RS59283B1 - Proteini sa dipeptidnim ponovkom kao terapeutsko ciljno mesto kod neurodegenerativnih bolesti sa ekspanzijom heksanukleotidnog ponovka - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za polipeptid koji se sastoji od (Gly-Ala)a dipeptidnih ponovaka, pri čemu je a ceo broj od 16 ili više, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvence aminokiselina HCDRl do HCDR3 i LCDR1 do LCDR3 kako je ovde navedeno.

Osnova pronalaska

[0002] Neurodegenerativni poremećaji su uobičajeno okarakterisani proteinskim depozicijama koje su specifične za bolest. Štaviše, u brojnim neurodegenerativnim bolestima mutacije koje uzrokuju genetički nasleđene varijante bolesti su povezane sa genima koji kodiraju proteinske depozicije, njihove prekursore ili njihove modulirajuće enzime. Funkcionalna analiza ovih genetskih varijanti je u osnovi pomogla u razumevanju mehanizama povezanih sa Alchajmerovom bolešću (AD) i Parkinsonovom bolešću (Gasser et al., 2011, Haass et al., 2007). Degeneracija frontotemporalnog režnja (FTLD) i amiotrofična lateralna skleroza (ALS) su ekstremni krajevi spektra preklapajućih neurodegenerativnih poremećaja koji su promenljivo povezani sa demencijom, promenama ličnosti, jezičkim nepravilnostima i progresivnom mišićnom slabošću (Josephs et al., 2011; Mackenzie et al., 2010; Rademakers et al., 2012). Istraživanje ALS-a i FTLD-a dramatično je ubrzano identifikacijom RNK/DNK vezujućeg proteina TDP-43 (Tar DNK vezujući protein od 43 kDa) kao obilno deponovanog proteina (Arai et al., 2011; Neumann et al., 2006) i otkrićem da mutacije u TARDBP uzrokuju porodične varijante obe bolesti (Benajiba et al., 2009; Sreedharan et al., 2008). Većina slučajeva pokazuje unutarćelijske inkluzije koje su snažno pozitivne na fosforilisani TDP-43. Ovi nalazi su takođe pomogli da se razvije koncept po kojem su ALS i FTLD multisistemski poremećaji sa preklapajućim kliničkim i patološkim karakteristikama i sličnim funkcionalnim i genetskim uzrocima (Rademakers et al., 2012; Sieben et al., 2012) i koji su, zato, klasifikovani kao FTLD-TDP, FTLD/ALS-TDP ili ALS-TDP. Pored TDP-43 i dugo poznatog SOD1 (super oksid dismutaza 1) gena, brojni drugi geni/faktori rizika povezani sa ALS i/ili FTLD su otkriveni uključujući FUS (fuzionisan u sarkomu), OPTN (optineurin), Ataxin 2, Chmp2B, VCP (protein koji sadrži valozin), TMEM106B, GRN (Progranulin), PFN (Profilin) i C9orf72 gen. Patološke ekspanzije ponovka u C9orf72 su pronađene u oko 40% porodičnih ALS pacijenata i 20% porodične FTLD, pokazujući da je C9orf72 najčešći genetski uzrok ovih neizlečivih poremećaja.

[0003] Nedavno, ekspanzija heksanukleotidnog ponovka GGGGCC u C9orf72 genu identifikovana je kao najčešća patogena mutacija u porodicama sa autozomno dominantnim FTLD, FTLD/ALS i ALS (DeJesus-Hernandez et al. 2011; Renton et al. 2011; Gijselinck et al. 2012). Dalje je otkriveno da je ekspanzija heksanukleotidnog ponovka unutar regulatornog regiona C9orf72 gena najčešći uzrok porodične amiotrofične lateralne skleroze i drugi najčešći uzrok degeneracije frontotemporalnog režnja. Ekspanzija heksanukleotidnog ponovka nalazi se uzvodno od C9orf72 otvorenog okvira čitanja, bilo u prvom intronu ili regionu promotora, zavisno od izoforme transkripta (videti Sl. 8A). Iako ekstremni sadržaj GC-a isključuje sekvenciranje kod pacijenata, veruje se da je broj jedinica ponovka GGGGCC najmanje nekoliko stotina u poređenju sa manje od 25 u zdravim kontrolama (van der Zee et al.2012). Patomehanizmi koji dovode do bolesti međutim ostali su nejasni.

[0004] Pacijenti sa C9orf72 ekspanzijom ponovka imaju kliničke simptome slične ostalim pacijentima sa FTLD/ALS-TDP, ali pokazuju nekoliko jedinstvenih patoloških karakteristika (Al-Sarraj et al. 2011; Boxer et al. 2011; Bigio et al. 2012; Whitwell et al. 2012). Agregati fosforilisanog TDP-43 su praćeni obilnim tačkastim i zvezdastim fosfo-TDP-43 negativnim citoplazmatskim inkluzijama u neuronima, posebno u cerebelumu, hipokampusu i frontotemporalnom neokorteksu koje se mogu identifikovati samo antitelima za p62, ubikvitin ili srodne ubikviline. Ovi fosfo-TDP-43 negativni agregati su visoko karakteristični za bolesne nosioce mutacije C9orf72 i odsutni su u drugim varijantama FTLD/ALS-TDP. Identitet jednog ili više proteina bolesti u ovim inkluzijama i njihov odnos sa C9orf72 ekspanzijom heksanukleotidnog ponovka je ostao nejasan. Iz istraživanja drugih neurodegenerativnih bolesti sa ekspanzijom ponovka izvan otvorenog okvira čitanja predložena su dva glavna patomehanizma:

[0005] Smatra se da ekspanzije ponovka u nekodirajućim regulatornim regionima gena uzrokuju bolest putem dva različita mehanizma koji se međusobno ne isključuju. Prvo, zbog ogromne dužine ekspanzije ponovka transkripcija i/ili obrada mogu biti pogođene što dovodi do haploinsuficijencije (van der Zee et al. 2012). Drugo, toksičnost RNK uzrokovana sekvestracijom proteina koji se vežu za RNK takođe može biti uzročna (Ranum et al., 2006). Trenutno, postoje dokazi za obe mogućnosti. Uočavanje nukleusnih RNK fokusa kod pacijenata sa ekspanzijom heksanukleotidnog ponovka GGGGCC, nalaz o kome se još uvek kontroverzno govori, sugeriše da esencijalni RNK vezujući proteini uhvaćeni u zamku mogu biti uključeni u bolest. Štaviše, nalaz smanjene ekspresije C9orf72 iRNK i smanjene transkripcione aktivnosti promotora C9orf72 na intermedijernim (7-24 ponovaka) alelima (DeJesus-Hernandez et al. 2011; Gijselinck et al. 2012; van der Zee et al. 2012) sugeriše gubitak funkcije kao mehanizam koji uzrokuje bolest. Ovi scenariji nisu međusobno isključujući i mogu se čak dešavati paralelno.

[0006] Nejasno je kako C9orf72 ekspanzija ponovka dovodi do karakterističnih p62-pozitivnih/TDP-43-negativnih inkluzija i naknadne neurodegeneracije. Postoji preko 150 radova o genetici i patologiji C9orf72. Međutim, funkcionalni podaci su i dalje veoma ograničeni.

[0007] Ovde prvi put otkrivamo da većina ovih karakterističnih inkluzija sadrži poli-(Gly-Ala) i u manjoj meri poli-(Gly-Pro) i poli-(Gly-Arg) proteine sa dipeptidnim ponovkom (DPR) koji su nastali ne-ATG-iniciranom translacijom od ekspandiranih GGGGCC ponovaka u tri okvira čitanja. Ovi nalazi direktno povezuju FTLD/ALS-asociranu genetsku mutaciju sa karakterističnom patologijom kod pacijenata sa C9orf72 ekspanzijom heksanukleotida.

[0008] Za sada postoji samo dokaz ne-ATG-inicirane translacije regiona egzonskog ponovka kod dve bolesti (Zu et al.2011). ATXN8 kodira prirodni poli-Q deo koji može uzrokovati poli-Q inkluzije nakon ekspanzije ponovka kod pacijenata sa spinocerebelarnom ataksijom tip 8 (SCA8). Ekspandirani CAG-ponovak translatira se u sva tri okvira čitanja (poli-Q, poli-A i poli-S) čak i nakon uklanjanja endogenog startnog kodona. Pronađeni su poli-Q i poli-A u agregatima pacijenta. Dalje, miotonična distrofija tipa 1 (DM1) uzrokovana je ekspanzijom CTG u 3'UTR gena DMPK. Otkrivena je translacija u retke poli-Q agregate kod pacijenata sa DM1 i u mišjim modelima. Mehanizam koji leži u osnovni je nazvan ponovak-asocirana ne-ATG-inicirana translacija (repeat-associated non-ATG-initiated translacion) (RAN) i patentiran je za poremećaje tri-, tetra- i pentanukleotidnog ponovka (WO2010/115033 A9). RAN translacija nije prikazana za intronske ponovke ili heksanukleotidne ponovke. U jednom članku komentaru Laura Ranum spekuliše o RAN-translaciji kod pacijenata sa C9orf72 (Ashizawa i Ranum 2012). Takođe je moguće da je translacija DPR proteina inicirana iz nekanonskog start kodona 5' regiona ponovka (Ivanov, I. P. et al. 2011; Peabody D. S. 1989; Touriol C. et al., 2003)

[0009] Pokazujemo po prvi put ne-ATG-iniciranu translaciju ekspanzije intronskog ponovka, koja uzrokuje p62-pozitivne/TDP43-negativne agregate poli-GA, poli-GP i poli-GR. Ovaj neobični mehanizam translacije i visoko abnormalni proizvod će olakšati selektivnije terapeutske pristupe nego što je to moguće za druge neurodegenerativne bolesti. Inhibiranje nastanka ili agregacije abnormalnih proteina sa dipeptidnim ponovkom će sprečiti ili odložiti napredovanje bolesti kod nosilaca mutacije. DPR patologija se može upotrebiti za sprečavanje, odlaganje ili lečenje FTD/ALS kod nosilaca mutacije C9orf72 destabilisanjem specifično C9ORF72 (intronske) RNK (npr. siRNK, anti-sens, izmena C9orf72 obrade), inhibirajući transkripciju ponovka i/ili translaciju u DPR (pretraga za RAN-specifične inhibitore translacije), i sprečavanjem agregacije DPR-a ili promovisanjem degradacije ili uklanjanja (hemijskim jedinjenjima ili imunoterapijom).

[0010] Slični mehanizmi su verovatno primenljivi za SCA36, uzrokovan ekspanzijom heksanukleotida GGCCTG u NOP56 (Kobayashi et al.2011). Neki od okvira čitanja kodiraju DPR kao u C9orf72, poli-GP i poli-PR, međutim sa različitim bočnim regionima. Stoga će terapeutski lekovi otkriveni za C9orf72 pacijente verovatno takođe biti korisni za SCA36 pacijente.

[0011] Agregirajući dugi (Gly-Ala) ponovci nisu poznati kod drugih humanih ili virusnih proteina. Međutim, Epštajn-Bar (Ebstein-Barr) virus kodira antigen bogat glicinom i alaninom. Dillner J. et al. (1984) PNAS 81: 4652 otkriva antitela prema sintetičkom peptidu za vezivanje Epštajn-Bar virus-determinišućeg nukleusnog antigena.

Sažetak pronalaska

[0012] U prvom aspektu ovaj pronalazak daje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za polipeptid koji se sastoji od (Gly-Ala)adipeptidnih ponovaka, pri čemu je a ceo broj od 16 ili više, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži CDR3 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 53; CDR2 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 54; i CDR1 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 55.

i

(i) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYTFTGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 68, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži EILPGSGSTK u skladu sa SEQ ID NO: 64 i CDR3 sekvencu koja sadrži GDFTNSHFAY u skladu sa SEQ ID NO: 60;

ili

(ii) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYTFTGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 68, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži ENLPGSGSTK u skladu sa SEQ ID NO: 65 i CDR3 sekvencu koja sadrži GDYSNSHFAY u skladu sa SEQ ID NO: 57;

ili

(iii) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYKFIGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 69, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži ENLPGSGTTK u skladu sa SEQ ID NO: 66 i CDR3 sekvencu koja sadrži GDYSNSHFTY u skladu sa SEQ ID NO: 59.

[0013] U drugom aspektu ovaj pronalazak daje farmaceutski preparat koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa prvim aspektom pronalaska i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0014] U trećem aspektu ovaj pronalazak daje upotrebu antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta u skladu sa prvim aspektom pronalaska u in vitro dijagnozi bolesti koju karakteriše ekspanzija genomskih GGGGCC ponovaka, pri čemu je bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od amiotrofične lateralne skleroze (ALS), frontotemporalne demencije (FTD), i amiotrofične lateralne skleroze-frontotemporalne demencije (ALS-FTD).

Spisak slika

[0015] U nastavku je opisan sadržaj slika sadržanih u ovoj specifikaciji. U ovom kontekstu, molimo takođe se pozovite na detaljan opis pronalaska iznad i/ili ispod.

Sl 1: Ekspandirani GGGGCC-ponovci se translatiraju u agregirajuće proteine sa dipeptidnim ponovkom (DPR). (A) Validacija antitela specifičnih za DPR imunoblotiranjem sa prečišćenim GST-fuzionim proteinima koji sadrže (GA)15, (GP)15ili (GR)15. (B) konstrukti GGGGCC-ponovka sa naznačenom dužinom ponovka kojima nedostaje uzlazni ATG su transfektovani u HEK293 ćelije. Restrikciona digestija za procenu dužine ponovka transfektovanih konstrukata (gornji panel). Imunoblotovi pokazuju ekspresiju u zavisnosti od dužine poli-GA i poli-GP proteina. Poli-GA proizvodi su se mogli otkriti počevši od ~38 ponovaka (strelica). Zvezdica označava nespecifičnu traku. Poli-GR proizvodi nisu otkriveni (nije prikazano). (C) Test filter zamke iz cerebeluma pacijenta (videti Sl. 2). Nerastvorljive frakcije Triton-X 100 resuspendovane su u 2% SDS, filtrirane kroz celulozno-acetatne membrane i zadržani proteini su detektovani sa naznačenim antitelima. (D) SDS-nerastvorljiva frakcija iz (C) je prokuvana u 4x Lamli (Lämmli) puferu (koji sadrži 8% SDS) i analizirana imunoblotiranjem. Strelice označavaju vrh gela.

Sl 2: Sažetak nalaza u slučajevima FTLD/ALS i kontrolama. Sažetak imunohistohemijskih nalaza za DPR, p62 i TDP-43 inkluzije za sve analizirane pacijente. TDP-43 patologija ispitivana je fosfo-TDP-43 ili pan-TDP-43 antitelima. NE, nije ispitivano. NA, nije dostupno.

Sl 3: Pregled DPR-patologije u cerebelumu. Imunohistohemija u cerebelarnom granularnom sloju upoređuje inkluziju obojenu sa p62, poli-GA, poli-GP i poli-GR specifičnim antitelima kod FTLD/ALS pacijenta sa C9orf72 mutacijom (TJ-1). Broj p62-pozitivnih agregata (A) sličan je broju poli-GA agregata (B), dok su poli-GP i poli-GR agregati ređi (C, D). Kod pacijenata i kontrola poli-GR antitela dodatno su pokazala slabo nukleusno i citoplazmatsko bojenje, verovatno zbog unakrsne reakcije sa prirodnim kratkim Gly-Arg ponovcima prisutnim u nekoliko DNK/RNK-vezujućih proteina. Barovi označavaju 20 μm. CBL-GL cerebelarni granularni sloj.

Sl 4: DPR proteini formiraju karakteristične TDP-43 negativne inkluzije kod pacijenata sa C9orf72. Imunohistohemija sa antitelima specifičnim za DPR (GA, GP, GR) otkriva poli-GA, poli-GP i poli-GR inkluzije koje nalikuju p62-pozitivnim agregatima kod FTLD/ALS pacijenata sa C9orf72 mutacijom (uporediti Sl.2). Tačkaste i inkluzije u vidu niti u cerebelarnom granularnom sloju (CBL-GL) (A-E).

Citoplazmatske zvezdaste (F-I) i intranukleusne tačkaste (J) inkluzije u hipokampalnim cornu ammonis regionima 2 i 3 (CA2 i CA3). Inkluzija mešovite morfologije u cerebelarnom molekulskom sloju (CBL-ML) i granularnom sloju dentatnog girusa (DG-GL) (K, L). Imajte na umu da su kod pacijenata i kontrola poli-GR antitela takođe pokazala slabo nukleusno i citoplazmatsko bojenje. Barovi označavaju 20 μm. Anti-GA i anti-GP specifičnost potvrđena je eksperimentima preinkubacije sa rekombinantnim antigenima (Sl. 5 A-F). Validacija anti-GR bila je samo moguća imunoblot eksperimentima (Sl. 1A), jer se sam poli-GR antigen vezao direktno na tkivo (Sl. 5 G-K). (M-O) Dvostruka imunofluorescencija otkriva sastav DPR-agregata kod C9orf72 FTLD/ALS pacijenta TJ-1. Nije primećena kolokalizacija DPR proteina sa fosfo-TDP-43 (videti Sl.6). Barovi označavaju 10 μm.

Sl 5: Preinkubacija sa poli-(Gly-Ala) i poli-(Gly-Pro) antigenima potvrđuje specifičnost anti-GA i anti-GP antitela. Imunohistohemija u hipokampalnom CA4 regionu C9orf72 mutacije slučaja TJ-1 obojena antitelima prema poli-GA, poli-GP i poli-GR preinkubiranim sa GST-(GA)15, GST-(GP)15, GST-(GR)15ili GST (označeno ružičastom bojom). Preinkubacija sa GST-(GA)15i GST-(GP)15potpuno je blokirala signale bojenja (uporediti (A) i (B) za anti-GA i (D) i (E) za anti-GP). Iznenađujuće, GST-(GR)15snažno je pojačao vidljive poli-GR signale (uporediti (G) i (H)). To je zbog direktnog vezivanja pozitivno naelektrisanog GST-(GR)15proteina za tkivo (pretpostavlja se za DNK, RNK i fosfolipide), pošto je anti-GST antitelo pokazalo identičan pojačani obrazac bojenja kada je preinkubirano sa GST-(GR)15(uporediti panel (J) i (K)). Preinkubacija sa GST nije oslabila imunohistohemijsku detekciju poli-GA, poli-GP i poli-GR (C, F, I). Barovi označavaju 20 μm.

