RS58967B1 - Metod evaluacije rizika za pml - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na metode procene rizika kod pacijenta da razvije progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (progressive multifocal leukoencephalopathy, PML).

OSNOV PRONALASKA

[0002] Terapijsko anti-VLA-4 (veoma kasni antigen, very late antigen 4) antitelo natalizumab indikovano je za lečenje povratne forme multiple skleroze (multiple sclerosis, MS) i umerene do jake Crohnove bolesti. Lečenje natalizumabom je, međutim, udruženo sa povećanim rizikom od progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), oportunističke infekcije mozga izazvane JC virusom (JC virus, JCV). PML se sreće prvenstveno kod imunokompromitovanih osoba i kod pacijenata koji primaju određene imunomodulatorne terapije, uključujući natalizumab. Pretpostavlja se da je PML rezultat kompleksne interakcije između domaćina i virusnih faktora, koja dovodi do reaktivacije i mutacije latentnog arhetipa JCV u neurotrofičnu formu koja može inficirati oligodendrocite u centralnom nervnom sistemu. Sandrock et al, 2011. Neurology, 76 (9, suppl 4), A248) odnosi se na stratifikaciju rizika za PML kod MS pacijenata i ulogu ranijeg korišćenja imunosupresanta, dužinu lečenja natalizumabom i status anti-JCV antitela. Gorelik et al, 2010. Ann Neurol, 68(3), 295-303 odnosi se na anti-JCV antitela i implikacije na stratifikaciju rizika za PML. Subramanyam et al, 2011. Neurology, 76(9, supple. 4), A636-A637 odnosi se na detekciju anti-JCV antitela pre i posle dijagnostikovanja PML kod MS pacijenata lečenih natalizumabom. Warnke et al, 2010. March Neurol, (6788), 923-930 odnosi se na uzročno-posledičnu vezu lečenja natalizumabom i PML.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0003] U svom najširem smislu, pronalazak se odnosi na predmet koji je definisan priloženim patentnim zahtevima.

Objava se, imeđu ostalog, odnosi na optimizovani, analitički validirani, osetljivi test za detektovanje prisustva JCV antitela u biološkoj tečnosti, npr., serumu ili plazmi i na različite druge metode, uključujući metode evaluacije i/ili lečenja pacijenata.

[0004] Prema tome, u jednom aspektu, objava obezbeđuje metod evaluacije nivoa anti-JCV antitela u uzorku. Metod uključuje jedan ili više ili sve sledeće korake:

(a) formiranje prve reakcione mešavine koja sadrži prvi alikvot uzorka i supstrat na kojem je izložena HPVLP (visokoprečišćena virusu slična čestica, highly purified viral-like particle, npr., visoko prečišćena VP1 čestica), npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu (signal-to-noise);

(b) detektovanje nivoa anti-JCV antitela vezanog za pomenuti supstrat na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu, npr., detektovanjem obeleženog detektujućeg reagensa, npr., anti-IgG antitela obeleženog enzimom, vezanog za anti-JCV antitelo koje je vezano za pomenuti supstrat; čime se evaluira nivo anti-JCV antitela u uzorku (kako će ovde biti reči, metod može uključivati klasifikovanje, ili dodeljivanje uzorku, vrednosti koja je indikativna za nivo anti-JCV antitela, vrednost koja se ponekad u ovom tekstu označava kao vrednost indeksa. Vrednost se može koristiti za evaluaciju uzorka ili pacijenta i, u primerima, za određivanje da li treba preći na dodatni korak metoda, npr., korak (c) dole); i (c) formiranje druge reakcione mešavine koja sadrži drugi alikvot uzorka i HPVLP u fazi rastvora, i detektovanje nivoa nevezanog anti-JCV antitela u pomenutoj drugoj reakcionoj mešavini, na primer detektovanjem anti-JCV antitela sposobnog da se veže za supstrat na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu (kako će ovde biti reči, metod može uključivati klasifikovanje, ili pripisivanje uzorku, vrednosti indikativne za stepen do kojeg inkubacija sa HPVLP u fazi rastvora smanjuje nivo nevezanog anti-JCV antitela u drugoj reakcionoj mešavini, vrednost koja se ponekad u ovom tekstu označava kao inhibicija, % inhibicije, ili slično. Ova vrednost se može koristiti za evaluaciju uzorka ili pacijenta),

evaluirajući time nivo anti-JCV antitela u uzorku.

[0005] U primeru, metod uključuje još i:

(d) formiranje treće reakcione mešavine koja sadrži treći alikvot pod uslovima pod kojima anti-JCV antitela u uzorku nisu vezana za HPVLP ili drugi antigen, i detektovanje nivoa anti-JCV antitela u trećoj reakcionoj mešavini, na primer detektovanjem anti-JCV antitela sposobnog da se veže za supstrat na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu. Inhibiciju ili % inhibicije, moguće je izračunati kao funkciju stepena u kojem inkubacija sa HPVLP u fazi rastvora (korak (c)) smanjuje količinu nevezanog anti-JCV antitela, u poređenju sa rezultatom u koraku (d).

[0006] U primeru, metod uključuje korake (a) i (b), i opciono, obezbeđuje rezultate za drugi entitet, npr., za pružaoca zdravstvene zaštite.

[0007] U primeru, metod uključuje korake (a), (b), i (c), i opciono, obezbeđuje rezultate za drugi entitet, npr., za pružaoca zdravstvene zaštite.

[0008] U primeru, metod uključuje korake (a), (b), (c), i (d), i opciono, obezbeđuje rezultate za drugi entitet, npr., za pružaoca zdravstvene zaštite.

[0009] U primeru metod uključuje korak (c) i opciono obezbeđuje rezultate za drugi entitet, npr., za pružaoca zdravstvene zaštite.

[0010] U primeru, metod uključuje korake (c) i (d), i opciono, obezbeđuje rezultate za drugi entitet, npr., za pružaoca zdravstvene zaštite.

[0011] U metodima opisanim u ovom tekstu koriste se optimizovani nivoi i količine reagenasa, što obezbeđuje poboljšane performanse. Prema tome, u primeru, za prvu reakcionu mešavinu, na pomenutom supstratu izloženo je 20 ng do 60 ng, 30 ng do 50 ng, 20 ng do 40 ng, 35 ng do 45 ng HPVLP. U primeru, na pomenutom supstratu izloženo je oko 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng ili 60 ng HPVLP. Tipično, multisupstratni uređaj, npr., ploča sa većim brojem bunarčića, npr., polistirenska ploča sa većim brojem bunarčića, imaće na svakom od većeg broja supstrata količinu HPVLP navedenu u ovom tekstu. Tipičan supstrat je unutrašnjost bunarčića na ploči sa većim brojem bunarčića.

[0012] U metodima opisanim u ovom tekstu koriste se optimizovani odnosi reagenasa i uzorka, čime se obezbeđuju poboljšane performanse. U primeru odnos µl uzorka (ovo se odnosi na nerazblaženi uzorak, ili na količinu uzorka u razblaženju, tako da će 100 µl razblaženja 1 µl :100 µl biti 1 µl uzorka), npr., seruma ili plazme, prema ng HPVLP izložene na supstratu u prvoj reakciji iznosi: između 1:100 i 1:20; 1:80 i 1:30; 1:60 i 1:20; 1:20 i 1:60; 1:30 i 1:50. U primeru odnos µl uzorka, npr., seruma ili plazme, prema ng HPVLP izložene na supstratu iznosi oko: 1:30, 1:40, ili 1:50. U primeru odnos µl uzorka, npr., seruma ili plazme, prema ng HPVLP izložene na supstratu iznosi oko: (0.08 do 1.2): 30, (0.08 do 1.2): 40, ili (0.08 do 1.2): 50.

[0013] U primeru, uzorak, npr., serum, za prvu reakciju, razblaži se, na primer oko 100-struko, u puferu, na primer, pre kontakta sa supstratom na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu. U jednom primeru, detekcija se vrši antitelom koje je obeleženo enzimom, npr., IgG koji je obeležen enzimom, kao što je IgG obeležen sa HRP (horseradish peroxidase, peroksidaza rena). U drugom primeru, detekcioni reagens, npr., HRP-obeleženi IgG, dodaje se u koncentraciji od najmanje 0.01 µg/mL, 0.02 µg/mL, 0.03 µg/mL, 0.04 µg/mL, 0.05 µg/mL, 0.06 µg/mL, ili 0.08 µg/ml. U jednom primeru, detekcioni reagens se obezbeđuje u višku od 10x do 100x u odnosu na antitelo vezano za supstrat. U primeru, detekcioni reagens se obezbeđuje u količini koja daje višak jednak ili veći od 10x, 20x, 50x, 75x ili 100x) u poređenju sa antitelom vezanim za supstrat.

[0014] U primeru, HPVLP u fazi rastvora u (c) prisutna je sa viškom čestica od 2x do 100x u odnosu na anti-JCV antitelo u drugoj reakcionoj mešavini ili uzorku. U primeru višak čestica u odnosu na anti-JCV antitelo u drugoj reakcionoj mešavini ili uzorku jednak je ili veći od 2x, 4x, 5x, 10x, 15x, 20x, 40x, 50x, 70x, 80x, 100x ili 110x.

[0015] U primeru, za drugu reakcionu mešavinu, 20 ng do 60 ng, 30 ng do 50 ng, 20 ng do 40 ng, 35 ng do 45 ng HPVLP izloženo je na pomenutom supstratu. U primeru oko 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng ili 60 ng HPVLP izloženo je na pomenutom supstratu. Tipično, multisupstratni element, npr., ploča sa većim brojem bunarčića, npr., polistirenska ploča sa većim brojem bunarčića, imaće na svakom od većeg broja supstrata količinu HPVLP preciziranu u ovom tekstu. Tipičan supstrat je unutrašnjost bunarčića na ploči sa većim brojem bunarčića.

[0016] U primeru, za drugu reakcionu mešavinu, uzorak se dovodi u kontakt sa HPVLP u fazi rastvora i zatim se dopušta da se nevezano anti-JVC antitelo veže za HPVLP izloženu na supstratu. U primeru, za drugu reakcionu mešavinu, uzorak je u istovremenom kontaktu sa HPVLP u fazi rastvora i HPVLP izloženom na supstratu

[0017] U primeru, odnos µl uzorka (ovo se odnosi na nerazblaženi uzorak, ili na količinu uzorka u razblaženju, tako da će 100 µl razblaženja 1 µl:100 µl biti 1 µl uzorka), npr., seruma ili plazme, prema ng HPVLP izložene na supstratu iznosi: između 1:100 i 1:20; 1:80 i 1:30; 1:60 i 1:20; 1:20 i 1:60; 1:30 i 1:50. U primeru, odnos µl uzorka, npr., seruma ili plazme, prema ng HPVLP izložene na supstratu iznosi oko: 1:30, 1:40, ili 1:50. U primeru, odnos µl uzorka, npr., seruma ili plazme, prema ng HPVLP izložene na supstratu iznosi oko: (0.08 do 1.2): 30, (0.08 do 1.2): 40, ili (0.08 do 1.2): 50.

[0018] U jednom primeru, uzorak, npr., serum, razblažuje se, na primer oko 100-struko u, na primer, puferu, pre kontakta sa supstratom na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu. U jednom primeru, detekcija se obavlja antitelom koje je obeleženo enzimom, npr., IgG koji je obeležen enzimom, kao što je IgG obeležen sa HRP. U drugom primeru, detekcioni reagens, npr., IgG obeležen sa HRP, dodaje se u koncentraciji od najmanje 0.01 µg/mL, 0.02 µg/mL, 0.03 µg/mL, 0.04 µg/mL, 0.05 µg/mL, 0.06 µg/mL, ili 0.08 µg/ml. U jednom primeru, detekcioni reagens obezbeđuje se u višku od 10x do 100x u odnosu na antitelo vezano za supstrat. U primeru, detekcioni reagens se obezbeđuje u količini koja daje višak jednak ili veći od 10x, 20x, 50x, 75x ili 100x) u poređenju sa antitelom vezanim za supstrat.

[0019] U jednom primeru, u zavisnosti od nivoa anti-JCV antitela detektovanih u koraku (b), obavljaju se koraci (c) i/ili (d).

[0020] U jednom primeru, u zavisnosti od nivoa anti-JCV antitela detektovanih u koraku (b), npr., ako je indeksni nivo (nOD) > 0.2 i < 0.4, izvode se koraci (c) i (d).

[0021] U jednom primeru, pre formiranja pomenute druge reakcione mešavine, uzorak, npr., serum ili plazma, razblažuje se u, npr., puferu, u količini jednakoj ili većoj od oko 50, 100, ili 150 puta. U drugom primeru, pre formiranja pomenute treće reakcione mešavine, uzorak, npr., serum ili plazma, razblažuje se u, npr., puferu, u količini jednakoj ili većoj od oko 50-struke, 100-struke, ili 150-struke. U još jednom primeru, detekcija jedne ili obe, druge i treće, reakcione mešavine vrši se antitelom koje je obeleženo enzimom, npr., IgG koji je obeležen enzimom, kao što je IgG obeležen sa HRP.

[0022] Detekcija jedne ili obe, druge i treće, reakcione mešavine može se izvesti IgG koji je obeležen sa HRP, dodatim u koncentraciji od najmanje 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, ili 0.08 µg/ml. U jednom primeru, detekcioni reagens obezbeđen je u višku od 10x do 100x (npr., 10x, 20x, 50x, 75x ili 100x) u odnosu na antitelo vezano za supstrat.

[0023] U jednom primeru, evaluiranje nivoa anti-JCV antitela u uzorku uključuje još i evaluiranje standarda, kao što je kalibrator granične vrednosti, koji ima, npr., indeks od oko 1 (npr., optička gustina je 1, gde pozitivna kontrola ima optičku gustinu 1.3, a negativna kontrola ima optičku gustinu 0.1) i odnos signala prema šumu jednak ili veći od 15x do 20x (npr., jednak ili veći od 16x, 17x, 18x, ili 19x), u koraku b. Drugi primer uključuje evaluiranje standarda, npr., pozitivne kontrole, sa, na primer, skorom od oko 1.3, u koraku b. U drugim primerima, metod uključuje još i evaluiranje standarda, na primer negativne kontrole, sa npr., skorom od oko 0.1, u koraku b.

[0024] U primeru, metod uključuje određivanje količine koja, vezujući se za pomenute HPVLP čestice u fazi rastvora, inhibira ili redukuje vezivanje za HPVLP čestice izložene na supstratu u poređenju sa vezivanjem za HPVLP čestice izložene na supstratu u pomenutom prvom alikvotu. Rezultati prvog koraka testa u dva koraka (koraci (a) i (b), gore) tipično se izražavaju kao normalizovana OD (nOD, ili "indeks") vrednost. Rezultati drugog koraka testa u dva koraka (koraci (c) i opciono (d) gore), tipično se izražavaju kao "procenat inhibicije". U primeru, nOD je OD450. U primeru, pomenuta inhibicija je manja ili jednaka prethodno određenoj vrednosti, npr., 45%, i pomenuti uzorak se klasifikuje kao negativan.

[0025] U primeru, pomenuta inhibicija je veća od unapred određene vrednosti, npr., 45% i pomenuti uzorak se klasifikuje kao pozitivan.

[0026] U jednom primeru, kalibrator granične vrednosti (cut-off calibrator, CO) podešava se tako da ima indeks reaktiviteta (nOD) oko 1.0, a pozitivna kontrola (positive control, PC) se podešava tako da ima indeks reaktiviteta oko 1.3. Rastvori CO i PC se prave mešanjem seruma koji je pozitivan za JCV antitela sa serumom koji je negativan za JCV antitela. Za negativnu kontrolu (negative control, NC), koju može predstavljati, na primer, bočica seruma negativnih na anti-JCV antitelo, ciljni indeks (nOD) je oko 0.1.

[0027] U jednom primeru, JCV antigen je VLP čestica, kao što je HPVLP, koja se hromatografski prečisti pre nego što se upotrebi u testu obezbeđenom u ovoj objavi.

[0028] U određenim primerima, uzorak je uzorak seruma, uzorak urina, uzorak plazme, uzorak krvi ili uzorak cerebrospinalne tečnosti (cerebrospinal fluid, CSF). U jednom primeru, uzorak je uzorak seruma koji se razblaži u odnosu 1:101 pre nego što se formira prva reakciona mešavina koja sadrži prvi alikvot uzorka i supstrat na kojem su izložene HPVLP.

[0029] U drugom primeru, sekundarni detekcioni reagens (npr., antihumani IgG) konjugovan je sa detektabilnim sredstvom, kao što je peroksidaza, na primer HRP. U jednom primeru, sekundarni detekcioni reagens može biti antihumani IgG, pri čemu je antihumani IgG konjugovan sa HRP. U drugom primeru, rastvor detekcionog reagensa koji sadrži IgG-HRP koristi se u koncentraciji od 0.04 µg/mL. Na primer, stok rastvor IgG-HRP u koncentraciji od 0.8 mg/mL se, pre korišćenja u testu za detektovanje nivoa anti-JCV antitela vezanog za HPVLP, razblaži u odnosu 1:15000, 1:20000, 1:30000 ili više. U drugom primeru, koncentracija sekundarnog detekcionog reagensa podešava se za nove partije da se poklopi sa signalom prethodne partije, a vreme inkubacije sa konjugatom iznosi samo 30 min. U jednom primeru, TMB (tetrametilbenzidin) i vodonik peroksid u puferu inkubiraju se sa reakcionom mešavinom koja sadrži mešavinu HRP IgG vezanu za anti-JCV antitelo, 20 minuta, ± 2 minuta.

[0030] U primeru, smanjenje detektovanog nivoa u drugom testnom uzorku u poređenju sa uzorkom koji nije preinkubiran, ukazuje da je uzorak pozitivan na anti-JCV antitelo, a promena u detektovanom nivou ispod preciziranog procenta ukazuje da uzorak ne sadrži JCV-specifično antitelo.

[0031] U jednom primeru, određeno je da uzorak ima indeksnu vrednost (tj., nOD vrednost) >0.2 i <0.4 ("nedeterminisana zona") posle prvog koraka testa, koji predstavlja formiranje prve reakcione mešavine koja sadrži prvi alikvot uzorka i supstrat na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu, i detektovanje nivoa anti-JCV antitela vezanog za pomenuti supstrat na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu. Tada može da se testira drugi alikvot uzorka u drugom koraku testa, koji uključuje formiranje druge mešavine drugog alikvota i HPVLP u fazi rastvora, pre detektovanja nevezanog anti-JVC antitela u drugoj mešavini, dovođenjem u kontakt druge mešavine sa supstratom na kojem je izložena HPVLP, npr., sa HPVLP supstratom sa visokim odnosom signala prema šumu.

[0032] U drugom primeru, ako se posle prvog koraka testa odredi da uzorak ima vrednost indeksa <0.2, onda se uzorak određuje kao negativan na anti-JCV antitelo. U jednom primeru, uzorak određen kao negativan na anti-JCV antitelo ne evaluira se korišćenjem drugog koraka testa.

[0033] U sledećem primeru, ako se posle prvog koraka testa odredi da uzorak ima vrednost indeksa >0.4, onda se uzorak određuje kao pozitivan na anti-JCV antitelo. U jednom primeru, uzorak određen kao pozitivan na anti-JCV antitelo ne evaluira se korišćenjem drugog koraka testa.

[0034] U jednom primeru, objava uključuje dobijanje biološkog uzorka (npr., plazme, seruma, krvi, urina, ili cerebrospinalne tečnosti (CSF)) od subjekta; i korelisanje detektovanog nivoa sa referencom odabranom tako da ukaže na lažno negativnu stopu ne veću od 3% i minimalnu unakrsnu reaktivnost sa drugim polioma virusima, npr., BK virusom (BKV). U nekim primerima, referenca, izvedena iz kontrolnog uzorka ili seta uzoraka, obrađuje se sa uzorkom uzetim od subjekta. U nekim primerima, referenca se bira tako da lažno negativna stopa testa ne bude veća od 1%. Test može da se izvede tako da HPVLP bude izložena na čvrstom supstratu kao što je mikrotirarska ploča ili pločica. U nekim primerima, HPVLP se sastoji suštinski od VP1 virusnog proteina. HPVLP može uključivati i druge virusne proteine, na primer najmanje jedan od VP2, ili VP3. Virusni protein/proteini u HPVLP mogu biti rekombinantno izvedeni (npr., MAD1 VP1) ili mogu biti prirodni virusni proteini (npr., izvedeni iz prirodnog izvora). Metod može da se izvede korišćenjem, na primer, biološkog uzorka dobijenog od subjekta koji se trenutno leči imunomodulatornim lekom, subjekta kod kojeg se razmatra otpočinjanje lečenja imunomodulatornim lekom, ili subjekta za kojeg se misli da ima progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML).

[0035] U drugom aspektu, objava obezbeđuje kit koji sadrži supstrat na kojem je izložena HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu. Supstrat može uključivati ploču sa većim brojem bunarčića, na primer ploču sa 96 bunarčića. U jednom primeru, kit uključuje jedno ili više ili sve od sledećeg: supstrat, kao što je ploča sa bunarčićima obloženim JVC antigenskim supstratom, npr., HPVLP; JCV antigen, npr., HPVLP, liofilizovana ili u rastvoru; JCV granični kalibrator, pozitivna kontrola za anti-JCV antitelo i JCV negativna kontrola, koji predstavljaju uzorke seruma kao što su serumi čoveka. U jednom primeru, kit uključuje, ili uključuje još i jedan ili više reagenasa za detektovanje kompleksa koji sadrži anti-JVC antitela vezana za antigen, a reagensi uključuju, na primer, JCV konjugat, uzorak kazeina, detektabilni reagens, kao što je TMB (tetrametilbenzidin), pufer za ispiranje, i reagens za zaustavljanje reakcije.

[0036] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje supstrat na kojem se nalazi HPVLP, npr., HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu.

[0037] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje kit koji sadrži HPVLP i najmanje jedan reagens za izvođenje testa za identifikovanje nivoa anti-JCV antitela u uzorku, kao što je biološki uzorak.

[0038] U drugim aspektima, objava se odnosi na rastvor koji sadrži HPVLP čestice, koji se sastoji suštinski od VP1-sadržavajućih čestica koje su veće veličine nego VP1 pentamer (kapsomera), npr., sadrže oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 72 pentamera ili sadrže oko 360 VP1 molekula.

[0039] Sledeći aspekt objave je metod pripremanja rastvora HPVLP, metod uključuje uklanjanje iz rastvora VP1-sadržavajućih čestica koje su veličine VP1 pentamera ili manje.

[0040] Metodi objavljeni u ovom tekstu bazirani su bar delom na otkriću da titar anti-JCV antitela i druge karakteristike kao što su afinitet/aviditet mogu biti indikatori rizika kod pacijenta da razvije progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML).

prema tome, u sledećem aspektu, objava obezbeđuje metod evaluacije rizika kod pacijenta da razvije PML koji uključuje sticanje znanja o titru antitela na JC virus (JCV) (npr., određen kako je ovde opisano i izražen kao normalizovana optička gustina (nOD) ili indeks) ili afinitetu/aviditetu (npr., kako je određeno kao što je ovde opisano i izraženo kao procenat inhibicije u potvrđujućem koraku testa) u uzorku uzetom od pacijenta, i opciono upoređivanje jedne ili više dobijenih vrednosti sa referencom objavljenom u ovom tekstu, da bi se time evaluirao rizik.

