RS59177B1 - T-ćelijski receptori - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na T ćelijske receptore (TCR) koji se vezuju za HLA-A2-ograničeni FMNKFIYEI (158-166) peptidni epitop koji nastaje iz α Fetoproteina (AFP). Određeni poželjni TCR pronalaska ispoljavaju odlične karakteristike vezivanja i profile specifičnosti za ovaj AFP epitop.

[0002] AFP se eksprimira tokom razvića fetusa i glavna je komponenta fetalnog seruma. Tokom razvića ovaj protein se produkuje u velikoj količini u žumancetnoj kesi i jetri, a kasnije se njegova količina smanjuje. Ekspresija AFP je često reaktivirana kod hepatocelularnog karcinoma (Butterfield i sar. J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8) i visoki nivoi ovog proteina se koriste kao dijagnostički marker za ovu bolest.

[0003] Kod hepatocelularnog karcinoma zabeležena je jedna od najnižih stopa preživljavanja od 5 godina u odnosu na sva maligna oboljenja u SAD, globalna godišnja učestalost je 1.2 miliona i verovatno će se povećavati usled pandemije hepatitisa B i C. Tretman obično uključuje operaciju, međutim ona je korisna samo ako se sprovede u ranim fazama bolesti. Stoga su poželjni novi tretmani.

[0004] Postoje četiri poznata epitopa koji su nastali iz AFP: AFP158, AFP137, AFP325 i AFP542 (Butterfield i sar. J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8 i Butterfield i sar. Cancer Res. 1999, 59: 3134-3142). HLA-A2-ograničeni AFP158 peptid FMNKFIYEI (SEQ ID Br: 1) obezbeđuje odgovarajuće mesto za nove imunoterapeutske intervencije; ovaj peptid je prirodno obrađen i eluiran iz HepG2 (HLA-A2 pozitivnih) linija karcinoma jetre i detektovan pomoću masene spektrometrije (Butterfield i sar. J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8). Odgajeni su klonovi T ćelija protiv AFP158 (i AFP137) (Pichard i sar. J Immunother. 2008 Apr;31(3):246-53). Međutim, T-ćelijski receptori koji prepoznaju ovaj peptid nisu prijavljeni.

[0005] Prema prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je T-ćelijski receptor (TCR) koji ne postoji u prirodi i/ili je prečišćen i/ili konstruisan, koji ima svojstvo vezivanja za FMNKFIYEI (SEQ ID Br: 1) HLA-A2 kompleks i sadrži bar jedan varijabilni domen alfa lanca TCR i bar jedan varijabilni domen beta lanca TCR,

pri čemu varijabilni domen alfa lanca sadrži Q1 do H112 SEQ ID Br: 11, SEQ ID Br 12, SEQ ID Br 13, SEQ ID Br 14 ili SEQ ID Br 15, i

varijabilni domen beta lanca sadrži D1 do T112 SEQ ID Br: 3.

[0006] TCR su opisani upotrebom TCR nomenklature Međunarodne imunogenetike (IMGT), i povezani su sa IMGT javnim bazama podataka TCR sekvenci. Prirodni alfa-beta heterodimerni TCR imaju alfa i beta lance. Uopšteno, svaki lanac sadrži varijabilne, spajajuće i konstantne regione, i beta lanac takođe obično sadrži kratki region raznolikosti između varijabilnih i spajajućih regiona, ali se ovaj region raznolikosti često smatra delom spajajućeg regiona. Svaki varijabilni region obuhvata tri CDR (regioni koji određuju komplementarnost) ugrađena u sekvencu okvirnog regiona, jedan je hipervarijabilni region koji se naziva CDR3. Postoji nekoliko tipova varijabilnih regiona alfa lanaca (V α) i nekoliko tipova varijabilnih regiona beta lanaca (V β) koji se razlikuju po svom okvirnom regionu, CDR1 i CDR2 sekvencama, i delimično definisanom CDR3 sekvencom. V α tipovi se po IMGT nomenklaturi označavaju jedinstvenim TRAV brojem. Tako "TRAV21" definiše TCR V α region sa jedinstvenim okvirom čitanja i CDR1 i CDR2 sekvencama, i CDR3 sekvencom koja je delimično definisana pomoću aminokiselinske sekvence koja je sačuvana od TCR do TCR, ali koja takođe uključuje aminokiselinsku sekvencu koja varira od TCR do TCR. Na isti način, "TRBV5-1" definiše TCR V β region sa jedinstvenim okvirom čitanja i CDR1 i CDR2 sekvencama, ali sa samo delimično definisanom CDR3 sekvencom.

[0007] Spajajući regioni TCR su slično definisani pomoću jedinstvene IMGT TRAJ i TRBJ nomenklature, a konstantni regioni pomoću IMGT TRAC i TRBC nomenklature.

[0008] Region raznolikosti beta lanca se označava u IMGT nomenklaturi pomoću skraćenice TRBD, i, kao što je spomenuto, povezani regioni TRBD/TRBJ su često označeni zajedno kao spajajući region.

[0009] Generalno se smatra da svaki α i β lanac α β TCR ima dva "domena" ili "regiona", odnosno varijabilne i konstantne domene/regione. Termini "domen(i)" i "region(i)" se ovde koriste naizmenično. Varijabilni domen se sastoji od povezanog varijabilnog i spajajućeg regiona. U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, termin "TCR alfa varijabilni domen" se stoga odnosi na spoj TRAV i TRAJ regiona, a termin TCR alfa konstantni domen odnosi se na vanćelijski TRAC region, ili na C-terminalno skraćenu TRAC sekvencu. Isto tako, termin "TCR beta varijabilni domen" se odnosi na spoj TRBV i TRBD/TRBJ regiona, a termin TCR beta konstantni domen se odnosi na vanćelijski TRBC region, ili na C-terminalno skraćenu TRBC sekvencu.

[0010] Jedinstvene sekvence definisane IMGT nomenklaturom su široko poznate i dostupne onima koji se bave proučavanjem TCR. Na primer, mogu se naći u javnoj IMGT bazi podataka. Takođe u udžbeniku "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc i LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8 otkrivene su sekvence definisane su pomoću IMGT nomenklature, ali zbog vremena kada je objavljen rad i posledičnog vremenskog kašnjenja, informacije koje se nalaze u pomenutom radu se ponekada moraju potvrditi referencama iz IMGT baze podataka.

[0011] SEQ ID Br: 2 i 3 su, redom, vanćelijske sekvence alfa i beta lanaca onoga što je u ovom dokumentu označeno kao "roditeljski" AFP TCR. Roditeljski AFP TCR ima sledeću upotrebu alfa i beta lanaca:

Alfa lanac: TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC (vanćelijska sekvenca roditeljskog AFP TCR alfa lanca je data na Slici 1 (SEQ ID Br: 2). CDR su definisani pomoću aminokiselina 27-32 (CDR1), 50-55 (CDR2) i 90-101 (CDR3) SEQ ID NO: 2.

Beta lanac: TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2 (vanćelijska sekvenca roditeljskog AFP TCR alfa lanca data je na Slici 2 (SEQ ID Br: 3). CDR su definisani pomoću aminokiselina 27-31 (CDR1), 49-54 (CDR2) i 92-102 (CDR3) SEQ ID Br: 3.

[0012] (Treba zapaziti da termini ’*01’ i ’*02’ ukazuju da postoji više od jedne alelske varijante za tu sekvencu, kako je određeno po IMGT nomenklaturi, i da je *01/*02 varijanta prisutna u TCR klonu koji je gore naveden. Takođe treba zapaziti da odsustvo "*" kvalifikatora znači da je poznat samo jedan alel za određenu sekvencu.)

[0013] U cilju obezbeđivanja referentnog TCR sa kojim može da bude upoređen profil vezivanja mutiranih TCR pronalaska, pogodno je koristiti rastvorljivi TCR koji ima vanćelijsku sekvencu AFP TCR alfa lanca prikazanu na Slici 3 (SEQ ID Br: 4) i vanćelijsku sekvencu AFP TCR beta lanca prikazanu na Slici 4 (SEQ ID Br: 5). Taj TCR se navodi ovde kao "referentni TCR" ili "referentni AFP TCR". Treba zapaziti da je SEQ ID Br: 4 identična vanćelijskoj sekvenci roditeljskog alfa lanca SEQ ID Br: 2 osim što je C159 supstituisan za T159 (to jest T48 u TRAC). Isto tako SEQ ID Br: 5 je identična vanćelijskoj sekvenci roditeljskog beta lanca SEQ ID Br: 3 osim što je C169 supstituisan za S169 (to jest S57 u TRBC2), A187 je supstituisan za C187 i D201 je supstituisan za N201. Ove cisteinske supstitucije u odnosu na vanćelijske sekvence roditeljskog AFP alfa i beta lanca omogućavaju formiranje disulfidnih veza između lanaca koje stabilizuju ponovo uvijeni rastvorljivi TCR, to jest TCR formiran pomoću ponovnog uvijanja vanćelijskih alfa i beta lanaca. Upotrebom stabilnog disulfidnim vezama povezanog rastvorljivog TCR kao referentnog TCR moguće je pogodnije proceniti afinitet vezivanja i poluživot vezivanja.

