RS59154B1

RS59154B1 - Fgf21 derivati i njihova upotreba

Info

Publication number: RS59154B1
Authority: RS
Inventors: Birgit Wieczorek; Tina Møller Tagmose; Kristian Sass-Ørum; Birgitte Andersen; Jørgen Olsen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2019-10-31
Also published as: AU2015371056A1; CN107108709B; US9744213B2; KR20170095256A; HRP20191292T1; TW202012431A; TWI681966B; US20180140673A1; MX2017007458A; MY181181A; RU2017125050A3; WO2016102562A1; EP3236991B1; ES2742503T3; JP2018505146A; BR112017011552A2; CN107108709A; JP6727210B2; ZA201703768B; TW201632545A

Description

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na derivate analoga FGF21, preciznije na analoge FGF21 koji imaju bočni lanac na poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181, i njihovu farmaceutsku upotrebu.

Stanje tehnike

FGF21 pripada podgrupi FGF19 atipičnih faktora rasta fibroblasta (FGF) sa metaboličkim a ne mitogenim efektima. FGF21 veže i aktivira FGF receptore (FGFR1c, FGFR2c i FGFR3c), ali samo u prisustvu beta-kloto koreceptora (BKL) koji ne signaliziraju. Tkivno specifična ekspresija BKL određuje metaboličku aktivnost FGF21. FGF21 transgeni miševi otporni su na gojaznost izazvanu ishranom i imaju duži životni vek. FGF21 je metabolički regulator potrošnje energije, metabolizma glukoze i lipida, sa velikim potencijalom da preokrene telesnu težinu, hiperglikemiju i dislipidemiju kod gojaznih pacijenata sa dijabetesom i dislipidemijom.

FGF21 pati od in vivo nestabilnosti zbog proteolize, a čak polovina endogenog cirkulišućeg humanog FGF21 je neaktivna. Gubitak aktivnosti nastaje usled degradacije C-kraja, većina ovih metabolita završava se na P171, a ne na S181. Zaštita od metaboličkog raspada na C-terminalnoj regiji poželjna je za terapeutski molekul FGF21. Inženjering C-terminalne regije može zaštititi od degradacije, međutim do sada je takav inženjering dolazio po ceni smanjene ili izgubljene potentnosti konstruisanog FGF21 jedinjenja. N-terminalna regija FGF21 veže se za FGFR-ove, dok se C-terminalna regija FGF21 veže za BKL. Skraćivanje C-terminalnih amino-kiselina dovodi do značajnog gubitka potentnosti.

PEGilacija na poziciji 180 od [180C]FGF21 ima za rezultat dramatično smanjenje in vitro aktivnosti (J. Xu et al, Bioconjugate Chemistry (2013), 24, 915-925). Fc fuzijski protein koji nastaje vezanjem Fc na C-kraj FGF21 mnogo je potentniji od nativnog FGF21 i N-terminalne Fc fuzije FGF21 (Hecht et al, PLoS One 2012, 7(11), e49345).

Kratak prikaz

Predmetni pronalazak se odnosi na derivate FGF21 koji imaju bočni lanac na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181 u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1 ). Predmetni pronalazak se odnosi na derivate FGF21 koji imaju bočni lanac na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 180 ili 181 u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1). Preciznije, bočni lanac je kovalentno vezan na poziciji FGF21 analoga koja odgovara poziciji 180 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili je kovalentno vezan na poziciji FGF21 analoga koja odgovara poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Tačnije, bočni lanac je kovalentno vezan na poziciji FGF21 analoga koji odgovara poziciji 170, 174 ili 175 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili je kovalentno vezan na poziciji FGF21 analoga koji odgovara poziciji 167, 171, 172 ili 173 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Cistein je prisutan u analogu FGF21 na poziciji vezivanja bočnog lanca. Bočni lanac je kovalentno vezan na atom sumpora cisteinskog ostatka na koji je spojen bočni lanac. Bočni lanac sadrži spojnicu (linker) i produžni deo (protraktor). Produžni deo može biti masna dikarboksilna kiselina.

Linker može da sadrži nekoliko veznih elemenata, kao što su jedan ili više gGlu ostataka, i/ili jedan ili više Ado ostataka (Ado je 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina), i/ili jedan ili više drugih diradikala koji sadrže *-NH grupu i *-CO grupu. Produžni deo i linker su povezani preko amidne veze. Linker je povezan sa atomom sumpora od 180Cys ili 181Cys proteina FGF21, putem tioetarske veze.

Linker može da sadrži nekoliko veznih elemenata, kao što su jedan ili više gGlu ostataka i/ili jedan ili više Ado ostataka (Ado je 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina) i/ili jedan ili više Trx elemenata (Trx je traneksaminska kiselina) i/ili jedan ili više *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* i/ili jedan ili više drugih di-radikala koji uključuju *-NH grupu i *-CO grupu. Produžni deo i linker su povezani preko amidne veze, dok je linker povezan sa proteinom FGF21 preko tioetarske veze preko atoma sumpora cisteina na poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181.

FGF21 protein ugrađen u derivat FGF21 pronalaska je analog zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), analog koji sadrži cisteinski ostatak na jednoj od pozicija koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 ( SEQ ID NO: 1).

Analog FGF21 derivata predmetnog pronalaska može imati do 30 promena amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1), od kojih se cisteinski ostatak na jednoj od pozicija 180 ili 181 računa za jednu amino-kiselinsku promenu. Maksimalnih 29 dodatnih promena mogu biti, nezavisne, jedna ili više ekstenzija, jedna ili više insercija (umetanje), jedna ili više delecija i/ili jedna ili više supstitucija.

Posebno se predmetni pronalazak odnosi na derivat FGF21 proteina, pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), pri čemu dati derivat sadrži produžni deo vezan za Cys ostatak preko linkera; pri čemu je produžni deo izabran iz grupe

Hem. 1A: HOOC-(CH2)X-CO-*,

Hem. 1B: HOOC-benzen-O-(CH2)x-CO-*

Hem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*

gde je x ceo broj u rasponu 8-18; i gde linker sadrži najmanje jednu od svake od Hem.

2, Hem. 3 i Hem. 4;

pri čemu Hem. 2 je izabrano iz:

Hem. 2A: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 2B: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* i

Hem. 2C: *-NH-CH2-cikloheksan-CO-*,

pri čemu je Hem. 3 *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, pri čemu je k ceo broj u rasponu od 1-5, n je ceo broj u rasponu 1-5, i

pri čemu Hem. 4 je izabrano iz

*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*

pri čemu je ceo broj u rasponu od 1-5 i

pri čemu su Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, povezane na svom *-NH kraju na kraj CO-* protektora, a na svom CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, amid ili estar.

Preciznije, pronalazak se odnosi, u prvom aspektu, na derivat FGF21 proteina, pri čemu navedeni protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), i najviše 30 modifikacija aminokiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1); pri čemu dati derivat sadrži produžni deo vezan na dati Cys ostatak preko linkera; pri čemu je produžni deo Hem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*, pri čemu je x ceo broj u rasponu 10-18; i gde linker sadrži najmanje jednu od svake Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4:

Hem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 3:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, i

Hem. 4:*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,

gde je k ceo broj u rasponu od 1-5, n je ceo broj u rasponu od 1-5, i m je ceo broj u rasponu od 1-5. Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, povezane na svom *-NH kraju na kraj CO-* protektora, a na svom CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Poželjni FGF21 derivati pronalaska koji su označeni kao jedinjenja 13 do jedinjenja 24 opisani su u eksperimentalnom odeljku.

Dalji poželjni derivati FGF21 pronalaska koji su označeni kao jedinjenja 13 do jedinjenja 18 opisani su u eksperimentalnom odeljku.

Dalji poželjni derivati FGF21 pronalaska koji su označeni kao jedinjenja 35 do jedinjenja 41 opisani su u eksperimentalnom odeljku.

Dalji poželjni derivati FGF21 pronalaska koji su označeni kao jedinjenja 43 do jedinjenja 56 opisani su u eksperimentalnom odeljku.

U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na analog FGF21 koji sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1). Analozi poželjno imaju visok stepen identičnosti sa humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1). Stepen identičnosti može se opisati brojem supstitucija ili modifikacija amino-kiselina u poređenju sa humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na FGF21 analog koji sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1) i maksimalno 30 modifikacija amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku upotrebu FGF21 derivata i analoga pronalaska, na primer za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji svih oblika dijabetesa i srodnih bolesti, kao što su poremećaji ishrane, kardiovaskularne bolesti, dijabetičke komplikacije; i/ili za poboljšanje lipidnih parametara, poboljšanje funkcije βćelija; i/ili za odlaganje ili sprečavanje napredovanja dijabetičke bolesti; i/ili za lečenje i/ili prevenciju hepatične steatoze i bolesti masne jetre nevezanih za alkoholizam (NAFLD).

Derivati FGF21 iz pronalaska su biološki aktivni. Na primer, veoma su potentni i, takođe ili alternativno, veoma se dobro vezuju za FGF receptore. Takođe, ili alternativno, oni imaju produženi farmakokinetički profil. Na primer, imaju veoma dug terminalni poluživot kada se daju i.v. miševima i/ili patuljastim svinjama. Posebna kombinacija dobre potetnosti i dugog poluživota može biti veoma poželjna.

Interesantno je da derivati FGF21 koji sadrže bočni lanac na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 i 181 zrelog humanog FGF21 zadržavaju potentnost.

Takođe, ili alternativno, primećeno je da derivati FGF21 koji sadrže bočni lanac na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 180 i 181, a naročito poziciji 180, zrelog humanog FGF21 zadržavaju visoku potentnost.

Opis

U nastavku, grčka slova mogu biti predstavljena njihovim simbolom ili odgovarajućim pisanim imenom, na primer: α = alfa; β = beta; ε = epsilon; γ = gama; ω = omega; itd. Takođe, grčko slovo od μ može biti predstavljeno sa "u", npr. u μl=ul, ili kod μM=uM.

Zvezdica (*) u hemijskoj formuli označava tačku vezanja.

Pronalazak se u prvom aspektu odnosi na derivat FGF21 proteina, pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), pri čemu derivat sadrži produženi deo vezan na dati Cys ostatak preko linkera; pri čemu je linker odabran iz grupe

Hem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,

Hem. 1B: HOOC-benzen-O-(CH2)x-CO- *

Hem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*

2, Hem. 3 i Hem. 4;

pri čemu Hem. 2 je izabrano iz:

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,

*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-* i

*-NH-(CH2)m-cikloheksan-CO-*,

pri čemu je m pojedinačno izabrano kao ceo broj u rasponu od 1-5,

pri čemu Hem. 3 je *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, pri čemu je k ceo broj u rasponu od 1-5, n je ceo broj u rasponu 1-5, i

pri čemu Hem. 4 je izabrano iz

*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*

pri čemu je m ceo broj u rasponu od 1-5.

U daljim realizacijama, Hem. 2 se bira iz:

*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* i

*-NH-CH2-cikloheksan-CO-*.

U daljim realizacijama, Hem. 2 je *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*.

U daljim realizacijama, Hem. 2 je *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*.

U daljim realizacijama, Hem. 2 je *-NH-CH2-cikloheksan-CO-*.

Kao što je gore pomenuto, derivat uključuje barem jednu od svake Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 međusobno povezane preko amidnih veza. Pored toga, vezni elementi povezani su u navedenom redosledu. Hem. 2 je spojen na svom *-NH kraju sa CO-* krajem produženog dela i Hem. 4 je na svom CH2-* kraju vezana za atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, amid ili estar.

U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na derivat FGF21 proteina, pri čemu navedeni protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili položaju 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1) i maksimalno 30 modifikacija amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1); pri čemu navedeni derivat sadrži produženi deo vezan na pomenuti Cys ostatak preko linkera; pri čemu je produženi deo Hem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*, pri čemu je x ceo broj u rasponu 10-18; i pri čemu linker sadrži najmanje jednu od svake od Hem.

2, Hem. 3 i Hem. 4:

Hem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, i

Hem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,

gde je k ceo broj u rasponu od 1-5, n je ceo broj u rasponu od 1-5, i m je ceo broj u rasponu od 1-5. Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, spojene na svom *-NH kraju na CO-* kraj produženog dela, a na svom CH2-* kraju na tiol grupu Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

FGF21 proteini i analozi

U prirodi je nativni FGF21 protein sintetizovan signalnim peptidom od 28 aminokiselina za sekreciju. Zreli FGF21 polipeptid koji se sastoji od preostale 181 aminokiseline je uključen u listu sekvenci kao SEQ ID NO: 1.

FGF21 protein derivata predmetnog pronalaska može se s vremena na vreme nazivati „kičma“ ili „proteinska kičma“ derivata ili „analog FGF21“.

Izraz „FGF21 protein“, kako se ovde koristi, odnosi se na analog ili varijantu humanog FGF21 (FGF21(1-181)), čija je sekvenca uključena u listu sekvenci kao SEQ ID NO:1. Protein koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1 može se, takođe, označiti kao „nativni“ FGF21, „zreli“ FGF21 i/ili „zreli humani“ FGF21.

U popisu sekvenci, prvom aminokiselinskom ostatku zrelog humanog FGF21 SEQ ID NO: 1 (histidinu) je dodeljen br. 1.

Primer analoga FGF21 je protein SEQ ID NO: 1, koji ima N-terminalni metionin, takođe, označen kao MetFGF21 (SEQ ID NO: 2). N-terminalni Met dodaje se kada je zreli humani FGF21 eksprimovan u E. coli, vidi npr. WO 2006/050247, Tabela 6. Dodatnom N-terminalnom aminokiselinskom ostatku, koji prethodi histidinu na poziciji 1 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1) je dodeljena pozicija br. -1. Neograničavajući primeri pogodne nomenklature za MetFGF21 SEQ ID NO: 2 su MetFGF21, [Met]FGF21 ili

[-1M]FGF21.

MetFGF21 pokazuje uporedivu biološku aktivnost sa zrelim humanim FGF21 SEQ ID NO: 1, i iz praktičnih razloga se često koristi kao referentno jedinjenje umesto zrelog humanog FGF21 SEQ ID NO: 1. Sekvenca amino-kiseline MetFGF21 je uključena u listu sekvenci kao SEQ ID NO: 2.

Ovde, FGF21 proteini iz pronalaska mogu biti opisani uz upućivanje na i) broj amino-kiselinskog ostatka u zreloj humanoj FGF21(1-181) koji odgovara aminokiselinskom ostatku koji je promenjen (tj. odgovarajuća pozicija u zreloj humanoj FGF21), i stvarnoj promeni.

Jedan aspekt pronalaska se odnosi na FGF21 protein (analog FGF21) koji sadrži supstituciju amino-kiselina tamo gde je divlji tip amino-kiselinskog ostatka supstituisan cisteinskim ostatkom. U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 i 175 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175 i 180 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 169, 170, 173, 174, 175, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174, 175 i 180 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174, 175, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174, 175 i 180 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174 i 175 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174 i 180 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173 i 174 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

Na primer, FGF21 protein iz pronalaska je definisan tako da sadrži Cys ostatak ili na poziciji koja odgovara poziciji 180 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1) ili na poziciji koja odgovara poziciji 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1). U jednoj realizaciji, FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

Ovi Cys ostaci FGF21 proteina iz pronalaska mogu se označiti kao Cys180 i Cys181, respektivno. Na primer, FGF21 protein iz pronalaska koji ima Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1) može se nazvati Cys181 FGF21 i/ili 181C FGF21, alternativno [Cys181]FGF21 i/ili [181C]FGF21.

Sledi neograničavajući primer odgovarajuće analogne nomenklature.

Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 označava analog zrelog humanog FGF21, pri čemu je alanin dodat na N-kraju (tj. Ala na poziciji koja odgovara poziciji -1 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1 )), asparagin koji se nalazi u prirodi na poziciji 121 supstituisan je glutaminom, metionin koji se prirodno nalazi na poziciji 168 supstituisan je leucinom, a alanin koji se prirodno nalazi na poziciji 180 supstituisan je cisteinom.

Sledi neograničavajući primer odgovarajuće nomenklature za derivat FGF21 analoga. S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]ace til]amino]etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 označava derivat analoga zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), pri čemu Ala[Gln121,Leu168,Cys180] označava promene amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1) sa brojevima koji se odnose na odgovarajuće pozicije zrelog FGF21, i pri čemu je supstituent [2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]-amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etilamino]-2-oksoetil]- kovalentno vezan za atom sumpora cisteina na poziciji koja odgovara poziciji 180 u zrelom humanom FGF21 (SEQ ID NO: 1).

FGF21 protein iz pronalaska može imati dodatne promene amino-kiselina u poređenju sa FGF21 (SEQ ID NO: 1), ali ograničene na maksimalno 30 promena aminokiselina. Ove promene su, takođe, u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1), i mogu nezavisno da predstavljaju jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija, insercija, ekstenzija i/ili delecija.

U određenoj realizaciji, zamene amino-kiselina su na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju jednoj ili više pozicija -1, 121 i 168 FGF21 (SEQ ID NO: 1).

U jednoj realizaciji, FGF21 protein ovog pronalaska sadrži -1Ala, 121Gln i 168Leu pored cisteinske amino-kiselinske supstitucije.

U jednom aspektu, FGF21 protein iz pronalaska sadrži -1Ala, 121Gln i 168Leu kao dodatak bilo kojem od 167Cys, 170Cys, 171Cys, 172Cys, 173Cys, 174Cys, 175Cys, 180Cys i 181Cys. Posebni FGF21 proteini iz pronalaska, takođe, ugrađeni u posebne derivate predmetnog pronalaska opisane u eksperimentalnom odeljku, su SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 i 20 listinga sekvenci.

U još jednoj posebnoj realizaciji, FGF21 protein iz pronalaska sadrži -1Ala, 121Gln i 168Leu kao dodatak bilo kojem od 180Cys ili 181Cys.

Posebni FGF21 proteini iz pronalaska, koji su, takođe, ugrađeni u posebne derivate pronalaska koji su opisani u eksperimentalnom odeljku, su SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 10 iz listinga sekvenci.

Protein „koji sadrži“ određene specifične promene može sadržati dodatne promene, u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Očigledno je iz gornjih primera da amino-kiselinski ostaci mogu biti identifikovani njihovim punim imenom, njihovim jednoslovnim kodom i/ili njihovim troslovnim kodom. Ova tri načina su potpuno ekvivalentna.

Izrazi „pozicija ekvivalentna“ ili „odgovarajuća pozicija“ mogu da se koriste za karakterizaciju mesta promene u varijantnoj FGF21 sekvenci pozivanjem na zrelu

1

humanu FGF21 (SEQ ID NO:1). Ekvivalentne ili odgovarajuće pozicije, kao i broj promena, lako se zaključuju, npr. jednostavnim rukopisom i vizuelnim pregledom; i/ili se može koristiti standardni program poravnanja proteina ili peptida, kao što je „poravnanje“ koje se zasniva na Nidleman-Vanšov algoritmu. Ovaj algoritam je opisan u Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, i program poravnanja koje su napravili Majers i V. Miler u "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (računarske aplikacije u biološkim naukama) (1988) 4 : 11-17. Za poravnanje se može koristiti podrazumevana matrica bodovanja BLOSUM62 i podrazumevana matrica identiteta, a razlika za prvi ostatak u prekidu može se postaviti na -12, ili po mogućnosti na -10, a razlike za dodatne ostatke u prekidu na -2, ili po mogućnosti na -0.5.

Primer takvog poravnanja je ovde ubačen u daljem tekstu, u kojem je sekvenca br. 1 zreli humani FGF21 (SEQ ID NO: 1), i sekvenca br. 2 je analogni Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21 (SEQ ID NO: 10). Izračunata identičnost je stoga 97,8%.

# 1: FGF21

# 2: Ala[121Q, 168L, 181C]FGF21

# Matrica: EBLOSUM62

# Razlika_prekida: 10,0

# Proširena_razlika: 0,5

# Dužina: 182

# Identičnost: 178/182 (97,8%)

# Sličnost: 179/182 (98,4%)

# Razmaci: 1/182 ( 0,5%)

# Rezultat: 952,0

1 1

U daljim realizacijama, FGF21 protein ili analog ili FGF21 kičma FGF derivata ima najmanje 80% identičnosti sa humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1), kao što je najmanje 85% identiteta, kao što je najmanje 90% identiteta, kao što je najmanje 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identitet sa humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Izraz „protein“ odnosi se na jedinjenje koje sadrži niz amino-kiselina međusobno povezanih amidnim (ili peptidnim) vezama.

