragment antitela ili sekvencu varijabilnog domena) ima najmanje 85% identičnosti aminokiselinske sekvence (uključujući, na primer, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% ili veću identičnost sekvenci) sa prirodnim humanim antitelom.

[0118] Potpuno humana ili humana antitela mogu biti izvedena iz transgenih (npr., dobijenih genetičkim inženjeringom kao što je “knockin”) miševa koji nose gene humanog antitela (nose varijabilne (V), diverzitetne (D), spajajuće (J), i konstantne (C) egzone) ili humane V, D i J regione iz humanih ćelija. Na primer, sada je moguće proizvesti životinje genetičkim inženjeringom (npr., miševe) koji su sposobni, nakon imunizacije, da proizvode potpuni repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina (videti, npr., Jakobovits et al., PNAS, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); i Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Transgeni (npr., dobijen genetičkim inženjeringom uključujući “knock-out”, “knock-in”, zamenu gena i slično) soj miševa može biti dobijen inženjeringom da sadrži sekvence gena iz nerearanžiranih humanih gena imunoglobulina. Humane sekvence mogu kodirati i teške i lake lance humanih antitela i funkcionisaće koriektno u miševima, podležući rearanžmanu da bi se obezbedio širok repertoar antitela sličan onome kod ljudi. Miševi dobijeni genetičkim inženjeringom mogu biti imunizovani sa ciljnim proteinom (npr., CD154, njegovi fragmenti, ili ćelije koje eksprimiraju CD154) da bi se stvorio raznovrsan niz specifičnih antitela i njihova kodirajuća RNK. Nukleinske kiseline koje kodiraju komponente lanca antitela takvih antitela mogu zatim biti klonirane iz životinje u vektor za prikazivanje. Tipično, zasebne populacije nukleinskih kiselina koje kodiraju sekvence teškog i lakog lanca su klonirane, i zasebne populacije su zatim rekombinovane pri inserciji u vektor, tako da bilo koja data kopija vektora dobija randomizovanu kombinaciju teškog i lakog lanca. Vektor je dizajniran da eksprimira lance antitela tako da se oni mogu sastaviti i prikazati na spoljašnjoj površini paketa za prikazivanje koji sadrži vektor. Na primer, lanci antitela mogu biti eksprimirani kao fuzioni proteini sa proteinom omotača faga sa spoljašnje površine faga. Nakon toga, može se izvršiti skrining paketa za prikazivanje u odnosu na prikazivanje vezivanja antitela sa ciljnom strukturom.

[0119] Dodatno, humana antitela mogu se izvesti iz biblioteka fagnog prikaza (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996), US 6,300,064). Mogu se stvoriti sinetetičke biblioteke faga koje koriste randomizovane kombinacije sintetičkih V-regiona humanog antitela. Selekcijom antigena mogu se stvoriti potpuno humana antitela u kojima su V-regioni veoma slične prirode kao humani. Videti US 6,794,132, 6,680,209, 4,634,666, i Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2:361-367.

[0120] Za stvaranje humanih antitela, takođe videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Humana antitela su dodatno razmatrana i opisana u U.S.5,939,598 i 6,673,986. Videti takođe U.S.6,114,598, 6,075,181, i 6,162,963. Also videti US 6,150,584, US 6,713,610, US 6,657,103, US 2003/0229905 A1, US 2004/0010810 A1, US 2004/0093622 A1, US 2006/0040363 A1, US 2005/0054055 A1, US 2005/0076395 A1 i US 2005/0287630 A1. Videti also EP 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, i WO 98/24893.

[0121] U alternativnom pristupu, drugi su upotrebili "minilokus" pristup. U minilokus pristupu, egzogeni Ig lokus je imitiran preko uključivanja delova (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Stoga, jedan ili više VH gena, jedan ili više DH gena, jedan ili više JH gena, mu konstantni region, i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) su formirani u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u, npr., US 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215., i 5,643,763. Videti takođe US 5,569,825, 5,877,397, 6,300,129, 5,874,299, 6,255,458, i 7,041,871, čija su otkrića ovde uključena u celini na osnovu reference. Videti takođe EP 0546073, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884. Dodatno videti Taylor et al. (1992 Nuc. Acids. Res., 20: 6287), Chen et al. (1993 Int. Immunol. 5: 647), Tuaillon et al. (1993 PNAS USA. 90: 3720-4), Choi et al., (1993 Nature Genetics 4: 117), Lonberg et al. (1994 Nature 368: 856-859), Taylor et al. (1994 International Immunology 6: 579-591), i Tuaillon et al. (1995 J Immunol. 154: 6453-65), Fishwild et al. (1996 Nature Biotechnology 14: 845), i Tuaillon et al. (2000 Eur J Immunol.

10: 2998-3005).

[0122] U specifičnijem primeru izvođenja prema predmetnom otkriću, potpuno humana antitela su pripremljena korišćenjem in vitro-prajmovanih humanih splenocita (Boerner et al.

1991. J. Immunol. 147:86-95).

[0123] U specifičnijem primeru izvođenja prema predmetnom otkriću, potpuno humana antitela su pripremljena kloniranjem repertoara (Persson et al. 1991. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2432-2436; Huang i Stollar 1991. J. Immunol. Methods 141: 227-236). Dodatno, US 5,798,230 opisuje pripremu humanih monoklonskih antitela iz humanih B ćelija, naznačeno time da B ćelije koje proizvode humano antitelo su imortalizovane infekcijom sa Epstein-Barr virusom, ili njegovim derivatom, koji eksprimira Epstein-Barr virus jedarni antigen 2 ("EBNA2"), protein neophodan za imortalizaciju. EBNA2 funkcija je nakon toga ugašena, što rezultuje u povećanju proizvodnje antitela.

[0124] Drugi postupci za proizvodnju potpuno humanih antitela uključuju upotrebu nehumanih životinja koje imaju inaktivirane endogene Ig lokuse i koji su transgeni za nerearanžirane gene teškog i lakog lanca humanog antitela. Takve transgene životinje mogu se imunizovati sa aktiviranim T ćelijama ili D1.1 proteinom (US 5,474,771; 6,331,433; i 6,455,044) i hibridomi se mogu generisati iz B ćelija izvedenih iz njih. Detalji ovih postupaka su opisani u tehnici. Videti, npr. različite objave/patente koji se odnose na transgene miševe koji sadrže humane Ig minilokuse, uključujući US 5,789,650; različite objave/patente u odnosu na XENOMOUSE® miševe, uključujući US 6,075,181; 6,150,584; i 6,162,963; Green, 1997, Nature Genetics 7: 13-21; Mendez, 1997, Nature Genetics 15: 146-56; i različite objave/patente koji se odnose na "tranzomne" miševe, uključujući EP 843961 i Tomizuka, 1997, Nature Genetics 16: 1433-43.

[0125] CD154 vezujući proteini i anti-CD154 antitela prema predmetnom otkriću takođe se odnose na unakrsno blokiranje vezujućih proteina ili antitela, ili na vezujuće proteine ili antitela koji se vezuju za isti epitop ili koji se vezuju za blisko povezani ili preklapajući epitop kao bilo koja od antitela opisana ovde. Unakrsno-blokiranje vezujućeg proteina ili antitela može kompetitivno inhibirati ili blokirati vezivanje bilo kojih antitela opisanih ovde. U određenim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje CD 154 vezujuće proteine i anti-CD 154 antitela koji se vezuju za isti epitop kao humanizovano antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO.12 ili SEQ ID NO.13 i sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO. 15 (342 Fab i Fab’ fragmenti), i koje pokazuje slične osobine vezivanja CD154 u kompetitivnim analizama sa anti-CD 154 antitelom 5c8, kao što je ovde opisano. U drugim primerima izvođenja, obezbeđuje CD 154 vezujuće proteine i anti-CD 154 antitela koja se vezuju za isti epitop kao i humanizovano antitelo koje sadrži sekvencu VL domena prema SEQ ID NO. 58 i sekvencu VH domena prema SEQ ID NO. 60 (varijabilne sekvence 338 antitela), i koje pokazuje slične osobine vezivanja CD 154 u kompetitivnim analizama sa anti-CD 154 antitelom 5c8, kao što je ovde opisano.

[0126] U određenim primerima izvođenja predmetnog otkrića, CD154 vezujući protein, npr. anti-CD 154 antitelo, pokazuje visok afinitet za humani CD154. Na primer u određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein disocira sa humanog CD154 (humani CD40L) sa KDu opsegu od 50 nM do 1 pM, uključujući i te vrednosti, kao što je određeno površinskom plazmon rezonancom (npr., Biacore®). Na primer, KDza humani CD154 može biti 25 nM do 1 pM, 10 nM do 1 pM, 5 nm do 1 pM, 1 nM do 1 pM, 0.5 nM do 1 pM, 0.1 nM do 1 pM, 75 pM do 1 pM, 50 pM do 1 pM, 20 pm do 1 pm, ili čak 10 pm do 1 pm. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema predmetnom otkriću disocira sa humanog CD154 sa KDu opsegu od 500 pM do 1 pM, uključujući i te vrednosti, kao što je određeno površinskom plazmon rezonancom (npr., Biacore®). U nekim primerima izvođenja, KDza humani CD154 je manja od 50 pM. Na primer, u nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, CD154 vezujući protein disocira sa humanog CD154 sa KDkoja je manja od 20 pM. U nekim od primera izvođenja prema predmetnom otkriću, CD154 vezujući protein disocira sa humanog CD154 sa KDkoja je manja od 10 pM. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema otkriću vezuje se za CD154 sa visokim afinitetom ali ne istiskuje vezani CD154 sa CD40. Afinitet antitela može biti pojačan sa postupcima poznatim u tehnici (videti, npr., Clark et al. 2006 Protein Sci. 15(5): 949-60, koji opisuju poboljšavanje afiniteta antitela korišćenjem kompjuterskog dizajna na osnovu strukutre, i Chao et al. 2006 Nat Protoc 1: 755-768, koji opisuje postupke izolovanja i inženjeringa scFvs sa željenim osobinama korišćenjem prikaza površine kvasca).

[0127] Kada se želi poboljšanje afiniteta antitela prema otkriću koje sadrži jedan ili više prethodnopomenutih CDRs, takva antitela sa poboljšanim afinitetom mogu se dobiti brojnim protokolima za afinitetno sazrevanje, uključujući, ali se ne ograničavajući na održavanje CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mešanje lanaca (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), korišćenje mutacionih sojeva E. coli. (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), DNK mešanje (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), fagni prikaz (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) i polni PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Svi ovi postupci afinitetnog sazrevanja su razmatrani od strane Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). Stoga, otkriće takođe obezbeđuje varijante sekvenci antitela prema otkriću koje se specifično vezuje sa CD154. Takve varijante sekvence sadrže jednu ili više semi-konzervativnih supstitucija unutar njihove sekvence i takver supstitucije poželjno značajno ne utiču na željenu aktivnost polipeptida. Supstitucije se mogu javiti prirodno ili mogu biti introdukovane na primer korišćenjem mutageneze (npr. Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551). Aminokiseline glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin, na primer, često se mogu međusobno supstituisati (aminokiseline koje imaju alifatične bočne lance). Od ovih mogućih supstitucija, poželjno je da su glicin i alanin korišćeni za međusobnu supstituciju (jer imaju relativno kratke bočne lance) i da su valin, leucin i izoleucin su korišćene za međusobnu supstituciju (jer imaju veće alifatične bočne lance koi su hidrofobni). Druge aminokiseline koje se često mogu međusobno supstituisati uključuju, ali nisu ograničeni na:

- fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance);

- lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju bazne bočne lance);

- aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance);

- asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju amidne bočne lance); i

- cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor).

[0128] Afinitet vezivanja CD154 vezujućih proteina, npr., anti-CD154 antitela, prema predmetnom otkriću mogu takođe biti opisani u realtivnim terminima ili u poređenju sa afinitetom vezivanja drugog antitela koje se takoše specifično vezuje za CD154 (npr., drgo anti-CD 154 antitelo koje je CD154-specifično, koje se ovde može označiti kao "drugo CD154-specifično antitelo". U nekim primerima izvođenja, drugo CD154-specifično antitelo može biti antitelo 5c8 (proizvedeno od strane hibridoma deponovanog kod ATCC pod pristupnim br. HB 10916, kao što je opisano u US 5,474,771) ili humanizovano 5c8). U drugim primerima izvođenja, drugo CD154-specifično antitelo može biti bilo koje od antitela prema otkriću, kao što su 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 ili 402 (Slika 12). Shodno tome, određeni primeri predmetnog otkrića odnose se na anti-CD 154 antitelo koje se vezuje za humani CD154 sa većim afinitetom od antitela 5c8, ili sa KDkoja je manja od KDantitela 5c8. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo prema predmetnom otkriću takođe inhibira CD154 aktivnost ili blokira CD154:CD40 interakciju u većem stepenu od nego drugo CD154-specifično antitelo, kao što je 5c8, na ekvimolarnim koncentracijama. Relativna sposobnost anti-CD154 antitela da blokira CD154:CD40 interakciju može se meriti bilo kojom dostupnom analizom, kao što su, npr., ICAM-1 analiza ushodne regulacije opisana ovde i analize kompetitivnog vezivanja.

[0129] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini i anti-CD154 antitela (uključujući fragmente antitela i derivate) prema otkriću korisni su za inhibiciju vezivanja CD 154 sa CD40 i to čine sa visokom specifičnošću, npr., sa IC50u opsegu od 10 pM do 1.5 mM, uključujući i te primere. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući proteini, npr., antitela, prema otkriću mogu imati IC50u opsegu od 10 pm do 500 pm, 50 pm do 500 pm, 100 pm do 500 pm, 250 pm do 750 pm, 500 pm do 1 mM ili 750 pm do 1.5 mM. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo ne agonizuje uznačajno CD40 aktivnost ili aktivira CD40 signalizaciju. U nekim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo prema predmetnom otkriću antagonizuje aktivnost CD 154 ili CD40 ili oba.

[0130] Određeni primeri izvođenja predmetnog otkrića, stoga, odnose se na CD154 vezujuće proteine i anti-CD 154 antitela koja se vezuju za humani CD 154 sa većim ili jednakim afinitetom u odnosu na drugo CD154-specifično antitelo (npr., antitelo 5c8 ili humanizovano 5c8), ili sa KDkoja je manja od ili jednaka KDdrugog CD154-specifičnog antitela, naznačeno time da anti-CD 154 antitelo značajno ne inhibira CD154:CD40 interakciju u odnosu na drugo CD154-specifično antitelo. Takva antitela mogu biti korisna kao analiza vezivanja i dijagnostički reagensi, na primer. Primeri antitela koja pokazuju visok afinitet za humani CD154 ali niži stepen CD154:CD40 inhibicije u poređenju sa drugim CD154-specifičnim antitelom su antitela 381 i 338 opisana ovde. Na primer, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD 154 antitela koja se specifično vezuju za humani CD 154 sa većim ili jednakim afinitetom (u odnosu na drugo CD 154-specifično antitelo, kao što je humanizovano 5c8, na primer) ali koja blokiraju CD154:CD40 interakciju u manjem stepenu od drugog CD154-specifičnog antitela. U sledećim primerima izvođenja, ova anti-CD 154 antitela koja inhibiraju vezivanje CD154 (CD40L) sa CD40 u manjem stepenu od drugog CD154-specifičnog antitela takođe značajno ne agonizuju CD40 aktivnost ili aktiviraju CD40 signalizaciju. Na primer, takva antitela, ukoliko su primenjena in vitro analizama potencije kao što je opisano u Primeru 7, ne moraju pokazati bilo kakvu statistički značajnu agonizaciju u odnosu na kontrolni tretman ili mogu pokazati 1%, 2%, 3%, 5%, ili 10% agonizacije u poređenju sa pozitivnom kontrolom (npr., CD154 ligand). Vidalain et al. (The EMBO Journal (2000) 19: 3304-3313) i Pearson et al. (International Immunology (2001) 13:273-283) opisuju CD40 signalni put i takođe obezbeđuju analize koje se mogu koristiti za određivanje da li ili ne CD154:CD40 interakcija je blokirana ili inhibirana, i do kog stepena.

[0131] U nekim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR izabran od CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5). Poželjno, antitelo sadrži najmanje dva CDRs izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5) i još poželjnije sva tri od ovih CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3.

[0132] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD 154 antitelo otkrića sadrži najmanje jedan CDR izabran od CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8). Poželjno, antitelo sadrži najmanje dva CDRs izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8) i još poželjnije sva tri od ovih CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3.

[0133] U sledećim primerima izvođenja, antitelo sadrži sva tri od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 (SEQ ID NOS: 3-5) i sva tri od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 (SEQ ID NOS: 6-8).

[0134] U sledećim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog teškog lanca prema bilo kojoj od SEQ ID NOS: 1, 9, 10 ili 11 i sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca prema SEQ ID NO: 2 ili 14.

[0135] U nekim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR izabran od CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44). Poželjno, antitelo sadrži najmanje dva CDRs izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDRH3 (SEQ ID NO: 44) i još poželjnije sva tri od ovih CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3.

[0136] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD 154 antitelo prema pronalasku sadrži najmanje jedan CDR izabran od CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47). Poželjno, antitelo sadrži najmanje dva CDRs izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47) i još poželjnije sva tri od ovih CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3.

[0137] U sledećim primerima izvođenja, antitelo sadrži sva tri od ovih CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 (SEQ ID NOS: 42-44) i sva tri od ovih CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 (SEQ ID NOS: 45-47).

[0138] U sledećim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog teškog lanca prema SEQ ID NO: 56 i/ili sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca prema SEQ ID NO: 54.

[0139] U nekim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR izabran od CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50). Poželjno, antitelo sadrži najmanje dva CDRs izabrana od CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDRH3 (SEQ ID NO: 50) i još poželjnije sva tri od ovih CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3.

[0140] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD154 antitelo otkrića sadrži najmanje jedan CDR izabran od CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53). Poželjno, antitelo sadrži najmanje dva CDRs izabrana od CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53) i još poželjnije sva tri od ovih CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3.

[0141] U određenim primerima izvođenja, antitela imaju komplementarnu sekvencu koja sadrži jedan ili više CDRs od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 lakog lanca, prethodno, ili komplementarnu sekvencu koja sadrži jedan ili više CDRs ili CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 teškog lanca, prethodno, respektivno. Stoga, u određenim primerima izvođenja, antitelo prema predmetnom otkriću sadrži CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) ili CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), i CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) ili CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

[0142] U sledećim primerima izvođenja, antitelo sadrži sva tri od ovih CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 (SEQ ID NOS: 48-50) i sva tri od ovih CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 (SEQ ID NOS: 51-53).

[0143] U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog teškog lanca prema SEQ ID NO: 60 i/ili sadrži sekvencu varijavilnog lakog lanca prema SEQ ID NO: 58.

[0144] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema predmetnom otkriću sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 62 i sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 65. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema predmetnom otkriću sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 63 i sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 66.

[0145] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema predmetnom otkriću sadrži sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 68 i sadrži sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 71. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein prema predmetnom otkriću sadrži sadrži sekvencu lakog lanca prema SEQ ID NO: 69 i sadrži sekvencu teškog lanca prema SEQ ID NO: 72. U drugim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein sadrži jednu od sekvenci prema SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 ili SEQ ID NO: 72.

[0146] Ovo otkriće takođe obezbeđuje CD154 vezujuće proteine koji poželjno dele najmanje 90%, 91%, 92%, 93% ili 94% identičnosti sa CD154 vezujućim proteinom otkrića. Još poželjnije, CD154 vezujući protein deli najmanje 95%, 96%, 97% ili 98% identičnosti. Najpoželjnije, CD154 vezujući protein deli najmanje 99%, 99.5%, 99.9% ili više identičnosti sa CD154 vezujućim proteinom otkrića. CD154 vezujući proteini otkrića mogu sadržati sekvencu varijabilnog domena koje je najmanje 85% identična sa varijabilnim domenom SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 60, ili jedan ili više njihovih CDRs.

[0147] Drugi primeri izvođenja prema pronalasku odnose se na bispecifična antitela. Bispecifična antitela su monoklonska, poželjno humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. Ona se mogu koristiti zasebno ili pomešana u kompozicijama koje sadrže poliklonske populacije. U predmetnom pronalasku, jedna of vezujućih specifičnosti je za CD154 antigen dok je druga vezujuća specifičnost za bilo koji drugi antigen, i poželjno za protein na ćelijskoj površini ili receptor ili subjedinicu receptora. Na primer, druga vezujuća specifičnost može biti ligand izabran između humanog serum albumina (HSA), TNFα, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-γ, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3 i VLA4.

[0148] U drugim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitelo sadrži generičko mesto vezivanja liganda. Generički ligand (npr., polipeptid) je sposoban da vezuje funkcionalne članove repertoara nezavisno od specifičnosti ciljnog liganda. Generički ligand se stoga može korisiti da se identifikuju ili izaberu (na primer, kao u procesima prečišćavanja i skrininga) funkcionalni članovi repertoari (kao što je kolekcija ili grupa antitela, nezavisno od antigen vezujućih specifičnosti antitela). Generički ligandi uključuju, na primer, Protein A, Protein G i Protein L. Pre-selekcija članova fagne biblioteke sa generičkim ligandima je data u WO 99/20749.

Fragmenti antitela

[0149] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na antigen-vezujući ili epitop-vezujući anti-CD 154 fragment antitela. Svi postupci i reagensi opisani prethodno u odnosu na anti-CD 154 antitela mogu se na sličan način koristiti da bi se proizveo i koristio anti-CD 154 fragment antitela prema predmetnom pronalasku.

[0150] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, anti-CD154 fragment antitela uključuje heteromerne komplekse antitela i fuzije antitela, kao što su bispecifična antitela, hemidimerna antitela, multivalentna antitela (tj., tetravalentna antitela) i jednolančana antitela. Hemidimerino antitelo je napravljeno od Fc dela i jednog Fab dela. Jednolančano antitelo je stvoreno od varijabilnih regiona vezanih sa proteinskim spejserima u jedan proteinski lanac.

[0151] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 fragment antitela prema predmetnom pronalasku može takođe uključiti proteine koji sadrže jedan ili više imunoglobulinskih lakih lanaca i/ili teških lanaca, kao što su monomeri i homo- ili heteromultimeri (npr., dimeri ili trimeri) ovih lanaca, gde su ovi lanci izborno vezani disulfidom ili na drugi način unakrsno povezani. Ova antitela mogu biti sposobna da se vezuju za jedan ili više antigena.

[0152] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje antigen-vezujuće fragmente celih antitela, kao što su Fab, F(ab)2, Fab’, F(ab’)2, F(ab’)3, F(v), Fd, dAb, diatela, minitela, i nanotela fragmenti antitela. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na fragmente koji sadrži samo jedan varjabilni domen, kao što je VH ili VL domen, ili na fragment koji sadrži samo domene teškog lanca ili lakog lanca. Fragmenti mogu biti humanizovani ili potpuno humani. Predmetni pronalazak takođe uključuje antigen-vezujuće fragmente koji su stvoreni od alternativnih potpornih regiona (videti, npr., Binz supra i Hosse supra) ili koji sadrže univerzalne okvirne regione. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na konjugate koji sadrže samo antigen-vezujući fragment ili CD154 vezujući protein koji specifično vezuje CD154 konjugovan kovalentno ili nekovalentno, ili direktno ili indirektno, sa funkcionalnim delom kao što je protein nosač ili PEG, na primer.

[0153] Anti-CD154 antitela prema predmetnom pronalasku uključuju divalentna antitela. Stoga, u određenim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na divalentni anti-CD 154 fragment antitela koji sadrži dva teška lanca antitela i najmanje jedan polimerni molekul u kovalentnoj vezi, gde je svaki teški lanac kovalentno vezan sa drugim sa najmanje jednim nedisulfidnim međulančanim mostom koji povezuje atom sumpora cisteina u jednom lancu sa atomom sumpora cisteina u drugom lancu, pri čemu se cisteinski ostaci nalaze na spoljnoj strani domena varijabilnog regiona svakog lanca, naznačeno time da najmanje jedan nedisulfidni međulančani most sadrži kovalentno vezani molekul polimera. Namera je da termin "ne-disulfidni" kao što je ovde korišćeno označava da S-S mostovi, npr. tipa koji se normalno nalazi u antitelima, su isključeni. Međulančani most tipa prisutnog u fragmentu prema pronalasku može međutim i dalje biti vezan sa teškim lancem preko -S-S-veze kao što je ovde opisano. Generalno, svaki molekul polimera u divalentnom fragmentu antitela prema pronalasku formira deo međulančanog mosta. Svaki most služi da poveže dva teška lanca i u svakom lancu će biti kovalentno vezan za atom sumpora cisteina. Kovalentna veza će generalno biti disulfidna veza ili, u specifičnim primerima izvođenja sumpor-ugljenik veza. Za primer struktura divalentnog antitela, videti WO 99/64460 i WO 05/061005.

