RS58928B1 - Transporter za krvno-moždanu barijeru - Google Patents

Transporter za krvno-moždanu barijeru

Info

Publication number
RS58928B1
RS58928B1 RS20190813A RSP20190813A RS58928B1 RS 58928 B1 RS58928 B1 RS 58928B1 RS 20190813 A RS20190813 A RS 20190813A RS P20190813 A RSP20190813 A RS P20190813A RS 58928 B1 RS58928 B1 RS 58928B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
brain
entity
blood
antibody
linker
Prior art date
Application number
RS20190813A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernd Bohrmann
Per-Ola Freskgard
Peter Maier
Jens Niewoehner
Alain Tissot-Daguette
Eduard Urich
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS58928B1 publication Critical patent/RS58928B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

OPIS
Predstavljeni pronalazak je transporter za krvno-moždanu barijeru koji povezuje receptore na krvno-moždanoj barijeri (R/BBB) i postupke vezane za njegovu upotrebu.
Osnova
Penetracija lekova za neurološke poremećaje u mozak, npr. bioterapeutski lekovi ili lekovi sa malim molekulima koji imaju mali stepen penetracije u mozak, strogo se ograničava prostranom i nepropusnom krvno-moždanom barijerom (BBB) zajedno sa drugim ćelijskim komponentama u neurovaskularnoj jedinici (NVU). Testirane su mnoge strategije za zaobilaženje ove prepreke a jedna od njih je da se upotrebi transcitozna putanja posredstvom endogenih receptora koji se nalaze na endotelima moždanih kapilara. Dizajnirani su rekombinantni proteini protiv ovih receptora, kao što su monoklonska antitela ili peptidi, kako bi se omogućila receptorima potpomognuta isporuka bioterapeutskih lekova u mozak. Ipak, strategije za povećanje maksimalnog unosa u mozak uz minimalizaciju pogrešnog sortiranja u endotelnim ćelijama mozga (BEC-ovi) i stepen akumulacije u određenim organelama (posebno u organelama koje omogućavaju degradaciju bioterapije) u BEC-ovima ostaje neistražena.
Monoklonalna antitela i drugi bioterapeutici imaju veliki terapeutski potencijal za lečenje patologije u centralnom nervnom sistemu (CNS). Ipak, ova putanja za unos u mozak zatvorena je preko BBB. Prethodna ispitivanja su prikazala da veoma mali procenat (oko 0,1%) IgG koji je ubrizgan u krvotoku može da prođe u deo CNS-a (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)). Ovo svakako ograničava bilo koji farmakološki efekat zbog male koncentracije antitela u okviru CNS.
WO 2012/075037 prikazuje bispecifično antitelo pune dužine koje se sastoji od Fab dela anti-BACE1 i Fab dela anti-transferinskog receptora. Ovo bispecifično antitelo radi kao transporter za krvno-moždanu barijeru.
US 2005/147613 prikazuje bispecifična antitela koja se sastoje od antitela pune dužine sa anti-transferinskim receptorom i antitela pune dužine anti-Abeta ili anti-transferinskog Fab dela i anti-abeta Fab dela. Obe konstrukcije rade kao transporter za krvno-moždanu barijeru.
Zbog toga, postoji potreba za sistemima za dostavu lekova za neurološke poremećaje kroz BBB koji će ih efikasno prenositi u mozak.
Rezime
U prvom aspektu, predstavljeni izum je transporter za krvno-moždanu barijeru koji sadrži entitet moždanog efektora, povezivača i jednog monovalentnog veznog entiteta koji se vezuje za transferinski receptor, dok povezivač spaja efektor sa monovalentnim vezivnim entitetom koji se vezuje za transferinski receptor, pri čemu monovalentni vezivni entitet koji povezuje transferinski receptor sadrži jedan ScFab koji je usmeren na prepoznavanje transferinskog receptora koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji se sastoji od amino kiselinskog niza sa Seq. Id. No. 14, 15 ili 16 i pri čemu je izabrani entitet moždanog efektora odabran iz grupe koja se sastoji od lekova za neurološke poremećaje, neurotropnih faktora i antitela usmerenih ka cilju na mozgu koja su izabrana iz grupe koja se sastoji od βsekretaze 1, Aβ, faktor epidermalnog rasta, receptor faktora epidermalnog rasta 2, Tau, fosfohorilatirani Tau, apolipoprotein E4, alfa sinuklin, oligomerni fragmenti alfa sinuklina, CD20, huntingtin, prion protein, ponovljena kinaza bogata leucinom 2, parkin, prezenilin 2, gama sekretaza, smrtni receptor 6, amiloidni prekursorski protein, p75 neurotrofin receptor i kaspaza 6.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, entitet moždanog efektora bira se iz grupe koja se sastoji od proteina, polipeptida i peptida.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, entitet moždanog efektora sastoji se od antitela pune dužine usmerenih na cilj u mozgu, ako je moguće, IgG pune dužine.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, transporter za krvnomoždanu barijeru sastoji se od IgG antitela pune dužine kao entiteta moždanog efektora, povezivača i jednog scFab koji vezuje transferinski receptor koji se nalazi u okviru niza amino kiselina sa Seq. Id. No.14, 15 ili 16, pri čemu je scFab spojen sa povezivačem na kraj C-priključka Fc dela jednog od teških lanaca IgG an+titela.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, entitet efektora je antitelo pune dužine usmereno na Aβ.
U konkretom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, antitelo usmereno na Aβ sadrži (a) H-CDR1 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No. 5, (b) H-CDR2 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No.6, (c) H-CDR3 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No. 7, (d) L-CDR1 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No. 8, (e) L-CDR2 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No.9 i (f) L-CDR3 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No.10.
U konkretom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, antitelo usmereno na Abeta sadrži (a) H-CDR1 koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No. 11 i VLdomen koji sadrži niz amino kiselina sa Seq. Id. No.12.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, prvi teški lanac antitela u transporteru za krvno-moždanu barijeru usmeren na cilj u mozgu sadrži modul za prvu dimerizaciju a drugi teški lanac antitela u transporteru za krvno-moždanu barijeru za cilj u mozgu sadrži drugi modul za dimerizaciju koji obezbeđuje heterodimerizaciju dva teška lanca.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, prvi modul za dimerizaciju prvog teškog lanac antitela u transporteru za krvno-moždanu barijeru usmeren na cilj u mozgu sadrži ispupčenja a modul za dimerizaciju drugog teškog lanca antitela u transporteru za krvno-moždanu barijeru za cilj u mozgu sadrži rupice u skladu sa strategijom dugme u rupici.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, entitet efektora je antitelo pune dužine usmereno na fosforilatirani Tau.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, entitet efektora je antitelo pune dužine usmereno na alfa sinuklein.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, povezivač je peptidni povezivač, poželjno peptid koji je niz amino kiseline sa dužinom od bar 25 amino kiselina, još poželjnija je dužina od 30 do 50 amino kiselina, konkretno navedeni povezivač je (G4S)6G2ili (G4S)4.
Sledeća tri prikaza izuma vezana su za transporter za krvno-moždanu barijeru pri čemu je entitet moždanog efektora protein, polipeptid ili peptid pod uslovom da entitet moždanog efektora nije antitelo pune dužine, konkretno IgG pune dužine.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, monovalentni vezni entitet koji se vezuje na transferinski receptor sadrži CH2-CH3 Ig entitet i jedan scFab koji se vezuje na transferinski receptor koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji se nalazi u okviru niza amino kiselina sa Seq. Id. No.14, 15 ili 16, pri čemu je scFab spojen na kraju C-priključka CH2-CH3 Ig entiteta sekundarnim povezivačem.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, transporter za krvnomoždanu barijeru sastoji se od entiteta moždanog efektora, povezivača, CH2-CH3 Ig domena, drugog povezivača i jednog scFab koji se vezuje na transferinski receptor koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji se sastoji iz niza amino kiselina sa Seq.. Id. No. 14, 15 ili 16, gde je entitet moždanog efektora spojen pomoću prvog povezivača na kraj N-priključka CH2-CH3 Ig domena a scFab je spojen na kraj C-priključka CH2-CH3 Ig domena pomoću drugog povezivača.
U konkretnom prikazu transportera za krvno-moždanu barijeru, CH2-CH3 Ig entitet je CH2-CH3 IgG entitet.
Transporter za krvno-moždanu barijeru u predstavljenom izumu može da se koristi kao lek, konkretno može se koristiti za lečenje neuroloških poremećaja kao što je Alchajmerova bolest.
Transporter za krvno-moždanu barijeru u predstavljenom izumu može se koristiti za prenos entiteta moždanog efektora kroz krvno-moždanu barijeru.
U konkretnom prikazu, teški lanac IgG antitela u transporteru za krvno-moždanu barijeru predmetnog pronalaska spojen je na svom kraju C-priključka Fc dela na scFab kao monovalentni vezivni entitet koji se vezuje na receptor u krvno-moždanoj barijeri sa sledećom strukturom:
• IgG teški lanac,
• Povezivač se vezuje na kraj C-priključka Fc dela IgG teškog lanca na kraj N-priključka VL domena scFab,
• Varijabilni domen lakog lanca (VL) i C-kapa domen lakog lanca scFab,
• Povezivač se vezuje na kraj C-priključka C-kapa domena lakog lanca scFab na kraj N-priključka VH domena scFab,
• Varijabilni domen teškog lanca (VH) scFab antitela i IgG CH3 domen teškog lanca.
U drugom aspektu, predstavljeni izum obezbeđuje fuzioni protein za transport entiteta moždanog efektora kroz krvno-moždanu barijeru koji se sastoji od CH2-CH3 Ig tela, povezivača i jednog scFab usmerenog na transferinski receptor koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji se sastoji od niza amino kiselina sa Seq. Id. No. 14, 15 ili 16, pri čemu scFab je spojen na kraju C-priključka CH2-CH3 Ig entiteta pomoću povezivača i gde je entitet moždanog efektora izabran iz grupe koja se sastoji od lekova za neurološke poremećaje, neurotrofnih faktora i delova antitela koji su usmereni ka cilju u mozgu i izabrani iz grupe koja se sastoji od scFv, Fv, scFab, Fab, VHH, F(ab')2 ili peptida usmerenih ka cilju u mozgu i pri čemu je cilj u mozgu izabran iz grupe u kojoj se nalaze β-sekretaze 1, Aβ, faktor epidermalnog rasta, receptor faktora epidermalnog rasta 2, Tau, fosforilirani Tau, apolipoprotein E4, alfa sinuklin, oligomerni fragmenti alfa sinuklina, CD20, huntingtin, prion protein, ponovljena kinaza bogata leucinom 2, parkin, prezenilin 2, gama sekretaza, smrtni receptor 6, amiloidni prekursorski protein, p75 neurotrofin receptor i kaspaza 6.
U konkretnom prikazu fuzionog proteina predmetnog pronalaska, fuzioni protein predmetnog pronalaska dalje se sastoji od povezivača na kraju N-priključka CH2-CH3 Ig entiteta koji spaja entitet moždanog efektora na kraj N-priključka CH2-CH3 Ig entiteta.
U konkretnom prikazu fuzionog proteina u trenutnom izumu, povezivač je peptidni povezivač, konkretno peptid koji je niz amino kiseline sa dužinom od bar 15 amino kiselina, još konkretnije sa dužinom od 20 do 50 amino kiselina, najčešće navedeni povezivač ima niz amino kiseline (G4S)6G2 (Seq. Id. No.13) ili (G4S)4(Seq. Id. No.17).
U konkretnom prikazu fuzionog proteina u predstavljenom izumu, CH2-CH3 Ig entitet je CH2-CH3 IgG entitet.
U trećem aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji se sastoji od fuzionog proteina predmetnog pronalaska i entiteta moždanog efektora spojenog na kraj N-priključka CH2-CH3 Ig entiteta fuzionog proteina predmetnog pronalaska pomoću povezivača.
U konkretnom prikazu konjugata predmetnog pronalaska, entitet moždanog efektora je neurotrofni faktor i pri čemu je povezivač koji povezuje neurotrofni faktor na kraj N-terminala CH2-CH3 Ig entiteta peptidni povezivač.
Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja se sastoji od konjugata predstavljenog izuma i farmaceutskog nosača, upotreba ovog spoja kao leka, konkretno, upotreba spoja za lečenje neurodegenerativnih bolesti, konkretno, Alchajmerove bolesti.
Kratak opis slika
Slika 1: Različiti formati transportera za krvno-moždanu barijeru (fuzioni proteini) korišćeni su u primerima. 1A: IgG usmeren na Aβ (mAb31). IB: jedan Fab (sFab = jedan scFab) usmeren na TfR spojen sa Fc delom IgG usmerenim na Aβ (mAb31). 1C: dupli Fab (dFab = dupli scFab) usmeren na TfR spojen sa Fc delom IgG usmerenim na Aβ (mAb31). Struktura scFab spojena je sa krajem C-priključka teškog lanca IgG antitela.
Slika 2: Vezivna svojstva fuzionih proteina prema Aβ strukturama. Afinitet za vezivanje izmeren je pomoću ELISA postavke koja pokazuje da su Fab konstrukcije očuvale Aβ vezivna svojstva. Vezivanje mAb31-8D3 konstrukcija na Abeta vlakna. Iako se 8D3 (otvoreni kvadrati) ne vezuje na imobilizirana Abeta vlakna, mAb31-8D3-dFab (popunjeni kvadrati), mAb31-8D3-sFab (otvoreni trouglovi) i mAb31 (popunjeni trouglovi) vezuju se sa uporedivim afinitetima.
Slika 3: Vezivna svojstva konstrukcija za Transferinski receptor (TfR). Afinitet za vezivanje izmeren je pomoću ELISA postavke koja pokazuje da se samo Fab konstrukcije vezuju za Transferinski receptor (TfR) a duple Fab konstrukcije imaju malo veći afinitet zbog bivalentnog režima vezivanja. Vezivanje mAb31-8D3 konstrukcija na mTfR. Dok se mAb31 (popunjeni trouglovi) ne vezuje za imobilizirani mTfR, mAb31-8D3-dFab (popunjeni kvadrati) vezuje se uz afinitet koji može da se uporedi sa 8D3 matičnim antitelom (otvoreni kvadrati). Monovalentna konstrukcija mAb31-8D3-sFab (otvoreni trouglovi) pokazuje srednji afinitet za vezivanje.
Slika 4: Dekoracioni plak anti-Aβ monoklonalnog antitela mAb31 (Fig. 4A), jedan Fab mAb31 (jedan scFab povezan sa krajem C-priključka za mAb31) (sl. 4B) i dupli Fab mAb31 (dupli scFabs povezan sa krajem C-priključka mAb31) (sl. 4C). Konstrukcija ubrizgana u PS2APP miša (n=3/konstrukcija), jedna intravenozna doza 10 mg/kg i zatim perfuzija mozga 8 sati nakon doze. Analiza uključuje imunohistohemiju i konfokalnu mikroskopiju za vezivanje plaka. Podaci pokazuju da samo konstrukcije sa jednim FabmAb31 imaju sposobnost da pređu BBB i da se vežu za plakove. Slika prikazuje jednu reprezentativnu oblast mozga svih životinja.
Slika 5: Prikazuje kvantifikaciju duple Fab-mAb31 konstrukcije. Bojenje plaka i kapilara je kvantifikovano kod sve tri tretirane životinje u tri različite oblasti (9 oblasti za svaku konstrukciju). Podaci prikazuju da postoji samo povećanje u kapilarima za duplu FabmAb31 konstrukciju u poređenju sa mAb31. Nisu otkriveni povećani nivoi duplog FabmAb31 na plaku (u mozgu). Kvantifikacija mab31 (HEK kontrola) u odnosu na dupli Fabmab3, 10 mg/kg, 8h posle doze.
Slika 6: Prikazuje kvantifikaciju jedne Fab-mAb31 konstrukcije. Bojenje plaka i kapilara je kvantifikovano kod sve tri tretirane životinje u tri različite oblasti (9 oblasti za svaku konstrukciju). Podaci prikazuju da postoji veliko povećanje u plakovima za jednu FabmAb31 konstrukciju u poređenju sa mAb31. Kvantifikacija fluorescentnog signala pokazuje povećanje od više od 50-puta za jedan Fab-mAb31 u poređenju sa mAb31 konstrukcijom. Takođe, postoji i nepostojano farbanje kapilara za konstrukciju jednog Fab-mAb31 u poređenju sa mAb31 što označava prolaz kroz BBB. Kvantifikacija mab31 (HEK kontrola) u odnosu na jedan Fab-mab3110 mg/kg, 8h nakon doze i 25 mg/kg, 24h posle doze.
Slika 7: Dekoracija plaka za anti-Aβ monoklonalno antitelo mAb31 pri dve različite doze i jedan Fab mAb31 (jedan scFab spojen na kraj C-priključka mAb31) pri veoma niskoj dozi. Konstrukcija ubrizgana u PS2APP miša (n=3/konstrukcija), jedna intravenozna doza i zatim perfuzija mozga u različitim vremenskim tačkama nakon doze. Analiza uključuje imunohistohemiju i konfokalnu mikroskopiju za vezivanje plaka. Podaci pokazuju da samo konstrukcije sa jednim Fab-mAb31 imaju sposobnost da pređu BBB i da se vežu za plakove. Izlaganje mozga je veoma brzo za konstrukciju jednog Fab-mAb31 a dekorativni plak je održiv tokom bar jedne nedelje nakon jedne administracije.
Slika 8: Kvantifikacija površinskog izraza ćelije za TfR tretiran jednim Fab-mab31 ili dvostrukim Fab-mAb31. Regulacija za smanjenje površine ćelije transferinskog receptora (TfR) pomoću konstrukcije dvostrukog Fab-mAb31. Endotelne ćelije mozga koje izražavaju TfR inkubirane su 24 sata konstrukcijom jednog Fab-mAb31 (sl. 8A) ili konstrukcijom duplog Fab-mAb31 (sl. 8B). Samo dupla Fab-mAb31 konstrukcija smanjuje nivo ćelija izraženih na površini TfR.
Slika 9: In vivo praćenje pomeranja ćelije za TfR tretiran jednim Fab-mab31 ili dvostrukim Fab-mAb31. U ranim vremenskim periodima in vivo ispitivanja bojenja kapilara i plaka. I sFab-MAb31 (sl. 9A) i dFab-MAb31 (sl. 9B) obeležavaju vaskulaturu mozga 15 minuta nakon injekcije bez obzira na njihovu distribuciju. Osam sati nakon injekcije, sFab-MAb31 dolazi do parenhima i boji amiloidne plakove (strelice, sl. 9C) dok dFab-MAb31 ostaje u vaskulaturi mozga na način sličan kao i nakon 15 minuta (sl. 9D). Za dFab-MAb31 nema detekcije amiloidnih plakova u parenhimu.
Slika 10: In vivo praćenje pomeranja ćelije za TfR tretiran jednim Fab-mab31 ili dvostrukim Fab-mAb31. Da bi se iskontrolisao integritet svih konstrukcija koje se koriste u studiji, obavljeno je bojenje transgenskih kriosekcija mozga miša od 18 meseci pomoću MAb31 (sl. 10A), sFab-MAb31 (sl. 10B) ili dFab-MAB31 (sl. 10C). Sl. 10D prikazuje rezultat kontrole. Rezultati prikazuju da su sve 3 konstrukcije detektovale amiloidne plakove u mozgu transgenskog miša.
