RS59075B1 - Mutantni ospa fragmenti i postupci i upotrebe koji se odnose na njih - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na supstance i njihovu upotrebu u postupcima za prevenciju i tretman Borrelia infekcije. Naročito, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži hibridni fragment C-terminusa proteina A spoljne površine (OspA), nukleinsku kiselinu koja kodira isti, ćeliju domaćina koja obuhvata nukleinsku kiselinu, postupak za proizvodnju polipeptida, i farmaceutsku supstancu (naročito za upotrebu kao medikament u postupku za tretiranje ili sprečavanje Borrelia infekcije) koja sadrži polipeptid i/ili nukleinsku kiselinu kao i komplet koji obuhvata farmaceutsku supstancu i drugu supstancu.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Lajmska borelioza, ili lajmska bolest, je najčešće registrovana bolest koju prenose krpelji u Evropi i Severnoj Americi. Bolest prouzrokuje infekcija gram-negativno-slična spiroheta, Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.) koja se prenosi artropodama, i može uključivati više organa ili tkiva, što daje kao rezultat kožne, srčane, mišićno-skeletne i neurološke poremećaje. U mnogim zemljama, lajmska borelioza nije zapažena bolest i zbog toga ne postoje egzaktni podaci koji se odnose na podatke o učestalosti pojave na godišnjem nivou. U Sjedinjenim Američkim Državama, uzročni agens je B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) i lajmska borelioza je lokalizovana na severo-istočne, srednje-atlantske i gornje severno-centralne države. U 2010, ukupno oko 30.000 slučajeva lajmske borelioze je zabeleženo za SAD u Centrima za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC). Ažurirani izveštaj Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) u 2013, koji uzima u obzir dijagnostičke podatke iz drugih izvora, procenjuje da je stvarni broj novih slučajeva na godišnjem nivou u S.A.D. približniji 300.000 (http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.html). U Evropi, B. afzelii i B. garinii su glavni uzročni agensi lajmske borelioze, kao i B. burgdorferi s.s. i B. bavariensis, koja doprinosi u manjem stepenu u zavisnosti od geografske lokacije. Rasprostranjenost lajmske borelioze značajno varira u različitim Evropskim zemljama sa ukupnim povećanjem pojave od zapada ka istoku. U većem delu Evrope, broj zabeleženih slučajeva lajmske borelioze povećao se od ranih 1990-tih (npr., Češka Republika, Estonija, Litvanija; videti izveštaj Svetske zdravstvene organizacije ,,Lajmska borelioza u Evropi’’ (Lyme borreliosis in Europe, WHO report of 2006)), i geogefska rasprostranjenost slučajeva je takođe proširena.

[0003] Borrelia pripada familiji Spirochaetaceae, koja je podeljena na medicinski važne rodove Treponema, Leptospira i Borrelia. B. burgdorferi s.I. je spiralnog oblika, veoma pokretljiva gramnegativna bakterija, dužine oko 10-20 µm i široka 0,2-0,5 µm, koja raste pod mikroaerofilnim uslovima. Ćelijski zid spiroheta sastoji se od citoplazmatske membrane okružene peptidoglikanom i nekoliko bičeva i zatim sa labavo povezanom spoljnom membranom.

[0004] Lajmska borelioza se generalno odigrava u stadijumima kategorizovanim na osnovu različitih kliničkih manifestacija, sa remisijama i pogoršanjima. Stadijum 1, rana infekcija, sastoji se od lokalizovane infekcije kože, praćenje u roku od nekoliko dana ili nedelja sa stadijumom 2, diseminiranom infekcijom, i meseci do godinama kasnije sa stadijumom 3, perzistentnom infekcijom. Međutim, infekcija je varijabilna; neki pacijenti imaju samo lokalizovane infekcije kože, dok drugi pokazuju samo kasne manifestacije bolesti, kao što je artritis. Različiti klinički sindromi lajmske borelioze su takođe izazvani infekcijom sa različitim B. burgdorferi s.I. vrstama. B. burgdorferi s.s. češće izaziva manifestacije na zglobovima (artritis) i srčane probleme, B. afzelii izaziva pretežno kožne simptome (erythema migrans; EM i acrodermatitis chronica atrophicans; ACA), dok je B. garinii implicirana u najvećem broju slučajeva neuroborelioze.

[0005] Lokalizovana infekcija – Najčešći simptom stadijuma 1 infekcije je erythema migrans, koja se odigrava kod 70-80% inficiranih ljudi. Ova kožna lezija je često praćena simptomima sličnim gripu, kao što je mijalgia, artralgia, glavobolja i groznica. Ovi nespecifični simptomi se javljaju kod 50% pacijenata sa erythema migrans.

[0006] Diseminirana infekcija – Tokom stadijuma 2, bakterija se premešta u krvotok sa mesta infekcije u distalna tkiva i organe. Neurološki, kardeovaskularni i artritični simptomi koji se javljaju u ovom stadijumu uključuju meningitis, kranijalnu neuropatiju i intermitentni inflamatorni artritis.

[0007] Perzistentna infekcija – Stadijum 3 infekcije je hroničan i dešava se u opsegu od meseci do godina nakon ujeda krpelja. Najčešći simptom u Severnoj Americi je reumatoidni artritis, izazvan infekcijom sa B. burgdorferi s.s. Perzistentna infekcija centralnog nervnog sistema sa B. garinii izaziva teže neurološke simptome tokom stadijuma 3, i perzistentna infekcija kože sa B. afzelii rezultuje u acrodermatitis chronica atrophicans.

[0008] U nekim rizičnim grupama, kao što su farmeri, šumari, planinari, trkači ili izletnici, stope seroprevalence i incidence bolesti su povećane, kao i kod dece mlađe od 15 godina starosti i odraslih između 39 i 59, bez preference u odnosu na pol. Ova povećana pojava pacijenata obolelih od lajmske borelioze je povezana sa promenama u šumskim staništima kao i socijalnim faktorima. Sredinske promene, kao što je fragmentacija šume, doveli su do oštrog smanjenja glodarskih predatora kao što su lisice i ptice grabljivice, što je zauzvrat dovelo do povećanja mišje populacije, sa posledičnim povećanjem populacije krpelja. U skorije vreme, delimično pošumljavanje je povećalo broj jelena i stoga broj krpelja. Suburbano širenje i povećano korišćenje šumskih oblasti za rekreaciju kao što je kampovanje i planinarenje dovelo je ljude u veći kontakt sa većim brojem vektora krpelja sa Borrelia. Svi ovi faktori zajedno su doprineli široj distribuciji Borrelia i višoj incidenci Lajmske borelioze.

[0009] Antimikrobna sredstva su glavni postupak za tretman Borrelia infekcije. Korišćeni antibiotik zavisi od stadijuma bolesti, simptoma, i alergije pacijenta na medikamente. Trajanje primene antibiotika takođe zavisi od stadijuma bolesti i težine simptoma. Rana Lajmska borelioza se tipično tretira sa oralnim tetraciklinima, kao što je doksiciklin, i polu-sintetičkim penicilinima, kao što je amoksiciklin ili penicilin V. Artritični i neurološki poremećaji se tretiraju sa visokim dozama intravenskog penicilina G ili ceftriaksona. Do 30% pacijenata sa Lajmskom boreliozom ne ispoljavaju rane karakteristične simptome infekcije sa Borrelia, čineći dijagnozu i tretman problematičnim. Primena antibiotika može biti dugotrajna (do nekoliko meseci) i ponekad neefikasna i stoga je raspravljano o njoj u oblasti koja se odnosi na Borrelia, naročito tokom kasnog stadijuma bolesti. Čak i slučaju efikasnog lečenja Borrelia, pacijentima može ostati onesposobljavajući umor, bol, ili neurološki simptomi u narednim godinama, što se označava kao sindrom posle lečenja Lajmske bolesti. Generalno, upotreba antibiotika može imati neželjene posledice, kao što je razvoj otpornosti od strane ciljnih mikroorganizama. Konačno, antibiotska terapija može efikasno izlečiti lajmsku boreliozu, ali ne obezbeđuje zaštitu od narednih infekcija.

[0010] Monovalentna vakcina zasnovana na 1-OspA serotipu (LYMErix™) odobrena je i na tržištu je u SAD za prevenciju lajmske bolesti izazvane Borrelia burgdorferi s.s., ali vakcina više ne postoji. Međutim, heterogenost OspA sekvenci u različitim serotipovima u Evropi i na drugim mestima isključuje efikasnu zaštitu sa vakcinom zasnovanom na OspA iz samo jednog serotipa.

[0011] Himerni OspA molekuli koji sadrže proksimalni deo iz jednog OspA serotipa, zajedno sa distalnim delom iz drugog OspA serotipa, uz zadržavanje antigenih osobina oba roditeljska polipeptida, mogue se koristiti za prevenciju i tretman lajmske bolesti ili borelioze (WO2011/143617, WO2011/143623). Pored toga vakcina koja sadrži stabilizovane fragmente C-terminusa od OspA iz šest glavnih serotipova Borrelia je pokazala da obezbeđuje široku zaštitu protiv Borrelia infekcije kod miševa (Comstedt, P, et al., 2014, Design and Development of a Novel Vaccine for Protection against Lyme Borreliosis, PLoS ONE 9(11):e113294).

[0012] Trenutno, ne postoji preventivni medikament za lajmsku boreliozu na tržištu i stoga postoji potreba u tehnici za razvojem takvog medikamenta koji može obezbediti efikasnu zaštitu protiv Borrelia koja je prisutna u SAD, Evropi i na drugim mestima, naročito za razvojem medikamenta koji može obezbediti efikasnu zaštitu protiv nekoliko Borrelia serotipova istovremeno. Serotip 3 OspA koji sadrži heterodimer, Lip-S4D1-S3hybD1, iz ovog pronalaska poboljšava naš prethodno opisan heterodimer, Lip-S4D1-S3D1 (videti WO2014/006226) i u pogledu lakoće proizvodnje i stimulacije specifičnih antitela kako je izmereno vezivanjem površine antitela na serotip 3 Borrelia spirochetes. Pored toga, specifičniji kvalitet odgovora imunog sistema na novi heterodimer ukazuje da je jačina takođe superiorna u poređenju sa prethodno opisanim heterodimerom.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0013] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži hibridne fragmente Borrelia proteina A spoljne površine (OspA), nukleinsku kiselinu koja kodira iste, vektor ili ćeliju domaćina koji sadrži takav molekul nukleinske kiseline. Dodatno, pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju takvog polipeptida i postupak za proizvodnju ćelije koja eksprimira takav polipetid. Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku supstancu koja sadrži takav polipeptid, molekul nukleinske kiseline, ili i takav molekul polipeptid ili nukleinsku kiselinu za upotrebu kao vakcina ili postupku lečenja ili sprečavanja Borrelia infekcije. Posebno, ovaj se pronalazak odnosi na poboljšani polipeptid za imunizaciju protiv serotipa 3 Borrelia, tako što je taj polipeptid pogodniji za prečišćavanje i indukuje specifičniji odgovor imunog sistema na Borrelia kako se procenjuje površinskim vezivanjem na Borrelia kada se uporedi sa serotipom 3 OspA koji sadrži konstrukt opisan u našoj prethodnoj prijavi WO2014/006226.

[0014] Napori da se razvije podjedinica vakcine za prevenciju lajmske borelioze bili su velikim delom usredsređeni na upotrebu borelijalnog proteina A spoljne površine (OspA) kao antigena. OspA protein je eksprimiran od strane Borrelia samo kada je u crevima vektora krpelja. Stoga, OspA antitela koja su proizvedena vakcinacijom ne bore se protiv infekcije u telu, već ulaze u creva krpelja kada se hrani krvlju. Tu antitela neutralizuju spirohete i blokiraju migraciju bakterija iz srednjeg creva u pljuvačne žlezde krpelja, put preko kog Borrelia ulazi u kičmenjačkog domaćina. Stoga, OspA-specifična antitela sprečavaju prenošenje Borrelia iz vektora krpelja u humanog domaćina.

[0015] Lipidovani oblik OspA iz B. burgdorferi s.s., soja ZS7, zajedno sa aluminijum hidroksidom komercijalno je razvijen kao vakcina protiv Borrelia (LYMErix™) od strane SmithKline Beecham, sada GlaxoSmithKline (GSK) za tržište SAD. Tri doze LYMErix™ tokom perioda od jedne godine bile su potrebne za optimalnu zaštitu. Nakon prve dve doze, efikasnost vakcine protiv Lajmske borelioze bila je 49%, i nakon tri doze 76%. Međutim, kratko nakon što je LYMErix™ bio komercijalno dostupan, povučen je sa tržišta 2002. Navedeni razlozi bili su pitanja praktične primene vakcine, na primer potrebe za revakcinaciju svake ili svake druge godine, kao i relativno visoka cena ovog preventivnog pristupa u poređenju sa tretmanom rane infekcije antibioticima. Dodatno, postojala je zabrinutost da LYMErix™ može pokrenuti autoimune reakcije u podgrupi populacije usled homologije sekvence sa humanim proteinom, iako ovo nikada nije dokazano. Dodatno, unakrsna-zaštita protiv drugih klinički značajnih Borrelia vrsta nije obezbeđena ovom vakcinom.

[0016] Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, objekat predmetnog pronalaska je obezbeđivanje poboljšane vakcine za prevenciju Lajmske borelioze. Poželjno, vakcina je lako proizvedena uz to da je zaštitna, bezbedna i efikasnija od postojećih terapija i/ili obezbeđuje zaštitu protiv više od jedne vrste Borrelia Pored toga, dobro je poznato u ovoj oblasti da različiti pacijenti odgovaraju drugačije na različite supstance vakcine. Samim tim, u svakom slučaju, bila bi izrazita prednost imati alternativne vakcine dostupne kao dodatne opcije za vakcinacije protiv Borrelia.

[0017] Problem u osnovi predmetnog pronalaska je rešen sa polipeptidom koji sadrži hibridni C-terminalni (OspA) fragment, pri čemu se taj hibridni fragment se sastoji od C-terminalnog domena OspA proteina Borrelia koji obuhvata fragment izveden iz OspA proteina soja Borrelia drugačijeg nego što je B. garinii, soj PBr, i drugi fragment OspA od B. garinii, soj PBr, i razlikuje se od odgovarajućeg fragmenta divljeg tipa najmanje po uvođenju najmanje jedne disulfidne veze. Specifično, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži hibridni C-terminalni OspA fragment kako je opisano gore u tekstu, pri čemu taj hibridni C-terminalni OspA fragment obuhvata, od N- do C-terminalni smer od i) prvi OspA deo se sastoji od amino kiselina 125-176 ili amino kiselina 126-175 od OspA iz Borrelia soja koji ne odgovara fragmentu od B. garinii, soj PBr, sa SEK ID BR: 8, i ii) drugi OspA deo obuhvata a) amino kiseline 176-274 od OspA iz B. garinii, sojn PBr (SEK ID BR: 8) ili b) amino kiseline 177-274 od OspA iz B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8) ili c) amino kiseline 177-274 od OspA iz B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8) sa supstitucijm treoninskog ostatka na amino kiselini 233 sa prlinskim ostatkom, pri čemu je drugi OspA fragment od a), b), ili c) mutantni i cistinom stabilizovan po tome što se razlikuje od odgovarajuće sekvence divljeg tipa barem po supstituciji divljeg tipa amino kiseline na poziciji 182 /- 3 od SEK ID BR: 8 putem cisteina i putem supstitucije amino kiseline divljeg tipa na poziciji 269 /- 3 od SEK ID BR: 8 putem cisetina i pri čemu disulfidna veza između cisteina na poziciji 182 /- 3 i cistein na poziciji 269 /- 3 pomenutog drugog OspA fragmenta je prisutna; i pri čemu numerisanje amino kiselina i supstitucija cisteina jeste u skladu sa numerisanjem odgovarajućih amino kiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s., soj B31 (SEK ID BR: 5).

[0018] Neočekivano, uvođenje pomenutog hibridnog C-terminalnog OspA fragmenta koji obuhvata sekvencu od B. valaisiana, soj VS116, spojenu fuzijom sa sekvencu iz serotipa 3 OspA (B. garinii, soj PBr), sa uvedenom disulfidnom vezom, dalo je kao rezultat heterodimerni protein (Lip-S4D1-S3hybD1) koji je bilo lakše prečistiti i stimulisati specifičniji odgovor imunog sistema na serotip 3 OspA nego heterodimer LipS4D1-S3D1 iz našeg prethodnog pronalaska (WO2014/006226). Kako je prikazano u Primerima, serotip 3 hibrid OspA C-terminalni fragment iz ovog pronalaska ima predviđenu izokonturu elektrostatičkog potencijala koja je sličnija drugim OspA fragmentima iz drugih serotipova nego serotipu 3 OspA fragmenta. Pored toga, serotip 3 hibridni OspA C-terminalni heterodimer koji sadrži fragment (Lip-S4D1-S3hybD1) je bilo lakše prečistiti, što je zahtevalo manje koraka da bi se dobio mnogo veći prinos nego Lip-S4D1-S3D1 heterodimer iz prethodnog pronalaska. Pored toga, iako su primećeni titri antitela bili slični, antitela su stimulisana kombinovanom vakcinom poboljšanog heterodimera vezanog specifičnije na Borrelia sa ekspresijom serotipa 3 OspA u poređenju sa kombinovanom vakcinom heterodimera iz prethodnog pronalaska. Najzad, in vivo zaštitni kapacitet kombinovane vakcine poboljšanog heterodimera je bio visok na četiri testirana Borrelia serotipa.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0019] Shodno tome, u prvom varijantnom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži hibridni C-terminalni fragment proteina A spoljne površine (OspA), pri čemu se pomenuti hibridni C terminalni OspA fragment sastoji od fuzije C-terminalnog domena dva različita OspA Borrelia soja i razlikuje se od odgovarajućeg fragmenta divljeg tipa najmanje po uvođenju npr. cistina. Preciznije, hibridni C-terminalni OspA fragment sadrži fuziju amino kiselina iz OspA proteina iz soja koji nije B. garinii, soj PBr, npr., B. valaisiana, soj VS116, ili B. spielmanii; sa amino kiselinama iz OspA proteina B. garinii, soj PBr, sa uvođenjem barem jedne disulfidne veze (cistin). Specifično, polipeptid iz ovog pronalaska sadrži hibridni C-terminalni OspA (protein A spoljne površine Borrelia) fragment, pri čemu hibridni C-terminalni OspA fragment sadrži, od N- do C-terminala smer, od i) prvog OspA dela koji obuhvata amino kiseline 125-176 ili amino kiseline 126-175 od OspA od Borrelia soja koji nije odgovarajući fragment od B. garinii, soj PBr, sa SEK ID BR: 8, i ii) drugog OspA dela koji sadrži amino kiseline 177-274 ili amino kiseline 176-274, (ali najpoželjnije amino kiseline 177-274, opciono sa zamenom treonin ostatka na amino kiselini 233 sa prolin ostatkom), od OspA iz B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8), pri čemu je drugi deo OspA mutant i cistinom stabilizovan po tome što se razlikuje od odgovarajuće sekvence divljeg tipa barem zamenom amino kiseline divljeg tipa na poziciji 182 /- 3 od SEK ID BR: 8 cisteinom i supstitucijom amino kiseline divljeg tipa na poziciji 269 /- 3 od SEK ID BR: 8 cisteinom i pri čemu je disulfidna veza između cisteina na poziciji 182 /- 3 i cistein na poziciji 269 /-3 od pomenutog drugog OspA fragmenta prisutan; i pri čemu je numerisanje amino kiselina i supstitucija cisteina prema numerisanju odgovarajućih amino kiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s., soj B 31 (SEK ID BR: 5).

[0020] Napominje se da:

Pozicija 182 /- 3 jeste skraćenica za poziciju 179, 180, 181, 182, 183, 184 ili 185, poželjno 182. Pozicija 269 /- 3 je skraćenica za poziciju 266, 267, 268, 269, 270, 271 ili 272, poželjno 269.

[0021] Poželjno, polipeptid sadrži hibridni C-terminalni OspA fragment, pri čemu hibridni C-terminalni OspA fragment obuhvata, od N- do C-terminalnog smera,

i) prvog OspA fragmenta (takođe se pominje kao prvi OspA deo) koji obuhvata amino kiseline 125-176 ili amino kiseline 126-175 od OspA iz Borrelia soja koji nije odgovarajući fragment B. garinii, soj PBr, sa SEK ID BR: 8, i

ii) drugi OspA fragment (se takođe pominje kao drugi OspA deo) koji obuhvata amino kiseline 177-274 od OspA iz B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8), pri čemu se drugi OspA fragment razlikuje od odgovarajuće sekvence divljeg tipa supstitucijom amino kiseline divljeg tipa na poziciji 182 /- 3 od SEK ID BR: 8 cisteinom i supstitucijom divljeg tipa amino kiseline na poziciji 269 /- 3 od SEK ID BR: 8 i pri čemu je prisutna disulfidna veza između cisteina na poziciji 182 /- 3 i cisteina na poziciji 269 /- 3 pomenutog drugog OspA fragmenta; i

pri čemu numerisanje supstitucija cisteina jeste prema numerisanju odgovarajućih amino kiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s., soj B31 (SEK ID BR: 5).

[0022] Utvrđeno je da polipeptid prema ovom pronalasku može da bude lako i delotvorno proizveden (videti Primer 2). Njegova proizvodnja je kao rezultata dala povećani prinos u poređenju sa poznatim proizvodima (videti Primer 2). Imunizacija sa polipeptidom prema ovom pronalasku je proizvela više nivoe antitela specifičnih za OspA protein u njegovom nativnom obliku i samim tim poboljšanu vakcinu (videti Primer 3). Pored toga, obezbedeo je zaštitu protiv in vivo Borrelia veštačkog inficiranja (videti Primer 4).

[0023] Borrelia je vrsta bakterije spirochete phylum. Prouzrokuje boreliozu, zoonozne, vektorom prenosne bolesti prenete prvenstveno putem krpelja i nekih vaši, zavisno od vrsta. U ovom trenutku ima 36 poznatih vrsta Borrelia. Od 36 poznatih vrsta Borrelia, 13 od ovih vrsta su poznate da prouzrokuju lajmsku bolest ili boreliozu i prenose ih krpelji. Glavne Borrelia vrste koje prouzrokuju lajmsku bolest su Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, i Borrelia garinii. Pojam B. burgdorferi s.l. obuhvata barem 13 Borrelia vrsta (Tabela A-1). Ove vrste nastaju u različitim geografskim regionima, i žive u prirodi u enzootskm krugovima koji obuhvataju krpelje Ixodes ricinus kompleksa (takođe se zovu Ixodes persulcatus kompleks) i divlji opseg domaćina životinja. Četiri Borrelia vrste su odgovorne za većinu infekcija kod ljudi: B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis i B. garinii. Tri druge vrste, B. lusitaniae, B. bissettii i B. spielmanii, se povremeno detektuju kod ljudi, ali njihova uloga u lajmskoj boreliozi je pouzdano poznata u ovom trenutku. Nove vrste Borrelia se još uvek utvrđuju.

Tabela A-1.

[0024] Kao što je prethodno dato detaljno, protein A spoljne površine Borrelia (OspA) je veoma zastupljen imunogeni lipoprotein Borrelia od naročitog interesa zbog svog potencijala kao kandidata za vakcinu. OspA B. burgdorferi s.l. je bazni lipoprotein koji ima molekulsku masu od približno 30 kDa i kodiran je na linearnom plazmidu. Važan aspekt OspA proteina je njegova N-terminalna lipidacija; odnosno, masnim kiselinama sa dužinom lanca između C14i C19sa ili bez dvogubih veza su spojene na N-terminus ostatka cisteina, karakteristike koja pojačava imunogenost OspA proteina. Pokazano je da slabo-imunogeni sintetički peptidi indukuju jače odgovore antitela kada su lipidovani; na primer, kada su kovalentno spojeni na Pam3Cys (Bessler i Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552), supstitucija masne kiseline pronađena na amino terminusu mnogih bakterijskih lipoproteina koje su sintetisani sa signalnom sekvencom koja određuje vezivanje lipida. Dodatno, pokazano je da Pam3Cys deo pojačava odgovore imunog sistema na OspA kod miševa, naročito preko njegove interakcije sa TLR-2 (Yoder, et al. (2003) Infection i Immunity 71:3894-3900). Stoga, očekivalo bi se da lipidacija C-terminalnog fragmenta OspA pojačava imunogenost i zaštitni kapacitet fragmenta.

