RS59416B1 - Multispecifični konstrukti antitela - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovo otkriće se odnosi na određene multispecifične konstrukte antitela, farmaceutske formulacije koje sadrže konstrukt, DNK koja kodira konstrukte i vektore sadržavajući iste. Otkriće se takođe proteže na metod eksprimiranja konstrukata, na primer, u ćeliji domaćina i metode za formulisanje iste kao farmaceutske kompozicije. Otkriće se takođe odnosi na upotrebu multispecifičnih konstrukata antitela i formulacija u tretmanu.

[0002] Postoji veliki broj pristupa za generisanje bi-specifičnih antitela, od kojih se mnogi zasnivaju na formatu koji su prvobitno opisali Morrison et al (Coloma and Morrison 1997, Nat Biotechnol. 15, 159-163) uključujući fuziju varijabilnih fragmenata jednog lanca (scFv) sa celim antitelima, npr. IgG, ili Fab fragmentima antitela, Schoonjans et al., 2000, Journal of Immunology, 165, 7050-7057.

[0003] Mertens et al., 2004, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 19, 1, 99-109 opisuje Fab-fragment povezan sa dva scFv molekula, poznat kao tzv. "tribodi". WO2013/068571 opisuje Fab fragment povezan na jedan dsscFv molekul. US2010/081796 opisuje IgG povezan sa dva dsscFv molekula.

[0004] U slučaju Fab-scFv, VHi VLdomeni scFv korišćeni u takvim bi-specifičnim i tri specifičnim molekulima obično se drže zajedno peptidnim veznicima. Međutim, za određene kombinacije VHi VLvarijabilnih domena, peptidni veznici nisu u stanju da pruže dovoljnu stabilnost scFv, rezultirajući 'disanjem' varijabilnog domena i slobodnim intermolekularnim uparivanjem sa varijabilnim domenima, i tako postoji tendencija da se formiraju multimeri kroz Fv deo jednog lanca od njih. Ovo je prikazano na Slici 1 u kontekstu bispecifičnog molekula.

[0005] Prisutni pronalazači ponovo konstruisali dotične multispecifične molekule antitela da bi obezbedili molekule antitela sa ekvivalentnom funkcionalnošću, istovremeno minimizirajući multimerizaciju u fazi ekspresije i/ili posle prečišćavanja. Ovo olakšava povećanje prinosa dobijenog "monomernog" materijala i obezbeđuje molekule pogodne stabilnosti za upotrebu u tretmanu posle prečišćavanja, koncentracije i formulacije.

[0006] Tako, u jednom aspektu je obezbeđen multispecifični molekul antitela obuhvatajući ili se sastojeći od:

a) polipeptidnog lanca formule (l):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

pri čemu:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, domen 1 istog;

X predstavlja vezu ili veznik;

Y predstavlja vezu ili veznik;

V1predstavlja dsFv ili dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsFv ili dsscFv.

[0007] Povoljno, multispecifični molekuli antitela iz ovog otkrića minimiziraju količinu agregacije viđenu nakon prečišćavanja i maksimiziraju količinu monomera u formulacijama konstrukta u farmaceutskim koncentracijama, uključujući održavanje visokih nivoa monomera tokom vremena skladištenja, na primer monomer može biti prisutan kao 50%, 60%, 70% ili 75% ili više, kao što je 80 ili 90% ili više, kao što je 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% ili više od ukupnog proteina.

Detaljan opis pronalaska

[0008] "Multi-specifično antitelo" kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na molekul antitela kao što je ovde opisano koji ima dva ili više domena vezivanja, na primer dva ili tri domena vezivanja.

[0009] U jednom izvođenju konstrukt antitela je tri specifična antitela.

[0010] "Tri-specifično antitelo", kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na molekul antitela sa tri mesta vezivanja antigena, koja mogu nezavisno da vežu iste ili različite antigene. U jednom primeru trispecifični molekul antitela veže dva različita antigena, tj. dva mesta vezivanja vežu isti antigen, a treće mesto vezanja veže drugi, različiti antigen. Poželjno, tri mesta vezivanja trispecifičnog molekula antitela pronalaska nezavisno vežu tri različita antigena.

[0011] U jednom izvođenu konstrukt je bi-specifično antitelo.

[0012] "Bi-specifični molekul" kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na molekul sa dva mesta vezivanja antigena, koja mogu da vezuju iste ili različite antigene.

[0013] U jednom izvođenju, svi domeni vezuju isti antigen, uključujući vezivanje istog epitopa na antigen ili vezivanje različitih epitopa na antigen.

[0014] U jednom izvođenju postoje tri vezujuća domena, i svaki od tri vezujuća domena veže različite (distingtivne) antigene.

[0015] U jednom izvođenju, tri vezujuća domena i dva vezujuća domena vežu isti antigen, uključujući vezivanje istog epitopa ili različitih epitopa na isti antigen, i treći vezujući domen veže različiti (distingtivan) antigen.

[0016] "Mesto vezanja antigena", u daljem tekstu "Antigen vezujuće mesto" kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na deo molekula, koji sadrži par varijabilnih regiona, naročito kognitivni par koji interferira specifično sa ciljanim antigenom.

[0017] Vezujući domeni kao što je ovde upotrebljeno uključuju antitelo sa jednim domenom, tj. varijabilni region i antigen vezujuća mesta.

[0018] "Specifično", kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na mesto vezivanja ili vezujući domen koji prepoznaje samo antigen za koji je specifičan ili vezujuće mesto ili vezujući domen koji ima značajno veći afinitet vezivanja za antigen za koji je specifičan u odnosu na afinitet prema antigenima za koje je nespecifičan, na primer 5, 6, 7, 8, 9, 10 puta veći afinitet vezivanja.

[0019] Afinitet vezivanja može biti izmeren standardnim testom, na primer rezonancom površinskog plazmona, kao što je BIAcore.

[0020] U jednom izvođenju, multispecifični molekul antitela prema ovom otkriću je obezbeđen kao dimer teškog i lakog lanca od:

Formule (l) i (ll) respektivno, pri čemu VH-CH1deo zajedno sa VL-CLdelom formira funkcionalni Fab ili Fab- ov ragment.

[0021] VHpredstavlja varijabilni domen, na primer varijabilni domen teškog lanca. U jednom izvođenju VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca. U jednom izvođenju VHje himerni varijabilni domen, to znači da sadrži komponente izvedene iz najmanje dve vrste, na primer humani okvir i ne-humane CDR-a. U jednom izvođenju VHje humanizovan. U jednom izvođenju VHje humani.

[0022] VLpredstavlja varijabilni domen, na primer varijabilni domen lakog lanca. U jednom izvođenju VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca. U jednom izvođenju VLje himerni varijabilni domen, to znači da sadrži komponente izvedene iz najmanje dve vrste, na primer humani okvir i CDRa ne-humane CDRa. U jednom izvođenju VLje humanizovan. U jednom izvođenju VH je humanizovan. U jednom izvođenju VHje humani.

[0023] Uopšteno, VHi VLzajedno formiraju domen vezivanja antigena, u daljem tekstu antigen vezujući domen. U jednom izvođenju VHi VLformiraju kognitivni par.

[0024] "Kognitivni par", kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na par varijabilnih domena iz jednog antitela, koji je generisan in vivo, tj. uparivanjem varijabilnih domena koji se prirodno javljaju izolovanih iz domaćina. Srodni-Kognitivni par je dakle VHi VLpar. U jednom primeru kognitivni par zajedno veže antigen.

[0025] "Varijabilni region", kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na region u lancu antitela koji sadrži CDR-i i okvir, naročito pogodan okvir.

[0026] Varijabilni regioni za upotrebu u ovom otkriću će generalno biti izvedeni iz antitela, koji mogu biti generisani bilo kojim metodom poznatim u stanju tehnike.

[0027] "Izvedeno iz" kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na činjenicu da je upotrebljena sekvenca ili sekvenca vrlo slična upotrebljenoj sekvenci dobijena iz izvornog genetskog materijala, kao što je laki ili teški lanac antitela.

[0028] "Vrlo slična" kao što je ovde upotrebljeno, se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je po celoj dužini 95% slična ili više, kao što je 96, 97, 98 ili 99% slična.

[0029] Varijabilni regioni za upotrebu u ovom pronalasku, kao što je iznad ovde opisano za VHi VL, mogu biti iz bilo kojeg pogodnog izvora i mogu biti, na primer, potpuno humani ili humanizovani.

[0030] U jednom izvođenju vezujući domen formiran od VHi VLje specifian za prvi antigen.

[0031] U jednom izvođenju vezujući domen formiran od V1je specifičan za drugi antigen.

[0032] U jednom izvođenju vezujući domen formiran od V2je specifičan za drugi ili treći antigen.

[0033] U jednom izvođenju CH1domen je domen 1 koji se prirodno javlja iz teškog lanca antitela ili njegovog derivata.

[0034] U jednom izvođenju, CLfragment, u lakom lancu, je konstantna kappa sekvenca ili konstantna lambda sekvenca ili derivat od njih.

[0035] Derivat domena koji se prirodno javlja, kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na mesto gde su jedna, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina u sekvenci koja se prirodno javlja zamenjene ili izbrisane, na primer za optimizaciju svojstva domena kao što je uklanjanje nepoželjnih svojstava, ali pri čemu je/su karakteristično svojstvo (svojstva) domene zadržana.

[0036] U jednom izvođenju jedna ili više prirodnih ili konstruisanih međulančanih (tj. između lakog i teškog lanca) disulfidnih veza su prisutne u funkcionalnom Fab ili Fab-ovom fragmentu.

[0037] U jednom izvođenju , "prirodna" disulfidna veza je prisutna između CH1i CLu polipeptidnim lancima formule (l) i (ll).

[0038] Kad je CLdomen izveden bilo iz Kappa ili Lambda, prirodna pozicija za vezu formirajući cistein je 214 u humanom cKappa i cLambda (Kabat numerisanje 4. izdanje 1987).

[0039] Tačna lokacija disulfidne veze formirajući cistein u CH1zavisi od konkretnog domena koji je zaista upotrebljen. Tako, na primer, u humanom gama-1, prirodna pozicija disulfidne veze je smeštena na poziciji 233 (Kabat numerisanje 4. izdanje 1987). Pozicija veze formirajući cistein za druge humane izotipe, kao takvi gama 2, 3, 4, IgM i IgD su poznati, na primer pozicija 127 za humani IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 i 128 teškog lanca humanog IgD i IgA2B.

[0040] Opciono može postojati disulfidna veza između VHi VLpolipeptida formule l i ll.

[0041] U jednom izvođenju, multi-specifično antitelo prema otkriću ima disulfidnu vezu u poziciji jednakoj ili odgovarajućoj onoj koji se prirodno javlja između CH1i CL.

[0042] U jednom izvođenju konstantan region sadržavajući CH1i konstantan region kao što je CLima disulfidnu vezu koja je u poziciji koja se ne javlja prirodno. Ovo može biti konstruisano u molekul uvođenjem cisteina (a) u lanac amino kiseline na traženoj poziciji ili pozicijama. Ova ne-prirodna disulfidna veza je dodatak ili kao alternativa prirodnoj disulfidnoj vezi prisutnoj između CH1i CL. Cistein (i) u prirodnim pozicijama mogu biti zamenjeni sa amino kiselinom kao što je serin koja nije sposoban za formiranje disulfidnog mosta.

[0043] Uvođenje konstruisanih cisteina može biti izvedeno korišćenjem bilo koje metode poznate u stanju tehnike. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, mutagenezu preklapanja PCR ekstenzije, mutagenezu usmerenu na mesto ili kasetnu mutagenezu (videti generalno, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Kompleti za mutagenezu usmerenu na mesto su komercijalno dostupni, npr. QuikChange® komplet za mutagenezu usmerenu na mesto (Stratagene, La Jolla, CA 9). Kasetna mutageneza može biti izvedena na osnovu Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323. Alternativno, mutanti mogu biti dobijeni ukupnom sintezom gena anilacijom, vezivanjem i PCR amplifikacijom i kloniranjem preklapajućih oligonukleotida.

[0044] U jednom izvođenju disulfidna veza između CH1i CLje potpuno odsutna, na primer međulančani cisteini mogu biti zamenjeni drugom aminokiselinom, kao što je serin. Tako u jednom izvođenju nema interlančanih disulfidnih veza u funkcionalnom Fab fragmentu molekula. Otkrića kao što su WO2005/003170 opisuju kako da se obezbede Fab fragmenti bez međulančane disulfidne veze.

[0045] V1predstavlja dsFvor ili dsscFv.

[0046] V2predstavlja dsFv ili dsscFv.

[0047] U jednom izvođenju V1i V2su oba dsscFv.

[0048] U jednom izvođenju V1i V2su oba dsFv. Kada oba V1i V2su dsFv, bilo VHili VLvarijabilni domeni su isti za V1i V2. U jednom izvođenju V1i V2imaju isti VHvarijabilni domen. U jednom izvođenju, V1i V2imaju isti VLvarijabilni domen. U jednom izvođenju, varijabilni domeni VHi VLsu isti za V1i V2. Ovo poslednje omogućava unakrsno vezivanje koje može biti poželjno za neke ciljeve.

[0049] U jednom izvođenju V1je dsscFv, i V2je dsFv. U jednom izvođenju V1je dsFv, i V2je dsscFv.

[0050] Tako, u jednom aspektu, je obezbeđen multispecifični molekul antitela obuhvtajući ili sastojeći se od:

a) polipeptidnog lanca formule (l):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

pri čemu:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, domeni 1 istog;

X predstavlja vezu ili veznik;

Y predstavlja vezu ili veznik;

V1predstavlja dsFv ili dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona, na primer domen konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsFv ili dsscFv;

[0051] "Varijabilni fragment jednog lanca" ili "scFv", kako što je ovde upotrebljen, se odnosi na varijabilni fragment jednog lanca obuhvtajući ili sastojeći se od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) koji je stabilizovan sa peptidnim veznikom između VHi VLvarijabilnih domena. VHi VLvarijabilni domeni mogu biti u bilo kojoj pogodnoj orijentaciji, na primer, C-terminus od VHmože biti povezan na N-terminus od VLili C-terminus od VLmože biti povezan na N-terminus od VH.

[0052] "Disulfidno stabilizovani varijablni fragment jednog lanca" ili "dsscFv", kao što je ovde upotrebljen, se odnosi na varijabilni fragment jednog lanca koji je stabilizovan sa peptidnim veznikom između varijabilnog domena VHi VL, i takođe uključuje i inter-domensku disulfidnu vezu između VHi VL.

[0053] "Disulfidno stabilizovani varijabilni fragment" ili "dsFv", kao što je ovde upotrebljen, se odnosi na varijabilni fragment jednog lanca koji ne uključuje peptidni veznik između varijabilnih domena VHi VLi umesto toga je stabilizovan interdomenskom disulfidnom vezom između VHi VL.

[0054] "Antitelo sa jednim domenom" ili "sdAb" kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od jednog monomernog varijabilnog domena antitela, kao što su VHili VLili VHH.

