RS58731B1 - Kompozicija koja sadrži jota-karagenan protiv virusnog konjuktivitisa - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak je u oblasti virologije i primenjene medicine i odnosi se na kompoziciju za upotrebu kao lek u profilaktičkom ili terapeutskom tretmanu virusno indukovanog konjuktivitisa.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Epidemijski keratokonjunktivitis (EKC) je ozbiljna i zarazna infekcija oka koja pogađa i konjunktivu i rožnjaču i uzrokovana je adenovirusima tipa D, pretežno serotipovima 8, 19, 37. Izolovano je više od 50 serotipova adenovirusa, i najmanje 19 dokumentovanih serotipova uzrokuje infekciju oka. Najčešć e povezani serotipovi koji uzrokuju EKC uključuju adenovirus 8, 19 i 37, a ređe i manje teške oblike, serotipovi 2-5, 7, 9, 10, 11, 14, 16, 21 i 29. Zbog niskih nivoa prirodnog imuniteta protiv adenovirusa u opštoj populaciji, tj. antitela adenovirusa tipa 8 se nalaze u manje od 5% opšte populacije u SAD, svaki pojedinac se smatra podložnim infekcijama.

[0003] EKC karakterišu tipični simptomi konjuktivitisa kao što je akutni početak crvenila i suzenja, oseć aj stranog tela i jak bol. Simptomi dalje uključuju upalu u konjunktivi (konjunktivitis) i rožnjači (keratitis), bol prouzrokovan upalama, edem, smanjen vid, suzenje, osetljivost na svetlost, oseć aj kao da je strano telo prisutno u oku i razvoj pseudo membrana. Tokom akutne faze, koja traje približno dve do tri nedelje, virusi su prisutni i repliciraju se. U tipičnom slučaju, prvo se zarazi jedno oko, nakon čega se infekcija proširi na drugo oko u roku od dva do tri dana. Oba oka su pogođena u 60% slučajeva. Infekcija u prvom oku je uglavnom ozbiljnija. Kod otprilike 20 - 50% pacijenata razviju se opaciteti rožnjače koji rezultiraju pogoršanjem vida koje ostaje nedeljama i mesecima, a u retkim slučajevima čak i godinama. Pošto je bolest po sebi često epidemična, zove se epidemijski keratokonjunktivitis (EKC). Adenovirusni konjuktivitis je infekcija koja se prijavljuje u Nemačkoj (videti npr. Meyer-Rüsenberg et al., Dtsch Arztebl Int 2011; 108(27): 475-80) i navedena je kao infektivna bolest kategorije IV japanskim nacionalnim epidemiološkim nadzorom infektivnih bolesti (NESID) sa obaveznim prikupljanjem, analizom i objavljivanjem izvještaja o pojavljivanjima.

[0004] EKC još uvek nema delotvorno lečenje, stoga postoji velika neispunjena medicinska potreba. Čini se da povidon-jodne kapi za oči imaju ograničenu efikasnost i istovremeno izazivaju dodatni oseć aj peckanja u upaljenim očima, a ponekad čak i diskoloraciju konjunktive. Kompatibilnija farmaceutska kompozicija koja bi se mogla koristiti za lečenje EKC-a i za prevenciju njegovog širenja bi stoga bila veoma poželjna za pacijente koji pate od te bolesti, kao i za pojedince koji dolaze u kontakt sa takvim pacijentima kao što su rođaci, prijatelji, kolege, lekari.

[0005] Za razliku od drugih podtipova virusa influence koji uzrokuju dominantnu respiratornu bolest kod ljudi, H7 influenca virusne infekcije često rezultiraju očnim, a ne respiratornim simptomima (Belser et al.,. Emerg Infect Dis. 2009; 15:859-865). Stoga, veoma je poželjno da je antivirusna formulacija dizajnirana za lečenje virusnih infekcija oka efikasna tokom epidemija influence koje rezultiraju očnim bolestima.

