RS58732B1 - Ang2 vezujući molekuli - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na oblast humane terapije, posebno na terapiju kancera i sredstva i kompozicije korisne u takvoj terapiji.

STANJE TEHNIKE

Kao što je opisano u na pr. US 2008/0014196, WO 2008101985 i US 2011/0027286, angiogeneza je biološki proces u kojem se formiraju novi krvni sudovi i koji su ukljuþeni u patogenezu brojnih poremeüaja, ukljuþujuüi þvrste tumore i metastaze kao i bolesti oka. Kada tumori dostignu kritiþnu veliþinu od približno 1 mm<3>, oni postaju zavisni od angiogeneze za održavanje snabdevanje krvi kiseonikom i hranjivim materijama kako bi se omoguüio njihov dalji rast. Terapije koje suzbijaju angiogenezu su postale važna opcija za tretman nekoliko tipova tumora.

Jedan od najvažnijih pro-angiogenih faktora je Angiopoietin2 (Ang2), ligand Tie2 receptora (Tie2), koji kontroliše vaskularno remodeliranje omoguüavanjem funkcija drugih angiogenih faktora, kao što je VEGF. Ang2 se u struci takoÿe navodi kao Tie2 ligand (US patent br. 5,643,755, Yancopoulos et al.2000, Nature 407: 242-248).

Ang2 je primarno eksprimiran od strane endotelnih üelija, snažno indukovan hipoksijom i drugim angiogenim faktorima i pokazano je da reguliše plastiþnost krvnih sudova tumora, dozvoljavajuüi krvnim sudovima da reaguju na VEGF i FGF2 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar; 10(3): 165-77). U skladu sa ovom ulogom, delecija ili inhibicija Ang2 dovodi do smanjene angiogeneze (Falcon et al., Am J Pathol.2009 Nov; 175 (5): 2159-70). Povišene koncentracije Ang2 u serumu zabeležene su kod pacijenata sa kolorektalnim karcinomom, NSCLC i melanomom (Goede et al., Br J Cancer.2010 Oct 26; 103(9): 1407-14), (Park et al., Chest.2007 Jul 132(1): 200-6), (Helfrich et al., Clin Cancer Res.2009 Feb 15; 15 (4): 1384-92). U CRC kanceru, nivoi Ang2 u seruma u uzajamnoj su vezi sa terapijskim odgovorom na terapiju za suzbijanje VEGF.

Ang-Tie sistem se sastoji od 2 receptora (Tie1 i Tie2) i 3 liganda (Angl, Ang2 i Ang4) (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar; 10 (3): 165-77). Tie2, Ang1 i Ang2 su najbolje prouþavani þlanovi ove porodice, Tie1 je jedan nezaštiüeni receptor i ulogu Ang4 za vaskularno remodeliranje još treba definisati. Ang2 i Ang1 posreduju suprotne funkcije nakon Tie2 vezivanja i aktivacije. Aktivacija Tie2 posredovana sa Ang2 rezultira aktivacijom endotelnih üelija, disocijacijom pericita, curenjem krvnih sudova i indukcijom pobuÿenja krvnih sudova. Za razliku od Ang2, signalizacija Ang1 održava integritet krvnih sudova regrutovanjem pericita, þime se održava mirovanje endotelnih üelija.

Angiopoietin 2 (Ang2) je izluþeni ligand od 66 kDa za Tie2 receptorsku tirozin kinazu (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar; 10 (3): 165-77). Ang2 se sastoji od N-terminalnog domena sa namotanim zavojnicama i domena sliþnog C-terminalnom fibrinogenu, koji je potreban za Tie2 interakciju. Ang2 je primarno eksprimiran od strane endotelnih üelija i snažno indukovan hipoksijom i drugim angiogenim faktorima, ukljuþujuüi VEGF. Tie2 se nalazi na endotelnim üelijama, hematopoetskim matiþnim üelijama i tumorskim üelijama. Pokazano je da Ang2-Tie2 reguliše plastiþnost krvnih sudova tumora, dozvoljavajuüi krvnim sudovima da reaguju na VEGF i FGF2.

In vitro, Ang2 je pokazao da deluje kao skromni mitogen, hemoatraktant i induktor formiranja tuba u endotelijalnim üelijama humane pupþane vene (HUVEC). Ang2 indukuje tirozinsku fosforilaciju ektopiþno eksprimiranog Tie2 u fibroblastima i promoviše nizvodne signalne dogaÿaje, kao što je fosforilacija ERK-MAPK, AKT i FAK u HUVEC. Opisana je antagonistiþka uloga Ang2 u odgovorima Ang1-indukovanih endotelnih üelija.

Pokazalo se da nedostatak Ang2 rezultira dubokim defektom limfnog obrasca kod miševa. Iako je gubitak Ang2 opcioni za embrioni vaskularni razvoj, Ang2-deficijentni miševi imaju perzistentne vaskularne defekte u retini i u bubrezima. Zajedno sa dinamiþkim obrascem ekspresije Ang2 na mestima angiogeneze (na primer jajnika), ovi rezultati ukazuju da Ang2 kontroliše vaskularno remodeliranje omoguüavanjem funkcija drugih angiogenih faktora, kao što je VEGF.

Ang2-Tie2 sistem ima kljuþne uloge tokom angiogenog prebacivanja i kasnijih faza tumorske angiogeneze. Ekspresija Ang2 je jako regulisana u endotelu povezanom sa tumorom.

Smanjen rast tumora je primeüen kada se implantira u Ang2-deficijentne miševe, posebno u ranim fazama rasta tumora. Terapijsko blokiranje Ang2 sa Ang2 mAbs pokazalo je široku efikasnost u razliþitim modelima tumorskih ksenografta.

Kao što je sumirano u gore navedenom US 2008/0014196, angiogeneza je ukljuþena u patogenezu brojnih poremeüaja, ukljuþujuüi þvrste tumore i metastaze.

U sluþaju rasta tumora, izgleda da je angiogeneza presudna za prelazak iz hiperplazije u neoplaziju, i za obezbeÿivanje ishrane za rast i metastaziranje tumora. Folkman et al., Nature 339-58 (1989), koja dozvoljava tumorskim üelijama da steknu prednost u rastu u odnosu na normalne üelije. Zbog toga su terapije za suzbijanje angiogeneze postale važna opcija leþenja za nekoliko tipova tumora. Ove terapije su fokusirane na blokiranje VEGF puta (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov.2004 May; 3 (5): 391-400)).

Antitela i drugi peptidni inhibitori koji se vezuju za Ang2 i Ang1 su pomenuti u na pr. U.S. Patent br.6,166,185; 7,521,053; 7,205,275; i US Patentnoj prijavi br.2006/0018909 i 2006/0246071. Dalje, US 2011/0027286 opisuje specifiþna monoklonska Ang2 antitela koja ne antagonizuju srodni molekul Angl.

Meÿutim, najmodernija monoklonska antitela (MAbs) i fuzioni proteini imaju nekoliko nedostataka u pogledu njihove terapeutske primene: Da bi se spreþila njihova degradacija, oni moraju biti uskladišteni na temperaturama blizu smrzavanja. Takoÿe, buduüi da se brzo probavljaju u crevima, nisu pogodni za oralnu primenu. Još jedno veliko ograniþenje MAbs za terapiju kancera je loš transport, što rezultira niskim koncentracijama i nedostatkom ciljanja svih üelija u tumoru.

Prdmet je ovog pronalaska da obezbedi nove poboljšane Ang2 vezujuüe molekule, tj. nanotela koja blokiraju vezivanje Ang2 za Tie2, ali ne i vezivanje Ang1 za Tie2.

Konkretnije, predmet ovog pronalaska je da obezbedi nove Ang2 vezujuüe molekule, i, specifiþno, Ang2 vezujuüe molekule koji se vezuju za Ang2 sisara, ali ne i za Ang1 sisara, a posebno za humani Ang2, ali ne i za humani Ang1, gde su takvi molekuli ili polipeptidi pogodni za terapeutske i dijagnostiþke svrhe kao što je ovde opisano. Dalji predmet ovog pronalaska je da obezbedi imunoglobulinske pojedinaþne varijabilne domene koji se specifiþno vezuju za Ang2, ali ne i za Angl.

Takvi Ang2 vezujuüi molekuli, ili Ang2 antagonisti, su korisni kao farmakološki aktivni agensi u kompozicijama u prevenciji, leþenju, ublažavanju i/ili dijagnostikovanju bolesti ili stanja povezanih sa Ang2-posredovanim efektima na angiogenezu.

Primeri takvih bolesti su rak ili kancerogena oboljenja kao što je rak dojke, karcinom bubrežnih üelija, rak jajnika i rak pankreasa, oþne bolesti kao što je starosna makularna degeneracija i dijabetiþka retinopatija, i/ili hroniþne bubrežne bolesti kao što su dijabetiþka nefropatija, postrenalna insuficijencija, prerenalna azotemija i unutrašnja bubrežna insuficijencija.

Dalji predmet ovog pronalaska je da obezbedi postupke za prevenciju, leþenje, ublažavanje i/ili dijagnostiku takvih bolesti, poremeüaja ili stanja, koji ukljuþuju upotrebu i/ili primenu takvih Ang2 vezujuüih molekula i kompozicija koje ih sadrže. Posebno, predmet ovog pronalaska je da se obezbede takvi farmakološki aktivni Ang2 vezujuüi molekuli, kompozicije i/ili metode koje obezbeÿuju prednosti u poreÿenju sa sredstvima, kompozicijama i/ili metodama koje se trenutno koriste i/ili su poznate u tehnici. Ove prednosti ukljuþuju poboljšana terapeutska i/ili farmakološka svojstva i/ili druge korisne osobine, na pr. za potrebe proizvodnje, naroþito u poreÿenju sa konvencionalnim antitelima kao što su ona opisana gore, ili njihovi fragmenti.

KRATAK OPIS PRONALASKA

U skladu sa prvim aspektom, obezbeÿen je Ang2 vezujuüi molekul, koji sadrži imunoglobulinski jednostruki varijabilni domen, naznaþeno time da navedeni imunoglobulinski jednostruki varijabilni domen sadrži tri regiona za odreÿivanje komplementarnosti CDR1, CDR2 i CDR3, naznaþeno time da CDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 168, CDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID Br: 171 i CDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 175.

Pronalazak se dalje odnosi na Ang2 vezujuüi molekul koji se sastoji od pomenutog imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena.

Dalje, pronalazak se odnosi na Ang2 vezujuüi molekul koji ima sekvencu u skladu sa SEK ID Br: 166.

U skladu sa drugim aspektom, obezbeÿena je nukleinska kiselina koja kodira pomenuti Ang2 vezujuüi molekul, kao i ekspresioni vektor koji sadrži navedene nukleinske kiseline.

Pronalazak se dalje odnosi na üeliju domaüina koja nosi jedan ili više ekspresionih vektora koji sadrže navedene nukleinske kiseline.

Pronalazak se dalje odnosi na postupak za proizvodnju ili generisanje Ang2 vezujuüeg molekula u skladu sa pronalaskom, koji obuhvata korake:

(a) transfekciju üelije domaüina sa jednim ili više navedenih vektora koji sadrže navedeni molekul nukleinske kiseline,

(b) kultivaciju navedene üelije domaüina, i

(c) izdvajanje i preþišüavanje pomenutog Ang2 vezujuüeg molekula.

Naredni aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži, kao aktivni sastojak, jedan ili više pomenutih Ang2 vezujuüih molekula kao što je definisano gore i najmanje fiziološki prihvatljiv nosaþ.

Pronalazak se dalje odnosi na primenu i upotrebu Ang2 vezujuüih molekula, nukleinskih kiselina, üelija domaüina, proizvoda i kompozicija koje su ovde prethodno opisane, kao i na postupke za prevenciju i/ili leþenje bolesti povezanih sa efektima angiogeneze posredovanih sa Ang2, poželjno raka, kancerogenih oboljenja i oþnih bolesti upotrebom Ang2 vezujuüih molekula kao što je gore definisano.

Ovi i drugi aspekti, zahtevi, prednosti i primene pronalaska üe postati jasni iz opisa izloženih ovde, koji slede.

DEFINICIJE

Ukoliko nije drugaþije naznaþeno ili definisano, svi upotrebljeni termini imaju uobiþajeno znaþenje u struci, što üe biti jasno struþnoj osobi. Na primer, upuüuje se na standardne priruþnike, kao što su Sambrook et al, " Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), i Roitt et al, " Immunology" (2<nd>Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), kao i na opšte stanje tehnike koje je ovde citirano. Pored toga, osim ukoliko nije drugaþije naznaþeno, svi postupci, koraci, tehnike i manipulacije koji nisu posebno opisani u pojedinostima mogu biti izvedeni i izvedeni su na naþin koji je poznat per se, što üe biti jasno struþnoj osobi. Referenca je, na primer, ponovo upuüena na standardne priruþnike, na opštu prethodnu tehniku koja je gore navedena i na druge reference koje su tamo citirane.

Izraz "angiopoetin-2" ili "Ang2", osim ako nije specificiran kao ne-humana vrsta (na pr. "mišiji Ang2", i td.) odnosi se na humani Ang2 ili njegov biološki aktivni fragment (na pr. fragment Ang2 proteina koji je sposoban da indukuje angiogenezu in vitro ili in vivo), tj. na humani Ang2 (varijanta 1) sa pristupnim br. NM 001147.2, na humani Ang2 (varijanta 2) koji ima pristupni br. NM_001118887.1 ili na humani Ang2 (varijanta 3) koji ima pristupni br. NM_001118888.1, i/ili na njihove biološki aktivne fragmente. Aminokiselinske sekvence Ang2 ne-humanih vrsta, kao što su mišji Ang2 i cino Ang2, mogu biti dostupni iz baze podataka proteinskih sekvenci pod pristupnim br,: NM_007426.3 (SEK ID BR: (SEK ID 188) i AB172643.1 (SEK ID BR: 187) ), respektivno.

Izraz "angiopoietin-1" ili "Ang1, osim ako nije specificiran kao ne-humana vrsta (na pr."mišiji Ang2", i td.) odnosi se na humani Ang1 ili njegov biološki aktivni fragment (na pr. fragment Ang1 proteina koji je sposoban da indukuje angiogeneze in vitro ili in vivo), tj. na humani Ang1 sa pristupnim brojem NM_001146.3, ili na njegov biološki aktivan fragment.

Osim ako nije drugaþije naznaþeno, termini "imunoglobulin" i "sekvenca imunoglobulina" -koji su ovde korišüeni da se odnose na antitelo teškog lanca ili na konvencionalno 4-lanþano antitelo - koriste se kao opšti termini koji ukljuþuju i antitelo pune veliþine, njegove individualne lance, kao i sve delove, domene ili njihove fragmente (ukljuþujuüi, ali ne ograniþavajuüi se na, domene ili fragmente koji vezuju antigen, kao što su VHH domeni ili VH/VL domeni, respektivno). Pored toga, termin "sekvenca" kako se ovde koristi (na primer u terminima kao što su "sekvenca imunoglobulina", "sekvenca antitela", "(pojedinaþna) sekvenca varijabilnog domena", "VHH sekvenca" ili "proteinska sekvenca"), treba generalno razumeti da ukljuþuje i relevantne aminokiselinske sekvence kao i sekvence nukleinskih kiselina ili nukleotidne sekvence koje kodiraju iste, osim ako kontekst zahteva nesto ograniþenije tumaþenje.

Izraz "domen" (polipeptida ili proteina), kako se ovde koristi, odnosi se na strukturu namotanog proteina koja ima sposobnost da zadrži svoju tercijarnu strukturu nezavisno od ostatka proteina. Generalno, domeni su odgovorni za diskretne funkcionalne osobine proteina i u mnogim sluþajevima mogu se dodati, ukloniti ili preneti na druge proteine bez gubitka funkcije ostatka proteina i/ili domena.

Termin "domen imunoglobulina", kako se ovde koristi, odnosi se na globularni region nekog lanca antitela (kao što je na pr. lanac konvencionalnog 4-lanþanog antitela ili antitela teškog lanca), ili na polipeptid koji se u suštini sastoji od takvog globularnog regiona.

Imunoglobulinski domeni su karakterisani time što zadržavaju imunoglobulinski namotaj karakteristiþan za molekule antitela, koji se sastoji od dvoslojnog sendviþa od oko 7 antiparalelnih beta-lanaca rasporeÿenih u dve beta-ploþe, opciono stabilizovane konzervisanom disulfidnom vezom.

Termin "varijabilni domen imunoglobulina", kako je ovde korišüen, oznaþava domen imunoglobulina koji se u osnovi sastoji od þetiri "okvirna regiona" koji se navode u tehnici i ovde ispod kao "okvirni region 1" ili "FR1"; kao "okvirni region 2" ili "FR2"; kao "okvirni region 3" ili "FR3"; i kao "okvirni region 4" ili "FR4", respektivno; gde su okvirni regioni prekinuti sa tri "regiona za odreÿivanje komplementarnosti" ili "CDR", koji se navode u tehnici i dalje u tekstu kao "region za odreÿivanje komplementarnosti 1" ili "CDR1"; kao "region za odreÿivanje komplementarnosti 2" ili "CDR2"; i kao "region za odreÿivanje komplementarnosti 3" ili "CDR3", respektivno. Prema tome, opšta struktura ili sekvenca imunoglobulinskog varijabilnog domena može biti naznaþena na sledeüi naþin: FR1 - CDR1 -FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. To je/su varijabilni domen(i) imunoglobulina koji dodeljuje specifiþnost antitelu za antigen tako što nosi mesto za vezivanje antigena.