[0055] U jednom izvođenju, kada V1i/ili V2su dsFv ili dsscFv, disulfidna veza između varijabilnih domena VHi VLod V1i/ili V2je između dva ispod navedena ostatka (osim ako kontekst ne ukazuje na drugačije upotrebljeno Kabatovo numerisanje u listi ispod). Gde god je referenca napravljena prema Kabatovom numerisanju, relevantna referenca je Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA.

[0056] U jednom izvođenju disulfidna veza je u poziciji izabranoj iz grupe obuhvatajući:

• VH37 VL95C videti za primer Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• VH44+ VL100 videti za primer; Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994); or Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al (1994); or Protein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997);

• VH44 VL105 videti za primer J Biochem.118, 825-831 Luo et al (1995);

• VH45 VL87 videti za primer Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• VH55 VL101 videti za primer FEBS Letters 377135-139 Young et al (1995);

• VH100 VL50 videti za primer Biochemistry 291362-1367 Glockshuber et al (1990);

• VH100b VL49;

• VH98 VL46 videti za primer Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• VH101 VL46;

• VH105 VL43 videti za primer; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993); or Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994),

• VH106 VL57 videti za primer FEBS Letters 377135-139 Young et al (1995)

i odgovarajućoj poziciji tome u paru varijabilnog regiona smeštenom u molekulu.

[0057] U jednom izvođenju disulfidna veza je formirana između pozicija VH44 i VL100.

[0058] Iznad navedeni aminokiselinski parovi su u pozicijama koje pogoduju zameni sa cisteinima tako da se mogu formirati disulfidne veze. Cisteini mogu biti konstruisani u ove željene pozicije sa poznatim tehnikama. U jednom izvođenju se zbog toga ugrađeni cistein prema ovom otkriću odnosi na to gde je ostatak koji se prirodno javlja u datoj poziciji aminokiseline zamenjen sa cisteinskim ostatkom.

[0059] Uvođenje ugrađenih cisteina može biti izvedeno bilo kojom metodom poznatom u stanju tehnike. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, mutagenezu preklapanja PCR ekstenzije, mutagenezu usmerenu na mesto ili kasetnu mutagenezu (videti generalno, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Kompleti za mutagenezu usmerenu na mesto su komercijalno dostupni npr. QuikChange® Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagen, La Jolla, CA). Kasetna mutageneza može biti izvedena na osnovu Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323. Alternativno, mutanti mogu biti dobijeni ukupnom sintezom gena kaljenjem, vezivanjem i PCR amplifikacijom i kloniranjem preklapajućih oligonukleotida.

[0060] Prema tome, u jednom izvođenju, kada V1i/ili V2su dsFv ili dsscFv, varijabilni domeni VHi VLod V1i/ili varijabilni domeni VHi VLod V2mogu biti povezani disulfidnom vezom između dva cisteinska ostatka, pri čemu je pozicija para cisteinskih ostataka izabrana iz grupe koja se sastoji od: VH37 i VL95, VH44 i

VL100, VH44 i VL105, VH45 i VL87, VH100 i VL50, VH100b i VL49, VH98 i VL46, VH101 i VL46, VH105 i VL43 i VH106 i VL57.

[0061] U jednom izvođenju, kada V1i/ili V2su dsFv ili dsscFv, varijabilni domeni VHi VLod V1i/ili varijabilni domeni VHi VLod V2mogu biti povezani sa disulfidnom vezom između dva cisteinska ostatka, jedan u VHi jedan u VL, koji su izvan CDR-a, pri čemu je pozicija para cisteinskih ostataka izabrana iz grupe koja se sastoji od VH37 i VL95, VH44 i VL100, VH44 i VL105, VH45 i VL87, VH100 i VL50, VH98 i VL46, VH105 i VL43 i VH106 i VL57.

[0062] U jednom izvođenju, kada V1je dsFv ili dsscFv, varijabilni domeni VHi VLod V1su povezani sa disulfidnom vezom između dva konstruisana ostatka cisteina, jedan na poziciji VH44, i drugi na VL100.

[0063] U jednom izvođenju, kada V2je dsFv ili dsscFv, varijabilni domeni VHi VLod V2su povezani sa disulfidnom vezom između dva dizajnirana konstruisana cisteinska ostatka, jednog na poziciji VH44, i drugog na VL100.

[0064] U jednom izvođenju, kada V1je dsFv ili dsscFv, VHdomen od V1je spojen na X. U jednom izvođenju, kada V1je dsFv ili dsscFv, VLdomen od V1je spojen na X.

[0065] U jednom izvođenju, kada V2je dsFv ili dsscFv, VHdomen od V2je spojen na Y.

[0066] U jednom izvođenju, kada V2je dsFv ili dsscFv, VLdomen od V2je spojen na Y.

[0067] Stručnjak će ceniti da kada V1i/ili V2predstavlja dsFv, multispecifično antitelo će sadržavati treći polipeptid kodirajući odgovarajući slobodni VHili VLdomen koji nije spojen na X ili Y. Kada V1i V2su oba dsFv, tada će "slobodni varijabilni domen" (tj. domen vezan putem disulfidne veze na ostatak polipeptida) biti zajednički za oba lanca. Tako, iako aktuelni varijabilni domen fuzionisan ili povezan preko X ili Y za polipeptid može biti različit u svakom polipeptidnom lancu, slobodni varijabilni domeni upareni s njim će generalno biti identični jedni drugima.

[0068] U jednom izvođenju X je veza.

[0069] U jednom izvođenju Y je veza.

[0070] U jednom izvođenju oba X i Y su veze.

[0071] U jednom izvođenju X je veznik, poželjno peptidni veznik, na primer pogodan peptid za povezivanje delova CH1i V1.

[0072] U jednom izvođenju Y je veznik, poželjno peptidni veznik, na primer pogodan peptid za povezivanje delova CLi V2.

[0073] U jednom izvođenju oba X i Y su veznici. U jednom izvođenju oba X i Y su peptidni veznici.

[0074] Izraz "peptidni veznik" kao što je ovde korišćen se odnosi na peptid koji se sastoji od aminokiselina. Raspon pogodnih peptidnih veznika će biti poznat stručnjaku sa ovog područja tehnike.

[0075] U jednom izvođenju peptidni veznik je u dužini od 50 aminokiselina ili manje, na primer 20 aminokiselina ili manje, kao što je oko 15 aminokiselina ili manje, kao što je 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 aminokiselina u dižini.

[0076] U jednom izvođenju veznik je izabran iz sekvence prikazane u sekvenci 1 do 67.

[0077] U jednom izvođenju veznik je izabran iz sekvence prikazane u SEK ID BR: 1 ili SEK ID BR: 2.

[0078] U jednom izvođenju X ima sekvencu SGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 1).

[0079] U jednom izvođenju Y ima sekvencu SGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 1).

[0080] U jednom izvođenju X ima sekvencu SGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 2). U jednom izvođenju Y ima sekvencu SGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 2).

[0081] U jednom izvođenju X ima sekvencu datu u SEK ID BR:1 i Y ima sekvencu datu u SEK ID BR:2.

[0082] U jednom izvođenju X ima sekvencu datu u SEK ID BR:69 ili 70. U jednom izvođenju Y ima sekvencu datu u SEK ID BR:69 ili 70. U jednom izvođenju X ima sekvencu datu u SEK ID BR:69 i Y ima sekvencu datu u SEK ID BR:70.

Tabela 1. Sekvence zglobnog veznika

Tabela 2. Sekvence fleksibilnog veznika

[0083] (S) je opciono u sekvencama 14 do 18.

[0084] Primeri krutih veznika uključuju peptidne sekvence GAPAPAAPAPA (SEK ID BR: 52), PPPP (SEK ID BR: 53) i PPP.

[0085] U jednom izvođenju peptidni veznik je peptid koji veže Albumin.

[0086] Primeri peptida koji vezuju Albumin su obezbeđeni u WO2007/106120 i uključuju:

Tabela 3

[0087] Pogodna upotreba peptida koji vezuju Albumin kao veznik može povećati polu vreme raspada multi-specifičnog molekula antitela.

[0088] U jednom izvođenju kada V1je dsscFv, postoji veznik, na primer, pogodan peptid za povezivanje varijabilnih domena VHi VLod V1.

[0089] U jednom izvođenju, kada V2je dsscFv, postoji veznik, na primer, pogodan peptid za povezivanje varijabilnih domena VHi VLod V2.

[0090] U jednom izvođenju peptidni veznik u dsscFv je u rasponu od oko 12 do 25 aminokiselina u dužini, kao što je 15 do 20 aminokiselina.

[0091] U jednom izvođenju, kada V1je dsscFv, veznik koji povezuje varijabilne domene VHi VLod V1ima sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 68).

[0092] U jednom izvođenju, kada V2je dsscFv, veznik koji povezuje varijabilne domene VHi VLod V2ima sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 68).

[0093] U jednom izvođenju kada V1je dsscFv, veznik koji povezuje varijabilne domene VHi VLod V1ima sekvencu SGGGGSSGGGGGGGGGGS (SEK ID BR: 69).

[0094] U jednom izvođenju, kada V2je dsscFv, veznik koji povezuje varijabilne domene VHi VLod V2ima sekvencu SGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 69)

[0095] U jednom izvođenju kada V1je dsscFv, veznik koji povezuje varijabilne domene VHi VLod V1ima sekvencu SGGGGSGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 70).

[0096] U jednom izvođenju kada V2je dsscFv, veznik koji povezuje varijabilne domene VHi VLod V2ima sekvencu SGGGGSGGGGTGGGGS SEK ID BR: 70).

[0097] Prema tome, u jednom aspektu je obezbeđen multispecifični molekul antitela, obuhvtajući ili sastojeći se od:

a) polipeptidnog lanca formule (l):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

pri čemu:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, domen 1 istog;

X predstavlja vezu ili veznik;

Y predstavlja vezu ili veznik;

V1predstavlja dsFv ili dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsFv ili dsscFv.

[0098] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje sekvence koje su 80%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95% 96%, 97%, 98% ili 99% slične sekvenci otkrivenoj ovde.

[0099] "Identitet", kao što je ovde upotrebljen, ukazuje da je na bilo kojoj određenoj poziciji u poravnatim sekvencama aminokiselinski ostatak identičan između sekvenci.

[0100] "Sličnost", kao što se ovde koristi, ukazuje da je, u bilo kojoj određenoj poziciji u poravnatim sekvencama, aminokiselinski ostatak sličnog tipa između sekvenci. Na primer, leucin može biti supstituisan izoleucinom ili valinom. Druge aminokiseline koje često mogu biti supstituisane jedna drugom uključuju, ali nisu ograničene na:

- fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance);

- lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju bazne bočne lance);

- aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance);

- asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju amidne bočne lance); i

- cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor).

[0101] Stepeni identiteta i sličnosti mogu biti lako izračunati (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J.1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L.1997, Genome Res.7:649-656,).

[0102] Antitela za upotrebu u multispecifičnim konstruktima predmetnog pronalaska mogu biti generisana bilo kojim pogodnim metodom poznatom u stanju tehnike.

[0103] Antitela generisana protiv polipeptidnog antigena mogu biti dobijena tamo gde je neophodna imunizacija životinje primenjivanjem polipeptida na životinji, poželjno ne-humanoj životinji, korišćenjem dobro poznatih i rutinskih protokola, videti na primer Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mnoge toplokrvne životinje, kao što su zečevi, miševi, pacovi, ovce, krave, kamile ili svinje mogu biti imunizovane. Međutim, miševi, zečevi, svinje i pacovi su generalno najpogodniji.

[0104] Monoklonalana antitela mogu biti pripremljena bilo kojom metodom poznatim u stanju tehnike, kao što je tehnika hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), tehnika trioma, tehnika humanog B-ćelijskog hibridoma (Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72) i tehnika EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0105] Antitela mogu takođe biti generisana korišćenjem metoda pojedinačnog limfocitnog antitela sa kloniranjem i ekspresijom imunoglobulinskog varijabilnog regiona cDNKa generisanih iz pojedinačnih limfocita izabranih za produkciju specifičnih antitela, na primer, metoda opisanih u Babcook, J. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 i WO2004/106377.

[0106] Antitela za upotrebu u ovom otkriću mogu takođe biti generisana korišćenjem različitih metoda prikaza faga poznatih u stanju tehnike i uključuju one opisane od Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol.1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) and WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; and US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 5,969,108, and WO20011/30305.

[0107] U jednom izvođenju, multispecifični molekuli prema otkriću su humanizovani.

[0108] Humanizovana (koja uključuju antitela koja su CDRa- graftovana) kao što su ovde upotrebljena se odnose na molekule koji imaju jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost određivanja regiona (CDRa) iz ne-humanih vrsta i okvirni region iz molekula humanog imunoglobulina (videti, npr. US 5,585,089; WO91/09967). Podrazumeva se da će možda biti potrebno preneti samo ostatke CDR-a koji određuju specifičnost, a ne ceo CDR (videti na primer, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Humanizovana antitela mogu opciono dalje sadržavati jedan ili više okvirnih ostataka izvedenih od nehumanih vrsta iz kojih su izvedene CDRa.

[0109] Kao što se ovde koristi, termin "humanizovani molekul antitela" se odnosi na molekul antitela pri čemu teški i/ili laki lanac sadrži jednu ili više CDR-a (uključujući, ako je poželjno, jednu ili više modifikovnih CDR-a) iz donora antitela (npr. mišje monoklonalno antitelo), graftovano u okvir varijabilnog regiona teškog i/ili lakog lanca akceptorskog antitela (npr. humano antitelo). Za pregled, pogledati Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. U jednom izvođenju , umesto celog CDR koji se prenosi, samo jedan ili više ostataka koji određuju specifičnost bilo kojeg od ovde opisanih CDR-a se prenose u okvir humanog antitela (videti na primer, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34).). U jednom izvođenju se samo ostaci koji određuju specifičnost od jednog ili više iznad opisanih CDRa prenose u okvir humanog antitela. U drugom izvođenju, samo se ostaci koji određuju specifičnost od svakog od iznad opisanih CDR-a prenose u okvir humanog antitela.

[0110] Kada su CDR-a ili ostaci koji određuju specifičnost graftovani, može se upotrebiti bilo koja odgovarajuća akceptrska sekvenca varijabilnog okvirnog regiona s obzirom na klasu/vrstu donora antitela iz kojeg su izvedene CDRa, uključujući mišje, primatne i humane okvirne regione. Pogodno, humanizovano antitelo prema predmetnom pronalasku ima varijabilni domen sadržavajući okvirne regione humanog akceptora kao i jedan ili više ovde prikazanih CDRa.

[0111] Primeri humanih okvira koji mogu biti korišćeni u ovom otkriću su KOL, NEWM, REl, EU, TUR, TEl, LAY i POM (Kabat et al supra). Na primer, KOL i NEWM mogu biti korišćeni za teški lanac, REl može biti korišćen za laki lanac, i EU, LAY i POM mogu biti korišćeni za oba teški i laki lanac. Alternativno, mogu biti upotrebljene humane embrionske – matične sekvence; dostupni su na: http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php.

[0112] U molekulu humanizovanog antitela iz ovog otkrića, akceptorski teški i laki lanci ne moraju nužno biti izvedeni iz istog antitela i mogu, ako se želi, sadržavati kompozitne lance imajući okvirne regione izvedene iz različitih lanaca.