Proteini iz pronalaska sadrže najmanje 151 konstitutivnu amino-kiselinu povezanu peptidnim vezama. U posebnim realizacijama, protein sadrži najmanje 160, poželjno najmanje 170, još poželjnije najmanje 180, još poželjnije najmanje 181, ili najpoželjnije najmanje 182. U dodatnim posebnim realizacijama, protein je a) sastavljen od, ili b) sastoji se od 181 ili 182 amino-kiselina.

U još jednoj posebnoj realizaciji, protein se sastoji od amino-kiselina međusobno povezanih peptidnim vezama.

Amino-kiseline mogu biti definisane kao jedinjenja koja sadrže aminsku grupu i grupu karboksilne kiseline, i, opcionalno, jednu ili više dodatnih grupa, često označenih kao bočni lanac. Amino grupa može, na primer, biti primarna ili sekundarna amino grupa.

Ostatak amino-kiseline je radikal amino-kiseline koji je ugrađen u peptid ili protein.

U posebnoj realizaciji, amino-kiseline proteina prema pronalasku su alfa-aminokiseline gde je atom azota primarne ili sekundarne amino grupe vezan za atom alfaugljenika.

U drugoj posebnoj realizaciji, amino-kiseline proteina iz pronalaska su izabrane iz kodiranih amino-kiselina i nekodiranih amino-kiselina.

U jednoj realizaciji, sve amino-kiseline proteina predmetnog pronalaska su kodirane amino-kiseline.

Kodirane amino-kiseline mogu se definisati kao što je u Tabeli 1 u odeljku 3AA-1 Preporuka IUPAC-a (Međunarodna unija čiste i primenjene hemije; videti http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/), gde su dati struktura, trivijalno ime, sistematski naziv, jednoslovni i troslovni simboli za 20 kodiranih amino-kiselina.

Izraz „nekodirane amino-kiseline“ odnosi se na sve ostale amino-kiseline.

Neograničavajući primeri nekodiranih amino-kiselina su D-izomeri kodiranih aminokiselina kao što su D-alanin i D-leucin.

U daljem tekstu, sve specifične amino-kiseline za koje nije naveden optički izomer podrazumeva se da označavaju L-izomer (osim ako nije drugačije precizirano), npr. kada se upućuje na specifičnu amino-kiselinu glutamina, misli se da se odnosi na L-glutamin, osim ako nije drugačije navedeno. S druge strane, gde su amino-kiseline opisane uopštenijim formulama kao što su molekulske formule ili strukturne formule, a kada nije prikazana stereohemija, ove formule treba da pokriju sve stereoizomere.

Prema ustaljenoj praksi u tehnici, N-kraj FGF21 proteina iz pronalaska je prikazan sa leve strane, a C-kraj sa desne strane.

FGF21 derivati

Izraz „derivat“ kako se ovde koristi u kontekstu proteina ili analoga FGF21 označava hemijski modifikovani FGF21 protein ili analog, u kome je dobro definisan broj supstituenata kovalentno vezan za jedan ili više specifičnih aminokiselinskih ostataka proteina. Supstituenti se mogu nazivati bočnim lancem/ima.

U određenoj realizaciji, bočni lanac je sposoban da formira nekovalentne agregate sa albuminom, čime se promoviše cirkulacija derivata u krvotoku, a takođe ima efekat produženja vremena delovanja derivata, zbog činjenice da se agregat FGF21 derivata i albumina samo sporo razlažu kako bi oslobodili aktivni farmaceutski sastojak.

Bočni lanac sadrži deo koji se ovde naziva produženi deo (protraktor).

Produženi deo može biti na udaljenom kraju bočnog lanca ili blizu njega, u odnosu na njegovu tačku vezanja na protein.

U još jednoj dodatnoj posebnoj realizaciji, ostvarenju bočni lanac sadrži deo između produženog dela i tačke vezivanja za protein, koji može biti označen kao linker. Linker se može sastojati od jednog ili više veznih elemenata.

U posebnim realizacijama, bočni lanac i/ili produženi deo je lipofilni i/ili negativno naelektrisan pri fiziološkom pH (7,4).

Bočni lanac se može kovalentno vezati za cisteinski ostatak FGF21 proteina alkilacijom.

U poželjnoj realizaciji, bočni lanac se sintetiše i aktivira sa haloacetamidnom grupom koja reaguje sa tiol grupom cisteinskog ostatka, usled formiranja kovalentne tiolugljenične veze (ovaj proces se naziva Cys-alkilacija) koja se, takođe, naziva tio-etarska veza. Tiol grupa stoga nije prisutna u derivatima, a bočni lanac je povezan preko atoma sumpora. U slučajevima kada se tiol grupa spominje u odnosu na derivat, ona se podrazumeva da je atom sumpora koji je deo tiolne grupe cisteina pre Cys-alkilacije.

U drugoj realizaciji, bočni lanac se aktivira sa maleimidnom grupom koja reaguje sa tiolnom grupom cisteinskog ostatka, tokom formiranja kovalentne tiol-ugljenične veze.

Za sadašnje potrebe, izrazi produžni deo, i linker mogu uključivati i neizreagovane, ali i reagovane oblike ovih molekula. Bez obzira da li je reč o jednom ili drugom obliku, iz konteksta je jasno koji se termin koristi.

U jednom aspektu, svaki produžni deo sadrži ili se sastoji od produžnog dela formule Hem. 1:

Hem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,

pri čemu je x celi broj u rasponu 10-18.

U alternativnim realizacijama, produžni deo Hem. 1 je izabran iz grupe produžnih delova koje je definisala Hem. 1A, Hem. 1B i Hem. 1C

Hem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,

pri čemu je x ceo broj u rasponu 8-18,

Hem. 1B: HOOC-benzen-O-(CH2)x-CO-*

1

pri čemu je x ceo broj u rasponu 8-18, i

Hem. 1C; HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*

pri čemu je x celi broj u rasponu 8-18.

Dužina lanca ugljenika definisana sa x može varirati od 8-18 za svaku od različitih Hem. 1 struktura, dok se, kao što je opisano u daljem tekstu, kraćoj ili dužoj verzija može dati prednost za različite vrste elemenata produžnih delova.

U posebnoj realizaciji 1A, *-(CH2)x-* se odnosi na ravni alkilen u kome je x ceo broj u rasponu 10-18, kao što je 14-18 ili kao što je 14-16.

U drugoj posebnoj realizaciji 1A, *-(CH2)x-* odnosi se na ravni alkilen u kome je x 16. Ovaj nosač može se ukratko nazvati C18 diacidom, tj. masnom dikarboksilnom kiselinom sa 18 atoma ugljenika. Kada je x = 16, struktura ovog veznog elementa odgovara Hem. 1a:

Hem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*.

U jednoj realizaciji, produžni deo je Hem. 1B. U jednoj realizaciji 1B, *-(CH2)x-* se odnosi na ravni alkilen u kome je x ceo broj u rasponu 8-14. U posebnoj realizaciji kada je x = 9, struktura ovog veznog elementa odgovara Hem. 1b.

Hem. 1b: HOOC-benzen-O-(CH2)9-CO*

U jednoj realizaciji, produžni deo je Hem. 1C. U jednoj realizaciji 1C, *-(CH2)x-* se odnosi na ravni alkilen u kome je x ceo broj u rasponu 10-18, kao što je 12-18 ili 14-18. U posebnoj realizaciji 1C, kada je x = 15, struktura ovog veznog elementa odgovara Hem. 1c

Hem. 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*

Nomenklatura je kao što je to uobičajeno u tehnici, na primer, u gornjim formulama *-CO-* odnosi se na karbonil (*-C(=O)-*). Na primer, u bilo kojoj formuli (R-CO-*) ovde (gde je R kao što je definisano svakom formulom), R-CO-* se odnosi na R-C(= O)-*. Benzen se odnosi na prstenastu strukturu koja je u Hem. 1B je supstituisan na C1 i C4 sa O-(CH2)x-* i -COOH, respektivno. HO-S(=O)2opisuje sulfonsku kiselinu.

Linker derivata pronalaska sadrži najmanje jedan od sledećih elemenata linkera Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4. Elementi Hem. 2 i Hem 3 oba sadrže –NH- i CO- kraj što im omogućava da se povežu međusobno amidnim vezama i bilo na -CO- ili -NH- produžni deo ili na Hem. 4.

Hem. 4 ima -NH-kraj (sposoban da formira amidnu vezu sa Hem. 2 ili Hem. 3, i -NH-CO-CH2-kraj, koji u nereagovanom obliku predstavlja haloacetamid sposoban da reaguje sa tiolnom grupom cisteina analoga FGF21.

Linker derivata pronalaska sadrži najmanje jedan od sledećih elemenata linkera Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4,

pri čemu je Hem. 2 izabrano iz:

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,

*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*,

*-NH-(CH2)m-cikloheksan-CO-*, i

pri čemu je m pojedinačno izabran kao ceo broj u rasponu od 1-5.

pri čemu je Hem. 3:*-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, pri čemu je k ceo broj u rasponu od 1-5, n je ceo broj u rasponu 1-5, i

pri čemu je Hem. 4 izabrano iz:

*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*

pri čemu je m pojedinačno izabran kao ceo broj u rasponu od 1-5.

U jednoj realizaciji, Hem. 2 je *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*, pri čemu m je 1, 2 ili 3. U jednoj realizaciji m je 2 ili 3.

U realizaciji gde je m 2, vezni element Hem. 2 može se označiti kao Hem. 2a odnosno *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*. Vezni element *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-* može se ukratko nazvati gGlu, gama Glu ili γ-Glu. U gGlu je to gama karboksi grupa amino-kiseline glutaminske kiseline koja se koristi za povezivanje sa drugim veznim elementom. U jednoj konkretnoj realizaciji, (svaki) gGlu vezni element je u L obliku.

U jednoj realizaciji, Hem. 2 je *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*, pri čemu m je 1, 2 ili 3. U jednoj realizaciji, m je 2 ili 3. Vezni element *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*, je derivat sulfonske kiseline, gde se karboksi grupa koristi za povezivanje sa drugim veznim elementom. U jednoj realizaciji m je 3, a vezni element Hem. 2 može se označiti kao Hem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*.

1

U jednoj realizaciji Hem. 2 je *-NH-(CH2)m-cikloheksan-CO-*, pri čemu m je 1, 2 ili 3. U jednoj realizaciji m je 2 ili 3. U Hem-u. 2 strukturi, cikloheksanski prsten je stoga supstituisan na C1 i C4 sa NH-CH2 i CO, respektivno.

U jednoj realizaciji, m je 1 i vezni element Hem 2 može se označiti kao Hem. 2c: *-NH-CH2-cikloheksan-CO-*. Ovaj vezni element se dalje može označiti kao Trx.

U veznom elementu Hem. 3, „k“ i „n“ mogu varirati između 1 i 5. Kada je k = n = 1, struktura ovog veznog elementa odgovara Hem. 3a:

U jednom aspektu Hem. 3 je Hem. 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*. Vezni element Hem. 3a se može ukratko nazvati Ado (8-amino-3,6-dioksoktanska kiselina), jer je njen diradikal.

U veznom elementu Hem. 4, „m“ može varirati između 1 i 5. U jednoj realizaciji, Hem. 4 je *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*, pri čemu je m 1, 2, 3 ili 4. U jednoj realizaciji, m je 2 ili 3.

U jednoj realizaciji, kada je Hem. 4 *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i m = 2 struktura ovog veznog elementa odgovara Hem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.

U jednoj realizaciji, Hem. 4 je *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-* gde je m 1 , 2, 3 ili 4. U jednoj realizaciji, m je 2 ili 3. U jednoj realizaciji, m je 4 ili 5.

Kad je Hem. 4 *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i m = 4 struktura ovog veznog elementa odgovara Hem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*.

Linker derivata iz pronalaska može da sadrži jednu ili više od ove tri različite vrste veznih elemenata, a može, takođe, da sadrži jedan ili više od svakog pojedinačnog veznog elementa. U jednoj realizaciji, linker sadrži samo jedan element Hem. 4. U jednoj realizaciji, linker sadrži jedan ili više elemenata svake od Hem. 2 i Hem. 3 i samo jedan element Hem. 4.

Kao neograničavajući primer, linker se može sastojati od jednog elementa Hem.

2, dva elemenata Hem. 3a i jednog elementa Hem. 4, međusobno povezanih preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, povezanih na svom *-NH kraju na CO-* kraj produžnog dela, a na svom CO-* kraju na atom sumpora Cys ostatka, bilo na poziciji 180 ili 181 FGF21proteina. Elementi Hem. 4 stoga vezuju -CO-* kraj Hem.2 /Hem.3 elemenata sa atomom sumpora cisteina analoga FGF21.

1

U sledećem primeru, linker se može sastojati od dva elementa Hem. 2, kao što su dva elementa Hem. 2a, dva elemenata Hem. 3a i jedan element Hem. 4, međusobno povezanih preko amidnih veza i navedenim redosledom. Element Hem. 2 koji je spojen na *-NH kraju na CO-* kraju produžnog dela, a Hem. 4 na svom CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka FGF21 proteina.

U jednoj realizaciji, linker je povezan sa tiol grupom cys-a na poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 173, 174, 175, 180 ili 181 FGF21 proteina. U daljim realizacijama, linker je povezan sa atomom sumpora Cys-a na poziciji 180 ili 181.

Nema potrebe naglašavati, samo radi dobrog redosleda: Izraz „u naznačenoj sekvenci“ znači da je *-NH kraj prvog pomenutog veznog elementa (ovde Hem. 2) povezan sa CO-* krajem produžnog dela, a CO-* kraj poslednjeg navedenog veznog elementa (ovde Hem. 4) povezan je sa tiolnom grupom datog Cys ostatka FGF21 proteina.

U jednoj realizaciji, derivat predmetnog pronalaska je izabran iz grupa koje se sastoje od:

a. Jedinjenje 13-24

b. Jedinjenje 35-41 i/ili

c. Jedinjenje 43-56.

U daljoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 13-24.

U jednoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 13-18. U jednoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 20-24.

U jednoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 35-41.

U jednoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 43-56. U jednoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 43-44 i 46-54. U jednoj realizaciji, derivat je izabran iz jedinjenja 44, 47 i 50-54.

Umesto Hem. 4, vezni element izveden iz maleimida može se koristiti tamo gde p i q mogu da variraju između 1 i 5:

O

1

Kada je p = q = 2, struktura ovog veznog elementa odgovara N-(2-aminoetil)-3-(-2,5-diokso-pirolidin-1-il)propanamidu:

Derivati pronalaska mogu postojati u različitim stereoizomernim oblicima koji imaju istu molekularnu formulu i sekvencu vezanih atoma, ali se razlikuju samo u trodimenzionalnoj orijentaciji svojih atoma u prostoru. Stereoizomerija derivatnih jedinjenja prema pronalasku naznačena je u eksperimentalnom delu, u imenima kao i strukturama, koristeći standardnu nomenklaturu. Ukoliko nije drugačije navedeno, pronalazak se odnosi na sve stereoizomerne oblike traženog derivata.

Funkcionalna svojstva

Derivati FGF21 iz pronalaska su biološki aktivni. Na primer, veoma su potentni i, takođe ili alternativno, veoma se dobro vezuju za FGF receptore. Takođe, ili alternativno, oni imaju produženi farmakokinetički profil. Na primer, imaju veoma dug terminalni poluživot kada se daju i.v. miševima i/ili patuljastim svinjama. Posebna kombinacija dobre potentnosti i dugog poluživota može biti veoma poželjna.

Takođe, ili alternativno, iznenađuje da derivati FGF21 koji sadrže bočni lanac iz pronalaska na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 173, 174, 175, 180 i 181 zrelog humanog FGF21 imaju visoku potentnost.

Prema prvom aspektu, derivati FGF21 imaju aktivnost FGF21. Na primer, derivati FGF21 ovog pronalaska imaju iznenađujuće dobru potentnost prema humanim FGF receptorima.

U prvoj posebnoj realizaciji, potentnost i/ili aktivnost se odnose na in vitro potentnost, tj. performanse u testu funkcionalnog FGF receptora, naročito na sposobnost aktiviranja humanog FGF receptora.

In vitro potentnost može, na primer, biti određena u testu sa celim ćelijama koje eksprimuju humane FGF receptore (FGFR1c, FGFR2c ili FGFR3c) i BKL. Na primer, odgovor humanih FGF receptora može se meriti korišćenjem HEK (humanih embrionalnih ćelija bubrega), koje prekomerno eksprimuju humani beta-kloto (BKL). HEK293 ćelije endogeno eksprimuju nekoliko FGF receptora, uključujući FGFR1c i FGFR3c. Ove ćelije ne

1

reaguju na FGF21 dok se ne transfektuju BKL koreceptorom. Aktivacija FGF receptora/BKL kompleksa dovodi do aktiviranja MAPK/ERK signalnog puta i fosforilacije ERK. Nivo fosforilovanog ERK-a (pERK) u određenoj vremenskoj tački povećava se sa povećanjem koncentracije FGF21. Jedan neograničavajući primer takvog ispitivanja opisan je u Primeru 6.

In vitro potentnost se, takođe, može odrediti u testu mišjim 3T3-L1 adipocitima. Na primer, analozi i derivati FGF21 mogu da se testiraju na njihovu sposobnost da povećaju unos glukoze u adipocite. Diferencirani 3T3-L1 adipociti endogeno eksprimuju FGFR1c i BKL. 3T3-L1 ćelije ne reaguju na FGF21 sve do posle diferencijacije budući da diferencijacija dovodi do ekspresije BKL koreceptora. Aktivacija FGFR1c receptora/BKL kompleksa povećava ekspresiju transportera glukoze 1 (GLUT1) i zbog toga će FGF21 analozi dovesti do povećane količine glukoze unete u adipocite na način da odgovaraju na dozu.

EC50 vrednost se obično koristi kao mera potentnosti leka. Odnosi se na koncentraciju predmetnog jedinjenja koja indukuje odgovor na pola puta između osnovne linije i maksimuma, u odnosu na krivu doza-odgovor. Popularno gledano, EC50 predstavlja koncentraciju u kojoj se primećuje 50% maksimalnog efekta. In vitro potentnost derivata prema pronalasku može se odrediti kao što je gore opisano, i određen je EC50 dotičnog derivata. Što je niža vrednost EC50, to je bolja potentnost.

Kao neograničavajući primer, derivat FGF21 iz pronalaska ima potentnost koja je merena korišćenjem HEK293 ćelija koje prekomerno eksprimuju humani beta-kloto koji odgovara EC50 na 0% HSA ispod 60 nM, poželjno ispod 20 nM, ili još poželjnije ispod 10 nM (npr. određeno kao što je opisano u Primeru 6).

Kao neograničavajući primer, derivat FGF21 iz pronalaska ima potentnost koja se meri korišćenjem unosa glukoze u 3T3-L1 adipocite koji odgovaraju EC50 ispod 60 nM, poželjno ispod 20 nM, ili poželjnije ispod 10 nM (npr. određeno kao što je opisano u Primeru 7).

Kao neograničavajući primer, derivat FGF21 iz pronalaska ima efikasnost Emaks koja se meri korišćenjem unosa glukoze u adipocitima 3T3-L1 od najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, ili poželjnije najmanje 90% (npr. određeno kao što je opisano u Primeru 7).

Kao neograničavajući primer, derivat FGF21 pronalaska ima potentnost koja se meri korišćenjem unosa glukoze u 3T3-L1 adipocite koji odgovaraju EC50 ispod 60 nM, poželjno ispod 20 nM, ili poželjnije ispod 10 nM (npr. određeno kao što je opisano u Primeru 7) i efikasnost Emaks koja se meri korišćenjem unosa glukoze u 3T3-L1

1

adipocite od najmanje 80%, ili poželjnije najmanje 90% (npr. određeno kao što je opisano u Primeru 7).

U drugoj posebnoj realizaciji, potentnost i/ili aktivnost se odnosi na in vivo potentnost. Proteini i derivati iz pronalaska su potentni in vivo, koji se mogu odrediti kao što je poznato u stanju tehnike u bilo kom pogodnom životinjskom modelu, kao i u kliničkim ispitivanjima.

Prethodno je pokazano da gubitak težine izazvan FGF21 kod mršavih miševa predviđa efekat kod gojaznih miševa i zato su mršavi miševi smatrani dobrim modelom za ispitivanje. Mršavi C57BL miševi su jedan primer pogodnog životinjskog modela, a efekat smanjenja telesne težine može se odrediti kod takvih miševa in vivo (određeno, npr. kao što je opisano u Primeru 9).

Prema drugom aspektu, derivati prema pronalasku su dugotrajni.