Izraz "imunoglobulinski jednostruki varijabilni domen" kako se ovde koristi oznaþava imunoglobulinski varijabilni domen koji je sposoban da se specifiþno veže za neki epitop antigena bez sparivanja sa dodatnim varijabilnim domenom imunoglobulina. Jedan primer imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena u smislu ovog pronalaska su "domeni antitela", kao što su imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni VH i VL (VH domeni i VL domeni). Drugi primer imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena su "VHH domeni" (ili jednostavno "VHH") iz kamelida, kao što je definisano u daljem tekstu.

U pogledu gornje definicije, domen za vezivanje antigena uobiþajenog 4-lanþanog antitela (kao što je molekul IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE, poznati u struci) ili Fab fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment kao što je disulfidno povezan Fv ili scFv fragment, ili dijatela (svi poznati u struci) izvedeni iz takvog konvencionalnog 4-lanþanog antitela, koji se normalno ne bi smatrali jednostrukim varijabilnim domenom imunoglobulina, kao u ovim sluþajevima, vezuju se za odgovarajuüi epitop antigena što se normalno se ne bi pojavilo sa jednim (pojedinaþnim) imunoglobulinskim domenom, veü sa parom (udruženih) domena imunoglobulina kao što su varijabilni domeni lakog i teškog lanca, tj. sa VH-VL parom domena imunoglobulina, koji se zajedno vezuju za epitop odgovarajuüeg antigena.

"VHH domeni", takoÿe poznati kao VHH, VHH domeni, VHH fragmenti antitela i VHH antitela, prvobitno su opisani kao antigen vezujuüi imunoglobulinski (varijabilni) domeni "antitela teškog lanca" (tj. "antitela lišenih lakih lanaca", Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). Termin "VHH domen" je izabran da bi se razlikovali ovi varijabilni domeni od varijabilnih domena teškog lanca koji su prisutni u konvencionalnim 4-lanþanim antitelima (koji se ovde oznaþavaju kao "VHdomeni" ili "VH domeni") i od varijabilnih domena lakog lanca koji su prisutni u konvencionalnim 4-lanþanim antitelima (koji se ovde oznaþavaju kao "VLdomeni" ili "VL domeni"). VHH domeni se mogu specifiþno vezati za epitop bez dodatnog antigen vezujuüeg domena (za razliku od VH ili VL domena u konvencionalnom 4-lanþanom antitelu, u kom sluþaju je epitop prepoznat od straneVL domena zajedno sa VH domenom). VHH domeni su male, robusne i efikasne jedinice prepoznavanja antigena formirane od strane jednog imunoglobulinskog domena.

U kontekstu ovog pronalaska, termini VHH domen, VHH, VHH domen, VHH fragment antitela, VHH antitelo, kao i "Nanobody®" i "Nanobody® domen" ("Nanobody" su zaštitni znak kompanije Ablynx N.V.; Ghent; Belgium) se koriste naizmeniþno i predstavnici su imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena (koji imaju strukturu FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i specifiþno se vezuju za neki epitop bez potrebe za prisustvom drugog imunoglobulinskog varijabilnog domena) i koji se razlikuju od VH domena po takozvanim "ostacima oznaka", kao što je definisano u na pr. WO2009/109635, slika 1.

Aminokiselinski ostaci imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena, na pr. VHH su numerisani u skladu sa opštim numerisanjem za VHdomene koje su dali Kabat et al.

("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), kako se primenjuje na VHH domene iz kamelida, kao što je prikazano na pr. na slici 2 u Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999).

Prema ovom numerisanju,

- FR1 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30,

- CDR1 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35,

- FR2 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 36-49,

- CDR2 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65,

- FR3 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94,

- CDR3 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102, i

- FR4 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113.

Meÿutim, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u struci za VHdomene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR može varirati i ne mora odgovarati ukupnom broju naznaþenih aminokiselinskih ostataka naznaþenih sa Kabatovim numerisanjem (to jest, jedna ili više pozicija u skladu sa Kabatovim numerisanjem mozda nije zauzeta u stvarnoj sekvenci, ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog Kabatovim numerisanjem). Ovo znaþi da, generalno, numerisanje u skladu sa Kabatom može ili ne mora da odgovara stvarnom numerisanju aminokiselinskih ostataka u datoj sekvenci.

Alternativni postupci za numerisanje aminokiselinskih ostataka VHdomena, koji se takoÿe mogu primeniti na analogan naþin na VHH domene, poznati su u stanju tehnike. Meÿutim, u ovom opisu, patentnim zahtevima i slikama, slediüe numerisanje u skladu sa Kabatom i primennjivaüe se na VHH domene kao što je gore opisano, osim ako nije drugaþije naznaþeno.

Ukupan broj aminokiselinskih ostataka u VHH domenu üe obiþno biti u opsegu od 110 do 120, þesto izmeÿu 112 i 115. Meÿutim, treba primetiti da kraüe i duže sekvence mogu takoÿe biti pogodne za ovde opisane svrhe.

Imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni, na pr. VHH i domenska antitela, u skladu sa poželjnim realizacijama iz pronalaska, kao što je gore definisano, imaju brojne jedinstvene strukturne karakteristike i funkcionalna svojstva što ih þini veoma povoljnim za upotrebu u terapiji kao funkcionalnih molekula koji vezuju antigen. Naroþito, i bez ograniþenja na to, VHH domeni (koji su "dizajnirani" po prirodi da se funkcionalno vezuju za antigen bez uparivanja sa varijabilnim domenom lakog lanca) mogu funkcionisati kao pojedinaþne, relativno male, funkcionalne antigen-vezujuüe strukturne jedinice.

Zbog njihovih jedinstvenih svojstava, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni, kao što je ovde definisano, kao što su VHH ili VH (ili VL) - bilo sami ili kao deo veüeg polipeptida, na pr. biparatopiþni molekul - nudi niz znaþajnih prednosti:

• samo jedan domen je potreban da veže antigen sa visokim afinitetom i sa visokom selektivnošüu, tako da nema potrebe da postoje dva odvojena domena, niti da se obezbedi da su ova dva domena prisutna u desnoj prostornoj konformaciji i konfiguraciji (tj. korišüenje posebno dizajniranih linkera, kao kod scFv-a);

• imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni mogu biti eksprimirani iz jednog molekula nukleinske kiseline i ne zahtevaju nikakvu post-translacijsku modifikaciju (kao što je glikozilacija);

• imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni mogu se lako konstruisati u multivalentne i multispecifiþne formate (kao što se ovde dalje razmatra);

1

• imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni imaju visoku specifiþnost i afinitet za svoj target, nisku inherentnu toksiþnost i mogu se primenjivati alternativnim putevima u odnosu na infuziju ili injekciju;

• imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni su visoko stabilni u odnosu na zagrevanja, pH, proteaze i druge denaturujuüe agense ili uslove i, prema tome, mogu biti pripremljeni, uskladišteni ili transportovani bez upotrebe rashladnih ureÿaja;

• Imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni su jednostavni i relativno jeftini za pripremu, kako na maloj zapremini, tako i na proizvodnoj zapremini. Na primer, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni mogu biti proizvedeni korišüenjem mikrobne fermentacije (na pr. kao što je dalje opisano u daljem tekstu) i ne zahtevaju upotrebu ekspresionih sistema sisara, kao na primer za konvencionalna antitela;

• imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni su relativno mali (približno 15 kDa, ili 10 puta manji od konvencionalnog IgG) u poreÿenju sa konvencionalnim 4-lanþanim antitelima i njihovim antigen-vezujuüim fragmentima, i stoga pokazuju visoku (višu) penetraciju u tkiva (ukljuþujuüi ali ne ograniþavajuüi se na þvrste tumore i druga gusta tkiva) i mogu se primenjivati u višim dozama od konvencionalnih 4-lanþanih antitela i njihovih antigen-vezujuüih fragmenata;

• VHH imaju specifiþna takozvana "svojstva vezivanja šupljina" (izmeÿu ostalog zbog njihove proširene CDR3 petlje, u poreÿenju sa VH domenima iz 4-lanþanih antitela) i stoga mogu takoÿe da pristupaju targetima i epitopima koji nisu dostupni konvencionalnim 4-lanþanim antitelima i njihovim antigen-vezujuüim fragmentima;

• VHH imaju posebnu prednost da su visoko rastvorljivi i veoma stabilni i nemaju tendenciju da stvaraju agregate (kao kod iz miševa dobijenih antigen-vezujuüih domena opisanih u Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)).

Imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni iz ovog pronalaska nisu ograniþeni u odnosu na specifiþni biološki izvor iz kojeg su dobijeni ili na specifiþni postupak pripreme. Na primer, dobijanje VHH može ukljuþiti sledeüe korake:

(1) izolovanje VHH domena iz prirodno nastalog antitela teškog lanca; ili skrining biblioteke koja sadrži antitela teškog lanca ili VHH i izolovanje VHH iz njih;

(2) ekspresiju molekula nukleinske kiseline koja kodira VHH sa sekvencom koja se javlja u prirodi;

(3) "humanizovanje" (kao što je ovde opisano) VHH, opciono posle sazrevanja afiniteta, sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira tako humanizovani VHH;

(4) "kamelizaciju" (kao što je opisano u daljem tekstu) imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog teškog domena iz prirodnog antitela iz životinjske vrste, naroþito iz vrsta sisara, kao što je iz ljudi, ili ekspresiju molekula nukleinske kiseline koja kodira za takav kamelirani domen;

(5) "kamelizaciju" VH, ili ekspresiju molekula nukleinske kiseline koja kodira za takav kamelirani VH;

(6) korišüenje tehnika za dobijanje sintetskih ili polu-sintetskih proteina, polipeptida ili drugih aminokiselinskih sekvenci;

(7) pripremu molekula nukleinske kiseline koja kodira VHH domen koristeüi tehnike za sintezu nukleinske kiseline, praüeno ekspresijom tako dobijene nukleinske kiseline;

(8) izlaganje antitela teškog lanca ili VHH sazrevanju afiniteta, do mutageneze (na pr. nasumiþna mutageneza ili mutageneza usmerena na mesto) i/ili bilo kojim drugim tehnikama da bi se poveüao afinitet i/ili specifiþnost VHH; i/ili

(9) kombinacije ili selekcije iz prethodnih koraka.

Pogodni postupci i tehnike za izvoÿenje gore opisanih koraka su poznati u struci i biüe jasni struþnoj osobi. Kao primer, postupci dobijanja VHH domena koji vezuju za specifiþni antigen ili epitop su opisani u WO2006/040153 i WO2006/122786.

U skladu sa specifiþnim realizacijama, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni iz pronalaska ili prisutni u polipeptidima iz pronalaska su VHH domeni sa nekom aminokiselinskom sekvencom koja u suštini odgovara aminokiselinskoj sekvenci prirodno prisutnoj u VHH domenu, ali koja je "humanizovana" ili "sekvenciono optimizovana" (opciono posle sazrevanja afiniteta), tj. zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci pomenute prirodno prisutne VHH sekvence sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajuüem položaju (položajima) u varijabilnom teškom domenu iz konvencionalnog 4-lanþanog antitela iz þoveka. Ovo se može izvesti korišüenjem postupaka koji su poznati u struci, a koji mogu biti rutinski korišüeni od strane struþne osobe.

Humanizovani VHH domen može sadržati jednu ili više sekvenci potpuno humanog okvirnog regiona, i, u još specifiþnijoj realizaciji, može da sadrži sekvence humanog okvirnog regiona izvedene iz humanih Vh3 sekvenci zametnih linija, DP-29, DP-47, DP-51, ili njihovih delova, ili da budu visoko homologni, opciono u kombinaciji sa JH sekvencama, kao što je JH5. Prema tome, protokol humanizacije može obuhvatati zamenu bilo kog VHH ostatka sa odgovarajuüim okvirom 1, 2 i 3 (FR1, FR2 i FR3) ostataka VH gena embrionske linije (kao što su DP 47, DP 29 i DP 51) bilo samostalno ili u kombinaciji. Pogodni okvirni regioni (FR) imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena iz pronalaska mogu biti izabrani od onih koji su navedeni na pr. u WO 2006/004678 i specifiþno, ukljuþuju takozvane klase "KERE" i "GLEW". Primeri su imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni koji imaju aminokiselinsku sekvencu G-L-E-W okvirno na poziciji 44 do 47, i njihove odgovarajuüe humanizovane kopije. Humanizovani VHH domen može da sadrži jednu ili više potpuno humanih sekvenci okvirnog regiona.

Na primer, humanizujuüa supstitucija za VHH koja pripada 103 P, R, S-grupi i/ili GLEW-grupi (kao što je definisano u daljem tekstu) je 108Q do 108L. Postupci humanizacije imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena su poznati u tehnici.

Vezujuüi imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni sa poboljšanim svojstvima u pogledu terapeutske primene, na pr. pojaþani afinitet ili smanjena imunogenost, mogu se dobiti iz pojedinaþnih vezujuüih molekula tehnikama poznatim u struci, kao što je sazrevanje afiniteta (na primer, polazeüi od sintetiþkih, sluþajnih ili prirodnih imunoglobulinskih sekvenci), CDR graftovanje, humanizovanje, kombinovanje fragmenata izvedenih iz razliþitih sekvence imunoglobulina, PCR sklapanje upotrebom preklapajuüih prajmera, i sliþne tehnike za inženjering imunoglobulinskih sekvenci koje su dobro poznate struþnoj osobi; ili bilo koja pogodna kombinacija bilo kojeg od prethodno navedenih, takoÿe nazvanih "sekvenciono optimizovani", kao što je ovde opisano. Referenca je, na primer, napravljena za standardne priruþnike, kao i za dalji opis i primere.

Ako je prikladno, vezujuüi molekul sa poveüanim afinitetom može se dobiti afinitetnim sazrevanjem drugog vezujuüeg molekula, koji predstavlja, u odnosu na afinitet sazrelog molekula, "roditeljski" vezujuüi molekul.

1

Postupci dobijanja VHH koji se vezuju za specifiþni antigen ili epitop su opisani ranije, na pr. u WO2006/040153 i WO2006/122786. Kao što je ovde detaljno opisano, VHH domeni izvedeni od kamelida mogu biti "humanizovani" (takoÿe se ovde nazivaju "sekvenciono optimizovani", "sekvenciono optimizovani" može, pored humanizacije, da obuhvati i dodatnu modifikaciju sekvence pomoüu jedne ili više mutacija koje daju VHH sa poboljšanim svojstvima, kao što je uklanjanje potencijalnih post-translacijskih modifikacionih mesta) zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci originalne VHH sekvence sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajuüem položaju (položajima) u VH domenu iz konvencionalnog 4-lanþanog antitela iz þoveka.

Humanizovani VHH domen može da sadrži jednu ili više sekvenci potpuno humanog okvirnog regiona, i, u još specifiþnijoj realizaciji, može sadržati sekvence humanog okvirnog regiona izvedene iz DP-29, DP-47, DP-51, ili njihovih delova, opciono kombinovano sa JH sekvencama, kao što je JH5.

"Domeni antitela", takoÿe poznati kao "Dab" i "dAb" (termini "Domen antitela" i "dAb" se koriste kao zaštitni znakovi od strane GlaxoSmithKline grupe kompanija) su opisani u na pr. Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.:

"Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); i u WO2003/002609.

Domeni antitela suštinski odgovaraju VH ili VL domenima antitela iz ne-kamelidnih sisara, posebno humanih 4-lanþanih antitela. Da bi se vezao epitop kao pojedinaþni antigen vezujuüi domen, tj. bez uparivanja sa VL ili VH domenom, respektivno, potrebna je specifiþna selekcija za takva svojstva vezivanja antigena, na pr. korišüenjem biblioteka humanih pojedinaþnih VH ili VL sekvenci domena.

Domeni antitela imaju, kao i VHH, molekulsku masu od približno 13 do približno 16 kDa i, ako su izvedena iz potpuno humanih sekvenci, ne zahtevaju humanizaciju za na pr. terapeutsku upotrebu kod ljudi. Kao što je u sluþaju VHH domena, oni su takoÿe dobro eksprimirani u prokariotskim ekspresionim sistemima, obezbeÿujuüi znaþajno smanjenje ukupnih troškova proizvodnje.

Pored toga, struþnoj osobi üe biti jasno da je moguüe "graftovati" jedan ili više gore navedenih CDR-ova na druge "skafolde", ukljuþujuüi ali ne ograniþavajuüi se na humane skafolde ili ne-imunoglobulinske skafolde. Pogodni skafoldi i tehnike za takvo CDR graftovanje su poznate u tehnici.

Izrazi "epitop" i "antigenska determinanta", koji se mogu koristiti naizmeniþno, odnose se na deo makromolekula, kao što je polipeptid, koji je prepoznat od strane molekula koji vezuju antigen, kao što su konvencionalna antitela ili polipeptidi iz pronalaska, i specifiþnije, od strane antigen vezujuüeg mesta navedenih molekula. Epitopi definišu minimum vezujuüih mesta za neki imunoglobulin, i kao takvi predstavljaju target za specifiþnost nekog imunoglobulina.

Za polipeptid (kao što je imunoglobulin, antitelo, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen iz pronalaska, ili generalno antigen vezujuüi molekul ili njegov fragment) koji se može "vezati za" ili "specifiþno vezati za", koji "ima afinitet za" i/ili koji "ima specifiþnost za" odreÿeni epitop, antigen ili protein (ili za najmanje jedan deo, fragment ili njegov epitop) se kaže da je "protiv" ili "usmeren protiv" navedenog epitopa, antigena ili proteina ili je "vezujuüi" molekul u odnosu na takav epitop, antigen ili protein. U ovom kontekstu, molekul koji vezuje Ang2 može takoÿe biti oznaþen kao "Ang2-neutrališuüi".