[0113] Okvirni regioni ne moraju imati potpuno istu sekvencu kao kod akceptorskih antitela. Na primer, neobični ostaci mogu biti promenjeni u češće nastale ostatke za tu klasu ili vrstu akceptorskog lanca. Alternativno, izabrani ostaci u akceptorskim okvirnim regionima mogu biti promenjeni tako da odgovaraju ostatku nađenom na istoj poziciji u donorskom antitelu (videti Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324). Takve promene bi trebale biti svedene na minimum koji je neophodan da se oporavi afinitet donorskog antitela. Protokol za izbor ostataka u akceptorskom okvirnim regionima koji bi možda trebali biti promenjeni je postavljen u WO91/09967.

[0114] Derivati okvira mogu imati 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline zamenjene sa alternativnom aminokiselinom, na primer sa ostatkom donora.

[0115] Ostaci donora su ostaci iz donorskog antitela, tj. antitela iz kojeg su CDR-i izvorno izvedeni. Ostaci donora mogu biti zamenjeni pogodnim ostatkom izvedenim iz okvira humanog receptora (akceptorski ostaci).

[0116] U jednom izvođenju, multi-specifična antitela ovog otkrića su u potpunosti humana, naročito jedan ili više varijabilnih domena su potpuno humani.

[0117] Potpuno humani molekuli su oni u kojima su svi varijabilni regioni i konstantni regioni (gde postoje) i teških i lakih lanaca humanog porekla ili su suštinski identični sekvencama humanog porekla, a ne nužno iz istog antitela. Primeri potpuno humanih antitela mogu uključiti antitela proizvedena, na primer iznad opisanim metodama prikaza faga faga, i antitela proizvedena od miševa kod kojih je mišji imunoglobulin varijabilan i opciono su geni sa konstantnim regionom zamenjeni njima odgovarajućim humanim, npr. kao što je generalno opisano u opštim terminima u EP0546073, US5545806, US5569825, US5625126, US5633425, US5661016, US5770429, EP 0438474 i EP0463151.

[0118] U jednom izvođenju, multispecifični molekuli antitela iz otkrića mogu selektivno vezivati dva, tri ili više različitih antigena od interesa.

[0119] U jedno izvođenju, antigeni od interesa vezani za domen vezivanja antigena formirani od strane VH/VLili V1ili V2nezavisno izabrani iz proteina povezanog sa ćelijom, na primer proteina ćelijske površine na ćelijama kao što su bakterijske ćelije, ćelije kvasca, T-ćelije, B-ćelije, endotelne ćelije ili tumorske ćelije i rastvorljivi protein.

[0120] Antigeni od interesa mogu takođe biti bilo koji medicinski relevantan protein, kao što su oni proteini koji su regulisani tokom bolesti ili infekcije, na primer, receptori i/ili njihovi odgovarajući ligandi. Konkretni primeri antigena uključuju površinske ćelijske receptore kao što su signalni receptori T ili B ćelije signalizirajućih receptora, kostimulatorni molekuli, inhibitori kontrolne tačke, prirodni receptori ćelija ubica, imunoglobulinski receptori, receptori famijije TNFR, receptori famijije B7, molekuli adhezije, integrini, receptori citokina/ hemokina, GPCRi, receptori faktora rasta, receptori kinaze, tkivni specifični antigeni, antigeni kancera, receptori za prepoznavanje patogena, receptori komplementa, hormonski receptori ili rastvorljivi molekuli kao što su citokini, hemokini, leukotrieni, faktora rasta, hormoni ili enzimi ili jonski kanali, epitopi, fragmenti i i translacioni modifikovani oblici od njih.

[0121] U jednom izvođenju, multispecifični molekul antitela iz ovog otkrića može biti upotrebljen za funkcionalno menjanje aktivnosti antigena koji su od interesa. Na primer, fuzioni protein antitela može da neutralše, antagonizuje ili agonizuje aktivnost navedenog antigena, direktno ili indirektno.

[0122] U jednom izvođenju V1i V2su specifični za isti antigen, na primer vezivanje istog ili različitog epitopa u njemu. U jednom izvođenju V1je specifičan za humani serumski Albumin. U jednom izvođenju V2je specifičan za humani serumski Albumin. U jednom izvođenju V1i V2su specifični za dva različita antigena.

[0123] U jednom izvođenju V1i V2su specifični za iste antigene, na primer iste i različite epitope na istom antigenu.

[0124] U jednom izvođenju, antigen od interesa vezan od strane VH/VLili V1ili V2obezbeđuje mogućnost regrutacije efektorskih funkcija, kao što je aktivacija puta komplementa i/ili regrutacija efektorske ćelije.

[0125] Regrutacija efektorske funkcije može biti u tome što je efektorska funkcija povezana sa ćelijom, pri čemu navedena ćelija nosi molekul za regrutaciju na svojoj površini. Indirektno regrutovanje može da se javi kada vezivanje antigena na domen vezivanja antigena (kao što je V1ili V2) u molekulu prema ovom otkriću polipeptida za regrutaciju uzrokuje otpuštanje, na primer, faktora koji zauzvrat može direktno ili indirektno regrutovati efektorsku funkciju ili može biti aktivacijom signaliziranja puta. Primeri uključuju IL2, IL6, IL8, IFNy, histamin, C1q, opsonin i ostale članove klasičnih i alternativnih kaskada aktivacije komplementa, kao što su C2, C4, C3-konvertaza i C5 do C9.

[0126] Kao što je ovde korišćen, "regrutni polipeptid" uključuje FcyR kao što su FcyRl, FcyRll i FcyRlll, put komplementa proteina, kao što je, ali bez ograničenja, C1q i C3, CD marker proteina (Klaster od Diferencijalnog markera) ili njegov fragment koji zadržava sposobnost regrutovanja ćelijski posredovane efektorske funkcije bilo direktno ili iindirektno. Regrutacija polipeptida takođe uključuje molekule imunoglobulina kao što su lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgE i lgA koji poseduju efektorsku funkciju.

[0127] U jednom izvođenju antigen vezujući domen (kao V1ili V2ili VH/VL) u multi-specifičnom molekulu antitela prema ovom otkriću ima specifičnost za put komplementa proteina, pri čemu je C1q naročito poželjan.

[0128] Dalje, multispecifični molekuli antitela iz ovog otkrića mogu biti korišćeni za helaciju radioaktivnih izotopa zahvaljujući antitelu sa jednom domenom koje se veže na nuklidni helatorski protein. Takvi fuzioni proteini se koriste u slikovnim ili radionuklidnim ciljajućim pristupima terapiji.

[0129] U jednom izvođenju antigen vezujući domen unutar molekula prema otkriću (kao što je V1ili V2ili VH/VL) ima specifičnost za serumski proteinski nosač, cirkulišući molekul imunoglobulina ili CD35/CR1, na primer obezbeđujući produženo poluvreme raspada na fragmentu antitela sa specifičnošću za navedeni antigen od interesa vezivanjem na navedeni serumski proteinski nosač, cirkulišući molekul imunoglobulina ili CD35/CR1.

[0130] Kao što se ovde koristi, "serumski proteinski nosač" uključuje protein koji veže tiroksin, transtiretin, ɑ 1-kiseli glikoprotein, transferin, fibrinogen i Albumin, ili fragment bilo koji od njih.

[0131] Kao što se ovdje koristi, "cirkulirajući molekul imunoglobulina" uključuje lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, slgA, lgM i lgD, ili fragment bilo kojeg od njih.

[0132] CD35/CR1 je protein prisutan u crvenim krvnim ćelijama koje imaju poluvreme raspada od 36 dana (normalan raspon od 28 do 47 dana; Lanaro et al., 1971, Cancer, 28(3):658-661).

[0133] U jednom izvođenju, antigen od interesa za koji VH/VLima specifičnost je nosač serumskog proteina, kao što je nosač humanog seruma, kao što je humani serumski Albumin.

[0134] U jednom izvođenju, antigen od interesa za koji V1ima specifičnost je nosač serumskog proteina kao što je nosač humanog seruma, kao što je humani serumski Albumin.

[0135] U jednom izvođenju, antigen od interesa za koji V2ima specifičnost je nosač serumskog proteina, kao što je nosač humanog seruma, kao što je humani serumski Albumin.

[0136] U jednom izvođenju samo jedan od VH/VL, V1ili V2ima specifičnost za nosač serumskog proteina, kao što je kao što je nosač humanog seruma, kao što je humani serumski Albumin.

[0137] U jednom izvođenju mesto vezivanja u konstruktu ovog otkrića sadrži 6 CDRa, na primer SEK ID BR: 71 za CDRH1, SEK ID BR: 72 za CDRH2, SEK ID BR:

73 za CDRH3, SEK ID BR: 74 za CDRL1, SEK ID BR: 75 za CDRL2 i SEK ID BR: 76 za CDRL3.

[0138] U jednom izvođenju, navedenih 6 CDRa SEK ID BR: 71 do 76 su u poziciji VH/VLu konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju navedenih 6 CDRa SEK ID BR: 71 do 76 su u poziciji V1u konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju navedenih 6 CDRa SEK ID BR: 71 do 76 su u poziciji V2u konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju navedenih 6 CDRa SEK ID BR: 71 do 76 su u poziciji V1i V2u konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju navedenih 6 CDRa SEK ID BR: 71 do 76 su u poziciji VH/VLi V1u konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju navedenih 6 CDRa SEK ID BR: 71 do 76 su u poziciji VH/VLi V2u konstruktima ovog otkrića.

[0139] U jednom izvođenju, mesto vezivanja Albumina u konstruktu ovog otkrića sadrži varijabilni domen teškog lanca izabran od SEK ID BR: 77 i SEK ID BR: 78 i varijabilni domen lakog lanca izabran od SEK ID BR: 79 i SEK ID BR: 80, naročito SEK ID BR: 77 i 79 ili SEK ID BR: 78 i 80 za teški i laki lanac, respektivno. U jednom izvođenju, ovi domeni su u poziciji VH/VLu konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju ovi varijabilni domeni su u poziciji V1. U jednom izvođenju ovi varijabilni domeni su u poziciji V2. U jednom izvođenju ovi varijabilni domeni su u poziciji V1i V2. U jednom izvođenju ovi varijabilni domeni su u poziciji VH/VLi V1u konstruktima ovog otkrića. U jednom izvođenju ovi varijabilni domeni su u poziciji VH/VLi V2u konstruktima ovog otkrića. Kada su varijabilni domeni u dve lokacije u konstruktima ovog otkrića, isti par varijabilnih domena može biti na svakoj lokaciji ili se mogu biti upotrebljena dva različita para varijabilnih domena.

[0140] U jednom izvođenju, multispecifični molekuli antitela iz ovog otkrića su obrađeni da se obezbedi poboljšani afinitet za ciljani antigen ili antigene. Takve varijante mogu biti dobijene pomoću brojnih protokola afiniteta maturacije uključujući mutiranje CDR-a (Yang et al J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), mešanje lanca (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), upotrebu mutatornih sojeva E. koli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mešanje DNK (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), prikaz faga (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i seksualni PCR (Crameri et al Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al (supra) razmatra ove metode afiniteta maturacije.

[0141] Poboljšani afinitet, kao što je ovde upotrebljeno u ovom kontekstu, se odnosi na poboljšanje u odnosu na polazni molekul.

[0142] Ako je poželjno, multispecifični konstrukt antitela za upotrebu u ovom otkriću može biti konjugovan sa jednim ili više efektorskih molekula. Podrazumeva se da efektorski molekul može sadržavati jedan efektorski molekul ili dva ili više takvih molekula tako povezanih da formiraju jednu funkcionalnu grupu koja se može vezati za antitela ovog pronalaska. Tamo gde je poželjno dobiti fragment antitela vezan na efektorski molekul, ovo može biti pripremljeno standardnim hemijskim ili rekombinantnim DNK postupcima u kojima je fragment antitela vezan direktno ili preko agensa za pripajanje na efektorski molekul. Tehnike za konjugovanje takvih efektorskih molekula sa antitelima dobro je poznata u stanju tehnike (videti, Hellstrom et al Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al eds., 1987, pp.

623-53; Thorpe et al 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Posebni hemijski postupci uključuju, na primer, one opisane u WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 i WO03031581. Alternativno, gde je molekul efektora protein ili polipeptid, veza se može postići primenom rekombinantnih DNK postupaka, na primer kao što je opisano u WO86/01533 and EP0392745.

[0143] Termin "efektorski molekul", kao što se ovde koristi, obuhvata, na primer, biološki aktivne proteine, na primer enzime, drugo antitelo ili fragmente antitela, sintetičke ili polimere koji se javljaju u prirodi, nukleinske kiseline i fragmente od njih, npr. DNK, RNK i fragmente od njih, radionuklide, radioizotope, naročito radiojodide, radioizotope, helirane metale, nanočestice i reporterske grupe kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti otkrivena od strane NMR ili ESR spektroskopije.

[0144] Drugi efektorski molekuli mogu obuhvatiti helirane radionuklide kao što su 111ln i 90Y, Lu177, Bizmut213, Kalifornijum252, Iridijum192 i Volfram 188/Renijum188; ili lekove kao što su, ali nisu ograničeni na, alkilfosfoholine, inhibitore topoizomeraze l, taksoide i suramin.

[0145] Drugi efektorski molekuli obuhvataju proteine, peptide i enzime. Enzimi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, proteolitičke enzime, hidrolaze, lijaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobuline, toksine kao što je abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin ili difterični toksin, protein kao što je insulin, ɑ -interferon, β-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta koji potiče iz trombocita ili tkivni plazminogeni aktivator, trombotički agens ili anti-angiogeni agens, npr. angiostatin ili endostatin ili, modifikator biološkog odgovora, kao što su limfokin, interleukin-1 (lL-1), interleukin-2 (lL-2), faktor stimulisanja kolonije granulocita makrofaga (GM-CSF), faktor stimulisanja kolonije granulocita (G-CSF), faktor rasta nerva (NGF) ili drugi faktor rasta i imunoglobulini.

[0146] Drugi efektorski molekuli mogu obuhvatiti supstance koje se mogu detektovati i koje su korisne, na primer, u dijagnozi. Primeri supstanci koje se mogu detektovati uključuju razne enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne nuklide, pozitronske emisione metale (za upotrebu u pozitronskoj emisionoj tomografiji) i neradioaktivne paramagnetne jone metala. Videti generalno US 4 741900 za jone metala koji mogu biti konjugovani sa antitelima za upotrebu kao dijagnostici. Pogodni enzimi uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; pogodne protetske grupe uključuju streptavidin, avidin i biotin; pogodni fluorescentni materijali uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid i fikoeritrin; pogodni luminescentni materijali uključuju luminol; pogodni bioluminescentni materijali uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin; i pogodni radioaktivni nuklidi uključuju 1251, 131l, 111ln i 99Tc.

[0147] U drugom izvođenju, efektorski molekul može povećati poluvreme raspada antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogenost antitela i/ili poboljšati isporuku antitela preko epitelijalne barijere na imuni sistem. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovog tipa uključuju polimere, Albumin, proteine koji vežu Albumin ili jedinjenja koja vezuju Albumin, kaso što su ona opisana u WO05/117984.

