RS59658B1 - Fuzioni proteini koji sadrže vezujući protein i interleukin-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za il15ra i njihova terapeutska primena - Google Patents

Fuzioni proteini koji sadrže vezujući protein i interleukin-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za il15ra i njihova terapeutska primena

Info

Publication number
RS59658B1
RS59658B1 RS20191593A RSP20191593A RS59658B1 RS 59658 B1 RS59658 B1 RS 59658B1 RS 20191593 A RS20191593 A RS 20191593A RS P20191593 A RSP20191593 A RS P20191593A RS 59658 B1 RS59658 B1 RS 59658B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cancer
antibody
fusion protein
binding
cells
Prior art date
Application number
RS20191593A
Other languages
English (en)
Inventor
Jung Gundram
Helmut Salih
Cornelia Lindner
Berit Lochmann
Original Assignee
Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum
Univ Eberhard Karls Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52629425&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59658(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum, Univ Eberhard Karls Tuebingen filed Critical Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum
Publication of RS59658B1 publication Critical patent/RS59658B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OSNOVA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na fuzione proteine koji sadrže vezujući protein i IL-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za IL15Rα kao i na njihove upotrebe, farmaceutske kompozicije koje sadrže takve fuzione proteine i postupak za proizvodnju takvih fuzionih proteina.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Druga generacija himernih ili humanizovanih monoklonskih antitela, kao što su Rituxan i Herceptin, značajno je popravila tretman pacijenata sa malignim limfomima i Her2-pozitivnim karcinomima dojke, respektivno. Generalno, međutim, terapeutska aktivnost druge generacije antitela je ograničena i ostaje urgentna medicinska potreba za razvojem optimizovanih reagenasa zasnovanih na antitelima (videti, na primer, Beck A, Wurch T, Bailly C, Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibody. Nat Rev Imunol. 2010; 10:345-352).
[0003] Smatra se da je sposobnost regrutovanja Fc-receptor (FcR)-pozitivnih imunih efektornih ćelija, kao što su NK ćelije, ključna za terapeutsku aktivnost većine antitela. Stoga, mnoge od strategija korišćenih za optimizaciju antitela fokusiraju se na poboljšanje Fc-dela što rezultuje u poboljšanoj aktivnosti ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). U principu ovo se može postići genetičkim inženjeringom glikozilacionog obrasca i/ili aminokiselinskom sekvencom CH2 domena IgGI-Fc dela koja se sadrži u većini antitumorskih antitela u trenutnoj kliničkoj upotrebi. (Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, et al. (2003) "The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity." J Biol Chem.278:3466-3473; Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa 0, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI. (2006) "Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function." Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010.
[0004] Obe strategije su korišćene u farmaceutskoj industriji za razvoj Fc optimizovane treće generacije antitela (Oflazoglu E, Audoly LP (2010) "Evolution of anti-CD20 monoclonal antibody therapeutics in oncology." MAbs 2:14-19): Roche (Basel, Switzerland) u saradnji sa Glycart (Schlieren, Switzerland) je razvio gliko inženjeringom dobijeno CD20-antitelo GA101 (Obinutuzumab). U nedavnoj velikoj kliničkoj studiji sa pacijentima koji pate od hronične limfne leukemije (CLL) ovo antitelo je bilo superiorno u odnosu na Rituxan (Goede V et al. (2014) "Obinutuzumab plus Chlorambucil in Patients with CLL and Coexisting Conditions." N Engl J Med 370:1101-1110).
[0005] Dva druga antitela usmerena na antigene povezane sa limfomom CD19 (XmAb5574) i CD30 (XmAb2513), razvijena od strane Xencor (Monrovia, CA USA) nose aminokiselinske izmene S239D i I332E (SDIE-modifikacija). Kao GA101, objavljeno je da ova antitela dovode do jasno uočljive poboljšane ADCC (Horton et al. (2008) "Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia." Cancer Res; 68:8049-8057; Foyil KV, Bartlett NL (2010) "Anti-CD30 Antibody for Hodgkin lymphoma." Curr Hematol Malig Rep 5:140-147) i trenutno se procenjuju u kliničkim studijama.
[0006] Dobro je ustanovljeno da citokini IL-2 i IL-15 poboljšavaju citolitičku aktivnost i ćelija prirodnih ubica (NK) i T ćelija. Oba citokina koriste zajednički βγ-receptor koji je kompletiran sa različitim α-lancem. Diferencijalna ekspresija α-lanca umnogome određuje biološku aktivnost citokina. Oba su sposobna da stimulišu NK ćelije i T ćelije. Međutim, dok IL-2 stimuliše T-regulatorne ćelije (T regs), izgleda da IL-15 promoviše ekspanziju npr. CD8+ memorijskih T ćelija i inhibira T regs (Ring et al. (2012) "Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15" Nat Imunol; 13:1187-1195; Waldmann (2006) "The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design" Nat Rev Imunol; 6:595-601; Perna et al. (2013) "Interleukin 15 provides relief to CTLs from regulatory T cell-mediated inhibition: implications for adoptive T cell-based therapies for lymphoma" Clin Cancer Res; 19:106-117).
[0007] Do sada, IL-2 faktor nekroze tumora (TNF), GM-CSF i IL-15 su korišćeni za konstruisanje imunocitokina (Kaspar M, Trachsel E, Neri D (2007) "The antibody-mediated targeted delivery of interleukin-15 and GMCSF to the tumor neovasculature inhibits tumor growth and metastasis." Cancer Res. 15;67(10):4940-8). Ovi imunocitokini su fuzioni proteini citokina sa antitelima, konstruisani i namenjeni da omoguće fokusiranu aktivnost citokina. Međutim, nakon in vivo primene, proporcija antitela koja je specifično vezana za tumor je ispod 1%. Dodatno, aktivnost konvencionalnog fuzionog proteina ne zavisi od njegovog specifičnog vezivanja. Kao posledica toga, sporedni efekti takvih fuzionih proteina izazvani sa ne-ciljnim vezivanjem za imune ćelije koje eksprimiraju respektivne citokinske receptore su značajne i ograničavaju doze koje se mogu bezbedno primeniti. Videti, na primer, List and Neri (2013) "Imunocytokines: a review of molecules in clinical development for cancer therapy". Clin Pharmacol; 5:29-45, Gillies et al. (1992) "Antibody targeted interleukin 2 stimulates T cell killing of autologous tumor cells", Proc Natl Acad Sci USA; 89:1428-1432, Albertini et al. (2012) "Phase II trial of hu14.18-11.2 for patients with metastatic melanoma". Cancer Imunol Imunother; 61:2261-2271, ili Ribas et al. (2009) "Phase 1/11 open-label study of the biologic effects of the interleukin-2 imunocytokine EMD 273063 (hu14.18-IL2) in patients with metastatic malignant melanoma" J Transl Med; 7:68.
[0008] U principu, određeni mehanizam dejstva IL-15 može obezbediti rešenje ovog problema: za razliku od IL-2, IL-15 okida njegov receptor u trans, koji je α-lanac receptora, eksprimiran na monocitima i dendritske ćelije trans-stimulišu β/γ-receptor na NK- i T ćelijama. Teoretski, ovo je optimalna situacija za konstruisanje fuzionog proteina ograničenog na target ćeliju kao što je imunocitokin koji okida βγ-kompleks IL-15 receptora (IL- 15Rβγ) tek nakon specifičnog vezivanja antitela za target ćeliju. Za ovu svrhu, međutim, vezivanje IL-15 za α-lanac njegovog receptora mora da se spreči.
[0009] U principu to se može postići kuplovanjem sa kompleksima vezujućih proteina ili fuzionim proteinima IL-15 i rastvorljivim rekombinantnim IL15Rα ili njegovim fragmentima (Bessard A et al. (2009) "High antitumor activity of RLI, an interleukin- 15 (IL-15)-IL-15 receptor alpha fuzioni protein, in metastatic melanoma and colorectal cancer." Mol Cancer Ther; 8:2736-2745; Vincent M et al. (2013) "Tumor targeting of the IL-15 superagonist RLI by an anti-GD2 antibody strongly enhances its antitumor potency." Int J Cancer; 133:757-765; Kermer V et al. (2012) "An antibody fusion protein for cancer imunotherapy mimicking IL-15 transpresentation at the tumor site." Mol Cancer Ther.; 11:1279-1288). Iznenađujuće, međutim, fuzioni proteini ili kompleksi IL-15 i IL-15RαFc su efikasniji od samog citokina i označeni su kao IL-15 superagonisti. Stoga, ne može se očekivati da takvi proteini izazovu ograničenu aktivnost u odnosu na target ćeliju nakon kuplovanja sa vezujućim proteinom koji targetira ovu ćeliju.
[0010] Müller et al. (2012) "Targeted cancer imunotherapy", Oncoimunology, 1(7):1213-1214 otkrivaju targetiranu imunoterapiju kancera sa antitelo-posredovanim trans-prikazivanjem IL-15 korišćenjem fuzionog proteina koji sadrži (a) antitelo koje se vezuje za antigen na ćeliji kancera i (b) IL-15.
[0011] U skladu sa ovim rezonovanjem aktivnost IL-15 superagonista nije dodatno poboljšana sa Fc-unakrsnim vezivanjem (Rubinsteinet al. "Converting IL-15 to a superagonist by binding to soluble IL-15Rα." Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103:9166-9171). Stoga, malo je verovatno da će aktivnost imunocitokina koji sadrže takve superagoniste biti ograničena na target ćeliju u prethodno definisanom smislu.
[0012] Kao sažetak, i dalje postoji potreba za obezbeđivanjem fuzionih proteina, koji mogu delovati na način specifičan za target ćeliju i/ili ne izazivaju sporedne efekte i/ili se mogu primeniti u bezbednim dozama. Ovaj problem je rešen sa primerima izvođenja koji se ogledaju u patentnim zahtevima, opisani su u opisu, i ilustrovani u Primerima i Slikama predmetne prijave.
REZIME PRONALASKA
[0013] Pronalazak je definisan priključenim patentnim zahtevima i sledećim primerima izvođenja.
[0014] Uzimajući u obzir prethodno navedeno, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji sadrži a) vezujući protein koji sadrži najmanje jedno vezujuće mesto, naznačeno time da se vezujuće mesto vezuje za antigen povezan sa target ćelijom; i b) IL-15 polipeptid, naznačeno time da IL-15 polipeptid sadrži najmanje jednu aminoksielinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 čime imaju smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom za divlji-tip IL-15 iz SEQ ID NO: 1 (Uniprot number: P40933-1) naznačeno time da se IL-15 polipeptid vezuje za IL-2/IL-15Rβγ, naznačeno time da je vezujući protein izabran iz grupe koja se sastoji od antitela, fragmenta divalentnog antitela, fragmenta monovalentnog antitela, ili proteinskog vezujućeg molekula sa vezujućim osobinama sličnim antitelu.
[0015] Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u aktivaciji efektorskih ćelija koje eksprimiraju IL2/IL-15 R βγ ograničenoj na target ćelije.
[0016] Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u target ćelija ograničenom targetiranom ubijanju ćelija posredovanom sa efektorskim ćelijama koje eksprimiraju IL-2/IL-15Rβγ.
[0017] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u poboljšanju citolitičke aktivnosti NK ćelija i T ćelija, poželjno NK ćelija, gama delta T ćelije, NK T ćelije i CD8+ T ćelija u poređenju sa citolitičkom aktivnošću nemodifikovanog vezujućeg proteina kao što je ovde opisano.
[0018] Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tremanu bolesti.
[0019] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein prema predmetnom pronalasku.
[0020] Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein prema predmetnom pronalasku.
[0021] Dodatno, predmetno otkriće odnosi se na ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku ili vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku.
[0022] Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku, koji sadrži upotrebu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein za ekspresiju fuzionog proteina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju fuzionog proteina.
[0023] Ovde je takođe unutar konteksta pronalaska otkriven komplet koji sadrži fuzioni protein prema predmetnom pronalasku.
[0024] Ovi aspekti pronalaska biće potpunije shvaćeni u odnosu na sledeći opis, crteže i neograničavajuće primere.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0025] Sl. 1. Stimulacija ograničena na target ćelije IL-15Rβγ-receptora sa primerom fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. Fuzioni protein prema predmetnom pronalasku sadrži (i) vezujući protein, koji, na primer, može biti molekul instaktnog dimernog antitela koji je usmeren na target antigen npr. na ćeliju tumora (Sl. 1A). Takav target antigen može, na primer, biti CD19 ili PSMA. Fuzioni protein prema predmetnom pronalasku dodatno sadrži (ii) IL-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom IL-15 divljeg tipa od SEQ ID NO: 1 i/ili nije više sposoban da se vezuje za IL-15Rα. U skladu sa tim, takav fuzioni protein prema pronalasku ima dve vezujuće specifičnosti, odnosno a) target antigen kao što je CD19 ili PSMA i b) IL-15Rβγ. Međutim takođe je moguće da je vezujući protein prema pronalasku bispecifični protein, na primer, bispeciifčni jednolančani Fv fragment koji ima jedno vezujuće mesto koje vezuje, na primer, CD19 i drugo vezujuće mesto koje vezuje, na primer, CD3. Takav bispecifični fuzioni protein može se fuzionisati, ili na svom N- ili C-terminusu sa IL-15 polipeptidom koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 rezultujući u molekulu sa tri vezujuća mesta.
[0026] Vraćanje na primer inventivnog fuzionog proteina prikazanog na Sl.1A koji kao vezujući molekul sadrži molekul antitela sa konstantnim CH2 i CH3 domenima. Takav vezujući protein može biti dodatno modifikovan tako da izaziva poboljšanu aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) u poređenju sa svojim nemodifikovanim odgovarajućim delom. Sl.
1A prikazuje jedan primer kako se može dobiti takav modifikovani vezujući protein, odnosno uključivanje takozvane SDIE modifikacije CH2 domena. Poznato je da ova mutacija povećava ADCC aktivnost molekula antitela. Kao što je prethodno pomenuto, dodatno vezujućem delu proteina, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku sadrži IL-15 polipeptid koji ima smanjeni ili bilo kakav afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom IL-15 divljeg tipa iz SEQ ID NO: 1. Takav IL-15 polipeptid je takođe šematski prikazan na Sl.1A. IL-15 polipeptid može biti vezan za vezujući protein preko (peptidnog ili ne-peptidnog) linkera. Alternativno, IL-15 polipeptid može biti takođe direktno fuzionisan sa vezujućim proteinom. Dodatno, u fuzionom proteinu prema pronalasku najmanje jedan (tj. jedan, dva ili više, na primer, čak tri) IL- 15 polipeptida su fuzionisani sa vezujućim proteinom. U primeru sa Sl. 1A, fuzioni protein sadrži dva mutirana IL- 15 polipeptida, od kojih je svaki fuzionisan sa CH3 domenom teškog lanca molekula antitela koji je korišćen kao vezujući protein.
[0027] Fuzioni protein prema predmetnom pronalasku omogućava aktivaciju IL-15-βγ-receptora ograničenu na target ćelije. Razlog za ovo je način na koji IL-15 izvodi svoju funkciju. Pod fiziološkim uslovima IL-15 vezuje se za dva targeta, koji su eksprimirani na različitim ćelijama (trans prikazivanje). Prvo, IL-15 divljeg tipa se vezuje sa visokim afinitetom za IL15Rα receptor koji je eksprimiran npr. na monocitima i dendritskim ćelijama. Drugo, IL15Rα zatim prikazuje vezani IL-15 (u trans) suprotnim ćelijama koje eksprimiraju IL-2/IL-15Rβγ. Pod fiziološkim uslovima IL-2/IL-15 βγ-receptor je eksprimiran na npr. memorijskim CD8+ T ćelijama, gama delta T ćelijama, NKT ćelijama ili NK ćelijama (Sl. 1B). Ovo znači da u odsustvu target ćelija βγ-receptor ne može biti aktiviran sa inventivnim fuzionim proteinima, jer se ne može odigrati trans prikazivanje od strane α-lanca (Sl.1C).
[0028] Sl. 1B i Sl. 1C kao primer opisuju funkcionisanje fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. Vezujući protein vezuje se za target ćeliju. Sa svojim IL-15 polipeptidnim delom, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku je zatim sposoban da se istovremeno veže sa βγreceptor-pozitivnim ćelijama kao što su CD8+ T ćelije ili NK ćelije (videti prethodno) i aktivira ove ćelije. Ovo imitira prikazivanje IL-15 preko IL-5Rα. Ovo je zato što trans-prikazivanje IL-15 βγ-kompleksu njegovog receptora je postignuto sa target ćelijom pre nego ćelijom koja eksprimira α-deo IL-15 receptora. Endogeni afinitet IL-15Rα je smanjen u fuzionim proteinima prema predmetnom pronalasku. Stoga, ukoliko target ćelija nije prisutna IL-15Rα posredovano prikazivanje se ne odigrava i kao posledica toga βγ-receptor-pozitivne efektorkse ćelije nisu aktivirane.
[0029] Sl.2. Vezivanje za IL-15Rα (A) i citolitička aktivnost različitih fuzionih proteina (B) koji sadrže različite IL-15 polipeptide. (A): CD19-pozitivne NALM16 ćelije su inkubirane sa naznačenim koncentracijama različitih fuzionih proteina, obojene sa rekombinantnim, Histagovanim IL-15R-α-Fc-fuzionim proteinom, Biotin-obeleženim anti-His antitelom i konačno sa streptavidin PE-konjugatom. Ćelije su zatim analizirane protočnom citometrijom.
[0030] Naročito, fuzioni protein αCD19-IL15wt (wt = divlji-tip) sadržao je CD19 antitelo 4G7 sa Fc optimizovanim humanim IgG1 konstantnim regionom (SDIE mutacija kao što je ovde opisano) fuzionisan sa humanim IL-15 (hIL-15) divljeg tipa, naznačeno time da je hIL-15 direktno vezan za CH3 domen preko linkera od dve aminokiseline, odnosno glicerin-serin linkera (ovde takođe označeno kao "kratki linker"). Ovaj fuzioni protein je služio kao kontrola. Dodatni testirani fuzioni proteini nazvani αCD19-IL15-E46K, αCD19-IL15-V49D ili αCD19-IL15-I50D sadržali su 4G7 antitelo sa Fc optimizovanim (SDIE) humanim IgG1 konstantnim regionom (SDIE mutacija kao što je ovde opisano). IL-15 polipeptid je mutiran na naznačenim položajima. Ovi položaji odgovaraju naznačenim položajima u SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, kao što je prikazano na Sl.5. Ovi aminokiselinski položaji dodatno odgovaraju aminokiselinskim supstitucijama E94K (za E46K), V97D (za V49D) i I98D (za I50D) u odnosu na SEQ ID NO: 1 (ovde takođe detaljnije opisano). U svim ovim fuzionim proteinima hIL-15 je direktno vezan sa CH3 domenom preko glicin-serin linkera.
[0031] Da bi se analiziralo da li IL-15 polipeptidi koji sadrže različite aminokiselinske supstitucije zadržavaju njihovu sposobnost da se vezuju za IL-15 Rα, u kulture je dodat Histagovani IL-15R-α-Fc-fuzioni protein (R&D systems). Stoga, ukoliko je IL-15 polipeptidni deo fuzionih proteina zadržao svoju sposobnost da se veže sa IL-15Rα, dodati His-tagovani IL-15R-α- Fc-fuzioni protein će se vezati (preko fuzionog proteina) za NALM 16 ćelije. Stoga, nakon dodavanja Biotin-obeleženog anti-His antitela (Qiagen) i streptavidin PE-konjugata (Life technologies) stvoriće se detektabilni signal. Ovaj signal je meren protočnom citometrijom (srednja vrednost intenziteta fluorescencije; MFI); y-osa na Slici 2A).
[0032] Sl. 2A prikazuje da je MFI detektovan za αCD19-IL15-wt (4G7-IL15-wt; wt = divlji-tip) fuzioni protein (kontrola) oko 300 MFI. Kako se IL-15 noramlno vezuje za ILR-15α ovaj signal obezbeđuje dokaze za vezivanje IL-15 sa IL-15Rα. αCD19-IL15-V49D (4G7-IL15-V49D) fuzioni protein pokazao je sličan signal u poređenju sa kontrolom čime je ukazao da se ovaj fuzioni protein vezuje za ILRα iako sa nešto nižim afinitetom. Fuzioni proteini αCD19-IL15-E46K (4G7-IL15-E46K) i αCD19-IL15-I50D (4G7-IL15-I50D) pokazali su MFI signal od oko 150, ukazujući da je vezivanje za IL-15Rα snažno smanjeno (ili čak odsutno). Isprekidana linija na Slici 2 A označava pozadinsko bojenje, odnosno, bojenje ćelija sa obeleženim detekcionim antitelima (bez IL15 koji sadrži fuzione proteine). Stoga, IL-15 polipeptidi koji sadrže aminokiselinske supstitucije E46K i I50D pokazali su snažno smanjeno/ili čak odsutno ILR15α-vezivanje ukoliko su korišćeni unutar fuzionog proteina koji sadrži vezujući protein (Slika 2A).
[0033] Na Sl. 2B, NALM16 ćelije su inkubirane sa respektivnim fuzionim proteinima takođe korišćenim za eksperimente prikazane na Sl. 2A i mononukleranim ćelijama periferne krvi (PBMC) zdravog dobrovoljca. Nakon 2 dana, proliferacija je procenjena korišćenjem analize usvajanja<3>H-timidina. Proliferacija u odsustvu fuzionih proteina i PBMC je definisana kao 100% proliferacija ondnosno 0% inhibicija proliferacije.
[0034] Obično takve PBMC ćelije sadrže limfocite, monocite i makrofage. Neki od limfocita, naročito NK ćelije, eksprimiraju Fcγ-receptore kao i β i zajednički γ lanac IL-2/IL-15 receptora za koji se može vezati IL- 15 (videti prethodno). Stoga, nakon vezivanja fuzionog proteina (ili više njih) za oba, NALM16 ćelije preko CD19 vezujućeg proteina (4G7: CD19-specifično antitelo) i NK ćelije preko IL15, NALM16 ćelije mogu biti ubijene. Vezivanje IL-15 sa IL-15Rβγ-aktivira NK ćelije i poboljšava antitelo posredovano ubijanje. Eksperimentima prikazanim na Sl.2A analizirana je citolitička aktivnost različitih fuzionih proteina.