[0154] Pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD154 antitelo koje je monovalentno antitelo ili monovalentni antigen vezujući fragment. Kao što je ovde korišćeno, termin "monovalentno" označava da dato antitelo ili antigen-vezujući fragment (npr., Fv, jednolančani scFv, dAb, Fab, Fab’, Fd, scFab, scFabΔC, itd.) može vezati samo jedan molekul svoje ciljne strukture. Prirodna antitela su generalno divalentna, po tome što imaju dve funkcionalne antigenvezujuće ruke, gde svaka sadrži VH i VL domen. Divalentno antitelo može vezati dva zasebna molekula istog antigena gde steričko ometanje nije problem. Nasuprot tome, "monovalentno" antitelo ima jedno antigen-vezujuće mesto za ciljnu strukturu. Antigenvezujući domen monovalentnog antitela može sadržati VH i VL domen ili može sadržati samo jedan imunoglobulinski varijabilni domen, tj., VH ili VL domen, koji ima kapacitet da veže CD 154 bez potrebe za odgovarajućim VL ili VH domenom, respektivno. Takav primer monovalentnog antitela je Fd fragment koji sadrži jedan imunoglobulinski varijabilni domen i koji se može vezati samo sa jednim CD154 antigen molekulom. Monovalentno antitelo nema kapacitet da unakrsno vezuje molekule jednog antigena.

[0155] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-CD154 antitelo, naznačeno time da se antitelo specifično vezuje za epitop za koji se specifično vezuje humanizovani Fab ili Fab’ fragment sa sekvencom teškog lanca prema SEQ ID NO: 12 ili 13, respektivno i sa sekvencom lakog lanca prema SEQ ID NO: 15. U određenim primerima izvođenja, antitelo prema ovom otkriću je fragment antitela sa sekvencom varijabilnog teškog lanca prema SEQ ID NO: 1, 9, 10 ili 11 i sa sekvencom varijabilnog lakog lanca prema SEQ ID NO: 2 ili 14. U drugim primerima izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku je fragment antitela sa sekvencom teškog lanca prema SEQ ID NO.12 ili 13 i sekvencom lakog lanca prema SEQ ID NO.15.

[0156] U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sekvence lakog lanca prema SEQ ID NO: 15 i sekvence teškog lanca prema SEQ ID NO: 13. U određenim primerima izvođenja, CD154 vezujući protein ili antitelo sadrži ili se sastoji od sekvence lakog lanca prema SEQ ID NO: 15 i sekvence teškog lanca prema SEQ ID NO: 12.

[0157] U alternativnim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje fragment antitela koji sadrži sekvencu varijabilnog teškog lanca prema SEQ ID NO: 56 i sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca prema SEQ ID NO: 54. U drugim primerima izvođenja, antitelo prema predmetnom otkriću je fragment antitela koji sadrži sekvencu varijabilnog teškog lanca prema SEQ ID NO.60 i koji sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca prema SEQ ID NO.58.

[0158] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje Fab’ ili F(ab’)2 ili F(ab’)3 fragment koji specifično vezuje CD154. Ovaj Fab’ ili F(ab’)2 ili F(ab’)3 fragment može biti humanizovan i može imati sekvencu teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 13 i može imati sekvencu lakog lanca koja sadrži ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 15.

[0159] U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje nema Fc domen. Takvo Fc-deficijentno antitelo ili fragment može biti monovalentan, divalentan, ili dodatno multivalentan.

[0160] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitela ili fragment antitela koji se specifično vezuje za epitop za koji se Fab’ ili F(ab’)2 ili F(ab’)3 fragmenti opisani prethodno specifično vezuju. Ova antitela ili fragmenti antitela mogu se identifikovati analizom sa unakrsnim vezivanjem kao što je ovde opisano (Primer 9). Ova antitela ili fragmenti antitela mogu biti izolovani, rekombinantni ili sintetički i mogu se vezivati za drugi molekul da formiraju antitelo-konjugate.

Antitela sa smanjenom efektornom funkcijom

[0161] Interakcija antitela i antitelo-antigen kompleksa sa ćelijama imunog sistema inicira različite odgovore, ovde označene kao efektorne funkcije. IgG antitela aktiviraju efektorne puteve imunog sistema vezivanjem sa članovima familije Fcγ receptora na površini ćelija i sa C1q sistema komplementa. Vezivanje efektornih proteina od strane klasterovanih antitela inicira raznovrsne odgovore, uključujući oslobađanje inflamatornih citokina, regulaciju proizvodnje antigena, endocitozu, i ubijanje ćelija. U nekim kliničkim primenama ovi odgovori su ključni responses za efikasnost monoklonskog antitela. U drugima oni provociraju neželjene sporedne efekte kao što su inflamacija i eliminacija ćelija koje nose antigen. Shodno tome, predmetni pronalazak se dalje odnosi na anti-CD154 antitela, sa izmenjenim, npr., smanjenim, efektornim funkcijama. Važno je da smanjena efektorna funkcija ne mora obavezno smanjiti sposobnost anti-CD 154 antitela da inhibira jednu ili nekoliko bolesti preko blokiranja CD154-CD40 interakcije (videti WO 05/03175, koja je ovde uključena u celini na osnovu reference).

[0162] Anti-CD154 antitela sa ukinutom efektornom funkcijom (npr., Fc-posredovanim efektornim funkcijama; videti u nastavku) su naročito poželjna za upotrebu kod subjekata gde postoji potencijal za neželjenu tromboemboličku aktivnost. Dodatno, ukinuta efektorna funkcija anti-CD 154 antitela može smanjiti ili eliminisati druge potencijalne neželjene sporedne efekte anti-CD 154 antitelo terapija, kao što je delecija aktiviranih T ćelija i drugih populacija ćelija indukovanih da eksprimiraju CD 154 ili Fc-zavisnu aktivaciju monocita/makrofaga.

[0163] Efektorna funkcija anti-CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku može se odrediti korišćenjem jedne od mnogih poznatih analiza. Efektorna funkcija anti-CD 154 antitela može se smanjiti u odnosu na drugo anti-CD154 antitelo. U nekim primerima izvođenja, drugo anti-CD 154 antitelo može biti bilo koje antitelo koje specifično vezuje CD154. U nekim primerima izvođenja, drugo anti-CD154 antitelo može biti antitelo 5c8 (proizvedeno od strane hibridoma deponovanog sa ATCC pod pristupnim br. HB 10916, kao što je opisano u US 5,474,771) ili humanizovano 5c8). U drugim primerima izvođenja, drugo CD154-specifično antitelo može biti bilo koje od antitela otkrića, kao što je 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 ili 402 (Slika 12). U drugim primerima izvođenja, gde anti-CD154 antitelo od interesa je modifikovano da bi se smanjila efektorna funkcija, drugo anti-CD 154 antitelo može biti nemodifikovano ili izvorna verzija antitela.

[0164] Efektorna funkcija anti-CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku može se takođe odrediti, npr., merenjem nivoa agregacije trombocita ili aktivacijom izazvanom tretmanom sa anti-CD 154 antitelom u odnosu na kontrolno antitelo. U nekim primerima izvođenja, stoga, anti-CD154 antitela prema predmetnom pronalsku ne posreduju ili ne pojačavaju agregaciju trombocita ili aktivaciju u standardnim analizama agregacije ili aktivacije trombocita. U drugim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitela posreduju u nižem nivou agregacije ili aktivacije trombocita u odnosu na drugo anti-CD 154 antitelo (npr., 5c8 ili humanizovano 5c8).

[0165] Primeri efektornih funkcija uključuju vezivanje Fc receptora, fagocitozu, apoptozu, pro-inflamatorne odgovore, nishodnu regulaciju receptora ćelijske površine (npr. B ćelijskog receptora; BCR), itd. Druge efektorne funkcije uključuju antitelo zavisnu ćelijskiposredovanu citotoksičnost (ADCC), pri čemu se antitela vezuju za Fc receptore na citotoksičmim T ćelijama, ćelijama prirodnim ubicama (NK), ili makrofagama što dovodi do smrti ćelije, i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC), što predstavlja smrt ćelije indukovanu aktivacijom kaskade komplementa (pregledno dato u Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997); Ward and Ghetie, rapeutic Immunol. 2:77-94 (1995); i Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)). Takve efektorne funkcije generalo zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (npr. varijabilni domen antitela) i može se proceniti korišćenjem standardnih analiza poznatih u tehnici (videti, npr., WO 05/018572, WO 05/003175, i U.S.6,242,195).

[0166] Efektorne funkcije se mogu izbeći korišćenjem fragmenata antitela bez Fc domena kao što su Fab, Fab’2, jednolančani Fv. Alternativa je bila korišćenje antitela IgG4 podtipa, koje se vezuje za FcγRI ali koje se slabo vezuje za C1q i FcγRII i RIII. IgG2 podtip takođe ima smanjeno vezivanje za Fc receptore, ali zadržava značajno vezivanje za H131 alotip FcγRIIa i do C1q. Stoga, dodatne promene Fc sekvence su neophodne da bi se eliminisalo vezivanje za sve Fc receptore i za C1q.

[0167] Nekoliko efektornih funkcija antitela, uključujući ADCC, su posredovane sa Fc receptorima (FcRs), koji vezuju Fc region antitela. Afinitet antitela za određeni FcR, i stoga efektorna aktivnost posredovana antitelom, može se modulisati izmenom aminokiselinske sekvence i/ili post-translacionim modifikacijama Fc i/ili konstantnog regiona antitela.

[0168] FcRs su definisani njihovom specifičnošću za imunoglobulinske izotipove; Fc receptori za IgG antitela se označavaju kao FcγR, za IgE kao FcεR, za IgA kao FcaR i tako dalje. Identifikovane su tri potklase FcγR: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16). I FcγRII i FcγRIII imaju dva tipa: FcγRIIA (CD32) i FcγRIIB (CD32); i FcγRIIIA (CD16a) i FcγRIIIB (CD16b). Kako je svaka FcγR potklasa kodirana sa dva ili tri gena, i alternativni RNK splajsing vodi do višestrukih transkripta, postoji široka raznovrsnost FcγR izoformi. Na primer, FcγRII (CD32) uključuje izoforme lla, llb1, llb2 llb3, i llc.

[0169] Mesto vezivanja na humanim i mišjim antitelima za FcγR je prethodno mapirano na takozvani "donji region zgloba" koji se sastoji od ostataka 233-239 (EU indeks numerisanja kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), Woof et al. Molec. Immunol.

23:319-330 (1986); Duncan et al. Nature 332:563 (1988); Canfield i Morrison, J. Exp. Med.

173:1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9036-9040 (1991)). Od ostataka 233-239, P238 i S239 su od onih citiranih kao moguće uključenih u vezivanje. Druge prethodno citirane oblasti koje su moguće uključene u vezivanje za FcγR su: G316-K338 (humani IgG) za humani FcγRI (samo preko poređenja sekvence; nisu procejneni supstitucioni mutanti) (Woof et al. Molec Immunol.23:319-330 (1986)); K274-R301 (humani IgG1) za humani FcγRIII (based na osnovu peptida) (Sarmay et al. Molec. Immunol. 21:43-51 (1984)); i Y407-R416 (humani IgG) za humani FcγRIII (na osnovu peptida) (Gergely et al. Biochem. Soc. Trans.12:739-743 (1984) i Shields et al. J Biol Chem 276: 6591-6604 (2001), Lazar GA et al. Proc Natl Acad Sci 103: 4005-4010 (2006). Ovi i drugi delovi lanaca ili regioni aminokiselinskih ostataka uključenih u vezivanje FcR mogu biti ogičledni stručnjaku iz ispitivanje kristalnih struktura Ig-FcR kompleksa (videti, npr., Sondermann et al. 2000 Nature 406(6793):267-73 i Sondermann et al. 2002 Biochem Soc Trans. 30(4):481-6). Shodno tome, anti-CD154 antitela prema predmetnom pronalasku uključuju modifikaciju jednog ili više prethodno pomenutih ostataka.

[0170] Drugi poznati pristupi za smanjivanje mAb efektorne funkcije uključuju mutiranje aminokiselina na površini mAb koje su uključene u efektorne interakcije vezivanja (Lund, J., et al. (1991) J. Immunol. 147(8): 2657-62; Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem.276(9): 6591-604; i korišćenje kombinacija različitih segmenata subtipa sekvence (npr., IgG2 i IgG4 kombinacije) da bi se dobila veća redukcija vezivanja vezivanja za Fcγ receptore nego sa bilo kojim zasebnim subtipom (Armour et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-1624; Mol. Immunol. 40 (2003) 585-593).

[0171] Veliki broj Fc varijanti sa izmenjenim i/ili smanjenim afinitetima za neke ili sve subtipove Fc receptora (i stoga za efektorne funkcije) su poznati u tehnici. Videti, npr., US 2007/0224188; US 2007/0148171; US 2007/0048300; US 2007/0041966; US 2007/0009523; US 2007/0036799; US 2006/0275283; US 2006/0235208; US 2006/0193856; US 2006/0160996; US 2006/0134105; US 2006/0024298; US 2005/0244403; US 2005/0233382; US 2005/0215768; US 2005/0118174; US 2005/0054832;US 2004/0228856; US 2004/132101;US 2003/158389; videti takođe US 7,183,387; 6,737,056; 6,538,124; 6,528,624; 6,194,551; 5,624,821; 5,648,260.

[0172] Kod CDC, antitelo-antigen kompleks vezuje komplement, što rezultuje u aktivaciji kaskade komplementa i generisanju kompleksa za napad na membranu. Aktivacija klasičnog komplement puta je inicirana vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za antitela (odgovarajuće potklase) koja su vezana za njihov srodni antigen; stoga aktivacija kaskade komplementa je delimično regulisana afinitetom vezivanja imunoglobulina za C1q protein. Da bi se aktivirala kaskada komplementa, neophodno je da se C1q veže za najmanje dva molekula od IgG1, IgG2, ili IgG3, ali samo jedan molekul IgM, prikačen za ciljni antigen (Ward i Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995) p.80). Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC analiza, npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

[0173] Pretpostavljeno je da su različiti ostaci IgG molekula uključeni u vezivanje sa C1q uključujući Glu318, Lys320 i Lys322 ostatke na CH2 domenu, aminokiselinski ostatak 331 lociran na zavoju blizu istog beta lanca, Lys235 i Gly237 ostaci locirani u donjem regionu zgloba, i ostaci 231 do 238 locirani u N-termininalnom regionu CH2 domena (videti npr., Xu et al., J. Immunol. 150:152A (Abstract) (1993),WO94/29351; Tao et al, J. Exp. Med., 178:661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol., 24:2542-47 (1994); Burton et al; Nature, 288:338-344 (1980); Duncan i Winter, Nature 332:738-40 (1988); Idusogie et al J Immunol 164: 4178-4184 (2000; U.S. 5,648,260, i U.S.5,624,821). Kao primer u IgG1, dve mutacije u COOH termininalnom regionu CH2 domena humanog IgG1-K322A i P329A ne aktiviraju CDC put i pokazano je da rezultuju u više od 100 puta manjem vezivanju C1q (US 6,242,195).

[0174] Stoga, u određenim primerima izvođenja pronalaska, jedan ili više od ovih ostataka može biti modifikovano, supstituisano, ili uklonjeno ili jedan ili više aminokiselinskih ostataka može biti inseriran da bi se smanjila CDC aktivnost CD154 antitela obezbeđenih ovde. Na primer u nekim primerima izvođenja, može biti poželjno smanjiti ili eliminisati efektornu funkciju (funkcije) predmetnih antitela da bi se smanjio ili eliminisao potencijal dodatnog aktiviranja imunih odgovora. Antitela sa smanjenom efektornom funkcijom mogu takođe smanjiti rizik od tromboemboličkih događaja kod subjekata koji primaju antitela.

[0175] U određenim drugim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD154 antitelo koje pokazuje smanjeno vezivanje za jedan ili više FcR receptora ali koje zadržava njegovu sposobnost da veže komplement (npr., u sličnom ili, u nekim primerima izvođenja, manjem stepenu od nativnog, ne-varijantnog, ili ishodnog anti-CD 154 antitela). Shodno tome, anti-CD 154 antitelo prema predmetnom pronalasku može vezati i aktivirati komplement uz pokazivanje smanjenog vezivanja za FcR, kao što je, na primer, FcγRIIa (npr., FcγRIIa eksprimirani na trombocitima). Takva antitelo sa smanjenim ili bez vezivanja za FcγRIIa (kao što je FcγRIIa eksprimiran na trombocitima, na primer) ali koja mogu vezati C1q i aktivirati kaskadu komplementa najmanje do nekog stepena smanjiće rizik od tromboembiličkih događaja uz zadržavanje možda željenih efektornih funkcija. U alternativnim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo prema predmetnom pronalasku pokazuje smanjeno vezivanje za jedan ili više FcRs ali zadržava njegovu sposobnost da vezuje jedan ili više drugih FcRs. Videti, na primer, US 2007-0009523, 2006-0194290, 2005-0233382, 2004-0228856, i 2004-0191244, koji opisuju različite modifikacije aminokiselina koje stvaraju antitela sa smanjenim vezivanjem za FcRI, FcRII, i/ili FcRIII, kao i supstitucije aminokiselina koje rezultuju u povećanom vezivanju za jedan FcR ali smanjenim vezivanjem za drugi FcR.

[0176] Shodno tome, efektorne funkcije koje uključuju konstantni region anti-CD154 antitela mogu se modulisati sa menjanjem osobina konstantnog regiona, i naročito Fc regiona. U određenim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom je poređeno sa drugim antitelom sa efektornom funkcijom i koja mogu biti ne-varijantno, nativno, ili ishodno antitelo (npr., antitelo 342 ili antitelo 5c8, koje je opisano u US 5,474,771) koje sadrži nativni konstantni ili Fc region koji posreduje u efektornoj funkciji. U specifičnim primerima izvođenja, modulacija efektorne funkcije uključuje situacije u kojima je aktivnost ukinuta ili u potpunosti nedostaje.

[0177] Nativna sekvenca Fc ili konstantnog regiona sadrži aminokiselinsku sekvencu identičnu sa aminokiselinskom sekvencom Fc ili lanca konstantnog regiona koji se nalazi u prirodi. Poželjno, kontrolni molekul koji se koristi za procenu relativne efektorne funkcije sadrži isti tip/subtip Fc regiona kao što ima test ili varijanta antitela. Varijanta ili izmenjeni Fc ili konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one kod nativne sekvence regiona teškog lanca najmanje po jednoj aminokiselinskoj modifikaciji (kao što je, na primer, post-translaciona modifikacija, aminokiselinska supstitucija, insercija, ili delecija). Shodno tome, varijanta konstantnog regiona može sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili insercija koje rezultuju u izmenjenim post-translacionim modifikacijama, uključujući, na primer, izmenjeni obrazac glikozilacije. Ishodno antitelo ili Fc region je, na primer, varijanta koja ima normalnu efektornu funkciju korišćenu za konstruisanje konstantnog regiona (tj., Fc) sa izmenjenom, npr., smanjenom, efektornom funkcijom.

[0178] Antitela sa izmenjenom (npr., smanjenom ili eliminisanom) efektornom funkcijom (funkcijama) može se generisati inženjeringom ili proizvodnjom antitela sa varijantom konstantnih, Fc, ili regiona teškog lanca. Može se koristiti tehnologija rekombinantne DNK i/ili kultura ćelija i ekspresioni uslovi da se proizvedu antitela sa izmenjenom funkcijom i/ili aktivnošću. Na primer, tehnologija rekombinantne DNK može se koristiti da se inženjeringom stvori jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili insercija u regionima (kao što su, na primer, Fc ili konstantni regioni) koji utiču na funkciju antitela uključujući efektorne funkcije. Alternativno, promene u post-translacionim modifikacijama, kao što su, npr. obrasci glikozilacije (videti u nastavku), mogu se postići manipulacijom ćelije domaćina i kulture ćelija i ekspresionih uslova kojima je proizvedeno antitelo.

[0179] Aminokiselinske izmene, kao što su aminokiselinske supstitucije, mogu izmeniti efektornu funkciju anti-CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku bez uticaja na afinitet vezivanja antigena. Aminokiselinske supstitucije opisane prethodno (npr., Glu318, Kys320, Lys332, Lys235, Gly237, K332, i P329), na primer, mogu se koristiti da se generišu antitela sa smanjenom efektornom funkcijom.

[0180] U drugim primerima izvođenja, aminokiselinske supstitucije mogu se napraviti za jednu ili više od sledećih aminokiselinskih ostataka: 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, i 322 konstantnog regiona teškog lanca (videti US 5,624,821 i US 5,648,260). Takve supstitucije mogu izmeniti efektornu funkciju uz zadržavanje antigen vezujuće aktivnosti. Izmena na jednoj ili više aminokiselina 234, 235, 236, i 237 može smanjiti afinitet vezivanja Fc regiona za FcγRI receptor u poređenju sa nemodifikovanim ili ne-varijantnim antitelom. Aminokiselinski ostaci 234, 236, i/ili 237 mogu se supstituisati sa alaninom, na primer, i aminokiselinski ostatak 235 može se supstituisati sa glutaminom, na primer. U sledećem primeru izvođenja, anti-CD154 IgG1 antitelo može sadržati supstituciju Leu na položaju 234 sa Ala, supstituciju Leu na položaju 235 sa Glu, i supstituciju Gly na položaju 237 sa Ala.

[0181] Dodatno ili alternativno, Fc aminokiselinski ostaci na 318, 320, i 322 mogu biti izmenjeni. Ovi aminokiselinski ostaci, koji su visoko konzervativni u mišjim i humanim IgGs, posreduju u vezivanju komplementa. Pokazano je da izmena aminokiselinskih ostataka smanjuje C1q vezivanje ali ne menja vezivanje antigena, vezivanje proteina, ili psosobnost Fc da se vezuje za mišje makrofage.

[0182] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD154 antitelo prema predmetnom pronalasku je IgG4 imunoglobulin koji sadrži supstitucije koje smanjuju ili eliminišu efektornu funkciju. IgG4 Fc deo anti-CD 154 antitela prema pronalasku može sadržati jednu ili više od sledećih supstitucija: supstitucija prolina glutamatom na ostatku 233, alanina ili valina fenilalaninom na ostatku 234 i alanin ili glutamat leucinom na ostatku 235 (EU numerisanje, Kabat, E. A. et al. (1991), supra). Dodatno, uklanjanje N-vezanog glikozilacionog mesta u IgG4 Fc regionu supstitucijom Ala sa Asn na ostatku 297 (EU numerisanje) može dodatno smanjiti efektornu funkciju i eliminisati bilo koju efektornu aktivnost koja može postojati. Drugi primer IgG4 mutanta sa smanjenom efektornom funkcijom je varijanta IgG4 subtipa koja sadrži mutacije S228P i L235E (PE mutacija) u konstantnom regionu teškog lanca. Ova mutacija rezultuje u smanjenoj efektornoj funkciji. Videti US 5,624,821 i US 5,648,260. Drugi primer mutacije u IgG4 kontekstu koji smanjuje efektornu funkciju je S228P/T229A, kao što je ovde opisano.

[0183] Drugi primeri promena aminokiselinske sekvence u konstantrnom regionu uključuju ali nisu ograničeni na Ala-Ala mutaciju opisanu od strane Bluestone et al. (videti WO 94/28027 i WO 98/47531; takođe videti Xu et al. 2000 Cell Immunol 200; 16-26). Stoga u određenim primerima izvođenja, mogu se koristiti anti-CD154 antitela sa mutacijama unutar konstantnog regiona uključujući Ala-Ala mutaciju za smanjenje ili ukidanje efektorne funkcije. Prema ovim primerima pronalaska, konstantni region anti-CD 154 antitela sadrži mutaciju u alanin na položaju 234 ili mutaciju u alanin na polođžaju 235. Dodatno, konstantni region može sadržati dvostruku mutaciju: mutaciju u alanin na položaju 234 i drugu mutaciju u alanin na položaju 235.