Slika 11: In vivo praćenje pomeranja ćelije za TfR tretiran jednim Fab-mab31. Konfokalna mikroskopija visoke rezolucije za in vivo tretirane uzorke prikazuje da sFab-MAb31 ne obeležava luminalnu stranu kapilara mozga već se zadržava u strukturama u obliku sudova koje prelaze luminalne membrane endotelnih ćelija i u okviru citosola endotelnih ćelija. Strelice na slici 11 označavaju sudove koji sadrže konstrukcije sFab-MAb31 na albuminalnoj strani nukleusa endotelnih ćelija. Ovi podaci prikazuju da oba sFab-MAb31 mogu da uđu u endotelne ćelije mozga i da pređu vaskulaturu i dostignu amiloidne plakove u okviru prostora parenhima u mozgu (Uporedite sa slikom 9A i C).
Slika 12: In vivo praćenje pomeranja ćelije za TfR tretiran dvostrukim Fab-mab31. Konfokalna mikroskopija visoke rezolucije za in vivo tretirane uzorke prikazuje da dFab-MAb31 ne obeležava luminalnu stranu kapilara mozga već se zadržava u strukturama u obliku sudova koje prelaze luminalne membrane endotelnih ćelija i u okviru citosola endotelnih ćelija. Strelice na slici 12 označavaju sudove oji sadrže konstrukcije dFab-MAb31 na albuminalnoj strani nukleusa endotelnih ćelija. Ovi podaci prikazuju da dFab-MAb31 može da uđe u endotelne ćelije mozga, ali tu biva zarobljen i ne može da prođe vaskulaturu i dostigne amiloidne plakove u okviru prostora parenhima u mozgu (Uporedite sa slikom 9B i D).
Slika 13: Izlaganje mozga i obeležavanje plaka nakon i.v. administracije. Sl. 13A: mAb31, dFab i sFab konstrukcije su intravenozno ubrizgavane u PS2APP transgenske životinje u količini 10 mg/kg, životinjama je obavljena perfuzija i žrtvovane su 8 sati nakon injekcije. Nije primećeno značajno povećanje u bojenju plaka za dFab u poređenju sa mAb31. Za sFab konstrukciju, detektovano je 55 puta veće bojenje plaka u odnosu na matični mAb31 na osnovu fluorescentnog intenziteta pri 555 nm od detekcije antitela. Reprezentativno imunohistohemijsko bojenje u korteksu mAb31 (sl. 13B), dFab (sl. 13C) i sFab (sl. 13D) 8 sati nakon injekcije. dFab prikazuje samo bojenje mikrosudova dok sFab boji amiloid-β plakove u velikom opsegu. Sl. 13E: Demonstracija da mala doza sFab konstrukcije (2,66 mg/kg) brzo i u velikoj meri dolazi do plakova u mozgu u poređenju sa 2 mg/kg i 10 mg/kg za mAb31. Ciljana aktivacija sFab konstrukcije je održiva tokom bar jedne nedelje nakon injekcije. Imunohistohemijsko bojenje prikazuje bojenje plaka za mAb31 na 2 mg/kg (sl. 13F) i sFab na 2,66 mg/kg (sl.13G) 7 dana nakon injekcije.
Slika 14: In vivo efikasnost hronične studije nosivosti plaka kod PS2APP miša tretiranog 14 nedelja i.v. injekcijama. Ciljano vezivanje plaka za date konstrukcije vezane za ostatke plaka na kraju studije prikazane su za malu dozu mAb31, srednju dozu mAb31, nisku dozu sFab i srednju dozu sFab u skladu sa tim (sl. 14A-D). Kvantitativna morfometrička analiza nakon imunohistohemijskog bojenja plakova prikazana je za korteks i hipokampus (sl. 14 E). Količina plaka kod životinja bez tretmana koje su žrtvovane u starosti od 4,5 meseca prikazana je na početnom nivou amilodoze na početku studije. Značajno smanjenje u broju plakova je evidentno nakon tretmana srednjom dozom sFab u poređenju sa progresivnim formiranjem plaka koji se vidi kod tretiranih životinja; trend smanjenog formiranja plaka pojavljuje se čak i pri niskim dozama sFab. Zbog toga, sFab konstrukcija značajno smanjuje broj plakova u korteksu i hipokampusu. Analiza veličine plaka otkriva smanjenje broja plakova, od čega se većina odnosi na male plakove. *p≤0,05, **p≤0,01, ***p≤0,001.
Slika 15: Multimer antitela sa delovima TfR scFab spojen sa Fc C-priključkom ne aktivira ADCC. NK92-posredno ubijanje eritroleukemijskih ćelija BA/F3 miša izmereno je preko kvantitativnog otpuštanja LDH. Samo multimerne konstrukcije sa TfR-vezivnim Fab ostatkom u “konvencionalnoj” “N-priključak na Fc” orijentaciji izazivaju značajan ADCC, dok su konstrukcije transportera za mozak u suprotnoj orijentaciji nečujne.
Sl. 16: scFab 8D3 usmereni na veze transferinskih receptora sa tri prepoznatljiva peptida u ekstracelularnom domenu transferinskih receptora miša. Vezivanje antitela 8D3 na 15mer peptide koji se preklapaju sa tri amino kiseline otkriveno je hemiiluminoescentnom detekcijom antitela inkubiranih na CelluSpot strani koja nosi imobilizovane mTfR peptide. Kutija: Peptidi br.373, 374 i 376 vezani sa 8D3 (Seq. Id. No.15, 16 i 17).
Detaljan opis definicija otelotvorenja pronalaska
"Krvno-moždana barijera" ili "KMB" odnosi se na fiziološku barijeru između perifernog krvotoka i mozga i kičmene moždine koja nastaje tesnim povezivanjem u endotelijalnim membranama plazme moždanih kapilara, stvarajući čvrstu barijeru koja ograničava transport molekula u mozak, čak i veoma malih molekula, kao što je urea (60 daltona). KMB u mozgu, krvno-moždinska barijera u kičmenoj moždini i krvno-retinalna barijera u retini predstavljaju granične kapilarne barijere u CNS-u, i ovde se zbirno pominju kao krvno-moždana barijera ili KMB. KMB takođe obuhvata krvno-CSF barijeru (horoidni pleksus), gde se barijera sastoji od ependimalnih ćelija a ne od kapilarnih endotelijalnih ćelija.
Dimerizacioni moguli sa ručicama u otvorima i njihova upotreba u inženjeringu antitela opisana je u delu Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Izdanje 2, broj 1, februar 1996, str.73-73(1)).
"Centralni nervni sistem" ili "CNS" odnosi se na kompleks nervnih tkiva koja kontrolišu telesne funkcije, i uključuje mozak i kičmenu moždinu.
"Receptor moždano krvne barijere" (skraćeno "KMB/R") je receptorni protein ekstracelularne membrane izražen na endotelnim ćelijama mozga koji ima sposobnost da prenosi molekule duž KMB ili da se koristi za transport egzogeno administriranih molekula. Primeri KMB/R ovde uključuju: transferinski receptor (TfR), insulinski receptor, receptor insulinu sličnog faktora rasta (IGF-R), lipoproteinske receptore male gustine, uključujući bez ograničavanja protein 1 koji je u vezi sa lipoproteinskim receptorom male gustine (LRP1) i protein 8 koji je u vezi sa lipoproteinskim receptorom male gustine (LRP8), kao i faktor rasta sličan epidermalnom faktoru rasta koji vezuje heparin (HB-EGF). Ovde je primer za KMB/R transferinski receptor (TfR).
“Entitet moždanog efektora” odnosi se na molekul koji treba da se transportuje u mozak preko KMB. Entitet efektora obično ima karakterističnu terapijsku aktivnost koja treba da se dovede do mozga. U entitete efektora spadaju lekovi za neurološke poremećaje i citotoksična sredstva, kao što su, npr. peptidi, proteini i antitela, konkretno, monoklonalna antitela ili njihovi delovi usmereni na cilj u mozgu.
"Monovalentni vezni entitet" odnosi se na molekul sposoban da se namenski veže i u režimu monovalentne veze na KMB/R. Krvno-moždani trasporter i/ili slične uređaje sa
1
trenutnim izumom karakteriše prisustvo jedne jedinice monovalentnog veznog entiteta, tj, krvno-moždanog transportera i/ili sličnog uređaja koji se sastoji od jedne jedinice monovalentnog veznog entiteta. Monovalentni vezni entitet pronalaska koji se opisuje uključuje, ali bez ograničenja na, proteine, polipeptide, peptide i delove antitela uključujući Fab, Fab', Fv delove, molekule antitela u jednom lancu kao što su npr. Fab sa jednim lancem, scFv. Monovalentni vezni entitet može na primer da bude protein kreiran pomoću najnovijih tehnologija kao što je fazni prikaz ili imunizacija. Monovalentni vezni entitet može da bude peptid. Monovalentni vezni entitet izuma sastoji se od jednog lanca Fab (scFab). U određenim prikazima, monovalentni vezni entitet sastoji se od CH2-CH3 Ig domena i jednog lanca Fab (scFab) usmerenog na receptor krvno-moždane barijere. scFab je spojen na kraj C-priključka CH2-CH3 Ig domena pomoću povezivača. U određenim prikazima, scFab je usmeren na transferinski receptor.
"Monovalentni režim vezivanja" odnosi se na specifično vezivanje KMB/R gde se interakcija između monovalentnog veznog entiteta i KMB/R odvija kroz jedan epitop. Monovalentni režim vezivanja sprečava dimerizaciju/multimerizaciju KMB/R usled interakcione tačke u jednom epitopu. Monovalentni režim vezivanja sprečava promenu intracelularnog sortiranja KMB/R.
Termin "epitop" uključuje bilo koju determinantu polipeptida koja ima sposobnost za određeno vezivanje za antitelo. U određenim slučajevima, determinanta epitopa uključuje hemijski aktivna površinska grupisanja molekula kao što su amino kiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u određenim slučajevima, može da ima posebne trodimenzionalne strukturalne karakteristike, i posebne karakteristike punjenja. Epitop je oblast antigena koja je vezana antitelom.
"Transferinski receptor" ("TfR") je transmembranski glikoprotein (molekulske mase oko 180.000) sastavljen od dve podjedinice vezane disulfidnom vezom (svaka ima prividnu molekulsku masu oko 90.000) koji učestvuje u prenosu gvožđa kod kičmenjaka. U jednoj realizaciji, ovde je TfR humani TfR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao u: Schneider et al. Nature 311: 675 - 678 (1984), na primer.
"Neurološki poremećaj", kao što je ovde upotrebljen, odnosi se na bolest ili poremećaj koji pogađa CNS i/ili koji ima etiologiju u CNS-u. Primeri bolesti ili poremećaja CNS-a uključuju, ali se ne ograničavaju na, neuropatiju, amiloidozu, kancer, bolest ili poremećaj oka, virusnu ili mikrobnu infekciju, upalu, ishemiju, neurodegenerativnu bolest, epilepsiju, poremećaje ponašanja i lizozomsku bolest nakupljanja. U svrhu ove prijave, podrazumevaće se da CNS uključuje oko, koje je inače odvojeno od ostatka tela krvno-retinalnom barijerom.
Specifični primeri neuroloških poremećaja uključuju, ali se ne ograničavaju na, neurodegenerativne bolesti (uključujući, ali se ne ograničavajući na, demenciju sa Levijevim telima, postpolio sindrom, Šaj-Dregerov sindrom, olivopontocerebelarnu atrofiju, Parkinsonovu bolest, multiplu sistemsku atrofiju, strijatonigralnu degeneraciju, tauopatije (uključujući, ali se ne ograničavajući na, Alchajmerovu bolest i supranuklearnu paralizu), prionske bolesti (uključujući, ali se ne ograničavajući na, goveđu spongiformnu encefalopatiju, skrepi, Krojcfeld-Jakobov sindrom, kuru, Gerstman-Štrojsler-Šajnkerovu bolest, spongiformnu encefalopatiju kod jelena i fatalnu familijarnu insomniju), bulbarnu paralizu, bolest motornog neurona i heterodegenerativne poremećaje nervnog sistema (uključujući, ali se ne ograničavajući na, Kanavanovu bolest, Hantingtonovu bolest, neuronsku ceroidnu lipofuscinozu, Aleksanderovu bolest, Turetov sindrom, Menkesov sindrom lomljive kose, Kokejnov sindrom, Halervorden-Špacov sindrom, Laforinu bolest, Retov sindrom, hepatolentikularnu degeneraciju, Leš-Nihanov sindrom i Unferiht-Lundborgov sindrom), demenciju (uključujući, ali se ne ograničavajući na, Pikovu bolest i spinocerebelarnu ataksiju), kancer (npr. CNS-a i/ili mozga, uključujući metastaze na mozgu nastale od kancera koji se nalazi na nekom drugom mestu u telu).
"Lek za neurološki poremećaj" je lek ili terapeutski agens kojim se leči jedan ili više neuroloških poremećaja. Lekovi za neurološki poremećaj iz ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, antitela, peptide, proteine, prirodne ligande jednog ili više CNS ciljeva, modifikovane verzije prirodnih liganda jednog ili više CNS ciljeva, aptamere, inhibitorne nukleinske kiseline (tj. male inhibitorne RNK (siRNA) i RNK molekule oblika male ukosnice (shRNA)), ribozime i male molekule, ili aktivne fragmente svega gore nabrojanog. Primeri lekova za neurološki poremećaj iz pronalaska opisani su ovde, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: antitela, aptamere, proteine, peptide, inhibitorne nukleinske kiseline i male molekule i aktivne fragmente svega što je prethodno nabrojano, koji su ili sami po sebi CNS antigen ili ciljni molekul kao što je, ali bez ograničavanja, amiloid prekursor protein ili njegovi delovi, amiloid beta, beta-sekretaza, gama-sekretaza, tau, alfa-sinuklein, parkin, hantingtin, DR6, presenilin, ApoE, markeri glioma ili drugih CNS kancera i neurotrofini, ili ih specifično prepoznaju i/ili deluju na njih (tj. inhibiraju, aktiviraju ili detektuju). Neograničavajući primeri lekova za neurološke poremećaje i odgovarajućih poremećaja za čije lečenje mogu da se koriste: Neurotrofni faktor nastao u mozgu (BDNF), hronična povreda mozga (Neurogeneza), Fibroblastni faktor rasta 2 (FGF-2), Rak anti-epidermalnog receptora za faktor rasta mozga, (EGFR)-antitelo, Neurološki faktor glialne ćelijske linije nastao usled Parkinsonove bolesti, (GDNF), Neurotrofni faktor nastao u mozgu (BDNF), Amiotrofna lateralna skleroza, depresija, poremećaj Lizosomalnog enzima, poremećaji Lizosomalnog skladišta u mozgu, Ciliarni neurotrofni faktor (CNTF) Amiotrofna lateralna skleroza, Neuregulin-1 šizofrenija, Anti-HER2 antitelo (npr. trastuzumab) metastaze na mozgu usled HER2-pozitivnog raka.
"Agens za imidžing" je jedinjenje koje ima jednu ili više osobina koje dopuštaju da se njegovo prisustvo i/ili lokacija detektuju direktno ili indirektno. Primeri takvih agenasa za imidžing uključuju proteine i jedinjenja sa malim molekulom, koji u sebi sadrže obeleženi deo koji omogućava detekciju.
"CNS antigen" ili "cilj u mozgu" je antigen i/ili molekul eksprimiran u CNS-u, uključujući mozak, koji može biti cilj za antitelo ili mali molekul. Primeri takvih antigena i/ili molekula uključuju, bez ograničenja: beta-sekretazu 1 (BACE1), amiloid beta (Abeta), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2), Tau, apolipoprotein E4 (ApoE4), alfa-sinuklein, CD20, hantingtin, prionski protein (PrP), ponovljena kinaza bogata leucinom 2 (LRRK2), parkin, presenilin 1, presenilin 2, gama sekretazu, receptor smrti 6 (DR6), amiloid prekursor protein (APP), p75 neurotrofinski receptor (p75NTR) i kaspazu 6. U jednom prikazu, antigen je BACEI.
Protein "nativne sekvence" se ovde odnosi na protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu proteina koji se nalazi u prirodi, uključujući varijante proteina koje postoje u prirodi. Termin kao što je ovde upotrebljen uključuje protein kao izolovan iz prirodnog izvora ili proizveden rekombinacijom.
Termin „antitelo” je ovde upotrebljen u najširem smislu i specifično pokriva monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) nastala od najmanje dva netaknuta antitela i fragmente antitela, dokle god pokazuju željenu biološku aktivnost.
"Fragmenti antitela" ovde uključuju deo netaknutog antitela koji zadržava sposobnost da veže antigen. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente; dvojna antitela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela, kao što su Fab sa jednim lancem (scFab), scFv i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela. Format “Fab sa jednim lancem” je npr. opisan u Hust M. et al. BMC Biotechnol.2007 Mar 8;7:14.
Naziv “monoklonsko antitelo”, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo, dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, t.j., pojedinačna antitela, koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, s izuzetkom mogućih varijanti koje se mogu razviti tokom proizvodnje, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita
1
antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Pored specifičnosti, prednost monoklonskih antitela je što nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima. Reč "monoklonska" ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela, koja bi se koristila u skladu sa ovim pronalaskom, mogu biti izrađena hibridoma postupkom, koji su prvi opisali Köhler i saradnici u Nature, 256:495 (1975), ili se mogu izaditi postupcima rekombinovanja DNK (vidi, npr., U.S. Patent No. 4,816,567). „Monoklonska antitela” se takođe mogu izolovati iz kolekcije antitela faga, pomoću tehnika opisanih u npr.: Clackson i dr., Nature 352:624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991). Specifični primeri monoklonskih antitela ovde uključuju himerna antitela, humanizovana antitela i humana antitela, uključujući i njihove fragmente koji vezuju antigen. Monoklonska antitela ovde specifično uključuju „himerna” antitela (imunoglobuline), kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od određenih vrsta, ili koji pripadaju naročitoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od drugih vrsta, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde obuhvataju „primatizovana” antitela, koja sadrže antigen-vezujuće sekvence varijabilnog domena, izvedene iz nehumanih primata (npr. majmun iz starog sveta, kao što je pavijan, rezus ili cinomolgus majmun) i sekvence humanog konstantnog regiona (US Pat. No.5,693,780).
„Humanizovani” oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) kod kojih su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona nehumane vrste (donorsko antitelo), kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim nehumanim ostacima. Nadalje, humanizovana antitela mogu da uključe ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Te modifikacije su načinjene kako bi se dodatno preradilo dejstvo antitela. U principu, humanizovano antitelo će obuhvatati suštinski sve od bar jednog, a tipično dva, varijabilna domena, kod kojih svi ili suštinski svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima ne-humanog imunoglobulina, i svi ili suštinski svi FR-ovi su od sekvence humanog imunoglobulina, osim FR supstitucije(a), kao što je gore navedeno. Humanizovano antitelo će opciono takođe da sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina, tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
2:593-596 (1992).
Ovde je "humano antitelo" ono koje sadrži strukturu aminokiselinske sekvence koja odgovara strukturi aminokiselinske sekvence antitela koje može da se dobije od humane B-ćelije, i uključujuje antigen-vezujuće fragmente humanih antitela. Takva antitela mogu se identifikovati ili napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali bez ograničenja na: proizvodnju pomoću transgenskih životinja (npr, miš) koje imaju sposobnost, nakon imunizacije, da proizvedu ljudska antitela u odsustvu proizvodnje endogenskog imunoglobina (pogledajte, npr, Jakobovits et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993); i US Patent Nos. 5,591,669, 5,589,369 i 5,545,807)); izbor iz biblioteka za prikaz faga koje izražavaju ljudska antitela ili delove ljudskih antitela (pogledajte, na primer, McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990); Johnson et al, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al, EMBO J.12:725-734 (1993);US Patent Nos.5,565,332 and 5,573,905); generisanje preko in vitro aktiviranih B ćelija (pogledajte US Patents 5,567,610 i 5,229,275); i izolaciju od ljudskog antitela koje proizvodi hibridomasu.