[0014] TCR pronalaska mogu biti transformisani u T ćelije, što ih čini sposobnim da unište ćelije sa AFP HLA-A2 kompleksom, i kao takvi daju se pacijentu tokom tretmana poznatog kao adoptivna terapija. U tom cilju, bilo bi poželjno da TCR imaju veći afinitet i/ili sporiju konstantu disocijacije za peptidni-HLA kompleks od prirodnih TCR specifičnih za taj kompleks. Dramatično povećanje afiniteta povezano je sa gubitkom antigenske specifičnosti u TCR genski-modifikovanim CD8 T ćelijama, što može dovesti do nespecifične aktivacije ovih TCR-transficiranih CD8 ćelija. Stoga, za adoptivanu terapiju bi bilo poželjno da TCR poseduju nešto viši afinitet i/ili sporiju konstantu disocijacije za peptid-HLA kompleks od prirodnih TCR specifičnih za taj kompleks, ali ne dramatično viši afinitet i/ili dramatično sporiju konstantu disocijacije za peptid-HLA kompleks od prirodnih TCR (videti Zhao i sar., (2007) J Immunol. 179: 5845-54; Robbins i sar., (2008) J Immunol. 180: 6116-31; i WO2008/038002).

[0015] TCR pronalaska su mutirani u odnosu na roditeljski AFP TCR. Mutacije se mogu izvoditi koristeći bilo koji odgovarajući metod uključujući, ali ne ograničavajući se na, one bazirane na polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR), kloniranje bazirano na restrikcionim enzimima, ili procedure kloniranja nezavisnog od ligacije (LIC). Ovi metodi su detaljno objašnjeni u mnogim standardnim tekstovima molekularne biologije. Za dodatne detalje o polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) i kloniranju baziranom na restrikcionim enzimima pogledati Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press. Dodatne informacije o procedurama kloniranja nezavisnog od ligacije (LIC) mogu se pronaći u Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6.

[0016] Takođe, obimu pronalaska pripadaju fenotipski tihe varijante bilo kog ovde opisanog TCR. Kako se ovde koristi, termin "fenotipski tihe varijante", odnosi se na one TCR koji imaju KDi/ili poluživot vezivanja za FMNKFIYEI (SEQ ID Br: 1) HLA-A2 kompleks unutar opsega KDi poluživota vezivanja objašnjenog ispod. Na primer, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti, moguće je proizvesti TCR koji sadrže promene u konstantnim i/ili varijabilnim domenima u poređenju sa onim gore opisanim bez promene afiniteta za interakciju sa FMNKFIYEI (SEQ ID Br: 1) HLA-A2 kompleksom. Takve trivijalne varijante uključene su u obim ovog pronalaska. Oni TCR u kojima je prisutna jedna ili više konzervativnih supstitucija takođe su deo ovog pronalaska.

[0017] Kao što će biti očigledno ljudima iz struke, moguće je skratiti sekvence na njihovom C kraju i/ili N kraju za 1, 2, 3, 4, 5 ili više rezidua, bez značajnog uticaja na karakteristike vezivanja TCR. Sve takve trivijalne varijante su obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0018] Prirodni TCR postoje u heterodimernim α β ili γ δ formama. Međutim, za rekombinantne TCR koji se sastoje od α α ili β β homodimera ranije je pokazano da se vezuju za peptid MHC molekula. Stoga, TCR prema pronalasku može biti heterodimerni α β TCR ili može biti homodimerni α α ili β β TCR.

[0019] Za upotrebu u adoptivnoj terapiji, α β heterodimerni TCR može, na primer, da bude transficiran kao lanci pune dužine koji imaju i citoplazmatične i transmembranske domene. U određenim primerima izvođenja TCR pronalaska mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kako je objašnjeno, na primer, u WO 2006/000830.

[0020] TCR pronalaska, naročito alfa-beta heterodimerni TCR, mogu da sadrže sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i/ili sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2. Sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca mogu biti modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se uklonila prirodna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 u TRAC i Cys2 egzona 2 u TRBC1 ili TRBC2. Sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanaca mogu takođe biti modifikovane supstitucijom cisteinskih rezidua za Thr 48 u TRAC i Ser 57 u TRBC1 ili TRBC2, pri čemu pomenuti cisteini formiraju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.

[0021] TCR prema pronalasku mogu da imaju jednolančanu formu, na primer videti WO 2004/033685. Jednolančane forme uključuju α β TCR polipeptidne tipove V α-L-V β, V β-L-V α, V α-C α-L-V β, V α-L-V β-C β, \/ α-C α-L-V β-C β, pri čemu su V α i V β TCR α i β varijabilni regioni redom, C α i C β su TCR α i β konstantni regioni redom, i L je linkerska sekvenca. U nekim primerima izvođenja jednolančani TCR prema pronalasku mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između rezidua odgovarajućih konstantnih domena, kao što je objašnjeno u WO 2004/033685.

[0022] TCR prema pronalasku imaju svojstvo vezivanja FMNKFIYEI (SEQ ID Br: 1) HLA-A2 kompleksa. Utvrđeno je da su određeni TCR pronalaska veoma pogodni za upotrebu u adoptivnoj terapiji. Takvi TCR mogu imati KDza kompleks manju od roditeljskog AFP TCR, na primer od oko 1 µM do oko 21 µM i/ili imaju poluživot vezivanja (T1⁄2) za kompleks u opsegu od manje od 0.5 sekundi do oko 2 sekunde. Povećanje afiniteta vezivanja prirodnog TCR često redukuje selektivnost TCR za njegov peptid-MHC ligand, i to je pokazano u Zhao Yangbing i sar., (J. Immunol, 2007179: 9, p5845-5854). Međutim, određeni TCR pronalaska ostaju selektivni za FMNKFIYEI HLA-A2 kompleks, uprkos tome što, u nekim primerima izvođenja, imaju veći afinitet vezivanja od roditeljskog AFP TCR (videti Primer 6).

[0023] Afinitet vezivanja (obrnuto proporcionalan ravnotežnoj konstanti KD) i poluživot vezivanja (izražen kao T1⁄2) mogu biti određeni pomoću bilo kog odgovarajućeg metoda. Treba imati na umu da dupliranje afiniteta TCR rezultira u prepolovljavanju KD. T1⁄2 je računat kao ln2 podeljen konstantom disocijacije (koff). Tako dupliranje T1⁄2 rezultira prepolovljavanjem koff. Vrednosti KDi koffza TCR se obično mere za rastvorljive forme TCR, to jest one oblike koji su skraćeni da bi se uklonile rezidue citoplazmatičnog i transmembranskog domena. Prema tome, razumljivo je da dati TCR ima poboljšani afinitet vezivanja, i/ili poluživot vezivanja za roditeljski TCR ako rastvorljiva forma tog TCR ima navedene karakteristike. Poželjno je afinitet vezivanja ili poluživot vezivanja datog TCR izmeriti nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, koristeći isti propratni protokol, i uzeti prosečne rezultate. U poželjnom primeru izvođenja ova merenja se izvode upotrebom rezonance površinskog plazmona (BIAcore), metodom iz Primera 3 u ovom dokumentu.

[0024] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja ne postoji u prirodi i/ili je prečišćena i/ili konstruisana, koja kodira za TCR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je cDNK. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni domen α lanca TCR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni domen β lanca TCR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu koja kodira i za varijabilni domen α lanca TCR pronalaska i i za varijabilni domen β lanca TCR pronalaska.

[0025] Ovde je opisan vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska. Poželjno, vektor je TCR ekspresioni vektor.

[0026] Takođe, pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži vektor (a) TCR vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska koja kodira u jednom otvorenom okviru čitanja, ili u dva odvojena otvorena okvira čitanja, alfa i beta lanac redom ili (b) prvi vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR pronalaska, i drugi vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR pronalaska. Takve ćelije su posebno korisne u adoptivnoj terapiji. Takve ćelije mogu biti izolovane i/ili rekombinantne i/ili neprirodne i/ili konstruisane.