[0006] Upotreba karagenana kao ekscipijenata i viskozifikatora u oftalmologiji je dobro uspostavljena. Patent Sjedinjenih Država br. 5,403,841 opisuje rastvore na bazi karagenana koji su korisni za pripremanje formulacija kapi za oči farmaceutski aktivnih sastojaka. Pri kontaktu sa suznim filmom, rastvori formiraju gel koji održava produžen kontakt sa konjunktivom, sprečavajuć i brzo uklanjanje aktivnog sastojka sa površine oka i olakšavaju ć i njegovu lokalnu isporuku. Za detaljan pregled oftalmičkih in situ gelirajuć ih sistema baziranih na karagenanima ili drugim polimerima pod nabojem vidi npr. Rupenthal et al., Int J Pharm. 2011; 411(1-2): 69-77 and 78-85. Polimerni sistemi koji sadrže karagenane su takođe korisni za transskleralnu isporuku makromolekularnih agensa (Thrimawithana et al., Eur J Pharm Sci. 2011; 44(3):399-409). Nijedna intrinzična farmaceutska aktivnost karagenana nije pomenuta ili implicirana u bilo kojem od gore navedenih dokumenata.

[0007] Neki očni farmaceutski preparati koji koriste karagenane kao ekscipijente i/ili mukomimetike sadrže antivirusna sredstva. Na primer, međunarodna patentna prijava WO 2007/039201 zahteva foto stabilne formulacije brivudina za lečenje herpetičkog keratitisa. Takođe je poznato da se karagenani i slični anionski polimerni mukomimetici mogu koristiti u rastvorima namenjenim za čišć enje i skladištenje kontaktnih sočiva, gde poboljšavaju adstringentna svojstva navedenih rastvora koji sadrže agense niske molekularne mase sa širokom antimikrobnom aktivnošć u kao što je vodonik peroksid, borat, ili cetilpiridinijum hlorid (videti WO 2009/152028 i WO 2010/038129). Karagenanska komponenta ovih rastvora ne pripisuje antivirusno ili antiinflamatorno dejstvo.

[0008] Poznato je da su oftalmički preparati na bazi prirodnih organskih polimera eksplicitno dizajnirani za lečenje upale konjunktive. Na primer, međunarodna patentna prijava WO 2005/046562 zahteva sulfatirane hijaluronske kiseline za takvu terapeutsku svrhu. Karagenani se ne pominju u ovom otkriću.

[0009] U Stiles et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci 2008; 49(4): 1496-1501) navodi se da je tretman mačaka koje pate od eksperimentalno indukovanog herpetičkog konjuktivitisa sa okularnom preparacijom lambda-karagenana smanjio trajanje infektivnosti životinje, iako klinički tok konjunktivitisa nije skrać en. Ovaj rad se bavi samo upalom konjunktive izazvanom mačijim herpes virusom; ne spominju se adenovirusi i karagenani osim onih iz lambda klase.

[0010] U WO 2009/027057 otkriven je antivirusni efekat jota-karagenana na tip B (respiratorni) adenovirusa. U istoj prijavi, međutim, pomenuto je da se ne može utvrditi značajan efekat na podtipove A, C i D.

[0011] WO 2010/000437 opisuje kompozicije koje sadrže jota i/ili kapa-karagenan, kao i njihovu proizvodnju (zahtev 7) za lečenje alergijskih stanja, pri čemu alergijsko stanje može biti alergijski konjunktivitis i lek može biti pena, gel, krema, kapi, pastila, tableta, kapsula, žvakać a guma ili suvi prah za primenu na sluznicu, između ostalog, očiju.

[0012] LEIBBRANDT A. et al. (PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, US, vol. 5, no. 12, 1 decembar 2010 (2010-12-01), stranice e14320-1) navodi da je jota-karagenan moć an inhibitor infekcije virusom influence A i ima antivirusni efekat na H1N1 i H3N2 virusnu infekciju.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0013] Iznenađujuće je sada otkriveno da se karagenan - a posebno jota-karagenan - može formulisati u novu farmaceutsku kompoziciju da bi se dobila antivirusna efikasnost protiv adenovirusa tipa D i infekcija izazvanih pomenutim adenovirusima tipa D, suprotno ranije pomenutom modernom znanju. Shodno tome, predmetni pronalazak, kako je zahtevano u nezavisnim patentnim zahtevima, odnosi se između ostalog na takve nove kompozicije koje se smatraju korisnim za prevenciju ili lečenje epidemijskog keratokonjunktivitisa.

[0014] Kao što je već navedeno u WO 2009/027057 jota-karagenan nije efikasan protiv adenovirusa tipa D u fiziološkim uslovima, tj. kada se polimer rastvori u 0.9% vodenom rastvoru NaCl. Međutim, slučajno je otkriveno da kada se jota-karagenan rastvori u vodi bez NaCl, polimer ispoljava neverovatnu efikasnost protiv adenovirusa tipa D.