"Multispecifično antitelo" je ovde antitelo koje ima vezujuće specifičnosti za najmanje dva različita epitopa. Multispecifična antitela data kao primer mogu da vežu i KMB-R i moždani antigen. Multispecifična antitela mogu se pripremiti kao kompletna antitela ili kao fragmenti antitela (npr. F(ab’)2 bispecifična antitela). Dizajnirana antitela sa dva, tri ili više (npr. četiri) funkcionalna antigen vezujuća mesta su takođe razmatrana (pogledajte npr. US Appln No. US 2002/0004587 A1, Miller et al.). Multispecifična antitela mogu se pripremiti kao kompletna antitela ili kao fragmenti antitela.
Antitela ovde uključuju "varijante aminokiselinskih sekvenci" sa izmenjenom antigenvezujućom ili biološkom aktivnošću. Primeri takvih izmena aminokiselina uključuju antitela sa povećanim afinitetom prema antigenu (npr. "afinitetno sazrela" antitela) i antitela sa izmenjenim Fc regionom, ukoliko je prisutan, npr. sa izmenjenom (povećanom ili smanjenom) ćelijskom citotoksičnošću koja zavisi od antitela (ADCC) i/ili komplementno zavisnom citotoksičnošću (CDC) (pogledajte, na primer, WO 00/42072, Presta, L. i WO
1
99/51642, Iduosogie et al.); i/ili povećan ili smanjen poluživot u serumu (pogledajte, na primer, WO00/42072, Presta, L.).
"Afinitetno modifikovana varijanta" ima jedan ili više supstituisanih hipervarijabilnih regiona ili okvirnih ostataka matičnog antitela (npr. matičnog himernog, humanizovanog ili humanog antitela) koji menjaju (povećavaju ili smanjuju) afinitet. U jednoj realizaciji, rezultujuća varijanta(e) izabrana za dalji razvoj imaće smanjen afinitet prema KMB-R-u, prema predmetnom pronalasku. Pogodan način za stvaranje takvih supstitucionih varijanti koristi displej faga. Ukratko, nekoliko lokacija hipervarijabilnog regiona (npr. 6–7 mesta) je mutirano kako bi se dobile sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Tako nastale varijante antitela na monovalentan način se izlažu na česticama sa filamentnim fagom kao fuzije sa gen III proizvodom MI3 koji se nalazi u svakoj čestici. Varijante izložene fagima se onda ispituju da se odredi njihova biološka aktivnost (npr. afinitet vezivanja). Da bi se odredili kandidati za mesta hipervarijabilnog regiona koja će se modifikovati, može da se izvrši alanin skenirajuća mutageneza, kako bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnih regiona koji znatno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti od koristi da se analizira kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo, kako bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i njegovog cilja. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci predstavljaju kandidate za supstituciju, prema tehnikama koje su ovde detaljno izložene. Kada se takve varijante naprave, panel varijanti se podvrgava skriningu, i antitela sa izmenjenim afinitetom mogu da se izaberu za dalji razvoj.
Ovde antitelo može biti "varijanta glikozilacije" tako da svaki ugljovodonik vezan za Fc region, ako je prisutan, bude izmenjen. Na primer, antitela sa zrelom ugljovodoničnom strukturom koja nema fukozu vezanu za Fc region antitela opisana su u: US Pat Appl No US 2003/0157108 (Presta, L.). Pogledajte takođe US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Antitela sa bisektnim N-acetilglukozaminom (GlcNAc) u ugljenim hidratima povezanim na Fc oblast antitela imaju referencu u WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. i US Patent No. 6,602,684, Umana et al. Antibodies with at least one galactose residue in the oligosaccharide attached to an Fc region of the antibody are reported in WO 1997/30087, Patel et al. See, also, WO 1998/58964 (Raju, S.) i WO 1999/22764 (Raju, S.) koji se odnosi na antitela sa izmenjenim ugljenim hidratom povezanim na određenu Fc oblast. Pogledajte takođe US 2005/0123546 (Umana et al.) koji opisuje antitela sa modifikovanom glikozilacijom. Termin „hipervarijabilni region” kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona za određivanje komplementarnosti” ili
1
„CDR” (npr. ostaci 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenulakog lanca i oko 31-35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Rabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/ili one ostatke iz „hipervarijabilne petlje” (npr. ostaci 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u domenu promenljivog lakog lanca i 26-32 (HI), 52A-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Chothia i Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987)). „Okvirni” ili „FR” ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona kao što su ovde definisani.
"Kompletno antitelo" je ono koje sadrži antigen-vezujući varijabilni region, kao i konstantni domen lakog lanca (CL) i konstantne domene teškog lanca, CH1, CH2 i CH3. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence.
"Golo antitelo" je antitelo (kao što je ovde definisano) koje nije konjugovano sa heterolognim molekulom, kao što je citotoksični deo, polimer ili radiološka oznaka.
"Efektorske funkcije" antitela odnose se na one biološke aktivnosti koje se pripisuju Fc regionu (Fc region nativne sekvence ili varijanta aminokiselinske sekvence Fc regiona) antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju C1q vezivanje, komplementarno zavisnu citotoksičnost (CDC), vezivanje Fc receptora, ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), itd. U jednoj realizaciji, ovde antitelo suštinski nema efektorsku funkciju.
Termin “antitelno-zavisna ćelijska citotoksičnost (ADCC)” odnosi se na lizu ljudskih ciljanih ćelija od strane antitela u prisustvu efektornih ćelija. Termin "komplementarnozavisna citotoksičnost (CDC)" označava proces iniciran vezivanjem faktora komplementa C1q za Fc deo većine potklasa IgG antitela. Vezivanje C1q na antitelo događa se usled definisanih interakcija protein-protein na takozvanoj lokaciji za vezivanje. Takvi Fc delovi lokacije za vezivanje poznati su u struci. Takvi Fc delovi lokacije za vezivanje su, npr, prepoznatljive po amino kiselinama L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 i P329 (numeracija u odnosu na EU indeks za Rabat). Antitela iz potklase IgG1, IgG2 i IgG3 obično pokazuju komplementarnu aktivaciju uključujući vezivanje C1q i C3, dok IgG4 ne aktivira sistem komplementa i ne vezuje C1q i /iliC3.
U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, kompletna antitela mogu biti raspoređena u različite "klase". Postoji pet glavnih klasa kompletnih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih može biti dalje podeljeno na “podklase” (izotipovi), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog
1
lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela zovu se alfa, delta, epsilon, gama, i mi, respektivno. Podjedinične strukture i trodimenzione konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. Termin "rekombinantno antitelo", kao što je ovde upotrebljen, odnosi se na antitelo (npr. himerno, humanizovano ili humano antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment) koje eksprimira rekombinantna ćelija domaćin, koja sadrži nukleinsku kiselinu koja šifrira antitelo. Primeri "ćelije domaćina" za proizvodnju rekombinantnih antitela uključuju: (1) ćelije sisara, na primer, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), COS, ćelije mijeloma (uključujući Y0 i NSO ćelije), ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK), Hela i Vero ćelije; (2) ćelije insekata, na primer, sf9, sf21 i Tn5; (3) ćelije biljaka, na primer biljaka koje pripadaju rodu Nicotiana (npr. Nicotiana tabacum); (4) ćelije kvasca, na primer, onih koji pripadaju rodu Saccharomyces (npr. Saccharomyces cerevisiae) ili rodu Aspergillus (npr. Aspergillus niger); (5) bakterijske ćelije, na primer Escherichia, coli ćelije ili Bacillus subtilis ćelije, itd.
Kao što je ovde upotrebljeno, "specifično vezivanje" ili "specifično se vezuje za" odnosi se na antitelo koje se selektivno ili prvenstveno vezuje za antigen. Afinitet prema vezivanju se generalno određuje standardnim testom, kao što je Skačardova analiza, ili tehnika površinske plazmonske rezonance (npr. primenom BIACORE®).
"Antitelo koje se vezuje za isti epitop" kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više.
Termin "citotoksični agens", kao što se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At211, I1131, I1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante.
"Efikasna količina" agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
1
Termin "Fc region" ovde se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Fc sastoji se od CH2 i CH3 domena imunoglobina. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Termin “CH2-CH3 Ig entitet” na način na koji se koristi ovde odnosi se na entitet proteina dobijen iz imunoglobina CH2 ili CH3 domena. “CH2-CH3 Ig entitet” sastoji se od dva “CH2-CH3” polipeptida koji formiraju dimer. Imunoglobulin može da bude IgG, IgA, IgD, IgE ili IgM. U jednom prikazu, CH2-CH3 Ig entitet dobijen je iz IgG imunoglobulina i ovde je naveden pod nazivom “CH2-CH3 IgG entitet”. Termin uključuje i prirodni niz CH2-CH3 domena i varijantu CH2-CH3 domena. U jednom prikazu, “CH2-CH3 Ig entitet” potiče iz ljudskog teškog lanca CH2-CH3 IgG domena koji se širi od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog-terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u CH2-CH3 domenu regiona ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Imunokonjugat" je fuzioni protein predstavljene inovacije konjugovan sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali se ne ograničavajući na obeleživač, lek za neurološki poremećaj ili citotoksični agens.
Termin "linker" na način upotrebljen ovde označava hemijski linker ili linker jednog lanca peptida koji se kovalentno povezuje sa različitim entitetima transportera krvnomoždane barijere i/ili fuzionog proteina i/ili konjugata predmetnog pronalaska,. Linker na primer povezuje entitet moždanog efektora sa monovalentnim veznim entitetom. Na primer,
1
ako se monovalentni vezni entitet sastoji od CH2-CH3 Ig entiteta i scFab usmerenog na receptor krvno-moždane barijere, tada linker povezuje scFab na kraj C-priključka CH3-CH2 Ig entiteta. Linker koji povezuje entitet moždanog efektora sa monovalentnim veznim telom (prvi linker) i linker koji povezuje scFab na kraj C-priključka CH2-CH3 Ig domena (drugi linker) može da bude isti ili različit.
Peptidni linkeri sa jednim lancem, koji se sastoje od jedne do dvadeset aminokiselina povezanih peptidnim vezama, mogu da se koriste. U nekim realizacijama, aminokiseline su izabrane od dvadeset aminokiselina koje postoje u prirodi. U nekim drugim realizacijama, jedna ili više aminokiselina je izabrana između glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. U drugim realizacijama, linker je hemijski linker. U određenim realizacijama, navedeni linker je peptid sa jednim lancem sa nizom amino kiseline čija je dužina najmanje 25 amino kiselina, uz poželjnu dužinu od 32 do 50 amino kiselina. U jednom slučaju navedeni linker je (GxS)n sa G = glicinom, S = serinom, (x =3, n= 8, 9 ili 10 i m= 0, 1, 2 ili 3) ili (x = 4 i n= 6, 7 ili 8 i m= 0, 1, 2 ili 3), ako je moguće uz x = 4, n= 6 ili 7 i m= 0, 1, 2 ili 3, ako je moguće uz x = 4, n= 7 i m= 2. U jednom slučaju navedeni linker je (G4S)4(Seq. Id. br.17). U jednom slučaju navedeni linker je (G4S)6G2(Seq. Id. br.13).
Vezivanje može biti izvršeno pomoću raznovrsnih hemijskih linkera. Na primer, monovalentno vezno telo ili fuzioni protein i entitet moždanog efektora mogu se povezati pomoću raznovrsnih bifunkcionalnih agenasa za kuplovanje proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bisdiazonijum derivati (kao bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Linker može biti "raskidivi linker", koji olakšava oslobađanje entiteta efektora nakon isporuke u mozak. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar., Cancer Res.
52:127-131 (1992), U.S. Patent br.5.208.020).
Kovalentno vezivanje može biti direktno ili preko linkera. U pojedinim realizacijama, direktna veza je konstrukcijom proteinske fuzije (tj. genetskom fuzijom dva gena koji šifriraju monovalentno vezivno telo za KMB-R i entitet efektora i ekspresijom kao jedan protein). U pojedinim realizacijama, direktna veza je stvaranjem kovalentne veze između reaktivne grupe na jednom od dva dela monovalentnog veznog tela za KMB/R i
2
odgovarajuće grupe ili akceptora na entitetu moždanog efektora. U pojedinim realizacijama, direktna veza je modifikacijom (tj. genetskom modifikacijom) jednog od dva molekula koji treba da se vežu da se obuhvati reaktivna grupa (kao neograničavajući primeri, sulfhidrilna grupa ili karboksilna grupa) koja formira kovalentnu vezu sa drugim molekulom koji treba da se veže pod odgovarajućim uslovima. Kao jedan neograničavajući primer, molekul (tj. aminokiselina) sa željenom reaktivnom grupom (tj. cisteinskim ostatkom) može biti uveden u npr. monovalentno vezno telo prema KMB/R, i formirana disulfidna veza sa neurološkim lekom. Postupci za kovalentno vezivanje nukleinskih kiselina za proteine takođe su poznati u struci (tj. foto umrežavanje, pogledajte, npr. Zatsepin et al.Russ. Chem. Rev. 74: 77-95 (2005)) Konjugacija može takođe da se obavi pomoću različitih linkera. Na primer, monovalentno vezno telo i entitet efektora mogu se povezati pomoću raznovrsnih bifunkcionalnih agenasa za kuplovanje proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Peptidni linkeri, koji se sastoje od jedne do dvadeset aminokiselina povezanih peptidnim vezama, mogu takođe da se koriste. U nekim takvim realizacijama, aminokiseline su izabrane od dvadeset aminokiselina koje postoje u prirodi. U nekim drugim takvim realizacijama, jedna ili više aminokiselina je izabrana između glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Linker može biti "raskidivi linker", koji olakšava oslobađanje entiteta efektora nakon isporuke u mozak. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar., Cancer Res. 52:127-131 (1992), U.S. Patent br.
5.208.020).
"Obeleživač" je ovde marker povezan sa fuzionim proteinom, koji se koristi za detekciju ili imidžing. Primeri takvih obeleživača uključuju: radioobeleživač, fluorofor, hromofor ili afinitetnu oznaku. U jednoj realizaciji, obeleživač je radioobeleživač upotrebljen za medicinsko snimanje, na primer tc99m ili 1123, ili spin obeleživač za nuklearnu magnetnu rezonancu (NMR) (takođe se zove magnetna rezonanca, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan, gvožđe, itd. "Pojedinac" ili "ispitanik" je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U nekim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
"Izolovano" antitelo je ono koje je izdvojeno iz komponente svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reverzno faznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman i sar., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Termin "uputstvo za upotrebu" koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
Termin "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat, koji je u takvom obliku da omogućuje da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome bi se formulacija primenjivala.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na sastojak farmaceutske formulacije, koji nije aktivni sastojak, koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali se ne ograničava na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Kao što je ovde upotrebljeno, "lečenje" (i gramatičke varijacije, kao što je "lečiti") se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali se ne ograničavaju na, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti, ili da uspore napredovanje bolesti.
Smeše i postupci
Postupci i proizvodi predmetnog pronalaska koriste ili primenjuju transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili fuzioni protein koji se vezuje za KMB/R. KMB/R antigen koji se koristi za proizvodnju ili za pregled za monovalentno vezno telo može biti, na primer, rastvorljivi oblik date porcije (npr. ekstraćelijski domen) koji sadrži željeni epitop. Alternativno, ili dodatno, ćelije koje eksprimiraju KMB-R na svojoj ćelijskoj površini mogu da se upotrebe za stvaranje ili skrining monovalentnog vezivnog tela. Drugi oblici KMB/R korisni za dobijanje monovalentnog vezivnog tela biće jasno vidljivi stručnjacima za ovu oblast. Primeri KMB/R ovde uključuju transferinski receptor (TfR), insulinski receptor, receptor insulinu sličnog faktora rasta (IGF-R), protein 1 koji je u vezi sa lipoproteinskim receptorom male gustine (LRP1) i LRP8 itd, i faktor rasta sličan epidermalnom faktoru rasta koji vezuje heparin (HB-EGF).
Prema predmetnom pronalasku, telo za "monovalentno vezivanje" na TfR je izabrano na osnovu ovde iznetih podataka koji pokazuju da takva antitela pokazuju poboljšan prolaz u CNS (na primer, mozak). Da bi se identifikovala takva vezna tela, dostupne su različite analize za merenje monovalentnog veznog režima, uključujući, bez ograničenja: Skačardova analiza, ili tehnika površinske plazmonske rezonance (npr. primenom BIACORE®) i ovde opisana ispitivanja in vivo.
Ovaj pronalazak pruža postupak za upotrebu monovalentnog veznog tela za transport entiteta moždanog efektora kao što je, na primer, lek za neurološki poremećaj, kroz krvnomoždanu barijeru koja se sastoji od izabranog monovalentnog veznog tela sa panela polovina monovalentnih veznih tela u odnosu na KMB/R jer ima monovalentni vezni režim za KMB/R. Monovalentni vezni režim osigurava efikasni KMB prelaz za određene KMB/R bez pmetanja normalnog interćelijskog sortiranja receptora.
