RS59073B1 - Analiza zasnovana na veličini frakcije fetusne dnk u majčinoj plazmi - Google Patents

Analiza zasnovana na veličini frakcije fetusne dnk u majčinoj plazmi

Info

Publication number
RS59073B1
RS59073B1 RS20190946A RSP20190946A RS59073B1 RS 59073 B1 RS59073 B1 RS 59073B1 RS 20190946 A RS20190946 A RS 20190946A RS P20190946 A RSP20190946 A RS P20190946A RS 59073 B1 RS59073 B1 RS 59073B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dna
size
fraction
calibration
concentration
Prior art date
Application number
RS20190946A
Other languages
English (en)
Inventor
Yuk Ming Dennis Lo
Kwan Chee Chan
Wenli Zheng
Peiyong Jiang
Jiawei Liao
Wai Kwun Rossa Chiu
Original Assignee
Univ Hong Kong Chinese
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49114635&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59073(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Hong Kong Chinese filed Critical Univ Hong Kong Chinese
Publication of RS59073B1 publication Critical patent/RS59073B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G16H10/40—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data for data related to laboratory analysis, e.g. patient specimen analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Algebra (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Description

Opis
[0001] Opis fetusne DNK bez ćelija u majčinoj plazmi otvara nove mogućnosti za neinvazivnu prenatalnu dijagnozu (Lo YMD et al. Lancet1997;350:485-487). Koncentracija srednje/prosečne frakcije fetusne DNK se pokazala da je približno 3% do 10% (Lo YMD et al. Am J Hum Genet 1998;62:768-775; Lun FMF et al. Clin Chem 2008;54:1664-1672). Koncentracija frakcije fetusne DNK je važan parametar koji utiče na učinak neinvazivnih prenatalnih dijagnostičkih testova korišćenjem DNK iz majčine plazme. Na primer, za neinvazivnu prenatalnu dijagnozu hromozomskih aneuploidija fetusa (e.g. trizomija 21, trizomija 18 ili trizomija 13), što je viša koncentracija frakcija fetusne DNK, to će viša biti prezastupljenost DNK sekvenci izvedenih iz aneuploidnog hromozoma u plazmi majke. Svakako, pokazano je da je za svako dvostruko smanjenje u koncentracije frakcije fetusne DNK u majčinoj plazmi, broj molekula koji bi trebalo prebrojati da bi se ostvarilo detektovanje aneuploidije bio četvorostruki (Lo YMD et al. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:13116-13121).
[0002] Za neinvazivnu prenatalnu detekciju trizomije fetusa putem nasumičnog masivnog paralelnog sekvenciranja, koncentracija frakcije fetusne DNK nekog uzorka bi uticala na količinu sekvenciranja koju čovek treba da izvede da bi se postigla robusna detekcija (Fan HC and Quake SR. PLoS One 2010;5:e10439). Svakako, broj grupa je uključivao korak kontrole kvaliteta u kom se koncentracija frakcije fetusne DNK prvo meri i samo bi uzorci koji sadrže više od minimalne koncentracije frakcije fetusne DNK bili kvalifikovani da generišu dijagnostički rezultat (Palomaki GE et al. Genet Med 2011;13:913-920). Druge grupe su uključivale fetusnu frakciju DNK koncentracije u njihov dijagnostički algoritam za procenu rizika za specifični uzorak majčine plazme dobijen iz aneuploidne trudnoće (Sparks AB et al. Am J Obstet Gynecol 2012; 206: 319.e1-9).
[0003] Pored detekcije aneuploidije, fetusna frakcija koncentracije DNK takođe slično utiče na neinvazivne prenatalne dijagnostičke testove sprovedene korišćenjem DNK majčine plazme za detektovanje monogenskih bolesti, npr. hemoglobinopatija (Lun FMF et al. Proc Natl Acad Sci USA2008;105:19920-19925) i hemofilije (Tsui NBY et al. Blood 2011;117:3684-3691). Fetusna frakcija koncentracije DNK takođe utiče na dubinu sekvenciranja koju treba izvesti za sastavljanje (konstruisanje) genetske i mutacione mape celog genoma fetusa, kao i sekvenciranja celog genoma fetusa (Lo YMD et al. Sci Transl Med 2010;2:61ra91 and U.S. Patent Application 2011/0105353).
[0004] Izvestan broj postupaka je opisan za merenje koncentracije frakcije fetusne DNK. Jedan pristup je da se izmeri koncentracija za fetus specifične, od oca nasleđene sekvence koje nema u majčinom genomu. Primeri takvih sekvenci obuhvataju sekvence na Y hromozomu koje su prisutne u fetusima muškarca i sekvencama iz RHD gena kod rezus D pozitivnog fetusa koji nosi rezus D negativna trudnica. Moguće je izmeriti i ukupnu DNK majčine plazme korišćenjem sekvenci koje su prisutne i kod majke i kod fetusa. Da bi se došlo do koncentracije frakcije fetusne DNK, moguće je izračunati odnos koncentracije za fetus specifične, od oca nasleđene sekvence u odnosu na koncentraciju ukupne majčine plazme DNK.
[0005] Još jedan primer sekvenci koje bi se mogle koristiti obuhvata upotrebu pojedinačnih polimorfizama nukleotida (Lo YMD et al. Sci Transl Med 2010;2:61ra91). Nedostatak korišćenja genetskih markera za merenje koncentracije frakcije fetusne DNK je što nijedan pojedinačni skup genetskih markera ne bi bio informativan za ceo par fetus-majka. Još jedan postupak koji bi mogao da se koristi je upotreba DNK sekvenci koje ispoljavaju fetusne ili za placentu specifične obrasce DNK metilacije u plazmi majke (Nygren AO et al. Clin Chem 2010;56:1627-1635). Potencijalni nedostatak upotrebe markera DNK metilacije je da može postojati odstupanje između pojedinaca na nivou DNK metilacije. Pored toga, postupci koji se koriste za detektovanje markera DNK metilacije su najčešće kompleks, koji obuhvata upotrebu na metilaciju osetljivog razlaganja restrikcionog enzima (Chan KCA et al. Clin Chem 2008;52:2211-2218) ili pretvaranja bisulfita (Chim SSC et al. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:14753-14758) ili metilisanog DNK imunotaloženja (MeDIP) (Papageorgiou EA et al. Nat Med 2011; 17: 510-513).
[0006] Zato što je koncentracija fetusne frakcije DNK važna vrednost, poželjno je imati dodatne postupke i sisteme za određivanje te vrednosti.
[0007] Prema ovom pronalasku, dat je postupak analiziranja uzorka majčine plazme iz trudnice, taj uzorak obuhvata DNK fragmente bez ćelija koji nastaju iz majčinih ćelija i iz ćelija fetusa, taj postupak obuhvata: za svaki od više DNK fragmenata iz uzorka plazme: očitavanja jedne ili više sekvenci dobijenih iz sekvenciranja DNK fragmenta, jedno ili više očitavanja sekvence uključujući oba kraja DNK fragmenta; poravnavanje jednog ili više očitavanja sekvenci sa referentnim genomom da bi se dobile poravnate lokacije za oba kraja DNK fragmenta; i korišćenje poravnatih lokacija da bi se odredila veličina DNK fragmenta; za svaku veličinu od više veličina: određivanje količine kompleta više DNK fragmenata iz uzorka plazme koji odgovara veličini, korišćenjem veličina određenih iz poravnatih lokacija za niz više DNK fragmenata; izračunavanje prve vrednosti prvog parametra na osnovu količina DNK fragmenata za više veličina, pri čemu prvi parametar obezbeđuje statističku meru profila veličine DNK fragmenata u uzorku plazme; poređenje prve vrednosti sa kalibracionom vrednošću; i procenu koncentracije fetusne frakcije DNK u uzorku plazme na osnovu tog poređenja
[0008] Druga izvođenja su usmerena na sisteme, prenosne potrošačke uređaje, i računarski čitljive medije povezane sa ovde opisanim postupcima.
[0009] Bolje razumevanje prirode i prednosti koje daje ovaj pronalazak moguće je dobiti sa pozivom na sledeći detaljan opis i priložene slike nacrta.
SL. 1 pokazuje grafikon 100 sa raspodelom veličine cirkulišuće DNK bez ćelije u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 2A pokazuje grafikon 200 sa raspodelom veličine fetusne DNK u dva uzorka majčine plazme (1. tromesečje trudnoće) sa različitim koncentracijama frakcije fetusne DNK prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
Slika 2B pokazuje grafikon 250 sa raspodelom veličine DNK fragmenta u dva uzorka majčine plazme (2. tromesečje trudnoće) sa različitim koncentracijama frakcije fetusne DNK prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 3 je grafikon toka postupka 300 koji prikazuje na slici postupak procene koncentracije frakcije klinički relevantne DNK u biološkom uzorku prema izvođenjima iz ovog pronalaska. SL. 4 je grafikon 400 pokazuje raspodelu veličine (elektroferogram) DNK iz majčine plazme dobijene korišćenjem elektroforeze prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 5A pokazuje grafikon 500 koji prikazuje proporciju DNK fragmenata koji su 150 bp ili manji za uzorke koji imaju različiti procenat fetusne DNK u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 5B pokazuje grafikon 550 pokazuje raspodelu veličine količina DNK frarmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)). SL. 6A je grafikon 600 koji pokazuje odnos veličine količina fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)).
SL. 6B je grafikon 650 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)).
SL. 7 je grafikon 700 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)).
SL. 8 je grafikon 800 koji pokazuje proporciju DNK fragmenata koji su 150 bp ili ispod za uzorke koji imaju različite procente fetusne DNK u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 9A je grafikon 900 koji pokazuje raspodelu veličine količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)). SL. 9B je grafikon 950 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)). SL. 10A je grafikon 1000 koji fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)).
SL. 10B je grafikon 1005 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)). SL. 11 je grafikon koji pokazuje odnos veličine testiranog procenta naspram procenta fetusne DNK za veličinu ponovljenih elemenata prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 12A je elektroferogram 1200 koji je moguće koristiti da bi se utvrdio odnos veličine prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 12B je grafikon 1250 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 200 bp do 267 bp i DNK od 290 bp do 294 bp za uzorke koji imaju različiti procenat fetusne DNK u plazmi majke prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 13 je grafikon toka postupka 1300 za određivanje tačaka podataka kalibracije na osnovu merenja napravljenih od uzoraka kalibracije prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 14A je grafikon 1400 odnosa veličine naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za komplet za obuku prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 14B je grafikon 1450 koncentracija frakcije izvedenih (procenjenih) iz linearne funkcije 1410 sa
SL. 14A naspram koncentracija frakcije izmerenih korišćenjem sekvenci specifičnih za fetus prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 15A je grafikon 1500 koji pokazuje proporciju DNK fragmenata od 150 bp ili ispod za uzorke koji imaju različite procente tumorozne DNK u plazmi dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom pre i posle resekcije tumora prema izvođenjima iz ovog pronalaska.
SL. 15B je grafikon 1550 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora.
SL. 16A je grafikon 1600 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora.
SL. 16B je grafikon 1650 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora.
SL. 17 je grafikon 1700 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora.
SL. 18A je grafikon 1800 koji pokazuje odnos DNK fragmenata od 150 bp ili ispod za HCC pacijente pre i posle resekcije tumora.
SL. 18B je grafikon 1850 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)), za HCC pacijente pre i posle resekcije tumora.
SL. 19A je grafikon 1900 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora.
SL. 19B je grafikon 1950 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)), za HCC pacijente pre i posle resekcije tumora.
SL. 20 je grafikon 2000 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)), za HCC pacijente pre i posle resekcije tumora.
SL. 21 je dijagram toka koji ilustruje postupak 2100 za analiziranje biološkog uzorka organizma da bi se odredila klasifikacija nivoa kancera prema izvođenjima iz ovog pronalaska. SL. 22 je tabela 2200 koja pokazuje neke uobičajene nepravilnosti hromozoma gledano za različite tipove kancera.
SL. 23 pokazuje blok dijagram računarskog sistema 2300 uzetog kao primer koji može da se koristi sa sistemom i postupcima u skladu sa izvođenjima ovog pronalaska.
[0010] Pojam "biološki uzorak" kako je ovde korišćen se odnosi na bilo koji uzorak koji je uzet od subjekta (npr. čoveka, kao što je trudnica) i sadrži jedan ii više molekula nukleinske kiseline od interesa. Primeri obuhvataju uzorke plazme, pljuvačke, fluida iz pluća, znoja, ascitne tečnosti (kao povećanu količinu trbušnog fluida), žuči, urina, seruma, pankreasnu tečnost, tvrdog izmeta i brisa grlića materice. Biološki uzorak moguće je dobiti od čoveka, životinje, ili drugog pogodnog organizma. Pojam "uzorak kalibracije" odgovara biološkom uzorku čija je klinički relevantna frakcija DNK poznata ili utvrđena preko postupka kalibracije, npr., korišćenjem alela specifičnog za klinički relevantnu DNK. Primeri klinički relevantne DNK su fetusna DNK u plazmi majke ili DNK tumora u pacijentovoj plazmi.
[0011] Kako je ovde korišćen, pojam "locus" ili oblik množine "loci" je lokacija ili adresa bilo koje dužine nukleotida (ili parova baze) koja ima varijaciju u genomima. Pojam "očitavanje sekvence" se odnosi na sekvencu dobijenu od svih ili dela molekula nukleinske kiseline, tj., fragmenta DNK. U jednom izvođenju, samo jedan kraj fragmenta se sekvencira. Alternativno, oba kraja (npr. oko 30 bp od svakog kraja) tog fragmenta je moguće sekvencirati da se generišu dva očitavanja sekvence. Uparena očitavanja sekvence je zatim poravnati sa referentnim genomom, što može obezbediti dužinu fragmenta. U još jednom izvođenju, linearni DNK fragment moguće je cirkulisati, npr. ligacijom, i deo na kom se proteže mesto ligacije je moguće sekvencirati.
[0012] Pojam "univerzalno sekvenciranje" se odnosi na sekvenciranje gde se adapteri dodaju na kraj fragmenta, i početnice (prajmere) za sekvenciranje spojene na adaptere. Dakle, svaki je fragment moguće sekvencirati istom početnicom, i zato sekvenciranje može biti nasumično odabrano.
[0013] Pojam koncentracija frakcije fetusne DNK se koristi ravnopravno sa pojmovima proporcija fetusne DNK i frakcija fetusne DNK, i odnosi se na odnos molekula fetusne DNK koji su prisutni u biološkom uzorku (npr. majčinoj plazmi ili uzorku seruma) koji je izveden iz fetusa (Lo YMD et al. Am J Hum Genet 1998;62:768-775; Lun FMF et al. Clin Chem 2008;54:1664-1672). Slično, pojmovi koncentracija frakcije tumorozne DNK moguće je koristiti ravnopravno sa pojmovima proporcija tumorozne DNK i frakcija tumorozne DNK, i odnose se na proporciju molekula tumorozne DNK koji su prisutni u biološkom uzorku.
[0014] Pojam "profil veličine" se generalno odnosi na veličine DNK fragmenata u biološkom uzorku. Profil veličine može biti histogram koji obezbeđuje raspodelu količine DNK fragmenata na raznovrsnim veličinama. Različiti statistički parametri (se takođe pominju kao parametri veličine ili samo parametar) mogu biti korišćeni da se razlikuje jedan profil veličine od drugog. Jedan parametar je procenat fragmenta DNK određene veličine ili opseg veličina u odnosu na sve fragmente DNK ili u odnosu na fragmente DNK druge veličine ili opsega.
[0015] Primeri "klinički relevantne" DNK obuhvataju fetusnu DNK u plazmi majke i tumoroznu DNK u pacijentovoj plazmi. Još jedan primer obuhvata merenje količine DNK povezane sa transplantatom u plazmi pacijenta koji je primio transplantat. Još jedan primer obuhvata merenje relativnih veličina hematopoezne i nehematopoezne DNK u plazmi subjekta. Ovo poslednje izvođenje je moguće koristiti za detektovanje ili nadgledanje ili prognostikovanje patoloških procesa ili povreda koji obuhvataju hematopoezna i/ili nehematopoezna tkiva.
[0016] Pojam "tačka podataka kalibracije" obuhvata "vrednost kalibracije" i izmerena je ili poznata koncentracija frakcije DNK od interesa (tj. klinički relevantna DNK). Vrednost kalibracije je vrednost parametra veličine kako je određeno za uzorak kalibracije, za koji je poznata koncentracija frakcije klinički relevantne DNK. Podatke kalibracije je moguće definisati na različite načine, npr., kao diskretne tačke ili kao funkciju kalibracije (takođe se zove i krivulja kalibracije ili površina kalibracija).