[0025] Analiza izolata B. burgdorferi s.l. dobijenih u Severnoj Americi i Evropi pokazala je da OspA ima antigenu varijabilnost i da se može definisati nekoliko različitih grupa na osnovu serologije. Objavljeni su anti-OspA mAbs koji se vezuju za specifične N- i C-terminalne antigene determinante. Rendgenska kristalografija i NMR analiza su korišćene za identifikaciju imunološki važnih hipervarijabilnih domena u OspA i mapirale su LA-2 epitop na C-terminalnim aminokiselinama 203-257 (Ding et al., Mol. Biol.

302: 1153-64, 2000). Prethodne studije su pokazale da se proizvodnja antitela naspram C-terminalnog epitopa LA-2 dovodi u vezu sa zaštitinim imunitetom nakon vakcinacije sa OspA (Van Hoecke et al. Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 i Steere et al., N Engl J Med (1998) 339:209-215). Pokazano je da antitela na LA-2 blokiraju prenos Borrelia od krpelja do domaćina (Golde et al., Infect Immun (1997) 65(3):882-889). Ove studije su sugerisale da C-terminalni deo OspA proteina može biti dovoljan za indukovanje zaštitnog imuniteta. Traba napomenuti da je sekvenca C-terminalnog dela OspA manje visoko konzervativna između Borrelia serotipova nego što je N-terminalni deo (videti Sl.1).

[0026] Na osnovu informacije iz studija datih prethodno, zajedno sa drugim, skraćeni oblici OspA koji sadrže C-terminalni deo (ovde takođe označeni kao "OspA fragment" ili "monomer") korišćeni su u prethodnom pronalasku (WO2014/006226). Pokazalo se da su ovi skraćeni oblici OspA manje protektivni od OspA proteina pune dužine. Iznenađujuće, međutim, nađeno je tokom prethodnog pronalaska da uvođenje disulfidne veze u skraćeni oblik (ovde takođe označena kao "mutantni OspA fragment", "cistinom stabilizovan OspA fragment", ili "mutantni fragment" "cistinom stabilizovan fragment") prevazilazi ovaj nedostatak. Bez ograničavanja na poseban mehanizam, smatra se da je poboljšana zaštita zahvaljujući povećanoj stabilnosti OspA fragmenta, kao što je pokazano u analizama merenja termalne stabilnosti.

[0027] Mutantni OspA fragment (ovde se takođe pominje kao drugi OspA fragment) može biti izveden iz bio kog soja Borrelia vrste; međutim, usled njihovog prevladavanja u oblasti medicine, naročito za ljude, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. Bavariensis i B. garinii su naročito poželjni. U skladu sa ovim pronalaskom, prvi OspA deo iz bilo kog soja Borrelia izuzev B. garinii, soj PBr i drugi deo iz B. garinii, stoj PBr. Samim tim, hibridni OspA fragment je izveden iz fuzije amino kiselina iz OspA od B. garinii, soj PBr sa amino kiselinama iz OspA iz bilo koje od Borrelia vrsta izuzev B. garinii, soj PBr (i samim tim sekvenca amino kiseline drugačija od amino kiselina iz OspA iz B. garinii, soj PBr), specifično iz B. burgdorferi s.s., B. afzelii, i B. bavariensis, posebno B. valaisiana, soj VS116. Prvi OspA deo obuhvata amino kiseline 125-176 ili amino kiseline 126-175 od OspA iz Borrelia soja koji nije odgovarajući fragment od B. garinii, soj PBr, sa SEK ID BR: 8, i drugi OspA deo obuhvata amino kiseline 176-274 ili najpoželjnije amino kiseline 177-274 od OspA iz B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8), pri čemu drugi OspA deo jeste mutant i cistinom stabilizovan po tome se razlikuje od odgovarajuće sekvence divljeg tipa barem putem zamene amino kiseline divljeg tipa na poziciji 182 od SEK ID BR: 8 putem cisteina i zamenom amino kiseline divljeg tipa na poziciji 269 od SEK ID BR: 8 cisteinom i pri čemu je disulfidna veza između cisteina na poziciji 182 i cistein na pozciji 269 pomenutog drugog OspA fragmenta je prisutan; i pri čemu numerisanje amino kiselina i supstitucija cisteina jeste prema numerisanju odgovarajućih amino kiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s., soja B31 (SEK ID BR: 5).

Međutim, četiri mutacije povezane sa delovima divljeg tipa mogu biti prisutne u prvim i drugim delovima prema ovom pronalasku (videti takođe u daljem tekstu). U preporučenom izvođenju gore u tekstu pomenute supstitucije sa cisteinom na pozicijama 182 i 269 su jedine mutacije relevantne za divlji tip. Alternativno, cistinom stabilizovane amino kiseline 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr se razlikuje u supstituciji ostatka treonina na amino kiselini 233 divljeg tipa OspA od Borrelia garinii, soj PBr, samo u pogledu prolinskog ostatka.

[0028] Poželjni primeri polipeptida obuhvataju

- hibridni C-terminalni OspA fragment koji sadrži amino kiseline 125-176 iz B. valaisiana, soj VS116, i cistinom stabilizovane amino kiseline 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr (SEK ID BR: 1), ili

- hibridni C-terminalni OspA fragment sadrži amino kiseline 126-175 iz B. spielmanii i cistinom stabilizovane amino kiseline 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr (SEK ID BR: 51).

[0029] Samim tim, u poželjnom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid sadrži ili se sastoji od sekvence amino acid kiseline SEK ID BR: 1. Alternativno, taj polipeptid sadrži ili se sastoji od sekvence amino kiseline iz SEK ID BR: 51.

[0030] U jednom izvođenju ovog pronalaska, drugi OspA deo je identičan u cistinom stabilizovanim amino kiselinama 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr, ali se od njih razlikuje u supstituciji treoninskog ostatka na amino kiselini 233 divljeg tipa OspA od Borrelia garinii, soj PBr, sa prolinskim ostatkom (SEK ID BR: 7).

[0031] Četiri Borrelia vrste B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis i B. garinii mogu se dalje klasifikovati prema njihovim OspA serotipovima, koji su određeni analizom sa monoklonskim antitelima specifičnim za respektivni OspA protein. Serotipovi 1-7, koji čine većinu humanih Borrelia infekcija, zajedno sa njihovim stopama zastupljenosti, prikazani su u Tabeli A-2 u nastavku.

Tabela A-2. Označavanje serotipa i prevalence B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis i B. garinii. Borrelia izolovana iz humane cerebrospinalne tečnosti ili kože ili iz vektora krpelja su serotipizovane testiranjem lizata celih ćelija sa mišjim monoklonskim antitelima, svakim specifičnim za određeni epitop OspA (kao što je opisano od strane Wilske et al., J. of Clin Microbiol (1993) 31(2):340-350 i predstavljeno u radu ,,Dejstvo klimatskih promena na krpelje i bolesti koje prenose krpelji’’ od strane Baxter Bioscience at "Climate change effect on ticks i tick-borne diseases", Brussels, 06 Feb 2009).

[0032] Struktura OspA proteina iz B. burgdorferi s.s. soja B31 određena je od strane Li et al. (Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). Sastavljena je od N-terminalnih (α-lanci 1 do 4) i centralnih β- ploča (αlanci 5 do 14n [N-terminalni deo]), barel ploča 1 (α-lanci 14c [C-terminalni deo] do 16), barel ploča 2 (α-lanci 17 do 21) i C-terminalna α-zavojnica. Pojam "C-terminalni OspA fragment" ili "OspA C-terminalni domen" ili "C-terminalni domen" ili "fragment divljeg tipa" ili "C-terminalni deo" u odnosu na OspA kao što je korišćeno u predmetnoj specifikaciji označava C-terminalnu aminokiselinsku sekvencu OspA, tj., OspA bez najmanje N-terminalne β-nabrane ploče (uključujući β-lance 1 do 4). U OspA iz B. burgdorferi s.s. soju B31, N-terminalna nabrana ploča sastoji se od aminokiselina 17 do 70 (nakon post-translacionog isecanja 16 amino kiselina dugačkog signalnog peptida za lipidaciju).

[0033] C-terminalni OspA fragment iz ovog pronalaska može takođe uključivati signalnu sekvencu lipidacije na N-terminusu, npr., signalnu sekvencu lipidacije od aminokiselina 1 do 16 OspA (SEK ID BR: 13) ili OspB (SEK ID BR: 14) iz B. burgdorferi s.s. soja B31, signalnu sekvencu za lipidaciju iz E. coli, koja je ovde označena kao "lpp lipidacioni signal" (SEK ID BR: 15), ili bilo koja druga signalna sekvenca, npr., kao što je definisano u nastavku.

[0034] Lipidacija proteina sa N-terminalnom signalnom sekvencom za lipidaciju, kao što su one prisutne na nascentnom (tek nastalom) OspA polipeptidu, dešava se u E. coli ekspresionom vektoru aktivnošću u koracima enzima diacilgliceril transferaze, signalne peptidaze II i transacilaze, respektivno. Prvi korak je transfer diacilglicerida na cistein sulfhidril grupu nemodifikovanog prolipoproteina, nakon čega sledi isecanje signalnog peptida sa signalnom peptidazom II i, konačno, acilacija α-amino grupe Nterminalnog cisteina apolipoproteina. Rezultat je postavljanje jednog lipida i glicerol grupe supstituisane sa dva dodatna lipida spojena na N-terminalnom cisteinskom ostatku polipeptida. Signalna sekvenca za lipidaciju, koja je isečena tokom lipidacije, nije prisutna u finalnoj sekvenci polipeptida.

[0035] Polipeptidi su biološki molekuli lanaca monomera amino kiseline povezanih peptidnim (amidnim) vezama. Kovalentne hemijske veze se formiraju kada karboksilna grupa jedne amino kiseline reaguje sa amino grupom druge. Polipeptidi iz ovog pronalaska su neprekidni ili razgranati lanci amino kiseline. Polipeptid iz ovog pronalaska sadrži cistin vezu. Prema predmetnom pronalasku, mutant OspA fragment može biti lipidovani protein, takođe lipoprotein, naznačeno time da lipidni delovi, zajedno sa gliceril grupom, se takođe označava kao "Lip". U skladu sa pronalaskom, Lip sadrži jedan do tri lipida kao što su C14-20alkil i/ili C14-20alkenil vezan za glicerol i amino grupu N-terminalnog cisteina polipeptida prema pronalasku, ili poželjno pri čemu je Lip deo formule (I) u nastavku,

u kojoj jedan od R1, R2ili R3je C14-C20alkil ili alkenil, i svaki od ostalih, nezavisno je C14-C20alkil ili C14-C20alkenil, i X je aminokiselinska sekvenca vezana za cisteinski ostatak prikazan u Formuli (I). Poželjnije, Lip plus N-terminalni cistein polipeptida je N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloksi) propil cistein (ovde označen kao "Pam3Cys") i povezan je preko C karbonila cisteina sa pomenuntom aminokiselinskom sekvencom prema pronalasku. U Formuli (I) prethodni R1, R2i R3bili bi delovi palmitoila i X je aminokiselinska sekvenca vezana za cisteinski ostatak.

[0036] U skladu sa predmetnim pronalaskom, C-terminalni domen OspA može da ima nedostatak najmanje N-terminalnog domena homolognog aminokiselinama 17 do 70 OspA iz B. burgdorferi s.s. soj B31. Dodatno, OspA C-terminalnom domenu prema predmetnom pronalasku mogu takođe nedostajati dodatni delovi centralne nabrane ploče kao što je definisano od strane Li i saradnika (Li et al., supra), naročito dodatne lance kao što su aminokiselinski delovi od aminokiseline 17 do 82, 93, 105, 118 ili 119, poželjno 17 do 129, poželjnije 1 do 124, 1 do 125, 1 do 129 ili 1 do 130 bilo koje Borrelia, naročito B. burgdorferi s.s., soj B31, ili homologe delove OspA proteina iz Borrelia sp. koji nisu B. burgdorferi s.s., soj B31.

[0037] U kontekstu predmetnog pronalaska, OspA C-terminalni domen se takođe označava kao "OspA fragment" ili "fragment OspA".

[0038] "Mutant C-terminalni OspA fragment" ili "mutantni fragment" ili "mutantni OspA fragment" u kontekstu polipeptida prema predmetnom pronalasku i kao što je korišćeno u ovom spisu označavaće OspA C-terminalni fragment, kao što je prethodno u tekstu definisano i ovde, koji se razlikuje od fragmenta divljeg tipa najmanje po najmanje dva introdukovana cisteina koji mogu formirati disulfidnu vezu, t.j. cistin. Bez vezivanja za teoriju, pretpostavlja se da disulfidna veza stabilizuje fragment u konformaciji pogodnoj za indukciju vezivanja antitela. Savijanje C-terminalnog fragmenta divljeg tipa OspA pokazuje stabilnost na sniženoj temperaturi u poređenju sa proteinom pune dužine (Koide et al., Structure-based Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350:290-299). Za predmetni pronalazak, sekvenca C-terminalnog domena B. burgdorferi s.s., soj B31 OspA je analizirana in silico da bi se odredili položaji za introdukovane disulfidne mostove koji mogu pojačati stabilnost savijanja ovog C-terminalnog domena. Rezultati analize su preneti na homologe OspA fragmente drugih vrsta Borrelia sa pretpostavkom da je savijanje sačuvano među vrstama.

[0039] "Hibridni C-terminalni OspA fragment" ili "hibridni fragment" ili "hibridni OspA fragment" u kontekstu polipeptida iz ovog pronalaska i kako se koristi u ovom spisu se odnosi na OspA C-terminalni fragment, kao što je definisan gore u tekstu i ovde, koji se razlikuje od fragmenta divljeg tipa po tome što

a) hibridni C-terminalni OspA fragment sadrži fuziju amino kiselina iz prvog OspA proteina iz soja koji je drugačiji od B. garinii, soj PBr, npr. B. valaisiana, soj VS116, ili B. spielmanii (odnosi se na prvi OspA deo); sa amino kiselinama iz drugog OspA proteina od B. garinii, soja PBr, sa uvođenjem barem jedne disulfidne veze (cistin) (se odnosi na drugi OspA deo) i opciono jednu ili više dodatnih mutacija; i

b) barem dva uvedena cisteina u hibridnom C-terminalnom OspA fragmentu iz disulfidne veze, t.j. cistin, i pri čemu pomenuti uvedeni cisteini su uvedeni kao što je ovde opisano i u skladu sa objašnjenjem iz WO2014/006226; i

pri čemu hibridni C-terminalni OspA fragment daje kao rezultat prirodno presavijene fragmente kako je izmereno npr. efikasnošću vezivanja antitela koja nastaje vakcinacijom ovog hibridnog C-terminalnog OspA fragmenta kod npr. miševa na antigen Borrelia serotipa 3, npr. Testiranjem vezivanja pomenutih antitela (dobijenih posle tri imunizacije) na površini serotipa 3 Borrelia protočnom citometrijom, npr. kako je opisano u Primerima.

[0040] Tipično, disulfidna veza može biti uvedena tako što će se uvesti jedan ili više, poželjno dva, cisteinska ostatka, pri čemu je disulfidna veza (S-S most ) formirana između tiol grupe dva cisteinska ostatka formira cistin amino kiseline. Samo jedan cisteinski ostatak je potrebno uvesti ukoliko je disulfidna veza formirana sa cisteinskim ostatkom prisutnim u OspA fragmentu divljeg tipa.

Dva cisteina su uvedena supstitucijom amino kiseline. Supstitucije su a) na poziciji 182 amino kiseline relevantne sekvence divljeg tipa OspA amino kiseline pomoću cisteina i b) na poziciji 269 amino kiseline relevantne sekvence divljeg tipa OspA amino kiseline pomoću cisteina i pri čemu je prisutna disulfidna veza između cisteina na poziciji 182 i cisteina na poziciji 269 pomenutog OspA fragmenta i tako se formira cistin. Numerisanje supstitucija cisteina je prema broju odgovarajućih amino kiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s., soj B31 (SEK ID BR: 5).

[0041] OspA mutant ili hibridni fragment može takođe sadržati dodatne mutacije u odnosu na divlji tip. Kao što je prethodno detaljno dato, struktura i površina domena OspA su poznati u tehnici. Shodno tome, mutantni fragment može sadržati dalje mutacije, naročito na mestima koja nisu na površini proteina i/ili nisu uključena u imuni odgovor i, stoga ne utiču na antigeni kapacitet. One mogu uključivati jednu ili više aminokiselinskih delecija, naročito malih (npr., do 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselina) delecija, jednu ili više aminokiselinskih adicija (naročito C- ili N-terminalno), jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, naročito jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Poželjno, broj dodatnih mutacija u prvom i drugom delu u odnosu na odgovarajući divlji tip je najviše 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, još poželjnije 3 ili 2, posebno 1. Još poželjnije dalja mutacija(e) jeste/jesu samo u drugom OspA delu. Preporučene mutacije su supstitucije, posebno konzervativne supstitucije. Primeri konzervativnih aminokiselinskih supstitucija uključuju, ali nisu ograničeni na, one navedene u nastavku:

Ala Ser Leu Ile; Val

Arg Lys Lys Arg; Gln; Asn

Asn Gln; His Met Leu; Ile

Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr

Cys Ser Ser Thr

Gln Asn Thr Ser

Glu Asp Trp Tyr

His Asn; Gln Tyr Trp; Phe

Ile Leu, Val Val Ile; Leu

[0042] Poželjne mutacije uključuju promene u izabranim delovima fragmenta, na primer, naznačeno time da sekvenca sa sličnošću sekvence sa antigenom povezanim sa funkcijom humanog leukocita (hLFA-1), koji postoji u B. burgdorferi s.s., je modifikovan, na primer, zamenjena sa homologom sekvencom iz OspA proteina iz druge Borrelia sp. Razlog za ovu modifikaciju je smanjenje rizika za indukciju imunološke unakrsne reakcije sa humanim proteinima. Još jedna poželjna mutacija je supstitucija prolina iz treonina na poziciji 233 u sekvenci OspA polipeptida iz B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8). Takođe, moguća je adicija signalne sekvence za lipidaciju u finalnom, ili intermedijernom, fragmentu, ili adiciju marker proteina (npr., za identifikaciju ili prečišćavanje).

[0043] U nekim primerima izvođenja, mutant ili hibridni OspA fragment je definisani kao u patentnim zahtevima i ima aminokiselinsku sekvencu koja ima 60%, poželjnije najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95% identičnosti sekvence sa fragmentom divljeg tipa. U sledećem primeru izvođenja, sekvenca se razlikuje po najviše 10%, najviše 9%, najviše 8%, najviše 7%, najviše 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, najpoželjnije najviše 1%, usled dodavanja sekvence, delecije ili supstitucije.

[0044] Identičnost, kao što je poznato u tehnici i kao što je ovde korišćeno, je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identičnost takođe označava stepen srodnosti sekvenci između polipeptidnih ili nukleotidnih sekvenci, kao što može biti slučaj, kao što je određeno poklapanjem nizova takvih sekvenci. Identičnost se može lako izračunati. Iako postoji određen broj postupaka za merenje identičnosti između dva polinukleotida ili dve polipeptidne sekvence, termin je dobro poznat stručnjaku (npr. Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Poželjni postupci za određivanje identičnosti su dizajnirani da bi dali najveće poklapanje između testiranih sekvenci. Postupci za određivanje identičnosti su kodirani u kompjuterskim programima. Poželjni postupci kompjuterskih programa da bi se odredila identičnost između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket (Devereux, J. et al., 1984), BLASTP, BLASTN, i FASTA (Altschul, S. et al., 1990).

[0045] Za razliku od mutantnog ili hibridnog OspA fragmenta, "fragment divljeg tipa" ili "OspA fragment divljeg tipa" u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na fragment OspA Borrelia koji se javlja u prirodi. Fragment divljeg tipa je dobijen N-terminalnim delecijama, ali ne sadrži interne delecije (osim signalnih sekvenci kao što je ovde detaljno dato) ili mutacija. U odnosu na hibridni i mutantni OspA fragment, fragment divljeg tipa se sastoji od identičnog dela OspA (identična dužina i isti soj OspA, itd.) i razlikuje se samo u prethodno u tekstu detaljno datim promenama.

Polipeptidi iz ovog pronalaska

[0046] Polipeptid je jedan linearni polimer aminokiselina povezanih peptidnim vezama, u nekim slučajevima takođe sa disulfidnim vezama. U skladu sa predmetnim pronalaskom, polipeptid takođe može sadržati jednu ili više post translacionih modifikacija; tj., vezanu biohemijski funkcionalnu grupu, kao što je vezani acetat, fosfat, lipid ili ugljeni hidrat, poželjno lipid ili lipidi vezani za N-terminalni cistein zajedno sa glicerolom, poželjnije 1 do 3 C14-C20alkil ili alkenil delova, još poželjnije 1 do 3 palmitoil grupa, najpoželjnije tri palmitoil grupe (Pam3).

[0047] Polipeptid prema predmetnom pronalasku je kako je definisan u patentnim zahtevima i sadrži ili se sastoji od hibrdnog C-terminalnog OspA fragmenta, pri čemu hibridni C-terminalni OspA fragment sadrži, od N- do C-terminalnog smera, od

i) prvog OspA dela koji se sastoji od amino kiselina od prvog C-terminalnog dela od OspA iz nekog soja Borrelia koji nije odgovarajući fragment B. garinii, soj PBr, sa SEK ID BR: 8, i počinje na poziciji oko 125 ili 126 i završava se na kraju 175 ili 176; i

ii) drugi OspA deo se sastoji od drugog C-terminalnog dela OspA koji neprekidno sledi prvi C-terminalni deo (npr. ako se prvi C-terminalni deo završava na poziciji 175, drugi C-terminalni deo se nastavlja na pozciji 176; ili ako se prvi C-terminalni deo završava na pozicijama 176, drugi C-terminalni deo se nastavlja na pozicijama 177 i tako dalje, međutim, može da bude da jedna ili dve ili više amino kiselina sve do 10 amino kiselina mogu biti obrisane u području fuzije 2 C-terminalnih delova, npr. i najpoželjnije ako se prvi C-terminalni deo završava na poziciji 175, drugi C-terminalni deo se nastavlja na poziciji 177), pri čemu se drugi OspA fragment razlikuje od odgovarajuće sekvence divljeg tipa supstitucijom amino kiseline divljeg tipa na poziciji 182 /- 3 od SEK ID BR: 8 pomoću cisteina i supstitucijom amino kiseline divljeg tipa na poziciji 269 /- 3 od SEK ID BR: 8 pomoću cisteina i pri čemu je prisutna disulfidna veza između cisteina na poziciji 182 /- 3 i cisteina na poziciji 269 /- 3 pomenutog drugog OspA fragmenta koja formira cistein (takođe se pominje kao "cistinom-stablizovan OspA fragment"); i

pri čemu je numerisanje amino kiselina i supstitucija amino kiselina prema numerisanju odgovarajućih amino kiselina pune dužine OspA of B. burgdorferi s.s., soj B31 (SEK ID BR: 5).

[0048] U još jednom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid sadrži ili se sastoi od hibridnog C-terminalnog OspA fragmenta koji se sastoji od amino kiselina 125-176 od B. valaisiana, soja VS116, i cistinom stabilzovanih amino kiselina 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr (SEK ID BR: 1).

[0049] U još jednom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid sadrži ili obuhvata hibridni C-terminalni OspA fragment koji obuhvata amino kiseline 126-175 od B. spielmanii i cistinom stabilizovane amino kiseline 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr (SEK ID BR: 51).

[0050] U još jednom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid je kao što je ovde definisano, i pri čemu je drugi OspA deo identičan cistinom stabilizovanim amino kiselinama 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr, ali se razlikuje od njega samo po supstituciji ostatka treonina na amino kiselini 233 divljeg tipa OspA od Borrelia garinii, soj PBr, sa prolinskim ostatkom.