[0027] Budući da su TCR pronalaska korisni u adoptivnoj terapiji, pronalazak uključuje ćelije koje ne postoje u prirodi i/ili su prečišćene i/ili konstruisane, pogotovu T ćelije, koje prezentuju TCR pronalaska. Postoje brojni odgovarajući metodi transfekcije T ćelija nukleinskim kiselinama (kao što su DNK, cDNK ili RNK) koje kodiraju TCR pronalaska (videti na primer Robbins i sar., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). T ćelije u kojima se eksprimiraju TCR pronalaska biće pogodne za upotrebu u lečenju kancera na bazi adoptivne terapije, kao što su kancer pankreasa i jetre. Kao što će biti poznato stručnjacima u ovoj oblasti, postoje brojni odgovarajući metodi pomoću kojih je moguće sprovesti adoptivnu terapiju (videti na primer Rosenberg i sar., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).

[0028] Kao što je poznato u stanju tehnike, TCR pronalaska mogu biti post-translaciono modifikovani kada se eksprimiraju u transficiranim ćelijama. Glikozilacija je jedna od modifikacija, koja obuhvata kovalentno vezivanje oligosaharidnih grupa za određene aminokiseline u TCR lancu. Na primer, ostaci aparagina ili serina/treonina su dobro poznata mesta za vezivanje oligosaharida. Status glikozilacije specifičnog proteina zavisi od brojnih faktora, uključujući sekvencu proteina, konformaciju proteina i dostupnost određenih enzima. Štaviše, status glikozilacije (to jest tip oligosaharida, kovalentno povezivanje i ukupan broj povezivanja) može uticati na funkciju proteina. Stoga, kada se proizvodi rekombinantni protein, kontrola glikozilacije je često poželjna. Glikozilacija transficiranih TCR može biti kontrolisana mutacijama transficiranog gena (Kuball J i sar. (2009), J Exp Med 206(2):463-475). Takve mutacije su takođe obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0029] TCR pronalaska može biti povezan sa oznakom za detekciju, terapeutskim agensom ili delom koji modifikuje farmakokinetička svojstva.

[0030] Određeni TCR pronalaska mogu da budu u rastvorljivoj formi (to jest da nemaju transmembranske ili citoplazmatske domene). Radi stabilnosti, TCR prema pronalasku, i poželjno rastvorljivi α β heterodimerni TCR, mogu posedovati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kako je opisano, na primer, u WO 03/020763. Neki rastvorljivi TCR pronalaska su korisni za pravljenje fuzionih proteina koji mogu biti korišćeni za isporuku detektabilnih oznaka ili terapeutskih agenasa antigenprezentujućim ćelijama ili tkivima koja sadrže antigen-prezentujuće ćelije. Oni mogu stoga biti povezani (kovalentno ili na neki drugi način) sa detektabilnom oznakom (u dijagnostičke svrhe kako bi se TCR koristio za detekciju prisustva ćelija koje poseduju FMNKFIYEI (SEQ ID Br 1) HLA-A2 kompleks; kao terapeutski agens; ili deo koji modifikuje farmakokinetička svojstva (na primer pomoću PEGilacije).

[0031] Detektabilne oznake u dijagnostičke svrhe uključuju, na primer, fluorescentne oznake, radioaktivne oznake, enzime, probe na bazi nukleinskih kiselina i kontrastne reagense.

[0032] Terapeutski agensi koji mogu biti povezani sa TCR pronalaska uključuju imunomodulatore, radioaktivna jedinjenja, enzime (perforin na primer) ili hemoterapeutske agense (cis-platin na primer). Kako bi se obezbedilo da se toksični efekti odvijaju na željenom mestu, toksin bi mogao da unutar lipozoma bude povezan sa TCR tako da se jedinjenje polako oslobađa. Ovo će sprečiti štetne efekte tokom transporta u telu i obezbediti da toksin ima maksimalni efekat nakon vezivanja TCR za odgovarajuće antigen-prezentujuće ćelije.

[0033] U ostale odgovarajuće terapeutske agense se ubrajaju:

• mali molekuli citotoksičnih agenasa, to jest jedinjenja sa sposobnošću da ubiju sisarske ćelije koja imaju molekularnu težinu manju od 700 Daltona. Takva jedinjenja mogu takođe sadržati toksične metale sa citotoksičnim efektom. Štaviše, podrazumeva se da ovi mali molekuli citotoksičnih agenasa takođe uključuju pro-lekove, to jest jedinjenja koja se raspadaju ili menjaju pod fiziološkim uslovima nakon čega se oslobađaju citotoksični agensi. Primeri takvih agenasa su cis-platin, derivati majtanzina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etoposid, gemcitabin, ifofamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, porfimer natrijum (fotofrin II), temozolomid, topotekan, trimetreksat glukuronat, auristatin E vinkristin i doksorubicin;

• peptidni citotoksini, to jest njihovi proteini ili fragmenti sa mogućnošću da ubiju sisarske ćelije. Na primer, ricin, toksin difterije, bakterijski egzotoksin A pseudomonasa, DNaze i RNaze;

• radionuklidi, to jest nestabilni izotopi elemenata koji se raspadaju sa istovremenom emisijom jedne ili više α ili β čestica, ili γ zraka. Na primer, jod 131, renijum 186, indijum 111, itrijum 90, bizmut 210 i 213, aktinijum 225 i astatin 213; helatni agensi mogu biti korišćeni kako bi se olakšala asocijacija ovih radionuklida sa visoko specifičnim TCR, ili njihovim multimerima;

• imuno stimulansi, to jest imuno efektorski molekuli koji stimulišu imuni odgovor. Na primer, citokini kao što su IL-2 i IFN- γ,

• Superantigeni i njihovi mutanti;

• fuzije TCR-HLA;

• hemokini kao što su IL-8, faktor trombocita 4, protein koji stimuliše rast melanoma, itd; • antitela ili njihovi fragmenti, uključujući antitela protiv T ćelija ili antitela protiv determinante NK ćelije (na primer anti-CD3, anti-CD28 ili anti-CD16);

• alternativni proteinski nosači sa karakteristikama vezivanja sličnim antitelu

• aktivatori komplementa;

• ksenogeni proteinski domeni, alogeni proteinski domeni, virusni/bakterijski proteinski domeni, virusni/bakterijski peptidi.

[0034] Za primenu kod pacijenata, mogu se obezbediti TCR ili ćelije pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili pomoćnih supstanci. Ćelije u skladu sa pronalaskom obično se isporučuju kao deo sterilne farmaceutske kompozicije koja normalno uključuje farmaceutski prihvatljive nosače. Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kojoj odgovarajućoj formi (u zavisnosti od željenog metoda davanja pacijentu). Može se obezbediti u pojedinačnom doznom obliku, ali se uglavnom obezbeđuje u zatvorenoj posudi i kao deo kompleta. Takav komplet bi normalno (mada ne obavezno) sadržao instrukcije za upotrebu. Može sadržati mnoštvo pojedinačnih doza.

[0035] Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za davanje bilo kojim odgovarajućim putem, poželjno parenteralnim (uključujući subkutanim, intramuskularnim, ili poželjno intravenskim) putem. Takve kompozicije mogu biti pripremljene bilo kojim metodom koji je poznat u farmaciji, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem (nosačima) ili pomoćnom supstancom (supstancama) pod sterilnim uslovima. TCR, farmaceutske kompozicije, vektori, nukleinske kiseline i ćelije pronalaska mogu biti obezbeđene u suštinski čistom obliku, na primer bar 50%, bar 60%, bar 70%, bar 80%, bar 85 %, bar 90%, bar 91%, bar 92%, bar 93%, bar 94%, bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% ili 100% čistoće.

[0036] Takođe je pronalaskom obezbeđen TCR pronalaska, ili ćelija prema pronalasku, za upotrebu u medicini, poželjno u metodi lečenja kancera. Metod može obuhvatiti adoptivnu terapiju;

• Poželjna svojstva svakog aspekta pronalaska su kao i za druge aspekte da može da bude izmenjeno sve što je potrebno da se izmeni. Navođenje ili identifikacija bilo kog dokumenta u ovoj prijavi nije priznanje da je takav dokument dostupan kao prethodno stanje tehnike u odnosu na ovaj pronalazak.

1

Opis slika

[0037]

Slika 1 (SEQ ID Br: 2) prikazuje aminokiselinsku sekvencu vanćelijskog dela alfa lanca roditeljskog AFP-specifičnog TCR kodiranog genom TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC.