[0017] Pojam "nivo kancera" može da se odnosi na to da li kancer postoji, na stadijum kancera, na veličinu tumora, koliko je delecija ili amplifikacija hromozomskog regiona obuhvaćeno (npr. udvostručeno ili utrostručeno), i/ili drugu meru ozbiljnosti kancera. Nivo kancera bi mogao da bude broj ili drugi karakteri. Nivo bi mogao da bude nula. Nivo kancera takođe obuhvata predmaligna ili prekancerna stanja povezana sa delecijama ili amplifikacijama.
[0018] Poznato je da molekula fetusne DNK bez ćelije u majčinoj plazmi jesu genetski kraći od molekula izvedenih iz majke (Chan KCA et al. Clin Chem 2004;50:88-92; Lo YMD et al. Sci Transl Med 2010;2:61ra91). Prisustvo fetusne DNK daje kao rezultat promenu u celokupnoj raspodeli veličine DNK majčine plazme i stepen promene se povezuje sa koncentracijom frakcije fetusne DNK. Merenjem specifičnih vrednosti profil veličine DNK majčine plazme, u izvođenjima je moguće dobiti koncentraciju frakcije fetusne DNK u majčinoj plazmi.
[0019] Nezavisno od primena u neinvazivnoj dijagnozi očevih gena, moguće je takođe koristiti izvođenja za merenje koncetracije frakcije klinički korisnih vrsta nukleinske kiseline različitih veličina u biološkim fluidima, koji mogu biti korisni za detekciju kancera, tansplantaciju, i medicinsko praćenje. Prethodno je pokazano da DNK izvedena iz tumora jeste kraća od DNK izvedene iz nekancera u plazmi pacijenta obolelog od kancera (Diehl F et al. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:16368-16373). U kontekstu tansplantacije, pokazano je da hematopoezno izvedena DNK kraća od nehematopoezne DNK (Zheng YW et al. Clin Chem 2012;58:549-558). Na primer, ako pacijent prima jetru od donora, onda je DNK izvedena iz jetre (nehematopoezni organ kod odrasle osobe) biti kraća od hematopoezno izvedene DNK u plazmi (Zheng YW et al.
Clin Chem 2012;58:549-558). Slično tome, kod pacijenta sa miokardijalnim infarktom ili moždanim udarom, DNK ispuštena od strane oštećenih nehematopoeznih organa (tj. srce i mozak, prema opisanom redosledu) bi očekivano mogla da daje kao rezultat promenu u profilu veličine plazme DNK prema kraćem spektru.
I. RASPODELA VELIČINE
[0020] Da bi se pokazala izvođenja, mi pokazujemo na sledećim primerima da je moguće izmeriti profil veličine, na primer, uparenim krajem masivno paralelnog sekvenciranja ili elektroforezom (npr. korišćenjem bioanalizatora). Ovaj poslednji primer je posebno koristan zbog elektroforeze korišćenje bioanalizatora je brz i relativno jeftin postupak. Ovo bi omogućilo da se brzo izvede ova analiza kao količina kontrolne mere pre nego što bi se podvrgao uzorak DNK plazme relativno skupom postupku sekvenciranja.
[0021] SL. 1 pokazuje grafikon 100 sa raspodelom veličine koja cirkuliše u DNK bez ćelije u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Raspodela veličine može se dobiti merenjem veličine DNK fragmenata i zatim prebrojavanjem broja DNK fragmenata u različitim veličinama, npr. unutar opsega od 50 baza do oko 220 baza. Grafikon 100 pokazuje dve raspodele. Raspodela 110 je za sve DNK fragmente u uzorku majčine plazme, i raspodela 120 je samo za DNK koja je iz fefusa. Horizontalna osa ima veličinu u baznim parovima (bp) DNK fragmenata. Vertikalna osa je procenat izmerenih DNK fragmenata
[0022] Na SL.1, veličina raspodele iz fetusa izvedene DNK u majčinoj plazmi je pokazana da je kraća od majčinih izvedenih uzoraka (Chan KC et al. ClinChem 2004; 50:88-92.) Nedavno, koristili smo analizu za masivno paralelno sekvenciranje sa uparenim krajem DNK specifične za fetus i ukupne DNK (uglavnom izvedene iz majke) kod trudnica. Ponovo smo pokazali da je glavna razlika između dve vrste DNK to što postoji redukcija u frakciji 166 bp DNK fragmenata i povećanje proporcije kraće DNK od ispod 150 bp za DNK izvedenu iz fetusa (Lo YM et al. Sci Transl Med 20102:61ra91).
[0023] Ovde, ističemo kako bi analiza raspodele veličine ukupnih fragmenata DNK u uzorku majčine plazme (primer biološkog uzorka) bila korisna za određivanje koncentracije frakcije fetusne DNK u majčinoj plazmi. Povećana koncentracija frakcije fetusne DNK u majčinoj plazmi bi kao rezultat dala skraćenje ukupne raspodele veličine ukupne DNK. U jednom izvođenju, relativno obilje (primer parametra) DNK fragmenata od približno 144 bp i DNK fragmenata od približno 166 bp bi moglo biti korišćeno da se odrazi koncentracija frakcije fetusne DNK. U još jednom izvođenju, drugi parametri ili kombinacije parametara u vezi sa profilom veličine mogu biti korišćeni da se prikaže raspodela veličine DNK iz plazme.
[0024] SL.2A pokazuje grafikon 200 sa raspodelom veličine fetusne DNK u dva uzorka majčine plazme (1. tromesečje trudnoće) sa različitim koncentracijama frakcije fetusne DNK prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Obe ove trudnice su nosile muške fetuse. Koncentracije frakcije fetusne DNK su određene iz proporcije sekvenci iz Y hromozoma među ukupno sekvenciranim DNK fragmentima. Oba uzorka su uzeta iz trudnica tokom prvog tromesečja njihovih trudnoća. Slučaj 338 (puna linija, koncentracija frakcije fetusne DNK 10%) je imala nižu koncentraciju frakcije fetusne DNK nego slučaj 263 (tačkasta linija, koncentracija frakcije fetusne DNK 20%). Kada se uporedi sa slučajem 263, slučaj 338 je imao višu vršnu vrednost na 166 bp ali vršne vrednosti za veličinu ispod 150 bp su bile niže. Drugim rečima, DNK fragmenti kraći od 150 bp su bili obilatiji u slučaju 263 pri čemu su fragmenti od približno 166 bp bili obilniji u slučaju 338. Ova zapažanja su bila usklađena sa pretpostavkom da je relativne količine kratke i duge DNK moguće dovesti u vezu sa koncentracijom frakcije fetusne DNK.
[0025] Slika 2B pokazuje grafikon 250 raspodele veličine fragmenata DNK u dva uzorka majčine plazme (2. tromesečje trudnoća) sa različitim koncentracijama frakcije fetusne DNK u skladu sa izvođenjima iz ovog pronalaska. Oba uzorka su uzeta od trudnica tokom drugog tromesečja. Obe ove trudnice su nosile muške fetuse. Koncentracije frakcije fetusne DNK su određene iz proporcije sekvenci iz Y hromozoma među ukupno sekvenciranim DNK fragmentima. Slično prethodnom uzorku, slučaj 5415 (tačkasta linija, sa višom koncentracijom frakcije fetusne DNK 19%) je imao više vršne vrednosti za veličine ispod 150 bp pri čemu je slučaj 5166 (puna linija, sa nižom koncentracijom frakcije fetusne DNK 12%) imao višu vršnu vrednost na 166 bp.
[0026] Međusobna povezanost različitih vrednosti parametra veličine prema vrednostima koncentracije frakcije fetusne DNK je pokazana na grafičkim prikazima podataka dole u tekstu. Pored toga, veličina fragmenata tumorozne DNK se dovodi u vezu sa procentom tumoroznih fragmenata DNK u uzorku sa fragmentima tumorozne DNK i fragmentima DNK iz normalnih ćelija. Dakle, veličina tumoroznih fragmenata se može koristiti i da se utvrdi procenat tumoroznih fragmenata u uzorku.
II. POSTUPAK
[0027] S obzirom da se veličina fragmenata DNK dovodi u vezu sa koncentracijom frakcije (takođe se pominje i kao procenat), izvođenja mogu da koriste ovu povezanost da bi se utvrdila koncentracija frakcije specifičnog tipa DNK (npr. fetusne DNK ili DNK iz tumora) u nekom uzorku. Specifičan tip DNK je klinički relevantan jer je to koncentracija frakcije koja se procenjuje. Sa tim u skladu, postupak može utvrditi koncentraciju frakcije klinički relevantne DNK u biološkom uzorku na osnovu izmerene veličine DNK fragmenata.
[0028] SL.3 je grafikon toka postupka 300 koji prikazuje na slici postupak procene koncentracije frakcije klinički relevantne DNK u biološkom uzorku prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Biološki uzorak obuhvata klinički relevantnu DNK i drugu DNK. Biološki uzorak je moguće dobiti od pacijenta, npr. pacijentkinje koja kao trudnica nosi fetus. Kod drugog izvođenja, pacijent može imati ili se sumnja da ima tumor. U jednoj primeni, biološki uzorak je moguće dobiti na mašini, npr., mašini za sekvenciranje, koja izvozi podatke merenja (npr. očitavanja sekvence) koja je moguće koristiti da bi se odredile veličine DNK fragmenata. Postupak 300 je moguće izvesti u celini ili delimično sa računarskim sistemom, kao što je moguće sa drugim postupcima opisanim ovde u tekstu.
[0029] U bloku 310, meri se količina DNK fragmenata koji odgovaraju različitim veličinama. Za svaku veličinu koja ima više veličina, količina više fragmenata DNK iz biološkog uzorka odgovara veličini koju je moguće izmeriti. Na primer, moguće je izmeriti broj DNK fragmenata koji imaju dužinu od 140 baza. Količine je moguće sačuvati kao histogram. U jednom izvođenju, meri se veličina svake od više nukleinskih kiselina iz biološkog uzorka, što je moguće izvesti na individualnoj osnovi (npr., sekvenciranjem pojedinačnog molekula) ili na grupnoj osnovi (npr. preko elektroforeze). Veličine mogu odgovarati izvesnom opsegu. Dakle, količina može biti za DNK fragmente koji imaju veličinu unutar specifičnog opsega.
[0030] Moguće je izabrati više fragmenata DNK nasumično ili preferencijalno izabranih iz jednog ili više unapred određenih regiona genoma. Na primer, ciljano obogaćivanje je moguće izvesti, kao što je opisano gore u tekstu. U jednom drugom izvođenju, fragmente DNK je moguće nasumično sekvencirati (npr., korišćenjem univerzalnog sekvenciranja), i očitavanja sekvence dobijena kao rezultat je moguće poravnati sa genomom koji odgovara subjektu (npr. referentnim humanim genomom). Zatim, moguće je koristiti samo fragmente DNK čija se očitavanja sekvence poravnavaju sa jednim ili više unapred utvrđenih regiona da bi se utvrdila veličina.
[0031] U različitim izvođenjima, veličina može da bude masa, dužina, ili druga pogodna mera veličine. Merenje je moguće izvesti na različite načine, kako je opisano ovde u tekstu. Na primer, moguće je izvesti sekvenciranje i poravnavanje uparenih krajeva fragmenata DNK, ili je moguće koristiti elektroforezu. Statistički značajan broj fragmenata DNK moguće je izmeriti da bi se obezbedio precizan profil veličine biološkog uzorka. Primeri statistički značajnog broja fragmenata DNK obuhvataju više od 100,000; 1,000,000; 2,000,000, ili druge pogodne vrednosti, koje mogu zavisiti od neophodne preciznosti.
[0032] U jednom izvođenju, podaci dobijeni od fizičkog merenja, kao što je sekvenciranje uparenog kraja ili elektroforeza, mogu biti primljeni na računaru i analizirani da bi se izvelo merenje veličine fragmenata DNK. Na primer, očitavanja sekvence iz sekvenciranja uparenog kraja je moguće analizirati (npr., poravnavanjem) da bi se odredile veličine. Kao drugi primer, elektroferogram koji nastaje od elektroforeze moguće je analizirati da bi se odredile veličine. U jednoj primeni, analiziranje fragmenata DNK zaista obuhvata stvarnu obradu sekvenciranja ili podvrgavanja fragmenata DNK elektroforezi, pri čemu druga sprovođenja mogu tek da izvedu analizu podataka koji nastaju kao rezultat.
[0033] U bloku 320, prva vrednost prvog parametra se izračunava na osnovu količina fragmenata DNK na više veličina. U jednom varijantnom rešenju, prvi parametar obezbeđuje statističku meru profila veličine (npr. histograma) fragmenata DNK u biološkom uzorku. Parametar je moguće pomenuti kao parametar veličine jer je određen iz veličine više fragmenata DNK.
[0034] Prvi parametar može imati različite oblike. Takav parametar je broj fragmenata DNK na
1
specifičnoj veličini podeljen sa ukupnim brojem fragmenata, koje je moguće dobiti sa histograma (bilo koja struktura podataka obezbeđuje apsolutni ili relativni broj fragmenata na specifičnim veličinama). Kao drugi primer, parametar bi mogao biti broj fragmenata u specifičnoj veličini ili unutar specifičnog opsega podeljen brojem fragmenata druge veličine ili opsega. Podela može da deluje kao normalizacija na broj za različiti broj DNK fragmenata koji se analizira za različite uzorke. Normalizaciju je moguće izvesti analiziranjem istog broja DNK fragmenata za svaki uzorak, koji efektivno obezbeđuje isti rezultat kao podela ukupnog broja analiziranih fragmenata. Drugi primeri parametara su opisani ovde.
[0035] U bloku 330, dobija se jedan ili više prvih podataka kalibracije. Svaka prva tačka podataka kalibracije precizira koncentraciju frakcije klinički relevantne DNK koja odgovara specifičnoj vrednosti (kalibraciona vrednost) prvog parametra. Koncentraciju frakcije je moguće precizirati u specifičnoj koncentraciji ili opsegu koncentracija. Vrednost kalibracije može odgovarati vrednosti prvog parametra (tj. parametru specifične veličine) kako je određeno iz više uzoraka kalibracije. Tačke podataka kalibracije moguće je utvrditi iz uzoraka kalibracije sa poznatim koncentracijama frakcije, koje je moguće izmeriti različitim tehnikama opisanim ovde. Barem neki od uzoraka kalibracije bi imali različite koncentracije frakcije, ali neki uzorci kalibracije mogu imati istu koncentraciju frakcije
[0036] U različitim izvođenjima, jednu ili više tačaka kalibracije moguće je definisati kao jednu diskretnu tačku, kao komplet diskretnih tačaka, kao funkciju, kao jednu diskretnu tačku i funkciju, ili kao drugu kombinaciju diskretnih ili neprekidnog niza vrednosti. Kao primer, tačku podataka kalibracije moguće je utvrditi iz jedne vrednosti kalibracije parametra veličine (npr. broj fragmenata u specifičnoj veličini ili opsega veličine) za uzorak sa specifičnom koncentracijom frakcije. Moguće je koristiti više histograma, sa različitim histogramom za svaki uzorak kalibracije, pri čemu neki od uzoraka kalibracije mogu imati istu koncentraciju frakcije.
[0037] U jednom izvođenju, izmerene vrednosti istog parametra veličine iz više uzoraka u istoj koncentraciji frakcije je moguće kombinovati da bi se odredila tačka podataka kalibracije za specifičnu koncentraciju frakcije. Na primer, prosek vrednosti parametra veličine moguće je dobiti iz podataka veličine uzoraka u istoj koncentraciji frakcije da bi se odredila specifična tačka podataka kalibracije (ili obezbedio opseg koji odgovara tački podataka kalibracije). U drugom izvođenju, više tačaka podataka koje imaju istu vrednost kalibracije je moguće koristiti da bi se odredila prosečna koncentracija frakcije.
[0038] U jednoj primeni, veličine fragmenata DNK se mere za veliki broj uzoraka kalibracije. Vrednost kalibracije istog parametra veličine se određuje za svaki uzorak kalibracije, pri čemu parametar veličine može biti grafički prikazan na poznatoj koncentraciji frakcije tog uzorka. Funkciju je zatim moguće ugraditi u tačke podataka tog grafikona, pri čemu funkcionalno uklapanje definiše tačke podataka kalibracije koje treba koristiti za određivanje koncentracije frakcije za novi uzorak.