[0051] Polipeptidi kako je definisano gore u tekstu i dalje kako je ovde definisano obezbeđuju titre antitela kod imunizovanih životinja, pri čemu pomenuta antitela pokazuju poboljšano vezivanje na njihove odgovarajuće antigene in situ kada se uporede sa polipeptidima iz relevantnog prethodnog stanja tehnike (npr. kako je definisano u WO2014/006226). Poželjno, polipeptid koji obuhvata hibridni C-terminalni OspA fragment iz ovog pronalaska utiče barem na 1,5-struko povećanje, poželjno barem 2-struko povećanje, još poželjnije barem 3-struko povećanje, i još poželjnije barem 4-struko povećanje, i od toga je poželjnije 5-struko povećanje, najpreporučljivije barem 10-struko povećanje u intenzitetu fluorescencije, izmereno protočnom citometrijom i izazvano antitelima pokrenutim posle tri imunizacije sa polipeptidom kod miševa vezivanjem na površinu serotipa 3 Borrelia, u poređenju sa jačinom fluorescencije izazvanom antitelima pokrenutim na polipeptid koji sadrži C-terminalni domen OspA proteina od Borrelia koji se razlikuje od odgovarajuće OspA sekvence divljeg tipa barem u dodavanju barem jedne cisteinske veze, poželjnije Lip-S4D1-S3D1 heterodimernog proteina kako je definisano putem SEK ID BR: 31, posebno pri čemu povećanje može da bude utvrđeno kako je opisano u Primeru 3.

[0052] Pored toga, u još jednom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid iz ovog pronalaska kako je definisan patentnim zahtevima moguće je proizvesti u višim prinosima sa standardnim postupcima i zahtevati manje koraka prečišćavanja kada se uporedi sa relevantnim polipeptidima iz prethodnog stanja tehnike (npr. kako je definisano u WO2014/006226). Poželjno, polipeptid koji obuhvata hibridni C-terminalni OspA fragment iz ovog pronalaska pokazuje barem 1,5-struko povećanje, poželjno barem 2-struko povećanje, još poželjnije, barem 3-struko povećanje, još poželjnije barem 4-struko povećanje, i još poželjnije barem 5-struko povećanje, još poželjnije barem 10-struko povećanje u prinosu proizvodnje, izmereno u miligramima po gramu biomase, u poređenju sa polipeptidom koji sadrži C-terminalni domen OspA proteina od Borrelia koji se razlikuje od odgovarajuće OspA sekvence divljeg tipa barem u dodavanju barem jedne cisteinske veze, još poželjnije Lip-S4D1-S3D1 heterodimerni protein kako je definisano pomoću SEK ID BR: 31, posebno kada to povećanje može da bude utvrđeno kako je opisano u Primeru 2.

[0053] Poželjno, polipeptid koji sadrži hibridni C-terminalni OspA fragment iz ovog pronalaska zahteva manje koraka za prečišćavanje nego polipeptid koji sadrži C-terminalni domen od OspA proteina od Borrelia koji se razlikuje od odgovarajuće OspA sekvence divljeg tipa barem u pogledu dodavanja barem jedne cisteinske veze, poželjnije Lip-S4D1-S3D1 heterodimernog proteina kako je definisano SEK ID BR: 31; još preciznije, zahteva barem jedan manje korak hromatografije.

[0054] Polipeptid može obuhvatiti a) hibridni C-terminalni OspA fragment kako je definisano u patentnim zahtevima, i b) dodatni mutantni OspA fragment kao što je definisano u patentnim zahtevima.

[0055] Polipeptid iz ovog pronalaska može sadržati a) hibridni C-terminalni OspA fragment kako je definisano patentnim zahtevima, i b) drugi OspA fragment, pri čemu je pomenuti OspA fragment C-terminalni u tome što obuhvata C-terminalni domen od OspA proteina Borrelia i jeste mutantni i cistinom stabilizovan po tome što se razlikuje od odgovarajuće OspA sekvence divljeg tipa barem po supstituciji amino kiseline na poziciji 182 sekvence divljeg tipa pomoću cisteina i supstitucijom amino kiseline na poziciji 269 sekvence divvljeg tipa pomoću cisteina i pri čemu je prisutna veza između cisteina na poziciji 182 i cisteina na poziciji 269 pomenutog OspA fragmenta; i pored toga pri čemu pomenuti mutantni OspA fragment počinje na poziciji 123, 124, ili 125 i završava se na poziciji 273 ili 274; i pored toga pri čemu numerisanje amino kiselina i supstitucija cisteina jeste u skladu sa numerisanjem odgovarajućih amino kiselina OspA pune dužine od B. burgdorferi s.s., soj B31 (SEK ID BR: 5). U jednom izvođenju ovog pronalaska, drugi OspA fragment može da bude bilo koji od mutantnih C-terminalnih fragmenata od OspA kao što je definisano gore u tekstu, npr., u kontekstu prethodnog pronalaska (WO2014/006226).

[0056] Prema predmetnom pronalasku, pomenuti mutantni OspA fragmenta i hibridni fragment iz ovog pronalaska ne sadrže (i) N-terminalnu nabranu ploču kao što je prethodno u tekstu definisano i (ii) opciono jedan ili više dodatnih lanaca centralne nabrane ploče kao što je prethodno navedeno. Međutim, polipeptid može sadržati jednu ili više funkcionalnih sekvenci kao što je signalna sekvenca, npr., signalna sekvenca lipidacije ili post-translacionalne modifikacije, kao što je lipidacija.

[0057] U daljem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, polipeptid prema predmetnom pronalasku sastoji se od (i) jednog ili više mutantnih OspA fragmenta, pri čemu najmanje jedan jeste hibridni C-terminalni OspA fragment prema ovom pronalasku, opciono spojenih sa linkerima, npr., kao što je definisano u nastavku ili jedan ili više mutantni OspA fragmenata i serotip 3 hibridni OspA C-terminalni fragment i (ii) opciono jednu ili više aminokiselina heterolognih sa OspA, naročito signalnu sekvencu i (iii) opciono post-translacionu modifikaciju, kao što je lipidacija.

[0058] Dakle, u još jednom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid iz ovog pronalaska kako je definisan patentnim zahtevima dodatno može da sadrži:

i) polipeptid koji je lipidovan ili pri čemu taj polipeptid sadrži lipidacioni signal, poželjno iz E. coli izveden lpp lipidacioni signal MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEK ID BR: 15); i/ili

ii) polipeptid koji sadrži sa mestom lipidacije povezano olovo peptida putem N-terminalnog ostatka cisteina kao mesto za lipidaciju, poželjno CSS; i/ili

iii) polipeptid koji sadrži linker između hibridnog C-terminalnog OspA fragmenta i drugi cisteinom stabilizovan OspA fragment, posebno pri čemu pomenuti linker sadrži npr.

GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEK ID BR: 16).

[0059] U jednom izvođenju iz ovog pronalaska, drugi C-terminalni OspA fragment je hibridni C-terminalni fragment od OspA prema ovom pronalasku.

[0060] U još jednom izvođenju ovog pronalaska, polipeptid sadrži ili se sastoji od heterodimera od Lip-S4D1-S3hybD1 (SEK ID BR: 27). Samim tim, u još jednom varijantnom rešenju, ovaj se pronalazak odnosi na polipeptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence amino kiseline i to SEK ID BR: 27 (heterodimer od Lip-S4D1-S3hybD1).

[0061] Polipeptid prema predmetnom pronalasku ima zaštitni kapacitet. Kao što je prethodno detaljno dato, uvođenje disulfidne veze u hibridni i hibridni/mutantni OspA fragment ali i hibridna priroda OspA fragmenta iz ovog pronalaska povećava zaštitni kapacitet polipeptida u odnosu na polipeptid koji sadrži pomenuti fragment bez disulfidne veze(a) i hibridnu prirodu OspA fragmenta. U nekim primerima izvođenja, zaštitni kapacitet je povećan najmanje 10%, poželjnije najmanje 20%, poželjnije najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% u odnosu na polipeptid koji sadrži pomenuti fragment bez disulfidne veze i hibridne prirode OspA fragmenta.

[0062] Pojam zaštitni kapacitet opisuje sposobnost da se zaštiti subjekt protiv Borrelia infekcije. U odnosu na polipeptid prema pronalasku, zaštitni kapacitet se odnosi na sposobnost polipeptida da indukuje odgovor imunog sistema koji štiti subjekta protiv Borrelia infekcije. Zaštitni kapacitet može se testirati primenom polipeptida na subjekta na način da se indukuje imunog reakcija sistema protiv polipeptida. Nakon toga, subjekat može biti izložen Borrelia.

[0063] Reakcija subjekta na infekciju se prati. Naročito, prisustvo Borrelia kod subjekta može se odrediti. Na primer, polipetid je zaštitni ukoliko se Borrelia ne može detektovati kod subjekta. Prisustvo Borrelia može se odrediti detekcijom Borrelia-specifičnih nukleinskih kiselina (npr., sa PCR) ili Borreliaspecifičnim antitelima (npr., sa ELISA ili Western blot) ili detekcijom same Borrelia (npr., kultivisanjem organa ili tkiva u medijumu za rast i potvrda prisustva Borrelia putem mikroskopa). Naročito, zaštitni kapacitet ("pc"), objavljen kao procenat, za određenu dozu definisan je kao što sledi:

pc (%) = [(broj ukupno testiranih subjekata – broj Borrelia-inficiranih subjekata / broj ukupno testiranih subjekata] x 100

[0064] Razlike u zaštitnom kapacitetu (Δpc) mogu se odrediti, npr. poređenjem zaštitnog kapaciteta (pc) mutant OspA fragmenta sa disulfidnom vezom (vezama) (pc [sa vezom]) prema zaštitnom kapacitetu OspA fragmenta bez disulfidne veze (veza) (pc [bez veze]). U skladu sa predmetnim pronalaskom, polipeptidi koji se porede razlikuju se samo u uvođenju najmanje jedne disulfidne veze. Promena u zaštitnom kapacitetu (Δpc) sa introdukcijom disulfidne veze (veza) određuje se kao što sledi, npr:

Δpc = (pc [uzorak] – pc [kontrola])

npr.

Δpc = (pc [sa vezom] – pc [bez veze])

[0065] Ukoliko je Δpc veća od nule (> 0), pod pretpostavkom da su svi drugi parametri (npr., doza i analiza) isti, onda je zaštitni kapacitet uzorka (npr. mutant OspA fragmenta sa disulfidnom vezom (vezama)) bolji od zaštitnog kapaciteta kontrole (npr. OspA fragment bez disulfidne veze (veza)). Nasuprot tome, ukoliko je Δpc manji od nula (< 0) pod pretpostavkom da su svi drugi parametri (npr., doza i analiza) isti, onda je zaštitni kapacitet uzorka (npr. mutantni OspA fragment sa disulfidnom vezom (vezama)) manji od zaštitnog kapaciteta korišćenog poređenja (npr. OspA fragment bez disulfidne veze (veza)).

[0066] Poželjno, polipeptid prema predmetnom pronlaasku je procenjen u odnosu na njegov zaštitni kapacitet in vivo testom veštačkog inficiranja gde su miševi imunizovani sa polipeptidom prema pronalasku ili sa placebo kontrolom su veštački izazvani sa Borrelia introdukovanom u imunizovane subjekte sa hipodermijskom iglom (postupak veštačkog inficiranja sa iglom) ili uvođenjem sa vektorom krpeljem (postupak veštačkog inficiranja sa krpeljem).

[0067] Postupak veštačkog inficiranja sa iglom je izveden za željeni Borrelia soj (npr., B. burgdorferi, soj ZS7) potkožnim uvođenjem Borrelia u dozi između 20 i 50 puta infektivne doze (ID)50miševima koji su imunizovani sa pomenutim prvim polipeptidom prvog aspekta ili sa odgovarajućom placebo (negativnom) kontrolom, kao što je samo pufer ili ađuvans i poređenjem stopa infekcije u izazvanim miševima. ID50je definisana kao doza pri kojoj je 50% veštački inficiranih miševa inficirano. Doza Borrelia je merena u broju bakterija. Doza za veštačko inficiranje može široko varirati i nezavisna je od soja; stoga, virulencija soja mora biti prvo procenjena eksperimentima sa veštačkim inficiranjem za određivanje ID50. Četiri nedelje nakon veštačkog inficiranja iglom, sakupljena je krv i tkiva za postupke očitavanja da bi se odredeo status infekcije. Ovi postupci očitavanja mogu biti npr. VlsE ELISA na serumima ili qPCR na sakupljenim tkivima za identifikaciju Borrelia, kao što je ovde opisano, ili drugim postupcima.

[0068] Postupak veštačkog inficiranja sa krpeljem izveden je primenom najmanje jedne nimfe krpelja (npr., I. ricinus) inficirane sa Borrelia (npr., B. afzelii, soj IS1), na mišu koji je imunizovan sa pomenutim prvim polipeptidom prema prvom varijantnom rešenju; i b) primenom najmanje jedne inficirane nimfe krpelja na drugog miša koji je imunizovan sa pomenutim drugim polipeptidom prema prvom varijantnom rešenju; i c) poređenje stopa infekcije kod dva miša, generalno šest nedelja nakon veštačkog inficiranja.

Poželjno, analiza ili test je urađen sa grupom miševa po polipeptidu koji se testira. Pogodan test je takođe opisan i ilustrovan u Primerima. Procena statusa infekcije može se uraditi korišćenjem VlsE ELISA na serumu ili qPCR na DNK izolovanom iz sakupljenih tkiva, ili korišćenjem drugih pogodnih postupaka.

[0069] Proizvodi prema pronalasku u kao što su, npr. polipeptidi prema pronalasku koji sadrže hibrdini OspA fragment i poželjno mutantni OspA C-terminalni fragment je moguće isporučiti 3 puta subjektu sa dozom od 30 µg, poželjno 10 µg, poželjno 5,0 µg, poželjno 1,0 µg, poželjno 0,3 µg ili niže imaju zaštitni kapacitet od 50% ili više, poželjno 60% ili više, poželjnije 70% ili više, poželjnije 80% ili više, poželjnije 90% ili više, još poželjnije 95% ili više, najpoželjnije 99% ili više. Zaštitni kapacitet je moguće proceniti u in vivo postupku veštačkog inficiranja, poželjno postupku veštačkog inficiranja sa krpeljem, poželjnije postupkom sa veštačkim inficiranjem iglom, npr. kao što je opisano u Primerima.

[0070] Razlika u zaštitnom kapacitetu (Δpc) između polipeptida prema pronalasku koji sadrži hibridni OspA C-terminalni fragment i placebo (negativne) kontrole je najmanje 50%, naročito najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99%, kada je primenjena 3 puta na subjekta sa dozom od 30 mg, poželjno 10 mg, poželjno 5.0 mg, poželjno 1.0 mg, poželjno 0.3 mg ili niže.

[0071] U skladu sa predmetnim pronalaskom, prvi deo hibridnog OspA može biti iz bilo kog soja Borrelia koji nije B garinii, soj PBr, sa SEK ID BR: 8, naročito od onih naznačenih ovde kao što su B. burgdorferi s.s., B. Garinii (nije soj PBr), B. afzelii, B. andersoni, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ili B. sinica, B. bavariensis, poželjno od B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis ili B. Garinii, ili spajanje (fuzija) OspA proteinskih fragmenata iz dve ili više ovih vrsta. Poželjno, OspA je od B. Valaisiana, posebno soj VS116 (SEK ID BR:4); ali može biti iz B. afzelii, naročito soj K78, OspA serotip 2 (SEK ID BR: 6); B. burgdorferi s.s., naročito soj B31, OspA serotip 1 (SEK ID BR: 5); B. garinii, naročito soj PBr, OspA serotip 3 (SEK ID BR: 8); B. bavariensis, naročito soj PBi, OspA serotip 4 (SEK ID BR: 9); B. garinii, naročito soj PHei, OspA serotip 5 (SEK ID BR: 10); B. garinii, naročito soj DK29, OspA serotip 6 (SEK ID BR: 11) ili B. garinii, naročito soj T25, OspA serotip 7 (SEK ID BR: 12). Aminokiselinske sekvence ovih OspA proteina (pune dužine) su date u nastavku.

[0072] U skladu sa ovim pronalaskom disulfidna veza može se formirati i između cisteina koji su uvedeni na bilo kojoj poziciji OspA fragmenta omogućavajući ili podržavajući odgovarajuće savijanje fragmenta. Položaji mogu biti selektovani, kao što je detaljno dato prethodno, na osnovu poznate strukture OspA. Primeri polipeptida koji sadrže barem jednu disulfidnu vezu uvedenu umetanjem cisteinskog ostatka na jednom od ostataka 182 /- 3 i jedan od ostataka 269 /- 3 (disulfidne veze tip 1; "D1") od B. afzelii K78 serotip 2 OspA, ili homologe aminokiseline OspA od Borrelia različite od B. afzelii, kao što je B. burgdorferi s.s., naročito soj B31, serotip 1; B. garinii, naročito soj PBr, serotip 3; B. bavariensis, naročito soj PBi, serotip 4; B. garinii, naročito soj PHei, serotip 5; B. garinii, naročito soj DK29, serotip 6; B. garinii, naročito soj T25, serotip 7 ili spajanje amino kiselina 125-176 od OspA of B. valaisiana, soj VS116, ili amino kiselina 126-175 od OspA of B. spielmanii i amino kiselina 177-274 of B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8), pri čemu je numerisanje amino kiselina supstitucija cisteina u skladu sa numerisanjem dogovarajućih amino kiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s., soj B31 (SEK ID BR: 5). Polipeptid iz ovog pronalaska sadrži barem jednu disulfidnu vezu uvedenu umetanjem ostatka cisteina na jednom od ostataka 182 /- 3 i jedan od ostataka 269 /- 3 (disulfidna veza tipa 1; "D1") od B. garinii, soj PBr (SEK ID BR: 8).

[0073] Napominje se:

Pozicija 182 /- 3 je skraćenica za položaj 179, 180, 181, 182, 183, 184 or 185, poželjno 182.

Položaj 269 /- 3 je skraćenica za položaj 266, 267, 268, 269, 270, 271 ili 272, poželjno 269.

[0074] Dodatni mutant fragment moguće je izvesti iz aminokiseline sa položaja 125, 126, 130 ili 131 do položaja 273 sekvence divljeg tipa OspA of B. afzelii soj K78, serotip 2 (SEK ID BR: 6) i razlikuje se samo po uvođenju najmanje jedne disulfidne veze, naročito naznačeno time da je najmanje jedna disulfidna veza između položaja 182 i 269 (disulfidna veza tipa 1); ili homologih fragmenata i položaja OspA od Borrelia sp. Različitog od B. afzelii, kao što je B. burgdorferi s.s., naročito soj B31, serotip 1; B. garinii, naročito soj PBr, serotip 3; B. bavariensis, naročito soj PBi, serotip 4; B. garinii, naročito soj PHei, serotip 5; B. garinii, naročito soj DK29, serotip 6 ili B. garinii, naročito soj T25, serotip 7.

[0075] Mutantni fragment može biti aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 43, SEK ID BR: 44, SEK ID BR: 45, SEK ID BR: 46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR: 48, najpoželjnije SEK ID BR: 46 i aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95% identičnost sekvence sa najmanje jednom od sekvenci sa SEK ID BR: 19 do 25, naznačeno time da cisteini nisu zamenjeni. Dodatne pojedinosti o mutacijama i identičnosti sekvence su prethodno date.

[0076] Kao što je prethodno detaljno dato, polipeptid prema predmetnom pronalasku može sadržati signalne sekvence. Pokazano je da lipidacija daje ađuvantske karakteristike OspA. Shodno tome, lipidovani oblici polipeptida prema pronalasku ili polipeptidi koji sadrže lipidacioni signal su poželjni. U poželjnom primeru izvođenja, polipeptid prema predmetnom pronalasku sadrži lipidacioni signal, poželjno lipidacioni signal proteina spoljne površine Borrelia, OspA ili OspB (SEK ID BR: 13 i 14, prema opisanom redosledu) ili poželjnije E. coli lpp sekvencu lipidacionog signala (SEK ID BR: 15). OspA fragment prema pronalasku koji sadrži lipidacioni signal je lipidovan tokom obrade i lipidacioni signalni peptid je isečen. Stoga signalni peptid nije više prisutan u zrelom lipidovanom proteinu.

[0077] Lipidovani proteini prema predmetnom pronalasku su označeni sa "Lip" na N-terminusu da bi se označila adicija grupa 3 masne kiseline i glicerola polipeptidu . Pogodni lipidacioni signali kao što su prethodno opisani uključuju MKKYLLGIGLILALIA (SEK ID BR: 13), MRLLIGFALALALIG (SEK ID BR: 14) i MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEK ID BR: 15). Iz razloga što e lipidni delovi i glicerol vezuju za N-terminalni cisteinski ostatak koji je prisutan u divljem tipu OspA proteina pune dužine, OspA C-terminalni fragmenti za lipidaciju mogu dodatno uključiti peptid koji sadrži cisteinski ostatak praćen dodatnim aminokiselinama. Na primer, sekvence kao što su CSS ili CKQN (SEK ID BR: 62) neposredno C-terminalno od lipidacione signalne sekvence obezbeđuju N-terminalni cisteinski ostatak za lipidaciju nakon isecanja lipidacionog signalnog peptida. Lipidovani peptidi koji sadrže cistein prisutni su u finalnom lipidovanom polipeptidu prema pronalasku.

[0078] Smatra se da OspA protein B. burgdorferi s.s. sadrži sekvencu sa kapacitetom da se vezuje za T-ćelijski receptor koji takođe ima kapacitet da se vezuje sa antigenom povezanim sa funkcijom humanog leukocita (hLFA-1) (ovde takođe označen kao "hLFA-1-slična sekvenca"). Sličnost ovog OspA regiona sa hLFA-1 može rezultovati u imunom odgovoru sa unakrsnom reaktivnošću nakon primene B. burgdorferi s.s. OspA na humanog subjekta i može indukovati autoimune bolesti, naročito autoimuni artritis, kod podložnih pojedinaca. Shodno tome, u poželjnom primeru izvođenja, polipeptid prema predmetnom pronalasku ne sadrži sekvencu sa vezujućim kapacitetom za T-ćelijski receptor koji ima vezujući kapacitet za antigen povezan sa funkcijom humanog leukocita (hLFA-1), i naročito ne sadrži aminokiselinsku sekvencu GYVLEGTLTAE (SEK ID BR: 17). U tom smislu, hLFA-1-slična sekvenca, naročito aminokiselinska sekvenca GYVLEGTLTAE (SEK ID BR: 17), može biti zamenjena sa homologom sekvencom iz OspA proteina druge Borrelia sp., naročito sa NFTLEGKVAND (SEK ID BR: 18).

[0079] U preporučenom izvođenju, polipeptid iz ovog pronalaska koji sadrži najmanje jednu disulfidnu vezu suštinski uspostavlja isti zaštitni kapacitet sa pomenutim polipeptidom protiv Borrelia infekcije u odnosu na najmanje jedan od divljeg tipa OspA proteina pune dužine izveden iz najmanje jednog Borrelia soja, naročito B. afzelii K78, OspA serotip 2 (SEK ID BR: 6); B. burgdorferi s.s., naročito soj B31, serotip 1 (SEK ID BR: 5); B. garinii, naročito soj PBr, serotip 3 (SEK ID BR: 7 i SEK ID BR: 8); B. bavariensis, naročito soj PBi, serotip 4 (SEK ID BR: 9); B. garinii, naročito soj PHei, serotip 5 (SEK ID BR: 10); B. garinii, naročito soj DK29, serotip 6 (SEK ID BR: 11) ili B. garinii, naročito soj T25, serotip 7 (SEK ID BR: 12).

[0080] Napominjemo da su dodatni detalji o mutacijama i identičnosti sekvence prethodno dati.