Dugotrajnost se može proceniti in vitro i/ili odrediti iz in vivo farmakokinetičkih studija. Povećanje in vitro potentnosti, EC50 vrednosti, u prisustvu albumina u serumu, ukazuje na afinitet na serumski albumin i predstavlja postupka za predviđanje produženog farmakokinetičkog profila ispitivane supstance na životinjskim modelima. Dugotrajnost se može odrediti, npr. kao terminalni poluživot (t1⁄2) nakon i.v. davanja, na primer, miševima ili patuljastim svinjama.

Kao neograničavajući primer, derivat ovog pronalaska ima terminalni poluživot nakon i.v. davanja miševima od najmanje 1 sata, poželjnije najmanje 3 sata, ili najpoželjnije najmanje 10 sati (određeno, npr. kako je opisano u Primeru 8).

Kao još jedan neograničavajući primer, derivat iz pronalaska ima terminalni poluživot nakon i.v. davanja patuljastim svinjama od najmanje 2 sata, poželjnije najmanje 10 sati, još poželjnije najmanje 20 sati ili najpoželjnije najmanje 50 sati (određeno npr. kao što je opisano u Primeru 8).

Prema trećem aspektu, derivati ovog pronalaska su dugotrajni i istovremeno imaju veoma dobru potentnost. Posebna kombinacija dobre potentnosti/ vezivanja i dugog poluživota može biti veoma poželjna.

Prema četvrtom aspektu, derivati iz pronalaska imaju dobra biofizička svojstva. Ova svojstva uključuju, ali nisu ograničena na fizičku stabilnost i/ili rastvorljivost. Ova i druga biofizička svojstva mogu se meriti korišćenjem standardnih postupaka poznatih u tehnici hemije proteina. U posebnoj realizaciji, ova svojstva su poboljšana u poređenju sa zrelim humanim FGF21.

Dodatne posebne realizacije derivata predmetnog pronalaska opisane su u odeljcima naslovljenim „POSEBNE REALIZACIJE“ pre eksperimentalnog odeljka.

2

Proizvodnja i prečišćavanje FGF21 jedinjenja

Proizvodnja proteina, npr. FGF21, dobro je poznata u stanju tehnike. FGF21 analozi mogu se proizvesti postupkom koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži DNK sekvencu koja kodira molekulu i koja je sposobna da eksprimuje FGF21 analoge u odgovarajućem hranljivom medijumu pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimovanje FGF21 analoga. Nekoliko rekombinantnih postupaka može se koristiti u proizvodnji FGF21 i njegovih analoga. Primeri postupaka koji se mogu koristiti u proizvodnji FGF21 u mikroorganizmima, kao što su, na primer, Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae su, na primer, opisani u WO12010553.

Specifični primeri postupaka za pripremu određenog broja derivata prema pronalasku su uključeni u eksperimentalni deo. Ukratko, analozi FGF21 su izvedeni na ostatku cisteina alkilacijom. Tiolni reaktivni bočni lanci, kao što su bočni lanci pripremljeni sa haloacetamidom, mogu tako da reaguju sa FGF21 analogom. FGF analog može biti pripremljen sa cistaminom koji štiti tiolnu grupu cisteina. Ako je tako, analog se redukuje npr. redukcionim sredstvom poput fosfina pre reakcije analoga sa tiolnim reaktivnim bočnim lancem.

FGF21 analozi i derivati predmetnog pronalaska mogu se prečistiti različitim postupcima poznatim u tehnici, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromatografiju (npr. razmenu jona, afinitetnu, hidrofobnu, hromatofokusiranje i isključenje veličine), elektroforetske postupke (npr. preparativno izoelektrično fokusiranje (IEF), diferencijalnu rastvorljivost (npr. taloženje amonijum sulfata) ili ekstrakciju (videti npr. Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Način primene

Izraz „tretman“ podrazumeva i prevenciju i minimiziranje pomenute bolesti, poremećaja ili stanja (tj. „tretman“ se odnosi i na profilaktičko i terapeutsko davanje FGF21 derivata prema pronalasku ili kompozicije koja sadrži FGF21 derivate prema pronalasku) osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno suprotno prema kontekstu.

Put primene može biti bilo koji put koji efikasno prenosi jedinjenje iz ovog pronalaska do željenog ili odgovarajućeg mesta u telu, kao što je parenteralno, na primer, supkutano, intramuskularno ili intravenozno. Alternativno, jedinjenje iz ovog pronalaska se može primenjivati oralno, pulmonalno, rektalno, transdermalno, bukalno, sublingvalno ili nazalno.

Farmaceutske kompozicije

Farmaceutske kompozicije koje sadrže derivat prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, amid ili estar i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens mogu da se pripreme kao što je poznato u tehnici.

Izraz „ekscipijens”, se u širem smislu osnosi na bilo koju komponentu osim aktivnog terapeutskog sastojka/jaka. Ekscipijens može biti inertna supstanca, neaktivna supstanca i/ili medicinski neaktivna supstanca.

Ekscipijens može služiti u različite svrhe, npr. kao prenosnik, nosač, razblaživač, pomoćno sredstvo u tabletama i/ili za poboljšanje davanja i/ili apsorpcije aktivne supstance.

Formulacija farmaceutski aktivnih sastojaka sa različitim ekscipijensima poznata je u stanju tehnike, vidi npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 19<th>edition (1995), i bilo koje kasnije izdanje).

Injekcione kompozicije koje sadrže FGF21 jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti pripremljene korišćenjem uobičajenih tehnika farmaceutske industrije koje uključuju rastvaranje i mešanje sastojaka kako je pogodno da se dobije željeni krajnji proizvod. Prema tome, prema jednoj proceduri, FGF21 jedinjenje iz predmetnog pronalaska je rastvoreno u pogodnom puferu na pogodnoj pH, tako da je taloženje minimizirano ili izbegnuto. Kompozicija za injektiranje je napravljena sterilna, na primer, sterilnom filtracijom. Antimikrobna sredstva se, takođe, mogu dodati kompoziciji.

Kompozicija može biti stabilizovana formulacija. Izraz „stabilizovana formulacija“ se odnosi na formulaciju sa povećanom fizičkom i/ili hemijskom stabilnošću, poželjno oba. Uopšteno, formulacija mora biti stabilna tokom upotrebe i skladištenja (u skladu sa preporučenom upotrebom i uslovima skladištenja) do isteka roka trajanja.

Izraz „fizička stabilnost“ se odnosi na njihovo fizičko stanje i promene bez promene kovalentnih veza i otuda tendenciju proteina da formira biološki neaktivne i/ili nerastvorljive agregate kao rezultat izlaganja termomehaničkom naprezanju i/ili interakciji sa destabilizujućim interfejsima i površinama (kao što su hidrofobne površine). Fizička stabilnost vodene proteinske formulacije može se proceniti vizuelnim pregledom i/ili merenjima zamućenosti i/ili merenjima koncentracije nakon izlaganja mehaničkom/fizičkom naprezanju (npr. agitaciji) na različitim temperaturama tokom različith vremenskih perioda. Alternativno, fizička stabilnost se može proceniti korišćenjem spektroskopskog agensa ili probe konformacionog statusa proteina kao što je npr. Tioflavin T ili sonde za „hidrofobni flaster“.

Termin „hemijska stabilnost“ se odnosi na hemijske (naročito kovalentne) promene u kovalentnim vezama u proteinskoj strukturi što dovodi do stvaranja hemijskih produkata razgradnje koji potencijalno imaju smanjenu biološku potentnost i/ili povećani imunogeni efekat u poređenju sa netaknutim proteinom. Hemijska stabilnost se može proceniti merenjem količine produkata hemijske razgradnje u različitim vremenskim tačkama nakon izlaganja različitim uslovima okoline, npr. pomoću SEC-HPLC, RP-HPLC, LCMS, i/ili mapiranjem peptida.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje FGF21 derivate sa poboljšanom fizičkom stabilnošću. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje FGF21 derivate sa poboljšanom hemijskom stabilnošću.

Kombinovani tretman

Tretman sa FGF21 derivatom u skladu sa ovim pronalaskom može se, takođe, kombinovati sa jednom ili više dodatnih farmakološki aktivnih supstanci, npr. odabranih iz antidijabetičkih sredstava, sredstava protiv gojaznosti, sredstava za regulaciju apetita, antihipertenzivnih agenasa, sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija koje su rezultat ili su povezane sa dijabetesom i sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poremećaja koji su rezultat ili su povezani sa gojaznošću.

Primeri ovih farmakološki aktivnih supstanci su: agonisti GLP-1 receptora, insulin, DPP-IV (dipeptidil peptidaza-IV) inhibitori, agonisti amilina i agonisti receptora leptina.

Farmaceutske indikacije

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na derivat iz pronalaska, za upotrebu kao leka.

U konkretnim realizacijama, derivat iz pronalaska može da se koristi za sledeće medicinske tretmane:

(i) sprečavanje i/ili tretman svih oblika dijabetesa, kao što su hiperglikemija, dijabetes tipa 2, oštećena tolerancija na glukozu, dijabetes tipa 1, insulin nezavisan dijabetes, MODI (adultni tip dijabetesa kod mladih osoba), gestacijski dijabetes i/ili za redukciju HbA1C;

(ii) odlaganje ili sprečavanje napredovanja dijabetične bolesti, kao što je progresija kod dijabetesa tipa 2, odlaganje progresije smanjene tolerancije glukoze (IGT) na insulin koji zahteva dijabetes tipa 2, odlaganje ili sprečavanje otpornosti na insulin, i/ili odlaganje progresije dijabetes tipa 2 koji ne zahteva insulin u dijabetes tipa 2 koji zahteva insulin;

2

(iii) poboljšanje funkcije β-ćelija, kao što je smanjenje apoptoze β-ćelija, povećanje funkcije β-ćelija i/ili mase β-ćelija, i/ili obnavljanje osetljivosti β-ćelija na glukozu;

(iv) sprečavanje i/ili lečenje poremećaja u ishrani, kao što je gojaznost, npr. smanjivanjem unosa hrane, povećanjem potrošnje energije, smanjivanjem telesne težine, suzbijanjem apetita, izazivanjem sitosti; lečenje ili sprečavanje poremećaja u ishrani, bulimia nervosa i/ili gojaznosti izazvane davanjem antipsihotika ili steroida; i/ili sprečavanje i/ili lečenje komorbiditeta kod gojaznosti, kao što je osteoartritis i/ili urinarna inkontinencija;

(v) prevencija i/ili lečenje komplikacija usled dijabetesa, kao što je nefropatija; (vi) poboljšanje lipidnih parametara, kao što su prevencija i/ili lečenje dislipidemije, smanjivanje ukupnih serumskih lipida; povećanje nivoa HDL; sniženje nivoa malih, gustih LDL; snižavanje nivoa VLDL: snižavanje nivoa triglicerida; snižavanje nivoa holesterola; snižavanje nivoa lipoproteina a (Lp(a)) kod čoveka; inhibiranje generisanja apolipoproteina a (apo(a)) in vitro i/ili in vivo;

(vii) prevencija i/ili lečenje kardiovaskularnih bolesti, kao što je sindrom X; ateroskleroza; infarkt miokarda, koronarna bolest srca, reperfuzijska povreda, moždani udar, cerebralna ishemija, rana srčana ili rana kardiovaskularna bolest, hipertrofija leve komore, koronarna arterijska bolest, hipertenzija, esencijalna hipertenzija, akutna hipertenzivna kriza, kardiomiopatija, insuficijencija srca, intolerancija na vežbanje, akutno i / ili hronično zatajenje srca, aritmij,; srčana disritmija, sinkopija, angina pektoris, reokluzija srčanog bajpasa i/ili stenta, intermitentna klaudikacija (ateroschlerosis oblitterens); dijastolička disfunkcija, i/ili sistolna disfunkcija; i / ili smanjenje krvnog pritiska, kao što je smanjenje sistolnog krvnog pritiska;

(viii) prevencija i/ili lečenje hepatične steatoze i oboljenja masne jetre nevezano za alkoholizam (NAFLD); i/ili

(ix) sprečavanje i/ili lečenje kritičnih bolesti, kao što je lečenje kritično bolesnog pacijenta, pacijent sa kritičnom bolešću polinefropatije (CIPNP) i/ili potencijalni CIPNP pacijent; sprečavanje razvoja kritične bolesti ili razvoj CIPNP-a; sprečavanje, lečenje i/ili izlečenje sindroma sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS) kod pacijenta; i/ili za sprečavanje ili smanjenje mogućnosti pacijenta koji pati od bakteriemije, septikemije i/ili septičkog šoka tokom hospitalizacije.

U određenoj realizaciji, indikacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od (i) -(vii). U drugoj posebnoj realizaciji, indikacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od (i), (iv), (vi) i/ili (vii). Posebno su poželjne sledeće indikacije: Dijabetes tipa 2 i/ili gojaznost.

U jednoj realizaciji, jedinjenja predmetnog pronalaska su za lečenje dijabetesa tipa 2. U jednoj realizaciji, jedinjenja predmetnog pronalaska su za lečenje gojaznosti.

Posebne realizacije

Slede posebne realizacije pronalaska:

1. Derivat FGF21 proteina,

pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1)

pri čemu navedeni derivat sadrži produžni deo vezan na dati Cys ostatak preko linkera;

pri čemu je produžni deo odabran iz grupe

Hem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,

Hem. 1B: HOOC-benzen-O-(CH2)x-CO-* i

Hem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*

gde je x celi broj u rasponu 8-18; i

pri čemu linker sadrži najmanje jednu od svake od Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4: pri čemu Hem. 2 je izabrano iz:

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*,

*-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-* i

*-NH-(CH2)m-cikloheksan-CO-*,

pri čemu je m ceo broj u rasponu od 1-5,

pri čemu Hem. 3 je *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, i pri čemu je k ceo broj u rasponu od 1-5 i n je ceo broj u rasponu 1-5, i

pri čemu Hem. 4:je izabrano iz

*-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i

*-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*

pri čemu je m celi broj u rasponu 1-5; i

2

pri čemu Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, spojene su na svom *-NH kraju na CO-* kraju produžnog dela, a na njegovom CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, amida ili estra.

Derivat prema realizaciji 1, pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na položaju 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181.

Derivat u skladu sa realizacijom 1, pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji 170, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181.

Derivat u skladu sa bilo kojim od prethodnih ostvarenja, pri čemu je Hem. 2 je izabran iz grupe:

Hem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* i

Hem. 2c: *-NH-CH2-cikloheksan-CO-*.

Derivat prema realizaciji 1, pri čemu je Hem. 4 izabran iz:

Hem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.

Hem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*.

Derivat FGF21 proteina, pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), i najviše 30 modifikacija amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1);

pri čemu dati derivat sadrži produžni deo vezan na dati Cys ostatak preko linkera;

pri čemu je produžni deo izabran iz grupe

Hem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*,

pri čemu je x ceo broj u rasponu od 10-18,

Hem. 1B: HOOC-benzene-O-(CH2)x

pri čemu je x ceo broj u rasponu od 8-18,

i

Hem. 1C; HO-S(=O)2-(CH2)x

pri čemu je x ceo broj u rasponu od 10-18,

2

pri čemu linker sadrži najmanje jednu od svake od Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4:

Hem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, i

Hem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,

gde je k ceo broj u rasponu od 1-5, n je ceo broj u rasponu od 1-5, a m je ceo broj u rasponu od 1-5;

i

pri čemu Hem. 2, Chem. 3, i Chem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, spojene su na svom *-NH kraju na CO-* kraj produžnog dela, a na svom -CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, amida ili estra.

Derivat prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, pri čemu je Hem. 1 izabran iz grupe:

Hem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*,

Hem. 1b: HOOC-benzen-O-(CH2)9-CO-* i

Hem. 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*

Derivat FGF21proteina,

pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), pri čemu navedeni derivat sadrži produžni deo vezan na Cys ostatak preko linkera;

pri čemu je nosač

Hem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,

pri čemu je x ceo broj u rasponu 10-18; i

pri čemu linker sadrži najmanje jedan od svake od Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4:

Hem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, i

Hem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,

2

pri čemu Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, spojene su na svom *-NH kraju na CO-* kraju produžnog dela, a na svom CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, amida ili estra.

Derivat proteina FGF21,

pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), i maksimalno 30 modifikacija amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1) ;

pri čemu dati derivat sadrži produžni deo vezan na pomenuti Cys ostatak preko linkera;

pri čemu je produžni deo

Hem. 1: HOOC-(CH2)x-CO-*,

pri čemu je x ceo broj u rasponu 10-18; i

pri čemu linker sadrži najmanje jedan od svake od Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4:

Hem. 2: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*,

Hem. 3: *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, i

Hem. 4: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*,

pri čemu Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, spojene na svom *-NH kraju na CO-* kraju produžnog dela, a na svom CH2-* kraju na tiol grupu Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, amida ili estra.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu dati protein ima najviše 30, kao što je 25, kao što je 20, kao što je 15, kao što je 10, kao što je 8,

2

kao što je najviše 5 modifikacija amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu dati protein ima 4 ili 5 modifikacija amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu dati protein ima 4 modifikacije amino-kiselina u poređenju sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu dati FGF protein ima najmanje 80%, kao što je 85%, kao što je 90%, kao što je 95% identičnosti sa zrelim humanim FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu navedeni FGF protein ima najmanje 96%, kao što je 97%, kao što je 98%, kao što je 99% identitet zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1 ).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu su promene aminokiselina na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju jednoj ili više pozicija 121, 168, 180 ili 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je jedna od promena amino-kiselina dodavanje Ala ostatka na poziciji koja odgovara N-kraju zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu protein sadrži Ala na N-terminalnom kraju datog proteina.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu protein sadrži 121Q.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu protein sadrži 168L.

2

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu protein sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 8 ili 10.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu protein ima sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu Hem. 1 je 1A ili 1C i x je ceo broj u rasponu 12-18.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu Hem. 1 je 1A ili 1C i x je ceo broj u rasponu 14-16.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu Hem. 1 je 1B i x je ceo broj u rasponu 8-12.

Postupak prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, gde x je 16.

Postupak prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, pri čemu je k ceo broj u rasponu 1-2.

Postupak prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, gde k je 1.

Postupak prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, pri čemu je n ceo broj u rasponu 1-2.

Postupak prema bilo kojoj od prethodnih realizacija, gde n je 1.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu m u Hem. 4 je ceo broj u rasponu 1-5.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu m u Hem4 je 2.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija pri čemu produžni deo sadrži Hem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*.

34. Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu se produžni deo sastoji od Hem. 1a: HOOC-(CH2)14-CO-*.

35.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu linker sadrži Hem.

3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*.

36.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu linker sadrži Hem.

4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.

37.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu se linker sastoji od najmanje jednog elementa Hem. 2, dva elementa Hem. 3 i jednog elementa Hem. 4.

38 Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu se linker sastoji od jednog elementa Hem. 2, dva elementa Hem. 3 i jednog elementa Hem. 4.

39 Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu se linker sastoji od dva elementa Hem. 2, dva elementa Hem. 3 i jednog elementa Hem. 4.

40.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu se linker sastoji od jednog elementa Hem. 2, dva elemenata Hem. 3a i jednog elementa Hem. 4a.

41.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat jedno od sledećeg:

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 13)

1

O H O O O N O

H

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 14)

O H O

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2 O-[[2- O[2-[ N

H2-[[(4S) O-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 15)

2

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoil-

O H O

amino)butanoil]amino]etoksi]e Otoks Oi]ace N

Htil]amin Oo]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 16)

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 17)

O H O O O N O

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[H2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Jedinjenje 18)

O H O O O N O

; S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[H2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 19)

4

; S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 20)

; S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 21)

; S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2 O-[2-[ O2-[[ N

H(4S)-4-k Oarboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 22)

O H O O O N O

H

; S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 23)

O H O O O N O

H

; S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Met[Cys181]FGF21 (Jedinjenje 24)

O H O O O N O

H

42. Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat jedno od sledećeg:

O H O O O N O

H

O H O O O N O

H

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 15)

O N O O

H

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 16)

O H O O O N O

H

O H O O O N O

H

; S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Jedinjenje 18)

O H O

. O O N O

H

43.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat izabran iz grupe jedinjenja 13-24 i 43 do 56.

44. Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat izabran iz grupe jedinjenja 35-41.

4

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat izabran iz grupe jedinjenja 13-24, 35-41 i 43 do 56.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 13.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 14.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 15. Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 16.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 17.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 18.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 19.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 20.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 21.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 22.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 23.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 24.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 35.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 36.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 37.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 38.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 39.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 40.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 41.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 43.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 44.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 45.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 46.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 47.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 48.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 49.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 50.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 51.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 53.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 54.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 55.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat Jedinjenje 56.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu derivat ima FGF21 aktivnost.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je derivat sposoban da aktivira FGF receptore.

Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, pri čemu je terminalni poluživot (t1⁄2) nakon i.v. primene na patuljastim svinjama najmanje 20 puta veći od terminalnog poluživota (t1⁄2) zrelog humanog FGF21.