[0184] U jednom primeru izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži IgG4 okvirni region, naznačeno time da će Ala-Ala mutacija opisivati mutaciju (mutacije) od fenilalanina u alanin na položaju 234 i/ili mutaciju leucina u alanin na položaju 235. U sledećem primeru izvođenja, anti-CD154 antitelo sadrži IgG1 okvirni region, naznačeno time da će Ala-Ala mutacija opisati mutaciju (mutacije) leucina u alanin na položaju 234 i/ili mutaciju leucina u alanin na položaju 235. Anti-CD154 antitelo može alternativno ili dodatno nositi druge mutacije, uključujući tačkastu mutaciju K322A u CH2 domen (Hezareh et al. 2001 J Virol.

75: 12161-8).

[0185] Drugi primeri aminokiselinskih supstitucija su obezbeđeni u WO 94/29351 (koja je uključena ovde na osnovu reference u celini), koja navodi antitela koja imaju mutacije u N-termininalnom regionu CH2 domena koje menjaju sposobnost antitela da se vezuje za FcRI, čime se smanjuje sposobnost antitela da se vezuju za C1q što zauzvrat smanjuje sposobnost antitela da fiksiraju komlement. Takođe videti Cole et al. (J. Immunol. (1997) 159: 3613-3621), koij opisuje mutacije u gornjim CH2 regionima u IgG2 koje rezultuju u manjem FcR vezivanju.

[0186] Postupci za generisanje bilo koje od prethodno pomenutih varijanti antitela koje sadrže aminokiselinske supstitucije su dobro poznati u tehnici. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, pripremu na mesto usmerene (ili posredovane oligonukleotidom) mutageneze, PCR mutageneze, i kasetne mutageneze pripremljenog DNK molekula koji kodira antitelo ili najmanje konstantni region antitela.

[0187] Mutageneza usmerena na mesto je dobro poznata u tehnici (videti, npr., Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) i Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1987)).

[0188] PCR mutageneza je takođe pogodna za stvaranje varijanti aminokiselinske sekvence od početnog polipeptida. Videti Higuchi, u PCR Protocols, pp.177-183 (Academic Press, 1990); i Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989).

[0189] Sledeći postupak za pripremanje varijanti sekvence, kasetna mutageneza, je zasnovana na tehnici opisanoj od strane Wells et al., Gene 34:315-323 (1985).

[0190] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom u kome je Fc region antitela, ili njegovi delovi, zamenjeni sa Fc regionom (ili sa njegovim delovima) sa prirodno smanjenom aktivnošću indukovanja efektorne funkcije. Na primer, humani IgG4 konstantni region pokazuje smanjenu ili ne pokazuje aktivaciju komplementa. Dodatno, različiti IgG molekuli se razlikuju po njihovom afinitetu vezivanja za FcR, što može biti usled najmanje delimično različite dužine i fleksibilnosti zglobnih regiona IgG (koja se smanjuje redosledom IgG3>IgG1>IgG4>IgG2).

Na primer, IgG4 pokazuje smanjenu ili nema vezivanja za FcγRIIa. Za primere himernih molekula i himernih konstantnih regiona, videti, npr., Gillies et al. (Cancer Res. 1999, 59: 2159-2166) i Mueller et al. (Mol. Immunol. 1997, 34: 441-452).

[0191] Pronalazak se takođe odnosi na anti-CD 154 antitela sa smanjenom efektornom funkcijom u kojima potpuno nedostaje Fc region. Takva antitela se takođe mogu označiti kao derivati antitela i antigen-vezujućih fragmenata prema predmetnom pronalasku. Takvi derivati i fragmenti mogu se fuzionisati sa ne-antitelo sekvencama proteina ili ne-proteinskim strukturama, naročito strukturama dizajniranim da olakšaju isporuku i/ili bioraspoloživost kad se primenjuju na životinju, npr., humani subjekat (videti u nastavku).

[0192] Kao što je prethodno razmatrano, promene unutar zglobnog regiona takođe utiču na efektorne funkcije. Na primer, delecija zglobnog regiona može smanjiti afinitet za Fc receptore i može smanjiti aktivaciju komplementa (Klein et al. 1981 PNAS USA 78: 524-528). Predmetno otkriće se stoga takođe odnosi na antitela sa izmenama u zglobnom regionu.

[0193] U specifičnim primerima izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku mogu se modifikovati da inhibiraju komplement zavisnu citotoksičnost (CDC). Modulisana CDC aktivnost se može postići introdukcijom jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija, ili delecija u Fc regionu antitela (videti, npr., US 6,194,551 i US 6,242,195). Alternativno ili dodatno, može se uvesti cisteinski ostatak (ostaci) u Fc region, čime se omogućava formiranje interlančane disulfidne veze u ovom regionu. Na taj način generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu ili smanjenu sposobnost internalizacije i/ili povećano ili smanjeno komplementom posredovano ubijanje ćelija. Videti Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992), WO 99/51642, Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); US 5,648,260; US 5,624,821; i WO 94/29351.

[0194] Dodatno se podrazumeva da efektorna funkcija može varirati u skladu sa afinitetom vezivanja antitela. Na primer, antitela sa visokim afinitetom mogu biti efikasnija u aktivaciji sistema komplementa u poređenju sa antitelima sa relativno niskim afinitetom (Marzocchi-Machado et al. 1999 Immunol Invest 28: 89-101). Shodno tome, antitelo se može izmeniti tako da je smanjen afinitet vezivanja za njegov antigen (npr., promenom varijabilnih regiona antitela postupcima kao što je supstitucija, adicija, ili delecija jednog ili više aminokiselinskih ostataka). Antitelo sa smanjenim afinitetom vezivanja može pokazivati smanjene efektorne funkcije, uključujući, na primer, smanjenu ADCC i/ili CDC.

[0195] Anti-CD 154 antitela prem apredmetnom pronalasku sa smanjenom efektornom funkcijom uključuju antitela sa smanjenim afinitetom vezivanja za jedan ili više Fc receptora (FcRs) u odnosu na ishodno ili ne-varijantno anti-CD 154 antitelo. Shodno tome, anti-CD 154 antitela sa smanjenim afinitetom vezivanja za FcR uključuju anti-CD154 antitela koja pokazuju 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 4-puta, ili 5-puta ili veće smanjenje vezujuće aktivnosti za jedan ili više Fc receptora u poređenju sa ishodnim ili ne-varijantnim anti-CD154 antitelom (npr., antitelo 342 ili 5c8). U nekim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom se vezuje za FcR sa oko 10-puta manjim afinitetom u odnosu na ishodno ili ne-varijantno antitelo. U drugim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom vezuje se za FcR sa oko 15-puta manjim afinitetom ili sa oko 20-puta manjim afinitetom u odnosu na ishodno ili ne-varijantno antitelo. FcR receptor može biti jedan ili više od FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), i FcγRIII, i njihovih izoformi, i FcεR, FcmR, FcδR, i/ili FcaR. U psecifičnim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom pokazuje 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 4-puta, ili 5-puta ili veće smanjenje u vezujućoj aktivnosti za FcγRIIa.

[0196] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo prema predmetnom pronalasku pokazuje smanjeno vezivanje za protein komeplementa u odnosu na drugo anti-CD 154 antitelo. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo prema pronalasku pokazuje smanjeno vezivanje sa fatorom od oko 1.5-puta ili više, oko 2-puta ili više, oko 3-puta ili više, oko 4-puta ili više, oko 5-puta ili više, oko 6-puta ili više, oko 7-puta ili više, oko 8-puta ili više, oko 9-puta ili više, oko 10-puta ili više, ili oko 15-puta ili više, u odnosu na drugo anti-CD154 antitelo.

[0197] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja izazivaju smanjenu efektornu funkciju kada su primenjena na subjekta. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo prema predmetnom pronalasku ne izaziva trombozu kod subjekta na koga je antitelo primenjeno. Tromboza uključuje, na primer, tromboemboličke događaje. Takvi događaji uključuju, npr., vaskulopatiju (npr., vaskularne promene kao što je zadebljanje intime i promene zida krvnog suda). U nekim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo prema predmetnom pronalasku izaziva manje tromboemboličkih događaja u odnosu na drugo CD154-specifično antitelo (npr., antitelo 342, antitelo 5c8 ili humanizovano 5c8). Anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom može pokazivati 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, ili 50% smanjenja u broju tromboembioličkih događaja kada je primenjeno na subjekta i u poređenju sa ne-varijantnim ili ishodnim anti-CD 154 antitelom.

[0198] U određenim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo prema ovom pronalasku ne izaziva agregaciju trombocita ili aktivaciju in vitro i/ili poboljšava agregaciju trombocita ili aktivaciju do manjeg stepena u poređenju sa drugim CD 154-specifičnim antitelom (npr., antitelo 5c8 ili humanizovano 5c8; videti Primer 1). Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, prisustvo CD 154 vezujućeg proteina, npr., anti-CD 154 antitela, prema predmetnom pronalasku u standardnoj analizi agregacije ili aktivacije trombocita ne rezultuje u agregaciji ili aktivaciji više od 20%, 25%, 30% ili 50% preko agregacije ili kativacije uočene u analizi negativne kontrole. Primer standardne analize agregacije trombocita je analiza opisana ovde (Primer 11, Analiza 1) i prikazana na Slici 26. I standardna analiza i alternativna analiza agregacije trombocita (Analiza 2, Slika 27) koje se mogu koristiti u pronalasku opisane su u Primeru 11. CD154 vezujući protein može biti rastvorljiv.

[0199] U određenim primerima izvođenja, predemtni pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD 154 antitelo koje sadrži jedan varijabilni domen imunoglobulina koji se specifično i monovalentno vezuje za CD40L, naznačeno time da vezivanje pomenutog rastvorljivog proteina za CD154 značajno ne indukuje JNK fosforilaciju u Jurkat T-ćelijama. Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD 154 antitelo koje sadrži jedan variablni domen imunoglobulina koji se specifično i monovalentno vezuje za CD154, naznačeno time da vezivanje pomenutog rastvorljivog proteina za CD154 značajno ne indukuje IFN-gama sekreciju od strane Jurkat T-ćelija kostimulisanih sa anti-CD3 antitelom.

[0200] Određeni primeri izvođenja predmetnog otkrića odnose se na anti-CD154 antitelo koje sadrži jednu ili više CDR sekvenci teškog lanca izabranih od DR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5), naznačeno time da antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili sihodnim Fc regionom. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži najmanje dva CDRs, i u drugim primerima izvođenja antitelo sadrži svetri CDR sekvence teškog lanca, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

[0201] Drugi primeri izvođenja predmetnog otkrića odnose se na anti-CD 154 antitelo koje sadrži jednu ili više CDR sekvenci lakog lanca izabranih od CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8), pri čemu antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koji daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži najmanje dva CDRs lakog lanca, i u drugim primerima izvođenja antitelo sadrži sve tri CDR sekvence lakog lanca, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDRL2 (SEQ ID NO: 7) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 8).

[0202] U sledećim primerima izvođenja predmetnog otkrića, anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom sadrži sve tri CDR sekvence lakog lanca, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 6), CDR-L2 (SEQ ID NO: 7) i CDRL3 (SEQ ID NO: 8), i sadrži sve tri CDR sekvence teškog lanca, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 3), CDR-H2 (SEQ ID NO: 4) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 5).

[0203] U određenim primerima izvođenja, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD154 antitelo koje specifično vezuje CD154 protein, naznačeno time da antitelo sadrži VH sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11. U određenim drugim primerima izvođenja, predmetno otkriće obezbeđuje antitelo koje specifično vezuje CD154 protein, naznačeno time da antitelo sadrži sekvencu teškog lanca izabranu od SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo koje sadrži bilo koje jednu ili više CDRs sekvenci ili sekvence teškog ili lakog lanca opisane prethodno je Fab ili Fab’ fragment ili njegov derivat. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je F(ab’)2 fragment ili njegov derivat. Takođe su uključeni drugi fragmenti antitela ili njihovi derivati koi sadrže CDRs sekvence ili sekvence teškog ili lakog lanca koji specifično vezuju CD154 protein. Ova antitela se mogu modifikovati zako da izazivaju smanjenu ili ne izazivaju efektorne funkcije. Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži VH sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u odnosu na nativni ili ishodni Fc region.

[0204] U drugim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži VL sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 14, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koji daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom.

[0205] U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 2. U dodatnim primerima izvođenja, antitelo koje sadrži SEQ ID NO: 2 je Fab ili Fab’ fragment ili njegov derivat. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je F(ab’)2 fragment ili njegov derivat. Drugi fragmenti antitela ili njihovi derivati koji sadrže CDRs sekvence ili sekvence teškog ili lakog lanca koje specifično vezuju CD154 protein su takođe uključene.

[0206] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži VL sekvencu izabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 14 i dodatno sadrži VH sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom.

[0207] U drugim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži VH sekvencu od SEQ ID NO: 29 i VL sekvencu od SEQ ID NO: 30, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom.

[0208] U određenim primerima izvođenja, predmetno otkriće obezbeđuje anti-CD 154 antitelo koje specifično vezuje CD154 protein, naznačeno time da antitelo sadrži sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 15. U sledećim primerima izvođenja, antitelo koje sadrži sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 15 dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom (npr., Fc region sa izmenjenom glikozilacijom i/ili drugom modifikacijom).

[0209] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak odnosi se na anti-CD 154 antitelo koje sadrži sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 15 i sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom (npr., Fc region sa izmenjenom glikozilacijom i/ili drugom modifikacijom).

[0210] U određenim primerima izvođenja, otkriće obezbeđuje anti-CD 154 antitelo koje sadrži sekvencu lakog lanca datu u SEQ ID NO: 2 ili 14 i sekvencu teškog lanca kao što je dato u SEQ ID NO: 1, 9, 10 ili 11. U nekim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo može biti fragment antitela. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je Fab ili Fab’ fragment ili njegov derivat. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je F(ab’)2 fragment ili njegov derivat. Drugi fragmenti antitela ili njihovi derivati koji sadrže CDRs sekvence ili sekvence teškog ili lakog lanca koje specifično vezuju CD154 protein su takođe uključeni. Dodatno, antitela mogu pokazivati smanjenu efektornu funkciju. Na primer, antitela koja sadrže Fc region mogu sadržati Fc region sa jednom ili više modifikacija (npr., izmenjena glikozilacija, konjugacija, itd.) tako da antitelo izaziva smanjeni ili ne izaziva efektornu funkciju (funkcije).

[0211] U drugim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 15 i sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 13, naznačeno time da antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom. U drugim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 15 i sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 12, naznačeno time da antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom.

[0212] U nekim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži jednu ili ili više CDR sekvenci teškog lanca izabranog od CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44), antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži najmanje dva CDRs teškog lanca, i u drugim primerima izvođenja antitelo sadrži sve tri CDR sekvence teškog lanca, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44).

[0213] U određenim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži jednu ili više CDR sekvenci lakog lanca izabranih od CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži najmanje dve CDRs sekvence lakog lanca, i u drugim primerima izvođenja antitelo sadrži sve tri CDR sekvence lakog lanca, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDRL2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47).

[0214] Dodatni primeri izvođenja predmetnog otkrića odnose se na anti-CD154 antitelo koje sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom, naznačeno time da antitelo sadrži sve tri CDR sekvence lakog lanca, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 45), CDR-L2 (SEQ ID NO: 46) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 47), i naznačeno time da antitelo sadrži sve tri CDR sekvence teškog lanca, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 42), CDR-H2 (SEQ ID NO: 43) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 44).

[0215] U drugim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži jednu ili više CDR sekvenci teškog lanca izabrane od CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50), antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo sadrži najmanje dva od CDRs teškog lanca, i u drugim primerima izvođenja antitelo sadrži sve tri CDR sekvence teškog lanca, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

[0216] U određenim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži jednu ili više CDR sekvenci lakog lanca izabrane od CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom. U sledećim primerima izvođenja, antitelo sadrži najmanje dva CDRs lakog lanca, i u drugim primerima izvođenja antitelo sadrži sve tri CDR sekvence lakog lanca, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53).

[0217] U određenim primerima izvođenja, anti-CD154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom sadrži sve tri CDR sekvence lakog lanca, koje su CDR-L1 (SEQ ID NO: 51), CDR-L2 (SEQ ID NO: 52) i CDR-L3 (SEQ ID NO: 53), i dodatno sadrži sve tri CDR sekvence teškog lanca, koje su CDR-H1 (SEQ ID NO: 48), CDR-H2 (SEQ ID NO: 49) i CDR-H3 (SEQ ID NO: 50).

[0218] U sledećim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje anti-CD 154 antitelo koje specifično vezuje CD154, naznačeno time da antitelo sadrži VL sekvence SEQ ID NO: 54. Otkriće se takoše odnosi na anti-CD 154 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 56. Anti-CD154 antitelo otkrića može sadržati i VL sekvencu SEQ ID NO: 54 i VH sekvencu SEQ ID NO: 56. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je Fab ili Fab’ fragment ili njegov derivat. U sledećim primerima izvođenja, antitelo ili fragment antitela je F(ab’)2 fragment ili njegov derivat. Antitelo ili fragment može biti humanizovano ili potpuno humano antitelo ili njegov fragment. Određeni primeri izvođenja prema predmetnom otkriću odnose se na anti-CD154 antitelo koje sadrži VH sekcvencu od SEQ ID NO: 56 i VL sekvencu od SEQ ID NO: 54, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom.

[0219] U sledećim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje anti-CD 154 antitelo koje specifično vezuje CD154, naznačeno time da antitelo sadrži VL sekvencu od SEQ ID NO: 58. U dodatnim primerima izvođenja, antitelo sadrži VH sekvencu od SEQ ID NO: 60. U sledećim primerima izvođenja, antitelo ili fragment sadrži VH sekvencu od SEQ ID NO: 60 i VL sekvencu od SEQ ID NO: 58. antitelo može biti Fab ili Fab’ fragment ili njegov derivat. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je F(ab’)2 fragment ili njegov derivat. Antitelo može takođe biti humanizovano ili potpuno humano antitelo ili njegov fragment. U drugim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na anti-CD154 antitelo koje sadrži VH sekvencu od SEQ ID NO: 58 i VL sekvencu od SEQ ID NO: 60, antitelo dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa nativnim ili ishodnim Fc regionom.

Anti-CD 154 antitela sa izmenjenom glikozilacijom

[0220] Uklanjanje glikana proizvodi strukturnu promenu koja bi trebalo da veoma smanji vezivanje za sve članove Fc receptor familije između vrsta. U glikozilovanim antitelima, uključujući anti-CD 154 antitela, glikani (oligosaharidi) vezani za konzervativno N-vezano mesto u CH2 domenima Fc dimera su zatvoreni između CH2 domena, sa ostacima šećera koji stvaraju kontakt sa specifičnim aminokiselinskim ostacima na suprotnom CH2 domenu.

Različiti obrasci glikozilacije su povezani sa različtim biološkim osobinama antitela (Jefferis i Lund, 1997, Chem. Immunol., 65: 111-128; Wright i Morrison, 1997, Trends Biotechnol., 15: 26-32). Određene specifične glikoforme daju potencijalno povoljnije biološke osobine. Gubitak glikana menja razmak između domena i povećava njihovu međusobnu pokretljivost i očekivano je da ima inhibitorni efekat na vezivanje svih članova Fc receptor familije. Na primer, in vitro studije sa različitim glikozilovanim antitelima su pokazale da uklanjanje CH2 glikana menja Fc strukturu tako da su vezivanje antitela za Fc receptore i protein komplementa C1Q uveliko smanjeni. Drugi poznati pristup za smanjenje efektornih funkcija je inhibicija proizvodnje ili uklanjanje N-vezanih glikana na položaju 297 (EU numerisanje) u CH2 domenu Fc (Nose et al., 1983 PNAS 80: 6632; Leatherbarrow et al., 1985 Mol. Immunol. 22: 407; Tao et al., 1989 J. Immunol. 143: 2595; Lund et al., 1990 Mol. Immunol.

27: 1145; Dorai et al., 1991 Hybridoma 10:211; Hand et al., 1992 Cancer Immunol. Immunother. 35:165; Leader et al., 1991 Immunology 72: 481; Pound et al., 1993 Mol. Immunol. 30:233; Boyd et al., 1995 Mol. Immunol. 32: 1311). Poznato je takođe da različite glikoforme mogu imati izrazit uticaj na osobine terapeutika, uključujući farmakokinetiku, farmakodinamiku, receptor-interakciju i tkivno-specifično delovanje (Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297). Naročito, za antitela, oligosaharidna struktura može uticati na osobine relaventne za rezistenciju na preoteazu, polu-život antitela posredovan FcRn receptorom, fagocitozu i fidbek antitela, dodatno efektornim funkcijama antitela (npr., vezivanje C1 kompleksa komplementa, koji uključuje CDC, i vezivanje sa FcγR receptorima, koji su odgovorni za modulaciju ADCC puta) (Nose i Wigzell, 1983; Leatherbarrow i Dwek, 1983; Leatherbarrow et al.,1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, PNAS, 89: 4285-4289).

[0221] Shodno tome, drugi načini modulacije efektorne funkcije antitela uključuju izmenu glikozilacije konstantnog regiona antitela. Izmenjena glikozilacija uključuje, na primer, smanjenje ili povećanje u broju glikozilovanih ostataka, promene u obrascu ili lokaciji glikozilovanih ostataka, kao i izmene u strukturi (strukturama šećera). Oligosaharidi koji se nalaze na humanim IgGs utiču na njihov stepen efektorne funkcije (Raju, T.S. BioProcess International April 2003.44-53); Mikroheterogenost humanih IgG oligosaharida može uticati na biološke funkcije kao što su CDC i ADCC, vezivanje za različite Fc receptore, i vezivanje za Clq protein (Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32; Shields et al. J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604; Shields et al. J Biol Chem.2002; 277(30):26733-40; Shinkawa et al. J Biol Chem. 2003 278(5):3466-73; Umana et al. Nat Biotechnol.1999 Feb; 17(2): 176-80). Na primer, sposobnost IgG da vezuje C1q i aktivira kaskadu komplementa može zavisiti od prisustva, odsustva ili modifikacije ugljenohidratnog dela pozicioniranog između dva CH2 domena (koji je normalno usidren na Asn297) (Ward and Ghetie, therapeutic Immunology 2:77-94 (1995).

[0222] Glikozilaciona mesta u polipeptidu koji sadrži Fc, na primer antitelo kao što je IgG antitelo, mogu biti identifikovana standardnim tehnikama. Identifikacija mesta glikozilacije može biti eksperimentalna ili zasnovana na analizi sekvence ili podataka modelovanja. Opisani su konsenzus motivi, odnosno, aminokiselinske sekvence prepoznate od strane različith glikozil transferaza. Na primer, konsenzus motiv za N-vezani glikozilacioni motiv je često NXT ili NXS, gde X može biti aminokiselina izuzev prolina. Nekoliko algoritama za lociranje potencijalnog glikozilacionog motiva je takođe opisano. Shodno tome, da bi se identifikovala potencijalna glikolizaciona mesta unutar antitela ili fragmenta koji sadrži Fc, sekvenca antitela je ispitana, na primer, korišćenjem javno dostupnih baza podataka kao što je internet sajt obezbeđen od strane Center for Biological Sequence Analysis (videti NetNGlyc servise za predviđanje N-vezana glikozilaciona mesta i NetOGlyc servise za predviđanje O-vezanih glikozilacionih mesta).

[0223] In vivo studije su potvrdile redukciju efektorne funkcije aglikozilovanih antitela. Na primer, aglikozilovano anti-CD8 antitelo je nesposobno za depleciju CD8-nosećih ćelija kod miševa (Isaacs, 1992 J. Immunol. 148: 3062) i aglikozilovano anti-CD3 antitelo ne indukuje sindrom oslobađanja citokina kod miševa ili ljudi (Boyd, 1995 supra; Friend, 1999 Transplantation 68:1632).

[0224] Važno je da dok izgleda da uklanjanje glikana u CH2 domenu ima značajan efekat na efektornu funkciju, druge funkcionalne i fizičke osobine antitela ostaju nepromenjene. Specifično, pokazano je da uklanjanje glikana ima mali ili nema efekat na polu život u serumu i vezivanje za antigen (Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol. Immunol. 29:949).