[0039] U bloku 340, prva vrednost se poredi sa vrednošću kalibracije barem jedne tačke podataka kalibracije. Poređenje je moguće izvesti na raznorazne načine. Na primer, poređenje može biti da li je prva vrednost viša ili niža od vrednosti kalibracije. Poređenje može obuhvatiti upoređivanje sa krivuljom kalibracije (sastavljenom od tačaka podataka kalibracije), i tako to poređenje može utvrditi tačku na krivulji koja ima prvu vrednost prvog parametra. Na primer, izračunata vrednost X prvog parametra (kako je utvrđeno iz izmerenih veličina DNK u novom uzorku) moguće je koristiti kao ulazni podatak u funkciji F(X), pri čemu je F funkcija kalibracije (krivulja). Izlazni podatak od F(X) je koncentracija frakcije. Opseg greške je moguće obezbediti, što može biti drugačije za svaku X, vrednost čime se obezbeđuje opseg vrednosti kao što je izlaz iz F(X).
[0040] U koraku 350, koncentracija frakcije klinički relevantne DNK u biološkom uzorku se procenjuje na osnovu poređenja. U jednom izvođenju, moguće je utvrditi da li je prva vrednost prvog parametra iznad ili ispod granične vrednosti kalibracije, i time se određuje da li je procenjena koncentracija frakcije neposrednog uzorka iznad ili ispod koncentracije frakcije koja odgovara graničnoj vrednosti kalibracije. Na primer, ako je izračunata prva vrednost X1za taj biološki uzorak iznad Xc vrednosti kalibracije onda je FC1koncentracije frakcije tog biološkog uzorka moguće utvrditi kao veću od FCc koncentracije frakcije koja odgovara Xc. Ovo poređenje je moguće koristiti da se utvrdi da li dovoljna koncentracija frakcije postoji u biološkom uzorku da bi se izveli drugi testovi, npr., testiranje za aneuploidiju fetusa. Ovaj iznos od iznad i ispod može zavisiti od načina na koji je taj parametar definisan. U takvom izvođenju, samo jedna tačka podataka kalibracije može biti potrebna.
[0041] U još jednom izvođenju, poređenje se izvodi unosom prve vrednosti u funkciju kalibracije. Funkciju kalibracije je moguće delotvorno uporediti sa prvom vrednošću prema vrednostima kalibracije identifikovanjem tačke na krivulji koja odgovara prvoj vrednosti. Procenjena koncentracija frakcije se zatim obezbeđuje kao izlazna vrednost funkcije kalibracije.
[0042] U jednom izvođenju, vrednost od više od jednog parametra je moguće utvrditi za taj biološki uzorak. Na primer, drugu vrednost je moguće utvrditi za drugi parametar, koji odgovara različitoj statističkoj meri profila veličine fragmenata DNK u tom biološkom uzorku. Drugu vrednost je moguće utvrditi korišćenjem istih merenja veličine fragmenata DNK, ili različitih merenja veličine. Svaki parametar može odgovarati različitoj krivulji kalibracije. U jednoj primeni, različite vrednosti je moguće uporediti nezavisno sa različitim krivuljama kalibracije da bi se dobilo više procenjenih koncentracija frakcije. koje je zatim moguće usrednjiti ili koristiti da bi se obezbedio opseg kao izlazni podatak.
[0043] U drugom sprovođenju, višedimenzionu krivulju kalibracije je moguće koristiti, pri čemu je različite vrednosti parametara moguće efikasno uneti u pojedinačnu funkciju kalibracije koja kao rezultat izvozi podatak o koncentraciji frakcije. Pojedinačna funkcija kalibracije može kao rezultat nastati iz funkcionalnog uklapanja svih tačaka podataka dobijenih iz uzoraka kalibracije. Dakle, u jednom izvođenju, prve tačke podataka kalibracije i druge tačke podataka kalibracije mogu biti tačke na višedimenzionoj krivulji, pri čemu to poređenje obuhvata identifikovanje višedimenzione tačke koja ima koordinate koje odgovaraju prvoj vrednosti i jednu ili više drugih vrednosti.
III. ODREĐIVANJE VELIČINE
[0044] Veličinu raspodele DNK u plazmi moguće je utvrditi, na primer, ali ne i ograničiti na, korišćenje PCR u realnom vremenu, elektroforezu i analizu masenom spektrometrijom. U različitim izvođenjima, izmerena veličina je dužina, molekularna masa, ili izmereni parametar koji je proporcionalan dužini ili masi, tako da je mobilnost u elektroforetogramu i vreme neophodno da se pređe utvrđeno rastojanje u uređaju za elektroforezu ili masenom spektrometru. U još jednom primeru, moguće je obojiti DNK interkalacionom fluorescentnom bojom, npr. etidijum bromidom ili SYBR zelenom, pri čemu će količina boje koja je vezana biti proporcionalna dužini molekula DNK. Moguće je utvrditi količinu vezane boje pomoću intenziteta emitovane fluorescencije kada UV svetlost sija na taj uzorak. Neki primeri za merenje veličine i podataka dobijenih kao primer su opisani u nastavku ovog teksta.
A. Prvi komplet uzorka fetusa korišćenjem sekvenciranja
[0045] Tabela 1 pokazuje informaciju o uzorku i analizu sekvenciranja za primer koji obuhvata frakciju DNK fetusa. Uzorci plazme su prikupljeni od 80 trudnica, svaka nosi pojedinačni muški fetus. Od ovih 80 trudnica, 39 su nosile euploidni fetus, 18 je nosilo fetus sa trizomijom 21 (T21), 10 su nosile fetus sa trizomijom 18 (T18), i 13 su nosile fetus sa trizomijom 13 (T13). Raspodela veličine DNK iz plazme je utvrđena korišćenjem masivnog paralelnog sekvenciranja sa uparenim krajem. Biblioteke sekvenciranja DNK iz majčine plazme su konstruisane kako je prethodno u tekstu opisano (Lo YM et al. Sci Transl Med 2010; 2:61ra91), izuzev što je barkod sa 6 baza uveden u molekule DNK svakog uzorka plazme kroz amplifikaciju PCR trostrukom početnicom.
[0046] Uvedena su dva uzorka u jednu traku sekvenciranja (tj. 2-struko sekvenciranje). Kod drugih izvođenja, više od dva uzorka je moguće uvesti u jednu traku sekvenciranja, npr.6, ili 12, ili 20, ili više od 20. Sve biblioteke su sekvencirane pomoću uređaja za analiziranje genoma Genome Analyzer IIx (Illumina) korišćenjem formata 36-bp X 2 PE. Još 7 ciklusa sekvenciranja je izvedeno da bi se dekodirala /sekvenca indeksa na svakom sekvenciranom molekulu DNK plazme. Očitavanja sekvence 36-bp su poravnata sa neponovljenim maskiranim humanim referentnim genomom (Hg18) (genome.ucsc.edu), korišćenjem Short Oligo-nucleotide Alignment Program 2 (SOAP2) (soap.genomics.org.cn). Identifikovana su očitavanja uparenog kraja (PE) sa pojedinačnim članovima sekvenciranim na istom položaju skupa na protočnoj ćeliji i jedinstveno poravnati sa pojedinačnom lokacijom u humanom genomu sa pravilnom orijentacijom i bez nepodudaranja nukleotida. Kod drugih izvođenja, to poravnavanje ne mora biti jedinstveno i dozvoljena su nepodudaranja.
[0047] Za analizu su oporavljena samo PE očitavanja koja su pokazala veličinu umetka ≤ 600 bp.
1
Sa ovim kriterijumima, veličina analiziranih fragmenata DNK iz plazme u ovim eksperimentima je bila u opsegu od 36 bp do 600 bp. Veličina svakog sekvenciranog DNK fragmenta je zasnovana na koordinatama najspoljašnjijih nukleotida na svakom kraju sekvenciranih fragmenata.
Tabela 1 pokazuje podatke za uzorke različitog statusa aneuploidije. Ti podaci obuhvataju izvestan broj slučajeva, srednja starost trudnoće i opseg, zajedno sa brojem srednjeg očitavanja uparenog kraja i opsegom i frakcijom fetusne DNK.
[0048] Koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorcima majčine plazme su izvedene iz količine sekvenci poravnatih sa hromozomom Y kako je prethodno opisano (Chiu RW et al. BMJ 2011;342:c7401). Ova tehnika je uzorak postupka kalibracije. Dakle, izmerenu frakciju fetusne DNK u Tabeli 1 je moguće koristiti u tačkama podataka kalibracije da bi se procenila frakcija fetusne DNK u novom uzorku. Uzorke korišćene da bi se prikupili podaci u Tabeli 1 moguće je smatrati uzorcima kalibracije.
B. Drugi komplet uzorka fetusa korišćenjem ciljanog sekvenciranja
[0049] Tabela 2 pokazuje informaciju o uzorku i ciljano obogaćenje DNK majčine plazme prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Uzorci plazme su prikupljeni od 48 trudnih žena, svaka je nosila samo jedan fetus. Od ovih 48 trudnica, 21 su nosile euploidni fetus, 17 je nosilo fetus sa trizomijom 21 (T21), 9 su nosile fetus sa trizomijom 18 (T18), i 1 je nosila fetus sa trizomijom 13 (T13). Ovi podaci, zajedno sa primerima datim dole u tekstu, prikazuju da je za izvođenja moguće koristiti ciljane tehnike. Raspodelu veličine DNK plazme moguće je odrediti korišćenjem masivnog paralelnog sekvenciranja sa uparenim krajem. U drugim izvođenjima, raspodelu veličine DNK plazme moguće je odrediti na primer ali ne ograničiti korišćenjem PCR u realnom vremenu, analizom elektroforezom i masenom spektrometrijom.
[0050] Da bi se dobila pokrivenost višestrukog sekvenciranja ciljnih regiona, u jednom izvođenju je korišćen Agilent SureSelect Target Enrichment System da bi se projektovale sonde koje bi snimile molekule DNK iz chr7 (0.9 Mb regiona), chr13 (1.1 Mb regiona), chr18 (1.2 Mb regiona) i chr21 (1.3 Mb regiona). U konstrukciji sonde, eksoni na chr7, chr13, chr18, i ključni region za Daunov sindrom na chr21 (21q22.1-q22.3) su prvo izabrani kao ciljni regioni. Zbog toga što chr13, chr18 i chr21 imaju manje eksonskih regiona od chr7, uvedeni su dodatni neeksonski regioni na chr13, chr18, i ključni region za Daunov sindrom na chr21 da bi se uravnotežila ukupna dužina ciljanog regiona među gore pomenuta četiri hromozoma. Izabrani neeksonski regioni su bili 120 bp dužine, jedinstveni za mapiranje, sa GC sadržajem blizu 0,5 i ravnomerno raspoređeni na ciljanim hromozomima
[0051] Koordinate svih od gore pomenutih eksonskih i neeksonskih regiona su podnete na platformu Agilent eArray za projektovanje ogleda.500 ng svake majčine plazme DNK biblioteke je inkubirano sa ogledima snimaka tokom 24 sata na 65°C. Posle hibridizacije, ciljani DNK molekuli su eluirani i amplificirani pomoću 12-ciklusne PCR analize prema uputstvima proizvođača. Biblioteke sa ciljnim obogaćenjem su indeksirane i sekvencirane na GA IIx (Illumina) korišćenjem formata 50-bp X 2 PE. Još 7 ciklusa sekvenciranja je izvedeno da bi se dekodirao sekvenca indeksa na svakom sekvenciranom molekulu DNK plazme. Očitavanja sekvence 50-bp su poravnata sa neponovljenim maskiranim humanim referentnim genomom (Hg18) (genome.ucsc.edu), korišćenjem programa za poravnavanje kratkih oligonukleotida Short Oligonucleotid Alignment Program 2 (SOAP2) (soap.genomics.org.cn). PE očitavanja sa pojedinačnim članovima su sekvencirana na istom položaju grupe na protočnoj ćeliji i jedinstveno poravnati na pojedinačnu lokaciju u humanom genomu sa pravilnom orijentacijom. Dozvoljena su bila dva nepodudaranja, složenost biblioteke sekvenciranja je bila značajno smanjena posle ciljanog obogaćivanja.
[0052] Za analizu su oporavljena samo PE očitavanja koja su pokazala veličinu umetka ≤ 600 bp. Sa ovim kriterijumima, veličina analiziranih fragmenata DNK iz plazme u ovoj studiji je bila u opsegu od 36 bp do 600 bp. Veličina svakog sekvenciranog DNK fragmenta je zasnovana na koordinatama najspoljašnjijih nukleotida na svakom kraju sekvenciranih fragmenata. Koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorcima majčine plazme su procenjene iz odnosa fragmenata koji su nosili alele specifične za fetus i alele koje su delile sa odgovarajućim majkama.
1
Tabela 2 pokazuje podatke iz ciljanog sekvenciranja za uzorke sa različitim statusom aneuploidije
C. Elektroforeza za uzorak fetusa
[0053] Pored korišćenja masivnog paralelnog sekvenciranja, analizu raspodele veličine DNK moguće je postići elektroforezom. Elektroforeza meri vreme koje je potrebno da se neki fragment pomeri kroz podlogu. Čestice različitih veličina zahtevaju različite vremenske periode da bi se pomerile kroz podlogu. Zato, u jednom izvođenju, mikrofluidnu elektroforezu biblioteke sekvenciranja od DNK majčine plazme moguće je izvesti da bi se utvrdila raspodela veličine DNK majčine plazme.
[0054] SL.4 je grafikon 400 pokazuje raspodelu veličine (elektroferogram) DNK iz majčine plazme dobijene korišćenjem elektroforeze prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Mikrofluidna elektroforeza je izvedena korišćenjem Agilent 2100 Bioanalyzer. Elektrofenogrami biblioteka sekvenciranja dva uzorka su prikazani na grafikonu 400. X-osa predstavlja vremensko trajanje DNK uzeto da se dospe do senzora i odgovara veličini fragmenata DNK. Y osa predstavlja fluorescentne jedinice (FU) DNK fragmenata koje prolaze kroz senzor u specifičnom vremenskom trenutku.
[0055] Vremensko trajanje fragmenta DNK potrebno da se dospe do senzora je pozitivno dovedeno u vezu sa tim fragmentom DNK. Bioanalizator 'Bioanalyzer' ima mogućnost da automatski pretvori vremensko trajanje u veličinu fragmenta upoređivanjem vremena potrebnog za izvođenje uzorka za testiranje sa onim iz mešavine fragmenata DNK sa poznatim dužinama (tj. DNK lancu-lestvicama). Biblioteke DNK sekvenciranja su naknadno sekvencirane korišćenjem masivno paralelnog sekvenciranja i frakcije sekvenci hromozoma Y su korišćene da bi se utvrdile koncentracije frakcije fetusne DNK ovih uzoraka.
[0056] U eksperimentalnom istraživanju sa malom parcelom 400, puna linija 410 predstavlja uzorak UK92797 koji je imao koncentraciju frakcije fetusne DNK od 8,3% i isprekidana linija 420 predstavlja uzorak UK94884 koji je imao koncentraciju frakcije fetusne DNK od 20,3%. Upoređivanje sa uzorkom UK92797, uzorkom UK94884 (uzorak sa više frakcija fetusne DNK) je imao relativno veću količinu DNK u elektroforeznom vremenskom intervalu od 63 sekunda do 73 sekunda (region A) što odgovara DNK veličini od 200 bp do 267 bp i relativno nižoj količini DNK uz
1
elektroforezno vreme od 76s (region B), što odgovara DNK veličini od ~292 bp
[0057] Prema proizvođačevom protokolu, kompleti DNK adaptera i početnica koji su imali ukupnu veličinu od 122 bp su uvedeni u DNK iz plazme za konstruisanje biblioteke sekvenciranja. Samim tim, region A odgovara fragmentima DNK iz plazme približno od 78 bp do 145 bp, i region B odgovara fragmentima DNK iz plazme od približno 170 bp. Takvo oduzimanje je moguće prilagoditi različitim protokolima za konstrukciju DNK biblioteke. Na primer, tokom pripreme biblioteke sekvenciranja sa jednim očitavanjem, ukupna veličina 92 bp od kompleta adapter/početnica bi bila uvedena, pri čemu bi ova veličina bila 119 bp za standardno pripremanje biblioteke sekvenciranja sa uparenim krajem.
[0058] U drugom izvođenju, DNK iz plazme je moguće amplificirati sistemom amplifikacije celog genoma ponatim stručnjacima u ovoj oblasti, npr. komplet kompanije Rubicon Genomics PlasmaPlex WGA kit (www.rubicongenomics.com/products). Zatim su amplifikovani (pojačani) proizvodi analizirani pomoću aparata za bioanalizu Bioanalyzer. Kod još nekih drugih izvođenja, pojačane proizvode je moguće analizirati pomoću elektroforeznog sistema iz npr. kompanije Caliper (www.caliperls.com/products/labchip-systems). Kod još nekih drugih izvođenja, raspodelu veličine DNK iz plazme je moguće analizirati direktno, bez pojačavanja, korišćenjem na primer, uređaja za sekvenciranje na bazi nanopora (npr. kompanije Oxford Nanopore Technologies (www.nanoporetech.com)), ili aparata za sekvenciranje Helico DNA (www.helicosbio.com).