[0041] U jednom primeru, titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije određuju se u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta, u uzorku krvi (serum ili plazma), ili uzorku CSF.

[0042] Ako se odredi da su titar ili/i procenat inhibicije, ili funkcija obe vrednosti ispod unapred određenog nivoa, određuje se da je pacijent pod nižim rizikom da razvije PML, a ako se odredi da su titar i/ili procenat inhibicije, ili funkcija obe vrednosti na ili iznad unapred određenog nivoa, određuje se da je pacijent pod višim rizikom da razvije PML.

[0043] Metod može dodatno da obezbedi određivanje titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije u uzorku uzetom od pacijenta što zahteva uklanjanje biološkog uzorka iz pacijentovog tela ili analiziranje uzorka dobijenog od pacijenta, ili ako se odredi da je pacijent pod niskim rizikom da razvije PML, primenjivanje terapije kao što je imunosupresantna terapija, kod pacijenta.

[0044] U jednom primeru, titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije određuju se u više od jednog biološkog uzorka dobijenog od pacijenta, kao što su jedan ili više uzoraka krvi (serum ili plazma), ili uzoraka CSF.

[0045] U jednom primeru, subjekt ima multiplu sklerozu, npr., pacijent oboleo od multiple skleroze koji već prima terapiju anti-VLA-4 antitelom, npr., natalizumabom.

[0046] U jednom primeru, određeno je da je pacijent pod nižim rizikom da razvije PML, i kod pacijenta se i dalje primenjuje anti-VLA-4 terapija, kao što je anti-VLA-4 antitelo, kao što je natalizumab, ili njegov fragment (kao što je njegov antigen-vezujući fragment).

[0047] U jednom primeru, određeno je da je pacijent pod višim rizikom da razvije PML, i pacijent se označava kao neko ko bi trebalo da primi alternativnu terapiju, npr., pacijent bi trebalo da prestane da prima terapiju anti-VLA-4 antitelom, npr., natalizumabom, i npr., trebalo bi da prima alternativnu terapiju, npr., alternativnu odobrenu terapiju za multiplu sklerozu (MS) kao što je Avonex®. U sledećem primeru, određeno je da je pacijent pod višim rizikom da razvije PML i kod pacijenta se primenjuje anti-VLA-4 terapija, npr., natalizumab.

[0048] U jednom primeru, na osnovu titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije, određeno je da je pacijent pod višim rizikom da razvije PML, i pacijent se identifikuje kao neko ko bi trebalo da se podvrgne dodatnom ispitivanju da bi se odredio rizik za razvijanje PML.

[0049] U jednom primeru, određuje se da pacijent ima niži rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi < 0.5, ili (ii) ako se odredi da titar anti-JCV antitela indikovan vrednošću indeksa ili nOD iznosi > 0.5 i < 3.0, a procenat inhibicije se odredi da je jednak ili manji od 70% ili 60%. Određuje se da pacijent ima intermedijarni rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JVC antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi >0.5 i <1.5, a procenat inhibicije se odredi da iznosi > 70%. Određuje se da pacijent ima viši rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JVC antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi >0.5 a procenat inhibicije se odredi da iznosi > 70%, ili (ii) ako pacijent pokazuje porast indeksa, nOD ili titra 2-puta u odnosu na prethodni test. Procenat inhibicije anti-JCV antitela može se meriti, na primer: (i) dovođenjem u kontakt biološkog uzorka dobijenog od subjekta, sa HPVLP u rastvoru pod uslovima pogodnim za vezivanje anti-JCV antitela u uzorku za HPVLP; (ii) odvajanjem JCV antitela vezanih za HPVLP iz rastvora da bi se napravio sekundarni uzorak; (iii) dovođenjem u kontakt sekundarnog uzorka sa HPVLP pod istim uslovima kao (i); i (iv) detektovanjem nivoa vezivanja anti-JCV antitela za HPVLP u sekundarnom uzorku.

[0050] U jednom primeru, titar anti-JCV antitela meri se, npr., (i) dovođenjem u kontakt biološkog uzorka sa HPVLP pod uslovima pogodnim za vezivanje anti-JCV antitela u uzorku za HPVLP; (ii) detektovanjem nivoa vezivanja anti-JCV antitela u uzorku za HPVLP; i (iii) korelisanjem detektovanog nivoa sa referentnim setom. Referentni set može da se odabere tako da ukaže na lažno negativnu stopu ne veću od unapred određene količine, na primer 3%. U drugom primeru, titar anti-JCV antitela meri se komercijalnom platformom, kao što je VIDAS® test (bioMérieux), ili drugom alternativnom platformom, kao što je metod u fazi rastvora ili metod lateralnog toka.

[0051] U jednom primeru, test ukazuje da biološki uzorak ne sadrži JCV antitela, i test tada uključuje još i: (iv) dovođenje u kontakt dela biološkog uzorka dobijenog od subjekta sa HPVLP u rastvoru pre koraka (i) i gde je HPVLP iz koraka (i) prikačena za čvrsti supstrat, tako da obezbedi sekundarni uzorak; (v) dovođenje u kontakt sekundarnog uzorka sa HPVLP pod istim uslovima kao (i); (vi) detektovanje nivoa vezivanja anti-JCV antitela za HPVLP u sekundarnom uzorku; i (vii) upoređivanje detektovanog nivoa anti-JCV antitela u sekundarnom uzorku sa nivoom vezivanja u biološkom uzorku kada je inkubiranje vršeno sa rastvorom bez HPVLP. Smanjenje detektovanog nivoa u uzorku preinkubiranom sa HPVLP u poređenju sa uzorkom inkubiranom u rastvoru ukazuje na to da je uzorak pozitivan za anti-JCV antitelo, a odsustvo promene detektovanog nivoa ukazuje da anti-JCV antitelo nije prisutno uzorku u iznad nivoa pozadinskog efekta.

[0052] U jednom primeru, test ukazuje da biološki uzorak sadrži JCV antitela, i određuje se da je pacijent pod višim rizikom za PML.

[0053] U još jednom primeru, određuje se da pacijent ima niži rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi < 0.5, ili (ii) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 0.5 i < 3.0, a procenat inhibicije se odredi da je manji ili jednak 70%. Određuje se da pacijent ima viši rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD iznosi > 3, a procenat inhibicije se odredi da je > 70%, ili (ii) ako pacijent pokazuje 2-struki porast indeksa, nOD ili titra u odnosu na prethodni test.

[0054] U jednom primeru, za određivanje rizika za PML koristi se samo vrednost indeksa (nOD) ili samo procenat inhibicije. Na primer, u jednom primeru, određuje se da pacijent ima niži rizik za PML ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi < 0.5, određuje se da pacijent ima viši rizik se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 0.5 i <1.5, ili određuje se da pacijent ima još viši rizik ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 1.5.

[0055] U jednom primeru, test ukazuje da biološki uzorak ne sadrži JCV antitela iznad nivoa pozadinskog efekta, i određuje se da je pacijent pod nižim rizikom za PML.

[0056] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje metod za evaluiranje ili proveru testnog postupka. Test anti-JCV antitela može da se reevaluira u pogledu efikasnosti u unapred određenom intervalu, na primer svakih 6 meseci ili jednom godišnje. U jednom primeru testa kontrole kvaliteta, obezbeđena je kolekcija uzoraka, npr., 30, 40 ili 50 uzoraka seruma i 30, 40, ili 50 uzoraka plazme, na primer, za evaluaciju sadašnjim optimizovanim metodom i ranijim metodom starije generacije. Procenjuje se poklapanje rezultata i ako se nađe da je poklapanje veće od, npr., 90% ili 95%, osobine testa se ocenjuje kao prihvatljive. U jednom primeru, panel uzoraka, koji sadrži npr., 90, 100, 150 ili više uzoraka sa poznatim statusom anti-JCV antitela, koristi se za procenu konzistentnosti performansi testa tokom vremena. Procenjuje se poklapanje rezultata i ako se nađe da je poklapanje veće od, npr., 90% ili 95%, osobine testa se ocenjuje kao prihvatljive. Panel uzoraka predstavljaju serumi pacijenata, koji su raspoloživi u dovoljnoj zapremini da se napravi banka uzoraka.

[0057] U jednom aspektu, entitet, npr., pružalac zdravstvene nege, stiče informacije koje su rezultat testa anti-JCV antitela, opisanog u ovom tekstu, i u odgovoru na te informacije, pruža pacijentu, npr., obolelom od MS, lečenje opisano u ovom tekstu.

[0058] U drugom aspektu, na pacijentu se obavlja JCV test opisan u ovom tekstu, i zatim se pacijent leči, npr., na osnovu rezultata testa leči se MS pacijent.

[0059] Titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije kod pacijenta moguće je reevaluirati u pravilnim intervalima, na primer svaka 3 meseca, svakih 6 meseci, ili svakih 12 meseci, ili u dužim intervalima, ili češće. Ako se zapazi porast titra antitela ili porast procenta inhibicije, to može ukazati na porast rizika kod pacijenta da razvije PML. Na primer, 2-struki ili 3-struki porast titra antitela (nOD ili indeks) može ukazati na povećan rizik za PML. Pacijent koji prima anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, može da prekine lečenje anti-VLA-4 terapijom, i opciono da otpočne lečenje alternativnim sredstvom, npr., imunosupresivnim sredstvom različitim od anti-VLA-4 terapije, ili različitim od natalizumaba. Porast titra može biti drugačije prikazan kod pacijenata sa visokim bazalnim titrom (npr., sa užom stopom titra) nego kod pacijenata sa niskim bazalnim titrom.

[0060] U jednom primeru, pacijent koji prima anti-VLA-4 antitelo, npr., natalizumab, može se kontrolisati, npr., svakih pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, petnaest, dvadeset, trideset, četrdeset meseci, u pogledu titra anti-JCV antitela i/ili procenta inhibicije.

[0061] U jednom primeru, pacijent se ne reevaluira u pogledu prisustva JCV antitela, ili titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije, unutar jedne ili dve ili tri nedelje posle primanja plazmafereze. U drugom primeru, pacijent se ne reevaluira u pogledu prisustva JCV antitela, ili titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije, unutar jedne ili dve ili tri nedelje posle primanja intravenskog tretmana imunoglobulinom (intravenous immunoglobulin, IVIG).

[0062] Mera titra anti-JCV antitela može biti izražena u odnosu na nOD ili vrednost indeksa.

[0063] Evaluacija pacijenta, kao je opisano u ovom tekstu, može se sprovesti pre primene anti-VLA-4 terapije, ili pošto je pacijent otpočeo sa anti-VLA-4 terapijom.

[0064] U jednom primeru, određeno je da pacijent ima niži rizik za PML, na primer pomoću testa opisanog u ovom tekstu, i pacijentu se daje anti-VLA-4 terapija. U drugom primeru, određeno je da pacijent ima viši rizik za PML i pacijentu se daje anti-VLA-4 terapija, npr., anti-VLA-4 antitelo, kao što je natalizumab. U još jednom primeru, određeno je da pacijent ima viši rizik za PML i pacijentu se daje terapija različita od anti-VLA-4 terapije, na primer interferon, glatiramer acetat ili kortikosteroid.

[0065] U jednom primeru, određeno je da pacijent ima viši rizik za PML, i pacijent prema tome prestaje da prima anti-VLA-4 terapiju.

[0066] Pacijent se može kontrolisati u regularnim intervalima, npr, svaka 3 meseca, svakih 6 meseci, svake godine, ili češće, ili manje često, u pogledu smanjenja titra anti-JCV antitela ili smanjenja procenta inhibicije JCV antitela. Smanjenje titra anti-JCV antitela ili smanjenje procenta inhibicije JCV antitela mogu ukazati na to da je kod pacijenta smanjen rizik da razvije PML.

[0067] U jednom primeru, kada se odredi smanjenje titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije JCV antitela ispod unapred određenog nivoa, čak i pošto su bili povišeni, onda pacijent može da prima, ili se određuje kao kandidat za lečenje anti-VLA-4 terapijom. Ako je pacijent prethodno primao anti-VLA-4, onda pacijentu može ponovo da se uvede anti-VLA-4 terapija. Posle ponovnog uvođenja anti-VLA-4 terapije, pacijent može da se evaluira svakih 6 meseci ili svake godine u pogledu smanjenja titra antitela ili smanjenja procenta inhibicije JCV antitela.

[0068] U jednom primeru, pošto je bilo određeno da je pacijent pod višim rizikom za PML, npr., određeno je da pacijent ima titar anti-JCV antitela, meren pomoću nOD, od >0.5, npr., >1.0 ili >1.5, onda se pacijent ne testira ponovo u pogledu JCV statusa. Na primer, pacijent može prekinuti lečenje anti-VLA-4 terapijom kao što je natalizumab, i ne testira se ponovo u pogledu statusa anti-JCV antitela.

[0069] U jednom primeru, metod evaluiranja pacijenta, kako je objavljeno u ovom tekstu, na primer određivanje titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije, može uključivati još i procenu drugih merila koja služe kao prediktori rizika. Na primer, metod evaluiranja pacijenta može uključivati još i: (a) određivanje da li je pacijent primao produženi tretman anti-VLA-4 terapijom (npr., duže od 24 meseca); ili (b) određivanje da li je pacijent primao određenu imunosupresivnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije (npr., mitoksantron ili druge terapije, u poslednje 2, 3, 5 godina ili ikada u životu pacijenta). Relativni rizik za PML kod pacijenta koji je imao titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije iznad unapred određenog nivoa, ali nema specifikovanu raniju upotrebu imunosupresanta i nije bio produženo lečen anti-VLA-4 terapijom, manji je nego relativni rizik kod pacijenta koji ima titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije ispod unapred određenog nivoa i ima specifikovanu raniju upotrebu imunosupresanta ili je bio produženo lečen anti-VLA-4 terapijom, koji je manji od relativnog rizika kod pacijenta koji ima titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije iznad unapred određenog nivoa i ima specifikovanu raniju upotrebu imunosupresanta i produženo je lečen anti-VLA-4 terapijom.

[0070] U jednom primeru, pacijent je primao anti-VLA-4 terapiju, npr., natalizumab, i u drugom primeru, pacijent prima anti-VLA-4 terapiju, na osnovu evaluacije, npr., evaluacije titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije. Na primer, kao rezultat evaluacije, pacijent se može klasifikovati kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju. U jednom primeru, pacijent klasifikovan kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju i dalje prima terapiju.

[0071] U nekim primerima, faktori koji će biti uključeni u model stratifikacije su pacijentova starost i pol.

[0072] Metod opisan u ovom tekstu, u evaluaciju pacijenta može uključiti jedan ili više faktora. Prema tome, u drugom aspektu, objava obezbeđuje metod evaluiranja pacijenta, npr., kao kandidata da bude lečen anti-VLA-4 terapijom.

[0073] Metod uključuje, na primer, dobijanje ili određivanje titra antitela na JC virus (JCV) i procenta inhibicije, u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta, npr., metodom opisanim u ovom tekstu. Ako se odredi da su titar antitela ili procenat inhibicije ispod unapred utvrđenog nivoa, onda pacijent može da se klasifikuje kao pogodan za lečenje prvom kategorijom terapije, kao što je anti-VLA-4 terapija, npr., natalizumab. Ako se odredi da su titar antitela ili procenat inhibicije iznad prethodno utvrđenog nivoa, pacijent se klasifikuje kao pogodan za drugu kategoriju terapije, npr., interferon, glatiramer acetat ili kortikosteroid. Dobijanje titra anti-JCV antitela i procenta inhibicije u uzorku dobijenom od pacijenta može uključivati uklanjanje biološkog uzorka iz pacijentovog tela ili analiziranje uzorka dobijenog od pacijenta. Metod evaluacije može uključivati i primenu terapije, na primer iz prve kategorije (npr., natalizumab) ili druge kategorije (npr., interferon, glatiramer acetat ili kortikosteroid), kod pacijenta.

[0074] U još jednom primeru, određuje se da pacijent ima niži rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi < 0.5, ili (ii) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 0.5 i < 3.0, a procenat inhibicije se odredi da je jednak ili manji od 70%. Određuje se da pacijent ima viši rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 1.5, a procenat inhibicije se odredi da iznosi > 70%, ili (ii) ako pacijent pokazuje porast indeksa, nOD ili titra dvostruko u odnosu na prethodni test. Određuje se da pacijent ima intermedijarni rizik za PML ako se utvrdi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 0.5 i < 1.5, , a procenat inhibicije se odredi da iznosi > 70%.

[0075] Kako je gore bilo reči, metodi evaluiranja pacijenta mogu uključiti više od jednog razmatranja ili faktora. Prema tome, metodi evaluiranja pacijenta mogu uključivati još i:

(aa) određivanje da li je pacijent primao produženi tretman anti-VLA-4 terapijom (npr., duže od 24 meseca) i, u nekim primerima, klasifikovanje prethodnog izlaganja anti-VLA-4 terapiji; ili

(bb) određivanje da li je pacijent primao specifikovanu terapiju imunosupresantom, različitu od anti-VLA-4 terapije (npr., u poslednjih 2, 3, 5 godina ili ikada u životu pacijenta), i, u nekim primerima, klasifikovanje prethodnog izlaganja imunosupresivnom sredstvu.

[0076] Tipično, pacijent koji ima titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije iznad unapred određenog nivoa, ali nema specifikovanu raniju upotrebu imunosupresanta i nije bio produženo lečen anti-VLA-4 terapijom, klasifikuje se da ima manji rizik da razvije PML nego što je relativni rizik kod pacijenta koji ima titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije ispod unapred određenog nivoa i ima specifikovanu raniju upotrebu imunosupresanta ili produženo lečenje anti-VLA-4 terapijom, koji je manji od relativnog rizika kod pacijenta koji ima titar anti-JCV antitela ili procenat inhibicije iznad unapred određenog nivoa i ima specifikovanu raniju upotrebu imunosupresanta i produženo lečenje anti-VLA-4 terapijom.

[0077] U jednom primeru, pacijent je prethodno primao anti-VLA-4 terapiju. U drugom primeru, metod uključuje primenu anti-VLA-4 terapije, npr., natalizumaba, kod pacijenta.

[0078] U jednom primeru, pacijent se klasifikuje kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju, i pacijent i dalje prima anti-VLA-4 terapiju.

[0079] Pacijenti koji su primali anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili manje, koji ranije nisu primali terapiju imunosupresantom (različitu od anti-VLA-4 terapije), i koji su u testu bili negativni u pogledu izlaganja JCV (npr., negativni na JCV antitela) tipično imaju najniži rizik da razviju PML. Suprotno tome, pacijenti koji su primali anti-VLA-4 terapiju duže od 24 meseca, koji su ranije primali terapiju imunosupresantom (različitu od anti-VLA-4 terapije), i koji su u testu bili pozitivni u pogledu izlaganja JCV (npr., pozitivni na JCV antitela) tipično imaju najviši rizik da razviju PML.

[0080] Nivo rizika kod pacijenta da razvije PML može se proceniti evaluiranjem jednog, ili bilo koja dva ili sva tri identifikovana faktora rizika. Na primer, može se smatrati da je pacijent, npr., pacijent sa multiplom sklerozom (MS), koji je u testu bio negativan na titar anti-JCV antitela, pod nižim rizikom za PML. Pacijent koji ima niži rizik za PML može imati rizik manji od oko 0.2/1000 pacijenata, npr., ≤0.11/1000.

[0081] U primeru, pacijent, npr., pacijent sa MS, koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili kraće (npr., 23 meseca, 22 meseca, 20 meseci, 15 meseci, 12 meseci, 6 meseci, 1 mesec ili kraće), i koji ranije nije primao imunosupresantnu terapiju, može se odrediti da je pod nižim rizikom za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik za PML od oko 0.54/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent može da se odredi kao kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab.

[0082] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, duže od 24 meseca, na primer oko 25 do 48 meseci ili duže (npr., 26, 28, 30, 36, 40, ili 48 meseci ili duže), i koji ranije nije primao imunosupresantnu terapiju, može se odrediti ili klasifikovati da ima viši rizik za PML. Pacijent pod višim rizikom za PML može imati rizik ≥ oko 3.7/1000 pacijenata, npr., oko 1.37/1000 pacijenata. Prema tome pacijent se može odrediti kao kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab.

[0083] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili kraće (npr., 24 meseca, 22 meseca, 20 meseci, 15 meseci, 12 meseci, 6 meseci, 1 mesec ili kraće), i koji je određen kao negativan za anti-JCV antitela, ili JCV nukleinsku kiselinu, može se odrediti ili klasifikovati da ima niži rizik za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik ≤0.2/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti kao kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab.

[0084] U primeru, pacijent koji nije ranije lečen imunosupresantom (različitim od anti-VLA-4 terapije), i koji je određen kao negativan za JCV, određuje se da ima niži rizik za PML, npr., ≤0.2/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti kao kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab.

[0085] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, duže od 24 meseca (npr., 25 meseci, 26 meseci, 28 meseci, 30 meseci, 35 meseci, 38 meseci, 40 meseci, 48 meseci ili duže), i koji je ranije primao imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije, može se odrediti da ima viši rizik za PML. Pacijent sa višim rizikom za PML može imati rizik od oko 0.37/1000 ili veći, npr., oko 4.3/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu. Na primer, pacijent koji ima viši rizik za PML, koji se leči anti-VLA-4 terapijom, može se češće kontrolisati u pogledu razvijanja PML nego pacijent koji ima niži rizik za PML.

[0086] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili kraće (npr., 24 meseca, 22 meseca, 20 meseci, 15 meseci, 12 meseci, 6 meseci, 1 mesec ili kraće), i koji je ranije primao imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije, može se odrediti da ima viši rizik za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik za PML od 0.66/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu. Na primer, pacijent koji ima viši rizik za PML, koji se leči anti-VLA-4 terapijom, može se češće kontrolisati u pogledu razvijanja PML nego pacijent koji ima niži rizik za PML.

[0087] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, duže od 24 meseca (npr., 25 do 48 meseci, na primer 26, 30, 36, 42 ili 48 meseci ili duže), i koji je određen kao pozitivan na JVC, određuje se da ima viši rizik za PML. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu.

[0088] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, duže od 24 meseca (npr., 25 do 48 meseci, na primer 26, 30, 36, 42 ili 48 meseci ili duže), i koji nije ranije primao tretman imunosupresantom (različitim od anti-VLA-4 terapije), i koji je određen kao pozitivan na JVC, određen je da ima viši rizik za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik za PML od 4/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu.

[0089] U primeru, pacijent, npr., MS pacijent, koji je ranije primao tretman imunosupresantom različitim od anti-VLA-4 terapije, i koji je određen kao pozitivan na anti-JCV antitela, ili JCV nukleinsku kiselinu, može se odrediti da ima viši rizik za PML. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu.

