RS59015B1 - Tieno[2,3-c]pirol-4-on derivati kao erk inhibitori - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na tieno[2,3-c]pirol-4-on jedinjenja, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, i farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja, koja inhibiraju aktivnost kinaze regulisane ekstracelularnim signalom (ERK) i mogu biti korisna za tretiranje kancera.

[0002] ERK/MAPK put je važan za proliferaciju ćelija i često je uočeno da je aktiviran u mnogim tumorima. RAS geni, koji su ushodno od ERK1/2, mutirani su kod nekoliko kancera uključujući kolorektalni, melanom, nesitnoćelijski kancer pluća kao i kancer dojke i tumori pankreasa. Visoka RAS aktivnost je praćena povećanom ERK aktivnošću kod mnogih humanih tumora. Studije su takođe pokazale da je ERK kritična komponenta RAS signalizacije. Ove opservacije podržavaju atraktivnost ERK1/2 puta signalizacije za razvijanje antikancer terapija u širokom spektru humanih tumora.

[0003] ERK inhibitori su poznati u tehnici; videti, na primer, WO2013130976. Dodatno, druga aminopiridin jedinjenja su poznata u tehnici; videti, na primer, WO 2010/022121, US 2003/0064982 i WO 2007/053776. Ostaje potreba da se obezbede alternativni ERK inhibitori, specifičnije za tretiranje kancera. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje ERK1/2 inhibitore koji mogu biti korisni u tretiranju kancera.

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje sledeće formule:

naznačeno time da:

R<1>je

ili

R<2>i R<3>su nezavisno metil ili R<2>i R<3>mogu biti uzeti zajedno da formiraju ciklopropil; R<4>je vodonik, metil, hloro, fluoro, ili triflurometil; i

R<5>je

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

[0005] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje sledeće formule:

naznačeno time da:

R<1>je

R<2>i R<3>su nezavisno metil ili R<2>i R<3>mogu biti uzeti zajedno da formiraju ciklopropil; R<4>je vodonik, metil, hloro, fluoro, ili trifluorometil; i

R<5>je

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

[0006] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje primer izvođenja za jedinjenje Formule I naznačeno time da R<2>i R<3>su metil.

[0007] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sledeći primer izvođenja za jedinjenje Formule I naznačeno time da R<4>je vodonik.

[0008] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sledeći primer izvođenja za jedinjenje Formule I naznačeno time da R<4>je vodonik.

[0009] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sledeći primer izvođenja za jedinjenje Formule I naznačeno time da R<1>je

[0010] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sledeći primer izvođenja za jedinjenje Formule I naznačeno time da R<5>je

[0011] Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0012] Kao naročiti primer izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on.

[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens. Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens.

[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji. Predmetni pronalazak obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretiranju kancera. Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u tretiranju kancera, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0015] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on za upotrebu u terapiji. Predmetni pronalazak obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4Htieno[2,3-c]pirol-4-on za upotrebu u tretmanu kancera. Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u tretmanu kancera, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il]-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on.

[0016] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za proizvodnju medikamenta za tretman kancera. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on za proizvodnju medikamenta za tretman kancera.

[0017] Predmetni pronalazak obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on u kristalnom obliku. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on u kristalnom obliku karakterisan sa obrascem difrakcije praha rendgenskim zracima koji ima karakteristične pikove, u 2θ ± 0.2°, koji se javljaju na 19.3° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 15.5°, 17.1°, 18.0°, 20.2°, 21.5° i 22.1°.

[0018] Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje poželjne primere izvođenja upotreba kao što su ovde opisane, u kojima je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, i nesitnoćelijskog kancera pluća. Poželjni kanceri su kolorektalni kanceri, kancer pankreasa, i nesitnoćelijski kancer pluća.

[0019] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u istovremenoj, zasebnoj ili sekvencijalnoj primeni u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapeutskih sredstava u tretmanu kancera. Poželjna hemoterapeutska sredstva za takve kombinacije su pan-RAF inhibitor jedinjenje, specifičnije 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea), CDK4/6 inhibitor jedinjenje, specifičnije palbociklib, ribociklib, ili [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-izopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili anti-VEGFR2 antitelo, specifičnije ramucirumab. Dodatna poželjna hemoterapeutska sredstva za takvu kombinaciju su jedinjenje inhibitor TGF-beta receptor kinaze, specifičnije galunisertib (videti WO 2004/048382), inhibitor ALK-5 kinaze, specifičnije EW-7197, jedinjenje inhibitor MEK, specifičnije kobimetinib ili trametinib, ili jedinjenje inhibitor Notch, specifičnije 4,4,4-trifluoro-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroksietil)-6-okso-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]1-metil-2-okso-etil]butanamid (videti WO 2013/016081). Dodatna poželjna hemoterapeutska sredstva za takvu kombinaciju su PD-L1 (ligand 1 programirane smrti) inhibitor ili PD-1 (programirana smrt 1) inhibitor.

[0020] Predmetni pronalazak poželjno sadrži jedinjenja Formule I sa sledećim supstituentima:

a) R<1>je

b) R<2>je metil;

c) R<3>je metil;

d) R<4>je vodonik; ili

e) R<5>je

[0021] Poželjnije, predmetni pronalazak sadrži jedinjenja Formule I sa sledećim kombinacijama supstituenata:

a) R<2>i R<3>su metil;

b) R<2>je metil, R<3>je metil, i R<4>je vodonik;

c) R<1>je

i R<5>je

d) R<2>je metil, R<3>je metil, R<4>je vodonik, i R<1>je

e) R<2>je metil, R<3>je metil, R<4>je vodonik, i R<5>je

ili

f) R<2>je metil, R<3>je metil, R<4>je vodonik, i R<1>je

i R<5>je

[0022] Kao što je prethodno korišćeno, i tokom opisa pronalaska, sledeći termini, ukoliko nije drugačije naznačeno, podrazumevaju sledeća značenja:

"Farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens" je medijum generalno prihvaćen u tehnici za isporuku biološki aktivnih sredstava sisarima, npr., ljudima.

[0023] "Farmaceutski prihvatljive soli" ili "farmaceutski priihvatljiva so" odnosi se na relativno ne-toksičnu, neorgansku i organsku so ili soli jedinjenja predmetnog pronalaska.

[0024] "Efikasna količina" označava količinu jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, predmetnog pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, predmetnog pronalaska koji će izazvati biološki ili medicinski odgovor ili željeni terapeutski efekat na tkivo, sistem, životinju, sisara ili čoveka koji je tražen od strane istraživača, veterinara, lekara ili drugog kliničkog lica.

[0025] Termin "tretman," "tretirati," "tretiranje," i slični, podrazumeva se da uključuje usporavanje ili reverziju napredovanja poremećaja. Ovi termini takođe uključuju olakšavanje, poboljšanje, atenuaciju, eliminisanje, ili smanjenje jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja, čak iako poremećaj ili stanje nije stvarno eliminisano i čak iako napredovanje poremećaja ili stanja nije samo po sebi usporeno ili preokrenuto.

[0026] Stručnjak će shvatiti da jedinjenja predmetnog pronalaska su sposobna da formiraju soli. Jedinjenja predmetnog pronalaska sadrže bazne heterocikluse, i shodno tome reaguju sa bilo kojim brojem neorganskih i organskih kiselina da bi formirala farmaceutski prihvatljive klisele adicione soli. Takve farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli i uobičajena metodologija za njihovo pripremanje su dobro poznati u tehnici. Videti, npr., P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977.

[0027] Jedinjenja predmetnog pronalaska su poželjno formulisana kao farmaceutske kompozicije primenjena različitim putevima. Poželjno, takve kompozicije su za oralnu primenu. Takve farmaceutske kompozicije i procesi za pripremanje istih su dobro poznati u tehnici. Videti, npr., REMINGTON: SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005).

[0028] Jedinjenja predmetnog pronalaska su generalno efikasna u širokom opsegu doze. Na primer, doze na dan noramalno spadaju unutar dnevnog opsega od oko 1 do 2000 mg. Poželjno takve doze spadaju unutar dnevnog opsega od 50 do 1000 mg. Poželjnije takve doze spadaju unutar dnevnog opsega od 125 do 400 mg. U nekim slučajevima nivoi doze ispod donje granice pomenutih opsega mogu biti više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima se mogu koristiti još veće doze, i stoga prethodni opsezi doza nisu nameravani da ograničavaju obim pronalaska na bilo koji način. Biće jasno da će količina jedinjenja koja je stvarno primenjena biti određena od strane lekara, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje koje se tretira, izabranog puta primene, stvarno primenjenog jedinjenja ili više jedinjenja, starosti, težine, i odgovora pojedinačnog pacijenta, i težine simptoma pacijenta.

[0029] Stručnjak će shvatiti da određena jedinjenja predmetnog pronalaska sadrže najmanje jedan hiralni centar. Predmetni pronlazak predviđa sve pojedinačne enantiomere ili dijastereomere, kao i smeše enantiomera i dijastereomera pomenutih jedinjenja uključujući racemate. Poželjno je da jedinjenja predmetnog pronalaska koja sadrže najmanje jedan hiralni centar postoje kao pojedinačni enantiomeri ili dijastereomeri. Pojedinačni enantiomeri ili dijastereomeri mogu se pripremiti počinjući sa hiralnim reagensima ili sa stereoselektivnim ili stereospecifičnim sintetičkim tehnikama. Alternativno, pojedinačni enantiomeri ili dijastereomeri mogu se izolovati iz smeša standardnim hiralnim hromatografskim ili kristalizacionim tehnikama.

[0030] Označavanje "izomer 1" u nazivu jedinjenja znači da odgovarajući intermedijer ili jedinjenje predmetnog pronalaska je prvi od dva eluirajuća enantiomera kada je smeša para enantiomera razdvojena hiralnom hromatografijom. Označavanje "izomer 2" u nazivu jedinjenja znači da odgovarajući intermedijer ili jedinjenje predmetnog pronalaska je drugi od dva eluirajuća enantiomera kada je smeša para enantiomera razdvojena hiralnom hromatografijom.

[0031] Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu pripremiti prema sintetičkim postupcima dobro poznatim i cenjenim u tehnici. Pogodni reakcioni uslovi za korake ovih reakcija su dobro poznati u tehnici i odgovarajuće supstitucije rastvarača i ko-reagenasa su unutar tehnike. Slično tome, stručnjak će shvatiti da sintetički intermedijeri mogu biti izolovani i/ili prečišćeni različitim dobro poznatim tehnikama kao što je potrebno ili željeno, i da često, će biti moguće koristiti različite intermedijere direktno u naknadnim sintetičkim koracima sa malo ili bez prečišćavanja. Dodatno, stručnjak će shvatiti da u nekim okolnostima, redosled u kojem su delovi introdukovani nije kritičan. Specifični redosled koraka neophodnih da se proizvedu jedinjenja predmetnog pronalaska je zavisan od specifičnog jedinjenja koje se sintetiše, početnog jedinjenja, i relativne labilnosti supstituisanih delova, kao što je dobro poznato stručnjaku iz oblasti hemije. Svi supstituenti, ukoliko nije drugačije naznačeno, su kao što je prethodno definisano, i svi reagensi su dobro poznati i cenjeni u tehnici.

[0032] Kao što je ovde korišćeno, sledeći termini imaju naznačena značenja: "ACN" se odnosi na acetonitril; "DCM" se odnosi na dihlorometan; "DMF" predstavlja N,N-dimetilformamid; "DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "DTT" se odnosi na ditiotreitol; "EDTA" se odnosi na etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "EGTA" se odnosi na etilen glikol tetrasirćetnu kiselinu; "ELISA" se odnosi na imunoenzimsku analizu; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "EtOH" se odnosi na etanol; "FBS" se odnosi na fetalni goveđi serum; "HBSS" se odnosi na Hank Balanced Salt Solution; "IC50" se odnosi na polovinu maksimalne inhibitorne koncentracije; "IVTI" se odnosi na in vivo target inhibiciju; "MS" se odnosi na masenu spektroskopiju; "MeOH" se odnosi na metanol; "NMR" se odnosi na nuklearnu magnetnu rezonancu; "PBST" se odnosi na fosfatno puferovani fiziološki rastvor koji sadrži Tween-20; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran; "UVW" se odnosi na ultra-ljubičastu talasnu dužinu, i "XRD" se odnosi na difrakciju rendgenskih zraka.

[0033] Ukoliko nije naznačeno suprotno, jedinjenja ilustrovana ovde su nazvana i numerisana korišćenjem ili ACDLABS ili Accelrys Draw 4.1.

[0034] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se sintetisati kao što je ilustrovano u sledećim šemama, gde R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, i R<5>su kao što je prethodno definisano.

