RS59468B1 - Postupci i kompozicije za isporuku arilsulfataze a u cns - Google Patents

Postupci i kompozicije za isporuku arilsulfataze a u cns

Info

Publication number
RS59468B1
RS59468B1 RSP20191354A RS59468B1 RS 59468 B1 RS59468 B1 RS 59468B1 RS P20191354 A RSP20191354 A RS P20191354A RS 59468 B1 RS59468 B1 RS 59468B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rhasa
brain
administration
protein
concentration
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Nazila Salamat-Miller
Katherine Taylor
Paul Campolieto
Zahra Shahrokh
Jing Pan
Lawrence Charnas
Teresa Leah Wright
Pericles Calias
Original Assignee
Shire Human Genetic Therapies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shire Human Genetic Therapies filed Critical Shire Human Genetic Therapies
Publication of RS59468B1 publication Critical patent/RS59468B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/54—Mixtures of enzymes or proenzymes covered by more than a single one of groups A61K38/44 - A61K38/46 or A61K38/51 - A61K38/53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis pronalaska
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0001] Terapija zamene enzima (ERT) obuhvata sistemsku primenu prirodnih ili rekombinantno izvedenih proteina i/ili enzima subjektu. Odobrene terapije se obično primenjuju subjektima intravenski i uglavnom su efektivne u lečenju somatskih simptoma enzimske deficijencije u osnovi oboljenja. Kao rezultat ograničene distribucije intravenski primenjenog proteina i/ili enzima u ćelije i tkiva centralnog nervnog sistema (CNS), lečenje oboljenja sa CNS etiologijom je poseban izazov, pošto intravenski primenjeni proteini i/ili enzimi ne prolaze kroz krvno-moždanu barijeru (KMB) na adekvatan način. Na primer, US 2009/017005 opisuje vodenu formulaciju humane α-L-iduronidaze (rhIDU) za upotrebu u lečenju mukopolisaharidoze tipa 1 (Hurlerovog sindroma). Kompozicija sadrži 0,58 mg/ml iduronidaze i 100 mM natrijum fosfata, 150 mM NaCl i 0,001% polisorbata 80 kao pomoćnih supstaci.
[0002] Krvno-moždana barijera (KMB) je strukturni sistem koji se sastoji od endotelnih ćelija i koji funkcioniše tako da se zaštiti centralni nervni sistem (CNS) od štetnih supstanci u krvotoku, kao što su bakterije, makromolekuli (npr. proteini) i drugi hidrofilni molekuli, putem ograničavanja difuzije takvih supstanci kroz KMB, a time u cerebrospinalnu tečnost (CST) i CNS.
[0003] Postoji nekoliko načina zaobilaženja KMB radi pobolјšanja isporuke terapijskog agensa u mozak, uključujući direktno intrakranijalno injeciranje, prolaznu permeabilizaciju KMB i modifikaciju aktivnog agensa da bi se izmenila tkivna distribucija. Direktno injeciranje terapijskog agensa u moždano tkivo u potpunosti zaobilazi vaskulaturu, ali je uglavnom praćeno rizikom od komplikacija (infekcije, oštećenja tkiva, imunog odgovora) koje nastaju intrakranijalnim injeciranjem i slabom difuzijom aktivnog agensa sa mesta primene. Do danas, direktna primena proteina u tkivo mozga nije postigla značajan terapijski efekat zbog postojanja barijera za difuziju i ograničene zapremine terapeutika koja može biti primenjena. Ispitivana je difuzija potpomognuta konvektorima, upotrebom katetera postavlјenih u parenhim mozga i sporih, dugotrajnih infuzija (Bobo i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen i saradnici, J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), ali trenutno nijedna odobrena terapija ne koristi ovakav pristup za dugoročnu terapiju. Dodatno, postavlјanje intracerebralnih katetera je veoma invazivno i manje poželјno kao klinička alternativa.
[0004] Pokušano je takođe sa intratekalnim (IT) injeciranjem ili sa primenom proteina u cerebrospinalnu tečnost (CST), ali terapijski uspeh još uvek nije postignut. Glavni izazov u ovom tipu lečenja je bila tendencija aktivnog agensa da se veoma čvrsto veže za ependimsku ovojnicu moždanih komora, čime je bila sprečena naknadna difuzija. Trenutno nema odobrenih proizvoda za lečenje genetičkih oboljenja mozga direktnom primenom u CST.
[0005] Zapravo, mnogi su verovali da su barijera za difuziju na površini mozga, kao i nedostatak efektivnih i pogodnih postupaka isporuke, prevelika prepreka za postizanje adekvatnog terapijskog efekta u mozgu u slučaju bilo kakvog oboljenja.
[0006] Mnogi poremećaji lizozomskog skladištenja utiču na nervni sistem i tako predstavljaju jedinstvene izazove u lečenju ovih oboljenja tradicionalnim terapijama. Često dolazi do znatnog nakupljanja glikozaminoglikana (GAG) u neuronima i moždanim ovojnicama obolelih individua, što vodi raznim oblicima CNS simptoma. Do danas, nijedan simptom CNS-a koji je posledica lizozomskog poremećaja nije uspešno lečen bilo kojim raspoloživim načinom.
[0007] Stoga, ostaje velika potreba za efektivnom isporukom terapijskih agenasa u mozak. Preciznije, postoji velika potreba za efektivnijom isporukom aktivnih agensa u centralni nervni sistem radi lečenja poremećaja lizozomskog skladištenja.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje efektivan i manje invazivan pristup za direktnu isporuku terapijskih agenasa u centralni nervni sistem (CNS). Predmetni pronalazak se delimično zasniva na neočekivanom otkriću da enzim koji se zamenjuje (arilsulfataza A (ASA)) u slučaju bolesti lizozomskog skladištenja (MLD) može biti direktno uveden u cerebrospinalnu tečnost (CST) subjekta kome je lečenje potrebno, u visokoj koncentraciji (većoj od 10 mg/ml), tako da enzim efektivno i ekstenzivno difunduje po raznim površinama i prodire u razne regione širom mozga, uklјučujući duboke moždane regione. Što je još više iznenađujuće, predmetni pronalazači su pokazali da se navedena isporuka visoke koncentracije proteina može obaviti upotrebom jednostavnih formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera i bez izazivanja značajnih štetnih efekata kod subjekta, kao što je jak imuni odgovor. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje visoko efikasan, klinički poželјan i pacijentu prilagođen pristup za direktnu isporuku u CNS radi lečenja raznih oboljenja i poremećaja koji su sa CNS komponentama, a prevashodno bolesti lizozomskog skladištenja. Predmetni pronalazak predstavlјa značajan napredak u polјu cilјanog dejstva na CNS i polju terapije zamene enzima.
[0009] Kao što je detalјno opisano u tekstu koji sledi, predmetni pronalazači su uspešno razvili stabilne formulacije za efektivnu intratekalnu (IT) primenu proteina arilsulfataze A (ASA). Zaista, stabilne formulacije prema predmetnom pronalasku mogu biti upotrebljene za isporuku u CNS putem intratekalnih (npr. IT-lumbalnih, IT-cisterna magna) primena za direktno injeciranje u CNS i/ili CST.
[0010] Preciznije, pronalazak obezbeđuje stabilnu vodenu formulaciju za intratekalnu primenu koja sadrži protein arilsulfatazu A (ASA) u koncentraciji većoj od 10 mg/ml, so i polisorbatni površinski aktivan agens (surfaktant), kao i puferski agens, pri čemu je so NaCl. U pojedinim primerima izvođenja, ASA protein je prisutan u ili do koncentracije koja je izabrana od 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml ili 300 mg/ml.
[0011] U raznim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata stabilnu formulaciju bilo kog od primera izvođenja koji je ovde opisan, pri čemu ASA protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1. U pojedinim primerima izvođenja, ASA protein sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identična sa SEQ ID NO: 1. U pojedinim primerima izvođenja, NaCl je prisutan u koncentraciji opsega od približno 30-300 mM. U pojedinim primerima izvođenja, NaCl je prisutan u koncentraciji koja je opsega od približno 137-154 mM. U pojedinim primerima izvođenja, NaCl je prisutan u koncentraciji od približno 154 mM.
[0012] U raznim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uklјučuje stabilnu formulaciju bilo kog od primera izvođenja koji je ovde opisan, pri čemu je polisorbatni surfaktant izabran iz grupe koju čine polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 80 i njihove kombinacije. U pojedinim primerima izvođenja, polisorbatni surfaktant je polisorbat 20. U pojedinim primerima izvođenja, polisorbat 20 je prisutan u koncentraciji od približno 0,005%.
[0013] U pojedinim primerima izvođenja, puferski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od fosfata, acetata, histidina, sukcinata, Trisa i njihovih kombinacija. U pojedinim primerima izvođenja, puferski agens je fosfat. U pojedinim primerima izvođenja, fosfat je prisutan u koncentraciji ne većoj od 50 mM (npr. ne većoj od 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM ili 5 mM). U pojedinim primerima izvođenja, fosfat je prisutan u koncentraciji ne većoj od 20 mM. U raznim aspektima, pronalazak uključuje stabilnu formulaciju bilo kog od primera izvođenja koji je ovde opisan, pri čemu je formulacija sa pH od približno 3-8 (npr. približno 4-7,5; 5-8; 5-7,5; 5-6,5; 5-7,0; 5,5-8,0; 5,5-7,7; 5,5-6,5; 6-7,5 ili 6-7,0). U pojedinim primerima izvođenja, formulacija je sa pH od približno 5,5-6,5 (npr. 5,5; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4 ili 6,5). U pojedinim primerima izvođenja, formulacija je sa pH od približno 6,0.
[0014] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uklјučuje stabilnu formulaciju za intratekalnu primenu koja sadrži protein arilsulfatazu A (ASA) u koncentraciji opsega od približno 15-300 mg/ml, NaCl u koncentraciji od približno 154 mM, polisorbat 20 u koncentraciji od približno 0,005% i sa pH je od približno 6,0. U pojedinim primerima izvođenja, ASA protein je koncentracije od približno 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml ili 300 mg/ml.
[0015] Prema raznim aspektima, predmetni pronalazak uključuje posudu za skladištenje koja sadrži jedinični dozni oblik stabilne formulacije iz raznih primera izvođenja koji su ovde opisani. U pojedinim primerima izvođenja, posuda za skladištenje je izabrana od ampule, bočice, boce, patrone, rezervoara, lio-injektora ili prethodno napunjenog šprica. U pojedinim primerima izvođenja, posuda za skladištenje je prethodno napunjen špric. U pojedinim primerima izvođenja, prethodno napunjen špric je izabran od borosilikatnih staklenih špriceva prevučenih pečenim silikonom, borosilikatnih staklenih špriceva prevučenih raspršenim silikonom ili špriceva od plastičnih smola bez silikona. U pojedinim primerima izvođenja, stabilna formulacija je prisutna u zapremini manjoj od oko 50 ml (npr. manjoj od oko 45 ml, 40 ml, 35 ml, 30 ml, 25 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml, 1,0 ml ili 0,5 ml). U pojedinim primerima izvođenja, stabilna formulacija je prisutna u zapremini manjoj od oko 3,0 mL.
[0016] Postupak lečenja metahromatske leukodistrofijske bolesti može uključivati korak intratekalne primene formulacije prema bilo kom primeru izvođenja koji je ovde opisan, subjektu kome je tretman potreban.
[0017] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uklјučuje formulaciju koja sadrži protein arilsulfatazu A (ASA) u koncentraciji opsega od približno 15-300 mg/ml, NaCl u koncentraciji od približno 154 mM, polisorbat 20 u koncentraciji od približno 0,005% i sa pH je od približno 6, za upotrebu u postupku lečenja metahromatske leukodistrofijske bolesti, pri čemu navedeni postupak obuhvata korak intratekalne primene formulacije subjektu kome je tretman potreban.
[0018] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena ne rezultuje značajnim štetnim efektima (npr. jakim imunim odgovorom) kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena kod subjekta ne rezultuje značajnim adaptivnim imunim odgovorom posredovanim T-ćelijama.
[0019] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje isporukom proteina arilsulfataze A u razna cilјna tkiva u mozgu, kičmenoj moždini i/ili perifernim organima. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje isporukom proteina arilsulfataze A u cilјna tkiva mozga. U pojedinim primerima izvođenja, cilјna tkiva mozga obuhvataju belu masu i/ili neurone u sivoj masi. U pojedinim primerima izvođenja, protein arilsulfataze A se isporučuje neuronima, glijskim ćelijama, perivaskularnim ćelijama i/ili ćelijama moždanih ovojnica. U pojedinim primerima izvođenja, protein arilsulfataze A se dodatno isporučuje neuronima u kičmeni moždini.
[0020] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije dalјe rezultuje sistemskom isporukom ASA proteina u periferna cilјna tkiva. U pojedinim primerima izvođenja, periferna cilјna tkiva su izabrana od jetre, bubrega, slezine i/ili srca.
[0021] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje lokalizacijom u lizozomima ciljnih tkiva mozga, neurona kičmene moždine i/ili perifernih ciljnih tkiva. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje u smanjenju skladištenja sulfatida u ciljnim moždanim tkivima, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U pojedinim primerima izvođenja, skladištenje sulfatida je smanjeno za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, jedan put, 1,5 put ili 2 puta u poređenju s kontrolom (npr. u odnosu na skladištenje GAG kod subjekta pre tretmana). U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje smanjenom vakuolizacijom u neuronima (npr. za najmanje 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, jedan put, 1,5 put ili 2 puta u poređenju sa kontrolom). U pojedinim primerima izvođenja, neuroni podrazumevaju Purkinjeove ćelije.
[0022] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje u povećanoj enzimskoj aktivnosti u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U pojedinim primerima izvođenja, enzimska aktivnost ASA je povećana za najmanje jedan put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u poređenju sa kontrolom (npr. u odnosu na endogenu enzimsku aktivnost kod subjekta pre tretmana). U pojedinim primerima izvođenja, povećana ASA enzimska aktivnost je najmanje približno 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ili 600 nmol/h/mg.
[0023] U pojedinim primerima izvođenja, enzimska aktivnost ASA je povećana u lumbalnom regionu. U pojedinim primerima izvođenja, povećana enzimska aktivnost ASA u lumbalnom regionu iznosi najmanje približno 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg ili 10.000 nmol/h/mg.
[0024] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena formulacije rezultuje smanjenim intenzitetom, ozbilјnošću ili učestalošću, ili odloženom pojavom najmanje jednog simptoma ili karakteristike MLD-a. U pojedinim primerima izvođenja, najmanje jedan simptom ili karakteristika MLD-a su kognitivno oštećenje; lezije bele mase; prošireni perivaskularni prostori u parenhimu mozga, ganglijama, žuljevitom telu i/ili moždanom stablu; atrofija; i/ili ventrikulomegalija.
[0025] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena se sprovodi jednom na svake dve nedelјe. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena se sprovodi jednom mesečno. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena se sprovodi jednom na svaka dva meseca. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena se upotrebljava zajedno sa intravenskom primenom. U pojedinim primerima izvođenja, intravenska primena nije češća od jednom nedeljno. U pojedinim primerima izvođenja, intravenska primena nije češća od jednom na svake dve nedelje. U pojedinim primerima izvođenja, intravenska primena nije češća od jednom mesečno. U pojedinim primerima izvođenja, intravenska primena nije češća od jednom na svaka dva meseca. U određenim primerima izvođenja, intravenska primena je češća od primene jednom mesečno, kao što je dva puta nedelјno, nedelјno, svake druge nedelјe ili dva puta mesečno.
[0026] U pojedinim primerima izvođenja, intravenska i intratekalna primena se izvode istog dana. U pojedinim primerima izvođenja, intravenska i intratekalna primena se, jedna u odnosu na drugu, ne vrše unutar određenog vremenskog perioda, kao što je ne unutar najmanje 2 dana, unutar najmanje 3 dana, unutar najmanje 4 dana, unutar najmanje 5 dana, unutar najmanje 6 dana, unutar najmanje 7 dana ili unutar najmanje jedne nedelјe. U pojedinim primerima izvođenja, intravenska i intratekalna primena se izvode po naizmeničnom rasporedu, kao što su naizmenična primena svake nedelje, svake druge nedelje, dva puta mesečno ili mesečno. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena zamenjuje intravensku primenu u režimu primene doza, kao što je režim intravenske primene svake nedelje, svake druge nedelјe, dva puta mesečno ili mesečno, pri čemu se svaka treća ili četvrta ili peta primena u takvom režimu doziranja može zameniti sa intratekalnom primenom umesto intravenske primene.
[0027] U pojedinim primerima izvođenja, intravenska i intratekalna primena se vrše sekvencijalno, tako što se najpre izvode intravenske primene (npr. primene doza jedan put nedeljno, svake druge nedelјe, dva puta mesečno ili mesečno, tokom dve nedelјe, mesec dana, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili više) nakon kojih slede IT primene (npr. primene doza jedan put nedeljno, svake druge nedelјe, dva puta mesečno ili mesečno tokom više od dve nedelјe, mesec dana, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili više). U pojedinim primerima izvođenja, najpre se izvode intratekalne primene (npr. primene doza jedan put nedeljno, svake druge nedelјe, dva puta mesečno, mesečno, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca, a tokom dve nedelјe, mesec dana, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili više), nakon čega slede intravenske primene (npr. primene doza jedan put nedeljno, svake druge nedelјe, dva puta mesečno ili mesečno tokom više od dve nedelјe, mesec dana, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili više).
[0028] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena se koristi u odsustvu intravenske primene.
[0029] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena se koristi u odsustvu istovremene imunosupresivne terapije.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0030]
Slika 1 ilustruje primere podataka za koncentracije arilsulfataze A (rhASA) u serumu nakon IV primene.
Slika 2 ilustruje primere podataka za koncentracije rhASA u serumu nakon IT-lumbalne primene.
Slika 3 ilustruje koncentraciju rhASA u CST-u za primer, nakon IV primene.
Slika 4 ilustruje koncentraciju rhASA u CST-u za primer, nakon IT-lumbalne primene.
Slika 5 ilustruje primere analize uticaja pufera i pH na termičku stabilnost rhASA.
Slika 6 ilustruje SDS-PAGE (Coomassie) analizu rhASA za primer, nakon skladištenja od dve nedelјe na 40±2°C.
Slika 7 ilustruje SDS-PAGE (Coomassie) analizu rhASA u IT formulacijama za primer, nakon skladištenja od 3 meseca na 5 i 25°C.
Slika 8 prikazuje izgled rhASA lekovite supstance i lekovitog proizvoda za primer, nakon 48 sati mešanja (Panel A) i protresanja (Panel B).
Slika 9 prikazuje izgled lekovitog rhASA proizvoda za primer (bez P20) sa (n=2) i bez prisustva gasovite faze (n=1) nakon mešanja od 48 sati.
Slika 10 ilustruje podatke za primer koji pokazuju puferski kapacitet rhASA lekovite supstance u poređenju sa kontrolnim puferom prilikom titracije sa hlorovodoničnom kiselinom.
Slika 11 ilustruje podatke za primer koji pokazuju puferski kapacitet rhASA lekovite supstance u poređenju sa kontrolnim puferom prilikom titracije sa 1M natrijum hidroksidom.
Slika 12 prikazuje uzorke rhASA za primer u fiziološkom rastvoru, pH 6,0, koji variraju u koncentraciji.
Slika 13 ilustruje SEC-HPLC analizu rhASA za primer (pH mobilne faze 5,5) u 154 mM NaCl, pH 5,9.
Slika 14 ilustruje SEC-HPLC analizu rhASA za primer (pH mobilne faze 7,0) u 154 mM NaCl, pH 5,9.
Slika 15 ilustruje profile za primer prilikom ekskluzione analize po veličini osnovnog i uzorka stabilnosti nakon 11 meseci, sa rhASA u 154 mM NaCl, pH 5.
Slika 16 prikazuje fotomikrografije tkiva mozga, moždanih ovojnica, infiltrata (iz grupa srednje i visoke doze, oba pola) za primer, nakon tretmana.
Slika 17 prikazuje fotomikrografije tkiva mozga, moždanih ovojnica, infiltrata (iz grupa srednje i visoke doze, oba pola) za primer, nakon tretmana.
Slika 18 prikazuje fotomikrografije tkiva mozga, perivaskularnog prostora, infiltrata (kod mužjaka iz grupe srednje doze; ženki iz grupe visoke doze) za primer, nakon tretmana.
Slika 19 prikazuje bojenje kičmene moždine alkijanski plavim za primer, kod imunolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASA, pokazujući rezultate za primer koji ilustruju smanjenje sulfatida koje je određeno bojenjem cervikalne kičmene moždine sa alkijanskim plavim kod životinja koje su primile intratekalne injekcije rekombinantnog hASA u Danima 1, 8, 15 i 22 i u dozama od 520 mg/kg težine mozga, ili kontrolu sa nosačem. Kao što je pokazano, tretman intratekalno injeciranim rekombinantnim hASA rezultuje u smanjenom nakupljanju u cervikalnoj kičmenoj moždini.
Slika 20 ilustruje primer morfometrijske analize preseka kičmene moždine obojenih alkijanskim plavim, iz imunolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASA, uklјučujući rezultate za primer koji ilustruju optičku gustinu alkijanske plave u ukupnoj kičmenoj moždini (T-kičmena moždina), ukupnoj sivoj masi (T-GM), lumbalnoj sivoj masi (L-GM), cervikalnoj sivoj masi (C-GM), ukupnoj beloj masi (T-WM), lumbalnoj beloj masi (L-WM) i cervikalnoj beloj masi (C-WM) koja je određena morfometrijskom analizom. Kao što je pokazano, uočeno je statistički značajno smanjenje obojenosti alkijanskim plavim kod životinja tretiranih sa rhASA u poređenju sa kontrolom koja je tretirana nosačem.
Slika 21 prikazuje smanjenje LAMP bojenja za primer u beloj masi (fimbriji/forniksu) imunolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASA, prikazujući rezultate za primer koji ilustruju nivo LAMP-1 u fimbriji koji je određen imunohistohemijom. Uvećanje = 20X. Kao što je pokazano, tretman intratekalno ubrizganom rhASA rezultuje u smanjenju LAMP-1 u beloj masi velikog mozga.
Slika 22 ilustruje morfometrijjsku analizu LAMP bojenja mozga za primer, kod imunolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASA, prikazujući rezultate za primer koji ilustruju intenzitet LAMP-1 bojenja u žuljevitom telu (lat. Corpus callosum, CC), fimbriji (F), beloj masi malog mozga (CB-WM) i moždanom stablu (BS) životinja tretiranih sa 20 mg/kg rhASA intravenski, 300 mg/kg (težine mozga) intratekalno primenjenog rhASA, 520 mg/kg (težine mozga) intravenski primenjenog rhASA ili sa kontrolom sa nosačem.
Slika 23 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktiranim uzorcima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene kontrolne doze sa nosačem svake druge nedelje tokom 6 meseci – glavna nekropsija.
Slika 24 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze rhASA od 1,8 mg/dozi, svake druge nedelje tokom 6 meseci – glavna nekropsija.
Slika 25 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze rhASA od 6,0 mg/dozi, svake druge nedelje tokom 6 meseci – glavna nekropsija.
Slika 26 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze rhASA od 18,6 mg/dozi, svake druge nedelje tokom 6 meseci – glavna nekropsija.
Slika 27 ilustruje koncentraciju ASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze PBS-a (kontrole) svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka.
Slika 28 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene kontrolne doze sa nosačem svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka.
Slika 29 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze rhASA od 1,8 mg/dozi svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka
Slika 30 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze rhASA od 6,0 mg/dozi svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka
Slika 31 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u punktatima mozga juvenilinih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze rhASA od 18,6 mg/dozi svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka
Slika 32 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u odabranim punktiranim uzorcima sa površine mozga iz životinja koje su predstavljale kontrole za uređaj i onih koje su tretirane sa nosačem i sa 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg rhASA. (mužjaci i ženke posebno, podaci za kontrolu sa uređajem su sa nekropsije nakon oporavka, svi ostali podaci su sa glavne nekropsije).
Slika 33 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u odabranim punktiranim uzorcima duboke bele mase mozga kod životinja koje su kontrole za uređaj i onih koje su tretirane sa nosačem i sa 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg rhASA. (mužjaci i ženke posebno, podaci za kontrolu sa uređajem su sa nekropsije nakon oporavka, svi ostali podaci su sa glavne nekropsije).
Slika 34 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u odabranim punktiranim uzorcima duboke sive mase mozga kod životinja koje su kontrole za uređaj i onih koje su tretirane sa nosačem i sa 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg rhASA. (mužjaci i ženke posebno, podaci za kontrolu sa uređajem su sa nekropsije nakon oporavka, svi ostali podaci su sa glavne nekropsije).
Slika 35 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u odabranim punktiranim uzorcima raznih regiona kod životinja koje su kontrole za uređaj i onih koje su tretirane sa nosačem i sa 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg rhASA. (kombinovani mužjaci i ženke, podaci za kontrolu sa uređajem su sa nekropsije nakon oporavka, svi ostali podaci su sa glavne nekropsije).
Slika 36 ilustruje koncentraciju rhASA za primer sa preseka kičmene moždine juvenilnih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka.
Slika 37 ilustruje koncentraciju rhASA za primer u jetri juvenilnih cinomolgus majmuna nakon IT primene doze svake druge nedelje tokom 6 meseci – nekropsija nakon oporavka.
Slika 38 prikazuje anatomske lokacije određenih punktata mozga za primer.
Slika 39 prikazuje anatomske lokacije određenih punktata mozga za primer.
Slika 40 prikazuje anatomske lokacije određenih punktata mozga za primer.
Slika 41 prikazuje anatomske lokacije određenih punktata mozga za primer.
Slika 42 prikazuje anatomske lokacije određenih punktata mozga za primer.
Slika 43 prikazuje anatomske lokacije određenih punktata mozga za primer.
Slika 44A - G ilustruje koncentraciju rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA) za primer, u ekstraktima tkivnih punktata iz tkiva mozga odraslih i juvenilnih cinomolgus majmuna kojima su primenjeni bilo nosač, 1,8 mg rhASA ili 18,6 mg rhASA. Svaka od Slika 44A-G odgovara regionu tkiva mozga koji je prikazan na Slici 39.
Slike 45A i B ilustruju poređenje koncentracija rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA) za primer, a koje su detektovane u dubokoj beloj masi (Slika 45A) ili u dubokoj sivoj masi (Slika 45B) tkiva mozga odraslih i juvenilnih cinomolgus majmuna kojima je intratekalno (IT) ili intracerebroventrikularno (ICV) primenjen rhASA.
Slika 46A prikazuje koncentracije rhASA koje su detektovane u nekoliko punktranih uzoraka tkiva dobijenih iz juvenilnih (starosti <12 meseci) cinomolgus majmuna kojima je IT primenjena doza od 18,6 ili 1,8 mg rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA). Kao što je prikazano na obe Slike 40A-B, koncentracija rhASA koja je isporučena u tkivo je bila unutar, ili je na neki drugi način premašila, cilјnu terapijsku koncentraciju proteina od 2,5 mg/mg. Anatomski regioni tkiva mozga koji odgovaraju svakom broju punktata prikazanom na Slici 46A i Slici 46B su: subkortikalna bela masa (1); periventrikularna bela masa i duboka bela masa (2); subkortikalna bela masa (3); subkortikalna bela masa (4); interna kapsula (5); interna kapsula kaudalnog jedra (6); duboka bela masa (7); subkortikalna bela masa i kora velikog mozga (8); putamen (9); temporalna subkortikalna bela masa i kora velikog mozga (10), duboka siva masa (11), duboka siva masa (12), frontalni periventrikularni i subkortikalni region (13); subkortikalna bela masa, površinska perifalksijalna kora velikog mozga (14); žuljevito telo i perikalozalna subkortikalna bela masa (15); duboka subkortikalna bela masa (16); duboka siva masa (17); duboka siva masa (18); periventrikularna bela masa (19); duboka subkortikalna bela masa (20); hipokampus (21); žuljevito telo (22); duboka bela masa (23); subkortikalna bela masa, okcipitalni režanj (24); i bela masa malog mozga(25).
Slika 47A ilustruje region tkiva duboke bele mase koje je izolovan iz cinomolgus majmuna nakon IT primene 1,8 mg rhASA. Slika 47B ilustruje imunobojenje tkiva duboke bele mase koje ukazuje na distribuciju rhASA u relevantnim ćelijama. Slika 47C ilustruje da je rhASA koji je IT primenjen kolokalizovan u organelama tkiva duboke bele mase cinomolgus majmuna, a posebno u lizozomima. Na levom gornjem panelu Slike 47C je ilustrovano imunbojenje ASA.
Slika 48 upoređuje distribuciju arilsulfataze A (rhASA) obeležene sa J<124>koja je dobijena upotrebom PET skeniranja, 24 sata bilo nakon IT- ili ICV-primene tako obeleženog rhASA cinomolgus majmunu.
Slika 49 ilustruje distribuciju ASA obeležene sa J<124>odmah nakon ICV primene cinomolgus majmunu i upoređuje distribuciju IT primenjenog ASA obeleženog sa J<124>tokom perioda od 2-5 sati. Kao što je pokazano, IT primena je dovela do isporuke ASA obeleženog sa J<124>u isti inicijalni odeljak (komore i proksimalnu kičmu) kao što je to pokazano za ICV primenu.
Slika 50 prikazuje primere ICV i IT primene u mišijem modelu.
Slika 51 prikazuje uređaj za intratekalnu isporuku lekova (IDDD od engl. intrathecal drug delivery device) za primer.
Slika 52 prikazuje PORT-A-CATH® pristupni sistem za intratekalnu implantaciju niskog profila za primer.
Slika 53 prikazuje uređaj za intratekalnu isporuku lekova (IDDD) za primer.
Slika 54 prikazuje uređaj za intratekalnu isporuku lekova (IDDD) za primer, koji omogućava kućnu primenu terapije zamene enzima (ERT) u CNS.
Slika 55 ilustruje i dijagram uređaja za primer, za intratekalnu isporuku lekova (IDDD) sa siguronosnim mehanizmom.
Slika 56 prikazuje primere lokacija unutar organizma pacijenta gde može biti postavljen IDDD; Slika 56B prikazuje razne komponente uređaja za intratekalnu isporuku lekova (IDDD); a Slika 56C prikazuje primere mesta insercije u telo pacijenta za IT-lumbalno injeciranje.
DEFINICIJE
[0031] Da bi predmetni pronalazak bio lakši za razumevanje, u nastavku teksta su najpre definisani određeni pojmovi. Dodatne definicije za termine koji slede i druge termine su navedene kroz samu specifikaciju.
Približno ili oko: Kako se ovde upotrebljava, izraz "približno" ili "oko", kada se upotrebljava za jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim primerima izvođenja, termin "približno" ili "oko" se odnosi na opseg vrednosti koji poptada unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje u bilo kom pravcu (većem ili manjem) od navedene referentne vrednosti, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili drugačije jasno iz konteksta (osim u slučaju kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
Poboljšanje: Kako se ovde upotrebljava, termin "pobolјšanje" označava prevenciju, smanjenje ili ublažavanje stanja ili pobolјšanje stanja subjekta. Poboljšanje obuhvata, ali ne zahteva, potpuni oporavak ili potpunu prevenciju bolesnog stanja. U pojedinim primerima izvođenja, poboljšanje obuhvata povećanje nivoa relevantnog proteina ili njegove aktivnosti koja je deficijentna u relevantnim obolelim tkivima.
Biološki aktivan: Kako se ovde upotrebljava, izraz "biološki aktivan" se odnosi na karakteristiku bilo kog agensa koji je sa aktivnošću u biološkom sistemu, a naročito u organizmu. Na primer, agens koji, kada se primeni organizmu, ima biološki efekat na taj organizam, smatra se biološki aktivnim. U konkretnim primerima izvođenja, kada je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koga karakteriše najmanje jedna biološku aktivnost proteina ili polipeptida, označava se obično kao "biološki aktivan" deo.
Agens za povećanje mase: Kako se ovde upotrebljava, termin "agens za povećanje mase" se odnosi na jedinjenje koje dodaje masu liofilizovanoj smeši i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovanog kolača (npr. olakšava proizvodnju suštinski uniformnog liofilizovanog kolača koji zadržava strukturu sa otvorenim porama). Primeri agensa za povećanje mase uklјučuju manitol, glicin, natrijum hlorid, hidroksietil skrob, laktozu, saharozu, trehalozu, polietilen glikol i dekstran.