[0015] Dalja istraživanja ovih neočekivanih nalaza dovela su do percepcije da smanjenje sadržaja natrijum hlorida, u poređenju sa fiziološkim (0,9%) rastvorom NaCl, u topikalnom okularnom rastvoru spremnom za upotrebu, može dramatično da smanji IC50vrednosti jota-karagena potrebnog za aktivnost protiv H7N7 podtipa virusa influence A. Ove karakteristike dozvoljavaju i preporučuju upotrebu polimera za prevenciju i lečenje infekcija oka uzrokovanih virusima H7 influence A.

[0016] Zbog toga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jota karagenan kao aktivni antivirusni sastojak u antivirusno efikasnoj količini, za upotrebu kao lek u profilaktičkom ili terapeutskom topikalnom lečenju virusnih infekcija oka uzrokovanih adenovirusom podtipa D ili virusom influence A podtipa H7, pod uslovom da kompozicija u svojoj formulaciji spremnoj za upotrebu ne sadrži više od 0,5% w/v soli metalhalogena.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0017] U prvoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jota karagenan kao aktivni antivirusni sastojak u antivirusno efikasnoj količini, za upotrebu kao lek u profilaktičkom ili terapeutskom topikalnom lečenju virusnih infekcija oka uzrokovanih adenovirusom podtipa D ili virusom influence A podtipa H7, pod uslovom da kompozicija u svojoj gotovoj formulaciji ne sadrži više od 0,5% w/v soli metalhalogena.

[0018] "Virusni konjunktivitis" označava infekciju konjunktive izazvanu virusom, kako je definisano kodnom grupom B30 Međunarodne klasifikacije bolesti, verzija 10 (ICD-10). U nekim izvođenjima, virusni konjunktivitis je konjunktivitis ili keratokonjunktivitis usled infekcije adenovirusom (ICD-10 kodovi B30.1 i B30.0, redom). U drugim izvođenjima, virusni konjuktivitis može biti izazvan drugim ili nespecificiranim virusima (ICD-10 kodovi B30.8 i B30.9), i mogu, na primer, biti uzrokovani sojem H7N7 virusa influence A.

[0019] U kontekstu predmetnog pronalaska, izrazi "tretirati" ili "tretman" ć e značiti terapeutske intervencije koje su namenjene da modifikuju klinički tok virusnog konjunktivitisa na takav način da bilo klinički simptomi kao što su okularno crvenilo i bol, poremeć aji vida i suzenje, itd., su manje ozbiljni nego bez intervencija sa preparatima prema pronalasku; ili da navedeni klinički simptomi traju krać e; ili da se skrati vremenski period tokom kojeg inficirani pojedinac koji ima navedene simptome ostaje sposoban da prenosi infektivne agense koji izazivaju virusni konjuktivitis na drugu osobu; ili bilo koju kombinaciju navedenih efekata.

[0020] Slično tome, u kontekstu predmetnog pronalaska, termini "sprečiti" ili "prevencija" ć e značiti da se virusna infekcija ne javlja ili da se ne pojavljuju klinički relevantni simptomi virusne infekcije u zdravom oku koje je prvo bilo izloženo preparatu prema predmetnom pronalasku i koji je zatim izložen određenoj količini infektivnog virusnog agensa koji bi inače, tj. u odsustvu takvog prethodnog tretmana, bio dovoljan da izazove virusni konjuktivitis. "Delimično sprečavanje"ć e značiti da se virusni konjunktivitis, ako ga izazove infektivni virusni agens uprkos prethodnom tretmanu oka sa preparatom iz predmetnog pronalaska, manifestuje simptomima koji su manje ozbiljni nego bez predtretmana, ili koji pokazuju odloženi početak, ili koji se brže razlažu.