Sl 6: DPR-agregati kolokalizuju sa p62, ali ne i TDP-43. Imunofluorescencija C9orf72 pacijenta TJ-1 sa navedenim antitelima pokazuje da nema ko-agregacije poli-GA i poli-GP sa fosfo-TDP-43-pozitivnim agregatima u hipokampusu (A-C). Međutim, slično poli-GA (Sl. 4M), poli-GP i poli-GR kolokalizovali su sa p62-pozitivnim agregatima (D, E). Depozicija poli-GA povremeno je primećena u fosfo-TDP-43 agregatima, ali nikada obrnuto, što ukazuje da deponovanje poli-GA prethodi agregaciji TDP-43 (F). Kolokalizacija p62 i DPR pozitivnih inkluzija u cerebelumu i hipokampalnom regionu CA4 kvantifikovana dvostrukom imunofluorescencijom kod tri pacijenta sa C9orf72 mutacijom (TJ-1, TJ-2 i TJ-3). U cerebelumu ukupno 370 do 822 (poli-GA analiza), 123 do 566 (poli-GP analiza) i 211 do 596 (poli-GR analiza) inkluzija je izbrojano po pacijentu. U CA4 ukupno je analizirano 48-73 inkluzije po pacijentu za svaku DPR vrstu (G). Barovi označavaju 10 μm. CA3 i CA4, hipokampalni cornu ammonis regioni 3 i 4; DG-GL, granularni sloj dentatnog girusa.

Sl 7: Patologija DPR-a je specifična za pacijente sa C9orf72 ekspanzijom heksanukleotidnog ponovka (A, B) Imunohistohemija sa poli-GA specifičnim antitelima (GA) ne otkriva agregate kod FTLD-TDP pacijenta (TJ-13) bez C9orf72 ekspanzije ponovka i u slučaju sa Hantingtonovom bolešću (TJ-11). Fosfo-TDP-43 i Hantington inkluzije se lako otkrivaju. Granularni sloj dentatnog girusa (DG-GL) i frontalni korteks, respektivno. (C) Poli-GA-pozitivne inkluzije, ali ne i fosfo-TDP-43 inkluzije u temporalnom korteksu pacijenta TJ-10 sa C9orf72 mutacijom dijagnostikovanom sa FTLD-UPS. Barovi označavaju 20 μm.

Sl 8: Diferencijalna regulacija C9orf72 transkripta kod nosilaca mutacija. (A) Genomska struktura C9orf72 (nije nacrtano u razmeri). (B) qPCR analiza pokazuje smanjenu ekspresiju obrađene zrele C9orf72 iRNK u cerebelumu slučajeva C9orf72 mutacije. Prajmeri iz egzona 2 do 3 otkrivaju sve C9orf72 izoforme. Prajmeri iz egzona lb do 2 otkrivaju alternativne transkripte kojima nedostaje ekspanzija ponovka. (C) Snažno povećana ekspresija sens i antisens transkripata koji sadrže C9orf72 intron 1. Prajmeri koji su upotrebljeni za reverznu transkripciju specifičnu za lanac i qPCR prikazani su na (A). Podaci su srednje vrednosti /- SEM. * označava p<0,05, # označava p<0,058 (Studentov t-test). Cerebelum od N=3 C9orf72 pacijenta i N=6 kontrola, koje uključuju zdrave individue i FTLD/ALS pacijente bez C9orf72 mutacije (kao na Sl.1C/D).

Sl 9: Identifikacija vezujućih proteina koji su specifični za GGGGCC-heksanukleotidni ponovak. (A) Reprezentativni srebrom obojeni gelovi koji pokazuju proteine koji se svlače odgovarajućim RNK koje sadrže ponovak. HEK293 nukleusni ekstrakti su inkubirani naznačenim RNK probama sa (+) ili bez (-) 50 puta u višku nebiotinilisanog RNK kompetitora. Vezivanja RNK/protein bila su oslabljena sa povećanjem koncentracije NaCl. U prisustvu GGGGCC kompetitora (G+), vezivanje RNK-protein je inhibirano, i proteini u protoku kroz (FL) frakciju su povećani. Uokvirene trake u 500 mM NaCl frakcijama elucije izrezane su radi identifikacije proteina pomoću LC-MS/MS. (B) Vestern blot (Western blot) analiza potvrđuje specifično vezivanje odabranih proteina za GGGGCC-ponovak. Alikvoti proteina koji se eluiraju na različitim koncentracijama soli podvrgnuti su elektroforezi, i vestern blot je izveden upotrebom navedenih antitela. Svi proteini pokazuju specifično vezivanje za GGGGCC-ponovak na visokim koncentracijama NaCl. Imajte na umu da je vezivanje bilo potpuno blokirano 50-puta u višku neobeleženim GGGGCC (+). HnRNP F, što nije jedan od 20 vezujućih proteina koji su specifični za GGGGCC-ponovak, upotrebljen je kao negativna kontrola. A, AAAACC ponovci; FL, protok kroz; G, GGGGCC ponovci.

Sl. 10: Lista 20 izabranih proteina koji se specifično vezuju za GGGGCC-ponovak 20 proteina je izabrano kao specifični vezujući proteini za GGGGCC ponovak na osnovu strogih kriterijuma opisanih u Primeru 9. Kvantitativna vrednost odražava relativnu količinu proteina procenjenu na osnovu intenziteta LC-MS/MS signala dobijenog iz 500mM elucije upotrebom Skafold programa (Scaffold software). U prisustvu ne-biotinilisanog kompetitora (kompeticija) GGGGCC ponovka vezivanje svih proteina je efikasno sprečeno. Osim toga, ovi proteini pokazuju najmanje 2 puta više vezivanja za GGGGCC RNK ponovak (GC) u poređenju sa AAAACC RNK ponovkom (AC). Ovde prikazane kvantitativne vrednosti su prosek tri nezavisna eksperimenta.

Sl 11: Identifikacija antitela koja se specifično vezuju za GGGGCC-ponovak (A) Reprezentativna vestern blot analiza koja pokazuje vezivanje odabranih GA-specifičnih antitela imunoblotiranjem sa prečišćenim GST-fuzionim proteinom koji sadrži GA-DPR (GA)15,. Alikvoti proteina su podvrgnuti elektroforezi, i vestern blot je izveden upotrebom navedenih antitela (GA 5E9, GA 5F2, GA 1A12). GST-fuzioni proteini koji sadrže GP-, GR, AP-, PR-DPR upotrebljeni su kao kontrola za specifičnost vezivanja GA. (B) ELISA eksperimenti koji pokazuju visok afinitet antitela specifičnih za GA. Antitela su inkubirana sa rastućim količinama GST-fuzionog proteina (GA)15i apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 450 nm. GST 2C8 antitelo je upotrebljeno kao kontrola. Da bi se utvrdila specifičnost vezivanja odabranih GA antitela, izvršena je ELISA. Zbog toga su ELISA ploče obložene magarećim-anti-mišjim antitelima (adsorbovana prema Ig pacova, 100 ng/bunarčiću) nakon čega sledi korak blokiranja (1% BSA u BBST). Prethodno obložene ploče su inkubirane sa mišjim anti-GA ili anti-GST antitelom za hvatanje (100 μl hibridomskog supernatanta razblaženog 1/5) i zatim inkubirane 1 sat na 37 °C sa serijom razblaženja GST-(GA)15. Vezani antigen je detektovan pacovskim anti-GST antitelom i sekundarnim magarećim anti-pacovskim HRP antitelom (adsorbovano prema mišjem Ig 40 ng/bunarčiću). Za kvantitativnu analizu, ploče su inkubirane sa HRP-supstratom TMB. Reakcija bojenja je zaustavljena sa HCl i izmerena je absorbanca na 450 nm.

Sl. 12: Sekvence varijabilnih regiona lakog lanca i varijabilnih regiona teškog lanca antitela GA 1A12, GA 5E9, i GA 5F2

Ovde su prikazane sekvence varijabilnih regiona lakih lanaca (LCVR) i teških lanaca (HCVR). Sekvence LCVR su identične, međutim, sekvence HCVR se razlikuju u tri različita anti-GA antitela (GA 1A12, GA 5E9, GA 5F2).

[0016] Sekvence LCVR i HCVR se mogu odrediti kao što je uobičajeno u stanju tehnike. Na primer, mogu se dobiti podaci kao što je opisano na http://antibody.bath.ac.uk/align.html. Sekvence CDR-a unutar odgovarajućeg teškog i lakog lanca su označene velikim slovima. Intervenirajući okvirni (framework) regioni navedeni su malim slovima.

Detaljan opis pronalaska

[0017] Pre nego što se ovaj pronalazak detaljno opiše u daljem tekstu, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense koji su ovde opisani pošto oni mogu varirati. Takođe treba razumeti da se ovde upotrebljena terminologija upotrebljava samo za opisivanje pojedinih primera izvođenja, i nije joj namena da ograniči opseg ovog pronalaska koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju ista značenja kao što ih obično razume onaj koji ima prosečno znanje u struci.

Definicije

[0018] U daljem tekstu su date neke definicije termina koji se često upotrebljavaju u ovoj specifikaciji. Ovi termini će, u svakom slučaju njihove upotrebe, u ostatku specifikacije imati odgovarajuće definisano značenje i poželjna značenja.

[0019] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koje slede, osim ako kontekst ne nalaže drugačije, reč "sadržati", i varijacije poput "sadrži" i "koji sadrži", treba razumeti kao uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kojeg drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka.

[0020] Kako se upotrebljava u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine neodređenih i određenih članova uključuju reference množine, osim ako sadržaj jasno ne diktira drugačije.

[0021] Kako se ovde upotrebljava, "individua" označava bilo kog sisara, gmizavca ili pticu koji mogu imati koristi od ovog pronalaska. Poželjno, individua je odabrana iz grupe koja se sastoji od laboratorijskih životinja (npr. miš, pacov ili zec), domaćih životinja (uključujući npr. zamorca, zeca, konja, magarca, kravu, ovcu, kozu, svinju, pile, patku, kamilu, mačku, psa, vodenu kornjaču, kopnenu kornjaču, zmiju, ili guštera) ili primata uključujući šimpanze, bonobe, gorile i ljudska bića. Posebno je poželjno da je "individua" ljudsko biće.

[0022] "Pacijent" je svaki primalac zdravstvenih usluga. Obično je pacijent bolestan ili povređen ili podložan bolesti ili povredi ili je u riziku od razvoja bolesti i stoga mu/joj treba lečenje od strane lekara, asistenta lekara, registrovane više medicinske sestre, veterinara, ili drugog zdravstvenog radnika. Kako se ovde upotrebljava, pacijent označava bilo kog sisara, gmizavca ili pticu koji mogu imati koristi od pronalaska koji je ovde opisan. Poželjno, "pacijent" je odabran iz grupe koja se sastoji od laboratorijskih životinja (npr. miš ili pacov), domaćih životinja (uključujući npr. zamorca, zeca, konja, magarca, kravu, ovcu, kozu, svinju, pile, patku, kamilu, mačku, psa, vodenu kornjaču, kopnenu kornjaču, zmiju, ili guštera) ili primata uključujući šimpanze, bonobe, gorile i ljudska bića. Posebno je poželjno da je "pacijent" ljudsko biće.

[0023] Termin "tkivo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na skup ćelija istog porekla koje ispunjavaju specifičnu funkciju usklađeno. Primeri tkiva uključuju, ali nisu ograničeni na nervno tkivo, mišićno tkivo, kost, hrskavicu, vezivno tkivo i epitelno tkivo. Više tkiva zajedno formiraju "organ" za obavljanje određene funkcije. Primeri organa uključuju, ali nisu ograničeni na mozak, mišić, srce, krv, skelet, zglob, jetru, bubreg, želudac, i kožu.

[0024] Termin "ćelija" kako se ovde upotrebljava može se odnositi ili na prokariotsku (npr. bakterijsku ćeliju) ili eukariotsku ćeliju (npr. ćeliju gljive, biljke ili životinje). Višećelijski organizmi sadrže nekoliko tipova ćelija diferenciranih da ispunjavaju različite funkcije u pomenutom organizmu. One uključuju, ali nisu ograničene na matične ćelije, embrionalne matične ćelije, ćelije nervnog sistema, ćelije krvi, ćelije imunskog sistema, mezenhimske ćelije, epitelne ćelije, intersticijalne ćelije, ćelije za metabolizam i skladištenje, žlezdana ćelije, ćelije vanćelijskog matriksa, kontraktilne ćelije, pigmentne ćelije, germinativne ćelije i tumorske ćelije. Termin "ćelija" kako se ovde upotrebljava takođe se odnosi na one ćelije koje su uklonjene iz svog prirodnog okruženja, poput izolovanih primarnih ćelija ili ćelijskih linija bilo kog od gore navedenih tipova ćelija. Obično se u biotehnološkim ispitivanjima upotrebljavaju ćelije poput bakterijske ćelije, ćelije kvasca, izolovane primarne ćelije ili ćelijske linije. U kontekstu ovog pronalaska izolovana primarna ćelija ili ćelijske linije su po mogućnosti poreklom od sisara.

[0025] Termini "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" ovde su upotrebljeni naizmenično. Molekuli nukleinske kiseline su podrazumevano polimerni ili oligomerni makromolekuli napravljeni od nukleotidnih monomera. Nukleotidni monomeri su sastavljeni od nukleobaze, šećera od pet ugljenika (kao što su, ali nisu ograničeni na ribozu ili 2ꞌ-dezoksiribozu), i jedne do tri fosfatne grupe. Obično se polinukleotid formira preko fosfodiestarskih veza između pojedinačnih nukleotidnih monomera. U kontekstu ovog pronalaska, povezivanje na molekule nukleinske kiseline uključuje, ali nije ograničeno na ribonukleinsku kiselinu (RNK), dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK), i njihove smeše, kao što su npr. RNK-DNK hibridi, kao i cDNK, genomsku DNK, rekombinantnu DNK, cRNK i iRNK. Nukleinska kiselina može da se sastoji od celog gena ili njegovog dela, nukleinska kiselina može takođe biti mikroRNK (miRNK) ili mala interferirajuća RNK (siRNK). MiRNK su kratki molekuli ribonukleinske kiseline (RNK), u proseku dugački samo 22 nukleotida, koji se nalaze u svim eukariotskim ćelijama. MircoRNK (miRNK) su post-transkripcioni regulatori koji se vezuju za komplementarne sekvence na ciljnim transkriptima informacione RNK (iRNK), obično rezultirajući represijom translacije i utišavanjem gena. Male interferirajuće RNK (siRNK), ponekad poznate i kao kratka interferirajuća RNK ili utišavajuća RNK, su kratke ribonukleinske kiseline (RNK molekuli), dužine između 20-25 nukleotida. Oni su uključeni u put RNK interferencije (RNKi), gde interferiraju sa ekspresijom specifičnih gena. Nukleinska kiselina takođe može biti veštačka nukleinska kiselina. Veštačke nukleinske kiseline uključuju poliamidnu ili peptidnu nukleinsku kiselinu (PNK), morfolino i zaključanu nukleinsku kiselinu (LNK), kao i nukleinsku kiselinu glikola (GNK) i nukleinsku kiselinu treoze (TNK). Svaka od njih se razlikuje od DNK ili RNK koje se nalaze u prirodi promenama na okosnici molekula.

[0026] Pogodni postupci detekcije nukleinskih kiselina kao što su DNK i/ili RNK uključuju npr. nortern blot (Northern blot) analizu, sautern blot (Southern blot) analizu, ispitivanja zaštite nukleaze (NPA), in situ hibridizaciju (ISH), lančanu reakciju polimeraze (PCR za detekciju DNK) i reverznu transkripciju-lančanu reakciju polimeraze (RT-PCR za detekciju RNK).

[0027] Termin "otvoren okvir čitanja" (ORF) odnosi se na sekvencu nukleotida koja se može translatirati u aminokiseline. Tipično, takav ORF sadrži start kodon, naredni region koji obično ima dužinu koja je višestruka od 3 nukleotida, ali ne sadrži stop kodon (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA, ili UGA) u datom okviru čitanja. Tipično, ORF-ovi se javljaju prirodno ili su veštački konstruisani, tj. gensko-tehnološkim sredstvima. ORF kodira za peptid, polipeptid, ili protein gde aminokiseline u koje se može translatirati formira lanac vezan za peptid.

[0028] Termini "genska ekspresija" ili "ekspresija" su ovde upotrebljeni naizmenično i odnose se na postupak kojim se genetske informacije upotrebljavaju za sintezu funkcionalnog genskog proizvoda. Tipično takav genski proizvod je peptid, polipeptid, ili protein, ili nukleinska kiselina kao što je ribozomalna RNK (rRNK), transportna RNK (tRNK) ili mala nukleusna RNK (snRNK). Genska ekspresija uključuje korake transkripcije, obrade RNK, translacije, i post-translacione modifikacije. Poželjno je da se termin upotrebljava za sintezu peptida, polipeptida ili proteina. Dakle, termin "detekcija ekspresije" poželjno se upotrebljava za detekciju ekspresije peptida, polipeptida ili proteina. Takva detekcija može se izvesti postupcima poznatim u stanju tehnike, naročito upotrebom liganada koji se specifično vezuju za peptid, polipeptid ili protein.

[0029] Tipično u sintezi proteina, DNK sekvenca koja kodira gen prvo se transkribuje u iRNK odakle se uklanjaju introni obradom RNK i egzoni se spajaju i naknadno translatiraju da bi se dobio aminokiselinski lanac, koji se onda savija u protein.

[0030] Termin "transkripcija" odnosi se na postupak u kojem je određeni segment DNK, tipično gen, transkribovan u RNK enzimom RNK polimerazom. Tokom transkripcije, DNK sekvenca se čita RNK polimerazom, koja stvara komplementarni, antiparalelni lanac RNK. Za razliku od replikacije DNK, transkripcija rezultira RNK komplementom koji uključuje uracil (U) u svim slučajevima u kojima bi se pojavio timin (T) u DNK komplementu. Ako transkribovan gen kodira protein, rezultat transkripcije je pre-informaciona RNK (iRNK) ili molekul iRNK, koji će se zatim translatirati u peptid, polipeptid ili protein. Alternativno, transkribovan gen može da kodira ili gene nekodirajuće RNK (kao što je mikroRNK, linkRNK, itd.) ili ribozomalnu RNK (rRNK) ili transportnu RNK (tRNK), druge komponente postupka sklapanja proteina, ili druge ribozime. "Obrada RNK" dešava se istovremeno ili posle postupka transkripcije i odnosi se na postupak gde se "introni" sadržani u pre-iRNK uklanjaju i "egzoni" se kovalentno spajaju.