Receptor manoza-6-fosfata nezavisan od katjona (CI-MPR): Kako se ovde upotrebljava, termin "receptor manoza-6-fosfata nezavisan od katjona (CI-MPR)" se odnosi na ćelijski receptor koji vezuje obleživače tipa manoze-6-fosfata (M6P) na prekursore kisele hidrolaze u Goldžijevom aparatu, a koji su time predodređeni za transport do lizozoma. Pored manoza-6-fosfata, CI-MPR takođe vezuje ostale proteine, uklјučujući IGF-II. CI-MPR je takođe poznat kao „receptor za M6P/IGF-II”, „receptor za CI-MPR/IGF-II”, „receptor za IGF-II” ili „receptor za IGF2”. Navedeni termini i njihove skraćenice se ovde upotreblјavaju naizmenično.
Istovremena imunosupresivna terapija: Kako se ovde upotrebljava, termin "istovremena imunosupresivna terapija" uklјučuje bilo koju imunosupresivnu terapiju koja se upotrebljava kao pretretman, za prekondicioniranje ili paralelno sa postupkom lečenja.
Razblaživač: Kako se ovde upotrebljava, termin "razblaživač" se odnosi na farmaceutski prihvatlјivu (npr. bezbednu i netoksičnu za primenu čoveku) supstancu za razblaživanje koja je korisna za pripremu rekonstituisane formulacije. Razblaživači za primer obuhvataju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferisan rastvor (npr. fosfatom puferisan fiziološki rastvor), sterilan fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.
Dozni oblik: Kako se ovde upotrebljava, termini "dozni oblik" i "jedinični dozni oblik" se odnose na fizički diskretnu jedinicu terapijskog proteina za pacijenta koji će biti tretiran. Svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog materijala koja je izračunata tako da se proizvede želјeni terapijski efekat. Podrazumeva se, međutim, da će o ukupnoj dozi kompozicije odlučiti ordinirajući lekar, uzimajući u obzir praksu zdrave medicinske procene.
Terapija zamene enzima (ERT): Kako se ovde upotrebljava, termin "terapija zamene enzima (ERT)" se odnosi na bilo koju terapijsku strategiju koja koriguje enzimsku deficijenciju obezbeđivanjem enzima koji nedostaje. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji nedostaje se obezbeđuje intratekalnom primenom. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji nedostaje se obezbeđuje infuzijom u krvotok. Jednom primenjen, enzim se preuzima od strane ćelija i transportuje u lizozom, gde enzim deluje na eliminaciju materijala koji se nakupio u lizozomima usled deficijencije enzima. Da bi terapija zamene lizozomskih enzima bila efektivna, terapijski enzim se obično isporučuje lizozomima odgovarajućih ćelija u ciljnim tkivima u kojima se ispoljava defekt u skladištenju.
Pobolјšati, povećati ili smanjiti: Kako se ovde upotrebljava, termini "pobolјšati", "povećati" ili "smanjiti" ili gramatički ekvivalenti, ukazuju na vrednosti koje su relativne u odnosu na osnovno merenje, kao što je merenje kod iste individue pre započinjanja tretmana koji je ovde opisan, ili merenje u kontrolnoj individui (ili više kontrolnih jedinki) u odsustvu tretmana koji je ovde opisan. "Kontrolna individua" je individua koji boluje od istog oblika bolesti lizozomskog skladištenja kao i individua koji se leči i koja je otprilike iste starosti kao individua koja se leči (da bi se osiguralo da je stadijum oboljenja kod lečene individue i kontrolne individue/individua uporediv).
Individua, subjekat, pacijent: Kako se ovde upotrebljava, pojmovi "subjekat", "individua" ili "pacijent" se odnose na lјude ili sisarske subjekte različite od čoveka. Individua (koji se takođe označava kao „pacijent“ ili „subjekat“) koja se leči je individua (fetus, novorođenče, dete, adolescent ili odrasli čovek) koja boluje od oboljenja.
Intratekalna primena: Kako se ovde upotrebljava, termin "intratekalna primena" ili "intratekalna injekcija" se odnosi na injekciju u kanal kičme (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu). Razne tehnike mogu biti upotrebljene, uklјučujući, bez ograničenja, lateralno cerebroventrikularno injeciranje kroz probušeni otvor ili pak punkciju u komore ili lumbalno ili slično. U pojedinim primerima izvođenja, "intratekalna primena" ili "intratekalna isporuka" prema predmetnom pronalasku se odnosi na IT primenu ili isporuku preko lumbalnog područja ili regiona, tj. lumbalnu IT primenu ili isporuku. Kako se ovde upotrebljava, termin "lumbalni region" ili "lumablno zona" se odnosi na područje između trećeg i četvrtog lumbalnog pršljena (pršljena donjeg dela leđa) i, još preciznije, L2-S1 regiona kičme.
Linker: Kako se ovde upotrebljava, termin "linker" se odnosi na aminokiselinsku sekvencu u fuzionom proteinu koja je drugačija od one koja se javlja na određenoj poziciji u prirodnom proteinu i u principu je osmišljena tako da bude fleksibilna ili da se umetne u strukturu poput a-heliksa, između dva proteinska ostatka. Linker se takođe označava i kao spejser.
Lioprotektant: Kako se ovde upotrebljava, termin "lioprotektant" se odnosi na molekul koji sprečava ili smanjuje hemijsku i/ili fizičku nestabilnost proteina ili druge supstance nakon liofilizacije i naknadnog skladištenja. Primeri lioprotektanta uklјučuju šećere poput saharoze ili trehaloze; aminokiselinu kao što je mononatrijum glutamat ili histidin; metilamin kao što je betain; liotropnu so, kao što je magnezijum sulfat: poliol kao što su trihidrični ili viši šećerni alkoholi, npr. glicerin, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen glikol; polietilen glikol; Pluronici; i njihove kombinacije. U pojedinim primerima izvođenja, lioprotektant je neredukujući šećer kao što je trehaloza ili saharoza.
Lizozomski enzim: Kako se ovde upotrebljava, termin "lizozomski enzim" se odnosi na bilo koji enzim koji je sposoban da smanji nakupljene materijale u lizozomima sisara ili koji može zaustaviti ili pobolјšati jedan ili više simptoma bolesti lizozomskog skladištenja. Lizozomski enzimi koji su pogodni za pronalazak uklјučuju i lizozomske enzime divljeg tipa ili modifikovane lizozomske enzime, a isti mogu biti proizvedeni rekombinantnim i sintetskim postupcima ili prečišćavanjem iz prirodnih izvora. Lizozomski enzimi za primer su navedeni u Tabeli 1.
Deficijencija lizozomskih enzima: Kako se ovde upotrebljava, "deficijencija lizozomskih enzima" se odnosi na grupu genetičkih poremećaja koji su posledica nedostatka (deficijencije) najmanje jednog od enzima koji su potrebni za razlaganje makromolekula (npr. podsupstarta enzima) do peptida, aminokiselina, monosaharida, nukleinskih kiselina i masnih kiselina u lizozomima. Kao rezultat, osobe koje boljuju od lizozomskih enzimskih deficijencija akumuliraju materijale u raznim tkivima (npr. u CNS-u, jetri, slezini, crevima, zidovima krvnih sudova i drugim organima).
Bolest lizozomskog skladištenja: Kako se ovde upotrebljava, termin "bolest lizozomskog skladištenja" se odnosi na bilo koju bolest koja je posledica deficijencije jednog ili više lizozomskih enzima koji su neophodni za metabolisanje prirodnih makromolekula. Ovakve bolesti obično rezultuju nakuplјanjem nerazgrađenih molekula u lizozomima, što dovodi do povećanja broja granula za skladištenje (takođe označenih kao vezikule za skladištenje). Navedene bolesti i razni primeri su detalјnije opisani u tekstu koji sledi.
Polipeptid: Kako se ovde upotrebljava, "polipeptid" je, generalno posmatrano, niz od najmanje dve aminokiseline koje su povezane jedna sa drugom peptidnom vezom. U pojedinim primerima izvođenja, polipeptid može uključivati najmanje 3-5 aminokiselina, od kojih je svaka vezana za druge putem najmanje jedne peptidne veze. Stručnjacima iz oblasti tehnike će biti jasno da polipeptidi ponekad uklјučuju „neprirodne“ aminokiseline ili druge entitete koje su ipak sposobni da se integrišu u polipeptidni lanac, po izboru.
Enzim koji se zamenjuje: Kako se ovde upotrebljava, termin "enzim koji se zamenjuje" se odnosi na bilo koji enzim koji može delovati tako da zameni, barem delimično, deficijentan ili enzim koji nedostaje u oboljenju koja se leči. U pojedinim primerima izvođenja, termin "enzim koji se zamenjuje" se odnosi na bilo koji enzim koji može delovati tako da zameni, barem delimično, deficijentan ili lizozomski enzim koji nedostaje u bolesti lizozomskog skladištenja koja će se lečiti. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje je sposoban da smanji akumulirane materijale u lizozomima sisara ili može zaustaviti ili pobolјšati jedan ili više simptoma bolesti lizozomskog skladištenja. Enzimi koji se zamenjuju koji su pogodni za pronalazak uklјučuju i lizozomske enzime divlјeg tipa ili modifikovane lizozomske enzime, a mogu biti proizvedeni upotrebom rekombinantnih i sintetskih postupaka ili prečišćeni iz prirodnih izvora. Enzim koji se zamenjuje može biti rekombinantan, sintetski, genski aktiviran ili prirodni enzim.
Rastvorlјivo: Kako se ovde upotrebljava, termin "rastvorlјiv" se odnosi na sposobnost terapijskog agensa da obrazuje homogeni rastvor. U pojedinim primerima izvođenja, rastvorlјivost terapijskog agensa u rastvoru u kome se primenjuje i putem koga se transportuje do ciljnog mesta delovanja (npr. ćelija i tkiva mozga) je dovolјna da omogući isporuku terapijski efektivne količine terapijskog agensa do ciljnog mesta dejstva. Nekoliko faktora može uticati na rastvorlјivost terapijskih agenasa. Na primer, relevantni faktori koji mogu uticati na rastvorlјivost proteina uklјučuju jonsku snagu, aminokiselinsku sekvencu i prisustvo drugih ko-solubilizujućih agenasa ili soli (npr. kalcijumovih soli). U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije su formulisane tako da su kalcijumove soli isklјučene iz takvih kompozicija. Terapijski agens u skladu sa predmetnim pronalaskom je rastvorlјiv u njegovoj odgovarajućoj farmaceutskoj kompoziciji. Potrebno je napomenuti da, iako su izotonični rastvori generalno poželјniji za lekove koji se parenteralno primenjuju, upotreba izotoničnih rastvora može ograničiti adekvatnu rastvorlјivost za neke terapijske agense i naročito za neke proteine i/ili enzime. Pokazano je tako da se blago hipertonični rastvori (npr. do 175 mM natrijum hlorid u 5 mM natrijum fosfatu na pH 7,0) i rastvori koji sadrže šećer (npr. do 2% saharoze u 5 mM natrijum fosfatu na pH 7,0) dobro podnose kod majmuna. Na primer, najčešće upotrebljavana odobrena kompozicija bolusne formulacije za CNS je fiziološki rastvor (150 mM NaCl u vodi).
Stabilnost: Kako se ovde upotrebljava, termin "stabilan" se odnosi na sposobnost terapijskog agensa (npr. rekombinantnog enzima) da održi svoju terapijsku efikasnost (npr. svu ili većinu od svojih predviđenih bioloških aktivnosti i/ili od fizikohemijskog integriteta) tokom dužih perioda vremena. Stabilnost terapijskog agensa i sposobnost farmaceutske kompozicije da održi stabilnost takvog terapijskog agensa može biti ispitivana tokom dužeg vremenskog perioda (npr. nakon najmanje 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili više). U principu, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane su formulisane tako da su sposobne da stabilizuju ili, alternativno, usporavaju ili sprečavaju razgradnju jednog ili više terapijskih agensa koji su sa njima formulisani (npr. rekombinantnih proteina). U kontekstu formulacije, stabilna formulacija je ona u kojoj terapijski agens koga ona sadrži suštinski zadržava svoj fizički i/ili hemijski integritet i svoju biološku aktivnost nakon skladištenja i prilikom izlaganju procesima (kao što su zamrzavanje/odmrzavanje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Stabilnost proteina može biti izmerena putem stope obrazovanja agregata visoke molekulske težine (HMW), gubitkom aktivnosti enzima, stvaranjem fragmenata peptida i promenom profila naelektrisanja.
Subjekat: Kako se ovde upotrebljava, termin "subjekat" označava bilo kog sisara, uklјučujući čoveka. U određenim primerima izvođenja, subjekat je odrasla osoba, adolescent ili novorođenče. Takođe se razmatra primena farmaceutskih kompozicija i/ili izvođenje postupaka lečenja in utero.
Značajna homologija: Fraza "značajna homologija" se ovde upotrebljava da označi poređenje između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što bi stručnjaci iz oblasti tehnike i procenili, dve sekvence u principu smatraju „značajno homolognim“ ukoliko sadrže homologne ostatke na odgovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu biti ostaci koji nisu identični i koji će biti odgovarajuće sličnih strukturnih i/ili funkcionalnih karakteristika. Na primer, kao što je dobro poznato onima sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike, određene aminokiseline su uobično klasifikovane kao „hidrofobne“ ili „hidrofilne“ aminokiseline i/ili kao one koje poseduju „polarne“ ili „nepolarne“ bočne lance Supstitucija jedne aminokiseline drugom istog tipa se često može smatrati „homolognom“ supstitucijom.
Kao što je dobro poznato u ovoj oblasti tehnike, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu biti upoređene upotrebom bilo kog od raznih algoritama, uklјučujući one koji su dostupni u vidu komercijalnih kompjuterskih programa kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST za praznine (engl. gapped) i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa su opisani u publikacijama Altschul i saradnici, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul i saradnici, Methods in Enzymology; Altschul i saradnici, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.
25:3389-3402, 1997; Baxevanis i saradnici, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; i Misener i saradnici, (izd.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Pored identifikacije homolognih sekvenci, prethodno navedeni programi obično obezbede i stepen homologije. U pojedinim primerima izvođenja, dve sekvence se smatraju suštinski homolognim ukoliko je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više odgovarajućih ostataka homologno duž relevantnog niza ostataka. U pojedinim primerima izvođenja, relevantan niz je potpuna sekvenca. U pojedinim primerima izvođenja, relevantan niz čini najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili više ostataka.
Značajan identitet: Fraza "značajan identitet" se ovde upotrebljava da označi poređenje između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što bi stručnjaci iz oblasti tehnike i procenili, dve sekvence se smatraju u principu „suštinski identičnim“ ukoliko sadrže identične ostatke na odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u ovoj oblasti tehnike, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu biti utvređene upotrebom bilo kog od raznih algoritama, uklјučujući one koji su dostupni u vidu komercijalnih kompjuterskih programa kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST za praznine (engl. gapped) i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa su opisani u publikacijama Altschul i saradnici, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul i saradnici, Methods in Enzymology; Baxevanis i saradnici, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; i Misener i saradnici, (izd.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Pored identifikacije identičnih sekvenci, prethodno navedeni programi obično obezbeđuju i stepen identiteta. U pojedinim primerima izvođenja, dve sekvence se smatraju suštinski identičnim ukoliko je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više odgovarajućih ostataka duž relevantnog niza ostataka identično. U pojedinim primerima izvođenja, relevantan niz je potpuna sekvenca. U pojedinim primerima izvođenja, relevantan niz čini najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili više ostataka.
Sintetska CST: Kako se ovde upotrebljava, termin "sintetska CST" se odnosi na rastvor koji je sa pH, sastavom elektrolita, sadržajem glukoze i osmalarnošću koje su konzistetne sa istima u cerebrospinalnoj tečnosti. Sintetska CST se označava i kao veštačka CST. U pojedinim primerima izvođenja, sintetska CST je Eliotov B rastvor.
Pogodan za isporuku u CNS: Kako se ovde upotrebljava, izraz "pogodan za primenu u CNS" ili "pogodan za intratekalnu isporuku", kada se odnosi na farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, u principu se odnosi na karakteristike stabilnosti, podnošlјivosti i rastvorlјivosti takvih kompozicija, kao i na sposobnost takvih kompozicija da isporuče efektivnu količinu terapijskog agensa koja se u njima nalazi na cilјno mesto isporuke (npr. u CST ili mozak).
Cilјna tkiva: Kako se ovde upotrebljava, termin "cilјna tkiva" se odnosi na svako tkivo koje je zahvaćeno bolešću lizozomskog skladištenja koja će se lečiti ili na bilo koje tkivo u kome se normalno eksprimira deficijentan lizozomski enzim. U pojedinim primerima izvođenja, cilјna tkiva uklјučuju ona tkiva u kojima postoji detektabilna ili abnormalno velika količina enzimskog supstrata, na primer uskladištena u ćelijskim lizozomima tkiva, kod pacijenata koji boluju ili su podložni bolesti lizozomskog skladištenja. U pojedinim primerima izvođenja, cilјna tkiva uklјučuje ona tkiva koja ispoljavaju patologiju, simptom ili karakteristiku povezanu sa bolešću. U pojedinim primerima izvođenja, cilјna tkiva uklјučuje ona tkiva u kojima se deficijentan lizozomski enzim normalno eksprimira sa povišenim nivoom. Kako se ovde upotrebljava, cilјno tkivo može biti cilјno tkivo mozga, cilјno tkivo kičmene moždine i/ili periferno cilјno tkivo. Cilјna tkiva za primer su detalјno opisana u nastavku teksta.
Terapijska struktura: Kako se ovde upotrebljava, termin "terapijska struktura" se odnosi na deo molekula koji obezbeđuje terapijski efekat molekula. U pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura je polipeptid sa terapijskom aktivnošću.
Terapijski efektivna količina: Kako se ovde upotrebljava, termin "terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu terapijskog proteina (npr. enzima koji se zamenjuje) koja obezbeđuje terapijski efekat tretiranom subjektu, uz prihvatlјiv odnos koristi i rizika koji se može primeniti na bilo koji medicinski tretman. Terapijski efekat može biti objektivan (tj. merlјiv nekim testom ili markerom) ili subjekativan (tj. subjekat daje indikaciju ili oseća efekat). Preciznije, "terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu terapijskog proteina ili kompozicije koja je efektivna za lečenje, ublažavanje ili sprečavanje želјenog oboljenja ili stanja ili za ispolјavanje detektabilnog terapijskog ili preventivnog dejstva, poput ublažavanja simptoma povezanih sa bolešću, sprečavanja ili odlaganja početka oboljenja i/ili takođe smanjenja ozbiljnosti ili učestalosti simptoma oboljenja. Terapijski efektivna količina se obično primenjuje u režimu doziranja koji može sadržavati više jediničnih doza. Za bilo koji određeni terapijski protein, terapijski efektivna količina (i/ili odgovarajuća jedinična doza u okviru efektivnog režima doziranja) može varirati, na primer, u zavisnosti od načina primene, kombinacije sa drugim farmaceutskim agensima. Takođe, specifična terapijski efektivna količina (i/ili jedinična doza) za bilo kog određenog pacijenta može zavisiti od niza faktora, uklјučujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost kliničke slike poremećaja; aktivnost specifičnog farmaceutskog agensa koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi; starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, način primene i/ili brzinu izlučivanja ili metabolizma specifičnog fuzionog proteina koji se koristi; trajanje tretmana; i slične faktore, kao što je dobro poznato u oblasti medicine.
Podnošlјivo: Kako se ovde upotrebljava, termini "podnošlјiv" i "podnošlјivost" se odnose na sposobnost farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska da ne izaziva neželјene reakcije kod subjekata kome se primenjuje ovakva kompozicija ili, alternativno, da ne izazovaju ozbilјnu neželјenu reakciju kod subjekata kome se ovakva kompozicija primenjuje. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska se dobro podnose od strane subjekta kome se takve kompozicije primenjuju.
Lečenje: Kako se ovde upotrebljava, termin "lečenje" (takođe "leči" ili "lečiti") se odnosi na bilo koju primenu terapijskog proteina (npr. lizozomskog enzima) koji delimično ili potpuno ublažava, pobolјšava, olakšava, inhibira, odlaže početak, smanjuje ozbilјnost i/ili smanjuje učestalost jednog ili više simptoma ili karakteristika određenog oboljenja, poremećaja i/ili stanja (npr. Hanterovog sindroma, Sanfilipo B sindroma). Takvo lečenje može biti za subjekta koji ne ispoljava znakove odgovarajuće bolesti, poremećaja i/ili stanja i/ili za subjekta koji ispoljava samo rane znake oboljenja, poremećaja i/ili stanja. Alternativno ili dodatno, takav tretman može biti tretman subjekta koji ispoljava jedan ili više utvrđenih znakova relevantnog oboljenja, poremećaja i/ili stanja.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0032] Predmetni pronalazak obezbeđuje, između ostalog, pobolјšane postupke i kompozicije za efektivnu direktnu isporuku terapijskog agensa u centralni nervni sistem (CNS). Kao što je prethodno razmatrano, predmetni pronalazak je zasnovan na neočekivanom otkriću da se ASA protein za lečenje metahromatske leukodistrofijske bolesti može direktno uvesti u cerebrospinalnu tečnost (CST) subjekata kome je lečenje potrebno, u visokoj koncentraciji, bez izazivanja značajnih štetnih efekata kod subjekta. Što je još više iznenađujuće, predmetni pronalazači su otkrili da enzim koji se zamenjuje može biti isporučen u jednostavnoj formulaciji na bazi fiziološkog rastvora ili pufera, bez upotrebe sintetske CST. Još neočekivanije, intratekalna isporuka u skladu sa predmetnim pronalaskom ne rezultuje značajnim štetnim efektima kod subjekata, kao što je jak imuni odgovor. Stoga, u pojedinim primerima izvođenja, intratekalno isporuka prema predmetnom pronalasku može biti upotrebljena u odsustvu istovremene imunosupresivne terapije (npr. bez indukcije imune tolerancije sa pretretmanom ili predkondicioniranjem).
[0033] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna isporuka prema predmetnom pronalasku omogućava efikasnu difuziju kroz razna tkiva mozga, što rezultuje efiaksnom isporukom enzima koji se zamenjuje u razna tkiva mozga u okviru površinskih, plitkih i/ili dubokih moždanih struktura. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna isporuka prema predmetnom pronalasku rezultuje dovolјnom količinom enzima koji se zamenjuje, a koji ulazi u perifernu cirkulaciju. Rezultat navedenog je da, u pojedinim slučajevima, intratekalna isporuka prema predmetnom pronalasku rezultuje isporukom enzima koji se zamenjuje u periferna tkiva, kao što su jetra, srce, slezina i bubreg. Ovo otkriće je neočekivano i može biti posebno korisno za lečenje bolesti lizozomskog skladištenja koja podrazumeva i CNS i periferne komponente i za koje je obično bila potrebna i redovna intratekalna primena i intravenska primena. Zamišlјeno je da intratekalna isporuka prema predmetnom pronalasku može omogućiti smanjenje doziranja i/ili učestalost iv injekcija bez narušavanja terapijskih efekata u lečenju perifernih simptoma.
[0034] Predmetni pronalazak obezbeđuje razne neočekivane i korisne osobine koje omogućavaju efikasnu i pogodnu isporuku enzima koji se zamenjuju u razna cilјna tkiva mozga, što rezultuje efektivnim lečenjem bolesti lizozomskog skladištenja sa CNS indikacijama.
[0035] Razni aspekti predmetnog pronalaska su detalјno opisani u odelјcima koji slede. Nije predviđeno da upotreba navedenih odeljaka ograničava pronalazak. Svaki odelјak može biti primenjen na bilo koji aspekt predmetnog pronalaska. U ovoj prijavi, upotreba "ili" označava "i/ili", ukoliko nije drugačije navedeno.
Terapijski proteini
[0036] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije koje su obezbeđene predmetnim pronalaskom se koriste za isporuku proteina arilsulfataze A (ASA) u CNS radi lečenja metahromatske leukodistrofijske bolesti. Pogodan ASA protein može biti bilo koji molekul ili deo molekula koji može zameniti aktivnost proteina arilsulfataze A (ASA) koji se javlja u prirodi ili koji može zaustaviti jedan ili više fenotipova ili simptoma koji su povezani sa deficijencijom ASA. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje pogodan za pronalazak predstavlja polipeptid sa N-krajem i C-krajem i aminokiselinskom sekvencom koja je suštinski slična ili identična zrelom humanom ASA proteinu.
[0037] Obično se humani ASA proizvodi kao prekursorski molekul čijom se obradom dobija zreli oblik. Ovakav proces se obično odvija uklanjanjem signalnog peptida od 18 aminokiselina. Uobičajeno je da se prekursorski oblik takođe označava kao prekursor pune dužine ili ASA protein pune dužine koji sadrži 507 aminokiselina. Cepanje 18 aminokiselina sa N-kraja rezultuje zrelim oblikom koji je dužine 489 aminokiselina. Stoga, podrazumeva se da 18 aminokiselina sa N-kraja generalno nisu potrebne za aktivnost ASA proteina. Aminokiselinske sekvence zrelog oblika (SEQ ID NO: 1) i prekursora pune dužine (SEQ ID NO: 2) uobičajenog humanog ASA proteina divljeg tipa ili onog koji se javlja u prirodi su prikazane u Tabeli 1.
Tabela 1. Humana arilsulfataza A
[0038] Shodno navedenom, u pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura pogodna za predmetni pronalazak je zreli humani ASA protein (SEQ ID NO: 1). U pojedinim primerima izvođenja, pogodna terapijska struktura može biti homolog ili analog zrelog humanog ASA proteina. Na primer, homolog ili analog zrelog humanog ASA proteina može biti modifikovan zreli humani ASA protein koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercija u poređenju sa ASA proteinom divljeg tipa ili onim koji se javlja u prirodi (npr. SEQ ID NO: 1), uz zadržavanje značajne aktivnosti ASA proteina. Stoga, u pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura pogodna za predmetni pronalazak je suštinski homologna zrelom humanom ASA proteinu (SEQ ID NO: 1). U pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura pogodna za predmetni pronalazak je sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologna SEQ ID NO: 1. U pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura pogodna za predmetni pronalazak je suštinski identična zrelom humanom ASA proteinu (SEQ ID NO: 1). U pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura pogodna za predmetni pronalazak je sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična SEQ ID NO: 1. U pojedinim primerima izvođenja, terapijska struktura pogodna za predmetni pronalazak sadrži fragment ili deo zrelog humanog ASA proteina.
[0039] Alternativno, enzim koji se zamenjuje pogodan za predmetni pronalazak je ASA protein pune dužine. U pojedinim primerima izvođenja, pogodan enzim koji se zamenjuje može biti homolog ili analog ASA proteina pune dužine. Na primer, homolog ili analog humanog ASA proteina pune dužine može biti modifikovan humani ASA protein pune dužine koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercija u poređenju sa ASA proteinom pune dužine divlјeg tipa ili onoga koji se javlja u prirodi (npr. SEQ ID NO: 2), uz zadržavanje značajne aktivnosti ASA proteina. Stoga, U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje koji je pogodan za predmetni pronalazak je suštinski homolog humanom ASA proteinu pune dužine (SEQ ID NO: 2). U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje koji je pogodan za predmetni pronalazak sadrži sekvencu aminokiselina koja je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologna SEQ ID NO: 2. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje koji je pogodan za predmetni pronalazak je suštinski identičan SEQ ID NO: 2. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje koji je pogodan za predmetni pronalazak je sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa SEQ ID NO: 2. U pojedinim primerima izvođenja, enzim koji se zamenjuje koji je pogodan za predmetni pronalazak sadrži fragment ili deo humanog ASA proteina pune dužine. Kao što se ovde upotrebljava, ASA protein pune dužine obično sadrži signalnu peptidnu sekvencu.
[0040] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein uključuje strukturu sa ciljanim dejstvom (npr. sekvencu koja ciljano deluje na lizozome) i/ili peptid koji prodire kroz membranu. U pojedinim primerima izvođenja, sekvenca sa ciljanim dejstvom i/ili peptid koji prodire kroz membranu su sastavni deo terapijske strukture (npr. putem hemijske veze, fuzionog proteina). U pojedinim primerima izvođenja, sekvenca sa ciljanim dejstvom sadrži manoza-6-fosfatni ostatak. U pojedinim primerima izvođenja, sekvenca sa ciljanim dejstvom sadrži IGF-I ostatak. U pojedinim primerima izvođenja, sekvenca sa ciljanim dejstvom sadrži IGF-II ostatak.
Formulacije
[0041] Vodene farmaceutske rastvore i kompozicije (tj. formulacije) koje se tradicionalno upotrebljavaju za isporuku terapijskih agenasa u CNS subjekata uklјučuju nepuferisan izotonični fiziološki rastvor i Eliotov B rastvor, koji je veštačka CST. Poređenje koje prikazuje sastav CST-a u odnosu na Eliotov B rastvor je uklјučeno u Tabelu 3 koja je data ispod. Kao što je prikazano u Tabeli 3, koncentracija Eliotovog B rastvora je blisko paralelna koncentraciji u CST-u. Eliotov rastvor B, međutim, sadrži veoma nisku koncentraciju pufera i shodno tome ne može da obezbedi adekvatan puferski kapacitet koji je potreban za stabilizaciju terapijskih agenasa (npr. proteina), naročito tokom dužeg vremenskog perioda (npr. u uslovima skladištenja). Štaviše, Eliotov B rastvor sadrži određene soli koje mogu biti nekompatibilne sa formulacijama predviđenim za isporuku nekih terapijskih agenasa, a naročito proteina ili enzima. Na primer, kalcijumove soli prisutne u Eliotovom B rastvoru su sposobne da posreduju u taloženju proteina i na taj način smanjuju stabilnost formulacije.
TABELA 3
Rastvor a a g<- ->p Fosfor Glukoza mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mg/L mg/l
CST
Eliotov B
rastvor
[0042] Predmetni pronalazak obezbeđuje vodene formulacije za terapijski agens koje su formulisane tako da su sposobne da stabilizuju ili, alternativno, uspore ili spreče razgradnju terapijskog agensa formulisanog unutar njih (tj. rekombinantnih ASA proteina).
[0043] Kako se ovde upotrebljava, termin "stabilan" se odnosi na sposobnost terapijskog agensa (tj. rekombinantnog ASA enzima) da održi svoju terapijsku efikasnost (npr. sve ili većinu predviđenih bioloških aktivnosti i/ili fiziohemijskog integriteta) tokom dužeg perioda vremena. Stabilnost terapijskog agensa i sposobnost farmaceutske kompozicije da održi stabilnost takvog terapijskog agensa mogu biti procenjene tokom dužeg vremenskog perioda (npr. poželјno tokom najmanje 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili više). U kontekstu formulacije, stabilna formulacija je ona u kojoj terapijski agens koga sadržim suštinski zadržava svoj fizički i/ili hemijski integritet i biološku aktivnost nakon skladištenja i tokom izlaganja procesima (kao što su zamrzavanje/odmrzavanje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Stabilnost proteina može biti ispitana procenom obrazovanja agregata visoke molekulske težine (HMW), gubitka enzimske aktivnosti, stvaranja fragmenata peptida i promene profila naelektrisanja.
[0044] Stabilnost terapijskog agensa je od posebnog značaja imajući u vidu održavanje specifičnog opsega koncentracije terapijskog agensa koji je potreban da bi se agensu omogućilo da posluži za svoju predviđenu terapijsku funkciju. Stabilnost terapijskog agensa može dodatno biti ispitana u kontekstu biološke aktivnosti ili fiziohemijskog integriteta terapijskog agensa tokom dužeg vremenskog perioda. Na primer, stabilnost u datoj vremenskoj tački može biti upoređena sa stabilnošću u ranijoj vremenskoj tački (npr. sa formulacijom Dana 0) ili sa terapijskim agensom koji nije formulisan, a rezultati ovog poređenja mogu biti izraženi u procentima. Poželјno je da farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska zadržavaju najmanje 100%, najmanje 99%, najmanje 98%, najmanje 97% najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 65%, najmanje 60%, najmanje 55% ili najmanje 50% biološke aktivnosti ili fiziohemijskog integriteta terapijskog agensa tokom dužeg vremenskog perioda (npr. izmereno tokom najmanje oko 6-12 meseci, na sobnoj temperaturi ili u uslovima ubrzanog skladištenja).