Šema 1: Sinteza jedinjenja formule I

[0035] Šema 1 ilustruje generalnu sintezu jedinjenja Formule I. Jedinjenje 1 je reagovano sa pogodno supstituisanim Jedinjenjem 2 pod dobro poznatim uslovima za aromatičnu supstituciju ili kuplujuću reakciju da bi se obezbedilo jedinjenje Formule I. Specifičnije, Jedinjenje 1 je reagovano sa Jedinjenjem 2 na povišenoj temperaturi u prisustvu pogodne baze kao što je natrijum hidrid, izopropilmagnezijum hlorid, cezijum karbonat, kalijum karbonat ili tercbutoksid. Izborno, introdukcija pogodnog liganda kao što je 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksanten ili 2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-1,1’-bifenil, i pogodnog katalizatora kao što je paladijum(II)acetat, tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) ili hloro[2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil][2-(2-aminoetil)fenil)] paladijum (II) u odgovarajućem rastvaraču kao što je 1,4-dioksan ili terc-butil alkohol mogu takođe obezbediti jedinjenje Formule I.

Šema 2: Sinteza jedinjenja formule I kada je R<5>jednako 3-metoksi-1H-pirazol-4-il ili 3-ciklopropil-1H-pirazol-4-il

[0036] Šema 2 ilustruje sintezu jedinjenja Formule I kada R<5>je 3-metoksi-1H-pirazol-4-il ili 3-ciklopropil-1H-pirazol-4-il. Jedinjenje 1 je reagovano sa Jedinjenjem 3, koje je pogodno supstituisano sa pirazol aminom sa pogodnim azotnim zaštitnim grupama kao što je tercbutiloksikarbonil, pod dobro poznatim uslovima za reakciju kuplovanja kao što je prethodno opisano da bi se obezbedilo Jedinjenje 4. Jedinjenje 4 je dodatno reagovano sa pogodnim azotnim deprotekcionim sredstvom kao što je hlorovodonik ili trifluorosirćetna kiselina u pogodnom rastvaraču kao što je 1,4-dioksan ili MeOH da bi se obezbedilo jedinjenje Formule I kada R<5>je 3-metoksi-1H-pirazol-4-il ili 3-ciklopropil-1H-pirazol-4-il.

Šema 3: Alternativna sinteza jedinjenja formule I

[0037] Šema 3 ilustruje alternativnu sintezu jedinjenja Formule I. Jedinjenje 5 je reagovano sa (2-bromoetoksi)-terc-butildimetilsilanom u prisustvu pogodne baze kao što je natrijum hidrid u pogodnom rastvaraču kao što je DMF da bi se obezbedlo Jedinjenje 6. Jedinjenje 6 je zatim reagovano sa pogodno supstituisanim Jedinjenjem 2 (R<5>-NH2) pod dobro poznatim uslovima reakcije kuplovanja kao što je prethodno opisano da bi se obezbedilo Jedinjenje 7. Jedinjenje 7 je reagovano sa pogodnim deprotekcionim sredstvom kao što je sirćetna kiselina u pogodnom rastvaraču kao što je smeša THF i vode da bi se obezbedilo Jedinjenje 8. Jedinjenje 8 je dodatno reagovano sa metansulfonil hlorid u pogodnom rastvaraču kao što je DMF u prisustvu pogodne baze kao što je trietilamin da bi se obezbedilo jedinjenje 9. Jedinjenje 9 je reagovano sa pogodnim aminom u pogodnom rastvaraču kao što je ACN da bi se obezbedilo jedinjenje Formule I.

Šema 4: Sinteza jedinjenja I

[0038] Šema 4 ilustruje postupak za sintezu Jedinjenja 1. Jedinjenje 10 je reagovano sa pogodnim sredstvom za brominaciju kao što je N-bromosukcinimid u pogodnom rastvaraču kao što je ACN da bi se obezbedilo jedinjenje 11. Jedinjenje 11 je reagovano sa pogodnom bazom kao što je natrijum hidrid ili natrijum hidroksid, i pogodnog N-alkilacionog sredstva kao što je 4-(2-hloroetil)morfolin da bi se obezbedilo jedinjenje 12. Jedinjenje 12 je reagovano sa bis(pinakolato)diborom, pogodnom bazom kao što je kalijum acetat, i pogodnim katalizatorom kao što je (1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen)paladijum(II) hlorid u pogodnom rastvaraču kao što je 1,4-dioksan pod povišenom temperaturom da bi se obezbedilo jedinjenje 13. Jedinjenje 13 je reagovano sa pogodno supstituisanim pirimidin jedinjenjem kao što je 2,4-dihloro-5-metilpirimidin, pogodnom bazom kao što je kalijum karbonat, pogodnim katalizatorom kao što je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum u pogodnom rastvaraču kao što je smeša 1,4-dioksana i vode pod povišenom temperaturom da bi se obezbedilo jedinjenje 1.

Šema 5: Alternativna sinteza jedinjenja 1

[0039] Šema 5 ilustruje alternativni postupak za sintezu Jedinjenja 1. Jedinjenje 11 je reagovano sa pogodnim azotnim zaštitnim sredstvom kao što je di-terc-butildikarbonat u pogodnom rastvaraču kao što je ACN u prisustvu pogodne baze kao što je N,N-diizopropiletilamin da bi se obezbedilo jedinjenje 14. Jedinjenje 14 je reagovano sa bis(pinakolato) diborom pod dobro poznatim uslovima za reakciju kuplovanja kao što je prethodno opisano da bi se obezbedilo jedinjenje 15. Jedinjenje 15 je reagovano sa pogodno supstituisanim pirimidin jedinjenjem pod dobro poznatim uslovima za reakciju kuplovanja kao što je prethodno opisano da bi se obezbedilo jedinjenje 16. Jedinjenje 16 je deprotektovano sa pogodnim deprotekcionim sredstvom kao što je trifluorosirćetna kiselina ili hlorovodonik u pogodnom rastvaraču kao što je DCM ili 1,4-dioksan da bi se obezbedilo jedinjenje 17. Jedinjenje 17 je reagovano sa pogodnim alkilacionim sredstvom kao što je 4-(2-bromoetil)morfolin u pogodnom rastvaraču kao što je N-metilpirolidon u prisustvu pogodne baze kao što je natrijum hidrid da bi se obezbedilo jedinjenje 1.

Priprema 1

6,6-Dimetiltieno[2,3-c]furan-4-on

[0041] Ohladiti rastvor 3-tiofenkarboksilne kiseline (250 g, 1.95 mol) u THF (9750 mL) do -70 °C u 20 L boci sa 3 vrata. Ovom rastvoru, dodati n-butil litijum (2.5 M u heksanu, 1872 mL, 4.68 mol) lagano uz održavanje temperature ispod -55 °C. Mešati reakcionu smešu jedan sat na -70 °C. Dodati aceton (187 mL, 2.55 mol) lagano na -70 °C. Dozvoliti da se reakciona smeša ugreje do 0 °C i mešati tri časa na 0 °C. Rezultujućem rastvoru, dodati 4 M HCl (1500 mL) na 0 °C i dozvoliti da se reakciona smeša zagreje do sobne temperature. Mešati rezultujuću smešu preko noći. Filtrirati reakcionu smešu kroz jastučić dijatomejske zemlje i isprati jastučić sa toluenom (3 x 500 mL). Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Rastvoriti rezultujući sirovi ostatak u toluenu (3750 mL) i vodi (250 mL) i dodati p-toluen sulfonsku kiselinu (100.1 g, 0.526 mol) na sobnoj temperaturi. Refluksovati reakcionu smešu 16 časova na 100 °C. Ohladiti reakciju do sobne temperature i koncentrovati pod sniženim pritiskom na 50 °C. Rastvoriti rezultujući ostatak u vodi i ekstrahovati sa EtOAc (2 x 10 L). Isprati organski sloj sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i vode. Osušiti organski sloj preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom na 50 °C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 200 g (61%) kao braon viskozna tečnost. MS (m/z): 169 (M+1).

Priprema 2

6,6-Dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0042]

[0043] Napuniti 5 L autoklav sa rastvorom 6,6-dimetiltieno[2,3-c]furan-4-onom (150 g, 0.891 mol) u amonijum hidroksidom (1000 ml). U zatvorenoj sredini, dovesti reakcionu smešu pažljivo do temperature od 200 °C i mešati 4 časa na 200 °C. Nakon 4 časa, ohladiti reakcionu smešu do sobne temperature i osloboditi amonijak gas. Ekstrahovati reakcionu smešu sa DCM (3 x 750 mL). Isprati organski sloj sa vodom (1 x 750 mL), i osušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom na 50 °C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 100 g (67%). MS (m/z): 168 (M+1).

Priprema 3

Metil 2-bromotiofen-3-karboksilat

[0044]

[0045] Tretirati rastvor 2-bromo-3-tiofenkarboksilne kiseline (10.1 g, 49 mmol) u MeOH (100 mL) sa sumpornom kiselinom (2.5 mL, 45 mmol). Zagrevati reakciju do refluksa preko noći. Koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom da bi se uklonio organski rastvarač i sipati rezultujuću smešu u ledeno hladnu vodu. Ekstrahovati hladni rastvor sa EtOAc. Isprati kombinovane organske ekstrakte sa vodom nakon čega sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Osušiti orgasnki rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 10.77 g (100%).

<1>H NMR (400.15 MHz, DMSO-d6) δ 7.65 (d, J=6 Hz, 1H), 7.34 (d, J=6 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H).

Priprema 4

Metil 2-cijanotiofen-3-karboksilat

[0046]

[0047] Zagrevati smešu metil 2-bromotiofen-3-karboksilata (28 g, 128 mmol) i bakar cijanida (15 g, 167 mmol) u N-metilpirolidonu (130 mL) do 120 °C preko noći. Ohladiti reakciju do sobne temperature i razblažiti sa EtOAc. Isprati organski rastvor sa zasićenim NaCl, osušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa 25% EtOAc u heksanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 15.2 g (71%).<1>H NMR (400.15 MHz, DMSO-d6) δ 8.10 (d, J=5 Hz, 1H), 7.58 (d, J=5 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H).

Priprema 5

Spiro[5H-tieno[2,3-c]pirol-6,1’-ciklopropan]-4-on

[0048]

[0049] Tretirati -70 °C rastvor metil 2-cijanotiofen-3-karboksilata (13.7 g, 79 mmol) i titanijum tetra(izopropoksida) (24.8 g, 87.4 mmol) u dietil eteru (330 mL) sa rastvorom etilmagnezijum bromida (3 M u dietil etru, 58 mL, 175 mmol). Mešati reakcionu smešu 60 minuta. Ukloniti hladno kupatilo i omogućiti da se smeša lagano zagreje do sobne temperature tokom jednog časa. Dodati bor trifluorid eterat (22.6 mL, 159 mmol) i mešati smešu dodatno jedan čas. Ugasiti reakciju sa 1 N hlorovodoničnom kiselinom (240 mL) i mešati preko noći. Razdvojiti organski sloj i povratno ekstrahovati vodeni sloj sa dodatnim etrom. Kombinovati organske ekstrakte i isprati sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak sa HPLC na C18 koloni (Kolona: 275 g; pokretna faza: A) 0.10% mravlje kiseline u vodi, B) 0.10% mravlje kiseline u ACN; Gradijent: 5-35% B; Stopa protoka: 80 mL/min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 1.02 g (35%).<1>H NMR (400.15 MHz, DMSO-d6) δ 8.43 (bs, 1H), 7.53 (d, J=5 Hz, 1H), 7.12 (d, J=5 Hz, 1H), 1.51 (m, 2H), 1.38 (m, 2H).

Priprema 6

2-Bromo-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0050]

[0051] U 20 L bocu koja sadrži 6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on (835 g, 4.99 mol) dodati ACN (10000 mL) i ohladiti rastvor do 10 °C. Dodati N-bromosukcinimid (444.4 g, 2.49 mol) u četiri jednaka dela reakcionoj smeši i mešati šest časova na 25 °C. Koncentrovati reakcionu smešu pod sniženim pritiskom i suspendovati rezultujuće jedinjenje u vodi i ekstrahovati sa EtOAc (3 x 4.1 L). Isprati kombinovane organske ekstrakte sa vodom (3 x 4.1 L) i zasićenim NaCl (4.1 L), osušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirati. Uskladištiti organski rastvor za kombinovanje sa dodatnim serijama.

[0052] Korišćenjem istog procesa kao prethodno, pripremiti dve dodatne serije počinjući sa 650 g i 835 g 6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on respektivno. Kombinovati organske rastvore iz sva tri izvođenja i koncentrovati pod sniženim pritiskom na 50 °C da bi se dobio 2-bromo-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on kao braon lepljivi materijal. Suspendovati rezultujući proizvod u dietil etar/heksan (2:1 zapr/zapr) i filtrirati da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 1542 g (45%). MS (m/z): 246/248 (M+1/M+3).

[0053] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Pripreme 6.