[0148] Gde je efektorski molekul polimer, generalno može biti sintetički ili polimer koji se prirodno pojavljuje, na primer opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac polialkilena, polialkenilen ili polioksialkilen polimer ili razgranati ili nerazgranati polisaharid, npr. homo- ili hetero-polisaharid.

[0149] Specifični opcioni supstituenti koji mogu biti prisutni na iznad pomenutim sintetičkim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0150] Specifični primeri sintetičkih polimera uključuju opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac poli(etilenglikol), poli(propilenglikol), poli(vinilalkohol) ili derivate od njih, posebno opciono supstituisani poli(etilenglikol), kao što je metoksipoli(etilenglikol) ili derivate od njih.

[0151] Specifični polimeri koji se pojavljuju prirodno, uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili derivate od njih.

[0152] "Derivati" kao što se ovde koriste su namenjeni da uključuju reaktivne derivate, na primer tiol-selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi i slično. Reaktivna grupa može biti vezana direktno ili preko segmenta veznika na polimer. Podrazumeva se da će ostatak takve grupe u nekim slučajevima formirati deo produkta kao vezujuće grupe između fragmenta antitela i polimera.

[0153] Veličina polimera može da varira po želji, ali će generalno biti u rasponu prosečne molekularne težine od 500Da do 50000Da, na primer, od 5000 do 40000Da, kao što je od 20000 do 40000Da. Veličina polimera može biti naročito izabrana na osnovu nameravane upotrebe produkta, na primer sposobnosti lokalizacije u određenim tkivima kao što su tumori ili produženo poluvreme raspada u cirkulaciji (za pregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Tako, na primer, gde je produkt namenjen da napusti cirkulaciju i prodre kroz tkivo, na primer za upotrebu u tretmanu tumora, može biti korisno koristiti polimer male molekularne težine, na primer, sa molekularnom težinom oko 5000Da. Za aplikacije u kojima produkt ostaje u cirkulaciji, može biti korisno koristiti polimer veće molekularne težine, na primer, koji ima molekularnu težinu u rasponu od 20000Da do 40000Da.

[0154] Pogodni polimeri uključuju polialkilenski polimer,kao što je poli (etilenglikol) ili, posebno, metoksipoli(etilenglikol) ili derivat od njih, i posebno sa molekularnom težinom u rasponu od oko 15000Da do oko 40000Da.

[0155] U jednom izvođenju antitela za upotrebu u ovom otkriću su spojena na poli(etilenglikol)(PEG) ostatke. U jednom konkretnom primeru antitelo je fragment antitela i PEG molekuli mogu biti spojeni kroz bilo koji dostupni bočni lanac aminokiseline ili terminalnu funkcionalnu grupu aminokiseline smeštenu u fragmentu antitela, na primer bilo koju slobodnu amino, imino, tiol, hidroksil ili karboksil grupu. Takve aminokiseline se mogu prirodno pojaviti u fragmentu antitela ili mogu biti ugrađene u fragment primenom metoda rekombinantne DNK (videti na primer US5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024). U jednom izvođenju, molekul antitela predmetnog pronlaska je modifikovani Fab fragment pri čemu je modifikacija dodatak na C-terminalnom kraju njegovog teškog lanca jedne ili više aminokiselina da bi se omogućilo vezivanje efektorskog molekula. Pogodno, dodatne aminokiseline formiraju modifikovani zglobni region koji sadrži jedan ili više cisteinskih ostataka na koje se može spojiti efektorski molekul. Za vezivanje dva li više PEG molekula može se koristiti više mesta.

[0156] Pogodni PEG molekuli su kovalentno povezani kroz tiolnu grupu od najmanje jednog cisteinskog ostatka smeštenog u fragmentu antitela. Svaki polimer molekula spojen za modifikovani fragment antitela može biti kovalentno povezan na atom sumpora cisteinskog ostatka smeštenog u fragmentu. Kovalentna veza će biti disulfidna veza ili, konkretno, sumpor-ugljenik veza. Gde je tiolna grupa korišćena kao tačka spajanja, mogu se upotrebiti odgovarajuće aktivirani molekuli efektora, na primer tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i cisteinski derivati. Aktivirani polimer može biti upotrebljen kao polazni materijal u pripremi fragmenata antitela modifiovanih polimerom kao što je iznad opisano. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je ɑ -halokarboksilna kiselina ili estar, npr. jodacetamid, imid, npr. maleimid, vinil sulfon ili disulfid. Takvi polazni materijali mogu biti dobijeni komercijalno (na primer od Nektar, ranije Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ili mogu biti pripremljeni od komercijalno dostupnih polaznih materijala koristeći uobičajene hemijske postupke. Konkretno PEG kao što je Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (koji se može dobiti iz Nektara, ranije Shearwater).

[0157] U jednom izvođenju, F(ab')2, Fab ili Fab' u molekulu je PEGiliran, tj. ima PEG(poli(etilenglikol)) kovalentno spojen na njega, npr. prema metodi opisanoj u EP 0948544 ili EP1090037 [videti takođe "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. U jednom izvođenju PEG je spojen na cistein u zglobnom regionu. U jednom primeru, PEG modifikovani Fab fragment ima maleimidnu grupu kovalentno povezanu sa jednom tiolnom grupom u modifikovanom zglobnom regionu. Ostatak lizina može biti kovalentno vezan na maleimidnu grupu, i na svaku od amino grupa lizinskog ostatka može biti spojen metoksipoli(etilenglikol)polimer koji ima molekularnu težinu od približno 20.000 Da. Zbog toga, ukupna molekularna težina PEG-a spojenog na Fab fragment može biti približno 40.000 Da.

[0158] Konkretno PEG molekuli uključuju 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etil amid od N,N’-bis(metoksipoli(etilen glikol) MW 20.000) modifikovani lizin, takođe poznat kao PEG2MAL40K (može se dobiti iz Nektara, ranije Shearwater).

[0159] Alternativni izvori PEG veznika uključuju NOF koji snabdeva GL2-400MA2 (pri čemu je m u donjij strukturi 5) i GL2-400MA (pri čemu je m 2) i n je približno 450:

m je 2 ili 5

[0160] To znači da svaki PEG je oko 20.000Da.

[0161] Dalji alternativni PEG efektorski molekuli sledećeg tipa:

su dostupni od Dr Reddy, NOF i Jenkem.

[0162] U jednom izvođenju je obezbeđen molekul antitela koji je PEGiliran (na primer sa ovde opisanim PEG), spojen kroz ostatak cisteinske aminokiseline na ili oko aminokiseline 226 u lancu, na primer aminokiseline 226 teškog lanca (sekvencijalnim numerisanjem).

[0163] U jednom izvođenju je obezbeđena polinukleotidna sekvenca koja kodira molekul ovog otkrića, kao što je DNK sekvenca.

[0164] U jednom izvođenju je obezbeđena polinukleotidna sekvenca koja kodira jednu ili više, kao što su dve ili više, ili tri ili više polipeptidnih komponenti molekula iz ovog otkrića, na primer:

a) polipeptidni lanac formule (l):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidni lanac formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

pri čemu:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, domen 1 istog;

X predstavlja vezu ili veznik;

Y predstavlja vezu ili veznik;

V1predstavlja dsFv ili dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsFv ili dsscFv.

[0165] U jednom izvođenju polinukleotid, kao što je DNK, je sadržan u vektoru.

[0166] Stručnjak će ceniti da kada V1i/ili V2predstavlja dsFv, multi-specifično antitelo će sadržavati treći polipeptid koji kodira odgovarajući slobodni VHili VLdomen koji nije spojen na X ili Y. Prema tome, multispecifični protein predmetnog pronalaska može biti kodiran sa jednim ili više, dva ili više ili tri ili više polinukleotida i oni mogu biti inkorporiran u jedan ili više vektora.

[0167] Opšte metode pomoću kojih vektori mogu biti konstruisani, transfekcijske metode i metode kulture su dobro poznate stručnjacima sa ovog područja tehnike. U tom pogledu, se poziva na "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

[0168] Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više vektora kloniranja ili ekspresije sadržavajući jednu ili više DNK sekvenci kodirajući multispecifični protein predmetnog pronalaska. Može se koristiti bilo koji pogodni ćelijski/vektorski sistem domaćina za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju molekul antitela predmetnog pronalaska. Bakterijski, na primer E. koli, i drugi mikrobni sistemi mogu biti upotrebljeni ili eukariotski, na primer sisara, sistemi ekspresije ćelije domaćina takođe mogu biti korišćeni. Pogodne ćelije domaćina sisara uključuju CHO, mijelom, NSO mijelomske ćelije i SP2 ćelije, COS ćelije ili ćelije hibridoma.

[0169] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupak za produkciju multispecifičnog proteina prema ovom otkriću koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina sadržavajuči vektor predmetnog pronalaska pod uslovima pogodnim za vođenje ekspresije proteina iz DNK koja kodira multispecifični protein predmetnog pronalaska i izolovanje multispecifičnog proteina.

[0170] Za produkciju produkata koji sadrže i teške i lake lance, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, prvi vektor koji kodira polipeptid lakog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno, može biti korišćen jedan vektor, vektor koji uključuje sekvence koje kodiraju laki i teški lanac polipeptida. U jednom primeru ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, svaki od njih kodirajući polipeptidni lanac molekula antitela predmetnog pronalaska. Gde V1i/ili V2su dsFv, ćelijska linija može biti transfektovana sa tri vektora, od kojih svaki kodira polipeptidni lanac multispecifičnog proteina iz pronalaska.

[0171] U jednom izvođenju ćelijska linija je transfektovana sa dva vektora od kojih svaki kodira različit polipeptid izabran od:

a) polipeptidnog lanca formule (l):

VH-CH1-X-V1;

b) polipeptidnog lanca formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

pri čemu:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, domen 1 istog;

X predstavlja vezu ili veznik;

Y predstavlja vezu ili veznik;

V1predstavlja dsFv ili dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsFv ili dsscFv.

[0172] U jednom izvođenju, kada V1je dsFv i VHdomen od V1je spojen na X, ćelijska linija može biti transfektovana sa trećim vektorom koji kodira VLdomen od V1.

[0173] U jednom izvođenju, kada je V1je dsFv i VLdomen od V1je spojen na X, ćelijska linija može biti transfektovana sa trećim vektorom koji kodira VHdomen od V1.

[0174] U jednom izvođenju, kada V2je dsFv i VHdomen od V2je spojen na Y, ćelijska linija može biti transfektovana sa trećim vektorom koji kodira VLdomen od V2.

[0175] U jednom izvođenju, kada V2je dsFv i VLdomen od V2je spojen na Y, ćelijska linija može biti transfektovana sa trećim vektorom koji kodira VHdomen od V2.

[0176] U jednom izvođenju, kada oba V1i V2su dsFv i VLdomen od V2je spojen na Y, i VLdomen od V1je spojen na X, ćelijska linija može biti transfektovana sa trećim vektorom koji kodira zajednički VHdomen od oba, V1i V2.

[0177] U jednom izvođenju, kada oba V1i V2su dsFv i VHdomen od V2je spojen na Y, i VHdomen od V1je spojen na X, ćelijska linija može biti transfektovana sa trećim vektorom koji kodira zajednički L domen od oba, V1i V2.

[0178] Podrazumevaće se da odnos svakog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina može varirati da bi se optimizirala ekspresija produkta multi-specifičnog antitela. U jednom izvođenju gde se koriste dva vektora odnos vektora može biti 1: 1. U jednom izvođenju gde se koriste tri vektora odnos vektora može biti 1: 1: 1. Podrazumevaće se da stručna osoba može pronaći optimalni odnos rutinskim testiranjem nivoa ekspresije proteina nakon transfekcije. Alternativno ili pored toga, nivoi ekspresije svakog polipeptidnog lanca multi-specifičnog konstrukta iz svakog vektora mogu biti kontrolisni korišćenjem istih ili različitih promotera.

[0179] Podrazumevaće se da dve ili više ili gde postoje, tri polipeptidne komponente mogu biti kodirane polinukleotidom u jednom vektoru. Takođe će se podrazumevati da, gde su dve ili više, naročito tri ili više, polipeptidne komponente kodirane polinukleotidom u jednom vektoru, relativni izraz svake polipeptidne komponente može varirati korišćenjem različitih promotera za svaki polinukleotid koji kodira polipeptidnu komponentu ovog otkrića.

[0180] U jednom izvođenju vektor sadrži jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira dva ili, gde postoje, tri, polipeptidna lanca multispecifičnog molekula antitela predmetnog pronalaska pod kontrolom jednog promotera.

[0181] U jednom izvođenju vektor sadrži jednu polinukleotidnu sekvencu koja kodira dva, ili, gde postoje, tri, polipeptidna lanca multispecifičnog molekula antitela iz ovog otkrića, pri čemu je svaka polinukleotidna sekvenca koja kodira svaki polipeptidni lanac pod kontrolom različitog promotera.

[0182] Multispecifični proteini prema ovom otkriću su eksprimirani u dobrim nivoima iz ćelija domaćina. Stoga se čini da su svojstva antitela i/ili fragmenata optimizovana i pogodna za komercijalnu obradu.

[0183] Povoljno, multispecifični molekuli antitela iz ovog otkrića minimiziraju količinu agregacije viđene nakon prečišćavanja i maksimiziraju količinu monomera u formulacijama konstrukta u farmaceutskim koncentracijama, na primer, monomer može biti prisutan kao 50%, 60%, 70% ili 75% ili više, kao 80 ili 90% ili više, kao što je 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% ili više ukupnog

proteina. U jednom primeru, prečišćeni uzorak multi-specifičnog molekula antitela iz ovog otkrića ostaje veći od 98% ili 99% monomernih nakon 28 dana skladištenja na 4°C. U jednom primeru, prečišćeni uzorak multi-specifičnog molekula antitela iz ovog otkrića sa 5 mg/ml u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatima (PBS) ostaje veći od 98% monomernih nakon 28 dana skladištenja na 4°C.

[0184] Molekuli antitela iz ovog otkrića i kompozicije koje sadrže iste su korisne u tretmanu, na primer u tretmanu i/ili profilaksi patološkog stanja.

[0185] Ovo otkriće takođe obezbeđuje farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži molekul antitela ovog otkrića u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razblaživača ili nosača. Prema tome, obezbeđena je upotreba antitela ovog otkrića za upotrebu u tretmanu i proizvodnji leka, naročito za ovde otkrivenu indikaciju.

[0186] Kompozicija će obično biti isporučena kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja normalno uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija ovog otkrića može dodatno sadržavati farmaceutski prihvatljiv adjuvant.

[0187] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupak za pripremu farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije obuhvatajući dodavanje i mešanje molekula antitela iz ovog otkrića zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razblaživača ili nosača.

[0188] Molekul antitela može biti jedini aktivni sastojak u farmaceutskoj ili dijagnostičkoj kompoziciji ili može biti praćen drugim aktivnim sastojcima, uključujući druge sastojke antitela, na primer anti-lL-1β, anti-T ćeliju, anti-lFNy ili anti-LPS antitela ili sastojke koji nisu antitela, kao što su ksantini. Drugi pogodni aktivni sastojci uključuju antitela sposobna indukovanju tolerancije, na primer, anti-CD3 ili anti-CD4 antitela.