[0035] Kao što se može videti na Sl.2B, αCD19-IL15-wt (4G7-IL15-wt, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) i αCD19-IL15-E46K (4G7-IL15-E46K, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) oba fuziona proteina dala su inhibiciju od oko about 80-85%. αCD19-IL15- V49D (4G7-IL15-V49D, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) protein postigao je sličan nivo, međutim, bio je manje efikasan na nižim koncentracijama. αCD19-IL15-150D (4G7-IL15-I50D, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) fuzioni protein i nemodifikovano αCD19-SDIE (4G7-SDIE) antitelo bez fuzionisanog IL-15 proteina rezultovali su u inhibiciji od oko 60% proliferacije. Stoga, iz grupe fuzionih proteina sa mutiranim IL-15, fuzioni protein koji je sadržao E46K aminokiselinsku supstituciju u IL-15 polipeptidu pokazao je najvišu citolitičku aktivnost protiv CD19 eksprimirajućih target ćelija i stoga je korišćen u sledećim eksperimentima.
[0036] Zaključci iz podataka prikazanih na Sl. 2: Dva od tri procenjena mutirana IL-15 polipeptida, E46K i I50D, nisu se vezivali za ILR-15Rα ukoliko su korišćeni unutar CD19-targeting fuzionog proteina (A). Fuzioni protein koji sadrži E46K aminokiselinsku supstituciju imao je najvišu citolitičku aktivnost protiv CD19 eksprimirajućih target ćelija (B).
[0037] Sl. 3. Proliferacija indukovana sa različitim fuzionim proteinima u NK92 ćelijama (Sl.
3A) i PBMC (Sl.3B). Dok su eksperimenti prikazani na Sl. 2 izvedeni sa fuzionim proteinima koji sadrže kratki linker eksperimenti prikazani na Sl. 3 koristili su dodatnu upotrebu fuzionih proteina koji sadrže dugački linker (L). Fuzioni proteini sa dugačkim linkerom sadrže lanac dugačak 20 aminokiselina (4-glicin 1-serin)4. U fuzionim proteinima koji sadrže kratak linker hIL-15 je direktno vezan sa CH3 domenom preko kratkog glicin-serin linkera. Fuzioni proteini koji sadrže dugački ili kratki linker su inkubirani sa NK92 ćelijama (Sl. 3A) ili PBMC (Sl. 3B) ćelijama dva dana. Zatim ćelije su obeležene sa<3>H timidinom, sakupljene na dan 3 na filteru i izbrojane u scintilacionom brojaču za tečnost.
[0038] Na Sl. 3A, NK92 ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama različitih fuzionih proteina kao što je naznačeno (x-osa i legenda za sliku na Sl.3A). NK92 ćelije su priordne ubice limfoma ćelija, koje ne eksprimiraju CD19 za koje se αCD19 vezujući protein vezuje (Gong et al. (1994) "Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells" Leukemia; 8(4):652-8). Stoga, ova ćelijska kultura nema target ćelije. Merenjem proliferacije preko<3>H-timidin brojanja kao što je prikazano na y-osi (Sl. 3A), procenjena je sposobnost fuzionih proteina da indukuju proliferaciju u efektorskim ćelijama generalno.
[0039] αCD19-IL15-wt (4G7-IL15wt; koji sadrži kratki linker, naznačeno time da 4G7 je Fcoptimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) i αCD19-IL15-wt-L (4G7-IL15wt-L; koji sadrži dugački linker, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) rezultovalo je u<3>H timidin broju od oko 25000. Međutim, protein sa dugačkim linkerom je bio znatno aktivniji na nižim koncentracijama ukazujući da kratki linker utiče na IL-15 aktivnost. Slično tome, fuzioni proteini koji sadrže IL-15 polipeptid fuzionih proteina prema predmetnom pronalasku bili su manje aktivni od onih koji sadrže divlji-tip IL-15 proteina. Stoga, E46K mutacija smanjuje IL-15 aktivnost kao što je očekivano jer ovi fuzioni proteini ne mogu biti prikazani od strane IL-15Rα. Dodatno, IL-15 aktivnost je dodatno smanjena fuzijom sa kratkim linkerom.
[0040] Slični rezultati su takođe dobijeni u eksperimentima prikazanim na Sl. 3B. Ovde, PBMC ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama različitih fuzionih proteina kao što je naznačeno (x-osa i legenda za sliku na Sl. 3B). Neke PBMCs (kao što su B ćelije) takođe eksprimiraju CD19, koji je detektovan sa αCD19 (ovde 4G7) vezujućim proteinom. Treba napomenuti da PBMC kultura takođe sadrži neke potencijalne efektorne ćelije kao što su npr. NK ćelijeKao na Sl. 3A, proliferacija je određena sa<3>H-timidin brojem kao što je prikazano na y-osi (Sl.3B).
[0041] U ovim eksperimentima, αCD19-IL15-wt (4G7-IL15wt; kratki linker) i αCD19-IL15-wt-L (4G7-IL15wt-L; koji sadrži dugački linker i divlji tip (wt) IL-15) rezultovali su u<3>H timidin broju od oko 6000 i 12000, respektivno. Ponovo, αCD19-IL15-E46K (4G7-IL15-E46K, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) obezbedilo je manju proliferaciju (oko 4500 brojanja<3>H timidina), dok je fuzioni protein αCD19- IL15-E46K-L (4G7-IL15-E46K-L; koji sadrži dugački linker, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju) rezultovao u detektovanoj proliferaciji sličnoj IL-15 divljeg tipa fuzionim proteinima (oko 8500 izbrojano; Sl.3B). Stoga, u ovom eksperimentu, αCD19-IL15-E46K-L (4G7-IL15-E46K-L) je indukovao veću proliferaciju/aktivaciju ćelija od αCD19-IL15-E46K (4G7-IL15-E46K) fuzionog proteina potvrđujući rezultate dobijene sa NK92 ćelijama.
[0042] Zaključci iz podataka prikazanih na Sl. 3: (i) Fuzioni protein sa IL-15 koi sadrži aminokiselinsku supstituciju E46K je manje aktivan od fuzionog proteina koi sadrži divlji-tip IL-15 i (ii) fuzioni proteini sa dugačkim linkerom (L) su aktivniji od onih sa kratkim linkerom. Stoga, fuzioni proteini koji sadrže dugački linker su korišćeni u sledećim eksperimentima.
[0043] Sl. 4. NK ćelijska aktivacija ograničena na target ćelije (Sl. 4A) i ubijanje B ćelija (Sl.
4B) u PBMC kulturama sa različitim fuzionim proteinima. Da bi se procenila ograničenost stvorenih fuzionih proteina na target ćelije, normalne PBMC su inkubirane sa divljim-tipom IL-15 i IL-15 polipeptidima koji imaju smanjeni afinitet za IL-15Rα od divljeg-tipa IL-15 koji se sadrži u različitim fuzionim proteinima koji targetiraju CD19 antigen povezan sa B ćelijom i membranski antigen specifičan za ćeliju prostate (PSMA), respektivno. Kako su B ćelije prisutne unutar PBMC kultura, CD19 služi kao relevantni target antigen u ovoj postavci, dok je PSMA odsutan i stoga irelevantan. PBMC su inkubirani tri dana sa naznačenim fuzionim proteinima (0.1 µg/ml) i zatim su analizirani sa protočnom citometrijom.
[0044] Na Sl. 4A aktivacija NK ćelije i ubijanje B ćelije je procenjenon merenjem broja CD56-pozitivnih ćelija koje eksprimiraju CD69 (CD56+/CD69+ dvostruko pozitivne ćelije). CD69 je eksprimiran sa aktiviranim NK ćelijama, dok je CD56 takođe eksprimiran od strane mirujućih NK ćelija. Izborom dvostruko pozitivnih ćelija (CD56+/CD69+), merene su samo aktivirane NK ćelije.
[0045] Na Sl. 4A, obezbeđeni su brojevi ćelija na y-osi i različiti korišćeni fuzioni proteini su prikazani na x-osi. U kontrolnoj PBMC kulturi ("samo PBMC") oko 12000 ćelija je eksprimiralo CD56 (CD56+) i oko 1000 su bile dvostruko pozitivne u odnosu na CD56 i CD69 (CD56+/CD69+). Primena 4G7 vezujućeg proteina koji targetira CD19 i sadrži SDIE mutacije (αCD19-SDIE) blago je povećao broj aktiviranih NK ćelija (αCD19-SDIE: Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju, bez IL-15 polipeptida vezanog za njega). Nasuprot tome, broj aktiviranih NK ćelija unutar PBMC kultura izuzetno se povećao kao rezultat dodavanja αCD19-SDIEIL15wt- L fuzionog proteina (4G7-IL15wt-L, koji sadrži dugački linker, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju). Manje prominentno ali i dalje izvanredno povećanje broja aktiviranih NK ćelija je takođe uočeno sa αCD19-SDIE-IL15-E46K-L fuzionim proteinom (4G7-IL15-E46K-L, koji sadrži dugački linker, naznačeno time da 4G7 je Fc-optimizovano 4G7 antitelo koje nosi SDIE-modifikaciju).
[0046] Izvedeni su dodatni eksperimenti sa fuzionim proteinima koji targetiraju PSMA, koji nije eksprimiran od strane PBMC ćelija. Ovde, dodavanje αPSMA-IL15-E46K-L fuzionog proteina (koji sadrži dugački linker) nije značajno izmenilo sastav ćelija. Nasuprot tome, primena αPSMA-IL15wt fuzionog proteina (koji sadrži dugački linker) značajno je povećala broj aktiviranih NK ćelija unutar pula CD56-pozitivnih ćelija.
[0047] Iz ovih rezultata se može zaključiti da je aktivacija NK ćelija sa fuzionim proteinima koji sadrže IL-15 polipeptid prema predmetnom pronalaskuis ograničena na target ćelije, odnosno vezujući protein targetira CD19, ali ne onaj koji targetira PSMA, aktivira NK ćelije i ubija B ćelije. Nakon primene fuzionih proteina koji sadrže divlji-tip IL-15 aktivacija NK ćelije ograničena na targetirane ćelije je jasno manje izražena. Ovo je stoga je divlji-tip IL-15 transprikazan od strane IL-15Rα i ne zahteva vezivanje fuzionog proteina za target ćelije.
[0048] Na Sl.4B aktivacija NK ćelija i ubijanje B ćelije je procenjeno merenjem broja CD20+ B ćelija. CD20 je ekskluzivno eksprimiran od strane B ćelija. U ovom eksperimentu, ćelijska kultura koja sadrži samo PBMC ćelije bez dodatka bilo kojih fuzionih proteina služila je kao kontrola. Ovde je izbrojano oko 12000 CD20-pozitivnih (CD20+) B ćelija. Dodavanje αCD19-SDIE kontrole je rezultovalo u smanjenju CD20-pozitivnih B ćelija (do oko 4000 ćelija). Treba napomenuti da αCD19-SDIE-IL15wt-L (koji sadrži dugački linker) i αCD19-SDIE-IL-15E46KL (koji sadrži dugački linker) fuzioni proteini su rezultovali u najvećem smanjenju CD20-pozitivnih B ćelija (oko 2000 ćelija). Nasuprot tome, dodavanje PSMAIL-15wt fuzionog proteina pokazalo je smanjenje do oko 6000 ćelija. Treba napomenuti da PSMA-IL-15-E46K-L fuzioni protein nije izmenio broj CD20-pozitivnih B-ćelija u poređenju sa "samo PBMC" kontrolom.
[0049] Stoga, smanjenje broja CD20+ ćelija (deplecija B ćelija) sa vezujućim protein-IL-15 polipeptidnim fuzioni proteinima bila je izraženija od one kod samog Fc-optimizovanog CD19 antitela (αCD19SDIE) (Sl.4B). Dodatno, PSMA usmereni fuzioni proteini su pokazali da IL-15-E46K-L fuzioni protein nije pokazao bilo kakav efekat na CD20-pozitivne B ćelije. Stoga, ubijanje B ćelija ograničeno sa target ćelijama je izraženije kod korišćenja IL-15-E46K-L fuzionih proteina, dok su fuzioni proteini koji sadrže IL-15 divlji tip pokazali manje izraženo ili čak odsustvo ubijanja B ćelija ograničeno sa target ćelijama (Sl.4B).
[0050] Na Sl. 4C aktivacija NK-ćelije je procenjena na PBMC kulturama sa depletiranim B ćelijama. B ćelije su depletirane sa magnetno-aktiviranim sortiranjem ćelija (MACS) korišćenjem CD19 MicroBeads (Miltenyi Biotec). Kao na Sl. 4A i 4B, za određivanje brojeva ćelija jednaka količina BD negativnih perlica (negativne perlice od BD Biosciences) je dadata svakom uzorku. Tokom merenja protočnom citometrijom isti broj BD negativnih perlica je dobijen za sve uzorke. Ovo je omogućilo kvantifikaciju ćelija i direktno poređenje broja ćelija između različitih uzoraka iz jednog eksperimenta. Ovi eksperimenti su demonstrirali da je aktivacija NK ćelija izuzetno smanjenja u prisustvu fuzionog proteina koi sadrži E46K mutirani IL-15 polipeptid i da skoro dostiže nivo odgovarajućeg proteina koji targetira PSMA. Ovo je stoga što su depletirane ćelije koje nose target antigen CD19. Aktivnost fuzionih proteina koji sadrže divlji tip IL-15 jedva da je bila pogođena.
[0051] Zaključci iz podataka prikazanih na Sl.4: a. aktivacija NK ćelije sa fuzionim proteinima koji sadrže IL-15 polipeptid prema predmetnom pronalasku je ograničena target ćelijama, odnosno protein koji targetira CD19 ali koji ne targetira PSMA aktivira NK ćelije i ubija B ćelije. Aktivacija NK ćelije sa CD19 targeting fuzionim proteinima koji sadrže mutirane IL-15 polipeptide je smanjena ukoliko su B ćelije depletirane iz PBMC (Sl.4C) b. Aktivacija NK ćelije sa oba fuziona proteina koji sadrže divlji tip IL-15 nije ograničena target ćelijama, odnosno oba fuziona proteina indukuju aktivaciju NK ćelije i najmanje nešto ubijanja B ćelija nezavisno od targetiranog antigena. c. Deplecija B ćelija sa inventivnim fuzionim proteinima je izraženija od one sa samim Fc-optimizovanim CD19 antitelom (4G7SDIE) (Sl.4B).
[0052] Sl. 5. Prikaz različitih sekvenci. Sekvenca divljeg tipa hIL-15 je prikazana na SEQ ID NO: 1. Prvih 48 aminokiselina ove sekvence koja je podvučena sadrže dugački signalni peptid od 48 aminokiselina, koji se iseca tokom sekrecije hIL-15 i nije deo IL-15 fuzionih proteina. Na SEQ ID NO: 1 odgovarajuće aminokiseline, koje su važne za vezivanje divljeg tipa IL-15 za IL-15Rα (prikazano na SEQ ID NO: 2, 3 i SEQ ID NO: 4, kao što je prikazano na Sl. 5) su naglašeni sivom bojom. Takođe su sivom bojom naglašene u SEQ ID NO: 1 aminokiseline važne za vezivanje za βγ- receptor kao što je opisano u in Ring et al. (2012) (Ring et al. (2012) "Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15" Nat Imunol; 13:1187-1195). Naročito, aminokiseline važne za vezivanje βγ receptora su aminokiseline koje odgovaraju aminokiselinskim položajima 55, 56, 58, 59, 109, 113, 116, 117, 156, 157, 160 of SEQ ID NO: 1. Aminokiselinski položaji važni za IL15Rα ili vezivanje βγreceptora su takođe prikazane u Tabelama 1 i 2 u nastavku.
[0053] Takođe su prikazane aminokiselinske sekvence jednog varijabilnog domena teškog lanca anti-CD19 antitela 4G7 (SEQ ID NO: 5), jednog varijabilnog domena lakog lanca anti-CD19 antitela 4G7 (SEQ ID NO: 6), jednog varijabilnog domena teškog lanca anti-FLT3 antitela BV10 (SEQ ID NO: 7), jednog varijabilnog domena lakog lanca anti-FLT3 antitela BV10 (SEQ ID NO: 8), jednog varijabilnog domena teškog lanca anti-FLT3 antitela 4G8 (SEQ ID NO: 9), jednog varijabilnog domena lakog lanca anti-FLT3 antitela 4G8 (SEQ ID NO: 10), jednog varijabilnog domena teškog lanca anti-PSMA antitela J591 (SEQ ID NO: 11), jednog varijabilnog domena lakog lanca anti-PSMA antitela J591 (SEQ ID NO: 12), jednog varijabilnog domena teškog lanca anti-endoglin antitela Kro23 (SEQ ID NO: 25), jednog varijabilnog domena lakog lanca antiendoglin antitela Kro23 (SEQ ID NO: 26). CDR sekvence su podvučene.
[0054] Sl.6. Prikaz fuzionog proteina anti-endoglin IgG1 (Kro23) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 mutanta (SEQ ID NO: 27), kao i lakog lanca anti-endoglin IgG1 (Kro23) (SEQ ID NO: 28). Na prikazu SEQ ID NO: 27, VH region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, praćeni sa CH1 regionom bez naglašavanja. Zglobni region je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen italik slovima, pri čemu sledeći CH2 region ponovo nije naglašen. Sledeći CH3 region je naglašen sivom bojom i predstavljen bold slovima, praćen sa linker sekvencom, koja nije naglašena. Finalni deo je IL15 mutant (IL15mut), koji je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen sa bold i italik slovima, i pri čemu je mutirana aminokiselina IL15 mutanta podvučena. Ova mutacija odgovara E46K mutaciji SEQ ID NO: 4. Na SEQ ID NO: 26, VL region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, pri čemu CL region nije naglašen.
[0055] Sl. 7. Prikaz fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 divlji tip sa glicin-serin linkerom (kratki linker) (SEQ ID NO: 29), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 E46K mutanta sa kratkim linkerom (SEQ ID NO: 30), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 V49D mutanta sa kratkim linkerom (SEQ ID NO: 31), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 I50D mutant sa kratkim linkerom (SEQ ID NO: 32), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 divlji tip sa (glicin4-serin1)4linker (dugački linker) (SEQ ID NO: 33), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 E46K mutanta sa dugačkim linkerom (SEQ ID NO: 34), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 V49D mutanta sa dugačkim linkerom (SEQ ID NO: 35), fuzionog proteina anti-CD19 IgG1 (4G7) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 I50D mutanta sa dugačkim linkerom (SEQ ID NO: 36), kao i laki lanac anti-CD19 IgG1 (4G7) (SEQ ID NO: 37). Na prikazu SEQ ID NOs: 30-37, VH region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, praćen sa CH1 regionom bez naglašavanja. Zglobni region je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen italik slovima, pri čemu sledeći CH2 region ponovo nije naglašen. Sledeći CH3 region je naglašen sivom bojom i predstavljen bold slovima, praćen sa linker sekvencom, koja nije naglašena. Finalni deo je IL15 mutant (IL15mut), koji je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen sa bold i italik slovima, i pri čemu je mutirana aminokiselina IL15 mutanta podvučena u fuzionim proteinima koji sadrže IL-15 mutante. Ova mutacija odgovara E46K (SEQ ID NOs: 30 i 34), V49D (SEQ ID NOs: 31 i 35), ili I50D (SEQ ID NOs: 32 and 36) mutaciji SEQ ID NO: 4, respektivno. Na SEQ ID NO: 37, VL region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, pri čemu CL region nije naglašen.
[0056] Sl. 8. Prikaz fuzionog proteina anti-FLT3 IgG1 (BV10) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 mutant (SEQ ID NO: 38), kao i lakog lanca anti-FLT3 IgG1 (BV10) (SEQ ID NO: 39). Na prikazu SEQ ID NO: 38, VH region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, praćeni sa CH1 regionom bez naglašavanja. Zglobni region je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen italik slovima, pri čemu sledeći CH2 region ponovo nije naglašen. Sledeći CH3 region je naglašen sivom bojom i predstavljen bold slovima, praćen sa linker sekvencom, koja nije naglašena. Finalni deo je IL15 mutant (IL15mut), koji je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen sa bold i italik slovima, i pri čemu je mutirana aminokiselina IL15 mutanta podvučena. Ova mutacija odgovara. Ova mutacija odgovara E46K mutacije SEQ ID NO: 4. Na SEQ ID NO: 39, VL region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, pri čemu CL region nije naglašen.
[0057] Sl. 9. Prikaz fuzionog proteina anti-FLT3 IgG1 (4G8) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 mutant (SEQ ID NO: 40), kao i lakog lanca anti-FLT3 IgG1 (4G8) (SEQ ID NO: 41). Na prikazu SEQ ID NO: 40, VH region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, praćeni CH1 regionom bez naglašavanja. Zglobni region je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen italik slovima, pri čemu sledeći CH2 region ponovo nije naglašen. Sledeći CH3 region je naglašen sivom bojom i predstavljen bold slovima, praćen sa linker sekvencom, koja nije naglašena. Finalni deo je IL15 mutant (IL15mut), koji je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen sa bold i italik slovima, i pri čemu je mutirana aminokiselina IL15 mutanta podvučena. Ova mutacija odgovara E46K mutaciji SEQ ID NO: 4. Na SEQ ID NO: 41, VL region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, pri čemu CL region nije naglašen.
[0058] Sl. 10. Prikaz fuzionog proteina anti-PSMA IgG1 (J591) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 divljeg tipa (SEQ ID NO: 42), fuzionog proteina anti-PSMA IgG1 (J591) teškog lanca koji sadrži SDIE modifikaciju i IL15 E46K mutanta (SEQ ID NO: 43), kao i laki lanac anti-PSMA IgG1 (J591) (SEQ ID NO: 44). Na prikazu SEQ ID NOs: 42 i 43, VH region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, praćeni sa CH1 regionom bez naglašavanja. Zglobni region je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen italik slovima, pri čemu sledeći CH2 region ponovo nije naglašen. Sledeći CH3 region je naglašen sivom bojom i predstavljen bold slovima, praćen sa linker sekvencom, koja nije naglašena. Finalni deo je IL15 mutant (IL15mut), koji je ponovo naglašen sivom bojom i predstavljen sa bold i italik slovima, i pri čemu je mutirana aminokiselina IL15 mutanta podvučena u fuzionom proteinu koji sadrži IL-15 mutant. Ova mutacija odgovara E46K (SEQ ID NO: 43) mutaciji SEQ ID NO: 4. Na SEQ ID NO: 44, VL region je naglašen sivom bojom, pri čemu su CDRs podvučeni, pri čemu CL region nije naglašen.