Generalno, termin "specifiþnost" se odnosi na odreÿen broj razliþitih tipova antigena ili epitopa na koje se može vezati odreÿeni antigen vezujuüi molekul ili antigen-vezujuüi protein (kao što je imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen iz pronalaska). Specifiþnost antigen vezujuüeg molekula može se odrediti na osnovu njegovog afiniteta i/ili avidnosti. Afinitet, predstavljen konstantom ravnoteže za disocijaciju antigena iz antigen vezujuüeg proteina (KD), je mera za jaþinu vezivanja izmeÿu epitopa i antigen vezujuüeg mesta na antigen vezujuüem proteinu: što je manja KD vrednost, to je jaþa snaga vezivanja izmeÿu epitopa i antigen vezujuüeg molekula (alternativno, afinitet se takoÿe može izraziti kao konstanta afiniteta (KA), koja iznosi 1/KD). Kao što üe biti jasno struþnoj osobi (na primer, na osnovu daljeg opisa ovde), afinitet se može odrediti na naþin poznat per se, u zavisnosti od specifiþnog antigena od interesa. Avidnost je mera jaþine vezivanja izmeÿu antigen vezujuüeg molekula (kao što je imunoglobulin, antitelo, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen ili polipeptid koji ga sadrži) i odgovarajuüeg antigena. Avidnost se odnosi na oba, na afinitet izmeÿu epitopa i njegovog antigen vezujuüeg mesta na antigen vezujuüem molekulu kao i na broj relevantnih mesta vezivanja prisutnih na antigen vezujuüem molekulu.

Deo antigen vezujuüeg molekula (kao što je antitelo ili imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen iz pronalaska) koji prepoznaje epitop se naziva "paratop".

1

Ukoliko nije drugaþije naznaþeno, termin "Ang2 vezujuüi molekul" ukljuþuje anti-Ang2 antitela, fragmente anti-Ang2 antitela, "anti-Ang2 antitelu sliþne molekule" i konjugte sa bilo kojim od navedenih. Antitela obuhvataju, ali nisu ograniþena na, monoklonska i himerizovana monoklonska antitela. Termin "antitelo" obuhvata kompletne imunoglobuline, kao što su monoklonska antitela dobijena rekombinantnom ekspresijom u üelijama domaüina, kao i fragmenti Ang2 vezujuüih antitela ili "molekuli sliþni antitelima", ukljuþujuüi jednolanþana antitela i linearna antitela, takozvana "SMIP" ("Small Modular Immunopharmaceuticals"), kao što je na pr. opisano u WO02/056910. Anti-Ang2 antitelu sliþni molekuli ukljuþuju imunoglobulinske pojedinaþne varijabilne domene, kao što je ovde definisano. Drugi primeri za molekule sliþne antitelima su imunoglobulinska super-porodica antitela (IgSF), ili CDR-graftovani molekuli.

"Ang2 vezujuüi molekul" odnosi se na monovalentne Ang2 vezujuüe molekule (tj. molekule koji se vezuju za jedan epitop iz Ang2) kao i na Ang2 vezujuüe molekule koji sadrže više od jednog Ang2 vezujuüeg imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena, koji se takoÿe nazivaju "formatirani" Ang2 vezujuüi molekuli. Formatirani" Ang2 vezujuüi molekuli mogu, pored Ang2 vezujuüih imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena, da sadrže linkere i/ili ostatke sa efektorskim funkcijama, na pr. ostatke sa poveüanim vremenom poluživota kao što su albumin-vezujuüi imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni, i/ili fuzioni partner poput serumskog albumina i/ili prikaþen polimer kao što je PEG.

Formatirani Ang2 vezujuüi molekul može, mada manje preferirano, takoÿe da sadrži dva identiþna Ang2 vezujuüa imunoglobulinska pojedinaþna varijabilna domena ili dva razliþita imunoglobulinska pojedinaþna varijabilna domena koji prepoznaju iste ili preklapajuüe epitope. U tom sluþaju, dva imunoglobulinska pojedinaþna varijabilna domena mogu da se vežu za isti ili preklapajuüi epitop u svakom od dva monomera koji formiraju Ang2 dimer. Eksperimentalni podaci, ukljuþujuüi kompetitivni ELISA test, otkrivaju znaþajno poboljšanje potentnosti formatiranih Ang2 dimera u poreÿenju sa pojedinaþnim gradivnim blokovima mono Ang2 vezujuüih molekula (podaci nisu prikazani).

Specifiþno vezivanje antigen vezujuüeg proteina za antigen ili epitop može se odrediti na bilo koji pogodan naþin poznat per se, ukljuþujuüi, na primer, testove koji su ovde opisani, Scatchard analize i/ili testovi kompetitivnog vezivanja, kao što su radioimunoeseji (RIA), enzimski imunotestovi (EIA) i sendviþ testovi kompeticije, i njihove razliþite varijante poznate su per se u tehnici.

1

Aminokiselinski ostaci üe biti naznaþeni u skladu sa standardnim aminokiselinskim kodom od tri slova ili od jednog slova, kao što je opšte poznato i dogovoreno u tehnici. Kada se porede dve aminokiselinske sekvence, termin "aminokiselinska razlika" se odnosi na insercije, delecije ili supstitucije naznaþenog broja aminokiselinskih ostataka na položaju referentne sekvence, u poreÿenju sa drugom sekvencom. U sluþaju supstitucije(a), takva supstitucija(e) üe prvenstveno biti konzervativna aminokiselinska supstitucija(e), što znaþi da je aminokiselinski ostatak zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom sliþne hemijske strukture i koji ima mali ili u suštini nikakav uticaj na funkciju, aktivnost ili druga biološka svojstva polipeptida.

Takve konzervativne aminokiselinske supstitucije su dobro poznate u tehnici, na primer iz W098/49185, gde su konzervativne aminokiselinske supstitucije poželjno supstitucije u kojima je jedna amino kiselina unutar sledeüih grupa (i) - (v) supstituisana sa drugim aminokiselinskim ostatkom unutar iste grupe: (i) mali alifatski, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro i Gly; (ii) polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi (nenaelektrisani) amidi: Asp, Asn, Glu i Gln; (iii) polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg i Lys; (iv) veliki alifatski, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, Val i Cys; i (v) aromatiþni ostaci: Phe, Tyr i Trp. Naroþito poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucije su sledeüe:

Ala u Gly ili u Ser; Arg u Lys; Asn u Gln ili u His; Asp u Glu; Cys u Ser; Gln u Asn; Glu u Asp; Gly u Ala ili u Pro; His u Asn ili u Gln; Ile u Leu ili u Val; Leu u Ile ili u Val; Lys u Arg, u Gln ili u Glu; Met u Leu, u Tyr ili u Ile; Phe u Met, u Leu ili u Tyr; Ser u Thr; Thr u Ser; Trp u Tyr; Tyr u Trp ili u Phe; Val u Ile ili u Leu.

Za polipeptid ili molekul nukleinske kiseline se smatra da je "(u) suštini izolovan (oblik)" - na primer, kada se uporedi sa njegovim prirodnim biološkim izvorom i/ili reakcionim medijumom ili medijumom za kultivaciju iz koga je dobijen - kada je on odvojen od najmanje jedne druge komponente sa kojom je obiþno povezan u pomenutom izvoru ili medijumu, kao što je drugi protein/polipeptid, druga nukleinska kiselina, druga biološka komponenta ili makromolekul ili od najmanje od jednog kontaminanta, neþistoüe ili minorne komponente. Konkretno, polipeptid ili molekul nukleinske kiseline se smatra "suštinski izolovanim" kada je preþišüen najmanje 2 puta, naroþito najmanje 10 puta, još posebnije najmanje 100 puta, i do 1000 puta ili više. Polipeptid ili molekul nukleinske kiseline koji je "u suštini izolovan oblik" je poželjno u suštini homogen, kako je odreÿeno korišüenjem

1

pogodne tehnike, kao što je pogodna hromatografska tehnika, kao što je elektroforeza u poliakrilamidnom gelu.

Termin "N-terminus" (takoÿe poznat kao amino-terminus, NH2- terminus, N-terminalni kraj ili aminski-terminus) odnosi se na startnu poziciju proteina/polipeptida (tj. Ang2 vezujuüeg molekula) koji se završava sa aminokiselinom koja ima slobodnu aminsku grupu (-NH2). Konvencija za pisanje peptidnih sekvenci je da se N-terminus stavi na levo i da se zapiše sekvenca od N- do C-terminusa. Kada je protein preveden iz informacione RNK, on se kreira od N-terminusa do C-terminusa.

"Identitet sekvence" izmeÿu dve sekvence Ang2 vezujuüa molekula ukazuje na procenat aminokiselina koje su identiþne izmeÿu sekvenci. Može se izraþunati ili odrediti kao što je opisano u paragrafu f) na stranama 49 i 50 u WO08/020079. "Sliþnost sekvence" ukazuje na procenat aminokiselina koje su ili identiþne ili koje predstavljaju konzervativne supstitucije aminokiselina.

Alternativni postupci za numerisanje aminokiselinskih ostataka VHdomena, koji se takoÿe mogu primeniti na analogan naþin na VHH domene, poznati su u stanju tehnike. Meÿutim, u ovom opisu, patentnim zahtevima i slikama, slediüe numerisanje u skladu sa Kabatom i primenjeno na VHH domene kao što je gore opisano, osim ako nije drugaþije naznaþeno.

Jedan "afinitetno sazreli" Ang2 vezujuüi molekul, naroþito VHH ili domen antitela, ima jednu ili više promena u jednom ili više CDR-ova, što rezultira poboljšanim afinitetom za Ang2, u poreÿenju sa odgovarajuüim roditeljskim Ang2 vezujuüim molekulom. Afinitetno sazreli Ang2 vezujuüi molekuli iz ovog pronalaska mogu biti pripremljeni postupcima poznatim u tehnici, na primer, kao što je opisano u Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, ili Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol.155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; and Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol.226(3): 889896; KS Johnson Johnson i RE Havkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.

Neka "aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: x" oznaþava aminokiselinsku sekvencu koja je 100% identiþna sa sekvencom prikazanom u odgovarajuüoj SEK ID BR: x.

Izrazi "kancer" i "kancerogeni" odnose se ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje se tipiþno karakteriše neregulisanim rastom/proliferacijom üelija. Primeri kancera koji se

1

tretiraju sa nekim Ang2 vezujuüim molekulom iz pronalaska ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Još odreÿeniji primeri takvih karcinoma ukljuþuju karcinom skvamoznih üelija, rak pluünih malih üelija, rak pluünih ne-malih üelija, adenokarcinom pluüa, skvamozni karcinom pluüa, rak peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrointestinalni kancer, rak pankreasa, glioblastom, rak grliüa materice, rak jajnika, rak jetre, rak mokraüne bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom bubrežnih üelija, karcinom endometrijuma ili karcinom materice, karcinom pljuvaþne žlezde, karcinom bubrega, karcinom jetre, karcinom prostate, karcinom vulve, rak štitnjaþe, kancer jetre, rak želuca, melanom i razliþiti tipovi kancera glave i vrata.

Disregulacija angiogeneze može dovesti do mnogih poremeüaja koji se mogu tretirati kompozicijama i postupcima u skladu sa pronalaskom. Ovi poremeüaji ukljuþuju i neneoplastiþna i neoplastiþna stanja. Neoplastije ukljuþuju, ali nisu ograniþene, na gore opisane.

Ne-neoplastiþni poremeüaji ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na neželjenu ili aberantnu hipertrofiju, artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijazu, psorijatiþne plakove, sarkoidozu, aterosklerozu, aterosklerotske plakove, dijabetiþke i druge proliferativne retinopatije ukljuþujuüi retinopatiju nedonošþadi, retrolentnu fibroplaziju, neovaskularni glaukom, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, dijabetiþni makularni edem, neovaskularizaciju rožnjaþe, neovaskularizaciju grafta rožnjaþe, odbacivanje grafta rožnjaþe, retinalnu/koroidalnu neovaskularizacija, neovaskularizaciju ugla (rubeoza), neovaskularna bolest oka, vaskularna restenoza, arteriovenske malformacije (AVM), meningiom, hemangiom, angiofibrom, hiperplazije štitne žlezde (ukljuþujuüi Graveovu bolest), transplantaciju rožnjaþe i drugih tkiva, hroniþnu upalu, upalu pluüa, akutnu povredu pluüa (ARDS), sepsu, primarnu pluünu hipertenziju, maligne pluüne izlive, cerebralni edem (na pr. povezan sa akutnim moždanim udarom/zatvorenom povredom glave/traumom), sinovijalnu upalu, formiranje panusa u RA, miozitis osifikans, hipertropiþno formiranje kostiju, osteoartritis (OA), refraktorni ascitis, bolest policistiþnih jajnika, endometriozu, 3. razmak od oboljenja fluida (pankreatitis, sindrom kompartmenta, opekotine, bolest creva), fibroide materice, preuranjeni poroÿaj, hroniþnu upalu kao što je IBD (Krohnova bolest i ulcerativni kolitis), odbacivanje bubrežnog alografta, inflamatorna bolest creva, nefrotski sindrom, neželjeni ili nenormalan rast mase tkiva (ne-karcinomski), hemofilni zglobovi, hipertrofiþni ožiljci, inhibicija rasta kose, Osijer-Veberov sindrom, retrolentalna fibroplazija piogenog granuloma, skleroderma, trahom, vaskularne adhezije, sinovitis, dermatitis, preeklampsija, ascitis, perikardni izliv (kao što je onaj povezan sa perikarditisom) i pleuralni izliv.

1

Termin "Rþne bolesti" odnosi se na proliferativne retinopatije ukljuþujuüi retinopatiju nedonošþadi, retrolentnu fibroplaziju, neovaskularni glaukom, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, dijabetski makularni edem, neovaskularizaciju rožnjaþe, neovaskularizaciju grafta rožnjaþe, odbacivanje grafta rožnjaþe, retinalnu/koroidalnu neovaskularizaciju.

Termin "hroniþne bolesti bubrega" odnosi se na dijabetiþku nefropatiju, postrenalnu insuficijenciju, prerenalnu azotemiju i unutrašnju bubrežnu insuficijenciju.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

U prvom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na Ang2 vezujuüi molekul koji sadrži imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen, naznaþeno time da navedeni imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen sadrži tri regiona za odreÿivanje komplementarnosti CDR1, CDR2 i CDR3, gde CDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 168, CDR2 ima aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEK ID BR: 171 i CDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 175.

SEK ID BR: 168 DYAIG

SEK ID BR: 171 AIRSSGGSTYYADSVKG

SEK ID BR: 175 VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA

U skladu sa poželjnim realizacijama, Ang2 vezujuüi molekul sadrži neki imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen, naznaþeno time da je navedeni imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen VHH ili domen antitela.

U skladu sa poželjnim realizacijama, Ang2 vezujuüi molekul sadrži neki imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen, naznaþeno time da je navedeni imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen VHH.

U skladu sa specifiþnim realizacijama, navedeni VHH se sastoji od nekog imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena koji ima sekvencu SEK ID BR: 166.

U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na Ang2 vezujuüi molekul koji se sastoji od pomenutog imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena.

Sekvence Ang2 veznika u skladu sa pronalaskom mogu biti modifikovane na njihovim N-terminusima (tj. delecija ili razmena prve amino kiseline) bez znaþajnog smanjenja njihove

2

aktivnosti vezivanja. Ova modifikacija poboljšava ko-/post-translaciono cepanje N-terminalnog metionina tokom intracelularne/citoplazmatske ekspresije u bakterijskim domaüinima (na pr. ali bez ograniþenja na Escherichia coli).

U jednom aspektu, navedeni VHH koji se sastoji od nekog imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena ima modifikaciju ili razmenu na N terminusu, gde je navedena modifikacija delecija prve aminokiseline i navedena razmena je zamena prve amino kiseline drugom aminokiselinom.

U jednoj od poželjnih realizacija prva amino kiselina na N terminusu je Valin (V) ili asparaginska kiselina (D) zamenjena sa na pr. Alaninom (A).

Ang2 vezujuüe komponente sa poboljšanim svojstvima u pogledu terapeutske primene, na pr. pojaþani afinitet ili smanjena imunogenost, mogu se dobiti iz pojedinaþnih Ang2 vezujuüih komponenti iz pronalaska tehnikama kao što su afinitetno sazrevanje (na primer, polazeüi od sintetiþkih, sluþajnih ili prirodnih imunoglobulinskih sekvenci), CDR graftovanje, humanizovanje, kombinovanje fragmenata izvedenih iz razliþitih sekvence imunoglobulina, PCR sklapanje upotrebom preklapajuüih prajmera, i sliþne tehnike za inženjering imunoglobulinskih sekvenci koje su dobro poznate struþnoj osobi; ili bilo kojom pogodnom kombinacijom bilo koje od prethodno navedenih. Referenca je, na primer, napravljena za standardne priruþnike, kao i za dalji opis i primere.

U još jednom izvoÿenju, predstavnici klase Ang2 vezujuüih imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena iz pronalaska koji ukljuþuju CDR-ove kao što je navedeno napred, imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju sekvenci aminokiselina prirodnog VH domena koji je bio "kamelizovanom", tj. zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci prirodnog varijabilnog teškog lanca iz konvencionalnog 4-lanþanog antitela sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajuüem položaju(ima) u VHH domenu antitela teškog lanca. Ovo se može izvesti na naþin koji je poznat per se, koji üe biti jasan struþnoj osobi, a referenca se dodatno upuüuje na WO 1994/04678. Takva kamelizacija se prvenstveno može pojaviti na položajima aminokiselina koji su prisutni na VH-VL interfejsu i na takozvanim Camelidae Hallmark ostacima (videti, na primer, takoÿe WO 1994/04678). Zadržani opis takvih "humanizacionih" i "kamelizacionih" tehnika i poželjnih sekvenci okvirnog regiona koji su u skladu s tim mogu se dodatno uzeti iz na pr.46. str. i 98. str.u WO 2006/040153 i 107. str. u WO 2006/122786.