[0021] Preparati prema predmetnom pronalasku tipično sadrže karagenan, poželjno jota-karagenan, kao aktivni antivirusni sastojak ili kao jedini aktivni antivirusni sastojak u koncentraciji od 0.05% do 1% težine, poželjno od 0.1 do 0.5%, i najpoželjnije od 0,1 do 0,3% težine gotovog preparata. Takođe, oni su ili u suštini slobodni od soli metalhalogena kao što su natrijum ili kalijum hlorid, ili sadrže više od 0.5% (w/v), poželjno ne više od 0.1% (w/v) jedne ili više soli metalhalogena. Metalne halidne soli se često koriste u galenskim formulacijama kao agensi za podešavanje jonske toničnosti. Na primer, tečne farmaceutske kompozicije zasnovane na "fiziološkom" rastvoru natrijum hlorida obično sadrže 0.9% w/v natrijum hlorida. "Suštinski slobodan" u ovom kontekstu znači da kompozicije predmetnog pronalaska ne sadrže više od tragova metalnih halidnih soli koje mogu poticati od nečistoć a drugih sastojaka prisutnih u kompoziciji.

[0022] Oftalmičke kompozicije za lokalnu primenu prema predmetnom pronalasku mogu imati pH vrednost u opsegu od 3.5 do 8.0, obično pH vrednost u opsegu od oko 4.0 do oko 8.0, i osmolalnost od oko 220 do 320 mOsm/kg. Međutim, za različite primene može biti poželjno da se osmolalnost prilagodi blago hipotoničnim vrednostima, pri čemu su navedene vrednosti tipično unutar opsega od 170 do 250 mOsm/kg, a specifičnije u opsegu od 190 - 220 mOsm/kg, da bi se kompenzovala hipertoničnost suznog filma usled bolesti ili prekomernog isparavanja kod pacijenata koji pate od konjunktivitisa. U skladu sa predmetnim pronalaskom, podešavanje osmolalnosti se postiže bez upotrebe jonskih agensa za toničnost, a naročito bez upotrebe metalhalogenih soli kao što je NaCl ili KCl. Umesto toga, željena osmolalnost se može podesiti dodavanjem najmanje jednog šeć era niske molekularne težine i polivalentnog alkohola male molekularne mase ("poliol"). Pogodni šeć eri mogu biti izabrani iz grupe monosaharida, disaharida i oligosaharida, i tipično od glukoze, fruktoze, manoze i saharoze. Pogodni polivalentni alkoholi, tipično šeć erni alkoholi kratkog lanca koji imaju okosnicu od 3 do 12 atoma ugljenika, mogu biti izabrani iz grupe glicerola, eritritola, sorbitola, manitola, ksilitola, treitola, inozitola i maltitola.

[0023] Topikalna oftalmička formulacija prema predmetnom pronalasku može sadržati jedan ili više oftalmološki kompatibilnih agensa za podešavanje pH ili pufer sisteme koji sprečavaju pomeranje pH tokom skladištenja. Takvi agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, bornu kiselinu, natrijum borat, kalijum citrat, limunsku kiselinu, natrijum bikarbonat, i razne neorganske fosfatne pufere kao što su Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4i njihove smeše. Minimalne jonske jačine uvedene bilo kojim takvim sredstvom za podešavanje pH ne utiču na suštinu pronalaska.

[0024] Takođe, topikalna oftalmička formulacija iz predmetnog pronalaska može da sadrži jedan ili više oftalmološki kompatibilnih surfaktanata. Surfaktant olakšava širenje formulacije preko površine oka i može biti nejonski ili anionski. Primeri ne-jonskih surfaktanata uključuju tiloksapol, polioksietilen sorbitan estre, polietoksilovana ricinusova ulja, poloksamere, polioksietilen/polioksipropilen surfaktante, polioksietilen stearat, polioksietilen propilen glikol stearat, hidroksialkilfosfonat, estre laurinske ili palmitinske kiseline i etere, trietanolamin oleat, ili kombinaciju prethodno navedenih agensa, ili druge agense poznate stručnjacima. Kada je uključen surfaktant, obično je prisutan u koncentraciji između 0.02% (w/v) i 0.1% (w/v) kompozicije.

[0025] U nekim izvođenjima, predmetna topikalna oftalmička formulacija može sadržati jedan ili više konzervansa da inhibira rast mikroba i da produži rok trajanja. Primeri konzervansa uključuju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, dinatrijum edetat (EDTA), polikvaternij-1, poliheksametilen bigvanid i perborat. Količina konzervansa je tipično manja od oko 0.01% (w/v) ukupne kompozicije.

[0026] Pored gore navedenih sastojaka, smatra se da u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska mogu biti prisutni različiti dodatni ili alternativni sastojci, alternativni sastojci uključuju bez ograničenja antioksidante kao što je vitamin E ili njegove komercijalno dostupne derivate kao što su tokoferol polietilen glikol 1000 sukcinat (TPGS), askorbinska kiselina ili natrijum metabisulfit.