[0090] U primeru, pacijent koji je ranije primao tretman imunosupresantom različitim od anti-VLA-4 terapije, i koji je određen kao pozitivan na anti-JCV antitela, ili JCV nukleinsku kiselinu, i koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, duže od 24 meseca (npr., 25 do 48 meseci, na primer 26, 30, 36, 42 ili 48 meseci ili duže), može se odrediti da ima viši rizik za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik od 9.8/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu.

[0091] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili kraće (npr., 24 meseca, 22 meseca, 20 meseci, 15 meseci, 12 meseci, 6 meseci, 1 mesec ili kraće), i koji je ranije primao tretman imunosupresantom različitim od anti-VLA-4 terapije, i koji je određen kao pozitivan na JCV, može se odrediti da ima viši rizik za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik od 4.5/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu.

[0092] U primeru, pacijent koji je primao anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili kraće (npr., 24 meseca, 22 meseca, 20 meseci, 15 meseci, 12 meseci, 6 meseci, 1 mesec ili kraće), i koji nije ranije primao tretman imunosupresantom (različitim od anti-VLA-4 terapije), i koji je određen kao pozitivan na JCV, može se odrediti da ima viši rizik za PML. Na primer, može se odrediti da pacijent ima rizik za PML od 0.35/1000 pacijenata. Prema tome, pacijent se može odrediti da nije kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom, ili se može odrediti kao kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, uz češću kontrolu.

[0093] Pacijentu za kojeg je određeno da ima niži rizik za razvijanje PML, može biti određen rizik ≤ od oko 0.54/1000 pacijenata, npr., ≤ 0.25/1000, ≤ 0.2/1000, 0.19/1000, ≤ 0.15/1000, ≤ 0.11/1000, ≤ 0.1/1000, npr., 0.3/1000, 0.25/1000, 0.2/1000, 0.19/1000, 0.15/1000, 0.11/1000, ili 0.1/1000 ili niži. Pacijentu za kojeg je određeno da ima viši rizik za PML može biti određen rizik od oko 0.54/1000 ili viši, npr., oko 0.55/1000, oko 0.60/1000, oko 0.66/1000, oko 1.2/1000, oko 1.37/1000, oko 2.0/1000, oko 2.5/1000, oko 3.0/1000, oko 4.3/1000, oko 5.0/1000, oko 7.8/1000, oko 8.0/1000, ili viši. Na primer, pacijentu za kojeg je određeno da ima viši rizik za PML može biti određen rizik od 0.3/1000, 0.35/1000, 0.5/1000, 0.66/1000, 1.2/1000, 1.37/1000, 2.0/1000, 2.5/1000, 3.0/1000, 4.3/1000, 5.0/1000, 7.8/1000, 8.0/1000 ili viši.

[0094] U jednom primeru, pacijent koji je primao raniji tretman anti-VLA-4 terapijom duže od 24 meseca i koji ranije nije primao terapiju imunosupresantom različitim od anti-VLA-4 terapije, i koji je određen kao JCV negativan, određuje se da ima niži rizik da razvije PML, i prema tome, pogodan je kandidat da i dalje prima tretman anti-VLA-4 terapijom kao što je natalizumab. Međutim, zbog toga što je primao anti-VLA-4 terapiju duže od 24 meseca, procena rizika može uključivati preporuku češćeg kontrolisanja pacijenta u pogledu razvijanja neželjenih simptoma, kao što su simptomi koji mogu ukazati na razvoj PML.

[0095] Pojačana kontrola pacijenata u pogledu razvijanja PML može uključivati češće testiranje za identifikovanje prisustva JCV, npr., češće testiranje testovima na anti-JCV antitela ili testovima na bazi nukleinskih kiselina. Pojačana kontrola može uključivati i MRI skeniranje u cilju identifikovanja lezija mozga nastalih usled PML.

[0096] U jednom primeru, pacijent koji ima manje anti-JCV antitela nego što iznosi unapred odabrani kriterijum, ima nedetektabilni nivo anti-JCV antitela.

[0097] U jednom primeru, pacijent je ranije primao anti-VLA-4 terapiju, i u drugom primeru, pacijent nije ranije primao anti-VLA-4 terapiju.

[0098] U još jednom primeru, pacijent se klasifikuje kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju, i kod pacijenta se primenjuje anti-VLA-4 terapija, npr., natalizumab.

[0099] U jednom primeru, određivanje, npr., određivanje da li je pacijent negativan na JCV, zahteva obezbeđivanje (npr., dobijanje ili primanje) pacijentovog biološkog uzorka i obavljanje imunotesta, kao što je ELISA test, da bi se JCV antitela detektovala u uzorku. U sledećem primeru, određivanje, npr., određivanje da li je pacijent negativan na JCV, zahteva obezbeđivanje pacijentovog biološkog uzorka i obavljanje testa, kao što je test baziran na PCR, da bi se nukleinska kiselina JCV detektovala u uzorku.

[0100] Ako je pacijent klasifikovan kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju, pacijent može da nastavi da prima anti-VLA-4 terapiju. Za pacijenta koji je klasifikovan kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju, određeno je da ima niži rizik da razvije PML, npr., rizik manji od oko 0.2/1000 pacijenata, npr., 0.3/1000 pacijenata, ili 0.2/1000 pacijenata ili 0.19/1000 pacijenata ili 0.11/1000 pacijenata. Na primer, pacijent sa nižim rizikom za PML može imati rizik ≤0.2/1000.

[0101] Za pacijenta koji nije klasifikovan kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju, ili je određen kao kandidat za anti-VLA-4 terapiju uz pojačanu kontrolu u pogledu razvoja PML, određeno je da ima viši rizik za razvoj PML, npr., rizik veći ili jednak oko 0.3.7/1000 pacijenata. Na primer, pacijent određen da ima viši rizik za PML može imati rizik od 0.37/1000, 0.35/1000, 0.66/1000, 1.2/1000, 1.37/1000, 2.5/1000, 4.3/1000, ili 7.8/1000 pacijenata.

[0102] U primeru, klasifikacija ranije izloženosti imunosupresantu, ako je odabrana, jedna je od sledećih:

pozitivna klasifikacija ranije izloženosti imunosupresantu, koja odgovara primanju imunosupresantne terapije različite od anti-VLA-4 terapije, unutar unapred odabranog vremenskog perioda, npr., unutar 1, 3, ili 5 godina, ili u toku životnog veka pacijenta; i negativna klasifikacija ranije izloženosti imunosupresantu, koja odgovara neprimanju imunosupresantne terapije različite od anti-VLA-4 terapije, tokom unapred odabranog vremenskog perioda, npr., unutar 1, 3, ili 5 godina, ili u toku životnog veka pacijenta

[0103] U primeru, klasifikacija ranije izloženosti VLA-4 teerapiji, ako je odabrana, jedna je od sledećih:

pozitivna klasifikacija ranije izloženosti VLA-4 terapiji, koja odgovara primanju anti-VLA-4 terapije duže od unapred odabranog vremenskog perioda, npr., 1, 2, 3, ili 5 godina ili duže; i

negativna klasifikacija ranije izloženosti VLA-4 terapiji, koja odgovara primanju anti-VLA-4 terapije kraće od unapred odabranog vremenskog perioda, npr., kraće od 6 meseci, 1, 2, 3, ili 5 godina.

[0104] U primeru, metod uključuje obezbeđivanje klasifikacije pogodnosti za tretman, koja se npr., može odabrati između jednog od sledećeg:

pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman, koja odgovara pacijentovoj pogodnosti za anti-VLA-4 tretman (pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman može dodatno biti podeljena na pozitivnu klasifikaciju pogodnosti za tretman, koja je udružena sa različitim upozorenjima ili zahtevima za kontrolu, kao što je pojačana kontrola u pogledu razvoja PML); i

negativna klasifikacija pogodnosti za tretman, koja odgovara pacijentovoj nepogodnosti za anti-VLA-4 tretman, ili koja odgovara pacijentovoj pogodnosti za anti-VLA-4 tretman, uz različita upozorenja ili zahteve za pojačanu kontrolu, na primer u pogledu razvoja PML.

[0105] Pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman u korelaciji je sa nižim rizikom za razvijanje PML, a negativna klasifikacija pogodnosti za tretman u korelaciji je sa višim rizikom za razvijanje PML. Niži rizik za razvijanje PML tipično odgovara riziku manjem od 0.2/1000 pacijenata, a viši rizik za razvijanje PML tipično odgovara riziku ≥0.37/1000.

[0106] Ako je pacijentu dodeljena klasifikacija niske izloženosti i negativna klasifikacija JCV statusa, pacijentu se dodeljuje pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman, npr., modifikovana pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman, koja savetuje ili zahteva kontrolu u pogledu razvoja PML

[0107] Ako je pacijentu dodeljena negativna klasifikacija ranije izloženosti imunosupresantu, i negativna klasifikacija statusa anti-JCVantitela, pacijentu se može dodeliti pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman, npr., modifikovana pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman, koja savetuje ili zahteva kontrolu u pogledu razvoja PML

[0108] Ako je pacijentu dodeljena klasifikacija niske izloženosti, negativna klasifikacija ranije izloženosti imunosupresantu, i negativna klasifikacija JCV antitela, pacijentu se dodeljuje pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman.

[0109] U jednom primeru, pacijentu je dodeljena pozitivna klasifikacija pogodnosti za tretman, i pacijentu se i dalje daje anti-VLA-4 terapija, npr., natalizumab.

[0110] U jednom aspektu, objavljen je i metod evaluiranja pacijenta, npr., evaluiranja pacijentovog rizika da razvije PML. Metod uključuje:

(aaa) određivanje da li je pacijent negativan ili pozitivan na JCV, na primer određivanjem da li je nivo anti-JCV antitela niži ili viši od unapred određenog kriterijuma, npr., kako je određeno metodom objavljenim u ovom tekstu;

(bbb) određivanje da li je pacijent primao anti-VLA-4 terapiju duže od unapred određenog perioda vremena (npr., duže od 24 meseca), ili kraće od unapred određenog perioda vremena, npr., 24 meseca ili kraće, ili nije primao anti-VLA-4 terapiju u ranije određenom vremenskom periodu, npr., u poslednjih 2, 3, 5 godina, ili nikada u svom životu;

(ccc) određivanje da li je pacijent bio lišen imunosupresantne terapije različite od anti-VLA-4 terapije tokom unapred odabranog vremenskog perioda ili je primao imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije tokom unapred odabranog vremenskog perioda (precizirano vreme) (npr., poslednjih 1, 2, 3, 4, 5, ili 10 godina ili nikada u svom životu); i zavisno od određivanja, evaluiranje pacijenta.

[0111] U primeru, odgovor na utvrđivanje da je pacijent negativan na JCV, je određivanje da pacijent ima niži rizik da razvije PML.

[0112] U primeru, odgovor na utvrđivanje da je pacijent pozitivan na JCV, je određivanje da pacijent ima viši rizik za PML.

[0113] U primeru određivanje, npr., određivanje da je pacijent negativan za JCV, uključuje ili zahteva uzimanje uzorka iz pacijentovog tela ili analiziranje uzorka dobijenog od pacijenta, ili metod zahteva još i primenu terapije kod pacijenta. Terapija može, npr., u slučaju pacijenta sa nižim rizikom, biti anti-VLA-4 terapija (npr., anti-VLA-4 antitelo), ili, npr., u slučaju pacijenta sa nižim rizikom, alternativna (ne-anti-VLA-4) terapija, npr., interferon, glatiramer acetat ili kortikosteroid.

[0114] U jednom aspektu, objavljen je metod ispunjavanja uputstava. Uputstva mogu, na primer, biti umetnuta u pakovanje, kako zahteva vlada, npr., pakovanje prema nalogu FDA (Food and Drug Administration, Agencija za hranu i lekove) ili EMA (European Medicines Agency, Evropska medicinska agencija), i predstavljaju vodič za upotrebu anti-VLA-4 terapije. Metod ispunjavanja uputstava uključuje opciono prijem uputstava; dobijanje rezultata evaluacionih metoda opisanih u ovom tekstu, i u zavisnosti od dobijenog rezultata, davanje preporuke za lečenje pacijenta i, opciono, dalje davanje terapije pacijentu. Uputstvo može naznačiti metod evaluacije opisan u ovom tekstu, što je od suštinskog značaja za bezbednu primenu terapije. Terapija može biti anti-VLA-4 terapija, npr., natalizumab.

[0115] Objavljen je metod evaluiranja pacijenta, metod zahteva obezbeđivanje kita za sakupljanje ili transport pacijentovog uzorka do pružaoca zdravstvene nege; prijem pacijentovog uzorka od strane pružaoca zdravstvene nege; izvođenje metoda kako je zahtevano u ovom tekstu.

[0116] Objavljen je i metod lečenja pacijenta. Metod zahteva dobijanje rezultata ovde opisanog metoda evaluacije pacijenta ili uzorka, i u odgovoru na dobijeni rezultat, primenu terapije kod pacijenta. Terapiju može predstavljati anti-VLA-4 terapija, kao što je natalizumab. Na primer, u odgovoru na rezultate koraka (a) i (b), koraka (a), (b), i (c), koraka (a), (b), (c) i (d), koraka (c), ili koraka (c) i (d), kod pacijenta se primenjuje terapija, npr., terapija opisana u ovom tekstu.

[0117] Objavljen je i kompjuterizovani metod odobravanja povraćaja novca, na primer cene anti-VLA-4 terapije. Stranka kojoj će se izvršiti povraćaj može biti treća stranka koja je izvršila plaćanje, kao što je osiguravajuća kompanija ili vladina agencija. Metod može uključivati (a) dobijanje rezultata metoda evaluacije pacijenta opisanog u ovom tekstu, i snimanje rezultata na medijumu koji se može očitati pomoću kompjutera; (b) sticanje dokaza o primeni anti-VLA-4 terapije kod pacijenta i snimanje dokaza na medijumu koji se može očitati pomoću kompjutera; i (c) ako je rezultat konzistentan sa primenom anti-VLA-4 terapije, odobravanje povraćaja ili povraćaj novca stranci.

[0118] U jednom aspektu, objavljen je metod selektovanja ili klasifikovanja pacijenta kao kandidata za primanje tretmana anti-VLA-4 terapijom, npr., natalizumabom. Na primer, metod može uključivati određivanje da je pacijent ranije primao anti-VLA-4 terapiju tokom 24 meseca ili kraće, npr., 1 do 24 meseca, 2 do 20 meseci, 5 do 15 meseci, ili 10 do 12 meseci, ili da pacijent ranije nije primao tretman imunosupresantom, i procenjivanje titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije. U jednom primeru, procena uključuje analiziranje uzorka dobijenog od pacijenta. Uzorak može biti, na primer, uzorak krvi, plazme seruma, urina, ili cerebrospinalne tečnosti. Ako procena pokaže da je pacijent pozitivan na JCV, npr., pozitivan na anti-JCV antitela ili JCV nukleinsku kiselinu, onda se pacijent ne bira ili klasifikuje kao kandidat za tretman anti-VLA-4 terapijom. Ako procena pokaže da je pacijent negativan za JCV, npr., negativan na anti-JCV antitela ili JCV nukleinsku kiselinu, onda se pacijent bira ili klasifikuje kao kandidat da primi tretman anti-VLA-4 terapijom.

[0119] Test za utvrđivanje prisustva anti-JCV antitela može biti imunotest, kao što je ELISA test. Test za utvrđivanje prisustva JCV nukleinske kiseline može biti, npr., PCR test ili metod sekvenciranja sledeće generacije (next generation sequencing, NGS) metod.

[0120] Pacijent za kojeg je određeno da ima niži rizik za PML, može dalje primati anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab. Pacijent za kojeg je određeno da ima viši rizik za PML, može dalje primati alternativu anti-VLA-4 terapiji, na primer interferon, glatiramer acetat, kortikosteroid ili TNF agonist. U jednom primeru, pacijent za kojeg je određeno da ima viši rizik za PML, može dalje primati anti-VLA-4 terapiju, uz moguću potrebu češćeg testiranja na PML, i kada je pacijent inicijalno određen kao JCV negativan, češće testiranje na JCV takođe može biti potrebno.

[0121] U jednom aspektu, objavljen je metod određivanja pacijentovog rizika za PML. Metod uključuje (a) određivanje da je pacijent ranije primao anti-VLA-4 terapiju (npr., natalizumab) tokom 24 meseca ili kraće, ili da pacijent ranije nije primao tretman imunosupresantom; i (b) procenjivanje statusa anti-JCV antitela kod pacijenta, pri čemu korak procenjivanja uključuje analiziranje uzorka dobijenog od pacijenta. Ako procenjivanje pokaže da je pacijent JCV negativan, onda se određuje da pacijent ima niži rizik za PML. Ako procenjivanje pokaže da je pacijent JCV pozitivan, onda se određuje da pacijent ima viši rizik za PML.

[0122] U sledećem aspektu, objavljen je metod lečenja pacijenta. Metod lečenja uključuje, npr., određivanje pacijentovog ranijeg izlaganja anti-VLA-4 terapiji, i određivanje da li je pacijent ranije primao tretman imunosupresantom. Opciono, može se odrediti i pacijentov status u pogledu JCV.

[0123] Ako se odredi da je pacijent primao anti-VLA-4 terapiju tokom 24 meseca ili kraće, i da ranije nije primao tretman imunosupresantom, onda se određuje da pacijent ima niži rizik za PML, i pacijentu se daje anti-VLA-4 terapija. Ako se odredi da je pacijent primao natalizumab duže od 24 meseca (npr., 25 meseci ili duže), i da ranije nije primao tretman imunosupresantom, onda se određuje da pacijent ima viši rizik za PML, i pacijentu se daje terapija koja je alternativna anti-VLA-4 terapiji, npr., interferon, kortikosteroid, statin ili TNF antagonist.

[0124] Određivanje pacijentovog prethodnog izlaganja anti-VLA-4 terapiji ili imunosupresantnu može uključivati postavljanje pitanja pacijentu ili negovatelju, npr., lekaru, sestri, roditelju ili drugom pružaocu nege. U nekim slučajevima, određivanje pacijentovog ranijeg izlaganja može uključivati pristupanje informacijama u bazi podataka, npr., medicinskoj bazi podataka.

[0125] Objavljen je i metod određivanja pacijentovog rizika za PML. Metod uključuje određivanje pacijentovog ranijeg izlaganja anti-VLA-4 terapiji, i određivanje da li je pacijent ranije primao tretman imunosupresantom. Opciono, može se određivati i pacijentov status anti-JCV antitela. Ako se odredi da je pacijent primao anti-VLA-4 terapiju 24 meseca ili kraće, i da nije ranije primao tretman imunosupresantom, onda se određuje da pacijent ima niži rizik za PML. Ako se odredi da je pacijent primao anti-VLA-4 terapiju duže od 24 meseca, i da nije ranije primao tretman imunosupresantom, onda se određuje da pacijent ima viši rizik za PML. Pacijent za kojeg je određeno da ima niži rizik za PML može dalje da prima anti-VLA-4 terapiju, npr., natalizumab. Nasuprot tome, pacijent za kojeg je određeno da ima viši rizik za PML može dalje primati terapiju koja je alternativna anti-VLA-4 terapiji, npr., interferon, kortikosteroid, statin ili TNF antagonist.

[0126] U jednom primeru, određuje se i pacijentov JCV status, i ako se odredi da je pacijent JCV negativan, onda se određuje da pacijent ima niži rizik za PML nego ako se odredi da je pacijent JCV pozitivan.

[0127] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju uobičajeno značenje koje razume prosečno obučeni stručnjak u oblasti kojoj predmetna objava, uključujući predmetni pronalazak, pripada. Iako se u primeni ili ispitivanju predmetne objave, uključujući predmetni pronalazak, mogu koristiti metodi i materijali koji su slični ili ekvivalentni ovde opisanima, pogodni metodi i materijali opisani su u nastavku ovog teksta. U slučaju nesporazuma, važeća će biti predmetna specifikacija, uključujući definicije. Pored toga, materijali, metodi i primeri dati su samo kao ilustracija i nije im cilj da ograniče pronalazak.

[0128] Detalji jednog ili više primera izvođenja pronalaska dati su u priloženim crtežima i opisima u nastavku teksta. Druge osobine, ciljevi i prednosti pronalaska biće očigledni iz opisa i crteža, kao i iz patentnih zahteva.

[0129] Na osnovu objave sadržane u ovom tekstu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod evaluacije pacijentovog rizika da razvije progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML), metod uključuje:

određivanje titra antitela na JC virus (JCV), izraženog kao indeks, u serumu ili plazmi pacijenta, pri čemu se određuje da pacijent ima visok rizik ako se utvrdi da titar JCV antitela iznosi >1.5;

gde se indeks određuje normalizovanjem OD vrednosti uzorka prema kalibratoru granične vrednosti, pri čemu se podešava da granični kalibrator ima vrednost 1,

gde granični kalibrator sadrži mešavinu seruma pozitivnog za JCV antitela i seruma negativnog za JCV antitela,

gde normalizovanje OD vrednosti negativne kontrole koja uključuje serum negativan na JCV antitelo prema graničnom kalibratoru rezultuje vrednošću 0.1, i

gde se titar JCV antitela određuje ELISA testom za detektovanje JCV antitela u uzorku.

[0130] Predmetni pronalazak i njegovi primeri izvođenja izloženi su u priloženim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0131]

SL. 1A i 1B predstavljaju grafikone koji prikazuju incidencu PML udruženu sa natalizumabom, prema kumulativnom trajanju tretmana (SL. 1A) i prema 12-mesečnim intervalima trajanja tretmana (SL.1B).

SL. 2 predstavlja šematski dijagram koji prikazuje aproksimativnu incidencu PML, startifikovano prema ranijoj upotrebi imunosupresanta i trajanju tretmana natalizumabom.

SL. 3 predstavlja šematski dijagram koji prikazuje aproksimativnu incidencu PML, startifikovano po statusu anti-JCV antitela u serumu, ranijoj upotrebi imunosupresanta, i trajanju tretmana natalizumabom.

SL. 4A i 4B predstavljaju grafikone koji prikazuju analizu senzitivnosti procena PML incidence kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo, stratifikovano prema ranijoj upotrebi imunosupresanta (da ili ne) i trajanju tretmana natalizumabom (1-24 meseca (SL. 4A) ili 25-48 meseci (SL.4B)). Baza= scenario osnovnog slučaja.

SL. 5A i 5B predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 1.

SL. 6A i 6B predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 2. SL. 7A i 7B predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 3. SL. 8A i 8B predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 4. SL. 9A i 9B predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 5. SL. 9C i 9D predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 6. SL. 10A i 10B predstavljaju grafikone koji prikazuju nOD odnosno titre pacijenta 7. SL. 11 predstavlja dijagram rasejanja, koji prikazuje podatke indeksa (x osa) i procenta inhibicije (y osa), sakupljene za grupu MS pacijenata.

SL. 12 predstavlja dijagram rasejanja, koji prikazuje podatke indeksa (x osa) i procenta inhibicije (y osa) sakupljene za grupu MS pacijenata.

FIG. 13 predstavlja dijagram rasejanja, koji prikazuje vrednosti indeksa određene za grupu MS pacijenata.