Slika 2 (SEQ ID Br: 3) prikazuje aminokiselinsku sekvencu vanćelijskog dela beta lanca roditeljskog AFP-specifičnog TCR kodiranog genom TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2.

Slika 3 (SEQ ID Br: 4) prikazuje aminokiselinsku sekvencu alfa lanca rastvorljivog TCR (koji je ovde označen kao "referentni TCR"). Sekvenca je ista kao na Slici 1 (SEQ ID Br: 2) osim što je cistein (podebljan i podvučen) supstituisan za T159 u SEQ ID Br: 2 (to jest T48 u TRAC konstantnog regiona).

Slika 4 (SEQ ID Br: 5) prikazuje aminokiselinsku sekvencu beta lanca rastvorljivog TCR (koji je ovde označen kao "referentni TCR"). Sekvenca je ista kao na Slici 2 (SEQ ID Br: 3) osim što je cistein (podebljan i podvučen) supstituisan za S169 u SEQ ID Br: 3 (to jest S57 u TRBC2 konstantnog regiona) i A187 je supstituisan za C187 i D201 je supstituisan za N201.

Slika 5 (SEQ ID Br: 6-20) prikazuje aminokiselinsku sekvencu mutiranih alfa lanaca koji mogu biti prisutni u TCR prema pronalasku. CDR regioni su podvučeni i aminokiselinske promene u odnosu na roditeljski AFP TCR su zasenčene.

Slika 6 (SEQ ID Br: 21) i (SEQ ID Br: 22) prikazuju DNK sekvence koje kodiraju TCR alfa i beta lance prikazane na Slikama 3 i 4 redom.

Slika 7 (SEQ ID Br: 23) prikazuje DNK sekvencu roditeljskog gena za AFP TCR (konstrukt alfa lanac-2A-beta lanac sa sekvencom svinjskog teschovirusa-1 2A podebljanom i podvučenom) za transdukciju T ćelija.

Slika 8 (SEQ ID Br: 24) prikazuje aminokiselinsku sekvencu roditeljskog AFP TCR za transdukciju T ćelija koja je nastala iz DNK sekvence koja je prikazana na Slici 7. Sekvenca svinjskog teschovirusa-1 2A podebljana je i podvučena.

Slika 9 prikazuje rezultate ELISPOT testa u kome je ocenjivano oslobađanje IFN- γ iz AFP TCR-transdukovanih T-ćelija kao odgovor na brojne ciljne ćelije.

[0038] Pronalazak je dalje objašnjen u sledećim neograničavajućim primerima.

Primeri

Primer 1

Kloniranje sekvenci varijabilnog regiona alfa i beta lanca roditeljskog AFP TCR u ekspresione plazmide na bazi pGMT7

[0039] Referentni AFP TCR varijabilni alfa i TCR varijabilni beta domeni su umnoženi pomoću PCR iz celokupne izolovane cDNK iz AFP T ćelijskog klona. U slučaju alfa lanca, oligonukleotid A1 gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaaaattctggacccctc (SEQ ID Br: 25) specifičan za sekvencu varijabilnog regiona alfa lanca koji kodira restrikciono mesto NdeI i oligonukleotid A2 ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg (SEQ ID Br: 26) specifičan za konstantni region alfa lanaca koji kodira restrikciono mesto SalI su korišćeni za umnožavanje varijabilnog domena alfa lanca. U slučaju beta lanca, oligonukleotid B1 gaattccatatggattctggagttacacaaaccccaaagcacctg (SEQ ID Br: 27) specifičan za sekvencu varijabilnog regiona beta lanca koji kodira restrikciono mesto NdeI i oligonukleotid B2 tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc (SEQ ID Br: 28) specifičan za sekvencu konstantnog regiona beta lanca koji kodira restrikciono mesto Age1 koriste se za umnožavanje varijabilnog domena beta lanca.

[0040] Alfa i beta varijabilni domeni su klonirani u pGMT7 eksprimirane plazmide sa C α ili C β pomoću standardnih metoda opisanih u priručniku (Molecular Cloning a Laboratory Manual Third edition by Sambrook and Russell ). Plazmidi su sekvencirani upotrebom uređaja Applied Biosystems 3730xl DNK Analyzer.

[0041] DNK sekvence koje kodiraju prekid TCR alfa lanca sa NdeI i SalI ligirane su u pGMT7 C α vektor, koji je prekinut sa NdeI i XhoI. DNK sekvence koje kodiraju prekid na TCR beta lancu sa NdeI i AgeI ligirane su u odvojeni pGMT7 C β vektor, koji je takođe prekinut sa NdeI i AgeI.

Ligacija

[0042] Ligirani plazmidi su transformisani u kompetentni soj XL1-plavih ćelija E.coli zasejanih na LB/agar podlozi koja sadrži 100 µg/ml ampicilina. Daljom inkubacijom tokom noći na 37°C, pojedinačne kolonije se skupljaju i narastaju u 10 ml LB koji sadrži 100 µg/ml ampicilina tokom noći na 37°C sa mućkanjem. Klonirani plazmidi su prečišćeni upotrebom Miniprep kita (Qiagen) i plazmidi su sekvencirani upotrebom aparata Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer.

[0043] Slike 3 i 4 redom pokazuju referentne AFP TCR aminokiselinske sekvence vanćelijskih α i β lanaca (SEQ ID Br: 4 i 5 redom) nastale iz DNK sekvenci sa Slike 7 (SEQ ID Br: 21) (SEQ ID Br: 22) redom. Treba zapaziti da su, u odnosu na roditeljski TCR, cisteini supstituisani u konstantnim regionima alfa i beta lanaca da bi obezbedili veštačku međulančanu disulfidnu vezu prilikom ponovnog uvijanja heterodimernog TCR. Uvedeni cisteini su podebljani i podvučeni.

Primer 2

Ekspresija, ponovno uvijanje i prečišćavanje rastvorljivog roditeljskog AFP TCR

[0044] Ekspresioni plazmidi koji sadrže TCR α lanac i β lanac redom, pripremljeni kao u Primeru 1, su transformisani odvojeno u soj BL21pLysS E.coli, i pojedinačne ampicilin otporne kolonije su gajene na 37°C u TYP (ampicilin 100 µg/ml) medijumu do OD600~0.6-0.8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0.5 mM IPTG. Ćelije su sakupljene 3h nakon indukcije centrifugiranjem na 4000rpm 30 minuta u Beckman J-6B. Ćelije u peletu su lizirane sa 25 ml Bug Buster® (Novagen) u prisustvu MgCl2i DNazeI. Peleti inkluzionih tela su izdvojeni centrifugiranjem na 13000rpm 30 minuta u Beckman J2-21 centrifugi.

[0045] Korišćena su tri pranja deterdžentom kako bi se uklonili delovi ćelije i membranske komponente. Svaki put je pelet inkluzionih tela homogenizovan u Triton puferu (50 mM Tris-HCI pH 8.0, 0.5% Triton-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) pre peletiranja centrifugiranjem na 13000rpm 15 minuta u Beckman J2-21. Deterdžent i so su onda uklonjeni sličnim pranjem u sledećem puferu: 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 1 mM NaEDTA. Konačno, inkluziona tela su podeljena u alikvote od 30 mg i zamrznuta na -70°C. Količina proteina inkluzionih tela je kvantifikovana rastvaranjem sa 6 M guanidin-HCI i OD merenja su urađena na Hitachi U-2001 spektrofotometru. Koncentracija proteina je onda izračunata upotrebom ekstinkcionog koeficijenta.

[0046] Oko 15mg β lanca TCR i 15mg α lanca TCR rastvorenih inkluzionih tela otopljeno je iz zamrznutih rezervi i razblaženi u 10 ml rastvora guanidina (6 M Guanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCI pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT), kako bi se obezbedila potpuna denaturacija lanaca. Rastvor guanidina koji sadrži potpuno redukovane i denaturisane

1

TCR lance ubrizgan je u 0.5 litara sledećeg pufera za ponovno uvijanje proteina: 100 mM Tris pH 8.1, 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA, 5 M Uree. Redoks par (cisteamin hidrohlorid i cistamin dihidrohlorid) do finalnih koncentracija 6.6 mM i 3.7 mM redom, su dodati oko 5 minuta pre ubacivanja denaturisanih TCR lanaca. Rastvor je stajao oko 30 minuta. Ponovno uvijeni TCR je dijaliziran u Spectra/Por ® 1 membrani (Spectrum; Proizvod Br. 132670) nasuprot 10 L H2O za 18-20 sati. Nakon tog vremena, pufer za dijalizu je promenjen dva puta sa svežim 10 mM Tris pH 8.1 (10 L) i dijaliza je nastavljena na 5 °C ± 3 °C narednih ~8 sati.