Za neuropatski poremećaj može biti izabran neurološki lek koji je analgetik, uključujući, ali se ne ograničavajući na, narkotik/opioidni analgetik (tj. morfin, fentanil, hidrokodon, meperidin, metadon, oksimorfon, pentazocin, propoksifen, tramadol, kodein i oksikodon), nesteroidni anti-inflamatorni lek (NSAIL) (tj. ibuprofen, naproksen, diklofenak, diflunisal, etodolak, fenoprofen, flurbiprofen, indometacin, ketorolak, mefenaminska kiselina, meloksikam, nabumeton, oksaprozin, piroksikam, sulindak i tolmetin), kortikosteroid (tj. kortizon, prednizon, prednizolon, deksametazon, metilprednizolon i triamcinolon), antimigrenski agens (tj. sumatriptin, almotriptan, frovatriptan, sumatriptan, rizatriptan, eletriptan, zolmitriptan, dihidroergotamin, eletriptan i ergotamin), acetaminofen, salicilat (tj. aspirin, holin salicilat, magnezijum salicilat, diflunisal i salsalat), antiepileptik (tj. karbamazepin, klonazepam, gabapentin, lamotrigin, pregabalin, tiagabin i topiramat), anestetik (tj. izofluran, trihlretilen, halotan, sevofluran, benzokain, hlorprokain, kokain, ciklometikain, dimetokain, propoksikain, prokain, novokain, proparakain, tetrakain, artikain, bupivakain, kartikain, sinhokain, etidokain, levobupivakain, lidokain, mepivakain, piperokain, prilokain, ropivakain, trimekain, saksitoksin i tetrodotoksin), i cox-2-inhibitor (tj. selekoksib, rofekoksib i valdekoksib). Za neuropatski poremećaj koji uključuje vrtoglavicu, može biti izabran neurološki lek koji je lek protiv vrtoglavice, uključujući, ali se ne ograničavajući na,
2
meklizin, difenhidramin, prometazin i diazepam. Za neuropatski poremećaj koji uključuje mučninu, može biti izabran neurološki lek koji je lek protiv mučnine, uključujući, ali se ne ograničavajući na, prometazin, hlorpromazin, prohlorperazin, trimetobenzamid i metoklopramid. Za neurodegenerativne bolesti može biti izabran neurološki lek koji je hormon rasta ili neurotrofni faktor; primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na neurotrofni moždani faktor (BDNF), nervni faktor rasta (NGF), neurotrofin-4/5, faktor rasta fibroblasta (FGF)-2 i druge FGF, neurotrofin (NT)-3, eritropoetin (EPO), faktor rasta hepatocita (HGF), epidermalni faktor rasta (EGF), transformišući faktor rasta (TGF)-alfa, TGF-beta, vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), cilijarni neurotrofni faktor (CNTF), glijalni neurotrofni faktor (GDNF), neurturin, trombocitni faktor rasta (PDGF), heregulin, neuregulin, artemin, persefin, interleukine, glijalni neurotrofni faktor poreklom iz ćelijskih linija (GFR), faktor stimulacije kolonija granulocita (CSF), CSF granulocita-makrofaga, netrine, kardiotrofin-1, ježeve, faktor inhibicije leukemije (LIF), midkin, pleiotrofin, koštane morfogenetičke proteine (BMP), netrine, saposine, semaforine i faktor matičnih ćelija (SCF). Za kancer može biti izabran neurološki lek koji je hemoterapeutski agens. Primeri hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilujuće agense, kao što je tiotepa i CYTOXAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfor-amid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite kao što je hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su endiinski antibiotici (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omegaI1 (pogledajte, npr. Agnew, Chem Intl. Ed. Engl,183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezane hromofore hromoproteina endiinskih antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što je metotreksat i 5-fluoruracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenale kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; maitanzinoide kao što je maitanzin i ansamitocine; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2’,2”-trihlortrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (“Ara-C”); tiotepa; taksoide, npr. TAXOL® paklitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM bez kremofora, nanočestičnu formulaciju paklitaksela dizajniranu pomoću albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) i TAXOTERE® doksetaksel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); hloranbucil; gemcitabin (GEMZAR®); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinske analoge kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platinu; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leukovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetlilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinonska kiselina; kapecitabin (XELODA®); farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore nabrojanog; kao i kombinacije dva ili više gorepomenutih jedinjenja, kao što je CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamid, doksorubicin,
2
vinkristin i prednizolon, i FOLFOX, što je skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATINTM) u kombaciji sa 5-FU i leukovovinom.
U ovu definiciju hemoterapeutskih agenasa takođe su uključeni anti-hormonski agensi čije dejstvo reguliše, smanjuje, blokira ili inhibira dejstvo hormona koji mogu da podstiču rast kancera, i često su u obliku sistemskog lečenja, ili lečenja za ceo organizam. Oni takođe mogu biti hormoni. Primeri uključuju anti-estrogene i selektivne modulatore estrogenskog receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), EVISTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON® toremifen; anti-progesterone; regulatore smanjenja estrogenskog receptora (ERD); agense koji deluju tako što suzbijaju ili zatvaraju jajnike, na primer, agoniste hormona za oslobađanje leutinizujućeg hormona (LHRH) kao što je LUPRON® iELIGARD® leuprolid acetat, goserelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; druge anti-androgene kao što je flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol. Pored toga, takva definicija hemoterapeutskih agenasa uključuje bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), DIDROCAL® etidronat, NE-58095, ZOMETA® zoledronska kiselina/zoledronat, FOSAMAX® alendronat, AREDIA® pamidronat, SKELID® tiludronat ili ACTONEL® risedronat; kao i troksacitabin (citozinski analog 1,3-dioksolanskog nukleozida); antisens oligonukleotide, naročito one koji inhibiraju ekspresiju gena na signalnim putevima koji učestvuju u aberantnoj ćelijskoj proliferaciji, kao što je, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine, kao što je THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditozilat (ErbB-2 i EGFR dvojna tirozin kinaza inhibitor malih molekula, takođe poznata kao GW572016); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore navedenog.
Još jedna grupa jedinjenja koja mogu biti izabrana kao neurološki lekovi za lečenje raka ili prevenciju su anti-kancerogeni imunoglobulini (uključujući, ali bez ograničenja na, trastuzumab, bevacizumab, alemtuksumab, cetuksimab, gemtuzumab ozogamicin, ibritumomab tiuksetan, panitumumab i rituksimab). U nekim slučajevima, antitela u konugaciji sa toksičnim supstancama mogu se koristiti za ciljanje i ubijanje željenih ćelija (npr, ćelija raka), uključujući, ali bez ograničenja na, tositumomab sa radiološkom oznakom.
2
Za bolest ili poremećaj očiju, neurološki lek može biti izabran tako da bude antiangiogeni oftalmološki agens (tj. bevacizumab, ranibizumab i pegaptanib), oftalmološki glaukomski agens (tj. karbahol, epinefrin, demekarijum bromid, apraklonidin, brimonidin, brinzolamid, levobunolol, timolol, betaksolol, dorzolamid, bimatoprost, karteolol, metipranolol, dipivefrin, travoprost i latanoprost), inhibitor ugljene anhidraze (tj. metazolamid i acetazolamid), oftalmološki antihistaminik (tj. nafazolin, fenilefrin i tetrahidrozolin), očni lubrikant, oftalmološki steroid (tj. fluormetolon, prednizolon, loteprednol, deksametazon, difluprednat, rimeksolon, fluocinolon, medrizon i triamcinolon), oftalmološki anestetik (tj. lidokain, proparakain i tetrakain), oftalmološki anti-infektiv (tj. levofloksacin, gatifloksacin, ciprofloksacin, moksifloksacin, hloramfenikol, bacitracin/polimiksin b, sulfacetamid, tobramicin, azitromicin, besifloksacin, norfloksacin, sulfisoksazol, gentamicin, idoksuridin, eritromicin, natamicin, gramicidin, neomicin, ofloksacin, trifluridin, ganciklovir, vidarabin), oftalmološki anti-inflamatorni agens (tj. nepafenak, ketorolak, flurbiprofen, suprofen, ciklosporin, triamcinolon, diklofenak i bromfenak), oftalmološki antihistaminik ili dekongestant (tj. ketotifen, olopatadin, epinastin, nafazolin, kromolin, tetrahidrozolin, pemirolast, bepotastin, nafazolin, fenilefrin, nedokromil, lodoksamid, fenilefrin, emedastin i azelastin). Za poremećaj povezan sa epileptičnim napadom može biti izabran neurološki lek koji je antikonvulziv ili antiepileptik, uključujući, ali se ne ograničavajući na, barbiturat antikonvulzive (tj. primidon, metarbital, mefobarbital, alobarbital, amobarbital, aprobarbital, alfenal, barbital, bralobarbital i fenobarbital), benzodiazepinske antikonvulzive (tj. diazepam, klonazepam, i lorazepam), karbamatne antikonvulzive (tj. felbamat), antikonvulzive inhibitore ugljene anhidraze (tj. acetazolamid, topiramat i zonisamid), dibenzazepinske antikonvulzive (tj. rufinamid, karbamazepin i okskarbazepin), antikonvulzive derivate masnih kiselina (tj. divalproeks i valproinska kiselina), analoge gama-aminobuterne kiseline (tj. pregabalin, gabapentin i vigabatrin), inhibitore ponovnog preuzimanja gama-aminobuterne kiseline (tj. tiagabin), inhibitore transaminaze gama-aminobuterne kiseline (tj. vigabatrin), hidantoinske antikonvulzive (tj. fenitoin, etotoin, fosfenitoin i mefenitoin), mešovite antikonvulzive (tj. lakozamid i magnezijum sulfat), progestine (tj. progesteron), oksazolidindionske antikonvulzive (tj. parametadion i trimetadion), pirolidinske antikonvulzive (tj. levetiracetam), sukcinimidne antikonvulzive (tj. etosuksimid i metsuksimid), triazinske antikonvulzive (tj. lamotrigin) i antikonvulzive derivate uree (tj. fenacemid i feneturid).
Kod lizozomske bolesti nakupljanja, neurološki lek može biti izabran tako da bude enzim, ili da podražava aktivnost enzima koji je oštećen zbog bolesti. Primeri rekombinantnih
2
enzima za lečenje poremećaja nakupljanja lizozoma uključuju, ali se ne ograničavaju na one koji su navedeni npr. u U.S. Patent Application publication no. 2005/0142141 (tj. alfa-L-iduronidaza, iduronat-2-sulfataza, N-sulfataza, alfa-N-acetilglukozaminidaza, N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza, beta-galaktozidaza, arilsulfataza B, beta-glukuronidaza, kisela alfaglukozidaza, glukocerebrozidaza, alfa-galaktozidaza A, heksozaminidaza A, kisela sfingomijelinaza, beta-galaktocerebrozidaza, beta-galaktozidaza, arilsulfataza A, kisela ceramidaza, aspartoacilaza, palmitoil-protein tioesteraza 1 i tripeptidil amino peptidaza1).
Za amiloidozu može biti izabran neurološki lek koji uključuje, ali se ne ograničava na, antitelo ili drugi vezujući molekul (uključujući, ali se ne ograničavajući na mali molekul, peptid, aptamer ili drugi vezivač proteina) koji se specifično vezuje za cilj izabran od: beta sekretaze, tau, presenilina, amiloid prekursor proteina ili njegovih delova, amiloid beta peptida ili njegovih oligomera ili fibrila, receptora smrti 6 (DR6), receptora za krajnje proizvode glikacije (RAGE), parkina i hantingtina; inhibitora holinesteraze (tj. galantamin, donepezil, rivastigmin i takrin); NMDA receptor antagonista (tj. memantin), agensa za iscrpljivanje monoamina (tj. tetrabenazin); ergoloid mezilata; antiholinergijskog antiparkinsonika (tj. prociklidin, difenhidramin, triheksilfenidil, benztropin, biperiden i triheksifenidil); dopaminergičkog antiparkinsonika (tj. entakapon, selegilin, pramipeksol, bromokriptin, rotigotin, selegilin, ropinirol, rasagilin, apomorfin, karbidopa, levodopa, pergolid, tolkapon i amantadin); tetrabenazina; anti-inflamatornog leka (uključujući, ali se ne ograničavajući na, nesteroidni anti-inflamatorni lek (tj. indometicin i druga gore nabrojana jedinjenja); hormona (tj. estrogen, progesteron i leuprolid); vitamina (tj. folat i nikotinamid); dimebolina; homotaurina (tj.3-aminopropansulfonska kiselina; 3APS); modulatora aktivnosti serotoninskog receptora (tj. ksaliproden); interferona i glukokortikoida.
Za virusne bolesti ili bolesti izazvane mikroorganizmima, neurološki lek može biti izabran iz grupe koja uključuje, ali se ne ograničava na, antivirusno jedinjenje (uključujući, ali se ne ograničavajući na, adamantanska antivirusna jedinjenja (tj. rimantadin i amantadin), antivirusni interferon (tj. peginterferon alfa-2b), antagonist receptora hemokina (tj. maravirok), inhibitor integraze (tj. raltegravir), inhibitor neuraminidaze (tj. oseltamivir i zanamivir), nenukleozidni inhibitor reversne transkriptaze (tj. efavirenz, etravirin, delavirdin i nevirapin), nukleozidni inhibitor reversne transkriptaze (tenofovir, abakavir, lamivudin, zidovudin, stavudin, entekavir, emtricitabin, adefovir, zalcitabin, telbivudin i didanozin), inhibitor proteaze (tj. darunavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, indinavir i sakvinavir), purinski nukleozid (tj. valaciklovir, famciklovir, aciklovir, ribavirin, ganciklovir, valganciklovir i cidofovir) i mešane antivirotike (tj.
2
enfuvirtid, foskarnet, palivizumab i fomivirsen)), antibiotik (uključujući, ali se ne ograničavajući na, aminopenicilin (tj. amoksicilin, ampicilin, oksacilin, nafcilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukoksacilin, temocilin, azlocilin, karbenicilin, tikarcilin, mezlocilin, piperacilin i bacampicilin), cefalosporin (tj. cefazolin, cefalksin, cefalotin, cefamandol, ceftriakson, cefotaksim, cefpodoksim, ceftazidim, cefadroksil, cefradin, lorakarbef, cefotetan, cefuroksim, cefprozil, cefaklor i cefoksitin), karbapenem/penem (tj. imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem i doripenem), monobaktam (tj. aztreonam, tigemonam, norkardicin A i tabtoksinin-beta-laktam, inhibitor beta-laktamaze (tj. klavulanska kiselina, tazobaktam i sulbaktam) u vezi sa drugim beta-laktamskim antibiotikom, aminoglikozid (tj. amikacin, gentamicin, kanamicin, neomicin, netilmicin, streptomicin, tobramicin i paromomicin), ansamicin (tj. geldanamicin i herbimicin), karbacefem (tj. lorakarbef), glikopeptide (tj. teikoplanin i vankomicin), makrolid (tj. azitromicin, klaritromicin, diritromicin, eritromicin, roksitromicin, troleandomicin, telitromicin i spektinomicin), monobaktam (tj. aztreonam), kvinolon (tj. ciprofloksacin, enoksacin, gatifloksacin, levofloksacin, lomefloksacin, moksifloksacin, norfloksacin, ofloksacin, trovafloksacin, grepafloksacin, sparfloksacin i temafloksacin), sulfonamid (tj. mafenid, sulfonamidohrisoidin, sulfacetamid, sulfadiazin, sulfametizol, sulfanilamid, sulfasalazin, sulfisoksazol, trimetoprim, trimetoprim i sulfametoksazol), tetraciklin (tj. tetraciklin, demeklociklin, doksiciklin, minociklin i oksitetraciklin), antineoplastični ili citotoksični antibiotik (tj. doksorubicin, mitoksantron, bleomicin, daunorubicin, daktinomicin, epirubicin, idarubicin, plikamicin, mitomicin, pentostatin i valrubicin) i mešovita antibakterijska jedinjenja (tj. bacitracin, kolistin i polimiksin B)), antifungalni agens (tj. metronidazol, nitazoksanid, tinidazol, hlorokvin, jodokvinol i paromomicin) i antiparazitik (uključujući, ali se ne ograničavajući na, kinin, hlorokvin, amodiakvin, pirimetamin, sulfadoksin, proguanil, meflokvin, atovakvon, primakvin, artemezinin, halofantrin, doksiciklin, klindamicin, mebendazol, pirantel pamoat, tiabendazol, dietilkarbamazin, ivermektin, rifampin, amfotericin B, melarsoprol, efornitin i albendazol). Za ishemiju, neurološki lek može biti izabran iz grupe koja uključuje, ali se ne ograničava na, trombolitik (tj. urokinazu, alteplazu, reteplazu i tenekteplazu), inhibitor agregacije trombocita (tj. aspirin, cilostazol, klopidogrel, prasugrel i dipiridamol), statin (tj. lovastatin, pravastatin, fluvastatin, rosuvastatin, atorvastatin, simvastatin, cerivastatin i pitavastatin) i jedinjenje koje poboljšava protok krvi ili elastičnost krvnih sudova, uključujući npr. lekove za krvni pritisak.
Za poremećaje ponašanja, neurološki lek može biti izabran od jedinjenja koja modifikuju ponašanje, uključujući, ali se ne ograničavajući na, atipični antipsihotik (tj.
2
risperidon, olanzapin, apripiprazol, kvetiapin, paliperidon, asenapin, klozapin, iloperidon i ziprasidon), fenotiazinski antipsihotik (tj. prohlorperazin, hlorpromazin, flufenazin, perfenazin, trifluoperazin, tioridazin i mesoridazin), tioksanten (tj. tiotiksen), mešoviti antipsihotik (tj. pimozid, litijum, molindon, haloperidol i loksapin), selektivni inhibitor preuzimanja serotonina (tj. citalopram, escitalopram, paroksetin, fluoksetin i sertralin), inhibitor preuzimanja serotonina-norepinefrina (tj. duloksetin, venlafaksin, desvenlafaksin, triciklični antidepresiv (tj. doksepin, klomipramin, amoksapin, nortriptilin, amitriptilin, trimipramin, imipramin, protriptilin i desipramin), tetraciklični antidepresiv (tj. mirtazapin i maprotilin), fenilpiperazinski antidepresiv (tj. trazodon i nefazodon), inhibitor monoamin oksidaze (tj. izokarboksazid, fenelzin, selegilin i tranilcipromin), benzodiazepin (tj. alprazolam, estazolam, flurazeptam, klonazepam, lorazepam i diazepam), inhibitor preuzimanja norepinefrina-dopamina (tj. bupropion), CNS stimulans (tj. fentermin, dietilpropion, metamfetamin, dekstroamfetamin, amfetamin, metilfenidat, deksmetilfenidat, lisdeksamfetamin, modafinil, pemolin, fendimetrazin, benzfetamin, fendimetrazin, armodafinil, dietilpropion, kafein, atomoksetin, doksapram i mazindol), anksiolitik/sedativ/hipnotik (uključujući, ali se ne ograničavajući na, barbiturat (tj. sekobarbital, fenobarbital i mefobarbital), benzodiazepin (kao što je gore opisano) i mešoviti anksiolitik/sedativ/hipnotik (tj. difenhidramin, natrijum oksibat, zaleplon, hidroksizin, hloral hidrat, aolpidem, buspiron, doksepin, eszopiklon, ramelteon, meprobamat i etklorvinol)), sekretin (pogledajte, npr. Ratliff-Schaub et al. Autism 9: 256-265 (2005)), peptid opioida (pogledajte, e.g., Cowen et al, J. Neurochem. 89:273-285 (2004)), i neuropeptid (pogledajte, npr. Hethwa et al. Am. J. Physiol.289: E301-305 (2005)).
Za upalu CNS-a, može biti izabran neurološki lek koji deluje na samu upalu (tj. nesteroidni anti-inflamatorni agens kao što je ibuprofen ili naproksen), ili koji leči osnovni uzrok upale (tj.anti-virusni ili antitumorski agens).
U drugoj realizaciji, entitet moždanog efektora je netaknuto ili antitelo pune dužine. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, netaknuta antitela mogu se svrstati u različite klase. Postoji pet glavnih klasa netaknutih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ. Podjedinične strukture i trodimenzione konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate. U jednoj realizaciji, netaknuto antitelo nema efektorsku funkciju.
Tehnike za stvaranje antitela su poznate, a primeri su dati u gornjem tekstu, u delu ovog dokumenta sa definicijama. U jednoj realizaciji, antitelo je himerno, humanizovano ili humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
Različite tehnike dostupne su za određivanje vezivanja monovalentnog vezivnog tela KMB/R. Jedan takav test je imunosorbentna analiza povezanih enzima (ELISA) za potvrđivanje sposobnosti za vezivanje na ljudski KMB/R (i antigen mozga). Prema ovom testu, ploče prevučene antigenom (npr. rekombinantnim sR/KMB) inkubiraju se sa uzorkom koji obuhvata monovalentno vezivno telo prema KMB/R i određuje se vezivanje antitela za antigen od interesa.
U jednom aspektu, monovalentno vezivno telo iz pronalaska ispitano je da se odredi njegova antigen vezujuća aktivnost, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, vestern blot, itd.
U jednom aspektu, monovalentno vezivno telo iz pronalaska je testirano na vezivanje jednog antigena prema KMB/R pomoću mapiranja epitopa rendgenskim određivanjem strukture.