Priprema 8

4-(2-Bromoetil)morfolin hidrobromid

[0054]

[0055] Tretirati rastvor trifenilfosfin dibromida (124 g, 293 mmol) u DCM (2.44 L) sa rastvorom 4-morfolinetanola (32 g, 244 mmol) u DCM (60 mL) u kapima tokom jednog časa uz održavanja reakcione temperature ispod 25 °C. Mešati smešu preko noći na sobnoj temperaturi. Izvesti dodatnu reakciju kao prethodno počinjući sa 4-morfolinetanolom (10 g, 76 mmol), uz odgovrajuću razmeru reagenasa. Kombinovati reakcione smeše i sakupiti čvrste supstance vakuum filtracijom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 76.7 g (84%).<1>H NMR (399.8 MHz, DMSO-d6) δ 4.05 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.78 (t, J=7 Hz, 1H), 3.67 (t, J=7 Hz, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.26 (m, 2H).

Priprema 9

terc-Butil 2-bromo-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilat

[0056]

Postupak sinteze 1:

[0057] Tretirati rastvor 2-bromo-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-ona (25 g, 102 mmol), 4-dimetilaminopiridina (1.25 g, 10 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (24 mL, 138 mmol) u ACN (481 mL) sa di-terc-butildikarbonatom (35 g, 162 mmol). Mešati smešu preko noći na sobnoj temperaturi. Koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom. Razblažiti smešu sa heksanom, filtrirati smešu preko jastučičća od silika gela i eluirati jastučić sa heksanom nakon čega sa 20% DCM u heksanu. Koncentrovati filtrat do sušenja da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 36.5 g (93%) kao narandžasto ulje.<1>H NMR (399.8 MHz, CDCl3) δ 7.19 (s, 1H), 1.74 (s, 6H), 1.58 (s, 9H).

Postupak sinteze 2:

[0058] Tretirati rastvor 2-bromo-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-ona (200 g, 813 mmol), N,N-dimetilpiridin-4-amina (9.93 g, 81 mmol) i di-terc-butildikarbonata (266 g, 1219 mmol) u ACN (2 L) u kapima sa N,N-diizopropiletilaminom (213 mL, 1219 mmol). Mešati smešu na sobnoj temperaturi četiri časa. Zagrevati reakciju do 30 °C dva časa. Ohladiti smešu do sobne temperature i mešati preko noći. Koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom. Razblažiti smešu sa EtOAc i isprati rezultujući organski rastvor dva puta sa vodom (300 mL) nakon čega sa zasićenim NaCl (300 mL). Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak na jastučiću silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-20% EtOAc u heksanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 253 g (90%). MS (m/z): 290/292 (M-izobuten+1/M-izobuten+3).<1>H NMR (399.8 MHz, CDCl3) δ 7.19 (s, 1H), 1.74 (s, 6H), 1.58 (s, 9H).

Priprema 10

terc-Butil 6,6-dimetil-4-okso-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilat

[0059]

[0060] Degazirati smešu terc-butil 2-bromo-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilata (114 g, 329 mmol), bis(pinakolato)dibora (125 g, 494 mmol) i kalijum acetata (97 g, 988 mmol) u 1,4-dioksanu (1.6 L) sa azotom 10 minuta. Dodati (1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen)paladijum(II) hlorid (5.38 g, 6.6 mmol) i zagrejati smešu na 90 °C četiri časova. Ohladiti reakciju do sobne temperature i filtrirati preko CELITE® jastučića. Koncentrovati filtrat i zatim tretirati ostatak sa 10% EtOAc u heksanu. Sakupiti talog vakuum filtracijom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 65.8 g (40%). MS (m/z): 338 (M-izobuten+1).

Priprema 11

terc-Butil 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilat

[0061]

Postupak sinteze 1:

[0062] Degazirati smešu terc-butil 2-bromo-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilata (36 g, 104 mmol), bis(pinakolato)dibora (59.8 g, 235 mmol) i kalijum acetata (33.2 g, 338 mmol) u 1,4-dioksanu (520 mL) sa azotom 10 minuta. Dodati (1,1’bis(difenilfosfino)ferocen)paladijum(II) hlorid (4.45 g, 5.5 mmol) i zagrevati smešu do 90 °C. Zagrevati smešu na 90 °C dva časa. Ohladiti reakciju do sobne temperature i mešati tri časa. Dodati 2,4-dihloropirimidin (22 g, 145 mmol) nakon toga rastvor kalijum karbonata (20.4 g, 147 mmol) u vodi (83 mL). Degazirati rezultujuću smešu sa azotom 10 minuta. Dodati tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (1.59 g, 1.38 mmol) i zagrevati smešu do 90 °C dva časa. Ohladiti smešu do sobne temperature i filtrirati preko CELITE® jastučića. Isprati filtrat sa tri dela vode i jednim delom zasićenog NaCl. Koncentrovati organske supstance pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-25% EtOAc u DCM da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 11 g (59%). MS (m/z): 324 (M-izobuten+1).

Postupak sinteze 2

[0063] Degazirati smešu terc-butil 6,6-dimetil-4-okso-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilata (11.7 g, 30 mmol), 2,4-dihloropirimidina (13 g, 89 mmol), kalijum karbonata (20.4 g, 147 mmol), i vode (50 mL) u 1,4-dioksanu (100 mL) sa azotom 10 minuta. Dodati tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (2.58 g, 2.2 mmol) i zagrevati smešu do 87 °C 1.5 čas. Ohladiti smešu do sobne temperature. Razblažiti smešu sa EtOAc (1 L) i isprati rezultujući rastvor sa vodom i zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Tretirati ostatak sa 30% EtOAc u heksanu (200 mL) i sakupiti rezultujući talog vakuum filtracijom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 7.6 g (67%). MS (m/z): 324 (M-izobuten+1).

Priprema 12

2-(2-Hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0064]

[0065] Mešati smešu terc-butil 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilata (6.36 g, 16.7 mmol) i trifluorosirćetne kiseline (25 mL) u DCM (25 mL) na sobnoj temperaturi dva časa. Koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom i razblažiti ostatak sa DCM. Podeliti smešu sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i sakupiti čvrste supstance iz bifazne emulzije. Isprati čvrste susptance sa etrom i osušiti pod vakuumom na 50 °C preko noći da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 4.65 g (99%). MS (m/z): 280 (M+1).

Priprema 13

2-(2-Hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on hidrohlorid

[0066]

[0067] Zagrevati rastvor terc-butil 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-karboksilata (66.7 g, 176 mmol) i hlorovodonika (4 M u 1,4-dioksanu, 263 mL, 1054 mmol) u 1,4-dioksanu (585 mL) na 30 °C pet časova. Ukloniti element za zagrevanje i mešati smešu na sobnoj temperaturi preko noći. Polako dodati heksan (800 mL) u reakcionu smešu. Mešati rezultujuću suspenziju 10 minuta i sakupiti čvrste susptance vakuum filtracijom. Osušiti čvrste supstance pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 56 g (100%). MS (m/z): 280 (M+1).

Priprema 14

2-Bromo-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0069] Dodati natrijum hidroksid (160 g, 4 mol) u vodu (250 mL) i mešati smešu do stvaranja čistog rastvora. Dodati 1,4-dioksan (2 L) nakon čega 2-bromo-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on (215 g, 874 mmol), tetrabutilamonijum jodid (300 g, 812 mmol) i 4-(2-hloroetil)morfolin hidrohlorid (300 g, 1564 mmol). Zagrevati smešu na 80 °C jedan čas. Ohladiti reakcionu smešu do sobne temperature. Razblažiti reakciju sa vodom (2 L) i ekstrahovati smešu sa EtOAc (3 x 2 L). Suvo kombinovati organske ekstrakte preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Dodati DCM (2 L) i heksan (2 L) i isprati rezultujući organski rastvor sa zasićenim NaCl (2 x 1 L). Koncentrovati organski rastvor pod sniženim pritiskom do minimalne zapremine. Otfiltrirati čvrste supstance da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 180 g (57%). MS (m/z): 359/361 (M+1/M+3).

Priprema 15

2-Bromo-5-[2-[terc-butil(dimetil)silil]oksietil]-6,6-dimetil-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0070]

[0071] Tretirati suspenziju natrijum hidrida (60 tež% u mineralnom ulju, 3.9 g, 97.5 mmol) u DMF (203 mL) na 0 °C sa 2-bromo-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-onom (20 g, 81.3 mmol) nakon čega sa (2-bromoetoksi)-terc-butildimetilsilanom (23.3 g, 97.5 mmol). Mešati reakciju na 0 °C jedan čas. Ukloniti ledeno kupatilo i mešati reakcionu smešu preko noći. Ugasiti reakcionu smešu sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i ekstrahovati sa EtOAc. Isprati organski rastvor sa zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa 20% EtOAc u heksanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 26 g (79%). MS (m/z): 404/406 (M+1/M+3).

[0072] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Pripreme 15.

Priprema 17

2-(2-Hloro-5-metil-pirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0073]

[0074] Degazirati smešu 2-bromo-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (5.76 g, 16 mmol), bis(pinakolato)dibora (4.88 g, 19.2 mmol) i kalijum acetata (4.86 g, 48 mmol) u 1,4-dioksanu (80 mL) sa azotom 20 minuta. Dodati (1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen)paladijum(II) hlorid (668 mg, 0.80 mmol) i zagrevati smešu na 90 °C preko noći. Ohladiti reakciju do sobne temperature, koncentrovati filtrat i zatim tretirati ostatak sa EtOAc. Talog je sakupljen sa vakuum filtracijom. Čvrstoj supstanci (3.7 g) dodati 2,4-dihloro-5-metilpirimidin (1.5 g, 9.1 mmol), 1,4-dioksan (50 mL), kalijum karbonat (3.8 g, 27 mmol) i vodu (33 mL). Degazirati rezultujuću smešu sa azotom 20 minuta. Dodati tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (790 mg, 0.68 mmol) i zagrevati smešu do 90°C dva časa. Ohladiti smešu do sobne temperature i razblažiti sa EtOAc. Isprati organski rastvor sa zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak sa silica hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-10% MeOH u EtOAc da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 1.82 g (19%). MS (m/z): 407 (M+1).

[0075] Sledeća jedinjenja su pripremljena suštinski postupkom iz Pripreme 17.

Priprema 24

2-(2-Hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0076]

Postupak sinteze 1:

[0077] Degazirati smešu 2-bromo-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (200 g, 557 mmol), bis(pinakolato)dibora (200 g, 788 mmol) i kalijum acetata (200 g, 2038 mmol) u 1,4-dioksanu (1 L) sa azotom 15 minuta. dodati (1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen)paladijum(II) hlorid (20 g, 27 mmol) i zagrevati smešu do 90 °C. Zagrevati smešu na 90 °C jedan čas. Ohladiti reakciju do 50 °C i dodati kalijum karbonat (250 g, 1809 mmol), 2,4-dihloropirimidin (230 g, 1543 mmol) i vodu (300 mL). Zagrevati smešu na 90 °C jedan čas. Ohladiti smešu do 35 °C i dodati vodu (700 mL). Ekstrahovati reakcionu smešu sa DCM (2 L). Vodeni rastvor je povratno ekstrahovan sa DCM (500 mL). Kombinovani organski rastvori su osušeni preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrirani i filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Razblažiti ostatak sa 10% EtOAc u heksanu (2 L) i mešati jedan čas. Dekantovati ishodnu tečnost i isprati čvrste supstance sa heksanom (500 mL). Rastvoriti čvrste susptance u DCM (300 mL) i polako dodati heksane (2 L). Sakupiti rezultujuće čvrste supstance vakuum filtracijom i osušiti da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 150 g (65%). MS (m/z): 393 (M+1).

Postupak sinteze 2:

[0078] Ohladiti smešu 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on hidrohlorida (10 g, 32 mmol) i tetrabutilamonijum jodida (1.17 g, 3.16 mmol) u N-metilpirolidonu (211 mL) do 0 °C korišćenjem kupatila sa ledenom vodom. Dodati natrijum hidrid (60 tež% u mineralnom ulju, 5.06 g, 126.5 mmol) u delovima. Mešati smešu na 0 °C 10 minuta i zatim dodati 4-(2-bromoetil)morfolin hidrobromid (13.9 g, 50.6 mmol). Ukloniti ledeno kupatilo i mešati smešu četiri časa. Ugasiti reakcionu smešu sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida i razblažiti smešu sa vodom (1 L). Ekstrahovati smešu sa izopropil acetatom (4 x 700 mL). Osušiti kombinovane organske ekstrakte preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Dodati 20% EtOAc u heksanu i mešati smešu jedan čas. Sakupiti čvrste susptance vakuum filtracijom i osušiti da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 8.6 g (69%). MS (m/z): 393 (M+1).

Postupak sinteze 3:

[0079] Tretirati rastvor 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5H-tieno[2,3-c]pirol-4-on (500 mg, 1.4 mmol) u DMF (14 mL) sa natrijum hidrid (60 tež% u mineralnom ulju, 129 mg, 3.2 mmol). Mešati smešu 10 minuta i zatim dodati 4-(2-bromoetil)morfolin hidrohlorid (412 mg, 1.8 mmol). Mešati reakcionu smešu na sobnoj temperaturi preko noći. Ohladiti smešu do 0 °C i dodati 4-(2-bromoetil)morfolin hidrohlorid (165 mg, 0.7 mmol) nakon čega natrijum hidrid (60 tež% u mineralnom ulju, 14 mg, 0.4 mmol). Ukloniti ledeno kupatilo i mešati smešu na sobnoj temperaturi preko noći. Dodati natrijum hidrid (60 tež% u mineralnom ulju, 14 mg, 0.4 mmol) i mešati rezultujuću smešu na sobnoj temperaturi pet časova. Razblažiti smešu sa vodom i ekstrahovati sa EtOAc. Isprati organske ekstrakte sa 5% vodenim rastvorom litijum hlorida. Koncentrovati organski rastvor pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-10% MeOH u DCM da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 524 mg (93%). MS (m/z): 393 (M+1).