[0047] Rastvorljivi TCR je odvojen od degradacionih produkata i nečistoća ubacivanjem dijaliziranog ponovno uvijenog produkta u POROS® 50HQ anjon-izmenjivačku kolonu i eluiranjem vezanog proteina sa gradijentom 0-500mM NaCl u 10 mM Tris pH 8.1 preko 50 zapremina kolone upotrebom Akta® prečistača (GE Healthcare). Frakcije pikova su udružene i mešavina inhibitora proteaza (Calbiohem) je dodata. Udružene frakcije su onda skladištene na 4 °C i analizirane pomoću metode SDS-PAGE sa Komazi-bojenjem pre nego su bile udružene i koncentrovane. Konačno, rastvorljivi TCR je prečišćen i okarakterisan upotrebom GE Healthcare Superdex® 75HR gel filtracione kolone prethodno uravnotežene u PBS puferu (Sigma). Pik koji je eluirao na relativnoj molekulskoj težini od otprilike 50 kDa je sakupljen i koncentrovan pre karakterizacije pomoću analize BIAcore® rezonance površinskog plazmona.

Primer 3

Karakteristike vezivanja

BIAcore analiza

[0048] Biosenzor rezonance površinskog plazmona (BIAcore® 3000) može biti korišćen za analizu vezivanja rastvorljivog TCR sa njegovim peptido-MHC ligandom. Ovo je olakšano proizvodnjom rastvorljivog biotinilovanog peptid-HLA ("pHLA") kompleksa koji može da se imobilizuje na streptavidinom obloženu vezujuću površinu (senzorni čip). Senzorni čipovi obuhvataju četiri individualne protočne ćelije koji mogu u isto vreme da mere vezivanje četiri različita pHLA kompleksa za receptor na T ćeliji. Ručnim ubrizgavanjem pHLA kompleksa omogućeno je precizno manipulisanje nivoom imobilisanih molekula klase I.

[0049] Biotinilarani molekuli klase I HLA-A*02 su ponovno uvijeni in vitro iz bakterijski eksprimiranih inkluzionih tela koja sadrže konstitutivne subjedinice i sintetički peptid, nakon čega sledi prečišćavanje i in vitro enzimska biotinilacija (O’Callaghan i sar. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). HLA-A*02-težak lanac je eksprimiran sa oznakom biotinilacije na C-kraju koja zamenjuje transmembranske i citoplazmatične domene proteina u odgovarajućem konstruktu. Dobijeno je da je nivo ekspresije inkluzionih tela ~75 mg/litru bakterijske kulture. MHC laki-lanac ili β2-mikroglobulin takođe je eksprimiran kao inkluziona tela u E.coli iz odgovarajućeg konstrukta, na nivou ~500 mg/litru bakterijske kulture.

[0050] Ćelije E. coli su lizirane i inkluziona tela su prečišćena do otprilike 80% čistoće. Protein iz inkluzionih tela je denaturisan u 6 M guanidin-HCI, 50 mM Tris pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 10 mM EDTA, i ponovno uvijen pri koncentraciji od 30 mg/litru teškog lanca, 30 mg/litru β2m u 0.4 M L-Arginina, 100 mM Tris pH 8.1, 3.7 mM cistamin dihidrohlorida, 6.6 mM cisteamin hidrohlorida, 4 mg/L AFP peptida je bilo potrebno opteretiti molekulom HLA-A*02, dodavanjem pojedinačnog pulsa denaturisanog proteina u pufer za ponovno uvijanje proteina na < 5°C. Dozvoljeno je da se ponovno uvijanje završi na 4°C tokom bar 1 sata.

[0051] Pufer je promenjen dijalizom u 10 zapremina 10 mM Tris pH 8.1. Proteinski rastvor je onda filtriran kroz 1.5 µm celulozo acetatni filter i nanet na POROS® 50HQ kolonu za razmenu anjona (8 ml zapremine zrna). Protein je eluiran sa linearnim 0-500 mM NaCl gradijentom u 10 mM Tris pH 8.1 upotrebom Akta® prečistača (GE Healthcare). HLA-A*02-peptidni kompleks je eluirao na oko 250 mM NaCl, i frakcije pika su skupljene, dodata je mešavina inhibitora proteaza (Calbiohem) i frakcije su ohlađene na ledu.

[0052] Biotinilacijom označenim pHLA molekulima je zamenjen pufer u 10 mM Tris pH 8.1, 5 mM NaCl upotrebom GE Healthcare kolone za brzu desalinaciju koja je uravnotežena u istom puferu. Odmah nakon eluiranja, frakcije koje sadrže proteine bile su ohlađene na ledu i dodata je mešavina inhibitora proteaza (Calbiohem). Onda su dodati biotinilišući reagensi: 1 mM biotin, 5 mM ATP (prečišćen na pH 8), 7.5 mM MgCl2, i 5 µg/ml BirA enzima (prečišćen prema O’Callaghan i sar. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Mešavina je onda inkubirana tokom noći na sobnoj temperaturi.

[0053] Biotinilovani pHLA-A*01 molekuli su prečišćeni upotrebom gel-filtracione hromatografije. GE Healthcare Superdex® 75 HR 10/30 kolona bila je prethodno uravnotežena sa filtriranim PBS i ubačeno je 1 ml biotinilovane reakcione smeše i kolona je razvijena sa PBS na 0.5 ml/min upotrebom Akta® prečistača (GE Healthcare). Biotinilovani pHLA-A*02 molekuli su eluirali na oko 15 ml kao pojedinačni pik. Frakcije koje sadrže

1

proteine su grupisane, hlađene na ledu, dodata je mešavina inhibitora proteaza. Koncentracija proteina je određena upotrebom Komazi-vezujućeg testa (PerBio) i alikvoti biotinilovanih pHLA-A*02 molekula su skladišteni zamrznuti na - 20°C.

[0054] Biosenzor BIAcore® 3000 rezonance površinskog plazmona (SPR) meri promene u indeksu refrakcije izražene u jedinicama odgovora (RU) blizu površine senzora unutar male protočne ćelije, što je princip koji se može koristiti za detekciju interakcija receptora i liganda i za analizu njihovog afiniteta i kinetičkih parametara. BIAcore® eksperimenti su izvršeni na temperaturi 25°C, upotrebom PBS pufera (Sigma, pH 7.1-7.5) kao radnog pufera i u pripremljenim razblaženjima proteinskih uzoraka. Streptavidin je imobilizovan na protočnim ćelijama standardnim metodama vezivanja sa aminom. pHLA kompleksi su imobilisani označavanjem biotinom. Test je onda izveden pomoću prelaska rastvorljivog TCR preko površina različitih protočnih ćelija sa konstantnim protokom, merenjem SPR odgovora tokom toga.

Ravnotežna konstanta vezivanja

[0055] Gore navedeni metodi BIAcore® analize su korišćeni za determinaciju ravnotežnih konstanti vezivanja. Serijska razblaženja disulfidno povezanih rastvorljivih heterodimernih formi referentnog AFP TCR su spremljena i ubrizgana pri konstantnom protoku 5 µl min-1 preko dve različite protočne ćelije; jedne obložene sa ~1000 RU specifičnog HLA-A*02 kompleksa, druge obložene sa ~1000 RU nespecifičnog HLA-A2 -peptidnog kompleksa. Odgovor je normalizovan za svaku koncentraciju merenjem na kontrolnoj ćeliji. Normalizovani podaci o odgovoru su ucrtani nasuprot koncentracije TCR uzorka i inkorporirani u krivu nelinearnog modela kako bi se izračunala ravnotežna konstanta vezivanja, KD(Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2. izdanje) 1979, Clarendon Press, Oxford). Konstanta vezivanja KDdisulfidno povezane rastvorljive heterodimerne forme referentnog AFP TCR (Primer 2) je oko 754 µM. Iz istih BIAcore® podataka T1⁄2 bio je oko <0.5 s.

Kinetički parametri

[0056] Metodi gore pomenute BIAcore® analize su takođe korišćeni za određivanje ravnotežnih konstanti vezivanja i konstanti disocijacije.

1

[0057] Za visoko-afinitetne TCR (videti Primer 4 ispod) KDje određena eksperimentalno merenjem stope konstante disocijacije, koff, i stope konstante asocijacije, kon. Ravnotežna konstanta KDje računata kao koff/kon.