Tabela A-3 Nomenklatura i SEK ID BR: lipidovanog mutantnihih heterodimera OspA fragmenta su opisani u ovom pronalasku

[0081] U još jednom preporučenom izvođenju, polipeptid prema prvom varijantnom rešenju može sadržati najmanje dva ili tri mutantna fragmenta koji su povezani preko jednog ili više linkera. Linker je relativno kratka aminokiselinska sekvenca upotrebljena da poveže dva fragmenta. Treba da je projektovan tako da se izbegne bilo kakav negativni uticaj na fragmente, njihovu interakciju kod subjekata koje treba tretirati ili vakcinisati ili nakon njihovog zaštitnog kapaciteta. Poželjni su kratki linkeri od najviše 21 aminokiseline, naročito najviše 15 aminokiselina, naročito najviše 12 ili 8 aminokiselina. Poželjnije, jedan ili više linkera je/su sastavljeni od malih aminokiselina da bi se smanjile ili minimizovale interakcije sa frgamentima, kao što su glicin, serin i alanin. Poželjniji linker je "LN1" peptid linker, fuzija dva zasebna regiona petlje N-terminalne polovine OspA iz B. burgdorferi s.s., soj B31 (aa 65-74 i aa 42-53, sa zamenom aminokiseline na položaju 53 od D53S) koji ima sledeću sekvencu: GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEK ID BR: 16). Linker može sadržati mesto lipitacije [0082] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, polipeptid prema prvom aspektu sadrži polipeptid sa ukupnom veličinom od najviše 500 aminokiselina, koji sadrži dva ili tri različita mutant fragmenta kao što je definisano u prvom izvođenju prvog varijantnog rešenja; ili polipeptid koji se sastoji od suštinski dva ili tri različita mutant fragmenta, jedan ili dva linkera i, izborno, N-terminalni cistein; i/ili polipeptid koji se sastoji od suštinski dva ili tri različita mutant fragmenta, N-terminalna ekstenzija fragmenta koja se sastoji od najviše 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ili 11 aminokiselino, poželjno najviše 10, 9, 8, 7 ili 6 aminokiselina, još poželjnije najviše 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselina, naznačeno time da N-terminalna ekstenzija je locirana direktno N-terminalno od fragmenta u respektivnom Borrelia OspA i, izborno, N-terminalni cistein. N-terminalni cistein može biti izborno praćen sa kratkim peptidnim linkerom od 1-10 aminokiselina dužine i poželjno ima oblik N-terminalnog CSS peptida. Nukleinske kiseline iz ovog pronalaska i povezana varijantnih rešenja

[0083] U još jednom varijantnom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema ovom pronalasku. Nukleinska kiselina može biti sadržana u vektoru i/ili ćeliji.

[0084] Pronalazak dalje obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira polipetid prema pronalasku. Za svrhe pronalaska termin "nukelinska kiselina(e)" generalno se odnosi na bilo koji poliribonukleotid ili polidezoksiribonukelotid, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modified RNK ili DNK uključujući jednolančane i dvolančane regione/oblike.

[0085] Termin "nukleinska kiselina koja kodira polipeptid" kao što je ovde korišćeno obuhvata polinukleotide koji uključuju sekvencu koja kodira peptid ili polipeptid prema pronalasku. Termin takođe obuhvata polinukleotide koji uključuju pojedinačni kontinuirani region ili diskontinuirane regione koji kodiraju peptid ili polipeptid (na primer, polinukleotide prekinute sa integrisanim fagom, integrisanom insercionom sekvencom, integrisanim vektorom, integrisanom transpozon sekvencom, ili usled RNK izmene ili reorganizacije genomske DNK) zajedno sa dodatnim regionima, koji takođe mogu sadržati kodirajuće i/ili ne-kodirajuće sekvence.

[0086] Stručnjaci će shvatiti da, kao rezultat degeneracija genetičkog koda, postoje mnoge nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptid kao što je opisan ovde. Neki od polinukleotida nose minimalnu sličnost sa nukleotidnom sekvencom bilo kog nativnog (tj., prirodnog) gena. Ipak, polinukleotidi koji variraju usled razlika u upotrebi kodona su specifično predviđeni sa predmetnim pronalaskom, na primer polinukleotidi koji su optimizovani za selekciju kodona kod ljudi i/ili primata i/ili E. coli.

[0087] Sekvence koje kodiraju željeni polipeptid mogu se sintetisati, u celini ili delimično, korišćenjem hemijskih postupaka dobro poznatih u tehnici (videti Caruthers, M. H. ef al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp.215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp.225-232 (1980)). Alternativno, sam protein može se proizvesti korišćenjem hemijskih postupaka da se sintetiše aminokiselinska sekvenca polipeptida, ili njen deo. Na primer, sinteza peptida se može izvesti korišćenjem različitih tehnika čvrste faze (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) i automatizovana sinteza se može postići, na primer, korišćenjem ASI 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

[0088] Dodatno, polinukleotidne sekvence prema predmetnom pronalasku se mogu dobiti inženjeringom korišćenjem postupaka generalno poznatih u tehnici da bi se izmenile sekvence koje kodiraju polipeptid iz različitih razloga, uključujući, ali se ne ograničavajući na izmene koje modifikuju kloniranje, obradu, i/ili ekspresiju genskog proizvoda. Na primer, DNK mešanje nasumičnom fragmentacijom i PCR ponovno sastavljanje genskih fragmenata i sintetičkih oligonunukleotida može se koristiti za inženjering nukelotidnih sekvenci. Dodatno, mutageneza usmerena na mesto može se koristiti da se ubace nova restrikciona mesta, izmene obrasci glikozilacije, izmene preference kodona, proizvedu splajs varijante, ili introdukuju mutacije, i tako dalje.

[0089] U sledećem aspektu pronalaska predmetni pronalazak se odnosi na vektore koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku, npr. povezanu sa promoterom koji je moguće indukovati tako da kada je promoter indukovan, eksprimiran je polipeptid kodiran nukelinskom kiselinom. U poželjnom primeru izvođenja, vektor je pET28b(+) (http://www.addgene.org/vector-database/ 2566/).

[0090] Sledeći aspekt pronalaska sadrži pomenuti vektor naznačen time da je inducibilni promotor aktiviran dodatkom dovoljne količine IPTG (izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida) poželjno u medijum za uzgajanje. Izborno ovo je u koncentraciji od između 0.1 i 10 mM, 0.1 i 5 mM, 0.1 i 2.5 mM, 0.2 i 10 mM, 0.2 i 5 mM, 0.2 i 2.5 mM, 0.4 i 10 mM, 1 i 10 mM, 1 i 5 mM, 2.5 i 10 mM, 2.5 i 5 mM, 5 i 10 mM. Alternativno promotor može biti indukovan promenom temperature ili pH.

[0091] Molekul nukleinske kiseline kao što je ovde korišćeno generalno se odnosi na bilo koji molekul ribonukleinske kiseline ili molekul dezoksiribonukleinske kiseline, koji može biti RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. Stoga, na primer, molekul nukleinske kiseline kao što je ovde korišćeno odnosi se na najmanje jedno- i dvo-lančanu DNK, hibridne molekule koji sadrže DNK i RNK koji mogu biti jednolančani ili, tipičnije, dvolančani, ili smeša jedno- i dvolančanih regiona. Kao što je ovde korišćeno, termin molekul nukleinske kiseline uključuje DNK ili RNK molekule kao što je prethodno opisano koji sadrže jednu ili više modifikovanih baza. Stoga, DNK ili RNK molekuli sa modifikovanim kičmama u svrhu stabilnosti ili iz drugih razloga su "molekul nukelinske kiseline" jer je taj termin ovde nameravan. Dodatno, DNK ili RNK vrste koje sadrže neuobičajene baze, kao što je inozin, ili modifikovane baze, kao što su tritilovane baze, da se navedu samo dva primera, su takođe molekuli nukleinske kiseline kao što je ovde definisano. Shvatiće se da je veliki broj različitih modifikacija načinjen na DNK i RNK molekulima koje imaju mnoge korisne svrhe za stručnjake. Termin molekul nukleinske kiseline kao što je ovde korišćen obuhvata takve hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike molekula nukelinskih kiselina, kao i hemijske oblike DNK i RNK karakteristične za viruse i ćelije, uključujući, između ostalog, jednostavne i kompleksne ćelije. Termin molekul nukleinske kiseline takođe obuhvata kratke molekule nukleinske kiseline često označene kao oligonukleotid(i). Termini "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" ili "molekul nukleinske kiseline" ovde su korišćeni naizmenično.

[0092] Nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku mogu biti sintetisane hemijski. Alternativno, nukleinske kiseline mogu biti izolovane iz Borrelia i modifikovane postupcima poznatim stručnjaku. Isto važi za polipeptide prema predmetnom pronalasku.

[0093] Dodatno, nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku mogu biti funkcionalno vezane, korišćenjem standardnih tehnika kao što je kloniranje, u bilo koju željenu sekvencu (sekvence) bilo da je regulatorna sekvenca Borrelia ili heterologna regulatorna sekvenca, heterologna lider sekvenca, heterologna marker sekvenca ili heterologna kodirajuća sekvenca da bi se stvorio fuzioni gen.

[0094] Molekuli nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku mogu biti u obliku RNK, kao što je iRNK ili cRNK, ili u obliku DNK, uključujući, na primer, cDNK i genomsku DNK dobijenu kloniranjem ili proizvedenom tehnikama hemijske sinteze ili njihovom kombinacijom. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana. Jednolančana DNK može biti kodirajući lanac, takođe poznat kao sens lanac, ili može biti ne-kodirajući lanac, koji se takođe označava kao anti-sens lanac.

[0095] Nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku može biti sadržana u vektoru ili u ćeliji domaćina. Prema tome, ovaj se pronalazak odnosi na vektor ili ćeliju domaćina poželjno E. Coli, koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku. Vektor može sadržati prethodno pomenutu nukleinsku kiselinu na takav način da se vektor može replicirati i može eksprimirati protein kodiran nukleotidnom sekvencom u ćeliji domaćinu.

[0096] Za rekombinantnu proizvodnju polipeptida prema pronalasku, ćelije domaćini mogu biti napravljene genetskim inženjeringom da sadrže ekspresione sisteme ili njihove delove nukleinske kiseline prema pronalasku. Introdukcija nukleinske kiseline u ćeliju domaćina može biti izvedena postupcima opisanim u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što je Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) i Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), kao što je, kalcijum fosfat transfektovanje, DEAE-dekstran posredovano transfektovanje, transvekcija, mikroinjekcija, katjonskim lipidom posredovana transfekcija, elektroporacija, konjugacija, transdukcija, scrape loading, balistička introdukcija i infekcija.

[0097] Reprezentativni primeri odgovarajućih domaćina uključuju ćelije gram negativnih bakterija, kao što su ćelije E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Yersinia. U jednom primeru izvođenja ćelija domaćin je ćelija Escherichia coli. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je E. coli BL21 (DE3) ćelija ili E. coli BL21 Star™ (DE3) cell.

[0098] Alternativno se takođe mogu koristiti ćelije gram pozitivnih bakterija. Veliki broj različitih ekspresionih sistema se može koristiti za proizvodnju polipeptida prema pronalasku. U jednom primeru izvođenja vektor je izveden iz bakterijskih plazmida. Generalno bilo koji sistem ili vektor pogodan za održavanje, propagaciju ili ekspresiju polinukleotida i/ili ekspresiju polipeptida u domaćinu može se koristiti za ekspresiju u tom pogledu. Odgovarajuća DNK sekvenca može se inserirati u ekspresioni sistem bilo kojim brojnim različitim dobro poznatim i rutinskim tehnikama, kao što su, na primer, one date u Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).

[0099] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, ćelije su uzgajane pod selekcionim pritiskom, kao što je u prisustvu antibiotika, poželjno kanamicina. U sledećem primeru izvođenja, ćelije su uzgajane u odsustvu antibiotika.

[0100] Veliki broj različitih ekspresionih vektora može se koristiti da se eksprimiraju polipeptidi prema predmetnom pronalasku. Genralno, bilo koji vektor pogodan da se održe, propagiraju ili eksprimiraju nukelinske kiseline da eksprimiraju polipeptid u domaćinu mogu se koristiti za ekspresiju u ovom pogledu. U skladu sa ovim aspektom pronalaska vektor može biti, na priimer, plazmidni vektor, jedno- ili dvostruko-lančani fagni vektor ili jedno- ili dvolančani RNK ili DNK virusni vektor. Početni plazmidi otkriveni ovde su ili komercijalno dostupni, javno dostupni, ili se mogu konstruisati od dostupnih plazmida rutinskom primenom dobro poznatih, objavljenih procedura. Poželjni od vektora, u određenim aspektima, su oni za ekspresiju molekula nukelinske kiseline i polipeptida prema predmetnom pronalasku. Konstrukti nukleinske kiseline u ćelijama domaćinima mogu se koristiti na konvencionalni način za proizvodnju genskog proizvoda kodiranog sa rekombinantnom sekvencom. Alternativno, polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu se sintetički proizvesti konvencionalnim sintetizatorima peptida.

[0101] Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovaj vektor. Reprezentativni primeri odgovarajućih ćelija domaćina uključuju bakterije, kao što su streptokoke, stafilokoke, E. coli, Streptomyces i Bacillus subtilis; gljive, kao što je kvasac i Aspergillus; ćelije insekata kao što su Drosophila S2 i Spodoptera Sf9 ćelije; sisarske ćelije kao što su CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 ili Bowes melanom ćelije; i biljne ćelije. Sistemi za translaciju bez ćelija mogu se takođe upotrebiti da proizvedu takav protein korišćenjem RNK izvedene iz DNK konstrukta prema predmetnom pronalasku.

[0102] Da bi se eksprimirala željena aminokiselinska sekvenca praktično introdukcijom vektora prema predmetnom pronalasku u ćeliju domaćina, vektor može sadržati, dodatno sekvenci nukelinske kiseline prema predmetnom pronalasku, druge sekvence za kontrolu ekspresije (npr., promotor sekvence, terminator sekvence i enhanser sekvence) i genske markere za selekciju mikroorganizama, ćelije insekata, ćelije životinjske kulture, ili slično (npr., geni za rezistenciju na neomicin i kanammicin). Dodatno, vektor može sadržati sekvencu nukelinske kiseline prema predmetnom pronalasku u ponovljenom obliku (npr., u tandemu). Vektor može biti konstruisan na osnovu procedura koje se konvencionalano koriste u oblasti genetskog inženjeringa.

[0103] Ćelije domaćini mogu biti kultivisane u odgovarajućem medijumu, i protein prema predmetnom pronalasku može se dobiti iz proizvoda kulture. Protein prema predmetnom pronalasku može biti rekuperovan iz medijuma kulture i prečišćen na konvencionalni način.

[0104] Prema tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju ćelije koja izražava polipeptid prema ovom pronalasku, obuhvata transformisanje ili transfektovanje pogodne ćelije domaćina sa vektorom prema ovom pronalasku ili postupak za proizvodnju polipeptida prema ovom pronalasku, obuhvata izražavanje molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku.

[0105] Alternativno, postupak za proizvodnju polipeptida kao što je prethodno definisan, moguće je karakterisati sledećim koracima:

a) introdukcija vektora koji kodira polipeptid u ćeliju,

b) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju pomenutog polipeptida, c) homogenizacija ćelije domaćina, i

d) podvrgavanje homogenata ćelije domaćina koracima prečišćavanja.

[0106] Ovaj pronalazak se još odnosi napostupak za proizvodnju polipeptida kao što je prethodno definisan, koji karakterišu sledeći koraci:

a) introdukcija nukelinske kiseline koja kodira polipeptid u vektor,

b) introdukcija pomenutog vektora u ćeliju domaćina,

c) uzgajanje pomenute ćelije domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju polipeptida, d) homogenizacija pomenute ćelije domaćina,

e) obogaćivanje polipetida u lipidnoj fazi separacijom faza, i

f) dodatno prečišćavanje preko gel filtracione kolone.

[0107] Ovaj pronalazak se još odnosi na postupak za proizvodnju polipetida kao što je prethodno definisano, naznačen sledećim koracima:

a) introdukcija nukleinske kiseline koja kodira polipetid u vektor,

b) introdukcija pomenutog vektora u ćeliju domaćina,

c) uzgajanjem pomenute ćelije domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju polipetida, d) homogenizacija pomenute ćelije domaćina,

e) obogaćivanje polipetida u lipidnoj fazi separacijom faza,

g) prečišćavanje gel filtracionom kolonom, i

h) izborno, dodatna obrada preko pufer izmenjivačke kolone.

Antitela i povezana varijantna rešenja

[0108] Takođe je opisano antitelo, ili najmanje njegov delotvorni deo, koje se selektivno vezuje za hibridni C-terminalni OspA fragment kao što je definisano u kontekstu ovog pronalaska, ali ne na prvi OspA deo i drugi OspA deo sam (t.j. ako nije spojen na drugi deo.

[0109] Antitelo može biti monoklonsko antitelo.

[0110] Efikasni deo može sadržati Fab fragment, F(ab) fragment, F(ab)N fragment, F(ab)2 fragment ili Fv fragment ili antitelo pojedinačnog domena.

[0111] Antitelo može biti himerno antitelo.

[0112] Antitelo može biti humanizovano antitelo.

[0113] Antitela se mogu specifično vezivati za hibrid OspA fragmenta polipetide iz ovog pronalaska, ali ne za prvi OspA deo i drugi OspA deo sam i ne na odgovarajuće polipeptide OspA fragment divljeg tipa. Specifično, antitelo se može specifično vezivati za disulfidnu vezu mutant OspA fragmenta iz ovog pronalaska.

[0114] Termin "specifičnost" odnosi se na broj različtiih antigena ili antigenih determinanti za koje se određeni molekul antigen-vezujućeg molekula ili antigen-vezujućeg proteina (kao što je Nanobody ili polipetid prema pronalasku) može vezati. Specifičnost antigen-vezujućeg proteina može se odrediti na osnovu afiniteta i/ili aviditeta. Afinitet, predstavljen konstantom ravnoteže za disocijaciju antigena sa antigen-vezujućim proteinom (KD), mera je za snagu vezivanja između antigene determinante i antigenvezujućeg mesta na antigen-vezujućem proteinu: što je manja vrednost KD, veća je snaga vezivanja između antigene determinante i antigen-vezujućeg molekula (alternativno, afinitet takođe može biti eksprimiran kao konstanta afiniteta (KA), koja je 1/KD).

[0115] Kao što će stručnjaku biti jasno (na primer na osnovu daljeg otkrića ovde), afinitet se može odrediti na način poznat per se, u zavisnosti od specifičnog antigena od interesa. Aviditet je mera snage vezivanja između antigen-vezujućeg molekula (kao što je antitelo ili njegov efikasni deo) i relevantnog antigena. Aviditet je povezan i za afinitet između antigene determinante i njegovog antigen vezujućeg mesta na antigen-vezujućem molekulu i broja relevantnih mesta vezivanja prisutnih na antigenvezujućem molekulu. Tipično, antigen-vezujući protein (kao antitelo ili njegov efikasni deo) vezivaće se za njihov antigen sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>do 10<-12>M ili manje, i poželjno 10<-7>do 10<-12>M ili manje i poželjnije 10<-8>do 10<-12>M (tj. sa konstantom asocijacije (KA) od 10<5>do 10<12>M-1 ili više, i poželjno 10<7>do 10<12>litar/mol ili više i poželjnije 10<8>do 10<12>M-1). Bilo koja KDvrednost veća od 10<4>M (ili bilo koja KAvrednost manja od 10<4>M-1) se generalno smatra da je indikacija nespecifičnog vezivanja. Poželjno, monovalentna sekvenca imunoglobulina prema pronalasku vezivaće se za željeni antigen sa afinitetom manjim od 500 nM, poželjno manjim od 200 nM, poželjnije manjim od 10 nM, kao što je sa manjim od 500 pM. Specifično vezivanje antigen-vezujućeg proteina sa antigenom ili antigenom determinantom može se odrediti na bilo koji pogodni način poznat per se, uključujući, na primer, Scatchard analiza i/ili analize kompetitivnog vezivanja, kao što je radeoimunoanaliza (RIA), enzimske imunoanalize (EIA) i sendvič kompetitivne analize, i njihove različite varijante poznate per se u tehnici, kao i druge tehnike ovde pomenute.

[0116] Konstanta disocijacije može biti stvarna ili prividna konstanta disocijacije, kao što će stručnjaku biti jasno. Postupci za određivanje konstante disocijacije biće jasni stručnjaku, i uključuju na primer tehnike pomenute ovde. U ovom pogledu, takođe će biti jasno da ne mora biti moguće izmeriti kontante disocijacije veće od 10-4 M ili 10-3 M (npr., 10<-2>M). Izborno, kao što će stručnjaku biti jasno, (stvarna ili privodna) konstanta disocijacije može se izračunati na osnovu (stvarne ili prividne) konstante asocijacije (KA), preko odnosa [KD= 1/KA].

[0117] Afinitet označava snagu ili stabilnost molekulske interakcije. Afinitet je uobičajeno dat sa KD, ili konstantom disocijacije, koja ima jedinice mol/litar (ili M). Afinitet takođe može biti izražen kao konstanta asocijacije, KA, koja je jednaka 1/KDi ima jedinice (litar/mol)<-1>(ili M<-1>). U ovom opisu, stabilnost interakcije između dva molekula (kao što je aminokiselinska sekvenca, nanotelo ili polipetid prema pronalasku i njegova nameravana ciljna struktura) biće uglavnom izražena u odnosu na KDvrednost njihove interakcije; pri čemu je jasno stručnjaku da u pogledu realcije KA= 1/KD, specifikovana snaga molekulske interakcije sa njenom KDvrednošću takođe se može koristiti za izračunavanje odgovarajuće KAvrednosti. KDvrednost karakterizuje snagu molekulske interakcije takođe u termodinamičkom smislu jer je povezana sa slobodnom energijom (DG) vezivanja preko dobro poznatog odnosa DG = RT.ln(KD) (jednako DG = -RT.ln(KA)), gde je R jednako gasnoj konstanti, T jednako apsolutnoj temperaturi i ln označava prirodni logaritam.

[0118] KDza biološke interakcije koje se smatraju smislenim (npr. specifičnim) su tipično u opsegu od 10<-10>M (0.1 nM) do 10<-5>M (10000 nM). Što je snažnija interakcija, niži je njen KD.

[0119] KDantitela može biti između 10<-12>M i 10<-5>M, manja od 10<-6>, manja od 10<-7>, manja od 10<-8>M, manja od 10<-9>M, manja od 10<-10>M, manja od 10<-11>M, manja od 10<-12>M.

[0120] KDse takođe može izraziti kao odnos konstante stope disocijacije kompleksa, označene kao koff, prema stopi njegove asocijacije, označene kon(tako da KD= koff/koni KA= kon/koff). Stopa disocijacije ima jedinice s<-1>(gde s je SI jedinica za second). Stopa asocijacije konima jedinice M<-1>s<-1>. Stopa asocijacije može varirati između 102 M<-1>s<-1>do oko 107 M<-1>s<-1>, približavajući se difuzijom-ograničenom stopom asocijacije za bimolekularne interakcije. Stopa disocijacije je povezna sa polu-životom date molekularne interakcije preko odnosa t1/2= ln(2)/koff. Stopa disocijacije može varirati izmrđu 10<-6>s<-1>(sko ireverzibilni kompleks sa t1/2od više dana) do 1 s<-1>(t1/2= 0.69 s).

[0121] Afinitet molekulske interakcije između dva molekula može se meriti preko različtih tehnika poznatih per se, kao što je dobro poznata površinska plazmon rezonanca (SPR) biosenzor tehnika (videti na primer Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) gde je jedan molekul imobilisan na biosenzor čipu i drugi molekul prelazi preko imobilisanog molekula pod uslovima protoka koji daju kon, koffmere i stoga KD(ili KA) vrednosti. Ovo se, na primer može izvesti korišćenjem dobro poznatih BIACORE instrumenata.

[0122] Stručnjaku će takođe biti jasno da izmerena KDmože odgovarati prividnoj KDukoliko postupak merenja na neki način utiče ma sopstveni afinitet vezivanja impliciranih molekula na primer preko artefakata koji su povezani sa oblogom biosenzora jednog molekula. Takođe, prividna KDmože biti merena ukoliko jedan molekul sadrži više od jednog mesta prepoznavanja za drugi molekul. U takvoj situaciji na mereni afinitet može uticati aviditet interakcije od strane dva molekula.

[0123] Sledeći pristup koji se može koristiti da se proceni afinitet je ELISA postupak u 2-koraka (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) od strane Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Ovaj postupak ustanovljava merenje ravnotežnog vezivanja faze rastvora i izbegava moguće artefakte povezane sa adsorpcijom jednog od molekula na površinu kao što je plastika.

[0124] Međutim, tačno merenje KDmože zahtevati intenzivan rad; stoga, prividne KDvrednosti su često određene da bi se procenila snaga vezivanja dva molekula. Treba napomenuti da sve dok su sva merenja načinjena konzistento (npr. održavajući nepromenjene uslove analize), merenja prividne KDmogu se koristiti kao aproksimacija prave KDi stoga u predmetnom dokumentu KDi prividna KDtreba da se tretiraju sa jednakom važnošću ili relevantnošću.