DETALJAN OPIS

[0132] Pronalazak je zasnovan, bar delom, na otkriću novih poboljšanih metoda procene rizika kod pacijenta za PML, koji uključuju procenjivanje titara anti-JCV antitela ili procenta inhibicije. Pronalazak je zasnovan, bar delom, na otkriću da titar anti-JCV antitela i procenat inhibicije antitela mogu biti indikator pacijentovog rizika da razvije progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML).

[0133] Pored toga, podnosioci su razvili optimizovani test za određivanje nivoa titra anti-JCV antitela u biološkom uzorku, i metod za kvalitativno testiranje antitela određivanjem vrednosti procenta inhibicije, i korišćenje ove informacije za određivanje pacijentovog rizika da razvije PML. Test uključuje: (a) formiranje prve reakcione mešavine koja sadrži prvi alikvot uzorka i supstrat na kojem su izložene HPVLP, pri čemu su VLP čestice prisutne u količini od 0.04 µg, i koncentraciji od 0.4 µg/mL; b) detektovanje nivoa anti-JCV antitela vezanog za HPVLP izloženu na supstratu, na primer detektovanjem obeleženog sekundarnog detekcionog reagensa, npr., anti-IgG antitela obeleženog enzimom, vezanog za anti-JCV antitelo vezano za pomenuti supstrat; (c) formiranje druge reakcione mešavine koja sadrži drugi alikvot uzorka sa HPVLP u fazi rastvora u koncentraciji od, npr., 0.4 µg/mL, i drugi alikvot uzorka u razblaženju od, npr., 1:100 ili 1:101; (d) formiranje treće reakcione mešavine koja sadrži negativni kontrolni rastvor koji ne sadrži HPVLP, i treći alikvot uzorka u razblaženju od., npr., 1:100 ili 1:101, ili 1:110 u negativnom kontrolnom rastvoru; (e) detektovanje nivoa nevezanog anti-JCV antitela u drugoj i trećoj reakcionoj mešavini, na primer detektovanjem JCV sposobnog za vezivanje sa supstratom na kojem su izložene HPVLP, gde je prisutna pomenuta HPVLP; (f) obezbeđivanje prve vrednosti koja odgovara nivou vezivanja anti-JCV antitela za HPVLP izloženu na supstratu u prvom alikvotu uzorka, i druge vrednosti koja odgovara nivou nevezanog anti-JCV antitela u drugoj reakcionoj mešavini, npr., nivou anti-JCV antitela koje se vezuje za HPVLP izloženu na supstratu iz pomenute druge reakcione mešavine; i (g) opciono, upoređivanje prvog i drugog nivoa antitela.

[0134] Podnosioci su otkrili i to da pacijent ima niži rizik da razvije PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi < 0.5, ili (ii) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 0.5 i < 3.0, a procenat inhibicije se odredi da je jednak ili manji od 70%. Pacijent ima viši rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 3, a procenat inhibicije se odredi da iznosi > 70%, ili (ii) ako je pacijent pokazao 2-struki porast indeksa, nOD ili titra u odnosu na prethodni test.

[0135] Pacijent se može kontrolisati u redovnim intervalima, na primer svakih 6 meseci ili svakih 12 meseci, u pogledu promena titra anti-JCV antitela ili procenta inhibicije. Ako rezultati narednog testa ukažu da pacijent i dalje ima titar anti-JCV antitela sa nOD manjom od 0.5, i procenat inhibicije <70%, onda se može odrediti da pacijent i dalje ima niži rizik za razvijanje PML. Ako naredni test ukaže na to da je titar pacijentovih antitela povećan 2 do 3 puta u odnosu na inicijalni test, onda se može odrediti da je pacijent pod povećanim ili višim rizikom da razvije PML. Podnosioci su posmatrali pacijente sa dijagnostikovanom PML, kako bi pokazali porast titra antitela i nOD 2 do 3 puta u šest meseci pre postavljanja dijagnoze.

[0136] Pacijent ima viši rizik za PML (i) ako se odredi da titar anti-JCV antitela, indikovan vrednošću indeksa ili nOD, iznosi > 3, a procenat inhibicije se odredi da iznosi > 70%, ili (ii) ako je pacijent pokazao 2-struki porast indeksa, nOD ili titra u odnosu na prethodni test.

[0137] Pacijent koji ispunjava ove kriterijume može se opciono, odrediti da nije kandidat za lečenje anti-VLA-4 terapijom, kao što je anti-VLA-4 antitelo, npr., natalizumab, ili se pacijent može dodatno procenjivti u pogledu drugih faktora rizika za ravijanje PML. Ovi faktori rizika uključuju to da li je pacijent ranije primao ili nije anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, i koliko dugo je pacijent primao terapiju; i da li je i koliko dugo pacijent ranije primao imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije. Pacijentov rizik za PML je kombinacija svih ovih faktora.

[0138] Titar antitela može se meriti pomoću "nOD" ili "indeksa". "nOD" je vrednost normalizovane optičke gustine u testu, kao što je ELISA test, za detekciju anti-JCV antitela.

[0139] Podnosioci su ranije otkrili da pacijenti koji su primali anti-VLA-4 terapiju, kao što je natalizumab, 24 meseca ili manje, i koji nisu ranije primali terapiju imunosupresantom, imaju niži rizik da razviju PML nego pacijenti koji ne ispunjavaju ove kriterijume. Pored toga, pacijenti sa najnižim rizikom su oni koji ispunjavaju ova dva kriterijuma i koji su pored toga JCV negativni, npr., pacijenti koji nisu pozitivni u testu na anti-JCV antitela ili JCV nukleinsku kiselinu, npr., JCV DNK. Ranije nije bilo poznato da svaki od ova tri faktora rizika ((i) količina vremena tokom kojeg je pacijent prethodno primao anti-VLA-4 terapiju; (ii) da li je pacijent ranije primao terapiju imunosupresantom različitim od anti-VLA-4 terapije ili nije; i (iii) JCV status) nezavisno doprinosi pacijentovom riziku za PML. Pronalazak opisan u ovo tekstu može da se koristi generalno za pacijente tretirane VLA-4 inhibitorom. Mogućnost da se identifikuju subpopulacije pacijenata sa različitim rizicima za PML omogućava bolju karakterizaciju rizika nego raniji metodi (tj., ukupan PML rizik) i treba da pomogne profesionalnim pružaocima zdravstvene nege i pacijentima da donesu bolje odluke o lečenju na osnovu bolje obaveštenosti o koristima i rizicima. Ovi kriterijumi za procenu rizika opisani su u zajedničkim U.S. privremenim patentnim prijavama 61/491,810, podnetoj 31. maja 2011. i 61/508584, podnetoj 15 jula 2011. Kriterijumi rizika opisani u ovom tekstu, koji se odnose na titar anti-JCV antitela (npr., meren nOD ili indeksnim nivoom) i procenat inhibicije, mogu se razmatrati u kombinaciji sa faktorima rizika opisanim u prethodnim zajedničkim privremenim patentnim prijavama.

[0140] Metodi određivanja rizika za PML mogu zahtevati sticanje jedne, dve ili sve tri JCV klasifikacije za pacijenta (npr., titar anti-JCV antitela, na primer meren nOD ili indeksnim nivoom, i procenat inhibicije), pacijentovu istoriju ranije anti-VLA-4 terapije, i pacijentovu istoriju ranije terapije imunosupresantom (različite od anti-VLA-4 terapije). U odgovoru na ove klasifikacije, pacijentu se može dodeliti klasifikacija pogodnosti za tretman. Pacijentima za koje se odredi da imaju nizak rizik da razviju PML može se dodeliti pozitivna klasifikacija za tretman, a pacijentima za koje je određeno da imaju viši relativni rizik da razviju PML može se dodeliti negativna klasifikacija za tretmana. Pacijent koji dobija pozitivnu klasifikaciju za tretman može dobiti preporuku za nastavak tretman ili za otpočinjanje tretmana anti-VLA-4 terapijom. Pacijent koji dobija negativnu klasifikaciju za tretman može dobiti preporuku da okonča tretman anti-VLA-4, preporuku da otpočne tretman terapijom različitom od anti-VLA-4 terapije, preporuku za nastavak ili optočinjanje anti-VLA-4 terapije uz povećani nadzor u pogledu znakova i simptoma PML.

[0141] Preporuka za dalji tretman anti-VLA-4 terapijom može biti udružena sa dodatnim uputstvima ili zahtevima da se pacijent dodatno ili pojačano kontroliše, na primer ako jedan ili više faktora ukažu da pacijent može biti pod povećanim rizikom za PML, npr., u slučaju ranijeg tretmana anti-VLA-4 terapijom dužeg od 24 meseca, npr., 25 meseci ili duže, ili u slučaju ranijeg tretmana imunosupresantom različitim od anti-VLA-4 terapije.

[0142] Da li je pacijent ranije primao anti-VLA-4 terapiju ili imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije može se odrediti na osnovu izjave pacijenta, ili informacije (usmene ili pismene) dobijene od roditelja, lekara, lekarskog pomoćnika, medicinske sestre ili drugog pružaoca zdravstvene nege. Informacija se može dobiti i iz baze podataka, kao što je medicinska baza podataka ili baza podataka o kliničkim ispitivanjima.

[0143] Ranije terapije imunosupresantom, različite od anti-VLA-4 terapije, koje će biti indikativne za povećani rizik za PML mogu uključivati raniji tretman antineoplastičnim sredstvima, imunosupresantima ili imunomodulatorima kao što su jedan ili više od betainterferona ili glatiramer acetata. Primeri imunosupresanata uključuju, npr., mitoksantron, metotreksat, azatioprin, ciklofosfamid, i mikofenolat, anti-CD20 terapiju (npr., rituksimab), anti-CD11a terapiju (npr., efalizumab), ili mikofenolat mofetil. Raniji tretman drugim imunosupresantnim terapijama, kako je opisano u nastavku ovog teksta, takođe će biti prediktivan za povećanje pacijentovog rizika za PML posle dodatne primene anti-VLA-4 terapije. Uopšteno, određivanje ranije upotrebe imunosupresanta je specifikovana upotreba koju može predstavljati bilo koja ranija upotreba imunosupresanta različitog od VLA-4 inhibitora (npr., anti-VLA-4 antitela) ili ranija upotreba unutar određenog vremenskog perioda, na primer, u okviru prethodnih 1, 2, 3, 5, ili 10 godina pre evaluacije rizika za PML.

[0144] Određivanje JCV statusa odnosi se na određivanje da li je pacijent bio izložen JCV i, prema tome, uključuje direktne metode određivanja izloženosti (na primer, detektovanje JCV proteina ili JCV DNK) i indirektne metode (npr., detektovanje antitela na JCV u uzorku dobijenom od pacijenta). Testovi za određivanje JCV statusa mogu uključivati testove za detektovanje JCV nukleinske kiseline (npr., DNK ili RNK), ili JCV seroprevalence, ili anti-JCV antitela u biološkom uzorku, na primer u uzorku plazme, seruma, krvi ili urina, ili u uzorku mononuklearnih ćelija periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), ili cerebrospinalne tečnosti. JCV nukleinska kiselina može se detektovati korišćenjem metoda poznatih u struci, na primer, metodima amplifikacije, npr., lančanom reakcijom polimeraze (polymerase chain reaction, PCR), ili metodom sekvenciranja sledeće generacije (NGS). JCV seroprevalenca može da se testira korišćenjem metoda poznatih u struci kao što je test inhibicije hemaglutinacije (haemagglutination inhibition (HI) test). JCV antitela mogu da se detektuju imunotestom kao što je ELISA test. U jednom primeru izvođenja, JCV antitela mogu da se detektuju metodom opisanim u Međunarodnoj patentnoj prijavi broj PCT/US2011/20832, u kojoj se za detektovanje nivoa vezivanja anti-JCV antitela u biološkom uzorku koriste HPVLP, pod uslovima pogodnim za vezivanje anti-JCV antitela. Metodi određivanja JCV statusa uključuju i određivanje titra anti-JCV antitela i procenta inhibicije. Detektovanje titra anti-JCV antitela i procenta inhibicije tipično uključuje test detekcije antitela u dva koraka, kako je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi broj PCT/US2011/20832.

[0145] Ukoliko se utvrdi prisustvo JCV u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta, npr., prisustvo JCV antitela, proteina, peptida, ili nukleinskih kiselina, određuje se da je pacijent "JCV pozitivan". Pozitivna JCV klasifikacija odgovara prisustvu JCV antitela u biološkom uzorku, npr., prisustvu JCV antitela jednakom ili većem od unapred odabranog kriterijuma. Unapred određeni kriterijum je tipično kvalitativna vrednost, npr., "detektabilna" količina antitela u skladu sa određenim testom, npr., imunotestom.

[0146] Metodi određivanja rizika za PML opisani u ovom tekstu mogu biti korisni za svakog čoveka-subjekta, uključujući subjekta koji razmatra tretman imunomodulatorom, na primer anti-VLA-4 terapijom (npr., natalizumab), anti-CD20 terapijom (npr., rituksimab), anti-CD11a terapijom (npr., efalizumab), ili mikofenolat mofetilom; subjekta koji je trenutno pod tretmanom imunomodulatorom; ili subjekta koji je prekinuo lečenje imunomodulatorom. Metod može biti koristan drugima koji mogu biti podložni PML kao što su osobe koje imaju limfoproliferativni poremećaj, kao što su multipli mijelom ili limfom; osobe koje su inficirane virusom humane imunodeficijencije (human immunodeficiency virus, HIV), ili imaju sindrom stečene imunodeficijencije (acquired immune deficiency syndrome, AIDS), koje imaju hematološke malignitete, ili autoimunske bolesti kao što su sistemski eritemski lupus (systemic lupus erythematosus, SLE), zapaljensku bolest creva, kao Chronova bolest (Crohn's disease, CD) ili ulcerativni kolitis, multiplu sklerozu (MS) ili artritis, npr., reumatoidni artritis (RA). Metod procene rizika može biti koristan i subjektima koji primaju imunosupresivnu ili imunomodulatornu terapiju, kao što su pacijenti sa transplantatima. Primeri imunosupresivne ili imunomodulatorne terapije uključuju natalizumab, rituksimab, efalizumab, i mikofenolat mofetil. Metod može biti koristan za procenu rizika kod subjekta koji ima poremećaj, ili je lečen lekom objavljenim u Piccinni et al. "Stronger association of drug-induced progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) with biological immunomodulating agents" Eur. J. Clin. Pharmacol.66:199-206,2010.

Definicije

[0147] Kako se koristi u ovom tekstu, "HPVLP" je visoko prečišćena VLP ("virus-like particle", "virusu slična čestica") koja se pretežno sastoji od VP1 proteina. "HPVLP" obezbeđena u pronalasku sačinjena je uglavnom od glavnog proteina kapsida "VP1", koji može biti prirodni VP1 ili rekombinantni VP1, iz poliomavirusa, JC virusa (JCV). HPVLP može biti sačinjena od, npr., najmanje jedne pentamerne podjedinice, više od jedne pentamerne podjedinice, do sedamdeset dve pentamerne podjedinice ili više VP1. Za HPVLP pronalaska mogu se vezivati antitela protiv prirodnog, intaktnog JC virusa. U nekim primerima izvođenja, HPVLP uključuje drugi i, opciono, treći polipeptid koji je minorni kapsidni protein JC virusa, npr., najmanje jedan VP2 ili VP3 polipeptid. VP2 ili VP3 mogu biti rekombinantni ili prirodni ili prirodni derivatizovani polipeptidi.

[0148] Takve "visokoprečišćene" čestice sadrže više od jednog VP1 pentamera, npr., najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 72 VP1 pentamera, ili manje od 100 VP1 pentamera. Takve visokoprečišćene čestice mogu se dobiti, na primer, metodom koji uključuje dvostruku filtraciju. Na primer, u jednom primeru, visokoprečišćeni preparat VLP dobija se prečišćavanjem čestica centrifugiranjem najmanje dva puta, npr., kroz saharozno jastuče. U drugim primerima, HPVLP se pripremaju korišćenjem hromatografskih metoda. Uopšteno, HPVLP preparat se može identifikovati prema svojoj aktivnosti u ELISA testu, korišćenjem definisanih kontrolnih uzoraka. U nekim slučajevima, takvi kontrolni uzorci su negativne kontrole i/ili kontrolni uzorci koji sadrže niske nivoe JCV antitela.

[0149] Kako se koristi u ovom tekstu, "HPVLP supstrat sa visokim odnosom signala prema šumu" je supstrat na kojem je izložena HPVLP. On se može koristiti za evaluaciju nivoa slobodnog (nevezanog za antigen ili drugi cilj, npr., HPVLP, u uzorku. Koncentracija HPVLP na supstratu je takva da, kada se meri količina prisutnog anti-JCV antitela, obezbeđuje odnos signala prema šumu od 10 do 30, 15 do 30, 15 do 25, 18 do 22. U primeru izvođenja, odnos signala prema šumu iznosi najmanje 10, 15, 18 ili 20. U primeru izvođenja, odnos signala prema šumu iznosi oko 10, 15, 18 ili 20. Odnos signala prema šumu može se odrediti pomoću uzorka, npr., kalibracione kontrole, koji daje optičku gustinu 1.0. U primeru izvođenja, HPVLP je dat na pomenutom supstratu u koncentraciji koja je rezultat liofilizovanja 0.5 ml, 0.8 ml, 1.0 ml, 1.2 ml, ili 1.5 ml 0.4 µg/ml HPVLP u bunarčiću ploče sa 96 bunarčića. U primeru izvođenja, HPVLP je dat na pomenutom supstratu u koncentraciji koja je rezultat liofilizovanja 1.0 ml 0.4 µg/ml HPVLP u bunarčiću ploče sa 96 bunarčića, koja je kako se koristi ovde, ekvivalentna 30 ng do 50 ng (npr., 40 ng) HPVLP po bunarčiću. U primeru izvođenja, HPVLP je dat na pomenutom supstratu u koncentraciji koja je rezultat liofilizovanja 0.05 ml do 0.35 mL ili 0.1 ml do 0.2 ml 0.4 µg/ml HPVLP u bunarčiću ploče sa 96 bunarčića. Količina HPVLP izložena na supstratu, ili uslovi pod kojima se deponovanje postiže, mogu varirati uz uslov da se dobija željeni odnos signala prema šumu.

[0150] Odnos signala prema šumu obračunava se upoređivanjem vrednosti optičke gustine negativne kontrole prema kalibratorskoj kontroli, da se odredi dinamički opseg intenziteta signala u testu.

[0151] U primeru izvođenja, uzorak se razblažuje oko 100 puta i granična vrednost za negativni skor je redukcija koja je jednaka ili manja od 45%, i granična vrednost za pozitivni skor je veća od 45%. U primerima izvođenja, razblaženje je različito od 100 puta ali je manje od 200 puta. Na primer, razblaženje je između 50- i 150-strukog, 75- i 125-strukog, 85- i 115-strukog. U primerima izvođenja, razblaženje je manje od 150-strukog, 125-strukog, 100-strukog, ili 75-strukog. U primerima izvođenja u kojima je razblaženje različito od 100-strukog (npr., 200-struko, 400-struko, 500-struko, 800-struko, do >1000000-strukog, granična vrednost ili drugi parametri, podešavaju se tako da uzorak dobije isti skor (pozitivan ili negativan) kao onaj koji bi dobio ako bi razblaženje bilo 100-struko, i granična vrednost za negativnost je manja od 45% i granična vrednost za pozitivnost je jednaka ili veća 45%.

[0152] Test detekcije anti-JCV antitela. Testovi se izvode dodavanjem biološkog uzorka supstratu koji je obložen sa HPVLP i detektovanjem uz korišćenje metoda poznatih u struci. Uopšteno, koristi se čvrsta osnovna podloga kao što je mikrotitarska ploča (na primer ploča sa 96 bunarčića); mada se mogu koristiti i drugi formati poznati u struci. U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak se razblažuje pre upotrebe u testu.

[0153] U određenim primerima izvođenja, testni format je enzimski imunotest (enzymelinked immunoassay, ELISA). Uopšteno, metod tipično uključuje oblaganje supstrata imobilisanim antigenom kao što je HPVLP, inkubiranje uzorka koji sadrži vezujuća antitela na imobilisani reagens, ispiranje da bi se uklonile nespecifično vezane vrste, i detektovanje vezanih imunskih kompleksa, npr., hromogenim ili hemiluminiscentnim testom. Hromogeni supstrati proizvode obojeni krajnji proizvod koji može da se detektuje vizuelno ili merenjem pomoću spektrofotometra. Hemiluminiscentni supstrati proizvode svetlost, koja se može meriti luminometrom.

[0154] Oblaganje ploče sa HPVLP obično uključuje inkubiranje čvrstog supstrata (kao što su bunarčići mikrotitarske ploče) sa rastvorom HPVLP u odgovarajućoj koncentraciji (npr., 0.4 µg/ml), preko noći ili tokom određenog broja sati. HPVLP mogu uključivati VP1 kao jedinu JCV virusnu komponentu, ili HPVLP može biti heterologa čestica koja sadrži najmanje jedan VP2 ili VP3 po čestici ili najmanje jedan od svakog od VP2 i VP3 po čestici. Posle nanošenja HPVLP, bunarčići ploče se isperu. Supstrat se zatim "obloži" nespecifičnim proteinom koji je antigenski neutralan u odnosu na uzorke koji će biti testirani. Pogodni materijali za oblaganje poznati su u struci i uključuju goveđi serum albumin (bovine serum albumin, BSA), kazein, šećere ili rastvore mleka u prahu. Ploče zatim mogu da se osuše i čuvaju duže vreme, na primer 1 dan, 1 mesec ili 1 godinu, pre nego što se pređe na sledeći korak testa.

[0155] Uzorak ili referenca inkubiraju se na pripremljenom supstratu pod uslovima koji omogućavaju formiranja kompleksa (HPVLP/JCV antitelo), kada se formira vezani kompleks. Detekcija vezanog kompleksa obavlja se korišćenjem obeleženog antitela koje može da se veže za humano antitelo. Uopšteno, obeleženo antitelo može da detektuje humani IgG ili humani IgG i IgM. U nekim slučajevima, test može da se izvede korišćenjem sekundarnog ili tercijarnog metoda detekcije.

[0156] Referentni uzorak može biti uzorak istog biološkog materijala (npr., plazma, serum, urin, ili CSF) izolovan iz individue za koju se na osnovu prisustva JCV DNK u urinu (uropozitivnost) zna da je inficirana JC virusom. Referentni uzorak se koristi za uspostavljanje testne granične vrednosti tako da stopa lažne negativnosti u testu ne bude veća od 1%-3%.

[0157] "Pod uslovima efikasnim u omogućavanju formiranja kompleksa", uopšteno, odnosi se na uslove u kojima su reagensi bili razblaženi da bi se smanjio pozadinski signal i da bi se obezbedila očitavanja rezultata unutar specifičnog opsega. Razblaživači mogu uključivati, u neograničavajućim primerima, rastvore koji uključuju BSA, fosfatom puferisani slani rastvor (phosphate buffered saline, PBS), ili PBS koji sadrži Tween.