[0058] TCR je ubrizgan preko dve različite ćelije, jedne obložene sa ~1000 RU kompleksa FMNKFIYEI HLA-A*02, i druge obložene sa -1000 RU nespecifičnog HLA-A2-peptid kompleksa. Protok je podešen na 50 µl/min. Tipično ubrizgano je 250 µl TCR na ~1 µM koncentracije. Pufer je onda proticao sve dok odgovor nije ponovo bio bazičan ili dok nije proteklo više od 2 sata. Kinetički parametri su računati upotrebom programa BIAevaluation®. Faza disocijacije je prilagođena jednačini pojedinačnog eksponencijalnog raspada koja omogućava izračunavanje poluživota.

Primer 4

Priprema mutiranih TCR prema pronalasku

[0059] Fagni prikaz je jedan od načina pomoću kojih biblioteke AFP TCR varijanti mogu biti proizvedene u cilju identifikovanja mutanata sa većim afinitetom. Fagni prikaz TCR i metodi skrininga opisani u (Li i sar, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) primenjeni su na roditeljskom AFP TCR Primera 1.

[0060] Identifikovani su TCR sa poboljšanim vezivanjem u poređenju sa roditeljskim AFP TCR, koji imaju jednu ili više mutacija u aminokiselinskim ostacima 31Q, 32S, 94D, 95S, 96G, 97Y, i 98A varijabilnog domena alfa lanca (upotrebom označavanja prikazanom u SEQ ID Br: 2). Specifični primeri aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona alfa lanaca (SEQ ID Br: 6 do 20) TCR višeg afiniteta prikazani su na Slici 5. Ovi alfa lanci su mutirani u CDR1 i/ili CDR3.

[0061] Eksprimirani plazmidi koji sadrže α-lanac i β-lanac TCR redom za sledeće TCR pronalaska pripremljeni su kao u Primeru 1:

1

[0062] Plazmidi su transformisani odvojeno u BL21 pLysS soj E.coli, i pojedinačne kolonije rezistentne na ampicilin rasle su na 37°C u TYP (ampicilin 100 µg/ml) medijumu do OD600~0.6-0.8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0.5 mM IPTG. Tri sata posle indukcije ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 4000rpm 30 minuta u Beckman J-6B. Peletirane ćelije su bile lizirane sa 25 ml Bug Buster® (Novagen) u prisustvu MgCl2i DNazeI. Peleti inkluzionih tela su izdvojeni centrifugiranjem na 13000rpm 30 minuta u Beckman J2-21 centrifugi. Tri pranja deterdžentom su onda korišćena kako bi se uklonili ćelijski delovi i membranske komponente. Svaki put je pelet inkluzionih tela homogenizovan u Triton puferu (50 mM Tris-HCI pH 8.0, 0.5% Triton-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA,) pre peletiranja centrifugiranjem na 13000rpm 15 minuta u Beckman J2-21. Deterdžent i so su onda uklonjeni sličnim pranjem u sledećem puferu: 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 1 mM NaEDTA. Konačno, inkluziona tela su podeljena u 30 mg alikvota i zamrznuta na -70°C. Količina proteina inkluzionih tela je kvantifikovana rastvaranjem sa 6 M guanidin-HCI i OD merenje je izvršeno na Hitachi U-2001 spektrofotometru. Koncentracija proteina je izračunata upotrebom ekstinkcionog koeficijenta.

[0063] Oko 10 mg β lanca TCR i 10 mg α lanca TCR rastvorenih inkluzionih tela za svaku TCR pronalaska razblaženo je u 10 ml rastvora guanidina (6 M Guanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCI pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT), kako bi se obezbedila

1

kompletna denaturacija. Rastvor guanidina koji sadrži potpuno redukovane i denaturisane TCR lance je onda ubrizgan u 0.5 litra sledećeg pufera za ponovno uvijanje proteina: 100 mM Tris pH 8.1, 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA, 5 M Uree. Redoks par (cisteamin hidrohlorid i cistamin dihidrohlorid) do finalnih koncentracija 6.6 mM i 3.7 mM redom, je dodat oko 5 minuta pre dodavanja denaturisanih TCR lanaca. Rastvor je stajao -30 minuta. Ponovno uvijeni TCR je dijaliziran u Spectra/Por® 1 membrani (Spectrum; Proizvod Br. 132670) nasuprot 10 L H2O tokom 18-20 sati. Nakon tog vremena, pufer za dijalizu je promenjen dva puta sa svežim 10 mM Tris pH 8.1 (10 L) i dijaliza je nastavljena na 5 °C ± 3 °C sledećih ~8 sati.

[0064] Rastvorljivi TCR je odvojen od degradacionih produkata i nečistoća nanošenjem dijaliziranog ponovno uvijenog proizvoda na POROS® 50HQ anjonsku izmenjivačku kolonu i eluiranjem vezanog proteina sa gradijentom 0-500mM NaCl u 10 mM Tris pH 8.1 preko 15 zapremina kolone upotrebom Akta® prečistača (GE Healthcare). Udružene frakcije su onda skladištene na 4 °C i analizirane pomoću metode SDS-PAGE sa Komazi-bojenjem pre nego što su bile udružene i koncentrovane. Konačno, rastvorljivi TCR su prečišćeni i okarakterisani upotrebom GE Healthcare Superdex® 75HR gel filtracione kolone prethodno uravnotežene u PBS puferu (Sigma). Pik koji eluira na relativnoj molekulskoj težini od oko 50 kDa je sakupljen i koncentrovan pre karakterizacije pomoću BIAcore® analize rezonance površinskog plazmona.

[0065] Profili afiniteta tako nastalih TCR za AFP epitop su procenjeni upotrebom metoda iz Primera 3, i upoređeni sa referentnim TCR. Rezultati su navedeni u sledećoj tabeli:

1

Primer 5

Transfekcija T-ćelija roditeljskim i varijantnim AFP TCR

(a) Priprema lentivirusnog vektora pomoću Ekspres-In posredovane prolazne transfekcije 293T ćelija

[0066] Za pakovanje lentiviralnih vektora koji sadrže gene koji kodiraju željene TCR korišćena je treća generacija pakovanja lentiviralnog sistema. 293T ćelije su transficirane sa 4 plazmida (jedan lentiviralni vektor koji sadrži gen sa pojedinačnim ORF za TCR alfa lanac-P2A-TCR beta lanac opisan u primeru 5c (ispod), i 3 plazmida koji sadrže druge komponente neophodne za konstruisanje infektivnih ali nereplikativnih lentiviralnih čestica) upotrebom Express-In posredovane prolazne transfekcije (Open Biosystems).

[0067] Za transfekciju uzeti jednu T150 bočicu sa 293T ćelijama u fazi eksponencijalnog rasta, koje su ravnomerno raspoređene na ploči, i sa nešto više od 50% konfluentnosti. Držati Express-In alikvote na sobnoj temperaturi. Staviti 3 ml medijuma bez seruma (RPMI 1640 10mM HEPES) u sterilnu konusnu epruvetu od 15 ml. Dodati 174 µl Express-In reagensa direktno u medijum bez seruma (ovo obezbeđuje 3.6:1 odnos težine reagensa u odnosu na DNK). Dobro promešati okretanjem epruveta 3-4 puta i inkubirati na sobnoj temperaturi 5-20 minuta.

[0068] U posebnu 1.5 ml mikrotubu dodati 15 µg DNK plazmida u unapred izmešane alikvote mešavine za pakovanje (koja sadrži 18 µg pRSV.REV (Rev ekspresionog plazmida), 18 µg pMDLg/p.RRE (Gag/Pol ekspresioni plazmid), 7 µg pVSV-G (VSV glikoproteinski ekspresioni plazmid)), obično ~22 µl i pipetirati gore i dole kako bi se obezbedila homogenost

2

DNK mešavine. Dodati ~1 ml Express-In/medijuma bez seruma u DNK mešavinu kap po kap i onda pažljivo pipetirati gore i dole pre nego što se mešavina prebaci nazad u preostali Express-In/medijum bez seruma. Okretati tubu 3-4 puta i inkubirati je na sobnoj temperaturi 15-30 minuta.

[0069] Ukloniti stari medijum za kulturu iz bočica sa ćelijama. Dodati Express-In /medijum/DNK (3ml) kompleks direktno na dno uspravne bočice sa 293T ćelijama. Polako, položiti bočicu da bi ćelije bile prekrivene i veoma nežno ljuljati posudu kako bi se obezbedila ravnomerna distribucija. Posle 1 minuta dodati 22 ml svežeg medijuma za kulturu (R10+HEPES: RPMI 1640, 10% toplotno-inaktiviranog FBS, 1% Pen/Strep/L-glutamin, 10 mM HEPES) i pažljivo vratiti u inkubator. Inkubirati tokom noći na 37°C/5% CO2. Nakon 24 sata, nastaviti sa sakupljanjem medijuma koji sadrži upakovane lentiviralne vektore.