Priprema 25

5-[2-[terc-Butil(dimetil)silil]oksietil]-6,6-dimetil-2-[2-[(2-metilpirazol-3-il)amino]pirimidin-4-il]tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0080]

[0081] Degazirati smešu 5-[2-[terc-butil(dimetil)silil]oksietil]-2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-tieno[2,3-c]pirol-4-ona (6 g, 13.7 mmol), 2-metilpirazol-3-amina (1.60 g, 16.4 mmol), cezijum karbonata (8.92 g, 27.4 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantena (790 mg, 1.37 mmol) i 1,4-dioksana (150 mL) sa azotom 10 minuta. Dodati paladijum(II)acetat (610 mg, 2.74 mmol) i zagrevati smešu na 90 °C 2.5 časa. Ohladiti smešu do sobne temperature i mešati smešu na sobnoj temperaturi preko noći. Razblažiti reakcionu smešu sa 10% MeOH u DCM i mešati smešu 15 minuta. Filtrirati smešu preko CELITE® i isprati čvrste supstance sa 10% MeOH u DCM. Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 60-100% EtOAc u DCM da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 5.73 g (84%). MS (m/z): 499 (M+1).

Priprema 26

2-Bromo-5-(2-hidroksietil)-6,6-dimetil-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0082]

[0083] Tretirati 2-bromo-5-[2-[terc-butil(dimetil)silil]oksietil]-6,6-dimetil-tieno[2,3-c]pirol-4-on (26 g, 64 mmol) u THF (40 mL) sa sirćetnom kiselinom (120 mL) i vodom (40 mL). Mešati smešu na sobnoj temperaturi preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu pod sniženim pritiskom. Razblažiti ostatak sa EtOAc i isprati rezultujući rastvor sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata nakon čega zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 18.97 g (100%). MS (m/z): 290/292 (M+1/M+3).

[0084] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Pripreme 26.

Priprema 28

2-(2-Bromo-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-il)etil metansulfonat

[0085]

[0086] Ohladiti rastvor 2-bromo-5-(2-hidroksietil)-6,6-dimetil-tieno[2,3-c]pirol-4-on (18.97 g, 65.4 mmol) u DCM (300 mL) do 0 °C. Tretirati smešu sa trietilaminom (13.7 mL, 98.1 mmol) i metansulfonil hloridom (8.24 g, 71.9 mmol). Mešati smešu na 0 °C dva časa. Isprati rastvor sa vodom i zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 23.8 g (99%). MS (m/z): 368/370 (M+1/M+3).

[0087] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Pripreme 28.

Priprema 30

3-Etil-4-nitro-1H-pirazol

[0088]

[0089] Rastvoriti 3-etil-1H-pirazol (1 g, 10.4 mmol) u sumpornoj kiselini (5 mL) i ohladiti smešu do -5 °C. Zatim dodati kalijum nitrat (1.16 g, 11.4 mmol) u delovima smeši. Mešati smešu preko noći uz dozvoljavanje da se polako zagreje do sobne temperature. Ohladiti smešu do 0 °C i polako ugasiti sa amonijum hidroksidom dok pH ne bude približno 10. Sakupiti rezultujuće čvrste susptance vakuum filtracijom i isprati sa malom količinom vode. Ohladiti filtrat do 0 °C i zatim sakupiti čvrste supstance iz filtrata vakuum filtracijom i isprati sa malom količinom vode. Kombinovati čvrste supstance i rastvoriti u DCM. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Ko-uparavati jednom sa dietil etrom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 1.34 g (91%). MS (m/z): 140 (M-1).

Priprema 31

terc-Butil 3-metoksi-4-nitro-pirazol-1-karboksilat

[0090]

[0091] Tretirati suspenziju 5-metoksi-4-nitro-1H-pirazola (3 g, 21 mmol), di-terc-butildikarbonata (6.9 g, 31.6 mmol) i 4-dimetilaminopiridina (1.28 g, 10.5 mmol) u DCM (300 mL) sa trietilaminom (5.85 mL, 42 mmol) i mešati smešu na sobnoj temperaturi preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 1-10% EtOAc u heksanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 3.48 g (68%).<1>H NMR (399.8 MHz, DMSO-d6) δ 9.10 (s, 1H), 3.98 (s, 3H), 1.56 (s, 9H).

Priprema 32

3 -Etil-1H-pirazol-4-amin

[0092]

[0093] Tretirati suspenziju paladijum (5 tež% na ugljeniku, 450 mg, 0.21 mmol) u EtOH (21 mL) sa 3-etil-4-nitro-1H-pirazolom (300 mg, 2.13 mmol). Mešati rezultujuću smešu pod atmosferom vodonika 6.5 časova. Filtrirati reakcionu smešu preko CELITE® i isprati čvrste supstance sa dodatnim EtOH. Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 240 g (99%).<1>H NMR (400.1 MHz, CD3CN) δ 7.02 (s, 1H), 2.54 (q, J=7 Hz, 3H), 1.17 (t, J=7 Hz, 9H).

[0094] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Pripreme 32.

Priprema 34

terc-Butil N-(2-ciklopropilpirazol-3-il) karbamat

[0095]

[0096] Ohladiti rastvor 2-ciklopropilpirazol-3-karboksilne kiseline (4 g, 26 mmol) u THF (35 mL) do 0 °C i zatim dodati trietilamin (5.5 mL, 39 mmol) nakon čega difenilfosfonski azid (8.5 mL, 39 mmol). Mešati smešu četiri časa uz zagrevanje reakcione temperature polako do sobne temperature. dodati terc-butil alkohol (4.99 mL) i zagrevati smešu na 70 °C 18 časova. Koncentrovati reakcionu smešu pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-20% MeOH u DCM da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 5.39 g (92%). MS (m/z): 224 (M+1).

Priprema 35

2-Ciklopropilpirazol-3-amin

[0097]

[0098] Tretirati rastvor terc-butil N-(2-ciklopropilpirazol-3-il)karbamata (5.39 g, 24 mmol) u DCM (12 mL) sa trifluorosirćetnom kiselinom (16 mL, 213 mmol). Mešati rastvor na sobnoj temperaturi jedan čas. Koncentrovati reakcionu smešu pod sniženim pritiskom. Rastvoriti ostatak u DCM i tretirati sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata dok pH faze vodenog rastvora zadržava vrednost >7. Razdvojiti faze i sušiti organsku fazu preko anhidrovanog natrijum sulfata. Filtrirati smešu i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Koncentrovati fazu vodenog rastvora pod sniženim pritiskom. Kombinovati ostatke iz organske i faze vodenog rastvora i prečistiti reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: 130 g C18; Pokretna faza: A) voda, B) ACN; Gradijent: 0-20% B). Koncentrovati frakcije i rastvoriti ostatak u 25% MeOH u DCM. Filtrirati smešu i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Rastvoriti ostatak u EtOAc i dodati vodu. Razdvojiti slojeve i povratno ekstrahovati vodenim rastvorom sloj sa EtOAc (8 x 100 mL). Koncentrovati kombinovane organske ekstrakte pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 2.27 g (76%).<1>H NMR (400.1 MHz, CD3CN) δ 7.02 (d, J=2 Hz, 1H), 5.33 (d, J=2 Hz, 1H), 4.28 (bs, 2H), 3.10 (m, 1H), 0.96 (m, 4H).

Priprema 36

2-(Dibenzilamino)etanol

[0099]

[0100] Tretirati smešu 2-(benzilamino)etanola (0.95 mL, 6.6 mmol) u ACN (35 mL) sa kalijum karbonatom (1.83 g, 13.2 mmol) nakon čega sa benzil bromidom (1.18 mL, 9.89 mmol). Zagrevati reakcionu smešu na 80 °C 1.5 časova. Ohladiti reakciju do sobne temperature i filtrirati smešu. Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom i prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-30% EtOAc u heksanu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 1.7 g (100%). MS (m/z): 242 (M+1).

Priprema 37

2-[2-(Dibenzilamino)etoksi]-2,2-difluoro-sirćetna kiselina

[0101]

[0102] Tretirati rastvor 2-(dibenzilamino)etanola (1.5 g, 6.2 mmol) i natrijum hloro-2,2-difluorosirćetne kiseline (950 mg, 6.19 mmol) u THF (12 mL) na 0 °C sa natrijum hidridom (60 tež% u mineralnom ulju, 500 mg, 12.5 mmol). Zagrevati reakcionu smešu do refluksa preko noći. Dodati dodatni natrijum hidrid (60 tež% u mineralnom ulju, 120 mg, 3 mmol) reakcionoj smeši i nastaviti zagrevanje dodatno 1 čas. Ohladiti reakciju do sobne temperature i razblažiti sa vodom. Ekstrahovati smešu sa dietil etrom. Razdvojiti slojeve i podesiti sloj vodenog rastvora na pH 6 sa 6 N hlorovodoničnom kiselinom. Ekstrahovati vodeni rastvor sa EtOAc. Kombinovati sve organske rastvore i osušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata. Filtrirati smešu i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 1.03 g (49%). MS (m/z): 336 (M+1).

Priprema 38

Metil 2-[2-(dibenzilamino)etoksi]-2,2-difluoro-acetat

[0103]

[0104] Tretirati rastvor 2-[2-(dibenzilamino)etoksi]-2,2-difluoro-sirćetne kiseline (100 mg, 0.298 mmol) u toluenu (9 mL) i MeOH (2 mL) sa (trimetilsilil)diazometanom (2 M u heksanu, 0.16 mL, 0.32 mmol) u kapima. Mešati smešu 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ugasiti reakciju sa sirćetnom kiselinom (0.1 mL) i koncentrovati reakcionu smešu pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 102 mg (98%). MS (m/z): 350 (M+1).

Priprema 39

4-Benzil-2,2-difluoro-morfolin-3-on

[0105]

[0106] Tretirati suspenziju paladijum (10% na ugljeniku, 50 mg, 0.141 mmol) u EtOH (15 mL) sa metil 2-[2-(dibenzilamino)etoksi]-2,2-difluoro-acetatom (485 mg, 1.39 mmol) u EtOH (15 mL). Mešati reakcionu smešu pod atmosferom vodonika (balon) na sobnoj temperaturi preko noći. Filtrirati reakcionu smešu preko CELITE® i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 294 mg (93%). MS (m/z): 228 (M+1).

Priprema 40

4-Benzil-2,2-difluoro-morfolin

[0107]

[0108] Tretirati rastvor 4-benzil-2,2-difluoro-morfolin-3-ona (290 mg, 1.28 mmol) u THF (13 mL) sa bor dimetil sulfid kompleksom (2 M u THF, 3.06 mL, 6.12 mmol). Zagrevati reakcionu smešu na 55 °C 3.5 časova i zatim prekinuti zagrevanje i nastaviti mešanje preko noći. Zagrevati reakcionu smešu do 55 °C dodatna dva časa. Ohladiti reakcionu smešu do sobne temperature i ugasiti dodavanjem u kapima hlorovodonične kiseline (6 N, 3.06 mL, 18.4 mmol). Zagrevati reakcionu smešu na 100 °C jedan čas. Ohladiti smešu do sobne temperature i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Razblažiti smešu sa vodom i podesiti pH do 12 sa 2 N natrijum hidroksidom. Ekstrahovati smešu sa EtOAc. Osušiti organske ekstrakte preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 120 mg (44%). MS (m/z): 214 (M+1).

Priprema 41

2-Bromo-6,6-dimetil-5-[2-(5-oksa-8-azaspiro[2.6]nonan-8-il)etil]tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0109]

[0110] Zagrevati smešu 2-(2-bromo-6,6-dimetil-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-il)etil metansulfonata (2.76 g, 6.9 mmol) i 5-oksa-8-azaspiro[2.6]nonana (2.18, 16.3 mmol) u DMF (33 mL) na 80 °C preko noći. Ohladiti smešu do sobne temperature i razblažiti sa EtOAc. Isprati organski rastvor sa zasićenim NaCl (3 x 30 mL). Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: 100g Gold C18; Pokretna faza: A) 0.1% mravlja kiselina u vodi, B) 0.1% mravlja kiselina u ACN; Gradijent: 5% B 5 minuta, 5%-50% B preko 20 minuta; Stopa protoka: 53 mL/minut) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 3.6 g (85%). MS (m/z): 399/401 (M+1/M+3).