IV. PARAMETRI VELIČINE
[0059] Kao što je pomenuto gore u tekstu, različiti parametri mogu obezbediti statističku meru profila veličine fragmenata DNK u biološkom uzorku. Parametar je moguće definisati korišćenjem veličina svih analiziranih fragmenata DNK, ili samo jednog dela. U jednom izvođenju, parametar obezbeđuje relativno obilje kratkih i dugih fragmenata DNK, pri čemu kratka i duga DNK može da odgovara specifičnim veličinama ili opsezima veličina.
[0060] Da bi se istražilo da li ukupna raspodela veličine DNK majčine plazme može da se koristi za odraz koncentracije frakcije fetusne DNK, koristili smo različite parametre da bi se kvantifikovalo relativno obilje kraktih i dugih DNK, i utvrdila međusobna uslovljenost ovih parametara i koncentracija frakcije fetusne DNK. Rezultati ovih istraživanja su dati u odeljcima dole u tekstu. Parameteri koje smo koristili, samo kao ilustraciju da bismo prikazali, za odražavanje relativnog obilja kratke DNK obuhvataju:
i. Proporcija DNK fragmenata od 150 bp ili niža, koja je označena kao CF (velična ≤ 150)). CF se odnosi na kumulativnu frekvenciju. Dakle, CF (veličina ≤150) se odnosi na zbirnu učestalost fragmenata manjih od ili jednakih sa 150 bp;
ii. Odnos količina DNK fragmenata ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)).
1
iii. Odnos količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)).
iv. Odnos količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)); i
v. Odnos količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)).
[0061] Drugi primeri parametara su frekvencija brojača nekog histograma. U jednom izvođenju, moguće je koristiti više parametara. Na primer, vrednost svakog parametra može dati procenat razlike i zatim procenat proseka koji je moguće utvrditi. U nekom drugom izvođenju, svaki parametar odgovara različitoj dimenziji višedimenzione funkcije kalibracije, pri čemu vrednosti parametara za novi uzorak odgovaraju koordinati na odgovarajućoj višedimenzionalnoj površini.
V. MEĐUSOBNA VEZA VELIČINE PREMA KONCENTRACIJI FRAKCIJE
[0062] Dva kompleta uzorka korišćenjem sekvenciranja se koriste da se ilustruje međusobna veza različitih parametara veličine za koncentraciju frakcije. Analiza veličine elemenata ponavljanja je takođe obezbeđena. Podaci elektroforeze takođe pokazuju međusobnu povezanost između parametara veličine i koncentracije frakcije.
A. Prvi komplet uzoraka
[0063] SL. 5A pokazuje grafikon 500 koji prikazuje proporciju DNK fragmenata koji su 150 bp ili ispod za uzorke koji imaju različiti fetusni DNK procenat u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Proporcija DNK ≤ 150 bp je grafički prikazana u odnosu na koncentraciju frakcije fetusne DNK za 80 uzoraka majčine plazme. Uzorci euploida su predstavljeni punim krugovima. Uzorci za trizomiju 13 (T13) su predstavljeni praznim trouglovima. Uzorci za trizomiju 18 (T18) su predstavljeni praznim romboidima i za trizomiju 21 (T21) su predstavljeni invertovanim praznim trouglovima.
[0064] Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i proporcije DNK ≤ 150 bp za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,787). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK se čini doslednom prema uzorcima sa različitim hromozomskim statusom. Ovi rezultati ukazuju da je analiza parametra veličine korisna za procenjivanje koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorku majčine plazme. U skladu sa tim, tačke podataka na SL.5 moguće je koristiti kao tačke podataka kalibracije iz postupka 300. Zatim, ako je za parametar CF(veličina ≤150) utvrđeno da je 30 za novi uzorak, procenat fetusne DNK moguće je proceniti kao vrednost između oko 7% i 16%. Tačke podataka na SL. 5 je takođe moguće koristiti da bi se utvrdila funkcija kalibracije koja se uklapa u prikazane tačke sirovih
1
podataka.
[0065] SL.5B je grafikon 550 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)). Odnos CF(veličine ≤150)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 80 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i CF(veličina ≤150)/veličine (163-169) odnosa za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,815). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
[0066] SL.6A je grafikon 600 koji prikazuje odnos veličine količina fragmenata DNK od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)). Odnos veličine (140-146)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 80 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličina (140-146)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,808). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
[0067] SL. 6B je grafikon 650 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)). Odnos veličine (140-154)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 80 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličina (140-154)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,802). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK se čini doslednom prema uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
[0068] SL.7 je grafikon 700 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen (veličina(100-150)/veličina(163-169)). Odnos veličine (100-150)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 80 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličine (100-150)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,831). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
B. Drugi komplet uzoraka
[0069] SL.8 je grafikon 800 koji pokazuje proporciju DNK fragmenata koji su 150 bp ili manji za uzorke koji imaju različite fetusne DNK procente u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Proporcija DNK ≤ 150 bp je grafički prikazana naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 48 uzoraka majčine plazme koji su bili masivno paralelno sekvencirani sa uparenim krajem posle ciljnog obogaćenja. Uzorci euploida su predstavljeni punim krugovima. Uzorci za trizomiju 13 (T13) su predstavljeni praznim trouglovima. Uzorci za trizomiju 18 (T18) su
1
predstavljeni praznim romboidima i za trizomiju 21 (T21) su predstavljeni invertovanim praznim trouglovima. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnos DNK ≤ 150 bp za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,816). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije. Ovi rezultati ukazuju da je analiza parametra veličine korisna za procenjivanje koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorku majčine plazme.
[0070] SL.9A je grafikon 900 koji pokazuje raspodelu veličine količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)). Odnos CF(veličine ≤150)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 48 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između odnosa koncentracije frakcije fetusne DNK i CF(veličina ≤150)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0). 776). Pozitivna korelacija između parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
[0071] SL.9B je grafikon 950 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)). Odnos veličine (140-146)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 48 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličina (140-146)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,790). Pozitivna međusobna uslovljenost parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
[0072] SL.10A je grafikon 1000 koji pokazuje odnos veličine količine fragmenata DNK od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)). Odnos veličine (140-154)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 48 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličina (140-154)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0, 793). Pozitivna međusobna uslovljenost parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
[0073] SL.10B je grafikon 1005 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)). Odnos veličine (100-150)/veličine(163-169) je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za 48 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličina (100-150)/veličine (163-169) za sve uzorke (Pearsonov koeficijent korelacije = 0, 798). Pozitivna međusobna uslovljenost parametra veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK je dosledna na uzorcima sa različitim hromozomskim statusom ploidije.
C. Ponavljanja
[0074] Gore u tekstu, pokazali smo da je veličina svih fragmenata DNK koje je moguće mapirati u
2
majčinoj plazmi povezana sa koncentracijom frakcije fetusne DNK. U ovom odeljku, ispitivali smo da li i analiza veličine elemenata ponavljanja u genomu može da se koristi za procenu koncentracije frakcije fetusne DNK u plazmi. U ovom primeru, analizirali smo raspodelu veličine mapiranja DNK fragmenata na Alu ponavljanjima tog genoma.
[0075] SL. 11 je grafikon koji pokazuje odnos veličine testiranog procenta naspram procenta fetusne DNK za veličinu ponovljenih elemenata prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Ovaj primer koristi odnos svih količina fragmenata DNK od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp (veličina(100-150)/veličina(163-169)) da bi se odrazila promena u raspodeli veličine naspram procenta fetusne DNK. Postoji pozitivna međusobna veza između odnosa veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK (Pearsonov koeficijent korelacije = 0,829). Ovaj rezultat nagoveštava da je analizu veličine elemenata ponavljanja moguće koristiti da bi se odredila koncentracija frakcije fetusne DNK u majčinom uzorku.
[0076] Pored toga što koristi masivno paralelno sekvenciranje, drugi postupci, npr. PCR, PCR u stvarnom vremenu i analiza masenom spektrometrijom mogu biti korišćene da bi se utvrdila raspodela veličine elemenata ponavljanja (npr. Alu ponavljanja) u majčinoj plazmi. U jednom izvođenju, DNK u uzorku majčine plazme može biti ligovan na linker. Zatim, PCR analizu je moguće izvesti korišćenjem jedne početnice specifične za Alu sekvence i drugu početnicu specifičnu za linker. Posle PCR, PCR proizvodi bi mogli biti analizirani za njihove veličine, npr. elektroforezom, masenom spektrometrijom, ili masivno paralelnim sekvenciranjem. Ovo bi omogućilo očitavanje veličina sekvenci izvedenih iz Alu ponavljanja u majčinoj plazmi. Ovu je strategiju moguće koristiti za drugu ciljnu sekvencu ili familiju sekvence. Pored toga, PCR može da prati ugneždena PCR koja obuhvata još jednu Alu-specifičnu početnicu, u kombinaciji sa bilo istom za linker specifičnom početnicom ili ugneždenom početnicom unutar linkera. Takva ugneždena PCR bi imala prednost povećanja specifičnosti amplifikacije prema sekvenci od interesovanja (u ovom slučaju to su Alu sekvence).
[0077] Jedna prednost korišćenja ponovljenih elemenata je to što imaju relativno visok broj kopija i tako mogu biti lakše da se analiziraju. Na primer, moguće je koristiti manje ciklusa amplifikacije. Takođe, sa većim brojem kopija, analitička preciznost je potencijalno viša. Potencijalni nedostatak je što izvesne klase elemenata ponavljanja mogu imati broj kopija koji varira od pojedinca do pojedinca.
D. Elektroforeza
[0078] SL. 12A je elektroferogram 1200 koji je moguće koristiti da bi se utvrdio odnos veličine prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Za sve analizirane biblioteke DNK, postoji oštra vršna vrednost na približno 292 bp, posle koje sledi sekundarna vršna vrednost koja se kreće u opsegu od 300 bp do 400 bp. Kako područje pod krivuljom za opseg veličine može predstavljati relativnu količinu fragmenata DNK iz tog regiona, koristili smo odnos područja regiona A (od 200 bp do 267 bp) i B (od 290 bp do 294 bp) da bismo kvantifikovali relativno obilje kratkih i dugih DNK fragmenata. Prvo smo ručno podesili polaznu vrednost jedinica fluorescencije (FU) na 0 i zatim smo generisali područje za izabrani region.
[0079] SL.12B je grafikon 1250 koji pokazuje odnos veličine količina DNK fragmenata od 200 bp do 267 bp i DNK od 290 bp do 294 bp (tj. odnos područja regiona A i B pokazan na elektroferogramu) za uzorke koji imaju različite procente fetusne DNK u majčinoj plazmi prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Bio je jedan slučaj T13 koji pokazuje nisku 292-bp vršnu vrednost sa vrednošću jedinica fluorescencije (FU) od 6,1, pri čemu su svi drugi slučajevi pokazali FU vrednost ≥ 20 jedinica fluorescencije (FU). Kako bi niska jedinica fluorescencije (FU) vrednost učinila merenje područja nepreciznim, ovaj slučaj je ignorisan iz analize. Odnos područja regiona A i B je grafički prikazan naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za svih drugih 79 uzoraka majčine plazme. Postoji pozitivan odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa područja A i B za ove uzorke (Pearson koeficijent korelacije = 0,723).
VI. UTVRĐIVANJE TAČAKA PODATAKA KALIBRACIJE
[0080] Kao što je pomenuto gore u tekstu, tačke podataka kalibracije moguće je definisati na raznovrsne načine. Pored toga, tačke podataka kalibracije moguće je dobiti na raznorazne načine. Na primer, tačke podataka kalibracije moguće je jednostavno pročitati iz memorije kao niza vrednosti kalibracije parametra zajedno sa odgovarajućom koncentracijom frakcije. Takođe, funkciju kalibracije moguće je pročitati iz memorije (npr. linearnu ili nelinearnu funkciju sa unapred određenim oblikom funkcije), pri čemu ta funkcija definiše tačke podataka kalibracije. Kod nekih izvođenja, tačke podataka kalibracije moguće je izračunati iz izmerenih podataka iz uzoraka kalibracije.
A. Postupak
[0081] SL.13 je grafikon toka postupka 1300 za određivanje tačaka podataka kalibracije na osnovu merenja napravljenih od uzoraka kalibracije prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Uzorci kalibracije obuhvataju klinički relevantnu DNK i drugu DNK.
[0082] U bloku 1310, dobija se više uzoraka kalibracije. Uzorke kalibracije moguće je dobiti kako je ovde opisano. Svaki uzorak je moguće analizirati zasebno preko odvojenih eksperimenata ili preko nekih sredstava identifikacije (npr. označavanjem fragmenta DNK barkodom) da bi se identifikovalo od kog je uzorka neki molekul. Na primer, uzorak kalibracije je moguće dobiti na mašini, npr. mašini za sekvenciranje, koja izvozi podatke merenja (npr. očitavanja sekvence) koje je moguće koristiti da bi se utvrdile veličine fragmenata DNK, ili se dobija na mašini za elektroforezu.
[0083] U bloku 1320, koncentracija frakcije klinički relevantne DNK se meri u svakom od više uzoraka kalibracije. U različitim izvođenjima merenje koncentracije fetusne DNK, moguće je koristiti od oca nasleđene sekvence ili epigenetskih markera specifičnih za fetus. Na primer, alel nasleđen od oca ne bi postojao u genomu trudnice i mogao bi biti detektovan u majčinoj plazmi u procentu koji je proporcionalan koncentraciji frakcije fetusne DNK. Epigenetski markeri specifični za fetus mogu obuhvatiti DNK sekvence koje ispoljavaju obrasce metilacije DNK specifične za fetus ili placentu u plazmi majke.
[0084] U bloku 1330, količine DNK fragmenata iz svakog uzorka kalibracije se mere za različite veličine. Te veličine je moguće izmeriti kako je ovde opisano. Te veličine je moguće prebrojati, grafički prikazati, koristiti da se napravi histogram, ili drugi postupak sortiranja da bi se dobili podaci u vezi sa profilom veličine uzorka kalibracije.
[0085] U bloku 1340, vrednost kalibracije se izračunava za neki parametar na osnovu količina fragmenata DNK na više veličina. Vrednost kalibracije moguće je izračunati za svaki uzorak kalibracije. U jednom izvođenju, isti parametar se koristi za svaku vrednost kalibracije. Međutim, izvođenja mogu koristiti više parametara kako je ovde opisano. Na primer, ukupna zbirna frakciju fragmenata DNK manja od 150 baza moguće je koristiti kao parametar, i uzorci sa različitom koncentracijom frakcije bi verovatno imali različite vrednosti kalibracije. Tačku podataka kalibracije moguće je odrediti za svaki uzorak, pri čemu tačka podataka kalibracije obuhvata vrednost kalibracije i izmerenu koncentraciju frakcije za taj uzorak. Ove tačke podataka kalibracije moguće je koristiti u postupku 300, ili ih je moguće koristiti da bi se odredile finalne tačke podataka kalibracije (npr., kako je definisano preko funkcionalnog uklapanja).
[0086] U bloku 1350, utvrđuje se funkcija koja aproksimira vrednosti kalibracije na skupu od više koncentracija frakcije. Na primer, linearnu funkciju je moguće ugraditi u vrednosti kalibracije kao funkciju koncentracije frakcije. Linearna funkcija može definisati tačke podataka kalibracije koje treba koristiti u postupku 300.
[0087] Kod nekih izvođenja, vrednosti kalibracije za više parametara je moguće izračunati za svaki uzorak. Vrednosti kalibracije za neki uzorak mogu definisati višedimenzionu koordinatu (pri čemu je svaka dimenzija za svaki parametar) koja zajedno sa koncentracijom frakcije može da obezbedi tačku podataka. Dakle, u jednoj primeni, višedimenzionu funkciju je moguće ugraditi u sve višedimenzione tačke podataka. U skladu sa tim, višedimenzionu krivulju kalibracije moguće je koristiti, pri čemu različite vrednosti parametara mogu efikasno da budu unete u jednu funkciju kalibracije koja izvozi koncentraciju frakcije. Pored toga, pojedinačna funkcija kalibracije može kao rezultat nastati iz funkcionalnog uklapanja svih tačaka podataka dobijenih iz uzoraka kalibracije.
B. Merenje koncentracije tumorozne DNK
[0088] Kao što je pomenuto, izvođenja je moguće takođe primeniti na koncentraciju tumorozne DNK, u biološkom uzorku. Primer koji obuhvata određivanje koncentracije frakcije tumorozne
2
DNK sledi u nastavku opisa.