Ang2 vezujuüe komponente iz pronalaska, na pr. imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni i/ili polipeptidi koji ih sadrže, imaju specifiþnost za Ang2 po tome što sadrže jedan ili više imunoglobulinskih pojedinaþnih varijabilnih domena koji se specifiþno vežu za jedan ili više epitopa u molekulu Ang2.

Specifiþno vezivanje Ang2 vezujuüe komponente za njegov antigen Ang2 može se odrediti na bilo koji pogodan naþin poznat per se, ukljuþujuüi, na primer, testove koji su ovde opisani, Scatchard analizu i/ili testove kompetitivnog vezivanja, kao što su radioimunoeseji (RIA), enzimski imunotestovi (EIA i ELISA) i sendviþ testovi kompetitivnosti, i njihove razliþite varijante poznate per se u tehnici.

U skladu sa još jednim izvoÿenjem, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni su domeni antitela, kao što je ovde definisano.

U tom sluþaju, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domeni, kao što je gore definisano, prisutni u monospecifiþnim vezujuüim molekulima iz pronalaska imaju sekvence koje odgovaraju sekvenci aminokiselina iz prirodno prisutnog VH domena koji je "kamelizovan", tj. zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci prirodnog promenljivog teškog lanca iz konvencionalnog 4-lanþanog antitela sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajuüem položaju(ima) u VHH domenu teškog lanca antitela.

Ovo se može izvesti na naþin koji je poznat per se, što üe biti jasno struþnoj osobi, a dodatno se može referencom pozvati na WO 94/04678. Takva kamelizacija se prvenstveno može pojaviti na aminokiselinskim pozicijama koje su prisutne na VH-VL interfejsu i na takozvanim Camelidae Hallmark ostacima (videti za primer takoÿe WO 94/04678). Zadržani opis takvih "humanizacionih" i "kamelizacionih" tehnika i poželjnih sekvenci okvirnog regiona koji su u skladu s tim mogu se dodatno uzeti iz na pr. 46. str. i 98. str.u WO 2006/040153 i 107. str. u WO 2006/122786.

Vezujuüe komponente imaju specifiþnost za Ang2, po tome što one sadrže jedan imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen koji se specifiþno vezuje za Ang2 molekul.

Specifiþno vezivanje vezujuüe komponente za njegov antigen Ang2 može se odrediti na bilo koji pogodan naþin koji je poznat per se, ukljuþujuüi, na primer, testove koji su ovde opisani, Scatchard analizu i/ili testove kompetitivnog vezivanja, kao što su radioimunoeseji (RIA), enzimski imunotestovi (EIA i ELISA) i sendviþ testovi kompeticije, i njihove razliþite varijante poznate per se u tehnici.

Ovaj pronalazak se takoÿe odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira za Ang2 vezujuüi molekul u skladu sa pronalaskom.

U poželjnoj realizaciji neki Ang2 vezujuüi molekul u skladu sa pronalaskom, kada je eksprimiran u Escherichia coli kodiran je nukleotidnom sekvencom:

SEK ID BR: 179

GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGACTGGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTG

AGTTGCGCAGTTAGCGGTATTACCCTGGATGATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCC

CAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCGCAATTCGTAGCAGCGGTGGTAGCACCTATTATG

CCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCAGCAGCGATAACAGTAAAAACACGGTTTATCTG

CAAATGAACTCATTACGTCCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGCGCAGCAGTTCCGGCAG

GTCGTCTGCGTTATGGTGAACAGTGGTATCCGATTTATGAATATGATGCATGGGGTCAAGG

TACACTGGTTACAGTGAGTAGC

Pronalazak se odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju Ang2 vezujuüe monospecifiþne vezne molekule iz pronalaska. Takvi molekuli nukleinske kiseline üe takoÿe biti ovde oznaþeni kao "nukleinske kiseline iz pronalaska" i mogu takoÿe biti u obliku genetskog konstrukta, kao što je ovde definisano. Nukleinska kiselina iz pronalaska može biti genomska DNK, cDNK ili sintetiþka DNK (kao što je DNK sa upotrebom kodona koja je specifiþno prilagoÿena za ekspresiju u üelijama domaüina ili organizmu domaüina). U skladu sa jednom realizacijom iz pronalaska, nukleinska kiselina iz ovog pronalaska je u suštini izolovana forma, kao što je gore definisano.

Dalji aspekt pronalaska se odnosi na ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira pomenuti Ang2 vezujuüi molekul u skladu sa pronalaskom.

U poželjnim izvoÿenjima, nukleinska kiselina iz pronalaska može takoÿe biti u obliku, može biti prisutna u i/ili može biti deo vektora, kao što je na primer plazmid, kosmid ili YAC.

Vektor može posebno biti ekspresioni vektor, tj. vektor koji može biti obezbeÿen za ekspresiju monospecifiþnog vezujuüeg molekula in vitro i/ili in vivo (tj. u pogodnoj üeliji domaüinu, organizmu domaüinu i/ili ekspresionom sistemu). Takav ekspresioni vektor

2

generalno sadrži najmanje jednu nukleinsku kiselinu iz pronalaska koja je operativno povezana sa jednim ili više pogodnih regulatornih elemenata, kao što su promoter(i), pojaþivaþ(i), terminator(i) i sliþno. Takvi elementi i njihova selekcija u pogledu ekspresije specifiþne sekvence u specifiþnom domaüinu su poznati struþnoj osobi. Specifiþni primeri regulatornih elemenata i drugih elemenata koji su korisni ili neophodni za ekspresiju molekula iz ovog pronalaska, kao što su promoteri, pojaþivaþi, terminatori, faktori integracije, selekcioni markeri, liderske sekvence, reporterski geni i sliþno, opisani su na pr. na str. od 131 do 133 u WO 2006/040153.

Takvi vektori eksprimiraju ili su sposobni da eksprimiraju jedan ili više monospecifiþnih vezujuüih molekula iz pronalaska; i/ili sadrže nukleinsku kiselinu iz pronalaska.

Nukleinske kiseline iz pronalaska mogu biti pripremljene ili dobijene na naþin koji je poznat per se (na pr. automatizovanom sintezom DNK i/ili tehnologijom rekombinantne DNK), na osnovu informacija o aminokiselinskim sekvencama za polipeptide iz datog pronalaska, i/ili mogu biti izolovane iz odgovarajuüeg prirodnog izvora.

U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na üelije domaüina koje nose jedan ili više ekspresionih vektora koji sadrže molekul nukleinske kiseline koji kodira Ang2 vezujuüi molekul u skladu sa pronalaskom.

U skladu sa posebno poželjnim izvoÿenjem, navedene üelije domaüini su bakterijske üelije; druge korisne üelije su üelije kvasca, üelije gljivica ili üelije sisara.

Pogodne bakterijske üelije ukljuþuju üelije iz grupe gram-negativnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Escherichia coli, Proteus, i Pseudomonas, i iz grupe gram-pozitivnih bakterijskih sojeve kao što su sojevi Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, i Lactococcus. Pogodne üelije gljivica obuhvataju üelije iz vrsta Trichoderma, Neurospora, i Aspergillus. Pogodne üelije kvasca ukljuþuju üelije iz vrsta Saccharomyces (na primer, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (na primer Schizosaccharomyces pombe), Pichia (na primer Pichia pastoris i Pichia methanolica), i Hansenula.

Pogodne üelije sisara ukljuþuju na primer CHO üelije, BHK üelije, HeLa üelije, COS üelije i sliþno. Meÿutim, takoÿe se mogu koristiti amfibijske üelije, üelije insekata, biljne üelije i bilo koje druge üelije koje se koriste u struci za ekspresiju heterolognih proteina.

Pronalazak dalje obezbeÿuje postupke za proizvodnju monospecifiþnog vezujuüeg molekula iz ovog pronalaska, a ti postupci obiþno obuhvataju sledece korake:

- kultivisanje üelija domaüina koje sadrže nukleinsku kiselinu koja je sposobna da kodira monospecifiþni vezujuüi molekul pod uslovima koji omoguüavaju ekspresiju monospecifiþnog vezujuüeg molekula pronalaska; i

- izdvajanje ili izolovanje polipeptida eksprimiranog u üelijama domaüina iz kulture; i

- opciono dalje preþišüavanje i/ili modifikovanje i/ili formulisanje monospecifiþnog vezujuüeg molekula iz pronalaska.

Poželjna realizacija predstavlja postupak za proizvodnju Ang2 vezujuüeg molekula koji ima sekvencu SEK ID BR: 166 koji obuhvata korake:

(a) transfekciju üelije domaüina sa jednim ili više navedenih vektora

(b) kultivisanje navedene üelije domaüina, i

(c) izdvajanje i preþišüavanje pomenutog Ang2 vezujuüeg molekula.

Za proizvodnju u industrijskim razmerama, poželjni organizmi domaüina ukljuþuju sojeve E. coli, Pichia pastoris i S. cerevisiae koji su pogodni za ekspresiju, proizvodnju i fermentaciju u velikim razmerama, a naroþito za farmaceutsku ekspresiju, proizvodnju i fermentaciju u velikim razmerama.

Izbor specifiþnog sistema ekspresije delimiþno zavisi od zahteva za odreÿene posttranslacione modifikacije, specifiþnije glikozilacije. Proizvodnja monospecifiþnog vezujuüeg molekula u skladu sa pronalaskom za koji je željena ili zahtevana glikozilacija, zahtevala bi upotrebu ekspresionih domaüina sisara koji imaju sposobnost da glikoziluju eksprimirani protein. U tom smislu, struþnoj osobi üe biti jasno da üe dobijeni uzorak glikozilacije (tj. vrsta, broj i položaj vezanih ostataka) zavisiti od üelije ili üelijske linije koja se koristi za ekspresiju.

Monospecifiþni vezujuüi molekuli iz pronalaska mogu biti proizvedeni bilo u üeliji kao što je gore navedeno intracelularno (na pr. u citozolu, u periplazmi ili u inkluzionim telima) i zatim izolovani iz üelija domaüina i opciono dalje preþišüeni; ili se mogu proizvesti ekstracelularno (na pr. u medijumu u kome se kultivišu üelije domaüina) i zatim izoluju iz medijuma za kultivaciju i opciono dalje preþišüavaju.

Postupci i reagensi koji se koriste za rekombinantnu proizvodnju polipeptida, kao što su specifiþni pogodni ekspresioni vektori, metode transformacije ili transfekcije, selekcioni markeri, postupci indukcije ekspresije proteina, uslovi kultivacije i sliþno, poznati su u

2

tehnici. Sliþno tome, tehnike izolacije proteina i tehnike preþišüavanja korisne u postupku proizvodnje polipeptida u skladu sa pronalaskom su dobro poznate struþnoj osobi.

Pronalazak se dalje odnosi na proizvod ili kompoziciju koja obuhvata ili sadrži najmanje jedan Ang2 monospecifiþno vezujuüi molekul u skladu sa pronalaskom i opciono jednu ili više dodatnih komponenti takvih kompozicija poznatih per se, tj. u zavisnosti od nameravane upotrebe kompozicije.

U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu Ang2 veujuüeg monospecifiþno vezujuüeg molekula iz pronalaska kao medikamenta.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu Ang2 vezujuüeg monospecifiþno vezujuüeg molekula iz pronalaska za postupak leþenja kancera, kancerogenih ili oþnih bolesti.

Za farmaceutsku upotrebu, neki Ang2 vezujuüi monospecifiþno vezujuüi molekul iz pronalaska ili polipeptid koji ga sadrži može biti formulisan kao farmaceutski preparat ili kompozicija koja sadrži najmanje jedan takav monospecifiþni vezujuüi molekul iz pronalaska i najmanje jedan fiziološki prihvatljiv nosaþ, razblaživaþ ili ekscipijent i/ili adjuvant, i opciono, jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja.

Pomoüu ne-ograniþavajuüih primera, takva formulacija može biti u obliku pogodnom za oralnu primenu, za parenteralnu primenu (kao što je intravenska, intramuskularna ili subkutana injekcija ili intravenska infuzija), za topikalnu primenu, za administriranje inhalacijom, pomoüu kožnih peþeva, pomoüu implanta, pomoüu supozitorija, itd. Takvi pogodni oblici za davanje - koji mogu biti þvrsti, polu-þvrsti ili teþni, zavisno od naþina primene - kao i postupci i nosaþi za upotrebu u njihovom pripremanju, üe biti jasni struþnoj osobi, i ovde su dalje opisani.

Prema tome, u sledeüem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan Ang2 vezujuüi monospecifiþno vezujuüi molekul, posebno jedan imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen iz pronalaska, kao što je gore definisano, ili polipeptid koji sadrži isti i najmanje jedan pogodan nosaþ, diluent ili ekscipijent (tj. pogodan za farmaceutsku upotrebu), i opciono jednu ili više dodatnih aktivnih supstanci.

Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekuli iz ovog pronalaska mogu biti formulisani i primenjeni na bilo koji pogodan naþin koji je poznat per se: referenca, naroþito za imunoglobulinske pojedinaþne varijabilne domene, je na primer napravljena u WO

2

2004/041862, WO 2004/041863, WO 2004/041865, WO 2004/041867 i WO 2008/020079, kao i standardnim priruþnicima, kao što su Remington's Pharmaceutical Sciences, 18<th>Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21<th>Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); ili Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (vidi na primer strane 252-255).

Na primer, imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen iz pronalaska kao što je gore definisan može se formulisati i primenjivati na bilo koji naþin koji je poznat per se za konvencionalna antitela i fragmente antitela (ukljuþujuüi ScFv i dijatela) i druge farmaceutski aktivne proteine. Takve formulacije i postupci za dobijanje istih biüe jasni struþnoj osobi, i na primer ukljuþuju preparate koji su pogodni za parenteralnu primenu (na primer, intravenska, intraperitonealna, subkutana, intramuskularna, intraluminalna, intra-arterijska ili intratekalna primena) ili za topikalnu (tj. transdermalno ili intradermalno) primenu.

Preparati za parenteralno davanje mogu, na primer, biti sterilni rastvori, suspenzije, disperzije ili emulzije koje su pogodne za infuziju ili injekcije. Pogodni nosaþi ili razblaživaþi za takve preparate ukljuþuju, bez ograniþenja, sterilnu vodu i farmaceutski prihvatljive vodene pufere i rastvore kao što su fiziološki fosfatno puferni rastvor, Ringerovi rastvori, rastvor dekstroze i Hank-ov rastvor; vodena ulja; glicerol; etanol; glikoli kao što su propilen glikol ili kao mineralna ulja, životinjska ulja i biljna ulja, na primer ulje kikirikija, sojino ulje, kao i njihove pogodne smeše. Obiþno, poželjni su vodeni rastvori ili suspenzije.

Prema tome, Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekul iz pronalaska može biti sistemski administriran, na pr., oralno, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosaþem kao što je inertni razblaživaþ ili asimilabilni jestivi nosaþ. Za oralno terapeutsko davanje, molekul iz pronalaska se može kombinovati sa jednim ili više ekscipijenata i koristiti u obliku tabelata za ingestiju, bukalnih tabelata, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafla i sliþno. Takve kompozicije i preparati treba da sadrže najmanje 0.1% Ang2 vezujuüih molekula iz pronalaska. Njihov procenat u kompozicijama i preparatima može, naravno, varirati i može biti pogodno izmeÿu oko 2 do oko 60% težine datog oblika jediniþne doze. Koliþina molekula iz pronalaska u takvim terapeutski korisnim kompozicijama je takva da üe se dobiti efektivan nivo doziranja.

Tabelate, pilule, kapsule i sliþno mogu takoÿe da sadrže veziva, ekscipijente, sredstva za dezintegraciju, lubrikante i zaslaÿivaþe ili sredstva za poboljšanje ukusa, na primer ona koja su navedena na stranama 143-144 u WO 08/020079. Kada je jediniþni oblik doze kapsula, on

2

može da sadrži, pored materijala gore navedenog tipa, teþni nosaþ, kao što je biljno ulje ili polietilen glikol. Razliþiti drugi materijali mogu biti prisutni kao premazi ili na drugi naþin modifikovati fiziþki oblik þvrstog oblika jediniþne doze.

Na primer, tabelate, pilule ili kapsule mogu biti obložene želatinom, voskom, šelakom ili šeüerom i sliþno. Sirup ili eliksir mogu sadržati molekule iz pronalaska, saharozu ili fruktozu kao zaslaÿivaþ, metil i propilparabene kao konzervanse, boje i arome kao što su ukus trešnje ili narandže. Naravno, bilo koji materijal koji se koristi u pripremi bilo kog oblika jediniþne doze treba da bude farmaceutski prihvatljiv i suštinski netoksiþan u upotrebljenim koliþinama. Pored toga, molekuli iz pronalaska mogu biti inkorporirani u preparate i ureÿaje sa odloženim oslobaÿanjem.

Preparati i formulacije za oralnu primenu mogu takoÿe biti obezbeÿeni sa enteriþkom oblogom koja üe omoguüiti konstruktima iz ovog pronalaska da se opiru uslovima u želucu i prolasku u creva. Opšte uzevši, preparati i formulacije za oralnu primenu mogu biti pogodno formulisani za isporuku u bilo koji željeni deo gastrointestinalnog trakta. Pored toga, pogodni supozitoriji se mogu koristiti za isporuku u gastrointestinalni trakt.

Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekuli iz pronalaska mogu se takoÿe primenjivati intravenski ili intraperitonealno pomoüu infuzije ili injekcija, kao što je dalje opisano na stranicama 144 i 145 u WO 2008/020079.

Za topikalnu primenu Ang2 vezujuüih monospecifiþnih vezujuüih molekula iz ovog pronalaska, generalno üe biti poželjno da se daju na kožu kao kompozicije ili formulacije, u kombinaciji sa dermatološki prihvatljivim nosaþem, koji može biti þvrst ili teþan, kao što je dalje opisano na strani 145 u WO 2008/020079.