Tabela 1:
[0059]
Tabela 1: Sekvence važne za IL-15Rα vezivanje
Tabela 2:
[0060]
Tabela 2: Sekvence važne za IL-15Rβγ vezivanje
[0061] Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 4 je fragment SEQ ID NO: 1, u kojem su položaji aminokiselina važni za IL-15Rα i IL-2/IL-15Rβγ vezivanje naglašeni kao na Sl.5.
DETALJAN OPIS
[0062] Predmetna prijava obezbeđuje fuzione proteine koji su sposobni za ubijanje ograničeno target ćelijama (ovih target ćelija), naznačeno time da ovi fuzioni proteini sadrže dva "različita funkcionalna dela ", odnosno kao prvi deo vezujući protein (kao što je ovde detaljno opisano) i, kao drugi deo, IL-15 polipeptid, poželjno humani IL-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za humani "IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 of SEQ ID NO: 1 (UniProt accession number: P40933). Pronalazači su našli da takav IL-15 polipeptid sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1. Napomenuto je u ovom kontekstu da termin "IL-15Rα" je korišćen u svom uobičajenom značenju da se odnosi na Interleukin 15 receptor, alfa podjedinicu, što znači podjedinicu Interleukin 15 receptora koja vezuje IL-15 sa visokim afinitetom i nezavisno od druge dve podjedinice IL-15 receptora, CD122 i CD132 (koje IL-15 receptor deli sa receptorom za IL-2). Aminokiselinska sekvenca "IL-15Rα" je poznata za mnoge vrste, sekvenca humanog "IL-15Rα" je deponovana pod UniProt accession number Q13261.
[0063] Takođe termin "IL-15" ili "IL15" je korišćen u njegovom uobičajenom značenju da se odnosi na Interleukin 15. Aminokiselinska sekvenca "IL-15" je poznata za mnoge vrste, sekvenca humanog "IL-15" je deponovan ako Izoforma IL15- S48AA pod UniProt accession number P40933 i GeneBank Accession number DQ893709, respektivno i prikazana je na SEQ ID NO: 1).
[0064] U principu u fuzionim proteinima koji sadrže takav IL-15 polipeptid target vezujući protein zamenjuje funkciju α-lanca IL-15 receptora, što rezultuje u stimulaciji βγ-lanca ograničenoj na target ćelije koja zavisi od vezivanja vezujućeg proteina za njegov target antigen, eksprimiran npr. na ćeliji tumora. Stoga, efekti na ne-ciljane strukture su smanjeni i moguća je primena viših doza, sposobnih da postignu npr. dovoljnu aktivaciju NK i T ćelija in vivo. Po aktivaciji, npr. NK ćelije mogu biti efikasno regrutovane sa npr. Fc optimizovanim targetirajućim vezujućim proteinom sadržanim u fuzionom proteinu prema predmetnom pronalasku (Sl.1).
[0065] Fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku su alternativa koja ima prednost u odnosu na poznate komplekse ili fuzione proteine IL-15 i pogodni rastvorljivi rekombinantni IL-15Rα ili njegove fragmente. U tom pogledu, videti, npr. Bessard et al. (2009) "High antitumor activity of RLI, an interleukin-15 (IL-15)-IL-15 receptor alpha fuzioni protein, in metastatic melanoma and colorectal cancer" Mol Cancer Ther; 8:2736-2745, Vincent et al. (2013) "Tumor targeting of the IL-15 superagonist RLI by an anti-GD2 antibody strongly enhances its antitumor potency." Int J Cancer; 133:757-765, ili Kermer et al. (2012) "An antibody fuzioni protein for cancer imunotherapy mimicking IL-15 trans-presentation at the tumor site" Mol Cancer Ther; 11:1279-1288). Svi rekombinantni IL-15Rα ili njegovi fragmenti opisani u ovim referencama sadrže takozvani "suši domen", koji je važan za IL-15 vezivanje za IL-15Rα (videti Wei et al. (2001) "The Sushi Domen of Soluble IL-15 Receptor α Is Essential for Binding IL-15 and Inhibiting Inflammatory and Allogenic Responses In Vitro and In Vivo" The Journal of Imunology; vol.
167, no.1, p. 277-282). Za konstrukte koji sadrže samo IL-15, jasno je da oni funkcionišu samo preko vezivanja za oba i IL-15αR i L-2/IL-15Rβγ. Bez vezivanja za teoriju veruje se da ova dvostruka zavisnost od dva receptora (α i βγ) čini aktivnost ovih konstrukata IL-15 divljeg tipa manje specifičnim u odnosu na target ćelije. Ovo je takođe pokazano u Primerima u predmetnoj prijavi, gde je pokazano da fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku deluju na mnogo više target-oganičeni način od fuzionih proteina koi sadrže divlji tip IL-15.
[0066] Takođe je pokazano da fuzioni proteini ili kompleksi IL-15 i IL-15RαFc su efikasniji u stimulaciji proliferacije memorisjkog-fenotipa CD8+ ćelija i NK ćelija od citokina zasebno. Stoga, ovi fuzioni proteini su označeni "IL-15 superagonisti". Usled neočekivane superagonističke funkcije IL15/IL-15Rα kompleksa malo je verovatno da njihov efekat može postati ograničen u odnosu na target ćelije sa fuzijom sa npr. antitelom koje targetira tumor vezani antigen. Da aktivnost "IL-15 superagonista" nije dodatno poboljšana sa Fc-unakrsnim vezivanjem (Rubinstein et al. (2006) podržava ovu pretpostavku. "Converting IL-15 to a superagonist by binding to soluble IL-15Rα" Proc Natl Acad Sci USA; 103:9166-9171). Nasuprot tome, inventivni fuzioni proteini opisani ovde koji sadrže vezujući protein i mutirane IL-15 varijante pokazuju izrazito smanjenu IL-15 aktivnost osim ukoliko nisu vezani za target ćeliju preko vezujućeg proteina.
[0067] Naročito, predmetni pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji sadrži
a) vezujući protein koji sadrži najmanje jedno vezujuće mesto, naznačeno time da vezujuće mesto vezuje antigen vezan sa target ćelijom; i
b) IL-15 polipeptid, naznačeno time da IL-15 polipeptid sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO:1 time imajući smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 od SEQ ID NO: 1 (Uniprot number: P40933-1),
naznačeno time da se IL-15 polipeptid vezuje za IL-2/IL-15Rβγ,
naznačeno time da je vezujući protein izabran iz grupe koja se sastoji od antitela, fragmenta divalentnog antitela, fragmenta monovalentnog antitela, ili proteinskog vezujućeg molekula sa osobinama vezivanja sličnim antitelu.
[0068] Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom otkriću može biti bilo koji protein koji je sposoban da veže antigen koji je povezan sa target ćelijom. Vezujući protein je molekul antitela, na primer, intaktno antitelo, fragment divalentnog antitela, ili fragment monovalentnog antitela. Alternativno, vezujući protein je proteinski vezujući molekul sa osobinama vezivanja sličnim antitelu.
[0069] "Molekul antitela " kao što je ovde korišćeno ‘može biti antitelo pune dužine, molekul rekombinantnog antitela, ili molekul potpuno humanog antitela. Antitelo pune dužine je bilo koje antitelo koje se javlja u prirodi. Termin "antitelo" takođe uključuje imunoglobuline (Ig’s) različitih klasa (tj. IgA, IgG, IgM, IgD i IgE) i potklasa (kao što su IgG1, IgG2). Takva antitela pune dužine mogu se izolovati iz različitih životinja kao što su npr. različite vrste sisara. "Molekul rekombinantnog antitela " odnosi se na molekul antitela čiji su geni klonirani, i koje je rekombinantno proizvedeno u ćeliji ili organizmu domaćinu, korišćenjem dobro poznatih postupaka genetičkog inženjerstva. Tipično, molekul rekombinantnog antitela je genetički izmenjen da bi sadržao aminokiselinsku sekvencu, koja se ne nalazi u prirodi. Stoga, molekul rekombinantnog antitela može biti molekul himernog antitela ili molekul humanizovanog antitela. U poželjnim primerima izvođenja, fuzioni protein sadrži teški lanac imunoglobulina opisan ovde i IL-15 mutant opisan ovde, koji mogu biti vezani preko linkera opisanog ovde. U ovom aranžmanu, poželjno je da je imunoglobulinski deo lociran N terminalno od IL-15 mutanta. U takvom fuzionom proteinu, laki lanac molekula antitela je uparen sa teškim lancem antitela kao u bilo kom regularnom antitelu ili fragmentu antitela (uporediti u ovom pogledu, takođe Sl.1A)
[0070] Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može takođe biti "fragment antitela". Takvi fragmenti antitela sadrže najmanje one delove antitela, koji formiraju (antigen) vezujuće mesto. Ilustrativni primeri takvih fragmenata antitela, da se nabroje samo neki, su jednolančani varijabilni fragmenti (scFv), Fv fragmenti, antitela sa jednim domenom, kao što su npr. VHH (kamelidna) antitela, di-scFvs, fragment antigen vezujućih regiona (Fab), F(ab’)2 fragmenti, Fab’ fragmenti, diatela, domen antitela, (Holt LJ, Herring C, Jespers LS, Woolven BP, Tomlinson IM. Domain antibody: proteins for therapy. Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11):484-90), ili bispecifični "Fabsc"-antitelo molekuli kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2013/092001 koji sadrže jednolančani Fv fragment koji je vezan sa Fab fragmentom preko CH2 domena.
[0071] Kao što je prethodno naznačeno, vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može biti antitelo ili fragment divalentnog antitela koji sadrži dva vezujuća mesta sa različitim specifičnostima, na primer, jednom specifičnošću protiv antigena povezanog sa tumorom kao što je FLT3, CD20, CD10, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, ili CD44v6 (videti takođe u nastavku) i receptorom kao što je CD3 ili CD16 koji je prisutan na efektorskim ćelijama kao što su T-ćelije ili NK ćelije. Primeri formata koji se mogu koristiti za takve fragmente divalentnog antitela uključuju (Fab)2’-fragment, bispecifični jednolančani Fv fragment, bsFc-1/2-dimer ili bsFc-CH3-1/2 dimer kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2013/092001. Takođe mogu se koristiti npr. molekuli bispecifičnog (ili trispecifičnog) antitela opisani npr. u Lamerisa et al. (2014) "Bispecific antibody platforms for cancer imunotherapy" Crit Rev Oncol Hematol. S1040-8428(14)00135-8, Kontermann (2012) "Dual targeting strategies with bispecific antitela" Landes Bioscience mAbs Vol. 4, Issue 2 182-197. Alternativno, vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može takođe biti bivalentni proteinski veštački molekul kao što je lipokalin mutein koji je takođe poznat kao "duokalin".
[0072] Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može međutim imati samo jedno vezujuće mesto, tj., može biti monovalentan. Primeri monovalentnih vezujućih proteina uključuju fragmente monovalentnog antitela, proteinski vezujući molekul sa vezujućim osobinama sličnim antitelu. Primeri takvih fragmenata monovalentnog antitela uključuju Fab fragment, Fv fragment, jednolančani Fv fragment (scFv) ili scFv-Fc fragment.
[0073] Kao što je prethodno objašnjeno, vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može alternativno biti proteinski vezujući molekul sa osobinama vezivanja sličnim antitelu. Ilustrativni primeri za proteinski vezujući molekul sa osobinama vezivanja sličnim antitelu koji se mogu koristiti kao vezujući proteini uključuju aptamer, mutein zasnovan na polipeptidu lipokalin familije (primeri lipokalin muteina koji su takođe poznati pod njihovim zaštićenim nazivom "Anticalin®" su, na primer, opisani u PCT prijavama WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, WO 2006/56464 ili WO 2008/015239, ili preglednom članku od strane Skerra, A. (2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74, 257-275), glutelo, protein zasnovan na ankirin osnovi, protein zasnovan na kristalnoj osnovi, adnektin, avimer, EGF-slični domen, Kringledomen, fibronektin tip I domen, fibronektin tip II domen, fibronektin tip III domen, PAN domen, G1a domen, SRCR domen, Kunitz/goveđi domen inhibitora pankreasnog tripsina, tendamistat, Kazal-tip domena inhibitora serin proteaze, Trefoil (P-tip) domen, von Willebrand faktor tip C domen, domen sličan anafilatoksinu, CUB domen, tiroglobulin tip I ponovak, LDL-receptor klase A domen, Sushi domen (moduli komplementnog kontrolnog proteina (CCP)), Link domen, Trombospondin tip I domen, imunoglobulin domen ili imunoglobulin slični domen (na primer, domen antitela ili teški lanac antitela kamile), C-tip lektin domen, MAM domen, von Willebrand faktor tip A domen, Somatomedin B domen, domen WAP-tipa sa četiri disulfidnim jezgrom, F5/8 tip C domen, Hemopeksin domen, SH2 domen, SH3 domen, Laminin-tip EGF-slični domen, C2 domen, "Kappabodies" (III CR1, Gonzales JN, Houtz EK, Ludwig JR, Melcher ED, Hale JE, Pourmand R, Keivens VM, Myers L, Beidler K, Stuart P, Cheng S, Radhakrishnan R. Design and construction of a hybrid imunoglobulin domen with properties of both heavy and light chain variable regions. Protein Eng. 1997 Aug;10(8):949-57) "Minitela" (Martin F1, Toniatti C, Salvati AL, Venturini S, Ciliberto G, Cortese R, Sollazzo M. The affinity-selection of a minibody polipeptid inhibitor of human interleukin-6. EMBO J. 1994 Nov 15;13(22):5303-9), "Janusins" (Traunecker A, Lanzavecchia A, Karjalainen K. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells. EMBO J. 1991 Dec;10(12):3655-9 and Traunecker A, Lanzavecchia A, Karjalainen K. Janusin: new molecular design for bispecific reagents. Int J Cancer Suppl. 1992;7:51-2), nanotelo, adnektin, tetranektin, mikrotelo, afilin, afitelo ili ankirin, kristalin, knotin, ubikvitin, cink-prst protein, autofluorescentni protein, ankirin ili ankirin ponovak protein ili protein sa ponovkom bogatim leucinom, avimer (Silverman J1, Liu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domens. Nat Biotechnol. 2005 Dec;23(12):1556-61. Epub 2005 Nov 20); kao i multivalentni avimer proteini koji su evoluirali mešanjem egzona familije humanih receptor domena kao što je takođe opisano u Silverman et al. (Silverman J, Liu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domens. Nat Biotechnol.2005 Dec;23(12):1556-61. Epub 2005 Nov 20).
[0074] Termin "vezujući protein" fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku takođe uključuje ne-proteinski aptamer. Takav aptamer je oligonukleinska kiselina koja se vezuje za specifični target molekul. Ovi aptameri su obično stvoreni njihovom selekcijom iz velikog pula randomizovanih sekvenci, ali takođe postoje prirodni aptameri. Specifičnije, aptameri se mogu klasifikovati kao: DNK ili RNK aptameri. Sastoje se od (obično kratkih) lanaca oligonukleotida. Stoga, proteinski aptamer kao što je prethodno opisano može takože uključivati oligonukleotidni deo kao dodatak proteinskom delu.
[0075] Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku stoga može biti proteinski vezujući molekul sa vezujućim osobinama sličnim antitelu, koji je izabran iz grupe od aptamera, muteina zasnovanog na polipeptidu lipokalin familije, glutela, proteina zasnovanog na ankirin osnovi, proteina zasnovanog na kristalnoj osnovi, adnektina, ili avimera.
[0076] (Receptor) protein koji je vezan od strane vezujućeg proteina može biti bilo koji antigen povezan sa target ćelijom kao što je ovde opisano. Predviđeno je u ovom kontekstu od strane predmetnog pronalaska da takođe ligand receptor proteina koji je izabran ovde kao target vezujućeg proteina bude (target) protein, koji je povezan sa target ćelijom kao što je ovde opisano. Primeri za takav prirodni ili rekombinantni ligand koji vezuje receptor protein povezan sa target ćelijom su CD135 takođe poznat kao Fms-slična tirozin kinaza 3 (FLT-3), receptor-tip tirozin-protein kinaze FLT3, ili kinaza-2 (Flk2) fetalne jetre. CD135 je receptor za citokin Flt3 ligand (FLT3L). Stoga, FLT3L se takođe može koristiti kao vezujući protein da se vezuje za FLT-3. Sa druge strane FLT-3 receptor se takođe može koristiti kao vezujući protein za vezivanje FLT-3L.
[0077] Okrećući se sada fiziološkom dejstvu fuzionog proteina prema pronalasku, sposobnost regrutacije Fc-receptor (FcR)-pozitivnih imunih efektornih ćelija, kao što su NK ćelije, je viđena kao važna za terapeutsku aktivnost fuzionih proteina prema predmetnom pronalasku. Dok fuzioni protein koji sadrži kao vezujući protein ("deo a)" fuzionog proteina) kao što je molekul antitela sa konstantnim CH2 i CH3 domenima može se koristiti za ovu svrhu, napominje se da različite strategije poznate stručnjaku mogu biti korišćene da se poboljša aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) vezujućih proteina fuzionih proteina (primeri rezimirani od strane Beck et al. (2010) i Natsume et al. (2009) (Beck A et al. (2010) "Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibody. Nat Rev Imunol; 10:345-352; Natsume A, Niwa R, Satoh M. "Improving effector functions of antitela for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC" Drug Des Devel Ther. 2009;3:7-16). Sposobnost regrutovanja Fcreceptor pozitivnih imunih efektornih ćelija nije međutim nikako ograničena na fuzione proteine u vezujućem proteinu je zasnovana na antitelu/imunoglobulinu. Pre, takođe je na primer, moguće koristiti kao vezujući protein druge proteinske molekule kao što je lipokalin mutein koji je fuzionisan sa delom Fc polipeptida (koji može sadržati CH2 i/ili CH3 domen) koji obezbeđuje ADCC aktivnost. Fc polipeptid je zauzvrat fuzionisan sa mutiranim IL-15 polipeptidom kao što je ovde opisano. U takvom fuzionom proteinu Fc deo/polipeptid služi ne samo za deo koji obezbeđuje "ADCC aktivnost" već istovremeno kao linker između vezujućeg proteina i mutiranog IL-15 polipeptida.
[0078] Stoga, vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može biti modifikovan tako da ima poboljšanu antitelo zavisnu aktivnost ćelijske citotoksičnosti (ADCC) u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom. ADCC aktivnost se može meriti dobro poznatim testovima, kao što su npr. Cella™-TOX, analiza GAPDH oslobađanja, koji se mogu dobiti npr. od Promega ili Interchim. Alternativno, ADCC se može takođe izmeriti kao što je opisano u Primerima ovde. Modifikovani vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može stoga imati povećanu ADCC aktivnost kada se poredi sa (istim ali) nemodifikovanim vezujućim proteinom koji ne sadrži modifikaciju. Na primer, modifikovano 4G7 antitelo kao što je opisano ovde u Primerima ima veću ADCC aktivnost od "normalnog" 4G7 antitela koje ne sadrži SDIE modifikacije u svom Fc delu.
[0079] Jedna od strategija za poboljšanje aktivnosti ubijanja ćelija od strane fuzionih proteina prema predmetnom pronalasku može, na primer, biti upotreba konvencionalnih himernih kao i Fc-optimizovanih molekula antitela koji sadrže "SDIE mutaciju". Poznato je da poslednje pomenuta antitela posreduju u izuzetno poboljšanoj antitelo zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC) (Lazar et al. (2006) "Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Nat Acad Sci USA 2006; 103:4005-4010; Horton et al. (2008) "Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia" Cancer Res; 68:8049-8057; Foyil and Bartlett (2010) "Anti-CD30 Antibody for Hodgkin lymphoma" Curr Hematol Malig Rep; 5:140-147).
[0080] Stoga, modifikovani vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može biti Fc optimizovan. Ova modifikacija rezultuje u poboljšanoj antitelo zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC) u poređenju sa ADCC aktivnošću nemodifikovanog vezujućeg proteina. Modifikovani vezujući protein može, na primer, biti intaktno antitelo, scFv-Fc fragment, bsFc1/2 dimer ili bsFc-CH3-1/2 dimer. Poslednja dva formata antitela su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO2013/092001.
[0081] Naročito, Fc-optimizacija može sadržati aminokiselinsku supstituciju, koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od F243L i/ili D270E i/ili R292P i/ili S298A i/ili S298N i/ili Y300L i/ili 305I i/ili A330V i/ili A330L i/ili I332E i/ili E333A i/ili K334A i/ili P396L i/ili S239D naznačeno time da je numerisanje položaja u skladu sa EU indeksom. Korišćeno numerisanje aminokiselina odgovara položajima sekvence prema Kabat numerisanju [EU-Indeks]. Fc-optimizovani modifikovani vezujući protein može takođe sadržati "SDIE" mutaciju kao što je opisano u Hofmann et al. (2012) "Generation, selection and preclinical characterization of an Fc-optimized FLT3 antibody for the treatment of myeloid leukemia" Leukemia; 26:1228-1237. Stoga, Fcoptimizacija može sadržati aminokiselinsku supstituciju koja sadrži S239D i I332E naznačeno time da je numerisanje položaja u skladu sa EU indeksom. Fc-optimizacija može takođe sadržati aminokiselinske supstitucije F243L, R292P, Y300L, V305I, i P396L naznačeno time da je numerisanje položaja u skladu sa EU indeksom. Fc-optimizacija može takođe sadržati aminokiselinske supstitucije F243L, R292P i Y300L naznačeno time da je numerisanje položaja u skladu sa EU indeksom.