[0189] U daljem izvođenju, antitelo, fragment ili kompozicija prema otkriću se koristi u kombinaciji sa daljim farmaceutski aktivnim agensom.

[0190] Farmaceutske kompozicije pogodno sadrže terapijski efikasnu količinu molekula antitela pronalaska. Termin "terapijski efikasna količina", kao što se ovde koristi, se odnosi se na količinu terapijskog agensa koja je potrebna da tretira, ublaži ili spreči ciljane bolesti ili stanja, ili da pokaže otkriveni terapijski ili preventivni efekat. Za bilo koje antitelo, terapijski efikasna količina se može prvobitno proceniti ili u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima, obično kod glodara, zečeva, pasa, svinja ili primata. Životinjski model može takođe biti korišćen da odredi odgovarajući raspon koncentracije i put primene. Takve informacije mogu biti korišćene za određivanje korisnih doza i puteva davanja kod ljudi.

[0191] Precizna terapijski efikasna količina za humani subjekat će zavisiti od težine bolesnog stanja, opšteg zdravstvenog stanja subjekta, starosti, težine i pola subjekta, ishrane, vremena i učestalosti davanja, kombinacije(a) leka, osetljivosti na reakciju i tolerancije/odgovora na terapiju. Ovaj iznos se može utvrditi rutinskim eksperimentima i prema proceni kliničara. Generalno, terapijski efikasna količina će biti od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg, na primer 0.1 mg/kg do 20 mg/kg. Alternativno, doza može biti od 1 do 500 mg dnevno, kao što je 10 do 100, 200, 300 ili 400 mg dnevno. Farmaceutske kompozicije mogu biti konvencionalno predstavljene u oblicima jedinične doze koje sadržavajući unapred određenu količinu aktivnog agensa iz pronalaska.

[0192] Kompozicije mogu biti primenjivane pojedinačno na pacijentu ili se mogu pimeniti u kombinaciji (npr. istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno) sa drugim agensima, lekovima ili hormonima.

[0193] Doza u kojoj se primenjuje molekul antitela iz ovog otkrića zavisi od prirode stanja koje se tretira, obima prisutne inflamacije i od toga da li se koristi molekul antitela profilaktički ili leči postojeće stanje.

[0194] Učestalost doze će zavisiti od poluvremena raspada molekula antitela i trajanja njegovog dejstva. Ako molekul antitela ima kratko poluvreme raspada (npr. 2 do 10 sati), možda će biti potrebno davati jednu ili više doza dnevno. Alternativno, ako molekul antitela ima dugo poluvreme raspada (npr. 2 do 15 dana), možda će biti potrebno davati dozu samo jednom dnevno, jednom nedeljno ili čak jednom svakog 1 ili 2 meseca.

[0195] Farmaceutski prihvatljiv nosač ne bi trebao sam da indukuje produkciju antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju i ne bi trebao biti toksičan. Pogodni nosači mogu biti veliki, sporo metabolizirani makromolekuli kao što su proteini, polipeptidi, lipozomi, polisaharidi, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiseline i neaktivne čestice virusa.

[0196] Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti upotrebljene, na primer soli mineralne kiseline, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati i sulfati, ili soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, malonati i benzoati.

[0197] Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapijskim kompozicijama mogu dodatno sadržavati tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Dodatno, u takvim kompozicijama mogu biti prisutne pomoćne supstance, kao što su agensi za vlaženje ili emulgatori ili pH supstance za puferovanje. Takvi nosači omogućavaju da farmaceutski kompozicije budu formulisane u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, kaša i suspenzija, koje pacijent guta.

[0198] Pogodni oblici za primenu uključuju oblike pogodne za parenteralnu primenu, npr. injekcijom ili infuzijom, na primer bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Ako je produkt za injekciju ili infuziju, može imati oblik suspenzije, rastvora ili emulzije u uljanom ili vodenom nosaču i može sadržavati agense za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, konzervans, stabilizovanje i/ili raspršivanje-disperziju. Alternativno, molekul antitela može biti u suvom obliku, za rekonstituciju pre upotrebe sa odgovarajućom sterilnom tečnošću.

[0199] Jednom formulisane, kompozicije ovog pronalaska mogu biti primenjivane direktno na subjektu. Subjekti koje treba tretirati mogu biti životinje. Međutim, u jednom ili više izvođenja kompozicije su prilagođene za primenu na humanim subjektima.

[0200] U jednom izvođenju, u formulacijama prema ovom otkriću, pH krajnje formulacije nije sličan vrednosti izoelektrične tačke antitela ili fragmenta, jer ako je pH formulacije 7, onda pl od 8-9 ili više može biti pogodan. Iako se ne želi vezati teorijom, smatra se da ovo može obezbediti konačnu formulaciju sa poboljšanom stabilnošću, na primer, antitelo ili fragment ostaje u rastvoru.

[0201] Farmaceutske kompozicije ovog otkrića mogu biti primenjivane bilo kojim brojem puteva, uključujući, ali bez ograničenja na, oralne, intravenske, intramuskularne, intra-arterijske, intramedularne, intratekalne, intraventrikularne, transdermalne, transkutane (na primer, videti WO98/20734), potkožne, intraperitonealne, intranazalne, enteralne, lokalne, sublingvalne, intravaginalne ili rektalne puteve. Hiposprejevi mogu takođe biti korišćeni za primenu farmaceutskih kompozicija pronalaska. Obično, terapijske kompozicije mogu biti pripremljene kao injekcije, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije. Čvrsti oblici pogodni za rastvor, ili suspenziju, u tečnim nosačima pre injekcije takođe mogu biti pripremljeni. Poželjno, molekuli antitela predmetnog pronalaska se primenjuju supkutano, inhalacijom ili lokalno.

[0202] Direktna isporuka kompozicija će generalno biti ostvarena injekcijom, subkutano, intraperitonealno, intravenozno ili intramuskularno, ili isporučena u intersticijumski prostor tkiva. Kompozicije mogu takođe biti primenjene u specifično tkivo od interesa. Tretman doziranjem može biti šema rasporeda pojedinačne doze ili višestruke doze.

[0203] Podrazumeva se da će aktivni sastojak u kompoziciji biti molekul antitela. Kao takav, biće podložan degradaciji u gastrointestinalnom traktu. Prema tome, ako će kompozicija biti primenjena putem gastrointestinalnog trakta, kompozicija će trebati da sadrži gense koja štite antitelo od gegradacije, ali koji oslobađaju antitelo nakon je apsorbovano iz gastrointestinalnog trakta.

[0204] Detaljna rasprava o farmaceutski prihvatljivim nosačima je dostupna u Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J.1991).

[0205] U jednom izvođenju formulacija je data kao formulacija za lokalne primene, uključujući inhalaciju.

[0206] Pogodni pripravci za inhaliranje uključuju inhalacione praškove, odmerene aerosole koji sadrže propelantne gasove ili inhalacione rastvore bez propelantnih gasova (kao što su rastvori i suspenzije koji se ne mogu raspršivati). Inhalacioni praškovi prema otkriću sadržavajući aktivnu supstancu se mogu sastojati isključivo od iznad navedenih aktivnih supstanci ili od smeše iznad navedenih aktivnih supstanci sa fiziološki prihvatljivim ekscipijentom.

[0207] Ovi inhalacioni praškovi mogu uključiti monosaharide (npr. glukozu ili arabinozu), disaharide (npr. laktozu, saharozu, maltozu), oligo- i polisaharide (npr. dekstrane), polialkohole (npr. sorbitol, manitol, ksilitol), soli (npr. natrijum hlorid, kalcijum karbonat) ili njihove smeše jedne sa drugom. Pogodno su korišćeni mono- ili disaharidi, upotreba laktoze ili glukoze, naročito ali ne isključivo u obliku njihovih hidrata.

[0208] Čestice za taloženje u plućima zahtevaju veličinu čestica manju od 10 mikrona, kao što su 1-9 mikrona, na primer od 0.1 do 5 µm, naročito od 1 do 5 µm. Veličina čestica aktivnog agensa (kao što je antitelo ili fragment antitela) je od primarne važnosti.

[0209] Propelantni gasovi koji mogu biti korišćeni za pripremu inhalacionih aerosola su poznati u stanju tehnike. Pogodni propelantni gasovi su izabrani između ugljovodonika kao što su n-propan, n-butan ili izobutan i halougljovodonici kao što su hlorisani i/ili fluorisani derivati metana, etana, propana, butana, ciklopropana ili ciklobutana. Iznad navedeni propelantni gasovi mogu biti korišćeni samostalno ili u smešama od njih.

[0210] Naročito pogodni propelantni gasovi su halogenirani derivati alkana izabrani između TG11, TG12, TG134a i TG227. Od iznad pomenutih halogeniranih ugljovodonika posebno su pogodni TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetan) i TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan) i smeše od njih.

[0211] Inhalacioni aerosoli koji sadrže propelentni gas mogu takođe sadržavati druge sastojke kao što su korastvarači, stabilizatori, površinski aktivni agensi (surfaktanti), antioksidansi, maziva i sredstva za podešavanje pH. Svi ovi sastojci su poznati u stanju tehnike.

[0212] Inhalacioni aerosoli koji sadrže propelantni gas prema pronalasku mogu sadržavati do 5% po težini aktivne supstance. Aerosoli prema pronalasku sadrže, na primer, 0.002 do 5% po težini, 0.01 do 3% po težini, 0.015 do 2% po težini, 0.1 do 2% po težini, 0.5 do 2% po težini ili 0.5 do 1% po težini aktivne supstance.

[0213] Alternativno, lokalna primena na plućima može takođe biti primenom tečnog rastvora ili formulacije suspenzije, na primer primenjivanjem uređaja kao što je nebulizator, na primer, nebulizator spojen na kompresor (npr.

Pari LC-Jet Plus(R) nebulizator spojen na Pari Master(R) kompresor proizveden od Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[0214] U jednom izvođenju formulacija je obezbeđena kao diskretne ampule koje sadrže jediničnu dozu za isporuku sa nebulizacijom.

[0215] U jednom izvođenju antitelo se daje u liofilizovanom obliku, za rekonstituciju ili alternativno kao suspenziona formulacija.

[0216] Antitelo iz ovog otkrića može biti isporučeno dispergovano u rastvaraču, npr., u obliku rastvora ili suspenzije. Može biti suspendovano u odgovarajućem fiziološkom rastvoru, npr. fiziološkom rastvoru soli, farmakološki prihvatljivom rastvaraču ili puferisanom rastvoru. Puferisani rastvori poznati u stanju tehnike mogu sadržavati 0.05 mg do 0.15 mg dinatrijum edetata, 8.0 mg do 9.0 mg NaCl, 0.15 mg do 0.25 mg polisorbata, 0.25 mg do 0.30 mg anhidrovane limunske kiseline i 0.45 mg do 0.55 mg natrijum citrata po 1 ml vode tako da se postigne pH od oko 4.0 do 5.0. Kao što je pomenuto iznad, suspenzija može biti napravljena, na primer, iz liofilizovanog antitela.

[0217] Terapijske suspenzije ili formulacije rastvora mogu takođe sadržavati jedan ili više ekscipijenata. Ekscipijenti su dobro poznati u tehnici i uključuju pufere (npr. citratni pufer, fosfatni pufer, acetatni pufer i bikarbonatni pufer), aminokiseline, ureu, alkohole, askorbinsku kiselinu, fosfolipide, proteine (npr. Albumin u serumu), EDTA, natrijum hlorid, lipozome, manitol, sorbitol i glicerol. Rastvori ili suspenzije mogu biti inkapsulirani u lipozome ili biorazgradive mikrosfere. Formulacija će se generalno biti obezbeđena u suštinski sterilnom obliku primenjujući sterilne postupke proizvodnje.

[0218] Ovo može uključiti produkciju i sterilizaciju filtracijom puferisanog rastvora rastvarača korišćenog za formulaciju, aseptičnu suspenziju antitela u sterilnom puferisanom rastvoru rastvarača, i doziranje formulacije u sterilne posude metodama poznatim prosečnom stručnjaku u stanju tehnike.

[0219] Formulacija koja se ne može isključiti prema ovom otkriću može biti obezbeđena, na primer, kao jedinice sa jednom dozom (npr., hermetički zatvorene plastične posude ili bočice) upakovane u omotnice od folije. Svaka bočica sadrži jediničnu dozu u zapremini, npr., 2 ml pufera rastvarač/rastvor.

[0220] Smatra se da su antitela ovog otkrića pogodna za isporuku putem nebulizacije.

[0221] Takođe je predviđeno da antitelo iz ovog pronalaska može biti primenjeno upotrebom genske terapije. Da bi se to postiglo, DNK sekvence koje kodiraju teške i lake lance molekula antitela pod kontrolom odgovarajućih DNK komponenti se uvode u pacijenta tako da se lanci antitela eksprimiraju iz DNK sekvenci i sastave in situ.

[0222] Patološko stanje ili poremećaj može biti, na primer, izabran iz grupe koja se sastoji od infekcija (virusnih, bakterijskih, gljivičnih i parazitskih), endotoksičnog šoka povezanog sa infekcijom, artritisa kao što je reumatoidni artritis, astme kao što je teška astma, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), karlične inflamatorne bolesti, Alchajmerove bolesti, inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, Pejronijeve bolesti, celijakije, bolesti žučne kese, Pilonidalne bolesti, peritonitisa, psorijaze, vaskulitisa, hirurške adhezije, moždanog udara, dijabetesa tipa l, lajmske bolesti, meningoencefalitisa, autoimunog uveitisa, imuno poredovanog inflamatornnog poremećaja centranog i perifernog nervnog sistema kao što je multipla skleroza, lupus (kao što je sistemski eritematozni lupus) i Gijen-Bareov sindrom, atopijski dermatitis, autoimuni hepatitis, fibrozirajući alveolitis, Grejvs-Bazedovljeva bolest, IgA nefropatija, idiopatska trombocitopenična purpura, Menijerova bolest, pemfigus, primarna bilijarna ciroza, sarkoidoza, skleroderma, Vegenerova granulomatoza, drugi autoimuni poremećaji, pankreatitis, trauma (operativni zahvat), bolest transplantata protiv domaćina, odbacivanje transplantata, bolesti srca, uključujući ishemijske bolesti kao što je infarkt miokarda kao ateroskleroza, intravaskularna koagulacija, resorpcija kostiju, osteoporoza, osteoartritis, parodontitis i hipohlorhidrija.

[0223] Ovo otkriće takođe obezbeđuje multispecifični molekul antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tretmanu ili profilaksi bola, naročito bola povezanog sa inflamacijom.

[0224] Tako je obezbeđeno multi-specifično antitelo prema ovom otkriću za upotrebu u tretmanu i metodama tretmana koje koriste isto.

[0225] U jednom izvođenju obezbeđen je postupak za prečišćavanje multi-specifičnog antitela (naročito antitela ili fragmenta prema pronalasku).

[0226] U jednom izvođenju obezbeđen je postupak za prečišćavanje multi -specifičnog antitela (naročito antitela ili fragmenta prema pronalasku) sadržavajući korake: izvođenja hromatografije anjonske razmene u režimu ne-vezivanja tako da se nečistoće zadržavaju na koloni i antitelo se održava u nevezanoj frakciji. Korak može, na primer, biti izveden na pH oko 6-8.