[0125] Konačno, treba napomenuti da u mnogim situacijama iskusni naučnik može proceniti da je pogodno odrediti afinitet vezivanja u odnosu na neki relevantni molekul. Na primer, da bi se procenila snaga vezivanja između molekula A i B, može se npr. korisitti referentni molekul C za koji se zna da se vezuje sa B i koji jepogodno obeležen sa fluorofor ili hromofor grupom ili drugim hemijskim delom, kao što je biotin za laku detekciju u ELISA ili protočnoj citometriji ili drugom formatu (fluorofor za detekcije fluorescencije, hromofor za detekciju apsorpcije svetla, biotin za streptavidin-posredovanu ELISA detekciju). Tipično, referentni molekul C je održavan na fiksnoj koncentraciji i koncentracija A je varirana u odnosu na datu koncentraciju ili količinu B. Kao rezultat dobijena je vrednost inhibitorne koncentracije (IC)50koja odgovara koncentraciji A na kojoj signal meren za C u odsustvu A je prepolovljen. Uz uslov da je obezbeđena KDref, KDreferentnog molekula, je poznata, kao i ukupna koncentracija referentnog molekula cref, prividna KDza interakciju A-B može se dobiti iz sledeće formule: KD= IC50/(1 cref/KDref). Napominje se da ako Cref<< KDref, KD ≈ IC50. Uz uslov da je merenje IC50izvedeno na konzistentan način (npr. održavanjem fiksne cref) za vezujuća sredstva koja se upoređuju, snaga ili stabilnost molekulske interakcije može se proceniti sa IC50i ovo merenje je ekvivalentno KDili prividnoj KDu ovom tekstu.

[0126] Takođe je opisana ćelijska linija hibridoma, koja proizvodi antitelo kao što je prethodno definisano.

[0127] Takođe je opisan postupak za proizvodnju antitela kao što je prethodno definisano koji karakterišu sledeći koraci:

a) iniciranje imunog odgovora kod ne-humane životinje primenom polipetida kao što je prethodno definisano na pomenutu životinju,

b) uklanjanje telesne tečnosti koja sadrži antitelo iz pomenute životinje, i

c) proizvodnja antitela podvrgavanjem pomenute telesne tečnosti koja sadrži antitelo daljim koracima prečišćavanja

ili se karakteriše sledećim koracima:

a) ) iniciranje imunog odgovora kod ne-humane životinje primenom polipetida kao što je prethodno definisano na pomenutu životinju,

b) ukanjanje slezine ili ćelija slezine iz pomenute životinje,

c) proizvodnje hibridoma ćelija specifičnih za pomenutu slezinu ili ćelije slezine,

d) selekcija i kloniranje hibridoma ćelija specifičnih za pomenuti polipetid,

e) proizvodnja antitela kultivisanjem pomenutih kloniranih hibridoma ćelija, i

f) izborno izvođenje dodatnih koraka prečišćavanja.

je opisano ovde.

Farmaceutske supstance i sa njima povezana medicinska varijantna rešenja

[0128] Još jedno varijantno rešenje iz ovog pronalaska se odnosi na supstancu koja sadrži (i) polipeptid prema ovom pronalasku, nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku,; i

(ii) opciono farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

[0129] Prema tome, polipeptid prema ovom pronalasku, nukleinska kiselina prema ovom pronalasku, ili farmaceutsku supstancu prema ovom pronalasku može biti – za upotrebu kao lek posebno kao vakcina ili - za upotrebu u postupku za lečenje ili sprečavanje Borrelia infekcije, posebno B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ili B. sinica infection, preferably a B. burgdorferi s.s., B. afzelii ili B. garinii infekcije.

[0130] Poželjno, supstanca još sadrži Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29) i Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33), supstanca još sadrži Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29), supstanca još sadrži Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33), ili supstanca dodatno sadrži Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEK ID BR: 27) i Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33).

[0131] A još jedno varijantno rešenje se odnosi na farmaceutsku supstancu kao što je prethodno definisano za upotrebu za lečenjeili sprečavanje infekcije Borrelia vrstama, poželjnije patogenim Borrelia vrstama kao što je ovde otkriveno poželjnije koji sadrži B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis i B. garinii.

[0132] Problem u osnovi predmetnog pronalaska je rešen u drugom varijantnom rešenju korišćenjem polipeptida prema ovom pronalasku i/ili nukleinske kiseline prema ovom pronalasku, za pripremu farmaceutske supstance za tretiranje ili prevenciju infekcije sa Borrelia vrstama, poželjnije patogenim Borrelia vrstama kao što je ovde otkriveno poželjnije koji sadrži B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis i B. garinii.

[0133] Farmaceutska supstanca može izborno sadržati bilo koji farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent, kao što su puferske supstance, stabilizatori ili dodatni aktivni sastojci, naročito sastojci koji su poznati u vezi sa proizvodnjom farmaceutske supstance i/ili vakcine. Poželjno, farmaceutski prihvatljiv ekscipijent sadrži L-metionin. Poželjno farmaceutska supstancaje korišćena kao medikament, naročito kao vakcina ili za prevenciju ili tretiranje infekcije izazvane Borrelia vrstama, poželjnije patogenim Borrelia vrstama kao što je ovde otkriveno poželjnije koji sadrži B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis i B. garinii, i/ili druge patogene protiv kojih su uključeni antigeni u vakcini. Poželjno, farmaceutska supstanca je za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja Borrelia infekcije, specifično B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B.

lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ili B. sinica infekcije, poželjno B. burgdorferi s.s., B. afzelii ili B. garinii infekcije.

[0134] U jednom primeru izvođenja farmaceutska supstanca dalje sadrži ađuvant. Izbor pogodnog ađuvanta koji će se pomešati sa bakterijskim toksinima ili konjugatima napravljenim korišćenjem procesa pronalaska je unutar znanja stručnjaka. Pogodni ađuvanti uključuju so aluminijuma kao što je aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat, ali takođe mogu biti soli drugih metala kao što su one kalcijuma, magnezijuma, gvožđa ili cinka, ili mogu biti nerastvorljiva suspenzija acilovanog tirozina, ili acilovanih šećera, katjonski ili anjonski derivatizovanih saharida, ili polifosfazena. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska supstanca kao ađuvant koristi aluminijum hidroksid.

[0135] U sledećem primeru izvođenja, farmaceutska supstanca dalje sadrži imunostimulatornu supstancu, poželjno izabranu iz grupe koja se sastoji od polikatjonskih polimera, naročito polikatjonskih peptida, imunostimulatornih oligodezoksinukleotida (ODNs), naročito oligo(dIdC)13 (SEK ID BR: 63), peptida koji sadrže najmanje dva Lys-LeuLys motiva, naročito peptid KLKLLLLLKLK (SEK ID BR: 61), neuroaktivna jedinjenja, naročito humani hormon rasta, aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, Freund-ov kompletan ili nekompletan ađuvant, ili njihove kombinacije. Poželjno, imunostimulatorna supstanca je kombinacija ili polikatjonskog polimera i imunostimulatornih dezoksinukleotida ili peptida koji sadrži najmanje dva LysLeuLys motiva i imunostimulatorne dezoksinukleotide, poželjno kombinacije KLKLLLLLKLK (SEK ID BR: 61) i oligo(dIdC)13 (SEK ID BR: 63). Poželjnije, pomenuti polikatjonski peptid je poliarginin.

[0136] U sledećem primeru izvođenja, farmaceutska supstanca sadrži natrijum fosfat, natrijum hlorid, L-metionin, saharozu i Polisorbat-20 (Tween-20) na pH od 6.7 /- 0.2. Poželjno, farmaceutska supstanca takođe sadrži aluminijum hidroksid, poželjno na koncentraciji od 0.15%.

[0137] U jednom primeru izvođenja, formulacija sadrži između 5 mM i 50 mM natrijum fosfata, između 100 i 200 mM natrijum hlorida, između 5 mM i 25 mM L-Metionina, između 2.5% i 10% saharoze, između 0.01% i 0.1% Tween 20 i između 0.1% i 0.2% (tež/zapr) aluminijum hidroksida. Poželjnije, formulacija sadrži 10 mM natrijum fosfata, 150 mM natrijum hlorida, 10 mM L-Metionina, 5% saharoze, 0.05% Tween 20 i 0.15% (tež/zapr) aluminijum hidroksida na pH 6.760.2. Još poželjnije, formulacija sadrži najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri mutant OspA heterodimera (od kojih je jedan polipetid prema pronalasku).

[0138] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska supstanca sadrži 3 heterodimere, poželjno Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEK ID BR: 27) i Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33). Poželjno, tri heterodimera su pomešani u molarnom odnosu od 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1, 2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1, 2:3:2, 2:3:3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1, 3:2:2, 3:2:3, 3:3:1, 3:3:2, najpoželjnije 1:1:1.

[0139] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska supstanca sadrži dva heterodimera, poželjno Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29) i Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33), Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29) i Lip-S4D1-S3hybD1 (SEK ID BR: 27) ili Lip-S4D1-S3hybD1 (SEK ID BR: 27) i LipS5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33) u molarnom odnosu od 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, 2:3, 3:2, poželjno 1:1.

[0140] U jenom primeru izvođenja farmaceutska supstanca ili vakcina prema pronalasku dodatno sadrži najmanje jedan dodatni antigen iz Borrelia ili patogen koji nije Borrelia (ovde označen generički kao "kombinovana farmaceutska supstanca ili vakcina"). U poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen je izveden iz Borrelia vrste koja izaziva Lajmsku boreliozu. U različitim aspektima, najmanje jedan dodatni antigen je izveden iz drugog patogena, poželjno patogena kog prenosi krpelj. U dodatnom aspektu, patogen izaziva groznicu Stenovitih planina, humanu granulocitnu erlihiozu (HGE), Sennetsu groznicu, humanu monocitnu erlihiozu (HME), anaplazmozu, Butansku groznicu, Rickettsia parkeri rikeciozu, Southern Tick-Associated Rash Illness (STARI), Helvetica tačkastu groznicu, 364D rikecioza, Afričku tačkastu groznicu, relapsnu groznicu, tularemiju, krpeljsku groznicu Kolorada, encefalitis koji se prenosi krpeljem (TBE, takođe poznat kao FSME), Krim Kongo hemoragijsku groznicu, Q groznicu, Omsk hemoragijsku groznicu, bolest šuma Kjasanur (KFDV), Powassan encefalitis, bolest izazvanu Heartland virusom ili babeziozu. U sledećem aspektu, bolest je Japanski encefalitis.

[0141] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen je izveden iz patogena koji se prenosi vektorom, poželjno krpeljem, izabranim iz grupe koja se sastoji od Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Neoehrlichia mikurensis, Coxiella burnetii i Borrelia lonestari, virusa encefalitisa koji se prenosi krpeljem (TBEV takođe poznat kao FSME virus), virusa krpeljske groznice Kolorada (CTFV), virusa Krim Kongo hemoragijske groznice (CCHFV), virusa Omsk hemoragijske groznice (OHFV), virusa Japanskog encefalitisa (JEV) i Babesia spp.

[0142] U sledećem aspektu, ovaj se pronalazak odnosi na komplet koji sadrži farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska i dodatni antigen kako je definisano gore u tekstu, pri čemu je barem jedan dodatni antigen sadržan u drugoj supstanci, specifično pri čemu je druga supstanca vakcina, poželjno vakcina za krpeljom prenet encefalitis, vakcina protiv japanskog encefalitisa ili vakcina protiv pegavog tifusa Stenovitih planina (Rocky Mountain, USA). Prva supstanca može, takođe, biti vakcina. Kombinovana farmaceutska supstanca ili vakcina prema pronalasku sadrži bilo koju supstancu kako je ovde definisana patentnim zahtevima u kombinaciji sa najmanje drugom supstancom vakcine. U nekim apsektima, druga supstanca vakcine štiti protiv bolesti koja se prenosi vektorom, poželjno bolesti koja se prenosi krpeljem. U različitim aspektima, druga supstanca vakcine ima sezonski raspored imunizacije kompatibilan sa imunizacijom protiv Borrelia infekcije ili Lajmske borelioze. U drugim aspektima, kombinovane vakcine su korisne u prevenciji više bolesti za upotrebu na geografskim lokacijama gde su ove bolesti prevalentne.

[0143] U jednom aspektu, druga supstanca je vakcina izabrana iz grupe koja se sastoji od vakcine protiv encefalitisa koji se prenosi krpeljem, vakcine protiv Japanskog encefalitisa, i vakcina protiv tačkaste groznice Stenovitih planina. U poželjnom aspektu, supstanca vakcine je FSME-IMMUN® (Baxter), Encepur® (Novartis Vaccines), EnceVir® (Microgen NPO) ili TBE Moscow Vaccine® (Chumakov Institute of Poliomyelitis i Viral Encephalitides of Russian Academy of Medical Sciences). U sledećem poželjnom primeru izvođenja, supstanca vakcine je IXIARO®/JESPECT® (Valneva SE), JEEV® (Biological E, Ltd.) ili IMOJEV® (Sanofi Pasteur).

[0144] Dodatno je obezbeđena farmaceutska supstanca, koja je vakcina, ova vakcina može dodatno sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. U poželjnom primeru izvođenja, ekscipijent je L-metionin.

[0145] Pronalazak takođe uključuje imunogene supstance kao što je definisano u patentnim zahtevima. U nekim varijantnim rešenjima, imunogena supstanca prema pronalasku sadrži bilo koju od supstanci kako su definisane u patentnim zahtevima i farmaceutski prihvatljiv nosač. U različitim aspektima, imunogena supstanca ima osobinu indukcije proizvodnje antitela koje specifično vezuje protein A spoljne površine (OspA). U određenim aspektima, imunogena supstanca ima osobinu da indukuje proizvodnju antitela koje specifično vezuje Borrelia. U određenim aspektima, imunogena supstanca ima osobinu indukcije proizvodnje antitela koje neutralizuje Borrelia. U nekim aspektima, antitelo je proizvedeno od strane životinje. U dodatnim apsektima, životinja je sisar. U dodatnim aspektima, sisar je čovek.

[0146] Preparati vakcine koji sadrže farmaceutske supstance prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti za zaštitu sisara podložnog Borrelia infekciji ili tretiranje sisara sa Borrelia infekcijom, primenom pomenute vakcine preko sistemskog ili mukozalnog puta. Ove primene mogu uključivati injekciju preko intramuskularnog, intraperitonealnog, intradermalnog ili potkožnog puta; ili preko mukozalne primene na oralni/alimentarni, respiratorni ili urogenitalni trakt. Iako vakcina prema pronalasku može biti primenjena kao jedan doza, njene komponente mogu se takođe ko-primeniti zajedno istovremeno ili u različito vreme.

[0147] U jednom varijantnom rešenju, obezbeđen je komplet za vakcinu, koji sadrži vijalicu koja sadrži farmaceutsku supstancu prema pronalasku, izborno u liofilizovanom obliku, i dodatno sadrži vijalicu koja sadrži ađuvant kao što je ovde opisano. Predviđeno je da će se u ovom aspektu pronalaska, ađuvant koristiti da se rekonstituiše liofilizovana imunogena supstanca. U sledećem apsektu, farmaceutska supstanca prema pronalasku može biti prethodno pomešana u vijalici, poželjno u špricu.

[0148] Takođe je opisan postupak za lečenje ili prevenciju Borrelia infekcije kod subjekta kom je potrebno koji obuhvata korak isporuke subjektu terapijski delotvorne količine polipeptida iz ovog pronalaska, nukleinska kiselina iz ovog pronalaska, antitelo ili farmaceutsku supstancu prema ovom pronalasku.

[0149] Takođe je opisan postupak imunizacije subjekta kom je potrebna a koji obuhvata korak isporučivanja subjektu terapijski delotvorne količine polipeptida iz ovog pronalaska, nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, antitela ili farmaceutske supstance iz ovog pronalaska.

[0150] Još je opisan postupak za imunizaciju životinje ili čoveka protiv infekcije sa Borrelia organizmom, koji obuhvata korak isporuke pomenutoj životinji ili čoveku delotvorne količine polipeptida iz ovog pronalaska, nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, antitela ili farmaceutske supstance iz ovog pronalaska, pri čemu je delotvorna količina pogodna da izazove odgovor imunog sistema pomenute životinje ili čoveka.

[0151] Još je opisan postupak za stimulisanje odgovora imunog sistema životinje ili čoveka naspram Borrelia organizma, koji sadrži korak isporučivanja pomenutoj životinji ili čoveku delotvorne količine polipeptida iz ovog pronalaska, nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, antitela ili farmaceutske supstance iz ovog pronalaska, pri čemu je delotvorna količina pogodna da stimuliše odgovor imunog sistema kod pomenute životinje ili čoveka.

[0152] Poželjno, Borrelia organizam je izabran iz grupe koja obuhvata B. burgdorferi, specifično B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. hisitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ili B. sinica, poželjno B. burgdorferi s.s., B. afzelii ili B. garinii.

[0153] Obezbeđen je postupak za sprečavanje ili lečenje primarnih i/ili učestalog ponavljanja epizoda Borrelia infekcije koji sadrži isporuku domaćinu imunozaštitne doze farmaceutske supstance ili vakcine ili kompleta prema pronalasku.

[0154] Dodatni aspekt pronalaska je farmaceutska supstanca prema pronalasku za upotrebu u tretmanu ili prevenciji borelijske bolesti. U jednom primeru izvođenja obezbeđena je farmaceutska supstanca za upotrebu u tretmanu ili prevenciji Borrelia infekcije.

[0155] Još jedno varijantno rešenje ovog pronalaska opisuje upotrebufarmaceutske supstance ili vakcine ili kompleta prema pronalasku u proizvodnji medikamenta za tretman ili sprečavanje Borrelia infekcije. U jednom primeru izvođenja obezbeđena je farmaceutska supstanca prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji medikamenta za tretman ili prevenciju Borrelia infekcije.

[0156] Opis obezbeđuje i postupke za indukovanje imunološkog odgovora kod subjekta. U različitim aspektima, takvi postupci sadrže korak primene bilo koje imunogene supstance ili supstance vakcine razmatrane ovde na subjekta u količini efikasnoj da izazove imunološki odgovor. U određenim aspektima, imunološki odgovor sadrži proizvodnju anti-OspA antitela.

[0157] Opis obuhvata postupke za sprečavanje ili lečenje Borrelia infekcijom ili lajmskom boreliozom kod subjekta. U različitim aspektima, takvi postupci sadrže korak primene bilo koje od supstance vakcine razmatrane ovde ili bilo koje kombinovane vakcine razmatrane ovde na subjekta u količini efikasnoj da spreči ili tretira Borrelia infekciju ili Lajmsku boreliozu.

[0158] Opis obuhvata upotrebu polipetida, nukleinskih kiselina, antitela, farmaceutskih supstanci ili vakcina prema pronalasku za pripremu lekova. Druga povezana varijantna rešenja su takođe obezbeđena u predmetnom pronalasku.

[0159] Namera je da termini "koji sadrži", "sadrži" i "sadrže" od strane pronalazača ovde da budu izborno zamenjivi sa terminima "koji se sastoji od", "sastoji se odi "sastoje se od, respektivno, u svakoj instanci. Termin "sadrži" znači "uključuje". Stoga, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, podrazumeva se da reč "sadrži", i varijacije kao što su "sadrže" i "koji sadrži" impliciraju uključivanje navedenog jedinjenja ili kompozicje (npr., nukleinske kiseline, polipetida, antitela) ili koraka, ili grupe jedinjenja ili koraka, ali ne na isključivanje bilo kojih drugih jedinjenja, supstanca, koraka, ili njihovih grupa. Skraćenica, "e.g.(npr.)" je izvedena iz latinskog exempli gratia, i ovde je korišćena da naznači neograničavajući primer. Stoga, skraćenica "npr." je sinonim sa terminom "na primer".

[0160] Primeri izvođenja koji se ovde odnose na "supstance vakcine" prema pronalasku su takođe primenjivi na primere izvođenja koji se odnose na "farmaceutske supstance" prema pronalasku, i obrnuto.

[0161] Ukoliko nije drugačije objašnjeno, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje kao što je uobičajeno poznato stručnjaku u čijoj se oblasti nalazi ovo otkriće. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji mogu se naći u Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew ef al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology i Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).

[0162] Oblici jednine "a", "an", i "the" uključuju množinu osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje suprotno. Slično, namera je da reč "ili" uključuje "i" osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje suprotno. Termin "množina" odnosi se na dva ili više. Dodatno se podrazumeva da sve veličine baza ili sve veličine aminokiselina, i sve vrednosti molekulske težine ili molekulske mase, date za aminokiseline ili polipetide su približne, i obezbeđene su za opis. Dodatno, numeričke granice date u odnosu na koncentracije ili nivoe supstance, kao što je antigen, mogu biti približne.

[0163] Poželjni nosač ili ekscipijent za polipeptide prema pronalasku u njihovim različitim primerima izvođenja, ili molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku je imunostimulatorno jedinjenje kao što je ađuvant za dodatnu stimulaciju imunog odgovora na polipeptid prema predmetnom pronalasku ili njegova kodirajuća nukleinska kiselina.

[0164] Ađuvansi ili imunostimulatorna jedinjenja je moguće koristiti u supstancama prema ovom pronalasku uključuju. Poželjno, imunostimulatorno jedinjenje u farmaceutskom preparatu prema predmetnom pronalasku je izabrano iz grupe polikatjonskih supstanci, naročito polikatjonskih peptida, molekula imunostimulatornih nukleinskih kiselina, poželjno imunostimulatornih deoksinukleotida, emulzija ulje-u-vodi ili voda-u-ulju, MF59, soli aluminijuma, Freund-ovog kompletnog ađuvansa, Freund-ov nekompletnog ađuvansa, neuroaktivnih jedinjenja, naročito humanog hormona rasta ili njihovih kombinacija.

[0165] Upotreba ađuvansa aluminijum hidroksida i/ili aluminijum fosfata je naročito poželjna, i antigeni su generalno adsorbovani za ove soli. Poželjno, aluminijum hidroksid je prisutan u finalnoj koncentraciji od 0,15%. Korisni aluminijum fosfatni ađuvans je amorfni aluminijum hidroksifosfat sa PO4/Al molarnim odnosom između 0,84 i 0,92. Još jedan ađuvans koristan za ovajpronalazak je so aluminijuma koja može da obezbedi supstancu vodenog rastvora koja ima manje od 350 ppb teškog metala na osnovu težine supstance vodenog rastvora. Još jedan koristan ađuvans na bazi aluminijuma je AS04, kombinacija aluminijum hidroksida i monofosforil lipida A (MPL).

[0166] Takođe, farmaceutska supstanca u skladu sa predmetnim pronalaskom je farmaceutska supstanca koja sadrži najmanje bilo koje od sledećih jedinjenja ili njihovih kombinacija: molekula nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku, polipeptida prema predmetnom pronalasku u njihovim raznolikim primerima izvođenja, vektor prema predmetnom pronalasku, i ćelije prema predmetnom pronalasku. U vezi sa tim, bilo koje od ovih jedinjenja može biti korišćeno u kombinaciji sa nesterilnim ili sterilnim nosačem ili nosačima za upotrebu sa ćelijama, tkivima ili organizmima, kao što je farmaceutski nosač pogodan za primenu na subjekta. Takvi nosači mogu da obuhvataju, ali bez ograničenja na, fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, desktrozu, vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije. Formulacija bi trebalo da odgovara režimu primene.

[0167] Farmaceutska supstanca sadrži stabilizator. Pojam "stabilizator" označava supstancu ili ekscipijens vakcine koji štiti imunogenu supstancu vakcine od štetnih uslova, kao što su oni koji se javljaju u toku zagrevanja ili zamrzavanja, i/ili produžava stabilnost ili rok trajanja imunogene supstance u stabilnom i imunogenom stanju. Primeri stabilizatora obuhvataju, ali bez ograničenja na, šećere, kao što su saharoza, laktoza i manoza; šećerni alkoholi, kao što je manitol; aminokiseline, kao što je glicin ili glutaminska kiselina; i proteini, kao što je humani serum albumin ili želatin.

[0168] Farmaceutske supstance prema predmetnom pronalasku mogu biti primenjene na bilo koji efikasan, prikladan način uključujući, na primer, primenu preko topikalnih, oralnih, analnih, vaginalnih, intravenskih, intraperitonealnih, intramuskularnih, subkutanih, intranazalnih, intratrahealnih ili intradermalnih puteva, pored ostalih. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutske supstance su primenjene subkutano ili intramuskularo, najpoželjnije intramuskularno.