[0031] Termin "intron" odnosi se na bilo koju nukleotidnu sekvencu unutar gena koja se uklanja obradom RNK. U stanju tehnike, termin intron se obično upotrebljava da označi obe, DNK sekvencu unutar gena i odgovarajuću sekvencu u RNK transkriptu koja se uklanja obradom RNK. Sekvence koje su spojene u konačnoj zreloj RNK nakon obrade RNK označavaju se kao "egzoni". Ponovo se termin egzon obično upotrebljava u stanju tehnike da označi obe, DNK sekvence unutar gena i odgovarajuće sekvence u RNK transkriptu koje su spojene tokom obrade RNK nakon uklanjanja introna.

[0032] Ribozomi olakšavaju proces "translacije" iRNK u aminokiselinski lanac indukujući vezivanje tRNK sa komplementarnim antikodon sekvencama iRNK. tRNK nose specifične aminokiseline koje se povezuju u polipeptid dok iRNK prolazi kroz i dok je "čita" ribozom. Tipično translacija je AUG-zavisan postupak, pri čemu je AUG kodon iRNK (koji odgovara ATG kodonu DNK) prepoznat kao mesto inicijacije translacije što rezultira time da je metionin prva aminokiselina u proizvedenom aminokiselinskom lancu. Međutim, takođe postoje i mehanizmi translacije nezavisni od AUG, npr. pri čemu metionin tRNK interaguje sa kodonom komplementarnim sa samo dva nukleotida. Kod virusa AUG-nezavisni translacioni mehanizam uključuje upotrebu unutrašnjih ribozomalnih mesta ulaska (IRES) koja strukturno oponašaju inicijatornu tRNK i manipulišu ribozomima da bi inicirali translaciju na ne-AUG mestu.

[0033] Termin "RAN-translacija" odnosi se specifično na AUG-nezavisan mehanizam translacije nukleotidnih ponovaka. U stanju tehnike je pokazano da se RAN-translacija dešava za egzonsku RNK koja sadrži trinukleotidne, tetranukleotidne i pentanukleotidne ponovke. U radu koji je vodio ka ovom pronalasku, iznenađujuće je pokazano i to da se intronska RNK transkribovana iz heksanukleotidnih ponovaka, prisutnih u genomu može translatirati RAN-translacijom. Polipeptidi koji su RAN-translatirani od takvih nukleotidnih ponovaka mogu se (ali ne moraju nužno) razlikovati od peptida ili polipeptida koji su translatirani na AUG-zavisan način po tome što im nedostaje početni metionin. Na primer, RAN-translacija može biti olakšana tako što prisustvo pomenutih nukleotidnih ponovaka promoviše formiranje strukture ukosnice koja kasnije pokreće RAN-translaciju.

[0034] Termini "aminokiselinski lanac" i "polipeptidni lanac" upotrebljavaju se sinonimno u kontekstu ovog pronalaska.

[0035] U kontekstu ovog pronalaska, termin "peptid" se odnosi na kratak polimer aminokiselina povezanih peptidnim vezama. Ima iste hemijske (peptidne) veze kao i proteini, ali je obično kraći u dužini. Najkraći peptid je "dipeptid", koji se sastoji od dve aminokiseline spojene jednom peptidnom vezom. Takođe mogu postojati tripeptidi, tetrapeptidi, pentapeptidi itd. Peptid takođe može da ima dužinu do 8, 10, 12, 15, 18 ili 19 aminokiselina. Peptid ima amino kraj i karboksilni kraj, osim ako nije ciklični peptid. U kontekstu ovog pronalaska, termin "dipeptidni ponovak (DPR)" se odnosi na dipeptid od dve aminokiseline koje su spojene jednom peptidnom vezom koji je dupliran nekoliko puta da bi se formirao duži peptid ili polipeptid, tj. dipeptidni ponovak može da sadrži 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 ili više dipeptida spojenih peptidnim vezama. Poželjno, dipeptidni ponovci su u opsegu od 500 do 10000, poželjnije u opsegu od 700 do 4500. "Dipeptidni ponovci" su proizvodi translacije heksanukleotidnih ponovaka. Značenje ovog termina dalje je opisano u nastavku. Potrebno je između ostalog, da najmanja jedinica ponovka ima dužinu od šest nukleotida, npr. u nukleotidnoj sekvenci "CGCGCGCGCGCG" (SEQ ID NO: 83) najmanja jedinica ponovka je "CG", pa je ova sekvenca dinukleotidni ponovak. S druge strane u nukleotidnoj sekvenci GGGCCCGGGCCC (SEQ ID N: 84) najmanja jedinica ponovka je "GGGCCC", pa je ovo heksanukleotidni ponovak. Heksanukleotid koji ne sadrži STOP kodon će stoga kodirati dipeptid i niz ponovaka takvih heksanukleotida će kodirati dipeptidni ponovak. Zbog degeneracije genetskog koda moguće je da postoji nukleotidna sekvenca koja ispunjava kriterijume da je heksanukleotidni ponovak koji kodira dipeptid identičnih aminokiselina, npr. najmanja jedinica ponovka nukleotidne sekvence "GGTGGCGGTGGC" (SEQ ID NO: 85) je "GGTGGC", koja kodira Gly-Gly. Međutim, poželjno je da dipeptid sadrži dve različite aminokiseline, npr. (Gly-Ala), (Gly-Pro), (Gly-Arg), (Ala-Pro), (Pro-Arg), Gly-Leu), (Ala-Trp), (Pro-Gly), (Ala-Gin). Inače, tj. ako bi aminokiseline dipeptida mogle biti identične, ne bi se moglo utvrditi za šest aminokiselina dug peptid da postoje tri dipeptidna ponovka, nego bi takvu sekvencu stručnjak smatrao ili heksapeptidom ili šestostrukim ponovkom monomera. Shodno tome, termin "dipeptidni ponovak (DPR)" se odnosi na dipeptid od dve različite aminokiseline koje su spojene jednom peptidnom vezom koji se duplira nekoliko puta da bi se formirao duži peptid ili polipeptid, tj. dipeptidni ponovak može da sadrži 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 ili više dipeptida spojenih peptidnim vezama.

[0036] Termin "polipeptid" odnosi se na jedan linearni lanac aminokiselina povezanih peptidnim vezama i poželjno sadrži najmanje oko 20 aminokiselina. Polipeptid može biti jedan lanac proteina koji se sastoji od više od jednog lanca, ili može biti i sam protein ako se protein sastoji od jednog lanca.

[0037] Termin "protein" odnosi se na molekul koji sadrži jedan ili više polipeptida koji uspostavljaju sekundarnu i tercijarnu strukturu i dodatno se odnosi na protein koji je sačinjen od više polipeptida, tj. nekoliko podjedinica, formirajući kvartarne strukture. Protein ponekad ima prikačene nepeptidne grupe, koje se mogu nazvati prostetičke grupe ili kofaktori.

[0038] "Izolovani peptid", "izolovani polipeptid", ili "izolovani protein" odnosi se na peptid, polipeptid ili protein koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja u ćeliji tako da drugi ćelijski materijal koji se normalno nalazi u blizini nije više prisutan. U kontekstu ovog pronalaska, takođe peptidi, polipeptidi ili proteini proizvedeni izvan svog prirodnog ćelijskog okruženja, npr. hemijskim sredstvima ili rekombinantnim sredstvima u ne-prirodnom okruženju smatraju se izolovanim peptidima, polipeptidima ili proteinima.

[0039] Polipeptidi ili proteini (uključujući proteinske derivate, varijante proteina, fragmente proteina, proteinske segmente, epitope proteina i domene proteina) mogu se dalje modifikovati hemijskom modifikacijom. Otuda, hemijski modifikovani polipeptid može da sadrži hemijske grupe i koje nisu ostaci koji se nalaze u 20 aminokiselina koje se javljaju u prirodi. Primeri takvih drugih hemijskih grupa uključuju bez ograničenja glikozilovane aminokiseline i fosforilisane aminokiseline. Hemijske modifikacije polipeptida mogu da daju povoljna svojstva u poređenju sa roditeljskim polipeptidom, npr. jedno ili više od povećane stabilnosti, produženog biološkog poluživota, ili povećane rastvorljivosti u vodi. Hemijske modifikacije uključuju bez ograničenja: PEGilovanje, glikozilaciju roditeljskih polipeptida koji nisu glikozilovani. Takve hemijske modifikacije primenljive na varijante koje se mogu upotrebljavati u ovom pronalasku mogu se dogoditi ko- ili post-translaciono.

[0040] "Antigeni protein" odnosi se u ovoj aplikaciji na polipeptid kao što je gore definisano koji sadrži barem jedan epitop. "Antigeni fragment" antigenog proteina je delimična sekvenca navedenog antigenog proteina koja sadrži najmanje jedan epitop. U svrhu imunizacije relevantni su samo oni delovi proteina koji izazivaju imunski odgovor. Prema tome, konstrukt nukleinske kiseline ne treba da kodira punu dužinu antigenog proteina kao što se nalazi npr. u bolesnoj ćeliji, ćeliji kancera, ili patogenu. Skraćeni fragment takvog proteina je dovoljan dokle god njegova aminokiselinska sekvenca sadrži epitop ili epitope odgovorne za prepoznavanje antigenog proteina od strane imunskog sistema. Termin "antigen" kako se ovde upotrebljava odnosi se na bilo koji molekul ili deo molekula, uključujući ali nije ograničen na nukleinsku kiselinu, aminokiselinu, peptid, polipeptid, protein, ugljeni hidrat, i lipid, za koji se ligand pronalaska veže.

[0041] Termin "epitop", kako je ovde upotrebljen, odnosi se na antigenu determinantu, koja je deo antigena koji specifično vezuje ligand ovog pronalaska, poželjno antitelo ili njegovim antigen-vezujući fragment. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitopi antigena mogu biti konformacioni epitop ili nekonformacioni, tj. linearni epitop. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Konformacioni epitop je sačinjen od isprekidanih delova aminokiselinske sekvence antigena. Ovi epitopi interaguju sa ligandom na osnovu karakteristika 3-D površine i oblika ili tercijarne strukture antigena. Većina epitopa su konformacioni. Nasuprot tome, linearni epitopi interaguju sa ligandom na osnovu svoje primarne strukture. Linearni epitop formira kontinuirana sekvenca aminokiselina iz antigena. Konformacioni epitopi poželjno sadrže između 8 i 20 diskontinuiranih aminokiselina, poželjno između 8 i 15 aminokiselina. Linearni epitopi imaju dužinu između 6 do 20 aminokiselina, poželjnije između 8 i 15 aminokiselina.

[0042] Peptidi, polipeptidi ili proteini mogu se otkriti različitim metodama, uključujući, ali ne ograničavajući se na test zamke filtera, vestern blot, enzim vezani imunosorbent test (ELISA), imunohistohemiju (IHC), imunocitohemiju (ICC), i ekskluzionu hromatografiju (SEC).

[0043] "Imunobojenje" uključujući, ali ne ograničavajući se na imunohistohemiju (IHC) ili imunocitohemiju (ICC), je metoda zasnovana na antitelu za otkrivanje specifičnog proteina u uzorku. Termin imunobojenje je izvorno upotrebljavan za označavanje imunohistohemijskog bojenja preseka tkiva. Sada, međutim, imunobojenje obuhvata širok spektar tehnika koje se upotrebljavaju u histologiji, ćelijskoj biologiji, i molekularnoj biologiji koje upotrebljavaju metode bojenja na bazi antitela. Dok su prvi slučajevi bojenja IHC upotrebljavali fluorescentne boje, druge ne-fluorescentne metode koje koriste enzime kao što je peroksidaza i alkalna fosfataza se sada češće upotrebljavaju. Ovi enzimi su u stanju da katalizuju reakcije koje daju obojeni proizvod koji se lako otkriva svetlosnom mikroskopijom. Alternativno, radioaktivni elementi se mogu upotrebljavati kao obeleživači, i imunoreakcije se mogu vizuelizovati autoradiografijom. Priprema tkiva ili fiksacija od suštinskog je značaja za očuvanje ćelijske morfologije i tkivne arhitekture. Neodgovarajuća ili produžena fiksacija može značajno umanjiti sposobnost vezivanja antitela. Mnogi antigeni se mogu uspešno demonstrirati na presecima tkiva koje je fiksirano formalinom i ukalupljeno u parafin. Optimizacija metoda i vremena fiksacije, pre-tretmana blokirajućim agensima, inkubacija antitelima sa visokim solima, i optimizacija pufera za ispiranje posle antitela i vremena ispiranja može biti važno za dobijanje visokokvalitetnog imunobojenja.

[0044] "Ekskluziona hromatografija (SEC)" je hromatska metoda koja omogućava razdvajanje molekula u rastvoru, npr. proteina, po njihovoj veličini, i u nekim slučajevima po molekulskoj masi. Obično se SEC primenjuje na velike molekule ili makromolekulske komplekse kao što su polipeptidi ili proteini. "Gel-filtraciona hromatografija" se obično odnosi na SEC, gde se vodeni rastvor upotrebljava za transport uzorka kroz kolonu, dok se „gel propusna hromatografija“ odnosi na SEC gde se organski rastvarač upotrebljava kao mobilna faza.

[0045] Termin "test zadržavanja na filteru" i "test zamke filtera" se ovde upotrebljavaju istovremeno i odnose se na analizu proteinskih agregata. Prečišćeni proteini se filtriraju kroz celulozno-acetatne filtere što rezultira zadržavanjem velikih agregata na filteru. Naknadno se ovi agregati vezani za membranu mogu okarakterisati bilo kojim sredstvima ili metodama poznatim u struci.

[0046] "Vestern blot" omogućava detekciju specifičnih proteina (nativnih ili denaturisanih) iz ekstrakata napravljenih od ćelija ili tkiva, pre ili posle bilo kojih koraka prečišćavanja. Proteini se uglavnom razdvajaju po veličini pomoću gel elektroforeze pre nego što se prebace na sintetičku membranu (obično nitroceluloza ili PVDF) suvim, polusuvim ili mokrim blot metodama. Membrana se zatim može ispitivati upotrebom antitela upotrebom metoda sličnih imunohistohemiji, ali bez potrebe za fiksacijom. Detekcija se obično vrši upotrebom antitela povezanih sa peroksidazom da katalizuju hemiluminescentnu reakciju. Vestern blot je rutinska metoda molekularne biologije koja se može upotrebljavati da se polu kvantitativno ili kvantitativno uporede nivoi proteina između ekstrakata. Razdvajanje po veličini pre blotovanja omogućava da se molekulska masa proteina odredi poredeći je sa markerima poznate molekulske mase. Vestern blot je analitička tehnika koja se upotrebljava za otkrivanje specifičnih proteina u datom uzorku tkivnog homogenata ili ekstrakta. Ona upotrebljava gel elektroforezu za razdvajanje proteina po dužini polipeptida (denaturišući uslovi) ili po 3-D strukturi proteina (nativni/nedenaturišući uslovi).

[0047] "Enzim vezani imunosorbent test (ELISA)" je dijagnostička metoda za kvantitativno ili polu-kvantitativno određivanje koncentracije proteina iz krvne plazme, seruma ili ekstrakata ćelija/tkiva na ploči sa više bunarčića (obično 96 bunarčića po ploči). Široko gledano, proteini u rastvoru se adsorbuju na ELISA ploče. Antitela koja se specifično vezuju za protein od interesa upotrebljavaju se kao probe za ploču.

[0048] "Elektronska mikroskopija (EM)" se može upotrebljavati za proučavanje detaljne mikro arhitekture tkiva ili ćelija. "Imuno-EM" omogućava detekciju specifičnih proteina na ultratankim presecima tkiva. Antitela obeležena česticama teških metala (npr. zlato) se mogu direktno vizuelizovati upotrebom transmisione elektronske mikroskopije.

[0049] "Marker", "oznaka", ili "obeleživač" je bilo koja supstanca koja može da ukaže na prisustvo druge supstance ili kompleksa supstanci. Marker može biti supstanca koja je povezana ili uneta u supstancu koju treba otkriti. Detektabilni markeri se upotrebljavaju u molekularnoj biologiji i biotehnologiji da bi se detektovao npr. protein, proizvod enzimske reakcije, sekundarni glasnik, DNK, interakcije molekula itd. Primeri pogodnih markera ili obeleživača uključuju fluoroforu, hromoforu, radio-obeleživač, metalni koloid, enzim, ili hemiluminescentni ili bioluminescentni molekul. Primeri fluorofora uključuju različite oblike zelenog fluorescentnog proteina (GFP), kao što su EnGFP, RFP, CYP, BFP, YFP, dsRed itd., fikobiliproteine (alofikocijanin, fikocijanin, fikoeritrin i fikoeritrocijanin), fluorescein (fluorescein izotiocijanat, FITC), rodamin (tetrametil rodamin izotiocijanat, TRITC), i cijanin boje (kao što su C2, Cy3 Cy5, Cy7). Primeri radio-obeleživača uključuju<3>H,<14>C,<32>P,<33>P,<35>S, 99mTc ili<125>I. Primeri enzima uključuju luciferazu, beta-galaktozidazu, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, glukoznu oksidazu, i ureazu.