Derivat prema bilo kojoj od realizacija 1-79, za upotrebu kao lek.

4

Derivat prema bilo kojoj od realizacija 1-79, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bilo kog od oblika dijabetesa i srodnih bolesti, kao što su gojaznost, poremećaji u ishrani, kardiovaskularne bolesti, komplikacije dijabetesa, i/ili za poboljšanje lipidnih parametara, poboljšanje funkcije β –ćelija, i/ili za odlaganje ili prevenciju napredovanja oboljenja dijabetesa; i/ili za lečenje i/ili prevenciju hepatične steatoze i bolesti masne jetre nevezanih za alkoholizam (NAFLD).

Upotreba derivata prema bilo kojoj od realizacija 1-79, za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju svih oblika dijabetesa i srodnih bolesti, kao što su gojaznost, poremećaji u ishrani, kardiovaskularne bolesti, komplikacije dijabetesa, i/ili za poboljšanje lipidnih parametara, poboljšanje funkcije β –ćelija, i/ili za odlaganje ili prevenciju napredovanja oboljenja dijabetesa; i/ili za lečenje i/ili prevenciju hepatične steatoze i bolesti masne jetre nevezanih za alkoholizam (NAFLD).

Postupak lečenja i/ili prevencije svih oblika dijabetesa i srodnih bolesti, kao što su poremećaji u ishrani, gojaznost, poremećaji u ishrani, kardiovaskularne bolesti, komplikacije dijabetesa, i/ili za poboljšanje lipidnih parametara, poboljšanje funkcije β –ćelija, i/ili za odlaganje ili prevenciju napredovanja oboljenja dijabetesa; i/ili za lečenje i/ili prevenciju hepatične steatoze i bolesti masne jetre nevezanih za alkoholizam (NAFLD).primenom farmaceutski aktivne količine derivata prema bilo kojoj od realizacija 1-79.

FGF21 protein koji sadrži supstituciju amino-kiseline divljeg tipa amino-kiseline cisteinskim ostatkom na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

FGF21 protein prema realizaciji 83, pri čemu FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173, 174, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

FGF21 protein prema realizaciji 83, pri čemu FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 170, 173 i 174 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

87. FGF21 protein prema realizaciji 83, pri čemu FGF21 protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara jednoj od pozicija 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

88. FGF21 protein prema realizaciji 83, pri čemu FGF21 protein sadrži -1Ala, 121Gln i/ili 168Leu pored varijante Cys ostatka.

89. FGF21 protein prema realizaciji 83, pri čemu FGF21 protein sadrži -1Ala, 121Gln i/ili 168Leu, pored cisteina na jednoj od pozicija 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 i 181 FGF21 (1-181) (SEQ ID NO: 1).

PRIMERI

Lista skraćenica

AcOD: deuterirani aceton

Ado: 8-amino-3,6-dioksaooktanska kiselina

BSPP: Bis(p-sulfonatfenil)fenilfosfin dihidratna dikalijumova so

DCM: dihlormetan

DMSO: Dimetilsulfoksid

DPBS: Dulbecco slani fosfatni puferni rastvor

EDAC: (3-dimethylaminopropyl) ethyl carbodiimide

ELSD: Detektor raspršivanja svetlosti

Fmoc: 9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonil

Fc: Fragment, kristališući

GLP-1: peptid-1 nalik glukagonu

gGlu: gama glutaminska kiselina

GLUT1: transporter glukoze 1

HATU: 2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronium heksafluorofosfat HEPES: 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina

HPLC: Tečna hromatografija visokih performansi

IgG4: Imunoglobulin G4

IBMX: 3-izobutil-1-metilksantin

IPTG: izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid

LCMS: Tečna hromatografija - masena spektroskopija

Mtt: 4-metiltritil

4

NMR: Nuklearna magnetna rezonanca

OtBu: terc-butil estar

PBS: slani fosfatni puferni rastvor

RF: faktor retardacije

Rt: vreme zadržavanja

RT: sobna temperatura

tBu: t-butil

TCTU: O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronium tetrafluoroborat TFA: trifluoroacetatna kiselina

Tris: tris(hidroksimetil)aminometan ili 2-amino-2-hidroksimetilpropan-1,3-diol Trx: traneksaminska kiselina

UPLC: Tečna hromatografija ultra performansi

ZOSu: N-(benzilooksikarboniloksi)sukcinimid

Materijali i postupci

Opšti metodi detekcije i karakterizacije

LCMS postupak 1

Uzorak se razblaži na pribl. 0,2 mg/ml i ubrizgava se u LCMS sistem, npr. 3-5 uL. LCMS instrument sastoji se od UPLC sistema i masenog spektrometra. Analozi su odsoljeni i možda razdvojeni na koloni reverzne faze (npr. C4, C8, C18 kolona ili predkolona) i analizirani su linearnim gradijentom acetonitrila u 0,02-0,05% TFA (trifluorosirćetna kiselina). Instrument treba kalibrisati i, ako je moguće, upotrebom lock mass spreja. Generiše se MS spektar nad glavnim hromatografskim vrhom i netaknuta masa se rekonstruiše koristeći algoritam dekonvolucije.

Primer podešavanja LCMS instrumenta (Synapt):

režim pozitivnih jona

3000 V kapilarni potencijal,

30V napon kupe

110°C temperatura izvora,

250 °C temperatura desolvatacije

protok gasa na konusu (N2) od 25L/h.

m/z opseg 200-3000

4

Daje se dekonvoluciona masa

LCMS postupak 2

Sistem: Agilent 1290 infinity series UPLC kolona: Aeris WIDEPORE 3.6µ XB-C182,1 x 50mm Detektor: Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A)Podešavanje detektora Postupak jonizacije: Agilent Jet Stream source Raspon skeniranja: m/z min. 100, m/z maks. 3200 pozitivni režim rada linearnog reflektora

Uslovi: Linearni gradijent: 5 % do 95 % B Trajanje gradijenta: 10 minuta 0-8 min 5-95% B, 8-9 min 95% B , 9-9,5 min 95-5% B 9,5-10 min 5% B Brzina protoka: 0,40 ml/min fiksno Temperatura kolone: 40°C

Eluenti Rastvarač A: 99,90 % H2O, 0,02% TFA Rastvarač B: 99,90 % CH3CN, 0,02% TFA Rastvarač C: NA

Specifikacija i validacija rezultata: Pronađena masa je ili m/z ((m+z)/z) jedinjenja za jedinjenja sa m<4000 ili masa (prosek) kao rezultat dekonvolucije korišćenjem Masshunter Workstation softvera verzije B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1 ( Agilent).

Izračunata masa je prosečna molekulska masa željenog jedinjenja. Izračunata m/z je molekulska masa (m+z)/z željenog jedinjenja.

LCMS postupak 3

Sistem: Agilent 1290 infinity series UPLC kolona: Phenomenex Aeris widepore 3,6µ C4 50x2,1 mm Detektor: Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230 (G6230A) Podešavanje detektora Postupak jonizacije: Agilent Jet Stream source Raspon skeniranja: m/z min. 100, m/z maks. 3200 pozitivni režim rada linearnog reflektora

Uslovi: Postupni gradijent: 5 % do 90 % B Trajanje gradijenta: 10 minuta: 0-1 min 5-20% B, 1-7 min 20-90 % B , 7-8 min 90% B 8-8,5 min 90-5 %B 8,5-10 min 5% B Brzina protoka: 0,40 ml/min fiksno Temperatura kolone: 40°C

Eluenti Rastvor A: 99,90 % H2O, 0,02% TFA Rastvor B: 99,90 % CH3CN, 0,02% TFA Rastvor C: NA

Specifikacija i validacija rezultata: Pronađena masa je ili m/z ((m+z)/z) jedinjenja za jedinjenja sa m <4000 ili masa (prosečna) kao rezultat dekonvolucije korišćenjem Masshunter Workstation softvera verzije B.05.00 Build 5.0.519.13 SP1 ( Agilent).

Izračunata masa je prosečna molekulska masa željenog jedinjenja. Izračunata m/z je molekulska masa (m z)/z željenog jedinjenja.

LCMS postupak 4

Sistem: Waters autopurification system

4

Kolona: Kinetex C184,6 mm x 50 mm

Detektor: UV: PDA, ELSD, MS Micromass Quatro micro

Podešavanje detektora: Postupak jonizacije: ES+ , raspon skeniranja 100-1000, konus 30 V, kapilarno 300 kV, vreme skeniranja 1,3 s; PDA: 210-400 nm; ELSD: Nebulizatorski grejač-hladnjak 70 %, drift cev 57,0 °C

Uslovi: Linearni gradijent acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA, tranjanje gradijenta: 4,0 min, ukupno trajanje: 6,0 min, brzina protoka: 1,1 ml/min, temperatura kolone: 23 °C

Priprema jedinjenja prema pronalasku

Primer 1: Kloniranje i eksprimovanje zrelog humanog FGF21

DNK i sekvence amino-kisellina za humani FGF21 su opisane od strane, npr. Nishimura et al. U Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000). Sekvence su dostupne i iz javnih baza podataka sa dodeljenim brojevima. EMBL:AB021975 i UNIPROT:Q9NSA1, respektivno.

Zreli humani FGF21 protein je kloniran i eksprimovan kao unutarćelijski protein u E.coli, bez signalnog peptida, ali sa dodatkom N-terminalnog metionina. Preciznije, kodiranje genske sekvence za zreli humani FGF21 (sa Met dodato na N-kraju) je kodonski optimizovano za eksprimovanje E.coli i klonirano između NdeI i BamHI mesta vektora pET11c. Ovo je stavilo gen FGF21 pod kontrolu promotora faga T7. Konstrukt ekspresije transformisan je u E. coli BL21 (DE3). Pokupljena je jedna kolonija i uzgojena u LB Amp 100 ug/mL do OD450od 0,5. Ekspresija je indukovana sa 0,3 mM IPTG tokom 4 sata pri 37 º C. Sirovi ekstrakti ćelija su dobijeni sonikacijom za analizu eksprimovanja FGF21. Kumasi obojen SDS-PAGE pokazao je uspešno eksprimovanje FGF21 koji je identifikovan uglavnom u frakciji peleta. Iako izračunata MW tako eksprimovanog MetFGF21 je 19,5 kD, ona je migrirala na gelu kao 25 kD protein, što je verovatno zbog visokog sadržaja prolina, koji odlaže kretanje proteina.

U ovoj prijavi, MetFGF21 se koristi kao referentno jedinjenje. Kada se FGF21 proizvodi primenom E. Coli ekspresionih sistema, na N-kraju FGF21 se uvodi metionin. Međutim, ne smatra se da ovo utiče na biološku aktivnost, pa se i FGF21 i MetFGF21 obično koriste kao referentna jedinjenja.

4

Primer 2: Kloniranje i eksprimovanje FGF21 analoga

Eksprimovani konstrukti za analoge u tabeli 1 (primer 3) napravljeni su mutagenezom na zrelom eksprimovanom konstruktu FGF21 opisanom u primeru 1.

Korišćen je Stratagene set za mutagenezu sa više mesta. Takođe je primenjen isti uslov eksprimovanja kao što je opisano u primeru 1. Kumasi plavom obojen SDS-PAGE pokazao je uspešno eksprimovanje analoga. Analozi su eksprimovani, uključujući dipeptidni Met-Ala N-kraj u FGF21 sekvence, što omogućava eksprimovanje FGF21 analoga sa Ala kao N-terminalnim ostatkom amino-kiseline usled cepanja Met od E. coli enzima.

Primer 3: Prečišćavanje zrelih FGF21 i FGF21 analoga

Da bi se prečistili zreli FGF21 i FGF21 analozi opisani u primerima 1-2, korišćeni su sledeći postupak ili slične tehnike:

Ćelijski pelet E.coli resuspendovan je u 10 mM kalijum-fosfata pH 6,0, i dva puta je poremećen homogenizatorom ispod 800 bara. Inkluziona tela su peletirana centrifugiranjem (10.000 x g, tokom 30 minuta), ponovo rastvorena u 50 mM Tris pH 8,0, i opciono dodato je 2M uree i/ili 5 mM cisteamina, i kaša je mešana tokom noći na 4 ºC. Pre nanošenja na kolonu, kaša je centrifugirana ponovo na 10.000 x g tokom 30 minuta. Supernatant je nanesen na hromatografiju za razmenu anjona (Q Sepharose Fast Flow smola, GE Healthcare) i eluiran sa 50-250 mM NaCl. 0,4M amonijum sulfat je dodat u bazen za eluiranje, koji je zatim nanet na Fenil FF kolonu (GE Healthcare), uravnoteženu u 20 mM Tris pH 8,0, 0,4M amonijum sulfata. Kolona je isprana sa 20 mM Tris pH 8,0, 1,5 M natrijum hlorida pre eluiranja sa 10% Tris-hloridnim puferom (20 mM Tris pH 8,0, 1,5M natrijum hlorida). 30Q kolona može se koristiti za dalje poliranje čistoće. Krajnji proizvod je analiziran pomoću SDS-PAGE ili drugih relevantnih tehnika. Za jedinjenja 3 i 5-10, zadržana je cisteaminska zaštita unetih cisteina tokom farmakoloških ispitivanja.

FGF21 analozi su pripremljeni kako je gore opisano. Netaknuta masa je određena pomoću LCMS (korišćenjem LCMS postupka 1) za jedinjenja.

Tabela 1A. FGF21 analozi 1 do 10.

4

Tabela 1B. FGF21 analozi 25 do 32

Primer 4: Priprema reagensa za derivaciju FGF21 analoga

Priprema reprezentativnog reagensa za derivaciju data je u Primeru 4.1.

Reagensi iz Pimera 4.2-4.4 se pripremaju postupkom datim u Primeru 4.1. Reagensi Pimera 4.5-4.17 su pripremljeni sličnim postupcima kao što je opisano u daljem tekstu.

Primer 4.1: Priprema 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}pentadekanska kiselina

1

O O H

Sintetički protokol čvrste faze:

Rastvor N-(benziloksikarboniloksi) sukcinimida (ZOSu, 100 g, 401 mmol) u dihlormetanu (500 mL) ukapavan je tokom 2 sata u rastvor etilendiamina (1, 189 mL, 2,81 mol) u dihlormetanu (750 mL) . Posle 30 minuta, suspenzija je filtrirana, a čvrste supstance isprane dihlormetanom. Filtrat se upari do suva i ostatak razblaži toluenom (1,00 L) i vodom (0,50 L). Dobijena smeša je filtrirana i filtrat je razdvojen da bi se dobile dve faze. Vodena faza je sadržavala proizvod; zbog toga je ekstrahovan dihlormetanom (2 x 250 mL). Sve organske faze su kombinovane, osušene preko bezvodnog natrijum sulfata, filtrirane i koncentrovane u vakuumu. Ostatak je razblažen toluenom (750 mL) i ekstrahovan sa 2 M vodenog rastvora hlorovodonične kiseline (500 mL) i 1M vodenog rastvora hlorovodonične kiseline (100 mL). Kisele vodene faze su kombinovane i bazifikovane rastvorom natrijum hidroksida (60,0 g, 1,50 mol) u vodi (90 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana dihlormetanom (4 x 200 mL), osušena iznad anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirana, koncentrovana u vakuumu i razblažena heksanima (200 mL). 4 M rastvora hlorovodonika u etru (100 mL, 400 mmol) je dodato u rastvor, dobijena suspenzija je koncentrovana u vakuumu i razblažena heksanima (1,00 L). Nataložena čvrsta supstanca je filtrirana, isprana heksanima i osušena u vakuumu da bi se dobio benzil estar hidrohlorid (2-amino-etil)-karbaminske kiseline kao beli prah. Prinos: 62,62 g (68%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 4:1): 0,25 (slobodna baza).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 7.42-7.26 (m, 5 H); 5.16 (s, 2 H); 3.60 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 3.32 (t, J=5.7 Hz, 2 H).

2-Hlortritil smola 100-200 mesh 1,7 mmol/g (3, 40,1 g, 68,1 mmol) ostavljena je da bubri u suvom dihlormetanu (250 mL) tokom 20 minuta. Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-Ado-OH, 17,5 g, 45,4 mmol) i N,N-diisopropiletilamina (30,1 mL, 173 mmol)u suvom dihlormetanu (50

2

mL) dodat je smoli i smeša je mućkana 5 sati. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N,N-diisopropiletilamina (15,8 mL, 90,8 mmol) u metanol/dihlormetan smeši (4:1, 250 mL, 2 x 5 min). Potom je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 250 mL), dihlormetanom (2 x 250 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 250 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretiranjem sa 20% piperidina u dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 250 mL), 2-propanolom (2 x 250 mL) i dihlormetanom (300 mL, 2 x 250 mL). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksicarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-Ado-OH, 26,3 g, 68,1 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (21,4 mL, 123 mmol) u N,N-dimetilformamidu (140 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N, N-dimetilformamidom (2 x 250 mL), dihlormetanom (2 x 250 mL) i N, N-dimetilformamidom (250 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 250 mL). Smola je isprana sa N, N-dimetilformamidom (3 x 250 ml), 2-propanolom (2 x 250 ml) i dihlormetanom (300 ml, 2 x 250 ml). Rastvor (S)-2- 9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)- -terc-butil estra glutarne kiseline (Fmoc-Glu-OtBu, 29,0 g, 68,1 mmol), O-(6-hloro-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 24,2 g, 68,1 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (21,4 mL, 123 mmol) u N,N-dimetilformamidu (140 mL) je dodat smoli i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N, N-dimetilformamidom (2 x 250 mL), dihlormetanom (2 x 250 mL) i N, N-dimetilformamidom (250 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x30 min, 3 x 250 mL). Smola je isprana sa N, N-dimetilformamidom (3 x 250 ml), 2-propanolom (2 x 250 ml) i dihlormetanom (300 ml, 2 x 250 ml). Rastvor 16-(terc-butoksi)-16-oksoheksadekanske kiseline (23,3 g, 68,1 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il) -N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU , 24,2 g, 68,1 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (21,4 mL, 123 mmol) u smeši N,N-dimetilformamid/dihlormetan (4:1, 200 mL) je dodat u smolu. Smola je mućkana tokom 1 sata, filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 250 ml), dihlormetanom (2 x 250 ml), metanolom (2 x 250 ml) i dihlormetanom (350, 6 x 250 ml). Proizvod se odvoji od smole tretiranjem sa 2,2,2-trifluoetanolom (250 mL) tokom 18 sati. Smola se isfiltrira i ispere sa dihlormetanom (2 x 250 ml), smešom 2-propanola/dihlormetana (1:1, 2 x 250 ml), 2-propanolom (250 ml) i dihlormetanom (3 x 250 ml). Rastvori su kombinovani; rastvarač uparen, a sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan/metanol 1:0-9:1). Čista (S)-22-(terc-butoksikarbonil)-41,41-dimetil-10,19,24,39-tetraokso3,6,12,15,40-pentaoksa-9,18,23-triazadotetrakontanska kiselina je sušena u vakuumu i dobijena je kao bledo žuto gusto žuto ulje.

Prinos: 30,88 g (83%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 4:1): 0,30.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,36 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 7,02 (t, J=5,4 Hz, 1 H); 6,55 (d, J=7,7 Hz, 1 H); 4,46 (m, 1 H); 4,18 (s, 2 H); 4,02 (s, 2 H); 3,83-3,36 (m, 16 H); 2,44-2,12 (m, 7 H); 2,02-1,86 (m, 1 H); 1,60 (m, 4 H); 1,47 (s, 9 H); 1,45 (s, 9 H); 1,36-1,21 (m, 20 H).

LC-MS postupak 4:

Čistoća: 100%

Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 3,60 min. Nalaz m/z, z=1: 818,7 (M+H)+

2- (7-Aza-1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU, 11,4 g, 30,1 mmol) i trietilamin (8,77 mL, 62,9 mmol) su zatim dodavani u rastvor (S)-22- (terc-butoksikarbonil) -41,41-dimetil-10,19,24,39-tetraokso-3,6,12,15,40-pentaoksa-9,18,23-triazadotetrakontanske kiseline (22,4 g, 27,4 mmol) u suvom dihlormetanu (110 ml). Trietilamin (5,72 mL, 41,0 mmol) je dodat suspenziji benzil-ester hidrohlorida (2-amino-etil)-karbaminske kiseline (6,94 g, 30,1 mmol) u suvom dihlormetanu (165 mL), a dobijena smeša je dodata gore navedenom rastvoru. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, a zatim je uparena do suva. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (500 mL); ispran sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2 x 200 ml), 5% vodenim rastvorom natrijum karbonata (2 x 200 ml, vrlo sporo odvajanje faza), 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (8 x 200 ml) i slanim rastvorom; osušen je preko bezvodnog natrijum sulfata i uparen do suva u vakuumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5) da bi se dobio terc-butil estar 15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-benziloksikarbonilamino-etilkarbamoil)-metoksi]-etoksi}-etilkarbamoil)-metoksi]-etoksi}-etilkarbamoil) -1-terc-butoksikarbonil-propilkarbamoil]-pentadekanske kiseline kao svetlo žuto gusto ulje.