[0089] Prikupili smo uzorke plazme od dva pacijenta koji boluju od hepatoćelijskog karcinoma (HCC) pre i posle hirurške resekcije tumora. Analiza veličine je izvedena korišćenjem masivno paralelnog sekvenciranja sa uparenim krajem (PE). Biblioteke sekvenciranja DNK iz majčine plazme su konstruisane kako je prethodno opisano (Lo YM et al. Sci Transl Med 2010; 2:61ra91). Sve biblioteke su sekvencirane pomoću aparata HiSeq 2000 (Illumina) korišćenjem formata 50-bp X 2 PE. Očitavanja sekvence 50-bp su poravnata sa neponovljenim maskiranim humanim referentnim genomom (Hg18) (http://genome.ucsc.edu), korišćenjem Short Oligonucleotid Alignment Program 2 (SOAP2) (soap.genomics.org.cn). Veličina svakog sekvenciranog fragmenta je zasnovana na koordinatama najspoljašnjijih nukleotida na svakom kraju poravnatih fragmenata.
[0090] Genotipovali smo DNK ekstrahovanu iz ćelija krvi i uzorka tumora iz pacijenata bolesnih od hepatoćelijskog karcinoma (HCC) korišćenjem sistema mikroniza Affymetrix SNP6.0. U svakom slučaju, regioni koji pokazuju gubitak heterozigotnosti (LOH) u tkivu tumora su identifikovani korišćenjem uređaja za analizu gena Affymetrix v4.0 (Affymetrix Genotyping Console v4.0) na osnovu intenziteta različitih alela SNP mesta. Koncentracije frakcije DNK izvedene iz tumora (F) su procenjene iz razlike u količinama sekvenci koje nose izbrisane i neizbrisane alele na LOH regionima korišćenjem sledeće formule: F = (A-B) / A x 100%, pri čemu je A broj očitavanja sekvenci koje nose neizbrisane alele na heterozigotima SNP-a u LOH regionima, i B je broj očitavanja sekvenci koje nose izbrisane alele za heterozigote SNP-a u LOH regionima. Tabela 3 pokazuje rezultate.
Tabela 3 pokazuje informaciju sekvenciranja i izmerenu koncentraciju frakcije tumorozne DNK u uzorcima plazme.
[0091] U još jednom izvođenju, moguće je koristiti lokus koji ispoljava duplikaciju. Na primer, tumor može da ispolji povećanje od jedne kopije jednog od dva homologna hromozoma tako da se alel duplira. Tada, stručnjak može da utvrdi prvu količinu A očitavanja sekvenci koje imaju neduplirane alele na jednom ili više heterozigotnih mesta (npr., SNP) i drugu količinu B očitavanja sekvence koja ima duplirani alel na mestima heterozigota. Koncentraciju frakcije F klinički relevantne DNK je moguće izračunati kao odnos prve količine i druge količine korišćenjem odnosa (B - A) / A.
[0092] U drugom izvođenju, moguće je koristiti jedno ili više mesta homozigota. Na primer, čovek može da identifikuje jedno ili više mesta gde je pacijent homozigotan i gde je jedna mutacija nukleotida prisutna u tumoroznom tkivu. U tom slučaju, prvu količinu A očitavanja sekvence sa alelom divljeg tipa moguće je utvrditi na jednom ili više mesta homozigota. I, drugu količinu B očitavanja sekvence sa mutiranim alelom moguće je utvrditi na jednom ili više mesta homozigota. Koncentraciju frakcije F klinički relevantne DNK je moguće izračunati kao odnos prve količine i druge količine korišćenjem odnosa 2B/(A+B).
C. Primer funkcionalnog uklapanja u tačke podataka
[0093] Primer izvođenja funkcionalnog uklapanja u vrednosti parametra utvrđen iz uzoraka kalibracije se sada opisuje. Analizirani su uzorci plazme od 80 trudnica od kojih svaka nosi jednostruki muški fetus. Od ovih 80 trudnica, 39 su nosile euploidni fetus, 13 je nosilo fetus sa trizomijom 13 (T13), 10 su nosile fetus sa trizomijom 18 (T18), i 18 su nosile fetus sa trizomijom 21 (T21). Prosečna starost trudnoće trudnica je bila 13 nedelja i 1 dan. DNK je ekstrahovana iz uzoraka plazme i sekvencirana korišćenjem platforme Illumina HiSeq2000 kao što su opisali (Zheng YW et al. Clin Chem. 2012;58:549-58.) osim što je sekvenciranje izvedeno u 8-strukom formatu. Za svaki DNK molekul, 50 nukleotida je sekvencirano iz svakog od dva kraja i poravnato na referentni genom (hg18).
[0094] Veličina sekvenciranog molekula je zatim izvedena iz koordinata najspoljnijeg nukleotida na oba kraja. Za svaki uzorak, srednja vrednost od 11,1 miliona fragmenata sekvenciranih i poravnatih jedinstveno na referentni genom. Odnos je izračunat podelom proporcije DNK molekula sa veličinom 100 bp do 150 bp proporcionisanjem DNK molekula sa veličinom 163 bp do 169 bp i ovaj odnos je poznat pod pojmom odnos veličine. Kako je kod svih 80 trudnoća nošen muški fetus, proporcija očitavanja sekvenci koje su bile jedinstveno poravnate sa Y hromozomom korišćena da se utvrdi koncentracija frakcije fetusne DNK u svakom uzorku DNK iz plazme.
[0095] Uzorci su bili nasumično podeljeni u dva kompleta, naime komplet za obuku i komplet validacije. Odnos između koncentracije frakcije fetusne DNK i odnosa veličine je utvrđen na osnovu uzoraka u kompletu za obuku korišćenjem linearne regresije. U tom slučaju, odnos veličine je korišćen da se izvede koncentracija frakcije fetusne DNK za postavku validacije korišćenjem formule linearne regresije. Validacija se razmatra u sledećem odeljku.
[0096] SL.14A je grafikon 1400 odnosa veličine naspram koncentracije frakcije fetusne DNK za komplet za obuku prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Kao što je pomenuto gore u tekstu, odnos veličine se izračunava podelom odnosa DNK molekula sa veličinom 100 bp do 150 bp prema delu DNK molekula sa veličinom 163 bp do 169 bp. Odnos veličine se iscrtava naspram
2
koncentracije frakcije fetusne DNK, kako je prikazano podacima na grafikonu 1405. Prazni krugovi predstavljaju euploidne slučajeve. Ispunjeni simboli predstavljaju aneuploidne slučajeve (kvadrat T13, krug T18 i trougao za T21). Linearni regresioni pravac 1410 koji nastaje kao rezultat iz funkcionalnog uklapanja u tačke grafikona. Funkcionalno uklapanje je moguće izvesti preko bilo kojih pogodnih tehnika, npr. najmanjih kvadrata. Pravac 1410 je moguće koristiti da bi se procenile vrednosti parametara izmerenih za druge primerke, koji nisu u kompletu obuke. Svaki deo pravca 1410 može da se posmatra kao kalibraciona tačka podataka.
VII. POREĐENJE SA KALIBRACIONIM TAČKAMA PODATAKA
[0097] Kao što je pomenuto gore u tekstu, kalibracione tačke podataka je moguće koristiti da bi se utvrdila koncentracija frakcije klinički relevantne DNK. Na primer, tačke 1405 primarnih podataka na SL. 14A moguće je koristiti da bi se dobio opseg koncentracije frakcije DNK za specifičnu vrednost kalibracije (označeni odnos veličine na SL.14A), pri čemu je opseg moguće koristiti da bi se odredilo da li je koncentracija frakcije iznad količine praga vrednosti. Umesto opsega, moguće je koristiti prosek koncentracija frakcije u specifičnom odnosu veličine. Na primer, koncentracija frakcije koja odgovara merenju od 1,3 kao odnosu veličine u novom uzorku može biti određena kao prosečna koncentracija izračunata iz dve tačke podataka na 1,3. U jednom izvođenju, moguće je koristiti funkcionalno uklapanje (npr. pravac 1410).
[0098] SL.14B je grafikon 1450 koncentracija frakcije izvedenih (procenjenih) iz linearne funkcije 1410 sa SL. 14A naspram koncentracija frakcije izmerenih korišćenjem sekvenci specifičnih za fetus prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Korišćenjem regresione jednačine (tj. pravac 1410) je utvrdilo na osnovu podataka iz kompleta za obuku, odnos veličine utvrđen za uzorak validacije je korišćen da se izvede koncentracija frakcije fetusne DNK za uzorke iz kompleta validacije. Izmerene koncentracije frakcije odgovaraju udelu sekvenci hromozoma Y u uzorku DNK iz plazme (tj. udeo poravnanja očitavanja sekvenci sa hromozomom Y).
[0099] Linija 1460 predstavlja savršeni odnos između dva kompleta vrednosti. Odstupanje od tačke 1455 grafikona ukazuje koliko je precizna bila procena, sa tačkama na pravcu 1460 koje su savršeno precizne. Kao što je ovde zabeleženo, procena ne mora da bude savršeno precizna, jer željeni test može jednostavno da bude da se utvrdi da li je dovoljan procenat klinički relevantne DNK u biološkom uzorku. Prazni krugovi predstavljaju euploidne slučajeve. Ispunjeni simboli predstavljaju slučajeve aneuploidije (kvadrat za T13, krug za T18 i trougao za T21). Srednja razlika između koncentracije frakcije fetusne DNK izvedene iz odnosa veličine i koja je izmerena iz proporcije sekvenci hromozoma Y je bila 2,1%. Razlika je bila manja od 4,9% u 90% ovih uzoraka.
[0100] Uzorci sa različitim statusom ploidije su korišćeni i u kompletu kalibracije i u kompletu validacije. Kako je prikazano na SL.14A, odnos između odnosa veličine i koncentracije frakcije fetusne DNK su bili usklađeni u svim uzorcima koji su imali status različite ploidije. Kao rezultat, koncentraciju frakcije fetusne DNK moguće je izvesti iz odnosa veličine uzorka bez prethodnog
2
znanja statusa ploidije uzorka kao što je prikazano na SL. 14B. Jedna krivulja kalibracije je korišćena za uzorke sa različitim statusom ploidije i, otuda, ne treba da znamo status ploidije uzorka pre upotrebe izvođenja da bi se utvrdila koncentracija frakcije fetusne DNK.
VIII. KANCER
[0101] Kao što je ovde opisano, izvođenja je moguće koristiti da bi se procenila koncentracija frakcije tumorozne DNK u biološkom uzorku. Kao u primerima sa fetusima, uzorke kalibracije je moguće koristiti da bi se utvrdile korelacione tačke podataka, npr. uklapanjem funkcije (npr. linearne funkcije) sa tačkama podatka koje pokazuju korelaciju između vrednosti parametra veličine i izmerene koncentracije frakcije.
A. Međusobna uslovljenost veličine i koncentracije tumorozne DNK
[0102] SL.15A je grafikon 1500 koji pokazuje udeo DNK fragmenata od 150 bp ili manje za uzorke koji imaju različite procente tumorozne DNK u plazmi dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre i posle resekcije tumora prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Udeo DNK ≤ 150 bp je iscrtan u odnosu na koncentracije frakcije tumorozne DNK za dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre (puni krugovi) i posle (prazni krugovi) resekcije tumora. Dva prazna kruga su veoma bliska po mestu jedan drugom (u praksi jedan na drugom). Ovi rezultati ukazuju da je analiza parametra veličine korisna za procenu koncentracije frakcije tumorozne DNK u uzorku plazme pacijenata obolelih od hepatoćelijskog karcinoma (HCC). Postoji smanjenje i u koncentraciji frakcije tumorozne DNK i proporciji fragmenata DNK od ≤150 bp posle resekcije tumora. Ispunjeni krug 1505 odgovara uzorku sa mnogo nižim procentom tumorozne DNK, koji se dovodi u vezu sa manjom veličinom tumora. Drugim rečima, pacijent sa većim tumorom ima veći udeo kratke DNK što se odražava većim udelom CF( ≤150 bp) u poređenju sa pacijentom sa manjim tumorom.
[0103] SL.15B je grafikon 1550 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora. Odnos CF(veličina ≤150)/veličina(163-169) je grafički prikazan u odnosu na koncentracije frakcije tumorozne DNK za dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre (puni krugovi) i posle (prazni krugovi) resekcije tumora. Dva prazna kruga su veoma bliska po lokaciji jedan drugom. Postoji smanjenje i kod koncentracije frakcije tumorozne DNK i odnosa veličine posle resekcije tumora.
[0104] SL.16A je grafikon 1600 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)), za dva pacijenta sa hepatoćeljiskim karcinomom (HCC) pre i posle resekcije tumora. Odnos veličina(140-146)/veličina(163-169) je grafički prikazan u odnosu na koncentracije frakcije tumorozne DNK za dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre (puni krugovi) i posle
2
(prazni krugovi) resekcije tumora. Postoji smanjenje i kod koncentracije frakcije tumorozne DNK i odnosa veličine posle resekcije tumora.
[0105] SL.16B je grafikon 1650 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)), za dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre i posle resekcije tumora. Odnos veličina(140-154)/veličina(163-169) je grafički prikazan u odnosu na koncentracije frakcije tumorozne DNK za dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre (puni krugovi) i posle (prazni krugovi) resekcije tumora. Postoji smanjenje i kod koncentracije frakcije tumorozne DNK i odnosa veličine posle resekcije tumora.
[0106] SL.17 je grafikon 1700 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)), za dva pacijenta sa hepatoćeljiskim karcinomom (HCC) pre i posle resekcije tumora. Odnos veličina(100-150)/veličina(163-169) je grafički prikazan u odnosu na koncentracije frakcije tumorozne DNK za dva pacijenta sa hepatoćelijskim karcinomom (HCC) pre (puni krugovi) i posle (prazni krugovi) resekcije tumora. Postoji smanjenje i kod koncentracije frakcije tumorozne DNK i odnosa veličine posle resekcije tumora.
B. Smanjenje veličine zahvaljujući lečenju
[0107] SL. 18A je grafikon 1800 koji pokazuje odnos DNK fragmenata od 150 bp ili ispod za pacijente sa hepatoćeljiskim karcinomom (HCC) pre i posle resekcije tumora. Par uzoraka od istog pacijenta sa kancerom je prikazan identičnim simbolima povezanim isprekidanom linijom. Postoji opšte smanjenje udela DNK ≤ 150 bp za DNK iz plazme kod pacijenata sa kancerom posle resekcije tumora.
[0108] Odvajanje prema vrednostima udela za podatke pre lečenja i posle lečenja prikazuje vezu između postojanja tumora i vrednosti parametra veličine. Odvajanje prema vrednostima za podatke pre lečenja i posle lečenja je moguće koristiti da bi se utvrdilo koliko je uspešno bilo lečenje, npr., upoređivanjem udela prema pragu vrednosti, pri čemu udeo ispod praga vrednosti može da ukaže na uspeh. U još jednom primeru, razliku između vrednosti pre lečenja i vrednosti posle lečenja moguće je uporediti sa pragom vrednosti.
[0109] Udeo (ili bilo koja druga vrednost parametra veličine) moguće je takođe koristiti da bi se detektovala pojava tumora. Na primer, moguće je utvrditi polaznu vrednost za parametar veličine. U tom slučaju, nešto kasnije, vrednost za parametar veličine je moguće ponovo izmeriti. Ako vrednost parametra veličine pokaže značajnu promenu, onda pacijent može da bude pod većim rizikom da oboli od tumora. Ako se vrednost parametra veličine ne razlikuje mnogo među pojedincima, što SL.18A pokazuje da udeo to ne čini (tj. jer su vrednosti posle lečenja iste), onda je istu polaznu vrednost moguće koristiti za druge pacijente. Dakle, polazna vrednost ne treba da se uzme za svakog pacijenta.
2
[0110] SL.18B je grafikon 1850 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od ≤150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (CF(veličina ≤150)/veličina(163-169)), za HCC pacijente pre i posle resekcije tumora. Par uzoraka od istog pacijenta sa kancerom je prikazan identičnim simbolima povezanim isprekidanom linijom. Postoji smanjenje u odnosu veličine za dva slučaja posle resekcije tumora.
[0111] SL.19A je grafikon 1900 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 146 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-146)/veličina(163-169)), za dva HCC pacijenta pre i posle resekcije tumora. Par uzoraka od istog pacijenta sa kancerom je prikazan identičnim simbolima povezanim isprekidanom linijom. Postoji smanjenje u odnosu veličine za dva slučaja posle resekcije tumora.
[0112] SL.19B je grafikon 1950 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 140 bp do 154 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(140-154)/veličina(163-169)), za dva pacijenta sa hepatoćelijskim tumorom (HCC) pre i posle resekcije tumora. Par uzoraka od istog pacijenta sa kancerom je prikazan identičnim simbolima povezanim isprekidanom linijom. Postoji smanjenje u odnosu veličine za dva slučaja posle resekcije tumora.