[0045] Terapijski agens je rastvorlјiv u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Termin "rastvorlјiv", kada se odnosi na terapijski agens predmetnog pronalaska, odnosi se na sposobnost takvog terapijskog agensa da obrazuje homogeni rastvor. Poželјno je da je rastvorlјivost terapijskog agensa u rastvoru u koji se primenjuje i kojim se on transportuje do mesta cilјnog delovanja (npr. do ćelija i tkiva mozga) dovolјna da omogući isporuku terapijski efektivne količine terapijskog agensa do mesta cilјnog dejstva. Nekoliko faktora može uticati na rastvorlјivost terapijskog agensa. Na primer, relevantni faktori koji mogu uticati na rastvorlјivost proteina uklјučuju jonsku jačinu, aminokiselinsku sekvencu i prisustvo drugih kosolubilizujućih agenasa ili soli (npr. soli kalcijuma). U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije su formulisane tako da su kalcijumove soli isklјučene iz takvih kompozicija.
[0046] Pogodne formulacije mogu sadržavati terapijski agens u raznim koncentracijama. U pojedinim primerima izvođenja, formulacije mogu sadržavati protein ili terapijski agens u koncentraciji koja je opsega od oko 15 mg/ml do 100 mg/ml. U pojedinim primerima izvođenja, formulacije prema pronalasku mogu sadržavati terapijski agens u koncentraciji od približno 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml ili 100 mg/ml.
[0047] Formulacije predmetnog pronalaska karakteriše njihova podnošlјivost bilo kao vodenih rastvora ili kao rekonstituisanih liofilizovanih rastvora. Kako se ovde upotrebljava, termini "podnošlјiv" i "podnošlјivost" se odnose na sposobnost farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska da ne izazivaju neželјene reakcije kod subjekata kome se takva kompozicija primenjuje ili, alternativno, da ne izazivaju ozbilјnu neželјenu reakciju kod subjekata kome se takva kompozicija primenjuje. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska se dobro podnose od strane subjekta kome se takve kompozicije primenjuju.
[0048] Enzim predmetnog pronalaska zahteva kontrolisan pH i specifične ekscipijense da bi se održala rastvorlјivost i stabilnost u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Tabela 4 navedena u nastavku teksta, identifikuje uobičajene karakteristike proteinskih formulacija za koje se smatra da održavaju rastvorlјivost i stabilnost proteinskih terapijskih agenasa.
TABELA 4
Puferi
[0049] Dodatni faktor koji je sposoban da izmeni rastvorlјivost terapijskog agensa (npr. enzima ili proteina) u vodenoj formulaciji ili za formulaciju pre liofilizacije je pH formulacije. Shodno navedenom, formulacije predmetnog pronalaska sadrže jedan ili više pufera. U pojedinim primerima izvođenja, vodene formulacije sadrže količinu pufera koja je dovolјna za održavanje optimalnog pH navedene kompozicije između oko 4,0-8,0 (npr. oko 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,2; 6,4; 6,5; 6,6; 6,8; 7,0; 7,5 ili 8,0). U pojedinim primerima izvođenja, pH formulacije je između oko 5,0-7,5, između oko 5,5-7,0, između oko 6,0-7,0, između oko 5,5-6,0, između oko 5,5-6,5, između oko 5,0-6,0, između oko 5,0-6,5 i između oko 6,0-7,5. Pogodni puferi uklјučuju, na primer acetatni, citratni, histidinski, fosfatni, sukcinatni, tris(hidroksimetil)aminometanski ("Tris") i pufere drugih organskih kiselina. Koncentracija pufera i pH opseg farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska su faktori u kontroli ili podešavanju podnošlјivosti formulacije. U pojedinim primerima izvođenja, puferski agens je prisutan u koncentraciji opsega između oko 1 mM i oko 150 mM ili između oko 10 mM i oko 50 mM, ili između oko 15 mM i oko 50 mM ili između oko 20 mM i oko 50 mM ili između oko 25 mM i oko 50 mM. U pojedinim primerima izvođenja, pogodan puferski agens je prisutan u koncentraciji od približno 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM ili 150 mM.
Toničnost
[0050] Formulacije takođe sadrže izotonični agens da bi se formulacije zadržale izotoničnima. Obično se pod "izotoničnim" podrazumeva da formulacija od interesa suštinski ima isti osmotski pritisak kao krv čoveka. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 240 mOsm/kg do oko 350 mOsm/kg. Izotoničnost može biti izmerena upotrebom, na primer, pritiska pare ili osmometara na principu tačke zamrzavanja. Primeri izotoničnih agenasa uklјučuju, ali nisu ograničeni na, glicin, sorbitol, manitol, natrijum hlorid i arginin. U pojedinim primerima izvođenja, pogodni izotonični agensi mogu biti prisutna u vodenim i/ili pre-liofilizovanim formulacijama u koncentraciji od oko 0,01 – 5 težinskih % (npr. 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 ili 5,0%). U pojedinim primerima izvođenja, formulacije za liofilizaciju sadrže izotonični agens da bi se formulacije pre liofilizacije ili rekonstituisane formulacije održale izotoničnima.
[0051] Dok su zotonični rastvori u principu poželјni za lekove koji se primenjuju parenteralno, upotreba izotoničnih rastvora može promeniti rastvorlјivost pojedinih terapijskih agenase i naročito pojedinih proteina i/ili enzima. Pokazano je da se blago hipertonični rastvori (npr. do 175 mM natrijum hlorida u 5mM natrijum fosfatu na pH 7,0) i rastvori koji sadrže šećer (npr. do 2% saharoze u 5mM natrijum fosfatu na pH 7,0) dobro podnose. Najčešće odobrena kompozicija formulacije za bolusnu primenu u CNS je fiziološki rastvor (oko 150 mM NaCl u vodi).
Stabilizatori
[0052] U pojedinim primerima izvođenja, formulacije mogu sadržavati agens za stabilizaciju (stabilizator) ili lioprotektant, da bi se zaštitio protein. Uobičajeno je da je stabilizator šećer, neredukujući šećer i/ili aminokiselina. Šećeri za primer uklјučuju, ali nisu ograničeni na, dekstran, laktozu, manitol, manozu, sorbitol, rafinozu, saharozu i trehalozu. Aminokiseline za primer uklјučuju, ali nisu ograničene na, arginin, glicin i metionin. Dodatni stabilizatori mogu uključivati natrijum hlorid, hidroksietil skrob i polivinilpirolidon. Količina stabilizatora u liofilizovanoj formulaciji je uglavnom takva da će formulacija biti izotonična. Međutim, hipertonične rekonstituisane formulacije takođe mogu biti pogodne. Dodatno, količina stabilizatora ne sme biti toliko niska da dođe do neprihvatlјive količine razgradnje/agregacije terapijskog agensa. Primeri koncentracija stabilizatora u formulaciji mogu biti opsega od oko 1 mM do oko 400 mM (npr. od oko 30 mM do oko 300 mM i od oko 50 mM do oko 100 mM) ili, alternativno, od 0,1% do 15% ( npr. od 1% do 10%, od 5% do 15%, od 5% do 10%). U pojedinim primerima izvođenja, odnos masa stabilizatora i terapijskog agensa je oko 1:1. U drugim primerima izvođenja, odnos masa stabilizatora i terapijskog agensa može biti oko 0,1:1, 0,2:1, 0,25:1, 0,4:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 2,6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ili 20:1. U pojedinim primerima izvođenja koji su pogodni za liofilizaciju, stabilizator je takođe lioprotektant.
[0053] U pojedinim primerima izvođenja, tečne formulacije koje su pogodne za predmetni pronalazak sadrže amorfne materijale. U pojedinim primerima izvođenja, tečne formulacije pogodne za predmetni pronalazak sadrže značajnu količinu amorfnih materijala (npr. formulacije na bazi saharoze). U pojedinim primerima izvođenja, tečne formulacije pogodne za predmetni pronalazak sadrže delimično kristalne/delimično amorfne materijale.
Agensi za povećanje mase
[0054] U pojedinim primerima izvođenja, pogodne formulacije za liofilizaciju mogu dodatno uklјučivati jedan ili više agenasa za povećanje mase. "Agens za povećanje mase" je jedinjenje koje dodaje masu liofilizovanoj smeši i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovanog kolača. Na primer, agens za povećanje mamože biti pobolјšati izgled liofilizovanog kolača (npr. suštinski uniformnog liofilizovanog kolača). Pogodni agensi za povećanje mase uklјučuju, ali nisu ograničeni na, natrijum hlorid, laktozu, manitol, glicin, saharozu, trehalozu, hidroksietil skrob. Koncentracije agenasa za povećanje mase za primer su od oko 1% do oko 10% (npr.1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% i 10,0%).
Surfaktanti
[0055] U pojedinim primerima izvođenja, poželјno je formulacijama dodati sufaktant. Primeri surfaktanata uklјučuju nejonske surfaktante kao što su Polisorbati (npr. Polisorbati 20 ili 80); poloksameri (npr. poloksamer 188); Triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum laurel sulfat; natrijum oktil glikozid; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearilsarkozin; linoleil-, miristil- ili cetil-betain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidoidopropil- ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil- ili dinatrijum metil ofeil-taurat; i MONAQUAT™ serija (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil glikol, polipropil glikol i kopolimeri etilena i propilen glikola (npr. Pluronici, PF68 itd.). Obično je količina dodatog surfaktanta takva da je smanjena agregacija proteina i da je obrazovanje čestica ili taloga svedeno na minimum. Na primer, surfaktant može biti prisutan u formulaciji u koncentraciji od oko 0,001 - 0,5% (npr. oko 0,005 - 0,05% ili 0,005 - 0,01%). Preciznije, surfaktant može biti prisutan u formulaciji u koncentraciji od približno 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% itd. Alternativno, ili dodatno, surfaktant može biti dodat liofilizovanoj formulaciji, formulaciji pre liofilizacije i/ili rekonstituisanoj formulaciji.
[0056] Drugi farmaceutski prihvatlјivi nosači, eksipijensi ili stabilizatori, kao što su oni opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol, A. ur. (1980) mogu biti uključeni u formulaciju (i/ili liofilizovanu formulaciju i/ili rekonstituisanu formulaciju) pod uslovom da ne utiču štetno na želјene karakteristike formulacije. Prihvatlјivi nosači, eksipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se korište i uklјučuju, ali nisu ograničeni na, dodatne puferske agense; konzervanse; korastvarače; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helatorne agense poput EDTA; metalne komplekse (npr. proteinske komplekse sa Zn); biorazgradive polimere poput poliestara; i/ili suprotno naelektrisane jone za obrazovanje soli poput natrijuma.
[0057] Formulacije, bilo u vodenom, obliku pre liofilizacije, liofilizovanom ili rekonstituisanom obliku, mogu biti ispitane analizama za ispitivanje kvaliteta proizvoda, vremena rekonstitucije (ukoliko su liofilizovane), kvaliteta rekonstitucije (ukoliko su liofilizovane), visoke molekulske težine, vlage i temperature staklaste tranzicije. Uobičajeno je da analiza kvaliteta proteina i proizvoda uklјučuju analizu stope razlaganja proizvoda upotrebom postupaka koje uklјučuju, ali nisu ograničene na, HPLC postupak ekskluzije po veličini (SE-HPLC), katjon izmenjivački-HPLC (CEX-HPLC), difrakciju rendgenskih zraka (XRD), modulisanu diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (mDSC), reverzno fazni HPLC (RP-HPLC), višestruko ugaono raspršivanje svetlosti (MALS), fluorescencu, apsorpciju ultralјubičaste svetlosti, nefelometriju, kapilarnu elektroforezu (CE), SDS-PAGE i njihove kombinacije. U pojedinim primerima izvođenja, procena proizvoda može uklјučivati i korak procene izgleda (bilo izgleda tečnosti ili liofilizovanog kolača).
[0058] U principu, formulacije (liofilizirane ili vodene) mogu biti skladištene tokom dužih vremenskih perioda na sobnoj temperaturi. Temperatura skladištenja obično može biti osega od 0°C do 45°C (npr.
4°C, 20°C, 25°C, 45°C itd.). Formulacije mogu biti skladištene tokom perioda u mesecima ili perioda u godinama. Vreme skladištenja će obično biti 24 meseca, 12 meseci, 6 meseci, 4,5 meseca, 3 meseca, 2 meseca ili 1 mesec. Formulacije mogu biti čuvane direktno u posudi za skladištenje koja se upotrebljava za primenu, odnosno sa kojo se eliminiše korak prenosa.
[0059] Formulacije mogu biti uskladištene direktno u posudi za liofilizaciju (ukoliko su liofilizovane), koja takođe može funkcionisati kao posuda za rekonstituciju, uz eliminaciju koraka prenosa. Alternativno, formulacije tipa liofiliziranih proizvoda mogu biti izmerene u manjim rastućim količinama za skladištenje. Skladištenje bi u principu trebalo da podrazumeva izbegavanje okolnosti koje dovode do razgradnje proteina, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, izlaganje suncu, UV zračenju, drugim oblicima elektromagnetnog zračenja, prekomernoj toploti ili hladnoći, brzim toplotnim šokovima i mehaničkom udaru.
Liofilizacija
[0060] Postupci mogu biti upotrebljeni za liofilizaciju bilo kog materijala, naročito terapijskog agensa. Uobičajeno je da formulacija pre liofilizacije dodatno sadrži odgovarajući izbor eksipijenasa ili drugih komponenti poput stabilizatora, puferišućih agenasa, agenasa za povećanje mase i surfaktanata da bi se sprečilo razlaganje jedinjenja od interesa (npr. proteinska agregacija, deamidacija i/ili oksidacija) prilikom sušenja zamrzavanjem i skladištenja. Formulacija za liofilizaciju može sadržavati jedan ili više dodatnih sastojaka, uklјučujući lioprotektante ili stabilišuće agense, pufere, agense za povećanje mase, izotonične agense i surfaktante.
[0061] Nakon što se supstanca od interesa i bilo koje dodatne komponente pomešaju, formulacija se liofilizira. Liofilizacija uglavnom obuhvata tri glavne faze: zamrzavanje, primarno sušenje i sekundarno sušenje. Zamrzavanje je neophodno da bi se voda pretvorila u led ili da bi se pojedine amorfne komponente formulacije prevele u kristalni oblik. Primarno sušenje je korak procesa u kome se led uklanja iz zamrznutog proizvoda, direktnom sublimacijom na niskom pritisku i temperaturi. Sekundarno sušenje je korak procesa kada se vezana voda uklanja iz matriksa proizvoda upotrebom difuzije zaostale vode na površinu isparavanja. Temperatura proizvoda tokom sekundarnog sušenja je obično viša nego za vreme primarnog sušenja. Pogledati Tang X. i saradnici, (2004) "Design of freezedrying processes for pharmaceuticals: Practical advice”, Pharm. Res., 21:191-200; Nail S.L. i saradnici, (2002) "Fundamentals of freeze-drying”, u Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Urednik Nail S.L., New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, str. 281-353; Wang i saradnici, (2000) "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm., 203:1-60; Williams N.A. i saradnici, (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review." J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59.
[0062] U pojedinim primerima izvođenja, tokom početnog zamrzavanja proizvoda može biti uveden korak anilinga (zagrevanja/hlađenja - kaljenja). Ovaj korak anilinga može smanjiti ukupno vreme ciklusa. Bez želje da bude vezano za bilo koju teoriju, pretpostavlјa se da korak anilinga može pomoći unapređenju kristalizacije ekscipijenasa i obrazovanja većih kristala leda usled ponovne kristalizacije malih kristala nastalih tokom preteranog hlađenja, što sa druge strane pobolјšava rekonstituciju. Uobičajeno je da korak anilinga obuhvata interval ili oscilaciju temperature tokom zamrzavanja. Na primer, temperatura zamrzavanja može biti -40°C, a korak anilinga će temperaturu povećati na, na primer, -10°C i održavati tu temperaturu tokom određenog vremenskog perioda. Vreme koraka kaljenja može biti raspona od 0,5 sati do 8 sati (npr.0,5; 1,01,5; 2,0; 2,5; 3; 4; 6 i 8 sati). Temperatura anilinga može biti između temperature zamrzavanja i 0°C.
[0063] Liofilizacija može biti izvedena u posudi za skladištenje poput epruvete, kesice, boce, tacne, bočice (npr. staklene bočice), šprica ili bilo koje druge pogodne posude za skladištenje. Posude za skladištenje mogu biti za jednokratnu upotrebu. Liofilizacija se takođe može izvesti u velikom ili malom obimu. U pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se formulacija proteina liofilizira u posudi u kojoj treba izvršiti rekonstituciju proteina da bi se izbegao korak prenosa. Posuda za skladištenje u ovom slučaju može, na primer, biti bočica od 3, 4, 5, 10, 20, 50 ili 100 cm<3>.
[0064] Za navedenu svrhu, dostupni su mnogi različiti liofilizatori, kao što su Hull pilot scale liofilizator (SP Industries, SAD), Genesis (SP Industries) laboratorijski liofilizatori ili bilo koji liofilizatori sposobni da kontrolišu navedene parametre procesa liofilizacije. Sušenje zamrzavanjem se postiže zamrzavanjem formulacije i naknadnim sublimiranjem leda iz zamrznutog sadržaja na temperaturi pogodnoj za primarno sušenje. Početno zamrzavanje dovodi formulaciju do temperature ispod oko -20°C (npr. -50°C, -45°C, -40°C, -35°C, -30°C, -25°C itd.) obično tokom ne više od oko 4 sata (npr. ne više od oko 3 sata, ne više od 2,5 sata, ne više od oko 2 sata). Pod ovakvim uslovima, temperatura proizvoda je obično ispod eutektične tačke ili temperature kolapsa formulacije. Uobičajeno je da se temperatura skladištenja tokom primarnog sušenja kreće od oko -30 do 25°C (pod uslovom da proizvod ostane ispod tačke toplјenja tokom primarnog sušenja) pri pogodnom pritisku, koji je obično opsega od oko 20 do 250 mTorr. Formulacija, veličina i vrsta posude u kojoj se nalazi uzorak (npr. staklena bočica), kao i zapremina tečnosti, uglavnom će diktirati vreme potrebno za sušenje koje može biti opsega od nekoliko sati do nekoliko dana. Faza sekundarnog sušenja se sprovodi na oko 0-60°C, u zavisnosti pre svega od vrste i veličine posude i tipa terapijskog proteina koji se koristi. Zapremina tečnosti će ponovo većinom diktirati vreme potrebno za sušenje, koje može biti opsega od nekoliko sati do nekoliko dana.
[0065] Kao opšta propozicija, liofilizacija će rezultovati liofilizovanom formulacijom u kojoj je sadržaj vlage manji od oko 5%, manji od oko 4%, manji od oko 3%, manji od oko 2%, manji od oko 1% i manji od oko 0,5%.
Rekonstitucija
[0066] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su u vodenom obliku nakon primene subjektu. Ukoliko su farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska liofilizovane, takve kompozicije moraju biti rekonstituisane dodavanjem jednog ili više razblaživača pre primene subjektu. U želјenoj fazi, obično u odgovarajuće vreme pre primene pacijentu, liofilizovana formulacija može biti rekonstituisana sa razblaživačem tako da se postigne željena koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji.
[0067] Mogu se upotrebljavati razni razblaživači. U pojedinim primerima izvođenja, pogodan razblaživač za rekonstituciju je voda. Voda koja se upotrebljava kao razblaživač može biti tretirana na razne načine, uklјučujući reverznu osmozu, destilaciju, dejonizaciju, filtraciju (npr. aktivnim ugljem, mikrofiltracijom, nanofiltracijom) i kombinacijama ovih postupaka tretmana. U principu, voda bi trebala da bude pogodna za injeciranje, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, sterilnu vodu ili bakteriostatsku vodu za injekcije.
[0068] Dodatni razblaživači za primer uklјučuju pH puferisane rastvore (npr. fosfatom puferisan fiziološki rastvor), sterilan fiziološki rastvor, Eliotov rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. Pogodni razblaživači mogu opciono sadržavati konzervans. Primeri konzervansa uklјučuju aromatične alkohole kao što su benzil ili fenol alkohol. Količina upotreblјenog konzervansa se određuje ispitivanjem različitih koncentracija konzervanasa u testovima kompatibilnosti sa proteinom i efikasnosti konzervansa. Na primer, ukoliko je konzervans aromatičan alkohol (kao što je benzil alkohol), on može biti prisutan u količini od oko 0,1-2,0%, od oko 0,5-1,5% ili oko 1,0-1,2%.
[0069] Pogodni razblaživači mogu obuhvatati razne aditive, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, pH puferišuće agense (npr. Tris, histidin,) soli (npr. natrijum hlorid) i druge aditive (npr. saharozu), uklјučujući one koji su prethodno opisani (npr. stabilizatore, agense izotoničnosti).
[0070] Prema predmetnom pronalasku, liofilizovan protein može biti rekonstituisan do koncentracije od najmanje 25 mg/ml (npr. najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml, najmanje 100 mg/) i bilo kog opsega između. U pojedinim primerima izvođenja, liofilizovana supstanca (protein) može biti rekonstituisana do koncentracije opsega od oko 25 mg/ml do 100 mg/ml (npr. od oko 25 mg/ml do oko 50 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 75 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 100 mg/ml, od oko 50 mg/ml do oko 75 mg/ml, od oko 50 mg/ml do oko 100 mg/ml). U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji može biti veća od koncentracije u formulaciji pre liofilizacije. U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji može biti oko 2-50 puta veća (npr. oko 2-20, oko 2-10 puta ili oko 2-5 puta) nego u formulaciji pre liofilizacije. U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji može biti najmanje oko 2 puta veća (npr. najmanje oko 3, 4, 5, 10, 20, 40 puta) nego u formulaciji pre liofilizacije.
[0071] Rekonstitucija prema predmetnom pronalasku može biti urađena u bilo kojoj posudi. Primerni posuda za skladištenje koje su pogodne za pronalazak obuhvataju, ali nisu ograničeni na, epruvete, bočice, špriceve (npr. jednokomorne ili dvokomorne), kesice, flaše i tacne. Pogodne posude za skladištenje mogu biti napravlјene od bilo kog materijala kao što je staklo, plastika, metal. Posude za skladištenje mogu biti za jednokratnu ili za višekratnu upotrebu. Rekonstitucija se takođe može izvesti u velikom ili malom obimu.
[0072] U pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se formulacija proteina liofilizira u posudi u kojoj će se izvesti i rekonstitucija proteina, da bi se izbegao korak prenosa. Posuda za skladištenje u ovom slučaju može, na primer, biti bočica od 3, 4, 5, 10, 20, 50 ili 100 cm<3>. U pojedinim primerima izvođenja, pogodan posuda za liofilizaciju i rekonstituciju je dvokomorni špric (npr. Lyo-Ject,® (Vetter) špricevi). Na primer, dvokomorni špric može sadržati i liofilizovanu supstancu i razblaživač, svaki u posebnoj komori koje su odvojene pregradom (pogledati Primer 5). Da bi se rekonstitucija izvršila, klip može biti pričvršćen za pregradu na strani razblaživača, tako da se pritikom klipa može potisnuti razblaživač u komoru proizvoda i time razblaživač dovesti u kontakt sa liofilizovanom supstancom čime dolazi do rekonstitucije kao što je ovde opisano (pogledati Primer 5).
Isporuka u CNS
[0073] Smatra se da su razne stabilne formulacije koje su ovde opisane generalno pogodne za isporuku terapijskog agensa u CNS. Stabilne formulacije prema predmetnom pronalasku mogu biti upotrebljene za isporuku u CNS intratekalnim (npr. IT-lumbalnim, IT-cisterna magna) primenama za direktno ili indirektno injeciranje u CNS i/ili u CST.
Intratekalna isporuka
[0074] Intratekalna primena može biti upotrebljena za isporuku ASA proteina u CST. Kao što se ovde upotrebljava, intratekalna primena (takođe označena kao intratekalna injekcija) se odnosi na injeciranje u kičmeni kanal (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu). Razne tehnike mogu biti upotrebljene uklјučujući, bez ograničenja, leteralno cerebroventrikularno injeciranje kroz izbušeni otvor ili putem cisternalne ili lumbalne punkcije ili sličnog. Primeri postupaka su opisani u Lazorthes i saradnici, Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 i Omaya i saradnici, Cancer Drug Delivery, 1: 169-179.
[0075] Prema predmetnom pronalasku, enzim može biti injeciran u bilo koji region koji okružuje kičmeni kanal. U pojedinim primerima izvođenja, enzim se injecira u lumbalnu zonu ili cisternu magna ili intraventrikularno u prostor cerebralnih komora. Kako se ovde upotrebljava, termin "lumbalni region" ili "lumbalna zona" se odnosi na područje između trećeg i četvrtog lumbalnog pršljena (pršljena donjeg dela leđa) i, još preciznije, L2-S1 regiona kičme. Uobičajeno je da se intratekalno injeciranje u lumbalni region označava i kao „lumbalna IT isporuka“ ili „lumbalna IT primena“. Izraz "cisterna magna" se odnosi na prostor oko i ispod malog mozga u vidu proširenja između lobanje i vrha kičme. Uobičajeno je da se intratekalno injeciranje u cisternu magna označava i kao "isporuka u cisternu magna". Izraz "cerebralna komora" se odnosi na šuplјine u mozgu koje su u kontinuitetu sa centralnim kanalom kičmene moždine. Uobičajeno je i da se injeciranja u šupljine cerebralnih komora označavaju kao intraverikularna cerebralna (ICV) isporuka.
[0076] U pojedinim primerima izvođenja, "intratekalna primena" ili "intratekalna isporuka" prema predmetnom pronalasku se odnosi na lumbalnu IT primenu ili isporuku, na primer, isporuku između trećeg i četvrtog lumbalnog pršljena (pršenja u donjem delu leđa) i, još preciznije, unutar L2-S1 regiona kičme. Smatra se da se lumbalna IT primena ili isporuka razlikuje od isporuke u cisternu magna po tome što lumbalna IT primena ili isporuka prema našem pronalasku obezbeđuje bolјu i efikasniju isporuku u udalјeni kanal kičme, dok isporuka u cisternu magna, između ostalog, obično ne dovodi do dobre isporuke u distalni region kanala kičme.
Uređaj za intratekalnu isporuku
[0077] Razni uređaji mogu biti upotrebljeni za intratekalnu isporuku prema predmetnom pronalasku. U pojedinim primerima izvođenja, uređaj za intratekalnu primenu sadrži priklјučak za pristup tečnosti (npr. priklјučak za injeciranje); šuplјe telo (npr. kateter) sa prvim otvorom za protok koji je u komunikaciji sa priklјučkom za pristup tečnosti i drugim otvorom za protok konfigurisanim za umetanje u kičmenu moždinu; i sa osiguravajućim mehanizmom za obezbeđivanje ubacivanja katetera u kičmenu moždinu. Kao neograničavajući primer prikazan na Slici 62, pogodan osiguravajući mehanizam sadrži jedno ili više proširenja montiranih na površini šuplјeg tela, kao i zašiveni prsten koji može biti namešten preko jednog ili više proširenja da bi se sprečilo da šuplјe telo (npr. kateter) isklizne iz kičmene moždine. U raznim primerima izvođenja, otvor za pristup tečnosti sadrži rezervoar. U pojedinim primerima izvođenja, otvor za pristup tečnosti sadrži mehaničku pumpu (npr. infuzionu pumpu). U pojedinim primerima izvođenja, implantirani kateter je povezan bilo sa rezervoarom (npr. za bolusnu isporuku) ili sa infuzionom pumpom. Otvor za pristup tečnosti može biti implantiran ili spolјašnji
[0078] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena može biti sprovedena bilo lumbalnom punkcijom (tj. sporom bolusnom injekcijom) ili sistemom za isporuku putem priključka-katetera (tj. infuzijom ili bolusnim injeciranjem). U pojedinim primerima izvođenja, kateter se ubacuje između lamina lumbalnih pršljenova, a vrh se ubacuje u tekalni prostor do željenog nivoa (u principu L3-L4) (Slika 63).
[0079] U odnosu na intravensku primenu, zapremina pojedinačne doze koja je pogodna za intratekalnu primenu je obično mala. Uobičajeno je da intratekalna isporuka prema predmetnom pronalasku održava ravnotežu u sastavu CST kao i intrakranijalni pritisak subjekata. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna isporuka se izvodi bez odgovarajućeg uklanjanja CST-a iz subjekata. U pojedinim primerima izvođenja, pogodna zapremina pojedinačne doze može biti, npr. manja od oko 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1 ml ili 0,5 ml. U pojedinim primerima izvođenja, pogodna zapremina pojedinačne doze može biti oko 0,5-5 ml, 0,5-4 ml, 0,5-3 ml, 0,5-2 ml, 0,5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1,5-3 ml, 1-4 ml ili 0,5-1,5 ml. U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna isporuka prema predmetnom pronalasku obuhvata najpre korak uklanjanja želјene količine CST-a. U pojedinim primerima izvođenja, pre IT primene se najpre uklanja manje od oko 10 ml (npr. manje od oko 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml) CST-a. U takvim slučajevima, pogodna zapremina pojedinačne doze može biti, npr. veća od oko 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml ili 20 ml.
[0080] Razni drugi uređaji mogu biti upotrebljeni za efekat intratekalne primene terapijske kompozicije. Na primer, formulacije koje sadrže želјene enzime mogu biti date upotrebom Ommaiya rezervoara koji je uobičajen za intratekalnu primenu lekova kod meningealne karcinomatoze (Lancet 2: 983-84, 1963). Preciznije, u ovom postupku, ventrikularna cevčica se ubacuje kroz otvor napravljen u prednjem rogu, pa se isti povezuje sa Ommaiya rezervoarom koji je ugrađen ispod kože glave, pa se rezervoar potkožno punktira da bi se intratekalno isporučio određeni enzim koji se zamenjuje i koji se injecira u rezervoar. Drugi uređaji za intratekalnu primenu terapijskih kompozicija ili formulacija kod individua su opisani u U.S. Pat. No.6,217,552. Alternativno, lek može biti dat intratekalno, na primer, jednom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Podrazumeva se da lečenje određenom dozom može biti u vidu primene jedne doze ili više doza.
[0081] Za injeciranje, formulacije predmetnog pronalaska se formulišu u tečnim rastvorima. Pored toga, enzim može biti formulisan u čvrstom obliku i ponovo rastvoren ili resuspendovan neposredno pre upotrebe. Liofilizovani oblici su takođe obuhvaćeni. Injeciranje može biti, na primer, u vidu bolusne injekcije ili kontinuirane infuzije enzima (npr. upotrebom pumpi za infuziju).
[0082] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, enzim se primenjuje lateralnim cerebroventrikularnim injeciranjem u mozak subjekata. Injekcija može biti uvedena, na primer, kroz izbušeni otvor napravlјen u lobanji subjekta. U drugom primeru izvođenja, enzim i/ili druga farmaceutska formulacija se primenjuje preko hirurški ubačenog šanta u cerebralnu komoru subjekata. Na primer, injekcija može biti uvedena u lateralne komore koje su veće. U pojedinim primerima izvođenja, injekcija takođe može biti uvedena u treću ili četvrtu komoru koje su manje.
[0083] U još jednom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije upotrebljene u predmetnom pronalasku se primenjuju injeciranjem u cisternu magna ili u lumbalnu zonu subjekta.
[0084] U još jednom primeru izvođenja postupka predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatlјiva formulacija obezbeđuje kontinuiranu/produženu primenu subjektu, npr. "sporo oslobađanje" enzima ili druge farmaceutske kompozicije koja se upotrebljava u predmetnom pronalasku, a tokom najmanje jedne, dve, tri, četiri nedelјe ili tokom dužeg vremenskog perioda nakon što je farmaceutski prihvatlјiva formulacija primenjena subjektu.
[0085] Kako se ovde upotrebljava, termin "produžena isporuka" se odnosi na kontinuiranu isporuku farmaceutske formulacije pronalaska in vivo, tokom vremenskog perioda nakon primene koji, poželjno je, podrazumeva najmanje nekoliko dana, nedelјu dana ili nekoliko nedelјa. Produžena primena kompozicije se može ispoljiti, na primer, kontinuiranim terapijskim efektom tokom vremena (npr. kontinuirana isporuka enzima može predstavljati kontinuirano smanjenu količinu granula za skladištenje kod subjekta). Alternativno, produžena isporuka enzima se može prikazati detekcijom enzima in vivo tokom vremena.
Isporuka do ciljnih tkiva
[0086] Kao što je prethodno razmotreno, jedna od iznenađujućih i važnih karakteristika predmetnog pronalaska je da se enzim koji se zamenjuje primenjuje upotrebom kompozicija predmetnog pronalaska koje su u stanju da efektivno i naširoko difunduju po površini mozga i prodru kroz razne slojeve ili regione mozga, uklјučujući duboke moždane regione. Dodatno, kompozicije predmetnog pronalaska efektivno isporučuju ASA enzim u razna tkiva, neurone ili ćelije kičmene moždine, uklјučujući lumbalni region, na koga je teško ciljano delovati postojećim postupcima isporuke u CNS, kao što je ICV injeciranje. Štaviše, kompozicije predmetnog pronalaska isporučuju dovolјnu količinu ASA enzima u krvotok i razne periferne organe i tkiva.