[0082] Takođe je predviđeno da naznačene aminokiselinske supstitucije odgovaraju naznačenim aminokiselinskim položajima. To znači da se, na primer, u fragmentima antitela ili vezujućim proteinima koji sadrže Fc domen numerisanje položaja naznačenih aminokiselina može razlikovati ali mogu još uvek imati slične susedne aminokiseline kao što je takođe ovde detaljnije objašnjeno u nastavku.
[0083] Kao što je prethodno objašnjeno sposobnost regrutovanja Fc-receptora (FcR)-pozitivnih imunih efektornih ćelija, kao što su NK ćelije, smatra se ključnim za terapeutsku aktivnost većine antitela. Sledeća strategija da se dobiju modifikovani vezujući proteini sa poboljšanom aktivnošću antitelo zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC), u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom postignuta je genetičkim inženjeringom glikozilacionog obrasca modifikovanog vezujućeg proteina.
[0084] Stoga, ukoliko su odgovarajući molekuli antitela korišćeni kao vezujući protein, takav modifikovani vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može imati glikozilacioni obrazac Fc-vezanih oligosaharida koji je različit od glikozilacionog obrasca Fcvezanih oligosaharida nemodifikovanog vezujućeg proteina. Naročito, modifikovani vezujući protein je manje fukozilovan od nemodifikovanog vezujućeg proteina. Modifikovani vezujući protein može takođe biti nefukozilovan. Na primer, Fc-vezani oligosaharidi modifikovanog vezujućeg proteina mogu biti 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% manje fukozilovani od Fc-vezanih oligosaharida nemodifikovanog vezujućeg proteina. Generalno fukozilacija proteina se može meriti tehnikama poznatim stručnjaku. Na primer, može se koristiti Click-iT® fucose alkyne od Life Technologies ili postupak kao što je opisan u EP 2483693.
[0085] Modifikovani vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može takođe sadržati oba, Fc-optimizaciju i glikozilacioni obrazac Fc-vezanih oligosaharida koji je različit od glikozilacionog obrasca Fc-vezanih oligosaharida nemodifikovanog vezujućeg proteina.
[0086] Stoga, u principu poboljšana ADCC vezujućeg proteina prema predmetnom pronalasku može se postići genetskim inženjeringom glikozilacionog obrasca i/ili aminokiselinskom sekvencom CH2 domena IgG-Fc dela koji se sadrži u većini antitumorskih antitela u trenutnoj kliničkoj upotrebi (Shinkawa et al. (2003) "The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity" J Biol Chem; 278:3466-3473; Lazar et al. (2006) "Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function" Proc Nat Acad Sci USA; 103:4005-4010).
[0087] Obe strategije su već korišćene u farmaceutskoj industriji za razvoj Fc optimizovanih antitela treće generacije (Oflazoglu & Audoly (2010) "Evolution of anti-CD20 monoclonal antibody therapeutics in oncology" MAbs; 2:14-19): Roche (Basel, Switzerland) u saradnji sa Glycart (Schlieren, Switzerland) je razvio gliko-konstruisano CD20-antitelo GA101 (Obinutuzumab). U nedavnoj velikoj kliničkoj studiji sa pacijentima koji pate od hronične limfne leukemije (OLL) ovo antitelo bilo je superiorno u odnosu na Rituxan (Goede et al. (2014) "Obinutuzumab plus Chlorambucil in Patients with CLL and Coexisting Conditions" N Engt J Med; 370:1101-1110). Druga dva antitela usmerena na antigene CD19 (XmAb5574) i CD30 (XmAb2513) povezane sa limfomom, razvijena od strane Xencor (Monrovia, CA USA) nose aminokiselinske izmene S239D i I332E (SDIE-modifikacija). Kao GA101, objavljeno je da ova antitela ispoljavaju izrazitu ADCC (Horton et al. (2008) "Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia" Cancer Res; 68:8049-8057; Foyil and Bartlett (2010) "Anti-CD30 Antitela for Hodgkin lymphoma" Curr Hematol Malig Rep; 5:140-147) i trenutno se procenjuju u kliničkim studijama). Takvi komercijalno dostupni vezujući proteini uključuju veltuzumab (anti-CD20 antitelo), ocrelizumab (anti-CD20), okratuzumab (anti-CD20 antitelo), obinutuzumab (anti-CD20 antitelo), XmAb5574 (anti-CD19 antitelo) i XmAb2513 (anti-CD20 antitelo).
[0088] U principu, bilo koji komercijalno dostupni vezujući protein može se koristiti za fuzioni protein prema predmetnom pronalasku. Dodatni primeri i čisto ilustrativni vezujući proteini koji se mogu koristiti u fuzionom proteinu prema predmetnom pronalasku uključuju rituksimab (anti-CD20 antitelo), ibritumomab (anti-CD20 antitelo), tiuksetan (anti-CD20 antitelo), tositumomab (anti-CD20 antitelo), ofatumumab (anti-CD20 antitelo), brentuksimab vedotin (anti-CD30 antitelo), gemtuzumab (anti-CD33 antitelo), ozogamicin (anti-CD33 antitelo), IGN101 (anti-EpCAM antitelo), adekatumumab (anti- EpCAM antitelo), labetuzumab (anti-CEA antitelo), minretumomab (anti-TAG-72 antitelo), J591 (anti-PSMA antitelo), hu3S193 (anti-Lewis Y antitelo), IgN311 (anti-Lewis Y antitelo), IM-2C6 (anti-VEGF antitelo), CDP791 (anti- VEGF antitelo), brevacizumab (anti-VEGF antitelo), trastuzumab (anti-ERBB2 antitelo), pertuzumab (anti-ERBB2 antitelo), MM-121 (anti-ERBB3 antitelo), cetuksimab (anti-EGFR antitelo), panitumumab (anti-EGFR antitelo), nimotuzumab (anti-EGFR antitelo), 806 (anti-EGFR antitelo), sibrotuzumab (anti-FAP antitelo), F19 (anti-FAP antitelo) i 81C6 (anti-tenascin antitelo). Predmetnoim pronalaskom je dodatno predviđeno da komercijalno dostupni vezujući proteini mogu biti modifikovani tako da imaju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa njeihovim nemodifikovanim odgovarajućim delovima.
[0089] Kao što je prethodno pomenuto, takođe su predviđeni bispecifični vezujući proteini sa jednim vezujućim mestom koji se vezuju za antigen koji je povezan sa target ćelijom kao što je ovde opisano, dok se drugo vezujuće mesto bispecifičnih vezujućih proteina vezuje za antigen povezan sa efektornom ćelijom ili target ćelijom. Antigeni povezani sa efektornom ćelijom mogu uključivati npr. CD3 ili CD16.
[0090] Različita bispecifična antitela i fragmenti divalentnog antitela su već korišćeni u kliničkim okruženjima. Primeri takvih bispecifičnih antitela i fragmenata divalentnih antitela koji se takože mogu koristiti za fuzione proteine prema predmetnom pronalasku uključuju BiMAb (anti-CD16 x anti-CD30 bispecifično monoklonsko antitelo), HRS-3/A9 (anti-CD16 x anti-CD30 antitelo), catumaksomab (removab, anti-EpCAM x anti-CD3), ertumaksomab (anti-HER2 x antiCD3), SHR-1 (anti-CD3 x anti-CD19), blinatumomab, CBA-CEACD3 (CD3 x CEA), BIS-1 (anti-EGP-2 x anti-CD3), MT-110 (anti- EpCAM x anti-CD3), EGFRBi (anti-CD3 x anti-EGFR BiAb), CD20Bi (anti-CD3 x anti-CD20 BiAb), MGD006 (anti-CD123 x anti-CD3), FBTA05 (anti-CD20 x anti-CD3), MGD007 (anti-gpA33 x anti-CD3), MOR209/ES414 (anti-PSMA x anti- CD3), BAY2010112 (anti-PSMA x anti-CD3), triomab antitela kao što je anti-CD3 x anti-EpCAM triomab i EGFRXCD3 bsFab2 (Jung et al. Int J Cancer "Local imunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antibody fragments and resting autologous lymphocytes: evidence for in situ T-cell activation and therapeutic efficacy." Jan 15;91(2):225-30, 2001). U jednom naročitom primeru, molekul bispecifičnog antitela vezuje CD3 i CD19. Primeri takvih bispecifičnih CD3 x CD19 molekula antitela uključuju one molekule jednolančanog antitela koji su opisani u Međunarodnim patentnim prijavama WO 99/54440 i WO 2004/106381. Takvi komercijalno dostupni vezujući proteini mogu takođe biti modifikovani tako da pokazuju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom kao što je ovde opisano.
[0091] Ovde je napomenuto da je unutar znanja prosečnog stručnjaka u oblasti ekspresije i prečišćavanja proteina da se konstruiše fuzija bilo kog takvog vezujućeg proteina opisanog ovde (molekul antitela ili proteinski vezujući protein) sa osobinama sličnim antitelu kao što je "Anticalin®) sa mutiranim IL-15 polipeptidom kao što je ovde korišćeno. Tipično, u ovu svrhu, stvorena je nukleinska kiselina koja omogućava, nakon ekspresije, fuziju mutiranog IL-15 polipeptida ili na C- ili na N-terminusu vezujućeg proteina. Prosečan stručnjak može odrediti (empirijski) kako da fuzioniše mutirani IL-15 polipeptid sa vezujućim proteinom uz održavanje funkcionalnosti oba dela u fuzionom proteinu prema pronalasku.
[0092] Dodatno je predviđeno da u jednom specifičnom primeru izvođenja vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku sadrži vezujuće mesto 4G7 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 5 (sekvencom varijabilnog domena teškog lanca od 4G7). Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može dodatno, ili alternativno takođe sadržati vezujće mesto 4G7 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO.6 (sekvenca varijabilnog domena lakog lanca od 4G7). Takođe ovi vezujući proteini mogu takođe biti modifikovani tako da pokazuju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom kao što je ovde opisano.
[0093] Takođe je predviđeno da vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku sadrži vezujuće mesto BV10 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 7 (sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca od BV10). Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može dodatno, ili alternativno takođe sadržati vezujće mesto BV10 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 8 (sekvenca varijabilnog domena lakog lanca od BV10). Takođe ovi vezujući proteini mogu takođe biti modifikovani tako da pokazuju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom kao što je ovde opisano.
[0094] Takođe je predviđeno da vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku sadrži vezujuće mesto 4G8 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 9 (sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca od 4G8). Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može dodatno, ili alternativno takođe sadržati vezujće mesto 4G8 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 10 (sekvenca varijabilnog domena lakog lanca od 4G8). Takođe ovi vezujući proteini mogu takođe biti modifikovani tako da pokazuju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom kao što je ovde opisano.
[0095] Takođe je predviđeno da vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku sadrži vezujuće mesto J591 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 11 (sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca od J591). Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može dodatno, ili alternativno takođe sadržati vezujće mesto J591 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 12 (sekvenca varijabilnog domena lakog lanca od J591). J591 antitelo je opisano u SAD patentu 6,107,090 i takođe je deponovano pod pristupnim brojem ATCC HB12126. Takođe ovi vezujući proteini mogu takođe biti modifikovani tako da pokazuju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom kao što je ovde opisano. Kao što je prethodno pomenuto, vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedno vezujuće mesto. Vezujući protein može međutim takođe sadržati dva ili više (na primer tri ili četiri) vezujuća mesta.
[0096] Takođe je predviđeno da vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku sadrži vezujuće mesto K-ro23 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 25 (sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca od K-ro23). Vezujući protein fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može dodatno, ili alternativno takođe sadržati vezujće mesto K-ro23 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO. 26 (sekvenca varijabilnog domena lakog lanca od K-ro23). Takođe ovi vezujući proteini mogu takođe biti modifikovani tako da pokazuju poboljšanu ADCC aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim vezujućim proteinom kao što je ovde opisano.
[0097] Vezujuće mesto vezujućeg proteina fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku vezuje se za antigen povezan sa target ćelijom. Target ćelija može, na primer, eksprimirati tumor povezani antigen (TAA) i/ili antigen povezan sa autoimunim bolestima. Primeri takvih TAA uključuju CD19, CD20, CD10, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD44v6, CD45, CDw52, Fms-slična tirozin kinaza 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R, (CD115), CD123, CD133, PDGFR-α (CD140a), PDGFR-β (CD140b), hondroitin sulfat proteoglikan 4 (CSPG4, melanom-povezan hondroitin sulfat proteoglikan), Muc-1, EGFR, de2-7-EGFR, EGFRvIII, Folat blokirajući protein, Her2neu, Her3, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, HLA-DR, IGFR, CD133, IL3R, fibroblast aktivirajući protein (FAP), Karboanhidraza IX (MN/CA IX), Karcinoembrionalni antigen (CEA), EpCAM, CDCP1, Derlin1, Tenascin, frizzled 1-10, vaskularni antigeni VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), Endoglin, CLEC14, Tem1-8, Tie2, mezotelin, epitelni glikoprotein 2 (EGP2), epitelni glikoprotein 40 (EGP40), kancer antigen 72-4 (CA72-4), podjedinica interleukin 13 receptora alfa-2, IL13Rα2, Ig kapa laki lanac (κ), GD3-gangliozid (GD3), GD2-gangliozid (GD2), acetilovane varijante GD2 i GD3, CD171, NCAM, alfa folat receptor (αFR), Lewis (Y), fetalni acetilholin receptor (FAR), homolog 3 virusnog onkogena ptičije eritroblastne leukemije (ERBB3), homolog 4 virusnog onkogena ptičije eritroblastne leukemije (ERBB4), homolog 2 virusnog onkogena ptičije eritroblastne leukemije (ERBB2), receptor faktora rasta hepatocita (HGFR/c- Met), klaudin 18.2, klaudin 3, klaudin 4, klaudin 1, klaudin 12, klaudin 2, klaudin 5, klaudin 8, klaudin 7, klaudin 6, membranski vezani CEA, Robo4 i CD138.
[0098] Primeri antigena povezanih sa autoimunim bolestima uključuju CD20, CD22, CD52 i TNFR, CD19, CD25, CD40. Target ćelija može biti ćelija tumora/kancera i/ili B ćelija.
[0099] Fuzioni protein prema predmetnom pronalasku takođe sadrži mutirani IL-15 polipeptid, naznačeno time da IL-15 polipeptid sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1. Takva mutacija rezultuje u IL-15 polipeptidu koji ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 sa SEQ ID NO: 1 (Uniprot number: P40933-1). IL-15 polipeptid takođe se ne mora uopšte vezivati sa IL-15Rα. IL- 15 polipeptid se vezuje za IL-2/IL-15Rβγ. U principu, međutim, bilo koja aminokiselinska supstitucija/delecija koja rezultuje u IL-15 polipeptidu koji ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 sa SEQ ID NO: 1 je predviđen predmetnim pronalaskom.
[0100] Termin "položaj" kada je korišćen u skladu sa predmetnim pronalaskom označava položaj aminokiseline unutar aminokiselinske sekvence prikazane ovde. Termin "odgovara" kao što je ovde korišćeno takođe uključuje da položaj nije određen samo brojem prethodnih aminokiselina. Položaj date aminokiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom koja može biti supstituisana može varirati usled delecija ili dodatnih nukleotida na drugim mestima u npr. (mutantu ili fragmentu) IL-15 polipeptida. Slično tome, položaj date aminokiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom koja može biti supstituisana može varirati usled delecije ili dodavanja aminokiselina na drugim mestima u npr. (mutantu, fragmentu ili divljem tipu) IL-15 polipeptida.
[0101] Stoga, pod "odgovarajućim položajem" kao što jekorišćeno u predmetnom pronalasku podrazumeva se da se aminokiseline mogu razlikovati u naznačenom broju ali mogu još uvek imati slične susedne aminokiseline. Aminokiseline koje se mogu zameniti, deletirati ili dodati su takođe sadržane unutar termina "odgovarajući položaj". Specifično, stručnjak može, pri poravnanju referentne sekvence (sekvence subjekta) na primer SEQ ID No: 1 sa aminokiselinskom sekvencom od interesa (sekvenca koja se traži), na primer, ispitati sekvencu od interesa za sekvencu iz SEQ ID NO: 4 (ili odgovarajuću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ovaj protein, respektivno) kada traži položaj aminokiseline kao što je ovde specifikovano (tj., položaj koji odgovara položaju 93 i/ili 112 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID No: 1).
[0102] Specifičnije, aminokiselina "L" ili "E" respektivno od pomenutog položaja je podložna supstituciji. Pomenuti "L" ili "E" je zatim zamenjen sa drugom aminokiselinom. Na primer, "L" iz pomenutog položaja je supstituisan sa aminokiselinom različitom od "L". Ili, na primer, "E" u pomenutom položaju je supstituisan sa aminokiselinom različitom od "E".
[0103] Da bi se odredilo da li aminokiselinski ostatak u datom (mutantu, fragmentu) IL-15 polipeptidne sekvence odgovara određenom položaju u aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID No: 1 stručnjak može koristiti načine i postupke dobeo poznate u tehnici, npr., poravnanja, ili ručno ili korišćenjem kompjuterskih programa kao što je BLAST2.0, koji označava Basic Local Alignment Search Tool ili ClustalW ili bilo koji drugi pogodni program koji je pogodan da stvori poravnanja sekvence.
[0104] IL-15 polipeptid fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može imati najmanje 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% identičnosti sa IL-15 polipeptidom kao što je prikazano na SEQ ID NO: 1.
[0105] Termin "identičnost sekvence" ili "identičnost" kao što je korišćeno u predmetnom pronalasku označava procenat parova identičnih ostataka – izborno nakon (homologog) poravnanja sekvence IL-15 polipeptida pronalaska sa sekvencom koja je u pitanju – u odnosu na broj ostataka u dužoj od dve sekvence. Identičnost se meri deljenjem broja identičnih ostataka sa ukupnim brojem ostataka i množenjem rezultata sa 100. Tipično, identičnost sekvence IL-15 polipeptidne sekvence identifikovane ovde je definisana kao procenat aminokiselina u kandidat sekvenci (sekvenci od interesa) koje su identične sa aminokiselinama u sekvenci proteina prikazanoj na SEQ ID No: 1.
[0106] Identičnost sekvence se može odrediti nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je neophodno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo koju konzervativnu supstituciju kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhe određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji može izvesti stručnjak, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što su BLAST, ALIGN, ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje potrebne algoritme da bi se postigao maksimum poravnanja preko pune dužine sekvenci koje se porede. Na primer, BLAST2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res.25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol.36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410; videti takođe http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome), mogu se koristiti da bi se izvršila pretraga poravnanja lokalne sekvence.
[0107] IL-15 polipeptid može takođe sadržati najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju najednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 93, 94, 97, 98, 99, 100, 114 i/ili 115 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1. IL-15 polipeptid može takođe sadržati najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 94, 97, 99 i/ili 100 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1. IL-15 polipeptid može takođe sadržati najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 94, 97 i/ili 98 aminokselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1. IL-15 polipeptid može takođe sadržati najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 94 i/ili 98 aminokselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1.
[0108] Aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselinska supstitucija, koja rezultuje u promeni aminokiseline na ovom položaju. U jendom primeru izvođenja, aminokiselina je supstituisana sa kiselom aminokiselinom, kao što je asparaginska kiselina, glutaminska kiselina ili baznom aminokiselinom kao što je lizin. Takođe je predviđeno predmetnim pronalaskom da aminokiselina koja odgovara položaju 94 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1 je supstituisana sa baznom aminokiselinom. Bazna aminokiselina može biti na primer izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina, lizina ili histidina, poželjno lizina.
[0109] Dodatno je predviđeno predmetnim pronalaskom da najmanje jedna aminokiselinska supstitucija je izabrana iz grupe koja se sastoji od L44D, E46K, L47D, V49D, I50D, L66D, L66E, I67D, i I67E. Numerisanje ovij aminokiselinskih supstitucija odgovara polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4 (Slika 5). Stoga, ove aminokiselinske supstitucije odgovaraju aminokiselinskim supstitucijama L92D, E94K, L95D, V97D, I98D, L114D, L114E, 1115D, i 1115E u odnosu na SEQ ID NO: 1 videti Tabele 3 i 4 u nastavku.
Tabela 3:
[0110]
Tabela 4:
[0111]
[0112] Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može takođe biti izabrana iz grupe koja se sastoji od E46K, V49D i/ili I50D u skladu sa aminokiselinskim položajima iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4 kao što je prikazano na Sl. 5. Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može takođe biti izabrana iz grupe koja se sastoji od E46K i/ili I50D u skladu sa aminokiselinskim položajima iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4 kao što je prikazano na Sl. 5. Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može dodatno biti izabrana iz grupe koja se sastoji od E46K u skladu sa aminokiselinskim položajima iz SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO. 4 kao što je prikazano na Sl.5.
[0113] Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može takođe biti izabrana iz grupe koja se sastoji od E94K, V97D i/ili I98D u skladu sa aminokiselinskim položajima iz SEQ ID NO: 1. Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može takođe biti izabrana iz grupe koja se sastoji od E94K i/ili I98D u skladu sa aminokiselinskim položajima iz SEQ ID NO: 1. Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može dodatno biti izabrana iz grupe koja se sastoji od of E94K u skladu sa aminokiselinskim položajima iz SEQ ID NO: 1.
[0114] IL-15 polipeptid fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može biti IL-15 protein pune dužine ili bilo koji njegov fragment ili mutant, naznačeno time da fragment i/ili mutant ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 iz SEQ ID NO: 1. Fragment ili mutant dodatno ima sposobnost vezivanja za IL-2/IL-15Rβγ.
[0115] Stoga, IL-15 polipeptidi kao i njegovi mutanti ili fragmenti imaju dve funkcije sa jedne strane vezuju se za IL-2/IL-15Rβγ i sa druge strane (i istovremeno) imaju smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 iz SEQ ID NO: 1.