Prinos: 23,84 g (88%)

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,35

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,39-7,26 (m, 6 H); 7,19 (t, J=6.3 Hz, 1 H); 6.91 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 6,52 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 5.83 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 5,09 (s, 2 H); 4.41 (ddd, J=12.3, 4.6 i 4.3 Hz, 1 H); 3,99 (s, 2 H); 3,97 (s, 2 H); 3,71-3,30 (m, 20 H);

4

2,33-2,08 (m, 7 H); 1,97-1,83 (m, 1 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,35-1,20 (m, 20 H).

LCMS postupak 4

Čistoća: 100%

Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 4,18 min Nalaz m/z, z=1: 994,9 (M+H)+

Paladijum na ugljeniku (10%, 1,27 g, 1,20 mmol) je dodat u rastvor gornjeg jedinjenja (23,8 g, 24,0 mmol) u metanolu (350 ml) i dobijena smeša je hidrogenizovana pod normalnim pritiskom tokom 4 sata. Katalizator se isfiltrira, a filtrat se upari do suva. Ostatak je uparen nekoliko puta iz dihlormetana da bi se uklonili ostaci metanola i osušen u vakuumu da bi se dobio terc-butil (S)-1-amino-25-(terc-butoksikarbonil)-4,13,22,27-tetraokso- 6, 9,15,18-tetraoksa-3,12,21,26-tetraazadotetrakontan-42-oat kao gusto bezbojno ulje.

Prinos: 20,50 g (99%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,05.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,54 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 7,41 (t, J=5,6 Hz, 1 H); 7,14 (t, J=5,5 Hz, 1 H); 6,68 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 5,25 (bs, 2 H); 4,39 (td, J=8,3 i 4,2 Hz, 1 H); 4,01 (s, 4 H); 3,74-3,39 (m, 18 H); 2,96 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 2,34-2,06 (m, 7 H); 1,97-1,83 (m, 1 H); 1,68-1,50 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,43 (s, 9 H); 1,37-1,19 (m, 20 H).

LCMS postupak 4

Čistoća: 100%

Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 1,43 min Nalaz m/z, z=1: 860,8 (M+H)+

N, N-diizopropiletilamin (4,98 mL, 28,6 mmol) je dodat u rastvor gornjeg amina (6, 20,5 g, 23,8 mmol) u suvom dihlormetanu (290 mL) na -30°C pod argonom.

Bromoacetil bromid (2,48 mL, 28,6 mmol) je ukapan i dobijeni rastvor je mešan na -30°C tokom još 3 sata. Kupka za hlađenje je uklonjena, smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, a zatim je rastvarač uklonjen u vakuumu. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (450 mL) i ispran sa 5% vodenim rastvorom limunske kiseline (300 mL). Faze su razdvojene u roku od 1 sata. Organski sloj je ispran vodom (300 ml), a dobijena emulzija je ostavljena da se odvoji preko noći da bi se dobile 3 faze. Čisti vodeni sloj je uklonjen i zaostale 2 faze su mućkane sa zasićenim vodenim rastvorom kalijum-bromida (100 ml). Faze su ostavljene da se odvoje preko noći, vodena je zatim uklonjena, a organska je osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen u vakuumu i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0,060 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5) da bi se dobio terc-butil (S)-1-bromo-28-(terc-butoksikarbonil)-2,7,16,25,30-pentaokso-9,12,18,21-tetraoksa-3,6,15,24,29-pentaazapentattrakontan-45-oat kao bezbojna čvrsta supstanca.

Prinos: 19,46 g (83%).

RF (SiO2, dihlormetan / metanol 9:1): 0,25

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,46 (m, 1 H); 7,33 (t, J=5,9 Hz, 1 H); 7,21 (t, J=5,1 Hz, 1 H); 6,92 (t, J=5,2 Hz, 1 H); 6,50 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 4,41 (ddd, J=12,2, 4,5 i 4,2 Hz, 1 H); 4,01 (s, 4 H), 3,85 (s, 2 H); 3,75-3,40 (m, 20 H), 2,36-2,08 (m, 7 H); 1,99-1,84 (m, 1 H); 1,68-1,51 (m, 4 H), 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,38-1,19 (m, 20 H)

LCMS postupak 4

Čistoća: 100%

Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 3,51 min. Nalaz: m/z, z=1: 980,9, 982,9 (M+H)+

Gornje jedinjenje (19,5 g, 19,8 mmol) je rastvoreno u trifluorosirćetnoj kiselini (120 mL), a dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sata.

Trifluorosirćetna kiselina uklonjena je u vakuumu i ostatak je uparen iz dihlormetana (6 x 200 mL). Dietil etar (200 mL) je dodat u uljani ostatak i smeša je mešana preko noći da bi se dobila suspenzija. Čvrsti proizvod je filtriran, ispran dietil etrom i heksanima i osušen u vakuumu da bi se dobio naslovni proizvod 15-{(S)-1-karboksi-3-[2- (2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etil-karbamoil]metoksi}etoksi) etilkarbamoil]propilkarbamoil} pentadekanska kiselina kao beli prah.

Prinos: 16,74 g (97%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.8 and 4.8 Hz, 1 H); 4.12 (s, 2 H), 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77 -3.39 (m, 20 H), 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-1.04 (m, 1 H); 1.71-1.56 (m, 4 H), 1.30 (bs, 20 H)

LCMS postupak 4:

Čistoća: 100%

Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 3,51 min Teorijski m/z, z=1: 869,8, Nalaz: m/z, z=1: 868,7, 870,7

Primer 4,2: Priprema 11-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}undekanska kiselina

O O

11-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoski)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}undecanska kiselina je pripremljenaistim postupkom kao što je opisano u Primeru 4.1 koji za rezultat ima gusto narandžasto ulje.

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.9 and 4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.10 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.79-3.38 (m, 20 H); 2.50-2.16 (m, 7 H); 2.16-2.00 (m, 1 H); 1.72-1.56 (m, 4 H); 1.42-1.24 (m, 12 H)

LCMS postupak 4:

Čistoća: 100% (ELSD)

Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 2,74 min Teoretski, m/z, z=1:813,8, Nalaz m/z, z=1: 812,0, 814,0

Primer 4.3: Priprema 13-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}tridekanska kiselina

13-{(S)-1- karboksi -3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil} tridekanska kiselina je pripremljena istim postupkom kako je opisano u Primeru 4.1 koji za rezultat ima gusto žuto ulje.

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.61 (dd, J=8.9 and 4.9 Hz, 1 H); 4.13 (s, 2 H); 4.11 (s, 2 H); 3.96 (s, 2 H); 3.77-3.40 (m, 20 H); 2.49-2.18 (m, 7 H); 2.16-2.07 (m, 1 H); 1.70-1.56 (m, 4 H); 1.31 (bs, 16 H).

LCMS postupak 4:

Čistoća: 100% (ELSD)

Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 2,94 min Teoretski m/z, z=1: 841,9, Nalaz: m/z, z=1: 841,7, 843,7

Primer 4.4: Pripreme 19-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]propilkarbamoil}nonadekanska kiselina

O

19-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-Bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil} nonadekanska kiselina je pripremljena istim postupkom kako je opisano u Primeru 4.1 koji za rezultat ima bež prah.

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,65-4,57 (m, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,10 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,77-3,43 (m, 20 H); 2,49-2,40 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 2,39-2,23 (m, 5 H); 2,17-2,07 (m, 1 H); 1,68-1,57 (m, 4 H); 1,30 (bs, 28 H)

LCMS postupak 4:

Čistoća: 100% (ELSD)

Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 2,17 min Teoretska masa: 926,0, Nalaz m/z: 926 (M+H)+

Primer 4.5: Priprema

18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina

O

Sintetički protokol za fazu rastvora:

Korak 1: benzil 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetilamino)-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-benziloksikarbonil-4-oksobutil]amino]-18-okso-oktadekanoat U rastvor etilendiamina (8,5 ml ml) u DCM (80 ml) i triehilamin (5,2 ml) na 0°C je dodat rastvor benzil 18-[[(1S)-1-benziloksikarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanoata (26 g), pripremljen kao što je opisano u WO10029159, u DCM (320 ml) ukapavanjem tokom 75 min. Nakon mešanja tokom 2 sata, filtriran je talog. Filtratu je dodata voda (200 ml) i izopropanol (50 ml). Smeša je ekstrahovana. Organski sloj je osušen pomoću MgSO4. MgSO4 je uklonjen filtracijom i filtrat je osušen u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 20,07 g (81%) LCMS: Teoretska masa: 956,2; Nalaz m / z, z = 1: 957,0

Korak 2: benzil 18-[[(1S)-1-benziloksikarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-hloracetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etillamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanoat

Hlorosirćetna kiselina (0,19 g) je rastvorena u DCM (15 ml). N-hidroksisukcinimid (0,22 g) i EDAC HCl (0,42 g) je dodato. Nakon mešanja tokom 2,5 sata benzil 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetilamino)-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-benziloksikarbonil-4-oksobutil]amino]-18-okso-oktadekanoat (1,5 g) u DCM (5 ml) je dodat. Posle mešanja preko noći na sobnoj temperaturi, smeša je ekstrahovana sa 1M HCl (2x20 ml) i vodom/slanim rastvorom 2:1 (30 ml). Organski sloj je osušen (MgSO4), filtriran i koncentrovan u vakuumu da bi se dobilo bistro ulje, 1,37 g (84%)

LCMS: Teoretska masa: 1032,7; Nalaz m/z, z=1: 1033,1

Korak 3: 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-hloracetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina.

U rastvor benzil 18-[[(1S)-1-benziloksikarbonil-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-hloracetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-oktadekanoata (10,5 g) u acetonu (140 ml) je dodato 10% PD/C (1,0 g) nakon aeracije azotom. Posle hidrogenizovanja tokom 6 sati, smeša je zagrevana do 40-50°C pre filtriranja. Talog u hladnom filtratu je izolovan i ispran acetonom i osušen da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, 7,42 g (85%).

Korak 4: 8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-Bromoacetil)amino]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina.

U suspenziju 18-[[(1S)-1-karboksi-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-hloracetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]amino]-18-okso-aceton stearinske kiseline (60 ml) je dodat natrijum bromid (5 ekv, 1,21 g). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon 2 sata je dodat natrijum-bromid (10 ekv., 2,41 g). Posle 2 dana, dodat je natrijum-bromid (5 ekv., 1,21 g). Posle 5 dana, smeša je koncentrovana. Polovini ostatka je dodat DCM (30 ml), 10% askorbinske kiseline (20 ml) i voda 30 ml. Emulziji je dodat izopropanol (50 ml) i voda (30 ml). Organska faza je odvojena i isprana dva puta smešom 10% askorbinske kiseline (20 ml) i izopropanola (10 ml). Organski sloj je osušen (MgSO4), filtriran i koncentrovan da bi se dobilo čvrsto ulje, koje je kristalizovano u acetonu i izolovano filtriranjem da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kontaminirano početnim materijalom, 0,80 g (72%).

LCMS: Teoretska masa: 896,9. Nalaz m/z, z=1: 898,9 (M+1)

Primer 4.6: Prriprema 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-12-okso-dodekanoinska kiselina

O

Protokol sinteze čvrste faze:

2-hlorotritil smola 100-200 mesh 1,8 mmol/g (1, 11,9 g, 21,4 mmol) je ostavljena da bubri u suvom dihlormetanu (80 ml) tokom 20 minuta. Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 5,50 g, 14,3 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (9,44 mL, 54,2 mmol) u suvom dihlormetanu (70 mL) je dodat smoli i smeša je mućkana 4 sata. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N, N-diizopropiletilamina (4,97 mL, 28,5 mmol) u smeši metanol/dihlormetana (4:1, 2 x 5 min, 2 x 57 mL). Zatim se smola ispere sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N, N-dimetilformamidu (1x5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor {2-[2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 11,0 g, 28,5 mmol), O- (6-hloro-benzotriazol- 1-il) -N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 10,1 g, 28,5 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (9,93 mL, 57,0 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor 1-terc-butil estra (S) -2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino) -glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 9,11 g, 21,4 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 7,60 g, 21,4

1

mmol) i N, N-diizopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor 4-[(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)metil] cikloheksankarboksilne kiseline (Fmoc-Trk-OH, 9,11 g, 21,4 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 7,60 g, 21.4 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,71 mL, 38,5 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana 1 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N, N-dimetilformamidom (2 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N, N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor mono-terc-butil estra (C12(OtBu)-OH, 6,13 g, 21,4 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 7,61 g, 21,4 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,71 mL, 38,5 mmol) u smeši dihlormetan/N,N-dimetilformamida (4:1, 80 mL) je dodat smoli i smeša je mućkana 1,5 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (6 x 80 mL), dihlormetanom (4 x 80 mL), metanolom (4 x 80 mL) i dihlormetanom (7 x 80 mL). Proizvod je odvojen od smole tretiranjem sa 2,2,2-trifluoroetanolom (80 mL) tokom 18 sati. Smola se isfiltrira i ispere sa dihlormetanom (4 x 80 ml), smešom dihlormetana/2-propanola (1:1, 4 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (6 x 80 ml). Rastvori su kombinovani; rastvarač uparen, a sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0-063 mm; eluent: dihlormetan/metanol 1:0-9:1). Čisti proizvod (2) je osušen u vakuumu i dobijen kao ulje. Prinos: 5,40 g (42%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,30.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,45-7,31 (m, 1 H); 7,10-6,97 (m, 1 H); 6,71-6,60 (m, 1 H); 5,70-5,58 (m, 1 H); 4,43-4,31 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,79-3,31 (m, 16 H); 3,13-3,08 (m, 2 H); 2,28-1,79 (m, 11 H); 1,71-1,51 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1,25 (bs, 12 H); 1,05-0,88 (m, 2 H).

LC-MS purity: 100%.

LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 2,16 min.

LC-MS m/z: 903.0 (M+H)+.

2

2- (7-Aza-1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU, 2,46 g, 6,48 mmol) i trietilamin (1,89 mL, 13,6 mmol) su zatim dodavani u rastvor gornjeg ulja (2, 5,31 g, 5,89 mmol) u suvom dihlormetanu (23 mL). Trietilamin (1,36 mL, 9,72 mmol) je dodat suspenziji benzil-ester hidrohlorida (2-amino-etil)- karbaminske kiseline (3, 1,49 g, 6,48 mmol) u suvom dihlormetanu (35 mL) i dobijena smeša je dodata u gore pomenuti rastvor. Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim je isparena u suvom stanju. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (70 mL); ispran sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (1 x 70 mL), 5% vodenim rastvorom natrijum karbonata (2 x 70 mL), 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (4 x 70 mL) i slanim rastvorom (70 mL); osušen je preko anhidrovanog natrijum sulfata i uparen. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0-063 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5 do 92:8) da bi se dobilo gusto žuto ulje. Prinos: 2,81 g (44%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,25.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,41-7,29 (m, 6 H); 7,22-7,13 (m, 1 H); 6,93-6,81 (m, 1 H); 6,62-6,58 (m, 1 H); 5,90-5,81 (m, 1 H); 5,68-5,55 (m, 1 H); 5,09 (s, 2 H); 4,42-4,33 (m, 1 H); 4,01-3,95 (m, 4 H); 3,75-3,30 (m, 20 H); 3,14-3,06 (m, 2 H); 2,31-2,01 (m, 11 H); 1,97-1,76 (m, 1 H); 1,65-1,52 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,27 (bs, 12 H); 1,04-0,87 (m, 2 H).

Paladijum na ugljeniku (10%, 0,15 g, 0,13 mmol) je dodat u rastvor gornjeg jedinjenja (2,81 g, 2,60 mmol) u metanolu (43 mL) i dobijena smeša je hidrogenizovana pod normalnim pritiskom tokom 2,5 sata. Katalizator je isfiltriran, a filtrat je uparen do suva. Ostatak je uparen četiri puta sa toluenom i osušen u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje 5.

Prinos: 2,01 g (81%).

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,51-7,36 (m, 2 H); 7,04-6,96 (m, 1 H); 6,76-6,66 (m, 1 H); 5,93-5,85 (m, 1 H); 4,41-4,29 (m, 1 H); 4,03-3,99 (m, 4 H); 3,73-3,25 (m, 18 H); 3,13-2,97 (m, 4 H); 2,34-1,78 (m, 11 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,30 (m, 12 H); 1,04-0,88 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 70:30 do 100:0 0,1% TFA): 0,67 min.

LC-MS m/z: 945,0 (M+H)+.

N, N-diizopropiletilamin (0,40 mL, 2,28 mmol) je dodat u rastvor gornjeg amina (5, 1,79 g, 1,90 mmol) u suvom dihlormetanu (30 mL) na -30°C pod argonom. Bromacetil bromid (0,20 mL, 2,28 mmol) je ukapan i dobijeni rastvor je mešan na -30°C tokom 3 sata. Kupka za hlađenje je uklonjena, smeša je mešana na sobnoj temperaturi dodatnih 1 sat, a zatim je uparena do suva. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (50 ml), ispran sa 5% vodenim rastvorom limunske kiseline (3 x 50 ml, veoma sporo odvajanje faza), 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (4 x 50 ml) i slanim rastvorom (50 ml ). Organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i uparen. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0-063 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5 do 93:7) da bi se dobilo žuto ulje.

Prinos: 1,63 g (80%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 95:5): 0,25.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,56-7,48 (m, 1 H); 7,43-7,34 (m, 1 H); 7,04-6,95 (m, 1 H); 6,62 (d, J=7,9 Hz, 1 H); 5,74-5,63 (m, 1 H); 4,43-4,33 (m, 1 H); 4,02 (s, 4 H); 3,85 (s, 2 H); 3,73-3,40 (m, 20 H); 3,14-3,09 (m, 2 H); 2,34-2,04 (m, 9 H); 1,97-1,76 (m, 4 H); 1,68-1,51 (m, 7 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,27 (m, 12 H); 1,07-0,90 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 2,16 min.

LC-MS m/z: 1066,0 (M+H)+.

Gornje jedinjenje (1,53 g, 1,44 mmol) je rastvoreno u trifluorosirćetnoj kiselini (25 mL) i ostavljeno da odstoji 1,5 sat. Trifluorosirćetna kiselina uklonjena je u vakuumu i ostatak je uparen tri puta sa toluenom i deset puta dihlormetanom da bi se dobila žuta uljasta čvrsta supstanca.

Prinos: 810 mg (59%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,64-4,54 (m, 1 H); 4,13 (s, 2 H); 4,11 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,78-3,40 (m, 20 H); 3,13-3,10 (d, J=6,6 Hz, 2 H); 2,51-2,19 (m, 9 H); 1,94-1,77 (m, 4 H); 1,68-1,41 (m, 7 H); 1,31 (bs, 12 H); 1,10-0,92 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 2,82 min.

LC-MS m/z: 952,0 (M+H)+.

4

Primer 4.7: Priprema 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromoacetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanske kiseline

O

Protokol sinteze čvrste faze:

2-hlortritilna smola 100-200 mesh 1,8 mmol/g (1, 11,9 g, 21,4 mmol) je ostavljena da bubri u suvom dihlormetanu (80 ml) tokom 20 minuta. Rastvor {2-[2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 5,50 g, 14,3 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (9,44 mL , 54,2 mmol) u suvom dihlormetanu (70 mL) je dodat u smolu i smeša je mučkana 4 sata. Smola je filtrirana i tretirana rastvorom N, N-diizopropiletilamina (4,97 mL, 28,5 mmol) u smeši metanol/dihlormetana (4:1, 2 x 5 min, 2 x 57 mL). Zatim je smola isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 y 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N, N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 11,0 g, 28,5 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 10,1 g, 28,5 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (9,93 mL, 57,0 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor 1-terc-butil estra (S)-2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 9,11 g, 21,4 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 7,60 g, 21,4 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) u N, N-dimetilformamidu (80 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor Fmoc-traneksaminske kiseline (Fmoc-Trx-OH, 9,11 g, 21,4 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 7.60 g, 21,4 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (6,71 ml, 38,5 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml), dihlormetanom (2 x 80 ml) i N,N-dimetilformamidom (2 x 80 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 80 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (100 ml, 2 x 80 ml). Rastvor mono-terc-butil estra heksadekanediojske kiseline (C16(OtBu)-OH, 7,33 g, 21,4 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 7,61 g, 21,4 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,71 mL, 38,5 mmol) u smeši dihlormetan/N,N-dimetilformamida (4:1, 80 mL) je dodat smoli i smeša je mućkana 1,5 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (6 x 80 mL), dihlormetanom (4 x 80 mL), metanolom (4 x 80 mL) i dihlormetanom (7 x 80 mL).