[0087] Stoga, u pojedinim primerima izvođenja, ASA enzim se isporučuje centralnom nervnom sistemu subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, ASA enzim se isporučuje u jedno ili više cilјnih tkiva mozga, kičmene moždine i/ili perifernih organa. Kako se ovde upotrebljava, termin "cilјna tkiva" se odnosi na bilo koje tkivo koje je zahvaćeno bolešću lizozomskog skladištenja i koje će biti tretirano ili na bilo koje tkivo u kome se normalno eksprimira deficijentan lizozomski enzim. U pojedinim primerima izvođenja, cilјna tkiva uklјučuju ona tkiva u kojima postoji detektabilna ili abnormalno velika količina enzimskog supstrata, na primer, uskladištena u ćelijskim lizozomima tkiva, kod pacijenata koji boluju od ili su podložni bolesti lizozomskog skladištenja. U pojedinim primerima izvođenja, cilјno tkivo obuhvata ona tkiva koja ispoljavaju patologiju, simptom ili karakteristiku povezanu sa bolešću. U pojedinim primerima izvođenja, cilјno tkivo obuhvata ona tkiva u kojima se deficijentan lizozomski enzim normalno eksprimira sa povišenim nivoom. Kako se ovde upotrebljava, cilјno tkivo može biti cilјno tkivo mozga, cilјno tkivo kičmene moždine i/ili periferno cilјno tkivo. Cilјna tkiva za primer su detalјno opisana u nastavku teksta.
Cilјna tkiva mozga
[0088] U principu, mozak može biti podeljen na različite regione, slojeve i tkiva. Na primer, tkivo moždanih ovojnica je sistem membrana koji obavija centralni nervni sistem, uklјučujući mozak. Moždane ovojnice sadrže tri sloja, uklјučujući čvrstu opnu, paučinastu opnu i meku opnu. U principu, osnovna funkcija moždanih ovojnica i cerebrospinalne tečnosti je zaštita centralnog nervnog sistema. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje do jednog ili više slojeva moždanih ovojnica.
[0089] U mozgu se razlikuju tri osnova podregiona, uklјučujući veliki mozak (cerebrum), mali mozak i moždano stablo. Hemifere velikog mozga koje se nalaze iznad većine ostalih moždanih struktura su prekrivene korom velikog mozga. Ispod malog mozga se nalazi moždano stablo, koje nalikuje stablјici na koju je pričvršćen veliki mozak. Na zadnjem delu mozga, ispod velikog mozga i iza moždanog stabla, se nalazi mali mozak.
[0090] Međumozak (dijencefalon), koji se nalazi blizu središnje linije mozga i iznad srednjeg možga, sadrži talamus, metatalamus, hipotalamus, epitalamus, pretalamus i pretektum. Mezencefalon, koji se takođe naziva srednjim mozgom, sadrži tektum, tegumentum, ventrikularnu mezokoeliju i cerebralne pendikule (nožice), crveno jedro i jedro III kranijalnog nerva. Mesencefalon je odgovoran za vid, sluh, kontrolu motorike, spavanje/budnost, pažnju i regulaciju temperature.
[0091] Regioni tkiva centralnog nervnog sistema, uklјučujući mozak, mogu biti okarakterisani na osnovu dubine tkiva. Na primer, tkiva CNS-a (npr. mozga) mogu biti okarakterisana kao površinska ili plitka tkiva, tkiva srednje dubine i/ili duboka tkiva.
[0092] Prema predmetnom pronalasku, terapijski protein (enzim koji se zamenjuje) može biti isporučen u bilo koje odgovarajuće cilјno tkivo/ciljan tkiva mozga koja su povezana sa određenom bolešću koju treba lečiti kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein (enzim koji se zamenjuje) u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje do površinskog ili plitkog cilјnog tkiva mozga. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje cilјnom tkivu mozga srednje dubine. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje u duboko cilјno tkivo mozga. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje kombinovano do površinskog ili plitkog cilјnog tkiva mozga, ciljnog tkiva mozga srednje dubine i/ili dubokog ciljnog tkiva mozga. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje u duboko tkivo mozga koje je najmanje 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm ili više ispod (ili unutar) spolјne površine mozga.
[0093] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje do jednog ili više od površinskih ili plitkih tkiva velikog mozga. U pojedinim primerima izvođenja, ciljna površinska ili plitka tkiva velikog mozga se nalaze unutar 4 mm od površine velikog mozga. U pojedinim primerima izvođenja, ciljna površinska ili plitka tkiva velikog mozga su izabrana od tkiva meke ovojnice, tkiva cerebralne vrpce kore velikog mozga, hipokampusa, Virhov-Robinovog prostora, krvnih sudova unutar VR prostora, hipokampusa, delova hipotalamusa na unutrašnjoj površini mozga, optičkih nerva i snopova, olfaktornog bulbusa i projekcija, kao i njihovih kombinacija.
[0094] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje do jednog ili više od dubokih tkiva velikog mozga. U pojedinim primerima izvođenja, ciljna površinska ili plitka tkiva velikog mozga se nalaze 4 mm (npr.5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm ili 10 mm) ispod (ili unutar) površine velikog mozga. U pojedinim primerima izvođenja, duboko ciljno tkivo velikog mozga uključuje cerebralnu traku kore velikog mozga. U pojedinim primerima izvođenja, duboko ciljno tkivo velikog mozga uključuje jedno ili više od međumozga (npr. hipotalamus, talamus, pretalamus, subtalamus itd.), srednjeg mozga, lentiformnog jedra, bazalnih ganglija, kaudatusa, putamena, amigdala, globusa palidusa i njihovih kombinacija.
[0095] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (npr. enzim) se isporučuje u jedno ili više od tkiva malog mozga. U određenim primerima izvođenja, jedno ili više ciljnih tkiva malog mozga su izabrani iz grupe koja se sastoji od tkiva molekulskog sloja, tkiva sloja Purkinjeovih ćelija, tkiva sloja granularnih ćelija, cerebelarnih nožica i njihovih kombinacija. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje u jedno ili više dubokih tkiva malog mozga, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, tkiva sloja Purkinjeovih ćelija, tkiva sloja granularnih ćelija, tkivo duboke bele mase malog mozga (npr. duboko u odnosu na sloj granularnih ćelija) i tkivo dubokih jedara malog mozga.
[0096] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje u jedno ili više od tkiva moždanog stabla. U pojedinim primerima izvođenja, jedno ili više ciljnih tkiva moždanog stabla uključuju tkivo bele mase moždanog stabla i/ili tkivo jedara moždanog stabla.
[0097] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje u razna tkiva mozga uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, sivu masu, belu masu, periventrikularna područja, mekupaučinastu ovojnicu, moždane ovojnice, neokorteks, mali mozak, duboka tkiva u kori velikog mozga, molekulski sloj, region kaudatusa/putamena, srednji mozak, duboke regione Varolijevog mosta ili produžene mođdine i njihove kombinacije.
[0098] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje raznim ćelijama u mozgu, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, neurone, glijske ćelije, perivaskularne ćelije i/ili ćelije moždanih ovojnica. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein se isporučuje oligodendrocitima duboke bele mase.
Kičmena moždina
[0099] U principu, regioni ili tkiva kičmene moždine se mogu okarakterisati na osnovu dubine tkiva. Na primer, tkiva kičmene moždine mogu biti okarakterisana kao površinska ili plitka tkiva, tkiva srednje dubine i/ili duboka tkiva.
[0100] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje do jednog ili više od površinskih ili plitkih tkiva kičmene moždine. U pojedinim primerima izvođenja, ciljno površinsko ili plitko tkivo kičmene moždine se nalazi unutar 4 mm od površine kičmene moždine. U pojedinim primerima izvođenja, ciljno površinsko ili plitko tkivo kičmene moždine sadrži meku ovojnicu i/ili snopove bele mase.
[0101] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje u jedno ili više od dubokih tkiva kičmene moždine. U pojedinim primerima izvođenja, duboko ciljno tkivo kičmene moždine se nalazi unutar 4 mm od površine kičmene moždine. U pojedinim primerima izvođenja, duboko ciljno tkivo kičmene moždine sadrži sivu masu kičmene moždine i/ili ependimske ćelije.
[0102] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim) se isporučuje neuronima kičmene moždine.
Periferna cilјna tkiva
[0103] Kako se ovde upotrebljava, periferni organi ili tkiva se odnose na sve organe ili tkiva koji nisu deo centralnog nervnog sistema (CNS). Periferna cilјna tkiva mogu uključivati, ali nisu ograničena na, krvni sistem, jetru, bubreg, srce, endotel, ćelije kosne srži ili ćelije izvedene iz kosne srži, slezinu, pluća, limfni čvor, kost, hrskavicu, jajnik i testis. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski protein (enzim koji se zamenjuje) u skladu sa predmetnim pronalaskom se isporučuje u jedno ili više perifernih cilјnih tkiva.
Biodistribucija i bioraspoloživost
[0104] U raznim primerima izvođenja, jednom kad se isporuči cilјnom tkivu, ASA enzim lokalizuje unutar ćelije. Na primer, terapijski agens (enzim) može biti lokalizovan u egzonima, aksonima, lizozomima, mitohondrijama ili vakuolama cilјne ćelije (npr. neurona kao što je Purkinjeova ćelija). Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, intratekalno primenjeni enzimi pokazuju dinamiku translokacije koja je takva da se enzim kreće unutar perivaskularnog prostora (npr. mehanizmima konvekcije potpomognutim pulsacijom). Pored toga, mehanizmi aktivnog aksonskog transporta koji podrazumevaju vezu primenjenog proteina ili enzima sa neurofilamentima, takođe mogu doprineti ili na drugi način olakšati distribuciju intratekalno primenjenih proteina ili enzima u dublјa tkiva centralnog nervnog sistema.
[0105] U pojedinim primerima izvođenja, ASA enzim koji je isporučen prema predmetnom pronalasku, može postići terapijski ili klinički efektivne nivoe ili aktivnosti u raznim ciljnim tkivima koja su ovde opisana. Kako se ovde upotrebljava, terapijski ili klinički efektivan nivo ili aktivnost je nivo ili aktivnost koji je dovoljan za postizanje terapijskog efekta u ciljnom tkivu. Terapijski efekat može biti objektivan (tj. merlјiv nekim testom ili markerom) ili subjekativan (tj. subjekat daje indikaciju ili oseća efekat). Na primer, terapijski ili klinički efektivan nivo ili aktivnost može biti enzimski nivo ili aktivnost koji su dovoljni da se ublaže simptomi koji su povezani sa oboljenjem u ciljnom tkivu (npr. skladištenje GAG).
[0106] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim koji se zamenjuje) isporučen u skladu sa predmentim pronalaskom, može postići enzimski nivo ili aktivnost koji iznose najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% od normalnog nivoa ili aktivnosti odgovarajućeg lizozomskog enzima u cilјnom tkivu. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim koji se zamenjuje) koji je isporučen prema predmetnom pronalasku, može dostići enzimski nivo ili aktivnost koji su povećani za najmanje 1 put, dva puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u odnosu na kontrolu (npr. endogene nivoe ili aktivnosti bez tretmana). U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (npr. enzim koji se zamenjuje), koji je isporučen prema predmetnom pronalasku, može dostići povećan enzimski nivo ili aktivnost koji su najmanje približno 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ili 600 nmol/h/mg u ciljnom tkivu.
[0107] U pojedinim primerima izvođenja, inventivni postupci predmetnog pronalaska su naročito korisni za ciljano dejstvo na lumbalni region. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim koji se zamenjuje) koji je isporučen u skladu sa predmetnim pronalaskom, može postići povećan enzimski nivo ili aktivnost u lumbalnom regionu od najmanje približno 500 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg, 700 nmol/h/mg, 800 nmol/h/mg, 900 nmol/h/mg, 1000 nmol/h/mg, 1500 nmol/h/mg, 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg ili 10.000 nmol/h/mg.
[0108] U principu, terapijski agensi (enzimi koji se zamenjuju) koji su isporučeni prema predmetnom pronalasku, imaju dovolјno dugo vreme poluživota u CST-u i cilјnim tkivima mozga, kičmene moždine i perifernih organa. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim koji se zamenjuje) isporučen prema predmetnom pronalasku, može biti sa poluživotom od najmanje približno 30 minuta, 45 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 12 sati, 16 sati, 18 sati, 20 sati, 25 sati, 30 sati, 35 sati, 40 sati, do 3 dana, do 7 dana, do 14 dana, do 21 dana ili do mesec dana. U pojedinim primerima izvođenja, U pojedinim primerima izvođenja, terapijski agens (npr. enzim koji se zamenjuje) isporučen prema predmetnom pronalasku može zadržati nivo koji se može detektovati ili aktivnost u CST-u ili krvotoku nakon 12 sati, 24 sata, 30 sati, 36 sati, 42 sata, 48 sati, 54 sata, 60 sati, 66 sati, 72 sata, 78 sati, 84 sata, 90 sati, 96 sati, 102 sata ili nedelјu dana nakon primene. Nivo ili aktivnost koji se mogu detektovati, mogu biti određeni upotrebom raznih postupaka koji su poznati u stanju tehnike.
[0109] U određenim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim koji se zamenjuje), isporučen prema predmetnom pronalasku, dostiže koncentraciju od najmanje 30 µg/ml u tkivima i ćelijama CNS-a subjekta nakon primene (npr. nakon jedne nedelјe, 3 dana, 48 sati, 36 sati, 24 sata, 18 sati, 12 sati, 8 sati, 6 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sata, 30 minuta ili manje nakon intratekalne primene farmaceutske kompozicije subjektu). U određenim primerima izvođenja, terapijski agens (enzim koji se zamenjuje) isporučen prema predmetnom pronalasku postiže koncentraciju od najmanje 20 µg/ml, najmanje 15 µg/ml, najmanje 10 µg/ml, najmanje 75 µg/ml, najmanje 5 µg/ml, najmanje 25 µg/ml, najmanje 10 µg/ml ili najmanje 05 µg/ml u ciljnim tkivima ili ćelijama subjekta (npr. tkivu mozga ili neuronima) nakon primene takvom subjektu (npr. nakon jedne nedelje, 3 dana, 48 sati, 36 sati, 24 sata, 18 sati, 12 sati, 8 sati, 6 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sata, 30 minuta ili manje nakon intratekalne primene takvih farmaceutskih kompozicija subjektu).
Lečenje metahromatske leukodistrofijske bolesti (MLD)
[0110] Metahromatska leukodistrofijska bolest (MLD) je autozomno recesivni poremećaj koji je rezultat deficijencije enzima arilsulfateaze A (ASA). ASA, koga kod lјudi kodira ARSA gen, je enzim koji razgrađuje cerebrozid 3-sulfat ili sfingolipid 3-O-sulfogalaktozilceramid (sulfatid) u cerebrozid i sulfat. U odsustvu enzima, sulfatidi se nakuplјaju u nervnom sistemu (npr. mijelinskim omotačima, neuronima i glijskim ćelijama) i u manjoj meri u visceralnim organima. Posledica ovih molekulskih i ćelijskih događaja je progresivna demijelinizacija i gubitak aksona unutar CNS-a i PNS-a, koji su klinički praćeni teškom motornom i kognitivnom disfunkcijom.
[0111] Definišuća klinička karakteristika ovog poremećaja je degeneracija centralnog nervnog sistema (CNS-a), koja rezultuje oštećenjem kognitivnih funkcija (npr. mentalnom retardacijom, nervnim poremećajima i slepilom, između ostalog).
[0112] MLD se može manifestovati kod male dece (kasno-infantilni oblik), gde obolela deca obično počinju da ispoljavaju simptome već nakon prve godine života (npr. sa oko 15-24 meseci) i uglavnom ne preživljavaju nakon starosti od 5 godina. MLD se može manifestovati kod dece (juvenili oblik), gde se kod obolele dece obično javlja kognitivno oštećenje oko starosti od 3-10 godina, pri čemu životni vek može varirati (npr. u opsegu od 10-15 godina nakon pojave simptoma). MLD se može manifestovati i kod odraslih (oblik sa početkom u adultnom dobu) i može se javiti kod individua bilo koje starosti (npr. obično sa 16 godina i kasnije), pri čemu progresija bolesti može veoma varirati.
[0113] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljene za efektivno lečenje individua koji boluju ili su podložne MLD-u. Termini "lečiti" ili "lečenje", kako se ovde upotrebljavaju, se odnose na pobolјšanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, prevenciju ili odlaganje početka jednog ili više simptoma bolesti i/ili smanjenje ozbiljnosti kliničke slike ili učestalost jednog ili više simptoma oboljenja. Primeri simptoma obuhvataju, ali nisu ograničeni na, intrakranijalni pritisak, hidrocefalus ex vacuo, akumulaciju sulfatnih glikolipida u mijelinskim omotačima u centralnom i perifernom nervnom sistemu i u visceralnim organima, progresivnu demijelinizaciju i gubitak aksona unutar CNS-a i PNS-a i/ili motornu i kognitivnu disfunkciju.
[0114] U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na delimično ili potpuno ublažavanje, pobolјšanje, olakšanje, inhibiciju, odlaganje početka, smanjenje ozbiljnosti i/ili incidence neuroloških oštećenja kod pacijenta sa MLD. Kako se ovde upotrebljava, termin "neurološko oštećenje" obuhvata razne simptome povezane sa oštećenjem centralnog nervnog sistema (npr. mozga i kičmene moždine). U pojedinim primerima izvođenja, razni simptomi MLD-a su povezani sa oštećenjem perifernog nervnog sistema (PNS-a). U pojedinim primerima izvođenja, neurološko oštećenje kod pacijenta sa MLD se karakteriše padom grube motorne funkcije. Kao što bi stručnjaci iz oblasti tehnike i procenili, gruba motorna funkcija može biti ispitana bilo kojim odgovarajućim postupkom. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, gruba motorna funkcija se meri kao promena u motornoj funkciji u odnosu na bazalnu vrednost, upotrebom sistema procene vrednosti ukupnih grubih motornih funkcija-88 (GMFM-88).
[0115] U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na smanjeno nakuplјanje sulfatida u raznim tkivima. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na smanjeno nakuplјanje sulfatida u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U pojedinim primerima izvođenja, nakupljanje sulfatida je smanjeno za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U pojedinim primerima izvođenja, nakupljanje sulfatida je smanjeno za najmanje jedan put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u odnosu na kontrolu. Kao što bi stručnjaci iz oblasti tehnike i procenili, skladištenje sulfatida može biti određeno bilo kojim odgovarajućim postupkom. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, skladištenje sulfatida se meri bojenjem alkijanskim plavim. U pojedinim primerima izvođenja, skladištenje sulfatida se meri bojenjem LAMP-1.
[0116] U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na smanjenu vakuolizaciju u neuronima (npr. neuronima koji obuhvataju i Purkinjeove ćelije). U pojedinim primerima izvođenja, vakuolizacija neurona je smanjena za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U pojedinim primerima izvođenja, vakuolizacija je smanjena za najmanje jedan put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u odnosu na kontrolu.
[0117] U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na povećanu aktivnost ASA enzima u raznim tkivima. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na povećanu aktivnost ASA enzima u cilјnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U pojedinim primerima izvođenja, aktivnost ASA enzima je povećana za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% ili više u poređenju sa kontrolom. U pojedinim primerima izvođenja, aktivnost ASA enzima je povećana za najmanje jedan put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u odnosu na kontrolu. U pojedinim primerima izvođenja, povećana ASA enzimska aktivnost iznosi najmanje približno 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg ili više. U pojedinim primerima izvođenja, enzimska aktivnost ASA je povećana u lumbalnom regionu. U pojedinim primerima izvođenja, povećana enzimska aktivnost ASA u lumbalnom regionu iznosi najmanje približno 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg, 10.000 nmol/h/mg ili više.
[0118] U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na smanjenu progresiju gubitka kognitivne sposobnosti. U pojedinim primerima izvođenja, progresija gubitka kognitivne sposobnosti je smanjena za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na smanjeno kašnjenje u razvoju. U pojedinim primerima izvođenja, kašnjenje u razvoju je smanjeno za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom.
[0119] U pojedinim primerima izvođenja, lečenje se odnosi na povećano preživlјavanje (npr. vreme preživlјavanja). Na primer, lečenje može rezultovati povećanim očekivanim životnim vekom pacijenta. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje rezultuje povećanim životnim vekom pacijenta za više od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 100%, oko 105% oko 110%, oko 115%, oko 120%, oko 125%, oko 130%, oko 135%, oko 140%, oko 145%, oko 150%, oko 155%, oko 160%, oko 165%, oko 170%, oko 175%, oko 180%, oko 185%, oko 190%, oko 195%, oko 200% ili više u odnosu na prosečan očekivani životini vek jedne ili više kontrolnih individua sa sličnom bolešću bez tretmana. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje rezultuje povećanjem očekivanog životonog veka pacijenta za više od oko 6 meseci, oko 7 meseci, oko 8 meseci, oko 9 meseci, oko 10 meseci, oko 11 meseci, oko 12 meseci, oko 2 godine, oko 3 godine, oko 4 godine, oko 5 godina, oko 6 godina, oko 7 godina, oko 8 godina, oko 9 godina, oko 10 godina ili više, u poređenju sa prosečnim očekivanim životnim vekom jedne ili više kontrolnih individua sa sličnom bolešću bez tretmana. U pojedinim primerima izvođenja, lečenje rezultuje dugoročnim preživlјavanjem pacijenta. Kako se ovde upotrebljava, termin "dugoročnog preživlјavanja" se odnosi na vreme preživlјavanja ili očekivani životni vek duži od oko 40 godina, 45 godina, 50 godina, 55 godina, 60 godina ili duže.
[0120] Termini „pobolјšati“, „povećati“ ili „smanjiti“, kako se ovde upotrebljavaju, označavaju vrednosti koje su relativne u odnosu na kontrolu. U pojedinim primerima izvođenja, pogodna kontrola je osnovno/bazalno merenje, kao što je merenje kod iste osobe pre započinjanja tretmana koji je ovde opisan ili merenje kod kontrolne jedinke (ili više kontrolnih jedinki) u odsustvu tretmana koji je ovde opisan. "Kontrolna osoba" je osoba sa istim oblikom MLD-a (npr. kasnim infantilnim, juvenilnim ili oblikom koji započinje u adultnom dobu) i koja je otprilike iste starosti i/ili pola kao i osoba koji se leči (kako bi se osiguralo da su stadijumi bolesti kod lečene osobe i kontrolne osobe/kontrolnih osoba uporedivi).
[0121] Pojedinac (takođe označen kao „pacijent“ ili „subjekat“) koji se leči je individua (fetus, novorođenče, dete, adolescent ili odrasli čovek) sa MLD ili koja je sa potencijalom da razvije MLD. Pojedinac može biti sa rezidualnom endogenom ASA ekspresijom i/ili aktivnošću ili bez merlјive aktivnosti. Na primer, osoba sa MLD može imati nivo ekspresije ASA koji je manji od oko 30-50%, manji od oko 25-30%, manji od oko 20-25%, manji od oko 15-20%, manji od oko 10-15%, manji od oko 5-10%, manji od oko 0,1-5% od normalnih nivoa ekspresije ASA.
[0122] U pojedinim primerima izvođenja, individua je individua kojoj je nedavno dijagnostikovana bolest. Obično je rano lečenje (tretman koji započinje što je pre moguće nakon postavlјanja dijagnoze) važno da bi se efekti bolesti sveli na najmanju moguću meru i da bi se povećale koristi lečenja.
Imunska tolerancija
[0123] U principu, intratekalna primena terapijskog agensa (enzima koji se zamenjuje) prema predmetnom pronalasku ne rezultuje ozbilјnim štetnim efektima kod subjekata. Kako se ovde upotrebljava, ozbiljni štetni efekti indukuju, ali nisu ograničeni na, značajan imuni odgovor, toksičnost ili smrt. Kako se ovde upotrebljava, termin "značajan imuni odgovor" se odnosi na teške ili ozbilјne imune odgovore, kao što su adaptivni T-ćelijski imuni odgovori.
[0124] Stoga, u mnogim primerima izvođenja, upotreba kompozicije u postupku lečenja MLD-a prema predmetnom pronalasku ne obuhvata istovremenu imunosupresivnu terapiju (tj. bilo koju imunosupresivnu terapiju koja se upotrebljava kao pretretman/predkondicioniranje ili paralelno sa postupkom). U pojedinim primerima izvođenja, takva upotreba ne uklјučuje indukciju imunske tolerancije kod subjekata koji se leči. U pojedinim primerima izvođenja, takva upotreba ne uklјučuje prethodan tretman ili predkondicioniranje subjekata upotrebom T-ćelijskog imunosupresivnog agensa.
[0125] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena terapijskih agenasa može uspostaviti imuni odgovor na ove agense. Stoga, u pojedinim primerima izvođenja, može biti korisno učiniti subjekata koji prima enzim koji se zamenjuje tolerantnim na terapiju zamene enzima. Imunska tolerancija može biti indukovana upotrebom raznih postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Na primer, može biti upotrebljen početni režim od 30 do 60 dana primene T-ćelijskog imunosupresivnog agensa kao što je ciklosporin A (CsA), kao i antiproliferativnog agensa kao što je azatioprin (Aza), u kombinaciji sa nedeljnim intratekalnim infuzijama niskih doza želјenog enzima koji se zamenjuje.
[0126] Bilo koji imunosupresivni agens koji je poznat stručnjaku može biti iskorišćen zajedno sa kombinovanom terapijom. Takvi imunosupresivni agensi obuhvataju, ali nisu ograničena na, ciklosporin, FK506, rapamicin, CTLA4-Ig i anti-TNF agense kao što je etanercept (pogledati npr. Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg i saradnici, 2000, Scand. J. Immunol.51, 224-230; Ideguchi i saradnici, 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret i saradnici, 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 875, 159-174; Slavik i saradnici, 1999, Immunol. Res.19, 1-24; Gaziev i saradnici, 1999, Bone Marrow Transplant.25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert i saradnici, 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi i saradnici, 2000, Transplantation 69, 1275-1283). Daklizumab antitelo na receptor za IL2 (.alfa. subjedinicu) (npr. Zenapax.™.), koje se pokazalo efektivnim kod pacijenata nakon transplantacije, takođe može biti upotrebljeno kao imunosupresivni agens (pogledati npr. Wiseman i saradnici, 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz i saradnici, 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli i saradnici, 1999, Drugs R. D. 1, 55-60; Berard i saradnici, 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff i saradnici, 2000, Transplantation 69,1867-1872; Ekberg i saradnici, 2000, Transpl. Int.13, 151-159). Dodatni imunosupresivni agensi obuhvataju, ali nisu ograničena na, anti-CD2 (Branco i saradnici, 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka i saradnici, 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva i saradnici, 2000, Arthritis Rheum.43, 638-644; Fishwild i saradnici, 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152) i anti-CD40 ligand (Hong i saradnici, 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule i saradnici, 2000, J. Virol.74, 3345-3352; Ito i saradnici, 2000, J. Immunol.164,1230-1235).
Primena
[0127] Razmatra se i pojedinačna, kao i višestruka primena terapijski efektivne količine terapijskog agensa (enzima koji se zamenjuju). Terapijski agens (enzimi koji se zamenjuju) može biti primenjen u pravilnim intervalima, u zavisnosti od prirode, težine kliničke slike i obima stanja subjekata. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna količina terapijskog agensa (enzima koji se zamenjuju) može biti intratekalno primenjena periodično, u pravilnim intervalima (npr. jednom godišnje, jednom na svakih šest meseci, jednom na svakih pet meseci, jednom na svaka tri meseca, dvomesečno (jednom na svaka dva meseca), mesečno (jednom svakog meseca), na dve nedelјe (jednom na svake dve nedelјe), nedelјno).
[0128] U pojedinim primerima izvođenja, intratekalna primena može biti upotrebljena zajedno sa drugim načinima primene (npr. intravenskom, subkutanom, intramuskularnom, parenteralnom, transdermalnom ili transmukoznom (npr. oralno ili nazalno)). U pojedinim primerima izvođenja, navedeni drugi načini primene (npr. intravenska primena) mogu biti izvedeni ne češće nego što je primena na dve nedelјe, svakog meseca, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca, jednom na svaka četiri meseca, jednom na svakih pet meseci, jednom na svakih šest meseci, godišnje.
[0129] Kako se ovde upotrebljava, termin "terapijski efektivna količina" je u velikoj meri određen na osnovu ukupne količine terapijskog agensa koji je sadržan u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. U principu, terapijski efektivna količina je dovolјna za postizanje smislene koristi za subjekata (npr. za lečenje, modulaciju, izlečenje, prevenciju i/ili pobolјšanje osnovne bolesti ili stanja). Na primer, terapijski efektivna količina može biti količina koja je dovolјna za postizanje želјenog terapijskog i/ili profilaktičkog efekta, kao što je količina dovolјna za modulaciju receptora lizozomskih enzima ili njihove aktivnosti čime bi se lečila takva bolest lizozomskog skladištenja ili njeni simptomi (npr. smanjenje ili eliminacija prisustva ili incidence "zebrastih tela" ili ćelijske vakuolizacije nakon primene kompozicija predmetnog pronalaska subjektu). U principu, količina terapijskog agensa (npr. rekombinantnog lizozomskog enzima) koja se primenjuje subjektu kome je isti potreban, zavisiće od karakteristika subjekta. Takve karakteristike uklјučuju stanje, ozbiljnost oboljenja, opšte zdravstveno stanje, starost, pol i telesnu težinu subjekata. Osoba sa prosečnim iskustvom u oblasti thenike će lako biti u stanju da odredi odgovarajuće doze u zavisnosti od ovih i drugih srodnih faktora. Dodatno, objektivni i subjekativni testovi mogu opciono biti upotrebljeni za identifikaciju optimalnih opsega doziranja.
[0130] Terapijski efektivna količina se obično primenjuje u vidu doznog režima koji može obuhvatati više jediničnih doza. Za bilo koji određeni terapijski protein, terapijski efektivna količina (i/ili odgovarajuća jedinična doza u okviru efektivnog režima doziranja) može varirati, na primer, u zavisnosti od načina primene, u kombinaciji sa drugim farmaceutskim agensima. Takođe, specifična terapijski efektivna količina (i/ili jedinična doza) za bilo kog određenog pacijenta može zavisiti od niza faktora, uklјučujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost kliničke slike poremećaja; aktivnost specifičnog farmaceutskog agensa koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi; starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, način primene i/ili stopu izlučivanja ili metabolizma specifičnog fuzionog proteina koji se koristi; trajanje tretmana; i slične faktore, a kao što je dobro poznato u oblasti medicine.
[0131] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna doza je opsega od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 500 mg/kg težine mozga, npr. od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 400 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg mozga težina do 300 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 200 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 100 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 90 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 80 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 70 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 60 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 50 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 40 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 30 mg/kg težina mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 25 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 20 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 15 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 10 mg/kg težine mozga.
[0132] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna doza je veća od oko 0,1 mg/kg težine mozga, veća od oko 0,5 mg/kg težine mozga, veća od oko 1,0 mg/kg težine mozga, veća od oko 3 mg/kg težine mozga, veća od oko 5 mg/kg težine mozga, veća od oko 10 mg/kg težine mozga, veća od oko 15 mg/kg težine mozga, veća od oko 20 mg/kg težine mozga, veća od oko 30 mg/kg težine mozga, veća od oko 40 mg/kg težine mozga, veća od oko 50 mg/kg težine mozga, veća od oko 60 mg/kg težine mozga, veća od oko 70 mg/kg težine mozga, veća od oko 80 mg/kg težine mozga, veća od oko 90 mg/kg težine mozga, veća od oko 100 mg/kg težine mozga, veća od oko 150 mg/kg težine mozga, veća od oko 200 mg/kg težine mozga, veća od oko 250 mg/kg težine mozga, veća od oko 300 mg/kg težine mozga, veća od oko 350 mg/kg težine mozga, veća od oko 400 mg/kg težine mozga, veće od oko 450 mg/kg težine mozga, veća od oko 500 mg/kg težine mozga.
[0133] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna doza takođe može biti definisana u vidu mg/kg telesne težine. Kao što bi stručnjak iz oblasti procenio, težina mozga i telesna težina mogu biti u korelaciji. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights”, Ann Neurol 1978; 4:345-56. Stoga, u pojedinim primerima izvođenja, doze mogu biti pretvorene kao što je prikazano u Tabeli 5.