Testovi za procenu unosa preko sistemske administracije pomoću transportera za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugata mogu se obaviti na način opisan u primerima ili kao što je poznato za transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konkretni konjugat. Merenje koncentracije u okviru prostora parenhima za CNS može takođe da se koristi za primer mikrodijalize ili postupak deplecije kapilara u kombinaciji sa ELISA ili merenjima radioaktivnosti obeleženog transportera za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugata.
Farmaceutske formulacije
Terapijske formulacije transportera za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugata korišćene u skladu sa ovim pronalaskom su pripremljene za čuvanje mešanjem sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remingtonove farmaceutske nauke 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide,
1
disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).
Ovde formulacije mogu takođe po potrebi da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja, opciono ona sa komplementarnim aktivnostima koje nemaju suprotan efekat jedna na drugu. Vrsta i efikasne količine takvih lekova, na primer, zavise od količine transportera za krvno moždanu barijeru i/ili konjugata koji se nalaze u formulaciji i kliničkih parametara ispitanika. O primerima takvih lekova govori se u nastavku.
Aktivni sastojci mogu takođe da se nalaze u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinske polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomima, albuminskim mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remingtonovim farmaceutskim naukama 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule. Primeri matrica sa trajnim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogele (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD 3.773.919), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamate , ne-razgradivi etilen-vinil acetat, kopolimer mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON DEPOT™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline, glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibutirnu kiselinu.
Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. U jednoj realizaciji, formulacija je izotonična.
Transporter za krvno moždanu barijeru i/ili konjugacija izuma može se koristiti u širokom spektru in vivo postupaka. Na primer, pronalazak obezbeđuje postupak za transport terapijskih jedinjenja kroz KMB pomoću transportera za krvno moždanu barijeru i/ili konjugata za KMB na način da monovalentno vezivno telo prenosi terapijsko jedinjenje spojeno sa njim kroz KMB. Na primer, pronalazak obezbeđuje postupak za transport terapijskog leka za neurološki poremećaj kroz KMB pomoću transportera za krvno moždanu barijeru i/ili konjugate za KMB na način da monovalentno vezivno telo prenosi lek za
2
neurološki poremećaj spojen sa njim kroz KMB. U jednoj realizaciji, KMB je ovde u sisaru (npr. čoveku), npr. onom koji ima neurološki poremećaj, uključujući, bez ograničenja: Alchajmerovu bolest (AD), moždani udar, demenciju, mišićnu distrofiju (MD), multiplu sklerozu (MS), amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS), cističnu fibrozu, Angelmanov sindrom, Lidlov sindrom, Parkinsonovu bolest, Pikovu bolest, Padžetovu bolest, kancer, traumatsku povredu mozga, itd.
U jednoj realizaciji, neurološki poremećaj je izabran od: neuropatije, amiloidoze, kancera (npr. koji uključuje CNS ili mozak), očne bolesti ili poremećaje, virusne ili mikrobne infekcije, upale (npr. CNS -a ili mozga), ishemije, neurodegenerativne bolesti, epilepsije, poremećaja ponašanja, lizozomske bolesti nakupljanja, itd.
Neuropatski poremećaji su bolesti ili abnormalnosti nervnog sistema koje se karakterišu neodgovarajućom ili nekontrolisanom nervnom signalizacijom, ili potpunim njenim nedostatkom, i uključuju, ali nisu ograničene na, hronični bol (uključujući nociceptivni bol), bol izazvan povredom telesnih tkiva, uključujući bol vezan za kancer, neuropatski bol (bol izazvan abnormalnostima nerava, kičmene moždine ili mozga) i psihogeni bol (u potpunosti ili uglavnom vezan za psihološki poremećaj), glavobolju, migrenu, neuropatiju, kao i simptome i sindrome koji često prate takve neuropatske poremećaje, kao što je vrtoglavica ili mučnina.
Amiloidoze su grupa bolesti i poremećaja vezanih za ekstracelularne proteinske naslage u CNS-u, uključujući, ali se ne ograničavajući na, sekundarnu amiloidozu, amiloidozu vezanu za godine, Alchajmerovu bolest (AD), blago kognitivno oštećenje (MCI), demenciju sa Levijevim telima, Daunov sindrom, naslednu cerebralnu hemoragiju sa amiloidozom (holandski tip); guamski Parkinson-demencija kompleks, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, Hantingtonovu bolest, progresivnu supranuklearnu paralizu, multiplu sklerozu; Krojcfeld Jakobovu bolest, Parkinsonovu bolest, prenosivu spongiformnu encefalopatiju, demenciju vezanu za HIV, amiotropnu lateralnu sklerozu (ALS), miozitis sa inkluzionim telima (IBM) i očne bolesti povezane sa beta-amiloidnim naslagama (tj. makularnu degeneraciju, optičke neuropatije vezane za drusen i kataraktu).
Kanceri CNS-a karakterišu se aberantnom proliferacijom jedne ili više ćelija CNS-a (tj. nervnih ćelija) i uključuju, ali se ne ograničavaju na, gliom, glioblastom multiforme, meningiom, astrocitom, akustični neurom, hondrom, oligodendrogliom, meduloblastome, gangliogliom, švanom, neurofibrom, neuroblastom i ekstraduralne, intramedularne ili intraduralne tumore.
Virusne ili mikrobne infekcije CNS-a uključuju, ali se ne ograničavaju na, infekcije virusima (tj. virus influence, HIV, poliovirus, rubela, ), bakterijama (tj. Neisseria sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Proteus sp., E. coli, S. aureus, Pneumococcus sp., Meningococcus sp., Haemophilus sp. i Mycobacterium tuberculosis) i drugim mikroorganizmima, kao što su gljivice (tj. kvasac, Cryptococcus neoformans), paraziti (tj. Toxoplasma gondii) ili amebe, koje dovode do patofiziologija CNS-a, uključujući, ali bez ograničavanja na, meningitis, encefalitis, mijelitis, vaskulitis i apsces, koji mogu biti akutni ili hronični. Upala CNS-a je upala izazvana povredom CNS-a, koja može biti fizička povreda (tj. usled nezgode, operacije, traume mozga, povrede kičmene moždine, potresa) ili povreda usled, ili u vezi sa jednom ili više drugih bolesti ili poremećaja CNS-a (tj. apsces, kancer, virusne ili mikrobne infekcije).
Ishemija CNS-a, kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na grupu poremećaja vezanih za aberantni protok krvi ili ponašanje krvnih sudova u mozgu, ili uzroke za to, i uključuje, ali se ne ograničava na: fokalnu moždanu ishemiju, globalnu moždanu ishemiju, moždani udar (tj. subarahnoidalnu hemoragiju i intracerebralnu hemoragiju) i aneurizmu.
Neurodegenerativne bolesti predstavljaju grupu bolesti i poremećaja povezanih sa gubitkom funkcije ili umiranjem nervnih ćelija u CNS-u, i uključuju, ali nisu ograničene na: adrenoleukodistrofiju, Aleksanderovu bolest, Alperovu bolest, amiotrofnu lateralnu sklerozu, ataksiju telangiektaziju, Batenovu bolest, Kokejnov sindrom, kortikobazalnu degeneraciju, degeneraciju izazvanu amiloidozom ili povezanu sa njom, Fridrajhovu ataksiju, frontotemporalnu lobarnu degeneraciju, Kenedijevu bolest, multiplu sistemsku atrofiju, multiplu sklerozu, primarnu lateralnu sklerozu, progresivnu supranuklearnu paralizu, spinalnu mišićnu atrofiju, transverzalni mijelitis, Refsumovu bolest i spinocerebelarnu ataksiju.
Epilepsije i epileptični poremećaji CNS-a obuhvataju neodgovarajuće i/ili nenormalno provođenje električnih impulsa u CNS-u, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: epilepsiju (tj. apsans napadi, atonični napadi, benigna dečja epilepsija, dečji apsans, klonični napadi, kompleksni parcijalni napadi, epilepsija frontalnog režnja, febrilni napadi, infantilni spazmi, juvenilna mioklonična epilepsija, juvenilna apsans epilepsija, Lenoks-Gastoov sindrom, Landau-Klefnerov sindrom, Dravetov sindrom, Otaharin sindrom, Vestov sindrom, mioklonični napadi, mitohondrijski poremećaji, progresivne mioklonične epilepsije, psihogeni napadi, refleksna epilepsija, Rasmusenov sindrom, jednostavni parcijalni napadi, sekundarno generalizovani napadi, epilepsija temporalnog režnja, toniklonični napadi, tonični napadi, psihomotorni napadi, limbična epilepsija, parcijalni napadi, generalizovani napadi, status epilepticus, abdominalna epilepsija, akinetički napadi, autonomni napadi, masivni
4
bilateralni mioklonus, katamenijalna epilepsija, iznenadni padovi, emocionalni napadi, fokalni napadi, gelastični napadi, Džeksonov marš, Laforina bolest, motorni napadi, multifokalni napadi, noćna epilepsija, fotosenzitivni napad, pseudo napadi, senzorni napadi, suptilni napadi, Rolandova epilepsija, napadi obustavljanja i vizuelno refleksni napadi).
Poremećaji ponašanja su poremećaji CNS-a koje karakteriše nenormalno ponašanje osoba koje su njime pogođene, i uključuju, ali nisu ograničeni na: poremećaje spavanja (tj. nesanicu, parasomnije, noćne more, cirkadijalne poremećaje vezane za spavanje i narkolepsiju), poremećaje raspoloženja (tj. depresiju, suicidalnu depresiju, anksioznost, hronične afektivne poremećaje, fobije, napade panike, opsesivno-kompulsivni poremećaj, poremećaj hiperaktivnosti i nedostatka pažnje (ADHD), poremećaj nedostatka pažnje (ADD), sindrom hroničnog umora, agorafobiju, posttraumatski stresni poremećaj, bipolarni poremećaj), poremećaje ishrane (tj. anoreksiju ili bulimiju), psihoze, razvojne poremećaje ponašanja (tj. autizam, Retov sindrom, Aspergerov sindrom), poremećaje ličnosti i psihotične poremećaje (tj. šizofreniju, deluzione poremećaje, i slično).
Lizozomski poremećaji nakupljanja su metabolički poremećaji koji su u nekim slučajevima vezani sa CNS-om ili imaju simptome specifične za CNS; takvi poremećaji uključuju, ali se ne ograničavaju na: Tej-Saksovu bolest, Gošeovu bolest, Fabrijevu bolest, mukopolisaharidozu (tip I, II, III, IV, V, VI i VII), poremećaj skladištenja glikogena, GM1-gangliozidozu, metahromatsku leukodistrofiju, Farberovu bolest, Kanavanovu leukodistrofiju i neuronske ceroidne lipofuscinoze tip 1 i 2, Niman-Pikovu bolest, Pompeovu bolest i Krabeovu bolest.
U jednom aspektu, transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat izuma koriste se kao da je lek dostavljen. U daljim aspektima, obezbeđen je transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat izuma za upotrebu u lečenju neurološke bolesti ili poremećaja (npr. Alchajmerove bolesti). U određenim aspektima, transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat izuma koriste se kada je obezbeđen postupak za lečenje. U određenim slučajevima, izum pruža transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat izuma za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima neurološko oboljenje ili poremećaj koji se sastoji od dsavanja pojedincu efikasne količine uz pomoć transportera za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugata izuma. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je opciono čovek.
Transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat iz pronalaska mogu da se koriste ili sami ili u kombinaciji sa drugim agensom u terapiji. Na primer, transporter za krvnomoždanu barijeru i/ili konjugat iz pronalaska mogu biti primenjeni zajedno sa bar jednim dodatnim terapeutskim agensom. U nekim realizacijama, dodatni terapeutski agens je terapeutski agens efikasan za lečenje istog ili različitog neurološkog poremećaja kao što je onaj za čije lečenje se koristi transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat. Primeri dodatnih terapeutskih agenasa uključuju, ali se ne ograničavaju na: različite neurološke lekove koji su gore opisani, inhibitore holinesteraze (kao što je donepezil, galantamin, rovastigmin i takrin), antagoniste NMDA receptora (kao što je memantin), inhibitore agregacije amiloid beta peptida, antioksidanse, modulatore γ-sekretaze, imitatore nervnog faktora rasta (NGF) ili NGF gensku terapiju, PPARγ agoniste, inhibitore HMS-CoA reduktaze (statine), ampakine, blokatore kalcijumskih kanala, antagoniste GABA receptora, inhibitore glikogen sintaze kinaze, intravenski imunoglobulin, agoniste muskarinskog receptora, modulatore nikotinskog receptora, aktivnu ili pasivnu imunizaciju amiloid beta peptidom, inhibitore fosfodiesteraze, antagoniste serotoninskog receptora i antitela protiv amiloid beta peptida. U pojedinim realizacijama, najmanje jedan dodatni terapeutski agens je izabran zbog svoje sposobnosti da ublaži jedno ili više neželjenih dejstava neurološkog leka.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena transportera za krvnomoždanu barijeru i/ili konjugata iz pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat iz pronalaska mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa drugim interventnim terapijama kao što su, ali bez ograničavanja, radijaciona terapija, bihejvioralna terapija ili druge terapije poznate u struci i prikladne za lečenje ili prevenciju datog neurološkog poremećaja. Transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat iz pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) mogu biti primenjeni na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralni, intrapulmonarni i intranazalni, i, ukoliko je poželjno lokalno lečenje, intraleziona primena. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu.
Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, monovalentnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Za upotrebu u terapeutskim postupcima, transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat iz predmetnog pronalaska formulišu se, doziraju i primenjuju na način saglasan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima. Transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat ne mora da bude, ali je opciono formulisan sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine u transporteru za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugatu koji je prisutan u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza za transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat iz pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, i odluke nadležnog lekara. Transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat se pogodno primenjuje na pacijenta jednokratno ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje i/ili prevenciju gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat predmetnog pronalaska. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, naznačeno time što kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Pronalazak opciono dalje sadrži uložak pakovanja sa uputstvom za lečenje neurološkog poremećaja kod ispitanika, pri čemu uputstvo ukazuje da lečenje pomoću transportera za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugata kao što je ovde objavljeno leči neurološki poremećaj, i opciono ukazuje da transporter za krvno-moždanu barijeru i/ili konjugat ima poboljšan prolaz kroz KMB usled svog monovalentnog režima vezivanja za KMB-R-u.
Primeri
Primer 1: Generisanje ekspresionih plazmida
Opis osnovnih/standardnih ekspresionih plazmida kod sisara
Željeni proteini su izraženi preko transientne transfekcije ljudskih embrionskih ćelija bubrega (HEK 293). Za izražavanje željenog gena/proteina (npr. Multimerni protein antitelo-Fab) koristi se transkripciona jedinica koja se sastoji od sledećih funkcionalnih elemenata:
• trenutnog ranog pojačivača i promotera iz humanog citomegalovirusa (P-CMV) sa intronom A,
• 5’-neprevedena oblast (5’UTR) ljudskog teškog imunoglobulinskog lanca, • signalni niz murinskog imunoglobulinskog teškog lanca (SS),
• gen/protein koji treba da se izrazi (npr. težak lanac antitela pune dužine), i • poliadenilacioni niz goveđeg hormona rasta (BGH pA).
Pored ekspresione jedinice/kasete u kojoj se nalazi gen koji treba da se izrazi, osnovni/standardni ekspresioni plazmid za sisare sadrži:
• poreklo replikacije iz vektora pUC18 koje dozvoljava replikaciju ovog plazmida u E. coil, i
• beta-laktamazni gen koji daje otpor ampicilinu u E. coli.
Kodiranje ekspresionih plazmida za fuziju sledećih antitela-scFab obavlja se uz konstruisane polipeptide/proteine:
Tetravalent Mab31-scFab(8D3) (sl. 1C) (Mab31 = ljudsko monoklonalno antitelo koje prepoznaje Abeta. INN iz Mab 31 = Gantenerumab)
Teški lanac (10132_pPM284_Mab31(IgG1)-(G4S)4-VL-Ck-(G4S)6-GG-VH-CH1) (Seq. Id. No.1) :
Sastav fuzionog proteina teškog lanca Mab31-scFab(8D3):
• Mab31 ljudski IgG1 teški lanac bez C-priključnog Lys
• Glicin Serin-linker
• Promenljivi domen lakog lanca (VL) varianta (L596V i L598I) iz miša 8D3 antitransferinsko antitelo (Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258)
• Ljudski C-kapa laki lanac
• GlicinSerin-linker
• Promenljivi domen teškog lanca (VH) iz miša 8D3 anti-transferinsko antitelo (Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258)
• Domen ljudskog teškog lanca IgG1 CH3
Laki lanac (5170-VL-Mab31-BsmI-L2-Neo-BGHpA) (Seq. Id. No.2)
Sastav Mab31 lakog lanca
- Mab31 ljudski Ckappa laki lanac
Trivalent Mab31-scFab(8D3) (sl.1B)
Knob teški lanac (10134_pPM287_Mab31(IgG1)_knob_SS_-(G4S)4-VL-Ck-(G4S)6-GG-VH-CH1) (Seq. Id. No.3)
Sastav ispupčenog fuzionog proteina teškog lanca Mab31-scFab(8D3)
• Mab31 ljudski IgG1 teški lanac bez C-priključnog Lys sadrži CH3 dugme mutaciju T366W i mutaciju S354C za formiranje dodatnog disulfidnog mosta
• GlicinSerin-linker
• Promenljivi domen lakog lanca (VL) varianta (L596V i L598I) iz miša 8D3 antitransferinsko antitelo (Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258)
• Human C-kapa laki lanac
• GlicinSerin-linker
• Promenljivi domen teškog lanca (VH) iz anti-transferinskog antitela miša 8D3 (Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258)
• Domen ljudskog teškog lanca IgG1 CH3
Teški lanac sa rupicom (10133 pPM286 Mab31(IgG1) rupica SS) (Seq. Id. No.4) Sastav fuzionog proteina teškog lanca sa rupicom Mab31
• Mab31 ljudski IgG1 teški lanac sadrži CH3mutacije rupice T366S, Y407V i L368A i mutaciju Y349C za formiranje dodatnog disulfidnog mosta
Laki lanac (5170-VL-Mab31-BsmI-L2-Neo-BGHpA) (Seq. Id. No.2)
Sastav Mab31 lakog lanca
- Mab31 ljudski Ckappa laki lanac
Primer 2: Pročišćavanje jedne ili dvostruke Mab31-scFab konstrukcije sFab i dFab
Lanci antitela su generisani prolaznom transfekcijom HEK293 ćelija (linija dobijena iz ljudskih embrionskih ćelija bubrega 293) kultivisana u F17 Medium (Invitrogen Corp.). Za transfekciju je korišćen "293-Fectin" transfekcioni reagens (Invitrogen). Lanci antitela izraženi su iz dva (tetravalentni Mab31-scFab(8D3)) ili tri (trivalentni Mab31-scFab(8D3)) različita plazmida, kodiranje za tetravalentni Mab31-scFab(8D3) teški lanac i odgovarajući Mab31 laki lanac, ili dugme i rupica trivalentnih Mab31-scFab(8D3) teških lanaca i Mab31 odgovarajućih lakih lanaca, u skladu sa tim. Dva ili tri plazmida su upotrebljena pri stopi za ekvimolarni plazmid nakon transfekcije. Transfekcije se obavljaju na način naveden u korisničkom uputstvu. Supernatantne ćelijske kulture koje sadrže antitelne fuzione proteine ubiraju se sadam dana nakon transfekcije. Supernatanti se čuvaju zamrznuti do purifikacije.