[0158] Pod "pogodnim" uslovima podrazumevaju se i temperatura i/ili vremenski period koji su dovoljni da omoguće efikasno vezivanje. Inkubacije tipično traju od oko jednog do dva sata ili od jednog do četiri sata, na temperaturama od približno 25°C do 27°C, ili inkubacije se mogu odvijati preko noći na oko 4°C. Međutim, stručnjaci u oblasti će razumeti da i drugi uslovi mogu biti pogodni.

[0159] Uopšteno, između inkubacija tokom izvođenja testa obavlja se jedno ili više ispiranja. Odgovarajući rastvori za ispiranje uključuju razblaživački pufer (npr., PBS ili PBS/Tween) ili boratni pufer.

[0160] Uopšteno, detekcija antitela vezanog za HPVLP obavlja se korišćenjem metoda dobro poznatih u struci. Uopšteno, takvi metodi se zasnivaju na detekciji obeleživača ili markera, kao što su radioaktivni, fluorescentni, biološki ili enzimski obeleživači. U.S. patenti koji razmatraju upotrebu takvih obeleživača uključuju, na primer, U.S. pat. br.

3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. Uopšteno, detekcija vezivanja anti-JCV antitela vrši se korišćenjem sekundarnog antitela koje je obeleženo. Uopšteno, sekundarno antitelo je specifično za detektovanje humanog IgG. Kvantifikacija se vrši merenjem stepena nastalog obojenja, npr., korišćenjem spektrofotometra koji radi u području vidljive svetlosti.

[0161] U jednom primeru izvođenja, test se obavlja u medicinskoj kancelariji, i obavlja ga, na primer, pružalac zdravstvene nege, npr., lekar, medicinska sestra ili tehničar, koji rade u jedinici gde se uzorak dobija od pacijenta. U drugom primeru izvođenja, biološki uzorak dobijen od pacijenta transportuje se u drugu jedinicu, npr., u jedinicu treće strane, gde se obavlja test. U ovom drugom slučaju, rezultati testa mogu da se saopšte pružaocu zdravstvene nege, na primer preko formulara koji se može podneti poštom ili elektronskim putem (npr., faksom ili e-poštom) ili preko on-lajn baze podataka. U jednom primeru izvođenja, rezultati testa (uključujući skrining test i, opciono, potvrdni test) mogu se uskladištiti u bazu podataka i može im pristupiti pružalac zdravstvene nege, na primer preko veba (worldwide web).

[0162] Sekundarni test. U nekim slučajevima, na primer, kada je nivo anti-JCV antitela u uzorku u zoni označenoj kao "dvosmislena zona" ili "indetermedijarna zona", npr., kada je odredi da postoji ograničena pouzdanost u vezi sa prisustvom ili odsustvom anti-JCV antitela (na primer kada se odredi da je nOD vrednost >0.2 i <0.4), obavlja se sekundarni test (označen u ovom tekstu i kao "potvrdni test") uzorka. U sekundarnom testu koriste se dva alikvota biološkog uzorka. Prvi se priprema pre upotrebe u testu, preinkubiranjem uzorka u rastvoru u prisustvu testnog pufera, tokom određenog vremenskog perioda (npr., 30 minuta, jedan sat, ili duže, na primer preko noći 4°C). Drugi alikvot se priprema pre upotrebe u testu, preinkubiranjem uzorka u rastvoru u prisustvu HPVLP, tokom određenog vremenskog perioda (npr., 30 minuta, jedan sat, ili duže). Dva alikvota se zatim koriste u HPVLP testu kako je opisano u ovom tekstu i uzorak se određuje kao pozitivan ili negativan na anti-JCV antitelo. Ako rezultati testa za alikvot inkubiran sa HPVLP pokažu vrednost <45% inhibicije (tj., "tačka preseka"), onda se tumači da je uzorak negativan na prisustvo JCV-specifičnih antitela. Ako rezultati testa pokažu vrednost ≥45% inhibicije, onda se tumači da uzorak sadrži JCV-specifična antitela i da je, dakle, pozitivan na antitelo.

[0163] Test obezbeđen u pronalasku, u kojem se koristi sekundarni test, označava se u ovom tekstu i kao "test u dva koraka" ili "dvostepeni test". Ranija verzija testa u dva koraka opisana je u zajedničkoj Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2011/020832.

[0164] Metodi bazirani na supstratima i rastvoru. Za HPVLP testni format može se koristiti svaki pogodan čvrsti supstrat. U nekim primerima izvođenja, supstrat je mikrotitarska ploča (npr., ploča sa 96 bunarčića), pločica, perlica ili kolona. Supstrat može biti pogodan za hromogeni ili hemiluminiscentni metod detekcije, ili metode bazirane na rastvoru kao što je proksimalna ligacija.

[0165] Tačka preseka. Pronalazak obezbeđuje metode analize u kojima se koriste " tačke preseka" kako bi se smanjila stopa lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata. Tačke preseka se uspostavljaju na osnovu podataka iz HPVLP testova (npr., za detektovanje JCV antitela u biološkom uzorku), uprosečenih, na primer, za duplikate testnih uzoraka i višestruke replikate (na primer, najmanje dva, najmanje četiri il inajmanje osam replikata kontrolnih uzoraka). Tačke preseka mogu se odrediti i statistički korišćenjem velikih panela ne-PML i PML uzoraka.

[0166] U jednoj verziji testa prema predmetnom pronalasku, rezultati inicijalnih HPVLP skrining testova, npr., ELISA testova, mogu dovesti do toga da se testni uzorak klasifikuje da ima ili da nema JCV-specifična antitela, ili, ako uzorak ne ulazi ni u jednu od ovih dveju klasifikacija, onda će se uzorak podvrgnuti dodatnom potvrdnom testu. Na primer, uzorci koji u HPVLP ELISA testu datom u pronalasku daju rezultat koji je manji od utvrđenog nivoa (npr., nOD450< 0.2) klasifikovaće se kao da ne sadrže JCV-specifična antitela, i uzorci koji daju rezultat u ELISA veći od utvrđenog nivoa (npr., nOD450> 0.4) klasifikovaće se kao pozitivni za JCV-specifična antitela. Uzorci koji ne jasno ne pripadaju ni jednoj od ovih klasifikacija (npr., 0.2 < OD450< 0.4) mogu se testirati u potvrdnom testu.

[0167] U jednom primeru izvođenja, potvrdni test zahteva korak preinkubacije sa puferskom kontrolom (ili drugim pogodnim rastvorom) ili sa HPVLP (u puferu ili drugom pogodnom rastvoru) da bi se JCV-specifična antitela preadsorbovala pre analize u HPVLP ELISA, kako je detaljno opisano kasnije u ovom tekstu. Posle preinkubacije sa HPVLP ako se reakcija u primarnom testu opada za manje od 45% u poređenju sa puferskom kontrolom, onda se tumači da je uzorak negativan na prisustvo JCV-specifičnih antitela. Ako rezultati pokazuju ≥45% smanjenje reakcije u poređenju sa puferskom kontrolom u primarnom testu posle preinkubacije sa HPVLP, onda se tumači da uzorak sadrži JCV specifična antitela. U nekim primerima izvođenja, obavlja se samo potvrdni test.

[0168] VP1. Upotreba HPVLP u testu za JCV antitela može poboljšati preciznost testa i korisna je u testu pogodnom za analitičke i dijagnostičke svrhe. VP1 za upotrebu u proizvodnji HPVLP može se generisati korišćenjem metoda poznatih u struci i može biti prirodni VP1 ili rekombinantno proizvedeni VP1, npr., VP1 iz JC virusa. Uopšteno, upotrebljeni VP1 je VP1 iz MAD1 soja JCV. U nekim primerima izvođenja, VP1 upotrebljen u testu uključuje VP1 iz više od jednog soja JCV, na primer, iz jednog ili više od sojeva 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4, i 7. Posle pripremanja VP1, npr., rekombinantno sintetisanog VP1, VP1 za upotrebu u testovima opisanim u ovom tekstu, se zatim prečišćava standardnim biohemijskim metodima koji uključuju metode gustinski gradijent /ultracentrifugiranje, ili niz koraka hemijske precipitacije, koncentrovanje/dijafiltracija i jonoizmenjivačka hromatografija. Metodi prečišćavanja tipično uključuju korak uklanjanja manjih proteina, uključujući monomerne VP1 polipeptide, ili pentamerni VP1. Uklanjanje ovih manjih čestica može se obaviti, na primer, u jednom koraku ili u dva koraka (npr., prvo korak filtracije za uklanjanje VP1 monomera, a zatim drugi korak filtracije za uklanjanje pentamernih VP1 čestica). Takvi biohemijski metodi prečišćavanja poznati su stručnjacima u oblasti. Primeri 1 i 7 obezbeđuju dva različita metoda prečišćavanja JCV VP1-VLP.

[0169] HPVLP preparat (HPVLP), prema jednom aspektu predmetnog pronalaska, ne sadrži značajne količine VP1 monomera (npr., prečišćen je da bi se uklonili monomeri). HPVLP preparat, prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, ne sadrži značajne količine VP1 molekula u kofiguracijama veličine VP1 pentamera, ili manjim (uključujući monomere). HPVLP može da se pripremi od rekombinantnog VP1 ili prirodnog VP1 (npr., izolovanog iz virusa ili virusnog kapsida). U nekim primerima izvođenja, dodatne JCV komponente, kao što su jedan ili oba mala proteina omotača JCV virusa, npr., VP2 ili VP3, uključene su u HPVLP česticu ili su udružene sa supstratom.

[0170] U nekim slučajevima, rekombinantno eksprimirani VP1 može da se ne udružuje u pentamere ili HPVLP koji liče na prirodne virusne kapside, na primer, rekombinantno eksprimirani VP1može da se asamblira u tube ili druge nesferične geometrijske oblike. Prema tome, objava se odnosi na metode proizvodnje HPVLP koji su suštinski sferične geometrije. Objava uključuje HPVLP preparate u kojima najmanje oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, ili oko 99% HPVLP u preparatu liči na prirodni JCV kapsid (tj., ima ikozaedričnu ili suštinski sferičnu konfiguraciju). U nekim primerima, HPVLP preparat sadrži najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% HPVLP u preparatu, koji liče na prirodni JCV kapsid. Takvi metodi mogu uključivati eksprimiranje virusnih proteina pod uslovima koji rezultuju takvim preparatom i/ili izolovanje i prečišćavanje eksprimiranih virusnih proteina, kako je opisano u ovom tekstu, da se proizvede takav preparat.

[0171] Metodi pravljenja HPVLP. HPVLP se mogu napraviti, na primer, transformisanjem bakulovirusa vektorom koji eksprimira VP1 gen, kao što je VP1 gen iz JC virusa. Bakulovirus se koristi za inficiranje kulture ćelija, kao što je kultura insekatskih ćelija (npr., SF9 ćelije) ili kultura sisarskih ćelija, i ćelije eksprimiraju VP1 protein. HPVLP se izoluju liziranjem ćelija i prečišćavanjem čestica nizom koraka centrifugiranja i ultrafiltracije. Uopšteno, prečišćavanje se obavlja korišćenjem metoda kao što su sedimentacija na saharoznom jastučetu, izopikničko (ravnotežno) ultracentrifugiranje i ekstenzivna ultrafiltracija, ili drugih metoda poznatih stručnjacima u oblasti. U određenim primerima, prečišćavanje će uključiti dva centrifugiranja kroz saharozno jastuče. U alternativnom metodu prečišćavanja, ćelije se liziraju i čestice se izoluju nizom koraka precipitacije i koncentrovanja/dijafiltracije, uz finalni jonoizmenjivački korak. U još jednom alternativnom metodu, HPVLP se prečišćavaju hromatografskim metodima i bez koraka centrifugiranja.

[0172] Čistoća se može procenjivati korišćenjem bilo koje od pogodnih tehnika poznatih u struci, na primer, analitičkim ultracentrifugiranjem, elektronskom mikroskopijom, PAGE analizom, masenom spektrometrijom, koncentrovanjem proteina, ili aktivnošću u ELISA sa kontrolnim serumima. Nedovoljno prečišćene VLP za rezultat imaju visoki pozadinski signal, dajući lažno visoke nivoe anti-JCV antitela ili izračunate stope izloženosti.

[0173] U nekim primerima, HPVLP sadrže VP1 kao jedini JC virusni protein.

[0174] U nekim primerima, HPVLP su heterogene čestice, i prema tome uključuju VP1 protein, i najmanje jedan od minornih proteina omotača JC virusa, npr., VP2 ili VP3. U drugom primeru, HPVLP uključuje VP1, VP2 i VP3 protein. HPVLP koja uključuje VP1 i VP2 može da se proizvede korišćenjem metoda poznatih u struci, na primer, transformacijom bakulovirusa nukleinskom kiselinom koja uključuje VP1 i VP2 gen, na primer pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura se inficira bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1 i VP2, i formiraju se HPVLP koje uključuju oba tipa proteina. U jednom primeru, VP1 i VP2 geni su na različitim DNK molekulima, DNK molekuli se transformišu u različite bakuloviruse i bakulovirusi se koriste za transfekciju ćelija u istoj kulturi. Ćelije eksprimiraju VP1 i VP2 proteine, i formiraju se HPVLP koje uključuju oba tipa proteina. U nekim slučajevima, heterogena HPVLP će uključivati, npr., jedan ili dva VP2 polipeptida na svakih pet VP1 polipeptida. Obično, HPVLP će sadržati više VP1 polipeptida nego VP2 polipeptida, kao što je to slučaj u prirodnom JC virusu.

[0175] HPVLP koja uključuje VP1 i VP3 ili VP1 i VP2 molekule može se proizvesti, na primer, transformisanjem bakulovirusa nukleinskom kiselinom koja uključuje VP1 i VP3 gen odnosno VP1 i VP2 gen pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura se inficira bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1 i VP3 ili VP1 i VP2, i formiraju se HPVLP koje uključuju oba tipa proteina. U nekim primerima, VP1 i VP3 ili VP1 i VP2 geni su na različitim DNK molekulima, DNK molekuli se transformišu u različite bakuloviruse, i bakulovirusi se koriste za transfekciju ćelija u istoj kulturi. Ćelije eksprimiraju VP1 i VP3 protein, odnosno VP1 i VP2 gen, i formiraju se HPVLP koje uključuju oba tipa proteina. HPVLP čestice mogu da se iz takvih preparata izoluju korišćenjem metoda poznatih u struci kao što su oni upotrebljeni za izolovanje JCV kapsida.

[0176] Tipično, VP1 pentamer koji je u heterogenoj HPVLP uključiće, npr., pet VP1 polipeptida i jedan VP3 polipeptid i/ili jedan VP2 polipeptid, zavisno od toga da li je VP3 gen ili VP2 gen upotrebljen za pravljenje konstrukata. Tipično, u HPVLP biće više VP1 polipeptida nego VP3 ili VP2 polipeptida. U nekim primerima, VP2 ili VP3 je iz polioma virusa koji nije JC virus, npr., BK virusni polipeptid.

[0177] HPVLP koja uključuje sva tri molekula, VP1 i VP2 i VP3, može se proizvesti transformisanjem bakulovirusa nukleinskom kiselinom (npr., kružnom DNK, npr., < 5.5 kb) koja uključuje VP1, VP2 i VP3 gen pod kontrolom istog ili različitih promotora. Ćelijska kultura, kao što je kultura sisarskih ćelija, inficira se bakulovirusom, i ćelije eksprimiraju VP1, VP2 i VP3 proteine. Posledično, formiraju se HPVLP koje uključuju sva tri tipa proteina. U jednom primeru, VP1 i VP2 ili VP3, ili oba gena nalaze se na različitim DNK molekulima, DNK molekuli se transformišu u isti ili različiti bakulovirus, i bakulovirus se koristi da inficira ćelije u istoj ili zasebnim kulturama. Ćelije eksprimiraju VP1, VP2 i VP3 protein, i formiraju se HPVLP koje uključuju oba tipa proteina. Heterogeni HPVLP može uključiti, npr., pet VP1 polipeptida i po jedan od VP2 i VP3 polipeptida, iako odnosi mogu varirati unutar preparata. Tipično, u HPVLP biće više VP1 polipeptida nego VP2 i VP3 polipeptida.

[0178] U nekim primerima, HPVLP će biti veće veličine nego VP1 pentamer. Pod većom veličinom misli se na to da je masa proteina sadržanog u HPVLP čestici veća od mase pentamera koji sadrži samo VP1.

[0179] U drugim primerima, metod pripremanja rastvora HPVLP može uključivati uklanjanje čestica iz rastvora (npr., VP1 monomera ili malih VP1 sadržavajućih čestica) koje su veličine VP1 pentamera ili manje. Za izvođenje ovog koraka prečišćavanja mogu se koristiti metodi kao što su centrifugiranje i hromatografija zasnovana na veličini čestica. U nekim primerima, za pripremanje HPVLP koje su veće od VP1 pentamera mogu se koristiti drugi metodi poznati u struci, npr., jonoizmenjivačka hromatografija. Uopšteno, HPVLP preparat pogodan za upotrebu u testu sadržaće najmanje 20% HPVLP, najmanje 25% HPVLP, najmanje 40% HPVLP, najmanje 60% HPVLP, najmanje 65% HPVLP, najmanje 70% HPVLP, najmanje 80% HPVLP, najmanje 85% HPVLP, najmanje 90% HPVLP, najmanje 95% HPVLP, ili najmanje 99% HPVPL u poređenju sa ne-HPVLP česticama (npr., po procentu pentamera u poređenju sa VP1 monomerima i agregatima koji sadrže manje od pet VP1 molekula).

[0180] Metodi evaluacije uzoraka i/ili subjekata. Kako se koristi u ovom tekstu, metodi evaluacije ili analiziranja subjekta ili biološkog uzorka dobijenog od subjekta uključuju jedno ili više od sledećeg: obavljanje analize uzorka, zahtevanje analize uzorka, zahtevanje rezultata analize uzorka, ili dobijanje rezultata analize uzorka. (obično, u ovom tekstu, odrediti (ili određivanje), analiza ili evaluacija (ili evaluiranje) mogu uključivati izvođenje datog metoda ili dobijanje podataka od onoga ko je izveo dati metod, ili oba).

[0181] Analiza ili evaluacija zahtevaju transformaciju materijala, npr., biološkog materijala ili komponenti testa. Na primer, biološki uzorak može da se evaluira u pogledu prisustva anti-JCV antitela, titra anti-JCV antitela i procenta inhibicije JCV antitela. Evaluacija se može izvesti pre ili posle ili u isto vreme kada pacijent prima tretman, na primer za MS. Evaluacija se bar delom bazira na analizi uzorka dobijenog od subjekta, npr., uzorka krvi, plazme, seruma, urina ili CSF. Prisustvo anti-JCV antitela može se odrediti dovođenjem u kontakt sa specifičnim vezujućim sredstvom, npr., JCV proteinom kao što je VP1. Vezujuće sredstvo može biti JCV protein, npr., VP1 u vidu čestice, npr., HPVLP.

[0182] U jednom primeru izvođenja, test za detektovanje prisustva anti-JCV antitela je test u dva koraka, kao što je onaj opisan u ovom tekstu. U testu se koriste HPVLP pod uslovima pogodnim za vezivanje anti-JCV antitela. Testom može da se detektuje svaki izotip anti-JCV antitela (uključujući IgG, IgM, IgA, i IgE). Test je i visokosenzitivan i može detektovati anti-JCV antitela u koncentraciji od, na primer, 2.0 µg/mL ili manje, npr.,.1.5 µg/mL ili manje, 1.25 µg/mL ili manje, 1.0 µg/mL ili manje, 0.5 µg/mL ili manje, 50 ng/mL ili manje, 10 ng/mL ili manje, 5 ng/mL ili manje, 1.7 ng/mL ili manje, ili 1 ng/mL ili manje.

[0183] U jednom primeru, uzorak se analizira u pogledu nivoa JCV nukleinske kiseline prisutne u uzorku. Na primer, nukleinske kiseline se mogu izolovati iz uzorka i upotrebiti za PCR amplifikaciju ili tehniku sekvenciranja sledeće generacije (Nex-Gen). U jednom primeru, sirovi lizat biološkog uzorka izloži se metodu amplifikacije, kao što je PCR, i amplifikovani proizvod se analizira jednim ili više od sledećeg: elektroforeza, mapiranje restrikcionih fragmenata, hibridizacija ili sekvenciranje, da se utvrdi da li su JCV DNK ili RNK prisutne u uzorku i u kojoj količini.

[0184] Biološki uzorak može da se ukloni iz pacijenta i analizira.

[0185] U nekim primerima izvođenja, pacijentov uzorak., npr., serum ili plazma ili uzorak cele krvi ili CSF, mogu se uskladištiti pre testiranja na JCV, npr., na JCV antitela ili JCV nukleinsku kiselinu. Pacijentov uzorak, npr., pacijentov uzorak koji sadrži JCV antitela ili JCV nukleinsku kiselinu, može se uskladištiti 1-21 dan, npr., 1-14 dana ili 1-7 dana ili duže (npr., jedan dan, dva dana, tri dana, pet dana, sedam dana, deset dana, 14 dana, 21 dan ili duže); jednu do šest nedelja, npr., jednu do tri nedelje ili jednu do dve nedelje ili duže (npr., do jedne nedelje, do dve nedelje, do tri nedelje, do šest nedelja ili duže); ili jedan do šest meseci, npr., jedan do tri meseca ili jedan do dva meseca ili duže (npr., do jednog meseca, do dva meseca, do tri meseca, do šest meseci ili duže). Uzorak može da se čuva, na primer, zamrznut (npr., na -80°C do -20°C), na 2-8°C, na ambijentalnoj temperaturi (18°C-25°C) ili na višoj temperaturi, npr., na 37°C.

[0186] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "sticati" ili "sticanje" odnosi se na dobijanje poseda nad fizičkim entitetom, ili vrednošću, npr., numeričkom vrednošću, "direktnim sticanjem" ili "indirektnim sticanjem" fizičkog entiteta ili vrednosti, npr., statusa pacijenta, na primer pre izlaganja anti-VLA-4 terapiji ili drugim imunosupresantima, ili JCV statusa. "Direktno sticanje" označava izvođenje procesa (npr., izvođenje sintetskog ili analitičkog metoda) za dobijanje fizičkog entiteta ili vrednosti. "Indirektno sticanje" odnosi se na primanje fizičkog entiteta ili vrednosti od druge strane ili izvora (npr., laboratorije kao treće strane koja direktno stiče fizički entitet ili vrednost). Direktno sticanje fizičkog entiteta podrazumeva izvođenje procesa koji uključuje fizičke promene u fizičkoj supstanci, npr., polaznom materijalu. Primeri promena uključuju pravljenje fizičkog entiteta od dva ili više polaznih materijala, deljenje ili fragmentaciju supstance, izdvajanje ili prečišćavanje supstance, kombinovanje dva ili više zasebnih entiteta u mešavinu, izvođenje hemijske reakcije koja uključuje prekidanje ili formiranje kovalentne ili nekovalentne veze. Direktno sticanje vrednosti podrazumeva izvođenje procesa koji uključuje fizičku promenu uzorka ili druge supstance, npr., izvođenjem analitičkog procesa koji uključuje fizičku promenu supstance, npr., uzorka, analita, ili reagensa (ponekad ovde označeno kao "fizička analiza"), obavljanje analitičkog metoda, npr., metoda koji uključuje jedno ili više od sledećeg: izdvajanje ili prečišćavanje supstance, npr., analita, ili njegovog fragmenta ili drugog derivata, iz druge supstance; kombinovanje analita, ili njegovog fragmenta ili drugog derivata sa drugom supstancom, npr., puferom, rastvaračem ili reaktantom; ili menjanje strukture analita, ili njegovog fragmenta ili drugog derivata, npr., prekidanjem ili formiranjem kovalentne ili nekovalentne veze između prvog i drugog atoma analita; ili promenom strukture reagensa ili njegovog fragmenta ili drugog derivata, npr., prekidanjem ili formiranjem kovalentne ili nekovalentne veze između prvog i drugog atoma reagensa.