[0169] U terapiji ili kao profilaktik, aktivno sredstvo farmaceutske supstance prema predmetnom pronalasku može se primeniti na individuu kao injektabilna supstanca, na primer kao sterilna vodena disperzija, poželjno izotonična.

[0170] Alternativno supstanca, poželjno farmaceutska supstanca može biti formulisana za topikalnu primenu, na primer u obliku masti, krema, losiona, masti za oči, kapi za oči, kapi za uši, sredstava za ispiranje, impregniranih zavoja i šavova i aerosolova, i mogu da sadrže odgovarajuće konvencionalne aditive, uključujući, na primer, konzervanse, rastvarače za pomoć u prodiranju leka i emolijense u mastima i kremama. Takve topikalne formulacije takođe mogu da sadrže kompatibilne konvencionalne nosače, na primer baze za kremu ili mast, i etanol ili oleil alkohol za losione. Takvi nosači mogu da čine od oko 1% do oko 98 težinskih % formulacije; uobičajenije oni mogu da čine do oko 80 težinskih % formulacije.

[0171] Pored terapije opisane u prethodnom tekstu, supstance ovog pronalaska mogu biti korišćene generalno kao sredstvo za tretman rane za prevenciju adhezije bakterija za matriksne proteine izložene tkivu rane i za profilaktičku upotrebu u dentalnom tretmanu kao alternativa, ili zajedno sa, antibiotskom profilaksom.

[0172] U poželjnom primeru izvođenja farmaceutska supstanca je supstanca vakcine. Poželjno, takva supstanca vakcine je pogodno u injektabilnom obliku. Konvencionalni ađuvansi mogu biti korišćeni za pojačanje imunog odgovora. Pogodna jedinična doza za vakcinaciju sa proteinakim antigenom je za odrasle između 0.02 µg i 3 µg antigena po kg telesne težine za decu između 0.2 µg i 10 µg antigena po kg telesne težine, i takva doza se poželjno primenjuje 1 do 3 puta u intervalima od 2 do 24 nedelje.

[0173] U naznačenom opsegu doza, nisu očekivani štetni toksikološki efekti sa jedinjenjima prema pronalasku, koji bi sprečili njihovu primenu na pogodne individue.

[0174] Kao dodatno varijantno rešenje, ovaj pronalazak obuhvata komplet koji sadrži jednu ili više farmaceutskih formulacija kao što su definisane u patentnim zahtevima za primenu na subjekta pakovanih na način koji olakšava njihovu upotrebu za primenu na subjekte. Poželjno, komplet sadrži formulaciju u krajnjoj zapremini od 2 mL, poželjnije u krajnjoj zapremini od 1 mL.

[0175] Ovaj pronalazak obuhvata komplete za proizvodnju jedne doze jedinice primene. Kompleti, u različitim aspektima, svaki sadrže prvi spremnik koji ima osušeni protein i drugi spremnik koji ima vodenu formulaciju. Takođe uključeni unutar obima ovog pronalaska su kompleti koji sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom ili više komora (npr., tečne špriceve i lio-špriceve).

[0176] Takav komplet može obuhvattiti farmaceutsku formulaciju kao što je definisana u patentnim zahtevima (npr., supstanca koja sadrži terapeutski protein ili peptid), pakovanu u spremnik kao što je hermetički zatvorena boca ili posuda, sa etiketom pričvršćenom za spremnik ili uključenom u pakovanje koja opisuje upotrebu jedinjenja ili supstance u izvođenju postupka. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija je pakovana u spremniku tako da je količina praznog prostora u spremniku (npr., količina vazduha između tečne formulacije i vrha spremnika) veoma mala. Poželjno, količina praznog prostora je zanemarljiva (tj., skoro ga nema).

[0177] Komplet može da sadrži prvi spremnik koji ima terapeutsku supstancu proteina ili peptida i drugi spremnik koji ima fiziološki prihvatljiv rastvor za rekonstituciju supstance. U jednom aspektu, farmaceutska formulacija je pakovana u obliku jedinične doze. Komplet izborno dalje obuhvata uređaj pogodan za primenu farmaceutske formulacije prema specifičnom putu primene. U nekim aspektima, komplet sadrži etiketu koja opisuje upotrebu farmaceutskih formulacija.

[0178] Farmaceutska supstranca može da sadrži opseg različitih antigena. Primeri antigena su celi ubijeni ili atenuirani organizmi, pod-frakcije ovih organizama, proteini, ili, u njihovom najjednostavnijem obliku, peptidi. Antigeni takođe mogu biti prepoznati od strane imunog sistema u obliku glikozilovanih proteina ili peptida i mogu takođe biti ili da sadrže polisaharide ili lipide. Kratki peptidi mogu biti korišćeni, s obzirom na to da citotoksične T-ćelije (CTL) prepoznaju antigene u obliku kratkih, obično 8-11 aminokiselina dugih, peptida zajedno sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC). B ćelije mogu da prepoznaju linearne epitope tako kratke kao 4 do 5 aminokiselina, kao i trodimenzionalne strukture (konformacione epitope).

[0179] Farmaceutska supstanca može dodatno sadržati hiperimuni serum-reaktivni antigen protiv proteina Borrelia-e ili njegov aktivni fragment ili varijantu, kao što su, npr., antigeni, fragmenti i varijante kao što su opisani u WO2008/031133.

[0180] Prema pronalasku, farmaceutsku supstancu prema još jednom varijantnom rešenju moguće je koristiti kao lek, naročito kao vakcina, naročito u vezi sa sa bolešću ili obolelim stanjem koje je uzrokovano, vezano ili povezano sa Borrelia-om.

[0181] Farmaceutska supstanca prema predmetnom pronalasku može biti korišćena kao lek, naročito kao vakcina, naročito u vezi sa bolešću ili obolelim stanjem koje je uzrokovao sa, vezano ili povezano sa Borrelia-om, poželjnije bilo kojom patogenom vrstom Borrelia i poželjnije za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju infekcije Borrelia-om, naročito infekcije sa B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ili B. sinica, poželjno infekcije sa B. burgdorferi s.s., B. afzelii ili B. garinii.

[0182] U vezi s tim, trebalo bi naglasiti da različite vrste Borrelia, uključujući B. burgdorferi s.l., sadrže nekoliko vrsta i sojeva uključujući one koje su ovde otkrivene. Bolest povezana, uzrokovana ili povezana sa bakterijskom infekcijom koja se sprečava i/ili leči prema predmetnom pronalasku obuhvata Lajmsku boreliozu (Lajmsku bolest). Specifičnije, Lajmska borelioza se generalno javlja u stadijumima, sa remisijom i pogoršanjima sa različitim kliničkim manifestacijama na svakom stadijumu. Stadijum rane infekcije 1 sastoji se od lokalizovane infekcije kože, praćene unutar nekoliko dana ili nedelja stadijumom 2, diseminovanom infekcijom, i mesecima ili godinama kasnije stadijumom 3, perzistentnom infekcijom. Međutim, infekcija je varijabilna; neki pacijenti imaju samo lokalizovane infekcije kože, dok drugi ispoljavaju samo kasnije manifestacije bolesti, kao što je artritis.

[0183] Farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska moguće je koristiti u postupku za lečenje ili prevenciju infekcije Borrelia-om kod subjekta kod koga postoji potreba za tim, koji sadrži korak primene na subjekta terapeutski efikasne količine farmaceutske supstance prema trećem aspektu.

[0184] Termin "subjekat" je korišćen u specifikaciji za opisivanje životinje, poželjno sisara, poželjnije čoveka, kome je obezbeđen trertman ilipostupak prema predmetnom pronalasku. Za tretman onih infekcija, stanja ili obolelih stanja koji su specifični za specifičnu životinju kao što je humani pacijent, termin pacijent se odnosi na tog specifičnog pacijenta. Poželjno, subjekat je čovek; međutim, medicinska upotreba supstance može takođe da obuhvata životinje kao što je živina uključujući kokoške, ćurke, patke ili guske, goveda kao što je konj, krava ili ovca, ili prateće životinje kao što su psi ili mačke.

[0185] Termin "efikasna količina" je korišćen u specifikaciji za opisivanje količine predmetne farmaceutske supstance koja bi se mogla koristiti za indukovanje nameravanog rezultata kada je korišćena u postpku predmetnog pronalaska. U brojnim aspektima predmetnog pronalaska, termin efikasna količina je korišćen zajedno sa tretmanom ili prevencijom. U ostalim aspektima, terin efiksna količina se jednostavno odnosi na količinu sredstva koja proizvodi rezultat koji je zabeležen kao koristan, uključujući u postupcima prema predmetnom pronalasku gde se traži tretman ili prevencija infekcije Borrelia-om.

[0186] Termin efikasna količina u vezi sa trenutnoopisanim jedinjenjima i supstancama je korišćen u specifikaciji za opisivanje one količine jedinjenja prema predmetnom pronalasku koja je primenjena na sisarskog pacijenta, naročito uključujući humanog pacijenta, koji pati od bolesti povezane sa Borreliaom, za redukciju ili inhibiciju infekcije Borrelia-om.

[0187] U preporučenom izvođenju, farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska je moguće koristiti u postupku imunizacije subjekta koji sadrži korak primene na subjekta terapeutski efikasne količine farmaceutske supstance trećeg aspekta predmetnog pronalaska.

[0188] Postupak sadrži indukciju imunološkog odgovora kod individue preko genske terapije ili na drugi način, primenom polipeptida ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku in vivo u cilju stimulacije imunološkog odgovora za proizvodnju antitela ili ćelijski-posredovanog T ćelijskog odgovora, T ćelija koje proizvode citokin ili citotoksičnih T ćelija, za zaštitu navedene individue od bolesti, bez obzira na to da li je bolest već uspostavljena unutar individue.

[0189] Proizvodi prema predmetnom pronalasku, naročito polipeptidi i nukleinske kiseline, su poželjno obezbeđeni u izolovanom obliku, i mogu biti prečišćeni do homogenosti. Termin "izolovan" kao što je ovde korišćen označava odvojen "rukom čoveka" iz njegovog prirodnog stanja; tj., ako se javljaju u prirodi, promenjen je ili uklonjen iz njegove originalne sredine, ili oba. Na primer, prirodni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid koji je prirodno prisutan u živom organizmu u njegovom prirodnom stanju nije "izolovan", ali isti molekul nukleinske kiseline ili polipeptid odvojen iz koegzistirajućih materijala njegovog prirodnog stanja je "izolovan", kao što je taj termin ovde korišćen. Kao deo od ili posle izolacije, takvi molekuli nukleinskih kiselina mogu biti spojeni sa ostalim molekulima nukleinske kiseline, kao što su molekuli DNK, za mutagenezu, da bi se formirali fuzioni geni, i za propagaciju ili ekspresiju u domaćinu, na primer. Izolovani molekuli nukleinskih kiselina, pojedinačni ili spojeni sa ostalim molekulima nukleinskih kiselina kao što su vektori, mogu biti uvedeni u ćelije domaćine, u kulturu ili u cele organizme. Uvedeni u ćelije domaćine u kulturi ili u celim organizmima, takvi DNK molekuli još uvek bi bili izolovani, kao što je taj termin ovde korišćen, zbog toga što oni ne bi bili u njihovom prirodnom obliku ili sredini. Slično, molekuli nukleinske kiseline i polipeptidi mogu da se jave u supstanci, kao što su formulacije medijuma, rastvori za uvođenje molekula nukleinskih kiselina ili polipeptida, na primer, u ćelije, supstance ili rastvore za hemijske ili enzimatske reakcije, na primer, koje nisu prirodne supstance, i, tu ostaju izolovani molekuli nukleinskih kiselina ili polipeptidi unutar značenja tog termina kao što je ovde korišćen.

[0190] Pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense opisane ovde zbog toga što oni mogu da variraju. Pored toga, terminologija koja je ovde korišćena je samo za svrhu opisivanja određenih primera izvođenja i nije bila namera da ograniče obim predmetnog pronalaska. Kao što su korišćeni ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini obuhvataju množinu osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Slično, reči "sadrži", "uključuje" i "obuhvata" tumače se pre uključujući nego isključujući.

[0191] Osim ukoliko su definisani drugačije, svi tehnički i naučni termini i bilo koji akronimi koji su ovde korišćeni imaju ista značenja kao što je uobičajeno shvaćeno od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike u oblasti pronalaska. Iako bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu biti korišćeni u izvođenju predmetnog pronalaska, ovde su opisani poželjno postupci i materijali.

[0192] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim slikama, tabelama, primerima i listingom sekvenci, iz kojih se mogu uzeti dodatne karakteristike, primeri izvođenja i prednosti. Kao takve, razmatrane specifične modifikacije ne treba tumačiti kao ograničavajuće za obim pronalaska. Stručnjaku iz date oblasti tehnike biće jasno da je moguće napraviti različite ekvivalente, promene i modifikacije bez udaljavanja od obima pronalaska, i na taj način treba razumeti da su takvi ekvivalentni primeri izvođenja uključeni ovde.

[0193] U vezi sa predmetnim pronalaskom, Sl. 1 prikazuje elektrostatički potencijalne izokonture disulfidnom vezom stabilizovanih fragmenata serotipa 1do serotipa 6 i B. valaisiana OspA (S1D1-S6D1 i BvaD1), kao i mutantni fuzioni OspA fragment iz ovog pronalaska koji se sastoji od amino kiselina 125-176 of B. valaisiana, soj VS116, i amino kiselina 177-274 od B. garinii, soj PBr, sa uvedenom disulfidnom vezom (S3hybD1).

Sl.2 pokazuje poravnanje amino kiseline od Lip-S4D1-S3hybD1, mutantni serotip 3 OspA fuzionog proteina heterodimera koji sadrži fragment, sa proteinom heterodimera Lip-S4D1-S3D1.

Sl. 3 šematski prikazuje proizvodnju heterodimera mutantnog fragmenta OspA prema predmetnom pronalasku.

Sl. 4 šematski prikazuje polipeptidne komponente jedne moguće farmaceutske supstance predmetnog pronalaska, "poboljšanu kombinovanu vakcinu", koji sadrži tri različita heterodimera mutantnog OspA, uključujući Lip-S4D1-S3hybD1.

Sl. 5 prikazuje hemijsku strukturu Pam3Cys, primer cisteina supstituisanog masnom kiselinom, kao što bi se mogao naći na N-terminusu lipidiranih polipeptida predmenog pronalaska.

Sl. 6 prikazuje vezivanje titera IgG antitela na Borrelia OspA protein serotipa 1-6 proizvedene kod miševa kao odgovor na imunizaciju sa vakcinom iz ovog pronalaska -kombinovanog poboljšanog heterodimera.

Tabela 7 prikazuje stabilnost antitela iz kombinovane vakcine poboljšanog heterodimera iz ovog pronalaska na površinu ćelije Borrelia spiroheta iz OspA serotipova 1-6..

[0194] Tabela 1 upoređuje prinos prečišćavanja od Lip-S4D1-S3hybD1 heterodimer i Lip-S4D1-S3D1 heterodimer

[0195] Table 2 prikazuje zaštitan kapacitet kombinovane vakcine poboljšanog heterodimera prema pronalasku protiv veštačkeizazova sa OspA serotipovi 1, 2, 5 i 6 Borrelia.

[0196] Slike i tabele koje mogu biti navedene u specifikaciji su opisane u daljem tekstu detaljnije.

[0197] Sl.1 Elektrostatička potencijalna stimulacija disulfidnom vezom stabilizovanih OspA fragmenata iz serotipa 1-6 (S1D1-S6D1) i B. valaisiana (BvaD1) kao i disulfidnom vezom stabilizovan fuzioni OspA fragment (S3hybD1). Izokonture (+/- 1 kT/e) su obojene svetlo za negativna naelektrisanja i tamno za pozitivna naelektrisanja, kao čvrsta površina. Površina dostupna u rastvaraču se prikazuje kao skica u obliku žičane strukture. Bele strelice označavaju poziciju dva proširena skupa koji daju podsticaj elektrostatičkoj polarnosti na istoj ravni serotipa 3 fragmenta. Može se videti da površine hibridnog OspA C terminalnog fragmenta ne poseduju proširene elektostatičke polarne skupove kao S3D1 monomer.

[0198] Sl.2 Poravnanje sekvence amino kiseline od Lip-S4D1-S3hybD1 i Lip-S4D1-S3D1 heterodimerni polipeptidi, pokazuje podudarnu (konsenzus) sekvencu. Taj Lip-S4D1-S3hybD1 heterodimer se razlikuje od Lip-S4D1-S3D1 heterodimera samo za 31 amino kiselinom ukupno.

[0199] Sl. 3 Proizvodnja heterodimera mutantnog OspA prema pronalasku sadrži C-terminalne dva fragmenta mutantnog OspA izabrana iz različitih OspA serotipova Borrelia sp. .ili hibridnog fragmenta mutantnog OspA C-terminalnog fragmenta (A) Šematski prikaz nukleinske kiseline koja kodira heterodimer lipidiranog mutantnog OspA. Komponente, od 5’ do 3’, sadrže kodirajuće sekvence za lipidacionu signalnu sekvencu (Lip signal), mali peptid koji sadrži cistein za N-terminalnu lipidaciju, mutantni C-terminalni fragment OspA sa dva nenativna cisteina, kratak linker peptid (LN1), praćen drugim C-terminalnim fragmentom mutantnog OspA sa dva nenativna cisteina. (B) Intermedijerni heterodimerni polipeptid mutantnog OspA sadrži nascentni proizvod direktno posle translacije konstrukta nukleinske kiseline. Od N- do C-terminusa, ovaj polipeptid se sastoji od lipidacione signalne sekvence (Lip signal), CSS peptid za lipidaciju (LP), fragmenta mutantnog OspA sa ne-nativnom disulfidnom vezom, kratkog linker peptida (LN1), praćenog drugim fragmentom mutantnog OspA sa nenativnom disulfidnom vezom. (C) Krajnji lipidirani heterodimerni polipeptid mutantnog OspA posle posttranslacione modifikacije. Heterodimer, od N- do C-terminusa, sastoji se odCSS peptida koji sadrži cistein sa lipidiranim N-terminalnim cisteinom, mutantnim fragmentom OspA stabilizovanim sa disulfidnom vezom, linker peptida (LN1) i drugog mutantnog fragmenta OspA stabilizovanog sa disulfidnom vezom. Lipidaciona signalna sekvenca je odvojena u toku post-translacione modifikacije polipeptida kao što je prikazano.

[0200] Sl. 4 Primer poželjne farmaceutske supstance prema predmetnom pronalasku. Tri heterodimera mutantog OspA, od kojih svaki sadrži dva mutirana fragmenta OspA izabrana iz dva različita Borrelia OspA serotipa ili hibridna mutantna OspA C-terminalna fragmenta (S3hybD1) su prisutni u supstanci, zajendo obezbeđujući OspA antigene iz šest različitih Borrelia OspA serotipova. Takva farmaceutska supstanca omogućava istovremenu imunizaciju protiv šest serotipova Borrelia.

[0201] Sl. 5 Ilustracija hemijske strukture Pam3Cys, primera supstitucije masne kiseline N-terminalnog cisteina pune dužine divljeg tipa OspA proteina kao i lipidiranog heterodimera mutantnog fragmenta OspA prema pronalasku. U toku post-translacione modifikacije pune dužine OspA proteina ili polipeptida prema pronalasku, N-terminalna lipidaciona signalna sekvenca je odvojena i masne kiseline, najčešće tri palmitoil grupe ("Pam3"), su enzimatski kovalentno vezane za N-terminalni cisteinski ostatak (atom sumpora, "S", je označen zvezdicom). Preostali ostaci polipeptidnog lanca, koji su locirani C-terminalno od Pam3Cys ostatka, su predstavljeni sa "Xn". (Modified from Bouchon, et al. (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61.)

[0202] Sl.6 Titri anitela generisani na svih šest serotipova OspA proteina pune dužine. Miševi su imunizovani tri puta sa 3 mg svake od naznačenih kombinovanih vakcina: Lip-S1D1-S2D1, LipS4D1-S3D1 i Lip-S5D1-S6D1 zajedno u 1:1:1 odnosu ("Het kombo"); Lip-S1D1-S2D1, LipS4D1-S3hybD1 i Lip-S5D1-S6D1 zajedno u 1:1:1 odnosu ("Poboljšani het kombo") ili sa Lip-Chimeric OspA ST1/ST2-His, Lip-Chimeric OspA ST5/ST3-His i Lip-himerni OspA ST6/ST4-His zajedno u 1:1:1 odnosu ("himerni kombo") u dvonedeljnim intervalima i serumi su prikupljeni u jednoj nedelji posle poslednje doze. Titri IgG antitela na šest različitih serotipova pune dužine OspA proteina su utvrđeni pomoću ELISA.

[0203] Fig. 7 Vezivanje antitela iz imunizovanih miševa za ćelijsku površinu Borrelia spiroheta. Miševi su imunizovani kao što je gore opisano i serumi su sakupljeni jednu nedelju posle poslednje doze and sakupljeni. Serijska razblaženja seruma su testirana za vezivanje za ćelijsku površinu Borrelia spirochetes preko bojenja ćelija ili protočne citometrije. Vrednosti intenziteta fluorescencije zabeležene kod bojenja sa serumima sakupljenim iz kontrolnih miševa imunizovanih samo sa Al(OH)3ađuvansom su oduzete zbog nespecifičnog vezivanja. (u ogledu vezivanja je korišćena Borrelia: B. burgdorferi, OspA serotip 1, soj N40; B. afzelii, OspA serotip 2, soj "PKo"; B. garinii, OspA serotip 3, soj "Fr"; B. bavariensis, OspA serotip 4, soj Fin; B. garinii, OspA serotip 5, soj "PHei"; B. garinii, OspA serotip 6, soj KL11.)

PRIMERI

Primer 1. Molekularno modelovanje hibridnog OspA C-terminalnog fragmenta fragmenata OspA serotipa 3

Motivacija da se konstruišu hibridni OspA ST3 C-terminalni fragmenti

[0204] kombinovana vakcina za lajmsku boreliozu kako je opisano u prethodnoj prijavi (WO2014/006226) se sastoji od tri mutantna OspA heterodimera. kratki stabilizovani frafmenti iz dva različita OspA serotipa (ST), izvedena iz C-terminalnog domena, se spajaju fuzijom sa kratkim linkerom da bi formirali heterodimer. Tri heterodimera su sastavljena od OspA ST1-ST2, ST4-ST3 i ST5-ST6. Za poboljšanje imunogenosti heterodimera, signalna sekvenca za lipidaciju se dodaje kao analogija sa zrelim OspA pune dužine koji je lipoprotein.

[0205] Lipidovani heterodimer sastavljen od OspA ST4-ST3 (Lip-S4D1-S3D1; SEK ID BR: 31) se pokazao manje rastvorljivim od dva druga heterodimera, koji daju kao rezultat slab oporavak tokom prečišćavanja. Ovaj problem je uglavnom moguće pripisati kratko stabilizovanom delu OspA ST3 jer ovaj protein, kao lipidovani monomer, ne može da bude izražen i prečišćen. Molekulsko modeliranje [0206] Obimno ispitivanje strukture stabilizovanih monomera je izvedeno in silico da bi se razjasnila kompatibilnost prevoja između monomernih modela u poređenju sa models OspA kristalnom strukturom (PDB:1OSP; Li H, Dunn JJ, Luft BJ, Lawson CL (1997) Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab. Proc Natl Acad Sci 94: 3584-3589) i da bi se uporedila njihova površinska svojstva sa ST3 tipom monomera. kristalna struktura predstavlja serotip 1 od Borrelia burgdorferi B31, i pokazuje OspA vezu sanjegovim N-terminusom, na mišje antitelo Fab 184.1. Modeli homologne strukture šest kratkih stabilizovanih OspA monomera su konstruisani počevši sa ST1 OspA kristalnom strukturom i dostupnim homolognim modelima (SwissModel; Kiefer F, Arnold K, Kunzli M, Bordoli L, Schwede T (2009) The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res 37: D387-392), koji su zatim modifikovani da bi obuhvatili stabilizujuće disulfidne veze i promene sekvence (redosleda+) gde je moguće (The PyMOL Molecular Graphics System, Version Open-Source, Schrödinger LLC).