Proteini se pročišćavaju iz filtriranih supernatanta iz ćelijske kulture. Supernatanti se primenjuju na Sefarose kolonu proteina A (GE Healthcare) i ispiraju sa PBS pH 7,4. Elucija antitela obavlja se pomoću 100 mM Citate pufera pri pH 3,0 a nakon toga sledi momentalna neutralizacija uzorka na pH6,5. Nakon koncentracije, agregatni protein i drugi prateći proizvodi odvajaju se iz monomernih antitela pomoću ekskluzione hromatografije (Superdex
4
200; GE Healthcare) u 20 mM histidina, 140 mM NaCl, pH 6,0. Svaki deo se analizira na analitičkom SEC (TSK G3000SWXL) i na elektroforeznom kapilarnom sistemu sa osnovom čipa (CE-SDS, LabChipGX, Caliper) za kvantifikaciju nepotpuno sklopljenih molekula i drugih pratećih proizvoda. Delovi monomernog antitela bez pratećih proizvoda se izvlače. Nakon koncentrisanja upotrebom MILLIPOREAmicon Ultra (30 odsecanja za molekularnu težinu) centrifugalnog koncentratora, protein se skladišti na -80 °C. Analitička karakterizacija krajnjeg proizvoda obavlja se pomoću UV određivanja proteina, CE-SDS, ekskluzione hromatografije, masne spektrometrije i određivanja endotoksina.
Primer 3: ELISA podaci za vezivanje za konstrukcije jednog scFab (sFab) i dvostrukog scFab (dFab)
Vezivanje mAb31-8D3 konstrukcija na transferisnki receptor miša (mTfR) procenjeno je pomoću indirektnog ELISA. Sve do sada, rekombinovani mTfR (ekstraćelijski domen; Sino Biological) bio je oblagan Maxisorb mikrotiter pločom (Nunc) na 1 µg/mL u PBS na 4°C tokom noći. Nakon blokiranja u 1% Crotein-C/PBS (pufer za blokiranje; Roche) u trajanju od 1 h na RT i 4 pranja sa 0,1% Tween-20/PBS (pufer za pranje), mAb31-8D3 konstrukcije su dodavane u bunare u koncentraciji između 0,01 i 150 nM u puferu za blokiranje i inkubirani 1 h na RT. Nakon 4 koraka ispiranja, konstrukcije se detektuju dodavanjem anti-ljudskog-IgG-HRP (Jackson Immunoresearch) uz 1:10,000 razblaženje u blokadnom puferu (1 RT), a nakon toga slede 6 pranja i inkubacija u TMB (Sigma). Absorpcija se očitava na 450 nm nakon zaustavljanja razvoja boje uz 1 N HCl.
Sl. 3 prikazuje da vezivanje bivalentnog mAb31-8D3-dFab na mTfR može da se uporedi sa 8D3 IgG, dok monovalentna konstrukcija mAb31-8D3-sFab prikazuje smanjeni afinitet.
Funkcionalnost mAb31 potvrđena je preko ELISA. Ukratko, Abeta(1-40) je obložen na 7 µg/mL u PBS na Maxisorp ploče 3 dana na 37°C da bi se dobila fibrilarna Abeta, a zatim se suši 3 h na RT. Ploča je blokirana uz 1% Crotein C i 0,1% RSA u PBS (pufer za blokiranje) u trajanju od 1 h na RT, a zatim se ispira jednom uz pufer. mAb31 konstrukcije se dodaju pri koncentracijama do 100 nM u puferu za blokiranje i inkubiraju na 4°C preko noći. Nakon 4 koraka pranja, konstrukcije se detektuju na način prikazan iznad.
Sl. 4 prikazuje da se obe mAb31-8D3 konstrukcije (sFab i dFab) vezuju sa uporedivim afinitetom kao i nemodifikovani mAb31 na imobilizirana Abeta vlakna.
Primer 4: Samo jedinačne scFab konstrukcije prolaze kroz KMB i boje plakove Sekcioniranje mozga i imunohistihemijsko bojenje:
Mozgovi su pripremljeni nakon PBS perfuzije i sagitalni krio-delovi su isečeni između lateralno ~ 1,92 i 1,68 milimetara u skladu sa moždanim atlasom Paksinosa i Frenklina. Mozgovi su isečeni na nominalnu debljinu od 20 mikrona na -15°C pomoću Leica CM3050 S kriostata i postavljeni na ranije ohlađene staklene ploče (Superfrost plus, Menzel, Germany). Za svaki mozak, tri isečka odvojena 80 mikrona postavljaju se na istu ploču.
Isečci se rehidriraju u PBS na 5 minuta a zatim se potapaju u 100% aceton ohlađen na -20°C na 2 min. Svi sledeći koraci se obavljaju na sobnoj temperaturi. Ploče sa isečcima mozga ispiraju se sa PBS, pH 7,4 a zatim se obavlja blokiranje nespecifičnih lokacija za vezivanje sekvencionalnom inkubacijom u Ultra V bloku (LabVision) u trajanju od 5 minuta a zatim sledi PBS pranje i inkubacija u rastvoru power block (BioGenex) uz 2% normalnog kozijeg seruma u PBS u trajanju od 20 min. Pločice se direktno inkubiraju uz sekundarno antitelo, afinitetno pročišćeni koziji anti-humani IgG (poseban teški i laki lanac) u konjugaciji sa Alexa Fluor 555 bojom (br. A-21433, serija 54699A, molekularne sonde) pri koncentraciji od 20 microg/ml u 2% normalnog kozijeg seruma u PBS, pH 7,4 u trajanju od 1 sat. Nakon dužeg pranja uz PBS, lokalizacija plaka se procenjuje duplim označavanjem Abeta plakova inkubacijom uz BAP-2, Roche kućnog murinskog monoklonalnog antitela u odnosu na Abeta konjugovan sa Alexa Fluor 488 bojom na 0,5 microg /ml u trajanju od 1 sat u PBS uz power block rastvor (BioGenex) i 10% normalnog ovčijeg seruma. Nakon PBS pranja, autofluorescentnost lipofuscina se smanjuje gašenjem kroz inkubaciju u 4mM CuSO4 u 50 mM amonijum acetata, pH 5 u trajanju od 30 minuta. Nakon ispiranja ploča dvostruko destilovanom vodom, ploče se postavljaju u Confocal Matrix (Micro Tech Lab, Austria).
Konfokalna mikroskopija
Tri slike iz svakog dela mozga za svakog PS2APP-miša sa egionima koje sadrže plak u frontalnom korteksu (region primarnog motornog korteksa) se beleže. Snimci se beleže pomoću Leica TCS SP5 konfokalnog sistema sa postavkom otvora od 1 Airy.
Plakovi imunoobeleženi pomoću Alexa Fluor 488 boja se beleže u istim spektralnim uslovima (488nm pobuđaj i 500-554nm opseg prolazne emisije) uz podešenu jačinu i rastojanje fotometra (obično, 770 V i -0% u skladu sa tim) na 30% snage lasera.
Vezivanje sekundarnih Alexa Fluor 555 antitela na pristupnoj površini isečaka tkiva beleži se pri pobuđajnoj liniji lasera od 561 nm kroz otvor opsega od 570 do 725 nm koji pokriva talasni opseg emisija primenjenog detektovanog antitela. Podešavanja instrumenata su održavane kao konstanta za akviziciju snimaka da bi se omogućilo komparativno merenje gustine za testirana ljudska anti-Aβ antitela; konkretno, snaga lasera, brzina snimanja, jačina i razmak. Snaga lasera je podešena na 30% i podešavanja za PMT jačinu su obično 850 V uz nominalni razmak od 0%. Ovo obezbeđuje vizuelizaciju bledo i jako obojenih plakova uz isto podešavanje. Frekvencija akvizicije je na 400 Hz.
Konfokalni snimci zabeleženi su kao jedan optički sloj sa HCX PL APO 20x 0,7 IMM UV objektivom u vodi, uz rezoluciju od 512 x 512 piksela i optičku dubinu merenja u vertikalnoj osi koja je interaktivno kontrolisana da bi se osigurao snimak u okviru isečka tkiva. Amiloidni plakovi koji se nalaze u slojevima 2-5 frontalnog korteksa su snimljeni i obavljena je kvantifikacija fluorescentnih intenziteta.
Statistička analiza
Imunopozitivni regioni su vizuelizovani kao TIFF snimci i obrađeni za kvantifikaciju intenziteta fluorescentnosti i oblasti (mereno u pikselima) sa ImageJ verzija 1.45 (NIH). Za kvantifikaciju, pozadinski intenziteti od 5 su oduzeti na svakom snimku i pozitivni regioni manji od 5 kvadratnih piksela su izbačeni filtriranjem. Ukupan intenzitet fluorescentnosti određen je kao zbir intenziteta jednog individualnog pozitivnog regiona, a srednja vrednost intenziteta piksela izračunava se deljenjem ukupnog intenziteta brojem analiziranih piksela.
Prosečne i standardne vrednosti devijacija izračunavaju se pomoću Microsoft Excel-a (Redmond / WA, USA) iz svih merenih isopovršina dobijenih sa devet slika koje su snimane na tri različita dela za svaku životinju. Statistička analiza je obavljena pomoću Studentovog testa za grupno poređenje ili Man-Vitnijevog testa.
10 mg/ml mAb31 (konstrukta na slici 1A), 13,3 mg/kg sFab-mAb31 1 (konstrukcija na slici 1B) i 16,7 mg/kg dFAb-mAb31 (konstrukcija na slici 1C) je i.v. ubrizgano u rep miša i nakon 8 sati obavljena je perfuzija mozga uz PBS. Isečci su pripremljeni na način opisan iznad i obojeni sa kozijim anti-humanim IgG. Za konstrukciju mAb31 skoro da nema detekcije specifičnog signala (slika 4A). Za sFab-mAb31 je detektovano prošireno bojenje plaka i kapilara (sl.4B) dok je kod dFab-mAb31 primećeno samo bojenje kapilara (slika 4C). Ovo jasno pokazuje da je monovalentni režim vezivanja (sFab-mAb31) na transferinski receptor mnogo efikasniji ako se konstrukcija sprovede kroz endotelne ćelije mozga u KMB. Kvantifikacija bivalentnog veznog molekula (dFab-mAb31) prikazana je na slici 5. Podaci pokazuju da nema povećanja u bojenju plaka za dFab-mAb31 konstrukciju, postoji samo povećanje u ukupnom intenzitetu zbog kapilarne akumulacije konstrukcije.
Primer 5: Kvantifikacija izlaganja mozga uz scFab konstrukciju Eksperimentalna procedura prikazana je u primeru 4. Kvantifikacija sFab-mAb31 izlaganja mozga prikazana je na slici 6 korišćenjem 10 mg/ml mAb31 (konstrukcija na slici 1A) i 13,3 mg/kg sFab-mAb31 (konstrukcija na slici 1B). Već 8 sati nakon injekcije sFabmAb31 konstrukcije postoji veliki unos u poređenju sa mAb31 (povećanje za oko 55-puta). Slični podaci dobijaju se nakon 24 sata nakon doze korišćenjem 25 mg/ml mAb31
4
(konstrukcija na slici 1A) i 33,3 mg/kg sFab-mAb31 (konstrukcija na slici 1B). Slika 6 trakođe prikazuje transijentno bojenje kapilara od strane sFab-mAb31 što ilustruje ciljani efekat i prelazak kroz KMB tokom vremena. Svi ovi podaci su veoma značajni kao što je prikazano na slici 6.
Slika 7 prikazuje podatke za mAb31 (konstrukcija za sl. 1A) i sFab-mAb31 (konstrukcija na sl.1B) konstrukciju pri niskoj dozi. Opet, samo je sFab-mAb31 konstrukcija u mogućnosti da pređe endotelne ćelije mozga i da oboji plak u mozgu. Maksimalni efekat se dostiže već 8 sati nakon doze. Samo pri većoj dozi (10 mg/kg) i relativno dužem vremenu (7 dana) za mAb31 konstrukciju postoji trend za povećanje signala za vezivanje na Abeta plakove u mozgu (slika 7). Svi ovi podaci su veoma značajni što je prikazano na slici 7.
Primer 6: Specifična regulacija smanjenja površine ćelije TfR uz dvostruku scFab konstrukciju
Eksperimentalni detalji: bEnd3 ćelije kultivirane na ploči formata 6-bunarčića. 2-3 dana nakon konfluensnog tretmana sa dFab-mAb31, sFab-mAb31 ili netretirana kontrola nakon 24 sata. Zatim je medijum uklonjen/aspiriran i ćelije se ispiraju dva puta sa ledenim PBS (-MgCl)(-CaCl) (Gibco 14190-094), 5ml/bunaru. 1ml Tripsin/EDTA (Lonza CC-5012)/ bunar je dodat, inkubiran na 37°C u trajanju od 15 minuta sve dok se sve ćelije ne otkače. Zaustavljena reakcija uz 1ml tripsinskog neutralizacionog rastvora (ledeni) (Lonza CC-5002).
2ml Tripsin/EDTA rastvor za neutralizaciju prikupljen u 50ml Falcon cevi i čuvan na ledu. Centrifugacija ćelija na 4°C uz 1400 o/min. 10 minuta. Resuspenzija peleta u 50ml bEnd3 ledenom medijumu (DMEM-12 (Gibco 31331) 10%FBS). Centrifugacija ćelija na 4°C uz 1400 o/min. 10 minuta. Resuspenzija peleta u 3ml ledenom FACS-puferu (BD 554656). Broj ćelija: a) sFab cev (2,5x10<5>ćelija/ml) vijabilnost: 47%, b) dFab cev (3,18x10<5>ćelija/ml) vijabilnost: 55%, c) kont. cev (4,6x10<5>ćelija/ml) vijabilnost: 57%. FACS boenje 1x10<5>ćelija/ependorf epruveti uz distribuciju i centrifugu (4°C, 10 min, 1500 o/min). Aspiracija supernanta; a) CD71-PE (klon R17217-IgG2a monoklonalni) (santa kruz sc-52504) 20 microL antitela/peletu (zapremina bojenja 100 microL) dopunjena do 100 microL ledenim FACS-puferom (BD 554656), b) CD31-APC (BD 551262) (pacovski anti mišji IgG2a (200 microg/ml)) 5 microg antitelo/pelet (zapremina bojenja 100 microL) dopunjeno do 100 microL sa ledenim FACS-puferom (BD 554656), c) 8D3-Alexa488 (1:50) (zapremina bojenja 100 microL) razblažena u ledenom FACS-puferu (BD 554656), d) Kont. izotip za Alexa488, APC i PE (sve iz BD). Inkubacija u mračnom i ledenom prostoru 1 sat. Popunjeno do 1,5 ml sa ledenim FACS-puferom i centrifugirano (4°C, 10 min, 1500 o/min). Dva puta ispran pelet sa 1,5 ml ledenog FACS-pufera i finalno resuspendovani pelet u 500 microL PBS. Merenje FACS obavljeno je pomoću instrumenta Guava Flow Cytometry. Podaci prikazuju da se dupla konstrukcija (dFab) (slika 8B) pojavljuje da smanji regulaciju transferinskog receptora na površini ćelija. Ovo ne može da se detektuje u postavci analize uz jednu (sFab) konstrukciju (slika 8A) što znači da monovalentni režim vezivanja nema direktan uticaj na trafiking ćelija i recikliranje koje određuje količinu transferinskog receptora na ćeliskoj površini endotelnih ćelija mozga.
Primer 7: In vivo intracelularno sortiranje jedne i dvostruke scFab konstrukcije APPswe/PS2 transgenom mišu ubrizgana je i.v (injekcija u rep) uz sledeće konstrukcije MAb31 (10mg/kg), sFab-MAb31 (13,3 mg/kg) ili dFab-MAb31 (17,44 mg/kg). Ubrizgana doza prikazuje veličinu molekula uz MAb31 upotrebljen kao referenca. 15 minuta ili 8 sati nakon injekcije, miševi su eutanazirani pomoću CO2i tretirani na sledeći način. Desni kardijalni atrijum srca je isečen tako da je došlo do izlivanja krvi i perfuzionog rastvora. Leva kardijalna ventrikula je isečena i sonda br.10 je ubačena u aortu. Otprilike 20 ml PBS je ubrizgano (~10 ml/min, sobna temperatura), a nakon toga 30 ml 2% PFA u PBS. Mozgovi su izvađeni i inkubirani dodatnih 7 sati u istom perfuznom rastvoru. Upotrebljen je vibratom za kreiranje slobodnih isečaka mozga od 100 mikrona koji su upotrebljeni za imunofluorescentno bojenje. Isečci su prvo permeabilizovani i i blokirani pomoću PBS-0.3% Triton X-100-10% seruma magarca. Zatim su isečci inkubirani tokom noći uz indikovana primarna antitela razblažena u PBS-5% magarećem serumu. Sekundarna antitela molekularnih sondi upotrebljena su u skladu sa preporukama proizvođača. Snimci su napravljeni korišćenjem Leica SP5 konfokalnog mikroskopa, Imaris softver je upotrebljen za obradu snimaka i 3D rekonstrukciju.
Ovi podaci ilustruju unos periferno dodatog sFab-MAb31 i dFab-MAb31 od strane endotelnih moždanih ćelija. MAb31, sFab-MAb31 i dFab-MAb31 detektovani su pomoću kozijeg anti-humanog antitela spojenog sa Alexa 555. Kao što je prikazano na slici, sFab-MAb31 (sl. 9A) i dFab-MAb31 (sl. 9B) obeležavaju vaskulaturu mozga 15 minuta nakon injekcije bez obzira na njihovu distribuciju. Osam sati nakon injekcije, sFab-MAb31 dolazi do parenhima i boji amiloidne plakove (sl. 9C strelice) dok dFab-MAb31 (sl. 9D) ostaje u okviru muskulature mozga slično kao i nakon 15 minuta. Uz dFab-MAb31 nema detekcije amiloidnih plakova u parenhimu.
Slika 10: Da bi se iskontrolisao integritet svih konstrukcija koje se koriste u studiji, obavljeno je bojenje transgenskih kriosekcija mozga od 18 meseci pomoću MAb31 (sl.10A), sFab-MAb31 (sl. 10B) ili dFab-MAB31 (sl. 10C). Rezultati prikazuju da su sve 3 konstrukcije detektovale amiloidne plakove u mozgu transgenskog miša.
4
Slika 11-12: Konfokalna mikroskopija visoke rezolucije prikazuje da sFab (sl. 11) i dFab-MAb31 (sl. 12) ne obeležavaju luminalnu stranu kapilara mozga već se zadržava u strukturama u obliku sudova koje prelaze luminalnu membranu endotelnih ćelija i u okviru citosola endotelnih ćelija. Strelice na slici 11 i 12 označavaju sudove koji sadrže konstrukcije sFab ili dFab-MAb31 na albuminalnoj strani nukleusa endotelnih ćelija. Sve zajedno, ovi podaci ukazuju da i sFab-MAb31 i dFab-MAb31 mogu da uđu u endotelne ćelije ali samo sFab-MAb31 može da prođe vaskulaturu i dostigne amiloidne plakove.
Postupci i kompozicije iz pronalaska pružaju način za veliko povećanje udela antitela distribuiranih u CNS, i tako se lakše postižu terapeutske koncentracije u CNS-u. Postupci i kompozicije trenutnog izuma su nove i značajno povećavaju efikasnost prelaska kroz različite organele u okviru BEC-ova korišćenjem optimalne i neometane intracelularne rute/sortiranja za dolazak do albuminalne strane.