Uopšteno, koncentracija Ang2 vezujuüih monospecifiþno vezujuüih molekula iz ovog pronalaska u teþnoj kompoziciji, kao što je losion, biüe od oko 0.1-25 tež%, poželjno od oko 0.5-10 tež%. Koncentracija u polu-þvrstom ili þvrstom sastavu, kao što je gel ili prah, biüe od oko 0.1-5 tež%, poželjno od oko 0.5-2.5 tež%.

Koliþina Ang2 vezujuüih monospecifiþno vezujuüih molekula iz pronalaska neophodna za upotrebu u tretmanu üe varirati ne samo u odnosu na odabrani monospecifiþni vezujuüi molekul, veü I u odnosu na naþin primene, prirodu stanja koje se leþi i starost i stanja pacijenta i na kraju üe biti diskreciono pravo lekara ili kliniþara. Takoÿe, doza monospecifiþnih vezujuüih molekula iz ovog pronalaska varira u zavisnosti od targetirane

2

üelije, tumora, tkiva, grafta ili organa. Željena doza može biti pogodno predstavljena u pojedinaþnoj dozi ili kao podeljene doze primenjene u odgovarajuüim intervalima, na primer, kao dve, tri, þetiri ili više sub-doza dnevno. Sama pod-doza se dalje može podeliti, na pr., na više diskretno labavo razdvojenih primena; kao što su višestruke inhalacije iz insuflatora ili primenom više kapljica u oko.

Režim primene može ukljuþivati dugoroþno, dnevno leþenje. Pod "dugoroþnim" se podrazumeva najmanje dve nedelje i po moguünosti nekoliko nedelja, meseci ili godina trajanja. Neophodne modifikacije u ovom opsegu doza mogu biti odreÿene od strane struþnjaka u ovoj oblasti koristeüi samo rutinsko eksperimentisanje, uzimajuüi u obzir ovde navedena uþenja. Videti Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Doza se može prilagoditi i od strane pojedinih lekara u sluþaju bilo kakve komplikacije.

U skladu sa daljim rešenjima, pronalazak se odnosi na upotrebu Ang2 vezujuüih monospecifiþno vezujuüih molekula iz ovog pronalaska, tj. imunoglobulinske pojedinaþne varijabilne domene ili polypeptide koji ih sadrže, u terapeutske svrhe, kao što su

- za prevenciju, leþenje i/ili ublažavanje poremeüaja, bolesti ili stanja, naroþito kod þoveka, koja su povezana sa Ang2 posredovanim i/ili Ang2 srodnim efektima koji se odnose na angiogenezu ili koji se mogu spreþiti, leþiti ili ublažiti modulacijom Notch signalnog puta i/ili Tie2 signalnog puta sa monospecifiþnim vezujuüim molekulom u skladu sa pronalaskom;

- u postupku leþenja pacijenta kome je potrebna takva terapija, takav postupak se sastoji od davanja, subjektu kome je to potrebno, farmaceutski aktivne koliþine najmanje jednog monospecifiþnog vezujuüeg molekula iz pronalaska, na pr. imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena, ili farmaceutskog preparata koji ga sadrži;

- za pripremanje medikamenta za prevenciju, leþenje ili ublažavanje poremeüaja, bolesti ili stanja koja su povezana sa Ang2 posredovanim i/ili Ang2 srodnim efektima koji se odnose na angiogenezu;

- kao aktivni sastojak u farmaceutskoj kompoziciji ili medikamentu koji se koristi za gore navedene svrhe.

U skladu sa specifiþnim aspektom, navedeni poremeüaj, bolest ili stanje je kancer ili kancerozna bolest, kao što je ovde definisano.

2

U poželjnim izvoÿenjima, pronalazak se odnosi na pomenuti farmaceutski preparat za leþenje kancera i kancerogenih oboljenja, kao što su karcinom dojke, bubrežnih üelija, rak jajnika i rak pankreasa.

U skladu sa drugim aspektom, bolest je bolest oka povezana sa Ang2 posredovanim i/ili Ang2 srodnim efektima koji se odnose na angiogenezu ili koji se mogu leþiti ili ublažiti moduliranjem Notch signalizacionog puta i/ili Tie2 signalizacionog puta sa Ang2 vezujuüim monospecifiþno vezujuüim molekulom iz pronalaska.

U drugom poželjnom izvoÿenju, pronalazak se odnosi na pomenutu farmaceutsku kompoziciju za leþenje oþnih bolesti, kao što je makularna degeneracija povezana sa starenjem i dijabetiþka retinopatija.

U još jednom poželjnom izvoÿenju, pronalazak se odnosi na pomenuti farmaceutski preparat za leþenje hroniþnih bubrežnih oboljenja.

U zavisnosti od kancera/kancerogenih bolesti, oþnih bolesti i/ili hroniþnih bolesti bubrega koje treba leþiti, Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekul iz pronalaska može se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava.

U poželjnim izvoÿenjima, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži, kao aktivni sastojak, jedan ili više navedenih Ang-2 vezujuüih molekula iz pronalaska, koji dalje sadrže jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kao što su hemoterapijska sredstva kao što su sredstva za ošteüenje DNK i/ili anti-mitotiþki lekovi u üelijama kancera (na pr. taksol) ili terapeutski aktivna jedinjenja koja inhibiraju angiogenezu (anti-angiogeni lek kao što je anti VEGF/VEGF receptor inhibitor (na pr. avastin, nitedanib i sunitinib, ili inhibitori signalnih puteva, kao što su mTOR inhibitori (na pr. temsirolimus) ili agense hormonske terapije (na pr. tamoksifen).

Pored toga, terapeutsko sredstvo može se dati istovremeno, opciono kao komponenta istog farmaceutskog preparata, ili pre ili posle primene monospecifiþnog vezujuüeg molekula.

U nekim realizacijama, dodatni terapeutski agens može biti, bez ograniþenja (i u sluþaju receptora, ukljuþujuüi odgovarajuüe ligande), jedan ili više inhibitora izabranih iz grupe inhibitora u kojoj su EGFR, VEGF, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK i PI3 kinaza, FGFR, PDGFR, Raf, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R ili IR.

Dalji primeri dodatnih terapijskih agenasa su inhibitori CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Mic, Flt3, HSP90, hedgehog antagonisti, inhibitori JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, proteazom, Rho, neki inhibitor wnt signalizacije ili inhibitor puta ubikvitinacije ili drugi inhibitor Notch signalnog puta.

Primeri Aurora inhibitora su, bez ograniþenja, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CIC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.

Jedan primer za inhibitor PLK je GSK-461364.

Primeri za VEGF inhibitor su avastin (Roche), aflibercept (Regeneron).

Primeri za raf inhibitore su BAY-73-4506 (takoÿe VEGFR inhibitor), PLX 4032, RAF-265 (takoÿe dodatno i VEGFR inhibitor), sorafenib (takoÿe dodatno i VEGFR inhibitor), i XL 281.

Primeri za KSP inhibitore su ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731 i SB-743921.

Primeri za src i/ili bcr-abl inhibitore su dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (takoÿe je i IGF-1R inhibitor), nilotinib (takoÿe je i PDGFR i cKit inhibitor), imatinib (takoÿe je i cKit inhibitor), i NS-187.

Jedan primer za PDK1 inhibitor je BX-517.

Jedan primer za Rho inhibitor je BA-210.

Primeri inhibitora PI3 kinaze su PX-866, BEZ-235 (takoÿe je i mTor inhibitor), XL 418 (takoÿe je i Akt inhibitor), XL-147 i XL 765 (takoÿe je i mTor inhibitor).

Primeri za cMet ili HGF inhibitore su XL-184 (takoÿe je i VEGFR, cKit, Flt3 inhibitor), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (takoÿe je i VEGFR inhibitor), MGCD-265 (takoÿe je i VEGFR, Ron, Tie2 inhibitor), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 i AV-299.

Jedan primer za c-Myc inhibitor je CKS-3543.

Primeri za Flt3 inhibitore su AC-220 (takoÿe je i cKit i PDGFR inhibitor), KW 2449, lestaurtinib (takoÿe je i VEGFR, PDGFR, PKC inhibitor), TG-101348 (takoÿe je i JAK2 inhibitor), XL-999 (takoÿe je i cKit, FGFR, PDGFR i VEGFR inhibitor), sunitinib (takoÿe je i PDGFR, VEGFR i cKit inhibitor) i tandutinib (takoÿe je i PDGFR i cKit inhibitor).

Primeri za HSP90 inhibitore su tanespimicin, alvespimicin, IPI-504 i CNF 2024.

1

Primeri za JAK/STAT inhibitore su CYT-997 (takoÿe u interakciji sa tubulinom), TG 101348 (takoÿe je i Flt3 inhibitor) i XL-019.

Primeri za Mek inhibitore su ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 i XL 518.

Primeri za mTor inhibitore su temsirolimus, AP-23573 (koji takoÿe deluje i kao VEGF inhibitor), everolimus (takoÿe je i VEGF inhibitor), XL-765 (takoÿe je i PI3 kinaze inhibitor), i BEZ-235 (takoÿe je i PI3 kinaze inhibitor).

Primeri za Akt inhibitore su perifosin, GSK-690693, RX-0201 i triciribin.

Primeri za cKit inhibitore su AB-1010, OSI-930 (takoÿe deluje i kao VEGFR inhibitor), AC-220 (takoÿe je i Flt3 i PDGFR inhibitor), tandutinib (takoÿe je i Flt3 i PDGFR inhibitor), aksitinib (takoÿe je i VEGFR i PDGFR inhibitor), XL-999 (takoÿe je i Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR inhibitor), sunitinib (takoÿe je i Flt3, PDGFR, VEGFR inhibitor), i XL-820 (takoÿe deluje i kao VEGFR i PDGFR inhibitor), imatinib (takoÿe je i bcr-abl inhibitor), nilotinib (takoÿe je i bcr-abl i PDGFR inhibitor).

Primeri za hedgehog antagoniste su IPI-609 i CUR-61414.

Primeri za CDK inhibitore su seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (takoÿe deluje i kao VEGFR2 i PDGFR inhibitor), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 i AG 024322.

Primeri za proteazomske inhibitore su bortezomib, carfilzomib i NPI-0052 (takoÿe je i NFkappaB inhibitor).

Jedan primer za neki inhibitor NFkappaB puta je NPI-0052.

Jedan primer za neki inhibitor puta ubikvitinacije je HBX-41108.

U poželjnim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo je anti-angiogeno sredstvo.

Primeri za anti-angiogene agense su inhibitori za FGFR, PDGFR i VEGFR ili odgovarajuüi liganadi (na pr. VEGF inhibitor kao što je pegaptanib ili anti-VEGF antitelo bevacizumab), i talidomidi, takvi agensi su izabrani izmeÿu, bez ograniþenja, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (takoÿe je i inhibitor of CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (imunomodulatorni lekovi), thalidomid derivati CC-4047, lenalidomid, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (takoÿe je i inhibitor za cKit i Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (takoÿe je i inhibitor za Flt3), sunitinib (takoÿe je i inhibitor za cKit i Flt3), aksitinib (takoÿe

2

je i inhibitor za cKit), vemurafenib (takoÿe poznat kao PLX4032, RG7204 ili R05185426, komercijalno nazvan zelboraf), inhibitor B-Raf enzima, crizotinib poznat kao ALK (kinaza anaplastiþnog limfoma) i ROS1 (c-ros onkogenel, receptor tirozin kinaze) inhibitor, lestaurtinib (takoÿe je i inhibitor za Flt3 i PKC), vatalanib, tandutinib (takoÿe je i inhibitor za Flt3 i cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, sorafenib tozilat (takoÿe je i inhibitor za Raf), RAF-265 (takoÿe je i inhibitor za Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (takoÿe je i inhibitor za EGFR i Her2), BAY-57-9352 (takoÿe je i inhibitor za Raf), BAY-73-4506 (takoÿe je i inhibitor za Raf), XL 880 (takoÿe je i inhibitor za cMet), XL-647 (takoÿe je i inhibitor za EGFR i EphB4), XL 820 (takoÿe je i inhibitor za cKit), i nilotinib (takoÿe je i inhibitor za cKit i brcabl) i nitedanib.

Dodatno terapeutsko sredstvo može takoÿe biti izabrano od EGFR inhibitora; može biti EGFR inhibitor sa malim molekulom ili anti-EGFR antitelo. Primeri za anti-EGFR antitela, bez ograniþenja, su cetuksimab, panitumumab, matuzumab; jedan primer za EGFR inhibitor malog molekula je gefitinib. Drugi primer za EGFR modulator je EGF fuzioni toksin.

Meÿu EGFR i Her2 inhibitorima korisnim za kombinaciju sa molekulom iz pronalaska su lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuksimab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (takoÿe je i inhibitor za VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (takoÿe je inhibitor za VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab.

Druga sredstva koja mogu biti pogodno kombinovana u terapiji sa Ang2 vezujuüim monospecifiþnim vezujuüim molekulom iz pronalaska su tositumumab i ibritumomab tiuksetan (dva radio-obeležena anti-CD20 antitela), alemtuzumab (anti-CD52 antitelo), denosumab, (jedan od ligand inhibitora faktora diferencijacije osteoklasta), galiksimab (CD80 antagonist), ofatumumab (CD20 inhibitor), zanolimumab (CD4 antagonist), SGN40 (modulator receptora CD40 liganda), rituksimab (inhibitor CD20) ili mapatumumab (agonist TRAIL-1 receptora) ili OMP-21M18 (DII4 inhibitori).

Drugi hemoterapijski lekovi koji se mogu koristiti u kombinaciji sa molekulima u skladu sa predmetnim pronalaskom su izabrani od, ali nisu ograniþeni na hormone, hormonalne analoge i antihormone (na pr. tamoksifen, toremifen, raloksifen, fulvestrant, megestrol acetat, flutamid, nilutamid, bikalutamid, ciproteron acetat, finasterid, buserelin acetat, fludrokortizon, fluoksimesteron, medroksiprogesteron, oktreotid, arzoksifen, pasireotid, vapreotid), inhibitore aromataze (na pr. anastrozol, letrozol, liarozol, eksemestan, atamestan, formestan), LHRH agoniste i antagoniste (na pr. goserelin acetat, leuprolid, abareliks, cetroreliks, deslorelin, histrelin, triptorelin), antimetabolite (na pr. antifolati kao metotreksat, pemetreksed, analozi pirimidina kao što su 5 fluorouracil, kapecitabin, decitabin, nelarabin, i gemcitabin, analozi purina i adenozina kao što su merkaptopurin tioguanin, kladribin i pentostatin, citarabin, fludarabin); antitumorske antibiotike (na pr. antraciklini kao što su doksorubicin, daunorubicin, epirubicin i idarubicin, mitomicin-C, bleomicin daktinomicin, plikamicin, mitoksantron, piksantron, streptozocin); derivate platine (na pr. cisplatin, oksaliplatin, karboplatin, lobaplatin, satraplatin); alkilirajuüih sredstava (na pr. estramustin, mekloretamin, melfalan, klorambucil, busulfan, dakarbazin, ciklofosfamid, ifosfamid, hidroksiurea, temozolomid, nitrozouree kao što su karmustin i lomustin, tiotepa); antimitotiþkih sredstava (na pr. vinka alkaloidi kao vinblastin, vindesin, vinorelbin, vinflunin i vinkristin; i taksani kao što su paklitaksel, docetaksel i njihove formulacije, larotaksel; simotaksel i epotiloni kao iksabepilon, patupilon, ZK-EPO); inhibitora topoizomeraze (na pr. epipodofilotoksini kao etopozid i etopofos, tenipozid, amsakrin, topotekan, irinotekan) i raznih hemoterapeutika kao što su amifostin, anagrelid, interferon alfa, prokarbazin, mitotan i porfimer, beksaroten, celekoksib.

Posebno poželjni partneri za kombinaciju molekula iz ovog pronalaska su VEGF antagonisti, kao što su bevacizumab (Avastin®), nitedanib, Sorafenib i Sunitinib.

U skladu sa još jednom realizacijom pronalaska, obezbeÿen je postupak dijagnostikovanja bolesti pomoüu

a) dovoÿenja u kontakt uzorka sa Ang2 vezujuüim molekulom u skladu sa pronalaskom, kao što je definisano gore, i

b) detektovanja vezivanja pomenutog vezujuüeg molekula za navedeni uzorak, i

c) poreÿenja vezivanja detektovanog u koraku (b) sa standardom, pri þemu je razlika u vezivanju u odnosu na navedeni uzorak dijagnostika bolesti ili poremeüaja povezanih sa VEGF- i/ili Ang2 posredovanim efektima na angiogenezu.

Za ovu i druge upotrebe, može biti korisno dodatno modifikovati Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekul iz pronalaska, kao što je uvoÿenje funkcionalne grupe koja je jedan deo specifiþnog vezujuüeg para, kao što je biotin-(strept)avidin vezujuüi par. Takva funkcionalna grupa se može koristiti za povezivanje vezujuüeg molekula iz pronalaska sa

4

drugim proteinom, polipeptidom ili hemijskim jedinjenjem koje je vezano za drugu polovinu vezujuüeg para, tj. kroz formiranje veznog para. Na primer, takav monospecifiþni vezujuüi molekul iz pronalaska može biti konjugovan sa biotinom i vezan za drugi protein, polipeptid, jedinjenje ili nosaþ konjugovan sa avidinom ili streptavidinom. Na primer, takav konjugovani monospecifiþni vezujuüi molekul iz pronalaska može da se koristi kao reporter, na primer u dijagnostiþkom sistemu gde je detektabilno sredstvo za proizvodnju signala konjugovano sa avidinom ili streptavidinom.