[0227] Postupak može dalje obuhvatiti početni korak hvatanja primenom hromatografije katjonske razmene, izvedene, na primer, na pH od oko 4 do 5.

[0228] Postupak se može dalje sastojati od dodatnih koraka hromatografije da bi se osiguralo da se nečistoće produkta i postupka odgovarajuće razreše iz toka produkta.

[0229] Postupak prečišćavanja može takođe obuhvatiti jedan ili više koraka ultra-filtracije, kao što je korak koncentracije i diafiltracije.

[0230] Prečišćeni oblik kao što je upotrebljen iznad je namenjen da se odnosi na najmanje 90% čistoće, kao što je 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w ili više čistoće.

[0231] Suštinski bez endotoksina je generalno namenjeno da se odnosi na sadržaj endotoksina od 1 EU po mg produkta antitela ili manje, kao što je 0.5 ili 0.1 EU po mg produkta.

[0232] Suštinski bez proteina ili DNK ćelije domaćina je generalno namenjeno da se odnosi na sadržaj proteina i/ili DNK ćelije domaćina 400 µg po mg produkta antitela ili manje, kao što je 100 µg po mg ili manje, naročito 20 µg po mg, prema potrebi.

[0233] Molekul antitela predmetnog pronalaska može takođe biti upotrebljen u dijagnozi, na primer u in vivo dijagnozi i snimanju bolesnih stanja.

[0234] U jednom izvođenju je obezbeđen metod izabranog multi-specifičnog proteinskog konstrukta prema predmetnom pronalasku sadržavajući:

a) određivanje prinosa monomernog multi-specifičnog proteina kada V1ili V2je dsscFv za dati par varijabilnog regiona

b) određivanje prinosa monomernog multi-specifičnog proteina kada je bilo koji od V1ili V2testiran u (a) je dsFv za isti par varijabilnog regiona i

c) upoređivanje prinosa monomera dobijenog u (a) i (b) i biranje multi-specifičnog proteina sa najvišim monomernim prinosom.

[0235] Tipično "par varijabilnog regiona" u koraku (a) i (b) metode su VHi VLpar. Generalno, VHi VLzajedno formiraju antigen vezujući domen, V1ili V2. Metod zbog toga omogućuje testiranje VHi VLpara kao oba dsscFv i dsFv u konstruktima predmetnog pronalaska i većina monomernih konstrukata je izabrana u koraku (c).

[0236] Tipično u koraku (a) i (b) metode je određen prinos nakon prečišćavanja, kao što je sledeća afinitetna hromatografija. Prinos monomera može biti određen bilo kojom pogodnom metodom, kao što je hromatografija za isključivanje veličine.

[0237] "Obuhvatajući" u kontekstu ove specifikacije je namijenjeno za značenje uključujući. Gde je to tehnički odgovarajuće, izvođenja ovog pronlaska mogu biti kombinovana. Izvođenja su ovde opisana kao da uključuju određene karakteristike/elemente. Otkriće se takođe proteže na odvojena izvođenja koja se sastoje ili se sastoje u osnovi od navedenih karakteristika/elemenata.

[0238] Bilo koja izvođenja koja su ovde posebno i izričito navedena mogu formirati osnovu za odricanje odgovornosti bilo sama ili u kombinaciji sa jednim ili više daljih izvođenja.

[0239] Ovo otkriće je dalje opisano ilustracijom samo u sledećim primerima, koji se odnose na prateće Slike, u kojima:

Kratak opis slika

[0240]

Slika 1 prikazuje konstrukte Fab-2xdsscFv i Fab-dsscFv-dsFv ovog otkrića.

Slika 2 prikazuje SDS-PAGE analizu prečišćenog proteina G, HEK293- eksprimirane Fab-1xdsscFv, 1xscFv i Fab-2xdsscFv proteine.

Slika 3 prikazuje G3000 SE HPLC analizu prečišćenog proteina G, HEK293-eksprimirane Fab-1xdsscFv, 1xscFv i Fab-2xdsscFv proteine.

Slika 4 SDS-PAGE analizu prečišćenih, HEK293- eksprimiranih Fab-2xdsscFv # 3 proteina

Slika 5 S200 SE HPLC analizu prečišćenih, HEK293- eksprimiranih Fab-2xdsscFv # 3 proteina

Slika 6 prikazuje SDS-PAGE analizu različitog prečišćenog proteina G Fab-dsscFv-dsFv konstrukta ovog otkrića.

(A) Fab-dsscFv-dsscFv uzorci. (B) Fab-dsscFv-dsFv uzorci.

Slika 7 prikazuje G3000 SE HPLC analizu prečišćenog proteina G Fab-dsscFv-dsFv konstrukta ovog otkrića.

Slika 8 prikazuje SDS-PAGE analizu različitih konstrukata prema ovom otkriću pod smanjenim uslovima.

Slika 9 prikazuje G3000 SE-HPLC analizu vremenskog toka monomernih Fab-1xdsscFv-1xscFv i Fab-2xdsscFv f formata

Slika 10 prikazuje SDS-Page analizu prečišćenog proteina-G EXPiHEK eksprimiranih Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

PRIMERI

[0241]

Fragmenti antitela na ANTIGEN 1 su obeleženi # 1

Fragmenti antitela na ANTIGEN 2 su obeleženi # 2

Fragmenti antitela na ANTIGEN 3 su obeleženi # 3

Fragmenti antitela na ANTIGEN 4 su obeleženi # 4

PRIMER 1: Fab-2xdsscFv

Konstrukcija plazmida za ekspresiju u ćelijama sisara

[0242] Plazmidi za ekspresiju Fab#2-(HC)dsscFv#3,(LC)dsscFv#4 i Fab#2-(LC)dsscFv#3,(HC)dsscFv#4 (videti Sliku 1), su konstruisani fuzionisanjem scFv#3 i scFv#4 na C-terminus od Km3 alotipa humanog kappa konstantnog regiona od #2 lakog lanca korišćenjem fleksibilnog veznika SGGGGSGGGGS [takođe navedeno ovde kao S, 2xG4S] (SEK ID BR: 2), ili fuzionisanjem scFv#3 i scFv#4 na C-terminus od, y1 izotipa humanog gama-1 CH1konstantnog regiona od #2 teškog lanca korišćenjem fleksibilnog veznika SGGGGTGGGGS [takođe navedeno ovde kao S, G4T, G4S] (SEK ID BR: 1). Pored toga, u DNK sekvencama su uvedene tačkaste mutacije na izabranim ostacima u okvirnom regionu od oba vL#3/vL#4 i vH#3/vH#4. Mutacije (teški lanac G44C i laki lanac G100C) su uvedene da bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teških i lakih lanaca od Fv # 3. Mutacije (teški lanac G44C i laki lanac Q100C) su uvedene da bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teških i lakih lanaca Fv # 4.

[0243] Fragmenti gena koji kodiraju scFv#4 i dsscFv#4 (vHvL i vLvH orijentacija) su proizvedeni hemijski i fuzionisani na Fab#2 kao što je detaljno opisano iznad da bi se generisao:

Plazmid e1: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-vL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR 68])-vH#4;

Plazmid f1: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-dsvL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvH#4; Plazmid e2: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-vH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR:68])-vL#4;

Plazmid f2: Laki#2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-dsvH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR:68])- dsvL#4; Plazmid g1 Teški#2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-vL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR:68])-vH#4;

Plazmid h1: Teški #2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-dsvL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvH#4; Plazmid g2: Teški #2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-vH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR:68])-vL#4; i Plazmid h2: Teški #2-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1])-dsvH#4-( GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvL#4. pND1 plazmid (Fab#2 Teški -(SGGGGTGGGGS SEK ID BR: 1)-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEK ID BR: 68)-dsvL#3) [Plazmid i] već je bio dostupan. Fragment gena koji kodira dsHLscFv # 3 je izrezan iz pND1 i fuzionisan na laki lanac #2 kao što je detaljno opisano iznad da bi se generisao: Laki #2- (SGGGGSGGGGS SEK ID BR: 2) -dsvH # 3- (GGGGSGGGGGGGGGSGGGGS SEK ID BR: 68)- dsvL #3 [Plazmid j].

Svi Fab fuzioni formati su klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E polyA sekvence.

HEK293 ekspresija Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0244] Ćelije HEK293 su transfektovane sa relevantnim plazmidima korišćenjem Invitrogen-ovog 293fektin transfekcionog reagensa prema uputstvima proizvođača. Plazmidi su pomešani kao što je prikazano u Tabeli 4 da bi se eksprimirali različiti konstrukti:

Tabela 4

Fab#2-(LC)dsHLscFv#3,(HC)dsLHscFv#4 1. Plazmid h1

2. Plazmid j

[0245] Odnos plazmida korišćenih za transfekcije je bio 1:1. Ukupno 50µg plazmidne DNK je inkubirano sa 125 µl 293fektina 4.25 ml Optimem medijuma tokom 20 minuta na RT. Smeša je onda dodata u 50 ml HEK293 ćelija u suspenziji na 1 x 10<6>ćelija/ml i inkubirana uz mućkanje na 37°C. Supernatanti su sakupljeni 10. dana centrifugiranjem na 1500 g da se uklone ćelije i supernatant je propušten kroz filter od 022µm. Nivo ekspresije je određen Protein-G HPLC.

[0246] Tabela 5 prikazuje rezultate Protein-G HPLC testa. Kao što se može videti, nivoi ekspresije svih konstrukata su bili uporedivi jedni sa drugim, pokrivajući raspon od 11-23 µg/ml. Oni koji su označeni zvezdicom (*) su bili izraženi u posebnoj transfekciji, zbog toga nivoi apsolutne ekspresije od LC-scFv#3, HC-scFv#4 ne mogu da se uporede sa HC-scFv#3, LC-scFv#4.

Tabela 5

Prečišćavanje proteina-G od HEK293 eksprimiranih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0247] ∼50 ml HEK293 supernatanata su koncentrovani ∼25 puta do ∼2 ml upotrebom odvajanja lOkDa molekularne težine centrifugiranjem koncentratora. Koncentrovani supernatanti su naneseni na 1 ml HiTrap proteina-G FF kolone (GE Healthcare) uravnoteženi u 20 mM fosfatu, 40 mM NaCl pH 7.4. Kolona je isprana sa 20 mM fosfata, 40 mM NaCl pH 7.4, i vezani materijal je eluiran sa 0.1 M glicina/HCl pH 2.7. Pik elucije je sakupljen i pH je podešena na ∼pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH 8.5. Elucije prilagođene pH su koncentrovane i pufer je izmenjen u PBS pH 7.4 upotrebom odvajanja lOkDa molekularne težine centrifugiranjem koncentratora.

SDS-PAGE analiza prečišćenog Proteina-G, HEK293 eksprimiranih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0248] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine do 9.75 µl, kojima je dodato 3.75 µl 4xLDS uzorka pufera i 1.5 µl 100 mM N-etilmaleimida (ne redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci). Uzorci su stavljeni u vrtlog, inkubirani na 70°C tokom 10 minuta, hlađeni i centrifugirani na 12500 rpm tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su napunjeni u 4-20% akrilamidni Tris/Glicin SDS gel i pušteni su ∼100 minuta na 125 V, konstantanog napona. Korišćene su tzv. "SeeBluePlus2" (Life Technologies) lestve molekularne težine su korišćene. Gelovi su obojeni sa Instant Plavom proteinskom bojom (Expedeon) i isprani sa destilovanom vodom.

[0249] Očekivane veličine traka nakon redukovanja i ne redukovanja SDS-PAGE su navedene u Tabeli 6.

Tabela 6

[0250] Očekuje se da će za sve proteine, ne-redukujući gel pokazti traku na∼100kDa, dok su očekivano redukujući gelovi pokazali udvostručene na ∼50kDa, sa jednakim bojenjem u obe trake.

[0251] Za sve Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv proteine, redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali obrasce vezivanja, koji su ukazivali na to da su konstrukti pravilno eksprimirani i u pogledu pozicije migracije i inteziteta bojenja sa dublikatom na ∼50kDa (Slika 2B, D). Dodatna najviša minorna traka je u konzistentna sa ne-redukovanim proteinom pune dužine. Kao što se očekivalo, multimeri povezani sa disulfidom su se videli na ne-redukujućem gelu ( Slika 2A, C), koji nestaju pod redukujućim uslovima (slika 2B, D). Minorne trake na ∼50kDa na ne-redukujućem gelu (slika 2A, C) mogu biti u skladu sa nepotpunom formacijom ds veze između teškog i lakog lanca u Fab regionu.

G3000 SE-HPLC analiza prečišćenog Proteina-G, HEK293 eksprimiranih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0252] 10µg prečišćenih uzoraka proteina (100 µl od 0.1 mg/ml zaliha razblaženih u PBS-u) su ubrizgani u TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300mm, kolone(Tosoh) 3 dana nakon prečišćavanja i razvijeno sa izokratskim gradijentom od 200mM fosfata pH 7.0 na 1 ml/min. Otkrivanje signala je bilo apsorbancijom na 280 nm.

[0253] Rezultati su prikazani na Slici 3. Kao što se može videti na Slici 3, nakon prečišćavanja Proteina-G, FablxdsscFvlxscFv i Fab-2xdsscFv formati su bili 83-89% monomerni.

[0254] Iako svi uzorci imaju slične monomerne nivoe u testu, oni uzorci koji sadrže scFv kojem nedostaje Fv disulfid se nalaze u dinamičkoj ravnoteži. To znači da je % monomera izmeren u testu za ove uzorke zavisan od koncentracije uzorka, više koncentrovni uzorci daju veći % monomera, i manje koncentrovani uzorci daju manji % monomera. Nasuprot tome, uzorci u kojima oba scFv sadrže disulfid su stabilni i nisu u dinamičkoj ravnoteži. Zbog toga se % monomera izmeren u testu ne menja sa promenama koncentracije u uzorku.

[0255] Kako su monomeri i multimeri u Fab-2xdsscFv formatima stabilni i nisu u dinamickoj ravnoteži, uzorci se mogu lako dalje prečišćavati da bi se povećao % monomera. Prečišćeni monomerni uzorci će takođe ostati monomerni čak i kada se povećava koncentracija konstrukta u datoj formulaciji, što čini konstrukte veoma pogodnim za upotrebu u farmaceutskim pripravcima. Suprotno tome, Fab-2xscFv nakon prečišćavanja kao monomer može biti podvrgnut intermolekularnoj razmeni dinamičkog domena između vL i vH scFv domena. Pored toga, teško je uočiti povećani rizik od stvaranja dimera, trimera, struktura višeg reda i agregata takvih molekula jer se neagregirani oblici mogu razgraditi na monomer nakon koraka razblaživanja koji se koriste tokom analitičkih metoda. Otuda Fab-2xdsscFv obezbeđuje dodatnu jasnoću tokom analize farmaceutskih kompozicija.