Priprema 42

terc-Butil 4-[[4-[6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-2-il]-5-metil-pirimidin-2-il]amino]-3-metoksi-pirazol-1-karboksilat

[0111]

[0112] Degazirati smešu 2-(2-hloro-5-metil-pirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (250 mg, 0.61 mmol), terc-butil 4-amino-3-metoksipirazol-1-karboksilata (157 mg, 0.74 mmol), cezijum karbonata (300 mg, 0.92 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantena (71 mg, 0.12 mmol) i 1,4-dioksana (6.4 mL) sa azotom 15 minuta. Dodati paladijum(II)acetat (14 mg, 0.0614 mmol) i zagrevati smešu na 110 °C preko noći. Ohladiti smešu do sobne temperature i razblažiti sa EtOAc. Isprati organski rastvor sa zasićenim NaCl. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak sa HPLC na C18 koloni (Kolona: 150 g; Pokretna faza: A) 0.10% Mravlja kiselina u vodi, B) 0.10% Mravlja kiselina u ACN; Gradijent: 10-50% B; Stopa protoka: 60 mL/min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 101 mg (28%). MS (m/z): 584 (M+1).

[0113] Sledeća jedinjenja su pripremljena suštinski postupkom iz Pripreme 42.

Primer 1

6,6-Dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0114]

Postupak sinteze 1:

[0115] Polako dodati 2-metilpirazol-3-amin (75 g, 772 mmol) suspenziji natrijum hidrida (60 tež% u mineralnom ulju, 30 g, 750 mmol) u N-metilpirolidonu (500 mL). Mešati rezultujuću smešu 90 minuta. dodati rastvor 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (145 g, 369 mmol) u N-metilpirolidonu (200 mL). Ohladiti egzotermnu reakciju do sobne temperature i sipati reakciju u vodu (3 L). Podesiti pH do ∼3 sa koncentrovanom hlorovodoničnom kiselinom (200 mL). Ekstrahovati smešu sa DCM (4 x 2 L). Neutralisati sloj vodenog rastvora korišćenjem 5 M natrijum hidroksida. Ekstrahovati ovaj vodeni rastvor sa DCM (2 x 2 L). Kombinovati ove organske ekstrakte i isprati sa vodom (2 L). Osušiti organske materijale preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak na čepu silika gela (2 kg) eluirajući sukcesivno sa DCM (2 L), 2.5% EtOH u DCM (2 L), 5% EtOH u DCM (2 L), 7.5% EtOH u DCM (2 L) i konačno 10% EtOH u DCM (10 L). Koncentrovati odgvarajuće frakcije pod sniženim pritiskom. Dodati EtOAc (1 L) i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Dodati EtOAc (1 L) i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Dodati EtOAc (500 mL) i heksan (500 mL). Sakupiti čvrste supstance vakuum filtracijom i isprati čvrste susptance sa heksanom (500 mL). Osušiti čvrste supstance pod vakuumom na 50 °C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 65.7 g (39%). MS (m/z): 454 (M+1).

Postupak sinteze 2:

[0116] Degazirati smešu 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (20.8 g, 52.9 mmol), 2-metilpirazol-3-amina (5.7 g, 58.2 mmol), cezijum karbonata (37.9 g, 116.5 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantena (2.6 g, 4.5 mmol) i 1,4-dioksana (529 mL) sa azotom 10 minuta. Dodati tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (2.4 g, 2.6 mmol) i zagrevati smešu do 85 °C četiri časa. Ohladiti smešu do sobne temperature i filtrirati smešu preko filter papira. Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Ponoviti reakciju počinjući sa 8 g 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona i kombinovati dva ostatka. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela (330 g) eluiranjem sa gradijentom od 5-25% MeOH u (10% EtOAc u DCM). Pulovati frakcije i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Ponovo prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela (330 g) eluiranjem sa gradijentom od 5-25% MeOH u 10% EtOAc u DCM. Pulovati frakcije i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Rastvoriti ostatak u DCM (400 mL) i zatim dodati aceton (1 L). Polako koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom do približno 700 mL. Sakupiti čvrste susptance vakuum filtracijom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 14.8 g (48%). MS (m/z): 454 (M+1).

Postupak sinteze 3:

[0117] Degazirati smešu 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (250 mg, 0.64 mmol), 2-metilpirazol-3-amina (124 mg, 1.3 mmol), cezijum karbonata (622 mg, 1.9 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantena (55 mg, 0.095 mmol) i 1,4-dioksana (6.4 mL) sa azotom 15 minuta. Dodati paladijum(II)acetat (14.3 mg, 0.0636 mmol) i zagrevati smešu na 90 °C preko noći. Ohladiti smešu do sobne temperature i filtrirati smešu preko filter papira. Isprati čvrste susptance sa 10% MeOH u DCM. Koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Ponoviti reakciju i kombinovati dva ostatka. Prečistiti ostatak sa HPLC na C18 koloni (30 x 75 mm, 5 um, xbridge ODB) eluiranjem sa 85 mL/minut gradijentom od 928% ACN u 10 mM amonijum karbonata (pH 10) u vodi. Pulovati frakcije i koncentrovati pod sniženim pritiskom da bi se uklonio ACN. Liofilizovati vodeni rastvor da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 100 mg (18%). MS (m/z): 454 (M+1).

[0118] Sledeća jedinjenja su pripremljena suštinski postupkom sinteze 3 iz Primera 1.

Primer 20

4-[(4-{6,6-Dimetil-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-4-okso-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-2-il}pirimidin-2-il)amino]-1H-pirazol-5-karbonitril

[0119]

[0120] Zagrevati rastvor 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (350 mg, 0.89 mmol), 4-amino-1H-pirazol-5-karbonitrila (116 mg, 1.07 mmol), kalijum karbonata (320 mg, 2.32 mmol), 2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-1,1’-bifenila (87 mg, 0.18 mmol), terc-butil alkohola (2.3 mL) i sirćetne kiseline (jedna kap) na 90 °C dva časa. Ohladiti smešu do sobne temperature. Razblažiti smešu sa 10% MeOH u DCM i filtrirati rastvor preko CELITE® kolone sa malom količinom silika gela na vrhu. Isprati kolonu sa 10% MeOH u DCM i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: C18, 275g Gold; Pokretna faza: A) 10 mM Amonijum bikarbonat u vodi sa 5% MeOH, B) ACN; Gradijent: 10% B 5 minuta, gradijent do 40% B preko 25 minuta; Stopa protoka: 125mL/ min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 240 mg (58%). MS (m/z): 465 (M+1).

[0121] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Primera 20.

Primer 22

6,6-Dimetil-2-{2-[(5-metil-1H-pirazol-4-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4Htieno[2,3-c]pirol-4-on

[0122]

[0123] Pročistiti smešu 2-(2-hloropirimidin-4-il)-6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)tieno[2,3-c]pirol-4-ona (230 mg, 0.59 mmol), 3-metil-1H-pirazol-4-amina (142 mg, 0.73 mmol), hloro[2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil][2-(2-aminoetil)fenil)]paladijum(II) (8 mg, 0.012 mmol), 2-di-terc-butilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenila (5 mg, 0.012 mmol) i natrijum terc-butoksida (118 mg, 1.2 mmol) tri puta sa azotom. dodati terc-butil alkohol (2 mL), zatvoriti reakciju i mešati smešu na sobnoj temperaturi 1.5 časova. Tretirati reakcionu smešu sa EtOAc i mešati smešu preko noći. Koncentrovati pod sniženim pritiskom. Rastvoriti ostatak u EtOAc i isprati organski rastvor sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida. Povratno ekstrahovati sloj vodenog rastvora dva puta sa EtOAc. Osušiti kombinovane organske ekstrakte preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-10% MeOH u DCM da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 164 mg (62%). MS (m/z): 454 (M+1).

[0124] Sledeća jedinjenja su pripremljena suštinski postupkom iz Primera 22.

Primer 25

6,6-Dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(tiomorfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0125]

[0126] Zagrevati smešu 2-[6,6-dimetil-2-[2-[(2-metilpirazol-3-il)amino]pirimidin-4-il]-4-oksotieno[2,3-c]pirol-5-il]etil metansulfonata (260 mg, 0.56 mmol), tiomorfolina (116 mg, 1.12 mmol) i trietilamina (0.18 mL, 0.38 mmol) u ACN (2 mL) na 60 °C preko noći. Ohladiti smešu do sobne temperature i filtrirati rastvor preko CELITE®. Isprati čvrste supstance sa 10% MeOH u DCM i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: C18, 275 g Gold; Pokretna faza: A) 10 mM amonijak u 5% MeOH u vodi, B) ACN; Gradijent: 10% B 5 minuta, gradijent do 10-65% B preko 25 min; Stopa protoka: 200 mL/min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 170 mg (64%). MS (m/z): 470 (M+1).

[0127] Sledeća jedinjenja su pripremljena suštinski postupkom iz Primera 25.

Primer 32

5-[2-(2,2-Difluoromorfolin-4-il)etil]-6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0128]

[0129] Tretirati suspenziju paladijum hidroksida (20% na ugljeniku, 63 mg, 0.09 mmol) u EtOAc (5 mL) sa 4-benzil-2,2-difluoro-morfolinom (95 mg, 0.45 mmol) u EtOAc (5 mL). Mešati reakcionu smešu pod atmosferom vodonika (balon) na sobnoj temperaturi pet časova. Filtrirati reakcionu smešu preko CELITE® i izolovati filtrat. Filtratu dodati trietilamin (0.11 mL, 0.79 mmol) i 2-[6,6-dimetil-2-[2-[(2-metilpirazol-3-il)amino]pirimidin-4-il]-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-5-il]etil metansulfonat (306 mg, 0.66 mmol). Zagrevati smešu na 80 °C jedan čas. Dodati ACN (15 mL) i zagrevati smešu na 80 °C dva dana. Ohladiti reakcionu smešu do sobne temperature i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 0-10% MeOH u EtOAc. Koncentrovati frakcije pod sniženim pritiskom. Ponovo prečistiti ostatak hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 50-100% EtOAc u heksanu nakon čega sa drugim gradijent od 0-10% MeOH u EtOAc da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 47 mg (30%). MS (m/z): 490 (M+1).

Primer 33

5-[2-(6,6-Difluoro-1,4-oksazepan-4-il)etil]-6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0130]

[0131] Tretirati 6,6-difluoro-1,4-oksazepan hidrohlorid (200 mg, 0.15 mmol) sa karbonatnom smolom (3 molarna ekvivalenta) u DCM (5 mL). Rotirati suspenziju smole jedan čas. Ukloniti čvrste susptance filtracijom i tretirati filtrat sa p-toluenesulfonskom kiselinom (250 mg, 1.45 mmol). Mešati rezultujuću smešu dva časa i zatim koncentrovati smešu pod sniženim pritiskom. Dodati ACN (2 mL) i 2-[6,6-dimetil-2-[2-[(2-metilpirazol-3-il)amino]pirimidin-4-il]-4-oksotieno[2,3-c]pirol-5-il]etil metansulfonat (200 mg, 0.43 mmol). Tretirati rezultujući rastvor sa trietilaminom (0.15 mL, 1.08 mmol). Zatvoriti reakcioni sud i zagrevati smešu na 80 °C tri časa. Ohladiti do sobne temperature i koncentrovati reakcionu smešu. Prečistiti ostatak reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: 50 g C-18; Pokretna faza: A) 0.1%TFA u vodi, B) 0.1% TFA u ACN; Gradijent 10-80% B). Koncentrovati frakcije koje sadrže proizvod. Rastvoriti ostatak u DCM i isprati sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Osušiti organski rastvor preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirati i koncentrovati filtrat pod sniženim pritiskom. Prečistiti ostatak reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: 15 g Gold C-18; Pokretna faza: A) 10 mM amonijum karbonat u vodi sa 10% MeOH, B) ACN; Gradijent 10-80% B) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 16 mg (7%). MS (m/z): 504 (M+1).

Primer 34

5-{2-[Ciklopropil(metil)amino]etil}-6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on

[0132]

[0133] Zagrevati rastvor 2-[6,6-dimetil-2-[2-[(2-metilpirazol-3-il)amino]pirimidin-4-il]-4-oksotieno[2,3-c]pirol-5-il]etil metansulfonata (70 mg, 0.16 mmol) i N-metilciklopropanamina (77 mg, 1.08 mmol) u DMF (1.7 mL) na 90 °C preko noći. Ohladiti smešu do sobne temperature. Prečistiti rastvor reverzno faznom hromatografijom na koloni (Kolona: 100 g Gold C-18; Pokretna faza: A) 0.1% mravlja kiselina u vodi, B) 0.1% mravlja kiselina ACN; Gradijent: 5% B 5 minuta, gradijent do 65% B preko 25 minuta; Stopa protoka: 60 mL/min) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 70 mg (37%). MS (m/z): 438 (M+1).

[0134] Sledeće jedinjenje je pripremljeno suštinski postupkom iz Primera 34.