Efikasnost Ang2 vezujuüeg monospecifiþnog vezujuüeg molekula iz ovog pronalaska ili polipeptida, i kompozicija koje ga sadrže, može se testirati korišüenjem bilo kog pogodnog in vitro testa, testa zasnovanog na üelijama, in vivo testa i/ili životinjskog modela poznatog per se, ili bilo koje njihove kombinacije, u zavisnosti od specifiþne bolesti ili poremeüaja od interesa. Pogodni testovi i životinjski modeli üe biti jasni osobi iz struke, i na primer ukljuþuju testove koji su ovde opisani i koji se koriste u dole navedenim primerima, na pr. U testu proliferacije.

Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekuli iz ovog pronalaska su prošli kroz opsežan proces optimizacije sekvenci koji ukljuþuje afinitetno sazrevanje, humanizaciju i uklanjanje potencijalnih posttranslacionih modifikacionih mesta da bi se obezbedio nizak imunogenski potencijal kod þoveka i poboljšana biofiziþka stabilnost. Neoþekivano, podaci pokazuju da takvi monospecifiþni vezujuüi molekuli iz ovog pronalaska imaju osobine koje su superiornije od onih vezujuüih molekula iz prethodnog stanja tehnike. Meÿu takvim svojstvima su visoka selektivnost za Ang2 neutralizaciju u poreÿenju sa Ang1 neutralizacijom, kao što se može na pr. videti iz podataka na slikama 9 do 10, 13 do 14, 16 do 19; potpuna inhibicija Ang2-Tie2 interakcije sa visokom potentnošüu, kao što se može na pr. iz podataka ELISA na slikama 6, 9, 13, 16, 18 i 20 i tabelama 12 do 13, 16 do 17, 20 do 22, kao i vrednosti IC50 (nM) za VHH u testu AlphaScreen kako je prikazano na primer u Tabeli 7 (Primer 7); i afinitet KD (nM) preþišüenih VHH na rekombinantnom humanom Ang2, cino Ang2, mišjem Ang2 u Tabelama 8, 14, 18 i 23.

Ovo ukazuje na to da Ang2 vezujuüi monospecifiþni vezujuüi molekuli iz ovog pronalaska su obeüavajuüi kandidati da imaju terapeutsku efikasnost u bolestima i poremeüajima koji su povezani sa Ang2 posredovanim efektima na angiogenezu, kao što su kancer, kancerozna oboljenja, oþne bolesti i/ili hroniþne bubrežne bolesti.

Kratak opis slika:

Oznake osa u Slikama 1 do 4, 6 do 7, 9 do 10, 12 do 14 i 16 do 20: X ose oznaþavaju OD 450 (nm) i Y ose oznaþavaju log kompetitora (M).

Slika 1 (Slika 1-1A do 1-2C): Preþišüeni VHH koji blokiraju hAng2-hTie2 interakciju (ELISA)

Slika 2 (Slika 2-1A do 2-2C): Preþišüeni VHH koji blokiraju mAng2-mTie2 interakciju (ELISA)

Slika 3 (Slika 3A do 3B): Preþišüeni VHH koji blokiraju cAng2-cTie2 interakciju (ELISA)

Slika 4 (Slika 4A do 41): Preþišüeni VHH koji blokiraju hAng1-hTie2 interakciju (ELISA)

Slika 5: Poravnavanje sekvenci afinitetno sazrelih varijanti VHH 28D10. Aminokiselinska sekvenca je poravnata sa humanom VH3/JH konsenzus sekvencom embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani masnim slovima u skladu sa definicijom AbM. Ostaci koji su supstituisani su podvuþeni.

Slika 6 (Slika 6A do 6C): Preþišüene afinitetno sazrele varijante VHH 28D10 koje blokiraju hAng2-hTie2 interakciju (ELISA).

Slika 7 (Slika 7A do 7C): Preþišüene afinitetno sazrele varijante VHH 28D10 koje blokiraju hAng1-hTie2 interakciju (ELISA)

Slika 8 (Slika 8A do 8B): Poravnavanje sekvenci VHH 1D01 sa hVH3-JH konsenzusom (A) i sekvencom optimizovanih varijanti VHH 1D01 (B). Aminokiselinska sekvenca je poravnata sa humanom VH3/JH konsenzus sekvencom embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani masnim slovima u skladu sa definicijom AbM..

Podvuþeni su ostaci koji üe biti mutirani u svoj ljudski par. Potencijalne lokacije posttranslacione modifikacije koje treba tretirati su u boksovima.

Slika 9 (Slika 9-1A do 9-3B): Preþišüene sekvence optimizovanih varijanti VHH 1D01 koje blokiraju hAng2-hTie2 (10-1), mAng2-mTie2 (10-2) i cAng2-cTie2 (11-3) interakciju (ELISA).

Slika 10: Preþišüene sekvence optimizovanih varijanti VHH 1D01 koje blokiraju hAng1-hTie2 interakciju (ELISA).

Slika 11 (Slika 11A do 11C): Poravnavanje sekvence VHH 37F02 sa hVH3-JH konsenzusom (A), sekvencama iz ciklusa 1 (B) i iz ciklusa 2 (C) optimizovanih varijanti VHH 37F02. Aminokiselinska sekvenca je poravnata sa humanom VH3/JH konsenzus sekvencom embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani masnim slovima u skladu sa definicijom AbM. Podvuþeni su ostaci koji üe biti mutirani u svoj ljudski par. Potencijalne lokacije post-translacione modifikacije koje treba tretirati su u boksovima.

Slika 12 (Slika 12-1 do 12-3): Preþišüena sekvence iz ciklusa 1 optimizovanih varijanti VHH 37F02 koje blokiraju hAng2-hTie2 (14-1), mAng2-mTie2 (14-2) i cAng2-cTie2 (14-3) interakciju (ELISA).

Slika 13 (Slika 13-1A do 13-3): Preþišüena sekvenca iz ciklusa 2 optimizovanih varijanti VHH 37F02 koje blokiraju hAng2-hTie2 (15-1), mAng2-mTie2 (15-2) i cAng2-cTie2 (15-3) interakciju (ELISA).

Slika 14: Preþišüena sekvenca iz ciklusa 2 optimizovanih varijanti VHH 37F02 koje blokiraju hAng1-hTie2 interakciju (ELISA).

Slika 15 (Slika 15A do 15D): Poravnavanje sekvence VHH 28D10 sa hVH3-JH konsenzusom (A), sekvencama iz ciklusa 1 optimizovanih varijanti (B) i iz ciklusa 2 varijanti (C) i ciklusom 3 (D) optimizovanih varijanti VHH 28D10. Aminokiselinska sekvenca je poravnata sa humanom VH3/JH konsenzus sekvencom embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani masnim slovima u skladu sa definicijom AbM. Podvuþeni su ostaci koji üe biti mutirani u svoj ljudski par. Potencijalne lokacije post-translacione modifikacije koje treba tretirati su u boksovima.

Slika 16 (Slika 16-1A do 16-3C): Preþišüena sekvenca iz ciklusa 1 optimizovanih varijanti VHH 28D10 koje blokiraju hAng2-hTie2 (18-1), mAng2-mTie2 (18-2) i cAng2-cTie2 (18-3) interakciju (ELISA).

Slika 17 (Slika 17A do 17B): Preþišüena sekvenca iz ciklusa 1 optimizovanih varijanti VHH 28D10 koje blokiraju hAng1-hTie2 interakciju (ELISA).

Slika 18 (Slika 18 -1A do 18 -3): Preþišüena sekvenca optimizovanih C50X-S53X varijanti VHH 28D10 koje blokiraju hAng2-hTie2 (20-1), mAng2-mTie2 (20-2) i cAng2-cTie2 (20-3) interakciju (ELISA).

Slika 19: Preþišüena sekvenca optimizovanih C50X-S53X varijanti VHH 28D10 koje blokiraju hAng1-hTie2 interakciju (ELISA).

Slika 20 (Slika 20-1A do 20-3C): Preþišüena sekvenca iz ciklusa 2 optimizovanih varijanti VHH 28D10 koje blokiraju hAng2-hTie2 (22-1), mAng2-mTie2 (22-2) i cAng2-cTie2 (22-3) interakciju (ELISA).

Primeri

Materijali i postupci

a) Generisanje HEK293H stabilnih üelijskih linija prekomerne ekspresije humanog ili mišjeg Tie2 receptora

cDNK koja kodira humani Tie2 (NM_000459.3; SEK ID BR: 182), mišji Tie2 (NM_013690.2; SEK ID BR: 183) i cino Tie2 (SEK ID BR: 184) su klonirani u pcDNK3.1-neo ekspresioni vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Da bi se uspostavile humane embrionske üelije bubrega (HEK), koje prekomerno eksprimiraju humani Tie2 ili mišji Tie2, roditeljske HEK293H üelije prolaze lipidno posredovanu transfekciju sa Fugene (Roche) sa pcDNK3.1-neo-hTie2, ili pcDNK3.1-neo-mTie2, respektivno. Za sve uslove, transfektanti su izabrani 2 dana posle transfekcije dodavanjem 1 mg/ml geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Za humani, mišji i cino Tie2, konaþni visoko ekspresioni klonovi su izabrani pomoüu klonova za sortiranje pojedinaþnih üelija koji se vezuju za PE obeležen anti-humani Tie2 (R&D Sistems, Minneapolis, MN, US), PE obeležen anti-mišji Tie2 (eBioscience, San Diego, CA, USA) i 2-stepeni kozji anti-humani Tie2 (R&D Sistems, Minneapolis, MN, US) praüeno sa PE obeleženim magareüim anti-kozijim (Jackson ImmunoResearch, Vest Grove, PA, USA), respektivno, koristeüi FACSAria Cell Sorter (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

b) Generisanje HEK293T üelijskih linija prekomerne ekspresije mišjeg ili cinomolgnih Ang2 i proizvodnja kondicionog medijuma za rekombinantne mišje i cinomologne Ang2

cDNK koja kodira za N-terminalni FLAG-oznaþeni mišji Ang2 (NM_007426.3; SEK ID BR: 185) i cinomolgni Ang2 (AB172643.1; SEK ID BR: 186) su klonirane u pSecTag2B ekspresioni vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). Humane embrionske üelije bubrega (HEK) tranzitno prekomerno eksprimirajuüih mišjih Ang2 ili cinomolgnih Ang2 su generisane lipidima posredovanom transfekcijom (Fugene; Roche) iz pSecTag2B-mAng2 ili pSecTag2B-cAng2, u HEK293T roditeljskoj üelijskoj liniji. Produkcije su izvedene u 1,5 litarskoj CF10 vreüici i 1,5L kondicioniranog medijuma (CM) je sakupljeno 5 dana nakon transfekcije.

c) Proizvodnja rekombinantne cinomologne Tie2/Fc himere u HEK293-F üelijama

cDNK koja kodira za ekstracelularni domen Tie-2 je subklonirana u ekspresioni plazmid pSecTag2b koristeüi odgovarajuüa restrikciona mesta da bi se dobio Fc-fuzioni protein. Transfekcija u HEK293-F üelije (Invitrogen) se izvodi kao što je opisano od strane proizvoÿDþa korišüenjem Megaprep (Qiagen) preparata plazmida, Optimem-medijuma (Invitrogen), 293-fektina (Invitrogen) pri poþetnoj gustini üelija od 1 x 10<6>vijabilnih üelija/mL sa 1µg plazmidne DNK/10<6>üelija. Transfektovane üelije se kultivišu u erlenmajerima pri šejkiranju 7 dana na 37°C. Kondicionirani medijum (CM) je sakupljen centrifugiranjem na 4000 g tokom 10 min i filtriran kroz sterilni filter (0,45µm membrana).

Fc-fuzioni proteini su preþišüeni upotrebom afinitetne hromatografije sa punjenjem CM pri 5 ml/min na 5 ml MabSelect SuRe protein A koloni, ekvilibrirane sa DPBS. Nakon koraka ispiranja sa DPBS, vezani Fc-protein je eluiran sa 10 mM natrijum citratnim puferom pH 3.0 i zatim neutralizovan do pH 7.0 dodavanjem 1M Tris/HCI pH 8.0. Preþišüeni protein je koncentrovan i pufer je razmenjen sa DPBS sa Millipore Amicon Ultra (sa presekom molekulske težine od 10 kDa) centrifugalnim koncentratorom. Prisustvo proteina potvrÿeno je standardnim analitiþkim metodama (elektroforeza sa Experion Pro 260 kit- BioRad; masena spektrometrija). Protein je dalje analiziran ekskluzionom hromatografijom veliþine i odreÿen je sadržaj endotoksina (Endosafe PTS kit - Charles River).

d) Proizvodnja rekombinantnog humanog, cinomolgnog, mišjeg i pacovskog Ang2-FLD u HEK293-F üelijama

Molekularno kloniranje i üelijska kultivacija se izvode kao što je opisano za Tie2-Fc-fuzioni protein. Za preþišüavanje His-oznaþenih proteina, CM se puni sa 5 ml/min na 2 ml Ni<2+>helacionoj sefaroznoj brzo protoþnoj koloni (His-Trap - GE Healthcare Life Sciences) koja je ekvilibrirana sa DPBS. Nakon punjenja u prisustvu 4% pufera za eluiranje (DPBS 0,5% imidazol) da bi se spreþilo nespecifiþno vezivanje, kolona je isprana sa DPBS. Ang2-FLD-proteini su eluirani iz kolone sa DPBS koji sadrži 0,5% imidazola. Zatim je izvršen korak ultrafiltracije za koncentraciju i razmenu pufera (sa presekom molekulske težine od 10 kDa). Odreÿeni alikvot proteina je zadržan za analitiþku karakterizaciju kao što je opisano za Tie2-Fc.

Primer 1

Imunizacija rekombinantnim humanim Ang2 indukuje humoralni imuni odgovor kod lama

1.1. Imunizacija

Nakon odobrenja Etiþkog komiteta fakulteta veterinarske medicine (Univerzitet u Gentu, Belgija), 4 lame (oznaþene br.406, 408, 454, 455) su imunizovane sa 4 intramuskularne injekcije (dan 0: 50 µg, dan 14: 20 µg, dan 28: 17,5 µg i dan 42: 17,5 µg doziranja) rekombinantnog humanog Ang2 (R&D Sistems, Minneapolis, MN, US). Antigen je formulisan u kompletnom Freund-ovom adjuvantu za primarnu injekciju na dan 0 (Difco, Detroit, ML, USA) i u nekompletnom Freund-ovom adjuvantu za injekcije pojaþivaþe (Difco, Detroit, ML, USA).

1.2. Procena indukovanih imunih odgovora kod lama

Da bi se procenila indukcija imunog odgovora kod životinja u odnosu na humani Ang2 pomoüu ELISA, serumi su sakupljeni na dan 0 (pre-imuni), dan 35 i dan 46 (vreme sakupljanja limfocita periferne krvi [PBL]). Ukratko, 1 µg/ml rekombinantnog humanog Ang2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) je imobilisano preko noüi na 4°C u MaxiSorp ploþi sa 96 ležišta (Nunc, Wiesbaden, Germany). Ležišta su blokirana rastvorom kazeina (PBS 1% kazein). Nakon dodavanja serijskih razblaženja seruma, specifiþno vezani imunoglobulini su detektovani upotrebom peroksidazom rena (HRP)-konjugovanih kozijih anti-lama imunoglobulina (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA) i naknadnom enzimskom reakcijom u prisustvu supstrata TMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidin) (Pierce, Rockford, IL, USA), pokazujuüi da je indukovan znaþajan od antitela zavistan imunski odgovor na humani Ang2. Reakcija antitela je organizovana i konvencionalnim i B-üelijskim repertoarima koji eksprimiraju samo antitela teškog lanca, pošto se vezani imunoglobulini mogu detektovati sa antitelima koji specifiþno prepoznaju konvencionalna lgGl antitela iz lama ili samo lgG2 ili lgG3 antitela teškog lanca iz lama. U svim lamama u koje je ubrizgan humani Ang2, odgovor antitela je organizovan pomoüu konvencionalnog i B-üelijama koje eksprimiraju samo antitela teškog lanca specifiþno u odnosu na humani Ang2. Odgovori Ang2 serumskog titra za svaku lamu su prikazan u Tabeli 1.

4

Tabela 1: Antitelom posredovan specifiþni serumski odgovor protiv rekombinantnog humanog Ang2

Legenda: (*) ;;Nizak (ili /-): 1.000 HSDS/N 2< 1.500 ;;Umeren (ili ): 1.500 HSDS/N 2< 13.500 ;;Dobar (ili +): 13.500 HSDS/N 2< 365.000 ;;Odliþan (ili ++): HSDS/N 2 365.000 ;;(*) HSD, najveüe razblaženje seruma; S/N 2, odnos signal-šum 2

Primer 2

Kloniranje fragment repertoara samo za antitela teškog lanca i priprema faga

Nakon završne injekcije imunogena, imunska tkiva kao izvor B-üelija koje proizvode samo antitela teškog lanca, sakupljena su od imunizovanih lama. Tipiþno, dva uzorka krvi od po 150 mL, sakupljena 4. i 10. dana nakon poslednje injekcije antigena, i jedna biopsija limfnog þvora, sakupljena je 4. dana nakon poslednje injekcije antigena, su sakupljene po svakoj životinji. Iz uzoraka krvi, mononuklearne üelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene upotrebom Ficoll- Hypaque u skladu sa uputstvima proizvoÿDþa (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Iz PBMC i biopsije limfnih þvorova (nije prethodno povišen iz životinje br.406), ekstrahovana je ukupna RNK, koja se koristi kao poþetni materijal za RT-PCR za amplifikaciju VHH kodirajuüih segmenata DNK, kao što je opisano u Primeru 3 (strana 46) u WO 05/044858. Za svaku imunizovanu lamu, konstruisana je biblioteka udruživanjem ukupne RNK izolovane iz svih sakupljenih imunih tkiva te životinje. Ukratko, PCR-amplifikovani VHH repertoar je kloniran preko specifiþnih restrikcionih mesta u vektor koji je dizajniran da olakša fagni prikaz VHH biblioteke. Vektor je izveden iz pUC119 i sadrži LacZ promoter, kodirajuüu fag gil proteinsku sekvencu M13, gen rezistencije za ampicilin ili karbenicilin, mesto za višestruko kloniranje i hibridni glll-pelB lidersku sekvencu. U okviru sa VHH kodirajuüom sekvencom, vektor kodira za C-terminalni c-myc tag i His6 tag. Fagi su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima i þuvani nakon sterilizacije preko filtera na 4°C za dalju upotrebu.