TABELA 5
[0134] U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna doza takođe može biti definisana u vidu mg/15 cm<3>CST-a. Kao što bi stručnjak iz oblasti procenio, terapijski efektivne doze zasnovane na težini mozga i telesnoj težini mogu biti prevedene u mg/15 cm<3>CST-a. Na primer, zapremina CST-a kod odraslih lјudi je približno 150 ml (Johanson CE i saradnici, "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease”, Cerebrospinal Fluid Res. 2008 May 14;5:10). Stoga, jednokratne injekcije doza sa od 0,1 mg do 50 mg proteina za odrasle bi približno predstavljale doze sa od 0,01 mg/15 cm<3>CST-a (0,1 mg) do 5,0 mg/15 cm<3>CST (50 mg) kod odraslih.
[0135] Podrazumeva se dalje i da bi za svakog određenog subjekta specifični režimi doziranja trebali da budu podešeni tokom vremena u skladu sa individualnim potrebama i profesionalnom procenom osobe koja primenjuje ili nadgleda primenu terapije zamene enzima, kao i da rasponi doza koji su ovde navedeni predstavljaju samo primere.
Komercijalni kompleti
[0136] Štaviše, obezbeđeni su komercijalni kompleti ili drugi predmeti proizvodnje koji sadrže formulaciju predmetnog pronalaska i obezbeđuju uputstva za njenu rekonstituciju (ukoliko je liofilizovana) i/ili upotrebu. Komercijalni kompleti ili drugi predmeti proizvodnje mogu uklјučivati spremnik, IDD uređaj, kateter i bilo koje druge predmete, uređaje ili opremu koji su korisni u intertekalnoj primeni i srodnim hirurškim operacijama. Pogodne posude za skladištenje obuhvataju, na primer, boce, bočice, špriceve (npr. prethodno napunjene špriceve), ampule, patrone, rezervoare ili lio-injektore. Posuda za skladištenje može biti obrazovana od raznih materijala kao što su staklo ili plastika. U pojedinim primerima izvođenja, posuda za skladištenje je prethodno napunjen špric. Pogodni prethodno napunjeni špricevi obuhvataju, ali nisu ograničene na, borosilikatne staklene špriceve prevučene pečenim silikonom, borosilikatne staklene šprice prevučene raspršenim silikonom ili plastične špriceve od smola bez silikona.
[0137] Uobičajeno je da posuda za skladištenje može sadržavati formulacije i etiketu na, ili udruženu sa spremnikom, koja može ukazivati na uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, etiketa može ukazivati da se formulacija rekonstituiše do koncentracija proteina koje su prethodno opisane. Etiketa može dalјe ukazivati da je formulacija korisna ili predviđena za, na primer, IT primenu. U pojedinim primerima izvođenja, posuda za skladištenje može sadržavati pojedinačnu dozu stabilne formulacije koja sadrži terapijski agens (enzim koji se zamenjuje). U raznim primerima izvođenja, pojedinačna doza stabilne formulacije je prisutna u zapremini koja je manja od oko 15 ml, 10 ml, 5,0 ml, 4,0 ml, 3,5 ml, 3,0 ml, 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml, 1,0 ml ili 0,5 ml. Alternativno, posuda za skladištenje u kojoj se nalazi formulacija može biti bočica za višekratnu upotrebu koja omogućava ponovlјene primene (npr. od 2-6 primena) formulacije. Kompleti ili drugi predmeti proizvodnje mogu dalje uklјučivati drugi spremnik koji sadrži pogodan razblaživač (npr. BWFI, fiziološki rastvor, puferisan fiziološki rastvor). Nakon mešanja razblaživača i formulacije, finalna koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji će uglavnom iznositi najmanje 1 mg/ml (npr. najmanje 5 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml, najmanje 100 mg/ml). Kompleti ili drugi predmeti proizvodnje mogu dalјe uklјučivati i druge materijale koji su poželјni sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uklјučujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, IDD uređaje, katetere, špriceve, kao i ubačena uputstva za upotrebu.
[0138] Pronalazak će biti potpunije razumljiv sagledavanjem primera koji slede. Primere, međutim, ne treba tumačiti ograničavajućim za područje pronalaska.
PRIMERI
PRIMER 1: TOKSIKOLOGIJA ARILSULFATAZE A NAKON IT PRIMENE
[0139] Da bi se ispitala sposobnost drugih intrathekalno primenjenih rekombinantnih enzima da se distribuiraju u ćelije i tkiva CNS-a, sprovedena je GLP studija da bi se procenila intratekalna primena ponavlјene doze rekombinantno pripremlјene humane arilsulfataze A (rhASA) sa toksikološkog i sa stanovišta farmakološke bezbednosti, tokom perioda od jednog meseca, kod juvenilnih (mlađih od 12 meseci) cinomolgus majmuna. Formulacija rhASA je pripremljena i formulisana u nosaču sa 154 mM NaCl, 0,005% polisorbata 20 na pH 6,0.
[0140] Da bi se postiglo navedeno, devet mužjaka i devet ženki juvenilnih cinomolgus majmuna je prema telesnoj težini nasumično podeljeno u jednu od tri grupe za tretman, kao što je prikazano u Tabeli 6 koja sledi. Životinje su (sa izuzetkom 1 mužjaka za Dozu 1) primale kratkotrajanu IT infuziju zapremine 0,6 ml sa 0, 3 ili 31 mg/mL rhASA (ukupna doza 0, 1,8 ili 18,6 mg) svake druge nedelјe, a ukupno tri doze po životinji. Praćeni su telesna težina, klinička slika, urađeni su neurološki i fizički pregledi, klinička patologija, oftalmološki pregledi, kao i uzorkovanja za toksikokinetiku. Sve životinje su obdukovane 29., 30. ili 31. dana (~24 sata nakon poslednje IT doze). Odabrana tkiva su prikupljena, sačuvana i mikroskopski analizirana.
TABELA 6
[0141] Koncentracije rhASA koje su detektovane u tkivima CNS-a cinomolgus majmuna su određene ELISA analizom i upoređene su sa terapijskim cilјem koji je predstavljao 10% od normalne koncentracije rhASA kod čoveka, što odgovara približno koncentraciji od 2,5ng/mg tkiva. Uzorci tkiva ili punktati su izdvojeni iz različitih područja mozga cinomolgus majmuna i dalјe su analizirani na prisustvo rhASA. Slika 24 ilustruje tkiva iz kojih su uzorkovani punktati. Uzorci punktiranih tkiva su odražavali porast koncentracije rhASA, kao što je prikazano na Slikama 25A-G, sa gradijentom nakupljanja u smeru od kore velikog mozga do duboke bele mase i duboke sive mase.
[0142] Koncentracije rhASA koje su detektovane upotrebom istih punktata nakon i IT i ICV načina primene kod šest majmuna kojima je primenja doza od 18,6 mg rhASA, prikazane su na Slikama 26A-B. Koncentracije rhASA koje su detektovane u dubokoj beloj masi (Slika 25A) i u duboko sivoj masi (Slika 26B) tkiva mozga odraslih i juvenilnih cinomolgus majmuna kojima je intratekalno (IT) ili intracerebroventrikularno (ICV) primenjen rhASA, bile su uporedive.
[0143] Punktirani uzorci tkiva izdvojeni iz mozga odraslih i juvenilnih cinomolgus majmuna su zatim analizirani da bi se odredile koncentracije rhASA koje su se deponovale u uzorku tkiva koji je izdvojen, a da bi se takve koncentracije uporedile sa cilјnom terapijskom koncentracijom od 2,5 ng rhASA po mg proteina (što odgovara vrednosti od 10% normalne koncentracije rhASA kod zdravog subjekata). Kao što je prikazano na Slici 27A, u svakom analiziranom punktiranom uzorka tkiva, doza od 18,6mg IT primenjene rhASA je rezultovala koncentracijom rhASA koja je premašila ciljnu terapijsku koncentraciju od 2,5 ng/mg proteina. Slično navedenom, kada je doza rhASA od 1,8 mg primenjena na IT način juvenilnim cinomolgus majmunima, svaki analiziran uzorak tkiva je karakterisala koncentracija rhASA koja je bila unutar ili je premašivala terapijsku koncentraciju od 2,5 ng/mg proteina, dok je medijana koncentracija rhASA bila iznad terapijskog cilјa za sve ispitivane punktate tkiva (Slika 27B).
[0144] Da bi se utvrdilo da li se IT primenjena rhASA distribuirala do odgovarajućih ćelija, tkivo je analizirano iz duboke bele mase cinomolgus majmuna nakon IT primene 1,8 mg ASA, u područjima koja su ilustrovana na Slici 28A. Imunbojenje tkiva duboke bele mase je ukazalo na distribucija rhASA u ćelijama oligodendrocita cinomolgus majmuna, kao što je ilustrovano Slikom 28B. Slično tome, Slika 28C ilustruje da je IT primenjena rhrASA kolokalizovala u tkivima duboke bele mase cinomolgus majmuna. Preciznije, prilikom bojenja radi kolokalizacije sa ciljnim organelama, kao što je lizozom, to je bilo očigledno (Slika 28C), a što je dalje podržalo zaključak da je rhASA koja se IT primenjuje sposobna da se distribuira u relevantne ćelije, tkiva i organele CNS-a, uključujući lizozome oligodendrocita. Prethodno podržava zaklјučak da je razlika u isporuci rhASA između ICV i IT primene takođe bila minimalna.
PRIMER 2: BIODISTRIBUCIJA SA RADIOAKTIVNO-OBELEŽENIM PROTEINOM
[0145] rhASA obeležena sa emiterom pozitrona<124>J je pripremljena i formulisana u nosaču sa 154 mM NaCl, 0,005% polisorbatom 20 na pH 6,0. Zapremina formulacije koja je ekvivalentna 3 mg rhASA (što odgovara približno 3 8 mg/kg mozga) primenjena je odraslim cinomolgus majmunima intracerebroventrikularnim (ICV) i intratekalnim (IT) načinima primene. Cinomolgus majmuni su podvrgnuti analizama PET skeniranja visoke rezolucije (microPET P4) da bi se utvrdila distribucija primenjenog RhASA obeleženog sa<124>J.
[0146] Podaci PET skeniranja (Slika 29) ilustruju da se i ICV i IT primenjena rhASA koji je obeležen sa<124>J efektivno distribuirala do tkiva CNS-a, a naročito da se rhASA koja je obeležena sa<124>J i koja je primenjena putem IT-lumbalnog katetera, odmah i ravnomerno širila u cerebrospinalnoj tečnosti (CST) duž kičme. Preciznije, kao što je prikazano na Sl.29, nakon ICV- i IT-primene su detektovane terapijske koncentracije rhASA koja je obeležena sa<124>J, u tkivima CNS-a cinomolgus majmuna koji je bio subjekat, uklјučujući mozak, kičmenu moždinu i CST. Koncentracije rhASA koje su detektovane u takvim tkivima CNS-a, a posebno u tkivima mozga, premašivale su terapijsku ciljnu koncentraciju od 2,5 ng/mg proteina.
[0147] Dok je distribucija rhASA proteina bila uporediva i prilikom IT i ICV načina primene, ICV je rezultovao u znatno manjem deponovanju unutar kičmenog stuba, kao što je prikazano Slikom 29.
[0148] Dvadeset i četiri sata nakon primene formulacije, kako ICV tako i IT primenjen ASA koji je bio obeležen sa<124>J, bio je efektivno distribuiran do tkiva CNS-a. Preciznije, dvadeset četiri sata nakon IT primene, 12,4% of primenjene doze je bilo u kranijalnom regionu, u poređenju sa 16,7% doze koja je ICV primenjena. Shodno navedenom, koncentracije rhASA koja je detektovana u takvim tkivima CNS-a, a posebno u tkivima mozga prilikom IT primene rhASA, približile su se onim koncentracijama koje su ustanovljene nakon ICV primene iste doze.
[0149] ICV injeciranje rhASA koja je bila obeležena sa<124>J, rezultovalo je neposrednim prenošenjem injecirane zapremine do cisterne magna, cisterne pontis, cisterne interpedunkularis i proksimalne kičmu, kao što je ilustrovano na Slici 30. Kao što je takođe ilustrovano na Slici 30, u roku od 2-5 sati, IT primenom je isporučena rhASA koji je obeležena sa<124>J do istih početnih struktura (cisterni i proksimalne kičme) kao što je to prikazano za ICV primenu. Dvadeset i četiri sata nakon i ICV i IT primene, distribucije rhASA obeleženih sa<124>J su bile uporedive, kao što je ilustrovano na Slici 31. Prema tome, za razliku od lekova tipa malih molekula, prethodno navedeni rezultati ukazuju da ICV primena nudi minimalne prednosti u odnosu na IT primena rhASA.
[0150] Ovi rezultati potvrđuju da rhASA može biti isporučena subjektu upotrebom manje invazivnog IT načina primene i da se time mogu postići terapijske koncentracije u ciljnim ćelijama i tkivima.
[0151] Bolesti lizozomskog skladištenja predstavlјaju familiju genetičkih poremećaja koji su prouzrokovani nedostatkom ili oštećenim enzimima, što rezultuje abnormalnim nakupljanjem supstrata. Dok periferni simptomi povezani sa nekoliko od ovih oboljenja mogu biti efektivno ublaženi intravenskom primenom rekombinantnih enzima, ne očekuje se da će intravenska primena takvih rekombinantnih enzima značajno uticati na CNS manifestacije koje su udružene sa većinom bolesti lizozomskog skladištenja. Na primer, rekombinantna humana iduronat-2-sulfataza (Idursulfaza, Elaprase®; Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lexington, MA) je odobrena za lečenje somatskih simptoma Hanterovog sindroma, ali ne postoji farmakološka terapija za lečenje neuroloških manifestacije koje mogu uklјučivati odložen razvoj i progresivno mentalno oštećenje. Navedeno je delom posledica prirode I2S, koji je veliki, visoko glikozilovan enzim molekulske težine od približno 76kD koji ne prolazi krvno-moždanu barijeru nakon intravenske primene.
[0152] Predmetni pronalazači su stoga sproveli program za ispitivanje intratekalne (IT) isporuke intratrakalne formulacije rekombinantnih humanih enzima, kao što su, na primer, iduronat-2-sulfataza (I2S), arilsulfataza A (rhASA) i alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu). Rezultati koji su ovde prikazani predstavlјaju prve koji pokazuju da IT-lumbalna primena rekombinantnih lizozomskih proteina rezultuje isporukom značajne frakcije primenjenog proteina u mozak i, posebno, da dovodi do širokog deponovanja takvih proteina u neuronima mozga i kičmene moždine i kod cinomolgus majmuna i kod pasa. Imunohistohemijske analize tkiva CNS-a su pokazale da je protein ciljano dopremljen do lizozoma, mesto patološkog nakupljanja glikozaminoglikana u poremećajima lizozomskog skladištenja. Štaviše, morfološka pobolјšanja prikazana u IKO modelu miša Hanterovog sindroma, mišjem modelu Sanfilipo sindroma tipa B sa Naglu deficijencijom i<-/->ASA (engl. knockout) mišem modelu metahromatske leukodistrofije (MLD), podržavaju zapažanje da se IT primenjen enzim distribuira do odgovarajućih tkiva i transportuje do odgovarajućih ćelijskih odeljaka i organela.
[0153] Sličnosti koje su uočene u obrascima raspodele u mozga koji su detektovani nakon IT-lumbalne i ICV primene I2S sugerišu na opsežan protok i aktivno ponovno mešanje CST-a. Stoga su u kliničkom okruženju, i IT i ICV načini primene potencijalno izvodlјivi, međutim, uočeno nakupljanje I2S u kičmenoj moždini nakon IT primene obezbežuje jasnu prednost u rešavanju posledica na kičmu koje nastaju naknadno, kao i komponenti bolesti lizozomskog skladištenja kao što je Hanterov sindrom. Štaviše, otvori za injeciranje u kičmu su manje ivanzivni i očekuje se da su pogodniji za hroničnu upotrebu, posebno kod pedijatrijskih subjekata.
[0154] Dokazi o perivaskularnom bojenju ćelija i dinamici translokacije proteina koji su uočeni prethodnim studijama PET skeniranja, ukazuju da se enzimi kreću unutar perivaskularnog prostora, verovatno mehanizmima konvekcije koji su potpomognuti pulsiranjem. Dodatni mehanizam transporta je predložen na osnovu uočene veze I2S sa neurofilamentima koja ukazuje na aktivan aksonski transport. Drugonavedeno verovatno započinje interakcijom proteina sa neuronskim manoza-6-fosfatnim (M6P) receptorima, koji su široko eksprimirani na ćelijama kičmene moždine i mozga i koji nakon direktne primene u parenhim mozga mogu prouzrokovati da se enzim 12S lako apsorbuje od strane ciljne ćelije. (Begley i saradnici, Curr Pharm Des (2008) 14: 1566-1580).
[0155] Dok je aksonski transport lizozomskih enzima ranije pretpostavljan, indirektnim in vivo postupcima i in vitro snimanjima, trenutne studije obezbeđuju prve direktne dokaze o aksonskom transportu nevirusnih ili eksprimiranih enzima koji se isporučuju putem CST-a. Stoga, deluje da isporuka proteina iz CST-a do površine mozga i dublјe u moždano tkivo, zavisi od aktivnih procesa prenosa, od kojih nijedan nije prethodno opisan ili rasvetljen za isporuku proteina ili enzima u ćelije, tkiva i organele mozga.
[0156] Nasuprot preovlađujućem stavu da bi dinamika protoka korz parenhimski intersticijum i CST sprečiti distribuciju proteina koji je IT primenjen u lumabalni region do bele mase mozga, trenutne studije jasno pokazuju da IT isporuka lizozomskog enzima rezultuje u raspodeli i nakuplјanju proteina u svim tkivima mozga, kao i deponovanju u lizozomskom odelјku cilјnih ćelija koje su mesto patološkog nakupljanja glikozaminoglikana. (pogledati npr. Fenstermacher i saradnici, Ann N Y Acad Sci (1988) 531: 29-39 i DiChiro i saradnici, Neurology (1976) 26:1-8.) Zajedno sa manje invazivnom prirodom IT-lumbalne isporuke, ovaj put nudi klinički relevantna sredstva isporuke bioloških terapeutika u mozak, naročito kod dece.
PRIMER 3: FORMULACIJE ARILSULFATAZE A ZA IT PRIMENU
[0157] Ovaj primer sumira rad na uspostavlјanju tečnog doznog oblika sa visokom koncentracijom rhASA (arilsulfaze A) i formulacija lekovite supstance i lekovitog proizvoda za lečenje Metahromatske leukodistrofije (MLD) putem intratekalnog (IT) načina primene.
[0158] Podaci o stabilnosti pokazuju da je formulacija lekovite supstance i lekovitog proizvoda na bazi fiziološkog rastvora (bez PBS 20) stabilna nakon 18 meseci na < -65 stepeni C i 18 meseci na 2-8 stepeni C. Tokom farmaceutskog razvoja ovog proteina, rastvorlјivost i stabilnost rhASA su ispitivane u ograničenim uslovima pufera i eksipijensa zbog njegove previđene isporuke u CNS. Prethodno su urađene studije razvoja formulacije kako bi se razvila intravenska (IV) formulacija. Na osnovu rezultata ovih eksperimenata, formulacija koja sadrži 30 mg/ml rhASA u 10 mM citrat-fosfatnom puferu, pH 5,5, sa 137 mM NaCl i 0,15% poloksomera 188 je izabrana kao vodeća IV formulacija. rhASA je takođe formulisana za IT isporuku u tri formulacije i podaci o stabilnosti ovog proteina su ispitivani pod tim uslovima. Upotrebljene su serije rhASA koje su bile izvedene iz materijala koji predstavljaju prethodnike proizvoda na jednom mestu. Rezultati su pokazali da je rhASA stabilan u 154 mM rastvoru natrijum hlorida sa 0,005% polisorbata 20 (P20), pH 6,0, tokom najmanje 18 meseci, na 2 - 8 stepeni C. Dodatno, urađena su i ispitivanja da bi se pokazala stabilnost u pogledu razlaganja usled zamrzavanja/odmrzavanja i razlaganja prouzrokovano agregacijom.
[0159] Serije iz razvoja su prečišćene, ultrafiltrirane i dijafiltrirane (UF/DF) u 10 mM citrat/fosfata, 137mM NaCl, pH 5,5, sa naknadnim UF/DF do konačnog fiziološkog rastvora koncentracije od približno 40 mg/mL. UF/DF postupci su sumirani u Tabeli 7.
Tabela 7: Izabrane formulacije za UF/DF operacije iz Kscellerek-a izvedenog
rhASA
[0160] rhASA formulisana kao 40 mg/mL rhASA u 10 mM citrat natrijum fosfata sa 137mM NaCl, na pH 5,6 je podvrgnuta dijalizi u pet formulacija koje su korišćene za studije IT prethodne formulacije (Tabela 8).
TABELA 8: Odabrani puferi za skrining IT kompatibilnih formulacija
Postupci
[0161] Za određivanje temperature toplјenja (Tm) diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC), upotreblјen je kapilarni DSC mikrokalorimetar (MicroCal) pri brzini skeniranja od 60°C/h i sa opsegom temperature od 10-110°C. Osnovne vrednosti za pufer su oduzete od vrednosti dobijenih skeniranjem protina. Skeniranja su normalizovana na koncentraciju proteina u svakom uzorku (izmerenu apsorpcijom ultralјubičastog zračenja na 280 nm i upotrebom koeficijenta ekstinkcije od 0,69 (mg/mL)-1.cm-1). Za početne eksperimente kratkotrajne stabilnosti, rhASA lekovita supstanca je podvrgnuta skladištenju tokom bilo dve nedelјe na 40°C ili jednog meseca na 40°C. Dodatni uzorci su ispitani na kratkotrajnu stabilnost na 2-8°C tokom 3 meseca. Uzorci su profiltrirani (Millipore, P/N SLGV033RS), pa su alikvotirani na po 0,5 ml u bočice od 2 ml sa Flurotec šlifovanim čepom od 13 mm.
[0162] Uticaj kompozicije formulacije (Tabela 8) na Tm (srednja temperatura termički indukovane denaturacije) je ispitivan upotrebom DSC. Vrednosti Tm za različite kompozicije formulacija su prikazane na Slici 5. Vrednosti Tm su pokazale slične temperature odvijanja procesa kod većine formulacija, osim što su uočene niske Tm vrednosti za rhASA formulisanu bilo u 5mM natrijum fosfatu sa 154mM NaCl na pH 7,0 ili u 1mM natrijum fosfatu sa 2mM CaCl2i 137mM NaCl na pH 7,0.
[0163] Ispitan je takođe efekat termički indukovane razgradnje rhASA u pet izabranih formulacija (Tabela 8). Uzorci su čuvani bilo 2 nedelјe ili jedan mesec na 40°C ili 3 meseca na 2-8°C. SDS-PAGE (Coomassie) analiza uzoraka čuvanih 2 nedelјe na 40°C je ukazala na fragmentaciju rhASA formulisane u 5mM natrijum fosfatu sa 154mM NaCl na pH 7,0 kao i u 1mM natrijum fosfatu sa 2mM CaCl2i 137mM NaCl na pH 7,0 (Slika 6). Za druge formulacije nije uočeno ovakvo razlaganje.
[0164] Prisustvo produkata raspada je u skladu sa nižim procentom glavnog pika koji je uočen RP-HPLC postupkom u istim vremenskim tačkama (Tabela 10). Utvrđeno je takođe da rhASA formulisana u 1mM PBS-u sa 2mM CaCl2na pH 7,0 nije zadržavala svoj pH na početku i nakon kratkotrajnog izlaganja uslovima termičkog stresa.
[0165] HPLC sistemi firme Waters su korišćeni za ekskluzione HPLC analize po veličini i reverzno fazne analize. Za početnu analizu sa SEC-HPLC, 50 µg rhASA je injecirano na Agilent Zorbax GF-250 kolonu (4,6mm x 250mm) i izokratički propušteno pri 0,24 mL/min, upotrebom mobilne faze tipa 100 mM natrijum citrata pH 5,5 (detekcija oktomera) sa talasnom dužinom detekcije od 280 nm. Analize su ponovlјene upotrebom uslova mobilne faze tipa 100 mM natrijum citrata, pH 7,0 (detekcija dimera).
[0166] Sva ispitivanja izmena pufera i koncentracija su urađena upotrebom Centricon-Plus 20 (Millipore, 10 kDa MWCO).
Preformulacijske skrining studije - efekat vrste pufera i pH
[0167] Zbog ograničenog broja odobrenih rastvora kompozicija koji su upotrebljeni za primenu u CNS, samo pet izotoničnih rastvora kompozicija, kao što je navedeno u Tabeli 8, je izabrano za postupak skrininga.
pH memorija
[0168] Pre odabira pufera za dugoročnu stabilnost, urađena su dva eksperimenta „pH memorije“ kako bi se ispitalo da li je protein prilikom izmene pufera sa fiziološkim rastvorom sposoban da održava pH prvobitnog pufera. U početnom eksperimentu, rhASA koncentracije približno 8 mg/mL, je najpre dijalizom van u 10 mM citrat-fosfat sa 137 mM NaCl, bilo sa pH vrednostima od 5,5 ili 7,0, nakon čega je sledila druga dijaliza u fiziološki rastvor. U drugom eksperimentu, rhASA je podvrgnut dijalizi u 10 mM citrat-fosfat sa 137 mM NaCl, bilo sa pH vrednostima od 5,5 ili 7,0, a naknadno je pufer izmenjen i koncentrovan u fiziološke rastvore do približno 35 mg/mL.
[0169] Kada je rhASA, formulisan u 10 mM citrat-fosfatu sa 137 mM NaCl na pH vrednostima bilo od 5,5 ili 7,0, podvrgnut dijalizi u fiziološki rastvor, nije uočeno povećanje zamućenost. pH finalnog fiziološkog rastvora je bio sličan pH prethodnog citrat-fosfatnog pufera kome je rhASA bila izložena. Kada je rHASA, formulisana u puferima na bazi citrat-fosfata pH vrednosti od bilo 5,5 ili pH 7,0, podvrgnuta dijalizi u fiziološki rastvor i zatim koncentrovana do približno 35 mg/mL upotrebom Centricon filtera, pH rastvora proteina u fiziološkom rastvoru su se promenili sa pH 5,5 na 5,8 ili sa pH 7,0 do 6,8, tim redom. Oba koncentrovana rastvora rhASA u fiziološkom rastvoru su bila blago opalescentna i imala su vrednosti OD320 u opsegu od 0,064 (pH 6,8) do 0,080 (pH 5,5).
Izbor eksipijenasa
[0170] Polisorbat 20 (P20) je uklјučen u svih pet izabranih rastvora kompozicije, u finalnoj koncentraciji od 0,005%. Izbor surfaktanta je napravlјen na osnovu prethodnog iskustva in vivo podnošlјivosti P20 u koncentraciji od 0,005% za isporuku drugih proteina firme Shire u CNS. Pripremlјen je rastvor 5% P20 (v/v) i dodata je odgovarajuća zapremina svakoj proteinskoj formulaciji da bi se dobila finalna koncentracija od 0,005%.
Studije robusnosti formulacije - Studija stabilnosti
[0171] Na osnovu početnih rezultata dobijenih skriningom različitih pufera i pH vrednosti, izabrana su tri rastvora kompozicije za dugoročne studije stabilnosti (priprema uzorka kao u Tabeli 8. Započeta je jednogodišnja studija sa predloženim formulacijama (Tabela 9). Stabilnost uzoraka u svakoj vremenskoj tački je analizirana upotrebom SEC-HPLC, RP-HPLC, OD320, koncentracije proteina, pH, specifične aktivnosti, SDS-PAGE (Coomassie) i izgleda.
Tabela 9 - Formulacije za dugoročne studije stabilnosti
TABELA 10: STABILNOST IZBRANIH FORMULACIJA NAKON 2 NEDELJE NA 40±2°C
[0172] Nije uočena značajna promena u specifičnoj aktivnosti za uzorke pod stresom (Tabela 10). HPLC analiza ekskluzije po veličini je detektovala određen stepen degradacije u uslovima termalnog stresa tokom 2 nedelje skladištenja uzorka formulisanog u 5 mM natrijum fosfatu sa 154 mM NaCl na pH 7,0. Degradacija je bila očiglednija nakon SEC-HPLC analize, upotrebom uslova mobilne faze sa pH 5,5 koje indukuje udruživanje rhASA sa oktamerom. Pod ovim uslovima mobilne faze, rhASA formulisanu na pH 7,0 u 1mM PBS sa 2mM CaCl2je takođe karakterisala značajna degradacija.
[0173] Nakon izlaganja od 1 meseca na 40°C, uzorke formulisane u 5mM PBS-u, pH 7,0, i 1mM PBS-u, pH 7,0, sa 2 mM CaCl2je karakterisala fragmentacija koja je utvrđena sa SDS-PAGE (podaci nisu prikazani). U skladu sa ovim opažanjem, smanjenje procenta glavnog pika je takođe uočeno nakon RP-HPLC i SEC-HPLC analiza uzorka čuvanih u ove dve formulacije pH 7 (Tabela 11). Pad u specifičnoj aktivnosti, međutim, uočen je samo za rhASA formulisan u 5 mM PBS, pH 7,0.
Tabela 11: Stabilnost izabranih IT formulacija nakon 1 meseca na 40±2°C
[0174] Nakon 3 meseca skladištenja na 2-8°C, rhASA je zadržala svoju aktivnost u svim formulacijama (Tabela 12). Dodatno, rhASA je održavala >99,8% površine svog glavnog pika, što je ispitano SEC-HPLC analizom, u oba uslova mobilne faze. Podaci o stabilnosti za 3 meseca na 2-8°C su sumirani u Tabeli 12.
TABELA 12: STABILNOST IZABRANIH IT PUFERA NAKON 3 MESECA NA 2-8°C
[0175] RhASA formulisane u fiziološkom rastvoru, pH 7,0, i 1 mM PBS-u, pH 7,0, sa 2 mM CaCl2,takođe su ispitane nakon 3 meseca skladištenja u ubrzanom stanju od 25°C. Kao što je prikazano na Slici 7, rhASA podleže neznatnoj količini fragmentacije u ovim formulacijama (sa intenzitetom približnim intenzitetu pika nečistoće tipa 0,5% BSA).
[0176] Sveukupno, ispitivanja preformulacija su pokazala da se stabilnost rhASA održava na vrednostima pH opsega od 5,5 do 6,0. U svim studijama u kojima su upotrebljeni formulacioni rastvori sa pH 7,0, rhASA je karakterisala fragmentacija kao jedan od načina njene razgradnje. Rezultati termičkog stresa koji su dobijeni za IT formulacije kandidate na pH 7,0, bili su slični rezultatima termičkog stresa koji su dobijeni za IV formulacije (10 mM natrijum citrat-fosfat sa 137 mM NaCl) na pH 7,0, gde je takođe uočena fragmentacija. Na osnovu ovih studija, izabrane su tri formulacije koje slede, kao u Tabeli 9, za stidoke dugoročne stabilnosti.
Studije zamrzavanja/odmrzavanja
[0177] Eksperimenti zamrzavanja-odmrzavanja su sprovedeni izvođenjem tri ciklusa kontrolisanog zamrzavanja-odmrzavanja, od ambijentalne temperature do -50°C sa stopom od 0,1°C/min na policama Veriso Genesis 35EL liofilizatora. Za ovu studiju, alikvoti od po jedan mL lekovite supstance koja je bila formulisana u 30 mg/mL za svaki od pet rastvora za kompozicije (Tabela 8), raspoređeni su u staklene bočice od 3 mL.
[0178] Lekovita supstanca (38±4 mg/mL) je upotrebljena za sva ispitivanja zamrzavanja i odmrzavanja. Za eksperimente zamrzavanja i odmrzavanja malog obima, alikvoti lekovite supstance od po 2 ml su razdeljeni u staklene bočice od 5 Ml sa Flurotec šlifovanim čepom od 20 mm. Eksperimenti stesa tipa zamrzavanja i odmrzavanja su izvedeni bilo na policama Virtis Genesis 35EL liofilizatora ili na policama zamrzivača sa kontrolisanom stopom promene temperature (Tenney Jr Upright Test Chamber, Model: TUJR-A-VERV). Urađena su tri ciklusa zamrzavanja do -50°C i otapanja do 25°C, bilo sa stopom zamrzavanja i odmrzavanja od 0,1°C/min (upotrebom zamrzivača sa kontrolisanom stopom promene temperature) ili sa stopom zamrzavanja od 0,1°C/min i brzinom odmrzavanja od 0,03°C/min (upotrebom liofilizatora). Za studije masovnog zamrzavanja-odmrzavanja, po 90 ml lekovite supstance je raspodelјeno u polikarbonatne boce od 250 ml. Za studije zamrzavanja i odmrzavanja na suvom ledu, po 3 ml lekovite supstance je razliveno u polikarbonatne bočice od 5 ml (Biotainer P/N 3500-05) sa i bez polipropilenskih poklopaca sa navojem. Uzorci su zamrznuti preko noći na -65°C i zatim stavlјeni na suvi led u zatvorenu kantu. Za ove eksperimente su, kao kontrole studije, upotrebljene staklene bočice sa zapušačem koje su sadržavale istu zapreminu uzorka. Za studije zamrzavanja i odmrzavanja razblažene lekovite supstance, alikvoti od po 1 ml rastvora koncentracije 1 i 5 mg/ml su razliveni u polipropilenske epruvete od 2 ml i zamrznuti na ≤ -65°C. Zamrznuti uzorci su nakon toga odmrznuti na površini radnog stola. Ciklus je ponovlјen do 10 puta da bi se imitirao bilo kakav potencijalan stress koji može nastati prilikom rukovanju sa alikvotima referentnog standarda.