[0113] SL.20 je grafikon 2000 koji pokazuje odnos veličina količina DNK fragmenata od 100 bp do 150 bp i DNK od 163 bp do 169 bp, koji je označen kao (veličina(100-150)/veličina(163-169)), za pacijente sa hepatoćeljiskim karcinomom (HCC) pre i posle resekcije tumora. Par uzoraka od istog pacijenta sa kancerom je prikazan identičnim simbolima povezanim isprekidanom linijom. Postoji smanjenje u odnosu veličine za dva slučaja posle resekcije tumora.
C. Postupak
[0114] SL. 21 je dijagram toka koji ilustruje postupak 2100 za analiziranje biološkog uzorka organizma da bi se odredila klasifikacija nivoa kancera prema izvođenjima iz ovog pronalaska. Postupak 2100 može analizirati biološki uzorak organizma (npr., čoveka). Biološki uzorak obuhvata DNK koja potiče od normalnih ćelija i potencijalno od ćelija povezanih sa kancerom. Barem nešto od DNK je bez ćelije u tom biološkom uzorku. Varijantna rešenja postupaka 300 i 1300 moguće je koristiti sa izvođenjima iz postupka 2100.
[0115] U bloku 2110, meri se količina DNK fragmenata koji odgovaraju različitim veličinama. Za svaku veličinu koja ima više veličina, količina više fragmenata DNK iz tog biološkog uzorka odgovara veličini koju je moguće izmeriti, kao što je opisano za postupak 300. Više fragmenata DNK moguće je izabrati nasumično ili preferencijalno izabrati iz jednog ili više unapred utvrđenih regiona genoma. Na primer, moguće je izvesti ciljano obogaćivanje ili je moguće koristiti odabir očitavanja sekvence koja su iz specifičnih regiona genoma, npr. kao što je opisano gore u tekstu.
[0116] U bloku 2120, prva vrednost prvog parametra se izračunava na osnovu količina fragmenata DNK na više veličina. U jednom varijantnom rešenju, prvi parametar obezbeđuje statističku meru profila veličine (npr. histograma) fragmenata DNK u biološkom uzorku. Parametar je moguće
2
pomenuti kao parametar veličine jer je određen iz veličine više fragmenata DNK. Primeri ovde datog parametra. Moguće je koristiti više parametara, što je takođe opisano ovde.
[0117] U bloku 2130, prva vrednost se poredi sa referentnom vrednošću. Primeri referentne vrednosti obuhvataju normalnu vrednost i graničnu vrednost koja je precizirano rastojanje od normalne vrednosti (npr. u jedinicama standardnog odstupanja). Referentnu vrednost je moguće utvrditi iz različitog uzorka od istog organizma (npr. kada je bilo poznato da je organizam bio zdrav). Dakle, referentna vrednost može odgovarati vrednosti prvog parametra utvrđenog iz uzorka kada se smatralo da organizam nema kancer. U jednom izvođenju, biološki uzorak je dobijen iz organizma posle lečenja i referentna vrednost odgovara vrednosti prvog parametra utvrđenoj iz uzorka uzetog pre lečenja (npr. kao što je prikazano gore). Referentnu vrednost je moguće utvrditi i iz uzoraka drugih zdravih organizama.
[0118] U bloku 2140, klasifikacija nivoa kancera u tom organizmu je unapred utvrđena na osnovu poređenja. U različitim izvođenjima, klasifikacija može biti brojčana, tekstualna, ili neki drugi indikator. Klasifikacija može da ima binarni rezultat da ili ne, što se tiče kancera, verovatnoću ili drugi zbir, koji može biti apsolutna ili negativna vrednost, npr. u odnosu na prethodnu klasifikaciju organizma u nekom prethodnom vremenskom periodu. U jednoj primeni, klasifikacija je što taj organizam nema kancer ili što je taj nivo kancera smanjen. U jednoj drugoj primeni, klasifikacija je što taj organizam nema kancer ili što je taj nivo kancera povećan.
[0119] Kao što je ovde opisano, nivo kancera može da obuhvati postojanje kancera, stadijum kancera, ili veličinu tumora. Na primer, bilo da prva vrednost prekoračuje (tj., da je veća od ili manja od, zavisno od toga kako se definiše prvi parametar) moguće ju je koristiti da bi se utvrdilo da li kancer postoji, ili barem verovatnoću (npr. procenat verovatnoće). Nivo iznad praga vrednosti može obezbediti povećanu verovatnoću, što može da dovede do upotrebe više pragova vrednosti. Pored toga, nivo iznad može da odgovara drugačijem nivou kancera, npr. više tumora ili veći tumori. Dakle, izvođenja mogu dijagnostikovati, stadijum, prognosticirati, ili nadgledati napredovanje nivoa kancera u tom organizmu.
D. Utvrđivanje veličine raspodele za specifične regione
[0120] Kao i u slučaju drugih izvođenja, prvi komplet fragmenata DNK može odgovarati jednom ili više unapred utvrđenih regiona genoma tog organizma. Dakle, analizu veličine je takođe moguće izvesti za odabrane regione, npr. specifične hromozome, krake hromozoma, ili više regiona (podskupa veće grupacije) iste dužine, npr., 1 Mb. Na primer, moguće je usredsređivanje na regione koji se često menjaju u tipu kancera koji je predmet proučavanja. Tabela 2200 za SL.
22 pokazuje neke česte nepravilnosti hromozoma koje se vide kod različitih tipova kancera. Pojačanje se odnosi na amplifikaciju hromozoma jednom ili više dodatnih kopija unutar specifičnog segmenta i gubitak se odnosi na brisanja jednog ili više homolognih hromozoma unutar specifičnog segmenta.
[0121] U jednom izvođenju, dodatne skupove DNK fragmenata je moguće identifikovati iz biološkog uzorka. Svaki skup DNK fragmenata može odgovarati različitim unapred utvrđenim regionima, kao što su regioni precizirani u tabeli 2200. Regione koji nisu povezani sa kancerom je takođe moguće koristiti, npr. da bi se utvrdila referentna vrednost. Količinu fragmenata DNK koji odgovaraju različitim veličinama je moguće utvrditi i vrednost veličine nekog parametra je moguće utvrditi za svaki dodatni skup/komplet fragmenata DNK, kao što je ovde opisano. Dakle, različitu vrednost veličine je moguće utvrditi za svaki genomski region, pri čemu postoji poklapanje jedan-jedan između skupa DNK fragmenata i genomskog regiona.
[0122] Svaka od vrednosti veličine može biti upoređena sa odgovarajućom referentnom vrednošću. Moguće je identifikovati unapred utvrđene regione kod kojih je odgovarajuća vrednost veličine drugačija nego što je odgovarajuća referentna vrednost. Kada je referentna vrednost normalna vrednost, određivanje statističke razlike je moguće učiniti upoređivanjem vrednosti veličine sa graničnom (npr. gde je granična vrednost specifičan broj standardnih odstupanja od normalne vrednosti, na osnovu pretpostavljene ili izmerene statističke raspodele). Odgovarajuće referentne vrednosti mogu biti iste ili drugačije za različite regione. Na primer, različiti regioni mogu imati različite normalne vrednosti za veličinu.
[0123] U jednom izvođenju, broj regiona statistički drugačijih od referentne vrednosti moguće je koristiti da bi se utvrdila klasifikacija. Dakle, moguće je utvrditi broj identifikujućih predodređenih regiona gde je odgovarajuća vrednost veličine statistički drugačija od odgovarajuće referentne vrednosti. Broj je moguće uporediti sa brojem praga vrednosti regiona da bi se odredila klasifikacija nivoa kancera u organizmu. Broj praga vrednosti moguće je utvrditi na osnovu odstupanja u okviru normalnih uzoraka i u okviru uzoraka zahvaćenih kancerom.
[0124] Kao što je istaknuto u tabeli 2200, različiti kanceri se dovode u vezu sa različitim delovima genoma. Dakle, koji regioni koji su statistički različiti mogu biti korišćeni da bi se utvrdio jedan ili više mogućih tipova kancera kada se mogući tipovi kancera dovode u vezu sa identifikovanim regionima. Na primer, ako se za vrednost veličine za DNK fragmente iz segmenta 7p hromozoma utvrdi da je značajno niža od normalne vrednosti (npr., kako je utvrđeno putem granične vrednosti), onda je kolorektalni kancer moguće identifikovati kao verovatni kancer kada klasifikacija označava da taj kancer postoji. Treba imati u vidu da je vrednost veličine za segment 7p hromozoma moguće koristiti kao jedini indikator da bi se utvrdila klasifikacija, ili je moguće koristiti više regiona. U jednom izvođenju, samo ako ukupna klasifikacija ukazuje da bi kancer imao vrednost veličine za segment 7p hromozom da se koristi za identifikovanje kolorektalnog kancera kao verovatnog oblika kancera.
IX. RAČUNARSKI SISTEM
[0125] Bilo koji od ovih računarskih sistema pomenutih ovde može koristiti bilo koji pogodan broj podsistema. Primeri takvih podsistema su prikazani na SL.23 u računarskom aparatu 2300. Kod
1
nekih izvođenja, računarski sistem obuhvata jedan računarski aparat, pri čemu podsistemi mogu biti komponente aparata računara. Kod drugih izvođenja, računarski sistem može obuhvatiti više računarskih aparata, svaki je podsistem, sa internim komponentama.
[0126] Podsistemi prikazani na SL.23 su međusobno povezani preko sistemske sabirnice 2375. Prikazani su dodatni podsistemi kao što je štampač 2374, tastatura 2378, fiksni disk 2379, monitor 2376, koji je spojen da prikaže adapter 2382, i drugi. Periferni uređaji za ulaz/izlaz (I/O), koji se spoje na I/O kontroler 2371, mogu biti priključeni na računarski sistem bilo kojim poznatim brojem uređaja poznatih u ovoj oblasti, kao što je serijski ulaz 2377. Na primer, serijski ulaz 2377 ili spoljni interfejs 2381 (npr. Eternet, Wi-Fi, itd.) moguće je koristiti da bi se priključio računarski sistem 2300 na mrežu širokog područja kao što je Internet, uređaj za priključenje miša, ili skener. Međusobna povezanost preko sistemske sabirnice 2375 omogućava centralnom procesoru 2373 da komunicira sa svakim podsistemom i da kontroliše izvršavanje instrukcija iz sistemske memorije 2372 ili fiksnog diska 2379, kao i razmenu informacija između podsistema. Sistemska memorija 2372 i/ili fiksni disk 2379 mogu obuhvatiti računarski čitljiv nosač podataka. Bilo koja od ovde pomenutih vrednosti može biti izvezena iz jedne komponente do druge komponente i može biti izvezena do korisnika.
[0127] Računarski sistem može obuhvatiti više istih komponenata ili podsistema, npr., priključenih međusobno pomoću spoljnjeg interfejsa 2381 ili unutrašnjeg interfejsa. Kod nekih izvođenja, računarski sistemi, podsistem, ili aparati mogu da komuniciraju preko mreže. U takvim primerima, jedan računar može da se smatra klijentom i drugi računar serverom, pri čemu svaki može biti deo istog računarskog sistema. I klijent i server mogu da obuhvate više sistema, podsistema, ili komponenata.
[0128] Treba razumeti da je bilo koje od izvođenja ovog pronalaska moguće ugraditi u obliku kontrolne logike upotrebom hardvera (npr. specifičnog integrisanog kola za neku aplikaciju ili programabilno polje pojasnog niza (FPGA)) i/ili korišćenjem računarskog softvera sa generalno programabilnim procesorom na modularni ili integrisani način. Na osnovu opisa i objašnjenja datih ovde, prosečan stručnjak u ovoj oblasti će znati i razumeti druge načine i/ili postupke za primenu izvođenja ovog pronalaska korišćenjem hardvera i kombinacije hardvera i softvera.
[0129] Bilo koja od softverskih komponenata ili funkcija opisanih u ovoj prijavi moguće je primeniti kao softverski kod koji treba da izvrši procesor upotrebom pogodnog kompjuterskog jezika kao što je, na primer, Java, C++ ili Perl upotrebom, na primer uobičajenih ili cilju orijentisanih tehnika. Softverski kod je moguće sačuvati kao niz instrukcija ili naredbi na kompjuterski čitljivom nosaču podataka za skladištenje i/ili prenos, pogodnih nosača podataka uključujući radnu memoriju (RAM), memoriju samo za čitanje (ROM), magnetni nosač podataka kao što je čvrsti disk ili disketna jedinica, ili optički nosač podataka kao što je kompakt disk (CD) ili DVD (digitalni višenamenski disk), fleš memorija, i slično. Kompjuterski čitljiv nosač podataka može biti bilo koja kombinacija takvog uređaja za skladištenje ili prenos podataka.
[0130] Takve programe je takođe moguće kodirati i preneti korišćenjem prenosnih signala
2
prilagođenih za prenos preko žičanih, optičkih, i/ili bežičnih mreža usklađenih sa raznovrsnim protokolima, uključujući Internet. Kao takav, kompjuterski čitljiv nosač podataka prema izvođenju iz ovog pronalaska može da bude stvoren korišćenjem podatkovnog signala kodiranog sa takvim programima. Kompjuterski čitljiv nosač podataka kodiran sa tim programskim kodom moguće je spakovati sa kompatibilnim uređajem ili obezbediti nezavisno od drugih uređaja (npr. preko Internet preuzimanja). Svaki takav kompjuterski čitljiv nosač podataka može da se nalazi na ili unutar pojedinačnog proizvoda računarskog programa (npr. čvrsti disk, ili CD, ili ceo računarski sistem), i može biti prisutan na ili unutar različitih proizvoda računarskog programa unutar sistema ili mreže. Računarski sistem može obuhvatiti monitor, štampač, ili drugi pogodni prikaz za omogućavanje bilo kog od rezultata pomenutih ovde korisniku.
[0131] Svaki od ovde opisanih postupaka može biti potpuno ili delimično izveden sa računarskim sistemom uključujući jedan ili više procesora, koje je moguće konfigurisati da izvedu korake. Dakle, izvođenja je moguće usmeriti na računarske sisteme konfigurisane da izvedu korake iz bilo kog od ovde opisanih postupaka, potencijalno sa različitim komponentama koje izvode odgovarajuće korake ili odgovarajuću grupu koraka. Iako su prikazani kao numerisani koraci, korake ovde datih postupaka moguće je izvesti u isto vreme ili različitim redosledom. Pored toga, delove ovih koraka moguće je koristiti sa delovima drugih koraka iz drugih postupaka. Takođe, svi ili delovi koraka mogu biti opcioni. Pored toga, bilo koji od ovih koraka iz bilo kog od ovih postupaka moguće je izvesti sa modulima, kolima, ili drugim uređajima za izvođenje ovih koraka.
[0132] Specifični detalji specifičnih izvođenja mogu biti kombinovani na bilo koji pogodan način bez udaljavanja od duha i obima izvođenja ovog pronalaska. Međutim, druga izvođenja ovog pronalaska moguće je usmeriti na specifična izvođenja koja se odnose na svako pojedinačno varijantno rešenje, ili specifične kombinacije ovih pojedinačnih varijantnih rešenja.
[0133] Gore dat opis izvođenja datih kao primer ovog pronalaska je dat kao prikaz u vidu slike i opisa. Nije predviđen da bude konačan ili da ograniči ovaj pronalazak do preciznog opisanog oblika, i brojne modifikacije i varijacije su moguće u svetlu gore datih objašnjenja. Ova izvođenja su izabrana i opisana da bi najbolje objasnila principe ovog pronalaska i njegove praktične primene da bi se time omogućilo drugim stručnjacima u ovoj oblasti da najbolje koriste pronalazak u različitim izvođenjima i sa različitim modifikacijama kao što je pogodno za specifičnu upotrebu koja se ima na umu.
[0134] Upotreba neodređenog člana za jedninu imenice "a", "an" ili određenog člana za množinu imenice "the" je predviđena da znači "jedan ili više" osim ako nije specifično naznačeno drugačije.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Postupak analiziranja uzorka majčine plazme iz trudnice, uzorak obuhvata fragmente DNK bez ćelije koji potiču iz majčinih ćelija i iz ćelija fetusa, pri čemu postupak obuhvata:
za svaki veći broj fragmenata DNK iz uzorka plazme:
prijem jednog ili više očitavanja sekvence dobijenih iz sekvenciranja fragmenta DNK, jednog ili više očitavanja sekvence koji uključuje oba kraja fragmenta DNK; poravnavanje jednog ili više očitavanja sekvenci sa referentnim genomom da bi se dobile poravnate lokacije za oba kraja fragmenta DNK; i
korišćenje poravnatih lokacija da bi se utvrdila veličina fragmenta DNK;
za svaku veličinu većeg broja veličina:
određivanje količine niza većeg broja fragmenata DNK iz uzorka plazme koji odgovaraju veličini, korišćenjem veličina utvrđenih iz poravnatih lokacija za više fragmenata DNK;
izračunavanje prve vrednosti prvog parametra na osnovu količina fragmenata DNK na više veličina, prvi parametar obezbeđuje statističku meru profila veličine fragmenata DNK u uzorku plazme; koji upoređuje prvu vrednost sa vrednošću kalibracije; i procenu koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorku plazme na osnovu tog poređenja.
2. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu prvi parametar predstavlja obilje malih fragmenata DNK u odnosu na obilje velikih fragmenata DNK, pri čemu mali fragmenti DNK imaju manju veličinu nego veliki fragmenti DNK.
3. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, još obuhvata:
izračunavanje jedne ili više drugih vrednosti jednog ili više drugih parametara na osnovu količina DNK fragmenata u više veličina, jednog ili više drugih parametara daje različite statističke mere profila veličine fragmenata DNK u uzorku plazme;
upoređivanje jedne ili više drugih vrednosti sa odgovarajućim drugim vrednostima kalibracije; i procena koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorku plazme na osnovu poređenja koja obuhvataju prvu vrednost i jednu ili više drugih vrednosti.
4. Postupak iz patentnog zahteva 3, pri čemu:
4
prva tačka podataka kalibracije precizira koncentraciju frakcije fetusne DNK koja odgovara vrednosti kalibracije prvog parametra;
jedna ili više tačaka drugih podataka kalibracije preciziraju koncentraciju frakcije fetusne DNK koja odgovara jednoj ili više drugih vrednosti kalibracije jednog ili više drugih parametara; i
prva tačka podataka kalibracije i druga tačka podataka kalibracije su tačke na višedimenzionoj krivulji i poređenje obuhvata identifikovanje višedimenzione tačke koja ima koordinate koje odgovaraju prvoj vrednosti i jednu ili više drugih vrednosti.
5. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:
tačka podataka kalibracije precizira koncentraciju frakcije fetusne DNK koja odgovara vrednosti kalibracije prvog parametra; i
tačke podataka kalibracije se određuju iz histograma koji odgovara različitom uzorku kalibracije, pri čemu taj histogram obezbeđuje količine fragmenata DNK na više veličine, i pri čemu barem deo različitih uzoraka kalibracije ima različite koncentracije frakcije.
6. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu jedna ili više očitavanja sekvence obuhvata sekvencu pune dužine DNK fragmenta.
7. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jedno ili više očitavanja sekvence dobijeno iz (celovitog) zaokruženog fragmenta DNK.
8. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jedno ili više očitavanja sekvence dobijeno iz uređaja za sekvenciranje na bazi nanopore.
9. Postupak iz patentnog zahteva 8, pri čemu je taj uređaj za sekvenciranje na bazi nanopore, sekvencer Oxford Nanopore Technologies.
10. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jedno ili više očitavanja sekvence dobijeno putem masivnog paralelnog sekvenciranja.
11. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, još obuhvata:
za svaki od više uzoraka kalibracije:
merenje koncentracije frakcije fetusne DNK u uzorku kalibracije;
merenje količina fragmenata DNK koje odgovaraju većem broju
veličina; i
izračunavanje odgovarajuće vrednosti kalibracije za prvi parametar na osnovu količina fragmenata DNK u više veličina, tačka podataka kalibracije tog uzorka kalibracije uključujući odgovarajuću vrednost kalibracije i izmerenu koncentracijom frakcije,
pri čemu je vrednost kalibracije utvrđena korišćenjem barem jedne od odgovarajućih vrednosti kalibracije.
12. Postupak iz patentnog zahteva 11, još obuhvata:
utvrđivanje funkcije koja aproksimira odgovarajuće vrednosti kalibracije tačaka podataka kalibracije na većem broju koncentracija frakcije.
13. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, još obuhvata koncentraciju frakcije fetusne DNK u dijagnostičkom algoritmu za procenu rizika da je taj uzorak plazme dobijen iz aneuploidne trudnoće.
14. Postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu poređenje prve vrednosti sa vrednošću kalibracije obuhvata utvrđivanje da li je prva vrednost prvog parametra iznad ili ispod vrednosti kalibracije, čime se utvrđuje da li je procenjena koncentracija frakcije uzorka plazme iznad ili ispod koncentracije frakcije praga vrednosti koja odgovara vrednosti kalibracije.
15. Postupak iz patentnog zahteva 14, još obuhvata testiranje uzorka za aneuploidiju fetusa kada je prvi parametar iznad vrednosti kalibracije.
16. Računarski program koji obuhvata više instrukcija koje može da izvrši računarski sistem, koje kada su tako izvršene kontrolišu računarski sistem da bi se izveo postupak iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva.
RS20190946A 2012-03-08 2013-03-08 Analiza zasnovana na veličini frakcije fetusne dnk u majčinoj plazmi RS59073B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261608623P 2012-03-08 2012-03-08
US201261621451P 2012-04-06 2012-04-06
EP17202838.3A EP3301193B1 (en) 2012-03-08 2013-03-08 Size-based analysis of fetal dna fraction in maternal plasma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59073B1 true RS59073B1 (sr) 2019-09-30

Family

ID=49114635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190946A RS59073B1 (sr) 2012-03-08 2013-03-08 Analiza zasnovana na veličini frakcije fetusne dnk u majčinoj plazmi

Country Status (18)

Country Link
US (7) US9892230B2 (sr)
EP (10) EP3354748B1 (sr)
JP (7) JP6073382B2 (sr)
CN (3) CN104254618B (sr)
AU (4) AU2013229186B2 (sr)
CA (2) CA2865523C (sr)
CY (1) CY1121828T1 (sr)
DK (5) DK3617324T3 (sr)
ES (3) ES2761624T3 (sr)
HR (1) HRP20191300T1 (sr)
HU (1) HUE044746T2 (sr)
LT (1) LT3301193T (sr)
PL (1) PL3301193T3 (sr)
PT (1) PT3301193T (sr)
RS (1) RS59073B1 (sr)
SI (1) SI3301193T1 (sr)
SM (1) SMT201900409T1 (sr)
WO (1) WO2013132305A1 (sr)

Families Citing this family (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
TWI335354B (en) 2006-09-27 2011-01-01 Univ Hong Kong Chinese Methods for the detection of the degree of the methylation of a target dna and kits
CA2780016C (en) 2009-11-06 2017-09-19 The Chinese University Of Hong Kong Size-based genomic analysis
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US12221653B2 (en) 2010-05-18 2025-02-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
RU2671980C2 (ru) 2011-02-09 2018-11-08 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления плоидности
US20140235474A1 (en) 2011-06-24 2014-08-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non invasive assessment of a genetic variation
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013052907A2 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2861856C (en) 2012-01-20 2020-06-02 Sequenom, Inc. Diagnostic processes that factor experimental conditions
EP2820129A1 (en) 2012-03-02 2015-01-07 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9892230B2 (en) * 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3978621B1 (en) * 2012-05-21 2023-08-30 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN111254500B (zh) 2012-12-10 2024-01-23 分析生物科学有限公司 靶向基因组分析的方法
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US11060145B2 (en) 2013-03-13 2021-07-13 Sequenom, Inc. Methods and compositions for identifying presence or absence of hypermethylation or hypomethylation locus
US10930368B2 (en) 2013-04-03 2021-02-23 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
KR102665592B1 (ko) 2013-05-24 2024-05-21 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
ES3037160T3 (en) 2013-06-21 2025-09-29 Sequenom Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10174375B2 (en) * 2013-09-20 2019-01-08 The Chinese University Of Hong Kong Sequencing analysis of circulating DNA to detect and monitor autoimmune diseases
KR102384620B1 (ko) 2013-10-04 2022-04-11 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
CN105874082B (zh) 2013-10-07 2020-06-02 塞昆纳姆股份有限公司 用于非侵入性评估染色体改变的方法和过程
CN105830077B (zh) 2013-10-21 2019-07-09 维里纳塔健康公司 用于在确定拷贝数变异中改善检测的灵敏度的方法
AU2014346562B2 (en) 2013-11-07 2018-11-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free nucleic acids for the analysis of the human microbiome and components thereof
GB2520765A (en) 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Multiplex detection of nucleic acids
ES2660989T3 (es) 2013-12-28 2018-03-27 Guardant Health, Inc. Métodos y sistemas para detectar variantes genéticas
GB2524948A (en) * 2014-03-07 2015-10-14 Oxford Gene Technology Operations Ltd Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
EP3736344A1 (en) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2945962C (en) 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
US12492429B2 (en) 2014-04-21 2025-12-09 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
EP2942400A1 (en) 2014-05-09 2015-11-11 Lifecodexx AG Multiplex detection of DNA that originates from a specific cell-type
JP6681841B2 (ja) 2014-05-09 2020-04-15 ライフコーデックス アーゲー 特別な細胞タイプに由来するｄｎａの検出とそれに関連する方法
EP3690061B1 (en) 2014-05-30 2025-01-01 Verinata Health, Inc. Detecting, optionally fetal, sub-chromosomal aneuploidies and copy number variations
US20180173846A1 (en) 2014-06-05 2018-06-21 Natera, Inc. Systems and Methods for Detection of Aneuploidy
EP4358097A1 (en) 2014-07-25 2024-04-24 University of Washington Methods of determining tissues and/or cell types giving rise to cell-free dna, and methods of identifying a disease or disorder using same
CN105296606B (zh) * 2014-07-25 2019-08-09 深圳华大基因股份有限公司 确定生物样本中游离核酸比例的方法、装置及其用途
US11783911B2 (en) * 2014-07-30 2023-10-10 Sequenom, Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20160053301A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Clearfork Bioscience, Inc. Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna
EP3502273B1 (en) 2014-12-12 2020-07-08 Verinata Health, Inc. Cell-free dna fragment
US11242559B2 (en) 2015-01-13 2022-02-08 The Chinese University Of Hong Kong Method of nuclear DNA and mitochondrial DNA analysis
US10364467B2 (en) * 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
US10319463B2 (en) 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
HUE058263T2 (hu) 2015-02-10 2022-07-28 Univ Hong Kong Chinese Mutációk detektálása rákszûrési és magzatelemzési célból
CN104789686B (zh) * 2015-05-06 2018-09-07 浙江安诺优达生物科技有限公司 检测染色体非整倍性的试剂盒和装置
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
JP6873921B2 (ja) 2015-05-18 2021-05-19 カリウス・インコーポレイテッド 核酸の集団を濃縮するための組成物および方法
EP3666902B1 (en) 2015-05-22 2024-07-03 Medicover Public Co Ltd Multiplexed parallel analysis of targeted genomic regions for non-invasive prenatal testing
IL305462A (en) 2015-07-23 2023-10-01 Univ Hong Kong Chinese DNA fragmentation pattern analysis suitable clean
DK3347487T3 (da) * 2015-09-11 2021-08-09 Inst Nat Sante Rech Med Ikke-invasive fremgangsmåder til vurdering af genetisk integritet af pluripotente stamceller
CN115035949A (zh) * 2015-09-22 2022-09-09 香港中文大学 通过母亲血浆dna的浅深度测序准确定量胎儿dna分数
KR101848438B1 (ko) * 2015-10-29 2018-04-13 바이오코아 주식회사 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법
HUE050491T2 (hu) 2015-11-10 2020-12-28 Eurofins Lifecodexx Gmbh Magzati kromoszomális aneuploidiák kimutatása olyan DNS régiókat alkalmazva, amelyek különbözõképpen vannak metilezve a magzat és a terhes nõstény között
JP6913089B2 (ja) 2015-11-11 2021-08-04 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｄｎａライブラリーの高効率構築
SG11201805119QA (en) 2015-12-17 2018-07-30 Guardant Health Inc Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna
US10095831B2 (en) 2016-02-03 2018-10-09 Verinata Health, Inc. Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations
WO2017165852A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Biological Dynamics, Inc. Disposable fluidic cartridge and components
EP3978627A1 (en) 2016-03-25 2022-04-06 Karius, Inc. Methods using synthetic nucleic acid spike-ins
RU2760913C2 (ru) 2016-04-15 2021-12-01 Натера, Инк. Способы выявления рака легкого
CA3030890A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
US11319594B2 (en) 2016-08-25 2022-05-03 Resolution Bioscience, Inc. Methods for the detection of genomic copy changes in DNA samples
EP4209598A1 (en) 2016-10-19 2023-07-12 The Chinese University of Hong Kong Gestational age assessment by methylation and size profiling of maternal plasma dna
WO2018081130A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for tumor detection
GB201618485D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence
AU2017355732A1 (en) 2016-11-07 2019-05-09 Grail, Llc Methods of identifying somatic mutational signatures for early cancer detection
KR20260032575A (ko) 2016-11-30 2026-03-09 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CN106591451B (zh) 2016-12-14 2020-06-23 北京贝瑞和康生物技术有限公司 测定胎儿游离dna含量的方法及其用于实施该方法的装置
CA3207879A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
SG11201906397UA (en) 2017-01-25 2019-08-27 Univ Hong Kong Chinese Diagnostic applications using nucleic acid fragments
JP7370862B2 (ja) 2017-03-17 2023-10-30 セクエノム， インコーポレイテッド 遺伝子モザイク症のための方法およびプロセス
WO2018191563A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Karius, Inc. Sample preparation methods, systems and compositions
US11342047B2 (en) 2017-04-21 2022-05-24 Illumina, Inc. Using cell-free DNA fragment size to detect tumor-associated variant
WO2018208820A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Biological Dynamics, Inc. Methods and systems for analyte information processing
CN111051536A (zh) 2017-07-26 2020-04-21 香港中文大学 利用不含细胞的病毒核酸改善癌症筛选
CN111526793A (zh) 2017-10-27 2020-08-11 朱诺诊断学公司 用于超低体积液体活检的设备、系统和方法
US11168356B2 (en) 2017-11-02 2021-11-09 The Chinese University Of Hong Kong Using nucleic acid size range for noninvasive cancer detection
US12084720B2 (en) 2017-12-14 2024-09-10 Natera, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
AU2018392601A1 (en) * 2017-12-19 2020-07-30 Xzom, Inc. Methods and devices for detecting and quantifying cell-free DNA fragments
WO2019126388A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Biological Dynamics, Inc. Methods and devices for detection of multiple analytes from a biological sample
US12590326B2 (en) 2018-01-10 2026-03-31 Guardant Health, Inc. Methods for fragmentome profiling of cell-free nucleic acids
US12398389B2 (en) 2018-02-15 2025-08-26 Natera, Inc. Methods for isolating nucleic acids with size selection
JP2021518106A (ja) * 2018-03-13 2021-08-02 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 治療用核酸構築物の非侵襲的な検出およびモニタリングのための方法
CA3082601A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 Karius, Inc. Sample series to differentiate target nucleic acids from contaminant nucleic acids
US12462935B2 (en) 2018-03-30 2025-11-04 Nucleix Ltd. Deep learning-based methods, devices, and systems for prenatal testing
WO2019195196A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Biological Dynamics, Inc. Dielectric materials
DE202019005627U1 (de) 2018-04-02 2021-05-31 Grail, Inc. Methylierungsmarker und gezielte Methylierungssondenpanels
US12024738B2 (en) 2018-04-14 2024-07-02 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring
WO2019209884A1 (en) 2018-04-23 2019-10-31 Grail, Inc. Methods and systems for screening for conditions
US12195794B2 (en) 2018-05-23 2025-01-14 The Regents Of The University Of California Methods of analyzing capped ribonucleic acids
US12234509B2 (en) 2018-07-03 2025-02-25 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
WO2020069350A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panel
UY38479A (es) 2018-11-19 2020-06-30 Sist Genomicos S L Método y producto informático de análisis de adn fetal por secuenciación masiva
EP4700161A3 (en) 2018-11-21 2026-03-11 Karius, Inc. Direct-to-library methods, systems, and compositions
CN113366122B (zh) * 2018-12-19 2024-01-12 香港中文大学 游离dna末端特征
WO2020186024A1 (en) 2019-03-13 2020-09-17 Grail, Inc. Systems and methods for enriching for cancer-derived fragments using fragment size
US12098429B2 (en) 2019-03-25 2024-09-24 The Chinese University Of Hong Kong Determining linear and circular forms of circulating nucleic acids
CN110136794A (zh) * 2019-05-22 2019-08-16 湖北可汗广电文化有限公司 一种基于人工智能的母婴全生命周期健康医疗服务系统
CA3147613A1 (en) * 2019-08-19 2021-02-25 Chang-Seok Ki Method for detecting chromosomal abnormality by using information about distance between nucleic acid fragments
KR20220097894A (ko) * 2019-10-16 2022-07-08 스틸라 테크놀로지스 핵산 서열 농도의 측정
WO2021108654A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Grail, Inc. Systems and methods for evaluating longitudinal biological feature data
IL303888B2 (en) 2020-02-05 2025-09-01 Univ Hong Kong Chinese Molecular testing using long cell-free fragments in pregnancy
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
JP2024523401A (ja) 2021-06-21 2024-06-28 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド コピー数情報に基づく組織起源分析のための方法および組成物
WO2023056065A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Guardant Health, Inc. Compositions and methods for synthesis and use of probes targeting nucleic acid rearrangements
KR20240174893A (ko) 2023-06-08 2024-12-18 지놈케어 주식회사 태아 분획을 증가시키는 방법
WO2025137389A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Guardant Health, Inc. Methods for targeted single-molecule genetic and epigenetic sequencing
WO2026015607A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Guardant Health, Inc. Methods for partitioning hyper-, hypo-, and non-methylated dna
US20260085358A1 (en) * 2024-07-09 2026-03-26 Centre For Novostics Relative and absolute cell-free dna concentrations for clinical utilities
WO2026060266A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Guardant Health, Inc. Use of copy number variants for the identification of false positive tumor calls

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
CA2387035A1 (en) 1999-10-13 2001-04-19 Sequenom, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
GB0016742D0 (en) 2000-07-10 2000-08-30 Simeg Limited Diagnostic method
US6664056B2 (en) 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
US8898021B2 (en) 2001-02-02 2014-11-25 Mark W. Perlin Method and system for DNA mixture analysis
JP2002272497A (ja) 2001-03-15 2002-09-24 Venture Link Co Ltd 癌の診断方法、およびその診断用ベクター
JP4444564B2 (ja) 2001-03-23 2010-03-31 サントリオン 三重螺旋相互作用によるターゲット二本鎖ｄｎａ配列の精製及び検出方法
NZ532310A (en) 2001-10-05 2007-02-23 Combinatorx Inc Combinations comprising a tetra-substituted pyrimidopyrimidine and a corticosteroid for the treatment of immunoinflammatory disorders
US20030180765A1 (en) 2002-02-01 2003-09-25 The Johns Hopkins University Digital amplification for detection of mismatch repair deficient tumor cells
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
IL163600A0 (en) 2002-03-01 2005-12-18 Ravgen Inc Methods for detection of genetic disorders
EP2236614A3 (en) 2002-08-15 2011-01-26 Genzyme Corporation Brain endothelial cell expression patterns
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
JP2006521086A (ja) 2003-02-28 2006-09-21 ラブジェン， インコーポレイテッド 遺伝子疾患の検出方法
EP1599608A4 (en) 2003-03-05 2007-07-18 Genetic Technologies Ltd Identification of fetal DNA and fetal cell marker in maternal plasma or serum
AU2003901671A0 (en) 2003-04-02 2003-05-01 The University Of Adelaide Comparative genomic hybridization
RU2249820C1 (ru) 2003-08-18 2005-04-10 Лактионов Павел Петрович Способ ранней диагностики заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки
US20050282213A1 (en) 2003-09-22 2005-12-22 Trisogen Biotechnology Limited Partnership Methods and kits useful for detecting an alteration in a locus copy number
EP1689884A4 (en) 2003-10-08 2007-04-04 Univ Boston PROCESS FOR THE PRENATAL DIAGNOSIS OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES
ATE435301T1 (de) 2003-10-16 2009-07-15 Sequenom Inc Nicht invasiver nachweis fötaler genetischer merkmale
US20050221341A1 (en) 2003-10-22 2005-10-06 Shimkets Richard A Sequence-based karyotyping
EP1678329A4 (en) 2003-10-30 2008-07-02 Tufts New England Medical Ct PRENATAL DIAGNOSIS USING CELL-FREE FEDERAL DNA IN FRUIT WATER
DE102004036285A1 (de) 2004-07-27 2006-02-16 Advalytix Ag Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
CN1779688A (zh) 2004-11-22 2006-05-31 寰硕数码股份有限公司 交互式医疗信息系统及方法
US7645576B2 (en) 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
EP1712639B1 (en) 2005-04-06 2008-08-27 Maurice Stroun Method for the diagnosis of cancer by detecting circulating DNA and RNA
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
EP3591068A1 (en) 2006-02-02 2020-01-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
EP2351858B1 (en) 2006-02-28 2014-12-31 University of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
WO2008150368A1 (en) 2007-05-24 2008-12-11 Apceth Gmbh & Co. Kg Cd34 stem cell-related methods and compositions
PL2557520T3 (pl) * 2007-07-23 2021-10-11 The Chinese University Of Hong Kong Określanie zaburzenia równowagi sekwencji kwasu nukleinowego
US12180549B2 (en) 2007-07-23 2024-12-31 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
US20090053719A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-26 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of nucleic acids by digital pcr
MX2010003019A (es) 2007-09-19 2010-04-30 Pluristem Ltd Celulas adherentes de los tejidos adiposo y de placenta y uso de las mismas en la terapia.