[0050] Kao što je ovde upotrebljen, termin "selekcioni marker" odnosi se na reporter gen koji prenosi određenu osobinu ćeliji ili organizmu koja omogućava takvoj ćeliji ili organizmu da opstane u okruženju u kojem ne bi preživeo bez navedenog reporter gena. Prema tome, ekspresija selekcionog markera omogućava veštačku selekciju ćelija ili organizma čiji genom sadrži navedeni reporter gen. Selekcioni markeri uključuju, ali nisu ograničeni na, auksotrofne marker gene i marker gene rezistentnosti koji daju rezistenciju na toksin ili antibiotik. Termini "selekcioni marker", "reporter gen", i "marker gen" ovde su upotrebljeni naizmenično. Selekcioni markeri mogu biti auksotrofni marker geni ili marker geni rezistentnosti koji daju rezistenciju na toksin ili antibiotik. "Auksotrofni marker gen" se razume kao gen koji omogućava rast takvih auksotrofnih ćelija ili organizma u uslovima selektivne kulture kodiranjem molekula potrebnog za sintezu proizvoda potrebnog za preživljavanje aksotrofnog prokariota na selektivnom medijumu koji se upotrebljava za gajenje ćelija u kulturi. Bilo koji marker gen koji je u stanju da dopunjava odgovarajući gen koji je nefunkcionalan u auksotrofnoj ćeliji ili organizmu može biti koristan u kontekstu ovog pronalaska. Kao što se ovde upotrebljavaju, termini "marker geni rezistentnosti koji daju rezistenciju na toksin i/ili antibiotik", ili njihove varijacije poput "marker geni rezistentnosti na toksin" ili "gena rezistentnosti na antibiotik" odnose se na reporter gene koji kodiraju enzim koji funkcionalno inaktivira toksin ili antibiotik. Funkcionalna inaktivacija toksina ili antibiotika može se postići ekspresijom marker gena koji nosi mutaciju(e) koja čini odgovarajući genski proizvod neosetljivim na toksin ili antibiotik. Alternativno, funkcionalna inaktivacija toksina ili antibiotika može se postići ekspresijom marker gena koji inhibira toksin ili antibiotik, npr. interakcijom ili vezivanjem za njega. Funkcionalna inaktivacija toksina ili antibiotika takođe se može postići ekspresijom marker gena koji poništava efekte toksina ili antibiotika. Jedinjenja antibiotika uključuju, ali nisu ograničena na tetracikline, sulfonamide, peniciline, cefalosporine, ansamicine, karbapeneme, makrolide, kinolone, aminonukleozide, aminoglikozide, peptide, glikopeptide, i lipopeptide. Na primer, higromicin B, neomicin, kanamicin, gentamicin, i G418 (takođe poznat kao Geneticin) su aminoglikozidni antibiotici koji su slične strukture. Uopšteno, neomicin i kanamicin se upotrebljavaju za prokariote, dok je G418 potreban za eukariote.

[0051] Različite vrste hemijskih obeleživača ili oznaka mogu se konjugovati sa sekundarnim ili primarnim antitelima i drugim molekulima da bi se olakšala njihova vizuelizacija (tj. detekcija i merenje) različitim metodama. Radioizotopi su ranije bili široko upotrebljavani, ali su skupi, imaju kratak rok trajanja, ne nude poboljšanje odnosa signala i šuma i zahtevaju posebno rukovanje i odlaganje. Enzimi i fluorofore su u velikoj meri zamenili radioaktivne izotope kao detektujuće oznake za analize. Brojna unapređenja reagenasa i instrumenata čine ove novije tehnologije svestranijim i moćnijim. Enzimske oznake kao što je peroksidaza rena (HRP) najčešće se upotrebljavaju za blot, imuno-analize i imunohistohemijske metode. Fluorescentne oznake se pretežno upotrebljavaju za ćelijsko snimanje, amplifikaciju i sekvenciranje nukleinske kiseline i mikročipove; međutim, fluorescentna tehnologija se brzo razvija za primenu u svim tipovima testova.

[0052] Termin "nivo ekspresije" odnosi se na količinu genskog proizvoda (npr. DPR) koja je prisutna u telu ili uzorku u određeno vreme. Nivo ekspresije može npr. biti izmeren/kvantifikovan/detektovan pomoću količina proteina ili iRNK koja kodira protein. Na primer, nivo ekspresije se može kvantifikovati normalizacijom količine genskog proizvoda od interesa (npr. DPR) koji je prisutan u uzorku sa ukupnom količinom genskog proizvoda iste kategorije (ukupni protein ili iRNK) u istom uzorku ili u referentnom uzorku (npr. uzorak uzet istovremeno od iste individue ili deo identične veličine (težine, zapremine) istog uzorka) ili identifikovanjem količine genskog proizvoda od interesa po definisanoj veličini uzorka (težina, zapremina itd.). Nivo ekspresije može biti izmeren/kvantifikovan/detektovan bilo kojim postupkom poznatim u stanju tehnike, npr. metodama za direktnu detekciju i kvantifikaciju genskog proizvoda od interesa (poput masene spektrometrije) ili metodama za indirektnu detekciju i merenje genskog proizvoda od interesa koji obično deluju vezivanjem genskog proizvoda od interesa sa jednim ili više različitih molekula ili sredstava za detekciju (npr. prajmer(i), probe, antitela, skafold-proteini) koji su specifični za genski proizvod od interesa (npr. DPR). Poželjno, nivo ekspresije se određuje na osnovu proteina pre nego na osnovu iRNK.

[0053] Termin "toksičnost" kako se ovde upotrebljava odnosi se na stepen do kojeg jedinjenje/supstanca moe oštetiti organizam ili podstrukturu organizma, poput ćelije (citotoksičnost), tkiva ili organa. Prema tome, termin "toksični efekat" odnosi se na oštećujuće dejstvo koje jedinjenje/supstanca ima na organizam, organ, tkivo ili ćeliju. Jedinjenje može da pokazuje toksični efekat time što oštećuje funkciju i/ili strukturu organizma, organa, tkiva ili ćelije, što može rezultirati izmenjenom funkcijom ili gubitkom funkcije određenih elemenata ili delova organizma, organa, tkiva ili ćelije, ili čak može rezultirati smrću navedenog organizma, organa, tkiva ili ćelije. Termin "toksično jedinjenje" se stoga odnosi na supstancu, npr. nukleinsku kiselinu, peptid, polipeptid ili protein, ili hemijsku supstancu ili jedinjenje, koje pokazuje toksično dejstvo na organizam, organ, tkivo ili ćeliju.

[0054] Toksičnost ili toksični efekat jedinjenja može se izmeriti upotrebom jednog ili različitih testova preživljavanja poznatih u struci koji uključuju, ali nisu ograničeni na, testove na bazi formazana (MTT/XTT), test laktat dehidrogenaze (LDH), ATP test, Kalcein AM, klonogeni test, test etidijum homodimera, evans plava boja, fluorescein diacetat hidroliza/ propidijum-jod bojenje (FDA/PI bojenje), protočna citometrija, TUNEL test, sa zelenim fluorescentnim proteinom (GFP), metil ljubičasta, propidijum jodid, tripan plava, ili resazurin. Nadalje, DNK bojenja mogu se upotrebljavati za razlikovanje nekrotičnih, apoptotskih i normalnih ćelija.

[0055] Termin "bolest" i "poremećaj" se ovde upotrebljavaju naizmenično, a odnose se na nenormalno stanje, naročito na nenormalno medicinsko stanje kao što je bolest ili povreda, pri čemu ćelija, tkivo, organ ili individua više nije u mogućnosti da efikasno izvršava svoju funkciju. Bolest je obično, ali ne nužno, povezana sa specifičnim simptomima ili znakovima koji ukazuju na prisustvo takve bolesti. Prisustvo takvih simptoma ili znakova može biti indikativno za ćeliju, tkivo, organ ili individuu koja boluje od bolesti. Izmena ovih simptoma ili znakova mogu biti indikativni za progresiju takve bolesti. Progresija bolesti obično je okarakterisana povećanjem ili smanjenjem takvih simptoma ili znakova koji mogu ukazivati na "pogoršanje" ili "poboljšanje" bolesti. "Pogoršanje" bolesti okarakterisano je smanjenom sposobnošću ćelije, tkiva, organa ili individue/pacijenta da efikasno izvršava svoju funkciju, dok je "poboljšanje" bolesti obično okarakterisano povećanom sposobnošću ćelije, tkiva, organa ili individue/pacijenta da efikasno izvršava svoju funkciju. Ćelija, tkivo, organ ili individua koja je "podložna" bolesti u zdravom je stanju, ali je posebno ranjiva na nastanak bolesti, npr. usled genetske predispozicije, nedostatka vakcinacije, slabo razvijenog ili nezrelog imuniteta, lošeg nutritivnog statusa, ili slično. Izbijanje bolesti još uvek može biti sprečeno profilaksom ili tretmanom iz predostrožnosti. Za ćeliju, tkivo, organ ili individuu se može "sumnjati da ima" bolest pri čemu navedena ćelija, tkivo, organ ili individua obično pokazuje rane ili slabe znakove ili simptome takve bolesti. U tom slučaju, početak bolesti može i dalje biti sprečen ili njena progresija može biti smanjena ili sprečena tretmanom.

[0056] Kako se ovde upotrebljava, "otkrivanje", "detektovanje", ili "detekcija" bolesti ili poremećaja odnosi se na utvrđivanje prisustva ili odsustva bolesti kod pacijenta. Na primer, ostatak koji se koristi za detekciju bolesti može da identifikuje prisustvo ili odsustvo pokazatelja bolesti u uzorku ili kod individue ili pacijenta. Na primer, bolest može biti otkrivena pomoću liganda ili obeleženog liganda koji interaguje sa, tj. vezuje se za ili formira kompleks sa nukleinskom kiselinom, ili peptidom, polipeptidom ili proteinom specifičnim za bolest. Bolest se takođe može otkriti pomoću inhibitora koji blokira mehanizam delovanja koji leži u osnovi bolesti i na taj način, menja simptome tako da osnovna bolest može biti identifikovana.

[0057] Kao što se ovde upotrebljava, "lečiti", "lečenje", "tretman" ili "terapija" bolesti ili poremećaja označava ispunjavanje jednog ili više od sledećeg: (a) smanjenje ozbiljnosti poremećaja; (b) ograničavanje ili sprečavanje razvoja simptoma karakterističnih za poremećaj(e) koji se leči(e); (c) inhibiranje pogoršanja simptoma karakterističnih za poremećaj(e) koji se leči(e); (d) ograničavanje ili sprečavanje ponovne pojave poremećaja kod individue koji je ranije imao poremećaj(e); i (e) ograničavanje ili sprečavanje ponovne pojave simptoma kod individua koje su prethodno bile simptomatske za poremećaj(e). Prema tome, terapija leči bolest ili poremećaj, ili simptome bolesti ili poremećaja ispoljavanjem jednog ili više od gore navedenih efekata (a)-(e). Na primer, bolest se može lečiti pomoću inhibiranja/blokiranja mehanizma delovanja koji stoji u osnovi bolesti, npr. preko jedinjenja koja inhibiraju ekspresiju polipeptida/proteina specifičnih za bolest ili inhibiranjem daljih procesa u koje je navedeni polipeptid/protein uključen. Bolest se takođe može lečiti aktiviranjem imunskog sistema pacijenata, npr. putem aktivne imunizacije, ili podrškom imunskom sistemu pacijenta, npr. putem pasivne imunizacije.

[0058] Dva ili više antigena proteina ili njihovi antigeni fragmenti su "imunološki identični" ako ih prepoznaju isto antitelo, T-ćelija ili B-ćelija. Prepoznavanje dva ili više imunogena polipeptida od strane istog antitela, T-ćelije ili B-ćelije je takođe poznato kao "unakrsna reaktivnost" navedenog antitela, T-ćelije ili B-ćelije. Poželjno, prepoznavanje dva ili više imunološki identičnih polipeptida istim antitelom, T-ćelijom ili B-ćelijom nastaje zbog prisustva identičnih ili sličnih epitopa u svim polipeptidima. Slični epitopi imaju dovoljno zajedničkih strukturnih i/ili karakteristika naelektrisanja da budu vezani Fab regionom istog antitela ili receptorom B-ćelije ili V regionom istog receptora T-ćelije. Karakteristike vezivanja antitela, receptora T-ćelije ili receptora B-ćelije su, poželjno, definisane afinitetom vezivanja receptora za epitop o kom se radi. Dva imunogena polipeptida su "imunološki identična" kao što se podrazumeva ovom aplikacijom ako je konstanta afiniteta polipeptida sa nižom konstantom afiniteta najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% konstante afiniteta polipeptida sa višom konstantom afiniteta. Postupci za određivanje afiniteta vezivanja polipeptida za receptor, kao što je ravnotežna dijaliza ili enzim vezani imunosorbent test (ELISA), dobro su poznati u stanju tehnike. Poželjno, dva ili više "imunološki identičnih" polipeptida sadrže najmanje jedan identični epitop. Najjači efekti vakcinacije se obično mogu postići ako imunogeni polipeptidi sadrže identične epitope ili ako oni imaju identičnu aminokiselinsku sekvencu. Termin "vakcina" odnosi se na biološki preparat, obično farmaceutski preparat, koji poboljšava imunitet na određenu bolest. Navedeni preparat može da sadrži jedan ili više imunogena specifičnih za bolest koji su pogodni za izazivanje imunskog odgovora. U kontekstu ovog pronalaska, navedeno jedinjenje može biti polipeptid koji je suštinski identičan ili imunološki identičan polipeptidu kako je navedeno niže i sadrži specificiran dipeptidni ponovak (DPR). Alternativno, vakcina može da sadrži konstrukt nukleinske kiseline koja kodira imunogeni polipeptid koji je suštinski identičan ili imunološki identičan polipeptidu koji sadrži specificiran dipeptidni ponovak. U kasnijem slučaju, poželjno je da se polipeptid eksprimira kod individue koja je lečena vakcinom. U kontekstu ovog pronalaska navedeni konstrukt nukleinske kiselina može biti vektor.

[0059] Kako se ovde upotrebljava, termin "vektor" se odnosi na protein ili polinukleotid ili njihovu smešu koja je sposobna da bude uneta ili za uvođenje proteina i/ili nukleinske kiseline od kojih se sadrži u ćeliju. Štaviše, termin "vektor" se odnosi na najmanje jedan polinukleotid formulisan sa preparatom lipozoma ili lipidnih nanočestica koji je sposoban da transfektuje ćeliju sa najmanje jednim polinukleotidom kako je opisano, npr. od strane Geall et al., 2012. Pored polinukleotida koji kodira gen od interesa, dodatni polinukleotidi i/ili polipeptidi mogu se uvesti u ćeliju. Dodavanje dodatnih polinukleotida i/ili polipeptida je naročito poželjno ako su navedeni dodatni polinukleotidi i/ili polipeptidi potrebni za uvođenje konstrukta nukleinske kiseline u ćeliju ili ako uvođenje dodatnih polinukleotida i/ili polipeptida povećava ekspresiju imunogenog polipeptida kodiranog konstruktom nukleinske kiseline ovog pronalaska.

[0060] U kontekstu ovog pronalaska poželjno je da se geni od interesa kodirani uvedenim polinukleotidom eksprimiraju u ćeliji nakon uvođenja jednog vektora ili više vektora. Primeri pogodnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na plazmide, kozmide, fage, viruse ili veštačke hromozome.

[0061] Primeri bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na neurološke poremećaje, inflamatorne bolesti, infektivne bolesti, kožna stanja, endokrine bolesti, intestinalne bolesti, genetske poremećaje, autoimune bolesti, traumatske bolesti, bolesti zglobova, i razne tipove kancera.

[0062] "Neurološki poremećaji" se odnosi na svaki poremećaj nervnog sistema pri čemu se strukturne, biohemijske ili električne abnormalnosti javljaju u mozgu, kičmenoj moždini ili drugim nervima koji utiču na niz simptoma koji uključuju ali nisu ograničeni na paralizu, slabost mišića, lošu koordinaciju, gubitak osećaja, napade, konfuziju, bol i izmenjeni nivo svesti. Primeri neuroloških poremećaja uključuju ali nisu ograničeni na oštećenje mozga ili pojedinih delova mozga (npr. oštećenje prefrontalnog korteksa, frontalnog režnja, parietalnog režnja, temporalnog režnja, okcipitalnog režnja, cerebeluma, hipokampusa, moždanog stabla, limbičkog sistema), disfunkciju mozga ili pojedinih delova mozga (npr. afazija, disartrija, apraksija, agnozija, amnezija, ataksija), ili inflamaciju mozga (npr. encefalitis, virusni encefalitis, tromboza kavernoznog sinusa, apsces mozga, amebe). "Neurodegenerativne bolesti" poput Alchajmerove, Parkinsonove bolesti, Hantingtonove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze (ALS), frontotemporalne demencije (FTD), koja se takođe naziva degeneracija frontotemporalnog režnja (FTLD), amiotrofične lateralne sklerozefrontotemporalne demencije (ALS-FTD, koja se takođe naziva ALS-FTLD), i spinocerebelarne ataksije su dalji primeri neuroloških poremećaja. Klinički i patološki termini FTD i FTLD (i ALS-FTD i ALS-FTLD) se sinonimno upotrebljavaju u ovoj aplikaciji. U neurološke poremećaje takođe su uključeni poremećaji kičmene moždine (npr. siringomielija, siringobulbija, Morvanov sindrom, vaskularna mijelopatija, Foix-Alajouanine sindrom, kompresija kičmene moždine) i inflamacija kičmene moždine (npr. mijelitis, poliomijelitis, demijelinizirajuća bolest, transverzalni mijelitis, tropska spastična parapareza, epiduralni apsces), centralna i/ili periferna neuropatija, poremećaji kranijalnog nerva (npr. trigeminalna neuralgija), poremećaji kretanja centralnog i/ili perifernog nervnog sistema (npr. Parkinsonova bolest, ALS, Turetov sindrom, multipla skleroza), poremećaji spavanja (npr. nesanica, hipersomnija, apneja u snu, narkolepsija, katapleksija, Klajn-Levin, poremećaj cirkadijalnog ritma spavanja, poremećaj napredne faze sna, poremećaj odložene faze sna), glavobolja (npr. migrena, klaster, napetost), neuropsihijatrijske bolesti, delirijum, demencija (npr. Alchajmerova bolest, vaskularna demencija, FTD, semantička demencija i demencija sa Levijevim telima), moždani udar (npr. MCA, ACA, PCA, Fovil-ov, Milard-Gubler, lateralno medularni, Veber-ov, Lakunar moždani udar), tumori (npr. gliomi, meningiomi, adenomi hipofize, tumori nervnih omotača), složeni regionalni sindrom bola, i bolesti motornog neurona (MND) (npr. ALS, primarna lateralna skleroza (PLS), progresivna mišićna atrofija (PMA), progresivna bulbarna paraliza (PBP), pseudobulbarna paraliza).