[0187] Najmanje jedan ili oba od određivanja pacijentovog statusa (npr., JCV statusa), ili nivoa aktivnosti, i određivanje da li status ima unapred odabrani odnos sa referentnim kriterijumom, uključuju jedno ili više od sledećeg: analiziranje uzorka, zahtevanje analize uzorka, zahtevanje rezultata analize uzorka, ili primanje rezultata analize uzorka. (Obično, analiza može uključivati jedno ili oba od: izvođenje datog metoda (npr., imunotest) ili primanje podataka od onoga ko je izveo dati metod.)

[0188] Anti-VLA-4 terapija. Anti-VLA-4 terapija predstavlja molekul, npr., jedinjenje sa malim molekulom (jedinjenje male molekulske težine) ili proteinsko biološko sredstvo (npr., antitelo ili njegov fragment, kao što je njegov antigen-vezujući fragment) koje blokira VLA-4 aktivnost. Molekul koji predstavlja anti-VLA-4 terapiju je VLA-4 antagonist. VLA-4 antagonist podrazumeva svako jedinjenje koje inhibira vezivanje VLA-4 integrina sa ligandom i/ili receptorom. Anti-VLA-4 terapija može biti antitelo (npr., , natalizumab (TYSABRI®)) ili njegov fragment, ili rastvorljiva forma liganda. Rastvorljive forme ligandskih proteina za α4 integrine uključuju rastvorljive VCAM-I ili fibronektinske peptide, VCAM-I fuzione proteine, ili bifunkcionalne VCAM-I/Ig fuzione proteine. Na primer, rastvorljiva forma VLA-4 liganda ili njegovog fragmenta može se primeniti za vezivanje sa VLA-4, i u nekim primerima kompetirati za VLA-4 vezujuće mesto na ćelijama, dovodeći time do efekata sličinih primeni antagonista kao što su anti-VLA-4 antitela. Na primer, rastvorljivi VLA-4 integrinski mutanti koji se vezuju za VLA-4, ligand ali ne pobuđuju integrin-zavisnu signalizaciju pogodni su za upotrebu u opisanim metodima. Takvi mutantni mogu delovati kao kompetitivni inhibitori divljeg tipa integrinskog proteina i smatraju se "antagonistima". Drugi pogodni antagonisti su "mali molekuli".

[0189] "Mali molekuli" su sredstva koja imitiraju delovanje peptida u narušavanju interakcija VLA-4/ligand, na primer, vezivanjem za VLA-4 i blokiranjem interakcije sa VLA-4 ligandom (npr., VCAM-I ili fibronektin), ili vezivanjem VLA-4 liganda i sprečavanjem liganda da interaguje sa VLA-4. Jedan primer malog molekula je oligosaharid koji imitira vezujući domen VLA-4 liganda (npr., fibronektin ili VCAM-I) i vezuje se za ligand-vezujući domen VLA-4. (Vidi, Devlin et al., Science 249: 400-406 (1990); Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990); i U.S. pat. br.4,833,092 (Geysen.)

[0190] "Mali molekul" može biti hemijsko jedinjenje, npr., organsko jedinjenje, ili mali peptid, ili veće peptid-sadržavajuće organsko jedinjenje ili nepeptidno organsko jedinjenje. "Mali molekul" ne treba da obuhvati antitelo ili fragment antitela. Iako molekulska težina malih molekula obično iznosi manje od 2000 daltona, ova cifra nije navedena kao apsolutna gornja granica molekulske težine.

[0191] Kombinaciona terapija ili alternative anti-VLA-4 terapiji. U nekim primerima, anti-VLA-4 terapija, npr., natalizumab, primenjuje se sa drugim sredstvom, ili se alternativna terapija može primeniti umesto anti-VLA-4 terapije, na primer kada se odredi da je pacijent pod povišenim rizikom za PML.

[0192] Neograničavajući primeri drugih sredstava za lečenje multiple skleroze u kombinaciji sa anti-VLA-4 terapijom, ili alternativna sredstva za upotrebu umesto anti-VLA-4 terapije, uključuju: soli fumarne kiseline, kao što je dimetil fumarat; sfingozin 1-fosfat (S1P)-antagoniste, kao S1B-blokirajuće antitelo sfingomab; interferone, kao humani interferon beta-1a (npr., AVONEX® ili Rebif®)) i interferon β-1b (BETASERON® humani interferon β supstituisan na poziciji 17; Berlex/Chiron); glatiramer acetat (označen i kao kopolimer 1 (copolymer 1), Cop-1; COPAXONE® Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); antitelo ili njegov fragment (kao njegov antigen-vezujući fragment), kao anti-CD20 antitelo, npr., Rituxan® (rituksimab), ili antitelo ili njegov fragment koji kompetiraju, ili se vezuju za preklapajući epitop, sa rituksimabom; mikstoksantron (NOVANTRONE®, Lederle); hemoterapijsko sredstvo kao klabribin (LEUSTATIN®), azatioprin (IMURAN®), ciklofosfamid (CYTOXAN®), ciklosporin-A, metotreksat, 4-aminopiridin, i tizanidin; kortikosteroid, kao metilprednizolon (MEDRONE®, Pfizer), ili prednizon; CTLA4 Ig; alemtuzumab (MabCAMPATH®) ili daklizumab (antitelo koje se vezuje za CD25); statine; i TNF antagoniste.

[0193] Glatiramer acetat je protein formiran od nasumičnog lanca amino kiselina (glutaminska kiselina, lizin, alanin i tirozin (odatle GLATiramer)). Glatiramer acetat može da se sintetiše u rastvoru od ovih amino-kiselina u odnosu od približno 5 delova alanina prema 3 dela lizina, 1.5 delova glutaminske kiseline i 1 deo tirozina, uz korišćenje N-karboksiaminokiselinskih anhidrida.

[0194] Dodatna druga sredstva, ili sredstva za upotrebu umesto anti-VLA-4 terapije, uključuju antitela ili antagoniste humanih citokina ili faktora rasta, na primer, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF, i PDGF. Drugi primeri drugih sredstava uključuju antitela na ćelijske površinske molekule kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ili njihove ligande. Na primer, daklizubmab je anti-CD25 antitelo koje može da ublaži multiplu sklerozu.

[0195] Drugi primeri antitela uključuju antitela koja obezbeđuju aktivnost sredstva opisanog u ovom tekstu, kao što je antitelo koje angažuje receptor za interferon, npr., interferon beta receptor. Tipično, u implementacijama u kojima drugo sredstvo uključuje antitelo, ono se vezuje za ciljni protein različit od VLA-4 ili različit od α4 integrina, ili bar za epitop na VLA-4 različit od onog koji biva prepoznat natalizumabom.

[0196] Drugi dodatni primeri drugih sredstava uključuju: FK506, rapamicin, mikofenolat mofetil, leflunomid, nesteroidne antiinflamatorne lekove (non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAID), na primer, inhibitore fosfodiesteraze, adenozinske agoniste, antitrombotička sredstva, inhibitore komplementa, adrenergička sredstva, sredstva koja interferiraju sa signalizacijom proinflamatornim citokinima kako je opisano u ovom tekstu, inhibitore IL- 1β konvertujućeg enzima (npr., Vx740), anti-P7s, PSGL, TACE inhibitore, inhibitore T-ćelijske signalizacije kao što su inhibitori kinaze, inhibitore metaloproteinaze, sulfasalazin, azatloprin, 6-merkaptopurine, inhibitore angiotenzin konvertujućeg enzima, solubilne receptore citokina i njihove derivate, kako je opisano u ovom tekstu, antiinflamatorne citokine (nprg. IL-4, IL-10, IL-13 i TGF).

[0197] U nekim primerima, drugo sredstvo može da se koristi za lečenje jednog ili više simptoma ili sporednih efekata MS. Takva sredstva uključuju, npr., amantadin, baklofen, papaverin, meklizin, hidroksizin, sulfametoksazol, ciprofloksacin, dokuzat, pemolin, dantrolen, desmopresin, deksametazon, tolterodin, fenitoin, oksibutinin, bisakodil, venlafaksin, amitriptilin, metenamin, klonazepam, izoniazid, vardenafil, nitrofurantoin, psilijum hidrofilni muciloid, alprostadil, gabapentin, nortriptilin, paroksetin, propantelin bromid, modafinil, fluokstin, fenazopiridin, metilprednizolon, karbamazepin, imipramin, diazepam, sildenafil, bupropion, i sertralin. Mnoga druga sredstva koja su mali molekuli imaju molekulsku težinu između 150 i 5000 daltona.

[0198] Primeri TNF antagonista uključuju himerna, humanizovana, humana ili in vitro napravljena antitela (ili njihove antigen-vezujuće fragmente) na TNF (npr., humani TNF α), kao D2E7, (humano TNFα antitelo, U.S. patent br. 6,258,562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (humanizovano anti-TNFα antitelo; Celltech/Pharmacia), cA2 (himerno anti-TNFα antitelo; REMICADE™, Centocor); fragmente anti-TNF antitela (npr., CPD870); rastvorljive fragmente TNF receptora, npr., p55 ili p75 humani TNF receptori ili njihovi derivati, npr., 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein, ENBREL™; Immunex; vidi, npr., Arthritis & Rheumatism 37:S295, 1994; J. Invest. Med.44:235A, 1996), p55 kdTNFR-IgG (55 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein (LENERCEPT™)); enzimske antagoniste, npr., inhibitori TNFα konvertujućeg enzima (TNFα converting enzyme, TACE) (npr., derivat alfa-sulfonil hidroksamskae kiseline, WO 01/55112, i N-hidroksiformamid TACE inhibitor GW 3333, -005, ili -022); i TNF-bp/s-TNFR (rastvorljivi TNF vezujući protein; vidi, npr., Arthritis & Rheumatism 39:S284, 1996; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology 268:37-42, 1995).

[0199] U jednoj implementaciji, anti-VLA-4 terapija i drugo sredstvo obezbeđuju se u vidu koformulacije, i koformulacija se daje subjektu. Moguće je još i to, npr., da se najmanje 24 sata pre ili posle primene koformulacije, zasebno primeni jedna doza formulacije anti-VLA-4 terapije i zatim jedna doza formulacije koja sadrži drugo sredstvo. U drugoj implementaciji, anti-VLA-4 terapija i drugo sredstvo obezbeđuju se u vidu zasebnih formulacija, i korak primene uključuje sekvencijalnu primenu anti-VLA-4 terapije i drugog sredstva. Sekvencijalna primena može se obezbediti istog dana (npr., sa razmakom od najviše jednog sata ili u razmaku od najmanje 3, 6 ili 12 sati), ili različitim danima.

[0200] Anti-VLA-4 terapija i drugo sredstvo, svaki za sebe, mogu da se primene u vidu većeg broja doza zasebno tokom vremena. Anti-VLA-4 terapija i drugo sredstvo, svaki za sebe, tipično se primenjuju prema određenom režimu. Režim primene jednog ili oba može podrazumevati regularan periodicitet. Režim primene anti-VLA-4 terapije može imati različiti periodicitet u odnosu na režim primene drugog sredstva, npr., jedno se može primenjivati češće od drugog. U jednoj implementaciji, jedno od anti-VLA-4 terapije i drugog sredstva primenjuje se jednom nedeljno i drugo se primenjuje jednom mesečno. U drugoj implementaciji, jedno od anti-VLA-4 terapije i drugog sredstva primenjuje se kontinuirano, npr., tokom perioda dužeg od 30 minuta, ali kraćeg od 1, 2, 4, ili 12 sati, i drugo se primenjuje u vidu bolusa. Anti-VLA-4 terapija i drugo sredstvo mogu se primeniti bilo kojim pogodnim metodom, npr., potkožno, intramuskularno ili intravenski.

[0201] U nekim primerima, anti-VLA-4 terapija i drugo sredstvo, svaki za sebe, primenjuju se u istoj dozi u kojoj se svaki od njih prepisuje kao monoterapija. U drugim primerima, anti-VLA-4 terapija primenjuje se u dozi jednakoj ili manjoj od količine potrebne za postizanje efikasnosti kada se primenjuje sama. Slično tome, drugo sredstvo može da se primenjuje u dozi koja je jednaka ili manja od količine potrebne za postizanje efikasnosti kada se primenjuje samo.

[0202] Kitovi. Reagensi za izvođenje testova anti-JCV antitela mogu se obezbediti u formi kita. Izuzeva uzorka uzetog od pacijenta, neki ili svi materijali potrebni za test mogu se obezbediti u formi kita. Kit može uključivati, na primer, supstrat, kao što je ploča sa bunarčićima obloženim JCV antigenskim supstratom, npr., HPVLP. Ploča može biti, npr., ploča sa 6 bunarčića, ploča sa 12 bunarčića, ploča sa 24 bunarčića, ploča sa 48 bunarčića, ploča sa 96 bunarčića, ili ploča sa 384 bunarčića, Ploče date u kitu mogu biti unapred obložene JCV VLP antigenom, na primer u koncentraciji od 0.4 µg/mL. U jednom primeru, kit uključuje materijale i reagense za upotrebu sa sistemima visoke propusnosti kao što su SPR (solid phase receptacle, posuda sa čvrstom fazom) nastavci, za upotrebu sa bioMerieux sistemima.

[0203] Kit može uključivati i JCV antigen, npr., HPVLP liofilizovan ili u rastvoru, za korišćenje u koraku potvrdnog testa. U jednom primeru, kit uključuje JCV kalibrator granične vrednosti, pozitivnu kontrolu za anti-JCV antitelo i JCV-negativnu kontrolu, što su uzorci seruma kao što je serum čoveka. Rastvori koji sadrže JCV antigen i serume mogu uključivati prezervans, kao što su natrijum azid, npr., 0.05%, 0.1%, 1.5%, i 2% natrijum azid. U jednom primeru, kit može uključivati jedan ili više reagenasa za detektovanje kompleksa koji sadrži anti-JCV antitela vezana za antitegen, kao HPVLP. Reagensi za detektovanje kompleksa uključuju, na primer, JCV konjugat, uzorak kazeina, detekatabilni reagens kao TMB (tetrametilbenzidin), pufer za ispiranje, i reagens za prekidanje reakcije.

[0204] JCV supstrat može biti, na primer, antihumano antitelo, kao antihumano antitelo konjugovano sa enzimom. U jednom primeru, JCV konjugat je afinitetno prečišćeno i sa peroksidazom konjugovano magareće antihumano antitelo. U drugom primeru, rastvor kazeina sadrži kazein, surfaktant i neazidni prezervans u puferu (npr., fosfatom puferisani slani rastvor (PBS)). U sledećem primeru, TMB supstratni rastvor uključuje TMB i vodonik peroksid u puferu. U sledećem primeru, kit uključuje pufer za ispiranje, a pufer za ispiranje može sadržati, na primer, surfaktant u PBS sa neazidnim prezervansom. Reagens za prekidanje reakcije može biti, na primer, kiselina, kao sumporna kiselina (npr., 1 M sumporna kiselina).

[0205] Rastvori dati u kitu mogu biti u takvim koncentracijama da je potrebno razblažiti ih pre upotrebe. HPVLP za upotrebu u rastvoru koji se vezuje za anti-JCV antitelo u biološkom uzorku, kao što je korak potvrđivanja u testu u dva koraka, može biti obezbeđen u koncentraciji od 2 mg/mL, 1.5 mg/mL, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, za upotrebu, na primer, u koncentraciji od 10 µg/mL, 5 µg/mL, 1 µg/mL, 0.8 µg/mL, 0.4 µg/mL, 0.2 µg/mL Pufer za ispiranje, na primer, može biti obezbeđen u koncentraciji od 10x. JCV supstrat (kao afinitetno prečišćeno i sa peroksidazom konjugovano magareće antihumano antitelo) može biti obezbeđeno u koncentraciji, na primer, 1 mg/mL, 0.8 mg/mL ili 0.6 mg/mL, za razblaživanje, npr., 1:40,000, 1:30,000, 1:20,000 ili 1:20,000 pre upotrebe u testu detekcije anti-JCV antitela.

[0206] Materijali za zaptivanje reakcionih mešavina, kao što su trake za zaptivanje, takođe se mogu nalaziti u kitu.

[0207] Saopštavanje rezultata. Rezultati analize procene rizika mogu se saopštiti centru za lečenje, ili pružaocu zdravstvene nege, ili davaocu osiguranja. U jednom primeru izvođenja, rezultati procene rizika čuvaju se u bazi podataka.

[0208] U jednom primeru izvođenja, informativni materijal se obezbeđuje za obavljanje i tumačenje procene rizika. Informativni materijal može obezbediti uputstvo o tome gde saopštiti rezultate procene, na primer centru za lečenje, ili pružaocu zdravstvene nege ili onome ko pravi bazu podataka. Informativni materijal može biti obezbeđen u kitu ili pakovanju, i može uključivati formulare za saopštavanje rezultata procene, uključujući svaku liniju procene (informacije koje se odnose na raniji tretman anti-VLA-4 terapijama, raniji tretman imunosupresantima, i JCV status), i adresu i kontaktne informacije gde poslati te formulare, ili druge slične informacije; ili URL (Uniform Resource Locator) adresu za saopštavanje rezultata on-lajn bazi podataka ili on-lajn aplikaciji (npr., u "app"). U drugom primeru izvođenja, informacioni materijal može uključivati uputstvo u vezi sa tim da li pacijent treba da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, u zavisnosti od pacijentovog rizika za PML, u skladu sa rezultatima procene rizika.

[0209] Kit ili pakovanje mogu uključivati i uputstva i artikle za sakupljanje ili transport pacijentovog uzorka do pružaoca zdravstvene nege, ili za prijem uzorka od pružaoca zdravstvene nege, ili za izvođenje evaluacionih metoda opisanih u ovom tekstu. Na primer, pored uputstava, kit ili pakovanje mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: tampon ili strugač, ili sud (npr., čaša, testna epruveta, ampula ili vrećica) za sakupljanje, skladištenje i transport biološkog uzorka. Kit ili pakovanje mogu sadržati i sve što je potrebno za izvođenje imunotesta ili testa sekvenciranja za detekciju JCV antitela, odnosno nukleinskih kiselina.

[0210] Kit može uključivati jedan ili više kontejnera za reagense potrebne za test, npr., JCV-detekcioni test. Reagensi mogu biti dati u u koncentraciji pogodnoj za upotrebu u testu ili uz uputstva o razblaživanju za korišćenje u testu. U nekim primerima, kit sadrži zasebne kontejnere, pregrade ili odeljke za testne komponente i informativni materijal. Na primer, testne komponente mogu se nalaziti u boci ili fioli, i informativni materijal može se nalaziti u plastičnoj fascikli ili pakovanju. U drugim primerima, zasebni elementi kita nalaze se u jednom, nepodeljenom kontejneru. Na primer, testni reagens se nalazi u boci ili fioli za koju je zakačen informativni materijal u vidu nalepnice. U nekim primerima, kit uključuje više (npr., paket) pojedinačnih kontejnera, svaki sadrži jednu ili više jediničnih formi (npr., za upotrebu u jednom testu) testne komponente. Na primer, kit uključuje više ampula, paketa u foliji ili blisteru, svaki sadrži jednu jedinicu testnog reagensa za upotrebu u testu skrininga ili potvrdnom testu. Kontejneri kitova mogu biti hermetički zatvoreni i/ili vodootporni. Kontejner može biti obeležen za upotrebu.

[0211] Oblik informativnog materijala kita ili pakovanja nije ograničen. U mnogim slučajevima, informativni materijal, npr., uputstvo, dat je u štampanom obliku, npr., u vidu štampanog teksta, crteža, i/ili fotografije, npr., obeleženi ili štampani list. Međutim, informativni materijal može biti dat i u drugim formatima, na primer u vidu materijala koji se čita na kompjuteru, video snimka ili audio snimka. U drugom primeru, informativni materijal kita je kontaktna informacija, npr., fizička adresa, imejl-adresa, veb sajt ili telefonski broj, preko kojih korisnik kita ili pakovanja može dobiti bitne informacije o tome kako da nađe podatke potrebne za analizu procenu rizika, npr., gde i kako da identifikuje ranije tretmane primenjivane kod subjekta, i kako da obavi test za određivanje JCV statusa pacijenta. Informativni materijal može biti obezbeđen u bilo kojoj kombinaciji formata.

[0212] U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak se daje izvršiocu testa, npr., pružaocu usluge (kao što je jedinica treće strane) ili pružaocu zdravstvene nege, koji evaluira uzorak u testu i obezbeđuje očitavanje. Na primer, u jednom primeru izvođenja, izvršilac testa prima biološki uzorak od subjekta, na primer uzorak plazme, krvi ili seruma, i evaluira uzorak korišćenjem testa opisanog u ovom tekstu, i određuje da li uzorak sadrži JCV antitela ili nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, izvršilac testa, npr., pružalac usluge ili pružalac zdravstvene nege, može odrediti, npr., kontaktiranjem sa pružaocem zdravstvene nege ili pružaocem usluge baze podataka, količinu prethodne anti-VLA-4 terapije koju je pacijent primao ili da li je pacijent ranije primao tretman imunomodulatorom. Izvršilac testa može odrediti i da subjekt nije kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom, kao što je natalizumab, ili da je subjekt kandidat da prima tretman imunomodulatorom, ili da subjekt može biti kandidat koji bi trebalo da bude pod povećanim nadzorom u poređenju sa subjektom za kojeg je određeno da ima negativan JCV status (npr., koji je testiran kao negativan za JCV nukleinsku kiselinu ili anti-JCV antitela). Na primer, kandidat koji je primao raniji tretman anti-VLA-4 terapijom 24 meseca ili kraće, i koji nije ranije primao terapiju imunosupresantom, ali za kojeg je određeno da je JCV pozitivan, može se odabrati kao kandidat da prima dalju anti-VLA-4 terapiju, ali uz preporuku da se pacijent češće kontroliše u pogledu razvoja neželjenih simptoma, kao što su simptomi koji mogu ukazati na razvoj PML.