[0027] Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku su tipično obezbeđene u sterilnom obliku za topikalnu primenu na frontalni deo oka, i poželjno su prilagođene za samoprimenu od strane pojedinca kome je to potrebno. U jednoj realizaciji, formulacija su kapi za oči bez čestica. U struci su poznati različiti kontejneri koji su pogodni za raspodelu tečnosti kap po kap na površinu oka kroz raspršivač na način koji može biti lako kontrolisan od strane pojedinca tokom samo-primene navedenih kapi. Poželjno, tipičan sistem kontejnera raspršivača je dizajniran da održava sterilnost kapi za oči tokom ponovne upotrebe.

[0028] Druge galenske formulacije u okviru pronalaska obuhvataju oftalmološki prihvatljive briseve, masti ili gelove koji se mogu primeniti na oko kao sprejevi ili aerosoli, ili gelovi koji se mogu davati u konjunktivalnu kesicu. Za svaku od ovih formulacija poznati su različiti proizvodi ili aplikacioni sistemi u struci koji su dizajnirani da raspodele takve formulacije na prednji deo oka bez rizika mehaničkog ošteć enja površine oka.

[0029] Za posebne primene, predstavljene farmaceutske kompozicije mogu takođe biti formulisane u uređaje za kontrolisano oslobađanje koji su ili privremeno smešteni u konjunktivalnu vre ć icu, ili se rastvaraju in situ dok oslobađaju karagenanski preparat prema pronalasku.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0030] Slika 1 je grafički prikaz rezultata testa iz primera 6, gde je antivirusni efekat jota-karagenana testiran na preživljavanju miševa koji su intraokularno inficirani sa virusom ptičjeg gripa A/H7N7; 10 miševa po grupi je inficirano virusom influence A/turska/Nemačka/R11/01 H7N7 i tretirano tokom perioda od deset dana, dva puta dnevno sa farmaceutskom kompozicijom opisanom u Primeru 4, ili sa placebom. Terapija je započeta odmah nakon infekcije.

[0031] Na x-osi se daje vreme preživljavanja (dani) i na y-osi % preživelih miševa; I = priprema jota karagenana (crna linija); P = placebo (isprekidana linija).

Primer 1

Postupak za određivanje IC50vrednosti adenovirusa

[0032] A549 ć elije su zasejane u tzv. mikrotiter ploče sa 96 bunarčića sa gustinom ć elija od 1.7*10<4>ć elija po bunarčiću i kultivisane tokom 24 sata u standardnom DMEM medijumu za kulturu tkiva koji sadrži 4.5 g/l glukoze. Suspenzija virusa koja sadrži različite količine karagenanskog polimera i NaCl je pripremljena i inkubirana tokom minimalnog perioda od 20 minuta. Ć elije su inficirane suspenzijom virusa koja sadrži ispitivanu supstancu (= karagenanski polimer) u datoj koncentraciji i na titru virusa od 1,3*10<3>infektivnih jedinica po bunarčić u. Jedan sat nakon infekcije uklonjen je inokulum virusa i dodat je polutekuć i sloj koji sadrži 2,5% w/v karboksimetil celuloze (CMC), karagenanski polimer i koncentracija soli NaCl u količini koja se testira. Ć elije su inkubirane 5 dana na 37°C. Zatim je uklonjen supernatant, ć elije su isprane 3 puta sa PBS i fiksirane za imunobojenje sa ledeno hladnom smešom metanol/aceton (1:1). Ć elije su dalje inkubirane 45 min sa blokiraju ć im puferom (Biolegend) i inkubirane sa mišjim antiadenovirus antitelom u razblaženju od 1:1000. Posle inkubacije od 1 sata, ć elije su ponovo isprane 3 puta puferom za ispiranje koji je sadržao 0,1% Tween 20 i zatim inkubirane 1 sat sa HRP konjugovanim anti-mišjim IgG antitelom u razblaženju od 1:1000. Zatim su ć elije isprane 3 puta sa PBS, nakon čega je dodat TMB supstrat (Biolegend). Posle reakcionog vremena od 10 minuta reakcija je zaustavljena dodavanjem 1N sumporne kiseline.