[0179] Efekat zamrzavanja-odmrzavanja na kvalitet rhASA u predloženim formulacijama sa 0,005% P20 je određen nakon 3 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja sa kontrolisanom brzinom procesa (0,1°C/min). Nije uočena promena izgleda rhASA i nisu identifikovani rastvorlјivi agregati ili materijali nastali razlaganjem, upotrebom bilo SEC ili RP-HPLC postupaka. Dodanto, redukujuća SDS-PAGE analizi nije ukazala na trake fragmentacije ili agregacije (podaci nisu prikazani). Tabela 13 sumira rezultate ovih studija.
TABELA 13: Efekat zamrzavanja-odmrzavanja na kvalitet rhASA lekovite supstance u studijama malog obima
[0180] Rezultati studija malog obima sa kontrolisanom brzinom zamrzavanja i odmrzavanja koje su urađene u triplikatu sa alikvotima lekovite supstance od 2 ml su sumirani u Tabeli 14. Nije uočena promena u kvalitetu lekovite supstance. Izgled zamrznute i odmrznute lekovite supstance je bio uporediv sa izgledom osnovnog uzorka. Nije upčeno ni smanjenje koncentracije proteina ili čistoće materijala.
TABELA 14: EFEKAT ZAMRZAVANJA-ODMRZAVANJA NA KVALITET RHASA LEKOVITE SUPSTANCE U
STUDIJAMA MALOG OBIMA
[0181] Svi eksperimenti su pokazali da rhASA zadržava svoje atribute kvaliteta nakon zamrzavanjaodmrzavanja. Treba napomenuti da je uočen mali trend pada u aktivnosti i reverzno faznom procentu glavnog pika za rhASA uzorke koncentracije 1mg/ml nakon deset ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja, kao što je prikazano u Tabeli 15.
TABELA 15: EFEKAT ZAMRZAVANJA-ODMRZAVANJA U STUDIJAMA MALOG OBIMA NA RHASA
LEKOVITU SUPSTANCU RAZBLAŽENU DO 1 MG/ML
Studije agitacije
[0182] Alikvoti od po 1,0 ml sterilnog profiltriranog proteina, formulisanog u dozi od 30 mg/ml u svakom od pet izabranih rastvora za kompozicije (Tabela 8) sa P20, su razdelјeni u staklene bočice od 3 ml sa Flurotec šlifovanim čepom od 13 mm. Bočice su stavlјene postrance na orbitalni šejker firme Labline i protresane tokom 24 sata na 100 obrtaja/min. Podešavanje je zatim povećano na 200 obrtaja/min tokom naredna 24 sata perioda protresanja.
[0183] Da bi se ispitala podložnost rhASA agitaciji, urađene su studije mućkanja i mešanja kako za lekovitu supstancu tako i za lekoviti proizvod u koncentracijama od 35,4 i 30 mg/mL, tim redom. Za ove studije, alikvota lekovite supstance od po 1,0 ml su razliveni u staklene bočice od 3 ml sa sa Flurotec šlifovanim čepom od 13 mm. Protrešene bočice su pregledavane svakog drugog sata tokom prvih 8 sati, a nakon toga u 24. i 48. satu. Bočice su uklanjane prilikom prvog zanka zamućivanja i analizirane. Izgled uzoraka je dokumentovan i uzorci su ispitivani upotrebom analiza pH, SEC-HPLC, specifične aktivnosti i OD320. Studije agitacije lekova su izvedene u triplikatu (u 154 mM NaCl, pH 6,0 sa 0,005% P20) i upoređene sa jednim ponovkom za lekovitu supstancu (u 154 mM NaCl, pH 6,0). Studije treskanja su takođe ponovlјene bez uklјučivanja P20 u formulaciju sa fiziološkim rastvorom. Za ove studije, razliveni su alikvoti bilo od 1 ml ili 3 ml lekovitog proizvoda koncentracije 30 mg/ml u bočice zapremine 3 ml kako bi se ispitivao efekat treskanja kao i zapremina gasne faze na kvalitet rhASA. Za ove studije treskanja je upotrebljena brzina od 220 obrtaja/min.
[0184] Početne studije protresanja rhASA za studije razvoja formulacija koje su urađene, pokazale su potencijalnu prednost prisustva surfaktanta. Za razvoj IT formulacija je stoga izabrano 0,005% P20 koje je uključeno u dalje studije treskanja. Nakon 15-24 sata mućkanja na 100 obrtaja/min, nisu uočene vidne promene ni za jednu od formulacija, pa je brzina mućkanja povećana na 200 obrtaja/min. Nije uočena promena izgleda tresenih uzoraka u predloženim formulacijama kandidatima nakon ukupno 48 sati mućkanja na 100 i 200 obrtaja/min. Uzorci su analizirani nakon ovog perioda, a rezultati su sumirani u Tabeli 16. Nijednim testom nije uočena bilo kakva promena. SDS-PAGE Coomassie analiza takođe nije pokazala prisutvo dodatne trake velike ili male molekulske težine u tresenim uzorcima (podaci nisu prikazani).
TABELA 16: REZULTATI STUDIJA PROTRESANJA ZA IZBRANE IT FORMULACIJE
[0185] Tokom prva 4 sata mešanja, nije uočena promena izgleda lekovite supstance (u 154 mM NaCl na pH 6,0) ili lekovitog proizvoda (u 154 mM NaCl, pH 6,0, sa 0,005% P20). Nakon 6 sati mešanja, i lekovita supstanca i lekoviti proizvod su postali su blago zamućeni (podaci nisu prikazani). Zamućenost je bila izraženija nakon 48 sati mešanja, kada u formulaciji nije bio prisutan P20. Dodatno, lekovita supstanca i lekoviti proizvod koji su bili izloženi tresenju su postali zamućeni nakon 24 sata. Slika 8 prikazuje zapažanja agitacije nakon 48 sati.
[0186] Tabela 17 i Tabela 18 sumiraju zapažanja studije agitacije.
TABELA 17: IZGLED RHASA LEKOVITE SUPSTANCE I LEKOVITOG PROIZVODA (SA P20) NAKON
PROTRESANJA
TABELA 18: IZGLED RHASA LEKOVITE SUPSTANCE I LEKOVITOG PROIZVODA (SA P20) NAKON
PROTRESANJA
[0187] Uzorci su nakon agitacije takože analizirani na OD320, pH, specifičnu aktivnost, RP-HPLC i SEC-HPLC. Rezultati su predstavlјeni u Tabeli 19 i Tabeli 20. Sveukupno, nije uočena značajna promena u kvaliteti rhASA nakon mešanja i protresanja, sa izuzetkom izgleda.
TABELA 19: UTICAJ 48 SATNIH PROTRESANJA NA LEKOVITU SUPSTANCU I LEKOVITI PROIZVOD
[0188] Nakon mešanja lekovitog proizvoda nakon 6 sati, sa 0,005% P20, jedan od tri replikata je postao mutan. Ovaj uzorak je uklonjen, a druga dva uzorka su mešana do 48 sati. Tabela 20 prikazuje prosečne podatke za duplikate uzoraka.
TABELA 20: EFEKAT PROTRESANJA OD 48 SATI NA LEKOVITU SUPSTANCU I LEKOVITI PROIZVOD
[0189] Na osnovu rezultata i vizuelnih zapažanja, lekovita supstanca i lekoviti proizvod nisu lako podložni degradaciji izazvanoj agitacijom, pošto je bilo potrebno 4 sata neprekidnog mešanja (pri podešavanju na broj 5) i 8 sati neprekidnog snažnog mućkanja (pri 220 obrtaja u minuti) da bi se promena u izgldu dogodila.
[0190] Studije protresanja su ponovlјene sa lekovitim proizvodom u odsustvu P20, Za ove studije, svaka bočica je bila napunjena bilo sa 1 ml ili 3 ml lekovitog proizvoda da bi se ispitao efekat protresanja, kao i zapremine gasovite faze na kvalitet rhASA. U bočicama od 3 ml napunjenim sa 1 ml, nije uočena promena izgleda lekovitog proizvoda tokom 8 sati mućkanja pri 220 obrtaja/min (n=2, podaci nisu prikazani). U bočidama bez gasne faze (n=1) je došlo do obrazovanja malih pahulјica, nekoliko vlakana i flokulentne materije sa bržom stopom u poređenju sa bočicama sa većim prostorom za gasnu fazu. Zapažanja dobijena nakon 48 h su prikazana na Slici 9.
[0191] Vizuelni rezultati su takođe sumirani u Tabeli 21 i Tabeli 22.
Tabela 21: IZGLED LEKOVITOG PROIZVODA U ODSUSTVU POLISORBATA 20 NAKON 48 SATI
PROTRESANJA U BOČICAMA OD 3 ML NAPUNJENIM SA 1 ML
Tabela 22: IZGLED LEKOVITOG PROIZVODA U ODSUSTVU POLISORBATA 20 NAKON 48 SATI
PROTRESANJA U BOČICAMA OD 3 ML NAPUNJENIM SA 3 ML
TABELA 23: REZULTATI NAKON 48 ČASOVA PROTRESANJA LEKOVITOG PROIZVODA U ODSUSTVU
POLISORBATA 20 U BOČICAMA OD 3 ML NAPUNJENIM SA 1 ML
TABELA 24: REZULTATI NAKON 48 ČASOVA PROTRESANJA LEKOVITOG PROIZVODA U ODSUSTVU
POLISORBATA 20 U BOČICAMA OD 3 ML NAPUNJENIM SA 3 ML
Studije kapaciteta puferisanja
[0192] Za određivanje puferskog kapaciteta rhASA, proizvod je titriran u triplikatu, bilo sa razblaženom kiselinom ili sa razblaženom bazom. Alikvoti od 10 ml lekovite supstance, bilo koncentracije 38 ili 30 mg/ml (potonji imitirua lekoviti proizvod), smešteni su u staklenu bočicu od 20 ml u koju je dodat mikro-magnetni štapić za mešanje. Alikvoti od po 1 µL 1N hlorovodonične kiseline (HCl) su dodavani u rastvor proteina, sadržaj je pomešan i pH je zabeležen. Eksperiment je nastavlјen dodavanjem spajkova 1 µL HCl, bez ispiranja pH sonde između merenja kako bi se izbeglo bilo kakvo razblaživanje, sve dok nije postignut pH od približno 5,5. Eksperiment je izveden u triplikatu i 5 mM fosfatnom puferu koji je sadržavao 150 mM natrijum hlorid, pH 6,0, a koji je paralelno titriran radi poređenja. Slično navedenom, lekovita supstanca u obe koncentracije je titrirana sa 1M natrijum hidroksidom (NaOH) do postizanja konačnog pH od približno 6,5. Da bi se ispitalo prisustvo bilo kakvog rezidualnog fosfata u rhASA, lekovita supstanca je analizirana induktivnom kuplujućom plazma masenom spektroskopijom (ICP-MS). Ispitivan je i puferski kapacitet razblažene rhASA lekovite supstance kako bi se osiguralo da se pH vrednost rastvora ne promeni nakon razblaživanja rastvora proteina. Razblaženi uzorci opsega od 30 mg/mL do 1 mg/mL su pripremlјeni u ependorficama zapremine 1,5 mL, a pH vrednosti su izmerene na početku razblaživanja i nakon nedelјu dana skladištenja na 2-8°C.
[0193] Rezultati ispitivanja titracije sa razblaženom kiselinom i razblaženom bazom su pokazali adekvatan puferski kapacitet rhASA rastvora. Za studije titracije upotrebom HCl, dodavanje približno 2 µL 1 M kiseline nije na početku promenilo pH ni lekovite supstance, ni puferske kontrole. Povećanje zapremine kiseline je, međutim, dovelo do dramatičnog pada pH pufera u poređenju sa rhASA lekovitom supstancom. Nakon dodavanja 13 µL 19 M HC1, pH puferske kontrole je bio za više od 2 pH jedinice niži od pH lekovite supstance. Koncentracija lekovite supstance od 30 mg/mL je takođe uklјučena u ovaj eksperiment da bi se imitirala koncentracija lekovitog proizvoda. Slika 10 ilustruje puferski kapacitet rhASA lekovite supstance u poređenju sa 5 mM natrijum fosfatnim puferom, pH 6,3, sa 150 mM natrijum hloridom prilikom titriranja sa kiselinom.
[0194] Titracija rhASA lekovite supstance sa natrijum hidroksidom je pokazala relativno različite rezultate (Slika 11) u pogledu održavanja pH vrednosti. Stopa promene pH se nije značajno razlikovala između lekovite supstance i puferske kontrole.
[0195] Na osnovu uočenih rezultata i bez želјe da budu vezani za bilo koju teoriju, verovatno je da rhASA doprinosi puferskom kapacitetu rastvora pošto asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu i histidinske bočne lance karakteriše sposobnost da deluju kao protonski akceptori i/ili donori kako bi se održao pH rastvora. Puferski kapacitet ovog proteina je takođe prethodno uočen prilikom studija sa preformulacijama u kojima je utvrđen efekat „pH memorije“. Zadržavanje pH je pokazano više puta i u laboratorijskim razmerama i u procedurama velikih razmera. Sveukupno, rezultati ova dva eksperimenta ukazuju da je puferski kapacitet rhASA u fiziološkom rastvoru preovladavajući u kiselom pravcu. Prema literaturi, puferski kapacitet za niže pH vrednosti je direktan pokazatelј većeg broja ostataka asparaginske kiseline i glutaminske kiseline unutar datog proteina u poređenju sa ostacima histidina. Iako nije želja da bude vezano sa bilo kojom teorijom, navedeno može zasita biti slučaj sa arilsulfatazom A u kojoj je prisutno ukupno 45 ostataka glutaminske kiseline, kao i asparaginske kiseline u poređenju sa 18 histidinskih ostataka.
[0196] Puferski kapacitet lekovite supstance se takođe može pripisati zaostalom vezanom fosfatu za koji je pokazano da je prisutan u lekovitoj supstanci upotrebom ICP-MS. Tabela 25 prikazuje količinu zaostalog fosfata koja je prisutna u tri različite LSDL serije lekovite supstance. Navedeni podaci takođe potvrđuju konzistentnost koraka ultrafiltracije i diafiltracije u procesu probnog obima.
Tabela 25: RAZIDUALNA KOLIČINA FOSFATA U LEKOVITOJ SUPSTANCI PROIZVEDENOJ U LSDL
[0197] Da bi se dalјe razumeo puferski kapacitet ovog proteina, ispitivan je i efekat razblaživanja na pH. Nakon razblaživanja rhASA lekovite supstance sa fiziološkim rastvorom do nižih koncentracija proteina, nije uočena promena pH vrednosti lekovite supstance. Potom, razblažene lekovite supstance su skladištene na 2-8°C tokom jedne nedelјe, nakon čega su ponovo urađena merenja pH. Tabela 26 sumira podatke. Rezultati pokazuju da razblaživanje i čuvanje na 2-8°C ne utiču na pH vrednosti razblažene lekovite supstance. Ovakva zapažanja dalјe potkreplјuju zaklјučak ispitivanja sa titracijom kiselinama i bazama koje su pokazale adekvatan puferski kapacitet rhASA lekovite supstance formulisane u fiziološkom rastvoru.
TABELA 26: PH VREDNOSTI RAZLBAŽENE RHASA LEKOVITE SUPSTANCE
[0198] Tokom ispitivanja razblaživanja rhASA i pH, uočeno je da izgled razblaženih uzoraka pokazuje smanjenje opalescencije u zavisnosti od koncentracije, tj. rhASA uzorci sa većim koncentracijama su bili više opalescentni u poređenju sa uzorcima sa nižim koncentracijama koji su bili skoro potpuno bistrog izgleda. Slika 12 prikazuje izgled razblaženog rhASA koji je uočen. Rastvor sa 1 mg/mL rhASA je pokazao izgled sličan vodi, dok je za izgled rastvora koncentracije 30 mg/mL utvrđeno da je između izgleda bilo koje od Referentnih suspenzija II i III ili III i IV.
Studije stabilnosti
[0199] Za studije stabilnosti, lekovita supstanca je formulisana kao 38±4 mg/mL u 154 mM NaCl, pH 6,0, dok je lekoviti proizvod formulisan kao 30±3 mg/mL u 154 mM NaCl, pH 6,0 u prisustvu i odsustvu 0,005% polisorbata 20. Alikvoti od po 1 ml lekovite supstance su razliveni u polikarbonatne bočice od 5 ml sa polipropilenskim zatvaračima na navijanje i čuvani na ≤ -65°C, od -15°C do -25°C i 2-8°C. Alikvoti od po od 1,0 do 1,1 ml lekovitog proizvoda su razliveni u staklene bočice od 3 ml sa Flurotec šlifovanim čepom od 13 mm i čuvani na 2-8°C, 25±2°C i 40±2°C. Bočice sa lekovitim proizvodom su tokom početne studije stabilnosti čuvane u uspravnom polozaju, a zatim je orijentacij obrnuta za potonje studi studije upotrebom lekovitog proizvoda bez P20. U svakoj vremenskoj tački, stabilnost uzoraka je ispitivana SEC-HPLC, RP-HPLC, OD320 analizama, određivanjem koncentracije proteina, pH, specifične aktivnosti, SDS-PAGE (Coomassie) i analizom izgleda. Peptidna mapa, glikanska mapa, kao i procenat formilglicina su rađeni na godišnjem nivou. Pored toga, drugonavedeni testovi su takođe urađeni u uslovima stresa i u ubrzanim uslovima.
[0200] Sveukupno, rezultati istraživanja preformulacije, zamrzavanja-odmrzavanja i agitacije ukazuju da su samo tri formulacije bile pogodne za dalјi razvoj. Za ove tri formulacije su započete dugoročne studije stabilnosti u prisustvu 0,005% P20. Tabela 27, Tabela 28 i Tabela 29 sumiraju podatke o stabilnosti za tri formulacije u odabranim vremenskim tačkama.
TABELA 27: DUGOROČNA STABILNOST NA 2-8°C ZA RHASU U 154 MM NACL, PH 5,9
Tabela 28: DUGOROČNA STABILNOST NA 2-8°C ZA RHASA U 154 MM NACL, PH 7,0
Tabela 29: DUGOROČNA STABILNOST NA 2-8°C ZA RHASA U 5 MM FOSFATNOM
PUFERU SA 145 MM NACL, PH 6,0
[0201] Studije stabilnosti, izvedene za do 11 meseci na 2-8°C, ukazale su da se kvalitet rhASA održava u prototipskim formulacijama. HPLC profili ekskluzije po veličini za rhASA u fiziološkom rastvoru, pH 5,9, su prikazani na Slikama 13 i 14. HPLC ekskluzija po veličini nije detektovala bilo kakve značajne promene koje su povezane sa stanjem rhASA nakon 11 meseci skladištenja na 2-8°C.
[0202] Sveukupno, kvalitet lekovitog proizvoda u sve tri formulacije koje su kandidati je bila odžana nakon 11 meseci skladištenja na 2-8°C
PRIMER 4 - TOKSIKOLOGIJA
[0203] Ovaj primer ilustruje intratekalnu (IT) primenu rhASA sa ponovlјenom dozom iz perspektive toksikološke i bezbednosne farmakologije tokom perioda od šest meseci. Proizvod koji je ispitivan za IT, u ovoj studiji je bio rhASA. Trideset šest mužjaka i 36 ženki cinomolgus majmuna je nasumično podeljeno u pet grupa tretmana. Životinje iz Grupe 1 su bile netretirane i sa implantiranim kontrolnim uređajem (priključkom i kateterom), odnosno nisu primale dozu sa nosačem ili proizvodom koji je ispitivan; međutim, ovim životinjama je davana doza sa 0,6 ml PBS-a prema rasporedu koji odgovara rasporedu primene doze ispitivanog proizvoda. Životinje u Grupama 2-5 su primale po 0,6 ml IT infuzije od 0, 3, 10 ili 31 mg/ml rhASA (ukupna doza 0; 1,8; 6,0 ili 18,6 mg) svake druge nedelјe (tj. ukupno 12 doza). Životinje su podvrgnute nekropsiji u 6 meseci (24 sata nakon poslednje IT doze), dok su preostale 4 životinje/pol/grupa bile podvrgnute nekropsiji na kraju četvonedelјnog perioda oporavka. Izabrana tkiva su prikupljena, sačuvana i mikroskopski ispitana.
[0204] U principu, promene vezane za proizvod koji je ispitivan mogu biti kategorizovane u dva glavna tipa i bile su prisutne kod svih nivoa doza (1,8; 6,0 i 18,6 mg/dozi). Povećanje infiltrata (belih krvnih zrnaca, obično sa izraženom eozinofilnom komponentom) u moždanim ovojnicama, parenhimu mozga, parenhimu kičmene moždine, trigeminalnom ganglion i povremeno korenovima/ganglijima spinalnih nerava (ili epineurijumu koji okružuje ove strukture). Bez želјe da bude vezano za bilo koju teoriju, navedeno povećanje je protumačeno kao posledica prisustva ispitivanog proizvoda (proteina) u intratekalnom prostoru i u tkivima nervnog sistema. Blago fokalno povećanje mikroglijskih ćelija u kičmenoj moždini i mozgu kod pojedinih životinja (mikroglioza nije uočena kod životinja sa visokim dozama). Bez želјe da bude vezano za bilo koju teoriju, obe kategorije morfoloških promena su protumačne kao odgovor na prisustvo ispitivanog proizvoda. Nije bilo dokaza o nekrozi neurona kod nijedne životinje. Nijedna promena koja je bila povezana sa ispitivanim proizvodom nije dalje bila povezana sa bilo kojim biološki štetnim reakcijama u mozgu, kičmeni moždini, korenovima ili ganglijama spinalnih nerava. Preciznije, nije bilo dokaza o nekrozi neurona ili biološki važnom glijskom odgovoru. Nije bilo ni lezija koje su se mogle povezati sa ispitivanim proizvotom u tkivima različitim od nervnog sistema.
[0205] Nakon perioda oporavka u trajanju od jednog meseca (perioda bez primena doza), promene u vezi sa ispitivanim proizvodom su bile ili u potpunosti razrešene ili su bile ograničene na ostatke prethodnog porasta u inflamatornom odgovoru koji je bio povezan sa prisustvom proizvoda koji je ispitivan. Nije bilo štetnih morfoloških efekata kod životinja koje su se oporavlјale. Na osnovu objektivnog mikroskopskog pregleda kojim je određivana semikvantitativna procena bojenja, imunohistohemijsko bojenje arilsulfataze A (rhASA; proizvod koji je ispitivan) je bilo povećano u mozgu i kičmenoj moždini, u raznim tipovima ćelija osim u neuronima, kod svih tretiranih grupa prilikom terminalnog žrtvovanja. Ovo povećanje je bilo očigledno i u Kupferovim ćelijama jetre. Nakon jednomesečnog perioda oporavka, rhASA bojenje u životinjama tretiranim ispitivanim proizvodom (sve dozne grupe) je bilo vraćeno na nivo kontrole (sa uređajem i/ili tretirane nosačem). Kod jednog mužjaka iz grupe niske doze, nakon poravka je bilo prisutno više žarišta i mesta gubitka neurona, što je ukazalo višestruke regione prethodne ishemije u kori velikog mozga. Iako tačna patogeneza ovih lezija kod ove životinje nije bila očigledna, nedostatak sličnih lezija u bilo kojoj drugoj životinji tretiranoj ispitivanim proizvodom, uklјučujući životinje koje su primale vioku dozu od 10X, ukazivao je da ove lezije nisu bile povezane sa ispitivanim proizvodom.
[0206] Ispitivani proizvod za IT primenu u ovoj studiji je bio rhASA. Trideset šest mužjaka i 36 ženki cinomolgus majmuna je nasumično podeljeno u pet grupa tretmana. Životinje iz Grupe 1 su bile netretirane i sa implantiranim kontrolnim uređajem (priključkom i kateterom), odnosno nisu primale dozu sa nosačem ili proizvodom koji je ispitivan; međutim, ovim životinjama je davana doza sa 0,6 ml PBS-a prema rasporedu koji odgovara rasporedu primene doze ispitivanog proizvoda. Životinje u Grupama 2-5 su primale po 0,6 ml IT infuzije od 0, 3, 10 ili 31 mg/ml rhASA (ukupna doza 0; 1,8; 6,0 ili 18,6 mg) svake druge nedelјe (tj. ukupno 12 doza). Životinje su podvrgnute nekropsiji u 6 meseci (24 sata nakon poslednje IT doze), dok su preostale 4 životinje/pol/grupa bile podvrgnute nekropsiji na kraju četvonedelјnog perioda oporavka. Izabrana tkiva su prikupljena, sačuvana i mikroskopski ispitana. Tabela u nastavku teksta prikazuje dizajn studije koji se odnosio na patološki aspekt ove studije.
[0207] U vreme žrtvovanja, mozak je issečen u modli za možak na koronarne presek debljine od približno 3 mm. Prvi presek i svaki drugi presek je zatim fiksiran u formalinu za histopatološku analizu i imunohistohemijsku analizu. Mozak je proceruiran u vidu potpunih koronarnih preseka. Navedeni preseci su obuhvatali najmanje regiona mozga koji slede.
● Neokorteks (uklјučujući frontalnu, parijetalnu, temporalnu i okcipitalnu koru velikog mozga):
preseci mozga od 1 do 8 (i presek 9 kada je postojao)
● Paleokorteks (olfaktorne bulbuse i/ili piriformni režanj): preseci mozga od 1 do 3
● Bazalne ganglije (uklјučujući kaudatus i putamen): preseci mozga 3 i 4
● Limbički sistem (uklјučujući hipokampus i cingulatni girus): preseci mozga 4 i 5
● Regioni talamusa/hipotalamusa i srednjeg mozga, uklјučujući substanciju nigru: preseci mozga 4 i 5
● Mali mozak, Varolijev most i produženu moždinu: preseci mozga od 6 do 8 (i presek 9 ukoliko je postojao).
[0208] Preseci mozga su navedeni u vidu liste u podacima Tabele kao preseci od 1 do 8/9 (presek 9 je bio obezbeđen od strane centra koji je vršio ispitivanje za pojedine životinje). Seciranje je blago variralo među životinjama. Preseci mozga koji su prethodno navedeni u listi (od 1 do 8/9) su bili lokacija koje približno odgovaraju raznim anatomskim regionima. Preseci mozga su navedeni u vidu liste u podacima Tabela kao individualni preseci, sa dijagnozama koje su važne za taj presek, a da bi se olakšao mogući, budući dodatni ponovni pregled mikroskopskih pločica (ukoliko uopšte). Tokom tumačenja podataka, upoređivana su pojedinačna anatomska mesta u mozga (kao što je prethodno navedeno) kako bi se identifikovali bilo kakvi jedinstveni efekti proizvoda koji je ispitivan (tj. jedinstveni za određeni region mozga). Na TPS-u, svi preseci mozga svih životinja su bili parafinizovani, isečeni na 5 mikrona, obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i mikroskopski analizirani. Pored toga, mozgovi životinja iz kontrolne i grupe sa visokom dozom su obojeni sa Fluoro-Žad B bojom (bojom koja povećava osetlјivost prilikom procene degeneracije neurona u mozgu), a urađena je i impregnacijom srebrom po Bielschowsky-om (postupak koji omogućava direktnu vizualizaciju aksona, dendrita i neuronske filamente), nakon čega su analizirani.
[0209] Kičmena moždina (cervikalna, torakalna i lumbalna) je isečena na preseke debljine jednog centimetra. Prvi presek i svaki drugi presek su zatim fiksirani u formalinu za histopatološku procenu i imunohistohemijsku analizu. Preseci kičmene moždine (cervikalni, torakalni (uklјučujući vrh katetera) i lumbalni) kod svih životinja su iseeni na približno 5 mikrona, obojeni H&E i pregledani analizom poprečnih i kosih regiona koji su slikani na svakom nivou. Serijski preseci kičmene moždine iz kontrolnih i grupa sa visokim dozama su dodatno obojeni Bielschowsky-jevom srebrnom bojom i anti-GFAP antitelima (imunohistohemijsko bojenje koje omogućava direktnu vizualizaciju astrocita i njihovih nastavaka).
[0210] Dorzalni korenovi kičmenog nerva i ganglion (uzeti u srednjem cervikalnom, srednjem torakalnom i srednjem lumbalnom regionau) su parafinizovani, pa su serijski preseci obojeni sa H&E.
Dodatno, serijski preseci iz kontrolnih i grupa sa visokim dozama su impregnirani srebrom po Bielschowsky-om.
[0211] Za preseke išijadičnog, tibijalnog i suralnog nerva iz svih životinja: Uzdužni presek svakog nerva je bio parafinizovan, isečen na po približno 5 mikrona i obojen sa H&E. Poprečni presek svakog nerva je naknadno fiksiran u osmijumu, impregnirano Spurr-ovom smolom, isečeno na približno 1 do 2 mikrona i obojen toluidin plavim. Postfiksacija osmijumom i impregnacija smolom je obezbedila vrhunsko očuvanje mijelina u perifernim nervima i samim tim detalјniji pregled nerava.
[0212] Sva prikuplјena tkiva i grube lezije su prikuljene prilikom nekropsije iz svih životinja, pa su parafinizovane, bojenje sa H&E i mikroskopski pregledane. Histopatološka obrada i procene, kao i imunohistohemijske analize su urađene od strane TPS-a.
Bojenje arilsulfatazom A (rhASA)
[0213] Sponzor studije je dostavio mikroskopske pločice sa pozitivnim kontrolama. Pločice su bile sa presecima jetre iz miševa injeciranjih sa rhASA. Sve mikroskopske pločice sa pozitivnim kontrolama su pokazale obilje dokaza za rhASA u Kupferovim ćelijama (sinusoidnim makrofagima) u jetri. Pločice sa pozitivnim kontrolama su čuvane sa ostalim pločicama iz studije. Sve analize preseka obojenih sa rhASA su inicijalno izvedene objektivnom analizom bez uvida u grupu tretmana životinja. Navedeno je postignuto tako što je patolog u početku analizirao pločice na kojima je na zatamnjenoj nalepnici bio obeležen samo broj životinje (od strane asistenta koji je poznavao koja je životinja zapravo analizirana), diktirajući ocenu (stepen ozbilјnosti) tokom evaluacije, a koju je asistent odmah beležio u Tabele podataka za ocenu bojenja (stepena ozbiljnosti). Identifikaciju životinje su zatim verifikovali i neuropatolog studije i asistent, kako bi se zagarantovao tačan unos podataka. Ovaj postupak je sproveden tako da ne unosi nikakvu pristranost u procenu ukupnog intenziteta imunohistohemijskog bojenja za detekciju intracelularne rhASA. Relativan stepen bojenja neurona, meningealnih makrofaga, perivaskularnih makrofaga i glijskih ćelija (astrocita i mikroglijskih ćelija, ali verovatno pretežno mikroglijskih ćelija) je ocenjen na svim presecima možda i kičmene moždine. Prosečna ocena ozbilјnosti na svakom nivou mozga i kičmene moždine za svaku od grupu je sabrana (po grupi) i zabeležena kao ukupna vrednost u kolonama označenim sa Mozak, Opšte, rhASA bojenje i Kičmena Moždina, Opšte, rhASA bojenje.
[0214] Generalno, rhASA bojenje u neuronima mozga je predstavljalo meru neurona u kori velikog mozga i drugim površinama jedara u mozgu. Bojenje rhASA u meningealnim makrofazima je bilo dokaz preuzimanja ispitivanog proizvoda i/ili endogenog rhASA u meningealnim makrofazima. rhASA bojenje perivaskularnih makrofaga je bilo mera preuzimanja rhASA od strane makrofaga u mozgu/kičmenoj moždini (ili endogenog rhASA), mada treba napomenuti da je perivaskularni prostor u mozgu i kičmeni moždini (Virhov-Robinsonov prostor) kontinualan sa moždanih ovojnicama. U principu, ocenjivanje rhASA bojenja u glijskim ćelijama je predominantno merilo preuzimanja ispitianog proizvoda/penetracije ispitivanog proizvoda u sivu i/ili belu masu, posebno u kori velikog mozga (corona radiata je bela masa ispod kore velikog mozga). Delovalo je da je rhASA bojenje u beloj masi bilo u astrocitima i mikroglijskim ćelijama.