Primer 3

Selekcija Ang2 specifiþnih VHH putem fag displeja

VHH repertoari dobijeni od svih lama i klonirani kao fagna biblioteka su korišüeni u razliþitim strategijama selekcije, primenom multiplih uslova selekcije. Varijable ukljuþuju i) Ang2 proteinski format: biotinilovani C-terminalni His-tagovani rekombinantni humani Ang2 pune dužine (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) i C-terminalni His-tagovani mišji Ang2 pune dužine (proizveden u GeneArt, sada Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ii) metod prezentovanja Ang2: ploþe direktno obložene mišjim Ang2 ili inkubacijom u rastvoru sa biotiniliranim humanim Ang2 praüeno sa kapturisanjem na ploþe obložene neutravidinom, i iii) koncentraciu antigena. Sve selekcije su izvršene u MaxiSorp ploþama sa 96 ležišta (Nunc, Wiesbaden, Germany).

Višestruke selekcije su izvedene na sledeüi naþin: Ang2 preparati za þvrste i rastvorne selekcione formate faza su prezentovani kao što je gore opisano pri višestrukim koncentracijama (biotinilovani humani Ang2: 50, 5, 0.5, 0.05 i 0.005 nM; mišji Ang2: 10, 1, 0.1 i 0.01 µg/mL). Posle 2 h inkubacije sa fagnim bibliotekama, praüeno opsežnim ispiranjem, vezani fagi su eluirani sa tripsinom (1 mg/ml) tokom 15-30 minuta na sobnoj temperaturi. Aktivnost tripsina se zatim odmah neutrališe primenom 0.8 mM inhibitora proteaze ABSF. Kao pozadinska kontrola, paralelno se vrše w/o antigen selekcije. Fagni izlazi koji pokazuju obogaüenje nad pozadinskom kontrolom su korišüeni za infekciju E. coli. Inficirane E. coli üelije su ili korišüene za pripremu faga za sledeüu selekcionu rundu (spašavanje faga) ili su nanesene na LB agarne ploþe (ampicilin glukoza 2%) za analizu pojedinaþnih VHH klonova. Da bi se sagledao selekcioni izlaz za specifiþna veziva ili blokatore, pojedinaþne kolonije su uzete sa agarnih ploþa i uzgajane u ploþama sa 96 dubokih bunara od 1 mL. LacZ-kontrolisana VHH ekspresija je indukovana dodavanjem IPTG (0.11mM finalno) u odsustvu glukoze. Periplasmiþni ekstrakti (u zapremini od ~80 µL) su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (kao što je opisano u na primer WO 2006/040153 koji je ovde citiran). Ukratko, kulture su centrifugirane 15 minuta na 4500 rpm. Pelet je zamrznut preko noüi ili tokom 1 sata na -20°C. Zatim se pelet odmrzava na sobnoj temperaturi 40 minuta, ponovo suspenduje u 15 ml peri pufera (50 mM NaHPO4, 300 mM NaCl) i šejkira 1 sat. Periplasmiþna frakcija je izolovana centrifugiranjem tokom 20 minuta na 14000 rpm.

Primer 4

Skrining periplazmiþkih ekstrakata u Ang2-Tie2 i Ang1-Tie2 ELISA i AlphaScreen testovima kompeticije

Periplazmiþni ekstrakti koji sadrže eksprimirane VHH su testirani u AlphaScreen kompetitivnom testu sa humanim Ang2 humanim Tie2, da bi se procenila njihova sposobnost blokiranja. Ukratko, humani Tie2/Fc himera (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) je biotinilovana korišüenjem N-hidroksisulfosukcinimidnog estra biotina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). FLAG tagovan humani Ang2 (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA) je kaptiran upotrebom akceptorskih zrnaca (Perkin Elmer, Waltham, MA, US) obloženih sa anti-FLAG M2 antitelom (Sigma, St Louis, MO, USA). Da bi se procenio kapacitet VHH da inhibiraju vezivanje humanog Ang2 za njegov receptor humani Tie2, 1:25 razblaženja periplazmiþkih ekstrakta koji sadrže eksprimirane VHH su inkubirana sa 0,1 nM FLAG otagovanim humanim Ang2. U ovu smešu, dodaju se akceptorske kuglice i 0.3 nM biotinilinovanih humani Tie2/Fc himera i dalje se inkubiraju tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Konaþno, dodaju se donorske kuglice konjugovane streptavidinom (Perkin Elmer, Waltham, MA, US) i smeša se inkubira dodatna 2 sata na sobnoj temperaturi. Pufer za ispitivanje je PBS 0.03% Tween-20 0.1% BSA. Fluorescencija se meri korišüenjem þitaþa ploþa Envision Multilabel (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) koristeüi talasnu dužinu ekscitacije od 680 nm i emisijsku talasnu dužinu od 520 nm. Smanjenje signala fluorescencije ukazuje da je vezivanje humanog Ang2 za humani Tie2 blokirano sa VHH eksprimiranim u periplazmiþkom ekstraktu. VHHs sposobni da blokiraju interakciju humanog Ang2 i humanog Tie2 za najmanje 50% su procenjeni u konfirmatornom ELISA baziranom kompetitivnom testu. Pored toga, unakrsna reaktivnost za vezivanje za mišji Ang2 i selektivnost u odnosu na humani Angl je takoÿe procenjena u kompetitivnoj ELISA analizi. Ukratko, humani ili mišji Tie2/Fc himera (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

4

imobilisana je pri 2 µg/mL preko noüi na 4°C u MaxiSorp ploþi sa 96 ležišta (Nunc, Wiesbaden, Germany). Ležišta su blokirana sa 1% rastvorom kazeina. 1:5 razblaženje periplazmiþkog ekstrakta koji sadrži eksprimirane VHH se inkubira sa sledeüim Ang vrstama prema tipu analize: 0.02 nM FLAG tagovani humani Ang2, 1:3.000 razblaženje HEK293 kondicioniranog medijuma koji sadrži FLAG tagovani mišji Ang2 ili 0.02 nM FLAG tagovani humani Ang1 (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA). Ova smeša se dodaje u Tie2/Fc obloženo ležište i inkubira 2 sata na sobnoj temperaturi.

Rezidualno vezivanje Ang je detektovano upotrebom HRP-konjugovanog anti-FLAG M2 antitela (Sigma, St Louis, MO, USA).

U drugom ciklusu skrininga, periplazmiþki ekstrakti koji sadrže eksprimirane VHH iz selekcionih izlaza koji su dali visoku raznolikost mišjih Ang2 unakrsno reaktivnih blokirajuüih VHH su testirani na 1:300 razblaženju. VHH koji inhibiraju vezivanje humanog Ang2 za humani Tie2, mišji Ang2 za mišji Tie2 i ne pokazuju inhibiciju vezivanja humanog Ang1 za humani Tie2 su odabrani. Analiza sekvence je otkrila 86 jedinstvenih VHH koji pripadaju grupi od 38 razliþitih B-üelijskih linija. Ukupan broj jedinstvenih sekvencionih varijanti koje su pronaÿene za svaku liniju B-üelija, reprezentativni VHH i korišüeni uslov selekcije, prikazani su u Tabeli 2. Pregled podataka o skriningu zasnovanom na AlphaScreen i ELISA testovima dat je u Tabeli 3. Aminokiselinske sekvence od svih jedinstvenih VHH-ova su prikazane u listi sekvenci (SEK ID BR: 1 do 86) I u Tabeli 4.

Tabela 2: Parametri selekcije koji se koriste za identifikaciju Ang2 specifiþnih VHH B-üelijskih linija.

4

4 Tabela 3: Skrining periplazmiþkih ekstrakata koji sadrže eksprimirani anti-Ang2 VHH<(a)>

4

<(a)>ako je identifikovano više jedinstvenih VHH varijanti unutar linije B-üelije, dat je opseg (min-maks) % inhibicije.

Tabela 4: Aminokiselinska sekvenca jedinstvenih anti-Ang2 VHH-ova identifikovanih tokom skrininga

4

4

1

2

4

1

Primer 5

Karakterizacija preþišüenih anti-Ang2 VHH

Podskup inhibitornih anti-Ang2 VHH-ova, odabranih iz skrininga opisanog u Primeru 4 su dalje preþišüeni i karakterisani. Izabrani VHH-ovi su eksprimirani u E. coli TG1 kao c-myc, His6-tagovani proteini. Ekspresija je indukovana dodavanjem 1 mM IPTG i ostavljeno je da se nastavi tokom 4 sata na 37°C. Posle spinovanja üelijskih kultura, periplazmiþki ekstrakti su pripremljeni zamrzavanjem-odmrzavanjem peleta. Ovi ekstrakti su korišüeni kao polazni materijal a VHH-ovi su preþišüeni pomoüu I MAC i ekskluzione hromatografije veliþine (SEC) što je dalo > 95% þistoüe, kako je procenjeno preko SDS-PAGE.

2

5.1. Procena hAng2 blokirajuüih VHH-ova u ELISA testu

Blokirajuüi kapacitet VHH-ova je procenjen u humani Ang2-humani Tie2 interakciji blokirajuüe ELISA analize. Ukratko, 2 µg/mL Tie2/Fc himera (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) je obloženo u MaxiSorp ploþi sa 96 ležišta (Nunc, Wiesbaden, Germany). Fiksna koncentracija od 0.02 nM FLAG-tagovanog humanog Ang2 (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA) je dodata u seriju razblaženja preþišüenog VHH (razblaženja u PBS 0.1% kazein 0.05% Tween-20) i inkubirana na obloženom humanom Tie2 receptoru u toku 2 sata. Rezidualno vezivanje humanog Ang2 se detektuje pomoüu peroksidaze hrena (HRP) konjugovanog anti-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO, USA) (Slika 1). Referentni molekul je Fab fragment iz Ab536 (US2009/0191212) (Slika 1-1) ili peptidni deo peptitela AMG386 (SEK ID BR: 25 u WO2004/092215) (Slika 1-2). Kao negativna kontrola koristi se neki irelevantni VHH. IC50vrednosti za VHH-ove koji blokiraju interakciju humani Ang2-humani Tie2 su prikazane u Tabeli 5-1 i Tabeli 5-2, respektivno.

Tabela 5-1: IC50(nM) vrednosti preþišüenih VHH-ova koje blokiraju hAng2/hTie2 interakciju (kompetitivna ELISA; VHH: n=2-3; Fab Ab536: n=6)

Tabela 5-2: IC50(nM) vrednosti preþišüenih VHH-ova koje blokiraju hAng2-hTie2 interakciju (kompetitivna ELISA; VHH: n=1-3; AMG386 peptid: n=3)

5.2. Procena unakrsne reaktivnosti prema mišjem i cinomolgnom Ang2 u blokirajuüem ELISA testu

Da bi se odredilo da li VHH inhibira vezivanje mišjeg Ang2 za mišji Tie2 i cino Ang2 za cino Tie2, izvodi se kompetitivni ELISA test. Ukratko, 2 µg/mL rekombinantnog mišjeg Tie2-Fc ili cino Tie2-Fc je oblagano preko noüi na 4°C u MaxiSorp ploþi sa 96 ležišta (Nunc,

4

Wiesbaden, Germany). Obložena ležišta su blokirana sa 1% rastvorom kazeina. FLAG-tagovani mišji Ang2 (1:3000 razblaženje kondicioniranog medijuma iz tranzitne HEK transfekcije) ili FLAG-tagovani cino Ang2 (1:800 razblaženje kondicioniranog medijuma iz tranzitne HEK transfekcije) i serija razblaženja preþišüenog VHH (razblaženja u PBS 0.1% kazein 0.05% Tween-20) su inkubirani na obloženom Tie2-Fc receptoru tokom 2 sata na sobnoj temperaturi da bi se postigla ravnotežna vezivanja. Rezidualno vezivanje FLAG-mAng2 ili FLAG-cAng2 je detektovano upotrebom HRP konjugovanog anti-FLAG M2 mAb (Sigma, St. Louis, MO, USA). Referentni molekul je Fab fragment iz Ab536 (mišji: Slika 2-1) ili peptidni deo peptitela AMG386 (mišji: Slika 2-2; cibr: Slika 3). Kao negativna kontrola koristi se neki irelevantni VHH. IC50vrednosti za VHH-ove koje blokiraju interakcije mišji Ang2-mišji Tie2 su prikazane u Tabela 6-1. IC50vrednosti za VHH koje blokiraju vezivanje mišjeg i cino Ang2 za mišji i cino Tie2, respektivno, prikazane su u Tabeli 6-2.

Tabela 6-1: IC50(nM) vrednosti preþišüenih VHH-ova koje blokiraju mAng2 za mTie2 interakciju (kompetitivna ELISA; VHH: n=2-3; Fab Ab536: n=5)

Tabela 6-2: IC50(nM) vrednosti preþišüenih VHH-ova koje blokiraju mAng2 i cAng2 za mTie2 i cTie2 interakciju, respektivno (kompetitivna ELISA; VHH: n=1-3; AMG386 peptid: n=3; n.d., nije odreÿeno)

5.3. Procena selektivnosti VHH-ova koji blokiraju humani Ang2 prema humanom Ang1 u ELISA testu

Da bi se odredilo da li anti-Ang2 blokirajuüi VHH-ovi su selektivni u odnosu na vezivanje u interakciji humani Ang1 za humani Tie2, sprovodi se kompetitivna ELISA test. Ukratko, 2 µg/mL rekombinantnog humanog Tie2-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) je oblagano preko noüi na 4°C u MaxiSorp ploþi sa 96 ležišta (Nunc, Wiesbaden, Germany). Obložena ležišta su blokirana sa 1% rastvorom kazeina. Fiksna koncentracija (0.02 nM) FLAG-tagovanog rekombinantnog humanog Ang1 (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA) i serija razblaženja VHH (razblaženja u PBS 0.1% kazeina 0.05% Tween-20) inkubirana je na obloženi receptor Tie2-Fc u toku 2 sata na sobnoj temperaturi da bi se postigla ravnotežna vezivanja. Rezidualno vezivanje FLAG-hAngl detektuje se upotrebom HRP konjugovanog anti-FLAG M2 mAb. Referentni molekul je peptidni deo peptitela AMG386 (Slika 4). Kao negativna kontrola koristi se neki irelevantni VHH. Indikativne vrednosti IC50za VHH-ove koje blokiraju interakciju humani Ang1-humani Tie2 su prikazane u Tabeli 7.

Tabela 7: IC50(nM) vrednosti preþišüenih VHH-ova koje blokiraju interakciju humani Ang1 za humani Tie2 (kompetitivna ELISA; VHH: n=2-3; AMG386 peptid: n=3)

5.4. Odreÿivanje afiniteta humani, mišji, cino Ang2 - VHH interakcije

Afiniteti VHH za vezivanje za humani, mišji i cino Ang2 su odreÿeni korišüenjem analize površinske plazmon rezonancije (SPR) (Biacore T100). Ukratko, VHH i referentne supstance su imobilisane na CM5 þipu preko aminskog povezivanja. Upotrebljen je kinetiþki pristup sa više ciklusa: razliþite koncentracije humanog, mišjeg i cino Ang2-FLD (0.4-1-2.6-6.4-16-40-100 nM) su ubrizgane. Ang2-FLD vrste su ostavljene da se asociraju u toku 2 min i da se disociraju u toku 20 min pri brzini protoka od 45 µL/min. Izmeÿu injektiranja, površine su regenerisane pulsom od 10 sekundi sa 25 mM NaOH i stabilizacionim periodom od 60 sekundi. Podaci o asocijaciji/disocijaciji su procenjeni fitovanjem 1:1 modela interakcije (Langmuir-ovo vezivanje). Konstanta afiniteta KDizraþunava se iz dobijenih konstanti brzine asocijacije i brzine disocijacije kai kdi su prikazane u Tabeli 8.

Tabela 8: Afinitet KD(nM) preþišüenih VHH za humani, mišji i cino Ang2

Primer 6

Afinitetno sazrevanje odabranog VHH

Varijanta VHH 28D10 (00027 koja nosi C50S/S53N i Q108L supstituciju - Primer 7.3) se podvrgava afinitetnom sazrevanju.

U prvom ciklusu, aminokiselinske supstitucije su uvedene nasumiþno u oba okvira (FW) i komplementarne determinišuüe regione (CDR) korišüenjem PCR metode koja je sklona grešci. Mutageneza je izvedena u dvostrukom PCR-baziranom pristupu koristeüi Genemorph II Random Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) koristeüi 1 ng VHH 00027 cDNK šablone, praüeno drugim PCR-om koji je podložan grešci koristeüi 0.1 ng proizvoda iz 1. kruga. Nakon koraka poliranja, PCR proizvodi su ubaþeni preko jedinstvenih restrikcionih mesta u vektor koji je dizajniran da olakša fagni prikaz VHH biblioteke. Konsekutivne runde selekcije u rastvoru su izvedene korišüenjem smanjenja koncentracija biotinilovanog rekombinantnog humanog Ang2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) i elucija tripsina. Periplazmiþni ekstrakti (u zapremini od ~ 80 µL) su pripremljeni u skladu sa standardnim metodama i skriningu vezivanja za rekombinantni humani Ang2-FLD u ProteOn (BioRad, Hercules, CA, USA) testu brzine otpuštanja.