Proizvod je odvojen od smole tretiranjem sa 2,2,2-trifluoroetanolom (80 mL) tokom 18 sati. Smola se isfiltrira i ispere sa dihlormetanom (4 x 80 ml), smešom dihlormetana/2-propanola (1:1, 4 x 80 ml), 2-propanolom (2 x 80 ml) i dihlormetanom (6 x 80 ml). Rastvori su kombinovani; rastvarač uparen, a sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0-063 mm; eluent: dihlormetan/metanol 1:0-9:1). Intermedijar (2) je osušen u vakuumu i dobija se kao ulje.

Prinos: 8,20 g (80%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,20.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,44-7,33 (m, 1 H); 7,07-6,97 (m, 1 H); 6,72-6,63 (m, 1 H); 5,70-5,59 (m, 1 H); 4,44-4,33 (m, 1 H); 4,15 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,76-3,32 (m, 16 H); 3,14-3,07 (m, 2 H); 2,38-1,77 (m, 11 H); 1,71-1,50 (m, 4 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,25 (bs, 20 H); 1,05-0,87 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100%.

LC-MS Rt (Sunfire 4,6 mm x 100 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 3,56 min.

LC-MS m/z: 959,0 (M+H)+.

2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU, 3,55 g, 9,34 mmol) i trietilamin (2,72 ml, 19,5 mmol) su zatim dodavani u rastvor intermedijera 2 (8,13 g, 8,49 mmol) u suvom dihlormetanu (34 mL). Trietilamin (1,78 mL, 12,7 mmol) je dodat suspenziji benzil-estar hidrohlorida (2-amino-etil)-karbaminske kiseline (2,15 g, 9,34 mmol) u suvom dihlormetanu (51 mL) i dobijena smeša je dodata gornjem rastvoru. Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim je isparena u suvom stanju. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (150 mL); ispran sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (1 x 100 mL), 5% vodenim rastvorom natrijum karbonata (2 x 100 mL), 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (4 x 100 mL) i slanim rastvorom; osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i uparen.

Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Silikagel 60, 0,040-0-063 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5 do 92:8) da bi se dobilo jedinjenje 4 u obliku gustog žutog ulja.

Prinos: 5,59 g (58%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 9:1): 0,20.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,41-7,31 (m, 6 H); 7,21-7,12 (m, 1 H); 6,92-6,83 (m, 1 H); 6,58-6,52 (m, 1 H); 5,89-5,79 (m, 1 H); 5,62-5,51 (m, 1 H); 5,10 (s, 2 H); 4,43-4,32 (m, 1 H); 4,05-3,92 (m, 4 H); 3,75-3,30 (m, 20 H); 3,15-3,07 (m, 2 H); 2,33-2,03 (m, 11 H); 1,97-1,68 (m, 1 H); 1,67-1,51 (m, 4 H); 1,45 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,26 (bs, 20 H); 1,05-0,87 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 70:30 do 100:0 0,1% TFA): 1,41 min.

LC-MS m/z: 1136,0 (M+H)+.

Paladijum na ugljeniku (10%, 0,27 g, 0,24 mmol) je dodat u rastvor gornjeg jedinjenja (4, 5,59 g, 4,93 mmol) u metanolu (85 mL), a dobijena smeša je hidrogenizovana pri normalnom pritisku 2,5 sata. Katalizator je isfiltriran, a filtrat je uparen do suva. Ostatak je isparen četiri puta sa toluenom i osušen u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje 5.

Prinos: 3,45 g (70%).

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,43-7,33 (m, 2 H); 7,05-6,94 (m, 1 H); 6,72-6,65 (m, 1 H); 5,69-5,59 (m, 1 H); 4,44-4,33 (m, 1 H); 4,03-3,98 (m, 4 H); 3,72-3,39 (m, 18 H); 3,15-3,07 (m, 2 H); 2,96-2,90 (m, 2 H); 2,34-1,78 (m, 13 H); 1,71-1,51 (m, 7 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,25 (m, 20 H); 1,07-0,93 (m, 1 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 70:30 do 100:0 0,1% TFA): 0,76 min.

LC-MS m/z: 1001,0 (M+H)+.

N,N-diizopropiletilamin (0,73 mL, 4,14 mmol) je dodat u rastvor gornjeg amina (5, 3,45 g, 3,45 mmol) u suvom dihlormetanu (55 mL) na -30°C pod argonom. Bromacetil bromid (0,36 mL, 4,14 mmol) je dodat u kapima i dobijeni rastvor je mešan na -30°C tokom 3 sata. Kupka za hlađenje je uklonjena, smeša je mešana na sobnoj temperaturi dodatnih 1 sat, a zatim je uparena do suva. Ostatak je ponovo rastvoren u etil acetatu (100 ml), ispran sa 5% vodenim rastvorom limunske kiseline (3 x 100 ml, veoma sporo odvajanje faza), 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (4 x 100 ml) i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko bezvodnog natrijum sulfata, filtriran i uparen. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (silikagel 60, 0,040-0-063 mm; eluent: dihlormetan/metanol 95:5 do 93:7) da bi se dobilo jedinjenje 6u obliku žutog ulja.

Prinos: 1,63 g (44%).

RF (SiO2, dihlormetan/metanol 95: 5): 0,15.

1H NMR spektar (300 MHz, CDCl3, dH): 7,55-7,46 (m, 1 H); 7,43-7,33 (m, 1 H); 6,99-6,89 (m, 1 H); 6,58 (d, J=7,5 Hz, 1 H); 5,72-5,59 (m, 1 H); 4,44-4,32 (m, 1 H); 4,02 (s, 4 H); 3,85 (s, 2 H); 3,74-3,40 (m, 20 H); 3,14-3,09 (m, 2 H); 2,33-2,05 (m, 9 H); 2,01-1,76 (m, 4 H); 1,67-1,53 (m, 7 H); 1,46 (s, 9 H); 1,44 (s, 9 H); 1,25 (m, 20 H); 1,07-0,89 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 50:50 do 100:0 0,1% FA): 3,47 min.

LC-MS m/z: 1122,0 (M+H)+.

Gore pomenuto jedinjenje (6, 1,63 g, 1,53 mmol) je rastvoreno u trifluorosirćetnoj kiselini (25 mL) i ostavljeno da odstoji 1,5 sat. Trifluorosirćetna kiselina je uklonjena u vakuumu i ostatak je uparen tri puta sa toluenom. Dietil etar (120 mL) je dodat uljanom ostatku i smeša je mešana tokom 1 sata. Zatim je talog isfiltriran, a ostatak osušen u vakuumu da bi se dobio beli prah.

Prinos: 1,55 g (90%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,65-4,56 (m, 1 H); 4,14 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,98 (s, 2 H); 3,78-3,44 (m, 20 H); 3,14-3,10 (d, J=6,8 Hz, 2 H); 2,48-2,21 (m, 8 H); 2,18-2,10 (m, 1 H); 1,97-1,79 (m, 4 H); 1,70-1,46 (m, 7 H); 1,32 (bs, 20 H); 1,11-0,93 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex, 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 3,32 min.

LC-MS m/z: 1008,0 (M+H)+.

Primer 4.8: Priprema 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-18-okso-stearinska kiselina

O OH

Protokol sinteze:

Vang Fmoc-Lys (Mtt) smola, 0,26 mmol/g (1, 11,7 g, 3,05 mmol) je ostavljena da bubri u dihlormetanu (100 ml) tokom 45 minuta. Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor {2-[2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 2,35 g, 6,09 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 2,17 g, 6,09 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (2,12 mL, 12,2 mmol) u N,N-dimetilformamidu (100 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), dihlormetanom (3 x 90 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 2,35 g, 6,09 mmol), O- (6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 2,17 g, 6,09 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (2,12 ml, 12,2 mmol) u N, N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1,5 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), dihlormetanom (3 x 90 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml) radi dobijanja intermedijara 1. Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor 1-terc-butil estra (S)-2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 1,94 g, 4,57 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,62 g, 4,57 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (1,43 ml, 8,23 mmol) u N,N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana 1,5 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL), dihlormetanom (3 x 90 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 90 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor 4-[(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)metil] cikloheksankarboksilne kiseline (Fmoc-Trx-OH, 1,73 g, 4,57 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il) -N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,62 g, 4,57 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (1,43 ml, 8,23 mmol) u N, N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana 1 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), dihlormetanom (3 x 90 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml) da bi se dobio intermedijer2. Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 50 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 50 ml), 2-propanolom (3 x 50 ml) i dihlormetanom (3 x 30 ml). Rastvor mono-terc-butil estra oktadekandiojske kiseline (C18(OtBu)-OH, 0,85 g, 2,28 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 0,81 g, 2,28 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (0,72 ml, 4,11 mmol) u N,N-dimetilformamid (50 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana 1,5 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 50 ml), dihlormetanom (3 x 50 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x50 ml). Mtt grupa je uklonjena tretmanom sa 80% 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolom u dihlormetanu (2 x 10 min, 2 x 30 min, 4 x 50 ml). Smola je isprana dihlormetanom (6 x 50 mL). Rastvor bromoacetatne kiseline (4,24 g, 30,5 mmol) i N,N'-diizopropilkarbodiimida (DIC, 4,01 mL, 25,9 mmol) u N,N-dimetilformamidu (50 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 45 minuta. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (5 x 50 ml) i dihlormetanom (10 x 50 ml). Proizvod je odvojen od smole tretiranjem trifluorosirćetnom kiselinom (50 mL) tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana trifluorosirćetnom kiselinom (1 x 25 mL) i dihlormetanom (2 x 30 mL). Rastvori su kombinovani, a rastvarači su upareni do suva što je dalo jedinjenje kao gusto smeđe ulje.

Prinos: 2,18 mg (64%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, 80°C, dH): 4,72-4,55 (m, 2 H); 4,16 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,80-3,62 (m, 12 H); 3,58-3,44 (m, 4 H); 3,32 (t, J=6,8 Hz, 2 H); 3,15 (d, J=6,8 Hz, 2 H); 2,51-2,07 (m, 8 H); 2,01-1,77 (m, 6 H); 1,72-1,44 (m, 11 H); 1,33 (bs, 24 H); 1,13-0,95 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 96%.

LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 3,68 min.

LC-MS m/z: 1124,1 (M+H)+.

Primer 4.9: Priprema 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentyl]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanske kiseline

1

O OH

Postupak sinteze bio je sličan Primeru 4.8, izuzev što se u sinteznim koracima sledeći intermedijar 2 mono-terc-butil estar heksadekandiojske kiseline (C16(OtBu)-OH) koristio umesto mono-terc-butil estra oktadekandiojske kiseline (C18(OtBu)-OH). Proizvod je dobijen kao gusto smeđkasto ulje.

Prinos: 2,05 mg (62%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, 80°C, dH): 4,71-4,55 (m, 2 H); 4,16 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,79-3,62 (m, 12 H); 3,58-3,44 (m, 4 H); 3,32 (t, J=6,7 Hz, 2 H); 3,15 (d, J=6,6 Hz, 2 H); 2,49-2,07 (m, 8 H); 2,01-1,77 (m, 6 H); 1,72-1,44 (m, 11 H); 1,33 (bs, 20 H); 1,13-0,97 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 92%.

LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 3,38 min.

LC-MS m/z: 1096,0 (M+H)+.

Example 4.10: Priprema 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]sulfonilamino]-10-okso-dekoksi]benzoeve kiseline

O O O O

Postupak sinteze bio je sličan Primeru 4.8, osim što su u sinteznim koracima sledeći intermedijar 1 prvo 3-karboksipropansulfonamid, a potom i 10-(4-tercbutoksikarbonilfenoksi)dekanska kiselina spojeni sa smolom korišćenjem standardne procedure Fmoc zaštitu/uklanjanja zaštite. Naredni sintetski koraci, cepanje i obrada kao što je prikazano u Primeru 4.8, dali su belu čvrstu supstancu.

2

LC-MS m/z:998,54 (M1+).

UPLC5: postupak 09_B4_1, Rt=8,3004 min (pH 2,3); 98% čistoće.

Primer 4.11: Priprema 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-okso-dekoksi]benzoeve kiseline

Postupak sinteze bio je sličan Primeru 4.8, osim što su u sinteznim koracima sledeći intermedijar 1 prvo 1-terc-butil estar (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu) i potom 10-(4-terc-butoksikarbonilfenoksi)dekanska kiselina spojeni sa smolom korišćenjem standardnih sintetskih postupaka Fmoc zaštite/uklanjanja zaštite. Naredni sintetski koraci, cepanje i obrada kao što je prikazano u Primeru 4.8, dali su belu čvrstu supstancu.

LC-MS m/z: 978,55(M1+) .

UPLC5: postupak 09_B4_1, Rt=7,573 min (pH 2,3); 99% čistoće.

Primer 4.12: Priprema 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-okso-arahidinske kiseline

Postupak sinteze bio je sličan Primeru 4.8, osim što je u sinteznim koracima sledeći intermedijar 1 prvo 1-terc-butil estar (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu) dvaput je spojen sa smolom, nakon čega 20-terc-butoksi-20-okso-arahidinska kiselina (C20(OtBu)-OH) je kuplovana na smolu korišćenjem standardnih sintetskih postupaka Fmoc zaštite/uklanjanja zaštite. Naredni sintetski koraci, cepanje i obrada kao što je prikazano u Primeru 4.8, dali su belu čvrstu supstancu.

LC-MS m/z: 1141,2 (M+H)+.

Primer 4.13: Priprema 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-okso-arahidinske kiseline

Postupak sinteze bio je sličan Primeru 4.8, osim što je u sintetskim koracima sledeći intermedijar 1 prvo 1-terc-butil estar (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu) povezan sa smolom, nakon čega je

20-terc-butoksi-20-okso-arahidinska kiselina (C20 (OtBu) -OH) spojena sa smolom korišćenjem standardnih sintetskih postupaka Fmoc zaštite/uklanjanja zaštite. Naredni sintetski koraci, cepanje i obrada kao što je prikazano u Primeru 4.8, dali su belu čvrstu supstancu.

LC-MS m/z: 1012,0 (M+H)+.

Primer 4.14: Priprema (2S,25S)-2-(4-(2-Bromoacetamido)butil)-4,13,22-triokso-25-(15-sulfopentadekanamido)-6,9,15,18-tetraoksa-3,12,21-triazaheksakozandiojske kiseline

4

O OH

Protokol sinteze:

Vang Fmoc-Lys (Mtt) smola 0,26 mmol/g (1, 36,7 g, 9,55 mmol) je ostavljena da bubri u dihlormetanu (200 ml) tokom 45 minuta. Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Rastvor {2-[2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N, N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (6,66 mL, 38,2 mmol) u N, N-dimetilformamidu (150 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), dihlormetanom (2 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (6,66 mL, 38,2 mmol) u N, N-dimetilformamidu (150 mL) je dodat u smolu i smeša je mešana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), dihlormetanom (2 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (150 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Rastvor 1-terc-butil estra (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 6,10 g, 14,3 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 5,09 g, 14,3 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (4,49 ml, 25,8 mmol) u N, N-dimetilformamida (150 ml) je dodat u smoli i mešavina je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), dihlormetanom (2 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (150 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Smola je razdvojena u tri dela, rastvor natrijum-16-sulfo-heksadekanojeve kiseline (3, 2,28 g, 6,37 mmol, (benzotriazol-1-iloksi) tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfata (PyBOP, 3,31 g, 6,37 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (2,22 mL, 12,8 mmol) u dimetil sulfoksidu (80 mL) je dodat jednoj vrsti gornjih smola i smeša je mućkana tokom 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom: vodenom smešom (3:1, 3 x 80 ml), N,N-dimetilformamidom (3 x 80 ml), dihlormetanom (3 x 80 ml) i N,N-dimetilformamidom (2 x 80 mL). Mtt grupa je uklonjena tretmanom sa 80% 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolom u dihlormetanu (3 x 10 min, 2 x 30 min, 5 x 80 ml). Smola je isprana dihlormetanom (6 x 80 mL). Rastvor bromoacetatne kiseline (6,64 g, 47,8 mmol) i N,N'-diizopropilkarbodiimida (DIC, 5,26 ml, 34,0 mmol) u N,N-dimetilformamidu (80 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 45 minuta. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (4 x 80 ml) i dihlormetanom (10 x 80 ml). Proizvod se odvoji od smole tretiranjem trifluorosirćetnom kiselinom (100 mL) tokom 1 sata. Smola je isfiltrirana i isprana trifluorosirćetnom kiselinom (1 x 40 mL) i dihlormetanom (3 x 50 mL). Rastvori su kombinovani, a rastvarači su upareni do suva što je dalo gusto smeđkasto ulje. Ulje je rastvoreno u vodi: smeša acetonitrila (4:1, 25 mL) i rastvor je propušten kroz kolonu (7 x 10 cm) Dowex 50WX4 u obliku H+ (50-100 mesh; eluent: voda). Frakcije sa kiselim pH su kombinovane i osušene zamrzavanjem da bi se dobio beli prah.

Prinos: 2,17 g (68%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 4,74-4,56 (m, 2 H); 4,16 (d, J=5,3 Hz, 4 H); 3,95 (s, 2 H); 3,82-3,64 (m, 12 H); 3,61-3,47 (m, 4 H); 3,33 (t, J=6,9 Hz, 2 H); 3,17-3,07 (m, 2 H); 2,54 (t, J=7,3 Hz, 2 H); 2,38 (t, J=7,5 Hz, 2 H); 2,34-2,09 (m, 2 H); 2,01-1,93 (m, 1 H); 1,93-1,78 (m, 3 H); 1,74-1,57 (m, 4 H); 1,57-1,29 (m, 24 H). LC-MS čistoća: 100%.

LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 2,86 min.

LC-MS m/z: 1003,9 (M+H)+.

Primer 4.15: Priprema: 12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-okso-dodekanoinske kiseline

Protokol sinteze:

Vang Fmoc-Lys (Mtt) smola 0,26 mmol/g (1, 36,7 g, 9,55 mmol) je ostavljena da bubri u dihlormetanu (200 ml) tokom 45 minuta. ). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N, N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,66 mL, 38,2 mmol) u N,N-dimetilformamidu (150 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), dihlormetanom (2 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 7,36 g, 19,1 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 6,79 g, 19,1 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (6,66 mL, 38,2 mmol) u N,N-dimetilformamidu (150 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), dihlormetanom (2 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (150 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 mL). Smola je isprana sa N,Ndimetilformamidom (3 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Rastvor 1-terc-butil estra (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 6,10 g, 14,3 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 5,09 g, 14,3 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (4,49 ml, 25,8 mmol) u N, N-dimetilformamidu (150 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 150 ml), dihlormetanom (2 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (150 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N, N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 150 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml), 2-propanolom (2 x 150 ml) i dihlormetanom (2 x 150 ml). Smola je odvojena u tri dela, rastvor 1-terc-butil estar (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 2,03 g, 4,78 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,70 g, 4,78 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (1.50 mL, 8.60 mmol) u N, N -dimetilformamidu (70 mL) je dodat jednoj vrsti gornjih smola (2) i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (2 x 70 ml), dihlormetanom (2 x 70 ml) i N,N-dimetilformamidom (70 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 30 min, 2 x 70 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 70 ml), 2-propanolom (2 x 70 ml) i dihlormetanom (2 x 70 ml). Rastvor mono-terc-butil estra dodekandioinske kiseline (C12(OtBu)-OH, 1,37 g, 4,78 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,70 g, 4,78 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (1,50 mL, 8,60 mmol) u smeši dihlormetan/N,N-dimetilformamida (4:1, 70 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana 1,5 sat. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml), dihlormetanom (3 x 150 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 150 ml). Mtt grupa je uklonjena tretmanom sa 80% 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolom u dihlormetanu (3 x 10 min, 2 x 30 min, 4 x 70 ml). Smola je isprana dihlormetanom (6 x 70 mL). Rastvor bromoacetatne kiseline (6,60 g, 47,8 mmol) i N,N'-diizopropilkarbodiimida (DIC, 5,30 mL, 34,0 mmol) u N,N-dimetilformamidu (90 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana 30 minuta. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (4 x 70 ml) i dihlormetanom (10 x 70 ml). Proizvod se odvoji od smole tretiranjem trifluorosirćetnom kiselinom (100 mL) tokom 1 sata. Smola je isfiltrirana i isprana trifluorosirćetnom kiselinom (1 x 40 mL) i dihlormetanom (2 x 40 mL). Rastvori su kombinovani, a rastvarači su upareni do suva što je dalo gusto smeđkasto ulje.