[0215] Šema ocenjivanja koja sledi je upotrebljena za ocenjivanje stepena rhASA obojenosti raznih vrsta ćelija (neurona, glijskih ćelija, makrofaga).
Objašnjenje sistema ocenjivanja (% od moguće obojenih ćelija)
[0216]
1 Manje od 10%
2 Više od 10 do 25%
3 Više od 25 do 50%
4 Više od 50 do 75%
5 Više od 75%
[0217] Potrebno je napomenuti da navedena šema nije strogo kvantitativna. Šema je upotrebljavana kao efikasan, semi-kvantitativna postupak procene stepena obojenosti rhASA u mozgu i kičmenoj moždini. Neuropatolog studije je primetio da nisu sve površine sa neuronima bile obojena na rhASA. Takođe je uočeno da je kod pojedinih kontrolnih životinja došlo do endogenog bojenja neurona, kao i da su ćelije horoidnog pleksusa i neuroni ganglija dorzalnih korenova imali tendenciju da se jače boje na rhASA, čak i u kontrolnim životinjama. BOjenje horoidnog pleksusa i ganglija dorzalnih korenova nije bilo procenjivano ali je neuropatolog studije primetio da je upadljivo, čak i u kontrolnim životinjama.
[0218] Napomena: Sve dozne grupe: Niska doza = 1,8 mg/dozi; Srednja doza = 6,0 mg/dozi; Visoka doza = 18,6 mg/dozi. Nisu uočene lizije koje su se mogle povezati sa ispitivanim proizvodom u tkivima sistema različitih od nervnog, osim u slučaju pojačanog rhASA bojenja u jetri svih doznih grupa (mužjaka i ženki; pogledati ispod).
Terminalno žrtvovanje životinja (primena doze svake druge nedelje tokom 6): preseci obojeni na rhASA
[0219] Došlo je do povećanja rhASA bojenja u sledećim tipovima tkiva/ćelija. Kada je razmatran efekat ispitivanog proizvoda na stepen rhASA bojenja u određenoj vrsti ćelije u određenoj doznoj grupi, za poređenje su uzemani u obzir nivoi bojenja u kontroli za nosač i kontroli sa uređajem iz istog eksperimetna (koje su žrtvovane istovremeno kao životinje nakon perioda oporavka).
[0220] Mozak, moždane ovojnice, makrofagi (sve dozne grupe, mužjaci i ženke)
● Mozak, perivaskularni, makrofagi (sve dozne grupe, mužjaci i ženke)
● Mozak, glijske ćelije (sve dozne grupe, mužjaci i ženke)
● Kičmena moždina, moždane ovojnice, makrofagi (sve dozne grupe, mužjaci i ženke)
● Kičmena moždina, perivaskularni, makrofagi (sve dozne grupe, mužjaci i ženke)
● Kičmena moždina, glijske ćelije (mužjaci i ženke iz grupa srednje i velike doze)
● Ćelije jetre, Kupferove ćelije (sve dozne grupe, mužjaci i ženke)
[0221] Zbog endogenog bojenja, najteže je bilo specifično definisati nivo rhASA bojenja u neuronima mozga i kičmene moždine. Bojenje na rhASA je ukazalo na konzistentno povećane nivoe rhASA u perivaskularnim makrofagima moždane ovojnicealnog sistema i mozga/kičmene moždine, kao i unutar glijskih ćelija. Nisu bile uočene razlike u rhASA bojenju u neuronima između kontrolnih i životinja koje su tretirane ispitivanim proizvodom.
Žrtvovanje životinja nakon oporavka (primena doze svake druge nedelje tokom 6, nakon čega je sledio 1 mesec bez primene doza)
[0222] U principu, promene vezane za ispitivani proizvod su ili potpuno razrešene ili su bile vidlјivo umanjene kod onih životinja kojima je dozvoljen period bez primene doza u trajanju od mesec dana pre nekropsije. Mikroskopske promene koje slede su bile prisutne sa učestalošću i/ili ozbilјnošću koje su ukazivale na moguću vezu sa ispitivanim proizvodom.
[0223] Mikroskopske promene koje su povezane sa ispitivanim proizvodom (životinje koje su se oporavlјale)
● Mozak, moždane ovojnice, infiltrati (grupe srednje i velike doze, oba pola) (Slike 16 i 17) ● Mozak, moždane ovojnice, infiltrati, % eozinofila (mužjaci, grupa srednje doze; ženke, grupa visoke doze)
● Mozak, perivaskularni, infiltrati (mužjaci, grupa srednje doze; ženke, grupa visoke doze) (Slika 18)
● Mozak, perivaskularni, infiltrati, % eozinofila (mužjaci, grupa srednje doze; ženke, grupa visoke doze)
● Mozak, siva masa infiltrati (sve dozne grupe, oba pola)
● Mozak, siva masa infiltrati, % eozinofila (mužjaci, grupa niske doze)
● Mozak, siva masa, eozinofili, nekroza (mužjaci, grupa niske doze)
● Kičmena moždina, moždane ovojnice, infiltrati (mužjaci iz grupa srednje i velike doze; ženke iz grupa niske i visoke doze)
● Kičmena moždina, moždane ovojnice, infiltrati, % eozinofila (mužjaci, grupa srednje doze;
ženke, grupa niske doze)
● Kičmena moždina, siva masa, infiltrati (ženke, grupa niske doza)
● Kičmena moždina, siva masa, infiltrati, % eozinofila (ženke, grupa niske doza)
● Ganglion dorzalnog korena i korenovi, epineurijum, infiltrati (ženke, grupa srednje doze) ● Korenovi i ganglije spinalnih nerava, infiltrati, eozinofili (mužjaci iz grupa srednje i visoke doze;
sve doze, ženke)
● Trigeminalni ganglion, infiltrati, eozinofili (mužjaci i ženke iz grupe srednje doze)
[0224] Za sve navedene promene je protumačeno da predstavljaju ostatke povećanih inflamatornih promena koje su zabeležene prilikom terminalnog žrtvovanja životinja. Kao prilikom terminalnog žrtvovanja životinja, nije bilo dokaza da je povećanje infiltrata inflamatornih ćelija koje je i dalјe bilo prisutno kod nekih životinja nakon oporavka, predstavljalo morfološke promene koje su prouzrokovale bilo kakve štetne efekte. U tkivima sistema različitih od nervnog, nije bilo ni lezija koje su se mogle povezati sa ispitivanim proizvodom.
Žrtvovanje životinja nakon oporavka (primena doze svake druge nedelje tokom 6, nakon čega je sledio 1 mesec bez primene doza): rhASA bojenje
[0225] Nije bilo indikacija povećanog rhASA bojenja kod mužjaka ili ženki koji su se oporavljali u poređenju sa kontrolama za uređaj i/ili nosač. U mozgu mužjaka iz grupa niskih, srednjih i visokih doza, nakon oporavka su zapravo postojali pokazatelјi smanjenog rhASA bojenja u pojedinim tipovima ćelija (ovo je variralo među tretiranim grupama) u poređenju kontrolama za uređaj i/ili nosač. Razlog za navedeno, uklјučujući i da li je to stvaran efekat, nije bio očigledan. Jedno od mogućih objašnjenja bilo bi da primena egzogene rhASA može prouzrokovati neko smanjenja proizvodnje endogene rhASA. Sličan nalaz nije bio prisutan u kičmenoj moždini mužjaka. Kod mužjaka i žena koji su se oporavlјali, bojenje u jetri je bilo slično onome koji je uočeno u kontrolama.
[0226] Generalno, promene koje su povezane sa ispitivanim proizvodom mogu biti svrstane u dve glavne vrste i bile su prisutne u slučaju svih nivoa doze (1,8; 6,0 i 18,6 mg/dozi).
[0227] Povećanje infiltrata (belih krvnih zrnaca, obično sa izraženom eozinofilnom komponentom) u moždanih ovojnicama, parenhimu mozga, parenhimu kičmene moždine, trigeminalnom ganglionu i povremeno korenovima/ganglijima spinalnih nerava (ili epineurijumu koji okružuje te strukture). Ovo povećanje je protumačeno kao rezultat prisustva ispitivanog proizvoda (proteina) u intratekalnom prostoru i u tkivima nervnog sistema.
[0228] Blago, fokalno povećanje mikroglijskih ćelija u kičmenoj moždini i mozgu kod pojedinih životinja (mikroglioza nije uočena kod životinja iz grupe visoke doze). Obe kategorije morfoloških promena su protumačene kao odgovor na prisustvo ispitivanog proizvoda. Nije bilo dokaza o nekrozi neurona u nijednoj životinji. Nijedna od promena koja je povezana sa proizvodom koji je ispitivan, nije bila u vezi sa bilo kojom od biološki štetnih reakcija u mozgu, kičmenoj moždini, korenovima ili ganglijima spinalnih nerava. Preciznije, nije bilo dokaza o nekrozi neurona ili o biološki važnom glijskom odgovoru. Nije bilo ni lezija u tkivima sistema različitog od nervnog koje su se mogle povezati sa ispitivanim proizvodom. Nakon jednomesečnog perioda oporavka (perioda bez primene doza), promene u vezi sa ispitivanim proizvodom su bile u potpunosti razrešene ili su bile ograničene na ostatke prethodnog porasta u inflamatornom odgovoru koji je bio povezan sa prisustovm ispitivanog proizvoda. Nije bilo ni štetnih morfoloških efekata kod životinja koje su bile ostavljene da se oporave.
[0229] Na osnovu objektivnog mikroskopskog pregleda kojim je utvrđena semi-kvantitativna procena bojenja, upčeno je da je imunohistohemijsko bojenje arilsulfatazom A (rhASA; ispitivani proizvod) povećano u mozgu i kičmenoj moždini, u različitim vrstama ćelija, osim u neuronima, u svim grupaka koje su tretirane ispitivanim proizvodom. Ovo povećanje je bilo očigledno i u Kupferovim ćelijama jetre. Nakon jednomesečnog perioda oporavka, rhASA bojenje u životinjama tretiranim ispitivanim proizvodom (sve dozne grupe) se bilo vratilo na nivo kontrole (sa uređajem i/ili nosačem). Kod jednog mužjaka iz grupe niske doze, nakon oporavka je došlo do pojave višestrukih žarišta astrocitoze i gubitka neurona, što ukazuje na više oblasti prethodne ishemije u kori velikog mozga. Iako tačna patogeneza ovih lezija kod ove životinje nije bila očigledna, nedostatak sličnih lezija u bilo kojim drugim životinjama tretiranim ispitivanim proizvodom, uklјučujući životinje iz grupe visoke doze koje su primile dozu od 10X, ukazivalo je da ove lezije nisu povezane sa ispitivanim proizvodom. Na osnovu strogo grubih i mikroskopskih nalaza (parafinskih preseka obojenih hematoksilinom i eozinom) u ovoj studiji, nivo kod koga nisu uočeni štetni efekti (NOAEL) je bio 18,6 mg.
PRIMER 5 - FARMAKINETIČKI PODACI
Podaci o životinjama nakon 6 meseci
[0230] Ovaj primer obezbeđuje interpretativnu analizu serumskih i CST koncentracija rhASA i antirhASA serumskih antitela kompanije Northern Biomedical Research, Inc.
[0231] Cilј primera je bio da se proceni intratekalna (IT) primena rhASA sa ponavlјanjem doze iz perspektive toksikološke i farmakologije bezbednosti kod juvenilnih (<12 meseci starosti) cinomolgus majmuna. U periodu od šest meseci je bilo dato ukupno 12 doza. Životinje su obdukovane 24 sata ili mesec dana nakon poslednje doze. Dizajn studije je prikazan u Tabeli 30.
TABELA 30: Dizajn studije
Postupci ispitivanja - Analiza antitela
[0232] Kvantitacija anti-rhASA antitela u serumu i CST-u cinomolgus majmuna je urađena upotrebom validiranog postupka. Ukratko, ispitivanje je započeto blokiranjem ploče prevučene MSD streptapogledatinom, nakon čega je sledila inkubacija sa rhASA obeleženim sa biotinom. Nakon koraka ispiranja, u ploču su dodati razblaženi uzorci, kalibratori i reagensi kontrole kvaliteta, pa je ploča inkubirana. Nakon dodatnog koraka ispiranja, dodat je lek obeležen sa SULFO TAG-om i nastavljana je inkubacija. Zatim je urađen konačan korak ispiranja i dodat je puger za MSD očitavanje. Proče su odmah očitane. Podaci signala u relativnim jedinicama luminiscencije (RLU) su analizirani upotrebom SOFTMax Pro matrica.
Koncentracija u serumu i CST-u
[0233] Kvantifikacija rhASA u serumu i CST-u cinomolgus majmuna je urađena upotrebom validiranog postupka. Postupak se zasniva na tehnologiji imunosorbentnih testova povezanih sa enzimom (ELISA). Ukratko, mikrotitar ploča je obložena zečjim poliklonskim antitelom (SH040) dobijenim na rekombinantnu humanu arilsulfatazu A (ASA). Nakon inkubacije sa ASA referentnim standardima i ispitnim uzorcima, vezani ASA protein je detektovan preko anti-ASA monoklonskog antitela (klon 19-16-3) konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP). Ploča je zatim inkubirana sa supstratom za HRP, TMB peroksidazom. Ova reakcija enzima i supstrata je zaustavlјena dodavanja 2N sumporne kiseline (H2SO4), pa je apsorbanca svakog bunarića izmerena na apsorpcionoj talasnoj dužini od 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 655 nm. Koncentracije ASA u uzorcima su izračunate upotrebom rhASA kalibracione krive sa iste ploče.
[0234] Sumirani rezultati za koncentracije rhASA u serumu, koncentracije rhASA u CST-u, Greška! Referentni izvor nije pronađen. koncentracije anti-rhASA antitela, koncentracije anti-rhASA antitela u CST-u i učestalost antitela po grupama i polu su prikazani u Tabeli 33-39 ispod.
Tabela 33: Sumirani rezultati za koncentracije rhASA u serumu Cinomolgus majmuna
Tabela 34: Sumirani rezultati za koncentracije u CST-u kod Cinomolgus majmuna
Tabela 35: Sumirani rezultati za koncentraciju anti-rhASA antitela u serumu
Tabela 36: Sumirani rezultati za koncentraciju anti-rhASA antitela u CST-u
Tabela 37: Serumske i CST koncentracije rhASA, muška i ženska u kombinaciji (ng/mL)
TABELA 38: Anti-rhASA antitelo u serumu i CST-u, kombinovani mužjaci i ženke (ng/mL)
[0235] Granica kvantifikacije za rhASA u serumu cinomolgus majmuna je 39,1 ng/ml, a svi uzorci seruma iz Grupa 1 i 2 su bili ispod granice kvantifikacije (BQL), pogledati Tabelu 33. Nivoi rhASA u serumu su ispitani pre i 24 sata nakon Doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12 (nekropsija nakon 6 meseci), u sredini perioda oporavka i pre nekropsije nakon oporavka. Nivoi rhASA se nisu mogli detektovati u Grupi 3 (1,8 mg/dozi), Grupi 4 (6,0 mg/dozi) i Grupi 5 (18,6 mg/dozi) pre primene Doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12, nakon Doze 12, u sredini perioda oporavka i pre nekropsije nakon oporavka. Nakon Doze 2, nivoi rhASA u serumu su bili u skladu sa dozom. Nakon Doze 4 (Grupa 3), Doze 6 (Grupe 3 i 4) i Doza 8 i 10 (mužjaci iz Grupa 3 i 4 i Grupe 5), nivoi rhASA se nisu mogli detektovati. Serumski nivo rhASA je opao u Grupi 4 (6,0 mg/dozi) nakon Doze 4 i u Grupi 5 (18,6 mg/dozi) nakon Doza 4 i 6 kod mužjaka i Doza 4, 6, 8 i 10 kod ženki. Ovaj prividni pad nivoa rhASA u serumu može biti povezan sa povećanjem koncentracije anti-rhASA antitela. Nije bilo očiglednih polnih razlika u nivoima rhASA u serumu, uzimajući u obzir varijabilnosti uzoraka i mali broj životinja po grupi u ovoj studiji.
[0236] Granica kvantifikacije za rhASA u CST-u cinomolgus majmuna je 19,5 ng/ml, a svi uzorci CST-a iz Grupa 1 i 2 su bili BQL, pogledati Tabelu 34. Mogao se detektovati rhASA u CST-u pre i nakon Doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12 (nekropsija nakon 6 meseci tretmana) u svim doznim grupama. Nivoi su bili viši nakon primene doze (otprilike 24 sata nakon primene) i zavisili su od doze. Nivoi u CST-u su bili mnogo veći od nivoa u serumu. Nije bilo očiglednih polnih razlika u nivoima rhASA u CST-u, uzimajući u obzir varijabilnosti uzoraka i mali broj životinja po grupi u ovoj studiji. Ni sredinom perioda oporavka ni pre nekropsije nakon oporavka, u svim doznim grupama se nije mogao detektovati rhASA. Nivoi u CST-u u okviru kolekcije podataka za Dozu 12 (nekropsija) kod svih grupa tretiranih sa rhASA su bili niži od nivoa nakon Doza 8 i 11. Potencijalni razlozi za niže nivoe rhASA pri nekropsiji uklјučuju veću uzetu zapreminu (ukupno ~2,25 ml za brojanja ćelija, hemiju, rhASA i anti-rhASA antitelo) prilikom nekropsije u odnosu na one uzete u intervalu primena doza tokom života (do 0,5 ml za koncentraciju rhASA pre ili nakon primene doze). Dodatno, nekim životinjama nije bio ugrađen kateter patenta prilikom nekropsije i uzorci su uzimani putem CM curenja, a ne preko katetera. Ovakvim načinom uzorkovanja su konzistentno dobijane niže koncentracije rhASA u poređenju sa uzorkovanjem preko katetera. Navedeno je verovatno posledica ograničenog protoka CST-a u rostrokaudalnom pravcu za koji se smatra da se odvija kod životinja poptu majmuna i čoveka u njihovom veritkalnom položaju (npr. dobro je poznato da sastojke CST-a karakterišu izraženi gradijenti tokom života individue).
[0237] Anti-rhASA antitela u serumu su detektovana kod svake životinje koja je u nekom trenutku lečena sa rhASA, pogledati Tabelu 35. Životinje su definisane kao pozitivne na anti-rhASA antitela ukoliko je nivo anti-rhASA antitela bio iznad granice kvantifikacije (78,1 ng/mL). Jednom kada su postale serokonvertovane, životinje su ostajale pozitivne na anti-rhASA antitela. Nijedna životinja nije bila pozitivna na anti-rhASA antitela u vremenskoj tački Predoze 2. Sve rhASA životinje, osim mužjaka pod rednim borjem 026 (Grupa 4; 6,0 mg/dozi), bile su pozitivne na serumska anti-rhASA antitela u vremenskoj tački Predoze 4. Mužjak br.026 je bio pozitivan na antitela u serumu u vremenskoj tački za Predozu 6. U Grupi 5 (18,6 mg/kg) uzorci za antitela prilikom nekropsije su bili sa nižim nivoom antitela. Ovo očigledno smanjenje može biti posledica prisustva supstanci koje interferiraju sa rhASA u testu. Titar je generalno bio veći u grupama srednjih i visokih doza (6,0 i 18,6 mg/dozi) u odnosu na životinje sa niskom dozom (1,8 mg/dozi). Prisustvo anti-rhASA antitela je očekivani rezultat lečenja cinomolgus majmuna sa rekombinantnim humanim proteinima<i>. S obzirom na varijabilnog rezultata, nije bilo očiglednih razlika po polovima.
[0238] Kod svih životinja kod kojih su se mogla detektovati anti-rhASA antitela u CST-u, takođe su se mogla detektovati rhASA antitela u serumu, sa izuzetkom Ženki sa redinim brojevima 049 (Grupa 3; 1,8 mg/dozi) i 057 (Grupa 4; 6,0 mg/dozi). Varijabilnost koncentracije i incidencije antitela je isključivala određivanje odgovora na dozu. Životinje su definisane kao pozitivne na anti-rhASA antitela ukoliko je nivo anti-rhASA antitela bio iznad granice kvantifikacije (78,1 ng/mL)
[0239] Kombinovane vrednosti nivoa rhASA u serumu i CST-u za mužjake i ženke su prikazane u Tabeli 36 i Tabeli 37. Kombinovani rezultati za mužjake i ženke su bili slični onima za pojedinačne polove, kao što je prethodno diskutovano.
PRIMER 6 - EFIKASNOST
[0240] U ovom primeru, 11 kontrola (mASA /+ hASA -/-) miševa divljeg tipa je raspodeljeno u Grupu A i nije primalo nikakav tretman. Zatim su trideset četiri (34) hASAC69S/ASA -/- miša raspodeljena u 5 doznih grupa koje su primale nosač (Grupa B) ili rhASA (rhASA) u dozama od 20 mg/kg (intravenski [IV]; Grupa C) ili 0,04; 0,12 i 0,21 mg (Grupe D, E i F, tim redom) u Dnima 1, 9, 15/16 i 22. Sve IV doze su primenjivane putem repne vene. Sve intratekalne (IT) doze su primenjivane u vidu infuzije, u zapremini od 12 µL i sa približnim opesegom od 2 µL/20 sekundi (Tabela 40).
TABELA 40: DIZAJN STUDIJE
[0241] ASA knockout miš hASAC69S/ASA(-/-) je prihvaćen model MLD-a i upotrebljen je za ispitivanje potencijalnih tretmana za ovo oboljenja. Intratekalni način primene je predviđeni način primene kod lјudi. Intravenski načinprimene je ispitan za navedeno jedinjenje i slično jedinjenje kod MLD miševa.
Intravenska kontrolna Grupa je dodata kao pozitivna kontrola za histološke promene koje se očekuju u perifernim organima. Životinje su primile 100, 300 ili 520 mg/kg težine mozga (0,04; 0,12; 0,21 mg, tim redom) rhASA. Nivoi doze su normalizovani na težinu mozga koja je izabrana za ovu studiju tako da odgovara dozi koja je planirana za upotrebu kod lјudi ili koja je upotrebljena u toksikološkim studijama ili u prethodnim efikasnim modelima bolesti lizozomskog skladištenja. Nije bilo očenikvano da ove doze ispolje toksičnost.
Receptura
j p
[0243] Nakon dospeća, svaka životinja je ispitivana radi procene zdravstvenog stanja.
Gajenje životinja
[0244] Životinje su gajene u grupama, u kavezima od polikarbonata koji je polimerizovan na visokim temperaturama, sa poklopcima sa filterom i opremljenima papirnom prostirkom tipa CareFresh i bocama sa vodom. Svaki kavez bio je jasno obeležen karticom koja je ukazivala na projekat, grupu, broji i pol životinja. Svaka životinja je bila jedinstveno obeležena upotrebom sistema bušenja uha. Životinje su tretirane u skladu sa smernicama na nivou države.
[0245] Cilјni uslovi za okoline u prostoriji za životinje i period osvetljenosti/mraka su bili sledeći:
[0246] Za vreme i nakon primene doze, fotoperiod je mogao biti privremeno prekinut za planirane aktivnosti. Takvi prekidi se ne za ishod ili kvalitet ovog istraživanja.
[0247] Sve raspoložive životinje divlјeg tipa (11) su grupisane u Grupu A i numerisane su od 35 do 45. ASA (-/-) hASA (+/-) životinjama su dodeljeni uzastopni brojevi (1 do 34) tokom aklimatizacije, prilikom njihovog vađenja iz kaveza, merenja telesne težine i bušenja ušiju. Životinje su zatim svrstane u grupe tretmana upotrebom programa Research Randomizer (www.randomizer.org), 3. januara 2011. godine, pri čemu je prvih 9 brojeva svrstano u Grupu B, sledećih 5 u Grupu C, sledećih 5 u Grupu D, sledećih 5 u Grupu E, dok je konačnih deset pripadalo Grupi F. Životinje su obeležene na način prikazan u Tabeli 41:
TABELA 41: OBELEŽAVANJE ŽIVOTINјA
Ispitivanje proizvoda i nosača
Ispitivani proizvod
[0248]
Nosač
[0249]
Priprema nosača
[0250] Nosač je upotrebljen kako je obezbeđen. Nosač je zagrejen na radnom stolu (sobnoj temperaturi). Jednom kada je nosač zagrejan, materijal je promešan blagim vrtenjem i okretanjem. Boce nisu mešane na vortekssu ili treskane. Boca je osuštena pre unošenja materijala. Bilo kakav zaostali nosač je vraćen u frižider (1°C-8°C).
Priprema dozne formulacije
[0251] rhASA je razblažen nosačem da bi se postigle neophodne koncentracije. Proizvod za ispitivanje je zagrejan na random stolu (sobna temperatura). Jednom kada je ispitivani proizvod zagrejan, materijal je pomešan blagim vrtenjem i obrtanjem. Boce nisu mešane na vorteksu ili treskane.
Boje za praćenje injekcija:
[0252] Za praćenje injekcija je upotrebljena infracrvena boja (poput IRDye®, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Boje poput ove su upotrebljavane za intratekalne injekcije kao procedura preživljavanja nakon intratekalne primene. Boja je pomešana sa ispitivanim proizvodom pre primene; 1 nmol boje je dodat u 1 µL ispitivanog proizvoda. Pored infracrvene boje, za praćenje injekcija je upotrebljen i 1 µL FD&C plave #1 (0,25%). Ova plava boja je uobičajeni aditiv za hranu i u principu se smatra bezbednom i netoksičnom.
Lumbosakralna IT injekcija rhASA ili nosača
[0253] Životinje iz Grupa B, D, E i F su primile intratekalne injekcije na Dane 1, 9, 15 ili 16 i Dana 22.
[0254] Odrasli miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 1,25%-tnog 2,2,2 tribromoetanola (Avertin) u dozi od 200-300 µL/10 grama telesne težine (250-350 mg/kg). Dlaka na leđima je uklonjena mašinicom za brijanje, između osnove repa i lopatica. Obrijano područje je očišćeno trljanjem sa povidinom/betadinom, a zatim izopropil alkoholom. Preko lumbosakralnog dela kičme je napravlјen mali medijalni rez na koži (1-2 cm) i identifikovan je presek dorzalne srednje linije i glavenog dela krila bedarih kositju (pojedinačnih bedarnih kostiju). Mišić u udubljenju bedarne kosti (gluteus medius) je mišić u obliku srca. Dve strane vrha „srca“ se nalaze približno kod krila bedarne kosti. Igla promera 32 godža koja je bila pričvršćena na stakleni Hamiltonov špric bez unutrašnjeg prostora od 10-20 µl, ubačena je dok se nije zapažen otpor kosti koja se nalazi ispor. Potom su urađena injeciranja sa 10 µl ispitivanog proizvoda, 1 µl infracrvene boje i 1 µl FD&C plave #1 (ukupna zapremina injeciranja 12 µl) brzinom od približno 2 µL/20 sekundi (12 µL/2 minuta). Rez na koži je zatvoren klipovima za rane. Uspeh injekcije je procenjen snimanjem, da bi se utvrdilo da li se infracrvena boja rasporedila po CNS-u, kao i vidlјiva plava boja. Nakon snimanja, životinja je ostavlјena da se oporavi u komori za oporavak.
Intravenska injekcija rhASA
[0255] Životinje iz Grupe C su primile intravenske injekcije Dana 1, 9, 15 i 22.
[0256] Za IV injekcije, životinje su anestezirane upotrebom izoflurana, ukoliko je bilo potrebno, pa su smeštene su u držač za životinje. Repna vena je proširena zagrevanjem, blagim lupkanjem repa sa prstom. Mesto injeciranja je zatim prebrisano 70%-tnim etanolom. Alternativno, životinja je smeštana u toplu komoru (40°C) tokom 1-1,5 minuta. Za injeciranje materijala koji je ispitivan je upotrebljena igla promera od 28 do 30 godža. Zapremina injekcije je bila 5-10 mL/kg.
[0257] Otprilike 24 sata nakon četvrte doze, životinje u Grupama B-F su eutanazirane. Životinje su podvrgnute različitim procedurama prikuplјanja tkiva, kao što je detalјno opisano u tekstu koji sledi. Životinje iz Grupe A nisu tretirane; ipak, one su eutanazirane 27. ili 28. januara 2011. godine i podvrgnute procedurama prikuplјanja tkiva, kao što je detalјno opisano u tekstu koji sledi.
Serum (sve životinje)
[0258] Terminalni uzorak krvi (približno 0,5 ml) je prikuplјen od svih životinja (Grupe A-F) retroorbitalnom punkcijom pod izofluranskom anestezijom. Staklena cev je postavljena u orbitu, laganim prodiranjem u područje isza oka i time remećenjem venske drenaže koja se nalazi iza oka. Krv je prikupljena kapilarnim delovanjem i/ili dejstvom gravitacije. Nakon prikupljanja krvi, na orbitalni pritiak je primenjen pritisak da bi se zaustavilo krvarenje.
[0259] Uzorci pune krvi su obrađeni u serum i zamrznuti na < -80°C. Serum je stavljen na -80°C i analiziran na prisustvo antitela.
Tkiva za ispitivanja svetlosnom mikroskopijom (Grupe A-F; 5 miševa po grupi)
[0260] Nakon uzimanja krvi, životinje su eutanazirane asfiksijom sa CO2. Pre perfuzije je uzet odsečak repa koji je zamrznut radi moguće genotipizacije. Otvorena je perikardijalna šuplјina. Tri (3) miša po grupi su transkardijalno perfundovana heparizovanim fiziološkim rastvorom (1 U/mL natrijum heparina u 0,9% NaCl, sterilisano putem filtera) koji je bio ledeno hladan i zatim sa 4%-tnim paraformaldehidom na približno 4C. Mozak joj je izvađen, a trbuh je isečen da bi se dodatno izložili unutrašnji organi. Mozak i leš su bili stavlјeni u paraformaldehid, osim odsečka repa koji je bio zamrznut.
Tkiva za analizu lipida (Grupe A, B i F; 6, 4 i 5 životinje, tim redom)
[0261] Nakon uzimanja krvi, životinje su eutanazirane asfiksijom sa CO2. Pre perfuzije je uzet odsečak repa koji je zamrznut radi moguće genotipizacije. Otvorena je perikardijalna šuplјina. Za analize lipida, 4-6 miševa po grupi je transkardijalno perfundovano heparizovanim fiziološkim rastvorom (1 U/mL natrijum heparina u 0,9% NaCl, sterilisano putem filtera) koji je bio ledeno hladan. Tkiva za primer koja su prikupljena za analizu lipida su prikazana u Tabeli 42.
Tabela 42: TKIVA PRIKUPLJNA ZA ANALIZU LIPIDA
[0262] Nakon prikuplјanja, tkiva su izmerena i zamrznuta, bilo na suvom ledu ili stavlјanjem u zamrzivač -80°C. Mozak je bio razdvojen na levu i desnu hemisferu. Desna je iskorišćan za analizu lipida upotrebom MS postupka. Leva će biti uporebljena za moguće analize N-acetil-L-aspartata (NAA). Tkiva su čuvana na -80°C do analize (pogledati Tabelu 43).
TABELA 43: USLOVI ČUVANJA UZORKA
[0263] rhASA smanjuje skladištenje sulfatida u kičmenoj moždini MLD miševa, posebno u beloj masi, Slika 19. Morfometrijska analiza kičmene moždine je pokazala da je optička gustina obojenosti alkijansko plavim bila statistički značajno smanjena nakon primene doza rhASA, Slika 20. MLD miševi tretirani sa rhASA su takođe pokazali smanjenu lizozomsku aktivnost u mozgu, Slika 21. Ovo smanjenje je bilo statistički značajno u grupi visokih doza (0,21 mg - 520 mg/kg težine mozga) u poređenju sa životinjama koje su bile tretirane nosačem, Slika 22.