[0063] "Simptomi" bolesti su implikacija bolesti koji su primetni u ćeliji, tkivu, organu ili individui koji imaju takvu bolest i uključuju, ali nisu ograničeni na bol, slabost, osetljivost, naprezanje, ukočenost, i grč ćelije, tkiva, organa ili individue. "Znaci" ili "signali" bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na promenu ili alteraciju kao što su prisustvo, odsustvo, povećanje ili povišenje, smanjenje ili pad, specifičnih indikatora kao što su biomarkeri ili molekularni markeri, ili razvoj, prisustvo, ili pogoršanje simptoma.

[0064] Termin "indikator" ili "biomarker" ovde se upotrebljavaju naizmenično. U kontekstu ovog pronalaska, "indikator" se može definisati kao supstanca u biološkom sistemu koja se upotrebljava kao indikator biološkog stanja navedenog sistema. U struci se termin "biomarker" ponekad takođe primenjuje za sredstva za detekciju navedene endogene supstance (npr. antitela, probe nukleinske kiseline, slikovni sistemi). U kontekstu ovog pronalaska, međutim, termin "biomarker" primenjivaće se samo za supstancu, a ne za sredstva za detekciju. Stoga, biomarkeri mogu biti bilo koja vrsta molekula prisutna u živom organizmu, kao što je nukleinska kiselina (DNK, iRNK, miRNK, rRNK itd.), protein (receptor ćelijske površine, citosolni protein itd.), metabolit ili hormon (šećer u krvi, insulin, estrogen, itd.), molekul karakterističan za određenu modifikaciju drugog molekula (npr. ostaci šećera ili fosforil rezidue na proteinima, metil-rezidue na genomskoj DNK, ekspanzija nukleotidnih ponovaka) ili supstanca koju je organizam internalizovao ili metabolit takve supstance. Prema tome, bolest ili poremećaj mogu biti okarakterisani prisustvom ili odsustvom, povećanjem ili smanjenjem takvog indikatora. Navedeni indikator bolesti može ili ne mora da uzrokuje bolest.

[0065] Indikatori prisustva i/ili napredovanja bolesti uključuju "genetske markere" kao što su nukleotidni ponovak, VNTR-ovi (varijabilni broj tandem ponovka; npr. STR (kratki tandem ponovak), AFLP (polimorfizam dužine amplifikovanog fragmenta), SSR (jednostavni ponovak sekvence), MLVA), SSLP (polimorfizam dužine jednostavne sekvence), RFLP (polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta), RAPD (slučajna amplifikacija polimorfne DNK), SNP (pojedinačni nukleotidni polimorfizam), SFP (polimorfizam sa jednom karakteristikom), DArT (tehnologija raznolikog niza), RAD markeri (DNK markeri povezani sa restrikcionim mestom).

[0066] Termin "nukleotidni ponovak" odnosi se na mesto u genomu gde kratka nukleotidna sekvenca formira ponavljajuće sekvence 2, 3, 4, 5, ili 6 nukleotida, tj. dinukleotida, trinukleotida, tetranukleotida, pentanukleotida, i heksanukleotida. U zdravom stanju broj ponavljanja ponovka može varirati između 1 i 50, tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50. Međutim, u bolesnom stanju ovi ponovci se mogu proširiti i ponavljaju se daleko češće nego u zdravom stanju, npr. mogu se proširiti 30 do 40 puta, što dovodi do nekoliko stotina ponavljanja ponovka, tj. 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500 ili 10.000, ili čak više ponavljanja. Prema tome, nivo ekspanzije dinukleotida, trinukleotida, tetranukleotida, pentanukleotida, ili heksanukleotida može biti indikator (i/ili uzrok) bolesti poput npr. neurološke bolesti, posebno neurogenerativne bolesti. Na primer, ekspanzija trinukleotidnih ponovaka (CAG)ni reverznog komplementa (CTG)nu komplementarnom lancu je povezana sa Hantingtonovom bolešću, ekspanzija pentanukleotidnih ponovaka ((ATTCT)ni reverznog komplementa (AGAAT)nu komplementarnom lancu povezana je sa spinocerebelarnom ataksijom SCA10, dok je ekspanzija heksanukleotida (GGGGCC)ni reverznog komplementa (CCCCGG)nu komplementarnom lancu povezana sa ALS, FTD, i FTD-ALS i ekspanzija heksanukleotida ((GGCCTG)ni reverznog komplementa (CAGGCC)nu komplementarnom lancu povezana je sa spinocerebelarnom ataksijom SCA36. U principu, nukleotidni ponovci mogu biti prisutni u egzonu ili intronu gena i mogu ili ne moraju biti transkribovani i mogu ili ne moraju translatirani u peptid ili polipeptid.

[0067] Neurogenerativne bolesti ALS, FTD i ALS-FTD su karakteristične po tome što su ekspandirani heksanukleotidni (GGGGCC)nponovci koji se nalaze unutar introna I C9orf72 gena. U zdravom stanju broj "n" GGGGCC-ponovaka može varirati između 1 i 19, tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, i 19. U bolesnom stanju broj "n" ovih ponovaka može biti ekspandiran kako bi se ponavljao daleko češće nego u zdravom stanju, npr. obično mogu biti ekspandirani mnogo više od 30 do 40 puta. Međutim, kod nekih pacijenata simptomi se mogu već pokazati počevši od 20 ponovaka. Dakle, u bolesnom stanju ekspanzija heksanukleotidnih ponovaka može dovesti do nekoliko stotina ponavljanja heksanukleotidnog ponovka, tj. 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, i 10.000 ponovaka, ili više. Tačan broj ponovaka se ne može odrediti postojećim tehnikama sekvenciranja. Transkripcija genskih GGGGCC-ponovaka i GGCCCC-ponovaka u komplementarnom lancu DNK (koja se takođe naziva antisens lanac) dovodi do RNK transkripcionih proizvoda koji sadrže ili GGGGCC- ili GGCCCC-ponovke sa gore navedenim brojevima. Iznenađujuće je da je translacija ovih transkripata pokrenuta ne-ATG kodonima. Sens transkript se translatira u sva tri okvira čitanja (poli-(Gly-Ala), poli-(Gly-Pro) i poli-(Gly-Arg)). Upotrebom reverzne transkripcije specifične za lanac otkrili smo i sens i antisens transkripte (Slika 8C). Dakle, postoji 6 okvira čitanja, ali dva rezultuju u identičnim DPR, i to poli-(Gly-Pro) DPR. Prema tome, pet različitih mogućih DPR su sledeći: poli-(Gly-Ala), poli-(Gly-Pro), poli-(Gly-Arg), poli-(Ala-Pro) i poli-(Pro-Arg). Naročito su poli-GA, poli-GP i poli-AP polipeptidi visoko hidrofobni i formiraju agregate u unutarćelijskoj sredini.

[0068] Genomska sekvenca regiona koji okružuje heksanukleotidni ponovak C9orf72 gena glasi kao što sledi u referentnoj sekvenci iz NCBI (SEQ ID No: 1)

pri čemu "n" ima gore istaknuta poželjna i najpoželjnija značenja.

[0069] Termin "polipeptidi koji sadrže ili se sastoje od dipeptidnih ponovaka kodiranih genomskim heksanukleotidnim ponovcima" se odnosi na polipeptide koji sadrže dipeptidne ponovke, poželjno od 9 ili više uzastopnih identičnih dipeptida. Poželjnije je da polipeptidi sadrže više od 10, više od 15, više od 20, više od 25, više od 30, više od 35, više od 40, više od 45, više od 50 dipeptidnih ponovaka. U poželjnim primerima izvođenja polipeptid sadrži ili se sastoji od dipeptidnih ponovaka sa dve različite aminokiseline, poželjno sa sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od (Gly-Ala)a, (Gly-Pro)b, (Gly-Arg)c, (Ala-Pro)d, (Pro-Arg)e, (Gly-Leu)f, (Ala-Trp)g, (Pro-Gly)h.(Ala-Gln)j, (Gly-Pro)k, i (Pro-Arg)lgde je a ceo broj od 16 ili više, poželjno 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; b je ceo broj od 28 ili više, poželjno 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; c je ceo broj od 21 ili više, poželjno 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; d je ceo broj od 17 ili više, poželjno 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; e je ceo broj od 24 ili više, poželjno 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; f je ceo broj od 15 ili više, poželjno 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; g je ceo broj od 9 ili više, poželjno 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; h je ceo broj od 28 ili više, poželjno 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; j je ceo broj od 16 ili više, poželjno 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; k je ceo broj od 28 ili više, poželjno 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više; i 1 je ceo broj od 24 ili više, poželjno 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000 ili više.

[0070] Termin "agregati" kako se ovde upotrebljava odnosi se na unutar- ili vanćelijsku akumulaciju peptida, polipeptida ili proteina.

[0071] Termini "uzorak" ili "uzorak od interesa" ovde se upotrebljavaju naizmenično, odnoseći se na deo ili parče tkiva, organa ili individue, obično manji od takvog tkiva, organa ili individue, koji bi trebalo da predstavlja celo tkivo, organ ili individuu. Nakon analize, uzorak daje informacije o statusu tkiva ili status zdravlja ili bolesti organa ili individue. Primeri uzoraka uključuju, ali nisu ograničeni na uzorke tečnosti, kao što su krv, serum, plazma, sinovijalna tečnost, limfna tečnost, cerebrospinalna tečnost, meningealna tečnost, žlezdana tečnost, aspirat iglene biopsije, spinalna tečnost i druge telesne tečnosti (urin, pljuvačka), kao i uzorak biopsije ili čvrste uzorke poput tkivnih ekstrakata mozga ili kičmene moždine. Dalji primeri uzoraka uključuju ćelijske kulture (npr. limfoblasti dobijeni od pacijenta) ili tkivne kulture.

[0072] Analiza uzorka može se izvršiti na vizuelnoj ili hemijskoj osnovi. Vizuelna analiza uključuje ali nije ograničena na mikroskopsko snimanje ili radiografsko skeniranje tkiva, organa ili individue što omogućava evaluaciju uzorka. Hemijska analiza uključuje ali nije ograničena na detekciju prisustva ili odsustva određenih indikatora ili detekciju promena u njihovoj količini ili nivou.

[0073] Termin "ligand", kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koju supstancu ili jedinjenje koje je u mogućnosti da specifično interaguje sa, npr. da se specifično veže ili formira kompleks sa, određenim molekulom, npr. polipeptidom ovog pronalaska koji sadrži ili se sastoji od dipeptidnog ponovka.

[0074] Termin "inhibitor" odnosi se na supstancu, npr. ligand, koja blokira dejstvo drugog jedinjenja, tj. molekula receptora. Tipično, inhibitori deluju vezivanjem za aktivno mesto molekula receptora, ili interaguju sa jedinstvenim mestima vezivanja koja nisu normalno uključena u regulaciju aktivnosti molekula receptora. Delovanje inhibitora može biti reverzibilno ili ireverzibilno u zavisnosti od dugotrajnosti interakcije kompleksa inhibitormolekul receptora. Primeri za inhibitore uključuju, ali nisu ograničeni na molekule nukleinske kiseline, kao što su siRNK ili miRNK, ili proteine kao što su transkripcioni faktori, molekuli imunoglobulina, antitela, antitelu slični proteini, peptidomimetici, hormoni, citokini, faktori rasta, ili neurotransmiteri.

[0075] Termin "imunoglobulin (Ig)" kako se ovde upotrebljava odnosi se na glikoproteine koji daju imunitet super porodice imunoglobulina. "Površinski imunoglobulini" su pričvršćeni za membranu efektorskih ćelija svojim transmembranskim regionom i obuhvataju molekule kao što su, ali nisu ograničeni na, B-ćelijske receptore, T-ćelijske receptore, proteine glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I i II, beta-2 mikroglobulin (β2M), CD3, CD4 i CD8. Tipično, termin "antitelo" kao što se ovde upotrebljava odnosi se na sekretovane imunoglobuline kojima nedostaje transmembranski region i na taj način mogu da se oslobode u krvotok i telesne šupljine. Antitela su grupisana u različite izotipove na osnovu teškog lanca koji poseduju. Postoji pet tipova teških lanaca humanih Ig označenih grčkim slovima: α, δ, ε, γ, i μ. Prisutan tip teškog lanca definiše klasu antitela, tj. ovi lanci se nalaze u IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM antitelima, redom, od kojih svaka vrši različite uloge, i usmerava odgovarajući imunski odgovor prema različitim vrstama antigena. Različiti teški lanci se razlikuju u veličini i sastavu; α i y sadrže približno 450 aminokiselina, dok μ i ε imaju približno 550 aminokiselina (Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science). Antitela sadrže četiri polipeptidna lanca, naime dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantan region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantan region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, koji su nazvani regioni koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecani sa regionima koji su više konzervirani, koji su nazvani regioni okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa ka karboksi-terminusu u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR za teške i lake lance se mogu odrediti kao što je poznato u tehnici. Na primer, sledeći skup pravila može se upotrebiti za pronalaženje CDR-ova unutar sekvence lakog i teškog lanca antitela, redom:

[0076] CDR-1 lakog lanca: Start: približno ostatak 24, Ostatak pre CDR-1 uvek Cys, Ostatak posle CDR1 uvek Trp. Tipično Trp-Tyr-Gln, ali takođe, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu; Dužina: 10 do 17 ostataka

[0077] CDR-2 lakog lanca: Start: uvek 16 ostataka posle završetka L1, ostaci pre načelno Ile-Tyr, ali takođe, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe, dužina uvek 7 ostataka;

[0078] CDR-3 lakog lanca: Start: uvek 33 ostatka posle završetka CDR-2; ostatak pre uvek Cys, ostaci posle uvek Phe-Gly-XXX-Gly, dužina: 7 do 11 ostataka

[0079] CDR-1 teškog lanca: Start: Približno ostatak 26 uvek 4 posle Cys (na osnovu Chothia AbM definicije, Kabat definicija započinje 5 ostataka kasnije); ostaci pre uvek Cys-XXX-XXX-XXX; ostaci posle uvek Trp. Tipično Trp-Val, ali takođe, Trp-Ile, Trp-Ala, dužina: 10 do 12 ostataka [AbM definicija, definicija Chothia isključuje poslednja 4 ostatka);

[0080] CDR-2 teškog lanca: Start: uvek 15 ostataka posle završetka Kabat / AbM definicije, CDR-1 teškog lanca;; ostaci pre: tipično Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, ali brojne varijacije, ostaci posle Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala, dužina Kabat definicije 16 do 19 ostataka (definicija prema AbM; Chothia definicija završava se 7 ostataka ranije)

[0081] CDR-3 teškog lanca: Start: uvek 33 ostatka posle završetka CDR-2 teškog lanca (uvek 2 aminokiselinska ostatka posle Cys); Ostaci pre uvek Cys-XXX-XXX (tipično Cys-Ala-Arg); Ostaci posle uvek Trp-Gly-XXX-Gly; Dužina: 3 do 25 ostataka. Ovaj skup pravila je poznat stručnjaku i može se naći i na http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid.

[0082] Termin "humano antitelo", kao što se ovde upotrebljava, namenjen je da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana mAbs mogu da uključe aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani imunoglobulinskim sekvencama humane germinativne linije (npr. mutacije uvedene nasumično ili mutageneze specifične za lokaciju in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima. Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, nije namenjen da uključi "humanizovana antitela" u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge vrste sisara (npr. miša), koje su nasađene na humane FR sekvence. Humana antitela takođe uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina i koje ne eksprimiraju endogene imunoglobuline.

[0083] Termin "monoklonalno antitelo", kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na preparat molekula antitela jedne molekulske kompozicije. Monoklonalno antitelo pokazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. U jednom primeru izvođenja, monoklonalna antitela proizvode hibridomi koji uključuju B ćeliju dobijenu od ne-humane životinje, npr. miša, koja je fuzionosana sa imortalizovanom ćelijom. Termin "rekombinantno antitelo", kako se ovde upotrebljava, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, nastala ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridoma koji je pripremljen od nje (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina koja je transformisana da eksprimira antitelo, npr. iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, nastala ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje obradu sekvenci gena imunoglobulina u druge DNK sekvence. Kao što se ovde upotrebljava, "heterologno antitelo" je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj koji se nalazi u organizmu koji se ne sastoji od transgenog organizma, i koje uglavnom potiče iz vrste koja nije transgeni organizam. Kao što se ovde upotrebljava, "heterohibridno antitelo" odnosi se na antitelo koje ima lake i teške lance koji potiču iz različitog organizma. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac asocira sa lakim lancem murina je heterohibridno antitelo.

[0084] Termin "antigen-vezujući fragmenti" odnosi se na fragmente antitela koji zadržavaju funkciju specifičnog vezivanja antigena ili antigenog proteina, ali kojima nedostaju neke ili sve druge strukturne karakteristike antitela ili veštačkih konstrukata koji sadrže delove antitela. Poželjni primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće Fab fragmente, Fc fragment, Fab' fragment, F(ab')2, jednolančane Fv, dvovalentne jednolančane promenljive fragmente (di-scFvs), tandemske scFvs, diatela, jednolančana diatela (scDB), triatela, bi-specifične pokretače T-ćelija (BiTEs®), ili preusmeravajuće molekule dvostrukog afiniteta (DART® molekuli).