Primer 36

2-{2-[(3-Metoksi-1H-pirazol-4-il)amino]-5-metilpirimidin-4-il}-6,6-dimetil-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on hidrohlorid

[0135]

[0136] Mešati rastvor terc-butil 4-[[4-[6,6-dimetil-5-(2-morfolinoetil)-4-okso-tieno[2,3-c]pirol-2-il]-5-metilpirimidin-2-il]amino]-3-metoksi-pirazol-1-karboksilata (101 mg, 0.173 mmol) i hlorovodonika (4.0 M u 1,4-dioksan, 2 mL, 8 mmol) u MeOH (20 mL) na sobnoj temperaturi 12 časova. Koncentrovati smešu do sušenja da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 80 mg (89%). MS (m/z): 484 (M+1).

[0137] Sledeća jedinjenja su pripremljena postupkom iz Primera 36.

Primer 40

6,6-Dimetil-2- {2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-{2-[2-oksa-5-azabiciklo[4.1.0]hept-5-il]etil}-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on, izomer 2

[0138]

[0139] Prečistiti 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(2-oksa-5-azabiciklo[4.1.0]hept-5-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on (Primer 30) hromatografijom na hiralnoj koloni (Kolona: Lux celuloza -4 21.2 x 250 mm; Pokretna faza: 40% izopropil alkohol (0.2% izopropilamin)/CO2); Vreme eluiranja: 11 minuta) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 24 mg (34%). MS (m/z): 466 (M+1).

Difrakcija praha rendgenskim zracima

[0140] XRD obrasci kristalnih čvrstih supstanci su dobijeni na Bruker D4 Endeavor rendgenskom difraktometru za prah, opremljenim sa izvorom CuKa λ = 1.54060 Å) i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak je skeniran između 4 i 40° u 2θ, sa veličinom koraka 0.009° u 2θ i stopom skeniranja od 0.5 sekundi/koraku, i sa 0.6 mm divergencijom, 5.28 fiksiranim anti-scatter, i 9.5 mm prorezima detektora. Suvi prah je pakovan na kvarcni držač uzorka i glatka površina je dobijena korišćenjem staklene pločice. Difrakcioni obrasci kristalnih oblika su sakupljeni na ambijentalnoj temperaturi i relativnoj vlažnosti. U kristalografskoj tehnici je dobro poznato da, za bilo koji dati kristalni oblik, relativni intenziteti difrakcionih pikova mogu varirati usled poželjne orijentacije koja rezultuje od faktora kao što je kristalna morfologija i habitusi. Tamo gde su prisutni efekti poželjne orijentacije, pikovi intenziteta su izmenjeni, ali su karkteristični položaji pikova polimorfa nepromenjeni. Dodatno, takođe je dobro poznato u kristalografskoj tehnici da za bilo koji dati kristalni oblik položaji ugaonih pikova mogu blago varirati. Na primer, položaji pikova se mogu pomeriti usled varijacije u temepraturi ili vlažnosti na kojima je uzorak analiziran, promene mesta uzorka, ili prisustva ili odsustva internog standarda. U predmetnom slučaju, varijabilnost položaja pika od ± 0.2° u 20 uzeće u obzir ove potencijalne varijacije bez ometanja nedvosmislene identifikacije naznačenog kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može se dobiti na osnovu bilo koje jedinstvene kombinacije jasno uočljivih pikova (u jedinicama od ° 2θ), tipično prominentnijih pikova. Difrakcioni obrasci kristalnog oblika, sakupljeni na ambijentalnoj temperaturi i relativnoj vlažnosti, podešeni su na osnovu NIST 675 standardnih pikova na 8.853 i 26.774 stepeni 2-teta.

Difrakcija praha rendgenskim zracima iz Primera 1, kristalni oblik 1

6,6-Dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4Htieno[2,3-c]pirol-4-on (Kristalni oblik 1)

[0141] Dodati 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on (103 mg) u rastvor ACN (1 mL) i vode (1 mL) i zagrevati smešu na 70 °C 10 minuta. Filtrirati i amogućiti da se rastvor ohladi do sobne temperature preko noći. Dodati vodu (2 mL) rastvoru polako tokom pet časova. Sakupiti čvrste supstance vakuum filtracijom i isprati sa vodom. Čvrste supstance osušiti na vazduhu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 94 mg (92%).

[0142] Pripremljeni uzorak iz Primera 1 Kristalni oblik 1 je karakterisan sa XRD obrascem korišćenjem CuKa zračenja da ima difrakcione pikove (2-teta vrednosti) kao što su opisane u Tabeli 1 u nastavku, i naročito da ima pikove na 19.3 stepeni u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 15.5, 17.1, 18.0, 20.2, 21.5 i 22.1 stepeni; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepeni.

Tabela 1: Pikovi difrakcije rendgenskih zraka iz Primera 1 Kristalni oblik 1

[0143] Nekoliko dokaza ukazuje da su procesi uključeni u inicijaciju, rast i napredovanje tumora posredovani aktivacijom jednog ili više signalnih puteva u ćelijama kancera. Put mitogenaktivirane protein kinaze (MAPK) je ključni regulator ćelijske proliferacije i preživljavanja. ERK je nishodni član ovog puta i igra centralnu ulogu u prenosu ekstracelularnih signala od aktiviranoe receptor tirozin kinaze (RTKs) kao što je EGFR, FGFR, PDGFR, VEGFR itd. Ova put je trostruka kaskada kinaze koja se sastoji od RAF, MEK i ERK (kinaza regulisana ekstracelularnim signalom) kinaza i aktivacija ovog puta počinje sa aktivacijom RAS, male GTPaze. Aktivacija RAS dovodi do regrutovanja RAF, serin/treonin kinaze i njene aktivacije. Aktivirani RAF zatim se fosforiliše i aktivira MEK1/2, koji zauzvrat fosforiliše i aktivira ERK1/2. Kada je aktiviran, ERK1/2 fosforiliše nekoliko nishodnih citoplazmatskih i jedarnih targeta uključenih u proliferaciju, rast i preživljavanje ćelija i EMT (epitelne-u-mezenhimsku tranziciju).

[0144] RAS/MAPK put je jedan od najvažnijih puteva za ćelijsku proliferaciju i smatra se da ovaj je put često aktiviran u -30% svih humanih kancera. Aktivacija puta konstitutivne MAPK može biti rezultat aktivacionih mutacija u RAS, BRAF, MEK1, gubitka supresora tumora NF1 ili ushodne aktivacije posredovane mutacijama, amplifikacijama ili aktivacijom posredovanom ligandom RTKs. Pokazano je da su sve tri familije RAS gena (KRAS, NRAS i HRAS) somatski mutirane kod nekoliko kancera uključujući kolorektalni, melanom, pluća i kancer pankreasa, najčešće kao rezultat jedne tačkaste mutacije na kodonima 12, 13, i 61. Ove mutacije izazivaju konstitutivnu aktivaciju RAS koja je praćena povećanom ERK1/2 aktivnošću i signalizacijom rasta. Mutacije u kodonima 12, 13 i 61 KRAS daju rezistenciju na jedinjenja i monoklonska antitela koja inhibiraju EGFR. KRAS mutacije su pronađene u 30% kancera pluća, 90% kancera pankreasa, 10% kancera želudca i 50% kolorektalnih kancera. NRAS mutacije su detektovane u oko 10-25% melanoma. Dodatno, RAS mutacije (HRAS, KRAS, i NRAS) su identifikovane u ∼55-60% tiroidnih kancera. Somatske tačkaste mutacije u BRAF dešavaju se u oko 8% humanih tumora, najčešće u melanomu (60%), kolorektalnim (10%) i tiroidnim kancerima (50%). Kod melanoma, izgleda da su sve BRAF mutacije unutar domena kinaze i jedna supstitucija (T-> A, V600E) čini 80% mutacija. BRAF mutacije su nađene, sa retkim izuzecima, u uzajamno isključujućem obrascem sa RAS mutacijama, sugerišući da ove genetičke izmene aktiviraju uobičajene nishodne efektore.

Biološke analize

[0145] Sledeće analize pokazuju da jedinjenja predmetnog pronalaska data u primerima su inhibitori aktivnosti ERK1 i ERK2 kinaze. Rezultati sledećih analiza takođe pokazuju da jedinjenja predmetnog pronalaska data u primerima inhibiraju ERK signalizaciju u ćelijama kancera. Dodatno, jedinjenje iz Primera 1 pokazuje ciljanu inhibiciju ERK puta u određenim modelima kancera sa ksenograftom tumora. Dodatno, jedinjenje iz Primera 1 inhbira rast tumora u određenim modelima kancera sa ksenograftom tumora.

Analiza ERK1 kinaze

[0146] Svrha ove analize je da se izmeri sposobnost jedinjenja da inhibiraju aktivnost ERK1 kinaze. Izvesti analizu ERK1 kinaze in vitro korišćenjem TR-FRET analize. Početi reakcije (12.5 µL) dodavanjem 5 µL ERK1 enzima (Invitrogen, #PRµ54B, finalna koncentracija 100 ng/mL) plus supstrat GFP-ATF2 (Invitrogen, # PV4445, finalna koncentracija 0.2 mM), 5 µL ATP rastvora (Invitrogen, # PV3227, finalna koncentracija 10 mM) pripremljena u kinaznom puferu (50 mM Hepes pH 7.4, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 0.01% Triton X-100, 1 mM DTT) i 2.5 µL analiziranih jedinjenja u DMSO rastvoru (finalno 4%, zapr/zapr) u PROXIPLATE™ sa 384-bunarčića (Perkin Elmer, #GRN6260). Inkubirati reakcionu smešu na sobnoj temperaturi 60 minuta. Zaustaviti reakciju dodavanjem 12.5 µL stop pufera (10 mM EDTA, 2 nM Tb-antipATF2 (pThr71) antitelo, Invitrogen, #PV4448) u TR-FRET puferu za razblaživanje (Invitrogen, # PV3574). Inkubirati ploče na sobnoj temperaturi dodatnih 60 minuta i očitati na ENVISION® (PerkinElmer) čitaču ploča na ekscitacionoj talasnoj dužini 340 nm. Izračunati TR-FRET odnos deljenjem GFP akceptorskog emisionog signala (na 520 nm) sa Tb donorskim emisionim signalom (na 495 nm). Izračunati procenat inhibicije korišćenjem bunarčića sa jedinjenjem u odnosu na podatke za Maksimum na ploči (DMSO kontrola) i Minimum (bez dodavanja enzima) kontrolne bunarčiće TR-FRET odnosa {% inhibicije = 100-[(test jedinjenje – medijana Min)/(medijana Max – medijana Min) X 100]}. Testirati sva jedinjenja na 10 koncentracija (20 mM do 0.001 mM) korišćenjem 1:3 šeme za razblaživanje. Izvesti Abs_IC50vrednosti fitovanjem procenta inhibicije i podataka koncentracije u deset tačaka sa 4-parametarskom nelinearnom logističkom jednačinom (jednačina 205) korišćenjem ACTIVITYBASE® 7.3 (ID Business Solutions Limited).

[0147] Jedinjenja iz primera unutar obima pronalaska su testirana u ovoj analizi suštinski kao što je prethodno opisano. Rezultati ove analize dokazuju da sva jedinjenja iz primera inhibiraju aktivnost ERK1 kinaze, sa IC50vrednostima manjim od 0.15 mM. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 ima IC50vrednost od 4.86 nM (60.20, n=7).

Analiza ERK2 kinaze

[0148] Svrha ove analize je da se izmeri sposobnost jedinjenja da inhibiraju aktivnost ERK2 kinaze. Izvesti analizu ERK2 kinaze in vitro korišćenjem TR-FRET analize. Početi sve reakcije (12.5 µL) dodavanjem 5 µL ERK2 enzima (Invitrogen, #PV3595B, finalna koncentracija 50 ng/mL) plus supstrat GFP-ATF2 (Invitrogen, # PV4445, finalna koncentracija 0.2 mM), 5 µL ATP rastvora (Invitrogen, # PV3227, finalna koncentracija 10 mM) pripremljena u kinaznom puferu (50 mM Hepes pH 7.4, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 0.01% Triton X-100, 1 mM DTT) i 2.5 µL analiziranih jedinjenja u DMSO rastvoru (finalno 4%, zapr/zapr) u PROXIPLATE™ sa 384-bunarčića (Perkin Elmer, #GRN6260). Inkubirati reakcione na sobnoj temperaturi 60 minuta. Zaustaviti reakcije dodavanjem 12.5 µL stop pufera (10 mM EDTA, 2 nM Tb-antipATF2 (pThr71) antitelo, Invitrogen, #PV4448) u TR-FRET puferu za razblaživanje (Invitrogen, # PV3574). Inkubirati ploče na sobnoj temperaturi dodatnih 60 minuta i očitati na ENVISION® (PerkinElmer) čitaču ploča na ekscitacionoj talasnoj dužini 340 nm. Izračunati TR-FRET odnos deljenjem GFP akceptorskog emisionog signala (na 520 nm) sa Tb donorskim emisionim signalom (na 495 nm). Izračunati procenat inhibicije korišćenjem bunarčića sa jedinjenjem u odnosu na podatke za Maksimum na ploči (DMSO kontrola) i Minimum (bez dodavanja enzima) kontrolne bunarčiće TR-FRET odnosa {% inhibicije = 100-[(test jedinjenje – medijana Min)/(medijana Max – medijana Min) X 100]}. Testirati sva jedinjenja na 10 koncentracija (20 mM do 0.001 mM) korišćenjem 1:3 šeme za razblaživanje. Izvesti Abs_IC50vrednosti fitovanjem procenta inhibicije i podataka koncentracije u deset tačaka sa 4-parametarskom nelinearnom logističkom jednačinom (jednačina 205) korišćenjem ACTIVITYBASE® 7.3 (ID Business Solutions Limited).