[0116] Fragment IL-15 polipeptida može biti bilo koji fragment IL-15 polipeptida koji se vezuje za IL-2/IL-15Rβγ i sa druge strane (i istovremeno) ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 iz SEQ ID NO: 1. Fragment može sadržati manje aminokiselina od IL-15 polipeptida fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. Takav fragment može takođe uključiti aminokiselinske delecije u odnosu na SEQ ID NO: 1. Fragment IL-15 polipeptida može imati dužinu manju od 162 aminokiseline, na primer, dužinu manju od 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100 ili manju od čak 50 aminokiselina. Primer fragmenta može biti IL- 15 polipeptid, koji se sastoji od ili sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na SEQ ID NO: 4, koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 60, 61, 62, 63 i/ili 64 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 4. Takav IL-15 fragment, može naravno, uključivati aminokiselinske supstitucije kao što je ovde opisano u odnosu na SEQ ID NO: 1, 2 ili 3 (koje odgovaraju respektivnim položajima sekvence na SEQ ID NO: 4). Fragment IL-15 polipeptida može najmanje sadržati aminokiseline važne za vezivanje βγ receptora od SEQ ID NO: 1. Na primer fragment IL-15 polipeptida može imati aminokiselinsku sekvencu uključujući aminokiselinske položaje 55, 56, 58, 59, 116, 117, 156, 157, 160 iz SEQ ID NO: 1.
[0117] Mutant IL-15 polipeptida može sadržati dodatne aminokiselinske supstitucije ili insercije u odnosu na IL-15 polipeptid fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. Stoga IL-15 polipeptidi mogu imati najmanje 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% identičnosti sa IL-15 polipeptidom kao što je prikazano na SEQ ID NO: 1.
[0118] Generalno termin " afinitet" označava snagu interakcije između epitopa i vezujućeg mesta vezujućih proteina. Postupaci za određivanje afiniteta datog vezujućeg proteina/IL-15 polipeptida su dobro poznati stručnjaku. Afinitet vezivanja mutantnog IL-15 polipeptida može biti izmeren sa više postupaka kao što je titracija fluorescencije, kompetitivna ELISA ili rezonancija površinskog plazmona (BIAcore™). IL-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za IL-15Rα ima niži afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 sa SEQ ID NO: 1 za IL-15Rα. Takođe je predmetnim pronalaskom predviđeno da IL-15 polipeptid fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku ima afinitet za IL-15Rα koji je 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % niži od afiniteta divljeg tipa IL-15 sa SEQ ID NO: 1 za IL-15Rα.
[0119] Za vezujuće proteine IL-15 polipeptide opisane ovde, smatra se da je vezivanje specifično kada je afinitet vezivanja veći od 10<-7>M. Naročito, smatra se da je vezivanje specifično kada je afiniet vezivanja oko 10<-8>do 10<-11>M (KD), ili oko 10<-9>do 10<-11>M ili čak viši. Stoga, vezujući proteini sa afinitetom prvog vezujućeg mesta i/ili drugog vezujućeg mesta i IL-15 polipeptidi u pikomolarnom opsegu (sa KD od 10<-12>M) su takođe obuhvaćeni u predmetnom pronalasku.
[0120] Predmetnim pronalaskom je takođe predviđeno da IL-2/IL-15Rβγ može biti eksprimiran od strane efektorne ćelije na kojoj se zasnivaju farmaceutske upotrebe pronalaska. Ovo znači da efektorna ćelija može eksprimirati IL-2/IL-15Rβγ. Primeri efektornih ćelija uključuju NK ćeliju ili T-ćeliju, kao što je CD8+ T ćelija, gama delta T ćelija ili NK T ćelija. Efektorna ćelija može takođe biti CD8+ T ćelija ili NK ćelija.
[0121] Vezujući protein i IL-15 polipeptid fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može dodatno sadržati linker. Ovo takođe znači da linker ne mora da bude prisutan i da IL-15 polipeptid može biti direktno vezan za vezujući protein. Međutim, linker takođe može biti prisutan da veže vezujući protein sa IL-15 polipeptidom.
[0122] U poslednje pomenutom slučaju, linker može u principu da bude vezan bilo gde za vezujući protein i IL-15 polipeptid, obično između C-terminusa jednog dela fuzionog proteina i N-terminusa drugog dela. Pogodni linkeri su poznati u tehnici i na primer opisani u Chen et al.
(2013) "Fusion protein linkers: property, design and functionality" Adv Drug Deliv Rev; 65(10):1357-69. Linker stoga može biti bilo koji linker poznat u tehnici.
[0123] Linker može, na primer, biti deo zasnovan na linearnom ili granatom ugljovodoniku koji je povezan sa oba partnera preko aktiviranih grupa bočnog lanca kao što su amino-, tiol ili hidroksil grupe. Linker takođe može sadržati ciklične delove. Ukoliko je vezujući deo zasnovan na ugljovodoničnom delu glavni lanac linkera može sadržati samo atome ugljenika ali oež takođe sadržati heteroatome kao što su atomi kiseonika (O), azota (N) ili sumpora (S). Linker može na primer uključivati C1-C20lanac ugljenikovih atoma ili lanac zasnovan na polietru kao što je lanac zasnovan na polietilen glikolu sa -(OCH2- CH2)- ponavljajućim jedinicama. U tipičnim primerima linkera zasnovanih na ugljovodoniku, vezujući deo može sadržati između 1 do oko 150, 1 do oko 100, 1 do oko 75, 1 do oko 50, ili 1 do oko 40, ili 1 do oko 30, ili 1 do oko 20, uključujući 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, i 19 atoma glavnog lanca. Na primer, linker može sadržati:
Naznačeno time da n je ceo broj od 0 do 20, ili od 1 do 10, ili od 1 do 5, ili naznačeno time da n je 3. Stoga, na primer n može biti 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20.
[0124] Linker može međutim takođe biti peptidni linker bilo koje pogodne dužine sve dok linker ne remeti funkciju jednog ili oba dela fuzionog proteina. Linker može sadržati dva ili više, pet ili više, 10 ili više, 15 ili više, ili 20 ili više aminokiselinskih ostataka. Peptidni linker može sadržati bilo koji aminokiselinski ostatak. U jednom primeru izvođenja, peptidni linker može biti bogat malim ili polarnim aminokiselinama kao što su Gly i Ser, ali može sadržati dodatne aminokiseline kao što su Thr i Ala da bi zadržala fleksibilnost, kao i polarne aminokiseline kao što su Lys i Glu da bi se popravila rastvorljivost. Primeri fleksibilnih linkera uključuju (GGGGS)n, naznačeno time da n može biti broj između 1-7 (SEQ ID NO: 13), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 14) i EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 15), (Gly)8(SEQ ID NO: 16), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 17), (Gly)6 (SEQ ID NO: 18).
[0125] Primeri rigidnih linkera uključuju A(EAAAK)nA, naznačeno time da n može biti broj između 1-7 (SEQ ID NO: 19), (XP)nnaznačeno time da n može biti broj između 1-13, pri čemu X označava bilo koju aminokiselinu, poželjno Ala, Lys, ili Glu, (Ala-Pro)7(SEQ ID NO: 20), ili peptide od 33-ostataka koji sadrže ponovljeni -Glu-Pro- ili -Lys-Pro-. Primeri in vivo linkera koji se može iseći uključuju na primer LEAGCKNFFPRSFTSCGSLE (SEQ ID NO: 21), G-S-S-T (SEQ ID NO: 22), CRRRRRREAEAC (SEQ ID NO: 23).
[0126] U jednom primeru izvođenja, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku sadrži linker, koji sadrži glicin i serin. Linker može, na primer, sadržati aminokiselinsku sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((4-glicin 1-serin)4; SEQ ID NO: 24). Moguće je da ili N-terminalno i/ili C-terminalno takav "glicin-serin" linker može sadržati dodatne aminokiseline koje su raspoređene između IL-15 polipeptida i/ili vezujućeg proteina. Ove dodatne aminokiseline mogu, na primer, biti prisutne usled strategije kloniranja koja je korišćena da se stvori fuzioni protein prema pronalasku. U jednom takvom ilustrativnom primeru, "glicin-serin" linker kao što je (GGGGS)4linker može imati dodatni N-terminalni serin (videti, na primer, fuzioni protein prikazan na Sl.6).
[0127] Linker međutim neće biti vezan za stvarno vezujuće mesto ili vezujuća mesta vezujućeg proteina i IL- 15 polipeptida. Na primer, linker(i) često neće biti vezani za CDR3 regione antitela ili fragmenta antitela.
[0128] Za vezujući protein zasnovan na antitelu, linker(i) mogu, na primer, biti vezani za Fab deo ili Fc deo molekula antitela (vezujući protein). Specifičnije, linker(i) mogu biti vezani za CH3, CH2 ili CH1 domen vezujućeg proteina fuzionog proteina predmetnog pronalaska. Stoga, linker(i) se takođe mogu vezati za region, koji je najviše spolja u vezujućem proteinu. Ovo znači da na primer, linker(i) mogu biti vezani za CH2 domen u npr. CH3 deletiranom vezujućim proteinima, ili CH1 u CH2/CH3 deletiranim vezujućim proteinima. Takođe je predviđeno predmetnim pronalaskom da su dva linkera vezana za dva CH3 regiona vezujućeg proteina kao što je antitelo, tako da svaki CH3 domen ima vezan jedan linker. Međutim, linker može takođe biti vezan za samo jedan CH3 region datog vezujućeg proteina. U jednom primeru izvođenja, IL-15 polipeptid je vezan za CH3 domen vezujućeg proteina preko linkera.
[0129] Može međutim takođe biti, na primer, u slučaju vezujućih proteina koji se sastoje samo od VH i VL lanaca antitela da je linker(i) vezan za region zgloba koji vezuje dva lanca. U slučaju bispecifičnih vezujućih proteina kao što su npr. BiTE konstrukti kao što je Blinatumomab, linker(i) se takođe mogu vezati za linker koji vezuje dva različita vezujuća mesta.
[0130] Kao što je ovde naglašeno linkeri su tipično vezani za Fc domen vezujućih proteina kao što je opisano ovde. Treba napomenuti da je dodatno moguće fuzionisati CH1, CH2 i/ili CH3 domen sa vezujućim proteinom koji tipično ne sadrži takve domene. Na primer, ovo se može uraditi za proteinski vezujući molekul sa osobinama vezivanja sličnim antitelu kao što je ovde opisano ili sa imunoreceptorima ili njihovim ligandima kao što je ovde opisano. Na primer, takvi CH1, CH2 i/ili CH3 domeni mogu biti fuzionisani sa molekulom lipokalina preko npr. kloniranja ovih domena u sekvencu koja kodira proteinski vezujući molekul. U takvim slučajevima linker ili više od jednog linkera zatim može takođe biti vezan za ove CH1, CH2 i/ili CH3 domene.
[0131] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku može vezivati endoglin (CD105) kao antigen i stoga može sadržati vezujući protein koji se vezuje za endoglin. Vezujući protein može, na primer, biti molekul antitela ili lipokalin mutein. Endoglin je protein koji je prekomerno eksprimiran na ćelijama endotela i koji je esencijalan za angiogenzu, na osnovu čega je važan protein za rast tumora, preživljavanje i metastaziranje ćelija kancera na druge lokacije u telu. Endoglin je selektivno eksprimiran sa visokom gustinom na angiogenim endotelnim ćelijama i ushodno je regulisan hipoksijom preko indukcije hipoksija-inducibilnog faktora-1-a (HIF-1-a). Ekspresija endoglina je takođe ushodno regiulisana na endotelnim ćelijama tumora nakon inhibicije VEGF puta. Kod pacijenata sa solidnim tumorima, visoka gustina tumorskih mikrosudova, kao što jeprocenjeno sa endoglin imunohistohemijom, u korelaciji je sa lošom prognozom. Primer endoglin vezujućeg antitela koje se može koristiti u fuzionom proteinu prema pronalasku je K-ro23, koje je opisano u Schwartz, K, doktorska teza, 2013, Eberhard Karls University, Tübingen, Germany, "Generierung, präklinische Charakterisierung und Optimierung monoklonaler Antikörper zur anti-angiogenetischen Therapie solider Tumoren". Drugi primeri endoglin-vezujućeg antitela koji se mogu koristiti u fuzionom proteinu prema pronalasku je antitelo nazvano TRC05, čiji su varijabilni domeni opisani u Seon et al., (2011), Endoglin targeted cancer therapy, Curr Drug Deliv, 8(1):135-143. Antitelo TRC105 se trenutno ispituje u kliničkim studijama za tretman više tipova solidnih tumora, pri čemu su završene kliničke studije faze 1 i faze 2. Shodno tome, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku može poželjno sadržati mesto vezivanja antitela iz K-ro23 ili TRC105. Ovo mesto vezivanja antitela može sadržati ili se poželjno sastojati od aminokiselinske sekvence koja ima identičnost sekvence od najmanje 80%, poželjno najmanje 85 %, poželjno najmanje 90 %, poželjno najmanje 95 %, poželjno najmanje 98 %, poželjno najmanje 99 % poželjno 100 % sa SEQ ID NO. 27. Pomenuti fuzioni protein može dodatno biti vezan, poželjno kovalentno vezan sa IgG lakim lancem koji sadrži ili se poželjno sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima identičnost sekvence od najmanje 80%, poželjno najmanje 85 %, poželjno najmanje 90 %, poželjno najmanje 95 %, poželjno najmanje 98 %, poželjno najmanje 99 % poželjno 100 % sa SEQ ID NO.28.
[0132] Sledeći poželjni vezujući partner za mesto vezivanja koje se sadrži u fuzionim proteinima prem apronalasku je fibronektin, poželjno ekstra domen-B fibronektina. Ekstra domen-B koji sadrži fibronektin (EDB-FN) je glikoprotein velike molekulske težine koji posreduje u ćelijskoj adheziji i migraciji. Ekspresija EDB-FN je povezana sa brojnim biološkim procesima povezanim sa kancerom kao što su tumorigeneza, angiogeneza, i tranzicija epitela-u-mezenhim (EMT). Poželjna primer izvođenja fuzionog proteina prema pronalasku može stoga sadržati molekul antitela koji se specifično vezuje sa fibronektinom, poželjno sa ekstra domenom-B fibronektina, i IL-15 mutantom opisanim ovde. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, vezujući partner može biti lipokalin mutein opisan u Međunarodnoj patentnoj prijavi WO2011/069992 koji vezuje fibronektin ekstra-domen B.
[0133] Dodatni poželjni vezujući partner za mesto vezivanja koje se sadrži u fuzionim proteinima prem apronalasku je tenascin, poželjno različite izoforme tenascina C. Tenascin C (TN-C) je glikoprotein koji je kod ljudi kodiran sa TNC genom. Uključen je u brojnim različitim kancerima kao što su osteosarkomi, hondrosarcomi, kancer bešike, i glioblastomi. U ćelijama glioblastoma, Tenascin-C ekspresija obezbeđuje veći klinički i funkcionalni značaj u odnosu na prognozu kancera i progresiju tumora. Poželjni primer izvođenja fuzionog proteina prema pronalasku može stoga sadržati molekul antitela koji se specifično vezuje za tenascin, poželjno tenascin c, i IL-15 mutant opisan ovde.
[0134] Dodatni poželjni vezujući partneri koji se sadrže u fuzionim proteinima prema pronalasku su antigeni ugljeni hidrati, kao što su gangliozidi GD2 i GD3 i njihove acetilovane varijante. Takvi antigeni su eksprimirani na ćelijskoj površini većine kancera i njihova ekspresija u normalnom tkivu je često ograničena. GD2 antitela kao i imunocitokini izvedeni iz njih su uspešno korišćeni za tretman dece sa neuroblastomom (videti, na primer, Navid et al, Immune Therapies for Neuroblastoma, Cancer Biol Ther. 2009 May; 8(10): 874-882, koji objavljuje rezultate kliničke studije za anti-GD2 antitela kao što je mišje monoklonsko anti-GD2 antitelo 3F8, ili himerno antitelo Ch14.18 i imunoccitokin ch14.18-IL-2 u kojima je Fab deo antitela 14.18 bio vezan za IL-2.
[0135] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u aktivaciji efektornih ćelija koje eksprimiraju IL2/IL-15Rβγ ograničenu na target ćelije. Termin "aktivacija efektornih ćelija ograničena na target ćelije" znači da IL2/IL-15Rβγ eksprimirajuće efektorne ćelije su aktivirane u prisustvu target ćelija. Ovo je postignuto fuzionim proteinima prema predmetnom pronalasku. Sa jedne strane, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku sadrži IL-15 polipeptid kao što je ovde opisano, koji se vezuje za IL2/IL-15Rβγ eksprimirajuće efektorne ćelije. Dodatno, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku sadrži vezujući protein, koji sadrži najmanje jedno vezujuće mesto, koje se vezuje za antigen povezan sa target ćelijom. Stoga, bez vezivanja za teoriju, dovođenje efektorne i target ćelije u međusobnu blizinu, efektorna ćelija može posredovati u svojoj funkciji kao što je ubijanje target ćelije na target specifičan način. Stoga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u target ćelija-ograničenom ubijanju posredovanom sa efektornom ćelijom koja eksprimira IL-2/IL-15Rβγ. Na primer, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku može se koristiti za poboljšanje citolitičke aktivnosti NK ćelija i T ćelija, poželjno NK ćelija, gama delta T ćelije, NK T ćelije i CD8+ T ćelija u poređenju sa citolitičkom aktivnošću fuzionog proteina koji sadrži nemodifikovani vezujući protein koji nema poboljšanu ADCC-aktivnost kao što je ovde definisano.
[0136] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na fuzioni protein prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tretmanu bolesti. Ovaj tretman može biti bilo koji tretman koji je zasnovan na angažovanju efektornih ćelija. Dodatno, bilo koja terapija usmere na antigene vezane sa specifičnom target ćelijom, koja uključuje angažovanje efektornih ćelija je označena ovim terminom. Na primer, tretman bolesti može biti tretman proliferativne bolesti ili autoimune bolesti.
[0137] Primeri proliferativnih bolesti uključuju kancer nadbubrežne žlezde, analni kancer, kancer žučnog kanala, kancer bešike, kancer kosti, tumore mozga i kičmene moždine, kancer dojke, Castleman-ovu bolest, kancer grlića materice, kancer debelog creva, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, Ewing familiju tumora, kancer oka, kancer žučne kese, gastrointestinalne karcinoidne tumore, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), gestacionu trofoblastnu bolest, Hodgkin-ovu bolest, Kaposi sarkom, kancer bubrega, kancer dušnika i hipofarinksa, leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML), hroničnu mijelomonocitnu leukemiju (CMML), kancer jetre, kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, karcinoidni tumor pluća, limfom, limfom kože, maligni mezoteliom, multipli mijelom, mijelodisplstični sindrom, kancer nazalne šupljine i paranazalnog sinusa, nazofaringealni kancer, neuroblastom, ne-Hodgkin-ov limfom, kancer usne šupljine i orfarinksa, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer penisa, tumore hipofize, kancer prostate, kancer rektuma, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer pljuvačne žlezde, sarkom, kancer kože, kancer bazalnih i skvamoznih ćelija, melanom, kancer merkel ćelija, kancer tankog creva, kancer želudca, kancer testisa, kancer timusa, kancer tiroidee, sarkom uterusa, kancer vagine, kancer vulve, Waldenstrom-ovu makroglobulinemiju, ili Wilms-ov tumor. Proliferativne bolesti mogu takođe biti leukemija ili limfom.
[0138] Primeri autoimunih bolesti uključuju sistemski eritemski lupus (SLE), Goodpasture-ov sindrom, sarkoidozu, sklerodermu, reumatoidni artritis, dermatomiozitis, Sjögren-ov sindrom, sklerodermu, dermatomiozitis, psorijazu, vitiligo, Alopecia areata, diajbetes melitus tip 1, autoimuni pankreatitis, Hashimoto-ov tiroiditis, Addison-ovu bolest, multiplu sklerozu, Myasthenia gravis, Polyarteritis nodosa, idiopatsku trombocitopenijsku purpuru, hemolitičku anemiju, sindrom antifosfolipidnog antitela, pernicioznu anemiju, gastrointestinalne bolesti, celijačnu bolest, inflamatornu bolest creva, autoimuni hepatitis ili primarnu bilijarnu cirozu.
[0139] Namera je da fuzioni protein prema predmetnom pronalaskuit generalno smanji sporedne efekte uočene nakon primene IL-15 na humane pacijente (Conlon et al. (2015) "Redistribution, hyperproliferation, activation of natural killer cells and CD8 T cells, and cytokine production during first-in-human clinical trial of recombinant human interleukin-15 in patients with cancer." J Clin Oncol. 33(1):74-82). Naročito, ovi "sporedni efekti" su negativni sporedni efekti, koji nisu korisni za pacijente. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da takvi negativni sporedni efekti su usled nespecifičnog (što znači ne-target ćelija specifične) aktivacije efektorne ćelije. Stoga, kao fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku obezbeđuju aktivaciju efektornih ćelija ograničenu target ćelijom, ovi sporedni efekti se mogu smanjiti ili čak nestati.
[0140] "Nespecifična aktivacija efektorne ćelije" ili "ne-target aktivacija" efektornih ćelija bi stoga mogla biti bilo koja aktivacija efektornih ćelija, koja nije povezana sa vezivanjem vezujućeg proteina kao što je opisano ovde sa antigenom povezanim sa target ćelijom. Na primer, aktivacija ne-target efektorne ćelije bi stoga mogla biti aktivacija efektorne ćelije nezavisna od target ćelije. U jednom primeru izvođenja, nespecifična aktivacija efektorne ćelije sadrži aktivaciju efektornih ćelija u odsustvu target ćelija.
[0141] Ilustrativni primeri sporednih efekata uključuju infuzionu reakciju, povišenu temperaturu/groznice, dispneju, probleme sa cirkulatornim sistemom, imunogenost, reakcije preosteljivosti, imunosupresiju, infekcije, anemiju, autoimunu hemolitičku anemiju, leukopeniju, trombopeniju, pancitopeniju, citopeniju, pogoršanje srčane insuficijencije, lizu tumora, sindrom oslobađanja citokina, tiroidne poremećaje, kardiotoksičnost, lokalnu kožnu reakciju, povišene transaminaze jetre, hipotenziju, serumsku bolest, mukokutane reakcije, reaktivaciju hepatitisa, progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML), renalnu toksičnost i srčane aritmije.
[0142] Fuzioni protein prema predmetnom pronalasku se takođe može koristiti za povećanje doze primenjenog fuzionog proteina u poređenju sa dozom korišćenom za fuzioni protein koji sadrži vezujući protein fuzionog proteina predmetnog pronalaska, i IL-15 polipeptid koji ne sardrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 1.