[0085] "Fab fragmenti" (takođe se nazivaju "Fab deo" ili "Fab region") svaki sa jednim mestom za vezivanje antigena, i rezidualni "Fc fragment" (koji se takođe naziva "Fc deo" ili "Fc region") čije ime odražava njegovu sposobnost da rado kristalizuje. "Fabꞌ fragment", koji se odnosi na Fab fragment koji dodatno sadrži zglobni deo molekula Ig, dok "F(abꞌ)2fragmenti" se podrazumeva da sadrže dva Fabꞌ fragmenta koji su ili hemijski povezani ili povezani preko disulfidne veze. Dok je sdAb (Desmyter et al., 1996). di-scFvs se može konstruisati povezivanjem dva scFvs (scFvA-scFvB). Ovo se može uraditi proizvodnjom jednog peptidnog lanca sa dva VHi dva VLregiona, dajući "tandem scFvs" (VHA-VLA-VHB-VLB). Druga mogućnost je kreiranje scFvs sa linkerima koji su prekratki da bi se dva varijabilna regiona zajedno savila, prisiljavajući scFvs da dimerizuju. Za generisanje ovih dimera uobičajeno se upotrebljavaju linkeri dužine od 5 ostataka. Ovaj tip je poznat kao "diatela". Još kraći linkeri (jedna ili dve aminokiseline) između VHi VLdomena dovode do formiranja monospecifičnih trimera, takozvanih "triatela" ili "tritela". Bispecifična diatela formiraju se ekspresijom u lance sa rasporedom VHA-VLB i VHB-VLA ili VLA-VHB i VLB-VHA, redom. Jednolančana diatela (scDb) sadrže VHA-VLB i VHB-VLA fragment koji su povezani linker peptidom (P) od 12-20 aminokiselina, poželjno 14 aminokiselina, (VHA-VLB-P-VHB-VLA). "Bi-specifični pokretači T-ćelija (BiTEs)" su fuzioni proteini koji se sastoje od dva scFvs različitih antitela pri čemu se jedan od scFvs veže za T ćelije putem CD3 receptora, i drugi za tumorsku ćeliju putem molekula specifičnog za tumor (Kufer et al. 2004). Preusmeravajući molekuli dvostrukog afiniteta (molekuli "DART") su diatela koja su dodatno stabilizovana preko C-terminalnog disulfidnog mosta.

[0086] Termini "specifično vezivanje" ili "posebno vezivanje" za antigen se odnose na sposobnost liganda da se veže za antigenu determinantu antigena sa visokim afinitetom. U tom kontekstu "visoki afinitet" označava da je Kdza interakciju ispod 1 x 10-5 M, poželjno ispod 1 x 10-6 M, poželjnije ispod 1 x 10<-7>, još poželjnije ispod 1 x 10<-8>M i najpoželjnije ispod 1 x 10-9 M.

[0087] Termini "farmaceutski preparat", "farmaceutska kompozicija", "medikament", "medicinski agens", "agens" i "lek" ovde se upotrebljavaju naizmenično i odnose se na supstancu i/ili kombinaciju supstanci koje se upotrebljavaju za identifikaciju, prevenciju ili tretman tkivnog statusa ili bolesti

[0088] "Farmaceutski prihvatljiv" označava odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden u Farmakopeji Sjedinjenih Država ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu na životinjama, i naročito na ljudima.

[0089] Termin "aktivni sastojak" odnosi se na supstancu u farmaceutskoj kompoziciji ili formulaciji koja je biološki aktivna, tj. koja daje farmaceutsku vrednost. Farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više aktivnih sastojaka koji mogu delovati u sadejstvu ili nezavisno jedan od drugog. Aktivni sastojak može biti formulisan kao neutralan ili soni oblik. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one koje su formirane sa slobodnim amino grupama kao što su one dobijene iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline itd., i one koje su formirane sa slobodnim karboksilnim grupama kao što su, ali nisu ograničene na one dobijene od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, hidroksida gvožđa, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina, i slično.

[0090] Termin "nosač", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na farmakološki neaktivnu supstancu, kao što je, ali nije ograničeno na razblaživač, ekscipijent, ili nosač sa kojim se daje terapeutski aktivni sastojak. Takvi farmaceutski nosači mogu biti tečni ili čvrsti. Tečni nosač uključuje, ali nisu ograničeni na sterilne tečnosti, kao što su fiziološki rastvori u vodi i uljima, uključujući petrolejskog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, poput ulja od kikirikija, sojinog ulja, mineralnog ulja, susamovog ulja i slično. Fiziološki rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za injekcione rastvore. Fiziološki rastvor je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija daje intravenski. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača opisani su u "Remingtonovim farmaceutskim naukama" E. V. Martina ("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin).

[0091] Pogodni farmaceutski "ekscipijenti" uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično.

[0092] Termin "adjuvans" odnosi se na agense koji olakšavaju, stimulišu, aktiviraju, potenciraju, ili modulišu imunski odgovor na aktivni sastojak kompozicije bilo na ćelijskom ili na humoralnom nivou, npr. imunološki adjuvansi stimulišu odgovor imunskog sistema na stvarni antigen, ali sami nemaju imunološki efekat. Primeri takvih adjuvanasa uključuju, ali nisu ograničeni na neorganske adjuvanse (npr. neorganske soli metala, kao što je aluminijum fosfat ili aluminijum hidroksid), organske adjuvanse (npr. saponini ili skvalen), adjuvanse na bazi ulja (npr. Frojdov (Freund’s) kompletni adjuvans i Frojdov nekompletni adjuvans), citokine (npr. IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, i INF-γ) partikularne adjuvanse (npr. imuno-stimulatorni kompleksi (ISCOMS), lipozomi, ili biorazgradive mikrosfere), virozome, bakterijske adjuvanse (npr. monofosforil lipid A, ili muramil peptidi), sintetičke adjuvanse (npr. ne-jonski blok kopolimeri, analozi muramil peptida, ili sintetički lipid A), ili adjuvanse sintetičkih polinukleotida (npr. poliarginin ili polilizin).

[0093] Farmaceutski preparati se primenjuju putem primene koja je pogodna za slučaj. Putevi primene uključuju, ali nisu ograničeni na intranazalnu primenu, intramuskularnu primenu, subkutanu primenu, oralnu primenu, i topikalnu primenu.

[0094] "Intranazalna primena" je primena farmaceutskog preparata na sluzokožu kompletnog respiratornog trakta uključujući pluća. Uobičajeno, farmaceutski preparat se primenjuje na sluzokužu nosa. Intranazalna primena se postiže instilacijom, raspršivanjem ili aerosolom. Poželjno, navedena primena ne uključuje perforaciju sluzokože mehaničkim sredstvima kao što je igla.

[0095] Termin "intramuskularna primena" odnosi se na ubrizgavanje farmaceutskog preparata u bilo koji mišić individue ili pacijenta. Poželjne intramuskularne injekcije se primenjuju u deltoidni mišić, mišić vastus lateralis ili u ventroglutealna i dorzoglutealna područja.

[0096] Termin "subkutana primena" odnosi se na ubrizgavanje farmaceutskog preparata u hipodermis.

[0097] Termin "oralna primena" odnosi se na primenu farmaceutskog preparata preko usta u gastrični sistem.

[0098] "Topikalna primena" je primena farmaceutskog preparata na bilo koji deo kože bez prodora kože iglom ili sličnim uređajem. Farmaceutski preparat se takođe može primeniti topikalno na sluzokožu usta, nosa, genitalnog regiona i rektuma.

[0099] Termin "nosač podataka" odnosi se na bilo koji medijum za čuvanje koji se može upotrebiti da pruži informacije korisniku. Oni mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na priručnike, knjige, knjižice, letke, brošure, papir, kao i medijum za čuvanje čitljiv pomoću računara. Termin "medijum za čuvanje čitljiv pomoću računara", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji medijum koji može da čuva podatke u formatu koji je čitljiv pomoću mehaničkog uređaja kao što je npr. računar. Primeri medijuma uključuju, ali nisu ograničeni na magnetni disk, optičke diskove, čvrsti disk, RAM, ROM, EEPROM (na primer fleš memorija), EPROM, DVD, Blu-Rej disk, disketu, DVD-RW disk, barkod, i karaktere magnetnog mastila.

Primeri izvođenja

[0100] U narednim pasusima različiti aspekti ovog pronalaska su detaljnije definisani. Svaki aspekt tako definisan može biti kombinovan sa bilo kojim drugim aspektom ili aspektima, ukoliko nije jasno naznačeno suprotno. Posebno, bilo koja odlika naznačena kao poželjna ili korisna može biti kombinovana sa bilo kojom drugom odlikom ili odlikama koje su naznačene kao poželjne ili korisne. U radu koji je vodio ka ovom pronalasku, iznenađujuće je pokazano da takođe intronska RNK transkribovana iz heksanukleotidnih ponovaka, prisutna u genomu može biti translatirana RAN-translacijom.

[0101] U prvom aspektu ovaj pronalazak daje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje se specifično vezuje za polipeptid koji se sastoji od (Gly-Ala)adipeptidnih ponovaka, pri čemu je a ceo broj od 16 ili više, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži CDR3 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 53; CDR2 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 54; i CDR1 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 55.

i

(i) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYTFTGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 68, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži EILPGSGSTK u skladu sa SEQ ID NO: 64 i CDR3 sekvencu koja sadrži GDFTNSHFAY u skladu sa SEQ ID NO: 60;

ili

(ii) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYTFTGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 68, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži ENLPGSGSTK u skladu sa SEQ ID NO: 65 i CDR3 sekvencu koja sadrži GDYSNSHFAY u skladu sa SEQ ID NO: 57;

ili

(iii) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYKFIGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 69, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži ENLPGSGTTK u skladu sa SEQ ID NO: 66 i CDR3 sekvencu koja sadrži GDYSNSHFTY u skladu sa SEQ ID NO: 59.

[0102] Bolest koju karakteriše ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka je neurološka bolest, još poželjnije neurodegenerativna bolest. Genomski heksanukleotidni ponovci kod takvih bolesti su izabrani iz grupe koja se sastoji od GGGGCC i GGCCTG na jednom postolju DNK i heksanukleotidnih ponovaka GGCCCC i CAGGCC na odgovarajućem komplementarnom DNK lancu, tj. bolest se karakteriše ekspanzijom heksanukleotidnih ponovaka GGGGCC i/ili GGCCTG na jednom DNK lancu i heksanukleotidnih ponovaka GGCCCC i CAGGCC na odgovarajućem komplementarnom DNK lancu. Poželjno, ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka GGGGCC (i/ili komplementarnih heksanukleotidnih ponovaka GGCCCC) karakteriše bolest izabranu iz grupe koja se sastoji od ALS, FTD, ALS-FTD, i ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka GGCCTG (i/ili komplementarnih heksanukleotidnih ponovaka CAGGCC) karakteriše bolest SCA36. Prema tome, ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka GGGGCC i/ili GGCCTG na jednom DNK lancu i heksanukleotidnih ponovaka GGCCCC i CAGGCC na odgovarajućem komplementarnom DNK lancu je pokazatelj odgovarajućih bolesti.

[0103] Otkriven je polipeptid koji sadrži ili se sastoji od dipeptidnih ponovaka sa sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od (Gly-Ala)a, gde je a ceo broj od 16 ili više, poželjno 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više.

[0104] U poželjnim primerima izvođenja, oznaka koja može da se detektuje je prikačena, poželjno kovalentno vezana za navedeni polipeptid. Pogodne oznake su poželjno izabrane iz grupe koja se sastoji od fluorofore, hromofore, radio-obeleživača, metalnog koloida, enzima, hemiluminescentnog ili bioluminescentnog molekula. Naročito je poželjno da je oznaka koja može da se detektuje fluorofora, poželjno GFP, ili enzim, poželjno luciferaza.

[0105] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema prvom aspektu pronalaska se specifično vezuje za ili formira kompleks sa koji se sastoji od dipeptidnih ponovaka sa (Gly-Ala)asekvencom, pri čemu je a ceo broj od 16 ili više, poželjno 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje se za epitop koji formira sam dipeptidni ponovak.

[0106] Poželjno, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od monoklonalnih, monovalentnih, bispecifičnih, heterokonjugatnih, multispecifičnih, rekombinantnih, heterolognih, heterohibridnih, himernih, humanizovanih (naročito CDR-nasađenih), deimunizovanih, ili humanih antitela. Poželjnije antitelo je humanizovano antitelo. U daljim poželjnim primerima izvođenja antitelo je IgG antitelo. U daljim poželjnim primerima izvođenja, antigen-vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od Fc fragmenta, Fab fragmenata, Fab' fragmenta, F(ab')2fragmenata, jednolančanog Fv (scFv), tandem scFvs, diatela, bispecifičnih diatela, jednolančanih diatela (scDb), triatela, bi-specifičnih pokretača T-ćelija (BiTEs®), i preusmeravajućih molekula dvostrukog afiniteta (DART®).

[0107] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti u skladu sa prvim aspektom ovog pronalaska sadrže laki lanac koji sadrži CDR3 sekvencu koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence QQLVEYPLT (SEQ ID NO: 53); CDR2 sekvencu koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence LMSTRAS (SEQ ID NO: 54) i CDR1 sekvencu koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence RSSKSLLYKDGKTYLN (SEQ ID NO: 55) i

(i) teški lanac koji sadrži CDR3 sekvencu koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GDFTNSHFAY (SEQ ID NO: 60); CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence EILPGSGSTK (SEQ ID NO: 64) i CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GYTFTGYWIE (SEQ ID NO: 68), poželjno ovo antitelo sadrži jedan ili više, najpoželjnije sve okvirne regione antitela GA 1A12;

ili

(ii) teški lanac koji sadrži CDR3 sekvencu koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GDYSNSHFAY (SEQ ID NO: 57); CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence ENLPGSGSTK (SEQ ID NO: 65) i CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GYTFTGYWIE (SEQ ID NO: 68), poželjno ovo antitelo sadrži jedan ili više, najpoželjnije sve okvirne regione antitela GA 5E9;

ili

(iii) teški lanac koji sadrži CDR3 sekvencu koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GDYSNSHFTY (SEQ ID NO: 59); CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence ENLPGSGTTK (SEQ ID NO: 66) i CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži, sastoji se suštinski, ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GYKFIGYWIE (SEQ ID NO: 69), poželjno ovo antitelo sadrži jedan ili više, najpoželjnije sve okvirne regione antitela GA 5F2.

[0108] U još jednom primeru izvođenja, pronalazak daje antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, sa varijabilnim regionom lakog lanca (LCVR) koji sadrži, sastoji se suštinski od ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 80 i varijabilnim regionom teškog lanca (HCVR) koja sadrži sastoji se suštinski od ili se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe od SEQ ID NO: 80, 81 i 82.

[0109] U poželjnim primerima izvođenja četvrtog aspekta, navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično se vezuje za (Gly-Ala)a, polipeptid u skladu sa drugim i trećim aspektom sa Kdvrednošću od 10 nM ili manje, poželjno 9 nM ili manje, poželjnije 8 nM ili manje, poželjnije 7 nM ili manje, poželjnije 6 nM ili manje, poželjnije 5 nM ili manje, poželjnije 4 nM ili manje, poželjnije 3 nM ili manje, poželjnije 2 nM ili manje, i još poželjnije 1 nM ili manje.

[0110] U poželjnim primerima izvođenja, oznaka koja može da se detektuje je prikačena, poželjno kovalentno vezana, za antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Pogodne oznake su poželjno izabrane iz grupe koja se sastoji od fluorofore, hromofore, radio-obeleživača, metalnog koloida, enzima, hemiluminescentnog ili bioluminescentnog molekula. Naročito je poželjno da je oznaka koja može da se detektuje fluorofora, poželjno GFP, ili enzim, poželjno luciferaza.

[0111] U trećem aspektu ovaj pronalazak daje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa prvim aspektom pronalaska za in vitro dijagnozu bolesti koju karakteriše ekspanzija genomskih GGGGCC ponovaka, pri čemu je bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od amiotrofične lateralne skleroze (ALS), frontotemporalne demencije (FTD) i amiotrofične lateralne skleroze-frontotemporalne demencije (ALS-FTD).

[0112] U poželjnim primerima izvođenja antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa prvim aspektom pronalaska se upotrebljava za in vitro dijagnstifikovanje bolesti koju karakteriše ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka, poželjno detekcijom navedenog polipeptida kod individue koji ima, sumnja se da ima, ili je podložna navedenoj bolesti. Poželjno, navedeni polipeptid je detektovan bilo kojim od gore opisanih postupaka, poželjno pomoću Vestern blota, ELISA, FACS, i imunocitohemije (npr. pomoću fluorescentne mikroskopije ili elektronske mikroskopije). U poželjnim primerima izvođenja detekcija polipeptida koji se sastoji od (Gly-Ala) dipeptidnih pononovaka je indikator za prisustvo bolesti.

[0113] U drugom aspektu ovaj pronalazak daje farmaceutski preparat koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa prvim aspektom pronalaska i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0114] U poželjnim primerima izvođenja farmaceutski preparat dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijent i/ili adjuvans i opciono jednu ili više dodatnih aktivnih supstanci. Dodatne aktivne supstance mogu biti efikasne protiv iste ili protiv drugačije bolesti ili poremećaja. Prema tome, dodatne aktivne supstance sadrže one koje imaju blagotvoran efekat u lečenju bolesti koju karakteriše ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka. Osim toga, dodatne aktivne supstance mogu biti usmerene na lečenje različitih bolesti ili poremećaja ili stanja pogodne za primenu u kombinaciji sa aktivnim sastojkom za lečenje bolesti koju karakteriše ekspanzija genomskih heksanukleotidnih ponovaka.

[0115] Poželjno, farmaceutski preparat prema drugom aspektu sadrži terapeutski efikasnu količinu navedenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u skladu sa prvim aspektom pronalaska i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa pogodnom količinom nosača i/ili ekscipijenta tako da se dobije oblik za pravilnu primenu pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu primene.

[0116] Farmaceutski preparat može biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzije, tableta, pilula, kapsula, prašaka, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Farmaceutski preparat se može formulisati kao supozitorija, sa tradicionalnim vezivima i nosačima kao što su trigliceridi.

[0117] Za pripremu farmaceutskih preparata ovog pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti bilo čvrsti ili tečni. Kompozicije u čvrstom obliku uključuju praškove, tablete, pilule, kapsule, pastile, kašete, supozitorije, i disperzibilne granule. Čvrst ekscipijent može biti jedna ili više supstanci, koje mogu delovati i kao razblaživači, arome, veziva, konzervansi, sredstva za dezintegraciju tableta, ili materijal za inkapsulaciju. U praškovima, ekscipijent je poželjno fino podeljena čvrsta supstanca, koja je u smeši sa fino podeljenim inhibitorom ovog pronalaska. U tabletama, aktivni sastojak je pomešan sa nosačem koji ima potrebna vezujuća svojstva u odgovarajućim proporcijama i kompaktovan u željeni oblik i veličinu. Pogodni ekscipijenti su magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktoza, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza, vosak koji se slabo topi, kakao puter, i slično. Za pripremu supozitorija, vosak koji se slabo topi, poput smeše glicerida masnih kiselina ili kakao putera, se najpre rastopi i aktivna komponenta se u njemu homogeno raspršuje, kao mešanjem. Rastopljena homogena smeša se zatim sipa u kalupe pogodne veličine, ostavi da se ohladi, i time očvrsne. Tablete, praškovi, kapsule, pilule, kašete, i pastile mogu se upotrebiti kao čvrste forme doziranja pogodne za oralnu primenu.