[0033] Apsorbancija je merena na 450 nm. Apsorpcija netretiranih inficiranih ć elija je postavljena na 100%, dok je apsorbancija neinficiranih tretiranih ć elija postavljena na 0%. Izračunavanje IC50vrednosti je izvedeno sa standardnom opremom EkcelFit. Paralelno, efekat procedure na neinficirane ć elije određen je bojenjem i fiksiranjem ć elija sa kristalno ljubičastim rastvorom koji sadrži 4% formaldehida. Nije detektovan značajan negativan efekat polimera i različitih koncentracija testiranih soli na neinficirane ć elije.

Tabela 1: IC50vrednosti jota-karagena na tri tipa adenovirusa zavise od koncentracije NaCl.

Sve vrednosti u µg/ml. [MA = manitol]

[0034] Kao što je prikazano u tabeli 1 jota-karagenan nije efikasan protiv adenovirusa 8, 19 i 37 kada je natrijum hlorid prisutan u fiziološkim koncentracijama. Pri koncentraciji od 0,5% NaCl detektuje se antivirusna efikasnost. U odsustvu NaCl IC50jota-karagenana je između 29 i 38 µg jota-karagenana na 1 ml eksperimentalnog rastvora za oblaganje.

[0035] Antivirusna efikasnost se zadržava kada se doda manitol dok se ne postigne osmolarnost od 200 mOsmol/L (0% NaCl 200 mOsm/L MA). Za postizanje rezultata prikazanih u Tabeli 1 manitol je dodat u koncentraciji od 36.4 mg/ml u rastvor koji sadrži 1.2 mg/ml jota-karagenana, što odgovara osmolalnosti od 193 mOsm/kg.

Primer 2:

Postupak za određivanje IC50vrednosti, za influencu A virusa H7N7

[0036] Test je izveden na MDCK ć elijama u postavci sa profilaktičkom pre-inkubacijom virusa i eksperimentalnim uzorkom za testiranje, infekcijom ć elija i tretmanom posle infekcije koriš ć enjem medijuma za polutečno teku ć e oblaganje sa 2,25% karboksimetilceluloze (CMC). Matriks testa je sastavljen od medijuma i uzorka matriksa u odnosu 2:1, što je rezultat početnog razređenja 1:3 skladištenih rastvora.

[0037] Test je postavljen u 6 ponavljanja za svaku koncentraciju test uzorka, i za inficiranu i neinficiranu kontrolu. Simulirana infekcija (kontrola toksičnosti) je napravljena u triplikatima. Konačne koncentracije jotakaragenana su bile 400, 120, 36, 10.8, 3.2, 0.97, 0.3, 0.09 µg/ml (1:3.33 serijska razblaženja). 1.7x10<4>ć elije su zasađene u pločice sa 96 bunarčića za kulturu tkiva, tako da dostignu oko 90% spajanja 24 do 28 sati kasnije. Jednaki volumeni dvostrukog koncentrovanog razblaživanja virusa i dvostruko koncentrovanih serija razblaženih test uzoraka su pomešani i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Virus w/o test uzorak i medijum su dodati samo inficiranoj i neinficiranoj kontroli, tim redosledom. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 45 minuta. Zatim je inokulum razblažen i raspodeljen u alikvote od 1 ml do epruveta sa okruglim dnom od 5 ml, tako pripremajuć i po 1 epruvetu za svaku koncentraciju test uzorka. 4 ml CMC medijuma po pločici za testiranje je prebačeno u konusnu epruvetu od 50 ml da bi se pripremio obložni medijum za inficirane i neinficirane kontrole.

[0038] Skladišteni rastvori su razblaženi do 800 µg/ml jota-karagenana sa medijumom za testiranje dopunjenim sa tripsinom, dajuć i mešavinu medija i matriksa uzorka u odnosu 1:2 sa tripsinom 1:500. Slede ć a serijska razblaženja su izvršena uz održavanje fiksnih matričnih uslova. 1 ml rastvora test uzorka je dodato u 1 ml CMC medijuma i snažno vorteksirano. CMC medijum za inficirane/neinficirane kontrole je kombinovan sa jednakom zapreminom mešavine test medijuma i matriksa 1:2 koja sadrži tripsin 1:500 i snažno su promešani. Medijumi za oblaganje su držani na 37°C u kontejneru sa toplom vodom. Neposredno pre upotrebe, rastvori su nakratko vorteksirani i sipani u bunarčić e duboke ploče. Konačni medijum za oblaganje: Opti-Pro sa 4 mM L-glutamina, ABAM, tripsin 1:1000 i 2.25% CMC. Ista procedura je izvedena u odsustvu virusa kao kontrola toksičnosti.