[0143] Obrazloženje u osnovi ove prijave je ponovo način dejstva fuzionih proteina prema pronalasku ograničen target ćelijom. Što je više target ograničena aktivnost fuzionog molekula, manji su očekivani sporedni efekti, i stoga može biti veća prinjena doza. Stoga, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku se može koristiti u tretmanu na takav način da je doza primenjenog fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku povećana u poređenju sa dozom korišćenom za fuzione proteine koji sadrže vezujući protein kao što je ovde opisano i divlji tip IL-15 polipeptida (npr. iz SEQ ID NO: 1).
[0144] Primenjena "doza" fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može varirati unutar širokih granica da bi se postigao željeni preventivni efekat ili terapeutski odgovor. Zavisiće, na primer, od afiniteta vezujućeg proteina za izabrani target kao i od polu-života kompleksa između vezujućeg proteina/IL-15 polipeptida i target antigena in vivo. Dodatno, optimalna doza će zavisiti od biodistribucije fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku, načina primene, težine bolesti/poremećaja koji se tretira kao i medicinskog stanja subjekta/pacijenta. Na primer, kada je korišćen u masti za topikalne primene, može se koristiti visoka koncentracija fuzionog proteina prema pronalasku.
[0145] Bilo koja pogodna doza fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku može se koristiti. Stručnjak je sposoban da, na primer, empirijski odredi pogodnu dozu fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. U ilustrativnim primerima izvođenja, fuzioni protein se može koristiti u dozi od oko 0.3 mg/kg telesne težine pacijenta, od oko 0.5 mg/kg telesne težine, od oko 1 mg/kg telesne težine, od oko 2 mg/kg telesne težine, do 20 mg/kg ili čak više doze. Doza može biti maksimalno 20 mg/m<2>/dan, 15 mg/m<2>/dan, 10 mg/m<2>/dan, 7.5 mg/m<2>/dan, 6 mg/m<2>/dan, 4 mg/m<2>/dan ili manje.
[0146] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein prema predmetnom pronalasku i izborno farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. U skladu sa tim, fuzioni protein prema predmetnom pronalasku može se formulisati u kompozicije korišćenjem farmaceutski prihvatljivih sastojaka kao i ustanovljenih postupaka primene (Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije, farmaceutski inertni neorganski ili organski ekscipijenti se mogu koristiti. Za pripremu npr. plilula, praškova, želatinskih kapsula ili supozitorija, na primer, mogu se koristiti laktoza, talk, stearinska kiselina i njene soli, masti, voskovi, čvrsti ili tečni polioli, prirodna i čvrsta ulja. Pogodni ekscipijenti za proizvodnju rastvora, suspenzija, emulzija, smeša aerosola ili praškova za rekonstituciju u rastvore ili smeše aerosola pre upotrebe uključuju vodu, alkohole, glicerol, poliole, i njihove pogodne smeše kao i biljna ulja.
[0147] Farmaceutska kompozicija može takođe sadržati aditive, kao što su, na primer, punioci, vezujuća sredstva, ovlaživači, klizajuća sredstva, stabilizatori, konzervansi, emulzifikatori, i dodatni rastvarači ili sredstva za povećanje rastvorljivosti ili sredstva za posizanje depo efekta. Poslednje pomenuto je da fuzioni proteini mogu biri inkorporisani u sisteme isporuke sa sporim iliproduženim oslobađanjem ili targetirane siseme isporuke, kao što su lipozomi i mikrokapsule.
[0148] Formulacije mogu biti sterilisane brojnim načinima, uključujći filtraciju preko filtera koji zadržava bakterije, ili inkorporacijom sterilizujućih sredstava u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom medijumu neposredno pre upotrebe. Brojne moguće primene za fuzioni protein prema predmetnom pronalasku postoje u medicini.
[0149] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein prema predmetnom pronalasku. Molekul nukleinske kiseline može biti DNK ili RNK i može biti genomskog ili veštačkog porekla i može biti jednolančana ili dvolančana. Primeri nukleinskih kiselina uključuju iRNK, cRNK, sintetičku RNK, genomsku DNK, cDNK sintetičku DNK, kopolimer DNK i RNK, oligonukleotide. Respektivna nukleinska kiselina može dodatno sadržati ne-prirodne analoge nukleotida i/ili biti vezana za afinitetni tag ili obeleživač, koji se zatim može sadržati u fuzionom proteinu. Takav afinitetni tag može biti his-tag, flag tag, streptag, HA-tag, kalmodulin-tag ili GFP-tag. Molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku može na primer biti sadržan u vektoru. Predmetno otkriće se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku ili vektor kao što je ovde opisano.
[0150] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku, koji sadrži upotrebu nukelinske kiseline koja kodira fuzioni protein za ekspresiju fuzionog proteina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju fuzionog proteina. U jednom primeru izvođenja, fuzioni protein je eksprimiran od strane ćelije dommaćina ili sistema bez ćelije.
[0151] Predmetno otkriće se takođe odnosi na postupak za tretiranje bolesti koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku na subjekta. Bolest na primer može biti proliferativna ili autoimuna bolest kao što je opisano ovde.
[0152] Termin "primena" označava primenu terapeutski efikasne doze fuzionog proteina na subjekta. Termin "primena" takođe se odnosi na postupak inkorporacije fuzionog proteina u tkiva organizma. Različiti putevi primene su mogući. Fuzioni protein ili farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku može, na primer, biti primenjena različitim putevima kao bilo koji parenteralni ili ne-parenteralni (enteralni ili topikalni) put koji je terapeutski efikasan za (poželjno) proteinske lekove. Postupci parenteralne primene uključuju, na primer, tehnike potkožne, intramuskularne, intracerebralne, intracerebroventrikularne, intratekalne, intranazalne, intra-atrijalne, intraperitonealne ili intravenske injekcije i infuzije, npr. u obliku rastvora injekcije, rastvora infuzije ili tinktura. Ne-parenteralni načini isporuke su, na primer, načini enteralne isporuke kao što je oralna isporuka, npr. u obliku pilula, tableta, kapsula, rastvora ili suspenzija, ili rektalno, npr. u obliku supozitorija. Međutim, ne-oralna isporuka je poželjna. Putevi topikalne primene uključuju epikutane ili inhalacione primene. Pregled isporuke leka u pluća, tj. ili preko inhalacije aerosola (koji se takođe mogu koristiti za intranazalnu primenu) ili intratekalne instilacije dat je od strane Patton et al. (2004) na primer (J.S. Patton et al. The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 pages 338-344). Generalno, fuzioni proteini i farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu se primeniti u formulacijama koje sadrže konvencionalne netoksične farmaceutski prihvatljive ekscipijente ili nosače, aditive i vehikulume po želji i kao što je ovde opisano.
[0153] Treba napomenuti da se termin "terapeutski" ili "terapeutski efekat" odnosi na inhibiciju ili aktivaciju faktora koji izazivaju ili doprinose abnormalnom stanju. Na primer, terapeutski efekat može biti ubijanje target ćelija koje je posredovano sa efektornim ćelijama. Stoga, može se izmeriti takav terapeutski efekat merenjem smanjenja u in npr. veličini tumora ili smanjenju količine B ćelija kod subjekta koji je primio fuzioni protein ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku u poređenju sa subjektom pre primene fuzionog proteina ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku.
[0154] Fuzioni proteinI ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku takođe se mogu koristiti u ko-tretmanu sa drugim terapijama. Takav ko-tretman može uključivati primenu fuzionih proteina ili farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku, poželjno u obliku medikamenta, na subjekta koji pati od bolesti, kao što je proliferativna ili autoimuna bolest primenu drugog medikamenta/leka. Primeri takvih dodatnih lekova su lekovi korišćeni u hemoterapiji, terapiji zračenjem, inhibitori angiogeneze ili vakcine protiv kancera. Dodatni primeri takvih dodatnih primera su tiroidni suplementi, vitamini kao što je B12, ili insulinske injekcije, imunosupresivi, kao što je kortizol, natalizumab ili Infliximab.
[0155] Fuzioni proteini ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu se takođe primeniti na subjekta. Termin "subjekt" može takođe označavati čoveka ili životinju. Subjekt takođe može biti subjekt koji pati od kancer aili autoimune bolesti. Subjekt može biti kičmenjak, poželjnije sisar. Sisari uključuju domaće životinje, životinje za sport, životinje kućne ljubimce, primate, miševe i pacove. Poželjno, sisar je čovek, pas, mačka, krava, svinja, miš, pacov, naročito poželjan je čovek. Stoga, u jednom primeru izvođenja, subjekt je kičmenjak, poželjno čovek.
[0156] Predmetno otkriće se takođe odnosi na upotrebu fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za tretiranje subjekta koji ima bolest.
[0157] Predmetno otkriće se takođe odnosi na komplet koji sadrži fuzioni protein prema predmetnom pronalasku. Takav komplet može dodatno sadržati a) jedan ili više pufera; b) jedan ili više protokola.
[0158] Pogodni puferi uključuju pufere, u kojima fuzioni proteini ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu biti uskladištene ili u kojima oni mogu biti direktno primenjeni na subjekta. Uposlednje pomenutom slučaju, takv pufer je netoksičan, fiziološki prihvatljiv pufer.
[0159] Predmetno otkriće se takođe odnosi na postupak za smanjenje aktivacije nespecifične target ćelije u terapiji, pri čemu terapija sadrži primenu na subjekta fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku.
[0160] Dodatno, predmetno otkriće se odnosi na postupak za smanjenje sporednog efekta u terapiji, pri čemu terapija sadrži primenu na subjekta fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. Ilustrativni primeri sporednog efekta uključuju najmanje jedan od reakcije na infuziju, povišene temperature/groznice, dispneje, problema sa cirkulatornim sistemom, imunogenost, reakcije preosetljivosti, imunosupresiju, infekcije, anemiju, leukopeniju, trombopeniju, pogoršanje srčane insuficijencije, lize tumora, sindrom oslobađanja citokina, tiroidni poremećaj, kardiotoksičnost, lokalnu reakciju kože, tiroidne poremećaje, povišene transaminaze jetre, hipotenziju, serumsku bolest, mukokutane reakcije, reaktivaciju hepatitisa, progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML), renalnu toksičnost, ili srčane aritmije.
[0161] Predmetno otkriće se takođe odnosi na postupak za povećanje doze fuzionog proteina u terapiji, pri čemu terapija sadrži primenu na subjekta fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku.
[0162] Pronalazak je dalje ilustrovan sa sledećim neograničavajućim Primerima.
Primer 1: Stvaranje fuzionih proteina
[0163] Konstruisanje Fc-optimizovanih, SDIE-modifikovanih antitela je opisana u Hofmann et al. (2012) "Generation, selection and preclinical characterization of an Fc-optimized FLT3 antibody for the treatment of myeloid leukemia" Leukemia 26:1228-1237. Plazmid koji sadrži humanu IL-15 sekvencu je dobijen od DKFZ Genomics and Proteomics Core facility (vektor: pENTR221, hIL-15 GeneBank Accession number: DQ893709, takođe prikazan na SEQ ID NO: 1). Treba napomenuti da prvih 48 aminokiselina ove sekvence sadrži dugački signalni peptid od 48 aminokiselina, koji se iseca tokom sekrecije hIL-15 i nije deo IL-15 fuzionih proteina. BspEI i Spel restrikciona mesta su dodata preko PCR na 5’ i 3’ kraju IL-15 sekvence koja je nakon toga klonirana u pJet1.2 blunt vektor. U prvom koraku, BspEI restrikciono mesto unutar IL-15 sekvence je uklonjeno korišćenjem PCR mutageneze. U sledećem koraku 3 različita IL-15 polipeptida je stvoreno preko PCR mutageneze (E46K, V49D, i I50D- ove mutacije odgovaraju aminokiselinskim supstitucijama E94K, V97D i I98D u odnosu na SEQ ID NO: 1, videti takođe Tabelu 3 kao što je ovde opisano). Četvrti različiti IL-15 polipeptidi su introdukovani preko BspEI i Spel restrikcionih mesta u ekspresioni vektor koji sadrži varijabilni domen za 4G7 (anti-CD19/αCD19) i Fc optimizovani humani IgG1 konstantni region, tj. konstantni domen nosi aminokiselinske zamene S239D i I332E (EU numerisanje). U ovim konstruktima hIL-15 je direktno vezan sa CH3 domenom preko glicin-serin (kratki linker) (Slika 1).
[0164] PSMA-IL-15wt i PSMA-IL-15-E46K konstrukti su stvoreni u skladu sa ekspresionim vektorom koji sadrži sekvencu za J591 (anti-PSMA). Konstrukti sa dugačkim linkerom su stvoreni kao što sledi: sekvenca koja kodira linker dugačak 20 aminokiselina (4-glicin 1-serin)4plus prvih 39 nukleotida IL-15 sekvence je sintetisano kao DNK fragmenti (koji sadrže 5’ BspEI i 3’ BgIII restrikciona mesta) u Eurofins Genomics, Ebersberg, Nemačka. IL-15 sekvenca sadrži BgIII restrikciono mesto na nukleotidnom položaju 39, stoga je (4G-1S)4linker vezan u različiti IL-15 koji sadrži ekspresione vektore preko BspEI i Bglll. Slično tome, endoglin-IL-15wt i endoglin IL-15-E46K konstrukti su stvoreni u skladu sa tim korišćenjem ekspresionog vektora koji sadrži sekvencu Kro23 (himerno anti-endoglin antitelo).
[0165] Svi plazmidi sa teškim lancem su transfektovani zajedno sa odgovarajućim vektorima lakog lanca u SP2/0 ćelije. Klonovi koje proizvode jedno antitelo su prošireni i antitela su prečišćena iz supernatanta hromatografijom prema afinitetu sa proteinom A.
Primer 2: Vezivanje za IL-15Rα
[0166] CD19-pozitivne NALM16 ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama različitih fuzionih proteina, obojene sa rekombinantnim, His-tagovanim IL-15R-α-Fc-fuzionim proteinom (R&D systems), Biotin-obeleženim anti-His antitelom (Qiagen) i konačno sa streptavidin PE-konjugatom (Life technologies). Ćelije su zatim analizirane sa protočnom citometrijom (BD FACS Calibur). Da bi se izabrali najpogodniji fuzioni proteini CD19-pozitivne NALM16 ćelije su inkubirane sa naznačenim koncentracijama različitih fuzionih proteina (na y-osi Slike 2 A i B).
[0167] Fuzioni protein αCD19-IL15wt sadržao je 4G7 antitelo (anti-CD19 antitelo) sa Fc optimizovanim humanim IgG1 konstantnim regionom (SDIE mutacija kao što je prethodno opisano) fuzionisan sa divljim tipom humanog IL-15, naznačeno time da je hIL-15 direktno vezan za CH3 domen preko glicin-serin (kratki linker). Ovaj fuzioni protein služio je kao kontrola. Dodatno testirani fuzioni proteini nazvani αCD19-IL15-E46K (4G7-IL15-E46K), αCD19-IL15-V49D (4G7-IL15-V49D) ili αCD19-IL15-150D (4G7- IL15-150D) sadržali su 4G7 antitelo, sa Fc optimizovanim (SDIE) humanim IgG1 konstantnim regionom. IL-15 polipeptid je sadržao naznačenu aminokiselinsku supstituciju, respektivno. Ove aminokiselinske supstitucije odgovaraju numerisanju SEQ ID NO: 2 (prikazano na Sl. 5). U svim ovim fuzionim proteinima hIL-15 je direktno vezan sa CH3 domenom preko glicin-serin (kratki linker).
[0168] Kako CD19 vezujući protein (ovde 4G7 antitelo) je usmeren protiv CD19 stoga će se vezati za NALM16 ćelije u ovoj analizi. Da bi se shvatilo da li su IL-15 polipeptidi fuzionih proteina zadržali njihovu sposobnost da se vezuju za IL-15Rα kulturama je ddoat His-tagovani IL-15Rα-Fc-fuzioni protein (R&D systems). Stoga, ukoliko je IL-15 polipeptid fuzionih proteina zadržao svoju sposobnost da se vezuje za IL-15Rα dodati His-tagovani IL-15Rα-Fc-fuzioni protein će ostati vezan preko fuzionog proteina sa NALM 16 ćelijama. Stoga, nakon dodavanja Biotin-obeleženog anti-His antitela (Qiagen) i streptavidin PE-konjugata (Life technologies) biće stvoren detektabilni signal. Ovaj signal je meren sa srednjom vrednošću intenziteta fluorescencije (MFI; y-osa sa Slika 2A).
[0169] Slika 2 A prikazuje da MFI detektovana za αCD19-IL15-wt (4G7-IL-15-wt) fuzioni protein je oko 300 MFI. Kako se IL-15 normalno vezuje za ILR-15Rα ovaj signal obezbeđuje dokaz za vezivanje IL-15 sa ILR-15α. αCD19- IL15- V49D (4G7-IL15-V49D) fuzioni protein nije se pokazao izraženo kao kontrola čime je naznačeno da se ovaj fuzioni protein vezao za ILR-15α sa nešto manje u poređenju sa αCD19-IL-15-wt fuzionim proteinom. Nasuprot tome, fuzioni proteini αCD19-IL15-E46K i αCD19-IL15-I50D pokazali su MFI signal od oko 150, što znači da je vezivanje za ILR-15α snažno smanjeno (ili čak odsutno) u poređenju sa αCD19-IL-15-wt fuzionim proteinom. Stoga, dva od tri procenjena IL-15 polipeptida, E46K i I50D, su smanjili/ukinuli IL-15Rα-vezivanje ukoliko su korišćeni unutar fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku (Slika 2A).
Primer 3: Citolitička aktivnost različitih fuzionih proteina koji sadrže različite IL-15 polipeptide
[0170] U sledećem eksperimentu analizirana je citolitička aktivnost fuzionih proteina testiranih u Primeru 2. Da bi se to postiglo, NALM16 ćelije su inkubirane sa respektivnim fuzionim proteinima. Dodatno, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) zdravog donora su dodate ovoj kulturi. Obično takve PBMC ćelije sadrže limfocite, monocite i makrofage. Neki od limfocita kao što su npr. NK ćelije, CD8+ T ćelije ili NK T ćelije eksprimiraju β i zajednički γ lanac IL-2/IL-15 receptora za koji se IL-15 može vezati (dodatno IL-15 α lancu). Stoga, nakon vezivanja fuzionih proteina za oba i NALM16 ćelije preko αCD19 (4G7) vezujućeg proteina i za βγ-pozitivnu ćeliju preko IL-15 polipeptida NALM16 (CD19 eksprimirajuća) target ćelija može biti ubijena.
[0171] Da ni se analizirala ova citolitička aktivnost, proliferacija NALM16 target ćelija je procenjena korišćenjem analize usvajanja<3>H-timidina nakon 2 dana. U tom pogledu, proliferacija u odsustvu fuzionih proteina i PBMC je definisana kao 100% proliferacije, što znači 0% inhibicije proliferacije. Stoga, što je detektovana veća količina inhibicije proliferacije, manje proliferacije se dešava u ovoj analizi. Slično, što je manja količina proliferacije, veća je citolitička aktivnost fuzionog protein.
[0172] Kao što se može videti na Slici 2B, αCD19-IL15-wt i αCD19-IL15-V49D fuzioni proteini su oba dala oko 80-85%, međutim, u slučaju mutantnog proteina više koncentracije su bile neophodne da bi se postigla uporediva aktivnost. αCD19-IL15-I50D fuzioni protein rezultovao je u inhibiciji od oko 60% proliferacije uporedive sa onom dobijenom sa roditeljskim αCD19-SDIE (4G7SDIE) antitelom bez IL-15 dela fuzionisanog sa njim. Treba napomenuti da αCD19- IL15-E46K fuzioni protein zajedno sa divljim tipom proteina obezbedio je najvišu inhibiciju proliferacije (Slika 2 B). Stoga, fuzioni protein koji sadrži IL-15 polipeptid sa E46K aminokiselinskom supstitucijom pokazao je najvišu citolitičku aktivnost od svih mutiranih proteina protiv CD19 eksprimirajućih target ćelija i stoga je korišćen u sledećim eksperimentima.
Primer 4: Proliferacija indukovana sa različitim fuzionim proteinima u NK92 ćelijama i PBMC ćelijama
[0173] Da bi se testirao značaj dugačkog linkera (L) nasuprot kratkog linkera, proliferacija IL15 responsivnih ćelija je procenjena korišćenjem analize usvajanja<3>H-timidina opisane u Primeru 3. Responsivne ćelije su bile ili NK92 ćelije (Slika 3A) ili PBMC (Sl. 3B). U fuzionim proteinima koji sadrže kratki linker hIL-15 je direkktno vezan za CH3 domen preko glicin-serin (kratki linker). Fuzioni proteini sa dugačkim linkerom sadrže linker dugačak 20 aminokiselina (4-glicin 1-serin)4, koji direktno vezuje hIL-15 za CH3 domen.
[0174] Fuzioni proteini koji sadrže dugački ili kratki linker inkubirani su sa NK92 ćelijama (Slika 3A) ili PBMC (Slika 3B) ćelijama dva dana. Zatim, ćelije su obeležene sa<3>H timidinom, sakupljene na dan 3 na filter jastučićima i brojane u scintilacionom brojaču za tečnost.
[0175] Na Slici 3A, NK92 ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama različitih fuzionih proteina kao što je naznačeno (x-osa i legenda Slika). NK92 ćelije su ćelije prirodne ubice limfoma, koje ne eksprimiraju CD19 za koji se αCD19 (4G7) vezujući protein vezuje (Gong et al. (1994) "Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells" Leukemia; 8(4):652-8). Stoga, ovoj ćelijskoj kulturi nedostaju target ćelije. Merenjem proliferacionog<3>H-timidin broja kao što je prikazano na y-osi (Slika 3A), sposobnost fuzionih proteina da indukuju proliferaciju u efektornim ćelijama je generalno procenjena.