[0264] Imunotolerantnim MLD miševima (hASAC69S/ASA(-/-)), starijim od jedne godine, intratekalnolumbalno je primenjivan rhASA po jedan put svake nedelјe tokom 4 nedelјe (ukupno 4 doze). Doze su bile nosač (154 mM NaCl, 0,005% polisorbat 20, pH ~ 6,0), 0,04; 0,12; 0,21 mg/dozi (normalizovane doze su bile 100, 300 i 520 mg/kg težine mozga, tim redom). U krajnjim vremenskim tačkama efikasnos je procenjivana imunohistohemijskom analizoma klirensa sulfatida i lizozomske aktivnosti unutar mozga i kičmene moždine. Kičmena moždina i preseci mozga su obojeni upotrebom alkijansko plave boje koja ciljano deluje na sulfatide u tkivima. Preseci mozga su takođe obojeni na prisustvo membranskih proteina asociranih sa lizozomima (LAMP), indikatorima lizozomskih procesa. Pored toga, urađena je morfometrijska analiza preseka kičmene moždine (cervikalnog, torakalnog i lumbalnog dela) i mozga obojenih alkalijanko plavim i na LAMP.
[0265] Ovi preliminarni rezultati pokazuju efikasnost intratekalne lumbalne primene rhASA. U poređenju sa miševima koji predstavljaju kontrole sa nosačem, MLD miševi tretirani sa rhASA ispoljavaju poboljštanje u histološkim markerima oboljenja, kao što je smanjenjenje skladištenja sulfatida (uočeno bojenjem sa alkijansko plavim) i lizozomske aktivnosti u mozgu. Navedene histopatološke promene su uočene blizu mesta primene (kičmena moždina), kao i u udalјenim delovima mozga.
PRIMER 7 - BIODISTRIBUCIJA 2
Pregled rezultata studije
[0266] U ovoj studiji, 36 mužjaka i 36 ženki juvenilnih cinomolgus majmuna (na početku < 12 meseci) je raspoređeno u svaku od 5 doznih grupa i primilo je rhASA (rhASA) u dozama od 0 (kontrola sa uređajem; životinjama je primenjeno 0,6 ml PBS-a), 0 (kontrola sa nosačem), 1,8; 6,0 ili 18,6 mg (Grupe 1, 2, 3, 4 i 5, tim redom) svake druge nedelјe tokom 6 meseci, a ukupno 12 doza. Sve doze su primenjene u vidu infuzije u zapremini od 0,6 mL, naon čega je sledilo ispiranje sa 0,5 mL PBS-a koji je divan tokom otprilike 10 minuta (Tabela 44Tabela).
TABELA 44: DIZAJN STUDIJE
Materijal i postupci
Prikupljanje tkiva
[0267] Mozak je sečen zatopljen u matriks za sečenje, na koronalne presek debljine 3 mm. Svaki mozak je isečen na pune koronalne preseke uklјučujući: neokorteks (uklјučujući frontalnu, parijetalnu, temporalnu i okcipitalnu koru velikog mozga), paleokorteks (olfaktorne bulbuse i/ili piriformni režanj), bazalne ganglije (uklјučujući kaudatus i putamen), limbički sistem (uklјučujući hipokampus i cingulatni girus), talamus/hipotalamus, srednji deo mozga (uklјučujući substanciju nigra), mali mozak, Varolijev most i produženu moždinu. Lokacije iz kojih su dobijeni pojedinačni uzorci tkiva (upotrebom uređaja za punkciju biopsija od 4-mm) su prikazani na Slikama 32 - 37. Slike na Figurama 32 - 37 su sa Univerziteta u Viskonsinu i iz komparativne kolekcije mozga sisara države Mičigen (kao i Nacionalnog muzeja zdravlјa i medicine). Punkcija broj 22 nije uzeta, pošto ova struktura nije bila prisutna tokom nekropsije. Pre analize na rhASA upotrebom imunosorbentnog testa povezanog sa enzimom, svi uzorci mozga su zamrznuti i čuvani na -60°C ili ispod.
[0268] Prvi presek mozga i svaki drugi presek nakon njega su fiksirani u formalinu za histopatološku i imunohistohemijsku evaluaciju. Drugi presek mozga i svaki drugi presek nakon njega su zamrnuti za analize koncentracije proizvoda koji je ispitivan. Pre zamrzavanja, uzorci mozga su uzeti iz desnog dela parno numerisanih preseka mozga za analizu ispitivanog jedinjenja radi analiza biodistribucije. Lokacija uzorka mozga je fotografisana prilikom nekropsije i brojevi preseka mozga su zabeleženi. Uzorci su dobijeni upotrebom bilo cirkularnog uređaja za punkciju od 4-mm ili sečenjem sa skalpelom da bi se optimizovala količina prikupljene bele mase. Radi analize ispitivanog proizvoda, svi punktati su zamrznuti i čuvani na -60°C ili ispod. Ostatak preseka mozga je zamrznut i čuvan na -60°C ili ispod, radi moguće analize ispitivanog proizvoda. Lokacije punktata su prikazane u Dodatku B.
[0269] Kičmena moždina (cervikalna, torakalna i lumbalna) je isečena na preseke debljine jednog centimetra. Prvi presek i svaki drugi presek nakon njega, su fiksirani u formalinu za histopatološku i imunohistohemijsku analizu. Drugi presek kičmene moždine i svaki drugi presek nakon njega su zamrznuti i čuvani na -60°C ili niže, radi analize ispitivanog jedinjenha. Distribucija preseka je podešena tako da je presek sa vrhom intratekalnog katetera (Presek 0) fiksiran u formalinu i histopatološki analiziran.
Priprema ekstrakata mozga, jetre i kičmene moždine i određivanje koncentracije rhASA
[0270] Punktati mozga, kičmene moždine i uzorci jetre su analizirani validiranim postupkom u skladu sa Uredbom o dobroj laboratorijskoj praksi (GLP) Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država (FDA) 21 CFR, deo 58 i sa važećim standardnim operativnim procedurama firme Midwest BioResearch. Uzorci tkiva su homogenizovani u puferu za lizu, centrifugirani da bi se uklonio debris tkiva, pa čuvani na -80°C do testiranja. Koncentracija rhASA u solubilnim frakcijama homogenata je određena ELISA postupkom, upotrebom poliklonskog zečjeg antitela SH040 kao antitela za “hvatanje” i anti-ASA monoklonalnog antitela 19-16-3 konjugovanog sa HRP-om (peroksidazom rena) kao antitelom za detekciju. Nakon koraka ispiranja da bi se uklonili nevezani materijali, rastvor supstrata tetrametilbenzidina (TMB) je reagovao sa peroksidom u prisustvu antitela konjugovanog sa HRP-om da bi se proizveo kolorimetrijski signal koji je bio proporcionalan količini ASA koja je vezana od strane anti-ASA antitela u početnom koraku. Dobijena količina rhASA u svakom homogenatu tkiva je interpolisana na osnovu standardne krive.
[0271] Uzorci su takođe analizirani testom određivanja proteina sa bicinhonininskom kiselinom (BCA), da bi se dobila koncentracija proteina u nepoznatom uzorku. Koncentracija proteina za svaki uzorak je određena interpolacijom sa albuminske standardne krive. Rezultati koncentracije rhASA su zatim normalizovani na ukupni protein u ekstraktima tkiva, što je određeno testom sa bicinhoninskom kiselinom.
[0272] ASA nivoi svih punktata iz grupa sa nosačem, tretmanima sa 1,8 mg/dozi, 6,0 mg/dozi i 18,6 mg/dozi, prikazani su na Slici 23, Slici 24, Slici 25 i Slici 26, tim redom. ASA nivoi svih punktata iz životinja koje su se oporavljal i iz kontrola sa uređajem, nosačem, kao i iz grupa kojima je primenjivano 1,8 mg/dozi, 6,0 mg/dozi i 18,6 mg/dozi su prikazani na Slici 27, Slici 28, Slici 29, Slici 30 i Slici 31, tim redom
[0273] Nivoi ASA za izabrane punktate koji su uzeti blizu površine (moždanih ovojnica) mozga su prikazani na Slici 32. ASA nivoi u izabranim punktatima koji su razmatrani kao oni koji sadrže uglavnom duboku belu masu mozga, prikazani su na Slici 33. Bela masa je sastavlјena od snopova mijelinizovanih nastavaka nervnih ćelija (ili aksona). Izabrani punktati koji sadrže uglavnom materijal iz duboke sive mase mozga su prikazani na Slici 34. Siva masa sadrži neuronska ćelijska tela, za razliku od bele mase. Vrednosti ASA u izabranim punktatima sa površine, duboke bele i duboke sive mase su prikazani za svaku doznu grupu na Slici 35.
[0274] Podaci o koncentraciji kičmene moždine su prikazani na Slici 36.
[0275] Podaci o koncentraciji u jetri su prikazani na Slici 37.
[0276] Nivoi koncentracije ASA u jetri, kičmeni moždini i mozgu kod kontrolnih grupa sa uređajem i grupa kojima je primenjivan nosač su, u pojedinim slučajevima, bili merlјivi. Nivoi u jetri i kičmenoj moždini su bili niži od onih u bilo kojoj od grupa koje su tretirane sa rhASA (Slika 23, Slika 32 i Slika 33).
Nivo rhASA izmeren u kontrolnim životinjama sa uređajem i životinjama kojima jep primenjivana nosač predstavlja unakrsnu reaktivnost između anti-rhASA antitela upotrebljenog u ELISA analizi sa nativnim proteinom cinomolgus majmuna. Navedene vrednosti u tkivima kontrola sa uređajem i nosačem ne predstavlјaju kvantitativne vrednosti za rhASA cinomolgus majmuna u tkivima, pošto stepen unakrsne reaktivnosti između antitela i cinomolgusnog ASA nije poznat i činjenica je da se u standardima testa upotrebljava humani ASA. Međutim, bez želјe da bude vezano za bilo koju teoriju, varijacije u nivou ASA koje su detektovane između tkiva iz kontrola sa uređajem i nosačem, mogu biti protumačene kao pokazana varijabilnost u relativnim količinama cinomolgusnog ASA u različitim tkivima i anatomskim regionima.
[0277] Nivoi ASA u presecima kičmene moždine su se kretali od 160-2352, 1081-6607 i 1893-9252 ng/mg proteina kod mužjaka i 0-3151, 669-6637 i 1404-16424 ng/mg proteina kod ženki u grupama koje su primale 1,8; 6,0 i 18,6 mg/dozi, tim redom (Slika 32). Nivoi ASA bili su viši u lumbalnom regionu kičme nego u cervikalnom regionu. Nivoi ASA proteina koji su detektovani u jetri, odgovarali su na dozu u grupama tretiranim sa rhASA, pri čemu su bili veoma niski u grupi sa nosačem. Sednji nivoi ASA su iznosili 88, 674 i 2424 kod mužjaka i 140, 462 i 1996 ng/mg proteina kod ženki iz grupa tretiranih sa 1,8; 6,0 i 18,6 mg/dozi (Slika 33).
[0278] Sveukupno, deluje da je nivo ASA povezan sa dozom u uzorcima koji su pripremljeni iz preseka kičmene moždine i jetre grupa kojima je primenjivana doza rhASA. Mnogi ispitivani regioni mozga su pokazale jasan odnos doze između nivoa ASA i primene rhASA, dok su drugi bile više dvosmisleni. U principu, nivoi ASA u mozgu su se povećavali sa dozom rhASA.
Primer 8: FARMAKOKINETIČKA I STUDIJA BIODISTRIBUCIJE
[0279] Cilј ove studije je procena farmakokinetike (PK) i biodistribucije raznih terapijskih zamenskih enzima nakon intratekalne (IT) i intravenske (IV) primene cinomolgus majmunima.
[0280] U ovoj studiji, ukupno dvanaest mužjaka i dvanaest ženki cinomolgus majmuna sa patentnim intratekalno-lumbalnim (IT-L) i kateterima postavljenim intratekalno i u cisternu magna (IT-CM), nasumično su podelјeni na osnovu telesne težine u četiri tretirane grupe za Fazu 1a (primena IS2) i Fazu 1b (primena ASA).
[0281] Krv i CST (iz IT-CM katetera) su sakuplјani u određenim intervalima nakon pimene doza tokom obe faze. Nakon što su prikupljeni poslednji uzorci iz Faze 1a, životinjama je dozvolјen period ispiranja od 7 dana pre početka Faze 1b.
[0282] Nakon što su prikupljeni poslednji uzorci iz Faze 1b, životinjama će biti dozvolјen period ispiranja od 7 dana do početka Faze 2. Ukupno 12 mužjaka i ženki cinomolgus majmuna iz faze 1b je nasumično pododelјeno na osnovu telesne težine u 12 grupa tretiranih sa IS2 (Grupe 1a-6a) i ASA (Grupe 1b-6b).
[0283] Apsolutna bioraspoloživost ASA u serumu nakon IT-L primene je iznosila ∼30 do 40%. Nasuprot navedenom, samo 0,5% IV doze je bilo bioraspoloživo u CST-u.
[0284] Izlaganje ASA u serumu se povećava na više nego proporcionalan način nakon IT-L primene.
[0285] Nakon IT-L primene, izloženost ASA u CST-u raste na manje nego proporcionalan način kako se povećava doza. Sumirani PK parametri rhASA u serumu, PK parametri rhASA u serumu u CST-u i bioraspoloživost su prikazani u Tabelama 45-47.
TABELA 45 – SUMIRANI PK PARAMETRI ASA U SERUMU CINOMOLGUS MAJMUNA
Tabela 46 - SUMIRANI PK PARAMETRI ASA U CST-U CINOMOLGUS MAJMUNA
Tabela 47 - BIODOSTUPNOST ASA U SERUMU I CST-u
[0286] Bioraspoloživost ASA u serumu nakon IT-L primene je iznosila ∼30-40%. Nasuprot navedenom, samo 0,5% doze koja je primenjena IV putem je bila bioraspoloživa u CST-u. Raspodela u CST-u i serumu je prikazana u Tabeli 48.
TABELA 48 - CST: SERUM RASPODELA
PRIMER 9 - LEČENJE MLD PACIJENATA
[0287] Direktna primena u CNS putem, npr. IT isporuke može biti upotrebljena za efektivno lečenje MLD pacijenata. Ovaj primer ilustruje multicentričnu studiju eksalacije doze koja je osmišljena zarad procene bezbednosti primene rhASA do 3 dozna nivoa svake druge nedelјe (EOW) tokom ukupno 40 nedelјa, upotrebom uređaja za intratekalnu isporuku lekova (IDDD) kod pacijenata sa kasnim infantilnim oblikom MLD-a. Na Slikama 45-48 su prikazani razni uređaji za intratekalnu isporuku lekova za primer koji su pogodni za lečenje ljudi.
[0288] Biće uključeno do 20 pacijenata:
Kohorta 1: 5 pacijenata (najniža doza)
Kohorta 2: 5 pacijenata (srednja doza)
Kohorta 3: 5 pacijenata (najveća doza)
5 pacijenti će biti nasumično izabrano za grupu koja neće biti tretirana.
[0289] Pacijenti su izabrani za studiju na osnovu uklјučivanja sledećih kriterijuma: (1) pojave prvih simptoma pre 30. meseca starosti; (2) pokretljivosti u vreme odabira (definisano kao sposobnost da se samostalno ustane i šeta unapred 10 koraka uz držanje za jednu ruku); (3) prisustvo neuroloških znakova u vreme pregleda. Pacijenti sa istorijom transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija se obično isključuju.
[0290] Određena je bezbednost rastućih doza rhASA koje su primenjivane IT injekcijom kod dece sa kasnim infantilnim oblikom MLD tokom 40 nedelјa. Pored navedenog, ispitivana je klinička aktivnost rhASA na grubu motornu funkciju i dalje farmakokinetika jednokratne i ponovlјenih doza u serumu, kao i koncentracije u cerebrospinalnoj tečnosti (CST-u).
[0291] Dok su određena jedinjenja, kompozicije i postupci koji su ovde opisani sa specifičnošću koja je u skladu sa određenim primerima izvođenja, primeri koji slede služe samo da ilustruju jedinjenja pronalaska i nije predviđeno da ista obraničavaju.
[0292] Jednina pojmova, kako se ovde upotrebljava, u specifikaciji i u Patentnim zahtevima, osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, treba razumeti tako da uklјučuje i množinu referentnih pojmova. Kada su elementi predstavlјeni u ovom opisu u vidu liste (npr. Markušijeve grupe ili u sličnom formatu), podrazumeva se da je svaka podgrupa elemenata takođe opisana i da bilo koji elementi mogu biti uklonjeni iz grupe. Potrebno je napomenuti i da, u principu, kada se pronalazak ili aspekt pronalaska odnosi na to da sadrži određene elemente, karakteristike itd., pojedini primeri izvođenja pronalaska ili aspekti pronalaska se sastoje, ili suštinski sastoje, od takvih elemenata, karakteristika itd. U svrhu pojednostavljenja ovih primera izvođenja, isti nisu u svakom slučaju specifično navedeni sa toliko mnogo reči.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Stabilna vodena formulacija za intratekalnu primenu koja sadrži protein arilsulfatazu A (ASA) u koncentraciji većoj od 10 mg/ml, so, polisorbatni surfaktant i puferski agens, pri čemu je so NaCl.
2. Stabilna vodena formulacija prema patentnom zahtevu 1, gde je ASA protein prisutan u koncentraciji opsega od 15-100 mg/ml, opciono gde je ASA protein prisutan u koncentraciji izabranoj od 30 mg/ml, 50 mg/ml ili 100 mg/ml
3. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde ASA protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.
4. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:
(i) ASA protein se proizvodi iz humane ćelijske linije, ili
(ii) ASA protein se proizvodi iz CHO ćelija.
5. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih Patentnih zahteva, gde je NaCl prisutan u koncentraciji koja je opsega od 30-300 mM, opciono u koncentraciji opsega od 137-154 mM, opciono u koncentraciji od približno 154 mM.
6. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je polisorbatni surfaktant izabran iz grupe koja se sastoji od polisorbata 20, polisorbata 40, polisorbata 60, polisorbata 80 i njihove kombinacije, opciono gde polisorbatni surfaktant je polisorbat 20, opciono gde je polisorbatni surfaktant prisutan u koncentraciji opsega od 0,001 do 0,5% i opciono gde je polisorbat 20 prisutan u koncentraciji od približno 0,005%.
7. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je puferski agens izabran iz grupe koja se sastoji od fosfata, acetata, histidina, sukcinata, citrata, Trisa i njihovih kombinacija, a opciono gde je puferski agens fosfat i prisutni je u koncentraciji ne većoj od 50 mM i opciono u koncentraciji ne većoj od 20 mM.
8. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je formulacija sa pH od približno 3-8,0, približno 6,0-6,5 ili približno 6,0.
9. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je formulacija rekonstituisana iz liofilizirane formulacije sa razblaživačem.
10. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu formulacija dalјe sadrži stabilizator.
11. Stabilna vodena formulacija prema patentnom zahtevu 10, gde je stabilizator izabran iz grupe koja se sastoji od saharoze, glukoze, manitola, sorbitola, PEG 4000, histidina, arginina, lizina, fosfolipida i njihove kombinacije.
12. Posuda za skladištenje koji sadrži jediničan dozni oblik stabilne vodene formulacije prema bilo kom od prethodnih Patentnih zahteva.
13. Posuda za skladištenje prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je posuda za skladištenje izabrana od ampule, bočice, patrone, rezervoara, lyo-injektora ili prethodno napunjenog šprica, opciono gde je posuda za skladištenje prethodno napunjen špric i opciono je izabran od borosilikatnih staklenih špriceva sa premazom od pečenog silikona, borosilikatnih staklenih špriceva sa raspršenim silikonom ili plastičnih špriceva od smola bez silikona.
14. Posuda za skladištenje prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je stabilna vodena formulacija prisutna u zapremini manjoj od oko 50,0 mL, opciono gde je stabilna vodena formulacija prisutna u zapremini manjoj od oko 5,0 mL.
15. Stabilna vodena formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, za upotrebu u postupku lečenja bolesti metahromatske leukodistrofije (MLD) koji obuhvata korak intratekalne primene formulacije subjektu.
16. Stabilna vodena formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu:
(i) intratekalna primena se upotrebljava zajedno sa intravenskom primenom, opciono gde intravenska primena nije češća od jednom mesečno ili nije češća od jednom na svaka dva meseca, ili
(ii) intratekalna primena se upotrebljava u odsustvu intravenske primene, i/ili
(iii) intratekalna primena se vrši jednom na svaka dve nedelјe, jednom mesečno ili jednom na svaka dva meseca, i/ili
(iv) intratekalna primena se upotrebljava u odsustvu istovremene imunosupresivne terapije.
RSP20191354 2010-06-25 2011-06-25 Postupci i kompozicije za isporuku arilsulfataze a u cns RS59468B1 (sr)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35885710P 2010-06-25 2010-06-25
US36078610P 2010-07-01 2010-07-01
US38786210P 2010-09-29 2010-09-29
US201161435710P 2011-01-24 2011-01-24
US201161442115P 2011-02-11 2011-02-11
US201161476210P 2011-04-15 2011-04-15
US201161495268P 2011-06-09 2011-06-09
EP11799037.4A EP2585104B1 (en) 2010-06-25 2011-06-25 Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a
PCT/US2011/041926 WO2011163650A2 (en) 2010-06-25 2011-06-25 Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59468B1 true RS59468B1 (sr) 2019-11-29

Family

ID=46888844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191354 RS59468B1 (sr) 2010-06-25 2011-06-25 Postupci i kompozicije za isporuku arilsulfataze a u cns

Country Status (26)

Country Link
US (1) US9770410B2 (sr)
EP (3) EP3626257B1 (sr)
JP (1) JP6045493B2 (sr)
KR (5) KR102094094B1 (sr)
CN (1) CN103282046B (sr)
AU (5) AU2011270670B2 (sr)
BR (1) BR112012033216B1 (sr)
CA (1) CA2803003C (sr)
CY (2) CY1122282T1 (sr)
DK (1) DK2585104T3 (sr)
ES (1) ES2754776T3 (sr)
HR (1) HRP20191923T1 (sr)
IL (3) IL291556B2 (sr)
LT (1) LT2585104T (sr)
ME (1) ME03647B (sr)
MX (2) MX382443B (sr)
NZ (2) NZ605873A (sr)
PL (2) PL2585104T3 (sr)
RS (1) RS59468B1 (sr)
RU (1) RU2671503C2 (sr)
SI (1) SI2585104T1 (sr)
SM (1) SMT201900589T1 (sr)
TW (1) TWI667037B (sr)
UA (1) UA115650C2 (sr)
WO (1) WO2011163650A2 (sr)
ZA (1) ZA201300675B (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT2588130T (lt) 2010-06-25 2016-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Terapinės priemonės pristatymas cns
JP6073783B2 (ja) 2010-06-25 2017-02-01 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ヘパランｎ−スルファターゼのｃｎｓ送達のための方法および組成物
HRP20191923T1 (hr) 2010-06-25 2020-01-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Postupci i sastavi za isporuku arilsulfataze a u cns
PT3103469T (pt) 2010-06-25 2021-03-04 Shire Human Genetic Therapies Administração de agentes terapêuticos no snc
KR20230159646A (ko) 2010-06-25 2023-11-21 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 이듀로네이트-2-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
US20140377244A1 (en) 2011-12-23 2014-12-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
CN112126634A (zh) 2013-01-09 2020-12-25 夏尔人类遗传性治疗公司 含用于纯化芳基硫酸酯酶a的方法
CN115120746A (zh) * 2013-05-15 2022-09-30 明尼苏达大学董事会 腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
US10208734B2 (en) * 2015-04-23 2019-02-19 Continuum Dynamics, Inc. Lift-driven wind turbine with force canceling blade configuration
PL3319597T3 (pl) * 2015-07-10 2021-10-11 Byondis B.V. Kompozycje zawierające koniugaty przeciwciało-duokarmycyna
JP2019509270A (ja) * 2016-02-17 2019-04-04 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド アリールスルファターゼａのｃｎｓ送達のための方法および組成物
CN109640961B (zh) * 2016-06-01 2021-11-02 施维雅知识产权英国有限公司 聚亚烷基氧化物-天冬酰胺酶制剂及其制备和使用方法
AU2017386888B2 (en) * 2016-12-28 2024-08-08 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Lyophilized preparation
KR102883778B1 (ko) 2017-09-22 2025-11-12 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Ii형 점액다당류증의 치료를 위한 유전자 요법
CN111699249A (zh) 2017-12-19 2020-09-22 夏尔人类遗传性治疗公司 纯化的芳基硫酸酯酶a及其组合物
US11738068B2 (en) 2018-06-25 2023-08-29 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Protein-containing aqueous liquid formulation
KR20220020261A (ko) 2019-05-03 2022-02-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 이염성 백질이영양증의 치료에 유용한 조성물
US20220348981A1 (en) * 2019-09-23 2022-11-03 University Of Washington Assay of arylsulfatase a enzymatic activity in dried blood spots by mass spectrometry and fluorometry
WO2024176112A1 (en) 2023-02-21 2024-08-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Large scale production of recombinant arylsulfatase a and compositions thereof

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4743265A (en) 1986-04-23 1988-05-10 Dij Catheter Corp Articulated catheter placement device
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
US6118045A (en) * 1995-08-02 2000-09-12 Pharming B.V. Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
US6063378A (en) 1997-08-22 2000-05-16 Seikagaku Corporation Therapeutic agent for herniated intervertebral disc
ES2312222T3 (es) 1998-12-07 2009-02-16 Genzyme Corporation Tratamiento de la enfermedad de pompe.
US6217552B1 (en) 1999-03-01 2001-04-17 Coaxia, Inc. Medical device for selective intrathecal spinal cooling in aortic surgery and spinal trauma
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US6534300B1 (en) 1999-09-14 2003-03-18 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases
US20020099025A1 (en) 1999-12-30 2002-07-25 Heywood James A. Treatment of neurological disorders
US6866844B2 (en) 2002-11-07 2005-03-15 Biomarin Pharmaceutical Inc. Precursor N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, methods of treatment using said enzyme and methods for producing and purifying said enzyme
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
WO2002087510A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Symbiontics, Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
AU2002347910A1 (en) 2001-10-16 2003-04-28 Symbiontics Inc. Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
DK1503788T3 (da) 2002-04-25 2011-10-17 Shire Human Genetic Therapies Behandling af alpha-galactosidase A-deficiens
EP1514106A4 (en) 2002-05-29 2007-05-09 Zystor Therapeutics Inc TARGETED THERAPEUTIC PROTEINS
ES2371913T3 (es) 2003-01-22 2012-01-11 Duke University Constructos mejorados para expresar polipéptidos lisosomales.
EP1638605B1 (en) 2003-06-20 2014-01-08 Raptor Pharmaceutical, Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US7442372B2 (en) * 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
EP1713904B1 (en) * 2004-01-30 2016-06-29 Shire Pharmaceuticals Ireland Limited Production and purification of recombinant arylsulfatase a
WO2005074888A2 (en) 2004-02-03 2005-08-18 Biodelivery Sciences International, Inc. Replacement enzyme cochleates
US20080014188A1 (en) 2004-02-06 2008-01-17 Zankel Todd C Manufacture of Highly Phosphorylated Lysosomal Enzymes and Uses Thereof
CA2553955C (en) 2004-02-10 2012-08-28 Zystor Therapeutics, Inc. Acid alpha-glucosidase and fragments thereof
US20050208090A1 (en) 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
US20090297592A1 (en) 2005-05-11 2009-12-03 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Lipid Vesicle Composition
AU2006254796B2 (en) * 2005-06-08 2012-08-16 Amicus Therapeutics, Inc. Treatment of CNS disorders associated with mutations in genes encoding lysosomal enzymes
AR059089A1 (es) * 2006-01-20 2008-03-12 Genzyme Corp Administracion intraventricular de una enzima para enfermedades de almacenamiento lisosomal
CN101410408A (zh) * 2006-04-04 2009-04-15 希尔制药爱尔兰有限责任公司 用于浓缩多肽的方法
HUE042402T2 (hu) * 2006-04-04 2019-06-28 Chiesi Farm Spa Eljárás polipeptid töményítésére
GB0611463D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Novartis Ag Organic compounds
WO2008070769A1 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Medtronic, Inc. Intrathecal catheter
CA2680189A1 (en) 2007-03-06 2008-09-12 Saint Louis University Modified enzyme and treatment method
JP2010536341A (ja) * 2007-08-15 2010-12-02 アムニクス， インコーポレイテッド 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法
US8420081B2 (en) 2007-11-30 2013-04-16 Abbvie, Inc. Antibody formulations and methods of making same
US7722865B2 (en) 2008-01-18 2010-05-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof
JP5627571B2 (ja) 2008-05-07 2014-11-19 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド リソソーム標的化ペプチドおよびその使用
US8436489B2 (en) 2009-06-29 2013-05-07 Lightsail Energy, Inc. Compressed air energy storage system utilizing two-phase flow to facilitate heat exchange
JP6073783B2 (ja) 2010-06-25 2017-02-01 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ヘパランｎ−スルファターゼのｃｎｓ送達のための方法および組成物
PT3103469T (pt) 2010-06-25 2021-03-04 Shire Human Genetic Therapies Administração de agentes terapêuticos no snc
KR20230159646A (ko) 2010-06-25 2023-11-21 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 이듀로네이트-2-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
LT2588130T (lt) 2010-06-25 2016-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Terapinės priemonės pristatymas cns
AU2011270672B2 (en) 2010-06-25 2017-01-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of Sanfilippo Syndrome type B
US20110318324A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for cns delivery of b-galactocerebrosidase
HRP20191923T1 (hr) 2010-06-25 2020-01-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Postupci i sastavi za isporuku arilsulfataze a u cns
JP2012062312A (ja) 2010-08-19 2012-03-29 Yoshikatsu Eto ハンター症候群の治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011163650A3 (en) 2013-06-13
CN103282046A (zh) 2013-09-04
PL2585104T3 (pl) 2020-01-31
EP2585104A2 (en) 2013-05-01
IL273854A (en) 2020-05-31
DK2585104T3 (da) 2019-10-14
ZA201300675B (en) 2017-11-29
TWI667037B (zh) 2019-08-01
IL291556B2 (en) 2024-02-01
AU2019204051B2 (en) 2021-07-22
KR102094094B1 (ko) 2020-03-27
AU2011270670A1 (en) 2013-02-14
SI2585104T1 (sl) 2019-11-29
JP2013538788A (ja) 2013-10-17
EP3626257B1 (en) 2021-08-04
IL291556B1 (en) 2023-10-01
MX382443B (es) 2025-03-11
KR20230079472A (ko) 2023-06-07
IL223758B (en) 2020-04-30
US9770410B2 (en) 2017-09-26
JP6045493B2 (ja) 2016-12-14
US20120009171A1 (en) 2012-01-12
EP2585104A4 (en) 2014-01-15
KR20130135821A (ko) 2013-12-11
BR112012033216B1 (pt) 2022-10-11
KR20200035167A (ko) 2020-04-01
AU2017202289B2 (en) 2019-03-14
EP2585104B1 (en) 2019-08-21
KR20180059580A (ko) 2018-06-04
KR20210131449A (ko) 2021-11-02
CN103282046B (zh) 2015-05-13
AU2017202289A1 (en) 2017-04-27
AU2021236557B2 (en) 2025-01-30
CA2803003A1 (en) 2011-12-29
IL291556A (en) 2022-05-01
AU2011270670B2 (en) 2017-01-12
CY1122282T1 (el) 2020-11-25
EP3964230A1 (en) 2022-03-09
SMT201900589T1 (it) 2020-03-13
LT2585104T (lt) 2019-10-25
CY1124910T1 (el) 2023-01-05
EP3626257A1 (en) 2020-03-25
IL273854B (en) 2022-04-01
TW201206464A (en) 2012-02-16
NZ702799A (en) 2016-08-26
KR101997935B1 (ko) 2019-10-04
MX344795B (es) 2017-01-05
ES2754776T3 (es) 2020-04-20
UA115650C2 (uk) 2017-12-11
RU2012154574A (ru) 2014-07-27
PL3626257T3 (pl) 2022-03-28
AU2021236557A1 (en) 2021-10-28
BR112012033216A2 (pt) 2020-08-25
WO2011163650A2 (en) 2011-12-29
MX2013000323A (es) 2013-06-05
AU2025202376A1 (en) 2025-04-24
KR102537084B1 (ko) 2023-05-26
RU2671503C2 (ru) 2018-11-01
NZ605873A (en) 2015-02-27
KR102318997B1 (ko) 2021-10-29
KR102720061B1 (ko) 2024-10-22
HRP20191923T1 (hr) 2020-01-10
AU2019204051A1 (en) 2019-08-29
ME03647B (me) 2020-07-20
CA2803003C (en) 2022-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7543459B2 (ja) アリールスルファターゼａのｃｎｓ送達の方法および組成物
AU2021236557B2 (en) Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a
KR102151889B1 (ko) 이듀로네이트-2-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
KR20140005842A (ko) 헤파란 n-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
HK1184709B (en) Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a
HK1184709A (en) Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a
HK40022682A (en) Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a
HK40022682B (en) Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a