Prinos: 2,94 mg (90%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,74-4,53 (m, 3 H); 4,17 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,81-3,40 (m, 16 H); 3,31 (t, J=6,8 Hz, 2 H); 2,57-2,20 (m, 10 H); 2,16-2,04 (m, 3 H); 1,89-1,75 (m, 1 H); 1,72-1,54 (m, 6 H); 1,52-1,41 (m, 2 H); 1,32 (bs, 12 H).

LC-MS čistoća: 100%.

LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 2,64 min.

LC-MS m/z: 1028,0 (M+H)+.

Primer 4.16: Priprema 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-okso-dodekanoinske kiseline

O OH

Postupak sinteze bio je isti kao na Primer 4.8, s tim što je u sinteznim koracima sledeći intermedijar 1 prvo 1-terc-butil estar (S)-2- (9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu) i potom 12-terc-butoksi-12-okso-dodekanoinske kiseline su kuplovani na smolu upotrebom standardnih sintetskih postupaka Fmoc zaštite/uklanjanja zaštite. Naredni sintetski koraci, cepanje i obrada kao što je prikazano u Primeru 4.8, daju jedinjenje u obliku gustog smeđkastog ulja.

Prinos: 97%

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4,73-4,55 (m, 2 H); 4,17 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,96 (s, 2 H); 3,80-3,42 (m, 16 H); 3,31 (t, J=6,78 Hz, 2 H); 2,49-2,17 (m, 7 H); 2,01-1,92 (m, 2 H); 1,87-1,76 (m, 1 H); 1,70-1,54 (m, 6 H); 1,52-1,41 (m, 2 H); 1,32 (bs, 12 H).

LC-MS čistoća: 100%.

LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 2,72 min.

LC-MS m/z: 900,0 (M+H)+.

Primer 4.17: Priprema 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-20-okso-arahidinske kiseline

O OH

Protokol sinteze:

Vang Fmoc-Lys (Mtt) smola 0,26 mmol/g (1, 11,2 g, 2,90 mmol) je ostavljena da bubri u dihlormetanu (100 mL) tokom 45 minuta. Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 2,23 g, 5,80 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 2,06 g, 5,80 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (2,02 mL, 11,6 mmol) u N,N-dimetilformamidu (100 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), dihlormetanom (3 x 90 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor {2-[2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)etoksi]-etoksi}-sirćetne kiseline (Fmoc-OEG-OH, 2,23 g, 5,80 mmol), O-(6-hlorbenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 2,06 g, 5,80 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (2,02 ml, 11,6 mmol) u N, N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 1,5 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), dihlormetanom (3 x 90 ml) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor 1-terc-butil estra (S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-glutarne kiseline (Fmoc-LGlu-OtBu, 1,85 g, 4,35 mmol), O- (6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,55 g, 4,35 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (1,36 ml, 7,82 mmol) u N, N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i mešavina je mućkana 1,5 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL), dihlormetanom (3 x 90 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N, N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor

4-[(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)metil]cikloheksankarboksilne kiseline (Fmoc-Trk-OH, 1,65 g, 4,35 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,55 g, 4,35 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (1,36 mL, 7,82 mmol) u N, N-dimetilformamidu (100 mL) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL), dihlormetanom (3 x 90 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL). Fmoc grupa je uklonjena tretmanom sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (1 x 5 min, 1 x 10 min, 1 x 30 min, 3 x 100 mL). Smola je isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), 2-propanolom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Rastvor mono-terc-butil estra ikosandioinske kiseline (C20(OtBu)-OH, 1,73 g, 4,35 mmol), O-(6-hlor-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TCTU, 1,55 g, 4,35 mmol) i N, N-diizopropiletilamina (1,36 ml, 7,82 mmol) u N,N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana tokom 2 sata. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml), dihlormetanom (3 x 90 ml), N,N-dimetilformamidom (3 x 90 ml) i dihlormetanom (3 x 90 ml). Mtt grupa je uklonjena tretmanom sa 80% 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolom u dihlormetanu (2 x 10 min, 2 x 30 min, 4 x 100 ml). Smola je isprana dihlormetanom (6 x 90 mL) i N,N-dimetilformamidom (3 x 90 mL). Rastvor bromoacetatne kiseline (8,06 g, 58,0 mmol) i

1

N,N'-diizopropilkarbodiimida (DIC, 7,60 ml, 49,3 mmol) u N,N-dimetilformamidu (100 ml) je dodat u smolu i smeša je mućkana 40 minuta. Smola je filtrirana i isprana sa N,N-dimetilformamidom (5 x 90 mL) i dihlormetanom (12 x 90 mL). Proizvod se odvoji od smole tretiranjem trifluorosirćetnom kiselinom (100 mL) tokom 1 sata. Smola je filtrirana i isprana trifluorosirćetnom kiselinom (1 x 50 mL) i dihlormetanom (7 x 70 mL). Rastvori su kombinovani, a rastvarači su upareni do suva što je dalo gusto smeđkasto ulje.

Prinos: 3,28 g (98%).

1H NMR spektar (300 MHz, AcOD-d4, 80 °C, dH): 4,68 (dd, J=8,0 i 5,4 Hz, 1 H); 4,60 (dd, J=7,9 i 5,3 Hz, 1 H); 4,16 (s, 2 H); 4,12 (s, 2 H); 3,94 (s, 2 H); 3,81-3,61 (m, 12 H); 3,59-3,44 (m, 4 H); 3,32 (t, J=6,8 Hz, 2 H); 3,14 (d, J=6,8 Hz, 2 H); 2,49-1,79 (m, 15 H); 1,73-1,43 (m, 11 H); 1,33 (s, 28 H); 1,11-0,96 (m, 2 H).

LC-MS čistoća: 100% (ELSD).

LC-MS Rt (Kinetex 4,6 mm x 50 mm, acetonitril/voda 20:80 do 100:0 0,1% FA): 4,04 min

LC-MS m/z: 1151,3 (M+H)+.

Primer 5: Priprema FGF21 derivata

Dobijanje reprezentativnog FGF21 derivata dato je u Primeru 5.1 (Jedinjenje 21).

Derivati FGF21 iz Primera 5.2-5.14 (Jedinjenja 11-20 i 22-14) se dobijaju postupkom koji je dat u Primeru 5.1. Derivat FGF21 iz Primera 5.15-5.37 se priprema postupkom datim u Primeru 5.1 ili kao što je ovde opisano u nastavku.

Primer 5.1: Jedinjenje 21

S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

2

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:10 (vidi primer 3).

Jedinjenje 21 je pripremljeno kako sledi:

Cys ostatak na poziciji 181 u S{Beta-181}-2-aminoetilsulfanil-Ala[Gln121,Leu168, Cys181]FGF21 analogu SEQ NO: 10, pripremljen kao što je uopšteno opisano u Primerima 1-3, modifikovan je na tiol grupi Cys ostatka na poziciji 181C sa reagensom pripremljenim u Primeru 4.1:

O O H

Da bi se zaštitio cisteamin Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (70 mg, 0,0036 mmol), u Tris i NaCl puferu (1,35 mg/ml) dodat je Tris u vodu da se podesi pH na 8,0. BSPP (Bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfin dihidrat dinatrijumska so, 12 mg) rastvorena u vodi je dodata i lagano mešana tokom 4 sata na sobnoj temperaturi. 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2- bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi} etoksi)etilkarbamoil]-metoksi}etoksi)etilkarbamoil] propilkarbamoil}pentadekanska kiselina (19 mg, 0,022 mmol) u etanolu (0,5 ml) je dodata. Nakon laganog mešanja preko noći, voda MiliQ (150 ml) je dodata da bi se smanjila provodljivost na 2,5 mS/cm. Smeša je prečišćena korišćenjem anjonske razmene na MonoQ 10/100 GL koloni korišćenjem A-pufera: 20 mM Tris, pH 8,0; B-pufera: 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0, protok 6 ml i gradijent 0-80% B preko 60 CV. Prinos: 37 mg, 51%.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20279,9: Nalaz: 20280,4

Primer 5.2: Jedinjenje 11

S{Beta-178}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys178]FGF21

O H O O O N O H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:6 (vidi primer 3), pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromoacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 2

Theoretska masa: 20279,9; Nalaz: 20280,2

Primer 5.3: Jedinjenje 12

S{Beta-179}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys179]FGF21

4

O H O

Ovo jedinjenje je derivat FG OF21 O ana N

Hloga SE OQ ID NO:7 (vidi primer 3), pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil} pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20203,8; Nalaz: 20204,2

Primer 5.4: Jedinjenje 13

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O H O O O N O

H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:8 (vidi primer 3), pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 11-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)-etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}undekanske kiseline iz Primera 4.2.

LCMS postupak 2

Teoretska masa: 20239,8; Nalaz: 20240,1

Primer 5.5: Jedinjenje 14

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O H O O O N O

H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:8 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 13-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}tridekanske kiseline iz Primera 4.3.

LCMS postupak 3:

Teoretska masa: 20267,8; Nalaz: 20268,1

Primer 5.6: Jedinjenje 15

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O N O O H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:8 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20295,9; Nalaz: 20296,2

Primer 5.7: Jedinjenje 16

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:8 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 17-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}heptadekanske kiseline iz Primera 4.5.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20323,9; Nalaz: 20324,5

Primer 5.8: Jedinjenje 17

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O H O

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 O ana Ologa N

H SEQ ID O NO:8 (vidi primer 3) prepremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 19-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)-etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}nonadekanske kiseline iz Primera 4.4.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20352,0; Nalaz: 20352,0

Primer 5.9: Jedinjenje 18

S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21

O H O O O N O

H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:9 (vidi primer 3) prepremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 17-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}heptadekanske kiseline iz Primera 4.5.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20236,8; Nalaz: 20237,0

Primer 5.10: Jedinjenje 19

S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

1

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:1 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 11-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}undekanske kiseline iz Primera 4.2.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20223,8; Nalaz: 20224,4.

Primer 5.11: Jedinjenje 20

S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

2

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:10 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 13-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etil-karbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}tridekanske kiseline iz Primera 4.3.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20251,8; Nalaz: 20252,2

Primer 5.12: Jedinjenje 22

S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

O H O O O N O

H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:10 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 17-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}-etoksi)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]propilkarbamoil}heptadekanske kiseline iz Primera 4.5.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20307,9; Nalaz: 20308,6.

Primer 5.13: Jedinjenje 23

S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

4

O H O O O N O

H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:10 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 19-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etil-karbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}nonadekanske kiseline iz Primera 4.4.

LCMS postupak 2:

Teoretska masa: 20336,0; Nalaz: 20336,2

Primer 5.14: Jedinjenje 24

S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Met[Cys181]FGF21

O H O O O N O

H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:11 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 17-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}heptadekanske kiseline iz Primera 4.5.

LCMS postupak 3:

Teoretska masa: 20372,2; Nalaz: 20372,2.

Primer 5.15: Jedinjenje 34

S{Beta-168}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Cys168]FGF21

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:13 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 13-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}tridekanske kiseline iz Primera 4.3.

LCMS postupak 1

Teoretska masa: 20225,; Nalaz: 20226,7

Primer 5.16: Jedinjenje 35

S{Beta-169}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys169]FGF21

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:14(vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20267,8; Nalaz: 20268,2

Primer 5.17: Jedinjenje 36

18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina -Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:15 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa

18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromacetil)amino]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinske kiseline iz Primera 4.5.

Primer 5.18: Jedinjenje 37

S{Beta-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:18 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20238,8; Nalaz: 20239,3

Primer 5.19: Jedinjenje 38

S{Beta-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21

O H O O O N O H

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:19 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 13-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}tritadekanske kiseline iz Primera 4.3.

LCMS postupak 1

Teoretska masa: 20281,9; Nalaz: 20281,9

1

Primer 5.20: Jedinjenje 39

18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina -Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21

O

O H O

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO: 19 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa

18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromacetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinske kiseline iz Primera 4.5

1 1

Primer 5.21: Jedinjenje 40

16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-16-okso-heksadekaska kiselina -Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:19 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa

16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromacetil)amino]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-16-okso-heksadekanske kiseline iz Primera 4.1

Primer 5.22: Jedinjenje 41

S{Beta-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21

1 2

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:20 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20210,8; Nalaz: 20211,4

Primer 5.23: Jedinjenje 42

S{Beta-176}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys176]FGF21

1

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:4 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 15-{(S)-1-karboksi-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-bromacetilamino)etilkarbamoil]metoksi}etoksi)-etilkarbamoil]metoksi}etoksi)etilkarbamoil]-propilkarbamoil}pentadekanske kiseline iz Primera 4.1.

LCMS postupak 3

Teoretska masa: 20279,9; Nalaz: 20280,4

Primer 5.24: Jedinjenje 43

4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-okso-deckoksi]benzoeva kiselina]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

1 4

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:8 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-okso-dekoksi]benzoeve kiseline iz Primera 4.11.

Primer 5.25: Jedinjenje 44

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]sulfonilamino]-10-okso-decoxy]benzoeva kiselina]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

1

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:8 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-oksobutil]sulfonilamino]-10-okso-dekoksi]benzoeve kiseline iz Primera 4.10.

Primer 5.26: Jedinjenje 45

20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-okso-arahidinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

1

20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksipentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-okso-arahidinske kiseline iz Primera 4.12.

Primer 5.27: Jedinjenje 46

20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-okso-arahidinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

1

20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]amino]-20-okso- arahidinske kiseline iz Primera 4.13.

Primer 5.28: Jedinjenje 47

(2S)-6-acetamido-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(16-sulfoheksadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]a mino]heksadekanska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

1

O S O H O

(2S)-6-[(2-bromacetil)amino]-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(16-sulfoheksadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]a mino]heksanske kiseline iz Primera 4.14.

Primer 5.29: Jedinjenje 48

12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-okso-dodekanoinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

1

O H

12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]amino]-12-okso- dodekanoinske kiseline iz Primera 4.16.

Primer 5.30: Jedinjenje 49

12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-okso-dodekanoinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

11

12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksipentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-okso-dodekanoinske kiseline iz Primera 4.15.

Primer 5.31: Jedinjenje 50

20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-20-okso-arahidinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O O H

20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksipentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cycloheksil]metilamino]-20-okso-arahidinske kiseline iz Primera 4.17.

Primer 5.32: Jedinjenje 51

16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cycloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanske kiseline-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O

16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromacetil)amino]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cycloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanske kiseline iz Primera 4.7.

Primer 5.33: Jedinjenje 52

16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

11

O O

16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksipentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanske kiseline iz Primera 4.9.

Primer 5.34: Jedinjenje 53

18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cycloheksil]metilamino]-18-okso-stearinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

O O

18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksipentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-18-okso-stearinske kiseline iz Primera 4.8.

Primer 5.35: Jedinjenje 54

12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-12-okso-dodekanoinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21

11

N O H O H

12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-bromacetil)amino]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-12-okso- dodekanoinske kiseline iz Primera 4.6.

Primer 5.36: Jedinjenje 55

4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-okso-dekoksi]benzoeva kiselina]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

11

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:10 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-okso-dekoksi]benzoeve kiseline iz Primera 4.11.

Primer 5.37: Jedinjenje 56

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]sulfonilamino]-10-okso-dekoksi] benzoeva kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21

11

O S

O O O O

Ovo jedinjenje je derivat FGF21 analoga SEQ ID NO:10 (vidi primer 3) pripremljeno postupkom opisanim u Primeru 5.1 korišćenjem reagensa

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-bromoacetil)amino]-1-karboksi-pentil]amino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-oksobutil]sulfonilamino]-10-okso-dekoksi]benzoeve kiseline iz Primera 4.10.

Farmakološki postupci

Upotrebljivost FGF21 analoga ili njihovih derivata iz predmetnog pronalaska kao farmaceutski aktivnih agenasa u redukciji dobijanja na težini i lečenju gojaznosti i dijabetesa kod sisara (kao što su ljudi), može se pokazati aktivnošću agonista FGF21 u konvencionalnim testovima, i testovi in vitro i in vivo koji su opisani u daljem tekstu.

Takvi testovi, takođe, pružaju sredstva kojima se aktivnosti FGF21 jedinjenja predmetnog pronalaska mogu porediti sa aktivnostima poznatih jedinjenja.

11

Primer 6: Potentnost FGF receptora u Erk testu fosforilacije u HEK293 prekomernim eksprimovanjem humanog BKL

Svrha ovog primera je da testira aktivnost, ili potentnost, FGF21 derivata in vitro. In vitro potentnost je merilo aktivacije FGF receptora u testu celih ćelija.

Potentnost FGF21 derivata iz Primera 5 određena je u HEK-u (humane embrionalne ćelije bubrega) prekomernim eksprimovanjem humanog beta-kloto (BKL), kao što je opisano u daljem tekstu.

Da bi se testiralo vezivanje derivata FGF21 na albumin, ispitivanje je izvršeno u odsustvu serumskog albumina, kao i u prisustvu humanog serumskog albumina (HSA) (0,1% koncentracije u finalnom ispitivanju). Povećanje vrednosti EC50 (smanjenje potentnosti) u prisustvu serumskog albumina za derivate FGF21 ukazuje na vezanje na albumina u serumu i predstavlja postupak za predviđanje produženog farmakokinetičkog profila ispitivane supstance na životinjskim modelima.

Rezultati za analoge FGF21 prikazani su u tabeli 2, a rezultati za derivate FGF21 prikazani su u tabeli 3. MetFGF21 (SEQ ID NO:2) je uključena kao referenca.

Načelo ispitivanja

HEK293 ćelije endogeno eksprimuju nekoliko FGF receptora, uključujući FGFR1c, FGFR3c i FGFR4. Ove ćelije ne reaguju na FGF21 dok se nisu transfektovane beta-kloto koreceptorom (BKL). Aktivacija FGF receptora/BKL kompleksa dovodi do aktiviranja MAPK/ERK signalnog puta i fosforilacije ERK-a. Nivo fosforilovanog ERK-a (pERK) u određenoj vremenskoj tački povećava se sa povećanjem koncentracije FGF21. Kao što je opisano u daljem tekstu, nivo pERK se meri posle 12 minuta stimulacije rasponom koncentracija FGF21 analoga.

Opis ispitivanja

HEK293/beta-kloto ćelije zasejane su sa 30.000 ćelija/ležištu u pločicama sa 96 ležišta u DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1), sa dodatih 10% FCS (Gibco #16140-071), 1% penicilina/streptomicina (Gibco #15140), 100 µg/ml Hygromycin-a B, (Calbiochem, #400052). Dva dana kasnije i dva sata pre dodavanja jedinjenja, ćelijski medijum je zamenjen sa 100 µl bazalnog medijuma (DMEM (BioWhittaker # BE12-604F/U1)). FGF21 analozi su razblaženi u medijumu za ispitivanje (DMEM (BioWhittaker #BE12-604F/U1) dopunjenim sa 0,02% Tween20), zagrejani do 37°C, dodati ćelijama (100 µl) i inkubirani na 37°C tokom 12 minuta. Derivati FGF21 su, takođe, testirani u prisustvu 0,1% HSA (Sigma - A1887). Sav medijum je brzo uklonjen i dodato je 50 µl

11

pufera za lizu po ležištu. Ploča je mućkana 5 minuta i lizat je bio spreman za merenje pERK. pERK se meri u pločama sa 384 ležišta pomoću AlphaScreen SureFire seta (PerkinElmer #TGRES10K). Ovaj set je zasnovan na ERK i pERK specifičnim antitelima kuplovanim sa zrncima donora i akceptora. Prisustvo pERK-a će dovesti akceptorska i donorska zrnca u neposrednu blizinu i generisaće se signal koji se očitava na EnVision-u. Podaci se analiziraju pomoću GraphPad prizme, a potencija FGF21 proteina je opisana kao apsolutna vrednost EC50.

Tabela 2A. Potentnost FGF21 analoga u HEK293/BKL ćelijama

Kao što se može videti iz rezultata u tabeli 2, uvođenje cisteina na pozicije 176, 177, 178 ili 179 dramatično smanjuje potentnost u poređenju sa MetFGF21.

Iznenađujuće, međutim, uvođenje cisteina na poziciju 180 ili na poziciju 181 dovodi do nesmanjivanja (180C) ili skromnog (181C) smanjenja potentnosti u poređenju sa MetFGF21. Jedinjenje 7, sa cisteinom na poziciji 180, pokazuje potentnost sličnu i

12

MetFGF21 i Jedinjenju 2 koji imaju iste promene amino-kiselina kao i Jedinjenje 8, osim cisteina na poziciji 180.