[0176] αCD19-IL15wt i αCD19-IL15wt-L (koji sadrži dugački linker) rezultovali su u<3>H timidin broju od oko 25000, međutim u slučaju mutantnog proteina veće koncentracije su neophodne da bi se dobila uporediva aktivnost. αCD19-IL15-E46K je obezbedio manju količinu proliferacije u kulturi ćelija (oko broja 5000 za<3>H timidin). Treba napomenuti da je fuzioni protein αCD19-IL15-E46K-L (koji sadrži dugački linker) indukovao proliferaciju od oko broja 20000 (Slika 3A). Stoga, fuzioni protein αCD19-IL15-E46K-L indukovao je višu proliferaciju/aktivaciju od αCD19-IL15- E46K fuzionog proteina.
[0177] Slični rezultati su takođe dobijeni na Slici 3B. Ovde, PBMC ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama različitih fuzionih proteina kao što je naznačeno (x-osa i legenda Slike na Sl. 3B). Neke PBMCs (kao što su B ćelije) takođe eksprimiraju CD19, koji je detektovan sa 4G7 vezujućim proteinom. Treba napomenuti da PBMC kultura takođe sadrži neke potencijalne efektorne ćelije kao što su npr. NK ćelije. Kao na Slici 3A, proliferacija je određena<3>H-timidin brojem kao što je prikazano na y-osi (Slika 3B).
[0178] U ovim eksperimentima, αCD19-IL15wt i αCD19-IL15wt-L (koji sadrži dugački linker i divlji tip (wt) IL-15 rezultovali su u<3>H timidin broju od oko 6000 i 12000, respektivno. Ponovo, αCD19-IL15-E46K je obezbedio manju proliferaciju (oko 4500<3>H timidin broja), dok je fuzioni protein αCD19-IL15-E46K-L (koji sadrži dugački linker) rezultovao u detektovanoj proliferaciji sličnoj IL-15 divljem tipu fuzionih proteina (oko 8500 broja; Slika 3B). Stoga u ovom eksperimentu, αCD19-IL15-E46K-L je indukovao višu proliferaciju/aktivaciju ćelija od αCD19-IL15-E46K fuzionog proteina.
Primer 5: Aktivacija NK ćelija ograničena target ćelijama i ubijanje target ćelija
[0179] Da bi se procenila aktivnost stvorenih fuzioninh proteina ograničena na target ćeliju, normalni PBMC su inkubirani sa divljim tipom IL-15 i mutiranim IL-15 polipeptidima sadržanim u fuzionim proteinima koji targetiraju CD19 antigen povezan sa B ćelijom i mebranskim antigenom specifičnim za prostatu (PSMA). Kako su B ćelije prisutne unutar PBMC kultura CD19 služi kao relevantni target antigen u ovom okruženju, dok je PSMA odsutan i stoga irelevantan. PBMC su inkubirane tri dana sa naznačenim fuzionim proteinima (0.1 µg/ml) i zatim su analizirani sa protočnom citometrijom.
[0180] Na Sl.4A aktivacija NK ćelije je procenjena merenjem broja CD56-pozitivnih ćelija koje eksprimiraju CD69 (CD56+/CD69+ dvostruko pozitivne ćelije). CD69 je eksprimiran sa aktiviranim T i B ćelijama, aktiviranim makrofagama i NK ćelijama, dok je CD56 eksprimiran samo sa NK ćelijama. Selekcijom dvostruko pozitivnih ćelija (CD56+/CD69+), merene su samo NK ćelije.
[0181] Na Sl. 4A, obezbeđeni su brojevi ćelija na y-osi i različiti korišćeni fuzioni proteini su prikazani na x-osi. U kontrolnoj PBMC kulturi ("samo PBMC") oko 15000 ćelija je eksprimiralo CD56 (CD56+) i oko 1000 je bilo dvostruko pozitivno za CD56 i CD69 (CD56+/CD69+). Primena αCD19-SDIE (4G7 antitelo koje sadrži SDIE mutacije; 4G7-SDIE) promenilo je kompoziciju ćelija samo marginalno (do oko 2500 aktiviranih NK ćelija). Nasuprot tome, broj aktiviranih NK ćelija unutar PBMC kultura se masovno povećao kao rezultat dodavanja αCD19-SDIE-IL15wt-L fuzionog proteina do približno 20.000 aktiviranih NK ćelija). Manje izraženo ali još uvek izvanredno povećanje u broju aktiviranih NK ćelija (približno 12.000) uočeno je sa αCD19-SDIE-IL15-E46K-L konstruktom.
[0182] Izvedeni su dodatni eksperimenti sa fuzionim proteinima koji targetiraju PSMA, koji nije eksprimiran u PBMC ćelijama. Ovde, dodavanje PSMA-IL-15-E46K-L fuzionog proteina nije aktiviralo NK ćelije. Nasuprot tome, primena PSMA-IL-15wt konstrukta je takođe značajno povećala broj aktiviranih NK ćelija unutar CD56-pozitivnog pula ćelija. Iz ovih rezultata može se zaključiti da je aktivacija NK ćelije sa konstruktima koji sadrže IL-15 polipeptid sa smanjenim afinitetom za IL-15Rα ograničena na target ćeliju, odnosno fuzioni protein koji targetira CD19 ali ne targetira PSMA aktivira NK ćelije i ubija B ćelije. Nasuprot tome, nakon primene fuzionih proteina koji sadrže divlji tip IL-15 (sa normalnim afinitetom za IL-15Rα) aktivacija NK ćelije ograničena target ćelijom je manje izražena ili čak odsutna. Ovo je stoga što je divlji tip IL-15 trans-prikazan od strane αIL15Rα i stoga ne zahteva vezivanje target ćelije da bi ispoljio svoju aktivnost.
[0183] Na Sl. 4B ubijanje B ćelija je procenjeno merenjem broja CD20+ B ćelija. CD20 je isključivo eksprimiran B ćelijama, stoga što je manje B ćelija prisutno u ćelijskoj kulturi efikasnije je ubijanje B ćelija od strane fuzionih proteina koji sadrže αCD19 vezujući protein (4G7; anti-CD19 antitelo).
[0184] Takođe u ovom eksperimentu, ćelijska kultura koja sadrži samo PBMC ćelije bez dodavanja bilo kojih fuzionih proteina služila je kao kontrola. Ovde je oko 12000 CD20-pozitivnih (CD20+) B ćelija izbrojano. Dodavanje αCD19-SDIE kontrole rezultovalo je u smanjenju CD20-pozitivnih B ćelija (do oko 5000 ćelija). Treba napomenuti da su αCD19-15wt-L i αCD19- IL15-E46K-L fuzioni proteini rezultovali u najvećem smanjenju CD20-pozitivnih B ćelija (oko 2000 ćelija). Nasuprot tome, dodavanje PSMA-IL15wt fuzionog proteina pokazalo je smanjenje do oko 6000 ćelija. Treba napomenuti da PSMA-IL15-E46KL fuzioni protein nije izmenio broj CD20-pozitivnih B-ćelija u poređenju sa "samo PBMC" kontrolom.
[0185] Stoga, smanjenje broja CD20+ ćelija (deplecija B ćelija) sa vezujućim proteinom/IL-15 fuzionim proteinima bilo je izraženije nego ono postignuto sa samim Fc-optimizovanim CD19 antitelom (αCD19-SDIE; 4G7SDIE) (Sl.4B). Dodatno, PSMA usmereni fuzioni protein PSMA-IL15-E46K-L niej imao nikakav efekat na CD20-pozitivne B ćelije i PSMA IL15-wt fuzioni protein imao je umereni efekat. Stoga, ubijanje B ćelija ograničeno target ćelijama je najizraženije korišćenjem IL-15-E46K-L fuzionih proteina, dok su fuzioni proteini koji sadrže IL-15 divlji tip pokazali manje izraženo ili čak odsutno ubijanje B ćelija ograničeno target ćelijama (Sl.4 B).
[0186] Na Sl. 4C aktivacija NK-ćelije je procenjena u PBMC kulurama sa depletiranim B ćelijama. B ćelije su depletirane sa magnetno-aktiviranim sortiranjem ćelija (MACS) korišćenjem CD19 MicroBeads (Miltenyi Biotec). Kao na Sl. 4B, za određivanje broja ćelija jednaka količina BD negativnih perlica (negativne perlice od BD Biosciences) je dodata svakom uzorku. Tokom merenja protočnom citometrijom isti broj BD negativnih perlica je dobijen za sve uzorke. Ovo je omogućilo kvantifikaciju ćelija i direktno poređenje broja ćelija između različitih uzoraka iz jednog eksperimenta. Kako je CD69 eksprimiran od strane aktiviranih T i B ćelija, aktiviranih makrofaga i NK ćelija i CD56 je eksprimiran samo od strane NK ćelija, deplecija B ćelija ograničila je ove ćelijske pulove na T ćelije i NK ćelije. Kako su CD19 eksprimirajuće ćelije depletirane u ovim eksperimentima aktivnost CD19 targetinga fuzionog proteina koji sadrži mutirani IL-15 je snažno smanjena ali ne od onoga koji sadrži divlji tip proteina.
[0187] Zaključci: aktivacija NK ćelije sa fuzionim proteinima koji sadrže IL-15 polipeptide sa smanjenim afinitetom za IL-15Rα divljeg tipa IL-15 (SEQ ID NO: 1) su ograničeni target ćelijama, odnosno protein koji targetira CD19 ali ne targetira PSMA aktivira NK ćelije i ubija B ćelije. Kao posledica toga, aktivacija NK ćelija od strane CD19 targeting fuzionog proteina je smanjena ukoliko su B ćelije depletirane iz PBMC (Sl. 4C). a. aktivacija NK ćelije sa oba fuziona proteina koji sadrže divlji tip IL-15 nije ograničena target ćelijama, odnosno oba fuziona proteina indukuju aktivaciju NK ćelije i najmanje nešto ubijanja B ćelija nezavisno od targetiranog antigena. b. Deplecija B ćelije sa vezujućim proteinom/IL-15 fuzionisanim proteinima (sa smanjenim afinitetom za IL-15Rα nego divlji tip IL- 15) je izraženija nego ona od samog Fc-optimizovanog CD19 antitela (αCD19-SDIE) (Sl.4B).
[0188] Ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini korišćeni u ovom dokumentu, uključujući opis i patentne zahteve, imaju definicije date u nastavku.
[0189] Ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "najmanje" koji prethodi seriji elemenata podrazumeva da se odnosi na svaki element u seriji.
[0190] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, ukoliko kontekst ne nalaže drugačije, reč "sadrži", i varijacije kao što su "koji sadrži" i "sadržati", podrazumeva se da uključuju navedeni ceo broj ili korak ili grupu celih brojeva ili koraka ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada je ovde korišćen termin "sadržati" može se zameniti terminom "sastojati se" ili nekada kada je ovde korišćeno sa terminom "imati".
[0191] Kada je ovde korišćeno "sastoji se od" isključuje bilo koji element, korak, ili sastojak koji nije specifikovan u elementu patentnog zahteva. Kada je ovde korišćeno, "sastoji se suštinski od" ne isključuje materijale ili korake koji materijalno ne utiču osnovne i nove karakteristike patentnog zahteva. U svakom pojavljivanju ovde bilo koji od termina "sadržati", "sastojati se suštinski od" i "sastojati se od" može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina.
[0192] Kao što je ovde korišćeno, vezni termin "i/ili" između više navedenih elemenata podrazumeva se da obuhvata i pojedinačne i kombinovane opcije. Na primer, gde su dva elementa spojena sa "i/ili", prva opcija se odnosi na primenjivost prvog elementa bez drugog. Druga opcija se odnosi na primenjivost drugog elementa bez prvog. Treća opcija odnosi se na primenjivost prvog i drugog elementa zajedno. Podrazumeva se da bilo koja od ovih opcija potpada pod značenje, i stoga zadovoljava zahteve termina "i/ili" kao što je ovde korišćeno. C Takođe se podrazumeva istovremena primena bilo koja više od jedne od ovih opcija potpada pod značenje, i stoga zadovoljava zahteve termina "i/ili" kao što je ovde korišćeno.
[0193] Reč "oko" kao što je ovde korišćeno odnosi se na vrednost koja je unutar prihvatljivog opsega greške az određenu vrednost kao što je određeno od strane stručnjaka, što će delimično zavisiti od toga kako je vrednost merena ili određena, tj., ograničenja sistema merenja. Na primer, "oko" može značiti unutar 1 ili više od 1 standardne devijacije, u skladu sa praksom u tehnici. Termin "oko" je takođe korišćen da označi da količina ili vrednost u pitanju može biti određena vrednost ili neka druga vrednost koja je približno ista. Namera je da izraz saopštava da slične vrednosti promovišu jednake rezultate ili efekte u skladu sa pronalaskom. U ovom kontekstu "oko" se može odnositi na opseg iznad i/ili ispod do 10%. Reč "oko" se u nekim primerima izvođenja odnosi na opseg iznad i ispod određene vrednosti koja je do 5%, kao što je do 2%, do 1%, ili do 0.5 % iznad ili ispod te vrednosti. U jednom primeru izvođenja "oko" se odnosi na opseg do 0.1 % iznad i ispod date vrednosti.
SPISAK REFERENCI
[0194]
1. Beck A, Wurch T, Bailly C, Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antitela. Nat Rev Imunol.2010; 10:345-352.
2. Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antitelodependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem. 2003; 278:3466-3473.
3. Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa 0, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI. Engineered antitelo Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:4005-4010.
4. Oflazoglu E, Audoly LP. Evolution of anti-CD20 monoclonal antitelo therapeutics in oncology. MAbs. 2010; 2:14-19.
5. Valentin Goede, M.D., Kirsten Fischer, M.D., Raymonde Busch, M.S., Anja Engelke, M.D., Barbara Eichhorst, M.D., Clemens M. Wendtner, M.D., Tatiana Chagorova, M.D., Javier de la Serna, M.D., Marie-Sarah Dilhuydy, M.D., Thomas Ilimer, M.D., Stephen Opat, M.D., Carolyn J. Owen, M.D., Olga Samoylova, M.D., Karl-Anton Kreuzer, M.D., Stephan Stilgenbauer, M.D., Hartmut Döhner, M.D., Anton W. Langerak, Ph.D., Matthias Ritgen, M.D., Michael Kneba, Elina Asikanius, M.Sc., Kathryn Humphrey, B.Sc., Michael Wenger, M.D., and Michael Hallek, M.D. Obinutuzumab plus Chlorambucil in Patients with CLL and Coexisting Conditions. N Engt J Med 2014; 370:1101-1110.
6. Horton HM, Bernett MJ, Pong E, Peipp M, Karki S, Chu SY, Richards JO, Vostiar I, Joyce PF, Repp R, Desjarlais JR, Zhukovsky EA. Potent in vitro and in vivo activity of an Fcengineered anti-CD19 monoclonal antitelo against lymphoma and leukemia. Cancer Res 2008; 68:8049-8057.
7. Foyil KV, Bartlett NL. Anti-CD30 Antitela for Hodgkin lymphoma. Curr Hematol Malig Rep 2010; 5:140-147.
8. Ring AM, Lin JX, Feng D, Mitra S, Rickert M, Bowman GR, Pande VS, Li P, Moraga I, Spolski R, Ozkan E, Leonard WJ, Garcia KC. Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15. Nat Imunof 2012; 13:1187-1195.
9. Waldmann TA. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. Nat Rev Imunol 2006; 6:595-601.
10. Perna K, De Angelis B, Pagliara D, Hasan ST, Zhang L, Mahendravada A, Heslop HE, Brenner MK, Rooney CM, Dotti G. Savoldo B. Interleukin 15 provides relief to CTLs from regulatory T cell-mediated inhibition: implications for adoptive T cell-based therapies for lymphoma. Clin Cancer Res 2013; 19:106-117.
11. Liu RB, Engels B, Schreiber K, Ciszewski C, Schietinger A, Schreiber H, Jabri B. IL-15 in tumor microenvironment causes rejection of large established tumors by T cells in a noncognate T cell receptor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110:8158-8163.
12. List T, Neri D. Imunocytokines: a review of molecules in clinical development for cancer therapy. Clin Pharmacol 2013; 5:29-45.
13. Gillies SD, Reilly EB, Lo KM. Reisfeld RA. Antitelo-targeted interleukin 2 stimulates Tcell killing of autologous tumor cells. Proc Nati Acad Sci USA 1992; 89:1428-1432.
14. Albertini MR, Hank JA, Gadbaw 8, Kostlevy J, Haldeman J, Schalch H, Gan J, Kim K, Eickhoff J, Gillies SD, Sondel PM. Phase II trial of hu14.18-11.2 for patients with metastatic melanoma. Cancer Imunol Imunother 2012; 61:2261-2271.
15. Ribas A, Kirkwood JM, Atkins MB, Whiteside TL, Gooding W, Kovar A, Gillies SD, Kashala 0, Morse MA. Phase 1/11 open-label study of the biologic effects of the interleukin-2 imunocytokine EMD 273063 (hu14.18-IL2) in patients with metastatic malignant melanoma. J Transl Med 2009; 7:68.
16. Bessard A, Sole V, Bouchaud G, Quernener A. Jacques Y. High antitumor activity of RLI, an interleukin-15 (1L- 15)-1L-15 receptor alpha fuzioni protein, in metastatic melanoma and colorectal cancer. Mol Cancer Ther 2009; 8:2736-2745.
17. Vincent M, Bessard A, Cochonneau D, Teppaz G, Sold V, Mailiasson M, Birkld S, Garrigue-Antar L, Quernener A, Jacques Y. Tumor targeting of the 1L-15 superagonist RLI by an anti-GD2 antitelo strongly enhances its antitumor potency. Int J Cancer 2013; 133:757-765.
18. Kermer V, Baum V, Hornig N, Kontermann RE, Müller D. An antitelo fuzioni protein for cancer imunotherapy mimicking IL-15 trans-presentation at the tumor site. Mol Cancer Ther.
2012; 11:1279-1288.
19. Rubinstein MP, Kovar M, Purton JF, Cho JH, Boyman 0, Surh CD, Sprent J. Converting IL-15 to a superagonist by binding to soluble IL-15R{alpha}. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103:9166-9171.
20. Bernard J, Harb C, Mortier E, Qudmener A, Meloen RH, Vermot-Desroches C, Wijdeness J, van Dijken P, Grötzinger J, Slootstra JW, Plet A, Jacques Y. Identification of an interleukin-15alpha receptor-binding site an human interleukin-15. J Biol Chem 2004; 279:24313-24322.
21. Quemener A, Bernard J, Mortier E, Plet A, Jacques Y, Tran V. Docking of human interleukin-15 to its specific receptor alpha chain: correlation between molecular modeling and mutagenesis experimental data. Proteins 2006; 65:623-636
22. Hofmann M, Grosse-Hovest L, Nubling T, Pyz E. Bamberg ML, Aulwurm S, Buhring HJ, Schwartz K, Haen SP, Schilbach K, Rammensee HG, Salih HR, Jung G. Generation, selection and preclinical characterization of an Fcoptimized FLT3 antitelo for the treatment of myeloid leukemia. Leukemia 2012; 26:1228-1237.
23. Holt LJ, Herring C, Jespers LS, Woolven BP, Tomlinson IM. Domen antitela: proteins for therapy. Trends Biotechnol.2003 Nov; 21(11):484-90
24. III CR, Gonzales JN, Houtz EK, Ludwig JR, Melcher ED, Hale JE, Pourmand R, Keivens VM, Myers L, Beidler K, Stuart P, Cheng S, Radhakrishnan R. Design and construction of a hybrid imunoglobulin domen with properties of both heavy and light chain variable regions. Protein Eng.1997 Aug;10(8):949-57
25. Martin F, Toniatti C, Salvati AL, Venturini S, Ciliberto G, Cortese R, Sollazzo M. The affinity-selection of a minibody polipeptid inhibitor of human interleukin-6. EMBO J.1994 Nov 15;13(22):5303-9
26. Traunecker A, Lanzavecchia A, Karjalainen K. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells. EMBO J.1991 Dec;10(12):3655-9
27. Traunecker A, Lanzavecchia A, Karjalainen K. Janusin: new molecular design for bispecific reagents. Int J Cancer Suppl.1992;7:51-2
28. Silverman J, Liu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domens. Nat Biotechnol.2005 Dec;23(12):1556-61. Epub 2005 Nov 20
29. Silverman J, Liu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domens. Nat Biotechnol.2005 Dec;23(12):1556-61. Epub 2005 Nov 20.
30. Lamerisa et al. "Bispecific antitelo platforms for cancer imunotherapy" Crit Rev Oncol Hematol. 2014; S1040-8428(14)00135-8
31. Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-340232. Chen et al. "Fuzioni protein linkers: property, design and functionality" Adv Drug Deliv Rev; 2013; 65(10):1357-69
33. Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA
34. J.S. Patton et al. The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc.2004 Vol.1 pages 338-344
35. Jung et al. Local imunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antitelo fragments and resting autologous lymphocytes: evidence for in situ t-cell activation and therapeutic efficacy Int J Cancer Jan 2001; 15;91 (2):225-30,
36. Natsume A, Niwa R, Satoh M. "Improving effector functions of antitela for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC" Drug Des Devel Ther.2009; 3:7-16.
37. Gong JH, Maki G, Klingemann HG. "Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells" Leukemia; 1994,8(4):652-8
38. Altschul, J. Mol. Evol.36 (1993), 290-300
39. Altschul, J. Mol. Biol.215 (1990), 403-410
40. Kontermann (2012) "Dual targeting strategies with bispecific antitela" Landes Bioscience mAbs Vol. 4, Issue 2182-197
41. Kaspar M, Trachsel E, Neri D. "The antitelo-mediated targeted delivery of interleukin-15 and GM-CSF to the tumor neovasculature inhibits tumor growth and metastasis." Cancer Res. 2007 May 15;67(10):4940-8.
42. Conlon KC, Lugli E1, Welles HC, Rosenberg SA, Fojo AT, Morris JC, Fleisher TA, Dubois SP, Perera LP, Stewart DM, Goldman CK, Bryant BR, Decker JM, Chen J, Worthy TA, Figg WD Sr, Peer CJ, Sneller MC, Lane HC, Yovandich JL, Creekmore SP, Roederer M, Waldmann TA "Redistribution, hyperproliferation, activation of natural killer cells and CD8 T cells, and cytokine production during first-in-human clinical trial of recombinant human interleukin-15 in patients with cancer." J Clin Oncol.2015 Jan 1;33(1):74-82.