[0213] U jednom primeru, izvršilac testa obavlja procenu rizika za PML, kako je opisano u ovom tekstu i određuje da je subjekt kandidat da prima tretman anti-VLA-4 terapijom kao što je natalizumab. U jednom primeru, izvršilac testa obaveštava pružaoca zdravstvene nege da je subjekt kandidat za lečenje anti-VLA-4 terapijom, i kod kandidata se primenjuje anti-VLA-4 terapija. Na primer, izvršilac testa može odrediti da pacijent ima niži rizik za PML i zatim obavestiti pružaoca zdravstvene nege o određivanju nižeg rizika i da je subjekt kandidat za lečenje anti-VLA-4 terapijom.

[0214] U drugom primeru, izvršilac testa određuje da pacijent ima viši rizik za PML i zatim obaveštava pružaoca zdravstvene nege o određivanju višeg rizika, i preporučuje pacijenta kao kandidata za lečenje anti-VLA-4 terapijom, ali da pacijent treba češće da se testira na PML i opciono, JCV status. U jednom primeru izvođenja, izvršilac testa obaveštava pružaoca zdravstvene nege da pacijent ima viši rizik za PML i da prema tome, pacijent treba da prima terapiju koja je alternativna anti-VLA-4 terapiji ili da je pacijent kandidat da prima anti-VLA-4 terapiju uz češće testiranje na PML i, opciono, JCV status.

[0215] Izvršilac testa može dati rezultate procene rizika, i opciono, zaključke u vezi sa jednim ili više od sledećeg: dijagnoza, prognoza, ili odgovarajuće terapijske opcije, na primer, pružaocu zdravstvene nege, ili pacijentu, ili osiguravajućoj kompaniji, u bilo kojem pogodnom formatu, na primer u vidu pošte ili elektronski, ili preko baze podataka. Informacije koje je sakupio i dao izvršilac testa mogu se čuvati u bazi podataka.

[0216] U jednom primeru, pružalac zdravstvene nege ili davalac osiguranja ili drugi entitet preporučuje, npr., pacijentu ili drugom pružaocu zdravstvene nege da pacijent bude podvrgnut proceni rizika za PML, kako je opisano u ovom tekstu.

[0217] Alati za stratifikaciju rizika za PML korisni su kao jedna komponenta u pojedinačnom odlučivanju o tretmanu u vezi sa odnosom koristi-rizika, uzimajući u obzir VLA4 inhibitor ili druga terapijska sredstva za koja je poznato da povećavaju rizik za razvijanje PML. Kvantifikacija pacijentovog rizika za PML može da se koristi na primer, za analizu odnosa korist-rizik.

[0218] Naslovi, npr., (a), (b), (i) itd. prikazani su samo da bi se olakšalo čitanje specifikacije i patentnih zahteva. Upotreba naslova u specifikaciji ili patentnim zahtevima ne zahteva da se koraci ili elementi izvode po alfabetskom ili numeričkom redosledu ili po redosledu po kojem su prikazani.

[0219] Pronalazak je dodatno ilustrovan sledeći primerima, koje ne treba shvatiti kao dodatno ograničavajuće.

PRIMERI

Primer 1. PML rizik kod MS pacijenata kvantifikovan je po prvi put korišćenjem dva uspostavljena faktora rizika i statusa anti-JCV antitela, kako je određeno jedinstvenim VP1 VLP-baziranim ELISA u dva koraka.

Metodi

Pacijenti, uzorci i sakupljanje podataka

[0220] Zbog toga što se PML retko javlja, podaci o PML pacijentima tretiranim natalizumabom sakupljeni su iz nekoliko izvora uključujući podatke iz Biogen Idec baze podataka o opštoj bezbednosti natalizumaba dobijene posle plasiranja na tržište i podatke kliničkih studija, na dan 4. marta 2011. Podaci o prethodnoj upotrebi imunosupresanta nisu bili dostupni za sve pacijente izložene natalizumabu; zato je proporcija pacijenata koji su ranije koristili i koji nisu ranije koristili imunosupresant, iz Globalnog programa opservacije bezbednosti za TYSABRI® (TYSABRI® Global Observational Program in Safety) (TYGRIS; NCT00477113, NCT00483847) korišćena kao procena za opštu populaciju tretiranu natalizumabom. TYGRIS je opservaciona studija kohorta dizajnirana za dobijanje podataka o dugotrajnoj bezbednosti kod MS pacijenata tretiranih natalizumabom, koja se odvijala u kliničkim uslovima. Procena prevalence anti-JCV antitela u opštoj MS populaciji bila je bazirana na pojedinačnom bazalnom uzorku plazme ili seruma, uzetom od pacijenata, iz četiri izvora koji su uključivali tekuće ili završene kliničke studije natalizumaba (AFFIRM (Polman et al., N. Engl. J. Med. 354:899-910, 2006; STRATIFY-1 (NCT01070823), TYGRIS-US, i nezavisni MS registar Švedske (dostupno na internetu msreg.net/cms/sv/home, pristup 3. februara 2011)). Klinički plan razvijen je za široku kolekciju uzoraka seruma i plazme dobijenih pre postavljanja dijagnoze PML, uključujući i kliničke studije i slučajeve posle puštanja na tržište.

Identifikacija dužine tretmana natalizumabom kao faktora rizika za PML

[0221] Procene incidence PML od ponovnog uvođenja natalizumaba na tržište izračunate su na osnovu izlaganja natalizumabu od izlaska na tržište do 28. februara 2011, i broja potvrđenih slučajeva PML maja 2011. PML incidenca za svaki period vremena (kumulativno trajanje ili 12-mesečni interval tretmana) izračunata je korišćenjem broja pacijenata koji su razvili PML tokom tog vremenskog perioda, podeljenog sa brojem pacijenata koji su nekada bili izloženi natalizumabu u tom trajanju.

Identifikacija ranije upotrebe imunosupresanta kao faktora rizika za PML

[0222] Istorije tretmana imunosupresantom MS pacijenata tretiranih natalizumabom, koji su razvili PML, u postavci praćenja od izlaska na tržište i u kliničkim ispitivanjima, dobijene su iz Biogen Idec baze podataka o opštoj bezbednosti natalizumaba na dan 2. novembra 2010. i upoređeni su sa podacima dobijenim iz TYGRIS. Ovaj granični datum o istoriji upotrebe imunosupresanta bio je odabran (u odnosu na 4. mart 2011. za sve druge podatke) jer se očekivalo da bi njegovo uključivanje kao faktora rizika u podacima o leku (decembar 2010. u EU) (Umetak u pakovanju. TYSABRI® (natalizumab). Biogen Idec. Weston, MA jul 2010; Sažetak karakteristika proizvoda. TYSABRI® (natalizumab). Biogen Idec. Weston, MA, 13. decembar 2010) moglo predstavljati neočekivani varijabilni faktor.

Identifikacija statusa anti-JCV antitela kao faktora rizika za PML

[0223] Ukupna prevalenca anti-JCV antitela u opštoj MS populaciji određena je korišćenjem jedinstvenog VP1 VLP-baziranog ELISA u dva koraka, kako je ranije opisano (Gorelik et al., Ann. Neurology, 2010). Prevalenca anti-JCV antitela kod MS pacijenata sa PML, čiji su uzorci seruma ili plazme iz perioda pre postavljanja dijagnoze PML bili raspoloživi, takođe je određena korišćenjem ovog testa i upoređena sa ukupnom prevalencom u opštoj MS populaciji.

Procena PML incidence preko serostatusa anti-JCV antitela

[0224] Incidenca PML kod pacijenata koji su pozitivni i koji su negativni na anti-JCV antitelo, procenjivana je korišćenjem ukupne opšte incidence PML i incidence posle 25-48 infuzija (vremenska tačka posle koje je porast incidence PML najistaknutiji u ovoj analizi), prevalence anti-JCV antitela u opštoj MS populaciji, i broja MS pacijenata sa PML čiji su uzorci iz perioda pre PML bili dostupni, i koji su testirani kao pozitivni na anti-JCV antitelo pre postavljanja dijagnoze. Jednostrani Fisherov test tačne verovatnoće korišćen je za upoređivanje procenjene incidence PML kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo i pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo. Da bi se dobila konzervativna procena incidence PML kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo, obavljena je analiza osetljivosti kako bi se ocenio uticaj hipotetičkih anti-JCV antitelo-negativnih PML slučajeva na ovu procenu. Pored toga, analiza osetljivosti obavljena je da bi se ocenila statistička pouzdanost ove procene variranjem broja PML slučajeva pozitivnih na anti-JCV antitelo.

Kvantifikacija PML rizika: ranija upotreba imunosupresanta, dužina tretmana natalizumabom, i pozitivan status anti-JCV antitela

[0225] Algoritmi za procenu faktora rizika razvijeni su za procenu incidence PML kod pacijenata koji su imali i koji nisu imali određene faktore rizika za PML udruženu sa natalizumabom i sa određenim serostatusom anti-JCV antitela. Ovi algoritmi procenjivali su rizik za PML prema ranijoj upotrebi imunosupresanta (da ili ne), trajanju tretmana natalizumabom (1-24 meseca i 25-48 meseca), i statusu anti-JCV antitela. Ovi algoritmi za procenu rizika bili su zasnovani na podacima o incidenci PML prema trajanju tretmana natalizumabom (1-24 ili 25-48 meseci) i procenama ranije upotrebe imunosupresanta, kod pacijenata tretiranih natalizumabom iz TYGRIS i kod onih sa PML. Pored toga, procenjena ukupna prevalenca anti-JCV antitela u opštoj MS populaciji korišćena je za imputiranje incidence PML udružene sa serostatusom za trofaktorski algoritam rizika, uz pretpostavku da su svi potvrđeni slučajevi PML udružene sa natalizumabom bili pozitivni na anti-JCV antitelo pre postavljanja dijagnoze. Analiza osetljivosti bila je izvedena da bi se kvantifikovao efekat variranja procena, korišćenog za razvijanje ovog trofaktorskog algoritma baziranog na najvišim i najnižim zapaženim vrednostima.

Rezultati

Identifikacija trajanja tretmana natalizumabom kao faktora rizika za PML

[0226] Na svetskom nivou, na dan 4. marta 2011. bila su identifikovana 102 potvrđena slučaja PML. Sveukupno, rizik za PML rastao je sa produženjem tretmana (SL. 1A), sa najvećim porastom rizika posle dve godine lečenja, i pikom od 1.68 slučajeva na 1000 pacijenata u trećoj godini (SL.1B). Podaci za trajanje tretmana preko četiri godine bili su ograničeni.

Identifikacija ranije upotrebe imunosupresanta kao faktora rizika za PML

[0227] Ranija upotreba imunosupresanta bila je češća kod pacijenata tretiranih natalizumabom, koji su razvili PML u poređenju sa pacijentima uključenim u TYGRIS, koji su predstavljali ukupnu populaciju pacijenata koji su primali natalizumab. Četrdeset pet procenata PML pacijenata tretiranih natalizumabom primalo je jednu ili više terapija imunosupresantom pre početka tretmana natalizumabom, u poređenju sa 20.3% pacijenata tretiranih natalizumabom (13.9% u SAD i 23.6% u EU) iz TYGRIS. Najčešće ranije korišćeni imunosupresanti i u PML populaciji tretiranoj natalizumabom i u TYGRIS uključivali su mitoksantron, metotreksat, ciklofosfamid, azatioprin, i mikofenolat, bez zapaženog specifičnog obrasca u tipu imunosupresanta, trajanju upotrebe ili periodu "ispiranja" između prekida upotrebe imunosupresanta i početka korišćenja natalizumaba (Tabela 1).

Tabela 1. Istorija prethodnog korišćenja imunosupresanta kod pacijenata sa PML udruženom sa natalizumabom i pacijenata uključenih u TYGRIS.

Kvantifikacija PML rizika: trajanje tretmana natalizumabom i ranija upotreba imunosupresanta

[0228] Kada su pacijenti stratifikovani prema dužini tretmana natalizumabom (1-24 ili 25-48 meseci) i prethodnoj upotrebi imunosupresanta (da ili ne), četiri odvojene podgrupe pacijenata su identifikovane u odnosu na incidencu PML (SL. 2). Od ovih podgrupa, u tri je procenjena incidenca PML bila približno jednaka ili manja od 1 na 1000. Rizik za PML bio je najniži kod pacijenata tretiranih natalizumabom 1-24 meseca, i koji nisu primali prethodnu imunosupresantnu terapiju, 0.19 na 1000 (95% CI: 0·10-0·33). Četvrta podgrupa, koja je uključivala pacijente koji su imali oba ova faktora rizika za PML, imala je najviši rizik, sa procenjenom incidencom PML od 4·3 na 1000 (95% CI: 2·9-6·2).

Identifikacija statusa anti-JCV antitela kao faktora rizika za PML

[0229] Za 5896 pacijenata iz AFFIRM, TYGRIS-US, STRATIFY-1, i Registra Švedske za MS bio je raspoloživ bazalni uzorak za testiranje anti-JCV antitela. Demografski podaci, uključujući trajanje tretmana natalizumabom i istoriju prethodnog tretmana natalizumabom, kada su bili dostupni, bili su slični među ovim izvorima podataka (Tabela 2). Ukupna prevalenca anti-JCV antitela u opštoj MS populaciji procenjena u ovoj studiji bila je 55% (95% CI: 54-56%).

Tabela 2. Prevalenca anti-JCV antitela i demografski podaci za opštu MS populaciju.

[0230] U TYGRIS-US setu podataka, informacije o starosti, polu i prethodnom korišćenju imunosupresanta bile su raspoložive za 1451 od 1480 pacijenata. U STRATIFY-1 setu podataka, informacije o prethodnoj upotrebi imunosupresanta bile su raspoložive za 988 od 1096 pacijenata. U setu podataka o MS pacijentima iz Švedske, za 2464 od 2497 pacijenata bile su dostupne informacije o starosti i za 2494 od 2497 pacijenata bile su dostupne informacije o polu. Podaci o prethodnoj upotrebi imunosupresanta nisu bili dostupni (not available, NA) kod MS pacijenata iz Švedske

[0231] Jedan ili više uzoraka iz perioda pre PML dobijeno je od 25 MS pacijenata tretiranih natalizumabom, 6.5-187 meseci pre postavljanja dijagnoze PML. Kao što je pokazano na Dopunskoj tabeli 1, ovih 25 pacijenata imalo je kliničke karakteristike slične onima kod 102 potvrđena slučaja PML širom sveta, što je pokazalo da nije bilo očigledne pristrasnosti prilikom selektovanja. Svi pacijenti za koje je bilo raspoloživo više pre-PML uzoraka, bili su testirani kao pozitivni na anti-JCV antitelo u svim vremenskim tačkama, uključujući uzorke uzete pre otpočinjanja tretmana natalizumabom. 100% (25 od 25) pozitivna prevalenca anti-JCV antitela kod MS natalizumabom tretiranih PML-pacijenata pre dijagnoze PML bila je značajno različita od očekivane prevalence od 55% zapažene u opštoj MS populaciji (p<0·0001), što pokazuje da status anti-JCV antitela može da služi kao dodatni alat u stratifikaciji rizika za PML.

Dodatna tabela 1. Kliničke karakteristike 25 MS PML pacijenata sa pre-PML uzorcima, u poređenju sa 102 slučaja posle izlaska na tržište.

[0232] Datum pojave MS bio je nepoznat za 5 pacijenata u grupi pozitivnih na anti-JCV antitelo i 38 pacijenata u svim PML grupama. Status ranije upotrebe imunosupresanta bio je nepoznat za 1 pacijenta u grupi pozitivnih na anti-JCV antitelo i 9 pacijenata u grupi svih PML pacijenata.

Procena incidence PML preko serostatusa anti-JCV antitela

[0233] Incidenca PML kod pacijenata koji su bili pozitivni na anti-JCV antitelo bila je procenjena kao gotovo dvostruko veća nego kod ukupne natalizumabom tretirane populacije (Tabela 4). Da bi se procenila ukupna incidenca PML preko statusa anti-JCV antitela, korišćen je sledeći metod: Na osnovu 25 MS pacijenata tretiranih natalizumabom, sa dostupnim pre-PML uzorcima, procenjeno je da 25 MS pacijenata sa PML potiče od približno 20276 pacijenata koji su primali tretman natalizumabom, što je bazirano na ukupnoj stopi PML, 1.23 na 1000 pacijenata (SL. 1). Uz pretpostavku da je 55% od ovih 20276 pacijenata bilo pozitivno na anti-JCV antitelo (tj., 11152 pacijenta) i da je 45% bilo negativno na anti-JCV antitelo (tj., 9124 pacijenta), procenjeno je da incidenca PML kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo iznosi 2.24 slučaja na 1000 tretiranih pacijenata (=1000×25/11152), 95% CI: 1.45-3.31, slično procenjenoj stopi iz literature (Tyler, Ann. Neurol. 68:271-274, 2010). Nasuprot tome, procenjena incidenca PML pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo bila je 0 slučajeva na 1000 pacijenata (95% CI: 0-0·40), što je značajno različito od procenjene incidence kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo, p<0·0001.

Tabela 4. Procenjena incidenca PMLpreko statusa anti-JCV antitela, na bazi 25 slučajeva PML koji su bili pozitivni na anti-JCV antitelo pre pojave PML.

[0234] Efekat trajanja tretmana natalizumabom na ovu procenu ocenjivan je analizom uz korišćenje incidence PML posle 25-48 meseci natalizumaba (što trajanje terapije posle kojeg je porast incidence bio najizraženiji). Rizik za PML posle 25-48 meseci terapije kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo bio je 3.97 na 1000 (95% CI: 2.36-6·27) i kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo bio je 0 na 1000 (95% CI: 0-0.99), Tabela 3.

[0235] U vreme pisanja ovog teksta, incidenca PML kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo nije mogla biti u potpunosti utvrđena jer nije bilo slučajeva PML koji su pre postavljanja dijagnoze bili testirani kao negativni na anti-JCV antitelo. Prema tome, za procenu incidence PML kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo, obavljena je analiza osetljivosti, koja je pretpostavila pojavu hipotetičkog slučaja PML kod pacijenta negativnog na anti-JCV antitelo, čime je omogućeno određivanje konzervativne procene za koju je stopa verovatno niža. Ova analiza je pokazala da je procenjena incidenca PML kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo najmanje 20 puta niža nego kod kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo, p<0·0001 (Tabela 3).

[0236] Analiza osetljivosti efekta povećanja broja PML pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo sa dostupnim pre-PML uzorcima koji su testirani kao pozitivni na anti-JCV antitelo pokazala je da se statistička pouzdanost u vezi sa povećanim rizikom za PML kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo, ne poboljšava sa povećanjem broja dostupnih pre-PML uzoraka iznad 25 (Tabela 5).

Tabela 5. Efekat porasta broja PML slučajeva pozitivnih na anti-JCV antitelo, na statističku pouzdanost procene incidence PML kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo.

Kvantifikacija rizika za PML: trajanje tretmana natalizumabom, ranija upotreba imunosupresanta, i status anti-JCV antitela

[0237] Kombinovani, kvantitativni algoritam procene rizika za PML razvijen je za MS pacijente tretirane natalizumabom, na osnovu trajanja tretmana natalizumabom, ranije upotrebe imunosupresanta, i statusa anti-JCV antitela (SL. 3). Pošto je izlaganje JCV uslov za PML, pacijenti koji su bili negativni na anti-JCV antitelo predstavljali su podgrupu najmanjeg rizika u algoritmu stratifikacije rizika za PML, sa procenjenim rizikom ≤ 0.11 na 1000 (95% CI: 0-0·59), bazirano na konzervativnoj proceni određenoj u analizi osetljivosti. Nasuprot tome, grupa najvišeg rizika sastojala se od pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo, koji su ranije koristili imunosupresante i koji su bili tretirani natalizumabom 25-28 meseci. Ovaj algoritam podrazumeva da su sva 102 potvrđena slučaja PML bila pozitivna na anti-JCV antitelo pre postavljanja dijagnoze PML. Za podgrupu sa višim rizikom (pacijenti koji su imali sva tri faktora rizika) procenjeni rizik za PML bio je približno 7.8 na 1000 (95% CI: 5·2-11·3). Za pacijente koji su bili pozitivni na anti-JCV antitelo i nisu ranije koristili imunosupresante, rizik za PML bio je konzistentan sa rizikom u ukupnoj populaciji tretiranoj natalizumabom u sličnim vremenskim tačkama (SL. 1A i 1B). Analiza osetljivosti efekta variranja procena, upotrebljena za razvijanje algoritma, rezultovala je minimalnim i maksimalnim vrednostima generalno konzistentnim sa originalnim procenama viđenim u scenariju osnovnog slučaja (vidi SL. 4A i 4B). Rizik kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo određen je uz pretpostavljanje pojave hipotetičkog slučaja PML kod pacijenta negativnog na anti-JCV antitelo.

[0238] U ovoj analizi varirane su prevalenca anti-JCV antitela u opštoj MS populaciji, od 48% (kako je viđeno u TYGRIS-US) do 59% (kako je viđeno u nezavisnom Registru Švedske), ranija upotreba imunosupresanta u MS populaciji tretiranoj natalizumabom od 14 do 24% (bazirano na procenama u SAD, odnosno EU, u TYGRIS), i procene izlaganja natalizumabu 25 do 48 meseci, od 35 do 45% (bazirano na sadašnjoj proceni od 40% i porastu od približno 10% u toku prethodne godine). Unete vrednosti predstavljaju tačke procene i 95% intervale pouzdanosti za svaki scenario (osnovni slučaj, minimum i maksimum). Uopšteno, scenario osnovnog slučaja je relativno konzistentan sa minimalnim i maksimalnim procenama.

[0239] Pošto je infekcija JCV uslov za razvoj PML, najniži rizik za PML određen je za pacijente koji su negativni na anti-JCV antitelo, ≤ 0·11 slučajeva na 1000 pacijenata tretiranih natalizumabom (95% CI 0-0.59), bez obzira na druge faktore rizika, što je najmanje 20 puta niže nego kod pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo, p<0.0001. Iako do danas nisu zabeleženi slučajevi PML kod pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo, stvarni rizik za razvoj PML ne može biti nula jer test anti-JCV antitela ima procenjenu analitičku stopu lažno negativnih rezultata između 2.5-3.2%.<1, 19>Nasuprot tome, rizik za PML bio je najveći kod pacijenata koji su imali sva tri faktora rizika (tretman natalizumabom 25-48 meseci, ranija upotreba imunosupresanta, i pozitivan status anti-JCV antitela) uz procenjenu incidencu od 7.8 slučajeva na 1000 pacijenata (95% CI: 5·2-11·3).

Primer 2. ELISA za anti-JCV antitelo bila je validirana u kliničkim laboratorijama da bi se pokazala robusnost metoda.

[0240] Nedavno je opisan novi, enzimski imunotest (ELISA) u 2 koraka, koji detektuje anti-JCV antitela u humanom serumu ili plazmi (vidi PCT/US2011/020832). Ključne odlike testa uključuju i direktno vezivanje i kompeticiju komponenti u rastvoru; upotrebu dobro okarakterisanih preparata čestica sličnih JC virusu (VLP); uključivanje odgovarajućih uzoraka za kontrolu kvaliteta (quality control, QC); statističko određivanje graničnih vrednosti testa korišćenjem velikog broja longitudinalno sakupljenih kliničkih uzoraka; normalizaciju signala testa; i detekciju nekoliko izotipova anti-JCV antitela (uključujući IgG, IgM, IgA, i IgE).