[0225] Iako postoji in vivo validacija aglikozilovanog pristupa, postoje objave rezidualne efektorne funkcije sa aglikozilovanim mAbs (videti, npr., Pound, J. D. et al. (1993) Mol. Immunol. 30(3): 233-41; Dorai, H. et al. (1991) Hybridoma 10(2): 211-7). Armour et al. pokazuju rezidualno vezivanje za FcγRIIa i FcγRIIb proteine (Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-1624; Mol. Immunol.40 (2003) 585-593). Stoga dodatno smanjenje efektorne funkcije, naročito aktivacije komplementa, može biti važno za garantovanje potpune ablacije aktivnosti u nekim slučajevima. Iz tog razloga, aglikozilovane forme IgG2 i IgG4 i G1/G4 hibrida su predviđene kao korisne u postupcima i komepozicijama antitela prema pronalsku koji imaju smanjene efektornih funkcija.

Stvaranje deglikozilovanih ili aglikozilovanih anti-CD 154 antitela

[0226] Anti-CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku nogu biti modifikovana ili izmenjena da izazovu smanjenu efektornu funkciju (funkcije) (u poređenju sa drugim CD154-specifičnim antitelom) uz izborno zadržavanje drugih vrednih atributa Fc dela.

[0227] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na aglikozil anti-CD 154 antitela sa smanjenom efektornom funkcijom, koja su karkaterisana modifikacijom na konzervativnom N-vezanom mestu u CH2 domenima Fc dela antitela. Modifikacija konzervativnog N-vezanog mesta u CH2 domenima Fc dimera može voditi do aglikozil anti-CD154 antitela. Primeri takvih modifikacija uključuju mutaciju konzervativnog N-vezanog mesta u CH2 domenima Fc dimera, uklanjanje glikana vezanih za N-vezano mesto u CH2 domenima, i prevenciju glikozilacije. Na primer, aglikozil anti-CD 154 antitelo može biti stvoreno menjanjem kanonijski N-vezanog Asn mesta u CH2 domenu teškog lanca u Gln ostatak (videti, na primer, WO 05/03175 i US 2006-0193856).

[0228] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, modifikacija sadrži muatciju na glikozilacionom mestu teškog lanca da bi se sprečila glikozilacija na mestu. Stoga, u jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, aglikozil anti-CD 154 antitela su pripremljena muatacijom glikozilacionog mesta teškog lanca, tj., mutacijom N298Q (N297 korišćenjem Kabat EU numerisanja) i eksprimirani u odgovarajućoj ćeliji domaćinu. Na primer, ova mutacija može biti postignuta sledećim protokolom preporučenim od strane proizvođača za komplet za mutagenezu jedinstvenog mesta od Amersham-Pharmacia Biotech® (Piscataway, NJ, USA).

[0229] Mutirano antitelo može biti stabilno eksprimirano u ćeliji domaćinu (npr. NSO ili CHO ćelija) i zatim prečišćeno. Kao jedan primer, prečišćavanje se može izvesti korišćenjem Protein i gel filtracione hromatografije. Stručnjacima će biti jasno da se takođe mogu koristiti dodatni postupci ekspresije i prečišćavanja.

[0230] U sledećem primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, aglikozil anti-CD 154 antitela imaju smanjenu efektornu funkciju, naznačeno time da modifikacija na konzerativnom N-vezanom mestu u CH2 domenu Fc dela pomenutog antitela ili derivata antitela sadrži uklanjanje glikana CH2 domena, tj. , deglikoziilaciju. Ova aglikozilaciona anti-CD 154 antitela mogu se stvoriti konvencionalnim postupcima i zatim deglikozilovana enzimski. Postupci za entimsku deglikozilaciju antitela su dobro poznati stručnjacima (Williams, 1973; Winkelhake & Nicolson, 1976 J. Biol Chem. 251:1074-80.).

[0231] U sledećem primeru izvođenja ovog pronalaska, deglikozilacija može biti postignuta uzgajanjem ćelija domaćina koje proizvode antitela u medijumu kulture koij sadrži inhibitor glikozilacije kao što je tunikamicin (Nose & Wigzell, 1983). Odnosno, modifikacija je smanjenje ili prevencija glikozilacije na konzervativnom N-vezanom mestu u CH2 domenima Fc dela pomenutog antitela.

[0232] U drugim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, rekombinantni CD154 polipeptidi (ili ćelije ili ćelijske membrane koje sadrže takve polipeptide) mogu biti korišćeni kao antigen da se generiše anti-CD 154 antitelo ili derivat antitela, koje zatim može biti glikozilovano.

[0233] U alternativnim primerima izvođenja, aglikozil anti-CD 154 antitela ili anti-CD154 antitela sa smanjenom glikozilacijom prema predmetnom pronalasku, mogu biti proizvedena postupkom opisanim u Taylor et al. (WO 05/18572 i US 2007-0048300). Na primer, u jednom primeru izvođenja, anti-CD154 aglikozil antitelo može biti proizvedeno izmenom prvog aminokiselinskog ostatka (npr., supstitucijom, insercijom, delecijom, ili hemijskom modifikacijom), naznačeno time da izmenjeni prvi aminokiselinski ostatak inhibira glikozilaciju drugog ostatka ili steričkim ometanjem ili naelektrisanjem ili sa oba. U određenim primerima izvođenja, prvi aminokiselinski ostatak je modifikovan aminokiselinskom supstitucijom. U sledećim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija je izabrana iz grupe koja se sastoji do Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Asn, Gln, Trp, Pro, Ser, Thr, Tyr, Cys, Met, Asp, Glu, Lys, Arg, i His. U drugim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija je ne-tradicionalani aminoksielinski ostatk. Drugi aminokiselinski ostatak može biti blizu ili unutar glikozilacionog motiva, na primer, N-vezani glikozilacioni motiv koji sadrži aminokiselinsku sekvencu NXT ili NXS. U jednom primeru izvođenja, prvi aminokiselinski ostatak je aminokiselina 299 i drugi aminokiselinski ostatak je je aminokiselina 297, prema Kabat numeraciji. Na primer, prva aminokiselinska supstitucija može biti T299A, T299N, T299G, T299Y, T299C, T299H, T299E, T299D, T299K, T299R, T299G, T299I, T299L, T299M, T299F, T299P, T299W, i T299V, prema Kabat numeraciji. U određenim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija je T299C.

[0234] Efektorna funkcija može takođe biti smanjena modifikacijom antitela prema predmetnom pronalasku tako da antitelo sadrži blokirajući deo. Primeri blokirajućih delova uključuju delove sa dovoljnom steričkom masom i/ili naelektrisanjem da se dešava smanjena glikozilacija, na primer, blokiranjem sposobnosti glikozidaze da glikoziluje polipeptd. Blokirajući deo može dodatno ili alternativno smanjiti efektornu funkciju, na primer, inhibicijom sposobnosti Fc regiona da vezuje receptor ili protein komplementa. U nekim primerima izvođenja, predmetno otkriće se odnosi na CD154 vezujući protein, npr., anti-CD154 antitelo, koje sadrži CDR3 sekvencu teškog lanca izabranu od SEQ ID NOS: 5, 44 i 50, i varijantu Fc regiona, gde varijanta Fc regiona sadrži prvi aminokiselinski ostatak i N-glikozilaciono mesto, gde prvi aminokiselinski ostatak je modifikovan sa hemijom bočnog lanca da bi se postigla povećana sterička masa ili povećano elektrostatičko naelektrisanje u poređenju sa nemodifikovanim prvim aminokiselinskim ostatkom, čime se smanjuje nivo ili na drugi način menja glikozilacija na N-glikozilacionom mestu. U određenim od ovih primera izvođenja, varijanta Fc regiona daje smanjenu efektornu funkciju u poređenju sa kontrolnim, ne-varijantnim Fc regionom. U sledećim primerima izvođenja, bočni lanac sa povećanom steričkom masom je bočni lanac aminokiselinskog ostataka izabranog iz grupe koja se sastoji od Phe, Trp, His, Glu, Gln, Arg, Lys, Met i Tyr. U sledećim primerima izvođenja, hemija bočnog lanca sa povećanim elektrostatičkim nabojem je bočni lanac aminokiselinskog ostatka izabranog iz grupe koja se sastoji od Asp, Glu, Lys, Arg, i His.

[0235] Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, glikozilacija i Fc vezivanje se može modulisati supstitucijom T299 sa naelektrisanom hemijom bočnog lanca kao što je D, E, K, ili R. Rezultujuće antitelo će imati smanjenu glikozilaciju kao i smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor usled nepovoljnih elktrostatičkih interakcija.

[0236] U sledećem primeru izvođenja, T299C varijanta antitela, koje je i aglikozilovano i sposobno da formira cisteinski adukt, može pokazati manju efektornu funkciju (npr., FcγRI vezivanje) u poređenju sa njegovim aglikozilovanim odgovarajućim antitelom (videti, npr., WO 05/18572). Shodno tome, izmena prve aminokiseline proksimalne u odnosu na glikozilacioni motiv može inhibirati glikozilaciju antitela na drugom aminokiselinskom ostatku; kada je prva aminokiselina cisteinski ostatk, antitelo može pokazati još manju efektornu funkciju. Dodatno, inhibicija glikozilacije antitela IgG4 subtipa može imati dublji uticaj na vezivanje FcyRI u poređenju sa efektima aglikozilacije kod drugih subtipova.

[0237] U dodatnim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na anti-CD154 antitela sa izmenjenom glikozilacijom koja pokazuje vezivanje za jedan ili više FcR receptora i koja izborno takođe pokazuju povećano ili normalno vezivanje za jedan ili više Fc receptora i/ili komplement-npr., antitela sa izmenjenom glikozilacijom koja najmanje zadržava isti ili sličan afinitet vezivanja za jedan ili više Fc receptora i/ili komplement kao nativno, kontrolno anti-CD 154 antitelo). Na primer, anti-CD 154 antitela sa pretežno Man5GlcNAc2N-glikanom kao struktura glikana prisutna (npr., naznačeno time da Man5GlcNAc2N-glikan struktura je prisutna na nivou koji je najmanje oko 5 molski procenata veći od sledeće predominantne glikanske strukture Ig kompozicije) može pokazati izmenjenu efektornu funkciju u poređenju sa populacijom anti-CD 154 antitela naznačeno time da Man5GlcNAc2N-glikanska struktura nije predominantna. Antitela sa predominantnom ovom glikanskom strukturom pokazuju smanjeno vezivanje za FcγRIIa i FcγRIIb, povećano vezivanje za FcγRIIIa i FcγRIIIb, i povećano vezivanje za C1q subjedinicu C1 komleksa (videti US 2006-0257399). Ova glikanska struktura, kada je predominantna glikanska struktura, daje povećanu ADCC, povećanu CDC, povećani polu-život u serumu, povećanu proizvodnju antitela u B ćelijama, i smanjenu fagocitozu od strane makrofaga.

[0238] Generalno, glikozilacione strukture na glikoproteinu će varirati u zavisnosti od ekspresije domaćina i uslova kultivisanja (Raju, TS. BioProcess International April 2003.44-53). Takve razlike mogu dovesti do promena i u efektornoj funkciji i farmakokinetici (Israel et al. Immunology. 1996; 89(4):573-578; Newkirk et al. P. Clin. Exp. 1996; 106(2):259-64). Na primer, galaktozilacija može varirati sa uslovima kulture ćelija, koji mogu učiniti neke imunoglobulinske kompozicije imunogenim u zavisnosti od njihovog specifičnog obrasca galaktoze (Patel et al., 1992. Biochem J. 285: 839-845). Struktura oligosaharida proizvedenih u ne-humanim ćelijama sisara naginju tome da budu blisko srodne onima od humanih glikoproteina. Dodatno, ekspresioni sistemi domaćina mogu biti napravljeni inženjeringom ili izabrani da eksprimiraju predominantnu Ig glikoformu ili alternativno mogu prirodno proizvesti glikoproteine koji imaju predominantne glikanske strukture. Primeri ineženjeringom napravljenih protein ekspresionih sistema domaćina koji proizvode glikoprotein koji ima predominantnu glikoformu uključuju gen nokaut/mutacije (Shields et al., 2002, JBC, 277: 26733-26740); genetički inženjering u (Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17: 176-180) ili kombinaciju oba. Alternativno, određene ćelije prirodno eksprimiraju predominantnu glikoformu – na primer, kokoške, ljudi i krave (Raju et al., 2000, Glycobiology, 10: 477-486). Stoga, ekspresija anti-CD 154 antitela ili kompozicije antitela koja ima izmenjenu glikozilaciju (npr., predominantno jednu specifičnu glikansku strukturu) mogu se dobiti od strane stručnjaka selekcijom najmanje jednog od mnogih ekspresionih sistema domaćina. Protein ekspresioni sistemi domaćina koji se mogu koristiti za proizvodnju anti-CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku uključuju životinje, biljke, insekte, bakterijske ćelije i slično. Na primer, US 2007-0065909, 2007-0020725, i 2005-0170464 opisuju proizvodnju aglikozilovanih imunoglobulinskih molekula u ćelijama bakterija. Kao dodatni primer, Wright i Morrison su proizveli antitela u CHO ćelijskoj liniji deficijentnoj u glikozilaciji (1994 J Exp Med 180: 1087-1096) i pokazali da su antitela proizvedena u ovoj ćelijskoj liniji bila nesposobna za komlement-posredovanu citolizu. Drugi primeri ekspresionih sistema domaćina koji se mogu naći u tehnici za proizvodnju glikoproteina uključuju: CHO ćelije: Raju WO 99/22764 i Presta WO 03/35835; hibridoma ćelije: Trebak et al., 1999, J. Immunol. Methods, 230: 59-70; ćelije insekata: Hsu et al., 1997, JBC, 272:9062-970, i biljne ćelije: Gerngross et al., WO 04/74499. Do stepena do kog je data ćelija ili ekstrakt rezultovao u glikozilaciji datog motiva, dostupne su tehnike prepoznate u tehnici za određivanje da li je motiv glikozilovan, na primer, korišćenjem gel elektroforeze i/ili masena spektroskopija.

[0239] Dodatni postupci za izmenu glikozilacionih mesta antitela opisani su, npr., u US 6,350,861 i US 5,714,350, WO 05/18572 i WO 05/03175; ovi postupci se mogu koristiti da se proizvedu anti-CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku sa izmenjenim, smanjenim, ili bez glikozilacije.

[0240] Aglikozil anti-CD 154 antitela sa smanjenom efektornom funkcijom mogu biti antitela koja sadrže modifikacije ili koja mogu biti konjugovana da sadrže funkcionalni deo. Takvi delovi uključuju blokirajući deo (npr., PEG deo, cistein adukt, itd.), detektabilni deo (npr., fluorescentne delove, radioizotopske delove, radioneprovidne delove, itd., uključuju dijagnostičke delove), i/ili terapeutski deo (npr., citotksična sredstva, anti-infalmatorna sredstva, imunomodulatorna sredstva, anti-infektivna sredstva, anti-kancer sredstva, antineurodegenerativna sredstva, radionuklide, itd.).

Konjugati antitela

[0241] Kada su primenjena, antitela se često izlučuju rapidno iz cirkulacije i stoga mogu izazvati relativno kratkotrajnu farmakološku aktivnost. Kao posledica toga, mogu biti neophodne česte injekcije relativno velikih doza antitela da bi se održala terapeutska efikasnost tretmana antitelom.

[0242] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitela prema predmetnom pronalasku mogu bit antitela modifikovana (npr., vezana za druge delove kao što je heterologni funkcionalni deo) da bi se povećao integrite i dugotrajnost antitela in vivo. Na primer, anti-CD154 antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti antitela koaj su modifikovana da uključe deo (funkcionalni deo) koji može povećati stabilizaciju, čime se produžava polu-život antitela u serumu. Polu-život CD154 vezujućeg proteina u serumu, npr., antitela, prema pronalasku može biti najmanje 3 dana, najmanje 7 dana, najmanje 14 dana, najmanje 21 dana, najmanje 28 dana, najmanje 1 mesec ili više. Takvi funkcionalni delovi koji povećavaju polu-život antitela mogu biti naročito korisni u primerima izvođenja gde antitelo je fragment antitela, na primer.

[0243] Modifikacije antitela mogu takođe povećati rastvorljivost proteina u vodenom rastvoru, eliminisati agregaciju, povećati fizičku i hemijsku stabilnost proteina, i veoma smanjiti imunogenost i antigenost proteina. Kao rezultat, željena in vivo biološka aktivnost može biti postignuta primenom takvih polimer protein adukata ređe ili u manjim dozama nego sa nemodifikovanim proteinom.

[0244] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, antitela prema pronalasku su antitela vezana za heterologne funkcionalne delove da bi formirale konjugate antitela. "Funkcionalni deo" odnosi se na bilo koji funkcionalni deo (npr., polipeptid, proteinski domen, nosač, polimer, itd.) koji je povezan sa antitelom prema pronalasku. Veza sa anti-CD154 antitelom može biti kovalentna ili ne-kovalentna i može takođe biti reverzibilana ili se može regulisati. Primeri molekula koji se mogu koristi da se formiraju konjugati CD 154 antitela prema predmetnom pronalasku uključuju ali nisu ograničeni na funkcionalne delove kao što su, npr., antineoplastična sredstva, lekovi, toksini, biološki aktivni proteini, na primer enzimi, drugo antitelo, derivat antitela ili fragment antitela, sintetički (na primer, PEG) ili prirodni polimeri, nukleinske kiseline i njihovi fragmenti, npr. DNK, RNK i njihovi fragmenti, aptameri, radionuklidi, naročito radiojodid, radioizotopi, helatni metali, nanočestice i reporter grupe kao što su fluorescentna ili luminescentna jedinjenja ili jedinjenje koje se može detektovati tehnikama vizuelizacije kao što su NMR ili ESR spektroskopija.

[0245] U dodatnom primeru, funkcionalni deo za koji je konjugovano antitelo prema pronalasku mogu povećati polu-život antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogenost antitela i/ili poboljšati isporuku antitela preko epitelne barijere u imuni sistem. Primeri pogodnih funkcionalnih delova ovog tipa uključuju polimere, dekstran, hidroksipropilmetacrilamid (HPMA), transferin, albumin, albumin vezujuće proteine ili albumin vezujuća jedinjenja kao što su ona opisana u PCT/GB2005/002084.

[0246] Gde je funkcionalni deo polimer on može, generalno, biti sintetički ili prirodni polimer, na primer izborno supstituisan sa pravim ili granatim polialkilenom, polialkenilen ili polioksialkilen polimer ili granati ili negranati polisaharid, npr. homo- ili heteropolidsaharid. Videti na primer Veronese and Pasut, 2005, Drug Discovery Today, 10(21): 1451-1458; Pasut et al., 2004, Expert Opinion in rapeutic Patents, 14(6):859-894.

[0247] Specifični izborni supstituenti mogu biti prisutni na prethodno pomenutim sintetičkim polimerima uključuju jedan ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0248] Specifični primeri sintetičkih polimera uključuju izborno supstituisane prave ili granate lance poli(glikola), poli(propilenglikol) poli(vinilalkohol) ili njihove derivate, naročito izborno supstituisani poli(etilenglikol) kao što je metoksipoli(etilenglikol) ili njihovi derivati.

[0249] Specifični prirodni polimeri uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili njihove derivate. Namera je da "derivati" u ovom kontekstu uključuju reaktivne derivate, na primer tiol-selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi i slično. Reaktivna grupa može biti povezana direktno ili preko linker segmenta za polimer. Biće jasno da će ostatak takve grupe u nekim slučajevima formirati deo proizvoda kao vezujuća grupa između fragmenta antitela i polimera.

[0250] Veličina polimera može biti varirana po želji, ali će generalno biti u opsegu prosečne molekulske težine od 500 Da do 50000 Da, poželjno od 5000 Da do 40000 Da i poželjnije od 20000 Da do 40000 Da. Veličina polimera može biti specifično izabrana na osnovu nameravane upotrebe proizvoda na primer sposobnosti da se lokalizuje u određena tkiva kao što su tumori ili produži polu-život u cirkulaciji (za pregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Stoga, na primer, gde je nameravano da proizvod napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, na primer za upotrebu u tretmanu tumora, može biti povoljno korišćenje polimera male molekulske težine, na primer sa molekulskom težinom od oko 5000Da. Za primene gde proizvod ostaje u cirkulaciji, može biti povoljno korišćenje polimera sa većom molekulskom težinom, na primer sa molekulskom težinom u opsegu od 20000 Da do 40000 Da.

[0251] Naročito poželjni polimeri uključuju polialkilen polimer, kao što je poli(etilenglikol) ili, naročito, metoksipoli(etilenglikol) ili njegov derivat, i naročito sa molekulskom težinom u opsegu od oko 15000 Da do oko 40000 Da.

[0252] Poželjno, antitelo, derivat antitela ili fragment antitela prema predmetnom pronalasku, uključujući antitelo ili fragment sa smanjenom efektornom funkcijom, povezan je sa polialkilen polimerom, naročito poli(etilenglikol) (ovde skraćeno PEG) ili njegov derivat. U određenim primerima izvođenja, antitelo, derivat antitela ili fragment antitela prema predmetnom pronalsku je fragment antitela koji je Fab’ ili F(ab’)2 fragment ili njegov derivat koji je vezan sa PEG ili na teškom lancu ili na lakom lancu ili na oba. Ovaj Fab’ ili F(ab’)2 njegov fragment može biti humani ili humanizovani.

[0253] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja ovog pronalaska, anti-CD154 antitela ovog pronalaska su antitela koja su modifikovana kovalnetnom vezom funkcionalnih delova kao što su polimeri rastvorljivi u vodi, kao što je poli(etilenglikol), kopolimeri poli(etilenglikola) i poli(propilenglikola), karboksimetil celuloza, dekstran, poli(vinilalkohol), poli(vinilpirolidon) ili poli(prolin) – za koje je sve poznato da pokazuju značajno duže poluživote u krvi nakon intravenske injekcije nego što to imaju nemodifikovani proteini. Videti, npr., Abuchowski et al. 1981. In: "Enzymes as Drugs", Holcenberg et al. (ed.) 1981. Wiley-Interscience, New York, NY, 367-383 (1981); Anderson, W.F. 1992. Human Gene rapy. Science 256:808-813; Newmark et al. 1982. J. Appl. Biochem. 4:185-189; Katre et al. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1487-1491.

[0254] U nekim primerima izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku su antitela vezana za funkcionalne delove kao što je za poli(etilenglikol) (PEG) delove. U jednom naročitom primeru izvođenja, antitelo je fragment antitela i PEG molekuli mogu biti vezani preko bilo kojeg dostupnog aminokiselinskog bočnog lanca ili termininalne funkcionalne grupe aminokiseline locirane u fragmentu antitela, na primer bilo koja slobodna amino, imino, tiol, hidroksil ili karboksil grupa. Takve aminokiseline se mogu naći u prirodi u fragmentu antitela ili mogu biti inženjeringom unete u fragment korišćenjem postupaka rekombinantne DNK (videti na primer US 5,219,996; US 5,667,425; WO 98/25971). U sledećem primeru izvođenja, Fab fragment prema predmetnom pronalasku je modifikovan dodavanjem na C-termininalni kraj njegovog teškog lanca jedne ili više aminokiselina da bi se omogućilo vezivanje funkcionalnog dela. Poželjno, dodatne aminokiseline formiraju modifikovani region zgloba koji sadrži jedan ili više cisteinskih ostataka za koje se može vezati funkcionalni deo. Više mesta se može koristiti za vezivanje dva ili više PEG molekula.

[0255] U određenim aspektima predmetnog pronalaska, PEG molekuli su kovalentno vezani preko tiol gupe od najmanje jednog cisteinskog ostatka lociranog u fragmentu antitela predmetnog pronalaska. Svaki PEG molekul vezan za modifikovani fragment antitela može biti kovalenento vezano za atom sumpora cisteinskog ostatka lociranog u fragmentu. Kovalentna veza će generalno biti disulfidna veza ili, naročito, sumpor-ugljenik veza. Gde je korišćena tiol grupa kao tačka vezivanja odgovarajuće aktiviranih funkcionalnih delova, na primer mogu se koristiti tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i cisteinski derivati. Aktivirani PEG može biti korišćen kao početni materijal u pripremi PEGmodifikovanog fragmenta antitela kao što je opisano prethodno. Aktivirani PEG može biti bilo koji PEG koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je α-halokarboksilna kiselina ili ester, npr. jodoacetamid, imid, npr. maleimid, vinil sulfon ili disulfid. U određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo kojnugat može sadržati dva PEG molekula sa dva molekula maleimida. Početni materijali se mogu dobiti komercijalno (na primer od Nektar, ranije Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ili mogu biti pripremljeni od komercijalno dostupnih početnih materijala korišćenjem konevencionalnih hemijskih procedura. Specifični PEG molekuli uključuju 20K metoksi-PEG-amin (koji se može nabaviti od Nektar, ranije Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (može se dobiti od Nektar, ranije Shearwater).