43. Navid et al, Immune Therapies for Neuroblastoma, Cancer Biol Ther.2009 May; 8(10): 874-8

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Fuzioni protein koji sadrži
a) vezujući protein koji sadrži najmanje jedno vezujuće mesto, naznačeno time da se vezujuće mesto vezuje za antigen povezan sa target ćelijom; i
b) IL-15 polipeptid, naznačeno time da IL-15 polipeptid sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 112, 113, 114, 115 i/ili 116 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO:1 na osnovu čega ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 od SEQ ID NO: 1 (Uniprot broj: P40933-1), naznačeno time da se IL-15 polipeptid vezuje za IL-2/IL-15Rβγ, naznačeno time da je vezujući protein izabran iz grupe koja se sastoji od antitela, fragmenta divalentnog antitela, fragmenta monovalentnog antitela, ili proteinskog vezujućeg molekula sa vezujućim osobinama sličnim antitelu.
2. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da proteinski vezujući molekul sa vezujućim osobinama sličnim antitelu je izabran iz grupe od aptamera, muteina zasnovanog na polipeptidu iz lipokalin familije, glutela, proteina zasnovanog na ankirin osnovi, proteina zasnovanog na kristalnoj osnovi, adnektina, avimera ili (rekombinantnog) receptor proteina.
3. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time da vezujući protein je tako modifikovan da ima poboljšanu aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) u poređenju sa istim ali nemodifikovanim vezujućim proteinom, izborno naznačeno time da modifikovani vezujući protein je Fc optimizovan i/ili izborno naznačeno time da modifikovani vezujući protein je antitelo, scFv-Fc fragment, bsFc-1/2 dimer ili bsFc-CH3-1/2 dimer.
4. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time da vezujući protein sadrži vezujuće mesto 4G7 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO.5 (sekvenca varijabilnog domena teškog lanca 4G7); i/ili naznačeno time da vezujući protein sadrži vezujuće mesto 4G7 antitela, koje ima identičnost sekvence od najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90 %, ili najmanje 95 %, ili najmanje 98 %, ili najmanje 99 % ili 100 % sa SEQ ID NO.6 (sekvenca varijabilnog domena lakog lanca 4G7).
5. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time da target ćelija eksprimira antigen povezan sa tumorom (TAA) i/ili antigen povezan sa autoimunim bolestima, naznačeno time je TAA poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD10, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD44v6, CD45, CDw52, Fms-slična tirozin kinaza 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R, (CD115), CD123, CD133, PDGFR-α (CD140a), PDGFR-β (CD140b), hondroitin sulfat proteoglikan 4 (CSPG4, melanom-povezan hondroitin sulfat proteoglikan), Muc-1, EGFR, de2-7-EGFR, EGFRvIII, Folat blokirajući protein, Her2neu, Her3, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, HLA-DR, IGFR, CD133, IL3R, fibroblast aktivirajući protein (FAP), Karboanhidraza IX (MN/CA IX), Karcinoembrionalni antigen (CEA), EpCAM, CDCP1, Derlin1, Tenascin, frizzled 1-10, vaskularni antigeni VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), Endoglin, CLEC14, Tem1-8, Tie2, mezotelin, epitelni glikoprotein 2 (EGP2), epitelni glikoprotein 40 (EGP40), kancer antigen 72-4 (CA72-4), podjedinica interleukin 13 receptora alfa-2, IL13Rα2, Ig kapa laki lanac (κ), GD3-gangliozid (GD3), GD2-gangliozid (GD2), acetilovane varijante GD2 i GD3, CD171, NCAM, alfa folat receptor (αFR), Lewis (Y), fetalni acetilholin receptor (FAR), homolog 3 virusnog onkogena ptičije eritroblastne leukemije (ERBB3), homolog 4 virusnog onkogena ptičije eritroblastne leukemije (ERBB4), homolog 2 virusnog onkogena ptičije eritroblastne leukemije (ERBB2), receptor faktora rasta hepatocita (HGFR/c- Met), klaudin 18.2, klaudin 3, klaudin 4, klaudin 1, klaudin 12, klaudin 2, klaudin 5, klaudin 8, klaudin 7, klaudin 6, membranski vezani CEA, Robo4 i CD138, tenascin i ekstra domen-B fibronektina; i/ili
naznačeno time da poželjno target ćelija eksprimira antigen povezan sa autoimunim bolestima, pri čemu je antigen izabran iz grupe koja se sastoji CD20, CD22, CD52 i TNFR, CD19, CD25, CD40, i/ili naznačeno time da poželjno target ćelija je ćelija tumora/kancera i/ili B ćelija.
6. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time da najmanje jedna aminokiselinska supstitucija je izabrana iz grupe koja se sastoji od L92D, E94K, L95D, V97D, I98D, L114D, L114E, I115D, I115E i/ili, poželjno E94K, V97D i/ili I98D, najpoželjnije E94K.
7. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačeno time da IL-15 polipeptid se ne vezuje za IL-15Rα, i/ili naznačeno time da IL-15 polipeptid je IL-15 protein pune dužine ili njegov fragment ili mutant, pri čemu fragment ili mutant ima smanjeni afinitet za IL-15Rα u poređenju sa afinitetom divljeg tipa IL-15 of SEQ ID NO: 1.
8. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačeno time da IL-15 polipeptid sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu kao što je prkazano na SEQ ID NO: 4, koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju (položajima) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 64, 65, 66, 67 i/ili 68 aminokiselinske sekvence prikazane na SEQ ID NO: 4.
9. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 za upotrebu u aktivaciji efektornih ćelija koje eksprimiraju IL2/IL-15Rβγ ograničenoj target ćelijama i/ili za upotrebu u target ćelijom-ograničenog ubijanja target ćelije posredovanog efektornim ćelijama koje eksprimiraju IL-2/IL-15Rβγ.
10. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time da je efektorna ćelija NK ćelija ili T-ćelija, poželjno NK ćelija, CD8+ T ćelija, gama delta T ćelija ili NK T ćelija.
11. Fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 za upotrebu u tretmanu bolesti, naznačeno time da su poželjno smanjeni sporedni efekti tretmana.
12. Fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time da je bolest proliferativna bolest ili autoimuna bolest, naznačeno time da poželjno proliferativna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera nadbubrežne žlezde, analnog kancera, kancera žučnog kanala, kancera bešike, kancera kosti, tumora mozga i kičmene moždine, kancera dojke, Castleman-ove bolesti, kancera grlića materice, kancera debelog creva, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, Ewing familije tumora, kancera oka, kancera žučne kese, gastrointestinalnih karcinoidnih tumora, gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST), gestacione trofoblastne bolesti, Hodgkin-ove bolesti, Kaposi sarkoma, kancera bubrega, kancera dušnika i hipofarinksa, leukemije, akutne limfocitne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije (CLL), hronične mijeloidne leukemije (CML), hronične mijelomonocitne leukemije (CMML), kancera jetre, kancera pluća, nesitnoćelijskog kancera pluća, sitnoćelijskog kancera pluća, karcinoidnog tumora pluća, limfoma, limfoma kože, malignog mezotelioma, multiplog mijeloma, mijelodisplstičnog sindroma, kancera nazalne šupljine i paranazalnog sinusa, nazofaringealnog kancera, neuroblastoma, ne-Hodgkin-ovog limfoma, kancera usne šupljine i orfarinksa, osteosarkoma, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera penisa, tumora hipofize, kancera prostate, kancera rektuma, retinoblastoma, rabdomiosarkoma, kancera pljuvačne žlezde, sarkoma, kancera kože, kancera bazalnih i skvamoznih ćelija, melanoma, kancera merkel ćelija, kancera tankog creva, kancera želudca, kancera testisa, kancera timusa, kancera tiroidee, sarkoma uterusa, kancera vagine, kancera vulve, Waldenstrom-ove makroglobulinemije, ili Wilms-ovog tumora; ili naznačeno time da poželjno autoimuna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od sistemskog eritemskog lupusa (SLE), Goodpasture-ovog sindroma, sarkoidoze, skleroderme, reumatoidnog artritisa, dermatomiozitisa, Sjögren-ovog sindroma, skleroderme, dermatomiozitisa, psorijaze, vitiliga, Alopecia areata, diajbetes melitus tipa 1, autoimunog pankreatitisa, Hashimoto-ovog tiroiditisa, Addison-ove bolesti, multiple skleroze, Myasthenia gravis, Polyarteritis nodosa, idiopatske trombocitopenijske purpure, hemolitičke anemije, sindroma antifosfolipidnog antitela, perniciozne anemije, gastrointestinalne bolesti, celijačne bolesti, inflamatorne bolesti creva, autoimunog hepatitisa ili primarne bilijarne ciroze
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8.
14. Molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, poželjno sadržan u vektoru.
15. Postupak za proizvodnju fuzionog proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, koji sadrži upotrebu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein za ekspresiju fuzionog proteina pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju fuzionog proteina.
RS20191593A 2015-03-06 2016-03-07 Fuzioni proteini koji sadrže vezujući protein i interleukin-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za il15ra i njihova terapeutska primena RS59658B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15157911.7A EP3064507A1 (en) 2015-03-06 2015-03-06 Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
EP16708154.6A EP3265478B1 (en) 2015-03-06 2016-03-07 Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for il15ra and therapeutic uses thereof
PCT/EP2016/054729 WO2016142314A1 (en) 2015-03-06 2016-03-07 FUSION PROTEINS COMPRISING A BINDING PROTEIN AND AN INTERLEUKIN-15 POLYPEPTIDE HAVING A REDUCED AFFINITY FOR IL15Ra AND THERAPEUTIC USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59658B1 true RS59658B1 (sr) 2020-01-31

Family

ID=52629425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191593A RS59658B1 (sr) 2015-03-06 2016-03-07 Fuzioni proteini koji sadrže vezujući protein i interleukin-15 polipeptid koji ima smanjeni afinitet za il15ra i njihova terapeutska primena

Country Status (16)

Country Link
US (3) US10906952B2 (sr)
EP (2) EP3064507A1 (sr)
JP (1) JP6757338B2 (sr)
CN (1) CN107636015A (sr)
BR (1) BR112017018975A2 (sr)
CA (1) CA2978808A1 (sr)
CY (1) CY1122494T1 (sr)
DK (1) DK3265478T3 (sr)
ES (1) ES2763598T3 (sr)
HR (1) HRP20192190T1 (sr)
HU (1) HUE047818T2 (sr)
PL (1) PL3265478T3 (sr)
PT (1) PT3265478T (sr)
RS (1) RS59658B1 (sr)
SI (1) SI3265478T1 (sr)
WO (1) WO2016142314A1 (sr)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
DK3143134T3 (da) 2014-05-15 2021-01-04 Nat Univ Singapore Modificerede, naturlige dræberceller og anvendelser deraf
EP3064507A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
CN112574316A (zh) 2015-07-02 2021-03-30 博际生物医药科技(杭州)有限公司 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白
EP3430058A4 (en) 2016-03-15 2019-10-23 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. MULTISPECIFIC FAB FUSION PROTEINS AND USES THEREOF
CN109715196A (zh) 2016-06-13 2019-05-03 转矩医疗股份有限公司 用于促进免疫细胞功能的组合物和方法
MY203000A (en) * 2016-10-14 2024-06-01 Xencor Inc Il15/il15r� heterodimeric fc-fusion proteins
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
CA3056591A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
BR112019019917A2 (pt) 2017-03-27 2020-04-22 Nat Univ Singapore receptores quiméricos nkg2d truncados e seus usos em imunoterapia de células exterminadoras naturais
MY201482A (en) * 2017-04-03 2024-02-26 Hoffmann La Roche Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
WO2019032628A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
CA3074826A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Torque Therapeutics, Inc. Therapeutic protein compositions and methods of making and using the same
WO2019067871A2 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Nantcell, Inc. ANTIGENIC PROTEINS AND ASSOCIATED METHODS
EP3749685A4 (en) 2018-02-09 2021-12-22 National University of Singapore ACTIVATOR CHEMERIC RECEPTORS AND THEIR USES IN NATURAL KILLING CELL IMMUNOTHERAPY
CN112004547A (zh) 2018-02-26 2020-11-27 新索思股份有限公司 Il-15缀合物及其用途
AU2019228381B2 (en) 2018-02-28 2021-12-16 Pfizer Inc. IL-15 variants and uses thereof
JP7334985B2 (ja) 2018-04-02 2023-08-29 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール 免疫細胞で発現される膜結合抗サイトカイン非シグナル伝達バインダーによるヒトサイトカインの中和
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
WO2019204646A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Lag-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and lag-3 antigen binding domains
MA52289A (fr) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères il-15/il-15ra et leurs utilisations
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
EP3806889A4 (en) * 2018-06-18 2022-07-13 Anwita Biosciences, Inc. CYTOKI FUSION PROTEINS AND USES THEREOF
WO2019246142A1 (en) * 2018-06-18 2019-12-26 Haiming Chen Soluble bispecific fusion proteins for cancer immunotherapy
EP3844186A4 (en) 2018-08-29 2022-08-17 National University of Singapore METHOD OF SPECIFIC STIMULATION OF SURVIVAL AND EXPANSION OF GENETICALLY MODIFIED IMMUNE CELLS
EP3847196A4 (en) 2018-09-07 2023-01-04 ITabMed (HK) Limited BISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
CN109207430A (zh) * 2018-09-25 2019-01-15 华东师范大学 一种嵌合抗原受体nk细胞及其制备方法和应用
JP6935383B2 (ja) * 2018-09-27 2021-09-15 公益財団法人実験動物中央研究所 免疫不全マウス
US20220002370A1 (en) 2018-09-27 2022-01-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
AU2019359475A1 (en) 2018-10-12 2021-05-20 Xencor, Inc. PD-1 targeted IL-15/IL-15Ralpha Fc fusion proteins and uses in combination therapies thereof
CA3120563A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Nkarta, Inc. Methods for the simultaneous expansion of multiple immune cell types, related compositions and uses of same in cancer immunotherapy
CN113438961A (zh) 2018-12-20 2021-09-24 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和NKG2D抗原结合结构域的靶向异二聚体Fc融合蛋白
WO2020132810A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific antigen binding proteins capable of binding cd19 and cd3, and use thereof
EP3773918A4 (en) 2019-03-05 2022-01-05 Nkarta, Inc. CD19 DIRECTED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR USES IN IMMUNOTHERAPY
IL288210B2 (en) 2019-05-20 2026-03-01 Cytune Pharma Dosing regimens of IL-2/IL-15 beta-gamma receptor agonists for the treatment of cancer or infectious diseases
AU2020315213A1 (en) * 2019-07-17 2022-02-03 National University Of Singapore Functional binders synthesized and secreted by immune cells
TW202128757A (zh) 2019-10-11 2021-08-01 美商建南德克公司 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
CN111690068B (zh) * 2019-11-13 2022-04-19 中国科学技术大学 一种IL-15/SuIL-15Rα-dFc-γ4复合体蛋白及其构造方法、应用
EP3822288A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
CN114761433B (zh) * 2019-12-11 2025-07-29 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗Claudin18.2单克隆抗体、其制备方法及用途
JP7814759B2 (ja) * 2020-09-17 2026-02-17 上海霖羲致企業管理有限公司 二重特異性組換えタンパク質及びその使用
WO2022090203A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 Cytune Pharma IL-2/IL-15Rβү AGONIST FOR TREATING SQUAMOUS CELL CARCINOMA
EP4232068A1 (en) 2020-10-26 2023-08-30 Cytune Pharma IL-2/IL-15RBetaGamma AGONIST FOR TREATING NON-MELANOMA SKIN CANCER
WO2022115865A2 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Xilio Development, Inc. Tumor-specific cleavable linkers
CN117186227A (zh) * 2020-12-23 2023-12-08 瑞泽恩制药公司 编码锚修饰的抗体的核酸以及其用途
CN117597355A (zh) 2021-06-23 2024-02-23 赛腾制药 白细胞介素15变体
WO2023280287A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Interleukin-15 variants and uses thereof
KR20240043797A (ko) 2021-08-13 2024-04-03 싸이튠 파마 암 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 항체-약물 접합체 조합
CN113956346B (zh) * 2021-10-26 2024-03-01 西安龙腾景云生物科技有限公司 一种重组白介素-15变体
CN115141283A (zh) * 2022-03-10 2022-10-04 厦门柏慈生物科技有限公司 一种融合蛋白、制备方法及其应用
JP7730432B2 (ja) * 2022-10-19 2025-08-27 アステラス製薬株式会社 がん治療におけるｐｄ－１シグナル阻害剤との組み合わせによる抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７二重特異性抗体の使用
WO2024170555A1 (en) * 2023-02-14 2024-08-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Il-15 fusion proteins with improved properties
WO2024215987A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES
EP4694916A1 (en) 2023-04-14 2026-02-18 SOTIO Biotech Inc. Engineered immune cells for treating cancer in combination with il-2/il-15 receptor ?? agonists
WO2025147512A1 (en) * 2024-01-02 2025-07-10 Eli Lilly And Company Immunogenicity assessment platform for biotherapeutic proteins
WO2025222129A2 (en) * 2024-04-19 2025-10-23 Mozart Therapeutics, Inc. Engineered cytokines and targeted cytokine delivery

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US7112324B1 (en) 1998-04-21 2006-09-26 Micromet Ag CD 19×CD3 specific polypeptides and uses thereof
DE19926068C1 (de) 1999-06-08 2001-01-11 Arne Skerra Muteine des Bilin-Bindungsproteins
WO2003029471A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of apolipoprotein d
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2008501621A (ja) 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
AU2003264100A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
ES2367027T3 (es) * 2004-02-27 2011-10-27 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Medicale) Sitio de unión de la il-15 para il-15ralfa y mutantes específicos de il-15 que tienen actividad agonista/antagonista.
US7892827B2 (en) 2004-11-26 2011-02-22 Pieris Ag Compound with affinity for the cytotoxic T lymphocyte-associated antigen (CTLA-4)
WO2006063974A2 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Cytos Biotechnology Ag Il-15 antigen arrays and uses thereof
EP2046820B1 (en) 2006-08-01 2010-10-20 Pieris AG Muteins of tear lipocalin and methods for obtaining the same
CN101743249B (zh) * 2007-05-11 2017-08-08 阿尔托生物科学有限公司 融合分子与il‑15变异体
US20120196310A1 (en) 2009-10-02 2012-08-02 Christiane Jaeger A-fucosylation detection in antibodies
RU2707126C2 (ru) 2009-12-07 2019-11-22 Пирис Аг МУТЕИНЫ ЛИПОКАЛИНА 2 ЧЕЛОВЕКА (Lcn2, hNGAL) С АФФИННОСТЬЮ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ МИШЕНИ
US8507222B2 (en) 2010-09-21 2013-08-13 Altor Bioscience Corporation Multimeric IL-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same
HUE033245T2 (hu) 2011-12-19 2017-11-28 Synimmune Gmbh Bispecifikus ellenanyag molekula
WO2014207173A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin 15 (il-15) antagonists and uses thereof for the treatment of autoimmune diseases and inflammatory diseases
EP3064507A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
AU2019228381B2 (en) 2018-02-28 2021-12-16 Pfizer Inc. IL-15 variants and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PL3265478T3 (pl) 2020-03-31
CN107636015A (zh) 2018-01-26
HUE047818T2 (hu) 2020-05-28
US10906952B2 (en) 2021-02-02
EP3265478B1 (en) 2019-09-11
JP6757338B2 (ja) 2020-09-16
HRP20192190T1 (hr) 2020-02-21
CY1122494T1 (el) 2021-01-27
US20180044391A1 (en) 2018-02-15
EP3265478A1 (en) 2018-01-10
US20210163564A1 (en) 2021-06-03
WO2016142314A1 (en) 2016-09-15
DK3265478T3 (da) 2019-12-16
SI3265478T1 (sl) 2020-01-31
US20220324931A1 (en) 2022-10-13
EP3064507A1 (en) 2016-09-07
CA2978808A1 (en) 2016-09-15
JP2018512168A (ja) 2018-05-17
BR112017018975A2 (pt) 2018-04-17
PT3265478T (pt) 2020-01-08
ES2763598T3 (es) 2020-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220324931A1 (en) FUSION PROTEINS COMPRISING A BINDING PROTEIN AND AN INTERLEUKIN-15 POLYPEPTIDE HAVING A REDUCED AFFINITY FOR IL15Ra AND THERAPEUTIC USES THEREOF
JP6557657B2 (ja) 分子
EP3035965B1 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses therof
CN106659775B (zh) 基于il-15的分子及其方法和用途
WO2021023658A1 (en) Antigen binding proteins specifically binding mage-a
EP4527466A2 (en) Anti-dll3 chimeric antigen receptors and uses thereof
JP2022528030A (ja) 多機能性融合タンパク質及びその使用
CN113056283A (zh) 关于治疗血液肿瘤的工程化和非工程化γδ-T细胞的组合物和方法
JP7362614B2 (ja) 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質
KR20240067081A (ko) Il-2 변이체 및 이의 융합 단백질
JP2022500077A (ja) 改善された抗ｆｌｔ３抗原結合タンパク質
CN113272016A (zh) 关于治疗实体肿瘤的工程化和非工程化γδ-T细胞的组合物和方法
WO2022090556A1 (en) Bcma/taci antigen-binding molecules
WO2023186100A1 (zh) 抗ror1的抗体及其用途
KR20250044482A (ko) 조작된 인터루킨-2 수용체 베타 결합 감소 작용제
JP2025538424A (ja) 併用療法の投与レジメン
EA051364B1 (ru) Улучшенные антигенсвязывающие рецепторы
CN117915931A (zh) 癌症免疫疗法的给药方案
HK40113187A (zh) 改善的抗原结合受体
HK40051640A (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses thereof
HK40088090A (zh) 改善的抗原结合受体
EA050894B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ В ОТНОШЕНИИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ И НЕСКОНСТРУИРОВАННЫХ γδ T-КЛЕТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ОПУХОЛЕЙ
EA049516B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ В ОТНОШЕНИИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ И НЕСКОНСТРУИРОВАННЫХ γδ T-КЛЕТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ
HK1225999B (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses thereof
HK1225999A1 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses thereof