[0207] Elektrostatički potencijalne izokonture svih šest kratkih stabilizovanih OspA monomera su stimulisani sa adaptivnim Puasonov-Bolcmanovim softverom za rešavanje jednačine(APBS; Baker NA, Sept D, Joseph S, Holst MJ, McCammon JA (2001) Elektrostatika nanosistema: primena na mikrocevčice i ribozom. Proc Natl Acad Sci 98: 10037-10041, pdb2pqr; Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, et al. (2007) PDB2PQR: proširivanje i ažuriranje automatskog dobijanja biomolekularnih struktura za molekularne stimulacije. Nucleic Acids Res 35: W522-525) da bi se utvrdilo da li kratko stabilizovan OspA ST3 protein ima obrazacn u elektrostatici površine koji odstupa od drugih OspA STs, što bi moglo objasniti problem rastvorljivosti kratko stabilizovanog OspA ST3 ("S3D1", Sl.1). Značajna polarnost u u raspodeli naelektrisanja je primećena na jednoj strani S3D1 (videti strelice), što nije primećeno ni kom drugom kratko stabilizovanim OspA ST.

[0208] izvedena je i stimulacija elektrostatičkog potencijala sa kratko stabilizovanim OspA iz B. valaisiana ("BvaD1", Sl.1). BvaD1 OspA fragment je pokazao varijantni polaritet izokontura elektrostatičkog potencijala na površini, što ga čini potencijalnim kandidatom za konstrukcioni element za delimičnu segmentu razmenu u cilju modifikovanja celokupne površine da se ne bi pokazale nikakvi značajno produžene grupacije proširenog elektrostatičkog polariteta kako je utvrđeno u S3D1. Poželjna veza između dela serotipa 3 i razmenjenog dela iz B. valaisiana u hibridnom monomeru je izabrana da bi zamenila N-terminalni beta-list monomera i da ostavi dva beta lista i Cterminalnu zavojnicu dela serotipa 3 nedirnutom, pod zadržavanjem celokupnog prevoja. TOvaj drugi uslov uglavnom zavisi od sterne kompatibilnosti gustko spakovanih hidrofobnih ostataka u jezgru tog molekula. Kompatibilnost prevoja za model hibridno stabilizovanog monomera, S3hybD1, je verifikovana sa molekulskom mehaničkom stimulacijom (Gromacs; Pronk S, Pall S, Schulz R, Larsson P, Bjelkmar P, et al. (2013) GROMACS 4.5: komplet za molekulsku stimulaciju otvorenog izvora visoke propusnosti i izrazite paralelnosti (a highthroughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit). Bioinformatics 29: 845-854). primena u obliku heterodimera koji sadrži hibridni OspA fragment

[0209] Kao rezultat stimulacija elektrrostatičkog potencijala, novi heterodimer koji sadrži eksperimentalno spajanje fuzijom fragmenata OspA proteina iz B. valaisiana i B. garinii (S3hybD1, Sl.

1), je kloniran: Lip-S4D1-S3hybD1. Pored promena prve jedne trećine serotipa 3 OspA fragmenta u heterodimeru, S4D1-S3hybD1, u poređenju sa Lip S4D1-S3D1, supstitucija amino kiseline na poziciji 233 (P233T, nomenklatura amino kiseline prema nezreloj OspA pune dužine; SEK ID BR: 8) od OspA ST3 je uvedena.

[0210] Kao što je ilustrovano detaljnije dole u tekstu, ovaj novi heterodimer pokazuje pretežno poboljšanu rastvorljivost kao i imunogenost naspram Borrelia koja ima ekspresiju serotipa 3 OspA kada je prečišćena i koristi se da bi imunizovala miševe.

Primer 2. Prečišćavanje i formulacija heterodimera lipidovanih mutantnih OspA fragmenta

Kloniranje i ekspresija lipidovanih heterodimera mutantnih OspA fragmenata koji nemaju -His oznaku

[0211] Spajanje fuzijom OspA monomera B. valaisiana/B. garinii soj VS116/PBr je bilo optimizovano kodonom za E. coli ekspresiju pomoću GeneArt (Germany). Lipidaciona signalna sekvenca je dodata na N-terminalni kraj je izvedena iz glavnog spoljnjeg lipoproteina membrane E. coli, Lpp, i posle toga je direktno bio C-terminalan pomoću CSS peptida da bi se obezbedeo N-terminalni cistein za lipidaciju. Poboljšani heterodimerni konstrukt je generisan spajanjem putem fuzije mutantnog serotipa 4 OspA fragmenta i hibridnog serotipa 3 OspA fragmenta preko linker sekvence "LN1". Genski fragmenti su klonirani u pET28b(+) vektor (Novagen, USA), i stabilizovani heterodimeri su eksprimirani u BL21 (DE3) ćelijama (Invitrogen, USA). Ćelije su sakupljene posle 4 sata centrifugiranjem i talog je čuvan na -70°C do 12 meseci pre dalje obrade.

Prečišćavanje lipidovani mutantni OspA fragmenta heterodimera

[0212] Ćelije su prekinute mehanički pomoću homogenizacije i lipidovani mutantni fragmenti OspA heterodimera, Lip-S4D1-S3D1 i Lip-S4D1-S3hybD1, su bili obogaćeni u lipidnoj fazi odvajanjem faze, korišćenjem Triton X-114 kao deterdženta. Posle toga, faza sa razblaženim deterdžentom je podvrgnuta hromatografiji na izmeni anjona (Q-sefaroza GE Healthcare, United Kingdom) su radili u režimu nevezivanja. Protokok dobijen kao rezultat je učitan na hidroksiapatit kolonu (Bio-Rad, USA) i lipidovani proteini su eluirani iz kolone pomoću linearnog gradijenta soli. Eluat je podvrgnut daljem prečišćavanju iznad DEAE-Sepharose koloni (GE Healthacare) u režimu nevezivanja posle čeka je usledila preko gel filtracione kolone (Superdex 200, GE Healthcare) za pufersku izmenjivačku kolonu. Vršne vrednosti lipidovanog mutantnog OspA heterodimera su sakupljene na osnovu analitičke ekskluzione kolone i SDS-PAGE. Posle sterilne filtracije, prečišćeni heterodimeri su čuvani na -20°C do formulacije.

Formulacija kombinovane vaccine

[0213] Studije u vezi sa formulacijom kombinovane vakcine iz ovog pronalaska su izvedene kako bi se optimizovala stabilnost. Različiti tipovi puferskih sredstava i stabilizatora su testirani na različitim koncentracijama u kombinaciji sa aluminijum hidroksidom i antigenom, kako je opisano u našoj prethodnoj prijavi WO2014/006226. Optimalna formulacija od 40 mg/mL svaki od tri heterodimera (120 mg ukupno proteina), 10 mM natrijum fosfat, 150 mM natrijum hlorid, 10 mM L-Metionin, 5% saharoza, 0,05% Tween 20 (polisorbat 20) i 0,15% (w/v) aluminijum hidroksid na pH 6,7 ± 0,2 je utvrđena Rezultati

[0214] Poboljšani heterodimer, Lip-S4D1-S3hybD1 je pokazao na oko 4-struko viši prinos u smislu mg/g biomase, značajno poboljšanje u odnosu na Lip-S4D1-S3D1. Pored toga, uporediva čistoća poboljšanog preparata heterodimera je bila dostižna sa jednim korakom hromatografije manje. (Videti Tabela 1.)

Primer 3. Imunogenost lipidovnih heterodimera mutantnog OspA fragmenta različitih serotipova.

Imunizacija miševa

[0215] Ženke C3H/HeN miševa su korišćene za sve studije. Pre imunizacije, grupama od desed miševa je uzeta krv iz facijalne vene i uzorci krvi pre imunizacijesu pripremljeni i sakupljeni. Tri s.c. imunizacije od 100 mL svaka je bila isporučena u intervalima od dve nedelje. Svaka doza je sadržala 1 mg odgovarajućih proteina heterodimera. Za poboljšanu kombinovanu vakcinu heterodimera: Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEK ID BR: 27) i Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33); za kombinovanu vakcinu heterodimera iz prethodnog pronalaska: Lip-S1D1-S2D1 (SEK ID BR: 29), LipS4D1-S3D1 (SEK ID BR: 31) i Lip-S5D1-S6D1 (SEK ID BR: 33) i za kombinovanu vakcinu himere: Lip-Chimeric OspA ST1/ST2-His (Sek ID br: 40), Lip-Chimeric OspA ST5/ST3-His (Sek ID br: 41) i Lip-Chimeric OspA ST6/ST4-His (SEK ID BR: 42). Sve kombinovane vakcine su formulisane sa aluminijum hidroksidom (Al(OH)3) u krajnjoj koncentraciji od 0,15%. Nedelju dana posle treće imunizacije, krv je prikupljena iz facijalne vene i pripremljeni su uzorci imunizovane krvi. U svakom eksperimentu, jedna grupa je imunizovana sa PBS formulisanim sa Al(OH)3 je uključena kao negativna kontrola (placebo grupa). Svi eksperimenti sa životinjama su izvedeni u skladu sa austrijskim zakonom (BGB1 br.501/1989) i odobrila ih je "Magistratsabteilung 58".

OspA ELISA

[0216] ELISA ploče (Maxisorp, Nunc, Denmark) su pemazane sa 50 ng (1 mg/mL) proteina razblaženog u puferskom sredstvu za premazivanje (PBS) po pregradi i inkubirane na 4°C tokom 16 do 72 sata. Antigeni premaza su bili C-terminalno His-oznakom obeležen lipidovani OspA ST1-6 pune dužine. Pufersko sredstvo obloge je odloženo i 100 mL puferskog sredstva za blokiranje (1% BSA, 0,5% Tween-20, PBS) je dodato i inkubirano na temperaturi okoline tokom 1-2 sata. Ploče su oprane tri puta sa 300 mL (prelivanjem) PBST (0,1% Tween-20, PBS). Petostruka razblaženja seruma su napravljena u puferskom sredstvu za blokiranje i 50 mL su dodati u svaku pregradu i inkubirani tokom 1 sat na temperaturi okoline. Ploče su oprane tri puta sa 300 mL (prelivanjem) PBST. Sekundarno antitelo (peroksidaza rena [HRP]-konjugovani zečje anti-mišje IgG, DAKO, Denmark) je razblaženo 1:2000 u puferskom sredstvu za blokiranje i 50 mL je dodato u svaku pregradui inkubirano tokom 1 sat na temperaturi okoline. Ploče su oprane tri puta sa 300 mL (prelivanjem) PBST. ABTS (2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina), Sigma-Aldrich, USA) je korišćen kao supstrat za HRP, 50 mL ABTS je dodat u svaku pregradu i inkubiran tokom 15 minuta u tami na temperaturi okoline. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 mL 1% SDS i apsorpcija je očitana na 405 nm. Ploča je posmatrana kao validna kada je apsorpcija prazne pregrade bila ispod 0,1. Uzorak je bio validan kada je najniže razblaženje imalo apsorpciju iznad 1,0 i najviše razblaženje je bilo ispod 0,1. Kada su ovi kriterijumi ispunjeni, utvrđena je polovina maksimalnog tira. Polovina maksimalnog tira je recipročna razblaženju koje odgovarasrednjoj apsorpcijiizmeđu najviših i najnižih razblaženja.

Protočna citometrija

[0217] Spirohete (1x106) su pomešane sa jednakom količinom 4% paraformaldehida i inkubirane tokom 2 sata na sobnoj temperaturi u ploči sa 96-pregrada (Nunclon 96U, Nunc). Ploča je centrifugirana tokom 5 minuta na 2,000 g i supernatant je odbačen. Ćelije su oprane sa 150 mL HBSS sa 2% BSA (HBSS-B), centrifugirane kao što je navedeno gore u tekstu, i supernatant je odbačen. Uzorci krvi miševa su inaktivirani toplotom inkubiranjem na 56°C tokom 35 minuta. Uzorci krvi inaktivirani toplotom su razblaženi u HBSS-B i sterilni filtrirani centrifugiranjem na 4,000 g tokom 3 minuta korišćenjem Costar spin-X filtera cevne centrifuge (0,22 mm, Corning, USA). Spirohete su razblažene u 100 mL serumu i inkubirane tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi. Ploča je centrifugirana tokom 15 minuta na 2,000 g i supernatant je odbačen. Ćelije su oprane jednom sa 150 mL HBSS-B i zatim su vraćene u suspenziju u 100 mL HBSS-B. Jedan mikrolitar sekundarnog antitela (PE conjugated goat anti-mouse IgG, Beckman Coulter, USA) je dodat u ćelije i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta u zamračenoj prostoriji. Spirohete su oprane jednom sa 150 mL HBSS-B i zatim su vraćene u suspenziju u 200 mL HBSS koja je sadržala 2,5 mM SYTO-17 DNK boje i inkubirane tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi u zamračenoj prostoriji. Obojene spirohete su peletirane centrifugiranjem tokom 5 minuta na 2,000 g i naknadno su vraćene u suspenziju u 200 mL HBSS. Označene spirohete su izmerene sa FC500 (Beckman Coulter) protočnog citometra, usmerenog za SYTO-17 pozitivne pojave.

Rezulati

[0218] Dve različite OspA formulacije heterodimera ("het kombo" i "poboljšani het kombo") kao i OspA kombinacija himere("kombi himera") su testirani za imunogenost na miševima. Hiperimuni uzorci seruma su analizirani tehnikom ELISA za reaktivnost naspram pune dužine OspA (antigen obloge) kao i za vezivanje na površini na Borrelia sojeve koji izražavaju različite OspA tipove seruma (ST1 to ST6).

[0219] ELISA rezultati su pokazali da su sve kombinacije vakcine stimulisale odgovore antitela na svih šest OspA serotipa (videti Sl.6). Posebno je vredno napomenuti u vezi sa ovim pronalaskom da je poboljšana OspA kombinovana vakcina heterodimera dala kao rezultat više nivoeantitela specifičnih za serotip 3 OspA u poređenju sa OspA kombinovanom vakcinom heterodimera iz prethodnog pronalaska, pri čemu su nivoi antitela na drugim OspA serotipovima bili uporedivo stimulisani pomoću obe vakcine.

[0220] Vezivanje antitela iz seruma hiperimunog miša direktno na borrelia spirohete je primećeno u slučaju Borreliae koja izražava svih šest OspA serotipova (videti Sl.7), što ukazuje da su antitelagenerisana kao odgovor na sve od antigena i funkcionalno su aktivna i mogu da vežu prirodni OspA in situ. Intenzitet fluorescencije je bio linearan i to na velikom opsgu razblaženja seruma.

Intenzitet fluorescencije e primećen kao odgovor na kombinovanu vakcinu poboljšanog heterodimera na spiroheti je bio uporediv sa onima primećenim kao odgovor na kombinovanu vakcinu heterodimera i kombinovanu vakcinu himere. Značajno je napomenuti, u vezi sa vezivanjem na serotip 3 OspA borrelia, antitela su generisana imunizacijom sa poboljšanom vakcinom su bila superiorna u odnosu na antitela generisana kao odgovor na obe od drugih kombinovanih vakcina.

Primer 4. Zaštitni kapacitet kombinovane vakcine poboljšanog heterodimera naspram in vivo Borrelia veštačke infekcije

Imunizacija miševa

[0221] Ženke C3H/HeN (H-2k) miševa su korišćene za sve studije (Janvier, France). Pre svake veštačke infekcije, grupama od pet miševa starosti 8 nedelja vađena je krv iz repne vene i pripremljeni i sakupljeni su pre-imuni serumi. Tri potkožne (s.c.) imunizacije od 100 µL, su primenjene u intervalima od dve nedelje u dozama navedenim u Tabeli 2. I vakcina sa kombinovanim poboljšanim heterodimerom i himerno kombinovana vakcina su sadržale tri proteina u odnosu od 1:1:1 kako je opisano u Primeru 3. Sve formulacije su obuhvatale aluminijum hidroksid (Al(OH)3) u krajnjoj koncentraciji od 0,15%. Jednu nedelju posle treće imunizacije, krv je sakupljana i pripremljeni su hiper-imuni serumi. U svakom eksperimentu, jedna grupa injektirana sa samo Al(OH)3(u formulaciji puferskog sredstva ili PBS) je uključena kao negativna kontrola i jedna grupa miševa je imunizovana sa lipidovanim proteinom divljeg tipa pune dužine iz odgovarajućeg OspA serotipa koji je poslužio kao pozitivna kontrola grupa B. burgdorferi soja B31, (OspA serotip 1, SEK ID BR: 34), B. afzelii soja K78, (OspA serotip 2, SEK ID BR: 35), B. garinii soja PHEi (OspA serotip 5, SEK ID BR: 38) ili (OspA serotip 6, SEK ID BR:39)).Svi eksperimenti na životinjama su izvedeni u skladu sa austrijskim zakonom (BGB1 Nr. 501/1989) i odobreni prema "Magistratsabteilung 58".

Veštačka infekcija iglom imunizovanih miševa sa in vitro uzgajanom Borrelia

[0222] Dve nedelje posle poslednje imunizacije, miševi su veštački inficirani s.c. sa spirohetama razblaženim u 100 mL podlozi za rast (BSKII). B. burgdorferi soj ZS7 izražava OspA serotip 1 (eksperimenti 1 i 2), B. garinii soj PHei koji izražava OspA serotip 5 (eksperimenti 10 do 13) ili B. garinii soj Ma koji izražava OspA serotip 6 (eksperimenti 14 do 17) su korišćeni za veštačko inficiranje. Doze za veštačko inficiranje su zavisile od soja i zavisile su od virulencije pojedinačnih sojeva, što je bilo izraženo eksperimentima za utvrđivanje ID50. Doze korišćene za eksperimente za veštačko inficiranje iglom su se kretale u opsezima od 20 do 50 puta ID50.

Pre svakog veštačkog inficiranja, OspA izraz je verifikovan protočnom citometrijom (videti primer 3). Veštačko inficiranje miševa je izvedeno samo sa kulturama kod kojih je >80% ćelija bilo pozitivno za OspA ekspresiju.

Veštačko inficiranje imunizovanih miševa krpeljima inficiranim sa B. burgdorferi ili B. afzelii ("veštačko inficiranje krpeljom ")

[0223] Dve nedelje posle poslednje imunizacije, miševi su veštački inficirani krpeljima koji nose B. burgdorferi soj Pra4 koji izražava OspA serotip 1 (eksperiment 3), B. burgdorferi soj Pral koji izražava OspA serotip 1 (eksperimenti 4 i 5) ili B. afzelii koji izražava OspA serotip 2 (eksperimenti 6 do 9). U cilju lakše infekcije krpeljem imunizovanih miševa, dlake sa leđa svakog miša su uklonjene sa Veet® kremom (Reckitt Benckiser, United Kingdom) i mali ventilirani spremnik je zalepljen za kožu superlepkom (Pattex, Germany). Zatim, dve do tri I. ricinus nimfe su inficirane sa B. burgdorferi soj Pral ili Pra 4 ili B. afzelii, soj IS1, su nanete po mišu, i omogućile su da se vežu i hrane sve dok nisu potpuno nahranjene i dok ne spadnu. Status ishrane je praćen dnevno za svakog pojedinačnog krpelja. Samo miševi od kojih je najmanje jedan potpuno ili skoro potpuno nahranjeni krpelj sakupljen su bili uključeni u konačno očitavanje.

[0224] Četiri ili šest nedelja posle veštačke infekcije iglom ili krpeljom , prema opisanom redosledu miševi su žrtvovani dislokacijom vrata. Krv je sakupljena iz orbitalne vene i konačni serumi su pripremljeni korišćeni za VlsE ELISA i/ili vestern blotom za određivanje statusa infekcije. Pored toga, sakupljena je bešika od svakog miša, i DNK je ekstrahovana i podvrgnuta kvantitativnom PCR-u (qPCR) za identifikaciju Borrelia.

ELISA sa nevarijabilnim regionom 6 (IR6) VlsE

[0225] Biotinilovani 25-merni peptid (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK, SEK ID BR: 59) poreklom od sekvence B. Garinii soja IP90 je korišćen za analizu (Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. Imunodominantni sačuvani region unutar promenljivog domena VlsE, promenljivi površinski antigen od Borrelia burgdorferi. J Immunol. 1999;163:5566-73).

96-komorne ELISA ploče prethodno obložene streptavidinom (Nunc), su obložene sa 100 µL/komorici (1 µg/mL) peptida u PBS dopunjenom sa 0.1% Tween (PBS/0.1T). Ploče su inkubirane preko noći na 4°C. Posle oblaganja peptidom, ploče su isprane jednom sa PBS/0.1T. Ploče su zatim blokirane jedan čas na sobnoj temperaturi (RT) sa 100 µL/komorici PBS 2% BSA, pre ponovnog ispiranja sa PBS/0.1T. Reaktivnost seruma posle veštačke infekcije (krajnjeg seruma) na peptid testirana je u razblaženjima 1:200 i1:400 u PBS 1% BSA. Ploče su inkubirane u trajanju od 90 minutana sobnoj temperaturi pre ispiranja tri puta sa PBS/0.1T. Svaka komorica je zatim primila 50 µL 1.3 µg/mL poliklonskog zečjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog za HRP (Dako) u PBS 1% BSA. Ploče su zatim inkubirane u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle tri ispiranja sa PBS/0.1T, ABTS (50 µL/komorici) je dodat kao supstrat (Sigma-Aldrich) i omogućeno je da se boja razvija u trajanju od 30 minuta. Apsorbanca je merena na 405 nm. Svi serumi su testirani u dve kopije. Negativne kontrole su obuhvatale PBS umesto seruma kao i ploče koje nisu obložene peptidom. Serumi iz miševa za koje je pokazano da su pozitivni na kulturu za B. borreliai infekciju su korišćeni kao pozitivne kontrole.

Ekstrakcija i prečišćavanje DNK

[0226] Bešika svakog miša je podvrgnuta DNK ekstrakciji i prečišćavanju korišćenjem kompleta za lako DN analiziranje krvi i tkiva DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) prema uputstvima proizvođača sa sledećom modifikacijom. Svaka bešika je razgrađena preko noći na 60°C korišćenjem 100 mL rekombinantne Proteinase K (PCR klase; 14-22 mg/mL, Roche). DNK je eluirana u 50 mL sterilne dejonizovane vode i sačuvana na -20°C. Kao negativna kontrola, svaki deseti uzorak je posle toga jednom prazno prečišćen u koloni u svakoj DNK ekstrakciji i prečišćavanju.

qPCR ciljano recA

[0227] Oligonukleotidni prajmeri su dizajnirani za recA gen na način da se oni mogu koristiti u qPCR za identifikaciju svih relevantnih vrsta Borrelia koje izazivaju Lajmsku boreliozu („forward“: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, SEK ID BR: 57, „reverse“: CCCATTTCTCCATCTATCTC, SEK ID BR: 58). recA fragment je kloniran iz B. burgdorferi s.s. soja N40 u pET28b(+), za upotrebu kao standard u svakoj reakciji. Hromozomska DNK ekstrahovana iz bešika miša je razblažena u 1:4 u vodi u cilju redukovanja matriksnih efekata zabeleženih sa nerazblaženom DNK. Master mešavina koja se sastoji od 10 µL SSoAdvanced™ SYBR® Green Supermix, 0.3 µL svakog prajmera (10 µM) i 7.4 µL vode pripremljena je za svaki eksperiment. Osamnaest µL master mešavine je mešano sa 2 µL razblažene DNK ekstrahovane iz bešike u mikrotitarskim pločama i DNK je amplifikovana upotrebom CFX96 PCR detekcionog sistema u realnom vremenu (Bio-Rad,). DNK je denaturisana u trajanju od 3 minuta na 95°C, a zatim je usledilo 50 ciklusa od 15 sekundi na 95°C i 30 sekundi na 55°C. Posle amplifikacije, DNK je pripremljena za analizu krive topljenja putem denaturacije u trajanju od 30 sekundi na 95°C, praćeno sa 2 minuta na 55°C. Analiza krive topljenja je izvedena pomoću 5 sekundi inkubacije na 55°C, sa 0.5°C povećanjem po ciklusu i 5 sekundi na 95°C. Na svakoj ploči, četiri kontrole bez templejta (NTC) su uključene kao i standardna kriva u dve kopije sa brojevima kopija obrasca u opsegu od 10 do 10.000.