[0149] Jedinjenja iz primera unutar obima pronalaska su testirana u ovoj analizi suštinski kao što je prethodno opisano. Rezultati ove analize pokazuju da sva jedinjenja iz primera inhibiraju aktivnost ERK2 kinaze, sa IC50vrednostima manjim od 0.15 mM. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 ima IC50vrednost od 5.24 nM (60.24, n=7).

ERK1/2 ćelijska mehanicistička analiza (pRSK1 alfaskrin analiza)

[0150] Svrha ove analize je merenje sposobnosti jedinjenja da inhibiraju ERK signalizaciju kod ćelija kancera in vitro. Izvesti pRSK1 Alfaskrin analizu korišćenjem HCT116 ćelijske linije kolorektalnog kancera (ATCC, # CCL-247). Rutinski kultivisati HCT116 ćelije u Dulbecco modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) (Hyclone, #SH30022) medijumu za rast koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco, #16000-044) u T-150 bocama i inkubirati u 5% CO2inkubatoru na 37 °C. Sakupiti ćelije kada postanu konfluentne confluent i zarznuti u medijumu za zamrzavanje na 1x10e7 ćelija/mL kao "zamrznute ćelije spremne za analizu" i uskladištiti u tečnom azotu. Da bi se izvela analiza, postaviti na ploču 40,000 HCT116 ćelija/bunarčiću u ploču za kulturu tkiva sa 96-bunarčića i inkubirati na 37 °C u 5% CO2inkubatoru preko noći. Test jedinjenja na 10 koncentracija počinjući na 20 µM najveće koncentracije i koristiti šemu za razblaživanje 1:3 (20 µM do 0.001 µM) sa finalnom DMSO koncentracijom od 0.5% (zapr/zapr). Dodati jedinjenja u 20 µL medijuma za rast bez seruma i inkubirati na 37 °C dva časa. Ukloniti medijum za rast i dodati 50 µL 1x pufera za lizu [Cell Signaling Technology, #9803] koji sadrži 1x halt proteazu & inhibitor fosfataze koktel [Thermo, #78441] u svaki bunarčić i inkubirati na sobnoj temperaturi 10 minuta na šejkeru. Preneti 4 µL ćelijskog lizata iz svakog bunarčića u respektivne bunarčiće u ploču za analizu sa 384 bunarčića [Perkin Elmer, #6006280] i dodati 5 µL reakcione smeše [2000 delova 1x test pufera (Perkin Elmer, #A1000), 1 deo biotin-RSK1 antitelo (Santa Cruz, #sc-231-β-G), 4 dela pRSK1 antitela (Abcam, #ab32413), 35 delova akceptorskih kuglica (Perkin Elmer, #6760617R)]. Zatvoriti ploču sa folijom (Beckman Coulter, # 538619) i inkubirati na sobnoj temperaturi dva časa. Dodati 2 µL donorskih kuglica [20 delova 1x test pufer, 1 de odonor kuglice] u svaki bunarčić i zatvoriti ploču sa providnim zatvaračem (Applied Biosystems, #4311971) i inkubirati na sobnoj temperaturi u mraku dva časa. Meriti intenzitet fluorescencije u svakom bunarčiću očitavanjem ploča u ENVISION® (PerkinElmer) čitaču ploča. Izvesti Rel IC50vrednosti fitovanjem procenta pRSK1 inhibicije [% inhibicije = 100-[(test jedinjenje – medijana Min)/(medijana Max-medijana Min) X 100] i podataka od deset koncentracija na 4-parametarsku nelinearnu logističku jednačinu (Abase equation 205) korišćenjem ACTIVITYBASE® 7.3 (ID Business Solutions Limited).

[0151] Jedinjenja iz primera unutar obima pronalaska su testirana u ovoj analizi suštinski kao što je prethodno opisano. Rezultati ove analize pokazuju da sva jedinjenja iz primera inhibiraju fosforilaciju ERK supstrata (RSK) u ćelijama tumora, sa IC50vrednostima manjim od 3 mM. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 ima IC50vrednost od 0.429 mM (± 0.173, n=8).

In Vivo analiza inhibicije targeta (IVTI) (pRSK1 ELISA analiza)

[0152] Svrha ove analize je merenje sposobnosti test jedinjenja da inhibiraju fosforilaciju ERK1/2 supstrata u životinjskom modelu. Implantirati ženke atimusnih golih miševa (22-25 g) od Harlan Laboratories sa 5x10e6 HCT116 ćelija kolorektalnog kancera (ATCC, # CCL-247) subkutano u desni bočni region u 200 µL 1:1 Hank balansiranog rastvora soli (HBSS) Matrigel rastvor. Meriti rast tumora i telesnu težinu dva puta nedeljno počinjući sedmog dana nakon implantacije. Kada veličine tumora dostignu 300-500 mm<3>, randomizovati životinje i grupisati ih u grupe od po pet životinja. Dozirati životinje ili sa jedinjenjem na odgovarajućoj dozi vehikulumu specifičnom za jedinjenje ili samom vehikulumu (vehikulum: 1% HEC/0.25% Tween 80/0.05% sredtvo protiv stvaranja pene) oralno i sakupiti tumore i krv u željenim vremenskim intervalima nakon doziranja. Žrtvovati životinje korišćenjem anestezije sa izofluranom plus cervikalnom dislokacijom. Momentalno zamrznuti tumore i uskladištiti na -80°C do obrade za pRSK1 nivoe sa ELISA analizom. Sakupiti krv u EDTA epruvete i centrifugirati za plazmu i zamrznuti na -80°C u ploči sa 96-bunarčića. Odrediti izlaganje jedinjenja korišćenjem standardnih postupaka.

[0153] Pulverizovati tumore u tečnom azotu i lizirati u 1x puferu za lizu (MSD, #R60TX-3) koji sadrži 1x halt proteazu & inhibitor fosfataze koktel (Thermo Scientific, #0861281), 1 mM fenilmetansulfonil fluoride (PMSF) (Sigma, # 93482-50ML-F) i 1 µM natrijum metavanadat (Sigma, #590088) korišćenjem Matrix D kuglica (MP Biomedical, #6913-500) u FastPrep-24™ Cell Disrupter mašini (MP Biomedical) u hladnoj sobi (4 °C). Preneti lizate tumora u sveže epruvete nakon centrifugiranja na 14000 rpm 20 minuta na 4 °C. Odrediti koncentraciju proteina tumora ili ćelijskih lizata korišćenjem Pierce BCA Protein Assay Kit (cat# 23225, Thermo Scientific). Ovaj komplet sadrži tri glavne komponente - (1) BCA Reagens A, koji sadrži natrijum karbonat, natrijum bikarbonat, bicinhoninsku kiselinu i natrijum tartarat u 0.1 M natrijum hidroksidu, (2) BCA Reagens B, koji sadrži 4% bakar(II)sulfat, i (3) standardne ampule albumina, koje sadrže 2 mg/mL u 0.9% fiziološkog rastvora i 0.05% natrijum azida. U ploče sa 96-bunarčića, dodati goveđi serum albumin protein standard za opseg koncentracije od 20-2000 ug/mL u 25 µL u duplikatu bunarčića da bi se dobila standardna kriva. Dodati ćelijske ili tumorske lizate razblažiti u 25 µL 1 x PBS u duplikatima test bunarčića. Pripremiti radni BCA reagens dodavanjem 2% Reagensa B Reagensu A (2 mL B 98 mL A), mešati bunarčiće i dodati 200 µL u svaki uzorak ili standard. Mešati bunarčiće, prekriti ploču i inkubirati na 37 °C 30 minuta. Ohladiti ploču do sobne temperature i meriti apsorbancu na ili blizu 562 nm na čitaču ploča (Envision plate reader od Perkin Elmer). Oduzeti prosečno merenje apsorbance na 562 nm replikata blanko standarda od 562 nm merenja svih drugih pojedinačnih standarda i nepoznatih (ćelijski ili tumorski lizat) replikata uzoraka. Pripremiti standardnu krivu plotovanjem prosečnog blanko-korigovanog merenja na 562 nm za svaki standard goveđeg serum albumina nasuprot njegove koncentracije u µg/mL. Koristiti standardnu krivu da bi se odredila koncentracija proteina svih nepoznatih uzoraka korišćenjem logaritama za fitovanje krive u u Microsoft Excel. Zamrznuti preostale lizate tumora na -80 °C. Korisiti jednom zamrznute-odmrznute lizate tumora za merenje pRSK1 ekspresije sa sendvič ELISA.

[0154] Obložiti ploče sa 96-bunarčića (Thermo, #15042) preko noći na 4 °C sa 40 ng RSK1 kozjeg antitela (Santa Cruz, # sc-231-G) i inkubirati na sobnoj temperaturi jedan čas i zatim na 4 °C preko noći. Isprati ploče tri puta sa 300 µL PBST (1x fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS) koji sadrži 0.05% Tween-20), blokirati sa 100 µL po bunarčiću blokirajućeg pufera (Thermo Scientific, #37532) i inkubirati na sobnoj temperaturi dva časa. Isprati ploče tri puta sa 300 µL PBST i preneti 20 µg lizata tumora u svaki bunarčić i inkubirati na 4 °C preko noći. Isprati ploče tri puta sa 300 µL PBST i inkubirati sa 100 µL pRSK1 (T359/S363) zečjeg antitela (1:1000 razblaženje u blokirajućem puferu) na sobnoj temperaturi četiri časa. Isprati ploče tri puta sa 300 µL PBST i inkubirati sa 100 µL anti-zečjeg HRP konjugovanog sekundarnog antitela (GE Healthcare UK, #NA934V; razblažiti 1:10000 u blokirajućem puferu). Inkubirati na sobnoj temperaturi jedan čas. Isprati ploče tri puta sa 300 µL PBST, dodati 100 µL SUPERSIGNAL® ELISA Femto maximum sensitivity supstrata (Thermo, #37075) i inkubirati na šejkeru jedan minut. Odrediti signal luminescencije korišćenjem ENVISION® čitača ploča. Odrediti pRSK1 nivo u svakom lizatu tumora uzimajući u obzir lizate od životinja tretiranih samo sa vehikulumom kao 100%. Anlizirati svaki uzorak u duplikatu i koristiti prosečne brojeve za izračunavanja. Izračunati TED50korišćenjem Excel i XL Fit.

[0155] Jedinjenje unutar obima pronalaska je testirano u ovoj analizu suštinski kao što je opisano prethodno. Rezultati ovog testa pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira RSK1 fosforilaciju u tumor ksenograft model. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 ima TED50vrednost od 16 mg/kg.

Modeli ksenografta tumora

[0156] Svrha ove analize je da se izmeri smanjenje zapremine tumora kao odgovor na primenu test jedinjenja. Izvršiti ekspanziju humanih ćelija kolorektalnog kancera HCT116 (ATCC, # CCL-247) u kulturi, sakupiti i injektirati 5x10e6 ćelija u 200 µ L of 1:1 HBSS+matrigel rastvor subkutano u zadnji desni bok ženki atimičnih golih miševa (22-25 g, Harlan Laboratories). Izvršiti ekspanziju humanih ćelija kancera pankreasa MIA PACA-2 (ATCC, # CRL-1420) ili humanih ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća CALU-6 (ATCC, # HTB-56) ili humanih ćelija kolorektalnog kancera COLO-205 (ATCC, # CCL-222) u kulturi, sakupiti i injektirati 5x10e6 ćelija u 200 µL 1:1 HBSS+matrigel rastvora subkutano u zadnji deo desnog boka ženki atimičnih golih miševa (22-25 g, Harlan Laboratories). Izmeriti rast tumora i telesnu težinu dva puta nedeljno počinjući sedmog dana nakon implantacije. Kada veličina tumora dostigne 200-400 mm<3>, randomizovati životinje i grupisati u grupe od osam do deset životinja. Pripremiti test jedinjenje u odgovarajućem vehikulumu (vehikulum: 1% HEC/0.25% Tween 80/0.05% sredstvo protiv stvaranja pene) i primeniti oralnom gavažom 14 do 21 dana. Odgovor tumora je određen merenjem zapremine tumora izvedene dva puta nedeljno tokom trajanja tretmana. Telesna težina je uzeta kao opšta mera toksičnosti.