[0070] Za skupljanje upakovanih lentiviralnih vektora, filtrirati supernatant ćelijske kulture kroz 0.45 mikronski najlonski filter za špric, centrifugirati medijum za kulturu na 10000 g 18 sati (ili 112 000 g 2 sata), ukloniti većinu supernatanta (vodeći računa da se ne poremetri talog) i resuspendovati talog u preostalih nekoliko mililitara supernatanta (obično oko 2 ml iz 31 ml početne zapremine po epruveti). Zamrznuti na suvom ledu u alikvotima od 1 ml i skladištiti na -80°C.

(b) Transdukcija T ćelija upakovanim lentiviralnim vektorima koji sadrže gene od interesa

[0071] Pre transdukcije upakovanim lentiviralnim vektorima, humane T ćelije (CD8 ili CD4, ili obe, u zavisnosti od zahteva) su izolovane iz krvi zdravih volontera. Ove ćelije su izbrojane i inkubirane tokom noći u R10 koji sadrži 50 U/ml IL-2 pri gustini od 1x10<6>ćelija po ml (0.5 ml/bunarčiću) u pločama sa 48 bunarčića sa prethodno opranim mikrokuglicama obloženim anti-CD3/CD28 antitelom (Dynabeads® T cell expander, Invitrogen) u odnosu od 3 kuglice po ćeliji.

[0072] Nakon stimulacije tokom noći, 0.5 ml čistog pakovanog lentiviralnog vektora je dodato u željene ćelije. Inkubirati na 37°C/5% CO23 dana. Tri dana nakon transdukcije izbrojati ćelije i razblažiti do 0.5x10<6>ćelija/ml. Po potrebi dodati svež medijum koji sadrži IL-2. Ukloniti kuglice 5-7 dana nakon transdukcije. Izbrojati ćelije i zameniti ili dodati svež medijum koji sadrži IL-2 u intervalima od 2 dana. Održavati ćelije u koncentraciji između 0.5x106 i 1x106 ćelija/ml. Ćelije mogu biti analizirane protočnom citometrijom od 3. dana i korišćene u funkcionalnim testovima (na primer ELISpot za IFN γ oslobađanje, videti Primer 6) od 5. dana. Od 10. dana, ili kada ćelije počnu usporeno da se dele i kada su smanjene veličine, zamrznuti ćelije u alikvotima od bar 4x10<6>ćelija/bočici (na 1x10<7>ćelija/ml u 90% FBS/10% DMSO) za skladištenje.

(c) Gen za roditeljski TCR za transdukciju T-ćelija pomoću metoda (a) i (b) gore.

[0073] Na Slici 7 je DNK sekvenca (SEQ ID Br: 23) koja kodira roditeljski AFP TCR (kodon-optimizovana za maksimalnu ekspresiju u humanoj ćeliji). To je konstrukt sa jednim otvorenim okvirom čitanja potpune dužine alfa lanca - svinjskog teschovirusa-1 2A - potpune dužine beta lanca. 2A sekvenca je podvučena, i prethode joj nukleotidi koji kodiraju mesto razlaganja furina kako bi se olakšalo proteolitičko uklanjanje sekvence 2A (diskutovano dalje dole u odnosu na Sliku 8 (SEQ ID Br: 24). Tokom nastanka proteina translacijom iRNK, izostankom peptidne veze na 3’ kraju 2A sekvence, produkuju se dva proteina: 1) fuzionisani alfa lanac-2A TCR, 2) beta lanac TCR. SEQ ID Br: 23 uključuje NheI i SalI restrikciona mesta (podvučeno).

[0074] Na slici 8 je aminokiselinska sekvenca (SEQ ID Br: 24) koja odgovara onoj na Slici 7 Na Slici 8:

M1- Q22 je liderska sekvenca koja je uklonjena sazrevanjem roditeljskog alfa lanca TCR

Q23-S274 odgovara sekvenci roditeljskog alfa lanca;

Q23-N246 odgovara vanćelijskom domenu roditeljskog alfa lanca;

L247-T268 je alfa lanac transmenbranskog regiona zrelog TCR;

L269-S274 je alfa lanac unutarćelijskog regiona zrelog TCR;

R277-R280 je mesto za uklanjanje furina kako bi se olakšalo proteolitičko uklanjanje, u Goldži aparatu, P2A sekvence A285-P303;

G275, S276, S281 do G284, su fleksibilni linkeri koji dozvoljavaju potpuno uklanjanje furina i P2A sekvenci;

R304-V323 je liderska sekvenca koja je uklonjena sazrevanjem roditeljskog beta lanca TCR

D324-G614 odgovara sekvenci roditeljskog beta lanca;

D324-E585 odgovara vanćelijskom domenu roditeljskog beta lanca;

I586-V607 je beta lanac transmenbranskog regiona zrelog TCR;

K608-G614 je beta lanac unutarćelijskog regiona zrelog TCR.

(d) T -ćelije transficirane roditeljskim i visoko-afinitetnim AFP TCR

[0075] Prateći procedure objašnjene pod (a) i (b) gore, gen za roditeljski AFP alfa-2A-beta TCR (SEQ ID Br: 23 (Slika 7)) je ubačen u pELNSxv lenti vektor upotrebom NheI i SalI restrikcionih mesta jedinstvenih za oba DNK konstrukta, i napravljene su transficirane T ćelije.

[0076] Slično, T-ćelije mogu biti napravljene transfekcijom genima identičnim SEQ ID Br: 23 (Slika 7) sa tom razlikom što ti geni kodiraju varijabilni domen alfa lanca koji ima jednu od SEQ ID Br: 6 do 20 asociranih sa sekvencom (D1 do T112) varijabilnog domena roditeljskog beta lanca SEQ ID Br: 3;

Primer 6

Aktivacija AFP TCR konstruisanih T ćelija

[0077] Sledeći test je urađen kako bi se pokazala aktivacija TCR-transduciranih citotoksičnih T limfocita (CTL) u odgovoru na linije tumorskih ćelija. IFN- γ produkcija, izmerena upotrebom ELISPOT testa, je korišćena kao očitavanje za aktivaciju citotoksičnih T limfocita (CTL).

ELISPOT

Reagensi

[0078]

Medijum u testu: 10% FCS (Gibco, Cat# 2011-09), 88% RPMI 1640 (Gibco, Cat# 42401), 1% glutamin (Gibco Cat#25030) i 1% penicilin/streptomicin (Gibco Cat# 15070-063).

Pufer za pranje: 0.01M PBS/0.05% Tween 20

PBS (Gibco Cat# 10010)

[0079] U ELISPOT kompletu za humani IFN γ (BD Bioscience; Cat# 551849) nalaze se antitela za hvatanje i detekciju i ploče sa 96 bunarčića sa humanim IFN- γ PVDF ELISPOT, sa povezanim setom AEC supstrata (BD Bioscience, Cat# 551951)

Metodi

2

Priprema ciljnih ćelija

[0080] Ciljne ćelije korišćene u ovom metodu su prirodne ćelije koje predstavljaju epitop: HepG2 ćelije hepatocelularnog karcinoma koje su oba HLA-A2<+>AFP<+>. HEP2 normalni humani hepatociti, koji su HLA-A2+AFP- , korišćeni su kao negativna kontrola. Dovoljno ciljnih ćelija (50 000 ćelija/bunarčiću) je oprano centrifugiranjem tri puta na 1200 rpm, 10 min u Megafuge® 1.0 (Heraeus). Ćelije su onda resuspendovane u medijumu testa na 10<6>ćelija/ml.

Priprema efektorskih ćelija

[0081] Efektorske ćelije (T ćelije) korišćene u ovom metodu su limfociti iz periferne krvi (PBL), dobijeni negativnom selekcijom upotrebom kompleta sa CD14 i CD25 mikrokuglicama (Miltenyi Biotech Cat# 130-050-201 i 130-092-983 redom) iz jednojedarnih ćelija sveže izolovane periferne krvi (PBMC) iz venske krvi zdravih volontera. Ćelije su stimulisane sa antiCD3/CD28 obloženim kuglicama (Dynabeads® T cell expander, Invitrogen), transdukovane lentivirusima koji nose gene koji kodiraju potpuni α β TCR od interesa (na osnovu konstrukta opisanog u Primeru 5 i prikazanog na Slici 7) i umnožene u medijumu za ispitivanje koji sadrži 50U/ml IL-2 do između 10 i 13 dana nakon transdukcije. Ove ćelije su onda smeštene u medijum za ispitivanje pre pranja centrifugom na 1200 rpm, 10 min u Megafuge® 1.0 (Heraeus). Ćelije su onda ponovno suspendovane u medijumu za ispitivanje pri 4X finalno potrebnoj koncentraciji.