[0256] U jednom poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku je modifikovani Fab fragment koji je PEGilovan, tj. ima PEG (poli(etileneglikol)) kovalentno vezan za sebe, npr. prema postupku opisanom u EP 0948544 (videti takođe "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical i Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry i Biological Applications", 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC i "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam i A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545). U jednom primeru PEG je vezan za cistein u regionu zgloba. U sledećem primeru, PEG modifikovani Fab fragment ima maleimid grupu kovalentno vezanu za jednu tiol grupu u modifikovanom regionu zgloba. Lizinski ostatak može biti kovalentno vezan za maleimid grupu i na svakoj od amin grupa na lizinskom ostatku može biti vezan metoksipoli(etilenglikol) polimer sa molekulskom težinom od približno 20,000 Da. Ukupna molekulska težina PEG vezanog za Fab fragment može stoga biti približno 40,000 Da.

[0257] U sledećem primeru izvođenja, funkcionalni deo je PEG i vezan je korišćenjem postupaka opisanih u WO 98/25971 i WO 04/72116, gde je lizil-maleimid grupa vezana za cisteinski ostatak na C-terminalnom kraju teškog lanca, i svaka amino grupa lizil ostatka je kovalentno vezana za njen metoksipoli(etilenglikol) ostatak koji ima molekulsku težinu od oko 20,000 Da. Ukupna molekulska težina PEG vezanog za antitelo je stoga približno 40,000 Da.

[0258] U sledećem primeru izvođenja, funkcionalni deo je PEG i vezan je za F(ab)2 fragment korišćenjem postupaka opisanih u WO 98/25971 i WO 04/072116, gde je lizil-dimaleimid grupa vezana za cisteinski ostatak na C-terminalnom kraju svakog Fab teškog lanca, i svaka amino grupa lizil ostatka je kovalentno vezana za njen metoksipoli(etilenglikol) ostatak sa molekulskom težinom od oko 20,000 Da. ukupna molekulska težina PEG vezanog za F(ab)2 antitelo je stoga približno 40,000 Da.

[0259] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo predmetnog pronalaska je Fab’ fragment antitela, koji može biti potpuno human ili humanizovan, i PEGilovan je ili u teškom lancu, lakom lancu ili oba. U drugim primerima izvođenja, fragment antitela, koji može biti potpuno human ili humanizovan, je PEGilovan na jednom ili oba teška lanca, ili na jednom ili oba laka lanca, ili na oba teška i laka lanca.

[0260] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo je PEG-vezano antitelo (npr., PEG-vezano humano antitelo) naznačeno time da PEG je vezan za antitelo na cisteinskom ili na lizinskom ostatku. U određenim primerima izvođenja, PEGilovano antiCD154 antitelo ima hidrodinamičku veličinu od najmanje 24 kD. U drugim primerima izvođenja, PEG može varirati u veličini od oko između 20 do 60 kD (uključujući). U sledećim primerima izvođenja, PEG-vezano anti-CD154 antitelo ima hidrodinamičku veličinu od najmanje 200 kD. U primerima izvođenja predmetnog pronalaska gde je anti-CD 154 antitelo vezano sa PEG delom, PEGilovano anti-CD154 antitelo može imati povećani in vivo poluživot u odnosu na anti-CD 154 antitelo kojem nedostaje PEG deo.

[0261] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje CD154 vezujući protein koji sadrži sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 15 i sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 13, naznačeno time da protein je PEGilovan.

[0262] Drugi funkcionalni delovi koji mogu biti korisni u poboljšanju integriteta i dugovečnosti antitela prema predmetnom pronlaasku in vivo uključuju polipeptide. Na primer, anti-CD154 antitela ili fragment antitela predmetnog pronalaska može biti modifikovan da uključuje humani serum albumin (HSA) polipeptid. Takav konjugat antitela može pokazivati povećanu stabilizaciju i povećani polu-život u serumu u poređenju sa ne-konjugovanim antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom. Na primer, u određenim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo konjugovano sa HSA može pokazivati povećanje in vivo polu-života u odnosu na ne-konjugovano anti-CD154 antitelo. Polu-život (tα- ili tβ-polu-život) HSA-konjugovanog antitela može biti povežan 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili više. tα-polu-život može biti unutar opsega od 0.25 minuta do 12 časova, na primer, dok tβ-polu-život može biti unutar 12-48 časova, na primer. tα- ili tβ-polu-život može poželjno biti najmanje 3 dana, najmanje 7 dana, najmanje 14 dana, najmanje 21 dana, najmanje 28 dana, najmanje 1 mesec ili više.

[0263] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska su antitela modifikovana sa funkcionalnim delom obeležavanjem sa detektabilnim markerom, na primer, radioaktivnim izotopom, enzimom, bojom ili biotinom, ili drugim afinitetnim reagensom.

[0264] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom pronlasku, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska su antitela modifikovana sa funkcionalnim delom tako što su konjugovana sa terapeutskim sredstvom, na primer, radioizotopom ili radionuklidom (npr.,<111>In ili<90>Y), delom toksina (npr., tetanus toksoid ili ricin), toksoidom ili hemoterapeutskim sredstvom (U.S. 6,307,026).

[0265] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska modifikovana su konjugacijom sa sredstvom za vizuelizaciju. Sredstva za vizulizaciju mogu uključivati na primer deo za obeležavanje (npr., biotin, fluorescentne delove, radioaktivne delove, histidin ili myc tag ili druge peptidne tagove) za laku izolaciju ili detekciju.

[0266] Dodatni primeri funkcionalnih delova za modifikaciju ili konjugaciju anti-CD514 antitela pronalaska, mogu uključivati serotoksine ili citotoksična sredstva uključujući bilo koje sredstvo koje je štetno po (npr. ubija) ćelije. Primeri uključuju kombrestatine, dolastatine, epotilone, staurosporin, majtanzinoide, spongistatine, rizoksin, halihondrine, roridine, hemiasterline, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihove anloge i homologe.

[0267] Funkcionalni delovi korisni u konjugaciji uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-folate (npr. aminopterin i metotreksat), antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuća sredstva (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, antramicin (AMC), kaliheamicine ili duokarmicine, CC-1065, enedieiene, neokarcinostatin), i anti-mitotička sredstva (npr. vinkristin i vinblastin). Videti Garnett, 2001, Advanced drug Delivery Reviews 53:171-216 za dodatne detalje.

[0268] Drugi funkcionalni delovi mogu uključivati helatirane radionuklide kao što su<131>I,<111>In i<90>Y, Lu<177>, Bizmut<213>, Californium<252>, Iridium<192>i Tungsten<188>/Renium<188>,<211>astatin; ili lekovi kao što su ali ne ograničavajući se na, alkilfosfoholine, inhibitore topoizomeraze I, taksoide i suramin.

[0269] Dodatni funkcionalni delovi uključuju proteine, peptide i enzime. Enzimi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, proteolitičke enzime, hidrolaze, liaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobuline, toksine kao što su abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije, majtanzinoid (na primer, ali ne ograničavajući se na, DM1), protein kao što je insulin, faktor nekroze tumora, α-interferon, β-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta izveden iz trombocita ili tkivni plazminogen aktivator, trombotičko sredstvo ili antiangiogeno sredstvo, npr. angiostatin ili endostatin, angiogenin, gelonin, dolstatini, MGB, bisidofenol azotni iperit, ili, modifikator biološkog odgovora kao što je limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulacije kolonije granulocita makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (GCSF), faktor rasta nerva (NGF) ili drugi faktori rasta.

[0270] Drugi funkcionalni delovi mogu uključivati detektabilne supstance korisne, na primer, u dijagnozi. Primeri detektabilnih supstanci uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne nuklide, pozitron emitujuće metale (za upotrebu u pozitron emisionoj tomografiji), i neradioaktivne paramagnetne metalne jone. Videti generalno US 4,741,900 za metalne jone koji se mogu konjugovati sa antitelima za upotrebu kao dijagnostici. Pogodni enzimi uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; pogodne prostetičke grupe uključuju streptavidin, avidin i biotin; pogodni fluorescentni materijali uključuju umbelliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid i fikoeritrin; pogodni luminescentni materijali uključuju luminol; pogodni bioluminescentni materijali uključuju luciferazu, luciferin, i ekvorin; i pogodni radioaktivni nuklidi uključuju<125>I,<131>I,<111>In i<99>Tc.

Nukleinske kiseline

[0271] U određenim aspektima, predmetni pronalazak se odnosi na nukleinske kiseline koje kodiraju anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska.

[0272] Shodno tome, u određenim primerima izvođenja predmetno otkriće odnosi se na izolovani, rekombinantni i/ili sintetički DNK molekul koji sadrži jednu ili više sekvenci izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 i SEQ ID NO: 73.

[0273] U sledećem aspektu, otkriće daje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži jednu ili više sekvenci koje kodiraju polipeptid koja uključuje sekvence najmanje 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% identične sekvenci varijabilnog domena od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 60 ili sekvence koja hibridizuje (npr., pod stringentnim uslovma) sa nukleinskom kiselinom koja kodira sekvencu varijabilnog domena od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 56 ili SEQ ID NO: 60.

[0274] Nukleinske kiseline pronalaska mogu dodatno uključivati regulatorne sekvence (npr., promotor sekvencu, netranslatirani 5’ region, i netranslatirani 3’ region) i/ili sekvence vektora. Na primer, nukleinska kiselina čini vektor. U dodatnim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na ćelije domaćine koje sadrže vektor. Ćelije domaćini mogu proizvesti antitelo tako da antitelo pokazuje smanjenu ili je bez glikozilacije (npr., ukoliko je prisutan Fc region).

[0275] Predmetno otkriće takođe se odnosi na varijante sekvence nukleinskih kiselina prethodno opisanih. Na primer, predmetno otkriće uključuje sekvence nukleinske kiseline koje su oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, 99.5%, 99.9% ili 100% identične bilo kojoj od sekvenci obezbeđenih ovde, uključujući njihove fragmente i komplemente. Predmetni pronalazak takođe uključuje nukleinske kiseline koje variraju u odnosu na sekvence obezbeđene specifično ovde usled degenerisanosti genetičkog koda.

[0276] Dodatno, predmetno otkriće uključuje sekvence koje specifično hibridizuju sa bilo kojim od nukleinskih kiselina obezbeđenih ovde. Termin "specifično hibridizuje" odnosi se na sposobnost sekvence nukleinske kiseline da hibridizuje sa najmanje 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili 100 uzastopnih nukleotida sekvence obezbeđene ovde, ili njoj komplementarne sekvence, kao što je da ima manje od 15%, poželjno manje od 10%, i poželjnije manje od 5% referentne hibridizacije sa kontrolnom nukleinskom kiselinom (npr., ne-specifična DNK ili DNK različita od sekvence specifičnog antitela obezbeđene ovde). Različiti hibridizacioni uslovi mogu se koristiti da se detektuje specifična hibridizacija, i stringentnost je određena primarno po stadijumu ispiranja hibridizacionog testa. Generalno visoke temperature i niske koncentracije soli daju visoku stringentnost, dok niske temperature i visoke koncentracije soli daju nisku stringentnost. Niska stringentnost hibridizacije je postignuta ispiranjem, na primer, oko 2.0 x SSC na 50°C, i visoka stringentnost je postignuta sa oko 0.2 x SSC na 50°C.

[0277] Nukleinske kiseline koje kodiraju CD154 vezujuće proteine predmetnog pronalaska mogu sadržati lider ili signalne sekvence. Lider i signalne sekvence mogu varirati i mogu biti supstituisane sa alternativnom lider sekvencom, i podrazumeva se da, u određenim primerima izvođenja, CD 154 vezujući proteini predmetnog pronalaska sadrže sekvence bez lider sekvence. Bilo koja pogodna alternativna lider ili signalna sekvenca može se koristiti.

Ćelije domaćini

[0278] Predmetno otkriće se odnosi na ćelije domaćine stvorene inženjeringom da eksprimiraju bilo koji od DNK molekula obezbeđenih na Slikama 2-8, 10, 11 i 13-16, uključujući varijante njihovih sekvenci.

[0279] Ćelije domaćini koje eksprimiraju anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska su takođe obezbeđene. U zavisnosti da li je vezujući protein ili antitelo, mogu sadržati samo jedan lanac, u kom slučaju, samo DNK sekvenca koja kodira taj polipeptidni lanac treba da se koristi za transfekciju ćelija. Za proizvodnju antitela koja sadrže dva lanca, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora. Alternativno, kada je odgovarajuće, jedan vektor može kodirati sekvence oba lanca, npr. laki i teški i laki lanac anti-CD 154 antitela, i varijacije u zavisnosti od specifične strukture antitela koja treba da se eksprimira. Ćelija domaćin može biti, na primer, prokariotska ćelija kao što je E. coli, ili druge mikrobne ćelije, ili eukariotske ćelije uključujući ali se ne ograničavajući na ćelije sisara kao što je humana, mišja, majmuna, zeca, koze, hrčka, ili ćelija pacova, ćelije insekata, ćelije ptica, biljne ćelije i ćelije nižih eukariota kao što su ćelije gljiva (videti u nastavku). Podrazumeva se da je mašinerija ćelije domaćina odgovorna za glikozilaciju rekombinantno eksprimiranih proteina i stoga specifični glikozilacioni obrasci se mogu izabrati da se dodatno izmeni efektorna funkcija antitela pronalaska.

[0280] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, ćelije domaćini korisne za izvođenje pronalaska mogu biti, na primer, (1) bakterijske ćelije, kao što su E. coli, Caulobacter crescentus, Streptococci, Staphylococci, Streptomyces vrste i Bacillus subtilis ćelije, i Salmonella typhimurium; (2) ćelije gljiva i Aspergillus ćelije, ćelije kvasca, kao što je Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, druge Pichia vrste , K. lactis (3) linije ćelija insekata, kao što su one od Spodoptera frugiperda - npr., Sf9 i Sf21 ćelijske linije, i expresSF™ ćelije (Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA) - Drosophila S2 ćelije, i Trichoplusia ni High Five® ćelije (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); (4) ćelije sisara, ili (5) biljne ćelije.

[0281] Shodno tome, CD154 vezujući proteini, npr., anti-CD154 antitela, predmetnog pronalaska mogu biti proizvedeni u bilo kojim dostupnim prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima sposobnim da kada se naprave inženjeringom eksprimiraju sekvence egzogene nukleinske kiseline. Niže eukariotske ćelije domaćini koje se mogu koristiti za proizvodnju anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska uključuju one ćelije opisane u tehnici (videti, npr., WO 02/00879, WO 03/056914, WO 04/074498, WO 04/074499, Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027; Hamilton et al., 2003, Nature, 301: 1244-1246 i Bobrowicz et al., 2004, Glycobiology, 14: 757-766).

[0282] Tipične sisarske ćelije uključuju COS1 i COS7 ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), NS0 mijeloma ćelija, NIH 3T3 ćelije, 293 ćelije, HEPG2 ćelije, HeLa ćelije, C127, 3T3, BHK, Bowes melanom ćelije, L ćelije, MDCK, HEK293, WI38, mišje ES ćelijske linije (npr., od sojeva 129/SV, C57/BL6, DBA-1, 129/SVJ), K562, Jurkat ćelije, i BW5147. Pronalazak stoga obezbeđuje ćelije koje eksprimiraju antitela predmetnog pronalaska, uključujući, ali se ne ograničavajući na ćelije hibridoma, B ćelije, plazma ćelije, kao i sisarske i humane ćelije domaćine rekombinantno modifikovane da eksprimiraju antitela predmetnog pronalaska (npr., adultne embrionalne stem ćelije). Druge korisne sisarske ćelijske linije su dobro poznate i lako dostupne od American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA, USA) i National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Human Genetic Cell Repository at Coriell Cell Repositories (Camden, NJ, USA). Ovi ćelijski tipovi su samo reprezentativni, i nije namera da ova lista bude isključiva.

[0283] Između drugih razmatranja, od kojih su neka prethodno opisana, ćelija domaćin može biti izabrana u odnosu na njihovu sposobnost da obradi eksprimirano anti-CD 154 antitelo na željeni način. Dodatno modifikovanoj glikozilaciji i aglikozilaciji, takve post-translacione modifikacije polipeptida uključuju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, karboksilaciju, karboksimetilaciju, fosforilaciju, lipidaciju, i acilaciju.

[0284] U sledećem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska su pripremljena preko translacije bez ćelija ili sintetisana in vitro. Geni koji kodiraju ove proteine mogu biti sintetisani in vitro.

[0285] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska su proizvedena u bioreaktorima koji sadrže antitelo-eksprimirajuće ćelije, da bi se olakšala proizvodnja velikih razmera.

[0286] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska su proizvedena u genetičkim inženjeringom stvorenim ili transgenim sisarima (npr., kozama, kravama, ovcama) koji eksprimiraju antitelo u mleko, da bi se olakšala proizvodnja velikih razmera anti-CD154 antitela (US 5,827,690; Pollock et al. 1999. J. Immunol. Meth. 231(1-2):147-57).

Terapeutski postupci

[0287] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobnada inhibira imuni odgovor kod subjekta. Antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija pronalaska, je primenjena na subjekta u efikasnoj inhibirajućoj količini.

[0288] U određenim primerima izvođenja, "efikasna inhibirajuća količina" anti-CD154 antitela, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo, je bilo koja količina koja je efikasna da inhibira CD154-CD40 interakciju kod subjekta na koga je primenjena. Postupci određivanja "inhibirajuće količine" su dobro poznati stručnjacima i zavise od faktora uključujući, ali ne ograničavajući se na: tip subjekta koji je u pitanju, veličine i starosti subjekta i farmakokinetičkih osobina specifičnog terapeutskog sredstva koje je isporučeno.

[0289] U sledećem specifičnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira imuni odgovor inhibicijom CD154-CD40 interakcije.

[0290] U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, anti-CD 154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da inhibira inflamaciju. Za svrhe predmetnog pronalaska, inflamatorni odgovori se karakterišu crvenilom, oticanjem, vrelinom i bolom, kao poledica dilatacije kapilara sa edemom i migracijom fagocitnih leukocita. Neki primeri inflamatornih odgovora uključuju: artritis, kontaktni dermatitis, hiper-IgE sindrom, inflamatornu bolest creva, alergijsku astmu, i idiopatsku inflamatornu bolest. Idiopatska inflamatorna bolest uključuje, na primer, psorijazu i lupus (npr., sistemski eritemski lupus (SLE), eritemski lupus izazvan lekovima, i lupus nefritis). Videti, npr., Gallin 1989. Fundamental Immunology, Chapter 26, Raven Press, 2<nd>Ed., pp.

721-733, New York. Ovo otkriće obezbeđuje postupakza tretiranje ili prevenciju simptoma sistemskog eritemskog lupusa (SLE) kod pojedinca, pri čemu postupak sadrži primenu monovalentnog CD154 vezujućeg proteina, npr., monovalentnog anti-CD154 antitela na pojedinca u količini efikasnoj da se tretira ili spreči sindrom SLE.

[0291] Neki primeri artritisa uključuju: reumatoidni artritis, ne-reumatoidni inflamatorni artritis, artritis povezan sa Lajmskom bolešću i inflamatornim osteoartritisom. Neki primeri idiopatske inflamatorne bolesti uključuju: psorijazu i sistemski lupus.

[0292] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da inhibira odbacivanje transplantiranog organa od strane subjekta.

[0293] U specifičnijem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da spreči odbacivanje transplantiranog srca, bubrega, jetre, kože, ćelija pankreasnog ostrvca ili kostne srži od strane subjekta.

[0294] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo, ili farmaceutska kompozicja koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira bolest graft-protivdomaćina kod subjekta.

[0295] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira alergijske odgovore, kod subjekta - na primer, polensku groznicu ili alergiju na penicilin ili druge lekove.

[0296] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira autoimuni odgovor kod subjekta koji pati od autoimune bolesti. U nekim primerima izvođenja, autoimuni odgovor je povezan sa ili je izveden iz stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od: reumatoidnog artritisa, miastenije gravis, sistemskog eritemskog lupusa, Graves bolesti, idiopatske trombocitopenije purpure, hemolitičke anemije, dijabetes melitusa, inflamatorne bolesti creva, Crohn bolesti, multiple skleroze, psorijaze, autoimunih bolesti izazvanih lekovima, ili lupusa izazvanog lekovima. U određenim primerima izvođenja, autoimuni odgovor je povezan sa ili je izveden iz sistemskog eritemskog lulpusa.

[0297] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da inhibira autoimuni odgovor kod subjekta koji pati od autoimunog odgovora koji je izveden iz infektivne bolesti.

[0298] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira autoimuni odgovor kod subjekta koji pati od autoimunog odgovora koji je izveden iz Reiter sindroma, apondiloartritisa, Lajmske bolesti, HIV infekcije, sifilisa, ili tuberkuloze.

[0299] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da inhibira fibrozu kod subjekta.

[0300] Neki primeri fibroze uključuju: plućnu fibrozu ili fibroznu bolest. Neki primeri plućne fibroze uključuju: plućnu fibrozu sekubdarnu u odnosu na sindorm adultnog respiratornog distresa, plućnu fibrozu izazvanu lekovima, idiopatsku plućnu fibrozu, ili hipersenzitivni pneumonitis. Neki primeri fibroznih bolesti uključuju: Hepatitis-C; Hepatitis-B; cirozu; cirozu jetre sekundarnu u odnosu na toksičnu povredu; cirozu jetre sekundarnu u odnosu na lekove; cirozu jetre sekundarnu u odnosu na virusnu infekciju; i cirozu jetre sekundarnu u odnosu na autoimunu bolest.

[0301] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira gastrointestinalnu bolest. Neki primeri gastrointestinalne bolesti uključuju: ezofagijalni dismotilitet, inflamatornu bolest creva (uključujući Crohn bolest i ulcerativni kolitis), gastritis, kolageni kolitis (uključujući limfocitni kolitis i mikroskopski kolitis), celijakalnu bolest (takođe nazvanu glutenska enteropatija, celijačna bolest, ili glutenska intolerancija), i sklerodermu.

[0302] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da inhibira vaskularnu bolest. Neki primeri vaskularne bolesti uključuju: aterosklerozu, bolest bubrežne arterije, limfedem, ishemijske poremećaje, i reperfuzionu povredu. Takođe su uključene bolesti kolagena vaskularnog/imunog kompleksa kao što je sistemski eritemski lupus ili krioglobulinemija.

[0303] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da inhibira proliferaciju ćelija T ćelijskog tumora kod subjekta koji pati od kancera T ćelija, - npr., leukemija T ćelija ili limfom. Takvo anti-CD154 antitelo, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, može biti primenjena na subjekta u količini efikasnoj da inhibira proliferaciju ćelija T ćelijskog tumora kod tog subjekta.

[0304] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da inhibira virusnu infekciju T ćelije subjekta sa humanim T-ćelijskim limfotropnim virusom tipa 1 (HTLV I). Takvo anti-CD 154 antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo može biti primenjena na subjekta u količini efikasnoj da inhibira virusnu infekciju.

[0305] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna za vizuelizaciju tumorske ćelije ili neoplastične ćelije kod subjekta koji eksprimira CD154 protein za koje se antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje. Postupak za vizuelizaciju tumorske ćelije ili neoplastične ćelije kod subjekta sadrži korake: primene na subjekta efikasne količine anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, ili kompozicije koja ga sadrži, pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i proteina na površini tumorske ćelije ili neoplastične ćelije; i vizuelizaciju bilo kog formiranog antitelo/protein kompleksa, čime se vizuelizuje bilo koja tumorska ćelija ili neoplastična ćelija kod subjekta.