Western blot

[0228] Vezivanje finalnih seruma na cele lizate ćelije iz borrelia vrste koja pripada odgovarajućem OspA serotipu je analizirano tehnikom vestern blot (western blot). Ukratko, 2,5 mg lizata spirohete po serumu miša koji je trebalo analizirati je odvojeno SDSPAGE pod redukovanim uslovima korišćenjem 4-12% Tris-Glycine ZOOM gelova (Invitrogen). Odvojeni proteini su preneti na nitroeluloznu membranu korišćenjem sistema za suvo blotovanje iBlot® Dry blotting system (Invitrogen). Posle blokiranja u 5% mleku tokom 1 sat, dodati su krajnji serumi u razblaženju od 1:2000 dilution i inkubirani na 4°C tokom noći. Membrane su zatim oprane tri puta sa PBS/0.1T posle čega je usledila jednosatna inkubacija u poliklonalnom zečjem anti mišjem IgG konjugovanom na HRP (Dako) razblaženom 1:10,000.

Imunoblotovi su vizuelizovani reagensima za detekciju vestern blotinga Amersham ECL Plus™ Western blotting detection reagents (GE Healthcare) and Kodak BioMax films (Kodak).

Očitavanje infekcije

[0229] Krajnje očitavanje infekcije je zasnovano na dva odvojena postupka: detektovanja u prisustvuantitela specifičnih za Borrelia (tehnike vestern blot western blot i VlsE ELISA) i prisustvo Borrelia DNK (qPCR ciljanje recA). U eksperimentimagde je korišćen B. burgdorferi soj ZS7 za veštačko inficiranje (eksperimenti 1 i 2), vestern blot tehnika zajedno sa qPCR su primenjene. U svim drugim eksperimentima, VlsE ELISA i qPCR su korišćeni. Postojala je visoka doslednost između dva postupka (>95%); samim tim miš je posmatran kao inficiran kada je barem jedna od te dve metode pokazala pozitivan ishod. Statistički značaj je utvrđen Fišerovim testom preciznosti (Fisher’s exact test) (dva kraja).

Rezultati

[0230] Heterodimeri lipidiranog mutantnog fragmenta OspA testirani su u odnosu na zaštitni kapacitet u dvanaest posebnih eksperimenata. Miševi su veštački inficirani sa B. burgdorferi s.s., sojem burgdorferi s.s. (OspA serotip 1, soj ZS7, veštačko inficiranje iglom, Eksperimenti 1 i 2 ili sojevi Pra1 ili Pra 4, veštačko inficiranje krpeljom, Eksperimenti 3 ili 4 i 5, prema opisanom redosledu), B. afzelii (OspA serotip 2, soj IS1, veštačko inficiranje krpljem, Eksperimenti 6-9), B. garinii (OspA serotip 5, soj PHei, veštačko inficiranje iglom, Eksperimenti 10-13) ili B. garinii (OspA serotip 6, soj Ma, veštačko inficiranje iglom, Eksperimenti 14-17). Kod nekih eksperimenata, drugi antigeni na bazi OspA, kao što je kombinovana vakcina himere ili lipidovani OspA protein pune dužine, su uključeni. Grupa miševa imunizovanih sa PBS ili formulacija puferskog sredstva kombinovana sa Al(OH)3 je služila kao placebo (sam ađuvans) kontrolna grupa u svakom eksperimentu.

[0231] Podaci o zaštiti iz 17 eksperimenata su sažeti u Tabeli 2. U svim eksperimentima, visok nivo infekcije je uočen u svim placebo grupama. Dodatno, slaba stopa infekcije je primećena u grupama koje primaju odgovarajući OspA protein pune dužine, uz izuzetak OspA serotipa 6 pune dužine, pri čemu je primećena samo delimična zaštita (eksperimenti 14 do 17). Ovi rezultati validiraju eksperimetalnu postavku i postupke očitavanja.

[0232] Kombinovana vakcina poboljšanog heterodimera je dalaznačajnu zaštitu (p-vrednosti <0,05), u dozi od 3 mg, kadasu miševi veštački inficirani sa in vitro uzgajanim B. burgdorferi s.s. ili B. garinii (OspA serotip 5 ili 6), ili krpeljima koji nose B. burgdorferi ili B. afzelii. Pored toga, kada su procenjene različite doze imunizacije za efikasnost vakcine, izrazito značajna zaštita (p-vrednosti <0,01) bi mogla da bude pokaana kada je 0,03 mg kombinovane vakcine poboljšanog heterodimera isporučeno i miševi su veštački inficirani sa B. afzelii ili B. garinii (OspA serotip 5 ili 6) (Eksperiment 8, 9, 12, 13 i 16).

Ukratko, kombinovana vakcina poboljšanog heterodimera je indukovala zaštitni imunitet naspram tri Borrelia vrste (B. burgdorferi, B. afzelii i B. garinii) uključujući četiri klinički relevantna OspA serotipa (1, 2, 5 i 6), kao što je pokazano na modelima miša korišćenjem in vitro uzgajanih spiroheta ili inficiranih krpelja za veštačko inficiranje.

[0233] Zaštita protiv serotipova 5 i 6 uporediva sa zaštitom koju je dala kombinovana vakcina poboljšanog heterodimera (podaci nisu prikazani).

[0234] Tabela 2. Zaštitni kapacitet poboljšane kombinovane vakcine mutantnog OspA heterodimeraiz ovog pronalaska u odnosu na OspA serotip 1, serotip 2, serotip 5 i serotip 6 Borrelia veštački izazvanu infekciju. Grupe miševa su imunizirane tri puta sa naznačenim dozama imunogena ili Al(OH)3 adjuvansa samog u intervalima od dve sedmice. Imunogeni korišćeni su bili 1:1:1 kombinacija mutantnih OspA heterodimera Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 i Lip-S5D1-S6D1 ("Kombinovana vakcina poboljšanog heterodimera "), 1:1:1 kombinacija od Lip-Chimeric OspA ST1/ST2-His, Lip-himerni OspA ST5/ST3-His i Lip-himerni OspA ST6/ST4-His ("kombinovana vakcina himere ") i Lip-OspA1-His (lipidovani OspA protein pune dužine iz B. burgdorferi soja B31) ili Lip-OspA2-His (lipidovani OspA protein pune dužine iz B. afzelii soja K78), Lip-OspA5-His (lipidovani OspA protein pune dužine iz B. garinii soja PHei) ili Lip-OspA6-His (lipidovani OspA protein pune dužine iz B. garinii soj DK29). Imunizovani miševi su veštački inficirani s.c. dve nedelje posle poslednje imunizacije sa naznačenim vrstama borrelia korišćenjem šprica (B. burgdorferi soj ZS7, B. garinii soj PHei ili B. garinii soj Ma) ili korišćenjem krpelja (B. burgdorferi soj Pra1 ili Pra4 ili B. afzelii soj IS1). P-value; Fišerov test preciznosti, na dva kraja, u poređenju sa samom ađjuvansnom grupom, su naznačeni u zagradama, nije značajno (n.s.).

A Zaštita naspram veštačkog inficiranja iglom sa serotipom 1 OspA borrelia kombinovanom vakcinom protiv himere i poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (jedna doza: 3µg)

B Zaštita protiv veštačke infekcije krpeljom sa serotipom 1 OspA borrelia kombinovanom vakcinom protiv himere i poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (jedna doza: 3µg)

Zaštita protiv veštačkog inficiranja krpeljom sa serotipom 1 OspA borrelia poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (smanjene doze: 3µg i 0,3µg)

(nastavak)

Zaštita protiv veštačkog inficiranja krpeljom sa serotipom 2 OspA borrelia kombinovanom vakcinom protiv himere i poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (jedna doza 3 µg)

E Zaštita protiv veštačkog inficiranja krpeljom sa serotipom 2 OspA borrelia poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (smanjene doze: 0,03 µg i 0,003 µg)

F Zaštita protiv veštačkog inficiranja iglom inficiranja iglom sa serotipom 5 OspA borrelia poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera

(jedna doza: 3 µg)

aštita protiv veštačkog inficiranja iglom sa serotipom 5 OspA borrelia poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (smanjene doze: 3 µg, 0,3 µg i 0,03 µg)

H Zaštita protivveštačkog inficiranja iglom sa serotipom 6 OspA borrelia poboljšanom kominovanom vakcinom protiv heterodimera (jedna doza: 3 µg)

(nastavak)

I Zaštita protiv veštačkog inficiranja iglom sa serotipom 6 OspA borrelia poboljšanom kombinovanom vakcinom protiv heterodimera (smanjene doze: 3µg, 0,3µg i 0,03 mg)

P-vrednost; Fišerov test preciznosti, dva kraja, u poređenju sa grupom sa samo ađuvansom, su označeni u zagradama. nije značajno (n.s.).

SEKVENCE

[0235]

SEK ID BR: 1

S3hybD1: hibridni OspA C-terminalni fragment; amino kiselina sa pozicija 125-176 iz Borrelia valaisiana, soj VS116, i amino kiselina 177-274 iz Borrelia garinii, sojn PBr, sa disulfidnom vezom tipa 1 i T na poziciji 233

SEK ID BR: 2

B. valaisiana (soj VS116), OspA aa 125-176 FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGK

SEK ID BR: 3

B. garinii (soj PBr, serotip 3), OspA aa 177-274, with T in position 233, from full-length OspA (SEK ID BR: 8)

SEK ID BR: 6

B. afzelii (soj K78; OspA serotip 2

SEK ID BR: 7

B. garinii (soj PBr, OspA serotip 3) sa P na poziciji 233 (embl pristup X80256.1)

SEQ ID NO: 8

B. garinii (soj PBr, OspA serotip 3) sa T na poziciji 233 (embl pristup ACL34827.1)

SEK ID BR: 9

B. bavariensis (soj PBi, OspA serotip 4)

SEK ID BR: 10

B. garinii (soj PHei, OspA serotip 5)

SEK ID BR: 11

B. garinii (soj DK29 OspA serotip 6)

SEK ID BR: 13

Borrelia OspA lipidacioni signal MKKYLLGIGLILALIA

SEK ID BR: 14

Borrelia OspB lipidacioni signal MRLLIGFALALALIG

SEK ID BR: 15

E. coli lpp lipidacioni signal MKATKLVLGAVILGSTLLAG

SEK ID BR: 16

LN1 peptidni linker konstruisan iz dva odvojena skupljena regina N-terminalne polovine OspA iz B. burgdorferi s.s. soj B31 (aa 65-74 i aa 42-53, zamena amino kiseline na poziciji 53: D53S) GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS

SEK ID BR: 17

hLFA-1-slična sekvenca iz B. burgdorferi s.s. soj B31 (OspA serotip 1) GYVLEGTLTAE

SEK ID BR: 18

Ne-hLFA-1-slična sekvenca iz B. afzelii soj K78 (OspA serotip 2)

NFTLEGKVAND

SEK ID BR: 19

B. burgdorferi s.s. (soj B31, serotip 1), OspA aa 126-273 sa zamenjenom hLFA-sličnom sekvencom iz serotipa 1 OspA

SEK ID BR: 20

B. afzelii (soj K78, serotip 2), OspA aa 126-273 SEK ID BR: 26

Lip-S4D1-S3hybD1-nt Sekvenca kodiranja za intermedijarnu i finalnu proteine fuzije heterodimera od OspA serotip 4 i OspA serotip 3 sa disulfidnom vezom tip 1, E. coli lpp lipidacioni signal , LN1 linker sekvenca, serotip 3 OspA fragment sadrži amino kiseline 125-176 of B. valaisiana, soj VS116 (SEK ID BR: 2) i amino kiseline 177-274 od B. garinii, soj PBr, serotip 3 (SEK ID BR: 3)

SEK ID BR: 27

Lip-S4D1-S3hybD1-aa: protein fuzije heteroimera OspA serotip 4 i OspA serotip 3, obuhvata amino kiseline 125-176 od B. valaisiana, soj VS116 (SEK ID BR: 2) i amino kiseline 177-274 od B. garinii, soj PBr, sterotip 3 (SEK ID BR: 3), sa disulfidnom vezom tipa 1, N-terminalni CSS za dodavanje lipida, LN1 linker sekvenca, N-terminalna lipidacija

SEK ID BR: 28

Lip-S1D1-S2D1-nt: Sekvenca kodiranja za intermedijerne i finalne heterodimerne fuzione proteine od OspA serotip 1 i OspA serotip 2 sa disulfidnom vezom tip 1, E. coli lpp lipidacioni signal , LN1 linker sekvenca, aa 164-174 od OspA serotip 1 zamenjen ne-hLFA-1-sličnom sekvencom NFTLEGKVAND

SEK ID BR: 29

Lip-S1D1-S2D1-aa: Protein fuzije heterodimera od OspA serotip 1 i OspA serotip 2 sa disulfidnom vezom tipa 1, N-terminalni CSS za dodavanje lipida, LN1 linker sekvenca, aa 164-174 od OspA serotip 1 zamenjena ne - hLFA-1-sličnom sekvencom NFTLEGKVAND, N-terminalna lipidacija

SEK ID BR: 30

Lip-S4D1-S3D1-nt: Sekvenca kodiranja za intermedijerne i finalne heterodimerne fuzione proteine od OspA serotipova 4 i 3 oba sa disulfidnom vezom tipa 1, E. coli lpp lipidacioni signal, N-terminalni CSS za dodavanje lipida, LN1 linker sekvenca

SEK ID BR: 31

Lip-S4D1-S3D1-aa: Protein fuzije heterodimeraod OspA serotipovi 4 i 3 oba sa disulfidnom vezom tipa 1, N-terminalni CSS za dodavanje lipida, LN1 linker sekvenca, N-terminalna lipidacija

SEK ID BR: 32

Lip-S5D1-S6D1-nt: Sekvenca kodiranja za intermedijerne i finalne heterodimerne fuzione proteine od OspA serotipovi 6 oba sa disulfidnom vezom tipa 1, E. coli lpp lipidacioni signal, N-terminal CSS for addition of lipids, LN1 linker sequence

SEK ID BR: 33

Lip-S5D1-S6D1-aa: Fuzioni protein heterodimera OspA serotipova 6 oba sa disulfidnom vezom tipa 1, N-terminalni CSS za dodavanje lipida, LN1 linker sekvenca, N-terminalna lipidacija

SEK ID BR: 34

B. burgdorferi(soj B31, OspA serotip 1) aa 18-273, lpp lipidacioni signal sekvence uklonjen (MKATKLVLGAVILG STLLAG, SEK ID BR: 15), C-terminalna His oznaka (LEHHHHHH), N-terminalni CSSF zar dodavanje lipida

SEK ID BR: 35

B. afzelii (soj K78; OspA serotip 2) aa 18-273, lpp lipidacioni signal sekvence uklonjen (MKATKLVLGAVILG- STLLAG, SEK ID BR: 15), C-terminalna His oznaka (LEHHHHHH), N-terminalni CSSF za dodavanje lipida

SEK ID BR: 36

B. garinii (soj PBr; OspA serotip 3) aa 18-274, lpp lipidacioni signal sekvence uklonjen (MKATKLVLGAVILG- STLLAG, SEK ID BR: 15), C-terminanal His oznaka (LEHHHHHH), N-terminalni CSSF za dodavanje lipida

SEK ID BR: 37

B. bavariensis (soj PBi; OspA serotip 4) aa 18-273, lpp lipidacioni signal sekvence uklonjen (MKATKLVLGAVILG- STLLAG, SEK ID BR: 15), C-terminalna His oznaka (LEHHHHHH), N-terminalni CSSF za dodavanje lipida

SEK ID BR: 38

B. garinii (soj PHei; OspA serotip 5) aa 18-273, lpp lipidacioni signal sekvence uklonjen (MKATKLVLGAVILG-STLLAG, SEK ID BR: 15), C-terminalna His oznaka (LEHHHHHH), N-terminalni CSSF za dodavanje lipida

SEK ID BR: 39

B. garinii (soj DK29; OspA serotip 6) aa 18-274, lpp lipidacioni signal sekvence uklonjen (MKATKLVLGAVILG- STLLAG, SEK ID BR: 15), C-terminalna His oznaka (LEHHHHHH), N-terminalni CSSF za dodavanje lipida

SEK ID BR: 40

Himerni OspA Serotip1/Serotip2, N-terminalna lipidacija, His-označen, uključujući OspB lipidacionu signalnu sekvencu: MRLLIGFALALALIG (SEK ID BR: 14) koja se cepa tokom procesiranja

SEK ID BR: 41

Chimeric OspA Serotip5/serotip3, N-terminalna lipidacija, His-označen, uključujući OspB lipidacionu signalnu sekvencu: MRLLIGFALALALIG (SEK ID BR: 14) koja se cepa tokom procesiranja

SEK ID BR: 42

Himerni OspA serotip6/serotip4, N-terminalna lipidacija, His-označen, uključujući OspB lipidacionu signalnu sekvencu: MRLLIGFALALALIG (SEK ID BR: 14) koja se cepa tokom procesiranja

SEK ID BR: 43 S1D1

SEK ID BR: 44 S2D1

SEK ID BR: 51

S3hybD1(Bsp): hibridni OspA C-terminalni fragment; amino kiseline 126-175 iz Borrelia spielmanii i amino kiselina 177-274 iz Borrelia garinii, soj PBr, sa disulfidom vezom tipa 1 i T na poziciji 233

SEK ID BR: 53

Prajmer prema napred za 16S-23S intergenski spejser GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG

SEK ID BR: 54

Reverzni prajmer za 16S-23S intergenski spejser GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG

SEK ID BR: 55

Ugnježdeni prajmer prema napred za 16S-23S intergenski spejser AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG

SEK ID BR: 56

Reverzni ugnježdeni prajmer 16S-23S intergenski spejser GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA

SEK ID BR: 57

Prajmer prema anpred za RecA gen od Borrelia CATGCTCTTGATCCTGTTTA

SEK ID BR: 58

Reverzni prajmer za RecA gen od Borrelia

CCCATTTCTCCATCTATCTC

SEK ID BR: 59

25-mer peptid iz nepromenljivog regiona 6 (IR6) od VlsE MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK

SEK ID BR: 60

Mouse cathelin RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE

SEK ID BR: 61 KLK peptid KLKLLLLLKLK

SEK ID BR: 62

N-terminalni peptid za lipidaciju CKQN

SEK ID BR: 635’-(dIdC)13-3’

dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji sadrži fragment hibridnog C-terminalnog OspA (spoljnog površinskog proteina A Borrelia), gde se hibrid C-terminalni OspA fragment sastoji od N-C-terminalnog smera, od

i ) prvi OspA deo koji se sastoji od aminokiselina 125-176 ili amino kiselina 126-175 OspA iz Borrelia soja

koji nije odgovarajući fragment B. garinii soja, PBr sa SEQ ID NO: 8, i

ii) drugi deo OspA koji se sastoji od

- aminokiseline 176-274 od OspA iz B. garinii soja, PBr (SEQ ID NO: 8) ili

- aminokiseline 177-274 od OspA iz B. garinii soja, PBr (SEQ ID NO: 8) ili

- aminokiseline 177-274 od OspA iz B. garinii soja, PBr (SEQ ID NO: 8), sa supstitucijom treonina s ostatkom aminokiselini 233 sa ostatkom prolina,

pri čemu je drugi OspA fragment mutant i cistin stabiliziran time što se razlikuje od odgovarajuće sekvenca divljeg tipa supstituiran barem aminokiselinom divljeg tipa na položaju 182 /- 3 od SEQ ID NO: 8 pomoću cisteina i supstitucijom aminokiseline divljeg tipa na položaju 269 /- 3 od SEQ ID NO: 8 pomoću cistein i gde je disulfidna veza između cisteina na položaju 182 /- 3 i cisteina na položaju 269 /- 3 navedenog drugog OspA fragmenta; i

pri čemu je numeriranje aminokiselina i cisteinskih supstitucija u skladu s numeracijom odgovarajućih aminokiselina pune dužine OspA od B. burgdorferi s.s. soja B31 (SEQ ID NO: 5).

2. Polipeptid u skladu sa patentnim zahtevu 1, naznačen time, da dalje sadrži drugi C-terminalni OspA fragment, gde spomenuti drugi C-terminalni OspA fragment je aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 43, SEQ, ID N0: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID N0: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 48, koji se razlikuju od odgovarajućg divljeg tipa OspA sekvence barem zamenom aminokiseline na položaju 182 sekvence divljeg tipa s cisteinom i supstitucijom aminokiseline na položaju 269 sekvence divljeg tipa s cisteinom, i aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, čak i više poželjno najmanje 95% identične sekvence prema najmanje jednoj od sekvenci sa SEQ ID NO: 19 do 25, gde se cisteini ne zamenjuju..

3. Polipeptid u skladu sa patentnim zahtevim 1 ili 2

i ) gde je polipeptid lipidiran ili gde polipeptid sadrži signal za lipidaciju, poželjno E. coli derivirane lpp lipidacije signal MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15); i / ili

ii) gde polipeptid obuhvaća peptid na mestu lipidacije koji je voden s N-terminalnim cisteinskim ostatkom kao mjestom za lipidaciju, poželjno CSS; i / ili

iii) gde polipeptid sadrži vezu između hibridnog C-terminalnog OspA fragmenta i drugog C-terminalni OspA fragmenta, posebno gde navedena veza sadrži GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID br.16).

4. Polipeptid u skladu sa bilo kojem patentnim zahtevom 1 do 3, naznačen time što se polipeptid sastoji od heterodimera SEQ ID NO: 27 (Lip-S4D1-S3hybD1).

5. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid u skladu sa bilo kojim patentnim od zahteom 1 do 4, posebno nukleinska kiselina koja sadrži ili se sastoji sekvence nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 26, gde je navedena nukleinska kiselina opciono sadržana u vektoru.

6. Stanica domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačena time, da je navedena stanica domaćina poželjno E. coli.

7. Postupak za proizvodnju polipeptida u skladu sa bilo kojim od patentnih od zahteva 1 do 4, naznačen time što se sastoji od sledećih koraka:

a) uvođenje vektora koji kodira polipeptid prema zahtevima 1-4 u stanicu domaćina,

b) uzgoj stanice domaćina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju navedenog polipeptida, c) homogeniziranje navedene stanice domaćina, i

d) podvrgavanje homogenata stanice domaćina koracima pročišćavanja.

8. Farmaceutska kompozicija naznačena time da sadrži:

(i) polipeptida prema bilo kojm od zahteva 1 do 4 ili nukleinsku kiselinu prema zahtevu 5; i

(ii) po izboru farmaceutski prihvatljivi ekspicijent.

9. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što sadrži heterodimerni protein SEQ ID NO: 29 (LipS1D1-S2D1), heterodimer protein SEQ ID NO: 27 (Lip-S4D1-S3hybDl) i heterodimerni protein SEQ ID NO: 33 (Lip-S5D1- S6D1).

10. Farmaceutska kompozicija u skladu sa zahtevom 8 ili 9, naznačen time, da farmaceutski prihvatljiv ekscipijens sadrži L-metionin.

11. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim patentnim zahtjvom 8 do 10, naznačen time, da dalje sadrži najmanje jedan dodatni antigen iz Borrelia.

12. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 8 do 11, naznačen time, da dalje obuhvata imunostimulirajuću supstancu, poželjno izabranu iz grupe koja se sastoji od polikationskih polimera, posebno polikationskog peptid, imunostimulatorng oligodeoksinukleotida (ODNs), posebno oligo ( dIdC )13 (SEQ ID NO: 63), peptidi koji sadrže najmanje dva LysLeuLys motiva, posebno peptid KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61), neuroaktivne spojeve, posebno ljudski hormon rasta, aluminijev hidroksid ili aluminijev fosfat, Freundov komplet ili nekompletni adjuvansi ili njihove kombinacije.

13. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom od 8 do 12, naznačen time što je navedeni farmaceutski sastav vakcina.

14. Polipeptid u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom od 1 do 4, naznačen time, što je nukleinska kiselina u skladu sa zahtevom 5 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 8 do13. naznačena time, da se upotrebljava kao lek, posebno kao vakcina.

15. Polipeptid u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1 do 4, nukleinska kiselina prema zahtevu 5 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kojm od zahjeva 8 do 13 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije infekcije Borrelia, osobito B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ili B. sinica infekcije, poželjno B. burgdorferi s.s., B. afzelii ili B. garinii infekcije.

16. Komplet, naznačen time, da sadrži farmaceutsku kompoziciju u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 8 do 13 i druga kompoziciju, naznačen time što druga kompozicija sadrži najmanje jedan dodatni antigen i / ili adjuvans.