CHOS ekspresija Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0256] CHOS ćelije su transfektovane sa relevantnim plazmidima sa metodama elektroporacije u 1L skali. Plazmidi su pomešani kao što je je prikazano u Tabeli 7 da bi se eksprimirao protein. Kulture su uzgajane u CD-CHO medijumu uz dodatak 2 mM GlutaMAX i inkubirane na 37°C sa 8% CO2na 140 rpm tokom 24 sata i naknadno inkubirane daljih 13 dana na 32°C. Na dan 4-ti nakon transfekcije, kulturi je dodat natrijum butirat u konačnoj koncentraciji od 3 mM. 14-tog dana nakon transfekcije, kulture supernatanata su sakupljene centrifugiranjem i sterilizovane 0.22 µm filtrom. Titri ekspresije su izmereni sa Protein G HPLC (Tabela 8).

Tabela 7:

Tabela 8:

Prečišćavanje Proteina-G od CHO eksprimiranih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0257] 1L CHO supernatanti su koncentrovani ∼25 puta do ∼40 ml koristeći lOkDa molekularnu težinu odvojenu tzv. "Amicon" mešane ćelije. Koncentrovani supernatanti su napunjeni u sistem za prečišćavanje tzv."AKTA Express" sa kolonom Proteina G i PBS-om kao tekućim puferom. Vezani materijal je eluiran sa 0.1 M glicin/HCl pH2.7 i pH podešenim na ∼pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH 8.5. Eluirani materijal je zatim koncentrovan korišćenjem koncentratora molekularne težine lOkDa, i dobijeni koncentrat je napunjen u tzv. "Superdex" koloni (GE Healthcare) za filtraciju gela sa PBS-om kao tekućim puferom. Pojedinačni pikovi ispiranja su prikupljeni i analizirani HPLC za isključivanje veličine da bi se odredila monomerna frakcija. Konačni monomerni protein je koncentrovan na 5 mg/ml u PBS-u i skladišteni na 4°C.

SDS-PAGE analiza prečišćenog proteina-G, CHOS eksprimirane monomerne frakcije Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0258] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS-om do zapremine od 9.75 µl, kojoj je dodato 3.75µl 4xLDS uzorka pufera i 1.5µl 100mM N-etilmaleimida (ne- redukovani uzorci) ili 1.5µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci). Uzorci su stavljeni u vrtlog, inkubirani na 70°C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 rpm tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su napunjeni u 4-20% akrilamid Tris/Glicin SDS gel i pokrenuti tokom ∼100 minuta na 125 V, konstantnog napona. Korišćene su skale molekularne težine Mark12 (Life Technologies). Gelovi su obojeni sa Instant plavom bojom proteina (Expedeon) i isprani destilovanom vodom.

[0259] Očekivane veličine traka nakon redukovanja i ne-redukovanja SDS-PAGE su navedene u Tabeli 9.

Tabela 9:

[0260] Očekivalo se da će za sve proteine ne-redukujući gel pokazati traku na ∼100kDa, dok su očekivano redukujući gelovi pokazali duplu na ∼50kDa, sa jednakim bojenjem u obe trake.

[0261] Za sve Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv proteine, redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali obrasce povezivanja koji su ukazivali da su konstrukti monomerni i ispravno eksprimirani u smislu pozicije migracije i intenziteta bojenja sa duplikatom na ∼50kDa (Slika 8B, D). Dodatna gornja minorna traka je u skladu sa neredukovanim proteinom pune dužine (Slika 8B, D). Za sve proteine, ne-redukujući gel je pokazao traku na ∼100kDa, što ukazuje na protein pune dužine (Slika 8A, a). Minorne trake na ∼50kDa na ne-redukujućem gelu (Slika 8A, b) mogu biti u skladu sa nepotpunom formacijom disulfidne veze između teškog i lakog lanca u Fab regionu.

G3000 SE-HPLC analiza vremenskog toka monomernih Fab-lxdsscFv-lxscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0262] 5 mg/ml prečišćenog monomera formata antitela je skladišteno na 4°C u PBS i analizirano na dan 4, dan 14 i dan 28 nakon prečišćavanja. Uzorci su razblaženi u PBS do 10 µg i ubrizgani u TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300 mm, kolonu (Tosoh) i razvijeni sa izokratskim gradijentom od 200mM fosfata pH 7.0 na 1 ml/min. Otkrivanje signala je bilo apsorbancijom na 280 nm. Rezultati su prikazani na Slici 9. Četvrtog dana nakon prečišćavanja, analiza Fab-2xdsscFv je pokazala da je većina proteina monomerna na početku eksperimenta (čvrste linije), ti da ostaje monomerna i stabilna tokom vremena, sa <1% definisanim kao multimeri ( dimeri, trimeri, viših naloga i velikih agregata). Sa druge strane, otkrivena je veća pojava multimerizacije za Fab-lxdsscFv-lxscFv za koji je primećeno da se linearno povećava sa vremenom (isprekidane linije). Zapravo, čini se da je prevalenca multimerizacije izraženija u formatima koji sadrže ne-disulfidno stabilizovane scFvs u VL/VHorijentaciji. Međutim, jasno je da su formati koji sadrže scFv kojem nedostaje Fv disulfid u dinamičkoj ravnoteži i skloniji su multimerizaciji tokom skladištenja od scFv koji su disulfidno stabilizovani. Zaista, pokazalo se da formati koji sadrže scFvs koji su i disulfidno stabilizovani ostaju monomerni čak i kada je koncentracija proteina u datoj formulaciji povećana. To čini konstrukte u kojima oba scFvs sadrže Fv disulfid idealno pogodnim za upotrebu u farmaceutskim pripravcima gde rizik od formiranja viših redova multimera ili velikih agregata tokom perioda skladištenja kritično treba da bude neznatan.

PRIMER 2: Fab-2xdsscFv (bivalentn sa dva ista dsscFv)

Konstrukcija plazmida za ekspresiju u ćeliijama sisara

[0263] Plazmidi za ekspresiju Fab#2-(HC)dsscFv#3,(LC)dsscFv#3 (videti Sliku 4), su konstruisani fuzionisanjem vdsscFv#3 na C-terminusu konstantnog regiona humanog kappa alotipa Km3 lakog lanca #2 korišćenjem fleksibilnog linkera SGGGGSGGGGS [takođe je naveden ovde kao S, 2xG4S] (SEK ID BR: 2), ili fuzionisanjem dsscFv#3 na C-terminusu od, y1 izotipa humanog gama-1 CH1konstantnog regiona teškog lanca #2 korišćenjem fleksibilnog veznika SGGGGTGGGGS [takođe je naveden ovde kao S, G4T, G4S] (SEK ID BR: 1). Tačke mutacije su uvedene u DNK sekvence na izabranim ostacima u okvirnom regionu oba VL# 3/VL# 1 i VH# 3/VH# 1. Mutacije (teški lanac G44C i laki lanac G100C) su uvedene da bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teških i lakih lanaca Fv#3.

[0264] pND1 plazmid (Fab#2 Teški-(SGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 1)-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvL#3) [Plazmid i] je već bio dostupan. Fragment gena koji kodira dsHLscFv # 3 je bio isečen iz pND1 i fuzionisan u laki lanac # 2, kao što je detaljno opisano iznad, da bi se generisao: Laki #2-(SGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 2])-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 68])-dsvL#3 [Plazmid j].

[0265] Fab fuzionii formati su klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E poliA sekvence.

HEK293 ekspresija Fab-2xdsscFv#3

[0266] HEK293 ćelije su transfektovane sa relevantnim plazmidima korišćenjem Invitrogen-ov 293fektin transfekcionog reagensa prema uputstvima proizvođača. Plazmidi su pomešani kao što je prikazano u Tabeli 10 da se eksprimira protein:

Tabela 10

[0267] Odnos plazmida korišćenih za transfekcije je bio 1:1. Ukupno 50µg plazmidne DNK je inkubirano sa 125 µl 293fektina 4.25 ml Optimem medijuma tokom 20 minuta na RT. Smeša je zatim dodata u 50 ml HEK293 ćelija u suspenziji na 1 x 10<6>ćelija/ml i inkubirana uz mućkanje na 37°C. Supernatanti su sakupljeni 10. dana centrifugiranjem na 1500g radi uklanjanja ćelija i supernatant je propušten kroz 0.22 µm filter. Nivo ekspresije je određen sa Protein-G HPLC. Tabela 11 prikazuje rezultate Protein-G HPLC testa. Nivo ekspresije je bio 20 µg/ml.

Tabela 11

Prečišćavanje HEK293 eksprimiranog Fab-2xdsscFv # 3

[0268] Supernatanti ∼50 ml HEK293 su bili koncentrovani ∼25 puta do ∼2 ml korišćenjem odvajanja 30kDa molekularne težine centrifugiranjem koncentratora. Koncentrovani supernatanti su bili prečišćeni, i dalje koncentrovani i puferski izmenjeni u PBS pH 7.4 korišćenjem odvajanja 30kDa molekularne težine centrifugiranjem koncentratora.

SDS-PAGE analiza prečišćenog Proteina-G, HEK293 eksprimiranog Fab-2xdsscFv # 3

[0269] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine od 9.75µl, kojma je dodato 3.75µl 4xLDS uzorka pufera i 1.5µl 100 mM N-etilmaleimida (ne redukovani uzorci) ili 1.5µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci). Uzorci su stavljeni u vrtlog, inkubirani na 70°C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 rpm tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su napunjeni u 4-20% akrilamid Tris/Glicin SDS gel i pokrenuti tokom ∼100 minuta na 125 V, konstantnog napona. Korišćena je tzv. "SeeBluePlus2" (Life Technologies) lestvica molekularne težine. Gelovi su obojeni Instant Plavom proteinskom bojom (Expedeon) i obezbojeni sa destilovanom vodom. Očekivane veličine traka posle redukovanja i ne-redukovanja SDS-PAGE su navedene u Tabeli 12.

Tabela 12:

[0270] Očekivalo se da ne-redukujući gel pokazuje traku na∼ 100kDa, dok se očekivalo da redukujući gel pokazuje duplu na ∼50kDa, sa jednakim bojenjem u obe trake.

[0271] Redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali obrasce vezivanja koji su ukazivali da su konstrukti pravilno eksprimirani i u pogledu pozicije migracije i intenziteta bojenja sa duplikatom na ∼50kDa (Slika 4B), međutim primećene su neke dodatne minorne vrste verovatno zbog sub-optimalne šeme prečišćavanja,

za razliku od standardnog metoda prečišćavanja posredovanog Proteinom G, koji se obično koristi za prečišćavanje Fabova. Disulfidno vezani multimeri su se videli na ne-redukujućem gelu (Slika 4A), koji nestaju pod redukujućim uslovima (Slika 4B).

S200 SE-HPLC analiza prečišćenog, HEK293 ekspresiranog Fab-2xdsscFv#3

[0272] 10µg prečišćenih uzoraka proteina (100µl od 0.1 mg/ml zaliha razblženih u PBS) su ubrizgani u Superdex 200 10/300 GL trougle kolone (GE Healthcare) 3 dana nakon prečišćavanja i razvijeni sa izokratskim gradijentom od PBS pH 7.4 na 1ml/min, uz kontinuirano otkrivanje apsorpcijom na 280nm. Rezultati su prikazani na Slici 5. Kao što se može videti na Slici 5, nakon prečišćavanja, Fab-2xdsscFv # 3 format je bio 81% monomer.

PRIMER 3: Fab-(HC)dsscFv-(LC)dsFv

Konstrukcija Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL vezanih ) plazmida za ekspresiju u ćelijama sisara

[0273] Fab#2 fuzioni proteini za ekspresiju Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv# 3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezani) (videti Sliku 6), su bili konstruisani fuzionisanjem bilo dsscFv#1 (dsvH-4xG4S-dsvL) ili dsvL#1 na C-terminusu konstantnog regiona humanog kappa alotipa Km3 lakog lanca #2 korišćenjem fleksibilnog veznika SGGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 69) da se generiše:

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsscFv#1 [Plazmid b] i

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsvL#1 [Plazmid c]; i

fuzionisanjem HLdsscFv#3 (dsvH-4xG4S-dsvL) na C-terminusu od, y1 izotipa humanog gama-1 CH1 konstantnog regiona teškog lanca#2 korišćenjem fleksibilnog veznika SGGGGSGGGGTGGGGS (SEK ID BR: 70) da se generiše: Teški #2-(SGGGGSGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 70])-dsscFv#3 [Plazmid a].

[0274] Tačka mutacije (teški lanac G44C i laki lanac G100C) su uvedene u u DNK sekvence na odabranim ostacima u okvirnom regionu vL # 3, vH #3, vL #1 i vH #1 da bi se stvorila međulančana disulfidna veza između teških i lakih lanacva Fv #3 i Fv #1. Geni Fab-fuzije teškog i lakog lanca su klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E poliA sekvence. Kodirajući geni:

Teški #2-(SGGGGSGGGGTGGGGS [SEK ID BR: 70])-dsscFv#3 [Plazmid a] i dsvH#1 slobodan domen [Plazmid d]

su proizvedeni hemijski i pojedinačno klonirani u ekspresione vektore sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E poliA sekvence.

[0275] Geni koji kodiraju dsscFv#1 i dsvL#1 su proizvedeni hemijski i fuzionisani na C-terminalu lakog lanca 2da bi se stvorio:

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsscFv#1 [Plazmid b] i

Laki#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEK ID BR: 69])-dsvL#1 [Plazmid c]

i celi konstrukti su klonirani u ekspresioni vektor sisara pod kontrolom HCMV-MIE promotera i SV40E poliA sekvence. HEK293 ekspresija od:

[0276]

Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i

Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezani)

[0277] Ćelije HEK293 su transfektovane sa relevantnim plazmidima koristeći Invitrogen-ov 293fektin transfekcioni reagens prema uputstvima proizvođača. Plazmidi su pomešani kao što sledi da eksprimiraju različite konstrukte kao što je prikazano u Tabeli 13 ispod:

Tabela 13

[0278] Za kombinaciju 2 plazmida odnos plazmida korišćenih za transfekcije je bio 1:1, dok je za 3 kombinacije plazmida odnos bio 1:1:1. Ukupno 50µg plazmidne DNK je inkubirano sa 125 µl 293fektina 4.25 ml Optimem medijuma tokom 20 minuta na RT. Smeša je tatim dodata u 50 ml HEK293 ćelija u suspenziji na 1 x 10<6>ćelija/ml i inkubirana uz mućkanje na 37°C. Supernatanti su

sakupljeni 10. dana centrifugiranjem na 1500 g da se uklone ćelije i supernatant je propušten kroz 0.22µm filter. Nivo ekspresije je određen sa Protein-G HPLC.

[0279] Rezultati su prikazani u Tabeli 14. Kao što se može videti, nivoi ekspresije oba konstrukta su bili uporedivi jedan sa drugim (16-18 µg/ml). U literaturi su navedeni izveštaji da ekspresija Fv regiona kojoj nedostaje bilo veznik između vL i vH ili motiv dimerizacije za spajanje vL i vH ima znatno niže nivoe ekspresije od povezanih Fvs. Iznenađujuće, ovo se ne primećuje u ovim podacima gde nije primećena značajna razlika između nivoa ekspresije svakog tipa konstrukta.

Tabela 14:

Protein-G prečišćavanje HEK293 ekspimiranih Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv# 3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezani)

[0280] ∼50 ml HEK293 supernatanta su koncentrisani ∼25 puta do ∼2 ml korišćenjem odvajanja lOkDa molekularne težine centrifugacijom koncentratora.