[0306] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitelo predmetnog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobna da detektuje prisustvo tumorske ćelije ili neoplastične ćelije kod subjekta koji eksprimira CD154 protein za koje se antitelo predmetnog pronalaska specifično vezuje. Jedan takav postupak za detekciju prisustva tumorske ćelije ili neoplastične ćelije kod subjekta sadrži korake: primene na subjekta efikasne količine anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, ili farmaceutske kompozicije koja ga sadrži, pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i proteina; izbacivanje bilo kog nevezanog sredstva iz subjekta; i detekciju prisustva bilo kog formiranog antitelo/protein kompleksa, pri čemu prisustvo takvog kompleksa ukazuje na prisustvo tumorske ćelije ili neoplastične ćelije kod subjekta.

Farmaceutske kompozicije

[0307] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CD154 antitelo kao što je opisano u predmetnom pronalasku.

[0308] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedno anti-CD 154 antitelo predmetnog pronalaska.

[0309] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, aglikozil anti-CD 154 antitelo (ili drugo anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom) prema pronalasku, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da se veže za CD154 antigen (npr., CD154 antigen koji je specifično vezan sa aglikozil hu5c8 proizveden od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni br. PTA-4931), i naznačeno time da aglikozil anti-CD 154 antitelo je naznačeno time što ima mutaciju N298Q (N297 korišćenjem EU Kabat numerisanja) i koje dodatno pokazuje smanjenu efektornu funkciju kao što je ovde opisano na drugim mestima.

[0310] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, aglikozil anti-CD154 antitelo (ili drugo anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom), ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, ne vezuje se za efektorni receptor. U specifičnijem primeru izvođenja, aglikozil anti-CD 154 antitelo, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je sposobno da se vezuje za CD154 protein koji je specifično vezan sa aglikozil hu5c8 proizveden od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni br. PTA-4931, i naznačeno time da aglikozil anti-CD 154 antitelo ili farmaceutska kompozicija se ne vezuje za efektorni receptor.

[0311] U specifičnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, aglikozil anti-CD154 antitelo (ili drugo anti-CD 154 antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom), ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, ne izaziva trombozu, uključujući tromboemboličke događaje. U specifičnijem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, aglikozil anti-CD 154 antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo je sposobno da se vezuje za CD154 protein koji je specifično vezan sa aglikozil hu5c8 proizveden od strane ćelijske linije koja ima ATCC pristupni br. PTA-4931, i naznačeno time da aglikozil anti-CD154 antitelo ili farmaceutska kompozicija ne izaziva trombozu.

[0312] U sledećem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutske kompozicije mogu dodatno sadržati bilo koji ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ađuvanata, vehikuluma, pufera i/ili stabilizatora. Primeri tehnika za formulaciju i primenu antitela predmetnog pronalaska može se naći, na primer, u "Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, poslednje izdanje.

[0313] U specifičnijem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosač je fosfatno puferovani fiziološki rastvor, fiziološki rastvor, voda, citrat/saharoza/Tween formulacije i emulzije - npr., ulje/voda emulzije.

[0314] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija može biti isporučena u mikroinkapsulacionom uređaju da bi se smanjio ili smanjio imuni odgovor domaćina protiv kompozicije. Vezujuća sredstva, kao što su antitela ili fragment antitela predmetnog pronalaska, mogu se takođe isporučiti mikroinkapsulirana u membrani, kao što je, na primer, lipozom ili drugi inkapsulirani ili imunozaštićeni vehikulum.

[0315] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija može biti u obliku sterilnog injektabilnog preparata, na primer, sterilne injektabilne vodene ili masne suspenzije. Ova suspenzija može se formirati u skladu sa postupcima poznatim u tehnici korišćenjem pogodnioh disperzionih, ovlažujućih, i suspendujućih sredstava.

[0316] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija može biti isporučena oralno, topikalno ili intravenski. Kada se primenjuje sistemski, terapeutska kompozicija treba da bude sterilna, suštinski bez pirogena i u parenteralno prihvatljivom rastvoru koji ima odgovarajuću pH, izotoničnost, i stabilnost. Na primer, farmaceutski preparat je suštinski bez pirogenih materijala da bi bio odgovarajući za primenu kao humani terapeutik. Ovi uslovi su poznati stručnjacima.

[0317] U specifičnijem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, za oralnu primenu, farmaceutska formulacija je formulisana u pogodnoj kapsuli, tableti, vodenoj suspenziji ili rastvoru. Čvrste formulacije kompozicija za oralnu primenu mogu sadržati pogodne nosače ili ekscipijente, kao što je kukuruzni skrob, želatin, laktoza, akacija, saharoza, mikrokristalna celuloza, kaolin, manitol, dikalcijum fosfat, kalcijum karbonat, natrijum hlorid, ili alginska kiselina. Sredstva za raspadanje koja se mogu koristiti uključuju, bez ograničenja, mikrokristalnu celulozu, kukuruzni skrob, natrijum skrob glikolat, i alginsku kiselinu. Vezujuća sredstva za tablete koja se mogu koristiti uključuju akaciju, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, polivinilpirolidon (Povidone™), hidroksipropil metilcelulozu, saharozu, skrob, i etilcelulozu. Lubrikanti koji se mogu koristiti uključuju magnezijum stearate, stearinsku kiselinu, tečni silicijum, talk, voskove, ulja, i koloidni silicijum dioksid.

[0318] U specifičnijem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, za topikalne primene, farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u pogodnoj masti. Neki primeri formulacija kompozicije za topikalnu upotrebu uključuju: kapi, tinkture, losione, kreme, rastvore, i masti koje sadrže aktivni sastojak i različite podloge i vehikulume.

[0319] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, formulacija topikalne polučvrste masti tipično sadrži koncentraciju aktivnog sastojka od oko 1 do 20%, - npr., 5 do 10%, u nosaču, kao što je na bazi farmaceutske kreme.

[0320] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutske kompozicije za inhalaciju i transdermalne kompozicije mogu se takođe lako pripremiti. Terapeutska kompozicija se može primeniti preko nosa ili pluća, na primer, kao tečnost ili prašak aerosola (liofilizovano).

[0321] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, tečne formulacije farmaceutske kompozicije za oralnu primenu pripremljene u vodi ili drugim vodenim nosačima mogu sadržati različita suspendujuća sredstva kao što je metilceluloza, alginati, tragant, pektin, kelgin, karaginan, akaciju, polivinilpirolidon, i polivinil alkohol. Tečne formulacije farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska mogu takođe uključiti rastvore, emulzije, sirupe i eliksire koji sadrže, zajedno sa aktivnim jedinjenjem (jedinjenjima), ovlaživače, zaslađivače, i sredstva za bojenje i aromatizere. Različite tečne i formulacije u obliku praška farmaceutskih kompozicija mogu se pripremiti konvencionalnim postupcima za inhalaciju u pluća sisara kog treba tretirati.

[0322] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, tečne formulacije farmaceutske kompozcije za injekciju mogu sadržati različite nosače kao što su biljna ulja, dimetilacetamid, dimetilformamid, etil laktat, etil karbonat, izopropil miristat, etanol, poliole - tj., glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol, i slično. U nekim primerima izvođenja, kompoziicja uključuje citrat/saharozu/Tween nosač. Za intravenske injekcije, verzije kompozicija rastvorljive u vodi mogu se primeniti postupkom ukapavanja, gde se farmaceutska kompozicija koja sadrži antifungalno sredstvo i fiziološki prihvatljivi ekscipijent primenjuje infuzijom. Fiziološki prihvatljivi ekscipijenti mogu uključivati, na primer, 5% dekstrozu, 0.9% slani rastvor, Ringer rastvor ili druge pogodne ekscipijente. Pogodni nerastvorljivi oblik kompozicije može se pripremiti i primeniti kao suspenzija u vodenoj bazi ili farmaceutski prihvatljivoj uljanoj bazi, kao što je estar masne kiseline sa dugim lancem - npr., etil oleat.

[0323] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži sadrži od oko 0.1 do 90% po težini (kao što je 1 do 20% ili 1 do 10%) anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0324] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, optimalni procenat anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska u svakoj farmaceutskoj kompozciji varira u skladu sa samom formulacijom i željenim terapeutskim efektom kod specifičnih patologija i korelisanih terapeutskih režima. Farmaceutska formulacija je dobro ustanovljena u tehnici. Konvencionalni postupci, poznati medicinskim stručnjacima, mogu se koristiti za primenu farmaceutske kompozicije na subjekta.

[0325] Shodno tome, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska odnose se na formulacije sa produženim oslobađanjem. Produženo oslobađanje, ili kontrolisano oslobađanje ili sporo oslobađanje, odnosi se na formulacije leka koje oslobađaju aktivni lek, kao što je polipeptid ili antitelo lek, tokom vremenskog perioda nakon primene na subjekta. Produženo solobađanje leka polipeptida, koje se može desiti u određenom opsegu željenog vremena (npr., minuti, časovi, dani, nedelje ili duže, zavisno od formulacije leka) razlikuje se od standardnih formulacija u kojima je suštinski cela dozna jedinica dostupna za neposrednu apsorpciju ili neposrednu distribuciju preko krvotoka. Formulacije sa produženim oslobađanjem mogu, u određenim primerima izvođenja, rezultovati u nivou cirkulišućeg leka iz jedne primene koja je zadržana, na primer, 8 časova ili više, 12 časova ili više, 24 časova ili više, 36 časova ili više, 48 časova ili više, 60 časova ili više, 72 časa ili više, 84 časa ili više, 96 časa ili više, ili čak, na primer, 1 nedelju ili 2 nedelje ili više, na primer, 1 mesec ili više. Kompozicije sa produženim oslobađanjem mogu sadržati monovalentno anti-CD 154 antitelo predmetnog pronalaska. U sledećim primerima izvođenja, monovalentno antitelo je humanizovano ili potpuno humano antitelo. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD 154 antitelo, anti-CD 154 antitelo je antitelo sa smanjenom efektornom funkcijom kao što je ovde opisano.

[0326] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija dalje sadrži imunosupresivno ili imunomodulatorno jedinjenje. Na primer, takvo imunosupresivno ili imunomodulatorno jedinjenje može biti jedno od sledećeg: sredstvo koje prekida T ćelijsku kostimulatornu signalizaciju preko CD28; sredstvo koje prekida kalcineurin signalizaciju, kortikosteroid, antiproliferativno sredstvo, i antitelo koje se specifično vezuje za protein eksprimiran na površini imune ćelije, uključujući ali se ne ograničavajući na CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 i RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ, i VLA-4.

[0327] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, imunosupresivno ili imunomodulatorno jedinjenje je takrolimus, sirolimus, mikofenolat mofetil ili njegov aktivni oblik mikofenolna kiselina, mizorubin, dezoksispergualin, brekvinar natrijum, leflunomid, rapamicin ili azaspiran.

[0328] U drugim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, antitela predmetnog pronalaska ili farmaceutske kompozicije koje ih sadrže mogu biti uključena u spremniku, pakovanju ili dispenzeru sama ili kao deo kompleta sa oznakama i instrukcijama za primenu.

Primena i putevi isporuke

[0329] Anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjena na subjekta na bilo koji način koji je medicinski prihvatljiv. Za svrhe predmetnog pronalaska, "primena" označava bilo koji standardni postupak primene antitela, fragmenta antitela ili farmaceutske kompozicije poznat stručnjacima, i ne treba da bude ograničen na primere obezbeđene ovde.

[0330] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene na subjekta injekcijom intravenski, subkutano, intraperitonealno, intramuskularno, intramedularno, intraventrikularno, intraepiduralno, intrarterijalno, intravaskularno, intraartikularno, intrasinovijalno, intrasternalno, intratekalno, intrahepatički, intraspinalno, intratumoralno, intrakranijalno; enteralnim, intrapulmonalnim, transmukozalnim, intrauterinim, ili sublingvalnim putevima primene, ili lokalno, npr., na mestima inflamacije ili rasta tumora.

[0331] U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene na subjekta oralno ili nazalno, ili inhalacijom, oftalmičkim, rektalnim, ili topikalnim putevima.

[0332] U specifičnijem primeru izvođenja, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjena na subjekta oralno u obliku kapsula, tableta, vodenih suspenzija ili rastvora.

[0333] U specifičnijem primeru izvođenja, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene na subjekta topikalno primenom kreme, masti ili slično.

[0334] U drugim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se takođe primeniti inhalacijom korišćenjem nebulizatora, inhalatora za suvi prah ili inhalatora sa merenom dozom.

[0335] U sledećim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene na subjekta primenom sa produženim oslobađanjem, takvim načinima kao što su depo injekcije erodibilnih implanata direktno primenjenih tokom operacije ili implantacijom infuzione pumpe ili biokompatibilnog implanta sa produženim oslobađanjem u subjekta.

[0336] U specifičnijem primeru izvođenja, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene na subjekta injektabilnim depo putevima primene, kao što je korišćenjem 1-, 3-, ili 6-mesečnih depo injektabilnih ili biodegradabilnih materijala i postupaka.

[0337] U specifičnijem primeru izvođenja, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni na subjekta primenom na kožu subjekta transdermalnog flastera koji sadrži antitelo, derivat antitela ili farmaceutsku kompoziciju, i ostavljajući flaster u kontaktu sa kožom subjekta, generalno 1 do 5 časova po flasteru.

[0338] U drugim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni na subjekta u bilo kojoj dozi po telesnoj težini i bilo kojoj učestalosti doze koja je medicinski prihvatljiva. Prihvatljiva doza uključuje opseg od oko 0.01 i 200 mg/kg telesne težine subjekta.

[0339] U bilo kom od postupaka korišćenja antitela ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, antitela ili farmaceutske kompozicije mogu biti primenjeni na subjekta u jednoj ili više doza dnevno, svaka 2, 3, 4, 5 ili 6 dana, nedeljno, mesečno ili bilo kom njihovom delu ili umnošku, i dodatno mogu biti primenjeni na subjekta ponovno u intervalima u opsegu od svakog dana do svakog drugog meseca, kao što je određeno od strane stručnjaka.

[0340] U bilo kom od postupaka korišćenja antitela ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, antitela ili farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, mogu biti primenjene na subjekta kome je to potrebno u intervalima dok god je to medicinski indikovano, u opsegu od dana ili nedelja do doživotno kod subjekta. U sledećim primerima izvođenja, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni na subjekta ponovljeno u intervalima u opsegu od svakog dana do svakog drugog meseca.

[0341] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-CD154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se primeniti u više doza na dan, ukoliko je poželjno, da bi se postigla željena dnevna doza. Efikasnost postupka tretmana može se proceniti praćenjem subjekta u odnosu na poznate znake ili simptome poremećaja.

[0342] Za sve primere izvođenja predmetnog pronalaska, doza i stopa doze anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska efikasne da proizvedu željene efekte zavisiće od različitih faktora, kao što je priroda bolesti koja se tretira, veličina i starost subjekta, cilja tretmana, specifične farmaceutske kompozicije koja je korišćena, farmakokinetike aktivnog sredstva, i procene odgovornog lekara.

[0343] Shodno tome, anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, biće primenjene u količini efikasnoj da se postigne njihova nameravana svrha. Terapeutski efikasna količina može se odnositi na količinu antitela efikasnog da spreči, poboljša ili ublaži simptome bolesti ili produži preživljavanje subjekta koji se tretira. Terapeutski efikasna količina može biti postignuta izmenom doze i doznog rasporeda primene predmetnih antitela.

[0344] Anti-CD 154 antitela predmetnog pronalaska, i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene kao jedna doza za određene indikacije, kao što je sprečavanje imunog odgovora na antigen kome je subjekt kratkotrajno izložen, kao što je egzogeni antigen primenjen jednog dana tretmana. Primeri takve terapije uključivali bi koprimenu fragmenta antitela pronalaska zajedno sa terapeutskim sredstvom, na primer antigenim farmaceutikom, alergenom ili krvnim proizvodom, ili vektorom genske terapije. Kod indikacija gde je antigen hronično prisutan, kao što je kontrola imune reakcije na transplantirano tkivo ili na hronično primenjene antigene farmaceutike, fragmenti antitela ili farmaceutske kompozicije pronalaska su primenjeni u intervalima onoliko dugo koliko je medicinski indikovano, u opsegu od dana ili nedelja do doživotnog trajanja kod subjekta.

[0345] U bilo kom od postupaka opisanom ovde, antitela ili farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene na subjekta sa drugim sredstvom. U određenim primerima izvođenja, sredstvo je terapeutsko sredstvo, kao što je, na primer, imunomodulatorno ili imunosupresivno sredstvo. Imunomodulatorno ili imunosupresivno sredstvo može biti bilo koje od sledećeg: (a) sredstvo koje prekida T ćelijsku kostimulatornu signalizaciju preko CD28;

(b) sredstvo koje prekida kalcineurin signalizaciju,

(c) kortikosteroid,

(d) anti-proliferativno sredstvo; i

(e) antitelo koje specifično vezuje protein eksprimiran na površini imune ćelije, uključujući ali se ne ograničavajući na CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 i RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ, i VLA-4. Imunomodulatorno ili imunosupresivno jedinjenje može biti, na primer, takrolimus, sirolimus, mikofenolat mofetil, mizorubin, dezoksispergualin, brekvinar natrijum, leflunomid, rapamicin ili azaspiran. Antitelo i drugo sredstvo mogu biti primenjeni istovremeno ili uzastopno.

[0346] U nekim slučajevima, prednost može biti primena jedne ili više nukleinskih kiselina pronalaska na subjekta kome je to potrebno. Terapeutski i dijagnostički postupaci prema pronalasku koji sadrže korak primene najmanje jedne nukleinske kiseline prema pronalasku prema dobro poznatim postupcima su uključeni u obim predmetnog pronalaska.

[0347] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, subjekat (subjekti) koji se mogu tretirati sa prethodno-opisanim postupcima je životinja. Poželjno, životinja je sisar. Primeri sisara koji se može tretirati uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude, ne-humane primate, glodare (uključujući pacove, miševe, hrčke i zamorce) krave, konje, ovce, koze, svinje, pse i mačke. Poželjno, sisar je čovek.

[0348] Ovaj pronalazak može biti bolje shvaćen na osnovu Primera koji slede. Međutim, stručnjak će lako shvatiti da diskutovani specifični postupci i rezultati su samo ilustrativni u odnosu na pronalazak kao što je ovde opisano.

PRIMERI

[0349] Sledeći primeri ilustruju postupke i proizvode prema predmetnom pronalasku.

PRIMER 1: STVARANJE ANTI-HUMANOG-CD154 ANTITELA SA SLAM

[0350] Selected Lymphocyte Antitelo Method (SLAM) (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, 93, 7843-7848; WO 92/02551; de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 i Lagerkvist, et al., 1995, BioTechniques 18:862-869) postupak je korišćen za identifikaciju i izolovanje anti-humanih CD154 antitela. SLAM omogućava da ćelije koje proizvode visoko afinitetna antitela stvorena tokom in vivo imunih odgovora budu izolovana iz bilo koje vrste. Izolovane pojedinačne ćelije koje proizvode antitelo su zatim klonski proširene nakon čega je izvršen skrining u odnosu na one klonove koji proizvode anti-CD 154 antitela nakon čega sledi naknadna identifikacija sekvence njihovih gena varijabilnog teškog (VH) i lakog (VL) lanca. Poseban postupak skrininga je detaljno dat u WO 04/051268. Stoga, B ćelije koje su pozitivne u odnosu na antitela na humani CD154 su izolovane.

[0351] Nekoliko pacovskih anti-humanih CD154 antitela je identifikovano i izolovano korišćenjem SLAM tehnologije (Slika 12). Jedno od ovih antitela, CA081 00342 ("342 antitelo"), je humanizovano, kao što je opisano u sledećem primeru. Njegova DNK i izvedene aminokiselinske sekvence su prikazane na Slici 2. Gen koji kodira ovo antitelo je kloniran.

PRIMER 2: HUMANIZACIJA CA081 00342 – STVARANJE 342.G2

[0352] SLAM antitelo 342 je humanizovano graftovanjem CDRs na okvirne regione humane klicine linije. Poravnanja sekvence antitela pacova (donor) sa humanim okvirnim regionima klicine linije (akceptor) su prikazana na Slici 9, zajedno sa dizajniranom humanizovanom sekvencom. Izabrana akceptorska sekvenca lakog lanca klicine linije bila je humani VK12-1-(1) 012 V-region plus JK1 J-region (V BASE, MRC Centre for Protein Engineering, UK; SEQ ID NO: 35 i 36) (Slika 3). Izabrana akceptorska sekvenca teškog lanca klicine linije bila je humani VH3 1-1 3-66 V-region plus JH4 J-region (V BASE, MRC Centre for Protein Engineering, UK; SEQ ID NO: 37 i 38) (Slika 3). Dodatno, izabran je različiti VH akceptor okvirni region, humana VH4 1-1 4-59 sekvenca (SEQ ID NOS: 39 i 40) (Slika 3). CDRs graftovane od donor na akceptor sekvencu su definisani sa Kabat (Kabat et al. Sequence of proteins of immunological interest (1987). Bethesda MD, National Institutes of Health, US), sa izuzetkom CDR-H1 gde je korišćeni kombinovana Chothia/Kabat definicija (videti WO91/09967). Za graftove gde su samo CDRs preneti od donor antitela na akceptor okvirne regione, konstruisane su verzije u kojima su ključni donor ostaci okvirnih regiona takođe uključeni. Ovi ostaci su identifikovani korišćenjem postupka na osnovu onoga opisanog u WO 91/09967. Na primer, graft VK1gL4 lakog lanca sadrži donor ostatke na položajima 38, 71 i 85; graft VH3 gH1 teškog lanca sadrži donor ostatke okvirnog regiona na položajima 24, 48, 49, 73 i 78; graft VH4 gH1 teškog lanca sadrži donor ostatke okvirnog regiona na položajima 48, 71 i 78. Sekvence svih ovih graftova su prikazani na Slici 9.

[0353] Geni koji kodiraju ove sekvence V-regiona su dizajnirane i konstruisane korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije od strane kompanija po ugovoru koje se bave sintezom gena (Entelechon GmBH; DNK 2.0; Blue Heron). Modifikacije da se stvore graftovane varijante su napravljene korišćenjem standardne oligonukleotid-usmerene mutageneze korišćenjem PCR. Sekvence signalnog peptida od originalnih antitela pacova su uključene u originalne dizajn gena, da bi se omogućila ekspresija korišćenjem ekspresionih vektora sisarske ćelije.

[0354] Graftovani geni lakog lanca su sub-klonirani u ekspresioni vektor lakog lanca, koji sadrži DNK koji kodira humani C-Kappa konstantni region (Km3 alotip). Graftovani geni teškog lanca su subklonirani u humani gama-4 ekspresioni vektor, koji sadrži DNK koja kodria humani gama-4 konstantni region koji sadrži zglobnu stabilizacionu mutaciju S241P (Angal et al, Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8). Može se koristiti bilo koji pogodni ekspresioni vektor. Originalni geni antitela pacova su takođe subklonirani u ove vektore, stvarajući plazmide koji eksprimiraju himerni pacovski V-region / humani C-region antitelo kao referentno u testu.

[0355] Ko-transfektovanje plazmida sa genom lakog lanca i genom teškog lanca u CHO ćelije omogućilo je ekspresiju IgG i analizu vezivanja humanog CD154 sa Biacore®.

[0356] Da bi se analizirala ekspresija u E. coli i aktivnost kao monovalenti Fab’, geni za ključne konstrukte su sub-klonirani u ekspresioni vektor pTTOD (Fab) (WO 03/48208, WO 03/031475). Sub-kloniranje je postignuto u postupku od 2-stadijuma: prvo je VK fragment gena kloniran kao EcoRV - BsiWI fragment; zatim je VH fragment gena kloniran kao PvuII -XhoI fragment. Ovoj proces fuzioniše DNK koja kodira signalni peptid iz OmpA proteina sa genima koji kodiraju i lake i teške lance, dajući sekreciju translatiranog proteina bakterijskoj periplazmi. Rezultujući plazmidi su transformisani u E. coli K-12 soj W3110 i korišćeni u eksperimentima indukcije u malim šejker bocama i za fermentaciju ćelija visoke gustine.

[0357] Selekcija optimalnog grafta načinjena je uzimajući u obzir i aktivnost u testu i ekspresione nivoe Fab u E. coli fermentaciji. Primer određivanja afiniteta sa Biacore® je prikazan u Tabeli 1. N aosnovu ovoga izabran je graft gL4gH1.

Tabela 1.