Ukratko, GLC ProteOn senzorski þip je obložen rekombinantnim humanim Ang2-FLD na "ligandnim kanalima" L3, L4, L5 i L6 (sa L1/L2 kao referentnim kanalom). Periplazmiþni ekstrakt klonova koji su afinitetno sazreli je razblažen 1:10 i injektiran preko "analitnih kanala" A1-A6. Proseþno otpuštanje se izraþunava za referentnu VHH 00027 koja se priprema i testira na isti naþin kao i afinitetno sazreli VHH-ovi i služi kao referenca za izraþunavanje poboljšanja otpuštanja. Najboljih 25 afinitetno sazrelih varijanti su prikazane u Tabeli 9. VHH su sekvencionirani (Tabela 10-A) da bi se identifikovale aminokiselinske mutacije korisne za poboljšanje brzine otpuštanja (Tabela 10-B).

Tabela 9: Poboljšanje brzine otpuštanja i namotaja afinitetno sazrelih varijanti VHH 00027

U poþetku je konstruisano 12 VHH varijanti koje sadrže kombinacije mutacija na poziciji Kabata 27, 29, 100b i 100i (Tabela 11; Slika 5). Razliþite kombinacije ove 4 mutacije su graftovane na sekvenciono optimizovanoj VHH 00042 okosnici (Slika 17-B) koja sadrži dodatnu D54G supstituciju (Primer 6.3). Aminokiselinska sekvenca je poravnata sa humanom VH3/JH konsenzus sekvencom embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani u sivoj boji u skladu sa AbM definicijom (Oxford Molecular's AbM antivirusni softver za modelovanje). Konstrukti su klonirani u ekspresioni vektor pAX100 u okviru sa C-terminalnim c-myc tagom i (His)6 tagom. VHH varijante su proizvedene u E. coli i preþišüene sa IMAC i SEC. Sekvence su prikazane u Tabeli 11. Svi ovi VHH-ovi su analizirani u hAng2/hTie2 (Primer 5.1; rezultati prikazani na slici 6 i Tabeli 12) i hAng1/hTie2 kompetitivnom ELISA testu (Primer 5.3; rezultati prikazani na slici 7 i Tabela 12) . Dodatno, temperatura topljenja (Tm) svake varijante na pH 7 je odreÿena u testu termiþkog pomeranja, koji se zasniva na promeni fluorescentnog signala u zavisnosti od temperature, nakon inkorporacije Sypro Orange (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), pp 289-298) (Tabela 12).

1

Tabela 10.A: Aminokiselinske sekvence afinitetno sazrelih anti-Ang2 VHH-ova

2

4

Tabela 10-B: Pojedinaþne mutacije ili njihove kombinacije koje daju poboljšanja u brzini odvajanja

Tabela 11: Aminokiselinska sekvenca afinitetno zrelih anti-Ang2 VHH-ova

Tabela 12: Pregled Tm, IC50(pM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnos afinitetno sazrelih varijanti iz VHH 00027

Iz potencije, Tmi perspektiva sekvence VHH 00908 se prenosi u drugi ciklus kombinovanog afinitetnog sazrevanja i optimizacije sekvence (Primer 7.3).

Primer 7

Optimizacija sekvenci odabranih VHH 1D01, 28D10 i 37F02

7.1 VHH1D01

Aminokiselinska sekvenca anti-Ang2 VHH 1D01 (vidi Slika 8-A) je poravnata sa humanom konsenzus sekvencom VH3/JH embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani u sivoj boji u skladu sa AbM definicijom (Oxford Molecular's AbM antivirusni softver za modelovanje). Podvuþeni su ostaci koji üe biti mutirani u svoj ljudski par. Potencijalne post-translacione modifikacione lokacije koje treba tretirati su boksirane. Poravnanje pokazuje da 1D01 sadrži 6 okvirnih mutacija u odnosu na referentnu sekvencu embrionske linije. Ne-humani ostaci na pozicijama 14, 41, 71, 74, 83 i 108 su odabrani za supstituciju sa svojim pandanom humane embrionske linije. Konstruisan je i proizveden set od sedam 1D01 varijanti koje nose razliþite kombinacije humanih ostataka na ovim pozicijama (Slika 8-B) (Primer 5). Paralelno, u 3 od ovih 7 varijanti potencijalno mesto Asp izomerizacije na poziciji D54G55 se uklanja uvoÿenjem D54G supstitucije, i u 1 od ovih 7 varijanti potencijalno mesto formiranja piroGlu na poziciji E1 se uklanja sa E-|D supstitucijom (AA sekvence su navedene u Tabeli 15).

Ove varijante su okarakterisane kao preþišüeni protein u humanoj (Slika 9-1), mišjoj (Slika 9-2) i cino (Slika 9-3) Ang2/Tie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.1; Primer 5.2), hAng1/hTie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.3; Slika 10). Dodatno, temperatura topljenja (Tm) svake varijante je odreÿena u testu termiþkog pomeranja (Primer 6). Pregled podataka može se naüi u tabeli 13. Dodatno, % FR identiteta humane embrionske linije je izraþunat u skladu sa AbM definicijom (Oxford Molecular's AbM antivirusni softver za modelovanje). Afinitet VHH 00921 za humani, cino, mišiji i pacovski Ang2 je prikazan u Tabeli 14 (Primer 5.4).

Tabela 13: Pregled Tm, IC50(nM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnos optimizirovanih sekvenci varijanti iz VHH 00027

n.d., nije determinisano

Tabela 14: Afinitet KD proþišüenog VHH 00921 za rekombinantni humani, cino, mišji i pacovski Ang2

1

Tabela 15: Aminokiselinska sekvenca optimizovanih sekvenci varijanti iz anti-Ang2 VHH 1D01

2

7.2 VHH 37F02

Aminokiselinska sekvenca anti-Ang2 VHH 37F02 (videti Slika 12-A) je poravnata sa konsenzus sekvencom humane VH3/JH embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani u sivoj boji u skladu sa AbM definicijom (Oksford Molecular's AbM antivirusni softver za modelovanje). Podvuþeni su ostaci koji üe biti mutirani u svoj humani par. Potencijalne post-translacione lokacije modifikacije koje treba tretirati su boksirane. Poravnanje pokazuje da 37F02 sadrži 4 okvirne mutacije u odnosu na referentnu sekvencu embrionske linije. Ne-humani ostaci na pozicijama 60, 74, 83 i 108 su odabrani za supstituciju sa svojim pandanom humane embrionske linije. Paralelno, potencijalno mesto izomerizacije Asp na poziciji D54G55 se uklanja uvoÿenjem D54G supstitucije. Konstruisan je i proizveden set od tri varijante ciklusa 137F02 koje nose razliþite kombinacije humanih ostataka na ovim pozicijama (Slika 12-B) (Primer 5; AA sekvence su navedene u Tabeli 21 -1).

Ove varijante su okarakterisane kao preþišüeni protein u humanoj (Slika 12-1), mišjoj (Slika 12-2) i cino (Slika 12-3) Ang2/Tie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.1; Primer 5.2). Dodatno, temperatura topljenja (Tm) svake varijante je odreÿena u testu termiþkog pomeranja (Primer 6). Pregled podataka može se naüi u tabeli 16. Dodatno, % FR identiteta humane embrionske linije je izraþunat u skladu sa AbM definicijom (Oxford Molecular's AbM antivirusni softver za modelovanje).

Tabela 16: Pregled Tm, IC50(pM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnosa sekvenca optimizovanih varijanti VHH 37F02 iz ciklusa 1

Pristup NNK biblioteke se koristi za izbacivanje dva potencijalna post-translaciona modifikaciona mesta u CDR3: i) oksidaciono osetljivog Met na poziciji 100e i ii) Asp izomerizacioni položaj na položaju D95S96. Pošto se D54G toleriše (VHH 00046 i 00920; Tabela 16 i Tabela 17), nijedan NNK pristup nije korišüen za izbacivanje ovog potencijalnog mesta izomerizacije Asp.

Na kraju, 3 NNK biblioteke koje sadrže VHH klonove koji nose supstitucije na pozicijama D95, S96i M100eza sve druge aminokiseline, su testirane u hAng2/hTie2 kompetitivnoj AlphaScreen (Primer 2) analizi. Ukratko, periplazmiþki ekstrakti koji sadrže eksprimirani VHH su skrinirani u 3 razliþita razblaženja (odgovarajuüi grubo na EC20, EC50i EC80roditeljskog VHH 37F02) i promene u % inhibicije na razliþitim taþkama razblaženja su uporeÿene sa roditeljskim 37F02. Na osnovu rezultata skrininga i podataka prikazanih u tabeli 17, napravljeno je 8 dodatnih varijanti VHH iz 2 ciklusa (na osnovu VHH 00920 okosnice) koje nose razliþite kombinacije izbacivanja D95S96i M100e(Slika 11-C; AA sekvence su navedene u Tabeli 19-2).

Sve ove varijante su okarakterisane kao preþišüeni protein u humanoj (Slika 13-1), mišjoj (Slika 12-2) i cino (Slika 12-3) Ang2/Tie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.1; Primer 5.2), hAng1/hTie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.3; Slika 14). Dodatno, temperatura topljenja (Tm) svake varijante je odreÿena u testu termiþkog pomeranja (Primer 6). Pregled podataka može se naüi u tabeli 17. Osim toga, izraþunat je % FR identiteta humane embrionske linije. Afinitet VHH 00928 za humani, mišji, cino i pacovski Ang2 prikazan je u Tabeli 18.

4

Tabela 17: Pregled Tm, IC50(pM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnosa sekvenca optimizovanih varijanti VHH 37F02 iz ciklusa 2

Tabela 18: Afinitet KDproþišüenog VHH 00928 za rekombinantni humani, cino, mišji i pacovski Ang2

Tabela 19-1

Tabela 19-2

7.3 VHH 28D10

Aminokiselinska sekvenca anti-Ang2 VHH 28D10 (videti Slika 12-A) je poravnata sa konsenzus sekvencom humane VH3/JH embrionske linije. Ostaci su numerisani u skladu sa Kabatom, CDR-ovi su prikazani u sivoj boji u skladu sa AbM definicijom (Oxford Molecular's AbM antivirusni softver za modelovanje). Podvuþeni su ostaci koji üe biti mutirani u svoj humani par. Potencijalne post-translacione lokacije modifikacije koje treba tretirati su boksirane. Poravnanje pokazuje da 28D10 sadrži 5 okvirnih mutacija u odnosu na referentnu sekvencu embrionske linije. Ne-humani ostaci na pozicijama 14, 71, 74, 83 i 108 su odabrani za supstituciju sa svojim pandanom humane embrionske linije. Paralelno, potencijalno mesto izomerizacije Asp na poziciji D54G55se uklanja uvoÿenjem D54G supstitucije. Slobodni cistein na položaju 50 je uklonjen supstitucijom sa Ala, Thr ili Ser. Na kraju je konstruisan i proizveden set od jedanaest varijanti ciklusa 128D10 koje nose razliþite kombinacije humanih ostataka na ovim pozicijama (Slika 15-B; AA sekvence su navedene u Tabeli 24-1).

Ove varijante su okarakterisane kao preþišüeni protein u humanoj (Slika 16-1), mišjoj (Slika 16-2) i cino (Slika 16-3) Ang2/Tie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.1; Primer 5.2), hAng1/hTie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.3; Slika 17). Dodatno, temperatura topljenja (Tm) svake varijante je odreÿena u testu termiþkog pomeranja (Primer 6). Pregled podataka može se naüi u tabeli 20. Osim toga, izraþunat je % FR identiteta humane embrionske linije.

Tabela 20: Pregled Tm, IC50(nM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnosa sekvenci optimizovanih varijanti VHH 28D10 iz ciklusa 1

n.d., nije determinisano

Dodatni set varijanti (ciklus 2) je kreiran da istraži supstituciju afinitetnog sazrevanja na poziciji A24V i da dalje istraži C50X-S53X varijante (Tabela 21; Slika 15-C; AA sekvence su navedene u Tabeli 23-4-2). Ove varijante su okarakterisane kao preþišüeni protein u humanoj (Slika 18-1), mišjoj (Slika 18-2) i cino (Slika 18-3) Ang2/Tie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.1; Primer 5.2), hAng1/hTie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.3; Slika 19). Dodatno, temperatura topljenja (Tm) za svaku varijantu je odreÿena u testu termiþkog pomeranja (Primer 6).

Tabela 21: Pregled Tm, IC50(nM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnosa sekvenci optimizovanih varijanti VHH 28D10 iz ciklusa 2

n.d., nije determinisano

Paralelno, NNK biblioteþki pristup se koristi za izbacivanje dva post-translaciona modifikaciona mesta u CDR2: dva sekvencijalna Asp izomerizaciona mesta na položaju D52aS53i D54G55. Pošto se D54G toleriše (Primer 6; Tabela 20) nijedan NNK pristup nije korišüen da se izbaci ovaj potencijalni Asp izomerizacioni položaj. Na kraju, 2 NNK biblioteke koje sadrže VHH klonove koji nose supstitucije na pozicijama D52ai S53za sve druge aminokiseline, su testirane u hAng2/hTie2 kompetitivnoj AlphaScreen (Primer 2) analizi. Ukratko, periplazmiþki ekstrakti koji sadrže eksprimirani VHH su skrinirani u 3 razliþita razblaženja (odgovarajuüi grubo na EC20, EC50 i EC80 referentnog 00902) i promene u % inhibicije na razliþitim taþkama razblaženja su uporeÿene sa referentnim 00902. Na osnovu rezultata skrininga i podataka prikazanih u tabeli 21, napravljeno je 7 dodatnih varijanti VHH iz 3 ciklusa (na osnovu 00908okosnice) (videti Sliku 15-D).

Krajnji cilj je da se konstruišu VHH varijante koje zadržavaju ili pokazuju poveüanu potenciju, poveüanu termostabilnost i imaju relevantne PTM lokacije izbaþene u odnosu na VHH 28D10. (AA sekvence su navedene u Tabela 24-3). Ove varijante su okarakterisane kao preþišüeni protein u humanoj (Slika 20-1), mišjoj (Slika 20-2) i cino (Slika 20-3) Ang2/Tie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.1; Primer 5.2), hAng1/hTie2 kompetitivnoj ELISA (Primer 5.3). Dodatno, temperatura topljenja (Tm) svake varijante je odreÿena u testu termiþkog pomeranja (Primer 6). Pregled podataka može se naüi u tabeli 22. Osim toga, izraþunat je % FR identiteta humane embrionske linije. Najoptimalnije promene sekvence su konaþno primenjene na varijantu VHH 00956 koja nije afinitetno sazrela (Slika 15-D). Afinitet VHH 00919, 00938 i 00956 za humani, mišji, cino i pacovski Ang2 prikazan je u Tabeli 23.

Tabela 22: Pregled Tm, IC50(nM) kod humane, mišje i cino Ang2 kompetitivne ELISA i hAng1/hAng2 IC50odnosa sekvenci optimizovanih varijanti VHH 28D10 iz ciklusa 3

n.d. nije determinisano

1

Tabela 23: Afinitet KDpreþišüenih VHH-ova 00919, 00938 i 00956 za rekombinantni humani, cino, mišji i pacovski Ang2

Tabela 24-1

2

4 Tabela 24-2

Tabela 24-3

VHH domen 00938 je realizacija pronalaska kako je naznaþeno u priloženim patentnim zahtevima. Drugi VHH domeni, prikazani gore, ali koja ne spadaju pod ove zahteve, su prikazani za potrebe poreÿenja ili da se objasni kako je dobijen VHH domen 00938.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Ang2 vezujuüi molekuli koji sadrži imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen, pri þemu navedeni imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen sadrži tri regiona za odreÿivanje komplementarnosti CDR1, CDR2 i CDR3, gde

CDR1 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 168,

CDR2 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 171 i

CDR3 ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 175.

2. Ang2 vezujuüi molekuli prema zahtevu 1, pri þemu navedeni imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen je VHH.

3. Ang2 vezujuüi molekuli prema zahtevu 2, pri þemu se navedeni VHH sastoji od imunoglobulinskog pojedinaþnog varijabilnog domena koji ima sekvencu koja se sastoji od SEK ID BR: 166.

4. Ang2 vezujuüi molekuli prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri þemu navedeni VHH ili navedeni imunoglobulinski pojedinaþni varijabilni domen ima modifikaciju ili razmenu na svom N-terminalu, pri þemu je navedena modifikacija delecija prve aminokiseline i navedena razmena je zamena prve aminokiseline drugom aminokiselinom.

5. Molekul nukleinske kiseline koji kodira Ang2 vezujuüi molekuli prema bilo kom od zahteva 1 do 4.

6. Ekspresioni vektor koji sadrži navedeni molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 5.

7. ûelija domaüina koja nosi jedan ili više ekspresionih vektora prema zahtevu 6.

8. Postupak za proizvodnju Ang2 vezujuüeg molekula prema bilo kom od zahteva 1 do 4, sadrži korake:

transfekciju üelije domaüina sa jednim ili više navedenih ekspresionih vektora prema zahtevu 6,

kultivisanje navedene üelije domaüina, i

izdvajanje i preþišüavanje pomenutog molekula koji vezuje Ang2.

9. Farmaceutska kompozicija, sadrži kao aktivni sastojak sadrži jedan ili više navedenih Ang2 vezujuüi molekuli prema bilo kom od zahteva 1 do 4, i najmanje fiziološki prihvatljiv nosaþ.

10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9, koja dalje sadrži jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa.

11. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 9 ili 10 za upotrebu u leþenju bolesti koja je povezana sa Ang2 posredovanim efektom angiogeneze.

12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11 za upotrebu u leþenju raka i kancerogenih bolesti.

13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11 za upotrebu u leþenju oþnih bolesti.

14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri þemu navedena bolest oka je makularna degeneracija povezana sa starenjem ili dijabetiþka retinopatija.

15. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11 za upotrebu u leþenju hroniþnih bolesti bubrega.