[0118] Kompozicije u tečnom obliku uključuju rastvore, suspenzije, i emulzije, na primer, vodu, fiziološke rastvore, vodeni rastvor dekstroze, rastvore glicerola ili rastvore vode/propilen glikola. Za parenteralne injekcije (npr. intravenske, intraarterijske, intraosealne infuzije, intramuskularne, subkutane, intraperitonealne, intradermalne, i intratekalne injekcije), tečni preparati se mogu formulisati u rastvoru, npr. vodenom rastvoru polietilen glikola. Fiziološki rastvor je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski.

[0119] Poželjno, farmaceutska kompozicija je u jediničnom obliku doziranja. U takvom obliku kompozicija može biti podeljena na jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Jedinični oblik doziranja može biti upakovana kompozicija, pakovanje koje sadrži diskretne količine kompozicije, kao što su upakovane tablete, kapsule, i praškovi u bočicama ili ampulama. Takođe, jedinični oblik doziranja može biti kapsula, bočica za injekciju, tableta, kašeta, ili sama pastila, ili to može biti odgovarajući broj bilo kojih od ovih u upakovanom obliku. Kompozicija, po želji, može takođe sadržati manje količine ovlaživača ili emulgatora, ili pH puferišuće agense.

[0120] U trećem aspektu ovaj pronalazak daje upotrebu antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta u skladu sa patentnim zahtevom 1 u in vitro dijagnozi bolesti koja je okarakterisana ekspanzijom genomskih GGGGCC ponovaka, pri čemu je bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od amiotrofične lateralne skleroze (ALS), frontotemporalne demencije (FTD), i amiotrofične lateralne skleroze-frontotemporalne demencije (ALS-FTD).

[0121] Heksanukleotidni ponovci imaju GGGGCC sekvencu. Poželjno, heksanukleotid (GGGGCC)nje odgovoran za formiranje agregata odgovornih za ALS, FTD ili ALS-FTD, i broj "n" je najmanje 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, i 500 ili više.

[0122] Sledeći primeri i slike su samo ilustrativni prikaz ovog pronalaska i ne treba ih tumačiti da ograniče na bilo koji način opseg pronalaska kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

Primeri

Primer 1 - Antitela

[0123] Da bismo direktno detektovali ekspresiju proteina sa postuliranim ponovkom, uzgajili smo antitela (anti-GA i anti-GP) prema (GA)15i (GP)15peptidima fuzionisanim sa proteinom koji veže maltozu i testirali monoklonalno antitelo (anti-GR) koje je prvobitno uzgajeno prema epitopu EBNA2A uključujući (GR)6ponovak (Kremmer et al., 1995).

[0124] Zečevi su imunizovani sa MBP-fuzionim proteinima koji sadrže ili (GA)15ili (GP)15ponovke na C-terminusu (Eurogentec). Rezultujući serum je prečišćen GST-fuzionim proteinima koji sadrže ili (GA)15ili (GP)15na C-terminusu. Ukratko, eksprimirani protein E. coli je umrežen za glutation-sefarozu (Pierce) i vezana antitela su eluirana promenom pH (0,15 M NaCl, 0,1 M glicin pH=2.5) i odmah neutralizovana (0,1 zapremina 1 M Tris pH=9.5). Monoklonalno poli-GR-ponovak-specifično antitelo 5A2 pacova prvobitno je generisano prema peptidnom antigenu (GQSRGQSR-GRGRGRGRGRGKGK; SEQ ID NO: 47) iz EBNA2 i detektuje specifično GST-(GR)15(Slika 1A) (Kremmer et al., 1995). p62 (miš, BD transdukcija), TDP zeca (Proteintech) fosfo-TDP-43 (Ser409/Ser410, klon 1D3) (Neumann et al., 2009) i GST antitelo pacova (6G9, Sigma) su komercijalno dostupni.

[0125] Sva tri DPR antitela su detektovala odgovarajući antigen ponovak imunoblotiranjem bez unakrsne reakcije sa druga dva DPR proteina (Sl.1A).

Primer 2 - Konstrukti heksanukleotidnog ponovka

[0126] Da bismo testirali da li se takvi proteini sa ponovkom mogu translatirati u odsustvu start kodona, klonirali smo region ponovka od pacijenata sa C9orf72 u vektor ekspresije sisara upotrebom ponovak primovane PCR.

[0127] Heksanukleotidni ponovak je amplifikovan ponovak primovanom PCR (6) iz pacijentovih limfoblasta (AGTACTCGCTGAGGGTGAAC; SEQ ID NO: 48; i CGTACGC ATCCCAGTTTGAGAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCC; SEQ ID NO: 49) i topokloniran u pEF6-V5/His (Invitrogen). Niti mesto višestrukog kloniranja niti C9orf72 genomska sekvence ne sadrže ATG start kodone. Pored toga, višestruki stop kodoni prisutni su u svim okvirima čitanja uzvodno od GGGGCC ponovka. Plazmidi su transformisani u bakterije Stbl2 (Invitrogen) koje su uzgajane na 32C da bi se izbegla rekombinacija. Zbog ekstremnog GC-sadržaja samo ∼20 ponovaka se moglo sekvencionirati. Veći broj ponovaka je bio zbog toga procenjen restrikcionom digestijom (Slika 1B).

[0128] Za duže konstrukte mogli smo samo upotrebiti restrikcionu digestiju da procenimo broj ponovka u rasponu od ∼28 do ∼145, jer ekstremni GC-sadržaj sprečava sekvenciranje (Sl. 1B gornji panel). Regionu uzvodno od GGGGCC-ponovka nedostaju ATG start kodoni i ugrađen u HEK293 ćelije (uzgajane sa DMEM dopunjenim sa 10% FCS i penicilin/streptomicinom), anti-GA antitela detektuju proteine povećane veličine počevši od bledog proizvoda od ∼38 ponovaka, što sugeriše da mehanizmi translacije zahtevaju minimalnu dužinu ponovka (Sl. 1B, strelica). Ipak, ne možemo isključiti translaciju kraćih polipeptida koji nisu detektovani zbog brze degradacije ili manjeg broja epitopa ponovka. Nismo detektovali poli-GR proizvode (podaci nisu prikazani) i samo najduži konstrukt sa ∼145 ponovaka dodatno eksprimira detektabilne količine poli-GP (Sl. 1B). Zajedno ovi podaci pokazuju da se GGGGCC ponovci srednje dužine pretežno translatiraju u poli-GA i manje količine poli-GP proteina u HEK293 ćelijama (Sl.1B).

Primer 3 - Test filter zamke

[0129] Da bismo analizirali agregaciju poli-GA, izveli smo testove filter zamke iz humanog post-mortem cerebeluma zdravih kontrola i FTLD/ALS-TDP pacijenata sa i bez C9orf72 ekspanzije heksanukleotidnog ponovka. Ovaj metod je dobro ustanovljen za proučavanje poli-Q agregacije (Li et al., 2003).

[0130] Materijal pacijenta pružili su Neurobiobanka iz Minhena (Neurobiobank Munich), Ludvig Maksimilians Univerzitet iz Minhena (Ludwig-Maximilians-University Munich) i Antverpenska bio banka na Institutu Born-Bunge, Univerziteta u Antverpenu (Antwerp Bio Bank at the Institute Born-Bunge, University of Antwerp) i prikupljen je i distribuiran u skladu sa smernicama lokalnih etičkih komiteta.

[0131] Cerebelum je homogenizovan u PBS koji sadrži 1% Triton-X 100, 15 mM MgCl2i 0,2 mg/ml DNaze I. Po centrifugiranju (180000 g tokom 30 min na 12°C) nerastvorljivi pelet je resuspendovan u 2% SDS 100 mM Tris pH=7 i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 1 h i potom filtriran kroz celulozno-acetatnu membranu sa veličinom pora od 0,2 μm (Li et al., 2003).

[0132] Primetili smo jak poli-GA signal samo kod FTLD/ALS pacijenta sa ekspanzijom heksanukleotidnog ponovka (Sl. 1C) što ukazuje da poli-GA formira SDS-nerastvorljive agregate u cerebelumu. Pored toga, otkrili smo i nerastvorljivi poli-GP i poli-GR kod pacijenata sa C9orf72 (Sl. 1C). 2% SDS-nerastvorljivog materijala je delimično rastvoreno nakon kuvanja u 8% SDS i može se analizirati putem SDS-PAGE. Sva tri antitela specifična za DPR detektovala su agregate velike molekulske mase na vrhu gela kod nosilaca C9orf72 mutacije, ali ne u kontrolama (Sl. 1D). Ovi nalazi ukazuju na to da se agregirajući DPR proteini generišu u sva tri okvira čitanja posebno kod pacijenata sa C9orf72 mutacijom.

Primer 4 - Imunobojenje

[0133] Parafinski preseci su prvo deparafinisani ksilolom i etanolom. Nakon kratkog ispiranja dejonizovanom vodom, otkrivanje antigena na presecima je izvedeno u mikrotalasnoj rerni šest puta po 3 min u 100 mM citratnom puferu (pH 6,0). Preseci su ostavljeni da se stabilizuju 20 minuta, nakon čega je usledilo kratko ispiranje dejonizovanom vodom. Endogena peroksidaza blokirana je sa 5% H2O2 u metanolu tokom 16 min. Nakon ispiranja dejonizovanom vodom, preseci su stavljeni u PBS sa 0,05% Brij35. Blokiranje je izvršeno sa 2% FCS u PBS tokom 5 min. Primarna antitela su razblažena blokirajućim rastvorom i inkubirana preko noći na 4°C. Za monoklonalna antitela pacova 5A2 i 1D3, zečije antipacovsko sekundarno antitelo (PARIS Anticorps) je dodatno upotrebljeno u razblaženju od 1:2000 tokom 1 h. Preseci su isprani dva puta sa PBS sa 0,05% Brij35 u trajanju od 5 minuta i razvijeni sa IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP (DCS) ili Novolink sistemom za detekciju polimera (NovoLink Polymer Detection System) za antitela pacova (Leica) koristeći DAB kao hromogen. Mikroskopske slike su dobijene BX50 mikroskopom i Cell-D softverom (Olympus). Za imunofluorescencu sekundarna antitela specifična za vrstu konjugovana sa Alexa-488 ili Alexa-544 (Invitrogen) su upotrebljena za dvostruko bojenje. TOPRO-3 (Invitrogen) je upotrebljen kao nukleusna boja. Autofluorescencija je smanjena sa 0,3% Sudan crnom. Konfokalne slike dobijene su sa LSM510 (Zeiss) sa uljno uranjajućim sočivom od 63x/1,4, koristeći prečnik rupe od 1 Ejrijeve jedinice. Osvetljenje i kontrast svake slike linearno su poboljšani upotrebom LSM softvera (Zeiss).

Primer 5 - Obrasci ćelijske distribucije DPR proteina

[0134] Da bismo odredili obrasce ćelijske distribucije ovih DPR proteina kod pacijenata sa C9orf72 mutacijama, fokusirali smo se na cerebelum i hipokampus u imunohistohemijskoj analizi, jer ovi regioni mozga sadrže brojne patologije inkluzija (Al-Sarraj et al., 2011; Mahoney et al., 2012; Bigio et al., 2012) (Sl.3A i 4A/B). Zapanjujuće, u svim slučajevima sa C9orf72 ekspanzijom ponovka, poli-GA specifična antitela detektovala su tačkaste neuronske citoplazmatske inkluzije (Sl. 3B i 4C). Njihov oblik i brojnost bili su slični p62 pozitivnim/TDP-43 negativnim inkluzijama za koje se smatra da su patognomonične za slučajeve C9orf72 mutacije. Osim toga, ovi tipovi inkluzija su takođe detektovani antitelima prema poli-GP i poli-GR, međutim u znatno manjem obimu (Sl.3C/D i 4D/E). Ovo sugeriše da se u poređenju sa poli-GA proteinima, poli-GP i poli-GR proteini ili manje efikasno translatiraju ili imaju nižu agregacionu sklonost (uporediti Sl. 1B). U hipokampusu većina inkluzija obojena sa tri DPR antitela podsećala je na p62-pozitivne inkluzije u obliku zvezde, tipične za pacijente sa C9orf72 (Sl. 4F-I i 5). Kao što je objavljeno za p62 bojenja (Al-Sarraj et al., 2011; Bigio et al., 2012), takođe smo primetili neke DPR-pozitivne intranukleusne inkluzije neurona (Sl. 4J). Slična DPR patologija je vidljiva i u ostalim regionima mozga, uključujući granularni sloj dentatnog girusa, molekulski sloj cerebeluma i neokorteks (Sl.

4K/L i Sl.2).

Primer 6 - Ko-lokalizacija DPR-pozitivnih i p62-pozitivnih agregata

[0135] Potom smo analizirali da li su DPR-pozitivni agregati identični p62-pozitivnim agregatima. Dvostruka imunofluorescencija na hipokampalnim presecima C9orf72 slučaja pokazala je kolokalizaciju poli-GA, poli-GP i poli-GR sa p62 u karakterističnim inkluzijama u obliku zvezde (Sl. 4M-O i 6D/E). Međutim, nije bilo koagregacije fosfo-TDP-43 i DPR proteina (Sl.6A-C), iako su ponekad mali sferični poli-GA agregati bili okruženi agregiranim fosfo-TDP-43 formirajući jezgro unutar fosfo-TDP-43 inkluzija (Sl. 6F). U skladu sa testom filter zamke (videti Sl. 1C), takvi poli-GA agregati nisu se mogli detektovati u FTLD-TDP slučajevima bez C9orf72 ekspanzija ponovka ili u slučajevima sa Hantingtonovom bolešću, koja ima ekspandirane poli-Q delove (Sl. 7A-B). Ukupno smo identifikovali intraneuronske agregate koji sadrže poli-GA, poli-GP i poli-GR kod svih sedam analiziranih pacijenata sa genetski potvrđenom C9orf72 ekspanzijom ponovka, ali ne u devet drugih slučajeva sa normalnom dužinom ponovka (videti Sl. 2). Zanimljivo je da neki pacijenti sa C9orf72 mutacijama pokazuju veoma malo fosfo-TDP-43 inkluzija u celom mozgu. Do sada je prijavljen samo jedan slučaj izuzetka (TJ-9) klasifikovan kao FTLD-UPS sa mutacijom C9orf72 i istaknutom ubikvitin-patologijom ali bez detektabilne TDP-43 patologije (3, 6). Otkrili smo mnogo poli-GA i neke poli-GP i poli-GR agregate u temporalnom korteksu ovog pacijenta (Sl. 7C i Sl. 2), što sugeriše da su DPR proteini presudni za FTLD patogenezu u ovom slučaju. Stoga predlažemo da je poli-GA glavna agregaciona vrsta kod FTLD-UPS pacijenata sa C9orf72 ekspanzijom ponovka i zato može biti glavni uzrok neurodegeneracije.

Primer 7 - RT-PCR analiza iRNK nivoa C9orf72 i GGGGCC ponovka

[0136] Do sad najpotpuniji podaci za patomehanizam kod pacijenata sa C9orf72 podržavaju haploinsuficijenciju kroz snažno smanjenu ekspresiju mutantnog alela (DeJesus-Hernandez et al. 2011, i Gijselinck et al, 2012, van der Zee et al. Human Mutation 2012).

[0137] Da bismo dalje potvrdili DPR-patomehanizam procenili smo nivo iRNK C9orf72 kod pacijenata putem RT-PCR analize (pozicija upotrebljenih prajmera je prikazana na Sl.8A).

[0138] RNK pacijenta je ekstrahovana pomoću kompleta RNeasy (Qiagen), uključujući DNaza I korak za uklanjanje genomske DNK. Dovoljan kvalitet RNK potvrđen je upotrebom Agilent RNK 6000 Nano kompleta na Agilent 2100 bioanalizatoru. Rezultujuće RIN vrednosti (4,7-7,2) nisu se statistički razlikovale između C9orf72 slučajeva i kontrola (p=0,25, Studentov t-test). cDNK generisana je upotrebom Taqman MikroRNK kompleta reverzne transkripcije (Life Techologies) sa slučajnim heksamerima ili lanac-specifičnim prajmerima za C9orf72 (CAATTCCACCAGTCGCTAGA; SEQ ID NO: 37; i CTGCGGTTGCGGTGCCTGC; SEQ ID NO: 38). Kvantitativna PCR je izvršena upotrebom SsoFast EvaGreen (Biorad) upotrebom intronskih prajmera specifičnih za C9orf72 (AAGAGGCGCGGGTAGAAG; SEQ ID NO: 39; i AGTCGCTAGAGGCGAAAGC; SEQ ID NO: 40) i egzonskih prajmera koji premošćuju introne za C9orf72 (sve izoforme: ACTGGAAT GGGGATCGCAGCA; SEQ ID NO: 41; i ACCCTGATCTTCCATTCTCTCTGTGCC; SEQ ID NO: 42; izoforme koje sadrže alternativni egzon 1b: CTGCGGTTGCGGTGCCTGC; SEQ ID NO: 43; i AGCTGGAGATGGCGGTGGGC; SEQ ID NO: 44) i gena sa konstitutivnom ekspresijom YWHAZ (TGAACAAAAGACGGAAGGTGCTG; SEQ ID NO: 45; i TCTGATAGGATGTGTTGGTTGCA; SEQ ID NO: 46).

[0139] Potvrdili smo da su nivoi iRNK C9orf72 smanjeni za ∼50% u mozgu pacijenta (Sl.

8B). Međutim, ekspresija introna 1 (gde se nalazi GGGGCC ponovak) je veoma povećana kod pacijenata sa C9orf72 argumentujući selektivnu stabilizaciju pre-iRNK koja sadrži ponovak (ili samog isečenog introna 1). Utvrđujemo da su pored sens transkripata takođe povećani antisens transkripti kod pacijenata sa C9orf72 (videti Sl.8B). Ovaj nalaz ima važne implikacije za terapeutske napore koji upotrebljavaju antisens oligonukleotide kao tretman za pacijente sa C9orf72 i povezuje tri predložena mehanizma bolesti: haploinsuficijenciju, hvatanje RNK-vezujućih proteina i RAN-translaciju.