Afinitet 342 Fab konstrukta sa Biacore® (prečišćeni Fab iz 1L fermentacije)

[0358] Napravljen je plazmid koji kodira Fab’ verziju grafta gL4gH1. DNK sekvenca od insercionog inserta ovog grafta prikazana je na Slici 8 (SEQ ID NO: 41). Slika 8 takođe obezbeđuje sekvencu inserta (SEQ ID NO: 28) za ekspresiju Fab fragmenta, koji se može koristiti za stvaranje F(ab)2 fragmenta.

PRIMER 3: STVARANJE AGLIKOZILOVANIH HU5C8 i HU342 ANTITELA MUTAGENEZOM USMERENOM NA MESTO

[0359] Aglikozilovana hu5c8 i hu342 antitela korisćena u sledećim eksperimentima su stvorena korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK. Aglikozilovano hu5c8 je stvoreno suštinski kao što je opisano u US2006/0193856, izuzev u odnosu na supstituciju huIgG4 Fc domena za IgG1 Fc domen koji je korišćen prethodno, da bi se dodatno smanjila efektorna funkcija. Sekvenca kapa lakog lanca aglikozilovanog hu5c8 je prikazana na Slici 13 (SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 i SEQ ID NO: 64). Težak lanac aglikozilovanog hu5c8 sadrži dve mutacije stvorene mutagenezom usmerenom na mesto u CH2 (T299A, Kabat EU) i zglobnim (S228P Kabat EU) domenima (Slika 14; SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 i SEQ ID NO: 67). T299A mutacija modifikuje N-glikozilaciono mesto u CH2 domenu tako da nije više supstrat za N-glikozilacione enzime, čineći molekul aglikozilovanim.

[0360] Aglikozilovano hu342 antitelo je izvedeno iz 342 Fab fragment vektora. Ova sekvenca je modifikovana dodavanjem humanih signalnih sekvenci i odgovarajućih humanih sekvenci konstantnog domena. Aglikozilovano hu342 antitelo takođe sadrži huIgG4 Fc domen. Sekvenca kapa lakog lanca aglikozilovanog hu342 je prikazana na Slici 15 (SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 i SEQ ID NO: 70). Težak lanac aglikozilovanog hu342 sadrži dve mutacije napravljene mutagenezom usmerenom na mesto u CH2 (T299A, Kabat EU) i zglobnim (S228P Kabat EU) domenima (Slika 16; SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 i SEQ ID NO: 73). T299A mutacija modifikuje N-glikozilaciono mesto u CH2 domenu tako da više nije supstrat za N-glikozilacione enzime, čineći molekul aglikozilovanim. I aglikozilovani hu5c8 i hu342 bili su stabilno eksprimirani u CHO ćelijama.

PRIMER 4: VEZIVANJE ZA CD154: MERENJE AFINITETA VEZIVANJA

[0361] Biacore® tehnologija prati vezivanje između molekula u realnom vremenu i bez potrebe za obeležavanjem. Jedan od interagujućih molekula, terminirani ligand, je ili imobilisan direktno ili je zarobljen na imobilisanoj površini dok drugi, terminirani analit, teče u rastvoru preko zarobljen površine. Senzor detektuje promene u masi na površini senzora kako se analit vezuje za ligand da formira kompleks na površini. Ovo odgovara procesu asocijacije. Proces disocijacije je praćen kada je analit zamenjen puferom. U Biacore® analizi afiniteta, ligand je anti-CD 154 antitelo kao što je 342 antitelo i analit je ekstracelularni domen humanog CD154.

[0362] Detalji postupak su kao što sledi:

Instrument: Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden.

Senzorni čip: CM5 (istraživačkog kvaliteta) kataloški broj: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Sweden. Čipovi su uskladišteni na 4°C.

BIAnornmalizujući rastvor: 70% (tež/tež) glicerol. Deo BIAmaintenance Kit Kataloški broj: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Sweden. BIAmaintenance kit je uskladišten na 4°C.

Kit za kuplovanje amina: kataloški broj: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Sweden. Etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (EDC). Napravljen do 75 mg/mL u destilovanoj vodi i uskladišten u 200 mL alikvotama na -70°C. N-hidroksisukcinimid (NHS). Napravljen do 11.5 mg/mL u destilovanoj vodi i uskladišten u 200 mL alikvotama na -70°C. 1 M etanolamin hidrohlorida -NaOH pH 8.5. Uskladišten u 200 mL alikvotama na -70°C.

Puferi: Tekući pufer je HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % surfaktant P20). kataloški broj: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Sweden. Pufer je uskladišten na 4 °C. Imobilizacioni pufer u Acetate 5.0 (10 mM natrijum acetat pH 5.0). kataloški broj: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Sweden. Pufer je uskladišten na 4 °C. Hvatanje liganda: Affinipure F(ab’)2 fragment kozjeg anti-humanog IgG, Fab’ fragment specifični (kataloški broj: 109-006-097) ili Fc fragment specifični (Kataloški broj: 109-006-098), Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA). Reagensi uskladišteni na 4 °C. Ligand: anti-CD 154 antitela.

Analit: Rekombinantni ekstracelularni domen humanog CD154. Materijal je pripremljen na 2 mg/mL (40 mM) u fosfatno-puferovanom fiziološkom rastvoru, uskladišten na 4 °C, i razblažen u HBE-EP tekućem puferu za analize. Tipično CD154 waje razblažen od ∼1 nM do ∼100 pM udvostručavanjem razblaženja za analizu afiniteta.

Rastvor za regeneraciju: 40 mM HCl pripremljeno razblaživanjem sa destilovanom vodom od 11.6 M stok rastvora (BDH, Poole, England. Kataloški broj: 101254H). 5 mM NaOH pripremljeno razblaživanjem sa destilovanom vodom od 50 mM stok rastvora. Kataloški broj: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Sweden.

Postupak anallize: BIA (Analiza biomolekulske interakcije) je izvedena korišćenjem Biacore® 3000 (Biacore AB). Affinipure F(ab’)2 fragment kozjeg anti-humanog IgG, Fc- ili Fab’-fragment specifičnog (Jackson ImmunoResearch) imobilisani su na CM5 senzor čipu preko hemije kuplovanja amina da bi se uhvatio nivo ≈6000 jedinica odgovora (RUs). HBSEP pufer (10mM HEPES pH 7.4,0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % surfaktant P20, Biacore AB) korišćen je kao tekući pufer sa stopom protoka od 10 ml/min. Anti-CD 154 antitela ili Fab fragmenti su korišćeni sa koncentracijama tako da su, po hvatanju imobilisane antihumane IgG-Fc (ili anti-humane IgG Fab’) površine, dali signal od ≈200 RUs. Humani CD154 je titrovan preko uhvaćenog antitela, na različitim koncentracijama. 90 mL CD154 je injektirano preko površine (faza asocijacije), praćeno sa 240 sekundi faze disocijacije, sve na stopi protoka od 30 mL/min. Površina je regenerisana sa dve 10 mL injekcije 40 mM HCl, nakon čega sa 5 mL injekcijom 5 mM NaOH na stopi protoka od 10mL/min. Oduzete referentne krive vezivanja analizirane su korišćenjem BIAevaluation software (verzija 3.2) praćenjem standardnih procedura. Kinetički parametri su određeni iz algoritma fitovanja.

[0363] Ovaj postupak se može koristiti da se proceni afinitet za CD154 protein, ili njegov fragment, bilo kog antitela, derivata antitela ili fragmenta antitela predmetnog pronalaska. Kd vrednosti dobijene sa Biacore® za anti-CD 154 antitela izolovana sa SLAM su prikazane na Slikama 12 i 18.

PRIMER 5: INHIBICIJA CD40 VEZIVANJA

[0364] Analiza zasnaovana na protočnoj citometriji je korišćena za procvenu vezivanja obeleženog CD40 sa CD154-eksprimirajućim D1.1 ćelijama. D1.1 Jurkat ćelije (American Type Culture Collection) su održavane u RPMI 1640 medijumu (Gibco, 31870-025)) koji sadrži 10% (zapr/zapr) fetalnog goveđeg seruma (FCS), 2 mM glutamina (Invitrogen, 23030024), 1mM natrijum piruvata (Invitrogen, 11360-039), 1% (zapr/zapr) D-(+)-glukoze (Sigma, G8769) & 10 mM HEPES (Sigma, H0887). U vreme analize, 100,000 D1.1 ćelija je inkubirnao u 100 mL RPMI 1640 medijuma 10% FCS, u prisustvu ili odsustvu serijski razblaženog anti-CD 154 antitela 15 minuta na sobnoj temperaturi. 5 mL 1:75 razblaženja hCD40-mFc-PE (Alexis Corp, ANC-504-050) je zatim dodato i inkubirano dodatnih 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja dva puta u fosfatno puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) koji sadrži 1% (tež/zapr) goveđeg serum albumina (BSA frakcija V, Serologicals Proteins Inc, 81-068-5) i 0.02% (tež/zapr) natrijum azida (BDH, 103692K), ćelije su resuspendovane u 200 mL PBS/1%BSA/0.02% natrijum azida i protočna citometrija je izvedena na Becton Dickinson FACScan. Vrednosti za geometrijsku sredinu fluorescencije (FL2) procenjene su u svim slučajevima. Inhibicija hCD40-mFc-PE vezivanja je izračunata u odnosu na signal u odsustvu antitela (0% inhibicija) i na signal u odsustvu hCD40-mFc-PE (100% inhibicija), korišćenjem formule:

[0365] IC50 vrednosti iz podataka su dobijene korišćenjem XLfit kao dela Activity Base paketa.

[0366] IC50 vrednosti CD40 vezivanja za anti-CD154 antitela izolovana sa SLAM su prikazane na Slikama 12 i 18.

PRIMER 6: ANALIZA KOMPETITIVNOG VEZIVANJA

[0367] Analiza zasnovana na protočnoj citometriji je korišćena za procenu vezivanja anti-CD154 antitela za CD 154-eksprimirajuće D1.1 ćelije. D1.1 Jurkat ćelije (American Type Culture Collection) su održavane u RPMI 1640 medijumu (Gibco, 31870-025) koji sadrži 10% (zapr/zapr) goveđeg fetalnog seruma (FCS), 2 mM glutamin (BioWhittaker, 17-605E) i 1 Penicilin-Streptomicin (Mediatech, 30002107). U vreme analize, 100,000 D1.1 ćelije su inkubirane u 10 mL PBS, 0.1% BSA, 0.02% natrijum azida (FACS pufer), u prisustvu ili odsusutvu serijski razblaženog anti-CD 154 antitela i biotinilovanog anti-CD 154 Fab (klon 342) 2 časa na 4°C. Ćelije su isprane tri puta u FACS puferu sa centrifugiranjem na 290xg 3 minuta između ispiranja. Dodato je 1:500 razblaženje streptavadin-R-fikoeritrin konjugata (Jackson Immunoresearch, 016-110-084) u 150 mM FACS puferu i ćelije su inkubirane jedan čas na 4°C. Ćelije su jednom isprane i fiksirane u PBS sa 3% formaldehidom na sobnoj temperaturi 10 minuta. Ćelije su resuspendovane u FACS puferu i propuštena kroz FacsCalibur (BD). Vrednosti za geometrijsku sredinu fluorescencije (FL2) su procenjene u svima slučajevima. Vezivanje biotin 342 Fab je plotovano nasuprot koncentracije kompetitivnog antitela da bi se dobile sigmoidne krive inhibicije koje su fitovane četvoroparametarsim fitovanjem krive korišćenjem GraphPad Prism. IC50 vrednosti generisane u ovoj analizi su prikazane na Slici 18.

PRIMER 7: ANALIZA USHODNE REGULACIJE ICAM-1

[0368] Sposobnost anti-CD 154 antitela da inhibiraju CD40L:CD40 interakcije na površini ćelije mereno je analizom in vitro potencije ko-kulture. Ligacija (npr., vezivanje) CD40 sa CD154 (CD40L) aktivira B limfocite što rezultuje u ushodnoj regulaciji CD54 (ICAM-1) na ćelijskoj površini i ova od kontakta zavisna CD40L:CD40 B ćelijska aktivacija može biti blokirana sa anti-CD 154. Ukratko, D1.1 Jurkat T limfom ćelije (CRL-10915, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) koje eksprimiraju CD154 i Ramos 2G6.4C10 B limfom ćelije (CRL-1923, ATCC) koje eksprimiraju CD40 ko-kultivisane su u 37° C inkubatoru sa 5% CO2preko noći na 1:4 odnosu sa titracijama anti-CD 154 Fabs ili kontrolnim intaktnim Ab (hu5C8). Analiza je izvedena u pločama sa okruglim dnom sa 96 bunarčića na koncentraciji od 1 X 10<6>ćelija/ml u RPMI kompltnom medijumu (RPMI sa 10% FBS, 1% L-glutamin, 1% natrijum piruvat i 10 mM HEPES pH 6.8, Gibco BRL, Rockville, MD, USA). Sledećeg dana ćelije su bojene jedan čas na 4° C sa CD20 FITC (#555622) i CD54 APC (#559771) od BD Pharmingen (San Diego, CA, USA) na koncentraciji od 1:100 i 1:200 respektivno u PBS koji sadrži 1% BSA i 0.1% natrijum azida. Ćelije su isprane i fiksirane sa 1% paraformaldehidom i analizirane na FACScan Calibur Cytometer (BD Biosciences). Geometrijska sredina fluorescencije Ramos ćelija (dvostruko pozitivne ćelije) nasuprot koncentracije anti-CD 154 (CD40L) je fitovana na 4-parametersku krivu korišćenjem DeltaGraph software (Red Rock Software, Salt Lake City, UT, USA) (Slike 12 i 18). IC50 vrednosti su korišćene da se odredi relativna potencija anti-CD 154 antitela.

PRIMER 8: AKTIVNOST U MODELU IMUNOG ODGOVORA MAKAKI MAJMUNA

[0369] Model korišćen da demonstrira aktivnost in vivo je opisan u Gobburu et al. (1998) J Pharmacol Exp therapeutics 286: 925. Makaki majmuni su primili jednu i.v. dozu ili fiziološkog rastvora, Hu5c8 antitela ili doznog odgovora 342 Fab’-PEG, 4 časa pre izazova sa jednom i.m. dozom 0.5 mL tetanus toksoida (TT). Svaka grupa tretmana sadržala je 3 mužjaka i 3 ženke. Na dan 30, data je druga doza inhibitora, i životinje su ponovo izazvane sa TT (sekundarni odgovor). Uzorci krvi su uzeti u izabranim vremenskim periodima do 50 dana za analizu i IgG i IgM anti-TT titara (Slike 19 i 21). Podaci pokazuju da 342 Fab’-PEG inhibira IgG i IgM imuni odgovor na TT na dozno zavisni način.

[0370] IgG anti-TT titri kod makaki majmuna su takođe mereni nakon tretmana sa jednom dozom (20 mg/kg za hu5c8, aglikozil 5c8 i aglikozil 342 i 40 mg/kg za 342 Fab’-PEG i 342 DFM-PEG) različitih oblika anti-CD154 antitela (Slika 20). Inhibicija TT imunog odgovora je uočena sa sva tri procenjivana antitela.

PRIMER 9: ANALIZA UNAKRSNOG BLOKIRANJA FLUORESCENCIJOM AKTIVIRANOG SORTIRANJA ĆELIJA

[0371] Osobine vezivanja anti-CD154 Fab’ fragmenata pronalaska proučavane su analizama unakrsnog blokiranja antitela. Ukratko, CD154-eksprimirajuće D1.1 Jurkat ćelije su inkubirane ili sa medijumom ili sa 10 mg/ml neobeleženim prvim anti-CD154 Fab’ 60 minuta na sobnoj temperaturi. Bez ispiranja, optimalno razblaženje Alexa Fluor 488-obeleženog drugog anti-CD 154 Fab’ (300 ng/ml) je dodato u toku 60 minuta. Ćelije su zatim isprane i analizirane protočnom citometrijom. Ukoliko se prvi i drugi Fab’ vezuju za isti epitop, prvi Fab’ će kompetitivno blokirati vezivanje drugog Fab’. Ukoliko se dva antitela vezuju za različite epitope, prvi Fab’ neće blokirati vezivanje drugog Fab’. Ukoliko drugi testirani Fab’ je 342, može se pokazati da 342 Fab’ je unakrsno blokiran sa 338 (Slika 23B), 381 (Slika 23D) i 335 (Slika 23G) Fab’s ali nije unakrsno blokiran sa 295 (nije prikazano), 402 (Slika 23C), 300 (Slika 23E), 303 (Slika 23H) ili 294 (Slika 23F) Fab’s. Kad obeleženi Fab’ je hu5c8, unakrsno blokiranje sa 338 (Slika 24A), 402 (Slika 24B), 381 (Slika 24C), 303 (Slika 24D), 335 (Slika 24E), 300 (Slika 24F) i 294 (Slika 24G) Fab’s se može demonstrirati. Testiranje sa A33 (izotip-odgovarajuće kontrolno antitelo) potvrđuje da nema nespecifičnog unakrsnog blokiranja (Slike 23A i 24H). Antitela 342 i hu5c8 bila su u međusobnoj kompeticiji za CD154 vezivanje bez obzira na to koje je bilo neobeleženo (prvo) i obeleženo (drugo) Fab’.

PRIMER 10: BIACORE® ANALIZA VEZIVANJA ANTITELA

[0372] Biacore® analysis vezivanja 342 i hu5c8 antitela sa rastvorljivim CD154 proteinom (sCD154) (ekstracelularni domen; ECD) ukazalo da je 342 izmestio hu5c8 vezivanje sa sCD154 kada je kao drugi dodat sCD154 (Slike 25 i B). 5c8 nije bio u stanju da izmesti 342 sa sCD154 kada je dodat kao drugi sCD154 (Slika 25 C). Antitelo 338 se slično ponašalo kao 342 u odnosu na ne-recipročnerezultate u kompetitivnoj analizi hu5c8.

[0373] Hu5c8 Fab se može vezati za 342 pune dužine (FL)/sCD154 kompleks (Slika 25D). Ovaj rezultat sugeriše da hu5c8 Fab nije u kompeticiji sa 342 FL mestom vezivanja kada je 342 FL dodat kao prvi. Bez vezivanja za teoriju, ovi rezultati sugerišu da vezivanje jedne ili dve ruke sCD154 trimera sa 342 ne sprečava hu5c8 vezivanje za "slobodnu" ruku (ruke).

[0374] Postoji malo (∼20RU) povećanje u vezivanju kada je hu5c8 Fab praćeno sa 342 Fab’ (Slika 25E). Ovaj rezultat pruža mogućnost da ili je hu5c8 Fab’ blokirao vezivanje 342 Fab’ ili da 342 Fab’ je zamenio hu5c8 Fab’ na uhvaćenom sCD154.

[0375] Ni 342 Fab’ niti hu5c8 Fab’ se vezuju za CD40:sCD154 kompleks ili utiču na disocijaciju kompleksa u analizi proteina. Činjenica da se nijedan Fab’ ne može vezati za CD40:sCD154 kompleks sugeriše da ili kompleks koristi sve tri ruke sCD154 ili da kompleks sterički ometa pristup bilo kom Fab’ do "slobodne" ruke.

PRIMER 11: AKTIVACIJA HUMANIH TROMBOCITA

Analiza 1

[0376] Agregacija trombocita može se izvesti korišćenjem objavljenih analiza (npr., Florian et al. (2005) Thrombosis Hemostasis 93: 1137). U jednoj analizi, trombociti su isprani iz plazme bogate trombocitima normalnog donora u HEPES-puferovanom fiziološkom rastvoru u BSA obloženim epruvetama i podešeni na 250,000 po mikrolitru (ml). Isprani trombociti su zatim pipetirani u agregometar kivetu (Chrono-Log 490D) i signal za praćenje je kalibrisan na nula procenata agregacije, korišćenjem HEPES (analitički) pufera za blankiranje. U ovom instrumentu kiveta je održavana na 37.0°C i silikonizovana magnetna šipka meša trombocite na 1000 rpm. Potpuno formirani imuni kompleksi (tj., antitelo plus rekombinantni humani rastvorljivi CD40L (rhsCD40L), u 1:1 stehiometriji gde je rhsCD40L tretiran kao trimerni) dodati su trombocitima i agregacija je procenjena kao trag izveden iz optičke gustine rastvora. Specifično, 15 µl imunog kompleksa je dodato u 285 µl isprane suspenzije trombocita tako da je nakon dodavanj u kivetu, finalna koncentracija sCD40L bila 10 µg/ml i ona IgG antitela je bila 27.8 µg/ml ili 16.7 µg/ml za Fab’-PEG. Podaci pokazuju da se agregacija dešava u prisustvu intaktnog IgG anti-CD40L antitela Hu5c8, ali ne sa 342 Fab’-PEG (Slika 26).

Analiza 2

[0377] U sledećoj analizi opisanoj u WO 07/59332, agregacija trombocita je merena dovođenjem u kontakt trombocita sa sredstvom za aktiviranje trombocita (npr., adenozin difosfat (ADP), kolagen, trombin, tromboksan, neurofil elastaza, pselektin, ili convulksin), dovođenjem u kontakt aktiviranih trombocita sa anti-CD 154 antitelom, i zatim dovođenjem u kontakt aktiviranih trombocita sa unakrsno vezujućim sredstvom (npr., rastvorljivi CD154 (sCD154), anti-humanim IgG antitelom, anti-hFc antitelom, RF, Fc receptor-pozitivnom pomoćnom ćelijom, rastvorljivim proteinom A, ili rastvorljivim humanim Fc receptorom). Agregacija je zatim kvantifikovana sa sedimentacijom trombocita, pri čemu je sedimetacija trombocita indikativna za agregaciju trombocita. Analiza agregacije je izvedena na plazmi bogatoj trombocitima (PRP). Približno 50 mL cele krvi ja sakupljeno u alikvotama 4.5 mL vakutejner epruvetama koje sadrže 0.5 mL 3.8% natrijum citrata. PRP je pripremljen centrifugiranjem antikoagulisane krvi na 200 g 10 minuta i sakupljanjem supernatanta. Da bi se izvela analiza, Biodata 4-kanalni profajler agregacije trombocita (PAP-4; Biodata Corp., Hatboro, PA) je blankiran korišćenjem kivete koja sadrži samo plazmu siromašnu trombocitima (PPP).350 µl alikvota PRP, koja sadrži oko 2 do 5 x 10<8>/mL trombocita, dodata je u kivetu sa šipkom za mešanje. Anti-CD40L antitelo, humani IgG, normali humani serum, CD40-Fc, ili anti-hFc su dodati u ukupnoj zapremini od 100 µl. Napunjena kiveta je postavljena u mašinu i komponente reakcije su pomešane pre dodavanja ADP.

[0378] Agregacija je inicirana sa dodavanjem sub-optimalne koncentracije ADP u 50 µl (finalna koncentracija varira za svaki poejdinačni uzorak). Agregacioni profajler ima četiri porta, koja mogu raditi istovremeno. Praćenje agregacije je generisano za svaki uzorak tokom četiri minuta nakon dodavanja ADP. Na kraju praćenja, instrument izračunava procenat agregacije poređenjem transmisije svetlosti kroz uzorak do sa transmisijom svetlosti kroz PPP blanko. Titracija je izvedena na početku svakog eksperimenta, i naknadna izvođenja su izvedena na suboptimalnoj ADP koncentraciji.

[0379] Rezultati iz ove analize su prikazani na Slici 27. PRP ja dobijena od jednog zdravog pojedinca. Agregacija je indukovana sa 0.75 µM ADP, za koji je određeno da je suboptimalan za ovog donora. Pozitivna kontrola anti-CD 154 antitela i negativna kontrola hIgG procenjeni su na 200 µg/mL i sCD154 na 30 µg/mL. Anti-CD154 antitelo ili hIgG je pomešano sa rekombinantnim sCD154 ne manje od 20 minuta pre dodavanja kivete koja sadrži PRP. Linije predstavljaju srednje vrednosti i standardne devijacije za dve tačke podataka. Rezultati pokazuju da dok negativna kontrola humanog IgG (hIgG) i sCD154 zajedno nisu imali nikakav efekat na agregaciju trombocita, pozitvna kontrola anti-CD 154 antitela pokjačala je agregaciju trombocita. Rezultati iz ove analize korišćenjem pozitivne i negativne kontrole pokazuju da ova analiza može biti korišćena da se poredi relativni efekat antitela prema predmetnom pronalsku na agregaciju trombocita.