Primer 8: Režim monovalentnog vezivanja receptora koji je važan za prelazak KMB
Anti-Aβ monoklonalno antitelo mAb31 je veoma specifičan i potentan Aβ veznik za plak koji nam obezbeđuje snažno očitavanje za određivanje ciljanog angažovanja u parenhimu mozga. Mi smo koristili PS2APP dupli transgenski model amilodoze za ispitivanje količine izlaganja mozga za dve konstrukcije transportera za mozak u poređenju sa mAb31 matičnim antitelom. Tri varijante se ubrizgavaju intravenozno u dozi 10 mg/kg a stepen izlaganja mozga određuje se kvalifikacijom količine antitela prisutnih u plaku 8 sati nakon injekcije. Za dFab konstrukciju nema značajnog povećanja u bojenju plaka koje se može primetiti u poređenju sa mAb31 (sl. 13A). Ipak, za sFab konstrukciju postoji masivno povećanje u bojenju plaka u poređenju sa matičnim mAb31 antitelom. Ciljano angažovanje na amiloidnim plakovima je poboljšano za više od 50-puta za sFab konstrukciju na osnovu kvantifikacije fluorescentnog intenziteta korišćenjem obeleženog sekundarnog antitela. Dok je sFab konstrukcija prikazala ekstenzivno bojenje plaka (sl. 13D), dFab se mogao detektovati samo u mikrosudovima (sl.13C) što označava da dFab konstrukcije ciljaju i ulaze u mikrosudove mozga ali ne uspevaju da izađu sa albuminalne strane. Ispitivali smo ciljani kapacitet angažovanja za sFab konstrukciju pri niskoj dozi 2,66 mg/kg i produžili in vivo vreme izlaganja za do 7 dana. Maksimalno bojenje plaka je dostignuto nakon 8 sati, a zatim je usledilo dosledno vezivanje plaka tokom bar jedne nedelje nakon jedne injekcije (sl.13E).
U prethodnoj studiji, matični mAb31 je dostizao maksimalno vezivanje plaka 7 dana nakon injekcije. Kvantifikacija bojenja struktura mikrosudova označava da je lokalizacija sFab konstrukcije veomaprelazna na KMB, što prikazuje relativno brzu stopu pri kojoj
4
konstrukcije prelaze barijeru. Reprezentativni snimci za bojenje plaka za matično antitelo mAb31 uz 2 mg/kg 7 dana nakon injekcije (sl. 13F) i ekvimolarnu koncentraciju za sFab konstrukciju (sl. 13G) koja ilustruje povećanje u vezivanju plaka koje se ostvaruje u okviru konstrukcije sFab transportera za mozak. Konstrukcija sFab prikazuje samo manju kolokalizaciju sa lizosomalnim odeljenjem, što će verovatno prikazati normalan konstitutivni prenos TfR do lizozoma. Naše in vitro studije takođe prikazuju recikliranje i transcitozu sFab konstrukcije.
Gledajući zajedno, ova otkrića ukazuju da sFab konstrukcija ne ometa normalan prolaz TfR. Suprotno tome, dFab konstrukcija prikazuje snažnu kolokalizaciju sa lizosomalnim odeljenjem ali bez transcitozne aktivnosti, ni in vitro ni in vivo.
Primer 9: Povećana dostava antitela kroz KMB prevodi se u povećanu in vivo potenciju
U sledećem setu eksperimenata, pitali smo se da li značajno povećanje izlaganja mozga korišćenjem monovalentnog režima vezivanja poboljšava in vivo potenciju anti-Aβ antitela u studiji dugotrajnog lečenja. Injektirali smo svake nedelje sFab konstrukt i kontrolno matično antitelo mAb31 tokom tri meseca. U prethodnoj 5-mesečnoj studiji, pokazano je da terapeutsko antitelo mAb31 smanjuje opterećenje plaka na 20 mg/kg. Na osnovu podataka prikazanih na slici 14 izabrali smo dve niske doze da bismo istražili da li bi poboljšana izloženost mozga dovela do pojačane in vivo potencije. Ciljno vezivanje plaka na kraju je pokazalo da je u obe doze bilo jače ciljano angažovanje sa sFab konstruktom nego kod matičnog mAb31 antitela (slika 14 A-D). Stepen amiloidoze u APPPS2 dvostrukim transgenim miševima je kvantifikovan na početnoj liniji, i prateći nosač, matični mAb31 male doze i tretman niskom dozom sFab konstrukta. Kod ovih niskih doza nije detektovan in vivo efekat sa matičnim monoklonskim mAb31 (slika 14E), što je predviđeno na osnovu prethodne dugoročne studije tokom 5 meseci. Nasuprot tome, značajno smanjenje broja plaka u korteksu i hipokampusu je zabeleženo sa 2,67 mg/kg niskom dozom sFab konstrukta. Čak i pri mnogo nižoj dozi od 0,53 mg/kg (slika 14E), primećen je trend u korist konstrukcije sFab, posebno u korteksu, iako nije dostigao statističku značajnost. Sekundarna analiza veličine plaka je pokazala izraženije smanjenje broja plaka za male plakove, u skladu sa načinom delovanja za mAb31. Ovi podaci ukazuju da povećana penetracija u mozgu, omogućena monovalentnim načinom vezivanja TfR, dovodi do značajnog poboljšanja potentnosti terapijskog antitela u hroničnom životinjskom modelu patologije Alchajmerove bolesti.
Primer 10: Efektna funkcija različitih fuzionih proteina antitela na ćelijama TfR BaF3 in vitro (ADCC)
4
BaF3 ćelije koje eksprimiraju receptore transferina (DSMZ, # CLPZ04004) (TfR+) su korišćene kao ciljne ćelije za eksperimente toksičnosti ćelija (ADCC) zavisne od antitela indukovanih različitim molekulima antitela-fuzije.
Ukratko, 1k104 BaF3 ćelije su postavljene u 96 ležišta sa okruglim dnom i opciono kokulturisane sa humanim NK92 efektorskim ćelijama (visoko afinitetni CD16 klon 7A2F3; Roche GlicArt) na efektor/ciljni odnos 3:1 u prisustvu ili odsustvu fuzionih proteina antitela. Posle četiri sata inkubacije (37 °C, 5% CO2), procenjena je citotoksičnost merena oslobađanjem laktata dehidrogenaze (LDH) iz mrtvih/umirujućih ćelija. Za ove ćelije obavljeno je centrifugiranje u trajanju od 5 min na 250xg i 50 ul supernatanta koji je prebačen na ploču sa ravnim dnom. Dodato je 50 ul LDH reakcione smeše (Roche LDH reakciona mešavina, kat. br. 11644793001; Roche Diagnostics GmbH) i reakcija je inkubirana 20 min na 37 °C, 5% CO2. Nakon toga, apsorbancija je merena na Tecan Sunrise Readeru na talasnoj dužini od 492/620nm.
Svi uzorci su testirani u triplikatima, a rezultati su izračunati na osnovu sledećih kontrola:
- Samo ciljane ćelije (+ medij)
- Maksimalno oslobađanje LDH: ciljane ćelije 3% Triton-X
- Spontano oslobađanje: ciljane ćelije NK ćelije (E:T od 3:1)
% specifične ADCC/lize izračunate su sledećim izrazom:
Uzorak - spontano oslobađanje
% spec. ADCC = X 100
Maksimalno oslobađanje - spontano oslobađanje
Slika 15: Fuzija antitela sa TfR scFab fragmentima u fuziji sa Fc C-terminusom ne indukuje ADCC. NK92-posredovano ubijanje BA / F3 mišjih eritroleukemijskih ćelija mereno je kvantifikovanjem oslobađanja FDH. Samo fuzioni konstrukti sa TfR-vezujućom Fab grupom u "konvencionalnoj" "N-priključak prema Fc" orijentaciji indukuju značajan ADCC, dok su konstrukcije u transporteru za mozak u obrnutoj orijentaciji tihe. Konstrukcije: 8D3-IgG (puna dužina 8D3 IgG), OA - 8D3 (jedan teški lanac za 8D3 IgG), mAb31 (antitelo za sl. 1A), mAb31-8D3-sFab (konstrukcija za sl. 1B), mAb31-8D3-dFab (konstrukcija za sl. 1C).
Primer 11: Mapiranje epitopa mTfR 8D3
Mapiranje epitopa monoklonskog antitela 8D3 je izvedeno pomoću biblioteke preklapajućih, imobilisanih peptidnih fragmenata (dužina: 15 aminokiselina, promena: 3
4
amino kiseline) koje odgovaraju sekvenci ekstracelularnog domena mišjeg receptora transferina 1 (90-763). Za pripremu peptidnog niza korištena je Intavis CelluSpots ™ tehnologija. U ovom pristupu, sinteza peptida obavlja se pomoću automatizovanog sintetizatora (Intavis MultiPep RS) na modifikovanim celuloznim diskovima koji se rastvaraju nakon sinteze. Rastvori pojedinačnih peptida koji ostaju kovalentno vezani za makromolekulsku celulozu se zatim nanose na obložene mikroskopske preparate. Sinteza CelluSpots™ je izvršena postepeno korišćenjem 9-fluorenilmetoksikarbonilne (Fmoc) hemije na amino-modifikovanim celuloznim diskovima u 384-komornoj ploči za sintezu. U svakom ciklusu spajanja, odgovarajuće aminokiseline su aktivirane sa rastvorom DIC/HOBt u DMF. Između koraka spajanja, amino grupe koje nisu reagovale su zatvorene sa smešom anhidrida sirćetne kiseline, diizopropiletil amina i 1-hidroksibenzotriazola. Po završetku sinteze, celulozni diskovi su prebačeni na ploču sa 96 bunarčića i tretirani sa smešom trifluoroacetatne kiseline (TFA), dihlorometana, triizoproilsilana (TIS) i vode za deprotekciju bočnog lanca. Posle uklanjanja rastvora za cepanje, peptidi vezani za celulozu su rastvoreni sa smešom TFA, TFMSA, TIS i vode, precipitirani sa diizopropil etrom i ponovo suspendovani u DMSO. Ovi peptidni rastvori su naknadno uočeni na Intavis CelluSpots™ slajdovima korišćenjem Intavis robota za praćenje slajdova.
Za analizu epitopa, pripremljene pločice su isprane etanolom i zatim Tris-puferisanim fiziološkim rastvorom (TBS; 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 8) pre nego što je korak blokiranja izveden 16 h na 4 °C sa 5 mL 10k Vestern Blocking reagensom (Roche Applied Science), 2,5 g saharoze u TBS, 0,1% Tween 20. Posle ispiranja (TBS 0.1% Tween 20), pločice su inkubirane sa rastvorom (1 µg/mL) antitela 8D3 u TBS 0,1% Tween 20 na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Posle ispiranja, preparati su inkubirani za detekciju sa anti-mišjim sekundarnim HRP-antitelom (1:20000 u TBS-T) praćenim inkubacijom sa hemiluminescentnim supstratom luminolom i vizuelizovani sa LumiImager (Roche Applied Science). ELISA-pozitivni SPOT-ovi su kvantifikovani i dodeljivanjem odgovarajućih peptidnih sekvenci identifikovani su epitopi koji vežu antitela.
Slika 16: 8D3 se vezuje za tri različita peptida u ekstracelularnom domenu mišjeg receptora za transferin. Vezivanje antitela 8D3 na 15mer peptide koji se preklapaju sa tri amino kiseline otkriveno je hemiiluminoescentnom detekcijom antitela inkubiranih na CelluSpot strani koja nosi imobilizovane mTfR peptide. Kutija: Peptidi br. 373, 374 i 376 vezani sa 8D3.
4
Tabela 1: Sekvence peptida ekstracelularnog domena mTfR vezanih pomoću 8D3 u eksperimentu mapiranja peptida.
Ovde je opisana grupa bioterapijskih konstrukata protiv receptora za krvno-moždanu barijeru, posebno transferinskog receptora (TfR), koji mogu da isporuče terapeutiku uključujući antitela, proteine, peptide i male molekule preko KMB u terapeutski relevantnim dozama. Distribucija određenih konstruisanih bioterapijskih konstrukata promenila se iz cerebrovaskularnog prostora u parenhimski prostor u roku od nekoliko sati nakon injekcije, što ukazuje na to da ovi konkretni konstrukti koriste optimalni transportni put kroz BEC-ove da bi se omogućilo da značajna količina bioterapeutika preko BEC-ova dođe do parenhima. Stepen upijanja bioterapeutskih konstrukata u i distribucije u CNS bio je potpuno zavisan od režima monovalentnog vezivanja za receptor krvne moždane barijere, posebno TfR. Kada TfR postane dimerizovan vezivanjem bioterapijskog konstrukta za KMB/R, nije detektovan nijedan detektabilni nivo unutar parenhimskog prostora. Jedinstvena sistemska doza pojedinačne Fab anti-Abeta monoklonalne konstrukcije konstruisane korišćenjem metodologije pronalaska ne samo da je dovela do značajnog preuzimanja antitela u mozgu, već i dramatično povećala bojenje anti-Abeta monoklonalnog vezivanja za patološke amiloidne plakove. Međutim, koristeći dvostruki Fab vezujući konstrukt na KMB/R, nije detektovan nijedan detektibilni nivo unutar CNS. Činjenice i eksperimenti prikazani u ovoj aplikaciji ilustruju ključne mehanizme koji doprinose povećanju unosa bioterapeutika (kao što su antitela) u CNS koristeći monovalentni način vezivanja protiv KMB/R. Prvo, dualni (ili multimerni) anti-KMB/R režim vezivanja ograničava unos za mozak brzom regulacijom KMB/R na površini ćelije na lumenu, čime se smanjuje ukupna količina anti-KMB/R koja se može uzeti u vaskulaturu, što je prvi korak u efikasnom prelasku KMB. Drugo, dvostruki (ili multimerni) anti-KMB/R režim vezivanja indukuje intracelularno različito sortiranje u BEC-ove koje sprečava da konstrukt dosegne abluminalnu stranu. Upadljivo, monovalentno vezivanje na KMB-R poboljšava prolaz i distribuciju u mozgu, uz snažno pomeranje lokalizacije od vaskulature do amiloidnih plakova u CNS-u. Drugo, modifikovani monovalentni način vezivanja bioterapeutskih konstrukata za KMB/R obezbeđuje recikliranje KMB/R na lumensku stranu da bi se omogućilo preuzimanje dodatne konstrukcije fuzionog polipeptida i transport do abluminalne strane i u parenhimu. Treće, bioterapijski konstrukt monovalentnog režima vezivanja je konstruisan na C-terminalnom kraju Fc dela IgG koji čuva originalni format za terapeutsko monoklonsko antitelo koje je u većini slučajeva kritično za in vivo efikasnost. Ovo se takođe može postići povezivanjem sa drugim delom IgG opisanim u ovoj prijavi. Ovo je korisno jer već razvijene IgG monoklonale sa ustanovljenom predkliničkom i kliničkom efikasnošću mogu biti inkorporirane u ovaj transportni sistem bez ugrožavanja utvrđene funkcije i efikasnosti. Nadalje, tehnologija monovalentnih ciljeva KMB/R koja se zasniva na transportu posredstvom receptora (RMT) otvara mogućnosti za široku primenu potencijalnih lekova za bolesti CNS-a. Pronalazak daje postupke za dizajniranje terapeutika koji prodiru u KMB, i čuvaju IgGs formate sa dokazanim terapeutskim aktivnostima koje u velikoj meri poboljšavaju transport kroz KMB i distribuciju terapeutika u CNS-u.
Prikazane sekvence amino kiselina
1
2
LISTA SEKVENCI
�
�
�
4
1

Claims (23)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Transporter za krvno-moždanu barijeru koji sadrži entitet moždanog efektora, povezivača i jednog monovalentnog veznog entiteta koji se vezuje za transferinski receptor, pri čemu povezivač spaja efektor sa monovalentnim vezivnim entitetom koji se vezuje za transferinski receptor, pri čemu monovalentni vezivni entitet koji se vezuje za transferinski receptor sadrži jedan ScFab koji je usmeren na transferinskom receptoru koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji uključuje aminokiselinske sekvence Seq. Id. No. 14, 15 ili 16 i pri čemu je izabrani entitet moždanog efektora odabran iz grupe koja se sastoji od lekova za neurološke poremećaje, neurotropnih faktora i antitela usmerenih ka cilju na mozgu koja su izabrana iz grupe koja se sastoji od β-sekretaze 1, Aβ, faktor epidermalnog rasta, receptor faktora epidermalnog rasta 2, Tau, fosforilatirani Tau, apolipoprotein E4, alfa sinuklin, oligomerni fragmenti alfa sinuklina, CD20, huntingtin, prion protein, ponovljena kinaza bogata leucinom 2, parkin, prezenilin 2, gama sekretaza, receptor smrti 6, amiloidni prekursorski protein, p75 neurotrofin receptor i kaspaza 6.
2. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 1, pri čemu je entitet moždanog efektora izabran iz grupe koja se sastoji od proteina, polipeptida i peptida.
3. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 2, pri čemu monovalentni entitet vezivanja koji se vezuje za transferinski receptor sadrži jedan scFab usmeren na transferinski receptor koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji se nalazi unutar aminokiselinske sekvence Seq. Id. No. 14, 15 ili 16 je vezan za C-terminalni kraj entiteta moždanog efektora pomoću povezivača.
4. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 1 do 3, pri čemu entitet moždanog efektora sadrži antitelo pune dužine usmereno na ciljanu moždinu.
5. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 4, pri čemu antitelo pune dužine je IgG pune dužine.
6. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 5, koji sadrži IgG antitelo pune dužine, kao entitet moždanog efektora, povezivač i jedan scFab koji je usmeren na transferinski receptor koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru, koji se nalazi unutar sekvence amino kiselina Seq. Id. No.14, 15 ili 16, pri čemu je scFab spojen sa povezivačem na kraj C-priključka Fc dela jednog od teških lanaca IgG antitela.
7. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 4-6, pri čemu efektorski entitet je antitelo pune dužine usmereno na Aβ.
8. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 7, pri čemu antitelo
2
usmereno na Aβ sadrži (a) H-CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence Seq. Id. No.
5, (b) H-CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No.6, (c) H-CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No. 7, (d) L-CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No.8, (e) L-CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No.9 i (f) L-CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No.10.
9. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 8, gde antitelo usmereno na Abeta sadrži VHdomen, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No.11 i VLdomen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Seq. Id. No.12.
10. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 4 do 6, pri čemu efektorski entitet je antitelo pune dužine usmereno na fosforilovani Tau.
11. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 4 do 6, pri čemu efektorski entitet je antitelo pune dužine usmereno na alfa sinuklein.
12. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 1 do 11, pri čemu je povezivač peptidni ovezivač.
13. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 12, pri čemu peptidni povezivač je aminokiselinska sekvenca sa dužinom od najmanje 20 aminokiselina.
14. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 13, pri čemu peptidni povezivač je aminokiselinska sekvenca dužine od 25 do 50 aminokiselina.
15. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 1, pri čemu monovalentni entitet vezivanja koji se vezuje za receptor transferina sadrži CH2-CH3 Ig entitet i jedan scFab usmeren na receptor transferina koji prepoznaje epitop u receptoru transferina koji se nalazi unutar aminokiselinske sekvence Seq. Id. No. 14, 15 ili 16, pri čemu je scFab spojen na kraju C-priključka CH2-CH3 Ig entiteta sekundarnim povezivačem.
16. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 15 koji sadrži entitet moždanog efektora, povezivač, CH2-CH3 Ig domen, drugi povezivač i jedan scFab usmeren na receptor transferina koji prepoznaje epitop u receptoru transferina koji se nalazi unutar aminokiselinske sekvence Seq. Id. No.14, 15 ili 16, gde je entitet moždanog efektora spojen pomoću prvog povezivača na kraj N-priključka CH2-CH3 Ig domena a scFab je spojen na kraj C-priključka CH2-CH3 Ig domena pomoću drugog povezivača.
17. Transporter za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 15 ili 16, pri čemu CH2-CH3 Ig entitet je CH2-CH3 IgG entitet.
18. Fuzioni protein za transport entiteta moždanog efektora kroz krvno-moždanu barijeru koji se sastoji od CH2-CH3 Ig entiteta, povezivača i jednog scFab usmerenog na transferinski receptor koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru koji uključuje aminokiselinske sekvence Seq. Id. No. 14, 15 ili 16, pri čemu scFab je spojen na kraju C-priključka CH2-CH3 Ig entiteta pomoću povezivača i gde je entitet moždanog efektora izabran iz grupe koja se sastoji od lekova za neurološke poremećaje, neurotrofnih faktora i delova antitela koji su usmereni ka cilju u mozgu i izabrani iz grupe koja se sastoji od scFv, Fv, scFab, Fab, VHH, F(ab')2 ili peptida usmerenih ka cilju u mozgu i pri čemu je cilj u mozgu izabran iz grupe u kojoj se nalaze β-sekretaze 1, Aβ, faktor epidermalnog rasta, receptor faktora epidermalnog rasta 2, Tau, fosforilirani Tau, apolipoprotein E4, alfa sinuklin, oligomerni fragmenti alfa sinuklina, CD20, huntingtin, prion protein, ponovljena kinaza bogata leucinom 2, parkin, prezenilin 2, gama sekretaza, receptor smrti 6, amiloidni prekursorski protein, p75 neurotrofin receptor i kaspaza 6.
19. Fuzioni protein za transportovanje entiteta moždanog efektora preko transportera za krvno-moždanu barijeru prema zahtevu 18, pri čemu je povezivač peptidni povezivač.
20. Fuzioni protein iz zahteva 18 ili 19, pri čemu CH2-CH3 Ig entitet je CH2-CH3 IgG entitet.
21. Konjugat koji sadrži fuzioni protein za transportovanje entiteta moždanog efektora preko transportera za krvno-moždanu barijeru prema zahtevima 18 ili 19 i entiteta moždanog efektora povezanog sa N-terminalnim krajem CH2-CH3 Ig entiteta fuzionog proteina pomoću povezivača.
22. Konjugat prema zahtevu 21, pri čemu je entitet moždanog efektora izabran iz grupe koju čine proteini, polipeptidi i peptidi.
23. Konjugat prema zahtevu 22, pri čemu je C-terminalni kraj efektorskog entiteta vezan za N-terminalni kraj CH2-CH3 Ig entiteta pomoću povezivača.
4
RS20190813A 2012-08-29 2013-08-26 Transporter za krvno-moždanu barijeru RS58928B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12182181 2012-08-29
PCT/EP2013/067595 WO2014033074A1 (en) 2012-08-29 2013-08-26 Blood brain barrier shuttle
EP13756076.9A EP2890712B1 (en) 2012-08-29 2013-08-26 Blood brain barrier shuttle

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58928B1 true RS58928B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=46963437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190813A RS58928B1 (sr) 2012-08-29 2013-08-26 Transporter za krvno-moždanu barijeru

Country Status (27)

Country Link
US (2) US20150322149A1 (sr)
EP (2) EP3315514B1 (sr)
JP (3) JP6219956B2 (sr)
KR (4) KR102036262B1 (sr)
CN (2) CN109053901A (sr)
AU (3) AU2013307406B2 (sr)
BR (1) BR112015004512B1 (sr)
CA (1) CA2879496C (sr)
DK (1) DK2890712T3 (sr)
ES (1) ES2733324T3 (sr)
HK (1) HK1205521A1 (sr)
HR (1) HRP20191153T1 (sr)
HU (1) HUE045144T2 (sr)
IL (2) IL237064A0 (sr)
LT (1) LT2890712T (sr)
MX (2) MX380701B (sr)
MY (1) MY178542A (sr)
NZ (1) NZ703585A (sr)
PL (1) PL2890712T3 (sr)
PT (1) PT2890712T (sr)
RS (1) RS58928B1 (sr)
RU (3) RU2711552C2 (sr)
SG (2) SG10201702702VA (sr)
SI (1) SI2890712T1 (sr)
TR (1) TR201909156T4 (sr)
WO (1) WO2014033074A1 (sr)
ZA (1) ZA201500346B (sr)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8609820B2 (en) 2011-10-28 2013-12-17 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
NZ629296A (en) 2012-01-27 2016-06-24 Prothena Biosciences Ltd Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
MX361875B (es) 2012-03-14 2018-12-18 Regeneron Pharma Moléculas de unión de antígeno multiespecifícas y usos de las mismas.
RU2711552C2 (ru) * 2012-08-29 2020-01-17 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Шаттл для гематоэнцефалического барьера
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
CA2924268C (en) * 2013-11-21 2021-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
JP6618912B2 (ja) 2013-12-20 2019-12-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 改良された、組換えポリペプチド作製方法
HRP20200384T1 (hr) 2013-12-20 2020-06-12 F. Hoffmann - La Roche Ag Humanizirana anti-tau(ps422) protutijela i načini uporabe
CA2933384A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
CA2932547C (en) 2014-01-06 2023-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent blood brain barrier shuttle modules
JP6744856B2 (ja) * 2014-04-08 2020-08-19 プロセナ・バイオサイエンシズ・リミテッド α−シヌクレインを認識する抗体を含む血液脳関門シャトル
AR100978A1 (es) * 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
BR112017023862A2 (pt) 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
HRP20201489T1 (hr) 2015-06-19 2020-12-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Imunoglobulini konjugirani s cys80
MX391086B (es) 2015-06-24 2025-03-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad diseñada.
WO2016207091A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific antibodies specific for her2 and a blood brain barrier receptor and methods of use
CN107810196B (zh) 2015-06-24 2021-11-05 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法
NZ741067A (en) 2015-10-02 2023-07-28 Hoffmann La Roche Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
AR106189A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
AU2016365834B2 (en) * 2015-12-08 2023-09-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
RU2019102746A (ru) 2016-07-14 2020-08-14 Биоарктик Аб Белок для транспорта в мозг
US10702589B2 (en) 2016-10-04 2020-07-07 Ann And Robert H. Lurie Children's Hospital Of Chicago Compositions and methods of treating neurological disorder and stress-induced conditions
KR20190114963A (ko) * 2016-12-02 2019-10-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 에볼라 바이러스에 대한 사용을 위한 dna 항체 작제물
RU2711912C2 (ru) * 2016-12-15 2020-01-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН) Аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши
US20190352335A1 (en) * 2016-12-19 2019-11-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Brain targeting long-acting protein conjugate
EP3560955A4 (en) 2016-12-26 2020-12-23 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO MYELIN OLIGODENDROCYTE GLYCOPROTEIN
AU2017385274B2 (en) 2016-12-26 2024-02-22 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion protein including BDNF
TWI761413B (zh) 2016-12-26 2022-04-21 日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司 通過血腦障壁之新穎抗人類運鐵蛋白受體抗體
US12049493B2 (en) 2017-01-06 2024-07-30 Abl Bio Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and uses thereof
KR20240095466A (ko) * 2017-01-30 2024-06-25 내션얼 리서치 카운슬 오브 캐나다 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도
BR112019016989A2 (pt) * 2017-02-17 2020-05-26 Denali Therapeutics Inc. Polipeptídeos de ligação ao receptor de transferrina manipulados
US10457717B2 (en) 2017-02-17 2019-10-29 Denali Therapeutics Inc. Engineered polypeptides
US10143187B2 (en) 2017-02-17 2018-12-04 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
MX2019012381A (es) * 2017-05-18 2020-01-23 Hoffmann La Roche Reduccion de reaccion secundaria relacionada con la aplicacion de un anticuerpo terapeutico.
FI3635009T3 (fi) 2017-06-07 2026-04-07 Regeneron Pharma Koostumuksia ja menetelmiä entsyymien internalisoimiseksi
SMT202300347T1 (it) * 2017-08-10 2023-11-13 Denali Therapeutics Inc Polipeptidi ingegnerizzati che si legano al recettore della transferrina
US11453701B2 (en) 2017-08-18 2022-09-27 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
CN107412747B (zh) * 2017-08-24 2018-05-22 北京亦贝安生物医药科技有限公司 一种含有乳铁蛋白和唾液酸的复方制剂
CN107410495B (zh) * 2017-08-24 2018-06-01 北京亦贝安生物医药科技有限公司 一种酸性乳糖酶和锌的复方制剂及其制备方法
WO2019055841A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Denali Therapeutics Inc. ANTI-TREM2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
AU2018345303B2 (en) 2017-10-02 2025-09-18 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising enzyme replacement therapy enzymes
WO2019074892A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation ANTIBODIES TARGETING GLIOBLASTOME STRAIN TYPE CELLS AND METHODS OF USE
CA3080351A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Ossianix, Inc. Improved tfr-selective binding peptides capable of crossing the blood brain barrier
US12071483B1 (en) 2017-12-14 2024-08-27 Abl Bio Inc. Bispecific antibody to alpha-synuclein/insulin-like growth factor 1 receptor and use thereof
US10688191B2 (en) 2018-01-19 2020-06-23 Hr Biomed, Llc Delivery of a chemotherapy agent across the blood-brain barrier
KR102012448B1 (ko) * 2018-02-01 2019-08-20 (주)프론트바이오 트리메토벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경병증 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
JP7779653B2 (ja) 2018-02-07 2025-12-03 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療用タンパク質送達のための方法および組成物
KR20190114907A (ko) * 2018-03-30 2019-10-10 한미약품 주식회사 뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물
EP3793591A1 (en) 2018-05-17 2021-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
JP7589049B2 (ja) 2018-06-21 2024-11-25 ノヴォ ノルディスク アー／エス 肥満を治療するための新規化合物
TWI857959B (zh) 2018-06-26 2024-10-11 日商協和麒麟股份有限公司 與細胞黏著分子3 結合之抗體
CN112424357B (zh) 2018-06-26 2024-12-24 协和麒麟株式会社 与硫酸软骨素蛋白聚糖5结合的抗体
KR20210074279A (ko) * 2018-08-22 2021-06-21 데날리 테라퓨틱스 인크. 항-her2 폴리펩타이드 및 이의 사용방법
EP3845648A4 (en) * 2018-08-30 2022-05-18 Nexmos Co., Ltd. APTAMER CAPABLE OF CROSSING THE BLOOD-BRAIN BARRIER AND ITS APPLICATION
US12351642B2 (en) 2018-09-14 2025-07-08 Ossianix, Inc. TFR-specific binding moieties and transcytosis method to select VNARs that cross cellular barriers
EP3870604B1 (en) 2018-10-26 2022-11-23 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibody screening method using recombinase mediated cassette exchange
KR102692543B1 (ko) 2018-10-26 2024-08-07 재단법인 목암생명과학연구소 Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
CN113661173B (zh) 2019-03-29 2024-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生表达FcRn的细胞的方法
CN113801219A (zh) * 2019-05-23 2021-12-17 江苏豪思睦可生物科技有限公司 一种转铁蛋白的制备方法及包含转铁蛋白的组合物和应用
WO2020254352A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a trivalent antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
JP7572977B2 (ja) 2019-06-19 2024-10-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって多価の多重特異性抗体発現細胞を作製するための方法
US20220257542A1 (en) * 2019-07-30 2022-08-18 Frontbio Inc. Pharmaceutical composition comprising trimethobenzamide or pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredient for preventing or treating neuropathic pain
US20220325265A1 (en) * 2019-09-09 2022-10-13 Hoffmann-La Roche Inc. Glucocerebrosidase mutants
KR102247568B1 (ko) 2019-10-11 2021-05-04 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 집속초음파 조사 시스템 및 집속초음파를 이용한 혈액뇌장벽 개방 조절 방법
CA3165846A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
CA3171988A1 (en) 2020-02-22 2021-08-26 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Human transferrin receptor binding peptide
KR20230012464A (ko) 2020-02-25 2023-01-26 브이아이비 브이지더블유 류신-풍부 반복 키나제 2 알로스테릭 조절제
PE20231931A1 (es) 2020-10-14 2023-12-01 Denali Therapeutics Inc Proteinas de fusion que comprenden enzimas sulfoglucosamina sulfohidrolasa y metodos de estas
WO2022258841A1 (en) 2021-06-11 2022-12-15 Bioarctic Ab Bispecific binding molecule
EP4373853A4 (en) * 2021-07-21 2025-07-02 Icahn School Med Mount Sinai ANTI-FSH ANTIBODIES AGAINST NEURODEGENERATIVE DISEASES
JPWO2023022234A1 (sr) 2021-08-19 2023-02-23
US20240366775A1 (en) 2021-08-24 2024-11-07 Peptidream Inc. Human transferrin receptor binding antibody-peptide conjugate
EP4396231A1 (en) 2021-09-01 2024-07-10 Biogen MA Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof
CN118556069A (zh) * 2021-10-01 2024-08-27 首尔大学校产学协力团 用于穿透血脑屏障的肽及其用途
KR102575322B1 (ko) * 2021-12-31 2023-09-08 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
AU2022428997A1 (en) * 2021-12-31 2024-08-15 Imnewrun, Inc. Blood-brain barrier permeable fusion protein and uses thereof
WO2023198661A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion proteins targeted to the central nervous system
JP2025523630A (ja) 2022-07-04 2025-07-23 ブイアイビー ブイゼットダブリュ 血液－脳脊髄液関門通過抗体
US20240059784A1 (en) * 2022-08-08 2024-02-22 Eli Lilly And Company Transferrin receptor binding proteins and conjugates
WO2024080843A1 (ko) * 2022-10-14 2024-04-18 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
WO2024091079A1 (ko) * 2022-10-28 2024-05-02 주식회사 아임뉴런 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도
CN120603851A (zh) 2023-01-30 2025-09-05 伊萨尔生物科学有限责任公司 用于治疗神经退行性疾病的人抗trem2抗体
TW202434613A (zh) 2023-02-17 2024-09-01 日商肽夢想股份有限公司 人類運鐵蛋白受體結合肽
EP4688846A1 (en) 2023-03-24 2026-02-11 BioArctic AB Antibody binding to the protease-like domain of the human transferrin receptor htfr1
CN121548587A (zh) 2023-07-24 2026-02-17 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
KR20260051039A (ko) 2023-08-09 2026-04-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-a-베타 단백질 항체, 이의 제조 방법 및 용도
WO2025054461A1 (en) * 2023-09-08 2025-03-13 California Institute Of Technology Ester derivatives of binders targeting ca-iv
TW202542190A (zh) 2023-12-20 2025-11-01 美商戴納立製藥公司 包含酸性α—葡萄糖苷酶之融合蛋白及其方法
US20260035475A1 (en) 2024-06-20 2026-02-05 Bioarctic Ab Stabilized binding molecule
WO2025262228A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Bioarctic Ab Bispecific binding molecule
WO2026068532A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 Bioarctic Ab Bispecific binding molecule
WO2026068519A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 Bioarctic Ab Ph sensitive binding molecule
WO2026068513A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 Bioarctic Ab Bispecific binding molecule

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE244763T1 (de) 1992-02-11 2003-07-15 Cell Genesys Inc Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ES2292236T3 (es) 1998-04-02 2008-03-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y sus fragmentos.
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
WO2000077178A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 Boston Biomedical Research Institute IMMUNOLOGICAL CONTROL OF β-AMYLOID LEVELS IN VIVO
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US6849032B2 (en) * 2002-11-20 2005-02-01 Fitness Botics, Inc. Exercise apparatus simulating skating motions
US20050142141A1 (en) 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
ES2672640T3 (es) 2003-11-05 2018-06-15 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
UA99097C2 (ru) * 2005-12-12 2012-07-25 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Композиция, содержащая антитела к амилоиду бета 4, имеющие гликозилированный вариабельный участок
DE102006013531A1 (de) * 2006-03-24 2007-09-27 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Polylactid-Nanopartikel
AU2009296297A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Roche Glycart Ag Bispecific anti-EGFR/anti-IGF-1R antibodies
PE20120591A1 (es) * 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
AR084020A1 (es) * 2010-11-30 2013-04-17 Genentech Inc Anticuerpos para el receptor de la barrera hematoencefalica de baja afinidad y sus usos
RU2711552C2 (ru) * 2012-08-29 2020-01-17 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Шаттл для гематоэнцефалического барьера

Also Published As

Publication number Publication date
ES2733324T3 (es) 2019-11-28
BR112015004512A2 (pt) 2017-11-07
JP2020007352A (ja) 2020-01-16
SG10201702702VA (en) 2017-06-29
MX367126B (es) 2019-08-06
HUE045144T2 (hu) 2019-12-30
EP2890712A1 (en) 2015-07-08
CA2879496C (en) 2024-01-09
KR20190121874A (ko) 2019-10-28
IL237064A0 (en) 2015-03-31
CN109053901A (zh) 2018-12-21
CN104520329A (zh) 2015-04-15
DK2890712T3 (da) 2019-07-08
MX2019006259A (es) 2019-09-23
IL278872A (en) 2021-01-31
MY178542A (en) 2020-10-15
RU2663120C2 (ru) 2018-08-01
CA2879496A1 (en) 2014-03-06
TR201909156T4 (tr) 2019-07-22
JP6219956B2 (ja) 2017-10-25
RU2018127006A (ru) 2019-03-14
KR20170041289A (ko) 2017-04-14
WO2014033074A1 (en) 2014-03-06
AU2020210286A1 (en) 2020-08-20
US20150322149A1 (en) 2015-11-12
RU2019142838A (ru) 2021-06-21
SI2890712T1 (sl) 2019-08-30
BR112015004512B1 (pt) 2021-08-24
JP6889218B2 (ja) 2021-06-18
EP2890712B1 (en) 2019-05-01
RU2015111093A (ru) 2016-10-20
NZ703585A (en) 2018-03-23
ZA201500346B (en) 2016-01-27
HK1205521A1 (en) 2015-12-18
LT2890712T (lt) 2019-07-25
EP3315514B1 (en) 2025-06-18
PL2890712T3 (pl) 2019-09-30
US20190276530A1 (en) 2019-09-12
HRP20191153T1 (hr) 2019-10-04
RU2711552C2 (ru) 2020-01-17
JP2015528452A (ja) 2015-09-28
AU2013307406A1 (en) 2015-01-29
PT2890712T (pt) 2019-06-28
KR20180088492A (ko) 2018-08-03
KR102036262B1 (ko) 2019-10-24
AU2018203400A1 (en) 2018-06-07
JP2018029602A (ja) 2018-03-01
EP3315514A1 (en) 2018-05-02
RU2018127006A3 (sr) 2019-03-14
AU2013307406B2 (en) 2018-03-15
SG11201500583PA (en) 2015-04-29
RU2754794C2 (ru) 2021-09-07
EP3315514C0 (en) 2025-06-18
KR20150039798A (ko) 2015-04-13
KR101885044B1 (ko) 2018-08-02
MX380701B (es) 2025-03-12
AU2018203400B2 (en) 2020-05-28
RU2019142838A3 (sr) 2021-06-21
MX2015002215A (es) 2015-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018203400B2 (en) Blood brain barrier shuttle
US10941215B2 (en) Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses thereof
KR102115438B1 (ko) 혈액-뇌 장벽 수송의 안전성을 개선하는 방법