[0039] Medijum za oblaganje je razblažen sa 100 µl PBS i aspiriran za imunobojenje. Svakom bunarčiću je dodato 100 µl PBS. Ploče su podvrgnute kratkotrajnom snažnom mešanju na šejkeru za mikroploče pri maksimalnoj brzini pre nego što je PBS aspiriran. Ispiranje je ponovljeno dvaput ili češć e ako su CMC kristali još uvek ležali na ć elijskom sloju. Dodato je 100µ l hladnog metanol/aceton fiksatora, ploče su inkubirane 20 do 30 minuta na -20°C, i ostavljene da se osuše nakon uklanjanja fiksatora.

[0040] Posle inkubacije od 1h sa 100 ml pufera za blokiranje, ploče su isprane jednom sa PBS i inkubirane sa 50 µl rastvora antitela (anti-NP 1:500) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Detekciono antitelo je dodato nakon pranja (rastvor 1:1000), i držano u kontaktu tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega su ploče ispražnjene i ponovo isprane tri puta sa puferom za ispiranje i jednom sa PBS. Dodato je 100 µl supstrata. 6 bunarčić a w/o (= bez) ć elija je napunjeno supstratom i posluženo kao prazno. Posle 10 do 15 minuta reakcija je zaustavljena sa 100 µl 1N sumporne kiseline. 100 µl je preneseno na ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom i apsorbancija je izmerena na 450 nm.

[0041] Evaluacija: Srednja vrednost praznih uzoraka je oduzeta od svih izmerenih vrednosti i srednjih vrednosti 6 izračunatih replikata (sirovi podaci). Srednja vrednost neinficiranih uzoraka je oduzeta od svih izmerenih vrednosti. Vrednosti su normalizovane na srednju vrednost inficiranih uzoraka, a dobijene vrednosti se oduzimaju od 100 da bi se dobila inhibicija kao procenat neinficiranih uzoraka. Inhibicije i prazni korigovani sirovi podaci su izvedeni u odnosu na koncentraciju razblaženja jota-karagenana. IC50vrednosti su izračunate kao što je gore opisano za adenoviruse.

Tabela 2: IC50vrednosti jota-karagenana na virusu influence H7N7 zavise od koncentracije NaCl. Sve vrednosti u /ml MA = 200 mOsm/L manitol

Primer 3: Antivirusni preparat očnih kapi za lečenje infekcija oka.

[0042] Jota-karagenan: 2.4mg/ml

Manitol: 36.4 mg/ml

Osmolarnost: 200 mOsm/L (osmolalnost: 192 mOsm/kg)

Viskoznost: 76 mPa.s

Ad vode 100%

Primer 4: Antivirusna formulacija očnih kapi za lečenje infekcija oka.

[0043] Jota-karagenan: 1,2 mg/ml

Manitol: 36.4 mg/ml

Osmolarnost: 200 mOsm/L (osmolalnost: 193 mOsm/kg)

Viskoznost: 8-15 mPa.s

Ad vode 100%

Primer 5:

[0044] Dobrovoljac muškog pola je patio od keratokonjunktivitisa približno 10 uzastopnih dana. Pacijent je prijavio crvenilo očiju, poveć an tok suza, svrab i peckanje oba oka najvjerovatnije uzrokovano virusnom infekcijom. Dobrovoljac je tretiran kapima za oči u rastvoru iz Primera 3 u režimu doziranja od 5 kapi po oku 3 puta dnevno tokom 5 dana. Već nakon prvog dana volonter je prijavio smanjenje simptoma kao što su svrab i crvenilo. Patološko stanje se stalno poboljšavalo tokom terapije, a petog dana terapija je prekinuta zbog potpunog odsustva klinički relevantnih simptoma. Nije bilo relapsa u periodu posmatranja od 14 dana.

Primer 6: Antivirusni efekat jota-karagenana na miševe inficirane intrakorinalno sa virusom ptičjeg gripa A/H7N7

[0045] H7N7 tip virusa influence pretežno ulazi u organizam putem infekcije očiju. Tip H7N7 pokazao se visoko patogenim za ljude i miševe. U najgorem slučaju, smrtne posledice mogu nastati ako se virus širi od primarne lokacije infekcije do pluć a. Kod C57BL6 miševa intraokularna infekcija virusom gripa H7N7 A/Turska/Nemačka/R11/01 dovodi do smrtnog ishoda. Ovaj model je korišć en za testiranje farmaceutske kompozicije opisane u primeru 4.