[0380] Da bi se odredilo da li trombociti eksprimiraju CD154 na njihovoj površini, trombociti se mogu inkubirati sa biotinkonjugovanim anti-CD 154 antitelom i prisustvo površinskog CD154 određeno kvantifikacijom vezanog biotinilovanog anti-CD40L antitela. Shodno tome, površinska ekspresija CD154 je procenjena nakon 1, 10, 20, 40, i 60 minuta inkubacije sa ili bez 10 mM ADP. Površinska ekspresija CD40L bila je detektabilna na ADP-aktiviranim trombocitima čak jedan minut nakon aktivacije i povećavala se tokom vremena. Vezivanje biotin-konjugovanog anti-CD 154 antitela je specifično za CD154, jer je preinkubacija biotinkonjgovanog anti- CD154 antitela sa sCD154 inhibiralo vezivanje sa aktiviranim trombocitima. Količina površinskog CD154 detektovana na inaktiviranim ("mirujućim") trombocitima takođe se povećavala tokom vremena. Ovaj fenom se verovatno može pripisati bazalnom nivou aktivacije trombocita pod eksperimentalnim uslovima.

PRIMER 12: POSTUPCI ZA ODREĐIVANJE IZMENJENE EFEKTORNE FUNKCIJE AGLIKOZILOVANIH I DRUGIH VARIJANTI ANTITELA

[0381] Sledeći primer opisuje analize korisne za određivanje i karakterizaciju efektorne funkcije (funkcija) aglikozilovanih i drugih modifikovanih varijanti antitela pronalaska.

[0382] Efektorna funkcija aglikozilovanih i drugih modifikovanih varjanti antitela pronalaska može biti karakterisana sposobnošću antitela da vezuje antigen i takođe vezuje Fc receptor ili molekul komplementa kao što je Clq. Naročito, FcyR vezujući afiniteti mogu biti mereni sa analizama na osnovu sposobnosti antitela da formiraju "most" između CD 154 antigena i ćelije koja nosi Fc receptor. Clq vezujući afinitet može biti meren na osnovu sposobnosti antitela da formira "most" između CD154 antigena i Clq. Interakcija antitela prema predmetnom pronalasku sa FcR ili sa komplementom može setakoše meriti sa AlphaScreen ® technology baziranoj na kuglicama (Perkin Elmer®).

Analize vezivanja Fc receptora

[0383] Analiza FcyR premošćavanja može biti izvedena oblaganjem Maxisorb ELISA ploča sa 96 bunarčića (Nalge-Nunc Rochester, NY, USA) sa rekombinantnim rastvorljivim humanim CD154 ligandom (npr., na koncentraciji od 1 µg/ml preko noći na 4°C u PBS; Karpusas et al.1995 Structure 3(10): 1031-1039 i 3(12): 1426 i Karpusas et al.2001 Structure 9(4): 321-329). Titracije glikozilovanih ili aglikozilovanih oblika anti-CD 154 antitela su vezane za CD154 30 minuta na 37 °C, ploče su zatim isprane, i vezivanje fluorescentno obeleženih U937 (CD64+) ćelija je mereno. U937 ćelije se mogu uzgajati u RPMI medijumu sa 10% FBS, 10 mM HEPES, L-glutamin, i penicilin/streptomicin, podeljeno 1:2, i aktivirano jedan dan pre analize sa 1000 jedinica/ml IFNy da bi se povećala ekspresija Fc receptora (FcyRI).

[0384] U sledećoj varijanti analize, sposobnost antitela pronalaska da se vežu za, ili pre, ne uspeju da se vežu za, još jedan Fc receptor, kao što je, FcyRIII (CD16) može biti izvedena korišćenjem prethodne analize premošćavanja nasuprot fluorescentno obeleženih humanih T ćelija (Jurkat ćelije) transfektovanih sa CD16 ekspresionim konstruktom. Ligand može biti proizveden od strane monosloja CD154-eksprimirajućih ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) uzgajanih u pločama za kulturu tkiva sa 96 bunarčića (Corning Life Sciences Acton, MA, USA). Na primer, CHO-CD 154+ ćelije zasejane u ploče sa 96 bunarčića IX10<5>ćelija/ml i uzgajane do konfluence u oc-MEM sa 10% dijaliziranim FBS, 100 nM metotrksat, L-glutamin, i penicilin/streptomicin (Gibco-BRL Rockville, MD, USA). CD 16+ Jurkat ćelije su uzgajane u RPMI sa 10% FBS, 400 pg/ml Geneticin, 10mM HEPES, natrijum piruvat, L-glutamin, i penicilin/streptomicin (Gibco-BRL) i podeljeno 1:2 jedan dan pre izvođenja analize.

[0385] U analizama za oba receptora, ćelije koje nose Fc receptor mogu biti obeležene sa 2’,7’-bis-(2-karboksietil)-5- (i-6)-karboksifluorescein acetoksimetil estar (BCECF- AM) (Molecular Probes Eugene, OR, USA) 20 minuta na 37°C. Nakon ispiranja da se ukloni višak obeleživača, 1x10<5>obeleženih ćelija je inkubirano u analizi 30 minuta na 37°C. Nevezane FcyR pozitivne ćelije su uklonjene ispiranjem nekoliko puta i ploče su očitane na čitaču mikroploča (Cytofluor 2350 Fluorescent Microplate Reader, Millipore Corporation Bedford, MA, USA) na ekscitacionoj talasnoj dužini od 485 nm i emisionoj talasnoj dužini od 530 nm.

[0386] Dodatno prethodno opisanim analizama, vezivanje antitela predmetnog pronalaska za Fc receptore može se meriti u kompeticionom formatu korišćenjem AlphaScreen™ (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay; Perkin Elmer) ili sirektno korišćenjem površinske plazmon rezonance (Biacore®). Biacore analize mogu pratiti vezivanje analit receptora sa antitelom zarobljenim na protein A/G čipu korišćenjem Biacore® 3000 instrumenta. Biacore® je dobro ustanovljeni postupak za karakterizaciju protein-protein interakcija (Myszka 1997 Curr Opin Biotechnol. 8:50-57.; Malmborg & Borrebaeck 1995 J Immunol Methods 183:7-13), i uspešno je korišćen za merenje vezivanja IgG antitela sa FcγRIII (Galon et al., 1997 Eur J Immunol. 27:1928-1932). Na primer, protein A/G je kovalentno kuplovan sa senzor čipom (npr., CM5 senzor čip korišćenjem NHS hemije). Tekući pufer (npr., HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% zapr/zapr surfaktant P20, Biacore®)), i pufer za regeneraciju čipa (npr., glicin 1.5 (10 mM glicin-HCl, pH 1.5, Biacore®)) su korišćeni u analizi. Varijanta anti-CD 154 antitela sa smanjenom efektornom funkcijom i divlji tip ili nativna anti-CD154 antitela su razblažena do 100 nM u tekućem puferu (npr., HBS-EP pufer) i vezan su za protein A/G čip 5 min. Receptori su vezani u asociacionoj fazi u seriji koncentracija, nakon čega je usledila faza disocijacije sa puferom. Ciklus bez antitela obezbeđuje bazalni odgovor. Senzogrami se mogu globalno fitovati u 1:1 Langmuir model vezivanja da bi se dobile ravnotežne konstante disocijacije (KDs) korišćenjem BIAevaluation software v4.1 (Biacore®), na primer.

[0387] AlphaScreen analize koriste netagovano antitelo za kompeticiju interakcije između biotinilovanog IgG vezanog za streptavidin donor kuglice i FcyR-His-GST vezan za anti-GST akceptorske kuglice. Divlji tip ili nativno anti-CD 154 antitelo (kao što je IgG1 antitelo) je biotinilovano korišćenjem standardnih postupaka i dijalizirano u PBS. Anti-GST akceptor kuglice i streptavidin donor kuglice su dostupne od komercijalnih dobavljača i mogu se koristiti na 20 µg/ml finalnoj koncentraciji. FcyRI-His-GST, FcyRIIIa-His-GST, FcyRIIa-His-GST, ili bilo koji drugi tagovani FcR, u 1X puferu analize (npr., 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.01% Tween-20, pH 7.4) je distribuiran u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića do 0.5 nM finalne koncentracije. Divlji tip ili nativno anti-CD 154 antitelo, varijanta anti-CD 154 antitela, ili pufer je pripremljen kao 1⁄2 log razblaženja u 1X puferu analize, i alikvotirana direktno u svaki bunarčić. Nakon kratkog centrifugiranja, biotinilovani divlji tip anti-CD 154 antitela (npr., IgG1 antitelo) u 1X puferu analize je dodat u svaki bunarčić do 5 nM finalne koncentracije.100 mg/ml

anti-GST acceptor beads are added to each well, i plate je incubated in dark for 1 hour at room temperature. Dodato je 100 µg/ml streptavidin donor kuglica u svaki bunarčić, i nakon kratkog centrifugiranja ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi 1.5 čas. Reakcioni uzorci su preneti na bele neprovidne ploče, i fluorescencija je očitana na Fusion™ Alpha-FP HT čitaču mikroploča (Perkin Elmer). Podaci mogu biti normalizovani do najvišeg signala (nema kompeticije) i fitovani na model komepticije za jedno mesto korišćenjem nelinearne regresije sa programom GraphPad Prism (GraphPad Software), na primer.

[0388] Stručnjak može izvesti prethodne ili slične analize da izmeri vezivanje varijanti antitela za bilo koji FcR, uključujući, na primer, FcyRIIa.

Analize vezivanja C1q

[0389] Analiza vezivanja C1q može biti izvedena oblaganjem Maxisorb ELISA ploča sa 96 bunarčića (Nalge-Nunc Rochester, NY, USA) sa 50 µl rekombinatnog rastvorljivog humanog CD154 liganda (Karpusas et al. Structure, 15; 3 (12): 1426 (1995) na 10 µg/ml preko noći na 4°C u PBS. Bunarčići su aspirirani i isprani tri puta sa puferom za ispiranje (PBS, 0.05% Tween 20) i blokirani najmanje 1 čas sa 200 µl/bunarčiću blokirajućeg/razblažujućeg pufera (0.1 M Na2HPO4, pH 7.0, 1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.1 % želatin). Antitelo koje se testira je razblaženo u blokirajućem/razblažujućem puferu počinjući od 15 µg/ml sa 3-puta razblaženjem. 50 µl je dodato po bunarčiću, i ploče su inkubirane 2 časa na sobnoj temperaturi.

[0390] Nakon aspiracije i ispiranja kao prethodno, 50 µl/bunarčiću 2 µg/ml Sigma humanog Clq (C0660) razblaženog u blokirajućem/razblažujućem puferu je dodato i inkubirano 1.5 časa na sobnoj temperaturi. Nakon aspiracije i ispiranja kao prethodno, dodato je 50 µl/bunarčiću ovčjeg anti Clq (Serotec AHP033), razblaženog 3,560-puta u blokirajućem/razblažujućem puferu. Nakon inkubacije od 1 časa na sobnoj temperaturi, bunarčići su aspirirani i isprani kao prethodno. Zatim je dodato 50 µl/bunarčiću magarećeg anti-ovčijeg IgG HRP konjugata (Jackson ImmunoResearch 713-035-147) razblaženog do 1:10,000 u blokirajućem/razblažujućem, i bunarčići su inkubirani 1 čas na sobnoj temperaturi.

[0391] Nakon aspiracije i ispiranja kao prethodno, dodato je 100 µl TMB supstrata (420 mM TMB, 0.004% H2O2u 0.1 M natrijum acetat/limunska kiselina puferu, pH 4.9) i inkubirano 2 min pre zaustavljanja reakcije sa 100 µl 2 N sumporne kiseline. Apsorbanca je očitana na 450 nm sa Softmax PRO instrumentom, i Softrnax software jkorišćen za određivanje relativnog afiniteta vezivanja (C vrednost) sa 4-parametarskim fitovanjem.

[0392] Alternativna analiza vezivanja C1q koristii ELISA za određivanje anti-CD154 vezivanja za C1q ali ne koristi CD154 kao most. Ukratko, ploče za analizu mogu biti obložene preko noći na 4°C sa varijantom antitela ili roditeljskim antitelom (kontrola) u puferu za oblaganje. Ploče mogu zatim biti isprane i blokirane. Nakon ispiranja, alikvot humanog C1q može biti dodat svakom bunarčiću i inkubiran 2 časa na sobnoj temperaturi. Nakon sledećeg ispiranja, 100 µl ovčijeg antikomplement C1q perokisdaza konjugovanog antitela može biti dodato svakom bunarčiću i inkubirano 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploča može biti opet isprana sa puferom za ispiranje i svakom bunarčiću se može dodati 100 µl supstratnog pufera koji sadrži OPD (O-fenilendiamin dihidrohlorid (Sigma)). Oksidaciona reakcija, uočena preko pojave žute boje, može biti se ostaviti 30 minuta i zaustaviti dodavanjem 100 µl 4.5 NH2SO4. Absorbanca se zatim može očitati na (492-405) nm.

[0393] Primer varijante antitela je onaj koji pokazuje "značajno smanjenje C1q vezivanja" u ovoj analizi. Značajna redukcija može biti, u nekim primerima izvođenja, oko 100 µg/ml varijante antitela pokazuje oko 50-puta ili veće smanjenje C1q vezivanja u poređenju sa 100 µg/ml kontrolnog antitela koje ima nemutirani IgG1 Fc region. U najpoželjnijem primeru izvođenja, varijanta polipeptida (tj., antitelo) ne vezuje Clq, tj., 100 µg/ml varijante antitela pokazuje oko 100-puta ili više smanjenje C1q vezivanja u poređenju sa 100 µg/ml kontrolnog antitela.

Aktivacija komplementa i CDC

[0394] Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvesti analiza komplement zavisne citotoksičnosti (CDC), npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Ukratko, različite koncentracije varijante polipeptida (tj., antitela) i humani komplement mogu biti razblažene sa puferom. Ćelije koje eksprimiraju antigen za koji se varijanta polipeptida vezuje mogu biti razblažene do gustine od oko 1 X 10<6>ćelija/ml. Smeše varijante polipeptida, razblaženog humanog komplementa i ćelije koje eksprimiraju antigen mogu se dodati u ploču za kulturu tkiva sa ravnim dnom sa 96 bunarčića i ostaviti da se inkubiraju 2 časa na 37° C i 5% CO2da bi se olakšala liza ćelija posredovana komplementom. Zatim se može dodati 50 µl alamar plavog (Accumed International) u svaki bunarčić i inkubirati preko noći na 37°C. Apsorbanca je merena korišćenjem fluorometra za 96-bunarčića sa ekscitacijom na 530 nm i emisijom na 590 nm. Rezultati mogu biti eksprimirani u jedinicama relativne fluorescencije (RFU). Koncentracije uzoraka mogu se izračunati iz standardne krive i procenat aktivnosti u poređenju sa nevarijantnim polipeptidom je zabeležen za varijantu polipeptida od interesa.

PRIMER 13: MAPIRANJE MESTA VEZIVANJA 342 ANTITELA NA CD154 PROTEINU

[0395] Izvedeni su eksperimenti da bi se identifikovali aminokiselinski ostaci u humanom CD154 koji su važni za vezivanje 342 korišćenjem humanih-mišjih himernih CD154 proteina.

342 se vezuje sa visokim afinitetom za humani CD154 ali se ne vezuje za mišji CD154. Stoga, mutiranjem CD154 mišjih ostataka u jedan od odgovarajućih humanih ostataka i merenjem promene u afinitetu mutiranog proteina za 342, mogu se identifikovati ostaci važni za vezivanje. Šest grupa mutanata je izabrano gde su humani ostaci na izabranim regionima introdukovani u rastvorljivi mišji CD154 (obeležen sa 1-6 na Slici 28). Ne-mutirani humani i mišji rastvorljiv CD154 (sCD154) proteini su takođe procenjivani. Različiti sCD154 proteini su korišćeni u Biacore® eksperimentima korišćenjem 342 (u IgG formatu) imobilisani na čipu i sa sCD154 supernatantima u fazi rastvora. Rezultati su pokazali da se 342 vezivanje dešava samo sa introdukcijom humane Grupe 5 ostataka u mišji CD154.

PRIMER 14: ANALIZA UNAKRSNOG BLOKIRANJA KOMPETITIVNOM ELISA

[0396] Da bi se demonstriralo unakrsno vezivanje 342 i 5c8 Fab’s, koristili smo kompetitivnu ELISA. U ovoj analizi, anti-Myc antitelo 9E10 je obloženo na ELISA ploču. Myc-tagovani CD154 je uhvaćen sa ovim antitelom. Serije razblaženja neobeleženog 342 ili 5c8 Fab’ su inkubirane ili sa 1 nM biotin 342 Fab’ ili sa 0.3 nM biotin 5c8 na ploči dva sata na sobnoj temperaturi u PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA. Ploča je isprana i količina vezanog biotinilovanog 5c8 Fab je određena korišćenjem streptavidin HRP kao sekundarnog. Signal je grafički prikazan i fitovan korišćenjem ili fitovanjem krive sa hiperbolom sa jednim mestom vezivanja ili hiperbolom sa dva mesta vezivanja u Prism software (Graph Pad).

[0397] Izvedena je titracija biotin 342 Fab’ na CD154 da bi se odredila odgovarajuća koncentracija za analizu unakrsnog vezivanja (Slika 29A). Pronađeno je da je 1 nM koncentracija na linearnom delu krive. Takođe je izvedena titracija biotin 5c8 Fab’ na CD154 da bi se odredila odgovarajuća koncentracija za analizu unakrsnog vezivanja (Slika 29B). Pronađeno je da je 0.3 nM koncentracija na linearnom delu krive. U eksperimentu za analiziranje unakrsnog vezivanja biotin 342 i biotin 5c8 Fab’s sa neobeleženim 342 Fab’, 342 Fab’ je inhibirao vezivanje biotin 342 Fab’ sa afinitetom od 0.09 nM (Slika 29C). 342 Fab’ inhibira vezivanje biotin 5c8 sa dva afiniteta, 0.134 nM i 76 nM (Slika 29C). Unakrsno blokiranje biotin 342 sa neobeleženim 5c8 Fab’ je prikazano na Slici 29D. Maksimalna koncentracija 5c8 Fab’ na ovoj krivi, 50 nM, je dosta pre tačke zasićenja za 5c8 i takođe je dosta pre 1 nM koncentracije biotin 342. Nedostatak kompletne inhibicije na ovim koncentracijama sugeriše da 5c8 nije sposoban da kompletno blokira sva vezujuća mesta 342 na CD40L.

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment, koje sadrži:

(a) sekvencu VH domena prema SEQ ID NO: 1 sa Slike 5; i

(b) sekvencu VL domena prema SEQ ID NO: 2 sa Slike 6.

2. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži:

(a) sekvencu teškog lanca izabranu od SEQ ID NO: 12 sa Slike 7, SEQ ID NO: 13 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 72 sa Slike 16; i

3. Anti-CD 154 antitelo ili njegov njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 2, koje sadrži sekvence teškog i lakog lanca izabrane od:

(a) SEQ ID NO: 12 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 15 sa Slike 7, respektivno;

(b) SEQ ID NO: 13 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 15 sa Slike 7, respektivno; i

(c) SEQ ID NO: 72 sa Slike 16 i SEQ ID NO: 69 sa Slike 15, respektivno.

4. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 3, koje sadrži sekvence teškog i lakog lanca od SEQ ID NO: 13 sa Slike 7 i SEQ ID NO: 15 sa Slike 7, respektivno.

5. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnim zahtevima 1-4, naznačeno time da:

(a) anti-CD 154 antitelo je anti-CD 154 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od multimernog antitela, heterodimernog antitela, hemidimernog antitela, tetravalentnog antitela, bispecifičnog antitela, jednolančanog antitela, i njihovih derivata; ili

(b) anti-CD 154 antitelo je antigen-vezujući fragment anti-CD 154 antitela, i pomenuti antigen vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, F(ab)2, Fab’, F(ab’)2, F(ab’)3, Fd, i Fv.

6. Anti-CD 154 antitelo prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da pomenuto anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment je modifikovan kovalentnim vezivanjem poli(etilenglikola) ili njegovog derivata.

7. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time da CD 154 antitelo je Fab’ fragment naznačeno time da tiol grupa u modifikovanom zglobnom regionu je kovalentno vezana za maleimid grupu koja je kovalentno vezana za lizinski ostatak, naznačeno time da je metoksipoli(etilenglikol) polimer koji ima molekulsku težinu od približno 20,000 Da vezan za svaku od amin grupa lizina.

8. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da:

(a) antitelo ili njegov fragment nema imunoglobulinski Fc region; ili

9. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo ili njegov fragment dodatno sadrži varijantu Fc regiona koja je hibridni Fc region koji sadrži sekvence iz više od jednog tipa Ig Fc domena.

10. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući njegov fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačeno time da antitelo ili njegov fragment nije glikozilovan.

11. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time da antitelo ili njegov fragment je vezan za funkcionalni deo izabran od blokirajućeg dela, detektabilnog dela, terapeutskog dela ili njihove kombinacije.

12. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačeno time da fragment je fuzija Fab, Fab’, Fd, Fv, scFv, scFab, ili scFab bez cisteina.

13. Molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12.

14. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da nukleinska kiselina je DNK molekul koji kodira anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment, DNK molekul sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17 sa Slike 6, SEQ ID NO: 18 sa Slike 6, SEQ ID NO: 22 sa Slike 5, SEQ ID NO: 23 sa Slike 7, SEQ ID NO: 24 sa Slike 7, SEQ ID NO: 25 sa Slike 6, SEQ ID NO: 26 sa Slike 7, SEQ ID NO: 27 sa Slike 7, SEQ ID NO: 28 sa Slike 8, SEQ ID NO: 41 sa Slike 8, SEQ ID NO: 70 sa Slike 15 i SEQ ID NO: 73 sa Slike 16.

15. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 13 ili DNK molekul prema patentnom zahtevu 14.

16. Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 15.

17. Postupak za proizvodnju anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta, naznačeno time da pomenuti postupak sadrži korake:

(a) kultivisanja ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 16 pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta, od strane pomenute ćelije domaćina; i

(b) rekuperacije anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta.

18. Postupak prema patentnom zahtevu 17, naznačeno time da ćelija domaćin je prokariotska ili eukariotska ćelija.

19. Kompozicija koja sadrži anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 i pogodni farmaceutrski nosač.

20. Kompozicija prema patentnom zahtevu 19, naznačeno time da pomenuta kompozicija dodatno sadrži dodatno imunosupresivno ili imunomodulatorno jedinjenje ili sredstvo.

21. Upotreba anti-CD 154 antitela ili njegovog CD 154-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 ili kompozicije prema patentnom zahtevu 19 ili 20 za pripremu medikamenta za tretiranje ili prevenciju humanog stanja, poremećaja ili bolesti posredovanih u celini ili delimično CD40 siganalizacijom ili simptoma bilo kog od prethodnog, naznačeno time da pomenuto stanje, poremećaj ili bolest je inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza.

22. Upotreba prema patentnom zahtevu 21, naznačeno time da inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza je izabrana od reumatoidnog artritisa, sistemskog eritemskog lupusa, spondilartritisa, inflamatorne bolesti creva, Crohn bolesti, psorijaze, skleroderme, lupus nefritisa, idiopatske trombocitopenije purpure, vaskularne bolesti i multiple skleroze.

23. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 19 ili 20 za upotrebu u tretiranju ili prevenciji humanog stanja, poremećaja ili bolesti posredovane u celini ili delimično sa CD40 signalizacijom ili simptoma bilo kog od prethodnog, naznačeno time da pomenuto stanje, poremećaj ili bolest je inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza.

24. Anti-CD 154 antitelo ili njegov CD 154-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 ili kompoziicja prema patentnom zahtevu 19 ili 20 za upotrebu u tretiranju ili prevenciji inflamatornog ili autoimunog odgovora ili fibroze prema patentnom zahtevu 23, naznačeno time da inflamatorni ili autoimuni odgovor ili fibroza je izabrana od reumatoidnog artritisa, sistemskog eritemskog lupusa, spondilartritisa, inflamatorne bolesti creva, Crohn bolesti, psorijaze, skleroderme, lupus nefritisa, idiopatske trombocitopenije purpure, vaskularne bolesti i multiple skleroze.