[0082] Ploče su pripremljene na sledeći način: 100 µl anti- IFN γ antitela za hvatanje je razblaženo u 10 ml sterilnog PBS po ploči. 100 µl razblaženih antitela za hvatanje je zatim raspoređeno u svaki bunarčić. Ove ploče su onda inkubirane preko noći na 4°C. Posle inkubacije ploče su oprane (program 1, ploča tipa 2, uređaj za pranje ploča sa 96 bunarčića Ultrawash Plus; Dynex) kako bi se uklonila antitela za hvatanje. Ploče su onda blokirane dodavanjem 200 µl medijuma za ispitivanje u svaki bunarčić i inkubirane na sobnoj temperaturi dva sata. Medijum za ispitivanje je onda opran sa ploča (program 1, ploča tipa 2, uređaj za pranje ploča sa 96 bunarčića Ultrawash Plus, Dynex) i bilo koji ostatak medijuma je uklonjen lupkanjem i tapkanjem ELISPOT ploča na papirnom ubrusu.

[0083] Sastojci testa su onda dodati ELISPOT ploči po sledećem rasporedu:

50 µl ciljnih ćelija 10<6>ćelija /ml (što daje ukupno 50 000 ciljnih ćelija/bunarčiću) 50 µl medijuma (medijum za ispitivanje)

50 µl efektorskih ćelija (20000 TCR-transdukovanih PBL ćelija/bunarčiću)

[0084] Ploče su onda inkubirane preko noći (37°C/5%CO2). Sledećeg dana su ploče oprane tri puta (program 1, ploča tipa 2, uređaj za pranje ploča sa 96 bunarčića Ultrawash Plus, Dynex) puferom za pranje i sušene tapkanjem na papirnom ubrusu kako bi se uklonio višak pufera za pranje. Onda je dodato u svaki bunarčić po 100 µl antitela za primarnu detekciju. Antitela za primarnu detekciju su razblažena u 10 ml pufera za razblaživanje (zapremina koja je potrebna za jednu ploču) koristeći razblaženja navedena u uputstvu proizvođača. Ploče su onda inkubirane na sobnoj temperaturi bar 2 sata pre nego što su oprane tri puta (program 1, ploča tipa 2, uređaj za pranje ploča sa 96 bunarčića Ultrawash Plus, Dynex) puferom za pranje; zaostali pufer za pranje je uklonjen tapkanjem ploče na papirnom ubrusu.

[0085] Sekundarna detekcija je urađena dodavanjem 100 µl razblaženog streptavidin-HRP u svaki bunarčić i inkubiranjem ploča na sobnoj temperaturi 1 sat. Streptavidin-HRP je razblažen u 10 ml pufera za razblaživanje (zapremina koja je potrebna za jednu ploču), koristeći razblaženja navedena u uputstvu proizvođača. Ploče su oprane tri puta (program 1, tip pločica 2, uređaj za pranje ploča sa 96 bunarčića Ultrawash Plus, Dynex) puferom za pranje i sušene tapkanjem na papirnom ubrusu kako bi se uklonio višak pufera za pranje. Ploče su onda oprane dva puta sa PBS dodavanjem 200 µl u svaki bunarčić, odlivanjem pufera i tapkanjem na papirnom ubrusu da bi se uklonio zaostali pufer. Ne više od 15 minuta pre upotrebe, jedna kap (20 µl) AEC hromogena je dodata u svakih 1 ml AEC supstrata i sve je promešano. 10 ml ovog rastvora je pripremljeno za svaku ploču; 100 µl je dodato po bunarčiću. Ploča je onda zaštićena od svetlosti upotrebom folije, i redovno se pratila pojava tačaka, obično u periodu od 5-20 minuta. Ploče su oprane vodom sa česme kako bi se završila razvojna reakcija, i sušene protresanjem pre njihovog rastavljanja na tri konstitutivna dela. Ploče su onda sušene na sobnoj temperaturi bar 2 sata pre brojanja tačaka upotrebom Immunospot® čitača ploča (CTL; Cellular Technology Limited).

REZULTATI

[0086] Oslobađanje IFN� iz aktiviranih TCR-transdukovanih T ćelija kao odgovor na različite AFP-pozitivne i kontrolne tumorske ćelijske linije ispitivano je ELISPOT testom (koji je opisan gore). Broj ELISPOT tačaka dobijen u svakom bunarčiću je prikazan upotrebom Graph Pad Prism®.

2

[0087] CD4+, CD8+ ili pomešane CD4+/CD8+ T ćelije koje eksprimiraju WT TCR ili jedan od TCR Br:1-5 (opisan u tabeli ispod) inkubirane su sa AFP+ HLA:A2+ tumorskom ćelijskom linijom HepG2 ili sa AFP- HLA:A2+ HEP2 normalnim hepatocitima. Kao kontrola je korišćen uzorak koji ne sadrži T ćelije.

[0088] Slika 9 pokazuje da se T ćelije transdukovane sa TCR opisanim u tabeli iznad aktiviraju kao odgovor na AFP pozitivne tumorske ćelije (HepG2). Aktivacija ovih varijanti TCR je veća nego kod WT TCR. Aktivacija pomoću AFP negativnih normalnih hepatocita (HEP2) je minimalna ukazujući na specifičnost TCR za AFP.

2

2

2

2

1

2

4

4

4

4

4

4

4

4

1

2

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. T–ćelijski receptor (TCR) koji ne postoji u prirodi i/ili je prečišćen i/ili konstruisan, koji ima svojstvo vezivanja za FMNKFIYEI (SEQ ID Br: 1) HLA-A2 kompleks i sadrži bar jedan varijabilni domen alfa lanca TCR i bar jedan varijabilni domen beta lanca TCR,

pri čemu varijabilni domen alfa lanca sadrži Q1 do H112 iz SEQ ID Br: 11, SEQ ID Br 12, SEQ ID Br 13, SEQ ID Br 14 ili SEQ ID Br 15, i

varijabilni domen beta lanca sadrži D1 do T112 iz SEQ ID Br: 3.

2. TCR prema patentnom zahtevu 1 koji ima TRAC sekvencu konstantnog domena alfa lanca i/ili TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena beta lanca.

3. TCR prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što je(su) sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanaca modifikovana(e) skraćivanjem ili supstitucijom kako bi se uklonila prirodna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 u TRAC i Cys2 egzona 2 u TRBC1 ili TRBC2.

4. TCR prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, naznačen time, što je(su) sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanaca modifikovana(e) supstitucijom cisteinskih rezidua za Thr 48 u TRAC i Ser 57 u TRBC1 ili TRBC2, pri čemu cisteini formiraju disulfidnu vezu između konstantnih domena alfa i beta lanaca TCR.

5. TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji je u jednolančanom formatu tipa V α-L-V β, V β-L-V α, V α-C α-L-V β, V α-L-V β-C β, ili V α-C α-L-V β-C β pri čemu su V α i V β α i β varijabilni regioni TCR redom, C α i C β su α i β konstantni regioni TCR redom, i L je linkerska sekvenca.

6. TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koji je alfa-beta heterodimer.

7. TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva povezan sa detektabilnom oznakom, terapeutskim agensom ili fragmentom koji modifikuje farmakokinetička svojstva.

8. Nukleinska kiselina koja ne postoji u prirodi i/ili je prečišćena i/ili konstruisana, koja kodira TCR prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

9. Ćelija koja ne postoji u prirodi i/ili je prečišćena i/ili konstruisana, koja prezentuje TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.

10. Ćelija prema patentnom zahtevu 9, koja je T-ćelija.

11. Ćelija koja sadrži

(a) TCR ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 8 koja kodira u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva odvojena otvorena okvira čitanja, alfa lanac i beta lanac redom; ili

(b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 ili ćelija prema patentnom zahtevu 9, 10 ili 11, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili pomoćnih supstanci.

13. TCR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili ćelija prema patentnom zahtevu 9, 10 ili 11, za upotrebu u medicini.

14. TCR ili ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, za upotrebu u postupku za lečenje kancera.

15. TCR ili ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu postupak sadrži adoptivnu terapiju.