WO2009051842A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 The Johns Hopkins University Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna
CA3069082C (en) 2008-09-20 2022-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
WO2010053980A2 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 The Johns Hopkins University Dna integrity assay (dia) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy
US20120021428A1 (en) 2009-03-31 2012-01-26 Marcus Otte Method for diagnosis of cancer and monitoring of cancer treatments
WO2011053790A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Fluidigm Corporation Assay of closely linked targets in fetal diagnosis and coincidence detection assay for genetic analysis
EP3783110B1 (en) 2009-11-05 2022-11-23 The Chinese University Of Hong Kong Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
CA2780016C (en) 2009-11-06 2017-09-19 The Chinese University Of Hong Kong Size-based genomic analysis
CN102597272A (zh) 2009-11-12 2012-07-18 艾索特里克斯遗传实验室有限责任公司 基因座的拷贝数分析
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
EP2370599B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Method for determining copy number variations
WO2011103236A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 The Johns Hopkins University Personalized tumor biomarkers
EP2576837B1 (en) 2010-06-04 2017-09-06 Chronix Biomedical Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers
EP2426217A1 (en) 2010-09-03 2012-03-07 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Analytical methods for cell free nucleic acids and applications
CN105243295B (zh) 2010-11-30 2018-08-17 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
US20130059738A1 (en) 2011-04-28 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
CA3069089A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Lineage Biosciences, Inc. Compositions and methods for analyzing heterogeneous samples
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013052907A2 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013060762A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 Roche Diagnostics Gmbh Method for diagnosing a disease based on plasma-dna distribution
US9845552B2 (en) 2011-10-27 2017-12-19 Verinata Health, Inc. Set membership testers for aligning nucleic acid samples
FR2981833B1 (fr) 2011-10-28 2013-12-06 Oreal Sachet de conditionnement de produit cosmetique
US9757458B2 (en) 2011-12-05 2017-09-12 Immunomedics, Inc. Crosslinking of CD22 by epratuzumab triggers BCR signaling and caspase-dependent apoptosis in hematopoietic cancer cells
WO2013086464A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 The Broad Institute, Inc. Markers associated with chronic lymphocytic leukemia prognosis and progression
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US20150197785A1 (en) 2012-08-10 2015-07-16 The Broad Institute, Inc. Methods and apparatus for analyzing and quantifying dna alterations in cancer
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US20140066317A1 (en) 2012-09-04 2014-03-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9769123B2 (en) 2012-09-06 2017-09-19 Intel Corporation Mitigating unauthorized access to data traffic
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
SI4056712T1 (sl) 2012-09-20 2024-10-30 The Chinese University Of Hong Kong Neinvazivno določanje metiloma tumorja iz plazme
US20140287937A1 (en) 2013-02-21 2014-09-25 Toma Biosciences, Inc. Methods for assessing cancer
WO2014145078A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Verinata Health, Inc. Generating cell-free dna libraries directly from blood
WO2014151117A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
IL285521B2 (en) 2013-08-19 2023-03-01 Singular Bio Inc Methods for single molecule detection
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
CN105830077B (zh) 2013-10-21 2019-07-09 维里纳塔健康公司 用于在确定拷贝数变异中改善检测的灵敏度的方法
GB201319779D0 (en) 2013-11-08 2013-12-25 Cartagenia N V Genetic analysis method
US10465238B2 (en) 2013-12-19 2019-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Quantification of mutant alleles and copy number variation using digital PCR with nonspecific DNA-binding dyes
GB2524948A (en) 2014-03-07 2015-10-14 Oxford Gene Technology Operations Ltd Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
CA2945962C (en) 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
ES2844229T3 (es) 2014-05-13 2021-07-21 Univ Texas Mutaciones génicas y alteraciones en el número de copias de EGFR, KRAS y MET
EP3690061B1 (en) 2014-05-30 2025-01-01 Verinata Health, Inc. Detecting, optionally fetal, sub-chromosomal aneuploidies and copy number variations
CA2953469A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
TWI813141B (zh) 2014-07-18 2023-08-21 香港中文大學 Ｄｎａ混合物中之組織甲基化模式分析
EP4358097A1 (en) 2014-07-25 2024-04-24 University of Washington Methods of determining tissues and/or cell types giving rise to cell-free dna, and methods of identifying a disease or disorder using same
CN115029342B (zh) 2014-08-22 2025-04-08 分析生物科学有限公司 用于无细胞dna的定量遗传分析的方法
CN107075730A (zh) 2014-09-12 2017-08-18 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 循环核酸的鉴定及用途
EP4092680A1 (en) 2014-09-12 2022-11-23 Illumina Cambridge Limited Detecting repeat expansions with short read sequencing data
EP3018213A1 (en) 2014-11-04 2016-05-11 Genesupport SA Method for determining the presence of a biological condition by determining total and relative amounts of two different nucleic acids
EP3218523B1 (en) 2014-11-14 2020-02-12 Liquid Genomics Inc. Use of circulating cell-free rna for diagnosis and/or monitoring cancer
EP3502273B1 (en) 2014-12-12 2020-07-08 Verinata Health, Inc. Cell-free dna fragment
WO2016097251A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Danmarks Tekniske Universitet Method for identification of tissue or organ localization of a tumour
EP3766986B1 (en) 2014-12-31 2022-06-01 Guardant Health, Inc. Detection and treatment of disease exhibiting disease cell heterogeneity and systems and methods for communicating test results
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
US10319463B2 (en) 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
HUE058263T2 (hu) 2015-02-10 2022-07-28 Univ Hong Kong Chinese Mutációk detektálása rákszûrési és magzatelemzési célból
EP3265079A4 (en) 2015-03-03 2019-01-02 Caris MPI, Inc. Molecular profiling for cancer
EP3288455B1 (en) 2015-05-01 2023-12-06 Guardant Health, Inc. Diagnostic methods
WO2016179530A1 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Seracare Life Sciences, Inc. Liposomal preparations for non-invasive-prenatal or cancer screening
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
AU2016293025A1 (en) 2015-07-13 2017-11-02 Agilent Technologies Belgium Nv System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject
EP4286847A3 (en) 2015-08-07 2024-07-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Genetic abnormalities in plasma cell dyscrasias
JP6991134B2 (ja) 2015-10-09 2022-01-12 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 無細胞ｄｎａを使用する集団ベースの処置レコメンダ
WO2017070497A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for use of driver mutations in cll
SG11201805119QA (en) 2015-12-17 2018-07-30 Guardant Health Inc Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna
US10982286B2 (en) 2016-01-22 2021-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Algorithmic approach for determining the plasma genome abnormality PGA and the urine genome abnormality UGA scores based on cell free cfDNA copy number variations in plasma and urine
EP4043581A1 (en) 2016-05-27 2022-08-17 Sequenom, Inc. Method for generating a paralog assay system
WO2018081130A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for tumor detection

Also Published As

Publication number Publication date
US20170132363A1 (en) 2017-05-11
US20220093212A1 (en) 2022-03-24
CN104254618B (zh) 2017-11-14
JP6073382B2 (ja) 2017-02-01
WO2013132305A1 (en) 2013-09-12
EP4382613A2 (en) 2024-06-12
AU2019204917A1 (en) 2019-07-25
EP3354748B1 (en) 2019-10-16
HK1245842A1 (zh) 2018-08-31
EP3617324B1 (en) 2022-05-25
CA3010254A1 (en) 2013-09-12
EP3882358A1 (en) 2021-09-22
US10297342B2 (en) 2019-05-21
JP7197209B2 (ja) 2022-12-27
JP2020146069A (ja) 2020-09-17
US9892230B2 (en) 2018-02-13
US10741270B2 (en) 2020-08-11
CA2865523A1 (en) 2013-09-12
JP6721642B2 (ja) 2020-07-15
EP3354748A1 (en) 2018-08-01
US11217330B2 (en) 2022-01-04
EP3301193B1 (en) 2019-04-24
US20200327960A1 (en) 2020-10-15
EP2823062B1 (en) 2018-01-03
US20170235877A1 (en) 2017-08-17
CN107630081A (zh) 2018-01-26
JP6392904B2 (ja) 2018-09-19
ES2659487T3 (es) 2018-03-15
EP3800272B1 (en) 2022-09-28
PT3301193T (pt) 2019-07-17
US20180157793A1 (en) 2018-06-07
CY1121828T1 (el) 2020-07-31
AU2019204917B2 (en) 2022-02-17
HK1206394A1 (en) 2016-01-08
EP3575412B1 (en) 2020-12-16
EP4112740B1 (en) 2024-02-28
ES2761624T3 (es) 2020-05-20
JP6849257B2 (ja) 2021-03-24
CA3010254C (en) 2023-11-28
PL3301193T3 (pl) 2019-10-31
AU2022203292A1 (en) 2022-06-02
CN107630070B (zh) 2021-04-30
EP3575412A1 (en) 2019-12-04
EP2823062A4 (en) 2015-10-07
CA2865523C (en) 2018-08-14
US20210257053A1 (en) 2021-08-19
JP2017063794A (ja) 2017-04-06
HK1246361A1 (zh) 2018-09-07
CN107630081B (zh) 2021-03-05
HK1261405A1 (en) 2020-01-03
CN104254618A (zh) 2014-12-31
ES2729504T3 (es) 2019-11-04
US11031100B2 (en) 2021-06-08
HUE044746T2 (hu) 2019-11-28
DK2823062T5 (en) 2018-03-12
AU2013229186B2 (en) 2016-11-24
CN107630070A (zh) 2018-01-26
EP2823062A1 (en) 2015-01-14
DK3301193T3 (da) 2019-07-22
SMT201900409T1 (it) 2019-09-09
JP2018196390A (ja) 2018-12-13
JP2024100931A (ja) 2024-07-26
SI3301193T1 (sl) 2019-08-30
DK2823062T3 (en) 2018-03-05
JP2023017006A (ja) 2023-02-02
EP4112740A1 (en) 2023-01-04
JP2015510757A (ja) 2015-04-13
EP3800272A1 (en) 2021-04-07
HRP20191300T1 (hr) 2019-10-18
AU2017201258B2 (en) 2019-04-18
EP2823062B2 (en) 2025-12-10
AU2013229186A1 (en) 2014-09-18
EP3882358C0 (en) 2025-02-19
EP3617324A1 (en) 2020-03-04
DK2823062T4 (da) 2026-02-02
HK1245844A1 (en) 2018-08-31
ES2659487T5 (en) 2026-03-03
EP2860266B1 (en) 2017-02-08
EP3301193A1 (en) 2018-04-04
DK2860266T3 (en) 2017-04-24
WO2013132305A8 (en) 2013-11-21
AU2017201258A1 (en) 2017-03-16
EP3882358B1 (en) 2025-02-19
LT3301193T (lt) 2019-07-25
EP2860266A1 (en) 2015-04-15
HK1202135A1 (en) 2015-09-18
DK3354748T3 (da) 2020-01-02
JP2021090438A (ja) 2021-06-17
US20130237431A1 (en) 2013-09-12
EP4382613A3 (en) 2024-09-18
DK3617324T3 (da) 2022-06-27
HK1200194A1 (en) 2015-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7197209B2 (ja) Ｄｎａのサイズに基づく解析
HK40084570B (en) Size-based analysis of fetal dna fraction in maternal plasma
HK40041430B (en) Size-based analysis of fetal dna fraction in maternal plasma
HK1245842B (zh) 母体血浆中胎儿dna分数的基於大小的分析
HK1246361B (zh) 母体血浆中胎儿dna分数的基於大小的分析
HK1261405B (en) Size-based analysis of dna for classification of cancer
HK1202135B (en) Size-based analysis of fetal dna fraction in maternal plasma
HK1206394B (en) Size-based analysis of dna for classification of a level of cancer
HK1200194B (en) Size-based analysis of fetal dna fraction in maternal plasma