Potentnost jedinjenja 9 sa cisteinom na poziciji 181 je samo neznatno smanjena u poređenju sa MetFGF21 i, takođe, sa Jedinjenjem 2 koji imaju iste promene aminokiselina kao i Jedinjenje 9, osim cisteina na poziciji 181.

Tabela 2B. Potentnost daljih FGF21 analoga u HEK293/BKL ćelijama

Može se videti da Jedinjenje #26 sa supstitucijom C168 amino-kiseline ima smanjenu potentnost, dok analozi sa cisteinom na pozicijama 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 i 175 imaju, iznenađujuće, potentnost sličnu MetFGF21.

Tabela 3A. Potentnost FGF21 derivata u HEK293/BKL ćelijama u odsustvu ili prisustvu 0,1 % HSA.

Kao što se može videti iz rezultata u tabeli 3A, iznenađujuće je utvrđeno da vezivanje bočnog lanca predmetnog pronalaska na cistein na bilo kojoj poziciji 178-181 ne dovodi do smanjenja potentnosti u poređenju sa jedinjenjima bez bočnog lanca (vidi tabelu 2). Jedinjenja 11, 12, 15 i 21 sadrže identičan bočni lanac pri čemu je element produžnog dela C16 diacid (Hem. 1a) (vezni elementi su jedan element Hem. 2, dva elementa Hem. 3a i jedan element Hem. 4a) . Kada se uporedi sa potentnošću odgovarajućih FGF21 analoga (Jedinjenja 5, 6, 7 i 9, vidi tabelu 2), može se videti da je potentnost ovih derivata FGF21 slična odgovarajućim FGF analozima (tj. onim koji nemaju bočni lanac ).

Uticaj na potentnost jedinjenja koja imaju elemente produžnog dela koji su različite dužine lanca masnih kiselina, takođe je istražen. Potentnost FGF derivata sa cisteinom na poziciji 180 bila je slična za derivate FGF21 koji imaju C12 diacid, C14 dijacid, C16 diacid ili C18 diacid kao element produžnog dela u odsustvu HSA. Potentnost FGF derivata sa cisteinom na poziciji 181 bila je slična za derivate FGF21 koji imaju C14 diacid, C16 dijacid, C18 diacid ili C20 diacid kao element produžnog dela u odsustvu HSA.

Povećanje koncentracije HSA nema uticaj ili skromno utiče na potentnost derivata koji sadrže bočni lanac C12, C14 ili C16, dok potentnost jedinjenja sa bočnim lancem C18 ili C20 ima smanjenu potentnost u prisustvu 0,1% HAS.

Kao što se može videti iz tabele 3A, porast vrednosti EC50 u prisustvu 0,1% serumskog albumina u poređenju sa EC50 vrednosti bez serumskog albumina za derivate FGF21 odgovara povećanju dužine produžnog dela. To dobro odgovara povećanom poluživotu za ove derivate FGF21 (videti Primer 8).

Tabela 3B. Potentnost daljih FGF21 derivata u HEK293/BKL ćelijama u odsustvu ili prisustvu 0,1 % HSA.

Potentnost FGF21 derivata sa različitim FGF21 kičmama kao što je gore opisano je dodatno testirana i otkriveno je da derivati sa cisteinom na poziciji 169, 170, 171, 172, 173, 174 i 175 svi zadržavaju potentnost kada su derivatizirani sa produžnim delom masne kiseline. Primećeno je da derivatizacija na Cys 169 malo smanjuje potentnost.

Tabela 3C. Potentnost daljih FGF21 derivata u HEK293/BKL ćelijama u odsustvu ili prisustvu 0,1 % HSA.

12

Da bi se uporedili daljnji produžni elementi, testirane su različite kombinacije produžnih delova i linkera. Svi su konjugovani sa Cys 180 ili Cys 181 i primećene su prilično slične funkcionalnosti dobijenih derivata FGF21, ukazujući na to da se mogu koristiti različiti elementi produžnog dela kad se konjuguju sa FGF21 Cys-om, kao što su Cys 180 ili Cys 181.

Primer 7: Unos glukoze u 3T3-L1 adipocite

C-terminalno modifikovani analozi su testirani na njihovu sposobnost da povećaju unos glukoze u mišje 3T3-L1 adipocite. Sledeći test je korišćen za određivanje biološke aktivnosti ili potentnosti FGF21 analoga i derivata predmetnog pronalaska.

Načela ispitivanja

In vitro potentnost se, takođe, može odrediti u testu sa mišjim 3T3-L1 adipocitima testiranjem FGF21 analoga i derivata na njihovu sposobnost da povećaju unos glukoze u adipocite. Diferencirani 3T3-L1 adipociti endogeno eksprimuju FGFR1c i BKL. 3T3-L1 ćelije ne reaguju na FGF21 sve do nakon diferencijacije, jer diferencijacija dovodi do eksprimovanja koreceptora BKL. Aktivacija FGFR1 receptora / BKL kompleksa povećava ekspresiju transportera glukoze 1 (GLUT1) i zato će agonisti FGF21 dovesti do povećane količine glukoze unete u adipocite kao odgovor na dozu.

Opis ispitivanja

Mišji 3T3-L1 fibroblasti (npr. dostupni iz ATCC, kataloški broj CL-173) održavani su u bazalnom medijumu (DMEM (4500 mg/l glukoze) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1% penicilina/streptomicina). Ćelijama nije dozvoljeno da dođu do konfluencije i treba ih prebaciti (preneti u nove bočice) pre nego što dostignu pribl. 60% konfluencije (vizuelnim pregledom).

Za ispitivanje unosa glukoze, ćelije su iznosile 15.000 ćelija/ležištu u pločici sa 96 ležišta (BIOCOAT), a kada su dostigle konfluentnost (velika gustina, s ciljem da se naprave diferencirane adipozne ćelije), medijum je promenjen iz bazalnog medijuma u bazalni medijum koji sadrži Troglitazon, IBMX, deksametazon (komercijalno dostupan od, na primer, Sigme) i humani insulin (komercijalno dostupan od, na primer, Novo Nordiska A/S).

Ćelije su korišćene 7-9 dana, dan nakon započinjanja diferencijacije. Ćelije su stimulisane rastućim koncentracijama (0-300 nM) FGF21 analoga ili derivata predmetnog pronalaska tokom 20 sati u bazalnom medijumu. Pre dodavanja 3H-deoksi-glukoze (u daljem tekstu: tragač) ćelije su isprane toplim (približno 37 ºC) testnim puferom (PBS sa 1 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2), HEPES-om i 0,1% humanog seruma albumina) i ćelije su inkubirane sa tragačem tokom 1 sata. Ova inkubacija je završena ispiranjem dva puta u ledeno hladnom puferu za ispitivanje. Ćelije su lizirane sa Triton X-100 i lizati su preneti na ploču sa 96 ležišta, dodat je microscint-40 (komercijalno dostupan od, na primer, Perkin Elmer-a), a količina tragača je izračunata u TOP brojaču (npr. Packard top-counter od Perkin Elmer-a). EC50 i Emaks predmetnog FGF21 jedinjenja su izračunati. Rezultati koji su prikazani u tabelama 4-5 u daljem tekstu pokazuju EC50 (potentnost) i Emaks (efikasnost) FGF21 analoga i derivata, respektivno.

Tabela 4: Unos glukoze u 3T3-L1 adipocite FGF21 analoga

12

Tabela 5. Unos glukoze u 3T3-L1 adipocite FGF21 derivata

Zbog vezivanja bočnih lanaca derivata FGF21 na albumin, FGF21 derivati (tabela 5) imaju nižu potentnost od odgovarajućih FGF21 analoga (tabela 4) zbog prisustva

12

seruma i samim tim albumina u bazalnom mediju za ispitivanje. Smanjenje potentnosti korelira sa dužinom elementa produžnog dela.

Primer 8: Farmakokinetička studija kod patuljastih svinja i miševa

Svrha ove studije je bila da utvrdi produženost in vivo FGF21 derivata posle i.v. davanja patuljastim svinjama i miševima, tj. produženje njihovog vremena u telu i time njihovo vreme delovanja. Ovo je učinjeno u farmakokinetičkoj (PK) studiji, gde je određen terminalni poluživot dotičnog analoga. Pod terminalnim poluživotom podrazumeva se period koji je potreban da bi se prepolovila određena koncentracija u plazmi u terminalnoj fazi eliminacije.

Studja na patuljastim svinjama

Ženke patuljastih svinja rase Gotingen dobijene su od Ellegaard Göttingen Minipigs (Dalmose, Danska) starosti oko 7-14 meseci i težine otprilike 16-35 kg.

Patuljaste svinje su smeštene ili pojedinačno (svinje sa stalnim kateterima) ili u grupi i hranjene su ograničeno jednom ili dva puta dnevno SDS-ovom hranom za patuljaste svinje (Special Diets Services, Eseks, Velika Britanija).

Posle minimalno 2 nedelje aklimatizacije dva stalna centralna venska katetera su postavljena u venu cava caudalis ili cranialis kod svake životinje. Životinjama je dozvoljen oporavak nedelju dana nakon operacije, a zatim su korišćene za ponovljena farmakokinetička ispitivanja sa pogodnim periodom ispiranja između uzastopnog doziranja.

Intravenske injekcije (zapremina koja odgovara na primer 0,050-0,125 ml/kg) jedinjenja date su kroz jedan kateter ili kroz venflon kanilu, a krv je uzorkovana u unapred definisanim vremenskim tačkama do 11 dana nakon doziranja (najbolje kroz drugi kateter ili venipunkturom).

Uzorci krvi (na primer 0,8 ml) su sakupljeni u epruvetama obloženim EDTA (8mM) i zatim centrifugirani na 4°C i 1942G tokom 10 minuta. Uzorci krvi su sakupljeni kako bi se adekvatno pokrio API profil pune koncentracije u plazmi i vremena. Na primer, uzorci krvi su sakupljeni na t = pre doze, 0,0833, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168 , 192, 216, 240, 264 sata nakon doze.

Plazma je pipetirana u epruvete Micronic na suvom ledu i držana na -20°C dok nije analizirana na koncentraciju plazme u odgovarajućem FGF-1 analogu pomoću ELISA-e. Pojedinačni profili koncentracije u plazmi -vreme analizirani su nekompartalnom farmakokinetičkom metodom u Phoenix-u v. 6.3 (Pharsight Inc., Mountain View, Kalifornija, SAD) ili drugim relevantnim softverom za PK analizu, i dobijeni terminalni

12

poluživot (harmonična srednja vrednost) je određen. Terminalni poluživot derivata FGF21 je aritmetička sredina dva određivanja sa različitim dozama, kao što je gore objašnjeno.

Studija na miševima

Farmakokinetički profil analoga FGF21 testiran je na normalnim mršavim C57bl miševima, n = 2-3 (približno 30 grama). Jedinjenja FGF21 su dozirana kao jedna intravenska doza od 20 mg/kg (približno 5 ml/kg).

Nivoi FGF21 u plazmi su određeni korišćenjem Fibroblast Growth Factor-21 Human ELISA (dostupno od BioVendor, kataloški broj RD191108200R). Računarski softver WinNonLin verzija 6.3 iz kompanije Pharsight Corportion, Cary N.C. je korišćen za farmakokinetički proračun. Rezultati su dati u tabeli 6.

Tabela 6: Farmakokinetični profili FGF21 analoga.

12

Kao što se može videti iz tabele 6, poluživot u plazmi povećava se sa dužinom lanca masnih kiselina elementa produžnog dela i kod patuljastih svinja i kod miševa.

Primer 9: Smanjenje telesne težine kod mršavih miševa

Da bi se utvrdila in vivo potentnost FGF21 derivata, uticaj na telesnu težinu proučavan je na mršavim C57BL miševima nakon supkutane (s.c.) primene. Prethodno je pokazano da gubitak težine izazvan FGF21 kod vitkih miševa predviđa efekat kod gojaznih miševa i zato su mršavi miševi smatrani dobrim modelom za ispitivanje.

Jedinjenja su administrirana s.c. 1 mg/kg ili jednom (QD) ili dva puta (BID) dnevno u 10 mM fosfata, 2% (w/vol) glicerola, 500 ppm (= 0,05%) polisorbata 80, pH = 8,15, (2 ml/kg) tokom 7 dana (n = 7-8). Odgovarajuće grupe koje su tretirane sa nosačem (kontrola) su tretirane sa 10 mM fosfatom, 2% (w/vol) glicerolom, 500 ppm (= 0,05%) polisorbata 80, pH = 8,15, (2 ml/kg) s.c. dva puta dnevno tokom 7 dana (n = 6-8). Izmerena je telesna težina pre doziranja i ponovo nakon 7 dana lečenja. Rezultati se mogu videti u tabeli 7.

Tabela 7: Promene u telesnoj težini od polazne osnove (procenat) od dana 1 do 7 Jedinjenja Doziran n/grupa Srednja vrednost SD

je Δ težina tela (%) Δ težina tela (%) Nosač BID 8

BID 8

QD 8

Nosač BID 6

12

BID 8

BID 7

BID 8

*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 Jednosmerni ANOVA post hoc Dunnet-ov test za poređenje jedinjenja sa odgovarajućim nosačem, n = 6-8

In vivo potentnost merena kao gubitak telesne težine derivata FGF21 koji imaju bočni lanac na poziciji 180 je veća od derivata koji imaju isti bočni lanac na poziciji 181. Potentnost in vivo je stoga u korelaciji sa in vitro potentnošću. Uticaj na smanjenje telesne težine zavisi od poluživota u plazmi. Ako je poluživot u plazmi kratak, tada doziranje dva puta dnevno povećava efikasnost.

1

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Derivat FGF21 proteina, naznačen time što dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1) i što dati derivat sadrži produžni deo vezan na pomenuti Cys ostatak preko linkera; i što je produžni deo odabran iz grupe Hem. 1A: HOOC-(CH2)x-CO-*, Hem. 1B: HOOC-benzen-O-(CH2)x-CO-* i Hem. 1C: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-* pri čemu je x ceo broj u rasponu 8-18; i i što linker sadrži najmanje jednu od svake od Hem. 2, Hem. 3 i Hem. 4: pri čemu je Hem. 2 izabrano iz: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*, *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-* i *-NH-(CH2)m-cikloheksan-CO-*, i što je m ceo broj u rasponu od 1-5, i što Hem. 3 je *-NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*, pri čemu je k ceo broj u rasponu od 1-5 i n je ceo broj u rasponu 1-5, i i što je Hem. 4:izabrano iz *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-* i što je m ceo broj u rasponu 1-5; i i što Hem. 2, Hem. 3, i Hem. 4 su međusobno povezane preko amidnih veza i u naznačenom redosledu, povezane na svom *-NH kraju na CO-* kraj produžnog dela, a na svom CH2-* kraju na atom sumpora Cys ostatka na poziciji koja odgovara poziciji 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili poziciji 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1), ili njegovoj farmaceutski prihvatljivoj soli, amidu ili estru.
2. Derivat prema zahtevu 1, naznačen time, što je Hem. 1 izabrana iz grupe: Hem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*, Hem. 1b: HOOC-benzen-O-(CH2)9-CO-* i Hem. 1c: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*
3. Derivat prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time što je Hem. 2 izabrana iz grupe: Hem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*, Hem. 2b: *-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-* i Hem. 2c: *-NH-CH2-cikloheksan-CO-*.
4. Derivat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je Hem. 4 izabrana iz: Hem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-* i Hem. 4b: *-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*.
5. Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 167, 170. 171, 172, 173, 174, 175, 180 ili 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1 ), kao što je 180 zrelog humanog FGF21.
6. Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što dati protein sadrži Cys ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 180 ili 181 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).
7. Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što protein sadrži izmene amino-kiseline na jednoj ili više pozicija, što jednoj ili više pozicija 121 ili 168 zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).
8. Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što protein sadrži dodatak Ala ostatka na poziciji koja odgovara N-kraju zrelog humanog FGF21 (SEQ ID NO: 1).
9. Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što protein sadrži jedan ili više 121Q i 168L, kao što je 121Q ili 168L ili oba.
10.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, naznačen time što protein ima sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20.
11.Derivat u skladu sa bilo kojom od prethodnih realizacija, naznačen time što protein sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 8 ili 10.
12.Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što produžni deo sadrži Hem. 1a: HOOC-(CH2)16-CO-*.
13.Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što linker sadrži jednu, dve ili tri od: Hem. 2a: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*, Hem. 3a: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-* i Hem. 4a: *-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*.
14.Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što se linker sastoji od jednog elementa Hem. 2, dva elementa Hem. 3 i jednog elementa Hem. 4. 15.Derivat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što je derivat jedan od sledećih: S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 13)

; O H O O O N O H 1 S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-

O H O oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cy Os18 O0]FG N HF21 (Je Odinjenje 14); S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 15)

; O N O O H S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 16)

O H O ; O O N O H S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 17)

O H O ; O O N O H 1 S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Jedinjenje 18)

1 S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 20)

; H S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 21);
1 S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 22)

O H O ; O O N O H S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 23)

O H O ; O O N O H 1 S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Met[Cys181]FGF21 (Jedinjenje 24)

1 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina -Ala[Gln121,Leu168,Cys170]FGF21 (Jedinjenje 36)

S{Beta-173}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys173]FGF21 (Jedinjenje 37)

; H 14 S{Beta-174}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (Jedinjenje 38)

; H 18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-18-okso-stearinska kiselina -Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (Jedinjenje 39)

; O O H O 16-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-16-okso-heksadekanska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys174]FGF21 (Jedinjenje 40)

; H S{Beta-175}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys175]FGF21 (Jedinjenje 41)

; H 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-okso- 14 dekoksi]benzoeva kiselina]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 43)

4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]sulfonilamino]-10-oksodekoksi]benzoeva kiselina]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 44)

14 20-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-okso-arahidinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 45)

14 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-20-oksoarahidinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 46)

14 (2S)-6-acetamido-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(16-sulfoheksadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]he ksadekanska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 47)

;O S O H O 12-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-oksododekanoinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 48) 14

12-[[(1S)-4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-12-okso- dodekanoinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 49) 14

; O H 1 20-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-20-okso-arahidinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 50)

O O H 1 1 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-16-oksoheksadekanska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 51)

O O 1 2 16-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-16-okso-heksadekanska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 52)

1 18-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-[(2-acetamido]-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-oksobutil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-18-okso-stearinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 53)

; O O 1 4 12-[[4-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-acetamidoetilamino)-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]karbamoil]cikloheksil]metilamino]-12-oksododekanoinska kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 54)

N O H ; O H 1 4-[10-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-1-karboksi-4-okso-butil]amino]-10-oksodekoksi]benzoeva kliselina]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 55)

1 4-[10-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(1S)-5-acetamido-1-karboksi-pentil]amino]-2-oksoetoksi]etoksi]etilamino]-2-okso-etoksi]etoksi]etilamino]-4-okso-butil]sulfonilamino]-10-oksodekoksi]benzoeva kiselina-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 56)

O S O O O O 1
16. Derivat FGF21 proteina, naznačen time što dati derivat je jedan od sledećih: S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 13)

O H O ; O O N O H S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 14);

O H O O O N O H 1 S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 15)

; O N O O H S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 16)

; H 1 S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180]FGF21 (Jedinjenje 17)

O H O ; O O N O H S{Beta-180}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys180,des181]FGF21 (Jedinjenje 18)

O H O ; O O N O H 1 S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(11-karboksiundekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 19)

; H S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(13-karboksitridekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 20)

; H S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(15-karboksipentadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 21); 1 1

O H O ; O O N O H 12 S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Ala[Gln121,Leu168,Cys181]FGF21 (Jedinjenje 23)

O H O ; O O N O H S{Beta-181}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-karboksi-4-(17-karboksiheptadekanoilamino)butanoil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]etoksi]etoksi]acetil]amino]-etilamino]-2-oksoetil]-Met[Cys181]FGF21 (Jedinjenje 24)

O H O O O N O H
17.Derivat prema bilo kojem od zahteva 1-16, za upotrebu kao lek. 1 Derivat prema bilo kojem od zahteva 1-16, za upotrebu u postupku lečenja i/ili prevencije bilo kog oblika dijabetesa i srodnih bolesti, kao što su gojaznost, poremećaji u ishrani, kardiovaskularne bolesti, komplikacije dijabetesa; i/ili za poboljšanje lipidnih parametara; poboljšanje funkcije β –ćelija; i/ili za odlaganje ili sprečavanje napredovanja dijabetesa; i/ili za lečenje i/ili prevenciju hepatične steatoze i bolesti masne jetre nevezanih za alkoholizam (NAFLD). Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 1 4