Koncentrisani supernatanti su naneti na 1 ml HiTrap Protein-G FF kolonu (GE Healthcare) uravnoteženi u 20 mM fosfata, 40 mM NaCl pH 7.4. Kolona je isprana sa 20 mM fosfata, 40 mM NaCl pH 7.4, i vezani materijal je eluiran sa 0.1 M glicin/HCl pH 2.7. Pik elucije je sakupljen i pH podešena na ∼pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH 8.5. Elucije prilagođene pH su koncentrovane i pufer je izmenjen u PBS pH 7.4 korišćenjem odvajanja lOkDa molekularne težine centrifugacijom koncentratora.

SDS-PAGE analiza prečišćenog Proteina-G, HEK293 eksprimiranih Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC) dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezanih)

[0281] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine od 9.75 µl, kojoj je dodato 3.75 µl 4xLDS uzorka pufera i 1.5 µl 100 mM N-etilmaleimida (ne- redukovani uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci) je dodato. Uzorci su stavljeni u vrtlog, inkubirani na 70°C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 rpm tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su napunjeni u 4-20% akrilamidni Tris/Glicin SDS gel i pokrenuti tokom ∼100 minuta na 125 V, konstantnog napona. Korišćena je tzv. "SeeBluePlus2" (Life Technologies) lestvica molekularne težine. Gelovi su obojeni Instant plavom proteinskom bojom (Expedeon) i obezbojeni sa destilovanom vodom.

[0282] Rezultati su prikazani na Slici 6. Za Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1,

se očekivalo da će ne-redukujući gel pokazati traku na ∼ 100kDa, dok se očekivalo da će redukujući gel pokazati duplu na ∼ 50kDa sa približno jednakim bojenjem u obe trake. Za Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezani), se očekivalo da će ne-redukujući gel pokazati traku na ∼100kDa, dok se očekivalo da će redukujići gel pokazati 3 trake na, ∼50, ∼36 i ∼13kDa, sa bojenjem približno u odnosu 3:2:1 gornje prema donjoj traci.

[0283] Redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali obrasce vezivanja koji su ukazivali da su konstrukti pravilno eksprimirani i u pogledu pozicije migracije i intenziteta bojenja. Ne-redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali značajne obrasce vezivanja >200kDa za Fab-2xdsscFv koji su bili u skladu sa multimerizacijom (Slika 6A, traka 2), ali je u uzorku Fab-dsscFv-dsFv uočeno manje vrsta velike molekularne težine (Slika 6B, traka 2).

G3000 SE-HPLC analiza prečišćenog Proteina-G, HEK293 eksprimirani, Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 i Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (LC-vL povezani)

[0284] 10µg pečišćenih uzoraka proteina (100 µl od 0.1 mg/ml zaliha razblaženog u PBS) je ubrizgano u TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300mm, kolonu (Tosoh) 3 dana nakon prečišćavanja i razvijeno sa izokratskim gradijentom od 200mM fosfata pH 7.0 na 1 ml/min. Detekcija signala je bila apsorbancijom na 280 nm.

[0285] Rezultati su prikazani na Slici 7. Nakon prečišćavanja proteina-G, Fab #2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1(LC-vL povezani) je bio 91% monomer, dok je Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 bio 30% monomera.

[0286] Poznato je da je dsscFv # 1 naročito sklon multimerizaciji. S obzirom da se multimerima fizički pridružuje dsscFv veznik (vL#1 ili vH#1 je uparen sa vH# 1 ili vL#1 iz različitog polipeptidnog lanca), zamenom dsscFv#1 sa dsFv#1 (što ne obuhvata scFv veznik) došlo je do značajnog povećanja u procentima dobijenog monomera.

[0287] Stručna osoba će tako shvatiti da bi, u zavisnosti od sklonosti dsscFv prema multimerizmu, u nekim slučajevima bilo korisno koristiti dsFv umesto dsscFv.

PRIMER 4 Biacore afinitet i demonstracija istovremenog vezivanja ciljeva antigena

[0288] Afiniteti vezivanja i kinetički parametri za interakcije Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC)dsHLscFv#4 su određeni površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) sprovedenom na BIAcore T100 ili BIAcore 3000 primenom

CM5 senzorskih čipova (GE Healthcare Bio-Sciences AB) i HBS-EP (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % v/v surfaktanata P20) pokretnog pufera. Svi eksperimenti su izvedeni na 25°C. Uzorci antitela su uhvaćeni na površini senzorskog čipa korišćenjem bilo humanog F(ab’)2-specifičnog kozjeg Fab (Jackson ImmunoResearch) ili sopstveno generisanog anti humanog CH1monoklonalnog antitela. Kovalentna imobilizacija antitiela za hvatanje je postignuta standardnom hemijom spajanja amina do nivoa od 6000-7000 jedinica odgovora (RU). Antigen #2, #3 ili #4 je titriran odvojeno preko uhvaćenog antitela. Svaki ciklus ispitivanja se sastojao od prvog hvatanja uzorka antitela korišćenjem 1 min injekcije, pre faze asocijacije koja se sastojala od 3 min injekcije antigena, nakon čega je disocijacija praćena tokom 10 min. Nakon svakog ciklusa, površina hvatanja je regenerisana sa 2 x 1 min injekcijama od 40 mM HCl, praćenih sa 30s od 5 mM NaOH. Korišćene brzine protoka su bile 10µl min<-1>za hvatanje, 30 µl min<-1>za faze asocijacije i disocijacije i 10µl min<-1>za regeneraciju. Kinetički parametri su određeni istovremenim globalnim uklapanjem rezultirajućih senzorgrama standardnom modeul vezivanja 1:1 korišćenjem softvera BIAcore T100 Evaluacija v2.0.1 ili BIAcore 3000 BIAEvaluacija v3.2. Rezultati su prikazani u Tabeli 15. Antitelo je pokazalo očekivane afinitete unutar pM-nM raspona za testirane antigene.

Tabela 15:

[0289] Potencijal da se Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC)dsHLscFv#4 istovremeno veže za sva 3 antigena je procenjen hvatanjem tri-specifičnog antitela na senzorni čip preko imobilizovanog antihumanog IgG-F(ab’)2. Svaki antigen ili mešani rastvor antigena #2, #3 i #4 je titriran preko uhvaćenog antitela u 3 min injekcijama. Odgovori vezivanja primećeni za nezavisne injekcije i kombinovane odgovore su prikazani u Tabeli 16. Odgovor vezivanja za kombinovani rastvor antigena #2/#3/#4 je bio ekvivalentan zbiru odgovora nezavisnih injekcija. Ovo potvrđuje da je Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC)dsHLscFv#4 sposoban da se istovremeno veže na sva tri testirana antigena.

Tabela 16:

Primer 5 Poređenje monomernog prinosa između Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0290] Ćelije EXpiHEK su transfektovane sa relevantnim plazmidima metodama elektroporacije na skali od 50 ml. Plazmidi su pomešani kao što je prikazano u Tabeli 17 da bi se eksprimirao protein. Kulture su rasle u medijumu za ekspresiju ExpiHEK i inkubirane na 37°C sa 8% CO2na 120 rpm tokom 16-18h, pre dodatka pojačivača 1 i 2. Kulture su naknadno inkubirane tokom dalja 4 dana na 37°C. Supernatanti kulture su sakupljani centrifugiranjem i sterilisani 0.22 µm filterom. Titri ekspresije su izmereni sa Protein G HPLC (Tabela 18).

Tabela 17:

Tabela 18:

Protein-G prečišćavanje EXPiHEK eksprimiranih Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0291] Supernatanti su koncentrovani ∼25 puta do ∼2 ml upotrebom odvajanja lOkDa molekularne težine koncentratora. Koncentrovani supernatanti su prečišćeni sa protein G HPLC korišćenjem fosfatnog pufera pH 7.4. Vezani materijal je eluiran sa 0.1 M glicin/HCl pH2.7 i pH podešen do ∼pH7.0 sa 2M Tris/HCl pH 8.5. Eluirani materijal je koncentrovan korišćenjem koncentratora lOkDa molekularne težine i pufer izmenjen u PBS. Prečišćeni protein je koncentrovan do ∼54-5 mg/ml u PBS i skladišten na 4°C.

SDS-PAGE analiza prečišćenog Proteina-G, EXPiHEK eksprimiranih Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0292] Uzorci (2 µg) su razblaženi sa PBS do zapremine 9.75 µl, kojoj je dodato 3.75 µl 4xLDS uzorka pufera i 1.5 µl 100 mM N-etilmaleimida (ne- redukovanii uzorci) ili 1.5 µl 10x NuPAGE redukujućeg agensa (redukovani uzorci). Uzorci su stavljeni u vrtlog, inkubirani na 70°C tokom 10 minuta, ohlađeni i centrifugirani na 12500 rpm tokom 30 sekundi. Pripremljeni uzorci su napunjeni u 4-20% akrilamid Tris/Glicin SDS gel i pokrenuti tokom ∼100 minuta pri 125 V, konstantnog napona. Korišćene su lestve molekularne težine tzv. "SeeBluePlus2" (Life Technologies). Gelovi su obojeni sa Instant plavom proteinskom bojom (Expedeon) i obezbojeni sa destilovanom vodom.

[0293] Očekivane veličine traka nakon redukovanja i ne-redukovanja SDS-PAGE su naznačene u Tabeli 19.

Tabela 19:

[0294] Očekivalo se da će za sve proteine ne-redukujući gel pokazati traku na ∼100kDa, dok se očekivalo da će redukujući gelovi pokazati dupliranu na ∼50kDa, sa jednakim bojenjem u obe trake.

[0295] Za sve Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv proteine, redukujući SDS-PAGE gelovi su pokazali obrasce vezivanja, što je ukazivalo da su konstrukcije pravilno eksprimirane u pogledu pozicije migracije i intenziteta bojenja sa duplom ∼50kDa (Slika 10B, a). Dodatna najviše minorna traka je u skladu sa ne-redukovanim proteinom pune dužine (Slika 10B, b). Za sve proteine, ne redukujući gel je pokazao traku na ∼130 kDa, što ukazuje na protein pune dužine (Slika 10A, a). Trake na ∼50kDa na ne-redukujućem gelu (slika 10A, b) mogu biti u skladu sa nepotpunom formacijom disulfidne veze između teškog i lakog lanca u Fab regionu.

G3000 SE-HPLC analiza Fab-2xscFv i Fab-2xdsscFv formata

[0296] Prečišćeni proteini antitela na ∼5 mg/ml su skladišteni na 4°C u PBS tokom 24 sata pre analize. Uzorci ekvivalentni koncentraciji od 25 µg su ubrizgani u TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300 mm, kolone (Tosoh) i razvijeni sa izokratskim gradijentom od 200mM fosfata pH 7.0 na 1 ml/min. Detekcija signala je bila apsorbancijom na 280 nm. Rezultati su prikazani u Tabeli 20. Analiza je pokazala da su svi Fab-2xdsscFv proteini bili > 90% monomerni. Sa druge strane, otkrivena je veća pojava multimerizacije za sve Fab-2xscFv. Jasno je da su formati koji sadrže scFv sa Fv disulfidom monomerniji u poređenju sa scFvs kojima nedostaje Fv disulphid. Ovo ukazuje na prednost korišćenja formata sa scFvs koji sadrže Fv disulfide u smislu selekcije terapijskih molekula sa stabilnim kvalitetima i takođe atributa koji bi bili korisni u procesu proizvodnje.

Tabela 20:

Claims (24)

Patentni zahtevi

1. Multispecifični molekul antitela obuhvatajući ili sastojeći se od:

a) polipeptidnog lanca formule (l):

VH-CH1-X-V1;

i

b) polipeptidnog lanca formule (ll):

VL-CL-Y-V2;

pri čemu:

VHpredstavlja varijabilni domen teškog lanca;

CH1predstavlja domen konstantnog regiona teškog lanca, na primer, domen 1 istog;

X predstavlja vezu ili veznik;

Y predstavlja vezu ili veznik;

V1predstavlja dsFv ili dsscFv;

VLpredstavlja varijabilni domen lakog lanca;

CLpredstavlja domen iz konstantnog regiona lakog lanca, kao što je Ckappa;

V2predstavlja dsFv ili dsscFv.

2. Multispecifični molekul antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je X veznik.

3. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 2, pri čemu je Y veznik.

4. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu V1je dsFv, i V2je dsFv.

5. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu V1je dsscFv i V2je dsscFv.

6. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu V1je dsscFv i V2je dsFv, ili pri čemu V1je dsFv, i V2je dsscFv.

7. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu je varijabilni domen lakog lanca ili varijabilni domen teškog lanca od V1spojen na X, na primer, putem peptidne veze.

8. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7, pri čemu je varijabilni domen lakog lanca ili varijabilni domen teškog lanca od V2spojen na Y, na primer, putem peptidne veze.

9. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu su varijabilni domeni lakog lanca i teškog lanca od V1i/ili varijabilni domene lakog lanca i teškog lanca od V2povezani putem disulfidne veze između dva konstruisana ostatka cisteina.

10. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9, pri čemu su varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca od V1i/ili V2povezani putem disulfidne veze između dva ostatka cisteina, pri čemu je pozicija para cisteinskih ostataka izabrana iz grupe obuhvatajući ili sastojeći se od : VH37 i VL95, VH44 i VL100, VH44 i VL105, VH45 i VL87, VH100 i VL50, VH100b i VL49, VH98 i VL46, VH101 i VL46, VH105 i VL43 i VH106 i VL57 (numerisanje prema Kabatu), pri čemu su vrednosti VHi VLnezavisno izabrane unutar datog V1ili V2.

11. Multispecifični molekul antitela prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je pozicija para konstruisanih ostataka cisteina VH44 i VL100.

12. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, pri čemu je X peptidni veznik.

13. Multispecifični molekul antitela prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je X peptidni veznik izabran od SEK ID BR: 1, 2, 69 i 70.

14. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do

13, pri čemu je Y peptidni veznik.

15. Multispecifični molekul antitela prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je Y peptidni veznik izabran od SEK ID BR: 1, 2, 69 i 70.

16. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15, koji je tri-specifičan.

17. Tri-specifični molekul antitela prema patentnom zahtevu 16, pri čemu svaki od tri vezujućih domena veže različite antigene.

18. Polinukleotid koji kodira multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 17.

19. Vektor koji obuhvata polinukleotid definisan u patentnom zahtevu 18.

20. Ćelija domaćina koja obuhvata polinukleotid ili vektor iz patentnog zahteva 18 ili 19 respektivno.

21. Ćelija domaćina koja obuhvata dva ili tri vektora, svaki vektor obuhvata polinukleotid koji kodira različiti lanac polipeptida multispecifičnog molekula antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 17.

22. Postupak koji obuhvata ekspresiju multispecifičnog molekula antitela iz ćelije domaćina definisanu u patentnom zahtevu 20 ili patentnom zahtevu 21.

23. Farmaceutska kompozicija, koja obuhvata multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 17 i najmanje jedan ekscipijent.

24. Multispecifični molekul antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 17 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 23, za upotrebu u tretmanu.