[0241] Validacija ELISA za anti-JCV antitelo vršena je u tri kliničke laboratorije, sa ciljem pokazivanja robusnosti metoda. Analitička validacija izvedena je evaluacijom intra- i intertestne preciznosti, analitičke specifičnosti i osetljivosti, interferencije matriksa i stabilnosti reagenasa.

[0242] Stabilnost anti-JCV antitela u uzorcima seruma i plazme pokazana je korišćenjem testnih QC uzoraka pripremljenih od pulovanih humanih seruma, kao i od uzoraka seruma i plazme uzetih od pojedinačnih davalaca. Pokazano je da su anti-JCV antitela stabilna u serumu ili plazmi tokom 6 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, i 14 dana bilo da se drže na ambijentalnoj temperaturi (18-25°C) ili na 2-8°C. Pored toga, stabilnost anti-JCV antitela u celoj krvi uskladištenoj na 2-8°C, na ambijentalnim temperaturama (18-25°C), ili na 37°C, u trajanju od 7 dana, 7 dana, i 3 dana, respektivno, pre procesovanja, pokazana je korišćenjem epruveta iz kolekcije seruma i plazme. Stabilnost JC VLP pokazana je u 4 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i tokom 18 meseci na 2-8°C.

[0243] Analitička validacija pokazala je da je test senzitivan, specifičan i precizan. Senzitivnost testa procenjena je na 1.7 ng/mL korišćenjem kontrolnog humanizovanog anti-JCV monoklonskog antitela, i na 1.25 µg/mL korišćenjem prečišćenog poliklonskog antitela iz seruma pozitivnih na anti-JCV antitelo. Procenjeno je da senzitivnost za detektovanje JCV infekcije iznosi 97.5%. Specifičnost testa za razlikovanje JCV specifičnih antitela od antitela na BK virus, srodni poliomavirus, takođe je bila pokazana. Prosečna među- i unutartestna preciznost bila je približno 6.4% i 12.2% za korak skrininga i 2.6% i 5.3% za korak potvrđivanja. Rezultati dobijeni za plazmu i serum bili su visokopodudarni, i jačina testa pokazana je visokom konkordancom rezultata dobijenih slepim testiranjem panela od 100 uzoraka u 3 laboratorije.

Primer 3. Poboljšani JCV test u dva koraka (Gen2 test) obezbeđuje preciznije rezultate nego originalni test (Gen1 test).

[0244] Test anti-JCV antitela u dva koraka modifikovan je posle ciklusa optimizacije. Novi test razlikuje se od prvog najmanje u sledećem:

• HPVLP se koristi pri koncentraciji supstrata od 0.4 µg/mL, na pločama u prvom koraku, i u rastvoru u potvrdnom testu, što je različito u odnosu na 1 µg/mL koliko se koristi u Gen1 testu;

• Pacijentov serum se razblažuje 1:101 pre nego što se nanese na HPVLP na pločama, u prvom koraku testa, ili na HPVLP u rastvoru u potvrdnom testu, što je različito u odnosu na 1:200 u Gen1 testu;

• Sekundarni reagens (anti-humani IgG) konjugovan sa HRP tipično se razblažuje 1:20000 (ali može se podesiti za nove partije da bi se izvršilo usaglašavanje sa signalom za prethodnu partiju), i vreme inkubacije sa konjugatom iznosi samo 30 min. U Gen1 testu, isti reagens se razblažuje 1:80000 i vreme inkubacije je 60 min;

• reakcija vezivanja testira se inkubiranjem HRP supstrata, TMB, 20 minuta ± 2 minuta, dok u Gen1, TMB inkubacija traje 20 minuta ± 5 minuta;

• U potvrdnom testu, 10 µl uzorka se dodaje u 1 mL pufera za potvrđivanje (razblaženje 1:101), i reakcija se odvija 10 do 20 minuta. U Gen1 testu, 2x koncentracija uzorka (razblaženje 1:100) i HPVLP (2 µg/mL) mešaju se u jednakim proporcijama i zatim inkubiraju 60 minuta.

• Kalibrator granične vrednosti (CO) podešen je da ima indeks reaktivnosti od oko nOD 1.0, a pozitivna kontrola (positive control, PC) je podešena da ima indeks reaktivnosti od oko nOD 1.3). CO i PC se naprave mešanjem seruma pozitivnog na anti-JCV antitelo i seruma negativnog na anti-JCV antitelo. Za negativnu kontrolu (negative control, NC), koja je tipično predstavljena bočicom negativnog seruma, ciljni indeks reaktiviteta je oko 0.1;. Kvalitativno, kontrole su iz različitih pulova humanog seruma, ali iz testne ciljne koncentracije, slične su kontrolnim nivoima Gen 1 kontrolnim nivoima.

[0245] Rezultati JCV Gen2 kliničke studije usaglašenosti sumirani su u Tabeli 6, dole. Sva Gen1 testiranja izvedena su u referentnoj laboratoriji Focus Diagnostics (Cypress, CA), a mesta testiranja za Gen2 test uključivala su Denver (n: ukupno= 275; na TYSABRI®= 149; "naïve"= 126); Njujork (n: ukupno= 275; na TYSABRI®= 136; "naïve"= 139); i Focus Diagnostics (n= ukupno 262; na TYSABRI®= 95; "naïve"= 167). Procenat usaglašenosti izražen je kao (Gen2/Gen1), donja i gornja granica od 96% intervala pouzdanosti (95% Cl: LB prema UB).

Tabela 6. Rezultati kliničke studije saglasnosti JCV Gen2

Primer 4. Status anti-JCV antitela može da se koristi za kategorizovanje pacijentovog rizika za PML.

[0246] Pretpostavili smo da pacijenti pozitivni na anti-JCV antitelo mogu dodatno da se stratifikuju u pogledu rizika za razvijanje PML na osnovu titra anti-JCV antitela (nOD ili indeks) i aviditeta/afiniteta anti-JCV antitela (% inhibicije). Ova pretpostavka izvedena je iz zapažanja da pacijenti koji imaju titar anti-JCV antitela i % inhibicije ispod unapred određenog nivoa ("klinička granična vrednost") imaju niži rizik za razvijanje PML u poređenju sa ukupnom populacijom pozitivnom na anti-JCV antitelo. Da bi se odredio relativni rizik za PML sugerisan statusom titra antitela i procentom inhibicije, titri anti-JCV antitela i procenat inhibicije mogu se odrediti pre otpočinjanja TYSABRI® (natalizumab) ili kada pacijenti već primaju TYSABRI®.

[0247] Da bi se odredio relativni rizik za PML sugerisan statusom titra antitela i procentom inhibicije u kombinaciji sa drugim faktorima rizika, sakupljeni su i analizirani ranije postojeći podaci iz dva različita testa anti-JCV antitela ("Generation I" i "Generation II"). Ranije postojeći podaci uključivali su informacije o titru anti-JCV antitela iskazane kao "nOD" ili "indeks".

[0248] U testu Generation I, 22% (77/356) pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo imalo je nOD > 1.0 (C-1801), i 34% (13/38) PML pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo imalo je nOD >1.0 (C-1801). Prema tome, ∼1.5 puta više PML pacijenata ima nOD > 1.0 u poređenju sa ne-PML pacijentima. Ovo se prevodi u 2-3-struki odnos rizika udružen sa nOD>1.0.

[0249] Zapaženo je i da 6% pacijenata na TYSABRI® koji nemaju PML, ima >2-struku promenu titra anti-JCV antitela (nOD) u longitudinalno sakupljenim uzorcima tokom >2 godine (C-1801). Međutim, glavnina PML pacijenata sa longitudinalnim uzorcima sakupljanim u informativnim vremenskim tačkama (>1 godine pre dijagnoze PML, i unutar 6 meseci od dijagnoze PML i pri dijagnozi PML) pokazala je >2-strukog porasta titra anti-JCV antitela (nOD). Ovo sugeriše da su pacijenti koji nisu ispoljili značajnu promenu titra JCV tokom vremena pod nižim rizikom da razviju PML.

[0250] Primeri nOD i titara antitela dati su na SL.5A-10B. Podaci za pacijente sumirani su u Tabeli 7.

[0251] Grafikon statističke analize prikazan je na SL.11.

[0252] Statistička analiza ukazuje za procenat inhibicije, ∼17% antitelo-pozitivnih uzoraka su manje od 0.502, i ∼0% PML uzoraka je manje od 0.502. ∼30% antitelo-pozitivnih uzoraka je manje od 70% inhibicije, i ∼0% PML uzoraka (sa indeksom <3.0) je manje od 70% inhibicije.

Tabela 7. Merenja titra anti-JCV antitela i nOD kod pacijenata.

Primer 5. Analitički validirani test anti-JCV-antitela uveden je u kliničku praksu za stratifikaciju MS pacijenata u pogledu višeg ili nižeg rizika za PML.

[0253] Cilj donje studije bio je proceniti promene titra anti-JCV-antitela pre i posle otpočinjanja tretmana natalizumabom.

[0254] Test anti-JCV-antitela (Gorelik et al., Ann. Neurol. 2010) primenjen je na uzorke MS pacijenata iz Švedske, tretiranih natalizumabom, koji su obuhvatali pet PML pozitivnih pacijenata. Normalizovane OD (nOD) vrednosti testa anti-JCV antitela izučavane su pre i tokom tretmana natalizumabom. Pozitivni uzorci razblaženi su u koracima razblaživanja 1:3 za određivanje nivoa titra. Proporcija istih pacijenata testirana je i na antitela na nukleusni humani citomegalovirusni (CMV) antigen (Schmitz et al., J. Clin. Microbiol. 1977), i na antitela na rekombinantni varičela-zoster (varicella zoster virus, VZV) glikoprotein E antigen (Thomsson, J. Virol. Methods 2011).

Tabela 8. Pacijenti testirani na anti-JCV antitela.

[0255] Posle otpočinjanja lečenja natalizumabom, nivoi anti-JCV antitela ostali su relativno stabilni, uz blagi pad nOD nivoa zapažen kod anti-JCV pozitivnih pacijenata. Očigledni pad nivoa anti-JCV antitela (nOD) zapažen je kada su pacijenti bili na tretmanu natalizumabom (n=471), ali ne tokom ranije terapije interferonom beta (n=210). Ovo ukazuje na potencijalni uticaj terapije natalizumabom na nivoe anti-JCV antitela, bez značajnog uticaja na serološki status i stopu seropozitivnosti (pre: 56%; posle 55%).

[0256] Posle otpočinjanja lečenja natalizumabom, blago je opao nivo anti-VZV (OD) (n=715), ali ne i anti-CMV (n=502) antitela.

[0257] Za 5 pacijenata koji su razvili PML, zapažene promene nivoa anti-JCV antitela (nOD) u serumu sumirane su u donjoj Tabeli 9. Nivoi anti-JCV antitela (nOD) u serumu porasli su u vreme dijagnoze PML u poređenju sa bazalnim vrednostima.

Tabela 9. Promene nOD tokom lečenja natalizumabom

[0258] Iz ove studije zaključili smo da terapija natalizumabom može dovesti do blagog smanjenja nivoa anti-JCV antitela (nOD), ne utičući na stopu JCV seropozitivnosti. Posebno, samo 5% anti-JCV pozitivne referentne popuilacije pokazuje promenu nOD vrednosti (ΔnOD) iznad 0.151 (95%-persentil), dok je ovo bilo zapaženo kod svih 5 slučajeva PML iz Švedske u vreme dijagnostikovanja u poređenju sa bazalnim vrednostima. Prema tome, u kontekstu stratifikacije rizika za PML opravdano je ispitivanje porasta nivoa anti-JCV antitela tokom terapije natalizumabom, pre dijagnostikovanja PML.

Primer 6. Upotreba kliničke granične vrednosti različite od analitičke granične vrednosti za razgraničavanje grupa visokog i niskog rizika, među pacijentima pozitivnim na anti-JCV antitela.

[0259] Rezultati studije Stratify I upotrebljeni su za određivanje kliničke granične vrednosti različite od analitičke granične vrednosti, za razgraničavanje grupa visokog i niskog rizika, među pacijentima pozitivnim na anti-JCV antitela. Prema tome, pacijentov rizik za PML bio bi inicijalno zasnovan na bazalnim nivoima titra anti-JCV antitela. Test Generation II anti-JCV antitela korišćen je u ovoj studiji.

[0260] Evaluirani su bili TYSABRI® ne-PML pacijenti (Stratify I, n= 1044) i PML pacijenti (> 6 meseci pre dijagnoze PML (n= 38) (SL. 12). U Generation II testu, 17% pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo imalo je titre (indeks) ispod najnižeg titra (indeks) zapaženog za uzorke od PML pacijenata sakupljene >6 meseci pre dijagnoze PML, što ukazuje da bi ovi pacijenti mogli imati niži rizik za razvijanje PML (kao pacijenti negativni na anti-JCV antitelo). Dodatno 50% pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo imalo je titre (indeks) ispod indeksa 1.5, u poređenju sa samo 13% PML pacijenata od kojih su uzorci uzeti >6 meseci pre dijagnoze PML koji su imali indek <1.5. Isto tako, samo 4.4% PML pacijenata za koje se nije znalo da li su ranije primali imunosupresivna sredstva imalo je uzorke sa indeksom <1.5, što sugeriše da bi ovi pacijenti mogli imati niži rizik da razviju PML u poređenju sa pacijentima sa visokim titrom anti-JCV antitela (nOD ili indeks).

[0261] Za pacijente sa nOD < 0.5 (109/1044 (10.4% od svih uzoraka) ili 109/549 (20% od pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo)) određeno je da su u grupi najnižeg rizika za PML (potencijalno niskog kao za grupu pacijenata negativnih na anti-JCV antitelo), jer nijedan pacijenat nije imao indeks <0.5. Pacijenti sa indeksom >0.5 ali <1.5 određeni su da pripadaju zoni nižeg rizika, pošto je 50% ne-PML pacijenata pozitivnih na anti-JCV antitelo i samo 13% PML pacijenata, respektivno, imalo uzorke u ovoj zoni. Pored toga, samo 4% PML pacijenata za koje nije bilo poznato da li su ranije primali imunosupresivne terapije, imalo je uzorke sa indeksom <1.5 (SL. 13). Pacijenti sa indeksom >1.5 (271/549 (50%) iz populacije pozitivne na anti-JCV antitelo) određeni su da su pod višim rizikom za PML. Četrdeset sedam procenata pacijenata bilo je negativno na anti-JCV antitelo.

[0262] Posle dijagnostikovanja PML, pacijenti su podvrgnuti imuno-adsorpciji (IA) ili razmeni plazme (plasma exchange, PLEX) da bi se uklonio natalizumab iz cirkulacije i da bi se uspostavila imunska funkcija. Kod ovih pacijenata, nivoi anti-JCV antitela brzo su vraćeni na vrednosti pre postupka.

Primer 7. Predložena statistička metodologija za dodeljivanje stratifikovanih rizika pacijentima sa multiplom sklerozom (MS) koji se leče korišćenjem TYSABRI®, koji su već testirani kao pozitivni na anti-JCV antitela u poboljšanom anti-JCV testu u dva koraka opisanom u ovom tekstu.

[0263] Za studiju STRATIFY-II (American Academy of Neurology (AAN) Meeting, April 21-28, 2012, apstrakt S041.002), biće evaluirane dve alternativne strategije (označene kao strategije 1 i 2, Strategy 1 i 2) za dodeljivanje PML rizika anti-JCV seropozitivnim pacijentima. Strategy-1, konzervativniji od dva metoda, biće poboljšanje jednog od neparametarskih bivarijatnih regiona tolerancije, što je dato u pridruženom saopštenju. Strategy-2, čija je statistička metodologija skicirana u nastavku, trebalo bi da veću proporciju budućih anti-JCV seropozitiva dodeli niskom riziku za razvijanje PML u poređenju sa Strategy-1.

[0264] Strategy-2 osmišljava niži simultani region tolerancije oko podešene jednačine koja meri %-inhibicije prema indeksu za uzorak PML pacijenta. Dok Strategy-1 konstruiše region nižeg rizika na bazi merenja %-inhibicije/indeksa iz dvostepenog anti-JCV testa kod STRATA (Ann. Neurol., 68:295-303, 2010) i STRATIFY-I (Ann. Neurol., 70:742-750, 2011) pacijenata (koji se skoro svi smatraju da imaju veoma nizak rizik za razvijanje PML), Strategy-2 konstruiše region visokog rizika na bazi merenja sakupljenih od MS pacijenata pre datuma postavljanja njihove dijagnoze PML. Iako naša ograničena kolekcija PML uzoraka možda nije dobar reprezent svih MS pacijenata lečenih korišćenjem Tysabri, inficiranih sa PML, Strategy-2 pretpostavlja da je odnos %-inhibicije prema indeksu u ovim uzorcima globalno reprezentativan za PML pre dijagnoze. Ova pretpostavka je statistički podržana anti-JCV PML podacima koji pokazuju odnos %-inhibicije prema indeksu paralelan onome iz STRATIFY-1+STRATA. Ovaj paralelizam koristi se u Strategy-2 za modelovanje PML odnosa %-inhibicije prema indeksu.

[0265] Odnos između %-inhibicije i indeksa biće prvo statistički modelovan za kombinovani set STRATIFY-1/STRATA/PML uzoraka. Prilagođena jednačina za %-inhibicije prema indeksu praviće razliku između PML i STRATIFY-1/STRATA uzoraka. Niži simultani 95% ili 99% region tolerancije će tada biti konstruisan oko podešene jednačine ograničene za PML uzorke. Budućim anti-JCV seropozitivima sa merenjima %-inhibicije/indeksa unutar ovog regiona tolerancije biće dodeljen viši rizik za razvijanje PML; ovaj region tolerancije trebalo bi da garantuje da će najmanje 95% (ili 99%) uzoraka od PML pacijenata pre njihove dijagnoze biti sa dodeljenim višim rizikom. Treba imati u vidu da će budućim uzorcima sa merenjima indeksa > 2.5 automatski biti dodeljen viši rizik za razvoj PML.

[0266] Statistički detalji. Sledeći mešoviti model (ili neko njegovo poboljšanje) biće "first fit"(prvi odgovarajući) korišćenjem SAS MIXED procedure za merenja %-inhibicija/indeks kombinovanog seta Gen-2 anti-JCV STRATIFY-1 STRATA PML uzoraka.

(1)

gde

Y (ili log-odnos)= -loge{1-%inhibicije/100};

X<+>= indeks ako je indeks< x0= x0za x0≤ indeks ≤ 2.5;

W=0 ako je uzorak sakupljen iz STRATIFY-1 ili STRATA pacijenta =1 ako je uzorak sakupljen od PML pacijenta pre postavljanja dijagnoze;

πi=nasumični efekat za pacijenta i;

εij=nasumično testno merenje longitudinalna greška za jth vremensku tačku ith pacijenta;

εijsu pretpostavljene normalno i nezavisno distribuirane sa srednjom nulom i varijansom σ<2>; πisu pretposavljene normalno i nezavisno distribuirane sa srednjom

nulom i varijansom εiji πisu pretpostavljene nezavisno. Tako za mešoviti model u jednačini (1), X<+>i W su fiksirani efekti, dok su πii εijnasumični efekti. Preliminarna procena x0bila je 1.77, ali će biti poboljšana. Niži 95 ili 99% simultani region tolerancije oko podešene jednačine biće konstruisan (ref. 1-5). Donje granice regiona tolerancije kao funkcija indeksnog nivoa tada će se ponovo transformisati u %-inhibicije. Budući uzorci čija merenja %-inhibicije/indeksa ulaze u region tolerancije ili imaju indeksna merenja > 2.5 biće ocenjeni kao viši rizik za razvijanje PML.

[0267] Donja Tabela 10 daje procenjene procente pozitiva na anti-JCV antitelo, koji će biti klasifikovani kao niži rizik na osnovu različitih nOD.

Tabela 10. Procenjene procente pozitiva na anti-JCV antitelo, koji će biti klasifikovani kao niži rizik na osnovu različitih nOD.

Claims (7)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Metod evaluacije rizika kod pacijenta da razvije progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML), naznačen time, što uključuje:

određivanje titra antitela na JC virus (JCV), izraženog kao vrednost indeksa u uzorku seruma ili plazme pacijenta, pri čemu se određuje da pacijent ima visok rizik ako se utvrdi da vrednost indeksa JCV antitela iznosi >1.5;

gde se vrednost indeksa određuje normalizovanjem OD vrednosti uzorka prema kalibratoru granične vrednosti, pri čemu se kalibrator granične vrednosti podesi da ima OD vrednost 1, pri čemu kalibrator granične vrednosti sadrži mešavinu seruma pozitivnog na JCV antitela i seruma negativnog na JCV antitela,

gde normalizovanje OD vrednosti negativne kontrole koja sadrži serum negativan na JCV antitelo prema kalibratoru granične vrednosti rezultuje vrednošću indeksa od 0.1, i

gde se titar JCV antitela određuje ELISA testom za detektovanje JCV antitela u uzorku.

2. Metod iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što se testiranje titra JCV antitela ponavlja u intervalima od 6 meseci ili 12 meseci, pri čemu porast titra antitela ili procenta inhibicije ukazuje na porast rizika kod pacijenta da razvije PML.

3. Metod iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-2, naznačen time, što uključuje još i:

(a) određivanje da li je pacijent primao tretman natalizumabom duže od 24 meseca; i/ili

(b) određivanje da li je pacijent primao određenu imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije, pri čemu se određena imunosupresantna terapija različita od anti-VLA-4 terapije bira između mitoksantrona, metotreksata, azatioprina, ciklofosfamida, mikofenolata, anti-CD20 terapije, anti-CD11a terapije, i mikofenolat mofetila.

4. Metod iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-3, naznačen time, što se pacijent klasifikuje da ima viši rizik za PML ako je primao natalizumab duže od 24 meseca, i nije ranije primao specifikovanu imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije pri čemu se specifikovana imunosupresantna terapija različita od anti-VLA-4 terapije bira između mitoksantrona, metotreksata, azatioprina, ciklofosfamida, mikofenolata, anti-CD20 terapije, anti-CD11a terapije, i mikofenolat mofetila.

5. Metod iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-4, naznačen time, što uključuje još i kontrolisanje pacijenata u pogledu razvijanja PML, opciono gde pomenuto kontrolisanje podrazumeva MRI skeniranje za identifikovanje moždanih lezija.

6. Metod evaluacije rizika kod pacijenta da razvije PML prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što uključuje:

(a) određivanje da li je nivo anti-JCV antitela veći od vrednosti indeksa 1.5; (b) određivanje da li je pacijent primao natalizumab duže od 24 meseca; i (c) određivanje da li je pacijent primao imunosupresantnu terapiju različitu od anti-VLA-4 terapije, pri čemu se imunosupresantna terapija različita od anti-VLA-4 terapije bira između mitoksantrona, metotreksata, azatioprina, ciklofosfamida, mikofenolata, anti-CD20 terapije, anti-CD11a terapije, i mikofenolat mofetila; i u odgovoru na određivanja, evaluiranje rizika kod pacijenta da razvije PML.

7. Metod iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što pacijent prima tretman natalizumabom.