Primer 8 - Kvantitativna analiza kolokalizacije p62 i poli-GA/GP/GR inkluzija

[0140] Da bi smo analizirali koja frakcija pojedinačnih tipova ćelija u bilo kom zahvaćenom regionu mozga pokazuje akumulacije dipeptidnog ponovka i da bismo procenili tačan stepen ko-lokalizacije poli-GA/GP/GR imunoreaktivnih inkluzija sa onim koje su imuno-obeležene antitelom p62, kvantitativno smo analizirali kolokalizaciju poli-GA sa p62 u karakterističnim inkluzijama kod tri pacijenta (videti Sl. 6G). Kolokalizacija p62 i DPR pozitivnih inkluzija u cerebelumu i hipokampalnom regionu CA4 kvantifikovana je dvostrukom imunofluorescencijom kod tri pacijenta sa C9orf72 mutacijom (TJ-1, TJ-2 i TJ-3). U cerebelumu ukupno 370 do 822 (poli-GA analiza), 123 do 566 (poli-GP analiza) i 211 do 596 (poli-GR analiza) inkluzija je prebrojano po pacijentu. U CA4 ukupno je analizirano 48-73 inkluzije po pacijentu za svaku DPR vrstu. U cerebelumu je više od 90% p62-pozitivnih inkluzija takođe bilo pozitivno na poli-GA. U hipokampusu ovaj broj je bio još veći: 98%. Pored toga, analizirali smo kolokalizaciju svih poli-GP i poli-GR u CA4. Dosledno utisku iz imunohistohemijske analize (videti gore), poli-GA je predominantna DPR vrsta. To snažno ukazuje na činjenicu da je poli-GA glavna komponenta u p62-pozitivnim i TDP-43 negativnim inkluzijama i dakle, važan novi protein bolesti kod pacijenata sa C9orf72 koji omogućava dijagnozu, profilaksu i tretman bolesti.

Primer 9 - Identifikacija proteina koji se specifično vezuju za GGGGCC-heksanukleotidni ponovak

[0141] Da bismo identifikovali proteine, koji bi se mogli vezati za GGGGCC heksanuleotidne ponovke, uradili smo testove afinitetnog pročišćavanja (pull down assays) upotrebom in vitro transkribovanih biotinilisanih RNK koje sadrže ili 23 GGGGCC ili 17 AAAACC ponovke kao kontrolu. Biotinilisane in vitro transkribovane RNK probe inkubirane su sa nukleusnim ekstraktima iz HEK 293 ćelija (Nukleusni ekstrakt je pripremljen kao što je prethodno opisano (Dignam et al., 1983). Koncentracija proteina je određena BCA metodom) u odsustvu ili prisustvu 50-puta u višku ne-biotinilisane kompetitorske RNK koja sadrži GGGGCC ponovak (Sl. 9A). Kompetitorska RNK sprečila je vezivanje, na šta ukazuje snažno pojačani protok (Sl. 9A; traka 4). Upotrebom rastućih koncentracija soli za eluciju vezanih proteina, primetili smo različit afinitet vezivanja proteina za GGGGCC/AAAACC ponovke nakon elucije sa 500 mM NaCl (Sl. 9A). Proteini koji se eluiraju sa 500mM NaCl iz GGGGCC ili AAAACC ponovaka podvrgnuti su LC-MS/MS. To je omogućilo identifikaciju 235 proteina u tri ponavljanja. 188 proteina identifikovano je najmanje dva puta u tri eksperimenta svlačenja. Od tih 188 proteina, vezivanje 127 proteina se može takmičiti sa viškom nebiotinilisanih GGGGCC proba. 72 proteina su pokazala najmanje dvostruko vezivanje za GGGGCC nad AAAACC. Svi proteini sa obiljem ≥ 20 u GGGGCC uzorku su konačno odabrani. Ovi strogi kriterijumi za filtriranje rezultirali su sa 20 proteina kao najboljih kandidata, od kojih su većina bili poznati faktori koji interaguju sa RNK kao što su heterogeni ribonukleoproteini (hnRNP), faktori obrade i iRNK vezujući proteini (Slika 10). Izbor ovih 20 proteina za koje su specifična antitela komercijalno dostupna potvrđen je zatim vestern blotom frakcija elucije. Za hnRNP A3, hnRNP A2B1, SFPQ, ILF3, NONO, hnRNP L, IL2BP1, ILF-2, i FUS jako i selektivno vezivanje za GGGGCC ponovak može se potvrditi u 500 mM NaCl frakciji, i ti signali su bili potpuno blokirani 50-puta u višku neobeležene GGGGCC probe (Sl.9B).

Primer 10: Identifikacija antitela koja se specifično vezuju za GGGGCC-ponovak

[0142] Da bi se utvrdilo da li se antitela specifično vezuju visokim afinitetom za polipeptid koji se sastoji od dipeptidnih ponovaka sekvence (Gly-Ala), tri različita mišja monoklonalna antitela su uzgajena (GA-5E9; GA-5F2 i GA-1A12). Stvaranje monoklonalnih antitela strategijom publikovanom u Mori et al., Science 2013, nije uspelo, jer su predominantno, IgM indukovana, koja nisu stabilna u hibridoma ćelijama i imaju slab afinitet. Samo je imunizacija agregiranih GA10peptida rezultirala IgG anti-GA antitelima. Antitela su generisana imunizacijom CBL miševa subkutano i intraperitonealno sa 30 μg agregiranog rekombinantnog peptida koji sadrži GA10vezan za polietilen glikol (C-PEG-(GA)10) subkutano i intraperitonealno sa smešom 5 nmol CpG 2006 oligonukleotida (Tib Molbiol, Berlin, Nemačka), 150 μl PBS-a i 150 μl Frojdovog nekompletnog adjuvansa. Miševi su pojačani sa 30 μg peptida u PBS-u nakon 6 nedelja. Hiperimune ćelije slezine fuzionisane su sa mišjom ćelijskom linijom mijeloma P3X63Ag8.653 upotrebom standardnih procedura. Supernatanti su pregledani ELISA, imunoblotom i imunohistohemijom. Klonovi GA 1A12 i GA 5E9 potklase IgG1 i klon GA 5F2 potklase IgG2a su stabilno subklonirani.

[0143] Alikvoti prečišćenih GST-fuzionih proteina koji sadrže GA-DPR (GA)15, GP-DPR (GP)15, GR-DPR (GR)15, AP-DPR (AP)15, PR-DPR (PR)15podvrgnuti su elektroforezi, i vestern blot je izvršen upotrebom naznačenih antitela (GA 5E9, GA 5F2, GA 1A12). GST-fuzioni proteini koji sadrže GP-, GR, AP-, PR-DPR-ove upotrebljeni su kao kontrola za specifičnost GA vezivanja. Da bi se dobilo više informacija o afinitetu upotrebljenih antitela, ELISA test je izvršen u skladu sa sledećom eksperimentalnom procedurom:

[0144] Uzeti zajedno ovi podaci pokazuju da je translacija intronske ekspanzije GGGGCC-ponovka kod FTLD/ALS pacijenata koja vodi do akumulacije nerastvorljivih DPR agregata. Poli-GA, najviše hidrofobni DPR, bio je najrobusnije detektovan nakon transfekcije GGGGCC-ponovaka u HEK293 ćelijama i u testu filter zamke iz humanog cerebeluma. Osim toga, poli-GA antitela obojila su preko 90% enigmatičnih p62 pozitivnih/TDP-43 negativnih inkluzija isključivo pronađenih u slučajevima FTLD/ALS sa C9orf72 mutacijom. U manjem obimu, poli-GP i poli-GR proteini takođe su se mogli otkriti u ovim agregatima. Nijedan proizvod nije kodiran otvorenim okvirom čitanja.

[0145] Dovoljni dokazi upućuju na patogenu ulogu DPR inkluzija kod FTLD pacijenata sa C9orf72 ekspanzijom heksanukleotidnog ponovka. Prvo, DPR patologija je predominantna u klinički relevantnim regionima mozga (hipokampus i frontotemporalni neokorteks) i verovatno prethodi TDP-43 patologiji, jer smo povremeno primetili poli-GA u jezgru TDP-43 inkluzija, ali nikada nismo pronašli fosfo-TDP-43 bojenje unutar DPR inkluzija. Drugo, pacijenti sa C9orf72 pokazuju cerebelarnu atrofiju koja se ne pojavljuje kod drugih genetskih ili sporadičnih varijanti FTLD/ALS koje nemaju cerebelarne DPR inkluzije. Treće, DPR patologija je direktna posledica ekspanzije heksanukleotida, najčešćeg genetskog uzroka FTLD/ALS. Konačno, najmanje jedan C9orf72 nosilac ekspanzije imao je obilnu DPR patologiju i varijantu ponašanja kliničkog FTLD, ali nije imao detektabilnu patologiju TDP43 inkluzije. Stoga će antitela specifična za DPR biti dragoceno sredstvo da dalje disekuju ulogu obilnih TDP-43 negativnih inkluzija u različitim regionima mozga.

[0146] Proteini sa dipetptidnim ponovkom su glavni protein bolesti u karakterističnim inkluzijama korteksa i cerebeluma kod FTLD/ALS pacijenata sa C9orf72 ekspanzijom heksanukleotida i direktno su povezani sa predominantnom patologijom. Neuobičajeni translacioni mehanizam i izrazito abnormalan proizvod olakšavaju selektivnije dijagnostičke i/ili terapeutske pristupe nego što je to moguće kod drugih neurodegenerativnih bolesti. Pogodni dijagnostički i/ili terapeutski pristupi uključuju aplikaciju i/ili primenu oligonukleotida, antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, proteina sličnih antitelu i/ili peptidomimetika usmerenih prema heksanukleotidnim ponovcima ili DPR proteinu.

Reference

[0147]

1. Al-Sarraj S, King A, Troakes C et al. (2011) p62 positive, TDP-43 negative, neuronal cytoplasmic and intranuclear inclusions in the cerebellum and hippocampus define the pathology of C9orf72-linked FTLD and MND/ALS. Acta Neuropathol 122 (6):691-702.

2. Arai T, Hasegawa M, Akiyama H et al. (2006) TDP-43 is a component of ubiquitinpositive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochem Biophys Res Commun 351 (3):602-611.

3. Ashizawa T., Ranun L.P. (2012) GGCCTG repeats put a hex on Purkinje cells and motor neurons in SCA36, Neurology 79(4), 302-303.

4. Benajiba L, Le Ber I, Camuzat A et al. (2009) TARDBP mutations in motoneuron disease with frontotemporal lobar degeneration. Ann Neurol 65 (4):470-473.

5. Bigio EH, Weintraub S, Rademakers R, Baker M, Ahmadian SS, Rademaker A, Weitner BB, Mao Q, Lee KH, Mishra M, Ganti RA, Mesulam MM. (2012) Frontotemporal lobar degeneration with TDP-43 proteinopathy and chromosome 9p repeat expansion in C9ORF72: clinicopathologic correlation. Neuropathology doi: 10.1111/j.1440-1789.2012.01332.x

6. Boxer AL, Mackenzie IR, Boeve BF, Baker M, Seeley WW, Crook R, Feldman H, Hsiung GY, Rutherford N, Laluz V, Whitwell J, Foti D, McDade E, Molano J, Karydas A, Wojtas A, Goldman J, Mirsky J, Sengdy P, Dearmond S, Miller BL, Rademakers R. (2011) Clinical, neuroimaging and neuropathological features of a new chromosome 9plinked FTD-ALS family. J Neurol Neurosurg Psychiatry 82(2): 196-203.

7. DeJesus-Hernandez M, Mackenzie IR, Boeve BF et al. (2011) Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72 (2):245-256.

8. Desmyter et al. (1996) Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. Nat. Structure Biol.3, 803-811

9. Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG (1983) Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res 11 (5):1475-1489.

10. Gasser T, Hardy J, Mizuno Y (2011) Milestones in PD genetics. Mov Disord 26 (6): 1042-1048.

11. Geall et al. (2012) Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci USA, 109, 14604-14609.

12. Gijselinck I, Van Langenhove T, van der Zee J et al. (2012) A C9orf72 promoter repeat expansion in a Flanders-Belgian cohort with disorders of the frontotemporal lobar degeneration-amyotrophic lateral sclerosis spectrum: a gene identification study. Lancet Neurol 11 (1):54-65.

13. Haass C, Selkoe DJ (2007) Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol 8 (2):101-112.

14. Huston et al. (1988) Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883

15. Ivanov IP, Firth AE, Michel AM, Atkins JF, Baranov PV. (2011) Identification of evolutionarily conserved non-AUG-initiated N-terminal extensions in human coding sequences. Nucleic Acids Res 39, 4220.

16. Josephs KA, Hodges JR, Snowden JS, Mackenzie IR, Neumann M, Mann DM, Dickson DW (2011) Neuropathological background of phenotypical variability in frontotemporal dementia. Acta Neuropathol 122(2): 137-153.

17. Kremmer E, Kranz BR, Hille A, Klein K, Eulitz M, Hoffmann-Fezer G, Feiden W, Herrmann K, Delecluse HJ, Delsol G, Bornkamm GW, Mueller-Lantzsch N, Grässert FA. (1995) Rat monoclonal antibodies differentiating between the Epstein-Barr virus nuclear antigens 2A (EBNA2A) and 2B (EBNA2B). Virology 208(1):336-42.

18. Kufer P., Lutterbüse R., Baeuerle P.A. (2004) A revival of bispecific antibodies. Trends Biotechnol. 22, 238-244.

19. Li H, Wyman T, Yu ZX, Li SH, Li XJ. (2003) Abnormal association of mutant huntingtin with synaptic vesicles inhibits glutamate release. Hum Mol Genet 12, 2021. 20. Ma AS, Moran-Jones K, Shan J et al. (2002) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3, a novel RNA trafficking response element-binding protein. J Biol Chem 277 (20): 18010-18020.

21. Mackenzie IR, Rademakers R, Neumann M. (2010) TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Lancet Neurol.9(10):995-1007.

22. Mahoney CJ, Downey LE, Ridgway GR, Beck J, Clegg S, Blair M, Finnegan S, Leung KK, Yeatman T, Golden H, Mead S, Rohrer JD, Fox NC, Warren JD (2012) Longitudinal neuroimaging and neuropsychological profiles of frontotemporal dementia with C9ORF72 expansions. Alzheimers Res Ther.2012 Sep 24;4(5):41.

23. Neumann M, Sampathu DM, Kwong LK et al. (2006) Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science 314 (5796):130-133.

24. Peabody DS (1989) Translation initiation at non-AUG triplets in mammalian cells. J Biol Chem 264, 5031.

25. Rademakers R, Neumann M, Mackenzie IR (2012) Advances in understanding the molecular basis of frontotemporal dementia. Nat Rev Neurol 8 (8):423-434

26. Ranum LP, Cooper TA (2006) RNA-mediated neuromuscular disorders. Annu Rev Neurosci 29:259-277.

27. Renton AE, Majounie E, Waite A et al. (2011) A Hexanucleotide Repeat Expansion in C9ORF72 Is the Cause of Chromosome 9p21-Linked ALS-FTD. Neuron 72 (2):257-268.

28. Sieben A, Van Langenhove T, Engelborghs S et al. (2012) The genetics and neuropathology of frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathol 124 (3):353-372.

29. Sreedharan J, Blair IP, Tripathi VB et al. (2008) TDP-43 mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Science 319 (5870): 1668-1672

30. Touriol C. et al. (2003) Generation of protein isoform diversity by alternative initiation of translation at non-AUG codons. Biol Cell 95, 169.

31. van der Zee J, Gijselinck I, Dillen L et al. (2012) A Pan-European study of the C9orf72 Repeat Associated with FTLD: Geographic Prevalence, Genomic Instability and Intermediate Repeats. Hum Mutat doi: 10.1002/humu.22244.

32. Vance C, Rogelj B, Hortobagyi T et al. (2009) Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6. Science 323 (5918): 1208-1211

33. Whitwell JL, Weigand SD, Boeve BF, Senjem ML, Gunter JL, DeJesus-Hernandez M, Rutherford NJ, Baker M, Knopman DS, Wszolek ZK, Parisi JE, Dickson DW, Petersen RC, Rademakers R, Jack CR Jr, Josephs KA. (2012) Neuroimaging signatures of frontotemporal dementia genetics: C9ORF72, tau, progranulin and sporadics. Brain 135(Pt 3):794-806.

34. Zu T, Gibbens B, Doty NS et al. (2011) Non-ATG-initiated translation directed by microsatellite expansions. Proc Natl Acad Sci USA 108 (1):260-265.

Claims (3)

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za polipeptid koji se sastoji od (Gly-Ala)adipeptidnih ponovaka, pri čemu je a ceo broj od 16 ili više, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži CDR3 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 53; CDR2 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 54; i CDR1 sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 55.

i

(i) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYTFTGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 68, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži EILPGSGSTK u skladu sa SEQ ID NO: 64 i CDR3 sekvencu teškog lanca koja sadrži GDFTNSHFAY u skladu sa SEQ ID NO: 60;

ili

(ii) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYTFTGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 68, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži ENLPGSGSTK u skladu sa SEQ ID NO: 65 i CDR3 sekvencu teškog lanca koja sadrži GDYSNSHFAY u skladu sa SEQ ID NO: 57;

ili

(iii) CDR1 sekvencu teškog lanca koja sadrži GYKFIGYWIE u skladu sa SEQ ID NO: 69, CDR2 sekvencu teškog lanca koja sadrži ENLPGSGTTK u skladu sa SEQ ID NO: 66 i CDR3 sekvencu teškog lanca koja sadrži GDYSNSHFTY u skladu sa SEQ ID NO: 59.

2. Farmaceutski preparat koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1 i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

3. Upotreba antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u skladu sa patentnim zahtevom 1 u in vitro dijagnostici bolesti koja je naznačena ekspanzijom genomskih GGGGCC ponovaka, pri čemu je bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od amiotrofične lateralne skleroze (ALS), frontotemporalne demencije (FTD), i amiotrofične lateralne skleroze-frontotemporalne demencije (ALS-FTD).