[0157] Jedinjenje unutar obima pronalaska je testirano u ovoj analizu suštinski kao što je opisano prethodno. Nađeno je da jedinjenje iz Primera 1 ima delta T/C% vrednosti kao što su obezbeđene u Tabeli 2 u nastavku. Ovi rezultati ukazuju da jedinjenje iz Primera 1 pokazuje značajnu antitumorsku aktivnost u nekoliko modela humanog ksenografta kancera uključujući HCT116, MIA PACA-2, CALU-6 i COLO-205.

Tabela 2: Efiaksnost iz Primera 1 u ksenograft modelima

In vivo studije kombinovanja

[0158] Usled heterogenosti tumora kombinovana terapija je postala esencijalna kod određenih tipova tretmana kancera za efikasnu terapiju ili da bi se prevazišla stečena rezistencija. Pretpostavljeno je da kombinacija targetiranih terapija ima potencijal da bude efikasnija u usporavanju ili čak zaaustavljanju kancera. U tom kontekstu, jedinjenje iz Primera 1 je testirano u odnosu na inhibiciju rasta tumora u kombinaciji sa pan-RAF inhibitornim jedinjenjem (videti WO 2013/134243, 1-(3,3-dimetilbutil)-3-(2-fluoro-4-metil-5-(7-metil-2-(metilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-6-il)fenil)urea, nadalje " pan-RAF inhibitorno jedinjenje"), CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem (videti WO 2010/075074, [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)- piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-izopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so), nadalje " CDK4/6 inhibitorno jedinjenje"), ili DC101 (videti, na primer, Witte L., et al Cancer Metastasis Rev., 17, 155-161, 1998, monoklonsko antitelo pacova usmereno protiv mišjeg VEGFR2 koje se može koristiti u eksperimentima kao surogat u miševima za anti-VEGFR2 Ab, poželjno ramucirumab (videti WO 2003/075840, takođe poznat kao Cyramza®, IMC-1121b, CAS registry number 947687-13-0)). Specifičnije, jedinjenje iz Primera 1 je testirano u kombinaciji sa ili pan-RAF inhibitornim jedinjenjem ili CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem u HCT116, kolorektalni kancer ksenograft model KRAS mutanta. Takođe, jedinjenje iz Primera 1 je testirano u kombinaciji sa ili CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem ili DC101 u NCI-H441, A549, i NCI-H2122, ksenograft modelima nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) KRAS mutanta.

[0159] Studije efikasnosti HCT116 kombinacije su urađene na atimičnim golim pacovima. Izvršiti ekspanziju humanih kolorektalnih ćelija kancera HCT116 (ATCC, # CCL-247) u kulturi, sakupiti i injektirati 5x10e6 ćelija u 200 µL of 1:1 HBSS+matrigel rastvor subkutano u zadnji deo desnog boka ženki NIH golih pacova (120-145 gm, Taconic Farms). Izmeriti rast tumora i telesnu težinu dva puta nedeljno počinjući sedmog dana nakon implantacije. Kada prosečne veličine tumora dostignu 200-300 mm<3>, randomizovati životinje i grupisati u grupe od pet do sedam životinja. Pripremiti test jedinjenje u odgovarajućem vehikulumu (videti u nastavku) i primeniti oralnom gavažom 21 do 28 dana. Odgovor tumora je određen merenjem zapremine tumora izvedenim dva puta nedeljno tokom trajanja tretmna. Vehikulum korišćen u ovoj studiji je 1% HEC (hidroksi etil celuloza)/0.25% Tween® 80/0.05% sredstvo protiv stvaranja pene. Jedinjenje iz Primera 1 i pan-RAF inhibitorno jedinjenje su formulisani u 1% HEC /0.25% Tween® 80/0.05% sredstvo protiv stvaranja pene. CDK4/6 inhibitorno jedinjenje je formulisano u 1% HEC u 25 mM natrijum fosfat puferu, pH 2. Primena jedinjenja iz Primera 1 na 10 mpk i 20 mpk QD rezultuje u aktivnosti jednog sredstva od 52% i 64% inhibicije rasta tumora respektivno (Tabela 3). Nasuprot tome, primena pan-RAF inhibitornog jedinjenja na 10 mpk i 20 mpk BID rezultuje u aktivnosti jednog sredstva od 29% i 68%, respektivno. Svi tretmani su statistički značajni (p<0.05) u odnosu na kontrolu sa vehikulumom izuzev pan-RAF inhibitornog jedinjenja na 10 mpk BID. Primena jedinjenja iz Primera 1 na 10 mpk, QD u kombinaciji sa pan-RAF inhibitornim jedinjenjem na 10 mpk, BID rezultuje u 94% inhibiciji rasta tumora (p<0.001) i rezultat kombinacije je "sinergistički" kao što je izračunat sa Bliss Independence postupkom (Tabela 3). Izgleda da se ova kombinacija toleriše jer ne postoji značajan gubitak telesne težine. Primena jedinjenja iz Primera 1 na 10 mpk, QD u kombinaciji sa pan-RAF inhibitornim jedinjenjem na 20 mpk, BID takođe je rezultoval au značajnoj (p<0.05) inhibiciji rasta tumora (95%) i rezultat kombinacije je "aditivan" " kao što je izračunato sa Bliss Independence postupkom (Tabela 3). Izgleda da se ova kombinacija toleriše jer ne postoji značajan gubitak telesne težine. U istoj studiji, primena jedinjenja iz Primera 1 na 10 mpk, QD sa CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem na 20 mpk QD rezultuje u 98% inhibiciji rasta tumora dok su efikasnosti jednog sredstva jedinjenja iz Primera 1 i CDK4/6 inhibitornog jedinjenja 52% i 76% inhibicije rasta tumora, respektivno. Kombinacija ova dva sredstva pokazuje statistički značajan "aditivni" rezultat kao što je izračunato sa Bliss Independence postupkom (Tabela 3). Izgleda da se ova kombinacija toleriše jer ne postoji značajan gubitak telesne težine. Ovi rezultati sugerišu da kombinacija jedinjenja iz Primera 1 sa ili pan-RAF inhibitornim jedinjenjem ili CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem može obezbediti veću korist pacijentima koji imaju KRAS mutantni kolorektalni kancer.

Tabela 3: Studije kombinacije jedinjenja iz Primera 1 sa pan-RAF inhibitornim jedinjenje, ili CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem u HCT116 ksenograft modelu KRAS mutanta kolorektalnog kancera

r

p

[0160] Efikasnost kombinacije je takođe testirana kod tri KRAS mutant NSCLC ksenograft modela uključujući A549 (KRAS_G12S) u SCID miševima kao i NCI-H441 (KRAS_G12V) i NCI-H2122 (KRAS_G12C) u atimičnim golim miševima. Izvršiti ekspanziju humanih ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća NCI-H441 (ATCC, # CRL-5807) i NCI-H2122 (ATCC, #CRL-5985) u kulturi, sakupiti i injektirati 5x10e6 cells u 200 µL of 1:1 HBSS+matrigel rastvora subkutano u zadnji deo desnog boka ženki atimičnih golih miševa (20-22 gm, Harlan Laboratories). Izvršiti ekspanziju humanih ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća A549 (ATCC, # CCl-185) u kulturi, sakupiti i injektirati 5x10e6 cells u 200 µL of 1:1 HBSS+matrigel rastvora subkutano u zadnji deo desnog boka ženki CB-17 SCID miševa(18-20 gm, Taconic Farms). Za sve ćelijske linije, izmeriti rast tumora i telesnu težinu dva puta nedeljno počinjući sedmog dana nakon implantacije. Kada prosečne veličine tumora dostignu 200-300 mm<3>, randomizovati životinje i grupisati u grupe od pet do sedam životinja. Pripremiti test jedinjenje u odgovarajućem vehikulumu (videti u nastavku) i primeniti oralnom gavažom (jedinjenje iz Primera 1 i CDK4/6 inhibitorno jedinjenje) ili intraperitonealno (DC101) 21 do 28 dana. Odgovor tumora je određen merenjem zapremine tumora izvedenim dva puta nedeljno tokom trajanja tretmna. Vehikulum korišćen u ovim studijama je 1% HEC/0.25% Tween® 80/0.05% sredsstvo protiv stvaranja pene. Jedinjenje iz Primera 1 je formulisano u 1% HEC /0.25% Tween® 80/0.05% sredstvo protiv stvaranja pene i the CDK4/6 inhibitorno jedinjenje je formulisano u 1% HEC u 25 mM natrijum fosfatnom puferu, pH 2. Primena jedinjenja iz Primera 1 kao zasebnog sredstva na 50 mpk rezultuje u 41% i 91% inhibicije rasta tumora u NCI-H2122 i A549 tumorima respektivno; i dovodi do 101% inhibicije rasta tumora (tj., 1% regresija tumora) u NCI-H441 tumorima. Primena CDK4/6 inhibitornog jedinjenja kao zasebnog sredstva na 50 mpk rezultuje u 53%, 51% i 81% inhibicije rasta tumora u NCI-H2122, A549 i NCI-H441 modelima respektivno. Takođe, kombinacija jedinjenja iz Primera 1 (50 mpk) sa CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem (50 mpk) rezultuje u 151 % (tj. 51% regresije) i 147 % (tj.

47% regresije) inhibicije rasta tumora u A549 i NCI-H441 tumorima respektivno; i 82% inhibicije rasta tumora u NCIH2122 tumorima. Rezultat kombinacije u sva tri modela tumora je "aditivan" kao što je izračunato sa Bliss Independence postupkom (Tabela 4). Generalno, izgleda da se ovi tretmani tolerišu kao što je naznačeno time da ne postoji značajan gubitak telesne težine. U istom NCI-H441 ksenograft modelu, DC101 u fosfatnom puferu je takođe primenjen intraperitonealno dva puta nedeljno (BIW) kao zasebno sredstvo ili u kombinaciji sa jedinjenjem iz Primera 1, 50 mpk, QD 28 dana. Primena DC101 na 20 mpk BIW rezultuje u aktivnosti zasebnog sredstva od 102% inhibicije rasta tumora (tj. 2% regresije). Kombinacija jedinjenja iz Primera 1 na 50 mpk, QD sa DC101 na 20 mpk, BIW rezultuje u 146% inhibiciji rasta tumora (tj. 46% regresije). Ovaj rezultat kombinacije je "aditivan" kao što je izračunato sa Bliss Independence postupkom (Tabela 4). Izgleda da se ova kombinacija toleriše jer ne postoji značajan gubitak telesne težine. Ovi rezultati sugerišu da kombinacija jedinjenja iz Primera 1 sa ili CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem ili anti-VEGFR2 antitelom može obezbediti veću korist pacijentima sa nesitnoćelijskim kancerom pluća sa KRAS mutacijom.

Tabela 4. Studije kombinacije jedinjenja iz Primera 1 sa CDK4/6 inhibitornim jedinjenjem ili DC101 ksenograft modelima nesitnoćelijskog kancera pluća sa KRAS mutacijom

Claims (16)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:
2. naznačeno time da: R<1>je
3. R<2>i R<3>su metil ili R<2>i R<3>mogu biti uzeti zajedno da formiraju ciklopropil; R<4>je vodonik, metil, hloro, fluoro, ili trifluorometil; i R<5>je
4. ili njihova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 1 naznačeno time da R<2>i R<3>su nezavisno metil. 3. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 2 naznačeno time da R<4>je vodonik. 4. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 3 naznačeno time da R<1>je
5. 5. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 4 naznačeno time da R<5>je
6. 6. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 5 koje je 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol 1-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
7. 7. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 6 koje je 6,6-dimetil-2-{2-[(1-metil-1H-pirazol-5-il)amino]pirimidin-4-il}-5-[2-(morfolin-4-il)etil]-5,6-dihidro-4H-tieno[2,3-c]pirol-4-on.
8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili so prema bilo kom od Patentnih zahteva 1-7, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens.
9. 9. Jedinjenje ili so prema bilo kom od Patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u terapiji.
10. 10. Jedinjenje ili so prema bilo kom od Patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u tretmanu kancera.
11. 11. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 6 za upotrebu u istovremenoj, zasebnoj ili sekvencijalnoj primeni u kombinaciji sa ramucirumabom u tretmanu kancera.
12. 12. Jedinjenje ili so prema Patentnom zahtevu 6 za upotrebu u istovremenoj, zasebnoj ili sekvencijalnoj primeni u kombinaciji sa [5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-piridin-2-il]-[5-fluoro-4-(7-fluoro-3-izopropil-2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-pirimidin-2-il]-aminom, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli u tretmanu kancera.
13. 13. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od Patentnih zahteva 10-12 naznačeno time da je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, i nesitnoćelijskog kancera pluća.
14. 14. Jedinjenje ili so za upotrebu prema Patentnom zahtevu 13, naznačeno time da kancer je kolorektalni kancer.
15. 15. Jedinjenje ili so za upotrebu prema Patentnom zahtevu 13, naznačeno time da kancer je kancer pankreasa.
16. 16. Jedinjenje ili so za upotrebu prema Patentnom zahtevu 13, naznačeno time da kancer je nesitnoćelijski kancer pluća. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5