[0046] Tri nedelje stari C57BL6 miševi (10 po grupi) su inficirani intraokularno sa 5 µl suspenzije koja sadrži 1.5 x10<5>plak formirajuć ih jedinica (pfU) virusa influence H7N7 A/turska/Nemačka/R11/01. Terapija je započeta odmah nakon infekcije bilo placebo preparatom koji sadrži 36,4 mg/ml manitola ili preparatom opisanim u primeru 4. Miševi su tretirani tokom perioda od deset dana, dva puta dnevno preparatom jota-karagenana ili placebom, pojedinačno. Nakon 14 dana umrlo je 80% miševa tretiranih placebom. Nasuprot tome, 50% miševa tretiranih jotakaragenanom je preživelo i oporavilo se od infekcije (videti Sliku 1). Statistička procena sa Log-rank testom (Prism 5 verzija 5.02) je otkrila značajnu razliku između ove dve grupe sa p-vrednošć u od 0.0492. Stoga se može zaključiti da intraokularno lečenje miševa sa preparatom jota-karagenana, kao što je opisano u primeru 4, dovodi do značajnog efekta u preživljavanju miševa inficiranih intraokularno sa smrtonosnom dozom virusa influence H7N7.

Claims (11)

Patentni Zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jota karagenan kao aktivni antivirusni sastojak u antivirusno efikasnoj količini, za upotrebu kao lek u profilaktičkom ili terapeutskom topikalnom tretmanu virusnih infekcija oka uzrokovanih adenovirusom podtipa D ili virusom influence A podtipa H7, uz uslov da kompozicija u formulaciji spremna za upotrebu ne sadrži više od 0.5% w/v soli metalhalogena.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu kompozicija ne sadrži više od 0.1% w/v pomenute soli metalhalogena ili je u suštini slobodna od soli metalhalogena.

3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je so metalhalogena izabrana iz grupe koju čine natrijum hlorid i kalijum hlorid.

4. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu kompozicija dalje sadrži agens za podešavanje osmolalnosti izabran iz grupe koja se sastoji od monosaharida, disaharida, oligosaharida i poliola male molekulske mase.

5. Kompozicija prema zahtevu 4, pri čemu je agens za podešavanje osmolalnosti izabran iz grupe koja se sastoji od glukoze, fruktoze, saharoze, manoze, glicerola, eritritola, manitola, sorbitola, inozitola, ksilitola, treitola i maltitola.

6. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu kompozicija dalje sadrži najmanje jedan oftalmološki kompatibilan aditiv izabran iz grupe koja se sastoji od agensa za podešavanje pH, surfaktanta, konzervansa i antioksidansa.

7. Jota karagenan u antivirusno efikasnoj količini za upotrebu u profilaktičkom ili terapeutskom topikalnom tretmanu virusnih infekcija oka uzrokovanih adenovirusom podtipa D ili virusom influence A podtipa H7, pod uslovom da kompozicija u formulaciji spremna za upotrebu ne sadrži više od 0.5% w/v soli metalhalogena.

8. Jota karagenan u antivirusno efektivnoj količini za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu kompozicija sadrži ne više od 0.1% w/v navedene soli metalhalogena, ili je u suštini slobodna od soli metalhalogena.

9. Jota karagenan u antivirusno efektivnoj količini za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu kompozicija dalje sadrži agens za podešavanje osmolalnosti izabran iz grupe koja se sastoji od monosaharida, disaharida, oligosaharida i poliola male molekulske mase.

10. Jota karagenan u antivirusno efektivnoj količini za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu je agens za podešavanje osmolalnosti izabran iz grupe koju čine glukoza, fruktoza, manoza, saharoza, glicerol, eritritol, manitol, sorbitol, inozitol, treitol, ksilitol, i maltitol.

11. Jota karagenan u antivirusno efikasnoj količini za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu kompozicija dalje sadrži najmanje jedan oftalmološki kompatibilan aditiv izabran iz grupe koja se sastoji od agensa za podešavanje pH, surfaktanta, konzervansa i antioksidansa.